バイオ技術最前線

バイオ技術最前線①

ゲノム編集技術を用いた有毒ステロイドグリコアルカロイド（SGA）低減ジャガイモの開発
澤井 学 、安齋 寛
1）2）1）国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 薬用植物資源研究センター
2）日本大学 生物資源科学部 くらしの生物学科 特任教授
1 ．SSR2遺伝子を標的としたTALENによるゲノム編
集ジャガイモの作出におけるホモログはコレステロール生合成に関わる還元酵素をコードしていることが知られている。筆者らはナス科

ジャガイモ（＝バレイショ）は三大穀物（トウモロコシ、植物であるジャガイモ、トマトのexpressed sequence tag

コムギ、イネ）に次いで世界で多く生産されている食用作（EST）データベースにはそれぞれ 2 つのDwf1ホモログ遺伝物である 。そんな主要食用作物であるジャガイモによる子cDNAがあることに気が付き、Sterol Side chain Reductase

食中毒が日本だけでもほぼ毎年の様に発生している 。こ（SSR）と名付けた。酵母異種発現系を用いたSSR酵素活

れはジャガイモを含むナス科植物にしばしば生成蓄積する性試験、RNAiによるSSR遺伝子発現抑制ジャガイモの作出

有毒なステロイドグリコアルカロイド（SGA）に起因すとその成分分析から、 2 つのSSRの内、主にSSR1が24-アる。SGAはコリンエステラーゼ阻害作用があり、副交感神

ルキルステロール生合成に寄与し、SSR2がコレステロー経を亢進させて、下痢や腹痛の症状を引き起こす 。ジャルならびにその代謝物であるSGA生合成に寄与しているこ

ガイモではα-ソラニン、α-チャコニンが主なSGAで（図とが明らかとなった。そこで、TALENを用いたゲノム編

1）、芽や緑色になった皮に比較的多く含まれる。SGAは集によるSSR2遺伝子破壊ジャガイモを試作した（図 2 ）。

コレステロールを生合成中間体とすることが知られていた

試作されたジャガイモは、見かけはもとのジャガイモと変が、動物の主要なステロールであるコレステロールは、植わらなかったが、SGA含量がもとのジャガイモの約1/10の物一般ではマイナーなステロールであり、植物におけるコ濃度にまで減少していた（図 3 ） 。なお、この試作当時

レステロールの生合成経路は明らかではなかった。高等植は、CRISPR-Cas9が発表されて間もなかったこともあって物ではカンペステロール、スチグマステロール、β-シト

ゲノム編集ツールとしてTALENを用いた。TALENのターゲステロールを代表とする24-アルキルステロールが主なスット配列の設計にはTAL Effector-Nucleotide Targeter 2.0

テロールであり、カンペステロールは植物ホルモンである

website（https://tale-nt.cac.cornell.edu） を利用した。まブラシノライドの生合成中間体である。アブラナ科シロイ

た、TALENの構築にはミネソタ大学VoytasのグループのヌナズナのDwf1遺伝子は24-アルキルステロール生合成にCermakらによるType IIS制限酵素を用いたDNA断片のア関わる還元酵素をコードしていると考えられており、動物

センブル法であるGolden Gate法

1）

2）

3）

図1

4）

5）

6 ，7 ）を応用した手法

8）がジャガイモ有毒SGAの構造

3バイオテクノロジスト図2

24-アルキルステロール生合成とSGA生合成経路の概略図のためのツールが植物細胞内で働くことで、ゲノムDNAが編集される。つまり、何らかの手段でゲノム編集のためのツールを植物細胞内で機能させる必要があり、それには遺伝子組換え技術がよく利用される。遺伝子組換え技術を用いてゲノム編集ツールを構成する遺伝子ら（以下ゲノム編集カセットと記載）をゲノムDNAに導入すると、導入されたゲノム編集カセットによってゲノム編集ツールが構成され、ゲノム上のターゲット遺伝子部分でゲノム編集が起こり、ゲノム編集植物が得られる。ジャガイモの遺伝子組換えではカルス化、再分化を伴うアグロバクテリウム法がよく用いられる。材料として利用できるジャガイモの部位はいくつかあるが、無菌培養でのカルス化、再分化を行うため、殺菌された材料を用いる。図 4 では無菌培養された植物体の茎を材料にしている。まず無菌培養された

