多量体タンパク質のサブユニット間相互作用を利用した新規機能性ハイドロゲルの構築と薬剤徐放システムへの活用
奈良先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科物質創成科学領域

真島剛史

Association-controllable hemoprotein assemblies and hydrogels were constructed from a fusion protein (FP) with twoc-type cytochrome units utilizing 3D domain swapping (3D-DS), where the same structural region is exchanged threedimensionally between molecules of the same protein. FP was expressed with E. coli and purified by ion exchange andsize exclusion chromatography. The dimer and trimer of FP, oligomerized by 3D-DS, were prepared by the procedure ofethanol addition, lyophilization, and redissolution of the residual. The obtained 3D-DS FP dimer constructed hemoprotein
assembly exhibiting a dynamic structural change between ring and linear forms, regulated by CO and imidazole binding.
The oligomerization of the FP 3D-DS dimer depended on the temperature and protein concentration. The structural change
between ring and linear structure of the dimer of FP 3D-DS dimer was directly observed by the high-speed atomic force
microscopy in solution. Highly concentrated 3D-DS FP trimer formed protein hydrogels, which decomposed by CO andimidazole binding. In this study, protein nanostructures and protein hydrogels were constructed through the interaction
between proteins. These results contribute as the basis of future functional supramolecular protein assemblies and drugdelivery systems using protein-based structures.

１．緒

ク質を融合したタンパク質を 3 D ドメインスワッピング

言（3 D-DS）機構 4）に基づいて設計した。3 D-DS は同じタン

ハイドロゲルは、水により膨潤するゲルであり、ドラッパク質が３次元的に同じ構造部位を交換することで多量化グデリバリーや生体代替・模倣材料への利用が可能なバイする、タンパク質の会合機構の一つであり、天然にも多くオマテリアルとして注目されている。中でもタンパク質を見られるものである。また、ヘムタンパク質とは、コファ原料としたハイドロゲルは、生体親和性や生分解性の高さ

クターとして鉄プロトポルフィリン IX（ヘム）を持つタンを持つ。これまでに、アルブミン等の球状タンパク質 1 , 2）パク質群であり、ヘムが機能発現に重要な役割を果たして3）やコラーゲン を用いたゲルの細胞培養足場や薬剤徐放へいる。まず超好熱菌 Allochromatium vinosum 由来のシトの応用が報告されているが、多くのタンパク質ゲルは、タクロム c’（AVCP）に着目した 5 , 6）。AVCP は通常 2 量体でンパク質の立体構造が崩れ、内部の疎水性残基が表出する存在し、ヘムが還元条件下で一酸化炭素（CO）と結合、もことでゲル化が起こっているため、タンパク質自体に由来しくは酸化条件下でイミダゾールと結合することで単量体する機能は消失している。タンパク質ハイドロゲルへ生体へと解離する（Fig. 1 a）
。この AVCP の機能を利用するこ

適合性を失わずに高度な機能を付与するためには、材料ととで、小分子による外部刺激により構造を制御可能なタンなるタンパク質の構造と機能を維持した状態でのゲル化がパク質ナノ構造体やタンパク質ハイドロゲルが構築できる必要であるが、未だ一般的な方法論が確立されていない。と考えた。次に、複数の AVCP を結合するため、超好熱本研究では、多量化するタンパク質のサブユニット間相互菌 Aquifexaeolicus 由来のシトクロム c 555 を円循環置換して作用を利用することで、ゲルの形成と分解を制御可能なタ構築したタンパク質（CPC）を AVCP の結合基盤部位としンパク質ハイドロゲルの構築に取り組んだ。て選択した 7）。CPC は N 末端部位と C 末端部位の間に α ヘ2．方リックスをリンカーとして挿入することで、3 D-DS 機構

