株式会社 Epigeneron

共同研究・共同事業枠

株式会社 Epigeneron
事業実施期間：開始 令和元年８月１日〜終了 令和元年１２月２６日

共同研究・共同事業者

株式会社テクノプロ テクノプロ・R&D 社

研究 ・ 事業名

新規抗がん剤のアッセイ方法の開発
交付申請内容研究・事業の目的及び意義
がん抑制遺伝子のプロモーター領域DNAが高度にメチル研究・事業の方法及び手段研究・事業の特徴（新規性、独自性 等）

研究・事業により期待される効果

本研究・事業は、Epigeneron社独自の技術であるiChIP法

本研究提案は、iChIPを用いて見出された、プロモーター領を用いて見出された、これまでにない創薬ターゲットに対する域をメチル化しがん抑制遺伝子の発現を低下・維持させてい抗がん剤を創出するためのスクリーニング系をEpigeneron

る蛋白質に対して、新たな薬剤をスクリーニングする方法を開社とテクノプロ社と共同で構築することである。

発することを目的としている。本研究・事業において開発される

これまでの成果としては、Epigeneron社において、がん抑新規薬剤のスクリーニング方法を応用することにより、HTSに制遺伝子であるp16遺伝子のプロモーターに特異的に結合しおけるヒット化合物の同定、さらにヒット化合物からのリードている蛋白質をiChIP法を用いて網羅的に同定した。同定され化合物への合成展開が可能となり、最適な新規開発用化合物た蛋白質のうち５つに対して当該蛋白質の遺伝子をsiRNAにの選定の一助となることが期待される。
また、リード化合物並

よってノックダウンしたところ、プロモーター領域のメチル化がびに新規開発用化合物の合成展開については、神戸に所在す減少した（脱メチル化が促進された）ことを確認した（図3）。
こる研究受託会社の起用を想定しており、本研究・事業におけるうした解析により、これらの候補蛋白質の機能を阻害すること成果は、神戸における創薬研究のエコシステムの構築・維持にによりp16遺伝子の再発現が誘導できる可能性が示された。

寄与するものと考えている。

当該蛋白質に対して、その阻害活性を有する化合物を探索することによりp16遺伝子発現を制御する新規メカニズムの抗がん剤創出が可能になると考えられる。

1.標的蛋白質の合成化されると、その発現が低下し、がん化が誘導されうることがEpigeneron社が発見した抗がん剤の標的となる蛋白質を知られている。がん抑制遺伝子の一つであるp16（CDKN2A）コードする遺伝子を合成し、テクノプロ社が発現プラスミドには、メラノーマ、大腸がんを含む多くのがん細胞において高度に挿入する。次いで、大腸菌蛋白質発現系を用いて、全長およびメチル化されており、それによる発現抑制が発癌に重要な役割部分長の蛋白質を合成する。意図した蛋白質が産生されていを果たすことが明らかとなってきた（図１）。今般、株式会社

ることをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動とクマシーブリ

Epigeneron（以下、Epigeneron社）はこのがん抑制遺伝子リアントブルー染色や、免疫ブロット解析により確認する。精製

p16に着目し、insertional chromatin immunopre-した蛋白質はHTSアッセイ系や、HTS後の各種試験系に使用cipitation(iChIP)法」（ 図２）を用いて、p16遺伝子プロモーする。

