株式会社 日立製作所

若手研究者支援枠株式会社 日立製作所

更なる培養の品質向上のため、培養自動化の次のステップとして、培養状態をモニタリングすることで培養過程においてリ事業実施期間：開始 平成31年4月1日〜終了 令和2年3月31日

申請者役職・氏名

基礎研究センタ 研究員

斉藤洸

研究 ・ 事業名

培養評価法開発に向けたエクソソームの解析
交付申請内容研究・事業により期待される効果

アルタイムでフィードバック制御出来る、インテリジェント自動日立製作所は、平成29年に再生医療の研究開発拠点を神培養システムの開発を目指している。再生医療等製品の製造

戸医療産業都市に開設し、オープンイノベーションによる再生

では、外部からの菌の混入や細胞のクロスコンタミネーション

医療用細胞製造のための閉鎖系自動培養技術の開発に取りのリスクが低い、完全閉鎖系の自動培養装置を使用することが組んでおり、平成31年3月には製品化を実現した。申請者らは求められる。完全閉鎖系で培養状態をモニタリングするためにこれまで、iPS細胞製造の商用化で世界をリードする大日本住は非侵襲で培養状態を計測する必要があるが、有効なモニタ

友製薬株式会社、ならびにiPS細胞を用いた再生医療実用化

リング手法は確立されていないのが現状である。の研究で世界をリードする京都大学iPS細胞研究所の髙橋淳

そこで、申請者らは従来廃液として処理しており未活用で教授との共同研究で、iPS細胞を用いたパーキンソン病治療法あった培養上清に着目し、培養上清中に含まれる、細胞が分泌の実用化に向けたドパミン神経前駆細胞の大量製造技術を開する小胞であるエクソソームをバイオマーカーとした新規培養

発、またその安全性を評価する手法を確立してきた。培養モニ評価技術の開発に着手することにした。エクソソームは放出元タリングは、培養自動化の次の課題である。非侵襲での細胞モ細胞の情報となる物質を多く含むことから、培養状態を正確にニタリング技術は、安全で高品質な細胞を製造する上で、再生反映する優れた指標として活用できることが予想されるが、エ医療分野における基盤技術となり得る。その中でもエクソソー

クソソームを指標として培養を評価した例は現在のところ存在

ムはモニタリング指標の有力な候補であると期待される。
日立しない。近年、エクソソーム内に存在するmiRNAが、がんの転製作所は引き続き、キーオピニオンリーダーである髙橋淳教授

研究·事業の目的及び意義

研究・事業の方法及び手段

再生医療向けの、移植に適した安全な細胞の製造にはク

これまで日立製作所で開発してきた自動培養装置を初めとし移に関わることが明らかとなり、miRNAが生体内における、がおよび大日本住友製薬株式会社(令和元年当時、現住友ファー

リーンルーム内での専門技術者による手技培養が欠かせないて、自動培養装置は、あらかじめ決定した培養条件において培んのバイオマーカーとして着目を集めている。本研究ではエクマ株式会社)と共同で、培養モニタリング技術に関する研究開が、設備の維持管理費や人件費が高額であり、再生医療の普養を行うシステムとなっている。細胞の品質評価は培養後に行ソソーム内のmiRNAにとどまらず、培養上清中エクソソームの発を神戸医療産業都市にて進めている。国内最大のバイオメ及を妨げている。
また、細胞品質が作業者のスキルに依存するわれ、培養へのリアルタイムのフィードバックはできない。更な粒子数密度および粒径分布、エクソソーム構成mRNAおよびディカルクラスター発で次世代の再生医療分野の基盤技術をため、品質の担保が重要である。
さらに、人が作業することによる培養の品質向上を目的として培養へのフィードバックを行うタンパク質等幅広く解析することが特徴である。
これにより、真開発することにより、広く包括的に利用される技術に成長できる生物学的汚染のリスクもある。
これらの課題を解決するため、ためには、非侵襲で培養状態をモニタリングする技術が不可欠に有効な培養評価指標を見出し、閉鎖系自動培養技術に適用ると期待される。

