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生物物理 62（5），271-275（2022）
DOI: 10.2142/biophys.62.271
受理日：2022 年 5 月 22 日

総説

De novo ペプチドナノポアの設計と精密 1 分子検出清水啓佑，宇佐美将誉，溝口郁朗，藤田祥子，川野竜司

東京農工大学工学府生命工学専攻

De novo protein design has emerged as a method to manipulate the primary structure for the development of artificial proteins andpeptides with desired functionality. This paper describes the de novo design of a pore-forming peptide that has a β-hairpin structure andassembles to form a stable nanopore in a bilayer lipid membrane. We designed two kinds of peptides, SV28: forming multidisperselysized nanopore and SVG28: monodispersely-sized nanopore, and succeeded to detect single molecule DNAs and polypeptides. Suchde novo design of a β-hairpin peptide has the potential to create artificial nanopores, which can be adjust size to a target molecule.
nanopore / de novo design / β-hairpin peptide / β-barrel / single-molecule detection

アセンシングへの応用について言及されている．

はじめに

1.

ナノポアタンパク質を設計して脂質膜中に構築する

ナノポア計測は，ナノサイズの孔を通過する分子を電気的に 1 分子レベルで検出する方法である

場合，膜への挿入・再構成が課題となる．そこで我々．ポアは，比較的脂質膜に挿入されやすい短鎖のペプチドに形成膜タンパク質が有する 1 分子レベルの分解能を利よるナノポア構築に着目した．天然では抗菌ペプチド用し，90 年代半ばから DNA シーケンスへの応用を目など短鎖のペプチドが脂質膜中に不安定ながらもポア1),2)指した研究が行われ，2015 年にその成果として安価・を形成する．30 残基以下の短いペプチドでは膜外部分小型なナノポア DNA シーケンサーが実用化された．

でポア構造を安定させることが難しく，そのためこれDNA 以外にも小分子 3)，タンパク質やペプチドの検出まで安定なナノポア構造の報告は少ない．天然配列のが検討されており ，特に次世代の技術としてタンパ再設計の例として，ナノポア形成タンパク質 Wza の膜ク質のアミノ酸シーケンスの実用化が期待されてい貫通部分に変異を加えた，ナノポア形成 α ヘリックス

る5)．しかしながら，1 アミノ酸を識別可能な高分解能ペプチドが報告されている 8)．これまで報告されていを得るためには，検出対象分子の大きさや形状に適しる人工設計ナノポアの多くが α ヘリックス構造を有したナノポアを用いる必要がある．現在知られている天ている一方，ナノポア計測に多く利用されている β バ

然のナノポア形成膜タンパク質ではポアのサイズや形レルタンパク質は，高い疎水性のため合成が難しいと状に制限があり課題となっている．そこで我々は，アいう課題があった．そこで我々は，分子検出可能なナミノ酸配列を人工的に設計することにより，目的のサノポアを構築する短い β ヘアピンペプチドの設計に挑

イズやポア形状を持ち検出対象分子に適したナノポア戦した．

4)を構築できるのではないかと考えた．
De novo 設計とは，de novo―新たに，最初から―と2.

いう言葉が示すように，天然にはない新たな物質設計

SV28 の配列設計および合成と捉えることができる．特にタンパク質の de novo 設計

我々が SV28 と命名したペプチドは，28 残基のアミの場合は，任意の構造を持つ人工タンパク質をアミノノ酸から構成されている．詳細なアミノ酸配列設計を酸配列設計により作製しようとする試みのことを指し，以下に記す．はじめにアミノ酸全長を 30 以下で固相合

約 40 年間にわたって研究が行われてきた．De novo 設成可能な 28 残基とした．β シート形成のため 2 本の β計における初期の研究では，α ヘリックスや β シートストランドとそれを繋ぐ β ターン構造，2 つの末端構といったタンパク質の基本構造である二次構造が設計造から構成される β ヘアピン構造を設定した．β ストされた ．近年では計算科学的手法による de novo 設計

ランドは膜貫通のために 10 残基の長さが必要であり，

6)が主流となり，水溶性のタンパク質だけでなく膜タン末端構造にそれぞれ 2 残基ずつ，β ターン構造に 4 残パク質の設計も報告されており 7)，その中ではナノポ基を採用し，合計 28 残基のペプチドを設計した（図De Novo Design of a Nanopore for Single-molecule Detection that Incorporates a β-hairpin Peptide
Keisuke SHIMIZU, Masataka USAMI, Ikuro MIZOGUCHI, Shoko FUJITA and Ryuji KAWANO
Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology

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目次に戻るナノポア形成 β シートペプチドの de novo 設計

図1
SV28 ペプチドの配列設計．
（a）骨格構造の決定．
（b）脂質膜中 β バレル構造を誘起する親水・疎水性アミノ酸の交互配列．
（c）脂質膜中構
造安定化のための芳香族アミノ酸導入．
（d）ペプチドの膜貫通方向制御のための電荷アミノ酸の導入．
（e）設計された SV28 ペプチドのアミノ酸配列．

．次に，脂質膜中でナノポア構造を形成するよう，
1a）

した 11) ．また，末端構造は正電荷を持つアルギニン

以下 3 つの設計指針に従い，骨格構造にアミノ酸配列と，スペーサーとしてグリシンを配置し RG-，-GR とを当てはめた．

した．

①親水・疎水アミノ酸の交互配置による β シート形成このようにして 28 残基のナノポア形成 β ヘアピン

親水性アミノ酸・疎水性アミノ酸の交互配列により，ペプチド SV28 を設計した（図 1e）．この SV28 が脂質β シート形成が誘起されるように設計した（図 1b）．

膜中で会合し β バレル型のナノポアを形成可能か，分さらにこの配列は親水面と疎水面が分かれた両親媒性子動力学（MD）シミュレーションにより確認した（図

構造を有する β シートを形成する ．そのため，β バ2）．まず β ヘアピン構造を持つ SV28 の 11 量体 β バレレル形成時に脂質膜と接する外側が疎水性，イオンをル構造を脂質膜中に形成させた．それを初期状態とし通過させる内側が親水性のナノポア形成を可能とした．て，1000 ns の MD シミュレーションを実施し，β バレ側鎖の立体障害を防止するために，親水性および疎水ル構造が維持されたことを確認した．この MD シミュ性残基に側鎖の小さいセリンとバリンを採用した（アレーションを 5 量体，7 量体でも同様に実施し，それラニンは α ヘリックス構造を誘起するため不採用としぞれにおいて 1000 ns 後の β バレル構造の維持を確認た）．

した．これらの結果から SV28 が脂質膜中で形成する②芳香族アミノ酸によるナノポア構造安定化

β バレル構造の安定性の高さを確認した．

9)

天然の膜タンパク質では脂質膜界面にチロシンやト続いて，我々は SV28 ペプチドの固相合成を試みた

リプトファンが多く局在していることが知られている．

が，SV28 は疎水性が高く凝集しやすいため一般的な手これらのアミノ酸の側鎖は脂質の頭部と水素結合を形法では合成困難であった．そこでイソアシルジペプチ成することで，タンパク質の膜貫通構造の安定化に寄与しており，これは Snorkeling 効果と呼ばれている10)．今回は，β バレル構造をより安定化させるチロシンを採用した（図 1c）．
③膜外部分の電荷アミノ酸による膜貫通方向制御
ペプチド間に逆平行 β シート構造を形成させるため，ペプチドのターン部分に負電荷，末端部分に正電荷を持つアミノ酸を配置し，電圧印加によりペプチドの膜貫通方向を揃えるよう設計した（図 1d）．ターン

図211 量体の SV28 ペプチドから構成される脂質膜中ナノポア構造のMD シミュレーション結果．

構造として，負電荷を持つアスパラギン酸を含みかつ4 残基の β ターン構造をとりやすい配列-DSDG-を採用
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目次に戻るナノポア形成 β シートペプチドの de novo 設計

ド法 12)により下記 2 段階の手順で合成した．まず，β③脂質膜へのコレステロール導入

シート構造を形成しない親水性の前駆体を固相合成す

コレステロール導入により脂質膜の流動性を低下さることで凝集を防止しながら合成および精製を実施しせ，脂質膜中でのペプチドの拡散を抑制することで，た．その後，イソアシルジペプチドの転移反応により一度形成されたナノポアの安定化を狙った．

前駆体から SV28 を合成した．この SV28 が脂質膜存在

上記 3 つの工夫により安定なナノポア形成は 67%ま下で設計通り β シート構造を形成することを，円偏光で向上し（図 3a），SV28 ナノポアの構造安定化に成功

二色性スペクトル測定により確認し，さらに放射性同した．得られたナノポアは単一の会合数で形成されず，位体アミノ酸を有する SV28 を用いた固体 NMR 測定

電 流 値 か ら 算 出 さ れ た SV28 ナ ノ ポ ア の 直 径 はにより，SV28 が脂質膜中で β-turn-β 構造をとることを1.7-6.4 nm であることが確認された（図 3b）．

確認した．

チャネル電流計測では，複数のサイズのポア形成が見られるが，そのうち約 5.4 nm のポアが形成された際に二本鎖 DNA 分子の検出を試みた．まず 50 bp の二本SV28 のチャネル電流計測

3.