10, 11）

ジャガイモ植物体の調製は、ジャガイモ塊茎を室温に置いて出芽させ（図 4 A）
、切り取った芽を70%エタノール、界図3

ゲノム編集によるジャガイモのSGA低減効果

面活性剤を加えた次亜塩素酸ナトリウム水溶液で殺菌し、滅菌水で繰り返しよくすすぎ、適切な植物組織培養用固形頻用されており、筆者らは共著者である広島大学の山本

培地に植え付けることで比較的容易に得ることができる

卓、佐久間哲史らによる改良法 を用いた。

（ただし、ウイルスフリーにするにはさらに成長点培養が9）必要である）。植え付けた芽は伸長して茎となり、葉が展

2 ．ジャガイモゲノム編集作業の概要

開し、発根する（図 4 B）
。頂芽を含む部分を切り取り、さて、ゲノム編集による有毒SGA低減ジャガイモの試作

新しい培地に植え付けると茎の切り口付近から発根し、生について述べたが、ここでジャガイモをゲノム編集する作長する。ただ、頂芽部分は 1 個体に 1 つであり、頂芽部分業の概要を紹介する。ジャガイモに限らず一般に植物のゲだけを新しい培地に植え付けていては、個体数は増加しなノム編集ではZFN、TALEN、CRISPR-Cas9などゲノム編集

い。腋芽を含む茎も新しい培地に植え付けると（図 4 C）、

4バイオ技術最前線
頂芽が無く頂芽優勢が起こらないため腋芽が生長し、新た集ツールが導入された遺伝子組換え植物でもある。ここな個体となり、植え付けた数だけ個体数が増加することにで、ゲノム編集カセットとゲノム編集を受けたターゲットなる。これを繰り返すことで無菌培養のジャガイモ植物体

遺伝子が異なる染色体に存在し、連鎖しなければ、メンデを維持、増殖でき、いつでもアグロバクテリウム法によるルの法則に従い、減数分裂でそれぞれ独立して配偶子に含遺伝子組換えに利用できる。さて、必要な数の無菌植物体

まれ、受精によって得られる種子の中には、ターゲット遺が用意できたら、腋芽を含まない様に茎の節間を切り出し伝子はゲノム編集されているがゲノム編集カセットを含ま（図 4 D）、ゲノム編集カセットを含む植物形質転換用ベない種子が存在する。すなわち遺伝子組換えではないゲノ

ク タ ー が 導 入 さ れ た ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム（Rhizobium

ム編集植物が得られることが期待できる（図 5 ）。しかし、radiobactor; 以下アグロバクテリウムと記載）の懸濁液をジャガイモの場合、塊茎で増殖するため普段は気に留めな付着させ、余分な菌液を滅菌したろ紙などで取り除いてかいが、男爵をはじめ雄性不稔な品種が多く、種子を得るのら抗生物質を含まない共存培地に静置する（図 4 E）。カが困難なことが多い。また、自家受粉ができて種子が得ら

ルス化用植物ホルモンならびにアグロバクテリウム除菌用れたとしても、そもそもジャガイモの品種はゲノムを構成す抗生物質（カルベニシリン、セフォタキシム、メロペネム

る遺伝子全てが必ずしもホモでなくヘテロ、すなわち純系など）の入った培地に静置する。茎切片の一部が脱分化ではなく雑種なことが多く、男爵の子供は男爵では無いこ（＝ カルス化）後、カルス付き茎切片をシュート誘導用とが大いに起こり得る。これではゲノム編集できても元の品植物ホルモンならびにアグロバクテリウム除菌用の抗生物種のジャガイモとして優れた特性を維持できない可能性が質の入った培地へ移す。カルスが再分化し、シュートが見ある。さらに、図 5 は簡略化のため二倍体で両相同染色体られたら（図 4 F）
、カルス（茎切片）からシュートを切りにゲノム編集が起こったことを想定して描いたが、男爵を出し、植物ホルモン無添加（必要なら発根誘導用植物ホルはじめ多くのジャガイモ品種は四倍体であるため、事態はモン入り）、アグロバクテリウム除菌用の抗生物質入り培より複雑である。そこで遺伝子組換えを回避する一つの手地に植え付ける（図 4 G）
。しばらくすると発根、生長し、法を考案した。

