インフルエンザ診断マニュアル(第 3 版)（平成 26 年 9 月）

1

目次Part I: イン フル エ ン ザ お よび イン フル エ ン ザ ウイル ス検 査 法 の 概 要
１ 病原体--------------------------------------------------------------------------------------------------------	
  3２ ヒトにおけるインフルエンザの疫学----------------------------------------------------------------------	  3---------------------------------------------------------------------------------------------------	
  4３ 臨床症状４ 検査の進め方-----------------------------------------------------------------------------------------------	  5Part II: ウイル ス分 離 と同 定-----------------------------------------------------	  6

１ インフルエンザウイルス分離のための臨床検体
２ ウイルス分離用検体の輸送と保存----------------------------------------------------------------------	  6３ 培養細胞を用いたインフルエンザウイルスの分離---------------------------------------------------	
  6４ 孵化鶏卵を用いたインフルエンザウイルスの分離-------------------------------------------------	  11５ 赤血球凝集阻止試験（HI test）によるインフルエンザ分離株の同定------------------------------	  15

６ ウイルス遺伝子検出法によるインフルエンザウイルスの同定--------------------------------------	  23

７ （参考）迅速診断のためのインフルエンザウイルスの検出-----------------------------------------	  32Part III: イン フル エ ン ザ ウイル スの 遺 伝 子 解 析
１ RT-PCR 法とシークエンス-----------------------------------------------------------------------------	  36

２ GISAID (The Global Initiative on Sharing All Influenza Data: www.gisaid.org/)の利用-------	  46

Part IV: イン フル エ ン ザ の 血 清 診 断
１ HI 試験による血清学的診断---------------------------------------------------------------------------	  50

２ ウイルス中和試験による血清学的診断----------------------------------------------------------------	  52Part V: 薬 剤 耐 性 イン フル エ ン ザ ウイル スの 検 出
１ 薬剤耐性変異の検出
２ 薬剤感受性試験

-----------------------------------------------------------------------------------	  58-----------------------------------------------------------------------------------------	
  65

検査依頼先

-----------------------------------------------------------------------------------------------------	
  83

執筆者リスト-----------------------------------------------------------------------------------------------------	  832

Part I
インフルエンザおよびインフルエンザウイルス検査法の概要
1.

病原体

インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科に属し、ウイルス粒子内部に存在する核蛋白質(NP)およびマトリックス蛋白質(M1)の抗原性の違いから A、B、C の３つの型に分けられる。ウイルス粒子はエンベロープをもち、直径 80〜120 nm の球状、または 1-2 µm の紐状の形態をしており、内部には８（C 型ウイルスは７）分節からなるマイナス鎖 RNA が遺伝子として含まれている（図 A）。A 型および B 型ウイルスでは粒子
表面には、宿主細胞表面に存在するレセプターに結合する赤血球凝集素（ヘマグルチニン、HA）と、子ウイルスが細胞表面から出芽する際に、レセプターのシアル酸を切断してウイルス粒子を細胞外へ遊離させる働きをするノイラミニダーゼ（NA）の２種類の糖蛋白質が存在する。一方、C 型ウイルスでは赤血球凝集
活性とエステラーゼ活性を併せもつ１種類の HEF 糖蛋白質のみが粒子表面に存在する。
Ａ型ウイルスはヒト以外の動物にも広く分布している人獣共通ウイルスで、粒子表面の糖蛋白質の抗原性の違いから、HA は 16 亜型、NA は 9 亜型に分けられ、それら全てはカモなどの水禽の世界に存在している。Ａ型ウイルスでは十〜数十年に一度の頻度でこれら亜型の組み合わせがこれまでの流行株とは大きく異なる新型ウイルスが出現し、ヒトの間でインフルエンザの世界的な大流行（パンデミック）を引き起こす。このことから、Ａ型ウイルスについては、ヒトと動物にわたる広範なサーベイランスが重要である。

2.

ヒトに お け るイン フル エ ンザ の 疫 学

毎年冬季になると世界各地でインフルエンザの流行がみられ、北半球にある温帯地域以北の国々ではおおむね 1-2 月頃が流行のピークとなる。わが国のインフルエンザは、毎年 11 月下旬から 12 月上旬頃に流行が始まり、翌年の 1-3 月頃にピークとなり、4-5 月にかけて終息していくというパターンであるが、最近では夏季にインフルエンザの集団発生や小流行があり、ウイルスも通年で分離されている。流行の程度とピークの時期はその年によって異なる。
インフルエンザ流行の大きい年には、インフルエンザおよびそれに関連した死亡数が顕著に増加し、さらには循環器疾患、慢性基礎疾患などによる超過死亡が増加し、結果的に全体の死亡数が増加することが知られている。ことに高齢者がこの影響を受けやすく、先進国などで共通に見られる現象となっている。全人口に対する高齢者の割合が急増している我が国においても、超過死亡は 1998/99 シーズンには 3 万人
以上も観測され、超過死亡の８割以上は 65 歳以上の高齢者によってもたらされており、社会的な問題となった。
2009 年にブタインフルエンザウイルス由来の A(H1N1)pdm09 ウイルス（図 1）が出現し、パンデミックを起こした。このウイルスの大流行に伴い、これまでの季節性 A(H1N1)ソ連型ウイルスが消滅し、2012 年現在、A(H1N1)pdm09、A(H3N2)香港型、B 型の 3 種類が季節性インフルエンザとして流行している。

3

図 1 2009 年にパンデミックを起こしたブタ由来の A(H1N1)pdm09 インフルエンザウイルス（国内分離株）の電子顕微鏡写真3.

臨床症状

感染から 1-3 日間ほどの潜伏期間の後、発熱・頭痛・全身の倦怠感・筋関節痛などが突然現われ、咳・鼻汁などの上気道炎症状がこれに続き、約１週間以内で軽快するのが典型的なインフルエンザで、いわゆる「かぜ」に比べて全身症状が強いのが特徴である。高齢者はインフルエンザに罹患することによって、2 次的な細菌感染による肺炎や気管支炎を起こしやすいことが知られているが、小児ではこれらの合併症に加えて中耳炎を起こしやすく、気管支喘息を誘発することもある。従来の季節性インフルエンザ患者では、ウ
イルス性肺炎を認めることはごく稀であるが、A(H1N1)pdm09 に感染した若年層では、比較的高い頻度でウイルス性肺炎を誘発することが報告されている。
インフルエンザの診断基準はインフルエンザの流行期間中(例年 11 月〜4 月)に以下の４つの項目全てを満たすものとされている。

１. 突然の発症
２. 高熱
３. 上気道炎症状
４. 全身倦怠感等の全身症状

なお、非流行期での診断は、類似疾患との鑑別のために、より多くの検査情報が必要である。

4

4.

検査の進め方インフルエンザの検査にはウイルス学的、遺伝学的および血清学的手法がある。前者２つはウイルスの検出と分離・同定が中心であり、病因の診断としては最も信頼がおける検査である。最近では種々の迅速診断キットが市販されており、臨床分離検体中のウイルス抗原の有無が短時間で判断できるようになってきているので、これらキットを併用した検査の進め方が有効である。一方、血清学的手法は抗体価の上昇をもとにした病因の確定診断で、正確な判定を下すためには急性期と回復期のペア血清を採取することが重要である。これら検査法の概要を図 2 に示す。

図 2 インフルエンザウイルス検査の概要

5

Part II
ウイルス分離と同定
患者から採取した検体からのウイルス分離は、ウイルス感染の病原診断として感度が高く、もっとも信頼できる方法である。また、インフルエンザ予防の要であるワクチンを供給するためには、ウイルスの分離は不可欠である。
一昔前までは、インフルエンザウイルスの分離培養に孵化鶏卵が盛んに用いられていた。しかし、その入手が困難であることやウイルスを孵化鶏卵で増殖させると元の抗原性、感染性が変化することから、今日
では、培養細胞を用いるのが普通になった。ところが現行のインフルエンザワクチンは、孵化鶏卵で増やしたウイルスから製造されるため、ワクチン株は孵化鶏卵で分離、継代されたウイルスを使用しなければならない。そのため、孵化鶏卵によるウイルス検出システムを備えた検査室では、培養細胞によるウイルス分離に加え、孵化鶏卵による分離も心がけたい。

1.

イン フル エ ン ザ ウイル ス分 離 の た め の 臨 床 検 体

病原診断のためのウイルス分離あるいは抗原検出の成功の鍵は、いかに上手に的確な臨床材料を得る
かにかかっている。検査材料には、咽頭拭い（Throat swab）液＊、鼻腔洗浄液（Nasal wash）、鼻咽頭分泌液（Nasopharyngeal secretions:NPS）、鼻腔拭い(Nasal swab)液＊、うがい液、鼻汁鼻かみ液などが一般的に用いられる。

＊

咽頭や鼻腔を拭った綿棒を浸す液には、0.5％ウシ血清アルブミンフラクションV （BSA）、ペニシリン（100-500 U/ml）、ストレプトマイシン（100-500μg/ml）、ゲンタマイシン（100μg/ml）およびアンフォテリシン
B（2 μg/ml）を添加した細胞培養培地（MEM培地または199培地）またはPBS(-)を用いる。生理食塩水はpHが不安定となるため使用しない。

2.

ウイル ス分 離 用 検 体 の 輸 送 と保 存

分離用検体を採取したら氷中または４℃に保管し、できるだけ速やかにウイルス分離を試みる。ウイルス
分離を行なうまでの日数が 5 日〜１週間程度であれば、４℃の状態を維持し、輸送も冷蔵状態で行う。しかし、それ以上の日数を要する場合は、検体を-70℃以下に保存し、輸送も凍結状態で行う。ウイルス分離用
検体は可能な限り凍結融解をさける。この操作を繰り返し行うと、ウイルスの感染性が低下して、ウイルス分離が困難になる。

3.

培 養 細 胞 を 用 い た イン フル エ ン ザ ウイル スの 分 離培養細胞によるインフルエンザウイルスの培養には、最初サル腎細胞やヒト胎児細胞などが用いられてい6

たが、最近は分離率が高いこと、また容易に入手できるという手軽さとコストの面からもほとんど
Madin-Darby canine kidney (MDCK)細胞が用いられている。

3.1 MDCK 細胞の培養
3.1.1 培養器具および試薬
組織培養用プラスチックフラスコ（75 cm2, 12.5 cm2）(BD Falcon Cat. #353018)
DMEM 培地（SIGMA Cat. #D6429）
ウシ胎仔血清（FBS）
ペニシリン/ストレプトマイシン（GIBCO BRL Cat. #15140-122）
ファンギゾン（GIBCO BRL Cat. #15290-018）
0.05％トリプシン/0.53 mM EDTA（GIBCO BRL Cat. #25300-054）
リン酸緩衝生理食塩水（PBS（-））（GIBCO BRL Cat. #14190-144）※上記試薬類は感染研で培養細胞の状態を検討し使用しているものであるが、他のメーカーのものに替えても差し支えない。

3.1.2 試薬の調製
増殖用培地
試薬

最終濃度

使用量

DMEM

-

500 ml

FBS

10%

50 ml

ペニシリン/ストレプトマイシン

100 単位/ml ペニシリン

5 ml

100 μg/ml ストレプトマイシン
ファンギゾン

0.5 μg/ml

1 ml

3.1.3 培養細胞継代法
1) 単層を形成した細胞の培地を吸引する。
2) PBS (-) 15 ml を器壁に沿って静かに加え、細胞表面を洗浄する。
3) トリプシン/EDTA 1〜2 ml を加え、37 ℃の CO2 インキュベーター(5% CO2)で保温する*。
4) 顕微鏡下で細胞が剥がれているのを確認した後、フラスコを軽くたたいて細胞を壁面から完全に剥がす。増殖用培地 5 ml を加え、泡立てないようにピペッティングして細胞を分散させる。細胞を回収し、800rpm（125g）で 5 分間遠心した後、上清を吸引除去し、新たに 10 ml の増殖用培地を加える。
5) 増殖用培地 10〜20 ml を加えた新しい 75cm2 プラスチックフラスコに細胞分散液 2 ml（おおよそ 1×107

６

細胞数/ml に相当）を植え込み、37℃の CO2 インキュベーター(5% CO2)で培養する。３〜４日で単層の細胞シートを形成する。12.5cm2 プラスチックフラスコの場合は、この細胞分散液 0.5 ml を、増殖用培地 2 mlを加えた新しいフラスコに植え込み培養する。２〜３日で単層の細胞シートを形成する。

＊

細胞によっては数分後にはもうほとんど円形化しているような場合もあるので処理時間に注意し、トリプシ

ン処理をしすぎないように注意する。また、30 分以上経過してもほとんどの細胞の形態に変化のない場合もあるので、そのような場合にはトリプシン/EDTA 溶液を追加して、再び 37℃に保温する。

3.1.4 細胞ストックの作製
細胞は、継代数を重ねすぎると性質が変化したり、作業途中の事故等でコンタミさせてしまったりすることがあるため、継代歴の新しいもので細胞のストックを作製しておく必要がある。ある一定の継代歴になれば、細胞を廃棄し、細胞ストックからあらたに起こした細胞を使用することで一定の分離効率を維持する事ができる。継代歴を重ねすぎた細胞ではインフルエンザウイルスの増殖性が低下することもある。
＊細胞凍結（細胞ストックの作製）
1) 継代時の方法と同様に 4）の遠心まで行い、上清を除去した後、凍結用培地（Recovery Cell Culture
Freezing Medium (GIBCO BRL Cat. #12648-010)に、>1x106 cells/ml の濃度で浮遊させる。
2) 2ml のセーラムチューブに 1ml ずつ分注し、徐々に凍結させるため、凍結処理容器（バイセル（日本フリーザー（株））等、無ければ厚いタオル等で包む）に入れ、-80℃で 1 晩凍結する。
3) 翌日、液体窒素タンクに移動させる。
感染研では、細胞のマスターストックは 50 本、ワーキングストックは 100 本作製している。通常ワーキング
ストック細胞を使用し、継代歴が 25 代になると廃棄し、あらたにワーキングストックを起こして使用している。
ワーキングストックが無くなった場合にはマスターストックからワーキングストックを作製する。

＊ストック細胞の起こし方
1) 液体窒素タンクに保管している細胞チューブを取り出したら、37℃のウォーターバスにチューブを浸け、すみやかに融解する。
2) 増殖用培地 15 ml を加えた 75cm2 プラスチックフラスコに融解した細胞液を加え、37 ℃の CO2 インキュベーター(5% CO2)で培養する。
3) 24 時間後、上清を吸引除去し、新しい増殖用培地 15 ml を加え、細胞が単層を形成するまで 37 ℃の
CO2 インキュベーター(5% CO2)で培養する。

3.2 インフルエンザウイルスの分離
3.2.1 器具および試薬

8

MDCK 細胞の単層培養（組織培養用 12.5 cm2 プラスチックフラスコ*）
DMEM 液体培地（SIGMA Cat. #D6429）
ペニシリン/ストレプトマイシン（GIBCO BRL Cat. #15140-122）
ファンギゾン（GIBCO BRL Cat. #15290-018）
リン酸緩衝生理食塩水（PBS（-））（GIBCO BRL Cat. #14190-144）
アセチルトリプシン（SIGMA Cat. #T6763）*

24 ウェルマルチプレートを使用する場合、使用ウェルの間隔を空けることで交叉汚染を避けることが可能。

不可能な場合、1 ml/tube（池本理化工業 Cat. #802-135-01）の使用が多検体の処理に適する。

※上記試薬類は感染研でウイルス分離効率を検討し使用しているものであるが、他のメーカーのものに替えても差し支えない。

3.2.2 試薬の調整
分離用培地
試薬

最終濃度

使用量

DMEM

-

500 ml100 単位/ml ペニシリン

5 ml

ペニシリン/ストレプトマイシン

100 μg/ml ストレプトマイシン
ファンギゾン

0.5 μg/ml

1 ml

3.2.3 ウイルス分離方法
1) 単層を形成した細胞の培地を吸引する。
2) PBS (-) 5 ml を器壁に沿って静かに加え、細胞表面を洗浄する。分離用培地で同様に洗浄した後、接種試料 0.1〜0.2 ml を細胞に接種する*。
3) 10 分おきに容器をゆすって、ウイルスを吸着させる。ウイルスの吸着は 34℃の CO2 インキュベーター内で行う。
4) 30〜60 分後**、トリプシン（0.5〜5 μg/ml）***を含む分離用培地 2.5 ml を加え、34 ℃の CO2 インキュベーターで培養する。
5) 細胞変性効果（CPE）の出現を毎日顕微鏡下で観察する。
6) CPE が出現したところで培地を採取する。6 日目あるいは 7 日目になったら、CPE 出現の有無にかかわらず培地を採取する。

9

*細胞が乾燥しないよう接種材料をすばやく細胞全体に広げる。

**

試料はウイルス吸着後取り除いた方が良い。

***

トリプシン濃度は細胞やトリプシンのロットによって異なるので、予め試験を行い細胞が 1 週間程度維持できる最大量を用いる。

（別法）MDCK 細胞浮遊法でのウイルス分離
0.1％BSA および 2.5 μg/ml アセチルトリプシン加 DMEM で MDCK 細胞数を 1×106 /ml に調整し、その0.5 ml を 24 ウェルマルチプレートに分注し、同時に検体 0.1 ml を接種する。34 ℃で培養する。

3.2.4 判定方法
培養上清中の HA 活性を測定する。方法については「5.1 赤血球凝集（HA）試験および赤血球凝集阻止（HI）試験の実際」の項を参照。

3.2.5 ウイルスの継代培養
HA 活性が検出されなかった場合は、回収したウイルス培養液を 10 倍に希釈し、別に用意した培養細胞に接種する。これを数回繰り返す。前回弱い CPE が確認されたり、低い HA 価が検出されたりした場合は、ウイルス培養液を 100 倍程度に希釈して接種する。

3.2.6 保存方法
ウイルス液は 3000 rpm、5 分間遠心し、細胞の破片を除いた後分注し-70℃以下に保存する。

（参考）A(H1N1)pdm09 ウイルスの培養における分離用培地の比較について
MDCK 細胞で培養継代を繰り返しても 8HA/ml に満たない A(H1N1)pdm09 ウイルス株の検出が 2010/11
シーズンに相次いだ。国立感染症研究所では、インフルエンザウイルスの MDCK 細胞における増殖効率を改善するため、種々の培地について検討した。その結果、DMEM 培地を用いた培養で A(H1N1)pdm09
ウイルスの増殖が顕著に改善されることが分かった（表 1）。

10

表 1 A(H1N1)pdm09 ウイル スの 培 養 に お け る培 地 の 比 較

ウイルス

4.

