Quick Start プロテインアッセイ
取扱説明書

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ご使用の前に本製品を正しく安全にお使いいただくために、ご使用の前に必ずこの取扱説明書を十分にお読みください。
お読みになったあとは、いつでも見られるところに必ず保管してください。

Quick Start プロテインアッセイ取扱説明書

目 次
Section 1 はじめに ................................................................................................................................................................... 1
1.1 原理...................................................................................................................................................................................... 1
1.2 タンパク質スタンダードの選択................................................................................................................................. 21.3 製品概要............................................................................................................................................................................ 2
Section 2 使用方法 .................................................................................................................................................................. 4
2.1 スタンダードアッセイ法 操作手順 .......................................................................................................................... 4
2.2 マイクロアッセイ法 操作手順................................................................................................................................... 5
Section 3 結果の解析 .............................................................................................................................................................. 5
Section 4 FAQ とトラブルシューティング ........................................................................................................................ 7
Section 5 参考文献 ................................................................................................................................................................... 9
Ordering Information................................................................................................................................................................ 10

Section 1 はじめに
Quick Start プロテインアッセイは、簡単に正しい手順で測定できるタンパク質の定量キットです。
Ready-to-use の試薬で希釈不要の染色液と、２種類のタンパク質スタンダードが７段階の濃度に希釈されています。希釈済みのスタンダードは 2 ml ずつスクリューキャップ式バイアルに分注されており、保存期間１年内でのタンパク質の安定性を保つことができます。

1.1 原理Bradford 法は、CBB(Coomassie Brilliant Blue) G-250 とタンパク質との結合を伴うタンパク質定量法です(Bradford 1976)。色素は pH 条件によって、陽イオン型（赤色）、中性型（緑色）、陰イオン型（青色）の３種類の色を呈します(Compton and Jones 1985)。酸性条件下では、色素には H+が付加して陽イオン性の赤色を呈します(Amax = 470 nm)。しかしタンパク質と結合すると、H+が取り除かれて陰イオン性の青色へと移動します(Amax = 595 nm) (Reisner et al. 1975, Fazekes de St. Gloth et al. 1963, Sedmack andGrossberg 1977)。
この測定法において、分光光度計やマイクロプレートリーダーで 595 nm の波長で測定しているのは、青色を呈する色素とタンパク質の結合体になります。
H+陽イオン型
470 nm (赤色)

H+中性型
650 nm (緑色)陰イオン型
595 nm （青色）

合成ポリアミノ酸による研究結果から、CBB G-250 は主に塩基性アミノ酸（特にアルギニン）や芳香族アミノ酸残基に結合する事が示されています(Compton and Jones 1985)。Spector(1985)は、色素‐アルブミン複合体の分子吸光係数は 10 倍以上の濃度範囲内で一定であることを見出しました。従って、Lambert–Beer の法則により、サンプル濃度に対して適切な色素量となる比率で混合することで、正確なタンパク質の定量を行うことが可能となります。
この定量法は、化学物質‐タンパク質間の相互作用、または化学物質‐色素間の相互作用によって干渉される事が知られています。タンパク質以外の化学物質による干渉は、３種（３色）のイオン型間の解離平衡に影響を及ぼすような化合物の場合に生じます。そのような干渉をもたらす試薬として、界面活性剤、フラボノイド、塩基性バッファーなどが知られています。これらは、色素への結合や pH シフトによって、緑色の中性型色素を安定化します (Compton and Jones 1985, Fanger 1987)。
それにも関わらず多くの化学物質はスタンダードアッセイ法での発色に影響を及ぼさない事が知られています。そのような一般的な試薬一覧を Table. 1 にまとめました。マイクロアッセイ法では色素に対するサンプル容量の比率が大きいため、許容される試薬の濃度は Table. 1 の濃度の 1/25 になります。このリストにあげられた化学物質は、BSA やウシγグロブリン(BGG)において、ほとんど（または全く）干渉を引き起こしません。しかし、全てのタンパク質と化学物質の結合性を測定したわけではないため、ある種のタンパク質と組み合わせた場合に干渉が生じる可能性は否定できません。

