Research Activities 2012
平成 24 年度研究成果報告-123-Division of Neuroscience

神経部門

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Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

In situ imaging of neural cells and their function
神経細胞機能の in situ イメージング

P.I.

Hisao Yamada, 山田久夫

E-mailyamada@hirakata.kmu.ac.jp

Affiliation

Regenerative Neural Medicine, 神経機能再生医学（解剖学第 1）講座

Collaborators

若林毅俊、森徹自、高森康晴、平原幸恵、小池太郎

Keywords

BrdU, IdU, subventricular zone, neurogenesis, mouse, cell cycle

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Adult neurogenesis in the subgranular zone of the hippocampus (SGZ) is enhanced by excess aswell as mild neuronal excitation, such as chemoconvulsant-induced brief seizures. Because moststudies of neurogenesis after seizures have focused on the SGZ, the threshold of neuronal
excitation required to enhance neurogenesis in the subventricular zone (SVZ) is not clear.
Therefore, we examined the responses of SVZ precursors to brief generalized clonic seizures
induced by a single administration of the chemoconvulsant pentylenetetrazole (PTZ). Cell cycle
progression of precursors was analysed by systemic administration of thymidine analogues. We
found that brief seizures immediately resulted in cell cycle retardation in the SVZ.
However, the same effect was not seen in the SGZ. This initial cell cycle retardation in the SVZ
was followed by enhanced cell cycle re-entry after the first round of mitosis, leading to precursor
pool expansion, but the cell cycle retardation and expansion of the precursor pool were transient.
Cell cycle progression in the PTZ-treated group returned to normal after one cell cycle. The
numbers of precursors in the SVZ and new neurons in the olfactory bulb, which are descendantsof SVZ precursors, were not significantly different from those in control mice more than 2 days
after seizures. Because similar effects were observed following electroconvulsive seizures, these
responses are likely to be general effects of brief seizures. These results suggest that neurogenesis
in the SVZ is more tightly regulated and requires stronger stimuli to be modified than that in the
SGZ.
われわれは、神経組織での細胞新生と分化を追究する一連の研究をおこなっているが、今回は以下の成果を紹介する。
成個体のニューロン新生は、例えば痙攣誘発性薬剤による短期発作といったニューロン
興奮で海馬歯状回顆粒層(SGZ)における新生が増強されるので、この方面の研究は SGZ に集中しておこなわれてきた。従って、側脳室周囲のニューロン新生領域(periventriculargerminal zone＝PVGZ、いわゆる脳室下帯＝SVZ)におけるニューロン過剰興奮とニューロ
ン新生の関係は明らかになっていない。
われわれは、痙攣誘発化学物質ペンチレンテトラゾール(PTZ)の単回投与によって誘発される全身性間代発作を起こさせたマウスを用い、SVZ 神経前駆細胞の細胞周期進行を、チミジン類似体 BrdU/IdU を系統的に投与することにより検索した。
発作をおこさせると、直ちに SVZ 神経前駆細胞の細胞周期進行が遅延したが、SGZ では遅延はおこらなかった。この最初の細胞周期遅延の後に、神経前駆細胞の細胞周期への再入が促進されることにより前駆細胞プールが拡大するが、これらの現象は一過性であった。またこの細胞周期の進行遅延は１周期で終了し、通常のサイクルに戻った。SVZ における前駆細胞数と、この前駆細胞が移動・分化した嗅球の新生ニューロン数は、痙攣発-125-

作後には、コントロールマウスとの間で有意差がなかった。電気刺激による痙攣発作でも同様の現象がみられたので、得られた現象は痙攣発作の際の細胞周期にとって一般的な現象と考えられる。
このような結果は、SVZ のニューロン新生は厳密に調整されていて、その修正には SGZの場合よりもより強い刺激を必要とすることを示唆している。
優れた成果があがった点
成個体脳内での神経前駆細胞の細胞周期に関する新たな知見が得られ、論文として発表
した。
問題点
特になし

2. List of Publications
Original Articles
1. Cui, Y., Li, Q-H., Yamada, H., Watanabe, Y. and Kataoka, Y. Chronic Degeneration of
Dorsal Raphe Serotonergic Neurons Modulates Cortical Spreading Depression: A Possible
Pathophysiology of Migraine. J. Neurosci. Res. レフェリー有, 91, 2013, 737–744.

2. Hirahara, Y., Matsuda, K.I., Liu, Y.F., Yamada, H., Kawata, M. and Boggs, J.M.
17β-Estradiol and 17α-Estradiol Induce Rapid Changes in Cytoskeletal Organization in
Cultured Oligodendrocytes. Neuroscience, レフェリー有, 235, 2013, 187-199.
3. Hirahara, Y., Matsuda, K.I., Yamada, H., Saitou, A., Morisaki, S., Takanami, K., Boggs, J.M.
and Kawata, M. G protein-coupled receptor 30 contributes to improved remyelination after
cuprizone-induced demyelination. Glia, レフェリー有, 61, 2013, 420-431.
4. Kimura, T., Jiang, S., Nishizawa, M., Yoshigai, E., Hashimoto, I., Nishikawa, M., Okumura, T.
and Yamada, H. Stabilization of human interferon-α1 mRNA by its antisense RNA.
Cell Mol. Life Sci. レフェリー有, in press, 2012.
5. Mori, T., Wakabayashi, T., Hirahara, Y., Takamori, Y., Koike, T., Kurokawa, K. and Yamada,H. Differential responses of endogenous adult mouse neural precursors to excess neuronal
excitation. Eur. J. Neurosci. レフェリー有, 36, 2012, 3184-3193.
6. Wakabayashi, T., Kosaka, J., Mori, T. and Yamada, H.
Prolonged Expression of Puma in Cholinergic Amacrine Cells During the Development of Rat
Retina. J. Histochem. Cytochem. レフェリー有, 60, 2012, 777-788.
Proceedings
1. Hirahara, Y., Wakabayashi, T., Mori, T., Matsuda, K., Koike, T., Takamori, Y., Kawata, M. and
Yamada, H. Expression and function of the G protein-coupled receptor 30 in oligodendrocyte.
14th International Congress of Histochemistry and Cytochemistry, Kyoto, 2012.8.

2. Koike, T., Wakabayashi, T., Mori, T., Hirahara, Y., Takamori, Y. and Yamada, H.
Histochemical demonstration of Sox2 and cell-markers in sensory nervous system.
14th International Congress of Histochemistry and Cytochemistry, Kyoto, 2012.8
3. Mori, T., Wakabayashi, T., Hirahara, Y., Takamori, Y., Koike, T., Kurokawa, K. and Yamada,H. Cell cycle analysis of neural precursors in the adult mouse subventricular zone.
14th International Congress of Histochemistry and Cytochemistry, Kyoto, 2012.8.

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Title of Project

Striatal neurons highly expressing GAD1 mRNA are populated in the lateral
striatum
マウス線条体における calbindin-poor 領域の空間配置と GABA ニューロン

P.I.

Tetsuo Sugimoto, 杉本哲夫

Affiliation

Anatomy and Brain Science, 脳構築学（解剖学第 2）講座

Collaborators

Trifonov Stefan、山下雄司、丸山正人、加瀬政彦

Keywords

GPR155, splicing variant, GABA neuron, lateral striatum

E-mailsugimoto@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Integral membrane protein GPR155 is a novel member of the group of proteins containing
DEP domain. It is expressed in the mouse striatum, hippocampus and cerebral cortex, andchanges in its expression have been related to autism-spectrum disorders and Huntington's
disease. Molecular mechanisms associated with the localization and function of GPR155 in the
striatum have yet to be elucidated. We have shown that GPR155 in the mouse has splicing
variants 1 to 5, in which variant 1 is dominant in the brain. We here demonstrate that the neurons
highly expressing the variant 1 are dominantly accumulated in the V-shaped stripe structure inmouse lateral striatum delineated by its low expression of Calbindin D28K. In this study, we have
prepared rabbit anti-peptide antibodies against mouse GPR155 and examined its distribution on
immunostained tissue sections of mouse striatum. To visualize the V-shaped stripe structure, wehave immunostained the tissue sections with Calbindin D28K antibodies. GPR155-heavily
immunopositive neurons were found in the lateral striatum largely conforming to the regions of
the V-shaped stripe structure visualized by the reduced Calbindin D28K immunoreactivity.
GPR155-moderately immunopositive neurons were distributed in the surrounding areas including
the central and medial striatal regions. The majority of GPR155-immunopositive cells appeared
as medium spiny projection neurons. GPR155-immunopositive fibers were accumulated inregions of external and internal segments of the globus pallidus and the substantia nigra pars
reticulata. Taken together with the results from in situ hybridization, GPR155-expressing neurons
might be projection neurons highly expressing GAD1 in the lateral striatum. These projection
neurons may contribute to basal ganglia circuits regulating motor execution.
マウス・ラットの線条体において in situ hybridization 法で GABA ニューロンの GAD 発現を検出したところ、特に線条体外側部において中型有棘ニューロン集団が GAD1mRNA を高度に発現していることを見つけ出した。一方、GAD2 に対する in situ
hybridization を試みたところ、GAD1 で示されたような特異的集積像は得られなかった。
また、hybridization には、GAD1、GAD2 の coding region に対する riboprobe に加えて5'-noncoding region および 3'-noncoding region に対する riboprobe を用い判定に慎重を期したが、いずれの結果においても線条体外側部の中型有棘ニューロン集団が GAD1 mRNA
を高度に発現していた。これと一致して、免疫染色により GAD1 陽性エレメントを検出したところ、in situ hybridization の結果と一致して線条体外側部に特に増強していることを見つけ出した。線条体外側部（被殻に相当する領域）は機能的には運動遂行の制御を担当する領域である。この領域は幾つかの点において他の線条体領域とは異なる特殊な線条体領域とみなすことができた。第一に、カンナビノイド 1 型受容体を高度に発現するニューロンが集中した。第二に、GPR155 タンパクを高度に発現するニューロンが局在した。第三に、大脳皮質との連絡を見た場合、GAD1 mRNA を高度に発現している領域は、口腔、顔面から前肢に対応する一次運動皮質の入力を比較的強く受けることがわかった。第四に、線条体外側部は patch-matrix 構造を呈しない領域に属することが判明し
た。
-127-

優れた成果があがった点
GPR155 マーカー発現などの新しいイメージング手法を用いて、線条体外側部ニューロンの特徴を明らかにした点。
問題点
特になし。

2. List of Publications
Original Articles
1. Maruyama, M., Yamashita, Y., Kase, M., Trifonov, S. and Sugimoto, T.
Lineage-specific purification of neural stem/progenitor cells from differentiated mouse
induced pluripotent stem cells.
Stem Cells Trans. Med. レフェリー有, in press, 2013.

2. Hamada, S., Trifonov, S., Houtani, T., Kase, M., Yamashita, Y., Baba, K., Shimizu, J.,
Maruyama, M., Tomoda, K., Yamashita, T. and Sugimoto, T.
Cholinergic fibers and muscarinic receptors in the central auditory system.
J. Kansai Med. Univ. レフェリー有, 63, 2012, 7-9.
3. Trifonov, S., Houtani, T., Kase, M., Toida, K., Maruyama, M., Yamashita, Y., Shimizu, J. and
Sugimoto, T.
Lateral regions of the rodent striatum reveal elevated glutamate decarboxylase 1 mRNA
expression in medium-sized projection neurons.
Eur. J. Neurosci. レフェリー有, 35, 2012, 711-722.
4. Horie, A., Fujiwara, H., Sato, Y., Suginami, K., Matsumoto, H., Maruyama, M., Konishi, I.
and Hattori, A.
Laeverin/aminopeptidase Q induces trophoblast invasion during human early placentation.
Hum. Reprod. レフェリー有, 27, 2012, 1267-1276.
Proceedings
1. 山下雄司, Stefan Trifonov, 丸山正人, 加瀬政彦, 杉本哲夫.
GPR 抗体を用いたマウス線条体外側部 V 字型縞構造の解析．
第 118 回日本解剖学会総会・全国学術集会, 高松, 2013.3

2. 丸山正人, 山下雄司, Stefan Trifonov, 加瀬政彦, 杉本哲夫.
神経幹細胞特異的に発現させた薬剤耐性遺伝子によるマウス iPS 細胞由来神経幹細胞の純化．
第 133 年会日本薬学会, 横浜, 2013.3
3. 山下雄司, Stefan Trifonov, 丸山正人, 加瀬政彦, 杉本哲夫.
マウス線条体 calbindin-poor 領域：中型ニューロンの選択的配置．
第 35 回日本神経科学大会, 名古屋, 2012.9-128-Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Imaging of disease-related molecules and cells
病因細胞および分子のイメージング

P.I.

Hiroko Matsuda, 松田博子

Affiliation

Cellular and Molecular Physiology, 細胞分子生理学（生理学第 1）講座

Collaborator

松田博子、岡田誠剛、武藤恵、林三樹夫

Keywords

K+ channel, pancreatic duct, electrophysiology, GH

E-mailmatsudah@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Expression of KCa3.1 channel in the pancreatic duct cells
Potassium channels play a vital role in maintaining the membrane potential and the driving
force for anion secretion in epithelia. In pancreatic ducts, however, identity of K+ channels
has not been extensively investigated. Therefore, the aim of our study was to functionallyidentify K+ channels that contribute to secretion in pancreatic ducts. The molecular basis of
K+ channels is revealed using RT-PCR analysis and immunostaining. We measured
equivalent short-circuit current (Isc), membrane potential, and single-channel currents using
electrophysiological techniques. Pancreatic duct cells expressed KCNN4 coding for anintermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel (KCa3.1). KCa3.1 protein localized inluminalandbasolateral
membranesofductcells.
DC-EBIO(5,6-dichloro-1-ethyl-1,3-dihydro-2H-benzimidazole-2-one), an activator of KCa3.1 channel,
increased Isc in Capan-1 monolayer. The effect was consistent with Cl− secretion in epithelia.
Clotrimazole, a blocker of KCa3.1 channel, inhibited Isc. KCa3.1 channel blockers
depolarized the membrane potential of cells in microperfused ducts dissected from rodent
pancreas. Cell-attached patch clamp single-channel recordings revealed KCa3.1 channels withan average conductance of 80 pS in freshly isolated duct cells. In conclusion, these results
indicated that the KCa3.1 channels may, at least in part, be involved in setting the resting
membrane potential. Furthermore, the KCa3.1 channels are involved in anion transport instimulated pancreatic ducts.
Lentiviral and Moloney retroviral expression of green fluorescent protein in somatotrophs
in vivo
Previous studies have shown that the locus control region (LCR) and the promoter of thegrowth hormone (GH) gene can control the expression of GH. Therefore, lenti- and retro-viral
vectors with these elements might be useful to monitor the activation of the GH gene and thedevelopment of newborn somatotrophs. To test this, we first constructed a lentiviral vector,
which expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of these elements, andinjected them into rat pituitaries in situ and in vivo. The lentiviral vector expressed GFP
specifically in the anterior lobe, and nearly all GFP-positive cells were anti-GH
immunoreactive. The GFP expression was upregulated by the administration of growth
hormone releasing hormone and an IGF-1 receptor blocker. Furthermore, the social isolationstress, which was shown to decrease the GH secretion, decreased the GFP expression. Second,
we injected the retroviral vector into neonatal rat pituitaries in vivo. At 30 days postinjection(DPI), almost all GFP-positive cells were anti-GH positive and anti-prolactin negative as thelentiviral expression. However, GFP was transiently expressed by developing lactotrophs at 8
and 16 DPI, suggesting that our vector lacks an element(s) which suppresses the expression.
Meanwhile, the retrovirally labeled cells tended to cluster with the cells of same type. An analysis
of cell numbers in each cluster revealed some features of cell proliferation. These viral vectors areshown to be useful tools to monitor the activation of the GH gene and the development of-129-

somatotrophs.
High-through-put assay for inwardly rectifying K+ channel
Based on a finding that overexpression of inwardly rectifying K+ channel (Kir2.1) decreases the
coexpression of GFP, we established a high-through-put assay for Kir2.1. We have screened thesamples from venom of scorpions and spiders and botanical extracts, from which many ion
channel modifiers have been found. We found a blocking compound and confirmed current
blockade.
膵導管細胞に発現する Ca2+依存性 K+チャネル
K+チャネルは負の膜電位を維持することで、上皮細胞における陰イオン分泌に駆動力を与える。重炭酸イオンを分泌する膵臓導管上皮細胞での K+チャネルの分子基盤については不明の点が多い。本研究で、膵臓導管細胞に機能発現する K+チャネルを明らかにした。
まず RT-PCR 法を用いて、KCNN4 分子の発現を認めた。次に免疫組織化学法を用いて、KCNN4 がコードする KCa3.1 蛋白が管腔側膜および血管側膜に分布することを観察した。
さらに導管細胞の単層培養を用いた短絡電流測定において、KCa3.1 チャネル機能に依存す
る上皮膜イオン輸送を認めた。また、KCa3.1 チャネルの遮断薬は新鮮分離導管細胞の静止
膜電位を脱分極させた。それに加えて導管細胞の血管側膜に、内向き整流性 K+コンダク
タンスを認めた。これらの結果は、KCa3.1 チャネルが導管細胞の膜電位を維持することで膵液分泌に寄与する可能性を示唆した。
レンチ及びレトロウイルスを用いた GFP のソマトトロフでの発現
成長ホルモンの分泌は、発達、加齢、ホルモンの影響を受けるだけでなく、身体的、精神的ストレスによっても変化する。我々は、成長ホルモン遺伝子の locus control region とプロモーターの下流に緑色蛍光タンパク(GFP)遺伝子を挿入したレンチ及びレトロウイル
スベクターを作製し、in vivo で GFP 発現を検討した。同レンチウイルスをラット下垂体に注入すると、GFP は前葉の抗 GH 免疫陽性細胞に発現し、GHRH 及び IGF 受容体遮断薬によって発現が増加した。幼弱ラットの隔離飼育ストレスは、GFP 発現を低下させた。
次に、同レトロウイルスで、新生細胞で検討し、GFP は一過性にラクトトロフに発現すること、並びに、同じ幹細胞に由来する細胞はクラスターを形成し、クラスター内の細胞は、分裂前にソマトトロフに分化するか否かが決定していることを明らかにした。
内向き整流性 K+チャネルの遮断・開口薬の天然物からの探索
我々は、細胞に過剰に発現させた内向き整流性 K+チャネル(Kir2.1)電流が細胞毒性をきたし、GFP の共発現を減少させることを利用して、同チャネル遮断・開口薬のハイスル
ープット・アッセイを確立し、サソリ、クモ毒、および、植物サンプルからのスクリーニ
ングを行い、遮断活性のある化合物を見出した。
優れた成果があがった点特記するほどの優れた成果は得られなかった。
問題点
特記するほどの問題点はない。
2. List of Publications
Original Articles
1. Hayashi, M., Wang ,J., Hede, S.E. and Novak, I.
An intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel is important for secretion inpancreatic duct cells.
American Journal of Physiology. Cell Physiol. レフェリー有, 303, 2012, C151−C159.

2. Okada, M., Matsuda, H. and Okimura, Y.
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Lentiviral and Moloney retroviral expression of green fluorescent protein in somatotrophs invivo.
PLoS One, レフェリー有, 8, 2013, e54437(1-11).
Proceedings
1. Taketo, M., Matsuda, H.
Changes of spontaneous GABAergic currents after increasing pre- and post-synaptic activities
in rat hippocampus.
第 90 回日本生理学会大会, 東京, 2013.3.

2. Hayashi, M., Wang, J., Hede, S.E., Novak, I.
KCa3.1 channel is important for secretion in pancreatic duct cells.
第 90 回日本生理学会大会, 東京, 2013.3.
3. Inagaki, A., Hayashi, M., Matsuda, H.
Adenosine receptors regulate Cl− channels in pancreatic duct cells.
第 90 回日本生理学会大会, 東京, 2013.3.
4. Hayashi, M., Wang, J., Novak, I., Matsuda, H.
膵液分泌に寄与するカリウムイオンチャネルの同定
2012 年度生理学研究所研究会, 岡崎, 2012.11.
5. Hayashi, M., Wang, J., Novak, I., Matsuda, H.
膵臓導管細胞に機能発現するカリウムイオンチャネル
第 105 回近畿生理学談話会, 守口, 2012.9.
6. Novak, I., Haanes, K.A., Wang, J., Hayashi, M. and Nielsen, L.S.
Purinergic signalling amplifies exocrine pancreatic functions.
International Symposium on Purinergic Signalling in New Strategy of Drug Discovery,
Fukuoka, 2012, June.
7. Novak, I., Wang, J. and Hayashi, M.
Purinergic signalling coordinates function of Cl− and K+ channels in pancreatic secretion.
International Symposium on Purinergic Signalling in New Strategy of Drug Discovery,
Fukuoka, 2012, May.
8. Okada, M., Kano, M. and Matsuda, H.
Current-dependent degradation of the inwardly rectifying potassium channel, Kir2.1.
Gordon Research Conference, Cell Biology of the Neuron, Waterville Valley, USA, 2012,
June.

-131-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

The role of serotonin and dopamine for cognitive processes in the primate.
霊長類におけるセロトニン・ドパミンによる認知機能の制御

P.I.

