Photon Factory Activity Report 2014 #32(2015) B	  BL-17A, NW12A/2013G102

植物由来植物由来芳香族ポリケタイド合成酵素の X 線結晶構造解析
X-ray crystal structure analysis of aromatic polyketide synthases from plants.
森貴裕, 阿部郁朗*
東京大学薬学系研究科, 〒113-0033 東京都文京区本郷 7-3-1
Takahiro Mori and Ikuro Abe*
Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku,
Tokyo, 113-0033, Japan
1 はじめに天然物の基本骨格を構築する二次代謝酵素は、活性部位の微妙な構造の違いで基質特異性や反応様式が大きく変化するものがあり、これが天然物の分子多様性を生み出す要因の一つとなっている。こうした二次代謝酵素の機能を、酵素タンパク質の立体構造をもとに改変し、基質特異性や反応性を人為的に拡張して利用する事により、さらなる新規骨格の創出が期待される。
ポリケタイド化合物とは、植物、微生物等、様々な生物から単離される、医薬品資源としても重要な化合物群である。このポリケタイド化合物の基本骨格構築を行うのがポリケタイド合成酵素（PKSs）であり、C2 のアセチルユニットの伸張反応を触媒する。
Ⅲ型ポリケタイド合成酵素は分子量約 40kDa のホモダイマー酵素であり、構造的、機能的にモジュールタイプの I 型、サブユニットタイプのⅡ型 PKS とは大きく異なる。Ⅲ型 PKS は、I 型やⅡ型 PKS に必要なアシルキャリアプロテイン（ACP）を必要としない独立型の PKS である。植物においては、植物内に普遍的に存在している chalcone などのポリフェノールの合成に関与するカルコン合成酵素（CHS）がよ く 研 究 さ れ て い る 。 CHS は 、 １ 分 子 の pcoumaroyl-CoA を受け入れ、3 分子の malonyl-CoAを縮合し、naringenin chalcone を生産する酵素である。その他にも様々な芳香族化合物の CoA エステルや、脂肪酸の CoA エステルを受け入れるⅢ型PKS が同定、機能解析が行われている。
糸状菌 Aspergillus oryzae 由来 CsyB は、fatty acylCoA、malonyl-CoA、acetoacetyl-CoA から 3-acyl-4hydroxy-6-alkyl-α-pyrone（AcAP）骨格を形成するⅢ型 PKS である。上述のように一般的なⅢ型 PKS は開始基質に、複数回 malonyl-CoA の脱炭酸を伴った縮合反応を触媒するのに対し、本酵素は、malonylCoA の脱炭酸を伴った縮合に加え、acetoacetyl-CoAとアルキルジケタイド中間体の縮合も触媒する。このような反応を触媒するⅢ型 PKS は初めての例であり、その詳細な反応メカニズムの解明を目的として X 線結晶構造解析に着手した。

ROOCoASCoAS

CH 3O

1 x CoASOOH

O

CH 3

CH 3

acetoacetyl-CoAacetyl-CoAO

O

O

C2-C18 3-acetyl-4-hydroxy-6-alkyl-α-pyrone(R= n-C1 -C17 )OH

malonyl-CoAR
OCoAS

O
R

C 3-C18 fatty acyl-CoA
R = n-C2-C17CoAS

O

O

OH

O

O

R
R

C 3-C18 fatty acyl-diketide-CoA
R = n-C2-C17

C 3-C7 3-acyl-4-hydroxy-6-alkyl-α-pyrone
R = n-C2-C6

図１	  A. oryzae CsyB の反応
2 実験
A. oryzae CsyB 及び変異体の精製と結晶化は参考
文献[1]で報告した方法で行った。X 線回折強度デー
タの収集は、Photon Factory の構造生物学ビームライン（PF-AR NW12A、PF-17A）を利用した。酵素の 結 晶 構 造 は 、Neurospora crassa 2'oxoalkylresorcylic acid synthase (ORAS)をモデルとした分子置換法により決定した。
3 結果および考察	  A. oryzae CsyB と CoA の複合体構造を 1.7 Å の分解能で決定した（表１）。両酵素の全体構造は他のⅢ型 PKS と同様なαβαβα構造を有しており、活性中心のアミノ酸残基、Cys、His、Asn の位置もよく保存されていた（図２）。

