第 16 回

自己抗体と自己免疫シンポジウム- 血管炎と自己免疫

vasculitis & autoimmunity-

抄録集2009 年 1 月 31 日 ( 土 ) 14:00 〜 18:00
経団連ホール（経団連会館）（東京都千代田区大手町）

プログラム■講演（14:05 〜 16:55）

1. RNA dynamics in T cells provides insights into drugs aﬀecting gene expression
Jack D. Keene（Duke University Medical Center）
座長：山本一彦（東京大学 アレルギーリウマチ内科学）
Chairman : Kazuhiko Yamamoto (The University of Tokyo)

2. プロテオミクスによる血管炎関連自己抗原とペプチドの探索
Proteomic surveillance of systemic vasculitis-related autoantigens and peptides

加藤 智啓 ( 聖マリアンナ医科大学 疾患プロテオーム・分子病態治療学）
Tomohiro Kato ( St. Marianna University School of Medicine)

座長：土屋 尚之 ( 筑波大学人間総合科学研究科 生命システム医学専攻）
Chairman : Naoyuki Tsuchiya ( University of Tsukuba)

3. MCTD患者の肺高血圧症発現に関連した抗内皮細胞抗体 (AECA)に対する抗原の解析
Identiﬁcation of possible antigens of anti-endothelial cell antibodies (AECA) related topulmonary hypertension (PH) in mixed connective tissue disease (MCTD)

澤井 高志 ( 岩手医科大学病理学 先進機能病理学部門）
Takashi Sawai (Iwate Medical University)

座長：吉田 俊治 ( 藤田保健衛生大学 リウマチ・感染症内科）
Chairman : Shunji Yoshida (Fujita Health University)

Coﬀee Break (15:35 〜 15:55)
4. Wegener 肉芽腫症：難治性病態と治療
Refractory Wegener's granulomatosis and its treatment

田村 直人 ( 順天堂大学 膠原病内科）
Naoto Tamura (Juntendo University School of Medicine)

座長：有村 義宏 ( 杏林大学 第一内科）
Chairman : Yoshihiro Arimura (Kyorin University School of Medicine)

5. 血管疾患に対する血管再生療法
Therapeutic vasculogenesis for vascular disease

浅原 孝之 ( 東海大学医学部 再生医療科学 / 先端医療センター 血管再生研究グループ )Takayuki Asahara (Tokai University School of Medicine, Institute of Biomedical Research and Inovation)

座長：針谷 正祥 ( 東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科 薬害監視学 )Chairman : Masayoshi Harigai (Tokyo Medical and Dental University Graduate School)■ 特別講演（16:55 〜 17:55）
Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies versus other neutrophil-speciﬁcantibodies: clinical and pathophysiological signiﬁcance.
Allan Wiik (Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark)座長：Jack D. Keene (Duke University Medical Center）
Chairman : Jack D. Keene（Duke University Medical Center）

1. RNA Dynamics in T cells Provides Insights into Drugs Affecting Gene Expression
Jack D. Keene
Department of Molecular Genetics and Microbiology,
Duke University Medical Center,
Durham, N.C. 27710, USA

The Posttranscriptional RNA Regulon theory proposed that RNA-binding proteins are able totarget multiple messenger RNAs (mRNA) and coordinate their expression at the levels of splicing,polyadenylation, export, localization, and translation. While this concept has been confirmed using
many types of eukaryotic cells, the most critical aspect of the theory involves how populations offunctionally related mRNAs within these regulons change dynamically during cellular processes
such as proliferation, differentiation, or drug treatment. Such biological perturbations alter thedynamic properties of RNA regulons leading to a concerted and organized response to cellularactivation. Previously, we examined mRNA dynamics during neuronal differentiation, but have now
discovered similar changes in mRNA populations in the immune system following the activation ofT cells. Indeed, dynamic changes within cellular systems, while difficult to study, are exceedingly
important and need to be understood mechanistically.
It is known that immune effectors are regulated at the levels of mRNA stability and translation
by RNA-binding proteins (RBPs) and microRNAs. Immune regulators, including cytokinesand chemokines, function in response to antigenic presentation, as well as during autoimmune
responses resulting from their inappropriate expression. Using microarray profiles of mRNAsassociated with HuR, an activator of translation and RNA stability, in mitogen-activated T cells, weobserved dramatic changes in the mRNA subsets associated with HuR that were not apparent usingtranscriptomic analysis. These mRNAs encode key cytokines and chemokines plus members of theWNT pathway, known to be involved in development and carcinogenesis. These dynamic mRNAdata sets were used to screen gene expression-drug connectivity libraries and yielded numerous
small molecule candidates. Several are anti-inflammatory drugs and were found to affect HuR
localization and T cell activation. These data suggest that dynamic ribonomic analyses can provide
clues to higher-order gene coordination, and reveal compounds that modulate posttranscriptional
regulation of immune cells.