Kae Nakamura, 中村加枝

Affiliation

Cognitive Neuroscience, 高次認知脳科学（生理学第 2）講座

Collaborators

磯田昌岐、上田康雅、則武厚、時田賢一

Keywords

dopamine, serotonin, monkey, reward, doral raphe N., hypothalamus

E-mailnakamkae@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
1. To understand the neuronal mechanisms of decision making based on rewards and punishments,
we recorded single neuronal activity of neurons in the dorsal raphe nucleus (DRN), the major
source of serotonin, and the lateral hypothalamic area (LHA), one of the main source of dopamine
neuronal activity which encodes reward predication error, while monkeys performed (1) Pavlovian
conditioning task and (2) Choice task.
In the DRN, we found that many neurons showed sustained modulation in activity which
encoded reward context; whether majority of trials were rewarded or punished. The finding
indicates that DRN neurons keep track of ongoing value of events.
The LHA has been implicated in encoding positive value. However, we found some neurons also
responded to punishments. There were also neurons which showed stronger activity for uncertain
situation. Thus LHA neurons exhibited much more variety of reward information than previously
thought.
2. Although much learning occurs through direct experience of errors, humans and other social
animals can learn from the errors of other individuals. Using two paired monkeys that monitoredeach other’s action for their own action planning, we identified a group of neurons in the medial
frontal part of the cerebral cortex that exhibited a selective activity increase upon seeing another’s
errors.
1. 報酬とそれを得るためのコスト・嫌悪刺激の情報を計算して行動を選択する神経メカ
ニズムを明らかにするために、我々は、カニクイザル計 3 頭において、パブロフ型の条件付け課題と、２者択一課題を訓練し、セロトニン細胞の存在する背側縫線核(DRN)、ドパミン系に強い投射がある視床下部外側部(LHA)から単一神経細胞外記録を行った。それぞれの領域では異なる形で報酬や嫌悪刺激情報が表現されていることがあきらかになった。
DRN：パブロフ型の条件付け課題において、持続的な神経の発火がみられるが、報酬が得られる試行が多いコンテキスト（試行の継続）と罰が与えられる試行が多いコンテキス
トによって発火率が大きく異なる神経細胞が多く見られた。そのことから DRN は現在行っている行動の価値を持続的にモニターすると考えられる。
LHA：従来は正の報酬に応答すると考えられていたが、正のみならず負の報酬に応答するものがあり、さらに報酬確率をコードしている細胞群も見つかった。さらに、報酬が与えられるかどうか不確定な場合に発火が強くなる細胞も見られた。このように LHA は従来考えられていたよりはるかに多様な情報処理が行われていることが明らかになった。
2. さらに、セロトニンは個体間の社会性に影響があるという仮説がある。社会性人間を含む社会的動物は、己の過ちのみならず、他人の過ちからも多くを学ぶことが可能である。
このような「他者から学ぶ」能力の神経機構を明らかにするため、2 頭のサルが互いに相手の行動を読み取り、それをもとに自己の最適行動を導いているときに、大脳皮質の神経細胞の活動を記録・解析した。そして、他者の行動の過ちを検出する神経細胞が、前頭葉の内側領域に存在することを突き止めた。
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優れた成果があがった点
報酬に関しての研究は多いが、罰の情報さらには社会的な相互作用に関しての情報処理の研究は非常に遅れている。本研究で、脳の複数の領域でこのような情報処理過程が測定された。
今後は、薬理行動学的な手法も取り入れ、物質的な基盤も明らかにしていきたい。
問題点
特にない。

2. List of Publications
Original Articles
1. Nakamura, K., Santos, G., Matsuzaki, R. and Nakahara, H.
Differential reward coding in the subdivisions of the primate caudate during an oculomotor
task.
J. Neurosci. レフェリー有, 32, 2012, 1518-1512
2. Isoda, M.
Recent advances in social neuroscience research using macaques.
Brain and Nerve. レフェリー有, in press, 2013.
3. Isoda, M.
Using saccades as a probe of higher brain functions.
Neuro Ophthalmol. Jpn. レフェリー有, in press, 2013.
4. McCairn, K.W., Iriki, A. and Isoda, M.
Deep brain stimulation reduces tic-related neural activity via temporal locking with stimulus
pulses.
J. Neurosci. レフェリー有, 33, 2013, 6581-6593.
5. McCairn, K.W., Iriki, A., Isoda, M.
Global dysrhythmia of cerebro-basal ganglia-cerebellar networks underlies motor tics
following striatal disinhibition.
J. Neurosci. レフェリー有, 33, 2013, 697-708.
6. Yoshida, K., Saito, N., Iriki, A., Isoda, M.
Social error monitoring in macaque frontal cortex.
Nat. Neurosci. レフェリー有, 15, 2012, 1307-1312.
7. Yamada, H., Inokawa, H., Matsumoto, N., Ueda, Y., Enomoto, K. and Kimura, M.
Coding of the long-term value of multiple future rewards in the primate striatum.
J. Neurophysiol. レフェリー有, 109, 2013, 1140-1151.
Books
1. McCairn, K.W., Imamura, Y., Isoda, M.
Oxford University Press, Animal models of Tics :Tourette Syndrome (eds.by Martino D&Leckman JF), 2013, 672.
Proceedings
1. Nakamura, K.
Differential reward coding in the dorsolateral and ventromedial part of the primate caudate.
The 42nd Annual Meeting of Society for neuroscience meeting, New Orleans, USA, 2012.10.
2. Noritake, A. and Nakamura, K.
Coding of reward uncertainty in the primate lateral hypothalamic neurons.
The 42nd Annual Meeting of Society for neuroscience meeting, New Orleans, USA, 2012.10.
3. Noritake, A. and Nakamura, K.
Uncertainty coding in the primate lateral hypothalamus area.
The 35th annual meeting, the Japan Neuroscience Society, 名古屋, 2012.9.
4. Hayashi, K., Noritake, A. and Nakamura, K.
Action control and value coding in the primate dorsal raphe nucleus.
The 35th annual meeting, the Japan Neuroscience Society, 名古屋, 2012.9.
5. Isoda, M.
Monitoring other’s actions in the medial prefrontal cortex of the macaque.
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第 3 回前頭前野国際シンポジウム（招待講演）, 京都, 2012.11.
6. 磯田昌岐.
眼球運動を手がかりとして認知機能の脳内機構を探る.
第 50 回日本神経眼科学会総会（招待講演）, 京都, 2012.11.
7. Yoshida, K., Saito, N., Iriki, A. and Isoda, M.
Atypical agent-related activities in the medial frontal cortex of a monkey with impaired social
monitoring.
The 42nd Annual Meeting of Society for neuroscience meeting, New Orleans, USA, 2012.10.
8. McCairn, KW., Iriki, A., Isoda, M.
The cerebellum contributes to basal ganglia mediated motor tics.
第 35 回日本神経科学学会大会, 名古屋, 2012.9.
9. Isoda, M.
Probing the neural correlates of self and others' actions in monkey medial frontal cortex.
Mirror neurons: 20 years after the discovery（招待講演）, 京都, 2012.9.
10. Ueda,Y., Okazaki,S.R., Yamanaka, K., Samejima, K., Enomoto, K., Inokawa, H., Matsumoto,N., Kano, M. and Kimura, M.
Cannabionid(CB1) receptors selectively modulate value of action encoded in the striatum.
The 35th annual meeting, the Japan Neuroscience Society, 名古屋, 2012.9.
11. Ueda, Y., Okazaki, S.R., Yamanaka, K., Enomoto, K., Kano, M. and Kimura, M.
Presentation Session Wed, Impairment of reward-based adaptive choice of actions by local
injection of cannabinoid CB1 receptor antagonist into the striatum of behaving monkeys.
The 42nd Annual Meeting of Society for neuroscience meeting, New Orleans, USA, 2012.10
12. Noritake, A. and Nakamura, K.
Neurons in the primate lateralhypothalamic area encode reward probability, uncertainty,
andpredicted values.
University of Chicago Organismal Biology & Anatomy Seminar Series, Chicago, USA,2012.10.

-134-

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Elucidation of pathogenesis and development of diagnosis and treatment of
intractable neural diseases
難治性神経疾患の病態解明と診断治療法の開発

P.I.

Seiji Ito, 伊藤誠二

Affiliation

Molecular and Functional Biology, 分子生体機能学（医化学）講座

Collaborators

松村伸治、矢尾育子、下條正仁、片野泰代、西田和彦

Keywords

ACh, imaging mass spectrometry, two-photon microscopy, spinal cordE-mailito@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
1.

Molecular Imaging
1) Neurodegenrative diseases such as Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease are causedby neuronal death, loss of function, in a given region. So far, pathological alterations in tissue
samples of postmortum brain and model animals were histochemically examined. Metabolite
distribution imaging via imaging mass spectrometry (IMS) is an increasingly utilized tool in thefield of neurochemistry.We succeeded in measurement of acetylcholine (ACh), a neurotransmitter,by IMS. Its distribution in the brain was well correlated with that of acetylcholinesterase. We
also identified mochi as obstracting substance in formalin-fixed paraffin-embeded samples
prepared from a paitient suffered with intestinal obstraction. At present, 6 departments belonging
to Molecular Imaging Center of Diseases use IMS and have obtained good results gradually.
2) Noxious and non-noxious stimuli are conveyed by prmary afferent fibers which form synapse
with spinal neurons, processed in network of dorsal horn of the spinal cord, transmitted to thecortex, and recognized as pain and touch, respectively. To clarify how sensory reception from theperipheral is processed in the spinal cord, we have analyzed spinal responses functionally andmorphologically using two-photon microscopy and fluorescent protein-expressing mice. Whilein vivo patch clamp can analyze cellular response in only one spinal neuron, two-photon
microscopy can analyze it in many cells simultaneously.
2. Approach from basic research to clinical application
1) The ingestion of a Japanese poisonous mushroom Clitocybe acromelalga causes marked
reddish edema and severe allodynia (erythromelalgia) in the tips of hands and feet, which continue
for a month. Acromelic acid-A (Acro-A), a minor constituent induced tactile allodynia byintrathecal (i.t.) administration in conscious mice, which was blocked by its analogue PSPA-4.
To elucidate its suppressive effect, we synthesized 11C-labeled PET ligand and demonstrated that
PSPA-4 binds to kainate receptors in the brain and spinal cord. At present we have examined
whether there is a receptor specific to acromelic acid.
2) To alleviate postoperative pain after surgical procedures such as hepato-biliary-pancreaticmalignancies, we demonstrated that the implantation of NSAID-infiltrated gelatin hydrogel may
serve as a useful analgesic method for the long-term relief of patients after surgery.
3）To clarify pathogenesis of Huntington’s disease, we have started to analyze iPS cells preparedfrom skin cells of healthy persons and patients suffered with Huntington’s disease in collaboration
with Center for iPS Research and Application of Kyoto University..
1. 分子イメージング
1) Alzheimer 病、Parkinson 病などの神経変性疾患は脳のある部位の神経細胞死によるloss of function によることが知られている。これまで、剖検脳やモデル動物での組織標本の病理学的変化を検討されてきた。質量顕微鏡を用いて神経伝達物質の 1 つアセチルコリ
ン(ACh)の測定に成功した。質量顕微鏡の ACh の脳内分布は、ACh の分解酵素 ACh エス
テラーゼの分布と一致していた。腸閉塞・穿孔性腹膜炎を併発した症例の食餌性異物を含む病理標本パラフィンブロックを用いて、食餌性異物としてモチを同定した。病態分子イメージングセンター参加６講座が質量顕微鏡を用いた研究を推進し、徐々に成果が上がっている。
2) 侵害刺激と非侵害刺激は 1 次求心性線維により伝達され、その中枢端の脊髄で脊髄ニューロンとシナプスを形成する。脊髄後角の神経回路網の情報処理により、大脳に伝達され、痛覚と触覚と認識される。末梢組織からの感覚受容がどのように処理されるのか、-135-

蛍光タンパクを発現する遺伝子改変マウスを用いて多光子励起顕微鏡下に、機能的、形態学的に解析を行っている。これまで、in vivo patch-clamp では１つの脊髄後角細胞の解析しかできなかったが、多光子励起顕微鏡を用いることにより多くの細胞の刺激応答を同時に見ることができるようになった。
2. 基礎研究から臨床応用へのアプローチ1) 茸毒毒ササコ Clitocybe acromelalga を食すると、1 ヶ月の長期間、四肢末端でアロデ
ィニアが生じる。その原因成分アクロメリン酸を極微量投与するとアロディニアが長期間生じ、その誘導体 PSPA-4 はアクロメリン酸のアロディニアを抑制する。抑制作用を解明するために、11C 標識 PET リガンドを合成し、脳と脊髄でカイニン酸受容体と特異的結合をすることを明らかにし、現在、アクロメリン酸に特異的な受容体があるかどうか検討している。2）肝胆膵臓癌など開腹手術後の術後痛を緩和するために、局所麻酔薬非ステロ
イド性消炎鎮痛薬(NSAID)をしみ込ませた徐放剤が有効であることを明らかにした。
さらに、3）ハンチントン病の病態を解明するために、京都大学 CiRA と健常人と患者
皮膚細胞から iPS 細胞を作製し、現在解析を進めている。
優れた成果があがった点
質量顕微鏡で神経伝達物質 ACh の測定をはじめ、病態分子イメージング参加講座との共同研究体制を構築した。
問題点
飛ばない質量顕微鏡サンプルと検出されたイオンピークの同定

2. List of Publications
Original Articles
1. Miyazaki, S., Minami, T., Mizuma, H., Kanazawa, M., Doi, H., Matsumura, S., Lu, J., Onoe,
H., Furuta, K., Suzuki, M. and Ito, S. The action site of the synthetic kainoid(2S,3R,4R)-3-carboxymethyl-4-(4-methylphenylthio)
pyrrolidine-2-carboxylic
acid(PSPA-4), an analogue of Japanese mushroom poison acromelic acid, for allodynia (tactilepain). Eur. J. Pharmacol. レフェリー有, 710, 120-127, 2013.
2. Lu, J., Katano, T., Nishimura, W., Fujiwara, S., Miyazaki, S., Okasaki, I., Aritake, K., Urade,Y., Minami, T. and Ito S. Proteomic analysis of cerebrospinal fluid before and after
intrathecal injection of steroid into patients with postherpetic pain. Proteomics レフェリー有, 12, 3105-3112, 2012.
3. Yamada, M., Yao, I., Hayasaka, T., Ushijima, M., Matsuura, M., Takada, H., Shikata, N.,
Setou, M., Kwon, AH. and Ito, S. Identification of oligosaccharides from histopathologicalsections by MALDI imaging mass spectrometry. Anal Bioanal Chem. レフェリー有, 402,
1921-1930, 2012.
4. Okuda-Ashitaka, E., Minami, T., Tsubouchi, S., Kiyonari, H., Iwamatsu, A., Noda, T.,
Handa, H. and Ito, S. Identification of NIPSNAP1 as a nocistatin-interacting protein
involving pain transmission. J Biol Chem., レフェリー有, 287, 10403-10413, 2012.
5. Araki, Y., Kaibori, M., Matsumura, S., Kwon, AH. and Ito, S. Novel strategy for the control
of postoperative pain: long-lasting effect of an implanted analgesic hydrogel in a rat model of
postoperative pain. Anesth. Analg. レフェリー有, 114, 1338-1345, 2012.
6. Sugiura, Y., Zaima, N., Setou, M., Ito, S. and Yao, I. Visualization of acetylcholine
distribution in central nervous system tissue sections by tandem imaging mass spectrometry.
Anal. Bioanal. Chem. レフェリー有, 403, 1851-1861, 2012.
7. Unezaki, S., Sasaki, A., Mabuchi, T., Matsumura, S., Katano, T., Nishio, N., Andoh, T.
Nakazawa, T. Yamamoto, T., Nakatsuka, T., Kuraishi, Y. and Ito, S. Involvement of Tyr1472
phosphorylation of NMDA receptor NR2B subunit in postherpetic neuralgia in model mice.
Mol. Pain レフェリー有, 8, 59(1-13), 2012.
8. Takagi, H., Setou, M., Ito, S. and Yao, I. SCRAPPER regulates the thresholds of long-term
potentiation/depression, the bidirectional synaptic plasticity in hippocampal CA3-CA1
synapses. Neural Plast. レフェリー有, 2012, 352829, 2012.
Proceedings
1. Yao, I. Sugiura, Y., Zaima, N., Setou, M. and Ito, S. Visualization of acetylcholine
-136-

2.

3.

4.

5.
6.
7.

distribution in the brain by imaging mass spectrometry. 60th ASMS Conference on Mass
Spectrometry and Allied Topics, Vancouver, May 19-25, 2012.
Ito, S. Sasaki, A., Unezaki, S., Andoh, T., Matsumura, S., Katano, T., Nishio, N., Nakatsuka,T., Kuraishi, Y. and Minami, T. Characterization of postherpetic neuralgia in mice withknock-in mutation of NMDA receptor. 14th World Congress on Pain, Milano, August 27-31,
2012.
Yao, I., Sugiura, Y., Zaima, N., Setou, M. and Ito, S. Optimization of conditions foracetylcholine detection in the nerve tissue sections by imaging mass spectrometry 19thInternational Mass Spectrometry Conference, Kyoto, September 17, 2012.
Katano, T., Fukuda, M., Okumura, N., Nakazawa, T., Yamamoto, T., Takao, T. and Ito, S.
Search of neuropathic pain related proteins in neuropathic pain model mice by iTRAQ
proteome analysis. The 42nd annual meeting of the Society for Neuroscience, New Orleans,
October 13-17, 2012.
Yao, I., Sugiura, Y., Zaima, N., Setou, M. and Ito, S. Imaging of acetylcholine in the nerve
tissue sections with mass spectrometry. The 42nd annual meeting of the Society for
Neuroscience, New Orleans, October 13-17, 2012.
矢尾育子、高雄啓三、宮川剛、伊藤誠二、瀬藤光利 Behavioral analysis of knockout
mice for F-box protein SCRAPPER. 第 33 回日本神経科学大会，第 53 回日本神経化学会大会，第 20 回日本神経回路学会大会合同大会, 神戸, 9 月 2 日, 2010.
片野泰代、山崎真弥、阿部学、福田正史、奥村宣明、中澤敬信、高尾敏文、山本雅、
崎村健二、伊藤誠二 Functional analysis of neuropathic pain-related protein invivo. 第 85 回日本生化学会大会, 福岡国際会議場・マリンメッセ福岡 福岡, 12 月
14-16 日, 2012.

-137-

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Analysis of intracytoplasmic inclusions of neurodegenerative diseasesby
imaging mass spectrometory
質量顕微鏡を用いた神経変性疾患細胞内封入体の研究

P.I.

Hirofmi Kusaka, 日下博文

Affiliation

Neurology, 神経内科学講座

Collaborators

金子鋭、和手麗香、藤田賢吾、中村正孝、朝山真哉

Keywords

TGFβ, ALS,

E-mailkusaka@hirakata.kmu.ac.jp

TDP-43

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Background: TAR DNA binding protein of 43 kDa (TDP-43) is naturally located in the
nucleus and has been identified as the major component of cytoplasmic ubiquitinatedinclusions in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We have reported that
TDP-43 and phosphorylated Smad2 (pSmad2), an intracellular mediator protein ofTransforming Growth Factor-β (TGFβ) signaling, are co-localized within cytoplasmic
inclusions in the anterior horn cells of sporadic ALS patients.
Objective: To investigate the possible pathophysiological linkage between pathologic
cytoplasmic inclusions containing TDP-43 and TGF

ad signaling.
/SmMethods: We replicated cytoplasmic aggregates of TDP-43 in HEK293T cells bytransfecting the cells with a nuclear localization signal deletion mutant of TDP-43 andinhibiting proteasome activity, and assessed the effect of TGFβ/Smad signaling on thecytoplasmic aggregate formation.
Results: The aggregates contained ubiquitinated, phosphorylated, and fragmented
TDP-43, consistent with the essential features of the human pathology. Moreover, theaggregates were co-localized with pSmad2 under continuous TGFβ stimulation.
Overexpression of Smad2 reduced the amount of cytoplasmic aggregates in HEK293T
cells, and TGFβ stimulation augmented this reduction effect in a dose-dependent
manner.
Conclusion: Activation of TGFβ/Smad signaling system is protective against aggregate
formation of cytoplasmically mislocalized TDP-43 and may be a potential therapeutic
approach to delay progression of ALS.
我々は筋萎縮性側索硬化症(ALS)において神経細胞の生存・保護に関与する TGFβ/Smad
シグナル伝達が障害されていることをこれまでに報告してきた。本研究では、細胞モデルを用いて TGFβ/Smad シグナルと TDP-43 凝集体形成との関連について検討した。
核移行シグナル(NLS)を変異させた TDP-43 発現プラスミド(ΔNLS-TDP-43)を HEK293T
細胞に発現させると、本来核に存在する TDP-43 はプロテアソーム阻害下で細胞質内に凝集体を形成した。これらの凝集体は、リン酸化 TDP-43(pTDP-43)抗体に陽性をした。この細胞モデルを用いて、TGFβ/Smad シグナルの賦活(Smad2 過剰発現や constitutive active 型
TGFβtype1 受容体(TGFCA)の共発現、外因性 TGF-β１の投与)や阻害(dominant negative 型-138-

TGFβtype1 受容体の共発現(TGFDN)、TGF-β1 kinase inhibitor の投与)に応じて、TDP-43 凝集体形成が影響を受けるか否かについて蛍光免疫染色法やウェスタンブロッティング法
により定量的に解析した。
ΔNLS-TDP-43 と Smad2 との共発現により、不溶性画分の pTDP-43 発現量は減少し、
ΔNLS-TDP-43、Smad2 と TGFCA を共発現させると、不溶性画分の pTDP-43 発現量はさらに減少した。細胞質に pTDP-43 陽性の凝集体を持つ細胞数もそれぞれ、約 35％、約 70％の減少し、LDH 活性の測定からこの減少は凝集体陽性細胞の死滅によるものではないことが確認された。ΔNLS-TDP-43、Smad2 と TGFDN を共発現させると、TGFCA のときに認められた pTDP-43 発現量の減少効果は消失した。外因性 TGF-β１単独投与では、不溶性画分の pTDP-43 発現量に変化は認めなかったが、Smad2 との組み合わせにより、不溶性画分の pTDP-43 発現量は TGF-β1 の濃度依存性に減少効果を示した。
TGFβ/Smad シグナルの賦活により細胞死を引き起こすことなく TDP-43 凝集体形成が抑制されたことから、ALS における治療法の開発において TGF-β/Smad シグナルが重要なターゲットとなる可能性が示唆された。
優れた成果があがった点
ALS 治療法の開発において TGF-β/Smad シグナルが重要なターゲットとなる可能性が示
唆された。
問題点
今回の結果は培養細胞系であり、よりヒトの病態に近い実験系で検討する必要がある。

2. List of Publications
Original Articles
1. Nakamura, M., Kaneko, S., Ito, H., Jiang, S., Fujita, K., Wate, R., Nakano, S., Fujisawa,
J.I. and Kusaka, H.
Activation of Transforming Growth Factor-β/Smad Signaling Reduces Aggregate
Formation of Mislocalized TAR DNA-Binding Protein-43.
Neurodegener Dis. レフェリー有, 11, 2013, 182-193.

2. Nakamura, M., Kaneko, S., Wate, R., Asayama, S., Nakamura, Y., Fujita, K., Ito, H. andKusaka, H.
Regionally different immunoreactivity for Smurf2 and pSmad2/3 in TDP-43-positive
inclusions of amyotrophic lateral sclerosis.
Neuropathol. Appl. Neurobiol. レフェリー有, in press, 2012.
Proceedings
1. Nakamura, M., Kaneko, S., Ito, H., Fujisawa, J. and Kusaka, H.
Activation of Transforming Growth Factor-beta/Smad Signaling Reduces Aggregate Formationof Mislocalized TAR DNA binding prtotein-43
64th American Academy of Neurology Annual Meeting, New Orleans, USA, 2012.4.

