Glycative Stress Research
Online edition : ISSN 2188-3610
Print edition : ISSN 2188-3602
Received : April 25, 2022
Accepted : May 29, 2022
Published online : June 30, 2022
doi:10.24659/gsr.9.2_106

Original article

Cleavage of glycated protein cross-linking and cleavage of AGEs
cross-linking of substances contained in vegetables and herbs
Yurim Kim, Saki Yokota, Masayuki Yagi, Chieko Sakiyama, Yoshikazu Yonei
Anti-Aging Medical Research Center and Glycative Stress Research Center,
Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University, Kyoto, Japan
Glycative Stress Research 2022; 9 (2): 106-111(c) Society for Glycative Stress Research（原著論文：日本語翻訳版）

野菜やハーブに含まれる物質の糖化蛋白架橋切断作用とAGEs 架橋切断作用
金 瑜林、横田早貴、八木雅之、﨑山智恵子、米井嘉一
同志社大学生命医科学部アンチエイジングリサーチセンター／糖化ストレス研究センター

抄録
糖化 ストレスによる体内での終末糖化産物（advanced glycation end products; AGEs）の生成や蓄積は老化や様々な疾患の進展要因となる。特に AGEs の生成に伴う蛋白の架橋形成は組織を硬化させるため生体機能の低下要因となる。N - フェナシルチアゾリウムブロミド（ N - phenacylthiazolium bromide; PTB）は α ジケトン結合（α-diketone bond）を切断する作用を有し、糖化した蛋白中の AGEs 形成に伴う架橋結合を切断する（AGEs架橋切断作用）（cleavage of AGE cross-linking; CAC）。しかし糖化による蛋白の架橋形成にはグルコスパン、

α ジケトン、lysine-dihydropyridinium-lysine が関与しているため、架橋切断作用の有用性は糖化蛋白を用いた検証が課題となる。一方、糖化リゾチームをモデルとした蛋白架橋切断作用（cleavage of glycated-proteincross-linking; CGPC ）の測定が報告されている。本研究では野菜やハーブ等に含まれる12 物質の CGPCとCAC を測定し、糖化によって重合した蛋白架橋の分解の可能性を検証した。12 物質の CGPC と CAC を測定した結果、6 物質（ 50 %）の CGPC と CAC の間には高い正の相関性が認められ、糖化蛋白架橋の分解に α ジケトン結合の切断が関与している可能性があった。一方、3 物質は CGPC だけが認められ、α ジケトン構造と異なる架橋結合を切断している可能性があった。CGPC 測定は α ジカルボニル結合以外の糖化蛋白架橋切断作用を評価できる可能性がある。

連絡先： 教授 八木雅之
同志社大学生命医科学部アンチエイジングリサーチセンター／
糖化ストレス研究センター〒610- 0394 京都府京田辺市多々羅都谷 1- 3
TEL & FAX：07 74-65-6394 e -mail：myagi@mail.doshisha.ac.jp
共著者：金 瑜林 cgsc2036@mail4.doshisha.ac.jp; 横田早貴 ctug2031@mail4.doshisha.ac.jp;
﨑山智恵子 csakiyam@mail.doshisha.ac.jp ; 米井嘉一 yyonei@mail.doshisha.ac.jp（ 1 ）Glycative Stress Research 2022; 9 (2): 106-111
本論文を引用する際はこちらを引用してください。
(c) Society for Glycative Stress ResearchGlycative Stress Research

KEY WORDS : 終末糖化産物（advanced glycation end products：AGEs）、						糖化リゾチーム（ glycated lysozyme）、糖化蛋白架橋切断作用（cleavage of glycated-protein cross-linking）、AGEs 架橋切断作用（cleavage of AGE cross-linking）