-2-2. プロテオミクスによる血管炎関連自己抗原とペプチドの探索
加藤 智啓
聖マリアンナ医科大学 疾患プロテオーム・分子病態治療学

我々の研究室では、プロテオミクスを中心的手法として、リウマチ性疾患の研究を進めている。プロテオミクスではその名の通り蛋白質を対象として、その量的評価のみならず、翻訳後修飾の評価、切断されて生成する小ペプチドの評価、また、抗原性の評価などが、ある程度の網羅性をもって可能である。自己抗原の探索については、プロテオミクスの基本的手法である 2 次元電気泳動とウエスタンブロットを組み合わせ、かつ、抗原のソースとする細胞を適切に選ぶことで、有効なスクリーニングシステムとすることができる。例
えば、我々は関節リウマチでは患者滑膜細胞で翻訳後修飾であるシトルリン化が起り、かつ自己抗原となっている蛋白質のスクリーニングや、本シンポジウムのテーマである血管炎で、血管内皮細胞蛋白質と他の細胞の蛋白質を２次元電気泳動で比較しつつ血管内皮細胞で優位に発現する自己抗原のスクリーニングを行っている。血管炎に関したスクリーニ
ングでは、約 150 個の自己抗原候補を検出し、質量分析により現在までにその約半数を同定している。その中には抗 Prx2 抗体など大中型血管炎でも優位に出現する抗内皮細胞抗体も同定された。現在、順次組換え蛋白質を作製し、自己抗原性の確認と臨床的意義を検討している。一方、切断されて生成する小ペプチドは、これまで検出する方法が確立してなかったことから研究の対象外であったが、やはりプロテオミクスの重要な手法である質量分析を直接応用することで、近年検出と同定が可能となってきている。我々は強皮症
あるいは血管炎について、この血清ペプチド探索を行い、後者についても血管炎患者血中で治療前に高値で治療により低下するペプチドを検出し、また同定しているので、その方法論と共に紹介したい。

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3. MCTD 患者の肺高血圧症発現に関連した抗内皮細胞抗体 (AECA) に対する抗原の解析
澤井 高志１）、鎌滝章央１）、佐々木信人２）１）２）

岩手医科大学

岩手医科大学内科学講座

病理学講座

先進機能病理学分野

呼吸器・アレルギー・膠原病内科分野

混合性結合組織病 (MCTD) において肺高血圧症 (PH) は重篤な合併症として知られており、死因の上位に位置しているが、その原因については不明である。
混合性結合組織病 (MCTD) の剖検例の解析
厚生省 ( 現厚労省 )MCTD 班で全国から剖検症例を集め、その死因と病態を検討した。
用いた症例は 32 例であるが、そのなかで明らかに PH が原因で死亡した症例は 11 例(34.4％ ) であった。その 11 例を解析すると主に血管型といわれる血管病変の目立つものが 9 例、間質型とよばれる肺線維症によるものはなく、混合型とよばれる血管型と間質型の混在する症例が 2 例であり、すべての PH が原因で死亡した症例で血管病変が認められた。
肺の血管内皮細胞の傷害が先行か？
血管型が優位を占めていたため組織学的に解析した結果、直径 100-200μm の血管での線維性内膜肥厚が圧倒的に多く、そのほか PH に伴う多彩な像が認められた。組織上から
PH の原因を明らかにすることを試みたが、剖検例であることと死亡までの時間が経過しているため原因か結果かの結論は得られなかった。そこで、臨床的には PH を呈していなかった MCTD の症例を検討し肺疾患には直接関連しない他の原因で死亡した症例と比較した。その結果、MCTD 群では PH の有無にかかわらず、直径 100μm 前後の小さな血管に血栓あるいはその器質化や内膜の肥厚が目立つという結果が得られた。このように血栓や内膜肥厚が見られたことから、PH の発症に内皮細胞の傷害が先行することが示唆された。
そこで、肺の小動脈の内皮細胞の傷害に標的を絞って解析を試みた。勿論、内皮細胞の傷害を引き起こす因子はいろいろ考えられるが、そのなかで、MCTD が抗 U1-RNP 抗体をはじめ様々な自己抗体を特徴とする自己免疫疾患であること、しかも病変の発生するのが肺の小血管であり決して全身の血管ではないことから、肺の細い血管の内皮細胞に傷害を引き起こす自己抗体を想定して実験を始めた。
抗内皮細胞抗体 (AECA) の存在
MCTD の患者を、PH 合併の有無と MCTD の治療の有無により、MCTD 治療例で PH合併例 (MCTD-PH 群 )、MCTD 治療例で PH 非合併例 (MCTD-nonPH)、MCTD 未治療例(MCTD-untreated(un)) に分け、内皮細胞と患者血清中の抗体との反応性の検討をおこなっ-6-た。実験に用いた細胞は大動脈血管内皮細胞 (HAEC)、肺動脈血管内皮細胞 (HPAEC)、肺微小血管内皮細胞 (HMVEC-L) である。方法としては培養した細胞を患者血清と反応させた後、FITC 標識抗ヒト IgG 抗体と反応させ、その蛍光強度をフローサイトメトリーで測定した。その結果、MCTD-PH 群、MCTD-un 群では MCTD-nonPH 群に比較し、蛍光強度が著しく高く、患者血清中の AECA との反応が亢進していることが示された。一方、3 種類の血管内皮細胞での比較では、特に有意な違いは認められなかった。
AECA の抗原の探索
MCTD 患者血清中における AECA の存在が確認できたため、次に、患者血清中の AECAが認識する抗原の探索を行った。HMVEC-L から調製した蛋白質を二次元電気泳動で展開し、ウエスタンブロットを行い、患者血清が強く反応したスポットをペプチドマスフィ
ンガープリンティングや LC-MS/MS で同定し、その結果、約 20 個の抗原候補蛋白質を得ることができた。この中には、様々な疾患で自己抗原としての報告のある vimentin やannexin が認められたが、ほかに MCTD 血清中の抗 U1-RNP 抗体が反応する U1-70K も含まれていた。抗原候補の組換え蛋白質を作製したところ、一部の抗原候補蛋白質に対して、MCTD 患者血清が反応性を示すことが確認できた。
現在、このなかでいくつかの候補に絞って、病態と抗体価との関連などから解析を進めている。PH の病態や発症機序に関連する自己抗原を解明することで、新たな診断法や治療法の可能性が開けることを期待している。

