平成 30 年度研究助成報告書

生物学的根拠に裏づけされた変形性膝関節症の痛みに対する運動療法の確立に向けた研究

1

縮運動が痛みと滑膜におけるマクロファージの動態に及ぼす影響について検討した。
材料と方法
1．実験動物1）

2）

1）

坂本淳哉（PT） ，佐々木遼（PT），本田裕一郎（PT），3）

片岡英樹（PT） ，沖田実（PT）1）

実験には 7 週齢の Wistar 系雄性ラット 27 匹を用い，これらを 1）8% モノヨード酢酸（以下，MIA）溶液を右膝関節腔内に投与し，膝 OA を惹起させた後，5 週間

1）

長崎大学生命医科学域（保健学系）

通常飼育する OA 群（n=8），2）同様の方法にて右膝関2）

社会福祉法人十善会十善会病院リハビリテーション部

節に OA を惹起させた後，低強度の筋収縮運動を負荷

3）

する Ex 群（n=10），3）MIA 投与の疑似処置として右社会医療法人長崎記念病院リハビリテーション部

膝関節腔内に生理食塩水を投与した後，5 週間通常飼育
キーワード：変形性膝関節症，筋収縮運動，疼痛軽減効果する Con 群（n=9）に振り分けた。なお，本研究は長崎大学動物実験委員会で承認（承認番号：1808091472）を背景受けた後，同委員会が定める動物実験指針に準じ，長崎

変形性膝関節症（以下，膝 OA）に対する理学療法で大学先導生命科学研究支援センター・動物実験施設におは，膝伸展運動や下肢伸展位挙上運動といった低強度のいて実施した。

筋収縮運動をはじめとした運動療法が広く実践されてお2．膝 OA モデルの作製方法

1‒4）にOA 群，Ex 群の各ラットに対しては，3 種混合麻酔よって明らかにされている。そして，欧米各国で発表さ薬（塩酸メデトミジン 0.375 mg/kg，ミタゾラム 2 mg/れた最近の膝 OA の診療ガイドラインを概観すると，運kg，酒石酸ブトルファノール 2.5 mg/kg）を腹腔内へ投動療法はすべての患者に適用すべき第一選択治療に位置

与して麻酔した後，30 ゲージの注射針（NIPRO 社）をづけられている。ただ，これまでに運動による疼痛軽減

膝蓋靭帯の直上に刺入し MIA 2 mg を右膝関節腔内に効果の生物学的メカニズムについてはほとんど検討され投与した。なお，Con 群の各ラットに対しては，同様のておらず，膝 OA の痛みの病態にどのような影響を及ぼ手順で生理食塩水を投与した。

しているのかは明らかにされていない。そのため，生物

3．低強度の筋収縮運動の実施方法

り，その疼痛軽減効果は多くの無作為化比較試験

7）

学的なエビデンスに裏づけされた膝 OA に対する運動療本研究において採用した膝 OA モデルは，先行研究法の確立のためには上記の課題解決が必要といえる。に準じており，それによると MIA 投与 14 日後にはヒ一方，膝 OA の痛みの病態については末梢組織を中ト OA の進行期に類似する組織学的所見が認められる心に解明が進んでおり，最近の先行研究では滑膜におけことが報告されている。また，前述した無作為化比較るマクロファージの動態変化が痛みに関連している可試験

能性が指摘されている

5）

1‒4）

では Kellgren-Laurence（KL）分類において。マクロファージはその機能

Grade ⅡまたはⅢレベルの OA 患者が対象となっているによって M1 マクロファージと M2 マクロファージに大ことが多い。そこで，Ex 群に対する低強度の筋収縮運

