22-05

取扱説明書(KOD-401)

Code No. KOD-401
Code No. KOD-401X5
Code No. KOD-401X10
保存温度 －２０℃
高正確・高効率・高速 PCR 酵素

ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－ Ｎｅｏ
KOD -Plus- Neo は、鹿児島県小宝島の硫気孔より単離された超好熱始原菌 Thermococcus kodakarensis KOD1 株由来の KOD DNA Polymerase1,2)をベースに開発された PCR 用酵素です｡KOD DNA Polymerase は､強い 3’→5’Exonuclease
活性（Proofreading 活性）を有するため､高い正確性を示し､特にクローニングを目的とした PCR に適しています｡また、本製品は、KOD DNA Polymerase に独自の伸長エンハンサーを添加することにより、従来の KOD -Plus-（Code No.
KOD-201）、KOD -Plus- Ver.２（Code No. KOD-211）の優れた正確性（Taq の約 80 倍）はそのままに、増幅量や伸長性を格段に向上させています。
さらに、伸長時間を従来の 1 min./ kb から 30 sec./ kb に短縮できるため、PCR に要する時間を大幅に短縮することができます。
本酵素には、Polymerase 活性と 3’→5’Exonuclease 活性を抑える 2 種類のモノクローナル抗体が混合されており､簡便に特異性の高い Hot start PCR を行うことができます。
特長● 微量なテンプレートから正確・高効率な増幅が可能
KOD -Plus- Neo には独自の伸長エンハンサー*が添加されており、微量なテンプレートからでも高正確・高効率に目的遺伝子を増幅することが可能になりました。本酵素は高い正確性（Taq の約 80 倍）を示し、低コピー数のテンプレートからも正確に目的遺伝子を増幅することができます。
*KOD DNA polymerase をはじめ高正確性 PCR 酵素は、20~30 サイクル以降、増幅が持続しなくなる<プラトー現象>が出やすいと言われています。伸長エンハンサーはこの<プラトー現象>を抑える働きを有し、反応をより長く持続させます。そのため、微量なテンプレートからの増幅や長いターゲットの増幅で特に大きな効果を発揮します。
● 様々なプライマーで同一温度サイクル条件を実現
検討不要のサイクル条件を実現しました。20mer 以上のプライマー（Tm 値*＞63℃）においては、まずは 2 ステップサイクルをお試しください。検討要らずで簡単です。

*プライマーの Tm 値の計算には、最近接塩基対法（Nearest Neighbor method）をお使いください。本取扱説明書記載のプライマーの Tm 値は、50 mM Na+濃度と0.5μM オリゴヌクレオチド濃度で計算した値を利用しております。
Ａ４２６０Ｋ＜製品の内容・技術に関するお問合せ＞
東洋紡（株）バイオプロダクト営業部 テクニカルライン
TEL 06-6348-3888 FAX 06-6348-3833
開設時間 9:00~12:00, 13:00~17:00 (土日祝日、休日を除く)
E-mail: tech_osaka@toyobo.jp[URL] https://lifescience.toyobo.co.jp/①

取扱説明書(KOD-401)● 増幅時間を短縮 （長いターゲットでより便利になりました）
伸長時間を、従来品の 1 min./ kb から 30 sec./ kb に短縮できます。伸長性が向上しているため、長いターゲットを迅速に増幅することができます。
● 幅広いターゲットの増幅
従来品より伸長性が向上し、様々な長さのターゲットを増幅できます。ヒトゲノム DNA をテンプレートとして 17.5
kb までの増幅を確認しています。また、反応液の Mg 濃度を 2 mM にすることで、ヒトゲノム DNA をテンプレート
として 24.0 kb までの増幅を確認しています。
１． 内容物
KOD-Plus- Neo は容量別に次の 3 種類をご用意しております｡
KOD-401(200 U×1 本)
KOD -Plus- Neo (1.0 U/μL)

