第 17 回

自己抗体と自己免疫シンポジウム- microRNA と自己免疫 -抄録集

2010 年 1 月 30 日 ( 土 ) 14:00 〜 18:00
丸ビルホール（東京都千代田区丸の内）プログラム■講演（14:05 〜 16:55）

1. RNA dynamics in stress and disease
Jack D. Keene（Duke University Medical Center）
座長：高崎 芳成（順天堂大学 膠原病内科）
Chairman : Yoshinari Takasaki（Juntendo University School of Medicine）

2. リウマチ性疾患における microRNA の臨床的役割
Clinical role of microRNA in rheumatic disease

池田 圭吾（順天堂大学 膠原病内科）
Keigo Ikeda（Juntendo University School of Medicine）

座長：小川 法良 ( 浜松医科大学 第三内科）
Chairman : Noriyoshi Ogawa ( Hamamatsu University School of Medicine)

3. microRNA 調節からみた関節リウマチ病態の理解
Approach to understand the pathophysiology of rheumatoid arthritis throughmicroRNA modulation

河野 誠司（神戸大学病院 検査部）
Seiji Kawano (Kobe University Hospital)

座長：岩本 雅弘 ( 自治医科大学 アレルギー・リウマチ科）
Chairman : Masahiro Iwamoto (Jichi Medical University)

Coﬀee Break (15:35 〜 15:55)
4. miRNA による骨・関節の発生と疾患制御メカニズム
miRNAs regulating bone and joint development and diseases

浅原 弘嗣 ( 国立成育医療センター研究所 移植・外科研究部）
Hiroshi Asahara (National Research Institute for Child Health and Development)

座長：倉沢 和宏 ( 獨協医科大学 呼吸器・アレルギー内科）
Chairman : Kazuhiro Kurasawa (Dokkyo Medical University, School of Medicine)

5. RNA サイレンシングと転移因子の抑制
RNA silencing and transposon silencing

塩見 春彦 ( 慶應義塾大学医学部 分子生物学教室 )Haruhiko Siomi (Keio University School of Medicine)

座長：室 慶直 ( 名古屋大学 皮膚結合組織病態学 )Chairman : Yoshinao Muro (Nagoya University Graduate School of Medicine)■ 特別講演（16:55 〜 17:55）
Autoantibodies to components of the microRNA pathway and aberrant
microRNA expression in autoimmune diseases
Edward K.L. Chan (University of Florida, Health Science Center)
座長：Jack D. Keene (Duke University Medical Center）
Chairman : Jack D. Keene（Duke University Medical Center）

1.

RNA Dynamics in Stress and Disease
Jack D. KeeneDepartment of Molecular Genetics and Microbiology,
Duke University Medical Center,Durham, N.C. 27710, USA

When cells and organisms are subjected to oxidative stress, inflammation and many common
diseases, effects on gene expression can be widespread. For example, DNA damage affects
transcription as the cellular response to survive and repair the damage ensues. While DNA responses
have been studied extensively during stress and disease, effects on RNA regulation also play
an important role in cell survival during chemical activation, stress and disease. For example, aposttranscriptional response can stabilize critical mRNAs following DNA damage that keeps theundamaged mRNAs accessible rather than producing defective transcripts from the damaged DNA
that will in turn produce defective proteins. In order to understand posttranscriptional RNA responses
to chemical activation, stress and disease our lab devised a probabilistic approach to investigate
RNA dynamics in mammalian cells. We used a leukemia-derived T cell activation model in whichcells are treated with a mitogen and a phorbol ester. Microarray analysis of mRNAs associatedwith the RNA-binding protein, HuR demonstrated global stabilization of hundreds of transcripts.
These HuR-associated mRNA populations changed over time of T cell activation and these mRNAs
encode functionally related groups of proteins including those forming the immunological synapse,
members of the WNT signaling pathway and many key cytokines and chemokines. In addition,
mRNA populations associated with HuR were highly enriched in microRNA targets, suggestingthat these are highly regulated subpopulations of transcripts that respond to T cell activation.
These dynamic RNA enrichment data were used to query a drug-gene-phenotype database andseveral specific compounds were revealed that include known anti-inflammatory, anti-aging andanticancer drugs such as Resveratrol, Geldanamycin, Valproic acid, Trichostatin and others. Whensome of these candidate drugs were tested, they were found to affect the HuR RNA-binding protein
demonstrating that these methods can reveal an under layer of the transcriptome that represents
global changes in RNA stability. These finding demonstrate that post-transcriptional RNA dynamics
and remodeling are biologically important features of the cellular response to chemical activation,induced stress and disease.