日立製作所では、神戸医療産業都市におけるオープンイノベーであるが、現在十分に有効な手法は知られていない。
そこで、培可能な、インラインでのモニタリングに適した指標を特定する。

ションにより、再生医療用細胞製造のための閉鎖系自動培養養上清中に含まれるエクソソームをバイオマーカーとした新規技術の開発に取り組んできた。

培養評価技術を開発することにした。エクソソームは放出元細

申請者らはこれまで国立研究開発法人日本医療研究開発

胞の情報となる物質を多く含むことから、培養状態を正確に反機構の2015〜2018年度の委託事業「再生医療の産業化に映する優れた指標として活用できることが期待される。本研究向けた評価基盤技術開発事業（再生医療等の産業化に向けたでは、エクソソーム由来の指標候補から実際の培養で機能する評価手法等の開発）」を受け、大日本住友製薬株式会社(令和モニタリング指標を決定する。具体的には、エクソソームの培養元年当時、現住友ファーマ株式会社)ならびに京都大学と共同

上清中の粒子数密度や形態、RNAやタンパク質等のエクソソーで、iPS細胞を用いたパーキンソン病治療法の実用化に向けた

ム構成因子等の指標候補について、iPS細胞の増殖過程、ならドパミン神経前駆細胞の大量製造技術を開発、またその安全びにドパミン神経前駆細胞への分化誘導過程において、細胞増性を評価する手法を確立してきた。本委託事業では、
日立製作

殖や分化状態等の細胞状態を反映するかどうかを検証する。

所が開発した閉鎖系自動培養装置iACE1（図1）を用いて、従手段としては、電気抵抗ナノパルス法による培養上清中エク来の手技培養から工業生産レベルのスケールアップを行った。

ソソームの粒子密度および粒径分布の解析、定量RT-PCRに

本研究では、閉鎖系自動培養装置を用いた細胞製造のさらよるマーカー候補遺伝子の発現解析、ELISA法によるマーなる安定化・品質向上を目的に、非侵襲で細胞状態を正確に医療グレードの細胞製造を可能にする単回使用の完全閉鎖系モジュールを採用。同時に10億個の細胞を大量培養でき、全対象疾患で共通基盤工程であるiPS細胞の増幅および分化培養が可能な汎用装置。
（※iACEは株式会社日立製作所の登録商標）

カー候補タンパク質の定量解析を実施する（図2）。

モニタリングすることを目指す。培養モニタリングは培養自動化の次の課題であり、安全で高品質な細胞を製造する上で、再生医療分野における基盤技術となり得る。具体的には、近年がん

1研究・事業の特徴（新規性、独自性等）のバイオマーカーとして着目を集める、細胞が放出する小胞で申請者らによるこれまでの研究開発により、自動培養装置をあるエクソソームを指標とした新規の培養評価手法の確立を用いたパーキンソン病向けドパミン神経前駆細胞の製造プロ目指す。本技術は再生医療等製品の製造に必要な自動培養技トコルの最適化を実現し、従来の手技培養と比較してiPS細胞術をさらに有用にするものであり、本技術の実装により広く包の増殖率向上の可能性があることが明らかになるなど、従来括的に利用可能になることが期待される。

法を超える効率・品質で細胞製造が可能になりつつある。

助成金成果抄録集

助成金成果抄録集2

株式会社 日立製作所

実績報告内容3〜4個程度しか観察されなかった（図1）。また、超遠心分離子であるNANOGとOCT4および腹側マーカーのCORIN、中が示された。そこで、iPS細胞からドパミン神経前駆細胞への脳マーカーのLMX1Aの発現量をマイクロアレイデータから抽分化誘導過程において、代表的なテトラスパニンタンパク質の出し、分化前後において細胞とエクソソームの間で比較した。

