成蹊大学理工学研究報告
J. Fac. Sci. Tech., Seikei Univ.
Vol.45 No.１ (2008) pp.49-50（研究速報）

NAIP および cIAP-1 mRNA によるがん幹細胞探索
吉本秀隆*1，久富 寿*2

Genetic screening of cancer stem cells by fluorescence in situ hybridization
Hidetaka YOSHIMOTO*1, Hisashi HISATOMI*2(Received March 10, 2008)

１．背景

domainおよびRINGドメイン構造を有し，アポトーシス誘導に関与するcaspase-3，-7および-9を阻害する。本研

近年，がん形成は幹細胞から形質転換したがん幹細胞

究では，NAIPおよびcIAP-1 をがん幹細胞探索の指標とを起源とすると考えられている1)。1997年のDickら2)によして用い，肝臓がん組織における両mRNAの発現局在をる白血病幹細胞の発見後，乳がんあるいは大腸がんなど

fluorescence in situ hybridization (FISH)法により確認した。の固形腫瘍においてもがん幹細胞が同定されている3)。
がん幹細胞の発見は，がん治療や治療後の再発に対する２．材料と方法考え方の転換期となった。抗がん剤治療や放射線治療にヒト肝臓がん由来細胞株Huh-7細胞からRNAを抽出し，よりがん細胞が死滅しても，治療終了後に残存したがん幹細胞からがん細胞が分化し，数年後に腫瘍を再構築す

cDNAを合成した。合成したcDNAにPCR溶液 (10×Paqると考えられる。また，術後に残存したがん幹細胞の他

5000TM Reaction Buffer，2.5 mM d(A,G,T)TP (TAKARA

組織への移動に起因してがんが転移する可能性もある。

BIO)，1.0 mM Cy5-dCTP (GE Healthcare)，30 pM Forward

したがって，すべてのがん細胞を死滅させるためには，Primer，30 pM Reverse Primer，0.8 U Paq5000TM DNA

がん幹細胞を特定し，がん治療の標的とする必要がある。

polymerase)を添加し，94℃/30秒，55℃/35秒，72℃/30秒

がん幹細胞を標的とした治療法開発のため，がん幹細胞を1サイクルとしたPCR反応を50サイクル行った (2720の同定が必要である。

サーマルサイクラー)。反応終了後，蛍光色素を修飾したがん幹細胞の特徴の一つとして，細胞死を抑制する抗PCR増幅産物を10% ポリアクリルアミドゲルに供し，電アポトーシス能が挙げられる。近年，生体の恒常性維持気泳動を行った。エチジウムブロマイド染色したPCR増や細胞死および発生調節へのヒト抗アポトーシスタンパ幅産物をUVトランスイルミネーターによって確認した。

ク質(Inhibitor of apoptosis ; IAP)の関与が報告されており

脱パラフィン処理した肝臓組織の連続切片を100 mM，IAP遺伝子を高発現するがん細胞はがん幹細胞である

グ リ シ ン 含 有 PBS に て 洗 浄 し た 。 0.3% Triton X-100

可能性が高い。この性質を利用することにより，がん幹(Wako) 含有PBSにて洗浄後，プロテナーゼK含有TEバッ細胞を特異的に検出できる可能性がある。

ファー(100 mM Tris-HCl，50 mM EDTA，pH 8.0)にてイン4)キュベートした。4% ホルムアルデヒド含有PBSにて後現在，８種類のヒトIAPが同定されており，これらはfamilyを形成している。胎児細胞および多種のがん細胞固定し，PBSにて洗浄した。0.25% 酢酸含有0.1M トリエ

はヒトIAP familyを高発現し，成熟細胞は極微量に発現する。

タノールアミンバッファーにて37℃，5分間インキュベー

本研究では，８種類のヒトIAPの中から比較的発現量

ト 後 ， 50% (v/v) ホ ル ム アミ ド 含有 4 × Saline Sodium

が多い，Neuronal Apoptosis Inhibitor Protein (NAIP) 5)およCitrate溶液 (SSC, 1×SSC: 150 mM NaCl，15 mM クエン

びcellular Inhibitor of Apoptosis Protein (cIAP-1) 6)に注目し酸ナトリウム; pH 7.0)にて37℃で1時間インキュベートた。NAIPは3種のBaculovirous IAP repeat (BIR)ドメインをした。蛍光プローブを94℃で変性後，ハイブリダイゼー有し，apoptosisの最終調節因子であるcaspase-3および-7を阻ション溶液 (40% ホルムアミド，10% デキストラン硫酸，1害する。cIAP-1は3種のBIRドメイン，caspase recruitment

