22-05- DNA Ligation Kit -Ligation high(Code No. LGK-101)

取扱説明書
TOYOBO CO., LTD.
Bioproducts Sales and Marketing Department
OSAKA JAPAN

A3274K－ 目 次 －[１] はじめに ............................................................................................. 1[２] プロトコール .......................................................................................... 1
１ 使用方法 .. .............................................................................. 1
２ 効率よくライゲーションをおこなうために ...................................... 1[３] Ligation highの特長 .............................................................................. 2
１ ライゲーション効率が優れています。 ........................................ 2
２ 少ない液量で反応できます。 ...................................................... 2
３ 安定性に優れています。 ............................................................ 2[４] 実施例 .................................................................................................. 3
１ インサート挿入ライゲーション ................................................... 3
２ リンカーライゲーション ............................................................... 4３ 塩濃度の影響 ........................................................................... 5[５] トラブルシュｰティング ............................................................................ 6[６] 関連商品一覧 ....................................................................................... 7
ご注意
本製品は研究用試薬です。診断･臨床用試薬として決して使用しないでください｡
また、本試薬の使用にあたっては実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください｡

1[１] はじめに
DNAフラグメントのライゲーションは、遺伝子操作実験で頻繁に行われる操作です。
従来のライゲーション反応は、基質に応じて条件を設定し、各反応組成を別々に添加するなど煩雑でした。また、インサート挿入ライゲーション等の場合、高い形質転換効率を得ることが困難でした。
そこで弊社ではこれらの問題を解決するために、ライゲーション反応を簡単な操作で、かつ高い効率で完了させるキットを開発しました。本キットの反応液にはライゲーション反応に必要な試薬はすべて含まれており、多種類のライゲーションに適用できます。
なお、本説明書ではLigation highを用いた時の標準的な結果を示しました。

[２] プロトコール
1．使用方法●本品は‐20℃で保存してください。
●Ligation highの融解を氷中で行います。5～10分で自然融解します。*1●ライゲーションに使用するDNA溶液を調製、準備します。
●DNA液量と半分量～同量のLigation highを混合します。
●16℃にて30分間反応させます。
●反応液は、反応終了後そのまま形質転換に使用できます。
2．効率よくライゲーション反応をおこなうために●ライゲーション効率が悪いときは、エタノール沈殿等でDNAを精製してください。
●反応液量を抑えたいときは、使用するDNA液量を少量にして、半分量のLigationhighと混合して下さい(2ページご参照)。
●コンピテントセルに多量の反応液を添加すると、形質転換効率が低下しますのでご注意ください。多量の反応液を添加する必要がある場合は、DNAをエタノール沈殿等にて濃縮してから実施してください。
●ライゲーション効率は、塩濃度によって影響を受けます。高いライゲーション効率を得たい場合は、塩を含まないTE buffer*2で DNAを溶解した後、ライゲーション反応を実施してください（5ページご参照)。

本キット中に沈殿が見られる場合がありますが、この沈殿は安定化剤として使用しているBSAが沈殿を形成したものです。ライゲーション効率には問題ありませんので、加温して溶かしたりせず、そのまま使用してください。
*210mM Tris-HCl，pH8.0/1mM EDTA
*11LGK-101

[３] Ligation highの特長*1
1. ライゲーション効率が優れています。
T4 DNA Ligaseを用いた場合よりも50倍以上の効率が得られます。
2. 少ない液量で反応できます。
Ligation highはDNA溶液と半分量～同量混合して使用します。
形質転換効率（cfu/μg）

1.00E+10
1.00E+09
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
1:0.2

1:0.5

1:1

1:2

1:3

T4 DNALigase

容量比（DNA溶液：Ligation high）

図１ 容量比(DNA溶液：Ligation high)による形質転換効率の違い
3. 安定性に優れています。
50回の凍結融解を行ってもライゲーション効率の低下は認められません。