接種後３日目接種後 4 日目

接種後 6 日目

接種後 7 日目

CPE

HA 価

CPE

HA 価

CPE

HA 価

CPE

HA 価

培地

A(H1N1)pdm09 ウイルス

DMEM

＋＋

８

＋＋

３２±

＋＋＋

３２±

＋＋＋

１６±

#1

MEM

-

＜２

＋

２±

＋

２±

＋

２±

A(H1N1)pdm09 ウイルス

DMEM

＋＋

１６±

＋＋

３２±

＋＋＋

１６±

＋＋＋

１６±

#2

MEM

-

＜２

＋

２±

＋

２±

＋

２±

A(H1N1)pdm09 ウイルス

DMEM

＋

１６±

＋

３２±

＋

１６

＋＋

３２±

#3

MEM

-

＜２

＋

２±

＋

２±

＋

２±

A(H1N1)pdm09 ウイルス

DMEM

＋＋

８

＋＋

３２±

＋＋＋

３２±

＋＋＋

３２±

#4

MEM

＋

２±

＋

２±

＋

２±

＋

２±

A(H1N1)pdm09 ウイルス

DMEM

＋＋＋

１６

＋＋＋

３２±

＋＋＋

３２

＋＋＋

６４±

#5

MEM

＋

２±

＋

２±

＋

２±

＋

２±

孵 化 鶏 卵 を 用 い た イン フル エ ン ザ ウイル スの 分 離

ヒトの咽頭拭い液等の接種材料からインフルエンザウイルスを孵化鶏卵で分離培養するには、羊膜腔内接種法が最も適している。一方、卵に馴化したウイルスの増殖には、ウイルス液量を確保できることから、尿膜腔接種法が適している。

4.1 羊膜腔内接種法
4.1.1 孵化鶏卵
卵令： ８〜９日卵を用いる。

4.1.2

検卵

１）暗室等にて孵化鶏卵に強い光源を当て、光源の反対側より孵化鶏卵の内部を観察し、発育状態を確か
め、胎仔側の気室と卵殻膜との境目に、なるべく血管の少ない部分に印（ライン）を付ける（図 1）２）検卵した卵を卵台に気室を上になる様に垂直に立てる。

11



   

図 1 検卵4.1.3 検体接種
１）卵殻上部気室部を中心にヨードチンキで清拭＊、ついで 70％アルコールで消毒する。
２）印より 約１cm 上部に消毒したハサミ等にて、直径約１cm になるように卵殻を取り除き 小窓をあける。
３）卵殻膜を透明にし、胎仔の位置を把握する為、高圧滅菌したサラダオイルを約 0.1 ml 小窓より滴下する。または卵殻膜を取り除く。
４）接種材料を注射器に吸い入れ、小窓より確認した胎仔の側に、検卵しながら注射針を刺し入れ、注射針の位置を確認後、羊膜腔内に 0.1 ml 接種する（図 2）（羊膜腔内に注射針の先端が入っているのかを確認する方法は、注射針に少量の空気を入れ羊膜腔内に針を刺し入れた際に空気を出す。羊膜腔内に針が入っていない場合には、空気が泡となって上昇して来る事が卵殻膜越しに確認出来る。また羊膜腔内に針が入っている場合には、泡はそこに留まる。）

  

 

図 2 羊膜腔内接種法

12５）羊膜腔内に接種後、卵殻気室部の小窓をセロテープ＊＊にて塞ぐ。

＊

省略してもよい。

＊＊

セロテープは無菌ではないので、卵液が付着しないように注意する。

4.1.4 培養
気室を上にした状態で静置し、加湿して 34 ℃にて、おおよそ 48 時間培養する。接種後 24 時間目で検卵し、死亡していた場合は、羊水を継代する。

4.1.5 羊水採液
１）一夜、4 ℃に静置した培養卵の卵殻上部気室部を中心に、ヨードチンキで清拭 ＊、ついで 70％アルコールにて噴霧消毒後、消毒したハサミ等にて気室部全体の卵殻を取り除く。
２）卵殻膜を消毒したピンセットにて取り除いた後、採液用の注射器の針にて、漿尿膜を破り、卵を傾け漿
尿液を滅菌シャーレ等に捨てる。
３）胎仔を卵の外に出さない様に注意しながら、さらに卵を傾けると、羊膜に包まれた胎仔が羊水とともに露出して来るので、風船状に膨らんだ羊膜腔から羊水を採液する（右図参照）。
なお採液される羊水の量は１ ml 前後である。

＊

省略してもよい。

4.1.6 判定
羊水中の HA 活性を測定する。方法については「5.1 赤血球凝集（HA）試験および赤血球凝集阻止（HI）
試験の実際」の項を参照。

4.1.7 ウイルスの継代培養
HA 活 性 が 検 出 され な か っ た 場 合 は 、回 収 した 羊 水 を 10 倍 に 希 釈 して 再 び 羊 膜 腔 内 に 接 種 す る。
これを数回繰り返す。低い HA 価が検出された場合は、羊水を 100 倍程度に希釈して接種する。

4.2 尿膜腔内接種法
4.2.1 孵化鶏卵
卵令：10〜11 日齢。検卵は羊膜腔内接種法に準じる。

13

4.2.2 検体接種
１）検卵が済んだ孵化鶏卵を、卵台に気室を上になる様に垂直に立て、卵殻上部気室部の印（ライン）を中
心にヨードチンキで清拭＊、ついで 70％アルコールで消毒する。
２）印（ライン）より 5 mm 程上部に、消毒した千枚通し等にて径 1 mm 弱の小穴を開ける。
３）接種材料を PBS（ペニシリン 100 単位／ml・ストレプトマイシン 100 μg／ml を含む。）にて通常 10 倍〜1000 倍に希釈し、希釈段階毎に数個ずつ接種する。
４）接種量は 0.1〜0.2 ml／個。接種後小穴を木工ボンド等にて塞ぐ。

＊

省略してもよい。

4.2.3 培養
羊膜腔内接種法に準じる。

4.2.4 尿液採液
１）一夜 4 ℃に静置した培養卵の卵殻上部気室部を中心に、ヨードチンキで清拭＊、ついで 70％アルコー
ルにて噴霧消毒後、消毒したハサミ、ピンセット等にて気室部の卵殻を大きく取り除く。
２）血管、卵嚢を傷つけない様に注意しながら、太めの注射針（18 ゲージ）を付けた注射器にて尿液を採液する。なお採液される尿液の量は 5〜10 ml である。

＊

省略してもよい。

4.2.5 判定
尿液中の HA 活性を測定する。方法については「5.1 赤血球凝集（HA）試験および赤血球凝集阻止（HI）
試験の実際」の項を参照。

4.2.6 保存法
分注して-70 ℃以下に保存する。

14

5

赤 血 球 凝 集 阻 止 試 験 （HI test）に よるインフル エ ンザ 分 離 株 の 同 定
インフルエンザ様疾患の患者から得られたスワブ等を、孵化鶏卵や MDCK 細胞等の培養細胞に接種することによって得られた検体に赤血球凝集活性が認められた場合、インフルエンザウイルスの存在を確認するために同定試験を行う必要がある。培養上清や鶏卵由来の羊水や漿尿液中のインフルエンザウイル
スの同定には、市販のインフルエンザウイルス同定キット（後述）や亜型特異的な抗体、型・亜型特異的
RT-PCR 法（後述）などを利用する。これらの方法は、インフルエンザウイルスの型別（前者）や、A 型ウイル
スの亜型の判別などに有効であり、分離されたウイルスの同定という目的を十分達成することが出来る。
国立感染症研究所(感染研)では、毎年のインフルエンザシーズンに先駆けて当該シーズンのワクチン
株および疫学的に重要であると考えられる株に対する抗血清を作製し、その抗原とともに要望のある地方衛生研究所に配布している。HI 試験の実施にあたり、血清中に存在する非特異的な血球凝集阻害物質
および非特異的血球凝集物質を取り除くための操作が必要であり、試験実施機関における試験の信頼性、再現性を確保するためには、これらの操作が適切に行われる必要がある。さらに試験毎に参照抗原および被検抗原の抗原量が厳密に調整されるとともに、試験結果の判定基準が常に一定であることが、試験の信頼度を高めることになる。したがって、これらの条件が十分保証される施設においては HI 試験がインフル
エンザウイルスの同定に最も適した試験方法であるため WHO による世界的なインフルエンザのサーベイラ
ンス活動においてもこの方法が採用されている。

5.1 赤血球凝集（HA）試験および赤血球凝集阻止（HI）試験の実際
5.1.1 インフルエンザウイルス同定キット
同定キットに含まれる抗血清は、当該シーズンのワクチン株および疫学的に重要であると考えられるウイ
ルスをウサギまたはフェレットに接種し、その血清を凍結乾燥させたものである。抗原は、抗血清の作製に用いたものと同じウイルスの感染しょう尿液を不活化したものである。

5.1.2 試薬
血球浮遊液（七面鳥、鶏、ヒト O 型またはモルモット血球）
滅菌蒸留水
0.01M リン酸緩衝液 (PBS) (pH7.2)
生理食塩水、0.85% NaCl

使用する赤血球の選択に際しては、臨床検体から分離されたインフルエンザウイルスの血球凝集性が流行シーズンや継代歴によって変化することを念頭に置く必要がある。細胞で分離された最近の A(H3)分離株はモルモット血球に対しては感受性が高いが、鶏および七面鳥血球に対する感受性は極めて低い株が多く見受けられる。B 型については、モルモット血球よりも鶏および七面鳥血球に対して反応性の良い株

15が見受けられることと、七面鳥血球とフェレット血清の組み合せでは非特異凝集と非特異抑制が認められることがわかった。これらの点を考慮して、2011/12 シーズンより感染研では、A(H1)ソ連型、A(H1)pdm09 には七面鳥血球を、B 型には鶏血球を、A(H3)にはモルモット血球を用いて HA と HI 試験を行っている。モルモット血球にはロット差がまれに見られるため、３ロットの血球を混合し使用している（表１）。A(H1)ソ連型、A(H1)pdm09、A(H3)、B に同一種の血球を使用する場合にはモルモット血球が推奨される。血球選択における注意点としては、同一検体においても異なる血球を用いることによって 4HA を示す抗原量が異なる
ため、HA および HI の一連の試験は同一種の血球で行う必要がある。また、血球浮遊液の至適濃度は血球種によって異なり、一般的に、七面鳥、鶏は 0.5％、ヒト、モルモット血球は 0.75％の濃度で使用する。鳥類の血球は 45 分間反応させ、哺乳類の血球は 60 分間反応させる。このように血球種の違いによって、至適濃度および反応時間が異なる。ただし、感染研ではモルモット血球浮遊液を 1%で使用している。血球の濃度が濃くなると HA 価はわずかに低くでるが、HA および HI 像の判定が容易になるためである。全ての血球で U 底マイクロプレートより、V 底マイクロプレートを用いたほうが、血球がきれいに日の丸状になり、判定が容易になる。A(H3)のウイルス株（例：A/Victoria/210/2009 (H3N2)）によっては NA 活性により、室温での HA 像が消失する株があり、感染研ではこの現象を防ぐため 4℃で HA、HI の反応を行っている。ここでは、感染研が行っているモルモット血球を用いた方法について記載する。

5.2 血清からの非特異的血球凝集阻止因子の除去
感染研から分与する同定用抗血清からの非特異的血球凝集阻止因子の除去には以下の方法（RDE法）を用いる*。

1. 凍結乾燥血清を指定量の滅菌蒸留水で溶解する。溶解した血清は-20℃以下の冷凍庫で保存する。
2. RDE(II)「生研」（デンカ生研）に滅菌生理食塩水 20ml を加えて溶解する。
3. 一容の血清に三容の RDE を加える（例 0.3ml 血清+0.9ml RDE）。
4. 37℃のウォーターバスで 18 時間から 20 時間作用させた後、56℃のウォーターバスで 30 分から 1 時間
加熱し、RDE を不活化する。
5. 室温に冷却した後、6 容の滅菌生理食塩水を加え、最終希釈を 10 倍とする。
6. モルモット血球（GRBC）の packed cells（HA、HI 試験に用いるものと同種の赤血球）を、10 倍希釈した16

血清 10 容に対して 1 容加え、緩やかに転倒混和する。
7. 室温 1 時間で、吸収する。途中転倒混和することで血球が沈殿しないようにする。
8. 2500〜3000rpm（1940g）で 5〜10 分間遠心し、血清と血球を分離する。
9. 吸収済血清と血球を反応させて、吸収が完全に行われたことを確認する**。
10. 吸収が不完全な場合は、6.からの操作を吸収が完全になるまで繰り返す。

*血清中の非特異的血球凝集阻止因子の性状および特異性は、血清ごとに異なり、また RDE のロットごとに RDE 活性が異なることを考慮する必要がある。このため、全量の抗血清を処理するに先立ち、RDE 処理および血球吸収によって、使用する抗血清の非特異反応が完全にのぞけるかどうかを、少量の抗血清を用いて事前に確認するべきである。不完全な RDE 処理や血球吸収による非特異反応は HI 試験の信頼性を著しく低下させる。
血清診断を行う場合には血清および抗原の種類によって、非特異的血球凝集阻止因子の除去方法としていずれの方法が適しているか（RDE 法、トリプシン過ヨウ素酸法等）を検討する必要がある。

**非特異的血球凝集因子の除去の確認法：
１）マイクロプレートの B 列から H 列まで、PBS (pH7.2) 50μl を加える。
２）A 列のそれぞれのウェルに 100μl の処理済み血清を加える。一列は血球対象として血清の代わりに、100μl の PBS を加える。
３）A 列から 50μl を取り、B 列から H 列まで二倍の階段希釈を行う。
４）全てのウェルに 50μl の 1%GRBC を加え、４℃で 60 分間反応させる。
５）血清存在下で血球対照と同様に血球が沈殿するかどうかを判定し、非特異的血球凝集因子が除かれたかどうかを調べる。
６）さらに、交差反応を示さない亜型の抗原を用いて HI 試験を行い非特異的な血球凝集阻止因子が RDE
処理によって、完全に除去されたかどうかを調べる。

17

処理済み血清	  100μl（または血球対照用 PBS)

1

二
倍
階
段
希
釈

PBS
50μl

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12

血清希釈倍率

A

10 倍

B

20 倍

C

40 倍

D

80 倍

E

160 倍

F

320 倍

G

640 倍

H

1280 倍HA 価の測定： （1 プレート 8 株 1：2 から 1：4096 まで測定）
1.

50μl の PBS を全てのウェルに分注する。

2.

ウイルス原液 50μl を 1 列目の各ウェルにそれぞれ加える。1 ウェルは血球対照としてウイルスの代わりに、PBS を 50μl 加える。

3.

1 列目の各ウェルをよく混和後、50μl をとり、順次 2 倍階段希釈を行う。

4.

全ウェルに 50μl の 1%GRBC を加える。

5.

低速で撹拌後、4℃で 60 分反応後、判定。完全凝集を与えるウイルス希釈の最高値の逆数をHA 価とする。

18

HA 価

2
1

4
2

8

16
3 4

32

128 512
2048
64
256
1024
4096
5 6 7 8 9 10 11 12

A
B
C
D
E
F
G
H
ウイルス（抗原）50μl

PBS 50μl
二倍階段希釈5.3 4HA/25μl 抗原液の作製 (1 プレート 12 株)
1.

上で求めた HA 価を 8 で割って、4HA/25μl 抗原液の作製に必要な抗原原液の希釈倍率を求める。すなわち抗原原液の HA 価が 64 の時は、原液を 8 倍希釈したものが計算上、4HA/25μl 抗原液となる。

2.

一回の試験に必要な抗原液の量をもとに PBS で、抗原原液を希釈して 4HA/25μl 抗原液を作製する。

3.

50μl の PBS を全てのウェルに分注。

4.

A 列にそれぞれ希釈した 4HA/25μl 抗原液 50μl を加える。

5.

A 列の各ウェルをよく混和後、50μl をとり順次 2 倍階段希釈を行う。

6.

50μl の 1%GRBC を加える。

7.

低速で撹拌後、4℃で 60 分反応後、判定。

8.

