〔生物工学会誌 第 101 巻 第 8 号 413．2023〕
DOI: 10.34565/seibutsukogaku.101.8_413

ナノポア応用研究の最前線
特集によせて庄司
ナノポア計測は，脂質二分子膜や窒化シリコン薄膜のようなイオン不透過性の薄膜に構築されたナノメートル
スケールの細孔（ナノポア）を流れるイオン電流を計測することで行われる．標的物質がナノポア内を通過することで一時的にイオンの流れが阻害され，阻害電流シグナルとして検出することができる．このシグナルは，ナ
ノポア内を通過した物質のサイズや形状，チャージなどの情報を有しており，統計解析により通過した物質の物
理的な情報を取得することができる．
カリフォルニア大学サンタクルーズ校の David W. Deamer
らのグループによって，1980 年代後半から 90 年代にかけてナノポアシーケンサーのコンセプトが考案された．
そして 1996 年に，そのコンセプトを実証した最初の論文が公開されてから今日に至るまで，ナノポア技術を用いた一分子計測技術は大いに発展を遂げてきた．2015
年に Oxford Nanopore Technologies 社から世界初の商用ナノポアシーケンサー（MinION）が販売されると，小型かつ安価なシステムとして，分子生物学や医学分野の研究者から大きな注目を浴び，MinION を用いた研究が数多く報告されている．本特集をご覧になられている生物工学会員の中にも，すでに使用された経験をお持ちの方がいらっしゃることと思われる．
一方，ナノポア技術はナノポアシーケンサー以外にも高感度・高時間分解能を有する一分子計測技術として，
分子サイズが数ナノメートル程度の低分子化合物から比較的大きなタンパク質，さらには直径数百ナノメートル程度の細胞小胞やウイルスの検出など，汎用的な計測手法として幅広く応用されている．しかしながら，日本国
内では，ナノポア技術を用いた分子計測技術が広く浸透しているとは言い難い状況である．そこで筆者らは，より多方面の分野の研究者からナノポア計測技術に興味を持っていただきたく，2022 年度に開催された第 60 回日
本生物物理学会年会にて，「先端的ラベルフリーナノポ
ア計測による生物物理学への応用と展開」というシンポジウムを開催し，ナノポア計測技術に関する最新の取組
み・研究成果を紹介した．本特集も，上記シンポジウムを聴講していただいた東京工業大学の松浦教授にお声がけいただき，企画させていただくこととなった．本特集
では，先のシンポジウムでご講演していただいた先生方
著者紹介

1
2

観 1・山崎洋人 2に加え，ナノポア技術の発展と応用に必要不可欠である
分野横断的な研究に取り組んでいらっしゃる先生方に寄稿をお願いした．
ナノポア計測において高感度一分子計測を実現するた
めには，「ナノポア内を流れる分子輸送現象の解明・理解」「標的分子に対する最適なナノポア構造体の設計・構築」「標的分子シグナルの増幅」そして「高精度シグナル解析技術」が必要不可欠である．そこで，青山学院大学の三井教授には有限要素法シミュレーションを用いたナノポ
ア近傍の分子の流れに関してまとめていただいた．東北大学の馬渕助教には，MD シミュレーションを用いた合成 DNA ナノポア内部のイオン輸送現象解析に関して執筆いただいた．これらのシミュレーション技術は，ナノポア計測によって引き起こされるさまざまな物理現象を理解する上で，もっとも重要な基礎技術である．また慶
応義塾大学の斎木教授には，光学的手法を用いたナノポ
ア近傍における標的 DNA 分子の挙動観察について寄稿いただいた．
群馬大学の神谷助教には遺伝子工学的な改変型ポア形
成膜タンパク質の構築と分子計測について執筆いただいた．理化学研究所の新津研究員には，de novo タンパク質
デザイン工学に基づいて設計される de novo 設計ナノポア
に関してまとめていただいた．
東京農工大学の川野教授には，DNA コンピューティン
グ技術を用いた標的核酸分子の特異検出および体液診断への応用に関して寄稿いただいた．多数の核酸分子が含まれる体液から標的分子のみを検出することは困難であり，DNA コンピューティングによる分子増幅技術はナノ
ポア計測の病理診断への応用を大きく加速させている．
最後に，名古屋大学の有馬講師には AI を用いたシグ
ナル解析およびウイルス検査への応用に関して執筆いた
だいた．煩雑な統計学的シグナル解析が必要であること
がナノポア計測の応用を妨げる課題の一つであるが，機械学習による解析プラットフォームの構築は，ナノポア技術の用途拡大を推し進めるであろう．
上述のように本特集では，ナノポア技術に関する複数の記事を紹介させていただいた．生物工学会の皆様にナノポア研究に興味を持っていただき，今後の皆様の研究に少しでもナノポア技術が寄与できることを期待している．

長岡技術科学大学 技学研究院 機械系（准教授） E-mail: kshoji@mech.nagaokaut.ac.jp
長岡技術科学大学 産学融合トップランナー養成センター（特任講師） E-mail: hirohitoyamazaki@vos.nagaokaut.ac.jp

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

413

特〔生物工学会誌 第 101 巻 第 8 号 414–417．2023〕
DOI: 10.34565/seibutsukogaku.101.8_414

集

DNA の泳動から評価するナノポア付近の物理的環境と有限要素法によるシミュレーション

Kent Lloyd1・守山 裕大 2・三井 敏之 2*
ナノポアとは，ナノスケールの膜に生成した同スケー
ルの穴のことである．天然に存在する生体物質としては，
細胞膜のイオンチャネルもナノポアといえるが，比較的ナノポアのシミュレーション
ナノポアを含むデバイスの開発は，25 年前に始まり，に内径が大きい α ヘモリシンのような溶血素子は，高分DNA などの検出が報告されてきたが，これらのデバイス

子センシングのパイオニアとして用いられ，現在のナノの開発に並行して必要だったのが，ポアを流れる定常状

ポアを用いた DNA シーケンスの成功につながった 1)．

態のイオン電流と検出物質による封鎖時の電流変化のシ

一方で，半導体デバイス技術の発展も進み，安定したナミュレーション技術であった．基本的にナノポアによる検ノスケールの加工制御法が確立され，さまざまな物質に出は，一次元の電流変化によりなされ，イオン電流が適切よる薄膜を用いた，人工的な固体ナノポアを用いた生体にポアを流れているか，物質がポアを通過する際に封鎖電分子やウイルスセンシングの研究も盛んである．

流を検出できるか，ポアの形状によってイオン電流の I-V

ナノポアセンシング

曲線が非対称になるかなど，観測データの解釈にシミュ
レーションが役立ってきた．特に COMSOL 社が開発したナノポアによるセンシングは，膜内のナノポアを通過

有限要素法のパッケージである COMSOL Multiphysics

する微小なイオンの流れをイオン電流として検出し，そは，固体ナノポアの実験に携わる多くの研究者に利用さの値の変化を I-V コンバーターで高速に計測することでれてきた．ナノスケールの物理を再現するシミュレーショ

行われる．イオン液体をポアのある膜で隔て，膜の両側ンとしては，分子動力学（MD）のほうが優れているが，の液内に基準電極として用いられる AgCl などの電極をいろいろな意味でハードルが高い．一方，COMSOL

配置して，電極間に一定の電位差を加えることによりイMultiphysics を使用することで，直接観測ができないポオン電流を得る．イオン電流は定常的だが，ポアを通過

アと分子などの相互作用や，イオン種による流れの発生，するイオンの速度より，遅い速度で動く高分子やウイル

ウイルスや DNA 分子などのポア通過経路によるイオン

スなどの物質がポアを通過したり相互作用したりすると，電流の変化などの予測が可能になり，少なくともイオン

イオンが通るポアの断面積を減らすことになり，電流値

電流では，予測と実測値が定量的に一致する．そこで筆は一時的に変化する．この変化を封鎖電流と呼び，これ者らは，ポア通過前や通過中の DNA 分子の挙動を蛍光がポアを通過する物質の検出手段である．ナノポアを通鎖電流により，1 分子の長さや形状の情報を直接観察で染色により光学的に観測することで，μm スケールでのDNA の速度を見積もり，その結果と有限要素法で予想したポア付近の電場や流れから，DNA が受ける力を評き，また 1 ウイルスの種類の評価が可能になる．現在，生価し，ポア付近の物理的環境を明らかにしてきた．本稿

過する 1 つの物質で 1 つの封鎖電流が発生するため，封体分子によるバイオポアを用いて，封鎖電流の変化から

では，シミュレーションに必要な微分方程式について，

DNA1 分子の塩基配列を検出できるようになったことは驚シミュレーション時間を短縮する方法や実験結果との相きである．一方，固体ナノポアの開発では，化学的・物理違などを説明する．筆者のような実験家にも，最新のパッ的パラメータの自由度が高いため，さまざまな材料によるケージの利用によりシミュレーションを研究ツールとし

ナノポアの作製方法が試されており，検出物質も DNA にて活用できるので，この場を借りて皆様にも有限要素法

限らず，RNA やウイルスなど，多岐にわたる．さらにによるシミュレーションをお勧めしたいと思う．

薄膜への電極の付加や，光学的な検出など物理量も増え

有限要素法はシミュレーションをする領域を有限個のており，今後の固体ナノポアの発展が楽しみである．

メッシュに分けて，それぞれのメッシュにおいて，与えられた微分方程式から得られる物理的な条件を満たすよ
うに連立方程式を立て，数値的に解く方法である．この方法の特徴は，メッシュを細かく分割することでより正* 著者紹介 青山学院大学理工学研究科（教授） E-mail: mitsui@phys.aoyama.ac.jp
1414

青山学院大学理工学研究科機能物質創成コース，2 青山学院大学理工学物理科学科

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

ナノポア応用研究の最前線
確な解を得ることができるが，近似解を反復的に求める液の流れが生じない (v = 0) と考えられるからである．

ので，その分，計算に時間がかかる．特に固体ナノポア

この場合，固体の表面電荷や，電極への印加電位と溶液におけるセンシングでは，ポアサイズや電極の付加によの電位との電位差から，式 (1) 〜 (3) の有限要素法による表面電位の制御など，物理的環境が多様で複雑である．

るシミュレーションによってイオン溶液中のイオンが固また，固体ナノポアのシミュレーションでは，MDシミュ

体表面付近に形成する電気二重層の厚さを見積もること

レーションよりも大きな領域をシミュレーションする必ができる．この厚さは，単純な幾何を仮定して式 (1) 〜 (3)

要があることから，主に有限要素法が用いられる．

を解析的に解いた結果から得られるデバイ長と一致す
る．実際には，ポア壁面の表面電荷により，ポア内部の有限要素法で取り扱う微分方程式
有限要素法によりナノポア付近の物理量を評価する場

K+ と Cl– の濃度は等しくならずに流れが発生する．この流れは電気浸透流と呼ばれ，式 (2) の右辺第一項は無視

合は，主にポアソンの式，ネルンスト・プランクの式，できない．この流れを評価するためには，流体力学のナ

ナビエ・ストークスの式の 3 つの微分方程式を使用する．

ビエ・ストークスの式が必要となる．

計算時間の短縮には，対称性やメッシュサイズの最適化③ナビエ・ストークスの式（Navier-Stokes equation）

から初期条件の設定まで，さまざまな工夫が必要である．
まずは 3 つの微分方程式について説明する．ポアソンの式，ネルンスト・プランクの式，ナビエ・ストークスの式それぞれナノポア付近における静電ポテンシャル，イe∑i zici∂v∇ϕ+ v ∙ ∇ v = − ∇p + η ∇2 v +
εf
∂t

(4)

ここで，ρf は流体密度，p は流体圧力，η は流体の粘性である．左辺の第二項は流体慣性であり，イオン溶液

オン輸送，水溶液（流体）の流れを記述する．
①ポアソンの式（Poisson equation）∇ ∙ εf ∇ϕ = −ρ = −e ∑i zici

ρfの流速 v は右辺の第三項のイオンの動きによる外力と流(1)

体の粘性によって生じる．ナノポアの系では，定常流を仮定して左辺の第一項を 0 とし， p も 0 とする．ここで

ここで， ϕ は電場，ρ は空間電荷密度，εf は媒質の誘得られた流速 v は，式 (2) の右辺の第一項の v を与える．

電率であり，真空の誘電率 ε0 と比誘電率 εr より，εf = ε0εr

この 4 つの式に基づく有限要素法の繰り返し計算によと表せる．zi と ci は，それぞれイオン種 i の価数と濃度

り，ポア付近の電場，イオン輸送，水溶液の流れが評価を表す．このポアソンの式は，ナノポア付近のイオンにできる．ポアが真円の場合，イオン電流はポアの抵抗とよる移動電荷や，ポア壁などの表面電荷，電極電位によ

ポアへのアクセス抵抗の直列として解析的に計算できる

る静電ポテンシャル ϕ を与え，以下の式に，その勾配でため，シミュレーション結果の妥当性を評価することがある電場 ϕ を，以下の②と③の式に用いる．

できる．また，シミュレーションのイオン輸送からポア②ネルンスト・プランクの式（Nernst–Planck equation）

を通過するイオン電流が予想でき，この値は実験的に測定されたイオン電流値と比較もできる．シミュレーショ

ji = civ − Di ∇ci − μici ∇ϕ(2)ン結果が妥当であれば，ナノポアの材質やイオン種を変更したり，ポアの形状を複雑にしたり，電極付加による∂ci= − ∇ ∙ ji∂t

(3)

電界制御の効果を与えたりした場合に，実験的に実装する前に，ナノポア周辺の物理量を容易に評価することがここで，ji，Di，μi はそれぞれイオン種 i のフラックス，