再分化植物体が得られる（図 4 H）
。ゲノム編集されていアグロバクテリウム法による遺伝子組換えでは、アグロるか再分化植物体のゲノムDNAのゲノム編集でターゲッバクテリウム感染からゲノムDNAに遺伝子導入が起こるトにした遺伝子領域を調べる。ゲノム編集されたジャガイまでにタイムラグがあり、その間に導入する遺伝子が機能モが得られたら、多湿で無菌なin vitroの培養環境から外のする「一過的発現」が起こることが知られている。この一環境に徐々にならしてから（＝ 馴化）、通常の栽培に移行過的発現によって目的とするゲノム編集が起これば、これする。ただし、この時点ではゲノム編集カセットが導入さ以降、ゲノム編集ツールは不要なため、ゲノムDNAにゲれた遺伝子組換えジャガイモである可能性から、第二種使ノム編集カセットが導入される必要はない。植物の遺伝子用等の遺伝子組換えジャガイモとして取り扱う。なお、ジ組換えでは導入したい遺伝子と共に選択マーカーとして抗ャガイモの品種によって最適な各培地の組成、植物ホルモ生物質耐性遺伝子を導入することが多い。培地に抗生物質ンの種類、濃度は異なるため、事前に調査、検討することを添加し、抗生物質への耐性を指標に導入したい遺伝子とをすすめる。また、一般的に対象とする植物の種類によ共に抗生物質耐性遺伝子がゲノムDNAに導入された遺伝り、適したアグロバクテリウムの菌株が異なることもあ子組換え植物細胞を選抜する。これらのことを逆手に取っり、除菌に使用する抗生物質もアグロバクテリウムの株ごて、筆者らは、抗生物質による積極的な選抜を行わなけれとに適した種類、濃度があるため、こちらも事前に調査、ば、一過的発現によって目的とするゲノム編集は起こって検討が必要となる。

いるが、ゲノム編集カセットがゲノムDNAには導入されていないジャガイモが得られる可能性が高まることを期待

3 ．非遺伝子組換えゲノム編集ジャガイモを得るための 1 つの方法

し、遺伝子組換え植物細胞を選抜するための抗生物質を用いずに遺伝子解析でゲノム編集ジャガイモを選抜した。そ上述のカルス化、再分化を伴うアグロバクテリウム法との結果、ゲノム編集されているがゲノム編集カセットが検いった遺伝子組換え技術を用いてゲノムDNAに導入する出されない、つまり、遺伝子組換えにあたらないことが期と、導入された遺伝子らはゲノム編集ツールを構成し、ゲ待されるジャガイモを得ることに成功した 。残念ながらノム上のターゲット遺伝子部分でゲノム編集が起こり、ゲ筆者らの論文が発表される前に、他のグループが別の植物ノム編集植物が得られる。ただし、この段階ではゲノム編を用いた同様なアイデアの研究論文を発表していたため、

11）5

バイオテクノロジスト

図46ジャガイモゲノム編集作業の概要

バイオ技術最前線

図5

ゲノム編集カセットの除去の共物：ジャガイモ（https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakuni

著者である理研の梅基直行、斉藤和季は、イソペンテニル

tsuite/bunya/0000082078.html）（2022年10月30日閲覧）

トランスフェラーゼ（ipt）遺伝子を用いてゲノムへの挿入

3）Friedman, M.（2006）. Potato glycoalkaloids andが起こった場合、形態異常が発生する仕掛けを組み込んだ

metabolites: roles in the plant and in the diet. J. Agric.