法により 2 量体、３量体を形成する（Fig. 1 b）。CPC は大腸

2 . 1 . ビルディングブロックタンパク質の設計

菌での発現時には単量体として得られ、エタノールの添タンパク質ナノ構造体及びハイドロゲルのビルディン加、凍結乾燥、再溶解の処理を行うことで多量化する。本

グブロックを作成するにあたり、2 種類の c 型ヘムタンパ

研究では、AVCP を N 末端側と C 末端側の 2 つのユニットに分割し、それぞれを CPC の N 末端側と C 末端側に結合

Construction of functiona l proteinhydrogels utilizing the interaction
between subunits of oligomeric proteins
Tsuyoshi Mashima
Graduate S chool of S cience a ndTechnology, Nara Institute of Scienceand Technologyする形で融合タンパク質（FP）を設計した（Fig. 1 c）
。FP
は CPC と同様に大腸菌での発現時には、単量体で得られ、エタノール添加、凍結乾燥、再溶解の処理を行うことで多量化すると考えられる。これにより、大腸菌の中でのタンパク質多量化による発現や精製時の問題を回避でき、精製を極めて簡便に行うことが可能となる。

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Fig. 1 タンパク質ナノ構造体とハイドロゲル構築の概略図。a）AVCP の構造とモノマー・ダイマー間平衡の模式図。N 末端側を青、C 末端側を赤で示す。b）CPC の予測構造と 3D-DS 2 量体の予測構造と 3 量体の結晶構造（PDB ID: 5Z25）。c）AVCP と CPCの融合による FP の構築と FP 3D-DS 多量体によるナノ構造体とハイドロゲル構築の模式図。

2 . 2 . ビルディングブロックタンパク質の発現と精製
FPはc型ヘムタンパク質を生産可能なCCM（cytochrome

2 . 4 . 3 D-DS FP dimer によるタンパク質ナノ構造体の構築と構造評価

c maturation）システムを有する大腸菌を用いて発現させ単離した 3 D-DS FP dimer を CO またはイミダゾール存た。FP は大腸菌の細胞膜と外膜間のペリプラズムに発現在下と非存在下で静置した後、SEC により会合状態の変化されるため、コールド・オスモティック・ショック法によを評価した。また、一度会合した 3 D-DS FP dimer に COり、FP を大腸菌から抽出した。得られた FP をフェリシアまたはイミダゾールが再度付加することで、離散することン化カリウムで酸化した後、イオン交換クロマトグラフィを確かめた。さらに、高速分子間力顕微鏡（AFM）を用いー及びサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により精製て、会合状態の 3 D-DS FP dimer の動的な構造を観察した。

した。FP の純度を SDS-PAGE で確認し、得られた FP の状態を SEC 及び UV-vis スペクトル、CD スペクトル測定

2 . 5 . 3 D-DS FP trimer によるタンパク質ハイドロゲルの構築から確認した。

単離した 3 D-DS FP trimer を酸化条件下で限外ろ過に

2 . 3 . ビルディングブロックタンパク質の多量化より濃縮し、ゲルを作成した。得られたゲルに対し、CO精製した FP に対して、エタノール添加、凍結乾燥、再またはイミダゾールを付加することで、ゲルが分解される溶解の処理を行い、多量化させた後、SEC により精製をか観察した。さらに分解後に酸化条件下で濃縮することで行った。エタノール添加の終濃度を比較したところ、2 量再度ゲル化が可能か確認した。

体（3 D-DS FP dimer）、３量体（3 D-DS FP trimer）とも

3．結果・考察に 40 %（v/v）で最も多く得られた。SEC は CO をバブリングした還元剤を含む緩衝液を移動相に用いて行った。得ら

3 . 1 . ビルディングブロックタンパク質の培養と精製れた 3 D-DS FP dimer 及び trimer については、SEC- 多角大腸菌を用いて培養、精製された FP は全て AVCP サブ度光散乱（MALS）測定により、設計通りの会合数の会合ユニット部分で結合した 2 量体（FP interface dimer）と体が得られていることを確認した。3 D-DS 多量化によるして得られた。FP interface dimer の UV-vis スペクトルタンパク質構造の変化については、酸化、還元、CO 付加

