OS2-2-7
LIFE2012 2012 年 11 月 2 日－4 日 愛知 (名古屋大学)

微小ナノカーボン電極を用いた細胞分泌物のリアルタイム計測技術の開発
Development of a real-time measurement technique for neurotransmittersusing nano carbon micro electrodes.
○鈴木郁郎（東京工科大学）、福田真生（東京工科大学）、後藤正男（東京工科大学）
Ikuro SUZUKI, Mao FUKUDA, Masao GOTOH, Tokyo University of Technology
Abstract: In this study, a single-wall carbon nanotube (SWCNT), multi-wall carbon nanotube (MWCNT) type-HB andtype-HC electrodes were created to detect the neurotransmitters at nM concentration level via cyclic voltammetry (CV)and chronoamperometry (CA). As results, dopamine was detected at 1nM level using MWCNT type-HB electrodes andserotonin at 1nM level using MWCNT type-HC electrode in CV measurements. In CA results, dose-response relationships
from 10 nM to 100 nM were observed in dopamine and serotonin. Moreover, we developed a CNT micro electrodes arraychip using electroplating method and detected the neurotransmitters at 10nM concentration level. These results suggest thepotential of CNT electrodes for in vitro and in vivo real-time neurotransmitter measurement.
Key Words: neurotransmitter, carbon nanotube, electrochemistry, dopamine, serotonin, adrenaline
1. はじめに神経回路を作動させる神経伝達物質の計測技術は，極めて重要な意味を持つ。パーキンソン病や統合失調症など，神経伝達物質の放出異常で引き起こる神経疾患は多く存在
し，疾患メカニズムの解明や薬の開発が待たれている。神
経伝達物質を計測する手法は主にマイクロダイアリシス法が用いられているが、脳内にプローブを挿入し、バッファー回収後に HPLC 等で計測するため、（ⅰ）リアルタイム計
測が難しい、（ⅱ）長期計測が難しい、（ⅲ）複雑な工程を要するなどの問題点がある。そこで、本研究では、神経伝達物質を電極により電気的に検出する技術の開発を目指し、
上記問題点を解決することとした。
神経伝達物質を電気的に検出する手法として、電気化学測定がある。電気化学測定の感度は、電極素材によって異なるが、近年、カーボンナノチューブ（CNT）が電気化学活性種に対して優れた特性を示すことが報告されている (1-7)。
生理活性物質の１つである神経伝達物質においても，CNT
は電気化学的反応性を持つ。CNT 電極を用いた神経伝達物
質計測はドーパミンで始めて行われ (8)，セロトニン (9)，ノルエピネフリン (10)など各種神経伝達物質の計測が報告されてきた。また，計測感度の上昇と検出物質選択性を持たせるために，カーボンファイバー電極に CNT を修飾させた
電極や官能基を修飾させた電極が開発されている (11-17)。しかしながら、細胞から放出される濃度である nM レベルでの検出の報告はほとんど無く、計測装置として確立されていない。
本研究では、nM レベルの検出感度を持つ、カーボンナノ
チューブの種類と作製条件を明らかにし、脳スライスや培
養細胞において高空間分解能で神経伝達物質をリアルタイ
ム計測可能なカーボンナノチューブ微小多電極アレイの開発を行なった。多層カーボンナノチューブ（MWCNT:
Multi-wall carbon nanotube）を用いたペースト電極により 1nM ドーパミンおよびセロトニンの検出を検出できることがわかった。また、電気めっき条件を確立したことで、電極サイズ 50m の CNT 多電極アレイ基板の作製に成功し、nM レベルで神経伝達物質の検出を確認した。これらのことから、CNT 多電極アレイチップを用いれば、細胞から放出される神経伝達物質をリアルタイムに計測できる可能性が示唆された。

