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愛媛大学農学部紀要（Mem. Fac. Agr., Ehime Univ.）
５
６：３
３−３
９（２
０
１
１）

Saccharomyces cerevisiae 由来グリセロール脱水素酵素の
精製と細菌由来酵素の基質特異性
趙 紅 梅＊＊・白石 雄大＊・田中 宏樹＊・渡部 保夫＊Hong mei ZHAO＊＊, Yudai SHIRAISHI＊, Hiroki TANAKA＊ and Yasuo WATANABE＊:
Purification of Glycerol Dehydrogenases from Saccharomyces cerevisiae
and the Substrate Specificity of Bacterial Enzymes
Abstract
We have obtained the dehydrogenases being specific for mannitol and arabitol with the gene cloning andover-expression in yeast cells, in order to measure the content of various sugar alcohols by using thedehydrogenases. In this study, we carried out the isolations of glycerol dehydrogenases from Saccharomyces
cerevisiae and determined its substrate specificities. Target proteins were purified by affinity
chromatography with the addition of ‘tag’ at N-terminus or C-terminus by gene recombination. The obtained
enzymes showed the low specificity for sugar alcohols. However, we found the bacterial enzymes thatshowed the high specificity for glycerol in commercial products. These glycerol dehydrogenases could beavailable in the enzymatic analysis of glycerol content.
キーワード：グリセロール脱水素酵素，基質特異性，酵素定量法

はじめに食品に含まれる場合の加工特性として，耐熱性，耐酸，
耐アルカリなどが上げられる．

糖アルコールとは，アルドース又はケトースを還元

特定保健用食品として機能性成分をその効能を表示して得られるポリヒドロキシアルカン（polyhydroxy-

して販売することが日本の消費者庁により許可されてalkane）をいう．三価アルコールとして，グリセロー

いる．虫歯の原因とならない甘味料として，キシリト

ル，四価アルコールとして，エリスリトール，五価ア

ールやエリスリトールを食品添加物として加えたチュ

ルコールとして D!アラビトール，キシリトール，D!

ー イ ン ガ ム が 販 売 さ れ て い る（http://www.caa.go.jp/

リビトール，六価アルコールとしてガラクチトール，

foods/index４.html）．

D!ソルビトール，D!マンニトール，七価アルコール

耐塩性酵母では，糖アルコールは，単糖類の代謝産として β!セドヘプチトールがある．グリセロールは物として広く見いだされるが，耐塩性酵母ではポリオ

脂質として，また耐塩性酵母の浸透圧ストレスに対すールデヒドロゲナーゼ（糖アルコールの種類に対してる細胞内浸透圧調節剤として広 く 自 然 界 に 存 在 し

ブロードな基質特異性を示す）の働きによって，細胞（Onishi，１９６３；van Zyl and Prior，１
９
９０）
，エリスリ

内に合成・蓄積され，浸透圧変化に応答する適合溶質

トールは海藻，地衣類，菌類に，D!アラビトールはとして機能することが知られている（Onishi，１９６
３；

マッシュルーム，地衣類に，D!ソルビトールはリンvan Zyl and Prior，１９９０）．

ゴ，桃，杏，海藻に，D!マンニトールは海藻，菌類，

これまでの研究では我々の研究室では，日本独特のキノコ類，タマネギ，人参などに含まれている．糖ア

調味料である味噌や醤油の製造に用いられる耐塩性酵

ルコールは，低カロリー，難消化性，非う蝕性などの母の浸透圧調節機構について研究してきた（Onishi，機能に加え，血糖値の急激な上昇を引き起こさない機

１９６３；Iwaki et al.，２００１；Watanabe et al.，２００４；

能性がある．なお，う蝕とは口腔内の細菌が糖質からWatanabe et al.，２００８）．即ち，Zygosaccharomyces rouxii

作った酸によって歯が脱灰化されることである．別に，のグリセロール合成系の制御が，これまでに詳細に研究されてきた出芽酵母 Saccharomyces

２
０
１
１年３月２
５日受領
２
０
１
１年７月２
２日受理
＊＊
愛媛大学農学部生化学教育分野＊＊
長江大学動物科学学院，中国湖北

cerevisiae のそ

れと非常に類似していることを明らかにした（Iwaki
et al.，２００１）．特に，Z. rouxii ではグリセロールの再吸収系が重要であることも示されてきた（van Zyl et３４