できる．

拡散定数，移動度で，v はイオン溶液の流速である．よっ

有限要素法の結果と観測結果て，式 (2) はイオン種の流速を与える．右辺は，溶液の流れによる移動の項，拡散項，電気泳動の項である．移

筆者らは，膜厚 200 nm の膜に直径 100 nm 以上のポ

動度 μi は，電場による外力と溶液の粘性により終端速度

アを作製することにより，ポア付近の電場の効果を増強

で移動するものとする．式 (3) はイオンの保存則である．

して，DNA の電気泳動を光学顕微鏡の分解能で観察しイオン溶液の流速 v は，次のナビエ・ストークスの式でている．DNA の動きは，次の式 (5) により記述すること与えられる．固体ナノポアの実験が始まった 2005 年頃ができる．

は，イオン溶液として KCl が使われていた．その理由は，

K+ と Cl– は溶液内のイオン濃度が等しく，移動度が同程度で極性が逆であるために，ナノポア内部で，イオン溶
生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

vDNA = vele+vEOF
ここで，vele は，vele = μici(5)ϕ より得られる電気泳動由来
415

特

集

の DNA の移動速度で，vEOF は電気浸透流による DNAの DNA が浸透流に及ぼす効果である．固体ナノポアにの流れである．DNA の正味の動きは，この 2 つの速度

よる DNA 検出では，イオン電流のノイズの急激な増加の合成として近似できる 2)．

がみられ，その後の DNA 検出がノイズにより困難にな

図 1 の白い spot が蛍光観測によるλファージ DNA で，る．短い DNA（<10 kbp）を使用するとノイズの増加が

yoyo-1 という蛍光分子を tag としている．上段の図では左上にナノポアがある．たとえば，0.58 s までにポアに近づいた λ ファージ DNA（左矢印）が 0.72 s では消え，ポアへの進入を示した．DNA の軌道（右下図）と，有限要素法の結果と式 (5) による DNA の動きを比べると，
イオン溶液が 0.1 M KCl，ポア SiN の場合，シミュレー
ションと実験結果は定量的に一致した 3)．図 2 のように，表面を導体にして表面電位を負にし，DNA の泳動と電あまりみられないので，DNA がナノポアに詰まって除気浸透流の向きを逆にした場合，シミュレーションではの位置に留まっている．1.14 s では，DNA が電気泳動

中心付近の DNA は進入して，他の DNA はポアから離と反対向きに伸びているように見える．この実験のシれる動きを予想した．興味深いことに実験でも同様の動ミュレーションでは，ポア内に DNA を置き，計測時間

きが確認できたが，浸透流の効果による DNA の進入は，の短縮のために円筒座標系を採用し，θ 依存性をなしと5 倍の範囲で観られたした．結果は，DNA の電荷による電気浸透流は電気泳．このように，溶液の流れが発4,5)

去できないのではないかと考えられていた．そこで筆者
らは，詰まりの様子を直接観測し，線形および環状のDNA を用いて，DNA がポアに詰まるとポア内の電場の力ではポアから取り出せないことを実験的に確認した 6)．
図 3 の上段は，ポアに詰まった DNA の様子を示す．DNA
は msec のスケールでポアを通過するため，観測では 1
フレーム以内に通過するはずだが，1 秒以上の間，ポア

生するシミュレーションでは，式 (4) の速度が大きくな

動の向きと逆で，式 (5) では，電気浸透流由来の vEOF（白るため，細かいメッシュが必要となり，計算時間が一日色矢印）の速さが μici ϕ による vele（灰色矢印）の速さと間くらいに増加する．そこで，式 (4) を除いた，あるい同程度であり，DNA の数を増やすと，vEOF のほうが大は式 (1) のみの解を得て，その結果を初期条件としてすきくなった．図 3 の下段では，予想される DNA の動き

べての式を用いた計算を行うと速やかに解が収束した．

を白色矢印と灰色矢印の合成として，黒矢印で示した．

もっとも興味深いシミュレーションの結果は，ポア内

グレースケールの図のため見づらいが，ポア内に DNAがない状態のシミュレーション（右下）では，DNA は黒矢印によりポアを通過する向きに動くが，ポア内に詰まりを模倣した線形と環状の DNA を置くと，DNA は，
黒矢印の向きより，電場による力とは逆向きの力を受け

図 1．上段は蛍光観測による DNA の泳動，下左図は TEM 像，
下中図はスケマティック，下右図は DNA の軌道 3)．Copyright2012 ACS．

図 2．左図はスケマティックで薄膜表面は Au．右上図は DNAの挙動を示す．右下図はシミュレーションによる挙動予想 4)．
Copyright 2015 IOP Science．

416

図 3．上段は DNA の詰まりの様子．中段はシミュレーション
における DNA の形状と位置，結果が下段．ポア内の vele を灰色矢印，vEOF を白色矢印，そして，予想される DNA の動きを黒色矢印で示す 6)．左下はポアのみの結果で，ポアに進入する
向き（黒矢印）に，一方で右下は DNA を右中図のように置いた結果として，DNA はポアから出る向きに動く．Copyright2019 MDPI．

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第101巻第8号（2023）

ナノポア応用研究の最前線

図 4．環状 DNA の振る舞い．左上段は phiX174，左下段 10 kbp
環状 DNA であり，ポアに進入しない．右は DNA の軌道 6)．

図 5．3D シミュレーションによるスリットポアの形状と DNAの位置を示す（左図）．中図と右図は DNA の表面電荷が 0 と–20 mC/m2 の結果で，電気浸透流による流れ（白色矢印）とDNA の電気泳動の速度（灰色矢印），この二つの合成による
DNA の動く向き（黒矢印）を示す．

る．これは図 3 の 1.14 s の DNA の逆向きの伸びの要因ている．図 5 は，実際の実験で使用するナノスリットととも考えられる．さらに電場などのパラメータを変えて同スケールの形状によるシミュレーションの結果であシミュレーションを行った結果，KCl イオン溶液を用いる．図 5 の左図のように，スリットの右端に DNA を置たナノポアによる DNA センシングでは，一度 DNA がいた．図 5 中と右図は，それぞれ DNA の表面電荷が 0

ポアに詰まると，電極の電位差だけでは詰まった DNAと –20 mC/m2 の結果である．DNA がスリット内にいなを除去できないことがわかった．そこで，筆者らは，い場合として，表面電荷を 0 としたシミュレーションもDNA の電荷による電気浸透流を増強するために環状DNA を用いて実験を行った．図 4 では，環状 DNA は，ポアに進入する直前に 180 度近く向きを変え，ポアから離れる動きが観られた．環状 DNA は，ポアに進入する
際に二本鎖の DNA が二本分進入することになる．このシミュレーションでは，DNA がポアに進入した後に，行った．この場合，DNA はスリットを通過する．一方で，
DNA の典型的な表面電荷である –20 mC/m2 を DNA 表
面に与えてシミュレーションを行うと，図 5 右図の黒矢印の向きに DNA は力を受ける．この向きはスリットから出戻る向きであり，先駆的な実験結果と一致する．このような変化を予想するために有限要素法によるシミュ

電気泳動による速さより，電気浸透流による逆流が大き

レーションは必須であり，COMSOL Multiphysics は有

くなり，DNAがポアから進入した側に戻る．このように，限要素法のパッケージとして実験家に優しく，ナノポア

ナノポア内の局所的空間では，表面電荷のある物質の進研究におけるシミュレーションのスタンダートとなりつ

入により物理的環境が常に変化することがわかった．

つある．今後は，シミュレーションを先行し，ポアの形

現在，筆者らはシミュレーションの 3D 化を行っている．
単純に 2D から 3D に変更するだけでは，解は収束しない．

状，イオン種，イオン濃度などのパラメータを決定してから実験を行いたいと考えている．

そこで，まずは①ポアソンの解を初期条件として，②ネ

文

ルンスト・プランクの式と③ナビエ・ストークスの式を解くときに，Auxiliary Sweep Continuation を適用する．
これは，パッケージ付属のアルゴリズムで，自動的に複数のパラメータによる結果を比べて，収束の時間を早める．この機能により，特異的な形状のポアでもシミュレー
ションが可能になった．

1)
2)
3)
4)
5)
6)

献

Xue, L. et al.: Nat. Rev. Mater., 5, 931 (2020).
Stein, D. et al.: Nano Lett., 10, 765 (2010).
Ando, G. et al.: ACS Nano, 6, 10090 (2012).
Sugimoto, M. et al.: Nanotechnology, 26, 065502 (2015).
Kato, Y. et al.: J. Phys. Chem. B, 122, 827 (2018).
Kubota, T. et al.: Polymers, 11, 84 (2019).

試しに，スリット状のポアに DNA を通す実験を行っ

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）417

特〔生物工学会誌 第 101 巻 第 8 号 418–421．2023〕
DOI: 10.34565/seibutsukogaku.101.8_418

集MD シミュレーションによるDNA ナノポアのイオン輸送解析
馬渕

拓哉 1,2*・高橋潤3

細胞膜を挟んで細胞の中と外を行き来するイオンの流れ

DNA ナノテクノロジーの特徴としては，DNA の塩基配列が 1 塩基単位で設計可能であるため，自由かつ精密
な 3 次元構造設計ができることである．また，塩基配列に DNA 以外の分子を修飾できるため，構造体に DNAを制御することで，生体内でのエネルギー活動の本質を以外の特性を付与することも可能である．そのほかにも，担う重要な膜タンパク質である．非常に複雑なイオン
チャネルの構造や機能を有機合成による人工分子で再現

DNA を混合するのみで自己集合により容易に設計した反応を実現できる点や DNA は安価かつ大量に製造でき

し，イオン輸送を制御しようとする研究は，生物工学やる点が挙げられる．

はじめに細胞膜中に存在するナノ細孔であるイオンチャネルは，医療など多分野における重要課題の 1 つである．近年，天然イオンチャネルの機能を模倣した人工分子を合成するプラットフォームとして「DNA ナノテクノロジー」
が注目されている．本稿では，DNA ナノテクノロジー
および人工 DNA チャネルに関する研究について概説し，理論から微視的現象を解析する分子シミュレーションの活用例について紹介する．

DNA ナノテクノロジー
DNA は生命の遺伝情報を保持する高分子であり，4 種類の塩基（A，C，T，G）を持つヌクレオチドがひも状に連なったものである．近年では，この DNA 分子を利用して人工的にナノ構造体を設計・合成する技術が発展し，ナノスケールの機能性材料やデバイスの構築が実現している 1,2)．
ナノテクノロジーの素材として DNA 分子を利用することを最初に提唱したのは，Seeman である 3)．Seeman
は，1982 年に DNA の相補性を利用し，4 方向に分岐す
る DNA 構造を自己集合させ，格子構造を作製する手法を提案した．1998 年には，2 つの 2 本鎖 DNA を結合させた構造体を用いて作製したタイル状の構造体を自己集合させ，原子間力顕微鏡でも観察可能なサイズの 2 次元構造体を作製することに成功した 4)．これらの研究が，ナノテクノロジーの素材として DNA を用いる DNA ナ
ノテクノロジーの始まりである．これ以降，2006 年にRothemund により，100 nm 程度までの 2 次元構造体を自在に設計できる DNA オリガミが開発され 5)，2009 年には Douglas らにより，2 次元の DNA オリガミを折りたたむことによって 3 次元の DNA ナノ構造体を作製できるようになった 6)．
著者紹介

418

1
2

図 1．DNA を基盤とした人工ナノポアの例．文献 2 の Figure 4より．

東北大学学際科学フロンティア研究所（助教） E-mail: mabuchi@tohoku.ac.jp
東北大学流体科学研究所，3 東北大学大学院工学研究科

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

ナノポア応用研究の最前線

人工 DNA チャネル

分子シミュレーションを用いた理論的解析

DNA ナノテクノロジーの発展に伴い，DNA を基盤とし．設計たさまざまな人工ナノポアが開発されている（図 1）

前述のように，さまざまな人工 DNA チャネルが開発され，実験によりその有用性が実証されている．しかしするポア径により輸送されるターゲット分子は異なるが，ながら，人工 DNA チャネル内部におけるナノスケール

本稿では，イオンや小分子の輸送をターゲットとした比のイオン輸送現象の詳細を実験的手法により解析するこ較的ポア径の小さな（< 〜 2 nm）人工 DNA チャネルのとは困難であるため，分子シミュレーションを用いた分研究について紹介する．

子論的手法が有効である．分子シミュレーションでは物2012 年に Simmel らによって作製された直径 2 nm の
ポアを有する DNA ナノポアが，最初に報告された人工DNA チャネルである 7)．疎水性分子であるコレステロー

理学的な理論に則って分子の動きを再現し，その統計集

ルを介して脂質二重膜への結合・貫通が確認されている．

に関しては，運動方程式に従って分子系の時間発展を数

この報告以降，膜貫通しイオンや小分子を輸送可能とす

値的に追跡することが可能な分子動力学（molecular団を解析する．その中でも，輸送経路やそれを規定する
分子間相互作用に関する分子レベルの理解を得ること

る人工 DNA チャネルを構築する研究がさかんに行われdynamics: MD）法などのアプローチが有効である．MDるようになった．Burns らによる 6 つの二重らせんの束法には複数のモデルが存在し，扱う対象の粒度に応じて（six-helix bundle: 6HB）が，人工 DNA チャネルの代表

