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I I本家禽学会誌,39.･J4Z‑J45,2002

ラジカルイニシエーターまたはデヒドロアスコルビン酸を投与したニワトリ

肝臓におけるグルタチオン依存性デヒドロアスコルビン酸還元酵素活性佐々木啓介l)｡古賀賢悟2)｡成田玲2).福田龍樹2).北口泰也2).青柳陽介2】)農業技術研究機構畜産草地研究所，茨城県茎￨￨筒町305‑0901
2)茨城大学農学部，茨城県阿見町300‑0392

生体は，アスコルビン酸(AA)の酸化によって生じる酸化型AA,すなわちデヒドロアスコルビン酸(DHAA)をすみやかにもとのAAに還元する機構を備えている。この機構を主として担っているグル
タチオン依存性DHAA還元酵素(GSH‑DHAR)活性が，ニワトリ肝臓において,2,2'‑アゾビスアミジノプロパンニ塩酸塩(AAPH)投与により誘起した酸化的ストレスおよびDHAA投与によりどのように変化するかについて検討した。16日齢のニワトリにAAPHあるいはDHAAを100g体重当たり40"mol腹腔内投与し,3時間後に屠殺して肝臓をサンフ･ルとして得た。酸化的ストレスにより肝臓のチオバルビツール酸反応物(TBARS)量は増加し,AAは減少した。DHAA投与により肝臓のTBARS=は変化せず,AA儂度は増加した。肝臓のGIIS‑DHAR活性は酸化的ストレスによっては変化しなかったが,DHAA投与により有意に上昇した。GSI‑I‑DHAR活性の制ill1に対してその基質であるDHAAが重要な役割を演じていることが示唆された。

キーワード：ニワトリ，アスコルビン酸リサイクル，グルタチオン依存性デヒドロアスコルビン酸還元
酵素，酸化的ストレス

緒 言

DHAA)に変換される(RoseandBode,1993)｡DHAAは不安定な化合物であり加水分解されやすいが（倉田，アスコルビン駿(AA)は，重要な抗雌化物質の一つであ1990),生体はこれを還元してAAに戻すリサイクル機

り，生体の水溶性凹分においてラジカル分子種を111"構の存在が知られている。ヒトやラットにおけるし，生体を酸化的ストレスから防御する働きを有する

DHAAの還元を直接的に扣う酵素としてグルタチオン(RoseandBode,1993)｡ニワトリ生体において,AA誘依存性デヒドロアスコルビン雌還元酵素(GSH‑DHAR,導体の給与は暑熱ストレス曝露あるいはラジカル開始剤

EC1.8.5.1)が知られており，渚性質が調べられている投与による摂食量および飼料効率の低下を軽減すること(Maellaro""J.,1994;Ishikawa""J.,1998)｡が報告されている（冑Wllら,1996;青柳ら,1997)。これ

著者らはこれまでに，ニワトリ各臓器におけるGSH‑はニワトリ生体内においてもAAが酸化的ストレスにDHAR活性について検討し，その結果当該酵素活性は対し防御的に働いたためと考えられている。このような肝臓において最も高いこと，活性は細胞質ゾルに局在AAの酸化的ストレスに対する防御反応により,AAはし，確かにグルタチオン依存性であることを明らかにし自らが酸化されアスコルビン酸フリーラジカルおよびデている。また，培養肝細胞においても細胞外DIIAAがヒドロアスコルビン酸（酸化型アスコルビン酸，迅速にAAに還元されることを確認しており,ll1臓はAAリサイクル機構において重要な役割を演じているも2001年9月28日受付2001年11月28日受理
連絡者：佐々木啓介〒305‑0901農業技術研究機構畜産草地研究所品質￨)H
発部畜産物品質評{llli研究室，茨城県茎￨崎町池の台2
TelO298‑38‑8690(直通）のと期待される(Sasaki"(zZ.,2001)。

霊長類を除く哺乳類や高度に進化した鳥類においては,AAの/￨ﾐ合成は肝臓において行われるが，ニワトリをはじめとする家禽においては,AA生合成の場は腎臓

FaxO298‑38‑8606(代表）である(Chatterjee,1973;Kiuchi"".,1982)。一方，

Email:ksuk@affrcgo.jp

肝臓における薬物代謝系においてAAが必要である（堀Copyright ©2002, Japan Poultry Science Association

J 4 2 日 本 家 禽 会 誌

39巻J1号(2002)

