私立大学戦略的研究基盤形成支援事業（平成 23 年～27 年）
Program supporting strategic research base formation for
private university from the MEXT of Japan (2011－2015)

病態分子イメージングによる体系的病態の解明と診断治療法の開発

Systematic elucidation of pathogenesis anddevelopment of diagnosis and treatment
by molecular imaging

研究成果最終報告書
MICD Research Report 2011 – 2015

関西医科大学
Kansai Medical University
平成 28 年 5 月
May 2016

Fig.1
A

B

C

D

図 1. 多色細胞系譜追跡法による舌毛状乳頭の幹細胞の同定 (Nat. Cell Biol. 15:511-518, 2013)

Fig.2
A

B

C

図 2. 多色細胞系譜追跡法を用いるオルガノイド形成過程の観察と移植されたマウス舌でのオルガノイドの拡大(Sci. Rep. 3:3224, 2013)

Fig.3

B

A

C

D

図 3. ショウジョウバエの卵形成に関わる転写因子 ovo の相同遺伝子 Ovol2 のマウス皮膚幹細胞での発現と表皮形成における役割 (Div. Cell 29:47-58, 2014)

Fig.4
A

C

B

図 4. 転写因子 Ovol2 タンパクの精母細胞パキテン期の XY 体での発現 (J. Androl. 33:277-286, 2012)

Fig.5
A

B

C

図 5. 質量顕微鏡を用いた精巣でのテストステロンのイメージング (Anal. Bioanal. Chem. in press, 2016)

Fig.6A

B

C

図 6. 二光子励起顕微鏡を用いた Mst1 による胸腺細胞のトラフィッキングと抗原認識の解析(Nat. Commun. 3:1098, 2012)

Fig.7
A

C

B

D

図 7. 二光子励起顕微鏡を用いた炎症に伴う脊髄後角ニューロンの形態変化の in vivo イメージング(Eur. J. Neurosci. 41:989-997, 2015)

Fig.8
A

B

f

図 8. 質量顕微鏡を用いた脳でのアセチルコリン (ACh) の分子イメージング(Anal. Bioanal. Chem. 403:1851-1861, 2012)

Fig.9AB

図 9. 扁桃体の Htr2a を発現する細胞による先天的と後天的恐怖の制御 (Cell 163:1153-1164, 2015)

B

Fig.10A

図 10. latent TGF-β binding protein 4 (LTBP4) による微小線維形成機構の解析(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:2852-2857, 2013)

Fig.11

AB

図 11. LTBP2 欠損による毛様小帯の線維形成不全と水晶体脱臼 (Hum. Mol. Genet. 23:5672-5682, 2014)

Fig.12
A

D

E

F

G
B

C

+

図 12. 蛍光タンパク発現マウスを用いた末梢神経切断－再生モデルの確立と Na チャネル NaX の役割(Eur. J. Neurosci. 39: 720-729, 2014)

図１ 多色細胞系譜追跡法による舌毛状乳頭幹細胞の同定 (Nat. Cell Biol. 15:511-518,
2013)
図２ 多色細胞系譜追跡法を用いるオルガノイド形成過程の観察と移植されたマウス舌での移植オルガノイドの拡大 (Sci. Rep. 3:3224, 2013)
図３ ショウジョウバエの卵形成に関わる転写因子ovoの相同遺伝子Ovol2のマウス皮膚幹細胞での発現と表皮形成における役割 (Dev. Cell 29:47-58, 2014)
図４ 転写因子Ovol2タンパクの精母細胞パキテン期のXY体での発現 (J. Androl. 33:
277-286, 2012)
図５ 質量顕微鏡を用いた精巣でのテストステロンのイメージング (Anal. Bioanal. Chem.
in press, 2016)
図６ 二光子励起顕微鏡を用いたMst1による胸腺細胞のトラフィッキングと抗原認識の解析 (Nat. Commun. 3:1098, 2012)
図７ 二光子励起顕微鏡を用いた炎症に伴う脊髄後角ニューロンの形態変化の in vivo イメージング (Eur. J. Neurosci. 41:989-997, 2015)
図８ 質量顕微鏡を用いた脳でのアセチルコリン (ACh) の分子イメージング (Anal.
Bioanal. Chem. 403:1851-1861, 2012)
図 ９ 扁 桃 体 の Htr2a を 発 現 す る 細 胞 に よ る 先 天 的 と 後 天 的 恐 怖 の 制 御 (Cell 163:1153-1164, 2015)
図10 latent TGF-β binding protein 4(LTBP4)による微小線維形成機構の解析 (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 110:2852-2857, 2013)
図11 LTBP2欠損による毛様小帯の線維形成不全と水晶体脱臼 (Hum. Mol. Genet. 23:
5672-5682, 2014)
図12 蛍光タンパク発現マウスを用いた末梢神経切断―再生モデルの確立とNa+チャネル
NaXの役割 (Eur. J. Neurosci. 39:720-729, 2014)
Figure 1. Identification of stem cells in lingual epithelium by multicolor lineage tracing
method.
(A) Time course of lingual epithelial progenitor cells in the interpapillary pit (IPP) labeled withmultiple colors using rainbow mice. Rosa26CreERT2/rbw mice were treated with tamoxifen andanalyzed at the indicated time points. The IPP gained monoclonality at day 28. (B) Immunostainingof the tongue epithelium with Keratin 5 and Ki67 antibodies and in situ hybridization, with a Bmi1probe. Schematic presentation of filliform papillae and magnified image of the IPP. (C) Fate ofcells derived from Bmi1-positive stem cells.

Bmi1CreER/+/Rosa26rbw/+ mice were injected withtamoxifen and analyzed at the indicated time points. (D) Cover of Nature Cell Biology 15 (5).
Bmi1-expressing cells ensure the maintenance and regeneration of keratinized cells in the murine
lingual epithelium.
Figure 2. Establishment of organoid culture system: generation of organoids having mature
keratinized epithelium from adult epithelial stem cells.
(A) Observation of organoid-forming process using color-labeled cells. Lingual epithelial cells of
Rosa-rainbow mice were cultured in the organoid culture system. Over time, the mosaic pattersdisappeared and most parts of the organoids were gradually occupied with blue color. (B) Expansionof engrafted organoids in the tongue of recipient mice at 1 week after engrafting. Striatum corneum
is indicated by arrows.
Figure 3. Expression of Ovol2/MOVO, a mouse homologue of Drosophila ovo in skinprogenitor cells and its role in epidermal differentiation.
(A) Expression of Ovol2 in epidermal progenitor cells. (B, C) In the skin of Ovol2 and Ovol1
double-knockout (DKO) mice, the basal and spinous layers displayed abnormal morphology and the
granules and cornified layers were immature due to blocked terminal differentiation. (D) Lack offunctional permeability barrier in the skin of DKO mice, as illustrated by dye penetration.
Figure 4. Restricted expression of Ovol2/MOVO in XY body of mouse spermatocytes at thepachytene stage.
(A) Schematic presentation of spermatogenesis. (B) Expression of Ovol2 in the XY body. (Upper
panel) Immunostaining of mouse testis with anti-Ovol2 and anti-γH2AX antisera. (Lower panel)
Ovol2 expression in seminiferous tubules at the different stages of spermatogenesis. (C) Ovol2
expression of spermatocytes at pachytene stage. Squash and spread spermatocytes were
immunostained with anti-Ovol2, anti-γH2AX, and anti-SYCP3 antibodies.
Figure 5. Visualization of testosterone distribution in the testis by imaging mass
spectrometry.
(A) Overview of on-tissue derivatization of testosterone with Gerald’s T reagent and MS spectrum at
m/z 402.3 and MS/MS/MS spectrum at m/z 343.15. (B) Distribution of derivatized testosterone anddetected product ion spectra in mouse testis treated with hCG (a), but not in naïve one (b). (C) Highspatial resolution images of derivatized testosterone in hCG-treated mouse testis. Arrowheads
indicate accumulated testosterone in Leydig cells.
Figure 6. Analysis of thymocyte trafficking and antigen recognition by Mst1 in the thymus by
two-photon microscope.
(A) The experimental design for analysis of thymocyte migration in sliced thymic tissues using
two-photon microscope. (B) Mst1+/+ or Mst1-/--labeled double positive and single positive cells
cultured on the thymic slice for several hours were observed within the thymic slice by a two-photon
microscope. (C) Antigen-specific thymocyte cluster formation in the thymic medulla of RIP-mOVA
mice.
Figure 7. In vivo two-photon imaging of structural dynamics in the spinal dorsal horn in an
inflammatory pain model.
(A) Schematic diagram of in vivo mouse preparation. (B) Two-photon images of an
EGFP-expressing spinal neurons before and 240 min after induction of inflammation by CFA andhigh-magnification images of the dendrite in the region shown by the dotted rectangle in the left
panel. (C) Increase in number of synapse in spinal dorsal horn after inflammation mediated byglutamate receptor activation.
Figure 8. Visualization of acetylcholine distribution in the brain by imaging mass
spectrometry.
(A) MS/MS spectra of m/z146 obtained from the ACh standard (left) and on brain tissue (right).
(B) a-c. Reconstructed ion intensity maps for the ion transition from m/z146 > 87 (a), in situ
hybridization with ACh esterase (b), and scheme of the mouse brain map from the Atlas (c). d-f.
Expanded ACh distribution image of the hippocampus (d), an optical image of the same brain
section stained with H & E (e) and scheme of corresponding scheme of the hippocampus (f).
Figure 9. Htr2a-expressing cells in the central amygdala control the hierarchy between
innate and learned fear.
(A) Graphical abstract. A population of serotonin 2A receptor (Htr2a)-expressing cells in the central
amygdala act as a hierarchy generator by prioritizing innate over learned fear. (B) A design of theexperiment. Immediate early gene expression in the dorsal and ventral PAG was analyzed after
Htr2a-expressing cell inactivation under innate- and learned-fear conditions.

Figure 10. Analysis of microfibril formation by latent TGF-β binding protein 4 (LTBP4).
(A) A proposed model for the role of LTBP4-fibulin-5 interaction in elastic fiber assembly. (B)Recombinant LTBP-4S protein (rLTBP-4S) promotes elastic ﬁber assembly without changing the
conﬁguration of microﬁbrils.
Figure 11. Lens dislocation (A) and no bundle structures of microfibrils in ciliary zonules (B)in LTBP2 knockout mice.
Figure 12. Establishment of peripheral nerve transection-regeneration model forregenerative therapy and the role of Nax, a sodium concentration-sensitive sodium channelin nerve regeneration.
(A) In vivo monitoring system of nerve transection-regeneration in thy1-YFP transgenic mice.
Regenerated sciatic nerve reinnervated to the foot can be monitored in vivo in alive mice over
several months. (B) Expression of Nax in non-myelinating Schwann cells of sciatic nerve. (C) Delayin nerve regeneration of Nax knockout mice was rescued by lactate, demonstrating the lactate shuttle
between regenerated axons and Schwann cells. (D) Graphic abstract. Nax is expressed in
non-myelinating Schwann cells of adult peripheral nervous system and involved in peripheral nerve
regeneration via the lactate shuttle, an energy supply system as observed in the brain between
neurons and glia.

目次 Contents
はじめに Preface

1Ⅰ．病態分子イメージングセンターの事業概要

3

Outline of Molecular Imaging Center of Diseases (MICD)

7

Ⅱ．病態分子イメージングセンターの研究成果

12

Research activities in Molecular Imaging Center of Diseases

21

Ⅲ．研究基盤形成と若手研究者の人材育成

32

Foundation of research base and cultivation of young researchers

34

Ⅳ．原著論文リスト List of original articles

37

Ⅴ．セミナー・シンポジウム・できごと

55

Seminars, symposia, and events

63

Ⅵ．病態分子イメージングセンターの外部評価・内部評価

71

External and internal evaluation of Molecular Imaging Center of Diseases

資料

Supplementary Information

１．病態分子イメージングセンター組織運営規則

84

Organization and administrative regulation of Molecular Imaging Center of Diseases
２．がん関連コンソーシアム

86

Cancer-oriented consortium
３．再生医療コンソーシアム

90

Regenerative medicine consortium
４．研究トークランチ

93

Research talk at lunch
５．関西医科大学研究医養成コース

94

Training course for future physician scientists in Kansai Medical University
６．研究医長会議

98

Meeting of head scientific physicians in clinical departments
７．第 1 回病態分子イメージングセンター年次集会抄録

100

Proceedings of the 1st annual meeting of MICD
８．第 2 回病態分子イメージングセンター年次集会抄録

110Proceedings of the 2nd annual meeting of MICD
９．病態分子イメージングセンター最終報告会抄録

117Proceedings of the final annual meeting of MICD
10．各事業推進者の平成 26 年度研究成果報告

128

Research activities 2014 by MICD core members
11．各事業推進者の平成 27 年度研究成果報告

194

Research activities 2015 by MICD core members
注）滝井キャンパスでの詳細な研究成果は平成 23‐24 年度研究成果中間報告書をご覧ください。
Note: Please refer to MICD Interim Report 2011-2012 for detailed research outcomes at Takii campus.

はじめに

医学・医療技術の進歩により世界一長寿国となった現在、認知症などの神経系疾患、がん、動脈硬化・糖尿病など代謝性疾患の早期診断と進行予防が喫緊の課題となっています。これらの疾患は生体の正常機能を担う遺伝子の変異、タンパク質の変性やエネルギー物質の蓄積によることが明らかになってきています。また、画像診断、組織診断の進歩により病変部位が可視化され、病気の早期診断と経過観察が可能になっていますが、関与する因子は多様で、治療成績の向上には必ずしもつながっていません。このような状況に対応するために、
平成 23 年度文部科学省私立大学戦略的研究基盤形成支援事業に応募した「分子イメージングによる体系的病態の解明と診断治療法の開発」（平成 23 年～平成
27 年）が採択され、平成 23 年 9 月に病態分子イメージングセンターが設立されました。本研究プロジェクトは１）蛍光イメージングによる分子動態、幹細胞の同定と病態解析、２）疾患の原因候補分子の分子イメージングと探索・同定、
３）診断と治療応用のための動物疾患モデルの作製に焦点を当てた全学的プロジェクトとして取り組みました。
平成 25 年度に枚方学舎に統合されたのを契機として、各事業推進者の研究成果を部門内、部門間の共同研究、トランスレーショナル研究に発展させるために、がん関連コンソーシアム、再生医療コンソーシアム、基礎系講座間の連携強化のための研究トークランチをスタートさせました。共同研究の実施場所として、北棟 5 階に臨床系綜合研究施設を設置して研究連携を推進する体制を構築しました。大学では若手研究者支援の臨床系研究医長制度、医学部に研究医養成コースを導入し、人材育成にも取り組みました。さらに、国内外の共同研究を推進した結果、本プロジェクトの研究は順調に進捗し、トップジャーナル
を含め欧文雑誌に 250 編以上発表し、国内外の学会発表は 420 回を数え、外部評価委員の高い評価を受けました。病態分子イメージングセンターの活動を通じて形成された研究基盤と若手研究者の育成が、枚方学舎の新しい研究所の礎となることを祈念しています。
平成 28 年 5 月
1Preface
At the present time Japan is the nation with the highest longevity owing to theadvances made in medicine and medical technologies, and the early diagnosis andprevention of the progression of neurodegenerative diseases such as dementia, cancer,
and metabolic disorders are of utmost importance and urgent matters of interest. It has
become evident that these diseases are caused by genetic mutations, deposition ofdegenerated proteins, and excessive storage of body fuel, which are essential for normal
functions in the body. Although recent progress in imaging and pathological diagnosis
has enabled us to make early diagnosis of many diseases and to conduct better
follow-up, a good outcome of treatment is not always achieved due to many pathogenic
factors. In order to cope with this situation, in 2011 we applied for a 5-year project
entitled “Systematic elucidation of pathogenesis and development of diagnosis andtreatment by molecular imaging” to the government program for the foundation ofstrategic research at private universities, supported by the Ministry of Education,
Culture, Sports, Science, and Technology of Japan. Upon acceptance of ourapplication, we established the Molecular Imaging Center of Diseases (MICD) in
September 2011. Our whole-university project has focused on 1) elucidation of thepathogenesis of various diseases through molecular dynamics studies and identificationof stem cells by fluorescence imaging, 2) the search for and identification of candidate
molecules involved in various diseases and their localization by molecular imaging, and3) the establishment of animal disease models and analyses of patients’ samples for thedevelopment of better diagnosis and treatment.
On the occasion of consolidating the campus in Hirakata in April 2013, to promotecollaborative research and translational research among basic and clinical departments,
we started three activities: a cancer-oriented consortium, a regenerative medicine
consortium, and lunch-time research talks among basic medical departments. At thattime we established MICD on the 5th floor of the north wing of the Hirakata campus.
Furthermore, we introduced a training course for future physician scientists in the
medical school and a meeting of head scientific physicians in clinical departments forcultivating young researchers. As the result of promoting collaborative research withother laboratories in Japan and abroad, the project has progressed satisfactorily, as
evidenced by the publication of more than 250 papers in foreign journals. Furthermore,
the project has received high valuation by the advisory board members of MICD. We
sincerely hope that this five-year research project will have served as a launch pad for a
new program that continues research initiated by our project and that our new institutewill become an international research foundation at the Hirakata campus.
May 2016

2

Ⅰ. 病態分子イメージングセンターの事業概要
１．大学名：関西医科大学
２．研究組織名：病態分子イメージングセンター
３．研究プロジェクト名： 分子イメージングによる体系的病態の解明と診断治
療法の開発
４．研究組織：病態分子イメージングセンターに神経、がん、代謝の３研究部門と支援部門の研究体制を構築し、３部門に部門統括者を配置します。部門統括者は部門内の研究を統括し、部門間の連携と調整を行い、運営会議はプロジェクトの事業計
画、成果報告、予算執行等を審議決定します。
 神経部門は神経可塑性・非可塑性、神経変性疾患
 がん部門は組織・がん幹細胞の同定、発がん･転移機構
 代謝部門は炎症、血管・組織の加齢変化、動脈硬化、糖尿病の病態解明を中心に基礎医学研究から臨床応用研究まで多岐にわたる研究を推進します。
 支援部門は本プロジェクトの研究推進と若手研究者の人材育成の支援を行います。
研究成果は学外の委員で構成される評価委員会の評価を受けます。
５．研究施設、設備・装置
《施設》
施設の名称

整備年度

病態分子
イメージングセンター

平成 23 年度

（千円）

研究施
設面積

研究室
等数

使用者
数

m2
818

21

62

平成 24 年度

事業
経費

補助金

49,552

24,761

135,325

67,662《装置・設備》
装置・設備の名称

（千円）

補助金

Imaging-MS for KMU

76,00038,00072,00036,000Inveon75,060

－

整備年度
研

質量顕微鏡

型番

事業
経費

究

平成 23 年度

高度細胞機能解析
蛍光イメージングシステム

平成 24 年度

小動物実験用マルチ
モダリティ SPECT/CT

平成 26 年度

装置ImageStream imaging flow
cytometer
ArrayScan VTI HCS reader

研

究

設

備

近赤外蛍光イメージャー
Odyssey system

平成 23 年度

LI-COR9201-00

7,300

4,866

HS オールインワン
蛍光顕微鏡

平成 23 年度

BZ-90000

13,4778,980

3

《研究費》（千円）

年度

消耗品費 通信運搬費 旅費交通費 業務委託費

会合費

雑費

修繕費

平成 23 年度

33,704

72

760

4,157

142

333

520

平成 24 年度

40,712

118

1,480

4,443

224

612

5,362

平成 25 年度

33,935

460

2,081

3,615

421

653

359

平成 26 年度

43,006

261

1,173

3,291

112

1,569

3,693

平成 27 年度

39,803

223

1,339

6,638

342

619

2,595

支払手数料

賃貸料

福利費

人件費

教育研究用
機器備品

図書費

合計
（円）

平成 23 年度

22

373

0

1,478

12,48886

54,135平成 24 年度

343

0

8

1,276

27,327

63

81,968平成 25 年度

342

印刷製本費

光熱水費

15,603

183

62,855

155

2,715
3,086

2,321

平成 26 年度

162
0

7,014

13,165

41

76,566

平成 27 年度

263

367

2,696

7,361

23,877

97

86,220年度

６．運営委員会委員
センター長

伊藤 誠二

副センター長上野 博夫

部門

基礎系部門統括者

臨床系部門統括者

神経部門

山田 久夫

日下 博文

がん部門

藤澤 順一

友田 幸一(2011-2014)
野村 昌作(2015)

代謝部門

中邨 智之

岡崎 和一

７．外部評価委員
外部評価委員Prof. Min Zhuo
神経部門

（University of Toronto, Dept. of Physiology
Editor-in-chief, Molecular Brain, Molecular Pain)

山本 雅教授
がん部門（沖縄科学技術大学院大学 細胞シグナルユニット
元東京大学医科学研究所所長 癌細胞シグナル分野)

代謝部門(Lab. Chief, Cell Biochemistry and Biology, National Institute of
Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH, USA)

Dr. John Hanover4８．研究事業者と共同研究者
研究事業者
神経部門

11 部門

がん部門

11 部門

代謝部門

11 部門
共同研究者

中畑 龍俊 副所長（京都大学 iPS 細胞研究所 臨床応用研究部門）
瀬藤 光利 教授（浜松医科大学 解剖学講座 細胞生物学分野）
近江谷 克裕 部門長（産業技術総合研究所 バイオメディカル研究部門）

９．研究プロジェクト参加研究者数：事業推進者 35 名
部門区分

事業推進者

課題名
【

神経部門

】

神経機能再生医学

山田 久夫

神経細胞機能の in situ イメージングに関する研究

脳構築学

杉本 哲夫

ニューロンの共存マーカーによる線条体外側部の解析

細胞分子生理学松田 博子

病因分子および細胞のイメージング

高次認知脳科学中村 加枝

霊長類におけるセロトニン・ドパミンによる認知機能の制御分子生体機能学

伊藤 誠二

難治性神経疾患の病態解明と診断治療法の開発

神経内科学

日下 博文

パーキンソン病モデルラットを用いた
大脳基底核神経回路の可塑性の研究

精神神経科学木下 利彦

統合失調症患者のミラーニューロンの形態変化：
拡散テンソル画像解析による精神科治療効果判定

脳神経再生医学淺井 昭雄

グリオブラストーマ癌幹細胞のin vivo イメージング法の開発

麻酔科学

新宮 興

静脈麻酔薬デクスメデトミディンの炎症反応に及ぼす影響

脊髄再生医学中谷 壽男

脊髄損傷に対する細胞治療の基礎および臨床研究

小早川

匂い分子により誘発される恐怖行動に関する研究

神経機能

令子

5

部門区分

事業推進者

課題名
【

博夫

がん部門

】

幹細胞病理学上野

多色細胞系譜追跡法を用いた幹細胞の維持機構の解析

ウイルス腫瘍学

藤澤 順一

ATL 発症機構の解明・予防法・治療法の開発

幹細胞生物学薗田精昭

ES 細胞様組織幹細胞の同定と分化経路の解明：細胞移植・再生医療への応用

公衆衛生学

西山 利正

組織幹細胞に高発現する遺伝子の機能解析とがん幹細胞との共通性の検討

法医学

赤根 敦

次世代シークエンサーを用いたラット microRNA の網羅的検索

分子遺伝学部門

木梨 達雄

リンパ節のホーミングの分子機構に関する研究

モデル動物部門

李成一

CRISPR/Cas9 を用いた遺伝子改変マウス作製

生体情報部門松田達志

がん幹細胞の機能・分化に関わるシグナル分子の解明

内科学第一

野村 昌作

耳鼻咽喉科学友田

幸一

質量顕微鏡による頭頸部がん関連因子の探索・同定

幹細胞異常症学

池原 進

骨髄内骨髄移植によるがん治療戦略に関する研究

ヒト樹状細胞によるさまざまな病態関連応答の解明と新たな難病治療戦略の開発

【
智之

代謝部門

】

分子薬理学

中邨

内科学第二

塩島 一朗

心筋梗塞後の再生医療に向けた診断治療に関する研究

内科学第三

岡崎 和一

自己免疫性膵炎の病態と線維化に関する研究

外科学權

質量顕微鏡法を用いた病理標本解析による
腸管内腔閉塞原因物質の同定と発症機構の解明

皮膚科学

岡本 祐之

質量顕微鏡を用いた表皮内メラニンの測定

整形外科学

飯田 寛和

超音波処理と次世代シークエンサーを用いた
インプラント感染の新規診断法の構築

形成外科学

楠本 健司

皮膚・軟部組織の加齢変化、組織再生における分子
イメージングによる病態解明と診断治療への応用

眼科学

高橋 寛二

脈絡膜血管新生、網膜変性症、網膜虚血再還流による障害の分子機構の解明

放射線科学

澤田 敏
谷川 昇

固形がんに対する RI 標識抗体による早期イメージング
診断剤および治療薬の開発における基礎研究

臨床検査医学高橋伯夫

高血圧の病態解明のための
脳内内因性ジギタリスの局在分析

病態検査学

蔦

幸治

病理診断への蛍光ナノ粒子イメージング技術の応用

雅憲

細胞外マトリックスの線維形成に関する研究

木原 裕

軟 X 線顕微鏡による細胞内機能イメージング

影島 賢巳

細胞内機能と構造のイメージングに関する研究

物理学

6

I. Outline of Molecular Imaging Center of Diseases (MICD)

1． University: Kansai Medical University
2． Organization: Molecular Imaging Center of Diseases
3． Title: Systematic elucidation of pathogenesis and development of diagnosis andtreatment by molecular imaging
4． Management
The center consists of three research divisions of neuroscience, cancer and metabolic
disorders, each of which is managed by two division heads from basic and clinical fields,
and a supporting division. The division heads integrate research in the division andadjust matters between divisions. The management committee deliberates anddetermines an annual plan, budget and outcome and other pertinent issues of the project.
We promote a wide-range research from basic to clinical medicine focusing on Neuroscience Division: neural function and neural plasticity, neurodegenerative
diseases Cancer Division: identification of tissue & cancer stem cells, mechanisms of
oncogenesis and metastasis
 Metabolic disorders Division: inflammation, aging in vessels and connective
tissues, and pathogenesis of atherosclerosis and diabetes
 Supporting Division: assistance to the project members to promote research
activities and to cultivate young researchers.
Research activities are evaluated by three outside members of advisory board.
5． Research facilities, apparatuses, and equipment《Facility》
Name of facility

Molecular Imaging
Center of Diseases

Fiscalyear

Research
Number of
facility area laboratories

2011
2012

m2

818

21

Numberof users(Unit: 1,000)
Operational
expenses(Apparatus)

Mass spectrometer

49,552

24,761

135,325

67,662

62《Apparatus and equipment》
Name

Subsidy

Fiscal year of
installation

Model number

2011

Imaging-MS
for KMU
Image Stream imaging
flow cytometer(Unit: 1,000)
Operational
Subsidy
expenses

76,00038,00072,00036,000

Advanced fluorescence imaging
system for cellular function
analyses2012

Multi-Modality
microPET/SPECT/CT

2014

Inveon75,060－2011

LI-COR9201-00

7,300

4,866

2011

BZ-90000

13,4778,980(Equipment)

Infrared imaging system Odyssey
HS All-in-one fluorescencemicroscope

Array Scan VTI HCS
reader7

《Research expenses》(Unit: 1,000)

Communications
Fiscal Experimental&
year
suppliestransportation

TravelOutsourcing

Meeting

Miscellaneous Maintenance2011

33,704

72

760

4,157

142

333

520

2012

40,712

118

1,480

4,443

224

612

5,362

2013

33,935

460

2,081

3,615

421

653

359

2014

43,006

261

1,173

3,291

112

1,569

3,693

2015

39,803

223

1,339

6,638

342

619

2,595

WelfarePersonnel

Machinery
appliance

373

0

1,478

12,48886

54,135

1,276

27,327

63

81,968

FiscalCommission
year

Lease

Book

Total (Yen)

2011

22

2012

343

0

8

342

Printing &Bookbinding

Utilities

2,715

2,321

15,608183

62,855

2014

155

162
0

3,086

7,014

13,165

41

76,566

2015

263

367

2,696

7,361

23,877

97

86,2202013

6． Committee members

Director

Seiji Ito

Vice-director

Hiroo Ueno

Division head

Basic

Clinical

Neuroscience

Hisao Yamada

Hirofumi Kusaka

CancerJun-ichi Fujisawa

Koichi Tomoda (2011-2014)
Shosaku Nomura (2015)

Metabolic Disorders

Tomoyuki Nakamura

Kazuichi Okazaki

7． Advisory board members
Advisory board
Division of
Neuroscience

Prof. Min Zhuo
(Dept. of Physiology, University of Toronto,
Molecular Brain, Molecular Pain, Editor-in-chief)

Division ofCancerProf. Tadashi Yamamoto(Cell Signal Unit, Okinawa Institute of Science andTechnology, Graduate University)

Division of
Metabolic Disorders

Dr. John Hanover(Lab. Chief, Cell Biochemistry and Biology, National Instituteof Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, NIH, USA)8

8． Core members of the CenterCore members
Division of Neuroscience

11 departments

Division of Cancer

11 departments

Division of Metabolic Disorders

11 departments
Cooperative members

Vice President Tatsuyosi Nakahata(Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University)
Prof. Mitsutoshi Setou(Cell Biology & Anatomy, Hamamatsu University School of Medicine)Dr. Yoshihiro Ohmiya(Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)

9． Research projects
DivisionCorememberTitle of research project【 Neuroscience 】

Regenerative
NeuralMedicine

Hisao
YamadaAnatomy andBrain Science

TetsuoSugimoto

Cellular andMolecular
Physiology

HirokoMatsudaImaging of disease-related molecules and cells

Cognitive
Neuroscience

Kae
Nakamura

The role of serotonin and dopamine for cognitive processes
in the primate

Molecular andFunctional
Biology

Seiji
Ito

Elucidation of pathogenesis and development of diagnosis
and treatment of intractable neural diseases

Neurology

Hirofumi
KusakaAnalysis of synaptic plasticity in the basal ganglia network in
Parkinson’s disease model rats

Neuropsychiatry

ToshihikoKinoshita

Alterations of mirror neurons in patients with schizophrenia
by fMRI

Neurosurgery

Akio
Asai

Development of in vivo imaging of cancer stem cells inglioblastoma

Medical Controlof Stress
Response

Koh
ShinguAnti-inflammatory property of dexmedetomidine, an
intravenous anesthetic

Spinal Cord
Regeneration

ToshioNakatani

Basic and clinical studies on cell treatment for complete
spinal cord injury

Functional
Neuroscience

Reiko
Kobayakawa

Study on fear induced by odorant molecules

In situ imaging of neural cells and their function
Analysis of mouse lateral striatum using antibodies for
GAD1, GPR155, Calb1 and dopamine receptors.

9【 Cancer 】
Stem Cell
Pathology

Hiroo
Ueno

Analyses of dynamics of intestinal stem cells by multi-color
lineage tracing method

Viral Oncology

Jun-ichiFujisawa

Analysis of ATL development in HTLV-1 infected
humanized mouse model

Stem Cell
Biology

Yoshiaki
SonodaIdentification of embryonic stem cell-like tissue committed
stem cells and elucidation of their differentiation pathway:
An application to cell therapy and regenerative medicine

Public Healthand International
HealthToshimasa
Nishiyama

Functional analysis of overexpressing genes in tissue stem
cells and searching the relationship with cancer stem cells

Legal Medicine

AtsushiAkane

The comprehensive analysis of rat microRNAs by next
generation sequencer

Molecular
Genetics

TatsuoKinashiMolecular mechanism of lymphocyte trafficking

Model AnimalSung-il
Lee

Generation of genetically modified mice by
CRISPR/Cas9-mediated genome editing

Cell Signaling

SatoshiMatsudaAnalysis of signal transduction molecules involved inproliferation, development and stemness

Internal
Medicine 1

Shosaku
NomuraDevelopment of novel therapeutic strategy and elucidationof functional basis for intractable diseases by humandendritic cell research

Otolaryngology

Koichi
TomodaSearch and identification of head and neck cancer-related
factors by imaging mass spectrometry

Stem Cell
DisordersSusumuIkeharaIBM-BMT is an effective strategy for cancer treatment

10【Metabolic Disorders 】

Molecular
Pharmacology

TomoyukiNakamura

Study of fibril formation in the extracellular matrix

Internal
Medicine 2

IchiroShiojima

Invention of cardiac regeneration therapy using
molecular imaging techniques

Internal
Medicine 3

KazuichiOkazakiA molecular imaging study of identifying biomarkers in
inflammatory gastroenterological disorders

Surgery

A-Hon
Kwon

Identification of causative material of small-bowel
obstruction from histopathological sections by
MALDI-imaging mass spectrometry

Dermatology

HiroyukiOkamotoMeasurement of melanin in epidermis using mass
microscope

Orthopedic
Surgery

Hirokazu
Iida

Establishment of new methods for diagnosis of implantassociated infections by sonication and next generation
sequencer

Plastic andReconstructive
Surgery

KenjiKusumoto

Clarification of skin and soft tissue aging and tissue
regeneration and application in diagnosis and treatmentusing molecular imaging

Ophthalmology

Kanji
Takahashi

Elucidation of molecular mechanism of choroidal
neovascularization, retinal degeneration and retinal
ischemia-reperfusion injury

Radiology

Satoshi
SawadaNoboruTanigawa

Development for diagnostic agents and the curative
drugs by the RI labeled antibody for the solid tumors

Clinical Sciencesand Laboratory
Medicine
Pathology andLaboratory
Medicine

Analysis of localization of endogenous digitalis in the

Hakuo
Takahashi

brain, and the pathophysiological roles in hypertention

Koji
Tsuta

Nanoparticle technique for pathological diagnosis

Hiroshi
KiharaImaging of cellular functions by X-ray microscopy

MasamiKageshima

Research for imaging of intracellular function and structure

Physics11

Ⅱ. 病態分子イメージングセンターの研究成果
病態分子イメージングセンター (MICD) における 5 年プロジェクト「分子イメージングによる体系的病態の解明と診断治療法の開発」の最初の 2 年間は滝井キャンパス、後半の 3 年間は枚方キャンパスで実施された。平成 25 年度に枚方学舎に統合されたのを契機として、各事業者のこれらの研究課題を部門内、部門間の共同研究、トランスレーショナル研究を推進するために、がん関連コンソーシアム、再生医療コンソーシアム、基礎系講座間の連携強化のための研究トークランチをスタートさせた。共同研究の実施場所として、北棟 5 階に臨
床系綜合研究施設を設置し、人的にも研究連携を推進する体制を構築した。さらに国内外の共同研究を推進した結果、本プロジェクトの事業推進者の研究は順調に進捗し、MICD の研究成果は Cell、Nature、Nat. Cell Biol.、Nat. Neurosci.、Nat. Commun.、Sci. Rep.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、Dev. Cell や J. Biol. Chem.、
Neuron、J. Neurosci.、Eur. J. Neurosci.、J. Immunol.、Blood、J. Gastroenterol.などの各領域のトップジャーナルを含め欧文雑誌に 250 編以上発表し、国内外の学会発表は 420 回を数える。なお、研究の進捗状況、研究の成果は年次報告会を 3回開催し、3 名の外部委員の評価をそのつど受けて、良い評価を得た。以下、36名の事業推進者の研究活動を 6 つのトピックスにわけ、MICD に関係する優れた研究成果は表紙裏の図にもとづいて紹介する。枚方キャンパスにおける事業推進者毎の詳細な研究活動と研究業績は本報告書の資料 10 と 11 を参照されたい。
なお、滝井キャンパスにおける詳細な研究成果とすべての事業推進者の年次毎の研究活動は平成 23‐24 年度研究成果中間報告書を参照されたい。中間報告書と最終報告書は MICD のホームページで公開する (http://micd.kmu.ac.jp/)。
１．組織幹細胞の同定
本研究プロジェクトでは、細胞移植・再生医療への応用やがんの治療法の開発を目指して、様々な角度からマウスおよびヒト由来の各種組織より、組織幹細胞を同定し、がん幹細胞への変化のメカニズムの解明に取り組んだ。舌乳頭は生体で最も速く回転する組織の 1 つで、その角化上皮細胞は舌の扁平上皮がんの源と考えられている。上野（幹細胞病理学）は自身で確立した多色細胞系
譜追跡法 (Nature 464:549-553, 2010) を用いて、舌の毛状乳頭小窩基底部に長期間生存する Bmi1 陽性の幹細胞が 1 個存在し、通常は静止状態あるいはゆっくり
細胞分裂する状態にあるが、放射線照射により細胞分裂し上皮を再生すること、
Bmi1 陽性の幹細胞を除去で再生が抑制されたことから、Bmi1 陽性の幹細胞が角化上皮細胞の維持再生に関与することを報告した（図１、Nat. Cell Biol.
15:511-518, 2013）。さらに、3 次元マトリクスを用いて正常およびがん化した舌上皮細胞や Bmi1 陽性の幹細胞のオルガノイド培養系を確立し、マウスに移植することにより、舌で扁平上皮と角化上皮に成熟させることに成功した。上野が開発したレインボーマウスと組み合わせて舌上皮細胞の系譜追跡、オールインワン顕微鏡による time lapse imaging により、その動態、再生、がん化を直接観察する事が可能となった（図２、Nature 476:409-413, 2011; Sci. Rep. 3: 3224, 2013）。
このように、舌、大腸など消化管上皮系幹細胞や後で述べる精巣の発生・維持、がん化が解析できる多色細胞系譜追跡法の確立に成功した (J. Gastroenterol.
48:423-433, 2013; Sci. Rep. 4:6175, 2014) 。
伊藤（分子生体機能学）らがクローニングしたショウジョウバエの卵形成に関与する遺伝子 ovo のマウス相同遺伝子産物 Ovol2 (MOVO) は Zn フィンガー型
転写因子で、ES 細胞に発現する。Ovol2 欠損マウスは心血管形成障害、神経管
12

閉鎖不全等により胎生致死となることを以前に報告した。皮膚では、表皮の基底細胞層や毛庖の前駆細胞に発現する。Ovol2 は Ovo 遺伝子ファミリーの Ovol1と共同して皮膚上皮幹細胞の分化の抑制、上皮への可塑的変化に関与すること
から、Ovol2 が幹細胞の重要な転写因子であることを示した。このことは、皮膚での Ovol2 発現が欠損するコンディショナルノックアウトマウスと Ovol1 欠損マ
ウス（胎生致死ではない）の 2 重欠損マウス (DKO) を作製して、皮膚の角化層の形成不全、即ち皮膚のバリア機構が形成できず、色素が浸潤して青く染まったことにより確認できた（図３、Dev. Cell 29:47-58, 2014）。
成体マウスでは Ovol2 は精巣に強く発現している。作製した Ovol2 抗体で免疫染色を行うと、精子形成が開始する生後 3 週間から、Ovol2 タンパクが精細管の外側に局在する精母細胞のパキテン期の XY 体に限局して発現していること、
転写抑制作用を有することを明らかにして、XY 体の形成、減数分裂の性染色体の不活化により精子形成に関与する可能性を示した（図４、J. Androl. 33:277-286,
2012）。ヒト精巣においても Ovol2 が XY 体に局在することを確認した。
上野らは前述の多細胞系譜追跡法を用いて Bmi1 陽性細胞が精祖細胞 (germstem cells) のマーカーであることを報告した (Sci. Rep. 3:3224, 2013) 。精子形成不全は男性不妊の大きな要因である。男性ホルモンの 1 つ、テストステロンをGirald T 試薬で誘導体化することにより、質量顕微鏡を用いて精巣でテストステロンのイメージングに成功した。性腺刺激ホルモンで刺激 1 時間後にテストス
テロンの産生がライディッヒ (Leydig) 細胞でみられ、細胞から遊離されたテス
トステロンが精細管の外側に精母細胞にも分布していることがイメージングされた（図５、Anal. Bioanal. Chem. 印刷中、2016）。
核膜ラミナに存在するラミン (Lamin) の遺伝子の変異は、早老症、成人発症
型白質ジストロフィーをはじめとする神経筋疾患でみられる。山田ら（神経機能再生医学）はこのような疾患に関わるラミンまたは核ラミナをイメージング法でとらえ、そのイソタイプごとの分布を解析した。その結果、ラミンは海馬
歯状回や側脳室周囲帯の神経系幹細胞、やや分化した神経前駆細胞、成熟ニューロンでそのイソタイプ構成を変化させながら、各細胞の分化に関与することがわかった。そして、側脳室周囲の神経前駆細胞のニューロン新生は厳密に調節されており、その修正には強い刺激が必要であることを示した。
西山、神田（公衆衛生学）は下垂体と聴覚伝導路の組織幹細胞の同定を行った。3 週齢マウスの蝸牛神経核に約 1%の sphere 形成能を有する side population細胞が存在し、この活性は加齢とともに低下することを示した。side population
で取得したこれらの細胞はさらに未熟な幹細胞または前駆細胞であることを発現遺伝子で確認した。さらに、聴覚情報を最初に統合する下丘においてもProminin-1 (CD133) 陽性細胞が sphere を形成し神経、グリアに分化することか
ら幹細胞であること、Prominin-1 が幹細胞のマーカーとなる可能性を示した。
薗田（幹細胞生物学）は、マウス骨組織から酵素処理法と FACS を用いて、直径 6～7 µm 程度の小型で核細胞比の大きな very small embryonic-like stem cell
(VSEL) として報告されていた未分化な組織幹細胞の効率的な分離方法を開発した。本法を用いれば、従来の骨髄を用いる方法に比べて 50～100 倍の効率でLineage-CD45-Sca-1+の表面免疫特性を示す組織幹細胞を分離することができ、この骨組織由来の微小幹細胞を BD VSEL と名づけた（特願 2012-220648）。BD
13

VSEL は、in vitro 培養系で血液系細胞に分化するとともに、in vivo 移植系において肝細胞に分化 (transdifferentiation) する可能性が示唆された (Stem Cells Dev.
25, 27-42, 2016) 。さらに、臨床応用につながる成果として、ヒト骨質からも同様の hBD VSEL の分離する方法を開発した（特願 2012-220648）。平行して、
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞 (DP MSC) を樹立（特願 2013-170480）した。DP MSC
は、本研究グループが発見同定 (Blood 101, 2924-2931, 2003) したヒト臍帯血由来 CD34 抗原陰性 (CD34-) 造血幹細胞 (HSC) （ヒト HSC の階層制上頂点にある未分化 HSC）を効率的に支持した (Stem Cells 33, 1554-1565, 2015) 。以上の研究成果に基づいて、CD34-HSCs を DP MSC と共培養することにより、CD34+HSC
を体外増幅する系を開発中である。
塩島ら（内科学第 2）はヒト心臓組織幹細胞を効率よく末梢血中に動員する方法を確立し、その機序を明らかにした。塩島はこれまで心筋細胞・血管内皮細胞・血管平滑筋細胞など心臓内の複数の細胞種に分化しうるヒト心臓組織幹細胞が心臓手術中に末梢血に動員されることを明らかにしてきた。本研究でヘパリンの静脈投与がヒト心臓からの組織幹細胞動員を起こすこと、また、ヘパリンが細胞外マトリクスに結合した hepatocyte growth factor (HGF) を遊離させ
HGF 血中濃度を上昇させることが、心臓組織幹細胞が末梢血へ動員される機序であることを明らかにした。
岡崎（内科学第 3）は消化管粘膜上皮・膵臓における有用な新規組織幹細胞マーカーとして Smad2/3 のリンカー部分のスレオニンリン酸化蛋白 (pSmad2/3LThr) を同定した。正常なマウス小腸・大腸粘膜や DSS 起因性大腸炎モデル、IL-10
ノックアウトマウス大腸炎・大腸がんモデル・セルレイン膵炎といった動物モデルを作製し、pSmad2/3L-Thr と Ki-67 の蛍光二重免疫染色を行った。DSS 起因性大腸炎モデル・セルレイン膵炎では、粘膜の障害時には pSmad2/3L-Thr 強陽性幹細胞がほぼ消失し、消化管や膵臓の治癒が進むにつれ、pSmad2/3L-Thr 強陽性幹細胞が著明に増加することを見つけた。これらの結果から、pSmad2/3L-Thrが組織上皮幹細胞のマーカーとして利用できることを確認した。
２．二光子励起顕微鏡による分子動態、細胞機能と病態の解析
木梨（分子遺伝学）はリンパ節スライス法による二光子励起顕微鏡を用いた in situ イ
メージングを樹立し、T 細胞の組織内高速移動に樹状細胞上の LFA-1/ICAM-1 を介する接着が必要であることを明らかにした(図６)。低分子量 G タンパク Rap1 と Rap1結合分子 RAPL、およびその下流エフェクター分子として作動する Ste20-like キナー
ゼ Mst1 のノックアウトマウスで制御性 T 細胞の抗原依存的抑制作用が障害されていたことから、Mst1 による胸腺上皮細胞の接着制御が自己抗原による負の選択に必要であることを示した。さらに、人工脂質二重膜を用いて、Mst1 欠損で抗原特異的接着構造である免疫シナプス構造ができないことを確認すると共に、Mst1 が kindlin 3 を介する高親和性 LFA-1 の形成に必要であることを示した。このように、in vitro や組織スライスの系を用いた解析から、従来リンパ球移動における役割が不明確であった間葉系の細網細胞 (fibroblastic reticular cells, FRC) がリンパ節内の移動において重要な役
割を持つことを明らかにした。そして、Mst1 欠損マウスでは、胸腺と制御性 T 細胞の障14

害の結果、自己免疫様病態が加齢とともに顕著になることを明らかにした (Nat.
Commun. 3:1098, 2012; J. Immunol. 191:1188-1199, 2013; Sci. Signal. 7:ra72, 2014) 。
大脳は生きた動物の鼻と両耳の 3 点で固定できるので顕微鏡下に長時間イメ
ージングすることは可能であるが、脊髄は呼吸や拍動によりぶれるので、in vivo
でイメージングすることは誰も成功していなかった。脊髄神経回路網における皮膚での感覚刺激応答を二光子励起顕微鏡で in vivo 蛍光イメージングを行うた
めに、伊藤（分子生体機能学）らは、まず神経特異的に蛍光タンパクを発現させたトランスジェニックマウス Thy1-YFP を用いて、脊髄での iv vivo 蛍光イメー
ジング法を確立した。そして、炎症に伴い脊髄後角の神経線維上の spine が増大すること、その増大がグルタミン酸拮抗薬で抑制されることを明らかにした（図７、Eur. J. Neurosci. 41:989-997 2015）。脊髄での in vivo イメージングに成功した
ので、子宮内遺伝子導入で Ca2+センサータンパクを発現させたマウスを用いて、二光子励起顕微鏡下に同時に 100 個に及ぶ脊髄後角ニューロンの応答の長時間、同時にイメージングすることに成功した。これまで、電気生理学的手法による
in vivo patch-clamp では 1 つのニューロンの刺激応答しか記録できなかったが、皮膚での熱、機械的、触覚刺激に応答に対する脊髄後角ニューロンの時空間的特性を明らかにした (PLoS One 9:e103321, 2014) 。
３．質量顕微鏡等による疾患原因候補分子の分子イメージング
アルツハイマー (Alzheimer) 病、パーキンソン (Parkinson) 病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患は脳や脊髄のある部位の神経細胞死による loss offunction によることが知られている。これまで、剖検脳やモデル動物での組織標
本の病理学的変化が検討されてきた。質量顕微鏡が神経化学の領域において、小分子化合物の分布のイメージングに有用なツールとなっている。矢尾（分子生体機能学）は神経変性疾患に関わる神経伝達物質の 1 つ、アセチルコリン(ACh) の解析のため、イオン化に用いるマトリクス、生体試料のサンプリングの迅速化、レーザー強度等の測定条件の最適化を行い、ACh のイメージングに
世界で初めて成功した。ACh のラット脳での分布は、その分解酵素アセチルコ
リ ン エ ス テ ラ ー ゼ の 分 布 と 一 致 し て い た （ 図 ８ 、 Anal. Bioanal. Chem.
403:1851-1861, 2012）。従来の遊離された ACh の代謝産物の測定と異なり、大脳皮質や運動ニューロンのシナプス終末のシナプス顆粒中の ACh を測定することから、剖検脳や動物モデルの病態解析に有用と期待できる。
さらに、病理組織標本の質量顕微鏡による分子イメージングを行う研究手法を確立するために、權（外科学）、矢尾は外科手術で摘出された異物のパラフィ
ンブロックから小腸で通過障害を起こした物質の同定を行った。脱パラフィン
処理、消化酵素処理後、病理組織標本を質量顕微鏡で解析して、アミロペクチ
ンと同定した。病理検査で行われている PAS 染色で陽性反応、前処理をした標
準サンプルの MS、MS/MS 解析でアミロペクチンであることを確認した (Anal.
Bioanal. Chem. 402, 1921-1930, 2012) 。病理組織標本を脱パラフィンして原因物
質を質量顕微鏡で同定できたことは、その適用範囲を病理組織診断に広げるも
のである。
15

山田（神経機能再生医学）は質量顕微鏡を用いて免疫組織化学で長年オリゴ
デンドロサイトのマーカーとして広く用いられている O4 モノクローナル抗体のエピトープをスルファチドと同定した。さらに、スルファチド合成酵素欠損
マウスを用いて確認した。スルファチドが胎生期のオリゴデンドロサイト系譜
決定期から生後髄鞘構築期に至るまで重要な役割をすることを示した。質量顕微鏡による精巣でのテストステロンの分子イメージングは１．ですでに述べた。
メラニンには紫外線防御能力の大きいユーメラニンと紫外線感受性の高いフェオメラニンの 2 種類が存在する。ヒトでは表皮にメラノサイトが存在するが、マウスのメラノサイトは真皮に存在するので、ヒトの皮膚組織の研究においてマウスを実験動物として用いることには制限があった。岡本（皮膚科）らはヒ
トの皮膚に近い紫外線感受性マウスを作製して、質量顕微鏡によるメラニンの測定を行った。しかし、メラニン、フェオメラニン、ユーメラニンはいずれも分子が重合しているため、うまくイオン化できず、測定できなかった。
内因性ウワバイン様物質 (EDLS) はラットやヒトの食塩負荷で産生されることがよく知られ、長年食塩摂取に関連する高血圧の原因の 1 つと考えられてきた。高橋（臨床検査医学）はマリノブフォトキシンとマリノブファゲニンが EDLSの候補であることを発見し、質量顕微鏡でその標準品を pg レベルの低濃度で検出することができた。しかし、副腎や視床下部の細胞や組織では EDLS を検出できなかった。
質量顕微鏡のイメージング解析は、組織の免疫染色ではできない脂質や神経伝達物質、低分子の代謝産物などの標的分子のイメージングを可能にしたが、標的分子のイオン化効率、シグナルノイズ比を高めること、フラグメントの同定を始め条件検討に時間を要し、確信が持てるデータを得るには専門的知識が要求された。
木原、楠本、影島（物理学）は軟 X 線顕微鏡や原子間力顕微鏡でタンパクから細胞のイメージング法の開発に取り組んだ。
４．遺伝子改変マウスやサルを用いた脳の高次機能の解析と臨床研究
線条体は前頭葉をはじめさまざまな大脳皮質から投射をうけて、行動の順
序・判断・情報の統合調節を担当している。杉本（脳構築学）は GABA ニュー
ロンの GABA 合成酵素 GAD1 と GPR155 の新しいイメージング法を用いて、GRP155 が線条体 D1 ニューロンの分子マーカーとなることを明らかにした。そして、ドーパミン D1 受容体も発現する線条体外側部のニューロンは、感覚運動
皮質の情報を基底核出力部に伝えるニューロンであることを示唆した。
報酬の獲得や嫌悪刺激からの回避のための行動選択においても大脳基底核線条体におけるドーパミンの作用を中心にその神経メカニズムが明らかにされてきた。中村、磯田（高次認知脳科学）らは、サルを用いて報酬、罰など高次脳機能の個体で の情報 処理と社会的相互作用の解析を行った (Nat. Neurosci.
15:1307-1312, 2012; J. Neurosci. 35:6195-6208, 2015) 。その結果、嫌悪刺激に対す
るストレスは大脳基底核線条体での情報処理プロセスに影響し、適切な行動選択を阻害する可能性を示した。実社会において自己の評価は他者との比較においてなされる場合が多い。自己と他者の比較に基づく報酬価値の相対評価に関与する大脳皮質と皮質下の細胞の役割が異なることをサルで示した。これらサルを用いる研究は、地道な研究であるが、現在 fMRI で明らかになりつつある前頭前野と情動系神経回路の行動変化をさまざまなコンテクスト（条件）で解析
16

でき、新しい道を開くことが期待される。
パーキンソン病は黒質緻密部のドーパミン性神経細胞の変性を特徴として、寡動や固縮などの運動障害を起こす神経変性疾患である。日下（神経内科学）
はプロジェクトの前半は神経変性疾患患者の剖検脳の細胞内封入体の解析、後半はパーキンソン病モデルラットとレポドーパ誘発性ジスキネジアモデルラットを用いて病態解析を推し進めた。
ノーベル生理学・医学賞を受賞した Axel が報告した 1,000 以上の嗅覚の受容器が数 10 万にも及ぶ匂い分子と反応し、どのように脳内に伝達され識別される
か良くわかっていなかった。匂い分子の感じ方は個人差が大きいことから、匂いが誘発する情動や行動は学習や経験により後天的に決定されると考えられてきた。小早川（神経機能）らは、匂いは鼻腔内で先天的と後天的な情報に分離されて脳に伝えられて情動や行動が誘発されることを明らかにした (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 112: E311-E320, 2015)。さらに、光遺伝学、薬理遺伝学、脳深部遺伝学による最新のイメージングシステムを駆使して、扁桃体中心核のセロトニ
ン 2A 受容体発現細胞が、先天的と後天的な恐怖を逆方向へ制御することで、2つの恐怖の階層性を制御することを明らかにした（図９、Cell 163:1153-1164,
2015）。これらの結果は匂いをパターンとして認識しているのではなく、匂い分
子の中にはホルモンと同じく 1 対 1 で対応しているものがあるということを示している。そして、精神神経疾患の治療薬の中にもこのような匂い分子として反応するものが多くある。小早川の研究成果は後天的な恐怖を緩和する薬剤の投与が先天的な恐怖を増悪する可能性を示唆しており、精神疾患の原因となる
恐怖情動の診断、治療において重要な知見である。
ヒトでは非侵襲の MRI や fMRI を用いた高次脳機能の解析が強力なツールとなっている。木下、齊藤（精神神経科）がハーバード大学医学部精神科精神画像研究所と連携して、MRI の拡散テンソル画像法を用いて健常者、患者、精神分析治療対象者のミューラーニューロンの描出に成功し、精神科治療効果の判定への応用を目指している。
５．臨床応用に向けた病態の解明と診断と治療法開発のための動物疾患モデルの作製
細胞外マトリックスの 1 つである弾性線維は固く丈夫なコラーゲン線維とは異なり、柔らかく伸び縮みする線維である。LTBP4 (latent-TGFβ binding protein 4)
は TGFβを不活性化状態に維持して細胞外マトリックス内に留め置く LTBP ファ
ミリーの 1 つである。中邨、赤間（神経病態薬理学）は弾性が減少した老人の皮膚組織は若年者に比べ LTBP4 の存在量が大きく減少していること、LTBP4 欠
損マウスが大動脈の硬化を示すことを発見し、LTBP4 が弾性線維構築に重要な機能を担っていることを示した。さらに、精製 LTBP4 タンパクをヒト皮膚線維芽細胞の培養液に加えることにより、濃度依存的に培養細胞上に弾性線維様の網目状線維構造を形成させるたことから、LTBP4 の発現量が弾性線維形成の律速となっていることを示した。このように、弾性線維形成において、LTBP4 は中邨が発見した fibulin-5／エラスチン複合体を微小線維上に誘導する新たな役
割を明らかにして、LTBP4 が弾性線維再生の治療標的になる可能性を示した（図17

10、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:2852-2857, 2013）。肺、大動脈、皮膚など伸縮性のある組織の弾性線維形成の足場となる LTBP ファミリーは加齢変化に関係するだけでなく、眼球の毛様小帯では微小線維そのものが水晶体を毛様体筋に保持する機能をもっている。中邨らが作製した LTBP2 の遺伝子欠損マウスは毛様小帯の線維形成が障害されており、水晶体脱臼、緑内障などヒトの眼疾患のモデル動物となる可能性を示した（図 11、Hum. Mol. Genet. 23:5672-5682, 2014）。
松田（細胞分子生理学）は膵外分泌における Cl-チャネルに対するアデノシンの役割を検討し、アデノシン受容体が A キナーゼアンカータンパクと Cl-チャネ
ルと複合体を形成して膵液の分泌が調節されていることを示した。
これまで 150 年間治療できなかった難治性神経障害性疼痛の 1 つ、カウザル
ギー（末梢神経の損傷後に発症する激しい痛み）の患者が組織エンジニアリン
グによる再生治療で治ったことが最近報告された。伊藤は末梢神経の再生機構を明らかにして治療に役立てるために、神経組織にだけに緑色蛍光タンパクYFP を発現するマウスの坐骨神経を切断し神経再生のメカニズムを調べる末梢神経の神経再生モデルを確立した。この末梢神経再生モデルは、何か月にも及ぶ同一個体の神経再生を YFP の in vivo イメージングで追跡できる利点がある。
Na+濃度依存性 Na+チャネル Nax の遺伝子欠損マウスでは、末梢神経の再生が大幅に遅れ、チューブの中にブドウ糖の中間代謝物の乳酸を持続して供給すると、神経の再生速度が速くなった。Nax は末梢神経の支持細胞であるシュワン細胞に発現している。シュワン細胞は中枢神経のオリゴデンドロサイトとアストロサ
イトの 2 役をしており、シュワン細胞は再生神経の通り道を作るとともに末梢神経の神経線維に栄養を供給して神経再生を助けていることがわかった（図 12、Eur. J. Neurosci. 39:720-729, 2014）。さらに、この神経再生に血液の供給とエンド
セリンが深く関わっていることが明らかにされた。
藤澤（ウイルス腫瘍学）は HTLV-1 感染ヒト化マウスがその発症予防薬の評価系に有効であることを示した。ヒト臍帯血由来造血幹細胞の NOG-SCID マウス
への骨髄内骨髄移植によりヒト化マウスを作製した。その腹腔内に HTLV-1 産生細胞株を移入して、マウス個体内でヒト T 細胞への HTLV-1 感染と感染 T 細胞の異常増殖および脾腫・肝臓への転移等、成人 T 細胞白血病 (ATL) 様病態の誘導がみられることを示し、HTLV-1 感染のモデルマウスの作製に成功した (Blood
123:346-355, 2014) 。感染数ヶ月の末梢血において、ATL 細胞特異的な花弁様分様核を持ったリンパ球の出現も再現された。さらに、藤澤は確立した HTLV-1
感染ヒト化マウスの系を用いて Tax ペプチドワクチンにより活性化された抗TaxCTL が ATL の発症制御に主要な役割を果たしていることを明らかにして、感染細胞内でのウイルスと宿主遺伝子の発現と宿主免疫系との相互作用の変化
が ATL 発症の転機となる可能性を示した。さらに、Tax ペプチドワクチンの経鼻投与でも皮下注射と同様な効果があることを示した。
PI3K-mTOR 経路は細胞の増殖・分化・生存を制御する細胞内シグナル伝達経路であり、種々のがん組織においてその異常が報告されている。松田（生体情報）は mTOR 経路の中でも、特に細胞増殖と密接に関わる mTORC1 経路に着目し、mTORC1 シグナルに必須なアダプター分子である Raptor 分子の細胞系譜特18

異的欠損マウスの樹立に取り組んだ。Raptor 分子を T 細胞系列特異的に欠失させたところ、胸腺細胞数の減少は認められず、末梢のヘルパーT 細胞の機能分化が部分的に阻害された。一方、樹状細胞系譜特異的に Raptor 分子を欠損させると、腸管における従来型樹状細胞の IL-10 産生能の低下と、それに伴う腸管免疫応答の異常亢進が観察された (J. Immunol. 188:4736-4740, 2012) 。2014 年には、造血系幹細胞を欠損させると、胸腺分化の初期に相当する DN1 と DN2 の段階で分化が停止すること、急性 T 細胞白血病の発症に mTORC1 が必要であることから、mTORC1 が急性 T 細胞白血病の標的分子となることを示した (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 111:3805-3810, 2014) 。さらに、2015 年には B 細胞の初期分化に
mTORC1 が重要であることを明らかにした。このように、松田は世界に先駆けて細胞系譜特異的 Raptor 欠損マウスを樹立し、従来は薬剤を用いて解析されてきた mTORC1 シグナルの重要性を次々と個体レベルで検証することに成功した。
高橋（眼科学）は脈絡膜新生血管モデルを作製して、マイクロスフェアによる血管新生の抑制作用の解析を行った。
李（モデル動物）は MICD の事業推進者の研究を支援するために CRISPR/Cas9を使用した遺伝子改変マウスの作製に取り組んだ。
６．診断・治療法の開発と臨床応用
池原は加齢に伴って発症する難病には免疫の異常が関与しており、骨髄内骨髄移植だけでなく胸腺の移植の併用が重要であることを示した。さらに、加齢に伴って発症する疾患は、骨髄の造血幹細胞ではなく、間葉系の幹細胞の異常に起因することを見出した。新しい骨髄移植のヒトへの応用を目指して野村（内科学第 1）と飯田（整形外科）との共同研究を行った。
中谷ら（脊髄再生医学）は先行プロジェクトで、頸髄損傷による四肢完全麻痺の 5 症例に実施した培養自己骨髄間質細胞の髄腔内投与による臨床試験成績をまとめた。これまでのところ最長 4 年間を経過しているが、血液生化学検査
あるいは画像診断で、何ら骨髄細胞移植によると思われる有害反応は無く、機能的には 1 症例で歩行可能、1 症例で装具にて起立保持可能、2 症例にて車椅子の自己操縦可能と 4 症例で症状の改善を認めたが、1 症例のみは無効であった。
骨髄細胞の髄液内投与は、有害反応が全く見られず、安全性が確認できた。
がんの血管侵襲、切除断端部のがん遺残、そして主腫瘍よりのリンパ節転移を手術中に正確に診断して、手術でがん組織を確実に取り切ることが極めて重要である。權、海堀（外科学）は臨床で使用が認可されている蛍光イメージン
グ試薬 indocyanine green (ICG) および 5-aminolevulinic acid (5-ALA) 蛍光法を術
中ナビゲーターとして用いる肝臓手術を実施した。48 症例の肝がん手術において、がん検出における感度・特異度・正診率は ICG 96%、50%、94%、5-ALA は57%、100%、58%であり、ICG は感度が高いが特異度が低く、また 5-ALA はその逆であった。48 症例中 5 症例で術前の画像診断や術中視触診で検出できなかった微小肝がんが ICG と 5-ALA いずれでも検出された。ICG および 5-ALA 蛍
光による術中ナビゲーションは、肝がん検出の感度・特異度を相互に補完し、さらなる微小肝がん検出の有効性が期待できることを示した。
人工股関節、人工膝関節、人工骨頭手術後に人工関節の感染やゆるみによりインプラントを抜去する症例がある。その感染細菌を同定して、早期治療に反映させることはやりがいのある課題であるが、バイオフィルムのため細菌の同定は容易でなかった。また、培養による細菌の同定には最低 5 日から 10 日必要
で早急に治療に反映させるために、検出感度の高い検査、診断が必要であった。
飯田（整形外科）は、超音波処理法を用いて生菌の検出感度を上げると共に、
19平成 27 年 6 月に次世代シークエンサーを購入して、PCR と次世代シークエンサ
ーによる診断法の構築を行っている。
次世代シークエンサーは、様々な病態や生命現象に関与し、比較的安定なマ
イクロ RNA の網羅的な解析にも威力を発揮する。赤根（法医学）は、死後も残存するマイクロ RNA を法医実務にバイオマーカーとなりうるか検討を行った。
手術による外科的侵襲の 1 つに炎症性ストレスがある。新宮（麻酔科）は手術で使用される静脈麻酔薬プロポフォールとデクストデトミディンに抗炎症作用があることを見出した。個々の麻酔薬の特性を周術期に使い分けて患者の予後の向上の必要性を示した。
下條（分子生体機能学）は神経特異的転写抑制因子 (REST/NRSF) のアイソフォーム sREST の発現が小細胞肺がんの発病と関連すること、この選択的スプラ
イシングを促進するタンパク nSR100 が小細胞肺がん細胞に強く発現し、sRESTの発現に関与することを見つけた。がん関連コンソーシアムで臨床系講座と共同研究を行い、nSR100 の発現を抑制するマイクロ RNA が小細胞肺がん患者血清中に存在することを明らかにした。nSR100 の遺伝子発現抑制を評価する invitro アッセイ系を構築して、その診断薬と治療薬の開発に関する特許を出願した（特願 2013-118649）。この特許出願は日本医療研究開発機構 (AMED) の創薬支援ネットワークの平成 27 年度の支援テーマとして「小細胞肺がん治療薬を目的とした核酸医薬の探索」の採択につながった。
最近、悪性腫瘍の薬物治療には分子標的治療薬が用いられるようになってきている。蔦（臨床検査学）は、標的分子の細胞膜での発現を正確にかつ高感度で判定するために、ダイナミックレンジの広い蛍光ナノ粒子染色による診断法の開発を進めている。
澤田、谷川、宇都宮（放射線科学）は RI イメージングルームに設置された小動物用 SPECT/ CT 装置を用いて固形がんに対する RI 標識抗体による早期イメー
ジング診断剤や治療薬の開発の基礎研究に取り組んだ。担がんモデルマウスに
67
Ga 標識 Her2 抗体（乳がん）、90Y 標識 CD38 抗体（多発性骨髄腫）、抗フェリチン抗体（腫瘍全般）を投与して、その体内動態を調べ、90Y 標識 CD38 抗体
が移植した腫瘍に集積することを示した。肝放射線塞栓術を確立するために、90Y
リピオドールを家兎肝転移モデルに投与してその延命効果を示した。
樹状細胞 (dendritic cell:DC) はサイトカイン産生を亢進させ、ナイーブな CD4
陽性 T 細胞をプライミングして免疫応答を活性化させるマスター細胞で、様々な炎症性疾患の病態発症･進展に重要な働きをする。野村と伊藤（内科学第 1）は、免疫炎症応答の亢進に樹状細胞と血小板のクロストーク機構に関する新しい視点を示した。上皮から産生される胸腺間質リンパ球増殖因子 (TSLP) と DCの相互作用はアレルギーにおける Th2 反応を引き起こすのに重要である。これまで知られていなかった血小板のアレルギー免疫応答調節機序として活性化された血小板が TSLP で活性化された DC によるケモカインの産生を増加させ、アレルギー性炎症を増幅させることを初めて報告した。野村は上皮が産生する
IL-33 が Th2 による炎症反応を誘導維持させる TSLP-DC 軸の正の調節因子であることを示し、血小板と IL33 がアレルギー治療の標的となる可能性を示した。
さらに、高脂血症薬スタチンが培養細胞系で TSLP-DC 軸を抑制してアレルギー抑制効果を示すこと明らかにして、臨床応用への可能性を示唆した。
楠本（形成外科学）は多血小板血漿による病的創傷治癒促進、脂肪組織由来
幹細胞の組織再生の基礎研究を行い、脂肪組織由来幹細胞を用いた乳房再建や多血小板血漿の臨床応用を目指している。
20

II. Research activities in Molecular Imaging Center of Diseases
The 5-year project “Systematic elucidation of pathogenesis and development of
diagnosis and treatment by molecular imaging” was carried out at Takii campus in
2011-2012 and Hirakata campus in 2013-2015. On the occasion of consolidating thecampus in Hirakata in April 2013, to promote collaborative research and translational
research from basic to clinical medicine such as early diagnosis and treatment, westarted three activities: a cancer-oriented consortium, a regenerative medicine
consortium, and lunch-time research talks among basic medical departments. At thattime we established Molecular Imaging Center of Diseases (MICD) on the 5th floor of
the north wing of the Hirakata campus and assigned a lab assistant in it. As the resultof promoting collaborative research with other laboratories in Japan and abroad, theproject has progressed satisfactorily, as evidenced by the publication of more than 250
papers in foreign journals including Cell, Nature, Nat. Cell Biol., Nat. Neurosci., Nat.
Commun., Neuron, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Sci. Rep., J. Biol. Chem., Neuron, J.
Neurosci., Eur. J. Neurosci., J. Immunol., Blood, and J. Gastroenterol. Our research
activities have been three times evaluated in situ at the 1st, 2nd and final annual meetingsand documantary evaluation of the 5-year research activities by advisory board
members of MICD. This section picks up 6 topics of research activities by all 36 core
members in MICD and the excellent achievements matched to the objectives to MICD
have been introduced with figures in the front. Detailed achievements by individual
core members at the Hirakata campus are included in Supplementary Information 10
and 11 of this report. Please refer those conducted at the Takii campus to MICD
Interim Report 2011-2012. These Interim Report 2011-2012 and MICD Research
Reports 2011-2015 are publicized on the internet (http://micd.kmu.ac.jp/).
1. Identification of tissue stem cells
In this project, aiming the application of cell transplantation and regenerative
medicine and the development of cancer therapy, we attempted to identify tissue stem
cells in various tissues in mice and humans and elucidate a mechanism of transition tocancer stem cells at multiple aspects. The filiform papillae of the tongue are one of thetissues with most rapid turnover rates in the mammalian body and lingual keratinizedepithelial cells are thought be the source of squamous cell carcinoma of the tongue.
Ueno (Stem Cell Pathology) showed that stem cells positive for Bmi1, keratin 14 andkeratin 5 are present in the base but not at the very bottom of the interpapillary pit andthat one stem cell per interpapillary pit survives for a long term. While the cells areusually in a slow-growing or resting state, they entered the cell cycle upon
irradiation-induced injury and regenerated tongue epithelium. The elimination of
Bmi1-positive stem cells significantly suppressed the regeneration. Taken together,
Ueno reported that the stem cells identified by using a multicolor lineage tracing
method established by himself are important for tissue maintenance and regeneration of21

the lingual epithelium (Fig. 1, Nature 464:549–553, 2010; Nat. Cell Biol. 15:511-518,
2013). Furthermore a novel lingual epithelial organoid culture system was establishedfrom lingual epithelial cells and Bmi1-positive stem cells using a three-dimensional
matrix. Ueno observed that organoids in culture could be engrafted and maturate in
the tongue of recipient mice and that the organoids generated from carcinogen-treatedmice had an abnormal configuration (Fig. 2, Sci. Rep. 3:3224, 2013). Thus Ueno
succeeded in the establishment of multicolor lineage tracing method applicable toidentification of intestinal stem cell such as tongue and colon, generation andmaintenance of testis mentioned below and analysis of cancer development in live
tissues in vivo.
A mouse homologue of Drosophila ovo, Ovol2 identified by Ito’s group(Molecular and Functional Biology) is a zinc finger transcriptional factor and expressedin embryonic stem cells. Although Ovol2 knockout mice are lethal as a result of
defects in extraembryonic and embryonic vascularization, neural tube and heart
formation, epidermis-specific conditional Ovol2 knockout mice revealed its exact invivo roles in the skin. Ovol2 as well as Ovol1 is expressed in progenitor cells of theepidermis and hair follicles.
Simultaneous ablation of transcriptional
repressor-encoding Ovol1 and Ovol2 (DKO) blocked terminal differentiation ofembryonic epidermal progenitor cells and resulted in expansion of the basal/spinouscompartments. DKO embryos lacked a functional permeability barrier due toimmature cornified layer, as illustrated by persistent dye penetration (Fig. 3, Dev. Cell
29:47-58, 2014).
In adult mice, Ovol2 is strongly expressed in the testis.
Ito prepared
Ovol2-specific antibody and revealed that Ovol2 expression is restricted to the XY bodyin mouse and human spermatocytes at the pachytene stage. These results suggested
that Ovol2 plays an important role in the XY body during spermatogenesis, possibly inthe processes of XY body formation and meiotic sex chromosome inactivation (Fig. 4, J.
Androl. 33, 277-286, 2012; Andrologia, in press, 2016). Ueno reported that Bmi1 is aseminiferous stage-dependent marker for long-term germ stem cells and that
Bmi1-positive cells play important roles in maintaining germ stem cells and inregenerating spermatogenic progenitors after injury by the multicolor lineage tracing
method (Sci. Rep. 4:6175, 2014).
Azoospermia or severe oligozoospermia is a major cause of male infertility.
Testosterone is one of the androgens synthesized from cholesterol as a precursor in the
Leydig cells of the testis could be visualized in the testis after derivatization with
Girald’s T reagent by imaging mass spectrometry. One hour after i.p. injection ofhuman chorionic gonadotropin, the biosynthesis of testosterone was observed in Leydig
cells and testosterone released from Leydig cells was distributed in the inside of theseminiferous tubules (Fig. 5, Anal. Bioanal. Chem. in press, 2016).
Lamins are thought to be implicated in normal morphogenesis andcell-differentiation. In the nervous system, their abnormality causes neurodegenerative
22

diseases such as Hutchinson-Gilford Progeria syndrome and leukodystrophy. Yamada(Regenerative Neural Medicine) investigated the expression patterns of lamin isotypes
in the adult neural tissues. In the neurogenic regions of adult rat brain, the lamins are
involved in cell differentiation by changing the composition of lamin isotypes fromneural stem cells, progenitor cells to mature neurons. Yamada also showed thatneuronal precursors in the subventricular zone (SVZ) are tightly regulated and required
stimuli stronger than those in the subgranular zone (SGZ).
Nishiyama and Kanda (Public Health) focused on the identification of tissue stem
cells in the pituitary and auditory pathway. The population of side population (SP)cells possessing sphere formation was about 1% of cochlea nuclei prepared from
3-week-old mice and decreased by aging. SP cells were characterized by gene
expression. Next, Kanda identified and characterized tissue stem cells in the inferior
colliculi which integrates sound information in the central auditory neural pathway anddemonstrated that Promin-1 is a marker of neural stem/progenitor cells present in theinferior colliculi which can be differentiated into both neurons and glia by its induction.
Sonoda (Stem Cell Biology) developed a highly effective isolation method ofmouse bone-derived very small embryonic-like (VSELs) phenotypic stem cells, namedbone-derived small cells (BDSCs), using enzymatic treatment of murine bone andFACS. Then he succeeded in isolation of BDSCs with 50-100 efficiency as comparedwith the conventional method. BDSCs were small (6~7 µm) and possessed a relatively
large nucleus surrounded by a narrow rim of cytoplasm. Moreover, these BDSCs
could differentiate to hematopoietic cells in vitro.
Very interestingly, theytransdifferentiated to hepatocytes in vivo after transplantation to syngeneic mice withmassive liver injury (Stem Cells Dev. 25, 27-42, 2016). Sonoda also developed ahighly effective isolation method of human BDSCs from human bone for future
possible clinical application.
In parallel, Sonoda established human bone++marrow-derived CD271 SSEA-4 mesenchymal stromal cells (DP-MSCs) andcharacterized their functions by co-culture with CD34-negative (CD34-) very primitive
hematopoietic stem cells (HSCs). DP-MSCs could support CD34- HSCs in the
co-culture system and CD34+ HSCs were efficiently produced (Stem Cells 33,
1554-1565, 2015). Based on these data, Sonoda is now developing an efficient ex vivo
expansion system for human CD34+ HSCs.
Shiojima (Internal Medicine 2) developed a method to effectively mobilize cardiac
stem cells into peripheral blood via upregulation of hepatic growth factor. Human
cardiac stem cell-like cells that are capable of differentiating into multiple cell types in
the heart was previously shown to be mobilized into circulation during open heart
surgery. In this project, Shiojima found that intravenous infusion of heparin mobilized
cardiac stem cells in peripheral circulation and demonstrated that heparin released
hepatocyte growth factor bound to extracellular matrix into circulation, which induced
the mobilization of cardiac stem cells.
Okazaki (Internal Medicine 3) determined the phosphorylated Smad2/3 at Thr220
23

