名古屋学芸大学健康･栄養研究所年報

第11号

2019年

《原著》

微小コロニー検査装置による一般生菌数定量精度の検証と実用化の可能性
1,2*

松尾 一生
1,2
森山
誠

1,2

星指 洋平
3
海谷 慎一

福岡
岸本

1,2

瑞紀
2,4
満

【要旨】
迅速かつ高精度の蛍光染色法による微生物微小コロニー検査装置「コロコロミー」による食品に対する生菌数カウントの結果を、標準培養法と比較した。培養 6 時間後に「コロコロミー」を使用し、生野菜、鶏肉、豚肉、および牛肉をそれぞれ検査した。 4 種類の生食材にたいして、48時間培養を行った標準検査法と比較した結果、 2 つの培養法におけるカウント数は線形相関を示し、単回帰分析
における決定係数 R2はそれぞれ0.90，0.72、0.62及び0.48であった。この結果は、「コロコロミー」が食品管理における迅速かつ高感度の細菌検査に資する検査装置として活用できるためにはデータの蓄積が必要であることを示した。
牽引用語：蛍光染色
微生物管理

微小コロニー法、マイクロコロニー法

メンブレンフィルタ法



培養時間

る 2 ）。

【緒言】

このような微生物汚染への対策として、2018

日本国内には、非加熱で摂食する食品が多く

年 6 月に食品衛生法が改正され、全ての食品事

流通しており、これらの食品の安全性を確かめ業者に対して、HACCP（Hazard Analysis andるために食品中の微生物検査が行われているもCritical Control Point）に沿った衛生管理が制のの、微生物汚染による食中毒を完全に防止す度化されることとなり、今後、日本国内での食るのは難しい。厚生労働省は2018年度の食中毒

品衛生の管理体制が大きく変動することが予想発生数を事件数で1,330件、患者数で17,282名とされる。

報告しているが、このうち細菌を原因とするもこれまで食品衛生法に基づいた公定法で検査のは事件数で467件、患者数で6,633名と、事件を行った場合、一般生菌数の検査では培養時間

数では第 2 位、患者数ではウイルスを原因とすは48時間必要となり、その他の検査となればさるものに次ぐ第 2 位である 。さらに、この統らに時間を要する場合もある。検査に時間がか

計数は医療機関からの報告数のため、軽い症状

かればかかるほど影響範囲は大きくなり、一部の患者からは診断や報告がされていないと考えの食品では出荷後に検査が行われていることかられ、実際の患者数は、原因となる病原細菌にら公定法よりも早く結果がわかる迅速検査法のより40倍～450倍あるとする調査結果も存在す

確立が不可欠な時代となっている。そのため、

1）

1 ．有限会社森山環境科学研究所
2 ．名古屋学芸大学 健康・栄養研究所
3 ．株式会社槌屋 技術開発本部 研究開発センター
4 ．名古屋学芸大学 管理栄養学部

9

従来の培養法等による微生物検査に代わる迅速おける食品の繊維質や粒子などによる微小な固検査法および装置の開発が求められている。

形異物の混入、油や食材の溶出液の影響による食品の微生物検査において、もっとも一般的

染色剤への影響、自家蛍光物質による蛍光観察に使用されるのは寒天平板を使用した混釈平板への影響などの問題があることも知られてお培養法である。培養法による微生物検査は培地

り、検証試験についても、擬似的に菌を混入し上に生育する生菌のみを対象としてカウントすた模擬試験や、溶液検体における測定結果の検ることが可能で、且つコロニーを回収すること