−1−

2. 方法
2-1 CNT ペースト電極を用いた神経伝達物質計測
2-1-1 ペーストカーボンナノチューブ電極の作製
カーボンナノチューブの種類による感度特性を調べるた
めに、単層 CNT（SWCNT：Single-wall carbon nanotube）
お よ び 2 種 類 の 多 層 CNT （ MWCNT: Multi-wall carbon
nanotube）中空型（type-HC）および竹筒型（type-HB）を材料としたペースト電極(BAS, 表面積：7.07 mm2)を作製し，ドーパミン，セロトニン，アドレナリンに対する検出感度を測定した。Type-HC は中空構造，type-HB は竹筒型構造を形成しており、共に約 8 層の多層構造を有している。電子誘導材としてグラファイトパウダー(Fisher)を使用し，CNT，
グラファイトパウダー，ミネラルオイルの重量比を 1:1:1
で秤量し，乳鉢に入れ，混練した。これをペースト型電極に充填し，ガラス板上で成型した。
2-1-2 電気化学計測(a)サイクリックボルタンメトリー計測作製した CNT 電極を用いて，サイクリックボルタンメトリー(CV: Cyclic Voltammetry)法による神経伝達物質計測を行った。測定対象はドーパミン(Sigma-Aldrich)，セロト
ニン(Wako)，アドレナリン(Wako)とし，溶媒として pH7.4
リン酸塩 pH 標準液(Wako)を使用した。各神経伝達物質を 0，0.001，0.01，0.1，1，10，100 M の濃度で調製し，参照
電極として塩化銀，対向電極には銀を用いた。電気化学ア
ナライザー(ALS1140A, BAS)を使用して計測した。測定条件
は初期電位：-0.2 V，高電位：0.8 V，低電位：-0.3 V，ス
キャン速度：0.05 V/s，サンプル間隔：0.001 V である。
解析ソフトウェアは Als-1140a を使用した。
(b)クロノアンペロメトリー(CA:Chronoamperometry)計測
CV による神経伝達物質計測の解析結果をふまえて，実際に細胞から放出される神経伝達物質をリアルタイム計測する手法であるクロノアンペロメトリー法による計測を行った。濃度相関を計測するために，測定中 0.001，0.01，0.05，
0.1，0.5，1 M の濃度になるように神経伝達物質を 100 秒
毎に順次添加し，スターラーを用いて各 3 秒間の撹拌を行った。神経伝達物質の濃度に依存して得られる電流値の解析は，神経伝達物質滴下＋10 秒後の値から PBS のみの電流値を差し引いた値を各濃度で検出された電流値として算出

であり，(C)は MWCNT type-HC 電極を用いてセロトニン
計測したボルタモグラムである。酸化ピーク電流の値は低濃度から順に，ドーパミン計測では 0.64, 0.97, 2.05, 5.76,
16.28 A となり，セロトニン計測は 0.014, 0.048, 0.25,
1.33, 6.27 A となった。図 2(C), (D)は測定結果から作成した検量線であり，r 値がそれぞれ 0.987 と 0.999 となったことから，10 nM から 100 M までの神経伝達物質とピー
ク電流値の間に強い相関があることがわかった。SWCNT
電極では，nM レベルの酸化ピーク電流は観察されなかった。

した。
2-2 CNT 微小多電極アレイの作製および神経伝達物質計測
2-2-1 CNT 微小多電極アレイの作製
50m 四 方 の ITO 微 小 多 電 極 ア レ イ 基 板 （ Alpha med
scientific）を用いた。多層カーボンナノチューブを超音波分散し、電圧印加により ITO 表面に電気めっきした。
2-2-2 CNT 電極表面の電子顕微鏡観察
電気めっきにより作製した電極表面の構造を評価するた
めに電子顕微鏡(JSM-7700F, JEOL)にて観察した。CNT 微小電極を試料台に固定し，Pt コーター(JFC-1600, JEOL)にて白金を蒸着させた。蒸着条件は真空度：3.00×10-5 Pa，電流値：10 mA，蒸着時間：35 秒×3 回とした。電子顕微鏡観
察は加速電圧 5 kV，エミッション 5 A の条件で行った。
2-2-3 CNT 微小電極を用いた神経伝達物質計測
ペースト電極と同様に、サイクリックボルタメトリー法で計測した。
3. 結果
3-1 神経伝達物質の電気化学測定
図 1 に各種 CNT 電極に対する 100 M 神経伝達物質 in
PBS と PBS のみのボルタモグラムを重ねて示す。(A), (D),(G)は SWCNT，(B), (E), (H)は MWCNT type-HB，(C), (F), (I)は MWCNT type-HC 電極であり，(A)-(C)はドーパミン，(D)-(F)はセロトニン，(G)-(I)はアドレナリンに対する測定結果である。作製した全ての CNT 電極において３種類の神経伝達物質の酸化ピーク電流の検出に成功した。電子移
動速度，酸化還元電位，反応生成物の違いから，ドーパミ
ン，セロトニン，アドレナリンのボルタモグラム形状は
CNT 電極の種類によらず固有の形状を示した。

