関東森林研究

論 文68-1(2017)新潟県産無花粉スギ種子からの不定胚形成細胞の誘導
Somatic embryogenic cell induction from seeds of pollen-free sugi (Cryptomeria japonica) produced atthe Niigata prefecture
丸山 E.毅＊１・細井佳久＊１・上野真義＊１・大西昇＊２・戸塚聡子＊３・岩井淳治＊３・森口喜成＊４
Tsuyoshi E. MARUYAMA＊１, Yoshihisa HOSOI＊１, Saneyoshi UENO＊１, Noboru ONISHI＊２,Satoko TOTSUKA＊３, Junji IWAI＊３, Yoshinari MORIGUCHI＊４＊１ 森林総合研究所
Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), Matsunosato 1, Tsukuba, 305-8687 Japan＊２ キリン株式会社
Kirin Company Limited, Fukuura 1-13-5, Kanazawa-ku, Yokohama, 236-0004 Japan＊３ 新潟県森林研究所
Niigata Prefectural Forest Research Institute, Unotoro 2249-5, Murakami, 958-0264 Japan＊４ 新潟大学
Niigata University, Ikarashi 2-no-cho 8050, Nishi-ku, Niigata, 950-2181 Japan
要旨：スギ花粉症の対策として，花粉を飛散させない無花粉スギの活用が進められている。現在，無花粉スギの苗木の生産現場では，室内ミニチュア採種園で得られた種子から苗木を育成し，ジベレリン処理によって雄花の開花を誘導したうえで無花粉個体を選抜後，出荷する方法が主に採用されている。育種母材が少ないことや無花粉個体の選抜までに２年以上の時間と手間がかかるため，苗木の生産効率が問題となっている。そこで，不定胚形成技術による大量増殖法に DNA マーカーを用いた無花粉スギ個体の早期選抜技術を組み合わせた革新的な無花粉苗木の大量生産方法の確立を目指している。今回は，新潟県産無花粉個体を母樹とした交配より得られた種子からの不定胚形成細胞の誘導効率について検討を行った。不定胚形成細胞は，７月上旬から 8 月上旬にかけて採取した種子を 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）と 6-ベンジルアミノプリン（BAP）を添加した 1/2 EM 培地上で誘導した。誘導効率に関しては，７月上旬に採取した種子を試料にした場合に最もよい結果が得られた。
キーワード：Cryptomeria japonica・花粉症・雄性不稔・未熟種子・EM 培地・胚培養
Abstract: As a measure against sugi-pollen allergy, the use of pollen-free sugi has been promoted. Actually, for the production ofpollen-free sugi, plants derived from seeds obtained in an indoor miniature seed orchard were selected as pollen-free individuals
after confirmation of the absence of pollen in male strobili induced by gibberellin treatment. In this way, due to the shortage ofbreeding parent material and that more than 2 years of time and effort is needed to select pollen-free individuals, the production
efficiency of the seedling becomes a problem. Therefore, we aim to establish a mass production method of pollen-free seedling byinnovative combination of early selection by DNA marker and mass propagation method based on somatic embryogenesis
technology. This time, we investigated the induction efficiency of somatic embryogenic cells from seeds produced at the Niigata
prefecture. Somatic embryogenesis cells were induced in seeds collected from early July to early August on 1/2 EM medium
supplemented with 6-benzylaminopurine (BAP) and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Regarding induction efficiency, thebest result was achieved when seeds were collected in early July.
Keywords: Japanese cedar, pollinosis, male sterility, immature seeds, EM medium, embryo culture

Ⅰ はじめに

産現場では，室内ミニチュア採種園で得られた種子からスギ花粉症の対策として，花粉を飛散させない無花粉個苗木を育成し，ジベレリン処理によって雄花の開花を誘体の活用が進められている。現在，無花粉スギ苗木の生導したうえで無花粉個体を選抜後，出荷する方法が主に