/Thr179 (pSmad2/3L-Thr) as a novel and useful marker of epithelial stem (orprogenitor) cells around crypt bases in small intestine and colon. pSmad2/3L-Thrpositive cells were located adjacent to actively proliferating cells and not
immunostained with Ki67, a proliferating marker of cell cycle in various animal models.
pSmad2/3L-Thr-explessing cells were slow-cycling cells and increased concurrent withhyperplastic changes in the regeneration phase of DSS-induced colitis. Associatedwith the regeneration and recovery, pSmad2/3L-Thr-positive cells markedly increasedin crypto bases of the digestive tract and tubular complex of the pancreas.
2. Analyses of molecular dynamics, cellular function and pathogenesis by
two-photon microscopyWith two-photon imaging using the lymph node tissue slice method, Kinashi(Molecular Genetics) revealed that high-speed interstitial migration of T cells requires
adhesion through LFA-1 and ICAM-1 (Fig. 6). Small GTP-binding protein Rap1
regulates adhesive processes during lymphocyte trafficking mediated by integrins
through its receptor RapL and its downstream molecule Ste20-like kinase Mst1. Since
antigen-specific suppressive functions of regulatory T cells were impaired in Mst1-/mice, Kinashi demonstrated that Mst1 has a key role in regulating self-antigen
recognition by thymocytes in the medulla (Nat. Commun. 3:1098, 2012). Kinashi
confirmed that MST-/- naive T cells showed defective antigen-specific adhesive structure,i.e. immunological synapse on the lipid bilayer displaying peptide-MHC and ICAM-1
and demonstrated that Mst1 is required for high-affinity LFA-1 through kindlin3.
Thus from two-photon microscopic analyses using in vitro and tissue slice system,
fibroblastic reticular cells that express ICAM-1 and constitute the T cell zone play a
critical role in rapid, directional migration of T cells. Autoimmune-like symptoms
became evident with aging in Mst1-/- mice due to impaired thymocyte selection (J.
Immunol. 191:1188-1199, 2013; Sci. Signal. 7:ra72, 2014).
Noxious and non-noxious stimuli are conveyed by primary afferent fibers which
form synapses with spinal neurons, processed in network of dorsal horn of the spinal
cord, transmitted to the cortex, and recognized as pain and touch, respectively. To
clarify how sensory reception from the periphery is processed in the spinal cord, Ito andMatsumura (Molecular and Functional Biology) have analyzed spinal responses
morphologically and functionally using two-photon microscopy and fluorescentprotein-expressing mice. Morphological alterations of spines in the neurites of the
spinal dorsal horn rapidly occurred after inflammation in the foot and leg via activationof AMPA and NMDA receptors by using thy1-YFP mice expressing fluorescent protein
specific to the nervous system (Fig. 7, Eur. J. Neurosci. 41:989-997, 2015). Ito andNishida expanded the two-photon microscopic research of in vivo structural imaging toin vivo functional imaging in the spinal cord by the intrauterine gene transfection
method. While in vivo patch clamp can analyze a cellular response in only one spinal
neuron, two-photon microscopy could analyze it in around 100 cells simultaneously andfor more than 6 h in vivo. Ito applied thermal, mechanical and touch stimuli to the skin24

of mice expressing the Ca2+ indicator protein YCnano50 in the spinal cord andsucceeded in making a temporal and spatial map of the stimulus-response of spinal
neurons to different stimuli (PLoS One 9:e103321, 2014).
3. Molecular imaging methods of candidate molecules related to diseases byimaging mass spectrometry
Neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease andamyotrophic lateral sclerosis are caused by loss of function due to neuronal death.
Pathological changes were examined in postmortem brain of patients or tissue samples
of model animals. Imaging mass spectrometry (IMS) is a gradually prevalent tool for
analysis of small molecule distribution in the field of neurochemistry. Yao (Molecularand Functional Biology) optimized analytical conditions such as matrix, ionization,quick sampling of materials, and laser intensity and first succeeded in imaging of ACh
by IMS showing that its distribution was coincident with that of the degrading enzyme
ACh esterase in rat brain (Fig. 8, Anal. Bioanal. Chem. 403:1851-1861, 2012). Since
IMS measures the ACh content of synaptic vesicles in the axon terminals, different
from measurement of a metabolite of released ACh from synapses, its detection of AChwill be useful to analyze animal models and postmortem brain samples of patients withneurodegenerative disorders such Alzheimer’s disease.
To establish molecular imaging of pathological samples on glass slides by IMS,
Kwon (Surgery) and Yao applied the IMS technique to formalin-fixedparaffin-embedded samples to identify a molecule responsible for the intestinal
obstruction. After the deparaffinization and enzymatic digestion, they identified it asamylopectin by the IMS. This result was confirmed by PAS staining, iodine, and MS
and MS/MS analysis of authentic amylopectin.
The IMS imaging ofparaffin-embedded tissue samples will expand its application to pathological diagnosis.
Yamada (Regenerative Neural Medicine) identified the monoclonal antibody O4
used for an oligodendrocyte marker for a long time, as sulfatide by IMS and confirmed
by mice lacking cerebroside sulfotransferase, an enzyme of sulfatide biosynthesis.
The sulfatide with short chain fatty acids was shown to regulate early oligodendrocyte
development.
There are two types of melanin in the skin: photoreactive pheomelanin andphotoprotective eumelanin. While melanocytes of mice are present in the dermis,
human melanocytes are present in the epidermis. Okamoto (Dermatology) produced
photoreactive mice derived from stem cell factor transgenic mice, which are suitable forphoto-biological tests in humans. Neither melanin, eumelanin nor pheomelanin was
detected in the skin of the mice by mass microscope, because melanin is a polymer ofsmall molecules and could not be ionized by pretreatment and matrices used.
It is well known that endogenous digitalis-like substances (EDLS) are produced
upon sodium loading in rats and humans and it is assumed to be a cause of hypertension
related to excess intake of sodium for many years. Since EDLS are structurally similar
25

with the similar molecular weight, it was difficult to identify them
immunohistochemically with specific antibodies. Takahashi (Clinical Sciences andLaboratory Medicine) found marinobufotoxin and marinobufagenin as candidates of
EDLD and detected the authentic samples at as low as a few pg by IMS. However,
EDLS could not be detected in cells and tissues such as adrenal and hypothalamus.
Although the IMS enables us to analyze small target molecules including lipids,
neurotransmitters, metabolites, it took much time to optimize the analytical conditions
such as ionization efficiency, increasing signal/noise ratio, and identification of MS
fragments and specialized knowledge was required for obtaining reliable data.
Atomic force microscopy (AFM) has gained recognition as an imaging tool forsurfaces of various materials ranging from solids to soft biological materials. Kihara,
Kusumoto and Kageshima (Physics) have tried to analyze structure and dynamics ofsolid-liquid interfaces and water response, conformation change of peptides andproteins and organelles by soft X-ray microscopy and AFM.
4. Analysis of brain functions in mice and monkeys and clinical research
The striatum is innervated from various regions of cerebral cortex including frontal
cortex and regulates the order of behaviors, evaluation, and integration of information.
Sugimoto (Anatomy and Brain Science) characterized the lateral region of the striatum
by GRP155 immunoreactivity and in situ hybridization of glutamate decarboxylase(GAD) 1 isoforms. GRP155 was predominantly expressed in the medium spiny
neurons that contain D1 dopamine receptors and GRP155-expressing neurons were in
charge of the direct pathway by which information from sensory-motor cortex transmits
to the output portion of the basal ganglia.
The role of the basal ganglia in decision making in face of both appetitive andaversive options has been clarified focusing on the dopaminergic neurons of thestriatum. Nakamura and Isoda (Cognitive Neuroscience) analyzed cognitive processes
in the monkey (Nat. Neurosci. 15:1307-1312, 2012; J. Neurosci. 35:6195-6208, 2015).
Nakamura demonstrated that the stress impaired the reward-based decision making
process by the neuronal mechanisms involving the basal ganglia. The value of one’s
own reward is influenced by a reward to others. Electrophysiological recordings inmonkey brains showed that medial prefrontal neurons coded self-reward informationand other-reward information, whereas midbrain dopamine neurons coded a subjective
value of one’s own reward. These studies using monkeys are steady for analyzing
various contexts of behaviors and open a new way to clarify the connection between
prefrontal cortex and the limbic system that has been now revealed by fMRI.
Parkinson’s disease is a neurodegenerative disease presenting progressive motor
dysfunction such as tremor, akinesia and rigidity and is caused by dopaminergic
neuronal loss in the substantia nigra pars compacta. Kusaka (Neurology) focused on
the analysis of inclusion body in the postmortem brain of neurodegenerative diseases in
the first half of the project and elucidation of pathogenesis of Parkinson’s model rats
26

and levodopa-induced dyskinesia rats in the second half of the project.
It remains unknown how more than 1000 odorant receptors reported by the Nobel
Prize laureate R. Axel bind to 100000 odorants and these signals are transmitted andintegrated in the brain. Since the sensitivity of smell molecules is varied amongindividuals, emotion and behaviors induced by smell have been considered to becontrolled by learned mechanism. Kobayakawa (Functional Neuroscience) revealed
that fear induced by odorant molecules are separated into inert and learned informationand transmitted to the brain via separate pathways (Proc. Natl. Acad. Ski USA
112:E311-E320, 2015). Furthermore, by using optogenetics, pharmacological genetics,
and in vivo fiber photometry system, Kobayakawa revealed that serotonin receptor
2A-expressing cells in the central amygdala control the hierarchy of the innate andlearned fear, prioritizing innate fear over learned fear (Fig. 9, Cell 163:1153-1164,
2015). These results suggest that smell is induced by the binding of odorant molecules
to their receptors like hormone and that it is not always recognized by a pattern of many
odorants. Since there are many drugs for mental disorders which serve as odorants, apossibility that administration of a drug that alleviates learned fear may worsen innate
fear. It is important to dissect and analyze the contribution of innate and learned
systems in mental disorders and prescribe appropriate drugs for the treatment.
In humans, noninvasive MRI is a powerful tool to analyze brain functions.
Mirror neurons are known to contribute to creating a sense of intimacy and their
dysfunction is considered to be one of the core deficits of socially isolating disorders.
Kinoshita and Saito (Neuropsychiatry) succeeded in the fiber tracts containing mirror
neurons of patients and healthy control by diffusion tensor imaging in collaboration
with Psychiatry Neuroimaging Laboratory of Harvard University and aimed to evaluate
their disorders before and after psychoanalytical treatment.
5. Establishment of disease animal models toward elucidation of pathogenesis anddevelopment of diagnosis and treatment
Different from stiff and strong collagen fibers, elastic fibers, one of extracellularmatrix, are ones with flexibility and elasticity. Although latent TGFβ binding protein
4 (LTBP4) is one of the LTBP family proteins, which bind to inactivate and store it in
the extracellular matrix, Nakamura and Akamai (Molecular Pharmacology) found thatamount of LTBP4 protein was greatly decreased in the skin of old donor. LTBP4
mutant mice had stiff, tortuous artery with inelastic property, indicative of arterysclerosis. By fiber formation assay on primary cultured human dermal fibroblasts,
recombinant LTBP4 protein in the culture medium of LTBP4-deficient fibroblast cells
restored elastic fiber meshwork formation in the cells in a dose-dependent manner.
Nakamura concluded that LTBP4 protein is a rate-limiting factor for elastic fiber
formation in the cultured cells and suggested that LTBP4 is a target molecule of elastic
fiber restoration (Fig. 10, Proc. Natl. Acad. Sci. 110: 2852-2857, 2013). While micro
fibrils, an extracellular matrix, provide a scaffold for elastic tissues such as lung, aorta27

and skin, they themselves connect lens with ciliary muscle in the ciliary body of the eye.
Nakamura also found that LTBP2 knockout mice developed lens luxation caused by the
impaired formation of ciliary body, suggesting that they are an ideal animal model forcongenital lens luxation, ectopia lentis and glaucoma in human (Fig. 11, Hum. Mol.
Genet. 23:5672-5682, 2014).
Matsuda (Cellular and Molecular Physiology) analyzed the role of adenosine in
CFTR Cl- channel of exocytosis of the pancreas and demonstrated that adenosine
receptor control the secretion of pancreatic juice by forming the complex of the
A-kinase anchoring protein ezrin and CFTR Cl- channel.
Although there was no definitive treatment for this intractable burning pain
‘causalgia’ over 150 years since its discovery, it was reported to be treated by surgery
with in situ tissue engineering. To clarify the mechanism of peripheral nerve
regeneration and promote translational research, Ito (Molecular and Functional Biology)
established a mouse model of nerve regeneration in thy1-YFP mice expressing YFP
specific to the nervous system. This nerve regeneration model has an advantage ofchasing the process of nerve regeneration in vivo using the same operated mice for along period. Unexpectedly, we found that nerve regeneration was markedly delayed inmice deficient in Nax, a sodium concentration-dependent Na+ channel and the delay was
restored by the continuous supply of lactate, a metabolite of glucose. Nax was
expressed in Schwann cells. Schwann cells in the peripheral nerve play two roles ofastrocytes and oligodendrocytes in the central nervous system. Ito demonstrated that
Schwann cells accelerated nerve regeneration by energy supply to regenerated axons via
a lactate shuttle in addition to the supply of growth factors in the nerve tract (Fig. 12,
Eur. J. Neurosci. 39:720-729, 2014). Furthermore, endothelin and blood supply wereshown to need nerve regeneration.
Fujisawa (Viral Oncology) demonstrated that HTLV-1infected humanized mousemodel (hu-NOG) is useful for the evaluation of the efficacy of immunization against
HYLV-1 infection and leukemogenesis. Fujisawa succeeded in HTLV-1 infection in
hu-NOG generated by intra-bone marrow-bone marrow transplantation of human stem
cells (Blood 123:346-355, 2014). In infected cells, abnormal proliferation of infected
T cell with highly lobulated or flower-shaped nuclei, splenomegaly and infiltration to
the liver were observed. Fujisawa clearly showed that Tax-peptide vaccine was
effective in the suppression of leukemic growth of HTLV-1 infected T cells in hu-NOG.
In this humanized model, host immune system against HYLV-1-infected lymphocyte
plays a crucial role in maintaining the asymptomatic state of HHTLV-1-infected carrier
people. Furthermore for the development of the prevention of HTLV-1, intranasal
vaccination of Tax–peptide vaccine was found as effective as the subcutaneous
injection.
The phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-mTOR pathway is important for thedifferentiation, proliferation and survival of a variety of cells and is shown to beabnormal in various tumor cells. Matsuda (Cell Signaling) has focused on mTORC1
28

pathway and established mTORC1 signal-deficient mice lacking Raptor specifically incell lineage. While the decrease in number of thymocytes ware not observed, Th17
differentiation was impaired in T cell-specific deletion. In dendritic cell-specificdeletion, IL10 production from a certain type of dendritic cells in the gastrointestinal
tract was impaired, leading to uncontrolled inflammation in the intestine (J. Immunol.
188:4736-4740, 2012). In 2014, Matsuda demonstrated that the development of earl T
cell progenitors was impaired at the DN2 stage in Raptor deficiency in all tissues
including hematopoietic cells and suggested that mTORC1 is a target molecule for
acute T cell leukemia (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:3805-3810, 2014). In thesemice, the number of B cells was markedly reduced but the number of common
lymphoid progenitors was not decreased. B-cell specific deleted mice revealed thatmTORC1 signal plays an essential role in B cell development at pro-B cell stage in thebone marrow. Thus, Matsuda established Raptor deficient mice specific to cell lineage
serially and revealed its roles in vivo.
Takahashi (Ophthalmology) prepared type 1 choroidal neovascularization animalmodel and investigated the effect of microparticles on neovascularization in the model.
Lee (Model Animals) tried to establish the technology for generation of geneticallymodified mice using the CRISPR/Cas9-mediated genome editing to support researchersof MICD.
6. Development of diagnosis and treatment and clinical application
Ikehara (Stem Cell Disorders) proposed that incurable diseases withaging-associated symptoms are linked to abnormalities in the immune system, andsuggested that transplantation of both intra-bone marrow-bone marrow (IBM-BM) andthymus can be effective interventions in the treatment of autoimmune diseases andaging-associated symptoms. Ikehara also showed that these diseases were caused bybone marrow mesenchymal cells, but not by hematopoietic cells. For clinicalapplication of IBM-BM transplantation to patients, Ikehara collaborated with Nomura(Internal Medicine 1) and Iida (Orthopedic Surgery).
Nakatani (Spinal Cord Regeneration) summarized clinical research for thetreatment of spinal cord injury by intrathecal administration of cultured autologous bonemarrow stromal cells into the cerebrospinal fluid perfomed in 5 patients with complete
tetraplegia in the previous project. The patients were closely observed for 6 months
and further followed up for 1 to 4 years with no adverse responses in biochemical andradiographic examinations. Functional recovery was evaluated as remarkable for twopatients, gradual or limited for 2 and in vain for 1. This clinical study confirmed that
intrathecal administration of cultured autologous bone marrow stromal cells was safeand feasible for treatment of spinal cord injury.
It is quite important for surgical treatment of cancers to evaluate invasion of bloodvessels into tumor, remnant of tumor tissue after resection and metastasis of lymph
nodes accurately during operation. Indocyanine green (ICG) and the porphyrin29

precursor 5-aminolevulinic acid (5-ALA) have been approved as fluorescence imaging
agents in the clinical setting. Kwon and Kaibori (Surgery) evaluated the usefulness of
ICG and 5-ALA for intraoperative identification of latent small liver tumors with 48
patients. The sensitivity, specificity, and accuracy for detecting the preoperatively
identified main tumors were 96%, 50%, and 94%, respectively with ICG and 57%,
100%, and 58%, respectively, with 5-ALA. Five new tumors were detected by both
ICG and 5-ALA fluorescence imaging during operation. Although the sensitivity formain tumor detection was relatively high by ICG fluorescence imaging, the specificity
was high by 5-ALA imaging. Intraoperative fluorescence navigation by ICG and
5-ALA compensates the sensitivity and specificity for the detection of latent small liver
tumors and its usefulness can be expected.
Surgical insults may cause inflammatory stress. Shingu (Medical Control andStress Response) found that the intravenous anesthetic propofol and the selective
α2-adrenergic receptor antagonist dexmedetomide possessed anti-inflammatory
properties. Which anesthetic is selected in various clinical situations is important for
the improvement of prognosis of patients.
Orthopedic implants are removed because of aseptic loosening and prosthetic joint
infections of hip and knee. It was challenging, but difficult and inaccurate, to identify
microorganisms growing in biofilms for the diagnosis of implant-associated infections.
Since it takes at least 5 days to 10 days to identify microorganisms by conventional
culture, rapid examination with high sensitivity is required for early treatment following
diagnosis of implant-associated infections. Iida (Orthopedic Surgery) improved theextraction of microorganisms in biofilm by sonication and is now constructing a rapid
diagnostic system with next generation sequencer in a combination with PCR.
Next generation sequencer is useful for comprehensive analysis of microRNAs,
because they are involved in a variety of life phenomena and pathogenesis and rather
stable.
Akane (Legal Medicine) examined the possibility of microRNAs as
postmortem biomarkers with next generation sequencer.
A molecular target drug has recently come to be used for the medical treatment ofmalignant tumors. Tsuta (Pathology and Laboratory Medicine) developed a diagnosis
kit for malignant tumors using the phosphor integrated dot with high illuminance andhigh dynamic range, superior to conventional fluorescent dye.
Shimojo (Molecular and Functional Biology) found that expression of sREST, anisoform of RE-1 silencing transcription factor (REST/NRSF) was related to thepathogenesis of small cell lung cancer and that nSR100 involved in alternative splicingof REST was also expressed in a cell line of human small cell lung cancer. In
collaboration with clinical departments in cancer-oriented consortium, it was shown thatmiRNAs that inhibit nSR100 expression were present in patients with small cell lungcancer. Shimojo established an in vitro assay system for the evaluation of nSR100
expression and applied it for the development of diagnosis and drugs. “Search foroligonucleotides toward the treatment of small cell lung cancer targeting nSR100” was30adopted by a grant from Japan Agency for Medical Research and Development(AMED) in 2015.
Sawada, Utsunomiya, and Tanigawa (Radiology) were engaged in basic researchon developing radioisotope-labeled anti-cancer drugs for early diagnosis and treatment
with SPECT/CT instrument installed in Radioisotope (RI) imaging room of MICD.
RI-labeled anti-Her2 antibody, CD38 antibody, anti-ferritin antibody were examined forearly diagnosis for breast cancer, multiple myeloma, and all kinds of tumors,
respectively, and 90Y-labeled CD38 antibody was shown to be accumulated intransplanted tumors. 90Y-labeled lipiodol was also shown to be effective in liver
metastasis of solid tumors in rabbits.
Dendritic cells (DCs) are master cells in activating immune responses throughenhancing by cytokine production and priming naive CD4+ T cells and implicate in theprocesses of various inflammatory responses. Nomura and Ito (Internal Medicine 1)
provided new insights of the cross-talk between DC and platelets in enhancement of
immune inflammatory responses. Interaction of thymic stromal lymphoprotein(TSLP) and DCs plays an essential role in evoking Th2 responses in allergy.
Activated platelets enhanced chemokine production by TSLP-activated DCs. Nomura
also demonstrated that IL33 produced by epithelial cells works as a positive regulator of
TSLP-DC axis that initiates and maintains the Th2 cell-mediated inflammatory
responses and suggested that platelets and IL33 would be new targets for the treatmentof allergic disorders. Furthermore, Nomura suggested a role of statins, lipid loweringdrugs, in controlling the TSLP-DC axis and their therapeutic potentials for allergic
diseases.
Kusumoto (Plastic and Reconstructive Surgery) has been engaged in basic researchon wound healing and cytoskeletal changes of adipocyte-derived stem cells and focusedon its clinical application to breast reconstruction using adipocyte-derived stem cells
after resecting breast cancer.

31

Ⅲ. 研究基盤形成と若手研究者の人材育成
大学のキャンパス統合により、病態分子イメージングセンターは 2013 年 3 月に滝井キャンパスから枚方キャンパス北棟 5 階に移転した。基礎社会医学系講座、臨床系講座、一般教育の教室・研究室は中央棟の 10‐12、8‐9、2 階にあり、病態分子イメージングセンターには数分で行くことができる。共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡など従来からある多くの顕微鏡に加え、高度細胞機能解析イメ
ージングシステム、オールインワン顕微鏡は顕微鏡室（図 13 左上）に配置され、多光子励起顕微鏡に加え、新たに質量顕微鏡の部屋（図 13 左下）が設置された。
RI イメージング室は基礎研究を臨床応用するために設置され、2014 年 12 月に小動物用 SPECT/CT 装置が導入された。臨床系綜合研究施設は臨床系講座が共用できる実験室で、日本の医科大学ではユニークな施設である。研究を円滑、効率的に進めるために、管理運営を支援する技師を臨床系綜合研究施設に置いた。講座の枠を超えた共同研究が促進されることを期待している。

図 13．病態分子イメージングセンター（枚方キャンパス北棟 5 階）神経、がん、代謝の 3 部門の研究体制に加えて、本プロジェクト後半の到達目標である疾患横断的研究の相乗効果、基礎研究から臨床応用研究へのトラン
スレーショナル研究を推進するために、平成 25 年度から、１）がん関連コンソーシアム、２）再生医療コンソーシアム、３）研究トークランチの 3 つの新しい取組（図 14）をスタートさせた。
１）がん関連コンソーシアムはがん幹細胞の同定、がんの診断、治療、合併症に関する事業推進者のグループ間連携を目的としている。1. 癌診療と cancer
stem cell、2. 新規抗癌剤治療薬（TKI 等）に関する多科横断的研究、3. がん診
療と合併症に関する研究、4. 寄附講座開講に寄与する癌研究の 4 つのテーマで複数の臨床系講座ならびに基礎系講座が共同で行うテーマを募集した。平成 25
年度は 12 テーマ、平成 26 年度は 10 テーマを選び、平成 27 年度は 4 テーマに絞りこんだ。この研究成果は毎年開催される学術集談会（平成 26 年 2 月 14 日、
平成 27 年 3 月 13 日、平成 28 年 3 月 18 日）で報告された（参考資料 2）。
２）再生医療コンソーシアムは再生医療の基礎研究から臨床研究、臨床応用への橋渡しの会議を 3 ヶ月に 1 回再生医療コンソーシアム研究会を開催し、2 から3 の参加グループが研究紹介、討論を行った。平行して、グループ横断連携プロ
32

ジェクトを募集
し、それぞれ 2、3 のグループ横断連携プロジェクトを立ち上げた。平成 26 年度、27 年度は「弾性線維再生技術の開発」と「乳房切除と乳房再生」などが採択され、がん関連コンソ
図 14．病態分子イメージングセンターと 4 つの新プロジェクト
ーシアムと同じ
くその研究成果を学術集談会で発表を行った（参考資料 3）。
３）研究トークランチは平成 25 年 4 月 16 日から毎月 1 回、第 3 火曜日昼食時に開催し、研究紹介、プログレスレポートを主とする基礎研究の検討会である。
1 回に 2 つの基礎社会系講座が担当して、毎回 50－70 名の参加者がある。第 1
ラウンドは、基礎社会系講座の研究紹介を事業推進者が行い、第 2 ランド以降は研究分担者や若手研究者のプログレスレポート、各講座で行っている実験手
技の紹介を行い、講座間の意思疎通や共同研究の促進を図っている（参考資料 4）。
平成 25 年度に文部科学省から研究医枠の医学部定員増 2 名が認められ、学部に研究医養成コース（参考資料 5）を開設した。平成 26 年度から臨床系講座に講座内の研究推進、若手研究者育成・支援のために、事業推進者を補佐する研究医長制度（参考資料 6）を導入した。さらに、平成 27 年 4 月に臨床研究支援センターが設置され、臨床研究、トランスレーショナル研究の推進の支援体制が作られた。
病態イメージングセンターでは、センターの年次集会だけでなく、慶応義塾大学医学部岡野栄之教授（平成 24 年 3 月 21 日）と理化学研究所発生・再生科
学総合研究センター故笹井芳樹グループディレクター（平成 25 年 3 月 22 日）の特別講演会、平成 27 年度には中西重忠、長田重一、高井義美、竹市雅俊博士の大学院の総合講義と協賛して開催したのを含め、この 5 年間で招待研究者による講演会を 70 回以上開催した。共同利用研究施設による機器説明会、利用説明会を大学院総合講義の中に組み込み、実施した。さらに、学内学術集談会などの研究発表会での発表を通じて若手研究者の育成を図った。
この 5 年間の病態分子イメージングセンターを核とするさまざまな活動を通じて、徐々にではあるが、事業推進者が連携して共同研究、トランスレーショ
ナル研究、臨床研究の機運が生じてきた。枚方キャンパスにできた研究基盤形
成と人材育成の取り組みが新しいプログラム、研究所の基盤となると期待される。

33

III. Foundation of research base and cultivation of young researchersin Molecular Imaging Center of Diseases (MICD)MICD was moved from Takii campus to the 5th floor of the north wing of Hirakata
campus in March 2013. Laboratories belong to individual departments are located on
2 and 8-12 floors of the central building of Hirakata campus and researchers of all
departments can access to the MICD within a few minutes’ walk. Many conventional
microscopes such as fluorescent microscopes and confocal microscopes as well as
all-in-one fluorescence microscope are gathered in the microscopic room (Fig. 13, upper
left) and two-photon microscope and imaging mass microscope are set in respective
rooms (lower left) of the MICD. To translate basic research to clinical application,
SPECT/CT instrument was installed in RI imaging room (upper right) in December,2014. The idea of Clinical Central Research Laboratory (CCRL) (lower middle andright) is unique to Japanese medical schools and will promote the collaborative researchamong clinical departments. To proceed research smoothly and efficiently, a technicalassistant is arranged for management and maintenance of CCRL.

Fig. 13 Map of MICD on 5th floor of the north wing of Hirakata campus

To promote collaborative research beyond divisions of Neuroscience, Cancer andMetabolic Disorders, and translational research from basic to clinical medicine such as
early diagnosis and treatment, three activities started on the occasion of consolidating
the campus in Hirakata in April 2013 (Fig. 14). 1) Cancer-oriented consortium formsa group research concerning diagnosis, treatments and complications of cancer in clinic,
2) Regenerative medicine consortium which accelerates translational research frombasic to clinical research and will extend to the treatment by regenerative medicine, and
3) research talk at lunch where an outline of research and experimental data arepresented and discussed mainly by researchers of departments belonging to basic
medicine at lunch once a month.

34

Fig. 14 Management of MICD and 4 research activities of the University

1) Cancer-oriented consortium aims at promoting collaborative research among
departments concerning identification of caner stem cells, development of diagnosis andtreatment of cancer, and complications of cancer. Research grant for cancer-oriented
consortium was founded in 2013 and the application was classified into 4 themes: 1.
medical treatment and cancer stem cells, 2. group research on novel anti-cancer drugs(e.g. tyrosine kinase inhibitors), 3. study on cancer therapy and its complications, and 4.
cancer research contributing to opening endowed departments. In 2013 and 2014, 12
and 10 themes were chosen. In 2015 the themes were narrowed down to 4. The
research outcomes of the grants were presented at the annual academic meetings of the
University on February 12, 2014, March 13, 2015, and March 18, 2016 (Supplementary
Information 2).
2) Regenerative medicine consortium held a research meeting for promoting
translational research and clinical application every 3 months. The participating
departments introduced their research activities and discussed toward clinicalapplication. In parallel, research grant for it was founded and 2 to 3 research groups
were selected every year. “Development of regenerative technology for elastic fibers”
and “Surgical resection of breast cancer and breast restoration” were selected in 2014,2015. The outcomes were presented at the annual academic meetings of the University(Supplementary Information 3).
3) Research talk at lunch among basic medical science departments is held on the third
Tuesday of every month starting on April 16, 2013. Research outlines of departments,
progress reports or technical notes were introduced by researchers. Every time, 2
researchers present their work and 50-70 members attend the meeting. After 1st roundwhere chief investigators or professors outlined research themes and prominent resultsof the departments, senior members of the department and young researchers haveintroduced their own research or technologies useful for other researchers. Researchtalk at lunch is worthy to promote collaborative research and exchange information35

among young researchers. In 2016, this activity will expand to researchers in clinicaldepartments (Supplementary Information 4).
In 2013, 2 students were permitted to increase admission capacity as physician
scientist by the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology ofJapan and the training course of future physician scientists was established in the
Medical School of the University (Supplementary Information 5). In parallel, westarted a consortium of the training course of future physician scientists in liaison with
Nara Medical University, Osaka Medical College, Hyogo College of Medicine andKobe University Faculty of Medicine to foster research mind in medical students andcultivate young researchers of basic medical science.
In 2014, head scientific physicians were assigned in clinical departments forenhancing their research activities, and supporting young researchers and their meetingis held every month (Supplementary Information 6). In 2015, the Clinical Research
Support Center was established to assist clinical research.
In addition to the annual meetings of MICD, special lectures by Prof. Hideyuki
Okano (Keio University Faculty of Medicine) and Group Director the late Yoshiki Sasai(RIKEN Center for Developmental Biology) were held on March 21, 2013 and March
22, 2014. In 2015, Drs. Shigetada Nakanishi, Shigekazu Nagata, Yoshimi Takai and
Masatoshi Takeichi gave lectures for graduate students and MICD members. During
this 5-year project, 70 lectures were held by invited speakers including above mentioned
well-known researchers. Technical seminars were also held for researchers and graduate
students. Young researchers had an opportunity to give a talk at meetings including
annual meetings of MICD and academic meetings of the University.
As shown in Fig. 14, these 5 years MICD has centered various research activitiesof the University and collaborative research, translational research and clinical research
have been gradually cultivated and sprouted among researchers. This 5-year research
project will have served as a launch pad for a new program that continues research
initiated by the project and a new institute that will be established in the near future at
the Hirakata campus.

36

Ⅳ. 原著論文リスト

List of original articles

Division of Neuroscience 神経部門
Regenerative Neural Medicine 神経機能再生医学
1.

Koike, T. and Yamada, H. Diverse functions of Sox2 in the peripheral nervous system. J.
Kansai Med.Univ. 66, 7-11, 2015.
2. Koike, T., Wakabayashi, T, Mori, T., Hirahara, Y. and Yamada, H. Sox2 promotes survival ofsatellite glial cells in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 464, 269-274, 2015.
3. Takamori, Y., Wakabayashi, T., Mori, T., Kosaka, J. and Yamada, H. Organization and cellulararrangement of two neurogenic regions in the adult ferret (mustela putorius furo) brain. J. Comp.
Neurol. 522, 1818-1838, 2014.
4. Koike, T, Wakabayashi, T., Mori, T., Takamori, Y., Hirahara, Y. and Yamada, H. Sox2 in theadult rat sensory nervous system. Histochem. Cell Biol. 141, 301-309, 2014.
5. Cui, Y., Li, Q-H., Yamada, H., Watanabe, Y. and Kataoka, Y. Chronic degeneration of dorsal
Raphe serotonergic neurons modulates cortical spreading depression: a possible
pathophysiology of migraine. J. Neurosci. Res. 91, 737–744, 2013.
6. Hirahara, Y., Matsuda, K.I., Liu, Y.F., Yamada, H., Kawata, M. and Boggs, J.M. 17β-Estradiol
and 17α-Estradiol induce rapid changes in cytoskeletal organization in cultured
oligodendrocytes. Neuroscience 235, 187-199, 2013.
7. Hirahara, Y., Matsuda, K.I., Yamada, H., Saitou, A., Morisaki, S., Takanami, K., Boggs, J.M.
and Kawata, M. G protein-coupled receptor 30 contributes to improved remyelination after
cuprizone-induced demyelination. Glia 61, 420-431, 2013.
8. Kimura, T., Jiang, S., Nishizawa, M., Yoshigai, E., Hashimoto, I., Nishikawa, M., Okumura, T.
and Yamada, H. Stabilization of human interferon-α1 mRNA by its antisense RNA. Cell Mol.
Life Sci. 70, 1451-1467, 2013.
9. Mori, T., Wakabayashi, T., Hirahara, Y., Takamori, Y., Koike, T., Kurokawa, K. and Yamada, H.
Differential responses of endogenous adult mouse neural precursors to excess neuronal
excitation. Eur. J. Neurosci. 36, 3184-3193, 2012.
10. Wakabayashi, T., Kosaka, J., Mori, T. and Yamada, H. Prolonged expression of puma incholinergic amacrine cells during the development of rat retina. J. Histochem. Cytochem. 60,
777-788, 2012.
11. Wakabayashi, T., Mori, T., Hirahara, Y., Koike, T., Kubota, Y., Takamori, Y. and Yamada, H.
Nuclear lamins are differentially expressed in retinal neurons of the adult rat retina. Histochem.
Cell Biol. 136, 427-436, 2011.
Anatomy and Brain Science 脳構築学
1.

2.

3.

4.

5.

6.

Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M. and Sugimoto, T. Overview andassessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase
activity in transgenic animals. Anat. Sci. Int. 91, 56-67, 2016.
Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M. and Sugimoto, T. Glutamic aciddecarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in
the mouse brain. BMC Neurosci. 15, Article No.114, 2014.
Maruyama, M., Yamashita, Y., Kase, M., Trifonov, S. and Sugimoto, T. Lineage-specificpurification of neural stem/progenitor cells from differentiated mouse induced pluripotent stem
cells. Stem Cells Transl. Med. 2, 420-433, 2013.
Horie, A., Fujiwara, H., Sato, Y., Suginami, K., Matsumoto, H., Maruyama, M., Konishi, I. and
Hattori, A. Laeverin/aminopeptidase Q induces trophoblast invasion during human earlyplacentation. Hum. Reprod. 27, 1267-1276, 2012.
Trifonov, S., Houtani, T., Kase, M., Toida, K., Maruyama, M., Yamashita, Y., Shimizu, J. and
Sugimoto, T. Lateral regions of the rodent striatum reveal elevated glutamate decarboxylase 1mRNA expression in medium-sized projection neurons. Eur. J. Neurosci. 35, 711-722, 2012.
Hamada, S., Trifonov, S., Houtani, T., Kase, M., Yamashita, Y., Baba, K., Shimizu, J.,
Maruyama, M., Tomoda, K., Yamashita, T. and Sugimoto, T. Cholinergic fibers and muscarinic
receptors in the central auditory system. J. Kansai Med. Univ. 63, 7-9, 2012.
37

Cellular and Molecular Physiology 細胞分子生理学
1.

2.

3.
4.
5.

Okada, M., Corzo, G., Romero-Perez, G.A., Coronas, F. and Matsuda, H. Possani LDA pore
forming peptide from spider Lachesana sp. venom induced neuronal depolarization and pain.
Biochim. Biophys. Acta 1850, 657-666, 2015.
Okada, M., Andharia N., and Matsuda, H. Increase in the titer of lentiviral vectors expressing
potassium channels by current blockade during viral vector production. BMC Neurosci. 16,
Article No. 30, 2015.
Hayashi, M. and Novak, I. Molecular basis of potassium channels in pancreatic duct epithelial
cells. Channels (Austin), 7, 432-441, 2013.
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proliferation and myofibroblastic differentiation in human dermal fibroblasts. Ann. Plast. Surg.
71, 219-224, 2013.
16. Notodiharjo, F.Z., Kakudo, N., Kushida, S., Suzuki, K. and Kusumoto, K. Bone regeneration
with BMP-2 and hydroxyapatite in critical-size calvarial defects in rats. J. Craniomaxillofac.
Surg. 40, 287-291, 2012.
17. Kakudo, N., Kushida, S., Minakata, T., Suzuki, K. and Kusumoto, K. Platelet-rich plasma
promotes epithelialization and angiogenesis in a splitthickness skin graft donor site. Med. Mol.
Morphol. 44, 233-236, 2011.
18. Kakudo, N., Kushida, S., Suzuki, K., Matsumoto, N. and Kusumoto, K. The effect of C3
transferase on human adipose-derived stem cells. Human Cell 24, 165-169, 2011.
52

Ophthalmology 眼科学

1.
2.
3.
4.
5.

Kimura, M., Ogata, N., Shima, C. and Takahashi, K. Choroidal melanoma with massive
extraocular extensions through sclera. Clin. Ophthalmol. 6, 2081-2084, 2012.
Yoshikawa, T., Nishimura, T., Minamino, K. and Takahashi, K. A long-term follow-up of
peripapillary retinoschisis with optic disc hypoplasia. Int. Ophthalmol. 33, 425-428, 2012.
Matsuoka, M., Ogata, N., Matsuyama, K., Yoshikawa, T. and Takahashi, K. Intraocularpressure in Japanese diabetic patients. Clin. Ophthalmol. 6, 1005-1009, 2012.
Tateno, H., Taomoto, M., Jo, N., Takahashi, K. and Uemura, Y. Clinical and histopathologicalfeatures of a suspected case of fish-eye disease. Jpn. J. Ophthalmol. 56, 453-457, 2012.
Shima, C., Adachi, Y., Minamino, K., Okigaki, M., Shi, M., Imai, Y., Yanai, S., Takahashi, K.
and Ikehara, S. Neuroprotective effects of granulocyte colony-stimulating factor on
ischemia-reperfusion injury of the retina. Ophthalmic. Res. 48, 199-207, 2012.

Radiology 放射線科学

1.
2.
3.
4.

Kanno, S., Utsunomiya, K., Kono, Y., Tanigawa, N. and Sawada, S. The effect of radiation
exposure on multidrug resistance: in vitro and in vivo studies using non-small lung cancer cells.
EJNMMI Res. 5, 11, 2015.
Kono, Y., Utsunomiya, K., Kanno, S. and Tanigawa, N. Longitudinal time dependent effects ofirradiation on multidrug resistance in a non-small lung cancer cell line. Mol. Cancer Ther. 13,
2706-2712, 2014.
Kariya, S., Komemushi, A., Nakatani, M., Yoshida, R., Sawada, S. and Tanigawa, N. CO2
microbubble contrast enhancement in x-ray angiography. Clin. Radiol. 68, 346-351, 2013.
Nakatani, M., Tanigawa, N., Kariya, S., Komemushi, A., Yagi, R. and Sawada, S. Analysis offactors influencing accuracy and complications in CT-guided lung biopsy. Minim. Invasive Ther.
Allied Technol. 21, 415-422, 2012.

Clinical Sciences and Laboratory Medicine 臨床検査医学
1.

2.

3.

4.

Takahashi, H. Upregulation of the renin-angiotensin-aldosterone-ouabain system in the brain is
the core mechanism in the genesis of all types of hypertension. Int. J. Hypertens. 2012, 242728,
2012.
Takahashi, H., Yoshika, M., Komiyama, Y., and Nishimura, M. The central mechanism
underlying hypertension: a review of the roles of sodium ions, epithelial sodium channels, therenin-angiotensin-aldosterone system, oxidative stress and endogenous digitalis in the brain.
Hypertension Res. 34, 1147-1160, 2011.
Yoshika, M., Komiyama, Y. and Takahashi, H. An ouabain-like factor is secreted fromimmortalized hypothalamic cells in an aldosterone-dependent manner. Neurochem. Int. 59,
104-108, 2011.
Yoshika, M., Komiyama, Y. and Takahashi, H. Isolation of marinobufotoxin from thesupernatant of cultured PC12 cells. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 38, 334-337, 2011.

Pysics 物理学

1.
2.
3.

4.

Niiyama, Y., Tuji, A., Takemoto, K. and Ichise, S. Pseudanabaena sp. nov. and P. subfoetida sp.
nov. (Cyanophyta/ Cyanobacteria) producing 2-methylisoborneol from Japan. Fottea 16, inpress, 2016.
Takemoto, K., Yoshimura, M., Yamamoto, A., Ichise, S., Namba, H. and Kihara, H. Imaging of
musty-odor producing filamentous cyanobacteria by various microscopies, AIP Conf.
Proc.1696, 020024, 2016.
Ikegaya, H., Suzuki, S., Ichise, S., Furuta, S., Wakabayashi, S., Ohigashi, T., Bamba, D.,
Namba, H., Kihara, H., Kishimoto, N. and Takemoto, K. Estimation of organic carbon content
of the cyanobacterium synechococcus sp. by soft X-ray microscopy, Geomicrobiol. J. 32,
827-835, 2015.
Kageshima, M. Layer-resolved relaxation dynamics of confined water analyzed throughsubnanometer shear measurement, Eur. Phys. Lett. 107, 66001, 2014.
53

5.
6.
7.
8.

Matsumura, Y., Shinjo, M., Matsui, T., Ichimura, K., Song, J. and Kihara, H. Structural study ofhNck2 SH3 domain protein in solution by circular dichroism and X-ray solution scattering.
Biophys. Chem. 175-176, 39-46. 2013.
Takemoto, K., Usui, K., Ohigashi, T., Fujii, H., Yoshimura, M., Namba, H. and Kihara, H.
Improvement of cryogenic 3-dimensional observation system of soft x-ray microscope at theSR center of Ritsumeikan University. J. Physics Conf. Ser. 463, 012009, 2013.
Takemoto, K., Mizuta, G., Yamamoto, A., Yoshimura, M., Ichise, S., Namba, H. and Kihara, H.
Soft x-ray imaging of intracellular granules of filamentous cyanobacterium generating musty
smell in Lake Biwa. J. Physics Conf. Ser. 463, 012052, 2013.
Takemoto, K., Ikegaya, H., Yaji, T., Ichise, S., Ohta, T. and Kihara, H. Infrared
micro-spectroscopy observation of plantplankton with in lake biwa. Memoirs of the SR Center,
Ritsumeikan University, 14, 173-17. 2012.

54

Ⅴ. セミナー・シンポジウム・できごと
2011 年 9 月
滝井キャンパス 2 号館北棟 4 階生化学室 2 と北棟 3 階 光学顕微鏡室 3 に近赤外蛍光イメー
ジャーOdyssey system と HS オールインワン蛍光顕微鏡がそれぞれ導入されました。
2011 年 12 月 16 日
滝井キャンパスセミナールーム A にて Assist. Prof. Mino Mari Kenduson (Dept. of Pathology,
Massachusetts General Hospital) による「Pathological aspects of intrapancretic papillary mucosal
neoplasia (IPMN) in USA」
（岡崎和一教授司会）と題して大学院講座が開催されました。
2012 年 3 月 22 日
附属枚方病院 13 階講堂にて岡野栄之教授（慶應義塾大学医学部生理学教室）をお招きし、「iPS 細胞技術を用いた神経再生・疾患・創薬研究」（今村洋二枚方病院長司会、淀川リバ
ーサイズメディカルサポートプログラム・病態分子イメージングセンター共催）と題する
病態分子イメージングセンターキックオフ特別講演会が開催されました。ビデオ収録（ビデオはイントラネットのサイトで「病態分子」と検索すると見られます。
）
2012 年 3 月 27、28 日
滝井キャンパス 2 号館北棟 2 階 電子顕微鏡室に質量顕微鏡が設置され、利用希望者に講習会が開催されました。4 月 25、27 日にも講習会が開催されました。
2012 年 4 月 27 日
滝井キャンパス 1 号館大会議室にて General Manager David Sykes 博士 (Learning &Development, Alzheimer's Australia Victoria) による「Care for People with Dementia」、Heather
Hill 教授 (Dance-Movement Therapy Association of Australia) による「Dementia and Dance
Therapy」（三宅眞理講師司会）と題する大学院講義が開催されました。
2012 年 5 月 1 日
附属枚方病院 13 階講堂にて山本雅教授（沖縄科学技術大学院大学、前東京大学医科学研究所所長）、Min Zhuo 教授 (University of Toronto, Canada) 、John A. Hanover 博士 (Lab Chief,
NIDDKD, NIH, USA) を外部評価委員として、病態分子イメージングセンター第 1 回 Annual
meeting を開催しました。
2012 年 5 月 11 日
滝井キャンパス南館臨床講堂にて大学院総合講義、綜合研究施設利用講習会で矢尾育子講師（分子機能生態学）が「質量顕微鏡の応用例」を発表しました。
2012 年 5 月 18 日
滝井キャンパス南館臨床講堂にて大学院総合講義、ラジオアイソトープ実験施設利用講習会で飯田秀博部長（国立循環器病研究センター画像診断医学部）による「核医学分子イメージングにおける定量化について」（宇都宮啓太講師司会）と題した講演が行われました。
2012 年 6 月 18 日
滝井キャンパス精神医療総合センターにて藤川洋子教授（京都ノートルダム女子大学心理学部心理学科）による「英国、スウェーデンの触法発達障害者に対する治療と支援」（木下利彦教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2012 年 6 月 22 日
滝井キャンパスセミナールーム B にて近藤直幸博士（Emory 大学医学部小児科）による「膜融合を介した HIV の侵入と細胞融合のキネティクス宿主因子によるその調整」（木梨達雄教授司会）と題した大学院講座が開催されました。

55

2012 年 8 月 6 日
滝井キャンパスセミナーA にて高橋秀人研究員（British Columbia 大学脳研究センター精神医学講座）による「新規シナプス接着分子の探索と機能解析」（岡田誠剛講師司会）と題した大学院講座が開催されました。
2012 年 10 月 18 日
滝井キャンパスセミナールーム S にて齊藤峰輝教授（川崎医科大学微生物学教室）による「HTLV-1 等の慢性ウイルス感染症による中枢神経障害の発症機序」（藤澤順一教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2012 年 10 月 30 日
滝井キャンパスセミナーA にて Assist. Prof. Mino Mari Kenduson（Massachusetts General
Hospital 病理学講座）による「Ductal neoplasms of the pancreas：with an emphasis on molecularalterations」（岡崎和一教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2012 年 12 月 17 日
枚方病院第 3 会議室にて土岐彰教授（昭和大学医学部外科学講座小児外科部門）の「小児鼠径ヘルニアの超音波診断」（濱田吉則准教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2012 年 12 月 20 日
病態分子イメージングセンターの RI イメージングルームを含む RI 実験施設の使用許可証が交付されました。
2013 年 1 月 18 日
滝井キャンパスセミナールーム A にて近江谷克裕研究部門長（産業技術総合研究所 バイ
オメディカル研究部門）による「医療イノベーションを目指した光イメージングの最前線」（伊藤誠二教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2013 年 2 月～3 月
枚方学舎竣工により、病態分子イメージングセンターを滝井キャンパスから枚方キャンパスに移転しました。
2013 年 3 月 21 日
枚方病院第 1 会議室にて中村龍文准教授（長崎大学大学院医歯薬学総合研究科 感染免疫学講座 先進感染制御学分野）の「HTLV-1 関連脊髄症 (HAM) に対する新規治療戦略」（藤澤順一教授司会）と大原義朗教授（金沢医科大学医学部 微生物学講座）の「新しいウイ
ルス感染症～ヒトカルジオウイルスについて～」（藤澤順一教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2013 年 3 月 22 日
枚方病院 13 階合同カンファレンスルームにて笹井芳樹グループディレクター（理化学研究
所 発生・再生科学総合研究センター 器官発生研究グループ）をお招きし、「三次元培養
での幹細胞から機能的な器官の自己形成」（病態分子イメージングセンター主催、伊藤誠二
センター長司会）と題した特別講演会が開催されました。ビデオ収録（ビデオはイントラ
ネットのサイトで「病態分子」と検索すると見られます。）
2013 年 4 月 12 日
枚方学舎 5 階病態分子イメージングセンター 質量顕微鏡室にて質量顕微鏡講習会が開催されました。
2013 年 4 月 12 日
枚方学舎 4 階会議室 D にて笹栗靖之センター長（産業医科大学名誉教授・臨床研究推進センター、前第 2 病理学講座教授）の「臨床、基礎医学の研究における病理学的アプローチの有用性について」（伊藤誠二教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
56

2013 年 4 月 15 日
枚方学舎 1 階第 1 講義室にて岩井潤部長（千葉県こども病院小児外科）の「総排泄腔遺残症に対する Total urogenital mobilization（TUM）」（濱田吉則准教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2013 年 4 月 17 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて山本慎也室長（Baylor 大学医学部 Jan and Dan
Duncan 神経 研究 所 分子ヒ ト 遺伝 学 部門 ）の 「 Identification of novel genes in neuronaldevelopment, function and maintenance through forward genetic approaches in Drosophila」（矢尾育子准教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2013 年 4 月 17 日
枚方学舎 2 階第 4 講義室にて Tsvee Lapidot 教授（Weizmann 科学研究所免疫学講座）による「Regulation of normal and leukemic human stem cells」（薗田精昭教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2013 年 4 月 26 日
枚方学舎 1 階加多乃講堂にて神澤輝実博士（東京都立駒込病院）をお招きし、「自己免疫性
膵炎」（岡崎和一教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2013 年 5 月 24 日
枚方学舎 1 階加多乃講堂にてラジオアイソトープ実験施設利用講習会で鈴木正昭特任研究員（国立長寿医療研究センター脳機能画像診断開発部、前理科学研究所分子イメージング
科学研究センター副センター長）による「高速カップリング反応による短寿命 PET 分子プ
ローブの革新的合成法と生物学的活用」（伊藤誠二教授司会）と題した講演が行われました。
2013 年 6 月 15 日
枚方学舎 4 階中会議室にて山本雅教授（沖縄科学技術大学院大学、前東京大学医科学研究所所長）、Min Zhuo 教授 (University of Toronto, Canada) 、John A. Hanover 博士 (Lab Chief,
NIDDKD, NIH, USA) を外部評価委員として、病態分子イメージングセンター第 2 回 Annual
meeting が開催されました。
2013 年 6 月 25 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて Ethan Bromberg-Martin 博士 (Laboratory of
Sensorimotor Research, National Eye Institute, NIH, USA) による「Neural circuits for information
seeking」（中村加枝教授司会）と題した講演が行われました。
2013 年 8 月 5 日
滝井学舎南館臨床講堂にて森島陽介博士による「脳領域間の機能的結合：基礎から治療応用を目指して」（木下利彦教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2013 年 8 月 11 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 18 時より進士恵実博士（スタットコム株式会社）による「精度の高いデータを構築するための仕組みと外科領域における propensity score の応用」（里井壯平准教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2013 年 9 月 18 日
枚方病院 13 階合同カンファレンスルームにて 18 時より原正則博士（新潟県立吉田病院小児科）による「一般市民病院における Clinician-Scientist としての生き方」（金子一成教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2013 年 11 月 29 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 16 時より能登原憲司博士（倉敷中央病院）による「2 型自己免疫性膵炎の病理」と Assist. Prof. Mino Mari Kenduson (Pathology, Harvard Medical
School, Staff Pathologist，Massachusetts General Hospital) による「Pancreatic stem cell and disease」
57

（岡崎和一教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2013 年 12 月 2 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 16 時半より山崎真弥先生（新潟大学脳研究所細
胞神経生物学分野）による「TARPs による AMPA 型グルタミン酸」（片野泰代講師司会）と題した大学院講座が開催されました。
2013 年 12 月 27 日
枚方学舎 6 階綜合研究施設セミナー室にて 16 時より池川雅哉教授（同志社大学生命医科学部医生命システム学科神経科学分野医生命機能研究室）による「Proteomic profiling andimaging for the studies of neurological diseases」（矢尾育子非常勤講師司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 1 月 16 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 15 時より伊波英克准教授（大分大学医学部微生物学講座）による「翻訳後糖鎖修飾のプロファイリングによる ATL 診断の試み」、16 時より藤井雅寛教授（新潟大学医歯学総合研究科ウイルス学分野）による「HTLV-1 感染による酸化ストレス応答の異常」、17 時より馬場昌範教授（鹿児島大学大学院医歯学総合研究科）
による「In silico スクリーニングを用いた抗ウイルス薬の同定」（藤澤順一教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 2 月 7 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 17 時より福島雅典センター長（先端医療振興財
団臨床研究情報センター (TRI) 、京都大学名誉教授）による「アカデミックリサーチオー
ガニゼーション (ARO) 体制整備の現状と課題」（伊藤誠二教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 3 月 19 日
枚方学舎 4 階中会議室にて 17 時より池原譲研究チーム長（産業技術総合研究所・糖鎖医工学研究センター・マーカー検出技術開発チーム）による「難治性がんの克服を目指した診断治療技術の総合研究開発」（海堀昌樹准教授司会）と題した大学院講座が開催されました2014 年 3 月 27 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 17 時より Research Associate Prof. Toshihiko Ezashi(University of Missouri) に よ る 「 Cellular reprogramming to study disorders of intellectual
disability and neurodevelopment」（伊藤誠二教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 3 月 27 日
枚方学舎 2 階第 3 講義室にて 17 時より Alexander Weymann 研究プロジェクト長（ドイツ ハイデルベルグ大学心臓外科）による「心臓血管外科領域の再生医療最前線」（岡田隆之講師
司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 4 月 14 日
枚方学舎 2 階学生セミナー室 2C にて 17 時より伊川正人教授（大阪大学微生物病研究所附属感染動物実験施設）による「CRISPR/Cas 人工制限酵素システムを用いたマウスゲノム編集」（中邨智之教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 6 月 5 日
枚方学舎１階オープンラウンジにてにて 17 時 15 分より Dr. Heater Hill (Dance-Movement
Therapy Association of Australia) 、および川岸恵子博士（大阪府急性期・総合医療センター精神科）による「Dementia and Dance Therapy」（三宅眞理講師司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 6 月 11 日
枚方学舎 10 階セミナー室 10B にて 14 時より喜多俊行助教（北海道大学遺伝子病制御研究58

室免疫制御分野）による「ミトコンドリア動態と細胞機能」（木梨達雄教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 6 月 11 日
枚方学舎 10 階セミナー室 10B にて 17 時より土井知光博士（東京大学医科学研究所実験動物研究施設）による「麻疹ウイルス持続感染機構の解析」（木梨達雄教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 6 月 18 日
枚方学舎 12 階セミナー室 12A にて 16 時より鶴下直也博士 (JN Biosciences LLC, CA, USA)による「抗体医薬研究開発の歴史と裏話」（藤澤順一教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 6 月 20 日
枚方学舎 12 階セミナー室 12A にて 15 時より Prof. Chou-Zen Giam (Dept. Microbiology and
Immunology, Uniformed Services University of the Health Sciences, USA) による「Outcomes of
HTLV-1 Infection： Senescence, Latency, Reactivation, and Pathogenesis」（藤澤順一教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
枚方学舎 2 階第 3 講義室にて 18 時より主任外科医 Sivakumar Sivalingam（マレーシア国立
循環器センター 先天性心疾患部門）による「先天性心臓血管外科領域の最前線」（岡田隆之講師司会）と題した大学院講座が開催されました。
枚方学舎 2 階第 4 講義室にて 18 時より三島健顧問（知的財産統括室）および坂本喜晴氏（坂本設計技術開発研究所代表取締役）による「研究成果：知的財産とその活用」（藤澤順一教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 7 月 14 日
滝井病院南館 2F 臨床講堂にて 18 時半より定本ゆきこ氏（京都少年鑑別所）による 「非行行動と思春期のメンタルヘルスの問題」（木下利彦教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 8 月 4 日
枚方学舎 2 階第 4 講義室にて 17 時より戸松俊治 Director (Skeletal Dysplasia Lab, Depts.
Biomedical Research and Orthopedics Nemours/Alfred I. du Pont Hospital for Children Wilmington,
DE, USA) による「グリコサミノグリカンとムコ多糖症」（赤間智也准教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 8 月 15 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 17 時より山田徹教授（アイオワ大学神経内科）
による「米国における医療・医学制度―日本との比較―」（座長：和歌山県立医科大学 玉置哲也名誉教授）、18 時より木村淳教授（アイオワ大学神経内科）による「脊椎末梢神経の電気生理学的診断」（座長：高知大学 谷俊一名誉教授）と題した大学院講座が開催されました。
（齋藤貴徳准教授総合司会）
2014 年 9 月 8 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 18 時より Dr. Hynek Mergental (The Queen
Elizabeth Hospital, Univ. Birmingham) による「Current clinical practice of liver transplantation andliver surgery in the UK」（權雅憲教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 9 月 17 日
枚方学舎 1 階試験・実習室にて 16 時より田中進博士（東京都医学総合研究所精神行動医学
研究分野 睡眠覚醒制御プロジェクト）による「過眠症ナルコレプシーの病態研究とオレキシン」（山田久夫教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
59

2014 年 9 月 18 日
枚方学舎 2 階学生セミナー室 2C にて 15 時半より長谷川功紀博士（熊本大学大学院生命科
学研究部機能病理学分野）による「低分子リガンド誘導体を用いた生体機能評価法の開発とその応用研究」（山田久夫教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 10 月 3 日
枚方学舎 2 階第 4 講義室にて 17 時より山下俊英教授（大阪大学大学院医学系研究科分子神経科学）による「中枢神経回路の障害と修復のメカニズム」（鍬方安行教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 10 月 27 日
枚方学舎 2 階第 4 講義室にて 17 時半より飛田護邦 ヒト幹細胞臨床研究対策専門官（厚生労働省医政局研究開発振興課再生医療研究推進室）による「再生医療等安全性確保法と学内での体制整備について」（楠本健司教授司会）と題した講演会が開催されました。
（共催：
再生医療コンソーシアム）
2014 年 11 月 7 日
枚方学舎 1 階第 1 講義室にて 17 時より藤堂具紀教授（東京大学医科学研究所先端医療研究センター先端がん治療分野）による「遺伝子組換えウイルスを用いた新たながん治療」（淺
井昭雄教授司会）と題した大学院企画セミナーが開催されました。
2014 年 11 月 21 日
枚方学舎 2 階第 4 講義室にて 17 時より市村幸一分野長（国立がん研究センター研究所脳腫
瘍連携研究分野）による「悪性脳腫瘍の発生機序と分子分類」（淺井昭雄教授司会）と題した大学院企画セミナーが開催されました。
2014 年 11 月 28 日
枚方学舎 4 階カンファ レンスルーム D にて 15 時半より Associate Prof. Mino Mari Kenduson(Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital) による「The current concept ofcolorectal carcinogenesis.」（岡崎和一教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 12 月 8 日
滝井病院南館 2 階臨床講堂にて 18 時より奥村克行博士（精神医学研究所附属東京武蔵野病院）による「病跡学研究 現代思想からのアプローチ」（木下利彦教授司会）と題した大学
院講座が開催されました。
2014 年 12 月 10 日
枚方学舎 2 階第 4 講義室にて 18 時より 喜多正和会長（公私立大学実験動物施設協議会、
京都府立医科大学）による「動物実験を行う際の心得と法規」（共催：動物実験委員会）（中
村加枝教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2014 年 12 月 11 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 18 時より中村徹博士（久留米大学医学部内科学講座 消化器内科部門/先端癌治療研究センター肝癌部門）による「肝硬変に対する末梢血CD34 陽性細胞移植による肝再生治療─基礎研究から臨床研究へ─」（海堀昌樹准教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2015 年 1 月 16 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 18 時より岩間厚志教授（千葉大学大学院医学研
究院細胞分子医学）による「造血幹細胞と造血器腫瘍のエピジェネティクス」（薗田精昭教
授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2015 年 1 月 21 日
枚方学舎 4 階中会議室にて 18 時より山城雄一郎特任教授（順天堂大学大学院プロバイオテ
ィクス研究講座）による「腸内細菌叢と宿主の健康および疾患感受性」（金子一成教授司会）
60

と題した大学院講座が開催されました。
2015 年 2 月 18 日
枚方学舎 2 階第 2 講義室にて 18 時より佐藤俊哉教授（京都大学大学院医学研究科・社会健康医学系専攻・医療統計学講座）による「臨床研究計画書の書き方～研究デザインとデー
タ解析～」（共催：研究医長会議）（海堀昌樹准教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2015 年 2 月 26 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 18 時より瀧原義宏教授（広島大学原爆放射線医科学研究所幹細胞機能学研究分野）による「造血幹細胞の活性操作法の開発を目指して」（薗
田精昭教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2015 年 2 月 27 日
枚方学舎 2 階第 4 講義室にて 17 時より学内特別講演として池浦司講師（内科学第 3）による「5-aminolevulinic acid (5－ALA)による膵癌の質的診断」、宇都宮啓太講師（放射線科学）
による「アイソトープ実験施設（Imaging room) での研究について」（座長：腎泌尿器外科学講座 吉田健志助教）、特別講演として黒田嘉弘准教授（大阪大学大学院情報科学研究科
サイバーメディアセンター）による「次世代手術ナビゲーションのための実時間臓器変形と可触化技術」、登尾啓史教授（大阪電気通信大学 総合情報学部情報学科）による「肝臓切除手術における先進的シミュレーションおよびナビゲーションシステムの開発」（座長：
外科学講座 海堀昌樹准教授）と題した第 1 回関西医科大学画像支援研究会・病態分子イメージングセンター第 3 回 Annual meeting が開催されました。
2015 年 3 月 11 日
枚方病院 13 階合同カンファレンスルームにて 18 時より野口満准教授（佐賀大学医学部泌
尿器科）による「小児下部尿路障害の診断と治療」（金子一成教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2015 年 4 月 9 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 16 時より中野伊知郎 Associate Prof. (Departmentof Neurosurgery, The Ohio State University) による「脳腫瘍幹細胞の可塑性と微小環境」（共催：がん関連コンソーシアム）（淺井昭雄教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2015 年 4 月 14 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 18 時より Alexander Weymann 博士（ハイデルベ
ルグ大学心臓血管外科）による「The frontier strategy of heart failure,from regeneration therapy toleft ventricle assisted device.」（岡田隆之講師司会）と題した大学院講座が開催されました。
2015 年 4 月 20 日
附属滝井病院南館 2 階臨床講堂にて 18 時より加藤忠史シニア・チームリーダー（理化学研
究所脳科学総合研究センター精神疾患動態研究チーム）による「双極性障害の神経生物学」（木下利彦教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2015 年 6 月 30 日
枚方学舎 2 階第 4 講義室にて 18 時より Assist. Prof. Taku Kambayashi (Univ. Pennsylvania,
Pathology and Laboratory Medicine) による「Novel immunomodulation strategies for treatment ofinflammatory diseases」（野村昌作教授司会）と題した大学院講座が開催されました。
2015 年 9 月 15 日
枚方学舎 4 階カンファレンスルーム D にて 17 時より Prof. Tsvee Lapidot (Department of
Immunology, Weizmann Institute of Science, Israel) による 「Metabolic regulation of blood andbone forming stem cells -The role of ROS and nitirc oxide.」（薗田精昭教授司会）と題した大学
院講座が開催されました。
61

2015 年 10 月 2 日
枚方学舎 2 階第 4 講義室にて 17 時半より中西重忠名誉教授（京都大学）による「行動選択の脳内情報処理機構」（平野伸二教授司会）と題した大学院企画セミナーが開催されました。
2015 年 10 月 30 日
枚方学舎 1 階加多乃講堂にて 17 時半より長田重一特任教授（大阪大学免疫学フロンティア
研究センター 免疫・生化学部門）による「細胞膜の非対称性とその崩壊」（平野伸二教授司会）と題した大学院企画セミナーが開催されました。
2015 年 11 月 6 日
枚方学舎 1 階加多乃講堂にて 17 時半より高井義美特命教授（神戸大学医学研究科生化学・分子生物学講座 シグナル統合学分野病態シグナル学部門）による「学問の楽しみ－神秘と人との出会い－」（平野伸二教授司会）と題した大学院企画セミナーが開催されました。
2015 年 11 月 13 日
枚方学舎 4 階中会議室にて山本 雅教授（沖縄科学技術大学院大学、前東京大学医科学研究所所長）、Min Zhuo 教授 (University of Toronto, Canada) 、John A. Hanover 博士 (Lab Chief,
NIDDKD, NIH, USA) を外部評価委員として、病態分子イメージングセンター最終報告会
The Final Annual meeting が開催されました。
2016 年 1 月 8 日
枚方学舎 1 階加多乃講堂にて 17 時半より竹市雅俊特別顧問（理化学研究所 多細胞システ
ム形成研究センター）による「細胞接着のダイナミクスと形態形成」（平野伸二教授司会）と題した大学院企画セミナーが開催されました。

62

V. Seminars, symposia, and events
September 2011
Infrared imaging system Odyssey and HS all-in-one fluorescence microscope were installed at
Biochemistry room 2 and Optical microscope room 3, respectively, of the north block of Building 2
in Takii campus.
December 16, 2011
Graduate lecture “Pathological aspects of intrapancretic papillary mucosal neoplasia (IPMN) in
USA” by Assistant Prof. Mino Mari Kenduson (Dept. of Pathology, Massachusetts General Hospital,
USA) was held at Seminar room A of Bld. 1 in Takii campus (sponsored by Prof. Kazuichi Okazaki).
March 22, 2012
Kick-off lecture “Neural regeneration and application of neural disorders by iPS cell technology”
by Prof. Hideyuki Okano (Dept. of Physiology, Keio University) was held at 13th-floor auditorium
in Harakata hospital (sponsored by Molecular Imaging Center of Diseases).
March 27, 28, 2012
Imaging mass spectrometry was installed at Electron microscope room on the 2nd floor of thenorth block of Building 2 in Takii campus. A technical institute of imaging mass spectrometry tousers was held. The second institutes were held on April 25 and 27.
April 27, 2012
Graduate lecture “Care for people with dementia” by Dr. David Sykes (Alzheimer's Australia
Victory) and Graduate lecture: Dementia and dance therapy by Dr. Heather Hill (Dance-Movement
Therapy Association of Australia) were held at 5th Grand Conference Room of Building 1 in Takii
campus (sponsored by Dr. Mari Miyake).
May 1, 2012
The 1st annual meeting of Molecular Imaging Center of Diseases was held at 13th-floor auditorium
in Harakata hospital in the presence of Drs. Tadashi Yamamoto, Min Zhuo, and John Hanover,advisory board members of Molecular Imaging Center of Diseases.
May 11, 2012
A technical institute of “Application of imaging mass spectrometry” by Dr. Ikuko Yao (Molecularand Functional Biology) as a topic of Graduate lecture was held at Clinical Auditorium in Takii
campus (organized by General Research Center).
May 18, 2012
Graduate lecture “A lecture concerning imaging technics and application” by Dr. Hidehiro Iida
(Dept. of Bio-medical Imaging, National Cerebral and Cardiovascular Center Research Institute)
was held at Clinical Auditorium in Takii campus (organized by Radioisotope Center).
June 18, 2012
Graduate lecture “Treatment and support to patients with disruptive behavior disorders in United
Kingdom and Sweden” by Prof. Yoko Fujikawa (Dept. of Psychology, Kyoto Notre Dame
University) was held at Psychiatric Center in Takii campus (sponsored by Prof. Toshihiko
Kinoshita).
June 22, 2012
Graduate lecture “Invasion of HIV by membrane fusion, kinetics of cell fusion and its regulation
by host factors” by Dr. Naoyuki Kondo (Dept. of Pediatrics, Emory University School of Medicine)
was held at Seminar Room B in Takii campus (sponsored by Prof. Tatsuo Kinashi).
August 6, 2012
Graduate lecture ”Search and functional analysis of novel glue molecules at synapse” by Dr.
Hideto Takahashi (Brain Research Centre and Dept. of Psychiatry, University of British Columbia)
was held at Seminar Room A in Takii campus (sponsored by Associate Prof. Masanobu Okada).
63

October 18, 2012
Graduate lecture “Pathogenesis of disturbance in central nervous system by chronic viral infection
including HTLV-1” by Prof. Mineki Saito (Dept. of Microbiology, Kawasaki Medical School) was
held at Seminar Room S in Takii campus (sponsored by Prof. Junichi Fujisawa).
October 30, 2012
Graduate Seminar “Ductal neoplasms of the pancreas：with an emphasis on molecular alterations"by Assist. Prof. Mino Mari Kenduson (Dept. of Pathology, Massachusetts General Hospital) was
held at Seminar Room A in Takii campus (sponsored by Prof. Kazuichi Okazaki).
December 17, 2012
Graduate lecture “Ultrasonic diagnosis of inguinal hernia in children” by Prof. Akira Toki (Div. of
Pediatric Surgery, Showa University) was held at Conference room 3 in Hirakata Hospital(sponsored by Associate Prof. Yoshinori Hamada).
December 20, 2012
Usage permission of RI imaging room in Molecular Imaging Center of Diseases was issued by the
Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology.
January 18, 2013
Graduate lecture “Front of photoimaging directed medical service innovation” by Dr. Yoshihiro
Ohmiya (Director, Biomedical Research Institute, AIST) was held at Seminar room A in Takii
campus (sponsored by Prof. Seiji Ito).
February –March, 2013
Research facilities in Molecular Imaging Center of Diseases and Laboratories were moved from
Takii campus to Hirakata campus.
March 21, 2013
Graduate lectures “New strategy of treatment to HTLV-I-associated myelopathy (HAM)” by
Associate Prof. Tatsufumi Nakamura (Div. of Molecular and Clinical Microbiology, Nagasaki
University Graduate School of Biomedical Sciences) and “New viral infectious disease –humancardiovirus” by Prof. Yoshiro Ohara (Dept. of Microbiology, Kanazawa Medical University) were
held at Conference room D in Hirakata campus (sponsored by Prof. Jun-ichi Fujisawa).
March 22, 2013
Special lecture sponsored by Molecular Imaging Center of Diseases: ”Self-formation of functionalorgan from stem cells by three-dimensional culture” by Dr. Yoshiki Sasai (Director, Organogenesis
and Neurogenesis Group, Center for Developmental Biology, RIKEN) was held at 13th-floor Joint
Conference room in Hirakata campus.
April 12, 2013
A technical institute of imaging mass spectrometry to users was held at Electron microscope room
in Molecular Imaging Center of Diseases.
Graduate lecture “Utility of pathological approach in clinical and basic research” by Dr. Yasuyuki
Sasaguri (Emeritus Professor, Director of Clinical trial research center, University of Occupational
and Environmental Health) was held at Conference room D in Hirakata campus (sponsored by Prof.
Seiji Ito).
April 15, 2013
Graduate lecture “Total urogenital mobilization toward persistent cloaca” by Dr. Jun Iwai (Chiefof Pediatric Surgery, Chiba Children’s Hospital) was held at Lecture room 1 in Hirakata campus(sponsored by Associate Prof. Yoshinori Hamada).
April 17, 2013
Graduate lecture “Identification of novel genes in neuronal development, function andmaintenance through forward genetic approaches in Drosophila” by Dr. Shinya Yamamoto (NRI
Fellow and Lab Head, Dept. of Molecular and Human Genetics, Jan and Dan Duncan NeurologicalResearch Institute, Baylor College of Medicine) was held at Conference room D in Hirakata campus(sponsored by Associate Prof. Ikuko Yao).
64

April 17, 2013
Graduate lecture “Regulation of normal and leukemic human stem cells” by Prof. Tsvee Lapidot(Dept. of Immunology, Weizmann, Institute of Science, Israel) was held at Lecture room 4 in
Hirakata campus (sponsored by Prof. Yoshiaki Sonoda).
April 26, 2013
Graduate lecture “Autoimmune pancreatitis” by Dr. Terumi Kamisawa (Director of Internal
medicine, Dept. of Internal Medicine, Tokyo Metropolitan Komagome Hospital) was held at Katano
Lecture Hall in Hirakata campus (sponsored by Prof. Kazuichi Okazaki).
May 24, 2013
Graduate lecture “Revolutionary synthetic method of short-life PET probe by high-speed coupling
reaction and its medical application” by Dr. Masaaki Suzuki (Dept. of Clinical and Experimental
Neuroimaging, National Center for Geriatrics and Gerontology) was held at Katano Lecture Hall in
Hirakata campus (organized by Radioisotope Center).
June 15, 2013
The 2nd annual meeting of Molecular Imaging Center of Diseases was held at 4th-floor Middle
Conference Room in Hirakata campus in the presence of Drs. Tadashi Yamamoto, Min Zhuo, andJohn Hanover, advisory board members of Molecular Imaging Center of Diseases.
June 25, 2013
Graduate lecture “Neural circuits for information seeking” by Dr. Ethan Bromberg-Martin(Laboratory of Sensorimotor Research, National Eye Institute, NIH) was held at Conference room D
in Hirakata campus (sponsored by Prof. Kae Nakamura).
August 5, 2013
Graduate lecture “Functional connection among brain regions: toward therapy from basic research”
by Dr. Yosuke Morishima was held at Clinical Auditorium in Takii campus (sponsored by Prof.
Toshihiko Kinoshita).
August 11, 2013
Graduate lecture “A method to make data with high precision and usage of propensity score in thefield of surgery” by Dr. Megumi Shinji (Statcom Co., Ltd.) was held at Conference room D in
Hirakata campus (sponsored by Associate Prof. Sohei Satoi).
September 18, 2013
Graduate lecture “Life style as clinician-scientist in general municipal hospital” by Dr. Masanori
Hara (Department of Pediatrics, Yoshida Hospital) was held at 13th-floor Joint Conference room in
Hirakata campus (sponsored by Prof. Kazunari Kaneko).
November 29, 2013
Graduate lectures “Pathology of type 2 autoimmune pancreatitis” by Dr. Kenji Notohara(Kurashiki Central Hospital) “Pancreatic stem cell and disease” by Associate Professor of Pathology,
Harvard Medical School, Staff Pathologist，Massachusetts General Hospital, Mino Mari Kenduson
were held at Conference room D in Hirakata campus (sponsored by Prof. Kazuichi Okazaki).
December 2, 2013
Graduate lecture “Modulation of AMPA-type glutamate receptors by TARPs” by Assistant Prof.
Maya Yamazaki (Brain Research Institute Basic Neuroscience Branch, Dept. of Cellular
Neurobiology, Niigata University) was held at Conference room D in Hirakata campus (sponsoredby Lecturer Tayo Katano).
December 27, 2013
Graduate lecture “Proteomic profiling and imaging for the studies of neurological diseases” by
Prof. Masaya Ikegawa (Genomics and Proteomics for Human and Model Organisms, Doshisha
University) was held at 6th-floor Seminar Room in Hirakata campus (sponsored by Associate Prof.
Ikuko Yao).

65

January 16, 2014
Graduate lectures “Trial of ATL diagnosis by glycosylation profiling” by Associate Prof.
Hidekatsu Iha (Dept. of Microbiology, Oita University), “Abnormal response to oxidative stress after
HTLV-1 infection” by Prof. Masahiro Fujii (Div. of Virology, Niigata University), and“Identification of anti-viral drugs by in silico screening” by Prof. Masanori Baba (Div. of Antiviral
Chemotherapy at Center for Chronic Viral Diseases, Kagoshima University.) were held at
Conference room D in Hirakata campus (sponsored by Prof. Jun-ichi Fujisawa).
February 7, 2014
Graduate lecture “Present status and problems of establishment of academic research organization(ARO)” by Prof. Masanori Fukushima (Director of the Translational Research Informatics Center(TRI) of the Foundation for Biomedical Research and Innovation (FBRI), Professor Emeritus ofKyoto University) was held at Conference room D in Hirakata campus (sponsored by Prof. Seiji Ito).
March 19, 2014
Graduate lecture “Comprehensive research and development toward the conquest of intractable
cancer” by Dr. Yuzuru Ikehara (Team Leader, Molecular Medicine Team, Research Centre for
Medical Glycoscience at National Institutes of Advanced Industrial Science and Technology (AIST))
was held at 4th-floor Middle Conference Room in Hirakata campus (sponsored by Associate Prof.
Masaki Kaibori).
March 27, 2014
Graduate lecture “Cellular reprogramming to study disorders of intellectual disability andneurodevelopment” by Research Associate Professor Toshihiko Ezashi (, University of Missouri)
was held at Conference room D in Hirakata campus (sponsored by Prof. Seiji Ito).
March 27, 2014
Graduate lecture “Forfront of regenerative medicine in the field of cardiovascular surgery” by Dr.
Alexander Weymann (Consultant Cardiothoracic Surgeon, Dept. of Cardiac Surgery, University of
Heidelberg) was held at Lecture room 3 in Hirakata campus (sponsored by Lecturer Takayuki
Okada).
April 14, 2014
Graduate lecture “Mouse genome editing by CRISPR/Cas system” by Prof. Masahito Ikawa(Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University) was held at 2nd-floor Student Seminarroom 2C in Hirakata campus (sponsored by Prof. Tomoyuki Nakamura).
June 5, 2014
Graduate lecture “Dementia and Dance Therapy” by Dance-Movement Therapy Association ofAustralia, Dr. Heater Hill and Dr. Keiko Kawagishi (Dept. of Psychiatry Osaka General Medical
Center)was held at 1st-floor Open Lounge in Hirakata campus (sponsored by Dr. Mari Miyake).
June 11, 2014
Graduate lecture “Mitochondria dynamics and cell function” by Assistant Prof. Toshiyuki Kita
(Div. of Immunoregulation, Section of Disease Control, Institute for Genetic Medicine, Hokkaido
University) was held at 10th-floor Seminar room 10B in Hirakata campus (sponsored by Prof. Tatsuo
Kinashi).
June 11, 2014
Graduate lecture “Analysis of the mechanism of persistent infection by measles virus” by Dr.
Tomomitsu Doi (Laboratory Animal Research Center, The Institute of Medical Science, The
University of Tokyo) was held at 10th-floor Seminar room 10B in Harakata campus (sponsored by
Prof. Tatsuo Kinashi).
June 18, 2014
Graduate lecture “History and inside story of research and development of therapeutic antibodies”
by Dr. Naoya Tsurushita (JN Biosciences LLC, CA, USA) was held at 12th-floor Seminar room 12A
in Hirakata campus (sponsored by Prof. Jun-ichi Fujisawa).

66

June 20, 2014
Graduate lecture “Outcomes of HTLV-1 Infection：Senescence, Latency, Reactivation, andPathogenesis” by Prof. Chou-Zen Giam (Department of Microbiology and Immunology, Uniformed
Services University of the Health Sciences, USA) was held at 12th-floor Seminar room 12A in
Hirakata campus (sponsored by Prof. Jun-ichi Fujisawa).
June 20, 2014
Graduate lecture “Forfront of congenital cardiovascular surgery” by Dr. Sivakumar Sivalingam(Department of Cardiovascular Surgery, National Heart Institute, Kuala Lumpur, Malaysia) was heldat Lecture room 3 in Hirakata campus (sponsored by Associate Lecturer Takayuki Okada).
June 20, 2014
Graduate lecture “Research products：intellectual property and its application” by Mr. Ken
Mishima (Advisor, Office of research management and intellectual property) and Mr. Yoshiharu
Sakamoto (Head, Sakamoto Sekkei Technical Development Lab) was held at Lecture room 4 in
Hirakata campus (sponsored by Prof. Jun-ichi Fujisawa).
July 14, 2014
Graduate lecture “Adolescent problems of misconduct and mental health” by Dr. Yukiko
Sadamoto (Kyoto Juvenile Classification Center) was held at Clinical Auditorium in Takii campus(sponsored by Toshihiko Kinoshita).
August 4, 2014
Graduate lecture “glycosaminoglycan and Mucopolysaccharidosis” by Dr. Shunji Tomatsu(Director, Skeletal Dysplasia Lab Departments of Biomedical Research and Orthopedics
Nemours/Alfred I. du Pont Hospital for Children Wilmington, DE, USA.) was held at Lecture room
4 in Hirakata campus (sponsored by Associate Prof. Tomoya Akama).
August 15, 2014
Graduate lectures “Health care system and medical education in USA―Comparison with Japan―”by Prof. Toru Yamada (Division of Clinical Electrophysiology, Department of Neurology Universityof Iowa Hospitals and Clinics.) (sponsored by Prof. Tetsuya Tamaki, Dept. of Orthopedic surgery,
Wakayama Medical University), “Electrophysiological diagnosis of central and peripheral
neuropathy” by Prof Jun Kimura (Dept. of Neurology, University of Iowa) (sponsored by Prof.
Toshikazu Tani, Dept. of Orthopedic Surgery, Kochi Medical School Hospital) were held at
Conference room D in Hirakata campus (organized by Dr. Takanori Saito).
September 8, 2014
Graduate lecture “Current clinical practice of liver transplantation and liver surgery in the UK” by
Dr. Hynek Mergental (The Queen Elizabeth Hospital, University of Birmingham) was held at
Conference room D in Hirakata campus (sponsored by Prof. A-Hon Kwon).
September 17, 2014
Graduate lecture “Pathophysiology of narcolepsy and orexin” by Dr. Susumu Tanaka (Dept. of
Psychiatry and Behavioral Science, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science) was held at
1st-floor Examination and Practice room in Hirakata campus (sponsored by Prof. Hisao Yamada).
September 18, 2014
Graduate lecture “Development of evaluation method of biofunction by low-molecular ligands
and its application” by Assistant Prof. Koki Hasegawa (Dept. of Pathology and Experimental
Medicine, Kumamoto University) was held at 2nd-floor Student Seminar room 2C in Hirakata
campus (sponsored by Prof. Hisao Yamada).
October 3, 2014
Graduate lecture “Mechanism of disturbance and recovery of central neural circuits” by Prof.
Toshihide Yamashita (Dept. of Molecular Neuroscience, Osaka University) was held at Lecture room
4 in Hirakata campus (sponsored by Prof. Yasuyuki Kuwagata).
October 27, 2014
Lecture “The regenerative medicine safety assurance act and construction of institutional system”
by Dr. Morikuni Tobita (Research and Development Division, Health Policy Bureau, Ministry of67

Health, Labour and Welfare) (co-sponsored by Regenerative medicine consortium) was held at
Lecture room 4 in Hirakata campus (sponsored by Associate Prof. Kenji Kusumoto).
November 7, 2014
Graduate Seminar “Novel cancer therapy by gene-engineered virus” by Prof. Tomoki Todo (Div.
of Innovative Cancer Therapy, The Advanced Clinical Research Center, The Institute of Medical
Science, University of Tokyo) was held at Lecture room 1 in Hirakata campus (sponsored by Prof.
Akio Asai).
November 21, 2014
Graduate Seminar “Generetion mechanism and molecular classification of malignant brain tumors”
by Dr. Koichi Ichimura (Div. of Brain Tumor Translational Research, National Cancer Center
Research Institute was held at Lecture room 4 in Hirakata campus (sponsored by Prof. Akio Asai).
November 28, 2014
Graduate lecture “The current concept of colorectal carcinogenesis.” by Associate Prof. Mino
Mari Kenduson (Harvard Medical School, Staff Pathologist, Massachusetts General Hospital) was
held at Conference room D in Hirakata campus (sponsored by Prof. Kazuichi Okazaki).
December 8, 2014
Graduate lecture “Pathographic research: an approach from contemporary philosophy” by Dr.
Katsuyuki Okumura (The Psychiatric Research Institute Tokyo Musashino Hospital) was held at
Clinical Auditorium in Takii campus (sponsored by Prof. Toshihiko Kinoshita).
December 10, 2014
Graduate lecture “Guideline and law of conduction of animal experiments” by Prof. Masakazu
Kita (Laboratory Animal Center, Kyoto Prefectural University of Medicine) (co-sponsored by
Animal experiment committie) was held at Lecture room 4 in Hirakata campus (sponsored by Prof.
Kae Nakamura).
December 11, 2014
Graduate lecture “Regenerative therapy to liver cirrhosis by peripheral CD34-positive celltransplantation─from bench to bed─” by Dr. Toru Nakamura (Assistant Prof., Div. of
Gastroenterology, Department of Medicine, Kurume University School of Medicine, Kurume) was
held at Conference room D in Hirakata campus (sponsored by Associate Prof. Masaki Kaibori).
January 16, 2015
Graduate lecture “Epigenetics of hematopoietic stem cells and cancer” by Prof. Atsushi Iwama(Dept. of Cellular and Molecular Medicine, Graduate School of Medicine, Chiba University) was
held at Conference room D in Hirakata campus (sponsored by Prof. Yoshiaki Sonoda).
January 21, 2015
Graduate lecture “Intestinal microbial flora and health and disease susceptibility of the host” by
Prof. Yuichiro Yamashiro (Department of Pediatrics, Juntendo University School of Medicine) was
held at 4th-floor Middle Conference Room in Hirakata campus (sponsored by Prof. Kazunari
Kaneko).
February 18, 2015
Graduate lecture “How to write clinical trial plan～research design and analysis～” by Prof.
Toshiya Sato (Dept. of Biostatistics, Kyoto University School of Public Health) (co-sponsored byresearch head meeting of the clinical departments) was held at Lecture room 2 in Hirakata campus(sponsored by Associate Prof. Masaki Kaibori).
February 26, 2015
Graduate lecture “Toward the development of a new method for controlling hematopoietic stem
cell activity” by Prof. Yoshihiro Takihara (Dept. of Stem Cell Biology, Research Institute for
Radiation Biology and Medicine, Hiroshima University) was held at Conference room D in Hirakata
campus (sponsored by Prof. Yoshiaki Sonoda).

68February 27, 2015
Joint symposium of the first KMU imaging-supporting conference and the 3rd annual meeting ofMolecular Imaging Center of Diseases was held at Lecture room 4 in Hirakata campus. Dr. Takeshi
Yoshida (Urology) chaired two lectures ”Qualitaitive diagnosis of pancreas by 5-aminolevulinic acid
(5－ALA)”by Lecturer Tsukasa Ikeura (Internal Medicine 3) and “Research at RI imaging room of
MICD belonging to RI Research Center”, by Lecturer Keita Utsunomia (Radiology).
Accociate Prof. Masaki Kaibori (Surgery) chaired special lectures ”Real-time transformation andtouchable technology for next generation operation navigation by Associate Prof. Yoshihiro Kuroda(Osaka University) and “Development of advanced simulation and navigation system for livertransection operation” by Prof. Keishi Noborio (Osaka Electro-Communication University).
March 11, 2015
Graduate lecture “Diagnosis and treatment of lower urinary tract disorders in children” by
Associate Prof. Mitsuru Noguchi (Dept. of Urology, Saga University) Associate Prof. was held at
13th-floor Joint Conference room in Hirakata campus (sponsored by Prof. Kazunari Kaneko).
April 9, 2015
Graduate lecture “Plasticity of brain tumor stem cells and microenvironment” by Associate Prof.
Ichiro Nakano (Dept. Neurosurgery, The Ohio State University) (co-sponsored by Cancer-oriented
consortium) was held at Conference room D in Hirakata campus (sponsored by Prof. Akio Asai).
April 14, 2015
Graduate lecture “The frontier strategy of heart failure, from regeneration therapy to left ventricle
assisted device.” by Dr. Alexander Weymann (Consultant Cardiothoracic Surgeon, Dept. of Cardiac
Surgery, University of Heidelberg) was held at Conference room D in Hirakata campus (sponsoredby Lecturer Takayuki Okada).
April 20, 2015
Graduate lecture “Neurobiology of bipolar disorder” by Dr. Tadafumi Kato (Senior Team Leader,
Laboratory for Molecular. Dynamics of Mental Disorders. Director, RIKEN-BSI Takeda
Collaboration Center) was held at Clinical Auditorium in Takii campus (sponsored by Prof.
Toshihiko Kinoshita).
June 30, 2015
Graduate lecture “Novel immunomodulation strategies for treatment of inflammatory diseases” byAssistant Prof. Taku Kambayashi (University of Pennsylvania, Pathology and Laboratory Medicine)
was held at Lecture room 4 in Hirakata campus (sponsored by Prof. Shosaku Nomura).
September 15, 2015
Graduate lecture “Metabolic regulation of blood and bone forming stem cells -The role of ROS
and nitirc oxide.” by Prof. Tsvee Lapidot (Department of Immunology, Weizmann Institute of
Science, Israel) was held at Conference room D in Hirakata campus (sponsored by Prof. Yoshiaki
Sonoda).
October 2, 2015
Graduate Seminar ”Information processing for selection of behaviors in the brain” by Emeritus
Professor Shigetada Nakanishi (Kyoto University) was held at Lecture room 4 in Hirakata campus(sponsored by Prof. Shinji Hirano).
October 30, 2015
Graduate Seminar “Disruption of asymmetry of the plasma membrane” by Distinguished
Professor Shigekazu Nagata (Osaka University, Immunology Frontier Research Center,
Biochemistry & Immunology) was held at Katano Lecture Hall in Hirakata campus (sponsored by
Prof. Shinji Hirano).
November 6, 2015
Graduate Seminar “Pleasure of learning – mystery and encounter of the mentor” by Distinguished
Professor Yoshimi Takai (Kobe University, Graduate School of Medicine, Biochemistry andMolecular Biology) was held at Katano Lecture Hall in Hirakata campus (sponsored by Prof. Shinji
Hirano).
69

November 13, 2015
The final annual meeting of Molecular Imaging Center of Diseases was held at 4th-floor Middle
Conference Room in Hirakata campus in the presence of Drs. Tadashi Yamamoto, Min Zhuo, andJohn Hanover, advisory board members of Molecular Imaging Center of Diseases.
January 8, 2016
Graduate Seminar “Dynamics of cell adhesion and morphogenesis” by Special Advisor Masatoshi
Takeichi (RIKEN Center for Developmental Biology) was held at Katano Lecture Hall in Hirakata
campus (sponsored by Prof. Shinji Hirano).

70Ⅵ-1. 病態分子イメージングセンターの外部評価
External evaluation of Molecular Imaging Center of Diseases
2013
Evaluation sheet
Name: Min Zhuo
Division in charge: Neuroscience
Evaluation:a. excellent,b. good, c. ordinary, d. bad, e. unknown

1. Molecular Imaging Center of Diseases
1) Organization including management2) Objective and concept
3) Outcome
4) Prospect

(a)
(a)
(a)
(a)

2. Division of Neuroscience
1) Presentation
2) Prospect

(a)
(a)

3. General comments and suggestions
I was very impressed by individual reports presented. I think that all speakers gave excellent
talks, and the qualities of science are high. I think that one major area that can be improved infuture will be integrative research activities, or some of joint projects among individual
investigators.

