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日本家禽学会誌,43.･c"03‑JIO9,2006

採卵鶏の免疫応答に及ぼす脱塩濃縮梅酢の影響
伊丹哲哉!、上田雅彦!、香川高士!、黒田順史2．吉村幸則31和歌山県農林水産総合技術センター畜産試験場養鶏研究所，和歌山県日高郡中津村船津644‑1111
2ｲⅡ歌￨｣￨県紀北家畜保健衛生所，和歌山市匝￨部640‑8483
3広島大学大学院生物圏科学研究科，東広島市鏡山739‑8528

脱塩濃縮梅酢(BX70)を飼料に添加し，白色レグホン種産卵鶏の免疫機能に及ぼす影響を検討した。
試験区は,BX70を0.07%,0.14%および2.80%の割合で添加した区（以下,0.07%区0.14%区，およOi2.80%区）を設疋し，対照区は無添加とした。各区には50羽を供試し,70〜51011齢の問，自由採食とした。細胞性免疫の指標としては，フィトヘマグルチニンPに対する遅延型過敏反応(DHT)を行った。また，液性免疫の指標としては，ニューカッスル病ワクチン抗体価（以下,ND‑HI価),ニワトリ伝染性気管支炎ワクチン抗体価（以下,IB‑SP値),Im渭中IgG濃度およびブルセラ・アボルタス抗原に対する血清中凝集抗体価(IgGおよびIgG+IgM)を調べた。試験は各区から10羽を無作為に抽出して行った。

DHTは,492日齢では0.07%区が対照区より有意に高かった。ND‑HI価は,215,320,428および500
日齢で0.07％区および2.80%区が対照区より有意に高かった｡IB‑SP値は,428および500日齢で0.14%区が対照区より有意に高かった。血清巾IgG濃度は,218日齢では0.07%区および2.80%区で，429日齢では2.80%区で,501日齢では0.07%区で対照区より有意に高かった。ブルセラ・アボルタス抗体lllli(IgG+IgM)は,241日齢において0.14%区で対照区より有意に高かった。これらのことから
BX70の産卵鶏への給与は，細胞性および液性免疫機能を冗進するものと考えられた。
キーワード：採卵鶏，脱塩濃縮梅酢，免疫機能一｜宮緒著者らは，梅漬けの目ll産物として産出される梅酢を濃縮したBX70を製造した。BX70は，梅肉エキス同様に，クエン腰やリンゴ酸などの有機酸，ミネラルを豊富に含み，産卵鶏へ給与すると，産卵性および卵質を改善させ給与することによっても免疫能を改善させる可能性が考えられる。そこで本実験は,BX70を飼料に添加し，産卵鶏の免疫機能への影響を追究した。

材料と方法
1．供試鶏および管理る効果がある（伊丹ら．2005)｡BX70の原料である梅は2002年3jjl9IIに孵化した白色レグホン種産卵鶏

古来から和漢民間薬として使用されており（亀岡と北(ジュリア）を初生ヒナで導入して育成し,70日齢で試側,1976),その作111には免疫応答の冗進が関連している峨鶏舎に移動して試験を￨)M始した。試験鶏舎では，供試可能性が考えられる。一方，クエン雌などの有機酸の給鶏は単飼ケージで飼養し，照りl条件を14L:10Dとし与が液性免疫の機能を冗進させることが報告されているた。飼料は市販飼料（株式会社日本配合飼料，神戸市）(Hadri"".,2004)｡BX70はクエン腰を35.3%,リンゴで，70〜12011齢は大雛用(CP14.0%以̲上,ME2,780

酸を10.2%と有機酸を多く含み（伊丹ら,2005),これをkcal/kg),121〜510日齢は成鶏用(CP17.0%以上,ME2,850kcal/kg)を川いた。これに下述の濃度でBX70を2006年4jl24日受付,2006年6月5日受理
連絡者：伊丹哲哉
和歌山県日高郡中津村船津l090‑l

