名古屋学芸大学健康･栄養研究所年報第10号

2018年

《総説》

ゲノム編集の原理と利用、そして課題
間崎剛1）

は、ヒトの生殖細胞や配偶子、接合体、胚の遺1 ．はじめに伝子改変は固く禁じられており、それは中国に本年（2018年）の11月26日、中国のある研究おいても同様である。先の報道が事実であるな

者が特定の遺伝子の機能をゲノム編集によりらば、その研究者は自国の指針にも反したこと破壊した受精卵から女児を誕生させたというとなる。

報道が、世界を駆け巡った。ゲノム編集は近現時点（2018年12月末）
では、その実験データ

年注目を浴びている新しい遺伝子改変技術でや女児の存在は確認されず、また、女児が出産あり、難病の治療手段としても期待されていされたという病院も事実関係を否定している。

る。この女児の場合は、ヒト免疫不全ウィルス

筆者は今、中国のその研究者が発表したことが（human immunodeficiency virus: HIV）への耐事実であるかどうかに関わらず、ゲノム編集と性付与を目的として、HIV がヘルパー T 細胞にはどういった原理に基づく遺伝子改変技術なの侵入する際に足がかりとなるケモカイン受容体か、そして、我々の生活をどのように豊かにす（CCR 5 ）遺伝子を破壊したとのことである。

る技術なのか、一方でその実施によりどのようこの臨床研究の問題点は 2 点あると、筆者はな悪影響が生じる恐れがあるのかについて、一考える。 1 点は、患者本人の同意のもとで行わ人でも多くの人に知ってもらう必要があると感れる遺伝子治療とは異なり、当然であるがそのじている。そこで僭越ながら、本総説を試みる

女児には CCR 5 を欠損することによるリスクこととした。

に関して説明を受ける機会と、その上で遺伝子改変を受け入れるかどうかを選択する機会とが2 ．ゲノム編集の概要与えられなかった点である。また、体細胞に施す 1 世代限りの遺伝子改変とは異なり、受精卵今から10年ほど前に登場した“ゲノム編集に施した改変はそれから発生した個体の生殖細（genome editing）”は、旧来の遺伝子組換え技胞にも伝わることから、CCR 5 の欠損は女児の術とは原理の異なる、新しい遺伝子改変技術で子孫にも伝播する可能性が高い。つまりこの行ある。ゲノム編集により、旧来の手法では困難為は、誕生した女児、およびその子孫に対するであった計画的な DNA 配列の書き換えや、非重大な人権侵害であると言える。

モデル生物の遺伝子改変が容易になった。さらもう 1 つの問題点は、ゲノム編集という手法にゲノム編集では、旧来の手法に比べてはるかにより特定の DNA 配列を人為的に書き換えたに簡便に、そして短時間のうちに遺伝子改変生ヒト個体を発生させたという点である。ゲノ物（genetically modified organism: GMO）が作

ム編集は DNA 配列を 1 塩基レベルで書き換え製できる。今後の人類の目標である“持続可能ることができる遺伝子改変技術であることか社会の形成”を達成するために我々は、食料問ら、肌や髪、目の色などの身体的特徴、さらに題やエネルギー問題、環境問題などの諸問題をは才能や能力などを自由に改変した人間（デザ解決していかねばならない。望ましい形質を付イナー・ベイビー）を生み出すことも、原理と与した GM 生物の利活用は、それら諸問題の解しては可能とする技術である。そのため各国で決に有効な手段であるとみなされている。以上

1 ）名古屋学芸大学管理栄養学部管理栄養学科

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のことからゲノム編集は、今世紀の人類の発展二本鎖 DNA を切断する。ZFN はゲノム編集技を支える基盤技術となるものと予測される。

術の黎明期に利用されていた方法であるが、そゲノム編集は、染色体の任意の部位においの作製に手間がかかるため、現在ではあまり利て DNA 二本鎖切断（double strand break）を用されていない。

誘発する技術である。その損傷は、細胞に備わ3.2 T ALEN（transcription activator-likeeffector nuclease）る 2 種類の修復機構（非相同末端結合、相同組換え修復）のいずれかにより速やかに修復されジンクフィンガードメインの代わりに、植る。非相同末端結合による修復では、切断部位

