成蹊大学理工学研究報告
J. Fac. Sci. Tech., Seikei Univ.
Vol.43 No.2 (2006) pp.103-106（特別研究費に係る論文）

TOF-SIMS を用いたバイオセンサ基板上のタンパク質分布評価
加藤信彦＊1，星奨＊2，青柳里果＊3，工藤正博＊4

Evaluation of Protein Distributions on Biosensor Surfaces by Using TOF-SIMS
Nobuhiko KATO＊1, Sho HOSHI＊2, Satoka AOYAGI＊3, and Masahiro KUDO＊4
ABSTRACT：Monitoring of proteins on biosensor surfaces in required for developing high performancebiosensors. In this study, distributions of proteins, protein A, immunoglobulin G (IgG) and bovine serum
albumin (BSA), immobilized on glass plates were monitored by means of a new protein monitoring techniqueusing time-of-flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS) that provides specific chemical imaging.
The TOF-SIMS spectra of the protein immobilized on glass plates were analyzed by means of mutual
information to select the appropriate fragment ions related to each protein for chemical imaging ofproteins. Finally the distributions of protein A, IgG and BSA are obtained respectively with this method.
Keywords：TOF-SIMS, Information entropy, protein A, immunoglobulin G (IgG), bovine serum albumin(BSA), chemical imaging, biosensor(Received September 28, 2006)

１．はじめに料とのスペクトル強度を比較した前後での情報エントロ
ピーの差である相互情報量を基に，特定タンパク質に起バイオセンサ基板上の固定化タンパク質の状態および因する二次イオンピークを選出する。

試料溶液との反応性を評価するためには，基板上の各タ

本研究では，基板上に固定化した免疫グロブリンプロ

ンパク質の分布測定が必要である。飛行時間型二次イオ

テイン A(PA)，免疫グロブリン G(IgG)，およびウシ血清

ン質量分析法(TOF-SIMS)は，材料表面上のタンパク質をアルブミン(BSA)の 3 種類のタンパク質の TOF-SIMS に検出する有望な測定法の１つである。しかし，二次イオよる識別を試みた。それぞれのタンパク質をガラス基板ン質量分析法(SIMS)では，一般に，巨大分子はフラグメに共有結合で固定化し，それらを TOF-SIMS で測定した。

ントイオンとして検出され，タンパク質は互いにフラグそれぞれのタンパク質を区別するために，各 TOF-SIMSメントイオンが類似するため，単純なスペクトル比較にスペクトルの相互情報量を求め，それぞれのタンパク質よる複数のタンパク質の識別は困難である。そこで，こに特異的なフラグメントイオンを選出した。また，主成

れまで主成分分析1), 2)

3)や情報エントロピー などを用い分分析による結果と比較した。

たスペクトル解析が行われている。主成分分析は特に定性分析で有効であり，数種類のタンパク質を TOF-SIMS

２．実 験

フラグメントイオン強度から識別できる。イメージングのための特定二次イオンの選出には情報エントロピーが2. 1 タンパク質固定化ガラス作成
スライドガラスを8×8 mmに切り出し，アミノプロピ

特に有効であり，この手法ではタンパク質試料と参照試

ルトリメトキシシラン2mlを含むトルエン30ml中で5時*1：物質生命理工学科助手(Research Associate, Dept. of Materialand Life Science),*2：物理情報工学専攻博士前期課程平成17年度卒業生,*3：島根大生物資源科学部助教授 (2005年2月まで成蹊大工学部助手),*4：物質生命理工学科教授(Professor, Dept. of Material and LifeScience )間還流し，表面をアミノシラン化した。そして，1%グルタルアルデヒドでアミノシラン化したガラス表面を架橋し，pH7.4リン酸緩衝溶液中に30時間，4℃でFITC標識
プロテインA，IgGおよび，BSAをそれぞれ固定化した。

－103－Table. 1

Fragment ions related to amino acids of protein.

