海生研研報，第21号，13－21，2015
Rep. Mar. Ecol. Res. Inst., No. 21, 13-21, 2015

原著論文

シロギスの性分化に及ぼす17β-エストラジオール曝露の影響
堀田公明*1§・岸田智穂*2・瀬戸熊卓見*3・渡邉裕介*1・
道津光生*2・足立伸次*4
Effects of 17β-estradiol Exposure on Gonad Differentiation in Japanese Whiting
Sillago japonica
Komei Hotta*1§, Chiho Kishida*2, Takumi Setoguma*3,
Yusuke Watanabe*1, Kosei Dotsu*2 and Shinji Adachi*4

要約：種苗生産したシロギス稚魚を用いて，生殖腺の性分化に及ぼす17β-エストラジオール(E2)の影響を調べた。飼育水中に異なる3濃度のE2（10，30，100ng/L区）およびジメチルスルホキシド（DMSO：
助剤対照区）を添加しながら，生殖腺が未分化な稚魚（孵化後30日，平均標準体長15mm）各区400個
体を21日間飼育し，その後E2およびDMSO無添加の清浄な海水で孵化後100日まで飼育して生殖腺の組
織観察を行った。その結果，30ng/L区および100ng/L区で性比が雌に偏った。また30ng/L区と100ng/L
区の一部の個体に精巣卵が認められた。以上より，シロギスでは生殖腺が未分化な時期を含む稚魚期に，30ng/L以上のE2に3週間程度曝露されると，生殖腺の性分化や精巣の発達に影響が現れることが明らかとなった。
キーワード：シロギス，性分化，性比，精巣卵，生殖腺，E2，17β－エストラジオール，曝露Abstract:We examined the effect of 17β-estradiol (E2) on gonadal sex differentiation in laboratory-reared
juvenile Japanese whiting Sillago japonica. Fish with undifferentiated gonads (30 days post hatch (dph), average
standard length 15mm, 400 fish in each experiment group) were water-exposed for 21 days to three different
concentrations of E2 (10, 30, 100ng/L nominal (10, 30, 96ng/L actual)) or solvent control (dimethylsulfoxide;
25mg/L). Fish were transferred to clean sea-water and reared until 100 dph, when all fish were sampled and sex
ratio (♂/♀) and gonadal abnormality were determined by histological observations. Sex ratio was skewed towards
female at 30 and 100 ng/L and testis-ova (gonadal intersex) were observed in some fish exposed to 30ng/L and100ng/L. These results suggest that gonadal sex differentiation and testis development in male Japanese whiting
could be affected by exposure to E2 concentrations greater than 30ng/L for three weeks during juvenile stages
with undifferentiated gonads.
Key words: Sillago japonica, sex differentiation, sex ratio, testis-ova, E2, 17β-estradiol, exposure（2015年4月9日受付，2015年8月17日受理）*1 公益財団法人海洋生物環境研究所 実証試験場（〒945-0017 新潟県柏崎市荒浜4-7-17）§ E-mail: hotta@kaiseiken.or.jp*2 公益財団法人海洋生物環境研究所 中央研究所（〒299-5105 千葉県夷隅郡御宿町岩和田300番地）*3 元海生研職員*4 北海道大学大学院 水産科学研究院（〒041-8611 北海道函館市港町3-1-1）― 13 ―

