皮膚細胞ゲノムのメチル化測定による加齢マーカーの開発
東海大学医学部

今西規

With the aim of developing molecular markers that can be applied to quantitatively assess skin cell ageing, we planned
to carry out genomic analysis of skin epidermal cells sampled from a large number of subjects. Here we focused on the'epigenetic clock', a method to estimate human ages based on methylation status of the genomes. Although various epigenetic
clocks have been developed for various organs for people in Western countries, these are expected to have large errors if
applied to the Japanese skin data. So, it is necessary to collect original epigenetic data and develop a formula for estimating
ages suitable for Japanese skin tissue. The resulting age estimator is expected to be of use not only in the cosmetology
field, but also in various fields such as forensic medicine and physical anthropology. As this study has been significantly
delayed from its original plan and is still ongoing, the main results of the study will be published elsewhere in the future. In
this paper, we present the results of verification experiments on each technical element that was required to complete thisresearch. Specifically, we report the evaluation of sampling methods that allow samples to be taken without contact between
the subject and the experimenter, a comparison of the collection efficiency of five different sample types, and the results oftrial measurements of bacterial flora that is possibly associated with aging. After several trial experiments, we have achieved
a situation where we can use these technologies consistently. The collection and analysis of samples for this study iscurrently underway. In the near future, the main objective of this study -the development of ageing markers for skin- shouldbe achieved.

１．緒

第二に、メチル化年齢の推定式は主に欧米人のデータを使言って作成されたため、日本人にもそのまま適用できるのか

1 . 1 . 研究の背景と目的どうかは十分に検証されていない。そこで本研究では、でヒトゲノムのメチル化とは、CpG 配列の C（シトシン）きるだけ低コストの実験手法で、かつ正確な年齢推定がでにメチル基（-CH 3）が付加される反応である。遺伝子領きる新しい方法の開発をめざしている。さらに、この手法

域のメチル化は遺伝子発現制御のための重要な機構のひとを日本人の皮膚試料に適用し、予測精度の検証と新たな年つである。メチル化の状態はヒトの発生初期にリセットさ齢推定式の開発を行うことをめざしている。

れ、その後は加齢とともに徐々に変化するが、一部のサイ皮膚の加齢に関する新たな分子マーカーを開発すること

トは年齢に正確に比例してメチル化度（メチル化を受けたは、コスメトロジー分野の発展のために必要である。コスDNA の割合）が増加または減少する。このことを利用して、メトロジー分野にはアンチエイジング効果を謳う化粧品やヒトゲノム上の CpG サイト 353 ヶ所のメチル化度からヒサプリメント食品が数多くあるが、その科学的なエビデントの年齢を推定する手法が開発された 1）。2018 年には皮スは明確でないことが多い。本研究により皮膚の加齢分子膚や血液などの組織を対象とした改良版のメチル化年齢推マーカーを確立することができれば、アンチエイジング効定法が提唱され、予測精度が向上した 。このメチル化年果を客観的に評価できるようになり、分野の発展に大きく齢（DNA methylation age）は加齢の分子マーカーとして貢献できると期待される。

2）

脚光を浴びており、各種疾患との関連や再生医療・加齢研究などへの応用について現在も精力的に研究が行われてい1 . 2 . 検証実験の目的る。

本研究では皮膚の加齢マーカーを作ることを目的として、一方で、この手法には欠点もある。第一に、多数の CpG多くの被験者から試料を採取する計画である。しかし、開サイトのメチル化度を測るためにはメチル化測定用アレイ

発する年齢推定法は将来的に法医学分野で広く活用できるを用いた実験が必要であり、実験のコストが非常に高い。

ことが望ましいので、皮膚だけでなく他の非侵襲的に採取できる試料についても、可能な範囲で同時に試料を収集することにした。そこで本研究では、皮膚表皮細胞に加えてDevelopment of molecular marker foraging based on epigenetic changes ofskin cells

爪、毛髪、唾液、口腔内粘膜について実際のサンプリングを行い、DNA 抽出効率の検証を行う。また、本研究では、
新型コロナウイルス感染症の流行が完全に終息していない

Tadashi Imanishi

状況下で、感染事故を決して起こさないような安全な方

Tokai University School of Medicine

式で試料採取を行うことが必要とされた。そのため、実験− 82 −

皮膚細胞ゲノムのメチル化測定による加齢マーカーの開発者が接触せず、被験者自身で採取を行うことを前提として、の右頬内側および左頬内側を各 50 回ずつこすり、キット試料の採取方法を作成することにした。に添付のチューブに格納して実験者に渡す方法をとった。

