PRESS RELEASE

令和 5 年 9 ⽉ 4 ⽇

報道関係者各位
⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター / ⽣理学研究所

全パルス光源・タイムゲート検出系を駆使した超解像⼆光⼦顕微鏡の開発
ー 脳組織「ナノ」イメージングの新たなアプローチ ー
⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター / ⽣理学研究所の⽯井宏和助教、⼤友康平准教授（順天堂⼤学⼤学院医学研究科 兼任）、Ching-Pu Chang 研究員、根本知⼰教授は、北海道⼤学⼤学院医学研究院の渡辺雅彦教授、⼭崎美和⼦准教授、東北⼤学未来科学技術共同研究センターの横⼭弘之教授と共同で、全パルス光源・タイムゲート検出系を駆使した独⾃の超解像⼆光⼦顕微鏡の開発に成功しました。
本研究成果は、国際科学雑誌 「PLOS ONE」 (2023 年 8 ⽉ 24 ⽇付) に掲載されました。
発表のポイント
1. 全パルス光源・タイムゲート検出系を駆使した超解像⼆光⼦顕微鏡（全パルス式⼆光⼦ STED 顕微鏡）の開発に成功しました。
2. 従来の超解像⼆光⼦像（⼆光⼦ STED 像）に⽐べてさらに約 1. 4 倍も⾼い空間分解能でマウス固定
脳スライスにおけるスパインの微細形態を可視化することを可能にしました。
3. 脳組織深部などで起こるナノスケールの⽣命現象の可視化を通じて、 ⽣物学・医学研究の更なる発展に貢献することが期待されます。

図. 神経樹状突起スパインの微細形態の可視化.

背景
⼆光⼦励起顕微鏡法*1 は、⽣体内をありのままにサブミクロンの空間分解能で観察することを可能とし、医学・⽣物学研究の発展に⼤きく貢献しています。しかし、空間分解能については、対物レンズの開⼝数と⼆光⼦励起波⻑によって規定される励起光の回折広がりにより、300 nm 程度でしかイメージングできないという⼤きな制約があります。そのため、⼆光⼦励起顕微鏡法は、三次元的な広がりを持つ神経回路網や、その回路網を伝搬する神経活動などを⽣体脳内で観察することを可能としてきましたが、記憶や学習によって変化する神経同⼠のつなぎめであるシナプス後部（樹状突起スパイン）の微細な形態変化を可視化するのは困難です。近年、この従来の可視化限界を打破し、100 nm 以下の空間分解能（ナノスケール）で超解像イメージングするための⽅法論が盛んに提案されています。例
えば、⼆光⼦励起顕微鏡法に、2014 年のノーベル化学賞の受賞対象となった超解像技術 ”誘導放出制御（STED）*2 ”を融合させることが試みられています。最近、この⼆光⼦励起 STED 顕微鏡法を⽤いることで⽣体脳内のスパイン形態の時空間ダイナミクスをナノスケールで可視化したという報告がいくつかありましたが、⾼度で複雑な光源系・光学系を構築する必要があり、広く⼀般化された技術とは⾔い難い状況でした。
本研究の内容我々は超解像技術の黎明期より独⾃の光技術を統合し、コンパクトかつ低侵襲的な超解像⼆光⼦励起 STED顕微鏡の開発を進めてきました。その空間分解能は従来の⼆光⼦励起顕微鏡の約５倍、70 nm に達しましたが、脳組織スライスなど⽐較的厚みのあるサンプルでは、STED 光照射に起因するバックグラウンドシグナルの上昇により空間分解能が顕著に劣化するといった問題がありました。本研究では、蛍光光⼦をサブナノ秒の精度でタイムゲート検出するためのシステムを新たに導⼊し、⼆光⼦励起はもちろん STED にもパルスレーザー光源*3 を採⽤した⼆光⼦励起
ゲート STED 顕微鏡（全パルス式⼆光⼦ STED 顕微鏡）を世界に先駆けて開発することに成功しました。1)全パルス光源系を⽤いることで観察対象への光照射を極限まで削ぎ落とし STED 顕微鏡法でしばしば問題となる光ダメージの影響を抑えること、2)蛍光光⼦のタイムゲート検出*4 により空間分解能の劣化に繋がる⽣体分⼦由来のバックグラウンドシグナルを除去すること、の両⽅を同時に実現することができました。特に脳組織イメージングにおけるタイムゲー
ト検出の効果はこれまで考えられてきた以上に⼤きく、ゲート検出範囲の最適化により従来の⼆光⼦ STED 像に⽐べてさらに約 1. 4 倍も⾼い空間分解能でマウス固定脳スライスにおけるスパインの微細形態を可視化できることを⾒出しました（図 1）。

図 1. 神経樹状突起スパインの微細形態の可視化.

