次世代シークエンサーを用いた乳酸菌・腸内細菌研究
下(協同乳業株式会社

村

有

美

研究所#〒1900182 東京都西多摩郡日m出町平井201)

Overview of studies using next generation sequencer about lactic acidbacteria and intestinal microbiome.
Yumi Shimomura(Kyodo Milk Industry Co., Ltd. 201 Hirai, Hinode-cho, Nishitama-gun, Tokyo 1900182, Japan)

要旨
次世代³ôª£ï±ônR’}fm¨ßÐåæô³ôª£ï±ôgn異i‘測定原理˜持`#³ãôÄæôÅfnA‘K（50～400 bp）¨ßÐåæô³ôª£ï±ôm数万～数千万倍„m配列Ãô
»˜出力fL‘ËŸμçôÓ¿Äm„m†#æôÅ数n数百～数千倍fA‘KæôÅ長K約10倍～
15倍（10～150 kb）j達X‘éï«æôÅm„mK存在X‘"本稿fn現在良N使用T’eC‘次

世代³ôª£ï±ôm概要g#\m使用jŠŒ得‹’^乳業技術j関連X‘乳酸菌†腸内細菌研究jcCe述x‘"1.

‘1)"³ôª£ïμ反応液中j塩基Sgj異i‘波次世代³ôª£ï±ôg測定原理m長m蛍光色素f標識T’^´Ã¥¨³Èªè¥½Å

概要

˜添加VeÙæÝåô¸連鎖反応（ PCR ）˜行E

最 初 m 次 世 代 ³ ô ª £ ï ± ô n 2005 年 j › Ý

g#´Ã¥¨³Èªè¥½ÅK合成f取Œ込}’^æ¦m当時m 454 Life Sciences 社（現在n Roche

際j\m塩基J‹m伸長K止}Œ#最終的j 1 塩Diagnostics 社 ） j Š b e Genome Sequencer 20

基Yc長Tm違E 3′末端K蛍光標識T’^ DNA 断

system ( GS20 ） K発 売 T’#大 変 i衝 撃 ˜与 G

片KfL‘"\’‹˜¨ßÐåæô内f電気泳動V^"従来m¨ßÐåæô˜用C^³ôª£ïμf

e配列長別j分離V#検出器m前˜通過X‘ DNA

n#同時j決定fL‘配列数n最大f„ 96 配列f断片m蛍光˜検出Ve\m蛍光派長ŠŒ塩基配列˜

Ab^K# GS20 m解析能n#取得配列長K 100 bp

決定X‘"1 cm配列m³ôª£ïμjcL 1 本m

fnA‘„mm#1 回måïf20万配列（総塩基数¨ßÐåæôK必要gi‘RgJ‹#一度j³ô¬20 Mb）m取得K可能fAb^"R’}fm³ôªïμfL‘±ïÓç数n物理的j限‹’eC^"次£ïμ技術gm違Cn#}Y測定原理jA‘"従来世代³ôª£ï±ôm GS20jŠ‘塩基配列決定方

m¨ßÐåæô˜用C^³ôª£ïμm方法n´Ã

法n#Mostafa Ronaghi g Pal Nyren jŠbe開発¥¨³法（±ï§ô法）g言•’# 1977 年j±ïT’^ÍŸé³ôª£ïμ法（pyrosequencing）˜§ô‹jŠbe発表T’^方法˜応用V^„mfA

利 用 V e C ‘2) " R ’ n sequencing by synthesis（ SBS ）法gCE DNA ˜合成ViK‹配列決定˜
行E方法m一cf#鋳型gi‘一本鎖 DNA j対V#

Tel042
597
5911

Vol. 66. 2016―8―

DNA ÙæÝåô¸g 4 cm塩基（A, T, G, C）˜ 1

PGM n#GS20g同様j£Úç´ãï PCR ˜用C

種類Yc添加Ve合成K起Rb^際j発生X‘ÐéeÏô¶上j DNA 分子˜増幅TZ‘K#³ôª£

æï酸塩（ pyrophosphate ）˜ ATP j変換V#çïμ方法n SOLiD g他m 2 機種f異ibeC‘"³Ñ¢åô¸発光反応˜検出X‘Rgf塩基配列m

SOLiD fn#Ïô¶nÑéô·çj固定T’‘"

決定˜行E方法fA‘"鋳型gi‘ DNA n#£ÚÏô¶上m一本鎖 DNA j異i‘蛍光色素f標識Tç´ãï PCR jŠbe 1 cmÚŸªéÏô¶上j’^ÓéôÒ（一部m配列K既知）˜ÓåŸÛï«1 種類m配列m~増幅T’#増幅後mÏô¶nÏô

V#åŸ®ô³ãï˜行E"åŸ®ô³ãïT’^¶K 1 c入‘大LTm¡¢çK莫大i数含}’‘ÓéôÒm蛍光˜読~取b^後nÓéôÒm蛍光標

ÓèôÄ（Pico TiterPlate）j固定T’e#各Ïô

識部分˜取Œ除Ce次mÓéôÒmÓåŸÛï«g¶m発光n CCD ¦ÝåjŠbe検出T’‘"現在åŸ®ô³ãï反応wg進‚"一連m伸長反応K終m代表的i次世代³ôª£ï±ô˜表 1 j示X"

