進化分子工学によるデザイナー炭化水素生合成経路の開発
早稲田大学先進理工学部応用化学科

梅野太輔

Squalene and squalane are compounds in demand in many industries, from ointments, health foods, special lubricants,nutrients and pharmaceuticals to biofuels, as well as in many cosmetics as a skincare ingredient due to its excellent
emulsifier performance and outstanding stability. Highly efficient and stable microbial production is required as a highly
efficient and sustainable supply method for these compounds. However, squalenes maintain a large C30 skeleton, and thecells had to be disrupted to extract the squalene from the cells, resulting in the contamination of countless impurities in theextract. In this study, we developed a system to synthesise mini-squalenes was created, for enabling the hyperproduction ofsqualene-like compounds via continuous extraction and the creation of novel squalene altermatives possibly wth the better
quality as cosmetic ingradiants.

１．緒（Sustainable Aviation Fuel）として大量生産する挑戦も始言まっている．化粧品産業はもちろん，医療・健康食品・潤スクアレンは，我々の皮表脂質の 5 ~ 15 % を占める炭化滑油など，産業需要の高いスクアレン・スクアランの年間水素成分であり，単にコレステロールなどの生理活性テル

需要はすでに数千トン（マーケットサイズは 200 億円）を超ペンの生合成原料となるのみならず，それ自身に積極的なえる 3）．燃料用途のスクアレンの実用生産に目処がつけば，役割があることがわかっている．我々の皮脂腺からは，一その需要規模は青天井に成長するに違いない．

日およそ 100 - 500 mg ものスクアレンが分泌され，汗腺かこのように需要の高いスクアレン・スクアランであるが，らのその他の分泌物と乳化して皮膚表面を保湿し、肌のなその持続可能な供給は脅かされている．主な供給源の一つ

めらかさの保持に役立っている．これらは化粧品素材としは深海ザメの肝油であるが，毎年，おびただしい数（~ 1 億て保湿クリームなどに使われるだけでなく，各種健康食品匹といわれる）のサメがスクアレンのために乱獲されてお1）素材としての需要がある ．さらには，インフルエンザウり，動物愛護の立場から，多くの企業が肝油由来スクアレイルスのアジュバンド（免疫賦活剤）として，1 shot あたりンの使用中止を宣言し始めている．さらに海洋汚染のため，

2）

1 mg のスクアレンが使用されている ．また，スクワレ

最近は，肝油に種々の有害物質が検出されるケースが増えンを水素還元して得られるスクワランはさらに需要が高い．

はじめている．また，植物スクアレンの多くはオリーブなそもそもスクアランは，第二次世界大戦中に日本軍が寒冷どの可食植物に由来するうえ，その含有量が気候によって地での戦車・戦闘機の潤滑油として用いたのが工業規模で大きく変動するため，安定な供給源にはなり得ない．またの利用のさきがけであるという 1）．戦後は，時計やカメラ

植物スクアレンはパラフィンなど他成分とともに抽出されのシャッター用潤滑油として民需使用されるようになったるため，高純度のスクアレン・スクアラン源とも言い難い．

が，その皮膚への親和性・良好な展伸性と低温特性，さらこのような背景のもと，スクアレンの持続可能で夾雑物のには保湿性に優れることから，化粧品への応用展開が一気少ない新たなリソースとして微生物生産への期待が高まっに進むことになった．今では，バスオイル，ヘアケア製品，ている．Amyris 社をはじめとする合生成物学ベンチャー

メークアップ剤，リップスティック，日焼け剤，ボディパは，スクアレン合成経路を導入した大腸菌や酵母などを徹ウダー，ネイルケア製品など，コスメ・スキンケアに関連底的に育種し，産業要請の一部（2013 年実績でおよそ需要する無数の製品に 0 . 1 ~ 50 % 程度の含有量で含まれるに至の 20 %）に応えつつあるが，その高い分子量（炭素骨格 30 ,っている．さらにスクアレン・スクアランは，完全なる炭

分子量 411 / 423）とロウのような油物性（沸点 285 / 417 ℃）化水素であるため，その燃料特性にも優れており，SAFによって，高い膜蓄積性を示し，細胞を破砕せずに取り出すことが困難である．その結果，膜蓄積容量を超える生産はできないという重大な問題によって，その直接の微生物

Directed evolution of pathways for nonnatural squalenes
Daisuke Umeno
Dept . Appl ied Chem ist r y, WasedaUniversity生産は困難である 4）．ファルネセン（C 15 骨格）程度の炭化水素の場合は，微生物の培養液に，有機溶媒（ドデカンなど）を上層するだけで，連続的に抽出しながら生物生産が可能となるため，~ 100 g/L を超える生産が可能となる 5）．前出の Amyris 社は，半分の分子量を持つ直鎖状テルペン（フ− 20 −