Evaluation sheet
Name: Tadashi Yamamoto
Division in charge: Cancer
Evaluation:a. excellent,b. good, c. ordinary, d. bad, e. unknown

1. Molecular Imaging Center of Diseases
1) Organization including management2) Objective and concept
3) Outcome
4) Prospect

(a)
(a)
(b)
(a)

Comments
The new Hirakata campus provides opportunity of interaction between basic medical scienceand clinics. This Molecular Imaging Center of Diseases should play important roles in suchinteraction. Indeed by seeing activities presented in the 2nd annual meeting, I am confident to thesuccess of the programs of the Imaging Center, as the Center integrates well both basic and clinicalResearch. The research outcome is good but probably more to come in near future.
2. Division of Metabolic Disorders
1) Presentation(a)712) Prospect(b)

3. Division of Neuroscience
1) Presentation
2) Prospect

(a)
(b)

4. Division of Cancer
1) Presentation
2) Prospect

(a)
(b)

Besides presented, I found Dr. Ishizaki is quite active in publication. Dr. Ueda’s work on the roleof Mst1 is of high quality. He is also active in publication. Stem cell-isolation presented by Dr.
Nakatsuka would be useful.
5. General comments and suggestions
As mentioned above, the topics presented in the meeting included both clinical and basic
researches. This indicates that the Molecular Imaging Center of Diseases of KMU is well organizedaiming at mingling of researches in various departments. The quality of presentation impressed methat the center is moving actively and its future is promising. I also found that the speakers wererelatively young, which is a good sign suggesting future development. On the other hand, I wasslightly disappointed by the relatively small numbers of audience. I assume that this may be because
the meeting was held on Saturday. But please keep paying efforts in recruiting young active graduate
students and postdoctoral fellows.
I didn’t have a chance to see the facilities of imaging. High performance microscopies would bevitally important for the center. Technics of imaging mass spectrometry is useful and needs to befurther improved. Experts for the use of super-resolution microscopy and multi-photon microscopy
and EM would be necessary.
The works presented at the meeting are excellent and especially the presentation by Ueno at theclosing is quite impressive. Probably there may be other PIs whose research activities were notrepresented at the meeting. By being presented, it would be easier to see the prospect of each
Division.

Evaluation sheet
Name: John Hanover
Division in charge: Metabolic Disorders
Evaluation:
1.

a. excellent,b. good, c. ordinary, d. bad, e. unknown

Molecular Imaging Center of Diseases
1) Organization including management2) Objective and concept
3) Outcome
4) Prospect

(a)
(a)
(b)
(a)

Comments
The center’s organization, goals and prospects are all extremely timely and well organized. As
the process matures and projects develop, excellent outcomes are expected for the center’s72investigators.
2.

Division of Metabolic Disorders

Masami Kageshima (Biophysics)
Atomic force microscopy – a versatile tool for imaging and probing
1) Presentation(b)
Dr. Kageshima has explored the mechanical properties measured through viscoelasticity. This
allows measurement of the elasticity of single polymer chains and mechanical denaturation of thechains. He described methods to discriminate forces using cyclic force applications. He firstchecked a stable alpha helix. Viscoelasticity was the most informative measurement producing aviscoelasticity spectrum. His method was applied to a dextran chain and the solvation of watermolecules on a mica surface. The methods developed may have applications in Disease imaging.
Support for such emerging technologies is encouraged although the current applications andoutcomes of the work are limited. Overall, a clear presentation and substantial promise for future
outcomes.
2) Prospect(b)
Satoshi Matsuda （Bioinformatics, IBS）
Immune regulation through the mTORC1 pathway
1) Presentation(a)Dr. Matsuda has found that p85 alpha plays a pivotal role in Th17 differentiation, but to Th1 or
Th2. He found that mTORC1/Raptor mTORC2/Raptor responds to PI3K and that Rapamycin
inhibits Th17 differentiation. Th17 differentiation is impaired in Raptor deficient T cells while
activation of the pathway leads to enhanced Th17 differentiation. Using Rag2-/- minus cells Th17
was reduced by rapamycin treated mice. He argues that mTorc1 regulates Th17 differentiation via
p70S6K. Blockade of PI3K mTORC1 pathway perturbs nuclear translocation of RORγ. He
suggests that S6K2 retains RORγ in the nucleus. This pathway is an interesting finding suggestingthat the Th17 response may be regulated independently of Th1 and Th2 suggesting numerous
therapeutic applications. In summary, a nice presentation with findings that suggest futureapplications.
2) Prospect(a)
Takaya Tsuno (Radiology)
Analysis of JAK-STAT and cell death pathways induced by IFN-α in human adherent cancer cells
1) Presentation(b)
Dr. Tsuno analyzed the molecules in IFN- α pathways; his goal was to in vivo verify the targetedcancer therapy developed from the in vitro studies. IFNAR1/2 and IRF9 RNAi inhibited AP
activity of IFN- α in OVCAR3 cells. Trail protein was secreted onto the membrane of OVCAR3
cells in response to IFN- α. Caspase 8 inhibitor restored the viability suggesting that Caspase
8/BID is important. BID may important for mitochondrial membrane potential. BID overexpression
has the potential to enhance the AP activity of IFN- α. Dr. Tsuno Will use integrin with RGD in
matrices to improve the therapeutic potential. BID transfection led to mitochondrial apoptosis as
well as A549 cells. The presentation was nicely prepared and the future applications were wellfleshed out and clear.
2) Prospect(a)73Evaluation by advisory board members
2015
Evaluation sheet
Name: Min Zhuo
Date: December 2, 2015
Evaluation:a. excellent, b. good, c. ordinary, d. bad, e. unknown

1. Molecular Imaging Center of Diseases
1) Organization including management2) Objective and concept
3) Outcome
4) Prospect

(a)
(a)
(a)
(a)

comments
In general, I am very impressed by the progress made over the years in the center. By using
modern imaging techniques, from single molecule level to clinical patients, the Center has provided
very impressive publications in major journals, as well as clinical application of new imaging
techniques. I think that the Center provides a good model where cutting edge researches using
integrative experimental approaches can thrive. Furthermore, it also provides a wonderful
opportunity for translational research and medical education opportunities.
2. Division in charge
1) Presentation(a)
There are many good presentations. For example, imaging of in vivo spinal dorsal horn to study
sensory mapping, this study provided novel insights into spinal network in pain process. Imaging
mass spectrometry method is very impressive and promising. It not only allow one to examine
specific chemical compounds in various parts of the body including brains, but also translate some ofbasic researches to potential drug discovery.
2) Prospect(a)
These new tolls are very impressive, and I hope that some of them can become high-impact
publications or even translational drug candidates by involving additional researchers orinternational collaborations.
3. Division not in charge, if any
1) Presentation(a)2) Prospect(a)There are excellent clinical presentations related to cancer surgery and treatment
4. General comments and suggestions• Adding new international collaborations to improve;• Improve English for some of young speakers, including presentative/answering
questions;• Integration between basic and clinical studies;74

Evaluation sheet
Name: Tadashi Yamamoto
Date: Meeting Nov 13, 2015
Evaluation:a. excellent,b. good, c. ordinary, d. bad, e. unknown

1. Molecular Imaging Center of Diseases
1) Organization including management ( a )2) Objective and concept(a)3) Outcome(b)4) Prospect(a)Comments
This year’s activity is good. I felt that MICD provides an excellent platform for the interaction
between basic scientists and clinicians. Outcome could be much better and I find very promisingprogress that will bloom in coming years.
2. Division in charge
1) Presentation(a)Imaging technology is well utilized in not only for the laboratory research but also in researches withclinical samples. Studies on bone marrow-derived HSC and MSC are well progressed. Microarray
analysis of gene expression in tissue stem cells and cancer stem cells have been conducted, which
will move forward to characterization of the gene highly expressed in SP cells. The results that, with
ICG, the sensitivity, specificity, and accuracy for detecting the preoperatively identified main tumors
were 96%, 50%, and 94%, respectively, is very exciting and should be encouraging for
intraoperative identification of latent small liver tumors. All presentations are promising and would
need a little more time to be really fruitful. Yet, as scientific activities are high, I look forward tohear the progress in coming years.
2) Prospect(b)
As mentioned above many basic progresses could be seen. Therefore, new recruitment ofresearchers form basic as well as clinical fields is necessary.
3. Division not in charge, if any
1) Presentation
2) Prospect

( )
( )

4. General comments and suggestions
As mentioned above, there are many good progresses in designing protocols and somepreliminary as well as conclusive data are about to be produced. So, I hope that merits of thiscenter should be maintained.

75Evaluation sheet
Name: John A. Hanover
Date: Meeting Nov 13, 2015

Evaluation:a. excellent,b. good, c. ordinary, d. bad, e. unknown

1. Molecular Imaging Center of Diseases
1) Organization including management2) Objective and concept
3) Outcome
4) Prospectcomments
2. Division in charge
1) Presentation

(a)
(a)
(a)
(b)

(a)

Some Notes and recommendations on each of the presentations follow with individual ratingsgiven:
10:10-10:30 Activities and prospect of Molecular Imaging Center of Diseases
Seiji Ito
10:30-12:00 Session 1: Division of Metabolic Disorders
Advisory Board: Dr. John A. Hanover, USA
Chair: Prof. Tomoyuki Nakamura & Prof.Kazuichi Okazaki
10:30-10:50 Keita Utsunomiya (Radiology),(a)The effects of radiation exposure on multidrug resistance in a
non-small lung cancer cell line.
Dr. Utsunomiya examined the effects of radiation exposure on multidrug resistance in a non-smalllung cancer cell line. Non-small cell lung cancer cell line H1299/wtp53 which is Pgp positive andexpresses BCRP. GG918was used to inhibit Pgp and BCRP. Radiation showed a dose dependent
increase in killing. These findings have important implications for increasing the efficacy ofradiation therapy.
10:50-11:10 Phan Thi Xuan Vien (Hematology, Respiratory Medicine &Reumatology), Statins,
HMG-CoA reductase inhibitors, have a potential to regulate Dendritic cell-mediated allergic
responses.
(a)Dr. Vien showed evidence that inhibitors of HMG-CoA reductase regulate dendritic cell – mediatedallergic responses. The findings suggest that HMG-CoA reductase inhibitors may be useful for
regulating allergic response. This effect was linked to OX40L expression on mDC by TSLP. The
mechanism appears to involve Stat6 or NF-KB or perhaps both. The findings offer a novel
approach to allergy treatment
11:10-11:30

Masayoshi Iwasaki (Cardiology, Nephrology, Endocrinology &Metabolism),
Circulating cardiac stem cells for cardiac repair.
(a)Dr. Iwasaki studies Cardiac stem cells and in particular tissue resident cardiac stem cells. He
showed that HGF mobilizes MAB-like cells and that Heparin injection (induces MAB mobilization)
His findings suggest that the Human heart is a niche of cMABs and may be mobilized under theconditions he has established.
11:30-11:45

Kazushige Uchida (Gastroenterology & Hepatology),
Analysis of neutrophil infiltration in type 1 and type2 autoimmune
pancreatitis.
(a)76Dr. Uchida studies AIP Autoimmune pancreatitis. Type I is IgG4 positive whileType 2 IgG4-negative.
These patients show granulocytic epithelial lesions. There was no difference in the duct epithelia
GCP-2 and IL-8. Given the prevalence of this form of pancreatitis in Japan, the findings haveclinical signifigance.
11:45-12:00 Kiichi Hirota (Department of Anesthesiology),
Activation of hypoxia-inducible factor 1 confers the metabolic reprograming in
the myeloid THP-1 cells(a)Dr. Hirota presented his work outlined his findings that:• HIF-1 accumulates in 1% O2• Induction of GLUT ENO• Lactate increases significantly in activated macrophages• n-propyl gallate- induces the HIF-1a accumulation in macrophages
The presentation was clear and suggests that hypoxia plays a key role in the“reprogramming” in myeloid THP-1 cells

2) Prospect(b)

All of the presented projects have important implications which can be translated into clinicalprogress in the short term. These were, in generally, clearly presented.
3. Division not in charge, if any
1) Presentation
2) Prospect

( )
( )

4. General comments and suggestions
Five-year program “Systematic elucidation of pathogenesis and development of diagnosis andtreatment by molecular imaging” was adopted by the Ministry of Education, Culture, Sports,
Science and Technology (MEXT) and Molecular Imaging Center of Diseases (MICD) wasestablished in September, 2011.
The goals of the project were:
1) to study in a wide-range fields that all departments at KMU can participate,2) to elucidate mechanisms of diseases by making use of various imaging systems andtechnologies,3) to translate basic research into diagnosis and treatment of diseases.
4) importantly to cultivate young researchers.
These goals have been largely accomplished based on the presentations. Imaging featured
prominently in all presentations. Also young scientists participated in all levels of the research.
In summary, I consider the five-year program a success since it accomplished its goals in a timely
way and quickly translated the findings into clinically-relevant advances.

77

Evaluation sheet for the 5-year research activities of MICD
Name: Min Zhuo
Date: April 11, 2016
Division in charge: Neuroscience
Evaluation:

1.

a. excellent,b. good, c. ordinary, d. bad, e. unknown

5-Year project of Molecular Imaging Center of Diseases
1) Organization including management(a)2) Objective and concept(a)3) Outcome(a)4) Prospect(a)comments

2. Division in charge
1) Outcome(a)a) General commentsb) Prominent achievementsc) Problems to be solved2) Prospect(a)

I think that potential international collaborations may even help MICD to produce better results withgreater impacted publications.

3. Division not in charge, if any
1) Outcome(a)2) Prospect(a)

4. General comments and suggestions
Over 5 years, I have seen wonderful progress made in the imaging centers.

From individual

presentations to posters, many PIs had benefited from the MICD. Quality of science is very
impressive; and some of studies have been published in major journals.
especially impressed the innovation and integration of the center.

Furthermore, I am

From basic research to clinicalapplication, works from MICD presents the future direction for medical researches. I recommend
is excellent, and I hope that the MICD will continue its success in future years.

78Evaluation sheet for the 5-year research activities of MICD

Evaluation:
1.

a. excellent,

Name: Tadashi Yamamoto
Date: April 17, 2016
Division in charge: Metabolic Disorders
b. good, c. ordinary, d. bad, e. unknown

5-Year project of Molecular Imaging Center of Diseases
1) Organization including management(a)2) Objective and concept(a)3) Outcome(a)4) Prospect(a)Comments
Five years ago, Kansai Medical University launched Molecular Imaging Center of Disease(MICD) to facilitate excellent pathological studies by introducing imaging technology. This was very
timely, as imaging technology has become very important for pathology in these days. At MICD
researchers from basic medicine and clinical medicine gathered together under the leadership of thechief of the center, Prof. Seiji Ito. Thanks to the great efforts and abilities and being equipped withhigh quality of imaging apparatus, such as those for imaging mass spectrometry and Image Stream
imaging flow cytometer, MICD has performed excellent researches in both basic and clinicalmedicine as well as in their collaborative researches. In other words, MICD grew to be an excellent
platform to conduct high-standard research, to mingle basic clinical medical sciences, and to educate
and train students and young researchers.
2.

Division in charge
1) Outcome(a)a) General comments
The activities of Division of Cancer have been excellent. High level of very basic researches has
been conducted, which is well affected to physician scientists resulting in conduction of promisingresearch projects. This largely owes to the presence of qualified researchers and the excellent
management in organization, research programs, and the education program. The high quality of
researches (some are mentioned below) resulted in publication of excellent papers in the competitive
journals.
b) Prominent achievements
During the research period of 5 years many interesting research were conducted. Among them
researches on stem cell biology represented by Professor Ueno’s and Sonoda’s works and viral
oncology represented by Prof. Fujisawa’s study are well conducted. Ueno’s works are at the level ofvery basic but important and have made a fundamental base for the search of cancer stem cells andtissue stem cells. In short Ueno’s group developed rainbow mice model in which multi-color lineage
tracing method is implemented. The model mice should be useful for tracing cancer stem cells aswell as tissue stem cells. Fujisawa’s works are also basic but could go forward to develop therapeutic
methods. Namely, humanized mice with HTLV-1 specific immunity can be applied for79drug-developing researches. There was also excellent progress in development of fluorescentimaging with ICG and/or 5-ALA. This technology allowed detection of minute tumors in the liver.
Not only these works, but also works in the Division of Cancer Research are cultivating stem cellresearch that include those conducted by Prof. Sonoda.

c) Problems to be solved
Although great efforts have been made for education, recruitment of young physician scientists
appears to be a problem to be solved in succeeding program in MICD. Next generation scientists ofbasic research would need to be nurtured or recruited for future development of research andeducation in Kansai Medical University.

2) Prospect(b)

I see that the MICD activity is largely contributing to the pathological studies in Kansai Medical
School. Imaging technology combined with animal model research has been established. Thus, once
the technology of MICD is more widely applied to various physiological studies, outcomes would bepromising. As the technology is expected to be useful for the cancer stem cell research, future
research programs in Kansai Medical School need to succeed what MICD has achieved.

3.

4.

Division not in charge, if any
1) Outcome( )2) Prospect( )General comments and suggestions
In the last 5 years, strong base for the active research is produced. Various equipments as well as

the bases for collaboration between basic research and clinical research are installed, which would
need to be followed by a succeeding new research program for further polishing and development of
medical sciences at Kansai Medical University.

80Evaluation sheet for the 5-year research activities of MICD
Name: John Hanover
Date: April 15, 2016
Division in charge: Cancer
Evaluation:a. excellent,b. good, c. ordinary, d. bad, e. unknown

1.

5-Year project of Molecular Imaging Center of Diseasesa
1) Organization including management ( a )2) Objective and concept(a)3) Outcome(b)4) Prospect(a)comments

2.

Division in charge
1) Outcome(a)a) General comments:
Most of the projects showed great promise and progress as presented in the oralpresentationsb) Prominent achievements:
Most of the projects achieved their research goals.
c) Problems to be solved2) Prospect(a)3.

Division not in charge, if any Not applicabe
1) Outcome( )2) Prospect( )4.

General comments and suggestions
Five-year program “Systematic elucidation of pathogenesis and development of diagnosis andtreatment by molecular imaging” was adopted by the Ministry of Education, Culture, Sports,
Science and Technology (MEXT) and Molecular Imaging Center of Diseases (MICD) wasestablished in September, 2011.
The goals of the project were:
1) to study in a wide-range fields that all departments at KMU can participate,2) to elucidate mechanisms of diseases by making use of various imaging systems andtechnologies,3) to translate basic research into diagnosis and treatment of diseases.
4) importantly to cultivate young researchers.
These goals have been largely accomplished based on the presentations. Imaging featured
prominently in all presentations. Also young scientists participated in all levels of the research.

In summary, I consider the five-year program a success since it accomplished its goals in a timely
way and quickly translated the findings into clinically-relevant advances. I was not able to attend
the complete meeting so my comments reflect the part of the program I was able to attend.

81Ⅵ-2. 病態分子イメージングセンターの内部評価
Internal evaluation of Molecular Imaging Center of Diseases「私立大学戦略的研究基盤形成支援事業」学内最終評価報告書（平成 28 年 5 月 9 日）
採択年度：平成 23 年(S1101034)
研究プロジェクト名：「分子イメージングによる体系的病態の解明と診断治療法の開発」
研究観点：研究拠点を形成する研究選定時「留意事項」：これまでの研究成果を基盤とする新たな成果に期待。さらに明確な目標設定が必要。
研究組織名：病態分子イメージングセンター
１、

はじめに
平成 23 年 4 月に表記私立大学戦略的研究基盤形成支援事業が 5 年間のプロジェクトとして開始され、平成 27 年 3 月に終了した。この間、平成 25 年には中間報告書が作成され、事業の推進を加速させている。事業の終了に当り、内部監査室による学内評価の結果を報告する。

２、

自己評価の実施体制
年次評価：研究組織「病態分子イメージングセンター」運営会議が、研究成果および研究費支出状況を点検評価し、その後の運営計画に改善を加えてきた。また、運営委員会は３名の外部の評価委員に、研究成果の中間発表評価および最終評価を依頼している。
学内最終評価：研究組織・研究代表者（伊藤誠二教授）の依頼により、本事業の学内最終評価を内部監査室が担当した。

３、

評価結果

３−１研究の進捗状況（１）「研究プロジェクトの目的・意義及び計画」の継続性「研究拠点を形成する研究」としての５年間の成果は、研究拠点を形成するに足る高度な技術開発を含む内容となっている。これらの研究は継続が望ましく、また可能であり、その継続により特色ある研究拠点の形成がより確固たるものとな
ると考えられる。
（２）「研究組織」の適切性
研究組織は 3 部門（神経、がん、代謝）からなり、拠点としての意義および必要性を十分配慮した配置となっている。また、それぞれの部門には学内研究者の得意分野が効果的に参画しており、学外共同研究者を含め、研究効率を高める最も適切な構成となっている。
（３）「研究施設・設備等」の利用時間・使用者数と研究成果（費用対効果）
本プロジェクトの研究施設・設備は本学綜合研究施設に新たに整備され、研究環
境のよい配置であり、また高度な技術を要する設備の使用には担当技術者が配置され、研究者の設備利用を円滑にしている。研究施設と設備の利用時間および利用者数は、その特徴に見合った適切な範囲にあると考えられる。
（４）研究の進捗状況と期待される成果
研究の進捗状況は個々の研究課題により幾分かの差があるが、全体としては、その中の傑出した或は将来性のある研究成果により、ほぼ十分と云える成果を上げている。本学の中核的研究グループが成果を上げ、学内共同研究および研究討論82

会を通じて学内全体の研究レベルに年々向上が見られることは喜ばしい。今後の学内研究の進め方にも役立つ、効率的な研究システム構築の契機となった。
（５）選定時「留意事項」に対する対処と成果
留意事項として「これまでの研究成果を基盤とする新たな成果に期待。
さらに明確な目標設定が必要」と記載されている。プロジェクト名は「分子イメージングによる体系的病態の解明と診断治療法の開発」であるが、組織名「病態分子イメージングセンター」が示す通り、中核グループは病態解明に必要性の高い病態分子の可視化・画像化に照準を合わせ、成功を収めている。この成果が学
内他部門および学外研究施設との共同研究に発展する可能性は高く、既にその兆しが見えている。
「留意事項」に対する対処と成果は良好な水準にあると考えられる。
（６）研究成果の公開状況
本学ホームページ内の「関西医科大学病態分子イメージングセンター」頁に、研究組織および研究成果の最新情報が掲載されている。
３−２研究費支出の適切性と費用対効果
研究費の支出は担当課により規則に添って適切に管理されている。施設、設備および消耗品他への支出状況も適正な比率を維持しており、研究が実質的にほぼ順調に進行したものと見られる。研究成果の内容から見て、費用対効果の判定（優、良、可）は、「優」判定が相当と見做せる。
３−３評価資源（１） 病態分子イメージングセンター組織運営規則（２） 病態分子イメージングセンター運営会議議事録（３） 「分子イメージングによる体系的病態の解明と診断治療法の開発」平成 23-24 年度
研究成果中間報告書（４） 「分子イメージングによる体系的病態の解明と診断治療法の開発」研究成果最終報
告書（案）（５） 関西医科大学病態分子イメージングセンター・ホームページ（６） 購入装置に係る固定資産台帳（７） 学内経理記録（平成 23〜27 年度病態分子イメージングセンター関係収支元帳）（８） 本プロジェクト担当課課長ヒアリング
４、自己評価結果への対応状況（研究内容の改善、研究費の配分等への反映）
自己評価の一環として実施された外部評価委員 3 名による研究成果中間報告の評価
では、１）組織運営と体制、２）目的と構想、３）研究成果、４）展望についての段階評価（a.excellent, b.good, c.odinary, d.bad）において、2 名の評価委員により３）
研究成果の b 判定があった以外は全て a 判定であった。これを受けて、研究組織は基礎系と臨床系の研究グループの共同体制を推奨し、研究発表会がその契機となり、いくつかの研究グループ間共同研究が始まっている。研究費の配分は研究グループ
自己負担分に見合う配分方法が取られており、共同研究の推進にも一定の配慮がなされていると考えられる。外部評価委員による最終評価では、３）研究成果は神経部門(a,a)、がん部門(a,b)、代謝部門(b,b)、プロジェクト全体の４）展望については、全員が a 判定としている。
評価者：関西医科大学内部監査室室長 稲垣千代子

83

（参考資料１）病態分子イメージングセンター組織運営規則(Supp. Info. 1) Organization and administrative regulation of MICD
(設置)
第 1 条 関西医科大学専門部に病態分子イメージングセンター（以下「センター」という。）を置く。
(目的)
第 2 条 センターは、基礎と臨床のトランスレーショナル研究発展のため、神経、がん、代謝の 3 研究グループと支援グループの研究体制を構築する。分子イメージン
グシステムを駆使して、患者と動物モデルの疾患の病態を分子から個体まで体系的に解明し、課題とする疾患の診断治療法の開発に結びつけることを目的とする。
(部門)
第 3 条 センターに次の部門を置く。
(1) 神経部門(2) がん部門(3) 代謝部門(職員)
第 4 条 センターの教職員は本学の教職員をもつて充て、兼務とする。ただし、本学教職員以外の者を嘱託として委嘱することができる。
(センター長)第 5 条 センターにセンター長を置く。
2

センター長は、センターを管理し、その運営にあたる。

3センター長は、大学院医学研究科委員会構成員の互選により選出し学長が任命する。

4

センター長の任期は 2 年とし、再任を妨げない。

(副センター長)
第 6 条 センターに副センター長を置く。
2

副センター長は、センター長を補佐し、センター長不在のときは、その職務を代行する。

3

副センター長は、大学院医学研究科委員会構成員の互選により選出し、学長が任命する。

4

副センター長の任期は 2 年とし、再任を妨げない。

(部門統括者)
第 7 条 第 3 条の部門に部門統括者(基礎系・臨床系)をおく。
2

部門統括者は、センター長と副センター長とが協議して大学院医学研究科委員会構成員の中から推薦し、学長が任命する。

(運営委員会)
第 8 条 センターに運営委員会を置く。
2

運営委員会は、次の者をもつて構成する。
(1) センター長(2) 副センター長
84

(3) 部門統括者 6 名
3

前項第 1 号及び第 2 号に掲げる委員の任期は、在任期間とする。

4

第 2 項第 3 号に掲げる委員の任期は 2 年とする。ただし、再任を妨げない。

5

運営委員会は、センターの円滑な運営をはかるために、次の事項を審議する。
(1) センターの予算の審議(2) センター長が必要とする事項(3) センターにおける研究の充実並びに促進に関する事項(4) 研究の成果の活用に関する事項(5) その他センター運営に関する事項

6

センターの施設利用に関することは、綜合研究施設に付託する。

7

運営委員会は、必要に応じてセンター長がこれを招集し、議長となる。

8

運営委員会の庶務は、学部事務部研究課において行う。

(規則の改廃)第 9 条 この規則の改廃は、センター運営委員会の審議を経て、大学院医学研究科委員
会の承認を得なければならない。
附則

この規則は、平成 23 年 8 月 1 日から施行する。
センター設置初年度の運営委員会構成員任期の終期は、平成 25 年 3 月 31 日とする。

85

（参考資料２）がん関連コンソーシアム(Supp. Info. 2) Cancer-oriented concortium＜構想＞

がんの臨床研究がますます必要となる。2012 年 9 月に 7 大学連携のがんプロフェシ
ョナル養成基盤推進プラン事業に参加したことに加え、枚方病院化学療法室の充実、病態分子イメージングセンター内の臨床系綜合研究施設の新設を好機と捉えて、がんの臨床研究を全学的戦略的に発展させる。（2012 年 11 月 13 日 全学教授会議事）


構成員は、がん関連領域の教授や教員に手上げ方式により 11 月末締切りで加入者を募り、その中から代表者、副代表者を決定する。



大学から 1,000 万円の資金導入を計画している。



将来本学のがんセンター設立へ発展させる。

平成２５年度事業【研究プロジェクト】臨床を中心とした横断的臨床研究を推進し、基礎はそれをサポートするという観点から、平成 25 年度の「がん関連コンソーシアム」のテーマは下記の3 点に絞り、12 件のテーマに対して研究費を配分した。
1. 癌診療と cancer stem cell （リーダー：薗田精昭）
山田

久夫

解剖学第一

1,110,000 神経系幹細胞と cancer stem cell

伊藤

量基

内科学第一

1,110,000

有効な免疫細胞療法の開発を目指して-免疫細胞療法と新規抗癌剤治療の相互作用機序の解明-

岩田亮一

脳神経外科学

1,110,000

グリオブラストーマの cancer stem cell の単離同定と樹状細胞治療への応用

2. 新規抗癌剤治療薬（TKI 等）に関する多科横断的研究（リーダー：倉田宝保）
下條

正仁

医化学

1,110,000 小細胞肺癌の新規治療法と早期診断法の開発

倉田

宝保

内科学第一

多癌腫における driver mutation 検索のための1,110,000 包括的ゲノム解析およびスクリーニングシステムの構築

金田

浩由紀

胸部心臓
血管外科学

1,110,000

臨床的分子標的治療後の腫瘍組織を用いた病理学的・分子生物学的検討

3. 癌診療と合併症に関する研究（リーダー：野村昌作）
野村

昌作

内科学第一

500,000 肺癌の血栓性合併症と活性型血小板に関する研究

段原

直行

内科学第三

500,000

がん化学療法中の腫瘍による合併症に対する内視鏡的処置の評価

86

河崎

裕英

小児科学

500,000

小児悪性腫瘍に対する化学療法時の発熱性好中球減少症における活性酸素種の病態への関与

柳本

泰明

外科学

830,000①がん化学療法における味覚異常評価法の検討②健康食品を用いた味覚異常改善効果に関する検討

杉

素彦

腎泌尿器
外科学

500,000

腎泌尿器外科悪性疾患手術における術後回復力強化プログラム (ERAS) の導入

谷川 昇

放射線科学

500,000 乳糜胸水に対する胸管塞栓術の評価【研究発表】
学内学術集談会（平成 26 年 2 月 14 日）で各テーマの代表者が研究成果を発表した。
座長：内科学第一 野村昌作 教授

発表者：医化学 下條正仁 講師「小細胞肺癌の新規治療法と診断法の開発に関する研究」
発表者：脳神経外科学 岩田亮一 助教「グリオブラストーマ癌幹細胞を標的とした樹状細胞療法の開発」
発表者：内科学第一 野村昌作 教授「癌と合併症に関する多科横断的研究」
平成２６年度事業【研究プロジェクト】臨床を中心とした横断的臨床研究を推進し、基礎はそれをサポートするという観点から、平成 26 年度の「がん関連コンソーシアム」のテーマは下記の4 点に絞り、10 件のテーマに対して研究費を配分した。
1. 癌診断と canser stem cell昭雄

脳神経外科学1,000,000

膠芽腫がん幹細胞に対する新規免疫療法の開発

神田 晃

耳鼻咽喉科・
頭頸部外科学1,000,000

唾液腺多形腺腫の癌化メカニズム解明と新しいマーカーの検索淺井

2. 新規抗癌剤治療薬（TKI 等）に関する多科横断的研究
下條

正仁

竹澤 健

金田

浩由紀

医化学

1,000,000

がん患者血液中エキソソーム内 miRNA の網羅的 miRNome 解析

内科学第一

悪性固形腫瘍における PD-L1 の発現、及び1,000,000 PD-L1 を標的にした新規分子標的薬の臨床導入の可能性の検討

胸部心臓血管
外科学

1,000,000

肺癌手術検体からの肺癌組織・
細胞バンクの確立に向けて87

3. 癌診療と合併症に関する研究
野村

昌作

内科学第一

1,000,000

組織因子発現マイクロパーティクルを用いた血栓性癌合併症の新規評価法の開発に関する研究

柳本

泰明

外科学

1,000,000

がん化学療法患者における oncology emergency の評価と対策

4. 寄付講座開講に寄与する癌研究
薗田

精昭

衛生学

1,000,000

新規白血病幹細胞 (LSC) を治療標的とする特異的抗体療法の開発

伊藤

量基

内科学第一

1,000,000

内因性 I 型 IFN 促進を標的とした新たな癌治療の開発

海堀

昌樹

外科学

難治性癌に対する早期診断および根治性かつ1,000,000 安全性を追求した外科系手術のための多科横断的な画像支援技術の開発【研究発表】
学内学術集談会（平成 27 年 3 月 13 日）で 2 名の代表者が研究成果を発表した。
座長：内科学第一 野村昌作 教授

発表者：内科学第一 野村昌作 教授「癌の合併症におけるマイクロパーティクルの意義」
発表者：衛生学

藤岡龍哉 講師「新規白血病幹細胞（LSC）を治療標的とする特異的抗体療法の開発」
平成２７年度事業【研究プロジェクト】臨床を中心とした横断的臨床研究を推進し、基礎はそれをサポートするという観点で、平成 26 年度の成果の展開が期待できる 4 件のテーマに対して、
平成 27 年度の「がん関連コンソーシアム」のテーマに研究費を配分した。
薗田

精昭

衛生学

2,500,000

新規白血病幹細胞 (LSC) を治療標的とする特異的抗体療法の開発

神田晃

耳鼻咽喉科・
頭頸部外科学2,500,000

唾液腺多形腺腫のがん化メカニズム解明と新しいマーカーの検索

野村

昌作

内科学第一

2,500,000

血管内皮細胞由来マイクロパーティクルを用いた癌関連凝固異常症の新規評価法に関する研究

柳本

泰明

外科学

2,500,000

消化器腫瘍の悪性化のメカニズム解明と新しい腫瘍マーカーの開発【研究発表】
学内学術集談会（平成 28 年 3 月 18 日）で研究費を配分されたテーマの研究成果を発表
した。
88

座

長：病態検査学 蔦幸治 教授

発表者：内科学第一 野村昌作 教授「血管内皮細胞由来マイクロパーティクルを用いた癌関連凝固異常症の新規評価法
に関する研究」
発表者：衛生学 藤岡龍哉

講師

「新規白血病幹細胞 (LSC) を治療標的とする特異的抗体療法の開発」
発表者：外科学 柳本泰明 講師「当院におけるがん関連緊急入院実態調査」
発表者：耳鼻咽喉科・頭頸部外科学

鈴木健介 助教「唾液腺腫蕩の悪性化のメカニズム解明と新しい腫湯マーカーの開発に関しての検討」

89

（参考資料３）再生医療コンソーシアム(Supp. Info. 3) Regenerative medicine concortium＜構想＞

再生医療をテーマとして大学全体で研究戦略を立てる効果的な基礎・臨床研究を開始する。
（2012 年 11 月 13 日 全学教授会議事）


臨床系講座と基礎社会医学系講座を横断的な連携システムをもって構築する。



構成員は再生医療に関心のある教授や教員にアンケートをし、手上げ方式で加入者を募り 11 月末締切り後、その中から代表者、副代表者を決定する。



大学から 1,000 万円の資金導入を計画している。

平成２５年度事業【研究プロジェクト】基礎研究から臨床研究へとトランスレーショナルな展開をする観点で、学内の再生医療に関する研究提案の中から 2 件を採択した。
薗田 精昭

衛生学

4,950,000

ヒト造血幹細胞の体外増幅システムの開発權

外科学4,950,000

肝不全患者自身の患者自己幹細胞および自家
組織由来足場材料を用いた革新的、低侵襲肝再生療法の開発雅憲【研究発表】
また、9 月から 3 ヶ月に 1 回再生医療コンソーシアム研究会を開催した。毎回 2－3
講座が研究紹介をし、その後ディスカッションをしている。基礎系研究者は研究トーク
ランチで研究紹介をしているので、本研究会では主に臨床応用につながる臨床系講座が研究の紹介をした。平成 25 年度は以下の研究発表を行った。


平成 25 年 9 月 20 日（金）発表者：松岡由和

助教（衛生学）、海堀昌樹 准教授（外科学）、森本尚樹 講師（形成外科学）

平成 25 年 12 月 13 日（金）発表者：覚道奈津子 助教（形成外科学）、伊藤量基 准教授（内科学第一）、山田晴彦



准教授（眼科学）平成 26 年 3 月 28 日（金）発表者：福井寿朗 講師（内科学第三）、塩島一朗



平成 26 年 2 月 14 日（金）学内学術集談会
座

長：薬理学 中邨智之 教授

発表者：衛生学 松岡由和 助教
90

教授（内科学第二）「ヒト造血幹細胞の体外増幅システムの開発」
発表者：外科学 松井康輔 講師「自己血管内前駆細胞を用いた外科的肝再生療法の試み」
平成２６年度事業【研究プロジェクト】基礎研究から臨床研究へとトランスレーショナルな展開をする観点で、学内の再生医療に関する研究提案の中から 3 件を採択した。
中邨 智之

薬理学

4,000,000 弾性線維再生技術の開発

薗田 精昭

衛生学

2,000,000

ヒト造血幹細胞の完全純化と階層制の解明-革新的造血幹細胞移植療法の開発

楠本 健司

形成外科学

4,000,000「わかりやすく」「安心できる」「良質な」乳癌切除から乳房再生への一貫治療【研究発表】
再生医療コンソーシアム研究会は、平成 25 年 9 月から年 4 回（6 月、9 月、12 月、3月）のペースで開催しており、研究に関する紹介、ディスカッションを行った。平成
26 年 12 月からは基礎系と臨床系との交流をより深めるために、研究医長会議で行っている臨床系研究室セミナーと合同で行うこととなった。なお、平成 26 年度は以下の研究発表を行った。


平成 26 年 6 月 13 日（金）神経内科学 中村正孝 助教「DNA 損傷応答シグナル分子 breast cancer susceptibility gene 1 (BRCA1) と神経変性」
小児科学 辻章志 准教授「分子標的療法による小児特発性ネフローゼ症候群治療の可能性」



平成 26 年 9 月 26 日（金）胸部心臓血管外科学 岡田隆之 講師「心拍動下 onlay grafting の遠隔期冠動脈 remodeling 効果」
脳神経外科学 埜中正博 教授「臍帯血幹細胞移植による脊髄髄膜瘤の新規治療法開発」



平成 26 年 12 月 17 日（水）薬理学 中邨智之

教授「弾性線維の形成と再生の分子機構」
形成外科学

覚道奈津子 助教

「脂肪由来幹細胞を使った脂肪再生の研究と今後の展望」



平成 27 年 3 月 18 日（水）91

衛生学 薗田精昭教授「ヒト造血幹細胞の完全純化と階層制の解明」
心療内科学

阿部哲也 講師「慢性疼痛における疼痛閾値と心理的側面の関連について」

平成 27 年 3 月 13 日（金）学内学術集談会
座長：薬理学 中邨智之 教授
発表者：形成外科学 田中義人 助教「「わかりやすく」「安心できる」「良質な」乳癌切除から乳房再生への一貫治療」
発表者：衛生学 松岡由和 助教「ヒト造血幹細胞の完全純化と階層制の解明 - 革新的造血幹細胞移植療法の開発」
発表者：薬理学 中邨智之 教授「弾性線維の再生」

平成２７年度事業【研究プロジェクト】基礎研究から臨床研究へとトランスレーショナルな展開をする観点で、学内の再生医療に関する研究提案の中から 2 件を採択した。
中邨 智之

楠本 健司

薬理学

形成外科学

5,000,000 弾性線維再生技術の開発「わかりやすく」「安心できる」「良質な」5,000,000 乳癌切除から乳房再生への一貫治療～医産連携から再生医療実施へ【研究発表】


学内学術集談会（平成 28 年 3 月 18 日）で研究費を配分されたテーマの研究成果を発表した。
座長：形成外科学

楠本健司 教授

発表者：薬理学 中邨智之 教授「弾性線維の形成と再生の分子機構」
座長：薬理学 中邨智之 教授
発表者：形成外科学 田中義人 助教「「わかりやすく」「安心できる」「良質な」乳癌切除から乳房再生への一貫治療～
医産連携から再生医療実施へ」

92

（参考資料４）研究トークランチ(Supp. Info. 4) Research talk at lunch＜構想＞
基礎社会医学系講座の各研究テーマを開示し、他の講座の研究内容や用いる実験技術を理解して、講座の垣根を越えた共同研究する環境作りを目的とする。（2012 年 11 月 13日

全学教授会議事）2015 年 3 月で昼食会を兼ねた基礎教授会がなくなるので、その時間帯を月 1 回各
基礎社会医学系講座の教授・教室員に加えて 臨床系講座からも研究に関心の深い教員にも参加を要請し、ランチタイムの研究交歓会を行う。



基礎社会医学系・臨床系の連携を横断的に図るテーマを検討し選択する。

 ランチタイムに開催するため、各講座で世話人を選び、昼食代は大学負担とする。
【研究発表】
平成25年度
開催日時

座長

4月16日

医化学・伊藤教授
分子遺伝学・木梨教授

5月21日

医化学・伊藤教授
分子遺伝学・木梨教授

6月18日

医化学・伊藤教授
分子遺伝学・木梨教授

7月16日

医化学・伊藤教授
分子遺伝学・木梨教授

発表講座
医化学
生理学第二
薬理学
病理学第一
微生物学
病理学第二
衛生学
公衆衛生学

休会
9月17日

医化学・伊藤教授
分子遺伝学・木梨教授

解剖学第一
解剖学第二

医化学・
下條講師
解剖学第二・
丸山講師
解剖学第一・
若林准教授
分子遺伝学部門・
片貝講師

分子遺伝学部門
モデル動物部門
生理学第二
病理学第一
病理学第二
公衆衛生学
解剖学第二
法医学

開催日時

座長

医化学・伊藤教授
10月15日分子遺伝学・木梨教授

11月19日医化学・伊藤教授
分子遺伝学・木梨教授

微生物学・
上野助教
生理学第二・
1月21日
則武助教
病理学第二・
2月18日
義澤講師

12月17日

発表講座
生理学第一
法医学
分子遺伝学部門
生体情報部門
医化学
薬理学
生理学第一
衛生学
解剖学第一
微生物学

休会
平成26年度

4月15日
5月20日
6月17日
7月15日

モデル動物部門・
李准教授
公衆衛生学・
11月18日
神田准教授
法医学・
12月16日
橋谷田講師
薬理学・
1月20日
赤間准教授
10月21日

休会
9月16日

医化学
衛生学
解剖学第一
微生物学
分子遺伝学部門
生体情報部門
生理学第二
病理学第一

休会

生体情報学部門・ 生理学第一
松田准教授
薬理学

休会
平成27年度

4月21日
5月19日
6月16日
7月21日

病理学第一・
吉田講師
衛生学・
佐々木准教授生理学第一・
林助教
微生物学・
上野助教

病理学第二
公衆衛生学
解剖学第二
法医学
神経機能部門
生理学第一
薬理学

薬理学・
赤間准教授
生理学第二・
11月17日則武助教
病理学第二・
12月15日
義澤講師
医化学・
1月19日
片野講師
10月20日

休会
9月15日

生体情報学部門・ 微生物学
松田准教授
法医学

麻酔科学
医化学
衛生学
解剖学第一
微生物学
分子遺伝学部門
モデル動物部門
休会

3月18日

93

解剖学第二・
加瀬講師

生理学第二
病理学第一

（参考資料５）関西医科大学研究医養成コース(Supp. Info. 5) Training course for future physician scientists in KMU
平成 16 年 4 月に新医師臨床研修制度が導入されたことにより、医科大学・医学部を卒業して、基礎医学研究に進む学生はほとんどなく、日本の医学研究、特に基礎医学研究の崩壊が喫緊の課題となった。そのため、文部科学省は医師不足解消のための「地域枠」に加えて、研究医養成のための「研究医枠」による医学部入学定員増を認めた。2013
年度、関西医科大学は、西日本の私立医科大学・医学部ではじめて「研究医枠」の定員2 名の増員が認められ、「研究医養成コース」を設置した。奈良県立医科大学、大阪医科大学、兵庫医科大学で関西 4 医科大学コンソーシアム（神戸大学医学部はオブザーバー）を結成し、医学部出身者の研究医養成を推進している。
○関西医科大学研究医養成コース運営委員会規程(趣旨)
第 1 条 関西医科大学医学部医学科の研究医養成コースの円滑な運営と研究医養成に係る奨学金貸与者へのキャリア支援を図るため、研究医養成コース運営委員会（以下、「運営委員会」という。
）を置く。
(所掌事務)
第 2 条 運営委員会の事務は次のとおりとする。
(1) 研究マインド育成コース・研究医養成コースに係る連携大学間の連絡・調整に関すること。
(2) 研究マインド育成コース・研究医養成コースの学生募集・選抜に関すること。
(3) 研究医養成コース 4 医科大学コンソーシアム発表会に関すること。
(4) 奨学金貸与者の卒前教育及び卒後のキャリア支援に関すること。
(5) その他研究医養成に必要と認められること。
(組織)
第 3 条 運営委員会は、次の各号に掲げる委員をもつて組織する。
(1) 副学長(2) 連携大学（奈良県立医科大学及び大阪医科大学、兵庫医科大学）から推薦のあつ
た専任教授

各1名

(3) 教務部長(4) 大学院教務部長(5) 教務副部長
2

前項の委員は、教授会の議を経て学長が任命又は委嘱する。

3

前項の規定により任命された委員の任期は 2 年とし、再任を防げない。ただし、欠員を生じたときは、これを補充し、その任期は前任者の残任期間とする。
(委員長)
第 4 条 委員会に委員長を置く。
2

委員長は必要に応じて委員会を招集し、その議長となる。
94

委員長に事故あるときは、あらかじめ委員長が指名した委員がその職務を代行する。

3(会議)
第 5 条 委員会は、委員の過半数の出席がなければ開催することができない。
委員長は、必要があると認めるときは、委員以外のものを委員会に出席させ、その2意見を求めることができる。
委員会の議事は、出席委員の過半数でこれを決し、可否同数のときは、議長の決す

3るところによる。
第 2 条(2)(4)(5)に関する会議にあたつては、
第 3 条(1)(3)(4)(5)の委員によつて開催し、4議を決するものとする。ただし、第 3 条(2)の委員の出席は、これを妨げない。
(庶務)第 6 条 運営委員会の庶務は、大学事務部において行う。
(委任)
第 7 条 この規程の施行に関し必要な事項は、委員長が定める。
附

則

この規程は、平成 25 年 7 月 1 日から施行する。
【研究医養成コースの概要】
研究医養成コースの概要は下図のとおりである。

(1) 4 月の新入生オリエンテーションで、パンフレット『基礎医学研究へのいざない』を配布し、研究医養成コースを紹介する。
(2) 4 月の基礎医学セミナー履修登録時に「研究マインド育成プログラム」参加者を募集し、5 月からプラグラムがスタートする。平成 25 年度は 8 名、平成 26 年度
は 15 名、平成 27 年度は 20 名がプログラムに参加した。
(3) 2 学年 3 学期に「研究マインド育成プログラム」に参加した学生の中から「研究医養成コース」に入る学生（定員 4 名）を募集し、平成 26 年度は 4 名（島本優
太郎・西村拓也・南暁彦・八木直人）、平成 27 年度は 1 名（西川瑞希）を選抜した。

95

【研究医養成コースコンソーシアム合宿】

平成 25 年度
日時：平成 25 年 8 月 22 日
場所：関西医科大学枚方学舎第 1 講堂
参加大学：関西医科大学、大阪医科大学、奈良医科大学…教職員 29 名
発表者：医化学伊藤誠二教授（副学長）「関西医科大学研究医養成コースについて」
奈良県立医科大学

藤本眞一教授「奈良県立医科大学研究医養成コースについて」
学生発表者：奈良県立医科大学
発表者：薬理学

2 名、関西医科大学

1名

中邨智之教授「生体の伸縮性を生み出す仕組みの研究」
奈良県立医科大学法医学工藤利彩助教「アルコールによって誘発される突然死（内因性急死）のメカニズムの解明─血管機能とアルコールの観点から─」
大阪医科大学泌尿器科学

東治人教授「浸潤性膀胱癌に対する新規膀胱温存療法’OMC-regimen’の治療成績と今後の展望」


平成 26 年度
日時：平成 26 年 8 月 20 日～21 日
場所：神戸ポートピアホテル
参加大学：関西医科大学、大阪医科大学、奈良医科大学、兵庫医科大学…教職員
41 名
発表者：医化学大阪医科大学伊藤誠二教授（副学長）、奈良県立医科大学

大槻勝紀教授、兵庫医科大学

藤本眞一教授、鈴木敬一郎教授

学生発表者：関西医科大学 5 名、奈良県立医科大学

2 名、大阪医科大学

発表者：関西医科大学

松井勝、大阪医科大学

吉田健志、奈良県立医科大学

1名
塩

見真由美
発表者：法医学橋谷田正樹講師「東日本大震災における法医学の役割」
形成外科学

覚道奈津子助教「脂肪幹細胞を使った再生医療の strategy」
大阪医科大学解剖学

平田あずみ助教「Mechanisms of tooth root and palate formation」


平成 27 年度
日時：平成 27 年 8 月 19 日～20 日
場所：奈良県橿原ロイヤルホテル
参加大学：関西医科大学、奈良医科大学、大阪医科大学、兵庫医科大学、神戸大学医学部…教職員 41 名
96

発表者：関西医科大学
科大学

伊藤誠二教授、奈良県立医科大学

小野富三人教授、兵庫医科大学

藤本眞一教授、大阪医鈴木敬一郎教授、神戸大学

篠原正和助

教
学生発表者：関西医科大学 4 名、大阪医科大学 2 名、奈良県立医科大学
発表者：兵庫県立医科大学解剖学「医学部から基礎研究の道へ
関西医科大学医化学八木秀司教授私の経験から」

伊藤誠二教授「我思う、ゆえに痛みあり」
大阪医科大学生理学

小野富三人教授「透明な小型魚類をモデルとした神経系の研究」

97

2名

（参考資料６）研究医長会議(Supp. Info. 6) Meeting of head scientific physicians in clinicaldepartments○臨床系研究医長に関する取扱要領(目的)
1 本学臨床系講座における研究体制の充実・研究活動の活性化を図るために、臨床系各講
座に研究医長を置く。
(役割・業務)2 研究医長は、所属する講座の大学院生、臨床研修医及びその他教員の研究について教授を補佐し、実験、論文作成、学会発表、公的研究費の申請等臨床系講座の教員の研究活動につき適切な指導・助言を行い、研究室の整備に努め、本学の研究の活性化に貢献する。
また研究に関する研究者倫理規範について広く啓発活動を行う。
(任用)
3

研究医長は、教授が、十分な研究業績若しくは研究指導能力を持つ准教授・講師・助教の中から 1 名を指名し、臨床系教授会の議を経て任用されるものとする。
(任期)
4

研究医長の任期は 1 年とし、再任を妨げない。

(処遇)
5

研究医長は、教育医長、病棟医長、外来医長の兼務を妨げない。なお、手当は、別に定める。
(研究医長会議)
6

研究医長は、第 2 項に定められている大学の研究の活性化のために、研究医長会議を開

催し、審議する。研究医長会議には研究医長の他、臨床系綜合研究施設責任者、研究担当
副学長が出席する。また学長が指名する者が参加することができる。
(議長)
7

前項の研究医長会議に議長を置く。議長は研究担当副学長とし、必要に応じ学長へ報告

する。
(事務)
8

研究医長会議の庶務は、大学事務部研究課が担当する。

(規程の改廃)9

この規程の改廃は全学教授会の議を経なけらばならない。

附則

本要領は、平成 26 年 4 月 1 日から施行する。
【研究活動】
平成 25 年 4 月に大学の学舎が枚方キャンパスに統合された。MICD に臨床系綜合研究施設が設置され、研究施設・装置・設備が枚方キャンパスに整備され、研究環境が整った。
臨床系の研究力を強化するために、臨床系 21 講座に研究医長を選出し、様々な活動を行う
98

研究医長制度を導入した。研究医長の中から、海堀昌樹（外科学）と伊藤量基（内科学第一）准教授を本会議の代表者にして以下の活動を行っている。
１．臨床系研究セミナー
毎月 2 講座ずつ、各講座の若手研究者が研究内容を行い、他の講座の研究内容を共有することで研究者間の連携を図る場を目指している。
２．科研費の申請書のブラッシュアップ
研究医長、基礎系教授が研究医長が推薦する科研費計画調書を他の講座の研究医長が回読し、研究計画などについて具体的なアドバイスを行っている。平成 27 年度臨床新規採択
件数は前年比で 9 件増加した。
３．臨床系講座の研究環境の改善
臨床系講座の研究力アップのため、研究医長にヒアリングを行い、学長に具申している。
【研究医長一覧】
講座名

平成 26 年度

平成 27 年度

平成 28 年度

内科学第一

伊藤 量基

伊藤 量基

伊藤 量基

内科学第二

塚口 裕康

塚口 裕康

塚口 裕康

内科学第三

内田 一茂

内田 一茂

内田 一茂

心療内科学

水野 泰行

水野 泰行

阿部 哲也

神経内科学

金子 鋭

金子 鋭

金子 鋭

精神神経科学

加藤 正樹

吉村 匡史

吉村 匡史

小児科学

辻

章志

河崎 裕英

辻

外科学

海堀 昌樹

海堀 昌樹

海堀 昌樹

胸部心臓血管外科学

金田 浩由紀金田 浩由紀岡田 隆之

呼吸器外科学

-

-

齋藤 朋人

脳神経外科学

吉村 晋一

吉村 晋一

吉村 晋一

整形外科学

串田 剛俊

串田 剛俊

串田 剛俊

形成外科学

森本 尚樹

森本 尚樹

森本 尚樹

皮膚科学

山﨑 文一

神戸 直智

神戸 直智

腎泌尿器外科学

木下 秀文

木下 秀文

木下 秀文

眼科学

山田 晴彦

山田 晴彦

山田 晴彦

耳鼻咽喉科・頭頸部外科学

神田 晃

神田 晃

神田 晃

放射線科学

河

河

相吉

中村 聡明

産科学・婦人科学

岡田 英孝

都筑 朋子

都筑 朋子

麻酔科学

廣田 喜一

廣田 喜一

廣田 喜一

臨床検査医学

桝田 緑

桝田 緑

桝田 緑

救急医学

室谷 卓

室谷 卓

室谷 卓

相吉

99

章志

（参考資料７）第 1 回病態分子イメージングセンター年次集会抄録

The 1st Annual Meeting of Molecular Imaging Center of Diseases
on May 1, 2012 at 13th-floor Auditorium, Hirakata Hospital

Program
1:00-1:10
1:10-1:30

1:30-2:30

Opening remarks
Introduction of advisory board members
Outline and prospect of Molecular Imaging Center of Diseases
Seiji Ito
Session 1: Division of Metabolic Disorders
Advisory Board: Dr. John A. Hanover, USA
Chair: Tomoyuki Nakamura, Kazuichi Okazaki

1:30-1:45 Tomoyuki Nakamura (Molecular Pharmacology)
Development and regeneration of elastic fiber
1:45-2:00 Hiroyasu Tsukaguchi (Internal Medicine 2)
Genetic approaches to identify new targets of molecular imaging for kidney andneurodevelopmental disorders
2:00-2:15 Toshiro Fukui (Internal Medicine 3)
The specific linker phosphorylation of Smad2/3 indicates epithelial stem cells incolon; particularly increasing in the regeneration phase of murine model of dextran
sulfate sodium-induced colitis
2:15-2:30 Tomoki Ito (Internal Medicine 1)
Dendritic cells as therapeutic targets of autoimmune diseases.

2:30-3:50

Session 2: Division of Neuroscience
Advisory Board: Prof. Min Zhuo, Canada
Chair: Tetsuo Sugimoto, Hirofumi Kusaka

2:30-2:42 Masayoshi Okada (Cellular and Molecular Physiology)
The degradation of the inwardly rectifying potassium channel, Kir2.1, depends on thecurrent level
2:42-2:54 Taketoshi Wakabayashi (Anatomy and Cell Science)
Cell type specific expression of lamin subtypes in rat retinal neurons
2:54-3:06 Hakuo Takahashi (Clinical Sciences and Laboratory Medicine)
Analysis of the brain digitalis-like substance underlying hypertension
3:25-3:37 Satoshi Kaneko (Neurology)
Analysis of intracytoplasmic inclusions of neurodegenerative diseases by imaging
mass spectrometry
3:37-3:50 Masahito Shimojo (Molecular and Functional Biology)
The challenges of neurodegenerative disease modeling using patient-specific iPSCs
100

3:50-4:50

Session 3: Division of Cancer
Advisory Board: Prof. Tadashi Yamamoto, Japan
Chair: Jun-ichi Fujisawa, Koichi Tomoda

3:50-4:05 Yosiaki Sonoda (Stem Cell Biology)
Prospectively isolated novel PDGFRα and Sca-1 double positive mouse dental pulp
stem cells exist in the tooth-forming niche
4:05-4:20 Jun-ichi Fujisawa (Viral Oncology)
Analysis of ATL development in HTLV-1 infected humanized mouse model
4:20-4:35 Masanori Yamada (Surgery)
Application of MALDI-imaging mass spectrometry to esophageal and gastric cancer
research
4:35-4:50 Tomoya Katakai (Molecular Genetics, IBS)
Live imaging of high-speed lymphocyte migration in lymph node stromal network by
two-photon microscopy

4:50-5:00

Closing Remarks

Hiroo Ueno

101

Abstract
Outline and prospect of Molecular Imaging Center of Diseases
Seiji Ito (Molecular and Functional Biology)
Molecular Imaging Center of Diseases was established in September 2011 upon adoption of the
program for the strategic research foundation at private universities supported by the Ministry of
Education, Culture, Sports, Science, and Technology (MEXT) of Japan. The Center aims tocontinue the former 5-year project “Interactive translational research toward the treatment of
intractable neural diseases by restoration and regeneration” carried out in Brain Medical ResearchCenter at Takii campus in 2006－2011 and expand translational research between basic and clinicaldepartments in a wide-range field of medicine in Hirakata new campus which will open in April
2013. We plan to establish the Center on the 5th floor of the mid-rise building in Hirakata new
campus and endeavor to make it a research foundation capable of pursuing interdisciplinary andstrategic research. The objectives of the Center are (1) to systematically elucidate pathogenesis ofvarious diseases by use of animal disease models and patient samples from molecular to individuallevels, (2) to translate the basic research on diseases into clinical application, by making the most of
state-of-the-art imaging systems including two-photon microscopy and imaging mass spectrometry,and (3) to cultivate young researchers. To accomplish them, the Center consists of three divisionsof Neuroscience, Cancer, and Metabolic Disorders, each of which is managed by two division heads
assigned from basic and clinical fields and a supporting division. The supporting division helps
project members to promote research activities and cultivate young researchers. The research
activities will be evaluated by advisory board members from outside. I will introduce examples ofcooperative research and overview the prospect of the Center.

Session 1

Division of Metabolic Disorders
Development and regeneration of elastic fiber
Tomoyuki Nakamura (Molecular Pharmacology)

Elastic fibers are ubiquitous extracellular matrix (ECM) components responsible for tissue
elasticity. Degradation of elastic fibers causes emphysema, arterial stiffness and loose skin. The
turnover rate of elastic fibers is very low, and there is no method to effectively regenerate elastic
fibers. The process of elastic fiber assembly involves elastin monomer (tropoelastin) deposition on
microfibrils, followed by cross-linking of tropoelastin by lysyl oxidase. As the turnover rate ofelastic fibers are very low, elastic fiber regeneration has been considered to be difficult.
We found that at least three secreted proteins, fibulin-4 and -5, and LTBP-4 (latent
TGFβ-binding protein 4), play essential roles in the elastogenesis process. Mouse arteries that lackeither of these genes were stiff, and the elastic lamellae were disorganized. We show independentroles of fibulin-4 and -5 in elastic fiber assembly that do not overlap each other, and an
LTBP-4-dependent role of fibulin-5.

Genetic approaches to identify new targets of molecular imaging forkidney and neurodevelopmental disorders
Hiroyasu Tsukaguchi (Internal Medicine 2)
Chronic kidney diseases and neurodevelopmental diseases (i.e., mental retardation, epilepsy)
are major health concerns with an overall prevalence of ~ 1-2% worldwide. The development ofsimpler, non-invasive molecular imaging techniques, visualizing the spatio-temporal progression of
disease processes, will greatly stimulate the generation of new therapeutic strategies for these102common disorders. In this study, we reasoned that understanding the pathophysiological basis of raremendelian disorders is the best way to select novel target molecules suitable for imaging studies inmore common disorders.
To address this issue, as a first step, we searched as-yet-undefined genes causing a rarecongenital disorder of Galloway-Mowat syndrome (GMS, MIM 251300). GMS is characterized byco-occurrence of malformation in central nerve systems (CNS) and renal glomeruli. Clinically, GMS
patients typically exhibit two core manifestations consisting of (1) nephrotic syndrome progressing
to end stage renal disease, and (2) psychomotor retardation and/or epilepsy. In ten Asian GMS
patients, we screened the exomes and structural variations across the whole genome. Several
suspicious candidate genes are now on the way of being validated for their biological significance.
To gain more insights into the pathophysiology underlying GMS, we generated patient-specific iPS
cells from one family (3 clones under 12 passages, in collaboration with Prof. Era’s lab, Kumamoto
University).
A neuron and glomerular podocyte share a common biological feature of terminallydifferentiated cells that exert their function through formation of specialized cell-cell junctions (i.e.,
synapse and slit diaphragm). Therefore, diseases pathways underlying GMS, e.g., metabolic activity,
cell proliferation, apoptosis, and migration, etc. are likely shared by these two cellular lineages.
Identification of GMS genes will open new avenue to create a real-time, noninvasive imaging
system that detect an unique biological process indispensable for building up a proper tissue
architecture of renal glomeruli and CNS.

The specific linker phosphorylation of Smad2/3 indicates epithelial stem
cells in colon; particularly increasing in the regeneration phase of murine
model of dextran sulfate sodium-induced colitis
Toshiro Fukui (Internal Medicine 3)
Stem cells play roles in mucosal cell homeostasis and repair. Although they are supposed to belocated around the crypt base of colon, useful markers have not been elucidated. Previously, we haveidentified the significant expression of Smad2/3, phosphorylated at specific linker threonine residues(pSmad2/3L-Thr), in specific epithelial cells of murine stomach and have suggested these cells to bestem cells. (J Gastroenterol 2011:46:456-68) In the present study, we explored whether
pSmad2/3L-Thr could serve as a marker for stem cells of colon.
Normal colons from C57BL/6 or Lgr5-EGFP knock-in (Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2) mice andcolons from murine model of dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis were examined. In
normal colons, pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells were found around the crypt base anddetected between Ki67 immunostaining-positive cells, but immunohistochemical co-localization of
pSmad2/3L-Thr with Ki67 was never observed. pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells
showed co-localization with cytokeratin8 and CDK4, different localization with ChromograninA,and similar localization with doublecortin and calcium/calmodulin-dependent protein kinase-like-1(DCAMKL1) immunostaining-positive cells. In DSS-induced colitis, both pSmad2/3L-Thr and Ki67
immunostaining-positive cells were significantly increased in the regeneration phase and decreasedin the injury phase compared with those of normal C57BL/6 mice. In colon of Lgr5-EGFP knock-in
mice, most pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells showed co-localization with Lgr5 (GFP),
but a small number of pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells showed different localization
with Lgr5. After immunofluorescent staining, we stained the same sections with hematoxylin-eosin
and observed pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells indicated undifferentiatedmorphological features and were confirmed around the crypt base. 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU)
labeling assay was used to examine label-retention (multiple BrdU pulses; three times a day for 2
days)ofpSmad2/3L-Thr
immunostaining-positive
cells.
Some
pSmad2/3L-Thr
immunostaining-positive cells showed co-localization with BrdU at 5 d, 10 d, and 15 d after BrdU
administration.
103

We have identified the significant expression of pSmad2/3L-Thr in specific epithelial cells ofmurine colon and have suggested these cells to be stem cells.

Dendritic cells as therapeutic targets of autoimmune diseases
Tomoki Ito (Internal Medicine 1)
Dendritic cells (DCs) are widely distributed in the body to enhance the innate immune responseby cytokine production through antigen recognition and initiate acquired immunity by priming naïve
CD4+ T cells. Therefore, DCs are the master cells in activating immune responses. Plasmacytoid
dendritic cells (pDCs), one of the human DC subsets, play not only a central role in antiviral immune
response in innate host defense but also a pathogenic role in the development of the autoimmune
responses by vicious spiral based on the dysregulated type I IFN production through sensing immune
complexes containing self-nucleic acids. Thus, type I IFNs and pDCs represent key molecular andcellular pathogenic components in autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus(SLE). Accordingly, control of the dysregulated pDC-derived type I IFN production provides analternative treatment strategy for SLE. We focused on two agents, IκB kinase inhibitor(BAY11-7082) and HMG-CoA reductase inhibitors (statins), and investigated theirimmunomodulatory effects in targeting the IFN response on pDCs.
Our study identified that both BAY11 and statins have the ability to inhibit nuclear translocationof IRF7 and IFN-α production in human pDCs. We also found that these agents inhibited both invitro IFN-α production induced by the SLE serum and the in vivo serum IFN-α level induced byinjecting mice with TLR ligand. These findings suggest that BAY11 and statins have the therapeuticpotential to attenuate the IFN environment by regulating the pDC function and thus provide thenovel foundation for the development of an effective immunotherapeutic strategy against
autoimmune disorders such as SLE.

Session 2

Division of Neuroscience

The degradation of the inwardly rectifying potassium channel, Kir2.1,
depends on the current level
Masayoshi Okada (Cellular and Molecular Physiology)
Protein expression is regulated by synthesis as well as degradation. Inwardly rectifying K+
channel (Kir2.1) regulates the excitability of nervous, cardiac, and vascular smooth muscular cells,
and its expression level is accurately regulated. In fact, both loss- and gain-of-function mutations of
Kir2.1 result in arrhythmia. But little is known about the degradation of Kir2.1. To examine thedegradation of Kir2.1, we constructed Kir2.1 fusion proteins with SNAP-tag and fluorescent timer(FT). The SNAP-tag, which covalently binds to a specific membrane permeable fluorescent dye,allows us to conduct a pulse-chase experiment with fluorescence. Our pulse-chase experiments
revealed the current-dependent degradation of Kir2.1 by following results: 1) shorter half-life of
SNAP-Kir2.1 in high expression cells; 2) elongation of half-life by the blockade of Kir current; and3) shorter half-life in a hyper-conductive mutant of Kir2.1. The fluorescence of FT changes
spontaneously and slowly from green to red; thereby the green/red ratio allows us detect the changes
in the half-life of the FT-fusion protein. Expectedly, the green/red ratio of FT-Kir2.1 was decreasedby the channel blockade, confirming the current-dependent degradation. Our results suggest apresence of K+ sensor and the usefulness of these two methods, which are in vivo applicable and do
not need radioisotope or antibody, in studying neurodegenerative diseases.
We also introduce the outlines of other ongoing projects.
1. Compensation for the reduced activity in the hippocampal newborn neurons.
2. Enhancement of the titer of lentiviral vectors, which express K+ channels.
104

3.
4.
5.
6.
7.
8.

High-though-put assay for the Kir2.1 using GFP.
Screening for Kir blocker and opener in Mexican Scorpion venom.
Lenti- and Retro-viral vectors specific for somatotroph.
Ion channels involved in the secretion of HCO3- from pancreatic duct cell.
Lentiviral vector specific for the secretin receptor expressing cells.
Ca2+ imaging and plasticity of the hippocampal GABAergic synapses.

Cell type specific expression of lamin subtypes in rat retinal neurons
Taketoshi Wakabayashi (Anatomy and Cell Science)
The nuclear lamins are type V intermediate filament proteins and the major component of thenuclear lamina. They are grouped into two subtypes, A-type, which include lamins A and C, andB-type, which include lamins B1 and B2. Lamins support nuclear membrane mechanically and arealso essential for proper cellular functions, including DNA replication, gene expression anddifferentiation. Abnormal expression of lamins causes several inherited diseases including muscular
dystrophy and neuropathy. However, the expression patterns of lamin subtypes have not been wellstudied, especially in the nervous system. In our laboratory, we have reported the expression patternsof lamin subtypes in neurons during adult neurogenesis.
Retina belongs to the central nervous systems. Because of its well-organized cellulararchitecture and relative simplicity, the retina has been used as a representative model for studying
neuronal cells in the central nervous system. Here, we report the immunohistochemical expression
patterns of lamin subtypes in retinal neurons of adult rat. All retinal neurons expressed lamin B1 andB2 in relatively equal amounts. By contrast, the expressions of A-type lamins were differentiallyregulated depending on the cell types. Photoreceptor cells did not show any immunoreactivity for
anti-lamins A and C antibodies. Other retinal neurons, which include retinal ganglion cells, amacrine
cells, bipolar cells and horizontal cells, were all positive for lamin C. Lamin A is expressed only inhorizontal cells and small populations of retinal ganglion cells. The differential expression pattern oflamin subtypes in retinal neurons suggests that they may be involved in cellular differentiation andexpression of cell-specific genes in individual retinal neurons.

Analysis of the brain digitalis-like substance underlying hypertension
Hakuo Takahashi (Clinical Sciences and Laboratory Medicine)
The central nervous system has a key role in regulating the circulatory system by modulating the
sympathetic and parasympathetic nervous systems, pituitary hormone release, and the baroreceptor
reflex. Digoxin- and ouabain-like immunoreactive materials were found more than 20 years ago in
the hypothalamic nuclei. These factors appeared to localize to the paraventricular and supraoptic
nuclei and the nerve fibers at the circumventricular organs and supposed to affect electrolyte balanceand blood pressure. The turnover rate of these materials increases with increasing sodium intake. As
intracerebroventricular injection of ouabain increases blood pressure via sympathetic activation, an
endogenous digitalislike factor (EDLF) was thought to regulate cardiovascular system-related
functions in the brain, particularly after sodium loading. Experiments conducted mainly in rats
revealed that the mechanism of action of ouabain in the brain involves sodium ions, epithelial
sodium channels (ENaCs), the renin–angiotensin–aldosterone system (RAAS) and oxidative stress,
all of which are affected by sodium loading. Rats fed a high-sodium diet develop elevated sodium
levels in their cerebrospinal fluid, which activates ENaCs. Activated ENaCs and/or increased
intracellular sodium in neurons activate the RAAS; this releases EDLF in the brain, activating the
sympathetic nervous system. The RAAS promotes oxidative stress in the brain, further activating the
RAAS and augmenting sympathetic outflow. Angiotensin II and aldosterone of peripheral origin act
in the brain to activate this cascade, increasing sympathetic outflow and leading to hypertension.
Thus, the brain Na+–ENaC–RAAS–EDLF axis activates sympathetic outflow and has a crucial role105

in essential and secondary hypertension. Major antihypertensive agents available recently are allacting at the central sites to reduce sympathetic activity and blood pressure. However, the exact siteof actions and the cascade operating in the brain are left undetermined. Our project aims toanatomically visualize the digitalislike substance and the related bioactive materials in the brain to
elucidate the mechanism of actions in hypertension.

Analysis of intracytoplasmic inclusions of neurodegenerative diseases
by imaging mass spectrometry
Satoshi Kaneko (Neurology)
The presence of insoluble protein aggregates in the cytoplasm of neurons is a key pathologicalfeature of most neurodegenerative diseases. In several disorders, the disease-specific pathologicalproteins were identified. However, the normal and pathological functions of these proteins arelargely unknown. Through this project we are planning to analyze biomolecules in relation to
intracytoplasmic inclusions using imaging mass spectrometry (IMS). Prior to analysis of humanbrain section by IMS, we performed immunohistochemical studies on intacytoplasmic inclusions ofneurodegenerative diseases to obtain further preliminary findings.
1) We investigated a family manifesting amyotrophic lateral sclerosis (ALS) with aheterozygous E478G mutation in the optineurin (OPTN) gene. TAR DNA-binding protein 43(TDP-43)-positive neuronal intracytoplasmic inclusions were reactive with anti-ubiquitin andanti-p62 antibodies, but negative for anti-OPTN antibody. Immunoreactivity of nuclear TDP-43 was
reduced in inclusion-bearing cells. Fragmentation of Golgi apparatus was identified in 70% of theanterior horn cells. The presence of anterior horn cells with preserved nuclear TDP-43 and a
fragmented Golgi apparatus indicates that patients with the E478G OPTN mutation would manifest
fragmentation of Golgi apparatus before loss of nuclear TDP-43.
2) Immunohistochemical analysis revealed that all the basophilic inclusions (BIs) were positive
for OPTN, Fused in sarcoma (FUS) and myosin VI in sporadic basophilic inclusion body disease(BIBD) patients and familial ALS with FUS mutation. However, the BIs showed no
immunoreactivity for TDP-43 or SOD1. Therefore, OPTN associates with each of the 3 major
ALS-related proteins, i.e., TDP-43, SOD1, and FUS. FUS is known to act as a co-activator of
NF-κB, and OPTN negatively regulates NF-κB activation. Therefore, sequestration of both FUS andOPTN in BIs may induce dysregulation of NF-κB activation, leading to neurodegeneration.
Moreover, OPTN and myosin VI play a role in the maintenance of Golgi apparatus. Theirsequestration in BIs may be an underlying pathomechanism of fragmented Golgi apparatus.
3) We demonstrated for first time that Smad ubiquitination regulatory factor-2 (Smurf-2) isco-localized in the phosphor-tau inclusions in progressive supranuclear palsy (PSP). As Smurf-2 isan E3 ligase of Smad2, intracellular signaling component of TGFβ, dysregulation of TGFβ/Smadsignaling may be an underlying pathomechanism of PSP.
These findings suggest that fragmentation of Golgi apparatus, impairment of the RNA quality
control system due to mislocalized RNA binding proteins, dysregulation of NFκB activation and/or
disturbed TGFβ/Smad signaling may take part in pathological processes of neurodegeneration.

The challenges of neurodegenerative disease modeling using
patient-specific iPSCs
Masahito Shimojo (Molecular and Functional Biology)
Neurodegenerative diseases such as Huntington’s disease (HD), Alzheimer’s disease, andamyotrophic lateral sclerosis are progressive diseases involving the degeneration of selected neurons.
Molecular biological analyses are advancing our understanding of intractable neurodegenerative
diseases, but translating them to the treatment of diseases is slow. For example, HD is a choreic
psychiatric neurodegenerative disease caused by a mutation in the huntingtin protein (Htt) in which106expansion of CAG tract at the 5’-end of the gene is translated into a toxic polyglutamine (polyQ)
stretch. The pathogenic mechanisms induced by polyQ-Htt are still not clearly understood and lackadequate models to investigate. It has been reported that Htt interacts with a key transcription factor,
RE1-silencing transcription factor (REST). REST is a major regulator of many neuronal genes
repressing their expression. The interaction between Htt and REST was found to retain REST in thecytosol, thereby preventing REST target gene repression. Several lines of evidence indicate thatpolyQ-Htt increases transcriptional repression by REST in HD. This results in increased occupancy
of multiple RE1s in different genes and would cause a number of REST target microRNAs andneuronal genes to be aberrantly repressed, which now provides us with a target for developing
treatments for HD. However we are lacking adequate systems for further advancing these studies inhuman-derived material.
The development of therapeutic strategies for treating diseases has relied heavily on the use ofanimal models. However they are limited in their ability to recapitulate the human disease. Recent
molecular technologies could provide human materials for studying human disease throughdifferentiating human stem cells into disease-specific cell types; especially disease-specific induced
pluripotent stem cells (iPSCs). The iPSCs can be generated by reprogramming fibroblasts derived
from individuals with a specific neurodegenerative disease. Generation and characterization of
iPSCs from patients have real advantages due to their ability to be differentiated into specific cell
types such as neurons and retain the defect causing the disease. In neurodegenerative diseases, such
affected cells cannot be collected from patients but can be generated from disease-specific iPSCs. By
using iPSCs for disease modeling, the genetic information contributing to neurodegeneration, isretained in in vitro studies.
Thus the generation of disease-specific iPSCs from patients with currently incurable diseases is
a promising approach for studying the mechanism of a particular disease at the cellular andmolecular levels and for developing new drugs and therapeutic targets.

Session 3

Division of Cancer

Prospectively isolated novel PDGFRα and Sca-1 double positive mousedental pulp stem cells exist in the tooth-forming niche
Yoshiaki Sonoda (Stem Cell Biology and Regenerative Medicine)
Mouse incisors erupt continuously throughout the life of the animal. Tooth-derived stem cells
are thought to exist in the apical end of the mouse incisor to mediate this process. Dental pulp stem
cells (DPSCs) are considered to be one of the tooth-derived stem cells. The isolation of DPSCs wasformerly carried out by cell attachment to cell culture dishes, thus resulting in the isolation of
unpurified heterogeneous DPSCs. On the other hand, a previous study showed that mouse bonemarrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) could be prospectively isolated by fluorescence
activated cell sorting (FACS) using MSC markers. In this study, we successfully isolated mouse
DPSCs from mandibular incisors by FACS using the MSC markers, PDGFRa and Sca-1. MousePDGFRa and Sca-1 double positive DPSCs exhibited a high growth potential in vitro and in vivo. In
addition, the DPSCs expressed odontoblast progenitor cell markers and they showed the ability todifferentiate into osteocytes, chondrocytes and adipocytes. An immunofluorescence analysis of theapical end of mouse incisors revealed that PDGFRα+Sca-1+ cells are present in the cervical loop(CL) of the incisors and the region surrounding the CL. In conclusion, these results revealed that themouse PDGFRα+Sca-1+ DPSCs possess the potential to differentiate into osteocytes, chondrocytes
and adipocytes. Furthermore, our findings suggest that PDGFRα+Sca-1+ DPSCs exist in the niche
for tooth-forming cells, because these cells localized in the CL of the incisors, and exhibited highgrowth potential.

107Analysis of ATL development in HTLV-1 infected humanized mouse model
Jun-ichi Fujisawa (Viral Oncology)
Adult T-cell leukemia (ATL) is an aggressive malignancy of mature CD4+ CD25+ T cells that
affects about 5% of individuals infected with HTLV-1 thirty to fifty years after neonate infection.
The molecular and genetic factors induced by HTLV-1 during such a long latent period remain
unclear, in part from the lack of an animal model that accurately recapitulates leukemogenesis. To
understand the mechanism of ATL development, we established a mouse model of HTLV-1
infection by using the humanized mouse established by the intra-bone marrow transplantation of
NOG-SCID mouse (IBMI-huNOG) with CD133+ hematopoietic stem cells purified from human
cord blood.
Human T-lymphocytes differentiate normally in the spleen and the peripheral blood of
IBMI-huNOG mice in several months after transplantation and peritoneal injection of HTLV-1
producing cells resulted in the leukemic growth of CD4+ CD25+ T-lymphocytes and led to thehepatosplenomegaly three to four months after infection. In the late period of infection, cells withhighly lobulated or flower-shaped nuclei appeared in the peripheral blood as seen in ATL patient.
Oligoclonal expansion of infected T cells was observed and common T-cell clones withidentical integration sites were identified in CD25- and CD25+ populations, indicating theconversion from CD25- to CD25+ in infected CD4+ T-cell populations in the course of selective
growth. Although Tax protein of HTLV-1 has been thought to be associated with theleukemogenesis, expression of Tax was observed in CD25- population but not in CD25+
population. It was therefore suggested that Tax might enhance the proliferation of CD25- CD4+
T-lymphocytes in early phase of infection but that some epigenetic change should be involved in
the outgrowth of CD25+ CD4+ T-lymphocytes in the late phase.
Thus, the HTLV-1 infected huNOG mouse model should provide a valuable system for the
analysis of ATL pathogenesis and the development of treatments against various HTLV-1
associated diseases.

Application of MALDI-imaging mass spectrometry to esophageal andgastric cancer research
Masanori Yamada (Surgery)
Acute abdomen obstruction is a common disease but may threat life occasionally. In thepresent case, she had severe abdominal pain and deteriorated rapidly in a shorter period.
Abdominal CT scanning demonstrated a high density mass in the dilated small intestine and air-fluid
level formation without free air. We did not know what caused acute abdomen obstruction.
Laparoscopic operation was performed to excise the inflamed small intestine and the obstructive
material. For imaging MS analysis, the surgically isolated intestinal portion and the foreign body
were fixed and paraffin embedded as performed routinely at Kansai Medical University Hospital.
With direct MALDI-TOF MS imaging, we identified mochi as the obstructing material in a small
intestinal obstruction. This is the first case of identification of obstructing material in direct MS
analyses of histopathological samples. MALDI-IMS is a very rapid and accurate technique withhigh sensitivity for direct analysis of materials in histopathological samples.
The liver is a frequent site of metastasis from gastric cancer and its rate is from 5 to 10%. The
hepatic resection or re-resection is thought to be a benefit for patients if gastric cancer and its
metastasis are well controlled, and liver metastasis is solitary or restricted to one lobe. However,hepatic resection is carried out in less than 10% of patients with metastasis because of multiple
hepatic nodules or associated peritoneal dissemination. Our prospect of research in Molecular
Imaging Center of Diseases is to detect a biomarker for liver metastasis with direct MALDI-TOF
MS imaging, which can help us perform appropriate therapy for patients by early diagnosis ofmetastasis.
108

Live imaging of high-speed lymphocyte migration in lymph node stromal
network by two-photon microscopy
Tomoya Katakai (Molecular Genetics, IBS)
Lymph node (LN) is a small organ for immuno-surveillance filtrating and monitoring foreign
substances (antigens) in lymph drainage from peripheral tissues. Live imaging using two-photon
laser scanning microscope (TP-LSM) is a valuable technique for addressing the behavior offluorescent-labeled motile cells inside the tissues. Applying TP-LSM to live LN has revealed thatlymphocytes within the tissue parenchyma robustly migrate searching for antigens. Especially, T
cells are moving at more than 10mm/min on average velocity. Tissue structure of LN is supportedby the three-dimensional (3D) network of non-hematopoietic stromal cells, which has beensuggested to be involved in the interstitial T cell migration. However, details of the interaction
between T cells and stromal cells, as well as underling molecular mechanism for the efficient,high-speed movement of T cells remain unclear. To address these issues, we set out to establish a
TP-LSM-based imaging system using LN tissue slice. T cells showed a complicated migratory
behavior in close association with stromal network. Antibody blockage of the major lymphocyte
integrin LFA-1 and the ligand ICAM-1 partially but significantly reduced T cell motility within LN
slice. T cell migration was also decreased in LN from ICAM-1 deficient mice compared with thewild type LN. Moreover, the inhibition of LFA-1 led to T cells’ slip on and detachment fromstromal network but still left substantial motility. Taken together, our observations indicate that
LFA-1/ICAM-1-dependent and -independent motilities enables T cells to exhibit high-speed
migration within 3D tissue environment. In addition, stromal network functions as scaffold for theefficient forward movement of T cells.

