〈一般研究課題〉 RNA interference による新規衛生および建材害虫防除システムの確立
助 成 研 究 者

中部大学

宮田恵多

RNA interferenceによる新規衛生および建材害虫防除システムの確立
宮田 恵多（中部大学）

Establishing of a Novel Control System of Sanitary
Insect Pests and Wood Insect Pests by RNAi
Keita Miyata(Chubu University)

Abstract：
RNA interference (RNAi), a phenomenon in which silencing of gene expression is triggered by adouble-stranded RNA (dsRNA) molecule, has been established as powerful and useful tool forreverse genetics-based studies in many organisms. RNAi triggered via microinjection of dsRNA iswidely used in reverse genetics studies of many insects. RNAi has been demonstrated in someinsects when fed with dsRNA. This discovery indicates the possibility of environmental RNAi(e-RNAi), which can potentially be used in RNAi-based pest management. In this study, it wasinvestigated whether RNAi could be available to control sanitary insect pests and wood insect
pests. The American cockroach (Periplaneta americana) and the Formosan subterranean termite(Coptotermes formosanus) were employed as model of sanitary insect pests and wood insect pests,respectively. These pest insects showed sensitive RNAi response to injection and/or feeding ofdsRNA. Thus, these findings suggested that RNAi has potential to control sanitary insect pests andwood insect pests.
１．はじめにFireとMelloのグループは、線虫（Caenorhabditis elegans：C. elegans）にセンスあるいはアンチセンスの一本鎖RNAを導入した場合には、それらに相補的なmRNAの発現に影響を及ぼさないが、－ 39 －

