名古屋学芸大学健康･栄養研究所年報第３号

２００９年

《原著》

黄色ブドウ球菌の AP-PCR 法による遺伝子多型解析
＊

岸本満

大澤絵理

＊

谷口＊

由季

森西＊

加奈

要旨
簡便かつ短時間で解析可能な S. aureus 型別法開発を目的に AP-PCR 法による遺伝子多型解析を行った。菌体 DNA は熱抽出法と DNA 抽出キット「Gen とるくん」による抽出法で抽出、10塩基のオリゴヌレオチドプライマー ３ 種で増幅を行い、増幅産物のバンドパターンより型別した。
型別成功率はプライマー A-03で最も高く（95.8％）、次いでプライマー272（93.1％）、プライマーF-04（84.7％）の順だった。しかし、熱抽出法ではプライマー272が最も高かった（97.2％）。
「Gen とるくん」による抽出法に対し熱抽出法は増幅産物のバンド本数が少ない傾向があったが型別成功率は同等だった。熱抽出法でも高率に型別できることがわかった。安価で簡便な熱抽出法
は食品工場、給食施設における食中毒菌の伝播実態調査にも利用できる。本型別法は汚染源調査の一次スクリーニングに有用である。さらに型別成功率および再現性を高めるため、熱抽出法の標準化、型別成功率の高いプライマーの設計、PCR 条件の調整が望まれる。
索引用語：

黄色ブドウ球菌、AP-PCR、遺伝子型別、汚染源調査、二次汚染緒

ひとつである。

言

S. aureus の遺伝子多型解析に関する報告はメ

黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ; 以チシリン耐性 S. aureus（Methicillin-resistant S.

下 S. aureus ）による食中毒は1984年までは年aureus；以下 MRSA）に関するものが多い 5-9 ）。

間200事例以上、細菌性食中毒全体の約30％を世界的にはパルスフィールドゲル電気泳動法

占める発生が見られた 1 ） が、漸次減少し2007（Pulsed-field Gel Electrophoresis；以下 PFGE

年は70事例で全体の9.6％を占める 。しかし、法）による多型解析が多用される 8-11）。しかし2000年には加工乳が原因で大規模な事例が発PFGE 法は、分離解析能は優れるものの、高生 、またおにぎり、弁当などが原因で多数価な電気泳動装置が必要なうえ、結果を得るの患者を出す事例も毎年報告されている。S.

までに数日を要する。また、DNA 抽出法におaureus は自然界に広く分布し、人の常在菌でいては熱抽出法と市販 DNA 抽出キットによもある。したがって、衛生的食品取扱評価のる方法が普及しているが、DNA 抽出キットに指標菌として、リスク管理に利用することがよる方法は熱抽出法と比較して操作手順が多でき 4 ）、調理環境で分離された S. aureus の遺く、煩雑である。そのため、一次スクリーニ伝子型別（ジェノタイピング）から、調理従ング法として食品工場や給食の現場で日常的事者の行動を検証し、有効な対策を講じるこに導入しにくく、実用的であるとはいえない。とが可能である。S. aureus の遺伝子多型解析

著者ら 4 ） は AP（Arbitrarily Primed）-PCR

は食中毒予防上、衛生管理上、有用な手法の法について、PFGE 法に比べて識別能は劣る

2）

3）＊名古屋学芸大学

管理栄養学部

25

が、解析にかかる時間が少なく、操作も簡便

集 落 一 白 金 耳 分 を 滅 菌 蒸 留 水540 μ l 中 にであることを報告し、その特徴を生かして汚混濁し、95℃の湯水中で 5 分間加熱した後、染源調査の一次スクリーニングへの活用を示

12,000rpm、 4 ℃にて10分間遠心分離を行い、

唆 し た。 ま た、 長 谷 川 ら上清を回収した。

12）は、 熱 抽 出 し た

DNA を AP-PCR 法およびポリアクリルアミ② DNA 抽出キットによる抽出法

ドゲル電気泳動法を用いることで PFGE 法よ「Gen とるくん」の操作手順にしたがい抽出りも簡易に MRSA の遺伝子多型解析ができるした DNA を50 μ l の TE-Buffer に溶解した。

ことを報告した。

（ ３ ）PCR 反応

本研究は簡便かつ短時間で解析可能な型別

AmpliTaq®Gold DNA Polymerase [Applied法の開発という観点から、熱抽出法、AP-PCR

Biosystems]法およびアガロースゲル電気泳動法を組み合MIX [Applied Biosystems] 2 μ l、GeneAmp

わせた S. aureus の遺伝子多型解析を行い、一10 × PCR Buffer [Applied Biosystems] 2 μ l、次スクリーニング法としての有効性を評価、

