Glycative Stress Research
Online edition : ISSN 2188-3610
Print edition : ISSN 2188-3602
Received : July 7, 2022
Accepted : August 29, 2022
Published online : September 30, 2022
doi:10.24659/gsr.9.3_135

Original article

Amyloid beta clearance and microglia: Effects of glycative stressand melatonin
Yoshikazu Yonei 1), Toshio Taira 2), Shino Otaka 2), Shizuko Sekiguchi 2),
ANM Mamun-or-Rashid 1), Masayuki Yagi 1), Hiroaki Masuzaki 3)1) Anti-Aging Medical Research Center/Glycative Stress Research Center,
Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University, Kyoto, Japan2) Sapporo Division, Cosmo Bio Co., Ltd., Otaru, Hokkaido, Japan
3) Division of Endocrinology, Diabetes and Metabolism, Hematology and Rheumatology,(Second Department of Internal Medicine), Graduate School of Medicine,
University of the Ryukyus, Nishihara, Okinawa, Japan
Glycative Stress Research 2022; 9 (3): 135-145(c) Society for Glycative Stress Research（原著論文：日本語翻訳版）

アミロイド ϐ クリアランスとミクログリア：
糖化ストレスおよびメラトニンの影響
米井嘉一 1) 、平 敏夫 2) 、大高志乃 2) 、関口志津子 2) 、Mamun-or-Rashid ANM 1) 、八木雅之 1) 、益崎裕章 3)

1) 同志社大学大学生命医科学部アンチエイジングリサーチセンター・糖化ストレス研究センター
2) コスモ・バイオ株式会社 札幌事業部
3) 琉球大学大学院 医学研究科 内分泌代謝・血液・膠原病 内科学講座（第二内科）

抄録
アミロイド β（A β）は、アルツハイマー病（AD）の発症や進行に重要な役割を果たす一方で、その生理的な役割は不明である。A β の重合は、神経毒性の増強、難分解性化、脳への沈着をきたし、その結果、A β のクリアランスが減少する。また、糖尿病や「睡眠の質」低下は、アルツハイマー病発症の代表的な危険因子とされている。強い糖化ストレスの代表疾患である糖尿病では、血中や組織のメチルグリオキサール（MGO）やアクロレインが増加し、「睡眠の質」低下に伴いメラトニン分泌が 低下する。本研究では、A β クリアランスに関与するミクログリアの A β 貪食能に着目し、A β の糖化とメラトニンの影 響について検証した。 糖化 A β

は、MGO またはアクロレインを用いて調製した。実 験には、蛍光標識 TAMRA-Aβ と初代ラットミクログリ

連絡先： 教授 米井嘉一
同志社大学大学院生命医科学研究科アンチエイジングリサーチセンター／
糖化ストレス研究センター〒610-0321 京都府京田辺市多々羅都谷 1- 3
TEL & FAX：0774-65-6394 e -mail：yyonei@mail.doshisha.ac.jp
共著者：平 敏夫 primarycelltaira@gmail.com;
大高志乃 shino-otaka@cosmobio.co.jp; 関口志津子 shizuko-sekiguchi@cosmobio.co.jp;
Mamun-or-Rashid ANM, mamunbtgeiu@gmail.com; 八木雅之 myagi@mail.doshisha.ac.jp;
益崎裕章 hiroaki@med.u-ryukyu.ac.jp（ 1 ）Glycative Stress Research 2022; 9 (3): 135-145
本論文を引用する際はこちらを引用してください。
(c) Society for Glycative Stress ResearchGlycative Stress Research

ア細胞（コスモ・バイオ社製）を使 用した。今回の実験 から、いくつかの新しい知見が 得られた。第一に、ミクログリアは A β を貪食するが、糖化 A β に対する貪食能は著しく低下していた。第二は、A β 貪食能はメラトニンによって増強されたことである。また、培養ミクログリアの自然死は、A β を無添加時 の方が、添 加
時よりも多かった。以上の所見を考慮すると、 従来の A β 除去に主眼を置く治 療よりも、糖化 ストレス対策と「睡眠の質」向上により A β の糖化修飾を予防することが、A D の進展予防に重要であると考えられる。

KEY WORDS : アルツハイマー病、ミクログリア、アミロイド β、メチルグリオキサール、		アクロレイン、メラトニン

はじめに
アミロイド β（ A β）とは、脳内で作られる蛋白質の一種である。健康な人の脳にも存在する物質であるが、その生理的役割については良くわか っていない。

A β は、通常、脳内の遺物として短期間で分解、排出される（ A β クリアランス）。しかし、酸化 ストレスや糖化ス
トレスにより A β の構造が修飾され、異常な A β が 生成される 1, 2)。特に糖化 ストレスによって蛋白同士が架橋形成されると、A β 同士が結合して異常な A β 重合体ができる。