はじめに材料と方法

糖化 ストレスによる体内での終末糖化産物（advancedglycation end products; AGEs）の生成や蓄積は老化や様々な疾患の進展要因となる 1, 2)。特に AGEs の生成に伴う蛋白の架橋形成は組織を硬化させるため生体機能の低下要因となる。糖化による蛋白の架橋形成にはグルコスパン、αジケトン（α-diketone）、lysine-dihydropyridinium-lysine が関与している 3)。 N - フェナシルチアゾリウムブロミド（ N -phenacylthiazolium bromide; PTB） は α ジ ケ ト ン 結 合（α-diketone bond）を切断する作用を有し、糖化した蛋白中の AGEs 形成に伴う架橋結合を切断する（AGEs 架橋切断作用）（cleavage of AGE cross-linking；CAC）4)。 試 料の CAC は 1-フェニル -1, 2- プロパンジオン（1-phenyl-1, 2-propanedione; PPD）を α ジケトン結合モデル化合物として、試料が分子内の α ジカルボニル結合を分解して遊離する安息香酸量を測定する。CAC はロスマリン酸（rosmarinicacid）5)、エラジタンニン類（ellagitannin）6)、フラボノイド（flavonoid）7) など、植物に含まれる物質に認められている。
一方、糖尿病ラットに CAC を有する物質である PTB を投与した試験では皮膚および尾コラーゲン中の糖化蛋白架橋を分解しなかった 8)。このため CAC による糖化蛋白架橋の切断作用の有用性は糖化蛋白を用いた検証が課題となる。
リ ゾ チ ー ム（lysozyme）は 糖 化 す る と ペ ント シ ジ ン（pentosidine）、ベスパーリジン（vesperlysine）、ピロピリジン（pyrropyridine）、クロスリン（crossline）等の架橋性AGEs の生成によって二量体（dimer）や三量体（trimer）を形成する 9)。 糖化リゾチームの重合化はポリアクリルアミドゲル電気泳動（polyacrylamide gel electrophoresis:SDS-PAGE ）によって検証可能である。糖化リゾチームをモデルとした蛋白架橋切断作用（cleavage of glycated-protein cross-linking；CGPC ）は食用紫菊花の 50 % エタ
ノール抽出エキスで報告されている 10)。

本研究では野菜やハーブ等に含まれる12 物質の CGPCと CAC を測定し、糖化によって重合した蛋白架橋の分解の可能性を検証した。

１) 試 薬使用した試薬は以下のメーカーから購入して使用した。リゾチーム塩酸塩（卵白由来）（ lysozyme, from egg white）、ロスマリン酸（rosmarinic acid）、1- フェニル -1, 2 -プロパンジオン（1-phenyl-1, 2-propanedione ; PPD）、 安息香 酸（benzoicacid）は富士フィルム和光純薬工業（大阪府大阪市）。2-40 %Mini-Protean TGX Precast gel は Bio-Rad(Hercules,California, USA) 。N -フェナシル チアゾリウムブロミド（ N-phenacylthiazolium bromide; PTB）
は Sigma-Aldrich Japan（東京都目黒区）。(-)-epicatechin、(-)-epigallocatechin gallate
は長良サイエンス（岐阜県、岐阜市）。7-hydroxyflavone、7, 4'dihydroxyflavone、7,4'-dihydroxyflavanone（liquiritigenin）、
5, 7- dihydroxyflavone 7-glucuronide (chrysin) 、3- (4 hydroxyphenyl) -1- (2,4,6-trihydroxyphenyl) propan-1-one（phloretin ）、rosmarinic acid（ester of caffeic acid and 3, 4dihydroxyphenyllactic acid）、3, 3', 4', 5,7-pentahydroxyflavone
3- rutinoside（rutin）は Extrasynthese（Genay Cedex, France）。
Punicalagin(2,3-(S)-hexahydroxydiphenoyl-4,6-(S,S)gallagyl-D-glucose) は Santa Cruz Biotechnology（Heidelberg,Germany）。 4', 5, 7- trihydroxyisoflavone（Genistein）は LCLaboratories（Woburn, Massachusetts, USA）。ローズマリー
抽出物 5) は A2P Science（Lyon, France）。その他の試薬は特級または HPLC グレードのものを富士フィルム和光純薬工業またはナカライテスク（京都府京都市）から購入して使用した。

