平成２７年度福島医薬品関連産業支援拠点化事業の実績報告書【概要版（HP 掲載用）】

平成２８年１０月
公立大学法人福島県立医科大学 ふくしま国際医療科学センター内
医療‐産業トランスレーショナルリサーチセンター

● 補助対象事業の結果
バイオマーカーの開発など、がん治療等に有効な医薬品を創出するための創薬研究を行うとともに、医療界と産業界を円滑に橋渡しをする
ことにより、がんを中心とした諸疾患の新規治療薬・診断薬・検査試薬や医療機器などの開発支援を多面的に行うための拠点を形成することを目的として、医療－産業トランスレーショナルリサーチセンター（医療‐産業ＴＲセンター）の整備を行った。
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拠点整備（拠点整備に係る研究備品設置事業）および拠点運営

１ 医薬品関連産業支援拠点化整備・運営事業
研究者の確保や機器等の整備（様式第 13 取得財産等管理台帳兼取得財産等明細表のとおり）など研究体制の充実を図り、次の研究活動に取り組んだ。また、企業との１１８件のコーディネート業務を行い、（10）の成果につなげた。
（１）各種ヒト由来検体の取得と遺伝子発現プロファイルの体系的取得・解析
福島県立医科大学附属病院、学外関連病院または共同研究機関等から各種ヒト検体（手術摘出組織、生検組織、末梢血、項目（８）において in vitro または in vivo で増殖させた組織・細胞等を含む）を採取・活用するための臨床研究基盤および取得方法を確立し（ＣＤ１、ＣＴ１）、1,460 件の臨床検体および付随する臨床情報を取得した（ＣＤ２、ＣＴ２）。
また、前記の臨床検体に加え、海外から入手可能なヒト由来検体、各種培養細胞、および市販の RNA サンプル、各種細胞（がん細胞株、正常細胞、遺伝子導入細胞、各種化合物を添加した細胞等を含む）、担がん動物由来がん組織及び購入した組織等の中から厳選した 2,200
サンプルの遺伝子発現プロファイルを取得した（項目（１）、（４）及び（９）で取得したものを含む）（ＧＥ１、ＣＤ３）。さらに、それら生体試料に付随する疾患名の統一作業を行い、6,600 件についてコード化を行った（ＣＴ３）。
これまでに取得したがん組織または正常組織の遺伝子発現プロファイルの解析（ＧＥ２）から、各種がん（乳がん、食道がん、卵巣がん等）の組織型分類マーカー遺伝子や診断マーカー遺伝子等を特定し、さらにそこから遺伝子を絞り込み、実用化へ向けて検査・診断薬企業と共同研究を始めている（ＧＥ３、ＩＮ１）。また、特定の抗がん剤の効果を予測できるバイオマーカー（遺伝子）の開発を進めた（ＧＥ４、ＩＮ２）。
がん化に関係する各種 EGFR、TP53 または BRAF 変異体 cDNA を導入した細胞株の遺伝子発現プロファイルを取得（ＧＥ５）し、各

