News No.103(2002)

News No.103(2002)

目次
Review
Slow response voltage-dependent fluorescence dye を利用したイオンチャネル作用薬の効率的探索系の開発と応用
名古屋市立大学大学院薬学研究科 今泉祐治 ..................... 1
ケミストからみたポストゲノム 3〜 SNP タイピング その 2（マススペクトルによる検出）
九州大学大学院工学研究院 片山佳樹 ................................ 8

試作品案内
BSB ................................................................................... 18
関連商品案内DiBAC4(3) ........................................................................... 6
お知らせ

PRTR 該当品 MSDS 試薬協会 HP 掲載 .............................. 13
販売中止予定案内 .................................................................. 13
Al Kit 商品名および仕様変更 ................................................ 17
フォーラム開催案内 .............................................................. 17

Topics on Chemistry
低分子リフォールディング剤
同仁化学研究所 佐々本一美 .............................................. 7

Commercial
新製品案内

Calcium Screening Kit ................................................... 14

新製品案内
容量、価格は下記ページをご覧ください。
Calcium Screening Kit .......................................................... 16

花しょうぶ
アヤメ科の植物で江戸系・肥後系・伊勢系の 3 種があり、 6 月頃美しい花を咲かせます。
江戸時代後期 肥後藩主 細川斎公（なりもり）が江戸より持ち帰り、「花の心のわかる武士であれ」と家臣に諭し品種改良を命じたといわれる肥後しょうぶ。門外不出とされたため、一般にひろまったのは昭和以降で、戦後は花しょうぶの主流を占めています。優雅な大輪の花で、花弁が大きく、豪華で堂々とした風格があります。
ちなみに、端午の節句でおなじみの菖蒲湯に使う「菖蒲」はサトイモ科の植物です。

News No.103(2002)

Slow response voltage-dependent fluorescence dye を利用した
イオンチャネル作用薬の効率的探索系の開発と応用(Development of high throughput screening system for the discovery of new compounds acting on ion channels byuse of slow response voltage-sensitive fluorescence dyes)

今泉祐治(Yuji Imaizumi)
名古屋市立大学
薬学研究科

大学院[ Summary ]High Throughput Screening (HTS) is getting a new massive wave in drug discovery
by pharmaceutical industries. Although ion channels are attractive targets fortherapeutic manipulation, assays of drugs acting on them do not always fit to HTS. It
has been widely accepted that Ca2+ activated K+ (KCa) channels play the central rolesin the negative feed back mechanism to regulate Ca2+ influx through voltage-dependent
Ca2+ channels in excitable cells. Opening of KCa channels may enhance cellular
protective mechanisms under pathophysiological circumstances. The usefulness ofslow response voltage-sensitive fluorescence dye such as DiBAC4(3), an oxonol anion,
for the assay of KCa channel openers in the scope of HTS was evaluated in heterologous
expression system in which BK channel, one of three classes of KCa channels, wasstably expressed. Using this screening system, some new terpenoid compounds having
BK channel opening action were actually discovered from natural products and theirderivatives. Further possible application of newly developed voltage-sensitive dyes
and novel technologies to improve drastically HTS system for the discovery of seed
compounds acting on specific ion channels is also discussed.

キーワード：

high throughput screening（高効率探索系）、ion channel（イオンチャネル）、voltage sensitive fluorescence dye（電位感受性蛍光色素）、Ca2+-activated K+channel（カルシウム依存性カリ
ウムチャネル）、K+channel opener （カリウムチャネル開口薬）、
gene transfection（遺伝子導入）、mammalian stable geen-expression system（哺乳動物遺伝子定常発現系）

1）はじめに医薬品シード化合物の探索法は最近の 10 年間で大きく発展し、ロボット化したアッセイ系システムを用いて、ソースとなる数十万検体の化合物から無作為に目的とする薬物活性を持つ化合物を高速・高効率に探索する方式(high throughput screening; HTS)
によることが多くなってきた。大規模な HTS の稼動に要する費用とそれに拠って得られたシード化合物の有用性のコストパー
フォーマンスに関しては議論のあるところであるが、大きな方向性として HTS が定着しつつあると思われる 1)。抗高血圧薬や抗不整脈薬などのイオンチャネル作用薬は臨床で使用されている（いわゆる医家向け）医薬品の売上高として全体の 10％程度を占めており、この分野での新薬開発意欲も高いと言われている。従って
イオンチャネル作用薬開発のためのHTSシステムは強い潜在需要を有すると思われる。しかし GTP 結合タンパク共役型薬物受容体や酵素をターゲットとした作用薬開発の場合と異なり、イオン
チャネル作用薬開発においては、DHP 系 Ca 拮抗薬のように 3Hラベル化合物のチャネル蛋白への結合実験が有効な場合を除くと、高効率アッセイ系を確立することが困難な場合も多い。このこともイオンチャネルに作用する新薬開発の障害要因になっていたよ
うに考えられる 2)。ここでは bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol (DiBAC4(3))などの slow response voltagesensitive fluorescence dye を用いたイオンチャネル作用薬の効率的探索実験系の長所と問題点および展望について、当研究室の研究対象の 1 つである Ca2+ 依存性 K+ チャネル開口薬探索を例にして概述したい。

2）イオンチャネル作用薬の探索法と電位感受性蛍光色素
膜電位感受性蛍光色素を利用したアッセイがイオンチャネル作用薬の高効率検索には特に有効な手法と考えられる。しかし膜電位感受性蛍光色素自体は 20 年ほど前から開発され、主に生理・生
化学学系の研究に用いられてきたにもかかわらず、この手法を活用した新薬候補化合物探索あるいは薬理学的検討についての結果が学術誌に報告されるようになったのは、ごく最近である。現在まで用いられてきた膜電位感受性色素を大別すると、膜電位感受性と時間分解能から Table 1 に示すような 2 種類に分類される。一方の色素は電位感受性が低い(100 mV あたり 2-10% の蛍光強度変化)ものの反応は速く（fast response probe: di-4-ANEPPS
や RH414 など;時定数はミリ秒）、脳スライス標本の活動電位伝播の検出などに用いられているが、新薬候補化合物の高効率探索には現在の HTS システムでは適していない。他方、電位感受性がより高い色素（slow response probe： oxonol 系陰イオン化合物として DiBAC4(3)， carbocyanine 系陽イオン化合物として
DiSC2(5)など；1 mV あたり 1% 程度の蛍光強度変化）は、電位変化に伴う蛍光変化が数十秒の時定数を持つため、活動電位やslow waveなど比較的速い電位変化を測定することは不可能であるが、緩徐な膜電位変化を捕らえることはできる 3)。これをマーカーとして膜電位が消失した細菌数をセルソーターで定量し、抗生物質等の効力を検定すること等にも利用されている 4)。イオン
チャネル作用薬に関しては、 ATP 依存性 K+ チャネルを発現させた培養細胞において、K+ チャネル開口薬及び経口糖尿病薬を効率的かつ定量的に評価するためにDiBAC4(3)などが用いられている
5)。次に述べる Ca2+ 依存性 K+ チャネル作用薬の検索にも活用され

1

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Table 1. List of voltage-sensitive fluorescence dyes

始めている。しかし一方では slow response probe による薬効評
価にはアーチファクトが入りやすいという報告もあり、製薬企業
におけるそれぞれのチャネル作用薬評価系での具体的な結果が論文公表されることは少ないため、評価系としての妥当性は充分明らかとなってはいない。

