日本家禽学会誌，51 : J 1-J 5，2014

Copyright ©2014, Japan Poultry Science Association

飼料中へのプロポリス残渣の添加が横斑プリマスロックの盲腸内細菌叢へ及ぼす影響伊藤謙1・赤峰知奈美1・河田和2・志村洋一郎2・稲元民夫2・喜多一美1

12

岩手大学農学部，岩手県盛岡市上田 020-8550
秋田県立大学生物資源科学部，秋田県秋田市新城中野 010-0195

現在，成長促進を目的として家畜・家禽の飼料へ抗生物質が添加されている。しかし，抗生物質を長期間使用すると，抗生物質に対する耐性菌が現れ，バイオセキュリティを脅かす可能性がある。そこで，近年では抗生物質に代わる天然物由来の成分を飼料に添加し，成長促進効果を示すか否か調べられている。プロポリスはミツバチによって集められ，抗菌作用を示すことが報告されている。したがって，本研究では，エタノール抽出後のプロポリス残渣が肉用鶏である横斑プリマスロックの盲腸内細菌叢へ及ぼす影響を調査した。プロポリス残渣を 2% 含む飼料を 10 日間，ニワトリへ給与した。
対照区としてプロポリス残渣を含まない飼料を給与した。飼養期間終了後，ニワトリから盲腸を摘出し，盲腸内容物を採取した。盲腸内容物から総 DNA を抽出し，細菌に普遍的に存在する 16S rRNA 遺伝子を PCR-DGGE（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）にて増幅・分離した。分離された DNA バンドの光学強度を定量解析ソフトを用いて測定した。その結果，プロポリス残渣添加区における 1 本のバンドの光学強度が有意に低くなった。有意差の認められた DNA バンドの塩基配列を調べたところ Ruminococcaceae 科と同定された。本研究の結果より，プロポリス残渣を飼料へ添加することで，グラム陽性嫌気性球菌である Ruminococcaceae 科を減少させる可能性が示された。
キーワード : プロポリス残渣，細菌叢，盲腸，変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法，横斑プリマスロック──────────────────────────緒なった。ここで，天然物由来の抗菌物質の一つとしてプロポリス言が挙げられる。プロポリスとは，ミツバチが樹皮の割れ目から樹抗生物質による成長促進作用が発見されたのは 1940 年代であ脂を採取し，自身の唾液と混合させたものを巣箱の隙間や壁に塗る。当時，乾燥させた Streptomyces aureofaciens の菌糸およびクり付けたものである。プロポリスは巣の修繕および浸水防止の他ロルテトラサイクリン（放線菌由来の抗生物質）を飼料へ添加すに抗菌性が認められており，巣を衛生的に保つ作用がある（照屋ることで家畜の成長を促進させることが発見された（Castanon，ら，2006）。そこで本研究では，プロポリスの抗菌性に着目し，エ2007）。以後ヨーロッパでは，法律で抗生物質の飼料への最大添

タノール抽出後のプロポリス残渣を飼料へ添加した飼料を肉用鶏加量を制限しつつ様々な抗生物質が使用されるようになった。しである横斑プリマスロックへ給与し，盲腸内細菌叢へどのようなかし，抗生物質を長期間使用すると抗生物質に対する耐性菌が現影響を及ぼすのか調査した。盲腸内細菌叢を解析するためにれ，バイオセキュリティを脅かす可能性があることが示唆され，

Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electro-

2006 年 1 月 1 日に抗生物質を成長促進剤として動物の飼料に添phoresis（PCR-DGGE ; 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）を行っ加することを禁ずる法律が全 EU 加盟国で施行された。日本におた。PCR-DGGE とは，まず細菌で普遍的に存在する 16S rRNA

