〈一般研究課題〉 概日リズムを考慮した糖尿病克服・予防に最適な生活環境
助 成 研 究 者

豊橋技術科学大学

沼野利佳

概日リズムを考慮した糖尿病克服・予防に最適な生活環境
沼野 利佳（豊橋技術科学大学）

Impaired circadian rhythms effect on the hormonal secretion
concerned with diabetics
Rika Numano(TOYOHASHI University of Technology)

Abstract：
The hurmonal secretion of hormone Insulin and GLP1 (glucagon-like peptide, gastric inhibitorypeptide) is regarded as significant in connection with diabetes, because it controls the level ofplasma glucose. It was reported that mutant mice of central clock gene (Clock and Bmal1), which
regulate mammalian circadian rhythms, exhibited impaired glucose tolerance, reduced insulin
secretion, and defected the size and proliferation in pancreatic islets In this study we examine
whether the impaired circadian rhythms with 24hr period effect on the hormone Insulin and GLP1
secretion.
The reaction of hormone secretion from single cell can be monitored in real time with theplasmid NPY::Venus which the neuropeptide Y (NPY) is fused to fluorescence protein (FP) Venus
In addition, we previously reported that photo-switched LiGluR (Light-Gated ionotoropic
Glutamate Receptor) could activate the cell membrane potential by photo illumination using original
photoisomerizable chemicals (MAG).
We could observe that the hormone Insulin and GLP1 secretion were promoted using photoactivated GluR system by transient photo-stimulation remotely in secretory cells. After secretory
cells were impaired circadian rhythms by knock-down of Clock and Bmal1, hormonal secretion wererepressed the number of the secretion reactions by photo-activated GluR system. It suggests that－ 63 －normal circadian rhythms are important for normal exocytosis in secretory cells by accommodating
life cycle to environmental cycle.
1.病を発症するなど、概日リズムとホルモン分泌制御は、密接に関連している。本研究の目的は、慨
はじめに体内時計で制御される24時間周期の概日リズムは、脳の中枢時計からリズムを発振し、膵臓な日リズムが変化することにより、糖尿病関連のホルモンであるインスリンやインクレチン分泌がどどの末梢分泌組織のリズムも制御する。リズムを規定する時計遺伝子の機能不全マウスでは、2型う変化するかを、リアルタイムイメージング測定系で明らかにすることである。具体的には、概日リズムを規定する時計遺伝子の発現を変化させることで、リズムを変化させた場合、分泌活動を顕糖尿病を発症するなど、概日リズムとホルモン分泌制御は、密接に関連している。本研究の目的
