ビフィズス菌利用食品における菌数測定方法の現状と課題
武藤正達，宮内浩文，越智(森永乳業株式会社 研究本部 素材応用研究所

浩，阿部文明〒2528583 神奈川県座間市東原 5183)

Current status and issues of methods for measuring the viable counts inbiˆdobacteria-containing foods
Masamichi Muto, Hirofumi Miyauchi, Hiroshi Ochi, Fumiaki Abe(Food Ingredients & Technology Institute, R&D Division, Morinaga Milk Industry Co., Ltd, 5
183, Higashihara, Zama,

Kanagawa 2528583, Japan)

要旨ÏÑœ¶μ菌n乳酸菌g共jÓéÌŸ¥ÂœªμgVe認識T’#様々i製品j添加T’eC‘"ÏÑœ¶μ菌m生菌数値n生理効果m指標gVe使用T’#åÕçj記載T’‘^ƒ#製造会社n賞
味期限時}fÏÑœ¶μ菌m生菌数˜維持X‘必要KAŒ#安定Ve菌数値˜計測X‘RgKfL‘
菌数測定技術K求ƒ‹’eC‘"本稿fn#}YÏÑœ¶μ菌m菌数測定技術j関Ve#重要i因子
fA‘寒天培地g希釈液m選択˜中心j説明X‘"次j#近年分析法n国際的i標準法K次々j制定
T’‘ŠEjiŒ#ÏÑœ¶μ菌m生菌数測定法j関Ve„2010年j国際標準法K発行T’eC‘^ƒ#RRfnÏÑœ¶μ菌数測定j関X‘国際標準法i‹rj日本jIP‘§ŸÅåŸï制定m動
LjcCe紹介X‘"最後m項fn#近年ÏÑœ¶μ菌数測定法j求ƒ‹’eC‘技術gVe#高精度i菌数測定˜行E^ƒj注意XxL点#菌種„VNn菌株特異的i菌数測定方法#培養法j依存V
iC新規m計測技術jcCe„触’‘"1.

産生ViC^ƒ#乳酸菌m定義J‹外’‘"}^Ïn W ƒ jÑœ¶μ菌fA‘ Biˆdobacterium 属g乳酸菌m代Ï Ñ œ ¶ μ 菌 n 1899 年 j Í μ À ô ç 研 究 所 m

表格fA‘ Lactobacillus 属˜比較X‘g#Biˆdoba-

Tissier 博士jŠŒ#乳児m糞便J‹発見T’^菌

cterium 属 n Actinobacteria 門 # Lactobacillus 属 nf#分類学上n Biˆdobacterium 属j分類T’‘«

Firmicutes 門j分類T’#門m階層J‹分類学上nåÜ陽性桿菌fA‘"発見当初#ÏÑœ¶μ菌n

異i‘Rg#Biˆdobacterium 属n偏性嫌気性菌j分Lactobacillus 属j分類T’^Rg„AŒ#乳酸菌m

類T’酸素存在下fn生育ViCK#Lactobacillus

一種gVe認識T’eC‘場合„A‘K#乳酸菌

属m多NK通性嫌気性菌j分類T’酸素存在下jI（Lactic acid bacteria）n分類学上m名称fniN#

Ce„生育X‘Rg#糖代謝jŠ‘生産物gVe

定義m 1 cj 50 以上m乳酸˜産生X‘RgK挙Biˆdobacterium 属nÏÑœ¶μ経路˜介Ve乳酸g

Q‹’eIŒ1)#ÏÑœ¶μ菌n50以上m乳酸˜

酢酸˜生産X‘K#Lactobacillus 属n乳酸˜生産X‘×Þ乳酸発酵#乳酸j加Ge酢酸†£»Êôç˜
生産X‘ÔÂé乳酸発酵„VNn\m両方m発酵˜E-mail: ma-mutou＠morinagamilk.co.jp

Vol. 68. 2018―8―

行 E i h # Biˆdobacterium 属 g Lactobacillus 属 n
分類・性質上大LN異i‘RgK分J‘1)"以上mŠEj#性質K異i‘Rgj起因Ve培養上m差異
K生W‘RgJ‹#菌数測定˜考G‘上fÏÑœ¶μ菌g乳酸菌n区別Ve考G‘xLfAŒ#\m^ƒ本稿fn両者˜区別Ve扱E"ÏÑœ¶μ菌˜配合V^製品n#日本jICen 1970 年代前半J‹
ÎÄwm健康増進˜目的j発売T’#現在fn発酵
乳#乳酸菌飲料#健康食品#海外fn育児用粉乳i
h#様々i製品j添加T’‘ŠEjibeC‘2)"ÓéÌŸ¥Âœªμm定義n# 2001 年j FAO /図1

培養法jŠ‘ÏÑœ¶μ菌m生菌数測定法m
概略図

WHO m 合 同 ë ô ¨ ï « « ç ô Ó j Š Œ 提 唱 T’3) #\m後 Hill ‹jŠbe修正T’^4) 「適正量
˜摂取V^際j宿主j有用i作用˜示X生菌体」gj液体状態f配合T’^場合g#¦Ó·ç†錠剤i