11.2 タンパク質スタンダードの選択
プロテインアッセイにおいて、スタンダードとして理想的なタンパク質は、測定しようとするタンパク質の精製標品そのものです。こうした絶対的な標準タンパク質を用意できない場合は、相対的なスタンダードとして別のタンパク質を選ぶ必要があります。測定しようとするタンパク質と類似した発色性を示すタンパク質が経験的に分かっているなら、それを相対的なスタンダードとして用いるのが最適です。もし、そのような情報がなく、単に相対的なタンパク質濃度を求めたいだけでしたら、どのような精製タンパク質をスタンダードとして用いても良いと言えるでしょう。プロテインアッセイでタンパク質スタンダードとして最もよく使用される２種のタンパク質は、ウシ血清アルブミン(BSA) と ウシγグロブリン(BGG) です。
Quick Start プロテインアッセイで使用する染色液では、BSA の方がγグロブリンのような一般的なタンパク質よりも強い発色を示します。従って、アルブミン濃度の高いサンプルや、発色の強いサンプ
ルを測定する時は、BSA をスタンダードとして使用するのが適しています。一般的な多くのタンパク質と同等の発色を示す場合は、BGG の使用が適しています。

1.3 製品概要
キットに含まれるすべての試薬は４℃で保存期間は 1 年です。スタンダード溶液には 0.9% NaCl と0.05% NaN3 が含まれます。
Quick Start プロテインアッセイ 1×染色液：
メタノールとリン酸を含む色素溶液が 1Ｌ入っています。染色液 5 ml を使用するスタンダードアッセイ法なら 200 回、マイクロプレートアッセイ法なら 4,000 回の測定が可能です。
Quick Start プロテインアッセイ BSA スタンダード：
2 mg/ml の BSA 溶液が、2 ml のチューブに 5 本入っています。
Quick Start プロテインアッセイ IgG スタンダード：
2 mg/ml の BGG(IgG) 溶液が、2 ml のチューブに 5 本入っています。
Quick Start プロテインアッセイ BSA スタンダードセット：
7 種類の濃度 (2, 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25, 0.125 mg/ml) の BSA 溶液が、2 ml のチューブに 2 本ずつ入っています。
Quick Start プロテインアッセイ IgG スタンダードセット：
7 種類の濃度(2, 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25, 0.125 mg/ml) の BGG(IgG) 溶液が、2 ml のチューブに 2 本ずつ入っています。

2Table １ Quick Start プロテインアッセイの共存許容試薬・濃度（スタンダードアッセイ法）
試薬名
Acetone

試薬名
10%

NaCl

2.5 M

Acetonitrile

10%NAD2 mM

Ampholytes pH 3-10

0.5%

NaOH

0.1 M

ASB-140.025%(NH4)2SO4

1M

Ascorbic acid

50 mM

NaHCO30.2 M

Bis-Tris pH6.5

0.2 M

Na2CO3

0.1 M

CaCl240 mM

NP-40

0.25%

CHAPS

10%

Octyl β-glucoside

0.5%

CHAPSO

10%

Octyl β-thioglucopyranoside1%

Deoxycholic acid

0.2%

PBS

○Dithioerythritol (DTT)

10 mM

Phenol Red

0.5 mg/ml

Dithiothreitol (DTE)

10 mM

PIPES0.2 M

DMSO

5%

PMSF

2 mM

Eagle's MEM○SB 3-10

0.1%

Earle's salt solution○SDS

0.025%

EDTA

0.2 M

Sodium Acetate pH4.8

0.2 M

EGTA

0.2 M

Sodium azide (NaN3)