KOD-401X5

KOD-401X10(KOD-401)×5(KOD-401)×10

200μL×1 本

10× PCR Buffer for KOD -Plus- Neo

1 mL×1 本

25 mM MgSO4

1 mL×1 本

2 mM dNTPs

1 mL×1 本

２． 安全上の注意
本製品は､研究用試薬です｡診断および臨床検査用試薬として使用しないでください｡また､本製品の使用にあたっては､実験室での一般の注意事項を厳守し､安全に留意してください｡関係する実験において､人体に有害な試薬を扱う場合も予想されます｡各試薬に添付されている注意書き､機器･器具に添付されている取扱説明書の指示を順守し､必要に応じて適切な保護具をご使用いただきますようお願いいたします｡
３． 性能･品質
KOD -Plus- Neo は､各ロットにおいて､ヒトゲノム DNA をテンプレートとしてβ-globin 遺伝子領域 17.5 kb の増幅ができることを確認して出荷しております。

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取扱説明書(KOD-401)
４． PCR プロトコール（１） プライマーの設計について
・ プライマーは可能な限り、22~35mer 程度（Tm 値*＞63℃）のものをご使用ください｡
・ GC 含量を 45~60%で設計してください。また、GC の偏りを確認してください。GC が 3’端領域に偏っているものでは、スメア、エキストラバンドが出やすくなります。
（5’側の半分は 60~70%, 3’側の半分は 40~50%の GC 含量で作製するのが理想です。
）
・ 3’末端を G か C で設計することでプライミング効率を高めることができます。ただし、前述したように 3’端
領域に GC が偏りすぎるとスメア、エキストラバンドが出やすくなるので注意してください。
・ 分子内二次構造や､プライマーダイマーの形成が起こらないように注意して設計してください｡
・ 長鎖ターゲットを増幅する場合は､25~35mer 程度で Tm 値が 65℃以上のプライマーをご使用ください｡
25mer 以上（Tm 値≧65℃）のプライマーを用いることで成功率が向上することがあります。
・ イノシンを含むプライマーの使用は避けてください。
*プライマーの Tm 値の計算には、最近接塩基対法（Nearest Neighbor method）をお使いください。本取扱説明書記載のプライマーの Tm 値は、50 mM Na+濃度と 0.5μM オリゴヌクレオチド濃度で計算した値を利用しております。
弊社では、最近接塩基対法（Nearest Neighbor method）に基づく Tm 計算プログラムを公開しています｡弊社のウェブページ (https://lifescience.toyobo.co.jp/user_data/pcr_tm.php) からダウンロードしてご利用になれます。
（２） PCR 反応液の調製
反応液を調製する前に各試薬を十分攪拌してご使用ください｡凍結している試薬は完全に融解してください｡
Components
Autoclaved, distilled water
10× PCR Buffer for KOD -Plus- Neo
2 mM dNTPs
25 mM MgSO4
プライマー (10μM each)

Volume(33 - X) μL
5 μL
5 μL
3 μL
0.75～1.5 μL

テンプレートX μL

KOD -Plus- Neo (1 U/μL)

1 μL

Total

50 μL

Final Concentration
1×
0.2 mM each
1.5 mM
0.15～0.3μM each
Genomic DNA ~200 ng/50μL
Plasmid DNA ~50 ng/50μL
cDNA ~200 ng/50μL
1 U/50μL

・ 全ての液を添加した後、反応液をボルテックス等で十分攪拌してサーマルサイクラーにセットしてください｡
・ PCR Bufferは終濃度1×でご使用ください。過剰に添加されますと、増幅が阻害されることがあります。
・ Mg濃度は、通常1.5 mM（終濃度）にてご使用ください。
・ プライマー濃度は、10 kb未満のターゲットにおいては、通常0.3μM（終濃度）にてご利用ください。10 kb
以上の長鎖を増幅する場合、0.15μM（終濃度）を推奨します（実施例2参照）。
・ 逆転写反応液をテンプレートとして用いる場合､逆転写反応液中の過剰のRNAがPCR反応を阻害することがあります｡PCR反応液50μLに添加する逆転写反応液量は､まず、RNA量として50 ng（Total RNA1μgを用いて20μLの容量で逆転写反応を行った場合､反応液1μL）程度でお試しください｡
・ テンプレートについて、詳細は、5.（1）をご参照ください。

