Glycative Stress Research
Online edition : ISSN 2188-3610
Print edition : ISSN 2188-3602
Received : March 31, 2020
Accepted : April 20, 2020
Published online : June 30, 2020
doi:10.24659/gsr.7. 2_142

Original article

Effect of glycated human serum albumin on BMP2-induced
osteoblastgenesis in C2C12 cells
Rina Yamamoto 1), Wakako Takabe 1, 2), Masayuki Yagi 2), Yoshikazu Yonei 1)
1) Anti-Aging Medical Research Center and Glycation Stress Research Center, Graduate School of Life and Medical Sciences,
Doshisha University, Kyoto, Japan
2) Department of Materials and Life Science​, Faculty of Science and Technology​, Shizuoka Institute of Science and Technology​,
Shizuoka, Japan
Glycative Stress Research 2020; 7 (2): 142 -151
(c) Society for Glycative Stress Research（原著論文：日本語翻訳版）

Effect of glycated human serum albumin on BMP2-induced
osteoblastgenesis in C2C12 cells
山本理奈 1)、髙部稚子 1, 2)、八木雅之 1)、米井嘉一 1)
1) 同志社大学大学院生命医科学研究科アンチエイジングリサーチセンター／糖化ストレス研究センター
2) 静岡理工科大学理工学部物質生命科学科

抄録［目的］成熟した骨組織を除去する破骨細胞と新しい骨組織を形成する骨芽細胞による骨リモデリングは、骨量と骨質の維持に重要である。骨の恒常性が崩れると、骨折のリスクの上昇や、骨粗鬆症の発症に繋がる。糖化最終生成物である AGEs（advanced glycation end products）は糖尿病の合併症に関与し、糖尿病患者は健常者と比較して骨粗鬆症の罹患率が高い。本研究では糖化ストレスが骨芽細胞分化（骨芽細胞形成）に及ぼす影響について検証することを目的とした。

［方法］マウス筋芽細胞である C2C12 に骨形成因子である bone morphogenetic protein 2（BMP2）を添加する

ことで骨芽細胞へ分化させた。AGEs による骨芽細胞分化への影響は、細胞にヒト 血清アルブミン（HSA）とglyceraldehyde（glycer）を反応させて生成した AGEs（HSA - glycer）と BMP 2 を共添加し、骨芽細胞分化マーカーである alkaline phosphatase（ALP）、osteocalcin（ OC）発現レベルを定量的リアルタイム P CR を用いて評価することで行った。さらに骨芽細胞分化必須転写因子である runt related transcription factor 2（Runx2）
及び osterix の発現への AGEs による影響についても評価した。また BMP2 シグナル伝達経路の調節に関与する Smad 経路への影響については、Smad 1/5/9 のリン酸化をウエスタンブロット法を用いて検証した。最後に

連絡先： 准教授 髙部稚子
静岡理工学科大学理工学部物質生命科学科〒4 37-8555 静岡県袋井市豊沢 2200-2
TEL：0538-45-0164 e-mail：takabe.wakako@sist.ac.jp
共著者：山本理奈 rina12210210@gmail.com;
八木雅之 myagi@mail.doshisha.ac.jp;
米井嘉一 yyonei@mail.doshisha.ac.jp

Glycative Stress Research 2020; 7 (2): 142 -151
本論文を引用する際はこちらを引用してください。
(c) Society for Glycative Stress Research（ 1 ）Glycative Stress Research

骨代謝回転に対する AGE の影響を評価については、骨代謝回転の主要な指標である osteoprotegerin（OPG）とreceptor activator of NF- кB ligand（RANKL）の発現量の比率をもって評価した。
［結果］HSA-glycer は BMP2 による ALP 及び OC の発現誘導を阻害した。また HSA-glycer により転写因子の発現と Smad 1/5/9 のリン酸化が部分的に抑制された。HSA-glycer による RANKL/OP G 比の減少から、
AGEs が骨代謝回転の低下をもたらす可能性が示唆された。
［結論］本研究結果より AGEs は Smad 経路を介して BMP2 誘発性骨芽細胞形成を阻害する可能性が示唆された。

KEY WORDS : 糖化ストレス、advanced glycation end products（AGEs）、		

bone morphogenetic protein 2（BMP2）、骨芽細胞形成、骨粗鬆症、骨代謝回転

はじめに骨粗鬆症とは、骨量の減少と骨質の低下を特徴とする疾患をいう 1)。日本では 2015 年に 1,200 万人以上が骨粗鬆症に罹患しており 、患者は QOL 低下に繋がる骨折のリス2)クに直面している。骨粗鬆症は全世代の人々に影響を与える可能性があるが、50 歳以上の人々、特に閉経後の女性において最も罹患率が高い 3, 4)。 年齢以外に、 Schwartz らの研究より、Ⅱ 型糖尿病の高齢女性は非糖尿病女性よりも骨な減少と骨質の低下をもたらす。我々の以前の研究では、

