〈一般研究課題〉 酵素複合体を導入したシアノバクテリアによるバイオエチレン生産の相乗機構の解明と大量生産の研究
助 成 研 究 者

名城大学

神藤定生

酵素複合体を導入したシアノバクテリアによるバイオエチレン生産の相乗機構の解明と大量生産の研究
神藤 定生（名城大学）An Engineered Platform for Bioethylene Production by a
Cyanobacterium Expressing a Chimeric Complex of Plant Enzymes.
Sadanari Jindou(Meijo University)

Abstract：
With the advent of global warming, cyanobacteria is becoming an attractive cell factories for
producing renewable chemicals due to their ability to capture solar energy and CO2 . Ethylene is asignificantly important industrial raw material for the production of various petrochemicalproducts. However, petroleum is a limited resource and emit excessive CO2 into the atmosphere
during its combustion and heat degradation process. Anaerobic cellulolytic bacteria produce enzyme
complex, which is called cellulosome. In 1994, Bayer and Lamed first proposed the construction ofenzyme complexes by utilizing dockerins and cohesins from cellulosomal systems. To reduce therate of global warming, we have developed a novel bio-ethylene synthetic process using the both
cellulosomal system and cyanobacteria. In vivo synergistic effect of chimeric enzyme complex onethylene production was demonstrated. In order to produce more bio-ethylene from cyanobacteria,
the investigation was performed as follows. First, to produce ethylene from SAM via ACC in aconcerted fashion with less inhibition of ACS, we have constructed two chimeric enzyme complexes,
SOC3D1 and SOC3D2 , based on cellulosomal system. Second, two chimeric enzyme complexes
were introduced into Synechococcus elongatus PCC7942 . Then, we have examined the in vivo
ethylene accumulation of engineered S. elongatus PCC7942 cells to determine whether theexpressed chimeric enzymes produce more ethylene.

－ 79 －１．緒言
現在の社会は、石油由来エチレンを利用した化成品の大量生産によって支えられている[1]。いっぽう、それら生産活動によって排出される二酸化炭素の削減は喫緊の課題である。我々は、光合成細菌の光合成産物をバイオエチレンとして回収し、さらに、嫌気性微生物のバイオマス分解システ
ムを模倣した酵素複合体化技術[2]により、エチレン生合成酵素を効率よく機能させる試みを行った[3]。すなわち、植物由来のエチレン生合成に関わる1-アミノシクロプロパン-l-カルボン酸（ACC）合成酵素（ACS）およびACC酸化酵素（ACO）を、セルロソームエンジニアリングで複合体化させ、酵素複合体（Ethylenome SOC2）を構築した。これを合成生物学の手法によりシアノバクテ
リアへ導入した結果、本細菌はバイオエチレンを3.4 nl/ml/O.D.730 /hの効率で生産した（図1）。さらに、Ethylenome SOC2の形成により3.7倍高いバイオエチレン合成活性を得た[4]。しかし、実用化を目指すとき、これは微量の生産量としか言えない。さらなるバイオエチレン生産効率の向上を目的として、本研究ではEthylenomeの酵素反応系および発現の最適化を行った。具体的には、既存の酵素複合体（SOC2）を構成するところのACSおよびACOへ、Arabidopsis thaliana 由来メチルチオア
デノシン（MTA）ヌクレオシダーゼ（MTAN）
1および2を新規に組み込んだ。MTAN1おS. elongatus PCC 7942

よび2はACSの反応副産物MTAをメチルチオリボースへ加水分解させる。これによりSynthetic pathway

S-adenosylhomocysteine

SAM

Methionine S-adenosylmethionine
Cycle

Homocysteine(SAM)

MTAのACS活性阻害が期待できる[5]。本H2C=CHC CH2Ethylene

ACC oxidase (ACO)
S. lycopersicum
ACOSolanum
lycopersicum
ACSCS

Methionine

Complex build bydockerin/cohesininteraction

酵素複合体（SOC3D1および2）を導入した性を検討したので、これを報告する。

HCN+ CO2+ H2O+ Dehydroascorbate

ACC

ACC synthase (ACS)

報告では、これら3種の酵素が保持される
シアノバクテリアのバイオエチレン生成活

Ascorbate
1/2 O2

Methylthio
Adenosine((MTA))

Ethylenomey

図1 P
bio-ethylene
production
byelongatus“Ethylenome”
Pathway
forathway
bio-ethyleneforproduction
by “Ethylenome”
in Synechococcus
PCC 7942.
in Synechococcus elongatus PCC 7942.

