水利用効率に関わる膜輸送体の大豆オーソログの機能解析
黒森崇＊・杉本 絵理子・篠崎 一雄

理化学研究所環境資源科学研究センター機能開発研究グループ

A Soybean Ortholog of the Membrane Transporter Involved inWater Use Eﬃciency
Takashi KUROMORI＊, Eriko SUGIMOTO and Kazuo SHINOZAKI
RIKEN, Center for Sustainable Resource Science, Gene Discovery Research Group,
Saitama 351-0198

ABSTRACT
It is important to apply our understanding of plant science to address sustainable
development goals (SDGs). For example, due to climate change, cultivated land
will be affected, and the use of water is becoming a serious global problem.
Abscisic acid (ABA) is an ordinary phytohormone, described as a stress hormone
responsible for coping with various environmental stresses in plants. Under thesystemic distribution of stress signals, ABA may be a mobile molecule within theplant. Recently, ABA transport systems in plants have been investigated, andseveral types of ABA transporters have been reported. We previously found thatAtABCG25 is a membrane transporter related to ABA intercellular transport inArabidopsis thaliana. We also observed that AtABCG25 expression enhanced wateruse eﬃciency in this model plant. However, the presence of AtABCG25 orthologs
in different plant species has not been analyzed extensively. Here, we identified
and carried out the functional characterization of an ortholog of AtABCG25 inGlycine max (soybean), viz. as GmABCG25. We tested the ABA transport activityof GmABCG25 and examined ABA-related phenotypes of GmABCG25-expressing
Arabidopsis plants. Results suggest that GmABCG25 is a possible functional
homolog of AtABCG25. Regulating intercellular ABA signaling using such ABAtransporters may represent a novel strategy for the breeding of commercially
important crops. Soy Protein Research, Japan 23, 17-21, 2020.

＊〒351-0198

埼玉県和光市広沢2-1

大豆たん白質研究Vol. 23（2020）17

Key words : ABC transporter, abscisic acid, Glycine max , phytohormone, water use
eﬃciency
アブシジン酸（ABA）は，植物が環境ストレスをせました．Sf9細胞（1×106細胞/mL）に対して，同受けた時に働くホルモンであり，植物体内で可動性シじタイターに対応するウイルスを感染させ，4%FBSグナル分子として働くと考えられています．最近，植（Gibco）
・100ユ ニ ッ ト/mLペ ニ シ リ ン・100μg/mL

物内でのABA輸送において，膜輸送体が重要な調節

ストレプトマイシンを含む液体培地Sf-900 III SFM

因子の一つであることが分かってきました1）．実際に，（Gibco）を振とう培養器100 rpmの速度で，28℃で48

ここ10年ほどで数種類の膜輸送体がABA膜輸送体と時間培養しました．その後，細胞培養液を1,000 rpm

1, 2）．私たちは，実験モデル植物で5分間の遠心分離によって収集し，培養液で2回洗のシロイヌナズナを材料として，ABA輸送に関与す

浄 し， 最 終 濃 度25 mg/mLで 再 懸 濁 し ま し た．[3H]る膜輸送体の一つであるAtABCG25を同定しました3）．

ア ブ シ ジ ン 酸（GE Healthcare， ま た はAmerican

AtABCG25は，ほとんどの生物種で高度に保存されてRadiolabeled Chemicals，Inc.） の 放 射 性 同 位 体 溶 液

いるATP-Binding Cassette（ABC）トランスポーターを加え，室温で16分間インキュベートしました．各

して報告されています

4）ファミリーに属しています ．ゲノムにコードされるサンプルから100μlを0.45μmメンブレンフィルター

ABCトランスポーターの数を調べると，一般に植物で（Millipore）に通してろ過しました．フィルター上には動物よりも数倍存在することが分かっており，多く残った細胞の放射性カウントを，液体シンチレーショのABCトランスポーターは植物固有の機能を持ってンカウンター（ALOKA）により測定しました．

いる可能性があることが示唆されています5, 6）．
さて，環境・エネルギー問題が全世界規模で深刻化

シロイヌナズナ植物を用いたGmABCG25の機能解析している状況で，例えば，地球温暖化への対策に植物

植 物 内 で 遺 伝 子 を 発 現 さ せ る た め に， 人 工 合 成のもつ生存戦略や独自の機能を役立てることは有効なし たGmABCG25 ORFを 含 む ク ロ ー ン（pENTR-対策の一つです．気候変動下では地球全体で耕作地なGmABCG25）を，以前の実験3）で用いた過剰発現ベクどが影響を受け，また乾燥地帯やそれに準ずる地域でターに組込み，35S :: GmABCG25 プラスミドを生成しは水の利用がこれまで以上に切迫します．私たちは，ました．35S :: GmABCG25 プラスミドをアグロバクテ

