全光学的手法を用いた老化皮膚における力学特性変化の解析
徳島大学ポストLEDフォトニクス研究所

長谷栄治

Extracellular matrices such as collagen and elastin are important factors that determine the mechanical properties of theskin. Therefore, to analyze the mechanical properties of the skin, it is desirable to visualize their distribution and measure
the mechanical properties at those locations. In response to this need, we developed a new all-optical multimodal imaging
technique that combines nonlinear optical microscopy with Brillouin scattering microscopy. This novel imaging techniqueallows for the simultaneous visualization of three key microscale information, such as collagen, elastin, and elastic modulus,within the same field of view. This approach not only facilitates a detailed understanding of the structural and mechanicalaspects of skin but also enhances our ability to assess how these properties change in various conditions, including aging.
Such insights are vital for advancing our knowledge of skin biology and could lead to improved strategies for diagnosing
and treating skin disorders.

１．緒とブリルアン散乱顕微鏡を融合した新たなマルチモーダル

言

光学顕微鏡を開発し，老化皮膚の詳細な力学の可視化を目

皮膚の老化とは，皮膚を構成している個々の細胞の機能指す．非線形光学顕微鏡では，SHG（第 2 高調波発生）光低下であり，表皮，真皮やその結合部，附属器の機能低下と 2 光子蛍光という 2 つの非線形光学現象を画像コントラに加え，形態に異常が出ることと定義できる．代表的な症ストとしたイメージングがかねてより皮膚科学・皮膚計測状として，シワ・タルミの形成やハリの不足，乾燥，疾患の分野において着目されている 1）．SHG ではコラーゲン分（色素異常，血管異常，脂腺異常）等が挙げられる．ここで，子の構造に由来する固有の 2 次非線形感受率を利用し，2

シワ・タルミ・ハリという老化による皮膚の外観変化に着光子蛍光ではエラスチン分子の自家蛍光特性をそれぞれ利目すると，これらは皮膚の力学特性の変化が強く影響する用することで，真皮層を構成する主要な細胞外マトリックものである．したがって，これらの形成や不足のメカニズスを選択的に可視化することが可能となる．また，光の音ムを調査する，あるいはそれらを抑制・軽減する方法を検波による非弾性散乱現象を用いたブリルアン散乱顕微鏡で討する上では，皮膚の力学特性を詳細に計測する手法が望は，その散乱光スペクトルから測定対象の粘弾性情報を得まれる．皮膚の真皮層は，皮膚全体の厚さの大部分を占められることから近年バイオイメージング分野で注目されてており，真皮層の約 70 wt％は細胞外マトリックスであるいる 2）．本研究ではこれらのモダリティを融合し，コラーコラーゲンが占める．したがって，このコラーゲンの分布

ゲン・エラスチンの選択的観察を行って皮膚力学特性に大や配向，線維の太さは，皮膚の力学特性を決定する上で極きく寄与する 2 つの物質の情報を得た後，ブリルアン散乱めて重要な役割を担っている．老化皮膚においては，内因顕微鏡により同一位置の粘弾性率を測定する．これらの計性の自然老化によりコラーゲンが変性・消失する上，外因測を若年皮膚および老化皮膚に対して行い，両者の比較か性の老化である光老化では，弾性線維であるエラスチンのら老化皮膚における力学特性変化の原因となる構造や物質蓄積・変性が起こる．これらのことから，老化皮膚の力学の同定を行うことを研究の最終目標とする．本研究ではそ特性を詳細に調査するためには，直径数 µm 程度のコラーの前段階として非線形光学顕微鏡とブリルアン散乱顕微鏡

ゲン線維およびエラスチン線維の分布やその状態を高空間それぞれを独立に開発し，正常な皮膚組織における同一箇分解で把握した上で，その位置における力学特性を同様に所のマルチモーダルイメージングを行った結果について報

高空間分解で計測することが望まれる．

告する．

そこで本研究では，非線形光学顕微鏡（多光子顕微鏡）

2．方法

非線形光学顕微鏡とブリルアン散乱顕微鏡から成るマAll-Optical Analysis of Mechanical
Properties in Aged Skin
Eiji Hase
I n st it ut e of Po st-L E D Phot on ic s ,Tokushima University

ルチモーダル光学顕微鏡の開発の前段階として，それぞれの顕微鏡を独立に構築して同一試料のイメージングを行う．図 1（a）に開発した顕微鏡装置の概略図を示す．はじめに，非線形光学顕微鏡の光源として波長可変のフェムト秒パラメトリック光発振器を用いた（中心波長可変幅− 131 −コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

= 680 - 1300 nm，パルス幅 = 120 fs，パルス繰り返し周波測される．また，2 光子自家蛍光の計測に関しては反射配数 = 80 MHz）．エラスチンからの 2 光子自家蛍光を取得す

