平成 29 年度研究助成報告書

1

脳卒中後早期理学療法のエビデンス構築に向けた基礎的検証
─モデル動物を用いた検証─

いる。そこで，本研究では，神経細胞の減少と樹状突起

1）
2）
3）
1）
玉越敬悟（PT），石田和人（PT），高橋英明（PT），対象と方法1）

早尾啓志（PT） ，田巻弘之

1）の退縮が早期介入によって抑制されているか後期介入および非介入と比較検証する。

1．実験動物と実験群
本研究には，Wistar 系雄性ラット（n=52）を用いた。

1）

新潟医療福祉大学リハビリテーション学部理学療法

全ラットは 12 時間の明暗サイクルの下，餌と水を自由学科摂取できる標準ケージで飼育した。すべての処置は新潟

2）

豊橋創造大学保健医療学部理学療法学科

医療福祉大学動物実験委員会の承認を得て行った。実3）

験群には偽手術 + 非介入群（SHAM 群；n=14），脳出

キーワード：脳出血，早期運動介入，樹状突起（ICH+ET；n=13），脳出血 + 後期介入群（ICH+LT；

名古屋大学大学院医学系研究科

血 + 非介入群（ICH 群；n=13），脳出血 + 早期介入群n=12）の 4 群を設けた。
はじめに発症後早期からのリハビリテーションは機能改善を

2．脳卒中モデルラットの作製促進させることが多くの臨床研究で確かめられており，ペントバルビタールナトリウム腹腔内投与麻酔下に脳卒中ガイドライン 2015 においても強く推奨されていて，ラットを脳定位固定器に固定した。頭部の皮膚をる。動物実験による基礎研究においても，早期リハビリ切開して頭蓋骨を露出させた後，ドリルでブレグマ縫1‒3）が，その一方合から左外側 3.6 mm の位置に小穴を開けた。ステンレで，早期リハビリテーションが脳傷害を増悪させること

ス製カニューレを頭蓋骨表面から深度 6.0 mm まで挿入

テーションの有効性が示されている
4）5）。これらの報告のもと，基礎研究した。血管壁を脆弱化させるコラゲナーゼ（TypeIV，分野では，脳卒中早期リハビリテーションの効果は脳傷

200 U/min，1.6 µ l，Sigma 社）を，マイクロシリンジ害の起因，重症度，部位で異なり，それぞれの病態に適ポンプ（Eicom 社）を用いて 0.2 µ l/min の流速で 8 分間

切な介入時期があることが近年の国際的な見解となって注入した。注入終了後，切開した頭部の皮膚を縫合し，いる。しかし，現在の早期リハビリテーションは，その切開部を消毒した。

も報告されている

介入効果が科学的に十分検証されていないまま提供されており，対象者によっては不適切な介入が行われている

3．運動条件

おそれがある。そのため，早期リハビリテーションの有運動介入にはトレッドミル走行を使用した。走行速度

効性を科学的に実証する基礎研究は，重点的かつ早急には，介入初日は 9 m/ 分，その後は 11 m/ 分とし，走行取り組むべきリハビリテーション分野の最重要課題であ時間は 60 分とした。走行期間は，ICH+ET 群は術後 2るといえ，新しい脳卒中早期リハビリテーション方針の日目から 8 日間まで，ICH+LT 群は術後 9 日目から 15策定にもつながる。これまでの研究で，コラゲナーゼ注日目までとした。

入法で作製した線条体出血モデルラットを用いて，運動療法の実施時期の違いが運動機能障害に与える影響につ4．運動機能評価いて検証した。トレッドミル走行を使用し，発症後 2 日

運動機能評価には Forelimb Placing test を用いた。

目から介入した群（早期介入）と発症後 8 日目から介入

本評価ではラットの髭をテーブル端に付けたときの前肢した群（後期介入）の運動機能を経時的に評価して比較の運動応答から運動麻痺の程度を評価できる。本評価を検証を行った。その結果，早期介入の方が後期介入より10 回試行し，前肢の運動応答回数を測定した。評価日運動機能の改善効果が高いことが分かった。大脳皮質のは，術後 1 日目，8 日目，15 日目とした。

厚さを解析したところ，早期介入は後期介入と比較して，皮質の萎縮抑制効果が高く，さらに，皮質を層別に5．神経細胞数の解析解析したところ，運動出力に関わる細胞がある第Ⅴ層の術後 16 日目に，全ラット（SHAM 群；n=6，ICH 群；萎縮を抑制していた。これらの結果から，脳出血後の早n=5，ICH+ET 群；n=7，ICH+LT 群；n=7）を生理食期介入は，大脳皮質の萎縮を抑制することで運動機能回塩水で灌流脱血し，その後，4% パラフォルムアルデヒ復を促進させることが分かった。皮質の萎縮は，神経細ドで灌流固定した。脳を採取し，同溶液で後固定した。