一つであるCD63の培養上清中における発現量を、ELISA法

その結果、未分化マーカーであるNANOGとOCT4は分化後により詳細に解析することにした。細胞分化に必要不可欠な分に細胞中では発現量が大きく減少したのに対し、エクソソーム化誘導因子であるFGF8欠乏条件下による培養と通常条件の法やポリマー沈殿法では様々な形態・粒径のものが観察され中ではその発現量はほとんど変化しなかった（図3）。腹側マー間で培養上清中CD63の発現量の比較定量を実施し、マーたが、PSアフィニティ法では数が少ないものの、ほぼ均一の形カーのCORINおよび中脳マーカーのLMX1Aの発現量は細胞カー候補としての可能性を検証した。その結果を図５に示す。

従来の自動培養装置は、あらかじめ決定した培養条件にお態・粒径のものが観察された（図1）。本手法は、エクソソーム表では分化後は大きくその発現量が増加したが、エクソソーム中通常培養条件ではday7をピークとした一過的な発現誘導がいて培養を行うシステムとなっている。細胞の品質評価は培養面に存在するフォスファチジルセリンにカルシウム依存的に結ではほとんど発現量に変化が見られなかった（図3）。
このことみられたのに対し、F G F 8 欠 乏 条 件 下では 培 養 上 清 中の後に行われ、培養へのリアルタイムのフィードバックはできない。

合する物質を応用しているため、純度が高いエクソソームが濃から、細胞中とエクソソーム中では分化前後における各マー

CD63の発現量は全培養期間において通常培養条件と比較し更なる培養の品質向上を目的として培養へのフィードバックを縮されていると考えられる。PSアフィニティ法で観察されたエカー遺伝子発現量の変化が全く異なっており、エクソソーム中て低く推移し、day7における発現量は通常培養条件と比較し行うためには、非侵襲で培養状態をモニタリングする技術が不クソソームと思われる形態・粒径の顆粒が超遠心法でも多数で変化する新規マーカー遺伝子を探索する必要があることがて約40％程度低かった。
また、FGF8欠乏条件下では、分化誘可欠であるが、現在十分に有効な手法は知られていない。そこ観察されたため、超遠心法でエクソソームが多数回収できてい分かった。

導初期であるday3で既に通常培養条件よりも培養上清中ので、今まで廃液として処理しており未活用であった培養上清にると判断し、濃縮が必要な解析については超遠心法で濃縮し着目し、培養上清中に含まれるエクソソームをバイオマーカーたサンプルについて実施することにした。

研究・事業の内容及び目標達成状況とした新規培養評価技術を開発することにした。エクソソームは放出元細胞の情報となる物質を多く含むことから、培養状態CD63の発現量が50%以上低かった。以上の結果から、培養④エクソソーム由来タンパク質の発現解析
エクソソームを構成するタンパク質としてCD63をはじめと②電 気抵 抗ナノパルス法による培養上 清中エクソソームのするテトラスパニンタンパク質が知られている。iPS細胞からドしていると考えられ、分化効率の悪い培養を早期に発見できるモニタリング指標として有効であることが分かった。

を正確に反映する優れた指標として活用できることが期待さ

粒子数密度の解析

パミン神経前駆細胞への分化誘導過程で、これらテトラスパニれた。

iPS細胞の増殖過程で培養上清中のエクソソーム粒子数密ンタンパク質の発現量がどのように変化するかを検証するため

以上の結果から、iPS細胞の増殖過程においては培養上清

本研究では、エクソソーム由来の指標候補から実際の培養度がどのように変化するかを解析するために、iPS細胞の培養に、イムノブロットによる発現解析を行った。iPS細胞からドパ中エクソソームの粒子数密度を測定することによって増殖をモで機能するモニタリング指標を決定した。具体的には、エクソ過程で毎日培養液を回収し、培養上清中のエクソソーム粒子ミン神経前駆細胞への分化誘導過程（分化培養開始（day0）、ニタリング可能であること、iPS細胞からドパミン神経前駆細ソームの培養上清中の粒子数密度や形態、RNAやタンパク質数密度を電気抵抗ナノパルス法により定量した。
まず、9日間の分化途中（day8）、分化終了時点（day12））において培養上清胞への分化誘導工程においてはエクソソームマーカータンパク等のエクソソーム構成因子等の指標候補について、iPS細胞のiPS細胞増殖過程における増殖倍数の変化を図2aに示す。培を回収し、超遠心分離によるエクソソーム画分の単離を行い、質であるCD63の発現量が分化効率の悪い培養を早期に発見できるモニタリング指標として有効であることが分かった。

