22-05

取扱説明書(KFX-101)

Code No. KFX-101
Code No. KFX-101X5
Code No. KFX-101X10
保存温度 －２０℃
高成功率 PCR 酵素

KOD FX
本製品は、KOD DNA Polymerase をベースに開発された高性能 PCR 試薬です。優れた｢増幅成功率｣、
「伸長性」
、
「増
幅効率」を示し、幅広い PCR において確実な結果を期待できます。また、本酵素には、Polymerase 活性と 3’→5’Exonuclease 活性を抑える 2 種類のモノクローナル抗体が混合されており､簡便に特異性の高い Hot start PCR を行うことができます。
特長
・ 高い増幅成功率(弊社 No.1)
GC リッチターゲットや細胞懸濁液などのクルードサンプルなどからも高い成功率で増幅が可能です。
・ 抜群の増幅効率
高い収量が得られるため、少ない鋳型量からでも増幅が可能です。
・ 優れた伸長性
λDNA を鋳型に 40kb、ヒトゲノム DNA を鋳型に 24kb、cDNA を鋳型に 13.5kb の増幅を確認しています。
・ ホットスタートで PCR パフォーマンス向上
2 種類の抗 KOD 抗体を酵素に混合することによって、非特異反応の原因となる常温下での Polymerase 活性と3'→5' Exonuclease 活性を抑制しています。抗体は PCR の最初の変性ステップで失活し、増幅反応には影響を及ぼしません。
１． 内容物KFX-101(200U×1 本)
KOD FX (1.0 U/μL)

200μL×1 本

2× PCR Buffer for KOD FX*

1.7mL×3 本

2mM dNTPs

KFX-101X5

KFX-101X10(KFX-101)×5(KFX-101)×10

1mL×2 本* 2× PCR Buffer for KOD FX は、-20℃保存で液状です（凍結しません）。-20℃以下で保存 した場合、凍結することがありますが、品質上問題なくご使用になれます。ご使用時には、融解後、良く攪拌してからご使用ください。
２． 安全上の注意
本製品は､研究用試薬です。診断および臨床検査用試薬として使用しないでください。また､本製品の使用にあたっては､実験室での一般の注意事項を厳守し､安全に留意してください。関係する実験において､人体に有害な試薬を扱う場合も予想されます。各試薬に添付されている注意書き､機器･器具に添付されている取扱説明書の指示を順守し､必要に応じて適切な保護具をご使用いただきますようお願いいたします。
３． 性能･品質
KOD FX は､各ロットにおいて､ヒトゲノム DNA を鋳型として、tPA 遺伝子領域 24kb の増幅ができることを確認して出荷しております。
（ tPA: tissue-type plasminogen activator ）＜製品の内容・技術に関するお問合せ＞
東洋紡（株）バイオプロダクト営業部 テクニカルライン
TEL 06-6348-3888 FAX 06-6348-3833
開設時間 9:00~12:00, 13:00~17:00 (土日祝日、休日を除く)
E-mail: tech_osaka@toyobo.jp
Ａ３７１２Ｋ[URL] https://lifescience.toyobo.co.jp/-1-

取扱説明書(KFX-101)
４． PCR プロトコール（１） PCR 反応液の調製
反応液を調製する前に KOD FX（酵素液）以外の各試薬を十分攪拌してからご使用ください。凍結している
場合は完全に融解してください｡
使用量
2x PCR buffer for KOD FX
2mM dNTPs
10pmol /μL Primer #1
10pmol /μL Primer #2

25 μL
10 μL
1.5 μL
1.5 μL

Template DNA

X μL

Autoclaved, distilled water
KOD FX (1.0U/μL)（ 11-X ）μL
1 μL
Total

最終濃度
1×
0.4mM each
0.3μM
0.3μM
Genomic DNA ～200 ng / 50μL
Plasmid DNA ～50 ng / 50μL
cDNA ～200 ng （RNA 相当量) / 50μL
1.0 U / 50μL

50 μL

・全ての液を添加した後、反応液を十分混合してからサーマルサイクラーにセットしてください。
（２） PCR サイクル条件
通常は以下の 2 ステップのサイクルを行ってください。プライマーの Tm 値が 73℃未満の場合、あるいは、
2 ステップのサイクルで増幅が見られない場合には､3 ステップのサイクルをお試しください。また、10kb 以
上のターゲットを増幅する Long PCR においてエキストラバンドあるいはスメアが認められた場合には、ス
テップダウン PCR をお試しください。
2ステップ
Predenature :Denature :Extension :3ステップ
94℃, 2min.
98℃, 10sec.
68℃, 1min. /kb