２) 試料
試料は野菜やハーブ等の植物に含まれることが知られている

12 物質（flavone、7-hydroxyflavone、7, 4'-dihydroxyflavone、7,4'-dihydroxyflavanone、
5,7-dihydroxyflavone 7-glucuronide、
3,3', 4', 5,7-pentahydroxyflavone 3-rutinoside、(-)-epicatechin、(-)-epigallocatechin gallate、4', 5, 7-trihydroxyisoflavone、
3-(4-hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)propan1-one、rosmarinic acid、punicalagin を使 用した（Table 1）。
P TB は CGPC 、CAC の陽性対照物質として使用した。

（ 2 ）糖化蛋白架橋切断作用とAGEs 架橋切断作用

Table 1. Relationship between CGPC and CAC of substances contained in vegetables and herbs.
NoSubstances

Typical herbs containing ingredients

CGPC (%)

CAC (%)

1flavonechamomile, green tea, parsleyNDND

37, 4'- dihydroxyflavone

broad beans, fenugreek

16.6 ± 4.7

ND47, 4'- dihydroxyflavanone(Liquiritigenin)

nuts, winged beans, leafy vegetables

8.3 ± 1. 3

ND55, 7-dihydroxyflavone 7- glucuronide(Chrysin)passion fruit, honey, propolis

54.7 ± 4.9

ND63, 3', 4', 5, 7-pentahydroxyflavone 3-rutinoside(Rutin)apple, buckwheat, green tea

13.6 ± 1.9

2.1 ± 0.9(-) -epicatechingreen tea, apple, berries, cacao
green tea, cacao

24.6 ± 5.4
96.8 ± 2.16.9 ± 0.2
42.0 ± 3.994', 5, 7-trihydroxyisoflavone(Genistein)soy, broad beans

NDND

10

3-(4-hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)propan-1-one(Phloretin)apple, pear

19.8 ± 1.3

1.1 ± 0.1

11

rosmarinic acid
(ester of caffeic acid and 3,4-dihydroxyphenyllactic acid)rosemary, lemon balm, perilla

33.6 ± 0.6

27.4 ± 0.1

12punicalagin(2,3-(S)-hexahydroxydiphenoyl-4,6-(S,S)-gallagyl-D-glucose)pomegranate

83.3 ± 2.0

22.8 ± 0.4

refPTB(N-phenacylthiazolium bromide)—5.6 ± 0.4

23.3 ± 0.2

278berries, green tea, citrus

7-hydroxyflavone(-)-epicatechin gallate

NDND

Data are shown as mean ± SD, n = 3; Sample concentration; 0.5 mmol/L (CGPC), 2.5 mmol/L (CAC); ND, less than 1 %; CGPC, cleavage of glycated-protein
cross-linking; CAC, cleavage of AGE cross-linking, ref; positive control; SD, standard deviation.,3 ) 糖化リゾチームの作成
糖化リゾチーム（ glycated lysozyme）は既報 10-12) を参考に、2 mg/mL リゾチームと0.2 mol/L グルコースを含む 0.1mol/L リン酸緩衝液（pH 7.4）を60 ℃ 、40 時間反応させた後、3kDa 限外ろ過膜（ Amicon Ultra-0. 5 mL centrifugal
filters Ultracel-3K ; Merck, Darmstadt, Deutschland）によっ量 体（M）、 二 量 体（D）の バ ンド の 強 度 を ImageJ（ NIH,Maryland, USA）13, 14) で解析した。糖化蛋白架橋切断率は以下に示した式により算出した。 CGPC は糖化蛋白架橋
切断率 1 % 以上を作用ありとした。
糖化蛋白架橋切断率 (%)＝[ 1 − {(DS /MS) / (DR /MR )}] × 100