6）

別されることが知られており ，前者はインターロイキ

動は，MIA 投与 14 日後から実施することとした。具体ン（以下，IL）-1 や腫瘍壊死因子 - α といった炎症性サ

的には，前述の 3 種混合麻酔薬を腹腔内へ投与して麻酔イトカインを産生して炎症を促進させる機能を有するこ

した後，低周波治療器トリオ 300（伊藤超短波社）を用とから，疼痛の発生に関与していると考えられている。

いて，刺激周波数 50 Hz，パルス幅 250 μ sec，刺激強度

一方，後者は IL-10 などの抗炎症性サイトカインを産生3 mA の条件で，大腿四頭筋を 2 秒間収縮，4 秒間弛緩して組織修復に関与し，炎症を沈静化させる機能を有すさせることで，膝関節伸展運動を誘発した。そして，こるとされており，疼痛の軽減に関与していると考えられの運動を週 5 回（20 分 / 日）の頻度で 3 週間継続してている。そして，膝 OA 患者の滑膜を検索対象とした負荷した。なお，実験期間終了後は各群の大腿直筋の筋先行研究5）によると，M2 マクロファージの遺伝子発線維横断面積を計測し，上記の条件による筋収縮運動に現が高い膝 OA 患者の滑膜では，発痛増強物質である筋線維肥大効果がないことを確認している

プロスタグランジン E2 の含有量が少ないことが報告さ

4．行動学的評価8）。

れている。これらの知見から，滑膜における M2 マクロ

実験期間中は経時的に注射側である右側膝関節の圧痛閾ファージの増加は疼痛軽減と関連しているのではないか値を測定した。具体的には，ランダルセリット式鎮痛効果と推測されている。

測定装置（Ugo Basile 製）を用いて，覚醒しているラット

そこで，本研究では，運動療法による膝 OA の疼痛の右側膝関節の外側裂隙に一定の速度で圧刺激を加え，後軽減効果の生物学的メカニズムの解明に寄与することを肢の逃避反応が出現する際の荷重量（g）を測定すること目的とし，ラット膝 OA モデルに対する低強度の筋収で評価した。データは 1 匹につき 5 回測定し，最大値と最2

平成 30 年度研究助成報告書小値を除外した 3 回分の値の平均値を採用した。

軟骨下骨では，関節軟骨消失後の代償反応とされる異型

5．試料作成軟骨形成や線維芽細胞の集積が認められた。そして，こ実験期間終了後，麻酔下のラットの左心室より生理食れらの所見を OARAI のスコアに基づいて評価したとこ

塩水を灌流して脱血を行い，その後，4% パラホルムア

ろ，OA 群および Ex 群は Con 群と比べて有意に高値をルデヒド／リン酸緩衝液（pH 7.4）を灌流し，組織固定示し，この 2 群間に有意差を認めなかった（表 1）。

を行った。灌流固定後は右側膝関節を摘出し，4% パラ

3．免疫組織化学的検索

ホルムアルデヒドにて後固定を行い，Morse 液を用い単位面積あたりの抗 CD68 抗体陽性細胞数については，た脱灰処理の後に，通法のパラフィン包埋を行った。

OA 群，Ex 群ともに Con 群と比べて有意に高値を示し，6．組織学的検索

この 2 群間に有意差は認められなかった（図 2A）。一方，各試料から 5 μ m 厚の矢状断薄切切片を作製し，サフ単位面積あたりの抗 CD206 抗体陽性細胞数については，ラニン O 染色に供した。そして，光学顕微鏡下にて観察

Ex 群は Con 群および OA 群と比べて有意に高値を示しし，国際変形性関節症学会（OARSI）が推奨するスコアた（図 2B）。に基づいて，関節軟骨および軟骨下骨の変性を評価した。
7．免疫組織化学的検索

考察

総マクロファージに対する免疫組織化学染色では，一本研究では，ラット膝 OA モデルを用いて，低強度次抗体に抗 CD68 抗体を，また，M2 マクロファージにの筋収縮運動が痛みに及ぼす影響とその生物学的メカニ対する免疫組織化学染色では抗 CD206 抗体を用いた。

ズムについて検討した。まず，MIA 投与後 4 〜 14 日目

そして，染色後は前方および後方関節包を顕微鏡用デジまでの膝関節の圧痛閾値の推移をみると，OA 群およびタルカメラにて撮影し，パーソナルコンピュータに取りEx 群は Con 群と比べて有意に低値を示し，また，この込んだ後，各抗体に対する陽性細胞数と面積を計測し，2 群間の間に有意差を認めなかった。つまり，MIA を2

