ハイブリッド型フィルタを用いたレンズレス蛍光イメージング
Lensless fluorescence imaging using a hybrid filter

１．研究の目的
レンズレスデバイスによる顕微観察技術は、レンズを用いない単純な光学系と画像処理を用いることによって微細な観察対象の撮像を行うものである[1]。この手法は、近年のイメージセンサおよびコンピュータの高性能化によって、実用性が向上されてきた。また、レンズを用いないことにより、小型なデバイスで広い

笹川 清隆 ( Kiyotaka SASAGAWA, Ph. D.)

撮像範囲を実現できることや、例えば生体組織の極近奈良先端科学技術大学院大学
先端科学技術研究科 物質創成科学領域 准教授傍に設置するような極小デバイスが実現可能といった(Associate Professor, Division of Materials Science, Graduate
School of Science and Technology, Nara Institute of Scienceand Technology)

蛍光観察の例はほとんど報告されていなかった。

特長がある。しかし、明視野の研究がほとんどであり、そこで本研究では、レンズレスイメージングデバイ

電子情報通信学会、映像情報メディア学会、IEEE 他
受賞：NAIST 学術奨励賞 (2019 年)
応用物理学会 Poster Award ( 2018 年)
映像情報メディア学会 鈴木記念奨励賞 (2011 年)
日本光学会 光学論文賞（2009 年）他光工学 集積回路工学 バイオメディ
カルイメージング
研究専門分野：光工学 集積回路工学 バイオメディカルイメージング

スにおける高感度な蛍光イメージングを可能とすることを目的とした。そのために、レンズレス系における従来の励起光除去フィルタの問題点を解決し高い性能を実現するハイブリッドフィルタを形成した。また、これを薄型化するための技術を確立し、刺入型のイメージングデバイスへの適用を行った。

あらまし２．研究の背景

レンズレス顕微イメージングデバイスに適用可能な生体組織観察において蛍光色素や蛍光タンパク質を高性能励起光除去フィルタを開発した。レンズレスイ用いたラベルは非常に重要なツールであり、様々な活メージングは簡便な構成の小型デバイスで細胞観察等動を観察するために広く用いられている。しかし、先が可能な空間分解能を得られることから様々な応用がに述べたようにレンズレスイメージングにおける蛍光期待されている。しかし、その多くは明視野観察用で観察デバイスの報告は少なかった。これは、一般的にあり、蛍光観察についての研究例は多くなかった。本

蛍光顕微鏡で用いられている高性能な干渉フィルタを研究では、レンズレス系において高い励起光除去性能そのまま用いてもレンズレスイメージングでは高い性を実現するフィルタを提案した。このフィルタは、干能が得られず、蛍光検出感度が低くなってしまうこと

渉フィルタと吸収フィルタから構成されており、それが要因の一つであった。

ぞれの欠点を補うように配置される。フィルタを作製

干渉フィルタは、その原理上、透過波長帯が光入射する手法として光ファイバの束から構成されるファイ角によって変化する。垂直入射において励起光を十分バオプティックプレートを干渉フィルタの基板としてに除去できる高い性能を持つフィルタも、斜めに入射用いる手法、および、干渉フィルタを紫外レーザーのする励起光は透過してしまう。レンズを用いた蛍光顕パルスによって剥離、転写する手法の開発を行った。

微鏡の光学系では、観察対象からの光は対物レンズにそれぞれの手法は、それぞれ大面積観察用デバイス、よってほぼ平行な光線となってフィルタを透過するたおよび、薄型の刺入型デバイスに適用可能であり、レめ、このフィルタの特性は問題とならない。しかし、ンズレス蛍光イメージングの応用範囲が広がるものとレンズレス光学系では、観察対象によって光が散乱さ期待される。

れ、様々な入射角でフィルタに到達する。そのため、干渉フィルタでは斜め入射成分を除去できず実効的な性能が低下してしまう。
1TELECOM FRONTIER No.111 2021 SPRING

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一方、吸収型のフィルタはそのような入射角依存性種の方法を開発した。

