RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix【RNA-direct™ Realtime PCR Master Mixトラブルシューティング 】※RNA-direct™ SYBR™Green Realtime PCR Master Mixトラブルシューティングはp3へ

1. 増幅がみられない、乱れる原因
対策
検出機器の設定などが蛍光色 標識に用いられている蛍光色素の種類によって、検素に適合していない出機器の設定を変更する必要があります。設定を適正化して再解析してください。
data collection の設定が不適 蛍光標識プローブや、蛍光標識プライマーを用いた
切
各種アッセイでは、アッセイ法により data collectionの推奨設定位置が異なります。設定を確認し、適正化して再実験してください。
サンプル位置の設定ミス
入力したサンプル番号と、機器にセットしたサンプルの位置が合っているか確認し、適正なサンプル位置を設定して再解析、あるいは再実験してください。
その他装置の故障・不具合
各装置の取扱説明書に従い、点検してください。
PCR 反応条件・プライマーの濃 プライマー濃度や PCR 反応条件の変更をご検討くだ度・配列などが不適切
さい。増幅が悪い場合は、一般的にアニーリング温度を下げる、アニーリング時間を長くするか、プライマー濃度を上げてみます。まれに、逆にアニーリング温度を上げることや、伸長時間の延長などで向上することもあります。ランプ速度を遅くすることで感度が改善される場合があります。また、GC 含量の高いターゲットでは、変性時間を延長することで、改善することもあります。それでも不良の場合は、プライマー再設計をおすすめします。
サンプルの純度が悪い
RNase の作用により鋳型 RNA が分解されている可能性があります。ピペット等の器具類は RNA 取扱専用のものを使用し、RNA を再調製してください。
2. 定量値がばらつく
原因
装置の故障・不具合

サンプルの純度が悪い対策
装置の不具合により、温度管理や検出にばらつきが生じている場合があります。各装置の取扱説明書に従い、点検してください。
純度が悪いサンプルは、ばらつきの原因となります。
均質なサンプルをご使用ください。また、サンプル中のゲノム DNA の残留により、ゲノム DNA 由来の増幅産物が検出されることがあります。DNase I 処理によりゲノム DNA の除去を行ってください。

RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix

2. 定量値がばらつく(つづき)
原因
対策
PCR 反応条件・プライマーの濃 PCR の増幅効率が悪い場合は、ばらつきも大きくな度・配列などが不適切る傾向があります。プライマー濃度や PCR 反応条件の変更をご検討ください。増幅が悪い場合は、一般的にアニーリング温度を下げる、アニーリング時間を長くするか、プライマー濃度を上げてみます。伸長時間の延長などでも向上することがあります。また、
GC 含量の高いターゲットでは、変性時間を長くすることで、改善されることがあります。それでも、ばらつきが大きい場合は、プライマーおよびプローブの再設計をおすすめします。
計量のばらつき多くのリアルタイム PCR 装置では、推奨反応スケー
ルよりも少量の液量で検出が可能ですが、検出感度や正確性が低下する場合があります。反応スケールを上げて推奨液量で再実験してください。
3. ブランクサンプルにシグナルがみられる。
原因
対策
陽性サンプルや PCR 産物のコ まずは、ブランクに用いたサンプル(水)を更新してくンタミネーション
ださい。それでも発生する場合は、使用する蒸留水やプライマー、試薬などを更新して再検討してください。

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1. 増幅がみられない、乱れる原因
対策™
検出機器の設定などがSYBR 検出機器の設定を適正化して再解析してください。
Green I に適合していない
data collection の設定が不適 SYBR™ Green アッセイでは通常、伸長ステップの最後に data collection を設定します。設定を確認し、適切正化して再実験してください。
サンプル位置の設定ミス
入力したサンプル番号と、機器にセットしたサンプルの位置が合っているか確認し、適正なサンプル位置を設定して再解析、あるいは再実験してください。
その他装置の故障・不具合
各装置の取扱説明書に従い、点検してください。
PCR 反応条件・プライマーの濃 プライマー濃度や PCR 反応条件の変更をご検討くだ
度・配列などが不適切
さい。増幅が悪い場合は、一般的にアニーリング温度を下げる、アニーリング時間を長くするか、プライマー濃度を上げてみます。まれに、逆にアニーリング温度を上げることや、伸長時間の延長などで向上することもあります。ランプ速度を遅くすることで感度が改善される場合があります。また、GC 含量の高いターゲットでは、変性時間を延長することで、改善することもあります。それでも不良の場合は、プライマー再設計をお勧めします。
サンプルの純度が悪い
RNase の作用により鋳型 RNA が分解されている可能性があります。ピペット等の器具類は RNA 取扱専用のものを使用し、RNA を再調製してください。
2. 定量値がばらつく
原因
装置の故障・不具合

サンプルの純度が悪い対策
装置の不具合により、温度管理や検出にばらつきが生じている場合があります。各装置の取扱説明書に従い、点検してください。
純度が悪いサンプルは、ばらつきの原因となります。
均質なサンプルをご使用ください。また、サンプル中のゲノム DNA の残留により、ゲノム DNA 由来の増幅産物が検出されることがあります。DNase I 処理によりゲノム DNA の除去を行ってください。

RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix

2. 定量値がばらつく(つづき)
原因
対策
PCR 反応条件・プライマーの濃 PCR の増幅効率が悪い場合は、ばらつきも大きくな度・配列などが不適切る傾向があります。プライマー濃度や PCR 反応条件の変更をご検討ください。増幅が悪い場合は、一般的にアニーリング温度を下げる、アニーリング時間を長くするか、プライマー濃度を上げてみます。伸長時間の延長などでも向上することがあります。また、
GC 含量の高いターゲットでは、変性時間を長くすることで、改善することがあります。それでも、ばらつきが大きい場合は、プライマーの再設計をおすすめします。
計量のばらつき多くのリアルタイム PCR 装置では、推奨反応スケー
ルよりも少量の液量で検出が可能ですが、検出感度や正確性が低下する場合があります。反応スケールを上げて推奨液量で再実験してください。
3. ブランクサンプルにシグナルがみられる(融解曲線分析を実施してご判断ください)。
原因対策
陽性サンプルや PCR 産物のコ まずは、ブランクに用いたサンプル(水)を更新してください。それでも発生する場合は、使用する蒸留水
ンタミネーション(ターゲットと同じピークの増幅 やプライマー、試薬などを更新して再検討してくださ産物がブランクサンプルで検出 い。
される場合)
プライマーダイマーなど非特異 プライマー濃度や PCR 反応条件の変更をご検討くだ反応の発生さい。非特異反応が出る場合は、アニール温度を上(ターゲットと異なるピークの増 げる、アニール時間、伸長時間を短くするか、プライ幅産物がブランクサンプルで検 マー濃度を下げてみます。3 ステップ化も効果がある出される場合)ことがあります。それでも発生する場合は、プライマー再設計をお勧めします。

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