Glycative Stress Research
Online edition : ISSN 2188-3610
Print edition : ISSN 2188-3602
Received : November 11, 2021
Accepted : December 1, 2021
Published online : December 31, 2021
doi:10.24659/gsr.8.4_171

Original article

Conventional evaluation of glycation with plate reader and its correlation
with CML formation
Sayuri Kato 1), Ryoji Nagai 1, 2)
1) Laboratory of Food and Regulation Biology, Graduate School of Agriculture, Tokai University
2) Laboratory of Food and Regulation Biology, Department of Bioscience, School of Agriculture,
Tokai University, Kumamoto, Japan,
Glycative Stress Research 2021; 8 (4): 171-174(c) Society for Glycative Stress Research（原著論文：日本語翻訳版）

プレートリーダーを用いた簡便なグリケーション進行の評価とCMLとの相関性
加藤紗優里 1) 、永井 竜 児 1, 2)1) 東海大学大学院農学研究科食品生体調節学研究室
2) 東海大学農学部バイオサイエンス学科食品生体調節学研究室

抄録
メイラード反応は還元糖のカルボニル基とアミノ酸のアミノ基が反応して、食品のみならず生体内でも進行する。本反応の初期にアマドリ転位物、その後、酸化や縮合反応などを経て終末糖化産物（ advanced

glycation end products: AGEs）が生成する。AGEs 生成にはアミノ酸の種類、温度などが関係している。
本研究では依然として定量が困難である AGEs をプレートリーダーで簡便に測定し、 N ε - (carboxymethyl )lysine ( CML ) に対する抗体を用いた ELISAと比較した。さらに、AGEs の生成が変化することが予測される糖の種類（ ribose, fructose, glucose）や濃度（ 5 mM, 30 mM ）を代えて、これら AGEs の生成がどのように変化するかを評価した。AGEs 生成を蛍光強度で評価した結果、プレートリーダーでインキュベート期間や糖の種類による変化が認められた。さらにその影響は糖質が高濃度であるほど顕著であった。そして簡易的な蛍光測定と抗体を使用した CM L 測定の間で相関性が確認されたことから、プレートリーダーで簡便に Glycation を評価できると考えられる。

KEY WORDS : 終末糖化産物（ advanced glycation end products: AGEs）、糖化反応（glycation）、		蛍光、 N ε - (carboxymethyl) lysine (CML )連絡先： 教授 永井竜児
東海大学農学部バイオサイエンス学科食品制御生物学研究室〒862 - 8652 熊本県熊本市東区東六 9 - 1 - 1
TEL & FAX：096 - 386 - 2692 e -mail：nagai-883@umin.ac.jp
共著者：加藤紗優里 0cnfm005@mail.u-tokai.ac.jp

Glycative Stress Research 2021; 8 (4): 171-174
本論文を引用する際はこちらを引用してください。
(c) Society for Glycative Stress Research（ 1 ）Glycative Stress Research

蛍光測定

はじめに食品や生体には様々な糖やアミノ酸、ペ プ チド、タンパ ク質が 存在する。糖のカルボニル基とアミノ酸のアミノ基が反応することで褐変反応であるメイラード反応が起こる。本反応はおおまかに前期および後期の反応に分けられる。前期反応では、カルボニル基とアミノ基が脱水縮合してシッフ塩基を経てアマドリ転位生成物（アマドリ化合物）が生成され、そこから様々なジカルボニル化合物も生成される。このアマドリ化合物は比較的安定な化合物であるが、後期段階では酸化、脱水反応などにより終末糖化産物（advanced glycation end products: AGEs）が生成される。本反応の進行に影響を及ぼす因子には糖やアミノ酸の種類、温度などが考えられる 1)。

メイラード反応は食品の加熱のみならず生体内でも起きており、その進行は食品の加熱調理に比較して緩やかであるが、糖尿病では進行が早い。これは糖尿病では健常者よりも血糖が高いためメイラード反応がより進行すること、さらに代謝経路や炎症反応から生成するカルボニル化合物によって迅速に生体 AGEs が 生成するからである 2)。

AGEs には蛍光を有する種類があり、それらは 一般的に励起波長 370 nm、蛍光波長 440 nm で検出がなされている 3)。AGEs 含量を評価する方法として蛍光強度の測定、抗 AGEs 抗体を用いた ELISA、機器分析などがあげられるが、 AGEs 測定は依然として困難な場合が多い。
今回、マイクロプレートリーダーを用いて簡便に蛍光強度で AGEs を評価し、酸化反応で生成することが知られている CML4, 5)に対する抗体を用いた ELISA と比較した。さらに、AGEs 生成に影響をおよぼすことが知られている糖の種類や濃度によるAGEs 生成の影響を、蛍光法とELISA 法で比較した。蛍光性 AGEs と非 蛍 光 性の CML
では測定方法が異なるため、現状では、これら AGEs の生成や阻害を評価するときは、それぞれ別の方法が行われている。そこで、AGEs 生成条件に変化を加えた時の蛍光性 AGEsとCML の生成に相関関係が 認められるかを検証した。

