Glycative Stress Research
Online edition : ISSN 2188-3610
Print edition : ISSN 2188-3602
Received : October 19, 2020
Accepted : November 15, 2020
Published online : December 31, 2020
doi:10.24659/gsr.7. 4_287

Original article

Involvement of glycative stress in diabetic nephropathy and effects ofanti-glycation material Kuromoji (Lindera umbellata Thunb.)
Kiriko Akiyama 1), Akihiko Shimode 1), Shigeru Matsumi 1), Tetsuya Maruyama 1),
Wakako Takabe 2), Masayuki Yagi 3), Yoshikazu Yonei 3)
1) Yomeishu Seizo Co. Ltd., Tokyo, Japan
2) Department of Materials and Life Science, Faculty of Science and Technology,
Shizuoka Institute of Science and Technology, Shizuoka, Japan3) Anti-Aging Medical Research Center/Glycative Stress Research Center,
Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University, Kyoto, Japan

Glycative Stress Research 2020; 7 (4): 287-297(c) Society for Glycative Stress Research（原著論文：日本語翻訳版）

糖尿病性腎症に対する糖化ストレスの関与と抗糖化素材クロモジ（Lindera umbellata Thunb.）の効果
秋山季理子 1) 、下出昭彦 1) 、松見 繁 1) 、丸山徹也 1) 、高部稚子 2) 、八木雅之 3) 、米井嘉一 3)1）養命酒製造株式会社
2）静岡理工科大学理工学部物質生命科学科
3）同志社大学生命医科学部アンチエイジングリサーチセンター・糖化ストレス研究センター

抄録［目的］抗糖化活性をもつクロモジ（ Lindera umbellata Thunb. ）が 糖尿病性腎障害に与える影響を検討した。

［方法］Streptozotocin（STZ）誘発糖尿病ラット（S TZ ラット）および自然発症糖尿病マウス（db/db マウス）
を用い、クロモジエキスを継続的に投与した時の糖化ストレス関連指標および生化学的変化を調べ、腎臓の炎症反応に与える影響を比較した。また、マウス培養マクロファージ細胞（RAW26 4.7）を用い、糖化物質が炎症反応に与える影響を調べた。

［結果］クロモジエキスは ST Z ラットと db/db マウスの腎組織中の炎症性 サイトカイン（ TNF- α，I L-6 ）量を抑制した。また、ST Z ラットでは腎重量の増加を抑制し、抗 N ε- (Carboxymethyl) lysine（CML）自己抗体量

連絡先： 教授 八木 雅之
同志社大学大学院生命医科学研究科アンチエイジングリサーチセンター／
糖化ストレス研究センター〒610-0394 京都府京田辺市多々羅都谷 1- 3
TEL＆FAX：07 74 - 65-6394 e -mail：myagi@mail.doshisha.ac.jp
共著者：秋山季理子 k-akiyama@yomeishu.co. jp; 下出昭彦 a-shimode@yomeishu.co.jp;
松見 繁 s-matsumi@yomeishu.co. jp ; 丸山徹也 te- maruyama@yomeishu.co. jp;
高部稚子 takabe.wakako@sist.ac ; 米井嘉一 yyonei@mail.doshisha.ac.jp（ 1 ）Glycative Stress Research 2020; 7 (4): 287-297
本論文を引用する際はこちらを引用してください。
(c) Society for Glycative Stress ResearchGlycative Stress Researchを抑制した。db/db マウスでは総コレステロール量の増加を抑制した。RAW264.7 細胞に CML -HSA（humanserum albumin）を処置すると TNF- α 産生量が増加したが、CM L 単独処置では増加しなかった。

［結語］クロモジエキスは糖尿病病態時の糖化ストレスを軽減させることにより、腎組織における炎症反応の進
展を抑制すると考えられた。

KEY WORDS : クロモジ（ Lindera umbellata Thunb.）、糖化最終生成物（advanced glycation end
products: AGEs）、カルボキシメチルリジン（ N ε - (Carboxymethyl) lysine）、

自己抗体、糖尿病 性腎症、炎症性 サイトカイン

自己抗体量を測定し、クロモジエキスの糖化ストレス軽減

はじめに
クスノキ科クロモジ（ Lindera umbellata Thunb. ）はリ

ナロール、ゲラニオール等の精油を含む芳香性植物であ作用が腎炎症に与える影響について検討した。また、培養

マクロファージ細胞（ RAW264.7 ）を用いて、糖化物質の炎症への関与について検討した。

り 1, 2)、乾燥させた幹枝は烏樟（ウショウ）と呼ばれる生薬として薬用酒に利用される 3)。また、不揮発性のクロモジエキス（kuromoji extract: KE）は抗酸化、抗糖化、抗潰瘍方法

彩な薬理作用があることから、生活習慣病をはじめとした

１. 被験物

作用、免疫機能改善作用および 抗 ウイルス作用などの多疾病予防を目的とした機能性素材として期待されている

4 - 8)。

これまで ヒト血 清 アルブミン（human serum albumin:HSA）- グル コース（ glucose: GLU ）糖化反応系を用い、500 種以上の食品素材を対象に糖化最終生成物（advanced
glycation end products: AGEs）の生成抑制活性を評価した結果 、クロモジエキスは食品素材の中でも強い活性を示すことを明らかにした 。また、HSAのみならずコラー
5)

ゲンおよびエラスチンに対する GLU 糖化反応系においても、AGEs に対する生成抑制活性が強いこと、AGEs の分解作用に関連する AGEs の架橋切断作用および 酸 化 蛋白

分解酵素（oxidized protein hydrolase: OPH）の活性増強
6)作用を有することを示した 。さらに、ストレプトゾトシン（streptozotocin: STZ ）誘 発 糖 尿 病 ラ ット に 対 す る ク
ロモジエキスの投与は腎組織中の増加した炎症性 サイト