CE表現K広N用C‹’#生理作用˜期待X‘jnhm健康食品†#海外jIP‘育児用調製粉乳mŠ

一定量m生L^菌数˜摂取X‘RgK好}VCg一

Ej乾燥V^粉末状態f配合T’^場合m二通Œm

般的j考G‹’eC‘"\m^ƒ#配合T’^ÏÑ

配合形態KA‘"特j#粉末状態f配合T’^ÏÑœ¶μ菌m品質˜評価X‘指標m一cgVe#生菌œ¶μ菌˜測定X‘場合n#第一段階希釈m時j乾

数値K利用T’eC‘"生菌数n#希釈V^検体˜燥状態mÏÑœ¶μ菌m菌体内K再r水分f満^T

寒天培地j接種V#培養X‘RgjŠŒ得‹’‘¯’#代謝活性˜再r取Œ戻X復水g呼o’‘現象KéÇô˜¦¡ïÄX‘RgjŠŒ Colony forming

起L‘^ƒ#第一段階希釈m条件j注意X‘必要K

units（CFUs）„VNn個m単位gVe記載T’‘"A‘"得‹’^検液n#希釈液˜用Ce目的濃度j

培養法jŠ‘ CFUs n製品måÕçj表示T’‘

到達X‘}f段階希釈˜行E"\m後#混釈法„V^ƒ#製造会社n賞味期限時}f CFUs ˜維持X

Nn塗抹法˜用Ce菌˜接種V^後j#ÏÑœ¶μ‘RgK求ƒ‹’#ÏÑœ¶μ菌数˜安定的j測定

菌n偏性嫌気性菌fA‘^ƒ嫌気培養˜行C# 72

X‘RgKfL‘菌数測定法K求ƒ‹’eC‘"

時間経過後m¯éÇô数˜計測Ve生菌数値˜計算

本稿fn#製品中j含有X‘ÏÑœ¶μ菌数測定

X‘"ÏÑœ¶μ菌数˜測定X‘際j重要gi‘#

法jcCe#培養法jIP‘寒天培地・希釈液m選

測定精度˜決定X‘因子gVen#寒天培地g希釈

択˜中心j紹介V^後#近年m動向gVe国際標準

液m選択K挙Q‹’‘"法†菌数測定法j関X‘課題jt’#最後j培養法
以外m新規m生菌数測定方法jcCe„紹介X‘"

2.
21

22

寒天培地

ÏÑœ¶μ菌m菌数測定j使用X‘培地n#ÏÑÏÑœ¶μ菌m生菌数測定法m現状

œ¶μ菌m~˜含‚製品fA‘J#発酵乳†乳酸菌
飲料mŠEjÏÑœ¶μ菌以外j Lactobacillus 属

ÏÑœ¶μ菌数測定法m概略

培養法jŠ‘ÏÑœ¶μ菌m生菌数測定法m各工

ihm乳酸菌˜含‚製品fA‘JjŠŒ種類˜変G

程˜図 1 j示X"}Yn#検査j使用X‘検体K‘必要KA‘"前者m場合jn非選択培地#後者m±ïÓç全体m代表X‘Rg˜目的j±ïÓçm均

場合jn選択培地˜使用X‘"表 1 jÏÑœ¶μ質化˜行E"次j希釈液˜用Ce第一段階希釈˜実

菌m菌数測定jŠN使用T’‘培地一覧˜示X"非施X‘"ÏÑœ¶μ菌n発酵乳†乳酸菌飲料mŠE

選 択 培 地 g V e n reinforced clostridial 寒 天 培 地

―9―

乳

業

技

術

表1

製品中mÏÑœ¶μ菌m菌数測定jICe使
用T’‘寒天培地
名称

RCM 寒天培地（RCA)
BL 寒天培地
GAM 寒天培地
mMRS 寒天培地
TOS 寒天培地
TOSMup 寒天培地
WSPMup 寒天培地

J‹ÏÑœ¶μ菌g乳酸菌˜判別X‘RgKfL‘12)"}^#抗生物質mÜÐé³ïK Lactobacillus

非選択/選択培地 引用文献
非選択培地
非選択培地
非選択培地
非選択培地
選択培地
選択培地
選択培地

属# Lactococcus 属ihm乳酸菌m生育˜広N抑制

（5)
（9)
（8)
（11)
（12)
（15)
（16)

X‘一方#ÏÑœ¶μ菌mÜÐé³ï耐性K高CR
gK報告T’eC‘13)"Seraˆni ‹n#ÏÑœ¶μ菌m Isoleucyl-tRNA 合成酵素（ IleS ）j変異K起
L#\m変異n Biˆdobacterium 属内f広N保存T’eC‘^ƒ#ÜÐé³ïK IleS j結合fLYj
Isoleucyl-tRNA m合成K阻害T’iCRgK#Ï

（RCM 寒天培地„VNn RCA g呼o’‘Rg„A

Ñœ¶μ菌m高CÜÐé³ï耐性j寄与VeC‘可‘）#glucose blood liver 寒天培地（BL 寒天培地）#

能性˜指摘VeC‘14) " TOS _Pf„ÏÑœ¶μmodiˆed MRS 寒天培地（ mMRS 寒天培地）# Gifu

菌m選択性nA‘„mm#乳酸菌jŠbenA‘程

anaerobic 寒天培地（ GAM 寒天培地）ih˜使用

度m大LTm¯éÇôK生育X‘Rg„A‘^ƒ#

X‘場合K多C"\’]’m培地m特徴˜挙Q‘g#

TOS 寒天培地jÜÐé³ï˜組~合•Z^ TOS-RCM 寒天培地nªéμÄæ´›属m菌数測定j開Mup 寒天培地gVe使用T’‘場合„多C15) "近発T’^培地fAŒ5)#CNcJm論文jICen

年#Bunesova ‹n Wilkins-Chalgren 寒天培地j大ÏÑœ¶μ菌数測定用m¯ïÄéôç培地gVe使豆ÖÓÄï# L ³μÂŸï塩酸塩#Ùæ¹çÕô