飼料に添加して70日齢から試験終了まで自由採食させた。飲水は自山摂取とした。供試鶏のワクチネーション

Tel：O738‑54‑Ol44

は，4日齢と28日齢にニュースカッスル･IB混合ワク

Fax：O738‑54‑O966

チン「カケッケン」（化学及血清療法研究所，熊本市）を

E‑mail:itami̲tOOO1@pref.wakayama･lg.jp

飲水で,1411齢でIBD生ワクチン「バーシン2」（ゲンCopyright ©2006, Japan Poultry Science Association
J 1 0 4 日 本 家 禽 学 会 誌

43巻J3号(2006)

コーポレーション，岐阜市）を飲水で接種した。次いで，式会社,東京都三鷹市）を用いて,125倍に希釈した血清

21日齢で日生研穿刺用鶏痘ワクチン（日生研検株式会

25"と血清希釈液75"を,i11ll定用フ･レートの各ウエル社，青梅市）を翼部筋膜穿針により，45日齢で「オイルに分注し，30分間室温で反応後，蛍光抗体ラベル血清

バックスNB2AC｣(化学及血清療法研究所）を頚部皮下100"jを加え，再度30分反応後，蒸留水で4回洗い，酵注射により，58日齢で鶏ロイコチトゾ．−ン病ワクチン

素基質溶液（テトラメチルベンゼン溶液)100"/,1又応停｢北研」（社団法人北里研究所，東京都港区）を脚部筋肉止液(0.12%フシ化水素酸)100"jをlllnに力llえた。被検IIn注射により，67日齢で「オイルバックスEDS‑76｣(化学清以外に，｜場性数値および陰性数値が明確にされている及1m清療法研究所）を脚部筋肉注射により，および84｢I指示血清（キット添付のもの）も￨司様の処II1を行った。

齢に「レイヤーミューンSE｣(第一科学株式会社，東京

以上の処理を行った測定用プレートを吸光マイクロフ。

都中央区）を頚部皮下注射で投与した。
2．試験区分

試験区はBX70を市販飼料へ0.07%,0.14%およびレートリーダーサンライズクラッシック526‑79701(テカンジャパン株式会社，川崎市）でOD価を求めた。
SP値は測定した0D値より以下の式で求められた。

2.80％添加した区（以下それぞれ,0.07%区,0.14%区おSP値＝よび2.80%区）および無添加の対照区の4区とし，各区被検￨Ⅲ清のOD値‑￨場性指示血清のODIII!1
被検血清のOD値一陰性指示血清の0D値には50羽を供試した。なお,BX70は伊丹ら(2005)の報告と同じ組成のものを使用した。
3．調査項目(1)遅延型過敏1文応(DHT)

各試験区より10羽を抽出し，同一個体において,210,これらはDewitaaj．(1997)のﾉﾉ法に準拠して行った。

(4)lm情にI1IgG濃度の測定
各試験区より10羽を抽出し,218,317,429および387および492日齢に遅延型過敏反応検査を行い細胞性501日齢に翼下静脈より真空採￨Ⅲ管を用いて採￨mし，免疫の指標とした(Cook"".,1982)。すなわち，まず，1,600×9,10分間の条件で遠心分離した血清を試験に供左右の肉垂の厚さを測定した。その後，滅菌PBSに溶解した。供試鶏は,ND‑HIIIINとIB‑SP値の測定用に採IIIIしした0.1％フィトヘマグルチニンーP(fl]光純薬工業株式たものを除いて抽出した。血清を滅菌蒸留水により10会社，大阪市）を右肉垂に，滅菌PBSを左肉垂に接種倍希釈し，ニワトリIgGフ･レート（エコスティック研究し，24時間後に再度肉垂の厚さを測定した。接種前後の所，古川市）の各ウエルに5 ずつ分注，48時間室温で右肉垂の測定値の差（右肉垂の￨匝脹の厚さ）から接種前反応させた後，反応したl'1の直径を測定した。得られた後の左肉垂の測定値の差を除いたものを判定値（以下，数値と既知の濃度のIgGを含む標準1m清より作成したPHA‑P値）とした。