S ; 試料添加時のリゾチームのバンド強度
R ; 試料溶解液のみを添加した時のリゾチームのて低 分 子物質を除去して作成した。

４) 糖化蛋白架橋切断作用（cleavage of glycated-protein cross-link；CGPC）

バンド強度

M ; リゾチームの単量体バンド
D ; リゾチームの二量体バンド

CGPC は既報を参考に 10)、糖化リゾ チームの二量体が試料の添加によって単量体に戻る比率を切断率として算出した。 CGPC の測定は 0.5 mg/mL 糖化リゾチームを含む 0.05 mol/L リン酸緩衝液中と 2 mmol/L の試料を 1 : 1に混合した溶液 （; S）、S の試料の代わりに試料の溶解液のみを添加した溶液 （; R）を作成し、37 ℃ で 16 時間インキュベートして反応させた。その後各反応液を 3kDa 限外ろ過膜により低分子物質を除去し後、4 -20 % SDS-PAGEに供した。泳動後のゲルは CBB Stain One（ナカライテスク、京都市中京区）で染色し、泳動像を Pharos F X System（ Bio-Rad、California, USA）で画像化後、リゾ チームの単5 ) AGEs 架橋切断作用（cleavage of AGE cross-link；CAC）

CAC は既報 4, 6, 15) に従い、PPDを架橋モデル物質とし、試 料 による PPD の α ジケトン 結 合 の 切 断 率 を 測 定 し た。
CAC の 測 定 は、5 mmol/L 試 料、10 mmol/L PPD、0.2mol/L リン酸緩衝液（pH 7.4）を 5 : 1 : 4 の割合で混合し、37 ℃ で 8 時間反応させた後、0.7 N 塩酸を添加して反応停止後、 PPD の α ジケトン 結合が試料によって切断され、（ A）、試料中の安息香酸量；（B）を遊離した安息香酸量；（ 3 ）Glycative Stress Research

既報 6) と同様の HPLC 条件で測定した。AGEs 架橋切断（ C ）の α ジケトン結合が切断され率は反応液中の PPD；
ると、1 mol の PPD から 1 mol の安息香酸が生成することから、以下に示した式で算出した。 CAC は AGEs 架橋切断率 1 % 以上を作用ありとした。

AGEs 架橋切断率 (%) = { ( A − B ) / C } × 100
A ; 反応液中の安息香酸量（mol）
B ; 試料中の安息香酸量（mol）
C ; 反応に供した PPD 量（mol）

測 定 値 は 3 回 測 定 の 平 均 値 ± 標 準 偏 差（standarddeviation：SD）で示した。測定値の相関性解析はスピアマンの順位相関係数（Spearman's rank correlation coefficient）を用い、危険率 5 % 未 満（ p < 0.05）を有意とした。統計解析には統計解析ソフト BellCurve for Excel（社会情報サービス、東京都新宿区）を使用した。

結果

CAC は試料の反応液中濃度 2.5 mmol/L において 12 物質 中 6 物 質（ 50 %）に 認 め ら れ た（Table 1 ）。CAC を 有す る 6 物 質 の 糖 化 蛋 白 架 橋 切 断 率 は 17.9 ± 14.0 % で、(-)-epigallocatechin gallate（42.0 ± 3.9 %）が最大値、3-(4hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)propan-1-one（1.1 ± 0.1%）が最小値を示した。6 物質の CAC には 38.2倍の差異が認められた。(-)-epigallocatechin gallate は 陽性対照として比較した P TB の 1.8 倍強い作用を示した。

3 ) ローズマリー抽出物とP TB の CGPC 測定

CGPC 測定ではリゾチームのバ ンド 強度の低下が認められた。特にローズマリー抽出物を 1 〜 5 mg/mL 添加した時はリゾチームの単量体バンド強度が無添加時を 100%としたとき 88. 5 〜 33.5 % に減弱した（Fig. 1, 2）。PTB のCGPC 測定ではローズマリー抽出物と同様にリゾチーム単量体 バ ンド 強 度の減弱が認められた。しかしその減弱は

１) 糖化蛋白架橋切断作用（CGPC）

CGPC は試料の反応液中濃度 0.5 mmol/L において 12物質中 9 物質（75 %）に認められた（Table 1）。CGPC を有PTB (mmol/L)
1± 標準偏差）で、(-)-epigallocatechin gallate（96.8 ± 2.1%）が最大値、7, 4'-dihydroxyflavanone（8.3 ± 1.3 %）が最小値を示した。9 物質の CGPC には 11. 7 倍の差異が認められた。(-)- epigallocatechin gallate は陽性対照として比較した
PTB の17.3 倍強い作用を示した。

２) AGEs 架橋切断作用 (CAC)

統計解析

MW

する 9 物質の糖化蛋白架橋切断率は 35.7 ± 30.4%（平均値25

無添加時を 100 % としたとき最 大（5 mmol/ L）で 93.6 %であった。リゾ チームの二量体バンド強度はローズマリー抽出物、P TB の添加濃度が高くなるとともに減弱した。

Rosemary extract (mg/mL)
Ref

0.1

0.5

1

2

535kDa

Dimer

25kDa

Monomer

11kDa

Fig. 1. CGPC by PTB and rosemary extract and the change of glycated lysozyme band intensity.