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取扱説明書(KOD-401)（３） PCR サイクル条件 [重要事項]

KOD -Plus- Neo のサイクル条件は、2 ステップサイクルを基本サイクルとするため、条件の設定を簡便に行うことができます。Tm 値が低いプライマーにおいても、63℃より高い Tm 値を有するプライマーであれば、ほとんどの場合、68℃でアニーリングできるように設計されています。まずは、以下の 2 ステップサイクルにてお試しください。
A. 2 ステップサイクル
プライマーの Tm 値が 63℃より高い場合は、2 ステップサイクルをご使用ください。
2ステップ
Predenature :Denature :Extension :94℃, 2 min.
98℃, 10 sec.
68℃, 30 sec./ kb

25～45
cycles・ ターゲットのコピー数が少ないと予想される場合や長鎖ターゲットを増幅する場合では、30~45サイクルでお試しください。
・ 伸長（Extension）時間は､ターゲット鎖長1 kb あたり 30 sec.で設定してください。
・ ターゲットのコピー数が少ないと予想される場合や10 kbを超えるターゲットの場合、伸長時間を1 min./ kbに延長する、または、反応液のMg濃度を2 mMにすると増幅量が増加することがあります。
・ DNA変性（Denature）を94℃, 15 sec.で行うことによりターゲットの増幅量が増加することがあります。
GC richターゲットでは、98℃, 10 sec.の変性条件としてください。
・ DMSOを添加する場合は、3ステップサイクルで行うか、25~35mer程度でTm値が68℃以上のプライマーをご使用ください｡プライマーのTm値が68℃より低い場合、2ステップサイクルにおけるDMSOの添加量は2%以下としてください。

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取扱説明書(KOD-401)
B. その他のサイクル
プライマーの Tm 値が 63℃以下の場合や 2 ステップサイクルで増幅が見られない場合は､3 ステップサイクルを
お試しください｡また、増幅産物にエキストラバンドあるいはスメアが認められた場合は、ステップダウンサイ
クルをお試しください。
3ステップ
Predenature :Denature :Annealing :Extension :94℃, 2 min.
98℃, 10 sec.
(Tm)℃, 30 sec.
68℃, 30 sec./ kb

25～45
cycles・ アニーリング温度をプライマーのTm値に設定してください。
ステップダウン
Predenature : 94℃, 2 min.
Denature :98℃, 10 sec.
Extension :74℃, 30 sec./ kb
Denature :98℃, 10 sec.
Extension : 72℃, 30 sec./ kb
Denature :98℃, 10 sec.
Extension : 70℃, 30 sec./ kb
Denature :98℃, 10 sec.
Extension : 68℃, 30 sec./ kb
Extension : 68℃, 7 min.

5 cycles5 cycles5 cycles15 ～ 30
cycles3ステップサイクル、ステップダウンサイクルにおいても以下のことがいえます。
・ ターゲットのコピー数が少ないと予想される場合や10 kbを超えるターゲットの場合、伸長時間を1 min./ kbに延長する、または、反応液のMg濃度を2 mMにすると増幅量が増加することがあります。
・ DNA変性（Denature）を94℃, 15 sec.で行うことによりターゲットの増幅量が増加することがあります。
GC richターゲットでは、98℃, 10 sec.の変性条件としてください。

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取扱説明書(KOD-401)
５． PCR をうまく行うために（１） テンプレートについて
・テンプレート量は以下を参照してください（PCR反応液50μLの場合）。
一般的なテンプレート量
Genomic DNA
Plasmid DNA
cDNA
λDNA