証、顕微鏡レベルの検査よりも培養時間を伸ばで分離株を獲得し、遺伝子学的、生化学的性状

して異物との差をわかりやすくして行う培養試などの分類学的な性状を調べることが可能であ験などが多く、混入した異物と同サイズの微小る。

コロニーを検査する手段については考慮されている報告はすくない。

しかし、これらのメリットと比較し、日常的な業務として微生物検査を実施する場合、培養

微生物微小コロニー検査装置「コロコロミー」

したコロニーのカウント数を得るためには一般

は、メンブレンフィルタ培養法と非殺菌性の蛍

的に数十時間の培養が必要であるため、これら

光染色剤を使うことで、微生物の蛍光染色反応の業務を恒常的に行う場合、休日を挟んでの検の継時的な変化を測定し、異物や溶出液の影響

査や、保管場所などの対応に検査従事者が大きを低減して微生物の微小コロニーのみを測定す

な労力を払う必要がある。

るように開発された装置である。

そこで、ELISA（Enzyme-Linked

本研究では、微生物微小コロニー検査装置

ImmunoSorbent Assay）法 、PCR

「コロコロミー」
を用いて、食品検体中の生菌数（Polymerase Chain Reaction） 法、LAMP

を微小コロニーカウントにより測定し、その生（Loop-mediated isothermal AMPlification）

菌数の測定精度について、標準培養法を用いた

法 、イムノクロマトグラフィー法 、TOF-MS

コロニーカウント数と比較し、その実用性につ（Time-of-Flight Mass Spectrometer） 法

いて検討した。

3）

6）

4 ，5 ）

7）、

8 ，9 ）ATP ふき取り検査法 、タンパク質ふき取り
10）

検査法11）、CO2消費測定法、定量 PCR 法12）、フ【方法】

ローサイトメトリー法13，14）、顕微鏡測定15，16）、蛍1 ．測定検体

光 in situ ハイブリダイゼーション法17－20）、微小、発熱量測定法 、酸素消検査対象の食品は2017年 4 月～2017年 7 月に

費量測定法28）など、食品中の衛生細菌を迅速か愛知県内小売店で購入した野菜類28検体、肉類

つ精度良く検出することを目的として、特定細51検体を用いた（表 1 ）。各食材は使用までは冷菌の検査・分類学的調査、汚染度の調査、細菌数

蔵または冷凍で保存し検査を行った。

コロニー検査法21－26）

27）

カウントなどの様々な技術が検証されている。
表1

特に、微小コロニー検査法は、公定法の測定

測定検体

対象である微生物のコロニーが生育初期段階で

種類

検体名

検体数

ある時点で測定することで、コロニー形成能を野菜類

イタリアンサラダ

4

キャベツ

6

ネギ

4

持つ生菌を迅速に検査可能である。微小コロニーの検出には、メンブレンフィルタ培養法と蛍光 in situ ハイブリダイゼーション法や蛍光染色法などが組み合わせて使用され、通常のコロ
ニーカウントの結果を迅速に得ることが可能で

白菜

1

水菜と大根のサラダ

4

ミックスサラダ

4

レタス

5

鶏肉

17

しかし、染色によって菌を殺菌した場合、検豚肉

17

査後の釣菌が不可能であることや、食品検査に牛肉17あることが知られている。

肉類

10

微小コロニー検査装置による一般生菌数定量精度の検証と実用化の可能性

2 ．細菌数測定法

測定用ケース上へ載置した。メンブレンフィル

2 ．1

タが染色剤で湿潤したことを確認後、迅速に測微小コロニー検査法

定用ケースを「コロコロミー」へセットして、検査は微生物微小コロニー検査装置「コロコ微小コロニーを測定した。

ロミー」（槌屋製）を用いて行った（図 1 ）。
食品検体は、滅菌したハサミなどで細かく切「コロコロミー」
はセットされた計測フィルタ

断した後、ストマッカー袋（アテクト製）に10 gに490 nm の励起光を照射し、520 nm 以上の蛍もしくは25 g を回収し、検体の 9 倍量のリン光を検出して撮影する。継時的なデータを取る

酸緩衝生理食塩水（Pro･media MV2-1000PBS、ため、撮影タイミングを 0 分、 1 分、 2 分、 3

エルメックス社製）と混合した。さらに、スト分に設定し、撮影後、「コロコロミー」で撮影

マッカー袋を、ストマッカーにセットして、250した画像をソフトウェア上で処理し、微生物のrpm、60 sec で破砕処理を行い、10倍希釈液と蛍光点のみを抽出した。細菌のカウントは「コした。10倍希釈液 1 mL と希釈水 9 mL を混合

