DC プロテインアッセイ
取扱説明書

500011150001125000116
5000113500011450001155000005
5000007
ご使用の前に本製品を正しく安全にお使いいただくために、ご使用の前に必ずこの取扱説明書を十分にお読みください。
お読みになったあとは、いつでも見られるところに必ず保管してください。

DC プロテインアッセイ取扱説明書

目 次
Section 1 製品概要と原理 ..................................................................................................... 1
Section 2 構成....................................................................................................................... 1
Section 3 測定に必要なもの .................................................................................................. 1
3.1 安全に対する注意 ......................................................................................................... 1
Section 4 共存許容試薬 ........................................................................................................ 2
Section 5 操作手順 ............................................................................................................... 3
5.1 スタンダードの調製 ........................................................................................................ 3
5.2 スタンダードアッセイ法 ................................................................................................... 3
5.3 マイクロアッセイ法 ......................................................................................................... 4
Section 6 様々なタンパク質の反応 .......................................................................................... 5
Section 7 保存....................................................................................................................... 5Section 8 トラブルシューティング ............................................................................................ 5
Section 9 参考文献 ................................................................................................................. 6
Ordering Information ................................................................................................................. 7

Section 1

製品概要と原理

バイオ・ラッドの DC プロテインアッセイは、界面活性剤を含んだ溶液のタンパク質濃度を測定するための比色定量用試薬です。この反応は、Lowry 法 1 を応用した方法ですが、測定時間が短くなるように改良を加えており、室温で 15 分間のインキュベーションによって 90% の発色が完了します。さらに、呈色の変化も、試薬添加後約 1 時間で 5%、2 時間でも 10% 以下に抑えられます。
この測定法は Lowry 法と同様に２段階の呈色反応からなっており、まずタンパク質溶液をアルカリ性条件下で酒石酸銅と反応させ、その後タンパク質と銅イオンの反応産物によって Folin 試薬が還元されます 1。発色は、主にアミノ酸のチロシン、トリプトファン残基などに起因しますが、シスチン、システイン、ヒスチジン残基によっても生じます 1, 2。 タンパク質中のこれらのアミノ酸残基によって Folin 試薬が還元され、1、2 または 3 個の酸素原子を喪失し、その結果 750 nm で最大の吸光度を持ち、405 nm で最小の吸光度を示す特徴的な青色を呈する還元物質が生成されます。

Section 2構成

DC プロテインアッセイ試薬セット（カタログ番号 5000116）には、以下の試薬が含まれます。
A 試薬（250 ml）：酒石酸銅を含む溶液
B 試薬（1000 ml x 2 本）：Folin 試薬を含む溶液
S 試薬（5 ml）
なお、DC プロテインアッセイキットⅠ（カタログ番号 5000111）には上記の試薬セットに、プロテインスタンダードⅠ（ウシγグロブリン）が付属し、DC プロテインアッセイキットⅡ（カタログ番号5000112）にはプロテインスタンダードⅡ（ウシ血清アルブミン）が付属します。

Section 3

測定に必要なもの

スタンダードアッセイ用：
13×100 mm テストチューブ
試薬を入れる容器（サイズは準備する量により異なります）
100、500μl、4.0 ml が測定可能なピペット
試薬分注用のメスシリンダー、ピペット
スペクトロフォトメーター 750 nm
ボルテックス
光波長１cm のプラスティックまたはガラスキュベット
13×100 mm テストチューブ用のチューブラック
マイクロプレートアッセイ用：
マイクロタイタープレート
試薬を入れる容器
試薬分注用ピペット
5、25、200μl が測定可能なピペット
マイクロプレートリーダー 750 nm
3.1 安全に対する注意
使用する際は、保護メガネや手袋を着用してください。
安全性に関するその他の詳しい情報は、安全データシート(SDS) をご参照ください。

1Section 4

共存許容試薬DC プロテインアッセイでのタンパク質定量に、影響を与えないことが確認された試薬を以下に示します。これらの試薬でも、DC プロテインアッセイ試薬に対するタンパク質との反応が変化する可能性もありますので、検量線を作成する際のスタンダードは、目的のサンプルと同じバッファーで希釈してください。
試薬名スタンダードアッセイ

Amino acids○Brij-35 (†)

1%C12E8 (*)

0.2%

CaCl2

0.05 M

CHAPS

1%

CHAPSO

1%Deoxycholate

1%

Digitonin

0.3%

Dithiothreitol (DTT)