BKチャネルは中枢神経および血管を始めとする臓器全ての平滑筋、腺細胞に高発現しており、それぞれに重要な機能を担っている。

3）Ca2+依存性K+チャネルの機能と作用薬の有用性
K+ チャネルは Na+ や Ca2+ チャネルと比較して、蛋白構造的な面からも、また活性化機構の面（電位依存型・リガンド活性型など）からも極めて多様性に富み、大まかに 8 種類ぐらいに分類される。
また、生体内分布に強い組織・部位選択性の見られる場合が多く、様々な疾患・病態に関与しているため、選択的な薬物の標的として魅力的である 6,7,8)。Ca2+ 依存性 K+ チャネルは細胞内 Ca2+ 濃度上昇
機能的には単一チャネルのにより活性化されるK+チャネルであり、大中小のコンダクタンスの違いから BK，IK，SK に分類される 9)。
細胞内への Ca2+ 流入は、神経・筋・膵臓ラ氏島 β 細胞などの興奮性細胞においては主に電位依存性 Ca2+ チャネルを介して行われ、化学伝達物質やホルモン遊離・収縮などの細胞機能を発揮するための情報伝達系で最も重要なステップである。同時に過剰な流入は
Ca2+ 過負荷による細胞障害をもたらすため、殆どの興奮性細胞種
は Na+ チャネルや Ca2+ チャネル活性に負帰還を掛ける機構を有する。Ca2+ 依存性 K+ チャネルは細胞内 Ca2+ 濃度上昇により活性化され、膜電位を K+ の平衡電位（-80 mV 程度）に傾ける（過分極させる）ため、活動電位の再分極相や後過分極あるいは静止膜電位の過分極を引き起こす。過分極は Na+ チャネルや Ca2+ チャネルを抑制し、活動電位発生や定常的な Ca2+ 流入を抑制するので、結果として細胞内 Ca2+ 濃度は低下する。従って Ca2+ 活性化 K+ チャネ
ルは細胞内Ca2+過上昇の負帰還機構の好適な担い手となり得る10)。
ここではBKチャネルの機能と作用薬についてごく簡単に述べる。

2

Fig.1 Chemical structures of large conductance Ca2+ activated K+ channel
activators (BK channel openers).

イオンチャネル本体を形成する BKα サブユニットは遺伝子多型があるものの基本的に 1 種類であるが、機能調節因子である β サブユ
ニットは現在 4 種類が知られ、組織特異的に分布している。4 量体
α サブユニットのそれぞれに β サブユニットが結合し、機能的 BK
チャネルを形成すると推測されている。主に平滑筋に存在している
BKチャネルのβ1サブユニットのノックアウトマウスが作成された
ところ、BK チャネル機能の低下により血管平滑筋が収縮気味となり、高血圧を発生している事がわかった 11)。逆に BK チャネルの活性を上昇させる薬物（開口薬）は高血圧・膀胱過敏症などの平滑筋
緊張度の上昇した疾患に有用ではないかと推測され、NS-1619 のNews No.103(2002)

誘導体の開発が試みられている（Fig.1）。BMS-189265 が脳血栓による虚血部の神経保護に有効であることも報告された12)。これまで検討された合成化合物は類似した化学構造に限定され、α サブユ
ニットに作用する。しかし実際に臨床利用される BK チャネル開口薬はまだ得られていない。例えば主に脳・神経に発現する β4 サブユニット 13)をターゲットとした β4 選択的 BK チャネル開口薬などは極めて魅力的である。Estradiolなどはβサブユニットに作用してBK チャネル開口作用を示すが 14)、特定の β サブユニットだけに作用するわけではない。特異的な BK チャネル開口薬の開発には新規の化学構造を見出すことが重要と考えられるが、そのためには高効率の探索系が必須となる。
これまで BK チャネル作用薬の高効率探索には125I ラベルされた
ペプチド性特異的拮抗物質のカリブドトキシン（ChTX，サソリ毒成分）のBKチャネルへの結合阻害実験が用いられることが多かった 15)。しかし、その方法で見つけられた dihydrosoyasaponin Iや maxikdiol などの天然物は、βサブユニットに結合して作用を発揮するという特徴はあるものの BK チャネルへ細胞質側からのみ作用し、しかも細胞膜透過性が低いため、シード化合物とは成り得なかった。一方、先に示した NS-1619 などの合成化合物は 125IChTX 結合阻害実験では充分な探索ができず、非効率的な電気生理学的実験が主に用いられてきた。

Fig.2 A schematic diagram of the procedure to prepare the high throughput
screening system to survey compounds acting on large conductanceCa2+ activated K+ (BK) channel α or β subunit. To examine whether
test compounds act on voltage-dependent Ca2+ channel would not
be sequentially performed in HTS system, because the probabilityof functional expression of the channel may be lower.

4）Slow response dye による Ca2+
依存性 K+ チャネル発現細胞の膜電位測定を同時に組み込んでの発現も行われているが、ごく限られた例にとどまっている。HTS システム構築の際にアキレス腱となる場合
我々は大コンダクタンス Ca2+ 依存性 K+ チャネル（BK チャネル） が多い。
αサブユニットと平滑筋型β1 サブユニットを単独あるいは共発現
DiBAC4(3)は陰イオンであるが lipophilic であり 17)、静止電位させた HEK293 細胞(HEKBKα 及び HEKBKαβ1)において、BKにおいても細胞膜を通過して内にも取り込まれて細胞質蛋白と結チャネル開口作用を持つ化合物の作用を、DiBAC4(3)による光学合すると推定される 18)。励起光（490 nm）照射により発する蛍光
的膜電位測定とパッチ電極を用いた膜電位・電流固定法を併用し （520 nm）は蛋白との結合により寿命が著しく増大する。細胞がて評価し、 DiBAC4(3)による膜電位評価の妥当性と HTS への応
脱分極すると細胞内へDiBAC4(3)の分布が増すため蛍光が増大す
用性を検討した 16)。同時に細胞内 Ca 2+ 濃度も Fura 2 あるいはる。 100 nmol/l の DiBAC4(3)を含む外液に HEK293 細胞を 20
Fura 2-AM を用いて測定した。
分間浸して色素を取り込ませた後、色素の存在下で実験を行った。
Fig.2に示すようにラット子宮平滑筋由来BKα(U55995)および490 nm の励起光を用いて、505 nm のダイクロイックミラーとβ1サブユニット(AF020712)の遺伝子を哺乳動物細胞への発現ベフィルターで選択した 520 nm 以上の蛍光画像をイメージングシ
クターである pcDNA3.1(+)と pcDNA/Zeo(+)にそれぞれ組み込
ステム(ARGUS-HiSCA, 浜松ホトニクス)により取得した。細胞み、HEK293 細胞に導入した。G418/Zeocin 耐性細胞を選択す
内 Ca2+ 濃度測定は 10 µmol/l の Fura 2-AM を含む外液に 20 分間
ることにより定常的にこれらのサブユニットを単独あるいは共発
浸した細胞を用いて、色素非存在下で励起は 340 および 380 nm現させた HEK293 細胞(HEKBKα 及び HEKBKαβ1)を作成した。 の紫外光により行い、480 nm での蛍光画像を取得した。場合に機能発現は単一チャネル電流記録により、α サブユニットは 90%
よっては同時にホールセルパッチクランプ法による電流記録を以上、α+β1 サブユニットは 80% 以上の細胞で発現していること行った。
を確かめた。イオンチャネル作用薬の HTS において最も重要なの
電位固定下に過分極を生じさせると、電位変化に対し最も蛍光は、対象となるチャネルの定常発現効率を高く保つことである。例
強度変化の大きい電位領域（-30 mV 付近）で蛍光の減少が観察さえば探索試験に用いる全細胞のうち少なくともBKαを機能発現しれた。さらに、実験プロトコールの最後に外液 K + 濃度を 140ている細胞が 90% 以上占め、BKαβ1 発現細胞は平均 40%（残りmmol/lに上昇させ、電位固定を外すと膜電位はほぼ0 mVになる。
50% は BKα のみ）しか機能発現していない場合、Fig.2 のように
この時の蛍光強度を FK とし、各保持電位での蛍光強度 F との比(F/BKα と BKαβ1 に対する作用の差から、β1 をターゲットとする化FK)の関係を求めたところ、ボルツマン式に適合した定量的関係が合物を見出すのはかなり困難である。しかし定常発現系で 2 種類
。さらにこのキャリブレーションが妥当か（実見出された。
（Fig.3）以上の遺伝子を同時に機能発現した細胞を70%以上の確率で得る
用可能か）を検討するため、電極法を用いて実測した膜電位とそことは大量培養の場合において、一般的にそれほど容易ではない。 の時の F/FK 値の関係をプロットすると、キャリブレーションと良1 つのベクターに 2 種の遺伝子（例えば α 及び β、サブユニット） く適合し、定量的関係が見出された。HEKBKαβ1 では静止膜電位3

