学位研究紹介

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学 位 研 究 紹 介

RNA 切断の定量化による唾液の抗 HIV-1作用に関する研究
Study on the anti-HIV-1 activity oforal fluid by quantitation of RNAcleavage

イマーの位置の定量値は同じになるはずである。一方，
RNA が途中で切断されていれば，そこの部分で逆転写反応が止まる。つまり，RNA が損傷していれば各プライマー部位の定量値は下流に行くに従い減少することになる。つまり CT 値の傾きが大きいほど RNA の切断が起こっていると考えられる。
B. RNA 精製

新潟大学大学院医歯学総合研究科顎顔面口腔外科学分野

RNA 抽出キット QIAamp® MinEluteTM Virus Spin

村山正晃

Kit（QIAGEN，以下 MinElute）を用いて RNA を精製

Division of Oral and Maxillofacial Surgery, Niigata University
Graduate School of Medical and Dental Sciences

Masaaki Murayama

した。
C. 逆転写反応（RT）
55℃で 30 分逆転写を行った後に 72℃で 10 分間反応させた。反応後，逆転写酵素を失活させるために 72℃【目で 10 分間の処理を行った。

的】D. リアルタイム PCR
AppliedHIV（human immunodeficiency virus） は 血 液 だ け

Biosystems

StepOnePlusTM リアルタイム

PCR システムにより TaqMan プローブを用いて A 点，でなく母乳，精液，膣分泌液，唾液，汗，涙などの体液B 点，C 点におけるリアルタイム PCR の CT 値を基ににも存在することが知られている。
これらの体液のうち，定量値を算出した。

血液，母乳，精液，膣分泌液を介して感染が成立するこE. 様々な処理による LAI RNA および 8E5 の損傷度のとは実証されているが，これまで唾液を介した感染であ検討ることを示す明らかな報告はない。
そこで今回私たちは，各実験について３回ずつ測定を行い，平均値と標準偏唾液の低感染性の原因が唾液中の HIV-1 ウイルス粒子差を求めた。の中の RNA が損傷を受けることにあるという仮説を立①

HIV-1 RNA の抽出・精製に伴う損傷度の評価て，それを検証するために，HIV-1 RNA の人為的逆転

LAI RNA を含む溶液を出発物質として，MinElute

写産物をいくつかの箇所でリアルタイム PCR により定を用いて RNA を精製した場合と，精製しなかった場合量する系を確立し，唾液中ウイルス RNA の損傷度を評について，それぞれ RT- リアルタイム PCR を行って，価する方法を開発したので，その詳細について報告する。

各プライマー部位における CT 値を求めた。
②【材料と方法】

逆転写反応の伸長度の評価
逆転写反応の伸長度を評価するにあたり，LAI RNAを T 7 プロモーター配列を含む PCR プライマーを用い１．材料て，今回設定した A~C の３箇所のプライマー部位を含標準 HIV-1 RNA として，感染性がないことが確認さ

む PCR 産 物 を 作 製 し た（ 以 下 T7 DNA）
。 こ の T7

れている HIV-1 株 8E5（以下 8E5）と，8E5 から精製しDNA を 鋳 型 と し て，T7 RiboMAXTM Express Large

たウイルス RNA（以下 LAI RNA）を用いた。

Scale RNA Production System （Promega） を用いて

２．方法
A. プライマーの設定と CT 値の傾きの意義
HIV のゲノムには，gag，pol，env という３つの主要遺伝子がある。そのうち HIV 遺伝子検査の標的とされており，比較的変異が少ない gag 遺伝子内の３箇所にリアルタイム PCR による定量のためのプライマーおよびプローブを設定した。図１に定量法の概要を示す。
もし RNA が完全で逆転写が 100％伸びていれば各プラ－ 67 －

図１

HIV-1

RNA 鎖の損傷度の測定原理

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新潟歯学会誌

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：2013

RNA を合成した（以下 T7 RNA）
。そして，T7 DNAと T7 RNA をそれぞれ RT- リアルタイム PCR を行って CT 値を求めた。
③

紫外線照射による損傷度の評価
紫外線照射装置 LAI RNA に紫外線を０，１，２，４，８分間照射し，RT- リアルタイム PCR で定量した。
④

唾液成分による損傷度の評価
唾液検体は健常人の全唾液とし安静時に採取（吐唾法）したものを用いた。得られた唾液検体は 70℃で 20 分間の熱処理を行ったものと，熱処理を行っていないものに分け，それぞれの唾液に 8E5 あるいは LAI RNA を添

図２ 唾液中における HIV-1 ウイルス粒子の分解過程モデル

加 し，37 ℃ で ０，2.5， ５，10 分 間 静 置 し た 後 にMinElute による RNA 精製を行った。得られた抽出液

で，RNA の損傷度を定量的に測定可能であることが示に RT- リアルタイム PCR を行って CT 値を求めた。

された。

F. 統計解析④唾液による影響の評価

リアルタイム PCR 定量値の検討には回帰分析を行っ

熱処理をしない場合の 8E5 株は，CT 値の傾きは処理た。解析ソフトは Statcel-The Usefull Addin Forms on

時間とともに次第に増大した。LAI RNA は５分以降でExcel を用いた。

まったく検出されなくなった。熱処理をした場合，8E5は CT 値の傾きは時間経過によらず０に近かった。LAI【結果と考察】RNA は，熱処理を行っていない唾液と同様に，RNA は５分以降でまったく検出されなくなった。

①すなわち唾液の中には，遊離ウイルス RNA を急速にHIV-1 RNA の抽出・精製に伴う損傷度の評価
精製する前の RNA と精製後の RNA はどちらも CT切断する熱に安定な活性と，ウイルス粒子の中の RNA値の傾きが０に近く有意差がなかった（P ＝ 0.48）。この切断に関与する熱不安定な活性が含まれることが示唆

れは RNA 精製時に RNA 鎖の切断は起こっていないこされた。前者は RNA 分解酵素であり，後者はウイルスとを示している。

粒子の構造を部分的に破壊する糖分解酵素やタンパク質②分解酵素と思われる。

逆転写反応の伸長度の評価
T-7 DNA と，T-7 RNA の CT 値の傾きを比較すると，以上の結果から，唾液中のウイルス粒子内 RNA が損どちらも０に近く有意差がなかった（P ＝ 0.72）。すな

傷を受ける機構として次のようなモデルが考えられる。

わち逆転写の伸長は測定領域の端までほぼ 100％起こっ

唾液中に存在するプロテアーゼあるいはグリコシダーゼていると考えられた。などの酵素の作用によりウイルス粒子が部分的に破壊さ③れる。次にそのゆるんだ構造を利用して RNA 分解酵素

紫外線照射による損傷度の評価
核酸は紫外線を照射することにより無作為に切断されが侵入し，ウイルス RNA が切断される。その結果，ウることが知られている。紫外線照射による損傷度の評価

イルスの感染性は消失する。一方，遊離した RNA の場において，紫外線照射の時間経過に伴い傾きが増加した。

合は，RNA 分解酵素による RNA 切断がいったん開始

すなわち今回設定した３箇所のプライマー部位を含む領されると，RNA 鎖全長にわたって急速に進行すると考域において RNA が次第に切断されていくことがわかっえられる（図２）。

た。以上より，今回私達の確立した実験系を用いること－ 68 －