Sample and 0.5 mg/mL glycated lysozyme were incubated at 37 ℃ for 16 hours, n = 1; SDS-PAGE wasconducted using 2 ~ 40 % acrylamide gels. Stained with CBB stain one; MW, molecular weight markers; Ref,incubation without sample (with 50 % ethanol); PTB, N-phenacylthiazolium bromide, a positive control; CGPC,
cleavage of glycated-protein cross-linking.

（ 4 ）糖化蛋白架橋切断作用とAGEs 架橋切断作用b)
60000

60000

50000

50000

Band intensity

Band intensitya)

40000
monomer

30000

dimer

30000
20000

10000

10000

01

2

34dimer

40000

20000

0

monomer

0501

Concentration (mmol/L)

2345

Concentration (mg /mL)

Fig. 2. Band intensity of PTB and rosemary extract on lysozyme dimer in the glycated lysozyme.

a) N-phenacylthiazolium bromide (PTB), b) rosemary extract. Sample and 0.5 mg/mL glycated lysozyme were incubated at 37 ℃ for 16hours, n = 1. SDS-PAGE was conducted using 2 ~ 40 % acrylamide gels, stained with CBB stain one. MW, molecular weight markers;
Ref, incubation without sample (with 50 % ethanol).

a)

考察b)

Fig.2
A, N-phenacylthiazolium bromide (PTB), B; rosemary extract; Sample and 0.5 mg/mL glycated lysozyme wereとincubatedat 37! for 16 hours; SDS-PAGE was conducted using 2-40% acrylamide gels. Stained with C１) CGPCCAC の関連性
BB stain one; MW, molecular weight markers; Ref, incubation
without sample (with 50% ethaol).
50

検証した 12 物質中、3 物質（flavone、7-hydroxyflavone、両方に作用が認められた。またこれら両方の作用を有す

る 6 物質の CGPCとCAC の間には相関性が認められ（ p <（Fig. 3）、蛋白架橋の分解に α ジケトン結合の切断が0.05 ）

840

CAC (%)

4', 5, 7-trihydroxyisoflavone）は CGPC 、CAC ともに認められなかった。また 6 物質（3, 3', 4', 5, 7-pentahydroxyflavone
3-rutinoside、(-)-epicatechin、(-)-epigallocatechin gallate、
3-(4-hydroxyphenyl)-1- (2,4,6-trihydroxyphenyl) propan1-one、rosmarinic acid、punicalagin）は CGPC 、CAC の30111220関与している可能性 があった。

一方、3 物質（7,4'-dihydroxyflavone、7,4'-dihydroxyflavanone、5,7-dihydroxyflavone 7-glucuronide）は CGPC だけ が 認 め
ら れ た。 特 に 5, 7-dihydroxyflavone 7-glucuronide の 蛋 白
架橋切断率（64.5 ± 17.7 %）は、CGPC を有する 9 物質中、第 3 番 目 に 作 用 が 強 か っ た。12 物 質の CGPC と CAC の有無や強弱には物質構造に関連する作用傾向が認められなかった。糖化による蛋白架橋には α ジケトン結合以外に、グルコスパン、lysine-dihydropyridinium-lysine によるものがある 3)。これら 3 物質が切断している架橋結合は αジケトン構造と異なる可能性があった。これらの結果から

CGPC 測定は α ジカルボニル結合以外の糖化蛋白架橋切断作用を評価できる可能性があった。しかし糖化リゾチームの二量体に形成された蛋白架橋構造は不明なため、メカニズムの推定に至らなかった。

（ 5 ）1076001020406080100120

CGPC (%)

Fig. 3. Correlation of six substances with both CGPC
and CAC.