1. はじめにFire と Mello のグループは、線虫（Caenorhabditis elegans：C. elegans）にセンスあるいはアンチセンスの一本鎖 RNA を導入した場合には、それらに相補的な mRNA の発現に影響を及ぼさないが、これらを二本鎖RNA（double stranded RNA：dsRNA）として導入した場合にmRNAの特異的発現抑これらを二本鎖 RNA（double stranded RNA：dsRNA）として導入した場合に mRNA の発現の特異的な制 が 起 こ る こ と を 発 見 し た（Fire et al., Nature, 1998）。 現 在、 こ の 現 象 はRNA interference抑制が起こることを発見した（Fire et al., Nature, 1998）。現在、この現象は RNA interference（RNAi）と呼ばれている。RNAiは、様々な生物で起こることが判明し、そのメカニズムも明らかと（RNAi）と呼ばれている。RNAi は、様々な生物で起こることが判明し、そのメカニズムも明らかとなっている。先ず、体内へ侵入した外来のdsRNAは、Dicerというヌクレアーゼにより切断されなっている。先ず、体内へ導入された外来の dsRNA は、Dicer というヌクレアーゼにより切断され21-23塩基対の低分子RNA（small interferinginterfering RNA：siRNA）となる。その後、siRNAはArgonaute21-23 塩基対の低分子 RNA（smallRNA：siRNA）となる。その後、siRNAは Argonauteなどの種々のタンパク質と会合してRNAinducedsilencingsilencingcomplex（RISC）を形成する。RISCcomplex（RISC）を形成する。そのRISCなどの種々のタンパク質と会合して RNA induced
は、が、構成成分のsiRNAに相補的なmRNAを特異的に認識、切断することで結果としてmRNAの発現
siRNA に相補的な mRNA を特異的に認識、切断することで結果として mRNA の発現の抑制が起こる。の抑制が起こる。この一連の流れがRNAiの基本機構として提唱され、現在の逆遺伝学的研究分野
この一連の流れが RNAi の基本機構として提唱され、現在の逆遺伝学的研究分野において RNAi は非においてRNAiは非常に安定した強力なツールとなっている。
常に安定した強力なツールとなっている。
RNAiを誘導する際の重要なステップである”dsRNAの導入”は、注射により直接的に体内へRNAi を誘導する際の重要なステップである”dsRNA の導入”は、注射により直接的に体内へ dsRNAelegansは導入されたdsRNAから誘導されるRNAidsRNAを導入する方法が一般的である。一方、C.
を導入する方法が一般的である。一方、C. elegans は導入された dsRNA から誘導される RNAi を導elegansは外来のを導入された部位から全身へ惹起する性質（SystemicRNAi）を有し、さらに、C.
dsRNA入された部位から全身へ惹起する性質（SystemicRNAi）を有し、さらに、C. elegans は外来のdsRNAを腸管あるいは表皮から取り込むことが可能であるため、給餌や浸漬によりdsRNAを導入を腸管あるいは表皮から取り込むことが可能であるため、給餌や浸漬により dsRNA を導入して RNAiしてRNAiを誘導すること（Environmental
RNAi：e-RNAi）が可能である。2007年にトウモロコシを誘導すること（EnvironmentalRNAi：e-RNAi）が可能である。2007
年にトウモロコシの害虫であvirgifera）の害虫であるウエスタンコーンルートワーム（Diabroticaおよび広食性で様々な農virgiferavirgifera
virgifera）および広食性で様々な農作るウエスタンコーンルートワーム（Diabroticaarmigera）
作物の害虫として知られるオオタバコガ（HelicoverpaarmigeraがdsRNAを発現するように遺伝子）がdsRNA を発現するように遺伝子物の害虫として知られるオオタバコガ（Helicoverpa
組換えされた植物を給餌することでRNAiを誘導することが可能であることが報告され、これまで組換えされた植物を摂取することで RNAi を誘導することが可能であることが報告され、これまで
C.
（BaumC. elegansの特異な現象であると考えられていたe-RNAiは昆虫でも起こることが示された
elegans の特異な現象であると考えられていた e-RNAi は昆虫でも起こることが示された（Baumet etal.,
2007、MaoNatNat
Biotechnol,
2007）。その後、昆虫のe-RNAiに関する報al.,Nat
NatBiotechnol,
Biotechnol,
2007、Maoetetal.,al.,
Biotechnol,
2007）。その後、昆虫の e-RNAi に関す告が劇的に増加した（Huvenne and Smagghe,
J Insect
Physiol,2010）。現在、昆虫のe-RNAiを応用る報告が劇的に増加した（Huvenneand Smagghe,
J Insect
Physiol,2010）。現在、昆虫の e-RNAi
し、害虫防除に使用する化学系薬剤の代わりに害虫が保存している遺伝子に相補的なdsRNAを害を応用し、害虫防除に使用する化学系薬剤の代わりに害虫が保存している遺伝子に相補的な dsRNA虫に摂取させRNAi誘導することで害虫をコントロールするといった革新的な害虫防除法の確立にを害虫に摂取させ RNAi 誘導することで害虫をコントロールするといった革新的な害虫防除法の確期待が高まっている（図1）。 1）
立に期待が高まっている（図。

図 1．e-RNAiによるペストコントロールのアイディア

この様に害虫駆除への応用に期待が高まっているRNAiを本研究では衛生および建材害虫防除へ応用することを試みた。現在、衛生および建材害虫（ゴキブリやシロアリ等）は、ヒトの目に付かない所に存在しており、最も効果的に駆除する手段は化学系薬剤の使用である。しかしながら、駆除で使用する化学系薬剤の特異性の低さによる標的としていない昆虫への影響や化学系薬剤に過敏なヒトへの影響等が問題視されており、汎用するには注意が必要であるのが現状である。

