関東森林研究論 文68-1(2017)

カラマツ-ハナイグチ共生系における根圏バクテリア接種の影響
Effects of inoculation with rhizosphere bacteria in the Larix kaempferi -Suillus grevillei symbiont
白川誠＊1・上原巌＊2・田中恵＊2
Makoto SHIRAKAWA＊1, Iwao UEHARA＊2 and Megumi TANAKA＊2＊1 東京農業大学大学院農学研究科
Graduate School of Agriculture,Tokyo Univ. of Agriculture＊2 東京農業大学地域環境科学部
Faculty of Regional Environment Sci., Tokyo Univ. of Agriculture
要旨：植物の根圏に特異的に生息するバクテリアを根圏バクテリアと呼ぶ。これらは，根圏土壌と根端で優占種が異なり，宿主植物や共生する菌根菌に対して様々な影響を及ぼすことが考えられる。本研究ではカラマツとハナイグチによる共生系に対して根圏バクテリアが及ぼす影響について明らかにするために，野外カラマツ根圏土壌由来バクテリアを用いた接種試験を行った。加えて，ハナイグチの菌糸成長を促進，または抑制するバクテリア株を特定するために根圏土壌と根端からバクテリアを選出し，in vitro でハナイグチとの二員培養を行った。接種試験では地下部乾重量において処理区間の有意差が認められ、ハナイグチと根圏バクテリアがそれぞれカラマツ実生の成長を促進する傾向が見られた。二員培養ではバクテリア株ごとに異なる菌叢の発達が見られ，特にカラマツ根端由来の Burkholderia２株，Ralstonia，Rhizobium がハナイグチの菌糸成長を有意に抑制した。二つの試験から，バクテリアは根圏における極めて小さな生息箇所の違いにより，カラマツ‐ハナイグチ共生系に対して異なる影響を及ぼすことが示唆された。
キーワード：外生菌根菌・根圏バクテリア・接種試験・二員培養・ハナイグチ
Abstract: “Rhizobacteria” is the bacteria that inhabiting specifically in plant rhizosphere. They have different dominant species inbulk soil and rhizosphere, it seems that a variety of effects on the host plant and mycorrhizal fungi. In this study, to clarify the effects
of rhizosphere bacterial inoculation in Larix kaempferi -Suillus grevillei symbiont, inoculation test was conducted using rhizospheresoil isolated from planted L. kaempferi. In addition, coculture experiment was carried out in vitro to identify the bacterial strain that
promote or inhibit the mycelial growth of S.grevillei. In the inoculation test, rhizosphere soil-derived bacteria and S. grevillei
significantly affect root dry weight of seedlings of L. kaempferi respectively. Moreover, a root tip-derived bacteria, significantly
suppressed the mycelial growth of S.grevillei in coculture experiment. Results suggested that bacteria have different effects
depending on each habitat in the rhizosphere.
Key-word: ectomycorrhizal fungi，rhizobacteria，inoculation test，coculture experiment，Suillus grevillei

Ⅰ はじめに根圏バクテリアの中には菌根菌の菌糸成長を促進するこ植物の根に感染し，菌根と呼ばれる共生体を形成する真とで宿主の成長に寄与するものも存在し，それらは菌根ヘ菌類の中で，マツ科やブナ科などの樹木と共生関係を結ぶ

ルパーバクテリア（MHB）と呼ばれる（４）。したがって，ものを特に外生菌根菌と呼ぶ。菌根の形成により，宿主樹外生菌根菌を用いた接種試験において，菌根菌の接種効果

木は窒素，リン，カリウムといった無機養分の吸収能の向を検討する際には根圏バクテリアの影響を考慮に入れる上や，乾燥や寒さへの耐性を得ることが知られている（２，必要がある。

