Copyright ©2003, Japan Poultry Science Association
日本家禽学会誌,40:c"3‑J20,2003

AFLP法による日本ウズラ選抜系統の遺伝的特性の分析
朴君・下桐猛l).前田芳實l).岡本悟2）
鹿児島大学大学院連合農学研究科，鹿児島市郡元890‑0065！)鹿児島大学農学部，鹿児島市郡元890‑0065
2)佐賀大学農学部，佐賀市本庄町840‑8502

本研究は，当研究室で日木ウズラの6週齢体重を指標として選抜・造成した体重大系統(LL)と体重小系統(SS)及び対照閉鎖集団として33年間維持してきた無作為交配集団(RR)の3系統について，それらの系統の遺伝子構成と3系統間の遺伝的近縁関係を明らかにすることを目的として,AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism:増幅断片長多型）法を用いて解析を行った。
選択的プライマー15組合せのうち14組において明瞭なAFLPバンドが検出された。AFLPバンドの総数は，計328本であり,177本の多型バンドと151本の非多型バンドが確認された。多型バンドのうち，45本は系統特異的なバンドであった。さらに体重選抜系統(LL･SS)は，体重に関わる遺伝子群が両極端にホモ化している可能性があり,AFLP分析で得られた多型バンドのうち，系統固有のバンドは14座位が確認された。多姻応付の割合はRRが0.548で一番高く，次はSSが0.503で,LLが0.441で一番低かった。

プライマーの組合せ14種類で得られた多型座位177座位から求められたBandSharing(BS)値は系統内では,LL系が0.817,SS系が0.810,RR系が0.740で，系統間ではLLとSS間が0.563,SSとRR間が0.536,LLとRR間が0.503であった。

各系統における遺伝距離(D=1‑BS)に基づいて平均距離法(UPGMA)で描いたデンドログラムでは，ウズラ3系統が系統こ､とにクラスターを￨:,'if成し,3つのグループに分けられた。これらの結果は,80世代以上もの問閉鎖集団として維持されてきた歴史を示唆するものである。また，系統間の位置関係
はLLとSSがクラスターを組み,RRがアウトグルーフ･として描かれた。これは，前述した系統間で得られるBS値の平均値を反映しているが,3系統間のBS値はほぼ同じ値であるので，分析個体数を増やすことによりさらに追究する必要があると考えられる。

キーワード:AFLP法，遺仁的構造，選抜系統，日本ウズラ

一一一目緒1993)。これまでウズラの選抜に伴う遺伝子描成の変化に関して多くの研究成果（前田ら,1978;Maeda"(z/.,特定の経済形質に対する選抜は，世代の更新に伴い着1980;Maedaaaj.,1981;Ardiningsasi"".,1993;万年

実に能力の改善が行われ，新しい特性を有する系統が作ら,Z993;M"""".,1997,1999)が発表されている。

出される。そのような能力の変化には，当然のことながArdiningsasiら(1993)及び万年ら(1993)は，本研ら，選抜形質に関与している辿伝子構成の変化や相関反究と同一ウズラ系統(LL,SS及びRR)についてそれ応としての間接選抜形質にも変化が起こる（前田ら，ぞれ蛋白質多型及びDNAフィンガープリント法を用い2002年9月19日受付2002年11月22日受理

及びSSの3系統間の遺伝的関係はこれらの2報告間で連絡者：朴君
住所：〒840‑8502佐賀県佐賀市本庄町l番地

一致した結果が得られていない。て遺伝子構成を解析している。しかしながら,LLとRR

佐賀大学農学部，動物生産学研究室

AFLP(AmplifledFragmentLengthPolymor‑

Tel：0952‑28‑8734

phism:増幅断片長多型）法は,1995年にVosらによっFax：0952‑28‑8735て開発されたDNAフィンガープリント法である。本法

Email:kdO107@edu.cc.saga‑u̲ac.jp

は，ゲノムDNAを2種類の制限酵素で￨析片化し，人工Copyright ©2003, Japan Poultry Science Association￨｜本家禽会誌40巻J1号(2003)

