経皮曝露されたナノ粒子の存在様式変化の理解と毒性発現を適切に解析・予測するための試験法の提案
和歌山県立医科大学薬学部

長野一也

To ensure the safe usage of silver nanoparticles (nAgs) in cosmetics, it is necessary to reveal the physical forms ofnAgs inside the skin, as these forms may change during the process of percutaneous absorption. In this respect, we havepreviously established an analytical system based on single-particle inductively coupled plasma mass spectrometry (sp-ICPMS) to determine the physical forms of nAgs in the skin. Here, we analyzed the physical forms of nAgs inside the mouseskin. Furthermore, we tried to propose an appropriate test system, to understand the kinetics of nAgs after dermal exposurein a simple and detailed manner.
We evaluated the quantity as well as the physical forms of Ag in the epidermis and dermis of mice after exposing
nAgs with 100 nm diameters (nAg100) or Ag+ to the skin. Sp-ICP-MS analysis indicated that nAg100 could be absorbed
and distributed into the deeper layers in the ionized form, whereas Ag+ was absorbed and distributed without a change inphysical forms. This data suggested that it is essential to consider the distribution and particle size of not only nAgs but also
Ag+ released from nAgs into the skin, to understand the skin response following exposure of nAgs. Next, we focused on athree-dimensional skin culture model as an animal-substitute in vitro test system from the viewpoint of animal welfare, andanalyzed the distribution of nAg100 (epidermal and dermal layer) and the amount and physical form of nAg100 in eachlayer. Sp-ICP-MS analysis showed that nAg100 could be also absorbed and distributed into the deeper layers in the ionized
form, as well as in vivo studies. The data suggested that a three-dimensional skin culture model could be a useful in vitro test
system for understanding the kinetics of nAgs after dermal exposure in a simple and detailed manner.

１．緒

応答（毒性を含む）
は、粒子の大きさや、粒子／イオンといっ言た存在様式の違いによって異なることを見出しており 5 - 7）、ナノ粒子は、組織浸透性が高いことから、化粧品をはじめ、 「投与・添加されたナノ粒子の物性」と「引き起こされる生身の回りの製品に応用されている 1）。一方で、ナノ粒子は、体応答（毒性を含む）」の間がブラックボックスのままでは、その微小さから、従来サイズの粒子とは異なる体内動態をナノ粒子に起因する毒性を真に理解しえない。したがって、示すため、皮膚内での炎症惹起をはじめ、様々な毒性発現

ナノ粒子含有製品の安全性担保には、ナノ粒子の存在様式

2）が指摘されている 。このような背景から、様々な素材・を定量的に理解し、毒性を発現させている正体を理解した大きさのナノ粒子が、動物などに投与され、それぞれの毒うえで、試験系を設定することが重要である（図 1）。

性は、投与されたナノ粒子に起因しているとの考察が散見

しかし、ICP-MS や電子顕微鏡観察といった従来手法は、される。また、その機序解析を目的とした in vitro 試験にお一長一短で、存在量と存在様式を同時評価できず、新たないても、in vivo で投与したナノ粒子をそのまま利用して技術基盤が求められていた（表 1）。

いる実験が多く認められる。しかし、最近では、1）抗菌スプレーなどに汎用される銀ナノ粒子が、生体内でイオン化されて粒子が小さくなることや 3）、逆に、イオンから粒子が再形成されることが報告されており 4）、必ずしも曝露されたナノ粒子自体が、毒性を発現させているとは限らないことがわかりつつある。そのため、in vitro 試験において、in vivo で投与したナノ粒子をそのまま利用することは、真実と異なる現象を観察している可能性も考えられる。さらに重要なこととして、2）ナノ粒子が起因する生体
Understanding the change in physicalforms of nanoparticles exposed dermally and proposing test methods for appropriate analysis and prediction of
their toxicity
Kazuya Nagano
School of Pharmaceutical Sciences,
Wakayama Medical University− 127 −

図1
表1

ナノ粒子の毒性評価の概要図

ナノ粒子の定量・定性評価するための手法

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

本観点から、申請者はこれまでに、上記のブラックボッ3．結果と考察

クスを解き明かすことを目指し、生体試料の前処理を最適化することで、生体内でのナノ粒子の存在量と存在様式を解析可能な「生体試料応用型 1 粒子 ICP-MS」を独自開発