世界初の試みにはならなかった 。なお、先の論文
12）

手法を開発している

4）。現在、SSR2遺伝子破壊ジャガイ

13）

モは国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構の隔離圃場にて栽培試験が行われている 。
14）

Food Chem. 54: 8655–8681.
4）Sawai, S., Ohyama, K., Yasumoto, S., Seki, H., Sakuma,T., Yamamoto, T., Takebayashi, Y., Kojima, M.,
Sakakibara, H., Aoki, T., Muranaka, T., Saito, K., andまとめ

Umemoto, N.（2014）. Sterol side chain reductase 2 is a

昨今話題のゲノム編集技術であるが、それを用いたゲノ

key enzyme in the biosynthesis of cholesterol, theム編集作物を作出するには、しばしば植物遺伝子組換え技

common precursor of toxic steroidal glycoalkaloids in術が用いられ、伝統的な植物組織培養技術がその基盤とな

potato. Plant Cell 26: 3763–3774.っている。植物組織培養では、扱う植物種はもちろん、品5）Doyle, E.L., Booher, N.J., Standage, D.S., Voytas, D.F.,

種、使用する部位、目的によって培地組成をはじめとするBrendel, V.P., Vandyk, J.K., and Bogdanove, A.J.（2012）.

培養条件が異なり、難易度もそれぞれで試行錯誤すること

TAL Effector-Nucleotide Targeter（TALE-NT）2.0: toolsとなる。近年ゲノム編集技術が広まったことをきっかけ

for TAL effector design and target prediction. Nucleicに、筆者ら植物科学者の中で植物組織培養技術の重要性がAcids Res. 40: W117–W122.

再認識された。また、このことを意識し、植物組織培養を

6）Engler, C., Kandzia, R., and Marillonnet, S.（2008）.A

テーマとしたシンポジウムも関連学会で開催されている。

one pot, one step, precision cloning method with highthroughput capability. PloS One, 3: e3647.

参考文献等

7）Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., and Marillonnet,

1）Food and Agriculture Organization（FAO）FAOSTATS.（2009）. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling

2020年データ（https://www.fao.org/faostat/en/#home）

method based on type IIs restriction enzymes. PloS

（2022年10月30日閲覧）

One, 4: e5553.

2）厚生労働省HP, 自然毒のリスクプロファイル：高等植

8）Cermak, T., Doyle, E.L., Christian, M., Wang, L., Zhang,

7

バイオテクノロジスト
Y., Schmidt, C., Baller, J.A., Somia, N.V., Bogdanove,

TALEN expression by Agrobacterium infection. Plant

A.J., & Voytas, D.F.（2011）. Ef ficient design andBiotech. 37: 205–211.

assembly of custom TALEN and other TAL effector-12）Chen, L., Li, W., Katin-Grazzini, L., Ding, J., Gu, X., Li,based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res.

Y., Gu, T., Wang, R., Lin, X., Deng, Z., McAvoy, R.J.,

39: e82.

Gmitter, F.G. Jr., Deng, Z., Zhao, Y., and Li, Y.（2018）.A9）Sakuma, T., Hosoi, S., Woltjen, K., Suzuki, K.,

method for the production and expedient screening ofKashiwagi, K., Wada, H., Ochiai, H., Miyamoto, T.,

CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants.

Kawai, N., Sasakura, Y., Matsuura, S., Okada, Y.,

Hortic. Res. 5: 13.

Kawahara, A., Hayashi, S., and Yamamoto, T.（2013）.

13）梅基直行, 斉藤和季, ゲノム編集植物の生産方法, 特願
2017-226643（WO2019/103034）

Efficient TALEN construction and evaluation methods
for human cell and animal applications. Genes to Cells

14）農研機構HP, 令和 4 年度 ステロイドグリコアルカロイ
ド低生産性バレイショ（ジャガイモ）の栽培状況（植18: 315–326.
10）新屋智崇, 松永悦子, ジャガイモの形質転換方法, 特願え付け（ 2 回目）の様子、 8 月30日、観音台第 3 事業
場組換え植物隔離ほ場（https://www.naro.go.jp/project/2009-168257（特開2011-19459）
11）Yasumoto, S., Sawai, S., Lee, H.J., Mizutani, M., Saito,K., Umemoto, N., and Muranaka, T.（2020）. Targeted