－ 40 －

本 研 究 で は、 ワ モ ン ゴ キ ブ リ（Periplaneta americana）お よ び イ エ シ ロ ア リ（Coptotermesformosanus）を衛生および建材害虫のモデルに用いて、RNAiがこれらの害虫をコントロールするのに有効であるか否かの検討を行ったので、その成果を報告する。
2．実験方法
2.1. ワモンゴキブリおよびイエシロアリの飼育
ワモンゴキブリは、住化テクノサービス株式会社から購入した成虫を実験に用いた。購入したワモンゴキブリは、プラスチックケース（縦30cm、横40cm、高さ30cm）中で実験に使用するまで室温で飼育した。なお、プラスチックケースの底に蒸留水で湿らせたキムワイプを敷き詰め、キムワイプが乾いたのを確認したら再度蒸留水で湿らせた。また、プラスチックケースの壁には、水で溶解した炭酸カルシウムをワモンゴキブリの脱走防止のために塗った。餌としては、実験動物用ペレットを与えた。
イエシロアリは、住化テクノサービス株式会社から購入した成虫（職蟻）を実験に用いた。購入したイエシロアリは、実験で使用するまでプラスチックケース（直径10cm、高さ60cm）の中に入れ、インキュベーター内（温度25℃、湿度70%）で飼育した。なお、蒸留水で湿らせたキムワイプをケースの中に入れることでイエシロアリに水分を与え、餌としてはクロマツの木片を与えた。
2.2. RNAi標的遺伝子のクローニング
ワモンゴキブリおよびイエシロアリにRNAiを誘導する際の標的遺伝子のクローニングを行った。ワモンゴキブリおよびイエシロアリからtotal RNAを抽出し、そのRNAを鋳型にSuperScriptIII（Invitrogen）を用いてcDNAを合成した。本研究でRNAiの標的とした遺伝子は、細胞骨格の形成に関わっているactin、tubulin、熱ショックタンパク質のHSP70および細胞内で様々な機能を示すことが知られるGAPDHを選択した。それぞれの標的遺伝子を、合成したcDNAを鋳型にPCRで増幅し、pCR2.1-TOPO vector（Life technologies）へクローニングした。dsRNAの合成は、以前、著者らが報告した方法に従い行った（Miyata et al., PLoS One, 2014）。作製したプラスミドを鋳型にクローニングした遺伝子の両末端にT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を付加するように設計したプライマーを用いてPCRを行った。そのPCR産物を鋳型にdsRNAの合成をMEGAscript T7Transcription Kit（Life technologies）で行い、合成したdsRNAの精製はMEGAclear Transcription
Clean-Up Kit（Life technologies）を用いて行った。精製したdsRNAは、-80℃で使用するまで保存した。
2.3. 注射によるdsRNAの導入および表現型解析（ワモンゴキブリ）
注 射 に よ る ワ モ ン ゴ キ ブ リ へ のdsRNAの 導 入 は、 ハ ミ ル ト ン 製 シ リ ン ジ（1701RN NeurosSyringe）を用いて行った。まず、ワモンゴキブリをプラスチックケースの中に入れ、そのケースを氷上に30分間静置した。昆虫は、変温動物であるため、氷上でインキュベートすることで一時的に活動することが出来なくなる。一時的に活動が停止したワモンゴキブリを仰向けに固定し、腹節の部分からハミルトン製シリンジで10μlのdsRNA溶液（10μg）を注射した（図2）。dsRNA溶液を注射したワモンゴキブリは、プラスチックケースの中に入れ、インキュベーター内（温度25℃、湿度－ 41 －70%）で飼育、観察した。
2.4. 給餌によるdsRNAの導入および表現型解析（イエシロアリ）
イエシロアリへのdsRNAの導入は、図3で示す様に行った。まず、イエシロアリを氷上で静置して一時的に活動を停止させ、ディッシュ（直径3.5cm）の中へ15頭入れた。イエシロアリの入ってい2.3. 注射による dsRNA の導入および表現型解析（ワモンゴキブリ）
