2024 年 4 ⽉ 5 ⽇
報道関係者各位
国⽴⼤学法⼈筑波⼤学
国⽴⼤学法⼈富⼭⼤学
公⽴⼤学法⼈横浜市⽴⼤学
⼤学共同利⽤機関法⼈⾃然科学研究機構⽣命創成探究センター
⼤学共同利⽤機関法⼈⾃然科学研究機構⽣理学研究所

⽣きた細胞内で⼩胞の動きを可視化し、２種類の⼩胞融合機構を発⾒マウス胚を包む卵⻩嚢の細胞を⽤いて、細胞内で物質の輸送などを⾏う⼩胞を蛍光物質で標識し、これが融合する過程を可視化する技術を開発しました。これにより⼩胞の融合過程を観察したところ、融合には２つの異なる様式があること、また、その制御に細胞⾻格アクチンが関与することを⾒いだしました。

細胞は、外界から物質を取り込み、エンドソームと呼ばれる⼩胞に包んで細胞内を輸送します。輸送
過程で、⼩胞は、⼩胞同⼠、あるいは他の細胞内⼩器官と融合しますが、多くの細胞ではそのサイズが⼩さいために融合過程を観察することが難しく、その制御機構はよく分かっていませんでした。
本研究では、マウス胚の⼀番外側にある臓側内胚葉細胞に着⽬し、蛍光物質でエンドソームを標識することにより、顕微鏡下でその融合過程を観察することに成功しました。これにより、エンドソームの融合には、２つのエンドソームが急速に融合して１つの⼩胞になる「同型融合」と、リソソームにゆっくりと吸収される「異型融合」の２種類の様式があることを⾒いだしました。膜の⼒学モデルを⽤いて⼩胞融合過程の数理解析を⾏ったところ、⼩胞のサイズが融合様式を決めており、⼩胞が⼩さい時は同型融合が、⼩胞が⼤きくなると異型融合が起こること、また、⼩胞の膜にゆらぎの⼒を作⽤させると、⼤きなサイズでも同型融合が起こることが分かりました。エンドソームにはアクチンと呼ばれる細胞⾻格タンパク質が結合しており、アクチンが同型融合を促進するゆらぎの⼒を発⽣させていると考えられました。さらに、アクチンのターンオーバーを促進するコフィリンや、アクチンと相互作⽤するミオシンも⼩胞融合に重要であることが明らかになりました。この観察系を⽤いることにより、細胞内⼩胞の融合や輸送の過程を制御する仕組みを解明できると期待されます。

研究代表者
筑波⼤学医学医療系
桝 正幸 教授
富⼭⼤学⼤学院⽣命融合科学教育部
⼩池 誠⼀ 特命助教
横浜市⽴⼤学理学部
⽴川 正志 准教授
⾃然科学研究機構⽣命創成探究センター／⽣理学研究所
根本 知⼰ 教授

