信州医誌，57⑸：163〜220，2009

信州大学において審査された医学博士論文要旨
学位審査委員

名

学位授与
番
号

学位授与
年 月 日

中嶋伸介

甲第763号

20. 3.31 IL‑15 inhibits pre‑B cell proliferation by 菅 根 一 男 池 田 宇 一
樋口京一
selectivery expanding Mac‑1 B220 NK cells（IL‑15は選択的に M ac‑1 B220 NK 細胞を増殖させ，プレＢ細胞の増殖を抑制する）

酒井典子

甲第764号

21. 3.31 High oxygen tension constricts epineurial 山 田 充 彦 森 泉 哲 次
池田宇一
arterioles of the rat sciatic nerve via reactive
oxygen species（活性酸素によるラット坐骨神
経線維上膜細動脈微小循環調節）小松哲

甲第765号

21. 3.31 Identiﬁcation of novel deletion polymor- 福 嶋 義 光 谷口俊一郎
中山淳
phisms in breast canser（乳癌における新規欠失型遺伝子多型の同定）

齊藤はるな

甲第766号

20. 9.30 Changes in activities of daily living during 池 田 修 一 本 郷 一 博
福嶋義光
treatment of late‑life depression（老年期うつ病の治療中における日常生活活動動作の変化）

小松通治

甲第767号

20. 9.30 Citrin deﬁciency as a cause of chronic liver 池 田 修 一 宮 川 眞 一
中山淳
disorder mimicking non‑alcoholic fatty liverdisease（シトリン欠損症では非アルコール性
脂肪性肝疾患類似の病態を呈する）

田澤浩一

甲第768号

20. 3.31 Therapeutic outcome of cyclic VAD (vincris- 田 中 榮 司 池 田 宇 一
中山淳
tine, doxorubicin and dexamethasone) ther-

氏

学

位

論

文

題

目

主

査

副

査

apy in primary systemic AL amyloidosis
patients（原発性全身性ＡＬアミロイドーシス
患者におけるＶＡＤ療法の効果）
周博

甲第769号

19. 9.30 Existence of an immunoglobulin G compo- 田 中 榮 司 菅 根 一 男
野見山哲生
nent of naturally occurring HLA class I antibodies that are not directed against self‑
antigens in human serum（ヒト血清中に存在する非自己抗原に対する IgG 型 HLA クラスＩ
自然抗体）

瀬戸山友一

甲第770号

21. 3.31 Development of Analysis Procedures for the 野見山哲生 福 嶋 義 光
大森栄
Simple Visualization of HospitalsʼMarket
Share, Using Hospital Income Calculated bymeans of the Diagnosis Procedure Combination (DPC) Payment System（DPC から集計した病院の収入データを用いた病院マーケット
シェア分析の単純化・可視化手法の開発）

掛川晃

No. 5, 2009

甲第771号

21. 3.31 M otor neurons essential for normal sciatic 加 藤 博 之 本 郷 一 博
佐々木克典
function in neonatally nerve‑injured rats
（正常な運動機能維持に必要な最小運動ニュー
ロン数の決定―新生児ラット坐骨神経における
研究―）
163

審査学位論文要旨

小山洋

甲第772号

21. 3.31 Hyperproduction of Hyaluronan in Neu‑In- 中 山
duced Mammary Tumor Accelerates Angiogenesis through Stromal Cell Recruitment :Possible Involvement of Versican/PG‑
M （乳腺腫瘍におけるヒアルロン酸の過剰産生は間質細胞を動員して，血管新生を促進する：
バーシカンの関与を含めて）

矢嶋紀幸

甲第773号

20. 3.31 Critical role of bone marrow apoptosis‑as- 天 野
sociated speck ‑like protein, an inﬂam-

淳 鎌田
徹
池田宇一

純 久保惠嗣大橋俊夫

masome adaptor molecule, in neointimal
formation after vascular injuryin mice（マウス血管傷害後の新生内膜形成における，骨髄由来のインフラマゾームアダプター分子であるアポトーシス関連スペック様カード蛋白質の重要
な役割）
森本

創

甲第774号

21. 3.31 Cardiac Overexpression of Monocyte Chemo- 山 田 充 彦 天 野中山
attractant Protein‑1 in Transgenic Mice

純
淳

Prevents Cardiac Dysfunction and Remodelingafter M yocardial Infarction（心筋特異的な
M CP‑1の過剰発現はマウス心筋梗塞モデルにおける心機能不全とリモデリングを改善する）
小島洋文

甲第775号

20. 3.31 One third of Japanese patients with M ultiple 加 藤 博 之 宇佐美真一
中山淳
Osteochondromas may have mutations ingenes other than EXT1 or EXT2（多発性骨軟骨腫の日本人患者の1/3は EXT1や EXT2以外の遺伝子に突然変異を持っている可能性があ
る）

藏井みゆき

甲第776号

21. 3.31 Expression of Aurora kinases A and B in 宮 川 眞 一 天 野純
谷口俊一郎
normal, hyperplastic, and malignant humanendometrium : Aurora B as a predictor forpoor prognosis in endometrial carcinoma（オーロラキナーゼＡとＢのヒト正常，増殖症，
悪性子宮内膜における発現：オーロラＢは子宮内膜癌における予後不良因子）

中村純子

甲第777号

21. 3.31 Biphasic function of focal adhesion kinase in 谷口俊一郎 鈴 木 龍 雄
樋口京一
endothelial tube formation induced by ﬁbril‑forming collagens（コラーゲン惹起性内皮細胞
管状構造形成における focal adhesion kinase
機能の二面性）久保直樹

甲第778号

21. 3.31 Identiﬁcation of oligopeptide binding to colon 中 山
cancer cells separated from patients using
laser capture microdissection（マイクロダイ
ゼクションを用いたヒト大腸癌細胞への結合ペプチドの同定）

164

淳 西沢
理
田中榮司

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

村山秀喜

甲第779号

21. 3.31 Deﬁciency of tumour necrosis factor‑α and 山 田 充 彦 天 野純
竹下敏一
interferon‑γ in bone marrow cells synergistically inhibits neointimal formation following vascular injury（血管傷害モデルでの骨髄細胞中の TNFαとインターフェロン γの欠如が相乗的に内膜肥厚の増殖を抑制した）陳忠

甲第780号

21. 3.31 Role ofα1‑Adrenergic Receptors in Detrusor 大 橋 俊 夫 山 田 充 彦
大森栄
Overactivity Induced by Cold Stress in Conscious Rats（覚醒下ラットにおける冷えスト
レスによって誘発された排尿筋過活動に対する
α1交感神経受容体の役割）

鈴木滋

甲第781号

21. 3.31 Head‑down tilt posture elicits transient 倉 科 憲 治 瀧
伸介
宇佐美眞一
lymphocyte mobilization from the iliac, but
not mesenteric, lymph nodes of rats（頭部低位姿勢は，ラット腸骨リンパ節から一過性のリンパ球動員を誘発するが，腸間膜リンパ節では誘発しない）

伊東理子

甲第782号

20. 3.31 The Association of Transforming Growth 福 嶋 義 光 宇佐美真一
浅村英樹
Factor Beta 1 Gene Polymorphisms with theEmphysema Phenotype of COPD in Japanese（日本人における肺気腫と TGF‑β1遺伝子多型との関連について）北原

桂

甲第783号

20. 9.30 M icrosatellite Scan Identiﬁes New Candidate 福 嶋 義 光 樋 口 京 一
田中栄司
Genes for Susceptibility to Alcoholic Chronic
Pancreatitis in Japanese Patients（アルコー
ル性慢性膵炎の疾患関連遺伝子のゲノムワイド
検索）

寺元

剛

甲第784号

20. 3.31 Role of dexamethasone and oncostatin M on 中 山
the formation of vacuoles in human fetalliver cells（ヒト胎児肝細胞内巨大空胞様小器
官形成におけるデキサメタゾン及びオンコスタ
チンＭの役割）小林真二

甲第785号

21. 3.31 Interleukin‑21 stimulates B‑cell immunog- 瀧
lobulin E synthesis in human beings concomitantly with activation‑induced cytidine
deaminase expression and diﬀerentiation into
plasma cells（ヒトにおいて IL‑21は AID 発現
および形質細胞への分化誘導を介しＢ細胞のIgE 産生を促進する）

芦田敦子

甲第786号

21. 3.31 Pathological activation of KIT in metastatic 中 山
tumors of acral and mucosal melanomas（肢端型・粘膜型悪性黒色腫の転移腫瘍における KIT の活性化）

No. 5, 2009

淳 西澤
理
田中榮司

伸介 竹下敏一
本田孝行

淳 田中榮司新藤隆行

165

審査学位論文要旨

山浦麻貴

甲第787号

21. 3.31 NADPH oxidase (Nox) 4 contributes to 谷口俊一郎 中 山淳
瀧伸介
transformation phenotype of melanoma cellsby regulating G2‑M cell cycle progression（活性酸素産生遺伝子 NOX4の G2‑M 期の細胞
周期進行の制御による悪性黒色腫の発癌への関
与）

小松佳道

甲第788号

20. 3.31 Airway hyper‑responsiveness in young adults 池 田 修 一 菅 根 一 男
田中榮司with asthma that remitted either during or
before adolescence（若年成人における小児喘
息既往者の気道過敏性の検討）

百瀬泰行

甲第789号

20. 3.31 Diﬀerentiation of Monkey Embryonic Stem 池 田 宇 一 西 沢理田中榮司Cells into Hepatocytes and mRNA Expression of Cytochrome P450 Enzymes Responsible for Drug M etabolism : Comparison of
Embryoid Body Formation Conditions andM atrices（サル胚性幹細胞の肝細胞への分化と薬物代謝に関与するシトクロム P450の mRNA
発現：胚様体作成条件および細胞外マトリック
スの比 ）

金子

稔

甲第790号

21. 3.31 Prion disease causes less severe lesions in 池 田 修 一 森 泉 哲 次
本郷一博
human hippocampus than other parts of brain（ヒトのプリオン病では海馬の障害が脳の他の部位に比べて少ない）

中嶌岳郎

甲第791号

21. 3.31 Bezaﬁbrate at clinically‑relevant doses 大 森
decreases serum/liver triglycerides via down‑
regulation of SREBP‑1c in mice: a novel
PPARα‑independent mechanism（臨 床 用 量でのベザフィブラートの中性脂肪低下作用は1ｃ型ステロール調節領域結合蛋白の低下に由来する：α型ペルオキシソーム増殖剤活性化受
容体に依存しない新規薬理作用の発見）

西村

甲第792号

20. 9.30 A Cross‑Sectional Observation of Eﬀect of 福 嶋 義 光 大 森
栄天野直二
Exposure to N‑Methyl‑2‑Pyrrolidone(NMP)on WorkersʼHealth（N‑メチル‑2‑ピロリドン（NMP）曝露が作業者の健康に及ぼす影響の時間断面研究）

趙甲第793号

21. 3.31 Immunohistochemical study of hard tissue 森 泉 哲 次 佐々木克典
中山淳
formation in the rat pulp cavity after tooth
replantation（歯の再植後の歯髄腔内に形成される硬組織に関する免疫組織化学的研究）

長手寿明

甲第794号

21. 3.31 Therapeutic and preventive eﬀects of meth- 樋 口 京 一 山 田 充 彦
加藤博之
otrexate on zymosan‑induced arthritis in（
マウスのザイモザン誘発関SKG mice SKG
節炎に対するメトトレキサートの治療的及び予
防的効果）

166

繁

栄 田中榮司山田充彦

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

松本竹久

甲第795号

21. 3.31 Phylogeny of a Novel “博Helicobacter heilman- 本 田 孝 行 能 勢
竹下敏一nii”Organism from a Japanese Patient with
Chronic Gastritis Based on DNA Sequence
Analysis of 16S rRNA and Urease Genes（日本人の慢性胃炎患者から検出された新規
Helicobacter heilmannii の 16S rRNA 遺伝
子と Urease 遺伝子の DNA 塩基配列解析に基づいた系統発生論）

川崎健治

甲第796号

21. 3.31 Sialic Acid Moiety of Apolipoprotein E and 本 田 孝 行 谷口俊一郎
樋口京一
Its Impact on the Formation of Lipoprotein
Particles in Human Cerebrospinal Fluid（ヒト脳脊髄液中リポ蛋白粒子の形成におけるアポリポ蛋白 E のシアル酸成分の影響）

羽生登

甲第797号

20. 3.31 Characterization of cysteine and homocys- 本 田 孝 行 池 田 修 一
樋口京一
teine bound to human serum transthyretin（ヒト血清トランスサイレチンに結合したシス
テインとホモシステインの特徴について）

塩原真弓

甲第798号

21. 3.31 Laboratory appraisal of optimal gaseous 本 田 孝 行 西 澤理
竹下敏一
conditions for growth of zoonotic Helicobacter felis ATCC 49179 （Helicobacter felis
ATCC 49179株の培養における至適ガス環境に関する検討）

伴緑也

甲第799号

21. 3.31 Reﬂexive contraction of the levator palpe- 池 田 修 一 森 泉 哲 次
本郷一博
brae superioris muscle to involuntarily sustain the eﬀective eyelid retraction throughthe transverse trigeminal proprioceptive
nerve on the proximal Muellerʼs muscle:veriﬁcation with evoked electromyography（ミューラー筋近位部を横走する三叉神経固有
感覚神経を介した，不随意に有効な開瞼を維持する上眼瞼挙筋の反射的収縮：誘発筋電図によ
る検証）

青木

薫

甲第800号

21. 3.31 A Thin Carbon Fiber Web as a Scaﬀold for 小 池 健 一 久 保 惠 嗣
中山淳
Bone Tissue Regeneration（骨再生の足場材料として機能する細いカーボンファイバー網）

No. 5, 2009167

審査学位論文要旨の骨髄細胞を用いて同様の検討を行った。

IL‑15 inhibits pre‑B cell proliferation by
selectively expanding Mac‑1 B220 NK
cells（IL ‑15は 選 択 的 に Mac‑1 B220 NK細胞を増殖させ，プレＢ細胞の増殖を抑制す
る）
中

嶋

伸

介

【結果】骨髄細胞を IL‑15存在下で培養すると Mac‑
1 B220 の NK 細胞が特異的に増殖し，IL‑7で誘導されるプレＢ細胞の増殖が抑制された。NK 細胞を除去すると IL‑15によるプレＢ細胞の増殖抑制が見られなくなり，逆に NK 細胞を添加するとプレＢ細胞の増殖抑制が増強したことから，IL‑15は NK 細胞を介してプレＢ細胞の増殖を抑制することが明らかとなっ（論文の内容の要旨）た。この培養系においては IFN‑γが産生されており，【背景と目的】Natural killer（NK）細胞は同型異種

IFN‑γレセプター欠損マウスを用いた実験や抗IFN‑の骨髄細胞において移植した骨髄細胞の再構築を障害

γ抗体による阻害実験ではプレＢ細胞の増殖の回復がするが，自己の細胞に対しては応答しない。この「自観察された。また，プレＢ細胞の増殖を検討したとこ

己寛容」は，NK 細胞上に発現し，自己 の M HC ク

ろ，IL‑15を添加して培養すると著明な増殖抑制が見

ラスⅠを認識する killer inhibitory receptor（KIR）

られたが，IFN‑γレセプター欠損マウス由来の骨髄からの抑制シグナルによると考えられている。その一細胞ではこのような抑制は見られなかった。以上のこ方で，特殊な環境下においては NK 細胞の「自己寛とから，IL‑15によるプレＢ細胞の増殖抑制は NK 細容」が克服されインターフェロン‑γ（IFN‑γ）の産胞が産生する IFN‑γを介していることが示された。

生を介して NK 細胞による免疫調節が行われるといライセンシングされていない β2m 欠損マウスの骨髄う報告がなされており，IL‑2のような NK 細胞の活細胞においても IFN‑γは産生され，またプレＢ細胞性化に働くサイトカインがそのような克服を誘導するの増殖が抑制された。

候補分子として挙げられている。しかし，「自己寛容」【結論】In vitro 培養系において，IL‑15存在下で特異の克服がどのような条件下で起こるかは依然不明であ的に増殖する M ac‑1 B220 の NK 細胞は IFN ‑γをる。そこで，NK 細胞の分化，増殖に働くサイトカイ

産生し，自己のプレＢ細胞の細胞周期を遅延させるこンであり，IL‑2と類似の構造を持つ IL‑15について，とで増殖を抑制した。また，β2m 欠損細胞の NK 細NK 細胞の「自己寛容」の克服を引き起こせるか否か

胞も IFN‑γを産生したことから，IL‑15による刺激を検討した。

は「自己寛容」や「ライセンシング」を超えて NK【方法】マウス骨髄細胞を IL‑7存在下で培養し，プレ細胞が IFN ‑γを産生できる可能性が示唆された。

Ｂ細胞が増殖する in vitro 培養系を構築し，そこにM ac‑1 B220 の NK 細胞の亜集団が「自己寛容」のIL‑15を添加し自己のプレＢ細胞の増殖が抑制される克服を担い，免疫調節作用を有する細胞であると考えか否かを調べた。次に，IL‑15が NK 細胞の増殖，活られた。

性因子であることから，プレＢ細胞増殖制御への NK（論文審査の結果の要旨）

細胞の関与を検討するため，骨髄細胞から NK 細胞

Natural killer（NK）細胞は自己の細胞に対してを除去して同様な検討を行うとともに，NK 細胞を再は「自己寛容」を示す。その一方で，特殊な環境下に添加して検討を加えた。また，プレＢ細胞の増殖を抑おいては NK 細胞の「自己寛容」が克服され NK 細

制する因子と IFN‑γの関係を検討するために，IFN‑

胞による免疫調節が行われるという報告がなされていγレセプターを欠損するマウスより単離した骨髄細胞

るが「自己寛容」の克服がどのような条件下で起こるを用いた培養を行うとともに，培養上清中の IFN‑γ

かは依然不明である。そこで，中嶋は NK 細胞の分の測定ならびに中和抗体を用いた IFN‑γの阻害実験

化，増殖に働くサイトカインである IL‑15について，を行った。さらに BrdU の取り込みや CFSE ラベル

NK 細胞の「自己寛容」の克服を引き起こせるか否かの細胞分裂による希釈を指標にプレＢ細胞の増殖を調を，in vitro でのプレＢ細胞の増殖制御を指標に検討

べた。MHC クラスⅠは「自己寛容」の獲得以外に機した。

能的な NK 細胞の成熟にも必須であると提唱されて中嶋は，マウス骨髄細胞を IL‑7存在下で培養し，いる（ライセンシング）。そこで，MHC クラスⅠを

プレＢ細胞が増殖する in vitro 培養系を構築し，そこ発現しない β2ミクログロブリン（β2m）欠損マウスに IL‑15を添加し自己のプレＢ細胞の増殖が NK 細168

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

胞によって抑制されるか否かを調べた。次に，NK 細胞の関与を検討するため，骨髄細胞から NK 細胞を除去したり，また NK 細胞を欠損する IL‑15ノックアウトマウスを用いるなどして同様な検討を行い，さらに NK 細胞を添加して同様に検討した。また，プレＢ細胞が増殖を抑制する因子と IFN‑γの関係を検討し，プレＢ細胞の細胞周期を調べた。さらに MHC
クラス

を発現しない β2ミクログロブリン（β2m）

欠損マウスの骨髄細胞を用いて同様の実験を行った。
その結果，中嶋は以下の結果を得た。

High oxygen tension constricts epineurial
arterioles of the rat sciatic nerve via
reactiveoxygen species（活性酸素によるラット坐骨神経線維上膜細動脈微小循環調節）
酒

井

典

子

（論文の内容の要旨）
末梢神経への血流供給は，正常な神経機能維持に重要な働きをしており，末梢神経の血流低下によって運

１．骨髄細胞を IL‑15存在下で培養すると Mac‑1

動神経の伝導速度遅延を生ずることが判明している。

B220 の NK 細胞が特異的に増殖し，IL‑7で誘導

また，糖尿病性神経障害は，末梢神経の微小循環障害

されるプレＢ細胞の増殖を抑制した。

がその一因であることが示唆されており，事実その病

２．IL‑15によるプレＢ細胞増殖抑制には NK 細胞が態生理において，糖尿病によって発生する活性酸素が必須であり，IL‑15はこの細胞を介してプレＢ細胞

糖尿病ラットの坐骨神経血流を著明に減少させることの増殖を抑制することが明らかとなった。

が明らかになっている。一方，末梢神経血流の生体内

３．プレＢ 細 胞 の 増 殖 抑 制 は NK 細 胞 が 産 生 す る

測定においては，レーザードップラー法や水素クリア

IFN ‑γを介していたが，IFN ‑α/βの関与は認め

ランス法が汎用されている。しかしながらこれらの方られなかった。

法では，末梢神経全体としての血流測定を可能とする

４．ライセンシングされていない β2m 欠損マウスのが，末梢組織血流量を直接決定する因子である抵抗血

骨髄細胞においても IFN‑γは産生され，またプレ管（小動脈―細動脈）の収縮―拡張の機能解析は十分Ｂ細胞の増殖が抑制された。

に評価することができない。今回我々は，麻酔下ラッ以上の結果より，炎症時に産生される IL‑15は，

ト坐骨神経線維上膜に走行する細動脈の径変化を生体

Mac‑1 B220 の NK 細胞を選択的に増殖させるとと内で直接観察できる生体顕微鏡システムを開発し，こもに IFN‑γ産生を誘導し，自己のプレＢ細胞の細胞のシステムを用いて活性酸素が末梢神経の微小循環機

周期を遅延させることでその増殖を抑制しうることが構に及ぼす影響を検討した。

示された。また，β2m 欠損細胞の NK 細胞において方法：７週齢の雄 Wistar ラットにウレタン・ αクロ

も IFN‑γを産生したことから，IL‑15による刺激はラローズを用いて麻酔を行った。左大腿動脈にカテー「自己寛容」や「ライセンシング」を超えて NK 細胞

テルを挿入し，実験中持続的に体血圧を測定した。生が IFN‑γを産生させる可能性が示唆された。本研究

体顕微鏡下，右坐骨神経をマイクロサージェリーの手の結果，Mac‑1 B220 の NK 細胞亜集団が，炎症時法を用いて展開した。ラットを37℃の保温プレートに「自己寛容」の克服を通じて，免疫調節作用を発揮

上に保定し，内径〜26μm の坐骨神経線維上膜に走するのではないかと考えられた。この研究は，感染な行する細動脈を水浸対物レンズと冷却 CCD カメラをどに伴って観察される骨髄抑制，とくにＢ細胞産生の通して観察し，内径変化をビデオマイクロスコープシ抑制の機構の一端を明らかにしたものであり，主査，

ステムによって経時的に計測した。坐骨神経表面には副査は一致して本論文を学位論文として価値があるも37℃‑pH7.4に維持した酸素分圧５mmHg の低酸素のと認めた。

クレブス液と酸素分圧140mmHg の高酸素クレブス
液を灌流し細動脈の径変化を指標として反応性を検討した。本実験において活性酸素の関与を検討するために次の薬物を用いた。ニフェジピン（Ca チャネル拮抗薬）
，ノルエピネフリン，スーパーオキシドディ
スムターゼ（SOD），テンポール（膜透過性 SOD 様物質），カタラーゼ（過酸化水素除去剤），ディヒドロ
エチオドニウムおよびアポシニン（NADPH オキシ

No. 5, 2009169

審査学位論文要旨

ダーゼ阻害薬），アロプリノール（キサンチンオキシダー

直接観察できる生体顕微鏡システムを開発し，このシゼ阻害薬），L‑NAME（内因性一酸化窒素（NO）合ステムを用いて活性酸素が末梢神経の微小循環機構に成酵素阻害薬），外因性 NO 供与体（SNAP）。

