Oct. 2016

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―5309（ 9 ）ヒト培養細胞内侵入 Haemophilus inﬂuenzae に対する
トスフロキサシンの影響―インフルエンザ菌による小児急性中耳炎反復メカニズムの視覚化と治療の可能性―
山中昇

藤沢御所見病院

保富宗城
和歌山県立医科大学耳鼻咽喉科・頭頸部外科（2016 年 8 月 10 日受付）
急性中耳炎の二大起炎菌の 1 つである nontypeable Haemophilus inﬂuenzae（インフルエンザ菌）は，宿主細胞内に侵入することにより小児急性中耳炎の難治化（遷延化，反復化）に影響すると考えられる。本研究では，ヒト培養細胞に侵入したインフルエンザ菌の動態を視覚化するとともに，ヒト培養細胞内に侵入したインフルエン
ザ菌に対するニューキノロン系抗菌薬のトスフロキサシンおよびセフェム系抗菌薬のセフジトレンの影響を in vitro にて検討した。
その結果，①インフルエンザ菌はヒト細胞内に侵入すること，②セフジトレンはヒト細胞内のインフルエンザ菌に影響を与えないこと，③トスフロキサシンはヒト細胞内に侵入したインフルエンザ菌に対し殺菌的に作用することの 3 点が示唆された。
以上の成績は，トスフロキサシンの小児難治性中耳炎に対する高い臨床効果を支持するものと考える。

急性中耳炎は，小児期に最も多くみられる感染により遷延性にそれぞれ関連すると考えられる 4）。

症の 1 つである 1）。近年，特に 2 歳未満の小児を中

トスフロキサシン（オゼックス ® 細粒小児用 15%）心に経口抗菌薬による治療にもかかわらず，容易は，小児急性中耳炎に対し，ニューキノロン系抗に症状が改善しない遷延例や，感染を繰り返す反菌薬として初めて保険適用が認められた薬剤であ復例といった，いわゆる難治例が多くみられるよる。その背景として，ペニシリン耐性肺炎球菌

うになっている 。

（PRSP）やβ-ラクタマーゼ非産生アンピシリン耐

2）

急性中耳炎の二大起炎菌の 1 つである nontypeable

性（BLNAR）インフルエンザ菌などの耐性菌がHaemophilus inﬂuenzae（以下，インフルエンザ菌） 1990 年以降に急増し，従来小児急性中耳炎の治療
は，宿主細胞内に侵入することにより小児急性中の中心であったβ- ラクタム系抗菌薬では効果不十

耳炎の反復性に ，バイオフィルムを形成すること分な症例が多く認められるようになったことがあ3）310（ 10 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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げられる。小児急性中耳炎児からの検出菌に対す間培養した。4 時間培養後，浮遊菌を培地交換にる検討では，トスフロキサシンは Streptococcus

よって除去し，200 μg/mL のゲンタマイシンを含む

pneumoniae（以下，肺炎球菌），インフルエンザ

1% FBS 含有 MEM を添加し，37°C, 5% CO2 下で菌，Moraxella catarrhalis（以下，モラクセラ）の

2 時間培養して，細胞外に存在するインフルエン

三大起炎菌に対し良好な抗菌力を有することが示

ザ菌を殺菌した。ゲンタマイシン含有培地除去後，された 5）。さらに，トスフロキサシンは，良好なトスフロキサシン（最終濃度 0.96 μg/mL）または細胞内移行性を示すことが報告されている 。

セフジトレン（最終濃度 1.425 μg/mL）を含む 1%

6）

そこで，本研究では，ヒト培養細胞内に侵入しFBS 含有 MEM を添加し，37°C, 5% CO2 下で 3 時たインフルエンザ菌の動態を視覚化するとともに， 間培養した。3 時間培養後，0.025% Triton X-100
ヒト培養細胞内に侵入したインフルエンザ菌に対により培養細胞の細胞膜を破壊し，LIVE/DEAD®

