別刷

Tsukita K, et al： Sci Adv, 9： eadf6358, 2023

微小管依存的なアクチン核形成因子の液 - 液相分離による，時空間的な上皮バリア制御
月田和人，北又学，田村淳，月田早智子

上皮バリアの絶え間ない調節は，常に変化し続ける生体外環境に対して，生体内環境の恒常性を保つために必須であるが，その機構については不明な点が多い．われわれは，アクチン重合核形成促進因子 cordonbleu（Cobl）が，微小管依存的に液 - 液相分離を起こすことで，上皮細胞間接着部位のアクチン線維束を発達させ，時空間的に細胞接着を制御することを見出した．

体内には，腸・肺・脳という大きな区画から，毛細だけでなく微小管とも密接に関連することが報告され血管のような小区画まで，大小さまざまな区画（生体てきた 4）〜 6）．微小管を退縮させると，TJ の細胞間バリコンパートメント）がある．生体コンパートメントにア機能も低下することから，微小管を介しての Cldn 重共通することは，上皮細胞シートがこれを内包し，バ合制御によるTJ 細胞間バリア機能制御の重要性も示唆リアとして機能する，ということである．上皮バリアされてきたが，その分子機構について多くが未解明では，さまざまな形態をとりながら，絶えず変化する外あった ．そこでわれわれは液 - 液相分離という現象に部刺激に適応し，内部環境をおのおの至適状態に維持注目し，Cobl が微小管，CR，AJC を密接につなげ，上している．

皮バリアを時空間的に制御することを明らかにした．

上皮バリアは ，細胞のアピカル面細胞膜 （頂端膜）と，細胞間に存在するタイトジャンクション（TJ）とアドへレンスジャンクション（AJ）で構成される apical

アクチン重合核形成促進因子 Cobl は，AJC直下に濃縮する微小管関連タンパク質である

junctional complex（AJC）により形成される．重要な微小管と AJC 間の相互作用の分子機構を明らかにすことに，AJC は，AJC 直下のアクチン・ミオシン線維るために，われわれは独自に単離した AJC 濃縮分画か束〔細胞を1 周取り囲むことから，circumferential ring

ら ，微小管に結合するタンパク質の探索を網羅的に（CR）とよばれる〕と密に結合し，CR はその発達度合行った．そして，AJC 直下に濃縮する微小管関連タンいを微調整しながら，AJC に適切な緊張を与え，TJ のパク質として同定されたのが，アクチン重合核形成促接着分子クローディン（Cldn）の重合で構築される TJ進因子として知られていた Cobl であった．培養上皮細の細胞間バリア機能を時空間的に制御する．一方胞・マウス組織上皮細胞の双方において ，「Cobl は ，で，われわれのグループを含め，AJC はアクチン線維

AJC 直下に局在し，アクチン線維・微小管と密接に関1）〜 3）

Phase separation of an actin nucleator by junctional microtubules regulates epithelial function

Kazuto Tsukita 1）2）/Manabu Kitamata 1）/Atsushi Tamura 1）〜 3）/Sachiko Tsukita 1）：Advanced Comprehensive ResearchOrganization, Teikyo University1）/Department of Neurology, Graduate School of Medicine, Kyoto University 2）/Department（帝京大学先端総合研究機構 1）/ 京都大学大学院医学研究科臨床神経of Pharmacology, Teikyo University School of Medicine3）
学 2）/ 帝京大学医学部薬理学講座 3））

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AB

TJ
AJC
微小管脱重合

AJ

微小管
アクチン
Cobl

Cobl の液 ‑ 液相分離による「つぶ」の消失

アクチン
ミオシン
クローディンE- カドヘリン
Cobl
微小管

CR 退縮

Cobl-KOCobl の消失
CR 退縮

AJC バリア機能の低下

図 1 Cobl は，AJC 直下で，微小管依存的に「つぶ」として存在し，AJC バリア機能を調節する

A）Cobl の局在を示す模式図．AJC 直下には，アクチンとミオシンで構成されるアクチン・ミオシン線維束（CR：circumferential ring）が存在する．Cobl は「つぶ」を形成し，CR に局在する．B）上皮細胞における Cobl の機能低下が引き起こす表現型をあらわす模式図．Cobl は微小管依存的に「つぶ」を形成する．微小管の脱重合により，この「つぶ」の形成が阻害されると，Cobl ノックアウト（KO）と同様の表現型（CR の退縮と AJC バリア機能の低下）を示す．
（主論文より引用）