了V^後n伸長V^配列n取Œ除J’#読~枠˜Y

各次世代³ôª£ï±ôm測定原理n GS20gn異‹V^形f同様m反応K複数回繰Œ返T’‘"最終ibeC‘"illumina 社製m³ôª£ï±ôjcC

的j#伸長j使用T’^ÓéôÒm蛍光色素m組~

en#}YÑéô·ç表面上j 1 本鎖 DNA ˜結合

合•ZJ‹配列 K決 定T’‘" Ion Proton g Ion

TZ#Òæ¿´ PCR 法˜用Ce増幅V#局所的j

PGM fn半導体½¿ÓjÏô¶˜固定X‘"配列

1000 分 子 程 度 m ª å μ » ô ˜ 形 成 T Z ‘R g f

m決定n SBS 法f#塩基K取ŒR}’‘際j放出

DNA ˜検出可能i量}f増幅TZ‘"配列決定方

T’‘水素Ÿ¥ïjŠ‘ pH m変化˜検出Ve配列

法jn SBS 法˜使用VeIŒ# 1 反応Sgj 3 ′末˜決 定 Ve C‘" Paciˆc Biosciences 社 m PacBio

端j保護基mcC^蛍光標識´Ã¥¨³Èªè¥½

n 1 分子æ›ç»ŸÜ（SMRTSingleMolecule,Å˜加G#合成j使用T’^塩基m蛍光˜測定V^

Real Time ） DNA ³ôª£ï±ôfA‘" DNA1

後#取ŒR}’^塩基m蛍光標識g保護基˜除去V分子gÙæÝåô¸m複合体˜ SMRT ·ç上j存

e次m反応wg進‚"Rm反応n 1 塩基Yc進‚

在X‘¡¢çm底j固定V#æï酸塩鎖j各塩基f^ƒ#×ÞÙæÚô領域（同W塩基K複数個続N領

異i‘蛍光色素K付加V^Èªè¥½Å˜添加Ve域）„正確j解析fL‘gC•’eC‘"Thermo¡¢ç上f³ôª£ïμ反応˜行C#合成f取Œ込Fisher Scientiˆc 社m SOLiD, Ion Proton g Ion}’^塩基m蛍光˜検出X‘Rgf配列˜決定X

表1

代表的i次世代³ôª£ï±ô

会社名

次世代
³ôª£ï±ô名最大æôÅ長最大æôÅ数

最大総塩基数

illumina

HiSeq X
HiSeq
NextSeq
MiSeq
MiniSeq

2×150 bp
2×150 bp
2×150 bp
2×300 bp
2×150 bp

60億
50億
4億
2,500万2,500万1.8 Tb
1.5 Tb120 Gb
15 Gb
8 Gb

Thermo Fisher
Scientiˆc

SOLiD 5500 W
Ion Proton
Ion PGM

1×75 bp, 2×50 bp
200 bp400 bp16億
8,000万550万

120 Gb, 160 Gb
10 Gb
2 Gb

5 万/cell

550 Mb/cell

PacBio Sequel System

40 kb
約10 kb)40 kb（平均 約10 kb)

PacBio RS II m約 7 倍

PacBio RS II m約 7 倍

MinION

150 kb 以上（平均 約10 kb)

10万3

10 Gb

PaciˆcBiosciences
Oxford Nanopore
Technologies

PacBio RS II

（平均

―9―

乳

業

技

術

‘"蛍光色素n DNA 合成j伴Eæï酸塩鎖m切断‘g#現在 Lactobacillales 目jn# 6 科 42 属 560 菌

g共j取Œ除J’#次m DNA 合成wg反応K進‚"

種68亜種K登録T’eC‘（2016年10月現在）（表Oxford Nanopore Technologies 社 m MinION n 約2）"Lactobacillales 目j属X‘細菌f完全®ÊÜ配100 g mÙô»Òç型次世代³ôª£ï±ôf#Í

列K登録T’eC‘株n464株#³ã¿Ä§ï³ô

¹¯ïj USB 接続Ve±ïÓç˜›ÓåŸV#ª£ïμjŠŒ®ÊÜm一部K登録T’eC‘Åå³ôª£ïμ˜開始X‘gæ›ç»ŸÜfªå¡ÅÑÄ®ÊÜK存在X‘株n実j約 1 万 3 千j„上±ôÏμjŠ‘解析K行•’‘"本機器m塩基配列‘（表 2 ）"完全®ÊÜ登録数m約半数gÅåÑÄ

m決定n#電流m通b^ÆÊÙ›g呼o’‘»ïÍ

®ÊÜm約 80 n Streptococcus 属細菌K占ƒeCª質m孔˜一本鎖m DNA K通過X‘際j生W‘電‘ K # R ’ n R m 属 j S. pyogenes † S. agalactiae

流m変化m度合C˜検出X‘RgjŠbe行•’‘"（共j溶血性èï±球菌）#S. pneumonia（肺炎球菌）

MinION fnÆÊÙ›数K約 500m 1 Ñéô·çf

ihj代表T’‘ÎÄ†動物j対X‘病原性細菌種³ôª£ïμ˜行EK#上位機種m PromethION

˜多N含~#研究K盛™fA‘Rgj起因X‘"工fnÆÊÙ›数K約 3000 mÑéô·ç 48 個˜用C

業的j利用T’‘乳酸菌m S. thermophilus „Rme同時#„VNn個別j³ôª£ïμfL‘"本機属j含}’eIŒ#本種m完全®ÊÜK決定T’^

種n早期利用Óé«åÜK開始T’eC‘"RmŠ

株n 15 株#®ÊÜm一部K登録T’eC‘株n 20

Ej最初m次世代³ôª£ï±ôK発売T’eJ‹

株存在X‘"

10 年間m³ôª£ïμ技術m進歩n非常j目覚}

乳酸菌m分類n#歴史的jn菌m形態†発酵形式
jŠbe行•’eL^6) " Lactobacillus 属細菌n乳

VC"

2.

