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病原性モノクローナル抗体を用いた天疱瘡の口腔粘膜病変発症機序の解明
Analysis of oral mucosal lesion of pemphigus using pathogenic pemphigus monoclonal antibodies
角田, 和之(Tsunoda, Kazuyuki)
中川, 種昭(Nakagawa, Taneaki)
2011
科学研究費補助金研究成果報告書 (2010. )本研究において口腔粘膜に生じる難治性自己免疫疾患である尋常性天疱瘡の自己抗体の解析を行った。その結果、天疱瘡には様々な病原性を有する自己抗体が存在する事をモノクローナルなレベルで確認した。また、自己免疫疾患における自己免反応性IgM抗体の詳細を解析するために、IgMクラスの天疱瘡モノクローナル抗体を作製し、IgMクラスの自己抗体には明らかな病原性がないことを確認した。これらは天疱瘡発症機序を解明する上で重要な知見となる。
研究種目 : 基盤研究(C)
研究期間 : 2008～2010
課題番号 : 20592346
研究分野 : 医歯薬学

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科研費の分科・細目 : 歯学・外科系歯学Research Paper
https://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=KAKEN_20592346seika

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様式 C‑19
科学研究費補助金研究成果報告書
平成 23 年 6 月 16 日現在
機関番号：32612
研究種目：基盤研究(C)
研究期間：2008〜2010
課題番号：20592346
研究課題名（和文）
病原性モノクローナル抗体を用いた天疱瘡の口腔粘膜病変発症機序の解明
研究課題名（英文）Analysis of oral mucosal lesion of pemphigus using pathogenic pemphigus monoclonal
antibodies
研究代表者
角田 和之 (TSUNODA KAZUYUKI)
慶應義塾大学・医学部・助教
研究者番号：60265915

研究成果の概要（和文）：本研究において口腔粘膜に生じる難治性自己免疫疾患である尋常性天疱瘡の自己抗体の解析を行った。その結果、天疱瘡には様々な病原性を有する自己抗体が存在する事をモノクローナルなレベルで確認した。また、自己免疫疾患における自己免反応性 IgM 抗体の詳細を解析するために、IgM クラスの天疱瘡モノクローナル抗体を作製し、IgM クラスの自己抗体には明らかな病原性がないことを確認した。
これらは天疱瘡発症機序を解明する上で重要な知見となる。
研究成果の概要（英文）：Pemphigus vulgaris is an autoimmune blistering disease of oral mucosa. We analyzed
pathogenic activity of pemphigus antibodies monoclonal level. In patient serum, thepemphigus autoantibody that has heterogenous pathogenicity was confirmed. We also
analyzed the pemphigus IgM autoantibodies as monoclonal level. We confirmed that
pemphigus IgM antibody did not have apparent pathogenic activity.
These finding will dissect the pathophysiolosical mechanism of pemphigus.
交付決定額（金額単位：円）2008 年度
2009 年度
2010 年度
総 計

直接経費
2,100,000
700,000
700,000
3,500,000

間接経費
630,000
210,000
210,000
1,050,000

合 計
2,730,000
910,000
910,000
4,550,000

研究分野：医歯薬学
科研費の分科・細目：歯学・外科系歯学
キーワード：①天疱瘡、②自己抗体、③病原性、④口腔病変、⑤デスモグレイン
１．研究開始当初の背景
粘膜・皮膚に生じる自己免疫性水疱形成疾患である尋常性天疱瘡（PV）の自己抗原蛋白
は 細胞 間接 着分 子で あるデ スモ グレ イン（Dsg）3 で、Dsg3 に対する病原性の抗 Dsg3自己抗体が細胞接着障害を引き起こすことが明らかにされている。PV では、ほぼ全例において病初期の段階で口腔粘膜のみに水疱、びらん形成が生じるがその初期病変の重症度は軽症から非常に重症な症例まで様々である。また治療抵抗性の難治病変が口腔粘膜に生じることはしばしばで、これらの現象は抗 Dsg3 抗体の病原性が深く関与しているものと考えられる。
２．研究の目的
PV の口腔粘膜症状の解析とその治療法の開発を大きな目的として本研究を行った。これまでに我々が作製した PV モデルマウス、抗 Dsg3 モノクローナル抗体を用いて PV 患者