連する」ことが見出された（図 1A）．

細胞において微小管をノコダゾール処理で退縮させた
ところ，驚くべきことに，Cobl の「つぶ」が消失する

Cobl は液 - 液相分離を起こし，それは，微小管依存的に促進されることを見出した．さらに in vitro においても Cobl の液 液相分離を起こす閾値濃度は，微小管の存在下で減少上皮細胞の蛍光抗体染色像の観察から，Cobl は，「つぶ」を形成していた．Cobl のアミノ酸配列は天然変性領域（intrinsically disordered regions）を豊富に含むことが予測され ，一部の天然変性領域が液 - 液相分離を誘導することが知られていることから，Cobl が液 液相分離を起こしている可能性が考えられた．

することが確認され，「微小管は C o b l の液 - 液相分離を促進する」ことが見出された．

微小管は Cobl の液 - 液相分離を促進し，AJC 直下のアクチン線維束を発達させる
ことで，AJC バリア機能を調節する

まず，培養上皮細胞において，ライブイメージング

上皮細胞 AJC におけるCobl 液 - 液相分離の役割を検を用いて Cobl の「つぶ」が融合することを確認し，さ証するために，まず，培養上皮細胞において，Cobl ノッらに，FRAP（fluorescence recovery after photo-クアウト（KO）上皮細胞を解析した．すると，Cobl-bleaching）を用いて Cobl の「つぶ」の内部と外部にKO 上皮細胞では，CR 中のアクチン線維束が顕著に菲ダイナミックな拡散があることを確認した ．さらに ，薄化（減少）することで，C R が退縮し，A J C バリア

in vitro においても同様に Cobl が「つぶ」を形成する機能も低下することが見出された．さらに，ノコダゾー

こと，またこの「つぶ」は融合し，「つぶ」の内部と外ル処理において，通常の上皮細胞では Cobl の「つぶ」部にダイナミックな拡散があることを確認した．よっが退縮すると同時に CR が退縮しはじめること，また，て，上皮細胞に認められる Cobl の「つぶ」は，Cobl のCobl-KO 上皮細胞ではさらなる CR の退縮が認められ

液 - 液相分離によって生じることが見出された．

ないことを確認した（図 1B）．

次に，Cobl と微小管の関連性を確認するため，上皮2152

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次に，Cobl 遺伝子改変マウスとして，Cobl のエキソ
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Cobl/ 微小管

微小管依存的に Cobl の液 ‑ 液相分離が促進され，Cobl のアクチン重合核形成促進作用が増大する液相分離を起こした
Cobl

アクチン /Cobl/ 微小管
＊

＊

08：00

Cobl
微小管

＊

アクチン＊
＊

＊

＊

図 2 Cobl は液 - 液相分離を起こすと，アクチン重合核形成促進作用が顕著に増大するA）微小管（青）上の液 - 液相分離を起こした Cobl（赤）から，アクチン線維（緑）が伸長する様子を捉えた全反射照明蛍光顕微鏡（TIRF）ライブイメージング像．この像では，2 つの Cobl の「つぶ」から計 7 本のアクチン線維が伸長している．B）Cobl
液 - 液相分離と微小管，アクチン線維との関連を示した模式図．
（主論文より引用）

ン 1 とイントロン 1 の境界部分に 84 塩基欠失を示すマ行った．その結果，Cobl のアクチン重合核形成促進作ウス （C o blマウス）を作製した ．この部分は ，用は，微小管を加えると著明に増大することが見出さ

Cobl の微小管結合ドメインに含まれており，in vitro でれた．また，Cobl と G- アクチン，α- チューブリンをCobl混合させ，TIRF による 3 色イメージングを行なったと

Δ84

Δ84/Δ84の機能を検証すると，驚くべきことに，Cobl

Δ84の液 - 液相分離は微小管では促進されないことが判明

ころ，Cobl は主に微小管上で液 - 液相分離を起こしてした．そして，Cobl-KO 培養上皮細胞に CoblΔ84 を導「つぶ」を形成し，その「つぶ」からアクチン線維が伸入しても，Cobl は「つぶ」を形成せず，CR は退縮し長していく様子が明確に観察された（図 2A）．微小管たままであり，TJ 細胞間バリアが回復しないことを確は Cobl の液 - 液相分離を促進することで，Cobl のアク認した．さらに，Coblチン重合核形成促進作用を増大させると考えられる．