製品m発酵†ÓéÌŸ¥ÂœªμgVe工業的j広次世代³ôª£ï±ô˜用C^研究m

N利用T’eC‘菌種˜多N含‚属fA‘K#\m

概要

分類n16S rRNA 遺伝子配列†®ÊÜ情報K明‹J

次世代³ôª£ï±ôn多Nm研究分野f利用T

ji‘jc’#R’}fm分類方法gm不一致K生’eC‘"®ÊÜ解析wm利用K最„良N知‹’e

W#再分類m必要性KAb^7,8) " Sun ‹n®ÊÜ

C‘K#ÎÄj対X‘研究分野fn#®ÊÜ変異解

情報J‹Rm問題˜解決VŠEg試~#Lactobacil-析†£Ð®ÊÜ解析（ DNA Ý½ç化部位m解析i

lus 属細菌 175 株g関連X‘ 8 属（ Atopobium 属#h）#遺伝子発現解析ihj„利用T’‘"微生物

Carnobacterium 属#Fructobacillus 属#Kandleria 属#

j対X‘研究分野fn#®ÊÜ解析n„`“™mR

Lactococcus 属#Olsenella 属#Pediococcus 属#Weis-

g#培養K不可能i生物j対X‘›Óéô½gV

sella 属）j含}’‘ 26 株m次世代³ôª£ï±ô

e#環境J‹微生物集合m DNA ˜直接抽出V#\

jŠ‘®ÊÜ配列決定g#Xfj®ÊÜ情報m公開m®ÊÜ˜解析X‘gCEÝ»®ÊÛªμm手段3)

T’eC‘ 2 属（ Leuconostoc 属# Oenococcus 属）

gVe„利用T’‘"本稿fn#乳酸菌m®ÊÜ解m12株g合•Ze#合計11属213株m®ÊÜ解析˜

析g\RJ‹得‹’‘情報例†#腸内細菌g乳業j

行b^8 "解析m結果# Lactobacillus 属m細菌間j

関X‘Ý»®ÊÛªμ解析m応用例˜紹介X‘"

n#同W目fA‘K異i‘科j属X‘細菌間f一般的j見‹’‘遺伝的i差異ŠŒ„大Li差異K存在

2―1

X‘RgK明‹Jjib^8) "T‹j# Sun ‹n®ÊÜ情報J‹何K•J‘J

現在#乳酸菌n Firmicutes 門m Bacilli 綱# Lac-

213株j共通X‘73遺伝子m›ÛÊ酸配列˜用Cetobacillales 目j属X‘細菌g考G‹’eIŒ4) #系統樹˜作成V#\’‹m系統的位置付P˜確認V

List of prokaryotic names with standing in^gR“#解析j用C^ 175株m Lactobacillus 属細nomenclature5) （ http: // www.bacterio.net / ） j Š

菌nXxe共通m祖先J‹分岐VeC‘K#

Vol. 66. 2016

― 10 ―

表2

Lactobacillales 目細菌m種類g登録®ÊÜ数

科

属

種

亜種

完全®ÊÜ

ÅåÑÄ®ÊÜ

Aerococcaceae

Abiotrophia
Aerococcus
Dolosicoccus
Eremococcus
Facklamia
Globicatella
Ignavigranum

4
8
1
1
6
2
1

0
0
0
0
0
0
0

0
8
0
0
0
0
0

2
17
1
2
7
2
1

Carnobacteriaceae

Agitococcus
Alkalibacterium
Allofustis
Alloiococcus
Atopobacter
Atopococcus
Atopostipes
Carnobacterium
Desemzia
Dolosigranulum
Granulicatella
Isobaculum
Jeotgalibaca
Lacticigenium
Marinilactibacillus
Pisciglobus
Trichococcus

1
10
1
1
1
1
1
12
1
1
3
1
1
1
2
1
5

0
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0

0
0
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0

0
7
1
1
1
1
1
23
1
1
6
1
1
1
2
1
12

Enterococcaceae

Bavariicoccus
Catellicoccus
Enterococcus
Melissococcus
Pilibacter
Tetragenococcus
Vagococcus

1
1
55
1
1
5
9

0
0
2
0
0
2
0

0
0
33
3
0
2
1

1
1
1398
11
0
5
1

Lactobacillaceae

Lactobacillus
Pediococcus
Sharpea

221
15
1

29
0
0

138
12
0

806
37
4

Leuconostocaceae

Convivina
Fructobacillus
Leuconostoc
Oenococcus
Weissella

1
5
24
3
21

0
0
7
0
0

0
0
13
1
5

0
7
43
200
23

Streptococcaceae

Lactococcus
Lactovum
Streptococcus

12
1
116

4
0
22

17
0
227

94
0
約1万

560

68

464

約1万3千

合

計

Pediococcus 属 # Weissella 属 # Leuconostoc 属 #gCE観点J‹#有用i機能˜持c可能性mA‘細Oenococcus 属# Fructobacillus 属細菌jcCe„#

