GS2-1-3

LIFE2012 2012 年11 月2 日I4 日愛知 (名古屋大学)

スパッタリング法を用いた Sr 固溶 HA 薄膜の作製と骨芽細胞様細胞による評価
Preparation of strontium substitution in HA thin films using sputtering technique and evaluation ofosteocompatibility with osteoblast-like cells○ 星野智大（茨城大院）

尾関和秀（茨城大）

増澤徹（茨城大）後藤哲哉（九歯大）青木秀希（国際アパ研）

Tomohiro HOSHINO, Ibaraki University
Kazuhide OZEKI, Ibaraki University
Tetsuya GOTO, Kyushu Dental College
Toru MASUZAWA, Ibaraki University
Hideki AOKI, International Apatite Co., Ltd
Abstract: The preparation of strontium (Sr) substituted hydroxyapatite (SrHA) films at Sr/(Sr+Ca) ratio of 0, 20, 40, 60,80, and 100 at.% to the HA on titanium by sputtering. The crystallinity and the Sr/(Sr+Ca) ratio in the film were observed
using X-ray diffractometer (XRD) and inductively-coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES), respectively.
Cell reaction to the SrHA was evaluated by measuring the cell attachment of human osteoblastic cells (Saos-2), alkaline
phosphatase (ALP) activity and osteocalcin (OCN) expression. From XRD patterns, the peaks shifted to lower 2θ valueswith Sr addition. In the ICP measurements, the Sr/Ca ratios in each sample almost corresponded to the target ratios. The
number of cells showed no significant difference in the SrHA except for Sr 40 at.%. The ALP activity for the Sr100 was
highest in all of the sample. In OCN expression, it showed a deceasing tendency with Sr addition.
Key Words: Hydroxyapatite, Stontium, Sputtering, osteocompatibility
1. 緒言
現在，歯科インプラントには様々な表面処理が施されたものがあり，その一つに生体適合性に優れたハイドロキシ
アパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2 ; HA）をコーティングする方法がある．スパッタリング法により HA がコーティングされた歯科インプラントは，コーティングなしのものに比べ速やかに周囲に骨形成が起こり，早期に高い骨結合強度が得られるという特徴がある．しかしながら，骨量や骨質が不十分な状態では適用できない場合があり，骨誘導能の優れた材料が求められている．近年骨芽細胞活性の促進作用があるとして Sr が注目されている．過去の研究では，Srを最大 7at.%ドープした HA 圧粉体がアルカリフォスファターゼ（ALP）活性及びオステオカルシン（OCN）発現を増大させたとの報告 1)もある．そこで本研究では，HA 中のCa を 各 比 率 で Sr に 置 換 さ せ た Sr 固 溶 HA
（Ca10-xSrx(PO4)6(OH)2 : SrHA）薄膜の有効性を検討するため，スパッタリング法により SrHA 薄膜を作製し，SrHA 薄膜中の Sr/(Sr+Ca) 比率及び結晶性，骨芽細胞様細胞による細胞接着性，ALP 活性及び OCN 発現について評価した．

2-2 細胞接着実験
ヒ ト 骨 芽 細 胞 様 細 胞 Saos-2 を 用 い ， 細 胞 濃 度 1 ×104cell/sample で各試料上に播種した．培養液には 10%ウシ
胎仔血清（和光純薬工業(株)），100μg/ml ペニシリン G（和光純薬工業(株)），50μg/ml ゲンタマイシン（Gibco），0.3μg/ml
ファンギゾン（Gibco）含有 α-MEM（Gibco）を用い，37Cで 6，24 時間培養した．培養後， TRIC-phalloidin（希釈率1:40，Molecular Probes）を用いて染色した．蛍光顕微鏡（BX50;オリンパス(株)）により，任意範囲内（0.57mm2）の細胞数をカウントし，接着細胞数を決定した．

2. 実験方法
2-1 試料作製
成膜ターゲットは，HA 粉末（太平化学産業(株)），溶液法で 作製 し 800°C 焼成し たストロンチウムアパタイト（Sr10(PO4)6(OH)2 ; SrAp），HA 及び SrAp を Sr 比率（Sr/(Sr+Ca)×100）20,40,60,80 at.%で混合させた粉末をそれぞれ用いた．成膜はスパッタリング装置 SPF-210HD（キヤノンアネルバ(株)）を使用し，基板には Ti（(株)ニラコ）を用いた．
成膜条件はガス圧力 0.5Pa，放電電力 100W で，膜厚は 1.0μmとした．さらに膜の結晶性の向上を図るために，温度 120°C，2-3 ALP 活性及び OCN 発現評価
Saos-2 を 1.0×104cell/ml の濃度で各試料上に播種した．
培養液には，10%FBS，抗生物質，アスコルビン酸 5mg/ml，β グリセロリン酸 216mg/ml，10-8M デキサメタゾンを含むα-MEM を用いた．ALP では培養 7 日目，OCN では培養 14日目で培養細胞を回収した．ALP 活性の測定は，ALP 測定キット（和光純薬工業(株)）を用いて染色後 405nm の吸光度を測定し，ALP 活性値を決定した．OCN 測定は，PCR反応後，増幅した DNA を電気泳動で分離し，その後 DNAをエチレンブロマイドで染色し，画像解析を行った．

−1−

圧力 0.20MPa で オートクレーブにより 6 時間水熱処理を行った．作製試料は，成膜ターゲットの Sr 比率が 0, 20, 40,60, 80, 100 at.%をそれぞれ，Sr0，Sr20，Sr40，Sr60，Sr80，Sr100 とする．
試料は，X 線回折装置 RINT2000（(株)リガク）で Sr 固溶及び結晶性，誘導結合プラズマ原子発光分析装置（ICP-AES ; ICPS-7510，(株)島津製作所）で Sr 比率測定を行った．

