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J'本亥言式慶食ノ厚生省生活衛生局

委託

財団法人食品薬品妥当番王手タ斗

秦野艇究!?所【 目 次 】

要約

緒言
実験材料

1. 実験動物および飼育条件

2. 被験物質
毒性予備試験(投与量の決定) ‑1. 方法、‑‑.‑̲.
.
ー‑‑・‑ ・‑…‑・‑・‑
・‑ ・‑一‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑一一‑‑.......̲‑‑一一一一一一一一・ー一一一 4

2
. 結 果

、一一一一一一一一一一一‑‑‑‑‑‑‑‑‑一一一一一一一一.....‑̲..̲.一一一一一一一 4ee

E

小核予備試験(標本作製時期の決定)一1.方法

2. 結果
小核本試験

1. 方 法一一一‑‑‑
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E2. 結果および考察
結論

一一一一一一一一…………一一一……一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一‑. 9

特記事項

文 献

……一一一…一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 10Tables1‑‑‑
5

【 要 約 】

被験物質チモール (TM) の生体内における細胞遺伝学的影響を評価するために、 C
rj:BD
F1雄および雌マウスを用い、強制経口投与による小核試験を実施した。毒性予備試験および小核予備試験を行い、投与量および標本作製時期を設定した後、小核本試験を実施し、陰性の結果を得た。
毒性予備試験を行った結果、 T Mの雄および雌マウスにおける最大耐量は、それぞれ2000mg/kgおよび 1250mg/kgであった。
000、 1750および 1500mg/kgを雄マウスに投与した
小核予備試験において、 T Mの 2250mg/kg を雄マウスに投与し、ところ、いずれの場合にも、死亡例が観察されたため、 14、 48および 72時間に骨髄の塗抹標本を作製した。小核出現頻度(小核を有する幼投与後 24時間群と他の群との聞に明瞭な差は認められなかった。また、赤若赤血球の比率)は、 2血球中に占める幼若赤血球の比率を指標とした骨髄細胞の増殖抑制も、認められなかった。

250mg/kg とし、標本作製時
これらの結果から、雄雌ともに小核本試験で の最高用量を 14時間に決定した。
期を投与後 2T Mの 3
12.5、625 および 1250mg/kgを雄および雌マウスにそれぞれ投与し、投与後24時間自に標本を作製した。小核出現頻度は、被験物質のいずれの投与群においても、溶媒対照群と比較して統計学的に有意な増加は認められず、用量依存性も認められなかった。
また、全赤血球中に占める幼若赤血球の比率は、 T Mのいずれの投与群においても、溶媒対照群との聞に有意差は認められなかった。

rj:BDF，雄および雌マウスの骨髄細胞にお以上の結果から、 T Mは、本試験条件下で Cいて、染色体異常誘発作用あるいは紡錘体形成阻害作用を示さないと結論した。

‑ 1‑

【 緒 言 】

OEC
D既存化学物質安全性点検に係る毒性調査事業の一環として、チモールの生体内における細胞遺伝学的影響を調べるために、雄および、雌マウスを用いて骨髄細胞における小核試験を実施した。まず、小核本試験に用いる投与量を決定するために毒性予備試験を行って最大耐量を求め、次に小核本試験における標本作製時期を決定するために小核予備試験を行い、それらの結果に基づいて小核本試験を行った。

2年 3月 31日、環保業第本試験は「新規化学物質に係る試験の方法について J (昭和 6237号、薬発第 306号、 62基局第 303号)および iOECD 毒 性 試 験 ガ イ ド ラ イ ン :474Jに準拠し、「化学物質 GLP 基準 J (昭和 59年 3月 31目、環保業第 39号、薬発第 229号
、 59基局第 85号、改訂昭和 63年 11月18目、環企研第 233号、衛生第 38号、 63基局第 823号)に基づいて実施した。

ワ臼

【実験材料】

1. 実験動物および飼育条件CRJ) から購入した 8週齢の C
rj:
BDFl(C57BL!
6
実験には、日本チヤールス・リバー(槻 (と DBA/2の近交系問 Fl) 雄および雌マウスを、 1週間以上予備飼育した後、異常の認められなかった動物を 9週齢で試験に供した。入荷日とその匹数は以下の通りである。
試験
毒性予備試験
小核予備試験
小核予備試験(追加分)
小核本試験