2.3. 注射による dsRNA（縦の導入および表現型解析（ワモンゴキブリ）るディッシュの中に紙2cm、横 2cm）を入れ、その紙に50μlのdsRNA溶液（10μgのdsRNA、注射によるワモンゴキブリへの dsRNA の導入は、ハミルトン製シリンジ（1701RN Neuros Syringe）
注射によるワモンゴキブリへのdsRNA の導入は、ハミルトン製シリンジ（1701RN Neuros Syringe）
0.5%ナイルブルー）を染み込ませた後、インキュベーター内でイエシロアリを3週間飼育した。なを用いて行った。まず、ワモンゴキブリをプラスチックケースの中に入れ、そのケースを氷上に 30を用いて行った。まず、ワモンゴキブリをプラスチックケースの中に入れ、そのケースを氷上に 30
お、ナイルブルーは、イエシロアリがdsRNAを摂取しているか否かを判定するマーカーとするた分間静置した。昆虫は、変温動物であるため、氷上でインキュベートすることで一時的に活動する分間静置した。昆虫は、変温動物であるため、氷上でインキュベートすることで一時的に活動する
めにdsRNA溶液に混合した。
ことが出来なくなる。一時的に活動が停止させたワモンゴキブリを仰向けに固定し、腹節の部分かことが出来なくなる。一時的に活動が停止させたワモンゴキブリを仰向けに固定し、腹節の部分からハミルトン製シリンジで 10μl の dsRNA 溶液（10μg）を注射した（図 2）。dsRNA 溶液を注射した
らハミルトン製シリンジで 10μl の dsRNA 溶液（10μg）を注射した（図 2）。dsRNA 溶液を注射した
3．実験結果および考察
ワモンゴキブリは、プラスチッックケースの中に入れ、インキュベーター内（温度 25℃、湿度 70%）
ワモンゴキブリは、プラスチッックケースの中に入れ、インキュベーター内（温度 25℃、湿度 70%）
3.1.
dsRNAの導入によるワモンゴキブリへの影響
で飼育、観察した。
で飼育、観察した。
種々の昆虫でRNAiを誘導することで異質な外観の表現型が現れる、あるいは致死が誘導されることが報告されている。例えば、貯蔵害虫であるコクヌストモドキ（Tribolium castaneum）のHox遺2.4. 給餌による dsRNA の導入および表現型解析（イエシロアリ）
2.4. 給餌による dsRNA の導入および表現型解析（イエシロアリ）
伝子の一つであるUbxをRNAiでノックダウンすると翅に変異が生じた表現型が現れることが報告
イエシロアリへの dsRNA の導入は、図 3 で示す様に行った。まず、イエシロアリを氷上でインキ
イエシロアリへのdsRNAの導入は、図3 で示す様に行った。まず、イエシロアリを氷上でインキされている（Tomoyasuet al.,Nature, 2004）。また、ゴキブリ目と近郊にあるバッタ目に属するトュベートし、一時的に活動を停止させ、ディッシュ（直径 3.5cm）の中へ 15 頭入れた。イエシロア
ュベートし、一時的に活動を停止させ、ディッシュ（直径3.5cm）の中へ 15 頭入れた。イエシロア
ノサマバッタ（Locusta migratoria）でactinに対してRNAiを誘導すると致死性を示すことが報告されリの入っているディッシュの中に紙（縦 2cm、横 2cm）を入れ、その紙に 50μl の dsRNA 溶液（10リの入っているディッシュの中に紙（縦2cm、横2cm）を入れ、その紙に 50μl の dsRNA 溶液（10ている（Luo et al., Insect Mol Biol, 2013）。この様な報告から、ワモンゴキブリにHox遺伝子や細μg の dsRNA、0.5%ナイルブルー）を染み込ませた後、インキュベーター内でイエシロアリを 3 週間
μg の dsRNA、0.5%ナイルブルー）を染み込ませた後、インキュベーター内でイエシロアリを 3 週間
胞骨格形成等の生存に関わる遺伝子を標的としたRNAiを誘導することで、体の一部に変異が生じ飼育した。なお、ナイルブルーは、イエシロアリが dsRNA を摂取しているか否かを判定するマーカ飼育した。なお、ナイルブルーは、イエシロアリが dsRNA を摂取しているか否かを判定するマーカて行動が制限される、あるいは致死を誘導することができると仮説立て、本研究を実施した。
ーとするために dsRNA 溶液に混合した。
ーとするために dsRNA 溶液に混合した。