1 mM

EDTA

25 mM

Guanidine-HCl

400 mMHCl

0.5 M

Imidazole×

2-Mercaptoethanol

×

NaOH

0.5 M

(NH4)2SO4

0.5 M

NP-40

2%

Octyl β-glucoside

1%SDS

10%

Sodium Azide (NaN3)

0.05%

Sucrose15%

Thesit (†)

1%

Tris-HCl, pH8.0

0.1 M

Triton X-100 (†)

1%

Triton X-114 (†)

1%

Tween-20 (†)

1%

Urea

4M

× は使用不可の試薬です。
DC プロテインアッセイで、2-Mercaptoethanol (BME) のような還元剤は使用できません。
マイクロアッセイの場合は、スタンダードアッセイの 1/10 程度の濃度を目安にして、「Section 8トラブルシューティング」に記載されたような検証実験を行い、マイクロアッセイにおける共存物質の影響の有無を個別にご判断ください。
(†) Brij と Tween は Atlas Chemical 社の登録商標です。Thesit は Desitin Arzneimittel GMBH の登録商標です。Triton は Rohm and Haas 社の登録商標です。
(*) octaethyleneglycol dodecyl ether

2Section 5

操作手順

5.1 スタンダードの調製
凍結乾燥されたプロテインスタンダードに精製水またはバッファーを 20 ml 加えて溶解します。より正確な値を得るために、スタンダードを溶解するバッファーには、サンプルと同じものを使用するのをお勧めします。20 ml で溶解したスタンダードのタンパク質濃度は、製品ラベルに表示されていますのでご確認ください（約 1.4±0.2 mg/ml で記載）。調製したスタンダードを 60 日以内に使用しない場合は、小分けして-20 ℃のフリーザーで保存してください。
注意： プロテインスタンダードにはタンパク質を溶解させるためにバッファー・塩が含まれています｡

5.2 スタンダードアッセイ法
スタンダードアッセイ法における測定可能範囲、サンプル量、染色液量測定可能範囲サンプル量
A’ 試薬量*B 試薬量

スタンダードアッセイ法
0.2-1.5 mg/ml BGG & BSA
100μl
5μl
500μl
25μl
4 ml
200μl

* A’ 試薬は 1 ml の A 試薬に対して S 試薬を 20μl 加えたものです。

１． 試薬の準備
1 ml の A 試薬に対して S 試薬 20μl を加え、A’試薬を作成します。
（この A’試薬は、１週間保存が可能です。沈殿が生じた場合は、溶液を温め、ボルテックスをして溶解してください。ピペッティングによる溶解はしないで下さい。チップに結晶がついてしまい、試薬の濃度が変わってしまう可能性があります。）
サンプルに界面活性剤が含まれていない場合は、ステップ１を省略して A 試薬を使用することも可能です。
２． 0.2 から 1.5 mg/ml の間で、3～5 段階のタンパク質濃度のスタンダードを用意します。
検量線は測定を行う度に作成する必要があります。
（正確な値を得るために、スタンダードを調製するバッファーは、サンプルと同じものを使用するのが望ましいです。）
３． 清潔で乾燥したテストチューブまたはマイクロプレートに、スタンダードまたはサンプルを入れます。
４． A’試薬または A 試薬（ステップ１参照）を加えて、ボルテックスをしてよく混ぜます。
マイクロプレートリーダーにミキシング機能が付属している場合、リーダーにセットし、５秒間ミックスしてください。機能がない場合は、プレートをゆっくり揺すって試薬を混ぜてください。
５． それぞれに試薬 B を加えて、直ちによく混ぜます。
６． 15 分後、750 nm で吸光度を測定します。
呈色は少なくとも１時間は安定です。
（750 nm 以外の波長を使用する場合は、トラブルシューティングガイドをご参照下さい。）

3

5.3 マイクロアッセイ法
マイクロアッセイ法における測定可能範囲、サンプル量、染色液量測定可能範囲サンプル量A’ 試薬量*
B 試薬量

マイクロアッセイ法
5-250μg/ml BGG & BSA
200μl
20μl
100μl
10μl
800μl80μl* A’ 試薬は 1ml の A 試薬に対して S 試薬を 20μl 加えたものです。