本研究の後半部分では、皮膚の表皮細胞のメチル化年齢

その後は Isohelix Buccalfix Plus DNA Isolation Kit（BFP-を推定するとともに、同じ被験者の皮膚細菌叢を調べる計

50、Isohelix 社）を用いて、製造者の提供するプロトコルに画である。メチル化年齢はさまざまな疾患群で実年齢と大したがって DNA 抽出までの操作を行った。

きくずれることや、状況によってはメチル化年齢が加速する現象も知られている 3）。そこで、メチル化年齢と細菌叢

2 . 4 . 細菌叢解析の関連を明らかにすることを目的としている。ここでは方各試料から抽出した DNA に対して、細菌の 16 S rRNA法論が機能することを検証するための試験的な細菌叢解析

遺伝子のほぼ全長を増幅できるユニバーサルプライマーを行った。

S-D-Bact- 0008 -c-S- 20 お よ び S-D-Bact- 1391 -a-A- 17

２．方を用いて PCR を行った。このプライマーセットには実績法があり、20 種のバクテリアゲノムの混合物をほぼ均一の2 . 1 . 皮膚表皮細胞のサンプリングと DNA 抽出割合で検出することに成功している 5）。塩基配列の決定に既報 4）を参考に、表皮細胞のサンプリングには 2 種類のは MinION Mk 1 B（Oxford Nanopore Technologies 社、以方法を用いた。ひとつは市販の洗顔シート、もうひとつは下 ONT 社 ）を 使 い、 フ ロ ー セ ル に は Flow Cell R 9 . 4 . 1

エタノール消毒綿である。それぞれを使って、被験者自（FLO-MIN 106 D、ONT 社）を使用した。複数のサンプ身で皮膚の一定面積を拭っていただいた。この洗顔シール を 一 度 の ラ ン で 解 析 す る た め、Rapid Barcoding Kit

トまたはエタノール消毒綿を被験者自身で 15 mL 遠沈管（SQK-RBK 004、ONT 社 ）に よ っ て サ ン プ ル に バ ー コに入れた。その後、実験者側で蒸留水 4 mL を添加しボルードを付加しつつ塩基配列を決定した。得られたデータテックスで 20 秒混和したのち、30 分静置した。次にボルを MinION 専用のベースコーラーである Guppy version

テックスで 20 秒混和し、遠沈管内でシートを絞った。そ3 . 2 . 8（ONT 社）で塩基配列に変換した。個々の配列の種の後遠心条件 2000 G × 1 分間で遠心分離した後、上清を同定と集計には、クラウド上でメタゲノム解析ができる廃棄し沈降物のみを使用した。ここからの DNA 抽出には

EPI 2 ME（ONT 社）と GenomeSync-GSTK システム 6）を使QIAamp DNA Investigator Kit（QIAGEN 社）を使用し、用した。

製造者の提供するプロトコルにしたがって操作を行った。

３．結果毛 髪 に つ い て は 毛根あり、毛根なしの 2 種類 の 材 料

3 . 1 . 皮膚表皮細胞のサンプリングに関する条件検討を用意した。いずれも 1 cm の長さにそろえた。これを同一人物の顔の右頬と左頬から、2 種類の方法（A：市QIAamp DNA Investigator Kit を使用して、製造者の提販の洗顔シート、B：エタノール消毒綿）で皮膚表皮細胞供するプロトコルにしたがって DNA 抽出までの処理を行を採取した。いずれのサンプリング方法を用いても遠心後った。proteinase K による酵素処理のステップは、56 ℃での溶液は白濁し、沈殿物が認められた。つまり表皮細胞が3 時間に変更した。

採取できていることが確認できた。また、それぞれの最終

2 . 2 . 爪および毛髪のサンプリングと DNA 抽出

爪は「爪切り」で切り取り、組織破砕・細胞破砕などの的 な DNA 抽 出 量 は、A：0 . 144 ng/µL、B：0 . 374 ng/µL

特別な処理を行わずにそのまま、またはヤスリを用いて粉であった（表 1）。この結果から、いずれの方法でもゲノム末化して使用した。QIAamp DNA Investigator Kit を使解析に用いるには十分な DNA 量が得られるが、エタノー用して、製造者の提供するプロトコルにしたがって DNA

