News No.108(2003)

No.1082003■ Review

一酸化窒素(NO)の未知機能研究のための制御されたNOドナーの分子設計
大和田智彦■ Topics on Chemistry

金ナノ粒子によって加速される酵素電極反応
渡辺栄治

■ 連載

ケミストからみたポストゲノム 8
片山佳樹

ISSN0385-1516

News No.108(2003)

目次
Review
一酸化窒素(NO) の未知機能研究のための制御された
NO ドナーの分子設計
東京大学大学院薬学系研究科 大和田智彦 .......................... 1
ケミストからみたポストゲノム 8
九州大学大学院工学研究院 片山佳樹 ............................... 10

Topics on Chemistry
金ナノ粒子によって加速される酵素電極反応
同仁化学研究所 渡辺栄治 ................................................. 16

Commercial
新製品案内
G6PD 分析用キット .......................................................... 18
残留塩素測定キット .......................................................... 20
試作品
ペルオキシダーゼ標識用キット ........................................ 19
関連商品
脱水素酵素、酸化酵素の補酵素 ........................................ 17

Q&A
遺伝子傷害検出抗体 ............................................................ 9

お知らせ
抗ニトログアノシン抗体キャンペーンのご案内 ................. 8
学会展示案内 ..................................................................... 19
容器および保存・輸送温度変更案内 ................................. 21
訃報 .................................................................................... 21
第 14 回フォーラム・イン・ドージン開催案内 ................. 22

製品案内
容量、価格は下記ページをご覧ください。

Anti-Nitroguanosine monoclonal antibody(Clone#NO2G52) ................ 9Anti-Nitroguanosine polyclonal antibody ........................... 9
8-Nitroguanine(lyophilized) ................................................. 9
PQQ ...................................................................................... 17
G6PD Assay Kit .................................................................. 19
残留塩素測定キット -SBT 法 ................................................ 20
残留塩素測定試薬 -SBT 法 ................................................... 20
色素液 .................................................................................... 20
検水調整液 ............................................................................ 20
Cell Counting Kit-8 ............................................................. 21

中国の研究者への技術支援のため現地スタッフ 4 名を揃え、本年 5 月、中国（上海）に事務所を開設いたしました。

News No.108(2003)

一酸化窒素（NO）の未知機能研究のための制御された NO ドナーの分子設計(Structural Design and Synthesis of Nitric Oxide Donors Aimed to Controlled Release.
Chemical Tools to Study and Utilize Unrevealed Biological Roles of Nitric Oxide.)大和田[ Summary ]Although many recent studies have established that nitric oxide(NO) is an important bioregulatory molecule of the smallest size,in a range of physiological processes from vasodilation andplatelet aggregation to neurotransmission and immune system,
possible indirect intervention of endogenous and induced NO
carriers, i.e., NO donors, is recently highlighted. Generally thephysiological concentration of free NO is very low. In order tounderstand uncovered Janus-faced actions of NO, and reorganize
complicated contribution of the isoforms of nitric oxide synthases(NOS), structural design and synthesis of novel NO donors, which
can be qualified with controlled release of NO or NO equivalents
in terms of the rate and place (i.e., targeting) are desired. Herein
we review briefly the recent studies about the chemical featuresof potential NO donors, particularly of S-nitrosothiols and Nnitrosamines. The latter compounds can be considered as
potential NO+ donors.

智彦(Tomohiko Ohwada)
東京大学大学院薬学系研究科
分子薬学専攻 薬化学教室

キーワード：
一酸化窒素，NO ドナー，ニトロソニウムイオン，S- ニトロソチオー
ル， N- ニトロソチオール , NO 合成酵素(NOS)

1. 一酸化窒素(NO) ドナー
Furchgottらが、血管弛緩物質を血管内皮細胞が産生していることを発見して以来、1980年代に血管内皮細胞の機能の解明が進んだ 1)。血管内皮細胞から産生される物質は、血管の弛緩だけではな
く、血管壁を構成する血管平滑筋細胞の細胞増殖抑制や内皮細胞表面への血液成分の接着なども調整していることが分かった。そのような血管内皮細胞の司る血管内皮機能をになう物質の本体が一酸化窒素（NO)であることが解明されたことは記憶に新しい。

NO は生体内の NO 合成酵素(NOS)によって arginine から生合成される（Fig.1）2)。NOS には内皮型(eNOS)、誘導型(iNOS)、
神経型(nNOS)の 3 種類のアイソフォームが存在しており、主に存在している場所が異なる（Fig.4 参照）3)。すなわち内皮型
NOS(eNOS)は前述のように血管内皮細胞に発現し、誘導型
NOS(iNOS）は単球・マクロファージ・好中球などの炎症性細胞、
nNOS は中枢神経系、特に小脳で発現している。産生される物質は同じ NO だが、NOS の種類により NO 産生の部位が異なるため

O2

NO / O2

NOS
NH
H 2N

N
H

L-Arginine

CO2

O2
NADPH

O
H 2N

NH 3

NO

N
H

CO2
NH 3

L-Citrulline

Fig. 1 Nitric oxide synthases (NOS)

ターゲットとする組織が異なり、また NO の産生量が異なる。一般に低濃度の NO は生体に有効な生理作用をもたらし、高濃度のNOは有害であるという濃度依存的な善玉・悪玉説が広く唱えられている 4)。
現在このような理解のもとで、NOS のアイソフォーム選択的な活性化剤・阻害剤等が医薬品への展開の可能性を前提として開発されている 5)。一方で NOS のアイソフォームの発現は生体内の環境変化によって誘導され得ること、またNOSの相互の連帯を司る
NO キャリアーの存在が示唆されること（たとえば Snitrosohemoglobin もその可能性がある）、また NOS が NO 産生
ではなく活性酸素などの NO と正反対の生理活性を有する活性酸
素種(Reactive Oxygen Species, ROS)を生成する機構（アン、単純な善カップリング）の存在も示されつつあり（Fig.1 参照）
悪論では理解できない NO の科学が存在している 6)。
ところで血漿中の NO 濃度についての興味深い調査が行われ以下の結果が得られている 7)。すなわちフリーの NO の血漿中の濃度
は 3.4 ± 0.6 nM と極めて微量であり、血管平滑筋では同様に数nM オーダーの NO が恒常的に産生され血圧調節に寄与していると考えられている。血管内皮ではフリーの NO よりも後述する SNO結合を有するシステインを含む低分子ペプチドや高分子蛋白質に由来する S- ニトロソチオール が 7.19 ± 5.73 µM、S- ニトロ
ソ蛋白質 が 6.92 ± 5.45 µM と 104 倍多く存在する。 S- ニトロ
ソ体は生体中で S-N 結合をホモリティクに開裂して NO を産生すると考えられているため、NO の貯蔵庫として S- ニトロソ体が生体中で機能していると考えられている 7)。
一方血液中に放出されたNOはヘモグロビンの鉄(Fe(II))の配位1

News No.108(2003)

子として速やかに Fe-NO 結合を生じ scavenge されるため8) 、実際の血流中の NO の機能は不明と言って良い。これに対して近年、
Stamler らはヘモグロビンが酸素のみならず NO のトランスポー
ターであり血圧調整に S - ニトロソ化されたヘモグロビン ( S n i t r o s o h e m o g l o b i n ) が関与していることを提唱している(Stamler 説）9)。すなわちヘモグロビンは 2 つのαサブユニット
および 2 つのβサブユニットからなる 4 量体構造で各サブユニッ
トがヘムを持ち、βサブユニットには反応性に富むシステイン残基の SH 基(Cys β 93)がある。ヘモグロビンの heme 鉄への酸素の結合が、ヘモグロビンの特定のシステイン(Cys β 93)の S- ニ
トロソ化を促進することがわかった。さらにヘモグロビンから酸素の脱離は末端組織の筋肉等で酸素分圧が低くなった際起きるが、それに伴うヘモグロビンの 4 量体構造の変化によって S- ニトロソ
ヘモグロビンから NO を遊離する機構がある、というものである。
解離した NO によって血管は拡張し血流を増やし、酸素が不足した末端組織に酸素吸着したヘモグロビンを運び酸素を供給する、
すなわちS-ニトロソヘモグロビンは酸素分圧を感じるセンサー機能を有している事が提唱されている。なお、ヘモグロビンのシス
テイン(Cys β 93)の S- ニトロソ化が NO 自身が起こすのか NO+様の分子種で起きるのかは明確ではない(S-ニトロソチオールの項参照）。一方ごく最近、 Bohle, Jordan ら 10) ならびに Houk,
Stamler, Toone ら 11) によって S- ニトロソチオールの結合性やコンホメーションが研究された。今まで化学的な関心が払われなかったのはむしろ不思議なくらいである。

換される酵素反応を抑制する効果をもつ化合物群、enalaprilat,
ramipril や captopril など）によって NO 産生の増加が報告されている（Fig.2）12)。NO 産生の増加が降圧薬の血管保護作用や臓器保護作用の本体ではないかとも考えられる。近年 S-nitrosocaptprilの構造解析が行われたのは興味深い（Fig.3 参照）13)。
また、高脂血症に用いられる HMG-CoA 還元酵素阻害薬である
statin 系薬剤（例えば cerivastatin)は phosphatidylinositol-3 kinase(PI3K)/Akt 系を介する NO の遊離が示されている（Fig.2) 14) 。高脂血症は酸化低密度リポタンパク質(LDL)を産生し、血管内膜障害や単球の接着、遊走を引き起こす。動脈硬化の過程である。NO 自身もしくは statin 由来の未知の NO ドナーが血管内膜の保護に寄与している可能性が高い。
最近、N-nitrosomelatonin の構造解析と生成の可能性が報告され脳内でのメラトニン(melatonin)が NO を scavange する機能が推測され概日リズム（催眠）との関連がもたれる（Fig.3) 15)。
このようにNOの関与する生物活性は未だ未知なところがあり、また、NO の存在量による活性調整を、NO 合成酵素である NOS
アイソフォームの発現部位特異性のみで制御できると言った単純な話ではないようである。
一方、全ての NO 関連の現象が一見 NO それ自身の機能と思われがちであるが、NO は生体内で極めて低濃度に維持されている。
そのため生体内での一酸化窒素のキャリアー（NO ドナー）の存在。タンパク質のシステイン残基が関与が提案されている（Fig.4）
する S- ニトロソ化合物の他に N- ニトロソ化合物も NO ドナーのまた、近年、高血圧に処方する降圧剤であるカルシウム・チャネ
ル阻害薬（amlodipine など）や ACE 阻害薬（生体内のアンジオ
テンシン I が血圧を上昇させる物質であるアンジオテンシン II に変

MeO
Cl
CO2Et

EtO2C
CH 3

N

N
H

N
H

O

F

CH 3

HO 2C
H

O

N

CO2H

CO2H
OH OH

NH 2

amlodipine

enalaprilat

cerivastatin

Fig. 2 Medicines Unexpectedly Relevant to NO Synthesis

O
HN

CH 3
O

O
ON

S

N

CO2H H 3C O

CH 3

CH 3
ON HN
S
CO2H
H 3C
CH 3

N
N O

S-nitrosocaptopril

N-nitrosomelatonin

S-nitroso-N-acetylpenicillamine(SNAP)

Fig. 3 Potent NO Donors

2

News No.108(2003)

