(625)

奈医誌. 0.NaraMed.Ass.
)40，625‑629，平 1

コロイド金標識アンドロゲンによる犬の精巣内アンドロゲンレセプターの検索
奈良県立医科大学第 2解剖学教室
奥 田 喜 一 ， 橋 本 研 二 ， 中 山 正 成 ， 山 本 浩 司

HISTOCHEMICAL STUDYO NANDROGEN RECEPTORIN CANINETESTISB YA NANDROGENLABELEDWITHCOLLOIDALGOLDYOSHIKAZUOKUDA，KENJIHASHIMOTO，MASANARINAKAYAMA
andHIROSHIYAMAMOTO
The2ndDepartment0
1A仰 tomy，NaraMedicalUniversityReceivedAugust2
9，19
89
Summary: With a colloi
dalgold‑labeled androgen (5α‑dihydrotestosterone)，the
c
1e
u
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fS
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androgenr
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oublelystaine
dpost‑embeddingmethodi
nanelectro
nm
icroscopicstudy.
Thebindingofdihydrotestosteronetotheandrogenr
ecepto
rwasp
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yblockedby
pre‑stainingwithtestosterone. Theandrogenr
eceptorwasconfir
medtol
ocalizeatdiffusedc1eolus， condensed chromatin， interchromatingr
anules， peri‑chromatin onl
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c1earsapweres
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sandnuIndexTerms
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cr
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co
pi
ccollo
idalg
oldl
abele
d androgen，cstudy緒言る.この Dihydrotestosteron
巴ータンパク質複合体のゲルi
慮過およびイオン交換セノレロースでの物理化学的性状は精巣での精子形成にはアンドロゲ γ が重要な働きをしこれまでに報告されているアンドロゲンレセプターの性eydigている.このアンドロゲンは精巣の間質にある L状と一致しておりベ核内で、の遺伝子発現に関わってい細胞が脳下垂体から分泌されるゴナドトロピン(主にihydrotestosteroneが 有 力 視 さ れ て いるホノレモンは dLH)の指令によりコレステローノレなどから合成，分泌さる.このDihydrotestost
巴roneのアンドロゲンレセプタ

れ1)，精細管内に入り精子形成に働いていると考えられーへの特異的結合を利用すれば，組織内のレセプターをている.精細管内に占める全細胞核内に存在するアンド検出することが可能である.当該教室ではこれまでに

estosterone(63%)，5a‑
Dihydrotes‑
ロゲンを調べると Ttosterone(14%)，Androstanediols(23%)であり，しかも Testost巴roneと Dihydrotestosteroneの核内でのestosteroneは種々の核タンパク質と結合存在形態は， Tしているが， Dihydrotestosteroneはゲノレ源過で、は一本種々の低分子リカ守ンドにコロイド金標識してレセプターの検出を電子顕微鏡学的に検討してきた.宮高 (1983)5)

BSA‑
Goldでインシュリンレセプタ一(T3)‑
BSA‑
Goldでチロキシンレセプターを，また B
eppu(1989)
7)ががインシュリンを，牧浦(1985)6)がトリヨードチロニンのピーク，イオン交換セノレロースでは二本のピ‑:;で表コロイド金標識したエストロゲ γ やプロゲステロンでそooth
されるタンパグ質に結合していることがB

れぞれのセレセプターの細胞内局在について検討を行(1975)
2)，Wrightetal.(
1979)3)らにより報告されていい，これらのコロイド金法が有用であることを示してき(626)

奥 田 喜 一 〔 他 3名〉た.今回，この方法を用いてコロイド金標識 dihydrotes‑

ド金粒子径を揃えた. GPNTを含む 10‑30%の linearestosteroneで成犬の精細管内のアンドロtosteroneと tglycerin d巴nsitygradientにこの沈査を重層し， 目立ゲンレセプターの細胞内の局在について，電子顕微鏡学

RP40Tローターで 14，000rpm，4'C，30分間遠心した.
'
Cに使用時まで保存した. 5
11'ー
当該バンドを集め， 4的に検索した結果を報告する.

dihydrotestosteroneの標識も同様に行った.