RAW264.7 細 胞 に お い て ヒト 血 清 ア ル ブ ミ ン（HSA）とglyceraldehyde から生成された AGEs が、receptor activatorof nuclear factor kappa-B ligand（RANKL）によって誘導される破骨細胞分化（破骨細胞形成）を阻害することを示した 20)。骨吸収以外にも、成熟破骨細胞は、transforming

growth factor beta（TGF-β）や bone morphogenetic protein 2

折率が高いことが示されている 5, 6)。骨強度において、骨量（BMP2）などの骨芽細胞分化（骨芽細胞形成）を調節 する

タ解析では Ⅱ 型糖尿病患者は健常者と比較して BMD が

AGEs は破骨細胞形成阻害だけでなく骨芽細胞形成にも影（または骨密度、BMD）と骨質の両方が重要であるが、メ7)正常または高いことが報告されている 。これらのことか

ら骨質の低下に対する糖尿病の寄与を明らかにするために多くの研究が行われてきた。
糖尿病は血中グルコース濃度が慢性的に高い症状をいう。

サイトカインを分泌する 21)。これらの結果から、我々は響を与えることで、結果、骨リモデリングの遅延及び骨質の低下に関与している可能性を考えた。

BMP は、TGF-β ファミリーサイトカインに属し、特に BMP2 は骨芽細胞形成においてよく知られている 22)。

酵素的架橋構造を形成する 16)。一 方、骨粗鬆症や糖尿病の

BMP は、Smad 依 存 性 ま た は 非 依 存 性 シ グ ナ ル 経 路 の両方を介して骨芽細胞形成を誘導する 23)。 Smad 依存経路
では、分泌された BMP2 が II 型受容体に結合すると、活性化した II 型受容体キナーゼによって I 型受容体がリン酸化され、その後、シグナルは Smad 蛋白質へ伝達される。
リン酸化された Smad 1/5/8 は、アルカリホスファターゼ（ALP）やオステオカルシン（OC）などの骨芽細胞特異的
蛋白質、および Runx2、osterix、Dlx5 などの骨形成転写。また、Shiraki らにより、いくつかの研究より、AGEs が酸化ストレスを介して過剰な血糖は非酵素的に蛋白質と反応し、糖化最終生成物（AGEs）を生成する。AGEs の蓄積は骨粗鬆症を含む 14)

複 数 の 疾 患 に 関 与 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る 8-13)。
最近では、Takeuchi らがフルクトーシスより合成される

glyceraldehyde はグルコースより毒性の高い AGEs を形成することを報告している 15)。骨組織の骨質の維持において主要な蛋白質である I 型コラーゲンは、転写後修飾として患者では、AGEs により不要な骨コラーゲンの架橋構造を形成し、骨の弾力性が失われる

17)

蛍光性架橋型 AGEs であるペントシジンは、骨粗鬆症における脊椎骨折の発生率の独立した危険因子であることが報告されている。これらのデータは AGEs の蓄積が骨質の18)低下に関与している可能性を示唆している。

骨リモ デリングは、骨の恒常性の維持にも重要である。
成熟した骨組織が破骨細胞によって除去された後、新しい骨組織は骨芽細胞によって形成され、毎年骨組織の約10 % が新しい組織へと生まれ変わる 19)。このような破骨細胞と骨芽細胞の働きのバランスの乱れは、骨量の大幅因子の発現を調節する24-26)。

骨芽細胞の細胞死を誘導することが報告されており27-29)、

McCarthy らの研究では、2 つの異なる骨芽細胞様細胞において、ウシ血清アルブミン（BSA）とグルコース（AGEBSA）から生成された AGEs を数日間添加することにより細胞増殖と ALP 活性が阻害されたことを報告している30) 。
しかし細胞死誘導のない条件下での AGEs による骨芽細胞
形成への影響に関する報告は少ない。本研究では、細胞毒性を示さない AGEs が BMP2 誘発性骨芽細胞形成に及ぼす影響について検証を行った。

（ 2 ）Effect of Glycated Protein on Osteoblastgenesis.

材料・方法
材料
ヒト/ ラット/ マウスの リ コ ン ビ ナ ント 蛋 白 質 で あ る

BMP2 は、R ＆ D systems（Minneapolis, MN, USA）から入手した。ヒト血清アルブミン（HSA）は Sigma-Aldrich（St.
Louis, MO, USA）から購入した。上記以外は Wako（Osaka,
Japan）より入手した。

細胞培養

マウス筋芽細胞である C2C12 細胞は、American Type
Culture Collection（Manassas, VA, USA）から購入した。
細 胞 は 10 % ウ シ 胎 児 血 清（Sigma-Aldrich）と 抗 生 物 質（Wako）を 含 む 高 グ ル コ ー ス（DMEM, Wako）を 含 む
Dulbecco’s Modified Eagle 培地で、37 ℃ で 5 % CO 2 の条件下で培養した。