可能性がある。また一酸化窒素のキャリアー自身が生体機能調節を行う可能性もあり得る。NO の生理的な濃度は小さいため、制御された放出(controlled release)を可能にする NO ドナーの分子設計・合成は、NO の真の生理機能解明の tool として、また創薬化学のシード化合物としての可能性を秘めている 16)。また血漿中の S-NO 誘導体は能動的な制御を受けた NO の貯蔵庫である可能性もある。本 Reviews では NO 機能解明に不可欠な制御された
NO ドナーの研究の一端を紹介する。昨年 Chemical Reviews 誌に同様の特集が組まれたのでそちらも参考にしてほしい 17)。

Bohle, Jordan ら 10) および Houk ら 11,15) の研究で、S-NO
結合はかなり二重結合性を帯びている事が示唆された（Fig.5）。3級チオールの S - ニトロソ化合物である ( C H 3 ) 3 C - S N O 1（Fig.5）の温度可変 15N-NMR から算出した回転障壁 (rotational
barrier) は 10.7 kcal/mol で、計算値 12.86 kcal/mol と良い一致
を示した。
C
C

C
C

O

O
S

N

S

N
S

Controlled Release

e-NOS synthesis
n-NOS
NO
i-NOS

NO-Donors(NO-Carr iers )anti conformation1

O

Fig.5 Resonance Structure of S-NO compounds

Potentially Important
Transnitrosation
Biological Activities ?
Inhibitors / Activators
Fig. 4 Chemical control of the concentration of NO through inhibition of
NOS and through controlled release from NO-donors

2. NO ドナーとしての S- ニトロソチオール
S- ニトロソチオールは比較的不安定で、市販されている S- ニト
ロソチオールは S -nitroso N -acetylpenicilamine (SNAP)（Fig.3）や S-nitrosoglutathione(GSNO)等が知られているのみである。S-nitroso cysteine は、血漿中の NO ドナーである可能性が Stamler によって指摘されていることは既に述べた。さらに興味深いことに、S-nitrosothiol は thiol と NO 自身との反応では生成せずに、NO+ (nitrosonium ion)との反応によってのみ生成することである（下式）18)。

NO

+

SH

X

R

SH + HNO 2

H

R

N

R

S

NO + HR

S

NO + H 2 O

S-NO 結合はホモリティックに開裂して S- ラジカルと NO にな
り NO ドナーとなることが考えられていたが、Wang, Cheng らによって RS-NO をはじめとする一連の NO ドナーの結合解離エ（熱量測定）
ネルギー(Bond Dissociation Energies, BDE)の測定と計算が行われた（Fig.6）19)。S-nitroso-t-butylthiol 1 および Snitrosobenzylthiol のヘテロリティック結合解離エネルギーは56~57 kcal/mol であるが、ホモリティック結合解離エネルギーは 28 kcal/mol である。計算したホモリティック BDE の値と良い一致をした 11) 。S-nitrosothiophenol 2 の場合の結果を Fig.7に示す。この結果はホモリティックな S-NO 結合開裂が溶液中で優先することを示唆している。一方、結合解離エネルギーの大きさから熱的なホモリティックな S-NO 結合の開裂は生理的な条件では重要ではないことが示唆された。

∆Hheterolysis

Y NO

Y

+
+

( NO )Eox(Y∆Hhomolysis

Y NO

一方NOは酸素が共存すると下式のように酸化され亜硝酸イオンが生成するため結果的に NO+ が生成する。NO が直接チオールを
S- ニトロソ化しているのではなく、NO+（および等価体）である。

+

+

Y

NO
)

Ered(

NO )

NO

∆Hhomolysis Y NO = ∆Hheterolysis Y NO — 23.06 [ Ered (NO) - Eox (Y)](kcal/mol)

Fig. 6 Solution Thermodynamic Cycles

2 NO

+

O2

2 NO 2

NO 2

+

NO

N2 O 3

X=H

homolysis
SNO

N2 O 3+ 2OH+

2 NO 2

H2 O

X

SH +

NO 2

H

( NO )RNO∆Hhom = 19.4 kcal/mol

S

+

NO

∆Hhet = 49.2 kcal/mol

X

X

+
+

+

heterolysis
SNO

R

S

S

NO + H 2 O

X2Fig. 7 Homolytic and Heterolytic Cleavage of S-Nitroso Bonds

3

News No.108(2003)

一方 S-nitrosocaptopril の構造（Fig.3）の考察が行われていることはこのS-ニトロソ化合物が充分に安定であることを示唆して
おり captopril の薬理活性との関連で興味深く 11)、Snitrosocaptopril自体が薬理活性の本体の可能性もある。もちろん
NO ドナーとして NO の供与機能によって薬理活性を発現している可能性も充分あり得る。

O
N

NO

NH

EtO

O

R
N N
R’

R
NH +

2

N O

R’

R

+

2 NO
H 2O

N N
N OCH 2OCH 3

O

HN

OH

N

N N

O

O

O

O

O

N OCH 2OCH 3

HO

O

N

N

O

N OCH 2OCH 3

O

O

O
N

N N

O

O
N OH

N

N

O

O

N N
N OCH 2OCH 3

3

Lysine residue
O

NH 2
N
H

(Bovine Serum Albumin)

O

O
N

N

N N
N OCH 2OCH 3

O

Fig. 9 Synthesis of Protein-Conjugated NO Donors

NO の放出時間の制御に加えて NO ドナーに臓器特異性、すな
わち組織へのターゲティングの試みもなされている 24)。肝ミクロ
ソーム P450 がビニルエーテルのビニル基のエポキシ化を触媒することに着目して NONOate の肝細胞選択的な prodrug の解除を期待した誘導体 4 が合成されている（Fig.10）。肝ミクロソーム
P450がビニルエーテルのビニル基をエポキシ化し、さらにエポキ
シド加水分解酵素が作用すると、結果的にビニル基はジヒドロ化
され diazoniumdiolate 5 が再生され NO ドナーとなる。実際 4 はTNFα (Tumor Necrosis Factor α)誘導の肝細胞のアポトーシスを阻害した。NONOate の O- ビニル体は肝細胞選択的な NO 作用
発現の可能性を示した。

NH 2
R’

O

R

O
N

EtO

N O Na

O

NaOH

DCC

Keeferらの一連の研究によって市販に耐えるNO ドナーとしてdiazoniumdiolate(NONOates)類の合成と応用が報告されている（Fig.8）20)。 NO とアミンを反応させると、アニオン性を帯びた
diazoniumdiolate 塩が生成することが知られており、さらに水溶液にすると NO を発生する 21)。Keefer らはポリアミンとの付加物を用い、貯蔵可能な安定性を有する新規な NO ドナーの開発を行い、NO の機能を対象とする薬理学や生化学研究に貢献している。
NONOates の問題点は、多くの化合物の半減期が短く分単位（2min 〜 30 min)である点である。すなわち、序論で述べたように
生体内の NO 濃度は正常状態では濃度調節が行われ低濃度に維持されているが、これらの NO ドナーは一過的に高濃度の NO を生体に作用させることになり、毒性や NO の artifact な生理活性を発現する可能性がある。そこで Keefer らはポリアミンの構造を変えることで半減期の延長を図った（Fig.8，NOC18 など）22)。

N N

N

O

3. NONOate の構造を持つ NO ドナー

CH 3OCH 2Cl OOONaOM e EtO

N N
R’

O

N O

O

BrCH 2CH2Br

N N
N O

diazoniumdiolate (NONOates)

O
HO

N

N

N
CH2CH3

NOC12HN

CH 3 H 3C

O
N
CH2 CH3

H 2N

N
N

O

NOC18

Cytochrome
P450

N(possible in vivo process)

NH 3

O
NOR 2

O

epoxidehydrolase

N N

NH 2

4
O

N N
N O

H2O

N O

O
N N

N O
O

pH 7.4, 37 °C

N N
N OCH2CH2Br

Na

OH

O2N

O

NaOH

N N

HO

N
OH

O

5

NH + 2NO

3 second half-life

Fig. 8 Diazoniumdiolates (NONOates) as Spontaneous NO Donors

またdiazoniumdiolate基を適切なリンカーを介した活性エステ、蛋白質の塩基性残基（例えば Lysine
ル化合物 3 を合成し（Fig.9）のアミノ基）とのアミド結合生成により、NONOates を蛋白質
(例えば bovine serum albumin)に固定化することで、化合物 1
mg 当たり 30-40 pmol/min の極めて微量に制御された NO の放出速度を実現し、半減期を３週間に延長することを達成している23)。
この際 3 のアセタール構造である O-methoxymethylene 基は生体内で加水分解され、diazoniumdiolate 基を再生する。

4

Fig. 10 Liver-Selective NO Donors. Prodrug and Targeting.

NONOatesにベンジル基を結合し光照射によってNOの放出の制御するケージ分子のデザインが報告された（Fig.11）25a, b)。化合物 7 は Tsien らの化合物 6 の改良版であるが 25c, d)、通常光切断に用いられる2-nitrobenzyl基よりもベンゼン環上メタ位に電子供与基がある方がFig.11に示したNONOate ラジカルの生成の経路が有利になると述べている。

News No.108(2003)

O

Et
Et

N N

R

N O
CH2

Et

X
N O
CH2

R

Y

O2N

a: R = H
b: R = OCH3
c: R = OCH2CO2Et

6

N N
Et

a: X = OCH3 , Y= H
7 b: X=NMe 2 , Y =H

O

Et

hν

N N
Et

機能を明らかにしたので紹介する 28) 。
X

O

Et

X
N O
CH2

芳香族 N- ニトロソウレアは芳香族 N- ニトロソアミンよりも NNO 結合が弱く NO 放出能が高いが、脂肪族 N- ニトロソウレアのN-NO 結合開裂は見られない。筆者らは脂肪族 N- ニトロソアミンである 7- アザビシクロ[2.2.1]ヘプタンの N- ニトロソアミン誘導体（Fig.14）が N-NO 結合開裂による NO 等価体（NO+)の徐放

O

Et

N N

N O

(A) N-Nitrosamines of 7-azabicyclo[2.2.1]heptanes

+ CH
2

Y

NO
N

NO
N

Y
X
O

Et
N N

+

Et

NO

CH2

+

Y

8

9

NO
N

O

O

O N
Ph

O N
Me
10

NO
N

2

NO
N

11

NO
N

NO
N

COOMe
COOMe

12

13

NO
N

NO
N

NO
N

O2N
COOCH317 COOCH3O2N

Fig. 11 Controlled Photochemical Release of NO from O2-Benzyl
Substituted NONOates

14

NO2

15

NO2

16

NO2

NO
N

COOMe
COOMe

COOCH3
COOCH3

18(B)Monocyclic aliphatic nitrosamines

4. N- ニトロソアミンの構造と N-NO 結合開裂
S- ニトロソ化合物の他に N- ニトロソ化合物も NO ドナーとして機能する可能性がある。N- ニトロソアミンの N-NO 結合がホモ
リティックに開裂すれば一酸化窒素（NO ）を放出し、ヘテロリ
ティックに開裂すればニトロソニウムカチオン（NO+）を放出す。すなわち N- ニトロソアミンは NO ドる可能性がある（Fig.12）ナーまたは NO+ ドナーとなりうる化合物群である。芳香族 N- ニ
トロソアミン（Fig.14 参照）や N- ニトロソウレア（Fig.13 参照）
では N-N 結合がホモリティックに開裂し NO を放出することが報

