22-05

SuperPrep®
Cell Lysis & RT Kit for qPCR
(Code No. SCQ-101)

SuperPrep®
Cell Lysis Kit for qPCR
(Code No. SCQ-201)

取扱説明書
TOYOBO CO., LTD.
Bioproducts Sales and Marketing Department
OSAKA JAPANA4944K

―目次―
[1]
[2]
[3]
[4]

[5]

[6]
[7]
[8]

はじめに・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
製品内容・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
製品のほかに用意するもの・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
使用方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
1. 細胞ライセートの調製・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・(1) 96 ウェルプレートで培養された接着細胞の場合・・・・・・・・・・・・・(2) 96 ウェルプレートで培養された浮遊細胞の場合・・・・・・・・・・・・・(3) 96 ウェルプレート以外の容器で培養された細胞の場合・・・・・・・
2. 逆転写(RT)反応・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
リアルタイム PCR(例) ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
1. THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (Code: QPS-101)をご使用の場合・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
2. THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix (Code: QPS-201)をご使用の場合・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
3. 他社 qPCR 試薬をご使用の場合・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
4. 1-step RT-qPCR 試薬をご使用の場合・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
実施例・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
トラブルシューティング・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
関連製品・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・―ご注意―
本キットに含まれる試薬は、すべて研究用試薬です。診断・臨床用試薬としては決して使用しないでください。本キットの使用にあたって
は、実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください。
※LightCyclerTM は、Idaho Technology Inc.並びに Roche
Molecular Systems Inc.の商標です。
※TaqMan®は、Roche Molecular Systems Inc.の登録商標です。
※SYBR®は、Molecular Probes Inc.の登録商標です。

SCQ-101_102

-1-

2
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20

[1] はじめにSuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)は、リアルタイム PCRによる遺伝子発現解析のための細胞溶解試薬(Lysis Reagents)と逆転写反応試薬(RT
Reagents)からなるキットです。本製品をご使用いただくことで、96 ウェルプレート等で培養した細胞から、逆転写反応の鋳型として利用可能な RNA を含む細胞ライセートを簡便に調製いただけます。さらに、本キットに含まれる逆転写反応（RT）試薬は、この細胞ライセートからの RT 反応に最適化されております。本キットにより、簡便、迅速に培養細胞からリアルタイム PCR 用の鋳型 cDNA の合成が可能です。
SuperPrep® Cell Lysis Kit for qPCR (Code: SCQ-201)は、細胞溶解試薬の別売品です。1-step リアルタイム RT-PCR による簡易アッセイのための細胞ライセートの調製にご使用になれます。
Cell Lysis(7min*1)

qPCR*2

Reverse Transcription(25min*1)

培養細胞

2-step リアルタイムRT
リアルタイムRT--PCR 高精度測定

PBS洗浄
Lysis Solution
添加
ライセートを
RT Master Mixと混合
37℃、15min→50℃、5min→98℃、5min

5min、室温
Stop Solution
添加2min、室温cDNAをリアルタイムPCR試薬と混合＜リアルタイムPCR試薬例＞
THUNDERBIRD®
Probe qPCR Mix(Code : QPS-101)
THUNDERBIRD®
®
SYBR qPCR Mix(Code : QPS-201）

1-step リアルタイムRT
リアルタイムRT--PCR*2

簡易測定＊1 作業時間を含まない時間を表示しています。
＊2 リアルタイムPCR試薬は本キットには含まれません。別途ご用意ください。

SuperPrep®

Cell Lysis Kit for qPCR
(Code No. SCQ-201)

SuperPrep®

Cell Lysis & RT Kit for qPCR
(Code No. SCQ-101)

図. 本製品によるリアルタイム PCR 解析フロー◆本製品の特長◆
1.

RNA 精製不要
培養細胞から、逆転写反応の鋳型として利用可能な RNA を含む細胞ライセートを簡便に調製することができます。調製したライセートを鋳型として、そのまま逆転写反応を行うことができるため、解析時間を大幅に短縮することが可能です。

2. ライセートから高品質な cDNA を合成
最適化されたバッファー組成により、RNase 等の細胞成分による RNA の分解を効
果的に抑えます（調製したライセート中の RNA は氷上で 2 時間安定です）。また、
DNase I 処理後に cDNA 合成を行うことから、ゲノム DNA のコンタミの少ない高品質な cDNA を合成することができます。逆転写試薬は弊社の高効率逆転写酵素-2-

SCQ-101_102

「ReverTra Ace®」をもとに最適化されたマスターミックスとなっており、簡便・高効率に cDNA 合成を行うことができます。合成した cDNA は長期保存可能です。
本試薬は、幅広い種類の細胞を用いるアッセイに使用可能です。下表の代表的な細胞について適用できることを確認しています。
表. 本製品の適用確認済み細胞
1
2

