広島工業大学紀要研究編
第 55 巻（2021）19-23

論文

ニホンウナギ卵形成過程での総 SOD と亜鉛の変化
楠目 峻大＊・新大樹＊＊・三浦智恵美＊＊＊（令和2年10月28日受付）

Mechanisms underlying stress tolerance during oogenesis in Japanese eel.
Takahiro KUSUME, Daiki ATARASHI and Chiemi MIURA（Received Oct. 28, 2020）

Abstract
The presence of the antioxidant enzyme Cu/Zn-superoxide dismutase（SOD）and zinc inspermatogonia of Japanese eel has been shown to play an important role in the antioxidant
system of germ cells. The purpose of this study was to clarify the mechanisms involved in thestress tolerance during oogenesis. The total SOD activity and the zinc levels, measured by acompetitive inhibition assay with a tetrazolium salt, and zinc fluorescent probe, respectively,
were found to decrease as the oocyte developed into more advanced stage. By employing anorgan culture system, zinc deficiency induced by an intracellular zinc chelating agent（TPEN）
was observed to cause atresia of follicle cells. Addition of zinc ions attenuates TPEN-inducedatresia. These results imply a relationship between SOD and zinc, and suggests an involvementof zinc in stress tolerance of follicle cells.
Key Words: stress, superoxide dismutase, oogenesis, zinc, organ culture system

1

ように二価または三価の金属イオンを持ち主に細胞質気質はじめにやミトコンドリアに含まれている酵素である。

生殖細胞と生殖腺は、生命の連続性を途切れさせないた

我々は、ニホンウナギ（Anguilla japonica ）雄を用いために様々な仕組みを有していると考えられる。その一つと実験により、精原幹細胞中に亜鉛および亜鉛により活性化して生殖細胞を外界からのストレスから守る仕組みが存在する銅亜鉛結合型（Cu/Zn）-SOD が特異的に存在し、そしている。の結果として精原幹細胞が強い酸化ストレスに対する抵抗細胞は外部からストレスが与えられると、細胞内で活性を有することを明らかにした 1, 2）。また精巣では細胞内性酸素（O₂⁻）が発生する。活性酸素は核に酸化反応を起の亜鉛を除去することにより精原細胞の細胞死が誘導されこし、癌などの疾患を引き起こす。しかし、活性酸素は細ることが示され、亜鉛が生殖細胞の維持に重要な役割を持胞内に存在するストレス耐性物質である活性酸素除去酵素

つことも明らかにした 1）。しかしながら、卵形成過程での（SOD）によって分解されるため細胞は正常な状態を保っ抗酸化機構は未だ明らかではない。そこでウナギの卵形成ている。SOD は活性中心に銅（Ⅱ）イオンと亜鉛（Ⅱ）

過程の防御メカニズムを明らかにすることで雄での生殖腺イオン、またはマンガン（Ⅲ）イオンや鉄（Ⅲ）イオンのの防御機構と比較検討し雌雄共通の生殖腺の防御メカニズ＊

広島工業大学大学院工学系研究科環境学専攻
広島工業大学環境学部地球環境学科（平成 30 年度卒業）＊＊＊
広島工業大学環境学部地球環境学科＊＊― 19 ―

楠目

峻大・新大樹・三浦

ムを解析することを目的として本実験を行った。

2

材料と方法

2.1

試験魚

智恵美

を同時に求め以下の⑴の数式によりホルマザン塩生反応の阻害率（SOD 活性値）を算出し阻害曲線を作成した。
阻害率（％）＝{（Blank1-Blank3）（サンプル溶液の吸光度）

本実験では、まずニホンウナギ（Anguilla japonica ）の（サンプル溶液と同じ濃度の吸光度）}/（Blank1-Blank3）

稚魚（シラスウナギ）をメス化した。メス化は、エストラ

×100 （式1）ジオール -17βを、20 ㎎ /kg の割合でクロコ 100（日清丸紅）に混合し飼料を作成し、この飼料をシラスウナギにさらに阻害率 50 ％時のサンプル溶液の濃度を FORECAST経口投与することにより行った。メス化したウナギ 67 匹関数を用いて求め、⑵の計算式により 1 ml あたりのユニッの体重および尾叉長の計測を行った後、卵巣を摘出した。

ト数を算出した。

卵巣はリンガー液（170 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 2.3 mM
CaCl₂・2H₂O, 3.0 mM MgSO₄・7H₂O, 5.0 mM HEPES,

ユニット数 /ml ＝ 1/ 関数で求めた阻害率 50％時のサンプル

5.0 mM D-glucose, pH 7.4）で体液等を洗浄後、成長段階の濃度 /0.02 × 10 （式 2）の同定、総 SOD 量の計測、蛍光染色に使用する為に分けた。
2.42.2卵細胞の成長段階の同定