物病原体 Xanthomonas から分泌される TALEに DNA 塩基の挿入や欠失が生じることが多い（transcription activator-like effector）タンパクため、これにより遺伝子機能を破壊することが質の DNA 結合ドメインを利用する方法であできる（ノックアウト）。相同組換え修復の場

る 3 ）4 ）。その34アミノ酸からなる DNA 結合ド合は、切断部位周辺を任意の DNA 配列に置きメインの12番目と13番目のアミノ酸残基を置換換えたり、外来の DNA 断片を挿入したりするするだけで 4 つの DNA 塩基のいずれかを認識（ノックイン）ことが可能となる。これにより、するドメインが作製できるため、ZFN よりも作翻訳産物のアミノ酸残基の置換や翻訳産物のタ製が容易である。 4 〜10個のドメインを作製しグ付け、遺伝子多型の改変、外来遺伝子の導入て連結し、それを FokI のヌクレアーゼドメイなどが実施できる。それらの実施方法についンと融合させる（TALEN）。ZFN の場合と同て、原理の説明をまじえつつ以下に概説する。

様に、反対鎖に結合する TALEN も作製して、標的部位を挟むように作用させる。後述する
CRISPR/Cas 9 に比べて認識配列の特異性が高3 ．染色体の任意の部位を切断する、3 つの方法

く、意図しない部位の切断活性（オフターゲッ染色体の特定の部位における DNA 二本鎖ト活性）を低く保つことができる方法である。

切断は、特定の DNA 配列を認識して結合す

3.3 CRISPR/Cas 9 （clustered regularlyるように改変した人工 DNA 結合ドメインとinterspaced short palindromic repeats/

DNA 切断ドメインとの融合タンパク質（ZFN,

CRISPR-associated protein 9 ）TALEN）により実施する。あるいは、古細菌古細菌や細菌に広く保存されている、ファーや細菌の持つ獲得免疫機構（CRISPR）を応用ジや外来プラスミドに対する獲得防御機構した方法により実施する。以下に、これらの方CRISPR（clustered regularly interspaced short法を概説する 1 ）。

palindromic repeats）を応用した方法である 5 ）。

3.1 ZFN（zinc-f inger nuclease）

この方法では、標的部位近傍の DNA と相補RNA ポリメラーゼ III による転写に関与す的塩基対を形成するガイド RNA（gRNA）がる転写因子 TFIIIA 中のジンクフィンガードメ

Cas（CRISPR-associated protein）ヌクレアーインを活用する方法である 。その Cys 2 His 2ゼを標的部位に誘導して、その部位の二本鎖型ジンクフィンガードメインは、 3 つの DNADNA が切断される。一般的なゲノム編集では、塩基を認識して結合する。そのドメイン中のアStreptococcus pyogenes 由来の Cas 9 ヌクレアー

ミノ酸残基を置換して数個のドメインを連結すゼが利用される。

2）

ることにより、染色体の特定の部位に結合する

20 bp ほどの gRNA を作製するだけで様々なDNA 結合ドメインに仕立て上げる。それを、II生物種のあらゆる領域を対象にできるため、非型制限酵素 FokI の配列非依存的ヌクレアーゼ

常に簡便な方法である。また、複数の gRNA を同ドメインと融合させる（ZFN）。同時に、標的部時に細胞に導入することで、多数の遺伝子座の位の下流側で反対鎖に結合する ZFN も作製す同時破壊や染色体の大幅な欠失を狙うことも可る。これら 2 つの ZFN が両 DNA 鎖に結合した能である。以上のことから現在では、CRISPR/

結果、FokI が標的部位にて二量体を形成して、Cas 9 がゲノム編集の主流を占めている。

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ゲノム編集の原理と利用、そして課題

3.5 ZFN や TALEN、CRISPR/Cas 9 の、ゲノ

しかし、gRNA はミスマッチを許容して標

ム編集以外への利用的以外の DNA 配列にも結合してしまうことから、CRISPR/Cas 9 は標的以外の部位をも切断

ジンクフィンガーや TALE といった DNAしてしまうオフターゲット作用の高い方法でも結合ドメインを転写アクチベーター（VP16なある 6 ）。それを防ぐために、一本鎖切断型（ニッど）や転写リプレッサー（KRAB など）と融カーゼ型）に改変した Cas 9 と、標的部位近傍の合したものは、人工転写調節因子として利用で両 DNA 鎖をそれぞれ認識する 2 種の gRNA をきる。また、ヒストン修飾酵素やシトシンメチ用いる方法が開発された。その方法では 2 種のル化酵素と融合すれば、特定の領域のエピゲgRNA が近接して結合した場合にのみ DNA 二ノムを調節することも可能である。GFP 融合

