22-05- DNA Ligation Kit -Ligation high Ver.2(Code No. LGK-201)

取扱説明書
TOYOBO CO., LTD.
Bioproducts Sales and Marketing Department
OSAKA JAPANA3706K－ 目 次 －[１] はじめに ............................................................................................ 1[２] 製品内容.............................................................................................. 2[３] プロトコール ......................................................................................... 3[４] 実施例 ................................................................................................. 4（１） 突出末端ライゲーション .. ....................................................... 4（２） 平滑末端ライゲーション............................................................ 4（３） リンカーライゲーション.............................................................. 5（４） TAクローニング ....................................................................... 5（５） TAクローニング＜PCR産物を直接クローニングする場合＞....... 6（６） ファージライゲーション ............................................................. 6[５] トラブルシュｰティング............................................................................ 7[６] APPENDIX .......................................................................................... 8（１） 関連プロトコール...................................................................... 8・ベクターの脱リン酸化 ............................................................. 8・プライマーのリン酸化 .............................................................. 8・PCR産物のリン酸化 ............................................................... 9（２） 関連商品 ................................................................................. 9
ご注意
本製品は研究用試薬です。診断･臨床用試薬として決して使用しないでください｡
また、本試薬の使用にあたっては実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください｡

[１] はじめにDNAフラグメントの連結反応（ライゲーション）は、遺伝子組換え実験で欠くことのできない操作の一つです。この反応には通常T4 DNA Ligaseが用いられますが、DNAの末端の構造やフラグメントの大きさなどによって反応効率が大きく異なり、都度条件の設定が必要でした。
弊社では、そのような煩雑さをなくし、迅速・簡便にライゲーションを行うことのできる1液タイプのライゲーション試薬「Ligation high」を開発し、お届けしてまいりました。
「Ligation high Ver.2」は、従来の「Ligation high」をさらに使いやすく改良した、高効率ライゲーション試薬です。
本製品には、以下のような特長があります。
● 高いライゲーション効率
通常のT4 DNA Ligaseを用いる場合よりも、数十倍の効率を得ることができます。
また、組成の改良により、従来品（Ligation high）に比べ、特にTAクローニングの効率が飛躍的に向上しました。

相対コロニー数12010080

青コロニー
白コロニー

604020

1液
キット

B社

1液
キット

A社

LigationhighVer.20

図1 性能比較（TAクローニング効率による比較）
Ligation high Ver.2でのコロニー数を100として比較しました。

● -20℃保存で凍結しません
フリーザーから取り出してそのままご使用になれます。
● Ready-to-use
従来のLigation high同様、プレミックスの1液タイプです。DNA溶液と、等量もしくは半量混合して使用します。

1LGK-201

[２] 製品内容●製品に含まれるもの
Ligation high Ver.2750μL × 1本※1反応あたり7.5μL使用する場合、100回用としてご使用になれます。

●保存温度-20℃※-30℃以下の温度で長期間保存した場合や、冷凍庫内の冷気の噴出口近くなどに保存した場合、凍結する可能性がありますが、凍結融解実験により活性が低下しないことを確認しています。凍結した場合は、チューブを指の腹でつまんで、液温が高くならないように注意しながら融解してください。白濁がみられた場合にも同様に溶解する
ことにより通常通りご使用になれます。

相対コロニー数

12010080

青コロニー
白コロニー

6040
20005

凍結融解回数
図2 凍結融解による形質転換効率の変化（TAクローニング効率による比較）
凍結融解回数0回でのコロニー数を100として比較しました。

LGK-2012

[３] プロトコール
DNA溶液に対し、本品を等量もしくは半量添加して使用します（詳細は表１）。
ベクターDNA＋インサートDNA*1
Ligation high Ver.2
16℃、30分間*3*47.5μL
3.75～7.5μL*2↓
100μLのコンピテントセルに、～10μLの反応溶液を加え形質転換を行う*5*1 比率は[4]実施例をご参照ください。
ライゲーション効率は塩濃度によって影響を受けます。高いライゲーション効率を得たい場合は、塩濃度の低いTE Buffer (10mM Tris-HCl[pH8.0], 1mM EDTA)などに溶解したDNA断片を用いてください。
*2 TAクローニングを行うときは、ライゲーション試薬を等量添加した方がライゲーション反応の特異性が向上します。
*3 ライゲーション効率が低い場合は、2時間を目安に時間を延長してください。2時間以上反応させても問題ありませんが、目立った効率の向上は期待できません。また、突出末端ライゲーションなどの場合は、5分程度の反応で十分な効率を得ることができます。
*4 反応温度は、4℃～25℃で検討することができますが、本試薬は16℃で最も効率が得られるように設計されています。
*5 形質転換時の添加量は、コンピテントセルの10%を越えないようにしてください。大量に加える場合は、エタノール沈殿等で濃縮して添加してください。また、エレクトロコンピテントセルを用いる場合も、エタノール沈殿が必要です。

