精確な新型コロナPCR検査に向けたNMIJの取り組み

国立研究開発法人 産業技術総合研究所
計量標準総合センター
バイオメディカル標準研究グループ
加藤 愛

2022/2/25
第9回JMACシンポジウム

計量標準総合センター（NMIJ）のミッション～生体関連物質計測における信頼性確保のために～標準物質の開発及び供給

バイオ分野および臨床化学分野
におけるトレーサビリティ上位の標準物質の開発・供給
臨床検査分野分析技術の開発

生体関連物質を高精度に測定する手法の確立
食品分野

国際整合化活動

国際比較試験等への参加による開発した標準物質や測定手法の国際整合性の担保
環境分野
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供給中のバイオ関連認証標準物質（CRM）の例（計31物質, 2022/2/25 現在）

低分子化合物ペプチド・タンパク質

核酸

加水分解アミノ酸（17種）（CRM6011-a～6027-a）
C反応性蛋白（CRM6201-c）

血清アルドステロン（CRM6402-b）

C-ペプチド（CRM6901-c）

ヒト血清アルブミン（CRM6202-a）

DNA水溶液（人工配列）（CRM6205-b）

RNA水溶液（人工配列）（CRM6204-b）

・測定における校正、分析法の妥当性確認等に使用可能
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SARS-CoV2・PCR検査における一般的な手順
抽出操作

逆転写反応

RNA

Real time PCR

DNA

Cq値

患者検体

陽性

陰性

Cq値のカットオフ値
・Cqのカットオフ値をもとにした判定を実施
・測定対象の遺伝子領域は国内外で統一されていない

著作権の関係上、掲載不可

・前処理～PCRのプロセスでは様々なキット、装置を利用

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3つのコホート研究におけるPCR検査のCq値の比較（Evans. D et. al, Clin Chem, 2022）

・有症状者のCq値の分布がLabごとに異なる・前処理法の有無やキットの違い
・逆転写反応やPCR反応キットの違い
・測定対象遺伝子領域の違い
・装置や実施者の違い…etc.

著作権の関係上、掲載不可

・Lab間で共通のCqのカットオフ値を設定した場合には臨床感度が大幅に違う結果に・Cq値をもとにした判定は危険・濃度値（コピー数濃度）での基準の設定が有効

標準物質/精確な核酸定量技術開発の必要性
5核酸絶対定量のためのNMIJのコア技術①

核酸モノマー、構成元素を指標とした絶対定量
LC-IDMS法の原理

核酸モノマー

LC/MSによる核酸モノマー分析

酵素あるいは酸による分解
DNA or RNA
P

本法の特徴
・LC-MS等の高精度分析技術を利用
・同位体希釈質量分析法（IDMS）等を用いた一次標準測定法
・分析の過程で核酸情報が消失

P

PP

P

P
PP

P

マイクロ波酸分解
ICP-MSによる元素分析
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核酸絶対定量のためのNMIJのコア技術②

核酸配列を考慮した絶対定量
デジタルPCR法の原理
分配

ウェル数のカウント(逆転写+)
PCR

元液濃度への換算

Cx コピー/mL

DNAorRNA

増幅が起きたウェル(ポジティブ)
増幅が起きなかったウェル(ネガティブ)

本法の特徴
・目的の核酸配列を特異的に定量可能
・従来のPCRよりもより高感度・高精度な定量が可能
・参照核酸標準を必要としない絶対定量法⇒新たな一次標準測定法として期待7国際比較と国際整合性確保
障壁のない
自由な取引

国際比較参加による同等性評価
SI
一次標準測定法
による値付け

国家計量機関（NMIJなど）

国際比較

認証標準物質（一次標準）
Certified Reference Material・濃度(純度)未知のサンプルを各参加機関が測定、結果を比較
・計量標準機関の測定能力の査定
製造業者
・試験比較で問題点を抽出常用標準（二次標準）
Reference Standard

試験機関、大学など

実用標準
Working Standard
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NMIJの参加した国際比較リスト（核酸分析関連）
名称