いても 2004 年に食品安全委員会が飼料添加物及び動物医薬品に遺伝子を標的として PCR を行う。その際，40 塩基のグアニンお起因する薬剤耐性菌の食品健康影響を評価するための基礎資料とよびシトシン（GC クランプ）の配列を含むプライマーを用いるして，食品を介してヒトの健康に影響を及ぼす細菌に対する抗生ことで，増幅した DNA に GC クランプを付加させ，それぞれの物質の重要度のランク付けが行われた。このように，国内外問わDNA に解離速度の違いを生じさせる。その後，変性剤を含むゲず家畜・家禽の飼料への抗生物質添加が問題視されるようになルを用いて電気泳動を行うことで配列の異なる DNA 断片を別々り，抗生物質に代わる天然物由来の抗菌物質が注目されるようにのバンドとして分離する方法である。最近我々は，PCR-DGGEで増幅・分離した DNA バンドの光学強度と元のサンプル中の細2013 年 11 月 8 日受付，2013 年 12 月 30 日受理
連絡者 : 喜多一美
〒020-8550 岩手県盛岡市上田 3-18-8
Tel : 019-621-6163
Fax : 019-621-6163
E-mail : kitak@iwate-u.ac.jp

菌数は比例することを示した（Kita et al., in press）。そこで，本研
究では，PCR-DGGE における DNA バンドの光学強度の測定することで，飼料へのプロポリス残渣添加が盲腸内細菌叢に及ぼす影響を調査した。

J1

日 本 家 禽 学 会 誌51 巻

J 1 号（2014）とした。PCR 産物 5 μl と 70% グリセロール 2 μl を混合した後，材 料 と 方 法混合したサンプルと DGGE marker II（株式会社ニッポンジーン，1． 供試鶏および飼養試験東京）をゲルにアプライし，130 V，60℃で 5 時間泳動を行った。

40 日齢の横斑プリマスロックを種鶏場（黎明舎種鶏場，大館，泳動バッファーは 1 × TAE（40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA ;秋田）から購入し，肉用鶏飼料（穀物 65%，油かす 21%，魚粉 6%，pH 8.0）を用いた。泳動後，ゲルを SYBR Gold（Invitrogen, Carlsbad,その他 8% ; CP 18%，ME 3,300 kcal/kg）を用いて 103 日間飼養しCA, USA）を 用 い て 染 色 し，ル ミ ノ・イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ーた。試験終了前の 10 日間，プロポリス残渣（角舘養蜂場有限会（LAS-4000，富士フィルム株式会社，東京）を用いてバンドを確社，八幡平，岩手）を 2% 添加した飼料をニワトリ 6 羽に給与し認した。その際，バンドの光学強度は Gel-Pro Analyzer（Versionた。本試験では，プロポリスをエタノールに 2 年間浸し，アル3.1，日本ローパー株式会社，東京）を用いて解析した。

コール抽出した後の残渣を用いた。対照区として，プロポリス残主要な DNA バンドをメスで切り取り，バンドから DNA を抽渣を含まない肉用鶏飼料をニワトリ 6 羽ヘ給与した。全てのニワ出するために TE buffer に浸し，4℃で一晩置いた。ホモジナイ

トリは民間の農場（ルーデンス農場，西根，岩手）内で飼育した。

ズし，抽出した DNA を Wizard SV Gel（Promega）and PCR Clean-

飼養試験終了後，ニワトリから盲腸を採取し，−30℃で保存した。

UP System （Promega）を用いて精製した。その際，357F （5′-本研究は，岩手大学動物実験委員会の承認を得ている。

CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）と 518R を 用 い て 再 度 PCR で2． 盲腸内容物からの DNA 抽出

DNA の増幅を行った。増幅した 16S rRNA 遺伝子を pGEM-T

盲腸内容物から DNA を抽出する前に，盲腸内容物の洗浄をEasy Vector（Promega）を用いてプラスミドを形成し，Esch-行った。盲腸から盲腸内容物 1 g を量り取り，ダルベッコ改変リ

erichia coli DH5α へ遺伝子導入した。16S rRNA 遺伝子を含むプン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を用いて懸濁した後，ナイロンメッ

ラ ス ミ ド を 精 製 し，BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit

シュ（セルストレイナー，100 μm Nylon，BD Falcon®，日本 DB（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）のマニュアルに従っ株式会社，福島）へ通し，盲腸内容物から異物を除去した。サンてシーケンスした。その際に，M13F および M13R のプライマー

プルを 3,300 × g，4℃で 10 分間遠心分離した後，上清を捨て，沈（Yanisch-Perron et al., 1985）を用いた。得られた塩基配列を用い殿物を 35 ml の DPBS を用いて懸濁した。懸濁液を再び遠心分離て，Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）検索を行った。