安定性（%）

100755001020304050

凍結融解回数

図2 凍結融解による形質転換効率の変化*1

本ページの実験結果はすべてセルフライゲーションによる結果です。セルフライゲーションは5ページと同様(TE bufferに溶解)の方法を用いました。

LGK-1012

[４] 実施例
1. インサート挿入ライゲーション(1) 方法●脱リン酸化したpBluescript®Il／Ban Ill(50ng,25fmol)に、pUC18／Taq Iの1,444ｂｐ断片（5～125ng,5～125ｆmol）を加えたDNA溶液を5μL調製しました。
●DNA溶液と同量(5μL)または半分量(2.5μL)のLigation highを混合し、16℃で30分反応させた。
●E.coli JM109のコンピテントセル*1を反応液2μLで形質転換し、X-Gal、IPTGおよびアンピシリンを含むLBプレート上で培養し、生育した白コロニー数より形質転換効率を測定した。
●コントロールとして、T4 DNA Ligaseを用いて16hr反応したものを用いた。
(2) 結果および考察

形質転換効率(cfu/μg)

1.00E+08
1.00E+07
Ligation high(1:1)

1.00E+06

Ligation high(1:0.5)
T4 DNA Ligase

1.00E+05
1.00E+04012345

インサート/ベクター（モル比）

図3 ライゲーション効率に及ぼすインサート／ベクターのモル比の影響
表2 全コロニーに対する白コロニーの割合（%）
インサート／ベクター（モル比）

Ligation high
（容量比1：1）

Ligation high
（容量比1：0.5）

T4 DNA Ligase

0.20.51.05.05250566663656172

12212739●インサート／ベクターのモル比は1.0以上で良好な結果を得ました。
*1

形質転換効率は1.07×109cfu/μg pBluescript®ll3LGK-101

2. リンカーライゲーション(1) 方法●脱リン酸化したpBluescript®Il／Hinc II(100ng,50fmol)、リン酸化したEcoR I リンカー（2.6～130ng,0.5～25pmol）を加えたDNA溶液を5μL調製した。
●DNA溶液と同量(5μL)または半分量(2.5μL)のLigation highを混合し、16℃で30分反応させた。
●E.coli JM109のコンピテントセル*1を反応液2μLで形質転換し、X-Gal、IPTGおよびアンピシリンを含むLBプレート上で培養し、生育した白コロニー数より形質転換効率を測定した。
●コントロールとして、T4 DNA Ligaseを用いて16hr反応したものを用いた。
(2) 結果および考察

形質転換効率（cfu/μg）

1.00E+08
1.00E+07
Ligation high(1:1)

1.00E+06

Ligation high(1:0.5)
T4 DNA Ligase

1.00E+05
1.00E+04
0100

200

300

400500リンカー/ベクター（モル比）

図4 ライゲーション効率に及ぼすリンカー／ベクターのモル比の影響
表3 全コロニーに対する白コロニーの割合（%）
リンカー／ベクター（モル比）

Ligation high
（容量比1：1）

Ligation high
（容量比1：0.5）

T4 DNA Ligase

1050100500515457545765647623243838●リンカー／ベクターのモル比は100以上で良好な結果を得ました。

*1

形質転換効率は1.07×109cfu/μg pBluescript®llLGK-101

43. 塩濃度の影響(1) 方法●pBluescript®II／Sca I (5ng)を、塩(NaCI)を添加したTE buffer 5μLに溶解した。
●DNA溶液と同量(5μL)または半分量（2.5μL)のLigation highを混合し、16℃で30分反応させた。
●E.coli JM109のコンピテントセル*1を反応液2μLで形質転換し、アンピシリンを含むLBプレート上で培養し、生育したコロニー数より形質転換効率を測定した。
(2) 結果及び考察形質転換効率（cfu/μg）

1.00E+10
1.00E+09
1.00E+08
Ligation high(1:1)

1.00E+07

Ligation high(1:0.5)

1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
0100200
TE buffer中のNaCl濃度（ｍM）300

図5 セルフライゲーションによる形質転換効率●DNAを溶解するbufferに塩が含まれていると、形質転換効率は低下する傾向にあります。高い形質転換効率を得たいときは、塩を含まないTE bufferにDNAを溶解してください。