異常 A β 重合体の形成は難分解性、神経毒性の増強、Aβ

クリアランスの低下を惹起する。さらに、A β 排出されずに脳に蓄積され沈着すると、A β 老人斑（アミロイド 病理）を形成する。神経毒性の強い異常 A β が、それまで健康な神経細胞の周囲にまとわりつくと、神経細胞にも影響を及ぼす。これが契機となって、微小管結合蛋白質の一つであるタウ蛋白質が、細胞質中で線維化・凝集する神経原線維変化を形成する。その結果、脳の委縮が徐々に進み、アルMethylglyoxal (MGO) による糖化 T-Aβ の作成

0. 5 mg の T-A β を 50µL のトリフルオロ酢酸（ T FA ）（ナ
カライテスク、京都）に溶解し、さらに超純水 450 µL を加えた。100 µL ず つマイクロチューブ 5 本に分注し、遠心

エバ ポレーターを用いて一 晩、濃縮・乾燥を行った。乾燥後、5 本のうち 2 本に 0.2 M リン酸バッファー（ pH 6.0 ）を 200 µL/ チューブに添加して溶解し、1 本 にまとめて
400 µL の T-Aβ 溶液とした。 T- A β 溶液を 96 well ブラックプレートに 80 µL/well で 4 well に分注し、MGO（富士フイルム和 光 純薬、大 阪 ）を終 濃 度 0m M（ Blank ）、0.4
mM、 2 mM 、10 mM になるように添加した。添加後のプレートを 37 ℃ のインキュ ベーターに静置して糖化を行った。添加前、添加後 1 時間、17 時間、65 時間後に、マイクロプレートリーダーで蛍光性終末糖化産物 AGEs
（advanced glycation end priducts）の波長である（励起：340 nm、蛍光：430 nm ）の蛍光値を測定し、糖化の指標とした。

ツハイマー型認知症が進行する。これが「アミロイドカス

糖化 T-Aβ を細胞に添加する際に、残存した MGO の

ケード 仮説」に糖化 ストレスを加味した概念である3-5) 。

これまで、A β が 翻訳語修飾を受けた時のミクログリア

貪食 に及ぼ す 影 響については 報 告 がない。本 研究では、

A β クリアランス機構の中で重要な役割を果たす MG に焦点を当て、Aβ の細胞内への取り込み、Aβ に糖化修飾を加えた時の取り込み能の変化について検証した。さらに睡眠の質に関与するメラトニン（ Mel ）の影響を検証した。

方法
試験試薬の調整実 験 試 薬 に は 蛍 光 標 識 し た TAMRA-Aβ（ コ ス モ・

バ イオ、東京）を用いた（以下 T-A β とする）。本試薬は

Aβ (1- 42) に P E G スペーサーを介して赤色蛍光 carboxyt
etramethylrhodamine (TAMRA) が 標識されている 6) 。

毒性が細胞に悪影響を及ぼす可能性があったため、糖化

T- A β 溶液から MGO を除くための処理として、1) エーテ
ル沈殿による粗精製及び 2) 逆相固相抽出による簡易精製を実施した。

1) エーテル沈殿による粗精製
10 mM MGO で 糖化した 0.5 mg/mL の T-Aβ 溶液をマ
イクロチューブに 30 µL ずつ小 分けし、T FAを 270 µL 添
加してよく撹拌・混和した。さらに、t -ブ チルメチルエー
テ ル（ Merck KGaA, Darmstadt, Germany）を 1. 5 mL 添
加 し、− 80 ℃ で 3 時間、そ の 後 4 ℃ で 一 晩 静 置して糖化 T-Aβ を 沈 殿 さ せ た。T-Aβ 溶 液 を 12,000 × g 、15 分
遠心して残存 MGO を含む上清を除去、再度、t -ブチルメ
チルエーテルを 1 mL 添 加して 撹 拌 後、12,000 × g 、15分で 遠 心し上 清を除去した。窒素吹付けにより乾固後、（ 2 ）ミクログリアの A β 貪食と糖化ストレス、メラトニン

acetonitrile（ ACN ）を500 µL 加え、超音波で 30 秒間処理、さ ら に 0.1 % TFA を 500 µL 加 えて 糖 化 T-Aβ を 溶解し、超微量分光光度計を用いて、556 nm の吸光度を測定した。

明）。MG は遠沈管等への付着により細胞数が減少してしまうため、マクロファージ接着防止コーティング 剤でコー
ティングした器材を用いて、余計な付着を防ぐ施策を講じ