図 2．ワモンゴキブリへのdsRNAの導入方法

図 3．イエシロアリに対するdsRNAの給餌方法－ 42 －

告されている（Luo et al., Insect Mol Biol, 2013）。この様な報告から、ワモンゴキブリに Hox遺伝子や細胞骨格形成等の生存に関わる遺伝子を標的とした RNAi を誘導することで、体の一部に変異が生じて行動が制限される、あるいは致死を誘導することでできると仮説立て、本研究を実施した。
本研究では、注射により actin および GAPDH dsRNA を 6 頭のワモンゴキブリに導入し、その影響
本研究では、注射によりactinおよびGAPDH dsRNAを6頭のワモンゴキブリに導入し、その影響を観察した。ネガティブコントロールには、Green Fluorescent Protein（GFP）dsRNA を導入した。
を観察した。ネガティブコントロールには、Green Fluorescent Protein（GFP）dsRNAを導入した。
actin および GAPDH dsRNA を注射されてから 1 週間後のワモンゴキブリには変化が認められなかた
actinおよびGAPDH dsRNAを注射されてから1週間後のワモンゴキブリには変化が認められなかっが、2 週間後では、GAPDH dsRNA を注射したワモンゴキブリは 50%の致死率を示し、actin dsRNA をた が、2 週 間 後 で はGAPDH dsRNAを 注 射 し た ワ モ ン ゴ キ ブ リ は 50%の 致 死 率 を 示 し、actin
注射されたワモンゴキブリは 100%の致死率を示した（表 1）。この結果からワモンゴキブリに actindsRNAを注射されたワモンゴキブリは100%の致死率を示した（表1）。この結果からワモンゴキブに対して RNAi を誘導することで致死を誘導することで可能であることが認められた。
リのactinに対してRNAiを誘導することで致死を誘導することで可能であることが認められた。
表 1．dsRNAを注射されたワモンゴキブリの致死率

これまでに、ワモンゴキブリの Hox 遺伝子の一つである Scr を RNAi によりノックダウンすると体これまでに、ワモンゴキブリのHox遺伝子の一つであるScrをRNAiによりノックダウンすると体の様々な部位に変異が生じた表現型が現れることが報告されている（Hrycaj et al., Dev Biol,の様々な部位に変異が生じた表現型が現れることが報告されている（Hrycaj et al., Dev Biol,
2010）。本研究成果から、RNAi の誘導によりワモンゴキブリに致死を誘導することができる結果が2010）。本研究では、ワモンゴキブリの細胞骨格形成遺伝子をRNAiによりノックダウンすること得られた。しかしながら、依然としてワモンゴキブリに dsRNA を給餌することで RNAi を誘導するこで致死を誘導することが可能であることを示した。しかしながら、依然としてワモンゴキブリにとが出来るか否かは不明である。今後、dsRNA の給餌により、注射により dRNA を導入した場合と同dsRNAを給餌することでRNAiを誘導することが出来るか否かは不明である。今後、dsRNAの給餌
様の RNAi による影響が現れるか否かを詳細に調べることで、e-RNAi を衛生害虫の防除へ応用するにより、注射によりdRNAを導入した場合と同様のRNAiによる影響が現れるか否かを詳細に調べことへの可能性を示すことが出来ると考えられる。
ることで、e-RNAiを衛生害虫の防除へ応用することへの可能性を示すことが出来ると考えられる。
3.2. dsRNA の導入（給餌）によるイエシロアリへの影響
3.2. dsRNAの導入（給餌）によるイエシロアリへの影響
建材害虫として知られている数種のシロアリ目に属する昆虫の中で、日本の多くの地域に生息し建材害虫として知られている数種のシロアリ目に属する昆虫の中で、日本の多くの地域に生息しているヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）は、湿った木材や土中で特定の巣を作らず生活ているヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）は、湿った木材や土中で特定の巣を作らず生活してしており、建築物の木材部位を加害する。一方、ヤマトシロアリと同様に日本の多く地域に生息しおり、建築物の木材部位を加害する。一方、ヤマトシロアリと同様に日本の多くの地域に生息してているイエシロアリ（Coptotermes formosanus）は、ヤマトシロアリとは対照的に、塊状の巣を作いるイエシロアリ（Coptotermes formosanus）は、ヤマトシロアリとは対照的に、塊状の巣を作り、コり、コロニーで生活している。近年、ヤマトシロアリに dsRNA を給餌することで RNAi を誘導するこロニーで生活している。近年、ヤマトシロアリにdsRNAを給餌することでRNAiを誘導することが可能であることが報告され（Zhou et al., Insect Biochem Mol Biol. 2008）、e-RNAiをシロアリ目昆虫の防除へ応用出来る可能性が示されている。しかしながら、イエシロアリのe-RNAiに関する報告は未だにない。本研究では、細胞骨格形成に関連しているtubulin、熱ショックタンパク質のHSP70のdsRNAを実験方法で示した様にイエシロアリへ与え、その影響を観察した。
まず、tubulinおよびHSP70 dsRNA溶液を染み込ませた紙を摂取したイエシロアリのtubulinおよびHSP70のmRNA発現レベルをリアルタイムPCRで測定した。図4で示すように、dsRNAを含む紙の給餌を開始後2日目から標的とした遺伝子の発現の抑制が観察され、4日目ではネガティブコントロールに比べ、50%以下にまで標的の発現が抑制されていた。
続いて、dsRNAの給餌によるイエシロアリへの影響を観察した。図5で示すように、dsRNA溶液を染み込ませたろ紙を摂取したイエシロアリは、1週目では何の変化も観察されなかったが、2週目から致死活性を示し、3週目では著しく高い致死性を示した。

