Ｐ０８００５
Ｐ１１００２
平成２４年度実施方針
バイオテクノロジー・医療技術部
１．件 名：プログラム名 健康安心イノベーションプログラム（大項目）ゲノム創薬加速化支援バイオ産業基盤技術開発
２．根拠法
独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構法第１５条第１項第２号
３.

背景及び目的・目標

３．１

背景及び目的近年、製薬企業の研究開発費は増大の一途であるものの、承認される薬剤の数は増えていない。
研究開発費の増大分は、主として臨床開発費に充てられ、探索研究に回せるリソースは相対的に減少している状況にあることもその理由の一つであるが、創薬ヒット化合物の発見につながる新
たなスクリーニング手法の技術革新と技術実証の不足により、新規医薬品候補化合物の探索効率が大幅に低下している可能性も指摘されている。
このため、最先端の知識と分析技術を組み合わせ、創薬開発のより早い段階から適切な医薬品
候補物質の取得を可能とする、標的蛋白質の立体構造をベースとした in silico スクリーニング
や探索対象となる化合物空間の拡大など、創薬の効率化に繋がる新たな技術の開発が必要である。
これにより、構造情報を基にした新しい観点からの画期的な新薬の創出、さらには膜蛋白質及びその複合体の機能、機構を説明する新しい概念の構築、天然物化学情報基盤の強化等により、ゲノム情報を活用した創薬技術の高度化による我が国バイオ産業の競争力強化、新産業の創出・育成を通じて、国際的優位性を確保することが期待できる他、個別化医療への応用とともに、健康維持・増進などを含めた幅広い分野への展開が期待できる。
３．２

目標(1) 研究開発項目＜１＞「創薬加速に向けたタンパク質構造解析基盤技術開発」(平成２０～２４
年度)
最終目標（平成２４年度）
標的とする膜タンパク質の「立体構造に指南された創薬戦略（ＳＧＤＤ: Structure Guided
Drug Development）」を実現し、創薬研究を効率化する基盤技術を確立する。
(2) 研究開発項目＜２＞「有用天然化合物の安定的な生産技術開発」（平成２３～２４年度）
最終目標（平成２４年度）
放線菌を対象に、新規の医薬品開発につながる有望な天然化合物の合成に必要な生合成遺伝子クラスターを体系的に取得し、安定生産に適したホスト放線菌、導入ユニットの構築及び導入技術を確立する。
なお、研究開発項目毎に目標を設定し、別紙に記載する。

1

４．実施内容及び進捗（達成）状況
４．１

平成２３年度事業内容(１) 研究開発項目＜１＞「創薬加速に向けたタンパク質構造解析基盤技術開発」(平成２０～２
４年度)
京都大学大学院理学研究科教授

藤吉

好則氏をプロジェクトリーダーとして、研究開発を実施した。詳細は別紙１を参照。
(２) 研究開発項目＜２＞「有用天然化合物の安定的な生産技術開発」（平成２３～２４年度）
独立行政法人産業技術総合研究所バイオメディシナル情報研究センター

新家一男氏をプロジェクトリーダーとして研究開発を実施した。詳細は別紙２を参照。
４．２

実績推移
Ｈ２０年度

Ｈ２１年度

Ｈ２２年度

Ｈ２３年度

委託

委託

委託

委託

実績額推移（百万円）
一般勘定
特許出願数（件）

８３８

８８６

６８７

１，３６５

０

０

０

１

論文発表数（報）

１６

５６

５３

７９

フォーラム等（件）

２８

２８

１０７

８７

５．事業の内容
５．１

平成２４年度事業内容

上記の目標を達成するため、以下の項目について、研究開発を実施する。
研究開発項目＜１＞「創薬加速に向けたタンパク質構造解析基盤技術開発」（Ｐ０８００５）
我が国の強みである世界最高レベルの膜タンパク質構造解析技術、タンパク質間相互作用
解析技術、高度な計算科学技術等の研究ポテンシャルを最大限活用し、膜タンパク質及びその複合体の細胞表層上における立体構造解析、相互作用解析、計算科学を用いた創薬候補化
合物の効率的な探索と更に実用性の高いリード化合物への展開等の創薬基盤技術の開発を行う。詳細は別紙１を参照。
研究開発項目＜２＞「有用天然化合物の安定的な生産技術開発」（Ｐ１１００２）
我が国の強みとする微生物ライブラリーや、天然物化学に対する知識基盤等を最大限に活用し、創薬リード化合物候補となりうる広いケミカルスペースを持った天然化合物を生産す
る生合成遺伝子とそれを応用した化合物生産を効率的に行う技術開発により、創薬の基盤技術を構築する。詳細は別紙２を参照。

2

５．２

平成２４年度事業規模
委託事業

一般勘定

１，４０７百万円（継続）※事業規模については、変動があり得る。

６．事業の実施方式(１) 評価の方法
評価については、研究開発項目毎に実施する。評価方法・評価時期等については別紙１及び別
紙２を参照。
(２) 運営管理各研究開発項目については、必要に応じて技術検討会を実施し、外部有識者の意見を適切に反映し、着実な運営を図る。
実施にあたっては、「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」（平成１３年度文部科学
省・厚生労働省・経済産業省告示第 1 号）等、研究開発関連の指針を厳守しなければならない。
また、本研究開発成果の事業化においては、「経済産業分野のうち個人遺伝情報を用いた事業分
野における個人情報保護ガイドライン」（平成１６･１２･２４製局第１号）を厳守する。なお、関連指針等が改正されたときは、改正後の指針を適用するものとする。
７．改訂履歴（1）平成２４年３月１日、制定（2）平成２４年８月１５日、開発成果創出促進制度の対象事業として「有用天然化合物の安定的な生産技術開発」が決定されたことに伴う事業規模の改定。

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別紙１
研究開発項目＜１＞「創薬加速に向けたタンパク質構造解析基盤技術開発」（Ｐ０８００５）
１．背景及び目的・目標
創薬研究では、蛋白質の立体構造に基づいた薬剤の開発による創薬研究の効率化への取り組みが進みつつある。このため、今後の医薬品産業の国際競争力の強化に向けて、蛋白質の立体構造解析技術や計算科学による創薬候補化合物探索技術等の基盤技術の構築が重要となっている。特に市販薬剤のターゲット（作用点）として、ほぼ５０％を占めている膜タンパク質は、生命現象の解明や創薬開発において重要な標的タンパク質である。また、膜タンパク質は細胞膜上における複合体形成や構造変化等により機能を発現していることから、細胞表層における膜タンパク質
及びその複合体の立体構造解析技術や膜タンパク質とリガンドの相互作用解析技術、その構造情報に基づいた計算科学的解析技術を構築し、創薬ヒット候補化合物を効率よく絞り込むための基盤技術を開発することで、「タンパク質立体構造に指南された創薬戦略（ＳＧＤＤ: Structure
Guided Drug Development）」を実現し、創薬研究を効率化することが重要である。
本事業では、我が国の強みである世界最高レベルの膜タンパク質構造解析技術、タンパク質間相互作用解析技術、高度な計算科学技術等の研究ポテンシャルを最大限活用し、膜タンパク質及びその複合体の細胞表層上における立体構造解析、相互作用解析、計算科学を用いた創薬候補化
合物の効率的な探索と更に実用性の高いリード化合物への展開等の創薬基盤技術の開発を行う。
[委託事業]＜最終目標（平成２４年度末）＞
ⅰ）電子線等による膜タンパク質及びその複合体の構造解析技術
細胞膜内での生体内に近い状態での膜タンパク質及びその複合体の立体構造を解析するため、以下の技術を確立する。また、これらの技術と既存の技術を活用し、ヒト由来（発現系）膜タン
パク質及びその複合体の構造を複数個解析する。
ａ）２次元結晶化された膜タンパク質及びその複合体を２Åより高い分解能で３次元構造解析
する技術、細胞膜内において自然な構造の状態で固定化された膜タンパク質等の全体像を
電子線トモグラフィー等により５０Åより高い分解能で３次元構造解析する技術を確立する。
ｂ）結晶化できない膜タンパク質の立体構造を８Åより高い分解能で解析する技術（単粒子解析等）を確立する。
ｃ）ａ）、ｂ）を組み合わせることにより自然な状態の膜タンパク質及びその複合体の構造を解析する技術を確立する。
ⅱ）核磁気共鳴法等による膜タンパク質及びその複合体とリガンド分子の相互作用解析技術
生体内に近い状態での膜タンパク質及びその複合体とリガンド分子の相互作用を解析するため、以下の技術を確立する。また、これらの技術を基に、５個以上の膜タンパク質等創薬標的タンパ
ク質を解析する。
ａ）解離定数がmM～μMと結合力が弱いリガンド分子の結合構造の解析技術を確立する。
ｂ）固体と液体が混合した不均一な系における膜タンパク質及びその複合体とリガンド分子の相互作用解析技術について従来法に比べ３倍に高感度化する。
ｃ）細胞表層における生体内に近い状態での膜タンパク質及びその複合体とリガンド間相互作