測定後、凍結乾燥し、冷蔵保管した。

た。播種翌日に未糖化 T-Aβ 及び MGO 糖化 T-Aβ を終濃2) 逆相固相抽出による簡易精製
SPE カラ ム（ HyperSep™ C18 カートリッジ； Thermo
Fisher Scientific、東京）のコンディショニングとして、95 %ACN/0.1% TFA 0.75 mL で洗浄、さらに 0.1% TFA 2.25
mL で 3 回平衡化を行った。ACN（acetonitrile）は Merck
KgaA より入手した。 2 mM MGO で糖化した 0.5 mg/mLの T-Aβ 溶液 40 µL と 0.1 % TFA 100 µL を SPE カラムにアプ ライし た。0.1 % TFA 2.25 mL で 5 回 洗 浄、さら に
95 % ACN/0.1% TFA 0.35 mL で 1 回洗浄した。洗浄後、95% ACN/0.1% TFA 0.6 mL で糖化 T-Aβ を溶出し、溶出液を回収した。回収した溶出液に 0.1% TFA 0.6 mL 添
加し、超微量分光光度計を用いて、556 nm の吸光度を測顕微鏡で細胞内への T-Aβ 取込を観察した。

度 1 µM になるように培地に添加し、4 日間暴露して蛍光再現性確認及び細胞毒性を検討するため、新たに調製した MG の混合培養系フラスコ 1 枚から、MG を回収し、
96 well ブラックプレート 15 well に播種した。播種翌日にMGO 0.4 mM, 2.0 mM, 10.0 mM の濃度で未糖化 T-Aβ
及び MGO 糖化 T-Aβを添 加し、4 日間暴露した。暴露後、蛍光 顕微鏡で細胞内への T-Aβ 取込を観察した。
観察後、培地で 2 回洗浄し、T-Aβ 及び 糖 化 T-Aβ を除去した。除去後 1 日目（培養 5 日目）、 4 日目（培養 8 日目）に細胞内への T-Aβ 取込の変化を観察し、8 日後（培養 12日後）にプロトコール 9) に従い細胞増殖 / 細胞毒性アッセ
イ試薬を培地の 1/10 量 添 加し、 2 時間、 37 ℃ インキュ定した。測定後、凍結乾燥し、冷蔵保管した。

ベーターで呈色反応させ、マイクロプレートリーダーにアクロレインによる糖化 T-Aβ (Gly-T-Aβ) の作成

細胞毒性を評価した。

て 450 nm（リファレンス：650 nm ）の吸光度を測定し、0. 5 mg の T-Aβ を 50 µL の TFA に 溶 解 し、さ ら に 超 純
水 450 µL を加えた。100 µL ずつマイクロチューブ 5 本に実験群の構成実 験群の構成を下記に示す。

分注し、遠心 エ バ ポレーターを用いて一晩 、濃 縮・乾燥を行った。乾燥後、5 本 のうち 2 本 に 0. 2 M リン 酸 バッ

ファー（ pH 6.0）を 200 µL/ チューブに添 加して溶解し、

1 本にまとめて 400 µL の T-Aβ 溶液とした。T-Aβ 溶液を
96 well ブラックプレートに 80 µL/well で 4 well に分注し、acrolein（富士フイルム和光 純薬）を終濃度 0 mM（Blank）、
0. 4 mM、2 mM、10 mM になるように添加した。添加後のプレ ートを 37 ℃ のインキュベーターに静置して糖化を行った。添加前、添加後 14 時間、62 時間後に、マイクロプレー
トリーダーで 蛍光性 AGEs の波長である（励起：34 0 nm、蛍光：430 nm ）の蛍光値を測定し、糖化の指標とした。

MG 初代培養細胞
これまでミクログリアの実験に用いられてきた株化細胞
はマクロファージ様の性質が 強く、炎症への反応や神経保護などの機 能 が 生体 内 のミクログリアとは大きく異なっている。初代ミクログリアは、出生直後の脳から調製され、ミクログリアの他に主にアストロサイトや神経細胞などの混合培養系で増殖させることで、ミクログリア本来の機能をある程度維持している7) 。検討では、アミロイド β の認識・排除というミクログリアの機能を検証するため、初代ミク
ログリア培養キット（コスモ・バイオ）を用いた 8) 。

初代 MG 細胞への T-Aβ および 糖化 T-Aβ の影響

S D ラット脳より調製した初代 MG の混合培養系 75 cm 2
フラスコ 1 枚からキット付属の培地を用いて、プロトコル 9)に従い浮遊した MG を回収し、96 well ブラックプレート 8
well に播 種した（なお、播種数はカウントできないため不a) Non-T-Aβ 群（無処置）b) T-Aβ 群		c) T-Aβ + Mel 群d) Gly-T-Aβ 群		e) Gly-T-Aβ + Mel 群