25～40
cyclesPredenature :Denature :Annealing :Extension :94℃, 2min.
98℃,10sec.
(Tm-5)℃, 30sec.
68℃, 1min. /kb

25～40
cycles

ステップダウン
Predenature : 94℃，2min.
Denature :98℃，10sec.
Extension :74℃，1min. /kb
Denature :98℃，10sec.
Extension : 72℃，1min. /kb
Denature :98℃，10sec.
Extension : 70℃，1min. /kb
Denature :98℃，10sec.
Extension : 68℃，1min. /kb
Extension : 68℃，7min.

5 cycles5 cycles5 cycles15 ～ 25
cycles＜製品の内容・技術に関するお問合せ＞
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開設時間 9:00~12:00, 13:00~17:00 (土日祝日、休日を除く)
E-mail: tech_osaka@toyobo.jp[URL] https://lifescience.toyobo.co.jp/-2-

取扱説明書(KFX-101)
・ 伸長時間(Extension)は､ターゲット鎖長1kb あたり 1min.で設定してください。ターゲット鎖長1kb あたり
30sec.で設定してもほとんどの場合増幅が得られますが、増幅量や増幅の確実性が低下する場合があります（P.9 検討例3ご参照）。
・ 本製品は非常に優れた増幅効率を有しているため、通常25～30サイクルで十分な増幅が得られます。ターゲットのコピー数が少ないと予想される場合や10kbを超えるLong PCRでは、30～40サイクルでお試しください。
５． PCR をうまく行うために（１） 反応チューブはできるだけ thin-wall タイプのものをご使用ください。また､PCR 反応液は total 50μL にすることをお勧めします。
（２） 滅菌水､プライマーは事前に小分け分注を行って保存し､都度使い切りにすることをお勧めいたします。
（３） dNTPs は必ず本製品添付のもの､あるいは弊社別売の｢dNTPs Mixture(2mM)｣(Code No.:NTP-201)をご使用ください。
（４） プライマーは GC 含量に偏りのない 22~35mer 程度(Tm 値>60℃)のものをご使用ください。また、分子内二次構造や､プライマーダイマーの形成が起こらないように注意して設計してください。
（５） 長鎖ターゲットを増幅するLong PCR では､できるだけプライマー設計ソフトを利用し、25~35mer 程度で、Tm 値が 65℃以上のプライマーを設計ください。また、プライマーの 3’端領域が GC リッチにならないようにご注意ください。
（６） テンプレート DNA の長さや純度は PCR の結果に大きく影響します。テンプレート DNA の量に余裕のある場合は､事前に電気泳動して品質を確認することをお勧めします。
弊社では、最近接塩基対法（Nearest Neighbor method）に基づく Tm 計算プログラムを公開しています｡弊社のウェブページ (https://lifescience.toyobo.co.jp/user_data/pcr_tm.php) からダウンロードしてご利用になれます。

６． PCR 産物のクローニングについて（１） 本製品で増幅した PCR 産物の末端形状は､blunt end(平滑末端)になっています。従って、PCR 産物をクローニングする場合には､必要によりリン酸化を行った後、blunt end を利用したクローニングを行ってください。
また､TAクローニングを行いたい場合には、弊社KOD / KOD-Plus- / KOD FX用TAクローニングキットTArgetTM
Clone -Plus-(Code No.:TAK-201)を用いることにより、簡便に TA クローニングを行うことができます。
（２） 本製品で増幅した PCR 産物を制限酵素にて処理し、その突出末端を利用してクローニングを行う場合には、制限酵素処理前に増幅産物の精製を行ってください。KOD FX(DNA Polymerase)が残存している場合、本酵素の持つ 3’→5’ Exonuclease 活性により制限酵素処理中に突出末端が削られる可能性があります。増幅産物の精製は、フェノール/クロロホルム処理を行った後、エタノール沈殿を行うか、弊社の磁性ビーズを利用した DNA 精製キット MagExtractor TM -PCR & Gel Clean up-(Code No.:NPK-601)を利用すると便利です。

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取扱説明書(KFX-101)
７． 性能データ（１） 増幅成功率（GC rich ターゲット、クルードサンプル）■ GC rich ターゲットの増幅
KOD FX では、他社 GC rich 対応 PCR 試薬が増幅できないターゲットでも増幅が可能でした。

●ヒト TGF-β2.3kb(GC含量約70%)
M1●ヒト IGF2R遺伝子[NM_000876] 8.9kb(GC含量約90%の領域を含むmRNA)

