信州医誌，57⑵：63〜70，2009

綜説

新規シナプス後部タンパク質の同定と機能の解明：
特に LRP4研究の進展について鈴木龍雄

信州大学大学院医学系研究科加齢適応医科学系独立専攻
分子細胞学部門神経可塑性学分野

Identiﬁcation and Functional Clariﬁcation ofNovel Postsynaptic Proteins:Progress in LRP4 Research
Tatsuo SUZUKI
Department of Neuroplasticity, Institute on Aging and Adaptation,
Shinshu University Graduate School of Medicine
Key words:postsynaptic density (PSD), dendritic mRNA, LRP4
シナプス後肥厚部，樹上突起に局在する mRNA，LRP4

はじめにたらされる。その症状は，精神機能の低下や異常，神経系の病気などとなって現れる。

ヒトの脳の機能は複雑な神経回路網の働きの上に成脳の高次機能の発現メカニズムを知り，また，神経り立っている。神経回路網を構成する基本素子がシナ系の病気を理解するとともに有効な治療法を見つけるプスである。よく制御された無数のシナプスの正常なためには，シナプス後部におけるシグナル伝達系の制活動があって初めて脳の高次な機能が発現する。シナ御について分子レベルで理解することが必須である。

プスには，その機能を発揮するための多数の分子群がそのためには，未知分子が半数を占め（後述），まだ機能的に配備されている。シナプスは，神経伝達物質完全には全体像が把握されていないシナプス後部タンの放出に関わるシナプス前部と，神経伝達物質を受けパク質群について，新規の分子を発見し，それらの機取った後の細胞内情報処理に関わるシナプス後部の二能を明らかにすることが不可欠である。

つの部分に分かれる。我々は長年シナプス後部に存在す

PSD はシナプス膜直下にある特殊な細胞骨格系で，るシナプス後肥厚部，postsynaptic density （PSD），複雑な細胞内情報処理を効率的に行う細胞内装置であの分子構築やそこでの情報処理のメカニズムを研究しる。PSD は電子顕微鏡で見ると，その分子密度の高てきた。シナプス後部では，神経伝達物質からの情報さを反映して一様に染まってしまい，内部の微細構造を受容体が受け取ったあと，様々な分子間の反応が引は判別しにくい（図１）。特殊な細胞骨格系である

き起こされて細胞内情報が処理される。その反応が集PSD は，短時間でも変化を起こすダイナミックな構中して効率よく，しかも巧妙に制御された形で行われ造体である。シナプス伝達に関わる情報処理反応はる場の一つとしてシナプス後肥厚部が 存 在 す る。

PSD 周辺ばかりでなく，場合によっては核にまで伝PSD を構成する分子種の数は数百から千のオーダー達され，遺伝子発現の変化をも引き起こし，逆に，に及ぶと見積もられる。それらの多数の分子の働きにPSD は核からのフィードバックを受ける。筆者らはよって正常なシナプス後部機能が発揮される。逆に，シナプス後部に存在する新規のタンパク質の網羅的なそれらの分子の異常により，シナプス機能の破綻がも同定とそれぞれの分子の機能の解明を目指して研究を別刷請求先：鈴木龍雄

松本市旭３‑１‑１信州大学大学院神経可塑性学分野

No. 2, 2009〒390‑8621

行ってきた。

63

鈴 木 龍 雄

図１ シナプス部位の電子顕微
鏡写真
矢印はシナプス後肥厚部。一個のシナプス棘が一本の樹状突起から出ているのが分かる。

シナプス終末棘樹状突起

新規 PSD タンパク質の網羅的同定の方法別する）。Dem mRNA は樹状突起（dendrite）内で局所翻訳されて，産物（Dem protein）はシナプス後細胞内には核周囲での翻訳系の他に，細胞内局所翻部のいろいろな場所に輸送・配備される。従って，訳系が存在している。神経細胞の樹状突起においてもDem を同定することにより PSD を含むシナプス後部この仕組みが備わっている。mRNA，リボソーム，タンパク質の同定がなされることになる。ラットの脳小胞体などの翻訳系の基本的エレメントのほか，翻訳から Siekevitz の方法により PSD 画分を分離し，そ系の制御に関わる様々な分子もほとんどシナプス後部こに含有されている mRNA 種を，塩基配列を片端かの局所翻訳系に備わっている 。シナプス後部の局ら決めることにより同定した。もう一つの網羅的方法