3 ウェル目まで完全凝集を認めれば O.K. 完全凝集でない場合は希釈液をもとに再調整後、再度 HA 価を測定する。*

19

*調整した 4HA/25μl 抗原液は、必ず back titration で力価を確認した後、その日のうちに HI 試験に供する。4℃で一晩以上保存した場合は、HI 試験実施前に HA 価の再確認をすること。

抗原	
  50μl	
 

1

二
倍
階
段
希
釈

PBS
50μl

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12A

2HA/50μl

B

4HA/50μl

C

8HA/50μl(4HA/25μl)

D

16HA/50 μE

l32HA/50 μF

l64HA/50 μGl128HA/50

H

μl
256HA/50μl

七面鳥血球の 8HA/50μl(4HA/25μl)例

GRBC の 8HA/50μl(4HA/25μl)

205.4 HI 試験
1.

25μl の PBS をウェル 2 から 12 まで分注する。

2.

50μl の 1：10 希釈抗体をウェル１に分注する。

3.

ウェル 1 から 25μl とり、ウェル 12 まで 2 倍階段希釈する。

4.

各ウェル 25μl ずつ 4HA/25μl のウイルス抗原を分注する。

5.

低速で撹拌後、室温で 60 分以上反応後、50μl の 1%GRBC を加える。

6.

低速で撹拌後、4℃で 60 分反応後、プレートは傾けずに判定。**抗体価は、完全に凝集阻止を示す抗体の最高希釈倍率の逆数とする。また、抗体の希釈倍率とは、2 倍
階段希釈終了後の抗体の希釈倍率で、抗原液、血球浮遊液による抗体の希釈は考慮に入れないものとする。0.5%七面鳥血球を用いた場合、血球凝集阻止の判定の際には、45 分後にプレートを傾けて、沈降した血球が血球対象と同様にウェル内で涙目状に流れるものを陽性とする。

5.5 判定例 （下表・次ページ図参照）
血清 HI 価抗 H1 血清抗 H3 血清

抗 B 血清判定

分離株 #1

320

＜10

＜10

H1

分離株 #2

＜10

2560*

＜10

H3

分離株 #3

＜10

＜10

80

B

分離株 #4

＜10

＜10

＜10

判定不能**

H1 標準抗原

5120

＜10

＜10

-

H3 標準抗原

＜10

10240

＜10

-

B 標準抗原

＜10

＜10

640

-

注意：
*：分離株 #2 の抗 H3 血清に対するウェル 10 の反応のように不完全な凝集阻止が認められた場合は、完全阻止を示す最終希釈（2560 倍）を抗体価とする。
**：分離株 #4 の様に標準抗血清のいずれとも反応が認められない場合、インフルエンザウイルスではない可能性も考えられるため、インフルエンザ診断キットや RT-PCR 法などによってインフルエンザ A 型、B型のいずれで（可能であれば亜型まで）あるかを決定する。

21

1
分離株	
  ＃1

A

分離株	
  ＃2

B

分離株	
  ＃3

C

分離株	
  ＃4

D

分離株	
  ＃1

E

分離株	
  ＃2

F

分離株	
  ＃3

G

分離株	
  ＃4

H
抗体価

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12

抗 H1 血清抗 H3 血清

10

1

160

40
20

2

80

3

4

640

2560
10240
1280
5120
20480

7

8

320

5

6

9

10 11 12

分離株	
  ＃1

A

分離株	
  ＃2

B

分離株	
  ＃3

C

分離株	
  ＃4

D

H1 標準抗原E

抗 H1 血清

H3 標準抗原F

抗 H3 血清

B 標準抗原血球対照

抗 B 血清抗 B 血清GH
PBS 25μl

抗血清 50μl

22

6

ウイル ス遺 伝 子 検 出 法 に よるイン フル エ ン ザ ウイル スの 同 定
Polymerase Chain Reaction (PCR) 法などの遺伝子増幅法は、遺伝子検査にとって今日では欠くことのできない重要な分子生物学的手法であり、種々のウイルス遺伝子の検出にも幅広く利用されている。この章では、臨床検体またはウイルス培養液からの RNA 抽出方法、TaqMan Probe を用いたリアルタイム
RT-PCR 法および Conventional RT-PCR 法による季節性インフルエンザウイルスの型・亜型同定法、また参考 と し て Direct RT-LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 法 を 用 い た A 型 お よ び
A(H1N1)pdm09 インフルエンザウイルスの同定法について述べる。

6.1 臨床検体またはウイルス培養液からの RNA の抽出
6.1.1 器具および試薬
マイクロ遠心機、マイクロピペット（200、1000µl）、100%エタノール、滅菌微量遠心チューブ（1.5ml）、
QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN Cat#52904）

6.1.2 RNA 抽出
QIAamp Viral RNA Mini Kit を用いて RNA 抽出を行う場合のプロトコールを下記に示した。なお、注意事項、詳細についてはキットに付属のマニュアルを参照すること。

1) 140µl の検体またはウイルス培養液をキャリア RNA 添加済みの Buffer AVL 560µl と混合し室温で 10
分間インキュベートする。
↓
2) スピンダウンした後、100%エタノール 560µl を添加し、15 秒間ボルテックスする。再びスピンダウンして溶液を回収する。
↓
3) 混合液 630µl を QIAamp スピンカラムに注入し、キャップを閉めて 6000×g（8000rpm）で 1 分間遠心する。
カラムを新しいコレクションチューブに移す。ろ液の入ったコレクションチューブは捨てる。この作業をもう一度繰り返す。
↓
4) Buffer AW1 500µl を添加し、キャップを閉めて 6000×g（8000rpm）で 1 分間遠心する。カラムを新しいコレクションチューブに移し、ろ液の入ったチューブは捨てる。
↓
5) Buffer AW2 500µl を添加し、キャップを閉めてフルスピード（20000×g、14000rpm）で 3 分間遠心する。
↓
6) カラムを新しいコレクションチューブに移し、フルスピード（20000×g、14000rpm）で 1 分間遠心する。

23↓7) カラムを新しい 1.5ml チューブに移し、Buffer AVE 60µl を添加する。キャップを閉めて室温で 1 分間イ
ンキュベートした後、6000×g（8000rpm）で 1 分間遠心する。

抽出した RNA は速やかに遺伝子検査に使用し、保存する場合はできるだけ-70℃以下で保存する。

6.2 リアルタイム RT-PCR (TaqMan Probe 法) による同定
インフルエンザウイルス遺伝子は一本鎖の RNA であるため、PCR 反応のためにウイルス RNA に相補的な DNA（cDNA）を reverse transcriptase（RT）で合成する必要がある。ここでは RT 反応と PCR 反応をシン
グルチューブで行う TaqMan Probe を用いたリアルタイム One-step RT-PCR 法により、季節性インフルエン
ザウイルスの型(A 型・B 型)・亜型(H1pdm09・H3・H1 ソ連型)を同定する方法ならびに B 型インフルエンザ
ウイルスの系統(ビクトリア系統・山形系統)を識別する方法を示す。一連の反応は 1 チューブ内で連続的に行い、増幅産物をリアルタイムに検出するため電気泳動が不要であり、conventional RT-PCR 法と比べて、判定までにかかる時間を短くする事ができる。また通常は、反応後のチューブを開ける必要がないので、電気泳動等のポスト PCR 操作によるコンタミネーションの可能性がなく、コンタミネーションによる偽判定のリス
クを減らす事ができる。

6.2.1 機材および試薬
マイクロ遠心機、マイクロピペット（2、20、200、1000µl）、RNase-free 滅菌蒸留水※1、滅菌微量遠心チューブ（1.5ml）、96well リアルタイム PCR 反応プレート、8 連ストリップキャップまたはプレートシール、リアルタイ
ム PCR 装置、プライマー、TaqMan プローブ、QuantiTect® Probe RT-PCR Kit (QIAGEN Cat#204443)、
RNase Inhibitor 20Units/µl(100µL) (ABI Cat#N808-0119)※1

RNase-free 滅菌蒸留水はコンタミネーションを防ぐために市販のものを使用するのが望ましい。検査ごとに新品を開封して使用するか、または予め清浄な環境で RNase-free の滅菌チューブ等に分注しておいたものを検査ごとに使用する。

6.2.2 リアルタイム RT-PCR 用プライマーおよびプローブについて
以下に感染研で使用しているプライマーおよびプローブを示す。
（A 型 同 定 用 ）Type A M 遺伝子検出用プライマーおよびプローブ：
MP-39-67For

5’-CCMAGGTCGAAACGTAYGTTCTCTCTATC

MP-183-153Rev

5’-TGACAGRATYGGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCA

24

MP-96-75ProbeAs

5’-(FAM)ATYTCGGCTTTGAGGGGGCCTG(MGB)

PCR 産物の長さ： 146bp（H1pdm09※ 2 亜 型 同 定 用 ）H1pdm09 HA 遺伝子検出用プライマーおよびプローブ：
NIID-swH1 TMPrimer-F15’-AGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGT

NIID-swH1 TMPrimer-R1

5’-TGTTTCCACAATGTARGACCATNIID-swH1 Probe25’-(FAM)CAGCCAGCAATRTTRCATTTACC(MGB)

PCR 産物の長さ：187bp※2

H1pdm09 の HA 遺伝子をターゲットとしており、H1 ソ連型の HA 遺伝子には反応しない。

（H3 亜 型 同 定 用 ）H3 HA 遺伝子検出用プライマーおよびプローブ:
NIID-H3 TMPrimer-F15’-CTATTGGACAATAGTAAAACCGGGRGA

NIID-H3 TMPrimer-R1

5’-GTCATTGGGRATGCTTCCATTTGG

NIID-H3 Probe15'-(FAM)AAGTAACCCCKAGGAGCAATTAG(MGB)

PCR 産物の長さ： 178bp（H1 ソ連型※ 3 亜 型 同 定 用 ）H1ソ連型 HA 遺伝子検出用プライマーおよびプローブ:
NIID-H1 TMPrimer-F1

5’-CCCAGGGYATTTCGCYGACTATGAG

NIID-H1 TMPrimer-R1

5’-CATGATGCTGAYACTCCGGTTACG

NIID-H1 Probe15’-(FAM)TCTCAAAYGAAGATACTGAACT(MGB)

PCR 産物の長さ: 133bp※3

H1 ソ連型の HA 遺伝子をターゲットとしており、H1pdm09 の HA 遺伝子には反応しない。

（B 型 同 定 用 ）Type B NS 遺伝子検出用プライマーおよびプローブ:
NIID-TypeB TMPrimer-F1

5’-GGAGCAACCAATGCCAC

NIID-TypeB TMPrimer-R1

5’-GTKTAGGCGGTCTTGACCAG

NIID-TypeB Probe15’-(FAM)ATAAACTTTGAAGCAGGAAT(MGB)

PCR 産物の長さ： 105bp

25

（B 型 ビクトリア系 統 同 定 用 ）Type B ビクトリア系統 HA 遺伝子検出用プライマーおよびプローブ:
TypeB HA F3vic v2

5’-CCTGTTACATCTGGGTGCTTTCCTATAATG

TypeB HA R3vic v2

5’-GTTGATARCCTGATATGTTCGTATCCTCKG

FAM-Type B HA Victoria

5’-(FAM)TTAGACAGCTGCCTAACC(MGB)

PCR 産物の長さ： 98bp

（B 型 山 形 系 統 同 定 用 ）Type B 山形系統 HA 遺伝子検出用プライマーおよびプローブ:
TypeB HA F3yam v2

5’-CCTGTTACATCCGGGTGCTTYCCTATAATG

TypeB HA R3yam v2

5’-GTTGATAACCTKATMTTTTCATATCCTCTG

FAM-Type B HA Yamagata

5’-(FAM)TCAGGCAACTASCCAATC(MGB)

PCR 産物の長さ： 98bp

6.2.3 リアルタイム RT-PCR (TaqMan Probe 法) 反応
QIAGEN 社の QuantiTect® Probe RT-PCR kit を用いた反応条件を示した。詳細はキットに添付のマニ
ュアルを参照すること。なお、試薬等の分注操作は全て氷上にて行う。

試薬

容量

最終濃度

2×QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix

12.5µl1×

Forward primer (10µM)

1.5µl

0.6µM

Reverse primer (10µM)

1.5µl

0.6µM

Probe (5µM)

0.5µl

0.1µM

QuantiTect RT Mix

0.25µlRNase Inhibitor (20U/µl )0.1µl

RNase free Water

3.65µlRNA template

5µl

Total 容量25µl

＜反応条件＞
使用するリアルタイム PCR 装置、試薬および反応容器等によって、最適な反応条件は異なるので、必ず事前に反応条件の最適化を行い、検出感度等の確認をしておく必要がある。以下に、試薬に QIAGEN 社
QuantiTect® Probe RT-PCR Kit、リアルタイム PCR 装置に BioRad 社 Chromo-4、Applied Biosystems 社

26Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイム PCR システムまたは Roche Diagnostics 社 LightCycler 2.0 または LightCycler 480 を使用する場合の反応条件を示した。
Chromo-4 を使用する場合
50˚C

30min.
↓

95˚C

15min.
↓

94˚C

15sec.

56˚C※4

1min.(Data Collection)※4×45 cycles

1 分間の反応時間とは別に、約 18 秒の Data 収集時間が必要である。

Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイム PCR システムを使用する場合(Standard モードで使用)
50˚C

30min.
↓

95˚C

15min.
↓

94˚C

15sec.

×45 cycles

56˚C

75sec. (Data Collection)

LightCycler 2.0 および LightCycler 480 を使用する場合*

Analysis Mode

Cycle

Temperature
(℃)

Time

Ramp Rate(℃/sec)Acquisition
Mode

RT

None

1

50

30min.

Max*

None

Denature

None

95

15min.

Max*

None

PCR

Quantification94

15sec.

1.5

None

56

75sec.

1

SingleCoolingNone40

30sec.

Max*

None

1
45

LightCycler 2.0 の場合は 20、LightCycler 480 の場合は 4.4 となる

6.2.4 リアルタイム RT-PCR の結果解釈と判定
TaqMan Probe 法は PCR の伸長反応中に、PCR 増幅領域に結合した TaqMan Probe が Taq polymerase

27の有する 5’→3’exonuclease 活性により分解されて発する蛍光シグナルの強度を測定する事で、リアルタイ
ムに PCR の増幅状態をモニターできる方法である。その蛍光シグナルの強度は増幅反応の進行に伴い指数関数的に増えていき、蛍光シグナルを最初に発するタイミングはサンプル中に存在するターゲットとなる
核酸量に依存する。蛍光シグナルが立ち上がり閾値を超えた時点の PCR 増幅サイクル数を Ct 値（Cycle
threshold）と呼ぶ。リアルタイム RT-PCR では、Ct 値を利用することで、検査結果の解析および判定を行う
ことが可能である。ターゲットとなる核酸が多い場合は、増幅サイクルの初期（Ct 値は小さい）に蛍光シグナ
ルが検出されるが、少ない場合は、増幅サイクルの終盤（Ct 値は大きい）で検出される。系によっては増幅サイクルの終盤で、非特異反応による TaqMan Probe の分解が起きることがある。蛍光シグナルの立ち上がりが確認されたといって、必ずしも特異的にターゲット核酸を検出しているわけではない場合もあるので、検出系の特性を事前に必ず確認する必要がある。また、使用するリアルタイム PCR 装置や試薬等によって、蛍光シグナルの増幅傾向に差がある可能性があることから、事前に必ず検出系の特性を十分に考慮した
上で、Ct 値の解析方法および判定基準の設定を行う必要がある。

6.3 Conventional RT-PCR 法による同定
インフルエンザウイルス遺伝子は一本鎖の RNA であるため、PCR 反応のためにウイルス RNA に相補的な DNA（cDNA）を reverse transcriptase（RT）で合成する必要がある。ここでは、RT 反応と PCR 反応をシン
グルチューブで行う One-Step RT-PCR 法と電気泳動により、季節性インフルエンザウイルスの型(A 型・B型)・亜型(H1pdm09・H3・H1 ソ連型)を同定する方法を示す。
なお PCR 法は、その検出感度の高さから、特に電気泳動等のポスト PCR 操作については、コンタミネー
ションの大きな元凶となりうるので、動線も考慮した PCR に適切なラボデザインを行い、検査する人は作業フローをしっかり確認し、コンタミネーションによる偽判定をしないように細心の注意を払う必要がある。

6.3.1 機材および試薬
マイクロ遠心機、マイクロピペット（2、20、200、1000µl）、RNase-free 滅菌蒸留水※5、滅菌微量遠心チューブ（1.5ml）、96well PCR 反応プレート、8 連ストリップキャップもしくはプレートシール、サーマルサイクラー、
プライマー、QIAGEN OneStep RT-PCR kit (QIAGEN Cat#210210)、RNase Inhibitor（Applied Biosystems
Cat# N808-0119）※5

RNase-free 滅菌蒸留水はコンタミネーションを防ぐために市販のものを使用するのが望ましい。検査ごとに新品を開封して使用するか、または予め清浄な環境で RNase-free の滅菌チューブ等に分注しておいたものを検査ごとに使用する。

6.3.2 プライマーについて28以下に感染研で使用しているプライマーを示す。
（A 型同定用）
Type A/M 遺伝子検出用プライマー：
Type A/M30F2/08

5’-ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG

Type A/M264R3/08

5’-TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG

PCR 産物の長さ： 244bp（H1pdm09※6 亜型同定用）
H1pdm09 HA 遺伝子検出用プライマー：
NIID-swH1 ConvPCR Primer-F15’-TGCATTTGGGTAAATGTAACATTG

NIID-swH1 ConvPCR Primer-R1

5’-AATGTAGGATTTRCTGAKCTTTGG

PCR 産物の長さ： 349 bp※6

H1pdm09 の HA 遺伝子をターゲットとしており、H1 ソ連型の HA 遺伝子には反応しない。

（H3 亜型同定用）
H3 HA 遺伝子検出用プライマー：
H3HA1-BIGIN

5’-AGCAAAAGCAGGGGATAATTCH3HA1-END

5’-TGCCTGAAACCGTACCAACC

PCR 産物の長さ： 1143bp（H1 ソ連型※ 7 亜 型 同 定 用 ）H1 former seasonal HA 遺伝子検出用プライマー：
H1 HA1-BEGIN

5’-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAA

H1 R105’-GCTATTTCTGGGGTGAATCTPCR 産物の長さ: 729bp※7

H1pdm09のHA遺伝子にも若干交差反応する場合がある。

（B 型同定用）
B 型 HA 遺伝子検出用プライマー：
BHA1-N

5’- AATATCCACAAAATGAAGGC

BHA1-C

5’- AGCAATAGCTCCGAAGAAAC

PCR 産物の長さ: 1116もしくは1119bp

6.3.3 One-Step RT-PCR 反応

29

QIAGEN 社の OneStep RT-PCR kit を用いた反応条件を示した。詳細はキットに添付のマニュアルを参照すること。なお、試薬等の分注操作は全て氷上にて行う。
試薬

容量

RNase-free 滅菌蒸留水

9.5µl

5×QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer

5.0µl

dNTP 混合液 (containing 10 mM of each dNTP)

1.0µl

sense (+) primer (10µM)

1.5µl

antisense (-) primer (10µM)

1.5µl

QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix (5 U/µl)

1.0µl

RNase Inhibitor (20U/µl)

0.5µl

RNA template

5.0µl

Total

25.0µl/test＜反応条件＞
使用するサーマルサイクラー、試薬および反応容器等によって、最適な反応条件は異なるので、必ず事前に反応条件の最適化を行い、検出感度等の確認をしておく必要がある。以下は、試薬に QIAGEN 社
OneStep RT-PCR kit、サーマルサイクラーに Applied Biosystems 社 GeneAmp® PCR System 9700 を使用
する場合の反応条件を示す。

(Type A、H1pdm09 同 定 用 )50˚C(H3、H1 ソ連 型 、Type B 同 定 用 )30min.