GAT C - 3 ′(forward), 5 ′- AGC TGC AAG CTC TCTGTA ACC ATG AC - 3′(reverse); Osterix, 5 ′- CGT CCTCTC TGC TTG AGG AA -3 ′(forward), 5′- GGG CTGAAA GGT CAG CGT AT - 3 ′(reverse); Runx2, 5’- CAG
TCC CAA CTT CCT GTG CT - 3 ′(forward), 5 ′- CCC
ATC TGG TAC CTC TCC GA - 3′(reverse); GAPDH,
5′- TGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT TGG C - 3 ′(forward), 5 ′- CAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC
CAC - 3′(reverse); Receptor activator of N F- к B ligand(RANKL), 5 ′- AGC CAT TTG CAC ACC TCA CC - 3 ′(forward), 5′- AAG CAA AT G ATT GGC GTA CAG
G - 3 ′(reverse); Osteoprotegerin (OPG), 5 ′- AGT GTG
AGG AAG GGC GTT AC - 3 ′(forward), 5′- AAT GTGCTG CAG TTC GTG TG - 3 ′(reverse) .

ALP 染色

糖化物を除去するために、遠心フィルター（10K, Merck
Millipore Burlington, MS, USA）を使用して限外濾過し、蒸留水を使用して 3 回洗浄した。

12 well プレートに C2C12 を 8 × 10 3/ well で播種した。
24 時間後、400 ng/mL BMP2 および 糖化 HSAを添加し、さらに 72 時間 インキュ ベ ートした。ALP 活性の測定には、Alkaline Phosphatase Staining Kit（Cosmo Bio Ltd.
Tokyo, Japan）を用いた。刺激後、細胞を PBS で 3 回洗浄した後、10 % ホルムアルデヒドで室温にて 10 分間固定した。蒸留水で洗浄した後、細胞をALP 活性溶液とともに
37 ℃ で 20 分間インキュベートした。細胞の染色画像は、
位相差顕微鏡（CKX41, OLYMPUS corp. Tokyo, Japan）
で観察し、cellSense software（OLYMPUS corp. ）を搭載
した digital camera（DP21, OLYMPUS corp. ）で撮影した。

細胞生存率の決定

ウエスタンブロット解析

糖化蛋白の調製

糖化蛋白は、ヒト血清アルブミン（HSA）とglyceraldehydeにより調製した。50 mmol / L リン酸緩衝液（PB, pH 7.4）
中 の HSA（8 mg/mL） お よ び 33 mmol/ L glyceraldehyde

を 60 ℃ で 4 0 時間インキュベートした。またコントロールとして glyceraldehyde を添加せず 60 ℃ で 40 時間イン
キュベートした加熱 HSAも作成した。反応後、未反応の細胞生存率を測定するため、Cell Counting Kit-8（Dojindo,

Kumamot, Japan）を用いて WST- 8 assay を行った。データ
は水処理または溶媒処理による細胞生存率を示す。

RNA 抽出および定量的リアルタイム PCR 解析

24 well プ レ ー ト に C2C12 を 4 × 10 3/ well で 播 種 した。24 時間後、設定濃度と時間において、細胞を BMP2 、糖化 HSA で刺激した。次に細胞を PBS で 1 回洗浄した
後、400 µL の ISOGEN II（Nippon Gene, Tokyo, Japan）
を 用 い て RNA を 抽 出 し た。RNA 量 は Nanodrop 2000
（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA）により測定した。逆転写は Applied Biosystems 2720 Thermal cycler（Thermo Fisher Scientific, MA）
を使用し、PrimeScript T M
RT Master Mix（Takara Bio Inc., Shiga, Japan）に 500 ngの RNAを加えて行った。定量的リアルタイム PCR（qPCR）
は、Thunderbird TM SYBR qPCR mix（Toyobo Co.,
Osaka, Japan） 及 び 遺 伝 子 特 異 的 プ ラ イ マ ー（Thermo
Fisher Scientific）を用いて行った。使用したプライマー
は 以 下 の 通 り で あ る：Alkaline phosphatase (ALP), 5 ′GAT CAT TCC CAC GTT TTC AC - 3 ′(forward), 5 ′TGC GGG CTT GTG GGA CCT GC - 3 ′(reverse);
Osteocalcin (OC), 5 ′- CCT CTC GAC CCG ACT GCA