所翻訳系は，シナプス可塑性の発現，特に長期増強としてジーンチップマイクロアレイを用いて Dem（Long‑term potentiation，LTP）の遅い相や記憶の。
mRNA を包括的に同定，解析した（図２）固定のプロセスなどに関与しているといわれる。この系により，① シナプス入力に対してすばやいタンパ

PSD 画分付随 mRNA

ク質合成，② シナプス入力部に限局したタンパク質最初の試行で，PSD 画分に含まれる mRNA650種合成が可能となる。また，③ 細胞体からタンパク質を精製し，そのうち約320種の cDNA 断片をクローニを運搬する場合に比べ，mRNA を運搬して同量のタングした。それらのうち，未知の Dem 候補遺伝 子ンパク質を供給する場合の方がエネルギー効率は，は（得られた断片配列がデータベース上で同定できないるかに優れていると考えられる。

もの）は121クローンであった。詳細は省略するが，未同定の PSD タンパク質を明らかにするための方法のうち，現在最も主流となっているのは，PSD 画

PSD 画分に付随する mRNA 種のうちの多くが真のDem である可能性が高い。

分のプロテオーム解析である。現在では，PSD 分子

ジーンチップでの解析には Aﬃmetrix 社のチップのプロテオーム解析は，世界各所の研究機関でほぼ完（Rat Expression Array 230A）を用いた 。ジーン了している。筆者らは，新規分子を網羅的に効率

チ ッ プ 解 析 に よ り，PSD 画 分 に 偏 っ て 存 在 す る

よく見つけるためには新しい方法を用いることが不可

mRNA 種が多数あることがわかった。この解析に基欠であると考え，シナプス後部の局所翻訳系に着眼しづいて，PSD 画分特異的遺伝子777種，PSD 画分にた網羅的同定法 を確立した。

高濃度に濃縮された遺伝子115種（濃縮率［前脳全体

シナプス後部に局在する mRNA 種をここでは総括における発現強度に対する PSD 画分での発現強度のして Dem（a molecule whose mRNA is localizing in比］
＞４），774種（同＞2.4），1,370種（同＞2.4）を 同the dendrite）という（時に Dem mRNAとして Dem定した。PSD 画分付随 mRNA がコードするタンパ

protein［Dem mRNA から翻訳される protein］と区ク質種の概要を図３に示した。特徴を整理する。① レセ

64

信州医誌 Vol. 57

新規シナプス後肥厚部タンパク質の同定

proteinfunctionpublications

synGAPβ

GAP for ras

LRP4

LDL receptor family

synUSP
NIDD
synArfGEF
r‑p55

de‑ubiquitinating enzyme
nNos‑binding, palmitoyltranasferase?
GEF for Arf
scaﬀolding

Li et al., 2001
M oon et al., 2008
Tian et al., 2006,
Lu et al., 2007
Zisman et al., 2007
Zhang et al., 2008
Tian et al., 2003
Saitoh et al., 2004
Inaba et al., 2004
Zhang et al., 2005

TANC

scaﬀolding

BAALC1‑6‑8CaM KII‑binding

図２

PSD 画分付随 mRNA の解析プロセス

Terada et al., 2007
Suzuki et al., 2005,
Nonaka et al, 2008
Wang et al., 2005と成果

図３ PSD 画分付随 mRNA の内訳 ，classiﬁed protein の内訳
論文10）に基づく。現在ではデータベースの更新により比率はやや異なる。
No. 2, 200965