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研究の背景細胞は、外界から栄養物質などを取り込んで利⽤します。この働きをエンドサイトーシス注１）と呼び、細胞膜が細胞質内に引き込まれて物質を取り込んだり、細胞外液ごと物質を細胞内へ取り込んだりします。取り込まれた物質は、エンドソーム注２）と呼ばれる⼩さな袋状の構造に包まれて、細胞内⼩器官注３）へと輸送されます。エンドソームは、取り込んだ物質の仕分けを⾏い、リソソーム注４）などの細胞内⼩器官への輸送を担っています。エンドソームなど膜に包まれた袋状の構造（⼩胞）を介した物質の輸送（⼩胞輸送注５））は細胞機能の根幹を成すものであり、その仕組みを知ることは細胞を理解するために重要です。⼩胞輸送の過程で、細胞内⼩胞は、⼩胞同⼠、あるいは他の細胞内⼩器官と融合しますが、多くの細胞では⼩胞のサイズが⼩さいため顕微鏡で個々の融合過程を観察することが難しく、融合を制御する仕組みはよく分かっていませんでした。
研究内容と成果
本研究では、発⽣の早い時期（胎⽣ 8.5 ⽇頃）のマウス胚を⽣きたままの状態で取り出して、エンドソームを標識する蛍光物質を取り込ませた後に、顕微鏡を⽤いて観察しました。この⽅法により、マウス胚の⼀番外側にある卵⻩嚢注６）の臓側内胚葉細胞と呼ばれる細胞内でのエンドソームの融合を観察することに成功しました。臓側内胚葉細胞は、胎盤が出来上がる前に、⺟親の⼦宮から胚へ多くの栄養分を運ぶ役割があるためにエンドサイトーシスが活発で、細胞内に⾮常に⼤きなエンドソームを持つため、観察が容易です。また、臓側内胚葉細胞では、頂端部からエンドサイトーシスによって物質を取り込み、それを細胞内の深い層にあるリソソームで分解し、分解された栄養物質を細胞底部から分泌して胚に届けていることが知られています（図１）。今回開発した⼿法を⽤いて臓側内胚葉細胞を観察したところ、後期エンドソームの融合には、エンドソーム同⼠が融合する「同型融合」注７）と、エンドソームとリソソームが融合する「異型融合」注７）の２種類の融合様式があることを発⾒しました。同型融合では、２つの後期エンドソームが接触して⼩孔が形成されると急速にその孔が拡⼤して１つの⼩胞になるのに対し、異型融合では、後期エンドソームとリソソームの間に形成された⼩孔が拡⼤せず、後期エンドソームがゆっくりとリソソームに吸収されていく様⼦が観察されました（図２）。⼒学モデルを⽤いて⼩胞が融合する過程の数理解析を⾏ったところ、主に⼩胞のサイズが融合様式を決定しており、サイズが⼩さい場合は同型融合が、⼤きな場合には異型融合が起こることが分かりました。臓側内胚葉細胞の後期エンドソームは⼤きく、理論上は異型融合が起こるはずですが、その場合でも膜に細胞⾻格やモータータンパク質注８）からの「ゆらぎの⼒」注９）を作⽤させると、サイズの効果に打ち勝ち、同型融合を誘導できることも⽰されました。
さらに、レーザー共焦点顕微鏡を⽤いて臓側内胚葉細胞の⼩胞の構造を詳しく調べたところ、後期エンドソームの表⾯にアクチン注 10）と呼ばれる細胞⾻格タンパク質が結合しており、後期エンドソームに結合しているアクチンは、細胞の頂端部から底部へ向けて伸びる線維と、後期エンドソームから放射状に周囲に伸びる線維の 2 種類があることが分かりました（図３）。アクチンは、筋⾁細胞でミオシン注 11）と共に働き、筋⾁の収縮に関わることは知られていますが、筋⾁以外の細胞にも存在し、形態形成、細胞分裂、⼩胞輸送などさまざまな⽣物現象に関与しています。薬物を⽤いてアクチンの重合を阻害すると、同型融合の頻度と速度が減少し、⾼濃度の薬物を作⽤させると異型融合に似た融合様式になることから、アクチンが同型融合を促進する⼒を発⽣させていると考えられました。さまざまなミオシン阻害薬を投与すると同型融合と異型融合の頻度がいずれも減少することから、筋⾁以外の細胞で働く種類のミオシンが⼩胞融合に必要なことが分かりました。さらに、アクチンを切断して重合・脱重合のターンオーバーを促進するタンパク質であるコフィリン注 12）の機能を阻害すると同型融合の頻度が減少することから、コ2フィリンによるアクチン動態の制御が⼩胞融合に重要だと考えられました。
今後の展開
⽣きた細胞内でエンドソームが融合する過程を可視化する実験系を確⽴したことで、⼩胞融合を制御する分⼦機構を調べることが可能になります。特に、マウス初期胚は、培養しながら各種薬物を作⽤させることができるため、細胞内で働く分⼦の働きを活性化したり阻害した時の効果を調べると、⼩胞融合を調節する仕組みを解明できます。また、さまざまな遺伝⼦改変マウスの胚を⽤いることで、おのおのの遺伝⼦の⼩胞輸送における役割を明らかにすることができます。
⼩胞輸送に異常が⽣じると、神経疾患、免疫疾患、糖尿病などが起こることが知られており、本研究は基本的な細胞機能だけでなく、さまざまな疾患の発症メカニズムの解明にもつながると期待されます。
参考図