菌«çôÓjcCe考察VeC‘"乳業j関連X‘

Rm Lactobacillus 属内f分岐VeC‘RgK明‹

有用i機能m 1 cgVe#細胞外皮（cell envelope）

Jgib^8 "}^# Sun ‹n乳酸菌m工業的利用

mÓéÂ›ô¸（»ïÍª質分解酵素）K挙Q‹’― 11 ―

乳業

技術

‘"Rm酵素n牛乳中m¦¸Ÿïm分解†9)#発酵£ï±ô˜用Ce DGCC7710 株m®ÊÜ配列˜取

乳製品m官能特性j寄与VeC‘10) "}^# Lac-

得V#®ÊÜ中j存在X‘ 4 箇所m CRISPR Cas

tococcus 属† Lactobacillus 属m prtP 遺伝子j¯ôÅ³μÂÜ˜同定V^"\VeÑšô´˜一種類Yc

T’eC‘細胞外ÓéÂ›ô¸måªÄ·Ðïn#DGCC7710 株j添加V#Ñšô´耐性株m取得g¬Þ¦Ÿïm一種fA‘Ÿï»ôÑ¢éï g 誘導»

CRISPR 部位m³ôª£ïμ˜行b^"Rm操作ïÍª（IP10）˜分解X‘Rgf T 細胞˜介V^

˜ 4 回繰Œ返V#最終的j 4 種類mÑšô´j対

炎症˜減少TZ‘„mKAŒ#炎症性腸疾患（IBD）

X‘耐性株m取得g#機能VeC‘g見‹’‘一部

mŠEi¬Þ¦Ÿï˜介X‘病気j対Ve治療効果

m CRISPR 部位j#感染TZ^各Ñšô´m®Ê

K期待T’eC‘11)"Sun ‹K解析V^213株mE

Ü配列m一部K挿入T’eC‘Rg˜確認V`#細胞外皮ÓéÂ›ô¸g~‹’‘遺伝子n 60^14) "RmRgn#乳酸 菌K機能 X‘ CRISPR 

個~cJŒ#細胞wm›ï¦æï«Ý¦Ç¶Üg#Cas ˜持c場合#人為的j複数mÑšô´j対X‘

基質特異性j影響˜与G‘g~‹’‘ÅÝŸï構造

耐性˜持^Z‘RgK可能fA‘Rg˜示X"}^#

n系統jŠŒ異ibeC^8)"RmŠEi®ÊÜ情

CRISPR 部位m配列n#\m菌株K過去j感染V

報m網羅的i解析n#分類法確立m^ƒm知見gi^Ñšô´m履歴部分fA‘^ƒ#株Sgj配列†‘g同時j#工業的i利用目的fm菌種m選択j役

長TK異i‘RgJ‹15) #株m´¢Ê»ŸÐï«

立c可能性KA‘"（遺伝子型判定）j„利用T’eC‘16,17)"

工業的j利用T’‘乳酸菌wmÑšô´感染n#
時j深刻i損害˜与G‘"RmŠEi乳業jIP‘

2―2

ÄåÒç³áôÂœï«m一手段giŒE‘細菌m

次世代³ôª£ï±ô˜用C^腸内細菌mÝ»®ÊÜ解析機能gVe# CRISPR Cas ³μÂÜ（ CRISPR 

2―2―1Äô»ç DNA ˜用C^Ý»®ÊÜ解析

Clustered regularly interspaced short palindromic

次世代³ôª£ï±ô˜用C^腸内細菌研究jn

repeats g Cas  CRISPR 関連»ïÍª質）K挙Q

大LN分Pe 2 cm手法K存在X‘"1 cnA‘生‹’‘" CRISPR Cas ³μÂÜn近年#®ÊÜ編

態系（腸内細菌研究fn糞便ih）ŠŒ抽出V^集

集ÀôçgVe非常j注目˜浴reC‘³μÂÜf

合体mÄô»ç DNA ˜#®ÊÜ³ôª£ïμg同A‘K#本来n細菌†古細菌mÑšô´†ÓåμÛ

様j配列決定X‘方法f#±ïÓç中j含}’‘微Åihm外因性m侵襲性核酸j対X‘感染抵抗性j

生物m遺伝子情報˜網羅的j取得V#\m生態系j

関与X‘³μÂÜfA‘12) " CRISPR K媒介X‘

IP‘微生物組成g微生物機能˜推定X‘目的ih

感染抵抗性n#細菌KÓåμÛÅ†Ñšô´ihm

f使用T’‘"西嶋‹n#健常i日本人106名m糞

侵襲性核酸J‹ DNA ˜獲得 V#\’˜ CRISPR

便中m微生物 DNA ˜次世代³ôª£ï±ôf網羅

部位j取Œ込‚Rgf生W‘" CRISPR 部位n転的j解析V#得‹’^ DNA 配列J‹約 490 万m重

写T’#Cas jŠbeÓé·¿³ï«T’e低分子

複m無C遺伝子˜同定V#T‹j遺伝子機能m推定

m crRNA ( CRISPR RNA ）giŒ#\’KÈªè˜ 行 b ^18) " } ^ # Ã ï Ú ô ª # μ Ö Ÿ ï # 中›ô¸（核酸分解酵素）m§ŸÅgibe侵襲性核国#μ¡¢ôÃï#é³›#¥ôμÄæ›#Ñåï酸m切断部位K特定T’#侵襲性核酸n切断T’