及ぼす影響を検討した。

結果：

方法は，麻酔下 Wistar ラットを用いて，生体顕微１．低酸素クレブス液の坐骨神経への表面灌流は，細動脈の径変化に影響を与えなかった。
２．ニフェジピンの坐骨神経への表面灌流は，細動脈に有意な拡張反応を誘起した。
３．ノルエピネフリンの坐骨神経への表面灌流は，細動脈に有意な収縮反応を誘起した。
４．高酸素クレブス液の坐骨神経への表面灌流は，細動脈に時間依存的収縮反応を誘起した。

鏡下に内径〜26μm の坐骨神経線維上膜に走行する細動脈を観察し，内径変化をビデオマイクロスコープ
システムによって経時的に計測した。坐骨神経表面には酸素分圧５mmHg の低酸素クレブス液と酸素分圧
140mmHg の高酸素クレブス液を灌流し細動脈の径変化を指標として反応性を検討した。本実験において活性酸素の関与を検討するために次の薬物を用いた。
ニフェジピン（Ca チャネル拮抗薬），ノルエピネフ

５．SOD，テンポール，カタラーゼ単独，およびSOD

リン，スーパーオキシドディスムターゼ（SOD），テ

カタラーゼの処置は，高酸素クレブス液による細動

ンポール（膜透過性 SOD 様物質）
，カタラーゼ（過脈収縮を解除した。

酸化水素除去剤），ディヒドロエチオドニウムおよび

６．ディヒドロエチオドニウムおよびアポシニンの坐アポシニン（NADPH オキシダーゼ阻害薬），アロ

骨神経への処置は，高酸素クレブス液による細動脈

プリノール（キサンチンオキシダーゼ阻害薬），L‑

収縮を解除した。

，
NAME（内因性一酸化窒素（NO）合成酵素阻害薬）

７．アロプリノールの坐骨神経への処置は，高酸素ク
レブス液による細動脈収縮を解除した。
８．高酸素クレブス液による細動脈収縮は，L‑NAME
存在下においても観察された。
９．高酸素クレブス液による細動脈収縮は，SNAPの投与によって解除された。
考察：麻酔下ラット坐骨神経線維上膜を走行する細動脈は，筋原性収縮を有していることが判明した。坐骨
神経線維上膜周囲の高酸素環境は，細動脈に収縮反応を誘起し，その作用機序に NADPH オキシダーゼな
らびにキサンチンオキシダーゼ由来のスーパーオキシ

外因性 NO 供与体（SNAP）。
その結果，次の結論を得た。
１．低酸素クレブス液の坐骨神経への表面灌流は，細動脈の径変化に影響を与えなかった。
２．ニフェジピンの坐骨神経への表面灌流は，細動脈に有意な拡張反応を誘起した。
３．ノルエピネフリンの坐骨神経への表面灌流は，細動脈に有意な収縮反応を誘起した。
４．高酸素クレブス液の坐骨神経への表面灌流は，細動脈に時間依存的収縮反応を誘起した。
５．SOD，テンポール，カタラーゼ単独，およびSOD

ド―過酸化水素の関与していることが判明した。また，

カタラーゼの処置は，高酸素クレブス液による細動

これら活性酸素による収縮反応は，内因性・外因性

脈収縮を解除した。

NO による修飾を受けないことが判明した。従って，

６．ディヒドロエチオドニウムおよびアポシニンの坐本研究によって活性酸素が末梢神経の微小循環調節機

骨神経への処置は，高酸素クレブス液による細動脈

構に重要な働きをしていることが明らかとなった。

収縮を解除した。

（論文審査の結果の要旨）
末梢神経への血流供給は，正常な神経機能維持に重要な働きをしており，末梢神経の血流低下によって運動神経の伝導速度遅延を生ずることが判明している。
また，糖尿病性神経障害は，末梢神経の微小循環障害

７．アロプリノールの坐骨神経への処置は，高酸素ク
レブス液による細動脈収縮を解除した。
８．高酸素クレブス液による細動脈収縮は，L‑NAME
存在下においても観察された。
９．高酸素クレブス液による細動脈収縮は，SNAPがその一因であることが示唆されており，事実その病の投与によって解除された。

態生理において，糖尿病によって発生する活性酸素がこれらの結果より，麻酔下ラット坐骨神経線維上膜

糖尿病ラットの坐骨神経血流を著明に減少させることを走行する細動脈は，筋原性収縮を有していることがが明らかになっている。今回我々は，麻酔下ラット坐判明した。坐骨神経線維上膜周囲の高酸素環境は，細骨神経線維上膜に走行する細動脈の径変化を生体内で動脈に収縮反応を誘起し，その作用機序に NADPH

170

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

オキシダーゼならびにキサンチンオキシダーゼ由来の在していた。

スーパーオキシド‑過酸化水素の関与していることがこのうちの APOBEC3B 遺伝子上に観察された領判明した。また，これら活性酸素による収縮反応は，

域は，一部の患者で正常組織と比べ乳癌細胞で特異的

内因性・外因性 NO による修飾を受けないことが判にコピー数の減少を認め，乳癌の癌化機構への関与が明した。従って，本研究によって活性酸素が末梢神経示唆された。さらにこの領域は，出現頻度の解析で，の微小循環調節機構に重要な働きをしていることが明

健常人に比べ乳癌患者に有意に多く認められ，乳癌発らかとなった。

症を予測する因子になりうる可能性も示唆された。ま

主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値のあるものと認めた。

た，他の３領域の遺伝子多型の出現頻度は，REV1Lと ZNF14遺伝子の２領域で健常人に比べ乳癌患者に多く認められる傾向があった。

Identiﬁcation of novel deletion polymorphisms in breast cancer（乳癌における新規
欠失型遺伝子多型の同定）
小松哲

近年，コピー数の変化による遺伝子多型が個体の多様性を決定する要因の１つであることが示されており，今回同定したこれらの新規遺伝子多型は，乳癌の発症や進展に何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。

（論文の内容の要旨）（論文審査の結果の要旨）【目的】乳癌は増加の一途をたどる疾患で社会的関心

マイクロアレイに代表されるゲノム科学の進歩によが高まっている。マイクロアレイに代表されるゲノム

り，一度に大量の遺伝情報を高速に処理することが出

科学の進歩によって，一度に大量の遺伝情報を高速に来るようになり，病気を分子レベルで解析することが処理することが出来るようになり，病気を分子レベル進められている。その結果，乳癌の発症や進展に関わで解析することが進められている。その結果，乳癌のる遺伝子の増幅や欠失をはじめ DNA レベルでの遺伝発症や進展に関わる遺伝子の増幅や欠失をはじめ子の再構築においても，より詳細な解析が可能になっDNA レベルでの遺伝子の再構築においても，より詳た。

細な解析が可能になった。

本研究では，乳癌における新規遺伝子異常の同定を本研究では，乳癌における新規遺伝子異常の同定を目的として，遺伝子のコピー数変化を comparative

目的として，遺伝子のコピー数変化を comparative

genomic hybridization (CGH) microarrayを用いゲ

genomic hybridization (CGH) microarrayを用いゲ

ノムワイドに解析した。

ノムワイドに解析した。

25種 類 の 乳 癌 培 養 細 胞 株 か ら DNA を 抽 出 し，

【方法】25種類の乳癌培養細胞株から DNA を抽出し，

遺 伝 子 コ ピ ー 数 の 変 化 を，Agilent 社 製 の Agilent

遺 伝 子 コ ピ ー 数 の 変 化 を，Agilent 社 製 の Agilent

Human Genome CGH Microarray Kit 44B を用いてHuman Genome CGH M icroarray Kit 44B を用いて解析し，新規ホモ欠失領域を検索した。また，乳癌培解析し，新規ホモ欠失領域を検索した。また，乳癌培

養細胞で選定したホモ欠失領域について，乳癌臨床サ

養細胞で選定したホモ欠失領域については，乳癌臨床

ンプルを Laser captured micro dissection 技術を用

サンプルを Laser captured micro dissection 技術をいて，正常細胞と癌細胞に正確に分けて DNA を抽出用いて，正常細胞と癌細胞に正確に分けて DNA を抽し，遺伝子コピー数の変化を定量 PCR で検証した。

出し，定量 PCR で検証した。さらに，乳癌患者と健さらに，乳癌患者と健常人の末梢血液サンプルを用い常人の末梢血液サンプルを用いて DNA を抽出し，定て DNA を抽出し，定量 PCR でその出現頻度を解析

量 PCR でその出現頻度を解析した。

した。

【結果と考察】乳癌培養細胞の CGH Microarray解析
により，16箇所のホモ欠失領域を同定した。乳癌臨床
サンプルの解析により，４領域は２〜８Kbp の狭い

その結果，小松は次の結論を得た。
１．乳癌培養細胞の CGH Microarray解析により，16箇所のホモ欠失領域を同定した。

範囲の欠失領域をもつ新規欠失遺伝子多型と考えられ

２．乳癌臨床サンプルの解析により，４領域は２〜た。こ の ４ 領 域 は そ れ ぞ れ ４ つ の 異 な る 遺 伝 子

８ Kbp の狭い範囲の欠失領域をもつ新規欠失遺（REV1L，ZNF14，NPAS1，APOBEC3B）上 に 存

伝子 多 型 と 考 え ら れ，こ の ４ 領 域 は そ れ ぞ れ ４

No. 5, 2009171

審査学位論文要旨

つの異なる遺伝子（REV1L，ZNF14，NPAS1，

往を持つ65歳以上の患者を対象とした。著明な身体

APOBEC3B）上に存在していた。

障害，認知症を合併する者は除外された。うつ病重症

３．APOBEC3B 遺伝子上で観察された領域は，一部

度は Hamilton Depression Rating Scale（Ham‑D）の患者で正常組織と比べ乳癌細胞で特異的にコピーを，認知機能は M ini Mental State Examination

数の減少を認めた。

（M MSE）を，ADL は Barthel Index（BI）および４．APOBEC3B 遺伝子上で観察された領域は，出現

Hyogo Activities of Daily Living Scale（HADLS）

頻度を解析した結果，健常人に比べ乳癌患者に有意を使用して，臨床評価を行った。評価は患者の観察とに多く認められた。また，他の３領域の遺伝子多型

患者又は家族との面接に基づき，約１カ月間に２回施の出現頻度は，REV1L と ZNF14遺伝子の２領域行した。ADL に関する評価と個人の特徴（年齢，教で健常人に比べ乳癌患者に多く認められる傾向に

育年数，Ham‑D，MMSE）は Spearmanʼ
s correla-

あった。

tion coeﬃcients で，評価毎の baseline score と fol-

これらの結果より，APOBEC3B 遺伝子上に観察さ

low‑up score は paired t‑test で検討した。また，れた領域が，乳癌の癌化機構に関与することが示唆さ

ADL の変化に Ham‑D，M MSE の変化が寄与していれた。また出現頻度の解析結果から，この領域の遺伝

る程度，および ADL の変化に各抑うつ症状の変化が子コピー数の変化は乳癌発症を予測する因子になりう

寄与している程度を重回帰分析にて調べた。

る可能性も示唆された。

【結果】対象者は男性22人，女性48人の計70人であり，以上のことより近年，コピー数の変化による遺伝子

内59人は外来患者，11人は入院患者であった。平均年

多型が個体の多様性を決定する要因の１つであること

齢は72.3±5.3歳（65〜87歳）であった。全員が現在が示されており，今回同定されたこれらの新規遺伝子の病相に対し，あるいは維持療法としての薬物治療を多型も，乳癌の発症や進展に何らかの役割を果たして受けていた。baseline で，Ham‑D はさまざまなうついる可能性が示唆される。

病重症度（13.7±8.0）を，MMSEは極めて軽度の認以上のことから，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

知機能欠損（26.9±1.9）を示した。43人（61.4％）
が HADLS の１つ以上の項目で障害を持っていた。
ADL に 関 す る BI，HADLS は Ham ‑D に baseline

Changes in activities of daily living during
treatment of late‑life depression（老年期うつ病の治療中における日常生活活動動作の変
化）
齊

藤

はるな

score，follow‑up score 共に統計学的に有意な相関関係を示した。Ham‑D，MMSE，HADLSは，baseline
score と follow‑up score 間に有意差があり改善を認めたが（それぞれｐ＜0.001，ｐ＝0.003，ｐ＝0.017），。HADLSBI は有意差を認めなかった（ｐ＝0.211）の下位項目である BADL は有意に改善を認めたが（論文の内容の要旨）（ｐ＝0.009），IADL は認めなか っ た（ｐ＝0.078）。

【背景と目的】老年期うつ病（late‑life depression；

HADLS の改善に Ham‑D の改善が有意に寄与してLLD）は，認 知 機 能 の 欠 損 と 並 ん で 身 体 能 力 障 害

いたが（ｐ＝0.017），MMSE は寄与していない結果（disability）との強い関連性が指摘されている。しかが得られた（ｐ＝0.996）。

し，LLD の重症度の変化（抑うつ症状の変動）に伴【結論】本研究の参加者は身体疾患による身体障害がう日常生活活動動作（activities of daily living；

ないにもかかわらず，多くの患者が ADL に少なくとADL）の変化について具体的に調査した報告は少なも１つ以上の問題を抱え て い た。う つ 病 重 症 度 とい。そこで本研究では，LLD の治療中である患者の

ADL の状態は２回の検査を通じて強い関連性を示し，

うつ病重症度，ADL（basic ADL；BADL と instru-

LLD の患者にはうつ病重症度の改善に伴い実質的な，認知機能の経時的変
mental ADL；IADL を含む）

ADL の改善が比化を同時に評価し統計学的に検討した。

ADL の改善はうつ病の治療効果によるもので，認知【対象と方法】信州大学医学部附属病院精神科に通院障害からは比 的独立していることが示唆された。以又は入院中の，精神疾患の分類と診断の手引（DSM ‑上により，高齢者のうつ病の治療にあたっては，それⅣ）に基づく大うつ病を現在患っているか，同病の既が身体機能障害の原因となり得ることを念頭に置いて，

172

的短期間で認められた。また，

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

患者の ADL について認識することの重要性が示された。
（論文審査の結果の要旨）
うつ病（depression）では身体能力障害はとくに注目されなかったが，老年期うつ病（late‑life depres-

Citrin deﬁciency as a cause of chronic liver
disorder mimicking non‑alchoholic fatty
liver disease（シトリン欠損症 では非アル
コール性脂肪性肝疾患類似の病態を呈する）

sion；LLD）において身体能力障害を呈する場合が多小い。齊藤は，信州大学医学部附属病院精神科で加療中

松

通

治

であり，精神疾患の分類と診断の手引（DSM ‑Ⅳ）に（論文の内容の要旨）基づく大うつ病を罹患しているか，その既往を持つ65【背景と目的】シトリン欠損症（CD）はSLC25A13遺

歳以上の患者について，うつ病重症度，ADL，認知

伝子の変異に起因し，新生児肝内胆汁鬱滞（NICCD）

機能の経時的変化を同時に評価し，これらの関係につや成人発症２型シトルリン血症（CTLN 2）の原因

いて統計学的に比 検討した。患者の観察と患者又はとなり，高アンモニア血症による精神神経症状が出現

家族との面接を約１カ月間に２回行い，うつ病重症度すると重篤となり死に至る患者もいる。また脳症発現はHamilton Depression Rating Scale（Ham‑D），認

前から脂肪肝や脂肪性肝炎を合併することが報告され知機能は M ini Mental State Examination（M MSE），ているが，その臨床像は未だ明らかではない。当科に日常生活活動動作（activities of daily living；ADL）

おいて非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）と診は Barthel Index（BI）と Hyogo Activities of Daily

断したが，10年後に高アンモニア血症を認め CTLN2

Living Scale（HADLS）を用いて，それぞれ臨床評と診断された患者を経験した。本研究ではシトリン欠価した。著明な身体障害，認知症を合併する者は除外損症に伴う脂肪性肝疾患の特徴を明らかにすることをされた。結果として以下のことが明らかとなった。

目的とした。

対象は男性22人，女性48人の計70人，平均年齢は【対象と方法】1979〜2007年に当院へ入院した19名の72.3±5.3歳（65〜87歳）であった。baselineで，Ham‑

CD 患者（男性11名，女性９名）を対象とし，身長・Dはさまざまなうつ病重症度（13.7±8.0）を，MMSE

体重などの理学所見，偏食傾向・膵炎などの既往歴，は極めて軽度の認知機能欠損（26.9±1.9）を示し，

血液生化学検査所見を解析した。また，肝組織の得43人（61.4％）がHADLSの１つ以上の項目で障害をられた14名については組織学的所見も解析対象とし持っていた。うつ病重症度と ADL との間には２回のた。比

検査を通じて強い関連性を認めた。Ham‑D，MMSE，

NAFLD 患者25名を選び比 検討した。

HADLS では，baseline score と follow‑up score 間【結果】CD 患者19名中16名（84％）が脂肪肝を有しに有意な改善を認め，またHADLSの改善には Ham‑ており，その内４名が精神神経症状発症以前より脂肪D の改善が有意に寄与していたが，M MSE は寄与し肝を指摘されていた。また NICCD の既往は１例で認ていない結果が得られた。すなわち，LLD の患者にめ，膵炎の既往も４例で認めた。豆類の嗜好を代表とはうつ病の改善に伴い実質的な ADL の改善が比的する偏食傾向を12名に認め，血液生化学検査では16名

短期間で認められ，ADL の改善はうつ病の治療効果に肝機能障害，６名に高中性脂肪血症をそれぞれ認めによるもので，認知機能からは比 的独立しているこた。脂肪肝と診断された16名中14名では組織学的にとが示唆された。

も脂肪肝の所見を認め，その内１名は脂肪性肝炎でこれらの結果より，老年期うつ病の治療にあたって対照群として SLC25A13遺伝子変異の無いあった。CD に合併した脂肪肝では SLC25A13遺伝子

は，それが身体機能障害の原因となり得ることを念頭

変異のない NAFLD 患者と比し，肥満（０vs72％，に置いて，患者の ADL を認識する重要性を明示した

Ｐ＜0.001）やメタボリック症候群（０vs36％，Ｐ＜

点で，本研究は意義あるものと考えられた。よって主0.001）の頻度は低く，膵炎の既往の頻度（13vs０％，

査，副査は一致して，本論文が学位論文として価値がＰ＝0.002）や血清 pancreatic secretory trypsin in-

あるものと認めた。

hibitor（PSTI）値（74vs10ng/mL，Ｐ＜0.001）が高かった。Receiver operating characteristic curve
解析により，Body mass index＜20kg/m ，PSTI＞
29ng/ml を cut‑oﬀ値として用いると CD に関連する

No. 5, 2009173

審査学位論文要旨

脂肪肝を鑑別することが可能であった。

論文を学位論文として価値があるものと認めた。

【結論】肥満やメタボリック症候群に関連しない非典型的な NAFLD を呈する患者では CD の可能性を考慮する必要がある。また偏食の傾向や既往歴の聴取はCD を診断する上で一助となる。CD による脂肪肝の鑑別には血清 PSTI ・ BM I が有用である可能性が示

Therapeutic outcoms of cyclic VAD therapy in primary systemic AL amyloidosis
patients（原発性全身性 AL アミロイドーシ
ス患者における VAD 反復療法の治療効果）

唆された。

田

（論文審査の結果の要旨）
シトリン欠損症（CD）は SLC25A13遺伝子変異によりaspartate‑glutamate carrier（AGC＝Citrin）の

澤

浩

一

（論文の内容の要旨）【目的】

欠損を生じ，成人発症２型シトルリン血症（CTLN2）

原発性全身性 AL アミロイドーシスに対しては，の原因となる。その経過の中で脂肪肝や脂肪性肝炎を

plasma cell dyscrasia を標的として，末梢血幹細胞合併することが報告されているが臨床像は未だ不明な移植を併用した大量メルファラン療法をはじめとした点が多い。また一見健康に過ごしていても，何らかの強力な化学療法の有用性が報告されている。今回我々きっかけで高アンモニア血症による精神神経症状を発は，VAD 反復療法（vincristine，doxorubicin，dex-

症し死に至る場合もあり，臨床上注意が必要な疾患で

amethasone）の有効性について前向きに検討した。

ある。本研究では CD に伴う肝病変の臨床的特徴を明【対象と方法】

らかにし，また精神神経症状発現前の患者を非アル

対象は，当院で原発性全身性 AL アミロイドーシス

コール性脂肪性肝疾患（NAFLD）より抽出するためと診断され，末梢血幹細胞移植を併用した大量メルファに有用なパラメーターを検討した。

ラン療法の適応外と考えられた８例（男性４名，女性４

当院へ入院した19名の CD 患者を対象とし，その名，平均年齢60.4歳）。何れも plasma cell dyscrasia

理学所見，既往歴，血液生化学検査所見，肝組織所に対する治療歴はない。全例２臓器以上でアミロイド見を解析した。また，SLC25A13遺伝子変異の無いの沈着を確認し，生検組織における特異抗体を用いた

NAFLD 患者25名を比 対照とした。

免疫染色で AL 型アミロイドと同定した。多発性骨１．CD 患者には高頻度に脂肪肝を認め，精神神経症

髄腫は International M yeloma Working Group の状の発現前から脂肪肝を合併している可能性が示唆基準に従って除外した。治療法（VAD 療法）は，vin-

された。

cristine 0.4mg/day，doxorubicin ９ mg/m /dayを

２．CD 患者に合併する NAFLD の特徴としては，

day1‑4に，dexamethasone 40mg/dayを day1‑4，

肥満やメタボリック症候群の合併が少ないこと，偏day9‑12，day17‑20に各々静注した。これらを４週毎食傾向・膵炎の既往を高頻度に認めること，血清に血清・尿中の M 蛋白が陰性化するまで繰り返した。

pancreatic secretory trypsin inhibitor（PSTI）の重篤な副作用が生じた場合には，M 蛋白が陰性 化上昇が挙げられる。

する前に中止した。完全寛解に至った場合，以後は３．Receiver operating characteristic curve 解析にinterferon α 3M IU/week で後療法を行った。

より，Body mass index＜20kg/m ，PSTI＞29

治療前後で performance status，尿蛋白量，血清ng/ml を cut‑oﬀ値として用いると CD に関連する

アルブミン，尿素窒素，血清クレアチニン，24時間ク

脂肪肝を鑑別することが可能であった。

レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス，血 清 free light chain

今回の研究では CD に合併する NAFLD の臨床的

（FLC）
，血清と尿の免疫固定法，血清BNP，心エコー，

特徴を明らかにすることで，精神神経症状発現前の骨髄中異常形質細胞を検討した。血液学的完全寛解は，CD 患者の診断に血清 PSTI ・ BM I が有用である可免疫固定法で血清・尿中の M 蛋白がいずれも陰性化能性が示唆された。本研究の成果は未だ不明な点の多することと定義した。

い CTLN2の臨床像に注目し，脂肪肝疾患との関連を【結果】明らかにした点で極めて意義のあるものである。よっ治療前には全８症例で血清ないし尿中から M 蛋白て主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値が検出され，７例で血清 FLCκ/λ比は異常値を呈し，があるものと認めた。よって主査，副査は一致して本かつ骨髄中異常形質細胞の増殖が認められた。８例中174