クロモジエキスの調製は既報の方法に準じた 5)。具体的には、細かく刻んだクロモジ（ Lindera umbellata Thunb.）の幹枝に 10 倍量の水を加えて 95 ℃ で 1 時間加温抽出した抽出液を遠心濾過し不溶物を除き、減圧濃縮機を用いて濃縮し、クロモジエキスとした。陽性対照薬は糖化反応阻害剤である塩酸アミノグアニジン（富士フィルム和光純
薬株式会社、大阪府大阪市）または抗糖尿病薬（インスリン抵抗性改善剤）としてメトホルミン塩酸塩（富士フィル
ム和光純薬株式会社）を用いた。

２. 糖尿病病態モデル動物における K E の効果
１）実験動物
6 週齢の Sprague Dawley（SD）雄性ラット（日本エスエ

ルシー株式会社、静岡県浜松市）、 7 週齢の C57BLKS/J

ニズムとして糖化や酸化ストレスが 関与することが報告

Iar- m +/+Leprdb（ db/+）雄 性 マ ウ ス お よ び C57BLKS/
J Iar -+Leprdb/+ Leprdb（ db/db）雄 性 マウス（日本エスエルシー株式会社）を温度：24 ± 2 ℃ 、湿度：50 ± 10 %、照明時間：1 日 12 時間（ 7 ～ 19 時）に設定されたバリア施
設内で飼育し、1 週間予備飼育後実験に用いた。

られた腎組織における炎症反応の抑制には、クロモジエキ

２）飼育管理カ イ ン（tumor necrosis factor- α: TNF-α, interleukin-6:
IL - 6 ）量を抑制し、腎機能の改善を認めた 5)。糖尿病性腎症の腎組織にはマクロファージを主体とする炎症細胞の浸潤による炎症性 サイトカインの増加 9)、腎症の進展メカされている10)。このことから、STZ 誘発糖尿病ラットでみスのAGEs の生成および蓄積抑制作用が関与しているものと考えられた。

本研究は STZ 誘発糖尿病ラット（STZ ラット）および自然発症糖尿病 マウス（ db/db マウス）の血清中の抗カルボ：CM L）
キ シメ チ ル リ ジ ン（N ε- (Carboxymethyl) lysine）

全ての試験期間を通し、ラットは飼 育 ケージとしてポリ カ ー ボ ネ ート 製 ケ ー ジ（ W26 × D42 × H18 cm）に、

マウスはポリカーボネート製ケージ（ W11 × D18 × H 11cm）に動物を個別に収容した。ケージには樅製床敷（実験動物用床敷 ソフトチップ：日本エスエルシー株式会社）（ 2 ）糖尿病性腎症に対するクロモジ（ Lindera umbellata Thunb. ）エキスの効果を入れたものを使用した。飼料は粉末 ラボ M R ストック

（日本農産工業株式会社、神奈川県横浜市）を、飲料水は井戸水を給水瓶を使ってそれぞれ自由摂取させた。体重採血を行い、血清を遠心、分取して凍結保存した。全採
血後は腹大動脈および後大静脈を切断して放血安楽死させ、 右 側 腎 臓 を 採 取 し、 重 量 測 定 後、 ラット は 4 倍 量、および摂餌量は週 1 回測定した。

マウスは 5 倍量の Radio-immunoprecipitation（RIPA）バッ

３）モデル動物の作製および 群構成

ナイズして遠心（14,000 g 、30 分）し、上清を分取して測ファー（富士フィルム和光純薬株式会社）を加え、ホモジ定まで冷凍保存した。

① スト レプトゾトシン（streptozotocin: STZ）
誘発糖尿病ラット
予備飼育終了後 7 週 齢 の ラットに STZ（富士フィルム

和光純薬株式会社）を 60 mg/kg 腹腔内投与し 3 日後に血５）測定方法
血糖値は簡易血糖測定器（ワンタッチウルトラ : ジョン

糖値を測定し、糖尿病病態（300 mg/dL 以上）を確認しソン・エンド・ジョンソン株式会社、東京都千代田区また口投与を行った。血糖値および体重に偏りがないように

ステム（バイエル薬品株式会社、大阪府大阪市）を使用し：SD ラットに蒸留水を投与したにより、正常群（Normal）

性脂肪（ TG）、遊離脂肪酸（NEFA）、 LDL コレステロー

STZ ラットを作製した。被検物の投与はディスポーザブ
ルシリンジ および 経口ゾンデを用いて 8 週間毎日強制経

群分けソフト（ StatLight: Yukms corp 、神奈川県川崎市）

はプレシジョンエクシード : アボットジャパン合同会社、
東京都港区）を使って測定した。 HbA1c は DCA2000 シて測定した。ラット血清の総 コレステロール（ T C ）、中：STZ ラットに蒸留水を投与
群（ n = 8 ）、対照群（ Vehicle）

ル（ LDL - C ）、 HDL コレステロール（ HDL-C）、総ビリ

STZ ラット に クロ モ ジ エ キ ス を 100 mg/kg/day 投与し：た 群（ n = 8）、クロ モ ジ エ キス 高 用 量 投 与 群（ KE300）
STZ ラットにクロモジエキスを 300 mg/kg/day 投与した
：STZ
群（ n = 8）、アミノグアニジン投与群（AMG100）
ラットに塩酸アミノグアニジンを 100 mg/kg/day 投与した群（ n = 8）を設けた。

ブミン（ GA）は生化学自動分析装置（株式会社日立製作：
した 群（ n = 8 ）、クロモジエキス低用量投与群（ KE100）②自然発症糖尿病（db/db）マウス

ルビン（ T-BIL）、グルコース（ GLU）およびグリコアル所、東京都千代田区）によって測定を行った。マウス血清 の T C 、 TG 、 LDL-C お よ び HDL - C は そ れ ぞ れ コ レ
ステロール E - テストワコー、トリグリセライド E - テス

トワコー、L タイプワコー LDL - C ・ M および HDL - コ
レステロール E - テストワコー（富士フィルム和光 純 薬株式会社）、アディポネクチン（ Adipo）はレビス 高分子
アディポネクチン - マウス / ラット（富士フィルム和光 純