0.5%

Ethanol

10%

Sodium citrate pH4.8, 6.4

0.2 M

Glucose20%

Sodium Phosphate

0.5 M

Glycerol5%

Sucrose10%

Glycine

0.1 M

Tributylphosphine(TBP)

5 mM

Guanidine-HCl

2M

Hank's salt solution○TBS(25mM Tris, 0.15M NaCl, pH7.6)

0.5X

HCl

0.1 M

TCEP

20 mM

HEPES

0.1 M

Thiourea

1M

Imidazole0.2 M

Tricine, pH 850 mM

KCl

2MTriethanolamine, pH7.850 mM

K3PO4

0.5 M

1M

β-Mercaptoethanol

1M

TrisTris-glycine(25mM Tris,192mM glycine)

MES

0.1 M

MethanolMgCl21X

10 %Tris-glycine-SDS(25mM Tris, 192mM glycine, 0.1% SDS)

0.5X

1M

Triton X-100

0.05%

modified Dulbecco's PBS○Tween-20

0.01%

MOPS

0.1 M

Urea

4M

＊

マイクロアッセイの場合は、1/25 の濃度になります※ Coomassie は Imperial Chemical Industries 社の登録商標です。Triton は Union Carbide 社の登録商標です。
Tween は ICI Americas 社の登録商標です。

3Section 2 使用方法
2.1 スタンダードアッセイ法 操作手順
スタンダードアッセイ法における測定可能範囲、サンプル量、染色液量測定可能範囲
サンプル量
染色液量

スタンダードアッセイ法
0.125-1.5 mg/ml BGG (IgG)
0.125-1.0 mg/ml BSA
100μl
20μl
5μl
5 ml
1 ml
250μl

1.

スタンダードアッセイ法は、染色液量が 5 ml, 1 ml となるキュベットアッセイと、250μl となるマイクロプレートアッセイの３種類の容量で測定を行うことができます。検量線は、ウシ血清アルブミン（BSA）では 0.125-1.0 mg/ml、ウシγグロブリン(BGG, IgG)では 0.125-1.5 mg/ml の範囲で直線性を示します。

2.

1×染色液を冷蔵庫から取り出し、室温に戻します。使用する前にボトルを転倒混和してください。

3.

2 mg/ml の BSA または BGG(IgG)スタンダードを使用する場合は、希釈系列を作成します。希釈に使用する溶液には、サンプルと同じバッファーを使用するのが望ましいです（参考：Section 4
FAQ とトラブルシューティング）。タンパク質の定量は通常デュープリケートからトリプリケートで行ってください。希釈済のスタンダードセットを使用するときは、ブランク (0 mg/ml) 用の精製水については、別途ご用意ください。

4.

試験管、マイクロチューブまたはマイクロプレートに、スタンダードとサンプルを分注します（1.5 mlのディスポーザブルキュベットもお使いいただけます）。１×染色液を各チューブ（またはキュベット）に加え、ボルテックス（または転倒混和）します。マイクロプレートの場合はマイクロプレートミキサーを使用します。ウェルごとにサンプルと染色液を混ぜる手間を省くには、マルチチャンネルピペットを使用します。次のウェルに染色液を加える際には、新しいチップに交換してください。

5.

室温で５分以上インキュベートします。時間が経つにつれて吸光度が高くなりますので、サンプルを室温で１時間以上インキュベートしないでください。

6.

分光光度計を 595 nm にセットします。ブランクでゼロ補正を行います（マイクロプレートリーダー
では必要ありません）。スタンダードとサンプルの吸光度を測定します。データの解析に関しましては Section3 をご参照ください。
注意： 分光光度計にレファレンスとサンプルホルダーがある場合は、２つのブランクサンプルを使用してゼロ補正をする必要があります。吸光度におけるバッファーの影響を測定したい場合は、レファレンスホルダーに精製水と染色液で満たしたキュベットを入れます。

4

2.2 マイクロアッセイ法 操作手順
マイクロアッセイ法における測定可能範囲、サンプル量、染色液量測定可能範囲
サンプル量
染色液量

マイクロアッセイ法
1.25-20μg/ml BGG (IgG)
1.25-10μg/ml BSA
1 ml
150μl
1 ml
150μl

1.