図１ エンドソームの可視化
妊娠８⽇⽬のマウス胚を蛍光物質で標識した後、臓側内胚葉細胞を顕微鏡観察すると、細胞外から取り込まれた物質が、初期エンドソーム、後期エンドソームを経てリソソームへ運ばれる様⼦が観察された。

3図２ エンドソームの２種類の融合様式
エンドソームの融合には、２つのエンドソーム（緑⾊）が急速に合体して１つの⼩胞になる同型融合（上段）と、エンドソームがゆっくりとリソソーム（⾚⾊）に吸収されていく異型融合（下段）があることが分かった。この２種類の融合は、⼒学モデルを⽤いた数理解析で予想されたものとよく似ていた。

図３ 本研究で明らかになった⼩胞融合機構
臓側内胚葉細胞の中では、最初に表層で同型融合が起こり、次いで深い層で異型融合が起こる。⼩胞の融合には、後期エンドソームの表⾯に結合しているアクチン線維を介した⼒が必要であり、アクチンの働きを調節するタンパク質も重要な役割を担っていることが分かった。

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⽤語解説
注１） エンドサイトーシス細胞が細胞外から物質を取り込むこと。極性を持つ⼤きな分⼦は脂質⼆重層である細胞膜を通り抜けることができないため、細胞膜上の受容体に結合した形で細胞膜が細胞質内に引き込まれたり、細胞外液ごと⼩胞内に取り込むことにより、物質が細胞内へ取り込まれる。
注２） エンドソーム
細胞内⼩胞の⼀つ。エンドサイトーシスによって細胞内へ取り込まれた物質の選別・輸送に関わる。形態的・機能的特徴から、初期エンドソーム、後期エンドソーム、リサイクリングエンドソームに⼤別される。初期エンドソームは取り込んだ物質の仕分けを⾏い、後期エンドソームはリソソームと融合することにより内容物を分解に導く。リサイクリングエンドソームは、⼀度取り込んだ物質を再び細胞外へ戻す。
注３） 細胞内⼩器官
真核⽣物の細胞内に存在する⼩胞体、ゴルジ体、ミトコンドリアなどの⽣体膜で区画された構造。タンパク質の合成・修飾やエネルギー産⽣などの役割を担う。いずれも⽣体膜で覆われており、おのおのの細胞内⼩器官で必要な物質の交換は⼩胞輸送により⾏われる。
注４） リソソーム
物質の分解を⾏う細胞内⼩器官。膜に包まれた構造で、内部に多数の加⽔分解酵素を持ち、タンパク質、糖、脂質などを分解し、再利⽤に供する。
注５） ⼩胞輸送
細胞内で⼩胞を介して物質を輸送する仕組み。真核細胞内には細胞内⼩器官があり、各細胞内⼩器官で必要な物質は、脂質⼆重膜から成る⼩さな袋（⼩胞）に梱包して輸送される。細胞内⼩器官の膜から⼩胞が出芽し、細胞内を移動して別の細胞内⼩器官に融合することを繰り返して、細胞は物質を輸送する。2013 年、⽶国の研究者 3 名がこの制御機構を発⾒し、ノーベル⽣理学・医学賞を受賞した。
注６） 卵⻩嚢
発⽣初期に胚を包んでいる膜構造。胚の外側に位置し⺟体組織に接している臓側卵⻩嚢は、２層の細胞層から成る。外側の層にある臓側内胚葉細胞は、胎盤が完成するまでの間、⺟胎から胚へ栄養を供給し、内側の層にある中胚葉細胞では、体の中で最初に⾎液細胞が作られる。
注７） 同型融合と異型融合
後期エンドソーム同⼠の融合のように、同じタイプの⼩胞が融合することを同型融合と呼び、後期エンドソームがリソソームに融合するように、異なるタイプの⼩胞が融合することを異型融合と呼ぶ。
注８） モータータンパク質
ＡＴＰ加⽔分解のエネルギーを⽤いて細胞内で⼩胞輸送、細胞内⼩器官の移動、細胞の収縮、染⾊体の分離などの運動を担うタンパク質の総称。
注９） ゆらぎの⼒
ここでは、膜の変形を引き起こす⼒に相当する数理モデルにおける変数を指す。
注１０） アクチン
細胞⾻格を形成するタンパク質の⼀つであり、単量体の球状アクチンがらせん状につながって線維状アクチンを形成する。筋⾁細胞ではミオシンとともに筋⾁の収縮を引き起こすが、筋⾁以外の全ての細胞にも存在し、⼩胞輸送、形態形成、貪⾷など多様な細胞機能に関与している。アクチンを重合または脱重合する因⼦の働きにより機能が調節されている。