鎖 DNA の検出を試みたが，DNA の通過を示す阻害電SV28 が形成するナノポアの安定性やサイズを評価す流シグナルは観察されなかった．そこでより長鎖のるために，脂質二分子膜中に形成されたナノポア内を1 kbp DNA を計測したところ DNA の通過による電流流れる微小電流を計測する，チャネル電流計測法を利阻害シグナルが再現よく観察された（図 3c）．この結用した．我々は液滴接触法により安定な人工平面脂質

果より，de novo 設計されたナノポアによる分子検出に二分子膜を簡便に作製できるため，長時間のチャネル成功した．さらにはより大きなサイズのポア（6.4 nm）電流計測をスループット高く実施可能である 13)．さらが形成された時を利用しグアニン四重鎖構造を持つに，これまで様々な天然のナノポア形成タンパク質おDNA の検出にも成功した．

よびペプチドの計測データを蓄積しており，電流波形の形状からナノポアの安定性を予測することが可能で4.

ある 14)．このチャネル電流計測の結果，SV28 の安定なSV28 の再設計およびポリペプチドの検出

ナノポア形成はわずか 3%であった（図 3a）．そこで下SV28 は直径 1.7-6.4 nm という幅広いサイズのナノポ記 3 つの計測条件を変更することにより，SV28 ナノポアを形成した．異なるサイズの標的分子を検出可能でアの安定化を試みた．

ある点では有用であるが，特定の分子の効率的な検出①印加電圧を 100 mV→200 mV に変更には単一サイズのナノポアが望ましい．そこで，SV28

SV28 は印加電圧により膜貫通方向が揃い，分子間逆のアミノ酸配列の再設計により単一サイズのナノポア

並行 β シート形成が促進されるように設計されているの構築に挑戦した．計算機による設計の先行研究におため，高電圧印加によりナノポアの構造安定化を狙っいて，β ストランド構造の中央にグリシンを導入するた．

こと（グリシンキンク）で，β バレル構造中の立体障②インキュベートによる構造安定化

害と構造的ひずみを減少させ，水溶液中の β バレル構

SV28 を脂質存在下での 37°C，24 時間インキュベー造の安定性を上げることが報告されている 15)．我々もトし，最安定構造のナノポア形成を促進させた．

既報を参考に SV28 の膜貫通領域の中央部分にグリシンを導入した β シートペプチド SVG28 を再設計した．
SVG28 ナノポアの構造安定性確認法および合成法
は，SV28 と同様にそれぞれ MD シミュレーションとイソアシルジペプチド法を使用した．合成した SVG28が脂質膜存在下で β シート構造を有することを円偏光二色性スペクトル測定により確認した．チャネル電流計測を行った結果，SVG28 のナノポア形成率は 90%となり，ポアの直径はおよそ 1.7 nm 付近の狭い範囲に収束することがわかった（図 4a）．
将来的なアミノ酸シーケンスへの応用を目指し，

図3（a）SV28 ナノポアの安定性評価．（b）SV28 ナノポアの直径の分布．（c）SV28 ナノポアを用いた二本鎖 DNA 電流計測．

SVG28 を用いて分子量の異なる poly-L-lysine（L-PLL，
分子量 50000〜70000，S-PLL，分子量 10000）の検出を273

目次に戻るナノポア形成 β シートペプチドの de novo 設計文 献1)

Bezrukov, S. M. et al. (1994) Nature 370, 279-281. DOI:
10.1038/370279a0.

2)

Kasianowicz, J. J. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93,13770-13773. DOI: 10.1073/pnas.93.24.13770.

図4（a）SVG28 ナノポアの直径の分布．
（b）SVG28 ナノポアを用いたポリペプチドアミノ酸のナノポア計測．

3)

Gu, L. Q. et al. (1999) Nature 398, 686-690. DOI: 10.1038/19491.

4)

Movileanu, L. et al. (2005) Biophys. J. 89, 1030-1045. DOI:
10.1529/biophysj.104.057406.

5)

Alfaro, J. A. et al. (2021) Nat. Methods 18, 604-617. DOI: 10.1038/
s41592-021-01143-1.

