標本道場・ベテラン編

2024 年 2 月執筆

細胞診

朝日大学歯学部口腔病態医療学講座
口腔病理学分野

宮本 侑果
永山 元彦

1. はじめに - 口腔擦過細胞診について -口腔擦過細胞診標本を用いた電顕観察への応用

2. 病理診断における電子顕微鏡
3. ナノパーコレーターについて
4. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（SEM 編）

1．はじめに- 口腔擦過細胞診について -口腔がんは近年罹患者数が増え、その死亡者数も増加の一途を辿っている。しかし、病変が大きくなってからの手術による欠損は、舌をはじめと

5. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（TEM 編）する重要な機能を損ない、著しい QOL の低下にもかかわらず希少癌とし

6. 口腔扁平上皮癌細胞の電子顕微鏡学的所見症状があり、視診や触診で良性疾患と悪性疾患を鑑別することが困難な場

7. おわりにかの前駆疾患と呼ばれる口腔潜在的悪性疾患（Oral Potentially Malignantて扱われている。口腔は直視直達が可能な臓器であるものの、多彩な臨床合も多い。また、口腔がんは原則突如単発に発生するのではなく、何らDisorders: OPMDs）を経て悪性化することが知られているため、直視直達が可能な口腔において前駆疾患を含め早期発見・早期治療は患者 QOL 向上に極めて重要となる。
口腔擦過細胞診は、細胞診専用ブラシを用いて対象粘膜表面を擦過し特に重層扁平上皮細胞を採取する方法で、外科的侵襲を伴わず比較的簡便に行えるスクリーニング検査として注目されている。特に近年は LBC（液状化検体細胞診）が導入され、術者の技量に左右されず均一な標本作製が可能となった。また、標本作製後の残液を利用したホルマリン固定
パラフィン包埋（FFPE）検体のセルブロック標本を用いて免疫組織学的検索や遺伝子等の分子生物学的検索が可能となり、細胞学・細胞診断学の幅が広がりつつある。口腔擦過細胞診の判定は従来使用されていた子宮頸がんを基本とするパパニコロウ分類から2015年に新報告様式（4段階：NILM/LSIL/HSIL/SCC）へ改変され明確な診断基準が確立された。しかし、口腔がんは子宮頚がんとは異なり、表層分化型の高分化がんが多く、オレンジ G（OG）好染の表層細胞とライトグリーン（LG）好染の中層〜深層細胞からその多彩な形態的細胞異型の程度（異型の多様性）を判定する必要があるため（図 1）、口腔細胞診を難しいと感じている細胞検査士や細胞診専門医が多いのが実情である 1, 2）。これは口腔細胞診判定の精度向上を目的に、より詳細な形態学的・分子生物学的解析が求められていることに相違ない。

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口腔病理学分野

宮本 侑果
永山 元彦

1. はじめに - 口腔擦過細胞診について 2. 病理診断における電子顕微鏡
3. ナノパーコレーターについて
4. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（SEM 編）
5. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（TEM 編）
6. 口腔扁平上皮癌細胞の電子顕微鏡学的所見
7. おわりに

図 1 口腔扁平上皮癌にみられる異型細胞（Papanicolaou 染色）
A：ライトグリーン（LG）好染深層型異型細胞
B：オレンジ G（OG）好染表層異型細胞
C：奇怪な細胞①（カニバリズム像）
D：奇怪な細胞②（オタマジャクシ様形態）
スケールバー：50µm

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2．病理診断における電子顕微鏡
電子顕微鏡には走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope, SEM）と透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope, TEM）がある。
SEM は主に 2 次電子を活用して物体の表面から得た情報を像として 10 倍から 10 万倍以上に拡大する。近年では卓上型の低真空走査型電子顕微鏡（LV-SEM）の登場により、厚切りしたパラフィン包埋切片標本を金属薄膜蒸着することなく直接 SEM 観察することが可能となり、電子顕微鏡のパラダイムシフトが起こったと言っても過言ではない。
一方、TEM は高電圧で加速された電子線を試料に照射して、試料を透過した電子の干渉像を拡大して観察する。TEM は試料作製から観察まで複数の過程があるが、SEM よりもさらに高い倍率・分解能で対象試料の超微細構造を捉え、病的変化を追求できるため、病理診断等への貢献は大きい。近年の病理学・病理診断学では分子生物学的手法・解析が特に注目−2−copyright(C)2001Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. All rights reserved.