堀田ら：シロギスの性分化に及ぼす E2 曝露影響

まえがき

魚を用いて性ホルモン投与による人為的性転換が行なわれている (Yamamoto, 1969; 高橋, 1978)。

エストロゲンまたはエストロゲン作用を有する

雄魚の雌化に用いられるホルモンとして，天然エ

化学物質（エストロゲン様内分泌かく乱化学物質：

ストロゲンであるエストロン，17β-エストラジ

EEDCs）（原，2013）に曝露された雄魚の血中にオール(E2)，エストリオールの他，合成エストは雌特異タンパク質のビテロゲニンが検出される

ロゲンのジエチルスチルベストロール，エチニル

ことから，雄魚の血中ビテロゲニンがEEDCsの影

エストラジオール，スチルベストロール等があり，

響指標に用いられるようになった（Sumpter and

これらのホルモンの中でもE2が比較的多く用い

Jobling, 1995）。一方，ビテロゲニンが検出されたられている（Hunter and Donaldson, 1983）。また，

雄魚の精巣を組織学的に調べても，必ずしも生殖エストロゲン以外にもテストステロンやメチルテ腺の異常は見出されない（飯島ら，2001; 堀田ら，

ストステロンのようなアンドロゲンを高濃度で体2002; Ohkubo et al ., 2003; Kleinkauf et al. , 2004）。

内投与した場合にも遺伝的雄の雌化が生じる。例

そこで，雄魚の生殖機能へのEEDCsの影響指標とえば，山本(1995)はヒラメを孵化後31日から100して着目されたのが精巣中の卵母細胞様の細胞，

日まで100μg/Lメチルテストステロン海水に浸いわゆる，精巣卵である（Gronen et al ., 1999）。

漬させると性比が雌に偏った。この結果は，高濃

精巣卵はこれまでに実施された日本の沿岸域にお度のアンドロゲンが体内で芳香化されエストロゲ

けるEEDCs影響の実態調査においてもマコガレイ

ンに転換されることによる逆説的効果とされていPleuronectes yokohamae （橋 本, 2000）， シ ロ ギ ス
Sillago japonica （堀田ら，2002），スズキLateolabrax
japonicus , ボラMugil cephalus ，コノシロKonosirus
punctatus ， サ ッ パSardinella zunasi ， ヒ イ ラ ギ
Nuchequula nuchalis ，マアナゴConger myriaster（和波ら，2003，2004, 2005）の精巣中に見出されている。魚類の性は水温等の環境要因によっても影響を受ける場合があることが知られており，性分化前に高水温処理を行うと，ヒラメParalichthys
olivaceus （Kitano et al.，1999），マツカワVerasper
moseri （Goto et al. , 1999）， マ コ ガ レ イ(Goto etal. ，2000)は 雄 へ の 分 化 を， ク ロ ソ イSebastes
schlegeli (Omoto et al.，2010）では雌への分化を誘発すると報告されている。しかし，魚類において高温処理によって精巣卵形成を報告した例は見当たらないことから，海産魚類の精巣卵形成に水温が関与した可能性は低いと考えられる。
魚類には機能的雌雄同体(一生の間に正常に雄および雌の双方として成熟し生殖する)を示す種が存在し，それらの魚では正常な生理学的メカニ
ズムのもとで性転換を行う（中村ら，2006； 小林，
2008）。しかし，日本沿岸で精巣卵が見出された魚類はいずれも雌雄異体魚であることから，精巣卵は異常な性転換の兆候とみなされる。
魚類の性転換に関する研究の歴史は古く，その実 験 手 法 と し て1930年 代 頃 か ら メ ダ カOryzias
latipes ， グ ッ ピ ー Poecilia reticulata , キ ン ギ ョCarassius auratus ，ゼブラフィッシュ Danio rerio ，
ナイルティラピアOreochromis niloticus 等の淡水る（Nakamura, 1975; Piferrer and Donaldson, 1991;
山本, 1995）。一方，EEDCsのノニルフェノール
やオクチルフェノールでは約10μg/L(Seki et al .,2002)，E2では約30ng/L(Hirai et al ., 2006)というアンドロゲンに比べ著しく低い濃度の曝露でメダカの精巣に精巣卵を誘発することから，海域で採取された雄魚に見出された精巣卵の形成には
EEDCsが関与した可能性が推察された。しかし，日本の沿岸域におけるEEDCs影響の実態調査で精巣卵が見出された海産魚類を用いて，精巣卵形成とEEDCsの関係を検討した報告はこれまでにない。
そこで，本研究では海域で精巣卵の存在が確認された魚類のうち，種苗生産技術が確立し，仔稚魚期からの飼育実験が可能なシロギスを供試魚として，EEDCsの中でも過去の知見が多いE2の曝露飼育を行い，海産魚類の精巣卵形成とEEDCsとの関係を調べた。
方
供試魚

法

新潟県柏崎市地先で釣獲したシロギスを親魚として，水槽内の自然産卵によって得られた卵を孵化させ，養成した稚魚を供試魚とした。養
成期間中は餌料としてシオミズシボワムシ