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ァルネセン）を微生物生産し，これらを化学触媒プロセス低分子化されることになる．エネルギー負荷の高いこので縮合してスクアレンを供給している．

クラッキングプロセスを避けるため，多くの研究者が「ち私たちは長年大腸菌でのスクアレンの高効率生産に挑ん
6）いさな（＜ C 25）スクアレン」の生合成に挑戦したが，これまできたが ，株の生産力の向上とともに，その蓄積毒性はで誰も成功していない．理論的には，スクアレン合成酵顕著となり，ある程度以上の生産は宿主致死に至ることが素（Squalene synthase, SQS）の反応ポケットの形状を再デ明らかになった．その原因はひとえに，大きすぎる分子ザインし，より小さな基質に最適化すれば，C 25 スクアレ骨格（C 30）にある．そもそも，その優れた油質・保水効果ンを合成できる SQS 変異体の創出は可能であろう．しかと低刺激性によって長年愛用されてきたスクアレン・ス

し色素前駆体であるフィトエンの場合 8 , 9）と異なり，スククアランであるが，油というよりは「ろう」に近い物性を持

アレンは分子量にかかわらず無色透明であり，それを前駆つ．これが本当に化粧品素材としての理想型なのであろう

体とするホパノイドやステロイド類も無色であるため，スか？その分子量をもう少しだけ小さくすることができれば，クリーニングの手立てがなかった．立体構造情報が豊富

流動性がより高く，かつスクアレンと同等の油質・保水効なヒト由来の SQS（hSQS）と中度好熱性シアノバクテリア果を示す，全く新しい化粧品素材が開発できるのではない（Thermocynechococcus）由来の SQS（tSQS）の 2 つを出発か？

点とし，Fig. 2 に示す 3 工程によって実験室内で「進化」さ

最近我々は，スクアレン合成酵素の近縁酵素であるフィトエン合成酵素（カロテノイド色素の原料骨格合成酵素）をせて C 25 構造を持つスクアレン合成酵素を創出することを試みた．

特異性変換し，イソプレンユニット 1 つぶんだけ小さい骨

具体的な工程を概説すると，以前の我々の発見 10）に基格を持つ C 25 カロテノイドを大腸菌に生合成させることにづき，tSQS/hSQS の NADH からの電子供与能を奪うアミ成功した．すると驚くことに，その化合物は，C 30 や C 40

ノ酸置換を導入し，カロテノイド前駆体デヒドロスクアレ骨格を持つ天然カロテノイドと異なり，大腸菌を破砕するン（DSQ）型の生産物を与える酵素変異体に変換する（工程ことなく，培養液に上層したドデカン層に連続的に抽出さ❶）．こうして得た C 30 -DSQS の反応ポケットにランダム

7）れてくることが明らかになった （Fig. 1）．フィトエンとなアミノ酸置換を遺伝子レベルで導入し，そのサイズ特異構造が酷似しているスクアレンも，その骨格サイズを小さ性の多様化を図る．我々は最近，C 25 骨格を持つフィトエく変更することによって，肌上での展性や保湿効果をそのンを前駆体としたときのみ，蛍光性の色素を与える不飽和ままに，その流動性や加工性，さらには微生物生産を可能化経路を開発した 7）．この系を使い，C 30 ではなく C 25 カとする新規な化粧品ベース素材となるのではないか．このロテノイドを合成する変異体を探索する（工程❷）．最後に，着想にもとづき本助成研究では，進化分子工学を駆使してこうして得られた C 25 -DSQS 変異体から工程❶で導入した「ミニスクアレン」合成酵素を実際に創出し，実際に大腸菌変異部位を野生型に戻し，還元能を復活させて C 25 -SQSで生産させることに成功した．

を得る（工程❸）という作戦である．

2．方法

2 . 2 . ミニスクアレンの大腸菌生産と抽出特性の調査

2 .1. ミニスクアレン合成酵素の創出得られた変異体を大腸菌にプラスミド発現させ，培地のバイオ燃料の分野でもスクアレンは注目されているが，体積の 20 ~ 50 ％のドデカンを上層したかたちで 30 ~ 37 ℃

実際に燃料として使うためには，クラッキングによってで 24 ~ 48 時間振盪培養した．その後，細胞外に抽出し得Fig. 1 大腸菌は C25 カロテノイドを放出する〜 C25 スクアレンも同様と期待される− 21 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

たスクアレン類は，培地を遠心し上澄として現れるドデカ

繰り返し，CrtI 共発現によって高い蛍光性を示す tSQS 変ン画分から，細胞残留したスクアレン類は，遠心時に得ら異体を得ることができた（工程❷：C 25 -DSQ：Fig. 3 a 左）．