12 well プレートに C2C12 を 5 × 10 4 / well で播種し、24 時間インキュベートした。次に、400 ng/mL BMP 2 、
糖 化 HSA ま た は 加 熱 HSA を 添 加 し、 任 意 の 時 間 刺 激を 行 った。 蛋 白 質 は、50 mmol/L Tris -HCl（ pH 7.4 ）、150 mmol / L NaCl 、0.1%SDS 、1% Triton X-100 を含む
RIPA buffer に プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 剤（Wako）及 び ホ ス
ファター ゼ 阻 害 剤 （ Roche Applied Science, Penzberg,
Germany）を用いて抽出した。細胞溶解物はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）（ 8 % polyacrylamide）で電気泳動した後、抽出した蛋白質
を polyvinylidene difluoride（PVDF）膜に転写し、TBS-Tの 5 % ス キ ム ミ ル ク 溶 液 で ブ ロ ッ キ ン グ し た。 次 に、膜を各一次抗体でブロットした。 Runx2、phospho-Smad
1/5/9 、 および Smad 1 抗 体 は cell signaling technology（Danvers, MA, USA） か ら、anti- GAPDH は Abcam（Cambridge, UK ）、 anti-β-acti n は Sigma-Aldrich か ら
購 入 し た。 一 次 抗 体 に 対 応 し た 二 次 抗 体（Santa Cruz
Biotechnology, CA, USA）を用いた後、chemiluminescencehorseradish peroxidase（HRP）により検出した。各実験のデータは 3 回行って同じ傾向であったもののうち、1 つを示した。Image J を使用して、蛋白質のバンド強度を測定し、蛋白質の発現量を評価した。

（ 3 ）Glycative Stress Research

統計処理

Tukey-Kramer による多重比較検定により統計解析を行った。誤差は、0. 05 未満の p 値で有意であるとした。

によりその発現上昇が抑制された。Glyceraldehyde を添加せずに 60 ℃ 40 時間インキュベートした加熱 HSAでは、

BMP2 による osterix の mRNA 発現誘導への影響は認められなかった。また BMP2 による Runx2 の mRNA 発現誘導
も HSA-glycer により抑制されたが、加熱 HSA では抑制さ結果れなかった（Fig. 3-b）。さらに Runx2 の蛋白質発現量につC2C12 細胞における BMP2の刺激時間およびが、 加熱 HSA では変化はなかった （Fig. 3-c）。これらのいても検証したところ、HSA-glycer によって抑制された

刺激濃度依存的な骨芽細胞形成への誘導

はじめに C2C12 細胞の骨芽細胞への分化条件を検証した。細胞に 400 ng/mL BMP2 を任意の時間刺激を与え、
qPCR を行った（Fig. 1-a）。骨芽細胞分化の初期マーカーである alkarine phosphatase（ALP）と成熟骨芽細分マーカーである osteocalcin（OC）の mRNA 発現量は、時間依存的に誘導された。次に C2C12 細胞を設定した BMP2濃度において刺激を与え、72 時間インキュベートした後、qPCR を行った。 ALP 及び OC の mRNA 発現量は、濃度依存的に誘導された（Fig. 1-b）。特に 300 ng/mL 以上の濃度では、BMP2 はこれらの mRNA 発現量を大幅に誘導した。さらに C2C12 細胞に対する BMP2 添加による ALP
活性への影響を検証するために、ALP 染色を行った。Fig.
1- c に示すように、ALP 活性は 400 ng/mL BMP2 によって刺激後 72 時間で ALP 発現誘導が確認された。したがって以降の実験においては、C2C12 細胞の骨芽細胞形成の条件を、BMP2 の刺激条件を刺激濃度 4 00 ng/ml、刺激時
間 72 時間とした。

データより HSA-glycer が骨芽細胞分化調節転写因子の発現にも影響を与えることが示唆された。

C2C12 細胞における糖化 HSA による
BMP2 誘導性 Smad リン酸化の阻害

BMP2 シグナル伝達経路は Smad 経路によって部分的に制御されている 31)。一般的な BMP シグナル伝達経路では、BMP の I 型受容体と II 型受容体が二量体を形成し、II 型受容体がリン酸化して I 型受容体を活性化する。その後、I 型受容体が Smad 1/5/8 をリン酸化する（Smad 8 は
Smad 9 としても知られる）。本実験では BMP2 によって誘導される Smad 経路に対する HSA-glycer の影響を検証することを目的とした。400 ng/mL BMP2 を添加後 24 時
間で Smad 1/5/9 のリン酸化が誘導されるが、400 µg/mL
HSA-glycer を BMP2 と同時添加した場合にはリン酸化
は有意に抑制された（Fig. 4）。これらのデータより HSAglycer に含まれていた AGEs が骨芽細胞形成の初期段階へ影響を与えている可能性が示唆された。

BMP 2 誘発性骨芽細胞形成における糖化 HSAの影響

骨リモデリングを調節する BMP 2 誘発性
サイトカインへの糖化蛋白の影響

72 時間の glyceraldehyde 由来の糖化 HSA（HSA-glycer）の処理では、最高濃度 400 μg/mL では細胞死誘導は確認されなかった（Fig. 2-a）。次に骨芽細胞形成に対する HSAglycer の 影 響 を 評 価 す る た め、C2C12 細 胞 に BMP2 とHSA-glycer を同時に添加した。 C2C12 細胞を 400 ng/mL
BMP 2 と濃度の異なる HSA-glycer を添加し、72 時間後、
qPCR を行った。BMP2 によって発現誘導された ALP 及
び O C の mRNA は、HSA-glycer によって発現抑制された（Fig. 2-b）。また ALP 染色においても、HSA-glycer により BMP 2 誘導性の ALP 活性上昇が抑制された（Fig. 2-c）。
これらのデータより、HSA-glycer が BMP2 誘発性骨芽細ことを示唆している。 骨リモデリングには破骨細胞形成