用T’eC‘Rg#}^nÏÑœ¶μ菌m菌数測定

Ä80˜添加V^ WSP 寒天培地˜開発V#ÜÐé³

j適VeC‘gm報告KA‘RgJ‹6,7,8)#比較的

ï˜添加V^ WSP-Mup 寒天培地˜使用X‘Rg

広範囲mÏÑœ¶μ菌数測定j適VeC‘g考G‹

f#特j従来m選択培地fn生育VjNC B. biˆ-’‘"BL 寒天培地n従来m目的gVen¡Úm脱dum 種m菌数測定jICe#TOS-Mup 寒天培地Š

繊維血液˜ 5添加V^血液入Œ寒天培地gVe#

Œ„高C生菌数値K得‹’‘Rg˜報告VeC

特j日本jICeŠN使用T’eL^K9,10)#ÏÑ

‘16)"

œ¶μ菌（Biˆdobacterium 属m~）m菌数測定˜行
23

E際jn脱繊維血液˜添加ZYj使用T’‘場合„

希釈液A‘8)"Modiˆed MRS 寒天培地（mMRS 寒天培地）

表 2 jÏÑœ¶μ菌m菌数測定jŠN用C‹’

n Lactobacillus ihm乳酸菌m培養j開発T’^‘希釈液˜示X"一般的j広N微生物m希釈操作j

MRS 寒天培地j#ÏÑœ¶μ菌jgbe必須›Û

使用T’‘塩化ÆÄæ¡Ü˜0.85含有X‘生理食

Ê酸fA‘ L³μÂŸï塩酸塩˜添加V^培地f

塩水#ÖÓÄïK添加T’^加ÖÓÄï生理食塩

A‘11) "ÏÑœ¶μ菌m液体培養液˜用C^継代

水#塩化ÆÄæ¡Ügæï酸塩K添加T’^緩衝Ö

培養jn mMRS 液体培地K頻繁j使用T’‘K#

ÓÄï水#1/4 強度æï®ç溶液ihKŠN使用TÏÑœ¶μ菌m菌数測定j使用X‘場合jn#ÏÑ’eC‘15,17)"日本fn光岡‹K開発V^光岡Ì¿

œ¶μ菌株jŠben mMRS 寒天培地K他m培地

Ñšô#寒天K省略T’^改光岡Ì¿ÑšôK使用

g比較Ve菌数値K低Jb^gm報告KA‘8)"

T’eL^8,9)"

一方#選択培地gVen# TOS ÓéÐ¥ï酸寒Roy ‹nÏÑœ¶μ菌m菌数測定j使用T’‘

天培地（TOS 寒天培地）K挙Q‹’‘"TOS 寒天

様々i希釈液jcCe紹介V#結論gVe加ÖÓÄ培地n糖源gVe転移¥æ°糖（ TOS ）˜含‚R

ï生理食塩水m使用˜推奨VeC‘6)"Straka ‹n

gK特徴f#ÏÑœ¶μ菌m資化性K強C一方#乳ÖÓÄïm添加濃度˜変G^生理食塩水˜用Ce菌

酸菌m増殖速度K緩†Ji^ƒ#¯éÇôm大LT

˜ 1 時間保持V^前後m菌数˜比較V# 0.1 以上

Vol. 68. 2018

― 10 ―

表2

製品中mÏÑœ¶μ菌m菌数測定jICe使
用T’‘希釈液

名称（引用文献)
各成分（g/L)
生理食塩水
塩化ÆÄæ¡Ü 8.5
加ÖÓÄï生理食塩水（17)塩化ÆÄæ¡Ü 8.5#¦¸Ÿï酵素分解物 1.0
光岡Ì¿Ñšô（9)æï酸二水素¦æ¡Ü 4.5 #æï酸水素二ÆÄæ¡Ü 6.0 #L ³μÂŸï塩酸塩一水和物 0.5#Ùæ¹çÕôÄ80 0.5#寒天 1.0
改光岡Ì¿Ñšô（8)æï酸二水素¦æ¡Ü 4.5 #æï酸水素二ÆÄæ¡Ü 6.0 #L ³μÂŸï塩酸塩一水和物 0.5#Ùæ¹çÕôÄ80 0.5
緩衝ÖÓÄï水（17)動物組織酵素分解物 10.0#塩化ÆÄæ¡Ü 5.0#
æï酸水素二ÆÄæ¡Ü12 水和物 9.0#æï酸二水素¦æ¡Ü 1.5
1/4 強度æï®ç溶液（15, 17)塩化ÆÄæ¡Ü 2.25#塩化¦æ¡Ü 0.105#塩化¦ç³¡Ü（無水） 0.06 #炭酸水素ÆÄæ¡Ü
0.05

図2

9 cmÏÑœ¶μ菌配合製品˜\’]’m希釈液˜用Ce菌数測定˜実施V^時m¯é

Çô数m相対値$図中m英字n有意差˜示
V#英字K異i‘g有意差KA‘Rg˜示X（p＜0.05)8)$

e#希釈液m pH#希釈液g±ïÓç˜混[eJ‹m保持時間#±ïÓçg希釈液m割合jcCe比較
試験˜実施V#\’]’希釈液m pH K低C時#保持時間K長C時#±ïÓçm割合K高C時j菌数値
K低下X‘Rg˜報告VeC‘19) "筆者‹m検討
jICe„#粉末状mÏÑœ¶μ菌数値n第一段階

mÖÓÄïK含}’‘場合j#1 時間保持後m菌m

j使用X‘希釈液m影響˜強N受P‘RgK示T’

生残率K上昇V^Rg˜報告VeC‘18) "阿部‹eC‘20)"

m検討fn#ÏÑœ¶μ菌 8 菌種/亜種m\’]’ÏÑœ¶μ菌m菌数測定法j関X‘標

3.

