2019 年度研究助成報告書

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関節運動の正常化は軟骨の変性を予防するのか？
―早期 OA マウスモデルを用いた研究―岡優一郎（PT, MSc）1），村田健児（PT, PhD）2），
1）3）

小曽根海知（PT, MSc）

，国分貴徳（PT, PhD）2），

金村尚彦（PT, PhD）2）
1）

埼玉県立大学大学院博士後期課程

2）

埼玉県立大学理学療法学科

図1

3）

日本学術振興会特別研究員 DC2

キーワード：変形性膝関節症，異常関節運動，Gremlin-1
経路

実験プロトコルし，軟骨基質分解酵素である MMP-13 や ADAMTS-5を誘導することが明らかとなった。また，MCL-T に併せて Gremlin-1 の促進剤の投与により OA 化が進行し，

緒言

Gremlin-1 の遺伝子欠損や抑制剤の投与により OA 化が変形性膝関節症（以下，膝 OA）の発症・進行要因と遅延したことから，過度なメカニカルストレスによるして過度な機械的ストレスが挙げられる。関節組織は力Gremlin-1 の誘導は，NF-κ B 経路を介して OA を発症さ学的環境に対して非常に敏感な性質をもっており，メカせることが明らかとなった。

ニカルストレスは関節組織の発達や長期的に形状を維持我々の研究室においてもメカニカルストレスと OAするためのもっとも重要な外的要因であると考えられての関連性を追ってきた。我々は ACL-T モデルに加えて，いる。しかし，長年にわたるストレスの集積や過度なス

ACL 切断によって生じた脛骨の前方への位置異常を管トレスによって関節軟骨が変性することが明らかになっ理する異常関節運動制動（以下，CAJM）モデルを開ている。過度なストレスは関節の不安定性や位置異常な

発 3）し，運動学の異なる２つのモデルを採用した結果，ど，膝関節の運動学になんらかの異常変化が生じたとき

IL-1β や TNF-α などの炎症性サイトカインの放出を抑に生まれる。そして，その関節不安定性や位置異常は関制し，OA の発症を遅延させることを明らかにした節構成体である靭帯や半月板などの損傷や，長年の生活しかし，CAJM による運動学的な変化が，関節軟骨に習慣などの積み重ねによって生じるマルアライメントにどのような影響を及ぼすのかはまだ完全に理解されていよって惹起されると考えられている。OA に関する動物ない。

4）。

モデルにおいては外科的処置によって靭帯を断裂する

本研究では 2 つの運動学が異なるモデルを使用して，モデルや炎症誘発性の薬剤を投与することによって OAストレス依存的に活性化する Gremlin-1-NF-κ B 経路とを惹起するモデルが確立されている。その中でも前十字軟骨変性を評価し，運動学的変化が軟骨にかかるストレ靭帯切断（以下，ACL-T）モデルは脛骨の前方引き出スにどのような影響を及ぼしているのかを明らかにする

しを制動する靭帯を切断することにより，関節不安定性ことを目的とした。脛骨が前方へ偏位する ACL-T モデは惹起され，関節軟骨の変性が生じると認識されていルでは Gremlin-1 が過剰発現するが，CAJM モデルではる。つまり，関節内環境が変化するとそれに伴い膝関節それら経路の活性が抑制され，軟骨の変性を予防するとで生じる運動学の変化を引き起こし，接触領域が変化す仮説を立てた。

ることによって生理的な負荷を逸脱したストレスが産生方され，OA 化につながっていると解釈できる。
近年，過度なストレスが関節軟骨に負荷されたとき

法

1．対象とデザインの生体内の反応として，Gremlin-1-NF-κ B 経路を通じ

本研究は学内動物実験倫理委員会の承認（承認番号て軟骨変性が生じることが報告された。Gremlin-1 は30-4）を得て実施した。12 週齢の ICR 系雄性マウス 32