本鎖切断が生じるため、オリジナルの CRISPR/体は生細胞における遺伝子座の可視化を（ラCas 9 法に比べて配列特異性が高く、オフターイブイメージング）、エピトープタグ融合体はゲット活性も低い。

特定の領域のクロマチン免疫沈降（chromatin3.4 ZFN や TALEN、gRNA/Cas 9 の細胞へのimmunoprecipitation: ChIP）を可能とする。こ7 ）8 ）

導入方法

れらのことを CRISPR/Cas 9 のシステムで実施

ZFN や TALEN、あるいは gRNA と Cas 9 のしたい場合は、ヌクレアーゼ活性を欠失させた細胞への導入は、それらをコードする DNA をdCas 9 を上記の種々の機能ドメインと融合さ発現ベクター上に構築して、そのトランスフェせればよい10）。

クションにより実施する。対象の細胞へのトラ
ンスフェクションは、ウィルスやリポソームを4 ．DNA 二本鎖切断の修復介して、あるいはマイクロインジェクションやエレクトロポレーション、パーティクルガンにZFN や TALEN、あるいは CRISPR/Cas 9 により行う。対象となる細胞に制限はなく、幹細より誘発された DNA 二本鎖切断は、以下に概胞や受精卵、培養細胞などあらゆる細胞に導入説する 2 種類の機構（NHEJ、HDR）のいずれ可能である。ただし植物の場合は、アグロバクかにより修復される。その際に DNA 塩基の挿テリウムを介して植物カルスに導入する方法が入や欠失（NHEJ）、あるいは任意の DNA 断片

一般的である。ZFN や TALEN、gRNA をどのへの置換や挿入が生じる（HDR）。

発現ベクター上に構築するか、またはそれらを4.1 非 相 同 末 端 結 合（nonhomologous endjoining: NHEJ）

どのトランスフェクション法にて細胞に導入するかは、導入する DNA のサイズや導入効率に切断末端同士が、そのままつなぎ合わされる応じて選択すればよい。

修復である。ZFN や TALEN、あるいは gRNA

トランスフェクション効率が低い場合は、と Cas 9 を導入した細胞では標的部位の切断がZFN や TALEN、 あ る い は gRNA と Cas 9 を繰り返し発生するために修復のエラーが高頻度コードする DNA を転写して RNA とし、それをで発生し、塩基の挿入あるいは欠失が生じる。

リポソームに封入して細胞に導入することも試

これにより、任意の遺伝子の機能を破壊できるみられる。または、ZFN や TALEN をタンパク（ノックアウト）。

質として、gRNA/Cas 9 を RNA・タンパク質複4.2 相同組換え修復（homology directed repair:HDR）合体にして、それらをエレクトロポレーションにより細胞に導入することもある 。これらの姉妹染色体のいずれかに DNA 二本鎖切断が方法は転写や翻訳の手間を要するものの、RNA生じた場合に、切断されていない染色体の相同やタンパク質は細胞内でのターンオーバーが速領域を鋳型にして修復される機構のことであいことから、DNA として導入する場合に比べる。これを逆手に取れば、染色体上の特定のてオフターゲット活性が低いという利点もあ部位の DNA 配列の置換や、特定の部位への外る。

来 DNA の挿入（ノックイン）が可能となる11）。

9）67

そのために、置換もしくは挿入したい DNA 断て、ES 細胞株が樹立できない生物種や植物にお片を対象染色体の標的部位の前後配列で挟んだいては、特定の遺伝子を標的としてノックアウDNA 断片（ドナー DNA）を用意する。そのドト株を作製することは不可能であった。DNA

ナー DNA を DNA 二本鎖切断の場に共存させ二本鎖切断修復機構はすべての細胞生物に普遍ると、ドナー DNA を鋳型にした HDR が行われ的な機構であることから、ゲノム編集はすべてる。その結果、ドナー DNA の中央部が切断部の生物に適用できる技術である。つまりゲノム位に挿入されることとなる。