５，６）。また，植物根圏には多様なバクテリアが生息し日本においてスギ・ヒノキに次ぐ造林樹種であるカラマている。こうしたバクテリアは根面や，根面に付着する土ツ（Larix kaempferi）は外生菌根菌の接種により成長が壌（根圏土壌）に存在しており，窒素固定細菌に見られる向上することが示されている（７,９）
。カラマツ根圏のバ根粒のような緊密な共生関係を持たない（12）ことから，クテリア相は根圏土壌と根端で優占種が異なることが示

宿主とはいわば「緩い」共生関係にあるといえる。

されている（11）が，それらが宿主植物及び菌根菌に及ぼ－

29 －（受理日 2017 年 3 月 31 日）

す影響や，バクテリア相が採取部位により異なる理由，根１．６．調査項目 育成期間終了後，掘り取って地上部端への定着の過程については明らかになっていない。

成長量，地下部成長量，地下部乾重量について測定した。

本研究では，カラマツに対する接種効果が示されている

ハナイグチ+根圏土壌ろ液接種区は菌根の形成状況につい（７）が，根圏バクテリアによる影響と合わせて行われたても調べた。また，各処理区シャーレから最も成長量の良研究例がないハナイグチ（Suillus grevillei）との共生系をい個体を選出し，その根端から得たバクテリアについて用いて二種類の実験を行った。まず，上記の共生系に野外

16SrRNA シーケンスを行い，属レベルでの推定をした後，カラマツ成木から採取した根圏土壌を用いた接種試験を根圏土壌ろ液と接種実生のバクテリア相の非類似度を行い，カラマツの実生成長に根圏土壌由来のバクテリアがNonmetric multidimensional scaling（NMDS）を用いて与える影響について調べた。加えて，接種した根圏土壌と序列化した。また，NMDS によりグループが形成された

供試実生根端のバクテリア相を調べることで接種試験後場合さらに Multiple-response Permutation Proceduresの根端における優占種と，根圏土壌由来のバクテリアが根（MRPP）を用いてグループを分割することの妥当性を調端へ定着する可能性について検討した。また，菌根菌の菌べた。これらの結果を元に接種したバクテリアの根圏への糸成長に対して影響を及ぼすバクテリアを特定するため定着について検討した。に，in vitro においてハナイグチと根圏バクテリアによる２．二員培養 接種試験及び白川ら（11）の結果を元に，二員培養を行い，ハナイグチの菌叢の変化を直接的に観察接種した根圏土壌に加えて，野外カラマツ成木根端及び接した。

種試験実生根端からそれぞれの優占種を中心に計７株のバクテリアを選出した（表－１）。各バクテリア株は YG

Ⅱ 材料と方法

培地，25℃暗黒下で 72 時間前培養した後，濁度を調整１．接種試験（OD600=0.05）した懸濁液として濃度 1/2MMN 培地に 50

１．１．培土 芝の目土，黒土，川砂を２：１：１で混µl 塗布し，中央にコルクボーラ―を用いて直径６mm に打ち抜いたハナイグチの菌糸体ディスクを配置した。20℃暗ぜ合わせ，121℃20 分で滅菌したものを使用した。
１．２．カラマツ実生 吸水処理及び有効塩素濃度１%

黒下で８週間培養し，菌糸成長とコロニーの観察を適宜行のNaClOによる表面殺菌処理を10分間行ったカラマツ種うと共に，培養８週目の菌叢直径を測定した。繰り返し数子を播種し，滅菌培土で75 日間培養したものを使用した。

