平成 30 年度研究助成報告書

前十字靭帯自己治癒に貢献する細胞の探索と検証

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傷後異常な関節運動を残し，CAM 群は ACL 損傷後異常な関節運動を制動した。閉創後，メデトミジン拮抗薬（0.75 mg/kg 塩酸アチパメゾール）を皮下に注射した。

森下佑里（PT，MSc）1），村田健児（PT，PhD）2），
2）

4．組織学的解析

2）

国分貴徳（PT，PhD） ，金村尚彦（PT，PhD）

1）組織採取実験終了後，右後肢の膝関節を採取し，4%PFA にて1）

埼玉県立大学大学院保健医療福祉学研究科博士後期課程

48 時間浸漬固定した。脱灰処理は 10%EDTA を用いて

埼玉県立大学保健医療福祉学部理学療法学科

約 70 日間行い凍結包埋した。包埋した組織は，クリオ

2）スタット CM3050S（Leica，Germany）にて 12 µ m に薄キーワード：前十字靭帯，関節制動，自己治癒切した。
2）免疫組織化学染色

はじめに内因性ペルオキシターゼ活性の抑制と非特異的反応の前十字靭帯（Anterior Cruciate Ligament：以下，ACL）

ブロッキング後，一次抗体には抗 CD45 抗体（希釈濃度損傷の発生率は年々増加傾向にあるものの，治療法は1:250，OriGene，USA），抗 CD73 抗体（希釈濃度 1:1500，1980 年代より外科的再建術が主流である。その背景にBioss, USA）
，抗 CD90 抗体（希釈濃度 1:500，Boster，は，ACL の治癒能力の低さが挙げられる。同じ膝関節USA）を用いた。二次抗体に Goat anti-rabbit IgG 抗体の靭帯でありながら治療に保存療法が選択される内側もしくは Horse anti-mouse IgG 抗体，VECTAIN Elite

側副靱帯と治癒能力を比較した研究では，scaﬀold の欠ABC Standard Kit（Vector Laboratories，USA）を用如1）

いて ABC 法を行った。DAB とヘマトキシリンで対比

そのため，長年 ACL の保存療法については懐疑的で染色し，光学顕微鏡にて観察した。

等を根拠に ACL の治癒能力の低さを示唆している。

あるとされてきたが，近年，装具を用いた保存的な介入により ACL が自己治癒することが報告されている

2）。

また，我々も動物を用いた研究により靭帯が治癒する結果

1．CD453）。これらの報告によると，ACL 損傷

全群・全時点において滑膜線維層に陽性所見が観察

後急性期からの運動学的介入が分子生物学的応答に影響された。Sham 群の靭帯実質部や ACLT 群および CAMし，自己治癒に重要であるとしている。

群の遺残靭帯，断端周囲の細胞，断端間細胞，治癒領域ことを報告した

ACL の自己治癒が示されているにもかかわらず，臨では陰性であった（図 1 a）。

床において保存療法が普及していない理由には，靭帯の自己治癒機構が解明されていないことが一要因であると

2．CD73

考えられる。そこで本研究は，ACL の自己治癒に貢献する細胞を明らかにすることを目的とした。

1 週時点の ACLT 群と CAM 群では遺残靭帯，断端周囲の細胞集団，断端間細胞が陽性所見を示した。2 週時点では，ACLT 群の断端間細胞と CAM 群の断端お対象および方法よび治癒領域で染色性が低下したが，ACLT 群の遺残1．倫理的配慮

靭帯と断端周囲の細胞は依然として陽性所見を示した

本研究は，埼玉県立大学動物実験倫理委員会の承認（図 1 b）。

（受付番号 29-6 号）を得て実施した。
3．CD90
2．対象
Wistar 系雄性ラット 11 週齢 24 匹を対象とした。対照（以下，Sham）群，ACL 切断（ACL Transection：以下，ACLT 群と CAM 群の遺残靭帯や断端周囲の細胞集団，断端間細胞に陽性所見を示した。2 週時点での染色性は両群ともに低下した（図 1 c）。

ACLT）群，関節包外関節制動（Controlled AbnormalMovement：以下，CAM）群に分け，さらに各群介入
後 1 週，2 週のグループに各 4 匹ずつ割りあてた。

考察
本研究は，ACL 自己治癒機構の解明に向け，組織学的解析を用いて ACL の自己治癒に貢献する細胞の3．外科的介入探索を行った。Morito らは，滑膜由来の間葉系幹細胞