表1 Ligation high Ver.2の添加液量比率および反応条件
DNA溶液 ： Ligation試薬の容量比 推奨反応条件
突出末端ライゲーション
1 ： 1 or 1 ： 0.516℃、5～30分
平滑末端ライゲーション
1 ： 1 or 1 ： 0.516℃、30分
リンカーライゲーション
1 ： 1 or 1 ： 0.5
16℃、30分
Tベクターへのライゲーション
1 ： 116℃、30分（精製PCR産物を用いる場合）
Tベクターへのライゲーション*1*2
1 ： 116℃、30分（PCR産物を直接使用する場合）
ファージライゲーション
1 ： 1 or 1 ： 0.516℃、30分*1 プライマーダイマーや非特異増幅がみられる場合は、できる限り精製してご使用ください。
*2 十分な増幅がみられる場合は、0.5～1μLを用いることにより良好な結果が得られます。
以下のように混合して反応させます。
滅菌水
PCR産物
Ligation high Ver.2

X0.5～17.515 (μL)＜→詳しくは、実施例（５）[p6]をご参照ください

3LGK-201

[４] 実施例（１）突出末端のライゲーション

120
100806040
2001：
51：
31：1

青コロニー
白コロニー

1：0.5

相対コロニー数

脱リン酸化したpUC19/HindIII（50ng, 25fmol）とλDNA由来のHindIII断片（564bp）を様々なモル比で混合したDNA溶液<7.5μL>に、Ligation high Ver.2<7.5μL>を添加し、16℃で30分間反応しました。その後、反応液10μLを用いてE. coli DH5αコンピテントセル<100μL>を形質転換し、LB/Amp(X-Gal、IPTG)プレートで培養後、コロニー数をカウントしました。その結果、Vector：Insert比は1：3以上で良好な結果を示すことが分かりました。

Vector ： Insert （モル比）
図3 突出末端のベクターライゲーション
1:5でのコロニー数を100として比較しました。

（２）平滑末端のライゲーション
脱リン酸化したpUC19/HincII（50ng, 25fmol）と精製PCR産物（KOD -Plus-で増幅した0.5kb
λDNA断片*1 、リン酸化済み）を様々なモル比で混合したDNA溶液<7.5μL>に、Ligationhigh Ver.2<7.5μL or 3.75μL>を添加し、16℃で30分間反応しました。その後、反応液10μLを用いてE. coli DH5αコンピテントセルを形質転換し、LB/Amp(X-Gal、IPTG)プレートで培養後、コロニー数をカウントしました。その結果、Vector：Insert比は1：3以上で良好な結果を示すことが分かりました。
KOD -Plus-で増幅したDNA末端は平滑化されています。
120120100

Vector ： Insert （モル比）

1：51：
31：
51：
31：
140200青コロニー
白コロニー

1：
160

1：0.5

相対コロニー数

10080
青コロニー
60
白コロニー
4020080

1：0.5

相対コロニー数*1

Vector ： Insert （モル比）

DNA ： Ligation high Ver.2 = 1：1

DNA ： Ligation high Ver.2 = 1：0.5

図4 平滑末端のベクターライゲーション
DNA ： Ligation high Ver.2 = 1：0.5、Vector ：Insert = 1：3でのコロニー数を100として比較しました。また、相対コロニー数はベクター量で補正した値になっています。

LGK-2014

（３）リンカーライゲーション

120

120

100100相対コロニー数80
青コロニー
60
白コロニー
4080
604020

青コロニー
白コロニー

20

1：
10

1：
5

1：0.5

1：
10

1：
51：31：
11：0.51：3001：1

相対コロニー数

脱リン酸化したpUC19/HincII（50ng, 25fmol）とHindIIIリンカー（10mer：リン酸化済み）を様々なモル比で混合したDNA溶液<7.5μL>に、Ligation high Ver.2<7.5μL or 3.75μL>を添加し、16℃で30分間反応しました。その後、反応液10μLを用いてE. coli DH5αコンピテントセ
ルを形質転換し、LB/Amp(X-Gal、IPTG)プレートで培養後、コロニー数をカウントしました。その結果、Vector：Linker比は1：10以上で良好な結果を示すこと、およびLigation high Ver.2の添加量が1/2量（DNA：Ligation high Ver.2 = 1：0.5）の方が若干良好な結果が得られることが分かりました。