マイクロアッセイ法は、染色液量が 1 ml となるキュベットアッセイと、150μl となるマイクロプレー
トアッセイの２種類の容量で測定を行うことができます。このアッセイにおける測定範囲はウシ血
清アルブミン (BSA)は 1.25-10μg/ml、ウシγグロブリン(BGG, IgG)では 1.25-20μg/ml の測定範囲になります。

2.

1×染色液を冷蔵庫から取り出し、室温に戻します。使用する前にボトルを数回転倒混和してください。

3.

スタンダードを使用して希釈系列を作成します。希釈に使用する溶液には、サンプルと同じバッファーを使用するのが望ましいです。タンパク質の定量は通常デュープリケートからトリプリケートで行ってください。

4.

試験管、マイクロチューブまたはマイクロプレートに、スタンダードとサンプルを分注します（1.5mlのディスポーザブルキュベットもお使いいただけます）。１×染色液を各チューブ（またはキュベット）に加え、ボルテックス（または転倒混和）します。マイクロプレートの場合はマイクロプレートミキサーを使用します。ウェルごとにサンプルと染色液を混ぜる手間を省くには、マルチチャンネルピペットを使用します。次のウェルに染色液を加える際には、新しいチップに交換してください。

5.

室温で５分以上インキュベートします。吸光度は時間が経つにつれて増加しますので、サンプルを室温で１時間以上インキュベートしないでください。

6.

分光光度計を 595 nm にセットします。ブランクでゼロ補正を行います（マイクロプレートリーダー
では必要ありません）。スタンダードとサンプルの吸光度を測定します。データの解析に関しましては Section 3 をご参照ください。
注意： 分光光度計にレファレンスとサンプルホルダーがある場合は、２つのブランクサンプルを使用してゼロ補正をする必要があります。吸光度におけるバッファーの影響を測定したい場合は、レファレンスホルダーに精製水と染色液で満たしたキュベットを入れます。

Section 3 結果の解析
１． 分光光度計またはマイクロプレートリーダーにゼロ点補正機能がない場合は、スタンダードやサンプルの吸光度よりブランクの吸光度の平均値を引いて求めてください。
２． 検量線を作成します。y 軸に 595 nm での測定値、x 軸に濃度をとり、測定値をプロットします。作
成した検量線を使用して、サンプルの濃度を求めます。サンプルを希釈して吸光度を測定した場
合は、希釈率などを考慮して最終濃度を算出します。
３． スタンダードアッセイ法とマイクロアッセイ法のどちらでも、マイクロプレートを使用した場合の吸光度は、キュベットを使用した場合に比べて、吸光度値は低くなるかもしれません。これはマイクロプレートリーダーを使用した方が、光路長が短いためです。この点は、検出感度にも影響するかもしれません。
４． 染色液量 5 ml でのアッセイ法を使用した検量線例は、図 1, 2 をご参照ください。

5

図１． スタンダードアッセイ法 （5 ml 容量） による検量線例

図２． マイクロアッセイ法による検量線例

6Section 4 FAQ とトラブルシューティング
質問
使用しているバッファーが共存許容試薬リストに載っていませんが、Quick Start プロテインアッセイで測定することはできますか。

対策
バッファーで希釈したスタンダード、精製水で希釈したスタンダードの 2 種類の希釈系列をつくり、それぞれ検量線を描いてみてください。（各サンプルに含まれるタンパク質量は同じにしてください。）同じような検量線が得られれば、そのバッファーは発色に干渉せず、使用可能と考えられます。
部分的な干渉であればバッファーや干渉物質を検量線作成時に加えることで補正できます。