ロコロミー」付属ソフトウェアによる自動カウ

し、食品検体の106倍希釈液が得られるまで希ントを用いて行った。測定は n= 2 で行い、1 g

釈を繰り返した。希釈液には市販の滅菌希釈水当たりの微小コロニー数を計算した。

（D9PBS、3M ヘルスケア社製）を用いた。希釈2 ．2

液 1 mL 分をセルロース混合エステル製メンブ

標準培養法

レンフィルタ（HABG02500、Merck Millipore

標準培養法は、通常の混釈平板培養法と相関社製）でろ過し、細菌を捕集した。メンブレン性が確認されている3MTM ペトリフィルム TM 培

フィルタを標準寒天平板（標準寒天培地、日水地を用いて行った29，30）。

製薬社製）上へ載置し 6 時間培養した。培養後、3MTM ペトリフィルム TM 培地 AC プレート培地を取り出し、メンブレンフィルタ上の微小（3M ヘルスケア社製）に希釈液を添加し、35度、コロニーを染色剤で染色し、微小コロニーの測

48時間培養した。各希釈倍率で測定は n= 2 で定を行った。染色剤には非殺菌性の FDA 系蛍行い、培養後のコロニーカウントは目視により

光 染 色 剤（EZFREAG57、Merck Millipore 社

行い、カウント数より 1 g あたりの生菌数を計製）を、メンブレンフィルタを固定するケース算した。

には47 mm プラスチックシャーレにフィルム
3 ．統計解析パレット（槌屋製）をセットした測定用ケースを用いた。染色の手順は、まず、染色剤を測定

コロコロミーおよび標準培養法で検出された用ケース上へ50 m L 滴下し、培養後の培地上か

コロニー数の相関は単回帰分析で行った。P 値

らメンブレンフィルタをピンセットで回収して＜0.01を有意水準とした。

【結果】
表 2 、表 3 に野菜類、肉類に対する「コロコロミー」を用いた検査結果と、培養法で得られたカウント結果を示した。
図 2 に野菜類に対する「コロコロミー」を用いた検査結果と、培養法で得られたカウント結果を比較したグラフを示した。野菜類28検体に対する決定係数は0.90と非常に強い正の相関を示した。回帰式の勾配係数は1.16と、「コロコロミー」で検出したカウント結果は標準培養法の結果に比べ若干低い値を示した。

図 1 「コロコロミーの外観」

11

表2

 菜類サンプルの「コロコロミー」及び「従来野培養法」で検出されたコロニー数
検体名

キャベツ．1キャベツ．2
ネギ．1
ネギ．2
ネギ．3
ネギ．4
ミックスサラダ．1
ミックスサラダ．2
ミックスサラダ．3
ミックスサラダ．4
レタス．1
レタス．2
レタス．3
レタス．4
レタス．5
水菜と大根のサラダ．
1
水菜と大根のサラダ．
2
水菜と大根のサラダ．
3
水菜と大根のサラダ．
4
イタリアンサラダ．1
イタリアンサラダ．2
イタリアンサラダ．3
イタリアンサラダ．4
キャベツ．3
キャベツ．4キャベツ．5キャベツ．6
白菜
表3

検体名
豚肉．1
豚肉．2
豚肉．3
豚肉．4
豚肉．5
豚肉．6
豚肉．7
豚肉．8
豚肉．9
豚肉．10
豚肉．11
豚肉．12
豚肉．13
豚肉．14
豚肉．15
豚肉．
16
豚肉．
17

コロコロミー ペトリフィルム AC
測定値 （一般生菌）【CFU/g】
375
2700
1100
2500
41300
4300001590008200001280000
3800000
52500
850000
2245
3900
2180
900
2120
9200
2350
2300
1390
3900
3300
15000
3250
9000
1670
4300
1980
12000
1220
7600
2745
15000
14850
38000
11950
43000
8300
20000
1850
6700
27775
39000
11100
48000
335
260
330
600
350
370
380
370
20600
110000