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

７例はネフローゼ症候群を呈しており，そのうち１例

も，VAD 反復療法は良好な治療効果が期待され，選は心アミロイドを主症状としていた。８例中３例で択肢の一つとして考慮すべき治療法の一つであると考

VAD を２ないし３クール施行後に，１例では１クーえられた。但し，臓器障害が進行した症例では VAD

ルのみで血液学的完全寛解に至った。これら４例中３療法であってもリスクが高く，適応の決定にあたって

例は interferon による後療法を施行したが，残りのは十分な注意が必要である。

１例は患者がの希望により行わなかった。４例とも（論文審査の結果の要旨）

M 蛋白の消失と同時に，血清 FLCκ/λ比が正常化し原発性全身性 AL アミロイドーシスの治療では，自た。VAD 終了後４年で全例生存し再発はない。この己末梢血幹細胞移植を併用した大量メルファラン療法

うち３例では尿蛋白・ BNP が改善した。

などの化学療法の有用性が報告されている。しかし，完全寛解に至らなかった残りの４例では，治療中に臓器障害が進行すると副作用のため治療の適応となら脳症やステロイドによる著明な体液貯留などの重篤なない症例も少なくない。本研究では，自己末梢血幹細副作用を来したため，寛解に至る前に治療を中断せざ

胞移植を併用した大量メルファラン療法の適応とならるを得なかった。これらの症例では，50％生存期間ない症例について，これに次ぐ治療である VAD 単独

は7.0±2.0カ月であった。

療法の有用性を検討した。対象は，自己末梢血幹細胞【考察】移植を併用した大量メルファラン療法の適応外である

原発性全身性 AL アミロイドーシスは，骨髄中の異が，VAD 療法は可能であると考えられた８例である。

常形質細胞から産生された免疫グロブリン軽鎖をアミ

VAD 療 法 は，vincristine 0.4mg/day，doxorubicin

ロイド前駆蛋白として，腎臓・心臓・消化管など全身９mg/m /dayを day1‑4に，dexamethasone 40mg/

臓器にアミロイドが沈着する予後不良疾患である。治dayを day1‑4，day9‑12，day17‑20に 各々静 注 し，療は，骨髄中の異常形質細胞を標的とした様々な治療

完全寛解に至るまで繰り返し施行した。完全寛解後は薬が試され，自己末梢血幹細胞移植を併用した大量メ

interferon α 3MIU/week で後療法を施行した。治療

ルファラン療法が現在では最も有効であるとされてい前後で performance status，腎機能各種検査，血清るが，治療に関連した有害事象も多いため，適応症例

free light chain（FLC），血清・尿の免疫固定法，血は限られる。VAD 療法も本疾患において，アミロイ

清 BNP，心エコー，骨髄所見を検討した。

ド前駆蛋白産生抑制や臓器障害の進行抑制において有その結果，田澤は次の結果を得た。

効性が期待され，また，移植前の導入療法としても用

１．VAD 療法により，８例中４例（50％）で血液学

いられている。本研究では，複数回の VAD 単独療法

的完全寛解に至り，その後４年の経過で全例が生存を行うことで，50％の症例で長期間にわたって完全しており再発はない。

寛解を維持することができ，腎機能や心機能の指標で２．寛解に至った４例中３例は interferon による後ある血清 BNP に改善が認められた。しかし，inter-療法を施行したが本療法の効果は不明であった。

feron 療法の完全寛解維持への寄与は不明であった。

３．完全寛解に至らなかった４例では，重篤な副作用

VAD 療法単独で良好な治療効果を得られた要因と一を来したため，治療を中断せざるを得なく，50％

つとして，多発性骨髄腫に比べ AL アミロイドーシス

生存期間は7.0±2.0カ月であった。

では異常形質細胞数が少ないことが寄与している可能

これらの結果より，原発性全身性 AL アミロイドー性が考えられた。

シスの治療において，自己末梢血幹細胞移植を併用し一方，副作用としては，腎機能障害と心機能障害をた大量メルファラン療法の適応外と考えられる症例で伴う６例で dexamethasone による体液貯留作用が認は，VAD 療法は治療選択肢の一つとして考慮すべきめられた。本疾患ではしばしば，腎臓や心臓などの臓であると考えられた。VAD 療法単独で良好な治療効

器に潜在性にアミロイドが沈着していることもあり，果を得られた要因として，AL アミロイドーシスでは体液負荷がかかる VAD 療法では，特に低アルブミン

標的細胞である異常形質細胞数が少ないことが考えら

血症や心機能障害などを合併している場合，厳重な水れた。ただし，臓器障害が進行した症例では副作用と分管理が必要である。

して高度の体液貯留がみられ，厳重な水分管理が必要

本研究の結果から，自己末梢血幹細胞移植を併用した大量メルファラン療法の適応外と考えられる症例でNo. 5, 2009と考えられた。よって，主査・副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。
175

審査学位論文要旨

frequency of the antibodies, as compared with the

Existence of an IgG component of naturally occurring HLA class I antibodies thatare not directed against self‑antigens inhuman serum（ヒト血清中に存在する非自
己抗原に対する IgG 型 HLA クラスＩ自然抗体）
周corresponding controls.However,the antibodies did
not appear to be involved in the development of
SLE because of no substantial relationship to theincidence of cytopenia or SLE disease activityindex
score. Each individual had 1 to 31 types of HLAclass I antibodies. Interestingly, HLA class I antibodies did not correspond to the individualʼ
s own

博

HLA antigens. Eight of 32 types of HLA class I（論文の内容の要旨）

antigens detected were rare in the Japanese popula-〔Introduction〕SLE occurs predominantly in youngtion :HLA‑A23, ‑A25, ‑A34, ‑B8, ‑B18, ‑B45, ‑B49,

women, particularly in females of child‑bearing

and ‑B57.

age. Accumulating data have demonstrated that

〔Discussion & Conclusion〕There are several possi-

speciﬁc HLA haplotypes are implicated as a key

bilities for the production of HLA class I antibodies.

genetic element in the susceptibility to SLE. We(1) Feto‑maternal immunization. In our results ofspeculated on a possible role for antibodies against

family analysis, the son carried 4 types of HLA

HLA antigens in the development of SLE.We there-

antibodies that did not correspond to the antigens offore compared the frequency of IgG type of HLA

the mother. (2) Antibody response arising throughclass I antibodies between SLE patients and healthy

sexual contact.Eight types of HLA class I antigens

controls, using a highly sensitive FlowPRA method

to which serum samples responded were rare in thefor the detection and deﬁnition of the antibodies.

Japanese population.(3)Autoantibodies.HLA class〔M aterials and M ethods〕Peripheral blood samples

I antibodies did not correspond to the individualʼswere harvested after obtaining fully informed con-own HLA antigens. These results suggest that ansent from 47 patients with SLE ［31 female patients

IgG component of naturally occurring HLA class I(mean age: 34, range: 11 to 69 years); 16 maleantibodies exists in human serum and that thesepatients (31, 9 to 81 years)］, and 149 healthy volun-

antibodies are not antibodies against self‑antigens.

teers ［19 healthy females (31, 22 to 53 years);130

Scoﬁeld et al. demonstrated that HLA‑B27 shares

healthy control males (35,20 to 54 years)］.HLA‑A,

short amino acid sequences with proteins from

‑B,and ‑Cw loci were determined with DNA‑based

enteric bacteria.In addition,segment 807‑816 of thetyping.For the HLA class I antibody screening test,

EB virus glycoprotein gp110 has been shown to

we used a panel of FlowPRA beads, which arecontain a six‑amino acid stretch (EQKRAA) thatmicroparticles (2 to 4 μm in diameter)coated withperfectly matches HLA Dw4.Therefore,it is likely

puriﬁed HLA class I molecules (FlowPRA, code

the antibodies are generated as a result of an

FL1‑30, One Lambda Inc.). We used the FlowPRA

immune response to environmental agents such as

single‑antigen class I HLA antibody detection test

bacteria and viruses,which are antigenetically iden-(FlowPRA, code FL1HD)to identify the speciﬁcity

tical with or similar to HLA antigens. These anti-

of HLA antibodies in serum samples. For samples

bodies may be an important part of the ﬁrst line ofwith high nonspeciﬁc binding, Adsorb Out

defense against hematological spreading infections.

beads

were used.

（論文審査の結果の要旨）〔Result〕Sixteen of 130 normal healthy males and

SLE は若い妊娠可能年齢の女性に好発する自己免

two of 10 normal females without a history of

疫疾患である。症状としては，発熱，多関節痛など多pregnancy (none had ever been transfused) pos-

彩で，白血球・リンパ球減少，血小板減少が15％かsessed HLA class I antibodies.In SLE,male,but not

ら45％の患者で認められている。リンパ球減少の原

female patients,showed a signiﬁcant increase in the

因の１つとして，抗 SSA‑Ro 抗体，抗 RNP 抗体及176

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

び抗 dsDNA 抗体が細胞周期を阻害したり，細胞中にることから，HLA クラスＩ抗体は細菌やウイルスな侵入して apoptosis を起こすことが報告されている。

どの環境因子に対する免疫応答の結果である可能性が近年，特異的な HLA ハプロタイプが本症の疾患感受考えられた。これらの抗体は，血液伝播性の感染症に性に重要であると報告されている。輸血や妊娠などに対する防御の第１線として重要な役割を演じているこより産生される HLA クラスＩ抗体は，血小板輸血不とが示唆された。

応の原因としても重要である。本研究では，SLE の

このように，正常ヒト血清中に IgG タイプの HLA

発症における HLA 抗体の関与について検討した。

クラスＩ抗体が自然抗体として存在を明らかにしたこ

高感度のFlowPRA法を用いて，SLE患者と健常対照者の間で IgGタイプの HLAクラスＩ抗体の頻度を比とは重要な知見と思われ，主査，副査は一致して本論
文を学位論文として価値があるものと認めた。

し た。HLA ク ラ ス Ⅰ タ イ ピ ン グ を Luminex

LABScreening，PCR‑SSOP法により，抗体スクリー
ニングを FlowPRA Screening Test，抗体の同定を
FlowPRA Single 法により実施した。
その結果，周 博は次の結論を得た。
1） 女性の SLE 患者31名のうち11名（35.5％）と男性患者16名中６名（37.5％）が HLA クラスＩ抗体陽性であった。一方，正常対照女性では，妊娠歴を持つ９名のうち４名と，妊娠歴も輸血歴も持たな

Development of Analysis Procedures for
the Simple Visualization of Hospitalsʼ
Market Share, Using Hospital Income
Calculated by means of the Diagnosis Procedure Combination (DPC) Payment System（DPC から集計した病院収入データを用いた病院マーケットシェア分析の単純化・可視化手法の開発）

い10名のうち２名が HLA クラスＩ抗体を保有して瀬戸山いた。興味深いことに，130名の健常男性の中で16名（12.3％）が HLA クラスＩ抗体陽性であった。

友

一（論文の内容の要旨）

2） 統計学的には，男性の SLE 患者における抗体保【背景と目的】新たな診療報酬制度である DPC 制度

有率は男性の正常対照よりも明らかに高かったが，が日本の国立大学病院において平成15年から開始され女性の SLE 患者と女性の正常対照との間には有意たことにより，この DPC データを中心に病院情報シ

差は認められなかった。17名の無治療の SLE 患者

ステムに保存されたデータを活用し，病院収益の分析

において，抗体保有と血球減少あるいは SLE の疾を効果的に行える環境が整ってきた。これまで報告さ

患活動スコアとの間には関連はみられなかった。まれてきた分析内容は，自院の収益分析を中心に行われた，HLA クラスＩ抗体は免疫抑制療法後の血清中てきた。しかし，病院運営の意思決定において，自院にも認められた。これらのことから，HLA クラスの状況だけでなく，マーケティング的な視点から，地Ｉ抗体は SLE の発症には関与していないと思われ域医療圏の中の位置付けや他施設との比 が必要と考た。

えられる。こうしたなかで，DPC データに記録され

3） HLA クラスＩ抗体保有者は，１から31種類の抗ている ICD‑10コード（国際疾病分類コード）を利用

体を持っていた。これらの HLA クラスＩ抗体は抗することで，厚生労働省の公的統計資料である「患者体保有者自身の HLA 抗原には対応していなかった。

調査」と関係づけることが可能であり，疾患ごとの患

また，HLA A23，A25などの８種類の HLA クラ者シェア（自院患者数/地域の総患者数）が容易に算スＩ抗原は日本人にはまれなものであった。

出できることに注目した。

4） ファミリー分析では，息子は母親の HLA クラス

今回，これらの病院情報システムのデータを用いて，Ｉ抗原とは無関係の４種類の HLA 抗原に対する抗病院のマーケティング分析を実施可能とすることを目

体を持っていた。

的に，地域医療圏における患者シェア分析について病これらの結果から， 児間免疫反応，性的接触を介院の状況を容易に推定できる単純な可視化手法の開発

した反応，あるいは自己免疫反応として HLA クラスを行った。

Ｉ抗体が産生されたとは考えにくかった。腸内細菌の【方法】可視化の手段として，⑴ 患者シェアマップ，

タンパクの一部は HLA‑B27と，EB ウイルス糖蛋白及び⑵ 患者ポートフォリオ・マネジメント（PtPM ）の一部は HLADw4とアミノ酸配列が完全一致してい図を開発した。PtPM 図は，ボストン・コンサルティ

No. 5, 2009177

審査学位論文要旨

ング・グループ（BSG）が提唱し，産業界でポピュ

働省の公的統計資料である「患者調査」と関係づけら

ラーな手法であるプロダクト・ポートフォリオ・マネれることに注目し，⑴ 患者シェアを算出，⑵ 情報をジメント（PPM ）図のテクニックを基に，病院市場

加工し，病院のマーケティング課題を容易に把握可能への導入を試みたものである。これら手法について，な表現手法を開発，⑶ 開発した表現手法を信州大学医

信州大学医学部附属病院の2004年４月から2005年９月

学部附属病院（以下，信州大学病院）の DPC データ

までの13,187人の入院患者データを適用し，その有用（13,187人の入院患者）に適用し，有用性を評価した。

性を評価した。

その結果，瀬戸山は以下の結果を得た。

【結果】患者シェア算出により，信州大学医学部附属１．分析手法として「患者シェアマップ」及び「患者病院の患者シェアが松本医療圏で12.9％，長野県内

ポートフォリオ・マネジメント（PtPM ）図」を導（三次医療圏）で3.9％であることがわかった。これき出した。

を患者シェアマップ及び PtPM 図化することにより，
西に高く東に低い患者偏在（高速道路の影響が示唆さ

２．開発した分析手法をもって，信州大学病院の患者
シェアの状況を明らかとした。

れる）や長野県全体をカバーしていない実際の診療圏

３．信州大学病院の入院患者の地理的・物理的位置条が明らかとなるとともに，がん診療によって安定的に件による患者動態を可視化し，説明可能とした。

収益を獲得する大学病院としての特徴や，資源投入の４．信州大学病院の地域別・疾患別の実際の診療圏を可否判断が求められる疾患群（循環器系疾患等）が明らかとなった。
【結論】患者シェアマップにより，一目で自院の患者可視化し，説明可能とした。
５．信州大学病院の疾患別の収益性や診療の特長を可視化し，説明可能とした。

状況の把握が可能であり，なおかつ，PtPM 図を確以上の結果より，提示された「患者シェアマップ」

認することにより，診療の特徴を把握し，病院資源を

及び「患者ポートフォリオ・マネジメント（PtPM ）どの分野に投入するかを効果的に判断できた。このよ図」という二つの分析手法の組み合わせにより，地域

うに，患者シェアマップと PtPM 図の組み合わせににおける患者の状況，診療圏の設定，シェア算出，自よって患者シェアを表現することにより，効果的な分院診療の特長の把握など，病院のマーケティング分析

析ができることを示した。また，これらの可視化は，で要求される多くの内容が提供され，DPC データの病院環境変化に対する病院の迅速な意思決定に有用な活用が病院マーケティング分析に有効であることが確資料として利用できる可能性を示した。

認された。さらに，情報の可視化がされたことにより，（論文審査の結果の要旨）

直感的に診療サービスや地域患者の動態を把握が可能

新たな診療報酬制度である DPC 制度が日本の国立であり，病院経営上，より迅速な意思決定に役立つと大学病院において平成15年から開始されたことにより，考えられた。このようなマーケティング分析手法の開記録された DPC データを中心に病院情報システムに

発は DPC 制度においては本研究が初めての試みであ保存されたデータを活用し，病院の経営分析を効果的る。また，これらの理論と手法を活用して他の医療機行える環境が整ってきた。経営分析においては，自施

関や地域医療へ展開することにより，地域医療全体の設内部の詳細な分析だけでなく，マーケティングの視向上に寄与する可能性を示唆するものであり，主査，

点から地域医療圏の中で患者の動態や自施設の特徴を副査は一致して本論文を学位論文として価値があるも明らかとすることが重要と考えられる。本制度が設計のと認めた。

された当初から，DPC データは病院のマーケティン
グ分析に活用されるようになることが予見されていたが，これまでの報告は自施設内部の経営分析に限られており，他施設との比 や医療マーケティングに関するものは見当たらない。そこで，瀬戸山は，病院に蓄積された DPC データが，病院のマーケティング分析に有効活用できるかどうかを検討した。
瀬戸山は，DPC データに記録される ICD‑10コード（国際疾病分類コード）を Keyとすることで，厚生労178

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

ン数で正常機能が維持されており，新生児期の坐骨神

Motor neurons essential for normal sciaticfunction in neonatally nerve‑injured rats
（正常な運動機能維持に必要な最小運動ニュー
ロン数の決定―新生児ラット坐骨神経におけ
る研究―）
掛

川

晃

（論文の内容の要旨）【目的】

経運動ニューロンの高い神経可塑性を示しているものと考えられた。
（論文審査の結果の要旨）
神経損傷後の運動機能回復については，生存する運動ニューロン数や損傷時の神経の成熟度により異なる。
本研究で掛川は，生後１日目のラットの坐骨神経に程度の異なる損傷を加え，８週間経過後の坐骨神経運動機能と生存する運動ニューロン数について検討し，正常運動機能を維持するための最小限のニューロン数を

新生児期の坐骨神経に損傷を加えると運動ニューロ

求めることを目的とした。坐骨神経の機能評価は，ンは細胞死をおこす。出生直後のラットの坐骨神経に

Footprint を採取し Static Sciatic Index（SSI）を用程度の異なる圧迫損傷（Crush injury）を加え，成熟い算出した。運動ニューロン数の計測は，軸索の逆行期まで生存させ，正常な運動機能維持に最低限必要な輸送能を利用し坐骨神経の分枝である総腓骨神経に神運動ニューロン数を決定することを目的として本研究

経トレーサー（BDA‑3000）を投与し脊髄まで運ばれを行った。

た運動ニューロンをカウントした。

【方法】

その結果，掛川は以下の結果を得た。

生後１日の Wistar 系ラットを用いて，坐骨神経に⑴ Control 群 の SSI は−5.49〜−17.66で あ り，神程度の異なる Crush injuryを加えた坐骨神経損傷モ

経損傷群は，−5.21〜−100.00であった。また，神デルラットを作成した。坐骨神経の運動機能評価は，

経切断群は−88.63〜−100.00と高度機能障害を呈Footprint を採取し，SSI（Static Sciatic Index）法

した。これらのことから SSI：−20.00以上が運動を用いて評価した。運動ニューロンの計測は，神経軸機能正常，SSI：−20.00未満が機能障害であるこ索輸送能を利用し，逆行性神経トレーサー（BDA‑とが確認された。

3000）で標識された BDA（＋）運動ニューロンを計⑵ 神経トレーサーで標識された運動ニューロン数は，測して行った。８週間経過後，神経トレーサーを総腓

Control 群では385〜571（平均442）であることが骨神経に48時間浸潤させ，その後還流固定を行い，脊分かり，正常であっても神経細胞数に個体差がある髄を採取し，厚さ50μm の凍結切片を作成し，ABC‑

ことが確認された。

DAB にて反応し，細胞核を有する BDA（＋）運動⑶ 神経損傷ラットのうち，機能正常群の運動ニューニューロンを計測した。

ロン数は74〜383，機能障害群の運動ニューロン数【結果】は14〜61，高度機能障害群の運動ニューロン数はControl 群の SSI は−20以上であった。Crush 群は，０〜32であった。

SSI が−20以上の機能正常群，SSI が−20〜−60の機Control 群の運動ニューロン数の平均442（100％）

能障害群，SSIが−60以下の高度機能障害群に分類されに比べ，機能障害群で最も多かったものは61（13.8た。Control 群の運動ニューロン数は，385〜571（平％）であった。また，運動機能正常で最も少なかった均442）であった。Crush 群の機能正常群は74〜383，

ものは74（17.5％）であった。

機能障害群は14〜61，高度機能障害群は０〜32であっ従って，正常機能を維持する為に必要最小限の運動

た。なお，神経切断群は，０〜８であった。Control

ニューロン数は正常の約15％程度だという事が確認

群の平均値を100％とすると，Crush 群の機能正常群された。

は17〜87％，機能障害群は３〜14％，高度障害群は以上より，生後間もないラットにおいて神経損傷後０〜７％，神経切断群は０〜２％であった。

に正常機能を維持するための運動ニューロンの必要最【結論】

小限数が明らかにされた。これまでに坐骨神経を用い新生児期の坐骨神経損傷においては，運動ニューロ

た同様の研究はなく，生物学的にも臨床医学的にも意

ンが約15％以上存在すれば，運動機能は正常に維持義があるものと考えられ，主査，副査は一致して本論されるものと結論された。非常に少ない運動ニューロ

文を学位論文として価値があるものと認めた。

No. 5, 2009179

審査学位論文要旨

果は，HA の過剰産生が腫瘍間質の形成を伴って血管Hyperproduction of hyaluronan in neu‑induced mammary tumor accelerates angiogenesis through stromal cell recruitment : possible involvement of versican/
PG‑M （乳腺腫瘍におけるヒアルロン酸の過剰産生は間質細胞を動員して血管新生を促進する：バーシカンの関与を含めて）
小山

新生の促進に働くことを示唆している。そこで次に，
Has2

腫瘍内で血管新生に働く HA の分子種を特定するため，マトリゲルに bFGF と様々な分子種のHA を添加してマウス皮下に移植し，マトリゲル内ヘ
モグロビン含有量を指標に血管新生の程度を評価した（マトリゲルプラグアッセイ）。鶏冠由来の高分子 HAを添加しても血管新生の促進は認められなかったが，低分子の HA オリゴ糖を低濃度で添加した場合には，

洋

以前の報告にある様に bFGF 単独に比べて顕著に血（論文の内容の要旨）

管新生を亢進した。また，臍帯由来の HA を用いた

【背景と目的】ヒアルロン酸（HA）は生体に広く分場合には，高分子であっても濃度依存的に血管新生が布する主要な細胞外マトリックス成分として，組織の促進されることが今回新たに分かった。ヒトバーシカ

構造維持に重要な役割を果たしている。一方，癌細胞

ン抗体を用いたドットブロット分析から，用いた臍帯

周囲に形成される HA 糖鎖に富んだ細胞外マトリッ

由来の HA 標品中にヒアルロン酸結合性プロテオグ

クスは，癌化に伴ってその形成が増大し，癌の未分化リカンであるバーシカンが混入していることが判明し，度やリンパ節転移率と密接な相関をもつことが示され血管新生の促進に HA とバーシカンが協調的に作用ている。そこで，癌における HA 産生と癌進展とのした可能性が考えられた。そこで，マトリゲルプラグ

関係解明を進めることが，新たなる治療戦略の糸口とアッセイにより HA‑バーシカン複合体の血管新生作なりうると考え，乳腺上皮及び乳腺腫瘍で HA を過剰用を検討したところ，複合体が筋線維芽細胞と CD31

産生するトランスジェニックマウスを樹立し，癌進展陽性細胞のマトリゲル内への動員を促進することを明における HA の影響を検討した。

らかにした。実際に，Has2【方法と結果】癌の発生と進展における HA 細胞外マ抽出液を HA プローブ及びバーシカン抗体を用いてトリックスの役割を解明する為に，乳腺上皮及び乳腺ドットブロット分析を施行したところ，Has2

