学 位 研 究 紹 介

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学 位 研 究 紹 介

低ホスファターゼ症におけるジスルフィド結合で架橋された組織非特異型アルカ
リホスファターゼ R433C の解析
Aberrant interchain disulfide bridgeof tissue-nonspecific alkaline
phosphatase with an Arg433 → Cys
substitution associated with severe
hypophosphatasia

pyrophosphate が石灰化を障害することや，局所のリン酸濃度の低下が低石灰化の原因と考えられている。

【目的】

TNSALP の 433 番 目 の ア ミ ノ 酸 で あ る ア ル ギ ニ ン（Ｒ）がシステイン（Ｃ）に変異した突然変異がホモ接合体として 1998 年に乳児致死型症例で，433 番目のアルギニンがヒスチジン（Ｈ）に変異した突然変異が複合へテロ接合体（R433H/D389G）として 1999 年に歯限局型症例で報告された。本研究では低ホスファターゼ症発新潟大学大学院医歯学総合研究科
口腔健康科学講座

口腔生命科学専攻

加齢歯科補綴学分野

那須 真樹子Division of Oral Health in Aging and Fixed Prosthodontics,症 機 構 解 明 の 一 助 と し て， 特 に 変 異 酵 素 TNSALP（R433C）（以下 R433C と略す）に注目し，分子生物学的手法を用いて解析を行った。

Department of Oral Biological Science, Course for Oral Life

【方Science, Niigata University Graduate School of Medical and法】

Dental Sciences

部位特異的突然変異法を用いて，TNSALP（R433C,Makiko Nasu

R433H）をコードする cDNA を作成し，COS-1 細胞にて野生型および本変異型タンパク質を一過性に発現させた。またより生理的な状態で比較・検討するため，野生【背景】型と R433C に関しては条件発現細胞株である CHO-K1Tet-On 細 胞 を 樹 立 し て 観 察 し た。 さ ら に 野 生 型

低ホスファターゼ症は骨や歯といった硬組織の低石灰TNSALP のなかで唯一遊離の状態である 102 番目のシ化を特徴とした遺伝性疾患で，組織非特異型アルカリホステイン残基の R433C への影響を調べるため，C102Sスファターゼ（tissue-nonspeciﬁc alkaline phosphatase,と R433C の double mutant cDNA を作成し COS-1 細胞TNSALP）がその原因遺伝子であることがすでに知らに発現させた。具体的な方法としては放射性アミノ酸標れている。低ホスファターゼ症はその重症度と発症時期

識 / 免疫沈降法（SDS/PAGE）, p - ニトロフェニルリンにより周産期型，乳幼児型，小児型，成人型，歯限局型酸を基質としたアルカリホスファターゼ活性測定，ウェに分類される。この疾患の生化学的な特徴は血清アルカスタンブロッティング，蛍光抗体染色を用いた。

リホスファターゼ活性の低下であり，低ホスファターゼ【結果と考察】症患者における臨床的表現系と酵素活性は深く関連している。一般的に血清中の酵素レベルが低ければ低いほど発症の時期が早く，しかも重篤な症状となりしばしば致COS-1 細胞において細胞内で合成された TNSALP の死性である。現在までに 191 の TNSALP の変異が報告

存在を免疫沈降法にて確認したところ，還元状態では野されており，このうちの約 80％がミスセンス変異であ生型（Wild）と２つの変異型はともに 66kDa（未熟型）る。アルカリホスファターゼは至適 pH がアルカリ性で，と 80kDa（成熟型）を示したが，非還元状態においてリン酸モノエステルをリン酸とアルコールに分解する基変異型 R433C では 130kDa（未熟型）や 160kDa（成熟型）

質特異性の低い酵素である。一般に細胞膜表面に膜アンも発現していた。これより R433C では一部がジスルフィカー型酵素として局在するエクトザイムであり，通常ド結合でダイマー化していることが推測される。（図１）dimer として酵素活性を発揮する。アルカリホスファ

ま た PI-PLC 処 理 に よ り GPI ア ン カ ー を 切 断 しターゼの活性低下が低石灰化を引き起こす機序について

TNSALP を細胞膜から遊離させると，Wild, R433H はは，完全には理解されていないが，アルカリホスファター培地中に 80kDa の成熟型が遊離した。一方 R433C はゼ の 活 性 低 下 に と も な い 蓄 積 す る inorganic

80kDa および 160kDa の成熟型がともに遊離するのが確− 47 −

220

新潟歯学会誌 37（2）：2007

認できたことより，R433C はダイマー化していても細R433C は Wild に比べプロテアーゼに対する感受性がよ胞膜表面に発現していることがわかる。（図２）一方，り高いことより，ジスルフィド結合は TNSALP の３次酵素活性は R433C が Wild に比べ約１／３の活性しか示元的構造に変化を与えていることが示唆された。ところさないのに対し，R433H は Wild に比べて高い触媒活性で，野生型 TNSALP には５つのシステイン残基が存在を示した。（図３）

し，そのうち 102 番目のシステイン残基だけがジスル

CHO-K1 Tet-On 細 胞 は 抗 生 物 質 Dox（doxycyclin）

フィド結合に関与せずに遊離の状態であることがすでににより遺伝子の発現を調節でき，Dox を添加することわかっている。その 102 番目のシステインをセリンに変ではじめて遺伝子を発現させることができる。この条件

異させ，R433C への影響を COS-1 細胞にて調べた結果，発現では R433C は非還元においてほとんどが 130kDa

102 番目のシステインは R433C へ影響を及ぼさないこ

または 160kDa で存在しており，その比活性は Wild のとが判明した。

約１／ 20 にまで低下していた。また蛍光抗体染色よりこれらの結果より，R433C はサブユニット間にジス

R433C は CHO-K1 Tet-On 細胞においても細胞膜上に発ルフィド結合を形成することで立体構造の変化とともに現していることがわかった。さらにパルスーチェイス実活性が極度に減少するため，細胞表面に発現するにもか験および EndoH 処理実験より，ジスルフィド結合は小かわらず，重症の低ホスファターゼ症を引き起こすと考胞体で形成されるが，その後の細胞内輸送の速度は野生えられる。

型分子とほとんど差が認められないことも明らかとなっ

【文た。

献】

次に R433C のジスルフィド結合によるダイマーの形成を阻害させるため，還元剤 dithiothreitol（DTT）を

Makiko Nasu, Masahiro Ito, Yoko Ishida, Natsuko

用い，その効果をウェスタンブロッティング（図４（Ａ））

Numa, Keiichi Komaru, Shuichi Nomura and Kimimitsuと酵素活性（図４（Ｂ））により検討した。DTT を加え

Oda : Aberrant interchain disulfide bridge of tissue-

ることで 80kDa の分子種が出現し，同時に酵素活性もnonspecific alkaline phosphatase with an Arg433 →上昇したことより，R433C はジスルフィド結合を形成

Cys substitution associated with severe

することでその触媒活性が低下すると考えられた。また

hypophosphatasia. FEBS Journal, 273 : 5612-5624, 2006.

図１

COS-1 細胞における TNSALP の生合成

図３

酵素活性

図２

TNSALP の細胞表面への発現（PI-PLC の処理）

図４ 変異型 TNSALP（R433C）の合成時における還元剤 DTT の効果− 48 −