増殖過程、ならびにドパミン神経前駆細胞への分化誘導過程

養期間中iPS細胞は継時的に増加し、特に5日目以降指数関CD63とその他テトラスパニンタンパク質であるCD81およびにおいて、細胞増殖や分化状態等の細胞状態を反映するかど数的に増殖することから対数増殖期にあったと考えられる。次CD9の発現をイムノブロットブロットにより解析した。放出元うかを検証した。以下では各種エクソソーム解析のためのエクに、培養過程で毎日回収した培養上清10mlからエクソソーム細胞におけるこれらマーカータンパク質の発現を解析するためソソーム分離法の立上げ結果、およびエクソソームの粒子数密を超遠心法により100倍に濃縮し、電気抵抗ナノパルス法で粒に、細胞ライセートサンプルについても同様の解析を行った。細度およびエクソソームを構成するRNAやタンパク質についての子数密度を測定した結果を図2bに示す。播種後5日目までは胞ライセートのみに発現するネガティブコントロールとして、解析結果、ならびに特定できた指標候補のモニタリング指標と上清中エクソソームの粒子数密度はほとんど変化しなかった

βアクチンについても発現解析を行った。
その結果を図４に示す。

本研究により、培養上清中のエクソソームが細胞状態を反映しての有効性を検証した結果について以下に記述する。

が、5日目以降には指数関数的に増加した。細胞増殖をほぼ反βアクチンは細胞ライセートサンプルのみに発現がみられ、エクする優れたモニタリング指標となり得ることが明らかとなった。

映した結果となった。培養上清中エクソソーム粒子数密度が細ソソーム画分には発現がみられなかった。
この結果から、エク特に、エクソソームの粒子数密度およびエクソソームマーカー胞増殖を反映したことから、エクソソーム粒子数密度と細胞数ソソーム画分には細胞デブリ等コンタミネーションは無く、タンパク質であるCD63の発現量がモニタリング指標として有iPS細胞の培養上清中にはエクソソームが存在するが、電気の相関を解析した。結果を図2cに示す。播種後1日目から9日エクソソームが単離できていると考えられた。CD63はday8に効であることが示された。エクソソームを用いた自動培養装置

抵抗ナノパルス法等によってエクソソームを定量するには培養目まで全期間でエクソソーム粒子数密度と細胞数の相関係数おいて一過的な強い発現がみられた。CD81についてもCD63によるフィードバック制御の実現に向けて、エクソソーム粒子数上清そのままの状態では密度が低すぎて解析できず、100倍を算出した結果、0.94であり高い正の相関が認められた。
さら同様にエクソソームサンプルにおいてday8における一過的な密度のインラインでの測定技術および培養上清中タンパク質程度に濃縮する必要があった。そこで、エクソソームの分離・濃に、細胞増殖が指数関数的に起こる播種後5日目から9日目ま強い発現がみられた。CD9はエクソソームサンプルでday0にの簡便な検出技術の検討を開始する予定である。CD63以外縮法の立上げと検討を行うことにした。
すでに確立されているでにおいて同様に相関係数を算出した結果、相関係数は0.94おける発現がみられたが、その後のday8およびday12では発のエクソソーム由来遺伝子およびタンパク質については引き続代表的なエクソソーム濃縮方法である超遠心分離法、フォスであり高い正の相関が認められた。
これらの結果から、対数増現がみられなかった。以上の結果から、CD63、CD81、CD9等

きマーカー探索を行い、高い精度でのモニタリングに適した指

ファチジルセリン（PS）
アフィニティ法、ポリマー沈殿法の3手殖期にあるiPS細胞は培養上清中エクソソームの粒子数密度のテトラスパニンタンパク質は分化のステージに応じて発現量標の特定を引き続き行う予定である。