予備飼育終了後、8 週齢のマウスの体重を個体別に測薬株式会社）によって測定を行った。さらに、血清中のう に、 前 述 の 群 分 け ソ フ ト を 用 い て 群 分 け し た。 被 検CML）自 己 抗 体 の 測 定 に は、ラットは CircuLex AntiCML rat autoantibody ELISA Kit（株 式 会 社 サイクレッ
クス、長 野 県 伊 那 市 ）を 用 い、 マ ウ ス は CircuLex AntiCML mouse autoantibody ELISA Kit（ 株 式 会 社 サ イ ク
レックス）を用いて測定した。腎組織上清中の TNF-α お
よび IL-6 の測定には、ラットは Rat OptEIA ELISA Set（ Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ,
USA）を用い、マウスは Mouse OptEIA ELISA Set（Becton,
Dickinson and Company）を用いて測定した。腎組織上清中の蛋白量はラット、マウスともに BCA Protein Assay
Kit（タカラバイオ株式会社、滋賀県草津市）を用いて測定し、各群の平均体重および血糖値がほぼ均一になるよ物の投与は ディスポーザブルシリンジおよび経口ゾンデを用いて 12 週間毎日強制経口投与を行った。群構成は、

db/+ 群：db/+ マ ウ ス に 蒸 留 水 を 投 与 し た 群（ n = 10）、：db/db マウスに蒸留水を投与した群（ n対照 群（Vehicle）：db/db マ= 10）、クロモジエキス低用量投与群（KE100）
ウスに 100 mg/kg/day のクロモジエキスを投与した群（ n：db/db マ= 10）、クロモジエキス高用量投与群（KE300）
ウスに 300 mg/kg/day のクロモジエキスを投与した群（ n：db/db マウスに= 10）、メトホルミン投与群（MET 350）
350 mg/kg/day のメトホルミン塩酸塩を投与した群（n =10 ）を設けた。

カ ル ボ キ シ メ チ ル リ ジ ン（ N ε- (Carboxymethyl) lysine:

定した。

６）動物試験倫理審査について

４）採 血および 剖検
部分採血は投与前および投与後については 4 週間おきに行った。血糖値の測定には無麻酔下で尾静脈採血した血液を用い、ヘモグロビン A1c（ HbA1c）の測定にはラッ
トはイソフルラン吸入麻酔下で頸静脈採血した血液を用い、マウスはイソフルラン麻酔下で眼窩静脈採血した血液を用いた。全採血は投与終了日の夕方から翌日まで 16

時間の絶食後に行った。ラットはイソフルラン麻酔下で
腹大動脈より、マウスはイソフルラン麻酔下で心臓より本試験実施にあたり、「動物の愛護及び管理に関する法

律（昭和 48 年 10 月 1 日

法 律 第 105 号、平 成 17 年 6 月

22 日改正）並び に「実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準」（平成 18 年 4 月 28 日、環境省告示
第 88 号）を尊守すると共に、「日本エスエルシー株式会

社実験動物福祉規定」に基づいて福祉審査委員会で審査および承認を受けた。（承認番号：17117 および 17118 ）（ 3 ）Glycative Stress Research

３. マ ウス培養 マクロファージ 細 胞（RAW264.7 ）に対 する糖化反応物の影響

照群の体重（38.0 ± 5.4 g）は db/+ 群（26.7 ± 0.8 g）より

１）培養細胞はみられなかった（Fig. 1-b ）。

マウスマクロファージ由来の RAW264.7 細胞は ATCC

（American Type Culture Collection 、Manassas, VA, USA）

より 購 入し た。 細 胞 は 10 % 非 働 化 牛 胎 児 血 清（ FBS，

Equitech-Bio, Inc., Kerrville, TX, USA）、100 units/mL ペ有意に高値を示した。対照群と被検物投与群の体重に差② 摂餌量
摂餌量の推移を Fig. 2 に示した。試験期間を通しての一日当たり摂餌量の平均値は、正常群（ 24.9 ± 1.07 g/日）

ニ シリンおよび 10 0 µg/mL ストレプトマイシン（ナカラと比較して STZ 対照群（37.4 ± 2.29 g/日）で多く、クロコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（DMEM、シな か っ た が、 ア ミノグ ア ニ ジ ン 投 与 群 に 差 は み ら れ なを用い、37 ℃ 、5 % CO 2 存在下で培養した。

db/+ 群（4.35 ± 0.53 g / 日）と比較して db/db 対 照 群（ 6.51 ± 0.62 g/ 日）の一日当たりの摂餌量は多かったが、イテスク株式会社、 京都府京都市）を添加したダルベッ

グマ アルド リッチ ジャパン合同会社、東京都目黒区）

２）糖化反応液CM L（株式会社ニッピ、東京都足立区）および CMLHSA（株式会社 サイクレックス）はリン酸緩衝生理食塩水（ phosphate-buffered saline: PBS）に希釈して用いた。

モジエキス低用量投与群（ 34.0 ± 3.62 g/ 日）で有意に少かった（Fig. 2-a）。

対照群と被検物投与群の摂餌量に差はみられなかった（ Fig. 2-b ）。
③腎重量

剖検時における腎重量を Fig. 3 に示した。正常群（2.24３）測定方法4 8 well プレ ートに 4 × 10 5 個 /mL の RAW26 4.7 細胞を播種後 2 4 時間培養し、洗浄後、任意濃度に希釈した
CML を 50 µL 添加し全量 500 µL となるように培地を加えて 24 時間培養した。また、任意濃度に希釈した CMLHSA および HSAを 125 µL 添加し全量 500 µLとなるように培地を加えて 3 時間培養した。培養後、培地上清を採取 し、 Assay Diluent（ Becton, Dickinson and Company）
で任意濃度に希釈し、Mouse OptEIA ELISA Set を用いて TNF- α を測定した。

± 0.15 g ）に対し ST Z 対照群（2.50 ± 0.24 g ）の腎重量は高値を示した。対照群と比較してクロモジエキス低用量投与群（ KE100 : 2.25 ± 0.19 g ）の腎重量は有意に低値を 示 し た が、 アミノグ ア ニ ジ ン 投 与 群 に 差 は み ら れ なかった（ Fig. 3-a）。

db/+ 群（0.36 ± 0.02 g ）に対して db/db 対照群（0.40± 0.03 g ）の腎重量は高値を示したが対照群と被検物投与群に差はみられなかった（Fig. 3-b ）。