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が native HEK より深く、BK チャネル抑制薬の 1 mmol/l tetraethylammonium により脱分極した。 HEKBK α/ αβ 1 においてEvans blue による BK チャネル開口作用を介した過分極は、その青色に阻害されることなく測定された。

Slow response voltage-sensitive dye の欠点は、当然のことながら時定数約 30 秒という時間分解能の悪さにある。HEK293細胞にもともと存在するムスカリン受容体をアセチルコリンで刺激し、細胞内 Ca2+ 濃度を上昇させると、BK チャネルが活性化され過分極を示すが、電極を介して直接測定した速い過分極にくらべ、
DiBAC4(3)による信号は遥かに遅く、一過性の反応は捉えられない。むしろ細胞内 Ca2+ 濃度変化を反映する Fura 2 のシグナルの方が遥かに変化が速いことがわかる。

Fig.4 Effects of acetylcholine (ACh) on membrane potentials (MPs) and[Ca2+]i in native HEK and HEKBKαβ in a layer. (A) Effects of ACh on
MPs measured with microelectrodes. (B) Effects of ACh on MPs (a,b) and [Ca2+]i (c,d) were simultaneously measured with DiBAC4(3)and Fura 2, respectively. Reference 16) with the permission fromJapanese Pharmacological Society.
Fig.3 Calibration of the relative fluorescence of DiBAC4(3) against clamp
potentials. (A) Changes in relative fluorescence intensity (F/FK) were
measured in standard solution at depolarization voltage steps in therange of –80 and +10 mV under voltage-clamp (solid line) in
HEKBKαβ stained with 100 nmol/l DiBAC4(3). V.C. and C.C. indicate
voltage-clamp and current clamp, respectively. The F/FK in not
voltage-clamped cells was shown in the same time course by broken
line. Single cells were selected for the recording based on cell
capacitance (<30 pF). At the end of the procedure, FK was measured
under current-clamp mode in 140 mmol/l K+ solution as indicated byhorizontal bar. (B) Transmitted images of cells and a pipette andfluorescence images of cells, which were voltage clamped or not
clamped. The cell attached by the pipette was voltage clamped. F
intensity in the voltage-clamped cell depended on the clamp
potentials, but that in non-clamped cell did not. The relationships
between F/FK and clamp potentials and non-clamped cell are shownin “A”. (C) The relationship between F/FK and corresponding clamp
potentials. The solid line represents the theoretical fit to the data
points using the Boltzmann equation (n=5). F/F k =1.1-0.7/{1+exp[(E+31)/17.8]},where E is the membrane potential(abscissa).
Closed triangle (n=5) and closed circle (n=5) represent the resultsin 140mmol/l K+ solution and the standard solution under currentclamp mode, respectively. Reference 16) with the permission fromJapanese Pharmacological Society.

4

HEKαβ1 では青色素の Evans blue による BK チャネル開口作用を介した過分極は測定できたが、BK チャネル開口試薬として汎用される NS-1619 は開口作用と対応した速やかな蛍光減少に加えて、アーチファクトとして緩徐な減少も生じさせた。NS-1619 は細胞質蛋白とDiBAC4(3)の結合に影響を与えている可能性が高い。

5）高効率探索システムを用いた BK チャネル
開口薬シード化合物の探索
上記の HEKBKαβ1 と DiBAC4(3)を用いた探索システムを利用して、植物成分テルペノイドを中心に天然物及びその誘導体化合物数十種類の内から、BKチャネル開口作用を有する化合物を探索した 19)。それらのうちピマル酸および関連ピマラン化合物に開口作用を見出した。一方、ピマル酸と極めて効力の近いアビエチン。インサイドアウトパッ酸には作用が認められなかった（Fig.1）
チクランプ法を用いて検討したこれら化合物の BK チャネル開口作用の効力は、DiBAC4(3)を用いた結果と非常によく良く一致したので、同検索システムの有用性が裏付けられた。ピマル酸は
HEKBKαとHEKBKαβ1で同じ程度単一チャネル活性を増強した

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ので、おそらく α サブユニットに作用すると推測される。また同様に DiBAC4(3)を用いた高効率検索は、中コンダクタンス(IK)あるいは小コンダクタンス(SK)のCa依存性Kチャネルαサブユニッ
トを HEK293 細胞に発現させた系での chlorzoxazone とその関連化合物などの開口作用検出も充分可能であった。IK や SK2 を発現させた HEK293 細胞では、10 µmol/l のピマル酸はチャネル開口作用を示さなかったので、Ca2+ 依存性 K+ チャネルのうち、BK
チャネルだけに作用することが明らかとなった。
ピマル酸及び関連ピマラン系化合物のBKチャネル開口作用は、細胞外から投与しても有効であり、1 µmol/l 以上で有意な作用が見られることから注目に値する。αサブユニットに作用し、チャネ
ルコンダクタンスには影響を与えずCa2+依存性及び電位依存性を増大させることにより開口確率を高めると推測される。アビエチ
ン酸は極めて類似した化学構造を持つにもかかわらず開口作用を持たないことは、C13 の残基の立体化学的位置関係が作用発現に重要な影響を持っていることを示唆しているかもしれない。
尚、これらのテルペノイド類のなかにも本探索システムでアーチファクトを生じさせるものが数個あり、BKチャネルを発現させていない HEK293 細胞でも有意な蛍光強度変化を生じさせた。しかしその変化の程度は軽度であり、常に native HEK に対する作用も対照群として検出していればアーチファクトとして検出できる。何よりも見過ごしの過誤よりも行き過ぎの過誤の方が、効率的検索システムとしては罪が軽いので、実際の HTS でアーチファ
クトが出た場合は更に別途の方法で検討することで製薬企業は対応していると推測される。

6） 今後の展望
本稿では DiBAC4(3)や関連の slow response probe は、 BK
チャネル開口薬の高効率探索に有用であることを概説した。しかし、アーチファクトの発生を感知するためチャネルを発現してない対象群でも必ず同時に検討する必要があることも明らかとなった。本探索システムを利用して、実際に BK チャネル開口作用を持
つピマル酸が天然物テルペノイドから発見された。ピマル酸及びその誘導体が有用な BK チャネル開口薬のシード化合物となる可能性を更に検討している。
数十万検体から、目的の作用を持つシード種化合物を HTS により検索するには、精度（再現性）が高いことと共に 1 検索あたりの所要時間が短くコストが低いことが要求される。現在、国内外のいくつかの企業が独自にイオンチャネル作用薬を含む新薬開発
用 HTS システムを開発・販売している。ATP 感受性あるいは Ca
依存性 K チャネルなどのように不活性化を持たないチャネル（一部の種類は持つ）の作用薬に関しては、slow response probe を用いたこれらの HTS は極めて有効な手段と考えられ、既にかなりの製薬企業で利用されつつある。その場合の要件は、上記のようにむしろ目的とするチャネルが少なくとも70%以上の細胞で定常的に機能発現している系を確立することであろう。複数のサブユ
ニットや関連蛋白を同時に定常的に高発現させた培養細胞系の大量調整は容易ではない。例えば F i g . 2 の最下段に示すように、
BKαβ に加えて発現効率の比較的低い電位依存性 L 型 Ca2+ チャネ
ルの α1C と β2 サブユニットを共発現させ、両イオンチャネルの機能的相関を含めた探索を行う必要がある場合は、HTS システムに繰り入れることは現在のところ極めて困難と思われる。
これらのHTSシステムを利用してイオンチャネル作用薬開発を行う場合に、最も大きな障害を伴うのは、言うまでもなく速い活
性化・不活性化を持つ電位依存性イオンチャネルに対する作用薬を検索する場合であろう。様々な工夫がされているが、少なくても従来のslow response probeを用いて正確な検索が可能かどうかは、時間及び電位分解能の点から疑問が大きいように思われる。
最近 DiBAC4(3) (acceptor) 及び coumarin-labeled phosphatidylethanolamine (donor) を用いて Fluorescence resonanceenergy transfer (FRET)に基づいた巧妙な膜電位変化記録法が報告されている 20)。非常に速い電位変化が蛍光強度比変化として捉えられ、HTS にも実用化され得るので 21)、やがて一般化する方法
かも知れない。
一方、最近 slow response voltage-sensitive dye に SYTO と呼ばれる cyanine 系のカチオン色素が開発された（Table1；構造式・分子量不明；Molecular Probe 社）。カチオン系色素としては DiSC が従来から知られているが、細胞呼吸抑制作用などを有するため、oxonol 系色素ほど利用されていない。アニオン系とカチオン系色素を同時に利用すると、膜電位変化が ratiometric なシ
グナルとして捉えることができ、定量性が格段に上昇しアーチ
ファクト検出も容易になる可能性がある。実際、 SYTO62 とDiBAC4(3)を併用した例が、免疫系細胞の SK/IK チャネルをターゲットとした HTS システムを含めて報告されている 22)。このようなFRETの応用や新規電位感受性色素の開発を含めた新たなHTS
系の確立は、新規イオンチャネル作用薬開発の可能性を飛躍的に高めるものと期待される。