検呈線からIgG濃度を求めた。

（2）ニューカッスル病ワクチン抗体｛llli(ND‑HI価）
各試験区より10羽を抽出し,215,320,428および500日齢に翼下静脈より真空採llⅡ管を用いて採￨Ⅲし，（5）ブルセラ・アボルタス抗原(BA)に対する凝集抗体価

各試験区より241および4171 1齢に10>11を1111出し，1,600×9,10分間の条件で遠心分離して，血清を試験に0.1m/のブルセラ・アボルタス抗原（以下,BA抗原；化供した。ワクチン抗体Ⅱiは，ニューカッスル病赤1m球凝学及血清療法研究所）を桟胸筋に接種した。1週間後に集素（化学及￨Ⅲ清療法研究所）を用いたマイクロタイ

lXimして血清を分離し，凝集抗体価を測定した。供試鶏タ一法で測定した（井上ら,1971;藤原ら,1973)。すなは，他の試験に供していないものから選定し，採血ならわち,V字底マイクロトレーのウエルに滅菌リン雌緩衝

びにⅢ清分離の方法は他の試験と同一の方法をとった。

食塩水(PBS)25浬/を加え，被検血清を25〃を1列目1m清の半分については,0.1M2‑メルカプトエタノールに加え，ダイリューターを用いて2倍ずつ段階希釈し，(ME)溶液(0.1MTris‑HCl緩衝液,pH8.0,100mlにその後ニューカッスル病赤血球凝集素25 と鶏lill球液

2‑MEを1.26mj添加）と血清を等量加え,37℃で60分25〃／を111日に加え，室温で60分間インキュベー卜した

間インキュベートし,2‑ME処理血清とした。凝集抗体後，凝集抑制した最終倍率をND‑HI{11iとした。

{l1iの測定はU底マイクロプレートの各ウエルに0.05%（3）ニワトリ伝染性気管支炎ワクチン抗体価(IB‑SP値）

ニワトリ伝染性気管支炎ワクチン抗体価の測定には，

牛血清アルブミン（シグマアド'ノッチ株式会社，東京郡）

添加PBSを50"ずつ分注し,1列目のウエルに未処理
ⅡⅡ情と2‑ME処理￨Ⅲ情を各々50"注入し，タ,イリュー

上述のND‑HI価の測定に供したものと同じ血清を用いターを11]いて2倍段階希釈をを行った。その後，再度各た。IBエリーザキット（アイデックスラボラトリーズ株

ウエルにPBSを50 加え,1分間振動混和後,24時illl

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伊丹ら：脱塩濃縮梅酢と免疫応答
室温にて湿潤箱で靜置した。凝集の得られた最高倍率をJlO5

考 察

もって凝集抗体価とした(MunnsandLamOnt,1990)｡

得られた数値は，ブルセラ・アボルタス抗原に対しての鶏の免疫機能には，生体内に侵入した異物をマクロIgG抗体価(2‑ME処理llll清の抗体価）およびIgG+IgMファージや頼粒球などが負食する日然免疫能とリンパ球抗体価(2‑ME未処理血清の抗体価）とし，両者の差をによる推得免疫能があり，それらが多様に連動しているIgM抗体価とした。

ことが知られている(Zekariasem/.,2002)。獲得免疫

4．統計分析

は，細胞性免疫と液性免疫に大別され，このうち遅延型各測定項￨｜については，分散分析とDuncanの多重検過敏反応は細胞性免疫応答の一指標として考えられる(Cookααj"1982)｡本実験では，遅延型過敏反応を測定定で解析した｡P<0.05を有意差があるものとした。