最初に WST- 8 を用いて糖化蛋白の細胞毒性を評価した。

胞形成を抑制することが示された。

糖化 HSA の骨芽細胞分化調節転写因子の発現 への影響
骨 芽 細 胞 分 化 調 節 転 写 因 子 と し て runt relatedtranscription factor 2（Runx2）や osterix のようないく

つかの主要な転写因子が同定されている 25) 。本実験では、

HSA-glycer が Runx2 と osterix の発現に与える影響を検証 し た。Fig. 3-a に 示 す よ う に、400 ng/mL BMP2 は、
osterix の mRNA 発現を誘導し、400 µg/mL HSA-glycer

我々のデータは HSA-glycer が骨芽細胞分化を抑制するも重要な要素となる。骨芽細胞は破骨細胞形成において重要な役割を果たすサイトカインである osteoprotegerin（OPG）と receptor activator of NF- к B ligand（RANKL）を分泌する。破骨細胞前駆細胞における RANKL とその受容体 RANK との結合は破骨細胞形成の引き金となり、OPG はデコイ受容体として働き、RANKL と RANK との結合を妨げる。このように破骨細胞形成に対する OPG はRANKL と相反する働きを担うことから、RANKL/OPG
比は骨代謝回転の主要な指標とされている。そこで HSAglycer が OPG および RANKL の発現に与える影響について qPCR を用いて評価した。C2C12 細胞を 400 ng/mL
BMP2 および 400 µg/mL HSA-glycer で 48 時間処理した
後、qPCR を行った。Figs. 5-a 及び b で示すように、HSAglycer に よ り RANKL の mRNA 発 現 量 は 減 少 し た が（Fig. 5-a）、そ の 一 方 で OPG の mRNA 発 現 量 は 変 化 がなかった（Fig. 5-b）。したがって HSA-glycer 添加により
RANKL/OPG 比が減少したことから、HSA-glycer は破骨細胞形成をも遅延させる可能性が示唆された。

（ 4 ）Effect of Glycated Protein on Osteoblastgenesis.

a)c)Relative
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Relative
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number4［ / 104［］/GAPDH10 4 GAPDH］［ / 10 GAPDH ］

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2025
20
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15
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0

24

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h］
h］

120

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100
80
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＊＊

40
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＊＊
＊＊

d)

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0

24

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00

2424

4848

7272［［
h］
h］

BMP2

PBS
PBS

BMP2
BMP2

＊＊
＊＊
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2025
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＊

15
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100

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200

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［ng/mL］
400［ng/mL］

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100
120

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＊＊

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20020
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PBS

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30
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00

＊＊

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100
120

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e)

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30
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00

b)

30

＊＊

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Relative
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30

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100

00

100
100 200
200 300
300 400
400［ng/mL］［ng/mL］

200

300

400 ［ng/mL］

Fig. 1. BMP2 increases the expression levels of ALP and OC in C2C12 cells.
(a, b) Sucrose (Suc). Time-dependent induction of ALP and OC, the markers of osteoblastgenesis, by BMP2. C2C12 cells were treatedwith 400 ng/mL BMP2 for up to 72 h. Quantitative real-time PCR (qPCR) analyses were performed for (a) ALP and (b) OC. All dataobtained were normalized by GAPDH and shown as the mean ± SD (n = 6). ** p < 0.01 vs. Time 0. (c, d) Concentration-dependent
induction of ALP and OC by BMP2. C2C12 cells were treated with up to 400 ng/mL BMP2 for 72 h. The expression levels of (c) ALP
and (d) OC. All data obtained were normalized by GAPDH and shown as the mean ± SD (n = 6). * p < 0.05, ** p < 0.01 vs. 0 ng/mL
BMP2. (e) BMP2 induced ALP activity in C2C12 cells. C2C12 cells were treated with 400 ng/mL BMP2 for 72 h. ALP staining were

performed to determine ALP activity. The images shown are representative of three independent experiments with similar results. Bar,100 μm. BMP2, bone morphogenetic protein 2; ALP, alkaline phosphatase; OC, osteocalcin; PCR, polymerase chain reaction; GAPDH,
glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; SD, standard deviation.

