福岡水海技セ研報 第10号 2000年3月
Bull.Fukuoka Fisheries Mar.Technol.Res.Cent.,No.10March2000

スサビノリフリー糸状体のDNA簡易単離法
岩渕 光伸・渕上 哲(研究部)

Rapid DNAisolation from Free Living concocelis of Porphyra Yezoensis

MitsunobuIwABUCHI,Satoshi FUcHIGAMI*(Research DepaTtment)

フリー糸状体湿重量0.01〜0.02gをD.W.に取る

形態的な分化に乏しく,環境変異が大きいアマノリ類
ろ紙等で水分を除きチューブに入れるの種の同定や系統解析にDNA解析技術を利用するためSolutlOnIを300〟1入れ、ハサミで丁寧に締切するの研究が行われ,種の識別に関してはDNA塩基配列の解析が有効であると報告されている。ト3)しかし,産業的に重要なことはノリ養殖品種を識別することであり,Vortex

5秒

そのための塩基配列部位はまだ特定されていない。した春SolutionⅡを150μ1入れる

がって,現段階における品種の識別は,ゲノム全体を解春Vortex lO秒

析して多型を検出するRAPD(Random Amplified

春50℃

Polimorphic DNA)法やAFLP(Amplified Fragment

30分

時折混ぜる

☆
SolutionⅢを150μ1入れる

Length Polymorphism)法が有効であると考えられる。

☆
Vortex lO秒

AFLP法は再現性も高く,今後注目される手法であるが,

古RIまたはDNAシーケンサーを必要とするため一般的で水冷15分はない。RAPD法は手法自体は簡便であり,PCR装置

春
15,500rpm15分
春
上澄みを新しいチューブに入れ等があれば実験可能であり多くの生物種で試みられてい☆
PCIを350〜400るが,再現性に問題があるため慎重な条件設定を必要とする。このことから,水溶性多糖類を多く含むアマノリ☆
Vortex葉体からCTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)

春

15,500rpm法を使ってDNAを単離した場合,塩化セシウム密度勾

茅「

55分☆
上澄みを新しいチューブに入れる

配超遠心によってDNAを精製しなければ再現性の高い

古
100%エタノールを750〜800〟1入れる

RAPDパターンは得られないとMizukami et al4,5)はI報告している。しかしノリ養殖の現場では100種類を有lに越える品種が存在しており,6)それらをRAPD法によっ70%エタノールlml中に入れる☆
15,500rpmて解析,識別するためのDNAを調整する上で,非常に5分多くの時間と煩雑な手間を要する塩化セシウム密度勾配

春
ピペットで上澄みを除く

超遠心による精製を各サンプルごとに行うことは不可能☆
5〜10分乾燥☆
TEを50〟1入れてDNAを溶解するに近い。
今回我々は,スサビノリフリー糸状体からのDNA単離法について検討を加え,塩化セシウム密度勾配超遠心

図1による精製を行わなくても,再現性の高いRAPDパターンが得られるDNA単離法を確立したので報告する。
* 有明海研究所ー45‑

フリー糸状体からのDNA単離プロトコール
網掛けが改変部位

岩

図2

渕・渕

上

遠心分離によって回収したDNAのRAPDパターン
M:マーカー 1〜4:DNA単離回数℃2分,720cl分を1サイクルとして45サイクルを行っ材料及び方法

た。PCR後,2.0%アガロースゲルで電気泳動を行い,スサビノリ系の品種であるナラワ緑芽,ナラワ赤芽及RAPDパターンを調べた。

び福岡1号のフリー糸状体からDNAを単離した。単離結にはニッポンジーン社のISOPLANTを使用し,単離プ

果

改変プロトコールによるDNAの収量は品種によってロトコールは検討の結果,図1のように改変した。
ISOPLANTに添付されているプロトコールとの主な差は認められたが,1.5mlチューブ1本当たり約0.02gの改変点は,RNaseをSolutionIに加えること,PCI処理フリー糸状体を使用して1〜4μgであった。A260/2を2回行うこと,そしてエタノール添加後に析出したD

80の値はほぼ上9〜2.0,多糖類含量の目安となるA234NAをチップに引っかけて回収することの3点である。

/260は約0.5で,不純物であるタンパク質と多糖類の混このプロトコールで単離したDNAの対照として,100入は少ないと判断された。

%エタノール添加処理までは全く同様とし,エタノール遠心分離によって回収したナラワ緑芽とナラワ赤芽の添加後のDNA回収を,一般的な回収法である遠心分離DNAをプライマーOPB‑12(CCTTGACGCA)で処理しによって行ったDNAを用意した。チップによる回収,た結果を図2に示した。4回の単離DNAのRAPDパター

遠心分離による回収のいずれについても各品種ごとに4ンは,どちらの品種も大きな違いは認められなかったが回行って,同一品種4サンプルのDNAが同じRAPDパ完全には一致しなかった。しかし,チップで回収したDターンを示すかどうかでDNAの質を判断した。

NAをプライマーOPB‑12,OPB‑15(GGAGGGTGTT)及びOPB‑17(AGGGAACGAG)で処理した結果は,さらに福岡1号に関しては,遠心分離によって回収したDNAを塩化セシウム密度勾配超遠心により精製し,図3に示したようにナラワ赤芽,ナラワ緑芽ともに4回同様にRAPD処理を行って比較した。超遠心による精製の単離DNAのRAPDパターンはすべて一致した。

は,DNA溶液1mlあたり1.0gの塩化セシウムと20μl/福岡1号から遠心分離によって回収したDNA,超遠mlの10mg/mlエチジウムブロマイド溶液を加え,ペッ心によって精製したDNA及びチップにひっかけて回収