種抗がん剤の感受性や EGF 非依存的な増殖能の獲得と相関する遺伝子発現変動パターンを明らかにした（ＧＥ６、ＩＮ３）。
食道類基底細胞癌の診断マーカーを開発し、特許出願を行った（ＧＥ７、ＩＮ４）。
血液を用いた網羅的遺伝子発現解析により、重症敗血症患者のバイオマーカー探索を行った（ＧＥ８、ＩＮ５）。
（２）cDNA リソースの新規取得と各種活用型への変換
ヒト遺伝子 6,361 遺伝子について、COSMIC データベースを用いて変異情報を追加し、より正確な遺伝子セットを構築した（ＴＡ１）。
それらの遺伝子から厳選した遺伝子について、その変異型として 255 種のエントリークローンを取得した（ＴＡ２）。また、未取得正常遺伝子 1，744 種のエントリークローンを取得した（ＴＡ３）。これらの総合計 1，999 遺伝子のエントリークローンは全塩基配列を決定した（ＴＡ４）。取得した cDNA クローンをレトロウイルスベクター発現クローンとして 1,059 種作製（ＴＡ５）し、遺伝子機能解析のために活用した。
また、不死化細胞について 12 種を新たに作製した（ＴＡ６）。
さらに、上記の疾患関連遺伝子およびその変異遺伝子、細胞初期化遺伝子等のレトロウイルスベクター発現クローンを各種細胞へ導入し、新規生体材料を作製した（ＴＡ７）。
（３）新規疾患関連遺伝子の探索と機能解析
発がん、浸潤・転移を制御する機能を個々の遺伝子について評価するための「多検体・個別遺伝子評価系」の開発において、NIH3T3細胞を用いた 96 ウェルプレートフォーマットのフォーカス形成アッセイと軟寒天コロニー形成アッセイ系（ＧＦ１）を用いて 802 個の癌関連候補遺伝子の個別評価を行い（ＧＦ２）、4 個のがん遺伝子候補を同定した。また、MCF10A 細胞等にがんで検出されるがん関連遺伝子（ALK, FLT3, DNMT3A, IDH1, IDH2, AKT1, GNAQ, GNA11, KIT1, KIT2, JAK2）の変異体を導入した計 204 細胞株を樹立（ＧＦ３）
し、増殖因子依存性、ウェスタンブロットによるリン酸化シグナル伝達経路の解析、薬剤感受性試験および遺伝子発現プロファイリングの取得を進めた（ＧＦ４）。
乳癌で予測された 33 カ所の遺伝子増幅部位に存在する 845 遺伝子から造腫瘍能を有する受容体遺伝子を一つ（累計４個）同定した（ＧＦ５）。
がん幹細胞などの特定の細胞の同定や細胞の分化・機能変化のイメージング、薬剤感受性試験、疾患マーカー・疾患関連遺伝子の探索を目的として遺伝子トラップ用のベクターの開発を進め、モデル薬物や任意の遺伝子に応答するレポーター細胞を作製した（ＧＦ６）。そして Forskolin に応答する遺伝子部位の候補として 2 個、Thapsigargin に応答する遺伝子部位の候補として 6 個、癌関連遺伝子である c-MYC、および HNF1B の発現に応答する遺伝子部位の候補としてそれぞれ 2 個、および 10 個を同定した。また、遺伝子トラップを利用してタンパク質どうしの結合を指標に遺伝子機能を評価する系を構築した（ＧＦ７）。これを用いて NFκB の構成因子である p65 に結合する因子の候補として 14 個同定した（ＧＦ８）。
（４）各種の刺激を加えた培養細胞の体系的遺伝子発現プロファイルの取得・解析
心筋細胞に対する薬物の遺伝子発現に与える影響を評価した。ヒト iPS 細胞由来の心筋細胞について、安定した心筋の拍動を確認後、抗がん剤を中心に 33 種類の化合物を処理し、100 サンプルの遺伝子発現プロファイルを取得した（ＣＢ１）。その結果、ヒト心筋細胞で、薬物に対する遺伝子発現に変化があることが判明した。更なる解析により、重篤な心毒性作用である催不整脈を引き起こす薬物に特徴的な遺伝子発現変化示す１９遺伝子を同定した（ＣＢ２、ＧＥ９、ＩＮ６）。これら遺伝子変化を指標に薬物の催不整脈作用を評価する系を確立した（ＣＢ３、ＧＥ１０、ＩＮ７）。加えて、心筋の器質障害を示す化合物の評価も行い、器質障害によると特徴的な遺伝子変化を検出することに成功した。
血管内皮細胞に対する薬物や生理活性物質の遺伝子発現に与える影響を評価した（ＣＢ４、ＧＥ１１、ＩＮ８）。ヒト臍帯静脈内皮細胞と各種ヒト血管内皮細胞に、44 種類の化合物や生理活性物質を処理し、109 サンプルの遺伝子発現プロファイルを取得した（ＧＥ１２）。
その結果、化合物や生理活性物質により特徴的な遺伝子発現変化が起こることを確認した。
（５）化学物質に対する基盤的培養細胞応答情報の体系的取得・解析
種々の薬物に対するヒトがん細胞の応答情報の体系的取得・解析を行うために 、子宮がん細胞 6 株、血液がん細胞 2 株、卵巣がん細胞2 株、肺がん細胞 21 株および大腸がん細胞 1 株に対して、抗がん剤を中心に 134 種類の化合物の感受性試験を行った（ＣＢ５）。その結果、5,618 のデータを取得し、クラスタ解析により化合物と細胞株の分類を行い、これらのデータのデータベース化を進めた（ＣＢ６）。
さらに、臨床リソース・データ基盤分野より樹立した臨床由来のがん細胞 4 株についても同様の解析（化合物 146 種類、490 データ）を行い、がん細胞株のデータと比較解析を行った（ＣＢ７）。
トランスクリプトーム解析分野および、遺伝子機能解析分野で作製したがん関連遺伝子の変異体発現細胞 95 株を用いて、144 種類の抗がん剤の感受性試験を行った（ＣＢ８）。これまでに、13,680 のデータを取得し、感受性パターンの解析を行った結果、特定の遺伝子変異と抗がん剤の感受性との関連性を明らかにした（ＣＢ９）。