m基準株j対Ve#生理食塩水#1/4 強度æï®ç

準法m推移

溶液#光岡Ì¿Ñšô#滅菌水˜含‚ 9 種類m希釈液˜用Ce菌数測定V^gR“#光岡Ì¿Ñšô3 1

国 際 標 準 化 機 構 （ ISO ） g 国 際 酪 農 連 盟（IDF）

˜使用V^場合j#安定的j高C菌数値K得‹’^Rg˜報告VeC‘"}^#ÏÑœ¶μ菌˜含‚市

国際標準化機構n 1947 年j設立T’^非政府組

販品 9 製品j同様m希釈液˜用Ce#ÏÑœ¶μ

織fAŒ#主要i活動gVen#国際標準法˜制定

菌m生菌数測定˜行b^gR“#¯éÇô数m総平

V#製品m品質・安全性・効率j関X‘国際規格˜

均値n光岡Ì¿Ñšô#加ÖÓÄï生理食塩水#生

提供X‘RgjŠŒ#国際貿易˜促進X‘RgK挙

理食塩水ih˜使用V^時j最„高C値˜示V#逆Q‹’‘"ISO n専門委員会（Technicalj 1 / 4 強度æï®ç溶液˜使用V^時n滅菌水jtee, TC）IŠr分科委員会（Subcommittee, SC）

次Cf¯éÇô数値K低Ni‘RgK報告T’eC}f細分化T’#\’]’m分科委員会f ISO 規‘（図 2）"

格K制定T’‘"乳製品j関X‘規格n ISO TC

commit-

前述mgIŒ#粉末状mÏÑœ¶μ菌˜最初j希34（食品j関X‘専門委員会）m SC 5（乳IŠr

釈液g混[‘第一段階希釈fn#乾燥状態f休眠V

乳製品j関X‘分科委員会）jICe審議T’‘"

eC‘菌j水分K満^T’#菌m代謝K再r活性化

一方# IDF n酪農乳業分野˜代表X‘非営利的T ’ ‘ 復 水 g 呼 o ’ ‘ 現 象 K 起 L ‘ " Muller ‹Jc非政治的i国際団体f#良質i生乳m生産g乳

n#ÏÑœ¶μ菌m第一段階希釈時m希釈液j関V

製品m開発・普及˜行C#科学的#技術的IŠr経― 11 ―

乳業

技術

済的発展˜推進X‘Rg˜目的gX‘団体fA‘"

jŠŒ定義g成分規格K決ƒ‹’eIŒ#発酵乳・

現 在 m g R “ # 乳 製 品 j 関 X ‘ 国 際 標 準 n ISO

乳酸菌飲料n一定量以上m乳酸菌˜含‚必要KA‘

TC34 SC5 IŠr IDF m合同規格gVe制定T’

RgJ‹#乳酸菌m菌数測定方法„同様j定ƒ‹’

eC‘"

eC‘"

乳IŠr乳製品中mÏÑœ¶μ菌数m国際標準法

乳等省令f規定T’^乳酸菌m菌数測定法n#特n# 2010 年j ISO29981 / IDF220 gVe発行T’

定m寒天培地˜好気f培養X‘RgK指定T’eC^"本方法fn#寒天培地gVe TOS-Mup 寒天培‘^ƒ#ÏÑœ¶μ菌n¯éÇô˜形成X‘RgK

地K指定T’eC‘"希釈液gVen 1 / 4 強度æ

fLY#日本m乳等省令上n乳酸菌gVe扱•’‘ï®ç溶液„VNn ISO6887 5 j記載m希釈液mRgniN#ÏÑœ¶μ菌m菌数測定法n規定T’

中f 1 / 4 強度æï®ç溶液g同等性K示T’^溶

eCiC状況fAb^"一方#ÏÑœ¶μ菌m研究

液g指定T’eC‘^ƒ#実質的j 1 / 4 強度æïK進~#健康上m意義„浸透X‘jc’e#市場f®ç溶液K使用T’eC‘"}^#粉末状mÏÑœn発酵乳・乳酸菌飲料wm利用K進‚ŠEjiŒ#¶μ菌m第一段階希釈jICen# 45 °C j保温V

乳製品中mÏÑœ¶μ菌˜乳酸菌J‹選択的j測定^希釈液˜±ïÓçg混濁TZ^後# 45 °Cf 5 分

X‘RgKfL‘菌数測定方法K求ƒ‹’eC^"

間 保 持 X‘方 法 K指 定 T ’eC‘ " ISO 29981 /RmŠEi背景J‹全国nb酵乳乳酸菌飲料協会mIDF 220 法fn#前述mgIŒ 1 / 4 強度æï®ç„g# 13 機関# 16 名„m専門家J‹構成T’‘Ï