μ#Öçô#›Ýæ¦#ÕÉ¶£å#Úå¡Ÿm健‘13) " 本 ³ μ Â Ü m 詳 細 n Barrangou ‹ m è Ï

常人 861 人分mÝ»®ÊÜÃô»˜同様j解析V

áô˜参照T’^C13)"Barrangou ‹n乳酸菌m¦

e#日本g他m国m菌叢g遺伝子機能m比較˜行bç ½ ß ô ¯ è ª ³ ã ï 株 m 1 c f A ‘ S. ther-^18) "菌叢n国Sgj有意j異ibeIŒ#日本

mophilus DGCC7710 株j 4 種類mÑšô´m耐性

人m腸内細菌叢fn Biˆdobacterium 属g Blautia 属

˜持^Z‘Rg˜試~^14) "}Y#次世代³ôªihm細菌K 12 ¦国中最„多N#逆j ClostridiumVol. 66. 2016

― 12 ―

属細菌† Methanobrevibactor smithii（Ý»ï産生古

種間f配列K異i‘ 9 J所m可変領域（V1～V9)22)

細菌）ihK少iJb^18)"日本人f Biˆdobacteri-g#他種間jICe„配列K類似„VNn保存T’

um 属細菌K多CgCE結果n#後述m中山‹m日

eC‘保存領域g呼o’‘領域K存在X‘" 16S

本人m菌叢解析結果g„一致X‘19) "日本人m腸rRNA 菌叢解析fn#解析対象gX‘可変領域m両内細菌叢m機能的i特徴gVen#炭水化物代謝†

側jA‘保存領域内je#ŠŒ多Nm細菌種˜検出›ÛÊ酸代謝#膜輸送j関•‘機能K他m 11 ¦国

fL‘ŠE設計T’^âÇÌô±çÓåŸÚôg呼g比較Ve高N#£Éç©ô代謝#翻訳#複製・修o’‘ÓåŸÚô配列˜使用X‘"次世代³ôª£

復機能†細胞運動性（鞭毛ih）K低Jb^18) "ïμ用mÓåŸÚôn#RmâÇÌô±çÓåŸ

日本人m腸内菌叢n#腸内f発生X‘水素˜Ý»ïÚô配列m他j#±ïÓç˜区別X‘^ƒmÌô

wg変換X‘ M. smithii K少iCg同時j#水素¯ôÅm役割˜X‘配列†#次世代³ôª£ïμm

˜酢酸wg変換X‘ Blautia 属K多N#Jc短鎖脂^ƒj必要i配列K付加T’eC‘"R’‹mÓå肪酸˜代謝産物gX‘炭水化物代謝機能˜多N有XŸÚô˜用CeÄô»ç DNA 中m16S rRNA 遺伝‘RgJ‹#予測T’‘日本人m腸内環境gVe#

子˜対象jVe PCR 増幅V#次世代³ôª£ï

酢酸˜含‚短鎖脂肪酸m生成量K他m 11 国ŠŒ„±ôjŠ‘ PCR 増幅断片m配列決定˜行E"出力

高C可能性K示唆T’^18) "RmŠEj#微生物

T’^Ãô»n QIIME23) ihmÌŸ¥ŸïÑ¤Ú

集合体mÄô»ç DNA ˜用C^Ý»®ÊÜ解析

ÂœªμÍŸÓåŸï˜用Ce菌叢解析˜行E事Kn#菌叢m持c機能g代謝産物m予測˜可能jX

fL‘"菌叢解析m»ô®¿ÄgX‘16S rRAN 遺‘"Ý»ØéôÜ解析g併用X’o#細菌叢m„c

伝子m可変領域†âÇÌô±çÓåŸÚôjcCe

機能jcCeT‹j明確i情報K得‹’‘可能性K

n統一T’eI‹Y# Illumina m公式ÓéÄ¯ôA‘"ç24)fn#解析領域n V3V4 ˜対象gV#ÓåŸÚ ô n Klindworth ‹25) K 選 定 V ^ S D Bact 

2― 2 ― 2

16S rRNA 遺伝子˜対象jV^Ý»®ÊCCTACGGGNGGCWGCAG 
0341 b S 17 ( 5 ′Ü解析)26)g SDBact0785aA21 (5′GACTACHV
3′Ý»®ÊÜ解析手法m 2 c目gVe#原核生物)26 ˜指定VeC‘K#実GGGTATCTAATCC 3 ′（細菌・古細菌）K必Y有X‘16S æØ¹ôÜ RNA

際n研究目的g使用X‘次世代³ôª£ï±ôm

（ rRNA ）遺伝子˜対象gV^ 16S rRNA 解析KA

æôÅ長（表 1）j適X‘ÓåŸÚôK選択T’e‘"本手法n環境・ÎÄ・動物由来m菌叢解析jI

C‘"服部‹m«çôÓ27) n V1 V2 m約 350 塩基

Ce汎用T’eC‘"本遺伝子m転写産物fA‘

対m可変領域˜対象gV#従来m27F âÇÌô±ç

16S rRNA n # 菌 体 内 f 他 m rRNA f A ‘ 5S

AGAGTTTGATYMTGGCTCAG
ÓåŸÚô（5′rRNA †23S rRNA#i‹rjæØ¹ôÜ»ïÍª)28) fnzg™h増幅fLiJb^ÏÑœ¶μ菌
3′質g共jæØ¹ôÜgCE複合体˜形成X‘"Rm„増 幅 f L ‘Š E j 一 部 改 変 V ^ Óå Ÿ Ú ô 27