は４とした。

１．３．ハナイグチ １/2MMN 培地で 20℃39 日間前

表－１．二員培養に供試したバクテリア株培養し，接種試験に用いた。

Table 1 Bacterial strains used in coculture experiment

１．４．根圏土壌 東京農業大学奥多摩演習林内の 40Genus

年生カラマツ成木 10 本から岡島・松中（８）の手法を用いて計５g の根圏土壌を採取した。採取した土壌に純水 50ml を加えて 30 分間振とうした後，雑菌によるコンタミネーションを防ぐために上澄み液を５µm のシリンジフィル
ターで濾して，バクテリアのみを含む根圏土壌ろ液とした。
また，採取した各成木の根圏土壌に含まれているバクテリアについて 16SrRNA シーケンスを用いて属レベルでの推定を行った。
１．５．処理区及び育成 control，根圏土壌ろ液接種区，ハナイグチ+根圏土壌ろ液接種区の３処理区を設定した。
滅菌培土を詰めた角シャーレ（23.3×8.2×1.5 cm）１枚につき３本ずつカラマツ実生を移植した。ハナイグチ接種区には前培養したシャーレからハナイグチの菌糸体を培地ごと切り取り，実生地下部に接種した。根圏土壌ろ液は育成 45 日目に角シャーレ１枚につき４ml を実生地下部に滴下した。育成は太陽光及び赤色灯（12 時間点灯）を光源とする培養棚にて室温で半年間行った。繰り返し数は４とした。

－Species

Isolation source

Abbr.

Arthrobacter

aurescens

Mature trees rhizosphere soil(field)

Ar.

Bacillus

drentensis

Mature trees rhizosphere soil(field)

Ba.１

Bacillussp.

Mature trees rhizosphere soil(field)

Ba.２

Burkholderia sp.

Mature trees root tip(field)

Bu.１

Burkholderia sp.

Mature trees root tip(field)

Bu.２

Ralstonia

mannitolilytica Seedlings root tip(inoculation tests)

Ral.

Rhizobium

tropici

Rhi.

３．統計解析

Seedlings root tip(inoculation tests)

接種試験の各測定項目にはKruskal-Wallis 検定，菌叢直径では one-way ANOVA 及び Tukey-Kramer 検定を行った。また，NMDS の類似度
指数は Jaccard 指数を尺度とした。統計解析には SPSSstatistics 21 及び PC-ORD(version６)を使用した。
Ⅲ 結果と考察
１．接種試験
１．１．成長量 地下部乾重量において処理区間の有意差が認められた（表－２）。control に対して他の２処理区が成長量が大きい傾向を示したことから，ハナイグチと根圏バクテリアがそれぞれ実生の成長促進に関与している

30 －関東森林研究68-1(2017)

表－２．接種試験の結果：実生の成長量（n=３~４）
Table 2 Effects of inoculation with rhizosphere soil on growth of L. kaempferi seedlings（n=3~4）
Treatment
Shoot height（cm) Root length (cm) Root dry weight(mg)control7.34±1.00
13.87±5.30
18.68±7.42
Rhizosphere soil
7.80±2.10
19.15±1.6335.80±7.98
S.grevillei +Rhizosphere soil
9.33±2.28
18.98±2.50
42.52±13.29
Kruskal-Wallis p value
>0.05
>0.05
<0.05

ことが示唆された。また，ハナイグチを接種した区では菌成されており（未発表），一概に促進したとは言えないが，根形成が確認された。形態分類からハナイグチだと考えら

結果的にハナイグチの菌糸成長に寄与する形になった。これるが，ITS 領域を用いたシーケンスで種を特定することのことから，根圏土壌由来と根端由来のバクテリアはハナはできなかった。

イグチの菌叢に対して異なる影響を及ぼすことが示唆さ

１．２．接種バクテリアの定着 根圏土壌及び各処理区れた。より宿主に近い根端由来バクテリアがハナイグチののカラマツ実生根端から検出されたバクテリアについて，菌糸成長を抑制したことについては，MHB として働くこNMDS による序列化を行ったところ，両者のバクテリアとが示されているものの，培養菌糸と菌根に対する反応が相が異なった（図－１）。さらに MRPP の結果から両者の異なる株や（５），菌根菌種の違いにより菌根形成を抑制グループ分けが有意に認められた（p<0.001）。根圏土壌でした例（３）が報告されており，ヘルパー効果の機構の違は Bacillus 属が優占して出現した他，Paenibacillus 属やいや組み合わせの相性と考えることができる。また，抑制