趙 紅 梅，白石 雄大，田中 宏樹，渡部 保夫

al.，１９９０；Tang et al.，２００５）．耐塩性酵母では，グリドを持つ酵母 ORF コレクションをオープンバイオシ

セロール以外の糖アルコールも合成蓄積されているこ

ステム社から購入した．

とが例証された（de Figueroa and Lucca，２００１）．以
上，一般に酵母においては各種糖アルコールを合成す

２．使用培地る能力が高いので，いろいろな糖アルコールを基質と使用した培地の組成は次の通りである．S パウダ

する脱水素酵素の遺伝子資源として適していると考え

ー・マイナス・ウラシル（S-Powder（-）ura）は，アミられた．

ノ酸及び硫酸アンモニウム不含酵母ニトロゲンベース

これまで当研究室で行ってきた研究から，マンニト（Difco 製）２５．
１g，硫酸アンモニウム７５．
４g，Ile ０．
４５ールについては，酵母 S. cerevisiae 由来のオープンリ

g，Val ２．
２５g，Ade ０．
３g，Arg ０．
３g，His ０．
３g，Leuーディングフレーム（ORF）名 YEL070w のマンニト

０．
４５g，Lys ０．
４５g，Met ０．
３g，Phe ０．
７５g，Trp ０．
３g，ールデヒドロゲナーゼの遺伝子の産物があり

Tyr ０．
４５g を混合することで調製し，次の培地試薬と（Watanabe et al.，２００６；渡部保夫ら，２
００
８）
，ソルビ

した．２％ラフィノースを含む SC マイナス ura 培地

トールについては，キッコーマン社製の大腸菌由来の（SC（-）ura 培地）は，５００ml 中に S-Powder（-）ura ３．
７５

ソルビトールデヒドロゲナーゼがあり（Minamiharag，ラフィノース１０g を加えて調製した．１％ガラク

Suzuki，１
９
９
７），ア ラ ビ ト ー ル に つ い て は，

ト ー ス 及 び１％ラ フ ィ ノ ー ス を 含 む SC（-）
ura 培 地and

Kluyveromyces lactis 由来のアラビトールデヒドロゲナ

は，５００ml 中に S-Powder（-）ura ３．
７５g，ガラクトース

ーゼが，D!アラビトールに高い基質特異性を持って５g，ラフィノース５g を加えて調製した．６％ガラいることが分かった（未発表）．

クトースを含む３×YP 培地は５００ml 中に酵母エキス

以上，現在，３種の糖アルコールに対して基質特異性の高い糖アルコール脱水素酵素を特定できたので，（Difco 製）１５g，ペプトン（Becton Dickinson 製）３０
g，ガラクトース３０g を加えて調製した．

次に，食品に多く含まれるグリセロールに高い基質特異性をもつ脱水素酵素の選別を計画した．上述の通り，

３．酵母株の培養方法

酵母では糖アルコール生産性が高いことから，出芽酵

２％グルコースを含む SC（-）ura 寒天培地に，グリ

母からグリセロール脱水素酵素を取得することを試み

セロール脱水素酵素の遺伝子 GCY1 や YPR1 を発現た．S. cerevisiae の全ゲノム配列はすでに決定されてベクターに組み込んだプラスミドを持つ酵母細胞を広おり（Dujon et al.，２００４），さらに，すべての遺伝子

げ３０℃３日間培養し，酵母保存プレートとした．培養が発現ベクターにクローニングされてもいる（Gelperinは次の２つの方法で行った．

et al.，２００９）．S. cerevisiae のデータベースよりグリセ!