血清の質的解析を期間中に行い PV の口腔粘膜病変の病態解析及び治療法開発の基礎データとする事を目的とした。
３．研究の方法(1) ELISA 法を用いた自己抗体の病原性解析
これまでに我々が単離した、マウス抗 Dsg3モノクローナル抗体（AK mAb シリーズ）を用いて、PV 患者の自己抗体が認識するエピトープと口腔内病変の重症度の相関関係を解析した。従来、天疱瘡の患者血清はポリクローナル抗体で、その、モノクローナルなレベルにおける抗 Dsg3 抗体の病原性については全く不明であった。AK mAb（５クローン）は Dsg3と Dsg1 のスワッピング分子を用いたエピトープの解析より、Dsg3 の細胞外領域の大きく分けて、N 末端領域、中央部、C 末端領域を認識する抗体であることが確認されている。
そこでこれらの異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を用いて、PV の口腔内病変重症度と自己抗体のエピトープの相関関係を解析した。
(2) エピトープ依存的な患者血清中の自己抗体の病原性の検討
AK mAb を利用して患者血清中の異なるエピトープを認識する自己抗体を精製し、invitro dissociation assay を用いて解析した。
本アッセイはヒト培養角化細胞をもちいた
抗 Dsg3 抗体の病原性評価法で技術的に確立されており、この結果は患者血清中のモノクローナルなレベルでの病原性を初めて示すことが可能である。
(3) 病原性天疱瘡モノクローナル抗体を用いた自己反応性 IgM 抗体の病原性解析
AK mAb の中でも強い病原性を有する AK23mAb の超可変部位を有するトランスジェニックマウスを作製し、そのマウスの解析を行った。更にトランスジェニックマウスより抗Dsg3 IgM モノクローナル抗体を単離し、その病原性を AK23 IgG と比較検討した。
４．研究成果ELISA 法を用いた自己抗体の病原性解析では、ELISA 法に必要な抗原蛋白およびモノクローナル抗体が大量に必要になる。そこで先ず抗 Dsg3 モノクローナル抗体（AK mAb）の大量精製と組み換え Dsg 蛋白の作製、精製を行った。PV モデルマウスより作製した複数のAK mAb のハイブリドーマを大量に培養し、r‑protein A column にて精製した。
また ELISA法の抗原蛋白として使用する rDsg3 蛋白をバ
キ ュ ロ ウ ィ ル ス 発 現 系 に て 作 製 し TALON
affinity column にて精製した。これらを用いてヒト Dsg3 組み換え蛋白を抗原とした
ELISA 法により、PV 患者血清中の抗 Dsg3 自己抗体の解析を行った。AK mAb はマウス、ヒト Dsg3 に交差反応性を有するクローンが存在し、Dsg3 細胞外領域の N 末端領域を認識し病原性を有する AK mAb（AK23）、中央部（AK18）および C 末端領域（AK20）を認識し明らかな病原性を有さない抗体に分類することが可能である（図 1）。

