国立大学法人神戸大学

若手研究者支援枠

国立大学法人神戸大学
事業実施期間：開始 平成30年10月1日〜終了 令和2年3月31日

申請者役職・氏名

大学院医学研究科 特命助教

槇野義輝

研究 ・ 事業名

抗がん剤設計のためのRasの動的構造解析
交付申請内容安定的に結合してより強い活性を示す医薬品開発候補物質のたRas・caged-GTP微結晶に光照射をすることで光保護基離理論的分子設計を効率的に進めるためには、揺らぎのメカニズ

脱後のRas・GTPのState 1からState 2への構造遷移についムを原子レベルで解明する必要がある。申請者らのグループはて、JASRIとの共同でSACLAを用いた時分割により可視化し、本申請に先駆け、先行研究を実施しRas・caged-GTPの微小ポケット開閉運動を原子レベルでのコマ送り動画として捕捉す結晶を用いたSACLAでの試験測定を実施した。その結果、ることを試みる。

State 1→State 2→GDP型への構造遷移を示唆するデータ

2. 時分割構造解析によるRas・caged-GTP複合体を用いた収集に既に成功しており、申請時点においてさらに高分解能のGTP加水分解反応の解明：データを収集するための測定条件の最適化段階にある。

Cage離脱後のRas・GTPに関しては、State 1構造からState2構造へ遷移した後、酵素触媒反応によりGTPが加水分解されRas・GDPになることが、これまでの申請者らの溶液NMRに研究・事業により期待される効果よる先行研究により既に確認されている。溶液NMRの結果で本研究が順調に推進され、成果をリード化合物の構造最適はポケット開閉運動（構造遷移パスウェイ）と比較してGTPの化に活用できれば、実現不可能と考えられてきたRasを分子標加水分解の反応速度は遅いことが示唆されており、上述の1.

的とした抗がん剤開発を一気に推進する起爆剤となる。将来と同様の手法で光照射による保護基の離脱→天然型Ras・研究も含め開発成功の暁には、その市場規模の大きさから、国GTPのState 1→State 2構造を経たのちのRas・GTP→Ras・

内医薬品産業振興への多大な寄与が期待される。

研究·事業の目的及び意義

研究・事業の方法及び手段

本研究では、新規がん治療薬を創出するための基盤的知見

がん遺伝子産物Ras蛋白質は薬剤結合部位に大きな揺らぎを得るべく、構造生物学の手法である核磁気共鳴（NMR）分光を持つため、静的構造情報のみを利用した従来型の理論的法、兵庫県が世界に誇る大型放射光施設SPring-8での蛋白分子設計のみでは医薬品創出が困難である。そこで、
まず揺ら質X線結晶構造解析、並びにX線自由電子レーザー（XFEL）ぎのある生体高分子の構造解析に秀でたNMR分光法を用い

施設SACLAにおけるシリアルフェムト秒時分割（SFX）測定をて、Ras蛋白質の機能発現に関わるGTP加水分解反応におけ電子を高エネルギー加速器の中で制御して運動させること

よって本研究で成果が得られれば、Rasを皮切りとして、これら用いて、Ras蛋白質の構造ダイナミクスと時分割の活性制御のる動的構造解析・反応速度論解析を行う。
さらに、SPring-8のにより得られる非常に強い光(SPring-8の10億倍の明るさ）を複数の低分子量G蛋白質に対する新規阻害剤開発研究に大きメカニズムを原子スケールで明らかにすることを目的として10億倍の明るさを持つSACLAと時分割シリアルフェムト秒利用したX線由電子レーザー施設を使用すれば、原子や分子く波及し、それらを加速する可能性がある。

研究を行う。

結晶構造解析を組み合わせた世界最先端の手法を用いることの瞬間的な動きを観察することができる。
日本が誇る超高品質

低分子量G蛋白質Rasはがん全体の約30％で常時活性化しで、Ras蛋白質の薬剤結合ポケットの開閉（ゆらぎ）メカニズムの電子ビーム技術、ならびに超精密電子制御技術の粋を結集ており、がん細胞の増殖・生存維持に係る機能を有する。そのを原子スケールで捕捉し、NMR分光で得られる構造情報と組したX線自由電子レーザー施設SACLAは、2011年のX線機能は薬剤が結合可能なポケットの開閉運動で制御されていみ合わせて解釈することで、新たな創薬基盤技術を開拓する。