するトスフロキサシンの影響について in vitro に細胞生存率アッセイ法キット（ライフテクノロジーて検討した。

ズジャパンより購入）により，細胞内のインフル
エンザ菌の生死を判定した。今回用いた IH202 株

I. 材料と方法に対するトスフロキサシンおよびセフジトレンの

MIC は，それぞれ 0.00375 μg/mL, 0.0075 μg/mL で
1. 細胞内に侵入したインフルエンザ菌に対するトスフロキサシンの影響の視覚化あった。
トスフロキサシンおよびセフジトレンの濃度は，（1）材料

成人の上顎洞粘膜・鼻茸の組織内への推定移行濃

本研究では，インフルエンザ菌として当施設で度から設定した。成人ではトスフロキサシンは上継代培養中のβ-ラクタマーゼ非産生アンピシリン

顎洞粘膜・鼻茸に血清中濃度の 100〜127% 移行

感受性（BLNAS）である IH202 株を用い，感染細する 7）。これより，小児においても血清中濃度の胞にはヒト咽頭癌由来細胞である Detroit 562 細胞

100% が移行するものとして，小児の常用量 1 日（American Type Culture Collection より購入）を用

12 mg/kg/ 分 2 を投与した時の Cmax 0.96 μg/mL8）いた。抗菌薬はトシル酸トスフロキサシン（大正を作用させた。セフジトレンは，成人では上顎洞

富山医薬品（株）より提供）およびセフジトレンナ

粘膜，扁桃に約 50% 移行する 9）。そこで，小児のトリウム（ナミキ商事（株）より購入）を用いた。

常用量の最大投与量 1 回 6 mg/kg を投与した時の（2）方法

Cmax 2.85 μg/mL10）の 50% で あ る 1.425 μg/mL を

Detroit 562 細胞は，10% ウシ胎児血清（FBS） 作用させた。これらの濃度を小児における推定副を含む変法イーグル培地（MEM）で継代培養後， 鼻腔組織移行濃度とした。
直径 27 mm のガラスベースディッシュに播種し，また，別検体を用いて，トスフロキサシンまた

37°C, 5% CO2 下で 2〜4 日間培養した。IH202 株

はセフジトレン処理後，1% FBS 含有 MEM にては，Brain Heart Infusion 寒天培地（BHIA）にヘミ

両薬剤を除去した後，BHIA を Detroit 562 細胞上ンおよびβNAD を添加して培養した。インフルエに乗せて 37°C で培養し，細胞内から増殖してくンザ菌の蛍光標識には，AcidiFluor

るインフルエンザ菌を撮影した。

TM

ORANGE-NHS（五稜化薬（株））を用いた。

細胞およびインフルエンザ菌は，ECLIPSE Ti-E

培 養 し た Detroit 562 細 胞 に IH202 株 を 1×10

倒立顕微鏡（Nikon Corporation）を用いて位相差

個 /mL となるように加え，37°C, 5% CO2 下で 4 時像を観察し，EOS5D デジタルカメラ（Canon Inc.）

7

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311（ 11 ）で撮影した。AcidiFluorTM ORANGE-NHS およびを用いた。異常値は，Grubbs-Smirnov 棄却検定にLIVE/DEAD 細胞生存率アッセイ法キットを使用

よって検定した。有意水準は p＜0.05 とした。

®

し た 際 に は，LSM-700 Laser scanning confocal

microscope（LSCM）および付属のソフトウェア

II. 結果（Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany）を 用 い て撮影した。また，インフルエンザ菌のコロニーは

α7S デジタルカメラ（Sony, Japan）で撮影した。

1. 細胞内に侵入したインフルエンザ菌に対するトスフロキサシンの効果の検討
インフルエンザ菌および Detroit 562 細胞を 4 時

2. 細胞内に侵入したインフルエンザ菌に対するトスフロキサシンの殺菌作用の定量化（1）材料
材料は，上述の 1. 項に準じた。
（2）方法

間共培養後，Detroit 562 細胞内にインフルエン
ザ菌が認められた（図 1）。ここで，あらかじめ蛍光イメージングプローブである AcidiFluorTM

ORANGE-NHS にて標識したインフルエンザ菌を用いたところ，Detroit 562 細胞内で蛍光を発Detroit 562 細胞は，10% FBS を含む MEM で継す る イ ン フ ル エ ン ザ 菌 が 認 め ら れ た（図 2）。