再現可能な現象の時間的・空間的スケールが大きく異な例として挙げられる ．この構造体は複数の一本鎖る．量子化学計算によって電子状態を扱う量子化学 MD，

DNA を組み上げて作製されており，6HB 内部ポア径は約 2 nm である．また，チャネルの膜貫通部分に位置す

原子一つ一つを扱う全原子 MD，複数の原子を 1 つの粗るリン酸基にはホスホロチオエート化によってエチル基

量子化学計算は計算コストが大きく，人工 DNA チャが修飾されており，チャネル表面と脂質二重膜間の疎水

ネルのような複雑な系における輸送現象に適用すること

性相互作用が強くなることで，脂質二重膜への貫通およ

はまだあまり一般的ではない．目的によっては量子化学

び膜貫通状態での安定化を実現している．同様の構造体的な要素を近似しても良い場面は多々あり，その場合はとして，4 つの二重らせんの束（four-helix bundle: 4HB）

全原子 MD のような古典力学に基づく方法を用いる．最からなるポア径が天然イオンチャネルとほぼ同等の約

近の一般的な計算機であれば数万から数十万原子からな

8)視化粒子として取り扱う上位の粗視化 MD などがある．

0.8 nm である人工チャネルも Göpfrich らにより報告さる系について数百ナノ秒から数マイクロ秒の計算が可能

れている 9)．DNA 配列中に疎水性分子であるコレステ

であり，チャネル内部のイオン透過現象を直接シミュ

ロールが膜アンカーとして修飾されており，実験においレーションすることが可能である．Yoo らは，前述したて脂質二重膜への貫通と電流の通過が確認されている．

Burns らによって作製された 6HB 人工 DNA チャネルを用いて，K+ および Cl– イオンの輸送特性およびナノポア
構造特性の全原子 MD による解析を行った 12)．その結果，

DNA ナノテクノロジーが用いられたもっとも簡素な人
工 DNA チャネルとしては，Göpfrich らによる二重らせん
DNA のみを用いた人工チャネルである 10)．親水性である DNA を脂質二重膜に貫通させナノポアを形成させる

膜張力がイオン輸送に大きく影響することが明らかとなった．Maingi らは，6HB 人工 DNA チャネルの構造ため，配列中に疎水性分子であるポルフィリンを膜アン

揺らぎについて解析を行った 13)．人工 DNA チャネル末カーとして修飾した．分子シミュレーションにより，脂端におけるサブマイクロ秒の時間スケールのゆらぎが，質二重膜の膜面と二重らせん DNA の間の隙間がイオンの人工チャネルの入出部の部分的開閉をもたらし，実験的通り道となりイオンが透過することが予想され，実験にに観察された電圧状態の変化に対するメカニズムと相関より実際に電流がチャネルを通過することが確認された．

があることを示唆した．

ほかにも膜貫通し物質を輸送するだけではなく，開閉

一方で，実験的にも収率向上が喫緊の課題 で あ るが可能なチャネルも開発されている．Howorka らは，DNA 構造体の膜貫通現象については，マイクロ秒オー
ダー以上の時間を要する現象のため，全原子 MD 法で再DNA を信号として入力することでポアの開閉が可能な人
工チャネルを報告した 11)．初期状態においては直径 2 nmのポアが 1 本の DNA によって閉じられているが，そのDNA の対となる DNA を入力することで，封をしていた
DNA が解離しポアが開く，という機構を持っている．
生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

現することは困難である．そこで，複数の原子の集団を一つの粒子として扱う（たとえば，MARTINI 力場 14) では DNA1 塩基あたり 7–9 粒子）ことで，大規模かつ複雑な系に対して長時間のシミュレーションを実現する．

419

特

集

Maingi らは粗視化 MD を用いて脂質二重膜への 6HB 人
工 DNA チャネルの貫通シミュレーションを行った 15)．
膜貫通時における人工 DNA チャネルに修飾した疎水性の膜アンカー分子と脂質二重膜との相互作用を解析し，膜アンカー分子の膜貫通時の影響が小さい一方で，膜貫通後の安定化に大きく寄与していることを明らかにした．
チャネル内部への分子修飾によるイオン輸送制御
これまでに報告されている透過の制御は，ポア径の調整によるサイズ依存性の制御のみにとどまり，チャネル
内部への機能性の付与による輸送制御は実現していな
い．一方で，イオン輸送を制御するために実験的にチャネル内部への分子修飾を試行錯誤で行うのは，検討すべき条件数が指数的に増え，膨大な時間とコストが必要となる．そこで分子シミュレーションを用いることで，種々の修飾分子とイオン間の相互作用特性を系統的に評価することが可能となり，イオン透過メカニズムの理解に向けて効率的に解析を進めることができる．
現在進行している筆者らの研究の一例として，図 2aに示すような 6HB を基本構造として用い，チャネル内

図 3．（a）エチル基修飾の有無で比較した電流値およびイオン
輸送比．（b）ナノポア半径方向の電流密度分布．

部への分子修飾が K+ および Cl– イオンの輸送特性に与える影響に関する解析結果の一部を紹介する．DNA の構となった．また，エチル基修飾の有無にかかわらず，

成要素であるリン酸基のうち図 2b に示した円筒領域内のリン酸基に対し疎水基であるエチル基を修飾した．

K+ イオンが電流値の 9 割以上を占めていることから，
6HB に対するエチル基修飾は電流の絶対値を抑制する

元々の 6HB はリン酸基により全体的に負に帯電しておのみで，イオン輸送比への影響は限定的であるというこり親水性だが，エチル基修飾によりチャネル内側表面がとが明らかとなった．図 3b にエチル基修飾の有無にお疎水性となる．

けるナノポア半径方向の電流密度分布を示す．エチル基

図 3a にエチル基修飾の有無で比較した電流値および修飾の有無にかかわらず，ポア中心部での輸送が支配的

イオン輸送比の結果を示す．エチル基修飾により電流値であり，チャネル界面の電流値への影響は比較的小さいが約 3 分の 1 となることが示され，チャネル内部の疎水ことが明らかとなった．

化により K+ イオンとチャネル表面の相互作用が抑制さ

今後は 6HB 以外にもさまざまなポア径を有する構造をれるのと同時に，疎水性相互作用によりポア径がより小用いつつ，かつエチル基以外の種々の極性・非極性分子さくなったことが電流値減少の要因であることが明らかを修飾させ，修飾位置，密度，イオン種などを変化させることでそれらの影響を調査し，人工 DNA チャネルの構造
特性とイオン輸送特性との相関の理解を進めていく．
新規人工 DNA チャネルの理論的設計に向けて
筆者らはこれまでの研究活動において，高分子電解質
膜におけるプロトン（H+）輸送現象の解明に取り組んできた．一見するとナノポアの研究とは分野も異なり関連性が低いと思われるかもしれないが，いずれもナノ細孔におけるイオン輸送という点では共通点も多い．プロト
ン輸送は Grotthuss 機構という従来の古典的な MD 法で

図 2．（a）6HB を用いた計算系の概略図．（b）エチル基修飾の位置（円筒領域内）．

420

は取扱いが困難な化学変化を伴う複雑な輸送機構を有するため，独自に開発した反応性プロトン輸送モデル
生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

ナノポア応用研究の最前線（aTS-EVB モデル）16) や ReaxFF モデルを用いて輸送メ
カニズムを明らかにしてきた

17–20)．これらのモデルは古典力学の範囲内で化学反応を取り扱うため，量子化学

MD と比較して計算コストを大幅に削減できるのが利点
で，人工 DNA チャネルのような複雑な系にも適用できる．
生体中に存在するプロトン濃度は Na+ のたかだか 100
万分の 1 程度と僅少だが，天然のプロトンチャネルには，他のイオンを排除しプロトンのみを選択し輸送する特性が備わっている．現状では道のりはまだまだ遠いが，筆者らはこれまでの異分野研究で培った解析技術を活用して，最終的には，エネルギー産生や細胞運動など多くの生命機能に重要であるプロトンの選択的輸送を可能とす
る人工 DNA チャネルの構築を実現したいと考えている．
おわりに
本稿では，DNA ナノテクノロジーを用いたナノポア
に関する研究について概説し，MD 法に立脚したイオン輸送解析や筆者らの取組みについて述べた．目的に応じて MD 法における粒度およびモデルを適切に使い分ける
ことが，プロトン輸送（化学反応）から膜貫通現象まで，
時間的・空間的スケールが大きく異なる現象に対する分子レベルでの理解の深化を実現する上で不可欠である．
さらに，実験グループと連携して進めることで，実験結果との比較・検討を行い，そのフィードバックを受けて

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

効率的に新規人工 DNA チャネルに向けた設計指針の改良を行っていくことが重要であると考えられる．
文献1) Shen, H. et al.: ACS Appl. Mater. Interfaces, 11, 13859(2019).
2) Murata, S. et al.: Adv. Funct. Mater., 32, 2201866 (2022).
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8) Burns, J. R. et al.: Nano Lett., 13, 2351 (2013).
9) Göpfrich, K. et al.: Nano Lett., 15, 3134 (2015).
10) Göpfrich, K. et al.: Nano Lett., 16, 4665 (2016).
11) Burns, J. R. et al.: Nat. Nanotechnol., 11, 152 (2016).
12) Yoo, J. and Aksimentiev, A.: J. Phys. Chem. Lett., 6, 4680
(2015).
13) Maingi, V. et al.: Acs Nano, 9, 11209 (2015).
14) Souza, P. C. T. et al.: Nat. Methods, 18, 382 (2021).
15) Maingi, V. et al.: Nat. Commun., 8, 14784 (2017).
16) Mabuchi, T. et al.: J. Chem. Phys., 143, 014501 (2015).
17) Mabuchi, T. and Tokumasu, T.: Mech. Eng. J., 4, 17-00054(2017).
18) Mabuchi, T. and Tokumasu, T.: J. Phys. Chem. B, 122, 5922
(2018).
19) Mabuchi, T. and Tokumasu, T.: J. Polym. Sci., Part B:
Polym. Phys., 57, 867 (2019).
20) Mabuchi, T.: J. Phys. Chem. B, 126, 3319 (2022).

421

特

〔生物工学会誌 第 101 巻 第 8 号 422–425．2023〕
DOI: 10.34565/seibutsukogaku.101.8_422

集

光学的手法を用いたナノポア計測技術
山崎

洋人 1・斎木

敏治 2*

はじめに

光学的手法を用いた生体分子のナノポア通過観察

ナノポア計測は，ナノサイズの孔を通過するイオン電

ナノポア計測において，分子検出スループットの向上

流測定を基盤技術とし，単一生体分子計測手法として注や分子通過速度制御のため，生体分子のナノポア通過の目されている．このイオン電流計測法は，生体分子のナ原理解明に向けた基礎研究が進められてきた．イオン電

ノポア通過時に生じるイオン流量変化を検知すること

流計測法を用いた事例として，イスラエル工科大学ので，高い時間・空間分解能でのラベルフリー計測を実現する ．その一方で，イオン電流計測法は，基本的にはMeller らは，ナノポア通過時間と DNA 長との相関を調べることで，一定の長さに DNA では，DNA とナノポ

単一のナノポアで計測するため，分子検出スループット

ア界面およびそれ自身との相互作用が強くなり，通過にに限界があることが課題としてあげられる．この課題を長い時間を要することを示した 5)．このように，イオン解決するために，イオン電流計測法に加えて，ナノポア

電流計測法ではナノポア通過時の DNA の挙動のみを観計測系に光学的手法を融合した計測アプローチがある

察対象とし，通過前後のナノポア近傍における挙動の情（図 1）．このアプローチでは，複数のナノポアごとの光報は一切得られない．そこで，これを直接観察するアプ

信号を高感度カメラで並列的に検知することにより，マローチとして，光学的手法が用いられている．たとえば，

ルチナノポア計測を可能とする．また，イオン電流計測

ノースカロライナ大の Timp らは，2 次元レーザースキャ

法と併用することで，ナノポア計測の機能性を高めるこンを行い，ナノポア周囲での DNA 挙動の可視化を実施ともできる．具体的には，①色素標識による単一生体分した 6)．その結果，ナノポア通過前の DNA は，ナノポ子の蛍光検出 ，②蛍光イオンインジケーターによるラ

アから数 μm 離れた領域でも電気泳動力と電気浸透流のベルフリー生体分子検出 ，③プラズモニックナノポアを影響を受けることを示した．しかしながら，この光学的活用した増強蛍光・ラマン光検出 などの研究事例がある．

アプローチでは，強い電気泳動力，電気浸透流，界面相

1)

2)

3)

4)

本稿では，筆者らによる光学的ナノポア計測の取組み

互作用を受け，劇的な挙動変化が予想されるナノポア近として，DNA 通過過程の可視化を紹介する．また，純傍（数 μm 以内）での観察ができないことが課題である．

光学的シーケンサー実現に向けた一塩基分解能ラマン計

そこで筆者らは，空間分解能サブ μm，時間分解能 100 μs測の試行についても触れたい．

を有する光学的観察手法を構築し，ナノポアごく近傍での DNA 通過ダイナミクスの可視化を試みた 7)．まず，シリコンの紫外光に対する高い遮光性を利用することで，サブ μm の集光スポットをナノポア界面上に実現した．
図 2a に有限差分時間領域法による光強度分布の計算結果を示す．紫外光（波長：355 nm）を膜厚 10 nm のシリコン薄膜に集光すると，薄膜上に直径 280 nm，深さ140 nm の光スポットが形成されることがわかる．また，高い時間分解能を有するフォトンカウンティング法（図 2b）を構築することで，100 μs の時間分解能で高感度な蛍光観察も可能とした．
光ディテクターから出力される電流パルス列（1 パルス
が 1 フォトン相当）を，大量メモリ搭載・高速 A/D 変換ボードに保存する．この保存波形のパルス数を Labview プロ
グラムで数えることで，時間分解能 100 μs 以下でのフォ
図 1．光学的手法を用いたナノポア計測の概要図
著者紹介