J14

アダプターを{､l川した後，その'￨'から特定の配列を持つものだけを選択的にPCR増幅させる方法である。従って①時間と手間がかからない上，一度に得られる情報量が多い，②事前に塩基配列などの情報を必要とせず，ゲノムワイドな解析が行える，③御られるデータの再現いった特徴がある，などの利点がある。それゆえ，selectlve‑PCRr，

Pl･imGlbequenc(ヨ５５Ｆ︑５報が必要でなく基本的にどんな生物種にも適用できるとブライマー

Table1.Primerusedinpre‑selectivePCRand

１Ｅ
１Ｅ
２Ｅ
３Ｅ
ＩＩＩＩ
Ｒ
ＲＲ
Ｒ
Ｏｃ
０ｃ０Ｃ
ＯＣ
Ｅ
ＥＥ
Ｅ

性が高い，④サンプルが微量ですむ，⑤既知のゲノム情表1.pre‑selectivePCRとselective‑PCRでlllいた

gactgcgtaccaattca
gactgcgtaccaattcaac
gactgcgtaccaattcaag

AFLP法は，マイクロサテライトなどのDNAマーカーの非常に優れたfj川な多型検出法であると考えられる。

T(ZOI‑Tll

T"91‑TI2ＣｇａＣへど

本研究は，多jW』性の検出に優れたAFLP法により，当gactgcgtaccaattcaca

ａａａａＣＣａａａａＣａａＣａａａａａｇ貝︺９貝︺９ｇｇ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣａｇａｇａａａｇｇａｇａｇｔｇｔｔｔｔｔｔ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣ
ＣＣＣｔｔｔｔＣｔｔＣ
ｔｇａ
ｇｇａ
ｇｇａｇｇａｇｇａ
ｇｇａ
ｇｇａｇｔｔｔｔａｔｔａｔａｇｇａｇａｇａｇｇａｇ
５５５５５５５

開発が他の家畜に比べて非常に遅れているウズラには，T(zql‑TI研究室で日本ウズラの6週齢体重を指標として選抜・造Tq91‑T2成した体重大系統と体重小系統及び対照閉鎖集団としてTfzql‑T3維持してきた無作為交配集団，3系統の遺伝子構成をl1月

Trzql‑T4らかにすると共に，3系統間の迩伝的類縁関係についてT(zql‑T5検討を行った。

材料及び方法1．供試ウズラ及びAFLP法

Sharing(BS)値を用いた。BS式は次式であらわされる[(Dunningtonら,1990),(BS=2Nab/(Na+Nb))]。

本実験では長期間の選抜により選抜限界に達している

ここでNabは個体aと個体bに共通する多型バンドと思われる休孟大系統82世代，体重小系統83世代及び数,NaとNbは個体aとbのそれぞれの多型バンドの閉鎖集団として長期間維持してきた無作為交配集団83総数である。つまり，2個体間で全バンドが共通であれ世代から各系統とも家系当たり雄1羽ずつ計8羽を用い(jiBS値はlとなり，逆に共通なバンドを全く持たなけた。DNAは血液（赤血球）から抽出し,Knorr(1999)ればBS値はOとなる。の手法を参考にO.D.測定で得た結果をもとにDNAのまた，系統間の遺伝的類縁関係は,BS値をもとにデ濃度を100ng/"/に調整した。膿度を一定に調整したゲンドログラムを作成して評価した。デンドロク､ラムの作ノムDNAを特定の6塩基を認識するEcoRI

成には，遺伝距離を求める必要があるが，その遺伝距離(TOYOBO)と4塩基を認識するT"I(NewEnglandにはBS値から求められるD値を採用した。D値は，以Biolabs)の両制限酵素で切断処理してアダプターをラ下の式で与えられる,(D=1‑BS)｡

イケーションさせた。アダプターを接続した制限酵素処

この値に基づいて，平均MIM法(UPGMA)によりデ理産物をプライマーEllとT11及びEllとT12の2fll

ンドログラムの作成を行った。デンドロク､ラムの作成は合せで1次PCR(pre‑selectivePCR)増幅を行った。そ分子進化遺伝学解析ソフトウェアであるMEGAver‐

