学位研究紹介

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学 位 研 究 紹 介

FGF-2 の組織内徐放を用いたマウス上顎皮質骨新生とその機序の解析
Analysis of a mechanism of additivebone generation on maxillary bone inmouse using recombinant human
FGF-2 incorporating gelatinhydrogel

解析した。加えて FGF-2 徐放開始後７日目，すなわち仮骨形成期骨膜における骨芽細胞関連マーカー遺伝子および FGF レセプター遺伝子の発現分布を in situ ハイブリダイゼーション法により検出した。また，これら遺伝子の発現量を Laser micro dissection 法およびリアルタ
イム RT-PCR 法により骨膜組織特異的に定量した。

【結新潟大学大学院医歯学総合研究科，口腔生命科学専攻，口腔健康科学講座，顎顔面口腔外科学分野

果】

マイクロ CT を用いた骨体積の計測から，FGF-2 の徐直樹

放により上顎骨体積は平均 50％増加する事が示され，Division of Oral and Maxillofacial Surgery,対照群の平均増加量１％と比較して有意に高値を示した

Department of Oral Health Science,（表 1）。組織学的な検索から，FGF-2 徐放開始後７日目

小玉

Course of Oral Life Science, Niigata Graduate School of Medicaland Dental Sciences

Naoki Kodamaには骨膜の多層化と既存歯槽骨に連続した仮骨形成が観察された。28 日目では骨膜の多層化と仮骨形成は終息し，層板構造を伴う肥厚した皮質骨が観察された（図 1）。
PCNA 免疫染色からは，骨膜構成細胞の増殖活性が対【目照群と比較して有意に上昇していることが示された（表的】2）。in situ ハイブリダイゼーション画像を図 2 に示す。
FGF-2 徐放群において FGFR1，FGFR2 および FGFR3

歯科口腔外科の分野において新たな骨の形成が望まれの何れにおいても仮骨を取り囲む cuboidal osteoblast にる状況がある。それは口唇口蓋裂における顎裂や失われ強いシグナルを検出し，骨膜の紡錐形細胞でもシグナルた歯槽骨の補填である。現在はこれらの骨の需要に対し陽性細胞の点在をみとめた。Runx2 は FGFRs にきわめ自家骨移植が適応されるが，一般的にドナーサイトへのて類似した発現パターンを示した。骨芽細胞系細胞の最侵襲が大きいことが問題となる。新たな骨を必要として終分化マーカーであるオステオカルシン（OC）は仮骨いる部位へ低侵襲に生体材料を適用し，生体が本来備えを取り囲む cuboidal osteoblast で特異的に検出された。ている骨再生能力を賦活することで骨を形成することが中期分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ可能になれば患者に大きな利益をもたらす事になる。近（ALP），オステオポンチン（OPN）は骨膜の広い範囲

年，Fibroblast growth factor-2（FGF-2）の組織内徐放で検出された（図 1）。この骨膜の関連遺伝子発現量をが骨折の治癒を促進する事や，骨欠損の再生を惹き起こ表 3 に示す。FGF-2 徐放群の FGFR，Runx2 および OCすことが報告されている。今回この研究では FGF-2 のを除く骨芽細胞関連マーカー遺伝子の発現量は対照群に組織内徐放を用いた歯槽骨新生の実用可能性を検討する

対して有意に高値を示した。対照群と正常骨膜間には差とともに，その生物学的機序を解析した。

を認めなかった。

【方法】

【考察】

最初に FGF-2 の組織内徐放による歯槽骨新生モデル

ゼラチンハイドロゲルを用いた FGF-2 組織内徐放はを作製した。ゼラチンハイドロゲルを担体とし，マウス歯槽骨上へ添加性の皮質骨増生をもたらすことを示し

上顎歯槽骨上で 20μg の FGF-2 を 10 日間徐放した。対た。これまで骨欠損モデルや骨折治癒モデルにおいて照としてゼラチンハイドロゲルのみを使用した実験群をFGF-2 を応用した骨再生が多く報告されてきているが，設定した。徐放開始 28 日後にマイクロ CT 撮影を行い，正常な骨への新生骨添加モデルは希である。我々の骨新画像解析により骨新生体積の定量を行った。次に骨新生生モデルは小動物ではあるが，新生する骨の体積は片側現象の機序を解析するために FGF-2 徐放開始後７，14，上顎骨の約 50％に達し，また組織学的に皮質骨であるおよび 28 日目の組織所見および PCNA 免疫染色所見をことから骨組織として十分な機械的強度が見込まれ，そ− 63 −

64新潟歯学会誌37（1）：2007の有用性は骨欠損部の再生や骨折の治癒と同等の意義をいた。FGF-2 のシグナルを直接受ける FGFR1, FGFR2持つと考えられる。このように培養細胞ではなく生体既および FGFR3 をコードする mRNA は仮骨表層の成熟存の骨原性細胞をコントロールすることにより骨を形成した骨芽細胞に強く発現していた。そのため，FGF-2させることが可能である点はこの方法の大きな利点であシグナルの影響がこれらの成熟した骨芽細胞により強くり，その簡便性，低侵襲性から実用可能性を持つと考え影響していると予想される。したがって，FGF-2 の作られる。

用の一つである細胞分裂誘起活性がより成熟した骨芽細FGF-2 による骨添加の組織学的な解析からは，増殖胞に対して強く働いている事が考えられる。これらの所した骨芽細胞が活発に骨基質を産生し，既存骨に連続し見は，既存骨表層に存在している成熟した骨芽細胞の増た仮骨を形成することにより皮質骨添加が生じているこ殖がこの仮骨形成を伴う急速な骨形成の重要な要素の一とが示された。また，細胞増殖と骨添加現象は一時的でつとなっていることを示している。骨膜組織特異的に抽あり，徐放開始後 28 日目には終息していた。仮骨を形出した RNA の定量的 RT-PCR は，FGF-2 刺激により骨成して急速に骨を形成していく過程は，長管骨骨折の治膜組織の Runx2 発現量が上昇する事を明らかにした。