Vector ： Insert （モル比）

Vector ： Insert （モル比）

DNA ： Ligation high Ver.2 = 1：1

DNA ： Ligation high Ver.2 = 1：0.5

図5 リンカーライゲーション
DNA ： Ligation high Ver.2 = 1：0.5、Vector ：Insert = 1：10でのコロニー数を100として比較しました。また、相対コロニー数はベクター量で補正した値になっています。

（４）TAクローニング

相対コロニー数

Tベクター（50ng, 25fmol）と精製PCR産物（Taq DNA polymeraseで増幅した0.5kb断片）を様々なモル比で混合したDNA溶液<7.5μL>に、Ligation high Ver.2 <7.5μL >を添加し、16℃で30分間反応しました。その後、反応液10μLを用いてE. coli DH5αコンピテントセル<100μL>を形質転換し、LB/Amp(X-Gal、IPTG)プレートで培養後、コロニー数をカウントしました。その結果、Vector：Insert比は1：3以上で良好な結果を示すことが分かりました。

120100806040200

青コロニー
白コロニー

1：0.5

1：1

1：3

1：5

Vector ： Insert （モル比）

図6 TAクローニング（精製産物使用）
1:5でのコロニー数を100として比較しました。

5LGK-201

（５）TAクローニング ＜PCR産物を直接クローニングする場合＞

相対コロニー数

T ベ ク タ ー （ 50ng, 25fmol ） と 良 好 な 増 幅 の 確 認 で き た 未 精 製 PCR 産 物 （ Taq DNA
polymeraseで増幅した0.5kb断片）を様々な比率で混合したDNA溶液<7.5μL>に、Ligationhigh Ver.2 <7.5μL >を添加し、16℃で30分間反応しました。その後、反応液10μLを用いてE. coli DH5αコンピテントセル<100μL>を形質転換し、LB/Amp(X-Gal、IPTG)プレートで培養後、コロニー数をカウントしました。その結果、なるべくPCR反応液の持ち込み量を少なくした方が良好な結果が得られることが分かりました。
また、（４）に示すように、精製したDNA断片を用いた方が高い効率が得られることが分かっており、効率が低い場合は、精製PCR産物を用いる方が良好な結果が期待できます。

120100806040200青コロニー
白コロニー

210.5

未精製PCR産物 添加量（μl）<15μl反応系>

図7 TAクローニング（未精製産物使用）
0.5μl添加でのコロニー数を100として比較しました。

（６）ファージライゲーション
EcoRI 処理したλZAP®II(500ng)と2.8kbのpRheo/EcoRI test insert（225ng）を混合した溶液＜5μL＞に、ライゲーション試薬を＜5μL＞もしくは＜2.5μL＞添加し、16℃で30min反応を行いました。その後、反応液1.5μLをGIGAPACK®III（Stratagene社製）を用いてインビトロパッケージングし、E. coli XL-1 Blue MRF’を感染させ、導入効率を測定しました。コントロールとして、Ligation highを用いて推奨条件にて同様の実験を行いました。生じたプラークをカウントした結果、Ligation high Ver.2を用いても、Ligation highとほぼ同等の結果が得られることが分かりました（表2）。
表2 ファージライゲーションにおける反応条件の影響
Ligation highLigation high Ver.2
DNA溶液：
Ligation試薬
1 ： 0.5
1 ： 0.5の容量比
効率5.6×106
6.3×106(pfu/μg ZAP®II)

LGK-201

6

Ligation high Ver.2
1 ： 15.5×106

[５] トラブルシュｰティング
トラブル

考えられる原因
コメント
コロニーが得られ 形質転換に用いてい コンピテントセルに対して、1/10 量を越える反る反応液量が多い応液を加えて形質転換すると効率が低下しまない、少ない。
す。1/10 量以下で形質転換を行ってください。
ベクター量が少ない ベクター量を増やしてライゲーションを行ってください。
ベクターに対してイン 実施例を目安にインサート DNA 量を見積もっ
サート DNA が少ない てください。
塩の持込が多い
PCR 産物を直接用いる場合など、反応液を多く持ち込むと効率が低下します。精製して用いることで、効率を向上させることができます。
ライゲーション反応
脱リン酸化したベクターには、リン酸化されてが成立していない
いない PCR 産物などの DNA 断片を連結することはできません。リン酸化した DNA 断片を用いてください。
TA クローニング
リン酸化された DNA 断片を用いることで、TAクローニングの効率を向上させることができます。リン酸化プライマー（APPEDIX 参照）を用いて PCR を行ってみてください。
インサート挿入率 プライマーダイマー TAクローニングを行う場合、プライマーダイマが低いの影響ーが多いと目的インサートの挿入率が低下します。精製してから行ってください。
反応が不十分2時間まで反応時間を延ばしてください。16時
間反応も可能ですが、2時間以上の効率の向上は期待できません。