図２	  CsyB の（A）全体構造、（B）活性部位
詳細な活性部位の解析の結果、CsyB の活性部位には、他のⅢ型 PKS において保存されている F375 がIle に置換され、主鎖の向きが変化したことにより他のⅢ型 PKS には見られない、深さ約 8 Å の新規疎水性ポケットが存在していた。この新規ポケットの役割を検討すべく、変異体実験を行った結果、興味深いことに、I375W 変異体では完全に活性が消失したのに対し、I375F 変異体においては基質特異性の拡張が見出された。さらに、両変異体の結晶構造を取Photon Factory Activity Report 2013 #31 (2014) B

得し、その活性部位を観察したところ、I375W での新規ポケット消失と I375F での拡大が明らかとなり、CsyB はこの新規ポケットを利用し２分子のアルキル鎖の縮合反応を触媒することが判明した（図３）。
これらの結果を基に、CsyB における AcAP 骨格形成メカニズムを提唱した。Ⅲ型 PKS において、２つ目のポケットを利用した触媒反応は初めての例であり、さらなるⅢ型 PKS の触媒多様性、構造多様性に興味が持たれる。

図３	  CsyB の活性部位構造 (A) 野生型 (B) I375F 変異体 (C) I375W 変異体
表１ リファイメントテーブル
Data collection

CsyB WT

Beam line

PF BL17A

CsyB WT
PF-AR NW12A

PF-AR NW12A

Wavelength (Å)

0.98001.00001.0000ACS

Unit cell paramaterSpace group

P21

P21

P21

a,b,c (Å)

70, 104.8, 73.5

69.9, 104.7, 73.0

70.1, 104.5, 73.6

β (°)
Resolution range (Å)

114.4

114.3

114.4

50.00-1.71 (1.81-1.71)

50.00-2.30 (2.44-2.30)

50-2.00 (2.12-2.00)

Completeness96.3 (95.3)

99.5 (99.1)

99.6 (99.1)<I/σI>

17.3 (5.3)

22.3 (5.5)

13.6 (3.81)

Rmerge (%)

5.2 (26.3)

5.3 (26.8)

7.7 (35.5)

Redundancy
No. of observedreflections
No. of uniquereflections
Refinement

3.8 (3.9)

3.8 (3.7)

3.8 (3.7)

388,694 (62,153)

161,189 (25,112)

247,674 (38,739)

101,115 (16,084)

42,629 (6,766)

65,058 (10,375)

Resolution (Å)

39.5-1.71

41.2-2.30

41.2-2.00

Overall Rwork (%)

17.5

17.3

17.3

Overall Rfree (%)

19.9

22.3

20.4

Total atoms

6523

6139

6476

No. of protein atoms

5730

5746

5723

No. of waters

697

393

657

No. of ligand

96-96

Protein atoms (Å2)

22.8

32.3

17.5Waters

32.93426.3

Ligands

34-32.1

Bond length (Å)

0.007

0.007

0.007

Bond angles (°)

1.15

1.038

1.068

Average B-factors

r.m.s.d. from ideal

4 まとめ	  糸状菌 Aspergillus oryzae 由来 CsyB の X 線結晶構造解析から、CsyB 特異的な２分子のアルキル鎖の縮合反応の触媒メカニズムを提唱した。本研究成果
は JBC 誌に掲載された。

参考文献[1] Yang, D. et al., Acta Crystallogr., Sect. F: Struct. Biol.
Cryst. Commun., 70, 730-733 (2014).
[2] Mori, T. et al., J. Biol. Chem., 290, 5214 (2015).