１． 試薬の準備
1 ml の A 試薬に対して S 試薬 20μl を加え、A’試薬を作成します。
（この A’試薬は、１週間保存が可能です。沈殿が生じた場合は、溶液を温め、ボルテックスをして溶解してください。ピペッティングによる溶解はしないで下さい。チップに結晶がついてしまい、試薬の濃度が変わってしまう可能性があります。）
サンプルに界面活性剤が含まれていない場合は、ステップ１を省略して A 試薬を使用することも可能です。
２． 5 から 250μg/ml の間で、3～5 段階のタンパク質濃度のスタンダードを用意します。
検量線は測定を行う度に作成する必要があります。
（正確な値を得るために、スタンダードを調製するバッファーは、サンプルと同じものを使用するのが望ましいです。）
３． 清潔で乾燥したテストチューブやマイクロプレートに、スタンダードまたはサンプルを入れます。
４． A’試薬または A 試薬（ステップ１参照）を加えて、ボルテックスなどでよく混ぜます。
マイクロプレートリーダーにミキシング機能が付属している場合、リーダーにセットし、５秒間ミックスしてください。機能がない場合は、プレートをゆっくり揺すって試薬を混ぜてください。
５． それぞれに試薬 B を加えて、直ちにボルテックスしてよく混ぜます。
６． 15 分後、750 nm で吸光度を測定してください。
呈色は少なくとも１時間は安定です。
（750 nm 以外の波長を使用する場合は、トラブルシューティングガイドをご参照下さい。）

4Section 6 様々なタンパク質の反応
どの比色分析においても、タンパク質の種類によって呈色に違いが生じます。下に示すグラフ
は、タンパク質を DC プロテインアッセイで測定したものです。タンパク質の違いによる傾きの差はわずかであることがわかります。

Section 7

保存

プロテインスタンダードⅠ（ウシγグロブリン）とプロテインスタンダードⅡ（ウシ血清アルブミン）
は、凍結乾燥状態の時は４℃で１年間保存できます。溶解した後は、４℃保存で 60 日以内に使用し、長期保存する場合には -20℃で保存するようにしてください。凍結融解を繰り返さないように、小分けして保存をしてください。
A 試薬、B 試薬、S 試薬は、直射日光を避け室温（20～30℃）で保存してください（A 試薬、B 試
薬は冷蔵保存も可能です）。試薬の使用期限はすべて、購入後６ヶ月です。

Section 8

トラブルシューティング

質問
共存許容試薬リストに含まれていないバッファーを使用するとき、試薬が反応を阻害するかどうかを調べるには、どのようにすればよいでしょうか。

回答
次のような二つの検量線を作成して検証実験を行ってください。
・測定するサンプルに使用しているバッファーで溶解したスタンダードを用いた検量線
・水で溶解したスタンダードを用いて検量線もしバッファーによる干渉がなければ、二つの検量線はどちらも直線性があり、同じ傾きを示します。もし部分的な干渉があった場合には、バッファーまたは干渉成分でスタンダードを溶解し、その検量線で定量することによって補正することができます。

波長は 750 nm 以外のものを使用することは 可能です。吸光度は 650-750 nm で測定する可能ですか。
ことができます。

5質問
回答
タンパク質の混合物を測定する時に、どのスタ タンパク質定量において、スタンダードとしてンダードを用いればよいでしょうか。
理想的なタンパク質は、測定しようとするタンパク質の精製標品そのものです。このよう標準タンパク質を用意できない場合は、スタンダードとして別のタンパク質を選ぶ必要があります。測定しようとするタンパク質と類似した発色性を示すタンパク質が分かっているなら、それをスタンダードとして用いるのが最適です。
バイオ・ラッドでは、スタンダード用のタンパク質として、精製されたウシγグロブリン（プロテインスタンダードⅠ、カタログ番号 5000005）とウシ血清アルブミン（プロテインスタンダードⅡ,カタログ番号 5000007）をご用意しております。
何らかのサンプルの前処理は必要ですか。

特に必要ありません。しかし、タンパク質は溶解している状態でなければなりません。（浮遊物がある懸濁液は、サンプルとして使用できません。）

試薬を冷蔵庫で保存することはできますか。

できます。しかし、試薬はすべて使用前に室温（20-30℃）に戻しておかなければなりません。
試薬Ｓは、低温室で保存していると沈殿物を生じることがありますが、37℃で 5 分間温めると、沈殿物を溶解する事ができます。

検量線に直線性が得られませんでした。

測定範囲内であっても、高濃度のタンパク質溶液における吸光度が低くなり、直線性が得られない場合があります。この測定結果は検量線として使用できないのではなく、測定したいサンプルもスタンダードと同様の発色をしているため、多項式の近似曲線を用いれば検量線として使用することができます。

Section 9 参考文献
1. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J., “Protein Measurement with the
Folin Phenol Reagent,” Journal of Biological Chemistry, 193 (1951): 265-275.
2. Peterson, Gary L., “Review of the Folin Phenol Protein Quantitation Method of Lowry,Rosebrough, Farr, and Randall,” Analytical Biochemistry, 100 (1979): 201-220.