代培養後，直径 35 mm のプラスチックディッシュ

AcidiFluorTM ORANGE は，エンドソームなどのに播種し，37°C, 5% CO2 下で 4 日間培養した後， 酸性環境下で蛍光を発するプローブであるため，

IH202 株を 1×107 個 /mL となるように加え，37°C,

イ ン フ ル エ ン ザ 菌 が Detroit 562 細 胞 の エ ン ド

5% CO2 下で 4 時間培養した。4 時間培養後，浮遊ソームに取り込まれていることが示唆された。

菌を培地交換によって除去し，200 μg/mL のゲン，
次に，トスフロキサシン（最終濃度 0.96 μg/mL）

タマイシンを含む 1% FBS 含有 MEM を添加し， セフジトレン（最終濃度 1.425 μg/mL）または，コ

37°C, 5% CO2 下で 2 時間培養して，細胞外に存在

ントロール（vehicle）をそれぞれ含有する MEMするインフルエンザ菌を殺菌した。ゲンタマイシ

にて 3 時間培養後の Detroit 562 細胞内のインフルン含有培地除去後，トスフロキサシン（最終濃エンザ菌を顕微鏡にて観察したが，各実験におけ

度 0.96 μg/mL）またはセフジトレン（最終濃度

るインフルエンザ菌の形態変化の差は明確ではな

1.425 μg/mL）を含む 1% FBS 含有 MEM を添加し， かった（図 3）。そこで，3 時間培養後の Detroit 562
37°C, 5% CO2 下で 3 時間培養した。3 時間培養後， 細胞に LIVE/DEAD® 染色を行った。LIVE/DEAD®
マグネシウム・カルシウム除去リン酸緩衝生理食

染色では，生菌は緑色蛍光を発し，死菌は黄色蛍塩水〔PBS（−）〕にて両薬剤を除去し，0.025%

光を発する。コントロールおよびセフジトレンでTriton X-100 により培養細胞の細胞膜を破壊したは，緑色蛍光を発するインフルエンザ菌が認めら

後，スクレーパーにて細胞内のインフルエンザ菌

れたが，トスフロキサシンでは，黄色蛍光を発すを採取した。採取したインフルエンザ菌は，BHIA

るインフルエンザ菌が認められ，細胞内のインフにて 37°C で 1 晩培養後にコロニー数を計数し，トルエンザ菌がトスフロキサシンにより殺菌された

スフロキサシンまたはセフジトレンに曝露後も細ものと考えられた（図 4）。

胞内に存在していた生菌数を推定比較した。イン

さらに，上述の検討と同じ処理をした別検体をフルエンザ菌のコロニーは EOS7D デジタルカメ用いて，抗菌薬除去後にインフルエンザ菌培養用

ラ（Canon Inc.）で撮影した。

培地 BHIA を細胞に添加したところ，コントロー

統計解析は一元配置分散分析と Bonferroni 検定

ルおよび，セフジトレン処理後（図 5）の Detroit312（ 12 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

図 1. インフルエンザ菌および Detroit 562 細胞の共培養後の顕微鏡像

69―5

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図 2. AcidiFluorTM ORANGE-NHS 標
識インフルエンザ菌の Detroit 562
細胞内への侵入

図 3. トスフロキサシン，セフジトレン処理後のインフルエンザ菌の形態変化

図 4. トスフロキサシン，セフジトレン処理後のインフルエンザ菌の LIVE/DEAD® 染色像

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313（ 13 ）図 5. BHIA 培地におけるセフジトレン処理後の Detroit 562 細胞からのインフルエンザ菌の増殖図 6. ト ス フ ロ キ サ シ ン，セ フ ジ ト レ ン 処 理 後 の Detroit 562 細 胞 か ら の イ ン フ ル エ ン ザ 菌
コロニー形成図 7. トスフロキサシン，セフジトレン処理後の Detroit 562 細胞から採取したインフルエンザ菌
コロニー形成能の定量的検討