Fig.2 Cyclic voltammograms of various concentrations of
dopamine using MWCNT type-HB electrode (A) and serotoninusing MWCNT type-HC electrode (B). The inset in (A) shows
the magnified response of oxidation peaks in 10 nM, 100 nM,
and 1 M dopamine. The inset in (B) shows the magnified
response in 10 nM, 100 nM, and 1M serotonin. Lower graphs
show the plot of oxidation peak height versus dopamine
concentration (C) and serotonin concentration (D) in
logarithmic scale.
図 3 は神経伝達物質 1 nM を測定したボルタモグラムである。(A)は MWCNT type-HB 電極を用いたドーパミン，(B)は MWCNT type-HC 電極を用いたセロトニンに対する測定結果を示している。ボルタモグラムが示すように，酸化ピーク電流が観察され，電流値はドーパミンが 1.23 A，セロトニンは 0.047 A であった。これらの結果から，1 nMという非常に低濃度の神経伝達物質を検出可能であることがわかった。

Fig.1 Comparative cyclic voltammograms of different
carbonnanotube

neurotransmitters.

electrodes
Solid

lines

and
show

different100

M

neurotransmitters in PBS (pH 7.4) and dot line noFig.3 Cyclic voltammogram of 1 nM neurotransmitter.
(A) CV of MWCNT type-HB in 1nM dopamine in PBS(pH 7.4). (B) CV of MWCNT type-HC in 1nM serotonin.

neurotransmitter in PBS. Vertical columns compare thetypes of CNT electrodes: SWCNT (panels A, D, and G),
MWCNT type-HB (panels B, E, and H), and MWCNT
type-HC (panels C, F, and I). Horizontal rows compare
different compounds: dopamine (panels A-C), serotonin(panels D-F), and adrenaline (panels G-I).
図 2 に同一電極によるドーパミンとセロトニンに対する神 経 伝 達 物 質 計 測 の 濃 度 相 関 を 示 す 。 (A) は MWCNT
type-HB 電極を用いてドーパミン計測したボルタモグラム

3-2 神経伝達物質のリアルタイム計測作製した CNT 電極を用いて CA 法による神経伝達物質の濃度相関を計測した結果を図 4 に示す。電圧は，酸化電位付近である 0.3 V に固定し，100 秒毎に順次神経伝達物質の濃度を上昇させて計測した。(A)は MWCNT type-HB 電極によるドーパミン，(B)は MWCNT type-HC 電極によるセロトニンの測定結果である。神経伝達物質投与による拡−2−

散の影響を排除するために，投与時に 3 秒間ゆっくりとス
ターラーにて攪拌し，解析は神経伝達物質滴下時＋10 秒後の電流値を検出した。図 4（A），（B）に挿入したグラフは，ドーパミンおよびセロトニン 10 nM 投与による拡大波形である。攪拌の影響により３秒間ノイズがあるが，投与後に電流値が上昇していることがわかる。また，(C)，(D)はそれぞれドーパミン，セロトニンの計測結果に対する検量線であるが，r 値が 0.993，0.991 となっており，10 nM から 100 M 投与において神経伝達物質と電流値には強い相関があることがわかった。同じ実験を 3 回繰り返したところ，ほぼ同様の結果となったことから再現性を有していることも確認された。

Current/nA電極であることがわかった。ITO のみの電極や従来の白金黒電極ではピーク電流は観察されなかった。図 7 は、ドー
パミン 100nM、10nM の計測結果である。100nM の検出は4 つの微小電極を同時に使用し、10nM の検出は 7 電極を同時に使用した。低濃度のピーク電流の検出には、電極面積に依存することがわかった。

(B)

(A)
1μM

100nM
10nM 50nM

1nM

1μM

500nM
1nM

(C)

100nM
10nM 50nM

0

500nM

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

Potential/V(D)
r=0.993

16
14
12
10
8
6
4
2
0
-2

Fig.6 Cyclic voltammogram of 1 mM dopamine using a
CNT electrode and a ITO bare electrode.

r=0.991(A)(B)

Fig.4 Amperometric responses of MWCNT electrodes
after subsequent addition of neurotransmitters in a PBS(pH 7.4). (A) Responses of the MWCNT type HB after
addition of dopamine. (B) MWCNT type-HC after
additionofserotonin.