T-Aβ メラトニン（Mel） 糖化処理

−
+
+
+
+

−
−
+
−
+

−
−
−
+
+

但し、Gly-T-Aβ 群には MGO 処理（10 mM）とアクロレ

イン処理（10 mM）の 2 方 式 が あり。Mel（ メラトニン）の培養液中終濃度は 100 µM とした。

本 研究では、MG 播 種の実験を 2 回施行した。第 1 回

目は、上記の a, b, c, d, e とし、d, e には MGO 処理 GlyT-Aβ を用いた。第 2 回目は a, b, d とし、d には MGO 処理とアクロレイン処理 Gly-T-Aβ を用いた。2 回の実験のMG 培養条件が異なるため解析は別々に施行し、統合しての T-Aβ 貪食能の解析は行わなかった。

統計解析
MG 細胞数はオールインワン蛍光顕微鏡（ BZ-X710 、
ニコン）と付属画像解析システム（ BZ-H3CM/ マクロセル

カウント）を用いて単位面積当たりの核の数を計測した。

MG による T-Aβ 貪食能は、T-Aβ 由来蛍光の面積（基準値以上の蛍光強度を有する領域面積）を総細胞面積（ µm 2 ）で除した値について、統計解析を行い、図では非特異的（ 3 ）Glycative Stress Research

背景蛍光領域面積（ Non-T-A β 群における非特異的高輝には細部数の減少は認められなかった（ Fig. 3-b ）。 10 日目（Bell Curve）を用い分散分析後 Fisher's post hoc test にて少なかった。T-Aβ 標識蛍光の MG 細胞質への取り込みが度領域）を調整した値を示した。統計解析はエクセル 統計評価した。

の MG 細胞数は、Non-T-Aβ 群に比べて多く、自然死が見られ、Aβ が MG によって貪食（細胞内への取り込み）されることが確認された。形態的な変化は特に認められなかった。

結果
糖化 Aβ の生成

Aβ の MGO 処理においては、MGO の濃度及び糖化時間が増えるに従って、蛍光性 AGEs は増加する傾向が認
め ら れ た（Fig. 1 ）。MGO 10 mM 添 加 後 65 時 間 で は 17
時間より蛍光値が低下したため、糖化条件は 10 mM で 1
昼夜の反応時間を採用した。

同様に、アクロレイン処理時には、アクロレインの濃度及び糖化時間が増えるに従って、蛍光性 AGEs は増加する傾向が認められた（ Fig. 2）。アクロレイン添加後 62 時
間では 14 時間より蛍光値が低下したため、糖化条件は 10

mM で 1 昼夜の反応時間を採用した。

T-Aβ + Mel 群 で は、MG 細 胞 数 は、2 日目 に 比 べ て、
10 日目には細部数が増加していた（Fig. 3-c ）。MG 細胞数
は、Mel 無しの T-Aβ 群に比べてやや多かった。自然死が少なかったのか、MG 増殖が促進されたのかについては、明らかにしえなかった。T-Aβ + Mel 群では、MG 細胞の蛍光取り込みが顕著で、 MG によるAβ 貪食が活発になっていた。形態的な変化は特に認められなかった。

一方、MGO 処理した Gly-T-Aβ 群では、MG 細胞数は、2 日目に比べて、10 日目には細部数が増加した（Fig. 3-d ）。
MG 細胞の蛍光取り込みはほとんど観察されなかった。形態的な変化は特に認められなかった。

Gly-T-Aβ + Mel 群では、MG 細胞数は、2 日目に比べて、10 日目も同程度であった（ Fig. 3-e）。MG 細胞の蛍光取り込みはわずかであった。

第 1 回目の培養実験
MG 細胞数とAϐ 貪食

MG による T-Aβ 貪食能について画像解析を行い、定量評価を行った（ Fig. 4 ）。T-Aβ + Mel 群の画像データを
T-Aβ 群と比較すると顕著の傾向強度が高く、T-Aβ 貪食が Mel により増加していた。しかし T-Aβ + Mel 群 3 デー
タのうち 2 つの値の取り込み蛍光輝度が異常に高かったた

自然死と判定した。

T-Aβ 群に比べて Gly-T-Aβ 群の MG 内蛍光輝度は有意に低く（ p = 0.03）、貪食能の低下を認めた。

培養は、MG 播種後 2 日目の時点で蛍光標識 T-Aβ 添加、
10 日目に観察した。
Non-T-Aβ 群では、MG 細胞数は、2 日目（実験開始日）に比べて、10 日目には細胞死により生存細胞数が減 少していた（Fig. 3- a, 実験開始日の写真無し）。細胞死の原因は

T-Aβ 群 では、MG 細胞数は、2 日目に比べて、10 日目

め、解析から除外した。図には除外しなかった値を示した。

AGE fluorescence intensity

2,000
1,600
1,200
800
400
0

MGO

17 hr

1 hr

0 hr
0 mM

0.4 mM

Fig. 1. Glycation of T-Aβ by MGO treatment.