562 細胞内からインフルエンザ菌の増殖が認めらろ，コントロールおよびセフジトレンでは，ほぼれ，その後コロニー形成が認められた。そこで， 同程度のコロニー形成が認められたが，トスフロ

BHIA 培地におけるコロニー形成を比較したとこ

キサシンではコロニー形成はほとんど認められな

314（ 14 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

図 8. トスフロキサシン，セフジトレン処理後
の生菌数

69―5

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III. 考察本研究では，ヒト培養細胞に侵入したインフル
エンザ菌の動態と，ヒト細胞侵入インフルエンザ菌に対するニューキノロン系抗菌薬であるトスフ
ロキサシンおよびセフェム系抗菌薬のセフジトレンの影響を検討した。検討の結果，①インフルエ
ンザ菌はヒト細胞内に侵入すること，②セフジト
レンはヒト細胞内のインフルエンザ菌に影響を与えないこと，③トスフロキサシンはヒト細胞内に侵入したインフルエンザ菌に対し殺菌的に作用することの 3 点が示唆された。
一般に，β-ラクタム系抗菌薬は細胞内移行性が低いことが知られており，我々の研究においても細胞内へ侵入したインフルエンザ菌に対しては抗かった（図 6）。

菌作用が低下する 11, 12）ことを報告している。
本研究において，トスフロキサシンとセフジト

2. 細胞内に侵入したインフルエンザ菌に対するレンは，インフルエンザ菌 IH202 株に対して，通トスフロキサシンの殺菌作用の定量化

常の液体培地における MIC は，それぞれ 0.00375,

細胞内に侵入したインフルエンザ菌に対する各

0.0075 μg/mL とほぼ同程度であるが，ヒト培養上薬剤の殺菌作用を定量化するため，各薬剤処理後

皮細胞内に侵入したインフルエンザ菌 IH202 株にの Detroit 562 細胞内から採取したインフルエン

対して，トスフロキサシンは殺菌的に作用したザ菌を BHIA にて培養し，コロニー形成を比較しが，セフジトレンはほとんど影響を与えなかった。各薬剤処理後のコロニー形成の状況を図 7 にた。以上のことから，トスフロキサシンは，細胞示した。各検体のコロニー数を計数し，異常値を内に移行して抗菌活性を発揮するのに対して，セGrubbs-Smirnov 棄却検定により棄却後に比較しフジトレンは細胞内移行性が低いために殺菌作用たところ，コントロール，トスフロキサシン処理， を示さなかった可能性が示唆された。
セフジトレン処理後に形成したコロニー数は，わが国の「小児急性中耳炎診療ガイドライン

そ れ ぞ れ， 673.0±244.9, 2.0±2.8, 425.0±87.32013 年 版」で は，過 去 6 ヵ 月 以 内 に 3 回 以 上，

（Mean±SD）であった。すなわち，セフジトレン

12 ヵ月以内に 4 回以上の急性中耳炎に罹患した状処理ではコントロールに比べ有意なコロニー数の態を反復性中耳炎，耳痛，発熱などの急性期症状減少が認められ（図 8, p＜0.05），トスフロキサシが顕在化していない状態で急性中耳炎にみられるン処理では，コントロールおよびセフジトレン処鼓膜所見を呈している状態が 3 週間以上持続して理に比べ有意にコロニー数の減少が認められたいる状態を遷延性中耳炎としている 13）。我々は，（図 8, p＜0.01）。

これに加え，免疫学的に未熟な 2 歳未満児の中耳炎も難治性と考えている。小児急性中耳炎の病態

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69―5315（ 15 ）を検討すると，2 歳未満児では 1 ヵ月以内に罹患

5% CO2 下で 4 時間共培養後，ECLIPSE Ti-E 倒立のある既往症例，反復例，遷延例が 2 歳以上児と顕微鏡を用いて位相差像を観察し，EOS5D デジ