ターに結合している蛋白質を網羅的に同定した。iChIP法は、LexA等の外来性DNA結合蛋白質の認識配列を単離対象ゲノ

2.標的蛋白質に対する阻害剤スクリーニング用結合アッセイ系

ム領域に挿入し、アフィニティー精製用タグを付加したLexAの構築を解析対象細胞に発現させることにより単離対象ゲノム領域を上記で合成した蛋白質に加え、市販の標的蛋白質を購入し標識し、架橋処理・断片化処理の後、タグに対する抗体等を用て、HTSに適したアッセイ系を構築する。具体的には、個々の候いてアフィニティー精製を行い、解析対象ゲノム領域を単離す補蛋白質に対して、理論的に酵素活性阻害と良く相関するようる技術であり、Epigeneron社取締役である藤井・藤田が開発な384-well plateを用いたホモジニアスな結合アッセイ系をした技術である。標的ゲノム領域の単離後に、質量分析解析を構築する。
アッセイ系構築には、これまでの研究成果により公行うことで、そのゲノム領域に結合している蛋白質を同定する知となっている知見の文献検索を行うほか、結晶構造解析等（図２）。
こうして同定した蛋白質群の中から、低分子化合物のから得られた活性中心の立体構造等の情報を駆使する。
また良い標的となるような蛋白質に対するsiRNAを用いた機能欠スクリーニングに適したアッセイ系とするため、S/N比・S/B比失実験を行い、発現を抑制するとp16遺伝子プロモーターがは3倍以上、Zʼ-factorは0.5以上の数値を目指す。

脱メチル化されるものを複数見出した。
このような抗がん剤の創薬ターゲットとなりうる分子（図３）に対する阻害剤を見出すため、high throughputscreening(HTS)及びリード化合物スクリーニング用のアッセイ系を株式会社テクノプロ・
R&D（以下、テクノプロ社）と共に構築する。上記2社が共同して研究・事業を進めることにより、がん抑制遺伝子の発現を高レベルに保つことで、がんの発生を抑制する新規メカニズムの抗がん剤創出を目指す。

1

助成金成果抄録集

助成金成果抄録集2

株式会社 Epigeneron

実績報告内容研究・事業の内容及び目標達成状況

タンパク質について全長および部分長タンパク質を合成し、同様の実験を実施するため、当該タンパク質をコードする全長と部分長の2種類の遺伝子を合成し、pGEX系ベクターに導入し、①研究・事業の背景：N末端GST融合タンパク質として発現するプラスミドを構築しがん抑制遺伝子のプロモーター領域DNAが高度にメチル化

大腸菌蛋白質発現系によりタンパク質の発現を行い、アフィニされると、その発現が低下し、がん化が誘導されうることが知らティークロマトグラフィーを用いて精製した。意図したタンパクれている。
がん抑制遺伝子の一つであるp16(CDKN2A)は、メ質が産生されていることをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳ラノーマ、大腸がんを含む多くのがん細胞において高度にメチ動とクマシーブリリアントブルー染色により確認した。本タンパ

ル化されており、それによる発現抑制が発癌に重要な役割を果

ク質の発現条件、および精製方法を用いて、4L培養スケールかたすことが明らかとなってきている。株式会社Epigeneron（以らのタンパク質精製を実施した。得られたタンパク質はHTS

下、Epigeneron社）
ではこのがん抑制遺伝子p16に着目し、アッセイ系の構築に使用した。

insertional chromatin immunoprecipitation(iChIP)法を用いて、p16遺伝子プロモーターに結合している蛋白質を網羅2.標的蛋白質に対する阻害剤スクリーニング用結合アッセイ系的に同定した。iChIP法は、LexA等の外来性DNA結合蛋白質の構築の認識配列を単離対象ゲノム領域に挿入し、アフィニティー精

上記で合成したタンパク質についてHTSに適し活性阻害と製用タグを付加したLexAを解析対象細胞に発現させることに良く相関するような384-wellplateを用いたホモジニアスな結より単離対象ゲノム領域を標識し、架橋処理・断片化処理の後、合アッセイ系を構築した。
スクリーニングに適したアッセイ系とタグに対する抗体等を用いてアフィニティー精製を行い、解析するため、アッセイ系の目標値はS/N比、S/B比が3倍以上、対象ゲノム領域を単離する技術であり、Epigeneron社取締役

Z'-factorが0.5以上となるように各タンパク質濃度、基質濃である藤井・藤田が開発した技術である。標的ゲノム領域の単度を最適化した。
また、未標識基質を使い、IC50を算出し、出離後に、質量分析解析を行うことで、そのゲノム領域に結合して来上がったアッセイ系を評価した。

