名古屋学芸大学健康･栄養研究所年報第6号

2014年

《原著》

経口免疫療法に効果的な食品摂取方法の探索
＊

山田千佳子

小瀬木一真

＊

和泉＊

秀彦

要旨
食物アレルギーの治療法として注目を集めている免疫療法を評価するための動物モデル（マウス）を作製し、このマウスを用いて、免疫療法の効果を高めるアレルゲンの投与方法を検討することを目的とした。卵白アレルゲンの一つであるリゾチームに感作させたマウスに、量の異なるリゾチー
ム、他の食品成分とリゾチームの混合物、化学修飾したリゾチームを経口投与し、免疫療法に対する効果を解析した。その結果、リゾチームの投与量によって、免疫療法後の免疫応答に差がみられた。また、デキストランとリゾチームを混合投与した場合、およびリゾチームにグルコースによる化学修飾を施した場合には、投与後の免疫応答がリゾチームのみ投与した場合とは異なり、特にデキストランとの混合投与は治療効果が高まる傾向がみられた。以上の結果から、免疫療法に用いられるアレルゲンは、他の食品成分との混合や他の食品成分による化学修飾によってその治療効果が変化することが明らかとなり、投与方法を改善することでより効果的な治療が出来る可能性が示唆された。また、その評価に、このモデルマウスが有効であると考えられた。
キーワード：食物アレルギー、経口免疫療法、リゾチーム、アナフィラキシーショック、アミノ-カルボニル反応品についてあまり関心が払われておらず、加熱はじめになどの簡単な加工を施しただけのものが使用

食物アレルギーの治療法の一つである経口

されているため、患者は薬のように治療食を食

免疫療法は、最終的にはその食品を食べられるべなければならない。また、医師によって投与ようになるという点で、大変有効な食物アレル量や投与期間が異なっており、患者への効果もギーの治療法だと考えられる。経口免疫療法

様々であることから、確立された治療法とは言とは、患者が医師の管理の下で原因食品を少量い難いのが現状である。

ずつ摂取し、症状が現れれば薬でそれを抑えな

一方、食品は大抵様々な加工を施してから食がら徐々に摂取量を増やしていき、これを通常すことが多いため、その過程で他の食品成分との食事が問題なく食べられるところまで続け相互作用をする。その結果、食品中のアレルゲる治療法である 。そのため、患者には不安やンは抗原性が変化し、元の状態よりも免疫療法苦痛に加えて経済的または時間的な負担がとの効果を高める可能性が期待される。食品成もなう。したがって、治療に用いる食品（アレ分の相互作用とアレルゲンの消化・吸収およびルゲン）には免疫応答を効果的に改善し、苦痛

抗原性の変化に関するこれまでの研究では、大が少なく、かつ短期間で済むような工夫が望ま

豆アレルゲンとコーンオイルを同時摂取するれる。ところが現在のところ、治療に用いる食と大豆アレルゲンの吸収量が増加するとの報

1）＊名古屋学芸大学大学院栄養科学研究科

57

告がある 2 ）。また、食物繊維の一種であるキトは Micrococcus luteus 菌体（和光純薬工業株式

サンを結合させた牛乳アレルゲン（β‐ラクトグ会社）を用い、540nm における吸光度の減少をロブリン）と元の β‐ラクトグロブリンの抗原溶菌活性として算出した。以上のようにして性を比較すると、キトサン結合 β‐ラクトグロ作製、性質の変化を解析したグルコース結合リブリンでは抗原性が低下したとの報告などがゾチームを20mg ずつアレルギーマウスに経口ある 。したがって、これらの知見をもとに免投与し、治療効果を解析した。

3）

疫療法で用いる食品の加工方法を検討するこ（ 2 ）抗体とによって、アレルギー症状が誘発されること

マウス血清中の IgG 1 の検出には POD-Linkedなく治療ができ、かつ患者もおいしく食べられる治療食が提案できると考えられる。

anti mouse IgG （SouthernBiotech）を、IgE の1

そこで本研究では、免疫療法の効果を上げる

検出には POD-Linked anti mouse IgE（Nordicために、治療に用いる食品の調理・加工方法をImmunology）を、糞中の IgA の検出には POD-検討した。まず、（ 1 ）免疫療法の効果を評価

Linked anti mouse IgA（Zymed Laboratories）するためのモデルマウスの作製および評価系を使用した。の構築を行い、これを用いて（ 2 ）免疫療法にまた、リゾチームと糖結合リゾチームの抗効果的なアレルゲン投与方法の検討を行った。