2．材料と方法
2.1. 発現ベクターpUC303-SOC3D1およびpUC303-SOC3D2の構築
理 研BRCよ り 提 供 さ れ たArabidopsis thaliana 由 来cDNAク ロ ー ン（pda00477, pda20265）か ら
MTAN1および2遺伝子を、Clostridium josui ゲノムDNAからCel8A由来ドックリン遺伝子を、それぞれPCR法で増幅させ、これらを融合させたキメラサブユニットAtMTAN1-Cjdoc

PCR-amplified MTAN1/2 catalytic
domains from Arabidopsis thaliana

MTAN1
MTAN2

およびAtMTAN2-Cjdocをそれぞれ構築した。上記で得たキメラサブユニットを保持するキメラ骨格タンパク質、既存のCip2へ

C. josui CipA由来コヘシン2を1つ追加した
Cip3C、を構築した。

PCR-amplified chimeric enzyme

BspHI

SalI

BspHI

RBS

Ptrc
tc

BspHI

RBS

Ptrc

SalIRBSMTAN1-Cjdoc

ACS-Ctdoc

MTAN2-Cjdoc
Each of these fragments was inserted into pUC303SOC2 by In-Fusion cloning reaction.
SalIRBSRBS

ACS-Ctdoc

lacIq

図2－ 80 －ACO-Acdoc

HindIII

RBS

Cip3C

pUC303-SOC3D1

lacIq
BspHI

Fusion法で連結させpUC303-SOC3D1およびpUC303-SOC3D2を得た（図2）。最後に、

pET-MTAN2-Cjdoc

pET-MTAN1-Cjdoc

以上、構築した3つのキメラ遺伝子ORFを 既 存 の pUC 303-SOC 2 ベ ク タ ー へ In-

Assembled in pET28a by In-Fusion cloning reaction.
His-tag
T7

His-tag

T7

PCR-amplified Cel8A dockerindomain from Clostridium josui

SalIRBS

ACO-Acdoc

HindIII

RBS

Cip3C

ppUC303-SOC3D2

XbaI
MTAN1-Cjdoc
A 1 CjRBS

TermSmR
MTAN2-Cjdoc XbaI

RBS

SmR

Map oftheplasmids
usedinstudy
this study.
Mapof theplasmids usedin thisTermこれら構築プラスミドを用いてSynechococcus elongatus PCC7942 （R2-PC）株を形質転換し、得られた組換え体をstrain SOC3D1およびSOC3D2とした。
2.2. 組換えシアノバクテリアstrain SOC3D1およびSOC3D2のタンパク質発現量の解析
形質転換によって発現した単一コロニーを釣菌し、BG-11液体培地を80 mL分注した大型試験管に植菌した。培養は27℃、エアーポンプによるバブリング（0.5 L/min）、白色蛍光灯の光による連続照明条件下でおよそO.D.730nm=0.6となるまで培養後、集菌を行った。超音波破砕後、遠心分離により無細胞抽出液を調製し、これを用いてSDS-PAGEおよび抗Hisタグ抗体を用いたウェスタンブロッティング解析を行った。
2.3. 組換えシアノバクテリアstrainSOC3D1およびSOC3D2のバイオエチレン生成能の測定
培養液10 mLを20 mLバイアル瓶に分注し、最終濃度50mMとなるようアスコルビン酸を添加した。つぎに、気相を二酸化炭素で置換し、密閉させた後、27 ℃、115 rpmで明光下で一晩振とう培養した。バイアル瓶のヘッドスペースからシリンジを用いて200 µL抜き取り、これをFID検出器を装備したガスクロマトグラフィーGC-2014（GC）で分析し、生成されたバイオエチレンを定量した。
3．結果
3.1. 組 換えシアノバクテリアによるEthylenome構成タンパク質の共発現
組 換 え シ ア ノ バ ク テ リ アstrain SOC 3D 1 お よ び

Western blottingstrain SOC3D2のEthylenome構成タンパク質発現量を観察するため、IPTGで発現誘導を行った後、可溶性画分中の組換えタンパク質を抗Hisタグ抗体によるウェスタンブロッティングで解析した。その結果、そACS-Ctdoc (62.5 kDa)

れ ぞ れ の 株 か らAtMTAN1-Cjdocお よ びAtMTAN2-ACO-Acdoc (48.5 kDa)

Cjdocを、既存のACS-CtdocおよびACO-Acdocと共に
MTAN2-Cjdoc(36.8 kDa)

目 的 サ イ ズ の バ ン ド で 検 出 し た。 し か し な が ら、
AtMTAN1-CjdocおよびAtMTAN2-Cjdocのバンド強度は、既存のEthylenome構成タンパク質であるACS-Cip2 (35.7 kDa)

図3

CtdocおよびACO-Acdocのそれと比較したとき、よりれなかった（図3）。
3.2. E thylenomeの酵素組成によるエチレン生成効率の比較
Ethylenomeの酵素組成の違いによるエチレン生成
効 率 の 比 較 をstrain SOC 2, strain SOC 3D 1 お よ び
SOC3D2を用いて検討した。結果、strain SOC3D1した。

－ 81 －x1.9

3.0
Effectsof MTAN on the enzyme complex
expressionin S. elongatus PCC 7942..
282.825
2.5
2.4

2.0
1.5

1.5

1.0
0.5

は strain SOC 2 の 1. 6 倍、strain SOC 3D 2 は strain
SOC2の1.9倍のバイオエチレン生産効率向上を観察Effects of MTAN on the enzyme complex
expression in S. elongatus PCC 7942.