-139-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Elucidation of pathogenesis of psychiatric disorder
精神障害の病態研究

P.I.

Toshihiko Kinoshita, 木下利彦

Affiliation

Neuropsychiatry, 精神神経科学講座

Collaborator

齊藤幸子、Martha Shenton

Keywords

mirror neurons, diffusion tensor imaging

E-mailkinoshit@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Introduction: Deficits in attention, memory, and neuromotor functions were noted in
descriptions of schizophrenia. The purpose of the current study is to identify and to evaluate motor
related white matter integrity in patients with schizophrenia compared with healthy controls.
Method: Diffusion tensor imaging (DTI) scans were analyzed from 17 patients and 20 controls.
Mean fractional anisotropy (FA), Trace were measured from the motor related white matter.
Results: The mixed ANOVA revealed a significant main effect of group on FA of the neurons
from premotor area to putamen, indicating that schizophrenic patients had lower FA than healthy
controls (p = .002). For the FA of the neurons from primary motor area to putamen, there were nogroup effects (p = .721).
Conclusion: The primary findings of this study were that there was the groupdifference for the FA of the neurons from premotor area to putamen between theschizophrenia patients and the controls. There was no group difference for the FA of
the neurons from primary motor area to putamen. Premotor area is actively involvedin transforming sensory inputs into appropriate actions. An anterior area with mirror
neurons is located in premotor area. Our result may provide support for the theory
that schizophrenia would be associated with the abnormality of mirror neurons.
事業推進者らが研究対象とするミラーニューロンは、この社会的認知に深い関連を有すると考えられる。ミラーニューロンは、相手の行動を自分が行動するときの回路を使って処理することで理解するという脳システムの一端を担っている。「心の理論(theory ofmind)」と関連しているとも言われ、下頭頂小葉から前運動野に投射するニューロンである。
ミラーニューロンと精神分析的精神療法は関連が深い。2005 年 Gallese らによるとミラ
ーニューロンは、フロイトが提唱してきた精神療法の現場でおこる「無意識の交流」や「投影性同一視」「共感」「転移逆転移」と関連がある。
事業推進者は、精神分析の第一人者である広島市精神保健福祉センターの衣笠隆幸センター所長に精神分析的精神療法について毎週指導を受けながら、精神分析的精神療法を患者に実施している。一方で Harvard 大学医学部精神科 Psychiatry Neuroimaging Laboratory（精神画像研究所）と連携し、拡散テンソル画像解析を用いたミラーニューロンの描出に取り組んでいる。
今年度は、精神分析の第一人者の指導を週に 1～2 回受けながら精神分析的治療を患者に実施した。また、3 テスラ MRI を用いて対象患者の MRI 拡散テンソル画像を撮像した（6 名の統合失調症患者と 7 名の強迫性障害患者）。今後対照となる健常者を撮像し、一定期間の治療の後で、ミラーニューロンが変化するか調査する予定。これとは別に、ミラーニューロンに関連する統合失調症の前運動野の障害を現在まとめているところで、詳細は英文報告で示す。
-140-

優れた成果があがった点
ミラーニューロンに関連が深いとされる精神分析的精神療法の指導を受けた点。
問題点対照となる健常者の撮影がまだな点。

2. List of Publications
Proceedings
1. 齊藤幸子, 大塚達以, 浅見剛, 木下利彦, Shenton, M.
拡散テンソル画像解析によるミラーニューロンの三次元構築の試み
第 108 回日本精神神経学会学術総会, 札幌, 2012.5.

2. 齊藤幸子, 大塚達以, 木下利彦, Shenton, M.
ミラーニューロンの三次元構築の試み
第 14 回日本ヒト脳機能マッピング学会, 札幌, 2012.7.

-141-

Annual Report 研究成果報告書

Title of ProjectPossible role of propofol’s cyclooxygenase-inhibiting property in alleviating
dopaminergic neuronal loss in the substantia nigra in an MPTP-induced murine
model of Parkinson’s disease
プロポフォールの活性化ミクログリア依存性神経細胞傷害に及ぼす影響

P.I.

Koh Shingu, 新宮興

Affiliation

Medical Control of Stress Response, 侵襲反応制御学(麻酔科学)講座

Collaborators

稲田武文

Keywords

propofol, leukotriene, dendritic cells

E-mailshingu@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Leukotrienes (LTs), divided into cysteinyl leukotrienes (CysLTs), which are important mediatorsof asthmatic responses, and leukotriene B4 (LTB4), a chemotactic and chemokinetic agent forleukocytes, are potent lipid mediators generated from arachidonic acid by 5-lipoxygenase(5-LOX). LTs are also considered to have immune-regulatory and pro-inflammatory actions.
Propofol is an intravenous anesthetic widely used for anesthesia and sedation that is alleged topossess anti-inflammatory properties. In the present study, we examined the effect of propofol on
LT production by dendritic cells (DCs). In murine bone marrow-derived DCs, propofol
significantly suppressed CysLT and LTB4 production after short-term stimulation with zymosan.
The protein levels of cytosolic phospholipase A2 and 5-LOX, or arachidonic acid release fromplasma membranes, were not affected by the presence of propofol.
Although zymosan treatment induced or enhanced the phosphorylation of ERK1/2, p-38 MAPK,
and JNK, which presumably up-regulates the activity of 5-LOX, the presence of propofol had no
additional effect on the phosphorylation status of any of these MAPKs. Similarly, zymosansignificantly increased the concentration of intracellular calcium, which is the most crucial
activator of 5-LOX, but no additional concentration changes were observed with the addition of
propofol.
Lastly, in an in-vitro cell-free ferrous oxidation-xylenol orange assay, propofol significantly
inhibited the 5-LOX activity of purified human recombinant 5-LOX enzyme with an IC50 of
approximately 7.5 µM. Thus, propofol’s inhibition of 5-LOX is not likely restricted to thecircumstances surrounding the production of LTs from DCs, but applicable to other types of
immune and non-immune cells that produce LTs. The 5-LOX-inhibiting activity of propofol may,at least in part, contribute to the well-known anti-inflammatory activity of propofol.
静脈麻酔薬プロポフォールのロイコトリエン産生に及ぼす影響を、樹状細胞を用いて調べた。まずマウス骨髄より骨髄細胞を取り出し成長因子の存在下に樹状細胞を誘導した。
こうして作成された樹状細胞をザイモザンの存在下に刺激したところ、プロポフォールは濃度依存的に樹状細胞からのロイコトリエン(LT) (cysteinyl LTs, LTB4)の産生を抑制する
ことを見出した。この抑制のメカニズムを探究したところ、プロポフォールはロイコトリ
エンの前駆体である細胞膜よりのアラキドン酸の遊離には影響せず、またロイコトリエン産生酵素である 5-リポキシゲナーゼ(5-LOX)の蛋白発現や 5-LOX の核膜への移動にも影
響せず、さらには 5-LOX activating protein (FLAP)の発現にも影響を与えなかった。
さらに 5-LOX をリン酸化させ活性化させる酵素である MAP キナーゼ (ERK.・JNK・p38)のリン酸化状態を精査したところプロポフォールはいずれの酵素のリン酸化状態にも影響を与えないことが明らかになった。また同様に 5-LOX の活性化に影響を与えると考えられる細胞内カルシウム濃度を測定した結果、プロポフォールはこのカルシウム濃度にも何ら影響を与えないことがわかった。最後に、精製した 5-LOX を用いて in vitro にプロポ
フォールの 5-LOX の酵素活性に対する影響を調べた結果、プロポフォールには直接的な-142-

5-LOX 酵素活性抑制作用があることがわかった。
したがって、プロポフォールのロイコトリエン産生抑制作用はマウス樹状細胞に限った
ものではないことが示唆された。プロポフォールの抗炎症作用は古くからよく知られてきた事実ではあるが、われわれは今回の実験結果を通して、プロポフォールの抗炎症作用のひとつの機序として炎症物質であるロイコトリエン産生の抑制があげられることが明らかにできた。
優れた成果があがった点
静脈麻酔薬であるプロポフォールにロイコトリエン産生酵素活性抑制作用があることは今までわかっていなかった。炎症物質であるロイコトリエン産生を抑制することにより、プロポフォールが、中枢神経変性疾患や癌の進行を予防する可能性が示唆できた点で優れた成果があったのではないかと考えられる。
問題点
今回の実験は in vitro の系で得られた結果であり、実際に in vivo でもこのプロポフォー
ルのロイコトリエン産生抑制作用が再現できるかどうかが今後の問題点となりうると考えられる。

2. List of Publications
Original Articles
1. Inada, T., Ueshima, H. and Shingu, K.
Intravenous anesthetic propofol suppresses leukotriene production in murine dendritic cells.
J. Immunotoxicol, レフェリー有, in press, 2012
Proceedings
1. Ueshima, H., Inada, T., and Shingu, K.
A981 Suppression of migration of murine bone marrow-derived dendritic cells withdexmedetomidine.
Anesthesiology 2012 Annual Meeting, Washington D.C., USA, 2012.10.

-143-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Analysis of the Brain Digitalislike Substance Underlying HYPERTENSION
高血圧の病態解明のための脳内内因性ジギタリスの局在分析

P.I.

Hakuo Takahashi, 高橋伯夫

Affiliation

Clinical Sciences and Laboratory Medicine, 臨床検査医学講座

Collaborators

小宮山豊、吉賀正亨、横井豊彦

Keywords

hypertension, endogenous digitalis, CNS, hypothalamus, sympathetic nerve

E-mailtakahash@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
We have been analyzing the endogenous digitalis-like factors (EDLF) by using the liquid
chromatography / mass spectrometry (LC/MS) for many years. Since EDLFs are structurally very
similar each other with the similar molecular weight, it was found to be difficult to identify them
immunohistochemically with specific antibodies. Direct analysis of EDLFs in tissues with the
LC/MS system is impossible. Thereby, development of imaging mass spectrometry made us
possible to analyze samples like cultured cells or tissues. It is suitable particularly for analysis of
low molecular chemicals and lipids, which were difficult to detect with immunohistochemistry.
Therefore, we are aiming at the determination of the localization of EDLFs in the brain and theadrenals by the imaging mass spectrometric technology.
We have explored the possible application of EDLFs determination with authentic
marinobufotoxin and marinobufagenin. Selection of matrix to maintain samples was the mostimportant step to determine them. The lowest concentration of the authentic material to be
determined was found to be a few pg by observing the same mass spectral pattern as that of the
LC/MS. Therefore, this technology was thought to be useful for determination of EDLFs. Then,
we have tried to determine EDLFs in cultured cell samples, and found difficult to identify EDLFs
in the sample possibly because of the matrix to be used. Another reason may be the sensitivity ofthe technology because concentration of the EDLF in cell may be lower than the pg order. We aregoing to repeat experiments by using other matrix to condition the sample suitable for imaging
mass spectrometry.
従来内因性ジギタリス(EDLF)の定性的解析は免疫組織染色や液体クロマトグラフィー/
質量分析(LC/MS)を用い行われきたが、EDLF の候補物質は非常に構造式が似ており、免疫組織染色でそれぞれの物質の存在を同定するのは困難であった。従来我々の研究で用いていた LC/MS は液体サンプルの解析のため、細胞、組織内の EDLF の解析を直接行うことは困難である。しかし近年、質量顕微鏡が発達してきており、細胞、組織を直接サンプルにして従来解析が難しかった低分子化合物や脂質成分の存在を質量分析することが可能となってきている。しかし未だ質量顕微鏡を用いた EDLF の研究は報告がない。
本研究では、質量顕微鏡を用いて、われわれがすでに LC/MS を用いてマススペクトルを得ている EDLF の候補物質であるマリノブフォトキシンとマリノブファゲニンにおいて、質量顕微鏡での質量分析を行った。保持剤として用いるマトリックスの調節と標品の濃度を検討しマススペクトルを確認したところピコグラム濃度まで LC/MS と同じマスス
ペクトルを確認したことから EDLF の研究に質量顕微鏡が有用な手法となることが示唆された。
質量分析においては標品の分析がもっとも重要となるため今回の標品のマススペクト
ルの検出は質量顕微鏡を用いた細胞、組織を対象とした研究の重要な一歩となる。今後、
EDLF の分泌組織と考えられている、副腎、視床下部の培養細胞株やラットの組織をサンプルに用いて EDLF の組織および細胞内分布の検討を行い、さらに EDLF 分泌にともなう細胞膜変化を検討する予定である。
-144-

達成度
現在、質量顕微鏡を用いて、われわれがすでに LC/MS を用いてマススペクトルを得ている EDLF の候補物質であるマリノブフォトキシンとマリノブファゲニンにおいて、質量顕微鏡での質量分析を行った。マトリックスの調節と標品の濃度を検討しマススペクトルを確認したところピコグラム濃度まで LC/MS と同じマススペクトルを確認した。しかし
質量顕微鏡は大学所有の機器を使用しているが学舎の移転にともない学内の質量顕微鏡が使用できなかった時期があり、当初の計画と比べて細胞、組織を対象とした研究への応用が遅れている。現在、副腎皮質のモデル細胞である Y-１細胞のサンプルに用いて検討をおこなっているが、現時点ではマススペクトルの検出に至っていない。
今後の計画
現在、標品においてピコグラム濃度までの検出が可能であるが、Y-1 細胞の結果から、
質量顕微鏡での検出感度を上げる必要があると思われる。そのため保持剤として用いるマ
トリックスの検討が必要と思われる。最終的には標品のフェムトグラム濃度でのマススペ
クトルの検出を目標して検討する。さらに EDLF の候補物質としてウアバインの標品のマ
ススペクトルの検出を行う。
優れた成果があがった点
Pg レベルで測定が可能であることを確認したこと。
問題点
それでも感度が足りない印象があり、精査中。

2. List of Publications
Original Articles

1. Takahashi, H.
Upregulation of the Renin-Angiotensin-Aldosterone-Ouabain System in the Brain Is the Core
Mechanism in the Genesis of All Types of Hypertension.
Inter. J. Hypertens. レフェリー有, in press, 2012

2. 高橋伯夫．
交感神経系と高血圧

呼吸と循環, レフェリー無, 60, 2012, 247-256.
Proceedings
1. 高橋伯夫．
あらゆるタイプの高血圧発症機序として中枢神経系の役割．
日本高血圧学会総会, 名古屋, 2012.9.

-145-

Annual Report 研究成果報告書
Title of ProjectStudies on cell treatment for complete spinal cord injury
脊髄損傷に対する細胞治療の実験的研究

P.I.

Toshio Nakatani, 中谷壽男

Affiliation

Spinal Cord Regeneration, 脊髄再生医学（救急医学科）

Collaborators

岩瀬正顕、前田裕仁、齊藤福樹、津田雅庸

Keywords

spinal cord injury & regeneration, transplantation, bone marrow stromal cells

E-mailnakatant@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
We have been studied experimental and clinical research for the treatment of spinal cord injury.
This year, we have made our effort to summarize and publish our recent clinical work as follows:
To determine whether intrathecal administration of cultured autologous bone marrow stromal cells(BMSCs) is safe and feasible for treatment of subacute spinal injury. Five patients with complete
tetraplegia due to cervical spinal injury on admission were included. A small amount of bonemarrow was obtained during surgery for spinal fusion. BMSCs were cultured, reaching 107-108
cells. The properties and functional efficacy of the BMSCs were verified with surface marker
analysis and a neurite extension test. BMSCs were administered by lumbar puncture. The patientswere closely observed for 6 months, and the Committee on Effectiveness and Safety of ClinicalTreatment (CESCT) evaluated safety.

No adverse responses were observed in biochemical andradiographic examinations. The CESCT did not recognize any harmful effects of thetransplantation, and concluded it was safe for treatment. The patients were further followed up for
1 to 4 years with no adverse responses. The recovery of American Spinal Injury Association
Impairment Scale (AIS) B and C patients at transplantation was rapid and remarkable, but gradualor limited in AIS A patients. This study demonstrated that intrathecal administration of cultured
autologous BMSCs is safe and feasible for treatment of spinal cord injury.

The above

study report has been accepted for publication. In our next step, we are planning to administerbone marrow mononuclear cells of the patient without incubation and proliferation. We alsoplanning an experimental study to continue our clinical trials.
我々は、従来より脊髄損傷の治療に向けての実験的研究、臨床試験を行ってきた。今年
度はそれらのうち、臨床試験の成果をまとめ、公表することに精力を注いだ。
我々がこれまで行ってきた培養自己骨髄間質細胞の髄液内投与による脊髄損傷治療の安全性と実現性について検討するために、頸髄損傷による四肢完全麻痺の５症例に実施した臨床試験成績をまとめて見た。試験に於いては受傷後の頸椎固定手術に際して、少量の骨髄海綿骨を採取し、培養して間質細胞を 107 乃至 108 に増殖させ、その細胞の質に関しては表面マーカーと突起伸長試験を経て確認した後に、患者の髄液内に投与して、移植細胞を損傷脊髄に到達せしめ 6 ヶ月の試験期間、及びそれ以降も経過を追跡し、外部委員を含む効果安全性評価委員会が安全性について評価した。血液生化学検査にて、或いは画像診断にて追跡しているが、これまでのところ最長 4 年間を経過しているが、何ら骨髄細胞移植によると思われる有害反応は無く、機能的には一症例で歩行可能、一症例で装具にて起立保持可能、2 例にて車椅子の自己操縦可能となり、American Spinal Injury Association
Impairment Scale にても motor score は従来の治療を行った症例に比べて、著しい改善を認-146-

めた。ただし、1 例のみは無効であった。本臨床試験は安全であり、かつ実現性が可能なものと考えている。
現在、我々は本治療法を確立するためにはより多施設での臨床試験が必要と考え、そのためには骨髄細胞を培養することなく、分離後直ちに移植する方法での臨床試験を行うべく、動物実験を経て臨床試験の準備を行っている。
優れた成果があがった点
骨髄細胞の髄液内投与の安全性に関して、有害反応が全く見られず、安全性に自信を深めた。
知覚機能は、大部分の症例で改善しているが、運動機能の改善は、受傷後 3 ヶ月を過ぎると改善が乏しいこと等が判明し、次のステップのプロトコル作りに大いに参考になったこと。
問題点
本研究は、施設基準の関係で滝井病院では細胞の分離操作を実施し出来ない。厚労大臣の許可を得て、共同研究施設である北野病院で実施している。（厚生科学審議会での審査と、北野病院の倫理委員会承認は得て居る。すべて他院の患者に対して実施しているが、本院での患者が発生した場合にも、北野病院に転院して実施する場合を考えて、念のために本学の倫理委員会にも申請した。当委員会で書類の改定を求められているうちに、10
例の予定数を終了したために、また、本院の患者は全く含まれていないために、その後の倫理委員会への再審査申請は行っていない。
）
胸髄レベルの運動機能が回復したとしても、それを評価する方法が難しいこと。

2. List of Publications
Proceedings
1. 齊藤福樹, 岩瀬正顕, 中谷壽男, 津田雅庸, 前田裕仁, 宮崎秀行, 北元健, 金沢武哲, 鈴木義久, 井出千束, 福島雅典.
当院における脊髄損傷に対する再生医療への取り組み
第 40 回日本救急医学会総会, 京都, 2012.11.
海外発表は 2013 年 8 月確定して居ますが、24 年度はありません。

-147-

Division of Cancer

がん部門

-148-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Dynamics of adult tissue specific stem cells by multi-color lineage tracing
method
多色細胞系譜追跡法を用いた幹細胞の維持機構の解析

P.I.

Hiroo Ueno, 上野博夫

Affiliation

Stem Cell Pathology, 幹細胞病理学講座

Collaborators

比舎弘子、吉田真子、厚海奈穂、田中敏宏、駒井資弘、矢内洋次、大町太一、大江秀一

Keywords

stem cell, development, regeneration

E-mailhueno@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Continuing last year’s research, we are trying to visualize the process of oncogenictransformation of intestinal epithelium. To this end, we are using our multi-color lineage tracing
method (rainbow mice) we developed.
It is well known that the adenomatous polyposis coli (Apc) gene is one of the key molecules(the tumor suppressor gene) for generating colon cancers. However, mutation of Apc gene canonly generate benign adenomas. Apcmin mice is one of the most popular model mice for theexperiments. In the intestinal epithelium of Apcmin mice that carry a point mutation in the Apc
gene, numerous adenomas are generated as the mice grow, and the mice eventually die because of
bleeding or obstruction of their intestine. To generate malignant tumors, we administrate several
chemicals to the Apcmin mice, and we have succeeded in generating adenomatous carcinomas. By
culturing normal and malignant intestinal epithelial cells in vitro (organoid culture), we are
currently analyzing dynamics of normal and cancer intestinal stem cells by time lapse imaging.
事業推進者はマルチカラー細胞系譜追跡法を開発して昨年度に引き続き消化管上皮細胞のがん化過程における正常成体腸幹細胞の維持機構の破綻について imaging を行っている。
大腸がんの前がん病変である大腸腺腫の発症にはがん抑制遺伝子である adenomatous
polyposis coli (Apc) 遺伝子の変異が深く関与している事が知られている。その代表的なマウスモデルの一つ、Apcmin マウスを用いる事でマウス小腸から大腸に効率的に腺腫を生じせしめる事ができる。しかしながら Apc 遺伝子変異単独では腺腫の段階で留まり、腺癌の発症にはつながらない。そこで私たちは化学発がんモデルを組み合わせ、Apcmin
マウスに起こる腺腫の一部が腺癌へと進展している状況を確認している。これらの系を私たちの開発した多色細胞系譜追跡法（レインボーマウス）と組み合わせ、大腸腺癌の起源につき解析を行い、さらに腸管上皮細胞の in vitro 培養（オルガノイド培養）の系を用いて正常およびがん化した上皮細胞培養系のイメージングを行っている。
優れた成果があがった点
正常およびがん化した腸管上皮細胞のオルガノイド培養およびレインボーマウスと組
み合わせて幹細胞を蛍光標識、オールインワン顕微鏡による Time lapse imaging により、その動態を直接観察する事が可能となった。
問題点
特に無し。

2. List of Publications
Original Articles
1. Tanaka, T., Komai, Y., Tokuyama, Y., Yanai, H., Ohe, H., Okazaki, K. and Ueno, H.

Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial-149-

cells.
Nat. Cell Biol. レフェリー有, in press, 2013.
2. Yanai, H., Tanaka, T. and Ueno, H.
Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.
JG レフェリー有, in press, 2013.
3. Zhang, H., Zheng, W., Shen, Y., Adhikari, D., Ueno, H. and Liu, K.
Experimental evidence showing that no mitotically active female germline progenitors
exist in postnatal mouse ovaries.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. レフェリー有, 109, 2012, 12580-12585.
Proceedings

1. 上野博夫.
多色キメラ法による幹細胞の発生及び成体組織維持機構の解析
日本消化器病学会セミナー, 東京, 2012.4.
2. 上野博夫.
マルチカラーモザイクマウス（レインボーマウス）による成体幹細胞研究について
千葉大学 GCOE セミナー, 千葉, 2012.8.
3. 上野博夫.
マルチカラー細胞系譜追跡法における消化管上皮幹細胞の解析
no side GI 講演会, 大阪, 2012.9.
4. 上野博夫.
マルチカラーキメラ法を用いた幹細胞・発生研究について
金沢医科大学セミナー, 金沢, 2012.11.
5. 上野博夫.
マルチカラー細胞系譜追跡法を用いた成体組織幹細胞の同定と解析
千里ライフサイエンスセミナー, 大阪, 2013.1.
6. 上野博夫.
腸幹細胞研究の最前線〜モデルマウスを用いた大腸がん発症過程の多色細胞系譜解析
守口市医師会講演会, 大阪, 2013.5.

-150-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Analysis of ATL development in HTLV-1 infected humanized mouse model
HTLV-1 感染ヒト化マウスを用いた ATL 発症過程の解析

P.I.

Jun-ichi Fujisawa, 藤澤順一

Affiliation

Viral Oncology, ウイルス腫瘍学（微生物学）講座

Collaborators

竹之内徳博、田中正和、上野孝治、荀潤澤、手塚健太、姚錦春

Keywords

HTLV-1, ATL, NOG-SCID, humanized mouse, leukemia stem cells

E-mailfujisawa@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Development of ATL-like symptoms has been successfully recapitulated in HTLV-1 infected
humanized mouse system that was established by intra-bone marrow transplantation of cord-blood
derived human hematopoietic stem cells into NOG mice. By using this system, we analyzed the invivo effect and its mechanism of various candidates for ATL treatment.
Treatment with the combination of anti-viral agents, zidovudine (AZT) and interferon-alpha(IFN), has been reported to be highly effective to certain type of ATL, but the mechanism of action
is totally unknown. We, therefore, examined the efficacy and the in vivo mechanism of AZT/IFN
treatment in the humanized mouse system.
HTLV-1 infected humanized mice were inoculated daily with AZT and IFN from two to fourweeks post infection and the number of infected cells and proviral loads (PVL) were analyzed.
Treatment with either AZT or IFN alone attenuated the onset of lymphoproliferative disorder in
2/3 of infected mice, while mock-treated mice were died of leukemia after 8 weeks post infection.
Furthermore, although most of treated mice retained a substantial amount of infected cells,
outgrowth of infected T-cells was kept prevented even after withdrawal of drugs. The combined
treatment suppressed the growth of infected T-cells in PBL almost completely and the PVL
remained low throughout lifetime. The suppressive effect is infected-cell specific because thenumber of uninfected human lymphocytes in PBL stayed constant on the administration of drugs.
We next examined the in vivo effect of 17-DMAG, a molecular chaperone HSP90 inhibitor,
which has been demonstrated to induce apoptosis of HTLV-1-infected cells in vitro by enhancing
the degradation of an oncogenic protein Tax of HTLV-1. Oral administration of 17-DMAG fromtwo to six weeks post infection effectively suppressed the growth of infected T-cells in peripheryand the PVL remained at the carrier level throughout lifetime. These results suggested that
infected cells with higher growth activity were more sensitive than those of lower growth,
provably due to the larger amount of Tax expression.
我々はこれまでに、ヒト臍帯血由来造血幹細胞の NOG-SCID マウスへの骨髄内骨髄移
植で作製したヒト化マウスの腹腔内に HTLV-1 産生細胞株を移入し、マウス個体内のヒト
T 細胞に HTLV-1 を感染させることで ATL 様病態を再現することに成功した。
そこで、この感染モデルを用いて、近年、一定のタイプの ATL に対する有効性が示唆されている、AZT および IFN-α を感染後 2 週〜4 週の間、連日腹腔内投与し、その効果を検証した。その結果、薬剤非投与群は感染 8 週以降、全例が白血病死するのに対し、両薬剤の単独投与群では、投与期間中、2/3 のマウスにおいて感染細胞数の増加が抑制され、その多くは投与期間後も、一定数の感染細胞の存在は認めるものの、感染細胞の増殖抑制-151-

は維持された。さらに、AZT・IFN-α 併用群では全個体で投与期間中および投与終了後も感染細胞数の増加は認められなかった。また、両薬剤の投与は非感染細胞の増殖には影響を及ぼさなかったことから、作用は感染細胞特異的であることが明らかとなった。
次に、HTLV-1 の発癌遺伝子産物 Tax の不安定化を介した HTLV-1 感染細胞の増殖抑制
効果が in vitro において示されている、シャペロン蛋白 Hsp90 阻害剤 17-DMAG の投与効果を解析したところ、感染 2〜6 週間の経口投与により、ほぼ全例の感染マウスにおいて感染細胞の増加が抑制され、投与中止後も感染細胞の異常増殖は観察されなかった。
これらの結果から、感染細胞集団の中でも、高い増殖性を示す細胞クローンが表記薬剤に対しより高い感受性を示すこと、またこの形質が Tax の発現と関連している可能性が強く示唆された。
優れた成果があがった点
HTLV-1 感染ヒト化マウスが抗 HTLV-1 あるいは ATL 発症予防薬の in vivo レベルでの評
価系として有効であることが示された。一方、これら薬剤の HTLV-1 感染細胞の増殖抑制機序を明らかにすることで、感染細胞の感染個体内増殖機序に対する理解が進むと期待される。
問題点
今後、上記薬剤によって死滅したと考えられる感染細胞群と、薬剤投与中止後に残存する感染細胞群の違いを、ウイルスおよび細胞遺伝子の発現レベルで明らかにする必要がある。

2. List of Publications
Proceedings
1. Fujisawa, J-I.
ATL-like phenotype in HTLV-1 infected humanized mouse model.
25th International Conference on Antiviral Research, 札幌, 2012.4.

2. 手塚健太, 上野孝治, 鄭真美, 荀潤澤, 田中正和, 竹之内徳博, 藤澤順一.
IBMI-ヒト化マウスを用いた HTLV-1 感染マウスモデル
第 1 回 ATL シンポジウム, 東京, 2012.8.

3. 手塚健太, 鄭真美, 上野孝治, 荀潤澤, 藤澤順一.
Carrier model of HTLV-1 infection in humanized NOG-mouse
第 71 回日本癌学会学術総会, 札幌, 2012.9.

4. 荀潤澤, 上野孝治, 齊藤峰輝, 手塚健太, 田中勇悦, 藤澤順一.
Altered pattern in viral mRNA expression of Iranian type HTLV-1 leading to enhanced
viralproduction.
第 60 回日本ウイルス学会学術集会, 大阪, 2012.11.

5. 手塚健太, 上野孝治, 鄭真美, 荀潤澤, 竹之内徳博, 藤澤順一.
HTLV-1 感染ヒト化マウスを用いた抗 ATL 治療法の評価
第 60 回日本ウイルス学会学術集会, 大阪, 2012.11.

-152-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Identification of embryonic stem cell-like tissue committed stem cells andelucidation of their differentiation pathway: An application to cell therapy andregenerative medicine
ES 細胞様組織幹細胞の同定と分化経路の解明：細胞移植・再生医療への応用

P.I.

Yoshiaki Sonoda, 薗田精昭

Affiliation

Stem Cell Biology, 幹細胞生物学(衛生学)講座

Collaborators

佐々木豊、中塚隆介、岩城隆二

Keywords

tissue stem cells, VSEL、Escells, regemerative medicine

E-mailsonoda@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
The aim of this study is to identify embryonic stem cell-like tissue committed stem cells fromvarious murine and human tissues and to apply them for the cell therapy and regenerative medicine
in the near future. Last year, we reported the identification of novel mouse dental pulp stem cell
(DPSC) and analysis of their functional properties. This year, we developed a highly effective
isolation method of mouse bone-derived very small embryonic-like stem cell (BD VSEL).
(Background) Ratajczak and his colleagues identified a unique population of very small
embryonic-like (VSEL) stem cells in adult mouse bone marrow (BM) (Leukemia 2006:20;857).
These VSELs are; 1) very small (~4 µm); 2) express pluripotent stem cell markers, such as Oct4,
Nanog, SSEA-1, and Rex-1; 3); responsive to a SDF-1 gradient; 4) possess large nuclei that
contain euchromatin. It is very interesting to note that VSELs possess the potential to differentiate
into 3 germ layers in vitro and in vivo, thereby contributing to tissue/organ regeneration. These
VSELs were isolated as lineage-negative (Lin-), Sca-1-positive (Sca-1+), CD45-negative (CD45-)
cells by FACS. However, the incidence of VSELs in BM-derived mononuclear cells is ~0.01%.
Therefore, it is difficult to isolate VSELs very effectively. This study describes our recently
developed highly efficient method for isolating VSELs using enzymatic treatment of murine bone.
(Materials and Methods) Murine BM nucleated cells (BMNC) were isolated from BM
flushed from the pairs of femurs and tibiae of 8 week-old C57BL/6 mice. Erythrocytes were
removed using a hypotonic solution. Then the remaining bone tissues were thoroughly washedusing PBS- with 2% FCS. These bone tissue specimens were crushed in a mortar and thenincubated in cell dissociation buffer containing α-medium with 5% FCS supplemented with 1.5
mg/ml type I collagenase and 2 mg/ml dispase at 37oC for 1 hour. Next, the BMNCs andbone-derived nucleated cells (BDNCs) were stained with various monoclonal antibodies, including
anti-lineages, anti-CD45, anti-Sca-1, anti-CXCR4, anti-CD133, and anti-PDGFRα, and then wereused for subsequent FACS analyses.
(Results) The R1 gate was set on the FSC channel using 4 and 10 µm synthetic beads, basedon the predicted very small size of VSELs. The VSELs were isolated from BMNCs and BDNCs bymulticolor FACS, as a population of Lin-Sca-1+CD45- cells. The incidences of VSELs in the
BMNCs and BDNCs were 0.001% and 0.1%, respectively. Therefore, the enzymatic treatment ofbone tissues yielded about 100 times the efficiency for the isolation of VSELs. The bone-derived(BD) VSELs were small (< 5 µm) and possessed a relatively large nucleus surrounded by a narrow
rim of cytoplasm. They expressed CD133, but not PDGFRα. However, they weakly expressed
CXCR4. The gene expression profiles were analyzed using real time quantitative PCR (RQ-PCR)
to evaluate the expression of ES cell markers (Oct4, Nanog, Rex1, Dppa3), HSC (KSL) markers(c-kit, Tal1, GATA2), and MSC markers (Nestin, Ang1, CXCL12, VE-Cadherin). Unexpectedly,-153-

BD VSELs expressed high levels of Nestin and Cadherin. However, they expressed higher levelsof Oct4 and Nanog compared to HSCs or MSCs. The gene expression profile of the BD VSELs
was clearly distinct from the well-defined populations of ES cells, KSL cells, and MSCs.
Interestingly, the number of these BD VSELs significantly increased after the induction of liver
injury by carbon tetrachloride administration. They were then most likely mobilized into theperipheral blood (PB). G-CSF did mobilize KSL cells into PB, as previously reported. However,
G-CSF did not mobilize the BD VSELs. The effects of sRANKL on the mobilization of BD VSELs
were examined in vivo. Interestingly, the number of BD VSELs significantly increased 2-3 days
after the administration of sRANKL. However, the number of VSELs in PB did not increase. These
results suggest that BD VSELs actively proliferated after liver injury and bone resorption.
(Conclusion) The present data suggest that the majority of the Lin-Sca-1+CD45- cells reside in
the bone tissue. BD VSELs resemble BM-derived VSELs. However, a RQ-PCR analysis revealed
that the gene expression profile of BD VSELs was different from those of the previously reported
BM-derived VSELs. Further studies will therefore be required to elucidate their stem cellcharacteristics and the potential relationship between BD VSELs and BM-derived VSELs.
本研究では、マウス及びヒト由来の各種組織より、ES 細胞様組織幹細胞を同定し、近未来の細胞移植・再生医療への応用を目指している。今年度は、マウス骨組織をを用いて、very small embryonic-like stem cell (VSEL)として報告されている未分化な組織幹細胞の効率的な同定・分離法の開発に成功した。
当初、既報の方法により、マウス骨髄より VSEL の分離を試みた。報告されているよ
うに、直径 5μm 程度の小型で核細胞比の大きな VSEL が分離可能であった。しかし、その採取効率は非常に低く、定量的な解析は困難であった。そこで、種々の方法を試みる過程で、マウス骨と酵素処理法などを工夫することにより、既報に比べて 50～100 倍の分離効率を有する新たな方法の開発に成功した（特願 2012-220648）。
（方法）骨髄を除去した C57BL/6 マウス骨組織を乳鉢で破砕し、酵素処理(type I
collagenase +dispase) し た 後 に 、 得 ら れ た 単 核 細 胞 を 7AAD, Annexin V, anti-lineage,anti-CD45, anti-Sca-1, anti-CD133, anti-CXCR4, anti-PDGFRa 抗体で多重染色し、FACS で
Lin-CD45-Sca-1+細胞を効率よく分取する方法を開発・確立した。本細胞を用いて以下の実験を行った。
（結果）
1）マウス骨由来単核細胞より、我々が開発した酵素処理法を用いることにより、従来の骨髄を用いる方法に比べて 50～100 倍の VSEL (Lin-CD45-Sca-1+細胞)を回収することが可能であった。
2）本細胞(以下、BD VSEL）は、直径が 5μm 程度と小型で、高い核細胞比を示した。
3）FCM 解析では、陽性マーカーとして、CD34, CD133 を発現していた。しかし、CXCR4の発現は弱かった。
4）RQ-PCR 解析では、BD VSEL は、既知の幹細胞である造血幹細胞(HSC)、間葉系幹細胞(MSC)、ES 細胞のいずれとも異なる遺伝子発現パターンを示した。興味あることに、
nestin, VE-cadherin を高発現していた。未分化細胞マーカーである Oct4, Nanog は、HSC,
MSC に比べて高く発現していた。
5）CCl4 による急性肝障害モデルでは、骨組織内で増加し、骨髄、末梢血へ動員される傾向を示した。
6）sRANKL 投与でも、骨組織内で増加傾向を示した。
7）BD VSEL は、加齢により増加傾向を示したことから、BM VSEL とは異なる in vivo
動態を示した。
（考察）
BD VSEL を効率的に分取する方法の開発に成功した。今後は、本細胞の機能解析、
特に、in vitro, in vivo における組織修復の可能性について研究を進める予定である。併せて、ヒト BD VSEL に関する研究を進展させる。
-154-

優れた成果があがった点
効 率的なマ ウス骨 由来の BD VSEL の同定・分 離法を開 発し、 特許出 願（特 願2012-220648）した点が特筆される。
問題点
大規模な細胞移植、再生医療実験の実施には、in vitro 増幅法の開発、各種臓器障害時に置ける in vivo 動態の解明など、更なる検討が必要である。

2. List of Publications
Proceedings
1. Iwaki, R., Nakatsuka, R., Matsuoka, Y., Takahashi, M., Fujioka, T., Sasaki, Y., Asano, H.,

Uemura, Y., Kwon, A-H. and Sonoda, Y.
Development of a Highly Efficient Method for Isolating Very Small Embryonic-Like StemCells Identified in Adult Mouse Bone and their Stem Cell Characteristics.
The54th Annual Meeting of American Society of Hematology, Atlanta, USA, 2012.12.
2. 岩城隆二, 中塚隆介, 松岡由和, 高橋雅也, 藤岡龍哉, 佐々木豊, 薗田精昭.
マウス骨質由来微小幹細胞の同定・分離法の開発とその幹細胞特性
第 12 回日本再生医療学会総会, 横浜, 2013.3.
Patents
1. 特願 2012-220648
発明者：薗田精昭, 中塚隆介, 岩城隆二, 飯田寛和
出願人：関西医科大学
発明の名称：微小幹細胞の分離方法-155-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Functional analysis of overexpressing genes in tissue stem cells and relationshipwith cancer stem cells
組織幹細胞に高発現する遺伝子の機能解析とがん幹細胞との共通性
の検討

P.I.

Seiji Kanda, 神田靖士

Affiliation

Public Health, 公衆衛生学講座

Collaborators

神田靖士、下埜敬紀、岡崎はるか、王澤蘊Keywords

tissue stem cells, SP cells, cancer stem cells, pituitary, auditory pathway

E-mailkandas@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
We focused on the tissue stem cells in pituitary and auditory pathway. In our previous study, we
identified the tissue stem/progenitor cells in pituitary gland and cochlear nuclei of auditory
pathway in vivo. In this study, we tried to characterized these tissue stem/progenitor cells andanalyze the gene expression.
Pituitary stem cells: Last year, we showed that the upregulated genes in SP cells were included
some specific markers of stem cells, Bcrp1 and Sca-1 etc. including a oncogene with microarray.
In order to characterize these genes’ function, we tried to clone these genes and subclone into themammalian expression vector that can control the expression of interested genes by adding
tetracycline to the culture medium. These plasmid clones were transfected to mouse iPS cells by
lipofection method. Now we tried to study the ability of differentiate and maintainance of
stemness in transfected iPS cells at several different concentrations of tetracycline in vitro. I
addition we tried to construct the new system of gene expression using viral vector instead of thatof plasmid vector.
Stem cells in Auditory pathway: Last year, we showed that about 1% of slow-cycling cells weredetected in cochlea nuclei (CN) of 3 week aged mice as SP cells, and several genes were detected
as an over-expressed genes same as common genes related with stem cells by microarray.
Especially, the related genes with neuronal differentiation such as Ndrp and neurotrohhin 3 weredetected, so we considered that these specific genes might be marker genes of tissue stem cells.
Therefore, we tried to search the tissue stem cells in different region (inferior colliculus, IC) ofauditory pathway. ICs were picked up from 1 week aged of BALB/c mice and single cellsuspension was prepared. These cells were cultured in the specific medium for neuronal stem
cells and could form the spheres after 1 week in vitro. Furthermore, we tried to form the spherefrom 1,8, 20-24, 40-48 weeks aged mice and checked the numbers of spheres. The results showed
the numbers of that was significantly decreased depend on the age compared with 1 week aged
mice. In the future, we will confirm the ability to differentiate into several cell types such asneuronal cells or other cell fate from these stem cells in vitro.
下垂体幹細胞の特徴付けと癌幹細胞との関連の検討
昨年度、下垂体幹細胞を SP 細胞を指標として単離しマイクロアレイにより発現遺伝子を探索した結果、Oncogene を含む数種類の SP 細胞に高発現する遺伝子を数種類見いだした。そこでこれらの遺伝子の機能を解析する目的でまずこれらの遺伝子をクローニング
し、テトラサイクリン存在下で発現調節可能な発現ベクターにサブクローニングした。これらのプラスミドをリポフェクション法でマウス iPS 細胞に遺伝子導入した。現在、テト-156-

ラサイクリンの存在下およびその添加期間を検討することによりそれぞれの遺伝子の分化誘導能及び未分化維持能などの検討をする予定である。
聴覚伝導路における組織幹細胞の同定と特徴付け
昨年度は 3 週齢マウスの蝸牛神経核に約 1％の slow cycling cell が存在し、マイクロアレ
イの結果から未熟な細胞に共通でみられる遺伝子の発現が MP 細胞と比較して高発現していた。中でも、Ndrp や Ntf(neurotrophin)3 など neuron と分化に関連のある遺伝子が検出されたことから新規組織幹細胞のマーカーとなる可能性が考えられた。本年度は聴覚伝導路の中で異なる部位である下丘に注目し、下丘中にある幹細胞の特徴付けを行った。1 週
齢の BALB/c マウスの下丘を摘出、単細胞に分離し、特殊培地を用いて培養し sphere の形成を確認、継代を繰り返し 9th sphere まで確認した。続いて 1、8、20-24、40-48 週齢のBALB/c マウスの下丘を摘出培養し sphere の形成数を比較したところ 1 週目に比して、8
週目、20-24 週目、40-44 週目に形成される sphere 数は有意に少なく、加齢により sphere
形成能が低下することがわかった。今後、これらの幹細胞に多分化能が存在することを確認する予定である。
優れた成果があがった点
聴覚伝導路における組織幹細胞の同定を行い、その特徴付けを行った結果、蝸牛神経核の他の組織（下丘）にも組織幹細胞が存在することが示唆された。以前の報告では聴覚伝導路に神経幹細胞が存在するという報告があったが、我々は発現遺伝子の解析から、SP細胞で取得したこれらの細胞はさらに未熟な幹細胞または前駆細胞で可能性を確認する
ことができた。またいくつかの組織幹細胞のマーカーとなり得る候補遺伝子が見つけることができた。
問題点
現在、下垂体幹細胞に特異的に発現する遺伝子の機能解析を行うためマウス iPS 細胞に遺伝子導入し、その分化能などを検討している。その時に使用するベクターはテトラサイ
クリンで目的の遺伝子の発現を調節可能な系を用いている。遺伝子が導入されていることは確認できたが、目的タンパクの発現がテトラサイクリンにより制御できているかどうかがまだ確認できていない。今後、新たにウイルスベクターを用いた系を確立し、早急に分化誘導実験へと進展できるように現在進めている。

2. List of Publications
Original Articles
1. Yoshida, M., Hosomi, R., Fukunaga, K., Kanda, S. and Nishiyama, T.
Tissue Lanthanum Deposition and Phosphorus Balance in Rats with Long-term Dietary
Administration of Lanthanum Carbonate.
Biomed. Res. Trace Elements レフェリー有, 23, 2012, 40-44.
2. Tamada, Y., Kanda, S., Yoshidome, A., Hayashi, I., Miyake, M. and Nishiyama, T.
Diagnosis of active tuberculosis using MPB64, a specific antigen of Mycobacterium bovis.
Microbiol. Immunol. レフェリー有, 56, 2012, 740-747.
Proceedings
1. Okazaki, H., Kanda, S., Suzuki, H., Ooka, H., Nishiyama, T. and Tomoda, K.
Characterization of adult mouse tissue specific stem/progenitor cells in inferior colliculus.
10th Annual Meeting International Society Stem Cell Research (ISSCR), Yokohama, 2012.6.
2. 大隅泰則, 神田靖士, 大岡久司, 岡崎はるか, 西山利正, 友田幸一.
下丘における加齢にともなう GluN1 遺伝子の発現制御
第 35 回日本分子生物学会年会, 福岡, 2012.12.

-157-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Molecular mechanism of lymphocyte trafficking
リンパ節のホーミングの分子機構に関する研究

P.I.

