Water Technologies & Solutions
Feasibility Study Report

Sievers M9 型を使ったアレルゲンの TOC 回収率の検討
作成者：Sievers Analytical Instruments ,Francis Lovato,Brett Clark

完了日：2019 年 5 月 31 日
目的
TOC 計 Sievers M9 型を使って洗浄水中の残留アレルゲンを定量できるかどうかを検証するためにこの試験を行いました。試験は、米国コロラド州ボルダーにある SUEZ Analytical
Instruments 社の Application Laboratory で実施されました。対象化合物は、小麦（対象タンパク質：グルテン）、乳（対象タンパク質：ラクトース）、大豆（対象タンパク質：トリプシンインヒビター）です。

背景TOC 計 Sievers M9 型の測定原理は、湿式紫外線酸化＋ガス透過膜式導電率測定方式です。
まず、UV ランプを使ってサンプル中の有機化合物を二酸化炭素（CO2）へと分解させます。
そして、ガス透過膜により CO2 を分離して、CO2 由来の導電率を検出します。炭素濃度として応答値を得ることができ、全炭素（TC）と無機炭素（IC）の差から全有機炭素（TOC）濃度を求めます。M9 型は、製薬業界や食品飲料業界で、製造設備の洗浄バリデーションのために一般的に使用されています。主に TOC が 50ppm 未満の水の試験に使用されます。
CO2 を溶液から分離して取り出すためには、分析装置内のサンプルの pH が 2 未満である必要があります。また、サンプルの pH が 8 以上になると、大気中の CO2 を吸収して IC が高くなります。IC が TC の 10 倍を超える場合は、オプションの ICR（無機炭素除去装置）が必要です。

試験概要
米国コロラド州ボルダーの Sievers Application Laboratory において、TOC 計 M9 型とオートサンプラーを使用して試験を行いました。サンプルは導電率＆TOC 両用バイアル（DUCT バイアル）に入れて分析を行いました。
以下の順序でこの試験を行いました。
1. 校正と校正確認2. 溶液調製
3. M9 分析
4. 校正確認標準液で機器の性能を確認
5. データ分析©2019 SUEZ All rights reserved

校正と校正確認
多点校正を実施した後、校正確認標準液を測定することで機器の精度を検証しました。

サンプル調製グルテンとトリプシンインヒビターは、それぞれの炭素含有量から TOC 濃度を決定して、0.01 ％の TOC 溶液を調製しました（グルテンの推定炭素含有量は 7.9 ％、トリプシンインヒビターは 1.6 ％）。炭素含有量をもとに、グルテンおよびトリプシンインヒビターの 20 ppm（TOC）溶液を調製しました。500 mL のメスフラスコに 126.9 mg を添加して 20 ppm（TOC）のグルテン溶液を調製しました。500 mL のメスフラスコに 24.6 mg を添加して 20 ppm（TOC）のトリプシンインヒビター溶液を調製しました。ラクトース溶液の調製では、分子式と分子量から 20 ppm（TOC）溶液に必要な量を決定しました。20 ppm（TOC）のラクトース溶液は、500 mL のメスフラスコに 23.8 mg を添加して調製しました。それぞれの 20 ppm 溶液を使用して、0.5 ppm、1 ppm、5 ppm、10 ppm の標準液を調製しました。すべての溶液は清潔なガラス容器で調製して、すぐに DUCT バイアルに移しました。
目標とする TOC 濃度および添加した 20 ppm 溶液の量を表 1 に示します。これらの濃度は、一般的に洗浄バリデーションアプリケーションで使用される測定範囲です。
表 1：サンプル希釈調製

予想 TOC 濃度

100 mL に添加する 20 ppm 溶液の量0.5 ppm

2.5 mL

1 ppm

5 mL

5 ppm

25 mL

10 ppm50 mL

アレルゲン TOC 分析
各サンプルの測定には自動試薬機能を用いて最適な試薬流量を決定しました。すべてのサンプルは、5 回測定 1 回棄却の条件で測定を行いました。グルテンの TOC 測定値を表 2、線形回帰結果を図 1 に示します。トリプシンインヒビターの TOC 測定値を表 3、線形回帰結果を図 2に示します。ラクトースの TOC 測定値を表 4、線形回帰結果を図 3 に示します。