測定項目

実施年度

P94.1

メチル化DNA測定

2008－2010

K86.b＊

遺伝子組み換え米の定量

2015-2016

K86.c＊/p113.4

遺伝子組み換え菜種の定量

2016-2018p184

がん遺伝子変異（SNP,定量

in-del ）の2017-2018p199

低レベル病原体ウイルス（HIVウイルス）由来RNAの定量

2019-2020

p199b

低レベル病原体ウイルス（SARSCoV2）由来RNAの定量

2020‐＊基幹比較（K study）の結果については、国際度量衡局（BIPM）の基幹比較データベースにて公開される。
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国際比較 （p199b：SARS-CoV2 RNA遺伝子の定量）〇目的：・各国NMIs/DIsが関連する標準物質を開発するにあたっての標準測定法の確立
・〃測定能力の評価〇測定サンプル： SARS-CoV2 RNA遺伝子のin vitro転写産物ほか〇内容： SARS-CoV2遺伝子を対象として各参加機関のプロトコールに基づいたRT-dPCR法やLC-IDMS等による定量を行い、測定結果を比較〇参加機関：NMIJ（日本）、NIMC(中国)、NIST(米国)、JRC(欧州)、 NIBSC(英国)、 KRISS(韓国)、NMIA（豪州）など16か国から21機関〇スケジュール：
・参加登録締切：2020年６月上旬
・試料の配布：2020年６月下旬
・測定結果の返送：2020年10月中旬
・プレスリリース：2020年12月
・現在レポートを取りまとめ中10

国際比較における各参加機関の比較結果

参加機関の中央値
NMIJのRT-dPCRによる測定結果
NMIJのLC-IDMSによる測定結果＊BIPMホームページ・プレスリリース（ https://www.bipm.org/en/-/2020-nmi-covid ）より転載
11計量トレーサブルな核酸計測に向けたNMIJの活動
SI （国際単位系）＜標準物質の開発・供給＞＜分析技術の開発＞

トレーサビリティ上位の標準物質や測定法の開発

一次標準測定法
国際的なルール（ISO規格）に則った標準物質生産

・同位体希釈質量分析法
・デジタルPCR法

技術コンサルなど

校正用試料

メーカの測定法
日常検査法

患者試料
測定結果
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＜国際整合化活動＞
・国際比較への参加 等開発した標準物質や測定法の妥当性確認

・校正用試料への値付け
・メーカー、試験機関の測定法の妥当性確認…etc.

人工核酸標準物質を用いたPCR検査の信頼性確保に向けた取り組み（2020年度・AMED指定案件）
抽出操作

PCR検査

逆転写反応

陽性??
陰性??
ウイルスRNA

DNA

増幅効率評価
抽出効率評価
反応効率評価陽性!

RNA認証標準物質
陰性!

• 天然に存在しない人工配列• 正確な総RNA濃度を付与• 均質性と安定性を担保標準物質との比較により検出精度向上！

RNA認証標準物質（RNA CRM）を利用した精度管理法の確立
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PCR検査の精度管理のためのコントロール物質の分類
分類

陽性コントロール

内在性コントロール

外来性コントロール

ターゲット遺伝子の人工合成核酸

検体に含まれるハウスキーピング
遺伝子

ターゲットウイルス遺伝子配列と相同性の低い人工合成核酸

利点

・逆転写やPCRプロセスの妥当性確認やノーマライズに使用可能・定量のための検量線作成に使用可能・検体からのRNA抽出以降のプロセスの妥当性確認やノーマライズに使用可能・検体からのRNA抽出以降のプロセスの妥当性確認やノーマラ
イズに使用可能・人検体を扱う実験において、外来性コントロールが実験者本人からコンタミするリスクはゼロ
・ターゲット遺伝子に併せて添加量が任意でコントロール可能

懸念点

・検体からのRNA抽出～逆転写のプロセスについて精度管理ができない
・検体そのものへのコンタミネー
ションが擬陽性の原因になりうる・ターゲット遺伝子との同時定量に影響を及ぼさない遺伝子配列を選択する必要あり
・ターゲット配列と同程度の発現量の遺伝子を選択する必要あり
・各検体において発現量にバラツキが出る可能性あり

・ターゲット配列との同時抽出・同時定量に影響を及ぼさない配列を選択する必要あり

代表配列

陽性コントロールRNA（感染研）

RNaseP(感染研プロトコールにて推奨)