溶液˜使用X‘Rgf菌数値K低下X‘Rg#}^Ñœ¶μ菌検査法検討委員会K構成T’#発酵乳・

筆者‹m検討jICe第一段階希釈時m 45 °C5分

乳酸菌飲料中mÏÑœ¶μ菌m菌数測定法j関X‘

間m保持時間jICe„菌数値K低下X‘RgJ§ŸÅåŸïK 2000 年j発行T’^21) "培地gV‹#現在#筆者K›ª³ãï½ôÜæô¼ôgib

en# TOS 寒天培地˜含‚ 3 種類K有用fA‘ge , 使用X‘RgKfL‘希釈液mæμÄ˜増†X

結論dP‹’#希釈液gVen#光岡Ì¿Ñšô˜

Rg#}^第一段階希釈時m温度˜下Q‘Rg˜目

窒素置換V^溶液#光岡Ì¿Ñšô#生理食塩水#

的gVe#改訂j向P^Óé´¢ªÄ˜進ƒeC‘"加ÖÓÄï生理食塩水# 0.1酵母£¨μ溶液m使

食品中j含有X‘微生物j関X‘ ISO 法m特徴

用 K 認 ƒ ‹ ’ ^ " \ m 後 # 前 述 m ISO29981 / 1 c m ISO 法 m 中 j 他 m 関 連 X ‘
gVen#◯

IDF220 gVeÏÑœ¶μ菌数測定法m国際標準法

ISO 法K参照・利用T’#個々m分析法m制度設計

K発行T’#2014年j ISO/IDF 法j沿E形f§Ÿ 具体的i分析法˜制定X‘K高ƒ‹’eC‘点#◯ÅåŸïK改定T’#培地gVen TOS-Mup 寒天

ISO 法K発行T’‘際jn複数m国g\m試験機関

培地#希釈液gVe 1 / 4 強度æï®ç溶液#„V

jICe#基準以上m精度KA‘JhEJ˜検証XNnÖÓÄï水#加ÖÓÄï生理食塩水#緩衝ÖÓ 培地jICe„A‘一定以上m‘必要KA‘点#◯

Äï水ihm同等性K確認fL‘溶液m使用K認ƒ

品質KA‘Rg˜確認X‘^ƒm#培地m性能評価‹’eC‘22)"j関X‘方法K記載T’eC‘点ihK挙Q‹’‘"R’‹特徴n#ISO 法˜用C‘RgjŠbe世
界mhRm分析機関jICe„同等m菌数値K得‹4.

ÏÑœ¶μ菌m菌数測定法j関X‘課題

41

高精度m菌数測定法˜目指Ve

前述mgIŒ#ÏÑœ¶μ菌m菌数値 CFUs n’‘ŠEi分析法˜提供X‘Rg˜理念gVe作成

製品måÕç表示j使用T’‘Rg#}^ 2015 年

T’‘Rgj起因VeC‘"

J‹開始T’^日本国内m機能性表示食品制度f
32

日本jIP‘§ŸÅåŸï制定m動L

n#ÏÑœ¶μ菌mŠEi機能性関与成分m分析値

日本f販売T’‘乳・乳製品jcCen乳等省令

Vol. 68. 2018

jcCen第三者機関jŠ‘分析K必要g規定T’― 12 ―

eC‘RgJ‹23) #製造会社_PfniN第三者

表3

機関jICe„高精度jÏÑœ¶μ菌m生菌数˜測
定X‘RgKfL‘方法K求ƒ‹’eC‘"特j#
粉末状態mÏÑœ¶μ菌m場合n#粉末状態j加工T’^菌˜目的m菌数}f賦形剤˜用Ce倍散X‘ÏÑœ¶μ菌数測定˜行E際j#³ßôèj
生育V^各¯éÇô数g変動係数m関係jc
Ce





試験群
◯
◯
◯
◯
添加菌濃度
3.00
2.00 1.00gX‘ 0.33
予想菌数値
（CFUs/
300 CFUs 200 CFUs 100 CFUs 30 CFUs
³ßôè)

Rg„A‘RgJ‹#菌数測定m分析精度K悪Cg
過剰j菌˜添加ViP’oi‹Y#生産性˜考慮X‘上f高精度i菌数測定法n重要i分析技術fA‘
g„言GŠE"VJViK‹#菌数測定j用C‹’‘培養法n#
分析m原理上hEVe„理化学的i分析値g比較V
e誤差K大LNibeV}E"\m理由gVe#理化学的測定fn#莫大i数m分子数˜測定X‘mj
対V#培養法fnZC[C300個以下m¯éÇô¦¡ïÄVJ行•iC^ƒfA‘"^_V#¦¡ïÄX‘¯éÇô数jcCe„#300˜超G‘g隣接X‘¯éÇô˜ 1 cgVe¦¡ïÄVeV}E£åôK頻発V#¯éÇô数K少iXM‘g変動K大
LNi‘"表 3 j筆者‹K試験V^#³ßôèj
生育V^ÏÑœ¶μ菌m#¯éÇô数jŠ‘変動係

No. 1
No. 2
No. 3
No. 4
No. 5
No. 6
No. 7
No. 8
No. 9
No. 10No. 11
No. 12
No. 13
No. 14
No. 15

301
348
319
327
328
328
318
271
282
315
286
353
282
307
337

199
192
199
204
191
209
186
199
195
198
200
204
221
183
219

115
98
108
115
111
88
102
115
96
100
99
121
107
94
107

21
37
23
28
31
29
38
29
26
36
28
26
34
33
28

標本平均
標本分散
標準偏差
変動係数

313.5
580.2
24.1
7.7

199.9
105.1
10.3
5.1

105.1
81.3
9.0
8.6

29.8
23.4
4.8
16.2

B. breve 種含有m粉末製品jcCe#希釈液gVe
生理食塩水#寒天培地gVe RCA ˜用Ce菌数測
定˜行b^"各試験群n段階希釈時j菌濃度˜0.33
J‹3.00}f変化TZ#各群#15枚m³ßôè˜用
Ce培養Ve得‹’^各¯éÇô数˜示V^"³
ßôèj添加X‘溶液n1.00 ml j固定V^"

数m違C˜示XK#¯éÇôm数K少iCg変動係
数K大LNi‘RgK分J‘"一方f#一回m分析
j使用X‘³ßôèm枚数n通常固定T’eC‘場
合K多C"Šbe#必要i分析感度˜上Q‘^ƒj
n#1 枚A^Œm¯éÇô数˜一定数以上jX‘#„VNn³ßôèm枚数˜増†X必要KA‘g考G