NO
N

NO

19

20

N

NO
N

NO
N

NO
N

NO
N

21

22

23

24

N NO
25

(C) Aromatic N-nitrosamines
CH3
N
NO
27

N
NO
26

Fig 14. A New Strategy for New NO Donors based on N-Nitrosamines

告されている 26)。
homolysis

O
N N

N

+

N O

N

+

N O

7- アザビシクロ[2.2.1]ヘプタンの N- ニトロソアミンは酸触媒のヘテロリティックな N-NO 結合開裂を起こす NO+ ドナーと現時点では考えている（Fig.15）28b)。

heterolysis
N O

heterolysis

N

N

+

Fig. 12 Three Possible Modes of N-NO Bond Cleavage of NNitrosamines

Wang らにより芳香族 N- ニトロソウレア（Fig.13）の結合解離
エネルギ−が熱力学サイクル（Fig.7 参照）で実測されており、芳香族 N- ニトロソウレアではホモリティック結合解離エネルギ−( 約 30 kcal/mol) はヘテロリティックな結合解離エネルギ−( 約60 kcal/mol) よりも小さいと見積もられている 27)。
O

O

N

CH3
N
CH3

N
X

O

N
X

O

N

O

S

Ph
O

N
OEt
P
OEt
O

N
X

O

N O

X = OCH3, H, Cl, NO2, etc
Fig. 13 Vasatile NO Donors Based on N-Nitrosoureas

N O

H

+

H

N
O

Hetero lyt ic
Cleavage

N OH+

NO Donors

O

+

NO

N
O
Ph

N
O
Ph

N
O
Ph

H
N

NO Transporter(NO Carri ers)

R-SH

N
O
O

N
Ph

NO

R S NONO Donors+

Fig. 15 Function of NO Donor

5. Griess 法によるN-ニトロソ化合物のN-NO 結
合開裂能の評価
NO を検出する方法として Griess 法が知られている29)。Griess
法は NO を NO 2- に空気酸化して酸性条件下生じる NO + をスル
ファニルアミドとのジアゾニウム塩化合物に変化させ、それとナ
フチルエチレンジアミンのジアゾカップリングによって生成する赤色色素(545 nm)を検出する方法である（Fig.16）。

5

News No.108(2003)-

Griess 法による N-NO 結合開裂の検出の経時変化を調査した。
Griess 法の利点の 1 つに NO / NO+ を安定な化合物 (色素) に変

4 H+ + 4 NO2-

4 NO + O2 + 2 H2O++

NO2 + 2 H

NO

+ H2O

換する点があるため、発色を経時的に観察することが可能である。

N
N

NH2

Griess 法は古典的な方法であり検出感度は低いが、この点は蛍光

+ NO+
N
N

SO2NH2+SO2NH2
H2NO2S

SO 2NH2 HN

N N

NH2

N
H

NH2

(595 nm)+Fig. 16 Griess Reaction to Detect NO and NO

この方法では NO は直接検出できないが操作が簡便であり、また確立された測定法としてよく用いられている。またGriess 法では当然 NO+ そのものを検出できるため、NO と NO+ を同時に検出できる。すなわち赤色の発色はN-NO 結合の開裂を意味する。合成したニトロソアミン化合物に Griess 法を適用し、 N-NO 結合。化合物の濃度を 0.5 mM、 0.25
開裂能の評価を行った（Fig.17）
mM、0.125 mM の3点に変え対照化合物として市販のNO ドナー、SNAP（Fig.3）を用いた。
である NOC12、NOC18（Fig.8）
37℃で 5 時間後の吸光度（545 nm)と生成した色素量をグラフに示した。 Fig.17 から明らかなように 7- アザビシクロ[2.2.1]ヘプタン骨格を持つニトロソアミン(8-18)、芳香族ニトロソアミン

0.3
0.25
0.2

Af ter 5 hr s
at 37 ℃.

6. ESR による N-NO 結合開裂によって生成する
NO の検出

0.5mM0.25mM
0.125mM

O

Bicyc lic

NO
N

N
CO2Na

CO2Na

N
O

Arom atic

Carbox y-PTIO

N

NO

NO2

Carbo xy-PTI

O
O N
Ph

9

0.1
(b) Carbox y-PTIO 22℃ pH3.8(a) Carb oxy-PTIO + NOC1222℃ pH7.4

0.05

Carboxy-PTIO
MnO

0

8 9 10 11 12 13 1415 1617 18 19 20 2122 23 24 25 26 27

Compounds

Fig. 17 Griess Assay Results, Reflecting the Ease of N-NO Bond Cleavageof the N-Nitrosamines.

(26,27)では呈色が見られるが 単環性脂肪族ニトロソアミン (1925)では呈色はほとんど見られない。これは Griess 法の条件下で8-18,26,27 は N-NO 結合を開裂して NO または NO+ を生成していることを示している。また、7- アザビシクロ[2.2.1]ヘプタ
ン骨格を持つニトロソアミンの中にはNO またはNO+ 供与能が既存の NO ドナーである NOC12、 NOC18、 SNAP と同等もしくは凌ぐもの (例えば 9) があることがわかった。

6

O

N

Monoc yc li c

0.15

このことから7-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタン骨格を持つニトロ
ソアミン、芳香族ニトロソアミンともに N-NO 結合開裂能、すな
わち NO または NO+ の放出は pH 依存性があり、ある程度 pH が低くなければならないことが示唆された。

MnO

NOC12
NOC18
SNAP

Concentration of Dye Formed (mM)0.35

色素法にない利点である 30)。
6 時間までは 1 時間毎に測定した。10 時間後および 24 時間後を測定した。既存の NO ドナー(NOC12、 NOC18)は瞬間的にNO の放出があるのに比べて7-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタン骨格を持つニトロソアミン 8-18 では 26 と同様に徐々に放出されている。除放性の NO ドナー分子は、恒常的に低濃度産生され作用を発揮する NO の本当の生理活性を調査するための有用な研究手段を提供する可能性があり、その開発は意義をもつ。
Griess 法ではGriess 試薬にリン酸が含まれるためpH4.0と酸性に傾いている。蒸留水の代わりにリン酸緩衝液 (PBS、pH7.4、0.25M) を用いるとサンプル溶液の pH は 5.5 になる。pH5.5 で同様に Griess 法を行うと、NOC12、NOC18、SNAP では呈色の度合いはpH4.0 に比較して程度は小さいが呈色するのに対して、
7- アザビシクロ[2.2.1]ヘプタン骨格を持つニトロソアミン 9、芳香族ニトロソアミン 26 ともに NO または NO+ の放出による呈色はほとんど見られなかった。

MnO

0 mi n0 hr sMnO

20 mi n6 hr s40 mi nCarboxy-PTI

60 mi n(c) Carb oxy- PTIO + NOC1222℃ pH3.8
MnO

ca 5 mi n
MnO

12 hr s(d) 9 + Carb oxy-PTIO 22℃ pH3.8
0 hr

MnO

MnO

6 hr
23 hr

Fig. 18 ESR Detection of Nitrogen Species Released from NNitrosamines

News No.108(2003)

降下作用が期待される。一方 S- ニトロソチオールの NO 生成の反N-NO結合開裂によって生成する窒素化学種の検出をCarboxy応機構も明解ではない。S- ニトロソチオール構造を経由する NO
PTIO を用いる ESR 測定によって行った。Carboxy-PTIO は水溶性の安定な有機ラジカルで、 Fig.18 のように NO と反応して （もしくはその等価体）の制御された放出（controlled release)を可能にする分子の分子設計は構造有機化学の理解なくしては実現
Carboxy-PTI となる。Carboxy-PTI は NO とは反応しない。
しない。さらに NO や NO+ の還元体である HNO (nitrosyl)（あるCarboxy-PTIO と Carboxy-PTI はともに有機ラジカルなのでESR によって特有のシグナルとして検出することが可能である。 いは NO-)の機能も注目されている 33)。
また序論で述べたように NO の生体内での機能は想像以上に混
前田らはこれを NO の選択的消去剤として利用しているが 31)、
沌としている。生体内物質もしくは医薬品などの外来物質に含まCarboxy-PTIO が NO+ などと反応せず NO のみを検出できるこれるヘテロ原子に対するニトロソ化は、リン酸化に匹敵する、あとから N- ニトロソ化合物の N-NO 結合開裂において生成する化
るいはより特異性の高い情報伝達の鍵となる制御反応である可能
学種として NO が含まれているかを調査するために Carboxy性もあり新しい機能性 NO(または NO+)ドナーの設計と合成は挑PTIO 共存下での ESR スペクトルの測定を行った。
戦的な研究課題である。
Carboxy- PTIO と NO ドナーの標品として NOC12 を用いて中性条件 (pH7.4) でESR スペクトルにおけるCarboxy-PTIO か
参考文献
ら Carboxy-PTI へのシグナル変化を確認した(Fig. 18a)。
1) Nobel Lectures (a) R.F. Furchgott, Angew. Chem. Int. Ed., 38, 1870
同様にしてニトロソアミン9についてCarboxy-PTIO 共存下で(1999). (b) F. Murad, Angew. Chem. Int. Ed., 38, 1856 (1999). (c) L.
の ESR シグナルの変化の測定を行ったが、Carboxy-PTIO に対J. Ignarro, Angew. Chem. Int. Ed., 38, 1882 (1999).
して10等量のニトロソアミンを用いているにも関わらず中性条件
2)
Theoretical study: D. J. Tantillo, J. M. Fukuto, B. M. Hoffman, R. B.
(pH7.4) では 12 時間後においても全く Carboxy-PTIO の減少がSilverman,
K. N. Houk, J. Am. Chem. Soc., 122, 536 (2000).
見られず NO は検出できなかった。pH を下げて酸性 (pH3.8) に
3) Review, P. J. Andrew, B. Mayer, Cardivovascular Research, 43, 521
したところ 7- アザビシクロ[2.2.1]ヘプタン 骨格を持つ N- ニト(1999).
ロソアミン 9 は NOC12 と比較して遅いものの、Carboxy-PTIO
4) M. Colasanti, H. Suzuki, Trends in Physiological Science, 21, 249のシグナルの消失が観測された(Fig. 18d)。Carboxy-PTIO は酸(2000).
性条件でも比較的安定であり、Carboxy-PTIO を pH3.8 の PBS
5) 例えば P.-E. Chabrier, M. Auguset, B. Spainnewyn, S. Auvin, S. Corに加えて 22℃で 24 時間放置しても余り変化はない(Fig. 18b)。しnet, C. Demerl Pallardy, C. Guilard-Favre, J.-D. Marin, B. Pignol,
かしラジカルトラップ後に生成するCarboxy-PTIは酸性条件で非V. Gillard-Roubert, C. Roussillot-Charnet, J. Schulz, I. Viossat, D.
常に不安定であり、生成してもすぐに壊れてしまうため検出できない。Fig. 24c は pH3.8 での NOC12 との反応の５分後の ESR
スペクトルを示している。ニトロソアミン 9 は pH3.8 の条件下
Carboxy-PTIO のシグナルが減少していることから、このスペク
トル変化はニトロソアミン 9 から NO がゆっくり生成し CarboxyPTIO が消費され Carboxy-PTI が生成したものと解釈するのが妥当である。なぜなら Griess 法では 9 は 6 時間後には 60% 以上の分解率で N-NO 結合開裂が起こっているのに対して CarboxyPTIO を用いた ESR スペクトルの検出では 6 時間でもあまり ESR
スペクトルに変化が見られない(Fig. 18d)からである。すなわち、
ニトロソアミン 9 は少なくとも一部は N-NO 結合をホモリティッ
クに開裂し NO を生成していると考えられる。

Bigg, S. Moncada, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 10824 (1999).
6)

Review, P. J. Andrew, B. Mayer, Cardivovascular Research, 43, 5217)(a) J.S. Stamler, O. Jaraki, J. Osborne, D. I. Simon, J. Keaney, J.

