2019 年度研究助成報告書

2 型糖尿病の不安障害併発機序の解明と多様な運動療法が及ぼす影響の基礎的検証

1

OLETF ラットの食餌量を LETO ラットと同量に制限する群（OL-FR 群：n = 6）
，OLETF ラットを週 5 日，暗期の 12 時間，1 匹ずつそれぞれ回し車を設置したケージに暴露する群（OL-WH 群：n = 8）に分けた。各ケー

越 智 亮 介（PT）1）， 藤 田 直 人（PT）1）， 久 恒 一 義 1），
1）2）

，浦川

Nguyen Tien Son（MD）
1）

1）

将（PT）

広島大学大学院医系科学研究科運動器機能医科学2）

ジ暗期 12 時間における回し車の回転距離を計測し，各ラットの走行距離とした。
2．経口ブドウ糖負荷試験

Department of Rheumatology and Endocrinology,

8 週齢時点に，耐糖能を評価するために経口ブドウ糖

103 Military Hospital, Vietnam Military Medical

負荷試験を行った。12 時間の絶食後，体重（kg）あたUniversityり 2 g のグルコースを経口投与した。糖負荷直前，糖負荷後 30 分，60 分，120 分に，外側尾静脈から採血し，キーワード：2 型糖尿病，情動行動，運動

キノプロテイングルコースデヒドロゲナーゼ酵素電極法
により，血糖値を計測した（ACCU-CHEK ST meter，はじめにRoche，東京）。

糖尿病患者は不安障害を合併しやすいことがメタアナ
1）
リシスで示されているが ，その発症機序は十分明らか

3．オープンフィールド試験にされていない。現在，不安障害に対する治療では，お経口ブドウ糖負荷試験の 1 日または 2 日後，活動量をもにセロトニン再取り込み阻害薬や認知行動療法が行わ評価するためにオープンフィールド試験を行った。10 分

れているが，治療反応性は 60% に限られており，不安間の自発行動を AnimalTracker（http://animaltracker.

障害には様々な生物学的，心理社会的要因が複雑にかか6）
elte.hu）により解析し ，フィールド全体の総移動距離わっていると考えられている

2）。神経ペプチドのひとつを算出した。

であるコレシストキニン（以下，CCK）は，おもに大脳辺縁系に局在しておりとが示され

3），不安の調節に重要であるこ

4），不安障害にかかわる要因として注目されている。

オープンフィールド試験の 1 日後，不安様行動を評価するために高架式十字迷路試験を行った。10 分間の自運動は 2 型糖尿病患者の不安症状を軽減することが報告されている

4．高架式十字迷路試験

5）。しかし，運動が 2 型糖尿病に合併した発行動を撮影し，全アームへの総進入回数に対するオープンアーム進入回数率を計測した。

不安障害を改善する機序は調べられておらず，その介入効果の科学的根拠は十分に検証されていない。

5．ホットプレート試験

我々はこれまでの研究で，過食により 2 型糖尿病を自高架式十字迷路試験の 1 日後から 2 日間，熱刺激に対然発症する Otsuka Long-Evans Tokushima fatty（以下，する反応性を評価するためにホットプレート試験を行っOLETF）ラットの不安様行動が亢進しており，扁桃体た。1 日目に，加温していないプレート上で 10 分間馴

基底外側核の CCK 陽性細胞の増加が関与する可能性を化させた。2 日目に，ラットをホットプレート（50 ±明らかにしたが，これらの変化が 2 型糖尿病の病態に伴2.5 °C）上に置き，逃避反応（後肢を引っ込める，後肢うものであるかは明らかにされていなかった。そこで，をなめる，ジャンプする）を示すまでの潜時を計測した。

本研究は，OLETF ラットの情動行動と関連する神経病

1 回の試行は 60 秒をカットオフ値とし，3 試行の逃避反態の変化が耐糖能低下に伴うものであるか，および，運応潜時の平均値を算出した。

動がこれらの変化を改善するかを明らかにすることを目的とし，食餌量制限や運動が情動行動と CCK 陽性細胞に及ぼす影響を検証した。

6．組織学的解析
ホットプレート試験の 2 日または 3 日後に，すべてのラットを生理食塩水で灌流脱血し，4% パラホルムアル

対象および方法
1．実験動物と実験群
本研究では，雄性 OLETF ラットと，対照の非糖尿デヒドで灌流固定した。その後，脳を摘出し，同溶液で 24 時間後固定した。30 µ m 厚の凍結切片を作製し，CCK の免疫組織化学染色を行った。CCK 陽性細胞は細病 モ デ ル で あ る Long-Evans Tokushima Otsuka（ 以胞体の直径が 10 µ m よりも大きいものを大型，小さい下，LETO）ラットを用いた。すべての実験は，広島

