新規な酵素群β-1,2-グルカン関連酵素の機能と構造
東京理科大学 理工学部 応用生物科学科 中島 将博【略歴】
2000 年 3 月 東京大学農学部卒業
2006 年 7 月 東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命工学専攻博士課程修了
博士（農学）取得
2006 年 7 月 独立行政法人 農業・食品産業技術総合研究機構 食品総合研究所
農研機構特別研究員
2010 年 4 月 岩手生物工学研究センター 研究員
2012 年 4 月 東京理科大学 理工学部 応用生物科学科 助教
2017 年 4 月 東京理科大学 理工学部 応用生物科学科 講師
2020 年 4 月 東京理科大学 理工学部 応用生物科学科 准教授
はじめに糖鎖はその構造が非常に多様性に富んでおり、その生体内での役割も多岐に渡る。特に近年では、様々な難分解性糖鎖で腸内環境改善効果が示されていることから糖鎖の潜在的な利用可能性が増している。現在でも様々な糖鎖が上市されているが、糖鎖構造の複雑さを考慮すると利用されている糖鎖の種類は限られていると言える。
しかし、天然から得られる糖鎖の多くは生成量が少ない、不均一などの理由により現実的に調製困難であり、機能探索を行う糖鎖の種類を増やすことは難しい。
β-1,2-グルカンはグルコースから構成される糖鎖にも関わらず大量調製が難しい糖鎖である。天然では主に環状糖として存在し、根粒菌においてマメ科植物への共生因子として機能するなどの報告があるが、その物性や食品素材としての性質という利用の観点からの有用機能の探索例はほとんどない。また、β-1,2-グルカンはジクザグ状のユニークな構造と推測される点、極めて高い水溶性を持つ点でセルロースやラミナリンとは全く異なっており、β-1,2-グルカンの新規な物性、生理機能が期待される。しかし、筆者の研究開始まで遺伝子同定された β-1,2-グルカン分解酵素は皆無であった。そのため、β-1,2-グルカン調製を行うにあたって利用できる酵素がなく、そのような酵素の探索と解析から始める必要があった。
糖質加リン酸分解酵素ホモログの機能探索
糖質加リン酸分解酵素は糖鎖と無機リン酸から糖 1 リン酸を生成する酵素である。この酵素の反応は可逆的であるため、逆反応を用いた糖鎖合成が容易である。そこで、糖質加リン酸分解酵素を含むファミリーの機能未知グループのホモログについて機能探索を行った。その結果、このホモログがグルコースとグルコース-1-リン酸(G1P)から β-1,2-グルカンを合成できることを見出し、最終的には三糖以上の β-1,2-グルコオリゴ糖（Sopns、n は重合度）を加リン酸分解する新規酵素(SOGP)と同定した 1。また、SOGP の X 線結晶構造解析を行い、この酵素において鎖長特異性が生じる構造
エキソ型SGL
Glc + G1P
N末端付加的要因を明らかにした 2（図1）。
β-1,2-グルカン大量調製法の確立
糖質加リン酸分解酵素を用いた糖鎖合成において、実用的な観点からは糖1リン酸は高価である。
そこで、スクロースホスホリラーゼによるスクロースからのG1P 供給系をSOGP の合成反応と組み合わせることで、G1Pを原料として用いないワンポットのβ-1,2-グルカン

ドメイン
（灰色）

Sop2

SOGP

β-グルコシダーゼ

SGL

Sop4

Sopns結合タンパク質
Sop3

β-1,2-グルコオリゴ糖(Sopns)
図1. これまでに明らかにしたβ-1,2-グルカン関連酵素と構造系を確立した。
グルコースとスクロースのみを出発糖原料として 2 L スケールでのβ-1,2-グルカン合成を行い、最終的に 100 グラム以上の精製 β-1,2-グルカンの調製に成功した 3。
β-1,2-グルカナーゼ遺伝子の同定
β-1,2-グルカナーゼ(SGL)はβ-1,2-グルカンの分解により Sopns を生成する酵素であるが、原核生物における報告は Chitinophaga arvensicola が SGL 活性を有することのみであった。そこで、大量合成したβ-1,2-グルカンを炭素源として C. arvensicola を培養し、その細胞抽出画分から SGL の精製を行い、最終的にゲノム既知の近縁種である Chitinophaga pinensis より候補タンパク質 Cpin6279 を得た。組換え Cpin6279 が β-1,2-グルカンに対して顕著な分解活性を示し、二糖から五糖までの Sopns を最終産物として生成したことから Cpin6279 をSGL と同定した。Cpin6279 は新規アミノ酸配列を有していたため、新規の糖質加水分解酵素ファミリー、GH144と認定された。さらに、このファミリーで初めて基質との複合体構造の取得に成功し、基質認識機構を明らかにした 4（図 1）。これにより β-1,2-グルカンからのSopns 大量調製が可能となり、また、高い分解効率、異なる分解様式をもつ SGL 探索のための構造情報基盤も得られたと言える。さらに真核生物からも sgl 遺伝子を同定し、新規ファミリー（GH162）が創設された 5。変異体や基質誘導体を用いた基質の分解様式の解析により、この酵素が極めてユニークな反応機構を有することも明らかにしている。
β-1,2-グルカン関連酵素群の探索
SOGP による β-1,2-グルカン合成と SGL による Sopns 調製が可能になったことにより β-1,2-グルカン関連酵素群の探索が容易になった。
この基質を用いてSOGP とSGL の遺伝子クラスター上に存在するβ-グルコシダーゼ、ABC トランスポーターの糖結合サブユニットの機能解析を行い、これらが Sopns を基質として好むことを明らかにし、これらの基質特異性を生じる立体構造的な要因も明らかにした 6-8（図 1）。また、GH144 酵素の探索により、β-1,2-グルカンの非還元末端側からソホロースを遊離する新規のエキソ型酵素を発見した。N 末端付加ドメインが基質クレフトの片側の端を塞ぐことが酵素をエキソ型にする要因であることを立体構造解析により明らかにした 9（図 1）。
1

Nakajima et al. PLOS ONE 2014; 9(3): e92353.
Nakajima et al. Scientific reports 2017; 7: 42671.
3
Abe et al.Journal of Applied Glycoscience 2015; 62(2): 47-52.
4
Abe et al. The Journal of Biological Chemistry 2017; 292(18): 7487-7506.
5
Tanaka et al. The Journal of Biological Chemistry 2017; 294(19): 7942-7965.
6
Nakajima et al. PLOS ONE 2016; 11(2): e0148870.
7
Ishiguro et al. FEBS Letters 2017; 591(23) 3926-3936.
8
Abe et al. The Journal of Biological Chemistry 2019; 293(23): 8812-8828.
9Shimizu et al. Biochemistry 2018; 57(26): 3849-3860.
2

今後の展望
SOGP と SGL のホモログは広く微生物に分布しており、これらの遺伝子クラスターや SOGP、SGL のホモログ、近縁のファミリーには糖質関連酵素と推定されるものの機能未知のタンパク質が多数存在している。これらの機能構造解析によってβ-1,2-グルカン関連酵素群の探索をさらに行うとともに、見出した酵素を用いた糖鎖調製法の確立、その糖鎖の食品、素材としての有用機能性の探索を行い、糖鎖の利用可能性を拡げていきたい。
謝辞
本研究は東京理科大学理工学部応用生物科学科で行われたものであり、田口速男教授をはじめ本研究にご協力いただいた関係諸氏に厚く御礼申し上げます。