いる蛋白質の同定が可能な方法である。
こうして同定した蛋白質群の中から、低分子化合物の良い標的となるような蛋白質に対するsiRNAを用いた機能欠失実験を行い、発現を抑制する

研究・事業の内容及び目標達成状況とp16遺伝子プロモーターが脱メチル化されるものを複数見出した。
このような抗がん剤の創薬ターゲットとなりうる分子に1.標的蛋白質の合成：対する阻害剤を見出すため、high throughput screening

市販合成品及びテクノプロにおいて合成した標的タンパク(HTS)及びリード化合物スクリーニング用のアッセイ系を株式質については、全長タンパク質および部分長のタンパク質を会社テクノプロ・R&D（以下、テクノプロ社）と共に構築するこ使って活性確認および活性比較を実施した結果、部分長の標ととし、その研究開発費についての助成を得るべく、令和元年的タンパク質が結合活性が最も強く検出された。
また、市販品度の神戸医療産業都市推進機構における研究開発助成金申よりも、単位重量当たりの価格が安く、数万化合物のHTSには請し採択された。

適しているテクノプロ合成品が得られたため、本研究・事業の目標は達成できたと考えられた。

②研究·事業の内容：

市販標的タンパク質の活性確認においては、濃度4条件、種本研究・事業では、Epigeneron社で見出した創薬ターゲッ

類2条件、阻害剤濃度3条件、ビオチン標識ペプチド4条件、反トとなりうる分子に対する阻害剤を見出すため、下記の共同研

応時間3条件の合計288条件について条件検討を行った。
こ究を実施した。

れらの内、反応時間(3時間）、阻害剤濃度(0mMの条件を固定した32条件についてグラフ化した（図1)。結果、部分長タンパ

1.標的蛋白質の合成
Epigeneron社が発見した抗がん剤の標的となるタンパク質について、市販品の全長タンパク質と部分長タンパク質を使って、その活性を確認した。
また、当該抗がん剤の標的となる

3

助成金成果抄録集ク質（108-286), GST tag、全長タンパク質(GST)共に、濃度依存的(5nMまで）、ビオチン標識ペプチド濃度依存的な活性上昇が確認された。
また、テクノプロにて合成した全長及び部分長タンパク質の助成金成果抄録集

4

株式会社 Epigeneron
活性確認の実験においては標的タンパク質濃度4条件、種類8

標的タンパク質濃度：1.2nM or 2.4nM

標的タンパク質濃度 0.45nM

条件、阻害剤濃度3条件、ビオチン標識ペプチド1条件、反応時

ビオチン標識ペプチド濃度 5.0nM

ビオチン標識ペプチド濃度 2.2nM間3条件の合計288条件について条件検討を行った。
これらのDMSO濃度 0% or 0.5%

DMSO濃度 0.5%

内、反応時間(3時間）、阻害剤濃度(0mM)の条件を固定した

上記の条件でのアッセイ系の評価結果

今後の展開
本研究・事業によって得られたアッセイ系を用いて、市販品

IC50:5.94µM（約0.59x10-5M)の標的タンパク質の阻害活性を有する化合物をスクリーニン

0.001µM〜100µM 10 となるような反応液に加えて、阻害S/B:8.7倍グする。その後、活性があると判断された化合物を用いてin

テクノプロで合成した全長タンパク質FLについては保存剤 の I C 5 0 を 算 出したところ、I C 5 0 が 参 考 文 献 に 近く、Z'-factor 0.92

vitroにおける薬効薬理試験を実施する。活性がある化合物がBufferの種類検討も実施したが、活性が低いものであった。
しZ ' - f a c t o rが0 . 5 以 上 、S / B比が3 倍 以 上の以 下の条 件が得られなかった場合には、当該アッセイを用いたHTSにより化たがって化合物スクリーニングを実施する目的で本標的タン