422

1
2

トンカウンティング法を考案した．従来手法（既製のフォ

長岡技術科学大学 産学融合トップランナー養成センター（特任講師）
慶應義塾大学 理工学部 電気情報工学科（教授） E-mail: saiki@elec.keio.ac.jp

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

ナノポア応用研究の最前線
トンカウンターを使用）では，ナノポア通過時の蛍光信

ポア通過後のドリフト速度が遅くなることを明らかにし号が単なるバースト（時間幅 2 ms）として検出されたのた 7)．また，空孔率の異なる 2 つのポーラスナノシリコン

に対し，本手法により，通過ダイナミクスを反映した波薄膜を用いて実験を行ったところ，検出波形の膜特性依形（たとえば急峻な立ち上がりとなだらかな立ち下がり）存性が見いだされた．この結果は，周囲のナノポアからが得られるようになった（図 2c）．

DNA が受ける複雑な流体力学的相互作用による，DNA
8)のナノポア通過速度の低下として説明できた（図 3a）．さこ の 光 学 的 手 法を用いて，ナノポア近傍における

DNA 挙動の DNA 長とナノポア膜特性依存性について究明した．まず，長さ 10 kbp と 48 kbp の DNA のナノ
ポア通過を比較したところ，検出波形に DNA 長依存性

らに印加電圧の増加に伴い，蛍光信号のピーク強度が高がみられた．理論計算との比較から，ナノポア近傍におるほど蛍光強度は高くなる）を反映しており，ナノポア

ける非一様な静電場分布が影響し，長い DNA ほどナノ通過時に静電場を受け，DNA の収縮が起きていると解くなることを見いだした．蛍光ピーク強度は光スポット
における DNA コイルの大きさ（スポットに小さく収ま釈した（図 3b）9)．以上の研究成果から，高空間・時間分解能を有する光学的手法がナノポア近傍における DNA
挙動の観察に有効であることを示した．
プラズモンを用いた一塩基分解能ラマン計測
ナノポア DNA シーケンサーの著しい技術進展を受け，修飾 RNA の網羅的解析やアミノ酸配列解読への展開に期待が寄せられている．しかし，イオン電流変化を信号とする現状のナノポアシーケンサーでは多種の修飾 RNA
やアミノ酸の識別は容易ではない．この課題克服に対しては，単一塩基・アミノ酸分解能ラマン分光によるスペク
トル情報の取得が有望である．ただし，ラマン信号は微弱であり，金属ナノ構造のギャッププラズモン（ホットスポッ
図 2．a）有限差分時間領域法によるシリコンナノ薄膜上の光ス
ポットの電場強度分布．b）時間分解フォトンカウンティング
法の概略．c）従来法と独自手法による検出波形の比較．

ト）を利用した電場増強効果による高分解能・高感度化が必須である．ただし一般的な認識では，たとえホットスポットを利用しても一塩基に相当するサブ nm の空間分解能達成はほぼ不可能である．短鎖 DNA ラマン計測において一塩基分解能の達成を主張する研究報告が数例あるが 4,10)，高分解能の起源については満足のいく理解に至っていない．図 4 に示す金属ナノ粒子表面のアダト
ム（吸着原子）が形成する「ピコキャビティ」の寄与がその可能性として挙げられるが 11)，具体的な原子スケール

金ナノ粒子

表面モフォロジー

アダトム

短鎖DNA

吸着配置

ギャップ

最表面金原子「ピコキャビティ」
図 3．a）ナノポア膜の空孔率の違いにともなう DNA 通過挙動の差異．b）蛍光信号ピーク強度の電圧依存性とナノポア通過
後の DNA 収縮による解釈．

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

図 4．金ナノ粒子二量体のギャップにおけるピコキャビティの形成と一塩基分解能の可能性

423

特

集

図 5．a： 金 ナ ノ 粒 子 二 量 体 作 製 後 の 電 気 泳 動 分 離．b，c：
AAA，CCC を挟み込んだ単一の二量体からのラマンスペクトル．

のモフォロジーや DNA のアダトムへの吸着配置の解明と最適化が必要である．ここでは，水中にて金ナノ粒子
二量体のギャップにピコキャビティを形成し，一塩基分解能ラマン分光計測を試みた研究を紹介する．

図 6．a，b：12C-A-12C，12C-G-12C を挟み込んだ単一の二量体からのラマンスペクトル

直径 40 nm の金ナノ粒子とオリゴヌクレオチド（短鎖DNA）を混合し，塩による粒子間反発の低減と加温イ
ンキュベーションにより金ナノ粒子二量体を効率良く形

マンスペクトルを取得できている．ホットスポットに存成した．その際，低 pH 下にてアデニンとシトシンをプ在するオリゴヌクレオチドの数を評価することは難しい

ロトン化し，金ナノ粒子への吸着率を高めた．これまで

が，数オリゴヌクレオチドを挟んだ単一の二量体からのの研究により，高温インキュベーションによって金ナノラマン信号をミリ秒スケールで測定できていることは確

粒子間に架橋生成，すなわち金表面原子移動が短時間で実である．グアニン（GGG）を混合した場合も同様の結生じていることを確認している．この事実は，インキュ

果を得ることができた（図 5c）．

ベーション温度を最適化することにより，一塩基分解能・続いて，一塩基分解能の可能性を議論するため，オリ高ラマン増強度を達成する金表面モフォロジーと DNA

ゴヌクレオチドとして 25 塩基シトシン（C）の中央のみ吸着配置が形成される可能性を示唆する．

アデニンで置き換えたもの（12C-A-12C）を用意した．

図 5a にインキュベーション後の金ナノ粒子溶液の電もし二量体ギャップにおけるホットスポットの広がりが気泳動写真を示す．アデニンが 3 つ連なったオリゴヌク

数塩基にわたるのであれば，ラマンスペクトルは C のレオチド（AAA）を混合した．溶液中には二量体だけでピークのみか，A と C のピークをともに含むことになる．

はなく，孤立した金ナノ粒子（単量体）や三量体も含ま

逆に A のみのピークが得られれば，ホットスポットが一れており，ゲル中の移動度の違いを反映して，それぞれ塩基程度に局在していること，すなわち一塩基分解能がバンドを形成している．混合したオリゴヌクレオチドの実現可能であることを支持する．実際，シングルショッ

濃度上昇とともに二量体，三量体の生成効率が向上してト測定（100 ms 測定）で得られた多数のスペクトルを精いることがわかる．続いて，ゲルから二量体のみを回収査すると，ある頻度で A からのピークのみを含むスペク

し，顕微ラマン分光測定を実施した．水中をブラウン運

トルが見つかった．図 6a はその一例である．C のピー

動する二量体を観測対象とし，レーザー集光スポットを

クのみを含むスペクトルも併せて示している．A を G で通過した瞬間に発するラマン散乱信号を検出した．なお，置き換えた 12C-G-12C に対しても同様の結果を得るこ

二量体の濃度は薄く，スポット内に同時に複数の二量体とができた（図 6b）．インキュベーション温度・時間やが存在する確率は無視できる．結果を図 5b に示す．ア

オリゴ，塩を加えるタイミングなど，最適化すべきパラ

デニンの呼吸モードに由来するピークが見えている．シ

メータが多く，十分な再現性を得るには至っていないが，ングルショットの計測時間は 100 ms と設定したが，粒一塩基分解能の実証実験としては一定の成果が得られた子の拡散係数を考慮すると，実効的には 10 ms 程度でラと考えている．

424

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

ナノポア応用研究の最前線

おわりにう分子の変形や配置変化をピコキャビティによるラマン測定で高感度に検出することができるであろう．

本稿では，光学的測定の利点を活かした DNA 検出・

謝

分光手法を二例紹介した．ナノポア通過過程の観察に関しては，DNA を二色で染色し，通過前と通過後のダイナミクスを分離して可視化する実験を試みている．前後の挙動に相関が見られ，通過速度制御の重要なヒントに

ここで紹介した研究成果はすべて，研究室の学生ならびに共同研究いただいた方々の努力とご尽力によるものであります．研究に携わったすべての方々に感謝申し上げます．

なると期待している．一塩基分解能ラマン測定に関して
は，短鎖 DNA のみでなく，塩基にも立ち返りながら，
ラマンスペクトルをもとに二量体ギャップ中（金表面に挟まれたサブナノ空間）での塩基の配置を議論している．
アミノ酸，ペプチド，タンパクへの応用を見据え，第一原理計算や分子動力学を駆使したシミュレーションの援用が不可欠であると認識している．一塩基分解能達成はシーケンシング応用だけでなく，ピコキャビティをプローブとした生体分子ダイナミクス計測の基本原理としての可能性も秘めている．たとえば，観察対象分子を挟み込んだ
金ナノ粒子二量体をナノポアで捕捉し，環境変化にともな

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

辞

文

1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)

献

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Chen, C. et al.: Nat. Commun., 9, 1733 (2018).
Carnegie, C. et al.: J. Phys. Chem. Lett., 9, 7146 (2018).

425

特

〔生物工学会誌 第 101 巻 第 8 号 426–430．2023〕
DOI: 10.34565/seibutsukogaku.101.8_426

集膜タンパク質の機能改変とナノポアセンサへの応用
神谷厚輝 1*・登坂俊行 1

Outer membrane phospholipase A（OmpLA）のはじめに
ナノサイズの孔をもったナノポアタンパク質が，人工脂質二重膜に再構成されるとパッチクランプ装置におい人工細胞膜への再構成て，そのナノポアの孔を通過するイオンを電流値として12 本の β ストランドから形成される OmpLA は，カルシウムイオン存在下で 2 量体を形成し，ホスホリパーゼ

計測できる 1)．この方法では，ナノポアタンパク質を一活性を有することが知られている 6)．筆者らは，大腸菌

分子レベルで簡単に観察可能である．さらに，DNA なで発現した OmpLA を精製し，人工細胞膜のパッチクラどの生体分子がちょうど通過できるポア直径をもつナノンプ 7,8) でイオンが OmpLA を通過することを初めて明

ポアを用いると，生体分子がナノポアを通過するときにらかにした．すなわち，OmpLA もナノポアを形成してナノポアを閉塞する．その際，ナノポア内を流れるイオ

いることが分かった．直径約 10 μm の細胞サイズのリンの量が減少するため，電流値の低下が生じる．したがっ

ポソームに OmpLA を再構成して，リポソーム外液に蛍て，この電流値の低下によって生体分子が検出される ．

光分子のカルセインを加えると，時間が経つにつれ，リ

生体分子検出でもっとも研究が盛んなナノポアタンパク

ポソーム内にカルセインの蛍光が観察された．したがっ質として α ヘモリシンがある．α ヘモリシンは細胞膜上て，OmpLA のナノポアは，イオンだけでなく小分子ので 6 量体と 7 量体を形成する ．6 量体と 7 量体ではナノ通過も可能である．

2)3)

ポア直径が異なり，7 量体のみ 1 本鎖 DNA がちょうど

OmpLA の β バレルを繋ぐ両端のループ構造は，正電通過できるポア直径である．α ヘモリシンのような複数荷アミノ酸と負電荷アミノ酸の偏りが生じている．これのサブユニットから形成されるナノポアは，さまざまなを利用することで，配向性を制御して OmpLA をリポ

直径を形成してしまうため生体分子の検出の再現性を出

ソーム膜に挿入できると考えた．たとえば，負電荷をもっすには，多くの実験回数を要する．そこで，筆者らは 1

たリポソームでは，OmpLA のループで正電荷アミノ酸本のポリペプチド鎖からナノポアを形成できるグラム陰が存在する側からリポソーム膜に挿入される．逆に，正性菌に存在する outer membrane protein（Omp）に注目

電荷をもったリポソームでは，OmpLA のループで負電して研究を行ってきた．本稿では，本研究室で行ってき荷アミノ酸が存在する側からリポソームに挿入される．

た Omp の研究について解説する．

各組成のリポソームに OmpLA を再構成後，リポソーム

Outer membrane protein とは外液にプロテアーゼ K を加えることで，リポソーム膜の外側に存在するタンパク質が分解される．ゲル電気泳動

大腸菌には，8–26 本の β ストランドの β バレルからなを行った結果，分解が OmpLA の配向によって予想され4)る多様な Omp が存在する ．また Omp の機能は，受動たタンパク質断片のバンドと一致した．すなわち，リポ

輸送，構造の完全性の維持，外膜の生合成と維持，ホス

ソームの表面電荷で OmpLA の配向性を制御できること

ト細胞の接着と侵入，バイオフィルム形成，細胞防御とを明らかにした．

非常に多様である．たとえば，14 本の β ストランドが β

次に，リポソームに再構成された OmpLA のホスホリバレル構造を形成する Omp である OmpG は，栄養物，パーゼ活性を利用したリポソーム膜の出芽を観察した．

イオン，タンパク質を受動的かつ選択的に取り込む機能
さの分子を取り込むことができ 5)，透過分子の選択性のOmpLA 再構成リポソームにカルシウムイオンを加えると OmpLA が 2 量体を形成することで，ホスホリパーゼ
活性が活性化する．リポソーム膜内に存在する OmpLA

低さからバイオロジカルセンサなどの工学的な応用が期がホスホリパーゼ活性を示すことで，リン脂質をリゾリ待される．

ン脂質と脂肪酸に分解する．カルシウムイオンの添加にを有している．OmpG は単糖類から三糖類までの大きより OmpLA が活性化してリポソーム膜内のリゾリン脂質と脂肪酸量が多くなると，リポソーム膜が不安定にな* 著者紹介 群馬大学大学院理工学府分子科学部門（助教） E-mail: kamiya@gunma-u.ac.jp1426