腫瘍においてヒアルロン酸合成酵素２（Has2）を強は HA の過剰産生と一致して Has2発現するトランスジェニックマウス（Has2）を高いバーシカンの集積を認めた。また，HA プローブに発生した乳癌では，Has2の発及びバーシカン抗体の二重染色を施行 し た 結 果，作製した。Has2

現と腫瘍内 HA 量ともに対照群（Has2

）よりも

Has2

著明に上昇した。Has2に比べ癌

カンの共局在を明らかにした。

では，Has2

及び Has2の腫瘍でに比べ約６倍腫瘍では HA リッチマトリックスにバーシ発生までの期間が短く，急速な腫瘍増大を認めた。病【考察】乳癌におけるヒアルロン酸の過剰産生が，腫理組織学的解析の結果，Has2

腫瘍では細胞間結

瘍間質の形成を強力に惹起し，それに関連して腫瘍血

合の弱い腫瘍細胞からなる低分化型腺癌の像を示し，管の新生に働くことを明らかとなった。そして，腫瘍Has2

腫瘍に比べ著明な腫瘍間質の形成を認めた。

内への間質細胞や血管内皮細胞の動員に，HA とその血管内皮特異的な CD31について免疫染色により解析

結合分子のバーシカンが細胞外マトリックスとして共したところ，Has2

的大きな血同して働くことが示唆された。今後は腫瘍間質の形成では微小な血管機構と腫瘍間質が血管形成に働く分子機構の解明を進が多数認められた。Real time 定量 RT ‑PCR 法によめる計画である。今回示した血管新生機構の更なる解り，腫瘍での血管新生因子の発現を検討した結果，代明が新たな治療戦略の開発に繫がり，また，HA 過剰

表的な血管新生因子である VEGF‑A とその転写因子

産生乳癌発症マウスがヒト進行性乳癌の病態を反映し

HIF‑1αの発現は，Has2た動物モデルとして，新たな発見をもたらしてくれる腫瘍組織では比管が散見されたのに対し，Has2と Has2において転写レベルで有為な差を認めなかった。これに対して，間質由来の血管新生因子である bFGF 及び SDF‑1α/
CXCL12の発現は，Has2

腫瘍組織では HAS2に比べて転写レベルで約２倍亢進していた。以上の結180ことを期待している。
（論文審査の結果の要旨）
ヒアルロン酸（HA）は生体に広く分布する主要な細胞外マトリックス成分として，組織の構造維持に重信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

要な役割を果たしている。一方，癌細胞周囲に形成される HA 糖鎖に富んだ細胞外マトリックスは，癌化に伴ってその形成が増大し，癌の未分化度やリンパ節転移率と密接な相関をもつことが示されている。そこで，癌における HA 産生と癌進展との関係解明を進めることが，新たなる治療戦略の糸口となりうると考え，本研究において我々は，乳腺上皮及び乳腺腫
瘍で HA を過剰産生するトランスジェニックマウス（Has2）を樹立し，癌進展における HA の影響を

Critical role of bone marrow apoptosis‑
associated speck‑like protein, an
inﬂammasome adaptor molecule, in
neointimal formation after vascular injury
in mice（マウス血管傷害後の新生内膜形成における，骨髄由来のインフラマゾームアダ
プター分子であるアポトーシス関連スペック
様カード蛋白質の重要な役割）検討した。また，マトリゲルプラグアッセイを用い，

矢血管新生に働く HA 分子種の同定及び HA‑バーシカン複合体の血管新生作用を検討した。
では Has2

紀幸（論文の内容の要旨）

その結果，小山は次の結論を得た。
１．Has2嶋

動脈硬化性病変や，冠動脈ステント留置術など冠動

コントロール群に比べ，脈形成術後の再狭窄における病理学的機序は，血管内腫瘍発生までの期間が短く，急速な増大を認めた。

皮傷害後の炎症性反応によって生じる新生内膜形成に

２．Has2

腫瘍では細胞間結合の弱い腫瘍細胞からなる低分化型腺癌の像を示し，Has2

腫瘍に 比 べ 著 明 な 腫 瘍 間 質 の 形 成 を 認 め た。ま た，
Has2の腫瘍では腫瘍細胞の境界部と間質に HAの蓄積が認められた。
３．Has2ていない。
インターロイキン（IL）‑1βや IL‑18といった炎症性サイトカインは，動脈硬化や再狭窄の進展といった，生体内の広範な免疫応答や炎症反応などを制御してい腫瘍では比れたのに対し，Has2よると考えられているが，その詳細な機序はよくわかっ

的大きな血管が散見さるが，活性型の IL‑1βと IL‑18の産生には，インターでは微小な血管が多数認

ロイキン変換酵素として知られるカスペース‑1による，められた。また，間質由来の血管新生因子である

その前駆体のプロセシングが必要であり，最近の研究

bFGF 及び SDF‑1α/CXCL12の 発 現 は，Has2

では，カスペース‑1は，インフラマゾームと名付けら腫瘍組織では Has2

れたアダプター分子の多量体において活性化されていに比べ転写レベルで約２倍

亢進していた。

ることが報告されている。

４．HA‑バーシカン複合体による筋線維芽細胞とアポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ASC）

CD31陽性細胞のマトリゲル内への動員の促進が認は，1999年に信州大学で発見されたアダプター分子でめられた。

あり，インフラマゾームの構成分子のひとつである。

５．ドットブロット分析にて，Has2
過剰産生と 一 致 し て Has2

では HA のASC は，そのＣ末にカスペースやアポトーシス・シに比べ約６倍高い

グナル経路の調節蛋白質に存在する結合モチーフであバーシカンの集積を認めた。また，Has2

組織

る caspase‑recruitment domain（CARD）が，N 末

では HA リッチマトリックスにバーシカンの共局には，遺伝性の炎症疾患である家族性地中海熱の原因

在が明らかとなった。

遺伝子産物である pyrin の N 末領域と高い相同性を今回の実験より，乳癌における HA の過剰産生が，示す pyrin‑like domain（PYD） が存在している。

腫瘍間質の形成を強力に惹起し，それに関連して腫瘍

CARD や PYD は同種結合活性をもつ結合ドメインで血管の新生に働くことを明らかとなった。そして，腫あり，ASC は CARD と PYD から構成されるシグナ

瘍内への間質細胞や血管内皮細胞の動員に，HA とそ

ル伝達経路の仲介者としての役割を担っている。さらの結合分子のバーシカンが細胞外マトリックスとしてに，ASCは 同 じ CARD を 持 つ カ ス ペ ー ス ‑1の リ ク

共同して働くことが示唆された。

ルートメントと活性化を制御しているため，カスペー

以上のことから，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

ス‑1を介した IL‑1βと IL‑18の活性化を制御することで，炎症やアポトーシスに関わっていると考えられている。
血管傷害における ASC の役割については解明され

No. 5, 2009181

審査学位論文要旨ておらず，本研究で は，ASC 遺 伝 子 欠 失 マ ウ ス をASC 遺伝子欠失マウス由来の血管平滑筋細胞の双方用いて，血管傷害後に生じる新生内膜形成におけるで，同様に ERK1/2と p38の顕著なリン酸化を認めた。

ASC の関与を詳細に検討した。

BrdU取り込み分析を用いて，ASC遺伝子欠失マ

ASC は正常血管において内皮細胞で発現しており，ウス培養血管平滑筋細胞の増殖能を検討したとこ

炎症や細胞死で発現が誘導されることが知られている。

ろ，野生型と ASC 遺伝子欠失培養血管平滑筋細胞でマウス大腿動脈にワイヤー傷害を加え，１週間後と３

PDGF‑BB の刺激による活性の差はなかった。また，週間後の傷害血管における ASC の顕著な発現を，免IL‑1βと IL‑18の刺激では，増殖能の亢進を認めな

疫組織学的手法を用いて確認した。ワイヤー傷害後のかった。核内増殖抗原（PCNA）の免疫組織染色で新生内膜形成は，ASC 遺伝子欠失マウスで野生型マ

は，ASC 遺伝子欠失マウスの新生内膜病変においてウスに比べて有意に減弱していた（ｐ＜0.01）。野生は，PCNA 陽性細胞数の減少を認めた。

型マウスの新生内膜病変では，IL‑1βと IL‑18が発現以上の結果から，ASC は傷害血管で著しく発現ししていたが，ASC 遺伝子欠失マウスでは発現が低下ていること，ASCの欠失は新生内膜病変におけるIL‑

していた。アポトーシスの関与を検討するため，傷害1βと IL‑18の発現を減少させ，血管傷害後の新生内２時間後の野生型マウスと ASC 遺伝子欠失マウスの膜形成を減弱すること，特に骨髄細胞における ASC

血管壁で TUNEL 陽性細胞の数を比したところ差の欠失が，新生内膜形成を減少したこと，in vitro のが な か っ た。新 生 内 膜 形 成 へ の 影 響 を，野 生 型 と実験で，ASC 遺伝子欠失マウス由来の血管平滑筋細ASC 遺伝子欠失マウスの傷害１週間後の再内皮化と，胞の増殖能は障害されていないこと，が新たな知見と傷害３週間後の血管平滑筋細胞数とマクロファージ数

して示された。

で比したが差はなかった。

骨髄細胞由来細胞の関与を検討するため，放射線照射したマウスに，予め採取した他の骨髄細胞を移植することで，野生型から野生型，野生型から ASC 遺伝

以上の結果より，骨髄細胞由来の ASC が，血管傷害後に生じる新生内膜形成において重要な役割を持つ
ことが示唆された（論文審査の結果の要旨）

子欠失マウス，ASC 遺伝子欠失マウスから野生型マ

動脈硬化性病変や冠動脈形成術後の再狭窄におけるウスの三種類の骨髄置換マウスを作製した。それぞれ病理学的機序は，血管内皮傷害後の炎症性反応によっにおいてワイヤー傷害３週間後の新生内膜形成を比て生じる新生内膜形成によると考えられている。

したところ，ASC 遺伝子欠失マウスの骨髄細胞を野アダプター分子であるアポトーシス関連スペック様

生型マウスに移植したマウスで，内膜形成の有意な減

カード蛋白質（ASC）は，シグナル伝達経路の仲介

少を認めた（ｐ＜0.05）。

者として，同じCARDを持つカスペース‑1のリクルー

ASC を発現している骨髄由来細胞の種類を検討す

トメントと活性化を制御しているため，カスペース‑1

るため，末梢血単核球をフローサイトメトリーで検証を介して炎症性サイトカイン IL‑1βと IL‑18の活性したところ，ASC はＴ細胞，単核球，顆粒球で発現化を制御することで，炎症やアポトーシスに関与してしていた。

いる。血管傷害における ASC の役割については解明

血管傷害後の新生内膜病変は，増殖した血管平滑筋

されておらず，本研究では，ASC 遺伝子欠失マウス細胞で構成されている。mitogen‑activated proteinを用いて，血管傷害後に生じる新生内膜形成におけるkinase（M APK）ファミリーは，細胞外からの刺激

ASC の関与を検討した。

を核内の転写機構制御にまで変換，伝達するリン酸化

８週齢から12週齢のオスのマウス大腿動脈にワイヤー

酵素群であり，血管平滑筋細胞の増殖において中心的傷害を加え，１週間後と３週間後の傷害血管におけるな役割を演ずる重要な酵素である。野生型マウス及びASC の顕著な発現を免疫組織学的手法を用いて確認

ASC 遺伝子欠失マウス培養血管平滑筋細胞における，した。ワイヤー傷害後の新生内膜形成は，ASC 遺伝

血清と成長因子の刺激による extracellular signal‑

子欠失マウスで野生型マウスに比べて有意に減弱してregulated kinase（ERK）1/2と p38 M APK（p38）

いた（ｐ＜0.01）。野生型マウスの新生内膜病変では，活性化の影響を，ウェスタンブロット法を用いて検討

IL‑1βと IL‑18が発現していたが，ASC 遺伝子欠失した。ウシ胎児血清と血小板由来増殖因子 BB アイソ

マウスでは発現が低下していた。骨髄細胞由来細胞のフォーム（PDGF‑BB）によって，野生型マウスと関与を検討するため，三種類の骨髄置換マウスを作製

182

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

し，それぞれにおいてワイヤー傷害３週間後の新生内梗塞の病態においてどのような役割を果たしているか膜形成を比したところ，ASC 遺伝子欠失マウスのはわかっていない。そこで本研究では，α‑cardiac

骨髄細胞を野生型マウスに移植したマウスで，内膜形

myosin heavy chain プロモーター下にマウス JE ‑成の有意な減少を認めた（ｐ＜0.05）。

MCP ‑1 遺伝子を導入した心筋特異的 MCP‑1発現

血管平滑筋細胞の増殖能を検証するため，野生型マ（M HC/MCP‑1）マウスを用いて，心筋梗塞後の心機ウス及び ASC 遺伝子欠失マウス培養血管平滑筋細胞

能やリモデリングにおける心筋 MCP‑1の役割を明らにおける，血清と成長因子の刺激による ERK1/2とかとすることを目的とした。

p38活性化の影響を，ウェスタンブロット法を用いて【方法と結果】８〜12週齢の雄性 MHC/M CP‑1マウ検討した。ウシ胎児血清と PDGF‑BB によって，野ス（n＝191）を用いた。心筋梗塞は吸入麻酔下にマ

生型マウスと ASC 遺伝子欠失マウス由来の血管平滑

ウスの左冠状動脈前下行枝を結紮することにより作製

筋細胞の双方で，同様に ERK1/2と p38の顕著なリンし，梗塞24時間及び14日後に組織学的評価を行い，梗酸化を認めた。

塞24及び48時間後，７，14，21，28日後に心機能評価

その結果，矢嶋紀幸は次の結論を得た。

を行った。M HC/MCP‑1マウスは，梗塞14日後に野１．ASC は傷害血管で著しく発現している。

生型に比べて梗塞領域の有意な減少（Ｐ＜0.01）と心２．ASCの欠失は新生内膜病変における IL‑1βと IL‑

機能不全の抑制（％ FS：42.6 vs.34.1，Ｐ＜0.001）

18の発現を減少させ，血管傷害後の新生内膜形成をを示し，組織学的には梗塞境界領域におけるマクロフ

減弱する。

ァージ及び血管内皮細胞の有意な増加を示した（Ｐ＜３．特に骨髄細胞における ASC の欠失が，新生内膜形成を減少する。

0.05）。この血管新生の増加に骨髄由来の EPC が関与しているかを確認するため，血管内皮マーカーであ４．in vitro の実験で，ASC 遺伝子欠失マウス由来

る Tie‑2のプロモーター下にマーカー遺伝子であるの血管平滑筋細胞の増殖能は障害されていない。

LacZ を発現させた Tie‑2/LacZ マウスの骨髄細胞をこれらの結果から，骨髄細胞由来の ASC が，血管用いて骨髄置換マウスを作製し，同様に組織学的評価

傷害後に生じる新生内膜形成において重要な役割を持を 行 っ た。MHC/MCP ‑1マ ウ ス の 心 臓 に お い てつことが示唆された。よって主査，副査は一致して本LacZ 陽性の血管内皮細胞が確認されたが，その数は論文を学位論文として価値があるものと認めた。

少数であった。そこで M HC/MCP‑1マウスでは末梢血中に EPC を動員するのか検討するために，経時的

CardiacOverexpression ofM CP‑1in Transgenic M ice Prevents Cardiac Dysfunction
and Remodeling after Myocardial Infarction（心筋特異的な MCP‑1の過剰発現はマ
ウス心筋梗塞モデルにおける心機能不全とリモデリングを改善する）
森

本

創に末梢血を採取し，フローサイトメトリーを用いて細胞表面マーカーを確認したところ，心筋梗塞後の末梢血には単球（Mac‑1 /Gr‑1 cells）は増加するが EPC（CD34 /Flk‑1 cells）は増加しないことがわかった。
血 清 中 の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン 濃 度 を cytometricbeads array法を用いて測定したところ，MHC/MCP‑
1マウスは，血清中に MCP‑1以外の IL‑6，IFN‑γ，IL‑10，IL‑12及び TNF‑αの上昇を認めないが，梗

（論文の内容の要旨）

塞後には IL‑6濃度の著しい上昇を示した。さらに，【背景と目的】単球やリンパ球の走化性を亢進させる

梗塞後の M HC/MCP‑1マウス心臓で STAT3の活性ケモカインである monocyte chemoattractant pro-化と心筋細胞の肥大が認められた。マウス新生仔単離

tein‑1（MCP‑1/CC ligand‑2）は，炎症や創傷治癒

心筋細胞における IL‑6による STAT3のリン酸化をにおいて重要な役割を果たしている。最近，骨髄由来

ウェスタンブロット法を用いて検出し た と こ ろ，の単球系細胞も血管内皮前駆細胞（EPC）に分化す

M CP‑1共存下には STAT3の持続的な活性化が明らることが報告され，さらに MCP‑1が血管新生作用をかとなった。また，MHC/M CP‑1マウス心では心筋示すことも報告されている。しかし，ケモカインであ

梗塞後に筋線維芽細胞の数が増加することも明らかとる MCP‑1は局所での濃度勾配によりその作用が制御なった。

されていることから，心筋そのものの M CP‑1が心筋【結 論】MHC/MCP ‑1マ ウ ス で は，心 筋 梗 塞 後 に

No. 5, 2009183

審査学位論文要旨

MCP‑1によるマクロファージの浸潤と血管新生の増加，心筋での IL‑6産生による STAT3の活性化を介した心筋細胞肥大作用，細胞保護作用や心線維芽細胞の蓄積により，心筋梗塞における心機能不全とリモデリングが改善されることが示唆された。
（論文審査の結果の要旨）
本 論 文 は ケ モ カ イ ン で あ る monocyte chemoattractant protein‑1（M CP‑1）の虚血性心疾患に対する有益な作用を示したもので，その価値は非常に高One third of Japanese patients with M ultiple Osteochondromas may have mutations
in genes other than EXT1 or EXT2（多発性骨軟骨 腫の日本人 患 者 の1/3は EXT1 や
EXT2 以外の遺伝子に突然変異を持っている可能性がある）
小

島

洋

文

い。また，論文審査にあたっては，各審査委員がそれ（論文の内容の要旨）

ぞれの専門の立場から本学位申請者に対し，口頭試問【背景と目的】多発性骨軟骨腫は四肢の長管骨の骨端を行った。

付近に膨隆した骨軟骨腫が生じる比 的頻度の高い常M CP‑1は，主に単球やリンパ球の走化性を亢進さ

染色体優性遺伝病であり，骨性隆起や骨変形が主な症せるケモカインであるが，虚血性心疾患に対する作用状であるが，患者のうち0.5から５％で軟骨肉腫やそについては，抗 M CP‑1遺伝子治療や MCP‑1受容体の他の肉腫への悪性化を呈することが知られている。

である CCR2欠損マウスを用いた基礎研究においてこの疾患の責任遺伝子として現在２つの遺伝子EXT1

MCP‑1の有害な作用が報告されている。しかしなが（8q24.11‑q24.13），EXT2（11p12‑p11）が単離されら，M CP‑1が血管新生を亢進させるなど有益な作用ている。多発性骨軟骨腫の日本人患者43家系についても報告されている。さらに，最近，骨髄由来の単球系

以前に同教室の研究で Single Strand Conformation

細胞が血管内皮前駆細胞（EPC）に分化することもPolymorphism（SSCP）法を使って遺伝子変異解析

報告されているが，MCP‑1はケモカインであるためを行い23家系に変異が認められた。今回我々は本邦に局所での濃度勾配によりその作用が制御されているこ

おける EXT1，EXT2 遺伝子変異のスペクトラムをとから，心筋そのものの MCP‑1が心筋梗塞の病態に明らかにする目的で，これらの43家系の検体を使っおいてどのような役割を果たしているかはわかっていて遺伝子変異スクリーニングとして検出 率 が 高 いない。そこで本研究では，α‑cardiac myosin heavy

Denaturing High Performance Liquid Chromatogra-

chain プロモーター下にマウス JE ‑MCP ‑1 遺伝子をphy（DHPLC）法を用いて遺伝子変異解析を行った。

導入した心筋特異的 MCP‑1発現（MHC/MCP‑1）【材料及び方法】単純 X 線検査にて骨軟骨腫を２個以マウスを用いて，心筋梗塞後の心機能やリモデリング上認める多発性骨軟骨腫の43家系（家族例19，散発における心筋 M CP‑1の役割を明らかとすることを目

例24）の患者を対象とした。同意を得た上でこれらの的とした。心筋に MCP‑1が発現しているが心筋障害患者の末梢血から DNA を抽出し，タンパク翻訳領域を起こしていない８〜12週齢の雄性 MHC/MCP‑1マを網羅するように EXT1 では17組の，EXT2 では16ウスと同一週齢の野生型マウスを用いて心筋梗塞モデ組のプライマーセットを作成し Polymerase Chain

ルを作成し，経時的に心機能測定と末梢血の細胞表面

Reaction（PCR）で増幅し，DHPLC法にてスクリー

マーカー評価，炎症性サイトカイン濃度測定を行った。

ニングを行い陽性パターンの波形を呈したものについ

さらに，心筋梗塞14日目の心臓を摘出し，免疫組織学て sequence を行い変異を解析した。さらに DHPLC

的 評 価 を 行 っ た。そ の 結 果，M HC/MCP‑1マ ウ ス

法にて境界型の波形を呈した検体についてはmismatch‑

では心筋梗塞後に MCP‑1によるマクロファージのspeciﬁc endonuclease を用いて PCR 産物を切断して浸潤と血管新生の増加，心筋 で の IL‑6産 生 に よ る

から DHPLC 法で解析する方法も補足的に行った。

STAT3の活性化を介した心筋肥大作用，直接的な細【結果】43家系中 DHPLC 法で陽性パターンを含む異胞保護作用や心線維芽細胞の蓄積により，心筋梗塞に常波形を呈したものはすでに SSCP 法で変異が確認

おける心機能不全とリモデリングが改善されることをされていた23家系を含む36家系であり，前者の23家系示唆した。

中２家系に境界型の波形が認められたためmismatch‑

以上の審査結果をもとに，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。
184

speciﬁc endonuclease を用いた DHPLC 法で解析した結果，明らかな陽性パターンの波形が認められた。
信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

これらの36家系の検体について sequence を行って変形を呈したものについて sequence を行い変異を調査

異を調べた結果，SSCP 法ですでに変異が見つかってした。

いた23家系以外に，SSCP法では変異が見つからなかっ

その結果，小島洋文は次の結果を得た。

た７家系で新たに変異が発見された。その他の陽性パ

１．43家系のうち SSCP 法で変異が見つかっている

ターンの波形を呈した６家系は多型であることが判明

23家系に加え７家系で新たに変異が発見され，このした。この新たに変異が見つかった７家系のうち３家

うち３家系の変異は今まで報告されていなかった新系の変異は今まで報告されていなかった新しい変異でしい変異であった。

あることがわかった。

２．SSCP法 の 検 出 率 23/43（53％）に 比 べ て【結論】SSCPによる解析では変異の検出率は43家系中DHPLC 法の検出率30/43（70％）は高く変異のス