使用しているバッファーには Quick Start プロテインアッセイが使用不可の界面活性剤を含みますが、どのようにしてタンパク質を定量すればよいですか。

サンプルの濃度が高いのであれば、界面活性剤の濃度を 0.1%以下になるように希釈して Quick
Start プロテインアッセイで測定することはできます。
もしくは、DC プロテインアッセイをご使用ください。DC プロテインアッセイは Lowry 法を改良したもので、1%イオン性または非イオン性の界面活性剤の存在下で測定することができます。

何らかのサンプルの前処理は必要ですか。

サンプルの前処理は必要ありません。ただし、タンパク質が可溶化している必要があります。ろ過していない懸濁液を使用することはできません。

青い色素がキュベットに吸着すると、測定結果 石英キュベットを使用している場合は、色素のに影響するのではないですか。
結合量は考慮する必要はありません(Bradford
1976)。したがって、サンプルを換えるごとに色素を除去する必要はありません。しかし、測定が終了したら、その後の測定のために、次のいずれかの洗浄処理を行って、色素を除去することをおすすめいたします。
・キュベットをメタノールで十分洗う。

・キュベットをガラス製の洗剤で洗ったあと、精製水で十分すすぐ。

・

0.1 N HCl にキュベットを数時間浸けておき、精製水で十分にすすぐ。

また、バイオ・ラッドでは、ガラス製のものより色素の付着が少ないポリスチレン製のディスポーザブルキュベット（カタログ番号2239950）をご用意しております。
595 nm 以外の波長で測定することができます 吸光度は 580-610 nmの波長で測定することがか。
できます。

7

質問
チューブに沈殿が生じてしまいました。

対策
バッファー中に界面活性剤が含む可能性があります。サンプルを希釈して界面活性剤の濃度を下げるか、透析を行ってください。

スタンダードとサンプルの吸光度が低い。

染色液が冷えている場合は、室温まで戻してから使用してください。もしくは、染色液が古いことが原因である可能性があります。購入して1年以上経っている場合は、新しい染色液に交換してください。

スタンダードの吸光度に問題はないが、サンプ サンプルに､界面活性剤やアルカリ溶液など反ルの吸光度が低い。
応を干渉する物質が含まれている可能性があります。Table 1の共存許容試薬・濃度を確認してください。またはサンプルを希釈してください。ス
タンダードを希釈する際は、サンプルと同じバッファーを使用してください。
また、タンパク質の分子量が小さい可能性があります。この方法で測定できる分子量の限界は、3,000-5,000 Daになります。
検量線に直線性が得られませんでした。

測定範囲内であっても、高濃度のタンパク質溶液における吸光度が低くなり、直線性が得られない場合があります。この測定結果は検量線として使用できないのではなく、測定したいサンプ
ルもスタンダードと同様の発色をしているため、多項式の近似曲線を用いれば検量線として使用することができます。

8

Section 5 参考文献
Bradford MM, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 72, 248–254 (1976)
Compton SJ and Jones CG, Mechanism of dye response and interference in the Bradford
protein assay, Anal Biochem 151, 369–374 (1985)
Fanger B, Adaptation of the Bradford protein assay to membrane-bound proteins bysolubilizing in glucopyranoside detergents, Anal Biochem 162, 11–17 (1987)
Fazekas de St. Groth S et al., Two new staining procedures for quantitative estimation ofproteins on electrophoretic strips, Biochim Biophys Acta 71, 377–391 (1963)
Reisner AH et al., The use of Coomassie Brilliant Blue G-250 perchloric acid solution forstaining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels, Anal Biochem 64,509–516 (1975)
Sedmak JJ and Grossberg SE, A rapid, sensitive and versatile assay for protein using
Coomassie Brilliant Blue G-250, Anal Biochem 79, 544–552 (1977)
Spector T, Refinement of the Coomassie blue method of protein quantitation. A simple andlinear spectrophotometric assay for less than or equal to 0.5 to 50 micrograms of protein,
Anal Biochem 86, 142–146 (1978)