真核細胞由来DNA
原核細胞由来DNA

5~200 ng
0.1~100 ng
10 pg~50 ng~200 ng (RNA相当量)
10 pg~10 ng

50 ng
10 ng
1 ng
50 ng (RNA相当量)
1 ng

・ テンプレートの長さや純度はPCR の結果に大きく影響します｡テンプレートの量に余裕のある場合は､事前に電気泳動して品質を確認することをお勧めします｡本酵素は RNA が多量に混入した場合、PCR 反応が阻害を受ける場合があります｡
・ 逆転写反応液をテンプレートとして用いる場合､逆転写反応液中の過剰のRNA がPCR 反応を阻害することがあります｡PCR 反応液 50μL に添加する逆転写反応液量は､まず、RNA 量として 50 ng（Total RNA1μg を用
いて 20μL の容量で逆転写反応を行った場合､反応液 1μL）程度でお試しください｡
・ ウラシルを含むテンプレートは使用できません。
（２） 添加剤について
・ プライマーが二次構造をとる場合や GC rich ターゲットを増幅する場合､DMSO を終濃度 2~5%になるように添加すると､増幅が改善される場合があります。ただし、DMSO はプライミング効率を下げることが知られています。DMSO を添加する場合は、プライミング効率を高めるため 3 ステップサイクルで行うか、25~35mer
程度で Tm 値が 68℃以上のプライマーをご使用ください｡プライマーの Tm 値が 68℃より低い場合、2 ステップサイクルにおける DMSO の添加量は 2%以下としてください。
（３） その他注意事項
・ 反応チューブはできるだけthin-wall タイプのものをご使用ください｡また､PCR 反応液は total 50μL にすることをお勧めします｡
・ 滅菌水､プライマーは事前に小分け分注を行って保存し､都度使い切りにすることをお勧めいたします｡
・ dNTPs は必ず本製品添付のもの､あるいは弊社別売の「dNTPs Mixture（2 mM）（Code No. NTP-201）」をご使用ください｡⑥＜製品の内容・技術に関するお問合せ＞
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６． PCR 産物のクローニングについて
・ 本製品で増幅した PCR 産物の末端形状は､blunt end（平滑末端）になっています。
従って、PCR 産物をクローニングする場合には､あらかじめリン酸化したプライマーを用いるか、PCR 産物の末端をリン酸化した後、blunt end を利用したクローニングを行ってください。
TA クローニングを行う場合には、弊社 KOD DNA Polymerase 用 TA クローニングキット「TArget CloneTM-Plus-（Code No. TAK-201）」を用いることにより、未精製 PCR 産物を用いて、簡便に TA クローニングを行うことができます。
また、TArget CloneTM -Plus-のパーツ別売品である「10× A-attachment Mix（Code No. TAK-301）」を用いる
ことで、PCR 産物の 3’末端に A を付加することができ、そのまま任意の T ベクターに PCR 産物をクローニ
ングすることができます。
その際のライゲーション試薬としては、
TA クローニングに優れる「Ligation high Ver.
２（Code No. LGK-201）」をお勧めします。
・ 本製品で増幅した PCR 産物を制限酵素にて処理し、その突出末端を利用してクローニングを行う場合には、制限酵素処理前に増幅産物の精製を行ってください。
DNA Polymerase が残存している場合、本酵素の持つ 3’→5’ Exonuclease 活性により制限酵素処理中に突出末端が削られる可能性があります。増幅産物の精製は、フェノール/クロロホルム処理を行った後、エタノール沈殿を行うか、弊社の磁性ビーズを利用した DNA 精製キット「MagExtractor TM -PCR & Gel Clean up-（CodeNo. NPK-601）」を利用すると便利です。

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取扱説明書(KOD-401)
７． 性能データ（１） 正確性
ヒトゲノム DNA をテンプレートにβ-globin 遺伝子の増幅を行い、PCR 産物を TArget CloneTM -Plus-（CodeNo. TAK-201）を用いて TA クローニングを行いました。その後、96 クローンをピックしてシーケンシングを行い、配列を確認しました。その結果、KOD -Plus- Neo は KOD -Plus-、KOD -Plus- Ver.２と同等の正確性を示しました。この正確性は Taq DNA Polymerase の約 80 倍優れている値であり、PCR 増幅でエラーが入る
ことはほとんどありません。