方法と材料(3) Postembedding法による染色(a) 一重染色法

材料
精巣は当院に来院した外見的に正常と思われる雑種の犬の精巣の超薄切片を 0.
05%
Triton X‑
100‑
phosestosterone17β成犬(雄 2歳〉の去勢手術により得た. Tphatebufferedsaline (pH7.
4) (TBS) で 3TC，10分

dihydrotestosterone17β‑
hemisuccinate‑BSA，511'‑

間，前処理した後，適宜に TBS溶液で希釈したそれぞれ

同hemicalCo̲より購入
hemisuccinate‑BSAは MakorC，30の 17nmコロイド金標識ステロイドホノレモンで 3TC

hite resin (medium grade) は London
した. LR W

分間湿籍中で反応させた.反応後 0.05%Tw
巴叩 20‑
phos‑

ChemicalCo より購入した.その他の試薬類は試薬特級

phatebufferedsaline(pH7.
4) (TWBS) で室温下， 3および電子顕微鏡用試薬を使用した.

‑6時間洗浄を行った.さらに蒸留水で、洗浄後，酢酸ウラニーノレ，レイノノレド液で染色し，透過型電子顕微鏡方法(JEOL1200EX) で観察した.

(1) 精巣の固定と包埋去勢手術により摘出した精巣を直ちに氷冷した 2
̲5%(b) 二重染色法

glutaraldehyde‑0.
1Mリン酸緩衝液中で 1‑2mm'に細17nmコ ロ イ ド 金 標 識 5
11'‑dihydrotestosteroneと切りし， 4'Cで 2時間固定した.固定後， 0.25MSucrose

5nmコロイド金標識 testosteroneによる同一表面上でで一昼夜洗浄し，上昇アノレコーノレシリーズで脱水後，の染色を行った .TBSで前処理後， TBSで希釈したコロQuetol8
12エボシ樹脂および LRWhiteに包埋し，加熱

ihydrotestosteroneで 3TC，30分間湿箱中イド金標識 d重合した.超薄切片は Nickelgrid(200‑300mesh)にので反応させた.反応後， TBSで 5分間 3回洗浄後， TBS'Cに保存した.
せ，使用時まで 4で希釈したコロザド金標識 testosteroneを 同 一 表 面 で(2) コロイド金標識リガンドの作成

3TC，30分間反応させた後， TWBSで 3‑6時間洗浄を(a) 金コロイドの作成行い，前記と同様にカウンター染色して電顕観察した (D17nmお よ び 5nmコ ロ イ ド 金 は Slot and Geuse(1985) ら8)の方法により作製した. 17nmコロイド金は48mlの 0.01%HAuCI4‑4H20を 60'Cに温め， 1%クエンTassay). また逆の二重染色 (T‑Dassay) も同様に行った.

(4) 金粒子の数と面積測定mlを加え，ワインレッド色になるまで加酸ナトリウム 2

細胞内での核と細胞質の金粒子の数はそれぞれコロニ温し，さらにコロイド金を安定化させるために 5分間煮ーカウンターで数えた.核と細胞質の面積はライツ半自沸した. 5nmコロイド金の作製は 1%クエン酸ナトリウ

動画像解析装置 (Leitz‑A.
S.
M.
) で測定した.

ムを加える際に， 1%タンニン酸を 0.
5ml，25mM炭酸カリウムを 0.
5mlを加えて 17nmコロイド金の場合と同様結果と考案
コロイド金標識ステロイドホノレモンの作成はステロイに作成した.

(b) コロイド金標識リガンドの作成

ドホノレモンそれ自体が水に不溶なのでコロイド金標識す

ア ン ド ロ ゲ ン 結 合 BSAの コ ロ イ ド 金 標 識 の 方 法 はることはできない.そこでこれを可溶化するためと，まRoth(198)ら9)の方法で、行った 0.
05mgの testosterone

たコロイド金と結合させるために，ステロイドホノレモン.
lmlの再蒸留水に溶かし， pH未調製の金コ‑BSAを Oをキャリャーであるタンパグ質と結合させる必要があpH5.
3)
10mlに加えてよく混ぜた後， O.
l5ml
ロイド溶液 (る . そ の 方 法 と 物 理 化 学 的 な 性 状 に 関 し て は Deanの5%
polyethylen巴glycolを加え，標識したコロイド金(1971)
10)らが報告している.しかしこのステロイドホノレ%
glycerin，0.
05%poly溶液を安定化させた.この液を 5モン BSA結合物は現在数社より市販されており，このethylene glycol，0.02%NaN" O.
Ol%
Triton X‑
100

市販されたものを今回使用してコロイド金標識を行っ同(GPNT) に重層し， 目立 PRS65Tローターで 17nmはた. コロイド金の作成は Slot&Geuze(1985)
8)の方法

24，000rpm，5nmは 27，000rpmで 4'C， 30分間遠心した.

oth(1978)9)で 17nmと 5nmの 2種類を作成し，標識は RlotandG巴use(1985)8)の方法でコロイ得られた沈査を Sらの方法で行った.この概要を Fig.
lに示した.さらに