50˚C

↓
95˚C

↓
15min.

95˚C

30sec.

50˚C

30sec.

72˚C

40sec.

↓
4˚C

×45 cycles

※8

94˚C

30sec.

50˚C

30sec.

72˚C

80sec.

×40 cycles

↓

↓
72˚C

15min.

↓↓
94˚C

30min.

10min.

72˚C
↓
4˚C

30

10min.
※8

H3 HA プライマー対のみを使用の際は反応温度を 56℃に設定する。ただし、他のプライマー対と同一サーマルサイクラーで同時に反応する場合は 50℃に設定する。その際、H3 は非特異反応が起きやすくなっているので留意する。

6.3.4 RT-PCR 産物のアガロースゲル電気泳動による確認
6.3.4.1 機材および試薬 (感染研での使用例)
電気泳動装置、UV 照射写真撮影装置、電気泳動用アガロース（1.5〜2.0％で使用）、分子量マーカー（100 bp DNA ladder, Promega 社 Cat#2101）、エチジウムブロマイド、1×TAE 電気泳動バッファー（50×TAE
ニッポンジーン社 Cat#313-90035 を希釈して使用）、6×Gel loading dye（Promega 社 Cat#G1881）。

6.3.4.2 電気泳動
One-Step RT-PCR にて増幅後、6×Gel loading dye 2µl と PCR 増幅液 10 µl をよく混合（ピペッティング）し、1.5%から 2.0％に調製したアガロース（以下、「ゲル」とする。）のウェルに混合液を 10 µl 入れる。他のウェルに分子量マーカーを入れる。
↓
電気泳動装置で 100V、30～40 分間、－から＋へ電気泳動する。
↓
泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色液に入れ、15～30 分間染色する。染色後、ゲルを 5～10 分間水
洗し、UV 照射装置にセットし、UV を照射して写真撮影する。

6.3.5 RT-PCR の結果解析と判定
各々の RT-PCR 産物の有無とバンドサイズ（Type A：244bp、H1pdm09：349bp、H3：1143bp、H1 ソ連型：
729bp、Type B：1116 もしくは 1119bp）の確認により判定を行う。

6.4 (参考) RT-PCR 法を用いた C 型インフルエンザウイルスの同定法
C型 NS 遺伝子検出用プライマー：
NS+24

5'- AAAATGTCCGACAAAACAGT

NS-7515'-CTAAGCGAGAGCATATAAGC

PCR 産物の長さ 728bp

C 型 NS 遺伝子検出 nested PCR 用プライマー：
NS+1715’- TCTTCCTTTGCACCTAGAAC

NS-5865’- CCTGTTTCAATTCCGGCCAC

PCR 産物の長さ 416bp

反応条件等、詳細については下記の文献を参考にすること。
Matsuzaki, Y. et al. A nationwide epidemic of influenza C virus infection in Japan in 2004. Journal of31

clinical microbiology 45, 783-788, (2007).

6.5 (参考) RT-LAMP 法を用いた A 型および A(H1N1)pdm09 インフルエンザウイルスの同定法
RT-LAMP 法は同一反応チューブ内において逆転写反応(Reverse transcription:RT)から Loop-Mediated
Isothermal Amplification (LAMP)を等温反応で行う核酸増幅法であり、増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの濁度測定、もしくは紫外線照射により発生する蛍光の目視観察により、増幅した核酸を検出する事ができる。
現在、栄研化学株式会社より以下の A 型インフルエンザウイルスおよび H1pdm09 インフルエンザウイル
ス同定用の RT-LAMP 試薬が販売されており、QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN）等により精製したRNA を用いる事で、RT-LAMP 法により A 型および H1pdm09 亜型の同定を行う事ができる。また、別売りの「インフルエンザウイルス用抽出試薬」を使用すると、咽頭または鼻腔から採取したスワブを抽出試薬に懸濁し、その懸濁液の一部を用いる事で、煩雑な RNA 精製を行わなくても、RT-LAMP 法により先の型・亜型同定を行う事ができる(Direct RT-LAMP 法)。使用方法については、各試薬に添付されている使用説
明書に従って行う。

(A 型同定用)
・「Ａ型インフルエンザウイルス検出試薬キット」(体外診断用医薬品)(H1pdm09 亜型同定用)
・「H1pdm2009 インフルエンザウイルス検出試薬キット」(体外診断用医薬品)

なお、RT-LAMP 法では標的遺伝子の 6 つの領域(反応時間を短縮するためのプライマーも含めると 8 つの領域)に対してプライマーを設定するため、特異性の非常に高い核酸増幅法となっているが、反面、この領域に変異が入った遺伝子を検出する場合には、検出感度が大きく低下する、あるいは全く検出できない事があるので、使用の際には対象となる流行株が検出できるかどうかなどの情報収集を行うとともに、各施設では検出感度や特異性等について十分に検討する必要がある。また、RT-PCR 法などと比較すると検出系によってはもともと検出感度が低い場合がある。従って、RT-LAMP 法による陰性結果が出たとしても、検査検体からこの検査方法でウイルス遺伝子が検出できなかったに過ぎず、必ずしも検査検体中のインフル
エンザウイルスの存在を否定するものではないことに留意しなければならない。

7（参 考 ）迅 速 診 断 の た め の インフル エ ンザ ウイル スの 検 出
わが国では、インフルエンザに対する治療薬として M2 阻害剤であるアマンタジン（商品名シンメトレル;

A 型インフルエンザのみに効果がある）および NA 阻害剤であるザナミビル（商品名リレンザ）, オセルタミビ

32

ル（商品名タミフル）, ラニナミビル（商品名イナビル）, ペラミビル（商品名ラピアクタ）が認可されている。これら抗ウイルス剤によるインフルエンザの治療は既に一般的となっており、臨床現場での迅速診断の重要性は高い。平成 26 年 9 月現在、わが国で市販されている迅速診断のためのインフルエンザウイルス抗原
検出用キットの一覧を示す。これらのキットはイムノクロマト法の原理に基づきインフルエンザウイルスのウイ
ルス核蛋白(NP)をウイルス抗原として検出する試薬である。使用方法については、各キットに添付されている使用説明書に従って行う。

商品名（50 音順）

製造販売元

検査対象

判定時間

A/B 型

3～8 分

標識

備考

白金－金
1

イムノエース Flu

株式会社 タウンズ

コロイド
イムノトラップ インフルエ
2

専用の機器がA/B 型

和光純薬工業株式会社

1分

磁性粒子

ンザ A･B3

イムノファイン TM FLU

必要株式会社ニチレイバイオサ
A/B 型

1～10 分

A/B 型

15 分

着色粒子

イエンス
エスプライン®
4

アルカリ
富士レビオ株式会社

インフルエンザ A&B-N
5

キャピリア®Flu A+B

フォスファターゼ
A/B 型

株式会社 タウンズ

金コロイド
着色粒子・金コロ

クイックチェイサー®
6

15 分
約 3.5〜

A/B 型

株式会社 ミズホメディー
Auto Flu A,B

専用の機器がイド・硫酸アンモニ

15 分

必要
ウム鉄・硝酸銀

クイックチェイサー®Flu A,B
7

株式会社 ミズホメディー

A/B 型

5～10 分

金コロイド（S/H タイプ）
8

クイックナビ TM-Flu

デンカ生研株式会社

A/B 型

8分

着色粒子

9

クイックナビ TM-Flu+RSV

デンカ生研株式会社

A/B 型

8分

着色粒子

10

QuickVue ラピッド SP influ

A/B 型

10 分

着色粒子

A/B 型

8分

金コロイド

A/B 型

1～10 分

着色粒子

A/B 型

5～15 分

着色粒子

DS ファーマバイオメディカ
ル株式会社
アリーア メディカル株式会
11

クリアビューInfluenza A/B
社
スタットマーク TM

株式会社ニチレイバイオサ

FLU スティック-N

イエンス

スポットケム TM i-Line

株式会社アークレイ ファク

12

専用の機器で

13
FluAB

トリー

も測定可

33

14

ピオキューブ® FluAB

専用の機器がA/B 型

東洋紡株式会社

約6分

フォスファターゼ
必要15

BD Flu エグザマン TM

日本ベクトン・ディッキンソン
A/B 型

15 分

金コロイド

A/B 型

約 5～10 分

金コロイド

株式会社
16

BD ベリタ−TM システム Flu

日本ベクトン・ディッキンソン

専用の機器が株式会社

必要
着色粒子・金コロ

富士ドライケム IMMUNO
17

約 3.5〜
A/B 型

株式会社 ミズホメディー
AG FluAB

専用の機器がイド・硫酸アンモニ

15 分

必要
ウム鉄・硝酸銀

18

ブライトポック®Flu

株式会社ニチレイバイオサ
A/B 型

1～10 分

着色粒子

A/B 型

3～10 分

金コロイド

A/B 型

5～10 分

金コロイド株式会社 LSI メディエンス

A/B 型

10 分

金コロイド

積水メディカル株式会社

A/B 型

2～10 分

着色粒子

積水メディカル株式会社

A/B 型

15 分

金コロイド

アルフレッサ ファーマ株式

A（H1N1）
15〜20 分金コロイド

会社

pdm09 亜型

イエンス
プライムチェック®Flu

アルフレッサ ファーマ株式(S タイプ)

会社

19

20

プライムチェック®Flu･RSV

アルフレッサ ファーマ株式会社

21

プロラスト Flu
ラピッドテスタ®

22
カラーFLU スティック23

ラピッドテスタ®FLU･NEO

24

Alfresa H1N1 Kit＊
ラインジャッジ®

25

A（H1N1）

白金－金

イムノエースコロイド

Flu 残液を利用

15 分株式会社 タウンズ
FluA/pdm＊

pdm09 亜型

* 研究用試薬（測定項目や測定に関して臨床的意義や有効性、安全性等が確立しておらず、薬事承認未申請未取得のもの）

これらのキット(「ラインジャッジ®FluA/pdm」「Alfresa H1N1 Kit」を除く)は臨床現場での A 型または B 型インフルエンザの迅速診断を目的としており、亜型を特定することはできない。また、「ラインジャッジ®FluA/pdm」「Alfresa H1N1 Kit」は A(H1N1)pdm09 ウイルスに由来する NP 蛋白質を検出することでA(H1N1)pdm09 ウイルス感染を診断する。検出感度については各社が発売するキット毎に大きく異なる場
合があり、また、ウイルス分離や RT-PCR 法などと比較すると検出感度が低く、特にウイルス量の少ない発34

病初期などではウイルス抗原を検出できない場合がある。これ らの キットに よる陰 性 結 果 は 検 査 検 体 からウイル ス抗 原 が 検 出 で きな か っ た に 過 ぎず 、必 ず しもインフル エ ンザ ウイル ス感 染 を 否 定 す るもの で は な い ことに 注 意 す る必 要 が あ る。また、検体採取の手技によっても検出感度が左右される場合があることから、診断はキットの検査結果のみで行わずに、他の検査結果や臨床症状を考慮して総合的に判断する必要がある。なお、迅速診断キットの中には、鼻汁・鼻かみ液や咽頭ぬぐい液を検体として使用できないものもあるので、注意が必要である。

35

Part III
インフルエンザウイルスの遺伝子解析
1 RT-PCR 法 とシ ー クエ ン ス
遺伝子配列を用いた解析により、ウイルスの抗原性予測、流行株の変化、薬剤耐性獲得の有無、などの情報を得ることができる。このため遺伝子解析は抗原性解析とともに、ウイルスサーベイランスにとって極めて重要である。
各施設において遺伝子解析を行う際の参考として、ここではインフルエンザサーベイランスの中心である、
HA および NA 遺伝子領域の塩基配列解析方法について説明する。

1.1. RT-PCR
インフルエンザウイルスのゲノムは一本鎖(-)RNAであるため、PCR法による遺伝子増幅の前に逆転写酵素を用いたRT反応が必要である。本項ではRT反応およびPCR反応を同一チューブ内で行うOne Step
RT-PCR法を用いた例を紹介する。RT-PCR法に使用する試薬は各試薬メーカーから多数販売されているが、ここでは、TaKaRa社のOne Step RNA PCR Kit (AMV)を使用した例と、Invitrogen社のSuperScript III
One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymeraseを使用した例を記載する。なお、使用するプライマーは 1-6. に示した。以下に試薬メーカーの推奨プロトコールに準拠した組成を示す。後述するシークエンス反応に必要なPCR産物を得るには、total volumeを記載した量の半分（25µl)以下に変更しても多くの場合は問題ない。また、サーマルサイクラーによっては反応に適用できるtotal volumeに制限がある
ため、各実験施設の設備に合わせて適宜変更する必要がある。

1.1.1. One Step RNA PCR Kit (AMV) (TaKaRa)を用いた例
まず、ウイルス RNA 以外の試薬を混合、調整しておく。

試薬
10x One Step RNA PCR Buffer
25mM MgCl2
10 mM dNTP
フォワードプライマー(10μM)
リバースプライマー(10μM)
RNase Inhibitor (40U/μl)
AMV RTase XL (5U/μl)
AMV-Optimized Taq (5u/μl)
DW
Total

使用量
最終濃度
5μl
1x
10μl
5mM
5μl
1mM
2μl
0.4μM
2μl
0.4μM
1μl
0.8U/μl
1μl
0.1U/μl
1μl
0.1U/μl
20.5μl47.5μl（反応液 mixture）

36

反応液 mixture を PCR 用チューブあるいは 96 well PCR 用プレートに１Well ずつ分注後、予めウイルス培養液（または臨床検体）から抽出（Part II ウイルス分離と同定、６ ウイルス遺伝子検出法によるインフルエンザウイルスの同定を参照）した RNA 2.5μl を加えて混合する。軽く遠心後、サーマル
サイクラーにセットし、次のサイクルで反応を行う。
50℃

30 min

94℃

2 min
↓

94℃

30 sec45℃

30 sec72℃

90 sec35 サイクル↓
72℃

10 min4℃∞

1.1.2. SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen)を用いた
例

試薬
2×Reaction Mix
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix
フォワードプライマー (10μM)
リバースプライマー (10μM)
Template RNA
DEPC
Total

使用量
25μL
2μL
1μL
1μL
2.5μL
18.5μL
50μL

最終濃度
×1
0.2μM
0.2μM
100ng〜1μg

反応液 mixture を軽く遠心後、サーマルサイクラーにセットし、次のサイクルで反応を行う。
55℃
94℃

15 min
2 min
↓

94℃
56℃
68℃

15 sec30 sec110 sec

35 サイクル

↓
68℃
4C

1min
∞

37

※RT-PCR 反応条件は、使用する試薬やサーマルサイクラーによって異なるため、適宜変更する必要がある。
※RT-PCR 反応後のサンプルを一時保存する際は 4℃、数日〜長期保存する際は-20℃以下で保存する。

1.2. RT-PCR 産物の確認、精製
1.2.1. アガロースゲル電気泳動① RT-PCR 産物 1μl と Loading Dye を適量混合（パラフィルム上などで）し、1%アガロースゲルにて電気泳動を行う。泳動 buffer は 1 x TAE を使用する。
② 電気泳動を 100V, 15〜20 分行った後、UV トランスイルミネーターにて RT-PCR 産物を確認、必要に応じて写真撮影を行う。