4

用を解析する技術を開発する。
ⅲ） 高精度in silico(※)スクリーニング等のシミュレーション技術
高精度のin silicoスクリーニングを実現するため、以下の技術を確立する。さらにⅰ）、ⅱ）の技術と連携により、産業上有用な化合物を１０個以上取得する。
ａ）タンパク質の動的性質を正しく評価し、タンパク質受容体への基質結合能を高い精度で計算できる新しい計算科学手法を確立し、in silicoスクリーニングの効率を従来法に比べ１０倍程度に上げる。
ｂ）タンパク質と化合物とのドッキング計算手法の精度を高め、ターゲット選択性能を従来法に比べ１０倍程度に上げる。
ｃ）タンパク質間相互作用及び超分子複合体の構造情報に基づく構造生理学、構造薬理学のアプローチにより、タンパク質間相互作用を阻害・制御する低分子化合物を選択・設計するため、医薬品化が困難な生理活性ペプチドから医薬品となりやすい非ペプチド性の化合物（低分子化合物等）を得る一般的手法を開発し、その技術の有効性を確認するため、最低１つの実証を行う。
(※) in silico：シミュレーション等の計算機科学的手法による＜中間目標（平成２１年度末）＞
ⅰ）電子線等による膜タンパク質及びその複合体の構造解析技術
細胞膜内での生体内に近い状態での膜タンパク質及びその複合体の立体構造を解析するため、以下の技術を開発する。また、これらの技術と既存技術を活用し、ヒト由来（発現系）膜タンパ
ク質及びその複合体の構造を最低１個解析する。
ａ）２次元結晶化された膜タンパク質及びその複合体を２Åより高い分解能で３次元構造を解析する技術、細胞の自然な状態での膜タンパク質及びその複合体の３次元構造を解析する
技術（電子線トモグラフィー等）を開発する。
ｂ）結晶化できない膜タンパク質の立体構造を１０Åより高い分解能で解析する技術（単粒子解析等）を開発する。
ｃ）ａ）、ｂ）を組み合わせることにより自然な状態の膜タンパク質及びその複合体の構造を解析する技術を開発する。
ⅱ）核磁気共鳴法等による膜タンパク質及びその複合体とリガンド分子の相互作用解析技術
生体内に近い状態での膜タンパク質及びその複合体とリガンド分子の相互作用を解析するため、以下の技術を開発する。また、これらの技術を基に、２個以上の膜タンパク質等創薬標的タンパ
ク質を解析する。
ａ）解離定数がmM～μMと結合力が弱いリガンド分子の標的分子結合部位を同定する解析技術を開発する。
ｂ）固体と液体が混合した不均一な系における膜タンパク質及びその複合体とリガンド分子の相互作用解析技術を従来法に比べ３倍の高感度の解析技術を開発する。
ⅲ）高精度in silicoスクリーニング等のシミュレーション技術
高精度のin silicoスクリーニングを実現するため、以下の技術を開発する。さらに、ⅰ)、ⅱ）の技術と連携により、産業上有用な化合物を５個以上取得する。
ａ）タンパク質の動的性質を正しく評価し、タンパク質受容体への基質結合能を高い精度で計5算できる新しい計算科学手法の開発し、in silicoスクリーニングの効率を従来法に比べ５倍程度に上げる。
ｂ）タンパク質と化合物とのドッキング計算手法の精度を高め、ターゲット選択性能を従来法に比べ５倍程度に上げる。
ｃ）タンパク質間相互作用を阻害・制御する低分子化合物の選択・設計の技術開発を行う。
２．実施内容及び進捗（達成）状況
京都大学大学院理学研究科教授

藤吉

好則氏をプロジェクトリーダーとして、以下の研究開発を実施した。
２．１

平成２３年度事業内容

研究開発項目①「電子線等による膜タンパク質及びその複合体の構造解析技術」
細胞膜内での生体内に近い状態で膜タンパク質及びその複合体の立体構造を解析するため、以下の基盤技術の開発を進めた。また、これらの技術と既存技術を活用して、ヒト由来（発現系）などの膜タンパク質及びその複合体の構造の解析を進めた。
(a) 解析が必要な膜タンパク質およびその複合体の構造解析を目指して、発現・精製技術、２次元結晶化技術の開発
膜タンパク質およびその複合体の大量発現・結晶化・構造解析
・ラットやマウス（げっ歯類）由来の水チャネルＡＱＰ４の阻害剤を開発したがヒト由来の水チャネルの阻害剤にはならない事が判明した。それゆえ、この阻害剤、アセタゾールア
ミドの結合において、２つのアミノ酸が、そしてこの２つのアミノ酸だけが、この違いを作り出していることを解明した。すなわち、ヒト由来のＡＱＰ４の発現系を昆虫細胞を用いて確立し、ヒトとげっ歯類で配列の異なる５つのアミノ酸をげっ歯類型にする変異体を発現・精製して、げっ歯類由来の水チャネルと同じようにアセタゾールアミドが水透過を阻害できるか否かの実験を行った。またその逆に、げっ歯類由来のＡＱＰ４をヒト型にする変異体を発現・精製して、アセタゾールアミドで阻害できなくなるか否かの実験を行った。その結果、げっ歯類の２つのアミノ酸、すなわちＶ５３とＴ１４９がヒトではそれぞれロイシンとメチオニンに変異しており、この２つのアミノ酸を変異することによって、げっ歯類のＡＱＰ４をヒト型に、ヒトのＡＱＰ４をげっ歯類型にすることが出来ることを解明した。
・ギャップ結合チャネルの複雑なゲーティング機構を明らかにするために、Ｃｘ２６のＭ３４Ａ変異体の大量発現を昆虫細胞で行って、分解能を向上させることで、プラグや細胞質側の複雑な構造を解明した。このギャップ結合の研究をさらに進めるために、遺伝性末梢神経障害や、慢性進行性筋脱力と筋萎縮などに関わるＣｘ３２や別のギャップ結合チャネ
ルであるイネキシンなどの昆虫細胞での発現に成功した。Ｃｘ３２については、さらに各種変異体を作製することにより（ギャップ結合を形成する場合には６量体の２つのヘミチ
ャネルが互いに結合した１２量体を形成するが）、ギャップ結合を形成しないヘミチャネ
ルだけを安定に形成する変異体を発見した。なお、この変異体は２次元結晶による高分解能の解析に適すると期待される。
・イオンチャネルの構造解析を目指して、様々な電位依存性 Na+チャネルのクローニングを行い、それらの機能解析を行った。さらに、これらの発現を試みるとともに２次元結晶の作製に成功した。それらの２次元結晶と極低温電子顕微鏡を用いて構造解析のためのデー