（２） 増幅効率・伸長性
KOD -Plus- Neo 及び従来の PCR 酵素を用いて、ヒトゲノム DNA をテンプレートに様々なサイズのβ-globin
遺伝子の増幅を行いました。反応はそれぞれの PCR 酵素の推奨条件に従って、30 サイクルにて実施しました。
その結果、KOD -Plus- Neo を用いた場合にのみ、
17.5 kb までの明瞭な増幅を確認することができました。
また、17.5 kb 以下の増幅においても他社 PCR 酵素を大幅に上回る収量が得られました。

（３） 微量テンプレートからの増幅効率
HeLa 細胞由来 Total RNA より逆転写した cDNA（Total RNA 0.5 ng 相当）をテンプレートとして、4 種類の遺伝子を増幅し、増幅効率を比較しました。反応はそれぞれの PCR 酵素の推奨条件に従って、40 サイクルにて実施しました。その結果、KOD –Plus- Neo のみ 4 種類の遺伝子すべてについて十分量の増幅を認めることができました。

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取扱説明書(KOD-401)（４） 伸長速度
ヒトゲノム DNA（50 ng）をテンプレートに様々な伸長時間でβ-globin 遺伝子（3.6 kb）の増幅を行いました。
その結果、従来品では増幅しない短い伸長時間でも明瞭な増幅を確認できました。このように、KOD -PlusNeo では伸長時間を 30 sec./ kb に設定することが可能です。

８． 実施例【実施例 1】Total RNA からの様々な遺伝子の全長 ORF の増幅
HeLa 細胞由来 Total RNA より逆転写した cDNA（Total RNA 50 ng 相当）をテンプレートとして、様々なプロテイン
キナーゼの ORF（open reading frame）の全長を増幅しました。反応はそれぞれの PCR 酵素の推奨条件に従って、30サイクルにて実施しました。その結果、KOD -Plus- Neo で増幅した場合にのみ、すべての遺伝子で明瞭な増幅産物を得ることができました。

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取扱説明書(KOD-401)【実施例 2】長鎖ターゲットの増幅例
ヒトゲノム DNA
（200 ng）
をテンプレートに様々なプライマー濃度でβ-globin 遺伝子（17.5 kb）、
tPA
（Human tissue-type
plasminogen activator）遺伝子（24.0 kb）の増幅を行いました。その結果、長鎖ターゲットの増幅では、プライマー濃度を下げることで増幅量が増すことが示されました。

このように 10 kb 以上の長鎖ターゲットを増幅する場合は、プライマー濃度を 0.15μM（終濃度）でご利用ください。
増幅量が向上する場合があります。

※弊社ウエブサイトの製品ページに本製品の実施例を掲載しております。ご確認ください。
https://lifescience.toyobo.co.jp/detail/detail.php?product_detail_id=167

９． 参考文献(1) Takagi, M., Nishioka, M., Kakihara, H., Kitabayashi, M., Inoue, H., Kawakami, B., Oka, M., and Imanaka, T., Appl.
Environ. Microbiol., 63, 4504-4510 (1997)(2) Hashimoto, H., Matsumoto, T., Nishioka, M., Yuasa, T., Takeuchi, S., Inoue, T., Fujiwara, S., Takagi, M., Imanaka, T.,
and Kai, Y., J. Biochem. (Tokyo), 125, 983-986 (1999)(3) Mizuguchi, H., Nakatsuji, M., Fujiwara, S., Takagi, M., and Imanaka, T., J. Biochem. (Tokyo), 126, 762-768 (1999)(4) Nishioka, M., Mizuguchi, H., Fujiwara S., Komatsubara, S., Kitabayashi, M., Uemura, H., Takagi, M., and Imanaka,T., J. Biotechnol. 88, 141-149 (2001).
(5) Hashimoto, H., Nishioka, M., Fujiwara, S., Takagi, M., Imanaka, T., Inoue, T., and Kai. Y., J. Mol. Biol., 306, 469-77(2001).
(6) Imanaka, T., and Takagi, M., J. Chin. Inst. Chem. Engrs., 32, 277-288 (2001).