2

表 2：小麦（対象タンパク質：グルテン）0.5 ppm , 1 ppm , 5 ppm , 10 ppm , 20 ppm の TOC 測定結果

予想濃度（ppm）

TOC（ppm）

標準偏差

RSD（％）

回収率（％）

0（DI）

0.018

0.002

9.31

N/A

0.5

0.483

0.02

3.19

97

1

1.0

0.01

0.92

102

5

5.5

0.03

0.44

110

10

11.1

0.08

0.74

111

20

21.90.20.87

109

Gluten TOC Recovery

Measured TOC (ppm)252015y = 1.0986x - 0.0241
R² = 0.9999

10500510152025

Expected TOC (ppm)
図 1.小麦（対象タンパク質：グルテン）の TOC 回収率

図 1 は、全範囲にわたって優れた直線性（R2 = 0.9999）を示しています。0.5〜20 ppm の範囲でグルテンの測定結果が一貫していることを示しています。さらに、表 2 では高い回収率が得られたことが示されています。

3

表 3：大豆（対象タンパク質：トリプシンインヒビター）0.5 ppm , 1 ppm , 5 ppm , 10 ppm , 20 ppm の TOC 測
定結果

濃度（ppm）

TOC（ppm）

標準偏差

RSD（％)

回収率（％）

0（DI）

0.032

0.03

80.3

N/A

0.5

0.419

0.01

2.91

84

10.8850.02

2.39

8954.80.06

1.26971010.1

0.090.93

1012020.70.62.83103

Trypsin (soybean) TOC Recovery

Measured TOC (ppm)25201510y = 1.0412x - 0.1954
R² = 0.9998

500510152025

Expected TOC (ppm)
図 2.大豆（対象タンパク質：トリプシンインヒビター）の TOC 回収率

図 2 は、全範囲にわたって優れた直線性（R2 = 0.9998）を示しています。0.5〜20 ppm の範囲でトリプシン（大豆）の測定値が一貫していることを示しています。さらに、表 3 では高い回収率が得られたことが示されています。

4

表 4：乳（対象タンパク質：ラクトース）0.5 ppm , 1 ppm , 5 ppm , 10 ppm , 20 ppm の TOC 測

定結果
予想濃度（ppm）

TOC（ppm）

標準偏差RSD（％）

回収率（％）

0（DI）

0.014

0.0008

5.26

N/A

0.5

0.529

0.004

0.8

106

11.00.013

1.21

103

55.1

0.03

0.48

103

1010.4

0.05

0.48

10420

20.6

0.150.83

103

Lactose TOC Recovery

Measured TOC (ppm)25201510y = 1.029x + 0.0048
R² = 1500510152025

Expected TOC (ppm)
図 3.乳（対象タンパク質：ラクトース）の TOC 回収率

図 3 は、全範囲にわたって優れた直線性（R2 = 1）を示しています。0.5〜20 ppm の範囲でラクトースの測定値が一貫していることを示しています。さらに、表 4 では高い回収率が得られたことが示されています。

5

アレルゲン導電率分析
小麦（対象タンパク質：グルテン）の導電率測定結果を TOC と合わせて表 5 に示します。
図 4 に示すように、M9 で測定したグルテンの導電率は TOC と優れた直線性を示します。
表 5：小麦（対象タンパク質：グルテン）の導電率測定結果

TOC（ppm）

平均 rCond（μS / cm）

標準偏差

RSD（％）

0.483

0.351

0.013

2.01

1.0

0.5

0.01

1.46

5.5

1.2

0.01

0.49

11.1

2.1

0.004

0.17

21.9

3.80.003

0.08

2025

Gluten Conductivity

Measured rCond Average (μS/cm)

4433y = 0.1589x + 0.3128
R² = 0.9995

221

10051015

Measured TOC (ppm)
図 4.小麦（対象タンパク質：グルテン）の導電率と TOC6大豆（対象タンパク質：トリプシンインヒビター）の導電率測定結果を TOC と合わせて表 6 に示します。図 5 に示すように、M9 で測定したトリプシンインヒビターの導電率は TOC と優れた直線性を示します。
表 6：大豆（対象タンパク質：トリプシンインヒビター）の導電率測定結果