ものを小型として分類し，扁桃体基底外側核における陽大学動物実験委員会の承認を得て実施された。実験群

性細胞密度を計測した。

は，LETO ラットを通常飼育する群（LE 群：n = 6），
OLETF ラットを通常飼育する群（OL-SE 群：n = 6），22019 年度研究助成報告書

7．統計学的解析
すべての測定値は平均±標準誤差で示した。血糖値および行動学的指標は，各群の比較のため，一元配置分散分析を行い，主効果を認めた場合に Bonferroni 法による多重比較を行った。CCK 陽性細胞密度は，実験群の要因と細胞体の大きさの要因の二元配置分散分析を行い，主効果または交互作用を認めた場合，Bonferroni 法による多重比較を行った。有意水準は 5% とした。
結果

1．血糖値
経口ブドウ糖負荷試験における血糖値は，LE 群と比較して，OL-SE 群のみ有意に高値を示し，OL-SE 群と 比 較 し て，OL-FR 群 お よ び OL-WH 群 は 有 意 に 低値 を 示 し た（LE 群：16,867.5 ± 411.7 mg/dL × min，
OL-SE 群：24,042.5 ± 1,000.9 mg/dL × min，OL-FR 群：
17,970 ± 884.0 mg/dL × min，OL-WH 群：16,638.8 ±535.0 mg/dL × min）。

図 1 扁桃体基底外側核の CCK 陽性細胞密度
CCK 陽性細胞を細胞体の直径が 10 µ m より大きいものを大型，小さいものを小型に分類し，扁桃体基底外側核における CCK 陽性細胞密度を計測した．CCK：コレシストキニン，
LE 群：LETO ラットを通常飼育する群，OL-SE 群：OLETF
ラットを通常飼育する群，OL-FR 群：OLETF ラットの食餌量を制限する群，OL-WH 群：OLETF ラットを回し車を設置したケージに暴露する群．* は LE 群に対する有意差を示す（p< 0.05）。

2．走行距離OL-WH 群の暗期 12 時間あたりの走行距離の平均は，4.9 ± 1.1 km だった。

考察
本研究で，8 週齢時点の OLETF ラットは耐糖能が低下しており，オープンフィールド試験の総移動距離から3．オープンフィールド試験

活動量低下，高架式十字迷路のオープンアーム進入回数

総移動距離は，LE 群と比較して，OL-SE 群，OL-WH率から不安様行動亢進，ホットプレート試験の逃避反応

群は有意に低値を示したが，OLETF ラットの 3 群間に潜時から熱刺激に対する反応性低下を示すことが明らか有意差を認めなかった（LE 群：33.8 ± 3.9 km，OL-SEになった。これらの OLETF ラットの情動行動の変化

群：16.3 ± 3.1 km，OL-FR 群：25.7 ± 4.6 km，OL-WH

は，先行研究の結果と一致している

群：9.3 ± 2.1 km）。

による抑うつモデル動物は，熱刺激や機械刺激に対する反応性が低下すると報告されており

4．高架式十字迷路試験
オ ー プ ン ア ー ム 進 入 回 数 率 は，LE 群 と 比 較 し て，

7）8）

。慢性ストレス

9），OLETF ラットの熱刺激への反応性低下はうつ様行動の一端を示している可能性がある。

OLETF ラットの 3 群がすべて有意に低値を示したが，また，本研究の食餌量制限は，OLETF ラットの耐糖OLETF ラットの 3 群間に有意差を認めなかった（LE能低下および活動量低下を抑制したが，不安様行動，熱群：24.5 ± 4.0%，OL-SE 群：3.0 ± 3.0%，OL-FR 群：4.5

刺激に対する反応性は変化させなかった。これらの結果± 3.2%，OL-WH 群：1.4 ± 1.4%）。

から，OLETF ラットは耐糖能の違いにかかわらず不安様行動，うつ様行動が亢進していることが示唆された。

5．ホットプレート試験
逃避反応潜時は，LE 群と比較して，OLETF ラット

運動は不安様行動やうつ様行動を減少させると考えられている10）。一方，本研究の回し車運動は，OLETFの 3 群がすべて有意に高値を示し，OL-SE 群と比較しラットの耐糖能低下を抑制したが，情動行動の変化を抑て OL-WH 群が有意に高値を示した（LE 群：5.0 ± 0.7