インキ ュベ ートした 各サンプルを蒸留水を用いて10 倍

希 釈 し、200 µL ず つ 96 ウェル プ レート（Tecan Greiner

96 Flat Transparent, Greiner Bio-One, Frickenhausen,Germany）に 添 加 し て、 蛍 光 プ レ ートリ ーダ ー（Tecaninfinite M PLEX, テカンジャパン、神奈川県川崎市）にて励起波長 370 nm 、蛍光波長 470 nm で蛍光測定した。

E LISAインキュベートした サンプルを 1 × PBS を用いて BSA
1 µg/mL に希釈して 96 well プレート（Clear Flat-Bottom
Immuno Nonsterile 96-Well Plates, Thermo, Massachusetts,
USA）に添加して、常法にしたがって CML を測定した 6)。
具体的には、抗原を冷蔵で 1 日静置したのち、0. 5 % ゼラ
チ ン Sigma, Darmstadt, Germany）で Blocking 後、1 次抗体として monoclonal anti-CM L antibody（ 0.5 µg/mL）をプレートに100 µL 添加して 1 時間室温で静置した。次 にHorseradish peroxidase 標識した 2 次抗 体 Goat antibody
Mouse IgG（KPL, USA ）をプレートに 100 µL 添加して1 時間室温で静置後、OPD（富士フイルム和光純薬、大阪）を用いて発色した。6 分間発色した後、2 M 硫酸で反応停止させ、TECAN infinite M PLEX にて吸光度 492 nm で測定した。

統計解析法

フリー 統計ソフト EZR（Easy R）7) を用いてボンフェローニ解析を行って有意差検定を行った。

結果
蛍光によるAGEs 生成の比較

蛍光測定の結果から、六単糖のグルコース、フルクトースよりも五単糖のリボースで蛍光性 AGEs の生成は増加し、さらに濃度依存的、時間依存的な増加が認められた（Fig. 1-a, b ）。さらに同じ六単糖でもグルコースよりフルクトースで高い蛍光強度を示した。14 日目の各サンプルにおいて多重検定（ボンフェローニ）を行った結果、5 mM の濃度では、(1) リボースとフルクトースの間、(2) リボース

方法とグルコースの間、(3) フルクトースとグルコースの間で蛍サンプルの調製光強度に有意差を認めた。30 mM の濃度では、(1) リボー

2 mg/mL ウシ血清アルブミン（BSA: Sigma, Darmstadt,Germany）にグルコース、フルクトース（関東化学、東京）、蛍光強度に有意差を認めた。

え、糖の濃度が 5 mM、30 mM になるように phosphate

CML 生成の比較

リボ ース（富士フイルム和光純薬、大阪）のいずれかを加buffer saline (PBS) で調製した。これらを 37 ℃ で 0, 3, 7,
14 日間インキュベ ート後、− 20 度で保 存し、後日、蛍光及び ELISA 法で AGEs を測定した。各糖、濃度、インキュベ ート時間を 3 サンプル ずつ調 整した。

スとフルクトースの間、(2) リボースとグルコースの間で5 mM の糖濃度において、CM L は六単糖のグルコース、フルクトースよりも五単糖のリボースで生成が増加し、30 mM でも同様の結果が得られた（ Fig. 2-a, b ）。つまり、
CM L 生成は糖の濃度依存的、時間依存的に増加すること（ 2 ）プレートリーダーによる従来の糖化の評価が明らかとなった。14 日目の各サンプルにおいて多重検定

考察

ボースとフルクトースの間、 (2)リボースとグルコースの間

通 常 AGEs を 測 定 す る と き は 蛍 光 検 出 器 を 備 え た
HPLC や質量分析装置を用いることが多いが、機器の維（ボンフェローニ）を行った結果、5 mM の濃度では、(1) リで CML含量に有意差を認めた。30 mM の濃度では、5 mMの時と同様のグループ 間で CML 含量に有意差を認めた。

持費や、サンプルの前処理が多段階必要である。それに蛍光による AGEs 生成と CML 量の比較

ストで簡便に一度に多検体の測定ができた。

蛍光性 AGEsと CML の生成量に相関性があるのか、インキュベート 14 日間行ったサンプルを用いて評価した。5対して今回はプレートリーダーにて蛍光性 AGEs を低コ蛋白の Glycation に伴い蛍光強度が増加し、蛍光検出器で AGEs 含量を評価することが一般的に行われている。

mM と 30 mM の 糖 濃 度 のリ ボ ー ス と フ ル クト ー ス で は強い相関性がみられた（ Fig. 3-a, b, e, f ）。さらに高濃度のンプルをキュベットに移して蛍光検出器で測定する必要