これらの mAb を利用し、ヒト Dsg3 を抗原として用いた ELISA 法にて各モノクローナル抗体を１次抗体として反応させ、２次抗体として患者血清を反応させた。また陽性コントロールとして AK mAb 単独での OD 値を測定し、両者間での競合率（ブロッキング率）を算出した。その結果、活動期 PV 血清の約 70％でAK23 と競合するエピトープを認識する自己抗体を有し、AK18、AK20 のエピトープを認識する自己抗体は約 3 割以下であることが確認された。本来ポリクローナル抗体である PV患者血清をモノクローナルなレベルで、解析することが可能であった。
次に抗 Dsg3 抗体のエピトープ依存的な病原性の解析を行った。そのための方法として
In vitro dissociation assay を用いて PV 自己抗体の病原性の検討を行った。まず invitro dissociation assay の条件を設定するために初代培養正常ヒト角化細胞を 24 ウェ
ルプレートにてコンフルエントまで培養した後に、様々な濃度のカルシウムを添加し重層化の度合いを比較検討した。そして抗 Dsg3抗体の病原性を評価するうえで Dsg1 の接着機 能 を 調 節 す る 事 が 可 能 な exfoliative
toxin A の添加量を比較検討し詳細な条件設定を行った。次にエピトープ依存的な患者血清の病原性を評価する前段階として、臨床症状と抗 Dsg3 抗体価の相関関係を in vitro
dissociation assay を行い、assay の妥当性を評価した。その結果臨床症状が active な患者血清はその dissociation score が高く、また臨床症状が remission の患者ではそのdissociation score が低いことが確認され、本方法は抗 Dsg3 自己抗体の病原性を定量的な評価に適した方法であると考えられた。
さらに PV 自己抗体の病原性解析を行う目的で、PV モノクローナル IgG 抗体(AK IgG mAb)を用いて PV 自己抗体のクラスの違いにおける病原性解析を行った。以前に我々は非病原性の AK7 IgG mAb の超可変部位を有する AK7 B細胞トランスジェニックマウス（B‑Tg）を作製し、自己反応性 IgM 抗体を産生する B 細胞は抹消リンパ組織中に排除されることなく存在していることを明らかにした。そこで本研究期間中に強い病原性を有する AK23 IgG
mAb の超可変部位を有する AK23 B‑Tg を作製した。AK23 B‑Tg では病原性を有する超可変部位を有するにもかかわらず、AK7 B‑
Tg と同様に自己反応性 B 細胞が抹消リンパ組織中に排除されることなく存在し、さらには分泌された抗 Dsg3 IgM 抗体の上皮細胞間への沈着を認めるものの、明らかな PV の表現型は誘導されなかった（図 2）。

（図 2）
そこで AK23 B‑Tg より病原性超可変部位を有する PV モノクローナル IgM 抗体（AK23 IgM）を単離した。in vitro dissociation assay
による病原性解析では、AK23 IgM は明らかな病原性を示さなかった。さらに AK23 IgM ハイブリドーマを接種し腹水化したマウスの口蓋粘膜の免疫電顕を実施し In vivo における AK23 IgM の病原性を観察した。その結果
AK23 IgM はデスモゾーム内に沈着することなく、優位にデスモゾーム周囲に沈着している像が観察された（図 3）。これは AK23 IgM は膜上の Dsg3 には結合するものの、デスモゾームに組み込まれた Dsg3 には結合していないためであると考えられた。そこで AK23 IgMをペプシンで 消化し F(ab )2 化したところ、
in vitro dissociation assay にて病原性が確認された(図 4)。以上の事実より PV での水疱形成においては、免疫グロブリンが病原性を発揮するためにはデスモゾームに組み込まれた Dsg3 蛋白に IgG クラスの抗体が結合する事が、一つの重要な因子であることが確認され、発症機序の一端が明らかにされた。
（ Tsunoda et al, American journal ofpathology, in press）
。

(図 3)

(図 4)