3 . 1．マウス皮膚に曝露された銀ナノ粒子の存在様式変化の解析してきた 8）。本技術を活用し、安全なナノ粒子含有化粧品

マウス皮膚に曝露された銀ナノ粒子の各層（表皮層と真などを開発するためには、①経皮曝露されたナノ粒子の存皮層）での存在量と存在様式変化を理解するため、100 nm

在様式が、皮膚内でどのように変化するのかを立証し、②の銀ナノ粒子（nAg 100）と、その対照群として、銀イオどういったナノ粒子が経皮曝露されると、どこに、何が、ン（Ag+）をマウス皮膚に塗布した。塗布 5 日後、皮膚組どれだけ分布するかを精査したうえで、③適切な試験系を織の各層における存在量を ICP-MS 法で解析し、存在様式設定することが求められる。

を生体試料応用型 1 粒子 ICP-MS 法で解析した。

そこで本研究では、銀ナノ粒子をモデルに、皮膚内でのその結果、いずれの曝露群においても、表皮と真皮で、存在様式変化を解析したうえで、3 次元皮膚培養モデルな銀が検出された（図 2（a））
。そこで、その存在様式を解析

どを活用することにより、毒性発現を適切に理解・予測すしたところ、Ag+ 曝露群では、表皮・真皮ともに、そのほるための試験系の提示を目指す。

とんどが曝露させた Ag+ として検出された。その一方で、

2．方

nAg 100 曝露群では、表皮・真皮ともに、曝露させた粒子法のみならずイオンが約 6：4 の割合で検出された（図 2（b））
。

2 . 1．マウス皮膚に曝露された銀ナノ粒子の存在様式変化の解析

また、その粒子径は、約 80 nm とイオン化に伴って小さくなっていることが示唆された（図 2（c））
。したがって、経モデルナノ粒子として、100 nm の銀ナノ粒子（nAg 100）を nanoComposix 社より購入し、実験に供した。硝酸銀を富士フィルム和光純薬より購入し、銀イオン（Ag+）を
nAg 100 の対照群として設定した。マウスは、ICR の雌（8週齢）を日本 SLC より購入した。皮膚組織の分画は、まず、テープストリッピングで角質層を採取し、表皮と真皮をMicrowave 法（200 W, 30 秒）にて分離した。各皮膚組織における銀の存在量については、ICP-MS 法によって評価した。また、存在様式については、高効率に回収でき、存在様式を変化させることのない水酸化ナトリウムによる前処理で組織を可溶化し、生体試料応用型 1 粒子 ICP-MS によって評価した 8）。

2 . 2．3 次元皮膚培養モデルに添加された銀ナノ粒子の存在様式変化の解析

3 次 元 皮 膚 培 養 モ デ ル（ 表 皮 モ デ ル：EPI- 212）を、KURABO より購入した。nAg 100 の添加濃度を検証するため、3 次元皮膚培養モデルに各種濃度（3 , 10 , 30 , 90 μg/mL）の nAg 100 を添加し、24 時間後、WST- 8 アッセイにより、3 次元皮膚培養モデルに対する障害性を検証した。障害性が観察されなかった最大濃度（90 μg/mL）のnAg 100 を 3 次元皮膚培養モデルの上層に添加し、24 時間後、サンプルを回収した。サンプルとしては、まず、3次元皮膚培養モデルの上層と下層の溶液をそれぞれ回収後、3 次元皮膚培養細胞層に水酸化ナトリウムを添加・溶解させて回収した。回収したサンプル中の銀の存在量・存在様式は、2 . 1 . と同様、それぞれ ICP-MS 法と生体試料応用型 1 粒子 ICP-MS によって評価した。

図 2 マウス皮膚に塗布した nAg 100 と Ag+ の存在量・存在様式の解析
マウス皮膚に nAg 100 とAg+ を 20 μg Ag/cm 2 で塗布し、5 日後、表皮と真皮中のAg の存在量と存在様式を解析した。
(a) は、表皮と真皮中に検出された銀濃度。(b) は、表皮と真皮中に検出された銀粒子の割合。(c）は、表皮と真皮で検出された粒子の平均粒子径。破線は、皮膚塗布時の粒子径。全データ
は平均値± S.E. で示した (n= 3 )。* p< 0 . 05（Student’ s t-test）− 128 −

経皮曝露されたナノ粒子の存在様式変化の理解と毒性発現を適切に解析・予測するための試験法の提案

降（3 次元皮膚培養の下層）に進むにあたって、少なくな皮吸収の過程でイオン化していることが示唆された。
以上から、マウス皮膚に曝露された nAg 100 は、その吸っており、皮膚バリアによって深部に向かって浸透する量収過程でイオン化し、表皮や真皮では、粒子とイオンが共は制限されていることが示唆された（図 3（a））
。次に、各存していることが明らかとなった。