<MEMO>-7-

4. Wegener 肉芽腫症：難治性病態と治療
田村 直人
順天堂大学 膠原病内科

Wegener 肉芽腫症(WG)は、好中球細胞質抗体(antineutrophil cytoplasmic antibody:ANCA)が病因に関連する全身性血管炎である。上・下気道および腎病変が特徴とされるが、その病態は多彩である。シクロフォスファミドおよびステロイドの併用療法が標準的寛解導入療法として用いられており、その寛解率は約 90% であるが約 50% に再燃が認められる難治性疾患である。わが国では ANCA 関連血管炎のうち、myeloperoxidase(MPO)ANCA が関連する顕微鏡的多発血管炎が多く、主に proteinase 3 (PR3)-ANCA が陽性となる WG は欧米に比べ頻度が少ない。
当施設において治療開始された WG は 2000 年から 22 例であり、発症年齢は 10 歳から 75 歳で男性が半数であった。上気道、下気道、腎病変はそれぞれ 18 例、15 例、8 例であった。それ以外の難治性病態として、肥厚性硬膜炎 4 例、声門下狭窄 2 例、腸管病変2 例などが認められた。死亡例は 5 例であった。
治療抵抗性、進行性で死亡した症例では全身臓器の血管炎が認められた。他の治療抵抗性の 2 症例でリツキシマブによるＢ細胞除去療法が施行された。2 症例ともに眼窩内肉芽腫を認め、1 例は気管支・肺病変を、もう 1 例は肥厚性硬膜炎を伴い、既存の免疫抑制療法に抵抗性であった。リツキシマブ投与後、2 症例ともに症状の改善および肉芽腫の縮小がみられ、Birmingham Vasculitis Activity Score (BVAS) の低下が認められた。1 例では約半年後に再燃が認められ 2 回目のリツキシマブ投与を行ったがその後 2 年の経過で再燃はみられておらず、もう 1 例では 3 年経過したが再燃はない。いずれの症例でも副作用は認められず、難治性 WG に対して有効性の高い治療法と考えられた。
一般的には PR3-ANCA と疾患活動性は相関すると考えられているが、その関連性についは議論の多いところである。前述のリツキシマブ治療を行った 2 症例においては、発症時は PR3-ANCA(通常の direct ELISA 法) 陽性であったが、リツキシマブ開始前の再燃時には陰性であった。そこで direct ELISA 法より感度が高いとされる capture ELISA 法で測定したところ、両者とも著名な高値が認められ、臨床症状の改善に伴い低下した。一部の病態、病期においては両者の測定値に乖離が認められることが示唆され、今後の検討が必要と考えられた。

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5. 血管疾患に対する血管再生療法
浅原 孝之
東海大学医学部 再生医療科学 / 先端医療センター 血管再生研究グループ