細胞名
A431
C2C12

接着／浮遊
接着
接着

種
H.sapiens
M. musculus

細胞
epidermoid carcinoma cell line
myoblast cell line

由来
上皮様細胞がん筋芽細胞

3Caco-2

接着

H.sapienscolon adenocarcinoma cell line

大腸がん

4

CHO-K1接着

C. griseus

ovary cell line

卵巣

5
6
7
8
9
10
11

COLO205
DLD-1
HCT-15HDF
HEK293
HeLa S3
HepG2

浮遊
接着
接着
接着
接着
接着
接着

H.sapiens
H.sapiens
H.sapiens
H.sapiens
H.sapiens
H.sapiens
H.sapienscolon adenocarcinoma cell line
colon adenocarcinoma cell line
colon adenocarcinoma cell line
primary foreskin fibroblasts (primary cell)
embryonic kidney cell line
cervix carcinoma cell line
hepatocellular carcinoma cell line

12

HUVEC

接着

H.sapiens

umbilical vein endothelial cells (primary
cell)

13

Jurkat浮遊

H.sapiens

T lymphocyte cell line

14

K562

浮遊

H.sapiens

myelogenous leukemia cell line

15
16
17
18

KUSA-A1
L929
MCF7
Neuro2a

接着
接着
接着
接着

M. musculus
M. musculus
H.sapiens
M. musculus

bone marrow stromal stem cell line
aneuploid fibrosarcoma cell line
breast adenocarcinoma cell line
neuroblastoma cell line

19

NIH-3T3

接着

M. musculus

embryo fibroblast cell line

20

PC12

接着

R. norvegicus

21

rMSC

接着

R. norvegicus

22
23

THP-1
U937

浮遊
浮遊

H.sapiens
H.sapiens

adrenal pheochromocytoma cell line
bone marrow stromal stem cells(primary cell)
acute monocytic leukemia cell line
leukemic monocyte lymphoma cell line

大腸がん
大腸がん
大腸がん
皮膚線維芽細胞
胎児腎
子宮頸がん
肝がん
臍帯静脈内皮細胞
白血病 T 細胞赤芽球様白血病細胞
骨芽細胞様株
結合組織
乳腺がん
神経芽細胞腫胎仔由来線維芽細胞
副腎褐色細胞腫
骨髄間質細胞単球
単球

3. ハイスループット解析のバラツキ低減
プロトコールから少量の分注工程や希釈工程を減らすことで、ハイスループット解析
におけるバラツキを低減しました。また、細胞溶解時のピペッティング操作を無くし、
DNase I 処理を並行して行うことで操作性を向上させました。DNase I の反応の停止
は Stop Solution を加えるのみで、RNA を不安定化する加熱工程などは不要です。
4. 様々なリアルタイム PCR 試薬に使用可能
様々なリアルタイム PCR 試薬（SYBR® Green I, TaqMan® アッセイ両方に対応可能）と組み合わせて使用可能です。
また、弊社 THUNDERBIRD® qPCR Mix (Code: QPS-101, QPS-201)等と組み合わせて用いることによって、培養細胞から簡便かつ高精度の遺伝子発現解析が可能であることを確認しています。また、弊社 RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix(Code: QRT-101, QRT-201)等の 1-step リアルタイム PCR 試薬と組み合わせる簡易アッセイも可能です（p.10～p.15 をご参照ください）。
SCQ-101_102-3-

[2] 製品内容
本製品には、以下の試薬が含まれており、100 反応用としてご使用になれます。
試薬は-20℃で保存してください。
SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)<Lysis Reagents>
試薬名
Lysis Solution

保存
-20℃

容量
5.5mL

または 2～8℃で5 ヶ月以内(注 1)

gDNA Remover
Stop Solution
RNase Inhibitor<RT Reagents>
試薬名
5×RT Master Mix
5×RT Master Mix no-RT
Control
Nuclease-free Water

-20℃
-20℃
-20℃

33μL
1.1mL
55μL

保存（注 2）
-20℃
-20℃

容量
860μL
86μL

-20℃

1.7mL×2

SuperPrep® Cell Lysis Kit for qPCR (Code: SCQ-201)[上記 SCQ-101 の Lysis Reagents の別売品です]
試薬名
保存
Lysis Solution
-20℃

容量
5.5mL

または 2～8℃で5 ヶ月以内(注 1)

gDNA Remover
Stop Solution
RNase Inhibitor
注1)
注2)

-20℃
-20℃
-20℃

33μL
1.1mL
55μL

gDNA Remover を添加した Lysis Solution を保存しないでください。必ずご使用の前に必要量の Lysis Solution を分取して gDNA Remover を添加してください。
長期に渡ってご使用される場合には、-30℃にて保存ください。