層の銀の存在様式を生体試料応用型 1 粒子 ICP-MS 法で評価したところ、皮膚表面（3 次元皮膚培養の上層）では、3 . 2．3 次元皮膚培養モデルに添加された銀ナノ粒子の存在様式変化の解析

ほとんどが粒子であったのに対して、表皮（3 次元皮膚培

nAg 100 のみならず、経皮曝露された各種ナノ粒子の動れて、イオン割合が大きくなっており、nAg 100 は、イオ態（どこに、何が、どれだけ分布するのか）を詳細に理解ン化しながら、浸透していることが示唆された（図 3（b））。

するためには、簡便でハイスループットな評価系が必要

実際、各層で検出された粒子の大きさを検証すると、皮膚である。そこで、動物愛護の観点からも、動物代替の in表面（3 次元皮膚培養の上層）から、表皮（3 次元皮膚培養vitro 試験法として、3 次元皮膚培養モデルに着目した。本の細胞層）、真皮（3 次元皮膚培養の下層）へと向かうにつ試験では、様々な 3 次元皮膚培養モデルの中から、表皮モれて粒子径が小さくなっており、イオン化に伴って小さくデルを選択した。すなわち、3 次元皮膚培養の上層・3 次なっていることが示唆された（図 3（c））。

養の細胞層）、真皮（3 次元皮膚培養の下層）と向かうにつ元皮膚培養の細胞層・3 次元皮膚培養層の下層がそれぞれ、以上から、マウス皮膚のみならず、3 次元皮膚培養モデin vivo における皮膚表面・表皮内・真皮以降を再現しう

ルに添加された nAg 100 も、その吸収過程でイオン化し、ると考えられた。

表皮や真皮では、粒子とイオンが共存していることが明ら

まず、3 次元皮膚培養モデルにおいても、銀ナノ粒子がかとなった。そのため、3 次元皮膚培養モデルは、経皮曝経皮吸収の過程でイオン化し、表皮や真皮では、粒子とイ露された各種ナノ粒子の動態（どこに、何が、どれだけ分オンが共存していることを明らかにするため、nAg 100 を布するのか）を詳細かつ簡便に理解するための評価系になモデルに、3 次元皮膚培養の上層・3 次元皮膚培養の細胞層・る可能性が示された。一方で、表皮や真皮に浸透する量や、3 次元皮膚培養の下層における存在量と存在様式を解析しイオン化の割合、粒子径の減少は、マウス皮膚と 3 次元皮た。最初に、nAg 100 の添加濃度を決定するため、各種濃膚培養モデルで乖離があった。これは、各種条件が異なる度の nAg 100 を 3 次元皮膚培養層に添加し、その障害性をため、必然ではあるものの、ヒト皮膚での経皮吸収後の動WST- 8 アッセイによって評価した。障害性が観察されな態を理解・予測するために、まずは、ヒト皮膚を用いて検かった最大濃度（90 μg/mL）を決定したうえで、nAg 100証したうえで、その結果に相応する 3 次元皮膚培養モデルを 3 次元皮膚培養モデルの上層に添加し、24 時間後、各の種類や条件を探っていくことで、動物代替の in vitro 試

層の銀の存在量と存在様式を解析した。

験法になることが期待される。

各層の銀の存在量を ICP-MS 法で評価したところ、いず4．総れの層にも銀が検出され、真皮にまで浸透していることが括示唆された。一方で、その量は、皮膚表面（3 次元皮膚培

本研究によって、nAg 100 が経皮曝露されても、皮膚組養の上層）から、表皮（3 次元皮膚培養の細胞層）、真皮以織内には nAg 100 がそのまま存在しているとは限らず、経図 3 3 次元皮膚培養モデル（表皮モデル）に添加した nAg 100 の各層での存在量・存在様式の解析
3 次元皮膚培養モデル（表皮モデル）に nAg 100 を 90 μg/mLで添加し、24 時間後、3 次元皮膚培養の上層（皮膚表面に相当）、3 次元皮膚培養の細胞層（表皮に相当）、3 次元皮膚培養の下層（真皮以降に相当）の Ag の存在量と存在様式を解析した。
（a）は、各層に検出された銀量。
（b）は、各層に検出された銀粒子の割合。
（c）は、各層で検出された粒子の平均粒子径。
全データは平均値±S.D.で示した（n= 3）。

− 129 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

皮吸収後の毒性を適切に解析するためには、各皮膚組織中

3） Park EJ., Yi J., Kim Y., Choi K., Park K. : Silverに存在する粒子とイオンの双方を考慮することの重要性がnanoparticles induce cytotoxicity by a trojan-horse示された。また、存在量のみならず、存在様式を含めた動type mechanism., Toxicol. Vitro. 24, 872-878（2010）．

態を簡便に推測する手法として、3 次元皮膚培養モデルの

4） Loeschner K., Hadrup N., Qvortrup K., Larsen A.,

有用性を部分的に明らかにした。特に、3 次元皮膚培養モ

Gao X., Vogel U., Mortensen A., Lam HR., Larsen EH.