DMSO溶解の阻害剤のスクリーニングには以下の条件が最適合物をスクリーニングしていく。

パク質を利用する場合、活性が強く検出される部分長タンパクであることが確認された。

32条件について検討した。結果、5nMまでの濃度依存的な活性上昇が確認された。

従 って、上 記 の 条 件 をもとに 市 販 の 阻 害 剤 の 濃 度 を-9質をアッセイ系構築に使うのが最適であると判断した。また、市販品とテクノプロ合成品を比較すると、活性に大きな違いは標的タンパク質濃度 1.2nM見られないことから、単位重量当たりの価格が低い、
テクノプロ

ビオチン標識ペプチド濃度 5.0nM合成品を使うこととした。

DMSO濃度 0.5%

2.標的蛋白質に対する阻害剤スクリーニング用結合アッセイ系

上記の条件でのアッセイ系の評価結果の構築

IC50:9.35µM（約0.94x10-5M)

条件検討ロットおよび大量合成ロットの2つのロットにおけS/B:15倍る標的タンパク質に関してアッセイ系の構築を行った。その結Z'-factor 0.88

果、どちらのロットでもHTSに耐えうるアッセイ系が構築できた。
大量合成ロットの標的タンパク質についても同様の実験を標的タンパク質の活性確認を行った結果、TLD buffer TLD実施し、HTSに適した条件を検討した。

を用いたスクリーニング実施が最適であると判断した。
そこで、結果、どの条件においても標的タンパク質濃度が5nMを超アッセイ系構築の条件検討は大量合成ロットの部分長タンパえると活性が下がる傾向が確認されたため、標的タンパク質のク質を使用した。濃度検討においては濃度8条件、種類1条件、Kd値は2nMまでで算出することとした。その結果、標的タンパ

ビオチン標識ペプチド8条件、反応時間3条件の合計192条件

ク質のKd値はビオチン標識ペプチドを最高濃度で添加した際について条件検討を行った。結果、どの条件においても標的タに算出された0.91nM付近とした。

ンパク質濃度が10nMを超えると活性が下がる傾向が確認されたため、標的タンパク質のKd値は5nMまでで算出すること

ビオチン標識ペプチド濃度検討においては標的タンパク質とした。その結果、標的タンパク質のKd値はビオチン標識ペプ濃度が5nMを超えると活性が下がる傾向が確認されたため、チドを最高濃度で添加した際に算出された1.16nM付近とし、活性が下がらない最高濃度の2nMで算出することとした。

ビオチン標識ペプチド濃度のKd値は5.20nM付近とした。

従って、ビオチン標識ペプチドのKd値は4.36nM付近とした。

標的タンパク質Kd値検討、およびビオチン標識ペプチドKd

標的タンパク質濃度およびビオチン標識ペプチド濃度検討

値 検 討 の 結 果 、アッセイに 設 定 する 濃 度 は 以 下 が 最 適の結果、大量合成ロットの標的タンパク質はそれぞれの濃度が(1Kd~2Kd)であると考えられる。

低くても十分な測定値が検出されることが確認できた。
また条件検討ロットの標的タンパク質を使用して阻害剤のIC50を算

標的タンパク質濃度(nM):1.16（付近）〜2.32（最高）出したところ、標的タンパク質量が低いほど阻害剤の影響を受ビオチン標識ペプチド濃度(nM):5.2（付近）〜10.4（最高）けやすいことが確認された。
そのため、大量合成ロット標的タン

上記の条件下で化合物が溶解しているDMSOに対してどのパク質に関してはタンパク質、ビオチン標識ペプチドの両者に程度の耐性を示すか検討した。
その結果、0.5%DMSO条件下おいて、以下に示すように1/2Kd付近に設定して阻害剤のではどの条件でも95％以上の活性を示したが、2%DMSOでIC50を算出することにし、阻害剤のIC50は参考文献より低くは67~79％と明らかな活性の低下が確認された。

算出され、Z'-factorが0.5以上、S/B比が3倍以上の以下の条件が最適であることが確認された。

以上の、実験結果により以下の条件が最適であることが考えられた。

5

助成金成果抄録集

助成金成果抄録集6