23家系56％であったが，今回我々の用いた DHPLC

クリーニングとして有用であった。

法では30家系70％であり，さらに６家系に多型では３．変異の分布の比率 EXT1（19/43），EXT2（11/あったが塩基配列異常を検出したことよりこの解析方

43）は欧米の多発性骨軟骨腫のものと同様の傾向で法は SSCP 法よりも感受 性 が 高 い 方 法 で あ り 本 疾

あった。

患の遺伝子変異スクリーニングとして有用である。

４．遺伝子変異と臨床症状や悪性化との関連は現時点

EXT1 と EXT2 の変異検出率について白人を対象とでは判明されなかった。

してものでは EXT1 では41から66％，EXT2 では29

これらの結果よりDHPLC法が変異解析のスクリーから33％であり，今回の我々の結果ではEXT1が44％，ニングとして有用であり，患者およびその家系の血液

EXT2 が26％であり白人の検出率とほぼ一致していを解析することによりこの疾患の発症の予測が可能とる。今回の研究で変異が検出されなかった13家系（30なると思われた。大きな欠失の報告が少ないことと未％）については，我々の用いた DHPLC 法では検出検出率が約30％であることを考えると日本人の多発の出来ない大きな欠失の可能性はあるが，今までの報性骨軟骨腫の患者の約３分の１は EXT1，EXT2 以告によると，その頻度は高くはない。よって，我々の外の遺伝子に変異を持つ可能性があり，さらなる解析

研究結果は日本人の多発性骨軟骨腫については約30％には第３の遺伝子の同定が待たれることがわかった。

が EXT1，EXT2 以外の遺伝子に変異があることを以上の結果より，主査，副査は一致して本論文を学位示唆している。

論文として価値があるものと認めた。

（論文審査の結果の要旨）
多発性骨軟骨腫は四肢長管骨の骨端付近に膨隆した
骨軟骨腫が生じる比 的頻度の高い常染色体優性遺伝
病であり数％の確率で悪性化することが報告されており，現在２つ の 遺 伝 子 EXT1（8q24.11‑q24.13），
EXT2（11p12‑p11）が単離されている。日本人患者の43家系についてすでに Single Strand Conformation Polymorphism（SSCP）法を使って遺伝子変異解析を行い23家系に変異が認められているが，今回は遺伝子変異スクリーニングとして検出率が高いとExpression of Aurora kinases A and B in
normal hyperplastic,and malignant humanendometrium :Aurora B as a predictor forpoor prognosis in endometrial carcinoma（オーロラキナーゼＡとＢのヒト正常，増殖症，悪性子宮内膜における発現：オーロラＢ
は子宮内膜癌における予後不良因子）
藏

井

みゆき

さ れ て い る Denaturing High Performance Liquid（論文の内容の要旨）

Chromatography（DHPLC）法を用いて遺伝子変異【背景と目的】オーロラキナーゼ（以下オーロラと略）解析を行った。

は細胞分裂時のクロマチン分離と細胞質分裂に必要で単純 X 線検査にて骨軟骨腫を２個以上認める多発あり 細胞分裂の鍵分子 といわれている。乳癌，大性骨軟骨腫の43家系（家族例19，散発例24）の患者を腸癌，膵臓癌などでその過剰発現が報告されているが，対象とし，これらの患者の末梢血から DNA を抽出し，子宮内膜組織におけるオーロラの発現や意義は不明で

EXT1では17組の，EXT2では16組のプライマーセッある。本研究では正常子宮内膜，子宮内膜増殖症，子トを作成し Polymerase Chain Reaction（PCR）で宮内膜癌におけるオーロラ A と B の発現を免疫組織増幅し，DHPLC 法にてスクリーニングを行い陽性波学的方法によって観察し，その結果を増殖マーカーでNo. 5, 2009185

審査学位論文要旨

ある Ki67発現および臨床病理学的因子と比するこ増殖に直接作用するのでなく，オーロラＡの過剰蓄積とによって，子宮内膜組織におけるオーロラ発現の意

による遺伝子不安定性によって引き起こされる２次的義を明らかにすることを目的とした。

な遺伝子変化が関与しているのかもしれない。また正【対象と方法】正常子宮内膜40例，増殖症30例，内膜

常内膜および内膜癌での蛋白質と mRNA の発現がよ癌73例を対象としてオーロラＡおよびＢの免疫染色をく相関していたことから，オーロラ A 発現が主に転施行した。免疫染色の結果は細胞質染色を Positivity

写によって制御されていることが示唆された。

index （PI：強陽性細胞の％ x１＋弱陽性細胞の％ x

オーロラＢの発現は核に優位に観察された。オーロ

0.5，満点100）として記載し，核染色は陽性細胞の％ラＢの基質は核蛋白ヒストンH３であるので，オーロ数を記載した。またオーロラ蛋白の特異性と発現機ラＢの核局在は機能的に重要であると考えられる。正序を検討するために，７例の新鮮組織（増殖期２例，

常内膜腺上皮におけるオーロラＢの発現は増殖期で増分泌期２例，内膜癌３例）を用いて Western blot，

強し分泌期に減弱したこと，分裂期細胞は陽性であっ

RT‑PCR を施行した。これらの検体は患者の同意をたこと，さらにオーロラ B 陽性細胞は Ki67も陽性で得て使用した。

あったことから，オーロラＢが正常内膜腺上皮の増殖【結果】オーロラ A の陽性染色は細胞質に観察された。

に深く関与していると考えられる。加えて正常内膜で正常内膜腺上皮では分泌期より増殖期に強く染色され，はオーロラＢの mRNAと蛋白質が類似した発現パ

分裂期の細胞も陽性であった。内膜癌におけるオーロ

ターンを呈したことから，正常内膜ではオーロラＢが

ラ A 発現は増殖期内膜と比して有意に増強した（P＝転写により制御されていることが示唆された。一方，

0.049）。組織分化度では grade １および２の症例で予想に反して内膜癌ではオーロラＢの免疫組織学的発発現が高い傾向にあったが Ki67および患者予後との現は増殖期内膜と比 して低下した。この原因は不明

間には明らかな相関は見られなかった。オーロラ A

であるが，内膜癌ではオーロラＢの mRNA と比mRNA の発現は正常，悪性ともに蛋白質と相関してて蛋白質の発現が低下していることから，内膜癌にはいた。

オーロラＢ蛋白質に対する何らかの翻訳後修飾機構がしオーロラＢの陽性染色は主に核に観察された。正常あるのかもしれない。内膜癌におけるオーロラＢの免内膜腺上皮では，分泌期に対して増殖期で有意に強く

疫組織学的発現は grade ３症例で有意に上昇し，ま（P＜0.0001），分裂期の細胞も染色された。また増殖た予後不良因子であったことから，オーロラ B が子期腺上皮のオーロラ B 陽性細胞は高頻度に Ki67も陽宮内膜癌の異常増殖に関与していることが示唆された。

性であった。一方，内膜癌におけるオーロラＢの発現

結論：本研究によって内膜癌におけるオーロラＡとＢ

は増殖期内膜より有意に低下したが（P＜0.0001），の発現異常が明らかとなった。特にオーロラ B 発現

grade ３における発現は grade １および２より有意にが内膜患者生存との相関を示したことから，臨床的応高く（P＜0.028），Ki67と相関し（Ｐ＝0.0003），オー用の可能性が示された。

ロラ B 陽性の患者生存は陰性患者に比べ有意に短期（論文審査の結果の要旨）間であった（P＝0.0135）。Western blot でのオーロ

オーロラキナーゼ（以下オーロラと略）は分裂期のラＢの蛋白質発現は増殖期内膜と比 して内膜癌で低進行に重要な細胞周期調節因子で，ヒト癌における発下し免疫染色と相関していたが，オーロラＢ mRNA

現異常が報告されている。本研究では子宮内膜組織にの発現は内膜癌でむしろ増加する傾向がみられた。

おけるオーロラＡとＢの発現とその意義を明らかにす【考察】オーロラＡの発現が正常内膜増殖期腺上皮細るために，正常内膜および腫瘍性内膜におけるオーロ胞で増加し分泌期で低下したこと，分裂期細胞で陽性

ラの発現と局在を免疫組織化学および分子生物学的にであったことから，オーロラＡが正常子宮内膜腺上皮検討した。

の性ステロイド依存性の増殖に関与していると考えら

正常子宮内膜40例，子宮内膜増殖症30例，内膜癌73れた。内膜癌ではオーロラＡの発現は正常内膜に比し例を対象としてオーロラＡ，Ｂの発現を免疫組織学的て増加しており，細胞増殖促進因子であるオーロラＡに観察し，結果を増殖マーカーである Ki67および患として妥当であると考えられたが，内膜癌においては者生存と比 した。またオーロラの発現機序を解析す

オーロラＡ発現は増殖能と相関しなかった。この原因るために，増殖期２例，分泌期２例，内膜癌３例の新としては，内膜癌においてはオーロラ A 発現が細胞

鮮組織を用いて Western blot，RT‑PCR を施行した。

186

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

その結果藏井は次の結論を得た。
１．オーロラＡ
1） 染色は細胞質に観察された。
2） 正常内膜腺上皮では増殖期に発現が増加し，分泌期で低下したので，正常子宮内膜の性ステロイ
ド依存性増殖に関与していると考えられた。

Biphasic function of focal adhesion kinase
in endothelial tube formation induced byﬁbril‑forming collagens（コラーゲン惹起性内皮細胞管状構造形成における focal adhesion kinase 機能の二面性）

3） 内膜癌で発現が増強したことから，癌遺伝子的中な機能を有すると予想された。しかし Ki67とは

村

純

子

相関がみられなかったので，オーロラＡが細胞増（論文の内容の要旨）

殖に直接作用するというよりは，過剰な蓄積に基【背景と目的】 Angiogenesis（血管新生）とは既存のづく遺伝子不安定性による２次的な遺伝子変化の脈管構造から新しい毛細血管が成長する過程であり，関与が示唆された。

創傷治癒の際などに生じる生理的な現象である一方で，

4） 蛋白質と m‑RNA の発現が相関したことから，転写による発現の制御が示された。
２．オーロラＢ

様々な疾患の病態に関与している。血管内皮細胞を取り巻く細胞外基質は，増殖因子等の液性因子と同様にAngiogenesis を制御する因子であり，インテグリン

1） 染色は主に核に観察された。

を代表とする細胞膜受容体を介して細胞―細胞外基質

2） 正常内膜腺上皮では増殖期で増強，分泌期で減間の相互的なシグナル伝達が行われている。Focal

弱したことから腺上皮の増殖に関与していると考

adhesion kinase （FAK） は接着斑に局在し，インテえられた。

グリンと細胞外基質の結合により活性化する非受容3） 内膜癌では正常内膜と比 して発現が減弱した。

体型チロシンキナーゼであり，細胞骨格の再編成や遊しかし内膜癌症例のなかでは増殖能と相関し，ま走，増殖に関わるシグナル伝達の中心的役割を果たした組織学的 grade の高い症例に高頻度に発現し，ており，angiogenesisの過程において重要な役割を

予後不良因子であった。

担っていることが知られている。血管内皮細胞の遊走

4） 正常内膜では蛋白質と m‑RNA の発現パターや管状構造の形成（tube formation）といった機能はンが一致したので，転写による発現の制御が示唆

angiogenesis の重要なプロセスであるが，特に代表された。一方，内膜癌では m‑RNA に比して蛋的な細胞外基質であるコラーゲンが内皮細胞の管状構

白質発現が低いことから，何らかの翻訳後修飾機

造形成を惹起することが知られており，angiogenesis

構の存在が示唆された。

のモデルとして研究されてきた。我々はヒト臍帯静脈

これらの結果より正常子宮内膜の性ステロイド依存内皮細胞（HUVEC）を用い，コラーゲン惹起性の性増殖においてはオーロラＡ，Ｂが関与していること，

tube formation における FAK の機能について研究しまた，子宮内膜癌ではオーロラＡ，Ｂの発現異常が存た。

在し，これが内膜癌の増殖に関与していることが明ら【材料及び方法】ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）

かになった。

を用いた。細胞外基質分子による管状構造の誘導実験

特にオーロラＢ発現が内膜癌患者の予後不良因子であったことから臨床的応用の可能性が示された。
以上より主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

には，タイプⅠ，Ⅱ，Ⅳコラーゲン，ビトロネクチン，
フィブロネクチンを用い，培地に加える手法で比を行った。インテグリンの機能の評価にはインテグリンのブロッキング抗体を用いた。FAK をノックダウン
した細胞は，siRNA を発現するアデノウイルスベク
ターを構築して HUVEC に感染させる手法で作成した。FAK 蛋白質の定量は Western blotting 法で行い，FAK の mRNA の測定には定量的 RT ‑PCR を行った。細胞の migration の評価には healing‑assay法を用いた。FAK の分解抑制実験にはカルパインインヒ
ビターを用いた。また，FAK cDNA を cationic pol-No. 5, 2009187

審査学位論文要旨

ymer を用いて HUVEC にトランスフェクションし，
FAK を過剰発現する細胞を作成した。

（論文審査の結果の要旨）
細胞外基質の angiogenesis の制御因子としての機【結果】まず，HUVEC を各種細胞外基質で刺激した

能は近年注目され明らかにされてきている。特に，コ

ところ，線維形成型コラーゲンであるタイプⅠ，Ⅱコ

ラーゲンゲル内で培養した内皮細胞が管状の構造をとっラーゲンのみが管状構造の形成を誘導した。この現象てくることは以前から確認されており，angiogenesis

は α2インテグリンブロッキング抗体により阻害されのひとつのステップのモデルとして実験に用いられてた。次に，FAK をノックダウンした HUVEC においきている。本実験で中村は，ヒト臍帯静脈内皮細胞にて，migration および線維形成型コラーゲンによるおける，コラーゲン惹起性の tube formation についtube formation の誘導実験を行ったところ，両方とて，特に細胞外基質とのシグナル伝達に関わる FAK

も抑制・阻害されることが確認できた。しかしその一の機能を中心に検討した。

方で，通常の HUVEC において，線維形成型コラー

細胞外基質分子の中でも tube formation を誘導す

ゲンに誘導される tube formation の過程で FAK 蛋

るのは，立体構造が正常に保たれた線維形成型コラー

白質が経時的に減少していくことを認めた。このとき

ゲンであり，そのシグナルは α２ β１インテグリン

FAK の mRNA 合成は，コラーゲン刺激後には一過を介して細胞内に伝達され，接着斑に局在する FAK

性に増加していたため，FAK 蛋白質の減少は分解のが重要な役割を果たすことで細胞の移動が開始するこ亢進によるものと考え，FAK 蛋白質の分解の抑制，とを，各細胞外基質分子の誘導実験の比 ・インテグ

および，FAK の過剰発現によって，FAK 蛋白質を

リンブロッキング抗体を用いた実験・ FAK のノック

維持するように保った状態を作ることを試みた。そのダウン実験から確認した。しかし一方で，この tube

結果，FAK 蛋白質の分解を減少させたカルパインイ

formation の過程において，重要であるはずの FAK

ンヒビターを与えた細胞では，線維形成型コラーゲン

蛋白質が著明に減少することが認められた。コラーゲによる tube formation の誘導が阻害された。また，

ン刺激後に mRNA 合成が増加しているにも関わらず

FAK を過剰発現した細胞は，管状構造の形成に加わFAK 蛋白質の減少が進行していることから，分解がらない様子が観察された。

著しく亢進している可能性があった。この矛盾にも見【考察】 線維形成型コラーゲンによる，α２ β１インえる現象に注目し，FAK の degradation の抑制効果

テグリンを介したシグナルが，HUVEC に tube for-があるカルパインインヒビターの投与，および FAK

mation を惹起することが示唆された。このモデルの過剰発現を HUVEC に対して行い，その条件下での中で FAK の機能について検討したところ，FAK

線維形成型コラーゲンによる tube formation を誘導

蛋白質を抑制した場合には細胞の migration や tube

したところ，双方において阻害される傾向がみられた。

formation が阻害されるのにもかかわらず，tube for-

これらの実験の結果から，中村は次の結論を得た。

mation の過程で FAK 蛋白質は著明に減少しており，

ヒト臍帯静脈内皮細胞において，その減少を抑制，または FAK 蛋白の発現を増大した

1） 線維形成型コラーゲンによる α２ β１インテグ

場合でも，tube formation が阻害されるという，一リンを介した刺激が，tube formation の誘導に重見矛盾した結果が得られた。この実験結果は，FAK要である。

は内皮細胞の tube formation の初期に細胞が動き始

2） FAK は tube formation の初期に，migration をめるための initiator として重要であるが，その後，開始する段階において重要な存在であるが，tube

速やかに低下することが管状構造の形成において必要

formation が進行していく過程においては速やかにであることを示唆するものであると考える。FAK 蛋

減少することが必要であることが示唆される。

白発現量の適切な調整は血管新生の過程において重要

線維形成型コラーゲンに限定して tube formation

であると考えられ，そのメカニズムの追求は血管新生が観察されたことは，細胞外基質の組成や質の差が，のプロセスの解明に有用であると考える。また，コラー

angiogenesis に影響を与える可能性を示唆する。まゲンゲルという生体内とは異なる条件が FAK 蛋白質

た本実験結果および考察は，FAK 蛋白質が非常に繊の発現を修飾している可能性についても検討が必要で細にコントロールされることが，angiogenesis のス

あるが，細胞外基質組成の差異による血管新生の組織

ムーズな進行に必要であることを示すものである。細

特異性の考察に有用であると思われる。

胞外基質による内皮細胞の制御に関して，検討すべき188

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

課題を浮き彫りにした側面もあり，今後メカニズムの宮癌由来細胞株）を用いてペプチド提示ファージと共解明に向けて発展性のある内容であるとして，主査，

培養してその回収量を測定した。次いで切除検体と副査は一致して本論文を学位論文として価値があるもDLD‑1，HCT ‑15（大腸癌由来細胞株）に対する大のと認めた。

腸癌結合ペプチド提示ファージとコントロールファー
ジの蛍光免疫染色とフローサイトメトリーを行い，結Identiﬁcation of oligopeptide binding tocolon cancer cells separated from patientsusing laser microdissection（マイクロダイ
ゼクションを用いたヒト大腸癌細胞への結合
ペプチドの同定）久保直成し，合成ペプチドの前投与により大腸癌結合ペプチ
ド提示ファージの DLD‑1への結合阻害を測定し，合成ペプチドの大腸癌細胞結合性を検討した。MTS
アッセイにおいて各種濃度の大腸癌結合ペプチド，コントロールペプチド存在下での癌細胞増殖を測定して，

樹

合成ペプチドの癌細胞増殖に対する影響を検討した。

（論文の内容の要旨）【背景と目的】大腸癌は比合性を検討した。また実際に大腸癌結合ペプチドを合【結果】バイオパンニング法により切除検体の癌組織的頻度の高い悪性腫瘍でへの大腸癌結合ペプチドとして，共通の３アミノ酸配あり切除不能または，再発に対して一般的に抗癌剤治

列のモチーフ SPT を含む SPTKSNS が同定された。

療が行われているが，その予後はいまだ満足できるも

SPTKSNS ファージはコントロールファージと比べ，のではない。最大の問題は，抗癌剤等の薬剤もしくはバイオパンニングを行った切除検体に対して約10倍集

治療遺伝子等を癌選択的に運搬できるベクターが存在積した（ｐ＜0.05）。別の２例の切除検体への結合率

しないことである。そこでペプチド提示ファージライ

はバイオパンニングを行った切除検体のそれぞれ1/10，

ブラリーを用いて標的組織や細胞に結合する未知のペ1/4であった。また，SPTKSNS ファージの各種ヒトプチドを同定する分子生物学的手法としてバイオパン

悪性腫瘍（大腸癌，胃癌，肝癌，膵癌，胆管癌，子宮ニング法が用いられた。実際のヒトの手術検体を用い癌）由来細胞株への結合能を in vitro で測定すると，たバイオパンニング法の報告はほとんどないが，我々

大腸癌細胞株に有意に多く結合しており DLD ‑1とはヒトの大腸癌の新鮮摘出検体からマイクロダイゼク

HCT‑15ではコントロールファージと比ションを利用したバイオパンニング法によりヒト大腸あった（ｐ＜0.05）が，大腸癌以外の細胞株では有意

癌結合ペプチドの同定を目的に研究を行った。

な結合は認めなかった。蛍光免疫染色とフローサイトメ【方法】進行大腸癌を摘出後，検体の一部を採取し凍トリーにおいても，SPTKSNS ファージはコントロー

結保存した。約20枚の連続切片を作製してからマイクルファージに比べより強い大腸癌結合性を示した。合ロダイゼクションで切り取った癌組織と７つのアミノ

成 SPTKSNS ペプチドの前投与により，SPTKSNS

酸配列を持つペプチド提示ファージライブラリーとファージの結合性は有意に阻害された（ｐ＜0.01）。

in vitro で共培養し，癌組織に結合したファージのみ

M TS アッセイにおいては，SPTKSNS ペプチド投を抽出した。このファージを増幅した後，さらに癌組

与により癌細胞増殖能に有意な影響は認められなかっ織と培養した。この操作を３回繰り返し最終的に得らた。

れたファージの DNA 配列を解読しペプチドの７個の【考察】マイクロダイゼクションを併用したバイオパ

アミノ酸配列を同定した。同定した結合ファージを切ンニング法によりヒト手術検体から大腸癌細胞に選択除検体の癌組織と培養し先端にペプチドを発現してい的に結合するペプチド SPTKSNS が同定された。今ないファージをコントロールとして比回の手法により臨床検体から癌細胞に結合するペプチ

すると同時に，し約７倍で蛍光免疫染色を行って，実際の大腸癌組織に対する大ドが同定され患者個人ごとのテーラーメード治療への

腸癌結合ペプチド提示ファージの結合性を検討した。

応用が期待される。

同定された大腸癌結合ペプチド提示ファージの各種細（論文審査の結果の要旨）

胞株への結合性を検討するため，DLD‑1，HCT ‑15，

バイオパンニング法はペプチド提示ファージライブ，AZ521（胃癌Colo205，LoVo （大腸癌由来細胞株）

ラリーを用いて標的組織や細胞に結合する未知のペプ由来細胞株）Huh‑7（肝癌由来細胞株），Panc‑1（膵チドを同定する分子生物学的手法である。そこで久保

癌由来細胞株），RBE（胆管癌由来細胞株），HeLa（子は，まずヒト大腸癌の新鮮摘出検体からマイクロダイ

No. 5, 2009189

審査学位論文要旨

ゼクションの手技を用いて大腸癌組織のみを分離した。

SPTKSNS ペプチドは大腸癌選択的結合性があるも次いで，バイオパンニング法によりし大腸癌選択的結のと考えられた。今回の手法により臨床検体からその合性を有すると考えられるオリゴペプチド（SPTK-

患者の癌細胞に結合するペプチドが同定され，患者個SNS）を同定し，⑴ SPTKSNS ファージの大腸癌切

人ごとのテーラーメード治療への応用が期待される可除検体に対する結合度の検討，⑵ SPTKSNS ファー

能性があるという点において有用な研究と考えられる。

ジの各種細胞株に対する結合度の比 ，⑶ 蛍光免疫染

したがって主査，副査は一致して本論文を学位論文と色，フローサイトメトリーによる SPTKSNS ファー

して価値があるものと認めた。

ジの大腸癌細胞への結合性の評価，⑷ 合成ペプチドによる SPTKSNS ファージ の 結 合 阻 害 の 測 定，⑸MTS アッセイによる SPTKSNS ペプチドの癌増殖に対する影響の評価を行い，SPTKSNS ペプチドの大腸癌選択的結合性ならびに大腸癌治療への応用における意義を検討した。
その結果以下の成績を得た。
1） ３ラウンドのバイオパンニングにより切除検体のDeﬁciency of tumour necrosis factor‑αandinterferon‑γ in bone marrow cells synergistically inhibits neointimal formation
following vascular injury（血管傷害モデル
での骨髄細胞中の TNFαとインターフェロ
ン γの欠如が相乗的に内膜肥厚の増殖を抑制した）