したところ,492LI齢に0.07%区で対照区に対して有意結 果に高い数値を示した。このことは,BX70は細胞性免疫フィトヘマクルチニンP接穂による遅延型過敏反応に及ぼす影響を表lに示したo210および387日齢では，応答の冗進に有効で，特に産卵後期で高い効果があることを示す。

添加各区と対照区との間では有意差は認められなかった

液性免疫への影響の評{illiとして，ワクチン抗体{'lliへのが，492日齢では0.07%区が対照区より有意に高い値を影響，自然抗体としてのIgG,ブルセラ・アボルタス抗示した。

原に対する血液巾凝集抗体価の測定を実施した。ワクチ

ND‑HI価については,215,320,428および500日齢

ン抗体IIIIのうち,ND‑HI価は各日齢で0.07%区およびで，007％区および2.80%IXが対照区より有意に高い数2.80％区が対照区より有意に高かった。一方,IB‑SP値値を示した。500日齢では,2.80%区0.07%区およびは．428日齢および50011齢において0.14%区が対照区0.14%区よりも有意に高くなった（図l)｡IB‑SP値はより有意に高かった。すなわちBX70はND‑HI価に対215および320日齢ではBX70による有意な影響を示さ

しては産卵前期から後期まで効果が認められ,IB‑SP値なかったが，428および500FI齢で0.14%区が対照区よに対しては産卵後期のみで効果が得られると考えられり有意に高い値を示した（図2)。

る。このことは,BX70の添加はND‑HI価とIB‑SP値のlⅢ清中IgG儂度は,218日齢で0.07%区および2.80%区で，429日齢においては280％区で,501日齢においいずれにも効果があると思われるが，有効な時期がワクチンの種類で異なる可能性が示唆される。ては0.07%区で対照区より有意に高い数値を示した（図IgGはワクチン接種鶏を用いたので，育成時に接種したワクチン及び環境中に存在する異物に対する抗体のレ3)。

ブルセラ・アボルタス抗原に対する血液中凝集抗体価

ベルを！又映していると考えられる。これらは，異物が生では,241FI齢では0.14%区のIgG+IgMが対照区より体内に侵入した際に広い範囲の抗原を認識して不活化す有意に高い数値を示した。417日齢のIgGは,0.14%区る役割を持つと考えられる。日齢とBX70の添加濃度にが2.80％区よりも有意に高い他を示したが,IgG+IgM一定の傾向は示されなかったが,BX70添IⅡは試験期間およびIgMについては添加区と対照区との間に有意差中全体においてIgG濃度を高める傾向を示した。

は認められなかった（図4)。

ブルセラ・アボルタス抗原接橦に伴う血液中凝集抗体

表1.産卵鶏へのBX70給与がPHA‑P反応に与える影響
PHA‑P値

(mm)

試験区分

ｂａａａ

1921‑￨齢．ｈくり

４８５８８８６９１１１２００００
士士士十一０８９２６８７８８５２５０１１１＋｜＋｜＋｜士９６６４９８９０３２１１００００38711齢

６５７５０５９６２４８５１１１１0．14%BX70

士士十一士

0.07%BX70０４０６８６５６００００００００

対照区

３１８３０３２８２３３４００００

210日齢

2.80%BX70

数値は平均値±標準誤差(n=10)。
￨!TI列異文字間で有意差あり(P<0.05)。
PHA‑P値=(PHA‑P接種後の肉垂の厚さ正の厚さ−接種前の肉垂厚さ）

接種前の肉垂の厚さ)‑(PBS接種後の肉Copyright ©2006, Japan Poultry Science Association
日本家禽学会誌43巻J3号(2006)