編集は、あらゆる生物・細胞において計画的な多くの生物では HDR よりも NHEJ が優先的ノックアウト株の作製を可能にする技術であに作用し、ドナー DNA を共導入しても期待通り、GM 生物の作製や遺伝子治療を支える技術りに置換・挿入されないことが多い。NHEJ をである。

抑制したり HDR を促進したりする効果のある

ゲノム編集にて導入される 1 塩基レベルの挿薬剤がいくつか発見されたことにより、近年で入や欠失、置換は、自然界において日常的に発は、HDR の効率が改善されつつある12）13）。

生している点突然変異と同等の変化である。したがって、大幅な欠失や異種生物の DNA 領域の挿入をともなわないゲノム編集により作製し5 ．ゲノム編集の利点と利用

た GM 生物は、従来の品種改良法により作製し旧来の遺伝子組換え技術では、外来遺伝子のた新品種と同等であるとみなすこともできる。

挿入部位を制御することは難しかった。そのたそのためアメリカやアルゼンチンなどの国でめ、導入した外来遺伝子が期待通りの発現を示

は、ゲノム編集により作製した GM 作物の利用さないことや、宿主の内在遺伝子を破壊してしに関して特に規制は設けられていない。

まい予想外の変化をもたらすことが多々あっゲノム編集に要する操作は、基本的には溶液た。そのような偶然性を排除できない旧来の遺を加えたり、混合したりするだけである。その伝子組換え技術とは異なり、ゲノム編集は遺伝ためゲノム編集は、（マイクロインジェクショ

子改変を施す部位を自由に選択できるため、極ンを除き）初心者でも容易に実施できる手法でめて計画的な手法である。

ある。また、特殊な装置や設備は必要とせず、遺伝子改変を施す部位を自由に選択できると一般的な実験室であればすでに備わっているよ

いうことは何にもまして、遺伝子破壊株（ノッうな機器を用いて実施できる。ステップも少なクアウト株）の作成において威力を発揮する。

く、偶然性の低い遺伝子改変手法であることか

これまでは、ノックアウト株の作製が困難であら、要する時間も旧来の方法に比べてはるかにるという理由から、遺伝子機能を破壊したい場短い。

合は RNAi（RNA interference）によるノック以上のことから、ゲノム編集はこれまでの遺ダウンの手法が頻用されてきた。しかし RNAi

伝子組換え手法に代わる新しい手法であり、特では、対象の遺伝子の発現が完全に消失するわ

殊な事情のない限り今後の遺伝子改変はすべてけではない。したがって RNAi 株には、対象のゲノム編集で行われるものと思われる。ゲノム遺伝子の機能が残存している懸念が常に生じて編集がどのようなことの解明に有効な手段であいた。一方ゲノム編集は、タンパク質コード領り、また、どのようなことに利用できる技術で域に DNA 塩基の挿入か欠失を導入してフレーあるのかを、以下に概説する。

ムシフトを誘発することにより、その遺伝子機5.1 遺伝子機能の解明
興味のある遺伝子があれば、そのノックアウ能を完全に喪失させられる手法である。
また、旧来の遺伝子組換え手法を利用してト株や GFP 融合体、またはアミノ酸置換体を作

ノックアウト株を作製する場合は、相同組換え製する。その遺伝子改変株の表現型を観察する活性の高い胚性幹細胞（embryonic stem cell:ことにより、その遺伝子の機能や局在、ドメイES 細胞）を利用する必要があった。したがっンの機能が推察できる。また、それらの遺伝子

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ゲノム編集の原理と利用、そして課題

改変株を用いたオミクス解析は、相互作用因子病因遺伝子の不活化を目的とする場合は NHEJやシグナル伝達経路の解明に貢献する。

を、病的変異の置換修復が目的ならば HDR を数万の gRNA ライブラリーを用いて、多数の誘導する。遺伝性疾患の治療だけでなく、HIV遺伝子をランダムにノックアウトすることもでウィルスの増殖抑制や、がん免疫療法の賦活化きる。その細胞集団の中から興味深い表現型をにも効果を発揮する。

示す細胞を単離して次世代シークエンサーによ

また、ゲノム編集技術を利用すれば、ヒトのるリシークエンスを実施することにより、ノッ遺伝子異常を再現した実験動物が数ヶ月のうちクアウトされた遺伝子が同定できる。これによに作製できる。一般的な遺伝性疾患のモデル動り、特定の生理機能の発揮に重要な役割を担っ物は、その疾患の新薬開発に威力を発揮する。ている遺伝子が明らかにできる。