最高輝度の計測

卵巣中の亜鉛イオンを調べるために、亜鉛イオン検出蛍

サンプルは Davidson 溶液（95 ％エタノール 165 ml、光試薬 ZnAF-2 DA（五稜化薬）で卵巣を染色した。卵巣

氷酢酸 58 ml、ホルマリン 110 ml、DW 168 ml）で固定しは摘出直後にリンガー液で希釈した 5 µM ZnAF-2 に、常保存した。固定標本は常法によりパラフィン包埋し、6 µm

温かつ遮光状態で 30 分浸漬した後、リンガー液で洗浄し、の組織切片を作成しヘマトキシリン－エオシン二重染色を倒立型顕微鏡 IX71（Olympus）を用いて波長 492 nm の施して卵細胞の成長段階の同定を行った。

蛍光強度を測定した。

3, 4, 5）

輝度の計測には画像解析ソフト ImageJ を使用した 9）。
2.3

総SOD量の測定

輝度（V）は⑶より算出し、これらの値の最高輝度を使用

総 SOD 量の測定には - 20℃で保存した卵巣を使用した。

した。

卵巣は 10 倍量の 0.25 M スクロースバッファーを加え氷上でホモジナイズし、遠心分離後（10,000 rpm、60 分、4 ℃）

V ＝ 0.299R ＋ 0.587G ＋ 0.114B （式 3）の上清を総 SOD 量の測定サンプル液とした。サンプル溶液は 200 mM リン酸バッファー（pH 6.8）で等倍、1/5、2.5

統計処理

1/25、1/125、1/625 に希釈し使用した。これらのサンプ

本 研 究 に お け る 統 計 処 理 は KaleidaGraph（Synergy

ルはキサンチンオキシターゼ（XOD）を反応させた。希Softwere）を用いて行った。得られた測定値を一元分散分釈したサンプル溶液（サンプル、Blank2）もしくは蒸留析に供した後、post-hoc テストとして Bonferroni 多重比水（Blank1、Blank3）をマイクロプレートに 20 µl 入れた較検定に供し、p< 0.05 を統計的有意差とした。

後、サンプルと Blank1 には 50 mU/ml XOD を同時に入2.6れ反応させた。Blank2 と Blank3 にはリン酸バッファー

卵巣器官培養による亜鉛除去実験のみを入れた。それぞれのウェルにテトラゾリウム塩反卵黄胞期卵細胞を用いた器官培養により亜鉛除去実験を

応液を 200 µl 混合し、XOD により生成した O₂⁻にテトラ行った。培養方法は L15 培地（Gibco）と L15 を浸透させゾリウム塩（WST-1）を結合させ、生じたホルマザン塩

た１％寒天上に 3 × 3 ㎜に細切した卵巣片を乗せ 20 ℃には iMark マイクロプレートリーダー（BioRad）を用いてて 14 日間行った 10）。培地には 100 µM 細胞内亜鉛キレー

450 nm の吸光度を測定した 6, 7, 8）。WST-1 反応溶液は、10ト剤（TPEN）を添加、および 100 µM TPEN と 250 µM

mM ヒポキサンチン 200 µl, 10 mM EDTA 200 µl, 5 mM

亜鉛イオン溶液（ZnCl₂）を添加した。培養終了後に卵巣WST-1 200 µl, 2M カタラーゼ 100 µl と 50 mM 炭酸バッ

片は Davidson 溶液で固定し、組織観察を行った。

ファー（pH 10.2）19.3 ml により作成した。
測定した吸光度から 1 ml あたりのユニット数（U）を算出した。算出は各希釈液中でのホルマザン塩生反応の吸3

結果と考察

3.1

ウナギの成長と卵細胞の関係

光度、ホルマザン塩生反応のみの吸光度（Blank1）、各希

本研究では 卵原細胞から卵黄球期までの卵形成過程が釈液の吸光度（Blank2）、WST-1 反応液の吸光度（Blank3）確認された（図 1）。卵原細胞は体長が 17 〜 21 ㎝の個体に― 20 ―

ニホンウナギ卵形成過程での総 SOD と亜鉛の変化

図 1 ニホンウナギの卵形成過程
写真は A）卵原細胞、B）染⾊仁期の卵原細胞、C）周辺仁期の卵原細胞、D）卵⻩胞期の卵原細胞、E）卵⻩球期の卵原細胞を⽰す。

図2

図3

ウナギの体⻑・体重と卵形成過程の関係

卵形成過程における卵細胞の平均直径見られた。22 ㎝〜 23.5 ㎝では染色仁期と周辺仁期の双方

図 4 卵形成過程での総 SOD 量と最⾼輝度の変化
グラフに記載されたアルファベットは Bonferroni 法により⽰された関係性を⽰す。の卵母細胞が存在していた。体長 23.5 ㎝ 体重 39.28 g の個体と、体長 24.5 ㎝ 体重 13.5 g の個体では卵黄胞期の卵母細胞が確認され、体長 25 ㎝以上の個体では全て卵黄球3.2期が確認された。以上のことから体長 25 ㎝を境に卵細胞卵形成過程での総SOD量は卵黄胞期から卵黄球期に成長すると考えられた（図 2）。