レーザーの発振以降、測定・解析システムの改良を伴い着実にるが、その動的構造情報の不足により、申請時においては未だ1. GTP型RasのSACLAおよびNMRによるポケット開閉進化を遂げ、従来型の静的X線結晶解析では定性的な理解にGDPの構造変化をSACLA及びSPring-8での測定で補捉し、の低分子量G蛋白質（Rap, Ral, Racなど）に広く認められる性研究・事業の特徴（新規性、独自性等）有効な分子標的がん治療薬は見出されていなかった。近年でメカニズム（構造遷移パスウェイ）の解明：
GTP結合型Ras(Ras・GTP)は薬剤結合可能ポケットが開いる。本研究を進める上で連携をとる神戸大学・島扶美博士なKRasG12C・GDPをターゲットとした抗がん剤として初めていた構造(State 1:不活性型）と閉じた構造 (State 2:活性型）

らびにJASRI・熊坂崇博士はSPring-8を用いたRasのSBDD

米国FDAに迅速承認されたこともあり、Rasはがん治療薬のの2つの構 造を遷 移している（ 図 1 ）。この構 造 遷 移 過 程を（構造ベース創薬）の研究実績と国内製薬企業への導出経験標的分子として再び世界的な関心を集めている。
そこで本研究SACLAにより高分解能で解析するには、均一かつ大量の高密がある(2013年，PNAS)。
また本事業で計画する時分割結晶

では、申請者の専門である構造生物学的見地からNMRを用い度の微小結晶溶液が必要となる。我々はこれまでの研究におい構造解析実験については、SACLAを利用したフェムト秒結晶た動的構造解析・反応速度論解析を行い、加えて世界最新鋭て、光保護基(cage)を有する人工型GTP（委託合成：（株）
ナー

構造解析が膜タンパク質である微生物型ロドプシンのバクテリ

光科学技術・X線自由電子レーザー施設SACLA等を利用するド研究所、神戸研究所）との複合体Ras(Ras・caged-GTP)にオロドプシンについての成功例として報告されている(2016年，

ことで、従来型の静的構造解析では困難であったRasの構造関して、SPring-8による単一結晶の構造解析と溶液NMRによScience)。
この新たな構造解析の技術の創薬ターゲッ ト分子ダイナミクスと活性制御メカニズムを時分割・原子分解能で解る解析によって、ポケットが開いたState 1構造をとり、cage離への応用は国内外を問わず新規性に富んでおり得られる成果

明し、得られた動的構造情報から阻害物質を効率的に見出し、脱直後の天然GTP型Rasは、速やかにState 1からState 2には世界的を牽引する結果となることが期待される。本研究では新たな創薬基盤技術の構築に寄与する。

構造遷移することを明らかにしてきている。そこで本申請課題

共同研究者らと有機的に連携することで、上記技術を最大限にでは、N M Rによる構 造 遷 移 過 程の部 位 特 異 的な構 造ダイ活用し、最も有望な創薬ターゲット分子の一つであるにも関わナミクスを詳細に解明するとともに、SACLAによるState 1かららず、未だ有効な阻害剤（抗がん剤）開発の成功例がないRas

State 2への構造遷移の観測を実施する。特にSACLA測定用蛋白質の、世界初となる原子レベルでの機能制御のメカニズム試料に関しては、均一な微小結晶溶液の大量調製が必要での解明を目指す。

助成金成果抄録集

さらに、GTP結合型Rasにおけるポケットの開閉運動とそれに連動したGTPの加水分解反応は、Rasに類似したがん関連その加水分解過程を可視化する 。

は2021年5月に、Amgen社のsotorasib（AMG510）がある。
申請者は神戸大学・島扶美博士らと共同で微結晶試料の1最適化を行う。具体的な構造変化の観測方法としては、得られ質であるが、時分割での構造変化と機能発現（いわゆる酵素触媒反応）の相関を原子レベルで解明した例はこれまでにない。