Streptmyces 属，Arthrobacter 属などが見られた。一方，を示した３属には根粒の形成により宿主と緊密な共生関

実生根端では Streptmyces 属が広く見られたが，control係を結ぶ種が含まれるが，菌根圏に生息するバクテリアかと根圏土壌ろ液接種区では Ralstonia 属が，ハナイグチ＋ら根粒を形成する種は出現していない（12）ことから供試

根圏土壌ろ液接種区では Rhizobium 属が優占して出現し，した根端由来の４株は根粒形成能を持たないことが考え

Bacillus 属 は 極 一 部 に 留 ま っ た 。 Ralstonia 属 とられる。しかし，こうしたバクテリアがハナイグチの菌糸Rhizobium 属については接種土壌には見られなかった属成長を有意に抑制したことから，宿主‐菌根菌と緩い共生であり，半開放下環境でのコンタミや，種子内部に生息し関係にあるはずのバクテリアが宿主とのより緊密な共生ていた可能性などが考えられるが由来は不明である。以上を求めて菌根菌に対して競合的に作用する可能性についのことから，本試験では接種した根圏土壌に含まれるバクても今後検討していく必要がある。

テリアは根端に定着せず，プロテオバクテリアに含まれる３属が根端を優占する結果となった。しかし，類似したバRalstonia

クテリア相を示した control（図中 B）とろ液接種区（図中R Squared Axis1=.528
Axis2=.701
MRPP(A ・BCD) p < 0.001

C）間で成長量に差が見られたこと，接種した根圏土壌中に出現した Bacillus 属，Arthrobacter 属，Paenibacillus
Rhizobium

属にはMHBとして報告されている株が存在する（５，10，１）ことから，接種したバクテリアが実生に対して成長促進効果を示したことが考えられる。また，根圏土壌ろ液接種区とハナイグチ＋根圏土壌ろ液接種区において優占種

Bacillusが異なったことから，ハナイグチの存在が根圏バクテリア相を変化させることが示唆された。
2．二員培養 供試した７株の内 Bu.１，Bu.２，Ral.，
Rhi.が control に対して有意に菌糸成長を抑制した（図‐図－１．NMDS による序列化２a）。加えて，Ba.２も菌叢直径は最も大きく成長したが，菌糸体ディスク付近を除いて菌叢が非常に薄くなっていFig.1 Nonmetric multidimensional scaling（NMDS）るため，抑制傾向にあると考えられる。また，抑制を示さ

analysis of bacterial communities

なかった Ba.１及び Ar.においては control に比べて気中菌

A : Rhizosphere soil B : Root tip (control) C : Root tip (rhizosphere soil)

糸が厚くなっており，特に菌糸体ディスク中央はディスク

D : Root tip (S.grevillei+ rhizosphre soil inoculated)

を覆うように菌糸の発達が見られた（図－２b）。この２株

Circle indicates that have the same dominant speciesに対しては培養 72 時間後にハナイグチにより阻止円が形－31 －Ⅳ まとめ引用文献

根圏土壌由来のバクテリアをカラマツ-ハナイグチ共生（１）ASPRAY, T.J., JONES, E.E., DAVIES, M.W., SHIPMAN,系に接種した結果，カラマツ実生根端への定着は見られな

M. and BENDING, G.D.（2013）Increased hyphal branching and

かったが，地下部乾重量の増加に寄与することが示唆されgrowth of ectomycorrhizal fungus Lactarius rufus by the helper

た。二員培養では根圏土壌由来のバクテリアがハナイグチ

bacterium Paenibacillus sp. Mycorrhiza 23：403-410の菌糸成長を有意に促進した一方で根端由来のバクテリ（２）DAVIES, JR.F.T., SVENSON, S.E., COLE, J.C.,