微鏡下でリアルタイムモニタリングする測定系を用いて、独自開発のグルタミン酸受容体を介したは、慨日リズムが変化することにより、糖尿病関連のホルモンであるインスリンやインクレチン分光照射で刺激を与える実験系も組み込みながら、ホルモン分泌の変化を観察する。これらの知見に泌がどう変化するかを、リアルタイム測定系で明らかにすることである。具体的には、概日リズムより、概日リズムを考慮した生活環境の改善により、血糖を低下させるホルモン分泌の効率を高くを規定する時計遺伝子の発現変化を抑制させることで、リズムを変化させた場合、グルタミン酸受維持することで、糖尿病克服、予防医学に役立つことである。
容体を介した光照射で数回にわたりくりかえし刺激を与えつつ、分泌活動を顕微鏡下でのリアルタ
生理活動の中でも、内分泌は、動物の恒常性、生殖、脳機能や行動を制御し、中でも、糖尿病にイムモニタリングにて、ホルモン分泌の変化を観察する。これらの知見は、概日リズムを正常に維かかわるホルモンであるインスリンを分泌する膵臓β細胞や、インスリン分泌量をコントロールす持する生活環境が、血糖を低下させるホルモン分泌の効率を高く維持する可能性を示す。
るホルモンであるインクレチン（グルカゴン様ペプチドや胃抑制ペプチドなど）を分泌する小腸内生理活動の中でも、内分泌は、動物の恒常性、生殖、脳機能や行動を制御し、中でも、糖尿病に分泌細胞のホルモン分泌機能は重要である。一方、体内時計で制御される  時間周期の概日リズかかわるホルモンであるインスリンを分泌する膵臓β細胞や、インスリン分泌量をコントロールすムは、地球上の全生物にとって普遍的なシステムであり、膵臓や小腸などの末梢組織の慨日リズムるホルモンであるインクレチン（グルカゴン様ペプチドや胃抑制ペプチドなど）を分泌する小腸内分も、中枢の体内時計によって制御されている。つまり、インスリンなどのホルモン分泌も概日リズ
泌細胞のホルモン分泌機能は重要である。一方、体内時計で制御される24時間周期の概日リズム
ムにより制御されている。高齢化社会を迎えた日本では、加齢による概日リズムの異常、不規則なは、地球上の全生物にとって普遍的なシステムであり、膵臓や小腸などの末梢組織の慨日リズム生活習慣による概日リズムの変調が、糖尿病、高脂血症、循環器系疾患などのメタボリックシンドも、中枢の体内時計によって制御されている。つまり、インスリンなどのホルモン分泌も概日リズローム発症の一端となりうる。
ムにより制御されている。高齢化社会を迎えた日本では、加齢による概日リズムの異常、また、不哺乳類における概日リズム研究は、 年代後半から 6&1 における時計遺伝子と呼ばれる遺伝
規則な生活習慣による概日リズムの変調が、内分泌の機能に影響し、糖尿病、高脂血症、循環器系子群の発現特性とその挙動で説明が行われてきた。概日リズムは、&ORFN や %PDO といった時計遺疾患などのメタボリックシンドローム発症の一端となりうる。
伝子により制御される。%PDO遺伝子の転写産物はそれぞれ、&ORFN 遺伝子の転写産物と結合して哺乳類における概日リズム研究は、1990年代後半から脳の一部である視交叉上核（SCN）におけヘテロダイマーをつくって、プロモーター領域の (ER[HV につき、多くの時計遺伝子 3HULRG 3HU
るClockやBmal1といった時計遺伝子と呼ばれる遺伝子群の発現特性とその挙動で説明が行われてき
3HUDQG3HU などの発現誘導する転写因子のひとつである。
た。Bmal1遺伝子とClock遺伝子の転写産物はヘテロダイマーをつくって、他の時計遺伝子のプロ
膵臓特異的に時計遺伝子 &ORFN や %PDO をノックアウトしたマウスは、ランゲルハンス島の大きモーター領域のE-boxesにつき、多くの時計遺伝子Periods，Cryptochromesなどの発現を誘導する転さが小さく、グルコース依存性インスリン分泌が起こらないために、 型糖尿病を発症する写因子のひとつである。
0DUFKHYD% 。このよ膵臓特異的に時計遺伝子
うに、概日リズムとホルモン分ClockやBmal1をノックアウト
泌制御は、密接に関連している。
したマウスは、ランゲルハン㻌
ス島の大きさが小さく、グル㻞㻚㻌 試料および実験方法㻌
コース依存性インスリン分泌
申請者は、グルタミン酸受容が起こらないために、2型糖体 iGluR のリガンド結合部位尿病を発症することが報告さのまわりに化合物の接着部とれている(Marcheva B., 2010)。
なる Cys 変異を導入した変異
概日リズムとホルモン分泌制
体 LiGluR と光反応性新規化学
御は、密接に関連している。
物質(MAG)組み合わせにより、
図 1 . LiGluRと光反応性化合物による光刺激系