置を用いて計測した．サンプルから発生した 2 光子自家蛍ることを考慮し，レーザー中心波長は 800 nm に設定した．

光は，入射側と同じ対物レンズによって集められ，同一光

レーザー光は 1 / 2 波長板（HWP）と偏光子（P）から成る路を逆方向に伝播した後，SHG 光検出側と同様にダイク出力調整器を経た後，SHG 光の偏光依存性をキャンセル

ロイックミラーと光バンドパスフィルター（透過波長中心するため 1 / 4 波長板（HWP）により円偏光となるよう設

450 nm，透過幅 40 nm）でレーザー基本波成分を除去した

定した．レーザー光の焦点は，ガルバノミラー（GM），リ後，パルスカウンターに接続されたフォトンカウンティン

レーレンズ，対物レンズ（OL）によりサンプル上で 2 次元グ型光電子増倍管によって光強度を計測する．上記セットスキャンされる．焦点において発生した前方透過 SHG 光アップを用いることで，サブ秒〜数秒程度で数百 µm 四方成分は，コンデンサーレンズにより集められ，ダイクロの視野における SHG および 2 光子蛍光強度分布をサブ µm

イックミラーおよび光バンドパスフィルター（透過波長中程度の空間分解能で画像化できる．

心 400 nm，透過幅 10 nm）でレーザー基本波成分を除去し次 に， 図 1（b）に 構 築 し た ブ リ ル ア ン 散 乱 顕 微 鏡 のた後，パルスカウンターに接続されたフォトンカウンティセットアップを示す．光源には波長 532 nm の狭線幅かング型光電子増倍管（PC-PMT）によってその光強度が計つ単一モード発振の半導体レーザー励起固体レーザー

図１ 構築した実験装置の概略図（a）非線形光学顕微鏡（SHG および 2 光子蛍光），（b）ブリルアン散乱顕微鏡− 132 −全光学的手法を用いた老化皮膚における力学特性変化の解析（DPSSlaser）を用いた．レーザー光はレーザー共振器への料の大部分は水分であること，また，たんぱく質など特定戻り光を除去するためのアイソレーターを通過した後，その物質においては式（1），（2）において屈折率と密度の増のビーム径が拡大され，出力調整される．レーザー光は対減が打ち消し合うことから，この周波数シフトの測定から物レンズによってサンプルに集光され，発生したブリル対象のばね定数に関する情報を得ることが可能となる．

アン散乱光は入射側と同じ対物レンズによって集められまた，測定試料としては，関連するすべての法律 , 倫理る．この際に集められた反射光には，その大部分を占める規定 , 規制を遵守し，Obio, LLC より提供された健康な白弾性散乱成分であるレイリー散乱光と，典型的にはそれよ

人女性の正常な腹部皮膚をミクロトームで厚さ 8 μm の凍り 6 〜 8 桁程度光強度が低いブリルアン散乱光成分が含ま結切片に切り分けた皮膚切片を用いた．測定の際には PBSれている．次に，入射側光路を逆方向に伝播し，1 / 4 波長（リン酸緩衝生理食塩水）を試料切片に滴下し，ウェット板と偏光ビームスプリッター（PBS）により反射光成分をな状態で測定した．

分岐する．分岐された光は対物レンズによりシングルモー

３．結果と考察ドファイバー（SMF）に入射され，自作のタンデム VIPA（virtuallyimagedphasedarray）型の分光計に入射する 3）．

3 . 1．皮膚断面切片のブリルアンイメージング

VIPA は傾けたファブリ・ペローエタロンと考えることがこれまでに，SHG および 2 光子蛍光を用いた皮膚試料でき，回折格子に比べて高いスペクトル分解能を持つ一の観察に関する様々な研究が行われており，コラーゲン・方，その自由スペクトル範囲（FSR）は回折格子に比べてエラスチン分布の選択的観察ができる特徴の有用性が ex

狭く，典型的な製品では数十 GHz 程度である．一方，生vivo，in vivo の両面から確認されている．一方，ブリル体試料からのブリルアン散乱による光周波数シフトは可視