2.0 mM

65 hr
10 mM

Results are expressed as mean of duplicate values. Fluorescent intensity derived from AGEs were measured by Ex 340 nm/Em 430
nm. MGO concentration; 0 mM, 0. 4 mM, 2.0 mM, 10 mM. T-Aβ, TAMRA-β-amyloid(1- 42); MGO, methylglyoxal; AGEs, advanced
glycation end products.

Fig. 1（ 4 ）ミクログリアの A β 貪食と糖化ストレス、メラトニン

AGE fluorescence intensity

350
300
250
200
150
100
50
0

0 hr

Acrolein

0 mM

14 hr
0.4 mM

62 hr
2.0 mM

10 mM

Fig. 2. Glycation of T-Aβ by acrolein treatment.

Results are expressed as mean of duplicate values. Fluorescent intensity derived from AGEs were measured by Ex 340 nm/Em 430 nm.
Acrolein concentration; 0 mM, 0. 4 mM, 2.0 mM, 10 mM. T-Aβ, TAMRA-β-amyloid(1- 42); AGEs, advanced glycation end products.

Fig. 2aabb

cc

Fig. 3.

dd

T-Aβ phagocytosis by microglia:
Fluorescence microscopy imageeea) Non-T-Aβ group (no treatment), b) T-Aβ group,c) T-Aβ + Mel group, d) Gly-T-Aβ group, e)

Gly-T-Aβ + Mel group. Images (x 100) of cultured
cells 10 days after seeding (8 days after additionof T- Aβ ). Red color portions indicate T- Aβ derived fluorescence uptaken by microglia. Notethe enhanced fluorescence by Mel (c) comparedwith the T-Aβ group (b) . Gly-T-Aβ is prepared by
MGO treatment (10 mM, one day). T-Aβ, TAMRAβ -amyloid (1- 42); MGO, methylglyoxal; Mel,melatonin; Gly, glycated.

g. 3

（ 5 ）

T-Aß fluorescence/Cell area (µm 2)

Glycative Stress Research

*

2.50

**

2.00
1.50
1.00
0.50
0.00

T-Aß
Melatonin
Glycation
by MGO

Group

−
−
−

＋
−
−

＋
＋
−

＋
−
＋

＋
＋
＋

Non-T-Aß

T-Aß

T-Aß + Mel

Gly-T-A ß

Gly-T-Aß + Mel

Fig. 4. Comparison of T-Aβ phagocytosis by MG: The first experiment

Y axis shows the values: T-Aβ fluorescence intensity / cell area (μm2 ) followed by adjustment for the area of nonspecific background fluorescence (nonspecifichigh intensity area in the non-T-Aβ group). Results are expressed as mean ± SD of triplet values (n = 4 except Non-T-Aβ group and T-Aβ + Mel group, n = 2),* p < 0.05, ** p < 0. 01 by Fisher's post hoc test ( T-Aβ + Mel group excluded). T-Aβ phagocytosis is inhibited by MGO-glycation while enhanced by Mel (100μM). Gly-T-Aβ is prepared by MGO treatment (10 mM, one day). MG, microglia; T-Aβ, TAMRA-β-amyloid (1- 42); MGO, methylglyoxal; Mel, melatonin;
Gly, glycated; SD, standard deviation.

Fig. 4

第 2 回目の培養実験

り、Aβ のクリアランスの障害の関与が示唆されている。

A ϐ 貪食とMGO・アクロレインの比較
MG 播種後 2 日目の時点で蛍光標識 T-Aβ 添加、10 日目

は明らかでない。

の蛍光顕微鏡像を Fig. 5 に示した。

T-Aβ 群では、標識蛍光が MG 細胞質への取り込みが見られ、A β が MG によって貪食（細胞内への取り込み）されることが再確認された（Fig. 5-b）。一方、MGO 処理とア
クロレイン処理による Gly-T-Aβ 群では、MG 内に標識蛍

光がほとんど見られず、MG による糖化 Aβ 貪食はほぼ認められなかった（ Fig. 5-c, d ）。MGO 処理とアクロレイン

処理には差がなかった。

培養 10 日目の 細胞数を Fig. 6 に示した。Non-T-Aβ 群、

MGO 処理 Gly-T-Aβ 群、アクロレイン処理 Gly-T-Aβ 群、
T-Aβ 群の間で細胞数に有意差はなかった。
MG による Aβ 貪食能について結果を Fig. 7 にまとめた。
MG による T-Aβ 貪 食 を、T-Aβ 群 と Gly-T-Aβ 群との間比較すると、糖化 T-Aβ に対する貪食能は著名に低下していた（ p < 0.001 ）。MGO 処理とアクロレイン処理には差がなかった。