Branchionus plicatilis ， ア ル テ ミ アArtemia salina ，配合飼料（海産魚用初期飼料2号 (株)ノーサン）を与えた。また，飼育水槽内の飼育水の水質を良好に保つため，孵化直後から孵化後30日まで，植― 14 ―

堀田ら：シロギスの性分化に及ぼす E2 曝露影響物プランクトン(Pavlova lutheri およびTetraselmis

100日の助剤対照区およびE2曝露区のすべての個

tetrathele )を添加した。

体について，生殖腺を含む体幹部全体をパラフィンに包埋し，常法により切片を作製し雌雄判定と試験条件

試験水槽として流水式のチタン製円形組織観察を行った。

水槽（500L：海水流量360L/h）4基を用意し，そのうちの3基には飼育水中のE2濃度が10, 30およ

分析結果の統計処理

び100ng/Lの飼育水をそれぞれ注水し，残り1基示し，それらの平均値の差の検定はKruskal-Wallis

結果は平均値±標準誤差でに はE2助 剤 で あ る ジ メ チ ル ス ル ホ オ キ シ ド検定およびDunnettの多重比較法を用いた。また，（DMSO）25mg/Lを注水し4試験区（3濃度区，1助性比の偏りの検定はχ2検定を用いた。

剤対照区）とした。各試験区には孵化後30日（9月6日）のシロギス稚魚400個体を収容し，流水条

結果

件で21日間，E2の曝露飼育を行った。曝露終了
後各水槽には清浄海水を注水し，孵化後100日ま

水温，塩分，ｐHおよびDOで飼育を継続した。曝露期間中および曝露後の清までの各水槽の水温は24.6～25.6℃，塩分は32.3

浄海水飼育中の水温/日長条件は25℃ /15L（4時～33.8psu, pHは8.1～8.2, DOは97.0～101.8％の範30分点灯，19時30分消灯，光源は昼光色蛍光灯）

囲内であった。

孵化後30日から100日とし，点灯および消灯前の照度は30分かけて徐々に変化させ薄明および薄暮の状態を模した。海水

海水中E2濃度

中E2濃度は，曝露期間中に3回，曝露終了後に1回，の海水中E2濃度を第1表に示した。曝露期間中は各濃度区の海水を採取し，「外因性内分泌攪乱化

いずれの曝露区のE2濃度も設定値の93～107％で学物質調査暫定マニュアル（水質，底質，水生生

安定した値を保っていた。また，曝露終了後3日物）」（環境庁水質保全局水質管理課，1998）およ目には，E2濃度が検出下限値以下まで減衰してび「要調査項目等調査マニュアル（水質，底質，いることが確認された。

E2曝露期間中および曝露終了後

水生生物）」（環境省環境管理局水環境企画課，
2003）に準じてLC/MSにより測定した。餌は配シロギスの体長と体重

合飼料（海産魚用初期飼料2～5号，(株)ノーサン）

での助剤対照区およびE2濃度区の供試魚の体長，を一日に体重（直近の測定値）の2％の量を毎日

体重の変化をそれぞれ，第1図A，Bに示した。孵与えた。

化後30，51，75，100日の助剤対照区の平均標準

孵化後30日から100日ま体 長(平 均 体 重)は， そ れ ぞ れ15±0mm(0.03±
試料採取方法孵化後30日の曝露開始前に50個0.00g)，29±1mm(0.30±0.03g)，58±3mm(2.9±体，孵化後51日(E2曝露終了時)および孵化後750.4g)，79±3mm(6.9±0.8g)で あ っ た。 い ず れ の日(清浄海水飼育中)に各区からそれぞれ50個体，

採集日においても10～100ng/L区の体長および体孵化後100日(試験終了時)に各区の生存個体のす重と助剤対照区のそれらの値との間に有意差はみべて(66～102個体/水槽)を取り上げて，過剰の4-られなかった。孵化後100日の100ng/L区の体重

アミノ安息香酸エチルで麻酔処理後，魚体全体を(4.6±0.6g)は助剤対照区(6.9±0.8g)に比べて低ブアン氏液で固定した。各区とも固定された供試い傾向がみられたが，有意差は認められなかった。