卵原細胞と周辺仁期、卵黄胞期、卵黄球期の卵母細胞の卵細胞の平均直径は染色仁期から周辺仁期、卵黄球期から総 SOD 量を計測したところ、各成長段階で変化が見られ卵黄球期にかけて大きくなっていた（図 3）。

た（図 4）。総 SOD 量は卵原細胞と周辺仁期の卵母細胞に― 21 ―

楠目

峻大・新大樹・三浦比較して、卵黄胞期の卵母細胞では減少傾向にあり周辺仁智恵美

これらの実験結果から SOD と亜鉛は共存関係にあり、期と卵黄球期を比較すると優位に減少していた。

亜鉛はストレス耐性において重要な物質であることが示唆された。

3.3

卵形成過程での亜鉛の最高輝度
3.5

亜鉛プローブで卵巣を蛍光染色したところ、卵細胞内にまとめ蛍光反応が見られた（図 5）。亜鉛の最高輝度は、卵原細ニホンウナギ雄では、A 型精原細胞が酸化ストレスに胞から周辺仁期、卵黄胞期、卵黄球期の卵母細胞へ成長す対する強い抵抗性をもつことが示されている 2）。このことるに伴い減少していた（図 4）。上記に述べた総 SOD 量のは精子形成の過程で生殖細胞が酸化ストレスを受け、発達変化と亜鉛輝度の変化から、両者には何らかの相関関係がした生殖細胞がダメージを受けたとしても、ストレス耐性あると考えられた。

をもつ A 型精原細胞が生き残るために再び精子形成を開始できることを意味していると考えられる。本研究では、

3.4

亜鉛除去実験

雌の生殖細胞に関しても、雄と同様の抗酸化機能が存在す

卵母細胞に対する亜鉛の作用は、卵巣培養系を用いて、る可能性があることが示唆された。この抗酸化機構は、雄細胞内の亜鉛を TPEN（亜鉛阻害剤）により除去するこでは減数分裂前の A 型精原細胞に存在していることに比とで解析した。その結果、Control では Initial control とべ雌では、減数分裂前の卵原細胞のみならず周辺仁期や卵比較して同様な形態が観察されたが、100 µM TPEN では黄胞期にかけての卵母細胞の時期にも多く存在し、その後、Control と比べて細胞質基質の減少と卵核ならびに核小体卵形成の進行に連れて減少していくことが示された。卵形の消失が確認された。100 µM TPEN に 250 µM ZnCl₂ を成では、精子形成に比べて減数分裂が発生の初期に起こり、添加した場合、細胞質気質と卵核ならびに核小体が確認でその後、生殖細胞は卵母細胞として、体内に長く維持されきた。このことから卵細胞に存在する亜鉛を除去した場合、ることから、雌の抗酸化機構は、雄に比べて長く維持され細胞はダメージを受けるが、外部からの亜鉛イオン溶液のているのではないかと考えられた。
今後は、さらに亜鉛の発現変化を定量・定性的に解析し、添加によって、受けた卵細胞のダメージはある程度回復で卵形成に対する亜鉛と Cu/Zn-SOD の相互作用を明らかにきると考えられた（図 6）。

する予定である。上記の結果と雄の生殖腺の防御機構から、雌雄での配偶子の防御メカニズムの全体像を更に明らかにしたいと考える。

謝

辞本研究の実施に当たり、愛媛大学の水族繁殖生理学研究室からシラスウナギを提供していただき、またハワイ大学

図 5 亜鉛プローブで蛍光染⾊した卵細胞
Ａ : 明視野下 Ｂ : 暗視野下を⽰す。の Dr. Fritzie T. Celino-Brady に英文校閲をしていただいたことをここに記して謝意を表します。

文献１）S. Yamaguchi, C. Miura, K. Kikuchi, F. Celino, T.
Agusa, S. Tanabe and T. Miura., Zinc is an essentialtrace element for spermatogenesis., Proc. Natl. Acad.
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２）F.T. Celino, S. Yamaguchi, C. Miura, T. Ohta,
Y. Tozawa, T. Iwai and T. Miura., Tolerance ofspermatogonia to oxudative stress is due to highlevels of Zn and Cu/Zn superoxide dismutase., PloS
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３）楳田晋、落合明、産卵期前後における養成ブリの成熟

図 6 亜鉛除去による卵細胞の組織学的変化
A）Initial control B）Control C）100 μM TPEN を添加
D）100μM TPEN と 250μM ZnCl₂ を添加。

について、魚類学雑誌、18 巻 4 号，175-181，（1974）．
４）中坪俊之、川地将裕、間野伸宏、廣瀬一美、関東沿岸― 22 ―

ニホンウナギ卵形成過程での総 SOD と亜鉛の変化域に回遊するマンボウ Mola mola の産卵期の推定水Biosci. Biotechnol. Biochem. 63, 485-488,（1999）．

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８）H. Ukeda, T. Shimamura, M. Tsubouchi，Y. Harada, Y.

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６）H. Ukeda, A. K. Sarker, D. Kawana and M. Sawamura.,

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