æØ¹ôÜn#DNA m遺伝子情報m写VfA‘ÝAGRGTTTGATYMTGGCTCAG 3 ′）Fmod （ 5 ′¿·ï´ßô RNA（ mRNA）m配列˜読~取be

TGC
˜設計V#æÌôμÓåŸÚôjn338R（5′対応X‘›ÛÊ酸˜付加V#»ïÍª質m合成˜行）˜用Ce健常者j
TGCCTCCCGTAGGAGT 3 ′EgCE自己複製j関•‘極ƒe重要i¯ïÙôÉIP‘市販mÓéÌŸ¥Âœªμm摂取時g摂取前ïÄm 1 cfA‘" 16S rRNA 遺伝子配列n進化

後m腸内細菌叢jcCe評価V^"被験者m腸内菌

g共jˆbNŒg変化VeC‘„mgVe#細菌m叢n#一部m細菌群fn変動K~‹’‘K#菌叢構

系統†分類学的i分類j適応T’eC‘20,21)"16S

造全体nÓéÌŸ¥ÂœªμjŠŒ変化ZY#安定rRNA 遺伝子n約 1600 塩基対f#\m配列中jn

的fA‘g結論付PeC‘27) "中山‹m«çôÓ― 13 ―

乳業

技術

n# V6 V8 領域（約 440 塩基対）˜対象gV# A ‹目的j応W^解析条件m選択K今後„必要ji‘gcctccctcgcgccatcag CAACGCGAAGA
967F （ 5 ′g考G‹’‘"（大文字m部分KâÇÌô±çÓ
ACCTTACC 3 ′
ATGGTACCG
åŸÚô配列領域))29) g 1390r ( 5 ′2―3)28) ˜改変Ve腸TGTGACGGGCGGTGTGTA 3 ′乳業分野jIP‘次世代³ôª£ï±ôm
利用

内細菌m解析j適V^ÓåŸÚôm Q968F#(5′

乳業分野m菌叢解析事例˜紹介X‘"Ercolini ‹CWSWSWWSHTWACGCGARGAACCTTACC nŸ»æ›m伝統的i½ô¶f#最高品質m水牛Þ

）g Q1390R# (5′CWSWSWWSHTTGACG
3′¿Àšèå½ô¶m製造過程jIP‘菌叢m変化˜）˜設計V^30,31) "中山‹GGCGGTGWGTAC 3 ′解析V^33) "Ÿ»æ›m±èçÊg¦¸ç»jA

K本ÓåŸÚô·¿Ä˜用Ce›´›m 7～10歳m‘二J所m生産所f#原料m水牛m乳#μ»ô»ô

学齢期児童m腸内細菌叢˜調査V^gR“#細菌gi‘前日mÌ¿½J‹mÆ½áåç×£Ÿ¦ç½

叢n Prevotellaceae 科（ P-type ）„VNn Biˆdobac-

ßô（ NWC ）#初期g熟成m終•Œm¦ôÅ（凝teriaceae 科 g Bacteroidaceae 科 （ BB-type ） j 属 X乳）#\Ve成形後m½ô¶m菌叢˜解析V^33)"‘細菌m存在量m多TjŠbe特徴付P‹’‘ 2

原 料 m 乳 j n 乳 酸 菌 以 外 j Acinetobactor sp. †cm£ïÂé»ŸÓ様ªåμ»ô˜示V^19) "\Pseudomonas fragi m 優 占 K 見 ‹ ’ ^ K # μ » ô’]’m細菌叢K持c機能的i構成˜ PICRUSt32)»ôm NWC 添加後n\’‹K優占X‘RgniN#

˜用Ce³Ûáèô³ãïV^gR“# P type f

NWC j含}’‘乳酸菌m S. thermophilus, L. lactis,

n腸内細菌m多糖類m分解活性K高N#胆汁酸m合

L. delbruenkii, L. helveticus（±èçÊm~）K½ô

成活性K低Cmj対V# BB type fn¥æ°糖m¶m製造過程˜通Ve優占VeC^"RmRgJ

分解活性g胆汁酸m合成活性K高CRgK予想T’‹#主j NWC j含}’‘乳酸菌K発酵j寄与Ve^19) "RmŠEj#R’}fn\m複雑TJ‹解C‘RgK示唆T’^33)"

析m規模†解像度j制限mAb^腸内細菌叢j対V

Stellato ‹n#同一工場内f作‹’‘»ŸÓm異e„#次世代³ôª£ï±ôm利用jŠbe細菌叢i‘½ô¶製品Sgj環境（使用器具mμëÒ）gm変動m検出†比較K高C解像度f容易j行G‘Š½ô¶m両方jcCe細菌g真菌m菌叢˜解析V#

Ejib^"