Each point indicates average value in triplets of CGPC
and CAC. Statistical analysis, Spearman's rank correlation
coefficient, p < 0.05; Sample concentration, 0. 5 mmol/L(CGPC), 2.5 mmol/L (CAC). Numbers in the graph indicatesubstance number in Table 1. CGPC, cleavage of glycatedprotein cross-linking; CAC, cleavage of AGE cross-linking,Glycative Stress Research２) CGPC 測定の課題

る架橋結合を切断している可能性があった。CGPC 測定は α ジカルボニル結合以外の糖化蛋白架橋切断作用を評価できる可能性がある。

る蛋白染色は色素を蛋白のアミノ基に静電相互作用などに謝辞

時に糖化リゾチームとローズマリー抽出物に含まれるロス

本研究の一部は第 23 回糖化ストレス研究会（熊本、2021 年 8 月 29日）にて発表した。本研究の出版にあたり、一般財団法人 医食同源生薬研究財団（IDF#22006）より支援を受けた。

CGPC 測 定 に お け るSDS-PAGE の リ ゾ チ ー ム 単 量 体
バンド 強度は、ローズマリー抽出物を 1 mg/mL 以上添加した時に無添加時を 100 % としたとき最大（5 mg/mL）で33.5 % に減弱する現象が認められた。CBB Stain One によよって吸着させて染色する方法である16)。染色不良は反応マリン酸およびその他の未知物質が共存したことによる色素結合部の荷電変化が推定された。蛋白質の糖化による架橋形成はグルコースの反応性アルデヒド基が蛋白鎖の反応性アミノ基と反応し、シッフ塩基の形成を経て糖化反応中間体となる 1, 2)。これらの糖化反応中間体はアマドリ生成物や蛋白のリジン- アミノ基を攻撃して、蛋白鎖を結合する安定した架橋結合を形成する。しかし、α ジカルボニル

利益相反申告結合による架橋が切断される際は元の蛋白構造に戻るのではなく、修飾物のついた蛋白単分子になる 9, 17)。このため蛋白と色素との静電相互作用が弱くなることで CBB 染色が正常に行われなかった可能性がある。CGPC は反応系に添加した試料が蛋白糖化によって重合したリゾチームを単量体に戻す比率を切断率として算出するため、リゾ チームの染色不良が測定誤差を生む要因となる。食用紫菊花抽出物の CGPC 測定値は糖化リゾチームの二量体 バンド 強度のみの減少率から蛋白架橋切断率が算出されている 10)。
この場合、リゾチーム単量体バンドの減弱は認められていない。リゾ チーム単量体バ ンドの減弱が起こったローズマ
リー抽出物の糖化蛋白架橋切断率を既報と本実験の解析方法で比較すると、 既報 10) の解析方法は本実験結果よりも1. 4 ～ 3.5 % 高値と算出された。本実験で測定した CGPC値の標準偏差は 0.4 ～ 5.4 % 認められているため、解析方法の違いが作用の有無を誤認させる数値では無かった。しかしリゾチームの染色不良を起こす試料の CGPC 測定では、本検証で使用した算出式を使用し、バンド強度の減少が蛋白架橋切断作用の過大評価要因にならないよう注意する必要がある。

研究限界

本研究ではハーブ等に含まれる 12 物質を試料としてCGPC、CAC を検証した。様々な物質の CGPC と CAC の関連性および CGPC の評価における蛋白染色への影響についてはさらに数多くの物質を比較検証する必要がある。

結語
野菜やハーブ等に含まれる 12 物質の CGPC と CAC を測定した結果、6 物質（50 %）の CGPC とCAC の間には高い正の相関性が認められ、糖化蛋白架橋の分解に α ジケトン結合の切断が関与している可能性があった。一方、3 物質は CGPC だけが認められ、α ジケトン構造と異な（ 6 ）本研究の実施にあたり利益相反となる事象はない。

糖化蛋白架橋切断作用とAGEs 架橋切断作用

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（ 7 ）