保存プレート上のコロニーを，２％ラフィノース

ロール脱水素酵素の遺伝子として，GCY1 と YPR1 がを含む SC（-）ura 培地３ml に植菌し，３０℃３日間培報告され て お り（http://www.yeastgenome.org/），オ ー

養し，前培養液とした．前培養液１ml を２％ラフ

プンバイオシステム社からこれらの遺伝子を発現ベク

ィ ノ ー ス を 含 む SC（-）ura 培 地１００ml に 移 植 し，

ターに組込んだ酵母クローンも市販されていた．そこ

３０℃で本培養した．対数増殖期後期の所定の濁度

で，これらの酵母クローンからグリセロール脱水素酵（OD６００nm）で遺伝子発現を誘導するために６％素を精製するとともに，基質特異性を調べることとしガラクトースを含む３×YP 培地を５０ml 加えた後，た．

２４時間振とう培養した．

タンパク質の精製法の一つにアフィニティークロマ

"保存プレート上のコロニーを，１％ガラクトース

トグラフィーがある．本実験では遺伝子組換えにより及び１％ラフィノースを含む SC（-）ura 培地３ml でタンパク質の N 末端あるいは C 末端にいろいろなタ

３０℃３日間前培養した．前培養液１ml を同培地１００グをつけ，それと相互作用を示す化学物質を固定化しml に移植し，３０℃で濁度（OD６００nm）が２になるた樹脂を充填したカラムにロードすることで粗抽出液まで振とう培養した．

からの一段階でのタンパク質の精製を行った．
材料及び方法
１．酵母株

４．酵母破砕液の調製
培養液を氷冷後遠心分離（１５００×g，１０分間４℃）した．上清を除去後，純水で酵母細胞を洗浄し，遠心S. cerevisiae GCY1 及び YPR1 の ORF を発現ベクタ

分離（１５００×g，１０分間４℃）により酵母細胞を回収

ー BG１
８
０
５（His タグ）及び pEGH（グルタチオン!S!

した．酵母細胞（５ml）に対して３００mM KCl を含む

トランスフェラーゼタグ）に挿入した組換えプラスミ

５０mM リ ン 酸 緩 衝 液（pH８．
２，１５ml）を 加 え 懸 濁 しSaccharomyces cerevisiae 由来グリセロール脱水素酵素の精製と細菌由来酵素の基質特異性

た．ステンレス製セルに細胞懸濁液とガラスビーズ

３５

結果および考察（１５g）を 入 れ，冷 却 水 を 循 環 し な が ら VibrogenZellumuhle を用いて１
０分間激しく振とうし，酵母細胞

１．S. cerevisiae GCY1 及び YPR1 遺伝子発現酵母

をガラスビーズで破砕した．遠心分離（１５００×g，１０株の細胞破砕液のグリセロール脱水素酵素活性分間４℃）によりガラスビーズを除いた後，細胞破砕

グリセロールに対して特異性の高いグリセロール脱液を遠心分離（１０，０００×g，１
０分間４℃）して上清を水素酵素を得る目的で，S. cerevisiae 由来の遺伝子の回収した．フィルター（ポアーサイズ０．
４５μm）でろ

産 物 に つ い て 検 討 す る こ と に し た．S. cerevisiae の過した後，Bio-Rad 製の液体クロマトグラフィーシス

GCY1 及び YPR1 遺伝子はグリセロール脱水素酵素のテム Profinia のためのサンプルとした．

遺伝子であると記載されているが（Costenoble et al.，２０００），その酵素作用機作については未知であった．

５．アフィニティクロマトグラフィー

S. cerevisiae の全ゲノム配列は既に決定されており，

１ml 容の IMAC カートリッジカラム（Bio-Rad 製）

さらにほとんどすべての ORF は発現ベクター（BG

あ る い は１ml 容 の GST カ ー ト リ ッ ジ カ ラ ム（Bio-１８０５）にクローニングされ，宿主酵母に組換えられてRad 製）を装着した Profinia を用いてグリセロール脱い る（Gelperin et al.，２００９）．酵 母 発 現 ベ ク タ ー BG