こで，もう2塩基（合計3塩基）付加したフ･ライマーをsion21(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis)用いて，本実験では15組合せで2次選択PCR(selec‑を用いた(Kumar"".,2001)｡

tivePCR)を行った。1次と2次PCRに使われたフ・ライマーの塩蜘肥l1を表lに示した。
PCR産物のバンドパターンを得るためポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を行った。ゲルは尿素をJToI)!は全多型バンド数に対する系統内で多型があったバンド数のf!lill合で求めた。
虫 士 E 日川口

不変性剤として加えた縦40cm×横35cmの6%変性ポリl)AFLPの結果

アクリルアミドゲルを用い，日本エードー社製の電気泳

体重選抜ウズラ2系統(SS及びLL)と対照閉鎖集団動装置でゲル淵度32℃以下に保ちながら定電力40W(RR)から得られたAFLP像を図lに示した。AFLPバで約2時間半'!u気泳動した。サイズマーカーには100bpンドが選択I!￨<jプライマー15組合せのうち14組においてladdermarkel‑を使用した。

検出された。それらを纒めると表2と表3のとおりであ2．分析方法

る。AFLPバンドの総数は，計328本であり．1組あた系統内及び系統間の遺伝的類似性の指標としてBandりの平均バンド数は22本であった。このうち，全バンド

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T 1 F

朴ら：日本ウズラの遺伝的特性の分析
SSRRLtjlO

L123456781234567812345678

f殿曇弁L麹蕊

家癖

蕊…ゞ

図1.SS,RR皮びLLの3系統から得られたAFLP像
Figl・ResultsofelectrophoresisbyAFLPmethodinSS,RRandLLlines.

SS:体重小系統,SmalllineRR:雌作為交配集団,RandombredpopulationLL:体重大系統，
Largeline

l〜8：各系統内の個体番号,Codeofindividualbirdinline.

数の54％に相当する177本の多型バンドと151本の非UPGMAでl,',Iiいたデンドログラムをlx￨2に示した。図2

多型バンドが確認された。lプライマー組合せあたりのに示されるように，本実験で供したウズラ3系統が系統

多型バンド数はEcoRI‑E3‑T"91‑TIにおける30本が最ごとにクラスターを構成し，3つのグループに分けられ多であり，平均1l.8本であった。多型座位の割合た。これらの結果は，80世代以上もの間閉鎖集団とし(Ppoly)はRRが0.548で一番高く，次はSSが0.503て維持されてきた歴史を示唆するものである。また，系

で,LLが0.441で一番低かった。

統間の位置関係はLLとSSがクラスターを組み,RR2）系統内及び系統間でのBS値の比較がアウトグループとして描かれた。これは，先述した

プライマーの組合せ14種類で得られた多型14141,):177

BSI￨uの系統lHlで得られるBSIII11の平均を｝又映している座位から求められたBandSharing(BS)値を表4に示が，先述のように3系統間でBS値はほぼ同値であるのした。系統内でのBS値は,LLが0.817±0.039,SSがで，この関係は個体数を増やすなどの更なる調査の余地

0.810±0.028となり，ほぼ同値を示したのに対して,RRがあると考えられる。

で0.740=t0.037と少し低い傾向が見られた。一方，系統

4）系統特異的なマーカーの検索￨川のBS値についてみると,LL‑SS間で0.563士0.046,

本研究で川いたウズラ3系統は80世代以上もの￨制，

SS‑RR間で0.536±0.035,LL‑RR間で0.503士0.034と閉鎖集￨寸￨として維持されており，さらにLLとSSは体なり，両選抜系統とRRの比較で少し低い傾向がある

重で選抜されてきているので，各系統に特異的に検出さが，標準偏差を考慮するとほぼ同値であると考えられ，れるか，あるいは検出されないマーカーがあると考えら

3系統は互いにほぼ等しく離れた系統になっていると考れる。そこで，表には示していないが，多型座位177座えられる。

位のうち系統特異的なバンドを調べた結果，13組合せで3）デンドログラムの作成

合計45本の系統特異的なバンドが確認された。そのう

各系統における辿伝距離D=1‑BSに基づいて

ちSSが26本で肢も多く，次はRRが11本で,LL"8Copyright ©2003, Japan Poultry Science Association
日本家禽会誌4()巻J1号(2003)

