日本家禽学会誌， : ‑ ，Copyright Ⓒ 2022, Japan Poultry Science Association≪技術報告≫

PCR 法によるホロホロチョウ（南村昌孝・石田和真・黒澤）の性判別

亮・高橋幸水・白砂孔明・岩田尚孝・小川博・桑山岳人

東京農業大学農学部，神奈川県厚木市船子 240‑0034
近年，鳥類の性判別に有用な方法として遺伝子解析による方法が用いられている。本実験はホロホロチョウの血液や羽軸根から抽出した DNA を用いて PCR 法で性特異的遺伝子を増幅させることにより性判別できるかを検討した。DNA は血液から抽出し，標的遺伝子として spindlin 遺伝子を用いた結果，性判別が可能であった。キジ科のニワトリ，ニホンキジ，ニホンウズラにおいても同様の条件で判別が可能であった。
また，ホロホロチョウの羽軸根を用いて性判別を行ったところ，血液と同様に判別が可能であった。
キーワード：ホロホロチョウ，性判別，PCR──────────────────────────緒

ホロホロチョウの性判別の標的遺伝子として，一般に鳥類の性言判別に広く用いられてきた Chromodomain-helicase-DNA-bindingprotein（CHD） 遺 伝 子（ 市 川 ら，2006） と ニ ワ ト リ（

家禽の品種の多くは体格や羽相などから雌雄の区別が可能なも）の W 染色体上に特異的にみられる繰り返しのが多い。しかし，世界の半数以上の鳥類種では成鳥において雌雄で外観から判断することは困難であり，幼鳥時の外観にも性差配列の Xho 領域（Clintonが表れることはほとんどないことから，その性判別は困難である

たが，性判別は不可能であった（未発表データ）。ホロホロチョ（Griffiths., 2001）を対象とした実験を行っウでの性判別が報告されている 2550/2718 のプライマーセット., 1998）。産業用家禽において，産卵用の雌と産肉用の雄の区別は極めて重要であり，性鑑別技術は欠かせない。養（Abdul-Rahman II

鶏の現場では肛門鑑別法や羽毛鑑別法が用いられているが，精度ウ及びニワトリの性判別が可能であることを確認した（未発表の高い鑑別には多くの経験・訓練が必要である。特にホロホロデータ）。本実験では，先に報告されている 2550/2718 以外にシチョウ（）では外観に性差がなくその判断がギダチョウ目で W 染色体と Z 染色体上で異なる領域に存在する難しい。近年では鳥類の雌雄を確認する方法として，簡便で判別

spindlin 遺伝子を対象とした SPIN12/SPIN13 のプライマーセッが容易に行える Polymerase Chain Reaction（PCR）法が多く用ト（Itohいられている（Miyaki

判別に有効か検討した。

., 1998；Jensen., 2003）。PCR 法による性判別は 1990 年にマウスとヒトで Sex-determining RegionY（Sinclair） 遺 伝 子 が 発 見 さ れ て 以 降（Gubbay., 2015）を用いた実験では，ホロホロチョ., 2001；De Kloet, 2002）が，ホロホロチョウの性材料および方法., 1990；
1． 供試鶏., 1990），哺乳類において盛んにおこなわれてきた。

雄は XY，雌は XX の性染色体を有する哺乳類において，東京農業大学農学部厚木キャンパスで飼育している個体のう遺伝子は雄の Y 染色体上に存在する性決定因子である。この遺ち，性成熟に達し雌雄が分かっているホロホロチョウ：GF（雌伝子領域を対象としたプライマーを用いることで多くの哺乳類の雄各 5 羽），キジ科鳥類（岐阜地鶏：G（雌雄各 1 羽），比内鶏：性判別が可能であり，Pomp ら（1995）をはじめとしてさまざまH（雌雄各 1 羽），桂矮鶏：B（雌雄各 1 羽），烏骨鶏：S（雌雄各な種において性判別が可能であることが報告されている。一方，1 羽），ニホンウズラ：Q（雌雄各 1 羽），ニホンキジ：K（雌雄哺乳類とは異なり雄で ZZ，雌で ZW の性染色体を有する鳥類で各 1 羽）），ダチョウ（アフリカンブラック）：AB（雌 2 羽）およは，W 染色体上にのみ存在し種間で広く保存されている任意のび野生の王国 群馬サファリパークで飼育しているダチョウ（アDNA 配列は，PCR に基づく性決定の目標にすることができるフリカンブラック）：AB（雄 3 羽，雌 1 羽）を供試した。