Tatsuo Kinashi, 木梨達雄

Affiliation

Molecular Genetics, 附属生命医学研究所 分子遺伝学部門

Collaborators

片貝智哉、植田祥啓、羽廣克嘉、富山尚、安田鐘樹、近藤直幸

Keywords

chemokine, antigen receptor, integrin, cell migration

E-mailkinashi@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
With two-photon imaging using lymph node (LN) tissues, we found that high-speed interstitialmigration of T cells required adhesion through LFA-1 and ICAM-1. Reduced lymphocyte
densities within LN augmented dependency of LFA-1 and ICAM-1 for interstitial migration of T
cells, suggesting that competitive binding to ICAM-1 is involved in T-cell intranodal migration.
To clarify the roles of Mst1 in thymocyte selection processes, we found that Mst1 deficiency
impaired negative selection against self-antigen. Two-photon imaging revealed that
CD4+thymocytes formed conjugates with Aire+ medullary thymic epithelial cells throughMst1-dependent LFA-1/ICAM-1 adhesion and recognized self-antigen. Consequently,
Mst1-deficient mice expressing OT-II and OVA transgenes exhibited defective negative selection
with increased activated effector T cells
Furthermore, Mst1 deficiency impaired antigen-specific suppression functions of regulatory T
cells. Wild-type regulatory T cells formed mobile immunological synapse formation and madefrequent contacts with antigen-presenting dendritic cells, and down-regulate a costimulatory
molecule CD86 on DC. In contrast, Mst1-deficient regulatory T cells were defective in
immunological synapse formation. The impairment of thymic selection and suppression functionsof regulatory T cells likely underlie autoimmunity development of Mst1-deficient mice.
リンパ節スライス法による 2 光子イメージングを樹立し、T 細胞の組織内高速移動には
LFA-1/ICAM-1 を介する接着が必要であることを明らかにした。リンパ節内のリンパ球密度が低下すると LFA-1/ICAM-1 依存性が高まることから、ICAM-1 に対する競合的結合がT 細胞の移動に関与していると考えられる。
胸腺細胞の選択過程において Mst1 の関与を調べた結果、Mst1 欠損によって自己抗原による負の選択が障害されていた。2 光子顕微鏡による解析の結果、胸腺組織内におけるCD4 陽性細胞は Mst1 依存性に Aire 陽性胸腺上皮細胞と LFA-1/ICAM-1 を介して接着し、抗原認識を行っていることが明らかになった。これらの結果と一致して、
OVA 抗原と OT-II
Ｔ細胞受容体の遺伝子を発現したマウスでは負の選択が障害され、末梢に活性化したエフ
ェクターＴ細胞が増加していた。
また、Mst1 欠損によって制御性 T 細胞の抗原依存的抑制作用が障害されていた。制御性 T 細胞は移動性の免疫シナプスを形成し、樹状細胞と頻繁に接触を繰り返し樹状細胞の CD86 の発現低下を引き起こしていたが、Mst1 欠損によってこれらの過程が障害されていた。したがって、胸腺および制御性 T 細胞の障害の結果、Mst1 欠損マウスは自己免疫を発症することが示唆された。
優れた成果があがった点
負の選択環境下での胸腺内自己抗原認識過程を 2 光子顕微鏡を用いて可視化でき、
Mst1 による胸腺上皮細胞との接着制御が負の選択に必要であることを示した
問題点
特になし
-158-

2. List of Publications
Original Articles
2. Ueda, Y., Katagiri, K., Tomiyama, T., Yasuda, K., Habiro, K., Katakai, T., Ikehara, S.,
Matsumoto, M. and Kinashi, T.
Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen-recognition in thethymus.
Nat. Commun. レフェリー有, 2012 3,1098.
7. Sekine, K., Kawauchi, T., Kubo, K., Honda, T., Herz, J., Hattori, M., Kinashi, T. andNakajima, K.
Reelin controls neuronal migration and positioning by promoting neuronal adhesion to
extracellular matrix via the inside-out activation of integrin α5β1.
Neuron, レフェリー有, 76, 2012, 353-369.
8. Fujii, Y., Shiota, M., Ohkawa, Y., Baba, A., Wanibuchi, H., Kinashi, T., Kurosaki, T. and Baba,Y.
Surf4 modulates STIM1-dependent calcium entry.
Biochem. Biophys. Res. Commun. レフェリー有, 422, 2012, 615-620.
9. Harada, Y., Tanaka, Y., Terasawa, M., Pieczyk, M., Habiro, K., Katakai, T.,
Hanawa-Suetsugu, K., Kukimoto-Niino, M., Nishizaki, T., Shirouzu, M., Duan, X., Uruno, T.,
Nishikimi, A., Sanematsu, F., Yokoyama, S., Stein, J.V., Kinashi, T. and Fukui, Y.
DOCK8 is a Cdc42 activator critical for interstitial dendritic cell migration during immune
responses.
Blood, レフェリー有, 119, 2012, 4451-4461.
Proceedings
1. Kinashi, T., Katakai, T., Ueda, Y. and Kondo, N.
Regulation of Lymphocyte “Stop and Go”: Analysis of Lymphocyte Trafficking using Live
Imaging Techniques,
第 23 回 CDB ミーティング”Building multicellular systems from cellular cross-talk”, 神戸,
2013.1.
2. 木梨達雄.
接着制御破綻による自己免疫発症の機序
第 16 回中国地区小児免疫宅物療法研究会, 広島, 2013.3.
3. Kinashi, T.
Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in thethymus.
第 41 回日本免疫学会学術集会シンポジウム, 神戸, 2012.12.
4. Katakai, T.
Autotaxin/lysophosphatidic acid axis is required for the optimal interstitial T cell migration
within lymph node.
第 41 回日本免疫学会学術集会, 神戸, 2012.12.
5. Ueda, Y.
Crucial roles of LFA-1 regulation in thymocyte trafficking and antigen recognition by Mst1.
第 41 回日本免疫学会学術集会, 神戸, 2012.12.
6. Tomiyama, T.
Roles of Mst1 in antigen-specific suppressor function of regulatory T cells.
第 41 回日本免疫学会学術集会, 神戸, 2012.12.
7. 木梨達雄
免疫細胞の組織内動態制御：イメージング手法による接着制御とその破綻の解析
第二回癌・免疫若手セミナー, 枚方, 2012.9.
8. 木梨達雄, 片貝智哉, 植田祥啓, 羽廣克嘉.
免疫細胞の組織内移動と停止の制御：イメージング手法による接着制御の解析
バイオイメージング学会, 京都, 2012.8.

-159-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Generation and image analysis of a gene-modified animal model
疾患モデル動物の作製およびイメージング

P.I.

Sung-il Lee, 李成一

Affiliation

Model Animals, モデル動物部門

Collaborators

小沢まどか

Keywords

ES cells, gene-engineered mouse, dendritic cells

E-mailsilee@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
In previous studies, we identified small GTPase Rap1a, its effector RAPL, and Mst1 as aregulator of trafficking of a lymphocyte. These molecules control integrin activation of alymphocyte by "inside-out" signaling like a stimulus of an antigen receptor or chemokine. In our
experiment, we investigated how Rap1 signaling would be concerned in adhesion of DCs, andcontrol of trafficking using Rap1 sensor by FRET. We observed that the activation of Rap1 wasintroduced only by adhesion with ICAM-1 in BMDCs, although needs the "inside-out" signal for alymphocyte. When a stimulus of CCL21 was added, activation of Rap1 was increased, andespecially it was remarkable in leading edge. In order to investigate what kind of role Rap1
signaling has in trafficking of DCs in vivo, we labeled the Mst1+/+DCs and the Mst1-/- DCs byrespectively different fluorescence, and injected to the foot-pad of C57BL6J mice. As a result ofobserving lymph node under the 2 photon microscopes, that the efficiency of trafficking to lymph
node was decreased in Mst1-/- DCs as compared with WT DCs. It was guessed that Rap1
signaling is important for adhesion and trafficking control of DCs.
v 以前、我々は small GTPase Rap1a とそのエフェクターRAPL および Mst1 をリンパ球のTrafficking のレギュレーターとして同定した。これらの分子は、抗原レセプターやケモカ
インの刺激のような”inside-out”シグナリングでリンパ球のインテグリン活性化を制御する。本実験では、我々は DCs の接着と trafficking の制御において、FRET による Rap1 セ
ンサーを使って、Rap1 シグナリングがどのように関わっているかを調べた。
その結果、リンパ球が Rap1 を活性化するには“inside-out”シグナルが必要なのに対して、
BMDCs では Rap1 の活性化が ICAM-1 との接着だけで誘導されることを確認した。CCl21の刺激を入れた場合さらに Rap1 の活性化は上がり、特にそれは leading edge に顕著であった。
In vivo において、DCs の遊走に Rap1 シグナリングがどのような役割を持っているかを調べるために我々は Mst1+/+ DCs と Mst1-/- DCs をそれぞれ別の蛍光でラベルし、C57BL6J
マウスのフットパットへ injection した。2 光子顕微鏡でリンパ節を観察した結果、WT DCsと比較して Mst1-/- DCs はリンパ節への遊走の効率が悪いことがわかった。これらのデー
タから DCs の接着や Trafficking の制御には Rap1 シグナリングが重要であると考えられる。
優れた成果があがった点
DC の接着や Trafficking に Rap1 シグナリングが重要であると確認できた。
問題点
特になし

2. List of Publications
Proceedings
1. Ozawa, M., Ueda, Y., Lee, S.I., Katakai, T. and Kinashi, T.
Roles of Rap1 signaling in dendritic cells migration.
日本免疫学会学術集会, 神戸, 2012.12.
-160-

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Identification of causative material of small-bowel obstruction from
histopathological sections by MALDI-imaging mass spectrometry
質量顕微鏡法を用いた病理標本解析による腸管内腔閉塞原因物質の同定と発症機構の解明

P.I.

A-Hon Kwon, 権雅憲

Affiliation

Surgery, 外科学講座

Collaborators

山田正法、海堀昌樹

Keywords

gastric cancer, liver metastasis, ileus, imaging mass spectrometry

E-mailkon@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Bowel obstruction or intestinal
obstruction is a mechanical or functional
obstruction of the intestine that prevents
the normal transit of digested materials.
It can occur at any levels distal to theduodenum of the small intestine and istypically considered to represent a
medical emergency. The case in thisstudy, surgery was needed to remove thenecrotic tissue and causative materials.
Laparoscopic operation was performed toexcise the inflamed small intestine and Fig. 1 Schematic diagram of the analysis in this study
the obstructive material. For imaging MS
analysis, the surgically isolated intestinal portion and the foreign body were fixed and paraffin
embedded as performed routinely at Kansai Medical University Hospital. Even after the materials
were removed, the cause and the identity of the materials were not clarified. To obtain theinformation of the extirpated materials, imaging mass spectrometry (IMS) technique was
employed.
Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-mass
spectrometry (MS) provides the means for in situ molecular analysis of a wide variety of
biomolecules. This technology, IMS, allows measurement of biomolecules in their native
biological environments without the need for target-specific reagents such as antibodies. In thisstudy, we applied the IMS technique to formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples to
identify a substance(s) responsible for the intestinal obstruction caused by an unidentified foreign
body. In advance of IMS analysis, some pre-treatments were applied. After deparaffinization ofsections, samples were subjected to enzyme digestion. The sections co-crystallized with matrix
were desorbed and ionized by a laser pulse with scanning. With IMS Convolution software which
we developed, we could automatically extract meaningful signals from IMS datasets. The
representative peak values were m/z 1013, 1175, 1337, 1499, 1661, 1823, and 1985. Thus it was
revealed that the material was polymer with 162 Da unit size, calculated from the even intervals.
In comparison with mass spectra of the histopathological specimen and authentic materials, themain component coincided with amylopectin, rather than amylose. Tandem MS (MS/MS) analysis
proved that the main component were oligosaccharides. Finally, we confirmed the identification ofamylopectin by staining with periodic acid-Schiff (PAS) and iodine. These results for the first timeshow the advantages of MALDI-IMS in combination with enzyme digestion for direct analysis ofoligosaccharides as a major component of histopathological samples.
The developing rate of liver metastasis in gastric cancer is from 5 to10% and the rate of hepatic
resection is less 10%. Although the liver a frequent location of metastases from gastric cancer,
hepatic resection is seldom indicated for metastatic gastric cancer because of mutiple hepatic
nodules or associated peritoneal dissemination.
We should analysis to detect that typical biomolecule that it is compared primary cancer to-161-metastatic cancer with MALDI-imaging mass spectrometry.

Conclusion:
With direct MALDI-TOF MS imaging, we identified mochi as the obstructing material in asmall intestinal obstruction. The results in this study indicate that IMS is a very rapid and accurate
technique with high sensitivity for direct analysis for histopathological samples. This is the firstcase of identification of oligosaccharides as a main component of histopathological samples using
direct MS analyses. MALDI-TOF MS in combination with enzyme digestion will be a support for
the histopathological study (Yamada et al., Anal. Bioanal. Chem.402, 1921-1930, 2012).
It is difficult to collect those samples (liver metastases) in gastric cancer, because thedeveloping rate of liver metastasis in gastric cancer is from 5 to10% and the rate of hepatic
resection is less 10%.
質量顕微鏡法を用いて腸閉塞の原因となった異物の成分を同定した。
1)質量顕微鏡法を用い外科手術で摘出された異物の病理組織標本から位置情報と質量ス
ペクトルを同時取得する。
食餌性異物による腸閉塞・穿孔性腹膜炎を併発した症例に対して、食餌性異物を含む病
理標本パラフィンブロックから 4μm 厚の切片を作製し、脱パラフィン処理後、適当な消化酵素を用い、標本中の分子を切断し、前処理を標本上で行った。前処理したサンプルを質量顕微鏡法により解析した。
2)質量顕微鏡法で画像化された分子種の同定を行う。
質量顕微鏡法で得られた情報から物質の成分を推定した。ポリマーのユニット構造を予想したところ多糖類であることが予想された。更に、多段階質量分析 MS/MS 測定を用いて病理組織標本を解析した結果、グルコースをユ
図１ 質量顕微鏡法による腸閉塞原因物質解析の概要
ニットとするアミロペクチンであることが判明した。これは餅の成分であることが知られている（図 1）。
3)各種の特殊病理染色法を用い検証する。
病理検査で行われている各種の特殊染色法で組織標本の染色を行った。異物の病理標本を作製し、特殊染色を施した結果、糖原か炭水化物の可能性を示唆する PAS 染色で陽性の結果を得た。S-100 蛋白染色による腫瘍検出、
Kossa 染 色 に よ る カ ル シ ウ ム 検 出 、 及 び
Dylon・Congo red でのアミロイド検出はすべて陰性であった（図 2）。また CD68 染色も陰性であり、生体内での異物反応は認めなかった。
以上の結果より、腸閉塞の原因物質が餅であ図２ 病理特殊染色結果ることが明らかとなった。
4)胃癌肝転移症例におけるバイオマーカーの同定
胃癌肝転移(stageIV)は外科的適応になることは少ないが、原発・肝転移巣(H1)が遺残な
く切除できる場合には切除を施行している。胃癌再発指標となる腫瘍マーカーとしては一
般的に CEA/CA19-9 などが使用されているが必ずしも再発病変との相関を示すことがな
いのが現状である。今後胃癌肝転移症例からバイオマーカーとなりうる分子を同定する予定である。
-162-

優れた成果があがった点
通常の病理検査では解明できない標本を、質量顕微鏡を使用することにより物質の成分を同定できた。腸閉塞の原因物質となった餅を質量分析を使用して分析したことが本邦で始めてであった。今回のように疾患の原因の同定はその予防に寄与できるものであると考えられる。通常の病理検査では解明できないケースに質量顕微鏡を適応することにより、原因を解明することができた。
胃癌肝転移切除症例の標本を採集しており、今後同様に分析を施行する予定である。
問題点
胃癌の肝転移に対して切除可能症例は年間 1～2 例と乏しく症例数確保に問題が残る。

2. List of Publications
1.

Yamao, J., Toyokawa, H., Kim, S., Yamaki, S., Satoi, S., Yanagimoto, H., Yamamoto, T.,
Hirooka, S., Matsui, Y., and Kwon, AH. Activation of alpha-smooth muscle actin-positive
myofibroblast-like cells after chemotherapy with gemcitabine in a rat orthotopic pancreaticcancer model. J. Hepatobiliary Pancreat. Sci. レフェリー有, 20, 206-213, 2013.

2.

Kaibori, M., Tanigawa, N., Kariya, S., Ikeda, H., Nakahashi, Y., Hirohara, J., Koreeda, C.,
Seki, T., Sawada, S., Okazaki, K., and Kwon, AH. A prospective randomized controlled trialof preoperative whole-liver chemolipiodolization for hepatocellular carcinoma. Dig. Dis. Sci.
レフェリー有, 57, 1404-1412, 2012.

3.

Araki, Y., Kaibori, M., Matsumura, S., Kwon, AH., and Ito, S. Novel strategy for the control
of postoperative pain: long-lasting effect of an implanted analgesic hydrogel in a rat model of
postoperative pain. Anesth. Analg. レフェリー有, 114, 1338-1345, 2012.

4.

Kaibori, M., Ishizaki, M., Matsui, K., and Kwon, AH. Clinicopathologic characteristics ofpatients with non-B non-C hepatitis virus hepatocellular carcinoma after hepatectomy. Am. J.
Surg. レフェリー有, 204, 300-307, 2012.

5.

Inoue, K., Nakane, Y., Michiura, T., Yamada, M., Mukaide, H., Fukui, J., Miki, H., Ueyama,Y., Nakatake, R., Tokuhara, K., Iwamoto, S., Yanagimoto, H., Toyokawa, H., Satoi, S., andKwon, AH. Ultrasonic scalpel for gastric cancer surgery: a prospective randomized study. J.
Gastrointest. Surg. レフェリー有, 16, 1840-1846, 2012.

6.

Matsui, Y., Yamaki, S., Yamamoto, T., Isizaki, M., Matsui, K., Yanagimoto, H., Toyokawa,
H., Kaibori, M., Satoi, S., and Kwon, AH. Absence of cystic duct leakage using locking clips
in 1017 cases of laparoscopic cholecystectomy. Am. Surg. 78, 1228-1231, 2012.

7.

Yokoigawa, N., Ogura, T. and Kwon, AH. Successful surgical control of peritoneal
dissemination of hepatocellular carcinoma. Case Rep Gastroenterol. レフェリー有, 6,
612-617, 2012.

8.

Yamada, M., Yao, I., Hayasaka, T., Ushijima, M., Matsuura, M., Takada, H., Shikata, N.,
Setou, M., Kwon, AH. and Ito, S. Identification of oligosaccharides from histopathologicalsections by MALDI imaging mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. レフェリー有, 402,
1921-1930, 2012.

-163-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Examination of application of IBM-BMT to intractable diseases of the nervous
system
難治性神経疾患に対する骨髄内骨髄移植の適用の検討

P.I.

Susumu Ikehara, 池原進

Affiliation

Stem Cell Disorders, 幹細胞異常症学（共同研究講座）

Collaborators

李銘、李清、石明Keywords

IBM-BMT, thymus, autoimmune diseases, tumor-bearing mice

E-mailikehara@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Gr-1 Ab administered in the IBM-BMT-plus-TT setting, suppresses tumor growth by depleting
the granulocytic myeloid-derived suppressor cells.

It has been shown that allogeneic intra-bone marrow–bone marrow transplantation (IBM-BMT)
plus thymus transplantation (TT) is effective for recipients with malignant tumors. Although TT
increases the percentage of T cells in the early period after BMT, the myeloid-derived suppressor
cells (MDSC) are still the dominant population. We used the Gr-1 Ab to deplete the granulocytic
MDSC (G-MDSC) in tumor-bearing mice that received IBM-BMT+TT Two weeks after the BMT,
the tumors in the Gr-1 Ab-injected mice were smaller than those in the control group. In addition,
Gr-1 Ab significantly increased the percentages of CD4+ and CD8+ T cells and decreased thepercentages of MDSC and G-MDSC cells. No side effects of the Gr-1 Ab on recipient or donor
thymus were observed.
担癌マウスを用い、骨髄内骨髄移植と胸腺移植と Gr-1 抗体を併用により、MDSC を除去し、癌の増殖を抑制することの検討を行った。
骨髄内骨髄移植と胸腺移植を併用するにより、悪性腫瘍の治療に有効な方法であることが明らかにした。骨髄移植後胸腺移植により、Ｔ細胞の比率は増加したが、MDSC もまた存在する。担癌マウスにおいて骨髄内骨髄移植と胸腺移植を併用し、MDSC を除去する
ために Gr-1 抗体を投与した。投与後 2 週目に 腫瘍サイズは 対照群より小さくなり、CD4 と CD8 の比率も増加し、MDSC の比率は低下したことが明らかにした。レシピエン
トとドナーの胸腺に Gr-1 抗体による副作用はみられなかった。
優れた成果があがった点
骨髄内骨髄移植と胸腺移植による免疫治療する上に、Gr-1 抗体を併用し、MDSC を除去することにより腫瘍の根治療法を開発した。
問題点
MDSC を除去するタイムミングと腫瘍の大きさとの関係が問題である。

2. List of Publications
Original Articles
1. Li, M., and Ikehara, S. Bone marrow stem cell as a potential treatment for diabetes. J. Diabetes-164-Res. レフェリー有, 2013, 329596, 2013.

2. Li, M., and Ikehara, S. Bone-marrow-derived mesenchymal stem cells for organ repair. StemCells Int. レフェリー有, 2013, 132642, 2013

3. Shi, M., Li, M., Cui, Y., Liu, L., Adachi, Y. and Ikehara, S. CD4+ T cell-depleted lymphocyte
infusion impairs neither the recovery of recipient thymus nor the development of transplanted
thymus. J. Immunol. レフェリー有, 190, 2976-2983, 2013.

4. Shimo, T., Adachi, Y., Yamanouchi, S., Tsuji, S., Kimata, T., Umezawa, K., Okigaki, M,
Takaya, J., Ikehara, S. and Kaneko, K. A novel nuclear factor κB inhibitor,
dehydroxymethylepoxyquinomicin, ameliorates puromycin aminonucleoside-induced
nephrosis in mice. Am. J. Nephrol. レフェリー有, 37, 302-309, 2013.

5. Shima, C., Adachi, Y., Minamino, K., Okigaki, M., Shi, M., Imai, Y., Yanai, S., Takahashi, K.
and Ikehara, S. Neuroprotective effects of granulocyte colony-stimulating factor on
ischemia-reperfusion injury of the retina. Ophthal. Res. レフェリー有, 48, 199-207, 2012.