能性KA‘"即`#生育†生残性j関•‘製造条件‹’‘"（培地・培養条件・\m後m加工条件ih）K最適}^#筆者‹m«çôÓfn#国内外˜含ƒe多化T’eC‘場合K多N#菌数測定jIP‘希釈時

Nm試験機関˜訪問V#ÏÑœ¶μ菌数測定法j関jA‘程度m酸素j曝T’e„#培養時j嫌気状態

X‘技術交流˜度々行beL^K#\m際jVoV

jX‘Rgf#¯éÇôK均一j生育X‘場合K多o話題ji‘mK#均一性˜上Q‘^ƒj偏性嫌気Cg考G‹’‘J‹fA‘"

性菌fA‘ÏÑœ¶μ菌˜ŠN撹拌X‘g#ÏÑœ

第一段階希釈g段階希釈時m容量g精度管理˜正¶μ菌j悪影響˜及{V#菌数値˜下Q‘原因ji

確j行ERg„重要fA‘"例gVe#第一段階希beV}EmfniCJgCERgfA‘"一方f

釈時#±ïÓçg希釈液˜混合撹拌X‘際jμÄÚ撹拌˜弱ƒ‘g正確i菌数値˜得‹’jNNi‘"¿¦ôih˜用C‘場合#下部j±ïÓçK沈~#

筆者‹n#例外nA‘jV“#正確i菌数測定˜行

十分j撹拌T’iCRgKŠNA‘^ƒ#均一j撹

E上fnA‘程度m撹拌n必要fniCJg考Ge

拌T’eC‘Rg˜ŠN確認X‘必要KA‘"}

C‘"Rm点jcCe#製品中mÏÑœ¶μ菌n糞^#段階希釈用m希釈液 9.0 ml ˜秤量X‘場合#

便中mÏÑœ¶μ菌gn酸素曝露m影響K異i‘可9.0 ml m精度管理KE}N行•’eCiC#„VN― 13 ―

乳業

技術

需要K高}‘„mg予想T’‘"n希釈液˜入’^後j密栓ZYj¥ôÄªèôÒ処
理Ve容量K変化VeC‘可能性„A‘"\m場
合#段階希釈時j 1 段階Sgj 5.0 m誤差˜含‚43

培養法j代•‘新VC菌数測定方法

操作˜行ERg˜仮定X‘g#\m操作˜ 6 回繰

近年#培養法j代•‘新規m生菌数測定法K開発

Œ返X_Pf 25 程度m誤差K発生X‘計算ji

T’eC‘"例Go#propidium monoazide（PMA）‘"希釈液m撹拌操作„ÐÖ¿Âœï«fniN#

˜使用V^ PCR 法m原理n次mgIŒfA‘"ØçÂ¿ªμjŠ‘撹拌˜用C^方KŠŒ均質化T

PMA n死菌„VNn細胞膜m強度K低下V^菌m’‘g思•’‘"

細胞内˜通過X‘"\m後#光照射˜行ERgf
PMA K DNA j 結 合 V # PCR 反 応 ˜ 阻 害 X ‘ ^42

菌種特異的„VNn菌株特異的i菌数測定方

ƒ#生菌g損傷菌・死菌˜区別X‘RgKfL

法‘28) "通常m PCR 法fn# 1 ±ŸªçSgj指数

ÓéÌŸ¥Âœªμm生理効果n一般的j菌株j

的j上昇X‘ PCR m±Ÿªç数J‹菌数値K計算

依存X‘g考G‹’‘^ƒ#近年#培養法jŠ‘Ï

T’‘K#Rm方法jŠ‘測定fn一般的j測定誤Ñœ¶μ菌m菌数測定j関Ve#¯éÇôj生育V

差K大LCRgK知‹’eC‘"Ã´»ç PCR f^ÏÑœ¶μ菌数˜ CFUs 値gVe計測X‘_P

n#½¿Ó内j細分化T’^¡¢çm 1 c 1 cj

fniN#生育V^菌m種†株˜同時j分析X‘R

ICe DNA ˜検出X‘RgKfL‘^ƒ# DNAgK必要gT’eC‘"ÏÑœ¶μ菌用m選択培地

量˜ŠŒ正確j測定X‘RgKfL‘"Hansen ‹j生育V^¯éÇôfAbe„#\’nÏÑœ¶μn乳酸菌gÏÑœ¶μ菌m菌数測定j関Ve#

菌fA‘Rg˜示唆X‘_PfAŒ#目的gX‘Ï

PMA 処理後j\’]’m株特異的iÓåŸÚô˜Ñœ¶μ菌種・株fA‘Rg˜示VeC‘•Pfn

用CeÃ´»ç PCR ˜行ERgf#従来m PCR

iCJ‹fA‘"\mŠEi理由J‹#生育V^¯

法ŠŒ„高精度j菌数測定X‘RgK可能fA‘R

éÇôK目的m株fA‘J˜確認X‘場合KA‘"g˜示VeC‘29)"

一例gVen#生育V^¯éÇôjcCe RAPD

Ñéô±ŸÄÝÄæô˜使用V^菌数測定j関V（Random Ampliˆcation of Polymorphic DNA）ihe„技術開発K進ƒ‹’eC‘"Ñéô±ŸÄÝÄm遺伝学的手法˜用Ce#目的m菌株g一致X‘J

æôn対象物˜高速f 1 c 1 c流路˜通過TZ#

˜確認X‘方法K挙Q‹’‘24,25)"