三 種 混 合 麻 酔 薬（0.375 mg/kg 塩 酸 メ デ ト ミ ジ ン，（Mesenchymal stem cell：以下，MSC）が ACL 損傷後

2 mg/kg ミタゾラム，2.5 mg/kg 酒石酸ブトルファノー

4）に増殖し，さらに損傷部位に付着することを示した 。

ル）を腹腔内に注入し，深麻酔をかけた。Sham 群は関さらに，Kanaya らは，ACL 部分損傷後に骨髄由来の節包の切開，骨孔の作成を行った。ACLT 群は ACL 損

MSC を注射することで ACL が治癒する傾向を示した

2

平成 30 年度研究助成報告書

図 1 ACLT 群および CAM 群における CD45，CD73，CD90 の IHC 染色像（a）CD45 は遺残靭帯，断端周囲の細胞，断端間細胞，治癒領域では陰性であった．（b）CD73 は 1 週時点の遺残靭帯，断端周囲の細胞集団，断端間細胞において陽性所見を示した．2 週時点では，
CAM 群の染色性は低下したが，ACLT 群は依然として陽性所見を示した．
（c）CD90 は ACLT 群の遺残靭帯や断端周囲の細胞集団，断端間細胞に陽性所見を示した．CAM 群においても類似していた．Scar bar = 100 µ m.

ことを報告した 5）。そこで，本研究では ACL の自己し，解析を進めることで ACL 自己治癒に貢献する細胞治癒に貢献しうる細胞として MSC に着目した。MSCを明言することができると考える。

は多分化能を有し，ヒトにおいては細胞表面マーカー
CD73，CD90，CD105 が陽性，CD34 や CD45 が陰性で結6）あれば MSC であると同定される 。

論
本研究は，ACL の自己治癒に貢献する細胞について

本研究において，ACLT 群および CAM 群の遺残靭組織学的手法を用いて検討した。その結果，ACL 治帯と断端周囲の細胞，断端間細胞は CD73，CD90 に陽癒 過 程 に お け る CD45，CD73，CD90 の 局 在 を 示 し，性であり，CD45 に陰性であった。したがって，ACL

ACLT 群や CAM 群で観察された断端周囲の細胞や断損傷後に増殖した断端周囲の細胞や断端間細胞は MSC

端間細胞には MSC が含まれることが明らかとなった。

を含み，増殖した細胞は関節制動により局在性が変化することが示唆された。また，CD73，CD90 の染色性は

文

1 週時点よりも 2 週時点で低下し，ACLT 群は CAM 群

1）Murray M, Martin S, et al.: Histological changes in thehuman anterior cruciate ligament after rupture. J Bone
Joint Surg Am. 2000; 82(10): 1387‒1397.
2）Ihara H, Miwa M, et al.: Acute Torn Meniscus Combinedwith Acute Cruciate Ligament Injury ‒Second LookArthroscopy After 3-month Conservative Treatment‒.
Clin Orthop Relat Res. 1994; 307: 146‒154.
3）Kokubun T, Kanemura N, et al.: Eﬀect of Changing theJoint Kinematics of Knees With a Ruptured Anterior
Cruciate Ligament on the Molecular Biological Responses
and Spontaneous Healing in a Rat Model. Am J Sports
Med. 2016; 44(11): 2900‒2910.

よりも染色性が維持されていた。これは幼若な間葉細胞の成熟が関係していると考えられる。CAM 群においてはすでに MSC が線維芽細胞へと成熟し ACL が治癒したため染色性は低下したが，ACLT 群は靭帯が治癒していないため 2 週時点でも断端周囲に幼若な間葉細胞が存在していると推察される。
本研究の限界としては，サンプル数が少なく定量化が行えていないことが挙げられる。今後サンプル数を増や献平成 30 年度研究助成報告書

4）Morito T, Muneta T, et al.: Synovial fluid-derived
mesenchymal stem cells increase after intra-articularligament injury in humans. Rheumatology. 2008; 47: 1137‒
1143.
5）Kanaya A, Deie M, et al.: Intra-articular injection ofmesenchymal stromal cells in partially torn anterior

3cruciate ligaments in a rat model. Arthroscopy. 2007;
23(6): 610‒617.
6）Maﬁ P, Hindocha S, et al.: Adult Mesenchymal Stem Cells
and Cell Surface Characterization ‒ A Systematic Reviewof the Literature. Open Orthop J. 2011; 5: 253‒260.