環境感染誌

Vol. 33 no. 2, 2018

〈原 著〉

温水洗浄便座で生成した次亜塩素酸水の緑膿菌に対する除菌効果
伊丹愛子 1,3）・桒原京子 2）・堀賢 1）

Eradication Effect of Electrolyzed Hypochlorous Acid Water Produced byElectronic Bidet Toilet Seat System against Pseudomonas aeruginosa
Aiko ITAMI1,3）, Kyoko KUWAHARA2）and Satoshi HORI1）
1）Department of Infection Control Science, Graduate School of Medicine, Juntendo University,2）Department of Microbiology, School of Medicine, Juntendo University, 3）Department of Research Institute, TOTO LTD.

（2017 年 8 月 10 日受付・2017 年 12 月 5 日受理）
要旨
近年，温水洗浄便座の汚染が医療関連感染の原因菌を媒介しない衛生的な温水洗浄便座が求められている．最新の温水洗浄便座では，水道水を電気分解して次亜塩素酸水（中性電解水）を生成し，ノズルを洗浄する機能を有している製品がある１，２）．本研究では，次亜塩素酸水生成機能付き便座で生成された低濃度中性電解水を用いて，医療関連感染で問題となりやすい緑膿菌に対する，除菌効果を明らかにすることを目的として本研究を実施した．その結果，緑膿菌臨床分離株，環境分離株とも次亜塩素酸濃度 0.5 mg/L で 30 秒以上，1.0 mg/L で 5 秒以上接触させることで，90% 以上の株で菌濃度 2 桁以上の除菌効果が得られた．以上の結果から，中性電解水は，低濃度でも接触時間と作用間隔を最適化すれば，緑膿菌に対して除菌効果があることが示唆された．
Key words：温水洗浄便座，緑膿菌，中性電解水，除菌序明らかにすることを目的とした．

文
温水洗浄便座の世帯普及率は 81.2% に達しており，医療現場でも広く普及している．近年，環境を介した水平材料と方法伝播防止の観点から，温水洗浄便座の汚染が医療関連感1．試験菌株

染の原因菌を媒介しない衛生的な温水洗浄便座が求めら

順天堂医院で 2015 年〜2016 年に入院患者から分離されている．最新の温水洗浄便座の一つには，水道水を電れた緑膿菌臨床分離株 44 株（このうち，PCR-based ORF

気分解して次亜塩素酸水（中性電解水）を生成し，ノズTyping（POT 法）のみ 28 株），水まわり汚れから分離

３）ルを洗浄する機能を有している．桒原らの研究 は，事された緑膿菌環境分離株 8 株を用いた．

前にノズルを培養液に浸し 35℃ で 2 日間培養後，ノズ2．菌の前培養ル表面にバイオフィルムが付着した状態からの中性電解保存菌株から普通寒天平板培地に 1 白金耳移植し，温水の洗浄条件について報告しており，実際の使用条件と度 35±1℃ で 20 時間培養した．
3．試験菌液の調整は大きく異なっている．私たちは，ノズルに付着した汚染菌が増殖する前に中性電解水で定期的に洗浄すれば，試験菌の菌体 1 白金耳量を 500 倍に希釈したニュート菌の過剰な増殖を抑制できると考えた．本研究では，医リエントブロス（以後 1/500 NB）にミキサーで均一に療施設で問題となりやすい緑膿菌を用いて，培養時間と分散させる．分光光度計において 600 nm の波長で透過菌の増殖の関係及び，液中での中性電解水の除菌効果を率が 70% となるように菌液濃度を調製することで，菌液濃度を約 108 cfu/mL に調製した．調製した菌液を，1/

