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特 集

感染症 ― 肺 炎 ―Topics 2
診断―診断法における新しい展開と方向性は？―

舘田一博

要旨：呼吸器感染症の原因病原体は一般細菌，抗酸菌，ウイルスに加え，真菌，マイコプラズマ，クラミドフィラまで多岐にわたることが特徴である．遺伝子診断法，免疫クロマト法など新しい診断技術が応用されているが，それでも原因がわからない呼吸器感染症が多数存在することを，改めて認識する必要がある．本稿では multiplex
PCR 法，LAMP 法などの遺伝子検査の呼吸器感染症への応用に加え，最近認可されたマイコプラズマ迅速診断法の特徴，さらに中・長期的な視点でみた呼吸器感染症診断法の開発の方向性について概説する．
キーワード：免疫クロマト法，Multiplex PCR 法，LAMP 法
Immunochromatography method, Multiplex PCR,Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）

連絡先：舘田 一博〒143‑0015 東京都大田区大森西 5‑21‑16
東邦大学医学部微生物・感染症学講座（E-mail: kazu@med.toho-u.ac.jp）

特集

感染症 ―肺炎―

673

は従来の報告に類似したものであるが，新しい検査法の呼吸器感染症原因病原体の多様性と診断の難しさ導入により肺炎球菌の重要性がさらに強調され，また通常の検査では診断されないウイルスの関与が改めて確認されている．また 30％近くの症例で混合感染を疑わせ肺炎の診療においては，日本呼吸器学会が市中肺炎，る成績が得られていることも重要である．

院内肺炎，さらに医療・介護関連肺炎診療ガイドラインを発刊している．肺炎の病原体診断に際しては，基礎疾患の有無，感染防御能の障害程度，入院期間，抗菌薬の理想の微生物・感染症検査法投与状況などの情報が重要となる．すなわち，感染防御能の障害が高度になればなるほど日和見病原体による感感染症診療において原因病原体の特定はきわめて重要

染症の頻度が高くなり，また先行する抗菌薬の投与が薬であるが，実際には原因病原体が判明する前に抗菌薬が剤耐性菌感染症の危険を増加させることになる．これら投与される（投与せざるをえない）ことがほとんどであ患者情報を参考にしながら，病態別にみた肺炎の原因菌る（empiric therapy）．このような現実のなかで，最初に関する疫学情報を考慮し適切な検査を選択・実施する．

は広域の抗菌薬でターゲットを外さない治療を開始し，市中肺炎では肺炎球菌が原因となることが最も多く，こ数日後の原因菌の特定と薬剤感受性の結果を待って狭域れに加えて若年者であればマイコプラズマが重要な原因の抗菌薬に変更する，いわゆる de-escalation therapy がとなる．そのほかに，一般細菌としてはインフルエンザ推奨されるに至っている．理想の微生物・感染症検査の菌や，黄色ブドウ球菌，非定型病原体として一つの形は，「抗菌薬処方の前に原因病原体と薬剤感受は，クラミドフィラ，そしてインフルエンザ性を推定することができる検査法」ということができる．

を代表とする多数のウイルスが肺炎の原因となる．院内

そのためには検体を採取してから 60 分（可能であれば肺炎では，上記市中感染症の原因に加えて，MRSA を30 分）以内に結果が判明する検査が必要であろう．また，代表とする薬剤耐性菌，，，合には，分離された菌が原因菌であるのか，汚染菌であ，るのかの鑑別が重要である．これら理想の微生物・感染などのブドウ糖非発酵菌の頻度が増加する．さらに症例によっては，，MRSA や多剤耐性緑膿菌などの耐性菌が原因となる場などのグラム陰性桿菌，緑膿菌，，症検査法の開発に向けてさまざまな検討が行われており，などの真菌を考慮すそのいくつかは臨床応用可能な状況にまで到達しつつある必要も出てくる．このように，肺炎の原因は多岐にわる．免疫クロマト法はその代表であり，インフルエンザたることが特徴であり，今日においても原因が特定できをはじめ，肺炎の診断としての尿中抗原検査（肺炎球菌，ない呼吸器感染症が多数存在していることを，改めて認識する必要がある．その理由としては，現在の微生物検），腸管感染症としての，ノロウイルス感染症の診断が可能となっている．また遺査の感度・特異度の問題があげられ，また未知の病原体伝子診断法としては，多くの病原体を一度に検索するが隠れている可能性も否定できない．

multiplex PCR 法，増幅感度を高めた loop-mediated iso-Johansson らは 184 例の市中肺炎症例を対象に，血液，thermal ampliﬁcation（LAMP）法，さらには検体採取