２）生化 学 検査

STZ 試 験 群 8 週 後 の 血 液 検 査 の 結 果 を Table 1- a に 示

し た。 糖 代 謝 関 連 指 標 の GLU、GA お よ び HbA1c は 正

４．データ処理結果は平均 ± 標準偏差（ standard deviation: SD）で 表

し、統計処理は 2 群間の比較は Wilcoxon の順位和検定を用い、多群間の比較にはノンパ ラメトリックで Bonferroni
法の多重比較検定を用い p < 0.05 を有意差ありとした。

常群と比較して STZ 対照群で有意に高値を示したが、対照 群 と 被 検 物 投 与 群 に 差 は み ら れ な か っ た。 脂 質 代 謝

関連指標は T G および HDL -C おいて正常群と比較してSTZ 対照群で有意に高値を示したが、対照群と比較してクロモジエキス投与群は高値を示す傾向がみられたもの（ HDL- C,の有意差はなかった（ TG, KE300: p = 0.088）

KE100: p = 0.095）。T C および NEFA は正常群と比較して対照群では差がみられなかったが、 T C においてはク
ロモジエキス投与群で有意に高値を示し、 NEFA におい

結果
1 . 糖尿病病態モデル動物における KE の効果てはクロモジエキス高用量投与群とアミノグアニジン投

１）体重、摂餌量および 腎重量

与群において有意に高値を示した。

① 体重
体重の推移を Fig. 1 に示した。正常群でみられるような 体 重 増 加 の 推 移 は ST Z 試 験 群 で は み ら れ な か っ た。

ま た、 試 験 8 週 後 の 体 重 は STZ 対 照 群（ 255 ± 37. 3 g）
で正常群（419 ± 29.1 g ）と比較して有意に低値を示したが、対照群と被検物投与群の体重に差はみられなかった（ Fig. 1-a ）。

db/db 対照群は db/+ 群と比較して試験開始時から体重は高値を示していたが、試験 12 週後においても db/db 対

db/db 試 験 群 12 週 後 の 血 液 検 査 の 結 果 を Table 1-b に示した。GLU および HbA1c は db/+ 群と比較して db/db
対照群で有意に高値を示した。 GLU は対照群と比較してメトホルミン投与群で低値を示す傾向がみられ（ p =0.059）、HbA1c は対照群と比較してメトホルミン投与群
で 有 意 に 低 値 を 示 し た。 TC、LDL-C、HDL-C は db/+と比較して db/db 対照群で有意に高値を示した。クロモ
ジエキス高用量投与群は対照群と比較して T C が有意に低値を示し、T G および LDL-C では低値を示す傾向がみ（ 4 ）糖尿病性腎症に対するクロモジ（ Lindera umbellata Thunb. ）エキスの効果

Fig. 1a) STZSTZ ratsa)ratsb) db/db
mice miceb) db/db

50

500

40

##
300
200

Body weight (g)Body weight (g)

400

##

30
20
10

100
0
0

1

2

3

4

5

6

7

Time (week)
VehicleKE100
KE300
STZ-induced diabetic rats

Normal0801AMG100

2

3

db/+

4

5

6

7

8

9

10

Time (week)
KE100
KE300
db/db diabetic mice

Vehicle11

12

MET350Fig. 1. Change of weight in the diabetic model animals.
a) STZ rats. Normal, no STZ-treat and vehicle treated group; Vehicle, STZ and vehicle treated group; KE100, STZ and 100 mg/kg/day

KE treated group; KE300, STZ and 300 mg/kg/day KE treated group; AMG100, STZ and 100 mg/kg/day AMG treated group. Results are
expressed as mean, n = 8, # # p < 0.01 vs. Normal.

b) db/db mice. db/+, non-diabetic mice and vehicle treated group; Vehicle, db/db diabetic mice and vehicle treated group; KE100, db/
db diabetic mice and 100 mg/kg/day KE treated group; KE300, db/db diabetic mice and 300 mg/kg/day KE treated group; MET350, db/db
diabetic mice and 350 mg/kg/day MET treated group. Results are expressed as mean. n = 9 – 10, # # p < 0.01 vs. db/+.

STZ, streptozotocin (i.p.); KE, kuromoji extract (p.o.); AMG, aminoguanidine (p.o.); MET, metformin (p.o.); i.p., intraperitoneal
administration; p.o., oral administration.

Fig. 2STZrats
rats
a) a)
STZ

b) db/db
in miceb) db/db
mice
12

50

Food intake (g/day)Food intake (g/day)

10
40
30
20
10

8
6
4
2

0
0

1
Normal2

34Time (week)
Vehicle
KE100

5

6
KE300

7

0

8

0

AMG1001
db/+

STZ-induced diabetic rats

2

3

4

Vehicle5

6

7Time (week)
KE100

8
KE300

9

10

11

12

MET350db/db diabetic mice

Fig. 2. Change of food intake amount in the diabetic model animals.
a) STZ rats. Normal, No STZ-treat and vehicle treated group; Vehicle, STZ and vehicle treated group; KE100, STZ and 100 mg/kg/day

KE treated group; KE300, STZ and 300 mg/kg/day KE treated group; AMG100, STZ and 100 mg/kg/day AMG treated group. Results are
expressed as mean, n = 8b) db/db mice. db/+, non-diabetic mice and vehicle treated group; Vehicle, db/db diabetic mice and vehicle treated group; KE100, db/
db diabetic mice and 100 mg/kg/day KE treated group; KE300, db/db diabetic mice and 300 mg/kg/day KE treated group; MET350, db/db
diabetic mice and 350 mg/kg/day MET treated group. Results are expressed as mean, n = 9 - 10.