参考文献
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関連商品
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著者紹介
氏
名：今泉祐治 (Yuji Imaizumi)
所
属：名古屋市立大学大学院 薬学研究科
細胞分子薬効解析学分野 教授
出身大学：東京大学薬学部・大学院修士
学
位：薬学博士専
門：イオンチャネルの分子薬理・電気生理学
連 絡 先：〒 467-8603 名古屋市瑞穂区田辺通り 3-1

TEL & FAX: 052-836-3431
E-mail: yimaizum@phar.nagoya-cu.ac.jp< 特長 >• Ar レーザー(488 nm)を励起光源として利用可能である。
• 膜電位変化に対し、高感度な蛍光変化を示す。
• 蛍光特性(メタノール中) λex = 493 nm, λem ＝ 516 nm
DiBAC4(3)は、Bis-oxonol 型のアニオン性膜電位感受性色素です。細胞外液に添加してインキュベートすると、膜電位に応じた
細胞内外の分布を示します。刺激によって細胞膜が脱分極すると、その電位変化を受け、細胞中の存在率が高くなります。細胞質中では、細胞内タンパク質や細胞内膜に結合し、その蛍光が増強します 1)。このような機構により、蛍光強度変化から、膜電位の変化を検出することができます。
DiBAC 4(3) は、 DiBAC 4 (5) や DiSBAC 2 (3) などの他の Biso x o n o l 型や、スチリル系の d i - 4 - A N N E P S 、シアニン系のDiOC6(3)などの膜電位感受性色素に比べ、高い電位応答性を持っています 2)。Bräuner らは、BICR/M1R-k 細胞（ラット乳癌細胞）において、-25 〜 -90 mV の膜電位範囲で約 1%/mV の蛍光強度変化が得られることを報告しています 2)。電位変化に伴う応答は 1 次の速度式に従い、その速度定数は 0.1 〜 0.8 /min と報告されています 2)。カルシウムイオン濃度と膜電位の相関解析 3)、抗生物質に対する細胞の生存率の分析 4)、ATP 感受性カリウムイオンチャネ
ルの活性評価 5)などの研究に応用されています。
Ar レーザー(488 nm)で励起可能なことから、フローサイトメ
トリー 4)、共焦点レーザー顕微鏡観察 6)などで利用可能です。最近
では、High-Throughput Screening(HTS)での細胞応答検出に最も頻繁に使用されている膜電位感受性色素です 7)。

参考文献
1) D. E. Epps, M. L. Wolfe, V. Groppi, Chem. Phys. Lipids, 69, 137 (1994).
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7) K. S. Schroeder, B. D. Neagle, J. Biomol. Screening, 1, 75 (1996).

6

品名

容量

価格（￥）

メーカーコード

DiBAC4(3)25mg

27,000

D545

News No.103(2002)

Topics on Chemistry
低分子リフォールディング剤（株）同仁化学研究所

ポストゲノム時代を迎え、組み換え蛋白質の受託生産ビジネスが盛んである。遺伝情報から読みとれるのは蛋白質の配列であり、形、すなわち生物学的な活性については、どのような発現系を用
いるかによって全く異なる。最も汎用される大腸菌の場合、多くの外来蛋白質は封入体とよばれる凝集体を形成し、これが組み換
え蛋白質合成における最も大きな障害になっている。封入体が生成した場合、変性剤や界面活性剤を用いて可溶化する。この活性を失った状態から正しい構造に蛋白質を巻き戻せるかどうかが、最もクリティカルな部分である。このリフォールディングには一
般的な効果的手法は存在せず、蛋白質によって試行錯誤が避けられない 1)。

佐々本

一美

これに対して、生体内でリフォールディングを司っている酵素

protein disulfide isomerase（PDI）は、-Cys-Gly-His-Cys- という配列の活性部位が 2 箇所あり、片方のシステイン残基の pKa
値は 6.7 と非常に低くなっている。遊離のシステインと比べて100 倍も酸性が高くなっているのは、空間的に近傍に位置する他の残基の影響だが、低分子でも低い pKa 値を持ったものであれば同様の効果が期待できる（以前この稿でも紹介した BMC は、比較的に低い値をもっている（8.3, 9.9）2)。 しかしこれまで用いられてきたのは、BMC も含め全て脂肪族チオール化合物であり、低い pKa 値を達成するのは無理である。かといって、PDI のような酵素を使用するのは、コストが高く、かつ精製操作が複雑になるといった問題を抱えている。

ジスルフィド（-S-S-）結合をもつ蛋白質の場合、正しく S-S 結
合を架けるには、チオール化合物（RSH）からなるレドックス・
バッファーに希釈して変性剤を除き、S-S 結合をゆっくり架け直せばよい。チオレートアニオン（RS-）が蛋白質内の S-S 結合を求核的に攻撃し、部分的に S-S 結合が切れることでコンフォメー
ションの自由度が増し、よりエネルギー的に安定なコンフォメー
ションをとり易くなる。さらに、その状態で新たな分子内 S − S結合が形成される。このように、基本的にチオール求核反応の連鎖であるリフォールディングを支配しているのは、RS- と S − S
結合との反応の速度論的要因、および、蛋白質側の熱力学的要因であると考えられる。

Fig.2 化合物 1 の構造

Lees らが報告している芳香族チオール（化合物 1）3)は pKa 値
が 6.6 と、PDI とほぼ同等の値をもっている（水溶性を付与する意味で、他端にカルボキシル基がついているが、SH 基の求核性に影響しないように共役しない位置にある）。論文では蛋白質として、リフォールディングの研究で汎用される RNase A（4 個の SS 結合をもっている）を用い、ランダムに S-S 結合が形成された状態（scrambled）および完全に還元された状態からの巻き戻し反応において GSH と性能を比較している。それによると、このin vitro リフォールディングの系において、化合物 1 は GSH の5 − 6 倍の反応速度を示し、レドックス・バッファーとして有用であると思われる。

Fig.1 リフォールディング反応

チオール化合物としては、グルタチオン（GSH）やシステイン、
DTT などがレドックス・バッファーとして用いられるが、RS- の生成比、すなわちチオールの pKa 値が反応速度に大きな影響を与えることは、上記の議論からも理解できる。 pKa 値はそれぞれ、GSH やシステインが 8.7、DTT は 9.2 および 10.1 である。
したがって中性 pH では殆どが非解離型（RSH）となっている。

蛋白質の機能はいうまでもなく、その形（フォールド）にあり、その意味で正しい形を作りあげるリフォールディングをコントロールすることは、極めて重要な技術といえる。無論、求核性だ
けではなく様々な要因がリフォールディングを支配しているが、何ら認識能を持たない低分子でもシャペロンとしての可能性を秘めていることが分かる。培養系へ添加するだけでいい真の低分子シャペロンが開発される日もそう遠くではないかも知れない。

参考文献
1) 津本 浩平、三沢 悟、熊谷 泉、蛋白質・核酸・酵素、2001, 46, 1238.
2) K. J. Woycechowsky, K. D. Wittrup and R. T. Raines, Chem. Biol.,
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3) J. D. Gough, R. H. Williams, Jr., A. E. Donofrio and W. J. Lees,

J. Am. Chem,. Soc., 2002, 124, 3885.

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News No.103(2002)