喀痰，鼻腔吸引液，尿などの検体を対象に，通常の培養から約 1 時間で結果が判明する遺伝子診断法などの開発

法に加えて血清抗体価，遺伝子診断，尿中抗原など今日も進んでいる．

利用できる検査法をすべて取り入れながら，一般細菌から非定型病原体・呼吸器原因ウイルスを含めその原因の頻度について報告している1）．その結果によると，全症例を対象とした場合の原因病原体の判明率は67％であっ

免疫クロマト法の呼吸器感染症への応用たが，全検体が採取されて検討された症例では診断率が89％であったことを報告している．予想されたように肺

1．免疫クロマト法の種類と注意点

炎球菌の頻度が 38％と最も高く，これに次いでウイル

これまでに，感染症診断に応用されている免疫クロマ

スが原因と考えられた症例が 29％であった．この結果

ト法の種類を表 1 に示した．その原理は，特異抗体（多674

表1

日呼吸誌

Topics 2

免疫クロマト法が診断に応用されている検体と病原体として 2 つの免疫クロマト法が利用可能となった．リボ

検テスト® マイコプラズマ（旭化成ファーマ）とプライム

呼吸器検体

体

病原体

チェック® マイコプラズマ抗原（アルフレッサファーマ）

A 群溶血性連鎖球菌
アデノウイルス
インフルエンザウイルス
RS ウイルス
肺炎球菌
マイコプラズマである．これまで肺炎球菌や用いられていたのに対し，この2つの診断キットではまったく新しい分子を標的としていることが特徴である．プ
ライムチェック® マイコプラズマ抗原では，マイコプラ

肺炎球菌
便

ズマがヒトの気道上皮細胞に付着する蛋白（P1 抗原）

ロタウイルス
ノロウイルス
アデノウイルスを検出する系として開発されており，咽頭ぬぐい液を対象とした検討で高い感度（91.7％）・特異度（92.7％）を示す成績が報告されている3）．P1 蛋白は気道において多量に発現している可能性があり，標的分子として重要な大腸菌 O157
泌尿器検体

感染症の尿中抗原診断においては病原体の多糖体抗原を検出する系が尿
糞2（6），2013候補となりうる．一方，リボテスト® マイコプラズマは，

淋菌クラミドフィラ

病原体のリボゾーム蛋白 L7/L12 を検出する診断法として開発された．リボゾーム蛋白 L7/L12 は菌体中に多量に存在する蛋白であり，これを特異性の高いモノクローくはモノクローナル抗体）による病原体抗原の認識と金ナル抗体の組合せで検出することにより診断する．リボ

5

コロイドなどの増幅系を組み合わせた検査法で，約 10ゾーム蛋白 L7/L12 はすべての病原体が保有する分子でCFU/ml の病原体抗原の存在を検出することができる．

あり，マイコプラズマ感染症以外の感染症への本系の応尿，咽頭ぬぐい，便などの検体を綿棒で採取したのちに用が期待されている．実際に，肺炎球菌感染モデルを用キットに挿入，約 15 分で出現する特異バンドの存在をいた検討で，リボゾーム蛋白 L7/L12 を標的とする検出肉眼で判定する検査法として開発されている．
「いつでも，系で感染とコロニゼーションを鑑別できること，また小どこでも，誰にでもできて，肉眼ですぐに判定できる」

児における偽陽性がみられにくい可能性が示されていという理想の検査法の一つとして普及している．

る4）．マイコプラズマ感染症における 2 つの免疫クロマ

特に，尿中抗原を用いた肺炎球菌やレジオネラ肺炎のト法の有用性を比較した成績は現在までのところ発表さ診断は，肺炎の病原体抗原を尿中から検出することから，れていない．今後，臨床症例のなかで，それぞれの検査感染症の確定診断に直結する検査法として汎用されてい法の特徴と有用性を評価していくことが必要である．

る2）．しかし，これら尿中抗原はいったん陽性となると長期間にわたって陽性が持続すること，肺炎球菌では小児で偽陽性例が多いことなどが指摘されていた．また，遺伝子診断法の進歩

血清群 1 感染では基本的に症だけしか診断することができないことから，次世代免1．Multiplex PCR 法を用いた病原体診断

疫クロマト法としてはこれらの点が改善されるべきポイ

呼吸器感染症の原因病原体の検索のために各種 multi-ントとなっている．特にレジオネラ肺炎では，すべてのplex PCR 法を用いた遺伝子検査法が報告されている．

属感染症（ .

のみならず .