れる細胞ペレットを回収し，アセトン抽出→ヘキサン／水

この変異体は全く C 25 -SQ を合成しなかったが，工程❶で二相分配させたヘキサン画分から回収した．

導入した 314 A変異を元のアミノ酸（V）に戻したところ（工３．結程❸），得られた変異体は，細胞内で C 25 -SQ を主生成物果として与えることがわかった（Fig. 3 a 右）
。自然界の SQS

3 . 1. ミニスクアレン合成酵素の創出

は種を問わず厳密に C 30 骨格のスクアレンを合成し，ホパ

我々は，中度好熱シアノバクテリアThermocynechococcus

ノイドやステロールなど，50 , 000 超ものトリテルペンは7）

すべて，この C 30 -SQ から生合成される．本研究は，３段を見出している．そのような変異のひとつ V 314 A（314 番

階の進化工程を経て，世界で初めて「ミニスクアレン」の生目の残基をバリンからアラニンに変換する変異）を導入し合成に成功した．

由来の tSQS の活性を落とさずその還元能だけを奪う変異

た tSQS 変異体を作出したところ，首尾よく C 30 -DSQ 合成

我々は，ヒト由来の hSQS においても，ミニスクアレン酵素として振る舞うことが確認された．この変異体を発現合成酵素化を試みた．hSQS は高血脂症創薬標的であったする大腸菌にカロテノイド不飽和化酵素 CrtI を追加発現こともあり，多くの X 線結晶構造が取得されている．しすると黄色いコロニーを与えた．この酵素は，C 30 -DSQ

かし tSQS と異なり，hSQS には，NADPH の結合がなけれを 3 ~ 4 ステップ不飽和化し，大腸菌に蓄積する

11）

．Fig.

ば縮合が完結しない独特な「仕掛け」が埋め込まれているため，単に C 30 -DSQS 化する変異を導入するだけでは，全体2 の工程❶が首尾よく成功したことになる．
この tSQS 変異体を親として，遺伝子全域にランダムな活性が大きく下がってしまう 10）．そこでこの酵素につい変異を様々な方法で導入して遺伝型を多様化した．得られては，構造情報を参考にした部位だけを特異的なランダムた tSQS ライブラリを，CrtI を共発現する大腸菌に導入し化を集中的に導入し，工程❷（C 25 骨格合成能の蛍光選抜）

たところ，ほとんどの変異体は親と代わり映えのない黄色によって，C 25 -DSQ 型の変異体を得た（Fig. 3 a 左）．得らコロニーを与えたが，数割のコロニーは白いコロニーを与れた変異体から，工程❶で導入した NADPH 結合性を奪うえた．これらはランダム変異によって tSQS の機能あるい変異のキャンセル（工程❸）を行ったところ，hSQSwt の 40

はフォールディング能が損なわれた「dead mutants」であ倍もの C 25 -SQ 合成ができる変異体の獲得に成功した（Fig.

る．そしてこれら有象無象の中に，わずかに蛍光性を示3 b 右）．

すコロニーが見られた．我々はこの蛍光性変異体を単離し，次の世代の親と定め，さらなるランダム変異導入（遺伝型3 . 2 . ミニスクアレン合成酵素の連続抽出培養の多様化）に供した．このサイクルを３世代にわたって右こうして獲得した C 25 SQS を大腸菌に導入し，ドデカン

Fig. 2 急がばまわれ？ ミニスクアレン合成酵素を創出する「進化工程」− 22 −

進化分子工学によるデザイナー炭化水素生合成経路の開発

Fig. 3. tSQS および hSQS のサイズ変異体

Fig. 4 C25SQ の膜透過性検証を上層したまま培養を行った．C 30 SQ は膜蓄積するため細でもない，新規生成物を合成していることを偶然発見し胞ペレット画分にのみ見られたが、C 25 SQ は上層したドデた．この化合物は，C 40 骨格を持ち，不飽和度は C 40 -DSQカン層にみられた（Fig. 4）．期待どおり，直鎖状 C 25 -SQ（カロテノイド原料であるフィトエンと同じ）でありながは細胞外に抽出することが可能であることが本系でも追認

ら，フィトエンの持つ 287 nm（3 つの二重結合の共役）をされた。

持たない．SQS の触媒する反応メカニズムを考慮すると，この新規化合物は C 40 デヒドロボトリオコッセン（DBo）だ

3 . 3 . もうひとつの反応特異性・分岐型スクアレンの合成と予測した（Fig. 5）．興味深いことに，この変異体は，C 20炭化水素の油質を決める主要素として，分子サイズと不が，C 15 原料（C 15 PP）の二分子縮合時には，天然型（直鎖型）飽和度が知られるが，これに加えて，分岐の有無という構の C 30 SQ を与えることが明らかになった．すなわちこの原料（C 20 PP）の二分子縮合産物はこの分岐型分子を与える造要素も重要である．SQS は 2 分子の C 15 PP を還元的に縮酵素は，同じ酵素の同じ反応ポケットの中で，基質サイズ合して直鎖状の C 30 SQ を合成する酵素であるが，我々はによって 2 つの異なる縮合形式での炭化水素構造の形成をhSQS のさらなるサイズ変異体の変更を画策しているうち触媒する極めて珍しい特色を持つ．我々の知る限り，このに，試作した hSQS 変異体のひとつが，SQ 型でも DSQ 型