2．アレル特異的なプローブを用いる
ハイブリダイゼーション

ケミストからみた
ポストゲノム3〜 SNP タイピング その 2（マススペクトルによる検出）〜
九州大学工学研究院応用化学部門

片

山

佳

樹

1．はじめに
前回、ゲノム上の特定の 1 塩基多型（SNP）のタイピング法として蛍光検出を用いる手法をご紹介した。今回は、検出法としてマススペクトルを用いる SNP タイピング法についてまとめてみた。マススペクトルは、ご承知の通り測定対象分子の質量を計測するものである。したがって、蛍光検出に比べ測定結果が明確で擬陽性や擬陰性が出にくいという利点がある。また、蛍光基やハプテンなどの標識を必要とせず、計測時間も短い（数秒から数分）
ことも大きな利点である。特に、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization(MALDI)法は、試料と混合して結晶化させたマトリックスにレーザー光を照射して、マトリックスが光のエネル
ギーを吸収することに基づき試料をイオン化する手法であり、飛行時間型（TOF）質量計測計と組み合わせた MALDI-TOFMS の実用化により、巨大生体分子への適用が可能となり、生化学分野への応用が飛躍的に発展した。DNA などの核酸の場合、イオン化に伴う断片化が顕著で、マススペクトルの利用には問題があったが、マトリックスとして3-ヒドロキシピコリン酸などが開発され、低エネルギーでのイオン化も可能となったことから断片化の抑制が可能となり、近年、マススペクトル分析の核酸への応用が急速に広がっている 1）。一方で、質量分析では計測対象の精製が必要な場合が多く、塩の影響などが計測を困難にする場合がある。
マススペクトルを用いる SNP の検出法は、大きく分けて次の 4
つのタイプに分けられる。このうち、最も活発に実用化が検討されているのはプライマ−伸長法である。
1) アレル特異的なプローブを用いるハイブリダイゼーション
2) プライマー伸長法：SNP 部位、あるいはそれより 1 塩基上流までのプライマーを結合させておいて、SNP特異的におこる伸長反応の生成物から判断。
3) PCR が不要な手法（Invader 法）
4) その他の方法

8

前回述べたように、SNP 部分を含む領域を PCR 増幅し、アレル特異的なプローブをハイブリダイズさせると、標的配列に対しフ
ルマッチの配列を有するプローブが安定な 2 本鎖を形成する。このプローブを何らかの方法で精製して質量分析するとSNPタイピン
グが可能である。精製には、プローブを含む 2 本鎖を基板やビーズなどの担体に何らかの方法で固定し洗浄するのが便利である。実際、DNA アレイを利用してこの種の方法が検討されている 2）。しかし、蛍光検出と同じくこの戦略では、多くの SNP を同時に計測できる利点があるものの、プローブの設計や計測条件の設定が極めて困難である。近年、DNA プローブのかわりに PNA を用いる手法が提案されている。PNAでは断片化が起こらないため、マトリックスとして 2,5-DHB などのより使いやすいものが利用でき、低塩濃度でもハイブリダイゼーションの選択性、安定性が優れ、塩の影響もないため、DNA プローブを用いるよりも優れている。一般的な手法としては、ビオチン付加型プライマーを用いて PCR 増幅
し、ストレプトアビジン修飾磁性ビーズに結合後、1 本鎖とし、プローブを反応して未反応プローブを洗浄除去、その後、ビーズに 2
本鎖として結合していたプローブを質量分析する(Fig.1a)3）。この手の精製法は、VNTR や STR などの特定塩基配列が繰り返すタン
デムリピート型の多型分析でも用いられている 4,5）。さらに、多くの SNP の同時計測を可能にするため、プローブに 8- アミノ -3,6ジオキサオクタン酸を 1 個から複数個 PNA プローブ合成時に付加しておき、プローブ間の質量差を増幅する手法も報告されている(Fig.1b)6）。しかしながら、プローブ間のハイブリダイゼーション
能力に大きな差がないため、上記の手法でも一方のアレルの計測でも別アレルの生成物のシグナルも検出され、ASO 法自体の欠点は以然として存在し、擬陽性を出さないという質量分析の長所を活かしきれていない。

3．プライマー伸長法と質量分析を利用する SNP タイピング
プライマー伸長法は、ポリメラーゼなどの配列特異性の高い酵
素反応を用いるため、ASO を利用する手法に比べ識別能が高く、
近年 , マススペクトルとの併用で多くの報告例がある。
いずれも、対象とする SNP 部位の 1 塩基上流までの配列に相補的なプローブをハイブリダイズさせ、その後、DNA ポリメラ−ゼで鎖を伸長させ、アレル間での伸長生成物の質量差を計測する。ポイントは如何に質量差を拡大できるかと、計測対象伸長生成物の長さ（質量）を如何に小さくできるか（質量分析時の断片化を抑え、かつ質量差を相対的に拡大する）である。

3-1：PINPOINT assay
PINPOINT assay は、プライマー伸長反応時に 4 種類の塩基に対応するジデオキシヌクレオチド 3 リン酸(ddNTP)を添加する方法である 7,8）。この場合、伸長反応はいずれの塩基の場合でも 1 塩基で停止する(Fig.2a)。従って、プライマーに 1 塩基が付加した

News No.103(2002)

Fig.1 SNP typing using allele-specific PNA probe hybridizationa) Schematic outline of PNA hybridization MALDI-TOF MS experimentb) Mass tag for the PNA probe for improving multiplexity

Fig.2 Schematic outlines of primer extension strategies using Mass spectrometrya) PINPOINT assay, b) PROBE assay, c) VSET assay

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News No.103(2002)

生成物間の質量差を計測することになる。この手法は、プライマー
伸長法の質量分析への適用法として最初の実用的手法であり、蛍光や放射性同位体などの高価な標識を必要とせず、質量分析の利点を利用できる。しかし、1 塩基間の質量差はそれほど大きくな
く、例えば頻度の多い A/T 多型では、アデニンとチミンの間の分子量の差は 9 しかなく、ヘテロ対合などの場合、検出できないことも多い 9）。ナトリウム塩やカリウム塩が混在すると、これらのカチオンとの付加物が生じ、計測をより困難なものにする。この様な欠点を補うため、できるだけ計測対象の分子量を小さくする工夫としてプライマーに切断サイトを導入しておき、伸長反応後に切断して計測対象をできるだけ小さくする手法 10） や、1 塩基間の質量差を拡大するため、例えば DNA 配列分析でダイターミネ−
ターとして用いられるフルオレセインや Cy5 などが標識された
ddNTP を利用して伸長反応を行う手法などが報告されている 9）。
たとえば、A/G アレルを判定する場合、ddGTP とフルオレセイ
ン‐12‐ddATP を用いた場合、両アレルでの生成物の分子量差は508Da と大きくなる。PINPOINT assay は、生成物の分子量が小さいため、複数の SNP を一度に計測する場合、分子量の重なりを避けやすいため、多くの SNP を一度に検定する性能に優れている。現在のところ、12 種類の SNP をジェノタイピングした例がある 8）。

3-2：PROBE 法（Primer Oligobase Extention）
PINPOINT assay の改良のため、マスタグを ddNTP に標識したり、プライマー切断反応を利用するのは手間とコストを要する。
これに対し、伸長反応時に一種類の ddNTP と残り 3 種類の dNTPを用いるのが PROBE 法である 11）。この場合では、SNP 部位に
ddNTPと相補的な塩基がある場合は1塩基で伸長反応が停止する
が、異なる塩基の場合は、次に鋳型鎖に ddNTP と相補的な塩基が現れるまで伸長反応が継続する(Fig.2b)。そのため、アレル間で伸長生成物の分子量鎖は 1 〜 10 塩基分程度にもなるので、質量差が大きくなり、判定が容易になる。最近、PROBE 法をチップ上で行い、実用性を向上させた手法も報告されている 12）。この場合、2 cm 角のシリコンチップ上に各々 2.5 mm 角の 6 × 6 のアレイ
状に 1 µl(1.56 pmol)の DNA を固定化している。固定化法は、3アミノプロピルトリエトキシシランでシリコン表面を修飾してアN-Succinimidyl(4-Iodoacetyl)aminobenzoate
ミノ基を導入し、(SIAB) で処理してチオール反応性基を導入し、5’‐チオール化プライマーで増幅した SNP 部位を含む領域を結合する(Fig.3)。本
手法は、伸長生成物の精製が容易で、実用性の高い手法として興味深い。

