国立大学法人神戸大学

共同研究・共同事業枠

国立大学法人神戸大学
事業実施期間：開始 平成30年4月1日〜終了 令和2年3月31日

共同研究・共同事業者

システム・インスツルメンツ株式会社を確立する。の生検による診断からのパラダイムシフトを誘起する本提案の（3）健常人およびがん患者のエクソソーム解析

成果は、知的財産として保護しつつ実用化に向けて企業との共30年度に臨床研究計画を神戸大学大学院医学研究科倫理同研究に発展させることで新産業を創出し、生産される次世代委員会に提出し審査を受け、31年度には神戸大学医学部附属

ナノ材料は国民の健康維持に貢献するなど大きな社会貢献発

病院を受診する主要5大がんのうち、主に乳がん患者20名と展に資する。

20名の健常人から体液を採取し、各抗体に対するエクソソームの結合パターン解析を行う。
この結合パターンを多変量解析し、健常人とがん患者の識別が可能かどうか検討し、がん診断

研究 ・ 事業名

がん診断用エクソソーム自動分析装置の開発の正確性、迅速性を評価する。

研究・事業の特徴（新規性、独自性

交付申請内容研究·事業の目的及び意義【本研究の目的】【国内の類似研究との比較】
現在のエクソソームタンパク質を分析するための主たる方法としては、ELISA法やプロテオーム解析法が挙げられるが、こ研究・事業の方法及び手段れらは煩雑なプロセスと長い測定時間を要する。
これらに対し、本研究において開発を行うエクソソームセンシング基板を申請者らは、最近、分子鋳型重合法の際、重合後に形成され用いる分析法では、試薬レスでインタクトのエクソソームを分

本研究では、がんの悪性化や転移・再発を予測・診断を可能た認識空間内のみを化学修飾する部位特異的鋳型重合後修析することが可能である点で、ステップ数の大幅な減少を実現にする新たなリキッドバイオプシー手法のための、エクソソーム飾 ( P I M )に世 界で初めて成 功し( A n g e w . C h e m . I n t . E d .

できる。
さらに、小型自動分析装置を開発することで、ほぼすべを前処理なしで計測可能なエクソソーム自動分析計を開発す2014; J. Am. Chem. Soc. 2009)、PIMを用いて作製した分ての分析工程の自動化が可能となり、極めて簡便なリキッドバる。

子認識素子をもつセンサーによりバイオマーカーの検出限界イオプシーを実現できる。

【本研究の意義】

を14pMと100倍以上向上させた(Angew. Chem. Int. Ed.

【研究の独創性・新規性】

エクソソームは、細胞から放出される約100nmの小胞で、本研究で開発するエクソソームセンシング基板は、エクソ2016) 。

様々な体液中に含まれ、内部に宿主細胞由来のタンパク質やそこで本研究では、この技術を用いて、世界で始めて、エクソソーム結合情報を蛍光変化に変換する機能を有したエクソmiRNA等を包含し、細胞間コミュニケーションを担っているとソーム結合空孔を作製して抗原抗体反応を融合し、結合情報ソーム結 合 空 間 共 通プラットフォームをもち、このプラットを可視化する蛍光レポーター分子をその空孔内に配置したエフォーム上に、任意の抗体を固定化できるなどのセンサシステ

クソソームセンシングチップを創製し、エクソソームを高感度・ムフォーマットとは一線を画す利便性を有している。本研究は、簡便に検出する。

国際的に鋳型重合法をリードしてきた神戸大学の独自技術を（1）エクソソームセンシング基板の開発あることから、きわめて創造的で独自性が高い。

報告されている (Nat. Cell Biol. 2007, 9, 654; Nature2015, 527, 329)。さらに、近年がん増殖・転移との関連が報告され、がんの新バイオマーカーと期待されている(Hematol.
Onc. 2017, 10, 175)。
がん細胞由来エクソソームは、がん細胞がなければ検出されず、従来用いられてきたバイオマーカーによるがん診断に比べ、診断の精度は格段に向上し、生検に変わるリキッドバイオプシーとして大きな期待がかけられている。
しかし、これまでに、エクソソームはELISAやプロテオーム解析を用いて測定・解析されてきたが、操作が煩雑で、時間がかかる、装置が高価などの問題がある。前処理なしに特定のエクソソームを簡便に測定する方法が強く要望されている。
このような現状を打破する本研究は、従来のがん診断法からのパラダイムシフトを誘起し、イノベーションを創出し、国民の健康に資する技術開発としてきわめて高い意義がある。

用いてのみ構築可能であり、基盤技術からすべてオリジナルで（1）-1 エクソソームセンシング空孔の形成：鋳型重合法の原

さらに、エクソソーム結合空孔を多数配置したエクソソーム理に基づき、シリカナノ粒子を鋳型にしてエクソソームが結合センシング基板を調製し、この基板が挿入・留置できる特注の可能な微小空間を生体適合性ポリマーで形成する。
ここに蛍扁平型ピペットチップと、吸引・吐出・分注から検出に至るすべ