1.2.2. RT−PCR 産物のアガロースゲルからの切り出し精製
電気泳動にて目的以外の増幅産物（非特異的増幅産物）が確認された場合、アガロースゲルからの切り出し精製を行う事によって解析精度の向上が期待できる。なお、非特異的増幅産物が微量であった場合、および存在しなかった場合は、ゲルからの切り出し精製を実施する必要はない（→項目 1-2-3. へ）。
アガロースゲルからの切り出し精製は、TaKaRa 社 NucleoSpinExtract II、QIAGEN 社 QIAquick Gel
Extraction Kit、BIO-RAD 社 Freeze N’ Squeeze スピンカラムなど、市販の試薬を用いて簡便に実施することができる。(切り出し精製を実施したら、項目 1-3.へ。)

1.2.3. RT-PCR 産物の精製
RT-PCR 産物に含まれている多量の未反応塩基、プライマーを除去することで、シークエンス解析の精度を向上させることができる。
古典的にはエタノール沈殿でも精製することが可能であるが、市販の試薬（QIAGEN 社 QIAquick PCR
Purification Kit、BECKMAN COULTER 社 Agencourt AMPure XP など）を用いることで簡便に精製することができる。

1.3. シークエンシング反応
使用するシークエンサーに対応したシークエンス試薬を用いて反応を行う。
ここでは、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いた例を以下に示す。

方法① 下の Mixture を作製する。使用するプライマーは 1-6. に示した。

38

試薬

使用量

BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

1μl

BigDye sequencing Buffer2μl

プライマー(1μM)

1.6μl

H 2O

xμl

RT-PCR 産物

yμl（10〜20ng）

Total

10μl

②	
 軽く遠心後、チューブをサーマルサイクラーにセットし次のプログラムで反応を行う。
96℃

1 min
↓

96℃

10 sec

50℃

5 sec

60℃

110 sec

25 サイクル↓
4℃∞※シークエンス産物を一時保存する際は４℃で、数日以上保存する場合は-20℃以下で保存する。

1.4. シークエンス反応産物の精製
シークエンス反応液中に残っている未反応の蛍光色素を除去する。エタノール沈殿法での除去も可能だ
が、BigDye XTerminator（Applied Biosystems）、MicroSpin G-25 Columns（GE ヘルスケア）などを用いることで反応産物を簡便に精製することが可能である。

1.5. シークエンス解析
精製したシークエンス反応物をシークエンサーにセットし、塩基配列の解析を行う。得られた波形データ
はシークエンス解析ソフトウェアを用いて必ず確認し、適宜修正して塩基配列を決定する。ノイズレベルが高くて正しく波形を読み取れない領域があれば、シークエンス反応条件（template DNA 量、アニーリング温度、使用プライマーなど）を変更し再度解析を行う。
なお、高価ではあるが Sequencher (Hitachi solutions/GeneCodes)、SeqScape (Applied Biosystems)、
Geneious (Biomatters)などの塩基配列アセンブリソフトウェアがあれば、多数の塩基配列を解析しながらアセンブリが可能となるため、極めて効率的に処理を進めることができる。

39

1.6. プライマーリスト
以下に HA, NA 遺伝子の RT-PCR およびシークエンス用プライマーを記す。HA 遺伝子については、HA
全長、HA1 領域、HA2 領域用のプライマーセットを記載しているので用途に応じて使い分けると良い。
1.6.1. HA（全 長 ）A(H1N1)pdm09
RT-PCR Primer Set (5' - 3')
H1HA1-BEGIN
HA2H1-1759-1778R
Sequence Primers (5' - 3')
Forward:swine H1-56-76F
swine H1-277-296F
swine H1-768-788F
swine H1-1013-1034F
H1-1224F
swine H1-1414-1433F
Reverse:swine H1-385-366R
swine H1-596-578R
H1-960R
swine H1-1219-1191R
swine H1-1662-1642R

AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTCATTATGTATAGGTTATCATGTGGTCCTACATTGTGGAAACAATAACATTCGAAGCAACTGG
TCCCGTCTATTCAATCTAGAGG
TCTGTTATTGAAAAGATGAAAACAATGCCAAGGAAATTGGCAAATGATGACACTGAGCTCGGATGGTGAATGCCCCATAGAAATGGGAGGCTGGTGTTTA
CATCTTTTCAATAACAGAACATCCAGAAACTGATTGCCCC

A(H3)
RT-PCR Primer (5' - 3')
H3HA1-BEGIN
HA2H3-1743-1762R
Sequence Primers (5' - 3')
Forward:
H3-7F
H3-334-354F
H3-598-619F
H3-912F
HA2H3-1288-1308F
Reverse:H3-334-354R
H3-616R
H3-939-960R
H3-1342R

AGCAAAAGCAGGGGATAATTCAGTAGAAACAAGGGTGTTTTATAATTCTATTAACCATGAAGAACCTTTTTGTTGAACGCAGCA
AATTTGACAAATTGTACATTTG
TCTGAATGCATCACTCCAAAGGAGAATTCAGGACCTCGAGACTGCGTTCAACAAAAAGGTCCCAAATGTACAATTTGTCAAA
ATGGTTTGTCATTGGGAATGCTGACCAGAGATCTATTTTAGTGTC40

HA2H3-1743-1762R

AGTAGAAACAAGGGTGTTTT

B
RT-PCR Primer (5' - 3')
BHA1-N
HA2B-1867-1887R
Sequence Primer (5' - 3')
Forward:
BHA1-N
BHA-459F
BHA1-703-722F
HA2B-1040-1061F
HA2B-1330-1352F
BHA-1537F
Reverse:
BHA1-400R
BHA1-802R
HA2B-1489-1512R
HA2B-1867-1887R
BHA1-CAATATCCACAAAATGAAGGC
AGTAGTAACAAGAGCATTTTT

AATATCCACAAAATGAAGGC
AGAAAATGCACCAGGAGGACCCTCAAAAGTTCACCTCATC
GCCCAATATGGGTGAAAACACCGGATGAACTCCACAACGAAATACACCAAACACAAATGCAACCAGTCCTCCTGGTGCCTTTTCTGCACCATGTAATCAACAACAACAGCAGAGGGACCCAGCATTTTCAGTAGTAACAAGAGCATTTTTAGCAATAGCTCCGAAGAAAC

1.6.2. HA1A(H1N1)pdm09
RT-PCR Primer (5' - 3')
H1HA1-BEGIN
swine H1-1106-1087R
Sequence Primer (5' - 3')
Forward:swine H1-56-76F
swine H1-277-296F
swine H1-366-385F
swine H1-768-788F
Reverse:swine H1-385-366R
swine H1-596-578R
swine H1-1106-1087R

AGCAAAAGCAGGGGAAAATAATGATAACCGTACCATCCATCCATTATGTATAGGTTATCATGTGGTCCTACATTGTGGAAACGAGCTCAGTGTCATCATTTG
AATAACATTCGAAGCAACTGGCAAATGATGACACTGAGCTCGGATGGTGAATGCCCCATATGATAACCGTACCATCCATC

A(H3N2)
RT-PCR Primer (5' - 3')41

H3HA1-BEGIN
H3-1105-1125R
Sequence Primer (5' - 3')
Forward:
H3-7F
H3-334-354F
H3-598-619F
Reverse:H3-334-354R
H3-939-960R
H3-1105-1125R

AGCAAAAGCAGGGGATAATTCCATCCACCATTCCCTCCCAAC

ATAATTCTATTAACCATGAAGAACCTTTTTGTTGAACGCAGCA
AATTTGACAAATTGTACATTTG
CTGCGTTCAACAAAAAGGTCC
ATGGTTTGTCATTGGGAATGCTCATCCACCATTCCCTCCCAAC

B
RT-PCR Primer (5' - 3')
BHA1-N
BHA1-C
Sequence Primer (5' - 3')
Forward:
BHA1-N
BHA1-187F
BHA1-703-722F
Reverse:
BHA1-400R
BHA1-802R
BHA1-CAATATCCACAAAATGAAGGC
AGCAATAGCTCCGAAGAAACAATATCCACAAAATGAAGGCTGCAAATCTCAAAGGAACAA
CCTCAAAAGTTCACCTCATC
GTCCTCCTGGTGCCTTTTCTGCACCATGTAATCAACAACAAGCAATAGCTCCGAAGAAAC

A(H1)ソ連 型
RT-PCR Primer Set (5' - 3')
H1HA1-BEGIN
H1-1109-1128R
Sequence Primer (5' - 3')
H1-24-45F
H1-345-365F
H1-406-424R
H1-679-699F
H1-853-873R
H1-1109-1128R

AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAACCATCTACCATTCCAGTCTAAAAGCAACCAAAATGAAAGAGAATGGAACATGTTACCCAG
CTCAAATGAAGATACTGAATGTCTCTGTAGTGTCTTCACA
ATCCAAAGCCTCTACTCAGTG
AACCATCTACCATTCCAGTC

1.6.3. HA2

42

A(H1N1)pdm09
RT-PCR Primers (5' - 3')swine H1-907-928F
HA2H1-1759-1778R
Sequence Primers (5' - 3')swine H1-907-928F
swine H1-1013-1034F
swine H1-1414-1433F
swine H1-1219-1191R
swine H1-1662-1642R
HA2H1-1759-1778R

ATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTATAAACACCAGCCTCCCATTTCTCCCGTCTATTCAATCTAGAGG
AACAATGCCAAGGAAATTGG
CATCTTTTCAATAACAGAACATCCAGAAACTGATTGCCCC
AGTAGAAACAAGGGTGTTTTT

A(H3N2)
RT-PCR Primers (5' - 3')
HA2H3-1017-1039F
HA2H3-1743-1762R
Sequence Primers (5' - 3')
HA2H3-1017-1039F
HA2H3-1086-1106F
HA2H3-1288-1308F
HA2H3-1508-1532R
HA2H3-1702-1723R
HA2H3-1743-1762R

CTGAAATTGGCAACAGGGATGCG
AGTAGAAACAAGGGTGTTTTCTGAAATTGGCAACAGGGATGCG
GGTTTCATAGAAAATGGTTGG
GGAGAATTCAGGACCTCGAGAAGTTCCATTTCTGATTGACCCTATGCAAATGTTGCACCTAATGTTGC
AGTAGAAACAAGGGTGTTTT

B
RT-PCR Primers (5' - 3')
HA2B-1040-1061F
HA2B-1867-1887R
Sequence Primers (5' - 3')
HA2B-1040-1061F
HA2B-1072-1093F
HA2B-1296-1320F
HA2B-1330-1352F
HA2B-1489-1512R
HA2B-1778-1798R

GCCCAATATGGGTGAAAACACCAGTAGTAACAAGAGCATTTTTGCCCAATATGGGTGAAAACACCGCCAATGGAACCAAATATAGACAAGTAAAGAATCTTCAAAGACTAAGGGATGAACTCCACAACGAAATAC
ACAGCAGAGGGACCCAGCATTTTC
TTTTCCTTATAGACAGATGGA

1.6.4. NA
A(H1N1)pdm09
RT-PCR primers (5' - 3')43

swine N1-F1
swine N1-R1
Sequence Primers (5' - 3')
Forward:swine N1-F1
swine N1-290-307F
swine N1-676-694F
swine N1-941-959F
swine N1-1111-1130F
Reverse:N1-327R
swine N1-548-532R
swine N1-959-941R
swine N1-1130-1111R
swine N1-R1

AGCAAAAGCAGGAGTTCAAAATGAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAACAGCAAAAGCAGGAGTTCAAAATGAGGGCTATATACAGTAAAGACACAAGAGTCTGAATGTGTAGGATACATATGCAGTGG
TTTGAGATGATTTGGGATCCCTTTACTGTATATAGCCC
GCACTTGCTGACCAAGC
CCACTGCATATGTATCCTAGGATCCCAAATCATCTCAAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAAC

A(H3N2)
RT-PCR primers (5' - 3')
H3N2-F1
H3N2-R1413
Sequence Primers (5' - 3')
Forward:
H3N2-F1
N2-F387
N2-497F
N2-F754
N2-1093F
Reverse:N2-299R
N2-R579-545
N2-843R
N2-R1108-1086
H3N2-R

AGCAAAAGCAGGAGTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTAGCAAAAGCAGGAGTCATGCGATCCTGACAAGTGTTATCATGAATGAGTTGGGTGTTCCTGCTTCAGGAAAAGCTGATACTAATGACGTGTGGATGGGAAGAATGCCACATTGCGGTTTGACCAACTTGAGCTGGACCATGCTATACATGCTGAGCACTTCCTGA
CCCATCCACACGTCATTTCCATTTCTAAAATTGCGAAAGCTTATAT

B
RT-PCR primers (5' - 3')
BNA-F5v2
BNA-R1498-1472
Sequence Primers (5' - 3')
Forward:TCAAAACTGAAGCAAATAGGCCAAATAGGAACAAAGGGTTTAGAACAGA

44

BNA-F5v2
BNA-93-73F
BNA-F355
BNA-F717
BNA-F937-950
BNA-1315F
Reverse:
BNA-R282
BNA-R557-537
BNA-R953-929
BNA-R1092
BNA-R1498-1472

TCAAAACTGAAGCAAATAGGCCAAAACGTTAACCCTATTTCTCAAAACTCAGCTCCCTTGATTGCCTGCAATTGCATCGGTTACACAGCAAAAAGACCCTTTG
ATGTCCCCTGTATTGGGATATATGTCCACTCCGGTTCTTCTACAGTTGGTATTTTGCC
CTTTTTGCTGTGTAACTGTTATCTACAAATCCTCCCTTGATAATAGGAACAAAGGGTTTAGAACAGAA(H1N1) ソ連 型
RT-PCR primers (5' - 3')
H1N1-F1
H1N1-R1
Sequence Primers (5' - 3')
H1N1-F1
N1-F336
N1-R461N1-F969-992
N1-R1100-1077
H1N1-R1
N1-F26-47
N1-F410-430
N1-R579-555
N1-F691-714
N1-R996-972
N1-R1415-1392

AGCAAAAGCAGGAGTTTAAAATGAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTCAAC
AGCAAAAGCAGGAGTTTAAAATGAATAAGAATTGGTTCCAAAG
CCCATTTGAATGTTTGTCATATCTGCAGTGGAGTGTTCGGTGACCTATCCAAACACCATTACCATAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTCAAC
TCCAAATCAAAAAATAATAACC
AACCTTTTTTCTGACCCAAGGTGGCATGCGCTTGCTGACCATGAGAACACAAGAGTCTGAATGT
ATTGTCACCGAACACTCCACTGC
GGCAACTCAGCACCGTCTGGCCA

45

2 GISAID (The Global Initiative on Sharing All Influenza Data: www.gisaid.org/)の 利 用
感染研で解析した塩基配列は、インフルエンザウイルスの国際データベースである GISAID に登録している。GISAID は 2006 年 8 月に構築・公開されたデータベースであり、各国の研究者が無償でヒト及び鳥イ
ンフルエンザウイルスについての情報を収集できることを目的としている。現在、感染研を含め WHO インフ
ルエンザ協力センターは解析した塩基配列を GISAID に登録しており、だれでも最新の情報を閲覧・入手することが可能である。なお GISAID は登録制であるため、使用に際しては最初に Web のトップページ“Registration” からユーザー登録を行う必要がある。
※本原稿は 2011 年 8 月 1 日時点での GISAID に基づいて執筆しています。GISAID のアップデートに伴い機能の修正、変更が行われた場合は以下の解説と異なる項目があるかもしれません。

遺伝子配列に関する情報は “EpiFul” (タブで区切られている)からアクセスすることができる。検索条件を入力する画面（図１）が表示されるので、必要事項を入力し検索を実行する。以下に使用頻度が高いと思われる項目を簡単に説明する。
・	 “Search patterns”欄から株名（部分的でも良い）により検索可能・	 Type, H, N などの項目を設定することにより亜型の絞りこみが可能
・	
 “Collection date”によりウイルス採取時期を絞り込むことが可能
・	
 “Originating Laboratory”、“Submitting Laboratory”によりウイルス分離、登録した機関を絞り込むことが可能・	
 “Required Segments”から目的の遺伝子配列を絞り込むことが可能

46

図 1. GISAID EpiFul 検索画面

検索結果（図 2）では株名一覧と共にウイルス継代履歴、ウイルス採取日、登録されている遺伝子配列の長さが表示される（これらの表示項目は Setting により変更可能）。

47図 2. GISAID EpiFul 検索結果画面

塩基配列を入手したい株は、株名左側にチェックを入れる。次に画面右下の Download ボタンを押すことで、ダウンロード画面へ移行する（図 3）。

48

図 3. GISAID EpiFul シークエンスダウンロード画面

入手する塩基配列は FASTA 形式である。FASTA 名はウイルス株名、継代履歴などを設定することでカス
タマイズすることができる。

49

Part IV
インフルエンザの血清診断
インフルエンザウイルス感染の診断は、ウイルス株自体が同定できる利点があるうえに、迅速であるという点でウイルス分離による方法が血清診断よりもすぐれている。一方で、ウイルス分離のための検体の採取が困難である場合や、ウイルス分離をする設備がないなどの理由で血清診断が必要な場合がある。また、不顕性感染を含む個人の感染の有無を調べる目的で血清診断が利用されることもある。このような目的での血清診断の際には急性期の血清と回復期（2〜4 週間後）のペア血清が必要である。急性期血清は、なるべく発症直後に採取する必要がある。また、たいていの人はインフルエンザウイルスに対する抗体を保有しているために、回復期血清一点での血清診断は、信頼性が低いために避けるべきである。このような条件が保証された上で、急性期血清と回復期血清の抗体価に４倍以上の上昇が認められたとき、ウイルス抗原の検出やウイルス分離が出来なかった場合でも他の臨床所見等と総合してウイルス感染の診断を行うことが出来る。
一方、ウイルス感染診断以外の目的でも、血清学的手法による抗体の検出によって、ウイルスの流行
状況、流行予測の基礎資料となる国民の抗体保有状況、ワクチンの免疫原性の評価などの疫学的、免疫学的研究に重要な情報を得ることができる。