3-3：VSET 法（Very Short Extention）
PROBE 法は、伸長生成物間の分子量差を拡大するよい手法であるが、一方のアレルでは複数塩基伸長が起こるので、多くの
SNP の一斉計測では別の SNP サイトの生成物との分子量が接近する恐れがある。また、長い生成物の場合、検出されない恐れも出てくる。例えば、19 mer のプライマーを用いた場合、10 塩基伸長した生成物のマスシグナル強度は、1 塩基伸長生成物に比べ 1／ 7 になってしまう。これを改善した手法が VSET 法である 13）。
この場合は、伸長反応に 1 種類の dNTP と残り 3 種類の ddNTPを用いる。VSET 法では、一方のアレル（SNP サイトが ddNTPのどれかと相補的）では 1 塩基の伸長が起き、dNTP と相補的なサイトでは、その次まで（2 塩基）伸長が起こる(Fig.2c)。従って、
PINPOINT 法に比べ検出感度は格段によいため、シビアな脱塩などが必要なくなる一方で、PROBE 法の欠点も克服できることになる。

3-4：Survivor assay
プライマー伸長法では、伸長生成物の方を検出するのが普通であるが、Survivor assay では、系中に加えた 4 種類の ddNTP の残量を計測する ( F i g . 4 ) 1 4 ）。計測には E S I - M S を用いる。
ESI(electrosplay ionization)は、小分子の定量的測定が高感度で行える利点がある。サーマルサイクラーでの反応（20 〜 30 サイ
クル必要）において、伸長したプライマーが未伸長プライマーと競争しないようにプライマーは大過剰用いる必要があり、加える
ddNTPの量の最適化が重要な因子となる。コントロールとテスト
サンプル間でのマスシグナルのピーク面積比が40％以上であると
き優位な差があるといえる。この手法は、同じ 4 種類の化合物(ddNTP)を測定するだけで、どんな SNP も計測でき、プログラ
ムやデータ処理が容易かつ迅速である利点があるが、一方で、複数の SNP を同時に計測するのは不可能である。

3-5：GOOD assay
GOOD assay は、プライマー伸長反応後、生成物を小さな分子

Fig.3 Schematic outline of the DNA-immobilization onto the silicon chip10

News No.103(2002)

Fig.4 Schematic outline of Survivor assay
The figure shows the case of heteroxygote.
Fig.5 Schematic outline of GOOD assaya) positive mode,b) negative mode

量の部分まで消化することと、生成物の荷電を＋ 1 あるいは− 1 にすることの双方により、検出感度と判定精度を向上することを特徴とする手法である(Fig.5)15）。DNA の MALDI-TOF MS 分析では、DNA を総荷電＋ 1 あるいは− 1 にすると検出感度が 100 倍向上するため、単一チューブ内で反応するだけで生成物を精製す
ることなく計測できる。計測手法としては、ポジティブモードとネガティブモードがある。ポジティブモードでは、プライマーの3’末端にホスホロチオエート結合を介した塩基を 3 つ導入し、その中間の塩基にはトリメチルアンモニウムヘキシル基を導入しておく 16）。このプライマーを用いて伸長反応を行うが、液中には αS-dNTP と α-S-ddNTP を加えておく。したがって、伸長生成物
では、プライマーの 3’- 末端側はすべてホスホロチオエート結合となる。その後、ヨウ化メチルで処理すると、ホスホロチオエート
部分はメチル化されアニオン荷電が消失する。これを 5’- ホスホジ
エステラーゼ処理すると、通常のリン酸エステル結合を有する塩
基部分は消化され、メチル化されて中性となったホスホロチオ
エート部分のみが残ることになる。これを質量分析することで、高感度に SNP が判定できる。ネガティブモードでは、プライマーの3 末端にホスホロチオエート結合を介した塩基を 1 つ導入し、さらにその先に通常のリン酸エステル結合で塩基を 1 つ導入する。
これを用いてポジティブモードと同様の条件で伸長反応、メチル化処理、ホスホジエステラーゼ処理を行うと、メチル化したホス
ホロチオエート結合の中に 1 つだけリン酸エステル結合（− 1 価アニオン）が残った生成物が得られるのでこれを計測する。
本手法は、通常の DNA を分析するものではないので、断片化が抑制されるため、マトリックスも自由に効果的なものを選択できる。精製が必要ない点、感度がよい点など魅力的な手法であるが、修飾 α-S-dNTP が必要な点、伸長反応後のステップが長い点が欠点である。

4．Invader assay の利用
これまでの手法はいずれも、SNP を含む領域を PCR 反応により増幅する必要があった。PCR は、ハイスループット化の大きな障害となるため、これを必要としない手法があれば魅力的である。
前回ご紹介したように Invader assay は、レポータープローブとInvasive プローブを用いる PCR が不要の手法である。すなわち、フラップエンドヌクレアーゼを用いてレポータ−プローブの一部を切断し、これを FRET プローブに挿入して再度切断反応を行う
ことで FRET を解除し、蛍光変化から SNP を判定する手法である。ここで、もし FRET プローブの切断される部分がマススペク
トル分析で検出可能であれば、本手法を質量分析に応用できる。具体的には、レポータープローブのフラップ部分（酵素で切断される部分）をアレルの違いにより、一方のプローブでは 3’末端にチミンが 2 つ、もう一方のアレルでは 3 つ存在させ、これが第 2 の11News No.103(2002)

Fig.6 SNP genotyping by the Invader assay and MALDI-TOF MS

プローブにハイブリダイズすると、前者では 3’−ビオチン化 T T
T が、後者では 3’−ビオチン化 T T T T が切断されるように設計されている(Fig.6)17）。これをストレプトアビジン修飾磁性ビーズで捕集し質量分析に供する。オリゴチミジンは、DNA 配列としては質量分析時における断片化が最も起こりにくく、検出感度もよい。マトリックスとしても α-CHCA など、通常の DNA 分析では使えないものも使用可能である。この手法を用いると、第 1、第 2ステップの反応それぞれ 2 時間を費やして 1 µg （0.5 amol）のDNA から 720 fmol のシグナル分子が得られ、質量分析で計測可能である。現在のところ、12 種類の SNP を同時計測可能である
ことが示されている。この手法では、切断されなかった過剰のビ
オチン化プローブも捕集されてしまうはずであるが、この様な長いプローブは検出条件では気化されず妨害とはならないという。

5．その他の手法
このほかには、多型部分を含む PCR 産物を利用する手法としプて、これをペプチド産物に変換して質量分析する手法がある18）。
ライマーとしてポリメラ−ゼ結合サイトと翻訳開始サイトを組み12込んだものを用い、増幅産物を in vitro 翻訳して得られるペプチドを質量分析で判定する。DNA 配列のままでは PCR 産物のアレル間の質量差は極めて小さく検出不可能であるが、ペプチドにすれば質量分析自体の感度も上がると同時に全体の長さも短く（質量が小さく）なり、しかもアミノ酸の変化に変換されるためアレル間の質量差も拡大する。SNP ではないが 1 塩基挿入変異などの検出に用いられた例がある。また、安定同位体標識 dNTP を用いた配列分析を利用する手法もあるが 19）、これらの手法はむしろ SNP
マッピングに向いているといえる。

6．おわりに以上、質量分析を用いる SNP 判定法について最近の動向をまとめてみた。マススペクトルを用いる手法は、検出結果が明確で蛍光検出のようなあいまいさが避けられる。また、検出速度にも優れ、自動化が容易という利点がある。反面、生成物の精製が重要になること、複数の SNP の同時計測能力がそれほど高くないことなどの欠点もある。しかしながらプライマー伸長法との組み合わせは今後有効な手法であることは間違いないであろう。

News No.103(2002)

SNP タイピングは、今後ゲノムワイドで行うとすると、実用性を考えた場合、スループットで現状の手法の 1~2 桁、コストで少なくとも 10 分の 1 になる必要がある 20）。当初活躍した ASO を用いるハイブリダイゼーション法は、多くの SNP を同時に測定する
タイピングでは、条件設定が難しい。現在ではプライマー伸長法
やライゲ−ション法など酵素反応を組み合わせたものが主流になりつつある。今後、真に実用的な手法もこのあたりから生まれる
かもしれないが、現状を考えるとまったく異なる考え方も必要かもしれない。また、WAVE system21）の様な HPLC 法なども、現在のナノ HPLC や 2 次元 HPLC などの開発を考えると新手法を考える上でのヒントとなるかもしれない。次回からは、DNA をひと
まず離れ、プロテオームなど、タンパク分析の新手法について考
えてみることにする。

参考文献

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掲載商品
・PRTR 法に該当する品目
検索可能項目・弊社カタログ品コード
・ CAS No.
・一般的な品名（和文、英文）
検索不可項目・弊社独自の製品名

1) K.J. Wu, A. Steding, C.H. Baker, Rapid Commun. Mass Spectrom.,4, 99 (1993).
2) R. Mei, P.C. Galipeau, C. Prass, A. Berno, G. Ghandour, N. Patil,
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3) P.L. Ross, K. Lee, P. Belgrader, Anal. Chem., 69, 4197(1997).
4) P.L. Ross, P. Belgrader, Anal. Chem., 69, 3966(1997).
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21) A. Kuklin, K. Munson, D. Gjerde, R. Haefele, P. Taylor, Genet. Test,98, 201(1997).