Lysis Solution
RT-qPCR 用に最適化された細胞溶解剤です。RNase 活性を低減する成分を含みます。付属の gDNA Remover を加えて使用します。細胞溶解とゲノム DNA の分解を同時に行います。

-4-

SCQ-101_102

gDNA Remover
本キットに最適化した DNaseI 溶液です。Lysis Solution 49.7μL に 0.3μL の割合で添加して使用します。測定時のバックグラウンドの原因となるゲノム DNA を分解します。
Stop Solution
Lysis Solution 中の酵素成分を不活性化する成分を含みます。
RNase Inhibitor
本キットに最適化した RNase Inhibitor 溶液です。Stop Solution に添加してご使用いただくことによって、サンプル中の RNase 活性をさらに低減します。
5× RT Master Mix
高効率逆転写酵素 ReverTra Ace®、RNase inhibitor、Oligo dT Primer、Random
Primer、反応バッファー、MgCl2、dNTPs、グリセロールなどを含んだ 5×濃度のマスター
ミックスです。蓋を開ける前にスピンダウンして、液を底に落としてからご使用ください。
また、粘性がありますので、ゆっくりとピペッティングを行ってください。
5× RT Master Mix no-RT Control
5× RT Master Mix から ReverTra Ace®のみを除いたマスターミックスです。逆転写(-)のコントロールの調製にご使用になれます。5× RT Master Mix と同様に、蓋を開ける前にスピンダウンして液を底に落としてからご使用ください。また、粘性がありますので、ゆっくりとピペッティングを行ってください。
Nuclease-free Water
Nuclease-free グレードの滅菌蒸留水です。ポリメラーゼ活性に影響を及ぼす恐れのあるジエチルピロカーボネート(DEPC)処理を行わずに調製されています。

[3] 製品のほかに用意するもの
本製品の他に、以下の試薬・機器類をご用意ください。
・ サーマルサイクラーまたはインキュベーター
本製品の RT 反応で推奨する温度(37℃、50℃、及び 98℃)を保つことができる機器をご用意ください。
・ リアルタイム PCR 装置及びリアルタイム PCR 用試薬
ご使用にあたっては各装置、試薬の取扱説明書に従ってください。

SCQ-101_102-5-[4] 使用方法
1. 細胞ライセートの調製(1) 96 ウェルプレートで培養された接着細胞の場合① 96 ウェルプレートに適当な数の細胞を播種します（例: 1～2x104 cells）。
細胞数が多すぎると、不十分な溶解や RT-PCR の阻害、ゲノム DNA の不十分な分解につながる可能性があります。本試薬では一般に 1x101～7x104 cells の細胞サンプルを処理することが可能ですが、細胞の種類によって多少異なります。104 cells を目安としていただくか、予備実験で上限を確認いただくことをお勧めいたします。

② 実験条件に従って、細胞をインキュベートします。
③ ウェルから培地を除去します。
④ 各ウェルに PBS(-)を加えます（100μL 程度）。
⑤ ウェルから PBS を除去します。
⑥ 必要量の Lysis Solution に gDNA Remover を添加します。下表を参考に、必要量より若干の余分量をみて調製してください。マルチチャンネルピペットをご使用時は10%程度の余分量をみて調製してください。
Lysis Solution
gDNA Remover

1 反応
49.7μL
0.3μL

10 反応
497μL
3μL

96 反応
4.77mL
28.8μLgDNA Remover と Lysis Solution の混合液は実験毎に調製してください。gDNA Remover を添加した Lysis Solution の保存は避けてください。

⑦ 各ウェルに Lysis Solution (gDNA Remover 含有) 50μL を加えます。
⑧ 室温で 5 分間インキュベートします。そのうち、最初に 30 秒間、プレートミキサーで（飛散しない程度の強さで）振とうしてください。プレートミキサーがない場合はプレートの横を手の甲でたたくなど、軽く振とうしてください。
サンプル数等によって、5 分後に Stop Solution が添加できない場合、室温で 5 分間インキュベートした後、サンプルを氷上に移して待機させてください。待機時間としては 2 時間を目安にして
ください。

-6-

SCQ-101_102

⑨ 必要量の Stop Solution に RNase Inhibitor を添加します。下表を参考に、必要量より若干の余分量をみて調製してください。マルチチャンネルピペットをご使用時は10%程度の余分量をみて調製してください。
Stop Solution
RNase Inhibitor

1 反応
9.5μL
0.5μL

10 反応
95μL
5μL

96 反応
912μL
48μL

⑩ 各ウェルに Stop Solution (RNase Inhibitor 含有) 10μL を加えます。
⑪ 室温で 2 分間インキュベートします。そのうち、最初に 30 秒間、プレートミキサーで（飛散しない程度の強さで）振とうしてください。プレートミキサーがない場合はプレートの横を手の甲でたたくなど、軽く振とうしてください。
RNase の活性が高い細胞については、氷上でインキュベートすることで、より再現性の高い結果を期待できます。