アン散乱顕微鏡による生体試料の観察については，その光を用いた場合，典型的に数 GHz から十数 GHz 程度であ大部分が胚や in vitro 培養細胞における観察への応用であることから，これを分光するために適切な素子となる．通り，皮膚組織の観察に用いられた例はほとんどない．そこ常，VIPA には線状に集光したレーザー光を入射させ，対で，準備実験としてブリルアン散乱顕微鏡を用いた皮膚向する反射面により波長に応じて背面から異なる出力角を断面切片の観察を実施した．図 2 に実験結果を示す．図 2持つ複数のビームが生じる．また，前述のようにレイリー（a）および（b）は皮膚断面切片の明視野像であり，画像上散乱に対して極めて弱いブリルアン散乱光の検出において方向が表皮側である．図 2（b）の拡大像において，表皮かSN 比（信号対雑音比）あるいは SB 比（信号対背景比）をよら真皮の範囲の皮膚組織が視野内に存在していることがわく測定するため，VIPA のタンデム型直交配置やスリット，かる．次に，図 2（c）は図 2（b）中の赤破線枠の領域をブリヨフィルターなどの空間マスク・フィルターを設置してリルアン散乱顕微鏡で測定し，各点のブリルアンスペクトいる．このような分光計により空間分散された後方散乱光

ルからブリルアン散乱の周波数シフト量を非線形カーブフ

スペクトルは高感度な電子増倍 CCD カメラ（EMCCD）にィットで得た後，その値をプロットしたブリルアンシフトよって計測される．この計測について顕微鏡 XY ステージ画像である．現状の装置では 1 点（1 ピクセル）あたりにを走査しながら行うことで，2 次元イメージングを行った．

露光時間とステージ移動時間を含めて数百 ms 程度要する

カメラの露光時間は 1 点（ピクセル）あたり 100 ms に設定ことから 60 μm* 150 µm の領域を 20 ピクセル * 50 ピクセルした．ここで，ブリルアン散乱光によるスペクトル解析でで粗く画像取得した．実際には NA= 0 . 7 の対物レンズをは，その光周波数シフトΩを測定する．

波長 532 nm にて用いているため焦点スポット径はサブ μmとなっていると考えられ，音響フォノンの平均自由行程も（1）

生体試料の場合はそれと同程度であることから，この条件

ここで，θは入射光と散乱光のなす角であり，今回用いは離散的な空間サンプリングとなっている．図から，表皮た反射配置の場合はθ = 180 ˚ となる．n は測定領域の屈折の角質層ではブリルアンシフトが高くなっており，顆粒層率であり，ω i は入射光の光周波数である．また，v は音速- 有棘層 - 基底層にかけてはシフト量が次第に減少していであり，このようにブリルアン散乱による周波数シフトはく様子が可視化されている．一方，真皮層では視野内にお幾何学的・光学的情報に加えて音響学的な情報が含まれていて最もブリルアンシフトが高くなっていることが確認でいる．ここで，音速 v は，きた．また，最上部の青色の部分は試料が存在しない箇所である．以上のような結果は，先行研究において原子間力（2）顕微鏡や超音波顕微鏡を用いた皮膚断層の弾性率イメージングを行った結果とよく一致していた 4 , 5）．そのため，ブと書ける．ρ は密度であり，M ’ は縦波弾性率と呼ばれる縦リルアンシフトイメージングで得られた結果についても，波音波の伝播に関係するばね定数である．ここで，生体試ブリルアンシフト量がその位置における弾性率に比例して− 133 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

図 2 皮膚断層切片のブリルアンイメージング結果（a）明視野像，（b）明視野拡大像，（c）ブリルアンシフト画像

図３ 皮膚断層切片のマルチモーダルイメージング結果（a）明視野像，（b）SHG（緑）および 2 光子蛍光（赤）画像，（c）2 光子蛍光画像，（d）SHG 画像，（e）ブリルアンシフト画像．

おり，ブリルアンシフト量を指標とすることで皮膚の弾性における SHG，2 光子蛍光およびブリルアンイメージング率分布の可視化に応用できることがわかった．

を行った．試料は先程と同様に皮膚断面切片を用いたが，コラーゲンおよびエラスチンの可視化のため真皮層に着目

3 . 2．真皮断面切片のマルチモーダル光学イメージ
ング（a）は皮膚切片の明視野画像であり，赤枠を SHG およびブリルアンシフトを用いた皮膚弾性率イメージングにお2 光子蛍光により非線形光学イメージングしたものが図 3

いてその有用性が確認できたので，同一の試料の同一箇所（b）である．画像視野は 137 µm 四方，画像サイズは 128してイメージングを行った．図 3 に実験結果を示す．図 3− 134 −全光学的手法を用いた老化皮膚における力学特性変化の解析

ピクセル四方である．疑似カラーとして SHG 強度を緑色，高く，かつ化粧品・薬品や美容器具開発といった皮膚老化２光子蛍光強度を赤色で重ねて表示している．どちらの現分野において有用であると考えられる．例えば，すでに知象でも線維状に存在するコラーゲン，エラスチンが高コンられているような老化によるコラーゲン・エラスチンの変トラストで可視化されていることがわかる．また，ブリル性・消失あるいは蓄積，真皮乳頭層の喪失といった形態学