STZ, streptozotocin (i.p.); KE, kuromoji extract (p.o.); AMG, aminoguanidine (p.o.); MET, metformin (p.o.) ; i.p., intraperitoneal
administration; p.o., oral administration.

（ 5 ）Glycative Stress Research

Table 1. The values of blood markers after treatment in the diabetic model animals.

a) STZ rats

STZ (-)

NormalVehicleKE100

GLU (mg/dL)

243 ± 37.3

496 ± 66.3 ##GA (%)

1.81 ± 0.22

HbA1c (%)

STZ(+)

KE300

AMG100480 ± 42.6

464 ± 63.5

53 0 ± 53.6

8.41 ± 0.81 ##8.85 ± 2.71

7.94 ± 2.38

8.79 ± 0.68

3.53 ± 0.14

8.06 ± 0.95 ##8.53 ± 1.95

7.98 ± 1.71

8. 53 ± 1.14

TC (mg/dL)

77 ± 9.0

96 ± 37.8

171 ± 65.4 **145 ± 40.1 *10 9 ± 17.4

TG (mg/dL)

99 ± 21.7

481 ± 385.2 #868 ± 529.2

1101 ± 881.0

5 4 4 ± 211.4

NEFA (μEq/L)

376 ± 63.3

457 ± 138.3

644 ± 123.3

847 ± 307.1 **655 ± 129.8 *LDL-C (mg/dL)

8.3 ± 1.2

16.6 ± 12.8

38.4 ± 29.7

34.6 ± 23.2

14. 5 ± 3.4

HDL-C (mg/dL)

28.1 ± 2.0

35.0 ± 9.1 #45.0 ± 11.6

38.8 ± 6.3

41. 3 ± 6.6

KE300

MET350b) db/db micedb/+

Vehicle

KE100

db/db

GLU (mg/dL)

102 ± 36.3

428 ± 6 4.4 ##419 ± 79.7

381 ± 101. 3

330 ± 109.6

HbA1c(%)

3.87 ± 0.12

9.53 ± 1.18 ##9.61 ± 1.09

8.88 ± 1.6 2

7.99 ± 1.71 *TC (mg/dL)

103 ± 12.0

132 ± 15.4 ##118 ± 12.6

117 ± 10. 0 *120 ± 16.8

TG (mg/dL)

109 ± 25.4

133 ± 27.1

111 ± 25.3

1 01 ± 2 6. 4

77 ± 18.4 **LDL-C (mg/dL)

39.2 ± 6.4

48.5 ± 12.5 #42.2 ± 6.4

37. 9 ± 4. 3

27.6 ± 3.4 **HDL-C (mg/dL)

62.6 ± 9.6

86.4 ± 13. 2 ##84.6 ± 11.1

84.4 ± 6. 9

88.8 ± 15.5

Adipo (μg/mL)

7.39 ± 3.94

7.78 ± 1.24

6.96 ± 1.95

6.60 ± 1.87

9.38 ± 7.35a) STZ rats. Normal, no STZ-treat and vehicle treated group; Vehicle, STZ and vehicle treated group; KE100, STZ and 100 mg/kg/day KE treatedgroup; KE300, STZ and 300 mg/kg/day KE treated group; AMG100, STZ and 100 mg/kg/day AMG treated group. Results are expressed as mean ±SD, n = 8, # p < 0.05, # # p < 0.01 vs. Normal; * p < 0.05, ** p < 0.01 vs. Vehicle.

b) db/db mice. db/+, non-diabetic mice and vehicle treated group; Vehicle, db/db diabetic mice and vehicle treated group; KE100, db/db diabetic miceand 100 mg/kg/day KE treated group; KE300, db/db diabetic mice and 300 mg/kg/day KE treated group; MET350, db/db diabetic mice and 350 mg/
kg/day MET treated group. Results are expressed as mean ± SD, n = 9 - 10), # p < 0.05, # # p < 0.01 vs. db/+; ** p < 0.01, * p < 0.05 vs. Vehicle.
STZ, streptozotocin (i.p.); KE, kuromoji extract (p.o.); AMG, aminoguanidine (p.o.); MET, metformin (p.o.); GLU, glucose; GA, glycoalbumin;
HbA1c, hemoglobin A1c; TC, total cholesterol; TG, triglycerides; NEFA, non-esterified fatty Acid; LDL-C, low-density lipoprotein cholesterol;
HDL-C, high-density lipoprotein cholesterol; Adipo, adiponectin; SD, standard deviation; i.p., intraperitoneal administration; p.o., oral administration.

（ 6 ）糖尿病性腎症に対するクロモジ（ Lindera umbellata Thunb. ）エキスの効果られた（ TG: p = 0.067, LDL-C: p = 0.084）。メトホルミ
ン投与群では T G および LDL- C が対照群と比較して有意に低値を示した。

3 ）血清中抗 CM L自己抗体量STZ 試験群 8 週後の血清中の抗 CML 自己抗体量の結液 中 の TNF- α 産 生 量 は 濃 度 依 存 的 に 増 加 が 認 め ら れ、

5 µg/mL および 10 µg/mL 処置では有意に増加した。また、HSA 溶液のみでは TNF-α の増加はみられなかった（ Fig. 6-b ）。

果を Fig. 4-a に示した。正常群（ 108 ± 54.4 µg/mL）に対考察量は有意に高値を示したが、対照群と比較してクロモジ

1. 糖尿病モデル動物について

し STZ 対照群（ 321 ± 171.6 µg/mL）の抗 CML 自己抗体エキス投与群（KE100 : 71 ± 55.8 µg/mL 、 KE300 : 113 ±89.3 µg/mL）およびアミノグアニジン投与群（122 ± 76. 3µg/mL）は有意に低値を示した。
db/db 試験群 12 週後の血清中の抗 CML 自己抗体量の結果を Fig. 4-b に示した。db/+ 群（ 22.6 ± 4.9 µg/mL）に対し db/db 対照群（ 37.7 ± 20.9 µg/mL）の抗 CML 自己抗体量は有意に高い値を示したが、対照群と比較して被験ST Z ラット は 1 型 糖 尿 病 モ デ ル と し て 用 い ら れ る。
ST Z の投与により膵 β 細胞で活性酸素種の産生が惹起さ
れ β 細胞が細胞死を起こしインスリン分泌が阻害されることで、急激に血糖値が上昇、高血糖が維持される11, 12)。