対してグルコースでは相関性が認められなかった（ Fig.て蛍光強度を測定し、蛍光強度が時間依存的に増加するこ

リボースとフルクトースではより強い相関性が示された。

3-c, d ）。

a)

2500
2500

2000
2000

* * *

1500
1500

1000
1000

1000
1000

* *
5510 10dayday* * *riboseriboseglucoseglucosefructosefructose

1500
1500

50050000 0fluorescence
fluorescence(30(30mM)
mM)
3000
3000

glucoseglucose fructose
fructose

2000
20000とが確認されたことから、プレートリーダーで AGEs がintensity / a.u.
intensity / a.u.

intensity / a.u.
intensity / a.u.

2500
2500

riboseriboseがあった。今回、 0. 2 mg/mL の反応溶液を 0.2 mL 用いb)

fluorescence
fluorescence(5 mM)(5 mM)

3000
3000

しかしながら、これまでの蛍光測定では 3 mL 程度のサ

500500015 1500 0

n =n3= 3* < *0.01< 0.015510 1015 15dayday

n =n3= 3* < *0.01< 0.01

Fig. 1. Measurement of fluorescent AGEs in fluorescence assay.
a) Fluorescence AGE intensity of 5 mM ribose, 5 mM glucose, 5 mM fructose; b) Fluorescence AGE intesnsity of 30 mM ribose, 30 mM

glucose, 30 mM fructose. Bar indicates standard deviation. * p < 0.01 by Bonferroni’s multiple test, n = 3, performed on each sample at day
14 using EZR software. AGEs, advanced glycation end products.

dayday* < 0.01* < 0.01

ELISAELISA(30 mM)(30 mM)
2.2
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

2.2 ribose ribose
2
1.8 glucoseglucose
1.6 fructosefructose
1.4
1.2
10.8
0.6
0.4
0.2
0005510absorbance at 492 nm/a.u.

02.2 ribose ribose
glucoseglucose
fructosefructose
21.8
1.6
1.4
1.2
* * * *
10.8
0.6
0.4
0.2
0051051015n 15= 3 n = 3

absorbance at 492 nm/a.u.

2.2
2
1.8
1.6
1.4
1.2
10.8
0.6
0.4
0.20b)ELISAELISA(5 mM)(5 mM)

absorbance at 492 nm/a.u.

absorbance at 492 nm/a.u.

a)dayday10* * * *

15n15= 3 n = 3* < 0.01* < 0.01

Fig. 2. CML measurement in ELISA.
a) CML formation of 5 mM ribose, 5 mM glucose and 5 mM fructose; b) CML formation of 30 mM ribose, 30 mM glucose and 30 mMfructose. Bar indicates standard deviation. * p < 0.01 by Bonferroni’s multiple test, n = 3, performed on each sample at day 14 using EZR
software. CML, N ε-(carboxymethyl) lysine; ELISA, enzyme-linked immuno sorbent assay.

（ 3 ）Glycative Stress Research

000.5

2500

2500
R² = 0.1448
2000

intensity / a.u.

intensity / a.u.

3000

1500
100050000e)e)

3000
2500

2000
1500

1000

50001 21.52d)d)

R² = 0.1448

1500
500
00.20

0.3
0.1

0.4
0.2

0.5
0.3

0.4

absorbance at 492
absorbance
nm / a.u. at 492 nm / a.u.

2000f)

1500

500

absorbance at 492
absorbance
nm/ a.u. at 492 nm/ a.u.

0.60103000

2500

R² = 0.5591
2500

2000

2000

1500
1000
500
01.5
0.5

21

2.5
1.5

2

2.5

0.1

0.4

0.5

R² = 0.5591

1500
1000
500
00.20

0.3
0.1

0.4
0.2

0.5
0.3

absorbance at 492
absorbance
nm / a.u. at 492 nm / a.u.

30 mM fructose30 mM fructose

3000
2500

3000

2000

2500
R² = 0.9684
2000

1000

1000

1500

500
00.6 0.4500

absorbance at 492
absorbance
nm / a.u. at 492 nm / a.u.

f)

R² = 0.862

0.4 0.2

0.5

1500

1000

30 mM glucose
30 mM glucosef)

1000

0.2 00R² = 0.9931

2000d)

0.500500

05 mM fructose
5 mM fructose

3000
R² = 0.862
2500

1500

1000

3000

1000

0.1

intensity / a.u.

intensity / a.u.