留まっていた蛋白質の構造と機能への理解を変貌させてきて立体構造に顕著な揺らぎを持つRasの薬剤結合ポケットに助成金成果抄録集

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国立大学法人神戸大学

実績報告内容遷移過程おける構造変化を補捉した。SACLAを用いた高分解

15N HSQCをベースとして使用し、信号の帰属には必要な各種能の構造解析を行うために必要な均一かつ大量で高密度の微3D NMR（hnca、hn(co)ca、hncacb、hn(co)cacb、hnco、結晶溶液は、研究協力者である神戸大学・教授・島扶美博士のhn(ca)coなど）を用いた。得られた15N HSQC スペクトルでは助言と協力を得て大量調製条件を検討した。その結果、Ras・そのシグナルの、特定のアミノ酸残基の化学シフト値から、構造変化を同期させ、天然型GTP結合Rasの構造並びにGTP

caged-GTPを蒸気拡散法と呼ばれる手法により結晶化し、得Ras・cage-GTPは溶液中でも結晶構造と同様なState 1様の加水分解反応過程におけるRasの構造変化を補捉した。本研られた結晶を種結晶として用いた微結晶の大量調製法を確立

構造であることが示唆された。Ras・caged-GTPからのcage

究ではNPE-cageと呼ばれる光保護基を使用したが、この化し、SACLAで測定可能な5−10μmの均一微結晶の大量調離 脱のための光 照 射 実 験は光の波 長 3 9 5 n mのL E D 光を

当該研究課題では、Ras蛋白質を標的とした新規がん治療

合 物は近 紫 外 光によりc a g eの離 脱が 開 始される。N P E -製に成功た。得られた微結晶サンプルはSACLAでのXFEL測NMRプローブの外で照射し、直ちに測定を開始することで薬を創出するための構造生物学的な基盤的知見を取得するた

caged-GTPには2つのジアステレオマー（R体・S体）が存在し、定並びにSPring-8での高輝度光を用いた微結晶サンプルのX行われた。
その結果、溶液中ではcage離脱は速やかに進行し、めに、光制御可能なGTPアナログであるcaged-GTPを活用し、両者は鏡合わせのような構造を持っている。互いに類似した物

線回折データを取得する手法であるSS-ROX法と呼ばれる測

その蛋白質構造はおよそ600 min.かけてゆっくりとGDP型へ

NMR分光法を用いてRasの薬剤結合が可能なポケット領域の理的性質（分子量、融点など）を持つジアステレオマーの合成・定等に供した。SACLAにおけるXFEL測定並びに、SPring-8と構 造 変 化することが示された。また、アミノ酸残基ごとに開閉運動を含むRas蛋白質の動的構造解析・反応速度論研究分離は一般に容易ではない。本研究では、その合成経路の検討、でのX線回折実験はJASRI・熊坂崇博士、河村高志博士らの協NMRシグナルの強度変化をトレースすることで、GTP加水を実施した。併せて世界最新鋭の光科学技術・X線自由電子並びに合成・分離を研究協力者である神戸大学・特命教授・力の下実施された。測定用の微結晶サンプルとしては1 107

分解反応に伴うRasの構造変化は上述のポケット領域の構造

レーザー施設SACLA等を駆使した構造ダイナミクスと活性制

森 一 郎 博 士の協力を得て実 施した。構 造 解 析には大 量の個・ml 程度の濃度の微結晶溶液サンプルを調製し、必要量に変化に加えて、ポケットに隣接するP-loop、α3-ヘリックスと御メカニズムを時分割・原子分解能で解明することを目的としcaged-GTPが必要であったが、その大量合成に先立ち、小規濃縮して使用した。XFEL測定並びにSS-ROX測定の結果、光呼ばれる領域においても顕著な構造変化が観測された（デーて研究を実施し、RasのGTP加水分解反応の分子動画作成の模での合成、分離・分取の検討を神戸大学大学院・理学研究

照射前のRas・caged-GTP微結晶サンプルは、NMRで観測タ非公開）。
すなわちRasのGTP加水分解反応に伴う構造変化一部に成功した。

科・准教授・松原亮介博士により実施した。
その結果、効率的なされた溶液構造と同様のポケットの開いたState 1様の構造では酵素触媒部位であるポケット並びに隣接する部位の構造変