法を用いてiPS細胞の培養上清（播種後7日目）からエクソソーを測定することによって増殖をモニタリング可能であることがが変化することから、モニタリング指標として有効である可能

ムを精製し、透過型電子顕微鏡によりエクソソームの純度と視分かった。

性が考えられた。

①エクソソーム分離法の立上・検討

野あたりのエクソソーム数を検証した。培養上清10ml（1.0③定量RT-PCR等によるエクソソーム含有RNA（遺伝子）の解析

ティブ染色により処理した。その結果、超遠心分離法では視野

次に、細胞中においてマーカー遺伝子として知られている遺イムノブロットによる解析により、CD63、CD81、CD9等のあたりの粒子数が100個程度と多数観察されたのに対し、PS伝子がエクソソーム中でも細胞状態を反映するマーカーとしてテトラスパニンタンパク質が分化のステージに応じて発現量がアフィニティ法やポリマー沈殿法では視野あたりの粒子数が機能しているかどうかを検証するために、未分化マーカー遺伝変化することから、モニタリング指標として有効である可能性

助成金成果抄録集

今後の展開

今後、本技術を再生医療分野において広く包括的に利用される基盤技術に育て上げることにより、周辺企業・機関等との相乗効果を生み出しながら神戸医療産業都市の発展に寄与

10 cells相当）を使用し、各サンプルは酢酸ウランによるネガ
73

上 清 中の C D 6 3 の 発 現 量 は i P S 細 胞 の 分 化 状 態 を反 映⑤得られたエクソソーム指標候補の有効性検証できることが期待される。
本成果の一部は以下学術論文として発表し、
日本生物工学会2022年度（第30回）論文賞を受賞した。

助成金成果抄録集

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株式会社 日立製作所
・Saito H, Kato M, Hirai K, Kiyama M, Ohyama K,Hanzawa H, Nakane A, Sekiya S, Yoshida K, Kishino
A, Tsuchida A, Kimura T, Takahashi J and Takeda S.
Analysis of extracellular vesicles as a potential
monitoring index for differentiation of neural lineage
cells derived from iPS cells. Journal of Bioscienceand Bioengineering 132(4), 381-389 (2021).

図3. iPS細胞からドパミン神経前駆細胞への分化誘導過程において、分化前(day0)および分化後(day13)の時点における未分化マーカー遺伝子NANOGおよびOCT4、分化マーカーCORINおよびLMX1Aの発現量をマイクロアレイ解析により定量した。

図1. 超遠心法（ultracentrifuge）、PSアフィニティ法（PS afﬁnity）、ポリマー沈殿法（polymer precipitation）を用いてiPS細胞培養上清からエクソソームを濃縮し、透過型電子顕微鏡で観察した。

図4. iPS細胞からドパミン神経前駆細胞への分化誘導過程において、分化前(day0)および分化途中(day8)、分化後(day13)の時点におけるエクソソームマーカータンパク質CD63、CD81、CD9および細胞のみに発現するコントロールβ-Actinの培養上清中エクソソームでの発現をイムノブロットにより解析した。比較対象として、細胞ライセートにおける発現も同様に解析した。PC：陽性コントロール（β-Actin、CD63、CD81：HCT116 exosome solution；CD9：293T Lysate sc-113009)。

図2. (a) iPS細胞を9日間培養し、毎日細胞数をカウントして播種細胞数に対する増殖倍数を算出した。(b) iPS細胞の培養上清を毎日回収し、超遠心法による濃縮の後に電気抵抗ナノパルス法によりエクソソーム粒子数密度を定量した。(c) 細胞数とエクソソーム粒子数

図5. iPS細胞からドパミン神経前駆細胞への分化誘導過程において、培養上清中エクソソームマーカータンパク質CD63の発現量を密度の相関を解析した。

ELISA法により経時的に定量した。分化誘導効率が低い培養例として、分化誘導因子FGF8欠乏条件（-FGF8）で分化培養を行い、通常培養条件（control）との比較を行った。

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助成金成果抄録集

助成金成果抄録集6