Δ84/Δ84

マウスの胃の検討を経時的に行うと，成長に伴って胃の上皮バリア機能が低下し，胃炎が引き起こされることが判明した．これにより，培養上皮細胞のみならず，生体内においても，「微おわりに小管は Cobl の液 - 液相分離を促進し，CR を発達させ本研究は，AJC バリア機能にきわめて重要な CR のることで，TJ 細胞間バリア機能を調節する」というこ調整に ，微小管により駆動される液 - 液相分離がかかとが見出された．

わっていることを示したはじめての研究である（図 2B）．

Cobl が，微小管上で「つぶ」を形成すると，そのアクチン重合核形成促進作用が著明に増大する

液 - 液相分離は ，非常に短時間に種々のタンパク質を集合させることができ，TJ 細胞間バリア機能のような絶え間ない微調整が必要な生体機能の調節機構として，非常に理にかなっている 7）8）．今後も TJ 細胞間バリア最後に，多角的に Cobl の液 - 液相分離が，Cobl のア機能への液 - 液相分離のかかわりがさらに解明されてクチン重合核形成促進作用に与える影響を検証した ．

いくことを期待しており ，ひいては ，液 - 液相分離に特に，Cobl と G- アクチン，α- チューブリンを精製し，対して人為的に介入することで，「上皮バリア操作」が全反射照明蛍光顕微鏡（TIRF：total internal reflec-いつの日か可能になることを夢見ている．

tion fluorescence microscope）による種々の検討を実験医学

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文献

本記事の DOI：10.18958/7309-00003-0000546-00

1）Takeichi M：Nat Rev Mol Cell Biol, 15：397-410, doi:10.
1038/nrm3802（2014）2）Rodgers LS & Fanning AS：Cytoskeleton (Hoboken), 68：
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4）Meng W, et al：Cell, 135：948-959, doi:10.1016/j.cell.2008.09.
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5）Kunimoto K, et al：Cell, 148：189-200, doi:10.1016/j.cell.
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7）Beutel O, et al：Cell, 179：923-936.e11, doi:10.1016/j.cell.
2019.10.011（2019）8）Citi S：Curr Biol, 30：R83-R86, doi:10.1016/j.cub.2019.11.060（2020）● 著者プロフィール ●月田和人：2013 年 ，京都大学医学部卒業．5 年間の臨床業務を経て，’18 年
より京都大学大学院医学研究科博士課
程（臨床神経学，髙橋良輔教授）に進学し，’22 年，同修了．博士課程では，
京 都 大 学 にてビッ クデー タを用 いた
データサイエンスを軸にしたドライ研究を行いながら，大阪大学および帝京大学の月田早智子研究室に出向き，上皮細胞を用いたウェット研究を行う．’23 年
より，京都大学大学院医学研究科臨床神経学特定助教．帝京大学先端総合研究機構特任研究員 ．今後はドライ研究とウェット研究を融合させたユニークな研究をめざしている．

僕は ，父親と母親とも上皮細胞基礎研究者であるという特殊な環境で生まれ育ちました ．僕は脳神経内科医なのですが ，まだ僕が小さい頃に父親と母親が常に家でも研究の議論をしていたことが忘れられず ，「両親の研究を少しでも理解したい」という思いで ，全く分野違いの母の研究室の門を叩きました ．すると ，右も左もわからないまま ，まずテーマとして提示されたのが，この「AJC に濃縮する微小管関連タンパク質の機能解析」でした．TIRF の系を立ち上げる部分など，人生で初めての経験ばかりで，論文作成に至るほとんどの行程でつまずき ，時間がかかりましたが ，本当に周りの方々の助けのおかげでなんとか論文掲載にこぎつけることができました ．先に天国に行ってしまった僕の父親はこの論文を読んでなんて言うかな？と思いを馳せています．

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書籍名：実験医学 Vol.41 No.13
使用頁：2151〜2154 頁
著者名：月田和人，北又 学，田村 淳，月田早智子
発行社：（株）羊土社
発行年：2023 年© YODOSHA CO., LTD. 2023