検体名
牛肉．1
牛肉．2
牛肉．3
牛肉．4
牛肉．5
牛肉．6
牛肉．7
牛肉．8
牛肉．9
牛肉．10
牛肉．11
牛肉．12
牛肉．13
牛肉．14
牛肉．15
牛肉．
16
牛肉．
17

 類サンプルの「コロコロミー」及び「従来培肉養法」で検出されたコロニー数
検体名
鶏肉．1
鶏肉．2
鶏肉．3
鶏肉．4
鶏肉．5
鶏肉．6
鶏肉．7
鶏肉．8
鶏肉．9
鶏肉．10
鶏肉．11
鶏肉．12
鶏肉．13
鶏肉．14
鶏肉．15
鶏肉．
16
鶏肉．
17

コロコロミー ペトリフィルム AC
測定値 （一般生菌）【CFU/g】
11750
18000
8100
11000
24750
52000
12100
10000
3450
5000
7150
11000
6950
7500
9550
7800
29000
56000
19100
38000
11050
25000
7550
23000
15650
68000
7600
22000
26000
33000
11300011000025725
33000

コロコロミー ペトリフィルム AC
測定値 （一般生菌）【CFU/g】
1900001300000
56500
2800001255001400000
29000
17000
34000
21000
49000
17000
35500
31000
38650
59000
34000
92000
48000
22000026500
17000030750
120000
17300
11000
30500
49000
19000
77000
16100
22000
7250
12000
コロコロミー ペトリフィルム AC
測定値 （一般生菌）【CFU/g】
2195005400002210002800001595000
1800000
59500041000040000
140000480000240000655000590000640000830000
26000
8700
53500
8800
26950
5000
28500
6200
39500
96000
32500
72000
13950
60000
4500
55000
6750
160000

図 3 に肉類に対する「コロコロミー」を用いた検査結果と、標準培養法で得られたカウント
結果を比較したグラフを示した。肉類51検体に対する決定係数は0.58で、回帰式の勾配係数は0.86だった。決定係数は野菜類に比べ低い値を示し、ばらつきが大きくなったものの、有意の正の相関関係を示していた。さらに、肉類について、各検体の種類による影響を考慮し、鶏肉、豚肉、牛肉の検査結果を別々に計算しなおした（図 4 、図 5 、図 6 および表 4 ）。

12

微小コロニー検査装置による一般生菌数定量精度の検証と実用化の可能性

図2

野菜類サンプルの「コロコロミー」および「従来培養法」で検出されたコロニー数の結果

図3

肉類サンプルの「コロコロミー」および「従来培養法」で検出されたコロニー数の結果

13

図4

鶏肉サンプルの「コロコロミー」および「従来培養法」で検出されたコロニー数の結果

図5

豚肉サンプルの「コロコロミー」および「従来培養法」で検出されたコロニー数の結果

14

微小コロニー検査装置による一般生菌数定量精度の検証と実用化の可能性

図6

牛肉サンプルの「コロコロミー」および「従来培養法」で検出されたコロニー数の結果

表4

食品ごとの決定係数、相関係数および有意確率

R2

r

β0

P

n

野菜類

0.90270.95011.1614

<0.01

28

肉類

0.57860.76070.8595

<0.01

51

鶏肉

0.71980.84840.9233

<0.01

17

豚肉

0.62170.78851.5744

<0.01

17

牛肉

0.47850.69170.7079<0.01

17

R ：決定係数、r：相関係数、β0：勾配、P：P 値（有意確率）、n：サンプル数
2

鶏肉における「コロコロミー」の検査結果と【考察】培養法の検査結果は決定係数が0.72で、勾配係数は0.92だった。豚肉に対する結果は決定係数

複数の細菌が混在している検体を、微小コロが0.62で勾配係数は1.57、牛肉に対する結果は決ニー検査を用いて検査する場合、微小コロニー

定係数が0.48で勾配係数は0.71だった。いずれまで生育が進むものの、目視可能となるサイズも有意の正の相関関係を示した。

まではコロニーが増殖しない細菌があることが知られている31）。

勾配係数にばらつきがあり、特に豚肉においては「コロコロミー」の結果が少なく培養法の

この場合、微小コロニー数は標準培養法にお間に1.5倍近い差があることが示された。

けるコロニー数に対して多くなる。
しかしながら、野菜類に対して微小コロニーの迅速検査を行った結果、微小コロニー検査の結果と標準培養法の結果は、決定係数で0.90と15