尾・吉田,1990)。これらのことから，肝臓は比鮫的AA

80﹃Ｉ削冒ｌ咄Ⅲ山旧山ⅡⅢ嘔Ⅲ︑↑１︑誼刺岬蠅岬岬岬岬岬岬

III側｢￨1GSH‑DHAR活￨￨4弓がどのように変化するかについ厭ｈ剛Ｆ剛
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司津ｒ４１１
名Ｆ具 肋ｌ酢昨．可ＬｕｈⅢⅥＩⅡⅡ川副．

DHARの基質であるDHAAを投与したニワトリのlll:

刈咄Ⅱ川帥則師卵酬ＪＥ廿・轆岬Ⅱ鯏干釧州州帆岬州岬︾

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川ⅡⅢ川碓洲Ⅷ︲︲蛸・燗岬紳紺洲岬Tb

固調珊耐困淵預判ル諦躯ｆＪｒ︲制姻隅酎珊螂恥到側眺輔
柵可祁：津γゞ鹸化的ストレスを誘導したニワトリ，およびGSH‑Ｉ

本研究では，ニワトリ肝臓におけるAAリサイクルの制御機構解明の一環として，ラジカル開始剤を投与してぬ閏 ぐ 国 巴るための重要な機能の一つである可能性が考えられた。

︵①討扇的垣︑一弓ロ消巨︶

ワトリ肝臓におけるAAリサイクルは,AA量を維持す０４０２０６の要求性が高いI蔵器である ''1能性が高い。このため，ニ0て検討した。

C材料および方法
単冠白色レグホーン種初生雄ヒナを市販の幼雛用飼料で16FI問予備飼育した。環境温度は30=tl℃，照Iﾘ1は，24時間照明とした。予備飼育終了後，ニワトリを5>l>1ずつ3群にわけ，それぞれを対照区(C区),ラジカルイニ，

R

図1.デヒドロアスコルビン酸または2,2'‑アゾビスアミジノフ･ロパンニ塩酸塩(AAPH)

投与がニワトリ肝臓のチオバルビツール雌反応物(TBARS)濃度に及ぼす影響

Fig.1.Effectofdehydroascorbicacidand2,2'‑azobis(amidinopropane)dihydrochlo‑

シエーター（2,2'一アゾビスアミジノプロパンニ塩酸蝋，

ride(AAPII)onthibarbituricacid

AAPH)投与区(R区),DHAA投与区(D区）とした。

reactivesubstances(TBARS)concent‑

AAPHは水溶性のラジカル開始剤であり(Niki,1990),

rationinchickenliver

ニワトリ個体における酸化的ストレス誘導に有効な物質

値は平均値±標準誤差(n=5).

である（青柳ら,1996)｡R区およびD区には，体重lOOgあたり0.5m/の生理的食塩水で溶解したAAPHまたはDHAA(80mM,40ﾒzmol/1009体重）をそれぞれllm

Valuesaremean±SE(n=5).

異符号間に有意差あり(P<0.05).
Meanswithdifferentsuperscriptare

differentsignincantly(P<0.05).

I′F内投与し,C区には体躯100gあたり0.5m/の/￨J:'￨!的食塩ﾉkを腹腔内投与した。投与3時間後にニワトリを過1林酔により屠殺し，肝臓をサンプルとして得た。これら

サンプルについてチオバルビッール酸反応物(TBARS),AA,およびGSH‑DHAR活性をそれぞれ測結果および考察AAPHあるいはDHAA投与3時間後のニワトリ肝臓定した。AA量についてはα,α′−ジピリジル法｢FTBARS濃度を￨叉l1に示したoD区においては，(Zannoni"".,1974)で,TBARS量についてはTBARS濃度はC区と差は見られなかった。R区におい

MasugiandNakamura(1977)の方法でそれぞれillll定ては,TBARS濃度はC区に比べて有意に上昇した。

した｡GSH‑DHARiW性については，肝臓を1O{容のTBARSは脂質過雌化物の指標として広く川いられてい100mMリン酸カルシウム緩衝液(pH72)でホモケナる。青柳ら(1996)は既にAAPHを投与することで，イズ後,12,0009で遠心分離した上清を用いた。活性測

AAPH由来のラジカルによると考えられる酸化的障害，

定はStahletal.(1985)の方法，すなわち0.25mM

すなわちTBARS量の上昇が肝臓で誘起されることを

DHAA,1mMGSHおよびl/10容の肝ホモジネート上示している。R区において肝臓中のTBARS量が増加し清を含む100mMリン酸カルシウム緩衝液(pH7̲2)をたことから,AAPHによりニワトリに酷化的ストレス