鈴 木 龍 雄

プターをコードする mRNA が PSD 画分に高度に濃内シグナル伝達系に繫がるある種のレセプターで，エ縮されている。② シグナル分子をコードする mRNA

ンドサイトーシスに関わると予想されている。脳では，が PSD 画分に多量存在し，かつ高度に濃縮されていLDL receptor ファミリーメンバーは，単にリポタンる。③ Cytoskeletal/scaﬀold/cell adhesion 分 子，パク質の取り込み受容体として働いているばかりでな

channel/transporterおよびkinase/phosphataseをコー

く，下流へのシグナル伝達，アミロイド前駆体タンパ

ド す る mRNAsが PSD 画 分 に 多 量 存 在 し，か つ 濃ク質（APP）やアミロイド βタンパク質（Aβ）の取縮されている。④ house‑keeping タンパク質をコーり込みを介して，シナプス可塑性やアルツハイマー病，ドする mRNAs は PSD 画分には濃縮されていない。

脳の発育に関わっていることが報告されている。

⑤ ribosome タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る mRNAs はLRP4はシナプス後部へのターゲッティングシグナ

PSD 画分に多量存在するが濃縮されてはいない。詳ルを持つ唯一の LDL receptor メンバーであり，筆者

細は論文 を参照されたい。

らの研究により，LRP4タンパク質が，カルボキシルPSD 画分付随 mRNA の解析により，Dem 分子は，末端の PDZ ドメイン結合配列で PSD‑95，SAP97な今まで知られていた以上に多数存在することが示唆さどと相互作用して，シナプス後部に局在することが明れた。我々の Dem プロジェクト開始以前に Dem とらかになった 。また，LRP4は CaMKして知られていた既知分子は，わずか24種ほどであっン酸化基質で，Ser1905のリン酸化により，PSD‑95たが，現在では，前述したように，少なくとも数百かや SAP97との相互作用がネガティブに影響をうけら千のオーダーで存在すると推定されるる 。このことから，シナプス後部の神経活動によっ。この指摘は最近の報告からも支持されるものであるの良いリ。もて LRP4レセプター複合体がダイナミックに制御されう一つ重要な点は，機能や性質が全く調べられていなる可能性が考えられる（図５）。以下にその後，明らいタンパク質をコードする mRNA 種がまだ数百種もかになった LRP4の生理機能について述べる。これま存在している点である。シナプス後部の機能や可塑性でに三種のリガンドを明らかにすることができた。

発現における役割などの正しい理解のためには，これapoE 結合とシナプス構造と神経細胞生存に対すらの mRNA がコードするタンパク質の機能の解明がる LRP4の役割必須である。

筆者らはまず apoE がリガンドの一つである可能性

LRP4 (LDL receptor‑related protein 4)について検討した 。一般に，LDL receptor ファミリータンパク質へのリガンド結合には，レセプターのDem プロジェクトで，当初得られた121個の未知遺生理的な立体構造が重要であることが指摘されていた伝子の中から，現在までに完全長 cDNA が得られた

ので，我々は，Cos7細胞に全長 LRP4を発 現 さ せ，分子が７種類ある（図２Ｂ）。個々のタンパク質につ細胞外から apoE を投与したあと，免疫共沈を行った。

いては，それぞれの論文を参照されたい。本綜説では

この場合，リガンドとレセプターとの結合を化学的にLRP4研究の進展について，筆者らが関与して明らか固定することにより結合を証明することができた。シになった点を中心に述べる。

ナプス部位は周囲をアストロサイトの突起によって囲LRP4は Low density lipoprotein (LDL) receptor

まれており，アストロサイトから放出される液性因子遺伝子ファミリーの新規メンバーであった（注：最初によって調節を受けていると言われている。最近，コに報告された LRP4 とは別物である）
（図４）
。LDL

レステロールがシナプスの形成や機能に必要不可欠なreceptor ファミリーのいずれのメンバーも大きな細成分であることが報告された 。apoE の多くはアス胞外領域に細胞外リガンド結合部位と思われる LDL