比較して有意に高い。すなわち，難治例は 2 歳未

タルカメラで撮影。

2）

満児に多く認められる 。2 歳未満児の中耳炎の図 2. AcidiFluorTM ORANGE-NHS 標識インフル

起炎菌は，インフルエンザ菌が主であるが 2），イ

エンザ菌の Detroit 562 細胞内への侵入

ンフルエンザ菌はヒト気道上皮細胞内への侵入を

AcidiFluorTM ORANGE-NHS で標識したインフ

介して再燃を招いて反復化に 11），急速なバイオ

ルエンザ菌と Detroit 562 細胞を 37°C, 5% CO2 下で，それぞれ関与

4 時 間 培 養 後， LSM-700 Laser scanning confocal

フィルム形成を介して遷延化に

14）

microscope および付属のソフトウェアを用いて撮することが示唆されている。
トスフロキサシンが，ヒト培養咽頭上皮細胞内に侵入したインフルエンザ菌に対して抗菌力を示す機序としては，細胞内濃度が他のキノロン系抗影。
図 3. トスフロキサシン，セフジトレン処理後のインフルエンザ菌の形態変化

菌薬に比べて高いこと 6），およびトスフロキサシ

インフルエンザ菌と Detroit 562 細胞の共培養系

ンの細胞内への浸透経路が，細胞のポーリン経路に，トスフロキサシン（最終濃度 0.96 μg/mL）まではなくリン脂質二重層を介する可能性があるこ

たはセフジトレン（最終濃度 1.425 μg/mL）を添加。

し， 37°C, 5% CO2 下 で 3 時 間 培 養 後， ECLIPSEとが報告されている

15）

今回の検討では，in vitro においてセフェム系抗Ti-E 倒立顕微鏡を用いて位相差像を観察し，細胞菌薬であるセフジトレンは，ヒト細胞内に侵入し内のインフルエンザ菌（矢印）を EOS5D デジタルたインフルエンザ菌には影響を与えなかった。一カメラで撮影。

方，トスフロキサシンは，ヒト細胞内に侵入した

図 4. トスフロキサシン，セフジトレン処理後のインフルエンザ菌に対しても殺菌的に作用するこインフルエンザ菌の LIVE/DEAD® 染色像とが示唆された。また，トスフロキサシンは in

インフルエンザ菌と Detroit 562 細胞の共培養系

vitro において，バイオフィルムを形成した BLNASに，トスフロキサシン（最終濃度 0.96 μg/mL）またおよび BLNAR インフルエンザ菌に対し，高い抗はセフジトレン（最終濃度 1.425 μg/mL）を添加し，。さらに，臨37°C, 5% CO2 下で 3 時間培養後に，0.025%Triton X-

床においても，我々の検討では，トスフロキサシ

100 に よ っ て 培 養 細 胞 の 細 胞 膜 を 破 壊 し た 後，

ンは小児の反復性中耳炎に対し，83.3% の優れたLIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit を

治癒率を示すとともに，その再燃を 90% 以上抑制用いて，細胞内のインフルエンザ菌の LIVE/DEAD®

した 5）。

染色を行った。LIVE/DEAD® 染色による蛍光は菌力を示すことが報告されている

16）以上から，トスフロキサシンは，小児急性中耳LSM-700 Laser scanning confocal microscope お よ炎の反復化や遷延化などの難治化を抑制すること

び付属のソフトウェアを用いて撮影。

が期待できる薬剤であると考えられた。

図 5. BHIA 培地におけるセフジトレン処理後のDetroit 562 細胞からのインフルエンザ菌の〈補足／図の説明〉
図 1. インフルエンザ菌および Detroit 562 細胞の共培養後の顕微鏡像
イ ン フ ル エ ン ザ 菌 と Detroit 562 細 胞 を 37°C,