水素酵素を精製した．操作手順は同装置取扱説明書に

１８０５では遺伝子は GAL1 プロモーターの下流に配置従い行った．緩衝液等は同装置純正の試薬を用いた．

されているので，培地へのガラクトースの添加により各遺伝子は発現誘導できる（Gelperin et al.，２００９）．

６．ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（PAGE）

そこで，GCY1 酵母株と YPR1 酵母株の培養液にそれぞれガラクトースを添加して再度培養した細胞の破砕

Profinia 溶出液（１０μl）に，純水（３０μl），サンプル液を調製した．ここで，GCY1 がコードするタンパク

バッファー（ナカライテスク製，４０μl）を加え，９５℃

質を GCY１タンパク質と，YPR1 がコードするタンパの沸騰水で５分間加熱した．ゲル（Bio-Rad 製ミニプ

ク質を YPR１タンパク質と呼ぶことにした．これら

ロテアン TGX，４から１５％）にロード後，２００V で約を粗酵素液としてグリセロール脱水素酵素活性を測定

３０分間電気泳動した．ゲルは ORIOLE 蛍光ゲルステしたところ活性を検出したので，それの最適 pH を決イン（Bio-Rad 製）を用いて９０分間染色し，紫外線照定した（データは示さない）．最適 pH は９．
５であり，射で観察した．

これまで知られているいろいろな糖アルコール脱水素酵素と類似していた（Cheng et al.，２００５；Hallborn et

７．ウエスタンブロット分析

al.，１９９５；Lin，１９６１；Link et al.，２００５；Stein et al.，SDS-PAGE 後のゲルからタンパク質をセミドライ

１９９７；Wong et al.，１９９３）．その条件でこの脱水素酵

トランスファー装置（バイオクラフト製）を用いて素の基質特異性を調べた（データは示さない）．これ

２００mA で約６０分間電気泳動し PVDF 膜に転写した．

らの結果は GCY１タンパク質及び YPR１タンパク質

一次抗体として抗 HA 抗体（Open Biosystems 製）とが糖アルコールに対して基質特異性の低い，いわゆるInvitrogen 製 Western Breeze キットを用いて目的のシポリオール脱水素酵素の性質を持っていることが示唆

グナルを検出した．

された．しかしながら，宿主とした酵母細胞には多種な脱水素酵素が相当量含まれていると考えられたの

８．グリセロール脱水素酵素活性測定
分光光度計の４ml 容石英セルに純水（１．
７ml），５００

で，GCY１タンパク質及び YPR１タンパク質の精製を計画した．

mM 炭酸−重炭酸緩衝液（pH１
０，０．
６ml）
，１M 硫酸
アンモニウム（０．
１ml），１M グリセロール（０．
３ml），＋

補酵素として１０mM NAD （０．
１ml）を入れた．酵素液（０．
１ml）を加えた後，レシオビーム分光光度計日立

２．６×His タグを用いて精製した GCY1 タンパク質及び YPR1 タンパク質のグリセロール脱水素
酵素活性

U!
１
８
０
０（日立製）を用いて３４０nm の吸光度の増加を

発 現 ベ ク タ ー BG１８０５は ORF の 塩 基 配 列 に 続 い

２０分間タイムスキャンした．基質特異性試験に用いたて，６×His，ヘ マ グ ル チ ニ ン ペ プ チ ド（HA），

基質は図中に示したものを用いた．

Protein A（ZZ ドメイン）をコードする配列が結合され，タンパク質の C 末端にこれらのタグが付加できるように設計されている．この特性を利用して GCY１タンパク質と YPR１タンパク質を精製した．Bio-Rad３６

趙 紅 梅，白石 雄大，田中 宏樹，渡部 保夫

UV１

UV２

UV２

UV１

UV２

UV１

図１

His タグタンパク質の Ni 結合樹脂アフィニティクロマトグラフィー（Profinia）

A：遺伝子非誘導酵母破砕液，B：GCY1 遺伝子発現酵母破砕液，C：YPR1 遺伝子発現酵母
破砕液，１A：カラム非吸着区分，１B，１C：カラム洗浄液，１D：カラム吸着区分（精製タンパク質），薄い色の実線：UV１（２８０nm）Ni!カラム溶出パターン，濃い色の実線（１
４
０
〜１
６
０ml）
：UV２（２８０nm）脱塩カラム溶出パターン