(1999).
Vita, D. Siggle, C. R. Valeri, J. Loscalzo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89, 7674 (1992). (b) J. S. Stamler, D. J. Singel, J. Loscalzo, Science,
258, 1898 (1992).
8)

O. Chen, S. Groh, A. Liechty, D. P. Ridge, J. Am. Chem. Soc., 121,
11910 (1999).

9)(a) T. J. McMahon, R. E. Moon, B. P. Luschinger, M. S. Carraway, A.
E. Stone, B. W. Stolp, A. J. Gow, J. R. Pawloski, P. Watke, D. J.
Singel, C. A. Piantadosi, J. S. Stamler, Nature Medicine, 8, 711 (2002).
(b) J.S. Stamler, L. Jia, J. P. Eu, T. J. McMahon, I. T. Demchenko, J.

+
BH は決定されていないが、酸性中

N- ニトロソアミンの pK
N- プ
ロトン化ではなく O- プロトン化を起こすことが知られている 32)。
以上のことから 7- アザビシクロ[2.2.1]ヘプタン 骨格を持つ Nニトロソアミン9 はわずかにN-NO 結合のホモリティックな切断を起こしNO を生成するが、Griess 法条件に対応する酸性条件では大部分がヘテロリティックな切断でNO+ を生成していると推定。
できる（Fig.15）

7．まとめ
ある構造を持った N- ニトロソアミン（ただし NO+ ドナー）は既存の NO ドナーに比べて徐放的であることが示唆された。実際
NO+ ドナーの生体内での機能は未知であるが、持続性の高い血圧

Bonaventura, K. Genert, C. A. Piantadosi, Science, 276, 2034 (1997).
(c) L. Jia, C. Bonaventura, J. Bonaventura, J. S. Stamler, Nature,
380, 221 (1996). (d) A. J. Gow, J. S. Stamler, Nature, 391, 169 (1998).
10) N.Arulsamy, D.S. Bohle, J.A. Butt, G. J. Irvine, P.A. Jordan, E. Sagan,

J. Am. Chem. Soc.,121, 7115 (1999).
11) M.D. Barberger, K. N. Houk, S. C. Powell, J. D. Mannion, K. Y. Lo, J.
S. Stamler, E. J. Toone, J. Am. Chem. Soc., 122, 5889 (2000).
12) X. Zhang, T. H. Hintze, Circulation, 97, 676 (1998).
13) M.D. Barberger,J. D. Mannion, S. C. Powell, J. S. Stamler, K. N. Houk,
E. J. Toone, J.Am. Chem. Soc., 123, 8868 (2001).
14) (a) M. Sata, H. Nishimatsu, E. Suzuki, S. Sugiura, M.Yoshizumi, Y.
Ouchi, Y. Hirata, R. Nagai, The FASEB Journal, 15, 2530 (2001). (b)U. N. Das, Experimental Biology and Medicine, 227, 88 (Minireview)

7News No.108(2003)

McIntyre, Can. J. Chem., 44, 105 (1966).

(2002).
15) A. G. Turjanski, F. Leonik, D. A. Restrin, R. E. Rosenstein, F.
Doctorvich, J. Am. Chem. Soc., 122, 10468 (2000).
16) (a) S. R. Hanson, T. C. Hutsell, L. K. Keefer, D. L. Mooradian, D. J.

33) (a) K. M. Miranda, N. Paolocci, T. Katori, D. D. Thomas, E. Ford, M.
D. Bartberger, M. G. Espey, D. A. Kass, M. Feelisch, J. M. Fukuto,
D. A. Wink, A biochemical rationale for the discrete behavior of ni-

Smith, Advances in Pharmacology, 34, 383 (1995). (b) P. G. Wang,

troxyl and nitric oxide in the cardiovascular system, Proc. Natl. Acad.

M. Xian, X. Tang, X. Wu, Z. Wen, T. Cai, A. J. Janczuk, Chem. Re-

Sci. USA, 100, 9196 (2003). (b) N. Paolocci, T. Katori, H. C. Cham-views, 102, 1091 (2002).

pion, M. E. St. John, K. M. Miranda, J. M. Fukuto, D. A. Wink, D. A.

17) Special issue. Chem. Rev., 102, No.4 (2002).
18) (a) Williams, D. L. H. Acc Chem. Res., 32, 869 (1999). (b) S. A. Lipton,
Y.-B. Choi, Z.-H. Pan, S. Z. Lei, H.-S. V. Chen, N. J. Sucher, J.

Kass, From the Cover: Positive inotropic and lusitropic effects of HNO/NO in failing hearts: Independence from β-adrenergic signaling, Proc.

Natl. Acad. Sci.USA, 100, 5537(2003).

Loscalzo, D. J. Singel, J. S. Stamler, Nature, 364, 626 (1993).
19) J.-M. L

J. M. Wittbrodt, K. Wang, Z. Wen, H. B. Schlegel, P. G.

Wang, J.-P. Cheng, J. Am. Chem. Soc., 123, 2903 (2001).
20) J. A. Hrabie, L. K. Keefer, Chem. Rev., 102, 1135 (2002).
21) (a) C. M. Maragos, D. Morley, D. A. Wink, T. M. Dunams, J. E.
Saavedra, A. Hoffman, A. A. Bove, L. Isaac, J. A. Harabie, L. K.
Keefer, J. Med. Chem., 34, 3242 (1991). (b) J. A. Hrabie, J. R. Klose,
D. A. Wink, L. K. Keefer, J. Org. Chem., 58, 1472 (1993). (c) K. M.
Davies, D. A. Wink, J. E. Saavedra, L. K. Keefer, J. Am. Chem. Soc.,
123, 5473 (2001).
22) J. E. Saavedra, P. J. Shami, L. Y. Wang, K. M. Davies, M. N. Booth,
M. L. Citro, L. K. Keefer, J. Med. Chem., 43, 261 (2000).
23) J. A. Hrabie, J. E. Saavedra, P. P. Roller, G. J. Southan, L. K. Keefer,

Bioconjugate Chem., 10, 838 (1999).
24) J. E. Saavedra, T. R. Billiar, D. L. Williams, Y.-M. Kim, S. C. Watkins,
L. K. Keefer, J. Med. Chem., 40, 1947 (1997).
25) (a) P. H. Ruane, K. M. Bushan, C. M. Pavlos, R. A. D’Sa, J. P.
Toscano, J. Am. Chem. Soc., 124, 9806 (2002). (b) K. M. Busham,

著者紹介
氏
名：大和田 智彦（Tomohiko Ohwada）
所
属：東京大学大学院薬学系研究科分子薬学専攻
薬化学教室
出 身 校：東京大学薬学部薬学科卒業（昭和 57 年卒）
学
位：薬学博士専
門：医薬化学，有機反応化学，計算化学，有機合成化学
研究テーマ：芳香族化合物の官能基化反応の開発
特徴ある生物活性物質の創製
主な著書等：トップ・ドラッグ（化学同人）（共訳， 2003 年）
連絡先：〒 113-0033
東京都文京区本郷 7-3-1（勤務先）

E-mail:ohwada@mol.f.u-tokyo.ac.jp

H. Xu, P. M. Ruane, R. A. D’Sa, C. M. Pavlos, J. A. Smith, T. C.
Celius, J. P. Toscano, J. Am. Chem. Soc., 124,12640 (2002). (c) A.
Srinivasan, N. Kebede, J. E. Saavedra, A. V. Nikolaitchik, D. A. Brady,
E. Yourd, K. M. Davies, L. K. Keefer, J. P. Toscano, J. Am. Chem.

Soc., 123, 5465 (2001). (d) L. R. Makings, R. Y. Tsien, J. Biol. Chem.,
269, 6282 (1994). (e) O. Arancio, M. Kiebler, C. J. Lee, V. Lev-Ram,
R. Y. Tsien, E. R. Kandel, R. D. Hawkings, Cell, 87, 1025 (1996).
26) (a) M. Tanno, S. Sueyoshi, N. Miyata, K. Umehara, Chem. Pharam.

Bull ., 45, 595 (1997). (b) M. Tanno, S. Sueyoshi, N. Miyata, S.
Nakagawa, Chem. Pharm. Bull., 44, 1849 (1996).
27) (a) J.-P.Cheng, M. Xian, K. Wang, X. Zhu, Z. Yin, P. G. Wang, J. Am.

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Chem. Soc., 120, 10266 (1998). (b) J.-P. Cheng, K. Wang, Z. Yin, X.
Zhu, Y. Lu, Tetarhedron Lett., 39, 7925 (1998). (c) X.-Q. Zhu, J.-Q.
He, Q. Li, M. Xian, J. Lu, J.-P. Cheng, J. Org. Chem., 65, 6729 (2000).
28) (a) M. Miura, S. Sakamoto, K. Yamaguchi, T. Ohwada, Tetrahedron

Lett., 41, 3637 (2000). (b) T. Ohwada, M. Miura, H. Tanaka, S.
Sakamoto, K. Yamaguchi, H. Ikeda, S. Inagaki, J. Am. Chem. Soc.,
123, 10164 (2001).
29) L. C. Green, D. A. Wagner, J. Glogowski, P. L. Skipper, J. S. Wishnok,
S. T. Tannenbaum, Anal. Chem., 126, 131 (1982).

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品名

容量

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和光コード

メーカーコード

Anti-Nitroguanosine monoclonal antibody(Clone#NO2G52)
10 µg
16,000347-90651
AB02
Anti-Nitroguanosine polyclonal antibody
10 µg
14,000344-90661
AB0130) T.Nagano, T. Yoshimura, Chem. Reviews, 102, 1235 (2002).
31) T. Akaike, M. Yoshida, Y. Miyamoto, K. Sato, M. Kohno, K. Sasamoto,K. Miyazaki, S. Ueda, H. Maeda, Biochemistry, 32, 827 (1993).
32) (a) T. Axenrod, Spectrosc. Lett., 3, 263 (1970). (b) S. J. Kuhn, J. S.