滑膜 1 mm あたりの陽性細胞数を算出して，各群で比投与した両群においては同程度の膝 OA が惹起された

較・検討した。と推察される。そして，低強度の筋収縮運動を負荷した

8．統計処理MIA 投与後 21 日目以降の推移をみると，Ex 群は Con

膝関節の圧痛閾値の比較には，二元配置分散分析を適群と比べて有意に低値を示したものの，OA 群と比べて用した。また，組織学的検索による関節軟骨および軟骨有意に高値を示した。つまり，ラット膝 OA モデルの下骨の変性の比較には，Kruskal-Wallis 検定を適用した。

進行期から低強度の筋収縮運動を負荷すると疼痛軽減

そして，免疫組織化学的検索による単位面積あたりのマ効果が得られることが示唆され，これは膝 OA 患者をクロファージ数の比較には，一元配置分散分析を適用し対象とした無作為化比較試験た。各検定において有意差を認めた場合は，事後検定と本モデルにおいても低強度の筋収縮運動による疼痛軽減

して Scheﬀe 法を適用した。なお，すべての統計手法と効果が確認された。

1‒4）と同様の結果であり，も有意水準は 5% とした。
結果

1．行動学的評価
膝関節の圧痛閾値について，OA 群および Ex 群はCon 群と比べて MIA 投与後 4 日目以降において有意に低値を示した。そして，この 2 群を比較すると，MIA投与後 14 日目までは有意差を認めなかったが，MIA 投
与後 21 日目以降において Ex 群は OA 群と比べて有意に高値を示した（図 1）。
2．組織学的検索
Con 群の染色像では，赤く濃染した関節軟骨が明瞭に確認された。これに対して，OA 群および Ex 群では関節軟骨が消失していた。また，OA 群および Ex 群の表1

図 1 膝関節の圧痛閾値の変化○：Con，△：OA，□：Ex．
p < 0.05．平均値±標準偏差．
#*：Con 群との有意差． ：OA 群との有意差．p < 0.05

関節軟骨および軟骨下骨の OARSI スコア
Con 群

OA 群

Ex 群

関節軟骨（0‒5）

0.2（0.1‒0.4）*5.0（4.9‒5.0）*5.0（4.8‒5.0）

軟骨下骨（0‒5）0（0‒0.6）

5.0（4.9‒5.0）**
5.0（4.5‒4.8）

データは中央値（95% 信頼区間），*：Con 群と有意差，p < 0.05

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ファージの動態や M2 マクロファージへの分化誘導にかかわる IL-4 や抗炎症性サイトカインの発現状況については検討できておらず，これらの点について明らかにしていくことは今後の課題である。
まとめ

本研究では，ラット膝 OA モデルに対する低強度の筋収縮運動が痛みと滑膜におけるマクロファージの動態に及ぼす影響について検討した。その結果，低強度の筋収図 2 A．単位面積あたりの抗 CD68 陽性細胞数
B．単位面積あたりの抗 CD206 陽性細胞数*：Con 群との有意差．#：OA 群との有意差．p < 0.05

縮運動を実施することで滑膜における M2 マクロファージが増加し，このことが疼痛軽減効果に関与している可能性が示唆された。しかし，今回明らかにできた低強度の筋収縮運動による疼痛軽減効果のメカニズムは，その次に，膝 OA の組織学的な病態について検索したと一端に過ぎず，今後，膝 OA に対する運動療法の生物ころ，実験期間終了時における関節軟骨および軟骨下骨学的なエビデンスの構築に向けて，より詳細な検討を進の OARSI スコアは，OA 群と Ex 群は Con 群と比べてめていく必要がある。