1 HI 試 験 に よる血 清 学 的 診 断
1.1 HI 試験による血清診断上の注意
血清診断の手法として HI 試験を用いる際には、血清の前処理に十分な注意が払われるべきである。インフルエンザ分離株の同定試験の稿でふれたように、血清中には非特異的な血球凝集阻止因子と血球凝集因子という相反する２つの因子が存在する。 非特異的な血球凝集阻止は、血清中の成分に含まれるある種の分子がインフルエンザウイルスのレセプターとして赤血球上のウイルスレセプターと競合することによってウイルスの血球への結合を阻害することによって起こる現象である。このような阻害分子として人や動物の血清中のα、β、γ-阻害物質という三種類の分子種が知られている。これらの阻害分子は、異なるイ
ンフルエンザ株に対して異なった作用を示すため、血清種とウイルス株の組み合わせによっては、異なった前処理が必要となる場合がある。

1.2 血清の前処理
人血清の前処理は HA、HI によるインフルエンザの同定試験の稿にある RDE(II) 「生研」（デンカ生研）による非特異的凝集阻止因子の除去と使用する血球による吸収処理で多くの場合対応可能である。動物血清などで、この処理によっても非特異的反応と思われる反応が除けない場合の変法の一つとしてトリプシン−過ヨウ素酸処理法がある。

50

トリプ シ ン −過 ヨウ素 酸 処 理 法

試薬：
トリプ シ ン 溶 液 200mg のトリプシン(SIGMA type(II), T-7409)を 25ml の 0.1M リン酸緩衝液(pH8.2)に溶かし、濾過滅菌する。少量に分注し-20℃以下で保存する。保存したトリプシン溶液は半年間使用可能である。
1/90M 過 ヨウ素 酸 カリウム(KIO4)溶 液 230mg の KIO4 を PBS pH7.2 に溶かし 100ml とし、濾過滅菌する。1/90M KIO4 溶液は要事調整とし一週間以内で使い切ること。
1% Glycerol 生 理 食 塩 水 （KIO4 の 作 用 を 中 和 す る） 1ml glycerol を 99ml の生理食塩水に加えて、濾過滅菌する。

手順：
1. 1/2 容のトリプシン溶液を 1 容の血清に加える。
2. 56℃30 分ウォーターバス内で非働化する。
3. 室温に冷却後、3 容の 1/90M KIO4 溶液を加え、混合し室温 60 分間静置する。
4. 3 容の 1% Glycerol 生理食塩水を加え、混合し室温 15 分間静置する。
5. 2.5 容の 0.85% NaCl を加えて混合する。最終希釈は 1：10 となる。
6. RDE(II)処理の場合と同様、HI 試験に使用する血球で吸収処理をする。
7. 非特異的凝集の有無を調べる。

1.3 抗原の HA 価測定および 4HA/25μl 抗原液の作製および HI 試験法
赤血球凝集阻止（HI）試験によるインフルエンザ分離株の同定の稿に準ずる。ただし、血清の階段希釈に関しては感染血清の抗体価は同定用の標準血清に比較して低いと予想されるので、10 倍から 1280 倍まで
でよい。

51

抗原	
  25μl	
 

抗体価	
 
被検血清	
 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12

A

10

B

20

二
倍 PBS
階 25μl
段
希
釈

C

40

D

80

E

160

	
 

F

320

G

640

H

0
1280

50μl

2 ウイル ス中 和 試 験 に よる血 清 学 的 診 断
ウイルス中和試験は、ヒトや動物のウイルス特異的な抗体を検出するのに極めて高い感度と特異性を有する。中和試験は、ウイルスと抗体を混合し中和反応するステップとそれを適当な宿主（培養細胞、孵化鶏
卵、マウスなどの実験動物）に接種するステップによって構成されている。感染が認められないときには、その検体に中和抗体が存在していることを示している。感染の有無について、培養細胞を宿主として用いた
場合、通常ウイルス感染による細胞変性効果(CPE)を指標としているが、それ以外にも様々な方法が開発されている。
中和試験は特定のウイルスに対する感染性を中和する抗体の測定に関して最も正確な方法である。インフルエンザウイルスの場合、中和抗体の主要な標的ウイルス蛋白質はヘマグルチニン(HA)であり、中和試験ではウイルス株特異的に抗体を検出することが可能である。ただ、中和試験は結果を得るのに時間がかかることや、試験に用いる感染性のウイルスを使用できる施設に制限があるなどの制約がある。
ここでは、MDCK 細胞を用いた中和試験の一例について説明する。

2.1 ウイルス中和抗体価の測定方法
ウイルス中和抗体価の測定は大きく「I.ウイルス力価測定」と「II. ウイルス中和試験」の２つの部分に分け52

ることができる。以下にその手順を示す。ここでは 24 穴プレートを使用しているが、96 穴プレートなどにも変更可能である。

材料および試薬
1 ウイルス分離用培地「3.4 インフルエンザウイルスの分離」の項を参照。
添加するトリプシン濃度についてはロット毎に至適濃度を決定しておく。
2 ウイルス希釈液
ウイルス分離用培地を使用する。
4 MDCK 細胞
細胞の継代によりウイルス感染に対する感受性が変化することが考えられるので、一定の継代数のものを使用する。
5 24 穴プレート
6 インフルエンザウイルス
孵化鶏卵または MDCK 細胞等を用いて増殖させる。方法については Part II の「3. 培養細胞を用いた
インフルエンザウイルスの分離」および「4. 孵化鶏卵を用いたウイルス分離と増殖」の項を参照。
7 抗体陽性血清
入手可能な中和抗体陽性の血清を分注して-20℃以下に保存する。
8 抗体陰性血清
入手可能な中和抗体陰性の血清を分注して-20℃以下に保存する。

2.2 方法
2.2.1 ウイルス力価測定
中和試験に使用するウイルスの感染価を測定する。

1) ウイルスを 10 倍階段希釈する。
希釈 (log10)

-1

-2

-3

-n

ウイルス

0.1ml

0.1ml

0.1ml

0.1ml

希釈液

0.9ml

0.9ml

0.9ml

0.9ml

2) MDCK 細胞を播いた 24 穴プレートの各穴に 1ml の PBS(-)を加えて洗浄する。
3) 通常-5~-8 の各希釈 0.1ml を各穴に接種する(各希釈 6 穴) 。
4) 34℃で 1 時間静置。
5) 分離用培地 0.5ml を各穴に加える。

53

この液は棄てる。

6) 34℃の CO2 インキュベーター（5% CO2）で 3 日間程度*培養する。
7) CPE の有無を判定し Reed&Muench の方法で TCID50 を計算する（測定例を参照）。
測定例
ウイルス感染価測定記録

実施日：

ウイルス：
ウイルス希釈 CPE陽
(log10)

CPE陰

累積陽

累積陰

割合

％CPE陽性性ウエル 性ウエル 性ウエル 性ウエル
数

数

数

数

0

/

-1

/

-2

/

-3

/

-4

/

-5

6

0

12

0

12/12

100

-6

5

1

6

1

6/7

86

-7

1

5

1

6

1/7

14

-8

0

6

0

12

0/12

0

50%の感染を起こす希釈(log10)は-6 と-7 の間にあり、その希釈は

-6-

86-50
86-14

= - 6.5で求められる。測定は 0.1ml を接種して実施しているので、このウイルス原液の感染価は6.5+1.0=7.5 (log10TCID50/ml)
になる。

54

[注 意 事 項 ]*通常 34℃で 3 日間程度であるが、使用するウイルス株により異なる。CPE が認められるウイルスの最大希釈のところで CPE が細胞全体に現れるのに必要な期間を設定する。温度についても、鳥由来のウイルスなどは 37℃の方がよく増殖するので必要に応じて設定する。

2.2.2 ウイルス中和試験
ウイルス力価を測定したウイルスを使用して被検血清の中和抗体価を測定する

1) 被検血清を下図のように 10 倍希釈から 2 倍階段希釈する* (96 穴プレートを使用)

被検血清(1:10) 100µl

50µl 50µl

被検血清 A
被検血清 B
被検血清 C被検血清 D
被検血清 E
被検血清 F
陰性血清対照陽性血清対照

10	
 

20	
 

40	
 

80	
  160	
  320	
  640 1280 2560 5120 10240 20480

50 µl のウイルス希釈液を分注しておく

2) 各穴に 50 µl（約 100 TCID50 の感染価になるように希釈しておく）のウイルスを加える。
3) 37℃で 30 分間静置し、抗原抗体反応を行う。
4) MDCK 細胞を播いた 24 穴プレート*の各穴に 1ml の PBS(-)を加えて洗浄する
5) 被検血清とウイルス混合液 0.1ml を 24 穴プレートの各穴に下図のように接種する

55

中和抗体価測定用

被検血清 A

被検血清 B

10

20

40

80

160

320

640

1280

2560

5120

10240

20480

10

20

40

80

160

320

640

1280

2560

5120

10240

20480

6) 血清の陽性対照および陰性対照とのウイルス混合液も 0.1ml を 24 穴プレートの各穴に下図のように接種する。

中和試験確認用
陰性血清対照

10

20

40

80

陽性血清対照

640

1280

2560

5120

160

320

10240 20480

細胞対照
ウイルス対照7) また細胞対照にはウイルス希釈液を、ウイルス対照には希釈したウイルス液（約 100 TCID50/50µl）とウ
イルス希釈液を等量混合したものを、それぞれ 0.1ml を各穴に接種する。
8) 中和試験に利用したウイルス液について感染価を確認するために、下図のようにウイルス希釈液を0.1ml ずつ各穴に接種する（「2.2.1 ウイルス力価測定」の項を参照）。
9) 34℃で 1 時間静置する。
10) 0.5ml のウイルス分離用培地を加える。
11) 34 ℃の CO2 インキュベーター（5% CO2）で２日間程度培養する。
12) ウイルス増殖を完全に抑制する血清の最大希釈倍数の逆数を中和抗体価とする*** (1)被検血清はあらかじめ 56℃で 30 分から１時間処理しておく。
(2)非特異的中和反応を除くためには、血清をあらかじめ 3 容の RDE を加え反応後、56℃で 30 分から１時間処理するほうが特異性の高い結果が得られる
ことがある。

56

(3)血清の希釈の範囲は予想される力価と目的に応じて選ぶ。

**中和抗体価の判定に際しては、陰性対照血清や陽性対照血清の力価が一定の範囲で測定できていることを確認する。また、ウイルスの感染価についても確認しておく。

57

Part V
薬剤耐性インフルエンザウイルスの検出
抗インフルエンザ薬は、A 型インフルエンザウイルスの M2 蛋白質を標的とする M2 阻害薬と、A 型および B 型ウイルスの NA 蛋白質を標的とする NA 阻害薬の 2 種類に分類される。日本国内では、2014 年 9月の時点で、M2 阻害薬としてアマンタジン（商品名シンメトレル）が販売されており、NA 阻害薬としてオセ
ルタミビル（商品名タミフル）、ザナミビル（商品名リレンザ）、ペラミビル（商品名ラピアクタ）およびラニナミビ
ル（商品名イナビル）が販売されている。現在流行しているほとんどすべての A(H1N1)pdm09 およびA(H3N2)ウイルスは M2 蛋白質に特徴的な S31N 耐性変異をもっており、アマンタジンに対して耐性を示す。
NA 阻害薬耐性ウイルスは、NA 蛋白質における特徴的な耐性変異および NA 阻害薬に対する感受性の低下により検出される。2008/09 シーズン以降、NA 蛋白質に特徴的な H275Y 耐性変異をもつオセルタミ
ビル耐性 A(H1N1)ソ連型ウイルスが世界中に広がり、日本国内でもほとんどすべての A(H1N1)ソ連型ウイ
ルスはオセルタミビルに対して耐性を示した。現在流行しているほとんどの A(H1N1)pdm09、A(H3N2)および B 型ウイルスはオセルタミビルに対して感受性を示すが、世界各国で散発的に H275Y 変異をもつオセ
ルタミビル耐性 A(H1N1)pdm09 ウイルスが検出されている。これらの H275Y 耐性変異株は、オセルタミビ
ルと同様の分子構造をもつペラミビルに対して交叉耐性を示すことが報告されており、日本国内で検出されたすべてのオセルタミビル耐性 A(H1N1)pdm09 ウイルスはペラミビルに対して交叉耐性を示した。

１ 薬剤耐性変異の検出
i. NA 遺 伝 子 お よび M 遺 伝 子 の シ ー クエ ンス法 に よる検 出
シークエンス法の詳細は、「Part III: インフルエンザウイルスの遺伝子解析」を参照。

代表的な既知の NA 阻害薬耐性変異は以下のとおりである。
NA アミノ酸変異
N1 NA

N2 NA

B NA

H275Y

E119V

R150K

D199N

R292K

D197E

I223R

N294S

D197N

N295S

I221T
N294S
G407S

58

（WHO 抗インフルエンザ薬耐性株サーベイランスウェブサイト
http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/en/より抜粋）

NA 阻害薬耐性変異の検出に用いる、各ウイルス NA 遺伝子に対するプライマーは「Part III: インフルエン
ザウイルスの遺伝子解析」を参照。

代表的な既知の M2 阻害薬耐性変異は以下のとおりである。
M2 アミノ酸変異

亜型

L26F

A(H1N1), A(H1N1)pdm09, A(H3N2), A(H5N1)

V27A

A(H1N1), A(H1N1)pdm09, A(H3N2), A(H5N1)

A30V/T

A(H1N1)pdm09, A(H3N2)

S31N

A(H1N1), A(H1N1)pdm09, A(H3N2), A(H5N1)

G34E

A(H1N1)M2 阻害薬耐性変異の検出に用いる、各ウイルス M 遺伝子に対するプライマーは以下のとおりである。
A(H1N1)pdm09
RT-PCR primer set

Forward

AMA-M1-2v2

5'-TCAGGGAGCAAAAGCAGGTAGATA-3'（第 1 候補）

ReverseAMA-Bm-M-1027R

5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT-3'

RT-PCR primer set

ForwardAMA-SZAM1+5'-CTCGAGCAAAAGCAGGTAGAT-3'（第 2 候補）

ReverseAMA-M-1027R

5'-AGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTAC-3'

ForwardswMP-9-27F

5'-TCTAACCGAGGTCGAAACG-3'

ReverseswMP-334-314R

5'-CCCCATGGAACGTTATTTCTC-3'

ForwardswMP-382-401F

5'-ATGGGCCTCATATACAACAG-3'

ReverseswMP-592-574R

5'-GTTCACTCGATCCAGCCAT-3'

ForwardswMP-682-703F

5'-GGTCTGAAAGATGACCTTCTTG-3'

ReverseswMP-967-947R

5'-GTTGACAAAATGACCATCGTC-3'

RT-PCR primer set

Forward

AMA-M1-2v2

5'-TCAGGGAGCAAAAGCAGGTAGATA-3'（第 1 候補）

ReverseAMA-Bm-M-1027R

5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT-3'

RT-PCR primer set

ForwardAMA-SZAM1+5'-CTCGAGCAAAAGCAGGTAGAT-3'（第 2 候補）

ReverseAMA-M-1027R

5'-AGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTAC-3'

Sequence Primer

A(H3N2)59

Sequence Primer

Forward

AMA-M1-2

5'-AGCAAAAGCAGGTAGATATTG-3'

Forward

AMA-12-31F

5'-GGTAGATATTGAAAGATGAG-3'

Forward

AMA-348-368F

5'-ACATTCCATGGGGCCAAAGAA-3'

Forward

AMA-379-400F

5'-GTTATTCTGCTGGTGCACTTGC-3'

ReverseAMA-571-595R

5'-TCCATAGCCTTAGCTGTAGTGCTGG-3'

ReverseAMA-588-607R

5'-CCAGCCATTTGCTCCATAGC-3'

Reverse

AMA-981-1002R

5'-CAGCTCTATGCTGACAAAATGA-3'

ReverseAMA-M-1027R

5'-AGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTAC-3'

ii. Allele-specific RT-PCR 法 に よる H275Y 変 異 の 検 出A(H1N1)pdm09 ウイルスは、NA 蛋白質の 275 番目のアミノ酸がヒスチジン（H）からチロシン（Y）に変異（823 番目の塩基が C から T に置換）するとオセルタミビルおよびペラミビルに対して耐性を示す。本法では、2 種類の異なる蛍光色素（FAM; 耐性株 Y275(T)、VIC; 感受性株 H275(C)）で標識された TaqMan
Probe を用いて One-step RT-PCR を行い、Allelic Discrimination 解析により、A(H1N1)pdm09 ウイルス NA
遺伝子について H275Y 変異の検出を行う。
本法は、HA 価 が 8 程 度 以 上 の ウイル ス培 養 上 清 に つ い て は RNA 抽 出 を行 う必 要 が 無 く、培 養
上 清 を 滅 菌 蒸 留 水 で 10 倍 希 釈 した もの を 直 接 PCR 反 応 液 に 加 え て 検 査 を 行 うことが で きる。鼻 腔
拭 い 液 な どの 臨 床 検 体 を 使 用 す る場 合 に は RNA 抽 出 液 を 使 用 す るが、検体中に含まれるウイルス量が非常に少ない場合があるため、検出感度は保証されない。