⑫

調製したライセートを氷上に移します。
細胞の種類によっては RNase の活性が強く、処理後も RNase 活性が残存する可能性がありますので、速やかに逆転写(RT)反応を行い、cDNA 化することをお勧めいたします。一時中断
される場合は 2 時間以内を目安に逆転写反応を行ってください。細胞ライセートの安定性については、p.17 [6] 3.をご参照ください。
cDNA の状態で保存することにより長期保存可能です。細胞ライセートとして保管する場合は80℃で凍結してください。その場合、少なくとも 2 週間程度保存可能です。

(2) 96 ウェルプレートで培養された浮遊細胞の場合
1 ウェルあたりの細胞数が 7.5×104 cells を超える場合は、細胞培養液の一部を新しい 96 ウェ
ルプレートに移して以下の処理を行ってください。

① プレート対応の遠心機で 2,000 rpm、5 分間遠心します。
② 培地を除去します。
プレートからの培地や PBS の除去はアスピレーターやピペットを用いてください。デカンテーショ
ンやペーパータオル上でのタッピングは細胞をロスする原因となります。

③ PBS(-) 100μL を加え、細胞を洗浄します（ピペッティング操作は不要です）。
④ 2,000 rpm、5 分間遠心します。
⑤ PBS を除去し、(1) ⑥以降の操作を行います。
SCQ-101_102-7-

(3) 96 ウェルプレート以外の容器で培養された細胞の場合① 細胞数を計測し、遠心して培地を除去します。
② 細胞を PBS(-)で洗浄します。
③ 細胞が 1×107 cells/mL 以下になるように PBS(-)に懸濁します。
④ マルチウェルプレートまたはマイクロチューブに 5μL ずつ分注し、(1) ⑥以降の操作を行います。

2. 逆転写(RT)反応（SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ -101)をご使用の場合）① 反応液の調製（40μL 反応の場合）
反応数を確認し、下表に従い、必要量より若干の余分量をみて RT マスターミックス
を氷上で調製します。穏やかに十分混合し、スピンダウンした後、PCR 用チューブまたはプレートに 32μL ずつ分注します。マルチチャンネルピペットをご使用時は 10%程度の余分量をみて調製してください。

5x RT Master Mix
Nuclease-free Water

1 反応
8μL
24μL

10 反応
80μL
240μL

96 反応
768μL
2,304μL

RT 反応は、20～40μL 反応系にライセートを 20%容量（40μL の場合、ライセート 8μL）添加す
ることをお勧めいたします。
RT(-)サンプルを調製される際は、5xRT Master Mix の代わりに 5xRT Master Mix no-RT
Control を使用してください。キットには 10 回用（40μL 反応）の no-RT Control が添付されています。

② 分注した RT マスターミックスにライセートを 8μL 加え、軽く混合した後、スピンダウ
ンして反応容器の底に落とします。
③ 以下の温度でインキュベートします。
37℃、15min.
50℃、 5min.
98℃、 5min. （酵素失活）
4℃、 Hold.

-8-

SCQ-101_102

④ 反応終了後、4℃または-20℃で保存します。4℃で 1 週間程度、-20℃で長期間保存が可能です。

SCQ-101_102-9-[5] リアルタイム PCR(例)リアルタイム PCR は、ご使用になる試薬や機器の取扱説明書をご参照ください。通常、10～15%容量を目安に cDNA をご使用いただくことで、再現性の高いリアルタイム
PCR 反応が可能です。ご使用のリアルタイム PCR 試薬によっては最適な鋳型量が異なる場合もありますので、予備実験を実施していただくことをお勧めします。以下に弊社
試薬を用いた例をご紹介いたします。

1. THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (Code: QPS-101)をご使用の場合
詳細は THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix の取扱説明書をご参照ください。
(1) 反応液の調製
TaqMan® Probe を用いた 50μL および 20μL 反応時の調製例を示します。用いるリア
ルタイム PCR 装置の特性に合わせ、適宜反応液量を増減させてください。

滅菌水
THUNDERBIRD® Probe
qPCR Mix
Forward Primer
Reverse Primer
TaqMan® Probe
50×ROX reference dye
cDNA 溶液 （[4].2.④）