癌組織への大腸癌選択的結合性を有するペプチドと村

して共通の３アミノ酸配列のモチーフ SPT を含む
SPTKSNS が同定された。

山

秀

喜

（論文の内容の要旨）

2） SPTKSNS ファージはコントロールファージと【背景と目的】

比べ，バイオパンニングに用いた切除検体に対して経皮的冠動脈形成術（PCI）後の再狭窄は，臨床的約10倍集積した（ｐ＜0.05）。別の２例の切除検体に大きな問題である。この再狭窄の機序として，血管への結合率はバイオパンニングを行った切除検体の傷害後の炎症反応の関与が示唆されている。組織壊死

それぞれ1/10，1/4であった。

因子アルファ（TNFα）とインターフェロンガンマ

3） SPTKSNS ファージの各種ヒト悪性腫瘍（大腸（IFNγ）は，代表的な炎症性サイトカインであり，癌，胃癌，肝癌，膵癌，胆管癌，子宮癌）由来細胞

血管傷害後の再狭窄部位に発現していることが示され株への結合能を in vitro で測定すると，大腸癌細胞ている。しかし，これまでの報告では，これらサイト

株に有意に多く結合しており DLD‑1と HCT ‑15でカインをそれぞれ抑制した場合の再狭窄への影響につはコントロールファージと比し約７倍であった

いては，一定の結論が出ていない。この原因として，（ｐ＜0.05）。大腸癌以外の細胞株では有意な結合はTNFαと IFNγがそれぞれ違う炎症シグナルを活性認めなかった。

化している可能性が考えられた。そこで，本研究では，

4） 蛍光免疫染色とフローサイトメトリーにおいても，

PCI 後再狭窄のモデルであるマウス血管傷害後の新SPTKSNS ファージはコントロールファージに比生内膜形成における TNFαと IFNγの役割について

べより強い大腸癌結合性を示した。

検討した。

5） 合成 SPTKSNS ペプチドの前投与により，SPT-【方法と結果】

KSNS フ ァ ー ジ の 結 合 性 は 有 意 に 阻 害 さ れ た

コ ン ト ロ ー ル（cont：BALB/c），TNFα欠 損（ｐ＜0.01）。一方で，コントロールファージでは，（Tnf

合成 SPTKSNS ペプチドの前投与による有意な結損（Tnf合阻害を認めなかった。

を用いた血管傷害を作製して評価した。cont の新生6） M TS アッセイにおいては，SPTKSNS ペプチ），IFNγ欠 損（Ifng
Ifng），TNFα/IFNγ欠）マウスの右大腿動脈にワイヤー

内膜では，TNFαおよび IFNγが強く発現していた

ド投与により癌細胞増殖能に有意な影響は認められ

が，Tnf

と Tnf

なかった。

めず，Ifng

以上より，マイクロダイゼクションを併用したバイかった。新生内膜面積は，cont，Tnf

と Tnf

Ifng

では TNFαの発 現 を 認
IFNγの発現を認めな
，Ifng

と

オパンニング法によってヒト手術検体から大腸癌細胞比に選択的に結合するペプチド SPTKSNS が同定され，面積はどの群でも同等であった。これから求めた新生

190

して TnfIfng

Ifng

で有意に減少しており，中膜信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

内膜の程度の指標である I/M は，Tnf

Ifng

で他

血管壁が活性化されて接着分子やサイトカイン／ケモの３群に比 して有意に減少していた。４群において，カインの発現が亢進し，流血中の単球やリンパ球といっ傷害後早期の再内皮化や新生内膜構成細胞の割合（多た骨髄由来の炎症細胞がリクルートされて血管壁へと

くは血管平滑筋細胞，一部はマクロファージ）に有意

接着・浸潤する。浸潤したこれら骨髄由来細胞がさらな差を認めなかった。PCNA 染色を用いた細胞増殖にサイトカインや増殖因子を産生することで，中膜平活性は，Tnfで有意に減少していた。さら滑筋細胞の内膜への遊走・増殖が誘導されて新生内膜に，９Gyの放射線照射後に骨髄細胞を移植して，３種類が形成されると考えられる。そこで，骨髄細胞のみでの骨髄移植マウス（BMTcont → cont，BMTcont →TNFαと IFNγの欠損したマウスで検討したところ，

Ifng

Ifng

→ cont）を 作 製

骨髄細胞由来の TNFαと IFNγが血管傷害後の新生して検討したところ，BM TTnf

→ cont で内膜形成に重要な役割を果たしていることが明らかとは BM Tcont → cont よ り も（ｐ＜0.01），ま た，

なった。これらの知見は，PCI 後再狭窄の新たな機BM Tcont → Tnf

序の解明と新たな治療戦略に大きく役立つものと期待

Tnf，BMTTnf

Ifng

Ifng

Ifng

よりも（ｐ＜0.05），血管

傷害後の新生内膜形成が有意に抑制されていた。

される。

【考察】

（論文審査の結果の要旨）

本研究では以下の実験結果を得た。

経皮的冠動脈形成術（PCI）後の再狭窄は，臨床的1） cont では新生内膜 で TNFαと IFNγを 発 現 しに大きな問題となっている。この再狭窄の機序として，ていたが，それぞれの遺伝子欠損マウスでは発現し血管傷害後の炎症反応の関与が示唆されている。そこないことを確認した。

で，本研究では，血管傷害後の新生内膜形成における

2） cont，Tnf，Ifngに比 して Tnf

Ifng

では血管傷害後の新生内膜形成が抑制された。
3） 傷害後早期の再内皮化に差を認めなかった。
4） 新生内膜の細胞増殖活性は Tnf

Ifng

で減少

していた。
5） TnfIfng

組織壊死因子アルファ（TNFα）とインターフェロ
ンガンマ（IFNγ）の役割について検討した。
コ ン ト ロ ー ル（cont：BALB/c），TNFα欠 損（Tnf），IFNγ欠 損（Ifng

損（Tnfの骨髄を移植したマウスでは，新Ifng），TNFα/IFNγ欠）マウスの右大腿動脈にワイヤーを用いた血管傷害を作成した。免疫組織染色において，

生内膜形成が抑制された。

TNFαと IFNγは cont の新生内膜部位に発現してこれらのことより，血管傷害後の新生内膜形成の病

いたが，それぞれの遺伝子欠損マウスでは発現していな態に骨髄由来の TNFαと IFNγが重要な役割を果た

いことを確認した。新生内膜形成は，cont や Tnf

していることが示された。

Ifng

と比

して TnfIfng，

で有意に抑制されて動脈硬化や PCI 後の再狭窄に炎症反応が重要であいた。いずれのグループ間においても再内皮化は同等るとの証拠が蓄積されてきている。しかし，炎症性サであった。新生内膜形成部位 で の 細 胞 核 増 殖 抗 原

イトカインである TNFαと IFNγの正確な役割につ（PCNA）を発現している細胞数は，Tnf

いては分か っ て い な い。こ の 原 因 の 一 つ と し て，有意に減少していた。さらに，骨髄移植モデルを用い

TNFαは転写因子 NF‑κB を介して，IFNγは転写

た検討により，骨髄細胞での TNFα/IFNγの欠損が

因子 STAT ‑1や IRF‑1を介してそれぞれ炎症シグナ

血管傷害後の新生内膜形成を抑制することが示された。

ルを伝達していること，これら TNFαの NF‑κB シ

これらの結果から，骨髄細胞由来の TNFαと IFNγ

グナルと IFNγの STAT‑1/IRF‑1シグナルとは相互が血管傷害後の新生内膜形成に重要な役割を果たして作用して相乗的に作用していることが考えられた。ついることが明らかとなり，PCI 後再狭窄の新たな機

まり，一方が阻害されると，他方が代償的に活性化し序の解明への一助となった。

ているため，それぞれのシグナル阻害実験の結果に条件によるばらつきが出るのではないかと考えられた。

Ifng

で

よって主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

そこで，TNFαと IFNγの両方の遺伝子欠損マウスで検討したところ，血管傷害後の新生内膜形成が相乗的に抑制されることが明らかとなった。血管傷害後の新生内膜形成の機序は明らかではないが，傷害された
No. 5, 2009191

審査学位論文要旨

eﬀects are mediated,at least in part,byα ‑AR andRole of α1‑Adrenergic Receptors in
Detrusor Overactivity Induced by Cold
Stress in Conscious Rats（覚醒下ラットにおける冷えストレスによって誘発された排尿筋過 活 動 に対 する α1交感 神経 受容体の 役
割）陳忠（論文の内容の要旨）
Aims:α‑Adrenergic receptors (ARs) are involved

α ‑AR subtypes and can be prevented/reduced by
α‑AR antagonists.
（論文審査の結果の要旨）
α‑Adrenergic receptors (ARs) are involved in
micturition control both centrally and peripherally.
α‑AR antagonists improve not only voiding but
also storage symptoms in patients with bladderoutlet obstruction. We investigated the role of α‑
AR mechanisms involved in detrusor overactivity
induced by cold stress in conscious rats.

in micturition control both centrally and peripheral-

Continuous cystometry was performed at roomly.α‑AR antagonists improve not only voiding but

temperature (RT,28 ± 2 ℃)and for 40 min at cold

also storage symptoms in patients with bladdertemperature (CT, 4 ± 2 ℃). Voiding interval (VI),outlet obstruction. We investigated the role of α‑

micturition volume(M V),and bladder capacity(BC)AR mechanisms involved in detrusor overactivity

were evaluated before and after intravenous admin-

induced by cold stress in conscious rats. M ethods:

istration of KM D‑3213 (selective α ‑AR antago-

Continuous cystometry was performed at roomnist), naftopidil (selective α ‑AR antagonist), tam-temperature (RT,28 ± 2 ℃)and for 40 min at coldsulosin (selective αtemperature (CT, 4 ± 2 ℃). Voiding interval (VI),prazosin (non‑selective α‑AR antagonist). Blood

micturition volume(MV),and bladder capacity(BC)pressure (BP), cumulative voided volume and body

were evaluated before and after intravenous admin-

temperature were also evaluated.

istration of KM D‑3213 (selective α ‑AR antago-

Results:nist),naftopidil (selective α ‑AR antagonist),tam-

1. At RT, none of the AR antagonists caused

sulosin (selective α

‑AR

‑AR

antagonist), andantagonist), andsigniﬁcant change in the cystometric parameters.

prazosin (non‑selective α‑AR antagonist). Blood

During 40 min of cold stress cumulative voided

pressure (BP), cumulative voided volume and body

volume and body temperature did not change.

temperature were also evaluated.
Results:At RT,none of the AR antagonists caused

2. Cold caused signiﬁcant decreases in VI,MV,andBC.

signiﬁcant change in the cystometric parameters.

3.Low doses of the AR antagonists had no eﬀect on

During 40 min of cold stress cumulative voided

CT‑induced decreases of these variables. How-

volume and body temperature did not change, butever, high doses of KM D‑3213, tamsulosin,

there were signiﬁcant decreases in VI,MV,and BC.

naftopidil and prazosin signiﬁcantly inhibited the

Low doses of the AR antagonists had no eﬀect on

CT‑induced decreases in VI, MV, and BC.

CT‑induced decreases of these variables.However,

4.Cold caused a signiﬁcant increase in BP,and thishigh doses of KM D‑3213,tamsulosin,naftopidil andwas not aﬀected by low doses of the AR antago-

prazosin signiﬁcantly inhibited the CT‑induced

nists. However, high doses of prazosin

decreases in VI, M V, and BC. CT caused asigniﬁcantly lowered the CT‑induced increase ofsigniﬁcant increase in BP,and this was not aﬀectedBP.

by low doses of the AR antagonists.However,highConclusions:doses of prazosin signiﬁcantly lowered the CT‑in-

Cold stress induces detrusor overactivity andduced increase of BP.

increases BP in conscious rats. These eﬀects are

Conclusions: Cold stress induces detrusor over-mediated, at least in part, by α ‑AR and α ‑AR

activity and increases BP in conscious rats. These

subtypes and can be prevented/reduced by α‑AR

192

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

出リンパ管内のアルブミン濃度を，１時間毎に計３時

antagonists.
以上より主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

間計測し検討した。
【結果】腸骨リンパ節輸出リンパ管からのリンパ流量
は，コントロール群と HDT 群の間に有意な差は認め

Head‑down tilt posture elicits transient
lymphocyte mobilization from the iliac,
but not mesenteric, lymph nodes of rats
（頭部低位姿勢は，ラット腸骨リンパ節から一過性のリンパ球動員を誘発するが，腸間膜リンパ節では誘発しない）
鈴

木

滋

られなかった。腸間膜リンパ節輸出リンパ管からのリンパ流量は，コントロール群よりも，HDT 群の方が多い傾向が認められた。一方，腸骨リンパ節から動員された細胞数は，コントロール群よりも HDT 群のほうが有意に多かった。それに対し，腸間膜リンパ節から動員された細胞数は，コントロール群と HDT 群との間に有意な差異は認められなかった。腸骨リンパ節から動員された細胞は，ほとんどがリンパ球であった。

（論文の内容の要旨）

そ の 動 員 さ れ た リ ン パ 球 の サ ブ セ ッ ト（CD3＋，【背景と目的】宇宙飛行中，微小重力は人体の生理機CD4＋，CD8a＋，CD45R＋）を解析したところ，コ能に影響を与え，宇宙飛行士が著明な顔面の浮腫をおントロール群と HDT 群の間に有意差はなかった。ア

こすことはよく知られている。リンパ管系は，組織間ジュバントによる免疫化をラットに施して同様の実験

𨻶からの細胞外液や高分子物質の輸送に重要な役割をを行ったが，腸骨リンパ節から動員されたリンパ球の担い，浮腫を防ぐ重要な因子の一つとして機能していサブセットは，コントロール群と HDT 群の両群とも，る。同時に免疫機能の維持と調節にも寄与している。

非免疫化下の実験との間に有意な差異は認められなかっ

しかしながら，模擬微小重力環境下におけるリンパ管た。腸骨リンパ節輸入リンパ管および輸出リンパ管内系のリンパ循環の反応については，未だ十分に解明さのアルブミン濃度は，コントロール群と HDT 群の間

れてはいない。そこで我々は，短時間の模擬微小重力に有意差は認められなかった。

が，ラットリンパ節のリンパ動態に与える影響を，ボー【結論】以上の結果から，ボールマンケージを用いた

ルマンケージと頭部低位（HDT）姿勢刺激を用いて，短時間の頭部低位刺激は，リンパ液のアルブミン濃度

無麻酔 in vivo の状態で検討した。ボールマンケージ

やリンパ流量を変化させることなく，ラット腸骨リンは，無麻酔 in vivo の状態におけるラットのリンパ液

パ節からのリンパ球の動員を一過性に誘発することがを収集する手段として有用であり，腸間膜リンパ管や示唆された。

胸管へカニュレーションを施すことで，リンパ流量やリンパ液の成分を無麻酔環境下で解析することが可能（論文審査の結果の要旨）
宇宙飛行中，微小重力は人体の生理機能に影響を与になる実験方法である。

え，宇宙飛行士が著明な顔面の浮腫をおこすことがよ【材料及び方法】まず最初に，水平位（コントロール）

く知られている。リンパ管系は，組織間𨻶からの細胞と頭部低位（HDT）姿勢での，腸骨ならびに腸間膜

外液や高分子物質の輸送に重要な役割を担い，浮腫をリンパ節の輸出リンパ管からのリンパ流量とリンパ球防ぐ重要な因子の一つとして機能し，免疫機能の維持

動員数を，１時間毎に計３時間計測し検討した。次に，と調節にも寄与している。しかし，模擬微小重力環境

頭部低位（HDT）姿勢刺激のリンパ循環変化が，免下におけるリンパ管系のリンパ循環の反応については，

疫学的な特異反応を通じて生じているか否かを判断す

未だ十分に解明されてはいない。そこで鈴木らは，る為に，アジュバントを用いて免疫化したラットを使

短時間の模擬微小重力が，ラットリンパ節のリンパ用して，同様の実験を行い，リンパ節から動員される

動態に与える影響を，ボールマンケージと頭部低位リンパ球の細 胞 サ ブ セ ッ ト（CD3＋，CD4＋，CD8（HDT）姿勢を用いて，無麻酔 in vivo の状態で検討

a＋，CD45R＋）の変化を検討した。すなわち，コンした。

トロール群と HDT 群でリンパ節から動員された細胞

以下に研究結果を示す。

のサブセットを，それぞれ１時間毎に計１時間，フロー1） ボールマンケージと頭部低位（HDT）姿勢を用

サイトメトリーを用いて解析し，検討した。さらに，い，リンパ管にポリエチレンチューブを挿入するこコントロール群と HDT 群で，リンパ節の輸入及び輸とで，ラット模擬微小重力負荷実験系を作製した。

No. 5, 2009193

審査学位論文要旨

本実験系において，短時間（３時間以下），無麻酔

濃度やリンパ流量を変化させることなく，ラット腸骨下，in vivo の条件下で，コントロール（水平位）

リンパ節からのリンパ球の動員を一過性に誘発するこ及び頭部低位（HDT）姿勢（模擬微小重力負荷）とが示された。

の両者で，ラット腸骨リンパ節輸入及び輸出リンパ管あるいは腸間膜リンパ節輸出リンパ管から，リン

主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

パ液を継続的に回収可能なことを確認した。
2） 腸骨及び腸間膜リンパ節輸出リンパ管からのリンパ流量の変化を解析した。腸骨リンパ節からのリンパ流量は，コントロール群と HDT 群の間に有意な差は認められなかった。腸間膜リンパ節からのリンパ流量は，コントロール群よりも，HDT 群の方が多い傾向が認められたものの，有意な差は認められなかった。

The Association of Transforming Growth
Factor Beta 1 Gene Polymorphisms with
the Emphysema Phenotype of COPD in
Japanese（日本人における肺気腫と TGF‑
β1遺伝子多型との関連について）
伊

東

理

子

3） 腸骨及び腸間膜リンパ節輸出リンパ管から動員さ（論文の内容の要旨）

れた細胞数の変化を解析した。腸骨リンパ節から動【背景と目的】慢性閉塞性肺疾患（COPD）は，世界員された細胞数は，１時間時で，コントロール群よ中で毎年約百万人が死亡する重大な健康問題で，2020

りも HDT 群の方が有意に増大し，３時間経過後も年には全死亡原因の第３位になることが予想されてい有意差が認められた。それに対し，腸間膜リンパ節る。喫煙は主要なリスク要因であるが，重喫煙者でから動員された細胞数は，コントロール群と HDTあってもCOPDを発症する者としない者がいることか群との間に有意な差は認められなかった。

ら遺伝的要因の関与が考えられている。Transform-4） 腸骨リンパ節輸出リンパ管から動員された細胞数

ing growth factor beta 1（TGF‑β1）は，免疫応答の中に占めるリンパ球の割合と，そのリンパ球のサや細胞増殖・分化，組織修復，細胞外基質産生などをブセットを解析した。腸骨リンパ節から動員された調節する多機能なサイトカインで，TGF‑β1活性を低細胞は，ほとんどがリンパ球であり，そのリンパ球下させたマウスでは加齢に伴って肺気腫を発症するこの割合はコントロール群と HDT 群の間に有意なと，COPD 患者の気道上皮では TGF‑β1活性が増加

差はなかった。動員されたリンパ球のサブセット

し 気 道 狭 窄 と 相 関 す る こ と か ら，TGF‑β1遺 伝 子（CD3＋，CD4＋，CD8a＋，CD45R＋）についても，（TGFB1）は COPD 発症の候補遺伝子の一つと考えコントロール群と HDT 群の間に有意な差はなかっられる。白人種，韓国人，中国人で TGFB1 多型とた。

COPD との関連が検討されているが，結果に相違が

5） アジュバントによる免疫化をラットに施し，リンある。人種差の他，調査対象が肺気腫病変と気道病変をパ球の割合とサブセットの解析を同様に行った。腸含む多様な集団であったことが原因と推測されたため，

骨リンパ節から動員されたリンパ球の割合とサブセッ

本研究では日本人の肺気腫に焦点をあて，TGFB1 多トは，コントロール群と HDT 群の両群ともに，非型との関連を検討した。

免疫化下の実験との間に有意な差は認められなかっ【方法】調査対象は，肺気腫群70名，対照群99名で，た。

肺気腫群は信州大学医学部附属病院を受診した患者で，

6） 腸骨リンパ節輸入リンパ管および輸出リンパ管の呼吸機能検査で閉塞性換気障害を認め，高分解能 CT

アルブミン濃度を解析した。腸骨リンパ節輸入リンで，両側上肺野，中肺野，下肺野の計６スライスのう

パ管のアルブミン濃度は，コントロール群と HDT

ち少なくとも１スライスで low attenuation area

群の間に有意差は認められなかった。腸骨リンパ節（LAA）を５％以上認める者，対照群は近隣病院の人

輸出リンパ管のアルブミン濃度は，コントロール群

間ドックを受診した8.5 pack year 以上の喫煙歴を有よりも，HDT 群の方が高い傾向が認められたもの

し，呼吸機能検査が正常の者とした。両群の血液サンプの，有意差は認められなかった。

ルよりDNAを抽出し，TaqMan assayを用いて，TG以上の結果から，ボールマンケージを用いた短時間

FB1の８つの単塩基多型（SNPs）（Promoter regionの頭部低位（HDT）刺激は，リンパ液のアルブミン
194： rs2241712，rs1982072，rs1800469

Exon 1 ：

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

rs1982073

Intron 2 ： rs2241716 ，rs4803455

多型との関連を検討し，TGFβ1遺伝子のハプロタイ

3ʼ
UTR： rs6957 ，rs2241618 ）について遺伝子型タプの一つが日本人の肺気腫と関与している可能性，さイピングを行い，各 SNPs について両群の遺伝子頻らに，二つの SNPs が気道狭窄の程度と関連してい度を比る可能性が示唆された。

した。連鎖不平衡をもとに haplotype を想定し，両群でその頻度を比した。肺気腫群において（論文審査の結果の要旨）

肺気腫に関連する可能性のある％１秒量，拡散能，慢性閉塞性肺疾患（COPD）は，喫煙が主要なリス

LAA スコアと各 SNPs との相関の有無を検討し，さク要因であるが，重喫煙者でも COPD を発症しない

らに肺気腫群を％１秒量，すなわち気流制限の程度に者がいることから，遺伝的要因の関与が考えられる。

より２群に分け，SNPs との関連を検討した。

Transforming growth factor beta 1（TGF‑β1）は，【考察】肺気腫群，対照群で各 SNPs の遺伝子頻度に免疫応答や細胞増殖・分化，組織修復，細胞外基質産有意差を認めなかった。しかし，３番目に頻度の高い生などを調節するサイトカインで，間質性肺炎など線

haplotype に有意差（ｐ＝0.02）が見られた。肺気腫

維化を来す疾患，動脈硬化，乳癌などに関与すると報群で，％１秒量と rs1800469 及び rs1982073 との間

告されている。TGF‑β1遺伝子（TGFB1）は COPDに相関（ｐ＝0.007及びｐ＝0.032）を認めたが，拡散発症の候補遺伝子であり，今回，日本人の肺気腫と能，LAA スコアと相関する SNPs は認められなかっ