Jl6

表2．各プライマーにおける多型バンド数と非多型バンド数
Table2.Nos・ofpolymorphicandnon‑polymorphicbandsineachprimel
プライマーの組合せ

多型バンド数非多型バンド数

Combination

No．of

No．of

EcoRIEl‑T"91T2
EcoRIEl‑TQolT3
EmRIE2−TaoITl
EcoRIE2−TaqIT2

EcoRIE2‑7､q91T3
EcoRIE3‑TqqlTl
EcoRIE3‑T(z91T2４３４１
７１７５３１１１１１２ ７１ ０９９６４１

EcoRIEl‑T(z91Tl

EcoRIE3‑T"91T3０９０１１１Ｆ０４１

EcoRIEl‑T"91T4
EcoRIEl‑7上z91T5
EcoRIE2‑T"91T4
EcoRIE2‑TQqlT5
ECORIE3‑Ta91T4

総バンド数
Totalbands

７２３２９２７１７１９４
１１５３
９ ０８８１９１７１９１１２

polymorphicband non‑polymorphicband

４１ ９２２６０１０１１３３１２２o[primer

EcoRIE3‑T(zqlT5

合計(Total)

1頁1

177

11J1328

表3．AFLP法による主な結果
Table3.MainresultsbvtheAFLPmethod

多Ii'lバンドが得られたプライマーの組合せの激14/15
No.olcombinationofprimerwhichwas
detectedpolvmorphism

全 1 5 組 か ら 得 ら れ た 合 計 バ ン ド 数 3 2 8
Totalbandswhichwasdetectedinallcombinationofprimer

平 均 バ ン ド 数 / 1 組 合 せ 2 2
Averageno.ofbandspel‑combinationof
prlmel・

合計バンドに対する多型バンドの害￨￨合54.0%(177/328)
Proportionofpolymorphicbandstototalbands

最 多 多 型 バ ン ド 数 / 1 組 合 せ 3 0
Largestno.ofpolymorphicbandsper
combinationofprimer

平 均 多 型 バ ン ド 数 / 1 組 合 せ 1 1 ． 8
Averageno.ofpolymorphicbandsper
combinationofprimel‑

多lli!1414位の割合("ojy)SS:0.503,RR:0.548,LL:0.441
Proportionofpolymorphicbands

本で一番少なかった。

そこで，体重選抜系統間で両極端に固定されたマーカー

さらに，体重選抜系統は，体重に関わる辿伝子群が両を洲べた。つまり，このマーカーとは，分析に供したLL極端にホモ化している可能性があり,AFLP分析で得ら(SS)の8個体全てでバンドが認められるのに対して，れた多型のうち系統'''1で系統固有‑に固定されたマーカー

もう一方のSS(LL)の8仙休ではバンドが認められながあれば，それら迪伝子群に繋がり得ると考えられる。

いような多型マーカーである。その結果,SSで劣性ホモCopyright ©2003, Japan Poultry Science Associationﾄら：日本ウズラの遺伝的特性の分析
表4．各系統及び系統間におけるBS値の平均値及びその標準偏差
llト

事実，万年ら(1993)は,DNAfingerprint法で本実験

1 ･と同じ3系統を解析し，系統内のBS値がLLで0.62=tllnGandDe[weenllneS

0.12,SSで0.79士0.10,RRで0.57=tO.16と報告してお系統

SS(Line)RR■I０００＋｜士十一０３６６３１８５５０００SS

ラは，4世代に遡って近交を回避した交配が以前から行われていることが反映されているためだと考えられる。

Table4.BSvalueandstandarddeviationwithinUg

T1弓JlI

O28aり，木実験の結果もこれを支持している。

さらに，興味深いことは,SSとLLのBS値がRRの035bO.740±().O37a

BS値よりも高い値を示す点である。供試したウズラ3046bO.503=t0.034b0.817±0.039

系統は同じ交配システムで閉鎖的に維持されているのSS:体重小系統,SmalllineRR:無作為交配集で，ほぼ同じBS値になることが予想される。それにも団,RandombredpopulationLL:体重大系統，関わらず，両選抜系統のBS値がRRより高くなったこ

RR
LL

Largelineとの理由として2つの原因が考えられる。その1つは体BS値士標準偏差BSValue士S.D

重の大小方向への選抜により，特定のバンドの固定が進異符号間に1%水準で有意差あり。
Meanswithdifferentsurperscriptsare

statisticallysigniflcantdifferenceatl%level
amonglines(a,b).