その原理の詳細は省略するが，臨床検体が入った試験管など内で多数の病原体に対するPCR増幅反応をまとめて行い，40菌種以上がヒトに病原性を示すことが報告されている）

これを高感度にしかも高い特異性をもって検出する方法

， .

， .

， .

を診断できる検査法の開発が待たれる．図 1 に東邦大学である．Lieberman らは，183 例の成人市中肺炎症例を医学部微生物・感染症学講座で診断したレジオネラ肺炎

対象に 12 種類の呼吸器関連ウイルスの関与について症例の原因菌の頻度を示した．

multiplex PCR 法を用いて検討している5）．その結果，2．免疫クロマト法によるマイコプラズマ感染症診断30％以上の症例でウイルスの関与が示唆され，コロナウ

2013 年 8 月にマイコプラズマ感染症の新しい診断法

イルス（13％），RS ウイルス（7％）の頻度が高かった

特集

感染症 ―肺炎―675

図 1 レジオネラ肺炎の起炎菌分布：200 症例の解析．我が国で経験されるレジオネラ症の半数近くは .
血清群 1 である．それ以外の属細菌による感染症では尿中抗原検査が陰性となることに注意しなければならない．

ことを報告している．Templeton らは 105 例の成人市中肺炎症例を対象に2．鎖置換反応を用いた高感度遺伝子増幅系：LAMP 法，マイコプラズマ，インLAMP 法は栄研化学が発明した次世代遺伝子増幅系

フルエンザウイルス，コロナウイルス，ライノウイルスで，感染症領域を含め多領域での応用が期待される検査に対する multiplex PCR 法を実施し，従来法との比較を技術の一つである．本法では，標的遺伝子の 6 つの領域行っている6）．原因病原体が推定できたのは，従来法でに対して 4 種類のプライマーを設定し，鎖置換反応を利は約 50％，一方 multiplex PCR 法では約 76％の症例で用して一定温度で反応させることが特徴である．具体的原因と思われる病原体で陽性結果が得られた．特にウイには，サンプルとなる遺伝子，プライマー，鎖置換型ルスの関与に関して，従来法では約 14％，これに対しDNA 合成酵素，基質等を混合し，一定温度（65℃付近）て multiplex PCR 法では約 56％の症例で陽性結果が報で保温することによって反応が進み，検出までの工程を1 ステップで行うことができる．これまでの PCR 反応告されている．
すでにキット化され市販されている multiplex PCR 法の場合にはサーマルサイクラーを用いた反応温度のサイとしては，パピローマウイルス関連（子宮頸癌との関連クリングが必要であったが（例：93℃ 1 分―55℃ 30 秒が強いウイルス型判定），淋菌・クラミドフィラ同時検―70℃ 1 分を 30 サイクルなど），LAMP 法では 65℃の出系，結核菌およびその抗菌薬耐性などが代表例である．

恒温槽 1 つで反応を進めることも可能である．現在のと最近になって，Seegene 社が結核菌関連（リファンピシころ，体外診断用医薬品として感染症領域の LAMP 法，呼吸器ウイルス関ン・イソニアジド・キノロン耐性）診断キットとして製品化されているのは連（16 種類），呼吸器細菌関連（，マイコプイコプラズマ，結核，SARS コロナウイルス，インフルエ，マラズマ，クラミドフィラ，百日咳，パラ百日咳），性感ンザウイルス（A 型，2009 pdm，H5 亜系）による感染染症関連（7 菌種），パピローマ関連（28 種類）の診断症が対象であるが，その他多くの病原体・感染症への応を可能にする，新しい multiplex PCR キットを開発して用が可能である．本法の増幅効率はきわめて高く，目的いる．日本ではまだその有用性に関する情報は得られてとする DNA を 15 分〜1 時間で 109〜1010 倍に増幅し，そいない．今後，このような multiplex PCR 法をどのようの高い増幅性から増幅産物の有無を肉眼で確認することに臨床応用していくか，その有用性とコストとの関連もができるほどである．現在，結核とインフルエンザに関含めて議論していく必要がある．

しては目視判定が可能な LAMP 法検査が確立しており，今後さまざまな感染症診断への応用が期待されている．

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日呼吸誌

Topics 22（6），2013M

図2

呼吸器感染症の診断法における将来展望．

3．注目される次世代遺伝子診断法・機器：自動化・単純化・短時間化の方向性

における結核診断法として推奨したことは特記されるべき事実である7）．

これまでに感染症領域の次世代遺伝子検査の方向性を示す診断法・機器がいくつか開発されている．今日においても最も重要な耐性菌である MRSA のスクリーニン
グ法を例にとると，日本ベクトンディッキンソン社，ロ