胞数の減少や樹状突起・シナプスの退縮によって引き起40 um 厚の凍結切片を作製し，ニッスル染色を施した。

こされる。脳出血後の運動療法は，神経細胞数の減少抑両側の大脳皮質第 V 層を光学顕微鏡で観察し，神経細制，すなわちアポトーシス細胞死の抑制効果があり，さ胞数をカウントした。

らに，樹状突起の退縮抑制効果があることが報告されて2

平成 29 年度研究助成報告書

図 1 樹状突起のトレーシング画像
樹状突起のトレーシングを行った後，細胞体を中心に同心円を描き，交差点数を解析した．図は各群の代表的な樹状突起のトレーシング画像である（A：SHAM 群，B：ICH 群，C：ICH+ET 群，D：ICH+LT 群）．脳出血発症によって樹状突起の退縮を認めた．早期介入によって樹状突起の退縮が抑制されたが，後期介入では抑制されなかった．

26．樹状突起の解析± 1.2 個 /mm ）。非傷害側では全群間に有意差は認め

術後 16 日目に，全ラット（SHAM 群；n=8，ICH 群；

な か っ た（SHAM 群；51.5 ± 1.3 個 /mm2，ICH 群；

n=8，ICH+ET 群；n=6，ICH+LT 群；n=5）を生理食

54.1 ± 2.8 個 /mm ，ICH+ET 群；52.9 ± 2.0 個 /mm ，

塩水で灌流脱血し，脳を採取した。200 um 厚の脳切片

ICH+LT 群；47.0 ± 1.8 個 /mm ）。

222を作製し，FD Rapid GolgiStain Kit を用いて樹状突起を染色した。光学顕微鏡で傷害側感覚運動野第 V 層に3．同心円と樹状突起の全交差点数おける神経細胞の樹状突起を観察した。ImageJ を用い

ICH 群および ICH+LT 群は SHAM 群より有意に低値て樹状突起を半自動的にトレーシングし，細胞体を中心を示した。また ICH+ET 群は ICH 群および ICH ＋ LTに 5 um 間隔に描いた同心円と樹状突起の交差点を測定群より有意に高値を示した（SHAM 群；365.7 ± 16.3 ヵした。

所，ICH 群；271.8 ± 13.5 ヵ 所，ICH+ET 群；413.5 ±44.2 ヵ所，ICH+LT 群；264.5 ± 17.5 ヵ所）。

7．統計学的手法
Forelimb placing test，神経細胞数，樹状突起と同心考

察

円の全交差点数の群間比較には一元配置分散分析を行本研究から，脳出血後の早期介入による運動機能の改い，その後，Turkey-Kramer 法を用いて多重比較検定

善は，大脳皮質感覚運動野第 V 層の神経細胞減少抑制を行った。なお，有意水準は 5% としたおよび樹状突起の退縮抑制が関与している可能性が示唆された。脳出血モデルラットを用いた先行研究で，血腫結果による直接の影響を受けない二次的な変性として大脳皮1．Forelimb placing test

質感覚運動野が萎縮することが示されている。これはICH+ET 群は，ICH 群および ICH+LT 群と比較して大脳皮質感覚運動野における神経細胞の樹状突起の退6）やアストロサイトの密度や突起数の減少 7）が関与

術後 8 日目と 15 日目に有意に高値を示した（術後 8 日

縮目：ICH 群；1.375 ± 0.595 回，ICH+ET 群；4.167 ±している可能性が高い。また，本研究の結果から，大脳2.927 回，ICH+LT 群；1.574 ± 1.272 回，術後 15 日目：

皮質感覚運動野第 V 層における神経細胞数の減少も関ICH 群；1.125 ± 0.398 回，ICH+ET 群；8.0 ± 1.125 回，与していることが分かった。先行研究では，脳出血後のICH+LT 群；1.714 ± 0.4 回）。

感覚運動野における樹状突起やアストロサイトの二次的変性が運動介入によって抑制できることが示されている

2．神経細胞数6）7）。本研究の結果から，運動介入による二次的変性

傷害側において ICH 群および ICH+LT 群は SHAMの抑制効果は，早期からの介入の方が後期からの介入よ群より有意に低値を示した。また ICH+ET 群は ICH 群り高いことが分かった。脳卒中発症後早期は，神経成および ICH ＋ LT 群より有意に高値を示した（SHAM2長因子が多く発現し，その後は NOGO などの成長抑制