-4-2. リウマチ性疾患における microRNA の臨床的役割
池田 圭吾
順天堂大学 膠原病内科

マイクロ RNA（microRNA：miRNA）とは、細胞内に存在する長さ 20 から 25 塩基ほ
どの 1 本鎖 RNA をいい、ノンコーディング RNA（ncRNA：タンパク質への翻訳はされない）の一種である。詳細なメカニズムに関しては依然不明な点があるものの、miRNA は複数のタンパク質とともに複合体（miRNP）を形成し、miRNA の配列と部分的に相補的な配列を含む標的メッセンジャー RNA（mRNA）に作用して、翻訳を抑制することで遺伝子の発現を調節していると考えられている。
我々は、miRNP がリウマチ性疾患患者血清中に広く認められる自己抗体（抗 Su 抗体）のターゲットであることを証明し、さらに in vitro の研究において、自己抗体のターゲットである miRNP が、miRNA の標的となる mRNA を結合しており、TNF αなどのサイトカインやリポ多糖（LPS）の刺激により、細胞内の miRNP に結合している miRNA や mRNAの量が変動することを明らかにした。
これらの成果に基づき、リウマチ性疾患において miRNA が、その活動性や診断の指標となりうるのか、最近の論文や、現在進行中の研究で得られたデータを元に報告を行いた
い。

-6-

3.

microRNA 調節からみた関節リウマチ病態の理解
河野 誠司
神戸大学病院 検査部

miRNA は、種々の機序で 3ʼ - 非翻訳領域への結合を介して mRNA からのタンパク翻訳を負に制御すると考えられている。最近では、miRNA による転写因子蛋白の負の制御やその制御される標的転写因子による miRNA の発現制御（フィードバック）も既に知られており、従って miRNA のタンパク発現に与える影響は、単純な miRNA からタンパク質への一方向性の制御ではない。ここで、直接的作用のみを考えるという条件に絞れば、疾患において特定の細胞群で対照に比べて増加する miRNA は、一群の mRNA からのタンパク翻訳を負に制御することにより、生理的状態の維持に必要なタンパク質の相対的欠如状態を招く可能性が考えられる。逆に、特定病態下で低下する miRNA は生理的状態では負に調節されている mRNA からのタンパク翻訳を増加させることになり、特定タンパク群の相対的増加が病態を修飾すると考えられる。
関節リウマチ（RA）は関節局所への炎症細胞の浸潤と滑膜の異常増殖、それにともなう骨破壊を病態とする病因不明の疾患である。我々は、1 つの分子種で多数の mRNA からの蛋白翻訳を制御する可能性のある miRNA 分子が、RA の病態に関与しているかどうか、関与しているとすればどのように関与しているかを明らかにすることを目的として、特に RA 由来の滑膜細胞に注目して研究を行った。これまでに、RA 患者の末梢血単核球(Pauley KM, et al. Arthritis Res Ther. 2008) や RA 患者関節滑膜（Nasaka T, et al. Arthritis
Rheum. 2008）で miR-146 が高発現しているという報告や、RA 患者関節滑膜線維芽細胞(RA-FLS) で miR-155 が高発現している（Stanczyk J, et al. Arthritis Rheum. 2008）という報告がある。我々は、RA-FLS と OA-FLS の miRNA プロファイリングを行い、RA-FLS 特
異的 miRNA を同定し、その中から RA-FLS で低発現である miR-124a に注目し、解析した（Nakamachi, el al. Arthritis Rheum. 2009）。miR-124a は RA-FLS に強制導入すると、RAFLS を G1 arrest させ、MCP1、angiogenin、IL-8、VEGF などのサイトカイン / ケモカインの分泌を変化させた。さらに miR-124a は RA-FLS の CDK2 や CDK6 蛋白の発現を抑制し、
luciferase assay の検討からその作用は直接的なものであった。また miR-124a は RA-FLS
からの MCP1 の分泌を同様に直接的に抑制した。これらの結果から、我々は miR-124a の発現低下が一連の蛋白群、特に向炎症性サイトカイン / ケモカインや細胞周期タンパク、の高発現を招き RA 病態の形成に関与していると推察する。このように RA 病態で増減する miRNA の分析から RA の病態理解が進み、新しい診断・治療法の開発につながっていくと期待する。