ベクターに対してインサートDNAが少ない
・一面にコロニー ベクターのセルフライゲーションが出現する・インサート挿入率が低い

実施例を目安にインサートDNA量を見積もってください。
ベクターの切断面が相補的な場合（平滑末端ライゲーションや単一制限酵素サイトへのクローニング）、ベクターをあらかじめ脱リン酸化処理しておくことにより、セルフライゲーションのノイズを効果的に減少させることができます。

試薬が保存中（輸 保存・輸送条件など送中）に凍ってしまった-30℃以下で保存した場合、試薬が凍結することがありますが、そのまま融解してご使用になれます。凍結で品質が低下しないことをあらかじめ確認しています。

7LGK-201

[６] APPENDIX（１）関連プロトコール●ベクターの脱リン酸化
精製ベクター溶液(0.5～2.5μg：制限酵素処理後精製)

80 (μL)

10×Buffer

10E. coli Alkaline Phosphatase (0.1～1U/μL)*

10Total100*目安として 5～20pmoles の 5’末端に対して 2U ですが、添加できる最大量(最終液量の 10%)を添加することでほとんどの場合、問題なく脱リン酸化できます。

↓平滑末端、3’突出末端 ⇒ 60℃、60min
5’突出末端 ⇒ 37℃、60min↓MagExtractor™ -PCR & Gel Clean up- (Code No.: NPK-601)などによる精製●プライマーのリン酸化(1)50pmole/μL(μM)以上の Primer 溶液を準備します。
(2)以下のように混合、反応させます。
Primer (50pmole/μL [50μM])

14 (μL)

10×Protruding End Kinase Buffer

210mM rATP <Code No. ATP-111 を希釈して使用>*1

2

T4 Polynucleotide Kinase(5～20U/μL)

2Total20↓
37℃、1h 反応↓
95℃、5min（T4 Polynucleotide Kinase を失活）↓← 50μL 滅菌ミリ Q 水を添加します
10pmole/μL [10μM] primer 溶液として使用します*2*3↓PCR を行います*1T4 Polynucleotide Kinase は添加できる最大量を添加します（最終液量の 10%）。

*2

このまま PCR 反応に使用します。
凍結して何度でも使用可能です。

*3LGK-201

8

●PCR産物（平滑末端）のリン酸化(1) 高正確性 PCR 酵素で増幅した PCR 産物を精製します。
(2) 以下のように混合、反応させます。
精製 PCR 産物（～1μg）

35 (μL)

10×Blunt End Kinase Buffer

510mM rATP*1 <Code No. ATP-111 を希釈して使用>*15T4 Polynucleotide Kinase(5～20U/μL)

5Total50↓
37℃、1h 反応↓
精製*1T4 Polynucleotide Kinase は添加できる最大量を添加します（最終液量の 10%）。

（２）関連商品品 名内 容

Code No.

50μmoles/0.5mL

ATP-111

500 回用NPK-301

200 回用NPK-601

１個

MGS-101

100μL×10 本

DNA-903

100μL×10 本

DNA-900

KOD -Plus- ＜高正確性 PCR 試薬＞

200U×1 本

KOD-201

KOD -Plus- Ver.2 ＜高正確性 PCR 試薬：バージョンアップ品＞

200U×1 本

KOD-211

KOD FX ＜高効率・正確性 PCR 試薬＞

200U×1 本KFX-101

rATP
MagExtractor™ -Plasmid<磁性ビーズを利用した Plasmid DNA 精製キット>
MagExtractor™ -PCR & Gel Clean up<磁性ビーズを利用した DNA fragment 精製キット>
Magical Trapper <磁性ビーズ分離用スタンド>
Competent high DH5α
<高効率 E.coli DH5αコンピテントセル、SOC 培地付>
Competent high JM109<高効率 E.coli JM109 コンピテントセル、SOC 培地付>

9LGK-201

【製造・販売元】－価格・在庫に関するお問い合わせ－
東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (大阪)〒530-0001 大阪府大阪市北区梅田一丁目１３番１号
大阪梅田ツインタワーズ・サウス
TEL 06-6348-3786 FAX 06-6348-3833
E-mail : order_lifescience@toyobo.jp
東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (東京)〒104-8345 東京都中央区京橋一丁目 17 番 10 号 住友商事京橋ビル
TEL 03-6887-8819 FAX 03-6887-8951
E-mail : order_lifescience@toyobo.jp－製品の内容・技術に関するお問い合わせ－テクニカルライン
TEL 06-6348-3888 FAX 06-6348-3833
開設時間 9:00～12:00 , 13:00～17:00 (土日祝日、休日を除く)
E-mail : tech_osaka@toyobo.jp［URL］ https://lifescience.toyobo.co.jp/