群馬大学大学院理工学府分子科学部門

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

ナノポア応用研究の最前線

図 1．リポソーム膜上での OmpLA の機能．リポソーム膜上における物質輸送とリポソームからの小胞の出芽．本図は，文献 9 を改変した．

り，細胞サイズのリポソームから小胞が出芽した（図 1）．
したがって，OmpLA は 1 種類の膜タンパク質で 2 つの機能をリポソーム上で再現することができる，珍しい膜タンパク質である ．

図 2．無細胞タンパク質合成系で合成させた OmpG と OmpAから得られた電流シグナル．本図は，文献 11 を改変した．

OmpG のナノポア直径の改変
前述のように，OmpG は 14 本の β ストランドからなる βバレル構造のナノポアを形成している．この OmpG の β ス

9)OmpG や OmpA の無細胞タンパク質合成とポア形成

トランド数を遺伝子工学的に増減させることで，OmpG の
ナノポア直径を変更できるのではないかと考えた．戦略とOmpG や OmpA を調製するには，リフォールディング

しては，OmpG のさまざまなドメイン部分に 4 本の β ストなど精製後に多くの処理が必要である．そこで，タンパ．大腸菌にて発現させたランドを増加・減少させた（図 3）

ク質を簡便に合成できる無細胞タンパク質合成系にて，改変 OmpG を精製し，精製した改変 OmpG の CD スペク

ナノポアを形成した OmpG や OmpA を調製できるかを

トルの取得と人工細胞膜のパッチクランプ測定によって検討した．一般的に，無細胞タンパク質合成系にて膜タ1 分子の改変 OmpG のナノポア内に透過するイオンを測定した．β ストランド数の増減によって，改変 OmpG のナノ
ポア内を流れる電流値は，野生型 OmpG と比べ変化した．
野生型 OmpG の電流値は 130 ± 17 pA であったのに対し，4 本の β ストランドを増加させた OmpG+4β(+164-202)の電流値は 150 ± 18 pA，4 本の β ストランドを減少させた OmpG-4β(Δ1-80) および OmpG-4β(Δ42-123) の電流値．
はそれぞれ 160 ± 22 pA，110 ± 10 pA であった（図 4）
当初の目論見通りに，β ストランド数を増加させた改変
OmpG は電流値が大きくなり，逆に β ストランド数を減少させた改変 OmpG は電流値が小さくなった．しかしながら，
β ストランド数の増減と電流値の大 小が 伴わない改変
OmpG も存在した 12)．

ンパク質を合成させるときは，人工細胞膜のリポソームを共存させることで，膜タンパク質の合成と同時にリポソームに膜タンパク質が組み込まれ，機能を有した膜タ
ンパク質を得る 10)．筆者らも，リポソームを共存させ，機能を保持したOmpGやOmpAの合成を目指した．まず，リポソーム組成による OmpG や OmpA の取込み量の違いを検討した．方法として，ナノサイズのリポソームを共存させて無細胞タンパク質合成を行い，ショ糖密度勾
配遠心により，リポソームに挿入されていない OmpGや OmpA とリポソームに分離した．その結果，大腸菌
膜から抽出されたリン脂質から形成されたリポソームや大腸菌膜組成に似せた合成リン脂質からなるリポソーム
では，多くの OmpG や OmpA がリポソームに挿入されることが明らかになった．そして，OmpG や OmpA を含むリポソームをパッチクランプ装置に接続した平面リ
ン脂質二重膜に融合させ，OmpG や OmpA ポア内を流れるイオンの電流値を計測することで，無細胞タンパク質合成系で合成した OmpG や OmpA がポアを形成するかを検討した．大腸菌で合成させた後に精製した OmpGや OmpA と同程度の電流値が計測され（図 2），無細胞タンパク質合成系で合成された OmpG や OmpA はリポ
ソーム上でナノポアを形成することが明らかになった 11)．
生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

図 3．OmpG の β ストランド数を増減することで OmpG ナノポ
ア直径を改変．4 本の β ストランド数を挿入した OmpG 変異体と 4 本の β ストランド数を削除した OmpG 変異体を形成した．
本図は，文献 12 を改変した．

427

特

集
結果のように β ストランド数に依存して電流値が変化した OmpG は，イオン透過性が高い序列いわば電流値が高い順に，OmpG+4β(+164-202) (150 ± 18 pA)，野生型

OmpG (130 ± 17 pA)，OmpG-4β(Δ42-123) (110 ± 10 pA)であった．しかしながら，β ストランド数を 4 本欠損させた OmpG-4β(Δ1-80) の電流値は，160 ± 22 pA となり
OmpG+4β(+164-202) や野生型 OmpG に比べ高い電流値を示した．16 本の β ストランドからなる OmpF や OmpC のポアサイズは 14 本の β ストランドからなる OmpG よりも小さいが，イオン透過性は OmpF や OmpC の方が大きい 13)．
これはナノポアタンパク質のイオン透過性の大きさはナノポアの大きさのみならず，ナノポア内表面に存在
図 4．野生型および変異型の OmpG 一分子から得られた電流シ
グナル．本図は，文献 12 を改変した．

する電荷をもつアミノ酸残基も影響すると考えられる．

OmpG-4β(Δ1-80) のポア内表面では野生型と比較してグルタミン酸残基の数が減少しており，他の OmpG と次に，β ストランドの増減だけでは，OmpG のナノポ比較してナノポア内表面の電荷バランスが大きく崩れてアの電流値を制御できない理由を知るために，さまざま

いる．OmpG-4β(Δ1-80) のイオン透過性の大きさはナ

な分子量のポリエチレングリコール（PEG）を水溶液に

ノポア内表面と透過するイオンとの静電的相互作用が影

加え，人工細胞膜パッチクランプによって，OmpG の響して野生型 OmpG よりも大きくなったと考えられる．

電流値変化から OmpG ナノポアのポアサイズを推測した．PEG は非イオン性物質であるため，OmpG のナノ
ポア直径よりも小さい直径の PEG は，OmpG のナノポ
ア内に滞留しイオンの流れを阻害する．したがって，電流値は減少する．逆に，OmpG のナノポア直径よりも大きな直径の PEG は，OmpG のナノポア内に滞留しないためイオンの流れを阻害しない．したがって，電流値の変化はない．この現象を利用し，低分子量の PEG から電流値の測定を行い，電流値の回復する分子量のPEG まで測定することで，ナノポアの直径を推測できる．野生型 OmpG では分子量 4000 以下の PEG を添加した際に電流値の減少が見られ，分子量 6000 以上の PEG

改変 OmpG のナノポアによる
さまざまな形状の DNA の検出

α ヘモリシンのナノポアによる一本鎖 DNA の検出を応用し，OmpG ナノポアによる DNA の検出を試みた．α ヘ
モリシンのポア直径は，ちょうど一本鎖 DNA が通過する
大きさである．OmpG のポア直径は，α ヘモリシンのポア
直径よりも大きいため，二本鎖 DNA(dsDNA) や分岐構造をもつ二本鎖 DNA の通過を試みた．dsDNA 存在下での
OmpG の電流シグナルは，OmpG 固有の短い時間で浅い電流阻害シグナルの他に，比較的長い時間で深い電流阻害シグナルが観察された．OmpG 特有の close イベン

添 加 に よ り 電 流 値が回復した．したがって，野生型

トと dsDNA の通過による close イベントを区別するた

OmpG では分子量 4000 程度の PEG に相当する大きさのめに，residual current（阻害時の残留電流率）が 0.5 以下，分子までナノポア内に滞留させることができると考えら

dwell time（close イベント継続時間）が 10 ms 以上のイベれ る． 同 様 に し て，OmpG+4β(164-202) で は 分 子 量．
ントを dsDNA の通過による close イベントとした（図 5）8000 以下，各 OmpG-4β では分子量 2000 以下の PEG の

ここで，open 状態の電流値を I open，阻害イベント時の電流添加によりイオン電流値が減少する結果が得られた．各

値をIblockとし，両者の比Iblock/Iopenをresidual currentとした．

OmpG における滞留させることができた最大サイズの
PEG から OmpG のポアサイズを比較すると，OmpG+4β(164-202) は野生型 OmpG よりも大きく，両 OmpG-4βは野生型 OmpG よりも小さくなると推定された．ポア
サイズの序列は大きい順に OmpG+4β(+164-202)，野生型 OmpG，OmpG-4β ( Δ1-80) と OmpG-4β ( Δ42-123) であり，ポアサイズが β ストランド数に依存する結果が得られた 12)．この PEG による OmpG ナノポア直径の推測
428

印加電圧を +100 mV から +120 mV に上げて阻害イベント
における dwell time の電位依存性を確認したところ，たと
えば 50 ms を超える阻害イベントの割合は +100 mV と比較して +120 mV では低下した．これは，印加電圧を高くすることで負電荷をもつ DNA が早くナノポア内を通過したためであると推測される．したがって，野生型

OmpG ナノポア内に dsDNA が通過していることが確認された．ポアサイズが異なる改変型 OmpG による dsDNA の生物工学会誌

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ナノポア応用研究の最前線

図 5．2 本鎖 DNA や分岐 DNA を OmpG ナノポアで検出（上段）．
OmpG ナノポアを 2 本鎖 DNA 通過時の電流シグナル．阻害が深く，長い阻害シグナルが DNA 通過である．本図は，文献 12を改変した．

図 6． 野 生 型 OmpG（ 上 段 ）と 変 異 型 OmpG（ 下 段 ）の 分 岐
DNA の residual current と dwell time の散布図．四角で囲まれた部分に存在する点が，DNA がナノポアを通過したイベントを表す．本図は，文献 12 を改変した．

検出を行った．野生型 OmpG よりもポアサイズが大き
い OmpG+4β(+164-202) でも dsDNA の通過シグナルが変することに成功した．OmpG のナノポア内を通過す確認された．しかし，野生型 OmpG よりもポアサイズ

るイオンの量は，ポア内部のイオンと接するアミノ酸残が小さい OmpG-4β(Δ42-123) では dsDNA の通過シグナ

基の電荷に依存して変化することが分かった．ポア直径

ルが確認されなかった．

を改変した OmpG によって，さまざまな形状の二本鎖

次に，T 字型に分岐した dsDNA が OmpG WT や OmpG+

4β(+164-202) のナノポアを通過するかを検討した．分岐部分の長さを，4 塩基対，10 塩基対，15 塩基対にしたものを設計した．野生型 OmpG の場合，4 塩基対分岐 DNA
では 150 秒間に 100 回の阻害イベントが，10 塩基対分岐
DNA では 150 秒間に 57 回の阻害イベントが観察された．
4 塩基対分岐 DNA のほうが，10 塩基対分岐 DNA に比べ，阻害イベントが多く，dwell time が長く，residual currentが低かった（図 6）．したがって，野生型 OmpG は 4 塩基
対分岐 DNA まで通過可能であることが示された．また，
OmpG+4β(+164-202) の 場 合，4 塩 基 対 分 岐 DNA で は
150 秒間に 107 回の阻害イベントが，10 塩基対分岐 DNA では 150 秒間に 171 回の阻害イベントが，15 塩基対分岐 DNA
では 150 秒間に 57 回の阻害イベントが観察された（図 6）．
この 結 果 から，OmpG+4β(+164-202) は 10 塩 基 対 分 岐
DNA まで通過可能であることが示された．この実験から，
ポアの直径の違いにより，形状の異なる DNA を認識できる可能性を示した 11)．
まとめ
グラム陰性菌の外膜に存在する Omp の一種の OmpGについて，β ストランド数を変えることでポア直径を改
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第101巻第8号（2023）

DNA の検出に成功した．さらに，無細胞タンパク質合成によって合成した OmpA や OmpG のナノポアをリポソームに再構成し，大腸菌で合成した OmpA や OmpGのナノポアと同等の電流値を示したことから，無細胞タ
ンパク質合成系で合成した OmpA や OmpG のナノポアのサイズは，大腸菌で発現した OmpA や OmpG のナノ
ポアのサイズと同等であった．この方法で，自由自在にポアサイズを設計でき，なおかつ，透過させる分子のみに特異性を持たせることができれば，次世代のバイオロ
ジカルセンサの創製に寄与する．Omp は他の膜タンパ
ク質に比べ，非常に熱安定性が高いことも大きな特徴である．したがって，野外の環境センシングなどにも活用可能である．また，このナノポアをリポソーム膜や細胞膜に再構成することで，リポソームや細胞の内外の選択的な物質輸送を可能にし，バイオリアクタや細胞機能操作に資する材料にも活用可能である．
文

献1) Kasianowicz, J. J. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,13770 (1996).
2) Crnković, A. et al.: Life, 11, 27 (2021).
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429

特
5)
6)
7)
8)
9)

430

集

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10) Moritani, Y. et al.: FEBS J., 277, 3343 (2010).
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生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

〔生物工学会誌 第 101 巻 第 8 号 431–434．2023〕
DOI: 10.34565/seibutsukogaku.101.8_431

De novo 設計ナノポアの創製
新津藍

近年の膜タンパク質の設計研究において，重要な標的（Protein Data Bank）への登録数の差を反映して依然発となってきたのがナノポア構造である．ナノポア構造を

展はゆるやかである 5)．したがって，ペプチドやタンパ

人工設計することができれば，ポアのサイズや化学的特ク質を対称的に並べる比較的シンプルな設計によりイオ性を自由に改変することが可能になる．本稿では，自己ンや分子の透過という機能が得られるナノポア構造は良会合してポアを形成する人工膜ペプチド・タンパク質のい標的と言える．

