助成番号 150493５－２	 

研	 究	 成	 果	 報	 告	 書	 	 （国立情報学研究所の民間助成研究成果概要データベース・登録原稿）	 
	 研究テーマ	 （和文） ＡＢ	 任意の細胞に隣接した細胞を遺伝的にマーキングする方法の開発	 研究テーマ	 （欧文） ＡＺ	 Development	 of	 a	 method	 to	 genetically	 mark	 cells	 that	 have	 contacted	 to	 any	 selected	 cells	 

研	 ｶﾀｶﾅ	 ＣＣ	  姓）カタオカ	 究氏	 代	 
漢字	 ＣＢ	  片岡	 表名	 ﾛｰﾏ字	 ＣＺ	  KATAOKA	 者	 名）コウスケ	 研究期間	 Ｂ	 ２０１５	
 ～	 ２０１６浩介	 報告年度	 ＹR	 ２０１６

	 年	 KOHSUKE	 研究機関名	 横浜市立大学	 	 年	 研究代表者	 ＣＤ	 横浜市立大学 生命医科学研究科・准教授	 所属機関・職名	 概要 ＥＡ (600 字～800 字程度にまとめてください。)	 
	 哺乳類を含む多細胞生物の発生過程は、細胞や組織がシグナルをやりとりすることで進行する。細胞間の接触はしばしば一過的であり、その後に互いの位置関係が変わってしまうと、事後に特定することは困難になる。このような発生学・医科学上の問題の解決に供するため、任意の細胞に隣接した細胞を遺伝的にマーキングする方法の開発を行うこととした。	 
このため、細胞表面の受容体とリガンドである Notch-Delta の線虫 C.	 elegans ホモログ（Lin12 および Lag2）を哺乳類の培養細胞でそれぞれ別個に発現させ、細胞どうしが隣接して Lin12-Lag2 の相互作用が生じた場合にのみ、Lin12 の細胞内ドメインが膜内切断されるような仕組みの構築を目指した。この際に、Lin12 の細胞内ドメインを DNA 組換え酵素 FLPe に置換しておけば、相互作用が生じた場合に遺伝的マーキングが起きる。	 
まず、Lin12 の細胞内ドメインを FLPe と置換した融合タンパク質と、リガンド Lag2 を、培養細胞で発現させて隣接させたが、Lin12 の切断とそれに伴う DNA 組換えは起きなかった。そこで、Lin12-	 Lag2 の認識には影響しない領域（シグナルペプチド、細胞膜貫通領域や LNR 領域、Mindbomb と結合する細胞内領域）をマウスのものと置換したさまざまなキメラ分子を作製した。これらの工夫にも関わらず、期待される動作を示す分子のペアを得ることはできなかった。	 
この過程で、同様のアイデアに基づく synNotch システムが報告され（Morsut ら	 Cell	 164:780-	 (2016))、残念ながら競争に敗れる結果となってしまった。応用例も報告され（Roybal ら	 Cell	 164:770-	 (2016))	 （Huang ら	 Development	 143:4073-	 (2016)）、多分野の諸問題の解決への応用が期待される。	 

キーワード	 ＦＡ	 細胞間シグナル	 	 （以下は記入しないでください。）	 Notch 受容体	 助成財団ｺｰﾄﾞ	 ＴＡ	 	 	 	 	 研究機関番号	 ＡＣ	 	 	 	 	 	 FLPe リコンビナーゼ	 研究課題番号	 ＡＡ	 	 シート番号	 	 -	
 1	 -	 	 	 遺伝子工学	 	 	 	 	 	 	 	  発表文献（この研究を発表した雑誌・図書について記入してください。）	 論文標題ＧＢ	  	 雑	 誌	 著者名	 ＧＡ	 	 ページ	 ＧＦ	 雑誌名	 ＧＣ	 	 発行年	 ＧＥ	 	 雑誌名	 ＧＣ	 	 発行年	 ＧＥ	 	 雑誌名	 ＧＣ	 	 ～	 発行年	 ＧＥ	 	 	 ～	 	 	 	 

巻号	 ＧＤ	 	 	 	 

	 巻号	 ＧＤ	 	 	 	 	 

	 巻号	 ＧＤ	 	 発行年	 ＨＤ	 	 	 	 	 総ﾍﾟｰｼﾞ	 ＨＥ	  	 発行年	 ＨＤ	 	 	 	 	 総ﾍﾟｰｼﾞ	 ＨＥ	  	 論文標題ＧＢ	  	 雑	 誌	 著者名	 ＧＡ	 	 ページ	 ＧＦ	 ～	 論文標題ＧＢ	  	 雑	 誌	 著者名	 ＧＡ	 	 ページ	 ＧＦ	 著者名	 ＨＡ	 	 

書名	 ＨＣ	 	 図	 書	 出版者	 ＨＢ	 著者名	 ＨＡ	 	 

書名	 ＨＣ	 	 図	 書	 出版者	 ＨＢ	 	 欧文概要 ＥＺ	 	 	 Development	 of	 multicellular	 organisms	 including	 mammals	 relies	 on	 intercellular	 signaling	 events.	 
In	 case	 that	 cell-cell	 contact	 is	 transient,	 it	 is	 difficult	 to	 identify	 cells	 that	 have	 contacted	 to	 any	 particular	 cell	 at	 later	 developmental	 stage.	 To	 overcome	 this	 difficulty,	 we	 tried	 to	 develop	 a	 method	 to	 genetically	 label	 cells	 that	 have	 contacted	 to	 any	 selected	 cells.	
 	 We	 utilized	 Notch-Delta	 homologs	 of	 C.	 elegans	 (Lin12	 and	 Lag2)	 in	 mammalian	 cells.	 The	 intracellular	 domain	 of	 Lin12	 should	 be	 cleaved	 only	 when	 the	 cell	 makes	 contact	 with	 Lag2-expressing	 cells.	 By	 replacing	 the	 intracellular	 domain	 of	 Lin12	 with	 FLPe	 recombinase,	 one	 can	 expect	 that	 the	 cell	 can	 be	 genetically	 labeled	 using	 Flp-mediated	 DNA	 recombination	 system.	
 	 We	 established	 cells	 that	 express	 Lin12-FLPe	 fusion	 protein	 or	 the	 ligand	 Lag2	 protein,	 respectively,	 but	  we	  could	  not	  observe	  contact-dependent	  cleavage	  of	  FLPe	  nor	  DNA	  recombination.	  We	  therefore	 constructed	 various	 chimeric	 receptors	 and	 ligands	 by	 replacing	 their	 signal	 peptides,	 transmembrane	 domains,	 LNR	 region,	 and	 intracellular	 domains,	 but	 any	 of	 the	 constructs	 did	 not	 work	 as	 we	 expected.	 	
 	 Unfortunately,	 other	 research	 group	 has	 recently	 reported	
 a	 cell-labeling	 system,	 named	 synNotch,	 based	 on	
 a	 concept	 similar	 to	 ours	 (Morsut	 et	 al.,	 Cell	 164:780-	 (2016)).	 Its	 application	 to	 anti-tumor	 therapy	 and	 developmental	 biology	 have	 also	 been	 reported	 (Roybal	 et	 al.,	 Cell	 164:770-	 (2016),	 Huang	 et	 al.,	 Development	 143:4073-	 (2016)）	 indicating	 that	 this	 novel	 technology	 would	 be	 a	 promising	 tool	 to	 solve	 a	 wide	 variety	 of	 unanswered	 problems.	 

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