しかし、健常状態での Aβ の存在理由やその生理的な役割

A β は生体内においてて生理的条件下で生成される。

γ セクレターゼは活性中心を持つプレセニリン、ニカスト
リン、Aph -1、Pen-2 からなる膜蛋白複合体である。基質はいずれも内腔側で切断を受けた後、（APP または Notch ）γ セクレターゼにより切断を受け、生じた A β は細胞外に分 泌される 3, 4) 。

γ セクレターゼは A β 産生経路においてカルボキシ末端側の切断に関与し、Aβ 量および 凝集性を決定する。そのため重要な AD 創薬標的分子と考えられ、様々な低分子化合物が γ セクレターゼ阻害剤として開発されてきた。しかし、Aβ 産生を抑制する療法は、治験の失敗が度重なっており、このことは Aβ が なんらかの生理的意義を有し、脳内 A β 量の低下が AD 治療につながらない可能性を示唆している 5) 。

A β 産生は AD の有無や年齢にかかわりなく生じており、正常脳では A β は適切に除去され、脳に蓄積することはな

い 10, 11 )。

以上の所見は、AD の進行制御のためには、A βクリアラ

考察

ンスの恒常性維持が重要であることを示している。剖検時

アルツハイマー病（ AD）は、進行性の認知症を引き起こす代表的疾患である。AD 患者の剖検脳では、老人斑の周辺に活性化した MG が集積していることが確認されておに病理学的に認められるAβ 沈着は、その時点で Aβ 産生、沈着、除去のバランスを反映している。

老人斑の周辺に活性化した M G が集積しており、Aβ

クリアランスに 重 要 な 役 割 を 果 た す。 ラ ット 培 養 MG

（ 6 ）

ミクログリアの A β 貪食と糖化ストレス、メラトニン

a aa

bbb

c cc

ddd

Fig.
55
Fig.
Fig. 5. T-Aβphagocytosis by MG: Comparison between MGO and acrolein treatment.

a) Non-T-Aβ group (no treatment), b) T-Aβ group, c) MGO-Gly-T-Aβ group, d) Acrolein-Gly-T-Aβ group. Images (x 4 00) of
cultured cells 10 days after seeding (8 days after addition of T-Aβ). Red color portions indicate T-Aβ-derived fluorescence uptaken by MG.
No difference between MGO (c) and acrolein (d) treatment. Note the much less fluorescence in c) and d) than that in b). Gly-T-Aβ is
prepared by MGO or acrolein treatment (10 mM, one day). MG, microglia; T-Aβ, TAMRA-β-amyloid(1- 42); MGO, methylglyoxal; Gly,
glycated.

700

Number of microglia

600
500
400
300
200
100
0

Gly-T-Aß group

Non-T-Aß group(MGO)

Fig. 6. Live cell counts of MG 10 days after seeding.

T-Aß group(Acrolein)

Results are expressed as mean ± SD of triplet values, counted the number of nuclei by image analyzer (n = 4, except Non -T-Aβ group, n =2). Gly-T-Aβ is prepared by MGO or acrolein treatment (10 mM, one day). MG, microglia; T-Aβ, TAMRA- β -amyloid (1- 42); MGO,
methylglyoxal; Gly, glycated; SD, standard deviation.

Fig. 6（ 7 ）Glycative Stress Research

T-Aß fluorescence/Cell area (µm 2 )

450

***

400
350
300
250
200
150
100
50
0

Gly-T-Aß group

Non-T-Aß group(MGO)

T-Aß group(Acrolein)

Fig. 7. Comparison of T-Aβ phagocytosis by MG: The second experiment

Y axis shows the values: T-Aβ fluorescence intensity/cell area (μm2 ). Results are expressed as mean ± SD, n = 3, *** p < 0.001 vs other groups,
by Fisher's post hoc test. T-Aβ phagocytosis is inhibited by MGO - and acrolein-treatment (10 mM, one day). MG, microglia; T-Aβ, TAMRAβ - amyloid (1- 42); MGO, methylglyoxal; Gly, glycated; SD, standard deviation.

Fig. 7の A β の 貪 食 に は、 低 分 子 量 G 蛋 白 質 の Ra c 1 や そ の下 流 で 働 く Wiskott-Aldrich syndrome protein family
verprolinhomologous protein（ WAVE）により制御される

アクチン線 維の再構築が 関与する12) 。

Aβ が MG に取り込まれると、細胞内で処理されて N 末
端側のフラグメントが 失 われる11) 。進行した AD モデルマ
ウスの活性化した MG は、ニコチン性アセ チルコリン受 容
体 α 7 nAChR が 発 現しており、CD14/ TLR 複合体が発現してクリアランス機能を発揮する13) 。

MG の 形 態 に つ い て は、ラ ット 新 生 仔 か ら 調 製 し た、Aβ 42 処置前の MG の形 態 は ロッド 型 で あ った が、処置

今回の実験からは、MG のAβ 貪食を促進する因子としてMel が 新たに加わった。「睡眠の質」向上に伴い Mel 分泌量は増加することから、A β クリアランスの恒常性維持のために良質の睡眠を維持することは、AD の進展予防のために重要と位置付けられる。