JlO616■対照区□0.07％BX7014□0．14％BX70□2,80％BX7012１

肴四○一︶眉︸壬１ｏｚ

０８６aa̲Laab̲LTb … 零1儒，鑑』

一欝篭

aa

僧L 臘bT

４２０215320428500

日齢IXll

BX70の飼料添加が異なる￨ ￨齢の産卵鶏のニューカッスルワクチン抗体価に及ぼす影響(ND‑HI価
数値は平均値±標準誤差(n=10)。
各日齢内で異文字間に有意差あり(P<0.05)。

5■■

■対照区
□0.07％BX70

ap0､14％BX70

4□2．80％BX70
ab︵Ｑ︑の︶四一口の１ｍ︸

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2 1 5 3 2 0 4 2 8 5 0 0

日齢
図2

BX70の飼料添加が異なる日齢の産卵鶏のIBワクチン抗体価(IB‑SP値）に及ぼす影響
数値は平均値士標準誤差(n=10)。
各日齢内で異文字間に有意差あり(P<0.05)。

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伊丹ら：脱塩濃縮梅酢と免疫応答25JlO7■対照区□0−07％BX70
画0．14％BX70□2.80％BX70

20aab

１５０１
言工﹄津野︲永距嘩字︵｜Ｅ勘Ｅ︶剖再熈目

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日齢

BX70の飼料添加が典なる￨I齢の唯卵鶏の￨mi'￨1IgG濃度に険ぼす影響
数値は平均値±標準誤差(n=10)。
各日齢￨ﾉ1で異文字間に有意差あり(P<0.05)。

図3６１４１■対照区□0.07％BX70□0．14％BX70

へ□2.80％BX70

ｨ nａ○１■ｌ里垂握眺蕊廿艇目

ー０８６４bDIと‑ab.「｡
Ⅱ鴬

２０,;
II箙
IgG+IgMIgGIgM

耐IM

IgG+IgMIgG

241日齢
図4

IgM

417日齢

BX70の飼料添力llが異なる日齢の産卵鶏のブルセラ

アボルタス抗原に対する血清1二￨I凝集抗体｛lliに及ぼす影響
数lli'[は平均値±標準誤差(n=10)。
各￨￨齢内で異文字間に有意差あり(P<005)。

価は生体内に侵入した異物に対するT細胞非依存'￨ﾉkのは口I榊￨生抗1%｛に対して右効な免疫反応を示す（国安，

抗体産生の機能を反映しており(MunnsandLamont,1985)。今￨ロlの結果では，雌卵前期(24111齢）では,IgG

1990),鶏の抗体産生過程では，他の動物と同じく初1りlに+IgMが0.14%区で対照￨;<に対して有意に高かったが，はIgM抗体，その後IgG抗体か距生されることが知ら産卵後期ではその差はなく,BX70の効果が産卵前期にれている（国安,1985)｡IgM抗体は，ウイルスや細菌な有効であった。

どの粒子状抗原に対してよく産生され，一力.,IgG仇休これらのことから，効果が認ぬられる日齢には異なるCopyright ©2006, Japan Poultry Science Association
J l O 8 日 本 家 禽 学 会 誌
ものの,BX70は細胞性免疫と，ワクチン抗体Ⅲ，自然抗体およびブルセラ・アボルタス抗原に対する抗体産生能で評価される液性免疫冗進に有効であると思われる。
制限給餌により液性免疫機能は低下するが，クエン酸を飲水摂取させることでその低下は抑えられることが知られている(Hadrie"/.,2004)｡BX70には，約4割以上のクエン酸をはじめとする有機酸が含まれていることから,BX70による免疫応答の冗進は有機酸の効果が関わる可能性が考えられる。ブロイラーにおいて，メチオニンの含量の増加が液性免疫応答や遅延型過敏反応を冗進すること（高橘ら,1992,Tsiagbe"""1987),バリン含量の増加がKD‑HI価を高めること(BhargavacZ"/.,1970),ナトリウム含量が液性免疫応答を冗進すること(PimentelandCook,1987)が知られている。これらのアミノ酸やナトリウムはBX70に含まれている（伊丹43巻J3号(2006)
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今後の検討を要する。
以上のことからBX70の産卵鶏への給与は，細胞性および液 腓免疫を兀進するものと考えられる。今￨ ''￨の試賊
では，免疫応答のBX70添加濃度による依存性は認められなかった。これは，産卵成績等に及ぼす結果と￨司様で50.1985.
MunnsPLandLamontSL.ResarchNote:Effectofあり，有効な添加濃度は0.07％〜0.14%であると考えら

