山陽論叢
山陽論叢 第第 24
24 巻
巻 （2017）(2017)

研究ﾉｰﾄ
研究ノート

分岐鎖α-ケト酸脱水素酵素複合体の構造と機能に関する比較
生化学：アフリカツメガエルXenopus laevis のデカルボキシラーゼ
αサブユニットの一次構造について
小野 和夫1) ･ 高地 英夫2)
キーワード ： 分岐鎖α-ケト酸脱水素酵素複合体，デカルボキシラーゼ, 1次構造，cDNAクローニング，アフリカツメガエル
要旨：アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の分岐鎖α-ケト酸脱水素酵素複合体デカルボキシラーゼαサブユニット（E1α）のcDNAクローニングを行い１次構造と機能の関連について検討した。その結果、アフリカツメガエルのE1αは，400残基からなり，分子量は45,698と推定された。ヒトとの比較でアミノ酸配列全体での類似性は，91%であった。またサブユニット相互作用部位およびリン酸化部位と推定される配列の類似性は98%以上であった。以上のことか
らE1αの構造と機能上，重要なアミノ酸（配列）は，動物種を超えて保存されていると考えられた。

はじめに酵素は，細胞の代謝反応の効率を高めるように一定の局在性をもって細胞内に分散している。
そのなかで，一連の反応に関与する数種の酵素は，中間生成物の連続的受け渡しと化学変化を円滑に効率よく行うことができるよう特定の立体配置で一定数分子集合して，“多酵素複合体”を形成することが知られている１）。
分岐鎖α-ケト酸脱水素酵素複合体（BCKADC）は，分岐鎖アミノ酸代謝の律速酵素として機能し，真核生物ではミトコンドリアに局在する。 哺乳類の BCKADC は，触媒酵素成分とし て decarboxylase(E1) ， dihydrolipoyl transacylase (E2) お よ び dihydrolipoamide
dehydrogenase (E3)を含み，24 分子の E2 が集合して形成された E2 コアに E1 と E3 がそれぞれ 12 および 6 分子結合して構成される。このうちチアミンピロリン酸(TPP)を補酵素とする E1 は，α2β2 のサブユニット構造をもち，E1β を介して E2 と結合すると考えられている。
E1α はこの TPP 結合サイトのほか，特異的なリン酸化酵素および脱リン酸化酵素によりリン酸化･脱リン酸化されるセリン残基をもち BCKADC のオーバーオール活性の調節に関与する1,2)。

哺乳類と鳥類を除くと真核生物の E1 の構造と機能についてはほとんど知られていない。
我々は，両生類のアフリカツメガエル Xenopus laevis （XL）肝ミトコンドリアの可溶化試料を抗
1)山陽学園短期大学食物栄養学科
2)福島県立医科大学医学部生化学第一講座

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小野 ･ 高地 ： 分岐鎖α- ケト酸脱水素酵素複合体の構造と機能に関する比較
生化学 ： アフリカツメガエル Xenopus laevis のデカルボキシラーゼαサブユニットの一次構造について