将来展望：
新しい検査法開発の方向性

シュ・ダイアグノスティックス社，日本ビオメリュー社
がそれぞれ BD マックス，LightCycler，EasyQ を開発

これまでとは全く異なる新しい検査法として，呼吸器

mec 領域を増幅

感染症患者の呼気中から病原体が産生する揮発性物質をすることによりその存在を確認する検査法であり，検査検出する方法が考案されている．Syhre らは，結核菌が時間としては 2〜3 時間が必要である．BD マックスにニコチン酸を産生することに着目し，これを揮発性分子おいては，オンデマンド形式での検体の挿入が可能であに変換したのちガスクロマトグラフィーで検出する可能り，また検体を挿入したのちほぼ全自動で検査が進行す性について報告している8）．検討された症例数はたかだ

ること，さらに独自のプライマーを調整することによりか 10 例前後であるが，喀痰塗抹検査で陽性を示した患

オーダーメイドの遺伝子診断ができることが特徴である．

者において特異的陽性シグナルが得られている．Cham-

感度・特異度に関しては，いずれの検査法においてもbers らは，アスペルギルス症患者の呼気中から 2-pen-90％以上と報告されている．最近になって，米国 Cepheidtylfuran を検出することの，診断への応用の可能性を報社が Xpert SA Nasal Complete という製品を開発し注告している9）．細菌由来の揮発性物質をターゲットとす目されている．これは手のひらサイズのカセットに検体る診断法の臨床応用にはまだまだ多数のハードルが残さを挿入して機器にセットすれば，約 1 時間で MRSA のれているが，大変興味深い研究テーマである．

販売している．いずれも MRSA の存在を推定できるという検査法である．東邦大学医療セ

また，新しい機器の感染症診断分野への応用について

ンター大森病院および大橋病院において実施した検討でもいくつか新しい報告がみられる．その一つが質量分析

は，入院患者 156 例の鼻腔における MRSA の保菌に関装置の細菌同定への応用である（MALDI-TOF MS）．

して，感度・特異度ともに 100％に近い成績が得られて本法は分離された細菌を対象に迅速かつ正確に菌種を同いる．WHO が Cepheid 社の Xpert 検査を発展途上国定する方法として開発されているが，これを臨床検体か特集用する試みも報告されている10）．Barbosa らは，感染症が疑われた 420 例の呼吸器検体を対象に，蛍光染色法とフローサイトメトリーを比較して報告している．蛍光染色法で陽性となった症例はすべて，フローサイトメトリーでも陽性となっている．特にフローサイトメトリーを応用することにより，細胞質内に存在する病原体抗原，すなわち貪食されたと考えられる病原体抗原を，迅速かつ特異的に定量検出できる可能性がある．最近になって，オンチップバイオテクノロジー
ズ社が卓上のセルソーターと閉鎖式チップを用いたディスポーザル・フローサイトメトリーを考案しており，感染症分野への応用が期待される．検出された病原体が感染症の原因菌であるのか，あるいは単なる汚染菌であるのかの判定は，感染症分野における最も難しい問題の一つであるが，フローサイトメトリーを用いた細胞内病原体抗原の検出が感染症の病原診断におけるブレイクスルーにつながることを期待している．

おわりにこれからの感染症診断法がどのように展開していくのか，その方向性は必ずしも明確ではない（図 2）．しかし，免疫クロマト法で実現した尿中抗原・血中抗原の迅速検出系に関しては，今後もさらなる進歩がみられるものと予想される．また，無菌検体からの抗原・遺伝子の検出系，あるいは呼気を用いた揮発性物質の検出など迅速化・自動化が可能な検査法においてどのような展開がみられるのか，これからの 10 年に期待したい．

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引用文献

らの病原体の推定に直接応用しようとする研究も展開されている．またフローサイトメトリーを感染症分野へ応

感染症 ―肺炎―

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AbstractDiagnosis for respiratory infections: Current status and future directions
Kazuhiro Tateda
Department of Microbiology and Infectious Diseases, Toho University School of Medicine
A variety of organisms play a critical role in respiratory infections, which may include mycoplasma,,and fungus in addition to bacteria, virus and mycobacterium. Although novel techniques, such as molecular diagnosis andan immunochromatographic test（ICT）,were applied in the clinical setting, it may be important that there are many casesof respiratory infections with unknown etiology. In this chapter, the usefulness of molecular diagnoses, such as multiplex
PCR and the loop-mediated isothermal amplification（LAMP）method and newly developed ICT for mycoplasma infections, was introduced. Furthermore, future directions of development of novel technology and instruments for rapid andcorrect diagnoses of respiratory infections will be discussed.