TOC（ppm）

平均 rCond（μS/ cm）

標準偏差

RSD（％）

0.419

0.207

0.01

0.74

0.885

0.258

0.004

0.53

4.8

0.994

0.001

0.09

10.1

2.118

0.001

0.02

20.7

4.650

0.002

0.03

Trypsin (soybean) Conductivity Recovery

Measured rCond Average (μS/cm)

5.0
4.5
4.0
3.5y = 0.2207x + 0.0073
R² = 0.99633.02.52.0
1.5
1.00.50.005

1015

Measured TOC (ppm)2025

図 5.大豆（対象タンパク質：トリプシンインヒビター）の導電率と TOC7

乳（対象タンパク質：ラクトース）の導電率測定結果を TOC と合わせて表 7 に示します。図 6 に示すように、M9 で測定したラクトースの導電率と TOC との間に直線性は示されませんでした。
イブプロフェンを含む他の化合物においても同様の例が確認されており、特定の化合物の酸解離が原因である可能性が高いと推察されます。10 ppm と 20 ppm のラクトース溶液において同じ導電率値を示したため、導電率のみを洗浄評価のために使用することに限界があることを示しています。今回の結果では、TOC は残留化合物を正確に検出できますが、一方導電率は10ppm を超えるラクトース濃度を過小評価することが示されました。
表 7：ラクトース導電率試験の結果。

TOC（ppm）

平均 rCond（μS / cm）

標準偏差RSD（％）

0.529

0.199

0.01

1.32

1.0

0.231

0.001

0.16

5.1

0.374

0.003

0.41

10.4

0.495

0.004

0.51

20.6

0.491

0.01

0.52

Lactose Conductivity Recovery

Measured rCond Average (μS/cm)

0.6
0.5
0.4

y = 0.0146x + 0.2479
R² = 0.7538

0.3
0.2
0.1
0.0
05

10152025

Measured TOC (ppm)
図 6.乳（対象タンパク質：ラクトース）の導電率と TOC

8

使用機器
グルテン：
•TOC 計 Sievers M9 ラボ型

シリアル番号：1401-0058•Sievers オートサンプラー

シリアル番号：19032088•オートサンプラー制御用ソフトウェア DataPro2
トリプシンインヒビターとラクトース：•TOC 計 Sievers M9 ラボ型

シリアル番号：1401-0043•Sievers オートサンプラー

シリアル番号：09040005•オートサンプラー制御用ソフトウェア DataPro2

結論と提言
設備洗浄後の残留アレルゲンを検出するためには、TOC 計 Sievers M9 型が有効です。M9型 を使用することで、グルテン（小麦）、トリプシンインヒビター（大豆）、ラクトース（乳）を微量濃度（> 0.500 ppm）で効果的に検出します。全ての化合物において 0.5 ppm から 20ppm の範囲で TOC 直線性を示しています。さらに、M9 型のオプションのサンプル導電率測定機能を使うことで、グルテンとトリプシンインヒビターの導電率を効果的に検出することができました。一般的な分析条件として、4 回測定 1 回棄却の測定プロトコルで 3 回の平均値を得ることを推奨します。
サンプル中の無機炭素（IC）は 500 ppb 未満であったので、無機炭素除去装置（ICR）は分析に使用しませんでした。ただし、サンプルの IC が 500 ppb を超える場合には、より高精度の結果を得るために ICR を使用することを推奨します。
グルテン、トリプシンインヒビター、ラクトースの測定に推奨される試薬流量（酸 / 酸化剤）
を表 8、9、10 に示します。
表 8：グルテンの TOC 測定に最適な試流量

TOC（ppm）

酸（μl / m）

酸化剤（µl / min）

0.50.301

10.15

10.9

10122013.59

表 9：トリプシンインヒビターの TOC 測定に最適な試薬流量

TOC（ppm）

酸（μl / min）

酸化剤（µl / min）

0.50.30110510.7

1011.72013

表 10：ラクトースの TOC 測定に最適な試薬流量

TOC（ppm）

酸（μl / min）酸化剤（µl / min）

0.5

10110.1510.8

1011.72012.9検証
ここに提示されたデータは正確で、TOC 計 Sievers M9 型の性能が確実であることを支持します。この試験結果に関して何か質問があれば私達にお問い合わせください。

Francis E. Lovato
Applications Specialist
Analytical Instruments – Suez Water Technologies &Solutions
Francis.Lovato@suez.com（翻訳：セントラル科学株式会社）

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