がん遺伝子産物Rasは低分子量G蛋白質であり、がん細胞合成経路・分離・分取の手法が見いだされ、2つのジアステレオあることが明らかとなった。次いでSACLA及びSPring-8に化も重要であることが示され、新たな創薬開発に資する構造情の増殖・生存維持に係る機能を有する。
このRas蛋白質はがんマーの分離に成功した。実際の大規模合成は神戸市に研究所よる時分割測定を実施した。XFEL測定ではcage離脱のため報になり得る知見を取得す至った。

全体の約30%で常時活性化しており、がん治療薬創出の標的を有する（株）
ナード研究所にて実施し、当該化合物の数十ミリのポンプ光（ 励 起レーザー 光 ）として近 紫 外 光 領 域である分子であるにも関わらず、従来の理論的分子設計のみでは医グラムスケールでの合成・分離に成功し、構造解析に必要な310nmの波長の光を使用し、時分割X線結晶構造解析を実施

このようなRasに関する構造変化は、Rasを標的とした新規薬品創出が困難である。その1つの理由は、Rasの薬剤結合可caged化合物安定供給が可能となった。当該研究所で合成さした。一連の測定の結果、光照射後に格子定数の時間変化ががん治療薬の開発の基盤となるのみならず、光制御可能な化能なポケット領域は比較的大きな揺らぎを持つことに起因し、れた化合物は神戸大学・理学研究科・准教授田村厚夫博士の観測された。
これは光照射によってcageが離脱し、構造遷移と合物を用いた研究手法として利用することで他の低分子量Gその動的構造情報が不足していることであると考えられる。そ協力によりCD（円二色性）スペクトル測定により、その評価をそれに続くGTP加水分解に伴う蛋白質の構造変化が生じた

蛋白質をターゲットとする創薬基盤技術への構造生物学的のこで本研究においては、揺らぎを持つ生体高分子の構造解析実施した。CDスペクトルではNPE-caged-GTPのような光学結果であることが強く示唆される結果であった。光照射直後の寄与としても意義のある結果であった。に秀でたNMR分光法を用いて、Rasの機能発現に関わるGTP活性を持つ物質の右円偏光、左円偏光の差を測定することでGTP結合型Rasの構造は、光照射後数ミリ秒のタイムポイント加水分解反応における動的構造解析を行った。加えて世界最取得化合物がR体であるかS体であるかを分析可能である。

でRasのポケット部分に着目すると、State 1様のポケットの開新鋭光科学技術・X線自由電子レーザー施設SACLAにおけるその結果、CDスペクトルによる明確な円二色性の違いが観測いた構造であり、光照射によるcage 離脱後の天然GTP型Ras時分割シリアルフェムト秒結晶構造解析（XFEL）並びに大型された（図２）。
さらにこれらの取得化合物についてNMR測定から State １様構造へ構造変化を示唆する構造情報の取得

放射光施設SPring-8における結晶構造解析などを駆使し、を実施した結果、R体・S体の2つの化合物ではそのジアステレに成功した（データ非公開）。
また、SPring-8でのSS-ROX法

本研究事業の推進によって得られた蛋白質の動的構造情報

Ras蛋白質の薬剤結合ポケットの揺らぎ（開閉）メカニズムをオマーに起因するNMRスペクトルの化学シフト値の差異が観などによるX線回折実験から、微結晶中のRasは光照射の数十の一部を、Rasをターゲットとした新規がん治療薬創出に向け原子スケールで補捉し、新たな創薬基盤技術を開拓するため測された。
このようにして、我々はNPE-caged-GTPの2つのジ時間後にはRas・GDPへと構造変化しており、その格子定数のた化合物の構造最適化に活用するで、これまで実現不可能での動的構造情報を取得した。

アステレオマーの取得に成功したが、S体のcaged-GTP及び変化などから議論すると、RasのGTP加水分解は State 1からあると考えられてきたRasを分子標的とした抗がん剤開発を推Ras・（S）-caged-GTPの蛋白質結晶は光に対しての不安定さ

