抗体部位特異的修飾法を用いた放射性医薬品の開発

伊東祐二

Ito Yuji（鹿児島大学大学院理工学研究科）

金山洋介

Kanayama Yosuke（理化学研究所ライフサイエンス技術基盤研究センター）

林良雄

Hayashi Yoshio

六車共平

Muguruma Kyohei（東京薬科大学薬学部）

by affinity peptide toward human immunoglobulin G）

1 はじめにの抗体医薬品開発における有用性について紹介する。

現在，がんや自己免疫疾患を中心に，国内でも既に 40 種類以上の抗体医薬品が，IgG フォーマットを中心に使用されている（国立医薬品食品衛生研究

2 抗体標識法所ホームページ）。抗体は，標的に対する高い分子抗体の化学修飾法として，一般的に用いられて標的能により，受容体やリガンド分子のアンタゴニいるのが，アミンカップリング法である（図 1A）。

スト（阻害剤）として作用するだけでなく，その 2 価性

こ れ は，Trastuzumab emtansine（Kadcyla） や，の分子構造の特性により，細胞上の受容体を架橋すIbritumomab tiuxetan（Zevalin）の調製にも使われてることで細胞へのシグナル伝達を行いアゴニストといる方法で，NHS（N-hydroxysuccimidyl）基で活性しても機能する。更に，Fc 領域を介した機能，例
えば，NK 細胞上の IgG 受容体（Fc γ RⅢα）との化されたカルボキシル基を持つリガンドを使って，結合による抗体依存的細胞傷害活性（ADCC）や，する方法である 4）。最も汎用される方法であるが，補体との結合による補体依存性細胞傷害活性（CDCC）導入するリガンド個数の制御が難しく，ランダムなによって，がん細胞等を細胞死に導き，死滅させる部位のアミノ基と反応するため，部位によっては，能力を持つ。これらの抗体の本来の機能に加え，近抗体の抗原結合機能を低下させることになる。一方，

年注目されているのが，化学修飾により機能性リガ抗体のヒンジ部位にあるポリペプチド鎖間のジスルンドを抗体に付加させた抗体医薬品である。すなわ

フィド結合（SS 結合）を部分的に還元することにち， 抗 体 に 抗 ガ ン 剤 を 付 加 し た 抗 体 薬 物 複 合 体

よって生じるスルフヒドリル基（SH）基に対して，（ADC），例えば，Trastuzumab emtansine（Kadcyla）

SH 基に反応性を有するマレイミド基を持つリガン

や Brentuximab vedotin（Adcetris），更に，キレート剤ドで修飾することも行われる（図 1B）5）。これは，を結合させた抗体に放射性同位体を標識した放射性Brentuximab vedotin の調製にも使われている方法で

3）

標識抗体，例えば，Ibritumomab tiuxetan（Zevalin）あるが，ペプチド鎖間の SS 結合は，抗体自身の安等である。本稿では，これらの抗体医薬品の作製に定性に寄与しており，SS 結合の切断の場合，L 鎖おいて用いられている化学的修飾（標識）法に関しと H 鎖間若しくは，H 鎖間の解離が懸念される。て，問題点を含め概説すると共に，筆者らが，最近更に近年では，遺伝子工学によるアミノ酸変異に開発した，抗体に対する親和性ペプチドを用いた新よって，新たな Cys の導入や，非天然型アミノ酸（例規の抗体標識法（CCAP-HIG：Chemical conjugation

えば，アジド化 Lys 等）の導入によって，前者では，

1）

2）

22

Isotope News2018 年 2 月号

No.755抗体の表面の Lys 残基のアミノ基をランダムに修飾

(A)
＋(A)

+アミノ基と活性化カルボン酸の反応

Lys248＋(B)＋還元チオールとマレイミドの反応

(B)
R1
(C)
(C)
(D)

pH 5.0〜8.0
5 min＋

R2

Lys248

R1 ル基
チオ
チオール基

R2
マレイミド基

R3 テル
チオエ
チオエーテル

アジド基

アルキン

トリアゾールLysの側鎖Glnの側鎖

(D)
(E)
(E)