制しなかった。先行研究では，本研究より短時間の回し秒，OL-SE 群：19.9 ± 2.6 秒，OL-FR 群：25.5 ± 2.3 秒，車運動やトレッドミル運動が，不安様行動やうつ様行動

OL-WH 群：31.2 ± 3.0 秒）。

を抑制したと報告されている

11）12）。今後は，情動行動へ影響し得る，回し車を設置したケージへの暴露時間お6．CCK 陽性細胞密度よび期間を検討する必要がある。

扁桃体基底外側核における CCK 陽性細胞密度は，実本研究で，OLETF ラットは耐糖能の違いにかかわら験群の有意な主効果，実験群と細胞体の大きさの有意ず扁桃体基底外側核の CCK 陽性細胞が増加していた。

な交互作用を認めた。多重比較の結果，細胞体が小さい

扁桃体への CCK 投与は不安様行動を亢進させCCK 陽性細胞密度のみ，LE 群と比較して，OLETF ラッ底外側核における CCK の選択的ノックダウンは不安様トの 3 群がすべて有意に高値を示した（図 1）。

行動やうつ様行動を減少させる4）13），基。これらの結果から，

2019 年度研究助成報告書

OLETF ラットの不安様行動やうつ様行動の亢進に扁桃体基底外即核の CCK 陽性細胞増加が関与していることが示唆された。
結論
OLETF ラットは耐糖能の違いにかかわらず不安様行動，うつ様行動が亢進しており，これらの変化には扁桃体基底外側核における CCK 陽性細胞の増加が関与していることが示唆された。運動による不安様行動，うつ様行動の抑制効果は認めなかった。
文

献1）Smith KJ, B land M, et al.: Association of diabetes with
anxiety: A systematic review and meta-analysis. J
Psychosom Res. 2013; 74(2): 89‒99.
2）Bystritsky A: Treatment-resistant anxiety disorders. MolPsychiatry. 2006; 11(9): 805‒814.
3）Vanderhaeghen JJ, Mey JDE, et al.: Immunohistochemical
localization of cholecystokinin- and gastrin- like peptides
in the brain and hypophysis of the rat. Proc Natl Acad
Sci USA. 1980; 77(2): 1190‒1194.
4）Del Boca C, Lutz PE, et al.: Cholecystokinin knockdown in the basolateral amygdala has anxiolytic andantidepressant-like effects in mice. Neuroscience. 2012;
218: 185‒195.
5）Ligtenberg PC, Godaert GL, et al.: Inﬂuence of a physical

3training program on psychological well-being in elderlytype 2 diabetes patients. Diabetes Care. 1998; 21(12):2196‒2197.
6）Guly s M, Bencsik N, et al.: AnimalTracker: An ImageJBased Tracking API to Create a Customized Behaviour
Analyser Program. Neuroinformatics. 2016; 14(4): 479‒481.
7）Yamamoto Y, Akiyoshi J, et al.: Increased anxiety
behavior in OLETF rats without cholecystokinin-Areceptor. Brain Res Bull. 2000; 53(6): 789‒792.
8）Li XL, Aou S, et al.: Spatial memory deﬁcit and emotional
abnormality in OLETF rats. Physiol Behav. 2002; 75(1-2):
15‒23.
9）Shi M, Qi W, et al.: Increased thermal and mechanicalnociceptive thresholds in rats with depressive-likebehaviors. Brain Res. 2010; 1353: 225‒233.
10）Alkadhi KA: Exercise as a Positive Modulator of Brain
Function. Mol Neurobiol. 2018; 55(4): 3112‒3130.
11）Patki G, Li L, et al.: Moderate treadmill exercise rescues
anxiety and depression-like behavior as well as memory
impairment in a rat model of posttraumatic stressdisorder. Physiol Behav. 2014; 130: 47‒53.
12）Lynch CA, Porter B, et al.: Access to voluntary running
wheel exercise: Prevention of anxiety-like behavior inchronically stressed rats, but potentiation of ethanol
intake/preference. Physiol Behav. 2019; 206: 118‒124.
13）Belcheva I, Belcheva S, et al.: Asymmetry in behavioral
responses to cholecystokinin microinjected into rat
nucleus accumbens and amygdala. Neuropharmacology.
1994; 33(8): 995‒1002.