109

（参考資料８）第 2 回病態分子イメージングセンター年次集会抄録

The 2nd Annual Meeting of Molecular Imaging Center of Diseases
on June 15, 2013 at 4th-floor Conference Room, Hirakata Campus

Program
10:00-10:10 Opening remarks

Seiji Ito

Introduction of advisory board members

10:10-11:10 Session 1: Division of Metabolic Disorders
Advisory Board: Dr. John A. Hanover, USA
Chair: Tomoyuki Nakamura, Tomoki Ito
10:10-10:30 Masami Kageshima (Biophysics)
Atomic force microscopy – a versatile tool for imaging and probing microscopic
mechanical properties of soft materials
10:30-10:50 Satoshi Matsuda (Bioinformatics, IBS)
Immune regulation through the mTORC1 pathway
10:50-11:10 Takaya Tsuno (Radiology)
Analysis of JAK-STAT and cell death pathways induced by IFN-α in humanadherent cancer cells

11:10-12:10 Session 2: Division of Neuroscience
Advisory Board: Prof. Min Zhuo, Canada
Chair: Tetsuo Sugimoto, Hirofumi Kusaka
11:10-11:25 Satoshi Kaneko (Neurology)
Activation of TGFβ/Smad signaling reduces aggregate formation of mislocalized
TDP-43
11:25-11:40 Masaki Isoda (Cognitive Neuroscience)
Two separate neural systems for understanding other’s actions
11:40-11:55 Kiichi Hirota (Anesthesiology)
Visualization of “hypoxia” in vivo: imaging of HIF-1 activation
11:55-12:10 Ikuko Yao (Molecular and Functional Biology)
Molecular imaging for diseases using mass spectrometry

13:00-14:00 Session 3: Division of Cancer
Advisory Board: Prof. Tadashi Yamamoto, Japan
Chair: Jun-ichi Fujisawa, Yoshiaki Sonoda
13:00-13:20 Morihiko Ishizaki (Surgery)
Clinical applications of indocyanine green-fluorescence imaging to liver surgery
13:20-13:40 Yoshihiro Ueda (Molecular Genetics, IBS)
Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in
the thymus
13:40-14:00 Ryusuke Nakatsuka (Stem Cell Biology)
Development of a highly efficient method for isolating bone-derived small stem
cells identified in adult mouse bone

14:00-14:15 Closing Remarks

Hiroo Ueno

110

Abstract
Session 1

Division of Metabolic Disorders

Atomic force microscopy – a versatile tool for imaging and probing
microscopic mechanical properties of soft materials
Masami Kageshima (Biophysics)
Atomic force microscopy (AFM) has gained recognition as an imaging tool for surfaces of various
materials ranging from solids to soft biological materials. Its force sensor is well-suited for
spatially-resolved measurement of mechanical response in the form of a complex quantity, i.e. a
viscoelasticity. During the course of research the author has developed a wide-band magnetic
excitation AFM apparatus, with which viscoelastic response of the sample under study is obtained ina wide frequency range by exciting the force sensor with an well-controlled magnetic force. Featuresof the instrument will be briefly overviewed. By utilizing the potential of AFM it’s possible todirectly access folding/unfolding dynamics of single biopolymers through viscoelasticity. A single
polymer chain is tethered between the AFM probe apex and the substrate. As it is stretched with atensile force it undergoes structural deformation and corresponding features in its viscoelasticity
profile are obtained. Examples of peptide in α-helix form, dextran, and titin, a giant protein moleculein muscle, will be shown1). In addition to single molecules, interest is also oriented to structure anddynamics of solid-liquid interfaces, especially those relevant to life phenomena. Response of watermolecules on a hydrophilic surface will be shown. A novel pulse-response measurement techniquewill also be briefly introduced2). It should be noted that the potential of AFM as a tool for analyzingmechanical response also covers mesoscopic or macroscopic systems like cells or organisms. Proper
understanding of its imaging mechanism and, if necessary, instrumentation technique will further
enhance its applicability.
1. M. Kageshima, Curr. Pharm. Biotech. 13, 2575-2588, 2012.
2. M. Kageshima, Beilstein J. Nanotech. 3, 260-266, 2012.

Immune regulation through the mTORC1 pathway
Satoshi Matsuda (Bioinformatics, IBS)
The mammalian target of rapamycin (mTOR) is a Ser/Thr kinase that affects broad aspects ofcellular functions including immunity. mTOR is the core component of the mTOR complex 1(mTORC1), which contains the adapter protein Raptor, whereas Rictor and Sin1 classify mTOR
complex 2 (mTORC2). mTORC1 acts downstream of the PI3K-Akt pathway to phosphorylate p70
S6 kinase (S6K) and eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1 (4E-BP1) in a
rapamycin-sensitive manner. Although the PI3K-Akt-mTORC1 axis is activated during T cell
activation, its physiological role remains obscure. Here, we demonstrate that the suppression of thisaxis by deletion of p85a, a predominantly expressed regulatory subunit of class IA PI3K, or Raptor,
an essential component of mTORC1, impairs Th17 differentiation. We further demonstrate that S6K
is involved in the PI3K-Akt-mTORC1 axis-mediated nuclear translocation of RORg, a mastertranscriptional regulator for Th17 differentiation. These results point toward a pivotal role of thePI3K-Akt-mTORC1-S6K axis in Th17 differentiation.
1. Ohtani, M., Hoshii, T., Fujii, H., Koyasu, S., Hirao, A. and Matsuda, S. mTORC1 in intestinal CD11c+CD11b+
dendritic cells regulates intestinal homeostasis by promoting IL-10 production. J.Immunol. 188, 4736-4740, 2012.
2. Kurebayashi, Y., Nagai, S., Ikejiri, A., Ohtani, M., Ichiyama, K., Baba, Y., Yamada, T., Egami, S., Hoshii, T.,
Hirao, A., Matsuda, S., and Koyasu, S. PI3K-Akt-mTORC1-S6K1/2 axis controls Th17 differentiation by
regulating Gfi-1 expression and nuclear translocation of RORg. Cell Rep. 1, 360-373, 2012).

111

Analysis of JAK-STAT and cell death pathways induced by IFN-α in humanadherent cancer cells
Takaya Tsuno (Radiology)
Human interferon (IFN)-α has been approved for the treatment of certain types of cancer.
Nevertheless, its effectiveness has met with varying degrees of success. Currently, a number oftumors including solid carcinomas are still resistant to IFN-α. Therefore, we have investigated key
molecules playing a significant role in cell viability regulated by IFN-α.
First, in the Janus kinases/Signal Transducers and Activators of Transcription (JAK-STAT)
pathway initiating IFN-α signal, IFN regulatory factor (IRF) 9-RNA interference (RNAi) completely
restored cell viability regulated by IFN-α in human ovarian adenocarcinoma OVCAR3 cells
sensitive to IFN-α (1). IRF9-RNAi followed by IFN-α treated in OVCAR3 cells inhibited gene
expression of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) which is one of cell
death ligands (1). IFN-α also upregulated TRAIL protein level in OVCAR3 cell–microenvironment(2). In cell death pathway after binding TRAIL to the receptors, BH3 interacting domain deathagonist (BID)-RNAi significantly restored cell viability regulated by IFN-α in OVCAR3 cells (2).
BID-RNAi prevented IFN-α from collapsing mitochondrial membrane potential (2). Furthermore,
pIRES-hBID plasmid led to significant inhibition of cell viability regulated by IFN-α in human lungcarcinoma A549 cells resistant to IFN-α (2). Thus, our in vitro studies suggest that BID is crucial forcell viability regulated by IFN-α which can induce mitochondria-mediated apoptosis.
To assess BID overexpression for the treatment of IFN-α-resistant tumors in a living body, invivo study has also been performed. Intravenous and subcutaneous injections of pIRES-BID andpegylated human IFN-α were administered in nude mice bearing subcutaneous A549 xenografts,
respectively. Electron microscopy findings revealed mitochondrial apoptosis in A549 xenografts
treated with pIRES-BID and IFN-α. Live imaging study detecting near-infrared fluorescent tracers
also indicated apoptosis induced by pIRES-BID and IFN-α in A549 xenografts. Consequently, ourcurrent study suggests that BID is a notable potential to be a targeted therapy for IFN-α resistanttumors.
1.
2.

IRF9 is a key factor for eliciting the antiproliferative activity of IFN-α. Tsuno T, Mejido J, Zhao T, Schmeisser H,
Morrow A, Zoon KC. J Immunother. 32, 803-816, 2009.
BID is a critical factor controlling cell viability regulated by IFN-α. Tsuno T, Mejido J, Zhao T, Phillips T, Myers
TG, Bekisz J, Zoon KC. J Immunother. 35, 23-31, 2012.

Session 2

Division of Neuroscience

Activation of TGFβ/Smad signaling reduces aggregate formation of
mislocalized TDP-43
Satoshi Kaneko (Neurology)
Background: TAR DNA binding protein of 43 kDa (TDP-43) is naturally located in the nucleus
and has been identified as the major component of cytoplasmic ubiquitinated inclusions in patientswith amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We have reported that TDP-43 and phosphorylated Smad2(pSmad2), an intracellular mediator protein of Transforming Growth Factor-β (TGFβ) signaling, areco-localized within cytoplasmic inclusions in the anterior horn cells of sporadic ALS patients.
Objective: To investigate the possible pathophysiological linkage between pathologic cytoplasmic
inclusions containing TDP-43 and TGFβ/Smad signaling.
Methods: We replicated cytoplasmic aggregates of TDP-43 in HEK293T cells by transfecting thecells with a nuclear localization signal deletion mutant of TDP-43 and inhibiting proteasome activity,
and assessed the effect of TGFβ/Smad signaling on the cytoplasmic aggregate formation.
Results: The aggregates contained ubiquitinated, phosphorylated, and fragmented TDP-43,
consistent with the essential features of the human pathology. Moreover, the aggregates were112

co-localized with pSmad2 under continuous TGFβ stimulation. Overexpression of Smad2 reduced
the amount of cytoplasmic aggregates in HEK293T cells, and TGFβ stimulation augmented thisreduction effect in a dose-dependent manner.
Conclusion: Activation of TGFβ/Smad signaling system is protective against aggregate formation ofcytoplasmically mislocalized TDP-43 and may be a potential therapeutic approach to delay
progression of ALS.
1. Nakamura M, Kaneko S, Ito H, Jiang S, Fujita K, Wate R, Nakano S, Fujisawa JI, Kusaka H. Activation ofTransforming Growth Factor-β/Smad Signaling Reduces Aggregate Formation of Mislocalized TAR
DNA-Binding Protein-43. Neurodegener Dis. 11, 182-193, 2012.
2. Nakamura M, Kaneko S, Wate R, Asayama S, Nakamura Y, Fujita K, Ito H, Kusaka H. Regionally different
immunoreactivity for Smurf2 and pSmad2/3 in TDP-43-positive inclusions of amyotrophic lateral sclerosis.
Neuropathol. Appl. Neurobiol. 39, 144-156, 2012.

Two separate neural systems for understanding other’s actions
Masaki Isoda (Cognitive Neuroscience)
Understanding the action of other individuals is of critical importance in the social world as itallows for a grasping of their mental states, such as beliefs, desires, and intentions. It has been
proposed that the brain has two separate systems for such action understanding –– the mirror systemand the mentalizing system. The mirror system mainly consists of the ventral premotor cortex andinferior parietal lobule and is hypothesized to play a role in understanding what others are doing via
embodied simulation. The mentalizing system, on the other hand, is mainly composed of the medial
frontal cortex and temporoparietal junction and assumed to play a part in understanding why others
are doing via mental simulation. These speculative roles are advocated on the basis of macro-level
analyses of human neuroimaging data. Accordingly, it remains unclear whether and how response
properties of individual neurons differ between the two systems during action observation.
Answering this question requires use of experimental animals and methodologies with a muchhigher spatiotemporal resolution. In this talk, I will review single-neuron recording data obtained in
the monkey brain, showing that mirror neurons nondifferentially respond to the actions of one’s own
and those of others, whereas mentalizing neurons can selectively respond to each of them. Thus, it
seems likely that the brain is equipped with dual systems that complement each other forunderstanding others: the mirror system whereby one can view others as analogous to oneself andthe mentalizing system whereby one can identify them as unique.
1.
2.

Yoshida, K., Saito, N., Iriki, A. and Isoda, M. Social error monitoring in macaque frontal cortex. Nat. Neurosci.
15, 1307-1312, 2012.
Yoshida, K., Saito, N., Iriki, A. and Isoda, M. Representation of others’ action by neurons in monkey medial
frontal cortex. Curr. Biol. 21, 249-253, 2011.

Visualization of “hypoxia” in vivo: imaging of HIF-1 activation
Kiichi Hirota (Anesthesiology)
For all organisms, changes in oxygen (O2) concentration represent a fundamental physiologic
stimulus. Particularly in vertebrate animals, either deficiency or excess of O2 elicits acute(rapid-onset and short-term) and chronic (delayed- onset and long-term) responses.
Oxygen plays a critical role in cellular homeostasis and many human diseases, including ischemic
diseases and cancer, are characterized by inadequate tissue oxygenation. In the former, lack ofoxygen contributes to cell death and, in the latter, lack of oxygen is an early signature of disease thatmight also affect malignant cell behavior. Oxygen deprivation in human tissue leads to the
up-regulation of a complex array of genes that exert adaptive functions, particularly with regard tocellular metabolism and improvement in O2 delivery.
One of the most important transcription factors controlling O2-tension regulated gene expression113

is hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1). HIF-1 is a heterodimer containing the constitutively expressed
HIF-1β subunit and the inducible HIF-1α subunit, which binds the consensus sequence hypoxia
responsive element (HRE) in the expression regulatory region. Regulation of HIF-1 activity occurs
at multiple levels in cells, and mechanisms regulating HIF-1α protein expression and transcriptional
activity have been extensively analyzed. The von Hippel–Lindau tumor suppressor protein has been
identified as a HIF-1α-binding component of an ubiquitin–protein ligase that targets HIF-1α forproteasomal degradation in non-hypoxic cells. Under hypoxic conditions, hydroxylation of
HIF-1-specific proline and asparagine residues is inhibited due to substrate (O2) limitation, resulting
in HIF-1α protein stabilization and transcriptional activation.
This time, I will talk about the transgenic mice that carry HRE/ODD(oxygen-dependentdegradation domain)-luciferase (HOL) gene that generates bioluminescence in an HIF-1-dependent
manner and its successful usage to monitor HIF-1 activity in ischemic tissues and postnatal hypoxia.
1.
2.

Harada H et al. Cancer cells that survive radiation therapy acquire HIF-1 activity andtranslocate towards tumour
blood vessels. Nat. Commun. 3, 783, 2012.
Kadonosono T, et al. Detection of the onset of ischemia andcarcinogenesis by hypoxia-inducible transcription
factor-based in vivo bioluminescence imaging. PLoS ONE, 6, e26640, 2011.

Molecular Imaging for Diseases Using Mass Spectrometry
Ikuko Yao (Molecular and Functional Biology)
Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) provides themeans for analysis of a wide variety of biomolecules. The technology, a combination of MALDI-MSand microscopy which is known as imaging mass spectrometry (IMS), provides us a novel
opportunity to visualize molecules directly on tissue surfaces without the need for target-specificreagents such as antibodies. As most of previous IMS studies analyzed the relative abundances ofmetabolite species, it is important to expand its application to various biomolecules for exploring
molecular basis of diseases. Here, we will show some examples of IMS application to diverse typesof biomolecules.
We applied IMS technique to directly detect neurotransmitters in the central nervous system(CNS) and visualize their localization in tissue samples. In MS/MS imaging, the transmitter could be
visualized with a high signal/noise ratio (S/N) by elimination of matrix interference. In the tandem
MS-imaging analysis of ACh in the mouse spinal cord, reconstructed ion intensity maps for ACh ion
showed that the ion which corresponds to ACh distributed around large motor neurons in the spinal
ventral horn. Similarly, we analyzed mouse brain sections with tandem MS imaging. In comparison
with the previous reports, it was revealed that ACh was localized in the region abundant inacetylcholinestelase. These results show that ACh is the suitable molecular species to detect inpositive ion detection mode by IMS, and that tandem MS imaging is useful for the analyses ofcholinergic neurons in the postmortem brain of neurodegenerative patients.
We also applied the IMS technique to formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples to
identify a substance(s) responsible for the intestinal obstruction caused by an unidentified foreign
body. In advance of IMS analysis, some pre-treatments were applied. After deparaffinization ofsections, samples were subjected to enzyme digestion. The sections co-crystallized with matrix weredesorbed and ionized by a laser pulse with scanning. A combination of enzyme digestion and the
2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix gave best mass spectrum. These results for the first timeshow that MALDI-IMS is an accurate technique with high sensitivity for direct analysis ofoligosaccharides in histopathological samples.
Our study shows that the direct detection of biomolecules will be useful for assessments such as
pathogenesis and evaluations of therapeutic strategies.
1.
2.

Sugiura Y, Zaima N, Setou M, Ito S, Yao I. Visualization of acetylcholine distribution in central nervous systemtissue sections by tandem imaging mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 403, 1851-1861, 2012.
Yamada M, Yao I, Hayasaka T, Ushijima M, Matsuura M, Takada H, Shikata, N, Setou M, Kwon AH, Ito S.
Identification of oligosaccharides from histopathological sections by MALDI imaging mass spectrometry. Anal

114

Bioanal Chem. 402, 1921-1930, 2012.

Session 3

Division of Cancer

Clinical applications of indocyanine green-fluorescence imaging to liver
surgery
Morihiko Ishizaki (Surgery)
BACKGROUND: Recently, some studies have reported the usefulness of intraoperative fluorescentimaging using indocyanine green (ICG) for the detection of sentinel nodes in breast and gastriccancer. These techniques are based on the finding that ICG binds to plasma proteins andprotein-bound ICG emits near-infrared light. Fluorescent imaging using ICG also has the potential todetect liver cancers through the visualization of the disordered biliary excretion of ICG in livercancer tissues compressed by the tumor, and to preventing postoperative bile leakage by using ICG
fluorescent cholangiography.
METHODS: Intravenous injection of the ICG reagent was performed as a liver function test 1 to 2
weeks prior to surgery. ICG fluorescent imaging was performed using the Photodynamic Eye (PDE)
infrared camera (Hamamatsu Photonics k. k., Shizuoka, Japan). 102 patients who underwent hepatic
resection without biliary reconstruction were divided into 2 groups. The control group (n = 50)
underwent a leak test with ICG dye alone, and the experimental group underwent a leak test withICG dye, followed by ICG fluorescent cholangiography using the PDE (PDE group, n = 52).
RESULTS: ICG fluorescent imaging was useful for liver surgical navigation as follows: three casesof recurrent hepatocellular carcinoma(HCC) after transcatheter arterial chemoembolization or
thermal ablation therapy; three cases of colorectal metastatic liver tumors after chemotherapy as
conversion therapy; two cases of intrahepatic cholangiocellular carcinoma (ICC); and two cases of
surface HCC that were not detected by preoperative computed tomography (CT) scan. In the ICC
cases, although dilatation of the bile duct could be detected, the tumor margins were ambiguous by
ultrasonography(US). ICG fluorescent imaging clearly described the dilatation of the bile duct
including the tumor. Among 42 patients with fluorescence in the PDE group, 25 patients had
insufficient closure of bile ducts on the cut surface of the liver, which were closed by suture or
ligation. There were 5 patients who developed postoperative bile leakage in the control group versus
no bile leakage in the PDE group (10% vs 0%, P = .019).
CONCLUSIONS: ICG fluorescent imaging was useful for liver surgical navigation including
selection of the mode of hepatic resection. ICG fluorescent cholangiography may have usefulpotential for prevention of bile leakage after hepatic resection.
1. Ishizawa, T. et al. Real-Time Identification of liver Cancers by Using ICG Fluorescent Imaging. Cancer, 115,2491-2504, 2009.
2. Kitai T, et al. Fluorescence navigation with ICG for detecting sentinel lymph nodes in breast cancer. Breast
Cancer, 12, 211-215, 2005.

Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen
recognition in the thymus
Yoshihiro Ueda (Molecular Genetics, IBS)
Thymocyte trafficking has an important role in thymic selection. Here we show that the Hippo
homologue Mst1 is required for thymocyte migration and antigen recognition by LFA-1 andICAM-1 within the medulla. Using two-photon imaging of thymic tissues, we found that highly
motile mature thymocytes arrest and are activated in the vicinity of rare populations of Aire(+)
ICAM-1(hi) medullary thymic epithelia in a negatively selecting environment. Notably, Mst1
deficiency or blocking the cell adhesion molecules LFA-1 and ICAM-1 results in inefficientmigration and antigen recognition of CD4(+) thymocytes within the medulla. Consistent with these115

defects, thymocyte selection is impaired in Mst1(-/-) mice, which display T cell-dependent
inflammatory infiltrates in multiple organs and develop autoantibodies. Our results suggest that Mst1
has a key role in regulating thymocyte self-antigen recognition in the medulla.
1.

2.

Ueda Y, Katagiri K, Tomiyama T, Yasuda K, Habiro K, Katakai T, Ikehara S, Matsumoto M, Kinashi T. Mst1
regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat. Commun. 3,1098, 2012.
Katagiri K, Katakai T, Ebisuno Y, Ueda Y, Okada T, Kinashi T. Mst1 controls lymphocyte trafficking andinterstitial motility within lymph nodes. EMBO J. 28, 1319-1331, 2009.

Development of a highly efficient method for isolating bone-derived small
stem cells identified in adult mouse bone
Ryusuke Nakatsuka (Stem Cell Biology)(Background) Ratajczak and his colleagues identified a unique population of very small
embryonic-like (VSEL) stem cells in adult mouse bone marrow (BM) (Leukemia 2006:20;857).
However, it is difficult to isolate these small stem cells (SSC) in BM very effectively. This study
describes our recently developed highly efficient method for isolating SSCs using enzymatic
treatment of murine bone.
(Materials and Methods) The bone tissue from 8 week-old C57BL/6 mice were crushed in a mortar
and then incubated in cell dissociation buffer. Next, the BM nucleated cells (BMNC) andbone-derived nucleated cells (BDNCs) were stained with various monoclonal antibodies and thenwere used for subsequent FACS analyses.
(Results) The incidences of SSCs in the BMNCs and BDNCs were 0.001% and 0.1%, respectively.
Therefore, the enzymatic treatment of bone tissues yielded about 100 times the efficiency for theisolation of SSCs. The bone-derived (BD) SSCs were small and possessed a relatively large nucleus
surrounded by a narrow rim of cytoplasm. However, the gene expression profile of the BD-SSCs
was clearly distinct from the well-defined populations of ES cells, KSL cells, and MSCs. The
number of these BD-SSCs significantly increased after the induction of liver injury by carbon
tetrachloride administration. They were then most likely mobilized into the peripheral blood.
(Conclusion) The present data suggest that the majority of the Lin-Sca-1+CD45- cells reside in thebone tissue. The gene expression profile of BD-SSCs was different from those of the previously
reported BM-derived SSCs (VSELs) while BD-SSCs resemble BM-derived VSELs.
1.
2.

Bone marrow as a home of heterogeneous populations of nonhematopoietic stem cells. Leukemia, 19, 1118-1127,
2005.
A population of very small embryonic-like (VSEL) CXCR4+SSEA-1+Oct-4+ stem cells identified in adult bonemarrow Leukemia, 20, 857-869, 2006.

Closing remarks
Hiroo Ueno (Stem Cell Pathology)
Generation of chimeras, which is now a standard technology for producing gene modified mutant
mice, was originally developed as a tool for developmental biology. However, application of
conventional single marker chimeric mice for developmental study had been limited. This situation
has been dramatically changed by development of multicolor chimeric mice using various kinds offluorescent proteins. Now by our technology, up to ten different clones could be distinguished in situ
by their colors, which enable us to perform more accurate statistical analyses and lineage tracing
experiments than conventional methods. The method could be applied to visualize not only cell
turnover of normal stem cells but also cancer development in vivo. As closing remarks, we will
briefly discuss what questions these methods are now answering and introduce lingual epithelial
stem cells we recently identified and reported.
116

（参考資料９）病態分子イメージングセンター最終報告会抄録

The Final Annual Meeting of Molecular Imaging Center of Diseaseson November 13, 2015 at 4th-floor Conference Room, Hirakata Campus

Program
10:00-10:10 Opening remarks

Koichi Tomoda

Introduction of advisory board members

10:10-10:30 Activities and prospect of Molecular Imaging Center of Diseases
Seiji Ito
10:30-12:00 Session 1: Division of Metabolic Disorders

10:30-10:50

10:50-11:10

11:10-11:30
11:30-11:45
11:45-12:00

Advisory Board: Dr. John A. Hanover, USA
Chair: Prof. Tomoyuki Nakamura & Prof. Kazuichi Okazaki
Keita Utsunomiya (Radiology),
The effects of radiation exposure on multidrug resistance in a non-small lung cancer
cell line.
Phan Thi Xuan Vien (Hematology, Respiratory Medicine &Rheumatology),
Statins, HMG-CoA reductase inhibitors, have a potential to regulate Dendritic
cell-mediated allergic responses.
Masayoshi Iwasaki (Cardiology, Nephrology, Endocrinology & Metabolism),
Circulating cardiac stem cells for cardiac repair.
Kazushige Uchida (Gastroenterology & Hepatology),
Analysis of neutrophil infiltration in type 1 and type2 autoimmune pancreatitis.
Kiichi Hirota (Anesthesiology),
Activation of hypoxia-inducible factor 1 confers the metabolic reprograming in the
myeloid THP-1 cells.

13:00-14:30 Session 2: Division of Neuroscience

13:00-13:18
13:18-13:36

13:36-13:54

13:54-14:12

14:12-14:30

Advisory Board: Prof. Min Zhuo, Canada
Chair: Prof. Kae Nakamura & Associate Prof. Satoshi Kaneko
Yukiko Saito (Neuropsychiatry)
Alterations of Mirror Neurons in Patients with Schizophrenia.
Mitsuaki Oki (Neurology）
Analysis of synaptic plasticity in the basal ganglia network by regional quantitationof mRNA in 6-OHDA-lesioned rats.
Kazuhiko Nishida (Medical Chemistry)Three-dimensional distribution of sensory stimulation-evoked neuronal activity ofspinal dorsal horn neurons analyzed by in vivo calcium imaging.
Yukie Hirahara (Anatomy 1)
Visualization of oligodendrocyte differentiation processes by using imaging mass
spectrometry.
Shuichi Simma
Seeing is believing-Novel approach to in-situ analysis using mass spectrometry-.

-

14:30-15:10 Poster presentation117

15:10-16:40 Session 3: Division of Cancer

15:10-15:30
15:30-15:50
15:50-16:10

16:10-16:25
16:25-16:40

Advisory Board: Prof. Tadashi Yamamoto, Japan
Chair: Prof. Jyun-ichi Fujisawa & Prof.Yoshiaki Sonoda
Masaki Kaibori (Surgery)
Clinical applications of fluorescent imagings in liver surgery.
Kouji Tsuta (Pathology Laboratory Medicine)
Fluorescence nanoparticles for histological diagnosis.
Ryusuke Nakatsuka (Hygiene)
Identification and Characterization of Lineage-CD45-Sca-1+ VSEL Phenotypic
Cells Residing in Adult Mouse Bone Tissue.
Jyun-ichi Fujisawa (Microbiology)
ATL development in HTLV-1 infected humanized mouse model.
Naoyuki Kondo (Molecular Genetics)
Single molecule imaging of LFA-1/ICAM-1 interaction at immune cell contact site.

16:40-17:00 Closing Remarks

Hiroo Ueno

118

Abstract
Session 1

Division of Metabolic Disorders

The effects of radiation exposure on multidrug resistance in a non-smalllung cancer cell line.
Keita Utsunomiya (Radiology)
Tc-99m MIBI (MIBI) is a substrate that exhibits the same uptake kinetics as cisplatin anddoxorubicin. Multidrug-resistance (MDR) is a mechanism that impedes chemotherapy of non-small
cell lung cancer (NSCLC).
We investigated the synergistic effects of chemotherapeutics, MDR modulator GG918 (final
concentration: 0.1μM, 0.001μM, and 0μM), and irradiation {0 Gy: C (control)-group; 3, 6, 9, 12 Gy:
I (irradiation)-group} in the non-small lung cancer cell line, H1299 exhibiting MDR, on MIBI anddoxorubicin ABC transporter kinetics, in vitro and in vivo, respectively.
Inhibition of H1299 cell proliferation by irradiation was found to be irradiation dose dependent. The
degree and duration of MDR inhibition in vitro in H1299 was also dose dependent. In the cells ofboth the C-group and 3 Gy I-group, no significant difference of MIBI accumulation was observed. In
the 6 Gy I-group, a higher MIBI accumulation was observed at only 7 days after irradiation relative
to the C-group. A higher MIBI accumulation in the 9, 12 Gy I-groups with a significant difference
from the C-group was observed at 4 to 14 days after irradiation. A significant negative correlation
between intracellular MIBI accumulation and cell replication was found. In combination with
low-dose MDR modulator, GG918, a synergistic reduction in MDR transport function was observed
48 hours after irradiation. High accumulation and retention of doxorubicin was observed in
irradiated tumors in the H1299 xenograft mice group at 2 to 14 days after 9 Gy irradiation comparedto the control mice group.
These results provide evidence for a synergistic effect of concurrent chemotherapy and radiotherapy
with MDR modulator. Chemotherapy should potentially be reconsidered to include a complementary
radiotherapy regime to improve the chemotherapy efficacy through MDR reduction.

Statins, HMG-CoA reductase inhibitors, have a potential to regulate
dendritic cell-mediated allergic responses
Phan Thi Xuan Vien (Hematology, Respiratory Medicine &Reumatology)
Thymic stromal lymphopoietin (TSLP), produced mainly by inflammatory epithelial cells, has apivotal role for initiating and maintaining allergic inflammation. TSLP stimulates myeloid dendritic
cells (TSLP-mDCs) to induce the expression of OX40L that induce and maintain Th2 cells andsecretion of Th2 cell-attracting chemokine CCL17.In our previous studies, we have shown that
HMG-CoA reductase inhibitors, statins, can inhibit the production of type I interferons (IFNs) fromplasmacytoid DCs, thus suggesting that statins can be utilized as therapeutic agents to break off the
IFN-mediated pathogenic spiral observed in some autoimmune diseases such as systemic lupus
erythematosus. Here we have expanded our study to mDCs, particularly to the
TSLP-mDCs-dependent Th2 pathway to examine the immunoregulatory role of statins in the allergic
responses.
TSLP induced human mDCs to express OX40L on their surface and CCL17 in the culture
supernatant, suggesting the promotion of Th2 cell-mediated responses. We found that addition of
statins, pitavastatin and simvastatin, into the DC culture, repressed the upregulation of OX40L
expression and CCL17 secretion. Furthermore, these inhibitoty responses by statins werecounteracted by the addition of mevalonic acid (MVA), indicating that the inhibitory effects ofstatins are mediated by the action as HMG-CoA reductase inhibitor through MVA pathway in
119

TSLP-mDCs. Rho Kinase (ROCK) inhibitor, as well as statins, also repressed the TSLP-induced
OX40L and CCL17 expression, suggesting that statins may exert the cholesterol-independent
inhibitory effect on TSLP-mDCs through the Rho-ROCK pathway. This study suggests a specificrole of statins in controlling the TSLP-mDCs-dependent Th2 pathway and the therapeutic potentials
for allergic diseases such as SLE.

Circulating cardiac stem cells for cardiac repair
Masayoshi Iwasaki (Medicine II)
Despite significant advances in diagnosis and therapy, the mortality of patients with heart failure still
remains high. Stem cell therapy is therefore one of the promising therapeutic options for chronic
heart failure.
Previously we isolated and characterized circulating mesoangioblasts (cMABs) from patients
undergoing cardiac surgery. These are a subset of mesenchymal stem cells, express CD73, KDR and
Nkx2.5, and are capable of differentiating into endothelial cells, smooth muscle cells andcardiomyocytes in vitro. When transplanted in vivo, these cells enhanced functional recovery
following myocardial infarction or hindlimb ischemia in mice (1,2). We also found that hepatocyte
growth factor (HGF) induces cMAB mobilization in rats (2).
To establish a feasible method for the isolation of human cMABs, we tested the hypothesis that
heparin induces cMAB mobilization by increasing serum HGF concentration in patients undergoingcardiac catheterization. Indeed, heparin increased serum HGF levels and the number of outgrowing
cMAB colonies in a dose-dependent manner. Simultaneous blood sampling from aortic sinus,
coronary sinus and right atrium revealed that cMABs are derived from the heart.
Our results demonstrate that heparin mobilizes human heart-derived cMABs during cardiac
catheterization. We are planning to characterize the localization of cMABs in the heart using
CD73-BAC-EGFP transgenic mice.
1.

Circ Res. 2010;106:1290-1302.

2.

Eur Heart J. 2011;32:627-636.

Analysis of neutrophil infiltration in type 1 and type2 autoimmune
pancreatitis.
Kazushige Uchida (Gastroenterology & Hepatology)
One of the histopathological characteristics of type 2 autoimmune pancreatitis (IDCP) is
granulocyte epithelial lesions (GEL). However, infiltration of neutrophils is well-known I type
1 AIP (LPSP). To clarify pathogenesis of type 2 AIP, we investigated mechanism of neutrophil
infiltration in type 1 and type 2 AIP.
The number of neutrophils around the interlobular pancreatic ducts was significantly higher in
IDCP than in alcoholic chronic pancreatitis (ACP), and LPSP. There was no significant
difference in the number of neutrophils around the intralobular pancreatic ducts among ACP,
LPSP and IDCP. The expression of neutrophils chemoattractants granulocyte chemotactic
protein-2 (GCP-2) in the interlobular pancreatic duct epithelia was significantly higher in IDCP
than in ACP and LPSP. There was no significant difference in the expression of IL-8 in theinterlobular pancreatic duct epithelia among ACP, LPSP and IDCP.
Our data showed that GCP-2 has an important roll in the neutrophil infiltration aroundinterlobular pancreatic duct in type 2 AIP.
1.

2.

Mitsuyama T, Uchida K, Sumimoto K, Fukui Y, Ikeura T, Fukui T, Nishio A, Shikata N, Uemura Y, Satoi S,
Mizuno N, Notohara K, Shimosegawa T, Zamboni G, Frulloni L, Okazaki K. Comparison of neutrophil
infiltration between type 1 and type 2 autoimmune pancreatitis. Pancreatology. 2015;15:271-80.
Okazaki K, Uchida K. Autoimmune Pancreatitis: The Past, Present, and Future. Pancreas. 2015;44:1006-16.

120

Activation of hypoxia-inducible factor 1 confers the metabolic
reprograming in the myeloid THP-1 cells
Kiichi Hirota (Anesthesiology)
Hypoxia induces expression of a select set of genes encoding glycolytic enzymes and glucose
transporters that generate ATP under specific conditions such as anaerobic circumstances. At
the cellular level, the adaptation includes a switch of energy metabolism from oxidative
phosphorylation to anaerobic glycolysis, increased glucose uptake and the expression of stressproteins related to cell survival and death. At the molecular level, the adaptation involveschanges in gene expression. The transcription factor hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) plays
an essential role in the maintenance of O2 homeostasis. HIF-1 is a heterodimer consisting of
HIF-1α and HIF-1β subunits that bind to specific regulatory sequences known as hypoxia
response elements. Expression of a line of enzymes involving glucose metabolism andoxidative phosphorylation (OXPHOS) are under regulation of HIF-1. Activation of myeloid
cells such as macrophages by pro-inflammatory stimuli causes them to undergo a metabolic
switch towards glycolysis and away from OXPHOS because activated myeloid cells arerecruited to diverse sites of inflammation, such as wounds, arthritic joints, and necrotic tumors,which all share in common a reduction in O2 tension below levels present in normal tissues.
However, it is only recently that the mechanisms responsible for this metabolic reprogramming
have been elucidated in more detail. HIF-1 plays an important role under conditions of bothhypoxia and normoxia and interference with this process actually abolishes the function ofmacrophages.
In this talk, we would like to demonstrate the involvement of HIF-1 in the metabolic
reprograming process during the differentiation process of the myeloid THP-1 cells.

Session 2

Division of Neuroscience

Alterations of Mirror Neurons in Patients with Schizophrenia
Yukiko Saito (Neuropsychiatry)Background and aim
The neural basis of impaired mirror neurons in schizophrenia is not completely understood. The
aim of this study is to evaluate the white matter microstructure of the tracts of mirror neurons inpatients diagnosed with schizophrenia. A secondary aim is to test for an association between
measures of white matter microstructure and Social function Scale. Mirror neurons are known
to contribute to creating a sense of intimacy, and there is evidence that dysfunction of mirror
neurons may be one of the core deficits of socially isolating disorders such as autism andschizophrenia. To the best of our knowledge, this is the first study to investigate the structuralconnectivity of the mirror neuron system in first episode schizophrenia.
Methods
Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired on 16 patients and 10 matched controls.
Fractional anisotropy (FA) and Trace were measured. In this study, we evaluate the fiber tracts
generated using two-tensor tractography algorithm. This method makes it possible to follow
tracts that pass through branching and crossing regions of the brain.
Results
Independent t test revealed a significant effect of group on Trace, with higher values in thepatients compared with healthy (p= .05). Patients with schizophrenia showed a significant
negaitive correlation between Trace in the fiber tract on the left hemisphere and the scores ofSocial Fanction Scales (rho =-.648, p = .007).
Conclusions
These results may have implications for novel therapeutic approaches, and prognosis of121

impaired social communication in patients with schizophrenia.

Analysis of synaptic plasticity in the basal ganglia network by regional
quantitation of mRNA in 6-OHDA-lesioned rats
Mitsuaki Oki (Neurology)
Background: Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disease presenting progressive motor
dysfunction. Its major neuropathological feature is dopaminergic neuronal loss in the substantia
nigra pars compacta. Dopaminergic treatment is effective initially, but it becomes less effective andmotor complications such as dyskinesia and wearing off appear in the advanced stage of the disease.
Not only presynaptic neuronal loss at nigrostriatal dopaminergic synapses, but also postsynaptic
dysfunction is considered to cause the decreased effectiveness. Non-dopaminergic neurotransmitters,such as glutamate, endocannabinoids and adenosine have been attracting attention recently toparticipate in the pathophysiological process of the postsynaptic dysfunction of Parkinson’s disease.
To evaluate postsynaptic changes of nigrostriatal dopaminergic synapses, we analysed mRNA
expressions of non-dopaminergic neurotransmitter receptors in 6-OHDA-lesioned rats andlevodopa-induced dyskinesia (LID) rats.
Methods: 6-OHDA was stereotaxically injected into the unilateral medial forebrain bundle of SD rats
to make unilateral PD model rats. These rats were subdivided into three groups and treated asfollows; 1) no medication, 2) continuous levodopa infusion, and 3) intermittent levodopa injection.
Two weeks after the treatment, involuntary movements such as dyskinesia were scored. Frozen
brains were coronally sectioned at 1 mm thickness. Approximately 0.7 mg of tissue from putamen
was die-cut by 18 guage non-bevel needle. Random hexamer-generated cDNA was applied to realtime PCR.
Results: Dopamine D1 and D2 receptor mRNAs were not elevated on the operated side of theputamen in untreated PD model rats. Dopamine D2 receptor mRNA was elevated in continuously
levodopa infused rats. Both dopamine D1 and D2 mRNAs were elevated in intermittently levodopa
injected rats. Endocannabinoid CB1 receptor mRNA was increased on the operated side of putamen
in all rats regardless of treatment. LID was observed only in rats treated with levodopa intermittently.
Adenosine A2a receptor (A2A) mRNA was increased on the 6-OHDA-treated side of putamen inthese rats.
Discussion: 1) Real time RT-PCR provided regional quantitation of mRNA expression in the basal
ganglia of PD model rats. 2) Increased A2A mRNA was associated with LID, but whether it is a
cause or a result of LID is not yet determined.

Three-dimensional distribution of sensory stimulation-evoked neuronal
activity of spinal dorsal horn neurons analyzed by in vivo calcium imaging
Kazuhiko Nishida (Medical Chemistry)
The spinal dorsal horn comprises heterogeneous populations of interneurons and projection
neurons, which form neuronal circuits crucial for processing of primary sensory information.
Although electrophysiological analyses have uncovered sensory stimulation-evoked neuronal
activity of various spinal dorsal horn (SDH) neurons, monitoring these activities from large
ensembles of neurons is needed to obtain a comprehensive view of the SDH circuitry.
To analyze the global distribution pattern of SDH neuronal activity in response to sensory
stimulation, we established in vivo calcium imaging of SDH neurons by using a two-photon
microscope. For in vivo calcium imaging, FRET-based calcium indicator protein, Yellow
Cameleon, which is insensitive to motion artifacts of living animals was introduced specificallyinto SDH neurons by in utero electroporation. This method enabled us to monitor the activities
of more than 200 SDH neurons at a single cell resolution across a wide region localized 1.4 mm
along the rostrocaudal axis and 150 µm in depth. Moreover, we extracted three-dimensional
122

neuronal activity maps of these neurons in response to cutaneous sensory stimulation.
Based on these technological backgrounds, we further examined three-dimensional
distribution of SDH neuronal activity in response to different sensory stimulation and cutaneous
pinch stimulation toward different points. These results provide a clue to understand neuronalprocessing of sensory information in the spinal dorsal horn.
1.

2.

Nishida K, Matsumura S, Taniguchi W, Uta D, Furue H, Ito S. Three-dimensional distribution of sensory
stimulation-evoked neuronal activity of spinal dorsal horn neurons analyzed by in vivo calcium imaging. PLoS
ONE 9(8): e103321 (2014)
Matsumura S, Taniguchi W, Nishida K, Nakatsuka T, Ito S. In vivo two-photon imaging of structural dynamics
in the spinal dorsal horn in an inflammatory pain model. Eur. J Neurosci. 41, 989-997 (2015)

Visualization of oligodendrocyte differentiation processes by using
imaging mass spectrometry
Yukie Hirahara (Anatomy and Cell Science)
Myelin is rich in two glycosphingolipids, galactosylceramide (GalC) and its sulfated form,
galactosylceramide I3-sulfate (sulfatide). GalC is 23 wt. % and sulfatide is 4wt. % of the myelin
total lipid in the central nervous system. These glycosphongolipids are necessary to consist themultilayered myelin sheath and to differentiate oligodendrocyte (OL). Sommer and Schachner
characterized OL specific monoclonal antibodies O1 and O4 that were generated by fusion ofmouse myeloma with spleen cells from mice immunized with bovine corpus callosum. The
following studies showed the antibody specificity of O1 is GalC and of O4 is sulfatide. The
O4-positive oligodendroblast was characterized by proliferative capacity but entering terminal
differentiation with non-migratory ability. However, the O4 antigen, sulfatide, has not been
detected at this stage by biochemical analysis. Therefore, the antigen reacting with the O4
antibody at this stage has been suspected to differ from sulfatide. In the present study, we
showed by imaging mass spectrometry that sulfatide existed in restricted regions of the spinal
cord at chick embryo stage 32, where oligodendroblasts first appear. At this stage, short-chain
sulfatide with 16 and 18 carbon fatty acids was predominant. The C18 sulfatide was also
detected in embryonic mouse spinal cord at E15.5, and gradually expands from the restricted
region to lateral part in madula and pons at E18.5. In addition to C18 sulfatide, C22 sulfatide
appear in ventral zone of spinal cord at E19.5, while, C24 sulfatide became dominant in adultspinal cord. Moreover, the sulfatide variant in mouse adult brain were compared with in
cerebroside sulfotransferase null mouse brains, which were not synthesized sulfatide variants.
The major sulfatide species were absent. These results show that the mass imaging signals
shows exact sulfatide signal. These data strongly suggest that the sulfatide with short chain fatty
acids exist at oligodendroblast stage and the different fatty acid chain of sulfatide specieschange during OL maturation. Together, these results demonstrate that the sulfatide with shortchain fatty acids species regulates the early OL development. We could use sulfatide variants as
the target molecule to trace OL differentiation and this tool would help to understand the OL
precursor cell maturation and contribute the therapy of neurological diseases including Multiple
Sclerosis.

Seeing is believing-Novel approach to in-situ analysis using mass spectrometry Shuichi Shimma (Advanced Science and Biotechnology,
Graduate School of Engineering, Osaka University)
Molecular imaging technique using mass spectrometry (imaging mass spectrometry: IMS) can
provide a number of visualizing targets of biomolecules because of the non-labeled feature. This123

means ionization on sample tissue surfaces is essential for IMS technique. Recently, several
instruments which can perform IMS using different ionization technique are available. Mass
Microscope (iMScope, Shimadzu) is the novel IMS instrument which is a combination of
microscope and tandem mass spectrometer, which is three-dimensional ion trap andtime-of-flight mass spectrometer. The author was one of the members in iMScope R&D groupfrom 2004 to 2007.
Many cutting-edge instruments are commercialized, however, only such expensive instruments
are insufficient for successful IMS. There are a lot of experimental steps including sample
preparation in IMS. The sample preparation and data interpretation are much more difficult in
IMS experiment than instrument operation. Especially, to improve ionization efficiency on thetissue surface is one of the most important points due to non-labeled feature.
Generally matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) is equipped in IMS instrument.
Conventionally, matrix solution is applied directly onto the tissue surface by spraying. Using
this method, insufficient (inhomogeneous) matrix crystal layer is formed on the tissue surface.
This inhomogeneous layer might become an artifact for imaging results. Of course, suchinsufficient matrix crystals prevent high ionization efficiency as well as high spatial resolution.
To overcome these problems in conventional method, the author developed two-step matrix
application method (two-step method)1). Two-step method is a combination of vaccuum
sublimation of matrix crystal prior to matrix solution spraying. Provided tiny and homogeneous
crystals work as seeds for crystal development in the second step. Two-step method can improve
quality of matrix crystal layer on the tissue surface, so that high ionization efficiency andnon-artifact imaging are available. Additionally, I performed on-tissue derivatization to improveionization efficiency for low polarity molecules such as steroid hormons. On-tissue
derivatization will become a promising technique to expand application areas in IMS.
In this presentation, the author will present the new sample preparation methodologies and theirapplications in pharmaceuticals and steroids visualization.
1.

Shimma S, et al. Alternative two-step matrix application method for imaging mass spectrometry to avoid tissue
shrinkage and improve ionization efficiency. J Mass Spectrom. 2013 48(12):1285-90

Session 3

Division of Cancer

Clinical applications of fluorescent imagings in liver surgery
Masaki Kaibori (Surgery)
Background: Indocyanine green (ICG) and the porphyrin precursor 5-aminolevulinic acid (5-ALA)
have been approved as fluorescence imaging agents in the clinical setting. The aim of this study wasto evaluate the usefulness of fluorescence imaging with both ICG and 5-ALA in the intraoperative
identification of latent small liver tumors.
Methods: The subjects were 67 patients who underwent hepatic resection for liver tumors. 5-ALA
hydrochloride (1 g) was orally administered to patients 3 hours before surgery. ICG (0.5 mg/kg),
which had been intravenously injected within 1 month prior to surgery. Intraoperatively, after visualinspection, manual palpation, and ultrasonography, fluorescence images of the liver surface wereobtained with ICG and 5-ALA prior to resection.
Results: With ICG, the sensitivity and specificity for detecting the preoperatively identified main
tumors were 94% and 60%, respectively. Twelve latent small tumors were newly detected on theliver surface using ICG, five of which proved to be carcinomas. With 5-ALA, the sensitivity andspecificity for detecting the main tumors were 48% and 100%, respectively. Five latent small tumors
were newly detected using 5-ALA; all were carcinomas. Overall, five new tumors were detected byboth ICG and 5-ALA fluorescence imaging; two were hepatocellular carcinomas and three weremetastases of colorectal cancers.
124Conclusions: Although the sensitivity and specificity of ICG fluorescence imaging for main tumor
detection were relatively high and low, respectively, the opposite was true of 5-ALA imaging.
Fluorescence imaging using 5-ALA may provide greater specificity in the detection of
surface-invisible malignant liver tumors than using ICG fluorescence imaging alone.

Fluorescence nanoparticles for histological diagnosis
Koji Tsuta (Pathology and Clinical Laboratory)
Various antibody therapies, such as breast cancer targeting the HER2 receptor, can also be used forthe treatment of other malignancies. The immunostaining can be influenced by factors such as time
duration for each reaction and concentration of antibody dilution. We recently developed
fluorescence nanoparticles of phosphor-integrated dot (PID), which show high luminance and highdynamic range compared to conventional fluorescent dyes.
Programmed death-1 (PD-1) is significantly upregulated on activated cancer-specific T cells. The
PD-1/PD-L1 signaling pathway plays an important role in escape antitumor immunity. Recent
anti-PD-1/PD-L1 drugs showed that blockage of PD-1 and PD-L1 interactions can reverse T-cell
exhaustion and restore antigen-specific T-cell responses.
This current study evaluated that the utility of the PID method for PD-L1 protein expression bycomparison with the conventional DAB method.
Materials and methods
We chose 5 types of cultured cell lines at various PD-L1 protein expression levels and used thewestern blot data as the gold standard. We developed each cell block from cultured cell lines andperformed PID staining and DAB staining for the PD-L1 antibody. PID signals were counted with anautomatic analysis device Pidanalyzer (Konica Minolta). The intensity of the DAB staining wasmeasured with an Aperio system.
Results
Among the three assessment procedures, the PID data correlated well with the western blot data.
One of the significant reasons was that the PID signal was countable in the density range of DAB
that was difficult to visualize using the naked eye.
Future perspectives
We conducted expression analysis of PD-L1 for 300 cholangiocarcinoma samples using this method
and plan to conduct a comparison with the clinical information.

Identification and Characterization of Lineage-CD45-Sca-1+ VSEL
Phenotypic Cells Residing in Adult Mouse Bone Tissue
Ryusuke Nakatsuka (Hygiene)
Murine bone marrow (BM)-derived very small embryonic-like stem cells (BM VSELs), defined by alineage-negative (Lin-), CD45-negative (CD45-), Sca-1-positive (Sca-1+) immunophenotype, werepreviously reported as postnatal pluripotent stem cells (SCs). We developed a highly efficientmethod for isolating Lin-CD45-Sca-1+ small cells using enzymatic treatment of murine bone. We
designated these cells as bone-derived VSELs (BD VSELs). The incidences of BM VSELs in the
BM-derived nucleated cells and that of BD VSELs in bone-derived nucleated cells were 0.002% and0.15%, respectively. These BD VSELs expressed a variety of hematopoietic stem cell (HSC),
mesenchymal stem cell (MSC) and endothelial cell markers. The gene expression profile of the BD
VSELs was clearly distinct from those of HSCs, MSCs and ES cells. In the steady state, the BD
VSELs proliferated slowly, however, the number of BD VSELs significantly increased in the bone
after acute liver injury. Moreover, GFP-mouse derived BD VSELs transplanted via tail vein injection
after acute liver injury were detected in the liver parenchyma of recipient mice. Immunohistologicalanalyses suggested that these BD VSELs might transdifferentiate into hepatocytes. The present study
demonstrated that the majority of the Lin-CD45-Sca-1+ VSEL phenotypic cells reside in the bone125

rather than the BM. However, the immunophenotype and the gene expression profile of BD VSELs
were clearly different from those of other types of SCs, including BM VSELs, MSCs, HSCs and ES
cells. Further studies will therefore be required to elucidate their cellular and/or SC characteristics
and the potential relationship between BD VSELs and BM VSELs.
1.

Nakatsuka R, Iwaki R, Matsuoka Y, Sumide K, Kawamura H, Fujioka T, Sasaki Y, Uemura Y, Asano H, Kwon
AH, Sonoda Y. Identification and Characterization of Lineage-CD45-Sca-1+ VSEL Phenotypic Cells Residing in
Adult Mouse Bone Tissue. Stem Cells Dev. 25, 27-42, 2016.

2.

Matsuoka Y, Nakatsuka R, Sumide K, Kawamura H, Takahashi M, Fujioka T, Uemura Y, Asano H, Sasaki Y,
Inoue M, Ogawa H, Takahashi T, Hino M, Sonoda Y. Prospectively Isolated Human Bone Marrow Cell-Derived
MSCs Support Primitive Human CD34-Negative Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 33, 1554-1565, 2015.

ATL development in HTLV-1 infected humanized mouse model
Jyunichi Fujisawa (Microbiology)
Development of ATL-like symptoms was successfully recapitulated in HTLV-1 infected humanizedmouse model system that was established by intra-bone marrow transplantation of NOG mice with
CD133+ hematopoietic stem cells purified from human cord blood1). In addition to the clonal
expansion of HTLV-1 infected CD25(+) CD4 T-cell, the induction of anti-HTLV-1 immune
responses such as anti-Gag/Env antibodies and the CTL against a viral transforming protein Tax was
observed in the HTLV-1 infected humanized mice. By using this system, we examined various
candidates for ATL treatment and the vaccine against HTLV-1 infection and leukemogenesis.
Treatment with the combination of anti-viral agents, zidovudine (AZT) and interferon-alpha (IFN),
has been reported to be effective to certain type of ATL but the mechanism of action is totally
unknown. We, therefore, examined the efficacy and the in vivo mechanism of AZT/IFN treatment in
the humanized mouse system2). HTLV-1 infected humanized mice were inoculated daily with AZTand IFN from two to four weeks post infection and the number of infected cells and proviral loads(PVL) were analyzed. Treatment with AZT and IFN suppressed the growth of infected T-cells in
PBL and the PVL remained low throughout lifetime even after withdrawal of drugs, whilemock-treated mice were died of leukemia after 8 weeks post infection. These results suggested thatthe drug treatment resulted in the cell death of vigorously growing infected-T-cells but not of
infected-T-cells with dormant growth, probably depending on the viral expression.
The humanized mouse model was further applied for the examination of the Tax-peptide vaccine torestrict the HTLV-1 infection and leukemogenesis3). Humanized mice were subcutaneously or
intranasally inoculated with the Tax-peptide vaccine and then infected with HTLV-1 by the
intraperitoneal injection of γ-irradiated HTLV-1 producing Jurkat cells. While the control mice diedof leukemia within two months, the leukemic growth of infected lymphocytes in the vaccinated mice
were retarded and two out of five mice stayed alive long with low rate of HTLV-1 infection. It was
thus concluded that Tax peptide vaccination can elicit protective immunity against HTLV-1 infection
and/or ATL developments.
Thus, the HTLV-1 infected humanized mouse model should provide an invaluable tool to understandthe mechanism of ATL leukemogenesis and to develop curable drug systems and the preventing
vaccine against the onset of leukemia.
1.

Kenta Tezuka, Runze Xun, Mami Tei, Takaharu Ueno, Masakazu Tanaka, Norihiro Takenouchi and Jun-ichi
Fujisawa: An animal model of adult T-cell leukemia: humanized mice with HTLV-1-specific immunity.

Blood

2014, 123: 346-355
2.

Kenta Tezuka, Mami Tei, Takaharu Ueno, Runze Xun, Hidekatu Iha, Jun-ichi Fujisawa: Inhibition of ATL
development in humanized mouse model by AZT/INF treatment. Retrovirology 2014, 11(Suppl1): P43.

3.

Jun-ichi Fujisawa, Sung-il Lee, Jinchun Yao, Yihua Ren and Masakazu Tanaka: Tax peptide vaccine suppressed
the leukemia in humanized mouse. Retrovirology 2015, 12(Suppl1): O43.

126

Single molecule imaging of LFA-1/ICAM-1 interaction
at immune cell contact site
Naoyuki Kondo (Molecular Genetics, IBS)
Lymphocyte integrin LFA-1 play a critical role on the migration and antigen-dependent stoppingof T cells in response to the T cell receptor- and chemokine receptor-mediated signaling.
Regulation of LFA-1 by small GTPase Rap1 and its downstream molecules, such as Mst1, Talinand Kindlin-3 play a critical role on the T cell homing and the suppression of autoimmunity.
LFA-1 forms mainly three types of conformations, low-, intermediate- and high-affinity
conformer, which correlate with the affinity for its ligand, ICAM-1; however how these
conformers are regulated by Rap1-related factors and the precise role of each conformer on T
cell function is still elusive. In this study, we setup the single molecule measurement system of
LFA-1/ICAM-1 binding event on supported planner lipid bilayer and assessed the distribution
and the function of conformer in T cell-antigen presenting cell (APC) contact site. We
demonstrate that low/intermediate conformers are dominated in conformers, whereas
high-affinity conformers were present as a rare population. Interestingly, decrease of the rare
population by gene knock-out of Rap1 or Mst1/2 resulted in drastic reduction of cell adhesion
frequency and formation of mature immunological synapse (IS), a layered supramolecular
activation clusters (SMAC) formed at T-APC interface.
Simultaneous imaging of active form of Rap1 and single molecule LFA-1/ICAM-1 binding
events showed activated Rap1 accumulated at inner areas of peripheral SMAC (pSMAC), in
which Mst1 was colocalized. To investigate the relationship between Rap1 signaling and key
integrin regulatory molecules, Talin and Kindlin-3 in IS formation, we performed 3D
immunofluorescent staining of T cells forming IS. Rap1b or Mst1 KO T cells showed defective
recruitment of Kindlin-3, which binds to the β2 subunit to stabilize high-affinity LFA-1
conformation, to the contact plane, while Kindlin-3 in wild-type T cells localized at contact
planes, in particular at inner pSMAC areas. These results indicate that Rap1 signaling toKindlin-3 controls the formation of rare high-affinity LFA-1 conformers at the inner pSMAC,
which is required for efficient adhesion to APC and mature IS formation.
1.

Tomiyama, T., Ueda, Y., Katakai, T., Kondo, N., Okazaki, K. and Kinashi. T. (2013) PLoS One 8:e73874.

2.

Katakai, T., Kondo, N. Ueda, Y. and Kinashi, T. (2014) J. Immunol. 617-26

Closing Remarks
Hiroo Ueno
Generation of chimeras, which is now a standard technic for producing gene modified mutant
mice, was originally developed as a tool for studying developmental biology. However,application of conventional single marker chimeric mice for studying developmental study had
been limited. This situation has been dramatically changed by development of multicolor
chimeric mice using various kinds of fluorescent proteins. Now by our technology, up to ten
different clones could be distinguished in situ by their colors, which enable us to perform moreaccurate statistical analyses and lineage tracing experiments than by conventional methods. The
method could be applied to visualize not only turnover of normal stem cells but also
development of malignant tumors in vivo. As closing remarks, we will briefly introduce ourprogress of stem cell research in the last three years using our technology.

127

（参考資料１０）各事業推進者の平成 26 年度研究成果報告
Research activities 2014 by MICD core members

Division of Neuroscience

神経部門
Anatomy and Brain Science, 脳構築学（解剖学第二）講座
Cellular and Molecular Physiology, 細胞分子生理学（生理学第一）講座
Cognitive Neuroscience, 高次認知脳科学（生理学第二）講座
Molecular and Functional Biology, 分子生体機能学（医化学）講座
Neurology, 神経内科学講座
Neuropsychiatry, 精神神経科学講座
Medical Control of Stress Response, 侵襲反応制御学（麻酔科学）講座
Spinal cord Regeneration, 脊髄再生医学（救急医学科）

128

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

GABA-synthesizing enzyme , GAD1 gene, alternative promoter usage, splicing
isoforms
GABA 合成酵素 GAD1 の遺伝子産物に関する体系的解明

P.I.

Tetsuo Sugimoto, 杉本哲夫

Affiliation

Anatomy and Brain Science, 脳構築学（解剖学第二）講座

Collaborators

Trifonov Stefan、山下雄司、丸山正人、加瀬政彦

E-mailsugimoto@hirakata.kmu.ac.jp

GABA-synthesizing enzyme , GAD1 gene, alternative promoter usage, splicing
Keywords

isoforms

GABA 合成酵素、GAD1 遺伝子、選択的プロモーターの使用、スプライシングアイソフォーム

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
To understand the dynamic aspects of GABAergic system in the CNS, a wide variety oftranscripts derived from the gene of GABA-synthesizing enzyme GAD1 gene were disclosed andcharacterized. To further increase our knowledge on the GAD1 gene structure, we explored indetail its exact structural organization, alternative promoter usage and splicing in the mouse byusing quantitative PCR, cloning, sequencing and in situ hybridization. It was clarified that GAD1
gene locus generates ten mRNA isoforms by the combined actions of utilizing different promotersand alternative splicing of the coding exons. Novel GAD1 splicing isoforms (Isoforms 7 and 10)
were identified and characterized (GenBank accession: KM102984 and KM102985, respectively).
It was found that GAD1 isoforms were expressed in different mouse tissues with similar pattern ofexpression and also early during development. In the brain of adult mouse, the highest levels of
expression were seen in the olfactory bulb. Isoforms 1/2 were the most abundant forms. Their
expression was significantly higher in the lateral compared to the medial striatum. We also
reported the activity of the different promoters in selected adult mouse brain regions andnon-neuronal tissues.
中枢神経系の正常および病態における GABA 作動性システムの動的な側面を理解する
ために、GABA 合成酵素 GAD1 の遺伝子産物の構成に関してマウスを用いてほぼその全容を解明した。これまで GAD1 遺伝子に由来する代表的な転写産物として、GAD67 をはじめ GAD44、GAD25 をコードする数種類のスプライシングアイソフォームが知られてきた。これらの GAD１遺伝子由来タンパクは、成体のみならず発達過程における神経系、
膵臓など非神経組織の GABA の多様な役割を担う構成要素と考えられた。今回の研究では、定量的 PCR、クローニング、配列決定および in situ ハイブリダイゼーションを使用して、その正確な構造を決定するとともに、複数個所のプロモーターの使用状況やスプ
ライシングを検討した。GAD1 遺伝子座から読み出される異なるプロモーターとコーディングエクソンの選択的スプライシングによって 10 種類の mRNA アイソフォームが生成した。新規 GAD1 スプライシングアイソフォーム（アイソフォーム 7 および 10）を報告した（GenBank アクセッション：それぞれ KM102984 と KM102985）。いずれのアイソ
フォームも発達過程の早期から発現し、嗅球において最高レベルの発現を示した。成体
脳ではアイソフォーム 1/2 が最も豊富に発現した。線条体におけるそれらの発現は、内側部に比べて外側部で有意に高値を示した。マウス成体の脳領域および非神経組織いずれにおいても、プロモーターの活性の相違に基づくアイソフォーム生成の差異が存在することを明らかにした。

2. List of Publications
Original Articles
1. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M. and Sugimoto, T. Glutamic aciddecarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantificationin the mouse brain. BMC Neurosci. 15, Article No.114, 2014. レフェリー有2. Maruyama, M., Yamashita, Y., Kase, M., Trifonov, S. and Sugimoto, T. Lineage-specificpurification of neural stem/progenitor cells from differentiated mouse induced pluripotent
stem cells. Stem Cells Transl. Med. 2, 420-433, 2013. レフェリー有129

Proceedings
1. Yuji Yamashita, Trifonov Stefan, Masato Maruyama, Masahiko Kase, Tetsuo Sugimoto.
Characterization of the expression of integral membrane protein GPR155 in the mousestriatum reveals its relation with D1 receptor-expressing striatal projection neurons. 第 37 回
日本神経科学大会，横浜，2014/09．
2. 加瀬政彦, 丸山正人, トリフォノフ ステファン, 山下雄司, 杉本哲夫. 機械的障害
後の成熟ラット脳における Bcas1 遺伝子発現細胞の分布変化． 第 119 回日本解剖学会総会・全国学術集会，下野，2014/03．
3. 丸山正人, 山下雄司, Trifonov Stefan, 加瀬政彦, 杉本哲夫. 神経幹細胞特異的に発現させた薬剤耐性遺伝子によるマウス iPS 細胞由来神経幹細胞の純化． 日本薬学会第133 年会，横浜，2013/03．

130

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Imaging of disease-related molecules and cells
病因分子および細胞のイメージング

P.I.

Hiroko Matsuda, 松田博子

Affiliation

Cellular and Molecular Physiology, 細胞分子生理学（生理学第一）講座

Collaborator

松田博子、岡田誠剛、武藤恵、林三樹夫

Keywords

E-mailmatsudah@hirakata.kmu.ac.jp

ion channel, synaptic plasticity, transepithelial transport
イオンチャネル、上皮膜輸送、シナプス可塑性

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Pancreatic acini secrete ATP and nucleotide-modifying enzymes. Adenosine, the end product ofATP, stimulated transepithelial ion transport through cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator (CFTR) Cl− channels in pancreatic duct cell monolayer. However, mechanism of theregulation has not been extensively investigated. Therefore, the present study aimed to clarify
the regulation of Cl− channels by adenosine in pancreatic duct cells. We measured whole-cellcurrent in human pancreatic duct cells (Capan-1) using gramicidin-perforated patch techniques.
The application of adenosine induced a sustained inward current at −83 mV with Kd value of 10µM. BAY 60-6583, an adenosine A2B receptor agonist, increased the inward current, which was
inhibited by a CFTR Cl− channel inhibitor (CFTRinh-172). The current response to BAY
60-6583 was observed in 68% of the cells tested. When chloride was substituted with equimolar
glutamate in the bathing solution, the reversal potential of the current-voltage curve significantly
shifted from −31 to −5 mV, indicating that membrane conductance was chloride selective. The
intracellular chloride activity, calculated with the Nernst equation using extracellular chloride
activity and the reversal potential, was 51 mM. Immunohistochemical analysis showed theimmunoreactivity of adenosine A2B receptors in Capan-1 monolayers. In conclusion, theseresults indicated that the adenosine A2B receptor mediated the increase in anion transport through
CFTR Cl− channels in Capan-1 cells.
The activity-dependent plasticity of excitatory synapses is considered to be a model of learningand memory. (Hayashi)
GABAA receptor-mediated inhibitory postsynaptic currents (IPSCs) regulate the excitatory
synaptic transmission by modifying activity of the principal cells, but plasticity of the inhibitory
synapses has not been sufficiently characterized. Several investigators reported that repetitive
depolarization of principal cells facilitates or suppresses inhibitory synaptic transmission. Thus,
direction (facilitation or suppression) and mechanism of the plasticity, remain to be established.
In the present experiments, GABAAergic sIPSCs were recorded in acute slices of neonatal rat
hippocampus. Using whole cell patch-clamp recording method, effect of the repetitive
postsynaptic depolarization on the sIPSCs was determined. Depolarization of postsynaptic
neurons alone did not cause marked alteration of the frequency or amplitude of sIPSCs.
Simultaneous activation of presynaptic and postsynaptic neurons however, induced transient
decrement of the frequency of the sIPSCs. In the presence of antagonists of metabotropic
glutamate receptors or an antagonist of CB1 receptor, the inhibition caused by this simultaneous
stimulation was suppressed. These results suggest that postsynaptic depolarization andfacilitation of glutamate release from presynaptic terminal transiently inhibit the sIPSCs and that
CB1 receptor probably participates in this inhibition. (Taketo)
Arachnoid venoms contain numerous peptides with ion channel modifying and cytolytic
activities. We developed a green fluorescent protein (GFP)-based assay that can monitor thechanges in currents through overexpressed inwardly rectifying K+ channels (Kir2.1), in which
GFP expression was increased by blockade of Kir2.1 current. Using this assay, we screened
venom of many spider species. A peptide causing GFP decreasing effect was purified andsequenced. Electrophysiological and pain-inducing effects of the peptide were analyzed withwhole-cell patch-clamp recordings and hot-plate test, respectively. Among venoms we screened,soluble venom from Lachesana sp. decreased the GFP expression. Purification and sequencing of
the peptide showed that the peptide is identical to a pore-forming peptide purified from Lachesana
131

tarabaevi venom. Whole cell patch-clamp recordings revealed that the peptide had no effect on
Kir2.1 current. Instead, it induced a current that was attributable to the pore-formation of thepeptide. The peptide was selectively incorporated into hyperpolarized, i.e., Kir2.1 expressing, cells
and for this reason the peptide decreased GFP expression in our Kir2.1 assay. The pore-formation
positively shifted the reversal potential and induced burst firings in the hippocampal neurons in asynaptic current-independent way. The application of the Lachesana sp. peptide induced
pain-related behavior in mice. The peptide, which was found in Lachesana sp. venom, formed
pores and thereby depolarized neurons and induced pain. Our data suggested an additional
physiological role of the pore-forming peptides.(Okada)膵臓は、重炭酸イオンを豊富に含む液性成分と消化酵素から構成される膵液を分泌する。それに加えて、膵液には ATP および ATP 加水分解酵素が分泌される。その結果、膵
液中の ATP はアデノシンへと分解されると考えられるが、アデノシンの生理学的意義は不明のままである。そこで本研究は、アデノシンによる膵液分泌の調節機構を明らかにすることを目的とした。グラミシジン‐パッチクランプ法を用いて、膵臓導管細胞（Capan-1）に機能発現する陰イオン電流を測定した。また、免疫組織化学法を用いてアデノシン受容体の細胞内分布を調べた。細胞外のアデノシンは Capan-1 細胞の陰イオン電流を増加させ、その Kd 値は 10 µM だった。また、アデノシン A2B 受容体作動薬（BAY 60-6583）は陰イオン電流を増加させた。その電流は cAMP 活性型 Cl チャネル抑制薬（CFTRinh-172）により抑制された。BAY 60-6583 による活性化は 68%の細胞で観察された。電流の逆転電位から細胞内の Cl イオン濃度を計算すると、51 mM だった。アデノシン A2B 受容体は単層 Capan-1 細胞の管腔側膜に局在していた。
以上の結果は、アデノシン A2B 受容体は cAMP
活性型 Cl チャネルを制御することを示唆する。(林)興奮性シナプスの活動依存性の可塑性は学習・記憶のモデルとみなされている。
GABAA受容体を介する抑制性シナプス後電流(IPSC)は、プリンシパル細胞の活動を修飾すること
で興奮性シナプス伝達を調節しているが、抑制性シナプスの可塑性については未だ十分に解明されていない。本研究においては、幼若海馬のスライス標品から GABAA 受容体作動性の自発電流（sIPSC）をパッチクランプ法で記録し、反復するプリンシパル細胞の脱分極に対する反応を観察した。シナプス後細胞の脱分極のみによっては sIPSC に明らかな変化はみられず、シナプス後細胞とシナプス前細胞が同時に活性化される条件のもとでは、
sIPSC 頻度の一過性の低下が観測された。代謝型グルタミン酸受容体や CB1 受容体のア
ンタゴニストの存在下にこの sIPSC 頻度の一過性の低下は抑制された。これらの結果か
ら、シナプス後細胞の脱分極と、シナプス前細胞からの伝達物質放出の増加とが一過性に
sIPSC を減少させていること、およびこの過程に CB1 受容体が関与していることが示唆された。(武藤)
我々は、培養細胞に発現させた過剰な K+電流の毒性によって GFP の共発現量が変化することを利用した high-through-put アッセイを確立し、これまでに多数のイオンチャネ
ル修飾薬が見出されているクモ類毒をスクリーニングし、pore 形成ペプチドを見出した。
同ペプチドは K+電流を発現し膜電位が深い細胞に選択的に pore を形成し、神経細胞を脱分極させた。同ペプチドは神経細胞の発火を促進し、マウス後肢への投与により痛覚過敏を惹起した。これまでにクモ類毒から pore 形成ペプチドは見出されているが、神経細胞刺激、発痛作用を示したのは、本研究が始めてであり、発痛により哺乳類による捕食を抑止していることが示唆された（Okada et al., 2015）。(岡田)

2. List of Publications
Original Articles
1. Okada, M., Andharia, N., and Matsuda, H. Increase in the titer of lentiviral vectors
expressing potassium channels by current blockade during viral vector production. BMC
Neurosci. 16, Article No. 30, 2015. レフェリー有2. Hayashi, M. and Novak, I. Molecular basis of potassium channels in pancreatic ductepithelial cells. Channels (Austin), 7, 432-441, 2013. レフェリー有132

Proceedings
1. 武藤恵、松田博子「Inhibition of spontaneous GABAergic currents after increasing pre- andpost-synaptic activity in rat hippocampus」、『第 92 回日本生理学会大会』、神戸、2015 年 3月
2. 林美樹夫、松田博子「Regulation of CFTR Cl channels by adenosine in pancreatic ductcells」、『第 92 回日本生理学会大会』、神戸、2015 年 3 月
3. 林美樹夫、稲垣明浩、松田博子「アデノシンによる膵液分泌調節」、『第 157 回日本獣医学会学術集会』、札幌、2014 年 9 月
4. Sheikh IA, Chatterjee T, Hayashi M, Saha DR, Chakrabarti P, Chakrabarti MK, Hoque KM.
Recombinant accessory cholera enterotoxin (Ace) of Vibrio cholera induces diarrhea by
stimulation of a chloride channel and inhibition of the Na+/glucose co-transporter SGLT1.
Digestive Disease Week 2014, Chicago, USA, 2014, May.
5. 武藤恵、松田博子「Activity-dependent repression of spontaneous inhibitory synaptic current
in rat hippocampus」、『第 91 回日本生理学会大会』、鹿児島、2014 年 3 月
6. 林美樹夫、稲垣明浩、松田博子「Adenosine A2B receptor regulates CFTR in pancreatic ductcells」、『第 91 回日本生理学会大会』、鹿児島、2014 年 3 月
7. Hayashi M, Inagaki A, Matsuda H Adenosine regulates Cl− channels in humanadenocarcinoma cell monolayer. The 37th Congress of the International Union of
Physiological Sciences (IUPS2013), Birmingham, UK, 2013, Jul.
8. Novak I, Wang J, Hayashi M, Kowal JM, Haanes KA. Purinergic signalling regulates
pancreatic epithelial transport and pancreatic stellate cells. 36th European Cystic Fibrosis
Conference, Lisbon, Portugal, 2013, Jun.
9. Novak I, Wang J, Hayashi M ATP regulates Cl− and K+ channels in human pancreatic ducts.
Experimental Biology 2013, Boston, USA, 2013, Apr.
10. Masayoshi Okada, Hiroko Matsuda, Geraldo Corzo, Fredy Coronas, Lourival Possani,
Modifications of TREK-1c channel, Gordon Research Conference Ion Channels, South
Hadley, MA, USA, July 6-11, 2014133

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

The role of serotonin and dopamine for cognitive processes in the primate.
霊長類におけるセロトニン・ドパミンによる認知機能の制御

P.I.

Kae Nakamura, 中村加枝

Affiliation

Cognitive Neuroscience, 高次認知脳科学（生理学第二）講座

Collaborators

松崎竜一、磯田昌岐、上田康雅、則武厚、安田正治

E-mailnakamkae@hirakata.kmu.ac.jp

dopamine, dorsal raphe nucleus, hypothalamus, monkey, Nucleus accumbens,
Keywords

reward, serotonin
ドーパミン、セロトニン、サル、報酬、背側縫線核、視床下部、側坐核

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
1.

The basal ganglia receive aversive information form the limbic stress circuit. However,whether and how the information is processed in the basal ganglia for optimal decision
making has not been well understood. We therefore trained three monkeys a choice saccadetask. We found that animals sometimes made suboptimal choice leading to airpuffs, when oneof two options was associated with an airpuff. It suggests that optimal decision making
process was impaired under the condition in which animals might receive an airpuff. We alsomeasured the heart rate as a measure of stress. We found that pulse-pulse interval (PPI)
decreased when one of the choice options was associated with an airpuff, indicating that theheat rate increased when animals received stress. We next recorded neuronal activity from thecaudate while animals performed the task. There were many neurons which encoded theinformation about the inclusion of the aversive stimulus, indicating that stress-related
information is processed in the caudate. These results suggest that stress impaired thereward-based decision making process in the basal ganglia.

2.

Previous studies reported that monoamine neurotransmitters such as dopamine and serotonin
influence our motivation and behavior in social situations. Particularly in a competitive
situation, comparisons between self-reward and other-reward may greatly activate themonoamine system and shape self-reward valuation affected by other-reward. To understandthe neuronal mechanism of this effect, we conditioned two paired monkeys in a
pseudo-competitive situation and recorded single-unit activity from medial prefrontal cortex.
We found that a group of neurons in this area encode other-reward probabilities as well as
self-reward probabilities.

1.

ヒトを含めた動物にとって、報酬の獲得や嫌悪刺激からの回避のために行動を選択することは、非常に重要である。これまでの研究から、報酬に関する情報が、黒質からドーパミン作
動性ニューロンを介して大脳基底核線条体へ入力しており、この情報に基づいて線条体では適切な行動選択のための情報処理がなされていると考えられている。一方、嫌悪刺激に関わる情報も、多くの脳領域からこの線条体へ投射しているが、大脳基底核で行っている
情報処理に対し、どのような影響を与えるのかについては不明であった。また、動物が嫌悪感覚を持っているという客観的な指標も測定されていなかった。そこで我々は 3 頭のサルを用いて、まず嫌悪刺激の存在が行動選択と、嫌悪感覚やストレスの指標としての脈拍に与える影響を評価した。さらに線条体尾状核の単一神経細胞の活動の記録を行った。課題では、二つの視覚刺激を同時に呈示し、二つのうち一つを眼球運動により選択させた。この結果、3 頭の動物で報酬を獲得するための行動選択が、選択肢の中に嫌悪刺激と結びついた選択肢が存在すると、そのような選択肢が無い場合に比べて、不適切な行動選択の割合の増加し、行動選択の反応時間が有意に変化する事が明らかとなった。さらに、脈拍の記録から、嫌悪刺激と結びついた選択肢が存在すると、有意に脈波間隔(PPI)が短縮することが観察された。これらの結果から、嫌悪刺激が視野にあるだけで、サルの報酬獲得のための適切な行動選択が障害されると示唆される。さらにこの時の大脳基底核線条体の尾状核より単一神経細胞の放電活動を記録すると、これらのストレスの影響を受けていると考えられる放電活動を示すニューロンが多く見つかった。以上のことから、嫌悪刺激によるストレスは大脳基底核線条体で行われる情報処理プロセスに影響を与え、適切な行動選択のため
134

のプロセスを阻害している可能性を示唆した。これらの成果には、北米神経科学大会・日本神経科学会(2013, 2014)において報告した。
2.

近年、脳内におけるセロトニン・ドーパミンなどのモノアミン系システムが、日々の社会生活における思考・動機や行動に影響を及ぼすという知見が多く報告されている。特に資源が限られて他者と自己の間で競合が生じている状況では、他者と自分の得た報酬を比較する
ことによって自己の得た報酬に対する価値が形成されると考えられる。そこで我々は、自己のみならず他者の得た報酬がどのように自己の得た報酬に対する価値に影響するかを明らかにする実験を行った。二頭のサルを向い合せ自己および他者の報酬確率を操作し、疑似的に競合関係にある状況を作り出した。そのような状況下において、ドーパミンおよびセ
ロトニンの強い投射があるサルの前頭葉内側部と呼ばれる場所から単一神経細胞活動の記録・解析を行った。その結果、自己の報酬確率だけではなく他者の報酬確率を表現している神経細胞が多数存在することを突き止めた。この成果は、北米神経科学大会(2014)等で報告した。

2. List of Publications
Original Articles
1. Nakamura, K. and Wong-Lin, K. Functions and computational principles of serotonergic andrelated systems at multiple scales. Front Integr. Neurosci. 8, Article No. 23, 2014.
2. Chang, S.W. and Isoda, M. Toward a better understanding of social le arning, social deciding,and other-regarding preferences. Front Neurosci. 8, Article No.362, 2014.
3. Nakamura, K. The role of the dorsal raphé nucleus in reward-seeking behavior. Front Integr.
Neurosci. 7, Article No.60, 2013.
4. McCairn, K.W., Iriki, A. and Isoda, M. Global dysrhythmia of cerebro-basal
ganglia-cerebellar networks underlies motor tics following striatal disinhibition. J. Neurosci.
33, 697-708, 2013.
5. Yamada, H., Inokawa, H., Matsumoto, N., Ueda, Y., Enomoto, K. and Kimura, M. Coding of
the long-term value of multiple future rewards in the primate striatum. J. Neurophysiol. 109,
1140-1151, 2013.
6. McCairn, K.W. and Isoda, M. Pharmacological Animal Models of Tic Disorders. Int. Rev.
Neurobiol. 112, 179-209, 2013.
7. Isoda, M. and Noritake, A. What makes the dorsomedial frontal cortex active during reading
the mental states of others? Front Neurosci. 7, Article No.232, 2013.
8. 中村加枝, 林和子, 則武厚. 意思決定・行動選択の神経科学 セロトニンと意思決定.
Clin. Neurosci. 32, 55-57, 2014.
9. 磯田昌岐. マカクザルを用いた社会脳研究の最近の進歩 Brain Nerv. 65, 679-686,
2013.
10. 磯田昌岐. 眼球運動を手がかりとして認知機能の脳内機構を探る．第 50 回日本神経眼科学会記念雑誌, 30, 9-16, 2013.
Proceedings
1. Noritake, A., Isoda, M. Role of primate dorsomedial prefrontal cells in social reward
valuation. International Symposium 2014‘Vision, Memory, Thought: how cognition emerges
from neural network', 東京, 2014 年 12 月
2. Noritake, A., Isoda, M. Social reward valuation in the macaque.Ⅱ. Role for dorsomedial
prefrontal cells. Society for Neuroscience, Washington D.C., USA, 2014 年 11 月
3. Isoda, M., Noritake, A. Social reward valuation in the macaque.Ⅰ. Design of a behavioral
paradigm. Society for Neuroscience, Washington D.C., USA, 2014 年 11 月
4. Ueda, Y., Tokita, K. and Nakamura, K. Behavioral and physiological impacts of aversive
information in the monkeys. Society for Neuroscience, Washington D.C., USA, 2014 年 11 月
5. 上田康雅, 岡崎哲, 山中航, 鮫島和行, 榎本一紀, 狩野方伸, 木村實. 強化学習に基づ
いた、サル線条体に存在する内因性エンドカンナビノイドの意思決定に関する役割,
第 37 回日本神経科学大会, 横浜, 2014 年 9 月
6. 中村加枝, 上田康雅, 時田賢一. 嫌悪刺激による意思決定行動と尾状核の神経活動への影響. 第 37 回日本神経科学大会, 横浜, 2014 年 9 月
7. Isoda, M. Probing the neural code of self and other's actions in the macaque medial frontal
135

8.

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10.
11.
12.

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14.
15.
16.

17.

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19.

20.

21.
22.
23.

24.

cortex. Federation of European Neuroscience Societies 2014, Milano, Italy, 2014 年 7 月
則武厚, 中村加枝. Neurons in the lateral hypothalamic area of cynomolgus monkeys may
provide precursor signals for midbrain dopaminergic neurons in reward processing. 日本動物心理学会第 74 回大会, 岡崎, 2014 年 7 月
Isoda, M. Clarifying the neuronal and genetic basis of social action monitoring using
macaques. The International Neuropsychological Symposium 2014, Lido di Camaiore, Italy,
2014 年 6 月
磯田昌岐. Clarifying the neural mechanisms of social action monitoring using macaques. 第91 回日本生理学会大会, 名古屋, 2014 年 3 月
Ueda, Y., Tokita, K. and Nakamura, K. Representation of the aversive information in the
primate caudate. Society for Neuroscience, San Diego, USA, 2013 年 11 月
Noritake, A., Nakamura, K. Modulation of responses to the conditioned and unconditioned
stimuli in the primate lateralhypothalamic area by an aversive option in Pavlovian
conditioning. Society for Neuroscience, San Diego, USA, 2013 年 11 月
磯田昌岐, 社会的認知機能のシステム生理学的理解. 第 3 回社会神経科学研究会, 岡崎, 2013 年 11 月
Isoda, M. Social action monitoring: from genes to physiology and behavior. International
symposium on Prediction and Decision Making, 京都, 2013 年 10 月
Isoda, M. Role for medial frontal cortex cells in social action monitoring. Symposium on
Neural Circuits for Adaptive Control of Behavior, France, 2013 年 9 月
Ueda, Y. A Role of eCB signaling in the control of primate basal ganglia function. Gordon
Research Conferences (2013) Cannabinoid Function in the CNS, Waterville Valley NH,
USA, 2013 年 8 月
McCairn, K., Iriki, A., Isoda, M. Global dysrhythmia of cortico-basal ganglia-cerebellar
networks underlie motor tics in a nonhuman primate model of Tourette syndrome. 第 11 回
世界生物学的精神医学学会国際会議, 京都, 2013 年 6 月
McCairn, K., Iriki, A., Isoda, M. Elimination of tic-related neuronal activity by deep brain
stimulation via interlocking with stimulus pulses. 第 11 回世界生物学的精神医学学会国際会議, 京都, 2013 年 6 月
McCairn, K., Isoda, M., Iriki, A., Takada, M., Matsumoto, M. Decoding a limbic-motor
network contribution to the expression of obsessive-compulsive behavior in macaques. 第 11回世界生物学的精神医学学会国際会議, 京都, 2013 年 6 月
McCairn, K., Isoda, M., Iriki, A., Takada, M., Matsumoto, M. Decoding a limbic-motor
network contribution to the expression of obsessive compulsive behavior in macaques. 第 36回日本神経科学大会, 京都, 2013 年 6 月
上田康雅,時田賢一,中村加枝. サルの尾状核における嫌悪刺激に関わる情報の表現様
式. 第 36 回日本神経科学大会, 京都, 2013 年 6 月
則武厚,中村加枝. サル視床下部外側野ニューロンの神経活動は嫌悪刺激の導入により抑制される. 第 36 回日本神経科学大会, 京都, 2013 年 6 月
McCairn, K., Iriki, A., Isoda, M. Deep brain stimulation eliminates tic-related neural activity
via interlocking with stimulus pulses. The 16th Quadrennial Meeting of the World Society
for Stereotactic, 東京, 2013 年 5 月
Isoda, M. Developing a systems neuroscience of self and others using macaques. Third
Symposium on Biology of Decision-Making, Paris, France, 2013 年 5 月

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Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Elucidation of pathogenesis and development of diagnosis and treatment of
intractable neural diseases
難治性神経疾患の病態解明と診断治療法の開発

P.I.