生体膜機能を活用することで，植物の個体レベルでのリウムにエレクトロポレーションにより導入し，さら水利用効率向上という新しい有用形質に着目していまにフローラルディッピング法によってシロイヌナズナ

す．既に，水分蒸散に関わる植物ホルモンABAに注形質転換植物体を作製しました．ABA感受性テスト

目した研究において，膜輸送体AtABCG25を過剰発現

は，1%（w / v）スクロース・0.8%（w / v）寒天と，した植物個体では水利用効率が向上する結果が得られ記載されているABA濃度を含むMS培地上で種子を発ています7）．大豆Glycine maxは，最も重要なマメ科穀芽させ，植物生育チャンバー（トミー精工）において，物の一つです．本研究では，AtABCG25に対応する大22℃で16時間明期/ 8時間暗期サイクルで生育させま豆の相同因子をクローニングして機能を調べました．

した．

モデル植物で得られた結果を実用植物に応用して，耐性と生長をバランス良く制御できる技術の創生を目指結果と考察します．
大豆におけるAtABCG25のオーソログ

方法

大豆のオーソログを選別するために，AtABCG25（662ア ミ ノ 酸，NCBI ID：NP̲565030.1） と 相 同 性

Sf9昆虫培養細胞を用いたGmABCG25輸送アッセイが高いたん白質配列を検索しました．BLASTサーチ

人 工 合 成 し たGmABCG25 ORFを，GATEWAY（NCBI）により，ABC transporter G family member

システムのエントリープラスミドに挿入しました

25 [Glycine max]（NCBI ID：XP̲003535544.1） と 登（pENTR-GmABCG25 ）．次に，以前に記載した方法8）

録されているたん白質配列が，最も相同性の高いもで，バキュロウイルス発現システム（Invitrogen）をのとしてヒットしました．たん白質配列のアライメ

使用してSpodoptera frugiperda （Sf）9細胞で発現さントにより，AtABCG25と比較して，同一アミノ酸18

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Vol. 23（2020）

が415/670 aa（62%），機能類似アミノ酸が510/670 aa低いことが分かりました（Fig. 2）．また，この減少（76%）の相同性を示しました（Fig. 1）．ここでは，レベルはAtABCG25を発現するSf9昆虫細胞と同程度

この大豆のたん白質をGmABCG25と記述します．のレベルでした．この結果は，ABA膜輸送に関して
GmABCG25がAtABCG25と同様のたん白質機能を持

ABA輸送アッセイにおけるGmABCG25の機能分析
GmABCG25とAtABCG25の 機 能 的 相 同 性 を 確 認

ち，細胞内から細胞外への排出活性をもつことを示唆しています．

す る た め に， 先 ずGmABCG25に 対 応 し た 遺 伝 子 配
列 を ク ロ ー ニ ン グ し ま し た． 次 に，GmABCG25がGmABCG25を発現させたシロイヌナズナにおけるAtABCG25と同様のABA輸送活性を有するか調べる

ABA感受性た め に，Sf9昆 虫 培 養 細 胞 でGmABCG25 を 発 現 さ せ次に，植物内でのGmABCG25の機能を調べるためました．細胞培養液にABAアイソトープを添加したに，シロイヌナズナ植物体に導入してGmABCG25の後，一定時間インキュベートし，細胞のみを残すよ発現作用を調べました．以前に，AtABCG25をシロイうにろ過しました．ろ過後の細胞内に残った放射性ヌナズナで過剰発現させた際，培地に加えたABAにカウントを測定したところ，GmABCG25を発現した

対して有意に非感受性を示し，排出活性をもつABA

Sf9昆虫細胞は，空のベクターを含む対照細胞よりも輸送体であるという結果をサポートしました3）．こFig. 1. Protein sequence alignment of AtABCG25 and GmABCG25. A result of the BLAST search is shown.
The upper sequence is from AtABCG25, the bottom sequence is from GmABCG25, and middle sequenceis conserved and similar amino acids.
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Vol. 23（2020）19こでは，先ず35S :: GmABCG25 ベクターを有する形(A)

質転換シロイヌナズナ植物を作製しました．そして，

ABA

ABA応答性をテストするために，2つの独立した形質転換系統について，発芽後のABA感受性を確認しました．その結果，GmABCG25 を導入した形質転換系
Survey theradioactivity

GmABCG25

統では，ABA感受性が大幅に減少しました（Fig. 3）．
以上の結果から，大豆のGmABCG25はシロイヌナズ
ナのAtABCG25と同様の，植物内での生理的機能をもつことが示唆されました．