創出に焦点を当て，最近の研究例や設計に利用できるツールを紹介する．さらに，鍵となる設計指針について

ナノポア設計のアプローチ

De novo 設計ナノポアを実現するためには，水相・脂も議論する．
膜タンパク質設計とナノポア構造

質膜表面・疎水相と異なる環境を貫通するペプチドやタンパク質を決まった数，決まった配置で並べる必要があ

タンパク質の設計には，天然のタンパク質を改変する

る．ここで鍵となるのが，それぞれの環境において最適ことで機能を摂動・付与する方法と，一からアミノ酸配なバランスで疎水性相互作用と極性残基間相互作用（水列を構築する de novo 設計がある．前者は α ヘモリシンを素結合・塩橋・cation–pi など）をもつ一連のアミノ酸配はじめとする天然タンパク質ポアの部分改変 1) や，Wza

列を設計することである．これは簡単な問題ではなく，などの天然の膜貫通ポア部分を抜き出してアミノ酸配列

これまで多様なアプローチにより安定な人工ナノポアを

アラインメントを実施することで得られるコンセンサス

目指した設計が行われてきた（図 1）．

配列ペプチドポア などを例とし，ナノポア設計におい
2)配列パターニング設計

タンパク質 de novo 設計のて広く行われてきた．一方，後者は膜貫通 α ヘリックス

手順は，まず骨格構造を設計し，次にそれを満足するよを束ねて作る人工イオンチャネルの研究に端を発し，うな側鎖の組合せを選択していく．計算機が発達する以40 年程前から設計法が開発されてきた．本稿では，この de novo 設計に焦点を当て，人工ナノポア創製への応前からタンパク質設計において行われてきた手法として用について議論する．

チーフを選択し，アミノ酸配列を最適化していく配列パは，骨格構造に特定の配列パターンを持つ天然の構造モ

膜タンパク質の de novo 設計には，2 つの利点がある．
まず，アミノ酸配列を設計し，その立体構造と機能を分析することで，配列―構造―機能相関を得ることができる点である．これは，膜タンパク質のフォールディング
ルールを理解する重要な情報となる．もう 1 つは，タン
パク質の構造や機能を自在に改変することができるようになる．これは新しい膜タンパク質材料を創製する道を拓く．この 2 つの観点から，設計の標的としてこれまで
もっとも注目されてきた構造の 1 つがナノポア構造である．その理由として，生物学的側面からは，イオンチャ
ネルをはじめとする生命システムに欠かせない機能を持つタンパク質ポアの機能をボトムアップに理解したいという動機がある 3)．また，タンパク質工学的側面からは，目的のナノポア計測に最適なポアサイズと化学特性を持
つ構造を人工設計により作製したいという需要も大いにあった 4)．さらに現実的な問題として，膜タンパク質の設計は水溶性タンパク質の設計と比べると，その PDB
著者紹介

図 1．ナノポア設計の例．（左）疎水性残基と極性残基を規則的に配置する配列パターニング設計の例．上段は 5 量体コイルド
コイル構造のヘリカルホイール，下段は β ストランド．（右）計算機を用いた立体構造ベースの設計例．上，下はそれぞれ
PDBID が 5M6Z，6X9Z．左側が膜断面，右側が膜垂直方向から見た構造．

理化学研究所開拓研究本部杉田理論分子科学研究室（研究員）・JST さきがけ

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

E-mail: ai.niitsu@riken.jp

431

特

集

ターニングが挙げられる．ナノポアの基本構造は，α ヘまで多くの場合，膜環境はアミノ酸配列の中に仮想的にリックスもしくは β ストランドをサブユニットとしたバ

組み込まれてきた．まず，水溶性タンパク質として配列

レル（筒形）構造である．DeGrado らのグループが報告

スクリーニングを行った後に，ポア構造の外側にありサ

した，もっとも初期の de novo 設計ナノポアは，α へリッ

ブユニット間の相互作用に関わらないアミノ酸残基を脂クスペプチドをサブユニットとしていた ．このペプチ

質ヘッドグループ近傍は芳香族アミノ酸，疎水相には疎ド設計では，疎水性残基がポアの外向き・親水性残基が水性アミノ酸，水相にはカチオン・アニオン性アミノ酸，

ポアの内向きとなり，かつ 7 回繰り返しパターンとするといった配置になるように置き換えて最適化を再度実施

ことでコイルドコイル構造を指向するよう配列パターニする．この戦略を用いて，筆者は Scott らと共同し，Aングされた（図 1 左上）．平面膜を用いた電流測定により，の配列スクリーニングを適用することで安定な α ヘリッ設計ペプチドはイオンを透過できるチャネルを形成する

クスペプチドチャネルが構築できることを報告した 10)ことが確認されている．一方，β ストランドペプチドをサブ（詳細は後述する）．Baker らは B の Rosetta を用い，リユニットとしたナノポア設計は試料の凝集が起こりやすくンカーで繋がる長い 4 回膜貫通モノマーを設計すること挑戦的であるが，配列パターニング（図 1 左下）によってでサブユニット間の相互作用面を大きくし，α ヘリック

β バレル構造を形成するペプチドが得られることが近年
川野らのグループから報告された 6)．タンパク質 de novo

スを基礎とするタンパク質ポアを構築した11)（図1右上）．
また β ストランドがすべてリンカーでつながる β バレル

設計において骨格構造は自由に選択できるように見え構造の設計12)（図1右下）にも同様の戦略で成功している．

るが，実際にフォールディングできる 現実的な 骨格

もう 1 つ膜環境を導入する方法としてとられているの構造は限られており，それを最初のステップで絞り込むが，構造モデリングの際の溶媒和スコアに仮想膜のスコことが重要であると指摘されている 7)．配列パターニン

アリング関数を組み込む戦略である．こちらの方が理に

グでは骨格構造を天然に存在する構造に限定しているこ

かなっているように思われるが，実際には水溶性タンパとから，その点では設計の成功率を高めるアプローチとク質に比べて考慮すべきパラメータが多い膜タンパク質なっている．

の構造安定性について正しく評価できるスコアリング関

3)

近年では，ア

数は，未だ発展途上にある．Rosetta の膜タンパク質オ

ミノ酸配列の組合せを広く探索して最適化するために，プションとして RosettaMP が公開されているが，これ計算機を用いた設計法が開発されてきた．その設計法は，

までは主に天然の膜タンパク質構造モデリングに活用さ計算機を用いた配列スクリーニング

大きく 2 つに大別される：れてきた．最近 Fleishman らは，膜タンパク質の膜挿入（A．配列ベース）配列パターニングを発展させて配列組

アッセイ実験データを基に改良した Rosetta スコアリング

合せを計算機で生成しスコアリングする手法

関数 13) を用いて [GAS]xxx[GAS] モチーフを持つ α ヘリッ（B．構造ベース）アミノ酸配列のランダム探索と立体構

クスペプチド 2 量体および 3 量体を de novo 設計した 14)．

造モデリングを同時に行って構造モデルの安定性をスコ

今後より大きな構造への応用可能性について検証が待たアリングする手法

れる．

A は短いモチーフ配列を探索するのに有効である．たとえば，コイルドコイル構造の繰り返し単位である 7 残設計に利用できるソフトウェア

基の配列を計算機により生成し，コイルドコイルの安定

前項で紹介した Rosetta の他にも，タンパク質設計を性を予測する bZip スコアを利用してスクリーニングす

支援するソフトウェアツールが公開されている．ここでることで，非常に安定な水溶性バレル構造を構築する手は最近のものを中心に紹介する．注意点として，これら法が Woolfson らのグループにより開発された ．B では，のツールは膜環境をスコアリング関数に組み込んでいな

骨格構造は 現実的 であれば天然構造に存在する必要い．したがって，ナノポア設計においては最初に水溶性はなく，リンカーも含めた長いアミノ酸配列をスクリーとして設計した構造を前述のように膜貫通構造に改変す

ニングすることができる．これは Baker らにより開発さるなどの工夫が必要となる．

8)

れた Rosetta が主流となり，現在広く設計に利用され骨格構造を角度や距離などのパラメータで表現して設計ている．ここで，A・B の手法は共に，水溶性タンパクを行うのに便利なのが ISAMBARD15) である．ISAMBARD

質を設計標的として開発がスタートしている．これらのは構造分析の機能もあり，高分解能構造や分子動力学計

方法を膜タンパク質，特にナノポア設計に応用するため算などから得られたタンパク質・核酸の立体構造のパラには脂質二重膜環境を設計に導入する必要がある．これ

メータを計算し，設計の起点とすることもできる．特に

9)

432

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ナノポア応用研究の最前線
コイルドコイル構造の設計がしやすくなっていて，コイ
ルドコイルに特化したモデリング機能をブラウザ上で簡単に動かせるツールとして，CCbuilder2.016) も公開されている．最近開発された Damietta17) は，スコアリング
関数に分子動力学計算の力場を参考にしたパラメータを用いて精度を高め，さらにエネルギー計算をテンソル化
して高速モデリングを実現している点が特徴である．

dTERMen18) は，スコアリング関数として天然のタンパ
ク質構造に存在する配列―立体構造モチーフとの相同性を指標にしている点でユニークである．このツールでは，
構造モチーフを探索するデータベースを膜タンパク質のみにすれば膜タンパク質設計にも応用できると期待される．また，dTERMen では，アミノ酸残基をノード，残基間相互作用をエッジとしたグラフとしてタンパク質の構造モチーフを表現し，PDB を参照データベースとしている点で，構造予測におけるブレークスルーである

AlphaFold219) と 共 通 点 が あ る．AlphaFold2 も し く はRosettaFold20) のタンパク質の de novo 設計への応用可能性としては，最近では機械学習を用いて骨格構造を生成する RF Diﬀusion21) との組合せが注目されている．ナノポ

図 2．コイルドコイル構造を基盤としたポアを形成する膜貫通
α ヘリックスペプチドの設計の流れ．ヘリカルホイールはコイ
ルドコイルの 7 残基繰り返し配列を示し，下方向の残基が内側を向いてバレル構造を形成するように設計している．上段右は水溶性ペプチド 6 量体の結晶構造（PDBID:6YB0）．p は極性
残基，h は疎水性残基．

ア設計の観点では，ColabFold22) 上で使える AlphaFold-

multimer による会合体予測や RF Diﬀusion の会合体生成を活用することで，ペプチド・タンパク質バレル構造の測された．続いて，この水素結合を維持しながら配列を設計が可能となるかもしれない．現状では，サブユニッ

膜貫通とするためにバレルの外側を向くアミノ酸を疎水

トの相互作用面が小さい場合に構造予測精度は低くなる性残基に置き換えた（ThhShhh）．ここでさらにコイル可能性があり，また，人工配列の膜タンパク質がどこま

ドコイル構造の安定性スコアを指標に配列スクリーニン

で正確に予測できるかという点も未知数であるため，今グを実施したところ，もっとも高スコアだった配列は後設計から実験まで系統的に行って検証を進める必要が

TVISAhA であった．そこで，脂質二重膜に貫通する長さとなるように 7 残基× 4 の 28 残基のペプチド配列を設計した．ここで残る h はペプチド相互作用に寄与せず外あるだろう．
ナノポア de novo 設計の課題
最後に筆者が設計を行ったペプチドポア

側を向いている残基であることから，膜表面に位置するを例にとっ部位 2 か所には Trp，疎水相に位置する部位 2 か所にはて，そこから見えるナノポア de novo 設計の今後の課題について議論したい．本研究では，先に述べた計算機を

Leu を配置して膜貫通トポロジーを指向した．また，N末端に 4 つの Lys を付与することで膜への挿入方向が一用いたコイルドコイル構造の配列スクリーニング（A）

定となるようにした．こうして得られたペプチドは，平により設計を行った（図 2）．

面膜での一分子チャネル電流測定において単一サイズの

10)

まず，以前設計された水溶性の de novo 設計 α ヘリック

安定なポアを形成しイオンを透過できることが確認さスバレル のアミノ酸配列を起点とした．水溶性のペプ

れ，これまで挑戦的とされてきたペプチドを基盤とする

チドバレルは疎水性残基が内側を向いて強固なパッキン

安定なイオンチャネルの設計が達成された．さらにここグを形成しているため，7残基の繰り返し配列（hpphhph，

で興味深い知見として，配列スクリーニングではやや低h：疎水性残基，p：極性残基）× 5 個のうち 2 個のみについてバレルの内向きのアミノ酸残基を極性残基の Thrと Ser に置き換えた（TppShph）ところ，水中で安定に 6量体を形成し続けた．得られた 6 量体の結晶構造では，Thr と Ser が水を含んだ水素結合ネットワーク形成が観スコアだった類似配列（TIISAhA）のペプチドでは，多8)

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第101巻第8号（2023）

様な異なるサイズのポア形成が観測された．Val と Ile という側鎖構造のわずかな違いが，バレル構造の安定性を大きく分けたのである．ここから明らかになったのは，
水素結合ネットワークと最適化されたペプチド間パッキ

433

特

集

ングの両者がそろって初めて安定なペプチドバレル構造

初の目標の一つに立ち返ると，外部シグナルによって開が得られること，さらに十分安定なパッキングを与える

閉するイオンチャネルの機構を設計によって理解するた

アミノ酸配列スペースは非常に狭いことの 2 点である．

めには，準安定状態の設計が必須である．そこから発展

後者についてはこれまでの筆者のコンセンサス設計ペプ

すれば，必要に応じて開閉するナノポア計測のための新

チドポアの設計過程 や DeGrado らのグループによる

しいタンパク質の設計への道筋も開けてくるだろう．

2)