原 性 を 比 較 す る た め に、anti LY rabbit IgG（ROCKLAND）と POD-linked anti rabbit IgG（BETHYL）を使用した。

実験方法（ 1 ）投与アレルゲン（ 3 ）実験動物及び飼育方法

アレルゲンとして用いたリゾチームは、和日 本 エ ス エ ル シ ー 株 式 会 社 の B10.A/

光純薬工業株式会社より購入したものを使用

SgSnSlc マウス（ 5 ～ 6 週齢、雌）を用いた。

した。リゾチームは単独投与、デキストラン

このマウスはリゾチームに対しては経口投与（MW. 40,000）（和光純薬工業株式会社）とののみで IgE が増加するほど感受性が高いこと

混合投与、グルコースと結合させた糖結合リゾが分かっている 5 ）。ソフトチップを敷いたプラ

チーム投与について検討した。

スチック製の飼育ケージにマウスを入れ、室温糖結合リゾチームは、次のように作製した。

24± 2 ℃、明暗サイクル12時間で飼育した。市リゾチーム 5 g とグルコース 5 g を Elix 水中に販の固形飼料（CE-2：オリエンタル酵母）と水溶解し、0.1M NaOH を用いて pH8に調整後、は自由に摂取させた。

凍結乾燥機にて粉末化した。これをデシケー

動物実験は、名古屋学芸大学動物実験規程にター内に入れ、60℃で24時間アミノ-カルボニ基づき、「実験動物の飼育および保管に関するル反応させた。未反応のグルコースを除去す基準（昭和55年総理府告示第 6 号）」を遵守しるために 4 日間透析後、再度凍結乾燥したものて行った。

を使用し、糖の結合による化学的性質の変化を（ 4 ）実験計画調べた。まず、SDS-PAGE 4 ） でグルコースの結合による分子量の変化を調べた。解析には

図 1 に従って実験を行った。まず、マウスを15％アクリルアミドゲルを用い、泳動後のゲルアレルギー状態にするため、リゾチーム /PBS

は CBB を含む染色液で染色してタンパク質を溶液（50 µg/200 µl）に水酸化アルミニウム（和検出した。また、グルコースの結合による抗原光純薬工業株式会社）を 1 mg 混合したものを性の低下を ELISA で確認した。さらに、リゾマウスの腹腔に 3 回投与した。その後、実験開チームはグラム陽性菌に対して溶菌活性を示

始50日目にマウスから採血して血中の IgE をすことから、グルコース結合リゾチームの溶菌ELISA で測定し、アレルギーの誘発を確認し活性を測定し、リゾチームと比較した。基質にた。このアレルギーマウスを各群に分け、それ58

経口免疫療法に効果的な食品摂取方法の探索

図1

免疫スケジュール（ 6 ）ELISA

ぞれ治療用リゾチームを 1 日 1 回10日間経口投与した。この治療前後で採血および採糞をマウスの血清および糞中のリゾチーム特異行い、各試料中のリゾチーム特異的抗体価を的抗体価の測定は以下のように行った。まず、

ELISA で測定し、免疫応答の変化を調べた。最96穴マイクロプレートにリゾチーム /PBS 溶

後に、この治療効果を評価するためにマウスに液（10 µg/ml）をコーティングし、その後 1 ％リゾチームを100mg 経口投与してアナフィラBSA（和光純薬工業株式会社）/PBST（PBS

キシーショックを誘導し、その症状についても溶液中に tween を0.05％含む）溶液でブロッキ解析を行った。

ングした。その後、マウス血清は1,000倍（リゾチーム特異的 IgG 1 測定）、100倍（リゾチー（ 5 ）試料の調製

ム特異的 IgE 測定）に希釈して加え、糞中 IgA

採取後の血液は、 4 ℃で 1 時間静置後、10分抽出溶液は原液を加えて、プレートにコーティ間遠心分離（ 4 ℃・3,000×g）を行い、その上清ングされたリゾチームと反応させた。プレーを採取した。上清は腐敗防止のためアジ化ナトを洗浄後、プレート内に残存した抗体を検トリウムを終濃度0.05～0.1％になるように加出するために、（ 2 ）に示した抗体を反応させえ、－20℃で保存した。

た。発色には o-フェニレンジアミン（和光純

また、糞中の IgA の抽出は以下のように行っ薬工業株式会社）を使用して一定時間発色さた。採取した糞0.1g に対して可溶性画分抽出せ、2N 硫酸溶液で反応を停止させた。その後、溶液 （PBS 溶液中に BSA10 µg、バシトラシ

