（報告様式４）【16he0702256h0003】
平成２９年５月３１日

平 成 ２ ８ 年 度

委 託 研 究 開 発 成 果 報 告 書

I. 基本情報事業

名 ：（日本語）未来医療を実現する医療機器・システム研究開発事業（英 語）Development of Medical Devices and Systems for Advanced Medical Services
研究開発課題名：（日本語）立体造形による機能的な生体組織製造技術の開発／細胞を用いた機能的な立体臓器作製技術の研究開発／細胞シート工学を基盤とした革新的立体臓器製造技術の開発（英語 ） Development of innovative manufacturing technology for three-dimensional cardiac

constructs based on cell sheet engineering
研究開発担当者
所属 役職 氏名：（日本語）パナソニックヘルスケア株式会社 モノづくりセンター
技術企画部 部長 岩名 信一（英 語）Panasonic Healthcare Co., Ltd.
Global Manufacturing Center, Technology Planning Department
General Manager, Shinichi Iwana
実

施期間：

平成２８年４月１日 ～ 平成２９年３月３１日

II. 成果の概要（総括研究報告）(和文)
本研究開発では、日本発世界初の細胞シート工学を基盤とした立体組織構築技術を発展させ、臨床応用可能な血管網付き立体心臓の製造技術を世界に先駆けて確立することを目指す。立体心臓は、移植吻合可能な動静脈血管網を有したブタ小腸を脱細胞化して、ヒト血管内皮細胞を再播種したものを平面状あるいは管状の血管床とし、その上あるいは内面にヒト iPS 細胞由来心筋シートを血管網を付与しながら段階的に積層化、これを生体環境を模したバイオリアクターを用いて灌流培養することで作製する。
本年度は、①～⑥の項目について、以下の研究開発を遂行した。
①臨床応用可能な血管床の開発：ラット小腸の脱細胞化および血管内皮細胞の再播種の条件を踏まえ、ブタ小腸の脱細胞化、血管内皮細胞の播種条件を検討した。その結果、ブタ小腸に関しても、脱細胞化後 DNA 残存量を目標値である 50 ng/mg 以下とすることを達成した。さらに、臓器灌流バイオリアクタ
ーを用いて、ヒト血管内皮細胞を血管腔内に播種・培養することにより、灌流可能な血管網を有するヒ1

ト血管床の作成方法を確立した。
②臓器灌流バイオリアクターの開発：脱細胞化、ヒト血管内皮細胞再播種、心筋シート積層化、灌流培養の一連の工程を実施できる臓器灌流バイオリアクターを開発した。また、電気的・力学的特性を測定する機構を培養チャンバーに組み込むことで、立体臓器の電位、収縮力、内圧の測定を可能とした。脱細胞化しないラット小腸を血管床とした灌流実験では、3 層のヒト心筋シートを 2 段階積層化し、6 日間を超えて長期に灌流培養することを達成した。また、脱細胞化しないブタ小腸を平面状血管床とした灌流実験では、自律拍動し収縮力(0.5mN)を測定可能な平面状心臓の作製に成功した。
③臓器灌流液の最適化：大気開放条件下の灌流培養に適した、Leibovitz's-15(L-15)を基礎培地とすることにより、小動物管状心臓を 6 日間以上、大動物平面状心臓を約 15 日間以上、連続灌流培養可能な基礎灌流液を確立した。また、灌流液成分として、血管網新生に適したサイトカインや、エネルギー代謝の向上が期待できる脂肪酸を選定した。
④細胞シート段階的積層化法の確立：立体臓器作製に必要な細胞シート作製用の種々のサイズ、形状の温度応答性培養容器を作製した。管状心臓の作製に関しては、円形断面の膨張・折り返し式貼付け機構を持つ、ヒト心筋シートの貼付デバイスの基本設計、試作機での動作確認を行い、管腔構造内面からシート状構造物の貼り付けが可能であることを示した。
⑤組織臓器の機能評価システムの構築：ディスポーザブルグルコース・乳酸センサーを使った連続自動測定装置を開発し、極めて少ない灌流液での立体臓器の代謝を測定することを可能にした。また、光干渉断層撮影装置 OCT を開発し、血管床上への心筋シート積層化状態ならびに作製臓器の拍動のリアルタイム観察を可能にした。
⑥作製臓器の移植と有効性評価：ヒト心筋細胞と内皮細胞を共培養し、内皮細胞のネットワーク構造が構築された心筋シートを脱細胞しない血管床上へ積層化し、灌流バイオリアクターを用いて灌流培養を行うことで、平面状心臓を作製したところ、心筋組織内と血管床との間に毛細血管の結合が認められた。
さらに平面状心臓をブタ心臓へ血管吻合して移植したところ、血流再開通にともない平面状心臓の拍動が再開されることを確認し、生体外で作製した動静脈付き立体臓器が、生体内でも機能し得ることを示した。
今後、これら技術の統合による連続した臓器作製工程の確立、更なる心筋シート積層化・灌流条件最適化による高機能な臓器の作製、そして作製臓器の移植による心機能改善効果を示すことで物理的な拍動による心機能・循環動態の改善というこれまでにない心疾患に対する再生医療の実現を目指す。
要約（英文）
Our project’s aim is to develop technology for structuring three-dimensional (3D) tissues andorgans based on cell sheet engineering, that is the first technology in the world from Japan, and toestablish a manufacturing technology of clinically applicable 3D cardiac constructs with vascularnetworks.
3D “planar or tubular” cardiac constructs have been constructed by the method of stepwise
laminating of human iPS cells-derived myocardial cell sheets “on or in” vascular beds, and performed
perfusion culture using by a bioreactor which would imitate biological environment. The pig small
intestine vascular beds, that would be capable to implant and anastomose arteriovenous vascular
network, have been produced by decellularization and reseeding of human vascular endothelial cells.
This year’s annual achievements of the project are summarized below.