疎水性残基のパッキング最適化を行った膜ペプチド 5 量体の設計過程23)においても，同様の知見が得られている．
そこで，より一般的に言い換えると，既存の de novo 設計法で得られる膜タンパク質は設計された水溶性タンパ
ク質とは異なり，天然のタンパク質が有する marginal

stability から脱していないことが示唆される．これをどのように解決していくかが，今後自在に膜タンパク質・
ナノポアを de novo 設計できるようになるための課題であると考えられる．
今後の展望
この課題へアプローチする方法を考察する．まず，既存の構造モデリングでは計算効率を向上して多くの配列候補を高速にスクリーニングする必要があるため，仮想的な膜環境のスコアリング関数が用いられている．しかしながら言うまでもなく，実際の脂質二重膜は脂質分子が流動性や伸縮性を持ち，タンパク質との相互作用によって動的に構造変化する．したがって，仮想膜環境で一次配列スクリーニングを行った後に，脂質分子を露わに組み込んだ構造モデリング，たとえば，分子動力学計算を用いた二次スクリーニングを行うことで設計の成功率向上につながると期待される．計算時間は長くなるが，一般に時間がかかる膜ペプチド・タンパク質実験の手間を最小に抑えることで，トータルの効率も向上すると考えられる．また，設計膜タンパク質が marginal stability から脱していないことを逆手にとり，分子動力学計算を導入することで，準安定状態を設計することもできるようになるかもしれない 24)．冒頭で述べたナノポア設計の当

434

文

献

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生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

〔生物工学会誌 第 101 巻 第 8 号 435–438．2023〕
DOI: 10.34565/seibutsukogaku.101.8_435

DNA コンピューティング技術とナノポア計測を組み合わせた体液診断技術
竹内

七海 1・滝口創太郎 1・神原史佳 1・川野竜司 1*

デコーディング手法としてのナノポア計測

はじめに
自然界では「情報」を「物質」に埋め込んで（符号化して）核酸分子を高感度・電気的・ラベルフリーに検出でき

利用している．低分子を想定したケミカルスペース（理論る技術として，ナノポア計測がある．ナノポア計測では，的に想定可能な分子の種類）は 1060 と推定されており 1)，

ナノサイズの孔（ナノポア）を通過した分子を電気的に検実際の分子の数はケミカルアブストラクトサービス（CAS）

出するため，検出分子とポア直径のサイズ親和性が検出の登録数をみると現在 2 × 10 を超えている ．では，こシグナルの S/N 比に重要である．狭窄部の直径が 1.4 nm

82)の膨大な種類の候補「物質」に具体的にどのようにしてのチャネル膜タンパク質 α-hemolysin（αHL）（図 1a）は，「情報」を符号化するのか？自然界では情報を物質の並

そのサイズから核酸検出に優れたナノポアとしてよく用び方・順序として埋め込む例が多数あり，これを利用しいられてきた．本項では，筆者らが提案してきたマイク

た情報処理は自然計算と呼ばれている ．

ロデバイス中でのナノポア計測法 4) とデコーディング手

3)

情報・計算では，順序とその保持が重要であると考え法への応用戦略 5) について概説する．ナノポア計測ではられている．これは，たとえばアルファベットのことを二つのチャンバーを持つマイクロデバイス中で脂質の単考えるとわかりやすい．情報は複数のアルファベットの分子膜で覆われた液滴を接触させる「液滴接触法 4)」に順序として埋め込まれ，それを保持することで伝達が可

より，接触界面に脂質二分子膜を作製する（図 1b）．こ能となる．生物ではこの情報の順序と保持を 5 種類の核

こに αHL が再構成されるとナノポアを通過したイオン

酸塩基と，20 種類のアミノ酸を用いて行っている．特により電流値が上昇する（図 1c）．αHL よりサイズの小に DNA は 4 種類の塩基 ATGC を用いて遺伝情報を保存，

さい一本鎖 DNA（ϕ ≒ 1.0 nm）は電位勾配下で瞬時にナ伝達している．DNA コンピューティングは，この DNA分子を用いた情報処理技術であり，自然計算の代表的な分野：分子コンピューティングの一種である．

DNA 分子による計算は，主に任意の情報を符号化（エンコード）した DNA 鎖の結合・解離，また酵素反応を組み合わせた化学反応により情報処理を行う．分子が計算を行うので，入力・出力とも DNA 分子の配列や構造といった形で行われる．ここで分子にエンコードされる
出力情報は人間が認識できる形にデコードされないと使うことができないため，核酸増幅やゲル電気泳動，出力した DNA 鎖に結合する蛍光プローブなどを用いるのが一般的である．本稿では，近年電気的一分子計測法として注目されているナノポア計測を DNA コンピューティ
ングにおける出力情報のデコーディングとして利用する
手法について概説する．また，このナノポアデコーディ
ングを体液診断など医療応用へと展開する取組みに関しても，最新の知見について紹介したい．

図 1．（a）チャネル膜タンパク質 α-hemolysin（αHL，PDB ID:
7AHL）の構造，（b）ナノポア計測用マイクロデバイスと液滴接触法，（c）αHL の再構成による電流値の上昇（d–f）αHL を用いて各構造の核酸分子を検出した際に得られる電流阻害シ
グナル* 著者紹介 東京農工大学大学院生命工学専攻（教授） E-mail: rjkawano@cc.tuat.ac.jp
1

東京農工大学大学院生命工学専攻

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

435

特

集

ノポアを通過し，一過的にイオンの流れが遮断された結果として時間の短い電流阻害シグナル（＝核酸検出シグナル）が得られる（図 1d）．一方で，サイズの大きな二本鎖 DNA（ϕ ≒ 2.0 nm）は αHL の狭窄部に詰まり，時間の長い電流阻害シグナルとして検出される（図 1e）．また二本鎖 DNA の末端に一本鎖領域を持たせると，一本鎖領域からナノポアに挿入された場合に電位勾配下で二本鎖領域を解離しながらゆっくりとナノポアを通過する（図 1f）．この通過時間は電流阻害シグナルにおける阻害時間であり，二本鎖領域の熱力学的安定性（ギブズ自由エネルギー：ΔG）に依存する 6)．以上のように，αHL
ナノポアによる核酸検出シグナルには，検出された核酸
分子の構造情報が反映される．また核酸分子の構造を塩基配列から人工設計するツールは充実しており，特に熱力学シミュレーション NUPACK7) では得られた分子構造の ΔG も算出できる．そこで DNA コンピューティン
グの出力情報を核酸分子の構造情報に落とし込む配列設計ができれば，ナノポア計測における電流阻害シグナル
から出力情報（＝構造情報）を電気的・ラベルフリーに
デコーディングできると考えた．
はじめに，入出力の情

論理演算のデコーディング

報を 0，1 で扱うシンプルな DNA 論理演算（NAND 回路）

図 2．ナノポア計測による DNA コンピューティング出力情報のデコーディングに関する研究．（a）NAND 回路，（b）酵素反応を含む AND 回路，（c）有向ハミルトン閉路問題（並列計算）．

の実装とナノポア計測によるデコーディングに取り組ん
だ 8)．出力情報としての DNA 分子がポアに詰まる二本

ナノポアに挿入されて電位勾配下で結合した相補鎖を解鎖もしくはポアを通過できる一本鎖・一本鎖領域を持つ

離しながらゆっくりとナノポアを通過できる．この通過

二本鎖を形成するよう，入力 DNA を配列設計した．こ

時間が出力分子の ΔG と相関することを利用して，電流れにより，ナノポア計測で出力分子を検出した際に時間の阻害時間の統計解析と熱力学シミュレーションの結果か，
長い / 短い電流阻害から出力 0，1 を容易に見分け（図 2a）

ら出力情報のデコーディングに成功した（図 2c）．

計算からデコーディングまでを約 10 分で実装した．次に，以上より，筆者らが開発してきた手法を用いてさまざ

より高度な情報処理として酵素反応を組み込んだ AND

まな DNA コンピューティングの出力情報を電気的・ラ回路の実装とデコーディングに取り組んだ 9)．出力 1 としベルフリーにデコーディングできることを示した．またて転写反応により一本鎖 RNA が増幅される分子反応系を設計することで RNA 検出シグナルの頻度から出力 0，1

DNA 分子にコードされた出力情報を電気信号へと変換可能なナノポア計測は，DNA コンピューティングと電子を見分け，約 1 時間での情報処理に成功した（図 2b）．

回路によるコンピュータの橋渡しになると期待できる．

DNA コンピューティ
ング提唱者である L. M. Adleman が実装した DNA 並列

体液診断への応用に向けて並列計算のデコーディング．Adleman は有向グラフの都市・DNA コンピューティングは，前述のような情報科学的研究だけでなく，DNA 分子の生体親和性を利用した経路の情報を符号化した DNA を配列設計することで，診断・治療などの医療応用が期待されている．本項では，有向ハミルトン閉路問題（巡回セールスマン問題のようDNA コンピューティングをナノポア計測と組み合わせに各都市を一筆書きで巡回できる経路を探索する組合せて体液診断に応用する研究を紹介する．ここでの標的バ計算についても，ナノポア計測による出力情報のデコー
ディングを試みた

10)

最適化計算）を解いてみせた ．本研究では，出力分子

イオマーカーである microRNA（miRNA）は 20 塩基程の末端構造としてヘアピンと一本鎖領域を形成するよう度の小さな RNA 分子であり，がんにおいては複数種類の計算用 DNA（都市・経路）を配列設計した．これによりmiRNA が同時に発現上昇・発現減少するため，miRNA

出力分子は図 2c のような構造を取り，一本鎖領域からの発現パターン認識が診断に有用である 12)．

11)

436

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

ナノポア応用研究の最前線

図 4．5 種 類 miRNA 検 出 に よ る 胆 管 が ん 診 断．（a）診 断 用
DNA による並列計算とナノポア計測の様子，（b）各入力パター
ンにおける電流阻害時間，（c）実検体における電流阻害時間．
図 3．AND 回路による小細胞肺がん診断．（a）AND 回路と出力分子（4WJ）の構造，（b）各入力パターンにおける電流阻害
シグナル．

のパターン」でより長い通過時間が得られた（図 4b）．
続いて実際の検体を用いて本手法の有効性を検証した．
健常者，胆管がん患者の血漿検体からシリカカラムを用AND 回路によるがん診断
DNA コンピューティン
グを用いた複数 miRNA 検出の第一歩として，小細胞肺がんで特異的に過剰発現する2種類のmiRNA（miR-20a，miR-17-5p）を入力とする AND 回路（図 3a）を構築した 13)．
それぞれの miRNA について存在する / しない場合を 1/0とし，入力が（1，1）の場合にのみ入力 miRNA と設計した診断用 DNA が四つ又構造（4WJ）を取り，ナノポアに詰まる．それ以外の入力では 4WJ は形成されず，短い電流阻害時間が得られる．結果，入力（1，1）の場合にもっ，小細胞肺がとも長い電流阻害時間が観察され（図 3b）
んの miRNA 発現パターンを識別することができた．
5 種類 miRNA 同時検出によるがん診断
miRNA のいて miRNA を抽出し，診断用 DNA を添加して並列計算を行った．ナノポア計測の結果，がん検体でより長い
通過時間が観察され（図 4c），miRNA の発現パターンから胆管がんを識別することに成功した．
おわりに
本稿では，人工配列設計した DNA を分子計算機として扱う DNA コンピューティングと呼ばれる研究分野を紹介するとともに，ナノポア計測によるDNAコンピュー
ティング出力情報のデコーディングと病理診断への応用について概説した．ナノポア計測は分子に符号化された情報を電気信号へと変換するため，自然計算と電子回路より複雑な発現パターン認識を目指し，胆管がんで特異によるコンピュータの橋渡しなど，さらなる応用展開が的に発現上昇する 5 種類の miRNA（miR-193，miR-106a，期待できる一方で，本稿で紹介したような実験系は習熟

miR-15a，miR-374，miR-224）の同時検出を試みた ．
5 種類の miRNA と同時に結合できる診断用 DNA（図 4a）を用いて，miRNA を入力分子，診断用 DNA を計算実
行分子，診断用 DNA/miRNA 二本鎖分子を出力分子とする並列計算を行った．診断用 DNA は一本鎖領域からポア内に侵入し，miRNA との結合をほどきながらポア
内を通過する．
「がんのパターン（5 種類の miRNA が発
現）」と「その他のパターン（1 種類または 3 種類の miRNA

したスキルを必要とする．最近では使用方法がプロトコ

14)

ル化されたナノポア計測デバイスが市販されており，産業界のサポートが本稿で紹介した技術を実用化する足掛かりとなり得る．特に，Oxford Nanopore Technology
社のマルチプレックスに計測ができるポータブルなナ
ノポアアレイ 15) に DNA コンピューティングを利用した
病理診断システムを搭載することで，新たな「その場診断」ツールとして社会に実装できると考える．

が発現）」についてナノポア計測を行ったところ，「がん生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

437

特

集

謝

辞

本研究で用いた血漿検体は国立国際医療センター（NCGM）
バイオバンクよりご提供いただきました．この場を借りて深く御礼申し上げます．また，本研究は科研費基盤（A）および新学術領域「分子ロボティクス」の助成により進めることができました．ご支援，ご協力に感謝いたします．

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438

4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)
12)
13)
14)
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生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