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口腔病理学分野

宮本 侑果
永山 元彦

1. はじめに - 口腔擦過細胞診について -されているものの、電子顕微鏡観察は形態の根本を捉えることができると

2. 病理診断における電子顕微鏡

本稿では、口腔擦過細胞材料を用いて電顕試料作製方法および電顕像と細3. ナノパーコレーターについて胞診でみられる所見について紹介する。

いう点で極めて意義の高い手法であるが、細胞診に用いられることはない。

4. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（SEM 編）

3．ナノパーコレーターについて

5. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（TEM 編）の遠心法による細胞回収に代わりフィルター吸引による濾過法としてナノ6. 口腔扁平上皮癌細胞の電子顕微鏡学的所見

は耐薬品性、耐熱性を備えたポリカーボネート性メンブレンフィルターを

7. おわりにLBC 検体から簡便に電顕標本作製〜観察まで応用できる方法にこれまでパーコレーター（JEOL）を活用することができる。ナノパーコレーターと採用したディスポーザブルタイプの SEM 専用試料台である。メンブレン
フィルターは膜厚 10µm、孔径 0.6µm で微小物や微粒子を捕捉し、SEM 観察から元素分析までその用途は多彩である。口腔擦過細胞診材料は婦人科細胞診のそれと比べて細胞採取量が圧倒的に少なくセルブロック標本作製
時に細胞のロスの為に十分な量の細胞を獲得できないことが多い。そこで効率よく細胞を回収する方法としてナノパーコレーターを用いた方法を紹介する。

図 2 ナノパーコレーター（JEOL）A： ナノパーコレーター（実物）
B： ナノパーコレーター使用（実際）：ナノパーコレーターをディスポーザブルタイプのシリンジに装着して使用する。

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1. はじめに - 口腔擦過細胞診について -4．ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（SEM 編）

2. 病理診断における電子顕微鏡
3. ナノパーコレーターについて
4. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（SEM 編）
5. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（TEM 編）
6. 口腔扁平上皮癌細胞の電子顕微鏡学的所見
7. おわりに

図 3 ナノパーコレーターを用いた SEM 用電顕試料作製方法の概略図

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口腔擦過細胞診材料を SEM 観察する場合は、採取した細胞を 2.5% グル
タールアルデヒド 0.1M リン酸緩衝液（pH7.0）内に懸濁し、遠心分離（1,500rpm、5 分間）を行い、上清液を捨て 0.1M リン酸塩緩衝液を加えて 3 回洗浄する。洗浄後、懸濁液をディスポーザブルタイプのシリンジに装着したナノパーコレーターのメンブレンフィルター上に滴下する。滴下後、シリンジを引きリン酸緩衝液の滴下と吸引の繰り返しで固定液を洗浄する。ナノパーコレーター上に残った細胞をアルコール脱水及びヘキサメチルジシラザン（HGM）で処理後、金属薄膜（オスミウム）を蒸着することで観察可能となる。また、LBC 検体から作製したセルブロック標本を低真空走査型電子顕微鏡（LV-SEM）で観察する場合は、LBC 検体を一度10% ホルマリン固定液に置換し、１時間程固定させた後、懸濁液をナノパーコレーター上に滴下する。滴下後、シリンジを引き蒸留水の滴下と吸引の繰り返しで固定液を洗浄する。ナノパーコレーター上に残った細胞に 3％低融点寒天で一塊に固め細胞のロスを最低限に抑えた FFPE 検体の 4µm 切片を作製する。キシレンで脱パラフィン後に 2% 酢酸ウラン染
色液を切片に滴下（3 分間）→蒸留水で洗浄→レイノルド鉛染色液を切片に滴下（3 分間）→蒸留水で洗浄を行い、自然乾燥後に観察可能となる。

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1. はじめに - 口腔擦過細胞診について -5．ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（TEM 編）

2. 病理診断における電子顕微鏡
3. ナノパーコレーターについて
4. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（SEM 編）
5. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（TEM 編）
6. 口腔扁平上皮癌細胞の電子顕
微鏡学的所見図 4 ナノパーコレーターを用いた TEM 用電顕試料作製方法の概略図