んだこと，もう1つはRandomdriftによる固定である。

しかしながら，この'術Ⅱllはさらに追究する必要がある。
AFLP分析で得:られた多型座位177座位のデータから描かれたデンドログラムは,SSとRR及びLLが系統ごとに一つのクラスターを構成し，3グループに分け型に固定されたマーカーは，全多型マーカー177座位中られた。これらの結果は万年ら(1993)の報告と一致し4座位のみであり，他方,LLで劣性ホモ型に固定されたており，これらは3系統とも系統内交配で長期間，閉鎖マーカーは10座位確認された。

的に選抜，維持されてきた歴史が反映された結果である

考 察と考えられる。さらに，系統間の類縁関係は,SSとLLが近くに位置付けられ,RRが離れている結果となった。

本実験で使用した体重大小系統は，長期間の選抜より

この結果は，万年ら(1993)の報告ともArdiningsasiら

LLがSSに比'肢して雌雄とも6週齢体重でおよそ5倍(1990)のタンパク質多型を解析した報告とも異なって大きく，顕著な体重差が認められる。このような辰期間いた。しかしながら,*IJI究で得られた3系統間のBSの選抜が系統内あるいは系統間で遺伝的にどのように反値は,LL‑SS間で0.563±0.046,SS‑RR間で0.536=t映されるのであろうか？そこで，ゲノムワイドに多型0.035,LL‑RR間で0.503±0.034となり，標準偏差を考性の検出ができるAFLP法によりLL,RR及びSS系盧するとほとんど差が認められない。つまり，これらの統の遺伝子構成を調べた。

3系統は遺伝的にほぼ等しく離れた集団となっており，その結果，14組の選択的プライマーの組合せにより177本の多型バンドを得た。刀年ら(1993)の体重選抜ウそれゆえ選抜実験によって，系統の遺伝的構成に違いが認められたと推察される。

ズラにおけるDNAフィンガープリント像による分析で本実験で得られた多型マーカーのうち,LL及びSSは，3系統''1だけではなく，同一系統内ですら同じパで見られるそれぞれの系統固有のバンドは体重大小方向ターンを示すのは認められなかったと報告しているが，へ長期間選抜した結果，｜山￨定されたものと考えられる本研究でもそれが支持され，さらに，短期￨H1で150以上が，これらのバンドのlll現が体重大小の原因とどのようもの多型座位を検出できたことは,AFLP法がウズラのな関係にあるかは不Iﾘlである。しかし，体重選抜系統遺伝的特性の分析には，特に有効な手法であることを示(LL･SS)間で系統￨!Irl有に固定された合計14座位の唆している。

マーカーが認められ，体重選抜系統は，体重に関わる遺BS値の系統￨ﾉ1の平均値は,LLで0.817±0.039,SSで伝子群が両極端にホモ化している可能性があり，これら0.810±0.028となり，ほぼ同値であったのに対して,RRマーカーが体重に関与する遺伝子群の情報に繋がり得るで0.740±0.037と少し低い傾向が見られた｡Leeらと考えられる。ただし，ゲノム配列の95％以上はイント(2000)はニワトリの近交系8集団についてAFLP法でロンやスペーサーといった遺伝情報をもたない配llであ類縁関係を調べているが，系統内のBS値を0.91〜097

り，興味のある情報になることは少ないと予想されるのと碓定しており，我々の結果に比べて,奇<l11i定していで，体重に関与する有効なマーカーをもっと得なければる。この1噸囚としては，おそらく，我々の供試したウズならない。しかしながら，このような多型バンドをITil収，

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Ｉー

４Ｓ
６Ｓ
２Ｓ
５Ｓ
１Ｓ
３Ｓ
８Ｓ
７Ｌ
４Ｌ
６Ｌ
８Ｌ
５Ｌ
１Ｌ
７Ｌ
２Ｌ
３Ｒ
８Ｒ
２Ｒ
５Ｒ
１Ｒ
４Ｒ
３Ｒ６Ｒ
７ＳＳ
ＳＳ
ＳＳ
ＳＳ
ＳＬ
ＬＬ
ＬＬ
ＬＬ
ＬＲ
ＲＲ
ＲＲ
ＲＲ
Ｒ

日本家禽会誌40巻J1号(2003)