機器および試薬
RNase-free 滅菌蒸留水
RNase-free 滅菌蒸留水はコンタミネーションを防ぐために市販のものを使用するのが望ましい。検査ごとに新品を開封して使用するか、または予め清浄な環境で RNase-free の滅菌チューブ等に分注しておいたものを検査ごとに使用する。
96 ウェルリアルタイム PCR 反応プレート
リアルタイム PCR 装置
リアルタイム RT-PCR 用反応試薬
QuantiTect Virus + ROX Vial Kit (QIAGEN Cat. #211031, 211033, 211035) を使用する機種
Roche LightCycler 480
Agilent MX3000P、Agilent MX3005P
ABI 7500、ABI 7500Fast

60

BioRad CFX96
QuantiTect Virus Kit (QIAGEN Cat. #211011, 211013, 211015) を使用する機種
ABI 7900HTABI StepOne、ABI StepOnePlus
ABI 7300
ABI 7000

リアルタイム RT-PCR 用プライマーおよびプローブ
RT-PCR

Forward

H1N1NA-F690-719

5’-ATGTGCATGTGTAAATGGTTCTTGCTTTAC-3'

primer set

ReverseH1N1NA-R847-872

5'-ACACATGTGATTTCACTAGAATCAGG-3'

FAM-274Ya-swH1N1-F823-835

5’-(FAM)TACTATGAGGAAT(MGB)-3'

VIC-H274a-swH1N1-F823-835

5’-(VIC)CACTATGAGGAAT(MGB)-3'

耐性株検出用
Probe
感受性株検出用Probe

リアルタイム RT-PCR 反応
1. QuantiTect Virus + ROX Vial kit を用いた反応液
試薬

容量

最終濃度

5×QuantiTect Virus NR Master Mix

4.0 μl1×
0.6 μM Forward primer

40×プライマー＋プローブ Mix

0.5 μl0.6 μM Reverse primer
0.1 μM FAM-Probe
0.1 μM VIC-Probe

QuantiTect Virus RT Mix

0.2 μl

50×ROX Dye Solution＊1

0.4 μlRNase free Water

12.9 μl

Template＊2

2.0 μlTotal 容量

1×

20 μl

61

2. QuantiTect Virus kit を用いた反応液
試薬

容量

最終濃度

5×QuantiTect Virus NR Master Mix

4.0 μl1×
0.6 μM Forward primer

40×プライマー＋プローブ Mix

0.5 μl0.6 μM Reverse primer
0.1 μM FAM-Probe
0.1 μM VIC-Probe

QuantiTect Virus RT Mix

0.2 μlRNase free Water

13.3 μl

Template＊22.0 μlTotal 容量20 μl

＊1 Roche LightCycler480 では、代わりに RNase free Water を使用する。
＊2 Template には HA 価が 8 程度以上のウイルス培養上清を用いる。培養上清を遠心して細胞由来成分を除去し、滅菌蒸留水で 10 倍希釈したものを 2 μl 使用する。HA 価が 8 程度以下のウイルス株の場合はRNA 抽出液 2 μl を使用する。鼻腔拭い液などの臨床検体を使用する場合には RNA 抽出液を 2 μl 使
用するが、検体中に含まれるウイルス量が非常に少ない場合があるため、検出感度は保証されない。

ABI 7000、ABI 7300、ABI 7500、ABI 7500 Fast（Standard モード）、ABI 7900HT、ABI StepOne、ABI
StepOnePlus および Roche LightCycler 480 では、H275 陽性コントロールと Y275 陽性コントロールは各数
点、陰性コントロールは 1 点 とする。

Agilent MX3000P および Agilent MX3005P では、H275 陽性コントロールと Y275 陽性コントロールは各数
点、陰性コントロールは 3 点 とする。

陰性コントロールは、RNase free Water を使用する。

62

3. ABI 7000、ABI 7300、ABI 7500、ABI 7500 Fast（Standard モード）、ABI 7900HT、ABI StepOne および ABI StepOnePlus での反応条件
Pre-read

60 C˚

1 min

50 C˚

20 min↓95 C˚Amplification

5 min

↓
95 C˚
56 C˚

Post-read

15 sec×40 cycles＊3

45 sec（Data Collection）

60 C˚

1 min

＊3 反応がプラトーに達すると各陽性コントロールを結んだ線が直線状にならず、結果判定が行いにくくなるのでサイクル数を 40 に設定する。

4. Roche LightCycler 480 での反応条件
Analysis Mode

Cycle

RT

None

1

Denature

None

1

PCR

Quantification

45

Temperature

AcquisitionTime

Ramp Rate（℃/sec）

50

20 min

4.4

None

95

5 min

4.4

None

95

15 sec

1.5

None

56

45 sec1Single（℃）

Mode

5. Agilent MX3000P、Agilent MX3005P での反応条件
50 C˚

20 min

↓
95 C˚

5 min

↓
95 C˚
56 C˚

15 sec45 sec×45 cycles＊4（Data Collection）＊4 反応がプラトーに達すると各陽性コントロールを結んだ線が直線状にならず、結果判定が行いにくく

63なるのでサイクル数を 45 に設定する。

Allelic Discrimination 解析
Allelic Discrimination 解析では、PCR 反応終了後（エンドポイント）の各サンプルの蛍光強度を利用して判定を行う。したがって、Applied Biosystems 社の機器では結果の判定に Amplification データを使用せず、
Post-read データのみを使用する。Roche Diagnostics 社の機器では、反応終了後 Analyze で Endpoint
genotyping を選択して解析を行う。
本法では、823 番目の塩基が C のものは VIC で修飾されたプローブによって検出され、塩基が T のもの
は FAM で修飾されたプローブによって検出される。したがって、反応終了後の蛍光強度は、サンプルの823 番目の塩基の T と C の割合を反映している。
本法では、従来のように Ct 値を利用しての検査の精度確認は行わない。それに代わり、検査結果の判定
は、Allelic Discrimination の図で以下の 2 つの条件が満たされた場合に有効とする。
（１）H275 陽性コントロールおよび Y275 陽性コントロールを結んだ線が直線状になる。
（２）陰性コントロールが、両陽性コントロールの直線との交点付近にある。

図 1. ABI 7500、ABI 7500 Fast、ABI StepOne および ABI StepOnePlus での解析結果の参考例

図 2. Roche LightCycler 480 での解析結果の参考例

64

２ 薬剤感受性試験
NA 阻害薬に対するウイルスの感受性は、薬剤感受性試験により算出される IC50 値（NA 活性を 50％阻害する薬剤濃度）によって表される。WHO は世界規模の抗インフルエンザ薬耐性株サーベイランスにおける耐性株の IC50 値について判定基準を示しており、日本国内のサーベイランスもこの基準に準じている。
日本国内のサーベイランスにおける耐性株の判定基準を以下に示す。
A 型ウイルス

分類

B 型ウイルス

感受性株と比較して感受性株< 10 倍 IC

感受性低下株

10-100 倍 IC

高度感受性低下株（耐性株）>100 倍 IC< 5 倍 IC

50
50

50

5-50 倍 IC>50 倍 IC

50

50

50

（WHO 抗インフルエンザ薬耐性株サーベイランスウェブサイト
http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/en/を参照）

薬 剤 感 受 性 試 験 は 蛍 光 法 お よ び 化 学 発 光 法 に 大 別 さ れ る 。 蛍 光 法 は 基 質 と し て MUNANA(4-(methylumbelliferyl)-N-acetylneuraminic acid)を使用し、化学発光法は基質として NA-Star あるいは
NA-XTD を使用する。MUNANA 基質は Sigma-Aldrich、Biosynth、Sequoia Research Products から市販されている他に、Applied Biosystems からキットの一部として提供されている。NA-Star および NA-XTD 基質
は Applied Biosystems からキットの一部としてのみ提供されている。
化学発光法は蛍光法より感度が高く、少量のウイルスで試験が実施できるが高価である。一方、蛍光法は安価であり、また耐性ウイルスと感受性ウイルスの IC50 値の差が大きいため、耐性ウイルスと感受性ウイ
ルスの混合ウイルス株の検出に適している。

i. MUNANA 基 質 を 用 い る蛍 光 法
材料および試薬
蛍光測定用 96 ウェルプレート
蛍光測定用プレートリーダー
NA 阻害薬（NI; NA inhibitor）
Oseltamivir carboxylate（Roche または Sequoia Research Products）
Peramivir（BioCryst または Sequoia Research Products）
Zanamivir（GlaxoSmithKline または Sequoia Research Products）
Laninamivir（Daiichi Sankyo または Sequoia Research Products）
4-Methylumbelliferone sodium salt（4-MU）（Sigma-Aldrich）

65

NA-Fluor Influenza Neuraminidase
Kit を使用しない場合

試薬

Assay Kit
（Applied Biosystems）

2'-(4-Methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid,
MUNANAsodium salt hydrate

NA-Fluor Substrate

基質（Sigma-Aldrich, Biosynth, Sequoia Research Products）−20℃ 遮光保存−20℃ 遮光保存
2×Assay

66.6 mM MES, 8 mM CaCl2, pH 5.5-6.5

Buffer

2-8℃ 保存

Stop

0.14 M NaOH in Ethanol

Solution

用時調製

NA-Fluor 2×Assay Buffer（66.6 mM MES, 8 mM CaCl2, pH 6.5）
2-8℃ 保存
NA-Fluor Stop Solution（0.2 M Na2CO3）
2-8℃ 保存

ISIRV 参照株（感染研インフルエンザウイルス研究センターから入手可能）
インフルエンザウイルス

型／亜型

NA 変異

A/Mississippi/3/2001

A(H1N1)-

A/Mississippi/3/2001

A(H1N1)H275Y

A/Perth/265/2009

A(H1N1)pdm09-

A/Perth/261/2009

A(H1N1)pdm09

H275Y

A/Fukui/20/2004

A(H3N2)-

A/Fukui/45/2004

A(H3N2)

E119V

B/Perth/211/2001

B-

B/Perth/211/2001

B

D197E

試薬の調製
2×Assay Buffer（Kit を使用しない場合）
以下の試薬を混合し、10 M sodium hydroxide で pH 5.5-6.5 に調整する。
ポアサイズ 0.2μm のフィルターを通す。
13 g 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid（MES）
8 ml 1 M CaCl2

66

992 ml 蒸留水
Stop Solution（用時調製）（Kit を使用しない場合）
以下の試薬を混合する（96 ウェルプレート 1 枚分）。
2.225 ml 0.824 M NaOH
11 ml absolute ethanol
1×Assay Buffer
2×Assay Buffer を蒸留水で２倍希釈する。
2.5 mM MUNANA master stock solution
MUNANA 25 mg を 20 ｍｌの蒸留水で溶解し、1 アッセイ分ずつ小分けして−20℃ 遮光保存。
200 μM MUNANA working solution（用時調製）
2.5 mM MUNANA stock solution 480 μl に 1× Assay Buffer 5.52 ml を加える（96 ウェルプレート 1 枚分）。
100 mM 4-MU master stock solution
4-MU 198.1 mg を 10 ml の蒸留水で溶解し、小分けして−20℃ 遮光保存。
40% ethanol in NA-Fluor Stop Solution（用時調製）（Kit を使用する場合）
NA-Fluor Stop Solution 7.2 ml に absolute ethanol 4.8 ml を加える（96 ウェルプレート 1 枚分）。
25 mM NI master stock solution
蒸留水で溶解し、小分けして−20℃保存。
500 μM NI working stock solution
25 mM NI master stock 50 μl に蒸留水 2,450 μl を加え、1 アッセイ分ずつ小分けして−20℃保存。

ウイルスの不活化試験に用いるウイルスは以下のいずれかの方法で不活化できる。
ウイルス液またはウイルス希釈液に最終濃度 0.1% NP-40 を添加する。
ウイルス液またはウイルス希釈液に最終濃度 0.2-1% Triton X-100 を添加する。
NA-Fluor Stop Solution に最終濃度 40% ethanol を添加する。

4-MU Standard Curve の作成
4-MU は MUNANA 基質がウイルスの NA 活性による切断を受けた結果として遊離する蛍光物質である。
4-MU の Standard Curve を作成することにより、各測定機器における蛍光値（relative fluorescence unit；
RFU）の linear range を特定することができる。MUNANA 基質を用いる薬剤感受性試験では、得られた
RFU が linear range に収まるように、あらかじめ最適なウイルス希釈倍率を決定する必要がある。

67

1. 100 mM 4-MU master stock solution を Stop Solution で以下のとおり 2 倍階段希釈する。
希釈

必要量

濃度

Dil 1 (1:1000)

1 μl MS + 1,000 μl SS

100 μMDil 2 (1:2)

500 μl Dil 1 + 500 μl SS

50 μM

Dil 3 (1:2)

500 μl Dil 2 + 500 μl SS

25 μM

Dil 4 (1:2)

500 μl Dil 3 + 500 μl SS

12.50 μM

Dil 5 (1:2)

500 μl Dil 4 + 500 μl SS6.25 μM

Dil 6 (1:2)

500 μl Dil 5 + 500 μl SS3.12 μM

Dil 7 (1:2)

500 μl Dil 6 + 500 μl SS1.56 μM

Dil 8 (1:2)

500 μl Dil 7 + 500 μl SS

0.78 μM

Dil 9 (1:2)

500 μl Dil 8 + 500 μl SS

0.39 μM

Dil 10 (1:2)

500 μl Dil 9 + 500 μl SS

0.20 μM

Dil 11 (1:2)

500 μl Dil 10+ 500 μl SS

0.10 μM

Dil 12500 μl SS

0 μM

MS: Master Stock
SS: Stop Solution

2. 上記の 2 倍階段希釈液をそれぞれ 96 ウェルプレート 2 ウェルに 200 μl ずつ入れる。

3. プレートを excitation 350 nm-365 nm、emission 440 nm-460 nm の波長で測定する。

4. X 軸に 4-MU 濃度、Y 軸に RFU をとってグラフにプロットし、4-MU Standard Curve を作成する。

図 3.

4-MU Standard Curve685. linear range RFU を決定し、薬剤感受性試験で利用するために、NA 活性の基準値を設定する。

図 4. 図 3 の linear range RFU 拡大図
この例では 4-MU 1.5 μM 相当の RFU～52,000 が NA 活性の基準値として適当である。

ウイルス NA 活性の測定
薬剤感受性試験において信頼性の高い IC50 値を算出するためには、最適量のウイルスを使用する必要がある。そこで、試験に用いるウイルスの NA 活性を測定し、各測定機器において linear range RFU となる最適なウイルス希釈倍率を決定する。

1. 96 ウェルプレートのすべてのウェルに 1×Assay Buffer を 50 μl ずつ入れる。
ウイルス 50 μl を A 行に入れ、以下のプレートレイアウトに従って B から G まで順次 2 倍階段希釈する。
H 行の No Virus Control には、1×Assay Buffer のみが入る。
ウイルス最終希釈

1

倍率
2倍

A

4倍

B

8倍

C

16 倍

D

32 倍

E

64 倍

F

128 倍

G

2

Virus 1

3

4

Virus 2

5

6

Virus 3H

7

8

Virus 4

No Virus Control

図 5. プレートレイアウト

69

9

10

Virus 5

11

12

Virus 6

2. 200 μM MUNANA working solution 50 μl を各ウェルに加える。

3. プレートにふたをして撹拌し、遮光して 37℃で 60 分間インキュベーションする。

4. Stop Solution を各ウェルに 100 μl ずつ加え、反応を停止する。

5. プレートを excitation 350 nm-365 nm、emission 440 nm-460 nm の波長で測定する。

6. No Virus Control の RFU 平均値を求めてバックグラウンド値を算出し、各ウェルの RFU 値からバックグ
ラウンド値を引く。

7. X 軸にウイルス希釈倍率、Y 軸に RFU-バックグラウンド値をとってグラフにプロットする。

8. 各ウイルスについて、4-MU standard curve から得られた NA 活性の基準値となる RFU 値をもとに最適希釈倍率を算出する。

NA 活性の基準 RFU 値

最適希釈倍率

図 6. NA 活性プロットの参考例

70

NA 阻害薬感受性試験
1. 各ウイルスを上記で得られた最適希釈倍率に従って 1×Assay Buffer で希釈する（用事調整）。

2. 500 µM NI working stock solution を 1×Assay Buffer で以下のとおり階段希釈する。
NI 濃度（4×） NI 最終濃度

希釈

必要量

Dil 1 (1:25)

30 μl WS + 720 μl AB

20,000 nM

5,000 nM

Dil 2 (1:3.16)

250 μl Dil 1 + 540 μl AB

6,330 nM

1,583 nM

Dil 3 (1:3.16)

250 μl Dil 2 + 540 μl AB

2,000 nM

500 nM

Dil 4 (1:3.16)

250 μl Dil 3 + 540 μl AB

633 nM

160 nM

Dil 5 (1:3.16)

250 μl Dil 4 + 540 μl AB

200 nM

50 nM

Dil 6 (1:3.16)

250 μl Dil 5 + 540 μl AB

63.4 nM

16 nM

Dil 7 (1:3.16)

