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時間分解赤外分光法および凍結トラップX線結晶構造解析によるP450nor
反応中間体の解析
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兵庫県立大 院生命，2理研 SPring-8，3理研 CLST，4University of Liverpool，
5
東大 院理
1
2
2
○ 野村高志 ，當舎武彦 ，杉本宏 ，久野玉雄 3，山際来佳 1，ChaiGopalasingam4，
山下恵太郎 5，平田邦生 2，山本雅貴 2，城宣嗣 1，久保稔 1

Reaction Intermediate Analysis of P450nor by Using Time-resolved IRSpectroscopy and Freeze-trap X-ray Crystallography○Takashi Nomura1, Takehiko Tosha2, Hiroshi Sugimoto2, Tamao Hisano3, Raika Yamagiwa1,
Chai Gopalasingam4, Keitaro Yamashita5, Kunio Hirata2, Masaki Yamamoto2, Yoshitsugu
Shiro1, Minoru Kubo1
1Graduate School of Life Science, University of Hyogo, Japan
2
RIKEN SPring-8 center, Japan
3
RIKEN CLST, Japan
4
Institute of Integrative Biology, University of Liverpool, United Kingdom
5Department of Biological Sciences, The University of Tokyo, Japan【 Abstract】P450nor is a heme enzyme that catalyzes the reduction of NO to N2O in thedenitrification. In the catalytic reaction, NO is reduced by two electrons directly transferredfrom NADH. The resulting highly-activated species (intermediate-I) is the key intermediate tounderstand NO reduction reaction of P450nor. However, its electronic and geometric structures
are not yet known. Here, we successfully characterized the coordination and protonation
structures of intermediate-I of P450nor by the combinational use of freeze-trap XFEL
crystallography at SACLA and time-resolved IR spectroscopy. The crystallography revealed
that NO in intermediate-I is bound to the heme in a highly bent form, with a Fe-N-O angle ofca. 120o. On the other hand, the NO stretching IR signal of intermediate-I was observed at 1330
cm-1, assignable to the single protonated state (Fe-NHO). On the basis of the N-O vibrational
data and the Fe-N-O coordination geometry, the QM/MM calculation is underway to further
elucidate the electronic structure and reactivity of intermediate-I.
【序】脱窒カビ（Fusarium oxysporum）由来の一酸化窒
素還元酵素 P450nor は、地球上の窒素循環において、一酸化窒素（NO）を亜酸化窒素（N2O）へと還元するヘム酵素である。P450nor の酵素反応では、（1）酸化型のヘム（Fe3+–H2O）に NO が結合した後、（Fe3+–NO型の生成）（2）NADH からのヒドリド（H–）移動によって、NO が 2 電子還元される（中間体 I の生成）。最後に（3）中間体 I と 2 分子目の NO が反応することで Fig. 1 Reaction cycle of P450nor
N2O が生成し、系は酸化型に戻る（2NO + NADH + H+→ N2O + H2O + NAD+）（Fig. 1）。
中間体 I は NO 活性型であり、NO 還元反応の鍵を握っている中間体である。しかし、中間体 I は不安定種であり観測が困難なため、その配位構造やプロトン化状態（Fe-NHO or Fe-NHOH）は未だ明らかになっていない。そこで本研究では、P450nor の反応機構を解明するために、X 線結晶構造解析と赤外分光法を併用し、中間体 I の配位構造とプロトン化状態の決定を目指した。
【方法】P450nor の酵素反応を駆動するために、紫外光励起により NO を放出するケージド NO を用いた。P450nor にケージド NO と NADH を混合し、紫外光を照射することで NO 還元反応を開始できる。これまでに時間分解可視吸収分光法を適用し、中間体 I はケージド NO 光励起後、結晶相では秒、溶液相ではサブミリ秒の時間スケールで生成することを明らかにしている 1。そこで、X 線結晶構造解析では凍結トラップ法、赤外分光測定ではポンププローブ法により中間体 I を観測することにした。
X 線結晶構造解析では、ケージド NO と NADH を浸潤させた微結晶をメッシュループに多数散布し、ケージド NO 光励起 3 秒後に微結晶を急速凍結することで中間体I の凍結微結晶を調製した。凍結微結晶を X 線自由電子レーザー（XFEL）施設 SACLAに持ち込み、シリアル測定によって 1 結晶 1 照射条件で無損傷構造解析した。
一方、時間分解赤外分光では、ケージド NO 光励起後の時間分解スペクトルを測定した。スペクトルは、(1) ケージド NO 光励起前との差スペクトルを計算し、(2) その差からケージド NO 由来のピークを差し引き、最後に(3) 14NO を用いた結果と 15NO を用いた結果の差を評価することで（triple difference）、ヘムに結合した NO 伸縮振動を検出した。
【結果・考察】中間体 I の XFEL 結晶構造解析結果を Fig.
2 に示す（分解能 1.8 Å）。Fe-N-O 角は約 120o であった。
Fe3+–NO 型の Fe-N-O 角は約 160 o のため 1、ヒドリドによる 2 電子還元によって、ヘムに結合した NO はヘム法線から大きく傾くことがわかる。一方、Fe-N 結合軸は、中間体 I では 90o に近かった。
Fig. 3 に時間分解赤外分光測定の結果を示す。赤が実測
スペクトル、黒がガウシアンでフィッティングしたスペ Fig. 2 X-ray structures of Fe3+–NO
クトル、青と緑がその分割成分である。この時間分解ス
and intermediate-I
ペクトルには、同位体シフトを示す 2 本のシグナルが含まれていた。1 つは 1330 cm-1 (D15N = 32 cm-1、青) のシグナルで、サブミリ秒のタイムスケールで増加した。もう1 つは 1289 cm-1 (D15N = 27 cm-1、緑) のシグナルで、1330cm-1 の減少に伴いミリ秒で増加した。1330 cm-1 のシグナ
ルは、NHO が結合したヘムモデル化合物の NO 伸縮振動数 2 とほぼ一致する事から、Fe–NHO の NO 伸縮振動に帰属される。一方、1289 cm-1 のバンドは、まだ帰属に至っていない。
現在、1289 cm-1 の帰属のために重水や NADD を使った解析を進めるとともに、得られた配位構造とプロトン化状態を踏まえて QM/MM 電子状態解析を進めている。
【参考文献】[1] Tosha et al., Nat Commun., 8, 1585 (2017)[2] Abucayon, E. G. et al., Dalton Trans. ,45, 18259 (2016).
Fig. 3 Time-resolved IR spectra ofP450nor