ような「自動仕分け機能」を持つ酵素の報告はない．

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Fig. 5 新規 C40 炭化水素を合成する SQS 変異体

謝

4．総 括

辞
本研究の遂行にあたって多大なる御支援をいただきましスクアレンの微生物生産における最大の問題は，細胞からそれを取り出せないことにある．米国ベンチャーた公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に厚く御礼申し上げます．

Amyris 社は，C 15 骨格を持つファルネセンを連続微生物生産し，これを化学触媒で縮合してスクアレンに変換する，（引用文献）半生物・半有機合成のスクアレン製造方法を実用化し，世1） 海谷 篤，天然スクアレン，スクアランの用途と最近の原料事情．油化学 , 1990, 39（8）,525-529.

界スクアレン需要の 2 割を担うことに成功している．しかしこのスクアレンは完全なる微生物合成ではないため，真2） K.J. Fisher; R. Kinsey; R. Mohamath, et al. Semi-の「バイオスクアレン」とは言い難い．本研究では，炭素骨

synthetic terpenoids with differential adjuvant

格をあと 5 つぶんだけ間引いた C 25 スクアレンは，勝手にproperties as sustainable replacements for shark

大腸菌の外に出てくることを発見した．化学触媒過程を一squalene in vaccine emulsions. 2023, npj Vaccines, 8, 14.

切排したかたちで，廃糖や廃油などから一段でスクアレン・3） https://www.greenpeace.org/static/planet4-eastasia-

スクアランを大量合成することができるとしたら，この化

stateless/2 0 1 9/1 1/eca7ede5-eca7ede5-etc-squalanesynbio-casestudy2014.pdf

合物こそが，唯一にして絶対のフォーマットであると我々は確信している．大量微生物生産に適した改質型・連続抽4） Y. Meng; X. Shao; Y. Wang; Y. Li; X. Zheng; G.

出可能な「ミニスクアレン」の生合成経路は，イソプレノイ

Wei; S-W. Kim; C. Wang, Extension of cell membrane

ド原料供給路を強化した微生物などの併用によって，拡大

boosting squalene production in the engineered

し続けるエマルジョン型保湿剤需要に応えられる，真に全Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng., 2 0 2 0, 1 1 7（1 1）,生物生産な新規化粧品素材となる可能性が高い．また，一3499-3507.

過的かつ不規則なパンデミック対応に不可欠なアジュバン

5） A. Meadows; K. Hawkins; Y. Tsegaye, et al.

ドの大量供給体制の整備にも，一役買う可能性がある．さRewriting yeast central carbon metabolism forらに，本研究を進展させれば，C 5 +C 20 や C 5 +C 15 型の非天

industrial isoprenoid production. Nature, 2 0 1 6, 5 3 7,然スクアレンシリーズやその分岐型炭化水素などの生合成

694–697.

が可能となる．軟膏成分やスキンケア素材として，実験室

6） A. Katabami; L. Li; M. Iwasaki, M. Furubayashi; K.
Saito; D. Umeno, 2015, 119（2）,165-171.

でも自然界でもアクセス不能だった，数多くの新規な物性を持つバイオ化粧品素材のシリーズ開発ができるものと期

7） 梅野太輔，尾島 匠，非対称骨格を有するカロテノイド及び蛍光性非対称骨格を有するカロテノイド，特願待される．

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Enzymol., 2022, 671, 351-382.

2023-112676．
8） M. Furubayashi; M. Ikezumi; S. Takaichi, et al. A10）M. Furubayashi; L. Li; A. Katabami; K. Saito; D.

highly selective biosynthetic pathway to non-naturalUmeno: Directed evolution of squalene synthase for

C5 0 carotenoids assembled from moderately selective

dehydrosqualene biosynthesis, FEBS Lett., 2014 , 588 ,enzymes. Nat Commun. 2015, 6, 7534.

3375 ‒ 3381 .

9） M. Furubayashi; D. Umeno, Use of directed enzyme11）D. Umeno; A.V. Tobias; F.H. Arnold; Evolution of theevolution to create novel biosynthetic pathways for

C 3 0 Carotenoid Synthase CrtM for Function in a C 4 0

production of rare or non-natural carotenoids. Methods

Pathway. J. Bacteriol., 2002 , 184（23）, 6690 - 6699 .

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