魚のうち30個体の体長と体重を測定した。孵化後

孵化後100日の雌雄別の体長と体重をそれぞれ，

30，51，75日の助剤対照区の一部の個体と孵化後第2図A，Bに示した。体長および体重については

第1表

E2曝露期間中および終了後の海水中E2濃度

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第1図

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孵化後30日から100日までのシロギスの体長と体重の変化。A：体長，B：体重，各点の検体数は30個体，縦線は標準誤差。体長，体重はブアン固定後に測定。

第2図

各濃度区と助剤対照区との間で有意差は認められなかった。同じ濃度区の雌雄間の値を比較すると，

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孵化後100日のシロギスの雌雄別の体長と体重。A：体長，B：体重，M：雄，F：雌。括弧内の数字は検体数，縦線は標準誤差。助剤対
照区の雄と雌の生存個体数はそれぞれ28個体と39個体であったが，雄3個体と雌4個体の体長と体重が測定時欠測のため，助剤対照区の検体数が25個体と35個体となった。体長，体重はブアン固定後に測定。図中の米印(*)は有意水準5%で差が認められたことを示す。

10ng/L区の体長と体重および100ng/L区の体重で孵化後100日の助剤対照，10ng/L，30ng/Lおよは，雌の値が雄の値よりも有意に大きい値を示した（P <0.05）。

び100ng/L区 の 性 比(♂/♀)は， そ れ ぞ れ0.72，

生存個体数と性比

1.17，0.46および0.17で，30ng/L区と100ng/L区の性比は有意に雌に偏っていた(P <0.01)。

孵化後100日の生存個体数と性比を第2表に示した。孵化後100日の助剤対照，10ng/L，30ng/Lおよび100ng/L区の生存個体数は，助剤対照区の生殖腺組織

それぞれ69，66，93および102個体で，そのうち開始日）には体腔背壁に始原生殖細胞を含む生殖生殖腺が未分化なシロギスが，それぞれ2，1，1，

隆起が形成され始めた時期にあり，生殖腺はまだ7個体含まれていた。助剤対照区および10ng/L区

雌雄未分化であった(第3図A)。しかし，孵化後の生存個体数が他の濃度区に比べ少なかったが，51日(E2曝露終了日)には未分化生殖腺(第3図B)

その理由は，助剤対照区では孵化後30日頃に原因に加え，卵巣腔形成を開始した卵巣組織像(第3図不明のへい死が発生したこと，10ng/L区では孵C)も観察された。すわなち，以上の組織観察の化後80日に試験水槽の残餌回収中に誤って供試魚

結果は，本研究におけるE2曝露時期が生殖腺がを排水口から流出させてしまったことによる。

未分化な発達段階から開始されたことを裏付けて― 16 ―

孵化後30日（E2曝露堀田ら：シロギスの性分化に及ぼす E2 曝露影響
第2表

孵化後100日のシロギスの生存個体数と性比
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いる。
孵化後100日の助剤対照区の雄の精巣は，精子B!

に至る各発達段階の生殖細胞で構成され，活発な精子形成像(第3図D)を示した。また，雌の卵巣は卵黄形成期の卵母細胞(第3図E)を含み成熟途上にあった。
E2曝 露 区 の 生 殖 腺 組 織

孵 化 後100日 の10～

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100ng/L区の雄の精巣組織像は助剤対照区の雄の精巣と同様に，活発な精子形成像を示した(第4図A, C，E)。しかし，30ng/L区の雄29個体中1個体と100ng/L区の雄14個体中3個体から精巣卵が認
め ら れ た(第5図A：30ng/L区 雄， 第5図B ～ D：
100ng/L区雄)。
孵化後100日の10～100ng/L区の雌の卵巣はいずれも周辺仁期までの卵母細胞で構成され未熟な様相を示したが，異常な組織像は認められなかった(第4図B，D，F)。
第3図

考
曝露時期の設定

察性ホルモンによって遺伝的雄あるいは雌をそれぞれ機能的な雄と雌に性転換させ助剤対照区のシロギスの生殖腺組織像。A：孵
化後30日未分化生殖腺，B：孵化後51日未分化
生殖腺，C：孵化後51日卵巣，D：孵化後100日
精巣，E：孵化後100日卵巣，AとBの図中の矢印は未分化生殖腺を，Eの図中の矢印は卵黄形
成期の卵母細胞を示す。バーは50μmを示す(A～ E共通)。