（ 5 ）Glycative Stress Research

140
140 140140
120
120 120
120
100
100 100
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80
80 80
80
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60 60
60
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40 40
40
20
20 20
20
0
0
0
0
HSA-glycer
0
HSA-glycer 00
HSA-glycer［µg/mL］
HSA-glycer［µg/mL］ 0［µg/mL］［µg/mL］

d)no additionno addition
nonoaddition
addition% control% control% control% control

a)

50
50 50
50

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number［ / 104 4 GAPDH
］
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10/ 10GAPDH］ ］
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40
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［ / 10 4 GAPDH ］

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100 100
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number［ / 104 4 GAPDH
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4
GAPDH
［ /［
10/ 10GAPDH］ ］
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number200
200 200
200
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150 150
150

0

0
0

0

BMP2
BMP2
BMP2
BMP2

BMP2+HSA-heated
BMP2+HSA-heated
BMP2+HSA-heated
BMP2+HSA-heated

100
200
300
400
100 100 200 200 300 300 400 400
100
200
300
400

BMP2
BMP2
BMP2
BMP2

＊＊
＊＊ †
＊＊
＊＊
†† †
＊＊
＊＊
＊＊
＊＊

100
100 100
100

BMP2+HSA-glycer
BMP2+HSA-glycer
BMP2+HSA-glycer
BMP2+HSA-glycer†††† †††††††† ††
††
†† ††
††
††

50
50 50
50

0
0
0
0
HSA-glycer
0
HSA-glycer
HSA-glycer［µg/mL］ 0 0 0
HSA-glycer［µg/mL］［µg/mL］［µg/mL］

400
400 400400†††††††† †††††††††††† ††
††
††
††
††
††

20
20 20
20

c)

300
300 300
300

＊＊
＊＊
＊＊
＊＊

30
30 30
30

0
0
0
HSA-glycer
0
HSA-glycer
HSA-glycer［µg/mL］ 0 0 0
HSA-glycer［µg/mL］［µg/mL］［µg/mL］

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200 200
200

0

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0

0

100
200
300
400
100 100 200 200 300 300 400 400
100
200
300
400

BMP2
BMP2
BMP2
BMP2

Fig. 2. Glyceraldehyde-derived glycated HSA suppress BMP2-induced ALP and OC in C2C12 cells.
(a, b, c) C2C12 cells were treated with glyceraldehyde-derived glycated HSA (HSA-glycer) up to 400 μg/mL for 72 h with or without
400 ng/mL BMP2. (a) WST-8 assay was performed to determine cytotoxicity of HSA-glycer (n = 6). (b, c) Effect of HSA-glycer on
BMP-2 -induced mRNA expression of (b) ALP and (c) OC. All data obtained were normalized by GAPDH and shown as the mean ±SD (n=6). ** p < 0.01 vs. without BMP2. † p < 0.05, †† p < 0.01 vs. BMP2 without HSA-glycer. (d) Effect of glycated HSA on BMP-

2 -induced ALP activity. C2C12 cells were treated with 400 μg/mL HSA-glycer or HSA-heated and 400 ng/mL BMP2 for 72 h. ALP
activity was examined by ALP staining assay. The images shown are representative of three independent experiments with similar
results. Bar, 10 0 μm. HSA, human serum albumin; BMP2, bone morphogenetic protein 2; ALP, alkaline phosphatase; OC, osteocalcin;
WST- 8, 2- ( 2- methoxy- 4 - nitrophenyl) - 3 - (4 - nitrophenyl) -5 - ( 2, 4 - disulfophenyl)-2H - tetrazolium; GAPDH, glyceraldehyde
3-phosphate dehydrogenase; SD, standard deviation.

（ 6 ）Effect of Glycated Protein on Osteoblastgenesis.
on
iti
on

ad n
n o itio
d
ad
no

a)
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Relative
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numberRelative［ / 10 6 number
GAPDH ］
6
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GAPDH］ ］
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BMP2

BMP2
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HSA-glycer

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A
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r

no

+ +
HSA-glycer- + - +
BMP2
Fig. 3. Glyceraldehyde-derived glycated HSA inhibit the expression of transcription
factors regulate osteoblastgenesis.
no

a

i
dd

no

a

i
dd

HS

A-

a
he

HS

g
A-

l yc

Fold change

pSmad
1/5/9for
BMP2
C2C12 cells were treated with 400 μg/mL
HSA-glycer or HSA-heated and 400 ng/mL BMP2 for 48 h. qPCR analysis
were performed
1.5(a) Osterix and (b) Runx2. All data obtained were normalized
by GAPDH and shown as the mean ± SD (n = 4). * p < 0.05, ** p < 0.01
vs. no addition. † p < 0.05,†† p < 0.01 vs. BMP2. (c) Samples (30 μg of proteins) of the crude extract were used for western blot analysis
BMP2using antibody against Runx2. The bars show the mean ± SD (n = 3) of the ratio against BMP2. ** p < 0.01 vs. BMP2.
Smad††1p < 0.01 vs.
1
BMP2
with HSA-heated.
HSA, humanserum albumin; glycer,
glyceraldehyde; BMP 2, bone morphogenetic protein 2; PCR, polymerase
no addition
HSA-heated
HSA-glycer＊＊
chain reaction; qPCR, quantitative real-time PCR; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase;SD, standard deviation.