State 2を経てGDP型へと至る逐次的な変化であることが示唆進する起爆剤になり得る。

を有していたため、本研究では主として光に対して安定なR体された（図３）。

研究・事業の内容及び目標達成状況①光制御可能なGTPアナログ（caged-GTP）の合成
低分子量G蛋白質であるRasは活性型のGTP結合型Rasのcaged-GTPを使用し、caged-GTP結合型Ras（Ras・(Ras・GTP)と不活性型のGDP結合型(Ras・GDP)を行き来すcaged-GTP）の微結晶サンプルを調製し、XFEL測定等の構ることでその機能が制御されている。
このようなRasのGTP造解析実験に供した。

加水分解活性のため、天然型GTP結合型Rasは時々刻々とGDP結合型へと構造変化をする。そこで本研究では光制御可

3②SACLAによる時分割測定（XFEL測定）

-1

今後の展開

特に本研究事業においては、① SACLAでのXFELによる時分割測定並びにSPring-8でのX線結晶構造解析によってRas③NMRを用いた Ras・caged-GTP の GTP 加水分解過程に蛋白質の薬剤結合可能なポケット領域の開閉運動の可視化のおける部位特異的な構造変化の追跡一部を達成し、② NMRによるGTP加水分解反応に伴うRasの本研究では上述のX線結晶構造解析（SACLA・SPring-8）

各 領 域の速 度 論 解 析によってポケット領 域に隣 接するp -に加えて、NMR分光法によるRasのGTP加水分解反応に伴うloop、α3-ヘリックス領域の構造変化がRas分子のGTP加水能なcaged-GTPを用いることで、光照射をGTP加水分解反応

Ras蛋白質の構造遷移過程をSACLAにより高分解能で解溶液中での蛋白質の構造変化をトレースする試みも実施した。

分解反応を制御していることを示唆する結果を得るに至った。のトリガーとして様々な構造解析を実施した。光反応性保護基析するには、均一かつ大量の高密度の微小結晶溶液が必要でNMR測定は神戸大学・医学研究科所管のBruker Avance III

このような、本研究で得られた構造データは、①Ras・GTPのcageは特定の波長の光を照射することで直ちに遊離する。

あった。
また、Rasは内因性のGTP加水分解活性を持つため、600分光器を使用し1H共鳴周波数600.13279833MHz、薬 剤 結 合ポケットを、がん化シグナルが O F Fとなるような

従って、caged-GTPは光照射によって速やかに天然型GTPへ

天然型GTP結合型Rasは時々刻々とGDP結合型へと構造変測定温度298Kで実施された。測定サンプルはリン酸緩衝液中ポケットの開放状態に保つ（＝Ras・GTPのState 1の安定化）、と至る。本研究ではcaged-GTPのこれらの光反応性を活用し、化 す る 。そこで 、本 研 究 で は 先 に 述 べ た 光 制 御 可 能 なに均一に溶解したRas・cage-GTP（400―1200μM）とした。

あるいは、②Ras・GTPからRas・GDPへと至るGTP加水分解

光照射とNMR並びにSACLA/SPring-8での測定におけるcaged-GTPを用いることで、天然型GTP結合Ras並びに構造測定手法は蛋白質の溶液NMR測定で一般的に用いられる反応を促進させる（＝Rasの不活性化促進）を実現するための助成金成果抄録集

助成金成果抄録集4国立大学法人神戸大学基盤的知見となり得る（図3）。今後の展開として、本助成事業を発展させるべく、Ras蛋白質内の水素結合などを含めたアミノ酸-アミノ酸間相互作用等の詳細を他のcage化合物（例えばS体）などを使用して解明し、得られる構造生物学的知見を総合的に活用することで、新規がん治療薬の開発が大きく推進することが期待される。将来的な研究を含め新規がん治療薬が開発された暁には、その市場規模の大きさから国内医薬品産業の振興に対する多大な寄与が期待される。
また、本研究で一部解明したGTP結合型蛋白質のポケットの開閉運動と、それに伴うGTP加水分解反応はRasに類似した他のがん関連の低分子量G蛋白質（RapやRalなど）に広く共通した性質である。
これら蛋白質の構造・機能相関の時分割での原子レベルの解析複数の低分子量G蛋白質に展開することで、新規シグナル伝達阻害剤開発の研究に大きな波及効果をもたらし、それらを加速することが期待できる。

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助成金成果抄録集

助成金成果抄録集6