マウス脳 MG は、活性酸素種（ ROS）を多く産生するサブセットと ROS を産生しないサブセットの 2 群に分けて比較した実 験では、神経細胞と共培養すると、活性酸素産生 MG は神経毒性を示し、活性酸素非産生 MG は神経保護作用を示した 18)。また、HIV-1 Nef 蛋白質を導入しての報告が ある14) 。今回の実験に用いた培養 MG の形態は、NADPH オキシダーゼ活性を高めた培養実験では、神経保護的な MG クローンが 毒性 MGクローンに変化する。これ
ら所見は、MG が環境に応じて神経保護性サブセットからA β クリアランスに影響する因子

Aβと糖 化 Aβ に接触した MG がどのように変化を起こすか、両 Aβ に違いがあるのか、については、今後の検討課

後すぐに形態をアメボイド型に変化させ、貪食を始めたと
培養 2 日目からアメボイド 型であった。

M G の Aβ クリアランスに影 響する因子に関する報告は少ない。アセチルコリンエステラーゼ（AChE）阻害薬のガランタミンは、MG 表面の nAChR にリガンドとして結合し、CD14/ TLR 複合体の発現を促し、Aβ クリアランスを促進する15)。MG のAβ 貪食は、heat shock proteins（Hsp）
により増強され、反対に、核内蛋白質として知られる highmobility groupbox protein-1（HMGB 1）により阻害される16)。ル チン（ケルセチン- 3 - ルチノシド ）は、抗酸化作用と AGEs 生成抑制作用を有する天然フラボノイドである。
ルチンナトリウム（ Na R ）は、MG における貪食関連受容体の発現レベルを増加させることにより、MG を増加させ、A β クリアランスを促進する可能性が指摘されている17) 。

神経毒性 サブセットへと変化する可能性を示唆している。

題である。

AD におけるアルデヒドの関与
糖化 ストレスが 強 い 代表的疾患である糖尿病は万病の源と言われ、様々な加齢疾患の発症リスクを高める。根本

的な要因はアルデヒド（- CHO 基を有する化合物）を産生しやすいこと、開環型グルコース、開環型フルクトースをはじめとして、4 -ヒドロキシノネナール（ HNE ）、アクロ

レインなどの脂質過酸化生成物や MGO 、グリオキサール（GO）、グリセルアルデヒド、3 デオキシグルコソン（ 3D G ）が増加した状態である。これらのアルデヒド はカルボニ

ルストレスとして、蛋白のカルボルニル化反応を惹起し、（ 8 ）ミクログリアの A β 貪食と糖化ストレス、メラトニン

さらに AGEs を産生し、AD の神経変性に寄与する19-22) 。
アルデヒドによる Aβ アミロイド 蛋白の糖化は、毒性が増強した有害な形態変化の可能性 がある23) 。

Aβ 糖化による AGEs 形成が Aβ 凝集能を変化させる24) 。
Aβ 糖化は、成熟線維への β 変換を著しく遅らせ、オリゴ
マ ーなどの毒性形態が残存しやすくなる25, 26) 。脳神経系

においては、Aβ のみならず、タウ蛋白、α- シヌクレインの糖化が 認知症の発症と進展に関与すると考えられている。

Mel は記憶力に対しても好影響を及ぼす 51, 52)。Mel の分 泌障害を示す OXYS ラットでは Mel 投与により、不安の増大と参照記憶の劣化が抑制される 53)。 Mel は、活性酸素
や RAGE（receptor for advanced glycation end products）の上昇を抑制することにより、D - ガラクトース投 与マウスの記憶機能を向上させることも明らかにされている 51) 。

Mel は、 血 液 脳 関 門 を 通 過 し、 脳 組 織 で N1-acetyl-5 methoxykynuramine (AMK) に変換され、マウスの長期

MGO は Aβ 凝集体のサイズを増加させる26) 。AD 患者の CSF 中の MGO 濃度は健常者に比べ高く 27) 、MGO 由

物体記憶を促進されることが報告された 54) 。

ついては、血清中 MGO が 高いほど認知機能が低下しやす

吸制御比と ATPase の加水分解活性がする減少する55) 。さ来のヒド ロイミダゾロン化合物も多い
29)

いことが 報告されている

28)。認知症の進展に。

一方、アクロレインは、脂質過酸化やポリアミン代謝により生成され、高い求核性を持ち反 応 性 が 強い。アクロ
レインは、システイン、リジン、ヒスチジンなどの求核性Aβ が 神経細胞に取り込まれると、ミトコンドリア内膜のイオン勾配が 変化、ミトコンドリア障害が 惹起され、呼らにマイトファジーが障害を受けるため、ミトコンドリア