8キャンペーン問合せ先：
和光純薬工業学術部
同仁化学研究所 マーケティング部

TEL:06-6203-1788
TEL:096-286-1515

News No.108(2003)

Q＆A
遺伝子傷害検出抗体

Anti-Nitroguanosine monoclonal
antibody(Clone#NO2G52)
Anti-Nitroguanosine polyclonal antibody
8-Nitroguanine(lyophilized)
Q1
A1

A2

Q3
A3

Q4
A4

in vitro でニトログアノシンが発生していることは、これま
でにも HPLC や ESI-MS での検出報告があります。しかし、これらの方法ではニトログアノシンがあることは分かっても、どこにどのくらいあるのかは分かりませんでした。病理解析を行う上でも顕微鏡写真は必要となります。
抗体を用いることでそれを得ることができます。

この抗体を用いることで何がわかりますか？

8- ニトログアノシンは、一酸化窒素（NO）と活性酸素（スーパーオキシドアニオンラジカル）によって生じる過酸化亜硝酸（パーオキシナイトライト）によって RNA がニトロ化された核酸です。生体組織が炎症を起こすと多量の NO が産生され、多くの過酸化亜硝酸が生じて、グアノシン、デオキシ
グアノシンをニトロ化することが知られております。8- ニ
トログアニン残基の局在や量などを調べることにより、 8ニトログアノシン残基の役割や遺伝子傷害、発癌機構の解明に役立つことが期待されます。
ポリクローナル抗体で染色された場合、次のような確認を行うことをおすすめします。
①標準の 8- ニトログアニンと競合させて染色されなくなる
こと②Sodium hydrosulfite等の還元剤で試料中のニトログアノ
シン、ニトログアニンをアミノグアノシン、アミノグアニンに還元して染色されなくなること

Q2A68- ニトログアノシンは RNA 由来ですが、DNA 由来の 8- ニ
トロデオキシグアノシンは、
抗ニトログアノシン抗体で標識されますか。
抗ニトログアノシン抗体は 8- ニトログアニン残基を認識しますので、8- ニトロデオキシグアノシンも標識されます。8ニトログアノシン修飾体を抗原として抗体を作成したので、
抗ニトログアノシン抗体と呼んでおります。

Q7
A7

抗ニトログアノシン抗体はどのくらい保存できますか？
有効期間は設けておりませんが、希釈前の段階で、冷蔵で 1年使用できることを確認しています。凍結・融解の繰り返し
は劣化を早めますので、一旦解凍後は冷蔵にて保管してください。また、希釈されますと吸着などもあり、期間の保証はできません。

Q8
A8

使用する濃度はどのくらいでしょうか？
これまでの報告では、組織染色で 10 µg/ml、ELISA で 1 µg/
ml(モノクロ) となっております。対象とされる組織によっても最適濃度は変わってきますので、
上記濃度を目安にご検討ください。

Q9
A9

ミトコンドリアの DNA を染色したいが可能でしょうか。
抗ニトログアニン抗体は開発されたばかりで応用に関しての事例があまりありません。
ミトコンドリアに関しても染色される可能性はありますが、現段階ではわかりません。

Q10 ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とどちらを使った方が良いのでしょうか。
A10 ヒトのサンプルなどでは特異性、力価の高いモノクローナル
抗体をご使用になることをおすすめします。

論文では凍結切片が用いられているようですが、パラフィン
切片は染色に使用できないのでしょうか？
パラフィン切片でも染色は可能です。ただし、凍結切片よりも染色性は劣るようです。
組織によっても条件は異なります
ので、一度ご検討ください。
ホルマリン標本は染色できますか。
事例がありませんのでわかりません。
凍結切片での使用をおすすめします。
品

Q5
A5ブロッティングはできますか？

Cell lysate でのドットブロット、スロットブロットの実績はあります。

Q6

ニトログアノシンの検出は他の方法で行われたものはありま
すか？

名

容量

価格（￥） メーカーコード

Anti-Nitroguanosine monoclonal antibody(Clone#NO2G52)
50 µg（50 µl/vial） 65,000
AB02Anti-Nitroguanosine polyclonal antibody
50 µg（250 µl/vial） 55,000
AB01
8-Nitroguanine(lyophilized)
100 µg15,000N455

9News No.108(2003)

ケミストからみた
ポストゲノム8〜プロテインアレイ（3） 膜タンパクアレイ・生体膜アレイ〜
九州大学工学研究院応用化学部門

片

山

佳

樹

のみ本来の活性を維持するものであるから、それらを単独で基板上に固定しても変性が著しく、活性が失われてしまう。しかしな
がら、現在の薬物ターゲットの 50％が膜タンパクであることからも分かるように、非常に重要な解析対象である。単純に膜タンパ
クの存在量や存在比を網羅的に解析するには、膜画分を分離後、通常のプロテオーム解析同様、2 次元電気泳動による方法や１）、最近
では、プロテイナーゼなどの処理条件を工夫することで、膜内ドメインや細胞外、細胞内ドメインを分けて解析する網羅的解析法（質量分析）も報告されている 2）。しかしながら、膜タンパクの機能を評価するためには、基板上に膜と同じ環境を作り上げる必要がある。脂質膜は、本来流動性が高く不安定なものであるから、これを基板上に修飾して取り扱うには、かなりの工夫が必要である。
ここでは、まず、生体膜の基板への固定化法、ついで、基板上での膜のパターニングの方法，基板上に配列させた膜の組成をそれ
ぞれ変化させる方法、それを用いた膜タンパク解析例などをご紹介する。固体基板上に膜を形成させると、2 分子膜の両側で環境が非対称になるため、組み込んだタンパクの配向が一定になりやす
い、表面が膜分子をアンカリングすることで膜の機械強度を高める、表面特異的な分析手法を利用できるなどの利点がある。一方、固体表面と膜が接近するため、膜の流動性やタンパクに悪影響が出る可能性もあるため、この点を考慮したシステムを開発する必要がある。

１．はじめに２ . 生体膜の基板上への固定化法

前回までに種々のプロテインアレイに関してご紹介したが、それらのアプローチが適用困難な対象として膜タンパクがある。膜タンパクは、生体脂質膜という極めて組織化された特殊な環境で固体基板表面を、生体膜あるいは類似した構造体で修飾する最も古典的な手法は、Langmuir-Brodjett 法である 3）。また、直接基板上に固定化する手法としては、アルキルシランでガラス表面に

b)

a)

water

c)

d)

oligohistidine
nickel ion
NTA chelator

Fig.1 Diffenrent types of supported membrane on solid surfacea) highly hydrophobic surface consisting of SAM hydrocarbon tail that result in lipid monolayer, b) lipid bilayer on hydrophilic surface, c) surface
presenting amphiphilic tethers anchor lipid bilayler, d) anchoring of lipid bilayer using the interaction between NTA-Ni complex and oligohistidine

10News No.108(2003)

疎水膜を作成したり 4,5）、金基板上にアルカンチオール誘導体で自リンカー部分の長さで調節できる。その他のアンカーとしては、例
己組織化膜(SAM) を形成したりする方法がある 6,7）。また、よりえば、アルカンチオールにペプチドを介してトリニトリロ酢酸
生体膜類似の環境を志向して、リン脂質のアルキル鎖末端にチ （NTA）型キレーターを導入したもの 14） や、リン脂質のヘッドグ
オールを導入して金基板上に膜を化学吸着させる方法がある8-10）。 ループにオリゴエチレングリコールを導入して末端をジスルフィ
しかしながらこれらの手法では、基板と膜関連構造体が直接結合
ドで 2 分子を結合したもの 15）、アルカンチオールにオリゴエチレ
しており、間に空間が無いことから、膜外ドメインを有する膜タ
ングリコールを介してオリゴヒスチジンを導入したり、脂質誘導
ンパクの存在する場としては不向きである。SAM 上に脂質 2 分子体にペプチド鎖を介してオリゴヒスチジンを導入したりしたもの
膜の単分子膜を作ると、脂質分子は親水性のヘッドグループを水など 16） がある(Fig.1(d))。これらはいずれも NTA- ニッケル錯体
11）とオリゴヒスチジンの 3 元錯体形成を利用して膜を基板上のリン相に向けて並び擬似 2 分子膜となる(Fig.1(a)) が、やはり基板とSAMの間に隙間が無いのが難点である。一般にガラス基板上にカー分子と結合させて機械強度を上げるために用いられる。具体
脂質 2 分子膜を作成すると、ガラス表面上に 10 Å程度の水の相が的な分子構造は Fig.2 に示した。基板上の両親媒性アンカーに形成され、膜外ドメインが小さなタンパクであれば膜に組み込む
SAM 形成型アルカンチオールを用いると、機械強度は優れている
ことができる(Fig.1(b))12）。
基板と膜の間にさらに大きな空間を形が、これに結合する脂質 2 分子膜の流動性は制限されてしまう。一成させる試みとしては、両親媒性のアンカーを用いる方法がある
方、アンカーに脂質誘導体を用いれば、基板上のアンカーも側面方向にある程度拡散できるので、これに結合する膜の流動性への(Fig.1(c))13）。この場合には、基板に SAM を形成させるため、根影響は小さくてすむ一方、機械強度は前者に比べ劣ると考えられ
元部分に親水鎖を有し、その先に疎水部分を有する分子を用い、そる。NTA-Ni- オリゴヒスチジンの結合は、発現タンパクの精製にの上に脂質 2 分子膜を形成する。親水空間の大きさは、親水性のDifferent types of amphiphilic tethers
H
N

HS
O

O

O

H
N

N
H

CO2 H
N
H

O

CO2H

N

CO2 H

O
O

HS

6

O

(His)6

O

O

O

O
O
O
O

S

O

(Gly-Ser)8N
H(His)6O

Different types of functionalized lipid for supported membraneH(His)6 N

O
O

O

O

O

N

C18

C 18

O
O

O

O

O P

O

n

S

2

OH

O
O

H
N

N
O

CO2H
N

CO2H

CO2H

Fig.2 Amphiphilic tethers and functionalized lipid for supported membrane using Ni-NTA complex-His interaction

11

News No.108(2003)

多用されるが、一般に EDTA やイミダゾール溶液で処理すれば解離する。しかし、基板上への膜の固定に用いる場合、これらの処理によっても固定された膜が外れることはない 16）。これは、脂質膜が基盤を完全に覆い、膜透過性のない EDTA などが、膜と基板上のアンカーの間にこれらの入り込めないことを示している。また、機械強度は若干劣るが、硬い基板と脂質膜の間に親水性のポ
リマーのクッションを敷く方法もある15,17）。これらの方法では、膜外ドメインの大きさによる制限は少なく、多くの膜タンパクに適用可能である。膜を基板上に形成する場合、機械強度を上げるた
めに膜を基板に何らかの方法で結合させると流動性が落ちて本来の膜の性質が損なわれてしまう。一方、膜の重要な特性である流動性を高めるために基板との相互作用を減弱させると、膜の機械強度が小さくなり、洗浄操作や繰り返しての気 -液界面を通過させる操作を行うと、多くの脂質がはがれて失われてしまうという問題がある。最近、これらの手法とは異なり、ガラス表面をγ - アミ
ノプロピルシランで処理するとホスファチジルコリンなど、本来の生体膜を乗せても安定に結合することが報告されている 18）。この場合、蛍光標識脂質を添加しておき、気 - 液界面を何度も通過させ、蛍光強度の現象をモニターしても、脂質の脱着はほとんど見られないという。また、レーザーにより蛍光消光部分を作り、その回復を観察すると、本来の脂質膜の 60％程度の回復率であり、かなりの膜流動性も保持していると見られる。
この様な基板上に脂質膜を形成させるためには、基板上を親水処理してある場合やガラス表面などでは、通常、脂質ベシクルを含む溶液と接触させていると、表面の状態に依存して、数分から 3日で表面に平面 2 分子膜が形成される 16）。このほかに、ベシクルを形成する力の弱い脂質や基板上に配列しにくい脂質では、脂質溶液にオクチルグルコシドなどの cmc（臨界ミセル濃度）の高い
界面活性剤を併用する方法もある 14,15）。この場合では、まず数秒から 1 分程度のうちに、基板上に脂質膜が単分子膜として並び、バルク表面に疎水部を向けた表面を形成するが、ここをオクチルグ
ルコシドが覆った状態になり、その後、徐々に界面活性剤濃度を下げていくことで脂質分子が置き換わっていき最終的に基板上に2分子膜が形成される 15）。そのまま放置しても、数時間で界面活性剤は脂質分子と置き換わる。

３．基板上に膜のパターン（膜アレイ）を形成させる手法
基板上に膜を区別された領域に独立させて並べていく方法は、。
大きく分けて以下の 3 種類がある（Fig.3）①基板上に膜を形成した後、ひっかいてパターンを作成する（Scratch Barriers）(Fig.3(a)) 19,20）。
②予めパターンを作成した基板上に膜を形成させる(Fig.3(b)) 21,22）。
③基板上に膜をスポット、スタンプ、あるいは作成した膜から必
要部分の膜を取り去る(Fig.3(c)) 18,24）。