6

Ordering Information
カタログ番号 品名
5000001
50000025000006
5000201

5000202

5000203

5000204

5000205
5000206
5000207
5000208
5000209
500011150001125000116
500011350001145000115
5000121

50001225000120

5000119
5000005
5000007
2239950
2239955

保存

プロテインアッセイキット Ⅰ
染色液 450ml、プロテインスタンダードⅠ：ウシ γ グロブリン
プロテインアッセイキット Ⅱ
染色液 450ml、プロテインスタンダードⅡ：ウシ血清アルブミン
プロテインアッセイ染色液、450ml

4℃

Quick Start プロテインアッセイキット１1×染色液 １L、Quick Start BSA スタンダード 2ml (2mg/ml)×5 本
Quick Start プロテインアッセイキット２1×染色液 １L、Quick Start BSA スタンダードセット 2ml (0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2mg/ml)×2 本
Quick Start プロテインアッセイキット３
1×染色液 １L、Quick Start IgG スタンダード 2ml (2mg/ml)×5 本
Quick Start プロテインアッセイキット４
1×染色液 １L、Quick Start IgG スタンダードセット 2ml (0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2mg/ml)×2 本
Quick Start プロテインアッセイ染色液、１L
Quick Start BSA スタンダード 2ml (2mg/ml)×5 本
Quick Start BSA スタンダードセット 2ml (0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2mg/ml)×2 本
Quick Start IgG スタンダード 2ml (2mg/ml)×5 本
Quick Start IgG スタンダードセット 2ml (0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2mg/ml)×2 本

4℃

DC プロテインアッセイキット Ⅰ
A 試薬：250ml、B 試薬：2L、S 試薬：5ml、プロテインスタンダードⅠ：ウシ γ グロブリン
DC プロテインアッセイキット Ⅱ
A 試薬：250ml、B 試薬：2L、S 試薬：5ml、プロテインスタンダードⅡ：ウシ血清アルブミン
DC プロテインアッセイ試薬セット
A 試薬：250ml、B 試薬：2L、S 試薬 5ml
DC プロテインアッセイ A 試薬、250ml
DC プロテインアッセイ B 試薬、1L
DC プロテインアッセイ S 試薬、5ml

4℃

RC DC プロテインアッセイキット Ⅰ
A 試薬：250ml、B 試薬：2L、S 試薬：5ml、RCⅠ試薬：250ml、RCⅡ試薬：250ml、プロテインスタンダードⅠ：ウシ γ グロブリン
RC DC プロテインアッセイキット Ⅱ
A 試薬：250ml、B 試薬：2L、S 試薬：5ml、RCⅠ試薬：250ml、RCⅡ試薬：250ml、プロテインスタンダードⅡ：ウシ血清アルブミン
RC DC プロテインアッセイ試薬セット
A 試薬：250ml、B 試薬：2L、S 試薬：5ml、RCⅠ試薬：250ml、RCⅡ試薬：250ml
RC 試薬セット
RCⅠ試薬：250ml、RCⅡ試薬：250ml

4℃
4℃

4℃

4℃

4℃

4℃
4℃
4℃
4℃
4℃

4℃

室温
室温
室温
室温
4℃

4℃

室温

室温

プロテインスタンダードⅠ
ウシ γ グロブリン、20ml に溶解 約 1.4mg/ml
プロテインスタンダードⅡ
ウシ血清アルブミン、20ml に溶解 約 1.4mg/ml

4℃

ディスポーザブルキュベット
スタンダード 3.5ml 100/Tray
ディスポーザブルキュベット
セミマイクロ 1.5ml 100/Tray

－4℃

－7

バイオ･ラッド ラボラトリーズ株式会社

ライフサイエンス
本www.bio-rad.com

社 〒140-0002 東京都品川区東品川 2-2-24 天王洲セントラルタワー Tel : 03-6361-7000※ 学術的お問い合わせは Email: life_ps_jp@bio-rad.com Tel : 03-6404-0331

Fax : 03-5463-8480
Fax : 03-6404-0334※本製品は研究用であり、診断目的にはご利用いただけません。
M13482L 2310a