し，上清を捨てた。沈殿物を TE buffer（10 mM Tris-HCl （pHBLAST とは，遺伝子データベース扱う機関（DNA Data Bank of7.5），1 mM EDTA）を用いて懸濁した。懸濁液を 1 ml 分取した

Japan ; DDBJ, European Nucleotide Archive ; ENA, The Euro-後，9,300 × g，4℃で 10 分間遠心分離し，上清を捨てた。洗浄しpean Bioinformatics Institute ; EBI, National Center for Biotech-

たサンプルは−80℃で凍結保存した。洗浄したサンプルからの総nology Information ; NCBI）が所有するシーケンスデータベース

DNA 抽出は ISOPLANT II DNA 抽出キット（株式会社ニッポン

上のデータと目的の塩基配列データを照合し，類似する配列を導ジーン，東京）を用いた。抽出した総 DNA は 200 μl の TE buffer

き出すツールである。また，BLAST 検索後の DNA 塩基配列情に溶解させた。

報は DDBJ のデータベースへ登録した。

3． 盲腸内細菌の PCR-DGGE

4． 統計解析

細菌において普遍的に存在する 16S rRNA 遺伝子の V3 領域を結果は平均値±標準誤差で表した。市販統計パッケージ SAS

標的として PCR を行うために，以下の DNA プライマーを使用（SAS,（SAS/STAT Version 6, SAS Institute, Cary, NC, USA）

した。357F-GC（5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG-1999）を用いて統計処理を行った。一元配置分散分析を用いて，GGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′（357F プライマー

プロポリスの効果を要因分析し，平均値の差の検定は Student のの 5′末端にアデニンを 1 ヌクレオチド，グアニンを 25 ヌクレオt 検定により解析した。

チドおよびシトシンを 14 ヌクレオチド付加），518R（5′-GTATT-結ACCGCGGCTGCTGG-3′; Muyzer et al., 1993）。それぞれのプラ果

イマーの濃度は 10 pmol/μl に調製した。20 μl の Go Taq Green

プロポリス添加飼料を給餌したニワトリの盲腸内容物中に生息Master Mix（Promega, Madison, WI, USA），2 μl のプライマー溶する細菌由来 16 rRNA 遺伝子の PCR-DGGE を図 1 に示した。番液および 5 μl のバクテリア DNA 溶液（50 ng/μl）を混合した後，号は切り出したバンドを示す。切り出したバンドの光学強度を表

PCR を行った。PCR は以下の条件で行った。94℃，4 分を 1 サイ

1 に示した。その結果，バンド番号④で対照区よりプロポリス添

クル ; 94℃，30 秒，65-56℃，30 秒および 72℃，30 秒を 20 サイク

加区の光学強度が有意に高かった（P＜0.05）。

ル（2 サイクル毎に 1℃下げる）; 94℃，30 秒，55℃，30 秒，72℃，切り出したバンドの 16S rRNA 遺伝子塩基配列を，DDBJ の1 分を 10 サイクル ; 72℃，4 分を 1 サイクル，4℃で保存した。

BLAST 検索を用いて分析した。配列の相同性が 90∼95% のもDGGE は DCodeTM Universal Mutation Detection System（Bio-のを科として同定し，96% 以上のものを属として同定した。本研

Rad , Hercules, CA, USA）のプロトコルに従って行った。8% ポ

究では，Paraprevotella 属（相同率 96%），Bacteroidaceae 科（相リアクリルアミド，変成剤濃度勾配が 20-60% のグラジエントゲ

同率 92%），Bacteroides 属（相同率 96%），Ruminococcaceae 科

ルをグラジエントメーカー（Model 475 Gradient Delivery System,（相同率 95%），Faecalibacterium 属（相同率 96%），unclassified

Bio-Rad）を用いて作製した。変性剤として 7 M 尿素を用い，40%Bacteria（miscellaneous）（相同率 93%），Psedoflavonifractor 属

ホルムアミドを 100% 変性剤とした時の 20-60% 変性剤濃度勾配（相同率 100%），Acetanaerobacterium 属（相同率 96%）が同定さJ2伊藤ら : プロポリス残渣と盲腸内細菌叢

図 1． PCR-DGGE によるニワトリの盲腸内細菌 16S rDNA の増幅および分離。プロポリス残渣添加
飼料を給与したニワトリおよび対照飼料を給与したニワトリから盲腸内容物を採取した。盲腸内容物中細菌から総 DNA を抽出し，16S rRNA 遺伝子を PCR-DGGE にて増幅・分離した。
丸数字のバンドは切り出して DNA を増幅し，シーケンス後，菌種を同定した。

表 1． PCR-DGGE によって分離された DNA バンドの光学強度

表 2． BLAST 検索による細菌の同定
No.