MICROPLATEREADER（コロナ電気株式会

ン50 µg、ベンズアミジン300 µg、ロイペプチ社

ン80 µg、キモスタチン20 µg、およびペプスタ測定した。

6）

MTP-650FA）を用いて492nm の吸光度をチン25 µg/ml を含む）を 1 ml 加え、in vitro

リゾチームと糖結合リゾチームの抗原性をshaker（TAITEC ROTATOR RT-50）で一晩比較するためには、まず、96穴マイクロプレー

振とうした。その後10分間遠心分離（ 4 ℃・

トにリゾチーム /PBS 溶液、グルコース結合20,000×g）し、その上清を IgA 測定試料としリゾチーム /PBS 溶液（10 µg/ml）をそれぞて－20℃で保存した。

れコーティングした。 1 ％ BSA/PBST 溶液でブロッキング後、anti-LY rabbit IgG を反応さ59せ、さらにプレートを洗浄後、POD-linked antiに、免疫療法としてリゾチーム（ 0 、0.2、2.0、rabbit IgG を加えた。発色は上記と同様に行20 mg/mouse）を 1 日 1 回、10日間経口投与しい、492nm の吸光度を測定した。

た。このリゾチーム投与による免疫応答の変化を解析するために、投与前後で採血および採（ 7 ）アナフィラキシーショックの解析糞を行い、試料中のリゾチーム特異的抗体価をアナフィラキシーショックの解析は、直腸測定した（図 2 ）。その結果、血中のリゾチー温の測定、ショック症状の観察および小腸のム特異的 IgG 1 には治療による変化は認められ炎症度について行った。直腸温は、DIGITALなかったが、リゾチーム特異的 IgE は20mg 投

THERMOMETER（株式会社芝浦電子

TD-与群で減少する傾向がみられた。また、糞中の320）を用いてショック誘導前と誘導30分後に測リゾチーム特異的 IgA は20mg 投与群で増加す定し、低下度を比較した。また、経口投与直後る傾向が認められた。さらに、治療効果を確認から30分間マウスのアレルギー症状を観察し、するために、治療用リゾチームの投与終了10日

スコア化した 7 ）。ショック症状は、鼻や頭を掻後に再度リゾチームを経口投与してアナフィ

く、擦る、目や鼻の周りが腫れる、毛が逆立ラキシーを誘導し、直腸温の測定およびショッ

つ、下痢、行動減少、呼吸数増加、喘息、不ク症状の観察を行い、ショック症状について自然な呼吸、チアノーゼ、意識を失う、痙攣、はスコア化して比較した（図 3 ）。その結果、死亡の項目について観察し、1 つの症状を 1 点20mg 投与群では他群より直腸温の低下が抑制として数値化し、その合計数を比較した。さらされる傾向およびショック症状が軽減されるに、小腸の炎症度については、エバンスブルー傾向がみられた。の小腸組織透過性を測定することにより比較以上の結果より、B10.A マウスにリゾチームした。ショック誘導30分後のマウスにエバンを投与してアレルギーマウスを作製し、このスブルー（和光純薬工業株式会社）を投与し、マウスにリゾチームを経口投与するとアレル10分後に小腸を摘出した。これを 3 等分してギー症状が改善されることが確認された。ま

胃側の上部組織からホルムアミド（和光純薬工た、その効果は投与量に依存し、今回検討を業株式会社）を用いて色素を抽出し、620nm の行った中では最も投与量の多い20mg 投与群で吸光度を測定して炎症の指標とした。

最も免疫療法の効果が高かった。したがって、この動物実験系を用いて免疫療法に効果的な（ 8 ）統計処理アレルゲンの摂取方法を評価し、ヒトへの治療に応用できるのではないかと考えられた。

統計解析にはエクセルを用いた。免疫療法前後およびショック誘導前後の解析値の比
較 に は Paired t-test を、 各 群 間 の 比 較 に は免疫療法に効果的なアレルゲンの投与方法のNon-repeated measures ANOVA 検 定 の 後、検討

Dunnett’s test を用いた。

①デキストランとの混合投与が免疫療法に与える影響
先の実験結果から、リゾチーム 20mg 投与

結果が最も免疫療法の効果が高いことが明らかとモデルマウスの作製および治療リゾチームのなったため、次にリゾチーム 20mg と同時に投与量による免疫応答の変化の解析

デキストランを投与し、同時投与した他の食品

まず、経口免疫療法のモデルマウスを作製

成分が免疫療法に及ぼす影響について調べた。

し、治療に用いるアレルゲン量を変化させた場治療による免疫応答の変化を解析するために、合の免疫療法に与える効果を解析した。図1に血中および糞中のリゾチーム特異的抗体価をしたがって B10.A マウスにリゾチームを投与測定した結果（図 4 ）、血中のリゾチーム特異的し、リゾチームアレルギーにした。このマウス