有意に高値を示し，この 2 群間に有意差は認められず，いずれも末期膝 OA に相当する点数であった。つまり，

文

低強度の筋収縮運動を実施しても関節軟骨や軟骨下骨の1）Topp R, Woolley S, et al.: The eﬀect of dynamic versus
isometric resistance training on pain and functioning
among adults with osteoarthritis of the knee. Arch Phys
Med Rehabil. 2002; 83: 1187‒1195.
2）Lim BW, Hinman RS, et al.: Does knee malalignment
mediate the eﬀects of quadriceps strengthening on knee
adduction moment, pain, and function in medial knee
osteoarthritis? A randomized controlled trial. Arthritis
Rheum. 2008; 59: 943‒951.
3）Jan MH, Lin JJ, et al.: Investigation of clinical eﬀects ofhigh- and low-resistance training for patients with knee
osteoarthritis: a randomized controlled trial. Phys Ther.
2008; 88: 427‒436.
4）Chang TF, Liou TH, et al.: Eﬀects of elastic-band exercise
on lower-extremity function among female patients withosteoarthritis of the knee. Disabil Rehabil. 2012; 34: 1727‒
1735.
5）Timur UT, Caron MMJ, et al.: Celecoxib-mediatedreduction of prostanoid release in Hoffa’s fat pad fromdonors with cartilage pathology results in an attenuatedinflammatory phenotype. Osteoarthritis Cartilage. 2018;
26: 697‒706.
6）Benoit M, Desnues B, et al.: Macrophage polarization inbacterial infections. J Immunol. 2008; 181: 3733‒3739.
7）Fernihougha J, Gentrya C, et al.: Pain related behavior in
two models of osteoarthritis in the rat knee. Pain. 2004;
112: 83‒93.
8）Ishikawa K, Kajiwara Y, et al.: Low-intensity muscle
contraction exercise following the onset of arthritis
improves hyperalgesia via reduction of joint inﬂammationand central sensitization in the spinal cord in a rat model.
Neurosci Lett. 2019; 706: 18‒23.
9）Mosser DM, Edwards JP: Exploring the full spectrum ofmacrophage activation. Nat Rev Immunol. 2008; 8: 958‒969.
10）Bobinski F, Teixeira JM, et al.: Interleukin-4 mediates
the analgesia produced by low-intensity exercise in micewith neuropathic pain. Pain. 2018; 159: 437‒450.

変性といった膝 OA の組織学的な病態の進行を抑止することは困難であることが示唆され，前述の Ex 群で認められた疼痛軽減効果のメカニズムに組織学的な病態の進行抑制は関与していないと推察される。
一方，滑膜におけるマクロファージの動態変化をみると，単位面積あたりの抗 CD68 抗体陽性細胞数については，OA 群と Ex 群は Con 群と比べて有意に高値を示し，この 2 群間には有意差を認めなかった。しかし，抗CD206 抗体陽性細胞数については，Ex 群は Con 群および OA 群と比べて有意に高値を示し，低強度の筋収縮運動を負荷すると滑膜においては M2 マクロファージが増加する可能性が示唆された。組織に炎症が生じると集積した単球はインターフェロン γ など作用によって M1 マクロファージに分化誘導される。その後，炎症が終息に向かう際には IL-4 などの作用によって M1 マクロファー
ジは M2 マクロファージに分化誘導され，抗炎症性サイトカインである IL-1 受容体アンタゴニストや Il-10 などを産生することが知られている
ら10）

9）

。そして，Bobinskiの先行研究では，神経障害性疼痛モデルマウスに低強度のトレッドミル走行を負荷すると，末梢神経の損傷部位では IL-4 および IL-1 受容体アンタゴニストの発現量と単位面積あたりの M2 マクロファージ数が増加し，痛覚過敏が改善することが示されている。このことから，運動によって痛覚過敏が改善するメカニズムの一端には，IL-4 の発現増加とそれに続く M2 マクロファージへの分化促進，抗炎症性サイトカインの産生増加が関与しているのではないかと考えられている。これらの知見に基づくと，本研究の Ex 群において認められた疼痛軽減効果にも，滑膜における M2 マクロファージの増加が関与している可能性が推察される。ただ，M1 マクロ献