20μL 反応
XμL
10μL

50μL 反応
XμL
25μL

最終濃度

6 pmol6 pmol4 pmol
0.4 or 0.04μL～3μL

15 pmol
15 pmol
10 pmol
1 or 0.1μL～7.5μL

0.3μM
0.3μM
0.2μM
1×/ 0.1×*1

1×*1: Applied Biosystems 社製機器、Agilent Technologies 社製機器などでは、ウェル間の蛍光強度および分注誤差補正のためにパッシブリファレンスを用います。これらの機器での反応の際にキット添付の ROX reference dye を添加してください。最適な添加量は機種により異なります。主な機器の添加量は以下の通りです。また、補正を行わない機器では添加する必要はありません。
表 1. 主な機器の最適な ROX reference dye 濃度
機器
Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、
StepOnePlus™ など
Applied Biosystems 7500、7500Fast、
Agilent Technologies 社製機器(オプション)など
Roche 社製機器、Bio-Rad 社製機器、BioFlux LineGene など- 10 -

最終濃度 (添加量)
1× (1/50 量)0.1× (1/500 量)不要

SCQ-101_102

(2) PCR サイクル条件設定（例）
ステップ

温度

時間

昇降速度

初期変性

95°C

60 秒*1

最大

95°C
60°C

15 秒*2
60 秒

最大
最大

PCR
(40 cycles)

変性
伸長(Data Collection は伸長ステップに設定します)*1: 本製品では高速ホットスタートシステムを採用しており、極めて短い初期変性時間で酵素が再活性化されます。ただし、鋳型 DNA の変性を完全に行うために、各機器の特性に応じた十分な初期変性時間を設定してください。最適時間がわからない場合は、60 秒に設定してください (初期変性
時間の延長は反応効率にはほとんど影響しません)。
表 2. 主な機器における最適な初期変性時間の目安
機器
Applied Biosystems 社製の高速サイクラー(Applied Biosystems 7500Fast 等)
キャピラリータイプの高速サイクラー(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的なブロックタイプのサイクラー(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(通常ブロック)、
StepOne™、StepOnePlus™、Agilent Technologies 社製機器、BioFlux Line Gene 等)

初期変性時間
20 秒
30 秒

60 秒

*2: PCR サイクル中の変性時間は、各機器の特性に応じて、以下の時間に設定してください。不十分な変性時間は、PCR 効率低下の原因となりますのでご注意ください。最適時間がわからない場合
は、15 秒に設定してください (変性時間の延長は反応効率にはほとんど影響しません)。
表 3. 主な機器における最適な PCR サイクル中の変性時間の目安
機器
PCR サイクル中の変性時間
Applied Biosystems 社製の高速サイクラー
3秒(Applied Biosystems 7500Fast 等)
キャピラリータイプの高速サイクラー
5秒(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的なブロックタイプのサイクラー(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(通常ブロック)、
15 秒
StepOne™、StepOnePlus™、Agilent Technologies 社製機器、BioFlux Line Gene 等)

SCQ-101_102- 11 -

2. THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix (Code: QPS-201)をご使用の場合
詳細は THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix の取扱説明書をご参照ください。
(1) 反応液の調製
50μL および 20μL 反応時の調製例を示します。用いるリアルタイム PCR 装置の特性に合わせ、適宜反応液量を増減させてください。

滅菌水
THUNDERBIRD® SYBR®
qPCR Mix
Forward Primer
Reverse Primer
50×ROX reference dye
cDNA 溶液（[4].2.④）

20μL 反応
XμL
10μL

50μL 反応
XμL
25μL

最終濃度

6 pmol6 pmol
0.4 or 0.04μL～3μL

15 pmol
15 pmol
1 or 0.1μL～7.5μL

0.3μM
0.3μM
1× / 0.1×*1

1×*1: Applied Biosystems 社製機器、Agilent Technologies 社製機器などでは、ウェル間の蛍光強度および分注誤差補正のためにパッシブリファレンスを用います。これらの機器での反応の際にキット添付の ROX reference dye を添加してください。最適な添加量は機種により異なります。主な機器の添加量は以下の通りです。また、補正を行わない機器では添加する必要はありません。
表 1. 主な機器の最適な ROX reference dye 濃度
機器
Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、
StepOnePlus™ など
Applied Biosystems 7500、7500Fast、
Agilent Technologies 社製機器(オプション)など
Roche 社製機器、Bio-Rad 社製機器、BioFlux LineGene など

最終濃度 (添加量)
1× (1/50 量)0.1× (1/500 量)
不要(2) PCR サイクル条件設定（例）
ステップ

温度

時間

昇降速度

初期変性

95°C

60 秒*1

最大

95°C
60°C

15 秒*2
60 秒

最大
最大

PCR
(40 cycles)

変性
伸長(Data Collection は伸長ステップに設定します)