3-1：Scratch Barriers 法
この方法は、予め基板上に膜をコートしておいてから、ピンセッ
トのようなもので機械的に 2 〜 3 ミクロンの刻み目を作って膜の間のバリヤーとするものである。しかしながら、膜の流動性を保っ12た状態では、安定なバリヤーを作るのは難しく、イオンエッチン
グなどでシャープなエッジを作ることが重要である。スクラッチ
バリヤーの安定性には、シリカなどの表面の水和状態が大きく影響するといわれている 19）。一般にガラス表面などに膜を置いた場
合、pH が低いと広がりやすいが、pH が中性以上になると、水分子が規則正しく配列し、膜の広がりを抑える。ただし、この方法で得られる膜同士の境目のバリヤーは、安定性が本質的に低いた
め、制御が難しい。

3-2：基板にパターンを作成しておいてから膜を引く方法
この方法では、基板上に膜分子が相互作用して脂質膜を形成できる表面と、膜分子が相互作用しない（膜が乗らない）表面でパターンを描いておいて、これに膜を乗せる方法である。結果的に、膜が乗らない領域が膜同士のバリヤーとなる。ベシクルが相互作用して基板上に平面 2 分子膜を形成できる材料は、ガラス、シリ
カ、酸化したポリジメチルシロキサン(PDMS)やある種の高分子などが知られている 25）。一方、膜が乗らない、バリヤーとなりう
る材料としては、金、アルミ、チタンなどの金属やアルミナ、酸化チタンなどの金属酸化物、ある種の高分子などが知られている。
この方法では、前述したベシクルで処理する操作で自動的に膜のアレイが完成する。バリヤーの幅は、10 nm のように細いものも作成できる。

3-3：基板上に膜をスポット、スタンプあるいは、要らない部分を取り去る方法
この方法では、パターンが描かれていない基板の必要部分に膜を置いていったり、要らない部分の膜を取り去ってパターンを形成する。膜をスポットしていく場合には、何らかの方法で膜を固定化しないといけない。前述の金 - チオール結合や NTA とオリゴ
ヒスチジンのニッケルイオンを介した結合や、アミノプロピルシ
ラン処理して表面に膜を乗せるという手法がある。単純に膜をガラス表面に乗せても、pH が中性以上では、膜分子同士の相互作用のために膜はそれほど広がらない。卵黄ホスファチジルコリンの膜をガラス表面に置いた場合でも、わずか（106％）しか広がらない 24）。また、さらに進化した方法では、PDMS を必要なパターンに成型しておき、この上に膜を乗せて、ガラス基板上に移す方法がある（Stamping）24,26）。PDMS 上に 2 分子膜を作るには、ベシクルを用いるが、疎水性の PDMS 表面では 1 時間、プラズマなどにより親水処理していると数分で膜が形成される。これをガラス基板に押し付けて膜を移す。蛍光標識脂質を混合しての検討では、1 回のスタンピングで、約 60％の膜が移し取られる。逆に、ガラス基板上に膜を作っておき、PDMS を押し付けてその部分の膜をはがし取り、膜のパターンを形成する方法(Blotting)もある 24）。
膜を取り除いた後できるバリヤーは、膜同士の広がりのため、幅が狭まると期待されるが、実際は PDMS が押し付けた際に変形するために、バリヤーの幅は PDMS のパターンより広くなる。これ
らの方法で基板上に並べられた膜は、いずれも高い流動性を有していることが蛍光消光回復法や電気泳動により実証されている。

News No.108(2003)a)Membrane-coated glass
Scratchb)

Vesicle fusion
Pre-patterned glassc-1)
weight

glass
PDMS

glass

c-2)
weight

glass
PDMS

glass

Fig. 3 Patterning of supported membranea) scratch barriers: membrane-coated surface is scratched by various techniques to make barriersb) surface is pre-patterned with membrane-binding and non-binding regionsc-1) Stamping: membrane is transferred to glass surface from PDMSc-2) Blotting: membrane on glass surface is removed by PDMS

13

News No.108(2003)

light
a)
photomask

Mambrane corrals

Photopatterned corralsb)

Vesicle fusion
Printed membrane patches

Combinatorial array of blended membranec)
Injectionof vesicle solutions

Captured membrane arrayd)

Different vesicle was spotted onto each corrals

Resulting membrane array

Fig. 4 Methods for making of membrane array in which each corral has different lipid-composition. a) Using of photochemical reaction, b) The firstmembrane is stamped in variably sized patches using PDMS stamp. The unfilled portions of each corral are then filled with second membranewith vesicle fusion. c) Two or more solutions containing different molecules are flowed over the surface of as pre-patterned substrate. d) Various
vesicle solutions containing different molecules are spotted separately in each corral.

14

News No.108(2003)

４．膜アレイのそれぞれのスポット（膜）の組成を変化させる方法
生体膜は、その組成が不均一でありこれがタンパクの機能発現などに重要な意味を持っている。パターン化した各膜部分の組成を変化させる方法としては、以下の 4 種類がある(Fig.4)。
①各膜部分に光反応性分子を入れてフォトマスクによりそれぞれの膜である種の機能を活性化したり消去したりする。その際、フォトマスクの大きさを変えることで、膜部分毎の反応量を調節できる(Fig.4(a)) 27）。
②区画した基板の各区画に PDMS で様々な量の膜を乗せてから、別の組成のベシクルで処理して、組成の異なる膜を作成する(Fig.4(b)) 26）。
③予めパターンを形成した基板に異なる膜分子を流し、各液の混合の度合いに勾配をつけて組成の異なる膜を並べる(Fig.4(c)) 28）。
④各区分ごとにベシクルを置いて、平面膜を形成させる(Fig.4(d)) 29）。
さらに、各膜区分ごとに電圧をかけることにより一時的に成分に濃度勾配を形成させることも可能である。

５．膜タンパクアレイ 30）
この様な膜アレイを膜タンパクの評価にまで用いた例はまだあまりない。Fang らは、アミノプロピルシラン処理したガラス上に膜をスポットしていき膜アレイを作成し、これに G タンパク会合性受容体(GPCR)を組み込んでその機能を評価している。GPCRとしては、ニューロテンシン受容体、各種アドレナリン受容体を用い、蛍光標識リガンドと非標識リガンドの競争を用いて、Kd 値などを評価している。その結果、均一系での測定結果と矛盾しな
い値や選択性が得られ、この膜タンパクアレイが正常に機能しうることが実証されている。

参考文献
1)

B. K. Shin, H. Q.Wong, A. Marie, F. L. Naour, F. Brichory, J. H. Jang,
R. Zhao, E. Puravs, J. Tra, C. W. Michael, D. E. Misek, S. M. Hanash,

J. Biol. Chem., 278, 7607 (2003).
2)

C. C. Wu, M. J. MacCoss, K. E. Howell, J. R. Yates III, Nat.

3)

L. K. Tamm, H. M. McConnell, Biophys. J., 47, 105 (1985).

4)

S. R. Wasserman, Y. T. Tao, G. M. Whitesides, Langmuir, 5, 1074

Biotechnol., 21, 532 (2003).

(1989).
5)

S. R. Wasserman, G. M. Whitesides, I. M. Tidswell, B. M. Ocko, P.
S. Parshan, J. D. Axe, J. Am. Chem. Soc., 111, 5852 (1991).

6)

J. K. Yae, D. B. Parry, K. D. Caldwell, J. M. Harris, Langmuir, 7, 307

7)

C. R. Kassel, S. Granick, Langmuir, 7, 532 (1991).

8)

W. Fabianowski, L. C. Coyle, B. A. Weber, R. D. Granata, D. G.

9)

E. Edinger, A. Golzhauser, K. Demota, Ch. Woll, M. Grunze,(1991).

Castner, A. Sadowik, S. L. Regen, Langmuir, 5, 35 (1989).

Langmuir, 9, 4 (1993).
10) M. K. Chaudhury, G. M. Whitesides, Science, 255, 1230 (1992).
11) C. Duschl, M. Liley, G. Corradin, H. Vogel, Biophys. J., 67, 1229
(1994).
12) T. M. Bayer, M. Bloom, Biophys., J. 58, 357 (1990).
13) S. Heyse, H. Vogel, M. Sanger, H. Sigrist, Protein Sci., 4, 2532 (1994).
14) T. Stora, Z. Dienes, H. Vogel, C. Duschl, Langmuir, 16, 5471 (2000).
15) H. Lang, C. Duschl, H. Vogel, Langmuir, 10, 197 (1994).
16) U. Radler, J. Mack, N. Persike, G. Jung, R. Tampe, Biophys. J., 79,
3144 (2000).
17) M. Kuhner, R. Tampe, E. Sackmann, Biophys. J., 67, 217 (1994).
18) Y. Fang, A. G. Frutos, J. Lahiri, J. Am. Chem. Soc., 124, 2394 (2002).
19) P. S. Cremer, S. G. Boxer, J. Phys. Chem. B, 103, 2554 (1999).
20) J. T. Groves, S. G. Boxer, Biophys. J., 69, 1972 (1995).

６．おわりに以上、膜タンパクの機能解析に必要な膜アレイの作成法や概念についてご紹介した。膜アレイは、その機械強度やパターニングなどの点においてまだ改善すべき点も多い技術であるが、基本的に膜タンパクに応用できそうな段階に達しつつある。今後、膜タ
ンパクが網羅的に解析できるようになれば、数多くのオーファン受容体のリガンドの探索や、膜でのタンパクの反応様式などの解明が進むものと期待される。

21) J. T. Groves, S. G. Boxer, Acc. Chem. Res., 35, 149 (2002).
22) J. T. Groves, N. Ulman, S. G. Boxer, Science, 275, 651 (1997).
23) L. Kam, S. G. Boxer, J. Biomater. Res., 55, 487 (2001).
24) J. S. Hovis, S. G. Boxer, Langmuir, 16, 894 (2000).
25) E. Sackmann, M. Tanaka, TIBTECH, 18, 58 (2000).
26) J. S. Hovis, S. G. Boxer, Langmuir, 17, 3400 (2001).
27) L. Kung, J. T. Groves, N. Ulmann, Adv. Mater., 12, 731 (2000).
28) L. Kam, S. G. Boxer, J. Am. Chem. Soc., 122, 12901 (2000).
29) J. T. Groves, S. G. Boxer, H. M. Bertozzi, Langmuir, 17, 5129 (2001).
30) Y. Fang, A. G. Frutos, J. Lahiri, ChemBioChem, 3, 987 (2002).