販売中止予定のご案内

2002 年 12 月 20 日をもちまして、下記商品の販売を勝手ながら中止させていただきます。
このたび本製品に原料として用いております非イオン性界面活性剤が、環境ホルモン物質に指定されました。それに伴い、購入メーカーより販売中止の連絡を受けたのが販売中止の理由です。
ご不明な点、詳細につきましては小社マーケティング部まで
お問い合わせください。
品名
容量
和光コード
メーカーコード
Scintisol 500
Scintisol EX-H

500 ml
3.8 L

344-03915
348-04013

SC08
SC09

13

News No.103(2002)

新製品
Calcium Screening Kit
Calcium Screening Kit は、細胞内 Ca2+ 測定試薬である Fura
2-AM あるいは Fluo 3-AM と、その測定に必要な Buffer 等を全て組み込んだキットです。近年、 High Throughput Screening（HTS）に使用されている FDSS （浜松ホトニクス株式会社）での測定に、最適な構成としています。
操作は Fura 2-AM DMSO 溶液あるいは Fluo 3-AM DMSO 溶
液を Assay Buffer に溶かして、細胞を培養したマイクロプレートに添加するだけと簡便となっております。Assay Buffer はシグナ
ルが高感度でより安定に得られるよう工夫されており、 HanksHEPES Buffer をベースに Probenecid や Pluronic F-127 を組み込んだ構成となっております。また、従来必要とされていた細胞の洗浄をせずに測定できることから、短時間で多くのサンプルを処理することが可能となりました。
trial version には Assay Buffer A と B があり、各々の Assay
Buffer でアッセイを行ない、2 種類のうちから、より最適な結果が得られる Assay Buffer をお選び頂けます。 trial version は各
Assay Buffer 1 本で 100 assays (96 穴プレート 1 枚分) が可能です。最適な Assay Buffer が決まりましたら、同一の Assay
Buffer を含む 2,000 assays キットをご使用ください。
〈キット内容〉

Calcium Screening Kit (Fura 2, type A)・Fura 2-AM
・DMSO
・Assay Buffer A(5X)

1 mg × 1 本
1 ml × 1 本
40 ml × 1 本＊ Fluo 3 タイプのキットには、Fura 2-AM の代わりに Fluo 3-AM 1mg × 1 本が含まれます。
＊ type B のキットには、 Assay Buffer A の代わりに Assay Buffer B が含まれます。

〈使用法〉（マイクロプレート 20 枚を処理する場合）
1．マイクロプレート中で細胞を培養する（培地 100 µl/well）。
2．Fluo 3-AM または Fura 2-AM 1 mg を添付の DMSO 1 ml で溶解する。
3．Assay Buffer(5X) 40 ml を別容器に移し、純水 160 ml を加えて、 1X のAssay Buffer を調整する。そこへ、Fluo 3-AM または Fura 2-AM の DMSO
溶液 1 ml を添加し Loading Buffer を作成する。
4．培地に 100 µl/well の Loading Buffer を添加し、37℃で 1 時間インキュベー
トする。

5．そのまま薬剤添加による蛍光強度変化を FDSS にて測定する。

本 Calcium Screening Kit を用いた場合と通常の方法（normal
assay, 洗浄操作あり）で測定した場合との比較を行いました。
normal assayと同等のシグナルが得キットを用いた測定の場合、られることを確認しています。系によってはシグナルの強度や応答反応に若干の差異があったり、シグナル自体が得られない場合(serotonin receptor を発現させた CHO 細胞を serotonin 刺激した場合など)がありますので御注意下さい。（以降のデータは浜松
ホトニクス株式会社のご協力を得て作成しました。）〈装置〉
FDSS-6000（浜松ホトニクス）【使用プレート】
オプティカルボトムプレート（NUNC） 黒 96 穴プレート

14〈使用 Buffer〉
・ normal assay では Hanks-HEPES Buffer に 0.08% Pluronic
F127 と 2.5 mmol/l Probenecid を添加したもの（pH7.4）を使用。
・ Calcium Screening Kit を使用した測定では添付の Assay
Buffer A もしくは B を使用。
〈カルシウムプローブ濃度〉
・ Fluo 3-AM（終濃度 2.2 µmol/l）・ Fura 2-AM（終濃度 2.5 µmol/l）※ normal assay の場合、Calcium Screening Kit の試薬濃度と等濃度に設定した。
〈使用細胞と添加薬剤〉
系 1 ) メラニン凝集ホルモン(MCH) 受容体を発現させたCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞 , 15,000 cells/well)を 10 nmol/l MCH で刺激した。同様に orexin B、serotonin などの受容体を発現させた CHO 細胞(15,000 cells/well)を使用し対応するリガンドで刺激した。
系 2) Angiotensin II Type-1 receptorを発現させた HEK293細胞(15,000 cells/well)を使用し 0.1µmol/l Angiotensin IIで刺激した。
系 3) SH-SY5Y 細胞(ヒト神経芽腫細胞 15,000 cells/well) を0.1µmol/l ionomycin で刺激した。
〈測定方法〉
1) 各種細胞を 15,000 cells / well でまき一晩培養した。
2) カルシウムプローブを含んだ Loading buffer を添加した。
3) 37℃で 1 時間インキュベートした。
4) normal assay の場合は、細胞を洗浄した。
5) 薬剤添加による蛍光強度変化を FDSS で測定した。
〈結果〉(1) Fluo 3 type の場合
下図 a)〜 d)に Normal assay と Kit 使用時におけるシグナルの比較を示す。初期蛍光強度を 1 とし、薬剤添加の影響を相対蛍光強度変化として表した。横軸は経過時間(秒)を示し、薬剤の添加時を▲で表した。

a) 系 1 (orexin )News No.103(2002)b) 系 1 (MCH)

系 1 (MCH)c) 系 2 (Angiotensin II)

系 2 (Angiotensin II)d) 系 3 (ionomycin)

系 3 (ionomycin)

15

News No.103(2002)

Calcium Screening Kit(2) Fura 2 type の場合e)〜 g)に normal assay と Kit 使用時におけるシグナルの比較を示す。340 nm と 380 nm で励起した場合の蛍光強度の比として表した。横軸は経過時間(秒)を示し、薬剤の添加時を▲で表した。
e) 系 1 (MCH)

品名

関連商品
品
名

f) 系 1 (orexin)g) 系 3 (ionomycin)

16

容量

価格（￥）

メーカーコード

Calcium Screening Kit (Fluo 3, trial version)
1set
販売中止
Calcium Screening Kit (Fluo 3, typeA)
2,000 assays
販売中止
Calcium Screening Kit (Fluo 3, typeB)
2,000 assays
販売中止
Calcium Screening Kit (Fura 2, trial version)
1set
販売中止
Calcium Screening Kit (Fura 2, typeA)
2,000 assays
販売中止
Calcium Screening Kit (Fura 2, typeB)
2,000 assays
販売中止