1）順天堂大学大学院感染制御科学，2）
順天堂大学微生物学，3）TOTO

500 NB を用いて，規定濃度に希釈し試験菌液とした．

株式会社総合研究所― 47 ―

環境感染誌

Vol. 33 no. 2, 2018
7．PCR-based ORF Typing（POT）法によるタイピ4．混釈培養法による菌数測定

ング

菌液をミキサーでよく攪拌後に 10 倍希釈系列を作製し，標準寒天培地で混釈後，35±1℃ で 48 時間培養し1）遺伝子抽出と遺伝子増幅法

た．培養後，原則として 30〜300 cfu/シャーレの集落がシカジーニアスⓇDNA 抽出試薬（関東化学株式会社，出現した希釈系列のコロニー数を計測した．

東京）を用いて緑膿菌臨床分離株及び環境分離株の遺伝5．緑膿菌増殖試験方法

子抽出を行った．緑膿菌用シカジーニアスⓇ分子疫学解JIS Z2801 抗菌加工製品―抗菌性試験方法４）に準拠し

析 POT キット（関東化学，東京）を用いて PCR を行った．て増殖を観察した．
1）試験片の清浄化

2）アガロースゲル電気泳動

5 cm 角の ABS プレートを，99% エタノールを吸収

1×TBE 緩衝液を用いた 4% アガロースゲルを用いて，させた脱脂綿で軽く 2〜3 回拭いた後，十分乾燥し試験

120 V で約 1 時間電気泳動を行った．その後，臭化エチ片とした．

ジウム溶液に 30 分浸漬後，UV トランスイルミネーター下でゲルの写真撮影を行った．

2）菌液の接種約 104 cfu/mL に調製した試験菌液をピペットで試験

3）POT 型の決定

片 1 枚当たり 300 μL 接種した．ピンセットを用いて 4電気泳動後のバンドパターンから，緑膿菌用シカジー

cm 角ストマッカーフィルムをのせ，試験菌液がフィル

ニアス分子疫学解析 POT キット（関東化学）の取扱説

ム全体に行きわたるようにピンセットで軽く押さえつけ明書に従い POT 型を決定した．

た後，培養した．
結3）培養

果1．緑膿菌増殖試験

試験菌液を接種した試験片の入ったシャーレを 35℃

緑膿菌臨床分離株 44 株，緑膿菌環境分離株 8 株を，培±1℃，相対湿度 90% 以上で 4，8，12 時間培養した．
4）菌液の回収

養時間が 4，8，12 時間の時点で 10 倍あるいは 100 倍以規定時間培養後，試験片を滅菌済ストマッカー袋内に上（cfu/cm2）増殖した菌株の割合を示す（図 1）．

いれ，これにピペットで生理食塩水 9 mL を加え手で十臨床分離株は，4 時間では 10 倍以上増殖した株は 0%分にもみ，試験菌を洗い出した．洗い出し液の 1 mL 当（0/44 株）であった．8 時間では，増殖 10 倍未満の株がたりの菌数を混釈培養法により測定した．

89%（39/44 株），10 倍以上 100 倍未満増殖した株が 11%

6．中性電解水殺菌試験方法５）（5/44 株）であった．12 時間では，増殖 10 倍未満の株

1）中性電解水の調製が 43%（19/44 株），10 倍以上 100 倍未満増殖した株が実機カットモデル内の白金族系触媒をコーティングした次亜塩素酸生成電極を有する電解槽に，遊離残留塩素27%（12/44 株）となり，100 倍以上増殖した株が 34%（15/44 株）であった．

を除去した神奈川県茅ヶ崎市が供給する水道水（pH 7.5

一方環境分離株は，4 時間では 10 倍以上増殖した株±0.1 に調製）を通水し，中性電解水を生成した．実際は 0%（0/8 株）で あ っ た．8 時 間 で は，10 倍 以 上 100の温水洗浄便座では，水質，温度，使用期間等によって倍未満増殖した株が 13%（1/8 株）であった．12 時間生成される次亜塩素酸濃度は変動するが，本研究では 0.3

では，10 倍以上 100 倍未満増殖した株が 38%（3/8 株）mg/L，0.5 mg/L 及び 1.0 mg/L の中性電解水を生成しとなり，100 倍以上増殖した株が 63%（5/8 株）となった．

た．

2）菌液の接種2．中性電解水殺菌試験

約 107 cfu/mL に調整した試験菌液を，磁性スターラー

中性電解水での緑膿菌臨床分離株及び環境分離株の殺で攪拌している中性電解水 49.5 mL に 0.5 mL 接種した．

菌試験の結果を示す（図 2）．生菌数が 2 桁（cfu/ml）以3）菌液の回収上減少した場合に「除菌された」と定義し，各濃度での，5，30，60 秒反応させた後，10% チオ硫酸ナトリウム除菌に至らなかった株の割合を生存率として示した．

50 μL が入った滅菌シャーレに 1 mL 分取した．それと臨床分離株は，次亜塩素酸濃度が 0.3 mg/L において同時にさらに 1 mL を分取し，0.1% チオ硫酸ナトリウ