飼料中プロポリス濃度
No.

0%

2%

①②

15.0 ±1.620.5*±2.2

18.2 ±3.026.1 ±2.1③④⑤37.5 ±3.033.9a±4.026.5 ±2.941.5*±3.523.2b±1.5⑥⑦⑧25.6 ±5.4
13.6 ±1.117.6*±1.118.0 ±3.214.8 ±0.7
21.0 ±1.3

17.1 ±5.8

菌名

分類

相同性（%）①②Paraprevotella
Bacteroidaceae

属
科

9692

③④⑤Bacteroides
Ruminococcaceae

属科

96Faecalibacterium⑥⑦⑧unclassified Bacteria
Pseudoflavonifractor
Acetanaerobacterium

属
no rank
属
属

95969310096

切り出した DNA バンドに含まれる細菌の塩基配列を解析し，DDBJ の BLAST 検索によって菌種を同定した。相同性が 90∼95% を科として，96% 以上を属として同定した。

図 1 において丸数字を付したバンドの光学強度をゲル画像定量解析ソフト（Gel-Pro）を用いて解析した。平均値±標準誤差，
n＝9，a∼b : p＜0.05。* 1 つの欠損値。

roidaceae bacterium）。

れた（表 2）。表 2 から，有意差の認められたバンド④の細菌はRuminococcaceae 科であった。以上から，飼料へプロポリスを給考与することでニワトリ盲腸内 Ruminococcaceae 科が減少するこ察

本研究から，プロポリスを飼料へ給与することでニワトリの盲とが示された。
以下は解析した細菌の塩基配列を DDBJ の遺伝子データベー

腸内細菌叢が変化し，特に Ruminococcaceae 科が減少することスへ登録した際の Accession number および相同性が最も高かっが示された。Ruminococcaceae 科はグラム陽性嫌気性球菌であた 細 菌 名 で あ る。AB850870（uncultured Acetanaerobacteriumる（渡邉ら，2010）。Grange et al.（1990）は，プロポリスのエタsp.），AB850871（uncultured Pseudoflavonifractor sp.），AB850872

ノール抽出物はグラム陽性菌に属する Staphylococcus aureus，（uncultured Bacteroidaceae bacterium），AB850873（uncultured

Staphylococcus epidermidis，Enterococcus spp.，Corynebacterium

Faecalibacterium sp.），AB850874（uncultured Paraprevotella sp.），spp.，Bacillus cereus およびグラム陰性菌に属する Branhamella

AB850875（uncultured Bacteroidaceae bacterium），AB850876

catarrhalis の増殖を完全に抑制したと報告している。また，彼ら（uncultured Faecalibacterium sp.），AB850877（uncultured Bacte-