6. Li, M., Vanella, L., Zhang, Y., Shi, M., Takaki, T., Shapiro, JI. and Ikehara, S. Stem celltransplantation increases antioxidant effects in diabetic mice. Int. J. Biol. Sci. レフェリー有,8, 1335-1344, 2012.

7. Zhang, Y., Hosaka, N., Cui, Y., Shi, M., Li, M., Li, Q. and Ikehara, S.
Effects of intra-bone marrow-bone marrow transplantation plus adult thymus transplantation on
survival of mice bearing leukemia.

Stem Cells Dev. レフェリー有, 21, 2012, 1441-1448.

Proceedings
1. 保坂直樹, 高橋伯夫, 池原進.
胸腺移植を併用した新しい骨髄移植法の悪性腫瘍への効果 II：胎生、新生、成体期の造血幹細胞と胸腺の比較.
第 101 回日本病理学会総会, 東京, 2013.4.

2. 保坂直樹, 高橋伯夫, 池原進.
骨髄内骨髄移植と成体胸腺併用移植による白血病の治療 II.
第 102 回日本病理学会総会, 札幌, 2013.6.
Patents
1. 発明の名称：悪性腫瘍の治療方法
国名：アメリカ
出願番号：786094
登録番号：US7541025
発明者名：池原 進 他-165-

Division of
Metabolic Disorders

代謝部門

-166-

Annual Report 研究成果報告書
Study of fibril formation in the extracellular matrix
細胞外マトリックス線維形成の加齢変化に関する研究

Title of Project
P.I.

Tomoya Akama, 赤間智也

Affiliation

Neuropharmacology, 神経病態薬理学（薬理学講座）

Collaborators

赤間智也、東淳子、野田和男、井上唯史、増田実希

Keywords

extracellular matrix, elastic fibers, gene-engineered mice

E-mailakamat@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
LTBP2 encodes a matrix protein, latent TGFb-binding protein 2 (LTBP-2), which is one offour LTBP family proteins (LTBP-1 to LTBP-4). LTBPs are multidomain glycoproteins containing
EGF-like domains and eight-cysteine domains, both of which are also found in other matrix
proteins, fibrillin-1 and -2. As the name indicating, LTBP bind to TGFβ molecules and function tokeep the signaling molecule inactive in the extracellular matrix of tissues until further induction
releases active TGFβ from the complex. Despite of homology and resembled domain structurewith other LTBPs, LTBP-2 does not bind to TGFβ molecules and thus the protein seems to have afunction distinct from direct involvement to TGFβ signaling. Several reports including ours
indicated association of LTBP-2 with microfibrils, which consist mainly of fibrillin-1, andsuggested to play a critical role in elastic fiber assembly. Recently homozygous mutations on
LTBP2 have been found on genetic eye diseases such as primary congenital glaucoma andmicrospherophakia in human, indicating an essential role of the protein in eye development.
Ltbp2-deficient mice have been reported as the homozygous mutant mice die at early embryonicstage, suggesting an essential role of LTBP-2 over early embryogenesis in mice. However, thisgene-knockout study of mice was inconsistent with the studies in human since LTBP2 mutation
was not reported for birth defect and/or early developmental abnormalities. Because of thisdiscrepancy, LTBP-2 seemed to have different function among species in vivo.
We have independently created conditional Ltbp2 mutant mice that have minimum alterationof mouse genome, and created systemic homozygous mutant mice to confirm their phenotype as
previously reported. Surprisingly, the homozygous mutant mice survived at adult stage without
obvious abnormality. By extensive analyses, however, we found that the homozygous mutant micedevelop lens luxation due to impaired ciliary zonule formation without typical phenotype related
to glaucoma. Suppression of LTBP2 expression in cultured human ciliary epithelial cells by
siRNA reduced formation of microfibril meshwork on the cells. Supplementation of recombinant
LTBP-2inculturemedium notonly

rescuedmicrofibril

meshwork

formationin

LTBP2-suppressed ciliary epithelial cells, but also restored unfragmented microfibrils on ciliary
epithelial cells of Ltbp2 mutant mouse eyes under organ culture, indicating essential function of
LTBP-2 for ciliary zonule formation. LTBP-2 contained a binding domain to fibrillin-1 at a second
half domain of the entire EGF-like repeats. Mutant LTBP-2 proteins that kept the fibrillin-1
binding domain intact were not secreted from their producing cells, suggesting secretion arrest
occurred to the mutant LTBP-2 proteins due to conformational alteration led by the mutations.
Ltbp2 mutant mouse is an ideal model animal for congenital lens luxation and ectopia lentis in
human.
細胞外マトリックスの一つである微小線維は 肺や大動脈、皮膚といった伸縮性のある-167-

組織に存在する弾性線維形成の足場になる一方で、眼球の毛様小体では微小線維そのもの
が 水晶体を毛様体筋につなぎ止める働きをしていると考えられている。微小線維は主に細胞外マトリックスタンパク質であるフィブリリン 1・2 から成り立っているが、その構築機構は未だに明らかとなっていない。我々は弾性線維および微小線維形成機構の解明に向けて研究を進めており、遺伝子改変マウスや培養細胞系を用いて線維形成に必須な遺伝
子群とその役割の解析を行なっている。
LTBP (latent TGFβ binding protein)蛋白質はその名の通り TGFβと結合して不活性型として細胞外マトリックス中に保持し、インテグリンなどによる刺激に応じて活性型 TGFβを放出すると考えられている蛋白質群である。アミノ酸配列の相同性からこれまでにLTBP1-4 の 4 種類が報告されているが、これらの中で LTBP2 だけは TGFβと結合しないことが示されており、その生物学的機能が不明であった。しかしながらこれまでにいくつかの論文でヒトの遺伝病の一つである先天性緑内障の原因が LTBP2 の遺伝子変異であることが報告され、LTBP2 の眼球における機能が指摘された。また最近になって更に複数の論文で、二次的に緑内障を引き起こす遺伝性球状水晶体の患者での LTBP2 の遺伝子異常が報告された。これらの結果から LTPB2 の水晶体構造、特に水晶体と毛様体筋をつなぐ
毛様小帯と呼ばれる線維の形成への関与が強く示唆され、LTBP2 の機能不全が毛様小帯の脱落を引き起こし、さらには緑内障発症へつながると予想された。しかしこれらのLTBP2 の機能を実験的に確認するシステムが存在せず、現在のところ直接的な証明はされていない。
以前の研究でマウスにおける Ltbp2 遺伝子欠損は胎生致死と報告され、LTBP2 の発生初期における役割が示唆されていた。しかしながらこの結果はヒトの LTBP2 欠損による遺伝
病の表現型とは大きく異なっており、ヒトとマウスの種差として説明されてきた。我々はCre-loxP システムを用いた、より人為的な影響の出にくい Ltbp2 遺伝子欠損マウスを作成し、その表現型を解析した。これらの変異マウスは特に目立った表現型を示さず、野生型と同様に成体にまで正常に発生し、交配も可能であった。しかしながら詳細な解析の結果、眼球内で水晶体をつなぎ止める毛様小帯の線維形成が Ltbp2 変異マウスでは大きく損なわれており、断片化した線維が見られるのみであった。このことから Ltbp2 変異マウスはヒトの遺伝性水晶体脱臼および球状水晶体のモデル動物となり得るものと結論された。
優れた成果があがった点
我々が作成した Ltbp2 遺伝子変異マウスの表現型はヒトで発見された LTBP2 遺伝子変異による水晶体脱臼の症状とよく一致しており、ヒトの眼疾患のモデル動物となるものと考えられる。この変異マウスを用いて研究を進めることにより、水晶体脱臼発症のメカニズムを解析できるものと期待される。
問題点疾患モデル動物としてマウスを用いる場合の欠点の一つとして得られるサンプル量に限りがある点が挙げられ、特にマウスの毛様小体から得られるタンパク量は非常に少なくその後の解析に限界がある。この問題点を解決するため、正常眼球としてはブタの眼球を用いてタンパク質の調製や機能解析を行うことを検討している。

2. List of Publications
Original Articles
1. Horie, T., Baba, O., Kuwabara, Y., Chujo, Y., Watanabe, S., Kinoshita, M., Horiguchi, M.,
Nakamura, T., Chonabayashi, K., Hishizawa, M., Hasegawa, K., Kume, N., Yokode, M., Kita,
T., Kimura, T. and Ono, K.
MicroRNA-33 Deficiency Reduces the Progression of Atherosclerotic Plaque in ApoE(-/-)
Mice.
J. Am. Heart. Assoc. レフェリー有, in press, 2012.
2. Noda, K., Dabovic, B., Takagi, K., Inoue, T., Horiguchi, M., Hirai, M., Fujikawa, Y., Akama,
T.O., Kusumoto, K., Zilberberg, L., Sakai, L.Y., Koki, K., Naitoh, M., von Melchner, H.,-168-

Suzuki, S., Rifkin, D.B. and Nakamura, T.
Latent TGFβ binding protein 4 promotes elastic fiber assembly by interacting with fibulin-5.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, レフェリー有, 110, 2013, 2852-2857.
3. Suzuki-Anekoji, S., Suzuki, A., Wu, S.-W., Angata, K., Murai, K.K., Sugihara, K., Akama,
T.O., Khoo, K.-H., Nakayama, J., Michiko N. and Fukuda, M.N.
In Vivo Regulation of Steroid Hormones by the Chst10 Sulfotransferase in Mouse.
J. Biol. Chem. レフェリー有, 288, 2013, 5007-5016.
Proceedings
1. 中邨智之
LTBPのTGFβ非依存的な役割
第44回日本結合組織学会学術大会・第59回マトリックス研究会大会 合同学術集会,
東京, 2012.6.
2. 赤間智也, Leona Ho, 小泉範子, 中邨智之
ジーントラップ型とノックアウト型の遺伝子変異マウスにおけるレポーター遺伝子
発現の相違
第 31 回日本糖質学会年会, 鹿児島市, 2012.9.
3. Nakamura, T.
Latent TGFβ binding protein 4 converts microfibrils to elastic fibers by interacting withfibulin-5.
Joint Meeting of the Society for Glycobiology & American Society for Matrix Biology, San
Diego, U.S.A. 2012.11.
4. Ho, L., Akama,T.O., Koizumi, N., Nakamura, T.
Disruption of B3gnt2 expression may not be achieved by gene-trapped mutant mice.
Joint Meeting of the Society for Glycobiology & American Society for Matrix Biology, San
Diego, U.S.A. 2012.11.
5. Akama, T.O., Fukuda, M., Fukuda, M.N., Nakamura, T.
Formation of an enzyme complex for efficent production of keratan sulfate
glycosaminoglycan.
Joint Meeting of the Society for Glycobiology & American Society for Matrix Biology, San
Diego, U.S.A. 2012.11.
6. 赤間智也, 福田道子, 中邨智之
β3GnT7は効率的なケラタン硫酸グリコサミノグリカン生合成に必須である
第85回日本生化学会大会, 福岡市, 2012.12.

-169-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Analysis of signal transduction molecules involved in proliferation,
development and stemness
がん幹細胞の機能・分化に関わるシグナル分子の解明

P.I.

Satoshi Matsuda, 松田達志

Affiliation

Cell Signaling, 生体情報部門

Collaborators

大谷真志

Keywords

PI3K、mTOR、cell proliferation、cell differentiation

E-mailmatsudsa@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Members of the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) family are important for the differentiation,
proliferation, and survival of a variety of cells, including immune cells. The basic activity of these
enzymes is to phosphorylate the third position of the hydroxyl group in the inositol ring ofphosphatidylinositol. There are four subclasses of the PI3K family; among these, class IA PI3K,
composed of a catalytic subunit (p110α, β, or δ) and a regulatory subunit (p85α, p55α, p50α,
p85β, or p55γ), works downstream of receptors such as T cell receptor (TCR) and CD28 in T cells
whose signaling pathways involve protein tyrosine kinases and Ras. By using p85α and p110γ
double deficient mice, we found that class IA and IB PI3Ks play a redundant role in mast celldifferentiation as well as mast cell function like antigen-induced degranulation. It is thus likelythat a chemical compound inhibiting both class IA and IB PI3Ks functions as a potent anti-allergy
drug.
In many cell types, PI3K signals through mammalian target of rapamycin complex1 (mTORC1)
consisting of mTOR, Raptor, and mLST8. For instance, it has been shown that PI3K-mTORC1
axis regulates the nuclear translocation of IRF7 for the production of type I interferon (IFN) in
plasmacytoid dendritic cells. Production of IL-12 in conventional dendritic cells (cDCs) is also
regulated by molecules downstream of PI3K including mTORC1. In CD4+ T cells, thePI3K-Akt-mTORC1 axis contributes to the activation, survival, and proliferation upon stimulation
through TCR and CD28. In collaboration with Koyasu Laboratory in Keio University School of
Medicine, we found that the suppression of this axis by deletion of p85α or PI3K/mTORC1
inhibitors as well as T cell-specific deletion of Raptor, an essential component of mTORC1,
impaired Th17 differentiation in vitro and in vivo in a S6K1/2-dependent fashion. Inhibition of
PI3K-Akt-mTORC1-S6K1 axis impaired the downregulation of Gfi1, a negative regulator of Th17
differentiation. We further found that S6K2, a nuclear counterpart of S6K1, was induced by the
PI3K-Akt-mTORC1 axis, bound RORγ, and carried RORγ to the nucleus. These results point
toward a pivotal role of PI3K-Akt-mTORC1-S6K1/2 axis in Th17 differentiation. We also foundthat mTORC1 plays an essential role in IL-10 production from a certain type of cDCs existing in
the gastrointestinal tract, and that dendritic cell-specific loss of mTORC1 signal, which is causedby specific deletion of Raptor in dendritic cell lineage, leads to uncontrolled inflammation in theintestine. Our data reveal a new role of the mTORC1 pathway in cytokine production besides
canonical cell proliferative regulation.
PI3K-mTOR 経路は細胞の増殖・分化・生存を制御する細胞内シグナル伝達経路であり、種々のがん組織においてその異常が報告されている。本研究では、PI3K-mTOR 経路に関わる各種分子の遺伝子改変マウスを対象に、これらシグナル伝達経路の活性の増減が各種
血球系細胞の分化・増殖過程に及ぼす影響の解析を試みた。
第一に、クラス IA PI3K の制御サブユニットである p85αを欠失したマウス（以下、
p85α-KO マウス）、クラス IB PI3K の触媒サブユニットである p110γを欠失したマウス（以-170-

下、p110γ-KO マウス）
、両者を共に欠失した p85α/p110γ二重欠損マウス（以下、DKO）
を用いて、マスト細胞機能の解析を行った。In vitro 分化系を用いた解析により、DKO マ
ウス由来の血球系幹細胞を用いた際に、明らかな分化の遅れが観察されたことから、血球系幹細胞からの効率的なマスト細胞分化誘導にクラス IA・クラス IB PI3K 経路が協調的に関わっていることが強く示唆された。さらに、分化誘導したマスト細胞を調べると、
DKO マウス由来マスト細胞の脱顆粒能が著しく低下していることが明らかとなり、クラス IA・IB の両経路を標的とすることで、効率的な抗アレルギー治療が可能になるものと考えられた。
第二に、mTOR 経路の中でも、特に細胞増殖と密接に関わる mTORC1 経路に着目し、
mTORC1 シグナルに必須のアダプター分子である Raptor 分子の細胞系譜特異的欠損マウスの樹立に取り組んだ。Raptor 分子を T 細胞系列特異的に欠失させたところ、末梢のヘルパーT 細胞の機能分化が部分的に阻害されることが分かった。また、活性化に伴う T 細胞の生存率が mTORC1 シグナルの無い状態では著しく低下する可能性も示唆され、現在、詳細を検討中である。一方、樹状細胞系譜特異的に Raptor 分子を欠損させると、腸管における従来型樹状細胞の IL-10 産生能の低下と、それに伴う腸管免疫応答の異常亢進が観察された。すなわち、mTORC1 シグナルが、従来型樹状細胞において抑制性サイトカイ
ン IL-10 の産生を介したホメオスタシス調節に関与することが明らかとなった。現在は、解析対象をさらに B 細胞系譜特異的 Raptor 欠損マウスに拡充し、解析に取り組んでいる。
優れた成果があがった点
世界に先駆けて樹状細胞特異的 Raptor 欠損マウスの樹立に成功し、従来は薬剤を用いて解析されてきた mTORC1 シグナルの重要性を、個体レベルで検証することに成功した。
問題点
キャンパスの引越に伴う保有マウスの SPF 化作業のため、年度の後半はほとんど実験を進めることができなかった。現在、T 細胞系譜特異的ならびに B 細胞系譜特異的 Raptor
欠損マウスの作出に努めており、数が揃い次第、実験の再開に取り組む予定である。

2. List of Publications
Original Articles
1. Takayama, G., Ohtani, M., Minowa, A., Matsuda, S. and Koyasu, S.
Class I PI3K-mediated Akt and ERK signals play a critical role in FcεRI-induced
degranulation in mast cells.
Int. Immunol. レフェリー有, 25, 2013, 215-220.
2. Powers, S.E., Mandal, M., Matsuda, S., Miletic, A. V., Cato, M. C., Tanaka, A., Rickert, R.C.,
Koyasu, S. and Clark, M.R.
Subnuclear cyclin D3 compartments and the coordinated regulation of proliferation andimmunoglobulin variable gene repression.
J. Exp. Med. レフェリー有, 209, 2012, 2199-2213.
3. Ohtani, M., Hoshii, T., Fujii, H., Koyasu, S., Hirao, A. and Matsuda, S.
mTORC1 in intestinal CD11c+CD11b+ dendritic cells regulates intestinal homeostasis bypromoting IL-10 production.
J. Immunol. レフェリー有, 188, 2012, 4736-4740.
4. Kurebayashi, Y., Nagai, S., Ikejiri, A., Ohtani, M., Ichiyama, K., Baba, Y., Yamada, T., Egami,-171-

S., Hoshii, T., Hirao, A., Matsuda, S., and Koyasu, S.
PI3K-Akt-mTORC1-S6K1/2 axis controls Th17 differentiation by regulating Gfi-1 expression
and nuclear translocation of RORγ.
Cell Reports, レフェリー有, 1, 2012, 360-373.
Proceedings
1. Matsuda, S., Nagai, S., Hoshii, T., Koyasu, S., Hirao, A. and Ohtani, M.
Role of the mTORC1 signaling pathway in acquired immunity.
第 35 回日本分子生物学会年会, 福岡, 2012.12.
2. Ohtani, M., Fujii, H., Sakai, K., Hoshii, T., Watanabe, T., Koyasu, S., Hirao, A. and Matsuda,
S.
mTOR complex 1 is critical for B cell development.
第 35 回日本分子生物学会年会, 福岡, 2012.12.
3. Nagai, S., Kurebayashi, Y., Ikejiri, A., Ohtani, M., Baba, Y., Hoshii, T., Hirao, A., Matsuda, S.
and Koyasu, S.
PI3K-Akt-mTORC1-S6K axis controls Th17 differentiation.
第 35 回日本分子生物学会年会, 福岡, 2012.12.
4. Matsuda, S. and Ohtani, M.
Role of the mTORC1 signaling pathway in T cell function.
第 41 回日本免疫学会総会, 学術集会, 神戸, 2012.12.
5. 藤猪英樹、小安重夫、松田達志
制御性 T 細胞機能発現における PI3K の役割
第 22 回 Kyoto T Cell Conference, 京都, 2012.7.
6. 永井重徳、紅林泰、大谷真志、松田達志、小安重夫
PI3K-Akt-mTORC1-S6K1/2 経路は Gfi の発現および RORγ の核移行を調節することにより Th17 分化を制御する
第 22 回 Kyoto T Cell Conference, 京都, 2012.7.
7. 大谷真志, 星居孝之, 平尾敦, 藤猪英樹, 小安重夫, 松田達志
樹状細胞における mTORC1 は IL-10 産生を介して腸管免疫に関与する
第 22 回 Kyoto T Cell Conference, 京都, 2012.7.
8. Ohtani, M., Hoshii, T., Fujii, H., Koyasu, S., Hirao, A. and Matsuda, S.
mTORC1 in dendritic cells regulates intestinal homeostasis by IL-10.
20th International Symposium on Molecular Cell Biology of Macrophages 2012, 本郷,2012.6.

-172-

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Development of novel therapeutic strategy and elucidation of functional basis
for intractable diseases by human dendritic cell research
ヒト樹状細胞によるさまざまな病態関連応答の解明と新たな難病治療戦略の開発

P.I.