Seiji Ito, 伊藤誠二

Affiliation

Molecular and Functional Biology, 分子生体機能学（医化学）講座

Collaborators

松村伸治、下條正仁、片野泰代、西田和彦、井上明俊

Keywords

Molecular imaging, Nax, Nerve regeneration, nSR100, Ovol2, PET
分子イメージング、Nax、神経再生、nSR100、Ovol2、PET

E-mailito@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
1. Molecular imaging
Noxious and non-noxious stimuli are conveyed by prmary afferent fibers which form synapse
with spinal neurons, processed in network of dorsal horn of the spinal cord, transmitted to thecortex, and recognized as pain and touch, respectively. To clarify how sensory reception from theperipheral is processed in the spinal cord, we have analyzed spinal responses functionally andmorphologically using two-photon microscopy and fluorescent protein-expressing mice. Whilein vivo patch clamp can analyze cellular response in only one spinal neuron, two-photon
microscopy can analyze it in many cells simultaneously in vivo.
We applied themal, mechanical and touch stimuli to the skin of mice expressing the Ca2+
indicator protein YCnano50, in the spinal cord by the intrauterine gene transfer method, and havesucceded in making a temporal and special map of the stimulus-response of spinal neurons
to different stimuli..
Patiens suffering from mushroom poisoning shows a long-lasting allodynia, pain evoked bytouch for one month. To clarify the mechanism of food poisoning, we synthesized 11C-labeledderivative of acromelic acid, a constitutent of the poison, for PET study and examined the binding
in the brain and spinal cord. The distribution of 11C-labeled derivative was coincident with thatof kainite receptor.
2. Studies on elucidation of the pathogenesis of neuropathic pain and attempts to its
treatment
We have demonstrated that GluN2N subunit of NMDA receptors and neuronal nitric oxide
synthase are important for the generation and maintenance of neuropathic pain. While protein
kinase A which is activated by cAMP has been extensively studied, the function of protein kinase
G (PKG) and its target proteins remain largely unknown. We expressed recompinant PKG in
insect cells Sf9 and phosphorylated homogenates of dorsal root ganglia using 32P-ATP. We foundthat purified PKG phosphorylate histone as a major substrate in the homogenate.
It was reported that at least some types of causalgia can be resolved successfully by surgery
using in situ tissue-engineered tube. To elucidate the mechanism of peripheral nerve
regeneration and promote translational research, we established a mouse model of nerve
regeneration in thy1-YFP mice. Unexpectedly, we found that Nax, a sodium-dependent Na+
channel is involeved in nerve regeneration by energy exchange between Nax-expressing Schwann
cells and regenerated axons via a lactate shuttle.
The year 2014 is the fruitful year in which we could publish works stuggled for many years.
We have promoted collaboration with laboratories inside and outside of Kansai Medical
Univeristy and demonstrated that there are striking similarities in molecular mechanisms of neuralplasticity beetween the spinal cord associated with pain behaviors and the hippocampus associatedwith long-term potentiation, learning and memory. In 2014, we could publish papers in Dev. Cell,
Eur. J. Neurosci., and Eur. J. Pharmacol., in collaboration with Dr. Xie Dai of University ofCalfornia Irvine, Prof. M. Noda of National Institute for Basic Biology, Drs. H. Onoe and H. Doi
of Riken Center for Molecular Imaging Science, and Prof. T. Minami of Osaka Medical College.
Major research activities in 2013 & 2014 are as follows.
1) In vivo imaging in the spinal cord of mice expressing fluorescent protein
2) Expression and characterization of recombinant protein kinase G, a target molecule of NO
3) Elucidation of the mechanism of periphenal nerve regeneration using animal model1374) Localization and property of binding protein to 11C-labeled acromelic acid in the brain amd
spinal cord by PET
5) Regulatory mechanism of REST synthesis by nSR100 in small cell lung cancer6) Role of Ovol2, mouse homologue of Drosophila ovo, in epidermal differentiation
１．分子イメージング
末梢組織からの感覚受容がどのように処理されるのか、蛍光タンパクを発現する遺伝子
改変マウスを用いて多光子励起顕微鏡下に、機能的、形態学的に解析を行っている。これまで、in vivo patch-clamp では１つの脊髄後角細胞の解析しかできなかったが、多光子励起顕微鏡を用いることにより末梢からの刺激応答を多くの細胞で同時に見ることができるようになった。胎生期 12.5 日に子宮内の胎児の中心管への遺伝子投与により脊髄後角に発現させた Ca2+蛍光指示タンパク YC nano50 解析結果を報告できたことである。
茸毒アクロメリン酸の食中毒で神経障害性疼痛のときに生じる疼痛反応アロディニア
症状が長期間持続する。その作用を明らかにするためにアクロメリン酸の PET 用試薬を化学合成し、脳と脊髄での結合反応を調べた結果、カイニン酸受容体の分布と一致した。
２．神経障害性疼痛の病態解析と治療に向けた取り組み
我々は、神経障害性疼痛の発症維持に NMDA グルタミン酸受容体 GluN2B サブユニッ
トとその下流にある神経型一酸化窒素合成酵素の活性化が必要であることを明らかにしている。cAMP で活性化されるプロテインキナーゼ A は非常によく研究されてきたが、一酸化窒素で活性化されるプロテインキナーゼ G（PKG）は小脳と痛みを伝える後根神経節に強く発現している。しかし、PKG の標的となるタンパクは同定されていない。そこ
で PKG 遺伝子を昆虫細胞 Sf9 で発現させたタンパクを用いて後根神経節の標的タンパクを 32P-ATP を用いてリン酸化反応を行った結果、ヒストンが基質となることがわかった。
神経障害性疼痛の１つカウザルギーの治療に末梢神経の再生治療が有効であることが臨床の現場で報告された。我々は、神経組織に選択的に蛍光タンパクを発現する Thy1-YFP
マウスを用いて、再生医療にむけた基礎研究を行うモデルマウスを作製した。意外なことに Na+濃度依存性 Na+チャネルである Nax が Schwann 細胞と神経軸索の間でのエネルギーのやり取りをする乳酸シャトルを用いて神経再生の促進に関与することを明らかにした。
今年度は、これまで長年取り組んできた研究が論文として実を結んだ年といえる。
関西医科大学だけでなく、最先端研究を推進している国内外のトップクラスの研究室と数多くの共同研究を推進し、疼痛行動における脊髄の神経可塑的変化が記憶・学習などの高次脳機能でみられる神経活動の長期増強と共通の分子基盤があることを明らかにしてきた。カリフォルニア大学 Irvine 校 Dai 教授との共同研究成果を 2014 年 4 月に Dev. Cellに、自然科学研究機構基礎生物学研究所の野田昌晴教授との共同研究成果を 2014 年 2 月に Eur. J. Neurosci.に、理化学研究所分子イメージング科学研究センター土居久志、尾上浩隆チームリーダーと大阪医科大学南敏明教授との共同研究成果を Eur. J. Pharmacol.
を 2013 年 7 月に発表した。
平成 24 年度の主な成果は以下のとおりである。
１）蛍光タンパクを発現した脊髄後角での in vivo イメージング
２）一酸化窒素の標的分子プロテインキナーゼ G に関する研究
３）神経切断―再生モデルにおける神経再生機構の解明
４）PET を用いた触覚による痛みに関する茸毒アクロメリン酸の局在
５）小細胞肺がんにおける神経特異的転写抑制因子の産生調節機構
６）ショウジョウバエの卵形成遺伝子 ovo のマウスの相同遺伝子 Ovol2 の皮膚での解析

2. List of Publications
Original Articles
1. Unezaki, S., Katano, T., Hiyama, T.Y., Nguyen, H. T., Yoshii, S., Noda, M. and Ito, S.
Involvement of Nax sodium channel in peripheral nerve regeneration via lactate signaling.
Eur. J. Neurosci. 39, 720-729, 2014.
2. Lu, J., Yao, I., Shimojo, M., Katano, T., Uchida, H., Setou, M. and Ito, S. Identification of
nitrated tyrosine residues of protein kinase G-Iα by mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem.
406, 1387-1396, 2014.
138

3.

4.

5.

6.

Lee, B., Villarreal-Ponce, A., Fallahi, M., Ovadia, J., Sun, P., Yu, Q.C., Ito, S., Sinha, S., Nie,
Q. and Dai, X. Transcriptional mechanisms link epithelial plasticity to adhesion anddifferentiation of epidermal progenitor cells. Dev. Cell 29, 47-58, 2014.
Nishida, K., Matsumura, S., Taniguchi, W., Uta, D., Furue, H. and Ito, S. Three-dimensional
distribution of sensory stimulation-evoked neuronal activity of spinal dorsal horn neurons
analyzed by in vivo calcium imaging. PLoS One 9, e103321, 2014.
Tsuda, M., Kaneko, S., Ando, A., Nishimura, T., Okuda-Ashitaka, E., Ito, S., Taomoto, M.,
Matsumura, M. and Takahashi, K. Controllable urokinase gene expression in trabecularmeshwork cells. J. Clin. Exp. Ophthalmol. 5, Article No. 329, 2014.
Miyazaki, S., Minami, T., Mizuma, H., Kanazawa, M., Doi, H., Matsumura, S., Lu, J., Onoe,
H., Furuta, K., Suzuki, M. and Ito, S. The action site of the synthetic kainoid(2S,3R,4R)-3-carboxymethyl-4-(4-methylphenylthio)
pyrrolidine-2-carboxylic
acid(PSPA-4), an analogue of Japanese mushroom poison acromelic acid, for allodynia (tactilepain). Eur. J. Pharmacol. 710, 120-127, 2013.

Books
1. Katano, T., Ito, S. (2014) Chapter 5: Multifunctional Roles of Nitric Oxide (NO) in Neurons
Studies on Pediatric Disorders (Oxidative Stress in Applied Basic Research and Clinical
Practice)（Human Press, Springer）71-84 頁（全 494 頁）
Proceedings
1. Katano, T., Yao, I., Yamazaki, M., Abe, M., Fukuda, M., Okumura, N., Takao, T., Sakimura,
K. and Ito, S. Involvement of neuropathic pain-related protein-B(NPRP-B), a novel
functional molecule, in inflammatory and neuropathic pain in vivo. The 43rd annual meetingof the Society for Neuroscience, San Diego, November 9-13, 2013.
2. Shimojo, M., Shudo, Y. and Ito, S. Small cell lung cancer (SCLC)-specific RE1-silencing
transcription factor (REST) isoform is regulated by neural-specific Ser/Arg repeat-related
protein of 100 kDa (nSR100/SRRM4). The 43rd annual meeting of the Society for
Neuroscience, San Diego, November 9-13, 2013.
3. Shudo, Y., Shimojo, M. and Ito, S. Pituitary adenylate-cyclase activating polypeptide(PACAP) is possibly regulated by RE1-silencing transcription factor (REST/NRSF) isoform
in neuropathic pain. The 43rd annual meeting of the Society for Neuroscience, San Diego,
November 9-13, 2013.
4. Okuda-Ashitaka, E., Okamoto, K., Minami, T. and Ito, S. Involvement of NIPSNAP1, aneuropeptide nocistatin interacting protein, on inflammatory pain. The 43rd annual meetingof the Society for Neuroscience, San Diego, November 9-13, 2013.
5. Ito, S., Lu, J., Shimojo, M., Katano, T., Uchida, H. and Yao, I. Proteomic approach of nitrated
tyrosine residues of protein kinase G-Iα. The 43rd annual meeting of the Society for
Neuroscience, San Diego, November 9-13, 2013
6. Nguyen, H. T., Katano, T., Hiyama, Y. T., Noda, M. and Ito, S. Energy coupling ofaxon-Schwann cells by Nax and endothelin in nerve regeneration The 44th NIPS
International Symposium and The 5th Asian Pain Symposium, Okazaki, December 18-20,
2013.
7. Ito, S. Bifurcate roles of nitric oxide (NO) in neuropathic pain. The 44th NIPS International
Symposium and The 5th Asian Pain Symposium, Okazaki, December 18-20, 2013.
8. Nguyen, H. T., Katano, T., Matsumura, S. and Ito, S. Involvement of c-Jun N-terminal kinase
in peripheral nerve regeneration. The 44th annual meeting of the Society for Neuroscience,
Washington D.C., November 15-19, 2014.
9. Ito, S., Nguyen, H. T., Matsumura, S. and Katano, T. Involvement of endothelin in peripheral
nerve regeneration. The 44th annual meeting of the Society for Neuroscience, Washington
D.C., November 15-19, 2014.
10. Shimojo, M., Shudo, Y., Ito, S. Identification of small cell lung cancer (SCLC)-specificmiRNAs in blood as a tumor marker for the detection of SCLC. The 44th annual meeting of
the Society for Neuroscience, Washington D.C., November 15-19, 2014.
11. Nguyen, H. T., Katano, T., Matsumura, S. and Ito, S. Involvement of endothelin B receptor in
139

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

peripheral nerve regeneration using sciatic nerve transection-regeneration model. VSEM
Conference on Emergency Medicine, Saigon (Vietnam) March 9-13, 2015.
西 田 和 彦 、 松 村 伸 治 、 伊 藤 誠 二 . Three-dimensional distribution of sensory
stimulation-evoked neuronal activity of spinal dorsal horn neurons analyzed by in vivo
calcium imaging. In vivo カルシウムイメージングによる脊髄後角ニューロンの神経活
動の三次元分布の解析. 第 36 回日本神経科学大会・第 56 回日本神経化学会大会・第23 回日本神経回路学会大会合同大会、ポスター発表、京都（国立京都国際会館）、2013、
6 月 20-23 日
矢尾育子、松村伸治、伊藤誠二. Synaptic localization of CaMKII with mice model ofchronic pain. 第 36 回日本神経科学大会・第 56 回日本神経化学会大会・第 23 回日本
神経回路学会大会合同大会、ポスター発表、京都（国立京都国際会館）、2013、6 月
20-23 日内田仁司、伊藤誠二. Epigenetic gene regulation of RNA editing enzyme in neuron. 神経細胞における RNA 編集酵素のエピゲノム制御. 第 15 回日本 RNA 学会年会、ポスター
発表、松山（ひめぎんホール）、2013、7 月 24-26 日
平原幸恵、若林毅俊、森徹自、小池太郎、高森康晴、矢尾育子、伊藤誠二、後藤仁志、
小野勝彦、山田久夫. 質量分析イメージングを用いたオリゴデンドロサイト分化マー
カーO4 抗原実態解析. 第 54 回日本組織細胞化学会総会・学術集会、東京（航空会館）、
2013、9 月 27-28 日
下條正仁、首藤由江、伊藤誠二. 小細胞肺癌特異的 RE1-silencing transcription factor(REST) isoform は神経特異的 Ser/Arg repeat-related protein of 100 kDa (nSR100/SRRM4)により発現調節されている. 第 36 回日本分子生物学会、ポスター発表、神戸（神戸コンベンションセンター）、2013、12 月 3-6 日
首 藤 由 江 、 下 條 正 仁 、 福 永 幹 彦 、 伊 藤 誠 二 . 神 経 因 性 疼 痛 に お け る Pituitary
adenylate-cyclase activating polypeptide (PACAP)発現に関与する神経特異的転写抑制因子 RE1-silencing transcription factor (REST/NRSF) アイソフォームに関する研究. 第 36回日本分子生物学会、ポスター発表、神戸（神戸コンベンションセンター）、2013、
12 月 3-6 日
平原幸恵、若林毅俊、森徹自、小池太郎、高森康晴、矢尾育子、伊藤誠二、後藤仁志、
本家孝一、小野勝彦、山田久夫. 鶏胚脊髄オリゴデンドロサイト O4 抗原の実態解析
第 119 回日本解剖学会総会・全国学術集会、栃木（自治医科大学キャンパス）、2014、
3 月 27-29 日
Nguyen Huu Tu、片野泰代、松村伸治、伊藤誠二. 末梢神経再生モデルを用いた神経再 生 に お け る エ ン ド セ リ ン の 関 与 Involvement of endothelin in peripheral nerve
regeneration using tubing and osmotic pump model. 第 36 回日本疼痛学会、口演、大阪（KKR ホテルオーサカ）、2014、6 月 20-21 日
伊藤誠二、片野泰代、松村伸治、西田和彦. 成熟した疼痛研究の新しい展開 New
departure of mature pain research. 日本ペインクリニック学会第 48 回大会、教育講演、
新宿（京王プラザホテル）、2014、7 月 25 日
矢尾育子、松村伸治、片野泰代、山肩葉子、井本敬二、伊藤誠二. CaMKII キナーゼ
不活型 KI マウスにおける慢性疼痛モデル脊髄後角の CaMKII のシナプス局在. 第 37回日本神経科学大会、ポスター発表、横浜（パシフィコ横浜）、2014、9 月 11-13 日
西田和彦、松村伸治、伊藤誠二. In vivo カルシウムイメージングを用いた皮膚の異なる点への感覚刺激に応答する脊髄後角ニューロンの解析第 37 回日本神経科学大会、ポスター発表、横浜（パシフィコ横浜）、2014、9 月 11-13 日
下條正仁、首藤由江、伊藤誠二. 小細胞肺癌患者血液中に特異的に検出される miRNA
に関する研究. 第 37 回日本分子生物学会年会、ポスター発表、横浜（パシフィコ横浜）、2014、11 月 25-27 日
川端健太、藤原武史、寺内祥子、西村勇武、南敏明、伊藤誠二、芦高恵美子. JNK の活性化による MCP-1 遊離を介したノシセプチンのアロディニア発症 JNK-induced
MCP-1 release contributes to nociceptin/orphanin FQ-evoked allodynia. 第 38 回日本分子生物学会年会・第 88 回日本生化学会大会合同大会、ポスター発表、神戸（神戸ポートアイランド）、2014、12 月 1-4 日
140

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Analysis of synaptic plasticity in the basal ganglia network by regional
quantitation of mRNA in 6-OHDA-lesioned rats
パーキンソン病モデルラットを用いた
大脳基底核神経回路の可塑性の研究

P.I.

Hirofumi Kusaka, 日下博文

Affiliation

Neurology, 神経内科学講座

Collaborators

金子鋭, 和手麗香, 中村正孝, 隠岐光彬

Keywords

Parkinson’s disease, 6-OHDA, model rat, RT-PCR
パーキンソン病、6-OHDA モデルラット、リアルタイム PCRE-mailkusaka@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disease presenting progressive motor dysfunction
such as tremor, akinesia and rigidity. Its major neuropathological feature is dopaminergic neuronalloss in the substantia nigra pars compacta. Dopaminergic treatment is effective initially, but it
becomes less effective in the advanced stage of the disease. Not only presynaptic neuronal loss at
nigrostriatal dopaminergic synapses, but also postsynaptic dysfunction is considered to cause thedecreased effectiveness. Non-dopaminergic neurotransmitters, such as glutamate,endocannabinoids and adenosine have been attracting attention recently to participate in thepathophysiological process of the postsynaptic dysfunction of Parkinson’s disease.
PurposeTo evaluate postsynaptic changes of nigrostriatal dopaminergic synapses, we analyzed mRNA
expressions of non-dopaminergic neurotransmitter receptors in 6-OHDA-lesioned rats. Northernblotting and in situ hybridization have been applied to analyze mRNA expression in PD model
animals. However, the former has difficulty in regional analysis, and the latter lacks quantitativity.
Here we present a new method for regional quantitation of mRNA in the basal ganglia by real time
RT-PCR.
Methods
6-OHDA was stereotaxically injected into the unilateral medial forebrain bundle of SD rats.
Apomorphine-induced behavioral tests were performed 4 weeks after operation to evaluate
successfully operated animals. Frozen brains were coronally sectioned at 1 mm thickness.
Approximately 0.7 mg of tissue from striatum or globus pallidus was die-cut by 18 guage
non-bevel needle. Random hexamer-generated cDNA was applied to real time PCR. Expression ofmRNA on the operated side was compared to that on the unoperated side.
Results
Prodynorphin (Dyn) and metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) mRNA decreased in thedorsolateral striatum on the operated side, but proenkephalin (Enk) mRNA increased in theventrolateral striatum. Cannabinoid receptor 1 (CB1) mRNA showed tendency to increase in both
dorsal and ventral striatum. Adenosine A2a receptor (A2A) and mGluR5 mRNA increased in theglobus pallidus.
Discussion
Real time RT-PCR provided regional quantitation of mRNA expression in the basal ganglia of PD
model rats. Decreased Dyn and increased Enk mRNA indicated inhibited direct and activated141indirect pathways after dopamine depletion, respectively. Increased CB1, A2A and mGluR5mRNA may be compensatory mechanisms of the basal ganglia.
背景と目的
Parkinson’s disease(PD)は黒質緻密部ドパミン性神経細胞の変性を特徴とし、寡動や固縮などの運動症状をきたす。病初期にはドパミン補充療法の反応性は良好であるが、進行に伴い wearing off や dyskinesia といった運動合併症のみならず、全体的な薬効の低下が起こ
り、治療に難渋する。これらはドパミン神経の脱落による大脳基底核での presynaptic な
変化だけでは説明出来ず、postsynaptic あるいは extrasynaptic な変化も伴っていると考えられる。近年、大脳基底核回路に関する非ドパミン系伝達物質の関与が言われており、それらに対する PD 治療の応用が期待されている。本研究は、PD モデル動物を用いてドパミン神経の脱落後に生じる postsynaptic や extrasynaptic、さらにはネットワークレベルでの変化を解明し、PD の進行に伴って薬効が減弱していく機序や、進行期 PD の治療に
feedback できる病態生理を明らかにすることを目的とする。
材料と方法
SD rat 雌 体 重 220 ～ 250g の 片 側 medial forebrain bundle に 、 6-Hydroxydopaminehydrobromide(6-OHDA)を施注した。4 週の回復期間の後、apomorphine 0.5mg/kg を腹腔内投与して誘発される障害反対側への異常回転行動と、免疫組織化学での障害側Caudate-Putamen(CPu)における Tyrosine hydroxylase の染色性低下を併せて確認した。手術
成功例に対し、real time RT-PCR を施行し、術側と健側のドパミン D1・D2 受容体(drd 1・2)、adenosine A2A 受容体、mGluR5 受容体、CB1 受容体や proenkephalin、prodynorphin な
どの mRNA 量を対比した。
結果および考察
CPu と運動野の mRNA 発現量を検討したところ、手術側で drd2 が drd1 に比して、proenkephalin が prodynorphin に比して増加していた。これらは、大脳基底核回路が間接路優位になっている事を反映していると考えられた。CB1 受容体の mRNA は術側線条体で増加傾向を示し、A2A 受容体や mGluR5 受容体は術側の淡蒼球で増加していた。また術側運動野において Adenosine A2A 受容体の mRNA 量が増加傾向にあった。
2. List of Publications
Original Articles
1. Nakamura, S., Wate, R., Kaneko, S., Ito, H., Oki, M., Tsuge, A., Nagashima, M., Asayama,
S., Fujita, K., Nakamura, M., Maruyama, H., Kawakami, H. and Kusaka, H. An autopsy caseof sporadic amyotrophic lateral sclerosis associated with the I113T SOD1 mutation.
Neuropathology 34, 58-63, 2014. （査読あり）
2. Nakamura, M., Kaneko, S., Ito, H., Jiang, S., Fujita, K., Wate, R., Nakano, S., Fujisawa, J.
and Kusaka, H. Activation of transforming growth factor-β/Smad signaling reduces aggregate
formation of mislocalized TAR DNA-binding protein-43. Neurodegener. Dis. 11, 182-193,
2013. （査読あり）
Proceedings
1. 中村正孝・TGF-β/Smad シグナルによる TDP-43 凝集抑制効果の検討・第 54 回日本神経学会学術大会・東京・2013 年 5 月

142Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Alterations of Mirror Neurons in Patients with Schizophrenia
ミラーニューロンの形態変化：拡散テンソル画像解析による精神科治療
効果判定

P.I.

Yukiko Saito, 齊藤幸子

Affiliation

Neuropsychiatry, 精神神経科学講座

Collaborator

木下利彦, Martha Shenton

Keywords

E-mailsaitoyu@takii.kmu.ac.jp

mirror neurons, diffusion tensor imaging
ミラーニューロン、拡散テンソル画像解析

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Background and aim
The neural basis of impaired mirror neurons in schizophrenia is not completely understood The
aim of this study is to evaluate the white matter microstructure of the tracts of mirror neurons inpatients diagnosed with schizophrenia. A secondary aim is to test for an association between
measures of white matter microstructure and Social function Scale. Mirror neurons are known tocontribute to creating a sense of intimacy, and there is evidence that dysfunction of mirror neurons
may be one of the core deficits of socially isolating disorders such as autism and schizophrenia. To
the best of our knowledge, this is the first study to investigate the structural connectivity of themirror neuron system in first episode schizophrenia.
Methods
Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired on 20 patients and 20 controls. Fractional
anisotropy (FA) and Trace were measured. In this study, we evaluate the fiber tracts generatedusing an unscented Kalman filter based two-tensor tractography algorithm. This method makes it
possible to follow tracts that pass through branching and crossing regions of the brain.
申請者らが研究対象とするミラーニューロンは、この社会的認知に深い関連を有すると考えられる。ミラーニューロンは、相手の行動を自分が行動するときの回路を使って処理することで理解するという脳システムの一端を担っている。
「心の理論（theory of mind）」と関連しているとも言われ、下頭頂小葉から前運動野に投射するニューロンである。
ミラーニューロンと精神分析的精神療法は関連が深い。2005 年 Gallese らによるとミラ
ーニューロンは、フロイトが提唱してきた精神療法の現場でおこる「無意識の交流」や「投影性同一視」「共感」「転移逆転移」と関連がある。
申請者は、精神分析の第一人者である日本精神分析協会会長衣笠隆幸先生に精神分析的精神療法について毎週指導を受けながら、精神分析的精神療法を患者に実施している。一方で Harvard 大学医学部精神科 Psychiatry Neuroimaging Laboratory(精神画像研究所)と連携し、拡散テンソル画像解析を用いたミラーニューロンの描出に取り組んでいる。
平成 25 年度～26 年度は、精神分析の第一人者の指導を週に 1～2 回受けながら精神分
析的治療を患者に実施した。また、3 テスラ MRI を用いて対象患者の MRI 拡散テンソル
画像を撮像した（20 名の統合失調症患者と 16 名の強迫性障害患者、神経症 11 人、チッ
ク 1 人、健常者 33 人）。今後はミラーニューロンに関連の深い精神療法の前後で患者のミラーニューロンに変化があるか白質の微細構造を中心に調査する。現在これとは別に、ミラーニューロンに関連する統合失調症の前運動野の障害をまとめているところで、詳細は英文報告で示す。

2. List of Publications
Books
1. 齊藤幸子. 星和書店, 精神力動的視点が有効である場合はあるのか, 明日からできる
強迫症/強迫性障害の診療Ⅰ, 2015, 71-76
Proceedings
1. Saito Y, Kubicki M, Otsuka T, Asami T, Rathi Y, Pasternak O, Eckbo R, Kikinis Z, Clemm
143

2.
3.

4.

C, Koerte IK, Roppongi T, Kinoshita T, Shenton M ・ Motor related white matter
abnormalities in patients with first-episode schizophrenia・11th World Congress of BiologicalPsychiatry, 京都, 2013.6
齊藤幸子. 30 年にわたる強迫症状をもった症例について・第 59 回日本精神分析学会,
京都, 2013.11
Saito Y, Kono S, Takase K, Kurokawa H, Tanigawa N, Kinoshita T・SOCIAL COGNITIVE
IMPAIRMENTS IN SCHIZOPHRENIA : A DIFFUSION TENSOR IMAGING STUDY, 統
合失調症研究会, 東京, 2014.9
齊藤幸子. 強迫症状が消失し自発性が芽生えるまでの経過について, 第 13 回日本精
神分析的精神医学会, 高知, 2015.3

144

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Intravenous anesthetic propofol suppresses prostaglandin E2 and cysteinyl
leukotriene production and reduces edema formation in arachidonic
acid-induced ear inflammation
静脈麻酔薬プロポフォールの炎症反応に及ぼす影響

P.I.

Koh Shingu, 新宮興

Affiliation

Medical Control of Stress Response, 侵襲反応制御学（麻酔科学）講座

Collaborators

稲田武文

Keywords

intravenous anesthesia, leukotriene, propofol, prostaglandin E2 静脈麻酔、プロ
ポフォール、プロスタグランディン E2、ロイコトリエン

E-mailshingu@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Propofol is an intravenous general anesthetic widely used in the operating room for generalanesthesia and in intensive care units for sedation. In addition to its anesthetic effect, propofol isreported to have a variety of non-anesthetic effects, including anti-emesis, anti-epileptogenesis,
and oxygen radical scavenging. Also, due to its phenol-based structure, propofol has long beenthought to have an anti-inflammatory effect. Indeed, in vitro studies have indicated that propofol
suppressed prostaglandin (PG) E2 and leukotriene (LT) production; this could partially explain theobserved anti-inflammatory effect. These anti-cyclo-oxygenase (COX) and theanti-5-lipoxygenase (5-LOX) properties of propofol could have far-reaching implications inclinical settings because these enzymes are involved in neuroinflammation and cancer promotion.
Taken together, this could suggest that the use of propofol may be beneficial for surgical patients
suffering from certain kinds of neurodegenerative diseases (e.g., Alzheimer Disease, Parkinson’s
Disease), and for cancer patients undergoing tumor resection. Nevertheless, although propofol
may seem to be possibly an ideal extant anesthetic, many of its reported effects still must be
demonstrated in vivo. Specifically, the enzyme-inhibitory properties of propofol have only been
demonstrated in vitro and, as such, it remains to be seen if such effects can be directly extrapolated
to in vivo scenarios.
In the current studies, effects of propofol were tested in a murine model of arachidonic
acid-induced ear inflammation. Specifically, propofol - as a pre-treatment - was administeredintraperitoneally and then topical application of arachidonic acid was performed. After 1 hr, tissue
biopsies were collected and tested for the presence of edema and for levels of inflammatory
mediators. The results indicated that the administration of propofol significantly suppressed ear
edema formation, tissue myeloperoxidase activity, and tissue production of both prostaglandin E2
and cysteinyl leukotrienes. From the data, it can be concluded that propofol could exert anti-COX
and anti-5-LOX activities in an in vivo model and that these activities in turn could have, at leastin part, suppressed arachidonic acid-induced edema formation in the ear.
Any COX/5-LOX inhibiting activity of propofol in vivo could have profound clinicalimplications. One implication is that propofol could be beneficial in protecting patients fromneuroinflammation. Several COX and 5-LOX inhibitors have been reported to be protective, bothin vitro and in vivo against neurodegeneration associated with Alzheimer Disease and Parkinson’s
Disease. Another implication would be that propofol could play a potential role in inhibiting
cancer progression. Several studies have reported that inhibition of COX and 5-LOX pathways
resulted in reduced cancer cell proliferation and improved patient well-being. Oddly, while anumber of recent in vivo studies have shown that propofol ameliorated neuro-degeneration andretarded tumor growth, it remains unknown whether mechanisms underlying these outcomes wererelated to COX/5-LOX inhibition.
世界的に広く使用されている静脈麻酔薬であるプロポフォールには、抗酸化作用・抗炎症作用があるということは古くから知られている。我々は、プロポフォールのこれらの作用が同麻酔薬の有するプロスタグランディンおよびロイコトリエン産生抑制に少なくとも起因するのではないかという事実を突き止め、以来プロポフォールのシクロオキシゲナーゼおよび 5-リポキシゲナーゼ活性抑制作用について研究してきた。しかしながら、今までの実験結果はイン・ビトロの系で得られたものであり、実際にイン・ビボーの系でもこのプロポフォールのプロスタグランディン・ロイコトリエン産生抑制作用が再現できる
145

かどうかが続く課題の中心であった。したがって、平成 25 年度～26 年度の研究は、主として、プロポフォールのイン・ビボーにおけるシクロオキシゲナーゼおよび 5-リポキシ
ゲナーゼ活性抑制作用についての研究であった。
この目的を達成するため、マウスの耳介炎症惹起モデルを用いた。マウスにプロポフォールを投与したのち、耳介にアラキドン酸を塗布し炎症反応を起こさせた。アラキドン酸
投与一定時間後に、炎症を惹起させた耳介をサンプリングし炎症の程度を耳介の重量を測定することにより評価した。また、組織中のプロスタグランディン E2・ロイコトリエン
B4・システイニルロイコトリエン量もあわせて測定した。さらに組織に遊走した好中球数を評価するため、組織ミエロペロキシダーゼ活性も測定した。その結果、プロポフォー
ルは耳介の浮腫形成を抑制し、好中球の炎症組織への遊走を抑制し、組織中のプロスタグ
ランディン E2・システイニルロイコトリエンの産生を有意に抑制することが明らかになった。したがって、今回初めて、プロポフォールのシクロオキシゲナーゼおよび 5-リポ
キシゲナーゼ活性抑制作用が証明されたことになる。

2. List of Publications
Books
1. Inada T, Shingu K. Propofol: a dual inhibitor of cyclooxygenase and 5-lipoxygenase withpotential neuroprotective and antitumor properties. 61-79. In: Albertina Florence, editor.
Propofol:Pharmacokinetics,
MedicalUses
andPotential
HealthEffects(Pharmacology-Research, Safety Testing and Regulation) 出版社: Nova Science Pub Inc.
(2014/4/25 発行) 全 99 ページ

146

Annual Report 研究成果報告書
Studies on cell treatment for complete spinal cord injury
脊髄損傷に対する細胞治療の実験的研究

Title of Project
P.I.

Yasuyuki Kuwagata, 鍬方安行

Affiliation

Spinal cord Regeneration, 脊髄再生医学（救急医学科）

Collaborators

岩瀬正顕、中谷壽男、齊藤福樹

Keywords

BMMC, bone marrow stromal cells, cell infusion therapy, intrathecal
administration, spinal cord regeneration, spinal cord injury 脊髄損傷、脊髄再生、細胞治療、骨髄間質細胞、骨髄単核球、髄液内投与

E-mailkuwagata@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
We have reported that the intrathecal administration of cultured autologous bone marrowstromal cells (BMSC) is safe and feasible for treatment of spinal cord injury. Although the numberof stromal cells administered is multiplied by incubation, the incubation process takes days, isexpensive, and is complicated. In this trial, we studied the effect of intrathecal administration of
autologous bone marrow mononuclear cells (BMMC) without incubation for the treatment of
spinal cord injury.
Ten patients with tetraplegia or paraplegia due to spinal injury with American Spinal Injury
Association Impairment Scale (AIS) A or B on registration were included. Autologous iliac bonemarrow fluid was aspirated, centrifuged, and BMMC layer was obtained. The properties of the
BMMC were verified with surface marker analysis. Saline suspension containing 108-9 autologous
BMMC was administered into cerebrospinal fluid (CSF) by lumbar puncture. The patients wereobserved and evaluated using the International Standard Classification of Spinal Cord Injury
motor and sensory function scores for up to 6 months.
Although this study is in progress, no adverse response was observed in biochemical andradiographic examinations up to now. An AIS B tetraplegia patient who was administeredtreatment within a month after injury showed a dramatic increase in motor and sensory scores, and
his AIS improved to D. Although the main purpose of this study is to evaluate safety, thefollowing tendencies in their function were observed; earlier treatment is likely to result in better
motor score improvements. It was difficult for AIS grade A patients to improve their grade to B or
higher and for thoracic SCI patients to reflect improvements on their motor scores. This study
suggests that intrathecal administration of autologous BMMC without incubation is safe andfeasible for treatment of spinal cord injury.
従来、脊髄損傷治療に対して自家骨髄間質細胞を培養して髄液内に投与する方法で臨床試験を行い、安全で有望であることを報告してきた。培養により骨髄間質細胞は増殖する
ものの、培養には日数、複雑な操作を要し、高価につく。そこで、骨髄液から骨髄単核球を分離採取し、培養せずに髄液中に投与して脊髄損傷の治療に用いることを試みた。
American Spinal Injury Association Impairment Scale (AIS) が A あるいは B の四肢麻痺あるいは対麻痺の患者 10 例を対象とした。自己の腸骨から骨髄液を採取し、比重遠心法で自己骨髄単核球の浮遊液を得た。単核球の性状は表面マーカーで同定した。108-9 の自己骨髄単核球浮遊液を髄液中に腰椎穿刺にて投与した。患者は運動機能、感覚能の変化をInternational Standard Classification of Spinal Cord Injury motor and sensory function scores で評価し、半年まで追跡した。

2. List of Publications
Original Articles
1. Suzuki, Y., Ishikawa, N., Omae, K., Hirai, T., Ohnishi, K., Nakano, N., Nishida, H.,
Nakatani, T., Fukushima, M. and Ide, C. Bone marrow-derived mononuclear celltransplantation in spinal cord injury patients by lumbar puncture. Restor. Neurol. Neurosci.
32, 473-482, 2014. レフェリー有2. Nakano, N., Nakai, Y., Tae-Beom Seo, Homma, T., Yamada, Y., Ohta, M., Suzuki, Y.,
Nakatani, T., Fukushima, M., Hayashibe, M. and Ide, C. Effects of bone marrow stromal celltransplantation through CSF on the subacute and chronic spinal cord injury in rats. PLoS
147

One, 8, e73494, 2013.
Proceedings
1. Nakatani T, Suzuki Y, Saito F, Fukushima M, Ide C. Intrathecal administration of bonemarrow mononuclear cells for the treatment of spinal injury; a clinical trial. International
Surgical Week 2013, Helsinki(Finland), 2013 年 8 月
2. 齊藤福樹、津田雅庸、中谷壽男、鍬方安行、岩瀬正顕、 鈴木義久、井出千束、福島雅典. 脊髄損傷に対する新しい治療法--骨髄由来単核球を用いて--. 第 28 回日本救命医療学会, 久留米, 2013 年 9 月
3. Nakatani T, Suzuki Y, Saito F, Iwase M, Maeda Y, Tsuda M, Kuwagata Y, Fukushima M,
Ide C. Clinical trials for spinal injury treatment with autologous bone marrow cells
administration into cerebrospinal fluid. 7th Asian Conference on Emergency Medicine(ACEM2013), Tokyo, 2013 年 10 月
4. 岩瀬正顕、中森靖、津田雅庸、齊藤福樹、早川航一、 和田大樹、中山新士、中谷壽
男、鍬方安行、須山武裕、山原崇弘、川口琢也、淺井昭雄. 北河内圏域での頸椎頸髄損傷例の対応状況. 第 109 回近畿救急医学研究会, 京都, 2014 年 3 月
5. 岩瀬正顕、中谷壽男、中森靖、齊藤福樹、早川航一、和田大樹、鍬方安行. 脊髄損傷
搬送に関する検討. 第 28 回日本外傷学会, 東京, 2014 年 6 月

148Division of Cancer

がん部門
Stem Cell Pathology, 幹細胞病理学（病理学第一）講座
Viral Oncology, ウイルス腫瘍学（微生物学）講座
Stem Cell Biology, 幹細胞生物学（衛生学）講座
Public Health, 公衆衛生学講座
Molecular Genetics, 附属生命医学研究所 分子遺伝学部門
Model Animals, モデル動物部門
Cell Signaling, 生体情報部門
Internal Medicine 1, 内科学第一講座

150

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Dynamics of adult tissue specific stem cells by multi-color lineage tracing
method
多色細胞系譜追跡法を用いた幹細胞の維持機構の解析

P.I.

Hiroo Ueno, 上野博夫

Affiliation

Stem Cell Pathology, 幹細胞病理学（病理学第一）講座

Collaborators

熊野恵城、比舎弘子、吉田真子、厚海奈穂、田中敏弘、大町太一、大杉治之、中村尚広、田中聖道、石垣和彦

Keywords

development, regeneration, stem cell 発達、再生、幹細胞

E-mailhueno@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
To analyze the origin of, and to identify cancer stem cells within intestinal tumors, we utilized
three kinds of intestinal tumor models; (Apcmin mice, Apcmin mice injected with DSS, and C57BL6
mice injected with azoxymethane (AOM)). The tumors were successfully generated, and currently
candidate cancer stem cells were being analyzed by the multicolor lineage tracing method.
We identified long-term lingual epithelial stem cells that are located in the inter papillary pit.
They are Bmi1 positive and usually Ki67 negative. We established a method to culture lingual
epithelial stem cells in vitro. Several days after initiation of the culture, they formed sphere-shaped
organoids within matrigel.
We identified Bmi1 highly positive cells within seminiferous tubules as long term germ stem
cells.
①小腸および大腸上皮組織における悪性腫瘍に対する可溶化阻害蛋白質の効果を検討するために 3 種類（ (1)Apcmin マウス単独による方法。（腺腫モデル）(2)Apcmin マウスに
DSS を投与する方法（2nd hit モデル）(3)azoxymethane（AOM）による化学発がんモデル（自然発症がんモデル））の発がんモデルマウスを使って悪性腫瘍を発生させた。
②新たな成体幹細胞（舌上皮幹細胞）の研究を発展させるために当該組織に4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO)を投与して発がんさせるモデルを構築した。
③舌上皮幹細胞の培養法（オルガノイド培養系）を確立した。
④舌上皮幹細胞、食道上皮幹細胞を同定したのと同じ方法論にて他臓器の成体幹細胞の同定を進めている。その内の一つ精巣生殖幹細胞のマーカーを同定し論文投稿後改訂中である。このマーカーはこれまで同定されている精巣生殖幹細胞のマーカーと比べても非常に未分化な段階の生殖幹細胞にて強く発現しており、また精巣周期特異的な発現が認められるなど特徴的な発現パターンを示した。

2. List of Publications
Original Articles
1. Komai, Y., Tanaka, T., Tokuyama, Y., Yanai, H., Ohe, S., Omachi, T., Atsumi, N., Yoshida,N., Kumano, K., Hisha, H., Matsuda, T. and Ueno H. Bmi1 expression in long-term germ
stem cells. Sci. Rep. 4, Article No.6175, 2014. （レフェリー有）2. Hisha, H., Tanaka, T., Kanno, S., Tokuyama, Y., Komai, Y., Ohe, S., Yanai, H., Omachi, T.
and Ueno, H. Establishment of a Novel Lingual Organoid Culture System: Generation ofOrganoids Having Mature Keratinized Epithelium from Adult Epithelial Stem Cells. Sci.
Rep. 3, Article no.3224, 2013. （レフェリー有）3. Tanaka, T., Komai, Y., Tokuyama, Y., Yanai, H., Ohe, S., Okazaki, K. and Ueno, H.
Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells.
Nat. Cell Biol. 15, 511-518, 2013. （レフェリー有）Proceedings
1. 第 60 回日本病理学会秋期特別総会 A 演説 2014.11 沖縄 上野博夫 「マルチカラー細胞系譜追跡法による成体幹細胞の同定と癌の起原の研究」
2. 第 6 回癌・免疫若手セミナー 2014.10 大阪 上野博夫 「蛍光イメージングによる発生・幹細胞研究について」
3. 第 73 回日本癌学会学術総会 シンポジウム 2014.09 横浜 上野博夫「Identification151

of adult stem cells and analysis of the origin of malignant tumors by multicolor lineage
tracing method」
4. 第 52 回日本癌治療学会高松宮妃癌研究基金共催国際シンポジウム 2014.08 横浜
上野博夫 「Identification of adult stem cells and analysis of the origin of malignant tumors
by the multicolor lineage tracing method.」
5. 第 11 回日本病理学会カンファレンス 2014.08 神戸 上野博夫 「多色細胞系譜追跡法の幹細胞・発生研究への応用」
6. 第 16 回 Cardiovascular Metabolism and Aging Conference 2014.07 東京 上野博夫
7. 第 103 回日本病理学会総会 ランチョンセミナー 2014.04 広島 上野博夫 「マルチカラー細胞系譜追跡法による成体幹細胞の同定と解析」
8. 第 13 回日本再生医療学会総会シンポジウム 2014.03 京都 田中敏宏, 上野博夫
「舌糸状乳頭角化上皮細胞の維持・再生を担う舌上皮幹細胞の同定」
9. 国立循環器病研究センター セミナー 2014.03 大阪 上野博夫
10. 大阪市立大学大学院医学研究科分子病理学講座主催 医学研究セミナー 2013.12
大阪 上野博夫
11. 東京大学 第 64 回幹細胞治療フォーラム 2013.10 東京 上野博夫 「多色細胞系譜
追跡法による新規成体組織幹細胞の同定と機能分析」
12. 第 23 回日本サイトメトリー学会シンポジウム 2013.06 東京 上野博夫 「マルチカラー細胞系譜追跡法を用いた正常およびがん幹細胞の同定と解析」

152

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Analysis of ATL development in HTLV-1 infected humanized mouse model
HTLV-1 感染ヒト化マウスを用いた ATL 発症過程の解析

P.I.

Jun-ichi Fujisawa, 藤澤順一

Affiliation

Viral Oncology, ウイルス腫瘍学（微生物学）講座

Collaborators

竹之内徳博、田中正和、上野孝治、荀潤澤、手塚健太、姚錦春、任翊華

Keywords

E-mailfujisawa@hirakata.kmu.ac.jp

ATL, HTLV-1, NOG-SCID, humanized mice, leukemia stem cell
成人 T 細胞白血病、HTLV-1、NOG=SCID、ヒト化マウス、白血病幹細胞

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
We have established an HTLV-1-infected humanized mouse model (hu-NOG) to recapitulate
ATL development and HTLV-1-specific immunity. By using the hu-NOG system, we examinedthe efficacy of immunization against HTLV-1 infection and leukemogenesis.
We previously reported that DNA immunization of C57/BL mice with Tax expression vector
suppressed the growth of mouse lymphoma cells expressing Tax (EL4/Gax) through the activationof anti-Tax CTL. Thus, the efficacy of Tax-peptide vaccination was first examined in thesyngeneic mouse model. Both the subcutaneous and intranasal inoculations of a mixture of twelve
overlapping peptides encompassing whole Tax sequence with two different types of adjuvants, thecholera-toxin B subunit and a TLR7/8 agonist R848, suppressed the tumor growth of EL4/Gax
cells in C57/BL mice.
Subsequently, hu-NOG mice were subcutaneously or intranasally inoculated with the
Tax-peptide vaccine and then infected with HTLV-1 by the intraperitoneal injection of γ-irradiated
HTLV-1 producing Jurkat cells. While the control mice died of leukemia within eight weeks after
infection, the leukemic growth of infected lymphocytes in the vaccinated mice were retarded andtwo out of five mice stayed alive long with low rate of HTLV-1 infection.
These results suggested that the Tax-peptide vaccination induced the anti-Tax CTL leading to the
suppression of leukemic growth of HTLV-1 infected lymphocytes in the humanized mice.
Induction of long-surviving persistently infected mice after Tax immunization indicates the vitalrole of host immune system against HTLV-1 infected lymphocytes in maintaining theasymptomatic state of HTLV-1 infected carrier people. The intranasal inoculation of Tax-peptide
vaccine was found as effective as the subcutaneous injection, intranasal vaccination to other vial
proteins would be easily examined for the protective function against HTLV-1 infection.
我々はこれまでに、ヒト臍帯血由来造血幹細胞の NOG-SCID マウスへの骨髄内骨髄移
植で作製したヒト化マウスの腹腔内に HTLV-1 産生細胞株を移入し、マウス個体内のヒト
T 細胞に HTLV-1 を感染させることで ATL 様病態を再現することに成功した。
そこで、この HTLV-1 感染ヒト化マウスの系を用いて抗 HTLV-1 ワクチン投与の有効性を検討した。ヒト化マウスでの検討に先立ち、まず、我々が既に Tax DNA ワクチン投与による抗 Tax 細胞障害性 T 細胞(CTL)の誘導を介した Tax 発現マウス EL-4 T リンパ腫細胞株(EL4/Gax)の腫瘍増殖抑制を示しているマウス同種移植系を用いて、抗 Tax ペプチドワクチンの投与法およびアジュバントの評価を行った。その結果、Tax 蛋白全長(353aa)
にわたる 12 種類の 40 アミノ酸長のロングペプチド混合物をアジュバント（コレラ毒素 B
サブユニットあるいは TLR 7/8 アゴニスト R848）とともに C57/BL6 マウス皮下あるいは鼻腔にワクチン投与することで、Tax DNA ワクチンと同等の EL4/Gax 腫瘍増殖抑制効果が得たれた。次に、ヒト化マウスに対して同様のワクチンを投与した後 HTLV-1 を感染したところ、非投与マウス群は感染 8 週前後にほとんどのマウスが白血病死したのに対し、ワクチン投与マウス群においては、感染細胞の増殖が遅延し、40%(2/5)のマウスは低感染の状態を維持し長期に生存した。
以上の結果は、個体レベルでの ATL 発症制御において抗 TaxCTL が主要な役割を果たしていることを強く示唆しており、感染細胞内でのウイルスおよび宿主遺伝子の発現と宿主免疫系との相互作用の変化が ATL 発症の転機となる可能性が考えられた。

153

2. List of Publications
Original Articles
1. Tezuka, K., Xun, R., Tei, M., Ueno, T., Tanaka, M., Takenouchi, N. and Fujisawa, JI. An
animal model of adult T-cell leukemia: humanized mice with HTLV-1-specific immunity.
Blood 123, 346-355, 2014. [査読有]2. Ikebe, E., Kawaguchi, A., Tezuka, K., Taguchi, S., Hirose, S., Matsumoto, T., Mitsui, T.,
Senba, K., Nishizono, A., Hori, M., Hasegawa, H., Yamada, Y., Ueno, T., Tanaka, Y., Sawa,
H., Hall, A., Minami, Y., Jeang, K-T., Ogata, M., Morishita, K., Hasegawa, H., Fujisawa, JI.
and Iha, H. Oral administration of an HSP90 inhibitor, 17-DMAG, intervenes tumor-cell
infiltration to multiple organs and improves survival period for ATL model mice. Blood
Cancer J. 3, Article No.e132, 2013. [査読有]3. Tezuka, K., Tei, M., Ueno, T., Xun, R. and Fujisawa, JI. Carrier model of HTLV-1 infection
in humanized NOG mice. Retrovirology 11, P42, 2014. [査読無]4. Tezuka, K., Tei, M., Ueno, T., Xun, R., Iha, H. and Fujisawa, JI. Inhibition of ATL
development in humanized mouse model by AZT/INF treatment. Retrovirology 11, P43,
2014. [査読無]5. Ikebe, E., Kawaguchi, A., Tezuka, K., Taguchi, S., Hirose, S., Matsumoto, T., Mitsui, T.,
Senba, K., Nishizono, A., Hori, M., Hasegawa, H., Yamada, Y., Ueno, T., Tanaka, Y., Sawa,
H., Hall, W., Minami, Y., Jeang, K-T., Ogata, M., Morishita, K., Hasegawa, H., Fujisawa, JI.
and Iha, H. A novel HSP90 inhibitor, 17-DMAG, induces Tax down-regulation and its oral
administration to ATL-model mice intervenes against the infiltration property of the ATL-like
lymphocytes and provides extended survival period. Retrovirology 11, 44, 2014. [査読無]6. ATL マウスモデルの樹立とその新知見 藤澤順一, 血液内科 69(3): 394-399, 2014
[査読無]7. HTLV-1 感染の動物モデル 藤澤順一, 細胞 46(6): 12-19, 2014 [査読無]Proceedings
1. Tezuka, K., Tei, M., Ueno, T., Xun, R. and Fujisawa, J-I. Carrier model of HTLV-1 infection
in humanized NOG mice. 16th International Conference on Human Retroviruses: HTLV and
Related Viruses, Montreal, Canada. 27 June 2013
2. Tezuka, K., Tei, M., Ueno, T., Xun, R., Iha, H., Fujisawa, J-i. Inhibition of ATL developmentin humanized mouse model by AZT/INF treatment. 16th International Conference on Human
Retroviruses: HTLV and Related Viruses, Montreal, Canada. 27 June 2013
3. Ueno, T., Xun, R., Saito, M., Tezuka, K., Tanaka, Y. and Fujisawa, J-i. Altered pattern in viralmRNA expression of Iranian type HTLV-1 leading to enhanced viral expression. 16th
International Conference on Human Retroviruses: HTLV and Related Viruses, Montreal,
Canada. 27 June 2013
4. Ikebe, E., Kawaguchi, A., Tezuka, K., Taguchi, S., Hirose, S., Matsumoto, T., Mitsui, T.,
Senba, K., Nishizono, A., Hori, M., Hasegawa, H., Yamada, Y., Ueno, T., Tanaka, Y., Sawa,
H., Hall, W., Minami, Y., Jeang, K-T., Ogata, M., Morishita, K., Hasegawa, H., Fujisawa, J-i.
and Iha, H. A novel HSP90 inhibitor, 17-DMAG, induces Tax down-regulation and its oral
administration to ATL-model mice intervenes against the infiltration property of the ATL-like
lymphocytes and provides extended survival period. 16th International Conference on
Human Retroviruses: HTLV and Related Viruses, Montreal, Canada. 27 June 2013
5. Tezuka, K., Ikebe, E., Iha, H., Ueno, T., Xun, R., Fujisawa, J-i. Inhibition of ATL
development by HSP90 inhibitor 17-DMAG in humanized mouse model. 第 72 回日本癌学会学術総会、2013.10. 3. 横浜
6. 田中正和：ヒト化マウスを用いたHTLV-1感染モデル 第156回日本獣医学会学術集会
関連集会 獣医解剖サテライトフォーラム、2013.9.19. 岐阜
7. 荀潤澤、上野孝治、齊藤峰輝、手塚健太、田中勇悦、 藤澤順一：Altered pattern in viralmRNA expression of Iranian type HTLV-1 leading to enhanced viral production. 第 66 回日
本細菌学会関西支部総会・学術講演会、2013.11.16 大阪
154

伊波英克、池辺詠美、川口晶、手塚健太、田口慎也、廣瀬仁志,、西園晃、堀光雄、 長
谷川寛雄、山田恭暉、上野孝治、田中勇悦、澤洋文、Hall Wiliam W、 南康文、Jeang
Kuan-The、緒方正男、森下和広、長谷川秀樹、藤澤順一. Oral administration of an HSP90
inhibitor, 17-DMAG, intervenes tumor-cell infiltration into multiple organs and improves
survival period for ATL model mice. 第36回日本分子生物学会年会、 2013.12.5. 神戸
9. 田中正和、李成一、荀潤澤、姚錦春、藤澤順一：ヒト化マウスを用いた HTLV-1 感染
防御ワクチンの開発 第 1 回日本 HTLV-1 学会学術集会、2014. 8. 23. 東京
10. Fujisawa, J-i., Tanaka, M., Ueno, T., Xun, R., Yao, J. and Lee, S-il. Mouse model of ATL 第
73 回日本癌学会学術総会、2014. 9. 25. 横浜
11. Tanaka, M., Lee, S-il, Xun, R., Yao, J., Fujisawa, J-i. Long peptides vaccine to Tax
suppressed the overgrowth of HTLV-1-infected lymphocytes in humanized mouse model. 第73 回日本癌学会学術総会、2014. 9. 25. 横浜
12. 田中正和、李成一、荀潤澤、姚錦春、藤澤順一：Tax ペプチドワクチンのヒト化マウ
ス鼻腔投与による HTLV-1 感染抑制 第 62 回日本ウイルス学会学術集会、2014. 11. 11.
横浜
8.

155

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Identification of embryonic stem cell-like tissue committed stem cells andelucidation of their differentiation pathway: An application to cell therapy andregenerative medicine
ES 細胞様組織幹細胞の同定と分化経路の解明：細胞移植・再生医療への応用

P.I.

Yoshiaki Sonoda, 薗田精昭

Affiliation

Stem Cell Biology, 幹細胞生物学（衛生学）講座

E-mailsonoda@hirakata.kmu.ac.jp

佐々木豊、藤岡龍哉、松岡由和、中塚隆介、岩城隆二、高橋昌也、河村Collaborators

Keywords

孟
ES cells, regenerative medicine, tissue stem cells, VSEL
ES 細胞、再生医療、組織幹細胞、VSEL

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Identification of murine bone-derived small cells and their cell characterization
Murine bone marrow (BM)-derived very small embryonic-like (VSEL) stem cells (BMVSELs), defined by lineage-negative (Lin-), CD45-negative (CD45-), Sca-1-positive (Sca-1+)
immuno-phenotype, were reported as postnatal pluripotent stem cells. We developed a highly
efficient method for isolating VSEL-resembling cells using enzymatic treatment of murine bone.
We designated these cells as bone-derived small cells (BDSCs). The incidences of VSELs in the
BM-derived nucleated cells (BMNCs) and that of BDSCs in BDNCs were 0.001% and 0.1%,
respectively. These BDSCs expressed variety of hematopoietic stem cell (HSC), mesencymal stem
cell (MSC) and endothelial cell markers. The gene expression profile of the BDSCs was clearly
distinct from those of HSCs, MSCs, and embryonic stem cells. At the steady state, BDSCs slowly
proliferated, however, the numbers of BDSCs significantly increased in the bone after acute liver
injury. Moreover, GFP-mouse derived BDSCs transplanted via tail vein injection after acute liver
injury were detected in the liver parenchyma. Immuno-histological analysis suggested that these
BDSCs trans-differentiated into hepatocytes. The present study demonstrated that the majority of
the Lin-CD45-Sca-1+ VSEL-phenotypic cells reside in the bone tissue instead of BM. However, theimmuno-phenotype and the gene expression profile of BDSCs were different from those of BM
VSELs. Further studies will therefore be required to elucidate their stem cell characteristics and thepotential relationship between BDSCs and BM VSELs.
Establishment of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells and theirfunctional characterization
Hematopoietic stem cells (HSCs) are maintained in a specialized bone marrow (BM) niche,
which consists of osteoblasts, endothelial cells and a variety of mesenchymal stem/stromal cells(MSCs). However, precisely what types of MSCs support human HSCs in the BM remain to beelucidated because of their heterogeneity. In this study, we succeeded in prospectively
isolating/establishing three types of MSCs from human BM-derived lineage- and CD45-negative
cells, according to their cell surface expression of CD271 and stage-specific embryonic antigen(SSEA)-4. Among them, the MSCs established from the Lineage-CD45-CD271+SSEA-4+ fraction(DP MSC) could differentiate into osteoblasts and chondrocytes, but they lacked adipogenic
differentiation potential. The DP MSCs expressed significantly higher levels of well-characterized
HSC-supportive genes, including IGF-2, Wnt3a, Jagged1, TGFβ3, nestin, CXCL12, and Foxc1,compared with other MSCs. Interestingly, these osteo-chondrogenic DP MSCs possessed theability to support cord blood-derived primitive human CD34-negative severe combined
immunodeficiency (SCID)-repopulating cells. The HSC-supportive actions of DP MSCs werepartially carried out by soluble factors, including IGF-2, Wnt3a and Jagged1. Moreover, contact
between DP MSCs and CD34-positive (CD34+) as well as CD34-negative (CD34-) HSCs wasimportant for the support/maintenance of the CD34+/- HSCs in vitro. These data suggest that DP
MSCs might play an important role in the maintenance of human primitive HSCs in the BM niche.
Therefore, the establishment of DP MSCs provides a new tool for the elucidation of the human
HSC/niche interaction in vitro as well as in vivo.
1） マウス骨質由来微小（幹）細胞の同定とその細胞特性の解明
156

三胚葉系に分化可能な多能性組織幹細胞が生体組織中に存在するという報告はこれま
でにいくつか発表されている。この内、Ratajczak らはマウス骨髄内に微小な多能性組織
幹細胞 (Very Small Embryonic-Like cell, VSEL) の存在を報告している。我々は、微小細胞の幹細胞性を確かめるため、マウス骨質から VSEL 様の細胞（骨質由来微小細胞、Bone-Derived Small Cell, BDSC）を効率良く分離する方法を開発し、分離された BDSC の幹細胞性を検証した。
B6 マウス脛骨を分離し、骨髄をフラッシュアウトした残りの骨を Collagenase と Dispaseを含む酵素液にて処理し、骨質由来細胞を分離した。骨質由来細胞に含まれる BDSC の解析と分取はフローサイトメーター (FACSCanto II) とセルソーター (FACSAria I) を用い行った。BDSC は、FCM 解析、Realtime-PCR、イメージングサイトメーター (ImageStreamX
markII) 解析、培養実験、増殖活性試験、四塩化炭素投与による一過性肝障害モデルマウ
スへの移植実験の各実験を行い、幹細胞性の検証を行った。
VSEL と同様の表面免疫特性 (Lin-CD45-Sca-1+) を示す BDSC は、小型（直径 6～9μm）
で核比の高い細胞であった。表面抗原解析および遺伝子発現解析の結果、BDSC は既知の組織幹細胞（間葉系幹細胞、造血幹細胞）や ES 細胞とは異なる細胞特性を示した。一方、
BDSC では、多能性幹細胞マーカー（Oct4、Nanog など）を発現していなかった。BDSC
は生体内で増殖しており、骨中の BDSC のおよそ 4 分の 1 が生体内で恒常的に増殖していることが示唆された。また、BDSC は血球細胞の培養系でごく一部が増殖し、血球系マーカーの発現が認められた。四塩化炭素投与による急性肝障害モデルマウスでは、骨中のBDSC 数が有意に増加し、末梢中に遊走する可能性が示唆された。
GFP マウス由来の BDSC
を四塩化炭素投与後のマウスへ移植した結果、移植後 3 週後のマウス肝臓中に GFP 陽性細胞が認められ、肝細胞への分化転換が示唆された。
BDSC は既報の VSEL と類似点があるものの、VSEL で報告されているような多能性幹細胞マーカーを発現していないことが明らかとなった。また、肝障害モデルにおいて、
BDSC は障害肝臓内で細胞融合、あるいは分化転換している可能性が示唆された。しかし、
BDSC が何らかの組織幹/前駆細胞である可能性についてはさらなる検討が必要と考えられた（投稿準備中）。
2）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の樹立とその機能解析
造血幹細胞(HSC)は、骨髄内微小環境（ニッチ）においてその未分化性を維持している。
近年、マウスにおいては、骨芽細胞(Nature 425:778, 2003)、血管内皮細胞(Cell 121:1109,
2005)、nestin 陽性間葉系幹細胞(MSC) (Nature 466:829, 2010)および CXCL12-abundant
reticular (CAR) cells (Immunity 25:977, 2008)などの間質細胞が、ニッチとして働くことが報告されている。しかしながら、ヒトにおいては、どのような細胞が、どのような機構でHSC を支持しているかは明らかになっていない。そこで、本研究は、ヒト骨髄ニッチ細胞の予期的分離と、その HSC 支持機構の解明を目的として行った。
最初に、ヒト骨髄 CD45-Lin-分画を CD271 と SSEA-4 の発現により CD271+/-SSEA-4+/分画に亜分画し MSC の樹立を試みた。次いで、得られた各 MSC とヒト臍帯血由来 CD34HSC を 1 週間共培養した。その後、NOG マウスに骨髄内直接移植法により移植し、各MSC の in vitro における HSC 支持能を比較した。具体的には、移植後 20 週目にマウス骨髄および末梢血を回収し、ヒト CD45 陽性細胞の生着率を各 MSC との共培養群および
CD34- HSC 単独培養群間で比較、解析した。最後に、各 MSC 間で、HSC 支持因子の発現を比較することにより、ヒトニッチ細胞によるヒト HSC 支持機構の解析を行った。
ヒ ト 骨 髄 CD45-Lin-CD271+/-SSEA-4+/- 分 画 よ り FACS に て 細 胞 を 分 取 し た 結 果 、CD271-SSEA-4+分画を除く 3 分画より、10 代以上継代可能な MSC を得た。CD34- HSC と各 MSC との共培養における HSC 支持能を検討した結果、マウス骨髄中におけるヒト CD45
陽性細胞の生着率は、移植部位において、CD34- HSC 単独培養群と比較し、全ての MSC共培養群で有意に高値を示した。一方で、移植部位以外の骨髄および末梢血では、
CD271+SSEA-4+ 分画より樹立した MSC (DP MSC)との共培養群でのみ CD34- HSC 単独培養群と比較し、有意に高いヒト CD45 陽性細胞の生着が認められた。このことから、DPMSC は、他の MSC と比較し、最も高いヒト HSC 支持能を有することが示唆された。そこで、DP MSC と他の MSC 間における HSC 支持因子の発現の差を real time RT-PCR により解析した。その結果、DP MSC は他の MSC と比較し、IGF-2、Wnt3a、Jagged1、TGFβ3を優位に高く発現していた。これら因子のヒト CD34- HSC に対する支持効果を in vitro で157

検討した。その結果、IGF-2 および Jagged1 は CD34- HSCs からの CD34+細胞の産生を優位に促進することが明らかとなった(Stem Cells, 33:1554, 2015)。
今回の検討の結果、DP MSC はヒト骨髄ニッチにおいてヒト HSC の支持に重要である
可能性が示唆された。また、ヒト骨髄 MSC による HSC 支持は複数の因子により行われていることが明らかとなった。今後、検討を行うことにより、ヒト HSC 支持機構のさらなる解明を進める予定である。

2. List of Publications
Original Articles
1. Matsuoka, Y., Nakatsuka, R., Sumide, K., Kawamura, H., Takahashi, M., Fujioka, T., Uemura,Y., Asano, H., Sasaki, Y., Inoue, M., Ogawa, H., Takahashi, T., Hino, M. and Sonoda, Y.
Prospectively Isolated Human Bone marrow Cell-Derived MSCs Support Primitive Human
CD34-Negative Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells 33, 1554-1565, 2015. 査読有
2. Nakatsuka, R., Matsuoka, Y., Uemura, Y., Sumide, K., Iwaki, R., Takahashi, M., Fujioka, T.,
Sasaki, Y. and Sonoda, Y. Mouse dental pulp stem cells support human umbilical cord
blood-derived hematopoietic stem/progenitor cells in vitro. Cell Transplant 24, 97-113, 2015.
査読有
Books
1. Sonoda Y: Human CD34-negative hematopoietic stem cells. “Adult Stem Cell Therapies :Alternatives to Plasticity”. Humana Press, Springer, Berlin, pp.53-77, 2014.
Proceedings
1. 中塚隆介、松岡由和、角出啓輔、河村孟、藤岡龍哉、佐々木豊、薗田精昭：マウス骨質由来微小細胞の幹細胞性の検証。第 14 回日本再生医療学会総会、2015.3.21. 横浜
2. 松岡由和、角出啓輔、河村孟、中塚隆介、藤岡龍哉、佐々木豊、薗田精昭：ヒト造血幹細胞支持能を有するヒト骨髄間質細胞の予期的分離とその機能解析。第 14 回日本再生医療学会総会、2015.3.20. 横浜
3. 薗田精昭：ヒト造血幹細胞―その特性はどこまで解明されたのかー。第 37 回日本造血細胞移植学会総会、教育講演、2015.3.6.神戸
4. 薗田精昭：ヒト造血幹細胞の純化と階層制の解明。第 24 回日本サイトメトリー学会学術集会、特別講演、2014.6.29. 大阪
5. 中塚隆介、岩城隆二、松岡由和、角出啓輔、藤岡龍哉、佐々木豊、薗田精昭：マウス
骨質由来微小細胞の幹細胞性の検証と VSEL との比較検討。第 24 回日本サイトメトリ
ー学会学術集会、2014.6.28. 大阪
6. 薗田精昭：ヒト造血幹細胞の純化と階層制の解明。第 2 回奈良県輸血・造血細胞治療研究会、特別講演、2014.6.7. 大阪
7. Nakatsuka R, Iwaki R, Matsuoka Y, Sumide K, Fujioka T, Sasaki Y, Sonoda Y. Evaluation ofStem Cell Characteristics of Murine Bone-derived Small Cells. The 12th Stem Cell Research
Symposium, 2014.5.30. 福岡
8. 中塚隆介、松岡由和、角出啓輔、岩城隆二、高橋雅也、藤岡龍哉、佐々木豊、薗田精
昭：マウス切歯由来 Sca-1, PDGFRα 陽性歯髄幹細胞はヒト臍帯血由来造血幹細胞支持能を有する。第 13 回日本再生医療学会総会、2014.3.5. 京都
9. 松岡由和、薗田精昭：ヒト造血幹細胞支持能を有するヒト骨髄由来間葉系幹細胞の予期的分離とその機能解析。第 23 回日本サイトメトリー学会学術集会、シンポジウム、
2013.6.22. 東京
10. Iwaki R, Nakatsuka R, Matsuoka Y, Takahashi M, Fujioka T, Sasaki Y, Sonoda Y.
Development of a highly efficient method for isolating bone-derived small stem cells identified
in adult mouse bone. The 11th Stem Cell Research Symposium, 2013.5.17. 東京

158

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Functional analysis of overexpressing genes in tissue stem cells and relationshipwith cancer stem cells
組織幹細胞に高発現する遺伝子の機能解析とがん幹細胞との共通性の検討

P.I.

Seiji Kanda, 神田靖士

Affiliation

Public Health, 公衆衛生学講座

Collaborators

西山利正、下埜敬紀、岡崎はるか、王澤蘊Keywords

E-mailkandas@hirakata.kmu.ac.jp

cancer stem cell, pituitary, side population cells, tissue stem cell
組織幹細胞、SP cells, がん幹細胞、下垂体

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
We focused on the tissue stem cells in pituitary and auditory pathway. In our previous study, we
identified the tissue stem/progenitor cells in pituitary gland and cochlear nuclei of auditory
pathway in vivo. In this study, we tried to characterized these tissue stem/progenitor cells andanalyze the gene expression.
Pituitary stem cells: Last year, we showed that the up-regulated genes in SP cells were included
some specific markers of stem cells, Bcrp1 and Sca-1 etc. including an oncogene with microarray.
In order to characterize these genes’ function, we tried to clone these genes and subclone into themammalian expression vector that can control the expression of interested genes by adding
tetracycline to the culture medium. These plasmid clones were transfected to mouse iPS cells by
lipofection method. Now we tried to study the ability of differentiate and maintenance of
stemness in transfected iPS cells at several different concentrations of tetracycline in vitro. In
addition we tried to construct the new system of gene expression using viral vector instead of thatof plasmid vector and also construct the vectors that have different promoter to induce the protein
expression in mouse iPS cells.
Stem cells in Auditory pathway: In this study, we tried to identify and characterize the tissue
stem cells in the inferior colliculi (IC) which passes and integrates sound information first in thecenter auditory neural pathway. We paid attention to Prominin-1 (CD133) antigen with reports
as a marker of stem cells and tried to concentrate the tissue stem cells of IC using magnetic beads
with Prominin-1 (CD133) antibody. In the results, the population of Prominin-1 positive cells ofnewborn 1week mice was significantly higher than that of 3weeks mice by q-PCR. Furthermore,
the activity of spheroid formation of Prominin-1 positive IC cells derived from postnatal 1week
newborn mice was significantly higher than that of unsorted or Prominin-1 negative cells. By
immunohistochemistry, Prominin-1 positive cells were detected from newborn 1week mice andco-localization with SOX2 that is marker of stem cells was detected. The positive cells of SOX2
and Nestin, marker of neural stem/progenitor cells, were detected in spheres formed from single
cell of IC cells by immunocytochemistry and these cells could differentiated into both neurons andglia cells by the induction of differentiation. Therefore, the tissue stem or progenitor cells areexisted in IC of newborn mice and can differentiate into neurons and glia cells.
下垂体幹細胞の特徴付けと癌幹細胞との関連の検討
昨年度までに、下垂体幹細胞を SP 細胞を指標として単離しマイクロアレイにより発現遺伝子を探索した結果、Oncogene を含む数種類の SP 細胞に高発現する遺伝子を数種類見いだした。そこでこれらの遺伝子の機能を解析する目的でまずこれらの遺伝子をクローニングし、テトラサイクリン存在下で発現調節可能な発現ベクターにサブクローニングした。これらのプラスミドをリポフェクション法でマウス iPS 細胞に遺伝子導入した。現在、共同研究先から下垂体組織構築の立体培養法を習熟し、さらに遺伝子の発現時期を調整することでそれぞれの遺伝子の分化誘導能及び未分化維持能などの検討をする予定である。

159

聴覚伝導路における組織幹細胞の同定と特徴付け
今回の研究では、中枢聴覚伝導路のなかでもすべての上行聴覚情報が経由し音情報を最初に統合する重要な核である下丘において、幹細胞のマーカーとして報告がある
Prominin-1 (CD133) 抗原に注目し、新生仔マウスの下丘における神経幹/前駆細胞を濃縮、分離し、遺伝子発現や分化能を検討する事を目的とした。Prominin-1 の発現を q-PCR を用いて検討したところ生後 1 週未満の下丘における発現が 3 週以降と比較して有意に高い事が示された。
新生仔マウス下丘から取得した Prominin-1 陽性細胞の割合は成体に比し有意に高く、更に Prominin-1 陽性細胞の sphere 形成能を検討したところ、新生仔において、unsorted cells、Prominin-1 陰性細胞から形成されたものより有意に多い事が分かった。免
疫染色により、新生仔マウス下丘の Promiin-1 陽性細胞に幹細胞マーカーである SOX2 が共発現しており、Prominin-1 陽性細胞から形成された sphere に SOX2、神経幹前駆細胞のマーカーである Nestin の発現を認め、分化誘導することにより神経、グリアへ分化する事を示した。

2. List of Publications
Original Articles
1. Hosomi, R., Fukunaga, K., Arai, H., Kanda, S., Nishiyama, T. and Yoshida, M. Effect of
porcine hemoglobin on serum lipid content and fecal lipid excretion inrats. J. med. food, 17,302-309, 2014. レフェリー有2. Hosomi, R., Fukunaga, K., Arai, H., Kanda, S., Nishiyama, T. and Yoshida, M. Effect of
combination of dietary fish protein and fish oil on lipid metabolism in rats. J. Food Sci.
Technol. 50, 266-274, 2013. レフェリー有3. 大隅泰則, 八木正夫, 柴田清児ブル－ス, 神田靖士, 朝子幹也, 河本光平, 栗山博道,
西山利正, 友田幸一, 山下敏夫. 下丘における加齢にともなう GluN1 遺伝子の発現制
御 耳鼻咽喉科ニューロサイエンス レフェリー有 Vol.27 2013.4 P.25-29
4. 岡崎はるか、神田靖士、下埜敬紀、王澤蘊、西山利正、友田幸一 マウス下丘からの神経幹細胞の分離と発現遺伝子の解析 耳鼻咽喉科ニューロサイエンス レフェリー
有 28 巻 2014.04 P31-34
Proceedings
1. Fukunaga K, Hosomi R, Arai H, Kanda S, Nishiyama T, Yoshida M. Dietary Hemoglobin
Reduce Serum and Liver Cholesterol Contents and Increase Fecal Fatty Acids, Cholesterol,and Bile Acids in Rats. 104th American Oil Chemists' Society Annual Meeting & Expo, p.1
Canada 2013.4
2. Mishima N, Yoshikawa M, Shimono T, Nakatani I, Ishizaki H, Miyake M, Kanda S,
Nishiyama T. A Comparative Study on Efficacy of Purified Chick Embryo Cell Rabies
Vaccine (Rabipur®) as a Pre-exposure Prophylaxis for the Japanese, Administering threedoses on days 0, 7, 21 or 28 and three doses on days 0, 30, 180 The 13th Conference of theInternational Society of Travel Medicine, ポスター, オランダ 2013.5.
3. 岡崎はるか, 神田靖士, 下埜敬紀, 王澤薀, 西山利正, 友田幸一 マウス下丘からの神経幹細胞の分離と発現遺伝子の解析 第 31 回耳鼻咽喉科ニューロサイエンス研究会
大阪, 2013.8.24.
4. Phommanivong V, Kanda S, Shimono T, Lamaningao P, Waleluma Darcy A, Mishima N,
Nakatani I, Somphou P, Bilangkoun S, Nishiyama T. Molecular characterization andphylogenetic analysis of dengue viruses during an outbreak, July to August, 2013 in Lao
PDR. 第 36 回日本分子生物学会, ポスター, 神戸, 2013.12.3-6
5. 岡崎はるか、神田靖士、下埜敬紀、王澤蘊、西山利正、友田幸一 マウス下丘由来神
経 幹 / 前 駆 細 胞 の 性 格 付 け と 分 化 誘 導 の 検 討 第 13 回 日 本 再 生 医 療 学 会 総 会
2014.3.4-6 日本再生医療学会雑誌, 13, 316, Suppl 2014160

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Molecular mechanism of lymphocyte trafficking
リンパ節のホーミングの分子機構に関する研究

P.I.

Tatsuo Kinashi, 木梨達雄

Affiliation

Molecular Genetics, 附属生命医学研究所 分子遺伝学部門

Collaborators

片貝智哉、植田祥啓、近藤直幸、喜多俊行、福原貴太郎、安田鐘樹

Keywords

E-mailkinashi@hirakata.kmu.ac.jp

antigen receptor, cell migration, chemokine, integrin
抗原受容体、細胞移動、ケモカイン、インテグリン

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Regulation of T-cell trafficking play important roles in its development, maturation, antigen
responses, and homing. Within peripheral lymph nodes, T cells migrate rapidly and stop when
encountered cognate antigen. Interstitial motility of T cells are regulated in part through LFA-1
and ICAM-1. Using tissue slices of the lymph nodes (LN), which reproduced the dynamic
migration of lymphocyte in vivo, inhibition of LFA-1/ICAM-1 abolished high-velocity andrelatively straight movement of T cells. T cells migrate through intricate networks composed ofstromal cells and dendritic cells, both of with express ICAM-1. Using bone marrow chimera, wefound that ICAM-1 on dendritic cells but not stromal cells was responsible for the high-velocity
migration. When encountered cognate antigen, T cells stop and adhere to antigen presenting
dendritic cells. Using intravital two-photon microscopy, we found that ICAM-1 and Rap1effector
Mst1 are required for rapid deceleration upon encounter of cognate antigen presented on dendritic
cells, leading to immunological synapse (IS) formation. Mst1 deficient T cells was unable toadhere APC stably.
On supported lipid bilayer displaying peptide-MHC and ICAM-1, wild-type T cells exhibited aring of LFA-1/ICAM-1 with the central TCR/peptide-MHC cluster. In contrast, Mst1-deficientnaive T cells showed defective IS with diffuse pMHC and ICAM-1, suggesting the impairment of
IS formation results in defective antigen stopping in vivo. To clarify the role of Mst1 in IS
formation, we set up a single-molecule experiment, which allows us to measure lifetime of LFA-1
and ICAM-1 bindings in IS. We found that the majority of LFA-1 and ICAM-1 binding time wereshort (<1 sec), which occurred broadly in pSMAC. In contrast, the minor long lifetime binding(>20 sec) occurred in close proximity to cSMAC, which was abolished in Mst1 or Rap1b deficient
T cells. Talin1 and kindlin3 play critical roles for LFA-1 adhesiveness through binding β2cytoplasmic regions. Both talin 1 and kindling 3 were localized in pSMAC area in normal T cell
IS. Kindlin3 tended to accumulate in pSMAC in close proximity to cSMAC. While talin1 wasnormally present in pSMAC, kindlin3 was mislocalized in the distal pole of Mst1 deficient T cells.
These results suggest that Mst1 is required for high-affinity LFA-1 through kindlin3 that support
IS formation. Thus, Mst1 deficiency impairs immunological synapse formation essential for
antigen-recognition.
T 細胞の動態調節はその分化・成熟、抗原認識やホーミングに重要な役割をはたしている。リンパ節内では T 細胞は高速で移動し、抗原に遭遇すると停止する。リンパ節スラ
イス法による 2 光子イメージングによって T 細胞の高速移動は LFA-1/ICAM-1 を介していることを抗体による阻害実験によって明らかにした。リンパ節実質はストローマ細胞や樹状細胞による緻密なネットワークが形成されており、これらの細胞は ICAM-1 を発現している。骨髄移植の実験から T 細胞の高速移動に必要なのはストローマ細胞ではなく、樹状細胞の ICAM-1 であることが判明した。特異抗原投与によるリンパ節内 T 細胞停止接着の 2 光子ライブイメージング系を樹立し、抗原による停止には ICAM-1 と Rap1 エフェク
ターである Mst1 が必要であることが判明した。抗原特異的接着構造である免疫シナプスを人工脂質二重膜に peptide/MHC と ICAM-1 を用いて再現したところ、正常では pMHC
161

クラスター (cSMAC) を LFA-1/ICAM-1 がリング状 (pSMAC) に取り囲む構造を示すが、Mst1 欠損 T 細胞では瀰漫性の分布を示し、免疫シナプスが障害されていた。このため、抗原特異的停止が in vivo で起こらなかったと考えられる。さらに Mst1 欠損でおこる異常を詳細に調べるため、免疫シナプスにおける LFA-1/ICAM-1 結合の一分子解析系を樹立した。解析の結果、LFA-1/ICAM-1 結合は pSMAC 領域で起こり、大部分は１秒以下であっ
たが、低頻度であるが長期結合が cSMAC の近傍で観察された。Mst1 欠損あるいは Rap1b
欠損 T 細胞では長期結合が著しく低下していた。これらの細胞では talin1 は pSMAC 領域に存在するのに対して kindlin3 が接着面の対極に分布する異常を示した。これらの結果から Mst1 は kindlin3 を介する高親和性 LFA-1 の形成に必要であることが示された。

2. List of Publications
Original Articles
1. Katakai, T., Kondo, N., Ueda, Y. and Kinashi, T. Autotaxin Produced by Stromal Cells
Promotes LFA-1-Independent and Rho-Dependent Interstitial T Cell Motility in the Lymph
Node Paracortex. J. Immunol. 193, 617-626, 2014.（レフェリー有）2. Nishikimi, A., Ishihara, S., Ozawa, M., Etoh, K., Fukuda, M., Kinashi, T. and Katagiri, K.
Rab13 acts downstream of the kinase Mst1 to deliver the integrin LFA-1 to the cell surface
for lymphocyte trafficking. Sci. Signal. 7, ra72 2014.（レフェリー有）
3. Nakamura, T., Yasuda, S., Nagai, H., Koinuma, S., Morishita, S., Goto, A., Kinashi, T. and
Wada, N. Longest neurite-specific activation of Rap1B in hippocampal neurons contributes topolarity formation through RalA and Nore1A in addition to PI3-kinase. Genes Cells 18,
1020-1031. 2013.（レフェリー有）4. Yamamoto-Taguchi, N., Satou, Y., Miyazato, P., Ohshima, K., Nakagawa, M., Katagiri, K.,
Kinashi, T., Matsuoka, M. HTLV-1 bZIP Factor Induces Inflammation through Labile Foxp3
Expression. PLoS Pathog. 9, e1003630, 2013.
5. Tomiyama, T., Ueda, Y., Katakai, T., Kondo, N., Okazaki, K. and Kinashi, T. Antigen-specificsuppression and immunological synapse formation by regulatory T cells require the mst1
kinase. PLoS One 8, e73874, 2013.（レフェリー有）6. Katakai, T., Habiro, K. and Kinashi, T. Dendritic Cells Regulate High-Speed Interstitial T
Cell Migration in the Lymph Node via LFA-1/ICAM-1. J. Immunol. 191, 1188-1199, 2013.
（レフェリー有）7. Chung, C., Kim, T., Kim, M., Kim, M., Song, H., Kim, T.S., Seo, E., Lee, SH., Kim, H., Kim,
SK., Yoo, G., Lee, D.H., Hwang, D.S., Kinashi, T., Kim, J.M. and Lim, DS. Hippo-Foxa2
signaling pathway plays a role in peripheral lung maturation and surfactant homeostasis.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 7732-7737, 2013.
Books
1. 片貝智哉, 木梨達雄, リンパ球の高速移動を制御するリンパ節組織支持細胞ネットワーク, 細胞工学, 33:6(602-608) 2014
2. 木梨達雄, 免疫細胞と Hippo Pathway, 医学のあゆみ, Vol.251, No.5 455-461 2014
3. 石井優 編, 生体イメージング研究 Update, 光が描く 免疫・がん・神経系の時空間
動態, PP.50-62, 2014 年, 南山出版
Proceedings
1. Kinashi T., Kondo N. Single-Molecule Analysis of LFA-1/ICAM-1 Binding in Lymphocyte.
Biophysical Society 58th Annual Meeting. The Moscone Center, San Francisco USA. 15th－
19th Feb, 2014.
2. Kinashi T., Katakai T., Ueda Y., Kondo N. Regulation of lymphocyte migration andimmunological synapse formation through Rap1 signaling. 九州大学生体防御医学研究所
国際シンポジウム"Recent Advances in Immunology and Inflammation 2014" 11/7-11/8,
Fukuoka
3. Kinashi T., Ueda Y., Kondo N. Visualization of thymocyte trafficking and selection
processes: the importance of Rap1 signaling and integrins, International Symposium on
Multi-dimensional Fluorescence Live Imaging of Cellular Functions and Molecular
Activities, Jan 26th－28th, 2015、Kyoto.
4. Ueda Y., Kondo N.,Ozawa M., and Kinashi T. Visualization of Rap1 activation during
thymocyte development within the thymic tissues by 2-photon microscopy, International
162

5.
6.
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8.