コロイド金標識アンドログンによる犬の精巣内ア γ ドロゲンレセプターの検索(627)

標識したコロイド金粒子径を揃えるためにグリセリン密の金粒子が観察されたが，他の希釈率でも 63‑69%でコ度勾配遠心した.この作成したコロイド金標識ステロイ

ロイド金標識ア γ ドロゲンがいずれの希釈率の場合も核ドホルモ γ が組織中のホノレモンレセプターに対して特異に特異的に結合していることを示したことからアンドロ的結合活性があるかどうかを検索するために 17nmコロゲ γ をコロイド金標識してもなおこの結合活性は保持しイド金標識テストステロン (TBG)，およびジハイドロテていると考えられる.

ストステロン (DHTBG)を連続希釈して，犬の精巣の精Fig.
2は同一切片上で異なる粒子サイズのコロイド金で標識したテストステロ γ(5nmTBG)，とジヒデロテ細管をそれぞれ染色した.精細管内のセノレトリ細胞で得able1に示した.今回作成したものを各々 20た結果を Tストステロン(l7nmDHTBG)で二重染色し，セノレトリ‑80倍希釈した時，細胞中の核内にある金粒子数の単位細胞内の核と細胞質でのジヒドロテストステロンによる面積当りの比 CN/N+C)は TBGでは 60倍希釈のもの

金粒子の単位面積当りの数のみをグラフにした結果であ0倍希釈のものが最も良かが最も良く， DHTBGでは 4ssayは TBGで最初に染色し，同一表面上でる. T‑Daった.またこの希釈率の場合に両者ともに核に 75%以上DHTBGで後染色した場合を示し， D‑Tassayはその逆∞日ρID.此叩LD1AB乱I
郎 toANOO!∞凹旧制O
阻0.
05n巴oftheconjugatew
asdissolve
din0.
05m1ofD.
ι.
w.

0‑
8‑223. A叩 佃阻・国mixing

Oconjugate:
5<<‑
Androstan‑
17P‑ol‑3‑oneh阻むsuccinate:
BSAolutionpreparedbySlot&Geuze(1985)
10m1 ofcolloida1golds

after2‑
3min，additio
nof0.
15mlo
f5%polyethyl
e皿 glycol俄20，000)

十寸…

・centr
i
fu
gatio
na
t24，000‑
27，000r
伊 Ifo
r30minat2ch0.
5mlo
f5% 戸

Z 附

ω01% 副zuni
forml
ysizedcolloidalgoldl
abeled叩andr喝og凹enh加o悶 p鴎Fig.1. Thelabelingprofi1eofthedihydrotestosterone:BSAwiththecolloidalgold.

(628)

奥田〔他 3名〉喜である.いずれの場合も TBGは過剰の 20倍希釈を用chromatin領域へ結合を示し，核小体， interchromtin0倍希釈を用いた. T‑Dassayでの核い， DHTBGは 4granules，perichromatingranulesや，ここでは示して内の DHTBGの金粒子の数は1.20:
t0.
15，D‑Tassayでいないが condensedchromatinへの結合はほとんど見.
09:
t0.
16で T‑Dの核内の DHTBGの 金 粒 子 の 数 は 4られなかった.アンドロゲンレセプターの細胞内の存在

assayではジヒドロテストステロンの結合物の大部分へテストステロンで、マスクされていることが示された.逆ストステロン結合タンパク質はマスクされていないこと

ssayの反応時間と反応を示しているが，これは両者の a温度が同一条件であることから，テストステロンとジヒドロテストステロンの親和定数の違いによる結果と考えられる 11) 一方，細胞質中の D の 金 粒 子 の 数 は T‑Dassayでは 0.
34:
t0.
06，D‑Tassayではl.38:t0.
13であ，り Table1で示した結果とも一致し，細胞質中にも細胞全体の約 2割のレセプターが存在しており，新合成のnunuされた.しかし T‑Dassayでは約三分のーのジヒドロテロohHω 判ωMHuh﹄H白 川HomωHU叶μM咽 向 咽 同ouOHwmω 判O的にある特定のタンパク質へ結合することを示した.金粒子数で Table1で示した結果とも一致することが示{N巨ユ}ω

く3.4倍近い値を示し，ジヒドロテストステロ γ が特異'Qη4にジヒドロテストステロンで最初に染色した場合を T‑

Dassayの場合と DHTBGの金粒子数を比較するとやレセプターが認識されているのかもしれない.この二重1979)3)の報告に述
染色の結果は WrightandFranken(べられているようなジヒドロテストステロン特異的結合物が核内にあることを示した結果と一致し， これがアンO(N) (C)