*1

形質転換効率は1.17×109cfu/μg pBluescript®ll5

LGK-101[５] トラブルシュｰティング
トラブル

考えられる原因
コメント
コロニーが得られ 形質転換に用いてい コンピテントセルに対して、1/10 量を越える反る反応液量が多い応液を加えて形質転換すると効率が低下しまない、少ない。
す。1/10 量以下で形質転換を行ってください。
ベクター量が少ない ベクター量を増やしてライゲーションを行ってください。
ベクターに対してイン 実施例を目安にインサート DNA 量を見積もっサート DNA が少ない てください。
塩の持込が多い
PCR 産物を直接用いる場合など、反応液を多く持ち込むと効率が低下します。精製して用いることで、効率を向上させることができます。
ライゲーション反応
脱リン酸化したベクターには、リン酸化されてが成立していない
いない PCR 産物などの DNA 断片を連結することはできません。リン酸化した DNA 断片を用いてください。
インサート挿入率 プライマーダイマー PCR産物のクローニングを行う場合、プライマが低いの影響ーダイマーが多いと目的インサートの挿入率が低下します。その場合は、精製してから行ってください。
反応が不十分2時間まで反応時間を延ばしてください。16時
間反応も可能ですが、2時間以上の効率の向上は期待できません。

ベクターに対してインサートDNAが少ない
TA クローニングの効率が悪い
・一面にコロニー ベクターのセルフライ
ゲーションが出現する・インサート挿入率が低い

LGK-101実施例を目安にインサートDNA量を見積もってください。
Target CloneTM シリーズ（Code No.
TAK-101,TAK-201）のご使用をお勧めします。
ベクターの切断面が相補的な場合（平滑末端ライゲーションや単一制限酵素サイトへのクローニング）、ベクターをあらかじめ脱リン酸化処理しておくことにより、セルフライゲーションのノイズを効果的に減少させることができます。

6[６] 関連商品

品 名Competent high DH5α
<高効率 E.coli DH5αコンピテントセル、SOC 培地付>
Competent Quick DH5α
<サブクローニング用 E.coli DH5αコンピテントセル>
Competent high JM109<高効率 E.coli JM109 コンピテントセル、SOC 培地付>
Competent high DH5<高効率 E.coli DH5 コンピテントセル、SOC 培地付>
Ligation high Ver.2<高効率ライゲーションキット>
DNA Size Markers λ/HindⅢ digest<DNA サイズマーカー>DNA Ladder Markers

内 容

Code No.

100μL×10 本

DNA-903

100μL×20 本

DNA-913100μL×10 本

DNA-900

100μL×10 本

DNA-901

750μL×1 本

LGK-201

120μg×1 本

DNA-010

100 回用

100bp DNA Ladder<DNA ラダーマーカー>（15μg）×1 本

Quick Taq® HS DyeMix<ホットスタート対応・色素入り Taq Master Mix>
Quick Taq® HS DyeMix<ホットスタート対応・色素入り Taq Master Mix>
Target CloneTM<高効率 TA クローニングキット>
Target CloneTM -Plus<高効率 TA クローニングキット>

DNA-035

100 回用DTM-1011,000 回用DTM-101X10

10 回用

TAK-101

10 回用

TAK-201より詳細な情報は、弊社ウェブサイトをご覧ください

https://lifescience.toyobo.co.jp/

7LGK-101【製造・販売元】－価格・在庫に関するお問い合わせ－
東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (大阪)〒530-0001 大阪府大阪市北区梅田一丁目１３番１号
大阪梅田ツインタワーズ・サウス
TEL 06-6348-3786 FAX 06-6348-3833
E-mail : order_lifescience@toyobo.jp
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TEL 03-6887-8819 FAX 03-6887-8951
E-mail : order_lifescience@toyobo.jp－製品の内容・技術に関するお問い合わせ－テクニカルライン
TEL 06-6348-3888 FAX 06-6348-3833
開設時間 9:00～12:00 , 13:00～17:00 (土日祝日、休日を除く)
E-mail : tech_osaka@toyobo.jp［URL］ https://lifescience.toyobo.co.jp/