修復に支障をきたす 56) 。これに対し Mel が 抑 制 作 用 を示す 55, 56)。AD におけるミトコンドリアやマイトファジーの 障 害 に は、 ミト コ ンド リ ア 型 ア ル デ ヒド 脱 水 素 酵 素

アミノ酸とマイケル付加反応を起こし、蛋白のカルボニル（ALDH2）57) や RAGE 51) の関与が指摘されている。

kg/day、8 週間胃内投与）により認知機能低下と海馬萎縮が 認められた 30) 。臨床的にも、AD 患者の海馬や側頭葉で進めてきた結果、Mel が食後高血糖（血糖スパイク）を抑化を惹起する。ラットへのアクロレイン経口投与（ 2. 5 mg/

アクロレインが増加しており

31)、血漿および髄液中のアクロレイン結合蛋白が 健常者に比べて高いと進展にも関与している 34)。

。AD の発症32, 33)

我々は、その背景に潜む糖化ストレスの観点から研究を制すること58)、AGEs 分解促進作用 59) を有することを報告した。さらに今回は、Mel が MG の Aβ 貪食を促進すること見出した。これらの所見は、AD の進展をできるだけ遅らせるためには、睡眠の質を高め、自己の Mel 分泌を高Aβ 形態変化の影響に関する研究は多くない。MGO 処理により作成した糖化 Aβ は、RAGE 発現の亢進と GSK-3（ glycogen synthase kinase-3）活 性 化 を 惹 起 し、 毒 性 がめることが一次予防として重要でありことを示している。

MGO とアクロレイン処理による糖化 Aβ を作成し、MG貪食能への影響を検証するに至り、糖化 Aβ に対しては貪

結語

AD 予防策のパラダイムシフトと呼んでも良いであろう。

強いことが報告されている 35) 。そこで、今回は我々が、これまでに MG は、シナプスの機能制御、脳内異物除食能が低下することを見出した。

去または免疫に関わる細胞として、脳の恒常性維持に重要

Mel の関与

Mel は松果体から分泌されるホルモンで抗酸化作用 36)

や糖代謝の恒常性維持作用37)を有する。一方、睡眠の質低下と概日リズムの乱れは AD 発症のリスクを高めることが
知られ

38)

、これらの事象を結び付ける因子として Mel が注目されている39) 。Mel は、セクレターゼの発現制御ネットワークを調節することで、アミロイド 前駆体タンパク質（APP）のプロセシングとAβ の生成を抑制的に作用する40) 。

Mel は Aβ 凝集を阻害し 41- 44) 、神経毒性を改善し 45, 46) 、リンパ 管を介したリンパドレナージを改善し47)、BBB 輸送
および 分解経路を通じて Aβ クリアランスを促進する。
Aβ 40 は凝集性が強く脳内に沈着しやく、Aβ42 は排出されやすいことから、血漿 Aβ40/42 比は Aβ クリアランス
障 害の指標と位置付けられ、この比が高い AD 発症リス
クが 高 い 48) 。我々は、Aβ40/42 が 加齢に伴い増加すること 49) 、睡眠の質が低い集団では Aβ40/42 が 高いこと 50)を報告している。本所見は、Mel 分泌が低い集団では Aβ ク
リアランスが低下している可能性を示唆しており、本研究な役割を担うことが示されてきた。今回の実験からいく

つかの新知見が得られた。第一に、MG が Aβ を貪食・分解するだけでなく、Aβ 添加を受けない場合よりも MG に対し保護的に作用し、Aβ が MG の恒常性維持に、生理的役割として、貢献している可能性が示唆された。第二は、MG によるA β 貪食が Mel によって促進されることである。
Mel 分泌量が低下した「睡眠の質」低下者では AD 罹患率が高いという疫学所見に合致する。第三は、MG は糖化修飾を受けた Aβ に対し貪食困難となり、A β クリアランスが低下する可能性があることである。糖化 ストレスが 強く、糖化 Aβ 増加していると予想される糖尿病患者では AD 罹
患率が高いという疫学所見に合致する。

以上を考慮すると、これまでの Aβ を排除するというのではなく、糖化ストレス対策による Aβ 糖化修飾の予防、睡眠の質向上といった生活習慣による AD 進展予防が重要と考えられる。新規の創薬の観点からは、脳内に蓄積した糖化修飾 Aβ の処理物質や MG の貪食能促進物質の探索 が 期待される。

の結果と相反しない。

（ 9 ）Glycative Stress Research

利益相反申告謝辞

著者らは、本研究に関して申告すべき利益相反はない。

本研究は文部科学省研究助成（20K11593）によって実施された。本研究は、第 25 回 糖 化ストレス研究会（2022
年 9 月 10 日、京都）にて発表した。

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