BMP のアンタゴニストとして知られており，BMP と匹を使用した。すべてのマウスに対し前十字靭帯を切断のバランスは細胞の肥大と恒常性と相関するといわれ

し 6 週間の自由飼育によって早期 OA モデルを作成している1）。Gremlin-1 は繰り返されるストレスによって発現するといわれている。Chang らの報告

2）によると内側側副靱帯切断（以下，MCL-T）モデルでは，術後 2 週より関節軟骨の石灰化層に Gremlin-1 が発現し，それに伴い NF-κ B 経路の下流に当たる Iκ B-α が活性化た。その後未処置の ACLT 群と脛骨の前方偏位を抑制する CAJM モデルに分類した（図 1）。
2．モデル作成
手術手順は我々の先行研究

5）に沿って実施した。両群ともに ACL を完全に切断した。次に 25 ゲージの注2

2019 年度研究助成報告書

射針を用いて，大腿骨遠位後方と脛骨近位前方に骨孔を開けた。そして，3-0 ナイロン糸を骨孔に通して，脛骨の前方偏位を戻すように緊縛したものを CAJM 群とした。ACL-T 群は骨孔までは同様の処置を行い，ナイロン糸を緩く結ぶことによって脛骨の前方偏位を許した。
3．軟 X 線写真撮影
脛骨の位置異常を評価するために軟 X 線装置 M-60 を利用して撮影した。右後肢を採取し，膝関節 90°屈曲位で X 線画像を撮影した。画像はデジタル画像センサー
NAOMI によってデジタル化した。脛骨の位置異常は脛骨の前方移動量として，画像処理ソフトウェア Image Jを用いて定量化した。
4．組織学的解析
1）一般染色による解析

図2

Safranin-O 染色，各因子の蛍光免疫染色の組織像および解析結果

軟骨変性の評価を行うために 4 週，8 週時点の膝関節を供した。切片はミクロトーム ROM-380 を利用し，矢状断切片を作成し，Safranin-O Fast Green 染色を実施

意に減少していた（p < 0.001）。ACL-T 群，CAJM 群内した。軟骨の欠損の評価は OARSI スコアリングシステの比較においては ACL-T 群，CAJM 群ともに有意差はムに沿って実施した。また評価は 1 人の訓練された研究

見 ら れ な か っ た（[ACL-T 4week VS ACL-T 8week]；

者によって行われた。

p=0.843，[CAJM 4week VS CAJM 8week]；p = 0.877）。

2）蛍光免疫組織化学染色による解析

2．組織学的解析

Gremlin-1-NF-κ B 経路の活性化を評価するために免疫

Safranin-O Fast Green による染色像とスコアリング蛍光染色を実施した。一次抗体として Anti- Gremlin-1

結果を示した（図 2）。4，８週時点ともに CAJM 群が抗体（1:200 abcam），Anti -Iκ B-α 抗体（1:200 abcam），

ACL-T 群よりも軟骨変性が抑制されており，8 週時点

anti-MMP-13 抗 体（1:250 abcam），anti-ADAMTS-5 抗の ACL-T 群では軟骨の欠損が石灰化層に到達している体（1:100 bioss）を使用し，4℃にて 24 時間反応させた。

ものも多く観察された。OARSI score による分析では，二次抗体には Dylight 488（1:1000 ThermoFisher）を使4 週時点では OARSI score に差は見られなかったが，8用した。最後に DAPI を滴下し，組織切片を封入した。

週時点では ACL-T 群の OARSI score が CAJM 群より染色後，蛍光顕微鏡 BZ-X700 を用いて関節軟骨部をも 有 意 に 高 値 を 示 し た [4week；ACL-T VS CAJM]；撮像した。画像解析には KEYENCE ハイブリッドセル

p=0.131，[8week；ACL-T VS CAJM]；p < 0.001）。まカウントを利用し，陽性細胞率をカウントした。陽性細た，ACL-T 群，CAJM 群 内 の 比 較 に お い て は ACL-T