(B)
900

H-DPM

800

Cont

700
600
500
400300

Gm-1

200
1000ContGmAtGm-2Fig. 2. Transport assay of ABA efflux activity inGmABCG25 -expressing Sf9 culture cells. (A)The transport assay is illustrated. GmABCG25
was expressed in Sf9 cells using a baculovirus
expression system. Isotope solution of [3H]
abscisic acid was added, and cells werefiltrated. The radioactivity was counted
by a liquid scintillation counter. (B) ABA
efflux activity was measured in Sf9 culturecells containing GmABCG25 vector (Gm),
AtABCG25 vector (At), and empty vector(Cont) after 16 minutes incubation with isotopelabeled ABA. Each bar represents the mean
± SD (n = 4). H-DPM, 3H-disintegrations perminute.

20

ABA 0 μM

ABA 0.5 μM

ABA 1.0 μM

Fig. 3. Post-germinative growth of GmABCG25 expressing Arabidopsis plants under ABA
treatment. Seedlings of controls (Cont) andtwo transgenic lines (Gm-1 and Gm-2) bearing
the 35S :: GmABCG25 transgene were grownfor 14 days in ABA concentrations (0, 0.5, and1.0μM).

大豆たん白質研究Vol. 23（2020）

要約

食糧として豆類の中で最も重要な大豆の生産を維持するために，植物科学の知見を利用し役立てることは有力な手法の一つです．例えば，気候変動下では耕作地が影響を受け，また乾燥地帯では水の利用がこれまで以上に切実な問題となっています．本研究では，生体膜機能を活用することで，植物に個体レベルでの水利用効率向上という新しい有用形質を付与し，地球環境変動下においても作物の生産を安定維持することを目的としています．これまでもストレス耐性のような有用形質を付与する試みが行われてきましたが，植物体の生育そのものが阻害されてしまう副作用が起こることが多く，耐性と生長のバランスが問題となっていました．本研究では，植物個体として水利用効率を高めることを指標に，生長と反応のバランスを重視することで問題の解決を目指します．特に，膜輸送体に注目することで，これまでモデル植物で得られている結果を活用します．具体的には，モデル植物において気孔開閉を制御する植物ホルモンの膜輸送体を植物に導入することで，植物体の水利用効率が向上する結果が得られています．この成果を利用して，まず大豆のオーソログに相当する遺伝子をクローニングしました．次に，この大豆オーソログ因子が，モデル植物と同様のホルモン輸送活性をもつことを確かめました．さらに，モデル植物へ導入することで植物体への効果について調べ，植物体内での機能についても相同性があることが分かりました．生体内での活性物質の輸送を調節して，耐性と生長をバランス良く制御できる技術の創生を目指しています．

文献1）Kuromori T, Seo M and Shinozaki K (2018): ABA

5）Hwang JU, Song WY, Hong D, Ko D, Yamaoka Y,Transport and Plant Water Stress Responses.

Jang S, Yim S, Lee E, Khare D, Kim K, Palmgren

Trends Plant Sci, 23, 513-522.

M, Yoon HS, Martinoia E and Lee Y (2016): Plant

2）Boursiac Y, Leran S, Corratge-Faillie C, Gojon A,Krouk G and Lacombe B (2013): ABA transportand transporters. Trends Plant Sci, 18, 325-333.
3）Kuromori T, Miyaji T, Yabuuchi H, Shimizu

ABC transporters enable many unique aspects ofa terrestrial plant's lifestyle. Mol Plant, 9, 338-355.
6）D o T H T , M a r t i n o i a E a n d L e e Y ( 2 0 1 8 ) :Functions of ABC transporters in plant growth

H, Sugimoto E, Kamiya A, Moriyama Y andand development. Curr Opin Plant Biol, 41, 32-38.

Shinozaki K (2010): ABC transporter AtABCG257）Kuromori T, Fujita M, Urano K, Tanabata

is involved in abscisic acid transport andT, Sugimoto E and Shinozaki K (2016):

responses. Proc Natl Acad Sci U S A, 107, 2361-

Overexpression of AtABCG25 enhances the2366.

abscisic acid signal in guard cells and improves

4）Sánchez-Fernández R, Davies TG, Coleman JO

plant water use eﬃciency. Plant Sci, 251, 75-81.

and Rea PA (2001): The Arabidopsis thaliana8）Kuromori T, Sugimoto E and Shinozaki K (2014):

ABC protein superfamily, a complete inventory.

Intertissue signal transfer of abscisic acid fromJ Biol Chem, 276, 30231-30244.

vascular cells to guard cells. Plant Physiol, 164,1587-1592.

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