図 1. LiGluR と光反応性化合物による光刺激系

紫外光でグルタミン酸受容体のイオンチャネルが開き、膜電－ 64 －位変化が活性化する、一方、可視光照射でイオンチャネルが閉まり、不活性化するグルタミン酸受

2. 試料および実験方法
容体 LiGluR の作製に成功している（図 1） (M. Volgraf, 2006, S. Szobota, 2007, R
申請者は、新規に合成した光反応性化学物質MAGとグルタミン酸受容体iGluRのリガンド結合部
Numano 2009)。つまり、光照射により、GluR を開閉させ、細胞膜の電位・神経細胞の活動を可位のまわりに化合物の接着部となるCys変異を導入した変異体LiGluRの組み合わせにより、紫外光逆的に変化させ、UV 照射で正確に再現性よく活動電位が発生し、可視光照射で静止した。今回、でグルタミン酸受容体のイオンチャネルが開き、膜電位を変化させ活性化する、一方、可視光照射
この光刺激系を応用し、分泌細胞の膜電位を変化させ、電位依存性 Ca2+チャネルを開けて、ホルモでイオンチャネルが閉まり、元の状態にもどすグルタミン酸受容体LiGluRの作製に成功しているン分泌が起こると考えられる、本研究では、この光照射による刺激系で、インスリンやインクレチ（図１）。つまり、光照射により、GluRを開閉させ、細胞膜の電位を可逆的に変化させ、UV照射でンを分泌する膵臓β細胞や小腸内分泌細胞の細胞膜電位を変化させ、複数回にわたり刺激を任意の正確に再現性よく活動電位が発生し、可視光照射で静止した (Volgraf M., 2006, Szobota S., 2007,
タイミングでホルモン分泌を ON にする。つまり、この実験系にて刺激をすると、繰り返し光刺激
Numano R., 2009)。今回、この光刺激系を応用し、分泌細胞の膜電位を変化させ、電位依存性Ca2+ができるとともに、ピンポイント光照射で特異的な部位を刺激できるところが利点である(Tsuboi T.,
チャネルを開けて、ホルモン分泌が起こるだろうと考えた。本研究では、この光照射による刺激系
2003)。

で、インスリンやインクレチンを分泌する膵臓β細胞や小腸内分泌細胞の細胞膜電位を変化させ、全反射蛍光顕微鏡を用いて、細胞からのホルモン分泌反応を蛍光蛋白でリアルタイムモニターす刺激を複数回にわたり任意のタイミングで与え、ホルモン分泌をONにする。
る。具体的には、ニューロペプチドY（NPY）に黄色蛍光タンパク質 Venus を融合したプラスミド

全反射蛍光顕微鏡を用いて、細胞からのホルモン分泌反応を蛍光蛋白でリアルタイムモニターすNPY::Venus
を CMV プロモーターで強く発現させた分泌細胞に遺伝子導入し、反射全顕微鏡で観察る こ と が で き る。 具 体 的 に は、 分 泌 さ れ るする。全反射顕微鏡にて、エバネッセント光で細胞膜の表層のみを励起することで、分泌の瞬間をニューロペプチドY（NPY）に黄色蛍光タンパク蛍光シグナルの一瞬の強度変化で観察する。つ
質Venusを融 合 し た プ ラ ス ミ ドNPY::Venusを
まり、ホルモン分泌は、このようにVenus サン
CMVプロモーターで強く発現させた組み換え遺ダーイベントと呼ばれる Venus 蛍光輝度が細胞伝子を、分泌細胞に遺伝子導入し、全反射顕微膜付近で一過的に上昇する現象がみられ、Venus
鏡にて、エバネッセント光で細胞膜の表層のみのシグナルを持った分泌顆粒がホルモン分泌を励起することで、分泌の瞬間を蛍光シグナルとともに、分泌顆粒の中身が細胞外に出て拡散の一瞬の強度変化で観察できる（図２）。
（Tsuboi
し、シグナルがすみやかに消失する（図2）。

㻌T.,2003）(TsuboiT., 2003)