R3図2CCAP-HIG 法による部位特異的抗体修飾の概要

MOI: Molecule of InterestO(Gln)N

イソペプチドH(Lys)

内ジスルフィド結合を含む）は，カラム担体に固定化することで抗体の精製に利用できるが，CCAP 法＋

図1

では，このペプチドに R8K の変異を導入すること
で，ヒト IgG-Fc の Lys248 の側鎖に共有結合（アミ種々の抗体の修飾法

星マークは，導入される機能性リガンドを示す。（C-E）の R1-R3 の結合位置については，最下段の図を参照されたい。

ド結合）を介して IgG-BP を付加することができる。
具体的な手法の概略を図 2 に示した。IgG-BP の Lys8のεアミノ基を 2 価性の架橋剤 DSG（disuccinimidyl

マ レイ ミド 基を 持つ リ ガ ンド を 修飾 に 用 いた りglutarate）で修飾し，活性エステル基を導入する。こ（図 1C），後者では，クリック反応を利用したアルの Succinimidyl glutararyl（SG）化ペプチド試薬を，キン（例えば Dibenzylcyclooctyne: DBCO）を持つリ抗体の 1〜5 倍のモル比で抗体溶液と pH5.5〜8.0 のガンドの導入を行うこと（図 1D）ができる 。また，条件下で混合することで，5 分以内にヒト IgG 抗体トランスグルタミナーゼを利用して，特定の位置に（正確には，ヒト IgG1, 2, 4 のサブタイプに反応する）導入された Gln に Lys の側鎖を有するリガンドを導を定量的に修飾することが可能である。この反応は入する試みも行われている（図 1E）。図 1C-E の極めて部位特異的に進行し，ほぼ 100％，Lys248 の方法は，導入する個数や位置を制御できるという利側鎖のみへのペプチドリガンドを導入できる。

6）

7）点が存在する一方で，抗体上の目的部位での遺伝子この技術を利用すれば，前もって IgG-BP に抗ガン工学によるアミノ酸置換が必要となり，天然の抗体剤等の機能性リガンドを連結し，得られた IgG-BP 試の利用は不可である。

薬を抗体と混合するだけで，部位特異的に抗ガン剤

3 抗体部位特異的修飾法―CCAP抗ガン剤だけでなく，抗生物質や蛍光剤等様々な機等の機能性分子を抗体へ導入することが可能となる。
能性分子を，過剰な修飾による抗体の機能低下を憂

筆者らは，天然の抗体を用いた部位特異的な修飾慮することもなく，定量的かつ迅速に抗体の特定部を 達 成 す る た め，CCAP（Chemical conjugation byへ選択的に導入することができる。現在では，このaffinity peptide）法を開発した 。本手法は，IgG 抗ような低分子だけではなく，分子量が大きな抗体フ体の Fc へ特異的に結合する IgG 結合ペプチド（IgG-ラグメントや酵素等の導入にも成功している。

8）BP）を用いて共有結合を形成させる修飾法である。
この IgG-BP は，元々，プロテイン A に代わる抗体の精製用リガンドとして開発したものである 9）。こ

4 CCAP 法を用いた抗体の放射性同位体標識の IgG-BP（配列：GPDCAYHRGELVWCTFH，分子筆者らは，CCAP 法による抗体の放射性標識におけIsotope News2018 年 2 月号

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介した IgG-BP は，ヒト IgG1, 2, 4 の Fc に結合するが，(A)
Lys248+64Cu*

担癌ヌード
マウスを⽤いたPETイ
メージング

げっ歯類の IgG の Fc には結合しないため，マウス
IgG に修飾には適用できなかったが，筆者らは，最近，別の IgG-BP を用い，げっ歯類の抗体の CCAP修飾技術を開発した。このような親和性ペプチドを介した修飾技術によって，抗体のみならず種々のタンパク質分子のアフィニティペプチドを用いた部位(B)
HER2‐ C6 cellHER2+ A431 cell