1 2 3 4 5 6 7 M2

M1

1 2 3 4 5 6 M2

M1：1kb DNA ﾗﾀﾞｰ
1： KOD FX
2： KOD -Plus3： KOD -Plus-+5% DMSO
4： A社酵素
5： B社酵素
6： C社酵素
7： Taq DNA Pol.
M2：λ/ Hind III digest
鋳型：ヒトゲノムDNA10ng / 50μｌ反応系

M1：1kb DNA ﾗﾀﾞｰ
1： KOD FX
2： A社酵素
3: D社酵素
4: E社GCrich対応酵素
5: F社GCrich対応酵素
6: G社GCrich対応酵素
M2：λ/ Hind III digest
鋳型：ヒトcDNA（HeLa Total RNA50ng相当 ）/ 50μｌ反応系■ 全血をサンプルとしたダイレクト PCR
KOD FX では、全血をサンプル（鋳型）とした場合でも、8.5kb のターゲットの増幅が可能でした。
M1

1 2 3 M2
鋳型：ヒト全血2μl / 50μｌ反応系
M1：1kb DNA ﾗﾀﾞｰ
1： β-globin 1.3kb
2： β-globin 3.6kb
3： β-globin 8.5kb
M2：λ/ Hind III digest（２） 増幅効率
KOD FX では、他社 PCR 酵素を大幅に上回る収量が得られ、少ない鋳型量からでも増幅が可能でした。

KOD FX

KOD -Plus-

A社酵素

B社酵素

C社酵素

Taq DNA Pol.

M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M

鋳型：ヒトゲノムDNA
1：鋳型量 0.1ng / 50μｌ反応系
2：
1 ng
3：
10 ng
4：
100 ngターゲット：β-globin 2.8kb

PCRサイクル条件：
94℃ 2min.
98℃ 10sec.
30 cycles
68℃ 3min.

*他社酵素については、製品添付のﾌﾟﾛﾄｺｰﾙに従い30ｻｲｸﾙにて実施しました。

M:1kb DNA ラダー＜製品の内容・技術に関するお問合せ＞
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取扱説明書(KFX-101)（３） 伸長性（増幅可能鎖長）
KOD FX では、λDNA を鋳型に 40kb、ヒトゲノム DNA を鋳型に 24kb、cDNA を鋳型に 13.5kb の増幅が可能でした。
●Template:λDNA
M1

1●Template: ヒトゲノムDNA

2 3 4 5 M2M1

1 2 3 4 5 M2

鋳型：λDNA
10ng / 50μｌ反応系

鋳型：ヒトゲノムDNA
50～200ng / 50μｌ反応系

M1：1kb DNA ﾗﾀﾞｰ
1： 5kb2： 10kb
3： 20kb
4： 30kb
5： 40kb
M2：λ/ Hind III digest

M1：1kb DNA ﾗﾀﾞｰ
1： β-globin 1.3kb
2： β-globin 3.6kb
3： β-globin 8.5kb
4： β-globin 17.5kb
5： ｔPA
24.0kb
M2：λ/ Hind III digest●Template:逆転写反応液（cDNA）
M1

1 2 3 M2
鋳型：逆転写反応液（ヒトｃDNA）
total RNA100ng相当 / 50μｌ反応系
M1：1kb DNA ﾗﾀﾞｰ
1： Homo sapiens polymerase (DNA directed), epsilon [NM_006231] 6.8kb
2： Homo sapiens insulin-like growth factor 2 receptor [NM_000876] 8.9kb
3： Homo sapiens dystrophin [NM_004006] 13.5kb
M2：λ/ Hind III digest（４） 正確性
ヒトゲノム DNA を鋳型にβ-globin 領域 2.4kb の増幅を行い、PCR 産物を TArget CloneTM -Plus-(CodeNo.:TAK-201)を用いて TA クローニング後、96 クローンをピックしてシーケンシングを行い、配列の確認を行いました。その結果、KOD FX の PCR エラーによるミス塩基の取り込み頻度（エラー率）は、実際にシーケンシングにて解析した 144,535 塩基中、わずか 19 塩基でした。このエラー率は、Taq DNA Polymerase や
他社 Long PCR 用酵素の約 10 倍優れている値です。
PCRエ ラー率(100,000塩基あたりのエ ラー個数）
KOD -Pl us KODFX
FX
KOD
Pf u DN A Pol y mera s e
A 社 Long PCR 用試薬
Ta q DN A Pol y mera s e
0