)

0.5 1.5

2500

2000

05 mM glucose5 mM glucose

3000
2000

0 1

absorbance at 492
absorbance
nm / a.u. at 492 nm / a.u.

c)c)

)

0

3000
R² = 0.9931
2500

intensity / a.u.

500

30 mM ribose30 mM ribose

3000

intensity / a.u.

500

1500
1000

intensity / a.u.

1500

R ² = 0.9866b)
intensity / a.u.

2000

intensity / a.u.

intensity / a.u.

2500
2000
1000b)b)

5 mM ribose 5 mM ribose

3000
R ² = 0.9866
2500

intensity / a.u.

a)

3000

intensity / a.u.

a)

)

0

R² = 0.9684

1500

500
00 0.50.5 1

absorbance at 492
absorbance
nm/ a.u. at 492 nm/ a.u.

Fig. 3. Correlation between results of fluorescent AGEs and CML.
a) 5 mM ribose; b) 30 mM ribose; c) 5 mM glucose; d) 30 mM glucose; e) 5 mM fructose; f) 30 mM fructose. Samples incubated for 14

days with each sugar and concentration shown in Fig. 1 and Fig. 2 were used for evaluation. AGEs, advanced glycation end products; CML,N ε-(carboxymethyl) lysine.

評価できていると考えられた。さらに抗 CML 抗体を用い今 回デ ータは載せていないが、抗体を用いた ELISA 法

た ELISA の結果の相関性も確認されたことから、今回ので MG-H1も検証したが、あまり変化は認められなかった。

ことが確認された。今後、本手法は AGEs 生成阻害剤の探リーダーで簡便に評価可能であること、CMLと相関性が蛍光測定より、AGEs の生成が糖濃度や反応時間に依存AGEs 生成阻害剤の探索などに活用できると思われる。

手法で、これまでより簡便に AGEs 生成が評価できている索などに有用であると期待される。

して促進されること、さらに六単糖よりも五単糖においてAGEs 生成が増加したことが示された。
ELISA 法における CML 生成では、リボース、グルコース、フルクトースにおいて濃度依存的、時間依存的に CMLの生成量が増加したことが示された。つまり蛍光性 AGEsと同様に六単糖よりも五単糖において CML の生成量が増加したことが示された。

そして、蛍光性 AGEsと CM Lではリボースとフルクトースでは強い相関性が示された。さらに、糖の濃度が高いほどより強い相関性が示されたことから、糖尿病のような高血糖状態では蛍光性 AGEs と CML の生成量が相関する可能性が 高い。

以上のことから、蛍光性 AGEs は 96 ウェルのプレートあることが確認された。本法は大量検体の測定が必要な、利益相反申告すべての著者は、利益相反のないことを表明する。

謝辞
本 研 究 は、永井竜 児 が日本 学 術振 興会の科学 研 究費補助金（助成番号：20K05895）を受けて実施した。

（ 4 ）

1

プレートリーダーによる従来の糖化の評価

参考文献
1) Wells-Knecht KJ, Zyzak DV, Litchfield JE, et al.

Mechanism of autoxidative glycosylation: Identification ofglyoxal and arabinose as intermediates in the autoxidative
modification of proteins by glucose. Biochemistry. 1995;
34: 3702-3709.
2) Ahmed MU, Thorpe SR, Baynes JW. Identification ofN є-carboxymethyllysine as a degradation product offructoselysine in glycated protein. J Biol Chem. 1986; 261:
4889-4894.
3) Suehiro A, Uchida K, Nakanishi M, et al. Measurementof urinary advanced glycation end-products (AGEs)
using a fluorescence assay for metabolic syndromerelatedscreening tests. Diabetes Metab Syndr. 2016; 10(1Suppl 1): S110-S113.
4) Nagai R, Ikeda K, Higashi T, et al. Hydroxyl radical
mediates N є -(carboxymethyl)lysine formation fromAmadori product. Biochem Biophys Res Commun. 1997;
234: 167-172.
5) Nagai R, Unno Y, Hayashi MC, et al. Peroxynitrite
induces formation of N є-(carboxymethyl) lysine by thecleavage of Amadori product and generation of glucosone
and glyoxal from glucose: Novel pathways for protein
modification by peroxynitrite. Diabetes. 2002; 51: 28332839.
6) Nagai R, Fujiwara Y, Mera K, et al. Immunochemical
detection of N ε-(carboxyethyl)lysineusing a specificantibody. J Immunol Methods. 2008; 332: 112-120.
7) Kanda Y. Investigation of the freely available easy-touse software 'EZR' for medical statistics. Bone Marrow
Transplant. 2013; 48: 452-458.

（ 5 ）