環境中m微生物K½ô¶製品j与G‘影響m評価˜

次世代³ôª£ï±ôjŠ‘16S rRNA 解析n#行b^34) "½ô¶g器具m菌叢n#細菌・真菌共解析»ô®¿Ä˜16S rRNA 遺伝子j絞beC‘関

j双方fnbLŒg異ibeIŒ#細菌jcCen

係f#Äô»ç DNA ˜用C^Ý»®ÊÜ解析ŠŒ

全体的j½ô¶ŠŒ„器具m方K細菌叢m多様性K„各±ïÓçm解析部位m冗長度˜増†XRgK容高Jb^"S. thermophilus †腐敗性細菌m Pseudo-易i^ƒjŠŒ多Nm±ïÓç˜解析fL#Jc

monas 属細菌#Acinetobacter spp., Acinetobacter joh-Ãô»m処理„ŠŒ簡便iRgJ‹菌叢解析mÀô

nsonii g Psychrobacter spp. jcCen器具g½ô

çgVe汎用T’eC‘"RmŠEj#本法n強力¶˜含‚z{Xxem±ïÓçf検出T’^K#\iÝ»®ÊÜ解析ÀôçfA‘K#問題点„存在X

m存在率n双方f異ibeC^"Pseudomonas 属細‘"\’n#ÓåŸÚôm配列jŠben検出fL菌n器具fn平均f 30 m存在率˜占ƒeIŒ#iC微生物群K存在X‘Rg†# PCR jŠ‘増幅

高C„mfn 50 j„上b^K#½ô¶jIP‘ÌŸ›μihK生W‘^ƒ#異i‘条件（特j異i

本 属 細 菌 m 存 在 率 n 5  以 下 f A b ^ " S. ther-‘ÓåŸÚô）f行•’^菌叢解析結果n#正式jmophilus jcCenæ¯¿»以外m½ô¶fn平n比較X‘RgKfLiC"\m^ƒ#新規j菌叢

均f 70 （æ¯¿»½ô¶n約 25 ）#器具fn

解析˜計画X‘場合jn#\EV^点˜踏}GiK

3 ～ 43 m存在率˜占ƒeC^"真菌jcCe

Vol. 66. 2016

― 14 ―

„#器具j多N存在X‘真菌m大部分n½ô¶j„3) Pieter De Maayer, A. V., Don A. Cowan. Ý»

存在VeC^K#\’‹K優占種gi‘Rgn無J®ÊÛªμ解析m現状$®ÊÜ情報解析―次b^"乳酸菌g腐敗性細菌m存在率n負m相関K見世代³ô¬ï±ôm最新m方法g応用―$［編‹’‘RgJ‹#腐敗性細菌n乳酸菌jŠbe排除

集］ Poptsova, M. S. #［監訳］石井一夫#富T’eC‘RgK示唆T’^34) "R’‹m解析例

田因則#丹生谷博#大藤道衛#株式会社 £mŠEj#次世代³ôª£ï±ô˜用C^菌叢解析

È・Âœô・£μ#233268 (2016).

技術n#乳製品m品質管理j応用X‘RgKfL‘

4) 平山洋佑#遠藤明仁$乳酸菌分類m現在gÏ

g考G‹’‘"3.

Ñœ¶μ菌・乳酸菌分類小委員会K提言V^
新規乳酸菌種提唱m^ƒm最少基準$腸内細I • Œ j

菌学雑誌 #30, 1728 (2016).

腸内細菌叢†環境微生物m網羅的i解析n#次世

5) Parte, A. C. LPSNlist of prokaryotic names

代³ôª£ï±ôK普及X‘}fn得‹’‘情報K

with standing in nomenclature. Nucleic acids

限‹’eC^"微生物®ÊÜjcCe„同様f#A

research,‘目的遺伝子m®ÊÜ上m位置（遺伝子座）K•J(2014).

(Databaseissue):

D613D616

6) 辨野義己$ Lactobacillus 属m分類g同定$食‹iC場合jn#±²ïËŸÒæ¼Ÿ¸ô³ãïi

品g微生物 #8, 6574 (1991).

hf目的遺伝子˜検索V#T‹jªéôÇï«操作
˜行be³ôª£ïμ˜行EgCb^労力g時間˜7) Salvetti, E., Torriani, S. and Felis, G. E. The

要X‘作業K必要fAb^"現在fn#次世代³ô

genus Lactobacillus: a taxonomic update.

ª£ï±ôfÅåÑÄ®ÊÜ˜簡単j取得fL‘^

Probiotics and antimicrobial proteins, 4, 217ƒ#®ÊÜ中m目的遺伝子„数日程度A’o見cP

226 (2012).

‘RgKfL‘"完全®ÊÜm取得jcCen#現

8) Sun, Z. et al. Expanding the biotechnology

在f„††労力˜要X‘K#今後#éï«æôÅmpotential of lactobacilli through comparative

次世代³ôª£ï±ôm精度K}X}X上K’o#genomics of 213 strains and associated genera.

完全®ÊÜm解読„容易ji‘RgK予想T’‘"

Nat Commun, 6, 8322 (2015).

}^#現在nXfjÙô»Òç型m次世代³ôª£9) Agyei, D., Tambimuttu, S., Kasargod, B.,

ï±ôK存在VeC‘"今後#簡便性†価格KT‹

Gao, Y. and He, L. Quick and low cost im-

j追及T’’o#乳製品m製造現場fmÞÇ»æï

mobilization of proteinases on polyesters:«†微生物関連mÄåÒçj対X‘原因解明手段g

Comparison of lactobacilli cell-envelope pro-

Ve„次世代³ôª£ï±ôK汎用T’‘可能性K

teinase and trypsin for protein degradation.

A‘"

Journal of biotechnology, 188, 5360 (2014).