本研究の意義と展望
本研究では世界ではじめて全パルス光源・タイムゲート検出系を駆使した超解像⼆光⼦励起顕微鏡を開発し、タイムゲート検出がこれまで考えられてきた以上に脳組織の⼆光⼦ STED 像の空間分解能の向上に寄与することを⾒出しました。また本システムは、従来の⼆光⼦励起顕微鏡の利点や操作性を損なうことなく、観察者が再現よく効率的にイメージングできることをコンセプトに構築された点にも意義があります（図 2）。ただ実際の⽣体深部観察へと展開するには、組織による光学収差を補償する技術や、明るい蛍光プローブの選定・開発、多⾊化なども重要です。今後は、⽣きたまま、ありのままで、体の中を電⼦顕微鏡のように観察できる「⽣体ナノイメージング」を⽬指して、１つ１つの課題をクリアしていきたいと考えています。
なお、本研究で開発した全パルス式⼆光⼦ STED 顕微鏡は、⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センターの共同利⽤機器として広く利⽤者を募っています。知る限り⽇本で⼆光⼦励起 STED 顕微鏡を開発・運⽤している研究機関は当センターのみであり、ナノイメージングを通じて⽣物学・医学研究の更なる発展を推し進める⼀役を担いたいと考えています。

図 2. 全パルス式⼆光⼦ STED 顕微鏡の外観.
（参考）⽣命創成探究センター 機器案内 超解像顕微鏡システム 2 光⼦ STED 顕微鏡
https://www.excells.orion.ac.jp/equipments-for-cooperative-studies#1-9-2

研究サポート本 研 究 は 、 AMED ⾰ 新 脳 プ ロ ジ ェ ク ト （ JP19dm0207078 根 本 知 ⼰ ） 、 科 学 研 究 費 補 助 ⾦(JP15H05953 “Resonance Bio” 根本知⼰; JP16H06280 “Advanced Bioimaging Support” 根本知⼰; JP18K14659 ⽯井宏和; JP20H00523 根本知⼰; JP20H05669 根本知⼰; JP21K19346 ⼤友康平; JP22H02756 ⼤友康平)、光科学技術研究振興財団研究助成 (⽯井宏和)、ExCELLS 若⼿奨励研究(⽯井宏和) 等の⽀援を受けて実施されました。

掲載論⽂
雑誌名: PLOS ONE
論 ⽂ 名 : All-synchronized picosecond pulses and time-gated detection improve the spatialresolution of two-photon STED microscopy in brain tissue imaging
著者: Hirokazu Ishii, Kohei Otomo, Ching-Pu Chang, Miwako Yamasaki, Masahiko Watanabe,
Hiroyuki Yokoyama, Tomomi Nemoto* (*責任著者)
DOI: 10.1371/journal.pone.0290550
掲載 URL: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0290550(⽤語説明)*1 ⼆光⼦励起顕微鏡法
蛍光分⼦が、２つの光⼦を同時に吸収して励起状態に遷移する⾮線形光学現象を利⽤した蛍光顕微鏡法の⼀種。
従来の蛍光顕微鏡法と⽐べてより深い領域を低侵襲的に観察できるといったメリットがある。
*2 誘導放出制御（STED）顕微鏡法
100 年以上にわたって超えることができないと考えられていた蛍光顕微鏡の空間分解能の限界を打破した超解像技術の⼀種。励起光とは異なる波⻑の光（STED 光）を⾼強度でサンプルに照射する必要があり、しばしばサンプルに対する光ダメージが問題になる。
*3 パルスレーザー光源
ある⼀定の間隔でレーザー光を周期的に発振する光源。本研究では、⼆光⼦励起と STED ⽤に独⾃に開発した２種類のパルスレーザー光源を使⽤しており、それぞれのパルスタイミングを 10 ピコ秒（1000 億分の 1 秒）の精度で電気的に同期させている。
*4 タイムゲート検出
パルス光励起により放出された蛍光光⼦数の時間変化を計測し、特定の時間枠内の蛍光光⼦のみを検出する技術。

＜お問い合わせ先＞(研究に関するお問い合わせ)
⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター / ⽣理学研究所
教授 根本 知⼰TEL: 0564-59-5255
E-mail: tn@nips.ac.jp(広報に関するお問い合わせ)
⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター 研究戦略室
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⾃然科学研究機構 ⽣理学研究所 研究⼒強化戦略室
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