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11.
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15.
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17.

Symposium on Multi-dimensional Fluorescence Live Imaging of Cellular Functions andMolecular Activities, Jan 26th－28th 2015, Kyoto.
木梨達雄. Rap1シグナルによる胸腺細胞の動態制御機構「酵素学研究拠点シンポジウ
ム」徳島大学藤井節郎記念医学センター, 2月7日, 2014
Katakai T., kinashi T. Environmental control of high-speed T cell migration in the lymph
node. 日本免疫学会総会第42回学術集会, 幕張, 12月11～13, 2013
Kondo N., Ueda Y., Katakai T., Kinashi T. Live-imaging analysis of LFA-1/ICAM-1 androles of Mst1 in immunological synapse formation using primary T lymphocytes 日本免疫学会総会第42回学術集会, 幕張, 12月11～13, 2013
Ozawa M., Katakai T., Ueda Y., Lee S.I., Kinashi T. Crucial roles of Mst1for antigen
recognition during T cell-APC interactions. 日本免疫学会総会第42回学術集会, 幕張, 12
月11～13, 2013
Kinashi T., Katakai T., Ueda Y., Kondo N. Regulation of Lymphocyte “Stop and Go” via
LFA-1 and ICAM-1: Lymphocyte Trafficking Analysis using Live Imaging Techniques, 第51回日本生物物理学会シンポジウム, 京都, 10月29日, 2013
片貝智哉, リンパ節における高速T細胞遊走と組織環境, 第37回日本リンパ学会, 第69回学術講演会2013, 6月, 福岡
片貝智哉, リンパ節組織微小環境によるT細胞高速遊走の制御, 公益社団法人日本顕微鏡学会, 第69回学術講演会2013, 5月, 大阪
Ueda Y., Kondo N., Kinashi T. Sema3E-Plexin signals regulate thymocyte migration bymodulating Rap-1-dependent integrin activation, The 37th NAITO CONFERENCE ON
Bioimaging-a paradigm shift for the life sciences (ポスター番号PS[I]-39) July 15-18, 2014,
Niseko, Hokkaido, Japan
Kondo N., Ueda Y., Kataka T., and Kinashi T. Single molecule measurement of
ICAM-1/LFA-1 and the role of effector molecules on ICAM-1/LFA-1 regulation using totalinternal reflection microscopy, The 37th NAITO CONFERENCE ON Bioimaging-a
paradigm shift for the life sciences (ポスター番号PS[I]-17) July 15-18, 2014, Niseko,
Hokkaido, Japan
Kondo N., Ueda Y., Kataka T., and Kinashi T. Administration of LFA-1 conformationalchanges at immune cell contact sites., The 4th Annual Meeting for Whole-Organism Science
Society (口頭発表番号[28]), Sep 26-27, 2014, Toyonaka, Osaka, Japan
木梨達雄, 接着制御による胸腺細胞選択調節, JST CREST「免疫機構」領域第三回シンポジウム, 2014年10月8日, 東京
Ueda Y., Kondo N., Ozawa M., Katakai T., and Kinashi T. SEMA3E/Plexin D1 axis controls
thymocyte adhesion and polarization by modulating the Rap1signaling pathway 第43回免疫学会学術集会, 2014年12月10日～12日, 京都
木梨達雄, Imaging of thymocyte trafficking and antigen recognition: roles of Rap1 signaling
in self tolerance, 第3回御茶ノ水動脈硬化フォーラム, 2015年2月28日, 東京

163

Annual Report 研究成果報告書
Generation of mice carrying GFP reporter gene by CRISPR/Cas9-mediatedTitle of Projectgenome engineering
CRISPR/Cas9 を用いた遺伝子改変マウス作成

P.I.

Sung-il Lee, 李成一

Affiliation

Model Animals, モデル動物部門

Collaborators

西村愛美

Keywords

pronucleusi injection, gene-engineered animals, 前核注入、遺伝子改変動物

E-mailsilee@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
The recent development of site-specific endonucleases include ZFN, TALEN and CRISPR/Cas9
nucleases for selective genome cleavage has been an important advancement in genome
engineering. While genome editing technique is spread rapidly because simplicity of
manufacturing method for genetically modified mice created is not easy to use themicromanipulator technology. In this study, we also order to allow the creation of geneticallymodified mice using the CRISPR / Cas9, and essential is to establish the technology. The
microinjections were performed into the pronucleus of fertilized eggs with a pSpCas9 (BB)
-2A-GFP plasmid (PX458, donated from Molecular Genetics laboratory) mixture containing GFP,
and it was investigated whether it is functioning in the egg. Fertilized eggs have prepared apronuclear stage by in vitro fertilization from C57BL/6 mice that have been commonly used tocreate genetically modified mouse. In addition, PX458 plasmid from its nature, because GFP isgenerated when Cas9 works, can be visualized that the CRISPR / Cas9 is working in the egg. As aresult, 197 eggs that was used in the pronucleus microinjection, 160 eggs (81%) survived.
Subsequently, embryos generated until 2-cell stage were 124 eggs (78%). As a result of a portionof the 2-cell stage embryos were observed with a fluorescence microscope, it was able to confirm
the fluorescence of GFP in almost of the embryo. Although currently undergoing transplantation
offspring has not yet been achieved, it is considered to require further technical improvements.
ゲノム編集技術はマウスなどの限られた種でのみ実現可能であった遺伝子改変技術をあらゆる生物種や細胞腫で可能にし、近年、特に急激な開発が進んでいる。特に TALENや CRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集技術は作製方法の簡便さから急速に広まっているが、遺伝子改変マウス作成の為には卵子へのマイクロマニュピュレーター技術を要するため容易ではない。本研究で、私たちもこの内の CRISPR/Cas9 を使用した遺伝子改変マウスの作成を可能にするため、技術習得に取り組んできた。共同研究先の分子遺伝学教室よりKindlin-3 を目的遺伝子とした pSpCas9(BB)-2A-GFP (以下、PX458)プラスミドを供与して頂き、前核注入の技術習得および、それが卵子の中で機能しているかを調べた。マウスは遺伝子改変マウス作成によく使用されている近交系 C57BL/6 マウスから体外受精により前核期を作.成し、マイクロマニュピュレーターを用いてプラスミドを前核に注入した。
また、PX458 プラスミドはその性質上、Cas9 が働くと GFP が生成される為、卵子の中で
CRISPR/Cas9 が働いているかを可視化することが可能である。その結果、実験に供した
197 個の前核期卵子中、160 個(81%)の卵子が生存した。続いてその内 2 細胞期まで発生した胚は 124 個(78%)であった。また、2 細胞期胚の一部を蛍光顕微鏡で観察した結果、ほぼ全ての胚で GFP の蛍光を確認できた。現在移植を行っているが、産子はまだ得られておらず、更なる技術向上が必要であると考えられる。

2. List of Publications
Proceedings
1. 田中正和、李成一、荀潤澤、姚錦春、藤澤順一：ヒト化マウスを用いた HTLV-1 感染
防御ワクチンの開発.第１回日本 HTLV-1 学会学術集会, 東京, 2014 年 8 月
164

2.

3.
4.

田中正和、李成一、荀潤澤、姚錦春、藤澤順一：ヒト化マウスモデルに Tax ロングペ
プチドワクチン投与を行うことで HTLV-1 感染細胞の増殖を抑えることが出来た.第73 回日本癌学会学術総会, 横浜, 2014 年 9 月
藤澤順一、田中正和、上野孝治、荀 潤澤、姚 錦春、李成一：ATL のマウスモデ
ル. 第 73 回日本癌学会学術総会, 横浜, 2014 年 9 月
田中正和、李成一、荀潤澤、姚錦春、藤澤順一：Tax ロングペプチドワクチンのヒト化マウス鼻腔投与による HTLV-1 感染抑制. 第 62 回日本ウイルス学会学術集会, 横浜, 2014 年 11 月

165

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Analysis of signal transduction molecules involved in proliferation,
development and stemness
がん幹細胞の機能・分化に関わるシグナル分子の解明

P.I.

Satoshi Matsuda, 松田達志

Affiliation

Cell Signaling, 生体情報部門

E-mailmatsudsa@hirakata.kmu.ac.jp

Collaborators
Keywords

cell proliferation, mTOR, PI3K、細胞増殖、細胞分化

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Members of the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) family are important for the differentiation,
proliferation, and survival of a variety of cells, including immune cells. The basic activity of these
enzymes is to phosphorylate the third position of the hydroxyl group in the inositol ring ofphosphatidylinositol. There are four subclasses of the PI3K family; among these, class IA PI3K,
composed of a catalytic subunit (p110α, β, or δ) and a regulatory subunit (p85α, p55α, p50α,
p85β, or p55γ), functions downstream of receptors such as T cell receptor (TCR) and CD28 in T
cells whose signaling pathways involve protein tyrosine kinases and Ras. In many cell types,
PI3K signals through mammalian target of rapamycin complex1 (mTORC1) consisting of mTOR,
Raptor, and mLST8. For instance, it has been shown that PI3K-mTORC1 axis regulates thenuclear translocation of IRF7 for the production of type I interferon (IFN) in plasmacytoid
dendritic cells.
Since we have previously shown that class IA PI3K regulates T cell development during the
DN3 to DN4 transition, we evaluated the physiological role of mTORC1 in T cell development bygenetically deleting Raptor, an essential component of mTORC1. We analyzed thymi fromtamoxifen-induced Raptor-deficient mice (Raptorfl/fl; Rosa26-CreERT2), in which Raptor isefficiently deleted in all tissues including haematopoietic cells by two weeks after tamoxifen
treatment, and found that Raptor deficiency resulted in thymic atrophy. Flowcytometric analysis
revealed that development of early T cell progenitors, particularly at the DN2, is impaired by
Raptor deficiency. On the other hand, the lack of Rictor, an essential component of mTORC2,
led to seemingly normal development at the DN2 and DN3 stages, but failed to develop to DP
cells, indicating that mTORC2 plays a critical role in T cell development after the DN3 stages like
PI3K-deficient T cells. We further found that the lack of Raptor resulted in cell cycle
abnormalities in early T cell progenitors that were associated with instability of the cyclin
D2/D3-CDK6 complexes. In a model of myeloproliferative neoplasm and T cell acutelymphoblastic leukemia (T-ALL) evoked by K-ras activation, Raptor deficiency dramaticallyinhibited the cell cycle in oncogenic K-ras expressing T cell progenitors, but not myeloid
progenitors, and specifically prevented the development of T-ALL. Although treatment with
rapamycin, a well-known mTORC1 inhibitor, significantly prolonged the survival of recipient
mice bearing T-ALL cells, rapamycin-insensitive leukemia cells continued to propagate in vivo.
In contrast, Raptor deficiency in the T-ALL model resulted in cell-cycle arrest and efficient
eradication of leukemia. Although several ATP-competitive mTOR inhibitors appear to havepotent anticancer effects, a potential drawback to these agents is their inhibition of multiple
targets, which could lead to unwanted side effects or serious damage to normal tissues. Our
study revealed that mTORC1-specific inhibition contributes to the eradication of T-ALL cells.
The identification of targets downstream of mTORC1 or development of an mTORC1-specificinhibitor would contribute to the development of efficient and specific anticancer therapeutics.
166

PI3K-mTOR 経路は細胞の増殖・分化・生存を制御する細胞内シグナル伝達経路であり、種々のがん組織においてその異常が報告されている。本研究では、PI3K-mTOR 経路に関わる各種分子の遺伝子改変マウスを対象に、これらシグナル伝達経路の活性の増減が各種
血球系細胞の分化・増殖過程に及ぼす影響の解析を試みた。
具体的には、mTOR 経路の中でも、特に細胞増殖と密接に関わる mTORC1 経路に着目し、mTORC1 シグナルに必須のアダプター分子である Raptor 分子の細胞系譜特異的欠損
マウスの樹立に取り組んだ。Raptor 分子を造血系幹細胞で欠失させたところ、胸腺分化の初期に相当する DN1 から DN2 の段階で分化が停止することが分かった。一方、DN3 の段階を超えて Raptor 分子を欠失させた場合には、胸腺分化に大きな変化は認められなかった。一般に、胸腺細胞は DN2 の段階で著しい増殖を示すことから、胸腺細胞の増殖過程で mTORC1 が必須の役割を担うものと考えられた。そこで、金沢大学がん研究所の平尾教授との共同研究により、がん遺伝子産物 K-Ras の過剰発現による急性 T 細胞白血病(T-ALL) のモデルを用いて mTORC1 シグナルの必要性を調べたところ、予想通り、
mTORC1 シグナルを消失させることで、T-ALL の発症が完全に抑制されることが明らかとなった。以上の結果は、mTORC1 シグナルを標的とした、T-ALL 治療の有用性を in vivoで示すものと考えられる。
現在は、解析対象をさらに B 細胞系譜特異的 Raptor 欠損マウスに拡充すると共に、マスト細胞における mTORC1 シグナルの機能解析を目指し、マスト細胞特異的な Cre 発現
マウスの開発に取り組んでいる。

2. List of Publications
Original Articles
1. Hoshii, T., Matsuda, S. and Hirao, A. Pleiotropic roles of mTOR complexes inhaemato-lymphopoiesis and leukemogenesis. J. Biochem. 156, 73-83, 2014. レフェリー無2. Hoshii, T., Kasada, A., Hatakeyama, T., Ohtani, M., Tadokoro, Y., Naka, K., Ikenoue, T.,
Ikawa, T., Kawamoto, H., Fehling, H.J., Araki, K., Yamamura, K., Matsuda, S., and Hirao, A.
Loss of mTOR complex 1 induces developmental blockage in early T-lymphopoiesis anderadicates T-cell acute lymphoblastic leukemia cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111,
3805-3810, 2014. レフェリー有Proceedings
1. Ohtani, M., Fujii, H., Ohara, O., Koyasu, S., Kubo, M., and Matsuda, S. B-lineage specificloss of mTORC1 signal causes selective production of IgA against commensal bacteria. 第43 回日本免疫学会総会・学術集会(ワークショップ)・京都・2014 年 12 月
2. 松田達志、大谷真志、小安重夫，久保允人、平尾敦・mTORC1 シグナルによる B 細胞分化制御・第 24 回日本サイトメトリー学会学術集会・枚方・2014 年 6 月

167Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Development of novel therapeutic strategy and elucidation of functional basis
for intractable diseases by human dendritic cell research
ヒト樹状細胞によるさまざまな病態関連応答の解明と新たな難病治療戦略の開発

P.I.

Tomoki Ito, 伊藤量基

Affiliation

Internal Medicine 1, 内科学第一講座

Collaborators

野村昌作、札谷直子、中西孝尚、田中晶大、稲垣詔子、木畑佳代子

Keywords

E-mailitot@hirakata.kmu.ac.jp

autoimmune disease, dendritic cells, interferon-α, platelet, statin, TSLP, 樹状細胞, IL-33, OX40 リガンド, RANK リガンド, TSLP, 血小板, アレルギー1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) is a key player by induction of OX40-ligand (OX40L)
on dendritic cells (DCs), which triggers and enhances the Th2 cell differentiation and expansion inallergic cascade. Thus, TSLP-DC-OX40L axis might be the principal pathway in the inflammatorycascades in atopic dermatitis and asthma.
① IL-33, which is produced by epithelial cells, has been implicated in the Th2 immune responses
and pathogenesis of the allergic disorders. However, the role of IL-33 in the Th2-polarizing
TSLP-DC-OX40L axis still remains largely elusive. We focused on the ability of IL-33 topromote OX40L-mediated Th2 responses.
IL-33 remarkably enhanced TSLP-DCs-driven or OX40L-driven Th2 responses from naïve T
cells and the Th2 functional attributes of CRTH2+ CD4+ Th2 memory cells by the increased
production of IL-5, IL-9, and IL-13. In addition, IL-33 was expressed in the nuclei of
epithelial cells in not only skin lesion but also lymph nodes of the patient with atopic
dermatitis, suggesting a specialized role in adaptive T cell-priming phase.
IL-33 works as a positive regulator of TSLP-DC-OX40L axis that initiates and maintains theTh2 cell-mediated inflammatory responses, and therefore, it would be a new therapeutic target
for the treatment of allergic disorders.
② Meanwhile, interaction between TSLP and human dendritic cells (DCs) plays an essential rolein evoking inflammatory Th2 responses in allergy through expression of CCL17 by DCs,
which recruits memory Th2 cells to the skin. We newly identified the novel cross-talkmechanism between DCs and platelets in enhancement of immune inflammatory responses.
We found that TRAP (thrombin receptor agonist peptide) induced RANK ligand expression onplatelets, which promoted the CD86 expression on DCs. We further clarified that the activatedplatelets enhanced the production of CCL17 induced by the TSLP-activated DCs through
RANK ligand. Thus, activated platelets can intervene in adaptive immune responses throughinduction of functional modulation of TSLP-DCs. Platelets have the ability to enhance theDC-mediated Th2 response and may contribute to the allergic inflammation.
In conclusion, our study provides new insights in functions of IL-33 and platelets and thepossible mechanism of allergic responses that stem from DCs.
アレルギー発症機序において樹状細胞 (Denderitic Cell:DC) は Th2 関連アレルギー性炎症を惹起し、アレルギー性炎症カスケードを引き起こす。上皮由来のサイトカインである
胸線間質リンパ球増殖因子 (thymic stromal lymphopoietin:TSLP) が、ミエロイド系 DC から OX40L を発現させることによりナイーブ CD4 陽性 T 細胞を炎症性 Th2 細胞へ分化誘導し、アレルギー性炎症を惹起する。
さらに TSLP 刺激 DC は Th2 ケモカインである TARC
(thymus and activation-regulated chemokine, CCL17) を産生することにより、メモリーTh2細胞の局所浸潤に寄与して、アレルギー性炎症の維持に重要な役割を果たすことも判明している。
① この TSLP と同様に、上皮が産生する IL-33 は Th2 免疫応答やアレルギー疾患の発症
および病態維持に関与することが示唆されているが、TSLP‐DC‐OX40L 経路に対して、IL-33 がどのように関わっているかは未だ不明である。我々は上皮由来 IL-33 が、
168

TSLP 関連アレルギーカスケード (TSLP-DC-OX40L axis) にどのような影響があるかを検討した。IL-33 は OX40L と協働して、Th2 サイトカイン産生増量 (IL-5、IL-9、IL-13)する能力を確認した。その機序としては OX40L 刺激によって T 細胞の IL-33 受容体(ST2) の発現が増強することに起因すると思われる。さらに CRTH2 陽性メモリーT 細
胞は OX40L の刺激によって細胞増殖するが、IL-33 はその効果をさらに増強させる能力を示した。また OX40L で刺激することによってメモリーTh2 細胞の ST2 の発現が増強することも確認できた。IL-33 はアトピー性皮膚炎患者の皮膚角化細胞や真皮の血管内皮細胞の核だけでなく、リンパ節の上皮細胞の核内にも発現していることが判明した。このことから、IL-33 はアレルギー性炎症における T 細胞のプライミングの段階から関与していると考えられた。
② 血小板は炎症・血栓・動脈硬化において重要な役割をしており、サイトカインや TNF
スーパーファミリーなどの様々な免疫メディエーターを発現している。しかしながら、血小板と DC のクロストークによるアレルギー免疫応答調節機序の報告は殆ど無い。
今回我々は新たに、活性化血小板が RANK リガンド (RANKL:Receptor Activator for
Nuclear Factor B Ligand) を発現することを同定した。この活性化血小板によって、DCの持つ CD86 は発現増強し、さらに TSLP と同時に活性化血小板を添加することによって、DC から産生される CCL17 が増加することも明らかにした。さらに、活性化血小板に発現する RANKL が CD40L とともに TSLP-DC から産生される CCL17 を増加させる責任因子の一つであることを確認した。したがって、血小板は DC による Th2 免
疫応答を増強し、アレルギー性の炎症を増幅させる可能性が示唆された。
IL-33 ならびに血小板は、TSLP‐DC‐OX40L-アレルギー経路における促進因子として機能すると考えられた。これらのことから、IL-33 ならびに血小板がアレルギー治療の新しいターゲットとなる可能性が示唆された。

2. List of Publications
Original Articles
1. Nakanishi, T., Inaba, M., Inagaki-Katashiba, N., Tanaka, A., Vien, P.T. Kibata K., Ito, T. andNomura, S. Platelet-derived RANK ligand enhances CCL17 secretion from dendritic cells
mediated by thymic stromal lymphopoietin. Platelets 27, 1-7. 2014.
2. Murakami-Satsutani, N., Ito, T., Nakanishi T., Inagaki, N., Tanaka, A., Vien, P.T., Kibata K.,
Inaba, M. and Nomura, S. IL-33 Promotes the Induction and Maintenance of Th2 Immune
Responses by Enhancing the Function of OX40 Ligand. Allergol. Int. 63, 443-455, 2014.
3. Ito, T., Ozaki Y., Son, S., Nishizawa, T., Amuro, H., Tanaka, A., Tamaki, T. and Nomura, S.
Combined use of ursodeoxycholic acid and bosentan prevents liver toxicity caused byendothelin receptor antagonist bosentan monotherapy: two case reports. J.Med. Case Rep. 8,250, 2014.
4. Nomura, S., Ishii, K., Fujita, Y., Azuma, Y., Hotta, M., Yoshimura, Y., Nakanishi, T., Fujita,
S., Nishizawa, T., Nakaya, A., Tamaki, T., Satake, A. and Ito, T. Immunotherapeutic effectsof Ninjin-youei-to on patients with multiple myeloma. Curr. Immunol. 15, 19-27, 2014.
5. Ueba, T., Nomura, S., Inami, N., Yokoi, T. and Inoue, T. Elevated RANTES level isassociated with metabolic syndrome and correlated with activated platelets associatedmarkers in healthy younger men. Clin.Appl. Thromb. Hemost. 20, 813-818, 2014.
Books
1. 免疫応答における血小板と樹状細胞. 伊藤量基・先端医学社・Thrombosis Medicine・2014・7 ページ
2. 骨髄異形成症候群と血小板機能. 伊藤量基・先端医学社・Thrombosis Medicine・2014・
3 ページ
3. トシリズマブ治療における血清 IL-6 の治療効果予測バイオマーカーとしての重要性.
伊藤量基、嶋元佳子・科学評論社・リウマチ科・2014・
4. 樹状細胞と NK 細胞の相互作用. 中西孝尚、伊藤量基・科学評論社・臨床免疫・アレ
ルギー科・2013・7 ページ
5. アレルギー疾患における TSLP 関連 Th2 細胞誘導機序. 杉本博是、伊藤量基・科学評
169

論社・臨床免疫・アレルギー科・2013・7 ページ
Proceedings
1. Kayoko Kibata・Lenalidomide, a derivative of thalidomide, acts as immunoenhancer of typeⅠinterferon production from plasmacytoid dendritic cells. 13th International symposiumon Dendritic cells(DC2014) フランス トゥール・2014/09
2. Noriko Inagaki-Katashiba ・ Statins, HMG-CoAreductase inhibitors, have a potential toregulate DC-derived factors involved in TSLP-mediated allergic responses. 13th International
symposium on Dendritic cells s(DC2014) フランス トゥール・2014/09
3. Akihiro Tanaka・Novel usage of recombinant thrombomodulin as an inhibitor of type I
interferon production by plasmacytoid dendritic cells. 13th International symposium on
Dendritic cells s(DC2014) フランス トゥール・2014/09
4. Ryoichi Iwata・Therapeutical doses of temozolomide inhibit IL-10 production by dendritic
cells and enhance the CTL response. 13th International symposium on Dendritic cellss(DC2014) フランス トゥール・2014/09
5. Phan Thi Xuan Vien・Analogs of thalidomide act as immunomodulators of human myeloids
dendritic cells. 13th International symposium on Dendritic cells s(DC2014) フランス トゥー
ル・2014/09

170

Division of
Metabolic Disorders

代謝部門
Neuropharmacology, 神経病態薬理学（薬理学）講座
Internal Medicine 3, 内科学第三講座
Dermatology, 皮膚科学講座
Orthopedic Surgery, 整形外科学講座
Plastic and Reconstructive Surgery, 形成外科学講座
Ophthalmology, 眼科学講座
Radiology, 放射線科学講座
Physics, 物理学講座

172

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Study of fibril formation in the extracellular matrix
細胞外マトリックス線維形成の加齢変化に関する研究

P.I.

Tomoyuki, Nakamura 中邨智之

Affiliation

Neuropharmacology, 神経病態薬理学（薬理学）講座

Collaborators

赤間智也、井上唯史、藤川雄介、吉田秀之、増田実希

Keywords

E-mailnakamtom@hirakata.kmu.ac.jp

extracellular matrix, gene-engineered mice, LTBP, microfibril
細胞外マトリクス遺伝子改変マウス、LTBP、ミクロフィブリル、

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
The latent TGF-beta binding proteins (LTBPs) are multidomain glycoproteins containing
EGF-like domains and eight-cysteine domains, both of which are also found in other matrix
proteins, fibrillin-1 and -2. As the name indicating, LTBPs bind to TGF-beta molecules andfunction to keep the signaling molecule inactive in the extracellular matrix of tissues until further
induction releases active TGF-beta from the complex. On the other hand, several groups including
us have reported that LTBPs have their own biological functions distinct from TGF-beta signaling
especially for elastic fiber formation. In current project, we have been studying on function of two
LTBP proteins, LTBP-2 and LTBP-4, in vivo and in vitro.
To investigate biological function of LTBP-2, we created LTBP-2-deficient mice and analyzed
their phenotype. The homozygous mutant mice survived at adult stage without obvious
abnormality, however, we found that the mutant mice develop lens luxation due to impaired ciliary
zonule formation. In fact, homozygous mutations on LTBP-2 gene have been found on genetic eyediseases such as primary congenital glaucoma and microspherophakia in human, indicating anessential role of the protein in eye development. LTBP-2-deficient mouse is an ideal model animal
for congenital eye diseases in human.
LTBP-4–deficient mice exhibit elastic fiber disorders such as severe pulmonary emphysema andrectal prolapse. Previously we reported that LTBP-4 promoted elastic fiber formation in a
TGF-beta-independent manner. Because of their homology, LTBP-2 and LTBP-4 may haveoverlapping function in TGF-beta-independent manner. To answer this question, we generated
mice deficient in both LTBP-2 and LTBP-4, and analyzed those phenotypes. Double mutant mice
exhibited more severe pulmonary emphysema than LTBP-4 single knockout mice, and a half ofthe mice died before 4 weeks. These observations suggest that LTBP-2 and LTBP-4 have a
redundant function in elastic fiber formation in lungs. Because LTBP-4 was the only LTBP
member that was not expressed in the eyes, we generated LTBP-2-deficient mice that ectopically
express LTBP-4 in the eyes. Ciliary zounule microfibril formation was partially rescued in thesemice, suggesting that LTBP-2 and LTBP-4 also have a redundant function in zonular microfibril
assembly.
LTBP(latent TGFβ binding protein)蛋白質はその名の通り TGFβ と結合して不活性型として細胞外マトリックス中に保持し、インテグリンなどによる刺激に応じて活性型 TGFβ を放出すると考えられている蛋白質群である。アミノ酸配列の相同性からこれまでにLTBP-1 から LTBP-4 の 4 種類が報告されているが、これらの中で LTBP-2 だけは TGFβ と結合しないことが示されており、その生物学的機能が不明であった。我々は LTBP-2 の生物学的機能を明らかにするべく遺伝子変異マウスを作成し、その表現型を解析した。変異
マウスは特に目立った表現型を示さず、野生型と同様に成体にまで正常に発生し、交配も可能であった。しかしながら詳細な解析の結果、眼球内で水晶体をつなぎ止める毛様小帯の線維形成が 変異マウスでは大きく損なわれており、断片化した線維が見られるのみであった。これまでにいくつかの論文で水晶体脱臼を引き起こす家族性球状水晶体の患者での LTBP-2 の遺伝子異常が報告されており、我々の作成した LTBP-2 欠損マウスはヒトの家族性水晶体脱臼および球状水晶体のモデル動物となり得るものと結論された。
一方、LTBP ファミリー蛋白質の一つである LTBP-4 蛋白質の欠損マウスは重篤な肺気腫や直腸脱といった弾性線維形成不全の表現型を示すことから、生体において弾性線維の形成に重要な役割を示すことが我々を含む複数の研究室により報告されている。我々は以173

前に LTBP-4 蛋白質が TGFβ を介さない経路で弾性線維の形成を促進することを報告した。この TGFβ を介さない LTBP-4 の機能と LTBP-2 の機能とに重複があるのか調べる目
的で、LTBP-2 と LTBP-4 の二重欠損マウスを作成してその表現型を解析した。二重変異
マウスは LTBP-4 欠損マウスよりも重篤な肺気腫を示し、約半数の二重変異マウスは生後4 週を超えて生存することが出来なかったことから LTBP-2 と LTBP-4 は肺の弾性線維形成において共通の機能があることが示唆された。また毛様小帯を作り出す毛様体の細胞では LTBP ファミリー遺伝子の中で LTBP-4 のみが発現しておらず、さらには LTBP-2 欠損
マウスに全身で LTBP-4 を強制発現させたマウスを作成したところ毛様小帯のミクロフィ
ブリル形成が回復したことから LTBP-2 と LTBP-4 は特に弾性線維の基礎となるミクロフ
ィブリルの形成において共通の機能があることが明らかとなった。

2. List of Publications
Original Articles
1. Sugihara, K., Kobayashi, Y., Suzuki, A., Tamura, T., Motamedchaboki, K., Huang, C.-T.,
Akama, T.O., Pecotte, J., Frost, P., Bauer, C., Jimenez, J.B., Nakayama, J., Aoki, D., andFukuda, M.N., Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal
endometriosis. Nat. Commun. 5, 4478, 2015.（レフェリー有）2. Inoue, T., Ohbayashi, T., Fujikawa, Y., Yoshida, H., Akama, T.O., Noda, K., Horiguchi, M.,
Kameyama, K., Hata, Y., Takahashi, K., Kusumoto, K. and Nakamura, T., Latent TGF-βbinding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Hum. Mol.
Genet. 23, 5672-5682, 2014.（レフェリー有）3. Horie, T., Nishino, T., Baba, O., Kuwabara, Y., Nakao, T., Nishiga, M., Usami, S., Izuhara,
M., Nakazeki, F., Ide, Y., Koyama, S., Sowa, N., Yahagi, N., Shimano, H., Nakamura, T.,
Hasegawa, K., Kume, N., Yokode, M., Kita, T., Kimura, T. and Ono, K. MicroRNA-33b
knock-in mice for an intron of sterol regulatory element-binding factor 1 (Srebf1) exhibit
reduced HDL-C in vivo. Sci. Rep. 4, 5312, 2014.（レフェリー有）
4. Yokoyama, U., Minamisawa, S., Shioda, A., Ishiwata, R., Jin, M.H., Masuda, M., Asou, T.,
Sugimoto, Y., Aoki, H., Nakamura, T. and Ishikawa, Y. Prostaglandin E2 inhibits
elastogenesis in the ductus arteriosus via EP4 signaling. Circulation 129, 487-96, 2014.（レフェリー有）
5. Sugihara, K., Shibata, T.K., Takata, K., Kimura, T., Kanayama, N., Williams, R.,
Hatakeyama, S., Akama, T.O., Kuo, C.-W., Khoo, K.-H. and Fukuda, M.N., Attenuation offibroblast growth factor signaling by poly-N-acetyllactosamine type glycans. FEBS Lett. 587,
3195-3201, 2013.（レフェリー有）6. Horie, T., Nishino, T., Baba, O., Kuwabara, Y., Nakao, T., Nishiga, M., Usami, S., Izuhara,
M., Sowa, N., Yahagi, N., Shimano, H., Matsumura, S., Inoue, K., Marusawa, H., Nakamura,T., Hasegawa, K., Kume, N., Yokode, M., Kita, T., Kimura, T. and Ono, K. MicroRNA-33
regulates sterol regulatory element-binding protein 1 expression in mice. Nat. Commun. 4,2883, 2013.（レフェリー有）Proceedings
1. Akama, T.O., Fujikawa, Y., Inoue, T. and Nakamura, T. Mutant LTBP-2 proteins lacksecretion ability and fibrillin-1 binding activity. The Association for Research in Vision andOphthalmology (ARVO) annual meeting, Seattle, WA, USA, 2013 年 5 月
2. 藤川雄介, 赤間智也, 井上唯史, 中邨智之. 先天性眼疾患にて検出された LTBP-2 変
異の機能に与える影響の解析、 第 36 回日本分子生物学会年会、神戸ポートアイラ
ンド、2013 年 12 月
3. Nakamura, T. TGFbeta-independent role of LTBPs in microfibril and elastic fiber assembly.
Invited talk at Gordon Research Conference on Elastin and Elastic Fiber (July 21 - 25, 2013,
Biddeford, USA).
4. 中邨智之：「弾性線維は再生できるか〜 線維形成の分子機構 〜」太陽紫外線防御研究委員会 第24回シンポジウム 特別講演（大阪、2014年3月7日）
5. 中邨智之：「弾性線維は再生できるか〜 線維形成の分子機構 〜」第 5 回 日本創傷外科学会総会・学術集会 特別講演（京都、2013 年 7 月 11 日）

174

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

A molecular imaging study of identifying biomarkers in inflammatory
gastroenterological disorders
分子イメージングによる炎症性消化器病変のバイオマーカー探索

P.I.

Kazuichi Okazaki, 岡崎和一

Affiliation

Internal Medicine 3, 内科学第三講座

Collaborators
Keywords

E-mailokazaki@hirakata.kmu.ac.jp

西尾彰功、内田一茂、坂口雄沢、光山俊行、岡崎敬、豊永貴彦、坂尾将幸、福井寿朗、吉田勝則、山口隆志、高橋悠、鈴木尚
autoimmune pancreatitis, inflammatory gastrointestinal disorders, molecularimaging, mucosal regeneration, stem cells, tumor 自己免疫性膵炎、炎症性
腸疾患、分子イメージング、粘膜再生、幹細胞、腫瘍

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
In the pancreas and gastrointestinal tract, we studied the significance of IgG4-positive cells andpSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells as biomarkers in inflammatory gastrointestinal
disorders. In clarifying pathophysiology of IgG4-related autoimmune pancreatitis, the numbers
and ratios of Tregs, IgG4-positive, and IgG-positive cells immunohistochemically stained with
anti-toll-like receptors (TLR1-11), anti-Foxp3, IgG4, IgG antibodies, respectively, were useful. In
the regenerative study, pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells were detected in specificepithelial cells around crypt bases of both small intestines and colons of C57BL/6 mice, where
respective putative stem cells are thought to exist. In small intestines, most pSmad2/3L-Thr
immunostaining-positive cells were located around the +4 cell position from the bottom of crypts(just above Paneth cells). A few of them were also located at the places for CBCs (between Paneth
cells). Double immunofluorescent staining for pSmad2/3L-Thr and Ki67 demonstrated that
pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells were located adjacent to actively proliferating cells(proliferating zone) in both small intestines and colons, but immunohistochemical co-localizationof pSmad2/3L-Thr with Ki67 was never observed. In the regeneration phase of DSS-induced
colitis, pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells significantly increased, concurrent withhyperplastic changes and an increase in the number of Ki67 immunostaining-positive cells.
Double immunofluorescent staining for pSmad2/3L-Thr and CK8 demonstrated that
pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells were epithelial cells, but that for pSmad2/3L-Thrand Chr-A demonstrated that they were not enteroendocrine cells. In higher magnification with alight microscope, pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells indicated undifferentiatedmorphological features and were reconfirmed around crypt bases. pSmad2/3L-Thr
immunostaining-positive cells showed co-localization with CDK4 immunostaining-positive cells.
Although pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells were included in the
immunostaining-positive areas of MSI-1, they showed different localization from DCAMKL1
immunostaining-positive cells. MSI-1 and DCAMKL1 are candidate biomarkers for epithelial
stem (or progenitor) cells in the small intestine and colon. Most pSmad2/3L-Thr
immunostaining-positive cells were included in the Lgr5-GFP positive cells in crypt bases ofcolons. Conversely, in small intestines, most pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells
showed different localization from Lgr5-GFP positive cells in the places for CBCs and werearound the +4 cell position, although a few of them were included in the Lgr5-GFP positive cells.
BrdU label-retaining assay revealed that pSmad2/3L-Thr immunostaining-positive cells wereslow-cycling cells (i.e., LRCs).
炎症性消化器疾患における病態解析とバイオマーカー探索：
IgG4 関連自己免疫性膵炎（AIP）とアルコール性慢性膵炎の免疫担当細胞サブセット
における各 TLR の発現と IgG4 陽性細胞の病態解析を行い、AIP では TLR7 を発現した
M2 マクロファージが有意に浸潤しており、自然免疫系の異常が病態に関与し、バイオマ
ーカーになる可能性が示唆された。
2. 消化管・膵・肝再生における幹細胞の探索と粘膜再生・発癌メカニズムの解析：
最新の幹細胞、細胞周期研究の知見や、各消化器疾患モデルマウスの知見を応用する
ことにより、消化管粘膜上皮・膵における有用な新規組織幹細胞マーカーとしてリンカー
部スレオニンリン酸化 Smad2/3 蛋白（pSmad2/3L-Thr）を同定した。正常マウス小腸・大1.

175

腸粘膜や DSS 起因性大腸炎モデル、IL-10 ノックアウトマウス大腸炎・化学自然免疫系の関与を検討するために、発癌大腸癌モデル・セルレイン膵炎といったモデルを作製し、pSmad2/3L-Thr と Ki-67 の蛍光二重免疫染色法にて同様に組織幹細胞を検出し、組織上皮
幹細胞のマーカーとして利用できることを確認した。特に DSS 起因性大腸炎モデル・セ
ルレイン膵炎については pSmad2/3L-Thr 強陽性細胞を粘膜障害・再生の経過とともに経時的に確認し、活動性病変部では pSmad2/3L-Thr 強陽性幹細胞はほぼ消失しており、再生治癒状況が進行するにつれ消化管では粘膜基底部と膵では tubular complex における
pSmad2/3L-Thr 強陽性幹細胞は著明に増加していた。
消化管粘膜には二種類（slow- or rapidcycling）存在するとされる組織幹細胞のうち、slow-cycling stem cell の特徴に合致すると考えられた。IL-10 ノックアウトマウス大腸炎・大腸癌モデルにおいては pSmad2/3L-Thr
強陽性細胞の分布を腸炎部、癌部にて観察したが、粘膜が過形成となる腸炎部では
pSmad2/3L-Thr 強陽性細胞が著増していたが、癌部と思われた病変部では pSmad2/3L-Thr
強陽性細胞はほとんど発現していなかった。内視鏡的に摘出された組織標本（正常消化管
粘膜組織や各消化管腫瘍組織）を利用して、同様に pSmad2/3L-Thr 強陽性細胞を検出する
実験を予備的に施行したところ、腫瘍部において pSmad2/3L-Thr 強陽性細胞が散在性に認められた。

2. List of Publications
Original Articles
1. Fukui, Y., Uchida, K., Sakaguchi, Y., Fukui, T., Nishio, A., Shikata, N., Sakaida, N., Uemura,Y., Satoi, S. and Okazaki, K. Possible involvement of Toll-like receptor 7 in the developmentof type 1 autoimmune pancreatitis. J. Gastroenterol. 50, 435-444, 2015.
2. Kurishima, A., Inaba, M., Sakaguchi, Y., Fukui, T., Uchida, K., Nishio, A., Nomura, S. andOkazaki, K. Immunoregulatory function of PIR-A/B+ DCs in the inflammatory responses ofdextran sodium sulfate-induced colitis. J. Gastroenterol. 49, 1367-1377, 2014.
3. Nakayama, S., Nishio, A., Yamashina, M., Okazaki, T., Sakaguchi, Y., Yoshida, K., Fukui, T.,
Uchida, K. and Okazaki, K. Acquired immunity plays an important role in the developmentof murine experimental pancreatitis induced by alcohol and lipopolysaccharide. Pancreas 43,
28-36, 2014.
4. Okazaki, K., Uchida, K., Koyabu, M., Miyoshi, H., Ikeura, T. and Takaoka, M. IgG4
cholangiopathy - Current concept, diagnosis, and pathogenesis. J. Hepatol. 61, 690-695,
2014.
5. Sumimoto, K., Uchida, K., Kusuda, T., Mitsuyama, T., Sakaguchi, Y., Fukui, T., Matsushita,M., Takaoka, M., Nishio, A., and Okazaki, K. The role of CD19+ CD24high CD38high andCD19+ CD24high CD27+ regulatory B cells in patients with type 1 autoimmune pancreatitis.
Pancreatology. 14, 193-200, 2014.
6. Takahashi, Y., Fukui, T., Kishimoto, M., Suzuki, R., Mitsuyama, T., Sumimoto, K., Okazaki,T., Sakao, M., Sakaguchi, Y., Yoshida, K., Uchida, K., Nishio, A., Matsuzaki, K., andOkazaki, K. Phosphorylation of Smad2/3 at the specific linker threonine residue indicatesslow-cycling esophageal stem-like cells before re-entry to the cell cycle. Dis Esophagus
2015.
7. Kishimoto, M., Fukui, T., Suzuki, R., Takahashi, Y., Sumimoto, K., Okazaki, T., Sakao, M.,
Sakaguchi, Y., Yoshida, K., Uchida, K., Nishio, A., Matsuzaki, K. and Okazaki, K.
Phosphorylation of Smad2/3 at specific linker threonine indicates slow-cycling intestinal
stem-like cells before reentry to cell cycle. Dig. Dis. Sci. 60, 362-374, 2014.
8. Okazaki, K., Yanagawa, M., Mitsuyama, T. and Uchida, K. Recent advances in the concept
and pathogenesis of IgG4-related disease in the hepato-bilio-pancreatic system. Gut Liver 8,462-470, 2014..
9. Okazaki, T., Nishio, A., Takeo, M., Sakaguchi, Y., Fukui, T., Uchida, K. and Okazaki, K.
Inhibition of the dephosphorylation of eukaryotic initiation factor 2α ameliorates murine
experimental colitis. Digestion 90, 167-178, 2014
10. Mitsuyama, T., Uchida, K., Sumimoto, K., Fukui, Y., Ikeura, T., Fukui, T., Nishio, A.,
Shikata, N., Uemura, Y., Satoi, S., Mizuno, N., Notohara, K., Shimosegawa, T., Zamboni, G.,
Frulloni, L. and Okazaki, K. Comparison of neutrophil infiltration between type 1 and type 2
autoimmune pancreatitis. Pancreatology. 15, 271-280, 2014.
11. Tomiyama, T., Ueda, Y., Katakai, T., Kondo, N., Okazaki, K. and Kinashi, T. Antigen-specificsuppression and immunological synapse formation by regulatory T cells require the Mst1
kinase. PLoS One 8, e73874, 2013.
176

12. Koyabu, M., Uchida, K., Sakaguchi, Y., Fukata, N., Kusuda, T., Miyoshi, H., Yoshida, K.,
Sumimoto, K., Mitsuyama, T., Fukui, T., Nishio, A. and Okazaki, K. Possible involvement of
Foxp3+ regulatory T cells in the development of immune-mediated pancreatitis in MRL/Mp
mice treated with polyinosinic:polycytidylic acid. Int. J. Rheumatol. 2013, 367325, 2013.
Proceedings
1. Sumimoto, K., Uchida, K., Mitsuyama, T., Fukui, Y., Kusuda, T., Miyoshi, H., Fukata, N.,
Koyabu, M., Sakaguchi, Y., Ikeura, T., Shimatani, M., Fukui, T., Matsushita, M., Takaoka,
M., Nishio, A. and Okazaki, K. Regulatory B Cells in Type 1 Autoimmune Pancreatitis.
DDW2014・Chicago, IL,USA 2014/05
2. Ikeura, T., Takaoka, M., Uchida, K., Shimatani, M., Miyoshi, H., Fukui, Y., Sumimoto K, andOkazaki, K. Which has a higher risk for developing pancreatic cancer, autoimmune
pancreatitis or ordinary chronic pancreatitis? The 4th International Forum at the 100th
General Meeting of the Japanese Society of Gastroenterology. Tokyo. 2014/04
3. Sumimoto, K., Uchida, K., Mitsuyama, T., Fukui, Y., Kusuda, T., Miyoshi, H., Fukata, N.,
Koyabu, M., Sakaguchi, Y., Ikeura, T. and Shimatani, M. Comparison of IgG4-positive
Plasma Cell Infiltration Between Type 1 Autoimmune Pancreatitis and Pancreatic Ductal
Adenocarcinoma Based On Comprehensive diagnostic criteria for IgG4-related disease(IgG4-RD), 2011. The 2nd International Symposium on IgG4-RD and Associated Conditions.
Honolulu, HA, USA. 2014/02
4. Uchida, K., Fukui, Y., Mitsuyama, T., Sumimoto, K., Ikeura, T., Sakaguchi, Y., Shimatani,M., Fukui, T., Matsushita, M., Takaoka, M., Nishio, A. and Okazaki, K. Comparison of
IgG4-positive Plasma Cell Infiltration Between Type 1 Autoimmune Pancreatitis andPancreatic Ductal Adenocarcinoma Based On Comprehensive diagnostic criteria for5. 岡崎和一. 消化器領域における IgG4 関連疾患. 第 115 回日本消化器病学会 第 109
回日本消化器内視鏡学会 北海道支部例会、札幌、2014/09
6. 内田一茂、住本貴美、岡崎和一. 自己免疫性膵炎の各種診断基準の評価に基づく診断
アルゴリズムの提案。第 100 回日本消化器病学会総会、東京、2014/04
7. 内田一茂、住本貴美、光山俊行、塩見圭佑、池浦司、島谷昌明、高岡亮、岡崎和一. 当院における 1 型自己免疫性膵炎の診断アルゴリズムと各種診断基準についての検討。
第 111 回日本内科学会講演会。東京、2014/04
8. 松原揚典、内田一茂、南川健、住本貴美、光山俊行、池浦司、島谷昌明、高岡亮、岡崎和一. アザチオプリンにて加療した IgG4 関連硬化性胆管炎の 1 例. 第 203 回日本内科学会近畿地方会、大阪、2014/03
9. 堀谷俊介、内田一茂、光山俊行、住本貴美、三好秀明、池浦司、島谷昌明、高岡亮、
関寿人、
岡崎和一. 多臓器に病変を認め胆管病変が急速に進行した IgG4 関連疾患の 1
例、第 203 回日本内科学会近畿地方会 大阪、2014/03

177

Annual Report 研究成果報告書
Title of ProjectMeasurement of melanin in epidermis using mass microscope.
質量顕微鏡を用いた表皮内メラニンの測定

P.I.

Hiroyuki Okamoto, 岡本祐之

Affiliation

Dermatology, 皮膚科学講座

Collaborators

山崎文和、谷村裕嗣、岸本泉、Chuyen Hong

Keywords

E-mailhokamoto@hirakata.kmu.ac.jp

Melanocyte, melanin, eumelanin, pheomelanin, melanoma, UV, メラノサイ
ト、メラニン、ユーメラニン、フェオメラニン、メラノーマ、紫外線

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Melanin is known to be photoreactive and photoprotective, but its function in skin in vivo
remains controversial. Conventional experimental mice are not suitable for photo-biological tests
because of a defect in epidermal melanocytes and melanin.
Recently established stem cell factor transgenic (SCF-Tg) mice with epidermal melanocytes are
not a suitable animal model for UV-induced carcinogenesis either, because these animals haveheavily pigmented skin.
We developed a new SCF-Tg mouse with brown skin. These mice have less epidermal melaninthan black SCF-Tg mice. Eumelanin and pheomelanin measurement detected pyrrole-2, 3,5-tricarboxilic acid (PTCA) 400ng/mg and aminohydroxylalanin (AHP) 30ng/mg in the epidermisof brown SCF-Tg mice, while the respective values were 0.2ng/mg and <2ng/mg in albino miceand >1000ng/mg and 20ng/mg in black SCF-Tg mice.
A melanotic melanoma or metastatic region of melanoma could not detect melanin occasionally.
Therefore, it is important to detect a melanin (include eumelanin and pheomelanin ) in such a case.
We measured a melanin in mouse epidermis using mass microscope. Because of failure oftranspiration of melanin, we could not detect a melanin (include eumelanin and pheomelanin) in
epidermis. We need to find the matrix and method to use mass microscope of melanin.
メラニンには紫外線防御能力の大きいユーメラニンと紫外線感受性の高いフェオメラ
ニンの 2 種類が存在している。ヒトでは表皮にメラノサイトが存在するが、マウスのメラ
ノサイトは真皮に存在するので、ヒトの皮膚組織の研究においてマウスを実験動物として用いることには制限がある。ヒトのようにメラノサイトを表皮に有するマウスは既に存在しているが、かかるマウスにおけるメラノサイト発現量は過剰なものであり、異常な色素沈着が見られるので実験動物としては不適切なものであった(J Invest Dermatol, 125, 521,
2005)。そこでバッククロスを何度も行うことにより表皮内ユーメラニンの含有量が少な
く、フェオメラニンの含有量の多い新しい SCF-Tg マウスを作製した。このマウスはフェオメラニン含有量が多く、ユーメラニン含有量が少ないため通常の SCF-Tg マウスより格段に紫外線感受性が高く、ヒトの皮膚により近いと考えられる（特許番号 第 4406696 号）。
皮膚悪性黒色腫は時に通常染色や特殊染色を用いてもメラニンが測定できないタイプ(amelanotic melanoma) が存在し他の悪性腫瘍との鑑別が困難な場合や転移部ではメラニンが確認出来ない時がある。また、ユーメラニン、フェオメラニンは直接測定することができず、抗体などを用いて間接的に測定するしか計測する方法がなかった。質量顕微鏡によりそれらを直接測定出来るようになれば、採取した皮膚のユーメラニン、フェオメラニ
ン 含 有 量 か ら 将 来 の 悪 性 黒 色 腫 発 生 リ ス ク の 検 討 や 通 常 鑑 別 で き な い amelanotic
melanoma を診断できる可能性がある。
マウスを用いて、質量顕微鏡によるメラニンの測定を行ったが、メラニンは重合しているため、うまく飛ばすことができず、測定できなかった。フェオメラニン、ユーメラニンに関しても同様の結果であった。

優れた成果があがった点
未だ皮膚を用いてメラニンは測定できず。評価対象外である。
問題点
重合したメラニン、フェオメラニン、ユーメラニンを効率良く分解できるマトリックスを見つける必要がある。
178

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Sonication for diagnosis of implant-associated infections
超音波処理を用いたインプラント感染の新規診断法の構築

P.I.

Narumi Ueda, 植田成実

Affiliation

Orthopedic Surgery, 整形外科学講座

Collaborators

飯田寛和、上田裕輔、中村知寿、䯨賢一、奥田和之、高橋伯夫

Keywords

implant-associated infections, sonication
インプラント周囲感染、超音波処理法

E-mailuedanar@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Introduction: The diagnosis of implant-associated infections is challenging, and the conventional
culturing of periprosthetic tissue has been the gold standard for diagnosis of implant-associatedinfections. However, conventional diagnostic tests are inaccurate because the pathogenesis of
implant-associated infection is related to microorganisms growing in biofilms. We comparedculture of samples obtained by sonication of explanted implants to dislodge adherent bacteria from
implants with conventional culture of periprosthetictissue. The purpose of this study is to evaluate
the results of sonication that is microbiological diagnostic method for implant-associatedinfections.
Materials and Methods: Between January 2013 and January 2014, a total of 47 consecutive
patients underwent the removal of implants at our institution. Implants were removed because of
aseptic loosening in 17 patients, PJI in 17 patients, and others in 13 patients. Of the 17 patients in
PJI, 8 patients underwent two-stage exchange procedures. In the first surgical stage, after throughdebridement, ALAC beads and rod was replaced. In the second surgical stage, ALAC beads androd were removed, and a THA was performed. During the first and second surgical stage,
appropriate intravenous and oral systemic antibiotics were administered. Removed implants,
ALAC beads and rod in the surgical stage were subjected to sonication in a Bactosonic (BandelinGmbH, Berlin, Germany). The resulting sonication fluid was cultured for aerobic and anaerobic
bacteria.
Results: Of the 17 patients with aseptic loosening, 2 patient was positive for sonication for
Diagnosis of Implant-Associated Infections intraoperative conventional culture of periprosthetic
tissue. The sonication fluid culture of the removed ALAC beads and rod was negative in all
patients. One patient died from aspiration pneumonia after the second surgical stage. No
reinfection was observed at a mean follow-up of 12 months (range, 6-18 months). At last
follow-up, infection had been controlled and systemic antibiotics were not administered in all
patients.
Conclusion: Culture of sonicate-fluid has been shown to improve the diagnosis of
implant-associated infections. In the future, it may be common technique for diagnosis of
implant-associated infections associated with biofilm, but this new technique needs further study.

インプラント感染の診断, 治療の難渋する主な要因はバイオフィルムとその中の細菌であり, 我々はバイオフィルムの問題点を打破すべく, 2013年より超音波洗浄器を用いて人工関節感染やゆるみなどのインプラント抜去手術時に取り出したインプラント周囲のバイオフィルムを超音波により破砕し, その洗浄液を培養（超音波処理法）した。日本語
記載論文の内容では、2013年1月から10月までに当科でインプラントを抜去した36例を対象（男性7例, 女性29例）とした。 手術時平均年齢69歳（19〜90）であり, 抜去インプラ
ントは人工股関節19例, 人工骨頭9例, 人工膝関節4例, 観血的骨接合材料4例であった。抜
去理由は術前診断による深部感染12例, 非感染性ゆるみ16例, 頻回脱臼4例, 外傷後の変形性股関節症3例, インプラント破損1例であり, 摘出したインプラントは無菌下に超音波処理を施行した。術前は血液C-reactive protein(CRP)値と関節液の細菌培養検査（穿刺吸引法）を, 術中はインプラント周囲から採取する従来の細菌培養検査（従来法）と超音波処179

理をしたのち細菌培養検査（超音波処理法）を施行した。さらに病理組織検査も検討した。
術前血液CRP値の平均は, 深部感染例6.8±8.9mg/dl, 非感染性ゆるみ例0.4性1.0mg/dl, その他0.5±0.7mg/dlであった。従来法による術中の細菌培養検査の陽性率は, 深部感染例75%（9/12）, 非感染性ゆるみ例0%(0/15), その他0%(0/8)であり, 超音波処理を施行した細菌培養検査の陽性率は, 深部感染例83%(10/12), 非感染性ゆるみ例 6%(1/16), その他
0%(0/8)であった。 深部感染例において, 前医で抗菌薬が投与されており, 穿刺吸引法や従来法で細菌の検出を認めず, 超音波処理法でのみ細菌を検出できた症例を１例認めた。また, 非感染性ゆるみ例においても, 穿刺吸引法と従来法で細菌の検出を認めず, 超音波処理法にて細菌を検出した症例を1例認めた。
これまで我々の施設で超音波処理法を行ってきた結果, 従来の方法より生菌の検出感度が向上した。成果を学会発表および論文作成し, 本研究に対して災害外科財団より臨床研究に対しての下記助成を得た。本研究の中間報告は今年 1 月論文で報告し, 考えられた問題点を改善するための研究計画を行い, 2014 年１月よりコンタミネーションと超音波処理時間に関する検討を新たに開始し, さらに 2015 年 4 月より超音波処理に加えての新規診断方法の構築の研究を計画し、MSD より 2014 年 10 月に研究助成を得た。2015 年 2月に倫理委員会の承認を得て 3 月より PCR や次世代シーケンサーを用いた新規診断法の構築のための準備実験を行っており, 2015 年 4 月から臨床検体による検討を行っていく予定である。

優れた成果があがった点
人工関節感染やゆるみなどのインプラント抜去手術時に取り出したインプラント周囲のバイオフィルムを超音波により破砕し, その洗浄液を培養（超音波処理法）した。これまで我々の施設で超音波処理法を行ってきた結果, 従来の方法より生菌の検出感度が向上した。細菌が検出された症例の約 30%は従来の細菌培養検査のみの診断では不十分と考えられ, 超音波処理法のみ細菌検出できた症例も存在していた。従来法で不十分であった症例の 75％は複数細菌の検出例であった。
問題点
これまでの研究より超音波処理法の問題点が浮上した。まず, 生菌の検出率は増加したが各培養検査結果が一致しなかった症例を認め, コンタミネーションの可能性を否定できない。次に感染の術前診断であっても細菌検出できない症例が存在し, 要因として嫌気性菌などの培養が難しい細菌, 培養不可能な休眠状態の細菌が事態をさらに複雑にしていると考えられ, 超音波処理後の検体中に細菌が存在していても培養法で検出できない可能性がある。また, 培養による細菌の同定までに 5〜10 日程度は最低必要であり, 早急に治療に反映させるためには迅速かつ休眠状態の細菌や培養が難しい細菌も検出でき
るような検出感度の高い検査, 診断が期待される。

2. List of Publications
Original Articles
1. 植田成実, 䯨 賢一, 中村知寿, 岡本尚史, 上田祐輔, 飯田寛和. 超音波処理によるインプラント周囲感染診断 整形・災害外科 金原出版, 査読有, 58(1), 2015 年 1 月,
91-97
Proceedings
1. 植田成実, 䯨 賢一, 中村知寿, 岡本尚史, 上田祐輔, 飯田寛和. 超音波処理がインプ
ラント周囲不顕性感染症の診断に有用であった 1 例 HIP FORUM 軽井沢 (2013 年
7 月)
2. 植田成実, 䯨 賢一, 中村知寿, 岡本尚史, 上田祐輔, 飯田寛和. インプラント周囲不顕性感染症の診断に超音波処理が有用であった 1 例 第 122 回中部日本整形外科災害外科学会 愛知(2013 年 9 月)
3. 植 田 成 実 , 䯨 賢 一 , 中 村 知 寿 , 岡 本 尚 史 , 上 田 祐 輔 , 飯 田 寛 和 . Sonication for
Diagnosis of Implant-Associated Infections 26th Annual Congress, International Society forTechnology in Arthroplasty Frorida, USA(2013 年 10 月)
4. 植田成実, 䯨 賢一, 中村知寿, 岡本尚史, 上田祐輔, 飯田寛和. 超音波処理によるインプラント周囲感染診断の可能性 第 40 回日本股関節学会学術集会 広島(2013 年 11
180

5.
6.
7.

月)
植田成実, 䯨 賢一, 中村知寿, 岡本尚史, 上田祐輔, 飯田寛和. 超音波処理による人
工股関節感染の診断 第 44 回日本人工関節学会 沖縄(2014 年 3 月)
植田成実, 䯨 賢一, 中村知寿, 岡本尚史, 上田祐輔, 飯田寛和. 超音波処理処理によるインプラント周囲感染の診断 第 87 回 日本整形外科学会 神戸(2014 年 5 月)
植田成実, 䯨 賢一, 中村知寿, 岡本尚史, 上田祐輔, 飯田寛和. 整形外科手術における超音波処理を用いたインプラント周囲感染の診断(依頼：パネル) 第 37 回 日本骨感染症学会 東京(2014 年 6 月)

181

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Clarification of skin and soft tissue aging and tissue regeneration andapplication in diagnosis and treatment using molecular imaging.
皮膚・軟部組織の加齢変化、組織再生における分子イメージングによる病態解明と診断治療への応用

P.I.

Kenji Kusumoto, 楠本健司

Affiliation

Plastic and Reconstructive Surgery, 形成外科学講座

Collaborators

Keywords

E-mailkusumoto@hirakata.kmu.ac.jp

鈴木健司、森本尚樹、日原正勝、井口有子、覚道奈津子、田中義人、光井俊人、畔熱行、田中寧子、岩宮怜子. 山内崇史、小関梨奈、Priscilla V.、
小倉常敬、原朋也
regeneration, reconstruction, wound healing, tissue, cell, skin, fat, bone,cartilage, nerve, vessel 再生 再建 創傷治癒 組織 細胞 皮膚 脂肪
骨 軟骨 神経 血管

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
In our Department, biological and pathological wound healings are detailed investigated and after
applying various growth factors exchanges from pathological wound healing to normal woundhealing is evaluated by pathological molecular imaging procedures. Pathological molecular
procedures contributes basic research of wound healing and regenerative medicine to high-leveled
treatment and reconstruction in medical fields.
In our research in the period of April 2013 to March 2015, platelet-rich plasma(PRP),
adipose-derived stem cells(ASCs), high-pressured decellularization, bone regeneration, andelectric cell-tissue preservation are in main studied.
Adipose-derived stem cells (ASCs): Adequate mixture ratio of ASCs and normal fat cells is
clarified to keep the volume of the injected tissue. It is much meaningful that ASCs and normal fat
cells is available in the future broad medical field.
Platelet-rich Plasma (PRP): Activated PRP and freeze-dried activated PRP, which is preserved forweeks, are comparatively studied at the titer of growth factors, cell proliferation and effectivenessin wound healing models. Those are not different, then freeze-dried activated PRP is applied forlong period. It is much beneficial in the clinical usage of PRP.
High-pressured decellularization: In order to preserve a best scaffold for regeneration, skindecellularization under the condition of 200MPa of various pressure conditions is recognized. It
would be available against various cells and tissues.
Bone regeneration: As a clinical research, hydroxyapatite blocks are applied in the cases withfacial deformities. Hydroxyapatite material is much benefit at affinity and reproducibility.
Electric cell-tissue preservation:
It is clarified that under the condition of electric condition cells and tissues are preserved kept
fresh. The patent has been offered.
形成外科学講座では、生理的ならびに病的創傷治癒過程を検証し、種々の組織再生因子の付加により病的創傷治癒を生理的創傷治癒に近づける所見を病態分子イメージングでとらえることで、明らかな改善、治癒に関与するエビデンスを出している。この病態分子
イメージングにより明らかにされる創傷治癒、組織再生による基礎的現象を応用して、効果や精度の高い臨床的治療と再建に導く大きな役割を果たすことを目指している。
平成 25〜26 年度は、多血小板血漿（PRP）、脂肪組織由来幹細胞、高圧脱細胞化、骨再生、電場負荷での細胞・組織保存などで成果を挙げた。
脂肪組織由来幹細胞(ASCs)：ASCs による多分化能を明らかにし、骨、軟骨、脂肪などの組織再生により広い医学領域で応用可能であることを確認した。また、ASCs と正常脂肪細胞との生着のための適正混和比を明らかにし、将来の臨床応用での有効性の基盤となる
182

エビデンスを得た。
多血小板血漿(PRP)：PRP の活性化後とフリーズドライにした長期保存後とを比較検討し、
増殖因子、細胞増殖性、創傷治癒促進効果に同等の有効性を持つことが示された。PRPの今後の使用法の拡大に寄与する結果を得た。
高圧脱細胞化：皮膚組織に 200MPa 負荷により、脱細胞して足場（scaffold）としての皮
膚構築を目指す基盤を整えつつある。皮膚のみならず、多くの細胞・組織への応用が可能である。
骨再生： 臨床研究としてヒトの顔面変形に対して hydroxyapatite（HAP）の埋入検討を行った。HAP は材質的に組織親和性に優れ、形状の造形のための加工性にも富んでいた。
電場負荷条件での細胞組織の保存：電場負荷での細胞、組織の保存がより長期に行えることを示し、この特許申請を行った。

2. List of Publications
Original Articles
1. Katsube, M., Kusumoto, K., Nakano, M., Iguchi, Y. and Tanaka, Y. Application of poroushydroxyapatite blocks for maxillofacial deformities. Eur. J. Plast. Surg. 37, 461-468, 2014.
レフェリー有2. Inoue, T., Ohbayashi, T., Fujikawa, Y., Yoshida, H., Akama, T.O., Noda, K., Horiguchi, M.,
Kameyama, K., Hata, Y., Takahashi, K., Kusumoto, K. and Nakamura, T. Latent TGFβbinding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Hum. Mol.
Genet. 23, 5672-5682, 2014. レフェリー有3. Morimoto, N., Kakudo, N., Notodihardjo. P.V., Suzuki, S. and Kusumoto, K. Comparison ofneovascularization in dermal substitutes seeded with autologous fibroblasts or impregnatedwith bFGF applied to diabetic foot ulcers using laser Doppler imaging. Artif. Organs. 17,352-357, 2014. レフェリー有4. Kushida, S., Kakudo, N., Morimoto, N, Hara, T., Ogawa, T., Mitsui, T. and Kusumoto, K.
Platelet and growth factor concentrations in activated platelet-rich plasma: a comparison ofseven commercial separation systems. Artif. Organs. 17, 186-192, 2014. レフェリー有5. Kakudo, N., Morimoto, N., Ogawa, T. and Kusumoto, K. Potential of adipose-derived stem
cells for regeneration medicine: clinical application and usefulness of fat grafting. J. Stem
Cell Res. Ther. 4, Article No. 1000204, 2014. レフェリー有6. Kakudo, N., Morimoto, N., Kushida, S., Ogawa, T., and Kusumoto, K. Platelet-rich plasma
releasate promotes angiogenesis in vitro and in vivo. Med. Mol. Morphol. 47, 83-89, 2014.
レフェリー有7. Kushida, S., Kakudo, N., Suzuki, K. and Kusumoto, K. Effects of Platelet-Rich Plasma on
Proliferation and Myofibroblastic Differentiation in Human Dermal Fibroblasts. Ann. Plast.
Surg. 71, 219-224, 2013. レフェリー有8. Kakudo, N., Kushida, S., Suzuki, K. and Kusumoto, K. Effects of glycolic acid chemical
peeling on facial pigment deposition: Evaluation using novel computer analysis of
Digital-camera-captured images. J. Cosmet. Dermatol. 12, 281-286, 2013. レフェリー有9. Kakudo, N., Tanaka, Y., Morimoto N., Ogawa, T., Kushida, S., Hara, T. and Kusumoto, K.
Adipose-derived regenerative cell (ADRC)-enriched fat grafting: optimal cell concentrationand effects on grafted fat characteristics. J. Transl. Med. 11, Article No.254, 2013. レフェリー有Books
1. Kakudo N, Kushida S, Saito N, Suzuki K, Kusumoto K. Nova Science Publishers, Skin
Aging: New Research, A Procedure for the Assessment of Skin Aging, 2013, 131-136.
2. Kakudo N, Morimoto N, Kushida S, Iguchi Y, Kusumoto K. Nova Science Publishers,
Advances in Image Analysis Research, vol.11, Quantitative Evaluation of Facial Pigentation,
Wrinkles, and Pores Using Robo Skin Analyzer, 2014, 239-244

183

Proceedings
1. Notodihardjo Priscilla Valentin, 森本尚樹, 覚道奈津子, 松井誠, 田畑泰彦, 鈴木健司,
楠本健司. Combination of PRP and Biodegradable Gelatin Hydrogel Promotes Angiogenesis
and Wound Healing. 第 22 回日本形成外科学会基礎学術集会, 新潟市, 2013
2. 覚道奈津子, 森本尚樹, 櫛田哲史, 楠本健司. Platelet-rich plasma releasate の血管新生促進効果, 第 22 回日本形成外科学会基礎学術集会, 新潟市, 2013
3. 覚道奈津子, 森本尚樹, 原朋也, 小倉常敬, 楠本健司. 低酸素培養における脂肪組織
由来幹細胞の増殖効果. 第 22 回日本形成外科学会基礎学術集会, 新潟市, 2013
4. 覚道奈津子, 田中義人, 森本尚樹, 櫛田哲史, 原朋也, 楠本健司. ヒト脂肪組織由来間葉系前駆細胞（ADRCs）を用いた脂肪移植：移植脂肪の性状に与える至適細胞配合量の影響. 第 22 回日本形成外科学会基礎学術集会, 新潟市, 2013
5. 原朋也, 覚道奈津子, 森本尚樹, Notodihardjo Priscilla Valentin, 小倉常敬, 楠本健司.
多血小板血漿（PRP）が脂肪組織由来幹細胞（ASCs）の脂肪分化に与える影響. 第22 回日本形成外科学会基礎学術集会, 新潟市, 2013
6. 楠本健司, 福田智, 三宅ヨシカズ, 覚道奈津子, 櫛田哲史, Notodihardjo Priscilla
Valentin, 小倉常敬, 鈴木健司. 多血小板血漿（PRP）療法による創傷治療. 第 22 回日
本形成外科学会基礎学術集会, 新潟市, 2013
7. 森本尚樹, Pham Hieu Liem, 鈴木茂彦, 島耕史, 藤里俊哉, 馬原淳, 山岡哲二, 楠本健
司. 超高圧法を用いた皮膚の脱細胞化方法の検討, 第 22 回日本形成外科学会基礎学
術集会, 新潟市, 2013
8. 小倉常敬, 森本尚樹, 覚道奈津子, Priscilla Valentin, 原朋也, 楠本健司. フリーズドラ
イ技術を利用した Human Platelet-Rich Plasma の創傷治癒における至適濃度の検討. 第43 回日本創傷治癒学会, 大分県別府, 2013
9. 森本尚樹, Pham Hieu LIEM, 楠本健司, 鈴木茂彦. 人工真皮貼付創におけるニコチンの効果. 第 43 回日本創傷治癒学会, 大分県別府, 2013
10. 楠本健司, 森本尚樹, 福田智, 覚道奈津子, 三宅ヨシカズ, Valentin Prisilla, 小倉常敬,
原朋也. Principles of PRP and the PRP therapy. The 12th Korea-Japan Congress of Plastic
and Reconstructive Surgery, 仁川, 韓国, 2014
11. 小倉常敬, 森本尚樹, 覚道奈津子, 楠本健司. フリーズドライ技術を用いた長期保存
Platelet-Rich Plasma が有する創傷治癒促進効果の検討. 第 44 回日本創傷治癒学会, 仙台市, 2014
12. 覚道奈津子, 森本尚樹, 日原正勝, 尾川武史, Notodihardjo Priscilla Valentin, 楠本健司,
松井誠, 田畑泰彦. 多血小板血漿とゼラチンハイドロゲルを用いた血管新生効果の検討. 第 23 回日本形成外科学会基礎学術集会, 松本市, 2014
13. 覚道奈津子, 森本尚樹, 尾川武史, 原朋也, 小倉常敬, 楠本健司. ヒト脂肪幹細胞における低酸素下での FGF-2 産生の制御. 第 23 回日本形成外科学会基礎学術集会, 松本市, 2014
14. 原朋也, 覚道奈津子, 森本尚樹, 小倉常敬, 楠本健司. 多血小板血漿によるヒト真皮線維芽細胞の増殖機構の検討. 第 23 回日本形成外科学会基礎学術集会, 松本市, 2014
15. 小倉常敬, 森本尚樹, 覚道奈津子, 楠本健司. フリーズドライ Platelet-Rich Plasma を用いた創傷治癒促進効果の検討. 第 23 回日本形成外科学会基礎学術集会, 松本市,
2014
16. 森本尚樹. 線維芽細胞と bFGF～臨床試験から考える有効性と今後の展開～. 第 23 回
日本形成外科学会基礎学術集会, 松本市, 201417. 森本尚樹, 馬原淳, 神野千鶴, 覚道奈津子, 藤里俊哉, 山岡哲二, 鈴木茂彦, 楠本健司.
高圧を用いた皮膚の不活化の検討及び今後の臨床応用. 第 23 回日本形成外科学会基礎学術集会, 松本市, 2014
18. 覚道奈津子, 田中義人, 森本尚樹, 櫛田哲史, 原朋也, 楠本健司. ヒト脂肪組織由来間葉系前駆細胞（ADRCs）を用いた脂肪移植：移植脂肪の性状に与える至適細胞配合量の影響. 第 13 回日本再生医療学会総会, 京都市, 201419. 原朋也, 覚道奈津子, 森本尚樹, 小倉常敬, 楠本健司. BMP-2 ラット筋肉内異所性骨誘導能の加齢による影響. 第 13 回日本再生医療学会総会, 京都市, 2014
20. 森本尚樹, 伊藤蘭, 覚道奈津子, 楠本健司, 鈴木茂彦.bbFGF 保持型人工真皮の応用.
第 13 回日本再生医療学会総会, 京都市, 2014184

21. 小倉常敬, 森本尚樹, 覚道奈津子, 原朋也, 楠本健司. フリーズドライ技術を用いた
Human Platelet-Rich Plasma の創傷治癒促進効果および至適濃度の検討. 第 13 回日本
再生医療学会総会, 京都市, 2014
Patents
1. 名称：生体組織又は細胞の保存方法
出願番号：特願 2014−164746
発明者：薗田精昭、松岡由和、中塚隆介、飯田寛和
出願者：楠本健司、畔熱行、森本尚樹、覚道奈津子、原朋也、大野三規

185Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Elucidation of molecular mechanism of choroidal neovascularization, retinaldegeneration and retinal ischemia-reperfusion injury
脈絡膜血管新生、網膜変性症、網膜虚血再還流による障害の分子機構の解明

P.I.

Kanji Takahashi, 髙橋寛二

Affiliation

Ophthalmology, 眼科学講座

Collaborators

山田晴彦、尾辻剛、城信雄、三木克朗、盛秀嗣

Keywords

age-related macular degeneration, diabetic retinoathy, glaucoma
加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、緑内障

E-mailtakahask@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
In this fiscal year, we tried to clarify the relationship between neovascularization of the eye and its
causative factors.
First, we established our traditional animal models to develop ocular neovascularization like laser
induced choroidal neovascularization, hypoxic retinopathy, and ischemia-reperfusion injury. Last
year was our first year in new Kansai Medical University Hirakata campus, we had to prepare forthe facilities to use these animal models.
We have purchased several instruments like laser photocoagulation machine and fundus
photographic imaging instruments. This year, we could investigate further more about ocular
neovascularization compared to last year. To achieve better study circumstances, we purchased
real-time PCR instrument (TAKARA) in our laboratory.
This instrument helped us to investigate deeper about the mRNA expression in real time mannerand to compare the condition directly.
We have investigated further about type 1 choroidal neovascularization animal model,
micro-particle to inhibit choroidal and retinal neovascularization and anti neovascular mechanismof incretin-related drugs.
These experiments are still ongoing and will bring us some fruitful results in coming years.
当教室には伝統的な疾患モデル動物がある。教室の臨床テーマである、加齢黄斑変性に対してはレーザーによる脈絡膜新生血管の発生モデル、緑内障については水圧を利用した虚血再灌流モデル、糖尿病網膜症に対しては、低酸素網膜症モデルがある。平成２４年度から２５年度にかけて、重点的に設備の拡充を行なった結果、これらの伝統的モデル実験動物が再度使用可能となった。それらのモデル動物を使用する実験を行なう一方で、教室の新しい研究方向として、レーザーによる脈絡膜新生血管発生モデルに代表される Gass 分
類 2 型の脈絡膜新生血管モデルではなく、1 型の脈絡膜新生血管モデルを作成する手始めとして、blue light 暴露による網膜ストレスを惹起 し、1 型脈絡膜新生血管モデルを作製するプロジェクトを開始した。単なる blue light 暴露のみでは十分な酸化ストレスを与える事ができない可能性があったために、5-Ala を photosensitizer として利用した、加速実
験を同時に行なった。これについて、大学院生を中心にプロジェクトチームを再構成して、研究を開始した。残念ながらまだ十分な成果が得られていないが、酸化ストレスがどの程度網膜にかかっていたかを遺伝子的に調査するために、real time PCR 装置(TAKARA)を購入した。この事によって、rt-PCR を real time で観察する事によって遺伝子発現を定量化する事が教室の中で行なうことができるようになった。また、教室員の三木克朗は、科学研究費の財源を得て、脈絡膜新生血管治療の新しいアプローチとして、マイクロスフェア
を用いた新生血管抑制の研究を行っている。現在はマイクロスフェアを実験動物に導入して効果を判定し、同時に毎クロスフェアに薬剤を添加して、どのように脈絡膜新生血管が抑制されるかを検討する実験を行なっている。教室員の山田晴彦は、低酸素網膜症モデルを用いて、インクレチン関連酵素阻害薬が網膜にどのような影響を与えるかの研究を行い、購入した real-time PCR 装置で遺伝子発現についての検討を行っている。

186

優れた成果があがった点
教室の伝統的な動物モデルが高い再現性をもって再び利用できることになったこと。
Real-time PCR 装置を購入した事で、教室内で再現性の高い研究が可能となった。また、総研を利用せずに済むために順番待ちなどの時間的、空間的ロスを最小限にする事で、臨床科の問題である、時間の有効活用につなげることができた。
研究活動を持続的に行なって成果が現れてきた事で、科学研究費を得る事ができたこと（三木、尾辻）。
動物飼育に関する様々な装備を眼科研究室において整備し、本格的な実験研究が出来る環境が整った事。
問題点
眼科学教室としての人員に余裕が無く、臨床や、臨床研究にマンパワーを取られる結果、実験研究の進捗が予定よりも大幅に遅れていること。
実験動物の種類が SPF、コンベンショナルと２つの方法が同時に教室で混在するために、申請手続きが煩雑で、両者の切り替えにも時間を要するため、マンパワーの少ない当教室
では、このような切り替え作業が大きな負担となっている事。

187

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

The basic experiments of development for the diagnostic agent and the curative
drugs by the RI labelled antibody and Lipiodol for the solid tumors.
固形がんに対する RI 標識抗体・リピオドールによる早期イメージング診断剤および治療薬の開発における基礎研究

P.I.

Noboru Tanigawa, 谷川 昇

Affiliation

Radiology, 放射線科学講座

E-mailtanigano@hirakata.kmu.ac.jp

宇都宮啓太、菅野渉平、河野由美子
Collaborators
Keywords

共同研究者:株式会社ペルセウスプロテオミクス
RI therapeutic agent, In-111 labelled antibody, In-111-labelled lipiodol
RI 治療薬 Indium-111 標識抗体、Indium-111 標識リピオドール

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
The objective of this study is to develop the RI labelled antibody and Lipiodol to do the
proposal of the early confirmed-diagnosis and the treatment method for the solid-cancer at thesame time. The following three were performed and assessed.
ⅰ）To choose and decide optimal RI labelled antibody:
Various kind of RI (In-111, Ga-67, and Y-90) labelled Her 2 antibodies, which have different
chelate binding sites, were injected to the Xenograft (Her2-CHO, HCC1954) model mouse. The
SPECT/CT was performed for the imaging. The counts of the tumor and all organs were
measured. The difference of the two Xenograft group have now being evaluated.
ⅱ）To evaluate the Y-90 labelled CD38 antibody can be a therapeutic agent or not:In-111 labelled CD38 antibody was injected to the Xenograft bearing CD 38 positive Multiple
Myeloma cells (RPMI8226, NCI-H929, MM.1R). The SPECT/CT for CD 38 imaging was
performed at 3 day after the injection, whose results that greater RI accumulation was seen in thetumor, which suggests Y-90 labelled CD38 antibody can be a therapeutic agent for the Multiple
Myeloma.
ⅲ）To establish Y-90 labelled Lipiodol therapy for the Liver metastases:
Cold Lipiodol and Y-90 labelled Lipiodol were injected through the common hepatic artery of
the rabbits respectively. The kinetics of the Lipiodol in the rabbit was assessed by the SPECT/CT.
The therapy effect of the cold Lipiodol and hot Lipiodol was compared to the Contorl without any
Lipiodol. In conclusion, the hot Lipiodol is most effective in the three.
In addition to the above, it became possible to make Xenografts model mouse bearing
Her2-CHO, HCC1954, RPMI8226, NCI-H929 and VX2 liver metastases model rabbit without failat any time. In-111 labelled antibodies (Her2, CD38) and Y-90 Lipiodol were also possible to bemade without fail at any time (more than 95% labelling rate).

本研究の目的は固形癌の早期確定診断と治療方法の提案が同時にできる、RI 標識抗体や RI 標識リピオドールによる診断薬・治療薬を開発することである。26 年度は下
記の 3 点が確認・評価された。
ⅰ）固形癌の治療に最適な RI 標識抗体を選びだすため；キレート剤結合方法が異なる抗 Her2 抗体に RI（In-111, Y-90, Ga-67）を標識し、それらを Her2 発現細胞（Her2-CHO, HCC1954 細胞）を移植した xenograft モデルマウス
へ投与した。そして、SPECT/CT でのイメージングおよび臓器ごとのカウントを測定し、腫瘍への特異性および生態内動態を評価した。結果は現在検討中である。
ⅱ）Y-90 標識 CD38 抗体が上記の薬剤となりうるか検討するため；
CD38 陽性多発性骨髄腫細胞株（RPMI8226,NCI-H929,MM.1R）をヌードマウスの皮188下に移植し、In-111 標識抗体を静注した。3 日後に SPECT-CT の撮像を行ったところ、移植腫瘍に強い RI 集積が認められ、正常組織への集積はほとんど認められなかった。この事は Y-90 標識 CD38 抗体が治療薬となりうることを示唆している。
ⅲ）RI 標識 lipiodol を用いた肝放射線塞栓術の確立のため；
VX2 細胞をもちいた家兎肝転移モデルに、Cold Lipiodol, Y-90 標識 Lipiodol を投与した。そして、SPECT/CT にて、リピオドールの体内動態を評価した。さらにそれぞれ投与群の治療後経過を観察している。結果、Y-90 標識 Lipiodol 投与群では Control
群や Cold Lipiodol 投与群にひし明らかな延命効果を得ている。
優れた成果があがった点
ⅰ）Xenograft マウスはいずれも安定的な作成が可能となった。
ⅱ）VX2 による肝転移モデルの安定的な作成が可能となった。
ⅲ）In-111 標識抗体,Y-90 標識 Lipiodol はすべて 95％以上の高い安定性を確保できるようになった。
ⅳ）移植腫瘍への In-111 標識抗体の経時的変化をイメージングできた。
ⅴ）Y-90 標識 Lipiodol での治療効果が確認できた。
問題点ⅰ）腫瘍成長が早く内部壊死を生じるため、イメージングに適したサイズの検討が必要である。
ⅱ）SPECT の撮像法の最適化および統一が必要である。

2. List of Publications
Original Articles
1. Kanno, S., Utsunomiya, K., Kono, Y., Tanigawa, N. and Sawada, S. The effect of radiation
exposure on multidrug resistance: in vitro and in vivo studies using non-small lung cancer
cells. EJNMMI Res. 5, 11, 2015. レフェリー有2. Kono, Y., Utsunomiya, K., Kanno, S. and Tanigawa, N. Longitudinal time dependent effectsof irradiation on multidrug resistance in a non-small lung cancer cell line. Mol. Cancer Ther.
13, 2706-2712, 2014. レフェリー有189

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Research for imaging of intracellular function and structure
細胞内機能と構造のイメージングに関する研究

P.I.