非常に良好な結果が得られたが、その勾配係数に対する効果量の目安は、その測定対象によっは1.16と約1.2倍の値を示した。

て変動はあるものの、一般的な指標として、0.26以上で効果大であるとされている32）。

一方で、細菌の増殖速度が細菌種により異な

また、統計学の目安として使用されるギルることは常識として知られており、細菌種によフォードのルールにおいては、相関係数が0.9

る増殖の差がコロニー形成速度の差となること

以上を非常に強い相関、0.7以上を強い相関としも自明である。また、今回の試験では、通常のており、これは決定係数に変換するとそれぞれ業務時間である朝 9 時から夕方 5 時までの 8 時

0.81、0.49を基準とすることになる33）。

間で検査を終了させることを想定して、培養時肉類の結果を見ると決定係数は0.58と、相関間を 6 時間に設定した。

の基準となる0.26を上回っており、相関性があ

よって、一部の微生物に対して、微小コロ

ることがわかる。ギルフォードのルールと比較ニーが発現するほどの培養時間が取れないのしても、強い相関関係を示す決定係数0.49を上で、コロニーカウント数は標準培養法に比べて回っているが、野菜類の決定係数である0.90と低くカウントされると推測される。特に、微生比較すると、低い値である。

物微小コロニーの検査では、メンブレンフィル

この差が何を原因としているのかを考える

タ培養法を行うため、混釈平板培養法やシートと、野菜類の迅速検査は基本的に水洗いされた培地を用いた簡易培養法と異なり、細菌はメン

生野菜を用いており、その種類は全て葉茎菜でブレンフィルタの表面に存在することになる。

ある。これは葉菜類の検査で検出される細菌種

この際、検体内に存在する細菌種の増殖速度のが一定であり、迅速検査における回帰式が葉菜差により、増殖の遅いコロニーが生育するまで類の種類に関わらず一定であったとも考えられ培養を行うと、増殖の速いコロニーが増殖の遅る。

いコロニーを覆ってしまう可能性があり、十分対して、鶏肉、豚肉、牛肉の肉類に対する微生な培養を行うことは難しい。とくに放線菌や芽物検査は、その肉類の種類によって存在する細胞菌などコロニーが特徴的に広がる細菌を含む

菌種の割合が異なることが知られているため、場合、その影響が顕著であり、微生物微小コロ

肉類に対する迅速検査と標準培養法の決定係数

ニーの検査においては、培養時間を長期にしすが野菜類に比べて低い理由として、肉類の種類

ぎることが、必ずしも正確なカウントに直結すによる影響があるものと考えられた34）。

るわけではない。

そこで、肉類の種類に対して、個別に散布図

そのため、今回の試験のように、食品種類ごを作成し、その決定係数を計算したところ、鶏とに、検量線を引き、正確に短時間培養後の微肉、豚肉、および牛肉に対する決定係数はそれ小コロニー検査結果が、標準培養法の結果を近ぞれ0.72、0.62及び0.48であり、鶏肉、豚肉の似できるかを確かめることは重要である。今回

結果において、ギルフォードのルールに基づくの野菜類に対する試験結果を見ると、勾配係数

強い相関関係を持つことが示された。この結果は若干低い値を示したものの、決定係数は高は、肉類に対して、より高い相関性を持たせた

く、グラフ上でも有意の正の一次相関を示した試験を行う場合、その肉類の種類ごとに検量線ことから、野菜類に対して「コロコロミー」をを引くことが有効であることを示している。