6)

試みた結果，電流阻害シグナルが再現よく観察され（図pac198456080979.
7)4b），阻害シグナルの持続時間の差異から L-PLL と S-Xu, C. et al. (2020) Nature 585, 129-134. DOI: 10.1038/
s41586-020-2646-5.

PLL の識別に成功した 16)．SVG28 を用いたナノポア計

8)測では，ポリアミノ酸の検出と，その長さの違いに関Mahendran, K. R. et al. (2017) Nat. Chem. 9, 411-419. DOI:
10.1038/nchem.2647.

しては識別が可能であったが，ストランドに含まれる

9)

Mandel-Gutfreund, Y. et al. (2002) J. Mol. Biol. 323, 453-461.
DOI: 10.1016/s0022-2836(02)00973-7.

アミノ酸の種類毎の識別は難しく，今後機械学習を利10)用したシグナル解析などさらなる検討が必要になる．

Hong, H. D. et al. (2007) J. Am. Chem. Soc. 129, 8320-8327. DOI:
10.1021/ja068849o.

11)Chou, K. C. (1997) J. Pept. Res. 49, 120-144. DOI: 10.1111/j.1399-3011.1997.tb00608.x.

おわりに

5.

Kaiser, E. T. (1984) Pure Appl. Chem. 56, 979-987. DOI: 10.1351/12)

Sohma, Y. et al. (2004) Chem. Commun. 1, 124-125. DOI:
10.1039/b312129a.

アミノ酸配列を人工的に設計することで，脂質膜中13)にナノポア構造を構築することに挑戦してきた．運良

Kawano, R. et al. (2017) Chem 2, 393-403. DOI: 10.1016/
j.chempr.2017.02.002.

く複数のサイズのポアや，単一に近いナノポアの構築

14)に成功した．この過程で，親水疎水の界面を持つ脂質

Saigo, N. et al. (2019) ACS Omega. 4, 13124-13130. DOI:
10.1021/acsomega.9b01033.

15)二分子膜中で，どのようにアミノ酸配列を設計すればDou, J. Y. et al. (2018) Nature 561, 485-491. DOI: 10.1038/
s41586-018-0509-0.

3 次元的な構造を作らせることができるのかに関し，

16)

多少なりとも理解ができたと感じている．今後は完全

Shimizu, K. et al. (2022) Nat. Nanotechnol. 17, 67-75. DOI:
10.1038/s41565-021-01008-w.

な会合数の制御を試みるほか，分子認識能のあるナノポア構築に挑戦していきたい．

清水啓佑（しみず けいすけ）
東京農工大学大学院生命工学専攻
2020 年同大学修士課程卒業．
研究内容：β-ヘアピンペプチドの de novo デザイ
ンによるナノポア構築

ナノポアを利用した DNA およびポリペプチドの検出手法は現在研究途上の分野であり，これらの高感度検出や迅速・簡便な検出が求められる分野において高く注目されている．今後，人工ナノポアの設計技術はタンパク質の de novo 設計手法の発展とともに向上して清水啓佑いくと予想される．1 アミノ酸レベルでのポリペプチ

宇佐美将誉（うさみ まさたか）
東京農工大学大学院生命工学専攻
2022 年同大学修士課程卒業．
研究内容：α-ヘリックスペプチドの de novo デザインによるナノポア構築

ドの識別等，より高精度の検出が可能な人工ナノポアの誕生に期待したい．
最後に本研究は，疎水性の合成が難しいペプチドをイソアシルペプチド法で合成可能にしていただいた甲南大の臼井研究室，脂質膜中でのペプチド構造を固体

宇佐美将誉

溝口郁朗（みぞぐち いくろう）
東京農工大学大学院生命工学専攻
同大学修士課程
研究内容：配列設計 β バレルナノポアによる単一分子検出の NMR で評価していただいた横浜国大の川村研究室，MD シミュレーションを行っていただいたモンゴル国立大の Mijiddorj 博士との共同研究でなければ得られなかった成果です．共同研究者と研究室の皆様に深く感謝いたします．また本研究は新学術領域「発動分子科溝口郁朗学」をはじめ，複数の助成金の補助により成された成果であり，サポートに心から感謝いたします．

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藤田祥子（ふじた しょうこ）
東京農工大学大学院生命工学専攻
同大学修士課程
研究内容：無細胞合成可能な β バレルペプチドナ
ノポアの設計および評価

藤田祥子

川野竜司（かわの りゅうじ）
東京農工大学大学院生命機能科学部門
教授
連絡先：〒 184-8588 東京都小金井市中町 2-24-16
E-mail: rjkawano@cc.tuat.ac.jp

川野竜司

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