-8-4.

miRNA による骨・関節の発生と疾患制御メカニズム
浅原 弘嗣
国立成育医療センター研究所 移植・外科研究部

近年、小さなタンパクをコードしない RNA、いわゆる small non-coding RNA の生理学的および多くの疾患における重要な機能が次々に明らかにされている。中でも、あらゆる組織、臓器の発生に関与し、免疫、発がん、老化などの医学の重要な局面を制御することが明らかとなってきている miRNA が注目されている。
我々は関節リウマチ由来の滑膜組織においては、miR-146 の発現が高いことを報告している。この miR-146 は Baltimore らによって、THP-1 細胞をもちいて、TNF- αの刺激によって、NF- κ B を介して上昇すること、その miRNA の直接の ターゲットとして、IRAK1 などを同定し、TNF- αによる炎症刺激を収束するネガティブフィードバック機構として働くことが推察されている。 Stanczyk らは、miR-146 について同様の報告をしているのに加え、miR-155 も関節リウマチの罹患部位に特異的に高いことを報告している。Chan らは、関節リウマチ患者の末梢血におけるリンパ球を解析したところ、miR-16, miR-132,miR-146 そして miR-155 がコントロールにくらべ約２倍高いことを報告している。特に、
miR-146 と miR-16 は疾患活動性と相関がある ことを見出しており、新しい診断マーカとしての期待につながっている。
Dai らは SLE 患者からの末梢血リンパ 球をもちいて、miRNA を解析したところ、コン ト ロ ー ル に 比 較 し て、miR-196a、miR-17-5p、miR-409-3p、miR-141、miR-383、
miR-112、miR-184 の 上 昇 と、miR-189、miR-61、miR-78、miR-21、miR-142-3p、miR-342、miR-299-3p、miR-198、miR-298 の減少を確認している。さらに Tang らは、
リアルタイム PCR を用いた精査により、miR-146 が疾患において、優位に減少していることを報告した。miR-146 は type I interferon (INF) と Toll-like receptor-4 (TLR-4) のネガティブレギュレーターでもあることから、miR-146 の減少により、INF のシグナルが遷延化し、SLE の活動性の憎悪につながる可能性が考えられる。整形外科医・リウマチ医にとって最も多い関節疾患は変形性関節炎である。これら変形性関節症の軟骨細胞においては miR-140 という軟骨特異的な miRNA が特異的に減少していることが明らかとなった。
さらに、我々は変形性関節症の病態において組織障害性因子として働く ADAMTS5 などが、miR-140 の過剰発現によって強く抑制されることを見出した。すなわち、miR-140 は軟骨組織の恒常性維持に重要な役割をはたしている可能性が考えられる。また、中佐らは、上述の miR-146 が変形性関節症における軟骨細胞において上昇していることを明らかにした。変形性関節症における軟骨細胞のカタボリックな分子ネットワークは、IL-1 などのサイトカインで惹起されることが示唆されており、関節リウマチ、SLE の 病態と合わせて、miR-146 のリウマチ・自己免疫疾患・関節疾患における機能の解明が待たれる。