DNA 1 μ l、20pM の プ ラ イ マ ー 1 μ l に、 蒸検証した。

留 水 を 加 え 総 量20 μ l と し た。PCR 反 応 は1U、2mM GeneAmp®dNTP

EZcycler[EZC-96：旭テクノグラス ] を用い、長谷川らの方法に準じた。すなわち、94℃ 10

材料および方法

分の hot start を行った後、熱変性94℃ 1 分、1 ．S. aureus の分離、培養

アニーリング41℃ 2 分、伸長反応72℃ 2 分を40サイクル行い、最後に伸長反応72℃ 10分を大学生 6 名の鼻腔をふき取り、卵黄加マン行った。

ニット食塩寒天培地［日水製薬］で35℃、48時間培養、増殖した集落のうち黄色で光沢がPCR 増幅物の確認は1.5% アガロースゲル

あり周囲に白濁環を示すコロニーを釣菌、純（NuSieve®3:1Agarose[Lonza]）で電気泳動（ 1培養を行った。また、グラム染色（B&M 山中× TAE Buffer、100V 30分、分子量マーカー：変法；［MerkJapan］）、コアグラーゼ試験（ウPCRMarkers 50―2000bp[Novagen：TaKaRa]）

サギプラズマ栄研；［栄研化学］）、同定キッし、エチジウムブロマイド溶液（ 1 μ g/ml）でト（APISTAPH；［Biomerieux］）を用いて S.

30分間染色し、撮影（プリントグラフ ®AE-aureus と同定された－80℃保存菌株11株を純6914；［ATTO］）により行った。
純培養、ゲノム DNA 調製、PCR 反応の一培養した。

連の操作は同一の菌株、抽出法、プライマー
2 ．AP-PCR 法ごとに 3 回行った。

（ １ ）使用プライマー
10塩 基 の オ リ ゴ ヌ レ オ チ ド プ ラ イ マ ー結A-03（5’-AGTCAGCCAC-3’）、 2 7 2 （ 5 ’-

1 ．S. aureus の分離

AGGGGGCCAA-3’）、 F - 0 4 （ 5 ’-果大学生の鼻腔内ふき取り 6 検体のうち 1 検

GGTGATCAGG-3’）を使用した。

体から S. aureus が分離された（ID No.001）。

（ ２ ）ゲノム DNA の調製保存菌株（ID No.002～012）はトリプトソー

分離した S. aureus をトリプトソーヤ寒天培

ヤブイヨン培地［日水製薬］で一夜増菌培養後、地［日水製薬］に塗抹し、35℃、24時間培養

卵黄加マンニット食塩培地で35℃、48時間培後形成した集落一白金耳分（約10 μ l）を採取養し、S. aureus であることを確認した。

し、熱抽出法および DNA 抽出キット（Gen13）

2 ．遺伝子多型解析

とるくん™（酵母用）[TaKaRa]；以下「Genとるくん」）を用いて DNA を分離した。

増幅バンドパターンをもとに分類型別した①熱抽出法

結果を表 1 に示す。出現したバンドは、熱抽26

黄色ブドウ球菌の AP-PCR 法による遺伝子多型解析

出法の場合、プライマー A-03で150～2000bp

ドが出現した。バンドパターンによる分類型

間に 4 ～11本、プライマー272で100～2000bp

別を試みたところ、熱抽出法の場合、プライ間 に 3 ～ 10 本、 プ ラ イ マ ー F-04 で 100 ～マー A-03で10～12、プライマー272で10～12、2000bp 間に 1 ～ 7 本であった。「Gen とるく

プライマー F-04で 9 ～11に型別された。同様ん」による抽出法の場合、プライマー A-03でに「Gen とるくん」による抽出法の場合、プ50～2000bp 間に 5 ～15本、プライマー272でライマー A-03で11～12、プライマー272で103～10本、プライマー F-04で 2 ～11本のバン～11、プライマー F-04で 8 ～11に型別された。

表1AP-PCR 法による型別

27また、各プライマーの型別成功率は、熱抽出数が異なるものもあり再現性が良いとはいえ法ではプライマー A-03で94.4％、プライマーなかった。長谷川ら ２ ）は、テンプレート DNA272で97.2％、プライマー F-04で83.3％だっ量を2.5 μ g/μ l に調整して用いたことにより、た。同様に「Gen とるくん」による抽出法で安定した結果を得た。しかし、DNA 量測定をはプライマー A-03で97.2％、プライマー272プロトコルに組み込むことは、本研究の目的で88.9％、プライマー F-04で86.1％だった。と合致しないので DNA 量測定を実施しない

しかし、同一条件で 3 回行った結果を比較手順で検討した。しかし、テンプレート DNA

すると、バンドパターンの再現性は低く、最量が一定でないことが再現性を妨げている要も再現性よくバンドパターンが得られた場合因の １ つだと考えられた。

でも 3 回とも同一パターンが得られた株は12AP-PCR 法は1種類の短いプライマーを用株中 1 株、 3 回中 2 回に同一パターンが得らいて低いアニーリング温度で PCR を行う方法