融解曲線分析 (Melting / Dissociation Curve Analysis)*3- 12 -

SCQ-101_102

*1: 本製品では高速ホットスタートシステムを採用しており、極めて短い初期変性時間で酵素が再活性化されます。ただし、鋳型 DNA の変性を完全に行うために、各機器の特性に応じた十分な初期変性時間を設定してください。最適時間がわからない場合は、60 秒に設定してください (初期変性
時間の延長は反応効率にはほとんど影響しません)。
表 2. 主な機器における最適な初期変性時間の目安
機器
Applied Biosystems 社製の高速サイクラー(Applied Biosystems 7500Fast 等)
キャピラリータイプの高速サイクラー(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的なブロックタイプのサイクラー(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(通常ブロック)、
StepOne™、StepOnePlus™、Agilent Technologies 社製機器、BioFlux Line Gene 等)

初期変性時間
20 秒
30 秒

60 秒

*2: PCR サイクル中の変性時間は、各機器の特性に応じて、以下の時間に設定してください。不十分な変性時間は、PCR 効率低下の原因となりますのでご注意ください。最適時間がわからない場合
は、15 秒に設定してください (変性時間の延長は反応効率にはほとんど影響しません)。
表 3. 主な機器における最適な PCR サイクル中の変性時間の目安
機器
PCR サイクル中の変性時間
Applied Biosystems 社製の高速サイクラー
3秒(Applied Biosystems 7500Fast 等)
キャピラリータイプの高速サイクラー
5秒(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的なブロックタイプのサイクラー(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(通常ブロック)、
15 秒
StepOne™、StepOnePlus™、Agilent Technologies 社製機器、BioFlux Line Gene 等)*3: 融解曲線分析の設定は、各機器の標準設定に従ってください。詳しくは、各機器の取扱説明書をご覧ください。

3. 他社 qPCR 試薬をご使用の場合
SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)で調製した cDNA を
qPCR 反応系の 10～15%容量を目安にご使用ください。本キットの逆転写反応試薬以外の試薬で合成した cDNA の量や qPCR 反応の詳細は、お使いの試薬の取扱い説明書に従ってください。
化学修飾系ホットスタート qPCR 試薬をご使用の場合、本製品の RT 反応液の持込を最大 10%を目安としてご使用ください。使用する qPCR 試薬の性質によっては、この値は低下する可能性があります。逆転写反応液の添加量を減らしてください。
SCQ-101_102- 13 -

4. 1-step RT-qPCR 試薬をご使用の場合
本試薬で調製した細胞ライセート(p.6～8)を 1-step RT-qPCR の鋳型として簡易測定が可能です。1-step RT-qPCR 用試薬としては、弊社 RNA-directTM Realtime PCR
Master Mix (Code: QRT-101)、RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR MasterMix (Code: QRT-201)をご使用になれます。詳細は、各製品添付の取扱説明書をご参照ください。
A. RNA-directTM Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-101)をご使用の場合(1) 反応液の調製
50μL および 20μL 反応時の調製例を示します。用いるリアルタイム PCR 装置の特性に合わせ、適宜反応液量を増減させてください。

滅菌水 (RNase-free
grade)
RNA-directTM Realtime
PCR Master Mix
50mM Mn(OAc)2
Forward Primer
Reverse Primer
TaqMan® Probe
細胞ライセート([4].1.(1)⑫)

20μL 反応
XμL

50μL 反応
XμL

最終濃度

10μL

25μL

1x

1μL
6 pmol6 pmol4 pmol
1～2μL

2.5μL
15 pmol
15 pmol
10 pmol
2.5～5μL

2.5 mM
0.3μM
0.3μM
0.2μM

(2) PCR サイクル条件設定

ステップ

温度

時間

昇降速度

変性

90°C

30 秒

最大

逆転写反応

55°C

20 分

最大

変性

95°C

60 秒

最大

95°C
60°C

15 秒
60 秒

最大
最大

PCR
(40 cycles)

変性
伸長(Data Collection は伸長ステップに設定します)- 14 -

SCQ-101_102

B. RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix(Code: QRT-201)をご使用の場合(1) 反応液の調製
50μL および 20μL 反応時の調製例を示します。用いるリアルタイム PCR 装置の特性に合わせ、適宜反応液量を増減させてください。

滅菌水 (RNase-free
grade)
RNA-directTM SYBR®
Green Realtime PCR
Master Mix
50mM Mn(OAc)2
Forward Primer
Reverse Primer
細胞ライセート([4].1.(1)⑫)

20μL 反応
XμL

50μL 反応
XμL

最終濃度

10μL

25μL

1x

1μL
4 pmol4 pmol
1～2μL

2.5μL
10 pmol
10 pmol
2.5～5μL

2.5 mM
0.2μM
0.2μM(2) PCR サイクル条件設定

ステップ

温度

時間

昇降速度

変性

90°C

30 秒

最大

逆転写反応

55°C

20 分

最大

変性

95°C

60 秒

最大

PCR
変性
(40 cycles) アニ―リング
伸長

95°C
55°C
74°C

15 秒
15 秒
60 秒

最大
最大
最大

(Data Collection は伸長ステップに設定します)