ドロゲンレセプターと考えられ，今回のコロイド金標識

T‑D assay

ジヒドロテストステロンがこれを認識していると考えられる.
次に，このアンドロゲンレセプターの精細管内の各細胞内局在についてセノレトリ細胞で見ると， Fig.3に示す

iffusedようにジヒドロテストステロンは核内の dF
ig.2. The densityofthedihydrotestost巴r
onegoldpart
ic
1e
sinanuc
1巴uso
faSertolicell
巴dpos.
ofacaninetesti
sbydoublelystain
tembeddingmethod.T.DandD‑Tassays
weredescribe
dinmaterial
sandm
ethods.

︹NUCLEI(N)CYTOPLASM(C)N/N+Cx20x40
x60x80

1
8.
1
6:
t0.
62
10.
6
5士O578.
92土 0.
3
95.
7
8+0.
2
98.
64:
t03
640
9士0.
45
2.
80+
0.
532.
50士0.
2
96.
7
7士0.
117.
2
3:
t0.
2
67.
72+0.
3
2
7.
0
2土0.
2
5x20x40x60x80

48士1.0
51
7.
6.
1
2:
t0.
3
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9
8:
t0.
0
34.
13
士0.
228.
5
2士0.
5
12.
0
2+0.
.
1
51.7
4
:
t0.
0
71.7
8土 0.
2
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2土0.
0
97.
5
0士0.
2
1.
10
6.
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6土 0
7.
0
0:
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3
2

Jノ

TBG

︑
D

巴l. D巴nsityo
fthegol
dpar
tic
1esi
naSer
tolicellTabl

目

目

目

DHTBG

TBGi
sanassaybythecolloidalgoldlabeledtestoste
roneandDHTBGi
sanassaybythecol
loidalgoldlabeleddihydrotestosterone.(D)isaratiooft
hedi
lutionofeachsteroidlabeledwit
hcolloidalgold.(mean:tSE)
目コロイド金標識アンドログンによる犬の精巣内アンドロゲンレセプターの検索(629)

Fig.3. The dihydrotestosterone gold (arrowhead) wasstain巴dinaSertolicellofcanin巴testis.Nuleolus(NO)，cytoplasm(Cyt)andbasementmembrane(BM)
形態には非活性型と活性型の 2種類あり 12)，これらが核内でどのような分布をしているかは不明であったが，活性型も非活性型のセレプターも diffusedchromatin上979.
crinology104:1580，14) Chang， C.
H.， Rowley， D.R.， Lob!， T.
J. and.
J.・B
iochemistr
y2
1・4
102，1982Tindall，Dにあるとの結果を我々の最近の実験結果が示している

5)宮 高 和 彦 奈 医 誌 . 3
4:105，1983.

が1叫 4)，今回，得らわした結果はコロイド金標識したジヒド

6)牧浦宏男.奈医誌. 3
6 626，1985.

ロテストステロンがこの両者を認識しているのか，或は7) Beppu，K.・J.ElectronMicrosc.inpress.

非活性型のレセプターのみを認識しているのかは不明で、8)Slot，J.W.andGeu
晦e，H.
J.
:Eur.J.CellBiol3
8:

目

目

87，1985.

ある.

結 語
bov
in
eserumalbu
minに結合させたアンドロゲンをコロイド金標識する方法でも精巣組織内のアンドロゲンレセプターを検出し，これが細胞核内に特異的に存在することを電子顕微鏡による組織学的研究で示した.

4回 日 本 解 剖 学 会 近 畿 地 方 会
この論文の一部は第 6(1988年，関西医大〉にて発表した.

文 献1)Neaves，W.B.
:Contrac巴ption1
1:571，1975.

2) Booth，W.D.:Reprod.Fertil.42:459，19753) Wright，W.W. and Franken， A.L.: Endo‑9) Roth，J.，Bendayan，M.andOrcl，L.:J.Histo‑
978chem.Cytochem.26:1074，110) Dean，F.
D.
G.，Exley，D. andJohnson，M.W.:Steroids1
8:593，1971.
11)Liao，
S.andLiang，T.:MethodinEnzymology
36・313，1975.
12) Rowly，D.R.，Premont，R.
T.，Johnson，M.P.，
Young，C.
Y.
F.andT
indall，D.
J.
:B
iochemistry2
5・6988，198613) 中山正成，奥田喜一，橋本研二，別府謙一，山本浩
司.奈医誌. 40・3
15，198914) 中山正成，橋本研二，奥田喜一，山本浩司.奈医誌.
40 630，198
9目目