Masami Kageshima, 影島賢巳

Affiliation

Physics, 物理学講座

Collaborators

竹本邦子，新庄正路

Keywords

atomic force microscopy, soft X-ray microscopy, regenerative medicine, X-ray
slution scattering
軟 X 線顕微鏡、原子間力顕微鏡、再生医療、X 線小角散乱法

E-mailmkage@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTSIn Department of Physics three faculty staffs are independently in pursuit of the following
research subjects related to the present project.
1. Soft X-ray microimaging of prokaryotic organelle (Prof. Kuniko Takemoto)The goal of this study is to observe an unprocessed prokaryotic cell and identify the prokaryoticorganelles. Generally it has been said that there are not any organelles in prokaryotic cells.
However, many biologists has categorized a compartment bounded by a biological membrane witha dedicated biochemical function as an organelle. Improvement of an optical system and opticalsurface plate of soft X-ray microscope (XM) beamline BL-12 at SR Center of Ritsumeikan
University enabled a high-contrast X-ray transmission imaging and X-ray computed tomography(X-ray CT). Unique and diverse organelles were confirmed. Polyphosphate granule andcarboxysome were identified, respectively. In addition, a new freezing system for CT samples
were designed. The freezing system was placed without contacting with the XM system. The
isolated cryogenic system allows to avoid unwanted system vibrations which usually accompany
the operation of a cryogenic gas flow and lead to deterioration of three-dimensional (3D)reconstructed image. Using the new cryogenic system, we succeeded 3D imaging of hydrous
Phormidium tenue.
2. Analysis of anomalous dynamical properties of nano-confined water using atomic force
microscopy(Prof. Masami Kageshima)
Dynamical properties of water molecule confined into nanometer-scale hydrophilic gap is
crucial for understanding molecular scale biological phenomena. By using state-of-the-art atomic
force microscopy technique relaxation time of water monolayer and bilayer confined betweenhydrophilic substrate and hydrophilic AFM probe was successfully measured. Both monolayer andbilayer exhibited a strong shear thinning behavior with slightly different parameters. This fact
implies a possibility that this system is in a characteristic glassy state. Application of this approachto biomimetic systems like those involving polymer-covered surface is now planned.
3. Development of novel mechanical analysis method of cell sheet for regenerative medicine(Prof. Masami Kageshima and visiting assistant Dr. Toshiro Maruyama)
Sheet of cells or extracellular matrix cultured in vitro is a promising approach to novel
regenerative medicine for restoration of vessel wall, retina, etc. Since these sheet sample are
extraordinary thin, typically of the order of 10 μm, despite its large dimension readily exceeding 1
cm, analysis of its mechanical property is difficult. In the present research, a novel mechanicalindenter was developed by accurately regulating magnetic force exerted onto the sample via anelectromagnet. With this system it is possible not only to measure static mechanical parameters of
the sample material but also to analyze various dynamical properties as a response to a mechanicalload with various waveforms. Extension of this method to higher loading force regime is now
planned.
4. Structural analysis of Protein A and its mutant in solution (Dr. Masaji Shinjo)
We investigate structures of Protein A and its mutant by X-ray solution scattering. Previous
results were confusing because X-ray damage to the proteins disturbed precise analysis. This time,
we adopted time resolved measurements to estimate X-ray damage to the proteins. As a result, we190

could exclude scattering data from X-ray damaged proteins and got clear scattering data to
analyze. The measurement condition were confirmed.
① 軟 X 線顕微鏡による細胞内機能イメージング
原核細胞オルガネラの X 線顕微イメージングと構造同定を目指している。未処理で細胞径が 1 m 以下の微細シアノバクテリア Phormidium tenue と Synechococcussp.を、放射光を光源とした軟 X 線顕微鏡で観察し、原核細胞オルガネラの観察と構造同定を行った。
顕微鏡ビームラインの改良を行い、高コントラスト 2 次透過像およびµ-CT 断層像観察を可能にした。さらに放射線損傷の軽減および固定のため試料の凍結装置を導入すること
で、含水状態の観察に成功した。
② 原子間力顕微鏡によるナノギャップ中の水分子の特異的応答の解明
分子レベルの生命現象の理解の鍵となる、親水性ナノギャップ中の水の物性を計測し、シア応答が、非ニュートン的なシア・シンニングを示すことを確認し、特異なガラス状態にある可能性を示唆した。
③ 再生医療用細胞シートの物性計測法の開発
再生医療用の細胞シートや細胞外マトリックスシートは 10 μm のオーダーの薄さにして cm レベルの広さを持ち非常に柔らかいため力学物性計測が非常に困難である。
そこで、高精度に制御された磁気力を用いる新たな力学物性計測方法を開発した。
④ ProteinA 及びその変異体が溶液内でとり得る構造の解析
X 線小角散乱法により、ProteinA 及びその変異体の溶液内での構造を調べた。従来、測定によるデータのバラツキが大きく、解析の妨げとなっていたが、実験方法を見直し、X線によるダメージを受けた試料タンパクの影響を排除することによりデータを有効に生かせるようになった。

2. List of Publications
Original Articles
1. Ikegaya, H., Suzuki, S., Ichise, S., Furuta, S., Wakabayashi, S., Ohigashi, T., Bamba, D.,
Namba, H., Kihara, H., Kishimoto, N. and Takemoto, K. Estimation of organic carbon
content of the cyanobacterium synechococcus sp. by soft X-ray microscopy, Geomicrobiol. J.
32, 827-835, 2015. (査読有)2. Kageshima, M. Layer-resolved relaxation dynamics of confined water analyzed throughsubnanometer shear measurement, Eur. Phys. Lett. 107, 66001, 2014. (査読有)3. Matsumura, Y., Shinjo, M., Matsui, T., Ichimura, K., Song, J. and Kihara, H. Structural studyof hNck2 SH3 domain protein in solution by circular dichroism and X-ray solution scattering.
Biophys. Chem. 175-176, 39-46. 2013. (査読有)4. Takemoto, K., Usui, K., Ohigashi, T., Fujii, H., Yoshimura, M., Namba, H. and Kihara, H.
Improvement of cryogenic 3-dimensional observation system of soft x-ray microscope at theSR center of Ritsumeikan University. J. Physics Conf. Ser. 463, 012009, 2013. (査読有)5. Takemoto, K., Mizuta, G., Yamamoto, A., Yoshimura, M., Ichise, S., Namba, H. andKihara, H. Soft x-ray imaging of intracellular granules of filamentous cyanobacterium
generating musty smell in Lake Biwa. J. Physics Conf. Ser. 463, 012052, 2013. (査読有)6. 竹本邦子, 軟 X 線顕微鏡と蛍光顕微鏡によるシアノバクテリアの観察, 応用物理,
83, 293-296, 2014. (査読有)
7. 竹本邦子, 吉村真史, 大東琢治, 山本章嗣, 一瀬 諭, 難波秀利, 木原裕, 軟 X 線顕微鏡による琵琶湖産糸状カビ臭産生藍藻の細胞内微細構造観察, 放射光, 27, 258-266,
2014. (査読有)
8. 影島賢巳, 原子間力顕微鏡による物性計測技術の最近の進歩. ぶんせき , 2014,292-297, 2014. (査読有)9. 影島賢巳，原子間力顕微鏡を用いた動的物性計測の新展開，化学工業, 64, 17-24, 2013.
(査読無)10. 影島賢巳，原子間力顕微鏡を用いた動的物性計測―ナノメータースケールの粘弾性を
191

いかに測るか. 検査技術, 8, 8-16, 2014. (査読無)Books
1. 共著 竹本邦子, 軟 X 線顕微鏡によるバイオイメージング, O plus E（アドコム・メデ
ィア, 編集 油井識親）, 2014, 36(3) 301-30.
Proceedings
1. 吉村真史, 石井達也, 村上翔一, 竹本邦子, 木原裕, 難波秀利, 太田俊明. 結像型軟 X
線顕微鏡のクライオ機構の改良と CT 観察, 日本放射光学会, 草津市, 2015 年 1 月.
2. Takemoto, K., Yoshimura, M., Yamamoto, A., Ichise, S., Namba, H. and Kihara, H. Imagingof Musty-Odor-Producing Filamentous Cyanobacteria by Various Microscopies, 12th
International Conference on X-Ray Microscopy 2014 (XRM2014), Melbourne, Austraria,
Oct. 2014.
3. Yoshimura, M., Takemoto, K., Ohigashi, T., Namba, H., Kihara, H. and Ohta, T.
Three-Dimensional Observation of Soft X-Ray Microscope at the SR Center of Ritsumeikan
University, 12th International Conference on X-Ray Microscopy 2014 (XRM2014),
Melbourne, Austraria, Oct. 2014.
4. 大東琢治, 吉村真史, 竹本邦子, 難波秀俊, 木原裕, 結像軟 X 線 CT による 3 次元構造
観察, 日本バイオイメージング学会学術集会, 吹田市, 2014 年 9 月.
5. 竹本邦子, 吉村真史, 一瀬諭, 難波秀利, 木原裕, Ｘ線顕微鏡による Phormidium tenueとされている琵琶湖産糸状シアノバクテリアの微細構造観察. 日本放射光学会, 広島
市, 2014 年 1 月.
6. 吉村真史, 竹本邦子, 木原裕, 難波秀利, 太田俊明, 軟 X 線顕微鏡の高度化と現状.
日本放射光学会 広島市, 2014 年 1 月.
7. 竹本邦子, 山本章嗣, 一瀬 諭, 吉村真史, 塩野正道, 西村雅子, 水田 剛, 難波秀利,
木原 裕. Phormidium tenue とされている琵琶湖産糸状藍藻の微細構造観察 ― XM，TEM，低真空クライオ SEM による ―, 日本水処理生物学会, 神戸市, 2013 年 11 月.
8. 竹本邦子, 一瀬 諭, 吉村真史, 難波秀利, 木原 裕. 軟 X 線顕微鏡によるカビ種物質
産生藍藻 Phormidium tenue の微細構造観察, 日本バイオイメージング学会, 東京,
2013 年 9 月.
9. 影島賢巳, 丸山敏朗, 赤間智也, 中邨智之. 磁気力を用いた細胞シート力学物性計測法の開発（招待講演）第 10 回バイオプティクス研究会，小金井市，2013 年 12 月.
10. 影島賢巳. シア下での水和水粘弾性応答の分子層分解計測. 第 3 回ソフトマター研究会, 八王子市, 2013 年 12 月.
11. 影島賢巳. 原子間力顕微鏡でのシア粘弾性計測による水和水ガラス状態の検証，第 61回応用物理学会春季学術講演会，相模原市，2014 年 3 月．
12. 影島賢巳. シア下の水和水粘弾性応答の原子間力顕微鏡による分子層分解計測. 日本
物理学会第 69 回年次大会, 平塚市, 2014 年 3 月.
13. Kageshima, M. Is hydrated water in nanometer-scale space glassy at room temperature?–amolecularly resolved shear study with atomic force microscopy, 9th Liquid Matter
Conference, Lisbon (Portugal), July 2014.
14. Kageshima, M. Non-Newtonian Relaxation of Confined Water Layers Studied with
Sub-nanometer Shear Modulation of AFM Probe, 18th International Conference on
Non-Contact Atomic Force Microscopy, Tsukuba, August 2014.
15. 影島賢巳. せん断応答から見たナノ空間水分子の非線形緩和（招待講演）. 第 11 回バイオプティクス研究会, 豊中市, 2014 年 12 月.
16. 影島賢巳. 親水性表面間のサブナノメーター厚さの水の非ニュートン的シア特性. 第4 回ソフトマター研究会, 名古屋市, 2015 年 1 月.
17. 木原裕, 市村薫, 新庄正路. Protein A の溶液内構造，物構研サイエンスフェスタ. つくば市, 2014 年 3 月.

192

（参考資料１１）各事業推進者の平成 27 年度研究成果報告

Research activities 2015 by MICD core members

Division of Neuroscience

神経部門
Regenerative Neural Medicine, 神経機能再生医学（解剖学第一）講座
Anatomy and Brain Science, 脳構築学（解剖学第二）講座
Cellular and Molecular Physiology, 細胞分子生理学（生理学第一）講座
Cognitive Neuroscience, 高次認知脳科学（生理学第二）講座
Molecular and Functional Biology, 分子生体機能学（医化学）講座
Neurology, 神経内科学講座
Neuropsychiatry, 精神神経科学講座
Medical Control of Stress Response, 侵襲反応制御学(麻酔科学)講座

194

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

In situ imaging of neural cells and their function
神経細胞機能の in situ イメージング

P.I.

Hisao Yamada, 山田久夫

Affiliation

Regenerative Neural Medicine, 神経機能再生医学（解剖学第一）講座

Collaborators

田中進、平原幸恵、大江総一、小池太郎、滝澤奈恵

Keywords

Mass microscope, myelin, O4 Mab, oligodendrocyte, sulfatide 質量顕微鏡、ス
ルファチド、オリゴデンドロサイト、髄鞘、O4 モノクローナル抗体

E-mailyamada@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Visualization of sulfatide during oligodendrocyte differentiation processes with imaging
mass spectrometry
Myelin, a part of oligodendrocyte, is rich in two glycosphingolipids, galactosylceramide(GalC) and its sulfated form, galactosylceramide I3-sulfate (sulfatide). GalC is 23 wt.% andsulfatide is 4 wt.% of the myelin total lipid in central nervous system. Sommer and Schachner
characterized oligodendrocyte specific monoclonal antibodies O1 and O4 that were generated byfusion of mouse myeloma cells with spleen cells immunized with bovine corpus callosum. The
following studies speculated the antibody epitope for O1 and O4 are GalC and sulfatide,
respectively. Not only the matured oligodendrocytes but also the pro-oligodendroblasts showed
immunohistochemically positive to O4 monoclonal antibody, however, the O4 antigen, sulfatide,
was not detected by using 35SO4 incorporation in cultured oligodendroblasts and subsequent TLC
analysis. Therefore, the O4 antibody has been suspected to cross-react with different antigens fromsulfatide in the embryonic stage.
In the present study, we used imaging mass spectrometry to show sulfatide existed on restricted
regions of the ventral zone of the spinal cord at 13.5-days’ embryonic (E13.5) mouse, where
pro-oligodendroblasts first appear. At this stage, short-chain sulfatide with 16 and 18 carbon fatty
acids were predominant, and they gradually expands from the ventral spinal zone to lateral part in
medulla and pons. At E19.5, sulfatide with 22 carbon fatty acids appear in ventral zone of spinal
cord. In adult mouse spinal cord, long-chain sulfatide with 24 carbon fatty acids became
dominant. As well as, the O4(+)/O1(-) pro-oligodendroblasts obtained with a flow cytometriccell-sorter contained sulfatide with short chain (18 carbon) fatty acids. These data strongly suggestthat the sulfatide with short chain fatty acids exist at pro-oligodendroblast stage, and that longer
chain of fatty acid of sulfatide species change during oligodendrocyte maturation and myelin
forming. Next, we examined oligodendrocyte differentiation in cerebroside sulfotransferase (CST)-null mice that completely lack sulfatides. The number of immature oligodendrocytes in E14.5
CST-null mice was lower than that in wild type cervical spinal cord. However, the population of
the immature cells in CST-null mice increased rapidly and became comparable with that in wild
type E16.5 mice. Moreover, in oligodendrocyte primary culture from CST-null mice embryo,significant decreasing in the number of immature oligodendrocytes was shown at 3 day in vitro,and it recovered to a normal level at 5 day in vitro. These results prove that the sulfatide with shortchain fatty acids species regulates the early oligodendrocyte development.
我々の研究室では、分子レベルでのイメージング解析手法を用いて、神経系各細胞の分化過程を追究している。今回の報告は、髄鞘の脂質を質量分析イメージング法にて解析し、モノク
ローナル抗体のエピトープ部位を確定した成果である。追究するミエリン形成細胞オリゴデン
ドロサイト (OL) は、脂質に富む細胞であり、これら糖脂質が分化マーカーに使われている。
O4 モノクローナル抗体は、胎生期 OL 前駆体細胞から生後の髄鞘形成に至るまでの OL の分化成熟過程を認識する細胞マーカーとして、一般的によく使用されている。O4 抗体の認識部
位に関しては、硫酸化糖脂質、スルファチドであると類推されているが、胎生期の脊髄腹側部から発生する O4 陽性前駆細胞では、スルファチド合成が確認されないと報告されたため、胎生期の標本において O4 抗体は、スルファチド以外の物質を交差認識していると考えられてきた。そこで我々は、組織標本中の脂質分布密度を高い解像度で検出できる質量分析イメージン
グ法を使い、この胎生期に出現する O4 抗体のエピトープの実態を検証した。
ウシ脳由来の様々な脂肪酸をもった 12 種類のスルファチドのスペクトルを同定した後、O4陽性 OL 前駆細胞発現領域として報告されているニワトリ胚 8 日目脊髄組織に対して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析をおこなった。測定データから含有分子の195

イオン分布を画像化し、スルファチド分布の比較を行った結果、脊髄組織全体に広がって分布するホスファチジルイノシトールに対して、脊髄腹側部特異的に脂肪酸の短い C16 スルファ
チドと C18 スルファチドのシグナルを認めた。これらは、ミエリン鞘に豊富に存在する C24
スルファチドとは異なるものである。一方で、質量分析イメージング法において、成獣ミエリ
ン鞘では、様々な長さの脂肪酸をもったスルファチドが検出可能であるが、スルファチドを合成する酵素、セレブロシド硫酸基転移酵素 (CST) を欠損するマウス脳では、髄鞘に含まれるすべてのスルファチドは消滅していた。CST 欠損マウスでスルファチドは合成されないこと
は、生化学的解析でも明らかで、かつ組織化学的に O4 陽性細胞も出現しない。従って、質量分析イメージング法で示すスルファチドの値は信頼性が高いといえる。胎生期マウスでも質量分析イメージング観察したところ、OL 前駆体細胞の発生母地で C18-OH スルファチドが優位に検出され、この所見が脊髄中心管近傍から延髄、橋へと OL の発生過程局在移動に従って捉えられた。CST 欠損マウス胎生期の OL 前駆体数減少も考慮すると、スルファチドは胎生期
OL 系譜決定期から生後髄鞘構築期に至るまで合成され重要な機能を担っている。

優れた成果があがった点
胎生期オリゴデンドロサイト前駆細胞における O4 抗原の実態を明らかとした。もっとも優れたオリゴデンドロサイトマーカーとして世界中で使用されている抗体の特異性を明らかとしたことは、神経研究、特にグリア細胞分化過程の研究に大きく貢献することになる。

問題点
質量顕微鏡での条件検討には時間がかかる。また、特定分子を検出器でとりだし、それをフラグメント化し分子の最終同定を行うが、組織上での夾雑物が多いせいか、なかなかうまくいかない。質量分析による確実なデータを取るため、今後の条件検討が必要である。
（本成果のケースでは、ターゲット分子のノックアウト像と比較することにより、そのデータが信頼できるものとした）

2. List of Publications
Original Articles
1. Koike, T. and Yamada, H. Diverse functions of Sox2 in the peripheral nervous system. J.
Kansai Med.Univ. 66, 7-11, 2015.
2. Koike, T., Wakabayashi, T, Mori, T., Hirahara, Y. and Yamada, H. Sox2 promotes survival ofsatellite glial cells in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 464, 269-274, 2015.
3. Takamori, Y., Wakabayashi, T., Mori, T., Kosaka, J. and Yamada, H. Organization andcellular arrangement of two neurogenic regions in the adult ferret (mustela putorius furo)
brain. J. Comp. Neurol. 522, 1818-1838, 2014.
4. Koike, T, Wakabayashi, T., Mori, T., Takamori, Y., Hirahara, Y. and Yamada, H. Sox2 in theadult rat sensory nervous system. Histochem. Cell Biol. 141, 301-309, 2014.
Books
1. 森徹自, 山田久夫. 細胞系譜追跡の組織化学, 中西印刷
織細胞化学 2014, 175-187, 2014.

日本組織細胞化学会編

組

Proceedings
1. Koike T, Hirahara Y, Yamada H. Elongation of the axon initial segment of DRG neuron andproliferation of glial cells. 第 38 回日本神経科学大会（神戸）2015 年 7 月
2. 山田久夫. 組織化学の進化とともに歩んだ 35 年を振り返って. 第 56 回日本組織細胞化学会総会・学術集会 会長講演（枚方）2015 年 10 月
3. Mori T, Wakabayashi T, Hirahara Y, Takamori Y, Koike T, Kurokawa K, Yamada H. Cell
cycle analysis of endogenous neural precursors in the adult mouse brain after brief seizures.
第 120 回日本解剖学会総会・全国学術集会（神戸）2015 年 3 月
4. 平原幸恵. モノクローナル抗体 O4 のエピトープに迫る. 第 56 回日本組織細胞化学会
総会・学術集会 シンポジウム（枚方）2015 年 10 月

196

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Analysis of mouse lateral striatum using antibodies for GAD1, GPR155, Calb1
and dopamine receptors.
ニューロンの共存マーカーによる線条体外側部の解析

P.I.

Tetsuo Sugimoto, 杉本哲夫

Affiliation

Anatomy and Brain Science, 脳構築学（解剖学第二）講座

Collaborators

Stefan Trifonov、山下雄司、丸山正人、加瀬政彦

Keywords

GAD1, GPR155, Calb1, DRD1, DRD2

E-mailsugimoto@hirakata.kmu.ac.jp

グルタミン酸脱炭酸酵素 1、カルビンディン、ドーパミン受容体 D1、D2

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Our current studies revealed that the lateral region of mouse striatum has some features quite
different from those in the middle striatal region. The neuronal GAD1 content in the lateral region
was ~1.5-fold higher than the medial striatum as measured by quantitative PCR. We disclosed two
GAD1 isoforms probably contributing to the generation of multiple GAD1 gene transcripts. The
regional expression of Calb1 was at low to middle levels in the lateral region contrasted by theexpression in the middle region which has Calb1 expression at high levels. A unique membraneprotein GPR155 was predominantly expressed in the lateral region. GPR155 was detected almost
exclusively in medium spiny neurons that contain D1 dopamine receptors.
線条体は行動の順序・判断・情報の統合調整を担当する。マウスにおいて感覚運動皮質から直接強い投射を受ける線条体外側部をテーマに取り上げて imaging 研究をすすめてきた。これまで線条体外側部に関して（１）Calbindin-poor 領域に位置する（２）Calbindin
発現の多少により、前・中・後部の３部にわけられる（３）中部のニューロンは GABA
合成酵素 GAD1 をとりわけ高度に発現する（４）GAD1 mRNA アイソフォームは 10 種類
存在しており、中部では線条体内側部に比較して約 1.5 倍のアイソフォーム発現上昇を示すことを見出した（平成 23～26 年度成果報告）。本研究ではマウス線条体外側部に高発現を示す膜タンパク GPR155 のニューロン局在を免疫蛍光法で調べた。用いたマーカー抗体
は、GPR155 のほか GAD1、DRD1、DRD2、Calb1 で Alexa 標識二次抗体を組合せて多重標識像を得た。この結果、GAD1 陽性、DRD1 陽性を示した。GPR155/GAD1/D1 陽性ニューロンがとくに線条体外側部に集中したことから、感覚運動皮質の情報を基底核出力部に伝える Direct pathway 担当ニューロンの本体であると考えられる。

優れた成果があがった点
線条体の D1 ニューロンの機能、薬理学的特性および病態での意義に関し、今後の研究をすすめるに当たり、GPR155 をマーカーとして研究を深化できることが判った。

2. List of Publications
Original Articles
1. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M. and Sugimoto, T. Overview andassessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase
activity in transgenic animals. Anat. Sci. Int. 91, 56-67, 2016. レフェリー有Proceedings
1. 加瀬政彦, 山下雄司, Trifonov, S., 丸山正人, 杉本哲夫. DiI 注入法による Bcas1 in situ
hybridization 陽性細胞の形態描出. 第 56 回日本組織細胞化学会総会・学術集会, 枚方,2015 年 10 月．
2. 山下雄司, Trifonov, S., 丸山正人, 加瀬政彦, 杉本哲夫. マウス線条体外側部から起始す
る GPR155 含有黒質投射線維の解明. 第 38 回日本神経科学大会, 神戸, 2015 年 7 月.
3. 加瀬政彦, 山下雄司, Trifonov, S., 丸山正人, 杉本哲夫. In situ hybridization 標識細胞の総合的解析法. 第 120 回日本解剖学会総会・全国学術集会, 第 92 回日本生理学会大会
合同大会, 神戸, 2015 年 3 月.
197

Annual Report 研究成果報告書
Imaging of disease-related molecules and cells

Title of Project

病因分子および細胞のイメージング

P.I.

Hiroko Matsuda, 松田博子

Affiliation

Cellular and Molecular Physiology, 細胞分子生理学（生理学第一）講座

Collaborator

武藤恵、林三樹夫、Andharia Naaz

Keywords

Cl- channel, CFTR, epithelial transport, electrophysiology, synaptic plasticity,
IPSC

E-mailmatsudah@hirakata.kmu.ac.jp

Cl-チャネル、CFTR、上皮膜輸送、電気生理、シナプス可塑性、抑制性シナプス後電流

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Pancreatic acini secrete ATP and nucleotide-modifying enzymes. Adenosine, the end productof ATP, stimulated transepithelial ion transport through cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator (CFTR) Cl− channels in pancreatic duct cell monolayer. However, mechanism of theregulation has not been extensively investigated. Therefore, the present study aimed to clarify
the regulation of Cl− channels by adenosine in pancreatic duct cells. We measured whole-cellcurrent in human pancreatic duct cells (Capan-1) using gramicidin-perforated patch techniques.
The application of adenosine induced Cl− currents in Capan-1 single cells. The effects of
adenosine on whole-cell Cl− currents were inhibited by CFTR Cl− channel inhibitor(CFTRinh-172). Immunohistochemical analysis showed that the adenosine A2A and A2B
receptors co-localized with Ezrin, an A-kinase anchoring protein, in the luminal membranes ofCapan-1 monolayers and in rat pancreatic ducts. These results indicate that adenosine A2A andA2B receptors associates with Ezrin and accomplishes the compartmentalization of cAMPsignaling in the luminal membranes of pancreatic duct cells. Luminal adenosine may be anotherimportant coordinator for acini-to-duct signaling, and, by virtue of supporting ductal secretion, it
may help to flush out digestive enzymes delivered from acini.
GABAA receptor-mediated inhibitory postsynaptic currents (IPSCs) regulate the excitatory
synaptic transmission by modifying activity of the principal cells, but plasticity of the inhibitory
synapses has not been sufficiently characterized. Several investigators reported that repetitive
depolarization of principal cells facilitates or suppresses inhibitory synaptic transmission. Thus,
direction (facilitation or suppression) and mechanism of the plasticity remain to be established.
We recorded GABAAergic sIPSCs in acute slices of neonatal rat hippocampus. Using whole cell
patch-clamp recording method, effect of the repetitive postsynaptic depolarization on the sIPSCs
was determined. Depolarization of postsynaptic neurons alone did not cause marked alteration of
the frequency or amplitude of sIPSCs. Simultaneous activation of presynaptic and postsynaptic
neurons, however, induced transient decrement of the frequency of the sIPSCs. In the presenceof antagonists of metabotropic glutamate receptors (mGluRs), the inhibition of the sIPSCs causedby this simultaneous activation was suppressed, though the presynaptic activation was not
replaced by application of the mGluRs agonist. An antagonist of CB1 receptor also reduced theinhibition of GABAAergic currents. These results suggest that pre- and postsynaptic activationtransiently inhibits the sIPSCs and CB1 receptor probably participates in this inhibition.
膵臓は、重炭酸イオンを豊富に含む液性成分と消化酵素から構成される膵液を分泌する。それに加えて、膵液には ATP および ATP 加水分解酵素が分泌される。その結果、膵
液中の ATP はアデノシンへと分解されると考えられるが、アデノシンの生理学的意義は不明のままである。そこで本研究は、アデノシンによる膵液分泌の調節機構を明らかにすることを目的とした。
グラミシジン‐パッチクランプ法を用いて、膵臓導管細胞 (Capan-1)に機能発現する陰イオン電流を測定した。また、免疫組織化学法を用いてアデノシン受容198

体の細胞内分布を調べた。細胞外のアデノシンは Capan-1 細胞の陰イオン電流を増加させた。その電流は cAMP 活性型 Cl チャネル抑制薬 (CFTRinh-172) により抑制された。単層
Capan-1 細胞およびラット膵臓導管細胞の管腔側膜において、アデノシン A2A 受容体および A2B 受容体は A キナーゼアンカータンパクの Ezrin と共局在していた。以上の結果
は、管腔側膜のアデノシン受容体は Ezrin および cAMP 活性型 Cl チャネルとタンパク複合体を構成し、膵液分泌を調節することを示唆する。
興奮性シナプスの活動依存性の可塑性は学習・記憶のモデルとみなされている。GABAA
受容体を介する抑制性シナプス後電流 (IPSC) は、プリンシパル細胞の活動を修飾することで興奮性シナプス伝達を調節しているが、抑制性シナプスの可塑性については未だ十分に解明されていない。本研究においては、幼若海馬のスライス標品から GABAA 受容体作動性の自発電流 (sIPSC) をパッチクランプ法で記録し、反復するプリンシパル細胞の脱分極に対する反応を観察した。シナプス後細胞の脱分極のみによっては sIPSC に明らかな変化はみられず、シナプス後細胞とシナプス前細胞が同時に活性化される条件のもとでは、sIPSC 頻度の一過性の低下が観測された。代謝型グルタミン酸受容体のアンタゴニス
トはこの低下を抑制したが、アゴニストの投与によってはシナプス前細胞の活性化を再現できなかった。また CB1 受容体のアンタゴニストは sIPSC 頻度の一過性の低下を抑制した。以上よりシナプス前後の細胞の興奮が一過性に sIPSC を減少させていること、この過程に CB1 受容体が関与していることが示唆された。

優れた成果があがった点特記するほどの優れた成果は得られなかった。
問題点
特記するほどの問題点はない。
2. List of Publications
Original Articles
1. Okada, M., Corzo, G., Romero-Perez, G.A., Coronas, F. and Matsuda, H. Possani LDA pore
forming peptide from spider Lachesana sp. venom induced neuronal depolarization and pain.
Biochim. Biophys. Acta 1850, 657-666, 2015. 査読有
2. Okada, M., Andharia N., and Matsuda, H. Increase in the titer of lentiviral vectors expressing
potassium channels by current blockade during viral vector production. BMC Neurosci. 16,
Article No. 30, 2015. 査読有199

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

The role of serotonin and dopamine for cognitive processes in the primate.
霊長類におけるセロトニン・ドパミンによる認知機能の制御

P.I.

Kae Nakamura, 中村加枝

Affiliation

Cognitive Neuroscience, 高次認知脳科学（生理学第二）講座

Collaborators

磯田昌岐、上田康雅、則武厚、安田正治

Keywords

dopamine, serotonin, monkey, reward, sociality, doral raphe N., hypothalamus,

E-mailnakamkae@hirakata.kmu.ac.jp

basal ganglia, striatum, frontal cortex ドパミン、セロトニン、サル、報酬、
社会性、背側縫線核、視床下部、大脳基底核、線条体、前頭葉

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
1.

To reveal the role of the basal ganglia in decision making in face of both appetitive andaversive options, we derived a saccade task in which three monkeys chose a visual target
associated with a better option; rewards over tones, tones over airpuffs, and rewards over
airpuffs. We found that when one of the choice options was associated with an aversive
airpuff, the animals made suboptimal choices more often; chose the visual target associatedwith an airpuff. The autonomic response; the heart rate and the pupil size that reflect thedegree of stress also increased, indicating that optimal decision making process was impaired
under the situation. We next recorded neuronal activity from the caudate, an input channel ofthe basal ganglia, while the animals performed the task. We found that a great proportion of
the caudate neurons encoded the information about the inclusion of an aversive stimulus,
indicating that stress-related information is processed in the caudate. These results suggestthat the stress impaired the reward-based decision making process by the neuronalmechanisms involving the basal ganglia.

2.

We also investigated the role of dopamine in the subjective value coding in the social
environment. The value of one’s own reward is influenced by a reward to others. Such asocial reward comparison is ubiquitous in daily life. However, it remains unclear which brain
regions, or networks, monitor others’ reward information and thereby determine a subjective
value of one’s own reward. To address this issue, we devised a task for monkeys in which areward comparison between self and other was incorporated. Behavioral analyses revealed
that the monkey lowered the value of one’s own reward, albeit the same amount of receipt,
when a reward to another increased. Electrophysiological recording showed that largely
non-overlapping populations of medial prefrontal neurons coded self-reward information andother-reward information, while midbrain dopamine neurons coded a subjective value of
one’s own reward. These findings suggest that distinct classes of neurons in meso-cortical
networks participate in reward valuation in social settings.

3.

We further asked the role of the frontal cortex on regulation of mood and motivation.
Repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) is a noninvasive method to modulate
specific part of the brain, and rTMS on the frontal cortex has been used for the treatment ofmajor depression disorder. The mechanism of this effect, however, is unknown. We
hypothesized that the modulation of the frontal cortex leads changes in dopamine andserotonin system which in turn leads to the modulation of reward –information processing.
To this end, we applied rTSM over the frontal cortex of the awake monkey and examined theeffects on its behavior. We found that rTMS reduced the behavioral change depending on theamount of reward in a long time scale, but not in a short time scale. This result suggests thatthe neuronal circuit including prefrontal cortex is involved in the generating the mood basedon long-term reward information. So far, the animal studies regarding the effect of rTMS
were confined to examining the on-line change of behavior during stimulation or
physiological change of the brain in vivo after the stimulation. However, no study has notreported the long-term effect of rTMS on animal's behavior. Our result opens up the path fordetailed analysis for the long-term effect of rTMS on the emotional system in the brain.

1. 報酬の獲得や嫌悪刺激からの回避のために行動を選択することは、動物やヒトの生存200

にとって非常に重要である。これまでの研究から、報酬獲得行動においては、大脳基底核
線条体におけるドーパミンの作用を中心にその神経メカニズムが明らかにされてきた。しかし、嫌悪刺激情報処理による選択行動のメカニズムについては不明であった。そこで
我々は報酬と嫌悪情報両方を処理する選択課題を 3 頭のサルに行わせた。また、動物が嫌悪感覚を持っているという客観的な指標として、心拍数と瞳孔径を課題遂行中に測定した。課題では、二つの視覚刺激を同時に呈示し、二つのうち一つを眼球運動により選択させた。この結果、選択肢の中に嫌悪刺激と結びついた選択肢が存在すると、そのような選択肢が無い場合に比べて、不適切な行動選択の割合が増加し、反応時間が有意に変化し、さらに心拍数の上昇と瞳孔径の有意な上昇が観察された。これらの結果は、嫌悪刺激の存在がストレス反応と同時に適切な行動選択の障害を引き起こすことを示す。さらに、大脳基底核線条体（尾状核）の単一神経細胞活動を記録すると、これらのストレスの影響を受けていると考えられる発火を示すニューロンが多く見つかった。以上のことから、嫌悪刺激によるストレスは大脳基底核線条体で行われる情報処理プロセスに影響を与え、適切な行動選択を阻害している可能性を示唆した。これらの成果を日本神経科学大会（2015）で報告した。
2. 次に、ドーパミン細胞が社会的関係の中での主観的価値も表していることも明らかにした。実社会では、自己の評価は他者との比較を通じてなされる場合が多い。自他比較にもとづく相対評価の神経機構を明らかにするため、自他の報酬情報処理をモデルとし、２頭のサル個体を同時に用いた行動・神経生理実験を実施した。まず、サルが自己の報酬価
値を、他者の報酬との比較にもとづいて決定することを行動学的に示した（他者の報酬量が増加すると、自己の報酬量は同じであってもその主観的価値が低下する）。続いて、ドーパミン細胞および同細胞から強い投射を受ける前頭葉内側皮質細胞の活動を記録・解析した。その結果、大部分の前頭葉内側皮質細胞は、自己と他者の報酬情報を個別に表現するのに対し、大部分のドーパミン細胞は、両者の比較をもとに自己報酬の主観的価値を表現することを明らかにした。これらの成果を日本神経科学大会（2015）で報告した。
3. さらに、ドーパミン細胞・セロトニン細胞へ投射を送る前頭葉が情動のコントロールを行っていることを明らかにした。反復経頭蓋磁気刺激 (rTMS) は、非侵襲的に特定の脳部位の活動に変化を与える手法である。これまで、前頭葉への rTMS が、うつ病などに代表される気分障害の治療に効果を持つという報告が数多くなされてきている。情動の変動における、前頭葉の作用機序を明らかにするために、我々はサルの前頭葉に rTMS を施し、その行動への影響を調べた。課題では一定の報酬を予測させる視覚刺激呈示後ボタンを押す。その際、報酬大か中 (high value contxt) と中か小 (low value context) の二つのコンテ
キストを設定した。すると、反応時間は報酬の量の差だけでなく、コンテキストの影響も見られた。すなわち、同じ報酬中であってもコンテキストによって異なる反応時間を示す
ことがわかった。一方、前頭葉外背側部の 1Hz 低頻度刺激により、コンテキスト間の差への影響が減弱し、コンテキスト内の差のみをコードすることがわかった。
このことは、前頭葉を含む情動系神経回路が、おそらくその投射先であるセロトニン系を介して長期的な報酬情報に基づいた情動の変化に関わることを示唆する。これらの成果は
日本神経科学大会（2015）で報告した。

優れた成果があがった点
1. これまで、心拍や脈波を用いたストレス強度の評価に関しては、主にヒトを用いた実験系によって行われてきた。今回、我々はサルにかかるストレス強度をこれらの指標を用いて評価する事に成功した。これによって、嫌悪に関わるストレス情報を客観的に測定することが可能となり、動物を使った特に嫌悪刺激情報下での意志決定に関わるプロセスの解明に大いに役立つことが期待される。
2. これまで、報酬・罰に関する価値や価値づけに関する研究は一個体内のものが多く、社会的な相互作用を対象にしたシステム研究、特に生理学的手法を用いた研究は少ない。本研究により前頭葉内側部における他者－自己間の報酬価値の情報処理過程の一端を明らかにすることができた。自己と他者の比較にもとづく報酬価値の相対評価において、大脳皮質細胞と皮質下ドーパミン細胞が異なる役割を担うことを明らかにした。
201

これまでの rTMS を用いた動物実験では、rTMS 中の行動変化、もしくは in vitro における
rTMS 後の脳内変化などが報告されている。しかしながら、今回我々が行ったような、rTMS
による長期的な効果を観察した動物実験の報告は、まだ行われていない。今回の成果は、rTMS による情動系への長期的な影響を詳細に分析するための、新たな道を切り開くものと期待される。
問題点
特にない。

2. List of Publications
Original Articles
1. McCairn, K.W., Iriki, A. and Isoda, M. Common therapeutic mechanisms of pallidal deepbrain stimulation for hypo- and hyperkinetic movement disorders. J. Neurosci. 114,
2090-2104, 2015. 査読有
2. Hayashi, K., Nakao K. and Nakamura, K. Appetitive and aversive information coding in the
primate dorsal raphe nucleus. J. Neurosci. 35, 6195-6208, 2015. 査読有
3. Burton, A.C., Nakamura, K. and Roesch, M.R. From ventral-medial to dorsal-lateral striatum:
Neural correlates of reward-guided decision-making. Neurobiol. Learn Mem. 117, 51–59,
2015. 査読有
4. YYasuda, M. and Hikosaka, O. Functional territories in primate substantia nigra pars
reticulata separately signaling stable and flexible values. J. Neurophysiol. 113, 1681-1696,
2015. 査読有
5. 磯田昌岐；神経科学 ニホンザルの神経生理 自己の動作と他者の動作を区別する神経回路. Clin. Neurosci. 33, 147-150, 2015. 査読無6. 磯田昌岐； 社会的認知機能の生理学的理解：サルを用いた研究から. 神経心理学, 31,
17-25, 2015. 査読無7. 則武厚, 磯田昌岐；社会的階層と集団サイズ. 生体の科学, 66, 72-75, 2015. 査読無Proceedings
1. 中村加枝. Appetitive and aversive information coding in the primate dorsal raphe nucleus.
第 92 回日本生理学会大会・第 120 回解剖学会総会全国学術総会合同大会, 神戸
2015/03
2. 磯田昌岐. Probing social brain functions using an electrode. 第 38 回日本神経科学大会,
神戸, 2015/07
3. 上田康雅, 中村加枝. The impact of aversive information on the choice behavior, autonomic
responses, and the activity in the caudate in monkeys. 第 38 回日本神経科学大会, 神戸,
2015/07
4. 安田正 治, 中村晋也 , 岡田研一 , 飯島敏夫 , 小 林康 , 筒 井健一郎 , 中村 加枝 . An
integrated system for the quantitative measure of motivation and emotion in monkeys. 第 38回日本神経科学大会, 神戸, 2015/07
5. 山中航, 堀由紀子, 上田康雅, 南本敬史, 木村實. Centromedian nucleus of thalamus
exhibits neuron circuit-specific signals during a new learning of action-outcome associations.
第 38 回日本神経科学大会, 神戸, 2015/07

202

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Elucidation of pathogenesis and development of diagnosis and treatment of
intractable neural diseases
難治性神経疾患の病態解明と診断治療法の開発

P.I.

Seiji Ito, 伊藤誠二

Affiliation

Molecular and Functional Biology, 分子生体機能学（医化学）講座

Collaborators

松村伸治、下條正仁、片野泰代、西田和彦、井上明俊、舩津宣雄

Keywords

Diabetic neuropathy, imaging mass spectrometry, nerve regeneration, nSR100,
spinal cord, two-photon microscopy 糖尿病性ニューロパシー、質量顕微鏡、神経再生、nSR100、脊髄、二光子励起顕微鏡

E-mailito@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Molecular Imaging
We expanded the previous research of in vivo functional imaging to in vivo molphlogicalimaging in the spinal cord by two-photon microscopy. We first demonstrated that molphologicalalterations of spines in the neurites of the spinal dorsal horn folloing inflammation in the foot andleg via activation of AMPA and NMDA receptors.
We succeeded in in vivo imaging of testosterone in the testis after human chorionicgonadotropin (hCG) by imaging mass spectrometry. After derivatization of testosterone with
Girald’s T reagent, mass peak at m/z = 402.3 and MS/MS/MS peak at m/z = 343.1 were assigned
to testosterone and their distribution was localized in Leydig cells and spermatocyte in theseminiferous tubules.
1.

Approach from basic research to clinical application
We established the sciatic nerve transection – regeneration model in Thy1-YFP mice which
express fluorescent protein YFP specifically in the nervous system and pursuited peripheral nerve
regeneration over several months. The sciatic nerve comprises both sensory and motor nerves. In
this nerve regeneration model, we found that it took 4 weeks to cross a 5-mm gap, but it took only
2 weeks to reach the tip of foot, more than 4 cm distant from the transection site. We also
demonstrated that JNK, a member of MAPK, and neurotrophic factors played a role in nerve
regeneration at early and late phases. Now we have prepared type 2 diabetic model mice andstudied the mechanism of diabetic neuropathy and its treatment in a combination with nerve
transection- regeneration mode. We have also studied similarities and differences in molecules andpathway between itch and pain.
2.

3. Screening of miRNA expression in the serum of small cell lung cancer patients anddevelopment of RNAi drugs.
The RE1-silencing transcription factor (REST; also called the neuron-restrictive silencer factor;
NRSF) is one of the major silencing transcription factors controlling the expression of numerous
neuron-specific genes. Shimojo demonstrated that the expression of an SCLC-specific isoform of
REST (sREST) was highly expressed in small cell lung cancer (SCLC) cells and that sREST correlates withthe pathogenesis of SCLC. Furthermore, nSR100, an activator of REST alternative splicing, was also

highly expressed in SCLC and promoted the alternative splicing of REST. nSR100 expression was
regulated by a kind of miRNA. In the collaboration with clinical departments in cancer-related
consortium, Shimojo found that miRNAs were highly expressed in the serum of SCLC patientsand correlated with the expression of sREST and nSR100. He proposed the screening of siRNA tothe development of anti-cancer drug. This proposal was adopted by Japan Agency for Medical
Research and Development (AMED) in 2015.
１．分子イメージング
蛍光タンパクを発現させたマウスで炎症に伴い脊髄後角の樹状突起のスパイン形成が起こること、そのスパイン形成にグルタミン酸受容体が関与することを二光子励起顕微鏡を用いて、世界で始めて in vivo でイメージングすることに成功した。
質量顕微鏡を用いた分子イメージングで性腺刺激ホルモンで刺激した精巣でテストス
テロンのイメージングに検出に成功し、Leydig 細胞と精細管の外側に位置する精原細胞
でその局在を明らかにした。
203

２．基礎研究から臨床応用へのアプローチ
坐骨神経切断―再生モデルを用いて、長期間神経再生を in vivo で追跡できる系を確立した。坐骨神経は皮膚感覚を脊髄に伝える一次求心性線維と筋肉から運動ニューロンに位置感覚を伝える求心性線維と運動ニューロンから遠心性に筋肉に情報を伝える遠心性線
維が混在している。この動物モデルを用いると、神経損傷の間をうめるのには時間がかかるが、損傷した神経が遠位部の切断端に到達すると神経再生の速度が速くなること、MAP
キナーゼファミリーの中で、神経再生に関与するのは JNK であること、神経栄養因子の
NGF、GDNF などが関与していることを次々と明らかにした。
現在、糖尿病性ニューロパシーの治療に向けて 2 型糖尿病モデルマウスを作製し、糖尿病性ニューロパシーの病態と治療法の開発に着手している。
さらに、痒みモデルを作製し、疼痛と痒みの共通点と相違点を明らかにしている。
３．小細胞肺がん患者血清中の miRNA のスクリーニングと核酸医薬の開発
神経特異的抑制性転写因子(REST あるいは NRSF) はさまざまな神経に特異的な遺伝子の発現を神経組織で抑制する転写因子である。下條は小細胞肺がん（SCLC）由来の株細胞で SCLC に特異的な REST の変異体(sREST) が強く発現していることと SCLC の発病と相関していることを見つけた。さらに、選択的プライシングにより REST から sREST の発現に変換させる因子 nSR100 も SCLC 細胞に強く発現し選択的スプライシングを促進ていることを示した。nSR100 の発現はいくつかの miRNA により制御されていた。 がん関連コンソー
シアムで臨床系講座との共同研究で、ある miRNA が小細胞肺がんに高く発現していることから、この miRNA が sREST と nSR100 の発現制御に関わっていると考えた。そして、
nSR の発現を抑制する siRNA の合成とスクリーニングにより抗がん剤の開発を日本医療研究機構 (AMED) に提案し、2015 に採択された。

2. List of Publications
Original Articles
1. Shimma, S., Kumada, H-O., Taniguchi, H., Yao, I., Furuta, K., Matsuda, T. and Ito, S.
Microscopic visualization of testosterone derivatives on mouse testis tissues using imaging
mass spectrometry. Anal. Beoanal. Chem. in press, 2016.
2. Kawabata, K., Nishimura, I., Fujiwara, T., Terauchi, S., Minami, T., Ito, S. andOkuda-Ashitaka, E. Intrathecal administration of low-dose Nociceptin/Orphanin FQ induces
allodynia via c-Jun N-terminal kinase and monocyte chemoattractant protein. Eur. J.
Neurosci. in press, 2016.
3. Nguyen H. T., Katano, T., Matsumura, S., Pham M. V., Muratani, T., Minami, T. and Seiji Ito.
Role of c-Jun N-terminal kinase in late nerve regeneration monitored by in vivo imaging of
thy1-yellow fluorescent protein transgenic mice. Eur. J. Neurosci. 43, 548-560, 2016.
4. Matsumura, S., Taniguchi, W., Nishida, K., Nakatsuka, T. and Ito, S. In vivo two-photon
imaging of structural dynamics in the spinal dorsal horn in an inflammatory pain model. Eur.
J. Neurosci. 41, 989-997, 2015.
5. Omoto, H., Matsumura, S., Kitano, M., Miyazaki, S., Minami, T. and Ito, S. Comparison of
mechanisms of allodynia induced by acromelic acid A between early and late phases. Eur. J.
Pharmacol. 760, 42-48, 2015.
6. Shudo, Y., Shimojo, M., Fukunaga, M. and Ito, S. Pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide is regulated by alternative splicing of transcriptional repressor REST/NRSF in
nerve injury. Life Sci. 143, 174-181, 2015.
7. Uchida, H. and Ito, S. Differential regulation of RNA-ending enzymes, ADAR1 and ADAR2,
expression by 5-aza-2’-deoxycytidine and trichostatin A in human neuronal SH-SY5Y cells.
Neuroreport 26, 1089-1094, 2015.
8. Nguyen H. T., Katano, T., Matsumura, S. and Seiji Ito. Involvement of endothelin B receptor
in peripheral nerve regeneration using sciatic nerve transection-regeneration model. Pain Res.
30, 167-172, 2015.
9. Shimojo, M., Shudo, Y., Ikeda, M. Kobashi, T. and Ito, S. The small cell lung cancer-specificRE1-silencing transcription factor (REST) isoform is regulated by neural-specific Ser/Arg
repeat-related protein of 100 kDa (nSR100). Mol. Cancer Res. 11, 1258-1268, 2014.
Books
1. 西田和彦、伊藤誠二（2015）8 章：体性感覚の受容と伝達の分子機構「分子脳科学」
204

2.
3.

DOJIN BIOSCIENCE SERIES 三品昌美編（化学同人）89-98 頁（全 312 頁）
伊藤誠二（2015.6）PACAP と神経障害性痛「痛みの Science & Practice 第 8 巻 臨床に役立つ神経障害性痛の理解」（文光堂）29-30 頁（全 285 頁）
伊藤誠二（2016 出版予定）「分子から痛みを理解する」ブルーバックス（講談社）

Proceedings
1. Pham, M.V., Nguyen, H.T., Katano, T., Matsumura, S. and Ito, S. Two feasible mouse models
for neuropathy. The 2nd Gene & Immunotherapy Conference in Vietnam 2015, Ho Chi Minh,
September 25-26, 2015.
2. Nguyen, H. T., Matsumura, S. Katano, T., and Ito, S. Involvement of c-jun N-terminal kinase
in neurite extension of cultured DRG neurons. The 45th annual meeting of the Society for
Neuroscience, Chicago, October 17-21, 2015.
3. Katano, T., Watanabe, M., Yamazaki, M., Abe, M., Yao, I., Sakimura, K. and Ito, S.
Localization of neuropathic pain-related protein, BEGAIN in the spinal dorsal horn. The 45th
annual meeting of the Society for Neuroscience, Chicago, October 17-21, 2015.
4. Matsumura, S., Taniguchi, W., Nishida, K., Nakatsuka, T. and Ito S. Chasing morphologicalchanges of neuronal processes in the spinal dorsal horn in an inflammatory pain model byusing two-photon microscopy. The 45th annual meeting of the Society for Neuroscience,
Chicago, October 17-21, 2015.
5. Shimojo, M., Shudo, Y., Ito, S. Selective siRNA-mediated suppression of nSR100(SRRM4)
induces the cell death of small cell lung cancer. The 45th annual meeting of the Society for
Neuroscience, Chicago, October 17-21, 2015.
6. Nguyen H. T., Katano, T., Matsumura, S. and Ito, S. New mechanisms for pain control andclinical potential. International Conference on Pain-Anesthesiology and pain control-, Hanoi,
November 20, 2015.
7. 熊田アンリオバディア、谷口久哲、矢尾育子、古田享史、松田公志、伊藤誠二. 質量
顕 微 鏡 に よ る テ ス ト ス テ ロ ン の マ ウ ス 精 巣 に お け る 可 視 化 . Visualization of
testosterone on mouse testis with imaging mass spectrometry. 第 40 回日本医用マススペク
トル学会年会、ポスター発表、浜松（アクトシティ浜松コングレスセンター）、2015、
9 月 17-18 日

205

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Analysis of intracytoplasmic inclusions of neurodegenerative diseasesby
imaging mass spectrometory
パーキンソン病モデルラットを用いた大脳基底核神経回路の可塑性の研究

P.I.

Hirofmi Kusaka, 日下博文

Affiliation

Neurology, 神経内科学講座

Collaborators

金子鋭、和手麗香、中村正孝、隠岐光彬

Keywords

Parkinson’ disease、6-OHDA model mouse、RT-PCR
パーキンソン病、6-OHDA モデルマウス、リアルタイム PCRE-mailkusaka@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Background
Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disease presenting progressive motor
dysfunction. Its major neuropathological feature is dopaminergic neuronal loss in the substantia
nigra pars compacta. Dopaminergic treatment is effective initially, but it becomes less effective
and motor complications such as dyskinesia and wearing off appear in the advanced stage of thedisease. Not only presynaptic neuronal loss at nigrostriatal dopaminergic synapses, but also
postsynaptic dysfunction is considered to cause the decreased effectiveness. Non-dopaminergic
neurotransmitters, such as glutamate, endocannabinoids and adenosine have been attracting
attention recently to participate in the pathophysiological process of the postsynaptic dysfunctionof Parkinson’s disease. To evaluate postsynaptic changes of nigrostriatal dopaminergic synapses,
we analysed mRNA expressions of non-dopaminergic neurotransmitter receptors in
6-OHDA-lesioned rats and levodopa-induced dyskinesia (LID) rats.
Methods
6-OHDA was stereotaxically injected into the unilateral medial forebrain bundle of SD rats tomake unilateral PD model rats. These rats were subdivided into three groups and treated asfollows; 1) no medication, 2) continuous levodopa infusion, and 3) intermittent levodopa
injection. Two weeks after the treatment, involuntary movements such as dyskinesia were scored.
Frozen brains were coronally sectioned at 1 mm thickness. Approximately 0.7 mg of tissue fromputamen was die-cut by 18 guage non-bevel needle. Random hexamer-generated cDNA wasapplied to real time PCR. Expression of mRNA on the operated side was compared to that on theunoperated side.
Results
Dopamine D1 and D2 receptor mRNAs were not elevated on the operated side of the putamen
in untreated PD model rats. Dopamine D2 receptor mRNA was elevated in continuously levodopa
infused rats. Both dopamine D1 and D2 mRNAs were elevated in intermittently levodopa injectedrats.
Endocannabinoid CB1 receptor mRNA was increased on the operated side of putamen in all rats
regardless of levodopa treatments.
LID was observed only in rats treated with levodopa intermittently. Adenosine A2a receptor(A2A) mRNA was increased on the 6-OHDA-treated side of putamen in these rats.
Discussion
1) Real time RT-PCR provided regional quantitation of mRNA expression in the basal ganglia of
PD model rats.
2) Increased A2A mRNA was associated with LID, but whether it is a cause or a result of LID is
not yet determined.
背景と目的
Parkinson disease (PD) は黒質緻密部ドパミン性神経細胞の脱落を特徴とする進行性の神経変性疾患である。病初期にはドパミン補充療法が有効であるが、進行に伴い wearing
off や dyskinesia といった運動合併症および全体的な薬効の低下が起こり治療に難渋する。
これらはドパミン神経の脱落による大脳基底核での presynaptic な変化だけでは説明出来
206

ず、postsynaptic あるいは extrasynaptic な変化も伴っていると考えられる。近年、大脳基底核回路に関する非ドパミン系伝達物質の関与が言われており、それらに対する PD 治療の応用が期待されている。本研究は PD モデルラット、およびレボドパ誘発性ジスキネジ
ア(LID)モデルラットを用いてドパミン神経の脱落後に生じる postsynaptic や extrasynaptic、
さらにはネットワークレベルでの変化を解明し、PD の進行に伴って薬効が減弱していく
機序や、進行期に LID が発症する病態生理を明らかにし、新たな治療戦略を見いだすことを目的とする。
材料と方法
SD rat 雌 体重 220～250g の片側 medial forebrain bundle に、6- Hydroxydopaminehydrobromide(6-OHDA)を施注し一側性の PD モデルラットを作成した。この PD モデルラットに対して、①無治療、②持続的レボドパ投与、③間欠的レボドパ投与、の処置を行い、二週間後のジスキネジアをスコア化して評価した。また①～③の処置を行ったラットの凍結線条体組織において real time RT-PCR 法によりドパミン D1・D2 受容体(drd 1・2)、
adenosine A2A 受容体、mGluR5 受容体、CB1 受容体や proenkephalin、prodynorphin などの mRNA 量を定量し術側と健側とで比較した。
結果および考察
無治療群ではドパミン D1, D2 受容体 mRNA の増加は見られなかったが、レボドパ持続的投与群ではドパミン D2 受容体、レボドパ間欠投与群ではドパミン D1 および D2 受容体の mRNA が術側線条体で増加していた。レボドパ治療の有無によらず、endocannabinoid
CB1 receptor mRNA は術側線条体で増加していた。
LID は③のレボドパ間欠投与群においてのみ発症し、同群では術側線条体において、
adenosine A2A 受容体 mRNA の発現増加がみられた。

優れた成果があがった点
1. 凍結脳組織における mRNA 発現量の局所的かつ定量的な解析方法を確立した。
2. LID 発症の背景に A2A 受容体 mRNA の増加が確認された。
3. パーキンソン病の治療薬として新たなターゲットになり得ることが示された。
問題点
A2A 受容体 mRNA の増加が LID 発症の原因なのか、LID 発症に対する代償的変化なのかを解明する。このモデル系を用いて LID 発症抑制につながる治療薬を検索する。

2. List of Publications
Original Articles
1. Oki M, Hori S, Asayama S, Wate R, Kaneko S, Kusaka H. Early-onset Parkinson’s diseaseassociated with chromosome 22q11.2 deletion syndrome. Intern. Med. 55, 303-305, 2015.（査読有り）
Proceedings
1. Oki, M. Kaneko, K. Iida, S. Itani, K. Tsuge, A. Nakamura, M. Wate, R. Norihiro Takenouchi,
N. Kusaka, H. Regional quantitation of mRNA in 6-OHDA-lesioned rats by real time
RT-PCR. 第 56 回日本神経学会学術大会・新潟・2015 年 5 月

207Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Alterations of Mirror Neurons in Patients with Schizophrenia
ミラーニューロンの形態変化：
拡散テンソル画像解析による精神科治療効果判定

P.I.

Yukiko Saito, 齊藤幸子

Affiliation

Neuropsychiatry, 精神神経科学講座

Collaborator

木下利彦、Martha Shenton

Keywords

mirror neurons, diffusion tensor imaging

E-mailsaitoyu@takii.kmu.ac.jp

ミラーニューロン、拡散テンソル画像解析

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Background and aim
The neural basis of impaired mirror neurons in schizophrenia is not completely understood The
aim of this study is to evaluate the white matter microstructure of the tracts of mirror neurons inpatients diagnosed with schizophrenia. A secondary aim is to test for an association between
measures of white matter microstructure and Social function Scale. Mirror neurons are known tocontribute to creating a sense of intimacy, and there is evidence that dysfunction of mirror neurons
may be one of the core deficits of socially isolating disorders such as autism and schizophrenia. To
the best of our knowledge, this is the first study to investigate the structural connectivity of themirror neuron system in first episode schizophrenia.
Methods
Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired on 20 patients and 20 controls. Fractional
anisotropy (FA) and Trace were measured. In this study, we evaluate the fiber tracts generatedusing an unscented Kalman filter based two-tensor tractography algorithm. This method makes it
possible to follow tracts that pass through branching and crossing regions of the brain.
申請者らが研究対象とするミラーニューロンは、この社会的認知に深い関連を有すると考えられる。ミラーニューロンは、相手の行動を自分が行動するときの回路を使って処理することで理解するという脳システムの一端を担っている。
「心の理論（theory of mind）」と関連しているとも言われ、下頭頂小葉から前運動野に投射するニューロンである。
ミラーニューロンと精神分析的精神療法は関連が深い。2005 年 Gallese らによるとミラ
ーニューロンは、フロイトが提唱してきた精神療法の現場でおこる「無意識の交流」や「投影性同一視」「共感」「転移逆転移」と関連がある。
申請者は、精神分析の第一人者である日本精神分析協会会長衣笠隆幸先生に精神分析的精神療法について毎週指導を受けながら、精神分析的精神療法を患者に実施している。一方で Harvard 大学
医学部精神科 Psychiatry Neuroimaging Laboratory(精神画像研究所)と連携し、拡散テンソル画像解析を用いた
ミラーニューロンの描出に取り組んでいる。
平成 27 年度は、Harvard 大学医学部精神科精神画像研究所と連携することで、ようやく本邦でもミラーニューロンを含んだ脳白質繊維の描出に成功した（2015
図 1：ミラーニューロンの 3 次元構築
年 5 月、図 1、図 2）。既に 3 テスラ MRI を用いて対象患者の MRI 拡散テンソル画像を撮像しており（20 名の統合失調症患者と 16 名の強迫性障害患者、神経症 11人、チック 1 人、健常者 33 人）うち 2 名が精神分析治療対象者である。関西医大では精神分析治療を受ける
対象者が少ないことから日本精神分析協会会長の衣笠隆幸先生の協力を得て広島から 10 名ほどの精神分析対
象者を向後 2 年ほどかけて集める予定である。ミラー
図 2：緑：ミラーニューロン
ニューロンの障害程度を数値化することにも成功していて、統合失調症患者の結果から論文化する予定である。
208

優れた成果があがった点
1. ミラーニューロンに関連が深いとされる精神分析的精神療法の指導を受けた点。
2. 健常者の脳 MRI データをある程度収集できた点。
3. Harvard 大学の脳画像解析ソフトをまだ関西医科大学に移植することができた点。
問題点
成果報告として発表はしたが論文化がまだな点。

2. List of Publications
Proceedings
1. 齊藤幸子、衣笠隆幸、皆川英明、髙野悟史、高瀬勝教、木下利彦・精神力動的視点が有効である場合はあるのか－強迫性障害の治療において－・第 111 回日本精神神経学会学術総会・大阪・2015.6
2. 齊藤幸子、髙野悟史、高瀬勝教、黒川弘晶、谷川昇、木下利彦・ミラーニューロンの形態変化：拡散テンソル画像解析による統合失調症の社会機能評価・第 45 回日本神経精神薬理学会・第 37 回日本生物学的精神医学会合同年会・東京・2015.9
3. 齊藤幸子・沈黙の底の希望について・日本精神分析学会第 61 回大会・東京・2015.10

209

Annual Report 研究成果報告書
Title of ProjectAnti-inflammatory property of dexmedetomidine, a selective α2-adrenergic
receptor agonist
静脈麻酔薬デクスメデトミディンの炎症反応に及ぼす影響

P.I.

Koh Shingu, 新宮興

Affiliation

Medical Control of Stress Response, 侵襲反応制御学（麻酔科学）講座

Collaborators

稲田武文

Keywords

dexmedetomidine, TNF-α, prostaglandin E2
デクスメデトミディン、腫瘍壊死因子α、プロスタグランディン E2

E-mailshingu@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Surgical insults may cause inflammation around the dissected tissues, the occurrence of
which may severely intensify the pain induced by the surgical incision. Pain, in turn, exacerbates
inflammation. Therefore, the use of an intravenous anesthetic possessing an anti-inflammatory
property (such as propofol) could be a very effective strategy to improve patient perioperative
course. We have been studying the anti-inflammatory effects of propofol, which are caused by an
inhibition of cyclooxygenase and lipoxygenase enzymes. Another very versatile and widely used
intravenous anesthetic is dexmedetomidine. Dexmedetomidine is a highly selective α2-adrenergic
receptor agonist, which is particularly useful for sedation of patients in critical care units after
surgery. Therefore, our current aim was to determine whether dexmedetomidine also possesses an
inflammation-alleviating effect similar to that observed in propofol.
A murine subcutaneous air pouch model was utilized. In that model, a 6-day-old air pouch
was injected with carrageenan. After intra-sac injection of 1% carrageenan, dexmedetomidine
significantly decreased the number of neutrophils recruited into the pouch. The exudate fluid was
also measured for concentrations of tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-6, neutrophil
chemokines cxcl1 and cxcl2, prostaglandin (PG) E2, and leukotriene (LT) B4. We found that theamounts of TNF-α, IL-6, cxcl1, and cxcl2 in exudates were significantly decreased by thedexmedetomidine treatment. However, the amount of PGE2 and LTB4 was not affected.
In the present study, we found that the selective α2-adrenergic receptor agonist
dexmedetomidine has an anti-inflammatory property. Specifically, the drug inhibited the
production of pro-inflammatory cytokines and neutrophil chemokines in vivo. In the perioperative
period, such anti-inflammatory effects of dexmedetomidine may be desirable for the following
reason. Tissue incision inevitably provokes inflammation due, at least in part, to the activation of
the kinin/Kallikrein system, the platelet/coagulation system, and the cytokine production
following endothelium disruption. Next, inflammation of a wound may contribute considerably to
pain. Furthermore, pain itself exacerbates inflammation. Thus, such sequence of events is a“vicious cycle”, generating more pain and more inflammation. We say “desirable” because
dexmedetomidine, via its anti-inflammatory property, could disrupt the vicious cycle, leading to abetter post-surgery outcome.
We previously found that the intravenous anesthetic propofol also possesses
anti-inflammatory properties. Unlike in the case of dexmedetomidine, propofol has an inhibitory
effect on PGE2 and LT production via the direct inhibition of enzyme activity of cyclooxygenase
and lipoxygenase. Thus, although both anesthetics (i.e. propofol and dexmedetomidine) haveanti-inflammatory properties, the kind of inflammation inhibited and the mechanisms of inhibitionof inflammation seem to be somewhat different. In each of various clinical situations, thedetermination of which anti-inflammatory property is recommended is a question requiring further
study.
210

静脈麻酔薬は周術期の手術麻酔および術後の鎮静に広く使われている。いずれの時期にも、病態生理学的には、炎症反応が大きなウエイトをしめており、これら炎症反応が過度になりすぎないよう調整することが周術期管理として重要であると思われる。われわれは以前より、静脈麻酔薬であるプロポフォールが、イン・ビトロならびにイン・ビボーにおいてシクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼの酵素活性の抑制によりプロスタグ
ランディン(PGE2)・ロイコトリエン(LT)の産生を抑制することにより、炎症反応を低減させうることを報告してきた。今回われわれは、もうひとつの静脈麻酔薬であるデクスメデ
トミディンにも類似した作用があるかどうかを調べてみた。デクスメデトミディンは世界で広く使われている静脈麻酔薬であり、最近、集中治療室での適用が拡大したことにより今後ますます使用頻度が増すことが期待されている。
この目的のため、カラジーナン誘発性エアー・パウチ炎症マウスモデルを用いた。その結果、デクスメデトミディンは、パウチ内に遊走する好中球数を有意に減少させ、同時に浸出液中の TNF-α、インターロイキン(IL)-6、好中球ケモカインである cxcl1 および cxcl2
量を有意に減少させた。一方、PGE2 および LTB4 の産生には影響を及ぼさなかった。以
上の結果からデクスメデトミディンにもプロポフォールと同様、炎症を鎮静化させる作用があることが示唆された。
外科的侵襲は、生体にとって大きなストレスを生じうるが、その一つに炎症性ストレスがある。また、周術期の痛みは、これまたストレスではあるが、炎症性疼痛が少なからず関与するといわれている。静脈麻酔薬であるプロポフォールやデクスメデトミディンはい
ずれも炎症反応を低減させる作用があるようであるが、その低減させる炎症反応の内訳やメカニズムは同一ではない。これらの特性を周術期に如何に使い分けて患者の予後の向上に結び付けるかが重要な課題であると思われる。

優れた成果があがった点
静脈麻酔薬デクスメデトミディンが抗炎症作用を有する点を見出したことは、優れた成果があった点だと考えられる。また、炎症物質としてサイトカインである TNF-αや IL-6
のみならず、ケモカインやエイコサノイドにも注目した点は新しい成果があった点だと思われる。
問題点
デクスメデトミディンの抗炎症反応は、少なくとも一部は炎症物質の転写レベルでの問題であると思われるが、さらに詳細なメカニズムについて、実験がまだなされていない点が最大の問題点であると思われる。

2. List of Publications
Original Articles
1. Inada, T., Hirota, K. and Shingu, K. Intravenous anesthetic propofol suppresses prostaglandin
E2 and cysteinyl leukotriene production and reduces edema formation in arachidonic
acid-induced ear inflammation. J. Immunotoxicol. 12, 261-265, 2015. (レフリー有)211

Division of Cancer

がん部門
Stem Cell Pathology, 幹細胞病理学（病理学第一）講座
Stem Cell Biology, 幹細胞生物学（衛生学）講座
Public Health, 公衆衛生学講座
Legal Medicine, 法医学講座
Molecular Genetics, 附属生命医学研究所 分子遺伝学部門
Model Animals, モデル動物部門
Internal Medicine 1, 内科学第一講座
Stem Cell Disorders, 幹細胞異常症学（共同研究）講座

212

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Analyses of Dynamics of intestinal stem cells by multi-color lineage tracing
method
多色細胞系譜追跡法を用いた幹細胞の維持機構の解析

P.I.

Hiroo Ueno, 上野博夫

Affiliation

Stem Cell Pathology, 幹細胞病理学（病理学第一）講座

Collaborators

熊野恵城、比舎弘子、吉田真子、厚海奈穂、齋賀一歩、大杉治之、中村
尚広、田中聖道、石垣和彦

Keywords

stem cell, development, regeneration 幹細胞・発生・再生

E-mailhueno@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Continuing last year’s research, we are trying to visualize the process of oncogenictransformation of intestinal epithelium. To this end, we are using our multi-color lineage tracing
method (rainbow mice) we developed.
It is well known that the adenomatous polyposis coli (Apc) gene is one of the key molecules(the tumor suppressor gene) for generating colon cancers. However, mutation of Apc gene canonly generate benign adenomas. Apcmin mice is one of the most popular model mice for theexperiments. In the intestinal epithelium of Apcmin mice that carry a point mutation in the Apc
gene, numerous adenomas are generated as the mice grow, and the mice eventually die because of
bleeding or obstruction of their intestine. To generate malignant tumors, we administrate several
chemicals to the Apcmin mice, and we have succeeded in generating adenomatous carcinomas. We
are also analyzing candidate-cancer stem cells in 4NQO-induced tong cancer model mice.
①小腸および大腸上皮組織における悪性腫瘍に対する可溶化阻害蛋白質の効果を検討するために３種類（ (1)Apcmin マウス単独による方法。（腺腫モデル）(2)Apcmin マウスに
DSS を投与する方法（2nd hit モデル）(3)azoxymethane（AOM）による化学発がんモデル（自然発症がんモデル））の発がんモデルマウスを使って悪性腫瘍を発生させた。がん幹細胞の存在について検証中である。
②新たな成体幹細胞（舌上皮幹細胞）の研究を発展させるために当該組織に4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO)を投与して発がんさせるモデルを構築した。

③舌上皮幹細胞、食道上皮幹細胞を同定したのと同じ方法論にて他臓器の成体幹細胞の同定を進めている。その内の一つ皮膚足底幹細胞のマーカーを同定し論文投稿後改訂中である。
優れた成果があがった点
正常およびがん化した腸管上皮細胞のオルガノイド培養およびレインボーマウスと組
み合わせて幹細胞を蛍光標識、オールインワン顕微鏡による Time lapse imaging により、その動態を直接観察する事が可能となった。

2. List of Publications
Original Articles
1. Tanaka, K., Kumano, K. and Ueno, H. Intracellular signals of lung cancer cells as possible
therapeutic targets. Cancer Sci. 106, 489-496, 2015.
Books
1. 厚海奈穂, 上野博夫. マルチカラー細胞系譜追跡法. 北隆館, 細胞, 47, 360-363, 2015.
Proceedings
1. 上野博夫. 新規成体幹細胞の同定とがん化における細胞動態解析. 第 104 回日本病理学会総会, 名古屋, 2015 年 4 月
2. 上野博夫. 多色細胞系譜追跡による成体幹細胞の同定・発生・がん化研究. 関西眼科先進医療研究会, 大阪, 2015 年 7 月
213Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Identification of embryonic stem cell-like tissue committed stem cells andelucidation of their differentiation pathway: An application to cell therapy andregenerative medicine
ES 細胞様組織幹細胞の同定と分化経路の解明：細胞移植・再生医療への応用

P.I.

Yoshiaki Sonoda, 薗田精昭

Affiliation

Stem Cell Biology, 幹細胞生物学（衛生学）講座

Collaborators

佐々木豊、藤岡龍哉、松岡由和、中塚隆介、河村孟、角出啓輔

Keywords

tissue stem cells, VSEL, ES cells, regemerative medicine

E-mailsonoda@hirakata.kmu.ac.jp

組織幹細胞、微小幹細胞、ES 細胞、再生医学

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
1) Identification of murine bone-derived small stem cells and their cellular characterization
Murine bone marrow (BM)-derived very small embryonic-like (VSEL) stem cells (BMVSELs), defined by lineage-negative (Lin-), CD45-negative (CD45-), Sca-1-positive (Sca-1+)
immuno-phenotype, were reported as postnatal pluripotent stem cells. We developed a highly
efficient method for isolating VSEL-resembling cells using enzymatic treatment of murine bone.
We finally designated these cells as bone-derived VSELs (BD VSELs). Our experiments clearly
demonstrated that BD VSELs differentiated into hematopoietic lineage cells (mesoderm) in vitro.
In addition, in vivo transplantation analysis suggested that BD VSELs may transdifferentiate into
hepatocytes (endoderm) (Stem Cells Dev, in revise). Further studies will therefore be required toelucidate their stem cell characteristics and the potential relationship between BD VSELs and BM
VSELs.
2) Establishment of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells and theirfunctional characterization
Hematopoietic stem cells (HSCs) are maintained in a specialized bone marrow (BM) niche,
which consists of osteoblasts, endothelial cells and a variety of mesenchymal stem/stromal cells(MSCs). However, precisely what types of MSCs support human HSCs in the BM remain to beelucidated because of their heterogeneity. In this study, we succeeded in prospectively
isolating/establishing three types of MSCs from human BM-derived lineage- and CD45-negative
cells, according to their cell surface expression of CD271 and stage-specific embryonic antigen(SSEA)-4. Among them, the MSCs established from the Lineage-CD45-CD271+SSEA-4+ fraction(DP MSC) could differentiate into osteoblasts and chondrocytes, but they lacked adipogenic
differentiation potential. The DP MSCs expressed significantly higher levels of well-characterized
HSC-supportive genes, including IGF-2, Wnt3a, Jagged1, TGFβ3, nestin, CXCL12, and Foxc1,compared with other MSCs. Interestingly, these osteo-chondrogenic DP MSCs possessed theability to support cord blood-derived primitive human CD34-negative severe combined
immunodeficiency (SCID)-repopulating cells. The HSC-supportive actions of DP MSCs werepartially carried out by soluble factors, including IGF-2, Wnt3a and Jagged1. Moreover, contact
between DP MSCs and CD34-positive (CD34+) as well as CD34-negative (CD34-) HSCs wasimportant for the support/maintenance of the CD34+/- HSCs in vitro. These data suggest that DP
MSCs might play an important role in the maintenance of human primitive HSCs in the BM niche.
Therefore, the establishment of DP MSCs provides a new tool for the elucidation of the human
HSC/niche interaction in vitro as well as in vivo (Stem Cells 33:1554-1565,2015).
3) Identification of human bone-derived small stem cells and their cellular characterization
We developed a highly efficient method for isolating VSEL-resembling cells using enzymatic
treatment of human bone. We designated these cells as human bone-derived VSELs (hBD VSELs).
214

First, human thigh-derived bone tissues were thoroughly washed using PBS- with 2% FCS.
These bone tissue specimens were crushed in a mortar and then incubated in cell dissociationbuffer containing α-medium with 5% FCS supplemented with 1.5 mg/ml type I collagenase and 2
mg/ml dispase at 37oC for 1 hour. Next, the bone-derived nucleated cells (BDNCs) were stainedwith various monoclonal antibodies, including anti-lineages, anti-CD45, and anti-CD34. After the
staining, recovered cells were used for subsequent FACS analyses. We sorted small (4 to 10 µm)
Lineage-, CD45-, CD34+ cells as hBD VSELs. These hBD VSELs expressed CD49f, CD90,
CD105, and CD271. However, they did not express N-cadherin, KDR, CD133, CXCR4, Tie2,
Tra-1-60, and Tra-1-81. We are now doing in vitro and in vivo functional analyses in order toelucidate their cellular characteristics.
1. マウス骨質由来微小（幹）細胞の同定とその細胞特性の解明
平成 25 年度～26 年度の研究成果報告書に記載したように、B6 マウス脛骨より、既報のvery small embryonic-like stem cell (VSEL)と同様の表面免疫特性 (Lin-CD45-Sca-1+) を示す
bone-derived VSEL (BD VSEL) を効率的に FACS で分取する方法を開発・確立した。本細胞は、小型（直径 6µm 程度）で核比の高い細胞であった。表面抗原解析および遺伝子発現解析の結果、BD VSEL は既知の組織幹細胞（間葉系幹細胞、造血幹細胞）や ES 細胞とは異なる細胞特性を示し、多能性幹細胞マーカー（Oct4、Nanog など）を発現していなかった。機能解析の結果、in vitro 培養系で血球系細胞（中胚葉）への分化能を示した。また、
in vivo 移植実験において、肝細胞（内胚葉）への分化転換が示唆された。しかし、BD VSELが三胚葉に分化可能な組織幹/前駆細胞である可能性についてはさらなる検討が必要と考えられた (Stem Cells Dev, in revise) 。
2. ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の樹立とその機能解析
平成 25 年度～26 年度の研究成果報告書に記載したように、本研究では、ヒト骨髄ニッ
チ細胞（間葉系幹細胞、MSC）の予期的分離と、その造血幹細胞 (HSC) 支持機構の解明を行った。
はじめにヒト骨髄 CD45-Lin-CD271+/-SSEA-4+/-分画より FACS にて細胞を分取し、CD271-SSEA-4+分画を除く 3 分画より、10 代以上継代可能な MSC を樹立した。その結果、
CD271+SSEA-4+ 分画より樹立した MSC (DP MSC)が、最も高い CD34- 造血幹細胞 (HSC)
支持能を示した。今回の検討の結果、DP MSC はヒト骨髄ニッチにおいてヒト HSC の支持に重要である可能性が示唆された。また、ヒト骨髄 MSC による HSC 支持は複数の因子により行われていることが明らかとなった (Stem Cells 33:1554-1565,2015) 。今後、さらなる検討を行うことにより、ヒト HSC 支持機構の解明を進める予定である。
また、同様の方法でヒト骨質由来の CD45-Lin-CD271+SSEA-4+ 分画より MSC (BD
DPMSC) を樹立することに成功した。現在、本 BD DPMSC を用いて、in vitro, in vivo で機能解析を行っている。
3. ヒト骨質由来微小（幹）細胞の同定とその細胞特性の解明
ヒト骨質を材料として、マウス BD VSEL の counterpart と考えられる微小幹細胞 (humanbone-derived VSEL, hBD VSEL) を効率的に分離する方法を開発した。
大腿骨の人工骨頭置換術の際に切除された大腿骨骨端部の骨皮質ブロック（1～2cm 角）の提供を受けた（関医倫第 1114 号承認）
。骨皮質ブロックを collagenase-Dispase 液で分散し、骨皮質細胞浮遊液を得た。得られた細胞を、Lineage マーカー抗体、CD45 抗体、CD34
抗体、7AAD、及び AnnexinV を用いて免疫染色し、FACS を用いて直径 4～10μm で、7ADD、
AnnexinV、Lineage、及び CD45 陰性であり、且つ CD34 陽性である細胞を微小幹細胞 (hBD
VSEL) として分離した。hBD VSEL は、CD49f、CD90、CD105、CD271 が陽性であったが、N-cadherin、KDR(Flk-1) 、CD133、CXCR4、Tie2、Tra-1-60、Tra-1-81 などは陰性であった。
今後、in vitro, in vivo において、ヒト骨質由来 hBD VSEL の機能解析を行う予定である。

優れた成果があがった点
マ ウ ス 骨 由 来 の BD VSEL の 効 率 的 な 同 定 ・ 分 離 法 を 開 発 し （ 特 許 出 願 （ 特 願2012-220648））、その幹細胞性について in vitro, in vivo で詳細に検討した点が評価できる(Stem Cells Dev, in revise) 。
また、ヒト骨質からも同様の hBD VSEL を分離する方法を開発したことも、ヒトへの臨
215

床応用を考えると重要である。
加 え て 、 ヒ ト 骨 髄 か ら 未 分 化 な HSC 支 持 能 を 持 つ MSC を 樹 立 (Stem Cells
33:1554-1565,2015) （特願 2013-170480）したことは、細胞移植・再生医療への応用という観点から高く評価される。
問題点
これまでにヒト、マウスにおいて、成体組織内に三胚葉系に分化可能な多能性組織幹細胞が存在するという報告がある。しかしながら、今回同定されたマウス及びヒト骨質由来の BD VSEL の幹細胞性の検証には更なる確認実験が必要と考えられた。

2. List of Publications
Original Articles
1. Nakatsuka, R., Iwaki, R., Matsuoka, Y., Sumide, K., Kawamura, H., Fujioka, T., Sasaki, Y.,
Uemura, Y., Asano, H., Kwon, A-H. and Sonoda, Y. Identification and characterization of
Lin-CD45-Sca-1+ VSEL phenotypic cells residing in adult bone tissue. Stem Cells Dev. 25,
27-42, 2016. レフェリー有2. Matsuoka, Y., Nakatsuka, R., Sumide, K., Kawamura, H., Takahashi, M., Fujioka, T., Uemura,Y., Asano, H., Sasaki, Y., Inoue, M., Ogawa, H., Takahashi, T., Hino, M. and Sonoda, Y.
Prospectively Isolated Human Bone marrow Cell-Derived MSCs Support Primitive Human
CD34-Negative Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells 33, 1554-1565, 2015. レフェリー有Proceedings
1. Nakatsuka R, Matsuoka Y, Sumide K, Kawamura H, Fujioka T, Sasaki Y, Sonoda Y.
Evaluation of stem cell characteristics of adult mouse bone-derived small cells. The 44th
Annual Scientific Meeting of the International Society for Experimental Hematology,
September 18, Kyoto, 2015.
2. Matsuoka Y, Sumide K, Kawamura H, Nakatsuka R, Fujioka T, Sasaki Y, Sonoda Y.
Prospective isolation of human hematopoietic stem cell-supportive mesenchymal stem/stromalcells from human bone marrow. The 44th Annual Scientific Meeting of the International
Society for Experimental Hematology, September 18, Kyoto. 2015.
Patents
1. 名称：間葉系幹細胞の分離方法
出願番号：特願 2013-170480
発明者：薗田精昭、松岡由和、中塚隆介、飯田寛和
出願日：平成 25 年(2013 年) 8 月 20 日
2. 名称：微小幹細胞の分離方法
出願番号：特願 2012-220648
発明者：薗田精昭、中塚隆介、岩城隆二、飯田寛和
出願日：平成 24 年(2013 年) 10 月 2 日
出願審査請求準備中

216

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Functional analysis of overexpressing genes in tissue stem cells and relationshipwith cancer stem cells
組織幹細胞に高発現する遺伝子の機能解析とがん幹細胞との共通性
の検討

P.I.