特異的な修飾法の確立によって，新たな医薬品・診断薬の創製を目指していきたい。
なお，本研究は，AMED の革新的バイオ医薬品

図 3 CCAP-HIG 法による金属キレート剤 DOTA の抗体修飾（A）と DOTA 修飾抗体（Trastuzumab）を用いた担ガンマウ
スモデルによる PET 画像創出基盤技術開発事業「ヒト IgG 特異的修飾技術による多様な機能性抗体医薬の創出」プロジェクトの成果の 1 つであり，この技術の放射性標識への応用に関しては，日本メジフィジックス（株）へ技術導る有用性を評価するため，図 3A に示したような，DOTA を連結した IgG-BP（R8K）を合成し，これ出していることを申し添えます。

を DSG で修飾した。この SG 化ペプチド試薬を抗引 用 文 献体（Trastuzumab：抗 HER2 抗体）とモル比 1：3 で，1）LoRusso, P. M., et al., Trastuzumab emtansine: A uniqueantibody-drug conjugate in development for humanepidermal growth factor receptor 2-positive cancer. Clin.
Cancer Res., 17, 6437–6447（2011）2）Francisco, J. A., et al., cAC10-vcMMAE, an anti-CD30monomethyl auristatin E conjugate with potent andselective antitumor activity. Blood, 102, 1458–1465（2003）
3）Schaefer, N. G., et al., Radioimmunotherapy in nonHodgkin lymphoma: opinions of nuclear medicine
physicians and radiation oncologists. J. Nucl. Med., 52,830–8（2011）4）Boutureira, O., et al., Advances in Chemical Protein
Modification. Chem. Rev., 115, 2174–2195（2015）5）Hashida, S., et al., More useful maleimide componds forthe conjugation of Fab to Horseradish peroxidase
through thiol groups in the hinge. J. Appl. Biochem., 6,56–63（1984）6）Axup, J. Y., et al., Synthesis of site-specific antibodydrug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A., 109, 16101–16106（2012）7）Jeger, S., et al., Site-Specific and Stoichiometric
Modification of Antibodies by Bacterial
Transglutaminase. Angew. Chemie-International Ed., 49,9995–9997（2010）8）伊東祐二（鹿児島大学）, 特願 2015-103153：IgG 結合ペプチドによる抗体の特異的修飾（2015）9）伊東祐二（鹿児島大学）, 特願 2013-530055：IgG 結合性ペプチド及びそれによる IgG の検出および精製方法（2013）

pH5.5 で，30 分間反応させた後，陽イオン交換クロマトグラフィーで精製した。抗体の Fc は，ホモ 2量体の構造のため，2 か所の IgG-BP 結合サイトを持つ。このため，ペプチド試薬は，1 抗体当たり，1 個（1 価）若しくは 2 個（2 価）の付加体を生成する。ここでは，1 価の DOTA-IgG-BP（R8K）付加抗体を，放射性同位体 64Cu* で標識し，HER2 陽性A431 細胞とコントロールとして HER2 陰性 C6 細胞を移植した担ガンマウスモデルを使って，PET イメージングを行った（図 3B）。2 日後の撮影像では，通常のアミンカップリングの方法で DOTA 標識した抗体に比較して，約 2 倍の標識抗体のがん組織への集積が見られたことから，本法の有用性が示された。CCAP 法では，修飾による抗原への親和性の低下がほとんど起きないことが，DOTA 抗体のがん組織への高い集積の理由として挙げられる。

5 終わりに化学修飾による抗体への新たな機能性リガンドの連結は，抗体に新たな機能を付加する上で，極めて有効な方法である。CCAP 法は，抗体の抗原結合能を損なうことなく，抗体に機能性分子を部位特異的に付加する上での有用な手段を提供した。今回，紹24

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