2

①

The development of clinically applicable vascular beds
We have considered conditions of “pig intestine decellularization” and “human vascularendothelial cells reseeding”, in reference to our research evidence of rat small intestine conditions.
We have succeeded that the residual DNA amount is under 50 ng/mg, which is the target value, in
pig small intestine after decellularization. Moreover, using tissue perfusion bioreactors, by seeding
and culture of human vascular endothelial cells in blood vessel, we have established the production
method of human vascular beds with vascular networks that would be possible perfusion.
②The development of tissue perfusion bioreactors
We have established tissue perfusion bioreactors that would be able to perform series of steps,

namely, decellularization, deplating of human vascular endothelial cells, laminating of human iPS
cells-derived myocardial cell sheets, and perfusion culture. To develop the culture chamber with themechanism of electrical and mechanics measurement technology, we have been able to measurepotential, contractile force, and internal pressure in the 3D cardiac constructs.
And we have achieved stable long-term perfusion culture of two-step laminating of 3-layer
human myocardial cell sheets for over six days by using the non-decellularizated rat intestine
vascular beds.
By using non-decellularizated pig intestine planar vascular beds, we have succeeded inproducing planar cardiac constructs, which could have independence beating and could measure
0.5mN of contractile force.
③The optimization of media for organ perfusion
We have selected the Leibovitz's-15 (L-15) as basic media for perfusion culture under open air

condition, and established basic perfusion media that enable stable long-term perfusion culture of
the tubular tissues of small animals for over six days, and the planer cardiac constructs of large
animals for over 15 days. And we have screened components of perfusion media, such as cytokinesthat would be suited to angiogenesis, and fatty acids that could be expected improvement of energy
metabolism.
④The establishment of the methods for stepwise laminating of cell sheets
We have developed and produced temperature-responsive culture dishes for production of manykinds of size and shape of cell sheets that would be necessary for manufacture of 3D cardiacconstructs. We have performed the basic design for a circular cross-section device for attachment of
human myocardial cell sheets with expansion and fold-back scheme.
⑤ The establishment of the function evaluation system for 3D cardiac constructs
We have developed the continuous automatic measuring device with disposable glucose andlactate sensors to enable us to evaluate metabolism in 3D cardiac constructs by using very small
amount of perfusion media. We have also developed the Optical Coherence Tomography (OCT),
which enables us to perform real-time observation of laminated state of myocardial cell sheets andbeating of 3D cardiac constructs.
⑥The establishment of the methods of transplantation and for 3D cardiac constructs
We have produced 3D planar cardiac constructs to perform perfusion culture of laminatedco-culture of human myocardial and endothelial cell sheets with endothelial network structure on
non-decellularized vascular beds using perfusion bioreactor.

We have observed the binding ofcapillaries between the 3D planar cardiac constructs and the vascular beds. Moreover, we have3

transplanted 3D planar cardiac constructs to pig heart by vascular anastomosis, and verified
resumption of the beating of the cardiac constructs after blood flow recanalization. It would provethat in vitro 3D cardiac constructs with artery and vein could be functional in vivo.
In future, we would aim at realization of regenerative medicine for heart diseases using
improvement of cardiac function and hemodynamics by measurement physically beating as index,
ever before, to perform (1) establishment of continuous organ manufacturing process, (2) productionof high-performance 3D cardiac constructs by further technology of laminating of cell sheets andoptimization of perfusion conditions, and (3) improvement of cardiac function by further technologyof transplantation of 3D cardiac constructs.
III.

成果の外部への発表（１）学会誌・雑誌等における論文一覧（国内誌０件、国際誌０件）
該当なし（２）学会・シンポジウム等における口頭・ポスター発表（国内２件、国際０件）
１．
「光干渉断層撮影装置を用いた細胞シートの形態的観察結果と機能評価における相関性の検証」、口頭、小林真里、岩名信一、河田博知、水内公典、原口裕次、清水達也、
第 16 回日本再生医療学会、2017/03/08、国内
２．
「光干渉断層撮影装置（OCT）を用いた 3 次元細胞シート組織の非侵襲的観察・評価」、
口頭、小林真里、岩名信一、河田博知、水内公典、原口裕次、清水達也、
第 36 回日本動物細胞工学会シンポジウム、2017/03/29、国内（３）「国民との科学・技術対話社会」に対する取り組み
該当なし（４）特許出願該当なし

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