（６）生体材料の基盤的タンパク質発現情報の体系的取得・解析
平成 26 年度に引き続き、新たなプロテオーム解析技術である「逆相タンパク質マイクロアレイ法（RPPMA）」の開発に取り組んだ（ＰＡ１）。本法は、１枚のスライドガラスに数万検体由来のタンパク質サンプルを載せることにより、検体間のタンパク質の発現レベルを網羅的に横並びに比較できる画期的なシステムである。システムの開発と同時に RPPMA 用のタンパク質サンプル調製法を確立し、約 1,013検体以上のサンプル調製を行った（ＰＡ２）。次いで、予備実験を含み RPPMA を 702 解析以上行った（ＰＡ３）。RPPMA により注目されたタンパク質について、２次元電気泳動-ウエスタンブロット法（2D-WB）および質量分析法（MS）等で翻訳後修飾（リン酸化）等の詳細解析を 106 解析以上行った（ＰＡ４）。昨年度に引き続き、遺伝子発現解析用ライセートからタンパク質抽出を行い、2,010 検体以上を処理した（ＰＡ５）。
（７）生体材料の基盤的ゲノム配列情報の体系的取得・解析
ゲノム DNA の塩基配列を解析できるヒト由来サンプルの収集として、臨床検体由来サンプル 2,167 検体から DNA を抽出した（ＧＡ１）。
その中には、ゲノム配列解析の同意を得ている福島医大附属病院からの FMU#検体が 1,102 検体含まれている。次いで、がんおよび他の諸疾患患者における遺伝子塩基配列の変化を探索するとともにその検出方法の開発としては、①Whole Exome Sequence (WES)法のAmpliSeq Exome (ASE)法 (Ion Ampliseq Human Exome kit) での配列解析、②疾患遺伝子解析パネル法の CHP 50 遺伝子パネル（CancerHotspot Panel v2）、CLP 22 遺伝子パネル（Colon and Lung Cancer Panel）、AML 19 遺伝子パネルと CCP 409 遺伝子パネル（Comprehensive Cancer Panel）での配列解析、③Whole Genome Sequence (WGS)法での配列解析、および、④FLT3 遺伝子の PCR 法（FLT3/ITD Mutation Detection Set）での解析を行い、変異と CNV（Copy number variation）の検出・解析を行った（ＧＡ２）。WES
ASE 404 件、CHP 723 件、CLP 258 件、CCP 44 件、WGS 5 件のゲノム配列解析とその情報解析および PCR 法による FLT3 遺伝子変異解析 40 件の合計 1,474 件の解析を行った（ＧＡ３）。特に、FMU#検体については、DNA グレード、がん情報等の評価のために CHP とCLP での解析を、ASE 解析の前解析として積極的に行った（ＧＡ４）。また、できる限り原発腫瘍組織部位と隣接正常組織等のコントロール部位とのペアでの比較解析による変異解析に重点をおいた解析を行った（ＧＡ５）。実験手法や情報解析法についての改良も、データを取得しながら積極的に行った（ＧＡ６）。
（８）各種生体材料の活用型への変換
福島県立医科大学附属病院等からのがん組織（臨床検体）を免疫不全マウス(NOG)に移植・継代後、腫瘍を摘出して凍結保存、病理組織