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取扱説明書(KOD-401)
１０． トラブルシューティング
問題

対策

具体例･目安伸長時間を 1 min./ kb に延長する。
サイクル数を 2~5 サイクル増やす。

サイクル条件を変更する。

3 ステップサイクルで行う。
3 ステップサイクルでアニーリング温度を
Tm-5~Tm-10℃に下げる。
ステップダウンサイクルで行う(特に 10 kb 以
上の長鎖ターゲットで有効な場合がある）。

MgSO4 濃度を変更する。

増幅産物が見られない。
増幅産物が少ない。

標準 1.5 mM を 2.0 mM に上げる（特に 10 kb
以上の長鎖ターゲットで有効な場合がある）。
GC rich ターゲットでは、標準 1.5 mM を 1.0
mM に下げる。

テンプレートの量を増やす。
使用しているテンプレートの量、
テンプレートを精製し直す。
品質を確認する（特に、テンプレ
RNA による阻害をなくすため、cDNA サンプ
ートに RNA 等がコンタミしてな
ル量を減らす。
いか確認する）。
RNA を分解もしくは除去する。
使用しているプライマーの量、品質を確認する。

プライマー濃度を低くする（特に 10 kb 以上の長鎖ターゲットで有効な場合がある）。
プライマーを再調製、再合成する。
プライマーを設計し直す。

使用酵素量を増やす。

標準 1 U を 1.5~2.0 U に増やす。

添加剤を加える。

DMSO を終濃度 2~5%になるように添加する。[添加にあたっては、5.（2）添加剤について、をお読みください]
3 ステップサイクルで行っている場合、2 ステップサイクルに変更する。

サイクル条件を変更する。

2 ステップサイクルで行っている場合、ステッ
プダウンのサイクルで行う。
サイクル数を 2~5 サイクル程度減らす。

スメア、エキストラバンドが見られる。

MgSO4 濃度を下げる。

標準 1.5 mM を 1.0 mM に下げる。

使用しているテンプレートの量を確認する。

テンプレートの量を減らす。
プライマーを再調製、再合成する。

TA クローニングできない。

使用しているプライマーの品質を確認する。

プライマーを設計し直す（長めのプライマーを設計するとスメア、エキストラバンドが解消する場合がある）。

使用酵素量を減らす。

標準 1 U を 0.5~0.8 U に下げる。

専用のキットを用いる。

専用 TA クローニングキット「TArget CloneTM-Plus-（Code No. TAK-201）」を用いる。
<KOD -Plus- Neo の増幅産物の末端は平滑化されています。>＜製品の内容・技術に関するお問合せ＞
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取扱説明書(KOD-401)

１１． 関連商品品 名<高正確性 PCR 酵素>

KOD -Plus<高正確性 PCR 酵素（正確性をそのままに PCR 成功率 UP）>

KOD -Plus- Ver.2<高成功率 PCR 酵素>

KOD FX<高成功率 PCR 酵素（KOD FX の改良品）>

KOD FX Neo<KOD DNA Polymerase 用高効率 TA クローニングキット>

TArget CloneTM -Plus<TA クローニング用 A 付加試薬（KOD 用）>

10× A-attachment Mix<高効率ライゲーションキット>

Ligation high Ver.2<磁性ビーズを利用した DNA fragment 精製キット>

MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up-

包装

Code.No.

200 U×1 本(200 U×1 本)×5(200 U×1 本)×10

KOD-201
KOD-201X5
KOD-201X10

200 U×1 本(200 U×1 本)×5

KOD-211
KOD-211X5

200 U×1 本(200 U×1 本)×5(200 U×1 本)×10

KFX-101
KFX-101X5
KFX-101X10

200 U×1 本(200 U×1 本)×5(200 U×1 本)×10

KFX-201
KFX-201X5
KFX-201X10

10 回用

TAK-201

25μL×1 本(25 回用)TAK-301

750μL×1 本(100 回用)

LGK-201

200 回用NPK-601【製造・販売元】－価格・在庫に関するお問合わせ－

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大阪梅田ツインタワーズ・サウス
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