はグラム陰性菌に属する Pseudomonas aeruginosa および Esch-J3

日 本 家 禽 学 会 誌

51 巻

erichia coli の増殖をある程度阻害するが，Klebsiella pneumoniae

引に対しては効果が認められず，プロポリスはグラム陰性菌よりグ

用

文

献

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ラム陽性菌の増殖を優先的に抑制したことを明らかにしている。
これらの報告は，グラム陽性菌である Ruminococcaceae 科が減少した本研究の効果と一致している。プロポリスには複数の抗菌物 質 が 含 ま れ て い る こ と が 報 告 さ れ て お り（Debuyse, 1983 ;Meresta and Meresta, 1985-1986 ; Dimov et al., 1992 ; Metzner etal., 1979），これらの抗菌物質の抗菌活性はストレプトマイシンやオキシテトラシクリンよりも低いが，抗菌スペクトルが広いことが報告されており（照屋ら，2006），今後本研究で用いられたプロポリス残渣にも Ruminococcaceae 科以外の菌への抗菌性が見出される可能性もあると考えられた。
プロポリスは世界各地で採取されるが，土地や時期によって含有される物質の種類および構成成分が異なっている（Ghisalberti
et al., 1978 ; Bankova et al., 1992）。プロポリスの成分は，ミツバチが集める植物の滲出液，ミツバチからの分泌物およびプロポリスの精製度合いの 3 つの要素によって決定される（Ghisalberti,1979 ; Marcucci et al., 1994.）。ヨーロッパ産のプロポリスの原料植物はポプラであり，抗菌成分としてフラボノイドの一種であるアグリコンを含む。これに対してブラジル産のプロポリスはアレクリンが原料植物とされており，抗菌成分である桂皮酸誘導体やテルペノイドを含む。ヨーロッパ産とブラジル産のプロポリスでは，プロポリスの原料植物および成分が異なっているが，抗菌性を持つ点では共通である。海外同様に，国内においても地域によってプロポリスの成分が異なることが報告されている。例えば，沖縄産のプロポリスでは他の地域と比較して抗酸化作用およびポリフェノール含量が著しく高い。これは沖縄が亜熱帯に属し，他 の 地 域 と 植 生 が 異 な る こ と が 原 因 だ と さ れ て い る（Hamasaka et al., 2004）。本研究では岩手県八幡平産のプロポリス残渣をニワトリの飼料へ添加した。八幡平付近の植生はブナ林が多くを占めていることから（宮脇ら，1978），ブナ由来の成分が抗菌作用を示した可能性が高い。ブナ科のクリ属やコナラ属植物
では柔細胞が死ぬ間際に水溶性化合物であるタンニンを合成し，タンニンも抗菌作用を示すことが知られている（Taguri et al.,2004 ; 2006）。また，クリ属ではタンニンの一種である castalaginを多く含むことが報告されている（田中，2008）。よって，本試験で使用したプロポリスにおいても水溶性成分であるタンニン等が多く含まれ，グラム陽性嫌気性球菌である Ruminococcaceae 科を減少させた可能性も考えられた。今後は八幡平産のプロポリス中の抗菌成分の特定を行い，ブナの抗菌成分と一致するか否か調査することが必要である。

謝J 1 号（2014）

辞本研究は独立行政法人科学技術振興機構（JST）復興促進プログラム（A-STEP）の援助を受けた。飼養試験に関しては肉の横沢株式会社およびルーデンス農場の支援を受けた。DNA のシーケンスに関しては秋田県立大学生物資源科学部バイオテクノロジーセンターの協力を得た。上記の協力に深く感謝いたします。

J4伊藤ら : プロポリス残渣と盲腸内細菌叢
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Influence of Dietary Propolis Residue on the Bacterial Florain the Cecum of Barred Plymouth RockIto R. Ken1, Chinami Akamine1, Wataru Kawada2, Yoichiro Shimura2,Tamio Inamoto2 and Kazumi Kita1
12Faculty of Agriculture, Iwate University, Morioka, Iwate 020-8550

Faculty of Bioresource Sciences, Akita Prefectural University, Shimoshinjo, Akita 010-0195

Recently, antibiotics is added into feeds of domestic animals and poultry for the growth promotion. The use ofantibiotics for long term would give biosecurity threats because of arising antibiotic-resistant bacteria. Thereafter,
various natural substrates having growth promoting effects have been attempted to use as feed additives instead ofantibiotics. Propolis is collected by honeybees and known to have antibacterial effect. In the present study, therefore,
the effect of propolis residue after ethanol extraction on cecal microflora of barred Plymouth Rock was examined. The
diet containing 2% propolis residue was given to chickens for 10 days. Control birds were fed a diet without propolis
residue. At the end of experiment, ceca were removed and the cecal content was collected. Total DNA was isolated
from cecal content. The bacterial 16S rRNA gene was amplified and separated by PCR-DGGE. Optical density ofDGGE bands was analyzed using a commercial gel image analyzer. One DGGE band in the propolis residue group waslower than that in the control group. The analyzed sequence revealed that the lowered band with low optical density wasFamily Ruminococcaceae. These results suggested that dietary propolis residue could suppress the growth of Family
Ruminococcaceae.which is one of gram-positive anaerobic bacteria.
(Japanese Journal of Poultry Science, 51 : J1-J5, 2014)
Key words : propolis residue, bacterial flora, cecum, denaturing gradient gel electrophoresis, Barred Plymouth RockJ5