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タを収集した。
・創薬分野において期待されているＧＰＣＲ(ＥＴBＲ)の構造解析を目指して、構造を安定化させるために４００を超える全てのアミノ酸残基について変異体を作製し、発現系を構築した。この探索により構造を安定化できる変異体の組み合わせを解明したので、結晶化を目指したコンストラクトの探索とそれらの発現を進めた。さらに進めて、２次元結晶と３次元結晶化を試みて、分解能は低いが結晶化できるようになった。
（実施体制：社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研究所バイオメディシナル情報研究センター、独立行政法人産業技術総合研究所脳神経情報研究部門、
国立大学法人京都大学大学院理学研究科、学校法人慶應義塾大学大学院医学研究科）(b) 極低温高分解能電子顕微鏡等の開発、コンピューター解析の高速化と精密化①電子線トモグラフィー用極低温電子顕微鏡の開発
細胞に存在する生体内に近い状態の構造を解析することを実現するために、画像記録シ
ステムを含む電子線トモグラフィー用極低温電子顕微鏡システムの改良を行うことで、５０Åより高い分解能のトモグラフィー像の取得に成功したので、このシステムを用いて、ギャップ結合構造のトモグラフィー解析を行った。
②電子線回折を撮影できる２次元結晶の２Å分解能を超えるような高分解能の構造解析を可能にするプログラムの開発
２Å分解能を超えるような高分解能解析用のシステム開発に成功した。また、胃薬の開発に役立つ構造情報を取得するために、ＨＫ－ＡＴＰａｓｅとその阻害剤複合体の比較的悪い結晶を用いることで、構造解析の効率を向上させるような電子線結晶学用プログラムの開発を行った。
③電子線トモグラフィー用プログラムの開発
細胞に存在する自然な状態での膜タンパク質及びその複合体の解析のために、粒子ラベ
ルなしでも高分解能の電子線トモグラフィー解析ができるコンピュータプログラムをこれまでに開発したが、それを基にさらに使いやすいシステムへの改良を行った。
（実施体制：社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研究所バイオメディシナル情報研究センター、独立行政法人産業技術総合研究所脳神経情報研究部門、
国立大学法人京都大学大学院理学研究科、国立大学法人京都大学大学院農学研究科、独立行
政法人理化学研究所播磨研究所）(c) 電子顕微鏡とＸ線によるタンパク質構造解析
上記で開発した技術を用いた膜タンパク質およびその複合体の構造解析を行った。Ｘ線結晶構造解析法を用いた方が迅速に解析できるタンパク質複合体についてはＸ線による構造解析を行った。３次元結晶化が困難な膜タンパク質の構造解析は電子線結晶学を用いた構造解析を行い、胃のＨＫ－ＡＴＰａｓｅ等のように結晶性の良くない２次元結晶についても高い分解能での構造解析に成功した（Nature Commun., 2, 155 pp1-7 (2011)）。細胞に存在する状
態で電子線トモグラフィーの解析も行うことで、膜タンパク質やその複合体の自然な状態の構造解析を目指し、具体的には以下の内容を実施した。
・水チャネルＡＱＰ４の高分解能の構造解析と機能解析から、ＡＱＰ４の阻害剤の結合に必須の２つのアミノ酸を同定することに成功したので、ＡＱＰ４とその阻害剤との複合体の高分解能の構造解析のためのデータを収集し、構造を解析した。
・ギャップ結合チャネルの複雑なゲーティング機構を解明するために、Ｃｘ２６のＭ２３Ａ

7変異体の構造解析の分解能を向上させることに成功し、イネキシンの結晶化に成功した。
・電位感受性Ｎａ+チャネルの構造を解析するための２次元結晶化に成功したので、これらの構造解析を行って、細胞質側が閉じた構造と開いた構造という２つの状態の構造を解析した。
・ヒストンと相互作用する転写制御因子複合体の構造と機能をＸ線結晶構造解析法により解析した。
・ＨＫ－ＡＴＰａｓｅと次世代の胃薬開発に有用な情報となる阻害剤ＳＣＨ２８０８０との複合体の構造解析を行った。
・電子線トモグラフィー法で、立体構造解析できるシステムを構築したので、これらを用いて、コネキシンによるギャップ結合とイネキシンによるギャップ結合などの電子線トモグ
ラフィーによる構造解析を行った。
（実施体制：社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研究所
生物情報解析研究センター、独立行政法人産業技術総合研究所バイオメディシナル情報研究センター、独立行政法人産業技術総合研究所脳神経情報研究部門、国立大学法人京都大学大学院理学研究科、国立大学法人京都大学大学院農学研究科、独立行政法人理化学研究
所播磨研究所）
研究開発項目②「核磁気共鳴法等による膜タンパク質及びその複合体とリガンド分子の相互作用解析技術」(a) リガンドベース創薬デザインのためのＮＭＲ相互作用解析手法の開発・高度化
基盤技術開発として、リガンド･標的タンパク質ベース双方からの創薬デザインを実現するため、①リガンド中の各プロトンと創薬標的タンパク質との分子間距離をより正確に反映するリガンドベース解析手法の開発、および②創薬標的タンパク質上のリガンドの結合サイトを迅速に同定する標的タンパク質ベース解析手法の開発を行った。①については、
従来法であるSaturation Transfer Difference (ＳＴＤ)法において定量性を損なう原因となる“自己緩和速度”を差し引くことで、リガンド水素とタンパク質水素群との分子間距離を正確に測定する新たな手法DIRECTION法を開発した。これをＴＭＰ /bovineＤＨＦ
ＲおよびＳＢ２０４５８/ＭＡＰＫ(p((・)など複合体立体構造既知の系に適用した結果、予測値と観測データ間に高い整合性が見られた。また、本手法は結合部位におけるリガン
ドと標的タンパク質との間の空隙を検出することが可能であったことから、結合活性の弱いヒット化合物に本手法を適用することで、リードを創生する際の合成展開へのヒントを提示できることが示された。②については、無細胞タンパク質発現と部位特異的安定同位体標識を組み合わせることで、時間のかかる帰属作業を回避する新たな相互作用面決定法を開発した。さらに本手法で得られる情報を用い、複合体モデルを構築する手法を併せて開発した。本手法をＭＡＰＫ(p((・)に適応した結果、結合サイト既知の化合物について４Å程度の精度で複合体モデルを構築することが可能であった。
（実施体制：社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研究所
バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人東京大学大学院薬学系研究科）（b） 細胞膜複合体相互作用解析のためのＮＭＲ試料調製法の開発、及び細胞膜複合体相互作用解析のためのＮＭＲ解析法の開発
ＣＣＬ３ は大腸菌発現系により安定同位体標識したものを調製した。ＣＣＲ１、ＣＣ
Ｒ５ は昆虫細胞発現系により大量発現し、1 ％ n-dodecyl-β-D-maltopyranoside により

8形質膜から可溶化した。可溶化したＣＣＲ１ またはＣＣＲ５ はｒＨＤＬ 脂質二重膜中への再構成、精製を行った(ＣＣＲ１/ＣＣＲ５-ｒＨＤＬ)。これにより、昆虫細胞1Ｌ培養から約３０ μg のＣＣＲ１、約１０ μg のＣＣＲ５ を含むｒＨＤＬ を約８０ ％ の純度にて調製できた。ＣＣＬ３ とＣＣＲ１/ＣＣＲ５-ｒＨＤＬ を用いてＳＰＲ 解析を行った結果、両者の結合を検出でき、算出された解離定数はＣＣＬ３ とＣＣＲ１-ｒＨＤＬ、
ＣＣＬ３ とＣＣＲ５-ｒＨＤＬ のいずれにおいても約５ μMであった。
ＴＣＳ 実験によりＣＣＬ３ におけるＣＣＲ１/ＣＣＲ５-ｒＨＤＬ 結合部位決定を試みた。ＣＣＬ３ のアミドプロトンを解析対象とし、コントロール実験として受容体を含まない空ｒＨＤＬ を用いた。観測されたシグナル強度減少率について、ＣＣＲ１/ＣＣＲ５-ｒＨＤＬ を用いた実験結果からコントロール実験の結果を差し引いた値(ΔＲＲ) を算出した。その結果、ＣＣＲ１-ｒＨＤＬ を用いた実験では、ＣＣＬ３ 上のＧｌｎ４９Ｇ を中心とする領域とＧｌｎ３４を中心とする領域、ＣＣＲ５-ｒＨＤＬ を用いた実験ではＧ
ｌｎ４９Ｇを中心とする領域とＶａｌ６３ を中心とする領域において有意な・ＲＲ を観測し、これらの部位が結合界面に位置することが示された。
これらの結果から、ＣＣＬ３ のＧｌｎ４９を中心とする領域はＣＣＲ１、ＣＣＲ５結合部位として共通する一方、Ｇｌｎ３４またはＶａｌ６３ 近傍の領域は、ＣＣＲ１、ＣＣ
Ｒ５ に対する特異的な結合部位であることわかった。
さらに、これらの領域にはいずれも酸性残基が含まれていた。ＴＣＳ 実験から同定した結合部位に含まれる酸性残基は、ＣＣＲ１ またはＣＣＲ５ のリガンドとなる他のケモ
カインに保存されていたことから、他のケモカインにおいてもＣＣＲ１ およびＣＣＲ５の認識に重要であることが示唆された。
一方生細胞内ＮＭＲ観測に関しては、前年度までに、15Ｎ標識を施したＣＧ１ドメイン(ＣＧ１)をＨｅＬａＳ３細胞内に導入し、細胞内に内在する微小管との相互作用の観測を試みてきた。しかし、観測されたシグナルは運動性の高い末端部位と側鎖に由来するシグナルのみであり、微小管と相互作用を示す構造形成領域のシグナルは観測されなかった。
細胞内で構造形成領域に由来するアミドプロトンが観測されなかった原因として、細胞内の高い粘性の影響によってＣＧ１の運動性が低下し、ＮＭＲシグナルが顕著に広幅化してしまったためと考えた。
そこで本研究では、巨大分子のＮＭＲシグナルを高感度に検出するメチルＴＲＯＳＹ法を利用して、ＣＧ１のin-cell ＮＭＲ観測を行った。その結果、構造形成領域を含め、1(Ｃ標識を施したＣＧ１のメチル基に由来するシグナルを全て観測することができた。また、細胞内ＣＧ１のスペクトルはバッファー中におけるＣＧ１と比較して、Ｖ１０３に顕著な
化学シフト変化が観測された。この化学シフト変化は、①同様の化学シフト変化がバッフ
ァー中のＣＧ１に精製した微小管を加えた際にも観測されたこと、②微小管と相互作用しないＣＧ１変異体を細胞内に導入した際にはＶ１０３に化学シフト変化は観測されなかったこと、の２点より、細胞内微小管との相互作用を反映していると結論した。
本研究では、ＳＬＯを用いた蛋白質導入法を用いることで、生きた細胞内における内在性分子との相互作用を原子レベルで観測することに初めて成功した。今後は、本手法に転移交差飽和（ＴＣＳ）法を組み合わせることにより、細胞内の蛋白質間相互作用界面をより詳細に同定する方法を開発する。本研究の展開により、試料調製が困難である膜タンパ
ク質や、タンパク質複合体を対象としたリガンドとの相互作用様式の解明が期待できる。
（実施体制：社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研究所
バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人東京大学大学院薬学系研究科）