*
x1.6
*

nL C2H4//ml/OD730/h

低い結果となった。一方、野生株ではバンドが検出さ

MTAN1-Cjdoc
MTAN1Cjdoc ∆doc(37.7 kDa)

0.0

図40.0

WT

SOC2

SOC3D1 SOC3D2 he accumulation of ethylene in theTheadspace of closed cultures of S.
elongatus PCC 7942 strains SOC 2 ,SOC 3 D 1 and SOC 3 D 2 .

The accumulation of ethylene in the headspace ofclosed
l d culturesloff S.
S elongatusl
PCC7942
CC 942 strains
i SOC 2,2
SOC 3D1 and SOC 3D2.

4．考察
本研究で着目したMTAはACSの触媒作用によって生じるACCの副産物であり、これはACS活性を阻害することが分かっている。そこで、MTANを既存のEthylenomeへ組込むことで、ACS阻害物質のMTAを分解させ、バイオエチレン生産効率を向上させた。すなわち、本研究ではA. thaliana
由来のAtMTAN1および2を酵素複合体に含むstrain SCO3D1、SOC3D2を構築し、これら組換え体のバイオエチレン生産効率を既存のバイオエチレン生産株（SOC2）と比較した。その結果、MTANを 含 むstrain SOC3D1及 びSOC3D2に お い て は、 ど ち ら に お い て も 既 存 のEthylenome
SOC2より高いバイオエチレン生産効率を観察した。また、strain SOC3D2はstrain SOC3D1より高いバイオエチレン生産効率を示した。いっぽうで、AtMTAN1および2のMTAに対するK m 値はそれぞれ27.6 μM 及び33.4 μMであり、AtMTAN1がより高い親和性をもつことがParveenらにより示唆されている[5]。これは本研究と異なる結果を示唆するものとなる。しかしながらAtMTAN2はMTAのみならずS-アデノシルホモシステイン（SAH）をも分解することが出来る、二機能性酵素である。SAHはSAMの脱メチル化により生成され、メチオニンの代謝経路であるところのSAMサイクルにおいてメチルトランスフェラーゼ活性を阻害し、また、SAH蓄積で細胞増殖阻害を引き起こすことが分かっている。したがって、AtMTAN2が独自に持つSAH分解活性によってSAMの前駆体のメチオニンを合成する代謝経路が活性化し、その結果、AtMTAN2を含むstrain SOC3D2がより高いバイオエチレン生産効率を示したと考えられる。いっぽう、本研究と競合する既存のバイオエチレン生産系（Ethylene Forming Enzyme保持株）の生産能力は12g/日である[6, 7]。そこで、当該バイオエチレン生産系との生産効率比較をEFE株を得て、これを培養し、strain SOC3D2を保持する株とのエチレン生産効率を比較した。その結果、EFE株は4.7 nl/ml/O.D. 730 /hの効率で、SOC3D2は2.8 nl/ml/O.D. 730 /hの効率でバイオエチレンを生産した。strain SOC3D2はEFE株の60%の効率でバイオエチレンを生産することを明らかとした。今後、種々の条件下におけるエチレン合成の最適化、さらに合成生物学的手法による酵素複合体技術を生かした有用物質生産の開発において、本研究により確立された手法は極めて有用であると期待される。
参考文献
1．Ghanta, M., D. Fahey, and B. Subramaniam, Environmental impacts of ethylene production fromdiverse feedstocks and energy sources. Applied Petrochemical Research, 2013.
2．Caspi, J., et al., Conversion of Thermobifida fusca free exoglucanases into cellulosomal components:
comparative impact on cellulose-degrading activity. J Biotechnol, 2008. 135（4）: p. 351-7.
3．You, C. and Y.H. Zhang, Annexation of a high-activity enzyme in a synthetic three-enzyme complex
greatly decreases the degree of substrate channeling. ACS Synth Biol, 2013.
4．Jindou, S., et al., Engineered platform for bioethylene production by a cyanobacterium expressing achimeric complex of plant enzymes. ACS Synth Biol, 2014. 3(7): p. 487-96.
5．Parveen, N. and K.A. Cornell, Methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase, acritical enzyme for bacterial metabolism. Mol Microbiol, 2011. 79(1): p. 7-20.
6．Takahama, K., et al., Construction and analysis of a recombinant cyanobacterium expressing achromosomally inserted gene for an ethylene-forming enzyme at the psbAI locus. J Biosci Bioeng,－ 82 －2003. 95(3): p. 302-5.
7．G uerrero, F., et al., Ethylene synthesis and regulated expression of recombinant protein inSynechocystis sp. PCC 6803. PLoS One, 2012. 7(11): p. e50470.

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