EAVウイルスRNA（ロシュ・ダイアグノスティックス
（株））

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RNA CRM（NMIJ CRM 6204-b）の特徴

NMIJ CRM 6204-b
コンセプト:・一本鎖RNA（533 and 1033 bases）
・5種類のRNA配列
・特定の遺伝子配列をコードしない(人工配列)→いろいろなターゲットと組み合わせて使用可能
・均等な塩基組成、GC含量は約50％
・化学分析による精確な濃度値を付与
・均質性・安定性を担保した溶液の形状での頒布→定量分析における妥当性評価に使用可能
15厚労省・新型コロナウイルス感染症の PCR 検査等における精度管理マニュアル
別添（2021/4/17公開）より
４）内部精度管理
PCR 検査を含めた遺伝子関連検査を実施する場合、医療法等により、内部精度管理の実施は義務として求められている。実施内容として、コントロール
測定の頻度はラン毎に行う。内部精度管理は、測定システムの安定性による精度（再現性）を確保する上で必要であり、その際に統計学的に妥当な許容範囲（管理限界）の指標と基準について、あらかじめ定めておく。許容範囲（管理限界）とは、精度管理データのばらつきが許容できる範囲（限界）をいう。
精度管理データには、管理試料として陽性コントロールを測定し、その Ct 値や Threshold time（Tt）値を用いることが考えられる
具体的には、陽性コントロールの測定値の日内・日間の変動を管理するため、代表的な 管理図では、検査導入時に評価した測定値の精度（再現性）に基づくばらつきの管理限界（例えば、±3SD）を設定し、検査導入後に日常検査の実施中に測定した管理試料の結果について、その平均(Ｘ )と個々の測定値の最大と最小の差（R）を経時的（例えば、毎日）にプロットしてグラフ化し、モニターする。Ｘと R が管理限界内にある場合は、測定結果が安定的に得られていると見なす。管理限界を外れた場合、あるいは管理限界内でも偏位の傾向（トレンド、シフトなど）が見られる場合は、測定結果の安定性が確保されていない可能性が考えられ、原因の究明とそれに基づく是正を行う。原因として、測定装置（保守管理）や測定試薬（試薬劣化など）の不具合がないか、試薬管理（遮光、保管温度など）、装置操作手順、測定者の手技・技能（ピペット操作など）、検体管理が不適切でないかの確認を行う。
定期的に、また測定試薬のロット変更時など必要時に、患者検体またはフルプロセスコントロールを用いて、各プロセス（検体の前処理、RNA 抽出、逆転写、核酸増幅と検出）で患者検体と同じ挙動（反応過程）をモニターすることが望ましい。
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主な検討結果• 新型コロナウイルス遺伝子と同時定量可能なRNA CRM, プライマー・プローブペアを同定済み。
• 感染研のプロトコールをベースに、 RNA CRMが抽出～逆転写～PCR（duplex測定）のフルプロセスにおいて、外来性コントロールとして使用できることを確認済み。
• 実験者や装置が変わった場合にも、抽出～RT-qPCR（duplex測定）の工程を経たRNA CRM のCq値の相対標準偏差が5％以下に収まることを確認済み。
• フルプロセスを経た際、検出下限域のCq値が得られるように調整した希釈RNA
CRMについては、別途安定性評価を実施し、十分安定であることを確認済み。

管理限界の設定が可能な、新たなフルプロセス用
外来性コントロール標準物質として利用可能
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まとめ～PCR検査における標準物質の役割～
抽出・精製

検体

PCR反応

逆転写反応

RNA

データ解析

DNA

校正
試料

分析法・技能の妥当性評価

校正用
標準物質

Cq値
濃度

妥当性評価用
標準物質

トレーサ
ビリティ

国際単位系
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国際比較参加分析結果

謝辞
本研究の遂行にあたり、以下の関係者の皆様方に多大なるご理解とご協力を頂きました。
この場を借りて改めて深くお礼申し上げます。

〇バイオ計測技術コンソーシアム（JMAC）〇産総研・生命工学領域 バイオメディカル研究部門〇産総研・計量標準総合センター・物質計測標準研究部門＊本研究成果の一部は国立研究開発法人・日本医療研究開発機構（AMED）からの受託研究「新型コロナウイルスの信頼性の高い迅速診断システムの開発」の支援を受けたものである。

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