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（受理日 2017 年 3 月 31 日）

採用されている。育種母材が少ないことや無花粉個体のれた（表－３）。７月中旬に採取した種子の場合は，14％選抜までに２年以上の時間と手間がかかるため，苗木のの誘導率が得られ，７月上旬の結果に対して半分以下の生産効率が問題となっている。そこで，不定胚形成技術誘導率となった。また，８月上旬に採取した種子を試料による大量増殖法に DNA マーカーを用いた無花粉個体のにした場合は，約９％程度の誘導率が得られ，７月上旬早期選抜技術を組み合わせた革新的な無花粉苗木の大量の結果と比較して４分の１の誘導率となり，最も低い数生産方法の確立を目指している。今回は，新潟県産無花値を示した。表－３に示すように，種子採取時期間差の粉個体を母樹とした交配より得られた種子からの不定胚不定胚形成細胞誘導効率への影響については，スギや他形成細胞の種子採取時期による誘導効率の差異についての針葉樹においても報告されている（１，２，３，４）。

検討を行った。

しかしながら，新潟県産無花粉スギを母樹とした交配より得られた種子においては，はじめての実験報告でもあⅡ 実験方法

り，採取時期や家系間差の影響については，複数の家系

１．種子の採取 新潟県森林研究所にて，2016 年３月で確かめる必要がある。に人工交配を行い作出した「新大不稔３号（無花粉個体

２．不定胚形成細胞の維持・増殖 得られた不定胚形を母樹として：図－１）×珠洲２号」家系の球果（図－成細胞は誘導時と同じ培養条件で２～３週間ごとに継代２）を 2016 年７月上旬から８月上旬にかけて採取し，取培養することで維持・増殖が可能であった（図－６）。

り出した種子（図－３）を実験材料として用いた。各採IV おわりに取時期に 300～516 個の種子を使用した。
２．不定胚形成細胞の誘導 種子表面の殺菌は，１％

今回は，新潟県産無花粉スギを母樹とした交配より次亜塩素酸ナトリウム溶液に 15 分浸漬・撹拌し，滅菌得られた種子を用いて不定胚形成細胞の誘導に必要な水で洗浄して行った。殺菌処理後，種皮を剥ぎ取り，種条件を調べた。今後，得られた培養細胞系統を維持・子胚を含む雌性配偶体（megagametophyte）（図－４）増殖し，無花粉スギの植物体再生や DNA マーカー解析を不定胚形成細胞誘導用の培地に置床した。
容器として，による個体選抜条件を検討する。

直径 90 mm の４分割シャーレを用い，培地には無機塩を 1/2 濃度に下げた EM 培地（３）に，ショ糖 10 g/l，謝辞

グルタミン１ g/l，カゼイン 0.5 g/l，ゲルライト３ g/l，

本研究は、農林水産業・食品産業科学技術研究推進事

2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）10 μM，6-ベンジ業の支援によって実施した。関係各位の多大なご協力にルアミノプリン（BAP）５ μM を添加した固形培地を用感謝いたします。

いた（表－１）。培養は暗黒下，25℃で行った。
３．不定胚形成細胞の継代培養 誘導後の不定胚形成

引用文献

細胞は，誘導時の同一の 1/2 EM 培地にショ糖 30 g/l，

(1) FIND, J.I., HARGREAVES, C.L., REEVES, C.B. (2014)グルタミン 1.5 g/l，ゲルライト３ g/l，2,4-ジクロロフェ

Progress towards initiation of somatic embryogenesis from

ノキシ酢酸 ３ μM，6-ベンジルアミノプリン １ μM をdifferentiated tissues of radiate pine (Pinus radiata D. Don)

添加し（表－２）, 暗黒下，25℃の培養環境で維持し，

using cotyledonary embryos. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 50:増殖させた。

190-198.
(2) FINER, J.J., KRIEBEL, H.B., BECWAR, M.R. (1989)
Initiation of embryogenic callus and suspension cultures ofⅢ 結果と考察
１．種子の採取時期の不定胚形成細胞誘導効率への影

eastern white pine (Pinus strobus L.). Plant Cell Rep. 8: 203-

響 培養開始から１週間ごとに，実体顕微鏡下で培養物

206.の観察を行った。培養開始２週間後に，組織全体の膨張(3) MARUYAMA, E., TANAKA, T., HOSOI, Y., ISHII, K.,

あるいはカルス形成の開始が観察されたが，多くの外植

MOROHOSHI, N. (2000) Embryogenic cell culture, protoplast

体における不定胚形成細胞の誘導は，３－４週間後に明regeneration, cryopreservation, biolistic gene transfer and plant

らかとなった（図－５）。７月上旬から８月上旬にかけて

regeneration in Japanese cedar (Cryptomeria japonica D. Don).