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7. おわりにナノパーコレーターを用いてTEM観察する場合は以下の過程を経る。
① 専用ブラシ等で細胞を採取する。
② 採取した細胞を遠心チューブ内に入れた2.5%グルタールアルデヒド0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて30分間室温（25℃前後）で前固定を行う。
③ 遠心分離（1,500 rpm、5 分間）を行い、上清液を捨て 0.1M リン酸塩緩衝液を加えて3回洗浄する。
④ 次に、1% オスミウム 0.1M リン酸緩衝液（pH7.0）で 4℃, 30 分間、後固定を行う。
（細胞が黒色に染まることを確認する。
）⑤ 同様に遠心分離（1,500 rpm、5 分間）し、上清液を捨て 0.1M リン酸緩衝液を加えて３回洗浄する。
⑥ 洗浄後、シリンジに装着したナノパーコレーターメンブレンフィルター上に細胞を含んだ懸濁液を滴下する。
⑦ シリンジを引き、余剰な水分を除去しナノパーコレーター上のフィル
ターに細胞を吸着させる。
⑧ 65℃に加熱した3%低融点寒天で細胞を一塊に固める。
（図5-A）⑨ 寒天で固めた細胞集塊を 50% → 70% → 90% → 100% エタノールの順で脱水させる。
⑩ 実体顕微鏡下で、寒天のトリミングを行う。
（図5-B）⑪ トリミング後の寒天を 100% エタノール→ 100% エタノール：100% アセ
トン＝1:1 の混合液→100%アセトンの順に60分ずつ浸透させる。
⑫ EPOXY レジン（EPON812, TAAB）で包埋を行う。
（図5-C）⑬ 35℃, 12 時間→ 45℃, 12 時間→ 60℃, 24 時間重合させる。
（レジン包埋ブ−5−
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1. はじめに - 口腔擦過細胞診について -ロック）⑭ ウルトラミクロトームで超薄切片を作製する。

2. 病理診断における電子顕微鏡⑮ 2%酢酸ウランとレイノルド鉛による二重染色を行う。

3. ナノパーコレーターについて⑯ 透過型電子顕微鏡（HT-7700, HITACHI）にて観察を行う。

4. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（SEM 編）
5. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（TEM 編）
6. 口腔扁平上皮癌細胞の電子顕微鏡学的所見
7. おわりに図 5 寒天トリミングとレジン包埋
A : ナノパーコレーター上で一塊に固めた寒天
B : 実体顕微鏡下でトリミング中のモニター画面である。オスミウムによって黒色に染まっている細胞（青矢印）が確認できる。
C : トリミング後の寒天をレジン包埋（EPOXY レジン）する（黄色矢印）。

6．口腔扁平上皮癌細胞の電子顕微鏡学的所見
口腔の粘膜上皮細胞の表面には通常微小堤（microridge）と呼ばれるヒダ状構造物がみられる。これは 0.1µm 幅の間隔を持った細胞膜の構造物であり、この構造物は口腔粘膜以外に皮膚や角膜、膣等の重層扁平上皮細胞表面にみられる。舌扁平上皮癌から採取した細胞の SEM（S4500, HITACHI）像（図6-A, B）では、癌細胞は正常の上皮細胞とは異なり、表面に大きな皺が生じ微小堤の走行は乱れ不規則な形態をしていた。LBC 検体から作製したセルブロック標本の未染色切片（4µm）の低真空走査型電子顕微鏡（LVSEM）像（図 6-C, D）では、ホルマリン固定標本であるため細胞形態の保持性に劣るものの、癌細胞集塊を観察すると、核においては核膜及び核内の核小体をはじめとした超微細構造も観察することができる。

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1. はじめに - 口腔擦過細胞診について 2. 病理診断における電子顕微鏡
3. ナノパーコレーターについて
4. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（SEM 編）
5. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（TEM 編）
6. 口腔扁平上皮癌細胞の電子顕微鏡学的所見
7. おわりに

図 6 口腔扁平上皮癌にみられる癌細胞の SEM 像
A： 癌細胞表層の皺
B： 癌細胞表層の不規則な微小堤
C：癌細胞集塊（4µmFFPE（セルブロック）切片）
D：核内の構造（4µmFFPE（セルブロック）切片）
スケールバー A: 10µm, B,D: 3µm, C: 200µm