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注１１） ミオシン
アクチン上を運動するモータータンパク質。多くの種類があり、筋収縮、細胞の運動、⼩胞輸送などの役割を担う。
注１２） コフィリン
アクチン線維の切断、脱重合を引き起こすタンパク質。アクチン線維のターンオーバーを促進する。
研究資⾦
本研究は、科研費による研究プロジェクト（17024006、JP22H04926）および武⽥科学振興財団研究助成の⼀環として実施されました。⾼解像度顕微鏡解析は、科研費「学術変⾰領域研究（学術研究⽀援基盤形成）」の「先端バイオイメージング⽀援プラットフォーム」の⽀援を受けて実施されました。
掲載論⽂【題 名】 Actin dynamics switches two distinct modes of endosomal fusion in yolk sac visceralendoderm cells（アクチンのダイナミクスが卵⻩嚢臓側内胚葉細胞における２つの異なるエンドソーム融合様式を切り替える）【著者名】 Seiichi Koike12,3, Masashi Tachikawa4,5, Motosuke Tsutsumi6,7, Takuya Okada1,2, Tomomi
Nemoto6,7, Kazuko Keino-Masu1,2, Masayuki Masu1,2
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Graduate School of Comprehensive Human Sciences, University of Tsukuba

2Department of Molecular Neurobiology, Institute of Medicine, University of Tsukuba

3

Laboratory of Molecular and Cellular Biology, Graduate School of Science and Engineering for Research,

University of Toyama
4Graduate School of Nanobioscience, Yokohama City University

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PRESTO, Japan Science and Technology Agency

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Exploratory Research Center on Life and Living Systems (ExCELLS), National Institutes of NaturalSciences
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National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences【掲載誌】 eLife【掲載⽇】 2024 年 3 ⽉ 18 ⽇（オンライン先⾏公開）【DOI】

10.7554/eLife.95999

問合わせ先【研究に関すること】
桝 正幸（ます まさゆき）
筑波⼤学 医学医療系 教授
URL: https://trios.tsukuba.ac.jp/researcher/0000001641【取材・報道に関すること】
筑波⼤学広報局
TEL: 029-853-2040
E-mail: kohositu@un.tsukuba.ac.jp6富⼭⼤学総務部広報・基⾦室
TEL: 076-445-6028
E-mail: kouhou@u-toyama.ac.jp
横浜市⽴⼤学総務課広報担当
TEL: 045-787-2414
E-mail: koho@yokohama-cu.ac.jp
⽣命創成探究センター研究戦略室
TEL: 0564-59-5203
E-mail: press@excells.orion.ac.jp
⽣理学研究所研究⼒強化戦略室
TEL: 0564-55-7723
E-mail: public@nips.ac.jp

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