学的解析用および網羅的遺伝子発現解析用の検体作製を行った（ＡＥ１）。2015 年 4 月から 2016 年 3 月までに 162 件の臨床検体（婦人科がん、整形外科領域がん等の固形がん 112 件、白血病等の血液疾患で 50 件）を取り扱い、557 匹の担がんマウスを作製した（ＡＥ２）。
白血病モデルマウスの作製を進め、これまでに B 前駆細胞性急性リンパ性白血病（BCP-ALL）6 件、T 細胞性急性リンパ性白血病（T-ALL）
1 件および悪性 T リンパ腫（T-LBL）1 件について継代・凍結保存が可能であることを確認した。また、BCP-ALL3 件、T-ALL1 件、T-LBL1
件については、多数の NOG マウスに同時移植し、生着率や病態の進行過程を観察した結果、個体差も少なく良好な成績を得ることができた。BCP-ALL1 件および T-ALL1 件で、モデルマウスを使用した抗がん剤薬効評価試験の有用性が高いことを確認した（ＡＥ３）。
さらに、がん組織を培養細胞系へ移行させる加工技術の開発を目指し、臨床サンプル及び担がん動物由来のがん組織を用いた 227 件の各種培養実験（培地開発、遺伝子導入を含む）を行い、活用可能な新規がん細胞培養系として 8 件確立した（ＣＤ４）。
（９）各種薬剤の毒性試験及びそれに伴う臓器・組織の遺伝子発現プロファイルの取得・解析
ラットを用いた化学物質の生体応答評価の集積をめざし、薬物（サリドマイド 4,000 mg/kg、レナリドミド 1,000 mg/kg、塩酸イミプラ
ミン 125 mg/kg、イブプロフェンナトリウム 200 mg/kg、塩酸メトホルミン 1,500 mg/kg、アスピリン 500 mg/kg、セレコキシブ 2,000 mg/kg、アセトアミノフェン 1,500 mg/kg、イベルメクチン 10 mg/kg、シクロスポリン A 100 mg/kg、フェノフィブラート 500 mg/kg、シメチジン 1,500 mg/kg、クエン酸タモキシフェン 100 mg/kg およびリファンピシン 250 mg/kg: 計 14 薬物）を対象として試験を行った。被験薬をラットに 7 日間反復経口投与し、テレメトリー法による投与期間中の生理学的解析、諸臓器の遺伝子発現プロファイル取得や病理組織学的解析を行った（ＡＥ４、ＧＥ１３）。
サリドマイド誘導体であるサリドマイドとレナリドミドでは発現の増減する遺伝子が異なることが明らかになった（ＡＥ５、ＧＥ１４）。
また、投与に伴う体温変化が薬物によって異なり、テレメトリー法による体温モニタリングが毒性評価指標として有用であることが示唆された。
以上の試験で、オスの SD ラット 169 匹を使用した（ＡＥ６）。
（10）共同研究等
製薬企業との共同研究を 3 件（ＣＢ１０、ＰＡ６、ＧＥ１５、ＩＮ９）、成果情報提供契約を 8 件、秘密保持契約を 4 件締結し、研究を進めている。また、検査・診断薬企業と特許共同出願契約を 2 件締結し、2 つの特許出願が完了している（ＩＮ１０、ＧＥ１６）。

○拠点整備（拠点整備に係る施設建築事業）

２ 医薬品関連産業支援拠点駐車場整備事業
医大に整備予定の医療‐産業ＴＲセンターの駐車場の工事を行った。
３ 医薬品関連産業支援拠点施設整備事業
医大に整備予定の医療‐産業ＴＲセンターの建設工事を行った。
４ 医薬品関連産業支援拠点高圧受電設備整備事業
医大に整備予定の医療‐産業ＴＲセンターの高圧受電設備の工事を行った。