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(c) 創薬標的タンパク質複合体の相互作用解析
酸性条件下における活性化状態と不活性化状態の間の交換速度を求めるため、
selectivity filter に存在するＶａｌ７６のメチルシグナルを用いて、1(Czz exchange 解析を行った。４０˚C, ５０ｍＭ Ｋ+存在下における測定の結果を理論式に対してフィッテ
ィングした結果、活性化状態から不活性化状態への遷移速度定数 kai は０．４６ ± ０．
０２ (s-1), 不活性化状態から活性化状態への遷移速度定数 kia は０．９４ ± ０．０４(s-1)であることが明らかとなった。これらの値は、電気生理学解析における活性化状態と不活性化状態の間の交換速度と対応する。次に、ＫｃｓＡのＣ末端３５残基の細胞質内領域を切除したＫｃｓＡ ・Ｃを用いて、同一条件下で交換速度を解析した。まず、Ｖａｌ
７６メチル基の化学シフトが野生型と一致したことから、ＫｃｓＡ・Ｃの活性化状態・不活性化状態の selectivity filter の構造が共に全長ＫｃｓＡと同様であることを確認した。1(Czz exchange 解析を行った結果、ＫｃｓＡ・Ｃの kai は７．１７ ±０．１３ (s-1)、

kia は０．９６ ±０．０２ (s-1) と算出され、kia は全長ＫｃｓＡと同程度である一方、kaiが１０倍以上に増大することが明らかとなった。この結果は、膜貫通領域に位置する
selectivity filter の運動性が、そこから離れた細胞質内領域によって制御されていることを示している。
以上のように本研究では、結晶構造が得られない酸性条件下における活性化状態と不活性化状態の構造平衡について、その交換速度を解析することにより、カリウムチャネルのアロステリックな運動性制御機構を見出すことに成功した。Selectivity filter の構造はカリウムチャネル間で保存されているため、この部位に直接結合する化合物が不整脈などの重篤な副作用を発現することがあることが知られている。これに対し、本研究で得られた知見は、保存性の低い細胞質内領域を標的として活性化状態と不活性化状態の間の交換速度を間接的に制御することによって、より選択性が高く副作用の小さい新規化合物を創製できる可能性を示すものである。
（実施体制：社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研究所
バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人東京大学大学院薬学系研究科）
研究開発項目③「高精度 in silico スクリーニング等のシミュレーション技術」
主にＧＰＣＲを標的とした、モデリング、動的ゆらぎを考慮したスクリーニング、
Structure-based drug screeningおよび分子シミュレーションを援用した化合物活性予測手法、ＮＭＲ情報を利用したタンパク質―化合物複合体構造モデリング手法などを新規に開発した。２０１０年１２月に公開されたmyPresto version４．２では、分子動力学(ＭＤ)シミュレーション、ドッキングソフト、各種薬物スクリーニングソフト、タンパク質のリガンド
結合ポケット予測ソフト、薬物スクリーニング結果の信頼性評価ツール、溶解度などの物性予測ソフトなどが公開されているが、これらの手法を改良し、myPresto version ４．２０
５４として、２０１１年１０月に一般に公開した。
(a) in silico ドッキング計算の高精度化
・ドッキングソフトと分子動力学(ＭＤ)シミュレーションを組み合わせた手法（sievgeneＭＶＯ）を開発した。Sievgene-ＭＶＯは、タンパク質と化合物の複合体を最低１つ必要とするが、予測精度は、従来開発してきた複数の活性化合物を必要とする予測精度最高の
ＭＳ－ＭＴＳ法と同等であった。ＮＭＲ実験情報とドッキング計算を組み合わせたタンパ

10ク質―化合物複合体を予測する手法を開発し、p((ＭＡＰＫに適用し、従来のドッキング
計算の精度を上回ることを確認した。活性化合物の合成展開すべき部位の予測や物性予測など、リード創製を支援する手法を開発した。
・ドッキングのスコアの精度を高めるため、タンパク質及び低分子リガンドの動的構造、及び各種相互作用を考慮した複合体の構造予測法及び結合エネルギー算出法の開発を行なった。ＧＰＣＲに対し、動的ゆらぎを考慮したアンサンブルドッキング手法と、世界的に問題になっていた、予測結果の信頼性を評価する手法(Universal Active Probe)を開発し、適用できることを示した。また、マルチカノニカルＭＤを用いた ab-initio な複合体の構
造予測法の研究を行って Coupled folding and binding の問題にアプローチし、ハンチン
トン舞踏病原因タンパク質を例とし、単体では決まった構造を取らず、複合体になって始めて決まった立体構造を取る天然変性タンパク質の構造形成メカニズムを明らかにした。
（実施体制：社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研究所
バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人大阪大学蛋白質研究所）(b) 構造生理学アプローチによるタンパク質間相互作用解析
・「構造インタラクトーム」に踏み込んだ、ペプチドと同様あるいはそれ以上の強い結合性を有する非ペプチド性化合物（低分子化合物等）を、(a)sievgene-ＭＶＯなどを適用し、探索した結果、分子量が３５０Da 以下であるにも関わらず、活性が１μM 以下の新規な低分子化合物を２つ獲得した。ＣＯＭＢＩＮＥ法を myPresto に組み込んだ。
（実施体制：社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研究所
バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人大阪大学蛋白質研究所）(c) 創薬開発への応用促進に向けた技術開発
・ ＧＰＧＰＵなどのアクセラレーターを活用した、計算の高効率化と高速性が発揮できるプ
ログラムの開発を進め、生体膜に埋め込まれたＧＰＣＲの系（膜や溶媒分子を含んで約５
６，０００原子からなる）へ適用し、１０ ｎｓｅｃのＭＤ計算を従来の約３０倍の速度で行うことに成功した。この手法を活用することにより、アドレナリンβ(受容体とその特異的リガンドとの信頼性の高い複合体モデルを迅速に構築した。
・ リガンド・データベースや計算結果を整理したデータベースの開発・作成を継続し、市販
化合物約５００万種類に加え、合成可能なバーチャルな１６００万化合物のデータベースを構築し、配布した。このデータベースには、溶解度や、発がん性など化合物の物性予測
データを付加して、化合物情報の価値を高めた。
・ 具体的な創薬実証研究を、本研究の他のチーム、大学や公的研究所、創薬企業等と協力して実施した。μ受容体（ＧＰＣＲ）のアゴニストの探索を行い、有望なアゴニスト及びア
ンタゴニストを合計８化合物発見した。農薬、ＧＰ－ＶＩ、その他のＧＰＣＲ、ＣＨＫ１などを対象として、実証研究のためにヒット化合物探索を行なった。ＧＰＣＲ専用の配列
アラインメントソフト、ホモロジーモデリングの自動化手法を開発し、各種ＧＰＣＲに適用し、薬物スクリーニングが、容易に高い精度で行えるようにした。
（実施体制：社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研究所
バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人大阪大学蛋白質研究所）