トロサイトで産生されるので，シナプスの LRP4はシ（LDLa or リガンド結合
receptor ドメイン クラスＡ

ナプス周囲を囲むアストロサイトから放出されるタイプリピート）を有している。今まで見つかったすapoE/cholesterol を受け取って，シナプスの構造やべてのメンバーに apoE が結合するほか，多数のリガ活性の維持に関わっている可能性が，筆者らの実験かンド結合能を有するメンバーもある。また，カルボキらうかがわれた。実際，LRP4の細胞外ドメインに対シル末端側の短い細胞質ドメインにはエンドサイトーする抗体を培養液に加えて LRP4の apoE 結合をブシスに関わるコート小胞への集積シグナルがある。こロックすると，シナプス構造が壊れてしまう 。シナプのような構造から，このメンバータンパク質は，細胞ス後部に局在する LRP4の生理機能の一つは，apoE/66

信州医誌 Vol. 57

新規シナプス後肥厚部タンパク質の同定
Protein nameLigands

functionslipoprotein/cholesterol uptake
lipoprotein uptake, APP processing, intracellularsignaling, synaptic transmission
defect ‑＞ holoprosencephary, VD deﬁciency

LDLR
LRP1

ApoB, E, LDL
ApoE, α2‑MG, APP etc (＞30)

LRP2 (Megalin/gp330)

ApoB, E, J, H, etc

VLDLR

ApoE, Reelinrole in neuronal migration (embryo), especially in
cerebellum

LRP8 (ApoER2)

ApoE, Reelin

LRP1b
LRP4?
ApoE, F‑spondin, agrinrole in neuronal migration (embryo), especially inhippocampus and neocortex?
axonal guidance, synaptogenesis in muscle, ﬁnger
development

LRP5 (＝LRP7)
LRP6

Wnt proteins, dickoph proteins (?) bone formation, occular embryonic development
Wnt proteins, dickoph proteins
Wnt signaling, caudal paraximal mesoderm,mid‑andhindbrain development etc.
ApoE, Head activator peptide
Head regeneration in hydra, neurodevelopment

LRP11/SorLa

図４

図５

LDL receptor family member の特徴とドメイン構造

シナプス後部における LRP4と他の PSD タンパク質との相互作用モデル

コレステロールの受容体として働き，グリア―シナプ今後の研究課題である。

ス相関を媒介することであると考えられる。さらに，

Muscle でのシナプス形成における LRP4の役割

LRP4はコレステロールの取り込みに関わるほかにも，2005〜2007年にかけて，LRP4遺伝子の異常による多彩な機能を脳で果たしていると考えられているが，No. 2, 2009

表現系がマウス，牛で相次いで報告された。ほ67鈴 木 龍 雄ぼ共通して syndactyly（合指症）がみられ，顔面と頭蓋骨の異常も報告された。また，一つの mutation
では神経筋接合部（neuromuscular junction, NMJ）の形成不全が報告された 。
NM J の形成に関しては，運動神経の神経終末から分泌される糖タンパク質 agrinが作用するというagrin 仮説が20年近く前に提唱されていた 。その後，遺伝子改変マウスの解析から NMJ 形成には，Dok‑agrin の他に MuSK（muscle‑speciﬁc kinase）
7，rapsin が必須であることが明らかにされた（これらの遺伝子欠損マウスでは NM J が形成されない）。
しかし，agrin と M uSK は直接結合しないので，神経終末から分泌された agrin がどのようにして筋肉細胞内で MuSK を活性化し，NMJ 形成のシグナル処理がなされるかが不明であった。そこで agrin 分子から MuSK にシグナルを渡す仮想の agrin 結合分子，MASC（myotube ‑associated speciﬁcity component） ，の存在が想定されていたが，長い間，この分子の本体は不明のままであった。近年，LRP4遺伝子異常でも NM Jが形成されないことが明らかになった ことをうけて共同研究者のDr.M ei（Medicalcollege of Georgia, USA）は，LRP4が NMJ に高濃度に局在すること，LRP4が謎の M ASC 分子であり，筋肉細胞における MuSK signaling に関わっているこ