用いた微小コロニー検査を行うことで、迅速検

また、鶏肉と牛肉においては、勾配係数がそ査が可能であることを明らかにすることができ

れぞれ0.92と0.71であり、迅速検査と標準培養法

た。

の間でかなり近似した値を示していたことが確

食用の肉類についての迅速検査を行った結果認できた。決定係数は0.72と0.48を示しこの決について、検査したすべての肉類に対する検査

定係数は野菜類の試験より低いものの、十分に結果をグラフにまとめたところ、その決定係数

相関性があると思われた。

は0.58、勾配係数は0.86であった。決定係数 R 2

豚肉の試験においては、決定係数は0.62と上16

微小コロニー検査装置による一般生菌数定量精度の検証と実用化の可能性昇したが、勾配係数は1.57と野菜類を含めてもまた、培養時間を短く設定した微小コロニー

顕著に高く、迅速検査においては一部の細菌し検査法では、検査対象ごとの検量線の作成が重か検査できていない可能性が示唆された。さら要であり、その検量線を用いることで、標準培に、鶏肉、牛肉と大きく勾配係数が異なってい養法の結果を推定することが可能である。ただたことから、豚肉が肉類全体の迅速検査の相関

し、食品およびその由来によって検量線を作成

性が低い値となった原因の一因を担っていたこする必要がある。
以上のことから、「コロコロミー」は、標準培とが示唆される。
これらの結果は、肉類について、各肉類の種養法による生菌数検査を、準備からカウントま類ごとに検量線を引き直すことで、より精度良でを含めて 8 時間程度まで短縮することが可能

く迅速検査を行うことができる事を示していであると考えられるが、肉類については種類ごる。また、肉類の勾配係数は肉類の種類によりとの検量線を作成する必要があり、微生物検査

大きく異なり、全ての肉類を一つの検量線でまの迅速化に資する検査装置として活用の幅を広とめて検査してしまうと、標準培養法の結果とげられるようデータの蓄積が必要である。

ずれてしまう可能性が示された。
【謝辞】
【結論】

本研究は、平成28年度「新あいち創造研究開

食品中の微生物検査を行うための装置は数多

発．補助金」事業の助成を受けて実施した。まく開発・検討されており、今回我々が検討した

た平成28、29年度「名古屋学芸大学健康栄養研「コロコロミー」もその一つである。本報告で究所．研究実践課題」として実施した。

は「コロコロミー」を用いて、野菜類、肉類に対する微生物検査を行い、標準培養法と比較す【利益相反】

ることで、以下のような結果を得ることができ

海谷慎一（株式会社槌屋の社員）

た。
野菜類に対して、微小コロニー検査と標準培養法の間に、非常に高い相関性が得られ、培養【参考文献】

6 時間で迅速検査が可能であることが分かっ

1 ）厚生労働省た。

2 ）森川馨

肉類に対して、野菜類と同様に微小コロニー

食中毒統計資料．2018

食品衛生関連情報の効率的な活用に関する研究．厚生労働科学研究成果データベース．

検査と標準培養法の間に相関関係が見られた

2009

が、相関性は決定係数で0.5程度であり、各肉類

3 ）Tapchaisri, P., Wangroongsarb, P., Panbangred,に対して個別に検量線を引き直すことで決定係

W., et al. Detection of Salmonella contamination数を向上させることができた。

in food samples by dot-ELISA, DNA amplification
and bacterial culture. Asian Pac. J. Allergy

今回検証した結果は、微小コロニー検査法を

Immunol., 1999; 17 (1): 41-51.

標準培養法の代替として使用する場合、事前に4 ）宮原美知子，荒川英二．食品からの V. para­haemo­

検量線を引き相関性を確かめる必要があること

lyticus 迅 速 検 出 法 の 検 討． 防 菌 防 黴，2008; 36:を示している。

669-675.

従来、微小コロニー検査法は迅速検査法の一5 ）Fu, Z., Rogelj, S., Kieft, L. T., Rapid detection of環として実証試験が行われているが、今回の結Escherichia coli O157:H7 by immunomagnetic

果からは、特に「コロコロミー」を用いること

separation and real-time PCR. Int. J. Food
Microbiol., 2005; 99 (1): 47-57.