５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計 5 件）① Tsunoda K, Ota T, Saito M, Hata T,
Shimizu A, Ishiko A, Yamada T, NakagawaT,Kowalczyk AP, Amagai M: Pathogenic
relevance of IgG and IgM anitbodies
against desmoglein 3 in blister formationin pemphigus vulgaris, Am J Pathol (inpress, 査読有り)②角田和之, 加藤伸, 大内健嗣, 石河晃:
【白い皮膚病】 臨床例 口腔粘膜に生じた
白 色 海 綿 状 母 斑 , 皮 膚 病 診 療 2010,
32:955‑958（査読有り）③ Saito H, Shimizu A, Tsunoda K, Amagai
M, Ishiko A: Subcellular localization ofdesmosomal components is different
between desmoglein3 knockout mice andpemphigus vulgaris model mice, J DermatolSci 2009, 55:108‑
115（査読有り）④ Ota T, Aoki‑
Ota M, Tsunoda K, Nishikawa
T, Koyasu S, Amagai M: Autoreactive B‑
cellelimination by pathogenic IgG specific forthe same antigen: implications forperipheral tolerance. Int Immunol 2008,
20:1351‑1360（査読有り）⑤ Mori T, Hasegawa K, Okabe A, Tsujimura
N, Kawata Y, Yashima T, Kobayashi N, Kondo
S, Aisa Y, Kato J, Tsunoda K, Nagai T,Nakagawa T, Shigematsu N, Kubo A, Ikeda Y,Okamoto S: Efficacy of mouth rinse inpreventing oral mucositis in patients
receiving high‑dose cytarabine forallogeneic hematopoietic stem celltransplantation, Int J Hematol 2008,
88:583‑587（査読有り）〔学会発表〕（計 11 件）
① Keratin 13 gene mutation cases oral
white sponge nevus. Tsunoda K, Kato S,
Ouchi T, Ishiko A. 37th Annual Meeting of
the SCUR, Helsinki, Finland, 09.07‑
08 2010,(poster presentation)② 小池晶彦，宮下英高，高森康次，木村彩，角田和之，池内 忍.口腔内増殖性天疱瘡が疑われた 1 例，第 20 回日本口腔粘膜学会総会, 大阪, 2010.07.31‑
08.01 (口頭)
③ 宇賀允悠，角田和之，加藤 伸，小高利絵，角田博之，大内健嗣，石河 晃，中川種昭. ケラチン 13 遺伝子変異により生じた白色海綿状母斑の１例,第 20 回日本口腔粘膜学会
総会 大阪, 2010.7.31‑
8.01 (口頭)④角田和之: 口腔粘膜疾患のトランスレー
ショナルリサーチ 天疱瘡の基礎研究とその臨床応用, 第 19 回日本口腔粘膜学会総会・学術集会, 神奈川県三浦郡, 2009.06.05‑
06(シンポジウム)⑤小池晶彦, 角田和之, 柴秀行,新里知佳,加藤伸,永井哲,天谷雅行,中川種昭: 粘膜類天疱瘡の１例. 第 19 回日本口腔粘膜学会総会・学術集会, 神奈川県三浦郡,2009.06.05‑
06 (口頭)⑥ Bindingkinetic
analysisofanti‑desmoglein 3 monoclonal antibodies
by Biacore. Tsunoda K, Nakagawa T, Amagai
M: 6th General Session & Exhibition of theInternational Association for DentalResearch,
Miami, USA, 04.30‑
05.03
2009(oral presentation)⑦ 角田和之、中川種昭: 天疱瘡の病原性エ
ピ トー プを 認識 する 抗デス モグ レイ ン３
IgM 抗体の病原性解析. 第 63 回 NPO 法人日本口腔科学会学術集会, 浜松, 2009.4.16‑
17(口頭)⑧角田和之, 中川種昭, 天谷雅行: 天疱瘡
モノクローナル抗体の結合カイネティクス
解析による新たな病原性因子の探索. 第 53回日本口腔外科学会, 德島, 2008.10.20‑
21:(口頭)⑨角田和之, 畑毅, 清水篤, 石河晃, 山田健人, 中川種昭, 天谷雅行: デスモグレイ
ン 3 の天疱瘡病原性エピトープを認識する
IgM 抗体の作製とその病原性解析. 日本口腔粘膜学会雑誌 東京, 2008.09.19‑
20 (口頭)⑩ IgM to IgG isotype switching ofanti‑
desmoglein 3 antibodies is anessential step for pathogenesis ofpemphigus vulgaris. Tsunoda K, Ota T, HataT, Shimizu A, Yamada T, Nakagawa T, Amagai
M:
International
Investigative
Dermatology, annual meeting, Kyoto
05.14‑
17 2008 (poster presentation)⑪ 角田和之, 口腔粘膜にびらん、潰瘍を生じる疾患,日本皮膚科学会総会，京都2008.04.18‑
20（教育講演）〔図書〕（計 3 件）①角田和之,天谷雅行: 口腔粘膜に水疱・びらん・剥離ができている患者が来院したら？,医師・歯科医師のための口腔診療必携: 金原
出版､ 2010, P10②加藤伸, 新里知佳, 角田和之, 永井哲夫:
小児の口腔粘膜疾患, 小児歯科臨床: 全国
小児歯科開業医会、2010, 15: P10‑
19③角田和之: 口腔外科ハンドマニュア
ル 08 天疱瘡・類天疱瘡: クインテッセン
ス出版、2008, P27‑38

〔産業財産権〕○出願状況（計 0 件）

○取得状況（計 0 件）

〔その他〕
ホームページ等
なし
６．研究組織(1)研究代表者
角田 和之（TSUNODA KAZUYUKI）
慶應義塾大学・医学部・助教
研究者番号：60265915(2)研究分担者
中川 種昭（NAKAGAWA TANEAKI）
慶應義塾大学・医学部・教授
研究者番号：00227745(3)連携研究者なし