は，接触時間が 5 秒間では 2%（1/44 株），30 秒間ではムを含有した生理食塩水 9 mL に加えてよく撹拌した．

95%（42/44 株）の株が除菌された．また，0.5 mg/L にこの回収液の 1 mL 当たりの菌数を混釈培養法により測おいては，5 秒間で 68%（30/44 株），30 秒間では 100%定した．

（44/44 株）の株が除菌された．1.0 mg/L においては，5秒間で 100% の株が除菌された．
一方環境分離株は，次亜塩素酸濃度が 0.3 mg/L にお― 48 ―環境感染誌
(b)

(a)

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図 1 緑膿菌増殖試験結果
培養開始後の増殖の様子を経時的に示す．
（a）緑膿菌臨床分離株，（b）緑膿菌環境分離株
であり，増殖の程度は，■ 10 倍未満，■ 10 倍以上 100 倍未満，■ 100 倍以上で表記している．

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図 2 中性電解水による殺菌試験
中世電解水による除菌試験結果を示す．
（a）緑膿菌臨床分離株，（b）緑膿菌環境分離株であり，次亜塩素酸濃度はそれぞれ，■ 0.0mg/L， ■ 0.3mg/L， ■ 0.5mg/L， ■ 1.0mg/L で表記してある．

いては，接触時間 30 秒間で 100%（8/8 株）の株が除菌て同一の株が得られたのに対し，環境分離株（分離原 C）された．また，0.5 mg/L においては，5 秒間で 38%（3/では，13%（1/8 株）について同一の株が得られた．

8 株），30 秒間では 100%（8/8 株）の株が除菌された．1.0mg/L においては，5 秒間で 100%（8/8 株）の株が除菌考察
緑膿菌増殖試験において，緑膿菌臨床分離株と環境分された．
図 3 に次亜塩素酸濃度と接触時間を掛け合わせた値

離株を比較すると，培養時間 4 時間，8 時間では培養挙（以下 CT 値）と除菌可能な緑膿菌株の割合を示した．そ動に違いが見られなかったが，12 時間培養時点で増殖の結果から，CT 値がある一定以上を超えると急激に除一桁未満の株が，臨床分離株では 43%（19/44 株）であっ菌可能な株の割合が上昇し，約 0.07（mg・min/L）以たのに対し，環境分離株では 0%（0/8 株）であり，環上の時，除菌可能な株の割合が 90% を超えることが示

境分離株は臨床分離株と比べより多くの株で増殖するこされた．とが示された．本研究の試験条件が，栄養レベルを低く3．POT 法による遺伝子タイピング抑えた状態での，増殖挙動である．そのことから，人か

表 1 に臨床分離株及び環境分離株の同一 POT 型の検ら分離された臨床分離株と比較して，水まわり環境から出株数と，同一 POT 型の検出頻度を示した．POT1，分離された環境分離の方が低栄養条件において，増殖速POT2 ともに同一の値の場合同一の株とみなした．臨床度が早いことが示唆された．

分離株（分離原 E）では，36%（10/28 株）の株につい― 49 ―中性電解水殺菌試験では，次亜塩素酸の濃度が上がる

環境感染誌

Vol. 33 no. 2, 2018120

表1㝖⳦㐩ᡂᰴ⋡(%)

100
800.3mg/L

60

0.5mg/L
401mg/L200㻜㻜㻚㻞㻜㻚㻠

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図 3 次亜塩素酸濃度別の接触時間と除菌の程度
次亜塩素酸との接触時間と 2 桁以上の除菌を達成できた菌株の割合を次亜塩素酸濃度別に示す．次亜塩素酸は，◇ 0.3mg/L，〇0.5mg/L，△ 1.0mg/L で表記してある．

に従って除菌可能な株の割合が増えることが示されたが，緑膿菌環境分離株と臨床分離株では明確な違いは見られなかった．本研究のような水道水を電気分解して得られる低濃度の中性電解水においても，CT 値を規定値以上とすることによって，緑膿菌に対して除菌効果があると推察された．
一方で，POT 法を用いた遺伝子タイピングによる遺伝的多様性の検討では，緑膿菌臨床分離株は環境分離株と比べて同一株が検出される割合が高くなった．本研究で使用した環境分離株は 8 株と少ないため，明確な有意臨床分離株の同一 POT 型の検出株数を POT型別に表示する．

分離原

POT1

POT2

検出株数（株）

C
C
C
C
C，E
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
E
E
E
E
E
E
E

387
472
201
46105574
574
123
118
44575
383
314
9312554121415636
392
894
319
29453822389420689588739232016016160000004801600048004048184820481850322221111111111111111111111111