ageimmunizationintrvalontheanamnesticre‑

れる。

sponsetoT‑cell‑dependentandT‑cell‑independent
antigensinchickens.PoultryScience,70:2371‑

謝 辞

2374．1991．

PimentelJLandCookME.Suppressedhumoralim‑
実験に使用したBX70を此￨司で￨州発，提供してくださった，株式会社紀I､￨､￨ほそ川（和歌山県みなく町)，
ND‑HI価およびIB‑SP値測定に協力してﾄﾞさった和歌
山県紀北家畜保健衛生所に深謝致します。

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J109

ImprovementoflmmunityResponsebytheDeionizedandCondensedUmeVinegarinLayingHens
Tetsuyaltami'、
Masahiko
Ueda',
TakashiKagawa',
Yorifilmi
Kuroda2
andYukinoriYoshimura3
IWakayamaPrefectureResearchCenterofAgriculture,PoultryFarmillgResearchLaboratory,Forestry,
FisheriesandLivestockExperimentalStation,Hidaka‑gun,Wakayama644‑1111
2WakaVamaLivestockHealthCenter,Wakayama640‑8483

3GraduateSchoolofBiosphereScience,HiroshimaUniversity,Higashi‑Hiroshima739‑8528

TheaimofthisstudywastoexaminetheeHEctsofdeionizedandcondensedumevinegar(BX70)ontheimmunefunctionsinWhiteLeghornlayinghens.Experimentalbirdsaredivided

intofourgroups;control,0.07%,0.14%,2.80%groupswhichweresupplementedwithO,0.07,0.14,or2.80%ofBX70infbed,respectively.Eachgroupconsistedof50hensandwerekeptfree
accesstothefeedfrom70‑to510‑days‑old.Delayedhypersensitivitytest(DHT)using

phytohemagglutinin‑P(PHA‑P)wasperformedtoevaluatethecellularimmunity・Newcastle
diseaSeantibodytiter(ND‑HItiter),Avaininfectiousbronchitisantibodytiter(IB‑SPvalue),
IgGconcentrationsinserum,hemagglutinetingantibodiestiter(HA)toBJwce"αα加廊"s(IgG
andlgG+IgM)wereexaminedasparametersofhumoralimmunity.Thehenswhichwere

selectedrandomlywereusedforeachtest.TheDHTvaluewassignificantlygreaterin0.07%
groupthanincontrolat492‑days‑old.TheND‑HItitersweresignificantlyhigherin0.07%and2.80%groupsthanincontrolat215‑,320‑,428‑and500‑days‑old.IB‑SPvalueswere

signincantlyhigherin0.14%groupthanincontrolat428‑and500‑days‑old・SerumlgG

concentrationsweresignilicantlyhigherin0.07%and0.14%groupsat218‑days‑old,in2.80%
groupat429‑days‑oldandin0.07%groupat501‑days‑oldcomparedwithcorrespondingcontrol.
IgG+IgMtiterofHAtoBr"ce"αα加廊"swassignincantlyhigherin0．14%groupthancontrol
at417‑days‑old.TheseresultsshowthatBX70mayenhancecellularandhumoralimmune
functionsinlayinghens.

(JtZpα""eJD" α/q/PoM/"Scie"ce,43:"03‑JI022006)
Keywords:layinghen,deinonizedandcondensedumevinegar,immuneresponse