成体幹細胞研究が進む中、血管内皮前駆細胞 (endothelial progenitor cell) が末梢血液中に存在し、重症虚血部位の血管形成に関与することが判明した。この機序は、胎児期のみに存在するとされた血管発生 (Vasculogenesis)、つまり血管内皮前駆細胞が 未分化のままその場所にたどり着き、増殖、分化することで血管を構築する過程、に一致し、これまで考えられてきた成体の血管形成、既存隣接血管の血管内皮細胞による増殖 、遊走により成立する血管新生 (Angiogenesis) とは異なる概念が生まれた。この血管内皮前駆細胞の研究は医療応用に大きな可能性を秘めている。血管内皮前駆細胞の生物学的基礎研究の発展と共に、虚血部位の血管新生療法や動脈硬化部位の血管内皮再生療法や、増殖させた血管内皮前駆細胞を応用する前臨床研究が、トランスレーショナルリサーチとして展開されてきた。
この成果を得て、先端医療センターおよび東海大学では 2003 年 11 月よりバージャー病を含む慢性重症虚血下肢に対する自家末梢血血管内皮前駆細胞移植による血管再生治療を開始している。試験デザインは、単盲検下での用量漸増試験である。対象は、Fontaine
分類Ⅲ度以上かつ Rutherford 分類Ⅱ度Ⅳ群以上を示し、血管形成術・バイパス手術の適応がない患者である。フィルグラスチム(10μg/kg/day)の 5 日間投与後、アフェレーシスを実施し末梢血幹細胞 ( 単核球 ) を採取、CD34 陽性細胞を分離し、腰椎麻酔下に下腿 40箇所 ( 腓腹筋 30 箇所、趾間部 4 箇所、足底部内側筋 6 箇所 ) に筋肉内移植する。現在先端医療センターで 17 例の患者( 閉塞性動脈硬化症 5 例、バージャー病 12 例) 東海大学で４例の患者に試験治療を実施した。試験治療期間中、重篤な有害事象の発生はなく安全に実施できている。試験治療により自覚症状や潰瘍の改善は全例において認められている。
本シンポジウムでは、この血管再生療法についての現状を報告する。

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<SPECIAL PRESENTATION>
Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies versus other neutrophil-specificantibodies: clinical and pathophysiological significance.
Allan Wiik, MD, PhD.
Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark

Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies (ANCA) constitute just a minor part of antibodies
specifically directed to neutrophils. In a large laboratory routine only about 3-4% of sera comefrom patients with an ANCA-associated disease such as Wegener’s granulomatosis, microscopic
polyangiitis, Churg-Strauss syndrome or drug-induced vasculitis. Only some of those sera stemfrom new onset disease. Neutrophil-specific autoantibodies (NSA) thus mostly derive from patientswith rheumatoid arthritis, chronic active hepatitis, ulcerative colitis, primary sclerozing cholangitis
or other disorders characterized by chronic neutrophil/monocyte inflammation. Though NSA arereadily detected by indirect immunofluorescence (IIF) negative reactions are seen with classical
ANCA antigens e.g. proteinase 3 (PR3), myeloperoxidase (MPO), elastase (EL) or bacterial
permeability-increasing protein (BPI). Consensus-agreed definition of ANCA thus stresses theimportance of finding both positive IIF NSA and a positive reactivity with one or more ANCA
antigen(s) by f. ex. ELISA.
It is very important that cut-off values of ANCA are set at a level where true ANCA can beseparated from weak reactivity seen in some chronic inflammatory non-vasculitic disorders. Whether
ANCA levels should be monitored for follow-up of vasculitis patients is at present controversial.
Patients that manifest signs of vasculitis in the kidney and/or lungs should both be investigated for
ANCA and for antibodies to glomerular basement membrane (anti-GBM).
Solid phase assays (e.g. ELISA, beads or antigen arrays) based on direct coating with an ANCA
antigen give somewhat different results from assays based on antigen capture by a monoclonal
antibody or a ligand, possibly due to a different presentation of autoantigen epitopes. This is atleast assumed to be the case for PR3-ANCA assays, where positive results can be seen with capture
assays in the absence of reactivity in direct assays.
International discussions are now going on to establish new diagnostic criteria for vasculitic
disorders. Standardized ANCA are likely to become part of such criteria. New reference reagents for
PR3-ANCA and MPO-ANCA are now available from CDC in Atlanta http://vasculitis.org.

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世話人：山本一彦（東京大学 アレルギーリウマチ内科）
高崎芳成（順天堂大学 膠原病内科）
三森経世（京都大学 臨床免疫学）
Jack D. Keene（Duke University, Medical Center）
後援：

株式会社 医学生物学研究所