差は見られないものの，環境分離株の方が臨床分離株と比較して，遺伝的多様性が大きいことが示唆された．過Total

去の知見からも同じ病院内で分離された細菌と比較して，検出頻度は，総検体数に占める各 POT 型の割合である．
臨床分離株を分離原 C，環境分離株を分離原 Eとした．

市中で分離された細菌は遺伝的多様性が大きいとの報告がある５）．つまり当院においては，感染経路は特定でき36ないが，通院患者間で緑膿菌が水平伝播した可能性も否定できない．そのことから，中性電解水のノズル洗浄機
能を導入することで水平伝播のリスクを低減する効果が利益相反自己申告：あると考えられる．

伊丹愛子は TOTO 株式会社の社員である．
堀賢は TOTO 株式会社から研究資金援助を受けている．

結論
臨床分離株，環境分離株ともに培養時間 8 時間では，2文桁以上増殖した株が 0%（0/44 株，0/8 株）であったのに対し，培養時間 12 時間では，2 桁以上増殖した株が40% 以上（18/44 株，5/8 株）となった．以上から中性電解水での温水洗浄便座ノズルの洗浄間隔は，菌が 2 桁以上増殖する前の 8 時間以下とすることが望ましいと考えられた．
CT 値を 0.07 以上とすることで，除菌効果が得られた
ことから，適正な濃度と洗浄時間を設定することで，ノズルを除菌可能であることが示唆された．
― 50 ―

献1）石井克典，佐藤基和，梅本 渉，林 香里：トイレ機器の衛生管理に用いる水道電解水の水質安全性．機能水研究
2016; 12: 1-2.
2）日本機能水学会編，次亜塩素酸水生成装置に関する指針，第2 版―追補，機能水研究振興財団，2013.
3）桒原京子，左卉，堀賢：温水洗浄便座の洗浄ノズ
ルの除菌条件の検討．日本環境感染学会 2017; 32: 127-30.
4）日本工業標準調査会：抗菌加工製品―抗菌性試験方法・抗菌効果（Z2801）．日本工業規格.
5）児玉佑希子，渡辺瑞希，竹下朱美，小島栄一，庄野伸浩，森山康司：水道水の電解水による環境微生物の殺菌効果．防菌防黴 2011; 39: 279-83.

環境感染誌
6）Grundmann H, Hori S, Tanner G: Determining ConfidenceIntervals When Measuring Genetic Diversity and the Discriminatory Abilities of Typing Methods for Microorganisms. Journal of clinical microbiology 2001; 39: 4190-2.

Vol. 33 no. 2, 2018〔連絡先：〒253-8577 神奈川県茅ヶ崎市本村 2-8-1
TOTO 株式会社総合研究所分析技術第一 G
E-mail: aiko.itami@jp.toto.com〕

伊丹愛子

Eradication Effect of Electrolyzed Hypochlorous Acid Water Produced byElectronic Bidet Toilet Seat System against Pseudomonas aeruginosa
Aiko ITAMI1,3）, Kyoko KUWAHARA2）and Satoshi HORI1）
1）Department of Infection Control Science, Graduate School of Medicine, Juntendo University,2）
Department of Microbiology, School of Medicine, Juntendo University, 3）Department of Research Institute, TOTO LTD.

Abstract
In recent years, specifications with more stringent hygienic requirements have been neededfor toilet seats with electronic bidet sprayers to prevent their contamination and transmission ofpathogens responsible for healthcare-associated infections. Some of the latest models of bidet toilet seats are designed to electrolyze tap water and produce hypochlorous acid water (neutralelectrolyzed water) to cleanse the spray nozzles１，２）. This study was performed to clarify the optimal conditions of nozzle cleansing eradication of bacteria effect with low-concentration neutralelectrolyzed water using clinical and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa as acommon pathogen causing healthcare-associated infection. Exposure to neutral electrolyzed
water having a chlorine concentration of 0.5 mg/L for 30 s or longer, or of 1.0 mg/L for 5 s orlonger, led to a 2-log or more decrease in the level of P. aeruginosa for 90% or more of thestrains of both clinical and environmental isolates, thereby demonstrating the eradication of bacteria effect. The results suggest that, for eradication of bacteria against P. aeruginosa , neutralelectrolyzed water is effective even at low concentrations, provided that the exposure time andintervals are optimized.
Key words: electronic bidet toilet seat, Pseudomonas aeruginosa , neutral electrolyzed water,
eradication of bacteria― 51 ―