èô²ô˜当ee粒子m大LT#内部m複雑T#標}^#一cm製品中j二c以上mÏÑœ¶μ菌株

識T’^蛍光色素˜検出X‘測定方法fA‘K#例

K配合T’‘製品„AŒ#菌株Sgm生菌数K求ƒGo#全em菌m核様体˜染色X‘ SYTO24g#‹’‘場合„A‘"従来m方法gVe#ÏÑœ¶μ

死菌・損傷菌m膜˜通過Ve染色X‘ propidium

菌˜ 5m¡Ú脱繊維血液˜添加V^ BL 寒天培地

iodide（PI）˜組~合•Z‘Rgf#菌K生菌・死上j生育TZ‘g#菌株j依存V^特徴的i¯é

菌・損傷菌mh’j分類T’‘J˜計測X‘RgK

Çô˜形成TZ‘RgKfL26) #\’˜判別X‘

fL‘"乳製品中mÑéô±ŸÄÝÄæô˜使用V

gCb^ BL 血液寒天培地˜利用V^菌数測定K知^方法n# ISO / IDF gVe国際標準法K発行T’‹’eC‘"}^#筆者‹n製品中j含}’‘ B.

e C ‘30) " 従 来 m 方 法 f n # Ñ é ô ± Ÿ Ä Ý Äbreve g B. longum subsp. longum m菌種Sgm生菌

æô˜用C^菌株特異的i菌数測定法n不可能fA数測定法gVe#糖m資化性˜利用V^培地˜開発

b^K# Chiron ‹n加熱jŠ‘殺菌処理˜V^菌

V#既存m寒天培地g同等m生菌数値˜示XRg˜体„VNn菌m表面»ïÍª質j特異的iÙæª

報告V^27) "今後„#複数mÏÑœ¶μ菌株K配éôÆç抗体˜用Ce#Ñéô±ŸÄÝÄæôjŠ

合T’^製品jIP‘菌株Sgm菌数測定j対X‘‘菌株特異的i菌数測定K可能fA‘Rg˜示VeVol. 68. 2018

― 14 ―

C‘31)"

cluding Powder Milk with Live Lactic Acid^_V# PMA Ã´»ç PCR 法IŠrÑéô±bacteria, 1－4 (2001）4)ŸÄÝÄæô法n生菌fA‘JhEJn#PMA „Hill, C., Guarner, F., Reid, G., Gibson, G. R.,

VNn PI K細胞膜˜透過X‘JhEJj依存Ve

Merenstein, D. J., Pot, B., Morelli, L., Canani,C‘^ƒ#細胞膜mÌæ›性n維持VeC‘K培養

R.B., Flint, H. J., Salminen, S., Calder, P. C.

Ve„¯éÇô˜形成X‘RgKfLiC菌nand Sanders, M. E.: The International Scien-

VBNC（Viable but not culturable）n生菌gVe¦tiˆc Association for Probiotics and Prebiotics¡ïÄVeV}E"ÓéÌŸ¥ÂœªμgVe使用

consensus statement on the scope and ap-

X‘^ƒjn#ÎÄjIP‘生理効果˜有X‘Rg

propriate use of the term probiotic, Nat. Rev.

K前提gi‘^ƒ#今後#R’‹m測定法K一般的

Gastroenterol. Hepatol., 11, 506514 (2014）

5)

j普及VeCN^ƒjn# VBNC m状態m菌K生
理効果˜有X‘JhEJm検証K必要g思•’‘"5.

Hirsch, A. and Grinstead, E.: Methods for thegrowth and enumeration of anaerobic sporeformers from cheese, with observations on theI • Œ j110 (1954）
eŠect of nisin, J. Dairy Res., 21, 1016)ÏÑœ¶μ菌m培養法˜中心j#寒天培地・希釈

Roy, D.: Media for the isolation and enumera-

液m重要性i‹rj国際標準法wm取Œ組~#培養tion of biˆdobacteria in dairy products, Int. J.

法m課題ih˜紹介VeL^"ÏÑœ¶μ菌n偏性

Food Microbiol., 69, 167182 (2001）

嫌気性菌fA‘^ƒ菌数測定K難VCgm印象˜受

7)Payne, J. F., Morris, A. E. and Beers, P.:P†XCK#ÙŸïÄ˜抑G’o安定的j菌数測定

Note: evaluation of selective media for the

˜行ERgK可能fA‘"一方#新規分析方法m進

enumeration of Biˆdobacterium sp. in milk, J.

展n目覚}VN#今後 PMAÃ´»ç PCR 法IŠ

Appl. Microbiol., 86, 353358 (1999）8)rÑéô±ŸÄÝÄæô法Kμ»ï¼ôÅgVe定

Abe, F., Muto, M., Yaeshima, T. and Iwat-

着X‘可能性„考G‹’‘"VJV#h™i測定法

suki, K.: EŠects of suspension-dilution buŠersj„長所・短所nA‘^ƒ#\’‹˜見極ƒiKand plating media on enumeration of Biˆdobac-‹#今後m動向j注目VeCL^C"

terium, Milchwissenschaft, 64, 139142 (2009）9)

引 用 文 献1)2)

Eine verbesserte methodik der qualitativen

乳酸菌gÏÑœ¶μ菌m±Ÿ£ïμ#京都大und quantitativen analyse der darm‰ora von

学学術出版会#810, 2429, 3551, 8081,

menschen und tieren. Zentralbl. Bakteriol.