IgG 1 および IgE には治療前後で変化が見られ60

経口免疫療法に効果的な食品摂取方法の探索

図2

治療前後での LY 特異的抗体応答の変化

61

図3

アナフィラキシーショック誘導時の体温変化および症状の比較
A：ショック誘導前後での直腸温度の測定
B：ショック症状の比較
有意差検定には paired-test を用いたなかったが、糞中のリゾチーム特異的 IgA はデ②グルコース結合リゾチームが免疫療法に与キストランと混合投与することにより増加しえる影響た。さらに、アナフィラキシー誘導時のショッ次に、加工したアレルゲンの投与が免疫療法

ク症状の解析結果では（図 5 ）、直腸温の低下に及ぼす影響について調べるために、アミノ-が抑制される傾向および症状が軽減される傾カルボニル反応を利用してリゾチームにグル向がみられた。

コースを結合させ、このグルコース結合リゾ以上の結果より、デキストランとの混合投与チームをマウスに投与した。まず、作製したグは免疫療法の効果を促進する可能性が示唆さルコース結合リゾチームについて、グルコースれた。の結合を確認するために、化学的性質の変化に

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経口免疫療法に効果的な食品摂取方法の探索

図4

 キストランと LY の混合投与による治療後の LY 特異的抗体応答
デの変化
有意差検定には Non-repeated measures ANOVA 検定の後、Dunnett’s testを用いた

63

図5

 キストランと LY の混合投与によるアナフィラキシーショック誘導時のデ体温変化および症状の比較
A：ショック誘導前後での直腸温度の測定
B：ショック症状の比較
有意差検定には paired-test を用いたついて解析した。SDS-PAGE により分子量のこの活性の低下は、リゾチームの酵素活性部変化を調べた結果（図 6 -A）、元のリゾチーム位にグルコースが結合したためと考えられた。と比較してバンドが上方にシフトした。これ

以上の結果から、リゾチームへのグルコースのは、グルコースの結合によって見かけの分子量結合を確認した。

が増加したためと考えられた。また、リゾチー

さらに、グルコースの結合がリゾチームの抗ムは溶菌活性を持つ酵素タンパク質でもある原性に影響を与えていないかどうか確かめる

ため、この活性を測定し、リゾチームと比較ために、ELISA で抗体の結合能を測定し、リしたところ（図 6 -B）、グルコースを結合させゾチームと比較した（図 6 -C）。その結果、抗ることによって元の活性の約30％に低下した。

体の結合能には変化がみられなかった。この64

経口免疫療法に効果的な食品摂取方法の探索

図6

グルコース結合 LY の作製と化学的性質の変化の解析
A：グルコース結合による分子量の変化
B：グルコース結合よる溶菌活性の変化
C：グルコース結合による抗原性の変化結果であった。

ようにして作製したグルコース結合リゾチー
ムをマウスに20mg 投与し、免疫療法の効果を以上の結果から、アレルゲンにグルコースを解析した。その結果、リゾチーム投与群では観結合させるという加工は、免疫療法の効果を抑察された糞中 IgA の増加（図 7 -A）および直制すると考えられた。

腸温の低下（図 7 -B）が、グルコース結合リゾチーム投与群では観察されなかった。また、

考察

小腸の炎症度を解析し、比較した結果についても（図 7 -C）、グルコース結合リゾチーム投与

現在、ヒトで行われている経口免疫療法で群よりリゾチーム投与群の方が炎症が少ないは、まず初めに患者に経口負荷試験を行い、

65

図7

 ルコース結合 LY 投与による LY 特異的 IgA の変化とアナフィラキシー誘導
グ
時の直腸温度および小腸炎症度の比較
A：糞中 IgA の定量
B：直腸温度の測定
C：小腸炎症度の比較
Before-after 間の有意差検定には paired-test を用い、 3 群間の比較には Non-repeatedmeasures ANOVA 検定の後、Dunnett’s test を用いた

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経口免疫療法に効果的な食品摂取方法の探索

アレルギー症状の出ない最大摂取量を確定する。消化管内に分泌された IgA は、①アレルゲる 。この量を基にして患者にはアレルギー原ンと結合してそのまま排泄されることにより、因食品を定期的に摂取してもらい、様子を見な消化管から体内へアレルゲンが吸収されるのがら徐々に摂取量を増やしていく方法がとらを抑制する。②アレルゲンと結合した状態でれている。したがって、マウスの場合にもリゾ一部が吸収され、IgA 産生をさらに亢進させる