TGFB1 多型との関連を検討した。胸部 HRCT で肺た。肺気腫群の％１秒量が50％未満の群では，50％気腫を認める COPD 患者群70名，対照群99名につい以上の群と比す る と，rs 1800469の Ｔ ア レ ル とて，TGFB1 の８つの単塩基多型（SNPs）について

rs1982073のＣアレルをもつ頻度が有意に高かった。

遺伝子型タイピングを行い，両群で遺伝子頻度，ハプ（ｐ＝0.007及びｐ＝0.041）

ロタイプ頻度を比 した。また，肺気腫群において％【結 論】TGFB1 多 型 と COPD の 相 関 に つ い て，こ

１秒量，拡散能，low attenuation area（LAA）スコ

れまでに白人種において rs2241712，rs1800469 ，

アと各 SNPs との相関を検討した。

rs1982073 の３種類の SNPs で相関を示した報告と，以上の検討により，下記の結果を得た。

逆に rs1800469 ，rs1982073 の２種類の SNPs と全く

１．肺気腫群，対照群間で TGFB1 のいずれの SNPs

相関を示さなかった報告が見られる。また，アジア人

頻度にも有意差を認めなかったが，ハプロタイプ３種については，韓国人では上記３種類の SNPs の何の頻度が肺気腫群で有意に高く，そのブロック２にれとも相関を認めていないが，中国人では rs1800469

ついて，肺気腫との関連認めた。

と相関を示している。本研究の結果は人種的に近隣の韓国人の報告と類似していたが，過去に報告された TGFB1 多 型 と COPD と の 相 関 に つ い て 一 貫 した類似性は認められなかった。これは，民族間による
SNPs 間の連鎖不平衡の相違によるものが一因と考えられた。
本研究で％１秒量，すなわち気流制限と相関を認め

２．肺気腫群で，いずれの SNPs も LAA スコア，拡散能と相関を認めなかった。
３．肺気腫群で，rs1800469 と rs1982073 で COPDの重症度である％１秒量との関連を認めた。
４．肺気腫群のうち50％以下の重症〜最重症群で，％１秒量50％以上の軽症 〜 中 等 症 群 と 比し，

rs1800469 のＴアレルと rs1982073 のＣアレルをた rs1800469T アレル及び rs1982073C アレルは，もつ頻度が有意に高かった。

血漿中の TGF‑β1濃度を上昇させることが報告されこれらの結果により，TGFB1 のハプロタイプている。また，動物実験では，TGF‑β1の活性化は傍ロック２が日本人の肺気腫の発症に関与している可能細気管支領域の線維化をもたらすことが報告され，さ性と，rs1800469 ，rs1982073 が COPD の重症 度 にらに COPD 患者では，気道上皮で TGF‑β1mRNA 転

関与している可能性が示唆された。rs1800469 のＴ写が上昇しており，その程度は末梢気道狭窄と相関す

アレルと rs1982073 のＣアレルは，血漿中の TGF‑

ることが報告されている。すなわち rs1800469T ア

β1濃度を上昇させることが報告されており，
rs1800469T

レル及び rs1982073C アレルを持つ個体では，TGF‑

ア レ ル 及 び rs1982073C ア レ ル を 持 つ 個 体 で は，β1の活性化を通して末梢気道上皮下の線維化による気TGF‑β1の活性化を通して末梢気道上皮下の線維化に道狭窄が進行し，気流制限を来たしている可能性が考よる気道狭窄が進行し，気流制限を来たすという機序えられた。本研究では肺気腫に焦点をあて，TGFB1が考えられた。

No. 5, 2009ブ195

審査学位論文要旨

以上をもって，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

同定した。このうち RYR3は膵腺房細胞内の網内系に存在する Ca イオン放出チャンネルであることが報
告されており，胆汁酸による刺激やアルコール代謝のMicrosatellite Scan Identiﬁes New Candidate Genes for Susceptibility to Alcoholic
Chronic Pancreatitis in Japanese Patients（アルコール性慢性膵炎の疾患関連遺伝子のゲノムワイド検索）
北原桂

過程で起こる細胞内 Ca イオン伝達に関与するとされている。また腺房細胞内の異常な Ca イオン濃度上昇
が細胞壊死を起こすことも報告されている。これらのことから RYR3遺伝子変異が異常な細胞内 Ca イオン
濃度の上昇を起こし，細胞が壊死することで慢性膵炎を起こす可能性が考察された。
【結論】アルコール性慢性膵炎のゲノムワイド検索を（論文の内容の要旨）

用いて10個の疾患感受性遺伝子座と５個の疾患抵抗性【背景と目的】アルコール性慢性膵炎発症にはアル遺伝子座を同定することができた。また RYR3など

コール多飲以外に環境・遺伝因子などが複合的に関与

関係性の高い遺伝子に変異が存在する可能性が示唆さするとされている。慢性膵炎の個々の疾患関連遺伝子れた。今後これらの遺伝子について SNP 解析を行い，については PRSS1，PRSS2，CTRC，SPINK1など

遺伝子変異の有無を検討していく予定である。

のトリプシノーゲン関連遺伝子や ALDH2，ALDH3，（論文審査の結果の要旨）

CYP2E1などのアルコール代謝関連遺伝子の検討も進アルコール性慢性膵炎発症にはアルコール多飲以外められているが，アルコール性慢性膵炎との関係は充に環境・遺伝因子などが複合的に関与するとされてい分に解明されていない。本研究では従来の特定の遺伝る。慢性膵炎の個々の疾患関連遺伝子についてはトリ子に対象を絞る研究方法ではなく，全遺伝子のゲノム

プシノーゲン関連遺伝子やアルコール代謝関連遺伝子

ワイド検索を行い，網羅的に疾患関連遺伝子の同定をの検討も進められているが，アルコール性慢性膵炎と試みた。

の関係は充分に解明されていない。本研究では従来の【対象と方法】アルコール性慢性膵炎患者65人（男性

特定の遺伝子に対象を絞る研究方法ではなく，全遺伝63人，女性２人，平均年齢55.2歳）を対象とし，比子のゲノムワイド検索を行い，網羅的に疾患関連遺伝

対照群として健常者99人を選び疾患関連遺伝子を比子の同定を試みた。

検討した。血液より DNA を抽出し，マイクロサテ

アルコール性慢性膵炎患者65人を対象とし，比対

ライトマーカープライマーペアを400組用いて PCR

照群として健常者99人を選び疾患関連遺伝子を比検を 施 行 し た。ABI3130 Genetic Analyzer お よ び

討した。

GeneMapper ソフトウェアを用いて PCR 産物のアリ

その結果，北原は以下の結論を得た。

ルタイピングおよび相関解析を行い疾患関連マーカー

１．全染色体上で疾患感受性を示したマーカーは合計を同定した。さらに疾患関連マーカーの上下流500kb

10個，疾患抵抗性を示したマーカーは合計５個であっ以内に存在する遺伝子を NCBI map viewer で検索した。

疾患関連遺伝子を同定した。

２．疾患感受性を示す D15S1007マイクロサテライト【結果】全染色体上で疾患感受性を示したマーカーはマーカーとアルコール性慢性膵炎の間にもっとも強D2S125，D4S2935，D6S308，D10S547，D10S185，

い相関関係を認めた。

D10S217，D15S1007，D15S130，D18S61，D18S462

３．D15S1007マーカーの近傍にある遺伝子を検索しで合計10個，疾患抵抗性を示したマーカーは D1S213，

たところ，候補遺伝子として RYR3を同定した。

D2S367，D4S413，D7S516，D12S1723で合計５個で４．RYR3は膵腺房細胞内の Ca イオン放出チャンネ

あっ た。こ の う ち，疾 患 感 受 性 を 示 す D15S1007マ

ルであることが報告されており，RYR3の遺伝子変

イクロサテライトマーカーとアルコール性慢性膵炎

異が異常な細胞内 Ca イオン濃度の上昇を起こし，の間にもっとも強い相関関係を認めた（70.8％ vs.

慢性膵炎を起こす可能性が考えられた。

35.1％，OR＝4.48，Pc＝0.0001）。さらにD15S1007

今回の研究では慢性膵炎のゲノムワイド検索を行う

マーカーの近傍にある遺伝子を検索したところ，FMN1，

ことで，従来指摘されていなかった疾患候補遺伝子を

RYR3，AVEN などを疾患感受性候補遺伝子として同定することができた。慢性膵炎の発症には複数の遺196

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

伝子が関与していると考えられるが，その一つの遺伝

間 後 に 抽 出 し た 総 RNA を 用 い RT ‑PCR 法 に よ り子を同定できたことは病態解明に寄与するもので，将行った。空胞様小器官の定量は，６ well‑plate の一

来的には分子標的治療などに応用できる可能性もあり定領域内に形成した数を，計数ソフトを用いて直接計極めて意義のあるものである。よって主査，副査は一数することにより行った。画像解析は Scion Image

致して本論文を学位論文として価値があるものと認めを用いて行った。

た。

【結果】正常 HLF 細胞は均一な形態で単層に増殖す
るが，DEX と OSM （DEX/OSM ）を添加す る こ とRole of dexamethasone and oncostatin M
on the formation of vacuoles in human
fetal liver cells（ヒト胎児肝細胞内巨大空胞様小器官形成におけるデキサメタゾン及びオ
ンコスタチン M の役割）
寺

元

剛により HFL 細胞内部には，クラスター状に多数の空胞が形成された。これら空胞の数は，glucocorticoid
receptor（GR）antagonist で あ る RU‑486に よ っ て顕著に抑制された。HFL 細胞に OSM を処理することにより IL‑6 mRNA の発現量が顕著に増加した。
また，DEX を処理することにより，IL‑6R mRNAの発現量は減少した。OSM もしくは DEX/OSM に（論文の内容の要旨）

より空胞は顕著に巨大化し，gp130antagonist である【目的】Oncostatin Ｍ（OSM ）は interleukin（IL）‑

madindoline‑A（M DL‑A）によって約65％まで縮小

6ファミリーに属するサイトカインで，肝細胞の分した。空胞のサイズはRU‑486による変化を受けなかっ化・成熟，肝再生に重要な因子であることが知られてた。MDL‑A は IL‑6，DEX/IL‑6によって形成されいる。また，dexamethasone（DEX）はこれらサイた空胞に対しても縮小作用を示した。

トカイン類の効果にも影響を及ぼすことから，肝細胞【考察】Glucocorticoid は GR を介して生理機能や，成熟に重要な役割を果たすと考えられている。これま

遺伝子発現の調整を行い，この効果は，RU‑486にでの研究で，ヒト胎児肝（HLF）細胞に DEX 及びよって抑制される。HFL 細胞には，DEX/OSM ，もOSM を同時処理（DEX/OSM ）することにより，そしくは DEX/IL‑6の相互作用により，多数の巨大なの細胞内に多数の巨大な空胞様小器官が形成される

空胞様小器官が出現したが，その数は RU‑486処理にこと，また，こうした形態変化は両薬剤の相互作用によ

よって有意に減少した。このことより，HFL細胞におる結果であることを見出した（参考論文：Matsunaga

ける巨大空胞様小器官の形成において，DEX は空胞

T, Toba M, Teramoto T, Mizuya M , Aikawa K,の発生に関与しており，その効果は GR を介している

Ohmori S. Med Mol Morphol 41：53‑58，2008）。

ことが考えられた。興味深いことに，空胞は OSM に現在まで，グルココルチコイドとサイトカインの組みよって顕著に巨大化するが，その大きさへの RU‑486

合わせによる in vivo でのこうした形態変化に関するによる影響はなかった。参考論文で示した電子顕微鏡

報告はなく，未だ巨大空胞様小器官が形成される意義解析により，空胞の巨大化は空胞同士の膜融合によりは明らかにはされていない。そこで，HFL 細胞内に起こる可能性を示唆している。この空胞の巨大化は，出現する空胞様小器官の形成と巨大化の過程で DEX

M DL‑A によって抑制された。M DL‑A は，IL‑6に及び OSM が果たす役割を明らかにすることを目的と代表される cytokines の受容体サブユニットである

して研究を行った。

gp130の二量化を阻害することにより，その刺激効果【方法】HFL 細胞（６胎児肝混合，平均胎 齢13週）を抑制する。MDL‑A が IL‑6選択的阻害剤であるこは 米 国 Applied Cell Biology Research Institute 社と，OSM により IL‑6 mRNA が顕著に発現している（大日本製薬）より入手し，コラーゲン処理した６ことから，空胞が巨大化する一連の過程に，IL‑6がwell‑plate 上に播種し10％ FBS 含有 Williamʼs Ｅ培

関与しているものと考えられた。同様の形態変化は，地にて培養した。培養７日後に DEX（10 M ）およ

DEX/IL‑6で処理した HLF 細胞にも観察されており，び OSM （10ng/ml）を添加し，72時間後に細胞の回形成した空胞の数は顕著に増加した。これらのことよ

収，あ る い は 細 胞 の 固 定 を 行 っ た。な お，DEX はり，OSM は，IL‑6に関するシグナル伝達経路を一部

DM SO に溶解し，DM SO の最終濃度が0.1％となる

介して小胞の巨大化に関与しているものと考えられる。

ように添加した。mRNA 発現解析は，薬物処理72時

これらの結果より，巨大空胞様小器官の形成において，No. 5, 2009197

審査学位論文要旨

DEX は GR を介する経路を経て小胞が発現する現象

により巨大化することがわかっており，これらの結果に関与しており，OSM や，IL‑6によってこれらの小とあわせて，DEX は HFL 細胞内で，GR を介し て胞が融合することにより，巨大化を促進していること

空胞の発生に関与しているとこと，OSM は一部にIL‑が推察された。

6を介したプロセスを経て，空胞の巨大化に関与して（論文審査の結果の要旨）
OncostatinＭ（OSM ）は interleukin（IL）‑6フ ァいることを結論付けた。主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

ミリーに属するサイトカインで，肝細胞の分化・成熟，肝再生に重要な因子であることが知られている。また，
dexamethasone（DEX）はこれらサイトカイン類の効果にも影響を及ぼすことから，両者の併用は肝細胞成熟に重要な役割を果たすと考えられている。これまでの研究で，ヒト胎児肝（HLF）細胞に DEX 及びOSM を同時処理（DEX/OSM ）することにより，その細胞内に多数の巨大な空胞様小器官が形成されること，また，こうした形態変化は両薬剤の相互作用による結果であることを見出した（参考論文：Matsunaga T, Toba M, Teramoto T, Mizuya M , Aikawa

Interleukin‑21 stimulates B‑cell immunoglobulin E synthesis in human beings concomitantly with activation ‑induced
cytidine deaminase expression anddiﬀerentiation into plasma cells（ヒトにおいて IL‑21は AID 発現および形質細胞への分化誘導を介し B 細胞の IgE 産生を促進す
る）
小

林

真

二

。
K, Ohmori S. M ed Mol Morphol 41：53‑58，2008）（論文の内容の要旨）

HFL 細胞でのこうした形態変化に対する意義につい【背景と目的】IL‑21は，Ｔ細胞や NK 細胞に働き，ては報告されておらず，詳細に検討する事は大変意義

Ｂ細胞には免疫グロブリン産生に関して重要な役割を深いものであるとした。そこで，DEX 及び OSM に担っていることが判明してきた。IL‑21のＢ細胞に対ついて，関連の考えられる antagonist による影響を，する作用として Class Switch Recombination や形質細胞に生じる空胞数，及び空胞の径の観点から比 検細胞への分化誘導などが報告されている。近年，アレ討し，両薬剤の空胞形成に及ぼす役割について検討しルギーの病態に重要な役割を担う IgE の産生調節に，た。

IL‑21が IL‑4とともに深く関与することが示唆されてその結果，寺元 剛は次の結果を得た。

いる。ノックアウトマウスを用いた解析から IL‑21は

１．DEXとOSM は併用することにより相乗的に空胞

マウス IgE 産生に抑制的に作用することが報告され数が増加した。DEX 単独群及び DEX/OSM 群はた。しかしながら IL‑21のヒト IgE 産生に関する作用

glucocorticoid receptor antagonist である RU486

は明確に分かっていない。本研究は IL‑21のヒトＢ細を添加することにより用量依存的に空胞数が有意に

胞 IgE 産生における作用を検討した。

減少した。

【方法】アレルギー疾患をもたない健常人から末梢血

２．空胞は OSM を添加することにより有意に巨大化した。

を採取しフィコール分離して末梢血単核球を得た。
RosetteSepを用いてB細胞を分離し，さらにソーティ

３．IL‑6 antagonist である MDL‑A によって OSM

ング法でナイーブB細胞とメモリーB細胞を精製した。

により巨大化したと思われる空胞の大きさは有意に，
IL‑4，抗 CD40抗 体/CD32‑transfectants（CD32T）

小さくなった。

IL‑10な ど の 刺 激 下 に お い て，IL‑21（最 適 濃 度25

４．IL‑6についても，形成した空胞は優位に巨大化

ng/ml）を添加し14日間培養後培養上清中の IgE をし，MDL‑A によって，その大きさは有意に縮小し

ELISA で測定した。形質細胞の分化誘導は抗 CD38た。

抗体を用いフローサイトメトリー法で検討した。また，

５．OSM は IL‑6 mRNA を強いレベルで誘導し，
DEX は IL‑6 mRNA の発現を抑制した。
６．DEX と IL‑6は併用することにより相乗的に増加

RT‑PCRを用いて germline，AID，Blimp‑1，XBP1
各 mRNA の発現を検討した。
【結果】無刺激および IL‑4刺激下では，IL‑21の添加した。

によって IgE 産生はみられなかった。IL‑4＋抗 CD40

また，過去の報告より，空胞は各々が直接的な融合

抗体/CD32T 刺激下に IL‑21を添加したところ IgE 産198

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

生が著明に増強した。さらに，IL‑4＋抗 CD40抗体/

1） 無刺激およびIL‑4刺激下では，IL‑21の添加によっ

CD32T＋IL‑10刺激下では，IL‑21によって IgE 産生てIgE産生はみられなかった。IL‑4＋抗CD40抗体/の劇的な増加が認められた。またナイーブ B 細胞，

CD32T 刺激下に IL‑21を添加したところ IgE 産生

メモリー B 細胞に対しても同様の結果を得た。各刺が著明に増強した。さらに，IL‑4＋抗 CD40抗体/

激下において IL‑21は germline mRNA 発現を増強し

CD32T＋IL‑10刺激下では，IL‑21によって IgE 産

なかったが AID mRNA 発現を増強した。また IL‑21

生の劇的な増加が認められた。またナイーブ B 細は IL‑4＋ 抗 CD 40抗 体 /CD 32T 刺 激 下 で CD 38陽 性胞，メモリー B 細胞に対しても同様の結果を得た。

形質細胞への分化誘導を認め，その細胞内には高濃度

2） 各刺激下において IL‑21は germline mRNA 発現に IgE が存在することが確認された。また，形質細胞分化にかかわる遺伝子発現解析では IL‑21は，無刺を増強しなかったが AID mRNA 発現を増強した。
3） IL‑21は IL‑4＋抗 CD40抗体/CD32T 刺激下で激および IL4＋抗 CD40抗体刺激下において Blimp‑1

CD38陽性形質細胞への分化誘導を認め，その細胞

mRNA の発現を増強した。一方同じ刺激下で XBP1

内には高濃度に IgE が存在することが確認された。

mRNA 発現には影響を与えなかった。Western blot4） 形質細胞分化にかかわる遺伝子発現解析では IL‑

解析でも XBP1発現に影響しないことを確認した。

21は，無刺激および IL4＋抗 CD40抗体刺激下にお【結論】IL‑21は IL‑4と CD40ならびに IL‑10刺激下にいて Blimp‑1 mRNA の発現を増強した。一方同じ

おいてヒト B 細胞 IgE 産生を劇的に増強する作用を刺激下で XBP1 mRNA 発現には影響を与えなかっもつサイトカインであることが判明した。その作用機た。Western blot 解析でも XBP1発現に影響しな

序は AID の発現増強と Blimp‑1を介する形質細胞分いことを確認した。

化誘導作用の両者によるものであると結論された。

IL‑21は IL‑4と CD40ならびに IL‑10刺激下におい（論文審査の結果の要旨）てヒト B 細胞 IgE 産生を劇的に増強する作用をもつ

IL‑21は，T 細胞や NK 細胞に働き，B 細胞には免サイトカインであることが判明した。その作用機序は

疫グロブリン産生に関して重要な役割を担っているこ

AID の発現増強と Blimp‑1を介する形質細胞分化誘とが判明してきた。IL‑21のＢ細胞に対する作用とし導作用の両者によるものであると結論された。今後アて Class Switch Recombination や形質細胞への分化

レルギー疾患の治療において IL‑21の IgE 産生増強作誘導などが報告されている。近年，アレルギーの病態用は非常に有用な知見と考えられ，主査，副査は一致に重要な役割を担う IgE の産生調節に，IL‑21が IL‑

して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

4とともに深く関与することが示唆されている。ノッ
クアウトマウスを用いた解析から IL‑21はマウス IgE産生に抑制的に作用することが報告された。しかしな
がら IL‑21のヒト IgE 産生に関する作用は明確に分かっていない。本研究は IL‑21のヒトＢ細胞 IgE 産生における作用を検討した。
アレルギー疾患をもたない健常人から末梢血を採取しPathological activation of KIT in metastatic tumors of acral and mucosal
melanomas（肢端型・粘膜型悪性黒色腫の転移腫瘍における KIT の活性化）
芦

田

敦

子

フィコール分離して末梢血単核球を得た。RosetteSep（論文の内容の要旨）を用いて B 細胞を分離し，さらにソーティング法でナ【背景と目的】悪性黒色腫（M M ）の好発部位には大イーブ B 細胞とメモリー B 細胞を精製した。IL‑4，

きな人種差があり，白人では 間 歇 露 光 部 に 生 じ る

抗 CD40抗 体/CD32‑transfectants（CD32T），IL ‑10M M が大多数を占めるが，日本人では掌蹠，爪部になどの刺激下において，IL‑21（最適濃度25ng/ml）

発生する肢端型と粘膜型 MM が過半数を占める。一を添加し14日間培養後培養上清中の IgE を ELISA で方，近年の研究で MM の遺伝子異常は発生部位によ測定した。形質細胞の分化誘導は抗 CD38抗体を用いり異なることが明らかにされており，間歇露光部のフローサイトメトリー法で検討した。また，RT‑PCRを

M M では癌遺伝子 BRAF および NRAS の変異が高用いてgermline，AID，Blimp‑1，XBP1各mRNAの頻度に認められる。これに対して，肢端型や粘膜型で発現を検討した。

は BRAF ，NRAS 癌遺伝子変異は稀であるが，チロ

その結果，小林は次の結論を得た。
No. 5, 2009

シンキナーゼ受容体である KIT の遺伝子異常（変異199審査学位論文要旨

やコピー数増加）が40％近くに認められる。KIT 遺された。D820Y 変異を有する SM 3では SCF 刺激な伝子の変異は消化管の間質細胞腫瘍（GIST）に高率しにリン酸化 KIT が認められた。そこで，KIT を発に認められることはよく知られており，KIT の活性

現 し な い SM 2‑1株 を 対 照 と し て，SM 3と SMYM ‑化を阻害する分子標的薬である imatinib と sunitinib

PRGP について，imatinib と sunitinib の細胞増殖抑がその治療に広く用いられている。したがって，進行制 効 果 を 検 討 し た。D820Y 変 異 を 有 す る SM 3は期の肢端型や粘膜型の M M にもこれらの分子標的薬

imatinib では増殖が抑制されなかったが，sunitinib

が有力な選択肢となる可能性が高い。しかし，日本人で有意の増殖抑制効果がみられた。野生型 KIT をの肢端型および粘膜型の MM の転移巣における KIT

発現する SMYM ‑PRGPでは，imatinib，sunitinibと遺伝子変異の頻度やタイプは不明であり，これらの分も SCF依存性の細胞増殖と KIT の リ ン 酸 化 を 濃 度