9Ordering Information
カタログ番号 品名5000001
50000025000006
5000201

5000202

5000203

5000204

5000205
5000206
5000207
5000208
5000209
500011150001125000116
500011350001145000115
5000121

50001225000120

5000119
5000005
5000007
2239950
2239955

保存

プロテインアッセイキット Ⅰ
染色液 450ml、プロテインスタンダードⅠ：ウシ γ グロブリン
プロテインアッセイキット Ⅱ
染色液 450ml、プロテインスタンダードⅡ：ウシ血清アルブミン
プロテインアッセイ染色液、450ml

4℃

Quick Start プロテインアッセイキット１
1×染色液 １L、Quick Start BSA スタンダード 2ml (2mg/ml)×5 本
Quick Start プロテインアッセイキット２
1×染色液 １L、Quick Start BSA スタンダードセット 2ml (0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2mg/ml)×2 本
Quick Start プロテインアッセイキット３
1×染色液 １L、Quick Start IgG スタンダード 2ml (2mg/ml)×5 本
Quick Start プロテインアッセイキット４1×染色液 １L、Quick Start IgG スタンダードセット 2ml (0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2mg/ml)×2 本
Quick Start プロテインアッセイ染色液、１L
Quick Start BSA スタンダード 2ml (2mg/ml)×5 本
Quick Start BSA スタンダードセット 2ml (0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2mg/ml)×2 本
Quick Start IgG スタンダード 2ml (2mg/ml)×5 本
Quick Start IgG スタンダードセット 2ml (0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2mg/ml)×2 本

4℃

DC プロテインアッセイキット Ⅰ
A 試薬：250ml、B 試薬：2L、S 試薬：5ml、プロテインスタンダードⅠ：ウシ γ グロブリン
DC プロテインアッセイキット Ⅱ
A 試薬：250ml、B 試薬：2L、S 試薬：5ml、プロテインスタンダードⅡ：ウシ血清アルブミン
DC プロテインアッセイ試薬セット
A 試薬：250ml、B 試薬：2L、S 試薬 5ml
DC プロテインアッセイ A 試薬、250ml
DC プロテインアッセイ B 試薬、1L
DC プロテインアッセイ S 試薬、5ml

4℃

RC DC プロテインアッセイキット Ⅰ
A 試薬：250ml、B 試薬：2L、S 試薬：5ml、RCⅠ試薬：250ml、RCⅡ試薬：250ml、プロテインスタンダードⅠ：ウシ γ グロブリン
RC DC プロテインアッセイキット Ⅱ
A 試薬：250ml、B 試薬：2L、S 試薬：5ml、RCⅠ試薬：250ml、RCⅡ試薬：250ml、プロテインスタンダードⅡ：ウシ血清アルブミン
RC DC プロテインアッセイ試薬セット
A 試薬：250ml、B 試薬：2L、S 試薬：5ml、RCⅠ試薬：250ml、RCⅡ試薬：250ml
RC 試薬セット
RCⅠ試薬：250ml、RCⅡ試薬：250ml

4℃
4℃4℃

4℃

4℃

4℃
4℃
4℃
4℃
4℃

4℃

室温
室温
室温
室温
4℃

4℃

室温

室温

プロテインスタンダードⅠ
ウシ γ グロブリン、20ml に溶解 約 1.4mg/ml
プロテインスタンダードⅡ
ウシ血清アルブミン、20ml に溶解 約 1.4mg/ml

4℃

ディスポーザブルキュベット
スタンダード 3.5ml 100/Tray
ディスポーザブルキュベット
セミマイクロ 1.5ml 100/Tray

－4℃

－10

バイオ･ラッド ラボラトリーズ株式会社

ライフサイエンス
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