採取した種子からの不定胚形成細胞を誘導できたが，誘Plant Biotechnology 17: 281-296.

導効率に関しては７月上旬に採取したものが最もよい結(4) MIGUEL, C., GONCALVES, S., TERESO, S., MARUM,果を示し，36％の頻度で不定胚形成細胞の増殖が認めら

L., MAROCO, J., OLIVEIRA, M. (2004). Somatic－42 －関東森林研究

embryogenesis from 20 open-pollinated families of Portuguese68-1(2017)

Culture 76: 121-130.

plus trees of maritime pine. Plant Cell, Tissue and Organ

図－３. 採取した球果から取り出した種子（バー：1 cm）
Fig. 3 Removed seeds from the collected cones (bar: 1 cm)

図－１. 交配に用いた無花粉スギ「新大不稔３号」の台木（新潟県森林研究所内）
図－４. 種子胚を含む雌性配偶体（バー：1 cm）

Fig. 1 Pollen-free sugi rootstock used in the crossing

Fig. 4 Megagametophyte containing zygotic embryo (bar: 1 cm)(Niigata Prefecture Forest Research Institute)

図－２. 人工交配によって得られた無花粉スギ家系の球果図－５. 不定胚形成細胞の誘導（バー：1 cm）（バー：1 cm）

Fig. 5 Induction of embryogenic cells (bar: 1 cm)

Fig. 2 Cones of pollen-free sugi obtained by artificial crossing(bar: 1 cm)－43 －表－２. 不定胚形成細胞の増殖用培地組成
Table 2 Compostion of proliferation medium
CompoundKNO3MgSO4・7H2O
CaCl2・2H2O
Ca(NO3)2・4H2O
NaNO3
KH2PO4
NaH2PO4・2H2O
KCl
MnSO4・4H2O
H3BO3
ZnSO4・7H2O
KICuSO4・5H2O
Na2MoO4・2H2O
CoCl2・6H2O
FeSO4・7H2O
NaEDTA
Thiamine HCl
Pyridoxine HCl
Nicotinic acid
Glycinemyo-Inositol
Casein Acid Hydrolysate
L-glutamine
SucroseGelrite
2,4-D
BAP
pH5.6-5.8

図－６. 不定胚形成細胞の維持・増殖（バー：1 cm）
Fig. 6 Proliferation of embryogenic cells (bar: 1 cm)

表－１. 不定胚形成細胞の誘導用培地組成
Table 1 Composition of induction medium
CompoundKNO3
MgSO4・7H2OCaCl2・2H2O
Ca(NO3)2・4H2O
NaNO3
KH2PO4
NaH2PO4・2H2O
KCl
MnSO4・4H2O
H3BO3
ZnSO4・7H2O
KI
CuSO4・5H2O
Na2MoO4・2H2O
CoCl2・6H2O
FeSO4・7H2O
NaEDTA
Thiamine HCl
Pyridoxine HCl
Nicotinic acid
Glycinemyo-Inositol
Casein Acid Hydrolysate
L-glutamine
SucroseGelrite
2,4-D
BAP
pH5.6-5.8

Amounts
500
250
37.5
30
30
3580
40
1020
12.5
0.5
1.2
0.1
0.1
1520
2.5
0.25
2.5
2.5500
500
1000
10000
3000
105[mg/l]

Amounts
500
250
37.53030
3580
40102012.50.5
1.20.10.115202.50.25
2.52.5
500
0
1500
30000
3000
31

[mg/l][μM]＊表－１と組成の違う部分を太字にした

表－３. 種子採取時期が与える不定胚形成細胞誘導
効率への影響Table 3 Effect of seed collection time on the embryogenic cell
induction frequency
採取時期

[μM]

7 月上旬

7 月中旬

8 月上旬

(7/4)

(7/19)

(8/1)

36.0%

14.0%

8.7%

（108/300）（59/420）（45/516）＊（不定胚形成細胞を誘導した外植体数／全外植体数）－

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