ル消毒綿を使用する方が効率的に DNA を回収できること抽出までの処理を行った。proteinase K による酵素処理のが判明した。

ステップは、目視により完全に溶けるまで行った。

表12 . 3 . 唾液および口腔内粘膜細胞のサンプリングとDNA 抽出唾 液 は 被 験 者 自 身 で 10 mL チ ュ ー ブ に 入 れ、 実 験 者に 渡 す 方 法 を と っ た。DNA 抽 出 に は QIAamp DNAInvestigator Kit を使用した。
口腔内粘膜細胞は、専用の綿棒（Isohelix Swab SK- 2 S、Isohelix 社）を用いて採取を行った。被験者自身で口腔内− 83 −

条件検討に用いたサンプルと DNA 収量（液量 50 µL）

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

3 . 2 . 毛髪および爪のサンプリングに関する条件検討ルでの分類が可能であった。なお、GenomeSync-GSTK

同 一 人 物 の 毛 髪 10 mm か ら の DNA 抽 出 を 試 み た。

る結果が得られた。皮膚の細菌叢解析では、皮膚の常在proteinase K による酵素処理のステップでは、毛根を含菌 と し て 知 ら れ て い る 表 皮 ブ ド ウ 球 菌（Staphylococcus

む毛髪（サンプル C）と毛根を含まない毛髪（サンプル D）

epidermidis）やアクネ菌（Cutibacterium acnes）などが検のいずれのサンプルも 3 時間のインキュベーションで全出された。唾液の細菌叢解析では、口腔内の常在菌であるて溶け切っていた。それぞれからの DNA 回収量は、C：

Streptococcus salivarius をはじめとする Streptococcus 属

システムを用いた細菌叢の解析でも、EPI 2 ME と一致す

0 . 1950 ng/µL、D：0 . 0079 ng/µL で あ った（表 1）。両者には 25 倍の差がある。毛根があれば数本で十分な DNA を回収できるのに対し、毛根がない場合はかなりの長さあるいは多くの本数が必要と考えられた。
左手の第一指（親指）から爪を切りそのまま使用したもの（サンプル E、8 mg）と、爪を粉末化したもの（サンプル F、2 mg）について、DNA 抽出を行った。そのまま使用したサンプル E は 24 時間の酵素処理で半分ほど溶け残っていたのに対し、粉末化したサンプル F は 3 時間で完全に溶けていた。抽出された DNA 量はサンプル E では 1 . 12 ng/µL であったのに対し、サンプ
ル F では 0 . 0911 ng/µL であり、収量には10 倍以上の差があった（表 1）。いずれの方法でも解析に十分な量の DNA が得られるが、酵素処理時間は overnight とすることが望ましいと考えられた。

図1

皮膚細菌叢の解析例。検出された主要な細菌を種レベルで表示した。

図2

唾液細菌叢の解析例。検出された主要な細菌を種レベルで表示した。

3 . 3 . 唾液および口腔内粘膜細胞のサンプリングと細菌叢解析に関する条件検討
試験的に唾液と口腔内粘膜細胞の採取を行い、さらに DNA 抽出を行ったところ、いずれも高濃度で DNA が抽出できることを確認した。

3 . 4 . 細菌叢解析の試験的実施
皮膚と唾液から抽出した DNA について、細菌叢解析を試験的に実施した。塩基配列決定は問題なく実行できたが、ライブラリとして使用した DNA 量を少量に制限したため得られた read 数は皮膚が 12 本、唾液が 339 本であった。それぞれの塩基配列データを EPI 2 ME ソフトウエアによって種同定し、生物種の系統樹とともに表示した（図 1 および図 2）。塩基配列決定に使用した DNA シークエンサーがロングリードを決定できるタイプであるため、種レベ− 84 −

皮膚細胞ゲノムのメチル化測定による加齢マーカーの開発の細菌が優勢であった。また、皮膚細菌叢と比較すると大海大学医学部臨床研究審査会の承認を受けて、解析が進行きな多様性を持つことも示唆された。以上の結果から、皮中である。試料としては、さまざまな年代の日本人 280 名

膚および唾液（口腔内）の細菌叢に関するデータを問題なの血液由来 DNA を取得している。また、20 代から 70 代く取得できることを確認できた。のボランティア 48 名から皮膚表皮細胞、唾液、口腔内粘４．考