入荷日

入荷匹数

1994年 9月28日
1994年 10月 12日
1994年 10月19日
1994年 1
1月 9日

雄 雌 各36匹
雄 雌 各31匹
雄36匹
雄 雌 各31匹

CRJ) を 入 れ た TPX 樹 脂 製 ケ ー ジ
動物は、床敷としてホワイト・フレーク@ ((143x293x148mm， CRJ) に 1匹ずつ収容し、飼育室(設定温度;23:!
:1oc、 設 定 湿 度 :55:t5%、換気回数:約 15回/時問、明暗サイクル:午前 7時点灯、午後 7時消灯)で、マウス繁殖用固型飼料 (NMF、オリエンタル酵母工業(槻)と水道水を自由に摂取させて飼育した。動物の群分けは自由群分け(無作為抽出)により行った。個体識別はフェルトペンによりマウスの尾に群と個体番号を記し、ケージには群ごとに色の異なるカードに、試験系識別番号、群および個体番号を記載して個体識別の補助とした。

OE
C
D毒 性 試 験 ガ イ ド ラ
なお、すべての試験において、投与経路および投与回数は i
イ ン :474J に準拠し、単回強制経口投与とした。

2. 被験物質名 称

チモール (CAS.Nn89‑
83‑8)

英名(略称)

Thymol (TM)

製 造 元
ロット番号

純度98%以 上 ( 不 純 物 と し て 、 不 揮 発 物 0.05%以 下 、 他 の フ ェ ノール類限度内を含む)

物理化学的性質

性状;白色結晶
分 子 量 ;150.
22‑3‑分子式;C1oH140

融点;51.5C0

沸 点 ;233.5C0

保管条件

室温

購 入 先

【毒性予備試験(投与量の決定)】

1. 方法1)実験群の設定
小核試験に用いるチモール (TM) の投与量を決定するため、雄雌ともに各群 5匹ずつからなる 7群を設け、公差を 2
50mg!
kg とすることにより、投与量をそれぞれ、 500、750、 1000、 1250、 1500、 1750 および 2000mg!
kg とした。

2)検体の調製および投与方法
検体の投与容量はマウスの体重 kg 当たり 10mi とした。投与検体は T Mの所要量を正確に採取し、局方オリブ油(東豊薬品(棚、ロット番号:39L) に懸濁して最高用量の原液を調製した。それ以下の用量については、最高用量の調製液を上記の溶媒で希釈して所定の濃度に調製した。また、投与検体はすべて用時調製とした。
投与は強制経口投与とした。投与臼は、雄雌ともに 1994年 10月 5日に行った。投与時の3‑‑27g、雌で 19‑‑‑21gであった。
体重範囲は雄で 23)死亡率および一般状態の観察
投与当日を 0日として 4日間にわたり毎日一般状態を観察し、死亡の有無を調べた(1994年 10月 5‑‑8日)。

2. 結果
投与直後、すべての投与群において自発運動の低下が認められ、用量の増加とともに、‑4‑よろめき歩行、腹臥、呼吸促迫などの毒性徴候が現れた。死亡例は、雄では認められず、雌では 1500および 1750皿g/kg群で各 2匹確認された C
Table 1、 2) 。したがって、TMの強制経口投与による C
rj:
BDFI 雄および、雌マウスの最大耐量は、本実験条件下で、雄では 2000mg/旬、雌では 1250皿g/kgであると判断し、それぞれを小核予備試験に用いる TMの投与用量とした。

【小核予備試験(標本作製時期の決定)】

1. 方法1)実験群の設定

000皿g/kgを投与したところ、 15匹中 7匹の死亡例が観察され雄マウスに、 T Mの 2750た。そこで雄マウスについてさらに用量を下げて小核予備試験を実施したところ、 15匹中 2匹、 1500皿g/kg群で 15匹中 1匹の死亡が認められた (Table1)。
mg/kg群で 1250mg/kgを用いることとなしたがって小核予備試験において、雄、雌ともに同用量の 1ったため、標本観察は雄マウスについてのみ行うこととした。雄マウス各 5匹ず、つからな