11

２．２

実績推移
Ｈ２０年度

Ｈ２１年度

Ｈ２２年度

Ｈ２３年度

委託

委託

委託

委託

実績額推移（百万円）
一般勘定
特許出願数（件）

８３８

８８６

６８７

１，０７６

０

０

０

１

論文発表数（報）

１６

５６

５３

４２

フォーラム等（件）

２８

２８

１０７

６９

３．事業内容名古屋大学細胞生理学研究センター教授

藤吉 好則氏をプロジェクトリーダーとして、以下の研究開発を実施する。実施体制については別添を参照のこと。
３．１

平成２４年度事業内容

名古屋大学細胞生理学研究センター教授

藤吉 好則氏をプロジェクトリーダーとして、以下の研究開発を実施する。実施体制については別添を参照のこと。
研究開発項目①「電子線等による膜タンパク質及びその複合体の構造解析技術」
細胞膜内での生体内に近い状態で膜タンパク質およびその複合体の立体構造を解析するため、以下の基盤技術の開発を進める。また、これらの技術を活用して、ヒト由来（発現系）な
どの膜タンパク質およびその複合体の構造を複数個解析し、本基盤技術の有用性を示す。
(a) 解析が必要な膜タンパク質及びその複合体の構造解析を目指して、発現・精製技術、２次
元結晶化技術の開発①膜タンパク質及びその複合体の大量発現
・ ラットやマウス由来の水チャネルＡＱＰ４とその阻害剤、アセタゾールアミドとの複合体の構造解析から、ヒト由来水チャネルにも結合できる阻害剤候補を予測した。この化合物
が、ヒト由来ＡＱＰ４において水透過を阻害できるか否かを検証し、できるとすればその結合定数と阻害効率を測定するために、ヒト由来水チャネルの大量発現と精製を行う。
・ ギャップ結合チャネルのＣｘ２６の構造と機能の解析を行ったので、遺伝性末梢神経障害
や、慢性進行性筋脱力と筋萎縮などに関わるＣｘ３２、心臓や免疫の機能などに関わるＣ
ｘ４３などのコネキシンと別のギャップ結合チャネルであるイネキシンなどの発現・精製を行う。
・中心的イオンチャネルである電位依存性 Na+チャネルのクローニングを行い２つの状態の構造を解析したので、さらに高い分解能での解析を進めるために変異体を設計し、それらの発現と精製を行う。
・創薬分野において期待されているＧＰＣＲ(ETBR)の構造解析を目指して、構造を安定化させるために４００を超える全てのアミノ酸残基について変異体を作製・発現し、構造を安定化できる変異体の組み合わせを解明したので、その構造をさらに安定化するＴ４リゾチームのキメラを設計し、発現と精製を行う。
②上記①で発現・精製が成功した膜タンパク質の２次元結晶化、および、３次元結晶化を行う

12

・ヒト由来水チャネルＡＱＰ４と新しい阻害剤との複合体の構造解析を目指した 2 次元結晶作製を試みる。
・ギャップ結合チャネルの複雑なゲーティング機構を解明するために、Ｃｘ２６、Ｃｘ３２、Ｃｘ４３、そして別のギャップ結合チャネルイネキシンなどの様々な方法での結晶化を試みる。
・ イオンチャネルのより高い分解能での構造解析を目指して、電位感受性Ｎａ+チャネルの変異体の２次元結晶化を目指す。
・ ＧＰＣＲ（ＥＴBＲ）変異体の２次元結晶化と３次元結晶化を行う。
（実施体制：一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研究
所バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人名古屋大学細胞生理学研究センター、
国立大学法人京都大学大学院理学研究科）(b) 極低温高分解能電子顕微鏡等の開発、コンピューター解析の高速化と精密化①電子線トモグラフィー用極低温電子顕微鏡の開発
細胞に存在する生体内に近い状態の構造を解析することを実現するために、画像記録シ
ステムを含む電子線トモグラフィー用極低温電子顕微鏡システムの改良を行うことで５０Åの解析を可能にしたので、さらに進めて３０Å程度のより高い分解能のトモグラフィ
ー像の解析によって、生物学的に興味深いデータ取得を目指す。
②電子線回折を撮影できる２次元結晶を用いて２Å分解能を超えるような高分解能の構造解
析を可能にするプログラムの開発
２Å分解能を超えるような高分解能解析用のシステム開発に成功したので、さらに、結晶性の良くない２次元結晶でも、電子顕微鏡像を用いて構造解析することで高い分解能で、効率よく構造解析が出来るシステムの開発を行う。
③電子線トモグラフィー用プログラムの開発
細胞に存在する自然な状態での膜タンパク質及びその複合体の解析のために、粒子ラベ
ルなしでも高分解能の電子線トモグラフィー解析ができるコンピュータプログラムを開発したので、３０Å分解能という世界最高の分解能での解析を目指す。
（実施体制：一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研究
所バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人名古屋大学細胞生理学研究センター、
国立大学法人京都大学大学院理学研究科）(c) 電子顕微鏡とＸ線によるタンパク質構造解析
本プロジェクトで開発してきた基盤技術を用いた膜タンパク質、及びその複合体の構造解析を引き続き進める。Ｘ線結晶構造解析法を用いて迅速に解析できるタンパク質複合体については、Ｘ線による構造解析を進める。３次元結晶化が困難な膜タンパク質の構造解析は電子線結晶学を用いた構造解析を行い、結晶性の良くない２次元結晶についてもより高い分解能
での構造解析法の開発を行うことを目指す。細胞に存在する状態で電子線トモグラフィーの解析も行うことで、膜タンパク質やその複合体の自然な状態の構造解析を目指し、具体的には以下の内容を実施する。
・水チャネルＡＱＰ４の高分解能の構造解析と機能解析から、ヒト由来のＡＱＰ４も阻害できる化合物候補を見出したので、その阻害剤との複合体の高分解能の構造解析を実施する。
・ギャップ結合チャネルの複雑なゲーティング機構を含む様々なギャップ結合チャネルの構
造と機能を解析し、創薬に資する情報取得のために、Ｃｘ２６やＣｘ３２、Ｃｘ４３など

13

のコネキシンやイネキシンの構造解析を実施する。
・電位感受性Ｎａ+チャネルの２つの状態での構造を低い分解能で解析することに成功したので、これらの分解能の向上を試みることで、イオン選択性機構や gating 機構の解明を目指す。
・ヒストンと相互作用する転写制御因子複合体の構造と機能をＸ線結晶構造解析法などにより解明したので、さらに引き続きこれらの研究を進める。
・HK-ATPase とその各種阻害剤との複合体の構造解析を進め、次世代の胃薬開発のための情報を取得する。
・電子線トモグラフィー法で、立体構造解析できるシステムを構築したので、これらを用いて、ギャップ結合や、脳のギャップ結合、バキュロウィルスに発現した膜タンパク質などの構造解析を試みる。
（実施体制：一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研
究所生物情報解析研究センター、独立行政法人産業技術総合研究所バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人名古屋大学細胞生理学研究センター、国立大学法人京都大学大学院理学研究科）
研究開発項目②「核磁気共鳴法等による膜タンパク質及びその複合体とリガンド分子の相互作用解析技術」(a) リガンドベース創薬デザインのためのＮＭＲ相互作用解析手法の開発・高度化
基盤技術開発として、Hit-to-Leadプロセスを支援する新たなＮＭＲ解析手法の開発を行うとともに、これまでに開発したＮＭＲ解析手法の適用範囲を拡大するため、真核生物を用いた創薬標的タンパク質の発現および安定同位体標識法を開発する。Hit-to-Leadプ
ロセス支援としては、本プロジェクトにおいて開発し、高度化に成功した“ファージペプ
チドライブラリからの相互作用ペプチドの配列の同定法”と標的タンパク質上での化合物間の競合情報を取得するＩＮＰＨＡＲＭＡ法を組み合わせた新たな手法の開発に取り組む。本手法によりファージペプチドと標的タンパク質との複数の相互作用点を、一般的に相互作用点の少ないＨｉｔ化合物中に組み込むことが可能となり、化合物の結合強度を増強できると期待される。また創薬標的タンパク質の発現・安定同位体標識法としては、重水素化およびメチル選択標識法の開発により、本プロジェクトにおいて開発したアミドおよびメチル交差飽和法を酵母発現系から得られたタンパク質に対しても適用可能とする。
酵母における重水素化およびメチル選択標識法の開発により、“大腸菌において発現可能な標的タンパク質”に限られていたアミドおよびメチル交差飽和法の適用範囲が、受容体
細胞外ドメインをはじめとした難発現タンパク質を中心として大幅に広がることが期待される。
（実施体制：一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研
究所バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人東京大学大学院薬学系研究科）(b) 創薬標的タンパク質複合体の相互作用解析
電位依存性プロトンチャネルＨｖ１は、膜電位依存的な H+透過を担う４回膜貫通型蛋白質である。Ｎａ+、 Ｋ+, およびＣａ2+選択的電位依存性イオンチャネルは、選択的イオン透過を担うポアドメインと膜電位を感受する電位感受性ドメインＶＳＤを有するが、Ｈｖ
１はポアドメインを有さず、ＶＳＤ単独で電位感受と選択的 H+透過を担う。近年、精子細14