Seiji Kanda, 神田靖士

Affiliation

Public Health, 公衆衛生学講座

Collaborators

西山利正、下埜敬紀、岡崎はるか、王澤蘊Keywords

E-mailkandas@hirakata.kmu.ac.jp

tissue stem cells, SP cells, cancer stem cells, pituitary, auditory pathway 組織
幹細胞、side population 細胞、がん幹細胞、脳下垂体、聴覚経路

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
We focused on the tissue stem cells in pituitary and auditory pathway. In our previous study, we
identified the tissue stem/progenitor cells in pituitary gland and cochlear nuclei of auditory
pathway in vivo. In this study, we tried to characterized these tissue stem/progenitor cells andanalyze the gene expression.
Pituitary stem cells: Last year, we showed that the up-regulated genes in SP cells were included
some specific markers of stem cells, Bcrp1 and Sca-1 etc. including a oncogene with microarray.
In order to characterize these genes’ function, we tried to clone these genes and subclone into themammalian expression vector that can control the expression of interested genes by adding
tetracycline to the culture medium. These plasmid clones were transfected to mouse iPS cells by
lipofection method. Now we tried to study the ability of differentiate and maintainance of
stemness in transduced iPS cells by the plasmid vector that have effective promoter for ES cells
and pituitary specific transcription genes. After constructing the stable cell lines of each or
double transcription factors transduced, we try to develop the differentiation method with highefficiency. There is only a few information about mouse iPS cells differentiation into
pituitary-linage cells by the condition of cell culture and induction by transgenes, Therefore, welearned the 3D culture method differentiated mouse ES cells into pituitary related cells fromcollaborated team and try to construct the new method using both 3D culture and induction bytranscription factors that could control the expression level by tetracycline.
Stem cells in Auditory pathway: In this study, we tried to identify and characterize the tissue
stem cells in the inferior colliculi (IC) which passes and integrates sound information first in thecenter auditory neural pathway. We paid attention to Prominin-1 (CD133) antigen with reports
as a marker of stem cells and tried to concentrate the tissue stem cells of IC using magnetic beads
with Prominin-1 (CD133) antibody. In the results, the population of Prominin-1 positive cells ofnewborn 1week mice was significantly higher than that of 3weeks mice by q-PCR. Furthermore,
the activity of spheroid formation of Prominin-1 positive IC cells derived from postnatal 1week
newborn mice was significantly higher than that of unsorted or Prominin-1 negative cells. By
immunohistochemistry, Prominin-1 positive cells were detected from newborn 1week mice andco-localization with SOX2 that is marker of stem cells was detected. The positive cells of SOX2
and Nestin, marker of neural stem/progenitor cells, were detected in spheres formed from single
cell of IC cells by immunocytochemistry and these cells could differentiated into both neurons andglia cells by the induction of differentiation. Therefore, the tissue stem or progenitor cells areexisted in IC of newborn mice and can differentiate into neurons and glia cells.
下垂体幹細胞の特徴付けと癌幹細胞との関連の検討
昨年度までに、下垂体幹細胞を SP 細胞を指標として単離しマイクロアレイにより発現遺伝子を探索した結果、Oncogene を含む数種類の SP 細胞に高発現する遺伝子を数種類見いだした。そこでこれらの遺伝子の機能を解析する目的でまずこれらの遺伝子をクローニングし、テトラサイクリン存在下で発現調節可能な発現ベクターにサブクローニングした。さらに ES 細胞で in vitro における発現の実績のあるプロモーターに入れ替えたコン
ストラクトを作製し、遺伝子の発現時期をテトラサイクリンで調整することでそれぞれの遺伝子の分化誘導能及び未分化維持能などの検討し昨年度習熟した下垂体組織構築の立体培養法を用いて高効率な分化誘導法を確立している。
217

聴覚伝導路における組織幹細胞の同定と特徴付け
今回の研究では、中枢聴覚伝導路のなかでもすべての上行聴覚情報が経由し音情報を最
初 に統 合する 重要 な核で ある 下丘に おい て、幹 細胞 のマー カー として 報告 があ る
Prominin-1(CD133)抗原に注目し、新生仔マウスの下丘における神経幹/前駆細胞を濃縮、分離し、遺伝子発現や分化能を検討する事を目的とした。Prominin-1 の発現を q-PCR を用いて検討したところ生後 1 週未満の下丘における発現が 3 週以降と比較して有意に高い事が示された。
新生仔マウス下丘から取得した Prominin-1 陽性細胞の割合は成体に比し有意に高く、更に Prominin-1 陽性細胞の sphere 形成能を検討したところ、新生仔において、unsorted cells、Prominin-1 陰性細胞から形成されたものより有意に多い事が分かった。免
疫染色により、新生仔マウス下丘の Promiin-1 陽性細胞に幹細胞マーカーである SOX2 が共発現しており、Prominin-1 陽性細胞から形成された sphere に SOX2、神経幹前駆細胞のマーカーである Nestin の発現を認め、分化誘導することにより神経、グリアへ分化する事を示した。

優れた成果があがった点
聴覚伝導路における組織幹細胞の同定を行い、その特徴付けを行った結果、蝸牛神経核の他の組織（下丘）にも組織幹細胞が存在することが示唆された。さらに今回この下丘の組織から幹細胞のマーカーとして報告がある Prominin-1 (CD133) を指標として組織幹細胞の濃縮を試みその特徴付けを行った結果、その発現遺伝子及び sphere 形性能から下丘の組織中に含まれる幹細胞として特徴付けられた。
また Prominin-1 陽性細胞は新生仔マウスでその割合は多いが、加齢とともに減少することが示唆されたことから未熟な組織幹細胞のマーカーとしての可能性があると考えられた。
問題点
現在、下垂体幹細胞に特異的に発現する遺伝子の機能解析を行うためマウス iPS 細胞に遺伝子導入し、その分化能などを検討している。共同研究先にて習熟した下垂体組織構築
立体培養法はマウス ES 細胞にて行っており、当研究で使用するマウス iPS 細胞とは異なっていため現在のところ同方法では再現性がとれていない。それ故、ES 細胞で行なう培養条件の変更と本研究の特徴である関連遺伝子の発現時期の調整により、高効率分化誘導法を確立する予定である。

2. List of Publications
Original Articles
1. 王澤蘊, 神田靖士, 下埜敬紀, 岡崎はるか, ラーマニーガオ・ペーオペット, 西山利正.
漢方製剤のエストロゲン様作用の検討. 産婦人科漢方研究のあゆみ, レフェリー有,32, 16-20, 2015.
Proceedings
1. Viengvaly Phommanivong, 神 田 靖 士 , 下 埜 敬 紀 , Pheophet Lamaningao, Andrew
Waleluma Darcy, 三島伸介, 中谷逸作, Bounthanh Phaytanavanh, 西山利正. Molecular
Epidemiologic Study of Dengue fever and Chikungunya fever in Laos 2013-Specialreferences in Champasak province. ラオスにおけるデング熱、チクングニア熱の遺伝子
疫学的考察. 第 21 回近畿熱帯医学研究会, 大阪, 2015.3.14.
2. Viengvaly Phommanivong, Seiji Kanda, Takaki Shimono, Pheophet Lamaningao, Andrew
Waleluma Darcy, Nobuyuki Mishima, Issaku Nakatani, Bounthanh Phaytanavanh, Toshimasa
Nishiyama. Molecular Epidemiologic Study of mosquito-borne virus diseases in Laos
2013-Special references in Champasak province. 第 31 回びわ湖国際医療フォーラム, 大津, 2015.7.19.
3. 王澤蘊、神田靖士、下埜敬紀、岡崎はるか、ラーマニーガオ・ペーオペット、西山利
正. ラット下垂体腫瘍細胞 MtT/Se 細胞を用いた漢方製剤のエストロゲン作用の検討.
第 35 回産婦人科漢方研究会学術集会, 東京, 2015.9.13

218

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

The comprehensive analysis of microRNA in hearts of stress model rat
次世代シークエンサーを用いたラット microRNA の網羅的検索

P.I.

Atsushi, Akane, 赤根 敦

Affiliation

Legal Medicine,, 法医学講座

Collaborators

赤根 敦

Keywords

Next generation sequencer, microRNA, rat, physical stressE-mailakane@hirakata.kmu.ac.jp

次世代シークエンサー，マイクロ RNA，ラット，肉体的ストレス

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Non-coding microRNAs (miRNAs) hold enormous potential as a postmortem biomarker toquantify the physical stress applied before the death. Excited delirium syndrome causes a sudden
unexpected death under agitated and excited situation. The forensic autopsies and laboratory tests
can’t reveal the mechanism of the sudden death. Then, we constructed a rat model of excited
delirium syndrome-like situation by applying three stress modalities, alcohol intake for 3.8 g/kg
body weight, treadmill running for 90 min, and suppression by 2 kg water bag for 90 min.
The rats were divided into three groups: the control, the stress group A with alcohol intake andrunning, and the stress group B with alcohol intake, running and suppression. After the rats wereeuthanized by sevoflurane over-dose, total RNA was extracted from 20 mg left ventricle tissues.
The small RNA library and templates were prepared for the next generation sequencer (NGS)
analysis with Ion PGM system and Ion 318 Chip (Thermo Fisher Scientific).
The obtained data were analyzed by Torrent Suite software with reference to the rat miRNAdatabases. The top 30 miRNAs in expression level were selected and analyzed by statisticalmethods between the control and stress groups. The seven miRNAs (miR-126a-3p, miR-143-3p,
miR-16-5p, miR-22-3p, miR-26a-5p, miR-29a-3p, and miR-29b-3p) showed the significant
difference in expression level among the groups. Especially, miR-143-3p and miR-22-3p mightreflect the physical stress on rat hearts well.
It's not necessarily appropriate to suggest that these miRNAs have the same signal pathways,
target messenger RNAs and genes. Further investigations using quantitative PCR analysis andanimal experiments are required for establishing the stress biomarkers.
ノンコーディング RNA であるマイクロ RNA(miRNA)は約 20 塩基の 1 本鎖 RNA であるが，遺伝子発現を制御する機能を持ち，様々な生命現象や病態への関与が注目されている．
miRNA は短いがゆえに，死後も残存することが確認されており，法医実務に応用可能な
新たなバイオマーカーとなりえる可能性を持つ．そこで我々は，ラットに肉体的なストレスを与えた後に安楽死させ，心筋を試料として次世代シークエンサーによる miRNA の網
羅的検索を試みた．生後 9 週の SD ラットを次の 3 群に分けた．すなわちコントロール群，
アルコール（3.8g/kg, 21%）を飲ませた後，トレッドミル(35cm/s)で 90 分間の運動の群，
さらに，アルコール，トレッドミルの後，続けて 2kg 水袋による抑制 90 分の群である．
これは実際の解剖例をモデルとしており，興奮性せん妄のラットモデルとして構築した実験方法である．モデルとなった解剖例では，肉眼的に死因を追求することが極めて困難であったことから，死因決定の一助となるストレスマーカーの探索を目的としたのである．
心筋 20mg からキットにより totalRNA を抽出し，Ion Total RNA-Seq Kit v2 (Thermo Fisher
Scientific)により，ライブラリを構築した．引き続き Ion ChefTM Instrument，および Ion
PGMTM Hi-QTM Chef Kit でエマルジョン PCR，テンプレートを調整し，Ion PGMTM
Sequencer System(Applied Biosystems)を用いて，シークエンスを行った．得られたデータをラットゲノム，およびラット miRNA データベースをリファレンスとしてマッピングを行い，網羅的解析データを得た．
得られた miRNA データを群ごとに比較・検定を行い，有効な miRNA を検討した．

優れた成果があがった点
各群においてそれぞれ約 500 種以上の miRNA が検出されたが，そのうちで発現量の多219

い 30 種の miRNA を選択し，Kruskal-Wallis 検定を行った．その結果，7 種の miRNA(miR-126a-3p, miR-143-3p, miR-16-5p, miR-22-3p, miR-26a-5p, miR-29a-3p, miR-29b-3p) において，3 群間の有意差が見られた．肉体的なストレスをかけることで，126a-3p,
miR-143-3p, miR-16-5p, miR-26a-5p は発現量が有意に増加し，特に miR-143-3p は最も発現量が増加した．逆に miR-22-3p, miR-29a-3p and miR-29b-3p の 3 種は，ストレスをかけることで miRNA 発現量が有意に減少し，miR-22-3p が最も減少量が大きかった．この 2 種，
miR-143-3p と miR-22-3p は最も顕著にストレスに対して反応を示していると言え，ストレスマーカーとしての候補となった．

問題点
miRNA は鎖長が短く，一つの miRNA に対してターゲットとする mRNA，遺伝子が多数存在することから，miRNA のシグナル伝達機構の解明にはより詳細で複雑な解析が必要となる．従って，バイオマーカーとしての候補が決定されたとしても，その機能解明は困難であろう．また，今回は解析用のソフトウェアを使用しなかったため，微量な発現量の miRNA を無視した形となったが，そちらの方にこそストレスマーカーとしての候補
miRNA が存在するかもしれない．データは残されていることから，機会があればソフトウェアを使用しての解析も考慮すべきであろう．

220

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Molecular mechanism of lymphocyte trafficking
リンパ節のホーミングの分子機構に関する研究

P.I.

Tatsuo Kinashi, 木梨達雄

Affiliation

Molecular Genetics, 附属生命医学研究所 分子遺伝学部門

Collaborators

植田祥啓、近藤直幸、喜多俊行、福原貴太郎

Keywords

E-mailkinashi@hirakata.kmu.ac.jp

chemokine, antigen receptor, integrin, cell migration
ケモカイン、抗原受容体、インテグリン、細胞移動

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Regulation of T-cell trafficking play important roles in its development, maturation, antigen
responses, and homing. Within peripheral lymph nodes, T cells migrate rapidly and stop when
encountered cognate antigen. Interstitial motility of T cells are regulated in part through LFA-1
and ICAM-1. Using tissue slices of the lymph nodes (LN), which reproduced the dynamic
migration of lymphocyte in vivo, inhibition of LFA-1/ICAM-1 abolished high-velocity andrelatively straight movement of T cells. T cells migrate through intricate networks composed ofstromal cells and dendritic cells, both of with express ICAM-1. Using bone marrow chimera, wefound that ICAM-1 on dendritic cells but not stromal cells was responsible for the high-velocity
migration. When encountered cognate antigen, T cells stop and adhere to antigen presenting
dendritic cells. Using intravital two-photon microscopy, we found that ICAM-1 and Rap1effector
Mst1 are required for rapid deceleration upon encounter of cognate antigen presented on dendritic
cells, leading to immunological synapse (IS) formation. Mst1 deficient T cells was unable toadhere APC stably.
On supported lipid bilayer displaying peptide-MHC and ICAM-1, wild-type T cells exhibiteda ring of LFA-1/ICAM-1 with the central TCR/peptide-MHC cluster. In contrast, Mst1-deficientnaive T cells showed defective IS with diffuse pMHC and ICAM-1, suggesting the impairment of
IS formation results in defective antigen stopping in vivo. To clarify the role of Mst1 in IS
formation, we set up a single-molecule experiment, which allows us to measure lifetime of LFA-1
and ICAM-1 bindings in IS. We found that the majority of LFA-1 and ICAM-1 binding time wereshort (<1 sec), which occurred broadly in pSMAC. In contrast, the minor long lifetime binding(>20 sec) occurred in close proximity to cSMAC, which was abolished in Mst1 or Rap1b deficient
T cells. Talin1 and kindlin3 play critical roles for LFA-1 adhesiveness through binding β2cytoplasmic regions. Both talin 1 and kindling 3 were localized in pSMAC area in normal T cell
IS. Kindlin3 tended to accumulate in pSMAC in close proximity to cSMAC. While talin1 wasnormally present in pSMAC, kindlin3 was mislocalized in the distal pole of Mst1 deficient T cells.
These results suggest that Mst1 is required for high-affinity LFA-1 through kindlin3 that support
IS formation. Thus, Mst1 deficiency impairs immunological synapse formation essential for
antigen-recognition.
T 細胞の動態調節はその分化・成熟、抗原認識やホーミングに重要な役割をはたしている。リンパ節内では T 細胞は高速で移動し、抗原に遭遇すると停止する。リンパ節スラ
イス法による 2 光子イメージングによって T 細胞の高速移動は LFA-1/ICAM-1 を介していることを抗体による阻害実験によって明らかにした。リンパ節実質はストローマ細胞や樹状細胞による緻密なネットワークが形成されており、これらの細胞は ICAM-1 を発現している。骨髄移植の実験から T 細胞の高速移動に必要なのはストローマ細胞ではなく、樹状細胞の ICAM-1 であることが判明した。特異抗原投与によるリンパ節内 T 細胞停止接着の 2 光子ライブイメージング系を樹立し、抗原による停止には ICAM-1 と Rap1 エフェク
ターである Mst1 が必要であることが判明した。抗原特異的接着構造である免疫シナプスを人工脂質二重膜に peptide/MHC と ICAM-1 を用いて再現したところ、正常では pMHC
クラスター(cSMAC)を LFA-1/ICAM-1 がリング状(pSMAC)に取り囲む構造を示すが、Mst1
欠損 T 細胞では瀰漫性の分布を示し、免疫シナプスが障害されていた。このため、抗原特異的停止が in vivo で起こらなかったと考えられる。さらに Mst1 欠損でおこる異常を詳細に調べるため、免疫シナプスにおける LFA-1/ICAM-1 結合の一分子解析系を樹立した。
解析の結果、LFA-1/ICAM-1 結合は pSMAC 領域で起こり、大部分は 1 秒以下であったが、221

低頻度であるが長期結合が cSMAC の近傍で観察された。
Mst1 欠損あるいは Rap1b 欠損 T細胞では長期結合が著しく低下していた。これらの細胞では talin1 は pSMAC 領域に存在するのに対して kindlin3 が接着面の対極に分布する異常を示した。これらの結果から Mst1
は kindlin3 を介する高親和性 LFA-1 の形成に必要であることが示された。

優れた成果があがった点
1. T 細胞の高速移動には樹状細胞上の ICAM-1 が必要であり、従来のストローマ細胞説やリンパ球の ICAM-1 ではないことを明らかにした。
2. 抗原による T 細胞停止接着を 2 光子イメージングする系を確立し、Mst1 が欠損すると樹状細胞との免疫シナプス形成ができないことを示した。
3. 免疫シナプスを人工脂質二重膜で再現し、Mst１欠損によって免疫シナプス構造ができないことが明らかになった。
4. 免疫シナプスにおける LFA-1/ICAM-1 結合の一分子解析を確立し、Mst1 は kindlin3 を介する高親和性結合に必要であることを示した。

2. List of Publications
Original Articles
1. Ishibashi, M., Miyanaga, Y., Matsuoka, S., Kozuka, J., Togashi, Y., Kinashi, T. and Ueda, M.
Integrin LFA-1 regulates cell adhesion via transient clutch formation. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 464, 459-466. 2015.（レフェリー有）2. Fukuhara, T., Tomiyama, T., Yasuda, K., Ueda, Y., Ozaki, Y., Son, Y., Nomura, S., Uchida, K.,
Okazaki, K. and Kinashi T. Hypermethylation of MST1 in IgG4-related autoimmune
pancreatitis and rheumatoid arthritis. Biochem Biophys Res Commun. 463, 968-974, 2015.
（レフェリー有）222

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Generation of mice carrying GFP reporter gene by CRISPR/Cas9-mediatedgenome engineering
CRISPR/Cas9 を用いた遺伝子改変マウス作成

P.I.

Sung-il Lee, 李成一

Affiliation

Model Animals, モデル動物部門

Collaborators

西村愛美

Keywords

CRISPR/Cas9, pronucleus injection, CRISPR/Cas9 編集、前核注入

E-mailsilee@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
The recent development of site-specific endonucleases include ZFN, TALEN and CRISPR/Cas9
nucleases for selective genome cleavage has been an important advancement in genome
engineering. While genome editing technique is spread rapidly because simplicity of
manufacturing method for genetically modified mice created is not easy to use themicromanipulator technology. In this study, we also order to allow the creation of geneticallymodified mice using the CRISPR / Cas9, and essential is to establish the technology. The
microinjections were performed into the pronucleus of fertilized eggs with a pSpCas9 (BB)
-2A-GFP plasmid (PX458, donated from Molecular Genetics laboratory) mixture containing GFP,
and it was investigated whether it is functioning in the egg. Fertilized eggs have prepared apronuclear stage by in vitro fertilization from C57BL/6 mice that have been commonly used tocreate genetically modified mouse. In addition, PX458 plasmid from its nature, because GFP isgenerated when Cas9 works, can be visualized that the CRISPR / Cas9 is working in the egg. As aresult, 197 eggs that was used in the pronucleus microinjection, 160 eggs (81%) survived.
Subsequently, embryos generated until 2-cell stage were 124 eggs (78%). As a result of a portionof the 2-cell stage embryos were observed with a fluorescence microscope, it was able to confirm
the fluorescence of GFP in almost of the embryo. Although currently undergoing transplantation
offspring has not yet been achieved, it is considered to require further technical improvements.
ゲノム編集技術はマウスなどの限られた種でのみ実現可能であった遺伝子改変技術をあらゆる生物種や細胞腫で可能にし、近年、特に急激な開発が進んでいる。特に TALENや CRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集技術は作製方法の簡便さから急速に広まっているが、遺伝子改変マウス作成の為には卵子へのマイクロマニュピュレーター技術を要するため容易ではない。本研究で、私たちもこの内の CRISPR/Cas9 を使用した遺伝子改変マウスの作成を可能にするため、技術習得に取り組んできた。共同研究先の分子遺伝学教室よりKindlin-3 を目的遺伝子とした pSpCas9(BB)-2A-GFP (以下、PX458)プラスミドを供与して頂き、前核注入の技術習得および、それが卵子の中で機能しているかを調べた。マウスは遺伝子改変マウス作成によく使用されている近交系 C57BL/6 マウスから体外受精により前核期を作.成し、マイクロマニュピュレーターを用いてプラスミドを前核に注入した。
また、PX458 プラスミドはその性質上、Cas9 が働くと GFP が生成される為、卵子の中で CRISPR/Cas9 が働いているかを可視化することが可能である。その結果、実験に供した 197 個の前核期卵子中、160 個(81%)の卵子が生存した。続いてその内 2 細胞期まで発生した胚は 124 個(78%)であった。また、2 細胞期胚の一部を蛍光顕微鏡で観察した結果、ほぼ全ての胚で GFP の蛍光を確認できた。現在移植を行っているが、産子はまだ得られておらず、更なる技術向上が必要であると考えられる。

優れた成果があがった点
近交系 C57BL/6 マウスに対しての前核注入成績が 80%以上の生存成績であった。
問題点
マイクロマニュピュレーター技術の習得に多大な時間が必要である。さらに現在も産子を得られていない為、技術改善が急務であると考えられる。

223

2. List of Publications
Proceedings
1. Masakazu Tanaka, Jinchun Yao, Sung-il Lee, Yihua Ren, Norihiro Takenouchi, Jun-ichi
Fujisawa. Induction of APOBEC3B cytidine deaminase gene in HTLV-1 infected T-cells of
ATL model mouse. 17th HTLV conference. June 17- 22. 2015. Martinique F.W.I.
2. Jun-ichi Fujisawa, Sung-il Lee, Jinchun Yao, Yihua Ren, Masakazu Tanaka. Tax peptide
vaccine suppressed the leukemia in humanized mouse model of ATL. 17th HTLV conference.
June 17-22. 2015. Martinique F.W.I.
3. 田中正和, 姚錦春, 李成一, 任翊华, 竹之内徳博, 藤澤順一. HTLV-1 感染ヒト化マウ
スモデルにおけるシチジンデアミナーゼ APOBEC3B 遺伝子の活性化. 第 2 回日本
HTLV-1 学会学術集会. 平成 27 年 8 月 21 日—23 日. 東京.

224

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Development of novel therapeutic strategy and elucidation of functional basis
for intractable diseases by human dendritic cell research
ヒト樹状細胞によるさまざまな病態関連応答の解明と新たな難病治療戦略の開発

P.I.

Tomoki Ito, 伊藤量基

Affiliation

Internal Medicine 1, 内科学第一講座

Collaborators

野村昌作、札谷直子、中西孝尚、田中晶大、稲垣詔子、木畑佳代子

Keywords

dendritic cells, IL-33, OX40 ligand, RANK ligand, TSLP, platelets, allergy
樹状細胞

IL-33

E-mailOX40 リガンド

itot@hirakata.kmu.ac.jp

RANK リガンド

TSLP

血小板

アレルギー

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Dendritic cells (DCs) are the master cells in activating immune responses through enhancing
innate immunity by cytokine production and initiating acquired immunity by priming naïve CD4+
T cells. However, DCs play not only a central role in antimicrobial immune response in hostdefense but also a pathogenic role in the development of the several inflammatory disorders suchas allergy and autoimmune diseases. In allergy, epithelial cell-derived thymic stromal
lymphopoietin stimulates myeloid DC subset to express OX40L and CCL17 that induce andmaintain Th2 cell responses. Thus, myeloid DCs represent key cellular pathogenic cells in allergy.
Accordingly, control of the dysregulated myeloid DC functions provides an alternative treatment
strategy for allergy. We focus on specific roles of statins in controlling the myeloid
DCs-dependent Th2 pathway and their therapeutic potentials for allergy.
TSLP induced human mDCs to express OX40L on their surface and CCL17 in the culture
supernatant, suggesting the promotion of Th2 cell-mediated responses. We found that statinsrepressed the upregulation of OX40L expression and CCL17 secretion. Rho Kinase (ROCK)
inhibitor, as well as statins, also repressed the TSLP-induced OX40L and CCL17 expression,suggesting that statins may exert the cholesterol-independent inhibitory effect on TSLP-mDCs
through the Rho-ROCK pathway. This study suggests a specific role of statins in controlling the
TSLP-mDCs-dependent Th2 pathway and the therapeutic potentials for allergic diseases.
高脂血症治療薬として広く使用されている HMG-CoA 還元酵素阻害剤（スタチン）は、
近年、血清 CRP や冠動脈疾患に関する炎症性マーカーをも抑制することが示され、種々の炎症性疾患や免疫疾患に対する治療効果が注目されている。このスタチンが持つ抗炎症・免疫抑制作用を、この DC サブセットの持つそれぞれ独自のサイトカイン・表面分子発現の側面から解析することは、自己免疫疾患やアレルギーに対する新たな治療戦略に繋がる可能性がある。このスタチンの持つ、DC 機能阻害活性は SLE をはじめとする全身性
自己免疫性疾患や各種アレルギーに対する新たな治療戦略に寄与すると考えられる。
ミエロイド系 DC はアレルギー性炎症疾患の発症機序の中心に潜在している細胞と言える。この点に注目し、OX40L/CCL17 とその産生細胞としてのミエロイド系 DC を標的として、その抑制を誘導できる何らかの薬剤があるならば、それはすなわち、アレルギーにおける新たな治療の開発に繋がるといえる。
我々の検証の結果、in vitro における培養によって TSLP 存在下の mDC が発現する
OX40L と CCL17 がスタチンの添加によって著明に抑制されることが判明した(投稿準備中)。
今後樹状細胞をターゲットとした治療効果が、様々な炎症性疾患に対する治療へと拡大するであろう。少なくともアレルギーに対する治療戦略としても重要と考えられ、その一つの治療薬剤の候補がスタチンであると言える。
優れた成果があがった点
この成果から、免疫アレルギーカスケードにおける上流であるトリガーポイント（樹状細胞レベル）を抑制する能力を、スタチンが有することが証明された。実際にいくつかの論文でスタチンによるアレルギー抑制効果を示唆する報告があり、その免疫学的裏付けと225

なるデータといえる。すなわち、臨床応用において、重要な検討といえる。
問題点
in vivo での活性を検討できていないので、今後、マウスを用いた系での生体内での検討が必要と思われる。

2. List of Publications
Original Articles
1. Ito, T. Anti-inflammatory effects of statins -Novel investigation of the potent activity tohuman dendritic cell subsets as therapeutic cellular targets-. Cytometry Research, 25, 19-24,
2015.
Proceedings
1. Kayoko Kibata, Tomoki Ito, Muneo Inaba, Akihiro Tanaka, Noriko Inagaki-Katashiba,
Ryoichi Iwata, Phan Thi Xuan Vien, Shosaku Nomura. Lenalidomide, a derivative ofthalidomide, acts as immunoenhancer of typeⅠinterferon production from plasmacytoid
dendritic cells. 2015/7, 第 25 回日本サイトメトリー学会学術集会, 東京

226Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

IBM-BMT is an effective strategy for cancer treatment
骨髄内骨髄移植によるがん治療戦略に関する研究

P.I.

Susumu Ikehara, 池原進

Affiliation

Stem Cell Disorders, 幹細胞異常症学（共同研究）講座

Collaborators

李銘、李清、石明、足立靖

Keywords

E-mailikehara@hirakata.kmu.ac.jp

IBM-BMT, thymus, autoimmune diseases, tumor-bearing mice
骨髄内骨髄移植(IBM-BMT)、胸腺、自己免疫疾患、担癌マウス

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Allogeneic bone marrow transplantation has been used as a potentially curative therapy forleukemias, immunodeficiencies, and autoimmune diseases. Radiotherapy and/or chemotherapy,
performed as a conditioning regimen for bone marrow transplantation are prerequisites forsuppressing host immunity and to reduce the tumor burden. It has been shown that allogeneic bonemarrow transplantation plus thymus transplantation is effective in treating recipients withmalignant tumors. It has also been shown that newborn thymus transplantation can increase thepercentage and number of CD4+ T cells in the short term after bone marrow transplantation. The
combination of allogeneic bone marrow transplantation and thymus transplantation is effective in
restoring donor-derived T cell function in tumor-bearing mice, and no concomitantgraft-versus-host disease was observed. Although thymus transplantation increases the percentage
of T cells in the early term after bone marrow transplantation, the myeloid-derived suppressor cells
are still the dominant population. Myeloid-derived suppressor cells are a phenotypicallyheterogeneous cell population that includes myeloid progenitor cells and immature myeloid cells.
Studies have shown that myeloid-derived suppressor cells accumulate in most patients andexperimental animals with cancer. We used the Gr-1 Ab to deplete the granulocytic
myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice that had received bone marrowtransplantation plus thymus transplantation. Two weeks after the bone marrow transplantation, themice that received Gr-1 Ab showed smaller tumors than those in the control group.
In addition, Gr-1 Ab significantly increased the percentages and numbers of CD4+ and CD8+ T
cells, and decreased the percentages and numbers of myeloid-derived suppressor cells andgranulocytic myeloid-derived suppressor cells. No side effects of the Gr-1 Ab on recipient or donor
thymus were observed. These findings indicate that Gr-1 Ab administered after bone marrowtransplantation plus thymus transplantation may enhance the effectiveness of tumor suppression.
The anti-tumor effects seen after bone marrow transplantation involve many mechanisms. T cells
and granulocytic myeloid-derived suppressor cells reconstituted by donor (from bone marrow cells
or thymus transplantation) are very important in the immune system. The administration of Gr-1
Ab, which suppresses tumor growth by depleting granulocytic myeloid-derived suppressor cells
and increases the percentage and number of T cells, may represent a new choice for more
successfully inhibiting tumor growth.
われわれが開発した骨髄内骨髄移植法を用いることにより、ドナーの正常の造血幹細胞のみならず、間葉系幹細胞も正常ドナーの細胞に置換可能であることが判明した。骨髄由来免疫抑制細胞（myeloid─derived suppressor cells: MDSC）は、未熟な骨髄細胞であり、がん組織やリンパ節，末梢血中に見出される免疫抑制細胞として、免疫療法の効果を阻害している。われわれは、担癌マウスに骨髄内骨髄移植と胸腺移植と Gr-1 抗体を併用して、
granulocytic MDSC を除去すると、固形癌が縮小することを明らかにした。

優れた成果があがった点
細胞間の interaction と抗腫瘍性のメカニズムを明らかにし、新しい癌の免疫療法を開発
できる。
227

問題点
固形癌が小さくなったが、癌が消失までには至ってないので、さらに治療方法を検討する必要がある。

2. List of Publications
Original Articles
1. Shi, M., Li, M., Cui, Y., Adachi, Y. and Ikehara, S. Gr-1 Ab administered after bone marrowtransplantation plus thymus transplantation suppresses tumor growth by depleting granulocytic
myeloid-derived suppressor cells. PloS One 9, e97908, 2014. レフェリー有2. Ikehara S. Advances in leukemia treatment with bone marrow transplantation. J. Leuk. 2, 136,
2014. レフェリー有Books
1. Li, M., Guo, K. and Ikehara, S. Effects of Co-transplantation of thymus and stem cells on
treatment of malignant tumors. Understand Cancer-research and Treatment. iConcept Press
USA, 81-91, レフェリー有Proceedings
1. Li, M., Cui, Y., Adachi, Y. and Ikehara, S. Controlling tumor growth by depleting granulocytic
myeloid-derived suppressor cells after bone marrow transplantation plus thymustransplantation. 第 43 回日本免疫学会学術集会, 平成 26 年 12 月 10 日～平成 26 年 12
月 12 日（京都）2. Li, M., Shi, M., Cui, Y., Adachi, Y. and Ikehara, S. (Abstract was accepted to publish online)
Sirt1 expression related with sarcoma growth after stem cell transplantation combined with
depletion of myeloid-derived suppressor cells. 56th Annual Meeting of American Society of
Hematology, December 6-9, 2014, San Francisco, CA, USA
Patents
1. 発明の名称：悪性腫瘍の治療方法
国名：アメリカ
出願番号：786094
登録番号：US7541025
発明者名：池原 進 他

228

Division of
Metabolic Disorders

代謝部門
Neuropharmacology, 神経病態薬理学（薬理学）講座
Cell Signaling, 生体情報部門
Surgery, 外科学講座
Orthopedic Surgery, 整形外科学講座
Plastic and Reconstructive Surgery, 形成外科学講座
Pathology and Laboratory Medicine, 病態検査学講座
Physics, 物理学講座

230

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Study of fibril formation in the extracellular matrix
細胞外マトリックス線維形成の加齢変化に関する研究

P.I.

Tomoyuki Nakamura, 中邨智之

Affiliation

Neuropharmacology, 神経病態薬理学（薬理学）講座

Collaborators

赤間智也、藤川雄介、吉田秀之、石戸隆裕、増田実希

Keywords

elastic fibers, microfibril, LTBR 弾性線維、ミクロフィブリル、LTBP

E-mailnakamtom@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
We have been investigating biological function of latent TGF-beta binding proteins (LTBPs).
Some of LTBPs bind to TGF-beta molecules and function to keep the signaling molecule inactivein the extracellular matrix of tissues until further induction releases active TGF-beta from thecomplex. On the other hand, we have reported that LTBPs also have their own biological functions
distinct from TGF-beta signaling especially for elastic fiber and microfibril formation.
Mutations on LTBP2 gene have been found on genetic eye diseases such as primary congenital
glaucoma and microspherophakia in human, suggesting an essential role of the protein in eye
development. We have created Ltbp2-knockout mice and found that the mutant mice develop lens
luxation due to ciliary zonule fragmentation. This result indicated that LTBP-2 is required forformation of functional ciliary zonules, which mainly consist of thick microfibril bundles. Indeed,microsperophakia develops ectopia lentis as one of the major phenotypes in human, thus weconcluded that malformation of ciliary zonules is the primary cause of LTBP-2 deficiency inhuman and mouse. We then analyzed possible phenotype of the Ltbp2-mutant mice for glaucoma.
The Ltbp2 mutant on C57BL/6J (B6) background mice did not show increased intraocularpressure (IOP), which is one of the symptoms for glaucoma, at young and old ages, however, theLtbp2-/- on DBA2 background, which is know to develop glaucomatous phenotype more easily
than B6 mice, showed significantly increased IOP at 1-year old compared to the age-matchedsiblings with normal Ltbp2 allele. This result suggested that Ltbp2-/- on DBA2 background may
develop glaucoma, and the mice may be able to use as a model animal for human glaucoma. We
are now investigating other phenotypes related to glaucoma in the mutant mice at 1-year old, as
well as the mice of younger age.
我々は細胞外マトリックス蛋白質である LTBP(latent TGFβ binding protein)の生物学的機能を研究している。これまでの研究で LTBP ファミリー蛋白質の一つである LTBP-2 が、眼球で水晶体をつなぎ止めておく繊維状組織である毛様小体の形成に重要であることを明らかにした。ヒトにおいて LTBP-2 遺伝子の変異が先天性緑内障や家族性水晶体脱臼に見られており、後者の病態が LTBP-2 の機能不全による直接の症状であることが証明されたことになるが、LTBP-2 と緑内障との関連については未だ不明な点が多い。
そこで我々が作成した LTBP-2 遺伝子変異マウスのバックグラウンドを、基礎研究で最も一般に用いられる C57BL/6J 系統(B6)から緑内障を発症しやすいとされる系統である
DBA2 系統(DBA2)に移し、それぞれの系統で野生型と変異型のマウスの眼圧を計測した。
B6 では野生型とホモ変異型マウスにおいて眼圧に有意な差は見られなかったが、DBA2
では一年齢の加齢マウスにおいて野生型マウスよりも LTBP-2 ホモ変異型マウスの眼圧が有意に高かった。このことは LTBP-2 の欠損が緑内障の一つの指標である眼圧の上昇に少なくとも間接的に関与していることが示され、しかもマウスにおける眼圧の上昇には系統による違いが見られることから、LTBP-2 以外の別の遺伝子発現の影響が強く関与することが示唆された。
現在、他の緑内障の指標である網膜神経節細胞の脱落も見られるか解析中であり、また眼圧上昇がより若年齢でも見られるか解析を進めているところである。これらの結果は我々の作成した DBA2/LTBP-2 欠損マウスがヒトの緑内障のモデル動物となり得る可能性があるものと考えられた。
231

優れた成果があがった点
緑内障は日本人の失明原因の第一位となる疾患であるものの、その発症の機序や進行の過程など詳しいことはまだ分からない部分が多い。我々が作成した DBA2/LTBP-2 欠損マ
ウスの表現型がヒトの緑内障のモデル動物となる可能性があることから、このマウスの眼圧上昇の原因を詳細に調べることによって緑内障発症の原因に迫ることができるかも知
れない。また、このマウスを用いて新たな緑内障治療法の開発も期待できる。
問題点
生体内での機能を解析するのに遺伝子改変マウスは非常に有効な方法であるが、作成と解析に時間もコストもかかる。培養細胞などの実験系に移行させることができる実験はバックアップとして行っておく必要がある。

2. List of Publications
Original Articles
1. Fanhchaksai, K., Okada, F., Nagai, N., Pothacharoen, P., Kongtawelert, P., Hatano, S.,
Makino, S., Nakamura, T. and Watanabe, H. Host stromal versican is essential forcancer-associated fibroblast function to inhibit cancer growth. Int. J. Cancer 138, 630-641,
2016.（レフェリー有）2. Bultmann-Mellin, I., Conradi, A., Maul, A.C., Dinger, K., Wempe, F., Wohl, A.P., Imhof, T.,
Wunderlich, F.T., Bunck, A.C., Nakamura, T., Koli, K., Bloch, W., Ghanem, A., Heinz, A.,von Melchner, H., Sengle, G. and Sterner-Kock, A. Modeling autosomal recessive cutis laxa
type 1C (ARCL1C) in mice reveals distinct functions of Ltbp-4 isoforms. Dis. Model Mech.
8, 403-15, 2015.（レフェリー有）Proceedings
1. 吉田秀之、藤川雄介、井上唯史、赤間智也、中邨智之、LTBP2 と LTBP4 は弾性線維形成において重複する機能を有する、第 47 回日本結合組織学会学術大会、コクヨホール（東京）、2015 年 5 月
2. 中邨智之：「動脈の硬さを規定する細胞外マトリックス」第 47 回日本動脈硬化学会
学術集会. Featured Session 動脈硬化研究の新機軸（仙台、2015 年 7 月 9 日）
3. Nakamura, T.: TGFβ-independent role of LTBPs in microfibril and elastic fiber assembly,
and molecular function of Fibulin-4. Invited talk at Gordon Research Conference on Elastin
and Elastic Fiber (July 26 - 31, 2015, Biddeford, USA).
4. 赤間智也、安形清彦、中邨智之、福田道子、B. fragilis endo-beta-galactosidase のクローニング、 第 34 回日本糖質学会年会、東京大学、2015 年 7 月

232Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Analysis of signal transduction molecules involved in proliferation,
development and stemness
がん幹細胞の機能・分化に関わるシグナル分子の解明

P.I.

Satoshi Matsuda, 松田達志

Affiliation

Cell Signaling, 生体情報部門

E-mailmatsudsa@hirakata.kmu.ac.jp

Collaborators
Keywords

PI3K、mTOR、cell proliferation、cell differentiation
PI3 キナーゼ、哺乳類ラパマイシン標的タンパク細胞増殖、細胞分化

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Members of the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) family are important for the differentiation,
proliferation, and survival of a variety of cells, including immune cells. The basic activity of these
enzymes is to phosphorylate the third position of the hydroxyl group in the inositol ring ofphosphatidylinositol. There are four subclasses of the PI3K family; among these, class IA PI3K,
composed of a catalytic subunit (p110α, β, or δ) and a regulatory subunit (p85α, p55α, p50α,
p85β, or p55γ), functions downstream of receptors such as T cell receptor (TCR) and CD28 in T
cells whose signaling pathways involve protein tyrosine kinases and Ras. In many cell types, PI3K
signals through mammalian target of rapamycin complex1 (mTORC1) consisting of mTOR,
Raptor, and mLST8.
Since we have previously shown that class IA PI3K is involved in B cell development, weevaluated the physiological role of mTORC1 in B cell development by genetically deleting
Raptor, an essential component of mTORC1. We analyzed bone marrow (BM) cells fromtamoxifen-induced Raptor-deficient mice (Raptorfl/fl; Rosa26-CreERT2), in which Raptor isefficiently deleted in all tissues including haematopoietic cells by two weeks after tamoxifen
treatment, and found that loss of mTORC1 signal in hematopoietic stem cells leads to marked
reduction in the number of B cells but not common lymphoid progenitors, raising the possibility
that mTORC1 is involved in B cell development. Therefore, we generated B-lineage specificmTORC1 signal-deficient mice by crossing loxP-flanked Rptor alleles (Raptorfl/fl) mice with
mb1-Cre transgenic mice that express Cre recombinase in a B-lineage specific manner (Raptorfl/fl
x mb1-Cre mice, referred to here as RaptorB-/- mice).
Flow cytometric analysis of RaptorB-/- mice revealed the severely reduced number of CD19+ B
cells and a nearly complete absence of B220+IgM+ mature B cells in the spleen as well as
mesenteric lymph node (MLN). RaptorB-/- mice also lacked B1a and B1b B cells, subsets of B
cells producing natural antibody, in the peritoneal cavity. These results suggest that the mTORC1
signal is essential for B cell development. In the BM of RaptorB-/- mice, pro-B cells(B220+IgM-CD43+CD25-) were nearly 10-fold more abundant when compared with control mice,although both immature B cells (B220+IgM+) and pre-B cells (B220+IgM-CD43-CD25+) werevirtually absent. When the pro-B cells were subdivided into three populations, CD24-BP-1pre-pro-B cells, CD24+BP-1- cells, and CD24+BP-1+ pro-B cells17, RaptorB-/- mice had arelatively reduced proportion of pre-pro-B cells while the proportion of CD24+BP-1+ cells wasincreased. This suggests that the mTORC1 signal is necessary for developmental transition frompro-B cells to pre-B cells. Consistently, pro-B cells lacking Raptor failed to induce mobility
shifts of p70S6K and 4E-BP1, which are a measure of mTORC1-mediated phosphorylation. In
contrast, mTORC2-mediated phosphorylation at Ser473 of Akt was rather increased, supporting
the selective impairment of mTOCR1 signal. We thus conclude that mTORC1 signal plays an
indispensable role in B cell development at the pro-B cell stage in the BM.
PI3K-mTOR 経路は細胞の増殖・分化・生存を制御する細胞内シグナル伝達経路であり、種々のがん組織においてその異常が報告されている。本研究では、PI3K-mTOR 経路に関わる各種分子の遺伝子改変マウスを対象に、これらシグナル伝達経路の活性の増減が各種
血球系細胞の分化・増殖過程に及ぼす影響の解析を試みた。
具体的には、mTOR 経路の中でも、特に細胞増殖と密接に関わる mTORC1 経路に着目
233

し、mTORC1 シグナルに必須のアダプター分子である Raptor 分子の細胞系譜特異的欠損
マウス（Raptor-fl/fl）の樹立に取り組んだ。Raptor 分子をタモキシフェン誘導性に造血系幹細胞で欠失させたところ、リンパ球共通前駆細胞の数には変化が認められないものの、B 細胞数の低下が引き起こされたことから、mTORC1 シグナルが B 細胞の初期分化に関わる可能性が強く示唆された。そこで、B 細胞特異的に Raptor を欠失させるべく、B 細胞
特異的 Cre 発現マウス（mb1-Cre マウス）と Raptor-fl/fl マウスを交配させたところ、予想通り、骨髄中から IgM 陽性の未成熟 B 細胞が完全に消失することが明らかとなった。さ
らに解析を進めたところ、mTORC1 シグナルの欠失によって、proB 細胞から preB 細胞への分化段階に異常が生じ、その結果 B 細胞分化が proB 細胞の段階で完全に停止していることが分かった。

優れた成果があがった点
Raptor 欠損マウスを用いて、B 細胞の初期分化で mTORC1 シグナルが必須の役割を果たしていることを世界に先駆けて明らかにすることができた。

2. List of Publications
Original Articles
1. Cui, D., Arima, M., Takubo, K., Kimura, T., Horiuchi, K., Minagawa, T., Matsuda, S., andIkeda, E. ADAM12 and ADAM17 are essential molecules for hypoxia-induced impairmentof neural vascular barrier function. Sci. Rep. 5, 12796, 2015.

234

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Intraoperative detection of superficial liver tumors by fluorescence imaging
using indocyanine green and 5-aminolevulinic acid
インドシアニングリーンと 5-アミノレブリン酸の蛍光イメージングによる表在肝腫瘍の術中検出

P.I.

A-Hon Kwon, 權雅憲Affiliation

Surgery, 外科学講座

Collaborators

山田正法、海堀昌樹、矢尾育子（浜松医科大学）

Keywords

5-ALA, ICG, intraoperative diagnosis, liver tumors

E-mailkon@hirakata.kmu.ac.jp

5-アミノレブリン酸、インドシアニングリーン、術中診断、肝癌

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Background: Indocyanine green (ICG) and the porphyrin precursor 5-aminolevulinic acid
(5-ALA) have been approved as fluorescence imaging agents in the clinical setting. This study
evaluated the usefulness of fluorescence imaging with both ICG and 5-ALA for intraoperative
identification of latent small liver tumors.
Methods: There were 48 patients who had main tumors within 5 mm of the liver surface. 5-ALA
hydrochloride was orally administered to patients 3 h before surgery. ICG had been intravenously
injected within 14 days prior to surgery. Intraoperatively, after visual inspection, manual palpation,and ultrasonography, fluorescence images of the liver surface were obtained with ICG and 5-ALA
prior to resection.
Results: With ICG, the sensitivity, specificity, and accuracy for detecting the preoperatively
identified main tumors were 96%, 50%, and 94%, respectively. Twelve latent small tumors were
newly detected on the liver surface using ICG, five of which proved to be carcinomas. With
5-ALA, the sensitivity, specificity, and accuracy for detecting the main tumors were 57%, 100%,and 58%, respectively. Five latent small tumors were newly detected using 5-ALA; all werecarcinomas. Overall, five new tumors were detected by both ICG and 5-ALA fluorescenceimaging; two were hepatocellular carcinomas and three were metastases of colorectal cancer. The
sensitivity and specificity of ICG fluorescence imaging for main tumor detection were relatively
high and low, respectively, but the opposite was true of 5-ALA imaging.
Conclusions: Fluorescence imaging using 5-ALA may provide greater specificity in the detectionof surface-invisible malignant liver tumors than using ICG fluorescence imaging alone.
【目的】我々が行っている肝切除術 navigation としての Indocyanine green (ICG)および
5-aminolevulinic acid (5-ALA) 蛍光法を用いての肝臓手術の取り組みを報告する。
【方法・結果】A. ICG および 5-ALA 蛍光 navigation: 1) 微小肝癌検出：術前肝機能検査のための ICG(0.5mg/kg)静注、また 5-ALA は手術当日朝 750mg/body 服用、手術時に術前画像診断や術中視触診にて検出不能な肝癌主腫瘍以外の微小肝癌の検出を試みている。これまで 48 例肝癌手術において、癌検出における感度・特異度・正診率は ICG 96%、50%、
94%、5-ALA は 57%、100%、58%であり、ICG は感度が高いが特異度が低く、また 5-ALA
はその逆であった。これまで 48 例中 5 例に ICG および 5-ALA によって主腫瘍以外の術前画像診断では指摘され得なかった微小肝癌を検出し、切除し得た（肝細胞癌 2 例、転移性肝癌 3 例; 計 7 結節）。
【考察】肝癌検出における ICG および 5-ALA 蛍光 navigation は、両者にて感度・特異度を相互に補完し、さらなる微小肝癌検出の有効性が期待できる。

2. List of Publications
Original Articles
1. Kaibori, M., Matsui, K., Ishizaki, M., Iida, H., Sakaguchi, T., Tsuda, T., Okumura, T., Inoue,
K., Shimada, S., Ohtsubo, S., Kusano, M. Ikehara, Y., Ozeki E., Kitawaki, T. and Kwon, A-H.
Evaluation of fluorescence imaging with indocyanine green in hepatocellular carcinoma.
Cancer Imaging 16, 6, 2016.
Books
235

1.

Kaibori M., Matsui, K., Ishizaki, M. and Kwon, A-H. Detection of Bile Leakage After
Hepatic Resection by Intraoperative Indocyanine Green Fluorescent Imaging，Fluorescence
Imaging for Surgeons. Springer, 177-183, 2015.

Proceedings
1. Kaibori, M. Novel techniques to reduce postoperative complications after liver surgery. The
32nd Congress of the Pan-Pacific Surgical Association Japan Chapter. Honolulu, USA．(教育講演), 2015.
2. Kaibori, M., Iida, H., Matsui, K., Ishizaki, M., Sakuguchi, T., Mtsushima, H., Inoue, K. andKwon, A-H. Novel techniques to reduce postoperative complications after liver surgery. The
31st Congress of the Pan-Pacific Surgical Association Japan Chapter in Taipei, Taipei,
Taiwan, 2014.
3. Kaibori, M., Matsui, K., Iida, H., Ishizaki, M., Sakaguchi T., Matsushima, H., Yanagimoto, Y.
and Kwon, A-H. Novel techniques to reduce postoperative complications after liver surgery.
Daegu-Kansai HBP Surgeons Joint Meeting 2014. Daegu, Korea, 2014.
4. Kaibori, M. Intraoperative Identification of Hepatic Malignancies by Fluorescence Imaging
using ICG and 5-ALA. 14th Annual Surgery of the Forgut Symposium 2nd Annual
International Congress of Fluorescent Guided Imaging Surgery, Florida, USA, 2015.
5. Kaibori, M. Clinical Applications of Indocyanine Green Fluorescent Imaging to Liver
Surgery. 13th Annual Surgery of the Foregut Symposium. Florida, USA, 2014.
6. Kaibori, M., Matsui, K., Ishizaki, M., Iida, H., Sakaguchi, T., Matsushima, H., Inoue, K. andKwon, A-H. Clinical applications of indocyanine green-fluorescent imagng in liver surgery.
The 5th Biennial Congress of the Asian-Pacific Hepato-Pancreato-Biliary Association.
Singapore, 2015.

236

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Sonication for diagnosis of implant-associated infections
超音波処理を用いたインプラント感染の新規診断法の構築

P.I.

Narumi Ueda, 植田成実

Affiliation

Orthopedic Surgery, 整形外科学講座

Collaborators

飯田寛和、上田裕輔、中村知寿、䯨賢一、奥田和之、高橋伯夫

Keywords

Sonication, implant-associated infection
超音波処理法, インプラント周囲感染

E-mailuedanar@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
Introduction: The diagnosis of implant-associated infections is challenging, and the conventional
culturing of periprosthetic tissue has been the gold standard for diagnosis of implant-associatedinfections. However, conventional diagnostic tests are inaccurate because the pathogenesis of
implant-associated infection is related to microorganisms growing in biofilms. We comparedculture of samples obtained by sonication of explanted implants to dislodge adherent bacteria from
implants with conventional culture of periprosthetictissue. The purpose of this study is to evaluate
the results of sonication that is microbiological diagnostic method for implant-associatedinfections.
Materials and Methods: ⑴Between January 2013 and January 2014, a total of 47 consecutive
patients underwent the removal of implants at our institution. Implants were removed because of
aseptic loosening in 17 patients, PJI in 17 patients, and others in 13 patients. Of the 17 patients in
PJI, 8 patients underwent two-stage exchange procedures. In the first surgical stage, after throughdebridement, ALAC beads and rod was replaced. In the second surgical stage, ALAC beads androd were removed, and a THA was performed. During the first and second surgical stage,
appropriate intravenous and oral systemic antibiotics were administered. Removed implants,
ALAC beads and rod in the surgical stage were subjected to sonication in a Bactosonic (BandelinGmbH, Berlin, Germany). The resulting sonication fluid was cultured for aerobic and anaerobic
bacteria. ⑵Patients with clinical diagnoses of osteoarticular infection directly related to an
orthopedic device were included in the study from January 2014 to November 2014. The aim of
the present study was to evaluate the effects of duration, contamination of the sonication methodof bacteria often associated with prosthetic infections. On the basis of the results from theseexperiments, we propose a protocol for sonication of biofilm on extracted implants prior toconventional culture.
Results: ⑴Of the 17 patients with aseptic loosening, 2 patient was positive for sonication for
Diagnosis of Implant-Associated Infections intraoperative conventional culture of periprosthetic
tissue. The sonication fluid culture of the removed ALAC beads and rod was negative in all
patients. One patient died from aspiration pneumonia after the second surgical stage. No
reinfection was observed at a mean follow-up of 12 months (range, 6-18 months). At last
follow-up, infection had been controlled and systemic antibiotics were not administered in all
patients. ⑵Forty-five samples of sonicate fluid from 24 patients were included in the study(1.87 samples/patient). 11 patients had clinical diagnosis of prosthetic infection. In all thesesamples, the preoperative diagnosis of infection was clinically confirmed in the operation bymacroscopic periprosthetic purulence. Additionally, in one case, a sinus tract communicating withthe prosthesis was observed. The other 13 patientshad no clinical diagnosis of infection (aseptic
loosening in six cases, mechanical pain in four cases, pseudoarthrosis in two cases, fracture in one
case, dislocation in one case).
Conclusion: ⑴ Culture of sonicate-fluid has been shown to improve the diagnosis of
implant-associated infections. In the future, it may be common technique for diagnosis of
implant-associated infections associated with biofilm, but this new technique needs further study.
⑵The duration of sonication influenced bacterial viability. The most bacteria were recovered inculture after 1 minute of sonication. No sonication yielded fewer viable bacteria than sonicationfor 1 minute. Sonication for either 5 yielded fewer viable bacteria than sonication for 1 minute.

237

2013年より超音波洗浄器を用いて人工関節感染やゆるみなどのインプラント抜去手術
時に取り出したインプラント周囲のバイオフィルムを超音波により破砕し, その洗浄液を培養（超音波処理法）した。日本語記載論文より、2013年1月から10月までに当科でインプラントを抜去した36例を対象（男性7例, 女性29例）とした。 手術時平均年齢69歳（19〜90）であり, 抜去インプラントは人工股関節19例, 人工骨頭9例, 人工膝関節4例, 観血的
骨接合材料4例であった。抜去理由は術前診断による深部感染12例, 非感染性ゆるみ16例,
頻回脱臼4例, 外傷後の変形性股関節症3例, インプラント破損1例であり, 摘出したインプラントは無菌下に超音波処理を施行した。術前は血液C-reactive protein(CRP)値と関節液の細菌培養検査（穿刺吸引法）を, 術中はインプラント周囲から採取する従来の細菌培養検査（従来法）と超音波処理をしたのち細菌培養検査（超音波処理法）を施行した。さらに病理組織検査も検討した。術前血液CRP値の平均は, 深部感染例6.8±8.9mg/dl, 非感染性
ゆるみ例0.4性1.0mg/dl, その他0.5±0.7mg/dlであった。従来法による術中の細菌培養検査の陽性率は, 深部感染例75%（9/12）, 非感染性ゆるみ例0%(0/15), その他0%(0/8)であり, 超音波処理を施行した細菌培養検査の陽性率は, 深部感染例83%(10/12), 非感染性ゆるみ例
6%(1/16), その他0%(0/8)であった。 深部感染例において, 前医で抗菌薬が投与されており, 穿刺吸引法や従来法で細菌の検出を認めず, 超音波処理法でのみ細菌を検出できた症例を1例認めた。また, 非感染性ゆるみ例においても, 穿刺吸引法と従来法で細菌の検出を認めず, 超音波処理法にて細菌を検出した症例を１例認めた。
これまで我々の施設で超音波処理法を行ってきた結果, 従来の方法より生菌の検出感度が向上した。成果を学会発表および論文作成し, 本研究に対して災害外科財団より臨床研究に対しての下記助成を得た。本研究の中間報告は今年 1 月論文報告し, 考えられた問題点を改善するための研究計画を行い, 2014 年１月よりコンタミネーションと超音波処理
時間に関する検討を新たに開始し, 2014 年度の結果より時間は超音波処理の最初の報告である（NEJM2007）5 分よりは 1 分を推奨する結果であり,検査手技でもコンタミネーシ
ョンは確認できなかった。現在論文作成を行っている。さらに 2015 年 4 月より超音波処
理に加えての新規診断方法の構築の研究を計画し、MSD より 2014 年 10 月に研究助成を得、2015 年 2 月に倫理委員会の承認を得て 3 月より PCR や次世代シーケンサーを用いた新規診断法の構築のための準備実験を現在まで行い, 2015 年 6 月に次世代シーケンサーを購入し、９月に最初のシーケンスを行う。

優れた成果があがった点
2013 年より行っているデータが増え、中間報告の内容を示唆する結果である。今年 6月にシーケンサーを購入し、その新規検証の前段階である PCR の手法の確認実験（標準菌株を用いた）により精度が高まり、確立できたので、次のステップであるライブラリを作成してシーケンスを行うところまできた。今年 9 月と 12 月にシーケンスを予定しており、なんらかの結果が期待できる。
問題点
シーケンスを 9 月に行うため、シーケンスによる結果が定かでなく、精度もまだ不明
であり、今月まで行っていた標準菌株を用いた PCR の実験で使用した検体をコントロー
ルに臨床検体とあわせて検証を行う。

2. List of Publications
Proceedings
1. 植田成実. 超音波処理によるインプラント周囲感染診断の現状と今後の展望 第 8 回
天の川 骨・関節感染症研究会, 大阪 , 2015 年 6 月 6 日、依頼講演

238

Annual Report 研究成果報告書

Title of Project

Clarification of skin and soft tissue aging and tissue regeneration andapplication in diagnosis and treatment using molecular imaging.
皮膚・軟部組織の加齢変化、組織再生における分子イメージングによる病態解明と診断治療への応用

P.I.

Kenji Kusumoto, 楠本健司

Affiliation

Plastic and Reconstructive Surgery, 形成外科学講座

Collaborators

森本尚樹、日原正勝、（井口有子）、覚道奈津子、田中義人、光井俊人、
畔熱行、木村幸志伊、田中寧子、尾崎祐次郎、岩宮怜子、小関梨奈、岡本まき、西村京子、＜Priscilla V.、小倉常敬＞、原朋也、来方えん（）内 産休・育休中、 ＜＞内 既卒
Regeneration, reconstruction, wound healing, tissue, cell, skin, fat, bone,cartilage, nerve, vessel 再生、再建、創傷治癒、組織、細胞、皮膚、脂肪、骨、関節、神経、血管

Keywords

E-mailkusumoto@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
In our Department, aging changes and pathological wounds on skin/soft tissue are studied toaim to lead the pathological lesions to normal conditions using patho-molecular imagings.
In 2015, studies have been promoted in the themes of platelet-rich plasma (PRP),
adipose-derived stem cells (ASCs), high-pressured decellularization, bone regeneration, andelectric cell-tissue preservation.
Adipose-derived stem cells (ASCs): It is already studied that adequate mixture ratio of ASCs andnormal fat cells to keep the volume of the injected tissue. Our research target has focused onbreast reconstruction applying ASCs after resecting breast cancer. Then basic measurement study
has been started in clinical cases to predict the grafting amount of ASCs to lead symmetrical andesthetic formal reconstructed breast for long period.
Platelet-rich Plasma (PRP): It is clarified in our department that activated PRP combined withgelatin sponge on the ulcer leads to ideal wound healing. Then it is shown as clinical results that
PRP is very effective to cure deep and narrow fistulae.
High-pressured decellularization: In order to preserve a best scaffold for regeneration, skindecellularization under the condition of 200MPa of various pressure conditions is recognized.
Against congenital pigmented nevi, which can produce malignant melanoma as the basis, concrete
stages have been started using a specific pressure device.
Bone regeneration: Continuously implantation studies of hydroxyapatite and bone morphogenetic
protein (BMP) are promoted. It shows that the combination implantation method can be
expected to reconstruct bony defects and deformities in face and the other area.
Electric cell-tissue preservation: It is clarified that micro-vessels can be preserved in the electric
cell-tissue preservation. After preserving the micro-vessels, the trial of micro-anastomosis isstarted in the animal studies.
形成外科学講座では、皮膚・軟部組織の加齢性変化や種々の病的創傷治癒を病態分子イメージングで把握し、生理的皮膚・軟部組織や創傷治癒に向かわせることを目指している。
この病態分子イメージングにより明らかにされる創傷治癒、組織再生による基盤的現象を応用して、種々の医療的手法により精度高く完成度の高い臨床的治療と再建に導き、明ら
かな改善、治癒に至るエビデンスをさらに病態分子イメージングにて検証している。
平成 27 年度は、多血小板血漿（PRP）、脂肪組織由来幹細胞(ASCs)、高圧脱細胞化、骨再生、電場負荷での細胞・組織保存などで成果を挙げた。
脂肪組織由来幹細胞(ASCs)：ASCs による多分化能を明らかにし、骨、軟骨、脂肪などの組織再生により広い医学領域で応用可能であることを確認している。また、ASCs の生着性を明らかにし、将来の臨床応用対象である乳房再建での基盤となる応用対象の計測に関239

するエビデンスを得た。
多血小板血漿(PRP)：PRP を活性化し、ゼラチンスポンジ併用の埋入が創傷治癒に優れた結果を得ることを明らかにした。また、小瘻孔の閉鎖にも有効であることを示した。
高圧脱細胞化：皮膚組織に 200MPa 負荷により、脱細胞して足場（scaffold）としての皮
膚構築を目指す基盤を整え、巨大色素性母斑治療への特殊な加圧器を用いて具体的検証を開始した。
骨再生： 骨変形に対して hydroxyapatite（HAP）、bone morphogenetic protein (BMP)埋入による検討を行った。HAP は材質的に組織親和性に優れ、形状の造形のための加工性にも富み、BMP の併用が期待される再建法であることを検証している。
電場負荷条件での細胞組織の保存：電場負荷での細胞、組織の保存がより長期に行えることを示し、微小血管の組織保存性を検証中である。

優れた成果があがった点＃骨再生で、Hydroxyapatite と BMP の併用が有用、有効であることが示された。
＃ASCs の応用で、乳房再建での計測的基盤のデータを収集中である。
＃PRP とゼラチンスポンジとの併用が有効であることが明らかにした＃皮膚や組織の脱細胞化は巨大色素性母斑の治療にターゲットを絞り予備的検証を始めている。
＃電場条件が微小血管の保存に有効で、微小血管の組織移植における応用の有効性を検証
中である。
問題点
＊各項目の更なる有効性の検証と、臨床応用での具体的応用法の追究が今後の課題である。
＊再生医療等安全性確保法の施行に従い、PRP と ASCs、高圧脱細胞化の臨床応用の認可が得られるように、学術的、事務的基盤を整える必要がある。

2. List of Publications
Original Articles
1. Kakudo, N., Morimoto, N., Ogawa, T., Hihara, M., Koseki, R. and Kusumoto, K.
Elastofibroma dorsi: a case report with an immunohistochemical and ultrastructural studies.
Med. Mol. Morphol. 49, 42-47, 2016. レフェリー有2. Morimoto, N., Kakudo, N., Matsui, M., Ogura, T., Hara, T., Suzuki, K., Yamamoto, M.,
Tabata, Y. and Kusumoto, K. Exploratory clinical trial of combination wound therapy with agelatin sheet and platelet-rich plasma in patients with chronic skin ulcers: study protocol.
BMJ Open, 5, Article No.e007733, 2015. レフェリー有3. Katsube, M., Yoshiura, K. and Kusumoto, K. A Japanese family with popliteal pterygium
syndrome. Case Reports Plast. Surg. Hand Surg. 2, 50-52, 2015. レフェリー有4. Kushida, S., Kakudo, N., Morimoto, N., Mori, Y. and Kusumoto, K. Utilization ofplatelet-rich plasma for a fistula with subcutaneous cavity following septic bursitis: A casereport. Eplasty. 15, Article No.e31, 2015. レフェリー有5. 三宅ヨシカズ, 土岐博之, 松島貴志, 南方竜也, 畔熱行, 三宅良平, 鈴木健

6.
7.

司 , 日 原 正 勝 , 楠 本 健 司 . 切 断 指 外 傷 治 療 に お け る “Microsurgery
Co-operating Network” の構 築. 日本 形成 外 科学会 会誌, レフ ェ リー有,35(4), 197-202, 2015.
三宅ヨシカズ, 土岐博之, 楠本健司. 両側頬部の対称性皮下肉芽腫の 1 例.
日本形成外科学会会誌, レフェリー有, 35(6), 334-337, 2015.
楠本健司. 人工骨の基礎と将来展望. PEPARS. レフェリー無, 104, 1-6, 2015.

Books
1. 楠本健司. 顔面外傷：初期治療の要点, 「創傷外科」形成外科治療手技全書 III 第 1
版, 編集：平林慎一, 川上重彦, 楠本健司, 館正弘, 2-3, 克誠堂出版, 東京, 2015.
2. 楠本健司, 創傷治療の歴史, 「創傷外科」形成外科治療手技全書 III 第１版, 編集：平林慎一, 川上重彦, 楠本健司, 館正弘, 348-350, 克誠堂出版, 東京, 2015.
240

Proceedings
1. 覚道奈津子, 森本尚樹, 日原正勝, 小倉常敬, 原朋也, 鈴木健司, 楠本健司. 皮膚潰瘍に対する Magellan Autologous Platelet Separator System を用いた治療の経験. 第 58 回日
本形成外科学会総会, 学術集会, 京都, 2015 年 4 月
2. 岩宮怜子, 田中義人, 尾崎裕次郎, 田中寧子, 鈴木健司, 山本大悟, 楠本健司. 乳房イ
ンプラントを用いた乳房再建における IMF 作成方法の検討. 第 58 回日本形成外科学会総会, 学術集会, 京都, 2015 年 4 月
3. 光井俊人, 森本尚樹, 覚道奈津子, 日原正勝, 楠本健司. 眼窩骨折術後にコーンビーム
CT を用いた術後評価. 第 58 回日本形成外科学会総会, 学術集会, 京都, 2015 年 4 月
4. 三宅ヨシカズ, 土岐博之, 楠本健司. arrow incision と健側乳頭組織衣装による乳頭再建. 第 58 回日本形成外科学会総会, 学術集会, 京都, 2015 年 4 月
5. 森本尚樹, 楠本健司, 鈴木茂彦. bFGF 保持・徐放可能な新規人工真皮（コラーゲンゼ
ラチンスポンジ）の開発. 第 58 回日本形成外科学会総会, 学術集会, 京都, 2015 年 4月
6. 森本尚樹, 神野千鶴, 馬原淳, 覚道奈津子, 藤里俊哉, 山岡哲二, 鈴木茂彦, 楠本健司.
皮膚腫瘍組織の不活化及び再利用を目的とした術中高圧印加機器の開発. 第 58 回日
本形成外科学会総会, 学術集会, 京都, 2015 年 4 月
7. 田中義人, 田中寧子, 岩宮怜子, 尾崎裕次郎, 鈴木健司, 山本大悟, 坪田 優, 楠本健
司. 当院における乳房下溝部切開からの一次再建症例の検討. 第 58 回日本形成外科
学会総会, 学術集会, 京都, 2015 年 4 月
8. 田中義人, 田中寧子, 岩宮怜子, 尾崎裕次郎, 鈴木健司, 山本大悟, 畔熱行, 楠本健司.
当院における自家組織を用いた乳房再建の治療戦略. 第 58 回日本形成外科学会総会,
学術集会, 京都, 2015 年 4 月
9. 田中寧子, 田中義人, 畔熱行, 尾崎裕次郎, 岩宮怜子, 鈴木健司, 山本大悟, 楠本健司.
当院における DIEP Flap 乳房再建症例の検討. 第 58 回日本形成外科学会総会, 学術
集会, 京都, 2015 年 4 月
10. 楠本健司. 多血小板血漿(PRP)療法と再生医療等安全性確保法. 第 15 回日本抗加齢医学会総会, 福岡, 2015 年 5 月
11. 日原正勝, 森本尚樹, 覚道奈津子, 畔熱行, 光井俊人, 山内崇史, 小関梨奈, 楠本健司,
櫻本和人, 鍬方安行, 北澤康秀. 広範囲熱傷治療におけるハイブリッド法では空気暴
露と母床真皮化は不要である. 第 41 回日本熱傷学会総会, 学術集会, 名古屋, 2015 年
6月
12. 小関梨奈, 日原正勝, 笹尾卓史, 白澤保子, 勝部元紀, 楠本健司. 当科での眼窩内容除去後の義眼床再建方法. 第 110 回関西形成外科学会学術集会, 大阪, 2015 年 7 月
13. 日原正勝, 山内崇史, 楠本健司. 耳介部 composite graft で再建した陰茎亀頭部 SCC の１例. 第 31 回日本皮膚悪性腫瘍学会学術集会, 大阪, 2015 年 7 月
14. 覚道奈津子, 森本尚樹, 日原正勝, 小倉常敬, 鈴木健司, 楠本健司. 皮膚潰瘍に対するMagellan Autologous Platelet Separator System を用いた治療の経験. 第 7 回日本創傷外科学会総会, 学術集会, 東京, 2015 年 7 月
15. 森本尚樹, 神野千鶴, 覚道奈津子, 鈴木茂彦, 楠本健司. 先天性巨大色素性母斑に対する新規治療法～術中印加（高圧処理）装置の開発. 第 7 回日本創傷外科学会総会, 学術集会, 東京, 2015 年 7 月
16. 日原正勝, 森本尚樹, 覚道奈津子, 畔熱行, 光井俊人, 山内崇史, 小関梨奈, 楠本健司.
広範囲熱傷治療における培養表皮ジェイス移植の位置づけ−STAPLER with Hybrid−.
第 7 回日本創傷外科学会総会, 学術集会, 東京, 2015 年 7 月
17. 白澤保子, 仲野雅之, 福田智, 楠本健司. 大腿骨骨折手術既往患者に発生した人工物
感染を伴う褥瘡の 2 例. 第 7 回日本創傷外科学会総会, 学術集会, 東京, 2015 年 7 月
18. 福田智, 仲野雅之, 白澤保子, 楠本健司. クレイヨンラピッド（合成吸収性縫合糸）の使用経験. 第 7 回日本創傷外科学会総会, 学術集会, 東京, 2015 年 7 月
19. 福田智, 仲野雅之, 白澤保子, 福島聡美, 楠本健司. 当科で試みている難治性潰瘍患者の診療, 治療体系. 第 17 回日本褥瘡学会学術集会, 仙台, 2015 年 8 月

241Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Nanoparticle technique for pathological diagnosis
病理診断への蛍光ナノ粒子イメージング技術の応用

P.I.

Kouji Tsuta, 蔦幸治

Affiliation

Pathology and Laboratory Medicine, 病態検査学講座

Collaborators

本学外科学講座：權雅憲、柳本泰明、良田大典

Keywords(株)コニカミノルタ：岡田尚大、高橋優
fluorescence nano particle, immunostaining, immune modulatory drugs
蛍光ナノ粒子、免疫染色、免疫調整薬

E-mailtsutakoj@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTS
In late years, a molecular target drug comes to be used for the medical treatment of themalignant tumor other than a conventionally used cytotoxic drug. Among them, a lot of antibody
therapies represented by breast cancer for HER2 receptor come to be used with many organs. To
evaluate these protein expressions accurately is one of the important works for a pathologist.
Although the criteria for these antibodies are well established, in the routine practice, there is an
overlap and discordances among the pathologists. We recently developed the phosphor integrated

dot (PID) is high luminance and high dynamic range than conventional fluorescent dye. In
addition, relation of a dot of particle and antibody is 1:1, thus this technique will provide themore quantitative method than conventional diaminobentizyn based dye.
To evaluate the PID method, we chose 5 kinds of cultured cell lines in various kinds of thePD-L1 protein expression levels and we set Western blot data was gold standard. We made eachcell block from cultured cell lines and performed PID staining and DAB staining in PD-L1
antibody. The PID data correlated with the Western blot data as compared with the DAB method.
悪性腫瘍の薬物治療には、旧来からの殺細胞性の薬剤以外に、近年分子標的治療薬が用いられるようになってきている。それらの中でも、乳がんの HER2 受容体に代表されるような腫瘍細胞の膜に発現するタンパク質に対する抗体療法が各種臓器で使用されるようになってきている。これらの発現を正確に判定することは治療選択の上で重要であるが、現在使用されている免疫染色による手法は発色色素の強弱で判定がおこなわれており、色素呈色反応の時間などの因子の影響を受けやすく、また、診断者間での一致には経験が必要である。
蛍光ナノ粒子は輝度が従来の蛍光色素より数万倍高くかつ、経時的蛍光減弱の少ない微粒子（Phosphor Integrated Dot; PID）で、この粒子を抗体の検出キットとして応用すること
で、陽性反応を粒子による実数に置き換えることで診断の定量化を行うことが可能となってきている。本方法の利点は、色素法では濃度が飽和し測定が困難な領域においても輝点数を計測することで定量化が可能であり、より広いダイナミックレンジを用いたタンパク発現の情報を得ることが可能なことである。また、高輝度な性質を利用しタンパク発現量が低いものにおいても精密に計測することが可能と考えられている。
今回、PID 法が胆膵系腫瘍においても有用かを検討するために、現在免疫調整薬との関連で注目の高い PD-L1 を用いて有用性を検討するために基礎実験を行った。
過去の論文から種々の程度に PD-L1 タンパク発現のある培養細胞を 5 種類選択、これらの培養細胞を Western blot で定量化、培養細胞をセルブロック化し PD-L1 抗体でナノ粒
子染色と DAB 染色を行った。ナノ粒子の計測は蛍光顕微鏡を用いて 400 倍視野で撮影し自動解析装置 Pidanalyzer（コニカミノルタ）で 200-1000 細胞カウントし平均化、DAB 発
色は Aperio システムで DAB1 (0-+3 の H-score 0-300)、DAB2 (255 階調)で測定した。
242

優れた成果があがった点
5 種類の種々の程度に PD-L1 タンパクを発現している細胞株の Western blot の結果と最も相関するのは蛍光ナノ粒子染色であった
問題点
今後、ナノ粒子染色を実際の胆膵系の悪性腫瘍に応用し腫瘍内での発現ならびに腫瘍内での Heterogenieity を数値化する予定である。

2. List of Publications
Proceedings
1. 蔦幸治. ナノテクノロジーによる新たな高精度・定量的病理診断, 基礎と臨床応用 肺
腫瘍病理診断への蛍光ナノ粒子イメージング技術の応用. 日本病理学会, 第 104 回総会, 名古屋, 5 月 1 日

243

Annual Report 研究成果報告書
Title of Project

Research for imaging of intracellular function and structure
細胞内機能と構造のイメージングに関する研究

P.I.

Kuniko Kusumoto, 楠本(竹本)邦子

Affiliation

Physics, 物理学講座

Collaborators

楠本（竹本）邦子、影島賢巳、新庄正路

Keywords

regenerative medicine, soft X-ray microscope, X-ray sokution scattering
再生医療，軟 X 線顕微鏡、X 線小角散乱法

E-mailtakemoto@hirakata.kmu.ac.jp

1. SUMMARY OF RESEARCH RESULTSIn Department of Physics three faculty staffs are independently in pursuit of the following
research subjects related to the present project.
1. Soft X-ray microimaging of prokaryotic organelle (Prof. Kuniko Takemoto)The goal of this study is to observe a unprocessed prokaryotic cell and identify the prokaryoticorganelles. In the final project year, small cyanobacteria categorized as the picoplankton, of order
0.5 - 2.0 µm, were observed using a full-field soft X-ray microscope (XM) with the new cryogenic
system developed by us. The XM images were compared with those observed with a scanning soft
x-ray microscope (SXM), a transmission electron microscope (TEM), and a low temperature / low
vacuum scanning electron microscope (LT / LV SEM). In the XM images, polyphosphate granules
were absolutely identified. The X-ray absorption coefficients of polyphosphate granules weredifferent from each other. The observed difference probably reflected a difference in chemicalcomponent and/or accumulation activity of polyphosphate. The experimental results lead to theconclusion that it is possible to observe the function of prokaryotic organelle using TXM.
2. Development of novel mechanical analysis method of cell sheet for regenerative medicine(Prof. Masami Kageshima)
A novel magnetic indenter is being developed for mechanical analysis of cell sheets andextracellular matrix sheets that are promising technology for next-generation regenerative
medicine. Step response of cell sheet and matrix sheet of man’s fibroblast cells were analyzed. It
was concluded that the both samples undergo a response that consists of an instantaneous
deformation and subsequent two retarded elastic modes having different time constants.
Irreversibility in deformation between loading and unloading exhibited a characteristic switching
between these three modes only for the cell sheet sample, which is attributed to response of live
cells in the cell sheet sample. The irreversibility analysis also revealed that the above three
deformation modes are not of completely different natures but are flexibly interchangeable to one
another depending on loading history and force magnitude.
3. Structural analysis of Protein A and its mutant in solution (Dr. Masaji Shinjo)
Protein A is composed of five homologous domains (PA) that fold into a three-helix bundle. C5d
is a derivative of PA which is composed of five modified C domains. We investigate structures of
PA and C5d in both neutral and acidic pH by x-ray solution scattering. By improving measurement
process to avoid x-ray damage of protein, more accurate results are obtained than before. The
results show PA changes its structure depending on pH. It indicates structural change take the roleof PA binding to immunoglobulins in neutral pH and releasing it in acidic pH. C5d does not show
structural change in both pH. The structure of C5d seems almost same with PA in neutral pH.
①軟 X 線顕微鏡による細胞内機能イメージング
原核細胞オルガネラのフルフィールド透過型 X 線顕微顕微鏡(TXM)によるイメージングと構造同定を目指している。最終年度は、開発を続けてきたクライオ装置を TXM へ本格導入し、細胞径が 1µm 以下の微細シアノバクテリアの観察を行った。得られた微細構造の同定のため、走査型軟Ｘ線顕微鏡(SXM)や透過型電子顕微鏡(TEM)などの他の顕微鏡で観察した像との比較を行った。エネルギー分解能の高い SXM 像との比較により、その中の一つはポリリン酸顆粒体であることが分かった。また、ポリリン酸顆粒体のＸ線吸収量の差は、ポリリン酸顆粒蓄積の活性状態を反映していると考えられた。以上より、TXM
は、原核細胞オルガネラの機能の観察に有効であることが示された。
②再生医療用細胞シートの物性計測法の開発
244

新たな再生医療技術として期待されながら力学的性質の測定が困難な極薄の細胞シートに自在に負荷を加えて力学計測をする、新たな計測方法を開発した。ヒト線維芽細胞を培養した細胞シートと、これより細胞を除去したマトリックスシートの 2 種類の試料のステップ状負荷に対する応答を計測し、複数の時定数をもつ複合過程で変形が生じることや、負荷のオンオフにおける可逆性に細胞の生作用が影響することなどを見出した。
③Protein A から切り出した, 3 へリックスバンドルからなるドメインが 5 つ連なった試料(PA), 及びその C ドメインを改変して 5 つ連ねた試料(C5d)を用い, Ｘ線溶液散乱法により, それぞれの中性及び酸性溶液中での構造を調べた。データ測定方法を見直すことによ
り試料ダメージを少なく抑えて測定することで, より正確な知見が得られ, PA は中性と酸性で異なる構造をとること, C5d は酸性, 中性で構造に大きな違いは無く PA の中性条件とほぼ同じ構造をとることを見出した。

優れた成果があがった点①ポリリン酸顆粒体の X 線吸収量の差には、構造体の大きさだけでは説明できない違いが存在していた。これは、蓄積されているポリリン酸の組成や活性状態の違いを反映していると考
えられ、TXM で機能イメージングができたことを示唆している。
②細胞シート、マトリックスシートの両方とも、ステップ負荷に対して瞬間的に応答する純弾
性要素と、2 つの大きく異なる時定数を持つ遅延弾性過程の、合計 3 つのモードの合成で変形が起きていることが示された。また、負荷オンオフにおける可逆性の検証の結果、生きた細胞を含む試料においてのみ、特異なモード間のスイッチングが見られ、細胞が負荷力に応答する
効果ではないかと推論した。
③PA は抗体結合部位を持ち, 中性では抗体と結合し酸性 pH では解離する。pH による構造変化を裏付ける結果を得た。

問題点①機能をイメージしているかを確認する実験を行う必要がある。
②力の定量性を向上させる必要がある。また、負荷中の細胞外マトリックス組織の状態を光学的に観察できるようにすることも必要である。
③特になし

2. List of Publications
Original Articles
1. Niiyama, Y., Tuji, A., Takemoto, K. and Ichise, S. Pseudanabaena sp. nov. and P. subfoetida
sp. nov. (Cyanophyta/ Cyanobacteria) producing 2-methylisoborneol from Japan. Fottea 16,
1-11, 2016. (査読有)2. Takemoto, K., Yoshimura, M., Yamamoto, A., Ichise, S., Namba, H. and Kihara, H. Imaging
of musty-odor producing filamentous cyanobacteria by various microscopies, AIP Conf.
Proc. 1696, 020024, 2016. (査読有)Proceedings
1. 市村薫，竹本邦子，山本章嗣，一瀬諭，吉村真史，塩野正道，西村雅子，水田剛，難波秀利，木原裕，琵琶湖産糸状カビ臭産生藍藻 Phormidium tenue の細胞内微細構造観察，第 25 回電子顕微鏡大学，東京，2015 年 6 月.
2. 竹本邦子，吉村真史，難波秀利，木原裕，放射光を光源とした軟 X 線顕微鏡によるカビ臭産生シアノバクテリアの観察，日本組織細胞化学会，枚方市，2015 年 10 月.
3. 竹本邦子，軟 X 線顕微鏡法によるシアノバクテリア含水試料の細胞内微細，日本分子生物学会年会、神戸，2015 年 12 月.
4. 影島賢巳，丸山敏朗，赤間智也，中邨智之，細胞シート・マトリックスシートの粘弾性計測法の開発. 第 38 回日本バイオレオロジー学会年会，東京，2015 年 6 月
5. Kageshima, M., Maruyama, T., Akama, T.O., Nakamura, T.. Rheological Analysis of
Cultured Cell/Matrix Sheet for Regenerative Medicine Using Novel Magnetic Indenter(Awarded with “Best Paper Award”), International Conference on Bioengineering andBiotechnology (ICBB’15)，バルセロナ，2015 年７月．
6. 新庄正路，市村薫，木原裕，Structure of Protein A and its derivative in solution studied bysmall-angle x-ray scattering, 第 53 回生物物理学会年会，金沢，2015 年 9 月（予定）．

245私立大学戦略的研究基盤形成支援事業（平成 23 年～27 年）
MEXT– supported Program for the Strategic Research
Foundation at Private Universities (2011－2015)

分子イメージングによる体系的病態の解明と診断治療法の開発
Systematic elucidation of pathogenesis anddevelopment of diagnosis and treatment bymolecular imaging
研究成果最終報告書
MICD Research Report 2011-2015
関西医科大学
Kansai Medical University
平成 28 年 5 月
May 2016

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