-10-

5. RNA サイレンシングと転移因子の抑制
塩見 春彦
慶応義塾大学医学部 分子生物学

RNAi は分裂酵母からヒトに至るまで進化的に保存された分子経路であり、20-30 塩基長程度の小分子 non-coding RNA が Argonaute 蛋白質と複合体を形成して、遺伝子の発現を配列特異的に制御、特に抑制する機構である。RNAi とその関連分子経路の解析から、私たちの細胞には siRNA、miRNA、piRNA 等様々なしかも膨大な数の小分子 RNA が発現しており、これらが染色体の修飾、RNA の安定性、mRNA の翻訳等遺伝子発現のほぼ全てのレベルでの制御に関与していることが明らかとなってきた。このような抑制機構は包括的に RNA サイレンシングと呼ばれている。RNA サイレンシングはトランスポゾン（転移因子）やウイルスの抑制に関与することでゲノムの品質管理や生体防御に寄与していることも明らかになり、この機構は原始的な免疫機構として進化してきたと考えられるようになってきている。
幹細胞の自己新生と分化に RNA サイレンシング機構が極めて重要な役割を担っていることが最近明らかとなってきた。幹細胞の特性は自己新生能と多様な細胞に分化する能力を併せ持つことである。このような性状は、隣接細胞（niche）やその他外界からの刺激への応答、転写および転写後の遺伝子発現制御、さらにはエピジェネティックな制御による複雑なバランスの上に維持されている。幹細胞を生み出す自己複製機構を明らかにするための最も良く研究されているモデル系の一つがショウジョウバエの生殖幹細胞である。
RNA サイレンシングの中核因子である Argonaute タンパク質は遺伝子ファミリーを形成しているが、生殖細胞にはそのサブファミリーである PIWI タンパク質が発現している。
ショウジョウバエ生殖幹細胞の自己新生と分裂には幹細胞 niche を形成する体細胞における Piwi の発現が必須である。Piwi は niche において piRNA と結合し転移因子の発現を抑制している。我々は生化学的および遺伝学的解析を用いて、PIWI-piRNA 複合体による遺伝子発現抑制機構と生殖幹細胞制御機構との接点を探り、生殖幹細胞と niche との細胞および分子間の相互作用機構の解明を目指している。本シンポジウムでは研究室の最新の成果を発表し議論する予定である。

-12-

<SPECIAL PRESENTATION>
Autoantibodies to components of the microRNA pathway and aberrant microRNA
expression in autoimmune diseases
Edward K.L. Chan
Oral Biology and Anatomy & Cell Biology
University of Florida
Gainesville, FL 32610-0424, USA

Autoantibodies directed against intracellular antigens are characteristic features of many humansystemic rheumatic diseases. Our laboratory originally defined novel cytoplasmic foci called GWbodies (GWB, also known as mammalian P bodies) using anti-GW182 antibody-positive humanautoimmune sera. Recent studies showed that GWB play a critical role in small interfering RNA(siRNA) and microRNA (miRNA)-mediated functions. In addition, several proteins enriched inGWB, including GW182, argonaute 2 (Ago2), Ge-1, RAP55, and LSm, were identified as targets ofautoantibodies. Anti-Su, reported in 10-20% of SLE and other systemic autoimmune diseases, wasidentified as Ago2.
MicroRNA are short RNA molecules that post-transcriptionally regulate mRNA via translational
inhibition and/or degradation. The role of miRNA in regulating the inflammatory response in humanmonocytes was investigated. Pro-inflammatory cytokine stimulation induced GWB formation
along with upregulation of miR-146a in THP-1 monocytes. In response to LPS stimulation, thenumber of GWB consistently increased by 2 fold at 8 hours after stimulation and this increase
was abolished when the miRNA-effector proteins Rck/p54 or argonaute 2 (Ago2) were depleted.
Since the level of miR-146a increased from 19 fold up to 100 fold during LPS stimulation, thetransfection of a miR-146a-mimic into THP-1 cells was examined. It was determined that miR-146aalone can induce similar changes in GWB. The comparable increase in the number of GWB wasaccompanied by a reduction in major cytokines induced by LPS. Further studies in our laboratory
demonstrated that miR-146a was shown to be critical for endotoxin-induced tolerance. These datashow that the increase in size and number of GWB may serve as a biomarker for miRNA mediatedgene regulation, and miR-146a plays a significant role in the regulation of LPS-induced cytokine
production in THP-1 cells. These findings have clinical significance for patients with autoimmune
diseases such as rheumatoid arthritis and SLE where the over-production of inflammatory cytokines
is critical in disease pathogenesis. Data on the aberrant expression of some of these importantmiRNA in SLE and rheumatoid arthritis will be presented.

-14-世話人：山本一彦（東京大学 アレルギーリウマチ内科）
高崎芳成（順天堂大学 膠原病内科）
三森経世（京都大学 臨床免疫学）
Jack D. Keene（Duke University, Medical Center）
後援：

株式会社 医学生物学研究所