図６

Agrin から MuSK へのシグナルの流れ（モデル）
LRP4は長 い 間 不 明 で あ っ た agrin 受 容 体 で あ った。アグリン存在下では LRP4と M uSK 間の相互作用が増強し，M uSK とダウンストリームのシグナル伝達系の活性化が起きて，AChR のクラスター化が誘導される（文献27から改変）。とを明らかにした（図６） 。このように NM J 形成における LRP4の関与が明らかになった。agrin は脳誘因性断片は ﬂoor plate 腹側の細胞外基質／基底膜にも存在し，その発現抑制により dendrite の発達や（ECM /BM ）に結合する。結果として，commissuralシナプス形成が損なわれるので，中枢神経系のシaxonはﬂoor plateを回避して腹側のECM /BM に沿っナプス形成においても LRP4が関わっていることが想て伸長する。つまり，F‑spondin という一種の分子が像される。

限定分解をうけてその断片が適材適所に分布すること

axon‑guidance における LRP4の役割により，axon guidance が制御される仕組みが明らか

共同研究者の Dr.Klar（Hebrew University,Israel）になった。LRP4はこの過程に関わっている。Klar ら

らは apoE，agrin のほかに F‑spondin が LRP4のリは，Cos7細胞に LRP4を発現させ，共発現させた F‑ガンドとして働いて axon 伸長の進路決定に関わってspondin の TSR‑1‑4ドメイン（F‑spondin の axon 反いることを示した（図７） 。F‑spondin は軸索伸長発性ドメイン）との細胞外表面での共局在により，F‑の進路を決めるガイダンス分子である。F‑spondin はspondin と LRP4の結合性を示した。

底板（ﬂoor plate）に発現し，細胞外に分泌される。
その際，タンパク質分解酵素により限定分解をうけておわりに四つのフラグメントに分かれる。そのうちの二つの断以上，筆者が信州大学へ赴任してから開始し，現在片が神経管背側部から腹側に向かって伸びる交連神経も継続している研究の経緯とその進展をまとめた。現の軸索（commissural axon）に対して反発と誘因性在までに複数の新規シナプス後部タンパク質の性質をという相反する作用を示す。反発性の断片は ﬂoor論文としてまとめることができた。このプロジェクト

plate 細胞表面に分布する LRP4などのレセプター分によって，PSD 画分特異的 mRNA や PSD 画分に高子に結合して一時的に ﬂoor plate に固定される。一方，濃度に濃縮された機能未知のシナプス後部タンパク質68

信州医誌 Vol. 57

新規シナプス後肥厚部タンパク質の同定

図７ 交連ニューロンからの軸索の伸長経路 と交連ニューロン軸索伸長に対する F‑spondin と LRP4の役割
F‑spondin は ﬂoor plate 細胞から分泌され，限定分解をうけ，四つの断片に分かれる。Reelin/spondin domain,TSR5,6domain（TSR6は commissural axon 誘因性。 ＋ で示す）は ﬂoor plate 下面の ECM に結合し，TSR1‑4断片（commissural axon 反発性。 − で示す）は apoER2，megalin や LRP4などの受容体タンパク質に結合して ﬂoorplate cell 背側表面に分布する。F‑spondin 分解産物の誘因性と反発性によって commissural axon の伸長方向が決まる。

が数百から千のレベルで存在することが改めて浮き彫

未知のタンパク質の生理機能の解明をせずしてシナプりになった。つまり，神経科学研究の大きなターゲッ

ス機能や脳の正しい理解は得られない。今後も Demトの一つがここに存在するわけである。それらの機能プロジェクトを強力に推進したいと考えている。

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（Ｈ 20.10.27 受稿）

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