癒 モ デ ル で み ら れ る 骨 膜 性 骨 修 復 に 類 似 し て い る。

Runx2 の発現量が上昇した理由としては，第一に成熟

FGF-2 徐放による骨新生は本来生体に内在する骨膜性した骨芽細胞の割合が増加したことがあげられる。それ

骨修復機転を人工的に惹き起こす事によると考えられは Runx2 は増殖活性が高められた成熟した骨芽細胞にる。PCNA 染色を用いた増殖活性の評価から，FGF-2

強 く 発 現 し て い る か ら で あ る。 第 二 の 理 由 と し て，を含まないゼラチンハイドロゲル（FGF-2（-））を埋入

FGF-2 刺激により骨芽細胞系細胞の Runx2 の転写が促した骨膜組織の増殖活性が正常骨膜と比較して高いこと進されたことが考えられる。Runx2 は骨芽細胞の分化を示した。このことはゼラチンハイドロゲル埋入に伴うに必須である。FGF-2 徐放群の ALP の発現分布は仮骨外科的侵襲が内因性の組織修復機転を惹き起こしたため表層の骨芽細胞だけでなく骨膜外層の紡錐形細胞にまでと考えられる。内因性の組織修復過程においては，ｓ及び，対照群で増殖した細胞の大部分が骨芽細胞系細胞

caﬀold protein と結合しているさまざまな内因性のサイの発現型をもたないこととは対称的である。この違いは，トカインが働き，組織修復に関わる細胞の遊走や増殖，

FGF-2 は幼弱な骨芽細胞系細胞の Runx2 発現上昇を促分化に影響する。しかし，FGF-2 徐放群骨膜ではそれ進し，結果として分化が促進されることを示唆している。

以上の細胞増殖活性を示した。これは FGF-2 が持つ強今回の実験は，in vivo で観察される FGF-2 の骨形成効力な細胞分裂励起活性によると考えられる。FGF-2（-）

果が骨芽細胞の増殖によるものだけではなく，骨芽細胞群とは対称的に，FGF-2 徐放群では増殖している細胞系細胞の分化や成熟を Runx2 の発現上昇を通して促進の大部分が骨芽細胞のマーカーである ALP を発現してさせている可能性を示した。

表 1. Average volumes of one-sided maxillary bones 28 days after treatment with FGF-2（＋）
gelatinhydrogel or FGF-2（−）gelatinhydrogel.
Experimental group
FGF-2（＋）
FGF-2（−）＊†

Experimental side
Untreated side
Experimental side
Untreated side

Average volume［㎜3］＊7.19 ± 0.80 †4.82 ± 0.35
4.55 ± 0.74
4.49 ± 0.65

Values are expressed as the mean ± standard deviation of foyr samples.
P ＜ 0.01 compared with experimental side of FGF-2（−）

表 2. PCNA-positive cells indices［％］of the periosteums in the maxillary bone located at the site of gelatinhydrogel
implantation.
Experimental group
FGF-2（＋）
FGF-2（−）
Normal periosteum（No material implanted）

Experimental time
Day 7
75.92 ± 4.91AB
56.26 ± 5.81B
5.24 ± 0.72

Day 1448.28 ± 3.05AB
34.18 ± 7.82B
3.80 ± 2.00

Day 2818.06 ± 9.56
10.15 ± 4.50B
3.79 ± 2.35

Randomly selected high-power ﬁelds of the immunostained sections were examined and at least 1000 cells were counted
for PC10 staining in each section. Values are expressed as the mean ± one standard deviation of four samples.
A
P ＜ 0.05 compared with gelatinhydrogelB P ＜ 0.05 compared with Normal periosteum− 64 −

小玉 直樹65

表 3. mRNA expression values ＊ of FGFRs, Runx2 and bone markers of the periosteum day 7 after implantation of thegelatinhydrogel. [Copies of transcripts per 106 copies GAPDH]
FGF-2（＋）
FGF-2（−）
Normal periosteum

FGFR10.601 ± 0.211ab
0.235 ± 0.059b
0.165 ± 0.067

FGFR20.1171 ± 0.0495ab
0.0361 ± 0.0152b0.0358 ± 0.0146

FGFR30.0527 ± 0.0189ab
0.0208 ± 0.0075b0.0247 ± 0.0113

Runx20.722 ± 0.241ab
0.285 ± 0.109b
0.186 ± 0.066＊values are expressed as the mean ± one standard deviation of ﬁve samples.

aP<0.05 compared with FGF-2(-) b P<0.05 compared with Normal periosteum

ALP
1.480 ± 0.332ab
0.528 ± 0.160b
0.301 ± 0.223

OPN
1.687 ± 0.547ab
0.588 ± 0.120b
0.482 ± 0.255

図 1 Photomicrographs showing histological frontal cross section
with Hematoxylin-Eosin staining of the maxillary bone located atthe site of gelatinhydrogel implantation.
P: periodontal ligament, B: alveolar bone
NB: new bone, Po: periosteum Scale bars: 200μm

図 2. Photomicrographs showing in situ hybridization of periosteal tissues 7 days after
implantation of the gelatinhydrogel. mRNA signals were visualized by BCIP/NBT.
Counterstained with methyl green. Bar ＝ 30［μm］− 65 −OC39.96 ± 34.17
13.59 ± 6.61
16.54 ± 20.23