るためには，生殖腺の形態的性分化開始以前から
ホ ル モ ン 処 理 を 始 め る 必 要 が あ る(Yamamoto，
1969)。シロギスは体長約25mmでそれまで未分化

曝露期間中の供試魚減耗の影響だった生殖腺は卵巣へ分化する(堀田ら，未公表)

い死により，10ng/L区は流失させてしまったこ

ことから，シロギスの性分化に及ぼすE2曝露のとにより，それらの区の孵化後100日の生存個体影響を調べるためには，体長25mm以前に曝露を

数 は，30ng/L区 や100ng/L区 に 比 べ 約30％ 少 な

開始する必要があると考えられた。そこで本実験かった。もし助剤対照区あるいは10ng/L区でのでは，雌への形態的性分化が始まる以前の体長

供試魚の減耗が雄に選択的に起きたとすると，助15mmのシロギスを用いてE2曝露を行った。その剤対照区あるいは10ng/L区の孵化後100日の性比

結 果，30ng/L区 と100ng/L区 の 性 比(♂/♀)は そ

は有意に雌に偏ることになる。Hirai et al .(2006)

れぞれ0.46，0.17と有意に雌に偏った。助剤対照はメダカを受精卵から孵化後20日までE2の設定

区と10ng/L区の性比が 1 前後であったことから，

濃 度30ng/L(実 測 値33.5ng/L)でE2曝 露 し た と こ

30ng/L区と100ng/L区の雌の中には，遺伝的雄がろ，孵化後14日以降に精巣卵の形成を確認しておE2曝露により雌化した個体が含まれていると考り，それ以下のE2濃度では精巣卵は形成されなえられた。

かったことから，本実験結果はHirai et al .(2006)― 17 ―

助剤対照区はへ堀田ら：シロギスの性分化に及ぼす E2 曝露影響

第4図

第5図

B!

C!

D!

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孵化後100日の各E2濃度区の生殖腺組織像。A：10ng/L区精巣，B：10ng/L区卵巣，C：30ng/L区精巣，D：30ng/L区卵巣，E：100ng/L区精巣，F：100ng/L区卵巣，バーは50μmを示す(A ～ F共通)。

B!

C!

D!

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孵化後100日の各E2濃度区のシロギス雄の精巣に観察された精巣卵。Aは30ng/L区の雄1個体の精巣に観察された精巣卵(矢印)，B ～ Dは100ng/L区雄3個体のそれぞれの精巣組織に観察された精巣卵(矢印)。バーは505μmを示す。

― 18 ―

堀田ら：シロギスの性分化に及ぼす E2 曝露影響の報告と一致する。また，Brion et al . (2004)は，れる。一方，Maack and Segner (2004)の結果からゼブラフィッシュを供試材料として，孵化直後か稚魚期の雌魚におけるエストロゲン曝露の影響は

ら孵化後21日までの仔魚(生殖腺未分化)，孵化後可逆的とみられ，本実験においてE2曝露中止後

21日から42日までの稚魚(生殖腺の性分化期)，成の清浄海水飼育を孵化後100日以降も継続してい魚(孵化後200日以降)の異なる成長段階で，それれば，シロギス雌の卵巣の発達は再開したと推察

ぞれ海水中濃度5, 25, 100ng/L(実測値はそれぞれされるが，この点については今後の確認が必要で

4.6, 22, 117ng/L)の3段階のE2に3週間曝露した。

ある。

その結果，生殖腺の分化が開始する前の仔魚期にE2曝露された場合のみ，E2濃度に依存して性比海域におけるEEDCs曝露の可能性

日本沿岸の港が雌に偏り100ng/Lでは有意に高かった，と報告

湾内や湾奥，河口などの海水を，培養細胞を用いし て い る が， ゼ ブ ラ フ ィ ッ シ ュ に お い て もE2てエストロゲン活性を測定すると，E2等量で数5ng/L区や25ng/L区での性比の偏りは確認されて～数十ng/L，また，GC-MSを用いた機器分析にいない。以上より，本実験において10ng/L区でよりエストロン(E1)やE2を測定すると，その十性比の変動や精巣卵形成が見られなかったことは分の一の濃度レベルで検出される（Kawai et al .,過去の知見に沿った結果であり，助剤対照区や