J18

一日一５００︐

図2.AFLPから得られた3系統のデンドロクラム

AFLP分析で得られた多型座位の有無により描かれたデンドログラムである。辿伝距離はD＝I−BS
を，系統樹作成はUPGMA法を川いた。図lを参照
Fig2.DendrogramconstructedfromAFLPdatain31ines

ThedendrogramwasconstructedbyUPGMAmethodbasedongeneticdistance.Dvalue(D=1‑BS)wasusedforthegeneticdistance･SeeFig.1.

サブクローニング及び塩基配列情報を得て既知のマーカーとして，各系統に遺伝子が固定されているのか，あるいはそれらマーカーの染色体上の位置などを検索する
ことにより体重に関与する遺伝子群の情報をつかめるの

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日本家禽会誌4()巻J1号(2003)

120

AnalvsisofGeneticnaitsbyAFLPintheJapaneseQuailLines
ノSelectedforLargeandSmallBodyWeight
JunPiao,TakeshiShimogiri'),YoshizaneMaeda')andSatoruOkamoto2
TheUnitedGI‑aduateSchoolofAgriculturalScience,KagoshimaUniversity,Kagoshima890‑0065')GraduateSchoolofAgriculture,KagoshimaUniversity,Kagoshima890‑0065
2)GraduateSchoolofAgriculture,SagaUniversity,Saga840‑8502
Presentstudywasconductedonquailstoanalyzethegeneticpropertyoftwo

selectedlinesandabasedpopulation.Adivergentselectionfor6‑weekbodyweight
wasperformedforalong‑term83generationsinourlaboratory.Following31ineswere

established:LLandSSlineswereselectedforlarge(LL)andsmall(SS)bodyweight.
RRlinewasproducedbyrandommatinginaclosedpopulation(RR)asacontrolforthe
33years.Inthisresearch,thethreelines,LL,SSandRRlineswerecomparedbythe

AFLPmethod,whichiseffectivefordetectingthegeneticdiversityinthebase
sequence.

InfourteenoffifteencombinedprimerclearerAFLPbandshavebeendetected.

Thetotalnumberofbandswas328,includingl77bandsofgeneticpolymorphismand
151bandsofgeneticnon‑polymorphism.Inl77bandsofgeneticpolymorphism,45
bandswithlinespecincitvwerefound.FurtherfortheselectedlinesofLLandSS、

becauseofthepossibilityofhomozygotebothextremesingeneticsubgroupsowingto

bodyweight,141ocihavebeencon6rmedbyinvestigatingtheselectivemarkerfixed
onbothextremeswithinlinesbyAFLPmethod・Forthe"ojy,thatis(namely)
proportionofpolymorphicbandsthehighestwas0.548inRR,0.503inSSandthe
lowestwasO.441inLL,respectively.Thebandsharingvalues(BS),whichwere

calculatedfroml77bandsofgeneticpolymorphismforl4kindsofprimer,were0.817
inLL,0.810inSSandO.740inRR・BSvaluesbetweenLLandSSwere0.563,0.536
betweenSSandRR,and0.503betweenLLandRR.

ThedendrogrambyUPGMAobtainedfromthegeneticdistance(1‑BS)amongthe
selectedlines,whichwasconstructedfromtheclustersofthreeselectedlinesof
Japanesequail,wasdividedintothreegroups.Theseresultsshowthatthesustained

historyofthegeneticblockedgroupover80generations.Further,fromthepositions
ofgeneticdistance,LLandSSclusteredcombined,whereasRRwasout‑group・The
reasonmightbethattheBSvaluesweretheaveragedvaluesbetweenlines,whichwerealmostthesame.Therefore,itisnecessarytoincreasethenumberofbirdsfortheAFLPmethod.

(Jtzp(z"esePo""秒Scjg"ce,40:c"3〜cﾉ20,2003)

Keywords:AFLP,Genestructure,Selectedline,Japanesequail