はなく、レンズレスイメージングに適している[2]。吸収フィルタの場合フィルタ厚さを増すとともに指数関数的に透過率は低下する。しかし、フィルタ自体が蛍光を発するということが問題となる。微弱な蛍光を観察する場合、この自家蛍光が問題となり、実効的な励起光透過率には下限がある。特にレンズレス蛍光イメージングの光学系では励起光除去フィルタが検出器で図１あるイメージセンサの極近傍に配置されるため、検出(a)ハイブリッドフィルタの構造。
(b)ハイブリッドフィルタ搭載イメージセンサの例。

されやすい。
これを回避する手法として、プリズムを用いて励起

１つ目は、干渉フィルタの基板としてファイバオプ

光を斜めに入射させ試料を封入した観察対象のガラスティックプレート(Fiber Optic Plate; FOP)を用いる

底面で全反射させる手法なども提案されたが[3]、デバ方法である（図１）。FOP は光ファイバの束で構成さイス寸法が大きくなり、小型デバイスを作製するといれる板状のデバイスであり、一方の面からの入射像がう点では課題が残っていた。

光ファイバを介して他方の面に伝搬する。像の空間分解能はコアピッチによって決定され、厚い FOP を通３．研究の方法しても数μm 程度の空間分解能の像を伝搬する事が３．１可能である。また、通常のガラス板に近い強度を有し研究の進め方

干渉フィルタと吸収フィルタにおける問題点を解決ているため、干渉フィルタを形成する基板として用いする手法として、両者を積層したハイブリッド型のフる事が可能である。干渉フィルタの両面にそれぞれ、ィルタを作製することを提案した[4,5]。ここで、干渉ロングパスフィルタおよびショートパスフィルタを形フィルタを上層、吸収フィルタを下層とする。すなわ成して、バンドパス特性を持たせた。更に、色素添加

ち、励起光は先に干渉フィルタによって低減され、残樹脂によって構成される吸収フィルタを転写して、自りが吸収フィルタによって除去される。両者の目的は、立可能なハイブリッドフィルタ構成を実現した。

ともに励起光の除去であるので、その透過スペクトル

図 1(b)は試作したハイブリッドフィルタ搭載レンズは同じであることが望ましい。干渉フィルタは、入射レスイメージングデバイスである。イメージセンサに光を反射するために自家蛍光はほとんど発生しない。

は市販のものを用いている。FOP による厚さがあるた

また、観察対象の細胞等での散乱成分は透過するが、め、イメージセンサのパッケージ部よりも撮像面を上

その成分は入射光に対しては 1%以下程度である。その面にすることができる。図 2 は、このデバイスを用い散乱成分のみを吸収フィルタによって除去することで、てマウス脳スライスを撮像した例である。レンズレス励起光が直接吸収フィルタに入射した場合と比較してデバイスを用いて 1 つの細胞からの蛍光を検出するこ自家蛍光を著しく低減することが可能となる。とができている。

３．２

現在までに得られた成果

提案するハイブリッドフィルタを実現するためには、干渉フィルタを吸収フィルタ上に形成する必要がある。
本研究で用いた吸収フィルタ高い吸収特性を示す薄型フィルタであるが、高濃度の色素を添加した樹脂であるため、その上に高品質な干渉フィルタを構成することが難しい。そこで本研究では提案構造を実現する２2TELECOM FRONTIER No.111 2021 SPRING

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図３転写法によるハイブリッドフィルタを搭載した刺入用イメージセンサ。

４．将来展望FOP を用いた手法では、市販のイメージセンサを用いて、大面積の撮像が可能な小型デバイスを構成する
図２

ことができる。一般的な蛍光顕微鏡系では大型となっFOP を利用したハイブリッドフィルタ搭載デバイスにてしまう装置も小型化することが可能である。これによるマウス脳スライスの蛍光観察例。(撮像面積 11.3 mm×より、例えばインキュベータ内で培養されている細胞6.0mm)脳スライスは緑色蛍光タンパクが導入されている。のタイムラプスイメージングへの応用が期待される。
多数のデバイスを庫内に配置し、様々な条件で細胞の２つ目の方法は、干渉フィルタを転写する手法であ活動する条件を観察することが可能になる。また、蛍る[7]。本手法では、干渉フィルタを石英ガラス基板上光ラベルを用いた分子計測等への応用も考えられる。に形成し、さらに吸収フィルタをスピンコート法によ従来、試料を検査機関に送付していたような検査も現って塗布した。吸収フィルタ面をイメージセンサの撮場で即時に行える可能性がある。