デルは、本試験で利用した表皮モデルのほか、真皮モデル: Distribution of silver in rats following 2 8 days ofや、角層が未熟なタイプやバリア能が亢進したタイプなど、

repeated oral exposure to silver nanoparticles or silver

多種多様にラインナップされている。そのため、子どものacetate. Part. Fibre. Toxicol. 8, 18（2011）．

皮膚や皮膚疾患などによって角層が未熟な場合の評価も期

5） Morishita Y., Yoshioka Y., Takimura Y., Shimizu

待される。また、真皮に到達した粒子とイオンの影響を観Y., Namba Y., Nojiri N., Ishizaka T., Takao K.,

察するには、in vivo での皮膚を利用するよりも、3 次元皮Yamashita F., Takuma K., Ago Y., Nagano K., Mukai

膚培養された真皮モデルに直接、粒子・イオン単独もしくY., Kamada H., Tsunoda S., Saito S., Matsuda T.,

は双方を添加する方が、適切に真皮での応答を解析できる

Hashida M., Miyakawa T., Higashisaka K., Tsutsumi Y.

可能性も考えられる。

: Distribution of silver nanoparticles to breast milk andさらに本研究が進展することによって、将来的には、生体に曝露されたナノ粒子の運命から、毒性や機能を引き起their biological effects on breast-fed offspring mice.,
ACS Nano. 10（9）: 8180-91（2016）．

こす正体を明らかにすることも夢ではなく、安全で有用な

6） Hirai T., Yoshioka Y., Izumi N., Ichihashi K.,

ナノ粒子の設計やその利用方法も講じることが可能になる

Handa T., Nishijima N., Uemura E., Sagami K.,

かもしれない。例えば、ナノ粒子から徐放されるイオンがTakahashi H., Yamaguchi M., Nagano K., Mukai

毒性に関連する場合には、イオン化しにくい素材の利用や、Y., Kamada H., Tsunoda S., Ishii K., Higashisaka K.,

イオン化させない設計・利用方法が理論的に構築可能であTsutsumi Y. : Metal nanoparticles in the presence ofる。また、逆に、イオンが機能に関連する場合には、粒子

lipopolysaccharides trigger the onset of metal allergy

がイオン放出源のデリバリーキャリアとしてデザインする

in mice., Nat. Nanotechnol., 11（9）: 808-816（2016）．
7） Yamashita K., Yoshioka Y., Higashisaka K., Mimura

ことも可能かもしれない。
以上は、新たな機能性化粧品を安全かつ合理的に開発す

K., Morishita Y., Nozaki M., Yoshida T., Ogura T.,

ることに直結するため、コスメトロジーの進展に大きな貢Nabeshi H., Nagano K., Abe Y., Kamada H., Monobe

献が期待される。

Y., Imazawa T., Aoshima H., Shishido K., KawaiY., Mayumi T., Tsunoda S., Itoh N., Yoshikawa T.,（引用文献）

Yanagihara I., Saito S., Tsutsumi Y. : Silica and titanium1） Dubey SK., Dey A., Singhvi G., Pandey MM., Singhdioxide nanoparticles cause pregnancy complications

V., Kesharwani P. : Emerging trends of nanotechnology

in mice., Nat. Nanotechnol., 6（5）: 321-328（2011）．

in advanced cosmetics., Colloids Surf B Biointerfaces.,

8） Ishizaka T., Nagano K., Tasaki I., Tao H., Gao JQ.,
Harada K., Hirata K., Saito S., Tsujino H., Higashisaka

214:112440（2022）．
2） Larese FF., D’ Agostin F., Crosera M., Adami

K., Tsutsumi Y. : Optimization and evaluation ofG., Renzi N., Bovenzi M., Maina G. : Human skinpretreatment method for sp-ICP-MS to reveal thepenetration of silver nanoparticles through intact anddistribution of silver nanoparticles in the body.,

damaged skin., Toxicology. 255:33-7（2009）．

Nanoscale Res. Lett., 14（1）: 180（2019）．

− 130 −