Melting Curve Analysis

SCQ-101_102- 15 -

[6] 実施例
1. 精製 RNA を用いた検出との比較＜方法＞
SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)を用いて、HEK293 細胞 2.5x104
cells から細胞ライセートを調製した後、cDNA 合成（40μL 反応系）を行いました。また同時に、
HEK293 細胞から抽出した Total RNA 66.6ng から ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix (Code:
FSQ-201)を 用 い て cDNA 合 成 （ 40μL 反応 系 ） を 行 い まし た 。そ れ ぞ れ の cDNA を 鋳 型 にTHUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix (Code: QPS-201)を用いて 15 種類の House Keeping Gene
についてリアルタイム PCR 解析を行い比較しました。

＜結果＞

Purified RNA (Ct)30

R2 = 0.983

25

20

15

10
10

15

20

25

30

TM

SuperPrep® Lysate
Lysate(Ct)(Ct)
SuperPrep

15 種類のターゲットに対して、ライセートから調製した cDNA と精製 RNA から調製した cDNA との間で、高い相関性が認められました。このことから、本キットを用いることで、煩雑な RNA 精製を行うことなく、簡便にリアルタイム PCR による遺伝子発現解析を行えることが分かります。

2. アッセイ精度の評価＜方法＞
HeLa S3 細胞を 96 ウェルプレートに 2x104 cells/well ずつ播種し、100nM phorbol 12-myristate
13-acetate (PMA)を加えて 24 時間インキュベートしました。その後、PMA 処理した 12 ウェル、未処理の 12 ウェルを PBS(-)で細胞を洗浄し、SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ101)で処理して cDNA 合成を行いました。この cDNA を鋳型に THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix(Code: QPS-101)を用いて IL-6、IL-1β、β-actin 遺伝子の発現量をリアルタイム PCR を行って解析しました。同様に A 社細胞処理試薬を用いてリアルタイム PCR 解析を行いました。IL-6、IL-1β遺伝子の Ct 値をβ-actin 遺伝子で補正し（ΔCt）、PMA 処理の有無の差（ΔΔCt）を算出しました。続
いて Z’-factor を算出し、比較を行いました。

- 16 -

SCQ-101_102

Z’-factor : データのバラツキを考慮した、ハイスループットアッセイ系の質の目安となる数値です。一般に 0.5 以上
で良好と考えられます。今回は下記の式で算出しました。
Z’-factor = 1-3 x (ΔCt(+) 標準偏差 + ΔCt(-) 標準偏差) / |ΔΔCt|

＜結果＞
A 社試薬
35

30

30

25

25

Ct

Ct

弊社試薬
35

20

20

15

15
0

5

10

15

0

20

5

10

IL1β

A 社試薬

A 社試薬

IL-1β

Ct(IL-6)
平均
26.96
30.24
26.50
29.44

ΔCt(IL-6-β-actin)
平均
標準偏差
6.27
0.14
10.12
0.35
4.30
0.34
8.18
0.19

PMA
(+)
(-)
(+)
(-)

Ct(IL-1β）
平均
28.62
33.99
28.00
33.26

ΔCt(IL-1β-β-actin)
平均
標準偏差
7.93
0.15
13.87
0.38
5.80
0.47
11.99
0.34

IL-1β
弊社試薬

ACTB

PMA
(+)
(-)
(+)
(-)

IL-6
弊社試薬

IL6

15

20

well no.

well no.

IL-6β-actin

ΔΔCt
-3.85

Z'
0.62

-3.88

0.59

ΔΔCt
-5.94

Z'
0.74

-6.19

0.61

その結果、いずれも Z’-factor としては良好なアッセイ系の目安となる 0.5 をクリアしましたが、SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)と THUNDERBIRD® Probe qPCR
Mix (Code: QPS-101)を用いた弊社試薬系では、他社の試薬と比較して高い Z’-factor を示し、より質の高いアッセイが可能であることが分かりました。

3. 細胞ライセートの氷上安定性の確認<方法>
SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)を用いて、HeLa S3 細胞及び U937
細胞 4x104 cells から細胞ライセートを調製し、氷上にサンプルを移した後、0、1、2、3、4、7、24 時間
後に細胞ライセートをサンプリングし、すぐに cDNA 合成を行いました。同様に A 社試薬を用いて細胞ライセートを調製し、同様にサンプリングして、cDNA 合成を行いました。この cDNA を鋳型にTHUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (Code: QPS-101)を用いて、β-actin 遺伝子の発現量をリアル
タイム PCR を行って解析しました。