〔生物工学会誌 第 101 巻 第 8 号 439–442．2023〕
DOI: 10.34565/seibutsukogaku.101.8_439

AI と固体ナノポアセンサによるウイルス検査有馬

彰秀 1*・筒井

真楠 2・鷲尾隆 2・馬場嘉信 1,3,4・川合

知二 2

充分な広がりまでの時間を稼ぐことが求められた．感染

はじめにの診断にはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法や抗原検査

我々は，常にさまざまな物理性状を有する微粒子のが主に利用され，検査センターが街中に設置されるほど影響下にある．ウイルスや有害細菌はもちろんのこと，の広がりを見せた．これらの手法はそれぞれ高精度・短PM2.5 やバイオエアロゾルなど，健康を脅かす多種多

時間での判定が特徴であるが，高額な機器や専門的技能

様な微粒子へと対処していくため，その分析手法の開発が必要な点や，視認による判定では精度が検査者の能力は今後ますます重要になる．

に依存する点などが課題として挙げられる．

ナノポアは，その中でも 1 粒子レベルの圧倒的感度を

このような状況において，ナノポア計測の手技は比較．特に微細加工技術によって固体的シンプルであり，1 粒子検出に基づくため，感染初期

材料に作製する固体ナノポアは，化学的・機械的耐久性のまだウイルスが増殖していない段階でも評価できる可があり，ポア径を検体に寄せて作製が可能であることか能性がある．さらに，ウイルス感染症の示す疫学的観点

ら，粒子検出における高い S/N 比を狙える ．加えて分からではなく，ウイルスの粒子としての物理性状に基づ

子修飾・金属酸化物製膜などによる機能性の付与も容易いた分析が行える．そこで筆者らは，新規ウイルス検査であり，高い拡張性を有する 4,5)．

法の原理実証として，固体ナノポアを用いた単一ウイル持つセンサである

1,2)

3)

しかし，イオン電流シグナルに反映された各粒子の物理

ス粒子の検出とその識別を試みた 6–8)．

性状に着目する以上，性質の類似した粒子間における識ポリイミド製膜 SiNx ナノポアの作製

別精度の劣化は避けられない．本稿では，その解決を目指した筆者らによる人工知能（AI）技術とナノポア計測の融ウイルス検出に利用した SiNx ナノポアは，0.5 mm の合に基づく高精度ウイルス識別の展開について解説する．

Si ウエハの両面に 50 nm の窒化膜を製膜したものを基

ウイルス感染診断の現状とナノポア計測の親和性板として用い，微細加工技術を用いて作製した．片面のSiNx を反応性イオンエッチング（RIE）によって一部をウイルスは，DNA もしくは RNA がタンパク質の殻除去し，Si 層を露出させた．その露出部分を囲うようにであるカプシドによって包まれたヌクレオカプシドが基

ポリプロピレンチューブを接合し，水酸化カリウム溶液

本構造であり，種によっては，さらにその外側にエンベによって異方的にエッチングを行った．エッチングがもロープと呼ばれる脂質二重膜を持つ．種は同じであってう片面の SiNx まで到達すると，フリースタンディング

も，感染・伝播性や抗原性が変化した変異株の存在もあな SiNx 薄膜（メンブレン）が残る．この SiNx メンブレン

り，遺伝子はもちろんのこと，感染に寄与するスパイクに電子線リソグラフィーによって直径 300 nm の円を描タンパク質の違いなどもあり，その物理性状は多種多様

画し，RIE によって掘削した．

である．加えてよく知られるように，ウイルスは単独で筆者らが測定に用いた固体ナノポアの特徴として，直増殖することができず，宿主細胞の複製機構を流用する．

径に対する厚さの比（アスペクト比）が非常に小さい点がそのため，増殖において独自のサイクルを持つ感染性細挙げられる 9)．この低アスペクト比ナノポアは，その高い菌などと比較するとその対処ははるかに難しく，ヒトに空間分解能への期待から，グラフェンや MoS2 などの 2 次

感染するもので根絶を成し得たのは天然痘のみである．

元材料でのアプローチが研究室レベルで展開されてきた．

近年の新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパ

これまで筆者らは，その構造を SiNx ナノポアで模倣する

ンデミックにおいても，我々は変異株への対応に追われことで，高効率・高感度での計測が可能なデバイスとしてながらも，その発生から一応の収束までを目の当たりに利用してきた．加えて今回のウイルス検出では，デバイスした．特定の効果的な治療法が存在しない中で重要とさの低容量化を志向して，ポリイミドをナノポア近傍まで製れるのが早期発見・隔離であり，ワクチンの完成とその膜した．高時間分解能の計測のためには，デバイスの電気* 著者紹介 名古屋大学未来社会創造機構（特任講師） E-mail: arima@chembio.nagoya-u.ac.jp
13

名古屋大学未来社会創造機構，2 大阪大学産業科学研究所
名古屋大学大学院工学研究科，4 量子科学技術研究開発機構

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

439

特

集

図 2．呼吸器感染症起因ウイルス検出シグナルにおける波高（Ip）- 波幅（td）のヒストグラムと散布図．文献 6 より転載．
図1．
固体ナノポアによる単一ウイルス粒子検出．
（A）
概念図．
（B）
ポリイミド製膜 SiNx ナノポアの SEM 画像および（C）構造．
（D）
ウイルス検出におけるイオン電流トレース．文献 6 より転載．

すことが示唆されている 11)．SiNx ナノポアにおいて，電気浸透流が夾雑物に対するフィルタとしての機能を果た
気浸透流はウイルス粒子が牽引される方向とは逆へと流容量の低減化は重要な課題であり，このポリイミド層の寄れる．そのため，表面電荷が小さい粒子はポアへの侵入

与によってウイルス粒子の通過のような，短時間のイベンが阻害される．加えて，ナノポア計測ではポア径と比しトを捉えられることが明らかとなっている ．

て大きな粒子は通過できず，逆に微小な場合には充分な

10)

計測では酸素プラズマ処理を通して試料導入用の流路

イオン電流阻害を引き起こすことができない．EOF フィとなるポリジメチルシロキサン（PDMS）ブロックをナノルタに加え，これらの検出における選択性から，シグナ

ポアチップの両面に接合し，一方の流路に孔径 450 nm のルとして検出される粒子は大きく制限される．

メンブレンフィルタによって前処理を行った培養ウイル

しかし，たとえ同一種であってもそれぞれの粒子にはばらスの分散液，他方には緩衝液を導入した．Ag/AgCl 電つきがあるため，得られたシグナルからそのウイルス種を推極をそれぞれの流路に設置した後，電圧を印加した際に定することは容易ではない．ウイルス 5 種の検出における波

ナノポアを流れるイオン電流を計測した．検出対象とし高（I p）- 波幅（td）の散布図を図 2 に示す．ポリイミド製膜て，代表的な呼吸器感染症の起因ウイルスであるアデノ

SiNx ナノポアによって1 粒子レベルでの検出が可能であるこウイルス・コロナウイルス・RS ウイルス・A 型 /B 型イとが示された一方で，識別によく利用される両パラメータの分

ンフルエンザウイルスの 5 種を採用した（図 1）．
ウイルス 1 粒子検出
ナノポアを挟んで電圧を印加することで，ナノポアでの布には大きな重なりがあった．これを基にした識別が困難であることは明らかであり，新しいアプローチが必要であった．

AI ナノポアプラットフォームによるウイルス種識別析

電場集中が引き起こされる．これによって，ナノポア近傍

そこで活用したのが AI を利用した機械学習に基づくの粒子には，水中で荷電粒子が受ける静電気力である電解析である．低アスペクト比ナノポアを利用したことで，

気泳動力に加え，電気浸透流（Electroosmotic ﬂow; EOF）

イオン電流シグナルには検体粒子の物理性状が複雑に反の抗力が作用する．電気浸透流はナノポア壁面の対イオ

映されていると考えられ，それらの特徴を充分に活用しンが電場を受けて移動する際に，溶媒分子も引きずられて

6,7)．
たより高度なイオン電流波形解析を目指した（図 3）

いくことに伴って生じる壁面近傍の流体の流れである．

具体的には，これまで利用されていた波幅と波高に加今回のウイルス検出では，前処理としてメンブレン

え，面積や立ち上がりの角度，ピークの尖度や位置比，フィルタによる処理を行ったが，計測の段階でもこの電慣性といった多様なパラメータを採用した．さらに，シ440

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

ナノポア応用研究の最前線

図 3．AI と固体ナノポアセンサによるウイルス種識別．文献 7 より転載．

グナルを規定の間隔で分割し，各区間における電流値とこれらの新規パラメータをランダムに混合した形状特徴
量ベクトルを作成し，教師データとして分類モデル（分類木）に異なる組合せを学習させた．そして，検出されたイオン電流シグナルに対し，それぞれの分類木でウイ
ルス種を判定し，その多数決によって最終的な分類を行った．この幅広い特徴量のランダムな学習によってシグナルの形状特徴量を網羅的に捉えた識別を可能にしており，加えて多数の粒子からデータベースを構築することで，粒子集団としてのばらつきもカバーしている．
今回のウイルス種識別では，個別に計測を行ったそれ
ぞれのウイルス種のシグナルを学習させ，テスト用デー
タの推定を行った．その結果，5 種のウイルスにおいて70 ％を越える精度を示した（図 4）．強調したいのはこ
れが 1 粒子の検出に基づくものであり，シグナル数の増加によって精度が向上する点である．この 5 種の場合では 20 数個で 99 ％を越え，感染初期でも利用可能な検査

図 4．AI ナノポアプラットフォームによる複数種ウイルスの識別精度．文献 6 より転載．
8)も進んでいる．それがウイルス認識ナノポアである（図5）．

ウイルス認識ナノポアは，ナノポア壁面にウイルス認識法として実用化が検討できるレベルになってくる．さら分子を修飾することで，検出における特異性を増強させたに，A 型 /B 型インフルエンザウイルスの結果が示すように，ものである．設計思想は一般的なイムノセンシングと類似

同一ウイルス種の亜型の識別へも適用可能であり 11)，加え

しているが，大きく異なるのが強固な認識では逆に検出のて，唾液との混合溶液中での検出も行えることも実証され障害になる点である．ナノポアセンシングは，粒子の通過ている．今後臨床現場におけるこの AI ナノポアプラットに伴うイオン電流変化を検出するため，ポア閉塞が容易にフォームによる簡便・迅速・低侵襲の検査が期待される．

引き起こされると計測のスループットが激減する．

ウイルス認識ナノポアの開発

この課題を解決するために，ペプチドアレイを利用して適度な強度のペプチドを探索した．実証実験ではインフル

前項までは，分析において機械学習を活用することで，エンザウイルスを測定対象としたため，A 型（H1N1）イン

各シグナルの形状の特徴を網羅的に捉えた高精度識別を

フルエンザウイルスと強く相互作用する既知の配列を基準実現した事例について紹介した．この解析のソフト面とに，一部の配列を削ったものに対して結合試験を行った．

からのアプローチに加え，ハード面であるデバイスの改良

その中から適当と考えられる配列を抽出し，ポア内部に修

生物工学会誌

第101巻第8号（2023）

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特

集
の弱い認識に基づく高精度識別は，原理的にはあらゆる粒子に適応可能であり，今後多様な粒子の分析・識別に貢献することが期待される．
おわりに以上，AI とナノポアセンシングの融合に基づく，新たなウイルス検査について解説した．この AI ナノポア
プラットフォームでは，機械学習を利用した解析が行われるため，精度が数値として得られ，検査者の能力に依存しない判定が可能である．加えてデータベースの構築も容易であり，その有用性はシグナル数の確保やウイル
ス種の拡張によって爆発的に向上する．
この手法は，ウイルスに限らず細菌のような生体微粒子にも適用可能であり 12,13)，今後も多様な粒子解析における機械学習の利用が進むと考えられる．この AI ナノ
ポアプラットフォームを基盤としたベンチャー企業もすでに設立されており（アイポア株式会社：https://aipore.

com/），ナノポアチップや計測装置，AI を利用した解析が可能なソフトウェアまで一貫して提供している．
さらに，近年の研究により，複数のナノポアを集積したデバイスによって単一細菌の内包 DNA の抽出とその検出も実証されており 14)，粒子としての物理性状のみならず，その遺伝情報も活用できる可能性も見いだされつつある．加えて，シグナル解析においても深層学習を利用したノイズ除去アルゴリズムも開発されている 15)．今後も，バイオナノテクノロジーと情報科学の目覚ましい
図 5．ウイルス認識ナノポアによるウイルス粒子検出．（A）インフルエンザウイルス粒子検出および（B）分子認識ナノポアの概念図．（C）修飾したペプチド．（D）修飾の有無によるシグナルの比較．（E）機械学習で利用した形状特徴量および（F）
インフルエンザウイルスの亜型判別精度における形状特徴量依存性．文献 8 より転載．

飾した．この際，SiNx ナノポアに Au を積層し，リンカー部
位を加えたペプチドを金 - チオール結合によって修飾した．
このペプチド修飾ナノポアを用いた A 型インフルエン
ザウイルス粒子の検出では，非修飾（SiNx）ナノポアと比較して，通過時間の大幅な延長が確認された．さらに，その延長の度合いは結合試験で得られた認識強度の順と対応していた．加えて機械学習を利用した亜型間の識別において精度が向上することが示されたが，各形状特徴量に着目した際，もっとも高い値が得られたのは尖度であった．尖度はナノポア内部の粒子挙動を強く反映したパラメータであると考えられることから，ウイルス認識

進化を受け，この AI ナノポアプラットフォームもさらなる発展が期待される．
文

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献

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ナノポアの有用性も示された．この 1 粒子 - 少数粒子間442

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