Inset:

thecorresponding

calibration curves of 10 nM dopamine (A) and 10 nM
serotonin(B).

Signals

generatedforincreasing

concentrations of dopamine (C) and serotonin (D).

Fig.7 Cyclic voltammogram of 100 nM dopamine using
four CNT electrodes (A) and 10 nM dopamine using seven
CNT electrodes(B).
図 8 はセロトニン 10nM を 7 電極で計測した結果である。
7 電極を用いて PBS のみを計測した電流値に比べて、セロトニン 10nM 計測時に明らかな電流上昇が観察された。

3-3 CNT 微小多電極アレイ
ナノチューブの分散化条件と電気めっき条件を検討した
結果、めっきした電極表面の構造制御が神経伝達物質を高感度に計測するために必須であることがわかった。図 5 は、めっきした CNT 微小多電極アレイチップと表面構造の電子顕微鏡写真である。小さい粒子で構成され、粒子間に多くの空間が存在する構造が高い検出感度を示すことがわかった。
(A)
CNT64電極アレイ基板

(B)

(C)

Fig.8 Cyclic voltammogram of 10 nM serotonin using
seven CNT electrodes. Dot line shows only PBS.
100m

100nm

Fig.5 CNT multi-electrodes array. (A) Overview of 64ch CNTelectrodes. (B) Phase contrast image of single electrode. (C)SEM image of CNT electrode surface.
3-4 CNT 微小多電極アレイを用いた神経伝達物質計測
図 6 に 1mM ドーパミンを微小電極で測定したサイクリックボルタモグラムを示す。微小電極特有のピーク電流が検出され、また再現性もあったため、連続計測に耐えうる

4. 考察およびまとめ
MWCNT type-HC および type-HB 電極を用いて，1 nM〜
10 nM の濃度で神経伝達物質の電気化学的検出に成功した。
MWCNT に て 1nM レ ベ ル の 低 濃 度 検 出 に 成 功 し た が
SWCNT では 100 nM 以下の検出が難しかったため，CNTの種類に依存して感度特性が異なることが明らかとなったが，CNT の構造や純度に依存した感度特性は十分調べられていない。今後，神経伝達物質に対してより高感度を示す−3−

CNT の発見が期待される。また，ペースト電極の検出感度には電極の作製状態が大きく関与することもわかった。
100 nM 以下の検出では，MWCNT 電極においても，計測不可能な電極があり，特に 1 nM の検出においては，作製した電極の検出確率は 30 %程度であった。その原因は，人為的に CNT，グラファイト，ミネラルオイルを混練しているため，作製毎に表面構造にばらつきが生じるためだと考えられる。再現性がある電極を作製するためには，CNTの凝集状態を均一化する機械的な作製法を確立する必要がある。
カーボンナノチューブの電気めっき技術を検討したことにより、電気めっき法を用いた CNT 微小多電極アレイ基板の開発に始めて成功した。また、CNT 微小電極を用いて10nM の濃度におけるピーク電流の検出および電流の増大が観察された。これらの結果は、神経機能で重要となる神経伝達物質をリアルタイムで計測できる可能性を示唆しており、これまでにない新しい計測技術として多いに発展が期待できる。しかしながら、単一微小電極では nM レベルの検出が難しかったことから、今後は電極サイズを検討して行く必要がある。今後、ピーク電流が検出される酸化電位に固定して、脳スライスなどを用いて細胞から放出される神経伝達物質を計測する予定である。
謝辞
本研究の一部は，科学技術振興機構「研究成果最適展開支援プログラム」，および，科学研究費補助金「若手研究 B」，
および，日本私立学校振興・共済事業団「学術研究振興資金（若手研究者奨励金）」，および，カシオ科学振興財団「研究助成」によって行われた。

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