像面に対向するように接着し、その後、紫外線のパル転写手法を用いた手法では、本稿で示した生体刺入スレーザーを走査しながら照射することによって石英型デバイスのように非常に薄型かつ軽量なデバイスがガラス基板から剥離した。この手法によってハイブリ実現可能である。観察対象に対して低侵襲なデバイス

ッドフィルタ構造が実現される。本手法では、１つ目により、自由行動下での活動計測を大きな負担を与えの手法と比較して FOP を用いないため、デバイスのることなく行うこと可能になる。近年では、マウスの厚さを非常に薄くすることができる。この特徴は、特頭部に搭載することができるような小型顕微鏡デバイに生体に刺入するような生体埋植型のイメージングデスが開発されているが[7]、特に脳深部の観察を行う場バイスに適している。図３は、本手法によって作製し合など、生体への負担が大きい。本研究で開発した手たハイブリッドフィルタ搭載イメージセンサの例であ法を用いることにより、これを改善し、より自然な状る。デバイスの厚さは約 0.2 mm である。

態に近い生体機能計測を行えるものと期待される。
おわりに本研究では、ハイブリッドフィルタ構造とその形成手法を提案し、レンズレスイメージングデバイスでも高い蛍光検出性能を実現可能であることを示した。本稿では、励起光除去フィルタへの利用について述べた

3

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Lensless fluorescence imaging using a hybrid filterが、本手法は励起フィルタにも応用することが可能でNimmerjahn, Y. Ziv, A. Gamal, and M. J.

ある[8]。これらを組み合わせて、小型かつ高性能なレSchnitzer,ンズレス蛍光イメージングシステムを実現し、様々な

fluorescence microscope,” Nat. Methods, vol. 8,

玄能の観察への適用を目指して行たい。

no. 10, 871.

“Miniaturizedintegrationofa[8] M. I. Azmer, K. Sasagawa, E. Rustami, K.
本研究における動物実験は奈良先端科学技術大学院大Sugie, Y. Ohta, M. Haruta, H. Takehara, H.

学のガイドラインに従って行われた。

Tashiro, J. Ohta, “Miniaturized LED lightsource with an excitation filter for fluorescent

参考文献imaging,” Jpn. J. Appl. Phys., vol. 60, no. SB,[1] A. Ozcan, A. and E. McLeod, “Lensless imaging

SBBG07, Mar. 2021.

and sensing,” Annual Rev. Biomed. Eng. vol. 18,
pp.77-102 (2013).

この研究は、平成２９年度ＳＣＡＴ研究助成の対象と[2] S. A. Lee, X. Ou, J. E. Lee and C. Yang, “Chip-して採用され、平成３０～令和元年度に実施されたもscale fluorescence microscope based on a silofilter

complementaryのです。

metal-oxide

semiconductor image sensor,” Opt. Lett., vol. 38,
no. 11, pp.1817-1819 (2013).
[3] A. F. Coskun, I. Sencan, T. W. Su and A. Ozcan,“Lensless wide-field fluorescent imaging on achip using compressive decoding of sparseobjects,” Opt. Express, vol. 18, no. 10, pp.
10510-10523 (2010).
[4] K. Sasagawa, A. Kimura, M. Haruta, T. Noda, T.
Tokuda, J. Ohta, “Highly sensitive lens-freefluorescence imaging device enabled by acomplementary combination of interference andabsorption filters,” Biomed. Opt. Express, vol. 9,no. 9, pp. 4329-4344, Sep. 2018.
[5] K. Sasagawa, Y. Ohta, M. Kawahara, M. Haruta,T. Noda, T. Tokuda, J. Ohta, “Wide field-of-view

lensless fluorescence imaging device withhybrid

bandpass

emission

filter,”AIP

Advances, vol. 9, no. 3, 035108, Mar. 2019.
[6] E. Rustami, K. Sasagawa, K. Sugie, Y. Ohta, M.
Haruta, T. Noda, T. Tokuda, J. Ohta, “Needletype image sensor with band-pass composite
emission filter and parallel fiber-coupled laser
excitation,” IEEE Trans. Circ. Sys., vol. 67, no.
4, pp. 1092-1091, Apr. 2020.
[7] K. K. Ghosh, L. D. Burns, E. D. Cocker, A.
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