Tomoki Ito, 伊藤量基

Affiliation

Internal Medicine 1, 内科学第一講座

Collaborators

野村昌作、尾形誠、中西孝尚、田中晶大、稲垣詔子、木畑佳代子

Keywords

dendritic cells, IFN-α, IL-6, TNF, ICOS ligand, RANKligand, TSLP, platelets

E-mailitot@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
1) Interaction between thymic stromal lymphopoietin (TSLP) and human dendritic cells (DCs)
plays an essential role in evoking inflammatory Th2 responses in allergy through expression of
CCL17 by DCs, which recruits memory Th2 cells to the skin. We newly identified the novel
cross-talk mechanism between DCs and platelets in enhancement of immune inflammatory
responses. We found that TRAP (thrombin receptor agonist peptide) induced RANK ligand
expression on platelets, which promoted the CD86 expression on DCs. We further clarified thatthe activated platelets enhanced the production of CCL17 induced by the TSLP-activated DCs
through RANK ligand. Thus, platelets have the ability to enhance the DC-mediated Th2 response
and may contribute to the allergic inflammation. Our study could provide new insights of platelet
function into the possible mechanism of DC-mediated allergic response.
2) Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) have the potential to prime CD4+ T cells to differentiate
into IL-10-producing T regulatory cells through preferential expression of ICOS-ligand (ICOS-L).
Although pDCs produce cytokines such as type I IFNs, TNF-α, or IL-6 accompanying
upregulation of ICOS-L expression during activation, the roles of the pDC-derived cytokines inT-cell priming remain largely elusive. Therefore, we investigated the functional involvement ofthese cytokines in generating IL-10-producing T regulatory cells. We found that either IFN-α orIL-6 enhanced the ICOS-L-driven generation of IL-10-producing T cells from naïve CD4+ T cells
and their regulatory functions. However, IFN-α stimulation in the absence of ICOS-L showed
only a marginal tendency to increase the T cell production of IL-10 and thus pDC-derived type I
IFNs could function together with ICOS-L. In addition, IL-6 functioned to generate
IL-10-producing T cells only on T-cell priming by pDCs activated by Th2 condition. Thus, type I
IFNs and IL-6 act as supplementary factors for the ICOS-L-dependent IL-10-producing T celldifferentiation in pDCs. We also showed that pDC-derived TNF-α induced the ICOS-L expression
on pDCs in an autocrine manner and that IL-6 promoted the ICOS expression on T cells,
contributing to the ICOS/ICOS-L-mediated T cell response. Our results identify the molecular andfunctional basis underlying the tolerogenic pDC function in the adaptive immunity and suggestthat the ICOS-L-mediated regulatory T cell induction is backed up by the elaborate
cytokine-producing ability of pDCs.
1）アレルギー発症機序において樹状細胞（Denderitic Cell:DC）は Th2 関連アレルギー性
炎症を惹起し、アレルギー性炎症カスケードを引き起こす。上皮由来のサイトカインである胸線間質リンパ球増殖因子(thymic stromal lymphopoietin:TSLP)が、ミエロイド系 DC から TARC (thymus and activation-regulated chemokine, CCL17)を産生させることにより、メモ
リーTh2 細胞の局所浸潤とアレルギー性炎症の維持に重要な役割を果たすことが報告されている。
一方、血小板は炎症・血栓・動脈硬化において重要な役割をしており、サイトカインやTNF スーパーファミリーなどの様々な免疫メディエーターを発現している。しかしなが-173-

ら、血小板と DC のクロストークによるアレルギー免疫応答調節機序の報告は殆ど無い。
今回我々は新たに、活性化血小板が RANK リガンド (RANKL:Receptor Activator for
Nuclear Factor B Ligand)を発現することを同定した。この活性化血小板によって、DC の持
つ CD86 は発現増強し、さらに TSLP と同時に活性化血小板を添加することによって、DCから産生される CCL17 が増加することも明らかにした。さらに、活性化血小板に発現す
る RANKL が CD40L とともに TSLP-DC から産生される CCL17 を増加させる責任因子の一つであることを確認した。したがって、血小板は DC による Th2 免疫応答を増強し、ア
レルギー性の炎症を増幅させる可能性が示唆された。
また、活性化血小板を添加することにより成熟した TSLP-mDC とナイーブ T 細胞またはメモリーT 細胞を共培養し IL-4,IL-5,IL-13 の産生の上昇、つまり Th2 アレルギー応答に関連していることを確認した。
2）DC サブセットのうち、ヒト形質細胞様 DC (plasmacytoid DC:pDC)は、免疫応答初期には I 型 IFN 産生細胞として機能するが、その後、成熟して抗原提示細胞として機能する。
この成熟 pDC が分化誘導する T 細胞は、IL-10 産生制御性 T 細胞(Treg)であることが判明している。この機序の直接の責任分子が pDC が発現する ICOS リガンドである。一方、
pDC は ICOS リガンドの発現以外に、刺激活性化に伴い、I 型 IFN,IL-6,TNFαというサイトカインを産生するが、IL-10 産生 Treg 誘導に、これらサイトカインが、どのような作用をきたすかは不明であった。
我々はこの点を検討し、pDC の持つサイトカイン産生能も、ICOS リガンドによる IL-10
産生 Treg 誘導に合理的に作動していることを明らかにした。
１． pDC が産生する I 型 IFN は、ICOS リガンド存在下で、ICOS リガンドの持つ IL-10
産生 Treg 誘導能を増強する。
２． pDC の産生する IL-6 は、Th2 環境で IL-10 産生 Treg 誘導を増強するが、Th1 環境では、T 細胞分化において IL-10 産生に寄与しない。また、IL-6 は T 細胞に対して、ICOS
発現を増強することも確認し、ICOS リガンドによる効果を増強する一因と考えられる。
３．pDC の産生する TNFαは、ICOS リガンドの発現に対してもオートクラインの増強因子として機能していることを証明した。
これらの結果から pDC は抗原提示細胞としては、ICOS リガンドを発現することによりTreg 分化誘導を行うことに特化した細胞と言えるが、pDC の産生するサイトカインも、
この Treg 分化誘導を補助するように合理的に機能する。すなわち、pDC は ICOS リガン
ドを発現するのみならず、そのサイトカイン産生能も Treg 分化誘導に寄与するように精巧に作られている細胞であると考えられた。
優れた成果があがった点
DC に由来するアレルギー応答において、血小板による新たな増幅機序の可能性が考えられた。すなわちアレルギーの機序に樹状細胞のみならず、凝固系物質である血小板の役割を解明できた。
「炎症」という観点に対し、樹状細胞という免疫応答の司令塔的細胞の視点と、凝固線溶系因子である血小板に着目し、その関連を解明した。血小板の多面的な効能については国内外に種々の報告があるが、樹状細胞に基点をおいた研究は類を見ず、この点も優れた成果と考えられる。
pDC が炎症免疫応答病態ではなく、むしろ末梢寛容に貢献するという報告が集積されつつあることが、pDC の持つサイトカイン産生能も、ICOS リガンドによる IL-10 産生 Treg
誘導に合理的に作動していることを明らかにし、pDC の持つ Treg 分化誘導能の細胞学的分子メカニズムを解明できた。
問題点
in vivo での活性を検討できていないので、今後、マウスを用いた系での生体内での検討が必要と思われる-174-

2. List of Publications
Original Articles
1. Shimamoto, K., Ito, T., Ozaki, Y., Amuro, H., Tanaka, A., Nishizawa, T., Son, Y., Inaba, M.
and Nomura, S.
Serum interleukin-6 before and after therapy with tocilizumab is a principal biomarker inpatients with rheumatoid arthritis.
Rheumatology. レフェリー有, , in press, 201
2. Ogata, M., Ito, T., Shimamoto, K., Nakanishi, T., Satsutani, N., Miyamoto, R. and Nomura, S.
Plasmacytoid dendritic cells have a rational cytokine-producing capacity to enhance ICOS
ligand-mediated IL-10 production during T-cell priming.
Int. Immunol. レフェリー有 25, 2013, 171-182.
3. Ito, T.
Immune crosstalk between platelets and dendritic cells.
J. Japanese Society for Laboratory Hematology レフェリー有, 13, 2012, 397-340.
4. Ozasa, R., Hotta, M., Yoshimura, H., Nakanishi, T., Tamaki, T., Fujita, S., Nakamichi, N.,
Miyaji, M., Ishii, K., Ito, T. and Nomura, S.
Therapeutic effect of bortezomib for primary plasma cell leukemia followed by auto/allo stem
cell transplantation.
Int. Med. Case Rep. J. レフェリー有, 5, 2012, 39-43.
5. Conrad, C., Gregorio, J., Wang, Y-H., Ito, T., Meller, S., Hanabuchi, S., Anderson, S.,
Atkinson, N., Ramirez, P. T. Liu, Y-J., Freedman, R. and Gilliet, M.
Plasmacytoid dendritic cells promote immunosuppression in ovarian cancer via ICOS
co-stimulation of Foxp3+ T regulatory cells
Cancer Res. レフェリー有, 72, 2012, 5240-5249.
6. Fujita S, Nakanishi T, Yoshimura H, Hotta M, Nakamichi N, Tamaki T, Ishii K, Ito T,
Nomura S.
TGFβ(1) and sCTLA-4 levels are increased in eltrombopag-exposed patients with ITP.
Thromb. Res. レフェリー有, 130: 2012 415-9.
Books
1. 伊藤量基反応する核酸の種類と樹状細胞サブセットの産生するサイトカイン
科学評論社, 臨床免疫・アレルギー科, 2012, 10 ページ, 57, 234-243.
2. 伊藤量基
樹状細胞の分化・機能発現とサイトカイン
科学評論社, 臨床免疫・アレルギー科特別増刊号, 2012, 9 ページ, 57 suppl.21 689-697.
3. 伊藤量基
形質細胞様樹状細胞からの I 型インターフェロン産生抑制による新たな自己免疫疾患の治療
科学評論社, 臨床免疫・アレルギー科, 2012, 8 ページ, 58, 217-224.
Proceedings
1. 伊藤量基
血小板と樹状細胞の免疫クロストーク
第 13 回日本検査血液学会, 大阪, 2012.7.
2. 中西孝尚
An intimate link between dendritic cells and platelets in the maintenance of allergic response.
XXVII Congress of the International Society for Advancement of Cytometry, ドイツ・ライプ
ツィヒ, 2012.6.
3. 中西孝尚
樹状細胞と血小板の共同作用によるアレルギー性炎症の新たな機序
第 22 回日本サイトメトリー学会, 大阪, 2012.6.

-175-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Invention of cardiac regeneration therapy using molecular imaging techniques
分子イメージングによる心筋再生療法の開発

P.I.

Ichiro Shiojima, 塩島 一朗

Affiliation

Internal Medicine 2, 内科学第二講座

Collaborators

岩崎真佳、藤高啓祐、秦亮嘉

Keywords

cardiac stem cells, embryogenesis, myocyte regeneration

E-mailshiojima@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
The heart is the first organ to form during embryogenesis, and its contractile function is
maintained throughout life. Since cardiac myocytes lose their ability to proliferate soon after birth,the heart has been recognized as a post-mitotic organ that does not regenerate in response tovarious external stimuli. Recent studies however support the notion that small number of cardiac
myocytes are continuously renewed and that there exist cardiac intrinsic stem cells in the adult
heart that are capable of differentiation into various cell types including cardiac myocytes,
endothelial cells, and smooth muscle cells. The mechanism that controls the cardiac stem cell self
renewal and differentiation is largely unknown and, if elucidated, will have a broad impact in thefield of stem cell biology, organogenesis, and tissue regeneration.
We previously reported that human cardiac stem-like cells that are capable of differentiating
into multiple cell types in the heart can be mobilized into circulation during open heart surgery.
The specific aims of the present study are three-fold:(1) Establishment of the methodology to mobilize human cardiac stem cells with high efficiency
into circulation(2) Identification of cardiac stem cell-specific surface markers that can be used for imaging ofcardiac intrinsic stem cells(3) Identification of stem cell niche components in the heart
In this year we focused on the establishment of the methodology to mobilize human cardiac
stem cells with high efficiency into circulation and found that intravenous infusion of heparinmobilizes cardiac stem cells in peripheral circulation. Mechanistically, serum concentration ofhepatocyte growth factor (HGF) was markedly upregulated following heparin infusion in humansubjects, and HGF treatment was able to mobilize cardiac stem cells in rats, suggesting that
heparin induces the mobilization of cardiac stem cells via upregulation of HGF.
The observation that a relatively simple method (i.e., heparin infusion) is highly effective tomobilize cardiac stem cells is of both basic and clinical importance. Using this method, we willproceed to the identification of human cardiac stem cell-specific surface markers that can be used
for imaging of cardiac intrinsic stem cells. Identification of cardiac stem cell-specific markers willfurther advance our understanding of cardiac homeostasis and regeneration.
心臓は胎児発生の初期に形成され、その後も生涯にわたりその機能が維持される。哺乳類では心筋細胞の分裂能が出生直後に失われることから、心臓は再生しない臓器であると従来考えられてきたが、近年の解析により、成人期の心臓に心筋細胞や血管系の細胞に分化しうる組織幹細胞が存在することや、正常なヒトにおいても年間約１％の心筋細胞が新たに作られた細胞と入れかわることなどが明らかにされた。しかしながら組織幹細胞による心臓再生の分子メカニズムの詳細については現在ほとんど知られておらず、その制御機構が明らかになれば、幹細胞分化・組織の恒常性維持・器官再構築といった点において大-176-

きなインパクトを持つものと考えられる。
我々はこれまで心筋細胞・血管内皮細胞・血管平滑筋細胞など心臓内の複数の細胞種に分化しうるヒト心臓組織幹細胞が心臓手術中に末梢血に動員されることを明らかにしてきた。そこで本研究では以下の３点について検討することを目的とする。
①ヒト心臓幹細胞を効率よく末梢血中に動員する方法の確立②ヒト心臓幹細胞のイメージングに使用可能な特異的表面抗原の同定③心臓組織において心臓幹細胞が局在するニッチの同定
平成 24 年度の研究により、ヘパリンの静脈投与がヒト心臓からの組織幹細胞動員を起こ
すこと、また、ヘパリンが細胞外マトリクスに結合した hepatocyte growth factor (HGF)を遊離させ HGF 血中濃度を上昇させることが、心臓組織幹細胞が末梢血へ動員される機序であることが明らかになった。
優れた成果があがった点
ヒト心臓組織幹細胞が血中へ動員される機序を明らかにし、効率よく in vitro で培養することが可能になった点が最も優れた成果であると考えられる。
問題点
今後詳細な解析を進めていく上では動物モデルの確立が必須である。現在マウスやラットを用いてヘパリンによる心臓幹細胞の末梢血への動員を試みているが、ヒトの場合と異なり一定数の幹細胞が再現性をもって得られるところまでには至っていない。今後実験条
件のさらなる検討が必要であると考える。

2. List of Publications
Proceedings
1. 藤高啓祐.
ヘパリンによる多能性ヒト Mesoangioblast の循環血中への動員
日本再生医療学会, 横浜, 2012.6.

2. Hata, Y.
Multipotent human mesoangioblast mobilization induced by heparin.
European Society of Cardiology Congress, ドイツ・ミュンヘン, 2012.8.
3. Hata, Y.
Heparin induces the mobilization of human multipotent circulating mesoangioblasts during
cardiac catheterization.
日本循環器学会, 横浜, 2013.3.

-177-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Molecular imaging in the development of carcinogenesis and tissue
regeneration in inflammatory diseases of the digestive organs.
炎症性消化器疾患の発癌と再生における分子イメージング解析

P.I.

Kazuichi Okazaki, 岡崎和一

Affiliation

Internal Medicine 3, 内科学第三講座

Collaborators

西尾彰功、内田一茂、坂口雄沢、福井由理、栗島亜希子、住本貴美、光E-mailokazaki@hirakata.kmu.ac.jp

山俊行、岡崎敬、豊永貴彦、福井寿朗、吉田勝則、岸本房久、高橋悠、
鈴木尚、山口貴志
Keywords

molecular imaging, stem cells, tumor, epithelial regeneration, tumor, colitis,
autoimmune pancreatitis

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
In the pancreas and gastrointestinal tract, we studied the significance of IgG4-positive cells andpSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells as biomarkers in inflammatory gastrointestinal
disorders. In differenciating IgG4-related autoimmune pancreatitis and pancreas cancer, thenumbers and ratios of Tregs, IgG4-positive, and IgG-positive cells immunohistochemically stainedwith anti-Foxp3, IgG4, and IgG antibodies, respectively, were useful. In the regenerative study,
pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells were detected in specific epithelial cells around
crypt bases of both small intestines and colons of C57BL/6 mice, where respective putative stem
cells are thought to exist. In small intestines, most pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells
were located around the +4 cell position from the bottom of crypts (just above Paneth cells). A few
of them were also located at the places for CBCs (between Paneth cells). Double
immunofluorescent staining for pSmad2/3L-Thr and Ki67 demonstrated that pSmad2/3L-Thr
immunostaining-positive cells were located adjacent to actively proliferating cells (proliferatingzone) in both small intestines and colons, but immunohistochemical co-localization of
pSmad2/3L-Thr with Ki67 was never observed. In the regeneration phase of DSS-induced colitis,
pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells significantly increased, concurrent withhyperplastic changes and an increase in the number of Ki67 immunostaining-positive cells.
Double immunofluorescent staining for pSmad2/3L-Thr and CK8 demonstrated that
pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells were epithelial cells, but that for pSmad2/3L-Thrand Chr-A demonstrated that they were not enteroendocrine cells. In higher magnification with alight microscope, pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells indicated undifferentiatedmorphological features and were reconfirmed around crypt bases. pSmad2/3L-Thr
immunostaining-positive cells showed co-localization with CDK4 immunostaining-positive cells.
Although pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells were included in the
immunostaining-positive areas of MSI-1, they showed different localization from DCAMKL1
immunostaining-positive cells. MSI-1 and DCAMKL1 are candidate biomarkers for epithelial
stem (or progenitor) cells in the small intestine and colon. Most pSmad2/3L-Thr
immunostaining-positive cells were included in the Lgr5-GFP positive cells in crypt bases ofcolons. Conversely, in small intestines, most pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells
showed different localization from Lgr5-GFP positive cells in the places for CBCs and werearound the +4 cell position, although a few of them were included in the Lgr5-GFP positive cells.
BrdU label-retaining assay revealed that pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells wereslow-cycling cells (i.e., LRCs).
1． 炎症性消化器疾患における病態解析とバイオマーカー探索：
IgG4 関連自己免疫性膵炎(AIP)と膵癌における免疫担当細胞と IgG4 陽性細胞の関連性の検討をおこない、膵癌上流閉塞性膵炎においても IgG4 と Foxp3 の相関関係が認められ-178-

た(R＝0.733)ことより膵癌周囲の膵炎と AIP で IgG4/IgG 陽性細胞比率および IgG4 陽性細胞数の解析は病態解析のバイオマーカーになる可能性が示唆された。
2. 消化管・膵・肝再生における幹細胞の探索と粘膜再生・発癌メカニズムの解析：
最新の幹細胞、細胞周期研究の知見や、各消化器疾患モデルマウスの知見を応用することにより、消化管粘膜上皮・膵における有用な新規組織幹細胞マーカーとしてリンカー部
スレオニンリン酸化 Smad2/3 蛋白(pSmad2/3L-Thr)を同定した。正常マウス小腸・大腸粘膜や DSS 起因性大腸炎モデル、IL-10 ノックアウトマウス大腸炎・大腸癌モデル・セルレ
イン膵炎といったモデルを作製し、pSmad2/3L-Thr と Ki-67 の蛍光二重免疫染色法にて同様に組織幹細胞を検出し、組織上皮幹細胞のマーカーとして利用できることを確認した。
特に DSS 起因性大腸炎モデル・セルレイン膵炎については pSmad2/3L-Thr 強陽性細胞を粘膜障害・再生の経過とともに経時的に確認し、活動性病変部では pSmad2/3L-Thr 強陽性幹細胞はほぼ消失しており、再生治癒状況が進行するにつれ消化管では粘膜基底部と膵では tubular complex における pSmad2/3L-Thr 強陽性幹細胞は著明に増加していた。消化管
粘膜には二種類(slow- or rapid- cycling)存在するとされる組織幹細胞のうち、slow-cyclingstem cell の特徴に合致すると考えられた。IL-10 ノックアウトマウス大腸炎・大腸癌モデルにおいては pSmad2/3L-Thr 強陽性細胞の分布を腸炎部、癌部にて観察したが、粘膜が過形成となる腸炎部では pSmad2/3L-Thr 強陽性細胞が著増していたが、癌部と思われた病変部では pSmad2/3L-Thr 強陽性細胞はほとんど発現していなかった。内視鏡的に摘出された組織標本(正常消化管粘膜組織や各消化管腫瘍組織)を利用して、同様に pSmad2/3L-Thr 強陽性細胞を検出する実験を予備的に施行したところ、腫瘍部において pSmad2/3L-Thr 強陽性細胞が散在性に認められた。
優れた成果があがった点
1． 膵癌において IgG4 陽性細胞の検討はいくつか報告があるがと IgG4 関連自己免疫性膵炎との比較で詳細に検討したものはなく、臨床上問題となる限局性を呈する自己免疫性膵炎と膵癌の鑑別において非常に有意義な研究となった。
2． 消化管粘膜上皮・膵における有用な新規組織幹細胞マーカーとしてリンカー部スレオ
ニンリン酸化 Smad2/3 蛋白(pSmad2/3L-Thr)を同定することができた。消化管粘膜上皮幹細胞のうち、pSmad2/3L-Thr 陽性幹細胞は、slow-cycling stem cell の特徴に合致し、細胞周期 G0 の状態にあり、細胞増殖周期に入っていく直前の状態の幹細胞を捉えていると考えられた。
問題点
1． 難病を対象としており、十分なサンプル数の確保が容易でない。
2． 細胞内蛋白質のリン酸化部位特異的な発現を見ているため、遺伝子を lineage tracing
するような遺伝子発現の実験と結びつけることが出来ず、また生きたまま細胞を回収できないためその後の培養実験などをすることが出来ない点。

2. List of Publications
Original Articles
1. Fukui, Y., Uchida, K., Sumimoto, K., Kusuda, T., Miyoshi, H., Koyabu, M., Ikeura, T.,
Sakaguchi, Y., Shimatani, M., Fukui, T., Matsushita, M., Takaoka, M., Nishio, A., Shikata, N.,
Sakaida, N., Uemura, Y., Satoi, S., Kwon, AH. and Okazaki, K.
The similarity of Type 1 autoimmune pancreatitis to pancreatic ductal adenocarcinoma withsignificant IgG4-positive plasma cell infiltration.
J. Gastroenterol. レフェリー有, in press, 2012.

-179-

Proceedings
1. 内田一茂, 福井由理, 楠田武生, 三好秀明, 小藪雅紀, 池浦司, 島谷昌明, 高岡亮, 岡崎
和一.
膵癌における IgG4 陽性形質細胞の検討
第 110 回日本内科学会講演会, 東京, 2013.4.

2. 高橋悠, 福井寿朗, 岡崎和一.
pSmad2/3L-Thr の消化管幹細胞マーカーとしての検討とその応用
第 99 回日本消化器病学会総会, シンポジウム 14「消化器領域における幹細胞研究の進歩」, 鹿児島市 2013.3.
3. 高橋悠, 福井寿朗, 岡崎和一.
消化管上皮における pSmad2/3L-Thr 陽性細胞の検討
第 98 回日本消化器病学会総会, シンポジウム 2「消化管 stem cell の新たな展開」, 東京, 2012.4.
4. Takahashi, Y., Fukui, T., Suzuki, R., Kishimoto, M., Uchida, K., Matsuzaki, K., Nishio, A. andOkazaki, K.
The specific linker phosphorylation of Smad2/3 indicates epithelial stem cells in oesophagus.
20th United European Gastroenterology Week. Amsterdam, Netherlands, 2012.10.
5. Fukui, T., Suzuki, R., Takahashi, Y., Kishimoto, M., Uchida, K., Nishio, A. and Okazaki, K.
The specific linker phosphorylation of Smad2/3 indicates epithelial stem cells in colon;
particularly increasing in the regeneration phase of murine model of dextran sulfate
sodium-induced colitis.
GI Research Academy 2012, Tokyo, 2012.6.
6. Takahashi, Y., Fukui, T., Kishimoto, M., Nakajima, A., Sakaguchi, Y., Uchida, U., Nishio, A.,
Matsuzaki, K. and Okazaki, K.
The Specific Linker Phosphorylation of Smad2/3 Indicates Epithelial Stem Cells in
Esophagus.
Digestive Disease Week 2012, San Diego, USA, 2012.5.