は AVCP と CPC のスペクトルの和と完全に合致し、FP状態の UV-vis スペクトルを比較した。またイミダゾールの AVCP と CPC サブユニットのヘム周辺環境は融合後も結合能の変化についても、イミダゾール滴定によるヘムの維持されていることが明らかになった（Fig. 2 a）
。CD ス

吸収ピーク変化から評価した。

ペクトルについても同様に、AVCP と CPC のスペクトル− 53 −

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Fig. 2 a）FP（赤），AVCP（紫），CPC（緑）の UV-vis スペクトル。青点線は AVCP とCPC のスペクトルの和を示す。b）FP の SEC 測定の溶出曲線。移動相は 50mM リン酸カリウム緩衝液，pH7（青）、及び同様の緩衝液に 5mM ジチオナイトを添加し CO をバブリングしたもの（赤）。の和が FP interface dimer のスペクトルと合致し、FP のCO 結合能が失われていないことが示された。また、FP とAVCP と CPC サブユニットにおいて融合後もタンパク質

FP 3 D-DS dimer のイミダゾール結合能を比較したところ、構造に大きな変化が無いことが示された。さらに、還元条

FP 3 D-DS dimer の結合定数（Ka= 16 . 6 mM- 1）は FP の結件下で CO をバブリングし UV-vis スペクトルを測定した合定数（Ka= 10 . 0 mM- 1）から大きな変化がなく、3 D-DS

ところ、CO がヘムに結合した典型的なスペクトルが得ら多量化後もイミダゾール結合能が維持されていることがれ、FP interface dimer は CO 結合能を維持していること確認された。さらに FP 3 D-DS 多量体は酸化条件下でさが明らかになった。そして、還元条件CO雰囲気下において、らに会合し、より大きな多量体を形成した（Fig. 3 b）
。こFP interface dimer は単量体に解離した（Fig. 2 b）
。また、の多量体は再度 CO またはイミダゾールを付加することで、酸化条件下でイミダゾールを添加すると、FP interface

FP 3 D-DS dimer または trimer へと解離し、AVCP サブdimer は単量体へと解離した。これらの結果から、FP はユニット間の相互作用により、より高次の会合体を可逆的AVCP サブユニット間の相互作用により 2 量化しており、に形成することが示された。

AVCP と同様に CO とイミダゾールへの応答性を維持して3 . 3 . タンパク質ナノ構造体の構築いることが明らかになった。

FP 3 D-DS dimer の多量化は温度とタンパク質濃度に強3 . 2 . ビルディングブロックタンパク質 2 量体または 3 量体の構築と物性評価く依存しており、室温では FP 3 D-DS dimer の 2 量体のみが得られるのに対し、4 ℃下では 3 量体及びより高次の多3 D-DS 処理後に SEC により単離・精製された FP 3 D-量体が形成された（Fig. 4 a）。さらに、4 ℃下においてはDS dimer 及び timer は、還元条件 CO 雰囲気下においてもタンパク質濃度によって 3 D-DS FP dimer の 2 量体、3 量安定的に 2 量体及び 3 量体として存在しており、設計通り体、及び高次多量体の比率に大きな変化が見られた（Fig.に AVCP サブユニット間の相互作用ではなく、3 D-DS に4 b）。3 D-DS FP dimer の濃度が 0 . 5 µM では主に 2 量体よって多量化していることが示唆された。次にイミダゾが形成されたのに対し、25 µM や 50 µM 等の高濃度では 3ールを含む移動相を用いて、AVCP サブユニット間の相量体やより高次の多量体が主成分となった。これらの結果互作用が働かない状況で SEC-MALS 測定を行ったところ、から、FP 3 D-DS dimer が形成する多量体構造が平衡状態

FP 3 D-DS dimer 及び trimer の推定分子量は 47 . 1 kDa とにあることが示された。

76 . 6 kDa で、それぞれの計算値 50 . 6 kDa と 75 . 9 kDa に合次に、FP 3 D-DS dimer の 2 量体が設計通りの構造を致し、単量体（25 . 3 kDa）がそれぞれ 2 量化及び 3 量化しとっているか確認するために、AFM を用いて非常に低濃ていることが確認された（Fig. 3 a）。