（Itoh., 2001）。しかし，哺乳類とは性決定様式が異なる鳥類

本研究は東京農業大学生命科学研究倫理規定に則り行ったでは，性を明確に判別できる遺伝子がいまだ発見されていない。

（2020109）。
2． 血液および羽軸根の採取

2021 年 5 月 19 日受付，2021 年 12 月 25 日受理
連絡者：桑山岳人〒243‑0034 神奈川県厚木市船子 1737
Tel : 046‑270‑6589
Fax : 046‑247‑4338
E-mail : takehito@nodai.ac.jp

血液採取はヘパリンナトリウムで処理した 25 5/8 ゲージの注
射針（テルモ株式会社）と 2.5 m シリンジ（テルモ株式会社）を用い，翼下静脈から 1 m 採取し，2.0 m チューブに分注した。
羽軸根の採取は脊椎骨付近から 1 羽につき羽を 2 枚採取後，羽軸根のみを採取するため解剖はさみで切断し，羽軸根 1 cm をJ1

日 本 家 禽 学 会 誌59 巻

J 1 号（2022）

表 1． 使用したプライマーの配列および増幅断片の大きさ
プライマー
SPIN12SPIN13配列

断片の大きさ引用

5′-GCAGAATACAGCATGGATGGAA-3′5′-AGGTGGGCATCACTAATTCGAG-3′

Z : 1.0 kb
W : 1.2 kb

De Kloet, 2002

1.5 m チューブに採取した。
3． DNA 抽出採血した 1.0 m の血液を PBS で 3 倍に希釈し 5, 6 回転倒混和した。15 m ファルコン管に Lymphoprep（コスモバイオ株式会社）を 3 m 入れ，希釈した血液を Lymphoprep に混ざらないよ
う注入し 800×g で 20 分間の設定で遠心分離を行った。遠心分離後，パスツールピペットで単核球層を吸い取り 1.5 m チューブに分注した。分注した単核球層と PBS の総量を 1.5 m になるように PBS をいれ 5 分間遠心分離を行った。遠心分離後，チュー
ブの底のペレットを流さないように溶液を捨て（ペレットが確認されない場合は溶液を捨て PBS を 1.5 m になるように追加し再図 1． ホロホロチョウ血液由来 DNA から得られた泳動像
ホロホロチョウ（GF）。オスで 1 本，メスで 2 本のバンドが確認された。

度 5 分間遠心分離を行った），Cica Geneus DNA Prep Kit（forBlood&Tissue）（関東化学株式会社）の Buffer TL200 µ をペレット状のものに当てながら入れペレット状のものが溶けるまでピペッティングを繰り返した。その後 Cica Geneus DNA Prep Kitのプロトコール 2 から行い DNA を抽出した。
羽軸根は Buffer TL200 µ を入れ，Tissue Grinder（COYOTE）で均一化し，その後 Cica Geneus DNA Prep Kit のプロトコール2 から行い DNA を抽出した。
抽 出 し た DNA は 微 量 分 光 光 度 計（DeNovix 社 ） を 用 い てDNA 純度と濃度を測定した。
4． PCR 条件抽出した DNA は De Kloet（2002）を参考に SPIN12/SPIN13のプライマーを用いて PCR を行った。PCR 反応液は超純水 8.6µ ，SPIN12/SPIN13（100 µM） 各 0.2 µ ，Go Taq Green MasterMix 2×（Promega）10 µ ，DNA サンプル 3 µ の計 22 µ とした。

図 2． ニワトリ血液由来 DNA から得られた泳動像
左からホロホロチョウ（GF），岐阜地鶏（G），桂矮鶏（B），比内鶏（H），烏骨鶏（S）。すべての品種においてオスで 1 本，メスで 2 本のバンドが確認された。

PCR 条件は 94℃ 2 分の後，94℃ 30 秒，55℃ 20 秒，72℃ 1 分 20秒を 35 サイクル，72℃ 10 分で増幅を行った。プライマー配列は
表 1 に示した。
5． 電気泳動条件増幅した PCR 産物は 3％アガロースゲルの厚さを 0.5 cm にな