製 Profinia という金属固定アフィニティークロマトグ
ラフ装置を用いて行った．IMAC カートリッジカラム
からの溶出パターンは UV２８０nm でモニターした（図１）．ここで，溶出区分は１A：非吸着区分，１B と
１C：洗浄区分，１D：精製区分を示している．図１−A に遺伝子を誘導していない（すなわち，糖源としてラフィノースを用いた）場合には１D 区分にはほとんどタンパク質ピークがみられず，遺伝子は誘導されていないことを確かめた．図１−B に GCY1 遺伝子を発現し，GCY１タンパク質の精製を示しているが，１D に明瞭なタンパク質ピークを認め，遺伝子の発現誘導を確認した．図１−C に YPR1 遺伝子の場合を示しているが，GCY1 と同様にタンパク質を回収できた．
図２に GCY１タンパク質精製の各段階でのサンプ
ル の SDS-PAGE に よ る 分 析 結 果 を 示 し た．な お，
GCY1 がコードするタンパク質分子量３５KDa と，６
×His などのタグに由来するもの１９KDa で，計５４KDaと計算されるが，１D 区分のサンプルはほぼ相当分子量の位置に明瞭のバンドを確認し，精製が完了したことを確かめた．
上述の HA タグに対する抗体を用いて GCY１及び
YPR１タンパク質の精製各段階でウエスタンブロット
分析を行った（図３）．それぞれ１D 区分の精製バン

図２

GCY1 発現酵素の Profinia 溶出区分の SDS!ポリアクリルアミドゲル電気泳動

M：マーカータンパク質，１A，１B，１C，１D：Profinia
溶出区分Saccharomyces cerevisiae 由来グリセロール脱水素酵素の精製と細菌由来酵素の基質特異性

図３

３
７

GCY1 及び YPR1 発現酵素の Profinia 溶出区分のウエスタンブロット分析

A：GCY1 発現酵素，B：YPR1 発現酵素，M：マーカータンパク質，１A，１B，１C，１D：Profinia
溶出区分

図４

精製した GCY1 及び YPR1 発現酵素の基質特異性

A：GCY1 発現酵素，B：YPR1 発現酵素（グリセロールを基質としたときの活性を１００％とした相対活性を示した）

ドに強い反応を確認した．１D 区分以外の溶出区分に期待される．

も同一分子量に強いシグナルを確認した．これは非吸６×His タグ付き GCY１及び YPR１タンパク質が精着やカラム洗浄液に目的のタンパク質が存在すること製できたので，得られた酵素について基質特異性を調を示しており，６×His タグ付き GCY１及び YPR１タ

べた（図４）．期待に反して，試験した全ての糖アル

ンパク質の Ni 固定化カラムへの吸着が弱いことを示

コールを基質として反応することが分かった．これらしている．吸着条件を改善することで回収率の改善がの結果から，GCY１タンパク質はグリセロール脱水素３８

趙 紅 梅，白石 雄大，田中 宏樹，渡部 保夫

図５Cellulomonas sp. 由来酵素（G３５１２酵素）と Enterobacter aerogenes 由来酵素（G４７８３酵素）の基質特異性A：Cellulomonas sp. 由来酵素（G３５１２），B：Enterbacter aerogenes 由来酵素（G４７８３）（グリセロー
ルを基質としたときの活性を１００％とし，相対活性を示した）

酵素活性を示すが，基質特異性は低いと結論した．

いことを確認した（Oliveira et al.，２００６；Dominguez

YPR１タンパク質については別の遺伝子発現系を用い

et al.，２０１０）．

てさらに検討を行った．

本実験の目標は多種類の糖アルコールを酵素法により一括して定量するキットを作製するためにグリセロ

３．GST タグを用いて精製した YPR1 タンパク質のグリセロール脱水素酵素活性
酵母発現ベクター pEGH ベクターは ORF がコードールに対して基質特異性の高い脱水素酵素を得ることであったので，シグマ試薬の酵素を利用することでグリセロールの簡易定量法が構築できると推察された．