2002; Ohkubo et al ., 2003; 和波ら, 2004）。概して

10ng/L区における供試魚の減耗は，孵化後100日

日本沿岸海域のEEDCs濃度レベルは，一部の閉鎖の性比に大きな影響を及ぼさなかったと判断され海域や河川河口を除いてシロギスの精巣に精巣卵る。

を 誘 発 す る 濃 度(E2で30ng/L程 度)よ り 低 い と言ってよいであろう。しかし，海域によっては卵巣の発達に及ぼすエストロゲン曝露の影響

10

E2以外にもE1，ノニルフェノール，ビスフェノー～100ng/LのE2曝露区のシロギス雌の卵巣の卵母

ルA等の複数のEEDCsが検出されている。例えば，細胞は周辺仁期までの発達段階に留まり，卵黄形

中田・高田（2006）は，東京湾湾口の海水でE1，

成期には至らなかった。卵黄形成期以降の卵母細E2，ノニルフェノール，ビスフェノールA，オク

胞の発達には脳下垂体から分泌される生殖腺刺激

チルフェノールを測定したところ，それぞれ，

ホルモン(以下GTH)の存在が不可欠である一方，<0.01～1.7ng/L，0.2～1.1ng/L，2～20ng/L，0.8

周辺仁期の雌の脳下垂体を手術により除去しても～11ng/L，0.2～2ng/Lの濃度範囲で検出された。

卵は退行変性を起さないことから周辺仁期の卵母Sumpter and Jobling (1995)は，ニジマス肝細胞を細胞はGTHの支配は受けないことが示されてい用いたin vitro のEEDCs曝露実験を行い，EEDCsのる（会田，1989）。一般に脊椎動物において，外5物質を単独に投与した場合のそれぞれのビテロ部から過剰量の性ホルモンを投与すると，生殖腺

ゲニン産生量と5物質を混合して 1 度で投与したが退縮する場合があり，この現象は性ホルモンの場合のビテロゲニン産生量を比較したところ，混負のフィードバック作用により脳下垂体からの生合投与時のビテロゲニン産生量が単独投与の産生

殖腺刺激ホルモン分泌が強く抑制されるためと考量の合計の2倍近くになったことから，EEDCsのえ ら れ て い る（小 林・ 足 立，2002）。Maack and複合影響によりエストロゲン作用が増幅されるこ

Segner (2004)は，性分化期のゼブラフィッシュとを示した。したがって，海域のEEDCsの各物質を用いて，エチニルエストラジオール(EE2)の水の濃度が，例えば，中田・高田(2006)が報告して中濃度が10ng/Lとなるように曝露しながら28日

いるような比較的低レベルであっても，複数の間飼育した後，EE2曝露を止めて清浄水で飼育し

EEDCsが共存するならばシロギスの精巣に精巣卵たところ，EE2曝露群の産卵開始日は孵化後160を誘発する可能性は十分に考えられる。上記の知日で，無曝露群の産卵開始日の孵化後137日に比見を考慮した上で，海域のシロギスにおける精巣

べ遅くなったことを報告している。本実験におい卵の形成過程について次のように推察する。すなて，シロギス雌ではE2曝露により血中にE2が濃

わち，シロギスは生殖腺の未分化な時期を含む稚縮され，E2濃度が急激に上昇した結果，E2によ

魚期に，複数のEEDCsが共存する沿岸近くの水域

る負のフィードバックが働き脳下垂体からのに少なくとも3週間程度来遊すると，EEDCsの複GTH分泌が抑制され，その結果として卵巣の卵合影響により性分化後の稚魚の精巣に精巣卵が形母細胞の成熟段階が周辺仁期に留まったと考えら成される可能性がある。また，精巣卵は一度形成― 19 ―

堀田ら：シロギスの性分化に及ぼす E2 曝露影響されると長期に残存することから（Gronen et al .,1999; Seki et al ., 2002），精巣卵は成魚においても発見される可能性が十分高いと考えられる。
性分化期のシロギスを複数のEEDCs共存下で飼育して性比や精巣卵の頻度を調べることは，上記仮説の有力な検証方法の 1 つであり，今後実施されることが望まれる。
謝辞

この論文は，独立行政法人水産総合研究セン
ターから委託された広域レベル漁場環境保全方策
検討委託事業の報告のうち一部を公表するものであり，関係各位に謝意を表する。
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