図 2 . NPY::Venusによるホルモン分泌のリアルタイム観察系

図 2. NPY::Venus によるホルモン分泌のリアルタイム観察系
㻌 3. 実験結果
㻌 3.1 外部光刺激にて可逆的にホルモン分泌刺激がおきる㻟㻚㻌 実験結果㻌
膵臓β細胞株MIN6細胞や、小腸内分泌細胞株GluTag細胞に、分泌活動が蛍光シグナルの変化で㻟㻚㻝㻌
外部光刺激にて可逆的にホルモン分泌刺激がおきる㻌
観察できるNPY::Venusと光照射で膜電位を変化させるLiGluR受容体と赤色蛍光mCherryが連結した蛋白質LiGluR::mCherry受容体組み換え遺伝子をともに形質導入する。細胞を300nMの濃度の光
膵臓β細胞株 MIN6 細胞や、小腸内分泌細胞株 GluTag 細胞に、分泌活動が蛍光シグナルの変化反応性化合物が混入した培養液に15分培養する、その後、培養液中mCherryが発現している赤い細で観察できる
NPY::Venus と光照射で膜電位を変化させる LiGluR 受容体と赤色蛍光 mCherry が連結胞について、観察用のレーザーをNDフィルターなしで、強く細胞サンプルに照射したときとそのした蛋白質
LiGluR::mCherry 受容体組み換え遺伝子をともに形質導入する。細胞を 300nM の濃度の前後の、ホルモン分泌を分泌刺激時の分泌顆粒動態、分泌反応数等を蛍光シグナルの変化として観光反応性化合物が混入した培養液に15 分培養する、その後、培養液中 mCherry が発現している赤察した。
い細胞について、観察用のレーザーをND フィルターなしで、強く細胞サンプルに照射したときとその結果、レーザーを照射中や、その直後に、ホルモン分泌は、このようにサンダーイベントとその前後の、ホルモン分泌をサンダーイベントとして分泌刺激時の分泌顆粒動態、分泌反応数等を呼ばれる蛍光輝度が上昇する現象がみられ、分泌活動が促進されていることがわかった（図３）。
観察した。
その結果、レーザーを照射中や、その直後に、ホルモン分泌は、このようにサンダーイベントと呼ばれる蛍光輝度が上昇する現象がみられ、分泌活動が促進されていることがわかった（図 3）。

3－ 65 －

光照射直後光照射後さらに、４秒後

図 3 . GluTag細胞のホルモン分泌の可視化

3.2 時計遺伝子発現の異常はホルモン分泌に影響する
概日リズムを規定する重要な時計遺伝子であるBmal1,Clock遺伝子の発現抑制は、１細胞の概日リズムを異常なリズムにすることが報告されている。Short hairpin(shRNA)による発現ノックダウンにより、Bmal1,Clock遺伝子の発現をノックダウンした。膵臓β細胞株MIN6や、小腸内分泌細胞株GluTagにおいて、NPY::Venusにより、光刺激照射後、ホルモン分泌の回数を全反射顕微鏡で観察すると、正常のリズムを持つ細胞ではホルモン分泌が起こる条件で、ホルモン分泌がないか、頻度が著しく低くなる傾向がみられる。この事実は、膵臓特異的にBmal1をノックアウトマウスでは、インスリンを分泌が抑制され、糖尿病の発症・進展しやすいという報告と一致する。Bmal1遺伝子の発現低下が、１細胞レベルでも、ホルモン分泌反応を抑制することがわかった。また、本研
究では、１細胞レベルでの慨日リズムを測定できなかったため、Bmal1,Clock遺伝子のノックダウンにより、慨日リズムがどのくらい異常をきたしているかを同時に測定ができなかったが、Clock遺伝子機能不全マウスのリズムは、完全には消失せず、野生型マウスよりも弱くなっているという報告がある。（King D.P., 1997, Jin X., 1999）この結果は、慨日リズムが環境要因などにより弱くなっても、ホルモン分泌に影響をきたし、弱くなることを示唆する。
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