Amino acids

Chemical formula

Gly

CH4N

Arg

Amino acids

Chemical formula

30

Asn

C3H7N2O

87

CH3N243

Asn，Asp

C3H6NO288

Ala

C2H6N

44

Asn

C4H4NO298

Cys

CHS

45

Arg

C4H10N3100

Arg

C4H11N3101

Glu

C4H8NO2102

Asn，Prom/z

C4H8N

70

C3H4NOm/zArg

C2H7N373

His

C5H8N3110His

C4H5N281

Arg

C5H10N3112

His

C4H6N282

Arg

C5H11N4127

Gln，Glu

C4H6NO84

これらのタンパク質固定化ガラスは TOF-SIMS 測定直前

相互情報量：に純水で洗浄し，薬包紙で水分を吸収して，乾燥させた。

I(A; B) = S(A) − S(A | B)

2. 2

ここで，N は TOF-SIMS スペクトルの個数，n(a1)，n(a2)

TOF-SIMS 測定(3)

測定装置は TFS-2100(Physical Electronics, Eden Prairie,

は試料 1 および試料 2 の個数，n(a1,b1)，n(a2,b1)は試料 1MN)を用い，一次イオンは 15keV の Ga イオン，ラスタおよび試料 2 で閾値 V よりもピーク強度が高いスペクトーサイズは 120μm 角で，イオンドーズ量はスタティッ

ルの個数，n(a1,b2)，n(a2,b2)は試料 1 および試料 2 で閾122

ク限界である 10 ion/cm 以下とし，各タンパク質固定化

値 V よりもピーク強度が低いスペクトルの個数とする。

ガラス試料を測定した。また，試料には金属メッシュを

相互情報量は PA，IgG，BSA およびアミノシラン化ガラ被せ，中和電子銃を照射した。

スの各スペクトルの比較によって求めた。

2. 3

2. 3. 2TOF-SIMS スペクトル測定

2. 3. 1

相互情報量

主成分分析(PCA)

タンパク質を構成するアミノ酸由来のフラグメントイ

各 TOF-SIMS スペクトルにおける二次イオンのピーク

オン 6)として知られる Table 1 の二次イオンピークを用いm/z=40 ～ 200 を各スペクトルの Total Ion Count で規格て 各 試 料 ス ペ ク ト ル の 主 成 分 分 析 を 多 変 量 解 析 for化したピーク強度を用いて，相互情報量 4), 5)を計算した。

Excel(エスミ，東京)によって実行した。

相互情報量は，ある二次イオンピークの強度を対象にして，サンプルの種類(事象 A)に関する事前エントロピー３．結果および考察(式 1)を求め，そのピーク強度の，ある閾値 V との比較(事象 B)に関する事後エントロピー(式 2)を引くことによっ

IgG は分子量 155000 程度であり，PA(42000 程度)，て得られる(式 3)。ただし p(ai)，p(aj,bi)はそれぞれ確率BSA(69000 程度)と比べて非常に大きいが，どちらもタンn(ai)/N，n(aj,bi)/N を表す。

パク質であるために，共通するフラグメントイオンが多く，単純なスペクトル比較では識別が困難である。
そこで，TOF-SIMS によるフラグメントイオンから PA，事前エントロピー：

S(A ) = −∑ p(ai) log 2 p(ai)(1)

告されているフラグメントイオンを用いて，主成分分析した。その結果を Fig. 1 に示す。Fig. 1 より，Table 1 のフ

事後エントロピー：

S(A | B) = −∑ p(aj) ∑ p(aj,bi) log 2 p(aj,bj)

IgG，BSA を確認するために，タンパク質由来として報(2)ラグメントイオンを用いてガラス基板上の 3 種類のタンパク質(PA, IgG, BSA)が識別できることが示された。したがって，今回対象とした質量数 200 以下のフラグメント－104－

BSA-immobilized glass plate
Protein A-immobilized glass plate
IgG-immobilized glass plateaminosilanized glass plate

Fig. 1

Table ２

Score plot from PC1 and PC3 of Positive ion spectra.

Mutual information of BSA, Protein A, and IgG on glass plates.