一方、db/db マウスは 2 型糖尿病モデルとして用いられる。db/db マウスは食欲抑制ホルモンのレプチンの受容体に欠損があるため、過食が原因で肥満を伴い、 6 ～ 10物投与群では差はみられなかった。

週齢で高血糖を発症する13)。いずれの糖尿病モデルも糖4 ）腎組織中の炎症性 サイトカイン量ST Z 試 験 群 8 週 後 の 腎 組 織 中 の TNF - α および I L -6

糸球体基底膜の肥厚などが腎臓で観察され 13)、組織中に尿病性腎症に特徴的な糸球体メサンギウム 基質の拡大やは炎症性サイトカインの上昇が認められる14, 15)。さらに、量 を Fig. 5-a, b に 示 し た。 腎 組 織 中 の 蛋 白 量 当 た り の腎臓には AGEs の蓄積がみられることから、腎症の発症て STZ 対照群（ 1.72 ± 0.39 ng/mg protein）で有意に高値強く関与していると考えられている10, 16, 17)。本試験 で は、

TNF - α 量は正常群（1.26 ± 0.22 ng/mg protein）と比較しには生体蛋白質の糖化反応により生じた糖化 ストレスがを示したが、対照群と比較してクロモジエキス低用量投両モデル動物において腎重量が増加し、 STZ ラットの腎グアニジン投与群（ 0.85 ± 0.12 ng/mg protein）では有意た。腎重量の増加は糖尿病性腎症の初期症状においても群で差はみられなかったが、対照群（ 6.39 ± 1.27 ng/mg
protein）と比較してクロモジエキス投与群（KE100 : 4.54
± 1.63 ng/mg protein，KE300 : 4.24 ± 1.75 ng/mg protein）
およびアミノグアニジン投与群（4.03 ± 0.51 ng/mg protein）

において持続した高血糖が腎臓における炎症反応の進展

与群（KE100 : 1. 01 ± 0.30 ng/mg protein）および アミノに低値を示した。 IL- 6 量は正常群と比較して STZ 対照は有意に低値を示した。

db/db 試験群 12 週後の腎組織中の TNF- α および IL-6
量 を Fig. 5-c, d に 示 し た。 腎 組 織 中 の 蛋 白 量 当 た り のTNF-α 量 は 対 照 群（0.70 ± 0.19 ng/mg protein）と 比 較
してクロモジエキス高用量投与群（ KE300 : 0.47 ± 0.12
ng/mg protein）は有意に低値を示した。 IL-6 量 は 対 照 群（ 0.47 ± 0.12 ng/mg protein）と比較してクロモジエキス
高用量投与群（ KE300 : 0.32 ± 0.08 ng/mg protein）およびメトホルミン 投与群（ 0.35 ± 0.10 ng/mg protein）は 有
意 に 低 値 を 示 し た。 TNF- α および IL- 6 量 は db/+ 群とdb/db 対照群 で 差 はみられなかった。

組織中には TNF-α および IL - 6 産生量の増加が認められ認められる腎肥大によるものと考えられ、両モデル動物に関与していると考えられる。

AGEs はヒトや動物の組織で加齢に伴い増加し、糖尿病性腎症 18)、慢性腎不全 19)、動脈壁のアテローム硬化性病変 20) および アルツハイマー病 21) などと関連性があることが報告されている。また、 AGEs は抗原性を有し、自己抗体が産生されることが知られている。糖尿病患者の血清からは AGEs の自己抗体が高濃度で検出され、前述した様々な疾患に関連すると考えられている22)。特に、糖尿病性腎症の重症度との関連性が知られており、軽度の微量アルブミン尿症患者に比べ透析が必要な腎不全患者の方が高濃度に検出される23)。また、各種 AGEs に共通したエピトープを有する CML の自己抗体は血糖値が200 mg/dL 以上の 2 型糖尿病患者では健常者と比較して約 5 倍も増加する 22)。このことから CML に対する自己抗体量は生体内の AGEs の形成および蓄積を反映するため、

２. マウス培養 マクロファージ細胞（RAW26 4.7 ）に対する糖化反応物の影響

糖尿病の二次合併症早期発見に重要な役割を演じると考RAW26 4.7 細胞への糖化物質添加による TNF-α 産生
量を Fig. 6 に示した。 CML 溶液添加 24 時間後の培養液中の TNF-α 産生量は非添加と比較して変化はみられな
かった（ Fig. 6-a）。CML-HSA 溶液添加 3 時間後の培養えられる。本試験においても両モデル動物の血清中にはCML に対する自己抗体量の明らかな上昇を認めた。特にSTZ ラットにおける抗体量の増加は顕著であったが、この増加は AGEs 生成阻害剤 のアミノグアニジンの投与で抑 制 さ れ た。 こ の こ と は 両 モ デ ル 動 物 に お け る 腎 炎 症（ 7 ）Glycative Stress Research

Fig. 3STZrats
ratsa)a)STZb) db/db
mice miceb) db/db

0.5

3.5
3.0

#

0.4

2.5

Kidney wight (g)Kidney weight (g)

*

#

2.0
1.5
1.0

0.3

0.2

0.1

0.5
0.0

0.0
NormalVehicle

KE100

KE300

db/+

AMG100

Vehicle

KE100

KE300

MET350db/db diabetic mice

STZ-induced diabetic rats

Fig. 3. Kidney weight after treatment in the diabetic model animals.
a) STZ rats. Normal, No STZ-treat and vehicle treated group; Vehicle, STZ and vehicle treated group; KE100, STZ and 100 mg/kg/day

KE treated group; KE300, STZ and 300 mg/kg/day KE treated group; AMG100, STZ and 100 mg/kg/day AMG treated group. Results are
expressed as mean ± SD, n = 8, # p < 0.05 vs. Normal; * p < 0.05 vs. Vehicle.

b) db/db mice. db/+, non-diabetic mice and vehicle treated group; Vehicle, db/db diabetic mice and vehicle treated group; KE100, db/
db diabetic mice and 100 mg/kg/day KE treated group; KE300, db/db diabetic mice and 300 mg/kg/day KE treated group; MET350, db/db
diabetic mice and 350 mg/kg/day MET treated group. Results are expressed as mean ± SD, n = 9 – 10, # p < 0.05 vs. db/+.
STZ, streptozotocin (intraperitoneal administration, i.p.); KE, kuromoji extract (oral administration, p.o.); AMG, aminoguanidine (p.o.); MET,
metformin (p.o.); SD, standard deviation; i.p., intraperitoneal administration; p.o., oral administration.