クマンNVT65.2ローターで55,000r.p.m.,15時間遠心をしたDNAをOPB‑11(GTAGACCCGT)及びOPB‑12の行った。紫外線照射下でDNAバンドを回収し,水飽和プライマーで処理したRAPDパターンを図4に示した。

ブタノールで3回処理してエチジウムブロマイドを取りチップによって回収したDNAではどちらのプライマー除き,エタノール沈殿によって精製DNAを得た。

でも4回の単離DNAにRAPDパターンの違いは全く認

RAPD処理はオペロンランダムプライマーKITBのプめられなかった。遠心分離による回収を行ったDNAとライマ‑,TaKaRaTaqポリメラーゼと添付のdNTP及

超遠心による精製を行なったDNAでは,明瞭な主バンびバッファを用いた。PCR反応条件はパーキンエルマー

ドの位置,濃淡に違いは認められなかったが,薄いバン社Gene Amp PCR System9700により,92℃1分ドには若干の違いが認められた。

37.5一46‑

スサビノリフリー糸状体のDNA簡易単離法

ナラワ緑芽
23ナラワ緑芽

ナラワ赤芽
4

1234

図3

図4

M

123

ナラワ赤芽
4

M

1

チップに引っかけて回収したDNAのPAPDパターン
M: マーカー1〜4:DNA単離回収

福岡1号のRAPDのパターンの比較
M: マーカー1⑳2:遠心分離によって回収したDNA
3◎4:塩化セシウム密度勾配によって精製したDNA
5〜8:チップに引っかけて回収したDNA

ー47一234岩考渕・渕

上察

要約ISOPLANTを使用して本報告で示した改変プロトコー

1)スサビノリフリー糸状体からニッポンジーン社のISルに従ってフリー糸状体から単離したDNAは,福岡1

OPLANTを使用してDNAを抽出した。抽出プロト号,ナラワ緑芽及びナラワ赤芽の3品種において,複数コールはフリー糸状体に適するように改変した。のプライマーでRAPDパターンが一致し,非常に質の高2)改変プロトコールによって単離した糸状体DNAのいことが明らかとなった。

RAPDパターンは,非常に再現性が高かったことか

この改変プロトコールによって不純物の少ない高品質

ら,DNAに含まれる不純物は少なく,質的に高いのDNAが得られた理由として次の2点が考えられた。

ことが分かった。

第1は,材料にフリー糸状体を使用したことである。

3)DNAの単離時間は,2〜3時間と従来の方法に比フリー糸状体中の多糖類含量についての報告はないが,べて2分の1程度であり,多くのサンプルからDN

おそらくフリー糸状体は,莫体に比較して多糖類の含有Aを単離するのに適していると考えられた。

量が少ないものと推測され,そのため不純物の少ないD文NAを得ることができたと考えられた。また現在,品種献の流通はもっぱらフリー糸状体で行われていることから,

1)Y.Mizukami,H.Kito,Y.Kaminishi,N.Murase and

品種識別,系統解析の研究を行なう材料としてはフリー

M.Kunimoto:Nucleotide SequenceVariationin

糸状体の方が葉体よりも適当であると考えられる。

the RibosomalInternal Transcribed Spacer

第2には,最終段階のDNAの回収において,チップ

ReglOnS Of Cultivated(Cultivars)and Field‑を使用してDNAを引っかけて回収することである。チッCollected Thalli of PoTPhyra yezoensis。

プを使用せず遠心によりDNAを沈殿させて回収した場

Fisheries Science65,5,788‑789(1999).

合でも,超遠心を行なったサンプルのRAPDパターンと

2)M.Kunimoto,H.Kito,D.P.Cheny,Y.Kaminishiand

大きな違いは見られず再現性はかなり高いと判断された

Y.Mizukami:Discrimination of Porphyra spe‑が,図2に示したように一部再現性の低いものも認めら

Cies based on Small subunit ribosomal RNA ge

れた。それらのものでもチップで回収することによってne。Journal of Applied Phycology,11,211‑216

RAPDパターンの再現性は高まったことから,この操作(1999).

3)國本正彦:アマノリ属の遺伝的多様性。海洋と生物はDNAの質的な向上に有効であると考えられた。
また改変プロトコールに従った場合,DNA単離に要21,24,308‑312(1999).

する時間は2〜3時間と比較的短時間であり,多数のサ

4)Y.Mizukami,H.Kito,M.Kunimoto and M.Kobay

ンプルでも同時に処理が可能であった。植物の代表的な

ashi:Effect of DNA preparation fromlaver

DNA単離法であるCTAB法によってフリー糸状体からD(Porphyrayezoensis)Thallionreproducibility of

NAを抽出した場合,その単離時間は約4〜5時間を要RAPD(random amplified polymorphic DNA)paする。多くのサンプルを調査するためには,DNA単離

tterns.JournalqFAplliedPhycology.10,23‑29

はできるだけ短時間であることが要求され,その点から(1998).

も有効な単離法であると考えられる。

5)Y.Mizukami,M.Okauchi,H.Kito and M.Kobayas
hi:Discrimination of Laver Cultivars with

本報告では品種ごとのRAPDパターンの多型性について考察は加えていない。しかし,図3を見ても分かるよ

RAPD

うに,ナラワ緑芽,ナラワ赤芽との間でRAPDパターン

Makers。

Fisheris

Science62,4,547車551(1996).に相違が認められた。また図3と図5のOPB‑12のパター

6)岩渕光伸:利用されている品種の問題について。西ンを比較しても明らかな違いが認められた。このことか

海区ブロック藻類介類研究会報,第6号,pp.13‑

ら,RAPD法によって品種の識別が可能であると推測さ

16(1989).

れ,今後多くの品種を調査することによって,品種識別や系統解析に必要なデータが得られると期待される。

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