LIFE2012 2012 年11 月2 日I4 日愛知 (名古屋大学)

3-3 細胞接着性評価
Fig. 2 に接着細胞数を示す．接着細胞数は Sr40 が最も低く，Sr20，Sr60，Sr80 では有意差は認められなかったが，Ti と同程度であった．この結果から，Sr40 以外は良好な細胞接着性を有していると考えられる．また，Sr40 が低くなった要因の一つとして，SEM 観察（発表時に掲載する）から他よりも粒子が大きいため，表面が粗く細胞接着が抑制されたと考えられる．
3-4 ALP 活性及び OCN 発現
Fig. 3 に培養 7 日後の ALP 活性値を示す．Sr40 の ALP活性値が最も低く，Sr60 から Sr 比率の上昇に伴い ALP 活性も上昇し，Sr100 で最大となった．この結果から，SrHA薄膜は Sr0 や Sr100 と比較して，骨芽前駆細胞から骨芽細胞への分化は遅いと考えられる．
Fig. 4 に培養 14 日後の OCN 発現量を示す．Sr 比率の上昇に伴い減少傾向を示した．ALP では Sr100 が最大だったが，OCN では他と比べて低いことから，骨芽細胞の分化が進まなかったと考えられる．SrHA 薄膜では，Sr0 を基準とすると，わずかに分化が進んだと考えられる．
Ti

Ti Ti

(f) Sr100

Intensity [a.u.](e) Sr80(d) Sr60(c) Sr40(b) Sr20(a) Sr0102030
2θ[deg]4050Fig. 1 XRD patterns of : (a) Sr0, (b) Sr20, (c) Sr40, (d) Sr60, (e)Sr80, (f) Sr100. Key: ▽ =HA, ▼ = SrAp, ◎ =SrHA, Ti=titanium substrate.

−2−Number of cells

866ｈ24ｈ

420
Sr0Sr20

Sr40

Sr60 Sr80 Sr100

TiFig. 2 Number of osteoblast-like cells attached on the films
after 6, 24 h of culture in a certain area (0.57mm2) (N=15).
0.4
ALP [units/μL]

3-2 ICP 測定による Sr 比率
Table 1 に ICP 測定から算出した Sr 比率を示す．SrHA 薄膜の Sr 比率は，ターゲットの Sr 比率とほぼ一致した．この結果から，ターゲットの Sr 比率を変えることにより，Sr比率の異なる SrHA 薄膜の作製が可能であると示唆された．

Table 1 Sr/(Sr+Ca) ratio in the film (N=3).
SampleSr [at.%]Sr20
20.7±0.5
Sr40
40.3±1.0
Sr60
60.2±0.3
Sr80
79.8±0.80.30.20.10
Sr0

Sr20

Sr40

Sr60

Sr80 Sr100

Ti

Fig. 3 ALP activity on the films after 7 days of culture (N=4).
0.8
OCN/GAPDH

3. 実験結果及び考察
3-1 HA 及び SrAp, SrHA 薄膜の XRD パターン
Fig. 1 に水熱処理後の薄膜の XRD パターンを示す．全試料に基板による Ti のピーク（35.1°, 38.4°, 40.1°）が確認された．Sr0 及び Sr100 では，HA のピーク（25.8°, 31.7°, 32.2°,32.9°）と SrAp のピーク（24.4°, 26.5°, 30.4°）がそれぞれ確認された．SrHA 薄膜の Sr 固溶に関して，Sr 比率の上昇とともに低角側にピークがシフトした．これは，Ca よりも原子半径の大きい Sr が HA 結晶内に入ることで結晶中の面間隔が広がったためと考えられる．また Sr 比率の上昇とともに，半値幅の小さいピークが見られることから，Sr 比率の増加に伴い高い結晶性を有する傾向があると考えられる．

0.60.40.20
Sr0

Sr20

Sr40

Sr60

Sr80 Sr100

TiFig. 4 OCN expression on the films after 14 days of culture.
4. 結言
スパッタリング法を用いて SrHA 薄膜を作製し，SrHA 薄膜中の Sr(Sr+Ca)比率及び結晶性，骨芽細胞様細胞による細胞接着性，ALP 活性及び OCN 発現を評価した．
(1)XRD 結果より，ピークの低角側へのシフトから Sr 比率の異なる SrHA 薄膜の作製が確認でき， Sr 比率が高いほどSrHA 薄膜は高い結晶性を示した．
(2)ICP 結果から，Sr20，Sr40，Sr60，Sr80 の Sr/(Sr+Ca)比率はそれぞれ，20.7±0.5，40.3±1.0，60.2±0.3，79.8±0.8 となった．Sr 比率の異なるターゲットを用いることで，薄膜中の Sr 比率を制御できることが示唆された．
(3)細胞接着の結果，Sr40 は有意に低く，Sr20 及び Sr60，Sr80 では，Sr0 と同程度の細胞接着性を示した．
(4)ALP 活性及び OCN 発現評価において，ALP 活性ではSr100 が最大となり，OCN 発現では Sr0 が最大を示した．
今後の課題として，骨芽細胞による骨造成（石灰化）実験などを行い，Sr の有効性についてさらに検討を行う．
参考文献(1)C.Capuccini, P.Torricelli, E.Boanini, M.Gazzano, R.Giardino,
A.Bigi, Interaction of Sr-doped hydroxyapatite nanocrystals
with osteoclast and osteoblast-like cells, Journal of BiomedicalMaterials Research PartA, 594-600, 2009.