15

News No.108(2003)

Topics on Chemistry
金ナノ粒子によって加速される酵素電極反応(株) 同仁化学研究所 渡辺
N

栄治

NH2

N
N

H

O

N

N
HOOC HN

S

H
N

N

O
B
HO O
O
-

e-

glucose
FAD

PQQ

NH

O P O
O

-

S

O

O

O

O

e-

Apo-GOx

O

N

O

N

O P O

gluconic acidGOx

H OHOHOH HN

H H H H H

O

Au

Au

Fig.1 PQQ-GOx 電極の模式図

Raitmanらは金基板上に固定化した導電性ポリマー(ポリアニリ
ンとポリアクリル酸の複合ポリマー)に FAD を化学結合し、ApoGOx と再構成することにより効率的な GOx 電極を得ている 3)。この電極での 30℃での電子移動速度定数は 1000 s-1 であり、酸素をアクセプターとした場合とほぼ同様の値であった。
最近、Xiao らは金ナノ粒子(Au-NP)を結合した GOx 電極に関して報告している 4)。 N6-(2- アミノエチル)- フラビンアデニンジ
ヌクレオチドと、一ヶ所だけ N- ヒドロキシスクシンイミドによって活性化された金ナノ粒子(1.4 nm) を反応させることにより、
FAD 修飾金ナノ粒子が得られる。これを Apo-GOx と再構成した
後、ジチオール単分子膜を介して金電極に固定化する、若しくは金基板に固定化した後、Apo-GOx と再構成するという 2 通りの。
方法により、Au-NP-GOx 電極が得られる（Fig.2）
Au-NP-GOx 電極のグルコース酸化電流は、グルコース濃度がGOx の Km 値の 2 倍の 120 mmol/l を超えても上昇を続けた。電子移動速度定数は 5000 s-1 であり、酸素をアクセプターとした場
合の約 7 倍の値を示した。金ナノ粒子を介した電子移動は酸素へのそれよりも非常に早いため、電流値は酸素濃度の変化や、アス
コルビン酸のような阻害物質によって影響を受けない。

酵素電極において酸化還元酵素と電極の効率的な電子授受は、バイオセンサーやバイオ燃料電池の開発に非常に重要である。効率的な電子移動を達成するため、電子メディエーターによる酵素の修飾や導電性ポリマーによる酵素の固定化などが試みられているが、その多くは電子移動速度は本来の電子アクセプターである
酸素には遠く及んでいない 1)。このような遅い電子移動は、メディエーターが最適な位置に修飾されていない、酵素の配向性が悪いなどのためであると考えられる。
このような問題を解決するため、Zayats らはグルコースオキシダーゼ(GOx)の補酵素である FAD にピロロキノリンキノン(PQQ)
を化学的に修飾した分子をチオール基を介して金電極に結合し、その後 Apo-GOx を再構成することにより、メディエーターの位置、酵素の配向性を高めた PQQ-GOx 電極を作製している(Fig.1)2)。25℃での電子移動速度定数（触媒反応のターンオーバー数）は 700 s-1 であり、これは酸素をアクセプターとした場合とほぼ同様の値である。PQQ-GOx 電極での酸化は PQQ の酸化還元電位で起こり、また PQQ 部位を含まない電極では GOx は電極と直接電子授受を起こさないことから、PQQがメディエーターとして働いていることが示されている。

NH

O

O

N
H

P
H
N

Au55

O

N

N

N
H

OH
N

N

OH

S

O

O
O

N
N

N

H H H H H

FAD修飾金ナノ粒子

Fig.2 Au-NP-GOx 電極の模式図

16

FAD

Au55

GOx

O

H OHOHOH H

P O
Oglucosegluconic acid
NH

P O
O

-

S

O

O
-

e-

e-

Au

News No.108(2003)

関連商品
これに対し、活性化金ナノ粒子と GOx をリジン残基を介してランダムに結合し、金電極上のジチオール単分子膜上に固定化した
GOx 電極では活性な酵素電極は得られなかった。また、金ナノ粒子を用いず、FAD 修飾電極と Apo-GOx を再構成して得た GOx
電極では、GOx 活性はあるものの電極との直接の電子授受は起こさなかった。
このように、メディエーターを補酵素と直結し、酵素の配向性を高めることにより、非常に高効率な酵素電極を作製することが可能である。バイオセンサーやバイオ燃料電池へ応用するためには、駆動電圧や電極の安定性などの課題はあるが 5)、今後の進展が大いに期待される。

脱水素酵素、酸化酵素の補酵素

PQQ
化学名

4,5-Dihydro-4,5-dioxo-1H-pyrrolo[2,3-f]quinoline2,7,9-tricarboxylic acid, monohydrate
O
HO
NH

O

OH
.H O
2

OH

N

O
O

O

C14H6N2O8•H2O=348.22

参考文献
1)

A. Badia et al., J. Am. Chem. Soc., 115, 7053 (1993).

2)

M. Zayats et al., J. Am. Chem. Soc., 124, 2120 (2002).

3)

O. A. Raitman et al., J. Am. Chem. Soc., 124, 6487 (2002).

4)

Y. Xiao et al., Science, 299, 1877 (2003).

5)

A. Heller, Nature BioTech., 21, 631 (2003).

＜特長＞• レスポンスが早く溶存酸素に影響されない脱水素酵素、酸化酵
素の補酵素• 生理活性を有するラジカルスカベンジャー• 半世紀ぶりに見いだされた新種のビタミン

PQQ は、グルコース脱水素酵素（GDH）の活性中心となっているため、糖尿病のスクリーニングにおいて注目されています。これまではグルコースセンサーとしては酵素の扱いやすさの面からグルコースオキシダーゼ (GOD) が広く用いられてきましたが、PQQ を補酵素とする GDH は GOD に比べレスポンスが早く、溶存酸素に影響されないこと5)が明らかとなり、実用化へ向けた研究が進められています 6)。
また、ラジカルスカベンジャーとしての生理活性を有している
こと7)や、
金基板に固定化し電子伝達のメディエーターとする電極
半世紀ぶりに見いだされた新種ビタミンとしても報告されたり8)、
新聞等で取り上げられるなど、その利用はますます広がり、今後の研究が期待されます。
参考文献
1)

J. G. Hauge, J. Biol. Chem.,239, 3630 (1964).

2)

J. A. Duine, J. Frank Jzn, J. K. van Zeeland, FEBS Lett., 108, 443 (1979).

3)

J. A. Duine, J. Frank Jzn, P. E. J. Verxiel, Eur. J. Chem., 108, 187 (1980).

4)

K. Kano. K. Mori, B. Uno, T. Kubota, T. Ikeda, M. Senda, Bioelectrochem.

Bioenerg., 23, 227 (1990).
5)

E. J. D'Costa, I. J. Higgins, A. P. F. Turner, Biosensors, 2, 71 (1986).

6)

K. Sode, S. Nakasono, M. Tanaka, T. Matsunaga, Bioelectrochem.

Bioenerg., 42, 251 (1993).
7)

P. M. Gallop, M. A. Paz, R. Fluckiger, E. Henson, Connect. Tissue Res.,29, 153 (1993).

8)

E. Katz, V. Heleg-Shabtai, A. Bardea, I. Willner, H. K. Rau, W. Haehnel,

Biosens. Bioelectron., 13, 741 (1998).

品名

容量

価格（￥）

メーカーコード

PQQ

10 mg

RequestP384

17

News No.108(2003)

新製品
G6PD 分析用キット
G6PD Assay Kit＜特長＞• ヘモグロビンと反応しない。
• 産生されたホルマザンは水溶性が高い。
• 特殊な機械を必要とせず、結果の確認が目視でできる。
• マラリア流行地のような電気が供給されていない地域でも測定ができる。
• MTTホルマザン法では測定できなかった20-50％程度の欠損者に対しても測定できる。
• マイクロプレートリーダーなどを利用して、少量の試薬で正確な酵素活性を定量的に測定できる。
＜はじめに＞
G6PD 異常症とは、グルコース 6 リン酸脱水素酵素(G6PD)の活性が著しく低いため、ヘモグロビンの変性が起こり、溶血性貧血の症状を呈する病気です。G6PD の構造を決定する遺伝子は X
染色体に存在し、伴性劣性遺伝の形式を取るため、発症はほとんどが男性です。世界中ではおよそ 4 億人が G6PD の異常遺伝子を持っているとみなされています。G6PD 異常症患者は、平素は無症状ですが、マラリア薬として使用されているプリマキンを服用
すると、溶血性貧血を引き起こしてしまいます。従って、マラリ
ア流行地域における住民の G6PD 異常症の確認は、大変重要な課題となっています 1)。
G6PD異常症の確認には、今日までに多くの方法が発表され、蛍光スポット法 2,3)、ホルマザン基質の 3-(4,5-dimethyl-2thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide（MTT）と発色試薬の phenazine methosulfate（PMS）を使ったホルマザン
法 4,5,6) などが知られています。しかしながら、いずれの方法でも種々の問題を抱えているのが実情です 7, 8)。
今回開発した G6PD Assay Kit は、ホルマザン基質である 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5- (2,4disulfophenyl)-2H tetrazolium monosodium salt (WST-8)を用いている為、へモグロビンと反応せず、G6PD 異常症を簡便に判定することが可能となりました(Fig. 1)。また、WST-8 のホル

G6PD
6-PG

G-6-P
NADP+
Formazan(orange color)

NADPH
WST-8

1-methoxy PMS

マザンは水溶性で 460 nm に最大吸収を有し、強い橙色を呈する
ため目視で発色結果の確認が出来ます。従って、マラリア流行地のような電気が供給されていない地域でも、電源や高価な機器類を一切必要とすることなく、その場で測定が可能です。更に本法は、MTT ホルマザン法では測定できなかった 20-50％程度の欠損者に対しても測定できるようになりました(Fig. 2)。また、電気が供給されている都市部では、マイクロプレートリーダーなどを利用して、少量の試薬で正確な酵素活性を定量することも可能です(Fig. 3)。

A

B

C

D

E

A: G6PD 欠損血液（＜ 0.1 IU/g Hb）
B: 2 IU (25% activity)
C: 4 IU (50% activity)
D: 6 IU (75% activity)
E: 正常血液 , 8 IU (100% activity)
Fig. 2 発色例 (25℃で 15 分間反応)＜キット内容＞• Substrate mixture• Dye mixture

2 ml × 5 本
2 ml × 5 本＊別途必要な器具・試薬は、20 µl, 1000 µl マイクロピペットとチップ、1.5

ml マイクロチューブ、蒸留水および 1 mol/l HCl です。

＜測定操作＞
1) 1.5 ml マイクロチューブに蒸留水 760 µl を入れ、これに Substrate mixture 20 µl と Dye mixture 20 µl をそれぞれ添加し、よく振り混ぜる。
2) 1)のチューブにサンプルの血液を 5 µl 添加し、5 秒間よく振り混ぜる。
3) 25℃〜 35℃で 15 分間インキュベートする。
4) 1 mol/l HCl を 10 µl 添加し、反応を止める。反応停止後、目視で溶液の発色を、ポジティブコントロール溶液＊１及び、ネガ
ティブコントロール溶液＊ 2 と比較し、活性を判定する。
＊ 1 ポジティブコントロール溶液は上記操作の中で操作 2 ）の血液に、G6PD の活性が正常値を示す血液を使用して用時調製する。
＊ 2 ネガティブコントロール溶液は上記操作の中で操作 1）で Substrate

mixture は添加せずに用時調製する。操作 2）で使用する血液はいず
Fig.1

18

G6PD 発色の原理

れでもよい。

News No.108(2003)

試作品
G6PD 分析用キット

ペルオキシダーゼ標識用キット

mol/l)

Peroxidase Labeling Kit - NH2〈特長〉• 3時間でペルオキシダーゼコンジュゲートを調製することが可能• 活性化およびブロッキング操作がない• 調製に必要なすべての試薬がキットに含まれている