また、個々の患者の遺伝子異常を再現した疾患

5.2 有用な形質を備えた GM 生物の作製

モデル動物は、患者に治療を施す前の治療効果内在の遺伝子を改変することにより、あるいの検証や、薬の効果や副作用の確認に役立つ。

は他の生物種の遺伝子を導入することにより、以上のことからゲノム編集は、個別化医療の発病冷害に強い農作物、肉量の多い家畜、成長の展にも欠かせない技術である。

早い養殖魚など、食糧の増産に貢献する GM 生物が作製できる。また、アレルゲンを低下させ

6 ．ゲノム編集の課題

た卵、花粉症を緩和するコメ、認知症の予防に6.1 オフターゲットのリスク効果的な野菜など、消費者にメリットのある

現時点のゲノム編集では、意図せぬ部位をもGM 生物の作製も可能である。
ゲノム編集は、水素生産菌、バイオ燃料とな切断してしまうオフターゲットの発生を完全にる油脂を蓄積する藻類、生分解性プラスチック排除することは難しい。それにより、新たなアの原材料を生産する乳酸菌など、環境問題の解レルゲンの発生や、細胞のがん化が誘発される決に貢献する生物の生産性向上にも利用できることがありえる。実験動物や GM 作物の場合な技術である。また、重金属や放射性元素によりらば、野生種との交配により標的部位以外の変汚染された土壌の浄化に貢献する微生物や植物異を減らすことが可能である。しかし遺伝子治の作製も可能である（バイオレメディエーショ

療の場合は、ゲノム編集によるがん化のリスクン、ファイトレメディエーション）。

についてあらかじめ患者に伝えてインフォームある遺伝子改変を誘発するようなゲノム編集ド・コンセントを得る必要がある。また、ゲノム因子自体を発現させた GM 生物が野生個体と交編集を施した細胞を患者の体内に戻す前に、次配した場合、野生個体に由来する染色体も積極世代シークエンサーによるリシークエンスを実的に遺伝子改変を受ける。これにより、遺伝子施して標的部位以外の変異の有無を確認する必

変異を特定の生物種内に急速に伝播させる手法

要もある。のことを“遺伝子ドライブ”という。この手法

6.2 GM 生物の作製に用いる際の課題に基づき、生存や繁殖に不利な遺伝子改変を誘GM 生物は人類が抱える様々な諸問題を解決発する個体を環境中に放散することにより、そする有効な手段である一方で、その拡散が野生の生物種の撲滅が可能となる。これは、農作物種の生存や繁殖に悪影響をおよぼすこともありに害をおよぼす病害虫の防除、マラリアやデンえる。そのため、GM 生物の使用等に関してはグ熱を媒介する蚊の根絶、生態系に悪影響をお国際的な枠組みが定められ（カルタヘナ議定よぼす外来種の駆逐に威力を発揮する手法であ書）、我が国では“遺伝子組換え生物等の使用る。

等の規制による生物の多様性の確保に関する法

5.3 疾患の治療、薬効や副作用の確認

律（通称“カルタヘナ法”）により規制されて患者から採取した細胞にゲノム編集を施し、いる。ゲノム編集は 1 塩基レベルの遺伝子改変培養した後に患者の体内に戻す（遺伝子治療）。

を可能とする技術のため、ある個体の変異が突69然変異により自然に発生したものなのか、それするリスクとを秤にかけ、ケースごとに選択すともゲノム編集により人為的に導入された変異ることが肝心であると考える。

なのか、その区別は困難である。以上のことか

人はつい、理解できないものに対して“危険らゲノム編集は、GM 生物の使用等の規制をかなもの”というレッテルを貼ってしまう。本総いくぐるために悪用されかねない技術である。

説によりゲノム編集に対する理解が少しでもひゲノム編集技術に基づく遺伝子ドライブを実ろがり、理由もなく危険な技術というわけでは施して病害虫の撲滅を試みた結果、副次的な効ないことが一人でも多くの読者に伝われば良い果により生物多様性に重大な危機が生じることと思う。

もありえる。ある生物種内における遺伝子変異の拡散は不可逆的なものであることから、遺伝8 ．参考文献

子ドライブの実施に先立っては入念な影響評価

1 ）Gaj, T., Gersbach, C.A., Barbas C.F.III,“ZFN,が欠かせない。

TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for6.3 受精卵を用いた研究に用いる際の課題

genome engineering.”Trends Biotechnol. (2013)

ゲノム編集は、ヒトの受精卵等の生殖細胞に31: 397-405.