Runx2
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-

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BMP2
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BMP2
10
5

Smad 10ß -actin

BMP2

-

-

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+

HSA-glycer

-

+

-

+

25

Fig. 4. Effect of glyceraldehyde-derived glycated HSA on BMP2-induced Smad phosphorylation.
＊＊†

Fold change

C2C12 20
cells were treated with 400 μg/mL HSA-glycer and 400 ng/mL BMP2 for 24 h. Samples (20 μg of proteins) of the crude
extract were used for western blot analysis using antibody against phosphor-Smad 1/5/9, Smad 1 and β-actin. The bars show the＊＊mean ± 15
SD (n = 3) of the ratio against no addition. ** p < 0.01 vs. no addition. † p < 0.05 vs. BMP2. HSA, human serum albumin;
glycer, glyceraldehyde; BMP2, bone morphogenetic protein 2; SD, standard deviation.
10
5
0

（ 7 ）

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H

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Glycative
Stress Research
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BMP2

BMP2
BMP2
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A -- hHSSA
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A -- gl
HSSA
H

BMP2
BMP2
2

FoldchangechangeFold

2Fig. 5. Glyceraldehyde-derived
glycated proteins inhibited BMP2-induced RANKL, but not OPG.

考察

C2C12 cells were treated with 400 μg/mL HSA-glycer and 400 ng/mL BMP2 for 48 h. qPCR analyses were performed for (a) RANKL and
1.5 (c) The ratio of RANKL /OPG. All data obtained were normalized by GAPDH and shown as the mean ± SD (n = 4). ** p < 0.01(b) OPG.
1.5
vs. BMP2. †† p < 0.01 vs. BMP2 with heated-HSA. HSA, human serum albumin; BMP2, bone morphogenetic protein 2; RANKL, receptor
glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; SD, standard deviation.
activator of NF- кB ligand; OPG, osteoprotegerin; GAPDH,
＊＊
1
＊＊
1

††
††

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tio n
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lyycc ediitiohgeld骨粗鬆症は、骨量及び骨質の低下による骨強度の低下が
a dd
A -h
A -g
HSSA
n oo aHSSA
HnH
QOL を低下させる。
原因とされ、骨折につながり高齢者の骨粗鬆症は閉経後の女性だけでなく糖尿病患者に罹患率が
BMP2
BMP2

高いことから、高血糖状態が続くことにより生じる AGEs
及び、AGEs によって引き起こされる糖化ストレスと骨粗鬆症の関連について研究がなされている。骨質の維持には骨芽細胞と破骨細胞のバランスが保たれたスムーズな骨リモデリングが重要である。本研究では糖化ストレスが骨質

BMP2 依存的に骨芽細胞のマーカーである ALP 、OC の発現及び石灰化が観察された（Fig. 1）。この条件下において、糖化蛋白の影響を検証した。今回用いた AGEs は、フルクトース代謝の過程で生じる glycelaldehyde 33) と、ヒト
血液中に最も多く含まれる蛋白である HSA から生じた
glycelaldehyde 由来の糖化蛋白（HSA-glycer）である。本
研究結果は、HSA-glycer が BMP2 誘導性の骨芽細胞分化マーカー及び ALP 活性を抑制することを示した（Fig. 2）。
その他の研究においても、マウスの骨髄から単離した間質細胞である ST2 細胞について、ウシ血清アルブミンに与える影響について、特に骨芽細胞が分化する過程に着（BSA）と反応させた glycelaldehyde 由来の AGEs が、OC

Katagiriet ら の 研 究 より、マ ウ ス の 筋 芽 細 胞 で あ る
C2C12 は BMP2 刺激により骨芽細胞へ分化することが報
告されており 32)、本実験においても C2C12 細胞においてすることが報告されている 34) 。また glycolaldehyde にお目し C2C12 細胞を用いて検証した。

の mRNA の発現抑制及び ALP の活性抑制、石灰化を抑制

いても、Notsu らが BSA と反応させて得られた AGEs が、ST2 細胞において石灰化の抑制及び O C mRNA の発現を（ 8 ）

Effect of Glycated Protein on Osteoblastgenesis.

抑制することを報告している 35)。以上の報告より、本研究と骨代謝の指標である RANKL/OPG 比 40, 43, 44) を検証した

使用した細胞は異なるが、血清アルブミンとglyceraldehyde（Fig. 5）。RANKL は、骨細胞及び骨芽細胞から産生され制を誘導することが報告されている。しかしその 一 方でOPG は破骨細胞分化抑制因子である。骨芽細胞と破骨細胞抑制だけでなく細胞死誘導への関与することが示されたが

RANKL/ OPG 比が一定であることが必要と考えられるが、本研究結果からは、HSA-glycer 添加により RANKL/OPG
比は減少した（Fig. 5-c）
。RANKL /OPG 比の値が低い場