research_activities/laborator y/nias/154715.html）（2022年10月30日閲覧）

genome editing in tetraploid potato through transient◆著者紹介

澤井 学 Satoru Sawai

国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄

職務内容

養研究所 薬用植物資源研究センター 研・～ 2021年

医薬品、食品添加物原料

究員などとして用いられるマメ科カンゾウ

日本大学生物資源科学部非常勤講師の有用成分であるグリチルリチンの生

大阪大学招聘研究員（大学院工学研究科）

合成遺伝子探索やジャガイモ有毒ステロイドグリコアルカロイドの生合成遺学歴

伝子探索ならびにそれを標的としたゲ

2007年 日本大学大学院生物資源科学研

ノム編集による毒の少ないジャガイモ究科応用生命科学専攻博士課程修了の作出等に従事。

博士（生物資源科学）
職歴
2013年

独立行政法人 理化学研究所 環
国立大学法人 大阪大学大学院工学研究科 特任研究員（常勤）などを経て所属学会/その他
・日本植物バイオテクノロジー学会会員
・日本生薬学会会員
・日本植物細胞分子生物学会学生奨励賞受賞（2007年）

国立研究開発法人 医薬基盤・・TERPNET 2009（9th Inter national

健康・栄養研究所 薬用植物資源研究セ

Meeting: Biosynthesis and Function of

ンター 研究員（現在に至る）

Isoprenoids in Plants, Microorganisms

2019年 日本大学生物資源科学部非常勤and Parasites）, Good Presentation

講師（現在に至る）

Award 受賞（2009年）

2021年

2021年 大阪大学招聘研究員（大学院工学研究科）（現在に至る）・第 6 回 理 研 研 究 奨 励 賞（RIKEN The
6th Research Incentive Award） 受 賞（2015年）8

薬用植物資源の収集、保全、栽培試験、育種等に従事。

境資源科学研究センター 研究員
2015年

・2021年～

バイオ技術最前線
安齋 寛 Anzai Hiroshi

日本大学生物資源科学部くらしの生物学学会、日本応用動物昆虫学会、日本昆虫科 くらしのバイオ研究室 特任教授

学会、日本微生物生態学会
2006年 NPO法人日本バイオ技術教育学

学歴会理事に就任、副理事長を経て2019年か

東北大学1984大学院 農学研究科農芸化ら理事長

学博士後期単位取得満期退学
農学博士（東北大学）

コメント

経歴

日本大学農獣医学部水産学科の卒論で西1984年日本大学農獣医学部水産学科助手

澤一俊先生に師事し、多核性緑藻類オオ

2004年日本大学短期大学部農学科（生物ハネモのグルタミン酸脱水素酵素の研究資源学科）教授を行い、その後、東北大学農学部農芸化

2015日本大学生物資源科学部くらしの生学科農産利用学研究室で松田和雄先生に物学科くらしのバイオ研究室 教授師事。軟体動物タツナミガイのセルラー2021から、同 特任教授ゼの研究で学位を取得した。日本大学着

この間、2000年から日本大学大学院生物任後、日本大学短期大学部農学科の楠元

資源科学研究科生物資源利用科学専攻の守教授に師事し「植物細胞工学」と「植講師、教授を経て現在、特任教授を兼任

物細胞工学実験」を担当して、様々な植生物有機化学、生物工学、くらしのバイ物の組織培養に関する経験を積む。2002

オテクノロジー、バイオサイエンス実験

年からスタートした21世紀COEプログ等を担当

ラム（統括責任者 別府輝彦教授 2022年

所属学協会/その他度文化勲章受章）において、カブトムシ

日本農芸化学会、日本生物工学会、日本幼虫の腸内細菌叢の研究をスタートさせ生化学会、日本糖質学会、日本応用糖質る。この時、共著者の澤井 学氏とは同科学会、セルロース学会、マリンバイオじプロジェクトで研究をすることになっテクノロジー学会、日本水産学会、日本た。様々な研究テーマに取り組んだこと

水産増殖学会、日本生物教育学会、日本が、日本バイオ技術教育学会の仕事に役バイオ技術教育学会、日本環境動物昆虫立っている。

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