× Dehardt’ 溶 液(0.02% Ficoll (AppliChem) ， 0.02%

polyvinylpyrrolidone (AppliChem)，0.2 mg/mL ウシ血清ア*1：工学研究科応用化学専攻博士前期課程：物質生命理工学科准教授(hisatomi@st.seikei.ac.jp)ルブミン)，4×SSC，10 mM Dithiothreitol，1 mg/mLサケ*2－49－精子DNA)を添加し，37℃で20-50時間インキュベートしがんはモノクローナルな細胞集団ではない可能性が示唆た。ハイブリダイゼーション反応後，2×SSCおよび1×された。一方，NAIPおよびcIAP-1 mRNAが検出されない

SSCで洗浄後，NTEバッファー (500 mM NaCl，10 mM細胞は，がん細胞であるにもかかわらず，抗アポトーシ

Tris，1 mM EDTA，pH 8.0)にてインキュベートした。0.1
×SSCにて洗浄後，MitoTracker® Green FMを添加し，37℃，ス能が低いと考えられる。

1時間インキュベートした。インキュベート後，注射用蒸細胞である可能性を示したことで，これらmRNA陽性細留水で洗浄した。洗浄後，細胞形態および遺伝子発現を胞を標的とした治療法への応用が考えられる。両mRNA共焦点レーザー顕微鏡 (TCS-SL, Leica)にて観察した。

陽性細胞を特異的に死滅させることにより，がんの増殖NAIPおよびcIAP-1 mRNAを高発現する細胞が，がん幹や転移を飛躍的に抑制できる可能性が高い。また，肝臓３．結果以外のがん組織において確認されるNAIPおよびcIAP-1mRNAの高発現も，がん幹細胞由来と推測される。したがん幹細胞探索に用いるNAIPおよびcIAP-1 mRNA 由がって，両mRNAは肝臓がんの治療だけでなく，他の多来Cy-5ラベルプローブを合成した。合成に成功したプロ

くのがん幹細胞を特定するマーカーとして期待できる。

ーブを用い，肝細胞がん組織における両mRNAの発現局

本研究では，がん幹細胞の特徴の一つである多能性を在をFISH解析したところ，NAIPおよびcIAP-1 mRNAの細指標としたNanog 7)およびOct3/4 8)mRNAにてFISH解析胞質局在が確認され，両mRNAを高発現する細胞の点在を行ったが，両mRNAの発現は普遍的であった(未発表デが確認された (Fig.1)。

ータ)。また，これらmRNAではNAIPおよびcIAP-1 mRNAを指標としたFISH解析にて点在した細胞の特異性をさらに高めることが不可能であった。これら結果より，肝幹細胞探索およびがん幹細胞探索において，NanogおよびOct3/4 mRNAは標的として適していないと推測された。
本研究結果により，NAIPおよびcIAP-1 mRNAプローブによるがん幹細胞探索の可能性が示唆された。現在の技術において，組織切片から細胞を取り出し，増殖させることは不可能であるため，本研究結果だけではがん幹細胞をNAIPおよびcIAP-1 mRNAで同定したとは断定でき

Fig.1. NAIP and cIAP-1 mRNA expression in hepatocellular
carcinoma tissues.

ない。しかし，がん組織において，NAIPおよびcIAP-1mRNAを高発現した細胞の点在は，これらの細胞が他の４．考細胞よりも未分化ながん細胞であることを示し，その性察状はがん幹細胞と同様である。今後，プローブや検出法
本研究では，肝細胞がん組織におけるFISH解析により，の改良により，がん発生や転移に関与するがん幹細胞を更に特異的に検出可能となることが期待される。

NAIPおよびcIAP-1 mRNAの細胞質局在と両mRNAを高発 現 す る 細胞 の 点在 を 確 認し た 。 NAIPお よ び cIAP-1

参考文献

mRNAを高発現する細胞は両mRNAを低発現するがん細胞よりも未分化である可能性が高い。さらに，両mRNA

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を共に高発現する細胞は，片方のmRNAを高発現する細胞よりもさらに未分化ながん細胞と考えられるため，がん幹細胞である可能性が高い。本研究において，肝細胞がん組織中におけるNAIPおよびcIAP-1 mRNA陽性細胞の点在が確認された。従来，NAIPおよびcIAP-1 mRNA量は細胞集団として測定されており，がん組織において両mRNAは高発現している。本研究において，NAIPおよびcIAP-1 mRNA陽性細胞が点在して確認されたことから，これらmRNAの発現は，がん細胞として均一ではなく，個々の細胞によって異なることが明らかとなり，肝細胞－50－