キジ科のニワトリ，ニホンウズラ及びニホンキジとホロホロるように作成し 1×TAE（NIPPON GENE），6×Loading Buffer

チョウにおいて共に性判別が可能であったことから spindlin 遺伝（WAKO NIPPON GENE） を 2 µ と PCR 産 物 10 µ と 混 合 し，子はキジ科とホロホロチョウにおいて Z 染色体と W 染色体の異100V で 30 分間泳動した。泳動後のゲルは，0.5 µ /m に希釈しなる領域に共通して存在することが示唆された。
ダチョウでは雌雄ともに約 1.2 kb 付近でバンドが 1 本のみしかた Ethidium bromide（Q BIO gene）で 60 分間染色した後，紫確認できず，spindlin 遺伝子を用いた性判別は不可能であった

外線照射下でターゲット領域の増幅を確認した。

（図 6）。今回実験に供試し，性判別が可能だった品種は全てキジ結果および考察目に属する種である。Spindlin 遺伝子はキジ科，ホロホロチョウ

ホロホロチョウとキジ科のニワトリ，ニホンキジおよびニホン科以外のキジ目の性判別においても有用である可能性があり，汎ウズラにおいて De Kloet（2002）の報告と同様に雄で約 1.2 kb用性の高さが期待される。ダチョウ目に属するアフリカンブラッの 1 本のバンドが，雌で約 1.2 kb と約 1.0 kb の 2 本のバンドが検クでは同じ古顎下綱に属するシギダチョウ目で性判別が可能で出され，性判別が可能であった（図 1‑4）。また，羽軸根由来のあった（De Kloet 2002）ため，同様に性判別が可能であると予DNA においても，血液由来の DNA と同様の結果が得られた（図想していたが雌雄ともにバンドは 1 本のみしか確認できず，性判5）。

別 は 不 可 能 で あ っ た。 一 方 で SS1/SS2（sexing primer） とJ2

南村ら：ホロホロチョウの性判別

図 5． ホロホロチョウ羽軸根由来 DNA から得られた泳動像
ホロホロチョウ（GF）。血液由来 DNA と同様羽軸根由来 DNA でもオスで 1 本，メスで 2 本のバンドが確認された。

図 3． ニホンウズラ血液由来 DNA から得られた泳動像
左からホロホロチョウ（GF），ニホンウズラ（Q）。
オスで 1 本，メスで 2 本のバンドが確認された。

図 6． ダチョウ羽軸根由来 DNA から得られた泳動像
左からホロホロチョウ（GF），ダチョウ（アフリカンブラック：AB）。ダチョウでは雌雄共にバンドが1 本しか確認できなかった。
された。
図 4． ニホンキジ血液由来 DNA から得られた泳動像
左からホロホロチョウ（GF），ニホンキジ（K）。
オスで 1 本，メスで 2 本のバンドが確認された。

謝辞

ダチョウのサンプルの一部をご提供頂いた，野生の王国 群馬
サファリパーク様に感謝致します。

L014a/L014b（control primer）のプライマーセットを用いたダ引チョウの性判別が可能であるとの報告がなされている（Belloand Sanchez 1999）。ダチョウにおいては spindlin 遺伝子の W 染用

文

献

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色体と Z 染色体の遺伝子断片の長さに差が少ない，もしくは相当する領域が存在していない可能性が示された。
本研究によりホロホロチョウの性判別には spindlin 遺伝子を対象 と し た プ ラ イ マ ー SPIN12/13 が 有 用 で あ る こ と が 示 さ れ，spindlin 遺伝子はキジ目の性判別において有用である可能性が示

J3

日 本 家 禽 学 会 誌
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J4南村ら：ホロホロチョウの性判別

Sex Identification of Guinea Fowl (Numida meleagris) by PCR
Masataka Minamimura, Kazuma Ishida, Ryo Kurosawa, Yukimizu Takahashi,Koumei Shirasuna, Hisataka Iwata, Hiroshi Ogawa and Takehito Kuwayama
Tokyo university of agriculture, Faculty of Agriculture, Atsugi-shi Kanagawa-ken, 240-0034

Recently, polymerase chain reaction (PCR) is an efficient method for sex identification in avian. This study madeto verify efficient gene region for sex identification in guinea fowl (Numida meleagris). DNA was extracted fromblood. Target genes used for sex identification were spindling gene (SPIN). As a result, primer SPIN12/SPIN13(spindlin) were able to identify their sex. Also, Phasianidae including domestic fowl, Japanese quail and pheasantcould determine their sex by the same method.
In addition, sex identification using guinea fowlʼs rachis was as possible as using the blood method.
(Japanese Journal of Poultry Science, 59 : J1-J5, 2022)
Key words : guinea fowl, sex identification, PCR

J5