SampleMutual information (-)

Secondary ion peak (m/z)

BSA

1.0088

Protein A

1.00

40, 44, 56, 120, 124

IgG

1.00

70, 72, 81, 86, 91, 95, 100, 103, 105, 107, 110, 115, 128, 129, 130,131, 142, 143, 165

イオンによるタンパク質イメージングが，ガリウムイオ

この中で，強度が参照試料に比べて十分高いピークとン銃による通常の TOF-SIMS 測定でも可能であることが，して，BSA に由来する二次イオン，m/z=88，IgG に由来

主成分分析によって客観的にも確認された。

する二次イオン，m/z=70，72，130，PA に由来する二次

ただし，定性だけでなく，定量，分布測定を行うには，イオン，m/z=44，124 を選出した。これらの二次イオン

主成分分析結果の各主成分の負荷量と，試料と主成分得を用いて，各タンパク質のガラス基板上の分布を点の関係から，各ピークを特徴付ける必要がある。また，

TOF-SIMS 二次イオン像として得た。Fig. 2 に，PA 固定

各タンパク質に帰属するフラグメントイオンの決定は，化ガラス，IgG 固定化ガラスおよび BSA 固定化ガラスそ主成分分析だけでは困難であり，判別分析などの他の解れぞれにおける，各タンパク質に由来する二次イオン像析方法と併せて検討する必要がある。そこで，各タンパを示す。Fig. 2 より，タンパク質が固定化されたいないアク質試料における各ピークの相互情報量を計算し，比較

ミノシラン化ガラスでは，いずれのタンパク質起因の二することによって，各タンパク質に起因するピークを選次イオン像も暗く，ほとんど存在しないことが確認され出した。その際，PA が固定化されたガラス基板では，ガた。また，各タンパク質固定化ガラスでは，それぞれ固ラス基板由来の二次イオンが高強度で検出されたため，定化されていない他のタンパク質に起因する二次イオンIgG，BSA 固定化ガラス基板との差を抑えるために，全像は暗くなり，選出したピークが，それぞれのタンパクイオン強度ではなく，タンパク質に由来するピーク強度質に主に起因することが確認された。したがって ，の合計で規格化した。その結果，各タンパク質に由来すTOF-SIMS によるフラグメントイオンから複数のタンパるフラグメントイオンピークとして，高い相互情報量をク質に起因する二次イオンの選出が可能であることが示もつものを Table 2 に示す。

された。また，相互情報量を用いた場合は従来の PCA と－105－

ばかりでなく特定のタンパク質の定量およびイメージングを可能とする。今後はひとつの基板上に複数のタンパク質が固定化された試料に対して，相互情報量によるスペクトル解析の有効性を検討し，実際のバイオセンサ基板上における固液反応のモニタリングへ応用する。
Protein A-immobilized glass plate

文献1) M. S. Wagner, B. J. Tyler and D. G. Castner, Anal. Chem.,
74, 1824 (2002).
2) G.Coullerez, S. Lundmark, M. Malkoch, H. Magnusson, E.
IgG-immobilized glass plateMalmstrom, S. Hult and H. J. Mathieu, Appl. Surf. Sci., 34,55 (2002).
3) S. Aoyagi, M. Hayama, U. Hasegawa, K. Sakai, M. Tozu, T.
Hoshi and M. Kudo, e-J. Surf. Sci. Nanotech, 1, 67 (2003)
4) C. E. Shannon and W. Weaver, The mathematical theory ofinformation (University of Illinois Press, Urbana, IL, 1947)

BSA-immobilized glass plate

5) T. Fujikura, K. Sakamoto and J. T. Shimozawa, Anal. Chim.
Acta., 351, 387 (1997).
6) J-B. Lhoest, E. Detrait, P. Aguilar and P. Bertrand, J.
Biomed. Materials Res. 41, 95 (1998).

aminosilanized glass plate
Fig.2

TOF-SIMS secondary ion images related
to protein A, IgG and BSA.

比べて，標準試料との比較から容易にタンパク質起因のピークを選出できるという利点があることも示された。

4 まとめ
ガラス基板上に固定化したタンパク質の TOF-SIMS ス
ペクトルを情報エントロピーと主成分分析法で解析した
結果，異なるタンパク質は TOF-SIMS によって識別可能であることが示された。また，参照試料との相互情報量の比較によって，各タンパク質に起因するフラグメントイオンが選出できる。こうして選出された特異的なフラグメントイオンピークを用いて，各タンパク質のバイオセンサ基板上の分布を得ることができると考えられる。
したがって，TOF-SIMS による基板測定は，バイオセンサ基板の評価に有効であり，バイオセンサ機能評価および高性能化に大いに貢献できると期待される。
また，相互情報量による特異的ピークの選出は，タンパク質の TOF-SIMS スペクトルの解析を簡便にし，定性－106－