30℃でインキュベートし，ノI戒するAAを265nmの吸が誘導されたものと考えられた。

光度でモーターすることでｲ『った｡AAのモル吸光腱係肝臓のAA膿度をIxI2に示した。D区においては，数は14,800M‑Icm‑'を川いた｡GSH‑DHAR活'￨￨;はAA濃度はC区と比'li炎して有意に上昇した｡l1il述の通30℃で1分間にl"molのAAを生成する酵素量をl

り，生体はDHAAを還元してAAに変換する機櫛を備unitと定義し，全タンパク質あたりの比活性で表現しえており,D区におけるAA濃度の上昇は，投与したた。タンパク質量はLowry法を用いて測定し，標準物DHAAが還元されたことが主な要因として考えられた。

質としては牛血清アルブミンを川いた。

ただし，本研究においてのAA濃度の上昇はあまり大きなものではなかった。著者らはニワトリ培養￨}￨:細胞をDHAAで処即したところ，細胞内AAは処}!￨!lll#f間後

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佐々木ら：デヒドロアスコルビン酸還元岬素ｊa

詩鹿亘生ユ計諄壁學壬〆謹話萬垂篝議鍵，ロ⑭ＩＣ︻︶︾驚蕊︾蕊
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図2．デヒドロアスコルビン酸または2，2，−アゾC￨叉'3ビスアミジノプロパンニ塩酸塩(AAPH)

投与がニワトリ肝臓のアスコルビン酸濃度

デヒドロアスコルビン酸または2，2，−アゾビスアミジノフ･ロパンニ塩酸塩(AAPH)

ぼす影響

Fig.2.Effectofdehydroascorbicacidand2,2'‑ride(AAPH)onascorbatecollcentration

R

投与がニワトリ肝臓のク､ルタチオン依存性デヒドロアスコルビン酸還元酵素活性に及に及ぼす影響

azobis(amidinopropane)dihydrochlo‑，FIg.3

Effectofdehydroascorbicacidand2,2'‑
azobis(amidinopropanc)dihydrochlo‑

inchickenliverride(AAPH)onglutathion‑dependent

値は平均値±標準誤差(n=5).

dehydroascorbatereductaseactivitVin

ValuesaremGan=tSE(n=5).
異符号間に有意差あり(P<0.05).

値は平均値士標準誤差(n=5).

Meanswithdifferentsuperscriptare
differentsigniflcantly(P<0.05)̲

chickenliver

Valuesal℃mean±SE(n=5).
異符号￨H1に有意差あり(P<0.05).
Meanswithdifferentsuperscriptare
differentsigniflcantly(P<0.05)̲にもっとも上昇し，その後ゆるやかに減少することを示している(SasakigZ(z/.,2001)。また，本研究における酸化的ストレスによっては直接￨'l<jに制御されない可能性

DHAAの体軍あたり投与量は血中AA膿度をめやすとが強く示唆された。一〃,D区においてGSH‑DHAR活して設定しており，投与量としては‑'‑.分であると考えら性の上昇が見られたことから,GSH‑DHAR活性は，それる。このため,IXI2におけるD区での肝臓中AA上昇の基質であるDHAAにより制御されている可能性が示があまり大きくない理由としては，一度上昇した後に減唆された。また,D区の肝臓で見られたAA濃度の上昇

少に転じた場面をil11定した口I能性が考えられる。この点(lxl2）は，活性の上昇したGSH‑DI‑IARが投与されたをiﾘlらかにするためには,DHAA投与時における生体DHAAを還元した結果であると考えられた。また，著者

内のAAおよびDHAA濃度に関して経時的な検討が今らは予備的にニワトリ肝実質細胞の初代培養系を用いた後必要であると考えられた。一方,R区については，肝実験により，培養肝細胞の外因性DHAAの還元能力が臓AA濃度はC区に比べて有意に減少した。R区におAAPHによる酸化的ストレス処理によって誘導されなける肝臓AA濃度の減少は,AAPHにより誘導されたいことを見いだしている（データ示さず)｡以上の結果は雌化的ストレスに対しAAが防御的に働き酸化された

ニワ￨、リ肝臓のGSII‑DIIAR活性がR区において変化ためと考えられた。AAPH投与により雌化的ストレスしなかったことと符合し，酸化的ス￨､レスがAAリサイが誘導されたR区においては,AA代謝がC区に比べクルを直接的に制御しない可能性をさらに強めるものとて変動したものと考えられた。