アン散乱顕微鏡では図 3（b）中の白破線枠で囲った領域を的変化が，実際に局所的な力学特性にどのような影響を与イメージングし，ブリルアンシフトを解析して画像化した

えているのかを知ることができれば，適切な薬効を持ったものが図 3（e）である．ブリルアンイメージングは 50 µm

化粧品・薬品開発に応用できると考えられる．さらに，将四方領域を 50 ピクセル四方で取得した．また，比較のた来的には本手法を従来の力学特性計測手法と組み合わせれめ図 3（b）の同一領域における２光子蛍光，SHG 強度のば，ハリ・シワ・たるみといった老化に伴う外観のマクロ分布を別々に画像化したものを図 3（c）および（d）に示な変化が，コラーゲン・エラスチンといった個々の物質のす．SHG，2 光子蛍光，ブリルアンシフトの比較から，ブミクロな観点からどのような影響を受けているのか調査でリルアンシフトの大小はエラスチン（2 光子蛍光）分布よきると期待される．また，社会的な側面からは，少子高齢りもコラーゲン（SHG）分布を反映した分布となっている化が進むわが国において健康寿命の延伸，あるいは国際的ことが確認できる．実際に生体由来の単離したコラーゲンに評価の高いわが国のコスメトロジー産業の更なる振興におよびエラスチン線維それぞれを引張試験した先行研究で貢献するものと考えられる．

は，コラーゲンの弾性率がエラスチンの弾性率より典型的に 3 桁程度高い値であることが確認されている 6）．したが謝辞って，今回のイメージング領域におけるブリルアンシフト

本研究の実施にあたり，ご支援いただきました公益財団の変動はコラーゲンの持つ高い弾性率に起因する分布であ法人コーセーコスメトロジー研究財団様に深く感謝申し上ると考えられる．また，図 3（e）では 1 µm/pixel の高空間げます．

分解な計測によりブリルアンシフト画像において線維状の構造も確認できる．図 3（d）と（e）の比較により，これは（引用文献）

コラーゲン線維の存在を反映した分布となっていると考え

1） Campagnola PJ, Dong CY. Second harmonic

られ，組織中において直径数 µ ｍオーダーで存在するコラ

generation microscopy: principles and applications toーゲン線維の弾性率分布が高空間分解に可視化できたと考

disease diagnosis. Laser Photonics Rev. 5, 13-26, 2011.

えられる．以上のような結果から，SHG・2 光子蛍光・ブ2） Prevedel R, Diz-Muñoz A, Ruocco G, Antonacci

リルアン散乱を用いたマルチモーダルイメージングの皮膚G. Brillouin microscopy: an emerging tool for

計測における有用性が確認できた．

mechanobiology. Nat. Methods 16, 969-977, 2019.

４．総3） Scarcelli G, Yun SH. Confocal Brillouin microscopy

括for three-dimensional mechanical imaging. Nat.

本研究課題は，皮膚の力学特性を調査するための新規なPhotonics 2, 39-43, 2008.

光学顕微鏡の開発に関する研究内容である．これまで，皮4） Miura K, Yamashita K. Evaluation of aging, diabetes

膚の力学特性を測定する手法のほとんどは皮膚表面のみ

mellitus, and skin wounds by scanning acoustic（非 3 次元）の情報かつ低空間分解能でのマクロな測定でmicroscopy with protease digestion. Pathobiol. Agingあったことから，老化皮膚の力学特性変化に関する知見はAge Relat. Dis. 6, 1516072, 2018.

十分に蓄積されていない．特に，力学特性計測法の空間

5） Achterberg VF, Buscemi L, Diekmann H, Smith-

分解能あるいは画像視野の制限から，光学顕微鏡像で得らClerc J, Schwengler H, Meister JJ, Wenck H, Gallinat

れるような形態学的情報と力学特性とを適切に関連付ける

S, Hinz B. The nano-scale mechanical properties of

ことは困難であった．一方，申請研究では，全光学的手法

the extracellular matrix regulate dermal fibroblastの利用によりサブ µm 〜数 µm 程度の高空間分解能で同一function. J. Invest. Dermatol. 134, 1862-1872, 2014.

視野におけるコラーゲン・エラスチン・弾性率という 3 つ6） Muiznieks LD, Keeley FW. Molecular assembly andのミクロ情報の可視化に成功した．加えて，本手法は非mechanical properties of the extracellular matrix: A接触，ラベルフリーで分子選択的かつ外力の付与なく力学

fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica

特性が計測でき，さらに原理的には 3 次元空間の計測可能

Acta 1832, 866-875, 2013.

であることから，本研究で得られる知見の新規性は極めて− 135 −