及 び glycolaldehyde 由 来 の AGEs は 骨 芽 細 胞 の 分 化 抑Glyceraldehyde や glycolaldehyde 由 来 の AGEs は toxic
AGE とも呼ばれ、細胞障害を呈することが報告されている 36, 37)。先に述べた ST2 細胞では、AGEs が骨芽細胞分化34, 35)、本実験で用いた糖化蛋白は細胞毒性を示さなかった（Fig. 2-a）
。これは、主に糖化条件が異なることに由来していると考えられる。今回の我々の結果から、骨芽細胞分化過程の AGEs による抑制には細胞傷害による影響は少ないと考えられた。

骨芽細胞分化に必須の転写因子としては Runx2 や osterixが知られている。Runx2 は OC や collegen type I の発現調る破骨細胞分化促進因子であり、骨芽細胞から産生されるからなる骨形成リモデリングのバランスを保つためには、合、破骨細胞分化が抑制されることで骨吸収が遅くなり、
その結果、骨代謝は遅くなると考えられる。骨代謝回転の遅滞は、骨質を下げ骨強度が低下する原因となるとされている。事実、糖尿病を有しており骨粗鬆症に罹患する患者の RANKL/ OPG 比の減少が確認されている 41, 43) 。

最後に、本研究では HSA-glycer が骨芽細胞分化を抑制することを示したが、我々は同じ HSA-glycer が、マウス

節に関与することが報告されている 38)。Osterix は、Runx2

由来マクロファージ様細胞 RAW264.7 の RANKL 誘導性

らは Runx2 ノックアウトマウスの間葉系細胞においてもを合わせると、glyceraldehyde 由来の糖化蛋白は骨芽細胞によって調節を受けることが知られているが 39)、Matsubara

osterix の発現があることを報告している 。このことか40)

ら osterix の発現メカニズムには Runx2 依存性及び非依存

破骨細胞分化をも抑制することを報告している45) 。これら

分化と破骨細胞分化両方を抑制し、結果、低回転型骨代謝を促すことが考えられた。

当研究室ではこれまでに 500 種類以上の植物から AGEs

性の両方の発現経路があると考えられている。本研究ではHSA-glycer が Runx2 及び osterix の発現に与える影響について検証した（Fig. 3）。その結果、Runx2 発現は mRNA、
蛋白質ともに glyceraldehyde 由来の AGEs により 20 % ほ
どの弱い発現抑制を受けた（Fig. 3-b, c）。しかしながらその一方で、osterix の mRNA 発現は、50 % 以上の発現抑制が観察された（Fig. 3-a ）。このことから、Runx2 非依存的なosterix の発現誘導メカニズムもAGEs によって制御されている可能性が考えられた。

Miranda らの Ⅱ 型糖尿病と骨粗鬆症を併発している患者を対象に実施された臨床試験においても、健常者に比べの生成抑制作用を持つ植物を見出している。現在までに様々な骨粗鬆症治療薬が上梓されているが、 我々は AGEs が骨リモデリングの異常を起こすことで骨粗鬆症の発症に関与しているという観点から、AGEs の生成抑制作用を持つ

植物の効果を今後検証していく予定である。

結論
本研究では glyceraldehyde 由来の糖化蛋白質が、 Smad

糖尿病患者は Runx2 及び osterix の発現抑制が観察されて経路の阻害を介して BMP2 誘発性骨芽細胞形成を抑制する

AGEs が、これらの転写因子の異常を介して骨代謝に影響惹起する可能性が考えられた。

いる41)。このことからも、糖尿病患者で蓄積亢進していることを示した。また骨代謝回転の低下により骨質の低下をを与えている可能性が示唆された。

本研究では HSA-glycer が BMP2 受容体の活性化を介して起こる Smad のリン酸化を抑制することで骨芽細胞分化を抑制することを示した（Fig. 4）。これまでに糖化 ストレスと Smad シグナルに関しては、Sassi-Gaha らが、糖化反謝辞
本研究の一部は総合科学技術・イノベーション会議の SIP

応中間体の一種である 3-deoxyglucosone（3-DG）由来の（ 戦 略 的 イノ ベ ーション 創 造 プ ロ グ ラ ム 研 究 課 題 番 号抑制する Smad7 を発現上昇させることを報告している42)。

センター委託研究）より支援を受け実施された。

AGEs により collagen type I の発現抑制及び Smad 経路を

しかしながら糖化ストレスが Smad の発現に与える影響についての報告は少なく、また本実験の結果では HSA-

glycer による Smad のリン酸化の抑制レベルが 30% 程度であるにもかかわらず（Fig. 4）、顕著な骨芽細胞分化抑制

14533567）「次世代農林水 産業創造技術」（農研機構生研

利益相反申告、これらの差異については 今後更なを示しており（Fig. 2）
る検証が必要であると考えられる。

我々は HSA-glycer が骨芽細胞分化を抑制することを示したが、更に骨代謝バランスについての評価を行うため、（ 9 ）研究を遂行するにあたり利益相反に該当する事項はない。

Glycative Stress Research

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（ 10 ）

Effect of Glycated Protein on Osteoblastgenesis.

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