Fig. 4
a)a)
STZ
rats
STZ
rats

b) db/dbb) mice
db/db mice

600

#

**

500

*

70

*
Anti-CML autoantibody (µg/mL)

Anti-CML autoantibody (µg/mL)

700

400
300
200
100
0
NormalVehicle

KE100

KE300

#

60
50
40
30
20
10
0

AMG100db/+

STZ-induced diabetic rats

Vehicle

KE100

KE300

MET350db/db diabetic mice

Fig. 4. The values of blood anti-CML autoantibody after treatment in the diabetic model animals.
a) STZ rats. Normal, No STZ-treat and vehicle treated group; Vehicle, STZ and vehicle treated group; KE100, STZ and 100 mg/kg/day

KE treated group; KE300, STZ and 300 mg/kg/day KE treated group; AMG100, STZ and 100 mg/kg/day AMG treated group. Results are
expressed as mean ± SD, n = 8, # p < 0.05 vs. Normal; * p < 0.05, ** p < 0.01 vs. Vehicle.

b) db/db mice. db/+, non-diabetic mice and vehicle treated group; Vehicle, db/db diabetic mice and vehicle treated group; KE100, db/
db diabetic mice and 100 mg/kg/day KE treated group; KE300, db/db diabetic mice and 300 mg/kg/day KE treated group; MET350, db/db
diabetic mice and 350 mg/kg/day MET treated group. Results are expressed as mean ± SD, n = 9 – 10, # p < 0.05 vs. db/+.

STZ, streptozotocin (i.p.); KE, kuromoji extract (p.o.); AMG, aminoguanidine (p.o.); MET, metformin (p.o.); CML, N ε- (Carboxymethyl)
lysine; SD, standard deviation; i.p., intraperitoneal administration; p.o., oral administration.

（ 8 ）糖尿病性腎症に対するクロモジ（ Lindera umbellata Thunb. ）エキスの効果

Fig. 5a) TNF-αin STZa) TNF-α
inrats
STZ ratsb)b)
IL-6
in STZ
ratsrats
IL-6
in STZ

3.0

10

**
**

#

2.0
1.5
1.0

**

*

8
IL-6 (ng/mg protein)

TNF-α (ng/mg protein)

2.5

*

6

4

2

0.5
0.0

0
NormalVehicle

KE100

KE300

AMG100NormalVehicleSTZ-induced diabetic rats

KE100

KE300

AMG100STZ-induced diabetic rats

Fig.
Fig.55c)c)TNF-α
TNF-αininin
db/db
db/db
mice
mice
c)
TNF-α
db/db
mice

d)d)IL-6
IL-6inin
db/db
mice
mice
d)
IL-6
indb/db
db/db
mice

1.0
1.0

0.8
0.8

****

****

0.8
0.8

**

IL-6 (ng/mg protein)IL-6 (ng/mg protein)

TNF-α (ng/mg protein)
TNF-α (ng/mg protein)

0.6
0.6

0.6
0.6

0.4
0.4

0.4
0.4

0.2
0.2

0.2
0.2
0.0
0.0

0.0
0.0
db/+
db/+

VehicleVehicle

KE100
KE100

KE300
KE300

MET350
MET350

db/+
db/+

db/db
diabetic
mice
db/db
diabetic
mice

VehicleVehicle

KE100
KE100

KE300
KE300

MET350
MET350db/db
diabetic
mice
db/db
diabetic
mice

Fig. 5. The values of kidney cytokine after treatment in the diabetic model animals.
a) TNF-α, b) IL-6 in STZ rats. Normal, no STZ-treat and vehicle treated group; Vehicle, STZ and vehicle treated group; KE100, STZ and

100 mg/kg/day KE treated group; KE300, STZ and 300 mg/kg/day KE treated group; AMG100, STZ and 100 mg/kg/day AMG treated group.
Results are expressed as mean ± SD, n = 8, # p < 0.05 vs. Normal; * p < 0.05, ** p < 0.01 vs. Vehicle.

c) TNF-α, d) IL-6 in db/db mice. db/+, non-diabetic mice and vehicle treated group; Vehicle, db/db diabetic mice and vehicle treatedgroup; KE100, db/db diabetic mice and 100 mg/kg/day KE treated group; KE300, db/db diabetic mice and 300 mg/kg/day KE treated group;
MET350, db/db diabetic mice and 350 mg/kg/day MET treated group. Results are expressed as mean ± SD, n = 9 – 10, ** p < 0.01, * p < 0.05
vs. Vehicle.
STZ, streptozotocin (intraperitoneal administration, i.p.); KE, kuromoji extract (oral administration, p.o.); AMG, aminoguanidine (p.o.); MET,
metformin (p.o.); TNF-α, tumor necrosis factor-α; IL-6, interleukin-6; SD, standard deviation; i.p., intraperitoneal administration; p.o., oral
administration.

（ 9 ）Glycative Stress Researcha) CMLb) CML-HSA
##

##

##

##

Fig. 6. The values of TNF-α production by treatment with glycated materials in RAW264.7 cells.
a) CML treatment. b) CML-HSA treatment. The culture supernatant was collected 24 hours (a) or 3 hours (b)after the application and measured for TNF-α content by ELISA. Results are expressed as mean ± SD, n = 3, ##p < 0.05 vs. 0 µg/mL (control). CML, N ε-(Carboxymethyl)lysine; TNF-α, tumor necrosis factor-α; HSA, humanserum albumin; ELISA, enzyme-linked immuno sorbent assay: SD, standard deviation.