考えられた。

肝臓のGSH‑DI‑IAR活性を図3に示した。D区におい以上の結果より,AAリサイクルにおいて主要な働きてはC￨Xiに対し有意に上昇したが,R区においてはCを演じるGSH‑DHAR活性は,I￨職においてはその基質区と比べて変化は見られなかった。R￨×̲において，ニワであるDHAAがその制御に対し重要な働きを演じていトリは明らかに酸化的ストレス下にあり，さらにAA代る可能性が考えられた｡AAが利川されてDHAAに酸謝の変動が見られたにも関わらず,GSH‑DHAR活 性に化される反応は，雌化的ストレスに対して防御的に働くは変化が見られなかったことから,GSH‑DHAR活 性は場合のみならず，コラーゲン合成（佐藤・吉中,1990)

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J 4 4 日 本 家 禽 会 誌

39巻J1号(2002)など他の場面においても存在する。このことから，基質

IshikawaT,CasiniAFandNishikimiMMoleculal‑であるDHAAがGSH‑DIIARの活性に直接影響するこcloningandfunctionalexpressionofratliverとは，酸化的ストレスにより制御される可能性に比べてglutathione‑dependentdehydroascorbateredu‑合理的である考えられた◎これらのメカニズム，特にDHAAの作用機作についてさらに詳細な検討が必要であると考えられた。

ctase.TheJournalofBiologicalChemistry,273:28708‑28712.1998．

KiuchiK,NishikimiMandYagiK.PurincationandcharacterizationofL‑gulonolactoneoxidasefrom

しかし,R区においては酸化的ストレスによりAAが消費されDHAAが生じると考えられるにも関わらず，GSH‑DHAR活性に有意な変化は無かったoD区においては既に述べたとおり，大量のDHAAを投与している

chickenkidneymicrosomes.Biochemistry,27:5076‑5082.1982．

倉田忠男．ビタミンCの酸化還元'￨11i・日本農芸化学会
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MaellaroE,BelloBD,SugheriniL,SantLIcciA,Com‑と考えてよいため,GSH‑DHAR活性に有意な影響をおportMandCasiniAF.Purincationandcharacteri‑よぼしたと考えられた。しかし,AAPH処理による

zationofglutathione‑dependentdehydroascorbate

DHAAの生成についてはGSH‑DHARを誘導するほどの量ではなかった可能性がある。このことをIﾘl碓にするためには，酸化的ストレスに曝露したニワトリにおける体内DHAA量に￨對して経時的かつ定量的な検討が必要

reductasefromratliver.BiochemicalJournal,301:471−476．1994．

MasugiFandNakamuraT.MeasurementoI
thibal･bituricacidvalueinliverhomogenate

solubilizedwithsodiumdodecylsulphateandvari‑であると考えられた。以上のことから，酸化的ストレス

ationofthevaluesaffectedbyvitaminEand防御機構としてAAリサイクルが機能するかと､うか解

drugs.Vitamins(Japan),51:21‑29.1977.

明するためには，酸化的ストレス下での生体内DHAA濃度や肝臓GSH‑DHAR活性について，経時的な検討が必要であると考えられた。

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佐々木ら：デヒドロアスコルビン酸還元酵素

145

Glutathione‑DependentDehydroascorbateReductaseActivity
inLiverofChickenReatedwithDehvdroascorbateorlRadicallnitiator

KeisukeSasaki'),KengoKoga2),ReiNarita2),TatsukiFukuda2),
YasunariKitaguchi2)andYosukeAoyagi2)')NationallnstituteofLivestockandGrasslandScience,Kukizaki,Ibaraki305‑0901
2)SchoolofAgriculture,IbarakiUniversity,Ami,Ibaraki300‑0392
Glitathione‑dependentdehydroascorbatereductase(GSH‑DHAR)activityinliverofchickentreatedwithdehydroascorbateorradicalinitiatorwasinvestigated.16‑days‑oldmalechickenwereadministratedwithdehydroascorbateorradicalinitiator,

2,2'‑azobis(amidinopropane)dihydrochloride,at40"mol/100gbodyweight.After3
hours,liverwasharvestedandappliedtoanalysis.Thiobarbituricacidreactivesubstance(TBARS)increasedbyradicalinitiatorinliver．Liverascorbatedecreasedin
thebirdstreatedwithradicalinitiator.DehydroascorbatedidnotaffectcdTBARS

concentrationbutincreasedascorbateinliver,GSH‑DHARactivitywasnotchanged
byradicalinitiator,butincreasedbydehydroascorbatetreatement.Itwassuggested

thatdehydroascorbate,ansubstrateofGSH‑DHAR,playsanimportantroleforregula‑tionofdehydroascorbatereductionsysteminchickenliver.

&ﾉﾋz"7zesePo""ryScie"",39:cﾉ"‑JY5,2002ノ

Keyword:chicken,ascorbicacidrecycling,glutathione‑dependentdehydroascorbatereductase,oxidativestress