容量

Fura 2
1 mg
Fura 2-AM
1 mg
Fura 2-AM special packaging
50 µg × 8
Fura 2-AM special packaging
50 µg × 40
Fura 2-AM solution
1 ml
Fluo 3
1 mg
Fluo 3-AM
1 mg
Fluo 3-AM
10 mg
Fluo 3-AM special packaging
50 µg × 8
Fluo 3-AM special packaging
50 µg × 40
Rhod 2
1 mg
Rhod 2-AM
1 mg
Rhod 2-AM
10 mg
Coelenterazine-WS
1 mg
Coelenterazine-WS 10 mg
MQAE
50 mg
BCECF
5 mg
BCECF-AM
10 mg
BCECF-AM solution
1 ml
D-Luciferin K salt
25 mg
D-Luciferin K salt
100 mg
25 mg
DiBAC4(3)Cell Counting Kit-8
500 回用Cell Counting Kit-8
2500 回用
Cell Counting Kit-8
10000 回用
Cell Counting Kit-WR(for HTS)
10000 tests
Cell Counting Kit-HS(for HTS)
10000 tests
MTT
1g
MTT
5g
Calcein-AM
1mg

価格（￥）

コード

CS05
CS06
CS07
CS02
CS03
CS04

メーカーコード

23,60028,000347-05421 F014
F015

17,600348-05831 F025

Request38,00024,70033,000
RequestF025
343-05401 F016
345-05721 F019
F023
F023

23,200349-06961 F026

Request26,50043,500
Request
9,900
72,60013,0009,400
Request23,80019,00069,00027,000F026
344-05811 R001
341-05821 R002
R002
C397
C397
348-06051 M024
345-05184 B031
B262
344-05431 B034
L226
L226
D545

11,000347-07621 CK04

32,000343-07623 CK04

99,000CK04

46,000CK07

46,00013,10046,20010,500CK08
341-01823 M009
349-01824 M009
349-07201 C326

News No.103(2002)

商品名および仕様変更のお知らせ

HPLC による高感度アルミニウム測定試薬におきまして、上記の通りキットの商品名と仕様（内容、各試薬の品名、一部試薬の容量と容器）、および別売り分の移動相の商品名を変更いたしました
ので、お知らせいたします。
なお、キットおよび移動相ともに価格の変更はございません。また、1 キットでの測定回数は従来通り（50 回）ですが、HPLC 用
溶離液は別売りのみとなりましたので、ご注文の際はご注意ください。
＜アルミニウム分析専用カラムお取扱い中止のご案内＞
また、測定カラム（商品名：アルミニウム分析専用カラム）のお取扱いを中止させていただきます。
株式会社資生堂及び野村化学株式会社より発売される予定です。
詳細は以下の連絡先にお問い合わせ下さいますよう、あわせてご案内申し上げます。
【お問合せ先】 株式会社シノテスト 相模原事業所〒 229-0011 神奈川県相模原市大野台 2-29-14
TEL：042-753-1593 FAX：042-753-1892

品名
容量
価格（￥）
クロマトレーサー AI ラベル化試薬キット
1Kit（50 回用）
Request
クロマトレーサー AI HPLC 溶離液（R-3）

1000 ml

Request

メーカーコード

AL10
AL11

お知らせ

第 13 回フォーラム・イン・ドージン開催のご案内以下の要項で開催を予定しております。
詳細は次号にてご案内いたします。

テーマ：「生命機能と病の中の蛋白質フォールディング」
オーガナイザー：山本 哲郎（熊本大学大学院分子病理学 教授）
演者：
星野大（大阪大学蛋白質研究所 溶液学研究部門 助手）
永田 和宏（京都大学再生医学研究所 細胞機能調節分野 教授）
森正敬（熊本大学医学部 分子遺伝学教室 教授）
小椋光（熊本大学発生医学研究センター 細胞複製分野 教授）
田中 啓二（東京都臨床医学総合研究所 分子腫瘍学研究部門 部長）
西道 隆臣（理化学研究所脳科学総合研究センター神経蛋白制御研究チームリーダー）
安東由喜雄（熊本大学医学部附属病院 臨床検査医学講座 講師）
吉田 賢右（東京工業大学資源化学研究所 生物資源部門 教授）
堂浦 克美（九州大学医学系研究科脳神経研究施設 病理部門 講師）（敬称略）
日 時：平成 14 年 11 月 29 日(金) 10:15 〜 18:20
開 場：10:00
開演：10:15
会 場：鶴屋ホール（テトリア熊本 7 階）熊本市手取本町 6-1
参加費：無料
お問い合わせ・お申し込み先：フォーラム・イン・ドージン事務局 （担当：蒲野 、堀口）TEL：0120-489548 FAX：0120-021557
e-mail：komine@dojindo.co.jp または d-hori@dojindo.co.jp

17News No.103(2002)

試作品
アミロイド染色試薬

BSB〈特長〉• アミロイドβペプチド(Aβ)に対して高い親和性(Ki=0.4 µmol/l)1)をもつ。
• 従来の色素に比べ検出感度が高い蛍光色素である。
• 脂溶性物質で、脳−血液関門(blood -brain barier, BBB)を透過する。
アミロイドーシスはアミロイドが臓器や組織細胞の外に沈着してこ
れらの臓器や組織の働きを阻害する病気です。アミロイドーシスには、全身の様々な部分にアミロイド沈着が起こる「全身性アミロイ
ドーシス」と一部の臓器のみに沈着が起こる「限局性アミロイドーシス」があります。全身性アミロイドーシスには熊本地方で患者の多い
家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)と呼ばれる遺伝性のものがあり、肝臓でアミロイドを作り出し、それが全身の臓器などに沈着して障害を起こします。発症後 10 年で死に至る難病ですが、現在は肝移植などの治療により命を落とす危険性はなくなっています 2)。
他にも高齢で非遺伝的に発症する老人性アミロイドーシスや、透析患者の治療で使用する透析膜では除けないタンパク質が変化したアミロ
イドが引き起こす透析アミロイドーシス、リウマチで発現するタンパ
ク質が切れて出来るアミロイドによる二次性アミロイドーシスなどがあります。限局性アミロイドーシスには、アミロイドが脳に蓄積する老人斑(SP)があり、アルツハイマー病の特徴の 1 つです 3)。また、現在問題となっている狂牛病 ( 牛海綿状脳症 , BSE) や新型クロイツ
フェルト・ヤコブ病(νCJD)も限局性アミロイドーシスの一種です。
B S B は、アルツハイマー病の研究において最初に用いられ、Skovronksy らはアミロイド前駆体タンパク質(APP)を発現するトランスジェニックマウス Tg2576 に BSB を静注し、18 時間後の脳組織のSPに色素が集積していることを確認したと報告しています1)。
同様にアミロイドが沈着するその他のアミロイドーシスでも BSBを用いた研究が進められており FAP、透析アミロイドーシスや二次性アミロイドーシスなどの組織染色を行なった結果、アミロイドが沈着した部分を感度よく染色していることが確認されました。また、
BSE や νCJD を発症した組織でも同様の結果が得られています。

BSB は、従来の色素に比べ、親和性・検出感度共に高い蛍光色素です。
Skovronkyらの結果からin vivo の系での使用も可能であると考えられます。従来の色素では組織染色など in vitro でしか検出できないものも多く、in vivo の系で沈着アミロイドを検出した報告はありません。BSB
は安定性や毒性などの研究は必要ですが、FAP や BSE を含めたアミロ
イドーシスの診断・治療などの研究へのさらなる応用が期待されます。

18

各種アミロイドーシスの染色例（左列が BSB で染色したもので、白く光っている部分がアミロイドである。右列が Congo Red により染色したもので赤褐色に染まった部分がアミロイドである。）

AA amyloidosis

AL amyloidosis

DRA（透析アミロイドーシス）

familial CJD（家族性 CJD）

（データ提供：熊本大学医学部臨床検査医学

安東由喜雄先生）

参考文献
1) D. M. Skovronsky, B. Zhang, M.-P. Kung, H. F. Kung, J. Q.
Trojanowski, V. M.-Y. Lee, Proc. Natl. Acad. Soc., 97, 7609 (2000).
2) 安東 由喜雄 , 臨床病理 , 48, 425 (2000).
3) 佐々本 一美 , Dojin News, 97, 11 (2001).