ラット E1 抗体によりウエスタンブロットを行い，ブロット上 46K，37K および 36K の 3 つのタンパク質を検出した。これらの 3 種のタンパク質は，蔗糖密度勾配遠心によっていずれもE2 コアと結合することが確認されたことから，XL の E1 のサブユニットであることが強く示唆された 3)。そこで，これら 3 つのタンパク質が E1 のサブユニットとどのように関連するのかを明らかすることを目的として，cDNA クローニングにより E1α のアミノ酸配列を調べた。
さらに XL の E1α の 1 次構造と機能との関連についても検討した。
方法
XL の E1α サブユニット cDNA のクローニングと塩基配列の決定は前報に準じて以下の方法で行った４）。
先ず，E1α について哺乳類とニワトリで完全に保存されているアミノ酸配列をもとにミックスプライマーを作成し，XL 肝の cDNA ライブラリーをテンプレートとして PCR を行った。
JM109 にトランスフォームした。
得られた PCR 産物を pBluescriptKS＋にライゲーション後，組換え DNA をもつ大腸菌を定法により白コロニーとして選択した後，プラスミドを増幅，精製した。
挿入断片の塩基配列は、T3 と T7 プライマー及び Sequi Therm II Long-Read sequencing Kit (EPICENTRE. TECHNOLOGIES)を用いて 2 本鎖 DNA のシーケンスにより決定した。
このようにして cDNA の中央部分の塩基配列を決定した後，得られたクローンの 3’側に相補的なプライマーおよび cDNA が挿入されている λphage のマルチクローニングサイトの塩基配列の一部をプライマーとして PCR を行い，得られた PCR 産物を同様にクローニングし cDNAの 3’側の塩基配列を決定した。さらに cDNA の 5’側の配列についても同様に決定した。
結果と考察
cDNAの塩基配列と推定アミノ酸配列を図1に示す。cDNAのシーケンスの結果から成熟型
E1αのN末端はThr33と考えられた（図1）。またLys432の直後にTAA（mRNAでは終始コドンに相当）存在することからC末端はLysであると考えられた（図1）。これらの結果から，XLのE1αはヒトやウシのE1αと同様に400アミノ酸残基からなり，分子量は45,698と推定された。従って，イムノブロット上，抗ラットE1と反応した3つのたんぱく質のうち，46KのものがE1αサブユニットに相当すると考えられる。 また36Kおよび37Kのタンパク質はE1βサブユニットと関連することが強く示唆される。
哺乳類および鳥類（ニワトリ）の成熟型 E1αとのアミノ酸配列の比較を図２に示した。動
物種間でアミノ酸配列を比較するとXLのE1αサブユニットは，哺乳類および鳥類のサブユニットとアミノ酸レベルで高い類似性をもつ（ヒトとの比較では類似性が91%）（図2）。このことは，動物種を超えてE1の構造と機能が保存されていることを示している。
E1はTPPを補酵素とし，α2β2のヘテロテトラマー構造をとり，C末端付近のチロシン残基（特にTyr368）はE1βとの結合に必須の残基である可能性が指摘されている５）。また，E1の活性中心はαとβサブユニットの接触面に形成され，ここにE1αのTPP結合領域が配置される２）。このうちヒトE1αではAsn222がTPPおよびMg2+との結合に関与する２）ので、XLにおいても保存されているAsn222がその機能を担うと考えられる。
BCKADCのオーバーオール活性はE1のリン酸化／脱リン酸化により調節され２），このためのリン酸化部位は，E1αに2箇所存在し（ヒトE1ではSer292およびSer302），このうちSer292
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山陽論叢のリン酸化によりE1活性の90%以上が失われる 6) 。XLにおいてもこれらのSer292およびSer302に対応するSer残基が完全に保存されている（図2）。
このように哺乳類におけるTPP結合モチーフ，サブユニット相互作用部位およびリン酸化部
位の1次構造2)が，両生類のXLにおいても極めてよく保存されていることから，XLのE1αは構造および機能上，哺乳類および鳥類のものと相同であると考えられる。

図１ アフリカツメガエル E1αサブユニット cDNA の塩基配列と推定アミノ酸配列
図中の下線部および二重下線部は，ミトコンドリア移行シグナルおよびポリアデニル化シグナルをそれぞれ示す。

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生化学 ： アフリカツメガエル Xenopus laevis のデカルボキシラーゼαサブユニットの一次構造について

図２ 動物種間でのサブユニットのアミノ酸配列の比較
cDNA の塩基配列から推定されるアフリカツメガエル Xenopus laevis（XL）の成熟型 E1αのアミノ酸配列を哺乳類（ヒト，ウシ、ラット，マウス）および鳥類（ニワトリ）と比較した。
XL の配列上の網掛けされた残基は，比較した動物種間で完全に保存されていたものを示す。

謝辞
本研究は、山陽学園大学・短期大学学内研究補助（平成 27 年度）を受け、遂行されました。
心より感謝申し上げます。

文献
1) Perham RN， Packman L：2-Oxo acid de- hydrogenase multienzyme complexes：
Domains，Dynamic and Design. Ann NY Acad Sci，513，1-20 (1989)

2)

Chuang DT et al： Maple syrup urine disease (branched-chain ketoaciduria): An4- 152 -山陽論叢 第第 2424 巻
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update.

The Online Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease， eds

Scriver CR， et al. (McGraw Hill， New York)， pp 1–42 (2008)

3) Ono K ：Properties of the decarboxylase component of Xenopus laevis branched-chain
α-keto acid dehaydrogenase complex. Bulletin of Sanyo Gakuen College . 40，1-8(2009)4) Ono K et al ：cDNA cloning of the chicken branched-chainα-keto acid dehaydrogenase
complex: Chicken-specific residues of the acyltransferase affect the overall activity

and the interaction with the de hydrogenase. Eur. J. Biochem. 68，727-736 (2001)

5) Wynn RM et al:Structure， function and assembly of mammalian branched-chain

-ketoacid dehydrogenase complex. In “Alpha-Keto Acid Dehydrogenase Complexes”(ed by Patel MS，Roche TE， Harris RA)， Birkäuser Verlag， Basel， pp 101-117(1996)

6) Zhao Y et al : Site directed mutagenesis of phosphorylation sites of the branchedchain α-keto acid dehydrogenase complex. J Biol Chem， 269， 18583-18587（1994）

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