250 μl Dil 6 + 540 μl AB

20 nM

5 nM

Dil 8 (1:3.16)

250 μl Dil 7 + 540 μl AB

6.3 nM

1.6 nMDil 9 (1:3.16)

250 μl Dil 8 + 540 μl AB

2 nM

0.5 nM

Dil 10 (1:3.16) 250 μl Dil 9 + 540 μl AB

0.64 nM

0.15 nM

0 nM

0 nM

Dil 11540 μl AB

WS: Working Stock
AB: Assay Buffer

3. 上記の階段希釈液を以下のプレートレイアウトに従ってそれぞれ 25 μl ずつ入れる。
NI 最終濃度

（nM）

5,000

1,583

500

160

50

16

5

1.6

0.5

0.15

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A
B
C
D
E
F
G
H

Virus 1

Virus 2

No
Virus

Virus 3

Virus 4

図 7. プレートレイアウト

71

Control

4. 1 で希釈したウイルス液をプレートレイアウトに従い、NI 濃度の低い 11 列から 1 列に向かってそれぞれ
25 μl ずつ入れる。
No Virus Ｃｏｎｔｒｏｌには、1×Assay Buffer を 25 μl ずつ入れる。

5. プレートにふたをして撹拌し、37℃で 20 分間インキュベーションする。

6. 200 μM MUNANA working solution 50 μl を各ウェルに加える。

7. プレートにふたをして撹拌し、遮光して 37℃で 60 分間インキュベーションする。

8. Stop Solution を各ウェルに 100 μl ずつ加え、反応を停止する。

9. プレートを excitation 350 nm-365 nm、emission 440 nm-460 nm の波長で測定する。

IC50 値の算出
1. No Virus Control ウェルの RFU 平均値を求めてバックグラウンド値を算出し、各ウェルの RFU 値からバックグラウンド値を引く。
NI 存在下における各ウイルスの NA 活性率（%）は、NI 存在下での RFU 値÷NI 非存在下（11 列）での RFU 値×100として算出される。

2. X 軸に対数目盛で NI 濃度、Y 軸に NA 活性率（%）をとってグラフにプロットする。
sigmoidal curve-fitting または point-to-point plotting を用いて、IC50 値を算出する。

ii. NA-Star 基 質 を 用 い る化 学 発 光 法
材料および試薬
化学発光測定用 96 ウェルプレート
インジェクター付属化学発光測定用プレートリーダー
NA-Star 基質の発光の半減期は 5 分間と短いため、測定にはインジェクター付属の化学発光測定用プレートリーダーが推奨される。
NA 阻害薬（NI; NA inhibitor）
Oseltamivir carboxylate（Roche または Sequoia Research Products）
Peramivir（BioCryst または Sequoia Research Products）

72

Zanamivir（GlaxoSmithKline または Sequoia Research Products）
Laninamivir（Daiichi Sankyo または Sequoia Research Products）

NA-Star Influenza Neuraminidase Inhibitor Resistance Detection
Kit（Applied Biosystems）
NA-Star Substrate
4℃ 保存
NA-Star Assay Buffer
4℃ 保存
NA-Star Accelerator
4℃ 保存

ISIRV 参照株（感染研インフルエンザウイルス研究センターから入手可能）
インフルエンザウイルス

型／亜型

NA 変異

A/Mississippi/3/2001

A(H1N1)-

A/Mississippi/3/2001

A(H1N1)H275Y

A/Perth/265/2009

A(H1N1)pdm09-

A/Perth/261/2009

A(H1N1)pdm09

H275Y

A/Fukui/20/2004

A(H3N2)-

A/Fukui/45/2004

A(H3N2)

E119V

B/Perth/211/2001

B-

B/Perth/211/2001

B

D197E

試薬の調製
NA-Star Substrate（用時調製）
NA-Star Substrate を NA-Star Assay Buffer で 1,000 倍希釈する。
25 mM NI master stock solution
蒸留水で溶解し、小分けして−20℃保存。
50 μM NI working stock solution
25 mM NI master stock 20 μl に蒸留水 10 ml を加え、1 アッセイ分ずつ小分けして−20℃保存。

73

ウイルスの不活化試験に用いるウイルスは以下の方法で不活化できる。
ウイルス液に最終濃度 1% Triton X-100 を添加する。

ウイルス NA 活性の測定
薬剤感受性試験において信頼性の高い IC50 値を算出するためには、最適量のウイルスを使用する必要がある。そこで、試験に用いるウイルスの NA 活性を測定し、最適なウイルス希釈倍率を決定する。

1. 96 ウェルプレートのすべてのウェルに NA-Star Assay Buffer を 50 μl ずつ入れる。
あらかじめ NA-Star Assay Buffer で 5 倍希釈したウイルス 50 μl を A 行に入れ、以下のプレートレイアウトに従って B から G まで順次 2 倍階段希釈する。
H 行の No Virus Control には、NA-Star Assay Buffer のみが入る。
ウイルス最終希釈

1

倍率
10 倍

A

20 倍

B

40 倍

C

80 倍

D

160 倍

E

320 倍

F

640 倍

G

2

Virus 1

3

4

Virus 2

5

6

Virus 3H

7

8

Virus 49

10

Virus 5

11

12

Virus 6

No Virus Control

図 8. プレートレイアウト

2. 希釈済みの NA-Star Substrate 10 μl を各ウェルに加える。

3. プレートにふたをして撹拌し、室温で 30 分間インキュベーションする。

4. インジェクターを用いて NA-Star Accelerator 60 μl を各ウェルに加え、添加 2 秒後にウェル当たり 1 秒
間測定する。

5. X 軸にウイルス希釈倍率、Y 軸に Signal/Noise 値（各希釈ウイルスの測定値÷No Virus Control の測定

74値）をとってグラフにプロットする。

6. 各ウイルスについて、Signal/Noise 値が 40 となる希釈倍率が最適値となる。
ウイル スの NA 活 性 が 低 くウイル ス希 釈 倍 率 が 5 倍 以 下 とな る場 合 は 、培 地 に 含 まれ るフェノー ル
レッドの 干 渉 作 用 に より発 光 強 度 が 低 下 し、正 確 な 測 定 値 が 得 られ な い 可 能 性 が あ る。

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0123456!
7123456!

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8123456!

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Signal/Noise
＝40

!"!
!!
最適希釈倍率!"! #"! $"! %"! !&"! '#"! &$"!
()*+,-./,
図 9. NA 活性プロットの参考例

75

NA 阻害薬感受性試験
1. 各ウイルスを上記で得られた最適希釈倍率に従って NA-Star Assay Buffer で希釈する（用時調整）。

2. 50 μM NI working stock solution を NA-Star Assay Buffer で以下のとおり階段希釈する。
希釈

必要量

NI 濃度（2×）

NI 最終濃度Dil 1 (1:25)

30 μl WS + 720 μl AB

2,000 nM

1,000 nM

Dil 2 (1:3.16)

250 μl Dil 1 + 540 μl AB

633 nM317 nM

Dil 3 (1:3.16)

250 μl Dil 2 + 540 μl AB

200 nM

100 nM

Dil 4 (1:3.16)

250 μl Dil 3 + 540 μl AB

63.4 nM

32 nM

Dil 5 (1:3.16)

250 μl Dil 4 + 540 μl AB

20 nM

10 nM

Dil 6 (1:3.16)

250 μl Dil 5 + 540 μl AB

6.3 nM

3.2 nMDil 7 (1:3.16)

250 μl Dil 6 + 540 μl AB

2 nM

1 nM

Dil 8 (1:3.16)

250 μl Dil 7 + 540 μl AB

0.64 nM

0.32 nM

Dil 9 (1:3.16)

250 μl Dil 8 + 540 μl AB

0.20 nM

0.1 nM

Dil 10 (1:3.16)

250 μl Dil 9 + 540 μl AB

0.06 nM

0.03 nM

Dil 11540 μl AB

0 nM

0 nM

WS: Working Stock
AB: Assay Buffer

3. 上記の階段希釈液を以下のプレートレイアウトに従ってそれぞれ 25 μl ずつ入れる。
NI 最終濃度

（nM）

1,000

317

100

32

10

3.2

1

0.32

0.1

0.03

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A
B
C
D
E
F
G
H

Virus 1

Virus 2

No
Virus

Virus 3

Virus 4

図 10. プレートレイアウト

76

Control

4. 1 で希釈したウイルス液をプレートレイアウトに従い、NI 濃度の低い 11 列から 1 列に向かってそれぞれ
25 μl ずつ入れる。
No Virus Control には、NA-Star Assay Buffer を 25 μl ずつ入れる。

5. プレートにふたをして撹拌し、37℃で 20 分間インキュベーションする。

6. 希釈済みの NA-Star Substrate 10 μl を各ウェルに加える。

7. プレートにふたをして撹拌し、室温で 30 分間インキュベーションする。

8. インジェクターを用いて NA-Star Accelerator 60 μl を各ウェルに加え、添加 2 秒後にウェル当たり 1 秒
間測定する。

IC50 値の算出
1. NI 存在下における各ウイルスの NA 活性率（%）を、NI 存在下での測定値÷NI 非存在下（11 列）での測定値×100として算出する。

2. X 軸に対数目盛で NI 濃度、Y 軸に NA 活性率（%）をとってグラフにプロットする。
sigmoidal curve-fitting または point-to-point plotting を用いて、IC50 値を算出する。

iii. NA-XTD 基 質 を 用 い る化 学 発 光 法
材料および試薬
化学発光測定用 96 ウェルプレート
化学発光測定用プレートリーダー
NA 阻害薬（NI; NA inhibitor）
Oseltamivir carboxylate（Roche または Sequoia Research Products）
Peramivir（BioCryst または Sequoia Research Products）
Zanamivir（GlaxoSmithKline または Sequoia Research Products）
Laninamivir（Daiichi Sankyo または Sequoia Research Products）

77

NA-XTD Influenza Neuraminidase Assay Kit（Applied Biosystems）
NA-XTD Substrate
2-8℃ 保存
NA-XTD Assay Buffer
2-8℃ 保存
NA-XTD Accelerator
2-8℃ 保存
NA Sample Prep Buffer（10% Triton X-100 in NA-XTD Assay Buffer）
2-8℃ 保存

ISIRV 参照株（感染研インフルエンザウイルス研究センターから入手可能）
インフルエンザウイルス

型／亜型

NA 変異

A/Mississippi/3/2001

A(H1N1)-

A/Mississippi/3/2001

A(H1N1)H275Y

A/Perth/265/2009

A(H1N1)pdm09-

A/Perth/261/2009

A(H1N1)pdm09

H275Y

A/Fukui/20/2004

A(H3N2)-

A/Fukui/45/2004

A(H3N2)

E119V

B/Perth/211/2001

B-

B/Perth/211/2001

B

D197E

試薬の調製
NA-XTD Substrate（用時調製）
NA-XTD Substrate を NA-XTD Assay Buffer で 1,000 倍希釈する。
25 mM NI master stock solution
蒸留水で溶解し、小分けして−20℃保存。
500 μM NI working stock solution
25 mM NI master stock 50 μl に蒸留水 2,450 μl を加え、1 アッセイ分ずつ小分けして−20℃保存。

78

ウイルスの不活化試験に用いるウイルスは以下の方法で不活化できる。
ウイルス液に NA Sample Prep Buffer（10% Triton X-100 in NA-XTD Assay Buffer）を 1/10 量添加する。

ウイルス NA 活性の測定
薬剤感受性試験において信頼性の高い IC50 値を算出するためには、最適量のウイルスを使用する必要がある。そこで、試験に用いるウイルスの NA 活性を測定し、最適なウイルス希釈倍率を決定する。

1. 96 ウェルプレートのすべてのウェルに NA-XTD Assay Buffer を 50 μl ずつ入れる。
あらかじめ NA-XTD Assay Buffer で 5 倍希釈したウイルス 50 μl を A 行に入れ、以下のプレートレイアウ
トに従って B から G まで順次 2 倍階段希釈する。
H 行の No Virus Control には、NA-XTD Assay Buffer のみが入る。
ウイルス最終希釈

1

倍率
10 倍

A

20 倍

B

40 倍

C

80 倍

D

160 倍

E

320 倍

F

640 倍

G

2

Virus 1

3

4

Virus 2

5

6

Virus 3H

7

8

Virus 49

10

Virus 5

11

12

Virus 6

No Virus Control

図 11. プレートレイアウト

2. 希釈済みの NA-XTD Substrate 25 μl を各ウェルに加える。

3. プレートにふたをして撹拌し、室温で 30 分間インキュベーションする。

4. NA-XTD Accelerator 60 μl を各ウェルに加え、2 時間以内にウェル当たり 1 秒間測定する。

5. X 軸にウイルス希釈倍率、Y 軸に Signal/Noise 値（各希釈ウイルスの測定値÷No Virus Control の測定値）をとってグラフにプロットする。

79

6. 各ウイルスについて、Signal/Noise 値が 40 となる希釈倍率が最適値となる。
ウイル スの NA 活 性 が 低 くウイル ス希 釈 倍 率 が 5 倍 以 下 とな る場 合 は 、培 地 に 含 まれ るフェノー ル
レッドの 干 渉 作 用 に より発 光 強 度 が 低 下 し、正 確 な 測 定 値 が 得 られ な い 可 能 性 が あ る。

!"#$%&'()"*+!

!""""!

0123456!
7123456!

!"""!

8123456!

!""!

Signal/Noise
＝40

!"!
!!
最適希釈倍率!"! #"! $"! %"! !&"! '#"! &$"!
()*+,-./,
図 12. NA 活性プロットの参考例

80

NA 阻害薬感受性試験
1. 各ウイルスを上記で得られた最適希釈倍率に従って NA-XTD Assay Buffer で希釈する（用時調整）。

2. 500 μM NI working stock solution を NA-XTD Assay Buffer で以下のとおり階段希釈する。
希釈

必要量

NI 濃度（3×）

NI 最終濃度Dil 1 (1:25)

30 μl WS + 720 μl AB

20,000 nM

6,600 nM

Dil 2 (1:5)

100 μl Dil 1 + 400 μl AB

4,000 nM

1,320 nM

Dil 3 (1:5)

100 μl Dil 2 + 400 μl AB

800 nM

264 nM

Dil 4 (1:5)

100 μl Dil 3 + 400 μl AB

160 nM52.8 nM

Dil 5 (1:5)

100 μl Dil 4 + 400 μl AB

32 nM

10.56 nM

Dil 6 (1:5)

100 μl Dil 5 + 400 μl AB

6.4 nM

2.11 nM

Dil 7 (1:5)

100 μl Dil 6 + 400 μl AB

1.28 nM

0.422 nM

Dil 8 (1:5)

100 μl Dil 7 + 400 μl AB

0.256 nM

0.084 nM

Dil 9 (1:5)

100 μl Dil 8 + 400 μl AB

0.0512 nM

0.017 nM

Dil 10 (1:5)

100 μl Dil 9 + 400 μl AB

0.01 nM

0.003 nM

Dil 11400 μl AB

0 nM

0 nM

WS: Working Stock
AB: Assay Buffer

3. 上記の階段希釈液を以下のプレートレイアウトに従ってそれぞれ 25 μl ずつ入れる。
NI 最終濃度

（nM）

6,600

1,320

264

52.8

10.56

2.11

0.422

0.084

0.017

0.003

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A
B
C
D
E
F
G
H

Virus 1
Virus 2

No
Virus

Virus 3
Virus 4

図 13. プレートレイアウト

81

Control

4. 1 で希釈したウイルス液をプレートレイアウトに従い、NI 濃度の低い 11 列から 1 列に向かってそれぞれ
25 μl ずつ入れる。
No Virus Control には、NA-XTD Assay Buffer を 25 μl ずつ入れる。

5. プレートにふたをして撹拌し、37℃で 20 分間インキュベーションする。

6. 希釈済みの NA-XTD Substrate 25 μl を各ウェルに加える。

7. プレートにふたをして撹拌し、室温で 30 分間インキュベーションする。

8. NA-XTD Accelerator 60 μl を各ウェルに加え、2 時間以内にウェル当たり 1 秒間測定する。

IC50 値の算出
1. NI 存在下における各ウイルスの NA 活性率（%）を、NI 存在下での測定値÷NI 非存在下（11 列）での測定値×100として算出する。

2. X 軸に対数目盛で NI 濃度、Y 軸に NA 活性率（%）をとってグラフにプロットする。
sigmoidal curve-fitting または point-to-point plotting を用いて、IC50 値を算出する。

82

検査依頼先国立感染症研究所インフルエンザウイルス研究センター〒208-0011 東京都武蔵村山市学園 4-7-1
TEL: 042-561-0771、FAX: 042-561-6149

執 筆 者 リスト

国立感染症研究所

地方衛生研究所

イン フル エ ン ザ ウイル ス研 究 セ ン ター
中村一哉

長野秀樹（北海道立衛生研究所）

藤崎誠一郎

高橋雅輝（岩手県環境保健研究センター）

白倉雅之

林 志直（東京都健康安全研究センター）

高下恵美

川上千春（横浜市衛生研究所）

中内美名

小渕正次（富山県衛生研究所）

高山郁代

加瀬哲男（大阪府立公衆衛生研究所）

影山 努

岡山文香（堺市衛生研究所）

小田切孝人

山下育孝（愛媛県立衛生環境研究所）
千々和勝己（福岡県保健環境研究所）
喜屋武向子（沖縄県衛生環境研究所）
安井善宏（愛知県衛生研究所）
皆川洋子（愛知県衛生研究所）

83