胞の pH 調節因子としてＨｖ１が同定され、内因性カンナビノイドの一種である

N-arachidonoylethanolamine (ＡＥＡ) によるＨｖ１の活性化電位の低下に伴う精子細胞
内のアルカリ化が精子の受精能獲得を誘起することが提唱された。一部の男性不妊症患者
ではＨｖ１の精子膜上における発現量が少ないことが報告されており、Ｈｖ１のＡＥＡによる活性制御機構の解明は、生殖メカニズムの解明のみならず、不妊症治療に対して重要な知見を与えうる。しかしながら、ＡＥＡによるＨｖ１の活性化は、ＡＥＡを内因性リガンドとするカンナビノイド受容体を介さずに起こることが示されているが、ＡＥＡとＨｖ
１が直接相互作用するかは不明である。
そこで本年度では、ＡＥＡとＨｖ１の直接の相互作用を実験的に示すとともに、溶液ＮＭＲ法を用いてＨｖ１とＡＥＡの相互作用を構造生物学的に解析することで、ＡＥＡによるＨｖ１の活性化機構を明らかにすることを目的とする。
Ｇ蛋白質共役型内向き整流性カリウムチャネル(ＧＩＲＫ)は、Ｍ２アセチルコリン受容体など特定のＧＰＣＲへのリガンド刺激時に、３量体Ｇ蛋白質の βγ サブユニット(Gβγ)
により開閉が制御される内向き整流性カリウムチャネル(ＩＲＫ)である。ＧＰＣＲ刺激に応じたＧＩＲＫの開口により細胞外に K+が流出することにより生体膜の興奮性を抑制し、中枢神経における神経伝達など生理的に重要な過程に関わっている。特に心臓ペースメー
カー細胞においては、心拍数の抑制に重要な役割を担っているため、ＧＩＲＫ開閉を制御する構造メカニズムを明らかにすることにより、低分子化合物が標的とすべき部位や蛋白質の局所構造に関する知見が得られ、抗不整脈薬を開発する上で全く新しい創薬戦略を構築することが可能となる。
ＧＩＲＫは、Ｎ，Ｃ両末端を細胞内に有する２回膜貫通型のサブユニットが４量体を形成することにより機能する。ＧＩＲＫの開口は、Ｎ，Ｃ両末端からなる細胞内領域に、Ｇ
ＰＣＲ刺激に応じて３量体Ｇ蛋白質より解離した Gβγ が直接結合することにより構造変化が誘起され、その構造変化が膜貫通領域に存在する K+透過路を阻むゲートの構造変化へと伝播し、開口に至ると考えられている。近年、ＧＩＲＫの全長および細胞内領域を含む
ＩＲＫの結晶構造が次々と報告され、細胞内領域の立体構造や、膜貫通領域においてイオン透過路を阻む「ゲート」を形成していることなどが明らかとなってきた。しかし、これらはすべて Gβγ 非存在下の構造であり、Gβγ との直接の相互作用残基や構造変化様式
といったＧＩＲＫ開口に至るメカニズムは不明であった。そこで本年度では、ＧＩＲＫの細胞内領域と Gβγ をそれぞれ大量発現し、両者の相互作用を、定量的かつ構造生物学的に解析することにより、Gβγ によるＧＩＲＫ制御メカニズムを解明することを目的とする。
３量体Ｇ蛋白質(Gαβγ)は、細胞膜上のＧ蛋白質共役型受容体(ＧＰＣＲ)へのリガン
ド結合に共役して α サブユニット(Gα)と βγ サブユニット(Gβγ)とに解離し、各々が酵素やイオンチャネルなどのエフェクターに結合して活性を制御することにより、種々の細胞応答を引き起こす。Ｇ蛋白質とその制御因子の遺伝子変異に起因した疾病も多く見出されておりＧ蛋白質シグナリングの研究は疾病の発症メカニズムの理解と創薬研究にも大きく貢献することが期待されている。Gβγ のエフェクターの一つであるＧ蛋白質共役
型内向き整流性カリウムチャネル(ＧＩＲＫ)は、カリウムイオン(K+)電流による膜電位の制御を介して、心拍数の制御や神経伝達などの生理機能を担う。このＧＩＲＫの開閉は、
i/o ファミリーに属する三量体Ｇ蛋白質(Gi/o)から解離した Gβγ のみに制御され、かつ、Gαi/o 存在下でのみ迅速なに起こることが知られている。この i/o-ファミリー特異性や迅
速なＧＩＲＫ開閉は、Gαi/o とＧＩＲＫとの直接の相互作用により達成されていることが15示唆されている。このようなシグナリングの特異性や加速の機構を解明することは、それらに変調を与える低分子化合物の創出といった、全く新規の創薬戦略を提示することが可能となる。しかし、これまでに Gαi/o とＧＩＲＫとの相互作用様式については、直接の相互作用の有無を含め、詳細は不明である。そこで本研究では、Gαi/o とＧＩＲＫとの相互作用様式を、溶液ＮＭＲ法を用いて構造生物学的に解明することを目的とする。
（実施体制：一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研
究所バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人東京大学大学院薬学系研究科）
研究開発項目③「高精度 in silico スクリーニング等のシミュレーション技術」(a) in silico ドッキング計算の高精度化
・タンパク質の動的性質を反映した薬物ドッキング・スクリーニングの手法を開発する。ドッキングソフトと分子動力学(ＭＤ)シミュレーションを組み合わせた高速でかつドッキ
ン グ ス コ ア を 超 え る 精 度 を も つ 化 合 物 活 性 の 推 算 法 と し て 、 Linear Interaction
Energy(ＬＩＥ)法を元にした新規手法の開発を行う。活性化合物の合成展開すべき部位の予測など、リード創製を支援する手法も開発する。また、強力な類似化合物探索の手法を開発し、ドッキングソフトと組み合わせた、スクリーニングシステムの高度化を図る。
・ドッキングのスコアの精度を高めるため、タンパク質及び低分子リガンドの動的構造、及び各種相互作用を考慮した複合体の構造予測法及び結合自由エネルギー算出法の開発を継続的に実施する。また、マルチカノニカルＭＤを用いた ab-initio な複合体の構造予測法の研究を続行し、天然変性タンパク質における Coupled folding and binding の問題を解明するとともに、天然変性タンパク質をターゲットとした薬物開発の手法を検討する。
タンパク質―化合物複合体を迅速に計算できるシステムを開発し、今までに開発してきた手法の統合的な活用を可能にする。
（実施体制：一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研
究所バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人大阪大学蛋白質研究所）(b) 構造生理学アプローチによるタンパク質間相互作用解析
・「構造インタラクトーム」に踏み込んだ、ペプチドと同様あるいはそれ以上の強い結合性を有する非ペプチド性化合物（低分子化合物等）を探索・設計する新しい手法を開発する。
ＭＤ－ＭＶＯ法をドッキング計算と組み合わせた手法の改良・応用、(a)で開発した手法の適用を行い、非ペプチド性化合物の探索・リード創成を試みる。ＣＯＢＩＮＥ法は、実用性を高め、公開する。
（実施体制：一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研
究所バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人大阪大学蛋白質研究所）(c) 創薬開発への応用促進に向けた技術開発
・ ＧＰＧＰＵなどのアクセラレーターを活用した、計算の高効率化と高速性が発揮できるプ
ログラムの開発を進め、分子シミュレーションなどでのタンパク質―化合物複合体モデリ
ングの高速化を実現する。
・ リガンド・データベースや計算結果を整理したデータベースの開発・作成を継続する。市
販化合物約５００万種類に加え、合成可能なバーチャルな１６００万化合物のデータベース化も行うとともに、化合物の物性予測などを加える。

16

・ 具体的な創薬実証研究を、本研究の他のチーム、大学や公的研究所、創薬企業等と協力して実施する。具体的には、アクアポーリン４(ＡＱＰ４)ブロッカー、μ受容体（ＧＰＣＲ）のアゴニスト、ＰＡＲＬ、農薬、ＧＰ－ＶＩ、その他のＧＰＣＲ、ＣＨＫ１などを対象として、実証研究のためにヒット化合物探索を続行し、リード創成に向けた合成展開も行う。
ターゲットとする蛋白質のモデリング、既知薬物のドッキングテスト、及び本技術開発で開発してきた種々のin silicoスクリーニングを実施し、実用的なスクリーニングにおいて、どのようなノウハウで手法を組み合わせれば良いかを検討しながら手法の確立を目指す。ＧＰＣＲ専用のモデリング・薬物スクリーニング手法は、容易に行えるように開発を進め公開する。
（実施体制：一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研
究所バイオメディシナル情報研究センター、国立大学法人大阪大学蛋白質研究所）
３．２