度（25 nM）の FP 3 D-DS dimer 2 量体の溶液中の構造をまた、還元後の FP 3 D-DS dimer 及び trimer の大気下マイカ基板上で観察したところ、直径約 20 nm の環状の構及び CO 雰囲気下の UV スペクトルは、FP から大きな変造体が観察された（Fig. 5 a-d）。これらの構造は、FP 3 D-化は無く、3 D-DS による多量体化後もヘム周囲の構造やDS dimer 2 量体の AlphaFold 2 予測構造から計算された− 54 −

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Fig. 3 a）FP 3D-DS dimer の SEC-MALS 解析。移動相は 10mM イミダゾールを含む50mM リン酸カリウム緩衝液 , pH7。b）FP 3D-DS dimer の SEC 測定の溶出曲線。
移動相は 50mM リン酸カリウム緩衝液，pH7（青）、及び同様の緩衝液に 5mM ジチオナイトを添加し CO をバブリングしたもの（赤）。

Fig. 4 a）異なる温度での FP 3 D-DS dimer の SEC 測定の溶出曲線。移動相は 50 mMリン酸カリウム緩衝液 , pH 7，室温（赤），４℃（青）。b）様々な濃度での FP 3 D-DSdimer の SEC 測定の溶出曲線。移動相は 50 mM リン酸カリウム緩衝液 , pH 7。濃度は0 . 5 µM（赤），25 µM（紫），50 µM（青）。

シミュレーション構造とよく一致した。また、直線状の構間の相互作用により架橋構造を構築しゲル化していると考造体も同様に観察され（Fig. 5 e-f）
、こちらは FP 3 D-DSえられる。本ゲルはタンパク質の機能を活用した可逆的にdimer が片方の AVCP サブユニットのみで結合した構造の分解構築が可能なハイドロゲルである。

シミュレーション構造とよく一致した。これらの FP 3 D-

4．総

DS dimer 2 量体の環状と線形の 2 構造は AFM 観察中に相互に変化を繰り返しており、FP 3 D-DS dimer が形成する多量体が動的な構造体であることが示唆された。

括

本研究では、小分子である CO やイミダゾールに反応して会合するタンパク質に着目し、3 D-DS 機構を基盤として融合タンパク質を設計することで、タンパク質間相互作

3 . 4 . タンパク質ハイドロゲルの構築用により、タンパク質のみからなるナノ構造体及びタンパ

FP 3 D-DS trimer を 大 気 下 に お い て 限 外 ろ 過 に よ り

ク質ハイドロゲルの構築を達成した。本成果は、タンパク1 mM（FP 濃度）まで濃縮したところ、ゲルが得られた（Fig.

質をビルディングブロックとする、ナノサイズの機能性タ6）。得られたゲルは、還元条件 CO 雰囲気下におくことで、ンパク質構造体や、ドラッグデリバリーシステムの構築に分解され、再度大気下で濃縮することで、ゲルを形成した。

貢献するものである。

よって本ゲルは FP 3 D-DS trimer が AVCP サブユニット− 55 −

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Fig. 5 高速原子間力顕微鏡（AFM）測定 a）測定された AFM 画像（上）と環状の FP 3D-DS
dimer 2 量体の断面高さ（下）と b）そのシミュレーション画像。c）AlphaFold を用いて予測された環状の FP 3D-DS dimer2 量体の立体構造。d）マイカ基板（黄色）上の環状 FP
3D-DS dimer2 量体の AFM 測定の概略図。FP 3D-DSdimer 2 量体を緑色で示す。e）測定された AFM 画像（上）と直線状の FP 3D-DS dimer 2 量体の断面高さ（下）と f）そのシミュレーション画像。g）AlphaFold を用いて予測された直線状の FP 3D-DS dimer 2 量体の立体構造。h）マイカ基板（黄色）上の直線状 FP 3D-DS dimer2 量体の AFM 測定の概略図。
FP 3D-DS dimer 2 量体を緑色で示す。

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Fig. 6

FP 3D-DS trimer ゲルの写真と、内部構造の模式図。

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