で、培養 6 時間のメンブレンフィルタ培養物を6 ）Niessen, L., Luo, J., Denschlag, C., et al. The

用いて、微小コロニーをカウントすることが可

application of loop-mediated isothermal

能であることが示された。

17

amplification (LAMP) in food testing for bacterial18）Regnault, B., Martin-Delautre, S., Lejay-Collin, M.,

pathogens and fungal contaminants. Foodet al. Oligonucleotide probe for the visualization

Microbiol., 2013; 36 (2): 191-206.

of Escherichia coli/Escherichia fergusonii cells
by in situ hybridization: specificity and potential

7 ）Zhao, X., He, X., Li, W., et al. Development andevaluation of colloidal gold immuno­c hromato­applications. Res. Microbiol., 2000; 151: 521-533.

graphic strip for detection of Escherichia coli19）青井良平，清水茂雅，山崎浩司，et al. 培養併用蛍O157. African J. Microbiol., 2010; 4 : 663-670.

光 in situ ハイブリダイゼーション法を用いた汚染

8 ）Pavlovic, M., Huber, I., Konrad, R., et al. Appli­

指標大腸菌の迅速定量検出．日本食品科学工学会
誌，2011; 58: 483-489．

cation of MALDI-TOF MS for the Identification20）山崎浩司．蛍光 in situ ハイブリダイゼーション法

of Food Borne Bacteria. Open Microbiol., 2013; 7:を応用した迅速細菌検査法の開発と食品微生物制

135-141.
9 ）Hotta, Y., Sato, H., Hosoda, A., et al. MALDI-

御．日本食品科学工学会誌，2014; 61: 259-267．

TOF MS analysis of ribosomal proteins coded

21）馬場貴志，山口進康，那須正夫．マイクロコロニー

in S10 and spc operons rapidly classified

自動計数システムによる水環境中の生菌数の迅速計測．防菌防黴，2007; 35: 719-724．

the Sphingomonadaceae as alkylphenol22）Wang, X., Yamaguchi, N., Someya, T.,  et al. Rapid

polyethoxylate-degrading bacteria from theenvironment. FEMS Microbiol. Lett., 2012; 330 (1):and automated enumeration of viable bacteria

23-29.

in compost using a micro-colony auto counting
system. Journal of Microbiological Methods, 2007;10）Ukuku, O. D., Sapers, M. G., Fett, F. W., et al.

71: 1-6.

ATP Bioluminescence Assay for Estimation of23）Asano, S., Iijima, K., Suzuki, K., et al. Rapid

Microbial Populations of Fresh-Cut Melon. Journal

detection and identification of beer-spoilage lacticof Food Protection, 2005; 68: 2427-2432.

acid bacteria by microcolony method. J. Biosci.

11）川崎晋，山中俊介，川本伸一．蛋白質ふき取り法

Bioeng., 2009; 108: 124-129.

による食品製造現場での自主衛生検査の活用法と24）Baumstummler, A., Chollet, R., Meder, H., et al.

その有効性．日本食品微生物学会雑誌，2006; 23:

Development of a nondestructive fluorescence-

230-236．

based enzymatic staining of microcolonies for12）Khan, I. U., Gannon, V., Kent, R., et al. Devel­op­ment of a rapid quantitative PCR assay for direct

enumerating bacterial contamination in filterable

detection and quantification of culturable andproducts. J. Appl. Microbiol., 2011; 110: 69-79.

non-culturable Escherichia coli from agriculture25）Osono, E., Kobayashi, E., Inoue, Y., et al. Rapid

watersheds. J. Microbiol. Methods, 2007; 69: 480-detection of microbes in the dialysis solution by488．

the microcolony fluorescence staining method(Millflex quantum). Biocontrol Sci., 2014; 19: 57-

13）田中孝，土方智典，伊藤晶子．et al. フローサイト

60.

メトリーによるヨーグルト中の酵母の迅速検出．

26）千原裕貴，紙本和美，左海順，et al. 6-carboxy­

防菌防黴，2010; 38: 797-801.
14）田中孝，土方智典，上門英明．フローサイトメト

fluorescein diacetate を用いたマイクロコロニー

リーによる牛乳中の大腸菌群迅速検出．防菌防法のバイオプロセスへの適用．日本防菌防黴学会

黴，2011; 39: 71-75.