10) Fox, P. and Wallace, J. Formation of ‰avor

参考文献

compounds in cheese. Advances in applied

1) Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R.

microbiology, 45, 1786 (1997).

DNA sequencing with chain-terminating inhi-

11) von Schillde, M.-A. et al. Lactocepin secreted

bitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 74, 5463

by Lactobacillus exerts anti-in‰ammatory

5467 (1977).

eŠects by selectively degrading proin‰amma-

2) Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. A
sequencing

methodbasedontory chemokines. Cell host and microbe, 11,387396 (2012).

real-time

pyrophosphate. Science, 281, 363365 (1998).

12) Barrangou, R. et al. CRISPR provides ac-― 15 ―

乳業

技術

quired resistance against viruses in prokary-structure of the prokaryotic domain: the pri-otes. Science, 315, 17091712 (2007).

mary kingdoms. Proc Natl Acad Sci U S A, 74,

13) Barrangou, R. and Marra‹ni, L. A. CRISPR-

50885090 (1977).
22) Neefs, J. M., Van de Peer, Y., De Rijk, P.,

Cas systems: Prokaryotes upgrade to adaptive
immunity. Mol Cell, 54, 234244 (2014).

Chapelle, S. and De Wachter, R. Compilation

14) Barrangou, R. et al. Genomic impact ofof small ribosomal subunit RNA structures.

CRISPR

immunization

againstNucleic Acids Res, 21, 30253049 (1993).

bac-teriophages. Biochem Soc Trans, 41, 1383
1391 (2013).

23) Caporaso, J. G. et al. QIIME allows analysis ofhigh-throughput community sequencing data.

15) Shimomura, Y. et al. Complete genome se-

Nat Methods, 7, 335336 (2010).

24) 16S

quencing and analysis of a Lanceˆeld group G

Metagenomic

Sequencing

Library(http://support.illumina.com/

Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis

Preparation

straincausing streptococcal toxic shock

documents / documentation / chemistry _syndrome (STSS). BMC Genomics, 12, 17

documentation/16s/ 16s-metagenomic-library-(2011).

prep-guide-15044223-b.pdf).

16) Kamerbeek, J. et al. Simultaneous detection25) Klindworth, A. et al. Evaluation of generaland strain diŠerentiation of Mycobacterium

16S ribosomal RNA gene PCR primers fortuberculosis for diagnosis and epidemiology.

classical and next-generation sequencing-

J Clin Microbiol 35, 907914 (1997).

based diversity studies. Nucleic Acids Res 41,17) Briner, A. E. and Barrangou, R. Lactobacillus

111 (2013).

buchneri genotyping on the basis of clustered

26) Herlemann, D. P. et al. Transitions in bacteri-

regularly interspaced short palindromic repeat

al communities along the 2000 km salinity(CRISPR)

gradient of the Baltic Sea. The ISME journal,

locus

environmental

diversity.

microbiology,

Applied80,and9941001

5, 15711579 (2011).

(2014).

27) Kim, S. W. et al. Robustness of gut microbiota18) Nishijima, S. et al. The gut microbiome ofof healthy adults in response to probiotic inter-healthy Japanese and its microbial and func-

vention revealed by high-throughput pyrose-

tional uniqueness. DNA Res, 23, 125133

quencing. DNA Res, 20, 241253 (2013).

(2016).

28) Lane, D. J. 16S/23S rRNA sequencing.

19) Nakayama, J. et al. Diversity in gut bacterial

Nucleic acid techniques in bacterial systematics.

community of school-age children in Asia. Sci[ed.] Stackebrandt, E and Goodfellow, M.,

Rep, 5, 8397 (2015).

John Wiley and Sons, 125175 (1991).

20) FOX, G. E., Pechman, K. R. and Woese, C. R.

29) Sogin, M. L. et al. Microbial diversity in the

Comparative cataloging of 16S ribosomal

deep

ribonucleic

biosphere''.

Proceedingsofprocaryotic systematics. International Journal

AcademySciences,103,of Systematic and Evolutionary Microbiology,(2006).

acid:

molecular

approachto27, 4457 (1977).

and

of

the

underexploredthe``rareNational

1211512120

30) Nakayama, J. Pyrosequencebased 16S rRNA21) Woese, C. R. and Fox, G. E. Phylogenetic

Vol. 66. 2016sea

proˆling― 16 ―

ofgastro-intestinal

microbiota.

Bioscience and micro‰ora, 29, 8396 (2010).

sequencing of the microbiota involved in the31) 是則有希# Jiahui, J. #中山二郎$ 16S rRNA

production of water buŠalo mozzarella cheese.

遺伝子m大量³ôª¢ï³ï«jŠ‘菌叢解Appl

析m現状g問題点$日本乳酸菌学会誌 # 23,(2012).

2434 (2012).

EnvironMicrobiol,

78,81428145

34) Stellato, G., De Filippis, F., La Storia, A. and

32) Langille, M. G. et al. Predictive functional

Ercolini, D. Coexistence of Lactic Acidproˆling of microbial communities using 16S

Bacteria and Potential Spoilage Microbiota inrRNA

a Dairy Processing Environment. Appl Envi-markergene

sequences.

Naturebiotechnology 31, 814821 (2013).

ron Microbiol, 81, 78937904 (2015).

33) Ercolini, D., De Filippis, F., La Storia, A. andIacono, M. ``Remake'' by high-throughput― 17 ―

乳業

技術