胞率は指定区間（100 × 100 μ m）中の DAPI 染色によ群 で は 8 週 時 点 の OARSI score が 有 意 に 高 値 を 示

る陽性細胞中の各抗体の陽性細胞数の割合とした。

し，CAJM 群 で は 有 意 差 は 見 ら れ な か っ た（[ACL-T5．統計解析

4week VS ACL-T 8week]；p = 0.045，[CAJM 4week

統計解析は SPSS を用いた。すべてデータの正規性をShapiro-Wilk 検定にて確認後，二元配置分散分析を実施

VS CAJM 8week]；p = 0.402）（4 week ACL-T 群：2.4[1.9‒2.9]；CAJM 群：2.0[1.6‒2.4]，8week ACL-T 群：

した。また，事後検定としては Tukey 法を用いた。す3.8[3.3‒4.2]；CAJM 群：2.3[1.8‒2.7]）。

べてのデータは平均値［95％信頼区間］で示した。また，

3．免疫組織化学染色による解析すべての有意水準は 5％とした。

蛍光免疫染色による染色像と陽性細胞率の分析結果を示した（図 2）。Gremlin-1 の陽性細胞率は，4，8 週

結果

1．軟 X 線による脛骨の前方偏位の評価

時点ともに ACL-T 群の陽性細胞率が CAJM 群よりも有意に高値を示した [4week；ACL-T VS CAJM]；p <

組織採取後の膝関節を矢状面より軟 X 線写真を撮影し0.001，[8week；ACL-T VS CAJM]；p < 0.001）。また，た。脛骨の前方偏位量の測定結果を示した。4 週時点の前方偏位量は ACL-T 群：1.03[0.90‒1.17]mm；CAJM 群：群，CAJM 群ともに有意差は見られなかった（[ACL-TACL-T 群，CAJM 群の群内の比較においては ACL-T

0.51[0.40‒0.62]mm，8 週時点の前方偏位量は ACL-T 群：1.11[0.94‒1.29]mm；CAJM 群：0.59[0.50‒0.67]mm で あ っ4week VS ACL-T 8week]；p=0.372，[CAJM 4week VS

た。4 週での比較では CAJM 群は ACL-T 群よりも前方13，ADAMTS-5 に関しても ACL-T 群の陽性細胞率は偏位量が有意に減少しており（p < 0.001），8week におCAJM 群よりも高値を示した。

いても CAJM 群が ACL-T 群よりも前方偏位偏位量が有CAJM 8week]；p = 0.118）。 そ の 他 の Iκ B-α ，MMP-

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考察3

着目し介入することが多い。しかし，それら介入に対す

本研究は早期の変形性膝関節症モデルマウスに対しる科学的根拠は乏しく，運動学と軟骨変性の関連性につて，2 つの運動学が異なるモデルを採用し，メカニカルいて生物学的視点から追った研究はわずかである。そのストレスに応答する Gremlin-1-NFκ B 経路を評価するこ中で本研究結果は，2 つの運動学が異なるモデルを使用とによって，運動学的変化が軟骨変性に与える影響を明し，脛骨の前方偏位という運動学的異常を抑制することらかにすることを目的とした。

で軟骨変性にかかわる因子の発現を抑制することを示し

軟 X 線による脛骨の前方偏位量の計測では，4，8 週た。これは我々理学療法士が臨床の場で行っている治療群でともに CAJM 群の前方偏位量が ACL-T 群よりも有介入が大きな意義をもつということを示し，膝 OA の治意に減少していた。CAJM モデルを採用した以前の報療法確立に向けた重要な基礎的データとなり得るだろう。

4）5）では，脛骨を前方に引き出す装置を使用するこ本研究結果を解釈するうえで注意すべき点が存在すとによって膝関節の不安定性を評価してきた。しかし，る。MMP-13 や ADAMTS-5 といった軟骨基質分解因子