反応には AGEs 産生増加に伴う糖化ストレスが強く関与

２．
クロモジの 作用に ついてあると考えられる。

る自己抗体の上昇を強く抑制し、腎重量の増加、腎組織

し、その影響は 1 型糖尿病モデルの ST Z ラットで 顕著でクロモジエキスは ST Z ラットの血清中の CML に対す

AGEs による炎 症 性 サイトカイン上 昇 のメカニズムの一 つ として、マクロファージに存在する RAGE（ Receptor
for AGEs）を介した AGEs ／ RAGE 炎 症 シグ ナル 伝 達 系

対する GLU 糖化反応系において蛍光性 AGEs、CML 、3-に炎 症 細 胞 で あ る マ ク ロ フ ァ ー ジ の 著 明 な 浸 潤 が み（MGO）などの 生 成 を 抑 制 し、特 に CM L に 対 し て は 強RAGE の増加が認められる

用 と 酸 化 蛋 白 分 解 酵 素（ OPH ）の 活 性 増 強 作 用 が あり、への関与が報告されている。腎症患者では糸球体と間質ら れ 10, 24)、STZ ラットおよび db/db マウスの腎組織では。しかし、 RAGE を介

15, 25, 26)

中の TNF-α および IL- 6 量の増加を抑制した。

クロモジエキスは HSA、コラーゲンおよびエラスチンに、glyoxal（GO）、および methylglyoxal
deoxyglucosone（3DG）

い 生 成 抑 制 活 性 を 有 する 6)。さらに、AGEs 架 橋 切 断 作

重要であることが示されている。CML-BSAとRAGE とAGEs を分解する作用も有する 6)。また、クロモジの枝には procyanidin B1 および procyanidin B2 など のフラバン- 3 - オ ール 誘 導 体 や kaempferol、quercetin、hyperoside、
pinocembrin などの flavonoid 化合物が含まれ、AGEs 生成
阻害活性、MGO や GO の捕捉作用および AGEs によるアRAGE への結合には競合しなか った 29)。また、ヒト単球由来細胞への CML 単体処置では T NF- α の産生がみられする自己抗体量は、生体内の AGEs の形成および蓄積をした炎症反応の誘発に関しては各 AGEs について相反する議論が続いており、 CML に関しても RAGE と結合するための必要な構造を有していないとの報告もある27, 28)。
一 方 で RAGE と の 結 合 に は AGEs へ の 蛋 白 質 の 修 飾 がの結合に対し、CML 単体を共処置しても CML-BSA のポトーシスの誘導の抑制作用が報告されている 30- 36)。

各種 AGEs に共通したエピトープを有する CM L に対なかったのに対し、カゼイン糖化物の処置では産生を示反映する。クロモジエキスが有する強い抗糖化活性によ処置することにより TNF-α 産生が抑制された

RAGE 炎 症 シ グ ナ ル 伝 達 系 を 介 し た マ ク ロ フ ァ ー ジ 系

し、これに CML に対する抗体または RAGE 拮抗薬を共
27)

。我々

もマクロファージ由来 RAW264.7 細胞への CML 単体処
置では TNF-α 産生はみられなかったが、 CML-HSA 処

りAGEs の生成および蓄積を減少させることで AGEs ／炎症性細胞の活性化を抑え、腎臓の炎症反応の進展を軽減したと考えられる。また、db/db マウスより ST Z ラッ

置において用量依存的な産生増加が認められたことから、トの方 が 糖 化 ストレスによる影響は強くみられたが、クが重要であることを支持する結果であった。

AGEs の生成および蓄積が早くから進行する 1 型糖尿病

マクロファージの炎症誘発には AGEs への蛋白質の修飾

ロモジの効果は ST Z ラットにおいてより明確であった。

（ 10 ）

糖尿病性腎症に対するクロモジ（ Lindera umbellata Thunb. ）エキスの効果

モデルの方がクロモジの作用が顕著にみられたと考えられる。

一方、db/db マウスにおいては T C の増加がクロモジエ

キス投与により抑制された。コレステロール合成の主な場所は肝臓や小腸であるが、ST Z ラットは小腸での合成が多いのに対し、db/db マウスでは肝臓における合成が多いことが報告されている37)。 STZ ラット のようなインスリン依存的な糖尿病動物と db/db マウスのようなインスリン非依存的な糖尿病動物ではコレステロール合成に違いがあると考えられている。また、procyanidin B1 とprocyanidin B2 は db/db マウスにおいて T G および T C の増加抑制が報告されている25) が ST Z ラットでの報告は見当たらない。今回、 db/db マウスのみに認められたクロモ制したが、その抑制作用は糖化 ストレスの影響が大きい 1型糖尿病モデルである STZ ラットでより顕著に見られた。

クロモジエキスの糖尿病病態時の腎組織における炎症反応の 抑 制にはクロモジが有する強 い 糖化 ストレス軽減作用が 関与しているものと考えられた。

謝辞
本 研 究 は 総 合 科 学 技 術・イノベ ーション 会 議 の SIP（ 戦 略 的 イノベ ーション 創 造 プ ロ グ ラ ム

研究課題番号

14 533567 ）「次世代農林水産業創造技術」（農研機構生研

センター受託研究）によって実施された。

ジエキスのコレステロールの増加抑制作用は各糖尿病モ
デルの脂質代謝のメカニズムの違いが影響しているものと考えられる。

利益相反申告結論

製造株式会社より支援を受けた。

本研究を遂行するにあたり SIP 協力企業として養命酒

糖 尿 病 モ デ ル で は 生 体 内 で 増 加 し た AGEs が マ ク ロ

ファージなどの炎症性細胞を刺激することにより腎炎症を引き起こしていると考えられた。抗糖化作用をもつクロモ

ジエキスは STZ ラットおよび db/db マウスで腎炎症を抑参考文献

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