24時間群、 48時間群、 72時間群)を設け、小核本試験における適切な標本作製時る 3群 (期を決定することとした。

2)検体の調製と投与方法
検体の調製と投与方法は毒性予備試験の場合と同様に行った。雄マウスへの投与は、1994年 10月31日に行った。投与時の体重範囲は、 24‑‑28gであった。

3) 標本の作製

小核の観察のための骨髄標本は、 Schmid の方法 1. 2) に従って作製した。すなわち、投与後所定の時間に頚椎脱臼法によりマウスを致死させて左右の大腿骨を摘出した。その両骨端を切断して、骨髄細胞を 0.
6m
R のウシ胎児血清 CHazleton、ロット番号:12103343) で洗い出し、遠沈管に集め、 1000rpmで 5分間遠心分離して、上清を除いた。
沈溢をピペッテイング後、細胞浮遊液の一部をスライドグラス上に塗抹(各個体につき 3‑5‑枚の標本)し、それぞれの骨髄標本に試験系識別番号および暗番号を記し、室温で一晩自然乾燥させた。乾燥した骨髄標本は 5分間メタノールで固定し、標本観察時まで室温保存

しfこ。

4)骨髄標本のアタリジンオレンジ(A.O.)鐙光染色および小核の観察A.O.)蛍光染色および小核の観察は、林らの方法 3 4)
骨髄標本のアタリジンオレンジ (，に従って行った。 O.04mg/m1の A.O.溶液を上記のメタノールで、固定済の骨髄標本上に数滴滴下し、カバーグラスをかけ、カバーグラス上から漉紙で余分な溶液を十分吸い取り、鐙光顕微鏡下で観察した。
骨髄標本はそれぞれの個体ついて、 2名の観察者によりブラインド法で観察した。 l個000個の幼若赤血球 (polychromaticerythrocytes) を観察し、その中の小核を体あたり 200個観察し、そのなかの幼若有するものの数を記録した。また赤血球を 1個体あたり 5赤血球の比率を調べて、骨髄細胞の増殖抑制の指標とした。

2.結 果
結果は Table3に示した。小核出現頻度に関しては、 24時間群と他の群との聞に明瞭な差は認められなかった。また、この用量では、幼若赤血球の比率を指標とした骨髄細胞の増殖抑制も認められなかった。以上の結果から、小核本試験における標本作製時期を、4時間に決定した。また、 T Mの 1250mg/kg投与により、いずれの時間群におい投与後 2ても、骨髄細胞の増殖抑制も認められなかったことより、小核本試験に用いる T Mの最高250mg/kg と決定した。
用量を雄雌ともに 1【小核本試験】

1. 方法1)実験群の設定
毒性予備試験および小核予備試験の結果に基づき、小核本試験に用いる最高用量を雄雌250mg/kg とし、これをもとに公比 2で減じ、中用量を 625mg/kg、低用量をともに 1‑6‑312.5mg/kg とし、さらに、高用量群に死亡が認められた場合の予備群として 156.
3mg/kgを 設 け た 。 ま た 、 標 本 作 製 時 期 を 投 与 後 24時 間 に 設 定 し 、 各 群 5匹ず.つからなる 6群を以下のように設けた。

i)溶媒対照群(局方オリブ油)註) TM 156.
3皿g/kg投与群iii) TM 3
12.
5皿g/kg投与群iv) TM 625皿g/kg投与群v) TM 1
250皿g/kg投与群vi) 陽性対照群 Ccyclophosphamide， C PA :50皿g/kg)事
事当研究室で、本用量の CPAの強制経口投与により小核が有意に誘発されることが認められている。

2)検体の調製および投与方法
投与検体の調製および投与方法は毒性予備試験の場合と同様に行った。また、陽性対照物質(CPA， SigmaChe皿icalCo.、 ロ ッ ト 番 号 : 73H0846) は、局方生理食塩液(~欄大 塚 製 薬 工 場 、 製 造 番 号 :K3B88) に溶解して所定の濃度に調製し、10m.
e/kgの 容 量