光プローブおよび標的膜夕ンパク質に対する抗体を導入する。ての過程を自動化したロボットを用いることで、エクソソーム計（1）-2導入する抗体：導入する抗体は、CD9, CD63, CD81測を自動化する。
このようなエクソソーム自動分析計は、申請とし、各種エクソソームのこれらの抗体に対する結合特性を評者らの独自技術によってのみ達成される。

価する。
（2）エクソソーム自動分析計の構築
エクソソームセンシング基板を内部に装着したまま蛍光検出

助成金成果抄録集

研究・事業により期待される効果が可能な扁平構造をもつピペットチップ（サイズ100µL)を特

エクソソームは、細胞間のコミュニケーションを担うことが明注で作製し、エクソソームセンシング基板が挿入されたまま、試らかになって以来、その機能の解明のために、様々な研究が行料を吸引・分注・吐出・インキュベーションし、蛍光測定までをわれている。国民病とも言われ今日まで困難であったがん診断

自動で行うことのできるデスクトップタイプ小型自動分析装置を、システム・インスツルメンツ（株）の自動分析のノウハウと神を開発する。感度は、試料10µLに10 個のエクソソームが検出

戸大学オリジナルのセンシング技術を融合した革新的計測装可能とする。10分以内で1試料の分析ができる標準プロトコル置であるエクソソーム自動分析装置によって可能にする。従来41等）

助成金成果抄録集2

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実績報告内容研究・事業の内容及び目標達成状況

がん患者の識別が可能であることも示唆された。
このように、エクソソーム結合空孔を多数配置したエクソソームセンシング基板を調製し、この基板が挿入・留置できる

本研究では、(1)膜タンパク質組成を同時測定するエクソ特注の扁平型ピペットチップと、吸引・吐出・分注から検出に至ソームセンシング基板の開発、(2)エクソソーム自動分析計のるすべての過程を自動化したロボットを用いることで、エクソ構築、(3)健常人およびがん患者のエクソソーム解析を行った。

ソーム自動分析計の構築が可能であった。

初年度は、鋳型重合法の原理に基づき、エクソソームが結合可能な微小空間を生体適合性ポリマーで形成した。
その後、鋳今後の展開

型粒子除去後の結合空間内のみに蛍光プローブおよび標的タンパク質に対する抗体を導入し、エクソソームセンシング基板を得た。蛍光プローブ導入処理後は蛍光強度が増加したこと

今後は、主要5大がん（胃がん、肺がん、肝がん、乳がん、大腸から、結合空孔へ蛍光プローブが導入されたことを確認した。

がん）への水平展開を行い、健常人とがん患者の識別が可能

また、エクソソーム自動分析計のプロトタイプの構築についかどうか検討し、がん診断の正確性、迅速性を評価する。て、エクソソームセンシング基板を内部に装着したまま蛍光

このようなエクソソーム自動分析計は、申請者らの独自技術検出が可能な扁平構造をもつピペットチップ(サイズ 100μL)をによってのみ達成されるものであり、一般に向けて手軽にがん特注で作製し、エクソソームセンシング基板が挿入されたまま、診断が行えるようなビジネスモデルについて、実施可能かどう試料を吸引･分注・吐出・インキュベーションし、蛍光測定までか調査する。
また、エクソソームのみならず、様々な疾病にも使を自動で行うことのできるプロトタイプ機を構築した（図1）。作用可能であることから、今後広範な応用展開が期待される。

製したセンシングチップにて、標的膜タンパク質に対する抗体として抗CD9, CD63をそれぞれ導入し、5ng/mLのエクソソーム試料溶液を吸引・反応させ、蛍光強度変化を測定したところ、（図 1）

エクソソーム表面上に発現している膜タンパク質組成の違いによる種々のエクソソームの結合特性をこのチップを用いて評価可能であることを確認した。
次年度は、この結果をもとに、エクソソームセンシングを1検体10分以内で高感度に精度よく得るための最適化と、健常人およびがん患者のエクソソーム解析を行った。反応時間について検討したところ、5分以内の反応時間でも30-60分反応させた時と同じく高感度で検出可能であり、1検体10分以内でのプロトコルを達成することが可能であった。
また、
このプロトコルにて前立腺がん細胞であるPC3由来と、健常人細胞由来の種々の抗体に対するエクソソームの結合実（図 2）

験を行ったところ、抗GGT-1に対する結合挙動が異なることがわかった。そこで、乳がん関連のエクソソームを検出するため、
抗CD9、抗CD63、抗エストロゲン受容体（ER）、抗ヒト上皮成長因子受容体2（Her2）、抗GGT1の5種類の抗体を検出チップに結合させ、乳がん患者の涙液中エクソソーム(青)と健常人の涙液中エクソソーム(オレンジ)の結合挙動について検証した
ところ、抗Her2および抗GGT1に対する結合挙動が異なることが明らかとなった(図2)。
この結果について主成分分析を用いてパターンベースの解析を行ったところ、乳がん患者群と健常人群を分離でき、結合パターンを多変量解析し、健常人と3

助成金成果抄録集

助成金成果抄録集4