適用することでデザイナー・ベイビーの作製を2 ）Urnov, F.D., Miller, J.C., Lee, Y.L., et al.“Highly可能にしてしまう技術である。そのため、遺伝

efficient endogenous human gene correction using

子改変を施した受精卵の着床は、国際学会におdesigned zinc-finger nucleases.”Nature (2005)
435: 646-651.

いて自主的に規制されている。我が国の場合3 ）Mahfouz, M.M., Shamimuzzaman, M., Wibowo,

は、厚生労働省の定める“遺伝子治療等臨床研A., et al. “De novo-engineered transcription

究に関する指針”において、着床の有無にかかactivator-like effector (TALE) hybrid nuclease

わらずヒトの受精卵の遺伝子改変が禁止されてwith novel DNA binding specificity creates

いる。しかし一方で、ゲノム編集はヒトの受精

double-strand breaks.”Proc. Natl. Acad. Sci.

や発生のメカニズムの解明において威力を発揮

U.S.A. (2011) 108: 2623-2628.
4 ）Bogdanove A.J., Voytas, D.F.“TAL effectors:する手法であり、それによる生殖補助医療分野

customizable proteins for DNA targeting.”の発展が期待されている。そのため我が国でScience (2011) 333: 1843-1846.

は、一部の基礎研究に限りゲノム編集による受5 ）Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., et al.

精卵の遺伝子改変が解禁される見通しである。

“A programmable dual-RNA-guided DNA

しかし、遺伝子改変を施した受精卵をヒトや動endonuclease in adaptive bacterial immunity.”

物の子宮に移植することは許可されない。

Science (2012) 337: 816-821.
6 ）Fu, Y., Foden, J.A., Khayter, C., et al.“Highfrequency off-target mutagenesis induced by

7 ．最後にCRISPR-Cas nucleases in human cells.”Nat.
Biotechnol. (2013) 31: 822-826.

ゲノム編集は、ゲノムという生物の根幹をな

7 ）Mali, P., Aach, J., Stranges, P.B. et al.“CAS9す物質を不可逆的に修飾する技術であることかtranscriptional activators for target specificity

ら、その使用が人類および地球環境に取り返し

screening and paired nickases for cooperativeのつかない悪影響をおよぼしてしまう可能性がgenome engineering.”Nat. Biotechnol. (2013) 31,考えられる。しかし、難病や不妊に苦しむ人々

833-838.

にとっては光明となる新技術であることも事実8 ）Ran, F.A., Hsu, P.D., Lin, C.Y., et al.“Doubleである。また、今後の人類の食糧やエネルギー

nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 forenhanced genome editing specificity.”Cell (2013)の安定供給を考えた場合、この技術の使用を禁154: 1380-1389.

止することの方がより大きい不利益を招くと考9 ）Ran, F.A., Hsu, P.D., Wright, J., et al.“Genomeえられる。緊急性の有無、また、ゲノム編集をengineering using the CRISPR-Cas9 system.”Nat.

実施することで得られる利益とそれにより発生70ゲノム編集の原理と利用、そして課題

Protoc. (2013) 8: 2281-2308.
10）Chen, B., Gilbert, L.A. Cimini, B.A., et al.“Dynamicimaging of genomic loci in living human cells by an
optimized CRISPR/Cas system.”Cell (2013) 155:
1479-1491.
11）Beumer, K.J., Trautman, J.K., Mukherjee, K., etal.“Donor DNA utilization during gene targetingwith zinc-finger nucleases.”Genes Genomes
Genetics (2013) 3: 657-664.
12）Yu, C., Liu, Y., Ma, T., et al.“Small molecules
enhance CRISPR genome editing in pluripotent
stem cells.”Cell stem cell (2015) 16: 142-147.
13）Chu, V.T., Weber, T., Wefers, B., et al.“Increasing
the efficiency of homology-directed repair for
CRISPR-Cas9-induced precise gene editing inmammalian cells.”Nat. Biotechnol. (2015) 33: 543548.

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