-180-

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Clarification of skin and soft tissue aging and tissue regeneration andapplication in diagnosis and treatment using molecular imaging.
皮膚・軟部組織の加齢変化、組織再生における分子イメージングによる病態解明と診断治療への応用

P.I.

Kenji Kusumoto, 楠本健司

Affiliation

Plastic and Reconstructive Surgery, 形成外科学講座

Collaborators

鈴木健司、森本尚樹、堀尾修、日原正勝、覚道奈津子、田中義人、光井俊人、畔熱行、笹尾卓史、櫛田哲史、勝部元紀、三宅良平、上田実幸、
堀内あい、プリシラ、小倉常敬、原朋也
Regeneration, reconstruction, wound healing, tissute, cell, skin, fat, bone,cartilage, nerve, vessel

Keywords

E-mailkusumoto@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
In our Department, improvement and healing after various growth factors applications promotewound healing is evaluated in biological and pathological wound healings by pathologicalmolecular imaging procedures. Pathological molecular procedures contributes basic research ofwound healing and regenerative medicine to treatment and reconstruction in medical fields.
In our research of 2012, bone regeneration, adipose-derived stem cells, and platelet-richplasma are in main studied.
Bone regeneration: Once critical sized defects of rat calvarial bone was produced, bonemorphogenetic protein (BMP), hydroxyapatite (HAP), and the mixture (BMP/HAP) arecomparatively implanted. the mixed BMP/HAP group showed the highest level of bone induction.
And osteoinduction using BMP has been studied in osteoporosis rats.
Adipose-derived stem cells (ASCs): Multi-potentiality of ASCs in differentiation is clarified at
the basis of differentiation into bone, cartilage, and fat tissue. It is confirmed that ASCs is possible
to contribute to regenerate broad medical fields.
Platelet-rich Plasma (PRP): Relation between PRP application and αSMA is clarified. On
wound healing models, PRP contributes vascularization. In chronic wounds, pressure sores andincurable wounds, PRP promotes wound healing so much.
形成外科学講座では、創傷の生理的ならびに病的治癒過程を病態分子イメージングでとらえ、さらに種々の組織再生因子の負荷により病的創傷治癒が生理的創傷治癒に近づける
過程を病態分子イメージングとしてとらえることで、明らかな改善、治癒に関与するエビ
デンスを出すことを目指している。この病態分子イメージングにより創傷治癒、組織再生における基礎研究を治療学、再建学につなげる大きな役割を果たすものと考えている。
平成 23 年度は、骨再生、脂肪組織由来幹細胞、多血小板血漿(PRP)で、それぞれの成果を挙げた。
骨再生：ラット頭蓋骨の規格化した限界的骨欠損を作成し、骨形成タンパク(BMP)単独、あるいは hysroxyapatite(HAP)単独、両者併用で埋入した。この結果、骨欠損部の修復再生が生じるが、これを X 線画像、組織学的所見での画像解析を行った。これにより、BMP
が HAP より優れ、BMP+HAP 併用が最も骨欠損修復再生に効果的であることが明らかとなった。
脂肪組織由来幹細胞(ASCs)

細胞内に低分子量 G タンパク質 Rho が存在するが、exoenzyme C3 transferase が Rho inihibitor である。今回、C3 を加えることによる ASC
cytoskeleton の変化を観察した。C3 負荷によりストレスファイバーや α-SMA の発現も抑制された。C3 は ASCs の細胞内伝達の抑制因子である可能性が示唆された。
多血小板血漿(PRP) 均一採皮創で、PRP をハーフサイドで上皮化を比較検討した。術後13 日目に組織生検を行い PRP 群で、有意に表皮が厚く、血管数と αSMA が多かった。PRPの有意なる創傷治癒促進効果と判断した。また、PRP は有意に αSMA の増加と瘢痕拘縮-181-を生じることを明らかにした。
優れた成果があがった点＃骨再生で、BMP と HAP 併用が有用、有効であることが明らかできたこと＃ASCs において、多分化能により、再生の基盤となることが示唆されたこと＃PRP による αSMA の増加と瘢痕拘縮の関連と創傷治癒促進の結果が明らかとなったこと
問題点
BMP、ASCs、PRP の更なる探求と、臨床応用での投与法の追究が今後の課題である。

2. List of Publications
Original Articles
1. Notodiharjo, F.Z., Kakudo, N., Kushida, S., Suzuki, K. and Kusumoto, K.
Bone regeneration with BMP-2 and hydroxyapatite in critical-size calvarial defects in rats.
J. Cranio-maxillo-fac Surg. レフェリー有, 40, 2012, 287-291.
2. 田中義人, 楠本健司, 竹本剛司, 日原正勝, 田中寧子
当院開院から現在までのケロイド 135 症例の検討
瘢痕･ケロイド治療ジャーナル, レフェリー有, 6, 2012, 66-68.
3. 楠本健司, 田中義人, 山本純 傷跡・瘢痕拘縮治療の理論と実際 5)組織拡張器(ティッシュ・エキスパンダー)の適応と使用 形成外科, レフェリー有, 55, 2012, S340-S344.
4. 堀尾 修, 楠本 健司 血管腫・血管奇形の分類と診断
形成外科, レフェリー有, 55, 2012, 1169-1176.
5. Kakudo, N., Kushida, S., Ogura, T., Hara, T., Suzuki, K. and Kusumoto, K.
The use of autologous platelet-rich plasma in the treatment of intractable skin ulcer: A caseseries. Open J. Regen. Med. レフェリー有, 1, 2012, 29-32.
6. Kakudo, N., Kushida, S., Suzuki, K., Ogura, T., Notodihardjo, P.V., Hara, T. and Kusumoto,K. Effects of transforming growth factor-beta1 on cell motility, collagen gel contraction,
myofibroblastic differentiation, and extracellular matrix expression of human adipose-derived
stem cell. Human cell, レフェリー有, 25, 2012, 87-95.
7. 楠本健司, 福田智, 三宅ヨシカズ, 覚道奈津子, 櫛田哲史 多血小板血漿(PRP)と褥瘡、
難治性皮膚潰瘍の治療．日本医事新報, レフェリー無, 4626, 2012, 65-68.
8. Kushida, S., Kakudo, N., Suzuki, K. and Kusumoto, K.
Effects of Platelet-Rich Plasma on Proliferation and Myofibroblastic Differentiation in Human
Dermal Fibroblasts. Ann. plast. surg. レフェリー有, in press, 2012.
Books
1. Kakudo, N., Kushida, S., Ogura, T., Suzuki, K. and Kusumoto, K.
Adipose-Derived Stem Cells and their Application in Tissue Engineering. Ed by Takeshi
Ishikawa and Masayoshi Yamamoto.
Tissue Engineering: Fundamentals, Techniques and Applications, 5, 2012, 89-96.
2. Kakudo, N., Kushida, S., Saito, N., Suzuki, K., Kusumoto, K.
Evaluation of the Effect of Glycolic Acid Chemical Peeling on Facial Skin by Computer
Analysis of Digital Camera-Captured Images. Ed by Leon V. Berhardt
Advances in Medicine and Biology, Nova Science Publishers, 56, 2012, 149-154.
3. Kakudo, N., Kushida, S., Saito, N., Suzuki, K., Kusumoto, K.
A Procedure for the Assessment of Skin Aging. Ed by Ayaka Ekiguchi and Moriko Imada
Skin Aging: New Research, 13, 2013, 131-136.
Proceedings
1. Kusumoto, K., Suzuki, K., Fukuda, S., Kakudo, N., Tanaka, Y., Sasao, S., Miyake, Y.,-182-

Kushida, S., Priscilla, V. and Ogura, T.
Autologous platelet-rich plasma(PRP) and the application for various wounds and poor
conditions.
The 11th Japan-Korea Congress of Plastic and Reconstructive Surgery, Awaji. 2012.5.
2. Morimoto, N., Ito, T., Kanda, N., Kawai, K., Nakamura, Y., Teramukai, S., Yokode, M.,
Maekawa, T., Shimizu, A. and Suzuki, S.
An exploratory clinical study on the safety and efficacy of an autologous fibroblast-seeded
artificial skin cultured with animal product-free medium in patients with diabetic foot ulcers.
World Union of Wound Healing Societies2012. Yokohama, 2012.9.
3. Kushida, S., Kakudo, N., Ogura, T., Suzuki, K. and Kusumoto, K.
Effects of Platelet-Rich Plasma on proliferation and myofibroblastic differentiation in humandermal fibroblasts.
World Union of Wound Healing Societies2012. Yokohama, 2012.9.
4. Ogura, T., Kakudo, N., Kushida, S., Suzuki, K. and Kusumoto, K.
Platelet-Rich Plasma promotes healing of mouse skin wounds and increases vascularization
World Union of Wound Healing Societies2012. Yokohama, 2012.9.
5. Notodihardjo, P.V., Kakudo, N., Suzuki, K., Yasui, M., Tabata, Y. and Kusumoto, K.
A combination of gelatin hydrogel and Platelet-Rich Plasma promotes wound healing in mice.
World Union of Wound Healing Societies2012. Yokohama, 2012.9.
6. Kusumoto, K., Suzuki, K., Fukuda, S., Kakudo, N., Tanaka, Y., Sasao, T., Miyake, Y.,
Kushida, S., Notodihardjo, P.V. and Ogura, T.
Autologous Platelet-Rich Plasma(PRP) and the application for chronic wounds.
World Union of Wound Healing Societies2012. Yokohama, 2012.9.
7. Kusumoto, K.
Autologous Platelet-Rich Plasma on wound healing and the practical applications.
World Union of Wound Healing Societies2012. Yokohama, 2012.9.
8. Miyake, Y., Fukuda, S. and Kusumoto, K.
The treatment with PRP(Platelet-Rich Plasma) for pressure ulcer pocket.
World Union of Wound Healing Societies2012. Yokohama, 2012.9.
9. Fukuda, S., Nakano, M., Kusumoto, K.
Wound healing-promoting effects of sulfadiazine silver(GEBEN cream)-review of our seriesWorld Union of Wound Healing Societies2012. Yokohama, 2012.9.
10. Ogura, T., Kakudo, N., Kushida, S., Suzuki, K. and Kusumoto, K.
Proliferative effect on human dermal fibroblasts using Platelet-Rich Plasma(PRP) prepared byan automatic blood separation device "MAGELLAN"
World Union of Wound Healing Societies2012. Yokohama, 2012.9.
11. Kuro, A., Suzuki, K., Horio, O., Kakudo, N., Miyake, R., Toki, H., Kushida, S., Ogura, T. andKusumoto, K.
Usefulness of voltage-applied unfrozen storage of blood vessels.
World Union of Wound Healing Societies2012. Yokohama, 2012.9.
12. Morimoto, N., Rino, A., Fujitaka, J., Ito, R., Nakamura, Y., Kawai, K. and Suzuki, S.
Evaluation of neovascularization in a grafted bilayered artificial dermis and a cultured dermis
using laser doppler imaging
World Union of Wound Healing Societies2012. Yokohama, 2012.9.
13. Nakano, M., Fukuda, S., Miyake, Y., Kusumoto, K.
Cystic tumors treatment with Platelet-Rich Plasma(PRP)
World Union of Wound Healing Societies2012. Yokohama, 2012.9.
14. Kusumoto, K.
New approaches for the use of PRP in chronic wounds.
The 4th International Regenerative Surgery. Rome, Italy, 2012.12.
-183-

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Cellular function imaging by x-ray microscopy
軟Ｘ線顕微鏡による細胞内機能イメージング

P.I.

Kuniko Kusumoto, 楠本(竹本)邦子

Affiliation

Physics, 物理学講座

Collaborators

楠本（竹本）邦子、新庄正路、松村義隆、市村薫

Keywords

soft X-ray microscope, µ-CT、carboxysomepolyphosphate granule, XX-ray
solution scattering, folding

E-mailtakemoto@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
1. Soft X-ray microscopy imaging(1) Soft X-ray microscopic examinations of prokaryotic organelle
Recently, many biologists categorize any compartment bounded by a biological membrane with adedicated biochemical function as an organelle. Therefore a number of unique and diverse
organelles can be found in the prokaryotic. Unstained and unsliced air-dried cells of the
cyanobacterium, Phormidium tenue, were observed using soft X-ray microscope and some X-ray
absorbed structures were found in the cells. To identify the structures, the transmission electron
microscope (TEM) and low temperature / low vacuum scanning electron microscope (lowtemperature / low vacuum SEM) were done. Results of the observations showed that the structures
were carboxysome and polyphosphate granule.
(2) Soft x-ray micro computed tomography (µ-CT) observation of phytoplankton
We used soft X-ray tomography to study the 3D ultrastructural organization of whole cells of theunicellular green alga producing musty odor, Phormidium tenue.
P. tenue cells were encapsulated in a glass capillary tube and air-dried. 2.0 nm wavelength wasused for imaging. Forty five images were acquired with a rotation step of 4° and an exposure
time of 180 s. Cross sectional images by the CT were reconstructed by the convolution
back-projection method with Shepp-Logan filter. Air-dried cells were imaged using the natural
X-ray absorption contrast of them and it succeeded in acquisition of the first µCT image.
2. Structural change of SH3 domain protein
We investigate structural changes of hNck2 SH3 domain protein.
This protein takes β-structure rich conformation at native condition. It is known that hNck2 SH3domain takes equilibrium α-helix-rich intermediate at acidic pH.
By X-ray solution scattering and structural calculation, we found the protein forms ellipsoidal
dimer in native condition and forms elongated monomer in acidic pH. Calculations aboutmolecular weight and pair distribution functions also support these results.
1. 軟 X 線顕微鏡による細胞内機能イメージング①原核細胞オルガネラの X 線顕微イメージング
シアノバクテリア中に存在する原核細胞オルガネラの X 線顕微イメージングを目指した。染色や薄片化していない微小シアノバクテリアを軟 X 線顕微鏡で観察し、細胞内部で顆粒状の構造体を可視することができた。透過型電子顕微鏡および走査型電子顕微鏡による観察を行い、これらの構造体はカルボキシソーム様構造体とポリリン酸顆粒であることを明らかにした。
②軟 X 線µ-CT 法によるシアノバクテリアの 3 次元微細構造観察
軟 X 線顕微鏡に 3 次元観察を導入し、X 線µ-コンピュータトモグラフィー(µ-CT)で細胞の 3 次元観察することを目指した。Phormidium tenue と同定されているシアノバクテリアを直径 10 µ m のガラスキャピラリィに封入し，結像型軟 X 線顕微鏡を用いて CT による3 次元観察した。回転角 4 度毎に 45 枚の投影像を取得し、断層像の再構成は Filtered-184-

Backprojection 法で，Shepp-Logan フィルターを用いて行い、
風乾状態の P. tenue の X 線µ -CT
像を得ることができた。
2.SH3 タンパク質のとり得る構造多形
hNcK2 SH3 ドメイン蛋白について、構造の pH 依存性、濃度依存性を調べ酸性 pH で非天然構造モノマーとして存在し、中性ではダイマーに構造が変化する事を見出した。X 線の溶液散乱を行い散乱曲線から構造を計算し、中性 pH では確かに体積の大きなダイマーを形成している事、その形状は楕円体的である事等が分かった。又、酸性 pH では天然構
造は壊れているが、非天然のα-helix を含んで広がった構造をとっていてランダムコイル
では無い状態であると理解される。
優れた成果があがった点
シアノバクテリアを丸ごと観察し、原核細胞オルガネラの存在を確認と X 線µ -CT 像の取得に成功した。
X 線溶液散乱の結果から分子構造、体積、分子量を検討してこの蛋白質が酸性で α-helixに富むモノマー、中性 pH でダイマーをとる事、中性でも希薄溶液下ではモノマーとなる事を明らかにした。
問題点
軟 X 線顕微鏡による細胞内機能イメージングにおいては、含水状態で P. tenue の X 線µ-CT 撮影も試みたが、時間経過と共に試料が動き、3 次元像を得るに至らなかった。次年
度は、含水状態での試料固定法を検討し，含水状態での X 線µ -CT 像の獲得を目指す。

2. List of Publications
Original Articles
1. Matsumura, Y., Shinjo, M., Matsui, T., Ichimura, K., Song, J. and Kihara H.
Structural study of hNck2 SH3 domain protein in solution by circular dichroism and X-ray
solution scattering. Biophys. Chem. レフェリー有, 175-176, 2013, 39-46.

2. 竹本邦子, 木原裕 他 5 名 琵琶湖産の糸状カビ臭産生藍藻 Phormidium tenue の細胞内微細構造観察：軟 X 線顕微鏡と透過型電子顕微鏡および低真空クライオ走査型電子顕微鏡を用いた比較観察 日本水処理生物学会誌, レフェリー有, 48, 2012, 157-163.
3. Takemoto, K., Ikegaya, H., Yaji, T., Ichise, S., Ohta, T. and Kihara, H.
Infrared Micro-Spectroscopy Observation of plantplankton with in Lake Biwa.
Memoirs of the SR Center, Ritsumeikan University, レフェリー有, 14, 2012, 173-17
4. Takemoto, K., Kihara, H. et al.Soft X-ray Imaging of Intracellular Structure of Leptolyngbya
tenuis (Phormidium tenue) generating musty smell in Lake Biwa.
Memoirs of the SR Center, Ritsumeikan University, レフェリー有, 14, 2012, 171-172.
5. Matsumura, Y., Matsui, T., Ichimura, K., Song, J. and Kihara, H.
Structural study of hNck2 SH3 domain protein by X-ray solution scattering I. Concentration
dependence at pH 6. Photon Factory Activity Report, レフェリー無, 29, 2012, 368.
6. Matsumura, Y., Shinjo, M., Matsui, T., Ichimura, K., Song, J. and Kihara, H.
Structural study of hNck2 SH3 domain protein by X-ray solution scattering II. pH-dependent
structural change. Photon Factory Activity Report, レフェリー無, 29, 2012, 367.
7. Matsumura, Y., Shinjo, M., Matsui, T., Ichimura, K., Song, J. and Kihara, H.
Structural study of hNck2 SH3 domain protein by X-ray solution scattering III. Structure ofhNck2 SH3 domain at pH2. Photon Factory Activity Report, レフェリー無, 29, 2012, 365.
8. Shinjo, M., Matsumura, Y., Ichimura, K., Song, J. and Kihara, H.
Structural study of hNck2 SH3 domain protein by X-ray solution scattering IV. Structural-185-

analysis of hNck2 SH3 domain at pH 2 and pH 6: non-native alpha-helix-rich monomer andnative dimer. Photon Factory Activity Report, レフェリー無, 29, 2012, 366.
Proceedings
1. 竹本邦子, 木原 裕 他 4 名. 結像型軟 X 線顕微鏡試料システム. 第 26 回日本放射光学会年会・放射光科学合同シンポジウム, 名古屋市, 2013.1.

2. 吉村真史, 竹本邦子, 大東琢治, 木原裕 他 2 名 軟 X 線顕微鏡による軽元素マッピ
ング. 第 26 回日本放射光学会・放射光科学合同シンポジウム, 名古屋市, 2013.1.
3. Matsumura, Y., Shinjo, M., Matsui, T., Ichimura, K., Liu, J., Song, J. and Kihara, H.
Equilibrium expanded non-native alpha-helix intermediate of hNck2 SH3 domain at acidic
pH. The 6th International Symposium “Molecular Science of Fluctuations toward Biological
Functions”, 京都, 2012.12.
4. Matsumura, Y., Jin, X., Shinjo, M., Kimura, S. and Kihara, H. Teraherz spectroscopy ofproteins by synchrotron radiation at UVSOR. The 6th International Symposium “Molecular
Science of Fluctuations toward Biological Functions”, 京都, 2012.12.
5. Shinjo, M., Matsumura, Y., Ichimura, K., Song, J., Kihara, H.
Structural analysis of hNck2 SH3 domain at various pH: non-native α-helix-rich monomer
and native dimer. 第 50 回日本生物物理学会年会, 名古屋, 2012.9.
6. Matsumura, Y., Shinjo, M., Matsui, T., Ichimura, K., Song, J., Kihara, H. Structural properties
and folding process of hNck2 SH3 domain.第 50 回日本生物物理学会年会, 名古屋, 2012.9.
7. Takemoto, K., Mizuta, G., Yamamoto, A., Yoshimura, M., Ichise, S., Namba, H. and Kihara,
H. Soft X-ray Imaging of Intracellular Granules in Filamentous Cyanobacterium.
11th International Conference on X-ray Microscopy, Shanghai, China, 2012.8.
8. Takemoto, K., Kishin, U., Ohigashi, T., Fujii, H., Yoshimura, M., Namba, H. and Kihara, H.
Improvement of Cryogenic 3-Dimensional Observation System of Soft X-ray Microscope at
the SR Center of Ritsumeikan University.
11th International Conference on X-ray Microscopy, Shanghai, China, 2012.8.
9. 松村義隆, 新庄正路, 松井つとむ, 市村薫, Jianxing Song, 木原裕.
X 線溶液散乱による hNck2 SH3 domain 蛋白質の構造研究 その 1.
第 21 会日本バイオイメージング学会学術集会, 京都, 2012.8.
10. 松村義隆, 新庄正路, 松井つとむ, 市村薫, Jianxing Song, 木原裕.
X 線溶液散乱による hNck2 SH3 domain 蛋白質の構造研究 その 2.
第 21 会日本バイオイメージング学会学術集会, 京都, 2012.8.
11. 新庄正路, 森本康幹, 小島正樹, Jinsong Li, Xianju Jin, 松村義隆, 木原裕.
src SH3 ドメインにおける初期フォールディング中間体の構造解析 II -Local Minimum構造の探索-. 第 21 会日本バイオイメージング学会学術集会, 京都, 2012.8.
12. 竹本邦子, 木原裕. 他 4 名 軟 X 線顕微鏡によるピコ植物プランクトンの粘質鞘の解析. 第 21 会日本バイオイメージング学会学術集会, 京都, 2012.8.
13. 竹本邦子, 木原裕 他 5 名. 軟 X 線顕微鏡による糸状植物プランクトンの細胞内顆粒の観察. 第 21 会日本バイオイメージング学会学術集会, 京都, 2012.8.
14. 木原裕, 竹本邦子, 他 4 名 生きた細胞の動きを観測する軟Ｘ線顕微鏡の開発. 第 21 回
日本バイオイメージング学会学術集会, 京都, 2012.8.
15. Matsumura, Y., Shinjo, M., Ichimura, K., Matsui, T., Song, J. & Kihara, H. Structural featuresof hNck2 SH3 domain, (1P-018, 6/20). 第 12 回日本蛋白質科学会年会, 名古屋, 2012.6.
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