平成２４年度事業規模
委託事業

一般勘定

１０１７．４百万円（継続）※事業規模については、変動があり得る。
４．その他重要事項(１) 評価の方法
技術的及び政策的観点から、研究開発の意義、目標達成度、成果の技術的意義並びに将来の産業への波及効果等について、外部有識者による研究開発の事後評価を平成２５年度に実施する。
(２) 運営・管理
当該プロジェクトの実施にあたっては、「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」（平成１３年度文部科学省・厚生労働省・経済産業省告示第１号）等、研究開発関連の指針を厳守しなければならない。また、本研究開発成果の事業化においては、「経済産業分野のうち
個人遺伝情報を用いた事業分野における個人情報保護ガイドライン」（平成１６・１２・２４
製局第１号）を厳守する。
５．スケジュール
(１) 研究開発推進委員会の開催
研究開発の進捗状況を把握し、目標達成に向けた着実な進展を図るため、半期に一度の頻度で研究開発推進委員会を開催する。

17

（別添）事業実施体制の全体図
研究開発項目＜１＞「創薬加速に向けたタンパク質構造解析基盤技術開発」実施体制図

18

別紙２
研究開発項目＜２＞「有用天然化合物の安定的な生産技術開発」（Ｐ１１００２）
1.背景及び目的・目標
創薬ヒット化合物の探索については、近年、製薬企業を中心に、コンビナトリアルケミストリ
ーによる化合物合成とそのライブラリーを用いたハイスループットスクリーニングが盛んに行われたが、必ずしも期待された成果が出ておらず、豊富な生物活性と大きなケミカルスペースを持った天然化合物が再注目されている。微生物は、天然化合物のリソースとして最も有望なものの一つであるが、培養抽出物として安定的かつ大量に取得できないなど、そのままではスクリーニ
ングの効率化に様々な問題点がある。そこで、これまでに無い新しい骨格を持った化合物も含め、微生物の持つ天然化合物の生合成遺伝子を取り出して別のホスト菌株で発現させるなど、目的とする天然化合物を安定的かつ効率よく発現させる手法を開発することが重要である。
本事業では、我が国の強みとする微生物ライブラリーや、天然物化学に対する知識基盤等を最大限に活用し、創薬リード化合物候補となりうる広いケミカルスペースを持った天然化合物を生産する生合成遺伝子とそれを応用した化合物生産を効率的に行う技術開発により、創薬の基盤技術を構築する。
[委託事業]<最終目標(平成２４年度末)>
有用天然物の合成に必要な４０個の生合成遺伝子クラスターを取得し、その生産物を対応づけたデータベースを構築する。これら４０個の生合成遺伝子クラスター全てについて、化合物生産株となる別のホスト放線菌へ導入し、目的の天然物を２ mg/Lレベルで安定的に生産する技術を開発する。さらにこれら４０個について、安定的な生産が可能な天然物と困難なものを体系的に整理し、生産が困難なものについてはその原因を解明し、生産の改善を図る。
２.事業内容および進捗（達成）状況
独立行政法人産業技術総合研究所バイオメディシナル情報研究センター

新家一男氏のもと、以下の研究開発を実施した。なお、実施体制は別添のとおり。
２．１

平成２３年度事業内容(１) 生合成遺伝子クラスターライブラリーの構築① ギガシークエンサーを用いた放線菌ゲノム解析
放線菌ゲノムはＧＣ含有率が高く、通常のシークエンス解析が困難であることが知られている。ＯＩＳＴでは、既にショットガン法およびメイトペアー法を併せてほぼ完全に放線菌
全ゲノムを解読することに成功しているが、より安価かつ効率的に放線菌ゲノムを解読する
ため、複数の菌株を同時に解析する手法の開発を進めた。２３年度は、１６菌株について解析を行い、生合成遺伝子クラスター同定に必要十分なデータを出すことに成功した。現在、より精密なシークエンス解析を進めている。
② ゲノム情報からの生合成遺伝子クラスター同定法の開発
放線菌生合成遺伝子のうち、ポリケチド生合成経路 (ＰＫＳ) および非リボゾーマル型ペプチド合成経路 (ＮＲＰＳ) を構成するクラスターは、幾つかのモジュールからなり、相同性が高いことが知られている。その相同性を元に、ある程度の構造予測が可能であるが、正19

確に目的生合成遺伝子クラスターを同定する技術を開発することにより、効率的に生合成遺伝子クラスターの取得が可能になる。また、ゲノムシークエンスした後のアノテーション結果が明確に視覚化されたデータベース、および解析ソフトを開発することにより、生合成遺伝子クラスター全体を効率的に推察することが可能となり、取得すべき生合成遺伝子クラス
ターの範囲を容易に特定可能となる。２３年度は、微生物特に放線菌ゲノムに特化したアノテーションソフトを、プロジェクトメンバー間でＷｅｂを介して共有閲覧出来るようにシステムを確立した。さらに本システムに改良を加え、ＰＫＳで生合成される化合物の生合成遺伝子クラスターをより正確に予測同定するシステムを開発した。
③ コスミドベクターを用いた生合成遺伝子クラスター取得
巨大な生合成遺伝子クラスターの取得は、これまで主としてコスミドを用いて行われて来た。我々はこれまでの種々の改良により極めて効率的にコスミドクローンを作製する技術を取得しているが、本プロジェクトで用いる放線菌ホストであるＳＵＫＡ株は本コスミドの導入率が、他のホストと比較して格段に高い。そこで、４０ kbp 程度の生合成遺伝子クラスターに関しては、コスミドを用いてクローニングを行うことにした。本手法を用いて、これまでに２３個の生合成遺伝子クラスターの取得に成功した。
④ ＢＡＣベクターを用いた生合成遺伝子クラスター取得
臨床応用されている天然化合物は、erythromycin、avermectin、ＦＫ５０６および rapamycinなど大きな分子量からなるものが多く存在する。それらの生合成遺伝子クラスターは、４０ｋｂｐ超えるものが多く、巨大な生合成遺伝子クラスターでは１００ｋｂｐにもなる。このような巨大な生合成遺伝子クラスターの取得には、ＢＡＣベクターを用いる方法が適用されるが、我が国ではＢＡＣに関する技術のノウハウが乏しいのが現状であった。そこで、本プ
ロジェクトでは、特に放線菌に最適化したＢＡＣクローンの作製技術の開発を行うことにした。ゲル中での菌株処理法、用いる制限酵素などを種々検討した結果、１００ ｋｂｐ前後
までであればほぼ完全にＢＡＣクローンを作製する技術の開発に成功した。現在、本手法により、１０個の生合成遺伝子クラスターを取得している。
⑤ 特殊な生合成経路を持つ化合物の探索
非リボゾーマル型ペプチド合成経路 (ＮＲＰＳ) において、特殊なリジン輸送体 (Ｌｙｓ
Ｗ) を持つ化合物が近年明らかにされ、この輸送体遺伝子を指標に新たな生合成遺伝子が発見されることが期待されている。また、Ｃ－Ｐ結合を持つ化合物は、極めて小数しか報告されていないにも拘わらず、産業応用されている化合物を含め高い生物活性を示す。そこで、これら二つの特殊な生合成経路を持つ菌株を選抜するため、ＬｙｓＷおよびＣ－Ｐ合成酵素
を指標に、これら生合成遺伝子が生合成する新規化合物およびその生合成遺伝子クラスターの取得を行った。我々が持つ、一万以上の放線菌ゲノムライブラリーより、これら２つの生合成遺伝子を持つ菌株を選抜・培養を行い、二次代謝産物中から特徴を持った化合物の探索を行った。その結果、極めて高い頻度でＣ－Ｐ結合を有する化合物の存在を見出すことに成功した。
上記クローンに関しては、一つの化合物について複数のクローンを取得しているが、便宜上、一化合物一クローンとして計上している。