－ 43 －染み込ませたろ紙を摂取したイエシロアリは、1 週目では何の変化も観察されなかったが、2 週目から致死活性を示し、3 週目では著しく高い致死性を示した。

図 4．dsRNAの給餌によるmRNAの発現への影響
左が HSP70 dsRNA を給餌したイエシロアリの HSP70 発現量を示し、右が tubulin dsRNA を給餌したイエシロアリのHSP70 発現量を示している。発現量は、ネガティブコントロールの GFP dsRNA を給餌したイエシロアリの発現量を 1 として算出した値を示している。グラフ中の 2 および 4 は、dsRNA の給餌を開始してからの日数を示している。

図 5．dsRNAを摂取したイエシロアリの致死率
左は tubulin dsRNA を摂取したイエシロアリの致死率を示し、右は HSP70 dsRNA を摂取したイエシロアリの致死率を示す。

以上の結果から、イエシロアリでもヤマトシロアリと同様にe-RNAiを示し、tubulinおよびHSP70を標的としたRNAiがイエシロアリの致死を誘導することを示した。
3.3. イエシロアリのRNAiに対してdsRNAの長さがおよぼす影響
これまで、線虫C. eleganceをモデルに用いたRNAiメカニズム関する研究が盛んに行われていたが、近年、昆虫がe-RNAiを示すことなど、昆虫のRNAiメカニズムに関する報告が増えてきている。ゲノム解析が進んでおり、進化発生学の研究分野でモデルに用いられているコクヌストモドキ
は、C. eleganceと同様に全身性のRNAi（systemic RNAi）を示し、そのRNAiは、導入するdsRNAの長さによりRNAi効率が変動することが報告されている（Miller et al., PLoS One, 2012）。さらに、以前、著者らはウエスタンコーンルートワームの示すe-RNAiにおいてもdsRNAの長さがRNAi効率に影響を及ぼすことを報告した（Miyata et al., PLoS One, 2014）。本研究成果からイエシロアリがe-RNAiを示すことが認められたが、dsRNAの長さがRNAi効率に影響するか否かは不明である。
本研究では、500および100bp HSP70 dsRNAを合成し、それらのdsRNAを用いてイエシロアリのe-RNAiにdsRNAの長さが影響するか調べた。
500および100bp HSP70 dsRNAを実験方法で示した方法でイエシロアリへ給餌し、HSP70mRNAの発現量への影響をリアルタイムPCRで定量した。その結果、図6で示すように、100bp
HSP70 dsRNAを摂取したイエシロアリに比べ500bp HSP70 dsRNAを摂取したイエシロアリのHSP70 mRNAの発現は、劇的に抑制されていた。さらに、dsRNAを摂取したイエシロアリの観察－ 44 －

イエシロアリから致死は確認されなかった（図 6）。
これらの結果から、イエシロアリの示す e-RNAi は、ウエスタンコーンルートワームの e-RNAi と同様に給餌する dsRNA の長さが RNAi 効率に影響することが明らかとなった。また、イエシロアリの防除に e-RNAi を応用には、長鎖の dsRNA を用いる必要性があることが示された。

図 6．dsRNAの長さがおよぼす影響
左は 100 および 500bp HSP70 dsRNA を給餌開始してから 4 日後の HSP70 mRNA の発現量を示し、右は dsRNA を摂取したイエシロアリの致死率を示す。HSP70 mRNA の発現量は、ネガティブコントロールの値を 1 として算出した値を示している。