れた株は 5 株だった。

である。そのため、複数のランダム領域に対してプライマーが結合するので、PCR 条件や考試薬組成などによって影響を受けやすい14-15）。

察

しかし、AP-PCR 法は解析にかかる時間が少S. aureus 12株の型別成功率はプライマーなく、操作も簡便であることが特徴で、食品

A-03を 用 い た 時 に 最 も 良 好 で、 次 い で272、製造現場や厨房における伝播実態調査に活用

F-04の 順 だ っ た。A-03は 熱 抽 出 法、「Gen と可能な方法である。加えて、熱抽出法と組みるくん」による抽出法ともに型別成功率が高合わせることで、より迅速かつ安価で実用的

４）で示されたように型別に適しな型別法を確立することができる。本研究でたプライマーであると考えられた。272は 2 つ型別成功率90％を越える結果が得られたのでの DNA 抽出法間で型別成功率にもっとも大熱抽出法と AP-PCR を用いた型別法が汚染源きな差（8.3％）が見られた。F-04は型別成功調査の一次スクリーニングに有用であること率が最も低かった。今後さらに型別精度の高がわかった。今後熱抽出法における加熱時間、いプライマーの探索、検討が望まれる。

PCR 条件、および泳動条件等の検討を行い、く、先行研究再現性および型別成功率の向上が図られるこ

増幅産物の泳動バンド濃度から推測して、とを期待する。

熱抽出法では「Gen とるくん」による抽出法と同等の DNA 量が得られたと思われた。しかし、抽出ごとにバンドパターンは異なり、参考文献

熱抽出法ではバンド本数に少ない傾向がみら

1 ）小田隆弘 : ブドウ球菌食中毒の最近の動向 . 食品

れ た。 熱 抽 出 法 は 抽 出 液 に 菌 体 由 来 の Taq

衛生学雑誌，1998，39，J179-J185

polymerase inhibitor が含まれることがあり、2 ）厚生労働省食中毒統計資料：過去の食中毒発生状

これがバンドパターンおよびバンド本数に影況，2007，響したと考えられた。しかし、バンドパター

http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/04.

ンおよびバンド本数は異なったものの、試験

html#4-23 ）厚生省生活衛生局：「雪印低脂肪乳」等による黄ごとに判定すれば型別数および、型別成功率

色ブドウ球菌食中毒の経緯，2000，に大きな差は生じなかった。熱抽出法は特別

http://www.mhlw.go.jp/topics/0101/tp0119-2.

な試薬を必要とせず操作も簡便なため「Genhtml

とるくん」による抽出法よりも安価でより迅

4） 岸本

速に DNA を抽出することが可能であり、熱満，鈴木匡弘，森田妃美子他：調理施設から採取された黄色ブドウ球菌の RAPD-PCR，抽出法を用いた型別法の精度を高めていく方

BSFGE および PFGE による遺伝子多型解析．日向で本手法の改良が望まれる。

食微誌，2004，21（3），193-200
5 ）Bingen, E., Barc, M., Brahimi, N.,et al :Randomly

また、増幅バンドが不鮮明またはバンド本

28

黄色ブドウ球菌の AP-PCR 法による遺伝子多型解析

年報，2006，57，55-58

amplified polymorphic DNA analysis provides15）半田宏 . わかりやすい遺伝子工学 . 株式会社昭晃

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Abstract

Genotyping of Staphylococcus aureus Based on Arbitrarily Primed PCR
Michiru Kishimoto＊, Eri Ohsawa＊, Yuki Taniguchi＊ and Kana Morinishi＊

To develop the simple and short time genotyping method, we optimized DNA extract methods and PCRprimers.
Twelve Staphylococcus aureus isolated from the nasal of students were genotyped by Arbitrarily Primed
PCR method. The genomic DNA were extracted by heat method and DNA Extraction Kit. Three kinds ofoligonucleotide primers were used for PCR. The results were compared with primer. The accuracy of typing was
95.8% by Primer A-03, 93.1% by primer 272 and 84.7% by primer F-04. However, according to the accuracyof the extraction method, primer 272 was the highest in the heat method (97.2%). The heat method was almost
equal to DNA Extraction Kit method, though the number of the band of the amplification product had tended
to be a few compared with the Kit. This suggests heat method can used typing of for Staphylococcus aureus.
The heat method is low-cost and simple, can be used also for the spread investigation of actual conditionsof the food poisoning bacterium in the food factory and the kitchen. This typing protocol is useful for the firstscreening the polluter investigation.

＊ School of Nutritional Sciences, Nagoya University of Arts and Sciences30