20

40

60

80

100

120

140

160

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取扱説明書(KFX-101)
８． クルードサンプルを鋳型とした使用例
本製品は、様々なクルードサンプルに対しても高い成功率で増幅が可能です。例えば、全血、培養細胞、酵母な
どは、DNA を抽出することなく直接 PCR 反応液に加えるだけで十分に増幅が得られます。また、マウステールや植物組織の場合は、簡便な方法で調製したライセートで確実に増幅産物が得られます。以下にそのプロトコールをお示しします。
（１） 全血、培養細胞、酵母など●方法
PCR 反応液 50μL に以下の量のサンプルを直接添加し、PCR を実施します。
・全血…1～4μL
・培養細胞…～2ｘ104 cells（例：RPMI/10%FCS に懸濁した 1ｘ104 cells /μL の細胞懸濁液を 2μL）
・酵母…チップの先についた少量（ｺﾛﾆｰﾀﾞｲﾚｸﾄ PCR。酵素処理による酵母細胞壁の溶解は不要です。
）●実施例

1 2 3 4 5 6 M
鋳型：
ターゲット：

Jurkat細胞 2×104cells / 50μｌ反応系
β-globin 領域1.3kb、3.6kb、8.5kb

8.5kb
3.6kb
1.3kb
1,2：β-globin 1.3kb
3,4：
3.6kb
5,6：
8.5kb
M：λ/ Hind III digest（２） マウステールなど●方法
以下の方法（アルカリ溶解法）にてライセートを調製し、PCR に供します。
マウステール（3mm 程度）↓←50mM NaOH 180μL↓ Vortex にて良く攪拌↓ 95℃, 10min.インキュベート↓←1M Tris-HCl (pH8.0) 20μL
↓ Vortex にて良く攪拌↓ 遠心 12,000rpm, 10min.
上清（ライセート） ⇒ 0.5～2μL を PCR 反応液 50μL に添加※本方法ではマウステールは完全には溶解しません。
※熱アルカリ溶液の取り扱いに十分ご注意ください。
※Proteinase K を用いて調製されたライセートを直接 PCR に用いることはお勧めできません。
Proteinase K と SDS が PCR 反応に悪影響を及ぼす可能性がありますので、ご使用の場合、精製が必要となります。ライセートから直接 PCR されたい場合は、上記の「アルカリ溶解法」をお勧めします。

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取扱説明書(KFX-101)●実施例
KOD FX
M

A社酵素
M

B社酵素
M

M

2.6 kb

M: 1kb DNA ﾗﾀﾞｰ
鋳型:
ターゲット:

マウステールライセート0.5μl / 50μｌ Reaction
Mouse membrane glycoprotein (Thy-1) gene <M10246> 2.6kb（３） 植物組織など●方法
以下の方法（ワンステップ法）にてライセートを調製し、PCR に供します。
植物葉（3mm 角程度 1 枚）、精米（1 粒）↓←溶解 buffer 100μL↓ Vortex にて良く攪拌↓ 95℃, 10min.インキュベート↓ Vortex にて良く攪拌
上清（ライセート） ⇒ 1μL を PCR 反応液 50μL に添加

溶解 buffer :100mM Tris-HCl (pH9.5)
1M KCl10mM EDTA※本方法では植物組織は完全には溶解しません。
※参考文献：Biotechniques. 19: 394 (1995)●実施例
KOD FX

A社酵素

B社酵素

1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5
1: ﾄﾏﾄ葉2: ﾀﾊﾞｺ葉
3: ｲﾈ葉
4: 精米
5: ｲﾈ精製ｹﾞﾉﾑDNA
M: 1kb DNA ﾗﾀﾞｰ

1.3kb

鋳型:
ターゲット:

各植物組織ライセート1μl あるいは 精製DNA 10ng / 50μｌ Reaction
rbcL(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit gene) 1.3kb

上記以外にも実施例を弊社ウエブサイトの製品ページに掲載しております。ご確認ください。
https://lifescience.toyobo.co.jp/detail/detail.php?product_detail_id=164＜製品の内容・技術に関するお問合せ＞
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取扱説明書(KFX-101)
９． トラブルシューティング
トラブル