チーム投与量が少ないとアレルギー症状に影ことから 9 ），10）、経口免疫寛容の誘導に関与す響がでない、もしくはアレルギー症状の改善がる可能性があることが知られている11）。今回のみられ、投与量が摂取限界を超えている場合に実験における IgA 分泌までの免疫応答のメカはアレルギー症状が悪化するのではないかとニズムと、分泌された IgA の働きについてはさ予想した。しかし興味深いことに、今回検討しらなる解析が必要と考えられる。

8）

たリゾチーム投与量のうち、最も多量にあたる

また、グルコース結合リゾチームを治療に用20mg 投与群でアレルギー症状の緩和傾向がみいた場合、リゾチームよりも治療効果が下がっられ、一方で0.2、2.0mg 投与群では症状が悪化た。マウスをアレルギーにするために行ったした（図 3 ）。このことから、ある程度のアレ

最初の免疫に用いたアレルゲンは加工を施しルゲン量を効果的に摂取することが免疫療法ていないリゾチームを使用したため、グルコーにおいては必要と考えられる。

スの結合による構造の変化は治療効果を高めまた、血中の IgG 1 および IgE はリゾチームるのではないかと期待したが、逆の結果となっ投与量にかかわらず、治療前後で変化がみられた。このグルコースの結合による治療効果のなかった。一方で、治療後にアナフィラキシー低下に関するメカニズムについても今後解析を誘導すると、体温の低下やショック症状は治が必要である。

療用リゾチームの投与量によって異なった（図本研究では、現在ヒトで食物アレルギーの治2 および図 3 ）。通常は、IgE を指標にアレル療のひとつとして行われている免疫療法に着ギーの診断が行われ、IgE の増減が最も重要と目し、治療効果を高める効果的な食品の摂取方考えられている。しかし、最終的にはショッ法を探索するために動物モデルを作製し、評価ク症状の緩和が患者にとっては最も重要であ系を構築した。この評価系を用いて食品中のり、ヒトに対する免疫療法においては、治療後他の成分との相互作用について解析した結果、に IgE の減少が認められないにもかかわらず、他の食品成分との相互作用が免疫療法の効果ショック症状が緩和し、治療効果が認められるに影響を及ぼす可能性が示唆された。今後、こ場合がある。したがって、今回のモデルマウスの実験系を用いることでさらに免疫療法に効においても、IgE の増減とショック症状の間に果的な食品の摂取方法を検討することができは相関関係は認められなかったが、治療の効果ると考えられる。

はあったと評価できる。
また今回の実験では、デキストランとの混参考文献

合投与においてリゾチーム特異的 IgA の増加

1 ）今井 孝成：食物アレルギーの診断と治療が観察され、これにともなってアナフィラキ

経口免疫療法（解説 / 特集）．アレルギーの臨床2013；

シー誘導時のショック症状が軽減された（図 433：339-342．

および図 5 ）。また、グルコース結合リゾチー2 ）Weangsripanaval T, Moriyama T, Kageura

ムの投与においてリゾチーム特異的 IgA がリ

T, Ogawa T, Kawada T: Dietary fat and an

ゾチーム投与より減少し、これにともなってexogenous emulsifier increase the gastrointestinal

ショック症状についてもリゾチーム投与よりabsorption of a major soybean allergen, Gly m Bd
30K, in mice. J Nutr, 2005; 135: 1738–1744.

悪化傾向がみられた（図 7 ）。したがって、糞3 ）Aoki T, Iskandar S, Yoshida T, Takahashi K,

中 IgA の増加がその後に誘導されるショック

Hattori M: Reduced immunogenicity of beta-

症状の軽減に関与している可能性が示唆され

67lactoglobulin by conjugating with chitosan. Biosci
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68経口免疫療法に効果的な食品摂取方法の探索

Abstract

Search for a good preparation method of allergen for oral immunotherapys
Chikako Yamada＊, Kazumasa Ozeki＊, and Hidehiko Izumi＊

We established the mouse model of immune therapy to food allergy with egg-white lysozyme. The mice wereadministrated different dose lysozyme, mixture with another constituent and chemically-modified lysozyme
for therapy and analyzed symptoms induced after therapy. These mice showed shock symptoms but severity ofthem differed depending on the dose and form of the lysozyme. These results indicated that this mouse modelis useful for evaluation of effects of immune therapy with the allergen itself.
Keywords: food allergy, oral immunotherapy, lysozyme, anaphylactic shock, aminocarbonyl reaction＊ Graduate School of Nutritional Sciences, Nagoya University of Arts and Sciences69