するタンパク質の N 末端にグルタチオン!S!トランス摘

フェラーゼ（GST）と６×His タグが付加されるよう

要に設計されている．この YPR1 遺伝子発現系について

多種類の糖アルコールを一括して脱水素酵素を用い

GST とグルタチオンとの相互作用を利用したアフィて定量するために，マンニトールとアラビトールにつニティークロマトグラフィーを行った．GST-YPR１タ

いて，Saccharomyces cerevisiae と Kluyvermyces lactis

ンパク質を含む酵母破砕液をグルタチオンカートリッ

からそれぞれ遺伝子クローニング及びタンパク質の多ジカラムにロードし，緩衝液で十分に洗浄後，グルタ量発現により目的の酵素の単離精製を行った．本実験

チオンを添加して目的のタンパク質を用出した（デーでは S. cerevisiae からグリセロール脱水素酵素の精製

タは示さない）．得られた GST-YPR１タンパク質の基と基質特異性の決定を行った．遺伝子組換えによりタ質特異性を調べたが（データは示さない），グリセロ

ンパク質の N!末端あるいは C!末端にタグを付加したールに対してだけ特異性を示す酵素ではなく，ポリオ

後，アフィニティークロマトグラフィーにより精製しールデヒドロゲナーゼの特徴を持っていることが分かたタンパク質は期待に反して基質特異性に低い酵素でった．

あった．しかしながら，市販酵素にグリセロール含量の酵素的定量に利用できる基質特異性の高いグリセロ

４．市販グリセロール脱水素酵素の基質特異性
本実験の目的はグリセロールに特異的に反応する脱水素酵素を取得することであるので，シグマ試薬のグ
リセロール脱水素酵素について基質特異性を調べた（図５）．図５−A に Cellulomonas sp. 由来の酵素（シグ マ 試 薬 G３５１２）
，図５−B に Enterobactor aerogenes
由来の酵素（シグマ試薬 G４７８３）の基質特異性の結果を示したが，ともにグリセロールに対して特異性が高ール脱水素酵素を発見できた．
引用文献
Cheng H, Jiang N, Shen A, and Feng Y（２００５）Molecularcloning and functional expression of D-arabitol dehydrogenase gene from Gluconobacter oxydans in Escherichia coli.
FEMS Microbiol. Lett.２
５
２：３
５−４
２．
Costenoble R, Valadi H, Gustafsson L, Niklasson C, andFranzen CJ （２０００） Microaerobic glycerol formation in
Saccharomyces cerevisiae. Yeast１
６：１
４
８
３−１
４
９
５．