増殖
インフルエンザ菌と Detroit 562 細胞の共培養
系に，セフジトレン（最終濃度 1.425 μg/mL）を添加し，37°C, 5% CO2 下で 3 時間培養後に，MEM316（ 16 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS（1% FBS）で細胞を洗浄して薬剤を除去し，BHIA

69―5

Oct. 2016はセフジトレン処理後の細胞内生菌数を算出。

を Detroit 562 細胞上に乗せて 37°C, 10 時間培養後に，細胞内から増殖してくるインフルエンザ菌をECLIPSE Ti-E 倒立顕微鏡を用いて位相差像を観察し，EOS5D デジタルカメラで撮影。

謝辞
画像撮影に協力いただいた，（株）タイムラプス
ビジョンに感謝します。

図 6. トスフロキサシン，セフジトレン処理後のDetroit 562 細胞からのインフルエンザ菌コ
ロニー形成
インフルエンザ菌と Detroit 562 細胞の共培養

利益相反
本研究は，大正富山医薬品株式会社の支援を得
た。著者

山中

昇は大正富山医薬品株式会社か系に，トスフロキサシン（最終濃度 0.96 μg/mL） ら講演料を受けている。保富宗城は申告すべきも
またはセフジトレン（最終濃度 1.425 μg/mL）を添のはなし。

加し，37°C, 5% CO2 下で 3 時間培養後に，MEM（1% FBS）で細胞を洗浄して薬剤を除去し，BHIAを細胞上に乗せて 37°C, 18 時間培養し，増殖した
インフルエンザ菌のコロニーをα7S デジタルカメ
ラで撮影。
図 7. トスフロキサシン，セフジトレン処理後のDetroit 562 細胞から採取したインフルエン
ザ菌コロニー形成能の定量的検討
インフルエンザ菌と Detroit 562 細胞の共培養系に，トスフロキサシン（最終濃度 0.96 μg/mL）またはセフジトレン（最終濃度 1.425 μg/mL）を添加し，37°C, 5% CO2 下で 3 時間培養後に，0.025%Triton X100 で細胞膜を破壊して，スクレーパーで細胞内のインフルエンザ菌を採取。このインフルエンザ
菌を BHIA に播種し，37°C で一晩培養後に形成されたコロニーを EOS7D デジタルカメラで撮影。
図 8. トスフロキサシン，セフジトレン処理後の生菌数
インフルエンザ菌と Detroit 562 細胞の共培養系に，トスフロキサシン（最終濃度 0.96 μg/mL）またはセフジトレン（最終濃度 1.425 μg/mL）を添加し，37°C, 5% CO2 下で 3 時間培養後に，0.025%Triton X100 で細胞膜を破壊して，スクレーパーで細胞内のインフルエンザ菌を採取。このインフルエンザ
菌を BHIA に播種し，37°C で一晩培養後に形成されたコロニー数を計数し，トスフロキサシンまた文献
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THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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318（ 18 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―5

Oct. 2016

Bactericidal effect of tosuﬂoxacin on Haemophilus inﬂuenzae
internalized in cultured human cells
NOBORU YAMANAKA
Fujisawa Goshomi Hospital
MUNEKI HOTOMI
Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,
Wakayama Medical University
Nontypeable Haemophilus inﬂuenzae, one of the major causative bacteria for acute otitis
media（AOM）, is also considered to cause intractable otitis media including prolonged AOM andrecurrent AOM in children by the mechanism of internalization of the bacteria into epithelial cellsof middle ear mucosa. In this study, we visualized the dynamics of H. inﬂuenzae internalizationin cultured human cells. We also examined the effects of antimicrobials, including a novel
quinolone, tosuﬂoxacin, and a cephem antibacterial agent, cefditoren, on H. inﬂuenzae internalizedin cultured human cells.
The results indicated that（1）H. inﬂuenzae were internalized into human cells,（2）cefditoren
has no effect on internalized H. inﬂuenzae, and（3）tosuﬂoxacin has a bactericidal action on H.
inﬂuenzae invading human cells. These data strongly support high clinical efﬁcacy of tosuﬂoxacin
on intractable otitis media in children.