2因子が次第に増加する。そのため，発症早期はリハビリ

ICH+ET 群；54.4 ± 1.03 個 /mm ，ICH+LT 群；42.3

テーション介入で機能改善を促進させるための重要な時群；53.4 ± 2.1 個 /mm ，ICH 群；44.7 ± 2.2 個 /mm ，2

平成 29 年度研究助成報告書

3期とされている 8）。神経成長因子は，神経の可塑的変化発表実績や神経細胞死の抑制に関与しているため，早期介入に

1）玉越敬悟，石田和人，高松泰行，中川弘毅，早尾啓志，田巻弘之．脳出血モデルラットにおけるトレッドミル走行の実施時期の違いが運動機能回復および組織傷害に与える影響．第 52 回日本理学療法学術大会（千葉），2017.5
2）Tamakoshi K, Ishida K, Hayao K, Takahashi H, Tamaki
H. Early treadmill exercises inhibit cortical thickness
atrophy following intracerebral hemorrhage in rats．
The 40st Annual Meeting of the Japan Neuroscience
Society(Kobe), Jul. 2017.
3）Tamakoshi K, Ishida K, Hayao K, Takahashi H, Tamaki
H. Effect of early and late treadmill training on motor
functional recovery and the cerebral cortex after
hemorrhage in rats. Society for Neuroscience 2017(USA),Nov. 2017.
4）玉越敬悟，石田和人，早尾啓志，髙橋英明，田巻弘之．脳出血モデルラットにおける早期トレッドミル走行は大脳皮質の萎縮を抑制し機能改善を促進する．第 24 回脳機能とリハビリテーション研究会学術集会（千葉），2017.4
5）玉越敬悟，石田和人，早尾啓志，髙橋英明，田巻弘之．脳出血後の運動機能障害は脳梗塞と比較して自然回復が早い．第 24 回脳機能とリハビリテーション研究会学術集会（千葉），2017.46）玉越敬悟，石田和人，早尾啓志，髙橋英明，田巻弘之．脳出血後の早期リハビリテーションが運動機能回復および組織傷害に及ぼす影響．第 25 回日本運動生理学会（横浜），2017.7
7）玉越敬悟，石田和人，早尾啓志，髙橋英明，田巻弘之．脳卒中リハビリテーションの開始時期の違いが運動機能回復および組織傷害に及ぼす影響．第 16 回コメディカル形態機能学会（名古屋），2017.9
8）玉越敬悟，石田和人，早尾啓志，髙橋英明，田巻弘之．脳出血モデルラットにおける超早期リハビリテーションが運動機能回復および大脳皮質感覚運動野に及ぼす影響．
STROKE2018（福岡），2018.3
9）Tamakoshi K, Ishida K, Hayao K, Takahashi H, Tamaki
H. Effect of very early exercise on motor functional
recovery and brain damage after hemorrhage in rats.
The 95th Annual Meeting of the Physiological Society ofJapan (Kagawa), Mar. 2018.

よって感覚運動野の樹状突起の退縮抑制や神経細胞の減少抑制が引き起こされたと考えられる。今後，神経成長因子や細胞死抑制因子の発現状態について検証する必要がある。
文献1）Yang YR, Wang RY, et al.: Early and late treadmill
training after focal brain ischemia in rats. Neurosci Lett.
2003; 339: 91‒94.
2）Zhang P, Yu H, et al.: Early exercise improves
cerebral blood flow through increased angiogenesis inexperimental stroke rat model. J Neuroeng Rehabil. 2013;
10: 43.
3）Lee HH, Shin MS, et al.: Early treadmill exercisedecreases intrastriatal hemorrhage-induced neuronal cell
death and increases cell proliferation in the dentate gyrusof streptozotocin-induced hyperglycemic rats. J Diabetes
Complications. 2005; 19: 339‒346.
4）Risedal A, Zeng J, et al.: Early training may exacerbate
brain damage after focal brain ischemia in the rat. J
Cereb Blood Flow Metab. 1999; 19: 997‒1003.
5）Piao CS, Stoica BA, et al.: Late exercise reduces
neuroinflammation and cognitive dysfunction after
traumatic brain injury. Neurobiol Dis. 2013; 54: 252‒263.
6）Takamatsu Y, Tamakoshi K, et al.: Running exercise
enhances motor functional recovery with inhibition ofdendritic regression in the motor cortex after collagenaseinduced intracerebral hemorrhage in rats. Behav Brain
Res. 2016; 300: 56‒64.
7）Mestriner RG, Pagnussat AS, et al.: Skilled reaching
training promotes astroglial changes and facilitatedsensorimotor recovery after collagenase-induced
intracerebral hemorrhage. Exp Neurol. 2011; 227: 53‒61.
8）Murphy TH, Corbett D: Plasticity during stroke recovery:
from synapse to behaviour. Nat Rev Neurosci. 2009; 10:861‒872.