Saccharomyces cerevisiae 由来グリセロール脱水素酵素の精製と細菌由来酵素の基質特異性

de Figueroa LIC and Lucca ME（２００１）Prodction of polyols
by omsmotolerant yeasts. Food Microbiol. Protocols １
４：
２
３
３−２
４
１．
Dominguez KBH, Toth IV, et al.（２０１０）Sequential injection
kinetic flow assay for monitoring glycerol in a sugar
fermentation process by Saccharomyces cerevisiae. Appl.
Biochem. Biotechnol.１
６
０：１
６
６
４−１
６
７
３．
Dujon B et al.（２００４）Genome evolution in yeasts. Nature
４
３
０（６
９
９
５）
：３
５−４
４．
Gelperin DM, White MA, et al. （２００９） Biochemical andgenetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF
collection. Genes Developm.１
９：２
８
１
６−２
８
２
６．
Hallborn J, Walfridsson M, Penttila M, Keranen S, and HahnHagerdal B （１９９５） A Short-chain dehydrogenase genefrom Pichia stipites having D-arabitoldehydrogenase activity. Yeast１
１：８
３
９−８
４
７．
Iwaki T, Kurono S, Yokose Y, Kubota K, Tamai Y, and
Watanabe Y （２００１） Cloning of glycerol-３-phosphate
dehydrogenase gene（ZrGPD1 and ZrGPD2）and glycerol
dehydrogenase genes （ZrGCY1 and ZrGCY2） from thesalt-tolerant yeast Zygosaccharomyces rouxii. Yeast １
８：
７
３
７−７
４
４．
Lin ECC（１９６１）An inducible D-arabitol dehydrogenase from
Aerobacter aerogenes. J. Biol. Chem.２
３
６：３
１−３
６．
Link T, Lohaus G, Heiser I, Mendgen K, Hahn M, andVoegele RT（２００５）Characterization of a novel NADP（+）
dependent D-arabitol dehydrogenase from the plant
pathogen Uromyces fabae. Biochem. J.３
８
９：２
８
９−２
９
５．
Minamihara T and Suzuki M（１９９７）Properties of sorbitol
dehydrogenase from Pseudomonas sp. KS-E１
８
０
６ and
comparison with other sorbitiol dehydrogenases. J. Ferment.
Bioeng.８
４：２
５
４−２
５
６．
Oliveira HM, Segundo MA, et al.（２００６）Kinetic enzymatic
determination of glycerol in wine and beer using asequential injection system with spectrophotometricdetection. J. Agric. Food Chem.５
４：４
１
３
６−４
１
４
０．
Onishi H（１９６３）Osmophillic yeast. Adv. Food Res. １
２：５
３
−９
３．

３
９

Stein R, Gross W, and Schnarrenberger C（１９９７）Characterization of a xylitol dehydrogenase and a D-arabitol dehydrogenase from the thermo- and acidophilic red alga Galdieria
sulphuraria. Planta２
０
２：４
８
７−４
９
３．
Tang XM, Kayingo G, and Prior BA （２００５） Functional
analysis of the Zygosaccharomyces rouxii Fps1p homologue. Yeast２
２：５
７
１−８
１．
van Zyl PJ and Prior BA（１９９０）Water relations of polyol
accumulation by Zygosaccharomyces rouxii in continuous
culture. Appl. Microbiol. Biotechnol.３
３：１
２−１
７．
van Zyl PJ, Kilian SG, and Prior PA（１９９０）The role of anactive transport mechanism in glycerol accumulation duringosmoregulation by Zygosaccharomyces rouxii. Appl. Microbiol. Biotechnol.３
４：２
３
１−２
３
５．
Watanabe Y, Nagayama K, and Tamai Y（２００８）Expession ofglycerol ３-phosphate dehydrogenase gene （CvGPD1） insalt-tolerant yeast Candida versatilis in stimulated by highconcentrations of NaCl. Yeast２
５：１
０
７−１
１
６．
Watanabe Y, Takechi Y, Nagayama K, and Tamai Y（２００６）
Overexpression of Saccharomyces cerevisiae mannitol
７０w) in glycerol synthesisdehydrogenase gene (YEL０
deficient S. cerevisiae mutant. Enzyme Microbial. Technol.
３
９：６
５
４−６
５
９．
Watanabe Y, Tsuchimoto S, and Tamai Y（２００４）Heterologous expression of Zygosaccharomyces rouxii glycerol ３phosphate dehydrogenase gene （ZrGPD1） and glycerol
dehydrogenase gene （ZrGCY1） in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. ４：５
０
５−５
１
６．
Wong B, Murray JS, Castellanos M, and Croen KD（１９９３）
D-arabitol metabolism in Candida albicans: Studies of thebiosynthetic pathway and the gene that encodes NAD＋dependent D-arabitol dehydrogenase. J. Bacteriol. １
７
５：
６
３
１
４−６
３
２
０．
渡部保夫，武智由紀，金澤寛子，森田安佳里，山田寿，
玉井洋一（２００８）酵母由来のマンニトール脱水素酵素の特徴とマンニトールの酵素法分析への応用．Food
Function ４：１−６．