を続けた結果、500bp HSP70 dsRNAを摂取したイエシロアリは3週間目に高い致死率を示したが、4. 結論
100 HSP70 dsRNAを摂取したイエシロアリの死亡は認められなかった（図6）。
本研究では、ワモンゴキブリを RNAi で actin をノックダウンすることで致死を誘導することが可
これらの結果から、イエシロアリの示すe-RNAiは、ウエスタンコーンルートワームのe-RNAiと能であることを示すことができた。また、イエシロアリが e-RNAi を示すことが認められ、さらに、同様に給餌するdsRNAの長さがRNAi効率に影響することが明らかとなった。また、イエシロアリの防除にe-RNAiを応用には、長鎖のdsRNAを用いる必要性があることが示された。
4．結論
本研究では、ワモンゴキブリのactinをRNAiによりノックダウンすることで致死を誘導することが可能であることを示した。また、イエシロアリがe-RNAiを示すことが認められ、さらに、そのe-RNAiはdsRNAの長さによって効率が変動することが明らかとなった。これらの結果から、衛生および建材害虫の防除にe-RNAiを応用できる可能性を示すことができたと考えられる。しかしながら、本研究で得られた結果では、致死を誘導するまでに2週間以上の期間を要してしまい、化学系薬剤を使用した場合とは異なり、即効性がないという結果であった。また、dsRNAを効果的に給餌方法の検討など、現段階では、e-RNAiを衛生および建材害虫の防除へ応用するためには多く課題が残っている。今後、本研究で用いたワモンゴキブリおよびイエシロアリをモデルに衛生および建材害虫のe-RNAiメカニズム解析、最適dsRNA給餌方法の検討を進めていくことで、e-RNAiを応用した衛生および建材害虫の防除システムを確立することが可能になると考える。
謝辞
本研究を遂行するにあたり、ワモンゴキブリの飼育方法、RNA抽出方法など、様々な実験手法の指導をして下さった、中部大学応用生物学部環境生物学科の長谷川浩一准教授、中部大学応用生
物学研究科応用生物学専攻博士後期課程の小澤壮太氏（日本学術振興会特別研究員DC1）、鹿児島大学連合農学研究科博士後期課程の佐藤一輝氏（日本学術振興会特別研究員DC1）に御礼申し上げます。
参考文献
1） Fire A1 , Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC (1998 ) Potent andspecific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391,806-811－ 45 －2） B aum JA, Bogaert T, Clinton W, Heck GR, Feldmann P, Ilagan O, Johnson S, Plaetinck G,Munyikwa T, Pleau M, Vaughn T, Roberts J (2007) Control of coleopteran insect pests
through RNA interference. Nat Biotechnol, 25, 1322-1326
3） Mao YB, Cai WJ, Wang JW, Hong GJ, Tao XY, Wang LJ, Huang YP, Chen XY (2007)
Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs
larval tolerance of gossypol. Nat Biotechnol, 25, 1307-1313
4） H uvenne H 1, Smagghe G (2010) Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential ofRNAi for pest control: a review. J Insect Physiol, 56, 227–235
5） M iyata K, Ramaseshadri P, Zhang Y, Segers G, Bolognesi R, Tomoyasu Y (2014)
Establishing an in vivo assay system to identify components involved in environmental RNA
interference in the western corn rootworm. PLoS One, e101661
6） Tomoyasu Y, Wheeler SR, Denell RE (2005 ) Ultrabithorax is required for membranous
wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature, 433, 643-647
7） L uo Y, Wang X, Wang X, Yu D, Chen B, Kang L (2013) Differential responses of migratory
locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect
Mol Biol, 22, 574-5838） H rycaj S, Chesebro J, Popadić A (2010) Functional analysis of Scr during embryonic andpost-embryonic development in the cockroach, Periplaneta americana. Dev Biol, 341, 324-349） Z hou X, Wheeler MM, Oi FM, Scharf ME (2008 ) RNA interference in the termite
Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol,38, 805-1510） M iller SC, Miyata K, Brown SJ, Tomoyasu Y (2012) Dissecting systemic RNA interferencein the red flour beetle Tribolium castaneum: parameters affecting the efficiency of RNAi,PLoS One, e47431－ 46 －