SCQ-101_102- 17 -

<結果><U937>
U937

25

40

20

35

15

30

Ct

Ct

<HeLa
HeLa S3>

10
5

25
20

0

15
0

10

20

0

on ice (hr)
A社試薬(β-actin)

1020

on ice (hr)

弊社試薬(β-actin)

A社試薬(β-actin)

弊社試薬(β-actin)

HeLa S3 細胞においては氷上に 2 時間放置しても顕著な Ct 値の低下は認められませんでした。
一方、RNase 活性のより強い U937 細胞では 2 時間を超えると Ct 値の低下が認められました。
細胞の種類や処理細胞数が多いと RNase 活性の影響をより強く受ける場合があります。細胞ライセート調製後はサンプルを速やかに氷上又は 4℃に移し、すぐに cDNA 合成を実施いただくことをお勧めいたします。また、必要に応じて、ご使用の細胞で予備検討をお勧めします。

- 18 -

SCQ-101_102

[7] トラブルシューティング
現象
原因
リアルタイム PCR 細 胞 数 が 多 す ぎ
でシグナルが出な る
い、あるいは 遅れて検出されるRNA が分解している

逆転写反応液の添加量が多すぎる

定量性が低いSCQ-101_102

細胞溶解時に均質に混合されていない対策
・過剰の細胞由来成分により RT 反応や
qPCR 反応が阻害される場合があります。
播種する細胞を低減するか、ライセートを
Lysis Solution : Stop Solution = 5:1 混合液にて希釈して RT 反応に添加してください。
・細胞の種類によっては RNase の活性が強く、ライセート中の RNase を完全に失活できない場合があります。このような細胞では、細胞溶解後、ライセートを氷上に移し、速やかに RT 反応を行い、cDNA 化することをお勧めいたします。一般的なセルラインではラ
イセートは氷上で 2 時間程度安定です（p.17参照）。
・サンプル数が多く、Lysis Solution 添加 5
分後の Stop Solution の添加が困難な場
合、サンプルを氷上に移して待機させてください（p.6 参照）。
・ライセートを保存する場合は-80℃で凍結し、凍結融解はできる限り少なくしてください。
・細胞は用時調製したものをご使用ください。アッセイ用に凍結保存しておく場合は、培養後、PBS(-)で洗浄した細胞から PBS(-)
を除去し、-80℃で凍結してください。
・本製品の RT 反応液を qPCR 反応液へ最大 15%添加しても直線性には問題ないことを確認していますが、使用する qPCR 試薬の性質によっては、この許容量が低下する
可能性があります。逆転写反応液の添加量を減らしてください。
・本製品以外の RT 試薬をご使用の場合、
qPCR 反応への持込許容量が変わる可能性があります。予備実験をしてご使用ください。
・Lysis Solution、Stop Solution 添加後に攪拌ムラが生じないように混合してください。

- 19 -

[8] 関連製品
品名
各種蛍光プローブ・蛍光プライマー検出用リアルタイム PCR 試薬

THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix

高効率 SYBR® Green I 検出系用リアルタイム PCR 試薬

THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix
1-step qRT-PCR kit （TaqMan®アッセイ・プローブアッセイ用）

RNA-directTM Realtime PCR Master Mix
1-step qRT-PCR kit （SYBR® Green I アッセイ用）

RNA-directTM SYBR® Green Realtime
PCR Master Mix

Code No.
容量1mL×1 本(100 回用/20μL 反応) QPS-101T
1.67mL×3 本
QPS-101(500 回用/20μL 反応)
1mL×1 本(100 回用/20μL 反応) QPS-201T
1.67mL×3 本
QPS-201(500 回用/20μL 反応)
0.5mL×5 本
QRT-101(250 回用/20μL 反応)
0.5mL×5 本(250 回用/20μL 反応) QRT-201

より詳細な情報は、弊社ウェブサイトをご覧ください
https://lifescience.toyobo.co.jp/- 20 -

SCQ-101_102

【製造・販売元】－価格・在庫に関するお問い合わせ－
東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (大阪)〒530-0001 大阪府大阪市北区梅田一丁目１３番１号
大阪梅田ツインタワーズ・サウス
TEL 06-6348-3786 FAX 06-6348-3833
E-mail : order_lifescience@toyobo.jp
東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (東京)〒104-8345 東京都中央区京橋一丁目 17 番 10 号 住友商事京橋ビル
TEL 03-6887-8819 FAX 03-6887-8951
E-mail : order_lifescience@toyobo.jp－製品の内容・技術に関するお問い合わせ－テクニカルライン
TEL 06-6348-3888 FAX 06-6348-3833
開設時間 9:00～12:00 , 13:00～17:00 (土日祝日、休日を除く)
E-mail : tech_osaka@toyobo.jp［URL］ https://lifescience.toyobo.co.jp/