ペルオキシダーゼは、エンザイムイムノアッセイ（EIA）や組織染色などに利用される最も一般的な酵素として知られています。
多くのペルオキシダーゼコンジュゲートが市販され、利用されていますが、研究の多様性から研究者が自らコンジュゲートを調製するケースが増えてきています。ペルオキシダーゼを標識する方
Fig. 3 血液サンプルの発色の時間的増大法はいくつか知られていますが、いずれも煩雑で、時間や経験を＜注意事項＞
要します。
1．本キットは、冷凍にて保存してください。品質の劣化を防ぐ為に、融解
本キットは、アミノ基を有する分子にペルオキシダーゼを標識後は冷蔵の場合は 1ヶ月以内に、常温の場合は 10 日以内にご使用下さするためのキットです。 Amine Reactive Peroxidase は、そのい。
構造内に活性エステル基を有しているため、アミノ基を有する目
2．多くの検体を測定する場合、操作 1）を簡略化するために Substrate
的分子と混合するだけで安定な共有結合を形成します。低分子化
mixture 2 ml と Dye mixture 2 ml を 76 ml の蒸留水で希釈し（Total
合物を本キットで標識する場合には、未反応の低分子化合物は付
80 ml）、1.5 ml のマイクロチューブに 800 µl ずつ小分けして保存され属の Filtration Tube を用いて容易に除去することができます。まることをお薦めします。希釈後も冷凍・遮光で保存して下さい。もし、 た、IgG のような分子量の大きい分子をサンプルに使用する場合、冷蔵で保存される場合は、必ず遮光し、3 日以内にご使用下さい。
ペルオキシダーゼ活性や標識反応を阻害するような低分子化合物
3．HCl を添加し、反応を停止することで、目視でも、正常値の 50％の活 （アジ化ナトリウムやトリスなど）は、Filtration Tube を用いた前性しか持たないサンプル血液も容易に判別することができます。
処理によって除去されます。本キットには標識に必要なすべての
4．マイクロプレートリーダーを用いれば、450-460 nm の吸光度を測定
試薬と作製したコンジュゲートを保存するための溶液が含まれてすることで、活性を数値化することが出来ます。その際は、より正確ないます。
分析の為に、血液中のヘモグロビン量を測定することをお薦めします。

〈キット内容〉

5．本品は試験研究用です。診断用には使用できません。

参考文献
1)

A. Ishii, et al., Japanese Journal of Parasitology, 43, 312 (1994) .

2)

E. Beutler, Blood, 28, 553 (1966).

3)

E. Beutler and M. Mitchell, Blood, 32, 816 (1968).

4)

V. Fairbanks and E. Beutler, Blood, 20, 591 (1962).

5)

H. Fujii, et al., Acta Haematologica Japonica , 47, 185 (1984).

6)

A. Hirono, et al., Japanese Journal of Tropical Medicine and Hygiene,26, 1 (1998).

7)

I. S. Tantular, et al., Tropical Medicine and International Health, 4,245 (1999).

8)

容量G6PD Assay Kit

500 assays

価格（￥） メーカーコード

29,000秋から冬の学会展示ご案内
次の学会において、試薬新製品の展示を行ないます。
皆様のお越しをお待ちいたしております。

A. Pujades, et al., Int. J. Hematol., 69, 234 (1999).

品名• Amine Reactive Peroxidase• Buffer A• Buffer B• Storage Buffer• Filtration TubeG233

• 日本生化学会第 76 回大会
10 月 16 日（木）〜 18 日（土）• 第 26 回日本分子生物学会年会
12 月 10 日（水）〜 13 日（土）パシフィコ横浜
神戸国際展示場

19

News No.108(2003)

新製品
残留塩素測定キット
残留塩素測定キット -SBT 法
残留塩素測定試薬 -SBT 法＜特長＞• 溶かす手間が不要な溶液タイプ• 判定しやすい青緑色の発色• DPD の約 2 倍の感度
• DPD より極めて低い毒性・変異原性• 簡単な操作の測定法

ただけるという優れた特色をもっております。
これまで残留塩素測定試薬として汎用されていたオルトトリジン
は、毒性が高いため、2000 年 4 月に上水試験公定法から削除され、現在 DPD が公定法として残留塩素測定試薬の主流となっています。ところが、溶液の安定性が悪い DPD は粉末タイプがほとんどで測定の度に開封し溶かす必要があります。特に浴場施設などでは１日に何度も測定が必要なため、この作業の繰り返しで非常に手間がかかっていました。
残留塩素測定キット -SBT 法は、溶液タイプですぐに測定ができるため、貴重な時間の節約のお手伝いができる新しい方法です。

小社が新しい残留塩素測定法として開発しました残留塩素測定キット -SBT 法は、簡単な測定法でどなたにも安心してご使用い＜操作方法＞
1) 2本の試験管それぞれに白線まで
検水(浴槽水、プール水など)を入れる。水位の調整は添付のスポイドで行ってください。

左側へ(検水そのまま)右側へ(薬剤添加の検水)

4) 色調比色計の向かって左側に検水だけが入った試験管を、右側に検水調整液、色素液を入れた検水の試験管を入れる。

2) 1つの試験管の検水に検水調整液(白キャップ)を2滴加え、軽く振り混ぜる（振り混ぜずに次の操作に進んだ場合、色が着かない場合があります)。
0.4

5) 2つの窓の色が同じになるように色調比色板を回す。

0.

5

m
0.6

3) 次いで、色素液(青キャップ)を1滴加え軽く振り混ぜる（残留塩素が含まれている場合、直ちに青緑色の溶液となります)。

6) 色調比色計のポイントが指す数値を読む(この数値が検水に含まれる遊離残留塩素濃度で、ppm表示となります)。

pp

↑
この数字が
残留塩素濃度↑この2つの窓の色を見る＜測定時の注意事項＞
・・・・

検水温度が高いと色が変化し判別しづらくなります。検水温度により比色板(標準4〜25℃、高温30〜35℃)を使い分けてください。
検水調整液、色素液は誤って多く加えても、測定には問題ありません。
色調比色板を使って比色する際は、蛍光灯などのあかりにかざして行ってください。
使用後の試験管は水で洗浄して保管してください。

残留塩素測定キット -SBT 法のお問合せ先のご案内
本製品は、株式会社同仁グローカルの開発製品です。
このためお手数ですが、本製品に関してのご購入・ご質問は、
現在、小社製品をお買い求めの和光純薬工業様、販売店様ではなく、直接、同仁化学研究所マーケティング部、カスタマー
サービス部へお問合せください。
TEL：096-286-1515
フリーダイヤル：0120-489548
E-mail：info@dojindo.co.jp

20

品名
容量
残留塩素測定キット -SBT 法

set
残留塩素測定試薬 -SBT 法
100 回用残留塩素測定試薬 -SBT 法
500 回用色素液
100 ml
検水調整液
200 ml価格（￥）

メーカーコード

7,000

ZK01-50

1,300

ZK01-60

5,000
9,000
5,000

ZK01-60
ZK01-70
ZK01-80

News No.108(2003)

お知らせ
容器および保存・輸送温度変更のお知らせ
訃 報

Cell Counting Kit - 8
このたび皆様にご好評の Cell Counting Kit- 8 の容器変更に伴い、保存・輸送温度も変更しました。
〈特長および変更点〉• 4℃で 3ヶ月が 12ヶ月とより長期安定に• ガラスからポリ容器になり、取扱いがより安全に• 冷凍から冷蔵になり、輸送・保管がより簡便に
今後ともご愛顧いただきますようお願いいたします。

Cell Counting Kit - 8

100 回用新旧Cell Counting Kit - 8

500 回用 /2500 回用新旧Cell Counting Kit - 8

品

名

新聞、
テレビ等の報道によりすでにご存知の事と存じますが、 小社 代表取締役社長 上野景右は 平成 15
年 9 月 16 日午後 0 時 2 分 不慮の事故により 54 歳にて急逝いたしました。
ここに生前のご厚誼を深謝し謹んでご通知申し上げます。
尚、
葬儀は故人のご家族のご意向により近親者にて相営みました。
また「お別れの会」を 9 月 30 日（火）熊本ホテルキャッ
スルにて相営みました。
ご繁忙の中にもかかわらずたくさんの方々にご来臨、弔電を賜り、まことにありがとうございました。
今後とも変わらぬご愛顧を賜りますようよろしくお願い申し上げます。

10,000 回用

新

旧

容量

価格（￥）

コード

メーカーコード

3,800
11,00032,00099,000341-07761
347-07621
343-07623

CK04
CK04
CK04
CK04

Cell Counting Kit-8
100 回用500 回用2,500 回用
10,000 回用

21News No.108(2003)

11 月 28 日開催

14th フォーラム・イン・ドージン

糖鎖生物医学：多様な糖鎖構造がつくりだす生物機能と病態
日 時／ 2003 年 11 月 28 日（金）9:30-17:40（開場 9:00）
場 所／鶴屋ホール（テトリア熊本[ 鶴屋東館]7F ・熊本市手取本町 6 ‐1 ）代表世話人／前田 浩（熊本大学大学院医学薬学研究部 微生物学分野）
当番世話人／山本 哲郎（熊本大学大学院医学薬学研究部 分子病理学分野）
主 催：株式会社 同仁化学研究所
後 援：株式会社 ケミカル同仁
セッション 1

9:45-10:45
セッション 2

10:45-11:30
11:30-12:15
12:15-13:30
セッション 3
13:30-14:15
14:15-15:00
15:00-15:45
15:45-16:00
セッション 416:00-16:45
16:45-17:30

参加費／無料
定員／ 300 名

糖鎖の構造とあらたな生物機能＜座長：前田 浩＞
谷口 直之 （大阪大学大学院医学系研究科 生体制御医学生化学）「糖鎖の構造とあらたな生物機能」
多様な糖鎖構造と細胞識別機能＜座長：川畑 俊一郎（九州大学大学院理学研究院）＞
入村 達郎 （東京大学大学院薬学系研究科 生体異物学教室）「ムチンとレクチンの免疫生物学」
成松 久 （産業技術総合研究所 糖鎖工学センター）「バイオインフォマティクスを利用した糖鎖遺伝子の網羅的解析」
昼食
糖鎖構造異常と病態（1）＜座長：山本 哲郎＞
浅野 雅秀 （金沢大学 学際科学実験センター 遺伝子改変動物分野）「糖鎖と炎症反応及び IgA 腎症−ガラクトース転移酵素遺伝子 KO マウスの解析から−」
古川 鋼一 （名古屋大学大学院医学系研究科 生物化学講座）「シアル酸転移酵素の異常による病態のメカニズム」
宮城 妙子 （宮城県立がんセンター・研究所 生化学部門）「シアリダーゼ異常とがん・糖尿病」
コーヒーブレーク
糖鎖構造異常と病態（2）＜座長：角田 佳充（九州大学大学院農学研究院）＞
本家 孝一 （高知医科大学 遺伝子病態制御学教室）「糖鎖硫酸化の異常による病態の分子機構」
遠藤 玉夫 （東京都老人総合研究所 糖蛋白質研究グループ）「糖鎖構造異常と先天性筋ジストロフィー」

問い合わせ • 申し込み先：
熊本県上益城郡益城町田原 2025-5( 株) 同仁化学研究所内フォーラム • イン • ドージン事務局（担当：蒲野 • 堀口）

E-mail:komine@dojindo.co.jp または d-hori@dojindo.co.jp◎講演終了後、ミキサー（無料）を同開場にて予定しております。（17:45-19:30）◎参加ご希望の方は、所属 • 氏名 • 連絡先(住所 ,TEL,FAX,E-mail) • ミキサー参加の有無をご記入の上、 E-mail または FAX にてお申し込みください。
◎駐車場は有料となりますので、できるだけ公共の交通機関をご利用ください。
Tel:0120-489548, Fax:0120-021557

ホームページアドレス
URL : http:// www. dojindo.co.jp/
E-mail : info@dojindo.co.jp

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ドージンニュース No.108

News No.108
220120-021557
0120-489548

平成15年10月10日発行

株式会社同仁化学研究所

DOJINDO LABORATORIES

熊本県上益城郡益城町田原2025-5 〒861-2202
発行責任者 石田和彦 編集責任者 斉藤素子

年４回発行

許可なくコピーを禁ず