誌，2015; 43: 457-461．

15）荒井威吉，澤山成行，梨本一男．et al. 蛍光染色

27）坂宮章世，田中晶善．微生物熱測定と，その食品

フィルタ法による生乳中の細菌数測定の精度と実微生物学および土壌微生物学への応用．日本熱測定学会，2009; 36: 31-37．

用性．Milk Science, 2006; 55: 31-36.
16）Niwa, R., Yoshida, S., Furuya, N., et al. Method for28）山梨秀己，久保田裕美，郡司明博，et al. DOX を

simple and rapid enumeration of total epiphytic

用いた食品中のサルモネラ迅速検出法の検討．日
本食品微生物学会雑誌，2004; 21: 160-167．

bacteria in the washing solution of rice plants.

29）Ellis, P., Meldrum, R., Comparison of the compact

Can. J. Microbiol., 2011; 57: 62-67.
17）山村隼志，古泉綾子．蛍光 in situ ハイブリダイ

dry TC and 3M petrifilm ACP dry sheet media

ゼーション（FISH）法によるカビの迅速検出．防

methods with the spiral plate method for the

菌防黴，2011; 39: 525-530．

examination of randomly selected foods for18

微小コロニー検査装置による一般生菌数定量精度の検証と実用化の可能性

obtaining aerobic colony counts. J. Food. Prot.,
2002; 65: 423-425.
30）Nelson, T. M., LaBudde, A. R., Tomasino, F. S., etal. Comparison of 3M Petrifilm Aerobic Count
Plates to standard plating methodology for use
with AOAC antimicrobial efficacy methods
955.14, 955.15, 964.02, and 966.04 as an alternative
enumeration procedure: collaborative study. J.
AOAC. Int., 2013; 96: 717-722.
31）Kawai, M., Yamaguchi, N., Nasu, M.

Rapidenumeration of physiologically active bacteria
in purified water used in the pharmaceuticalmanufacturing process. J. Appl. Microbiol., 1999;
86: 496-504.
32）水本篤，竹内理．研究論文における効果量の報告のために．英語教育研究，2008; 31: 57-66．
33）Mukaka, M. M.

A guide to appropriate useof Correlation coefficient in medical research.
Malawi. Med. J., 2012; 24: 69-71.
34）Zhao, C., Ge, B., De Villena, J., et al. Prevalenceof Campylobacter spp., Escherichia coli, andSalmonella serovars in retail chicken, turkey,
pork, and beef from the Greater Washington, D.C.,
area. Appl. Environ. Microbiol., 2012; 67: 54315436.

19

Abstract

Experimental validation of the accuracy and applicability ofthe bioimaging microcolony counter to microbial examination tests
Issey Matsuo1,2*, Youhei Hoshisashi1,2, Mizuki Fukuoka1,2,
Makoto Moriyama1,2, Shinichi Kaiya3, Michiru Kishimoto2,4

A bioimaging microcolony counter “ColoColoMee” using membrane filtering method combining a fluorescent
staining technique for rapid and sensitive bacteria detection, was compared with the standard technique for evaluation of the viable bacterial counts in foods. We investigated bacteria in foods using “ColoColoMee”, with raw
vegetables, chicken, pork and beef, respectively. Using “ColoColoMee”, microcolonies could be detected after
6h of the incubation, compared to that after the conventionally used 48h incubation period. The results showeda linear correlation, and the decision coefficients R2 with standard incubating technique (48h of incubation) with
4 kind of raw foods were 0.90, 0.72, 0.62 and 0.48, respectively. These results indicated that “ColoColoMee” isuseful for rapid and sensitive bacteria detection in food quality control.
Keywords: Fluorescent dye staining, Microcolony detection method, Membrane Filter Method, Microbial
control, Incubation time

1 Moriyama Environmental Wellness Laboratories
2 Institute of Health and Nutrition. Nagoya University of Arts and Sciences
3 Research and Technology Development Division, Tsuchiya Co., Ltd.
4 Department of Nutritional Sciences. Nagoya University of Arts and Sciences20