告

本研究では脛骨の前方引き出し試験を実施することなくの発現は Gremlin-1-NF-κ B 経路の活性化を介さずとも起写真撮影を実施した。その結果，2 度目の外科的処置かこりうる。本研究では Gremlin-1 や Iκ B-α の発現をもっら 4，8 週時点ともに，CAJM 群の前方偏位量が減少してその経路の活性化を言及し，それによって分解因子がていた。このことから，CAJM 群は介入期間を通して発現したと考察した，現時点では Gremlin-1 経路と分解脛骨の前方偏位を抑制していたことが示唆される。

因子の発現の因果関係は明らかにすることができていな

ACL-T 群では脛骨の前方引き出しを制動する ACL をい。この因果関係を明らかにするためには，Gremlin-1切断することにより関節の不安定性を呈するモデルとしもしくはその下流経路の遺伝子をノックアウトしたマウて捉えられてきたが，本研究では前方引き出し試験を実スの採用や，上記関連因子の発現を抑制もしくは増加す施しなくても脛骨が前方偏位しており，運動時に脛骨がるような薬剤を投与し，基質分解因子や関節軟骨状態を前方に偏位するのではなく，常時脛骨が前方に偏位して確認する必要性がある。

いる状態で運動が遂行されている可能性が示唆される。
つまり，ACL-T モデルは脛骨が前方に偏位することに結論
運動学的異常を抑制する治療介入は Gremlin-1-NFκ B

より，関節軟骨後方へ過剰なストレスが加わるモデルで経路の活性を抑制し，関節軟骨の変性を予防する可能性あるといえる。
Gremlin-1 経路の陽性細胞率の比較における CAJM のがある。

外科的処置から 4 週時点では Gremlin-1，Iκ B-α ，MMP13 の陽性細胞率に差が見られたが，軟骨欠損の程度を利益相反示す OARSI score では差は見られなかった。Gremlin-1

本研究における利益相反はない。とその下流経路の因子は過剰なメカニカルストレスによって発現することがわかっている

2）。CAJM 群の各因子の陽性細胞率の抑制は，脛骨の前方偏位を管理する外科的処置を実施したことで，ACL-T によって生じる関節軟骨後方への局所的なストレスが減少していたことを示す。しかし，膝 OA にかかわる炎症・分解因子の発現後，軟骨の変性までには 6 週程度要するという報告もあるように，CAJM 後 4 週では軟骨の変性に差が生じなかった可能性がある。各因子の陽性細胞率は CAJM
後から 8 週時点でも差が見られており，軟 X 線で示された脛骨の前方変位量の違いが，メカニカルストレスの量の違いとなり，結果的にストレス依存的に発現する因子に差が見られたと考えられる。4 週時点では差が見られなかった OARSI score においても 8 週時点では差が見られ，CAJM 群では Gremlin-1 とそれに続く下流経路の活性が抑制されたことにより，軟骨変性を予防したと考えられる。
臨床現場において，膝 OA 患者に対し膝の関節運動に文

献1）Yi J, Jin Q, Zhang B, et al.: Gremlin-1 concentrations arecorrelated with the severity of knee osteoarthritis. Med
Sci Monit. 2016; 22: 4062‒4065.
2）Chang SH, Mori D, et al.: Excessive mechanical loading
promotes osteoarthritis through the gremlin-1-NF-κ B
pathway. Nat Commun. 2019; 10(1): 1‒5.
3）Kokubun T, Kanemura N, et al.: Eﬀect of Changing theJoint Kinematics of Knees with a Ruptured Anterior
Cruciate Ligament on the Molecular Biological Responses
and Spontaneous Healing in a Rat Model. Am J SportsMed. 2016; 44(11): 2900‒2910.
4）Murata K, Kanemura N, et al.: Controlling joint instability
delays the degeneration of articular cartilage in a ratmodel. Osteoarthr Cartil. 2017; 25(2): 297‒308.
5）Oka Y, Murata K, et al.: Impact of Controlling Abnormal
Joint Movement on the Effectiveness of Subsequent
Exercise Intervention in Mouse Models of Early Knee
Osteoarthritis. Cartilage. 2019.