994年 11月 16日に行った。投与時の体重範で単回強制経口投与した。投与は、雄雌ともに 13‑‑28g、雌で 18‑‑21gであった。
囲は、雄で 2秦野研究所において、156.3mg/kg群および 1250皿g/kg群の投与検体について室温遮光条件下で調製後 4時間までの TMの局方オリブ油中での安定性を調べた。その結果、調製 4時間後における各濃度の平均含量は、それぞれ初期値(0時間)の平均値に対して、

103および 96.
6%であった。これらの値は、当研究所で規定している基準内 (4時間後に0%以上)であった
おける平均含量が初期値の 9(Appendix1)。

また、同検体について、含量測定試験を行った。その結果、調製後の濃度は、いずれも当研究所で規定している基準内(溶媒中での平均含量が添加量の85‑‑115%) であっfこ (Appendix2、3)。

以上の結果から、

TMは局方オリブ油中では安定であり均一性も認められ、また調製検体中の被験物質の含量は所定の値の範囲内にあることが確認された。

‑7‑

3)標本の作製方法および 小核の観察1250mg/kg群において雄雌ともに毒性徴候は認められたものの、死亡した個体がな
56.
3皿g/kg群の標本作製は行わなかった。他の用量群の標本の作製およびかったため、 1小核の観察は、小核予備試験の場合と同様に行った。ただし標本の作製時期は小核予備試4時間 (1994年 11月 17日)とした。
験の結果に基づき、雄雌ともに投与後 24)有意差検定
それぞれの小核出現頻度について、 Fisher の正確確率検定法 5)により、溶媒対照群と、各検体投与群および陽性対照群との間で 5%水準で有意差検定を行った。検定にあた

onferroni の補正 6)を行った。更に、小核出現頻度の用っては、多重性を考慮して、 B
ochran‑Armitage の傾向検定 7)を 5%水準で、行った。
量(対数値)依存性について C
また、赤血球中に占める幼若赤血球の比率について、それぞれ溶媒対照群と、各検体投与群および陽性対照群との間で、 t検定を行った。検定にあたっては、多重性を考慮して、

Bonferroni の補正を行った。

2. 結果および考察
雄および雌の小核本試験の結果をそれぞれ Table4および 5に示す。雄雌ともに溶媒対照群と陽性対照群の小核出現頻度は、それぞれの過去 5年閣の背景データのばらつきのisher の正確確率検定法 C
Bonferroni の補範囲内(平均値i:3x標準偏差)であった。 F正)による有意差検定の結果、小核出現頻度は T Mのいずれの投与群においても、溶媒対ochran‑Armitage
照群と比較して統計学的に有意な増加は認められなかった。さらに、 Cの傾向検定の結果においても、 T Mの用量に依存した有意な増加傾向は認められなかった。
一方、 C P Aを 50mg/kg投与した陽性対照群での小核出現頻度は、 5%水準で有意な増加がみられた。
赤血球中に占める幼若赤血球の比率は、 T Mのいずれの投与群においても溶媒対照群との間に有意差は認められなかった。

‑8‑

【 結 論 】

以上の結果から、本試験条件下では被験物質 T Mは、骨髄細胞において、染色体異常誘発作用あるいは紡錘体形成阻害作用を示さず、また骨髄細胞の増殖抑制作用も示さないと結論した。

【特記事項】

全試験期間を通して、試験の信頼性に悪影響を及ぼす疑いのある予期し得なかった事態
および試験計画書からの逸脱は認められなかった。

‑9‑【 文 献 】

1)Schmid， W. :Them
icronucleustest. MutationRes.3
1 :9‑15(1975)

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編 : i毒性・薬効データの統計解析 J，サイエンテイスト社，東京
功7)吉村編 : i毒 性 ・ 薬 効 デ ー タ の 統 計 解 析 J ， サ イ エ ン テ イ ス ト 社 ， 東 京
功5)吉村(
1991)
， p
p.44
‑55.
「小核試験 J，サイエンテイスト社，東京

4) 林 真(1987)， pp. 76‑78.

6)吉村 功 、 大 橋 靖 雄 責 任 編 集 : i毒 性 試 験 講 座 14、毒性試験データの統計解析」

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