20

(２) 安定生産技術の開発
上記 (１) にてコスミドベクターにてクローニングした生合成遺伝子クラスターに関して、クローニング後再度高精度にシークエンス確認したクローンに関して、コスミドクローンの場合は発現ベクター系へ組み換えた。ＢＡＣクローンに関しては高精度シークエンスで確認
後そのまま使用した。これらの発現クローンを、順次以下のホスト菌株に導入して異種発現生産を進めている。
① コスミド法で取得した生合成遺伝子クラスターの放線菌ホスト株ＳＵＫＡ株での異種発
現生産
本プロジェクトの主ホストであるＳＵＫＡ (ＳＵＫＡ１７) 株を、上記 (１) にてクローニングしたコスミドベクターで形質転換し、薬剤選択性を指標にヒットクローンを選抜した。
これらのクローンに関して、再度ＰＣＲにて目的生合成遺伝子クラスターが組み込まれているかを確認したクローンを、主に４種類の培地を用いて異種発現生産を確認した。現在までに、１０個の生合成遺伝子クラスターに関して異種発現生産を検討し、６種類の化合物に関して生産を確認した。このうちの一つに関しては、そのままでは異種発現生産が確認出来なかったが、プロモーターを変換することで、生産させることに成功した。
② ＢＡＣ法で取得した生合成遺伝子クラスターの放線菌ホスト株ＳＵＫＡ株での異種発現
生産
ＢＡＣベクターは、コスミドベクターと比較して空ベクター自体の導入効率が低いが、扱う遺伝子サイズが２倍以上であり、巨大生合成遺伝子クラスターを組み入れた場合、さらに導入効率が低くなることが予想されたため、ベクター量を増加するなど種々検討しながら、生合成遺伝子の導入を進めた。これまでに、上記 (１) にて取得した生合成遺伝子クラスタ
ーのうち、４個の化合物に関して形質転換株の取得に成功した。これら、４つの化合物のうち、２つに関しては、目的化合物の生産に成功した。また、１つの化合物に関しては目的生合成遺伝子が組み込まれているが、そちらの生産は確認されず、代わりに別の新規物質を生産することを見出した。本化合物の生合成遺伝子クラスターサイズは８４ ｋｂｐであるが、使用したＢＡＣクローンで取得した遺伝子サイズは約１００ ｋｂｐであった。新規化合物の構造からこの生合成遺伝子クラスターは、後ろ部分に挿入された部分であると推定している。
③ コスミドクローンの放線菌ホスト株 Streptomyces albus 株での異種発現生産
本プロジェクトで主ホストとして用いるＳＵＫＡ株は、生合成遺伝子導入等に関して、精査されているホストであるが、全ての化合物に関して異種発現可能かを検証するため、世界中で放線菌標準ホストとして汎用されている、Streptomyces albus をコントロールに用いて生合成遺伝子クラスター導入を進めた。我々が用いた Streptomyces albusＧ１５３株は、ＳＵＫＡと比較すると形質転換効率が著しく低く、空のコスミドベクターを用いた導入率はＳＵＫＡ株に比較して１／１００～１／１０００であった。現在、複数の化合物について形質転換株を作成中であるが、ＳＵＫＡで高生産だった化合物についても、Streptomyces albus Ｇ１５
３株では生産が確認出来なかった。
④ ＢＡＣクローンの放線菌ホスト株 Streptomyces albus 株での異種発現生産
ＢＡＣクローンは、ＳＵＫＡを用いても導入率はコスミドと比較して著しく低いため、コ21

スミドの導入率の悪い Streptomyces albus 株ではさらに形質転換効率は低いと考えられた。実際にＳＵＫＡに導入した生合成遺伝子クラスターのうち、一つのクローンのみの形質転換に成功しているが、その形質転換率もＳＵＫＡと比較して１／５以下であった。この本生合成
遺伝子クラスターに関しては、今後異種発現を確認する予定である。
⑤ コスミドおよびＢＡＣクローンの放線菌ホスト株 Streptomyces reveromyceticus 株での異種発現生産
放線菌ホスト株 Streptomyces reveromyceticus 株には、内在性の休眠遺伝子の覚醒に関して確認し、その生産量は極めて高いものであったことが、本プロジェクトで用いる主な理由であるが、外来生合成遺伝子クラスターに関しては、未だ成功例は無い。今回取得した、生合成遺伝子クラスターのうち、コスミドクローンに関して２つ、ＢＡＣクローンに関して２つを導入した形質転換株を得ることに成功しており、異種発現生産に関しては今後確認予定である。
⑥ 生合成前駆体の合成
平成２３年度生合成遺伝子クラスターの取得、および異種発現を行った特殊な化合物に関して、その生合成経路解明のためのスターター物質、およびスターター骨格が改変された化
合物を人工生合成することを目的に、生合成スターター物質の合成を進めている。
以上の結果、ＳＵＫＡ株は放線菌ホストとして極めて効率の良いホストであることを再確認した。平成２３年度の目標に関して、生合成遺伝子クラスターの取得に関しては、ＢＡＣ技術をいち早く確立することに成功し、予定以上の効率で取得が出来ている。なお、放線菌
ゲノムのＢＡＣライブラリー作製に関しては、世界的な研究成果を比較しても最高水準の技術を確立したと考えられる。本プロジェクトで培った技術およびベクターは今後、放線菌遺伝子ライブラリー作製の標準となると思われる。異種発現に関しては、クローニングした生合成遺伝子クラスターのシークエンス配列を確認したものから、順次進めており、形質転換株の取得、異種発現生産に関して予定通りに進行中である。
２．２

実績推移
Ｈ２３年度
委託

実績額推移（百万円）
一般勘定
特許出願数（件）２８９

論文発表数（報）３７フォーラム等（件）１８０

受賞実績：1
３.事業内容独立行政法人産業技術総合研究所バイオメディシナル情報研究センター
以下の研究開発を実施する。なお、実施体制は別添のとおり。

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新家一男氏のもと、

３．１

平成２４年度事業内容(1) 生合成遺伝子クラスターライブラリーの構築放線菌が生産する広範な天然化合物リソースから、大きく複数に分類される化合物群の代表的な化合物を選抜するとともに、製薬企業が興味を持つ構造及び活性がユニークな天然物
由来の化合物候補を選抜し、これらの天然化合物の生合成遺伝子クラスター情報の取得を開始する。これらの生合成遺伝子クラスターの正確なシークエンス情報を解読すると共に、化合物と生合成遺伝子を対応づけるデータベースを構築し、類縁化合物の生合成遺伝子を探索するツールの開発につなげる。平成 24 年度は、継続して生合成遺伝子クラスターの取得を行うが、１５０ ｋｂｐを超える大きな生合成遺伝子クラスターをターゲットに、その取得技術に関してＢＡＣ法を改良する。
(2) 安定生産技術の開発
平成２４年度は、継続して取得した生合成遺伝子クラスターをホスト株に導入し、異種発現生産を確認する。異種発現で生産しなかった化合物、あるいは生産性の低かった化合物に関しては、プロモーターの変換、制御遺伝子の導入、生産培地の検討、変異リボソームのノックインなどを行い、種々の改良を行い生産の改善に取り組む。生合成遺伝子は、その前駆体あるいは生合成経路により分類されているが、本開発研究の中で、主ホスト株であるＳＵ
ＫＡ株で異種発現生産できなかった化合物を分類分けし、ある種の生合成遺伝子分類群の存在が推察された場合を想定し、他のホスト株を追加して形質転換、異種発現を進める。これらの、ホストとして異種発現を目的として内在性の二次代謝産物生合成遺伝子群の多くを欠失させた特殊なStreptomyces lividans株、および現在使用しているStreptomyces albus Ｇ１５３
株では無いオリジナル株と言われているStreptomyces albus J1074株の２つを追加する。また、配列解析を行った菌株から、第二のＳＵＫＡ株になり得る潜在能力菌株を有しているものを選定する基礎データを得る。
３．２

平成２４年度事業規模
委託事業

一般勘定

３８９．６百万円（継続）※事業規模については、変動があり得る。
４．その他重要事項(１) 評価の方法
技術的及び政策的観点から、研究開発の意義、目標達成度、成果の技術的意義並びに将来の産業への波及効果等について、外部有識者による研究開発の事後評価を平成２５年度に実施する。
(２) 運営・管理
当該プロジェクト成果の事業化においては、「経済産業分野のうち個人遺伝情報を用いた事
業分野における個人情報保護ガイドライン」（平成１６・１２・２４製局第１号）を厳守する。
５．スケジュール
(１) 研究開発推進委員会の開催
本プロジェクトの進捗状況の把握、方針の確認、また、適正な方向性検討のため、外部識者を含めた研究開発推進委員会を年二回開催する。

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（別添）事業実施体制の全体図
研究開発項目＜２＞「有用天然化合物の安定的な生産技術開発」実施体制図

NEDO
研究開発責任者：

新家一男

独立行政法人産業技術総合研究所
委託

バイオメディシナル研究センター

主任研究員

次世代天然物化学技術研究組合
研究開発テーマ①：生合成遺伝子クラスターライブラリーの構築
研究開発テーマ②：安定生産技術の開発
組合員

・独立行政法人産業技術総合研究所（①、②）

・一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム （①、②）・アステラス製薬株式会社（①、②）

・オーピーバイオファクトリー株式会社（①、②）

・塩野義製薬株式会社（①、②）

・合同酒精株式会社（①、②）

・Meiji Seika ファルマ株式会社（①、②）

・日本マイクロバイオファーマ株式会社

（①、②）

共同実施

北里大学

（①、②）

沖縄科学技術大学院大学

（①）

東京大学

（①）

理化学研究所

（①、②）

東北大学

（②）

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