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正常の舌粘膜上皮細胞と舌扁平上皮癌細胞のTEM（HT-4000, HITACHI）
像（図 7）では、SEM で確認された形態と一致した微小堤を有した正常の上皮細胞および癌細胞の断面を観察できる（図 7-B, D）。また、正常の上皮細胞では細胞質内の微細な線維（アクチンフィラメント）、核では二重膜構造を有する核膜、核内の所見ではヘテロクロマチンとユークロマチンに均等な分布及び核小体がみられた（図 7-B）
。一方、癌細胞では細胞質内のアクチンフィラメントの密で不規則な走行、核内の所見ではヘテロクロマチンの分布の増大が目立つ。特に核膜側に偏ったヘテロクロマチンの分布がみられたが、核の二重膜構造の肥厚はみられなかった（図 7-C, D）。これらの所見は所謂、光学顕微鏡レベルの細胞診における異型所見の代表である「細胞質輝度の上昇」、「核濃染」、「粗造なクロマチン」、「核膜肥厚」と関連すると考えられる。特に核膜肥厚と呼ばれるものは実際には核膜自体が肥厚−7−
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1. はじめに - 口腔擦過細胞診について -しているのではなく、ヘテロクロマチンが核膜側に偏在・集積することによってみられる現象であることがTEM像から分かった。

2. 病理診断における電子顕微鏡
3. ナノパーコレーターについて
4. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（SEM 編）
5. ナノパーコレーターを用いた電顕試料作製方法（TEM 編）
6. 口腔扁平上皮癌細胞の電子顕微鏡学的所見
7. おわりに図 7 口腔扁平上皮と癌細胞 透過型電子顕微鏡（TEM）像
A：トルイジブルー染色像（光学顕微鏡で観察対象となる細胞が含まれているか確認する。黄色矢印）
B： 舌粘膜上皮細胞（微小堤, 黄色矢頭）, C：癌細胞①, D：癌細胞②（微小堤, 黄色矢頭）
スケールバー A：10µm, B-D：1µm

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7．おわりに
本稿では、口腔擦過細胞診標本の電顕試料作製法とその所見を紹介した。
口腔擦過細胞診は未だ発展途上であり、今後更なる細胞判定の精度向上が期待される。口腔擦過細胞診標本を用いた電顕観察所見はスクリーニング検査でみられる細胞像の所見を裏付ける形態変化を捉えることができ、今後の細胞診断学の飛躍に大きく寄与するものと考える。
参考文献
1） 公益社団法人 日本臨床細胞学会編 . 細胞診ガイドライン 5 消化器 2015 年版 . 金原出版株式会社 . 18-58  2） 田中陽一 , 平井康夫 . 日本臨床細胞学会細胞診ガイドライン新報告様式準拠 口腔細胞診アトラス . 医学書院 .
2023. 1-7−8−
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図 1 口腔扁平上皮癌にみられる異型細胞（Papanicolaou 染色）
A：ライトグリーン（LG）好染深層型異型細胞
B：オレンジ G（OG）好染表層異型細胞
C：奇怪な細胞①（カニバリズム像）
D：奇怪な細胞②（オタマジャクシ様形態）
スケールバー：50µm
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図3

ナノパーコレーターを用いた SEM 用電顕試料作製方法の概略図

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図4

ナノパーコレーターを用いた TEM 用電顕試料作製方法の概略図

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図 6 口腔扁平上皮癌にみられる癌細胞の SEM 像
A：癌細胞表層の皺
B：癌細胞表層の不規則な微小堤
C：癌細胞集塊（4µmFFPE（セルブロック）切片）
D：核内の構造（4µmFFPE（セルブロック）切片）
スケールバー A: 10µm, B,D: 3µm, C: 200µm
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図 7 口腔扁平上皮と癌細胞 透過型電子顕微鏡（TEM）像
A：トルイジブルー染色像（光学顕微鏡で観察対象となる細胞が含まれているか確認する。黄色矢印）
B：舌粘膜上皮細胞（微小堤 , 黄色矢頭）, C：癌細胞①, D：癌細胞②（微小堤 , 黄色矢頭）
スケールバー A：10µm, B-D：1µm

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