考えられる要因

対策

サイクル

３ステップのサイクルで行う。アニーリング温度を
Tm-10℃程度まで下げる。
サイクル数を 2~5 サイクル程度増やす。
＜検討例 1 ご参照＞

プライマー

増幅産物が見られない。
増幅量が少ない。

プライマーの品質を確認する。→再調製・再合成する。
プライマーを再設計し直す。

鋳型ＤＮＡの純度・量

鋳型ＤＮＡの純度を確認する（特に RNA 等が多量にコンタミしていないかを確認する）。→鋳型 DNA の精製度を上げる。
適量の鋳型 DNA を使用する。＜検討例 3 ご参照＞
サイクル数を 2~5 サイクル程度減らす。
＜検討例 1 ご参照＞

サイクル

スメア、エキストラバンドが見られる。

ステップダウン PCR を行う。＜検討例 2 ご参照＞
プライマー

プライマーの品質を確認する。→再調製・再合成する。
プライマーを再設計し直す。

鋳型ＤＮＡ量適量の鋳型 DNA を使用する。＜検討例 3 ご参照＞

酵素量

酵素使用量を 0.5~0.8U/ 50μL 反応系程度に下げる。

■検討例 1：サイクル条件の検討（その 1）① ② ③ M

鋳型：逆転写反応液（ヒトｃDNA） Human Adult Skeletal Muscle total RNA 100ng相当 / 50μｌ反応系
ターゲット：Homo sapiens dystrophin [NM_004006] 13.5kb
PCRサイクル条件：
94℃ 2min.
98℃ 10sec.
①30 cycles ② 35 cycles ③ 40 cycles
68℃ 14min.
M：λ/ Hind III digest■検討例 2：サイクル条件の検討（その 2）①②

M

鋳型：ヒトゲノムDNA 200ng / 50μｌ反応系
ターゲット：tPA 24kb
PCRサイクル条件：①②

94℃ 2min.
98℃ 10sec.
68℃ 24min.

94℃ 2min.
98℃ 10sec.
74℃ 24min.
98℃ 10sec.
72℃ 24min.
98℃ 10sec.
70℃ 24min.
98℃ 10sec.
68℃ 24min.
68℃ 7min.

30 cycles

5 cycles5 cycles5 cycles20 cycles

M：λ/ Hind III digest＜製品の内容・技術に関するお問合せ＞
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取扱説明書(KFX-101)■ 検討例 3：鋳型 DNA 量と伸長時間の検討●ターゲット：β-globin 8.5kb②①

1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8

鋳型：ヒトゲノムDNA
1: 6ng / 50μl反応系
2: 12ng
3: 25ng
4: 50ng
5: 100ng
6: 200ng
7: 400ng
8: 800ng
PCRサイクル条件：①②

M:1kb DNA ラダー

94℃ 2min.
98℃ 10sec.
68℃ 4.5min.

94℃ 2min.
98℃ 10sec.
68℃ 9min.

④③④

94℃ 2min.
98℃ 10sec.
74℃ 12min.
98℃ 10sec.
72℃ 12min.
98℃ 10sec.
70℃ 12min.
98℃ 10sec.
68℃ 12min.
68℃ 7min.

94℃ 2min.
98℃ 10sec.
74℃ 24min.
98℃ 10sec.
72℃ 24min.
98℃ 10sec.
70℃ 24min.
98℃ 10sec.
68℃ 24min.
68℃ 7min.

30 cycles

30 cycles●ターゲット：tPA 24kb③

1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8

5 cycles5 cycles5 cycles20 cycles

5 cycles5 cycles5 cycles20 cycles

M：λ/ Hind III digest

１０．関連商品
包装

Code No.

<高効率・高成功率 PCR 酵素>
KOD FX Neo

200U×1 本(200U×1 本)×5
(200U×1 本)×10

KFX-201
KFX-201X5
KFX-201X10<高正確性 PCR 酵素>
KOD DNA Polymerase

250U×1 本(250U×1 本)×5

KOD-101
KOD-101X5<ホットスタート対応高正確性 PCR 酵素>
KOD -Plus-

200U×1 本(200U×1 本)×5
(200U×1 本)×10

KOD-201
KOD-201X5
KOD-201X10<信頼性を向上させたホットスタート対応高正確性 PCR 酵素>
KOD -Plus- Ver.2

200U×1 本(200U×1 本)×5

KOD-211
KOD-211X5

dNTPs Mixture(2mM)

1 mL

NTP-201<KOD / KOD -Plus- / KOD FX 用高効率TA クローニングキット>
TArget CloneTM -Plus-

10 回用

TAK-201<磁性ビーズを利用した DNA fragment 精製キット>
MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up-

200 回用NPK-601

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東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (大阪)〒530-0001 大阪府大阪市北区梅田一丁目 13 番 1 号
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