アは有意に抑制を示したことから，菌根においても同様のPHAVAPHUTANON, L., DURAY, S.A.,

結果が予想される。したがって，根圏バクテリアは根圏土

OLALDE-PORTUGAL, V., MEIER, C.E. and BO, S.H.（1996）

壌と根端というわずかな生息箇所の差によってカラマツ

Non–nutritional stress acclimation of mycorrhizal woody plants‐ハナイグチ共生系に及ぼす影響が異なることが示唆さ

exposed to drought. Tree Physiology 16：985-993

れた。

（３）DUNSTAN, W.A., MALAJCZUK, N. and DELL B.

(a)（1998）Effects of bacteria on mycorrhizal development andgrowth of container grown Eucalyptus diversicolor
F.Muell.seedlings. Plant and soil 201：241-249（４）GARBAYE, J.（1994）Helper bacteria：a new dimension
to the mycorrhizal symbiosis. New Phytol 128：197-210（５）KATAOKA, R. and FUTAI, K.（2009）A new mycorrhizal
helper bacterium, Ralstonia species, in the ectomycorrhizal
symbiosis between Pinus thunbergii and Suillus granulatus. BiolFertil Soils 45：315-320（６）LEHTO, T., BROSINSKY, A.,(b)

HEINONEN-TANSKI, H. and REPO, T.（2008）Freezing
tolerance of ectomycorrhizal fungi in pure culture. Mycorrhiza
18：385-392（７）村田義一（1991）カラマツ芽ばえの菌根形成と成長.

cont.

Ar.

Ba.1

北海道林業試験場試験報告 29：1-13

Ba.2（８）岡島秀夫・松中照夫（1973）根圏土壌に関する研究（第１報）トウモロコシ，アルファルファ根圏土壌溶液の無機成分について．日本土壌肥料学雑誌 44（11）：413-420
Bu.1

Bu.2Ral.

Rhi.

（９）QU, L.Y., SHINANO, T., QUORESHI, A.M, TAMAI, Y.,
OSAKI, M. and KOIKE, T.（2004）Allocation of 14C-carbon in

図－２．
（a）培養８週目ハナイグチの菌叢直径（n=３～４） two species of larch seedlings infected with ectomycorrhizal
fungi. Tree Physiology 24：1369-1376（b）培養８週目ハナイグチの菌叢の様子
Fig.2 (a)Mycelial growth of S. grevillei after 8 weeks（10）RÓZYCKI, H., KAMPERT, M., STRZELCZYK, E., LI,culture(n=3~4) (b)State of mycelium after 8 weeks culture

C. and PERRY, D.A.（1994）Effect of different soil bacteria on

Common letters indicate non-significant differences

mycorrhizae formation in scots pine(Pinus sylvestris L.)―in vitro(one-way ANOVA,Tukey-Kramer tests, p<0.05)

studies. Folia Forestalia Polonica 36：92-102

cont. : control Ar. : Arthrobacter aurescens Ba.1 : Bacillus drentensis（11）白川誠・上原巌・田中恵（2016）カラマツ根圏におBa.2 : Bacillus sp. Bu.1 : Burkholderia sp. Bu.2 : Burkholderia sp.

けるバクテリア群集の把握. 第 127 回日本森林学会大会学

Ral. : Ralstonia mannitolilytica Rhi. : Rhizobium tropici

術講演集：P1-062（12）TANAKA, M. and NARA, K.（2009）Phylogenetic

謝辞 ハナイグチ菌株を分譲して頂いた東京大学大学院

diversity of non-nodulating Rhizobium associated with pine

新領域創成科学研究科，奈良一秀教授に感謝を申し上げま

ectomycorrhizae. FEMS Microbiol. Ecol. 69：329-343

す。また，本研究は科研費 15K07486 の助成を受けて行いました。記して感謝いたします。

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