膜細胞を収集する予定である。以上の試料について、ゲノ察

ムのメチル化状態を測定する計画である。本稿で述べた

4 . 1 . 方法論の検証結果についてように、サンプリングと DNA 抽出までの段階については冒頭でも述べたように、本研究は皮膚表皮細胞をターゲ検証実験は完了した。ゲノム解析の方法は基本的には解析ットとしたメチル化年齢推定法の開発を目的としている。

キットを利用しつつ bisulfite sequencing によって行うが、しかし、他の部位についても同時に試料を得ることが望ま

target capture 技術を活用して目的とする CpG サイトを濃しい。そこで、どの試料が効率的に採取可能であるかを検縮することで、効率的にゲノム解析を実施する方針である。

討するために検証実験を行った次第である。まず、皮膚表

そして得られた配列データは計算機で解析し、メチル化さ皮細胞のサンプリングについては問題なく実施できることれた DNA 分子の割合を求める。以上のデータをそろえたを確認できた。メチル化状態の測定と細菌叢の解析のいずら、次は機械学習により皮膚の年齢推定式を得る。このたれの目的に対しても、必要な DNA 量を取得することがでめのプログラムはすでに準備ができており、問題なく実行きると考えられた。一方、毛髪については DNA の収量にできる見通しである。以上の研究が順調に進めば、近い将問題があった。また、十分な DNA 量を確保するためには来に皮膚の加齢マーカーについて発表できる状況になるで毛根を含めることが望ましいが、毛根を含む毛髪を採取すあろう。

るには軽微な侵襲が伴う。特に高齢者や女性などでは心理的な抵抗が強いと予想され、被験者の同意を得ることがや（引用文献）や難しいと考えられた。そして爪については、採取も容易

1） Horvath S. DNA methylation age of human tissues

で十分な量の DNA を回収可能であるが、試料採取後の処and cell types. Genome Biology 14（10）:R115. 2013.

理に時間と手間がかかることが問題である。しかも、爪は

2） Horvath S, Oshima J, Martin GM, et al. Epigenetic

組織学的には皮膚の一部であるとみなすことができるので、clock for skin and blood cells applied to Hutchinson

皮膚とほぼ同じ結果になる可能性もある。そのため優先順

Gilford Progeria Syndrome and ex vivo studies. Aging
10（7）:1758-1775. 2018.

位的には低く設定すべきであろうと判断した。以上の考察から、結論としては、本研究では皮膚表皮細胞に加えて唾

3） Onizuka M, Imanishi T, Harada K, Aoyama Y,液と口腔内粘膜細胞を採取することが望ましいと考えた。

Amaki J, et al. Donor cord blood aging accelerates in

これまでに、皮膚の加齢変化と細菌叢の間には「相関」

recipients after transplantation. Scientific Reports 13があるという報告がなされている。しかし、両者の因果関（1）: 2603. 2023.

係を証明した研究はない。細菌叢は皮膚の水分量や皮脂量

4） Bjerre RD, Hugerth LW, Boulund F, et al. Effects ofなどの物理化学的要因によって影響を受けると考えられる

sampling strategy and DNA extraction on human skin

ので、皮膚の加齢変化と細菌叢の両方に影響する交絡因子

microbiome investigations. Scientific Reports 9（1）:17287. 2019.

が存在することも、十分に考えられる。一方で私は、両者の関係については、細菌叢が原因で皮膚が老化したのでは

5） Mitsuhashi S, Kryukov K, Nakagawa S, Takeuchi

なく、皮膚細胞の老化が原因で細菌叢が変化したのだと予JS, Shiraishi Y, Asano K, and Imanishi T. A portable

想している。この仮説を証明するためには、メチル化年齢

system for rapid bacterial composition analysis using

推定法を用いた皮膚細胞の老化状態の評価が決定的な役割

a nanopore-based sequencer and laptop computer.

を果たすであろう。さらには皮膚だけではなく、口腔内でScientific Reports 7: 5657. 2017.

も同様の現象が観察される可能性がある。本領域の今後の6） Kryukov K, Imanishi T, and Nakagawa S. Nanopore
sequencing data analysis of 16S rRNA genes using the

研究成果に期待したい。

GenomeSync-GSTK system. Methods in Molecular

4 . 2 . 本研究のこれから

Biology 2632:215-226. 2023.

最後に本研究の今後について述べる。本研究はすでに東− 85 −