129134 (2010）

Parasitenkd. Infektionskr, Hyg. I Orig., 195,

上野川修一#山本憲二#世紀˜超G‘ÏÑœ

455469 (1965）
10)¶μ菌m研究―\m基礎g臨床応用J‹製品
開発w―#財団法人 日本ÏÑœ¶μ菌·ï

食品衛生検査指針 微生物編 2004#社団法人
日本食品衛生協会#349360（2004）»ô#271279（2011）3)

Mitsuoka, T., Sega, T. and Yamamoto, S.:

11)

Arroyo, L., Cotton, L. N. and Martin, J. H.:

Health and Nutritional Properties of Probiot-

Evaluation of media for enumeration of Bi-

ics in Food including Powder Milk with Liveˆdobacterium adolescentis, B. infantis and B.

Lactic Acid Bacteria. Report of a Joint FAO/

longum from pure culture, Cult. Dairy Prod. J.,

WHO Expert Consultation on Evaluation and29, 2021 2334 (1994）
12)

Nutritional Properties of Probiotics in Food in-― 15 ―

園池耕一郎#馬田三夫#務台方彦発酵乳製

乳

業

技

術

13)

品 中m Biˆdobacterium 生菌 数測 定法 選択 培ˆdobacterium Cell Counts in Commercial Pow-

地 m 検 討 # 食 品 衛 生 学 雑 誌 # 27, 238 244

der Products, Bioscience Micro‰ora, 29, 143

（1986）

148 (2010）
21)

Rada, V. and Koc, J.: The use of mupirocin for
selective enumeration of biˆdobacteria in fer-

数測定法#社団法人 全国nb酵乳乳酸菌飲料

mented milk products, Milchwissenschaft, 55,

教会（2000）

6567 (2000）
14)

22)

ÅåŸï#一般社団法人 全国発酵乳乳酸菌飲

Baru‹ni, E., Turroni, F., Foroni, E., Lodi, T.,

料教会（2014）
23)

24)

ceptibility in Biˆdobacteria, Appl. Environ.

Hayashi, H., Fukuyama, M. and Benno, Y.:

Milk products Enumeration of presumptiveUniˆcation of Biˆdobacterium infantis and Bi-biˆdobacteria Colony count technique at 37

ˆdobacterium suis as Biˆdobacterium longum,°
C, ISO 29981/IDF 220, ISO and IDF (2010）

Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 52, 19451951

Bunesova, V., Musilova, S., Geigerova, M.,(2002）
25)

Yaeshima, T. and Iwatsuki, K.: Antibiotic sus-tion of biˆdobacteria in probiotic supplements,

ceptibility of biˆdobacterial strains distributed

J. Microbiol. Methods., 109, 106109 (2015）

in the Japanese market, Biosci Biotechnol.

Microbiology of food and animal feeding

Biochem., 74, 336342 (2010）26)

cal examination Part 5: Speciˆc rules for the27)

Muto, M., Miyauchi, H., Xiao, J. Z. and Abe,preparation of milk and milk products, ISO

F.: Enumeration of Biˆdobacterium in pow-

68875, ISO (2010）dered milk products: eŠect of suspension

Straka, R. P. and Stokes, J. L.: Rapid Destruc-buŠer and development of selective enumera-tion of growth of Bacteria in commonly usedtion media, Milk Science, 64, 1523 (2015）
28)

diluents and its elimination, Appl. Microbiol.,Nocker, A., Cheung, C. Y. and Camper, A. K.:

5, 2125 (1957）

Comparison of propidium monoazide with

Muller, J. A., Stanton, C., Sybesma, W., Fit-

ethidium monoazide for diŠerentiation of live

zgerald, G. F. and Ross, R. P.: Reconstitution

vs. dead bacteria by selective removal of DNA

conditions

from dead cells, J. Microbiol. Methods, 67, 310

for

dried

probiotic

powders

320 (2006）

represent a critical step in determining cell
viability, J. Appl. Microbiol., 108, 13691379

20)

光岡知足#腸内菌m世界―嫌気性菌m分離g
同定―#叢文社#146154（1980）

pension and decimal dilutions for microbiologi-

19)

Xiao, J. Z., Takahashi, S., Odamaki, T.,

mupirocin-based media for selective enumera-

stuŠs Preparation of test samples, initial sus-

18)

Sakata, S., Kitahara, M., Sakamoto, M.,

Microbiol., 77, 31413146 (2011）

Pechar, R. and Rada, V.: Comparison of

17)

機能性表示食品m届出等j関X‘§ŸÅåŸï 消食表第156号#消費者庁（2018）

into Physiological and Genetic Mupirocin Sus-16)ÏÑœ¶μ菌使用発酵乳#乳酸菌飲料m§ŸSeraˆni, F., Bottacini, F., Viappiani, A.,

van Sinderen, D. and Ventura, M.: Insights

15)

nb酵乳・乳酸菌飲料中mÏÑœ¶μ菌m菌

29)

Hansen, S. J. Z., Morovic, W., DeMeules, M.,(2010）

Stahl, B. and Sindelar, C. W.: AbsoluteMuto, M., Abe, F., Yaeshima, T. and Iwat-

Enumeration of Probiotic Strains Lactobacil-

suki, K.: EŠect of Enumeration Method on Bi-

lus acidophilus NCFMand BiˆdobacteriumVol. 68. 2018

― 16 ―

animalis subsp. lactis Bl-04via Chip-Based

30)

31)

Chiron, C., Tompkins, T. A. and Burguiere,

Digital PCR, Front Microbiol., 9, 704 (2018）

P.: Flow cytometry: a versatile technology for

Milk and milk products Starter cultures,

speciˆc quantiˆcation and viability assessment

probiotics and fermented products Quantiˆ-of micro－organisms in multistrain probiotic

cation of lactic acid bacteria by ‰ow cytomet-

products, J. Appl. Microbiol., 124, 572584

ry, ISO 19344/IDF 232, ISO and IDF (2015）(2018）― 17 ―

乳業

技術