子標的薬の適応や選択の基準は明らかではない。そこ

依存性に抑制 し た が，抑 制 効 果 は sunitinib の 方 がで本研究では，肢端型および粘膜型 M M の臨床検体

imatinib より強力であった。

（主に転移巣腫瘍）について KIT の発現と遺伝子異常【結論】肢端型・粘膜型M M の転移腫瘍ではKIT の遺を解析し，さらに肢端型 MM の細胞株を用いてチロ

伝子異常または SCF/KIT の autocrine や paracrine

シンキナーゼ阻害薬である imatinib と sunitinib の細刺激により高頻度に KIT が活性化していることが示

胞増殖抑制効果を検討した。

唆された。肢端型 MM 細胞株に対する実 験 で は，【材料及び方法】＜臨床検 体＞MM の 切 除 標 本28例

KIT のゲノムタイプによってはチロシンキナーゼ阻（転移24例，原発４例）を用いた。内訳は，肢端型22例，害薬である imatinib と sunitinib は増殖抑制効果を示

粘膜型は６例であった。これらについてKIT（CD117）した。以上より，転移腫瘍の免疫組織染色や遺伝子解とStem cellfactor（SCF）の免疫染色，KIT （exon11，

析により適切に症例を選択すれば，KIT を標的とし

13，17，18），BRAF ，NRAS の DNA シークエンス，

た進行期 MM に対する分子標的治療が可能であるこreal‑time PCR を用いて KIT の，FISH を用いてとが強く示唆された。

cyclinD1 の，各々の gene ampliﬁcation を検討した。

（論文審査の結果の要旨）

また，凍結組織13例を用いて KIT とリン酸化 KIT の進行期の悪性黒色腫（MM ）の有効な治療法は確立

Western blot 解析を行った。＜細胞株＞肢端型 MM

されていない。近年の研究で MM の遺伝子異常は発の６つの細胞株を用いて imatinib と sunitinib に対す

生部位により異なることが明らかにされ，間歇露光部

る細胞増殖抑制効果を検討した。

の MM では癌遺伝子 BRAF および NRAS の変異が【結果】KIT の免疫染色では74％が陽性を示し，48

高頻度に認められるのに対して，肢端型や粘膜型では％では中等度以上の強い発現が認められた。KIT のBRAF ，NRAS 癌遺伝子変異は稀であるが，チロシ

ダイレクトシークエンスでは２例の転移腫瘍に K642

ンキナーゼ受容体のひとつである KIT の遺伝子異常

E および D820Y 変異が検出され，K642E 変異を示す（変異やgene ampliﬁcation）が40％近くに認められる。

１例を含む４例に KIT 遺伝子のコピー数増加が認め

KIT 遺伝子の変異は消化管の間質細胞腫瘍（GIST）られた。さらに，凍結組織を用いた Western blot 解に高率に認められることはよく知られており，KIT

析では８例（62％）に KIT のリン酸化が確認された。

の活性化を阻害する分子標 的 薬 で あ る imatinib とリン酸化は KIT の遺伝子異常を認めない５例にもみ

sunitinibがその治療に広く用いられている。したがっられ，これらの症例では免疫組織染色でメラノーマ細て，進行期の肢端型や粘膜型のM M にもこれらの分子胞だけでなく線維芽細胞や血管内皮細胞などの間質標的薬が有力な選択肢となる可能性が高い。
またimatinib細胞に KIT のリガンドである SCFの 発 現 が み ら れは KIT の juxtamembrane domain の変異には有効たことから，autocrine または paracrine 刺激によるだが kinase domain の変異には無効であることが知KIT の活性化が示唆された。一方，肢端型 M M 細胞

られている。日本人の過半数を占める肢端型および粘株６株における検討では，３株（Mel‑2，SMYM ‑膜型の MM の転移巣における KIT 遺伝子変異の頻PRGP，SM 3）において KIT の発現を認め，SM 3株

度やタイプは不明であり，これらの分子標的薬の適応には臨床検体でも検出された D820Y 変異が見出されや選択の基準は明らかではない。そこで芦田らは，肢た。KIT が 野 生 型 を 示 し た SM YM ‑PRGP で は，端型および粘膜型 MM の主に転移巣の臨床検体につSCF の paracrine 刺激により KIT のリン酸化が誘導

き，KIT の発現や遺伝子異常を検討した。さらに肢200

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

端型 MM の細胞株を用いてチロシンキナーゼ阻害薬
である imatinib と sunitinib の細胞増殖抑制効果を検討した。
その結果，芦田は次の結果を得た。
＜臨床検体での知見＞
１．KIT のタンパク発現は74％に認められ，48％は中等度から強陽性を示した。
２．KIT の遺伝子異常は19％に検出された。
３．変異は２例（K642E，D820Y）に認められた。
４．K642E 変異を示す１例を含む４例に KIT 遺伝子のコピー数増加が認められた。
５．Western blot 解析によるリン酸化 KIT の発現は，8/13例（62％）に認められた。

NADPH oxidase (Nox) 4 contributes totransformation phenotype of melanoma
cells by regulating G2‑M cell cycle pro
gression（活性酸素産生遺伝子 NOX4の G2/
M 期の細胞周期進行の制御による悪性黒色腫の発癌への関与）
山

浦

麻

貴

（論文の内容の要旨）【背景と目的】悪性黒色腫の発癌，増殖過程において活性酸素の産生が関与すると考えられているが，この活性酸素の発生源および発癌，増殖のシグナル伝達に６．８例のうち５例は KIT の遺伝子異常を伴わない

どのように関与するか，いまだ解明されていない。そが，これらの症例では免疫組織染色でメラノーマ細こで悪性腫瘍の増殖に関与すると報告されており，活胞だけでなく線維芽細胞や血管内皮細胞などの間質性酸素を産生するNADPH oxidase（NOX)４のヒト細胞に KIT のリガンドである SCF の強発現がみ

悪性黒色腫における発現と機能を解析した。

られた。

【方法，結果および考察】悪性黒色腫の培養細胞にお＜細胞株での知見＞

いて NOX4の mRNA レベルでの発 現 を Real‑time

７．D820Y変異を有する SM 3は imatinibでは増殖がRT‑PCR にて検討したところ，20検体中13検体に発抑制されなかったが，sunitinib で有意の増殖抑制

現の上昇が認められた。そこで NOX4の発現の上昇効果がみられた。

が見られた培養細胞（MM ‑BP）において NOX4の８．野生型 KIT を発現する SMYM ‑PRGP では，mRNA を small interferring RNAs（siRNAs）によ

imatinib，sunitinib とも SCF 依存性の細胞増殖とり抑制すると，液体培地での増殖が抑制され，足場非KIT のリン酸化を濃度依存性に抑制したが，抑制依存性の腫瘍増殖の抑制やヌードマウスでの腫瘍形効果は sunitinib の方が imatinib より強力であった。

成の抑制も認められた。この結果に一致し抗酸化剤

これらの結果より，肢端型・粘膜型M M の転移腫瘍（vitamine Ｅ）やフラボ蛋白抑制剤である Dipheny-

では，KIT の遺伝子異常またはSCF/KITのautocrine

leneiodonium chloride（DPI）によっても同細胞の液や paracrine 刺激により高頻度に KIT が活性化して体培地での増殖の抑制を認めた。さらに NOX4がどいることが示された。肢端型 MM 細胞株に対する実のように増殖に関与するかを解明するため，フローサ

験では，KIT のゲノムタイプによってはチロシンキ

イトメトリーの解析を行ったところ，siRNAs と DPI

ナーゼ阻害薬である imatinib や sunitinib は増殖抑制

が G2/M 細胞周期進行の抑制を誘導することが確か

効果があることが示された。以上の結果は，肢端型・められた。この細胞周期の抑制は別の悪性黒色腫の培

粘膜型 M M の転移腫瘍の免疫組織染色や遺伝子解析

養細胞（928mel）でも観察された。さらに siRNAs

により適切に症例を選択すれば，KIT を標的としたと DPI は G2/M 細胞周期チェックポイントで重要な進行期 M M に対する分子標的治療が可能であること

Cyclin Dependent Kinase1（CDK1）の Tyr15のリンを示唆している。本研究は KIT を標的とした分子標

酸化による不活性化状態に導き，またこの不活性化を的治療が本邦のメラノーマ患者に行える可能性を初め導く cdc25c の高リン酸化を引き起こすことも確認さて具体的に示したものであり，その臨床的意義は極めれた。これらの結果から NOX4の発現を抑制するとて大きい。よって，主査，副査は一致して本論文を学

cdc25c の高リン酸化による CDK1の不活性化を介し位論文として価値があるものと認めた。

て，G2‑M 細胞周期の制止が引き起こされ細胞増殖を抑制していることが示唆された。また活性酸素のスカ
ベンジャーであるカタラーゼを発現させた際にも G2/
M 細胞周期の制止を認めたことから，NOX4の産生

No. 5, 2009201

審査学位論文要旨

する活性酸素がメディエーターとなって G2‑M 細胞

今後治療と診断の分子標的への応用の可能性を示すも周期進行を制御していることが示唆された。さらにのであると考えられ，主査，副査は一致して本論文を悪性黒色腫の手術検体の免疫組織化学染色により学位論文として価値があるものと認めた。

NOX4の発現は13検体中31.0％に認められ，NOX4の発現と悪性黒色腫の発癌過程との関連が示唆された。
【結論】NOX4により産生された活性酸素は悪性黒色腫の発癌過程に必要であり，G2/M 期の細胞周期進行を制御することにより悪性黒腫の増殖に寄与している

Airway hyper‑responsiveness in young
adults with asthma that remitted either
during or before adolescence（若年成人における小児喘息既往者の気道過敏性の検討）と考えられた。今後，NOX4が悪性黒色腫の治療と診

小断の分子標的になりうると期待される。
（論文審査の結果の要旨）
悪性黒色腫の発癌，増殖過程において活性酸素の産

松

佳

道

（論文の内容の要旨）【背景・目的】生が関与すると考えられているが，この活性酸素の発

小児喘息患者は，思春期までに約50％以上が寛解

生源および発癌，増殖のシグナル伝達にどのように関するが，そのうち約40‑50％は成人になって再び発症与するか，解明されていない。本論文において山浦はするといわれている。小児喘息が寛解した後の気道過活性酸素を産生する NADPH oxidase（NOX）４の

敏性は30〜80％が陽性であり，思春期以降の寛解しヒト悪性黒色腫における発現と機能を解析し，次のよていく時期に気道過敏性が残存している人は再発する

うな結果を得た。

可能性が高いと報告されている。しかし，成人になっ

1） 悪性黒色腫の培養細胞において NOX4の mRNAて喘息が再発するメカニズムは解明されていない。小レベルでの発現を Real‑time RT‑PCR にて検討し児喘息から寛解した後にも気道炎症や気道過敏性が残たところ，20検体中13検体に発現の上昇が認められ存し，これらが再発に関連する可能性がある。我々は，た。

小児喘息から寛解したという若年成人において，気道

2） 培養細胞（MM ‑BP）において NOX4の mRNA

過敏性亢進やアレルギー性気道炎症が寛解しているかを small interferring RNAs（siRNAs）によ り 抑

どうかを検討した。

制すると液体培地での増殖が抑制され，足場非依存【対象・方法】

性の腫瘍増殖の抑制やヌードマウスでの腫瘍形成信州大学医学部の学生約400名に小児喘息，アレルの抑制も認められた．この結果に一致し抗酸化剤

ギーの既往，喫煙歴をアンケート調査した。返答の（vitamine Ｅ）やフラボ蛋白抑制剤であるDipheny-

あった学生の中で，非喫煙者で本研究に同意した学

leneiodonium chloride（DPI）によっても液体培地

生を寛解群（remission group），アトピー群（atopy

での増殖の抑制を認めた。

，コントロール群（control group）の３群にgroup）

3） NOX4が産生する活性酸素は cdc25c の脱リン酸分けた。小児喘息の既往があり無治療で５年以上症状化を介して，G2/M 細胞周期チェックポイントで重要の無い群24名（年齢：26±0.7歳）を寛解群，小児喘

な Cyclin Dependent Kinase1（CDK1）の Tyr15

息の既往がないがアレルギー疾患（アレルギー性鼻炎を脱リン酸化して活性化状態に導き，G2/M 細胞周やアトピー性皮膚炎など）を持ち，総Ig‑E値上昇，特期を促進することが示唆された。

異的Ig‑E抗体CAP‑radioallergosorbent test（RAST）

4） 悪性黒色腫の手術検体の免疫組織化学染色によりscore が６種の抗原（Dermatophagoides farinae,

NOX4の発現は13検体中31.0％に認められ，NOX4

Aspergillus fumigatus,Candida albicans,canine andの発現と悪性黒色腫の発癌過程との関連が示唆され

feline dander and Japanese cedar Cryptomeria

た。

japonica）いずれかの項目で陽性（acore≧１）を示

本研究により，NOX4により産生された活性酸素はす群25名（年齢：25.4±0.6歳）をアトピー群，アレル

悪性黒色腫の発癌過程に必要であり，G2/M 期の細胞ギー疾患を持たない，総 Ig ‑E値正常，CAP‑RAST

周期進行を制御することにより悪性黒腫の増殖に寄与

６種の項目の scoreがすべて正常の群19名（年齢：25.2

していると考えられた。NOX4の機能解析は，悪性黒±0.5歳）をコントロール群とした。方法は，血清総色腫の分子生物学的特徴の解明に重要な発見であり，

Ig‑E 抗体，特異的 Ig‑E 抗体 CAP‑RAST を測定し，

202

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

スパイロメトリーによる呼吸機能検査，呼気中 NO 濃

信州大学医学部生400名に小児喘息，アレルギーの度の測定，アストグラフ法を用いて気道過敏性試験

既往，喫煙歴をアンケート調査し，非喫煙者で本研究を施行した。さらに，高張食塩水吸入による誘発喀痰に同意した学生を３群に分けた。小児喘息の既往があ検査を施行した。

り無治療で５年以上症状のない24名を寛解群，小児喘【結果】

息の既往がなくアレルギー疾患を持ち，総 IgE 値上寛解群は気道過敏性亢進（P ＜0.01），喀痰中の好昇，特異的IgE抗体CAP‑RAST6種の抗原（Dermato‑

酸球数増多（P ＜0.05），ダニに対する特異的 IgE 抗

phagoides farinae, Aspergillus fumigatus, Candida

体陽性（P ＜0.01）がアトピー群，コントロール群に

albicans, canine and feline dander and Japanese

比べて有意に高値を示した。血清総 Ig‑E 抗体値は寛cedar Cryptomeria japonica）いずれかの項目で陽性

解群（P ＜0.01）とアトピー群（P ＜0.01）でコントを示す25名をアトピー群，アレルギー疾患を持たない，ロール群に比べて有意に高値を示した。呼吸機能検査

総 IgE 値，CAP‑RAST6種の項目が正常の19名をコ

は，いずれの群も％ VC，FEV ％は正常範囲内を示

ントロール群とした。方法は，血清総 IgE 抗体，特した。％ FEF％と％ FEF ％（P ＜0.01）は寛異的 IgE 抗体 CAP‑RAST を測定し，呼吸機能検査，解群が，アトピー群，コントロール群に比べて有意に低呼気 NO 濃度，気道過敏性試験，誘発喀痰検査を施行値を示した。呼気中 NO 濃度は，寛解群（P ＜0.01）

した。

とアトピー群（P ＜0.05）でコントロール群に比べてその結果，小松佳道は次の結論を得た。

有意に高値であったが，寛解群とアトピー群で有意差

１．寛解群は，コントロール群およびアトピー群に比は認めなかった。寛解群は気道過敏性亢進を持つもの

べて喀痰中好酸球数上昇を示し，呼吸機能検査におが50％（24名中12名），喀痰中の好酸球数が３ ％以上

いて％ FEF示したものが33％（24名中８名），どちらか一方が陽道過敏性亢進を示した。

％，％ FEF ％は有意に低値，気性のものは62.5％（24名中15名）に認められた。寛

２．寛解群とアトピー群は，コントロール群に比べて解群24名中に気道過敏性も好酸球性炎症もいずれも持有意に呼気 NO 濃度，総 IgE 値の高値を示した。

たないものは９名であった。寛解群の中で気道過敏性

寛解群とアトピー群の間に有意差は認めなかった。

亢進を持つ群（12名）と持たない群（12名）に分けて

３．寛解群において，気道過敏性亢進の陽性群は，陰検討した。年齢，性差，喘息の発症年齢に有意差は認性群に比べて小児喘息の罹病期間が長く，寛解期間

められなかったが，気道過敏性亢進を持つ群は持たなが短い，喀痰中好酸球数や呼気 NO 濃度が高値をい群に比べて有意に喘息の罹病期間が長く（P＜0.05），示した。

寛解している期間が有意に短かった（P ＜0.05）。さこれらの結果より，小児喘息を既往に持ち寛解したらに気道過敏性亢進を持つ群は，持たない群に比べてと判断された若年成人の約半数に気道過敏性亢進，好有意に喀痰中好酸球数，呼気中 NO 濃度が高値を示

酸球性の気道炎症，軽度の気流閉塞を示すことが分かっした（P ＜0.05）。

た。また，気道過敏性亢進には罹病期間が密接に関係【考案】していた。小児喘息寛解後もアレルギー性気道炎症や小児喘息を既往に持ち寛解したと判断された若年成

気道過敏性が残存する者があり，将来の喘息再発の危人の中で約半数に気道過敏性亢進，好酸球性の気道炎

険因子となる可能性が示唆された。これらの事実は臨症，軽度の気流閉塞を示すことが分かった。このこと

床的に重要と判断し，よって，主査，副査は一致しては，将来の喘息発症の危険因子となることが考えられ，本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

注意深い経過観察が必要と思われた。
（論文審査の結果の要旨）
小児喘息は，思春期までに約50％以上が寛解する
が，約40‑50％は成人になって再び発症するといわれている。しかし喘息が再発するメカニズムは解明されていない。我々は，小児喘息から寛解したという若年
成人の気道過敏性亢進や気道炎症が寛解しているかど
うかを検討した。
No. 5, 2009203

審査学位論文要旨

M atrigel reduced あるいは Matrigel をコートしたプ

Diﬀerentiation of Monkey Embryonic
Stem Cells into Hepatocytes and mRNA
Expression of Cytochrome P450 Enzymes
Responsible for Drug Metabolism : Comparison of Embryoid Body Formation Conditions and Matrices（サル胚性幹細胞の肝細胞への分化と薬物代謝に関与するシトクロ
ム P450の mRNA 発現：胚様体作成条件 お
よび細胞外マトリックスの比 ）
百

瀬

泰

行

（論文の内容の要旨）【目的】

レートに接着させ，さらに培養することにより分化した。CYP発現に対する酵素誘導の影響を明らかにする
ために，回収前72時間3‑メチルコラントレン（MC）
またはリファンピシン（RIF）を培地に添加した。
【結果】
EB 作成条件の検討で，肝細胞のマーカー遺伝子，
特にアルブミン（ALB）の発現レベルは，EB 形成のために２日間培養した方が，５日間培養の場合より明らかに高かった。しかし，cmES 細胞断片の大きさによる肝細胞マーカーの発現レベルに顕著な差は見られなかった。また，ECM としてコラーゲンⅠを使用した場合と比して，肝細胞マーカーの ALB，α‑フェトプロテイ ン（AFP）及 び CYP7A1の mRNA 発 現

ヒトの肝細胞を用いた薬物代謝試験は，医薬品開発

レベルは，各々Matrigel reduced で60，36及び９倍の初期段階において重要である。しかし，ヒト初代肝高く，Matrigelでは226，71及び19倍も高かった。さら細胞は短命で，長期間培養による維持は不可能である。

に，薬物代謝型 CYP 分子種の CYP1A1，CYP2C43，

ヒト胚性幹細胞（ES 細胞）は生体を構成するあらゆCYP2D 17及 び CYP3A 8の mRNA 発 現 レ ベ ル は，る細胞に分化可能であることから，初代肝細胞に代る

コラーゲンⅠ使用と比

薬物スクリーニングの有力な候補であるが，その使用で6.5，11，２及び３倍高く，Matrigelで10，23，２及には倫理的に限りがある。ヒト ES 細胞の表現型はサ

び2.5倍高かった。CYP1A1 mRNA の発現レベルは，

ル ES 細胞とよく類似していることが知られている。

CYP1A1の誘導剤である M C 処理によりコラーゲン

したがって，サル ES 細胞は霊長類 ES 細胞の分化機

Ⅰ，Matrigel reduced 及び Matrigel で各々７，４及構の研究やヒト ES 細胞のモデルとして有用であるとび４倍に誘導されたが，CYP3A の誘導剤である RIF考えられる。近年，サル ES 細胞は分化誘導因子を用

によっては全く誘導されなかった。一方，Matrigel

いることで，神経細胞，血液細胞，膵細胞など種々のreduced 及び Matrigel における CYP3A8 mRNA の細胞に分化可能であることが示された。サル ES 細胞

発現レベルは，RIF により顕著に誘導された。しか由来肝細胞は薬物代謝酵素の誘導や医薬品候補化合物

し，CYP2C43と CYP2D17 mRNA の発現レベルは，の相互作用のような薬物動態試験に利用可能と思われこれら化合物によってほとんど変動が認められなかっる。しかしながら，これまでサル ES 細胞の肝細胞へた。

の分化に言及した研究はほとんど報告されていない。

【考察】して各々M atrigel reduced

一般に，ES 細胞の分化は胚様体（EB）を形成後，分化後の細胞における肝細胞マーカーの発現は，細胞外マトリックス（ECM ）で処理したプレートにEB 作成のための培養を２日にした方が５日間より明接着培養することにより行う。ECM の性質は，培養らかに高かった。一方，コロニーの断片サイズは肝細する細胞の表現型の多くに大きな影響を及ぼすことが胞マーカー遺伝子の発現レベルに全く影響しなかった。

知られている。本研究は，サル ES 細胞の肝細胞へのこの結果は，肝細胞への分化は EB 形成のための培分化及びシトクロム P450（CYP）の mRNA 発現に

養時間に影響され，コロニー断片のサイズには影響及ぼす EB 形成条件並びに ECM の影響を明らかにすされないことを示している。Matrigel を用いた場合，ることを目的として検討を行った。

AFP，ALB，CYP7A1及 び CYP2C43の 発 現 レ ベ ル【方法】

が Matrigel reduced やコラーゲンⅠより高かった。

剥離したカニクイザル ES 細胞（cmES 細胞）のコ

その要因として，Matrigel に含まれる増殖因子やサロニーは，ピペッティングにて段階的に断片化した。

イトカイン類の肝細胞への分化への寄与の可能性が考EB はコロニー断片をコニカルチューブにて２またはえ ら れ た。ま た，MC 及 び RIF に よ っ て 各々CYP1５日間培養することにより作成し，コラーゲンⅠ，

A1及び CYP3A8が有意に誘導されたことより，ES

204

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

細胞から分化した肝細胞が，成熟肝細胞様の誘導作った。

用を示すことが明らかとなった。以上の結果より，

これらの結果より，Matrigel は ES 細胞の肝細胞

Matrigel は ES 細胞の肝細胞への分化に有用な ECMへの分化に有用な ECM であること，及び医薬品開発であること，及び医薬品開発における肝細胞のモデルにおける肝細胞のモデルとしてサル ES 細胞から分化としてサル ES 細胞から分化した細胞を応用可能であした細胞を応用可能であることが示された。よって，ることが示された。

主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値が（論文審査の結果の要旨）あるものと認めた。

サル ES 細胞由来肝細胞は薬物代謝酵素の誘導や医薬品候補化合物の相互作用のような薬物動態試験に利用可能と思われる。しかしながら，これまでサル ES細胞の肝細胞への分化に言及した研究はほとんど報告
されていない。本研究は，サル ES 細胞の肝細胞への分化及びシトクロム P450（CYP）の mRNA 発現に及ぼす胚様体（EB）形成条件並びに細胞外マトリックス（ECM ）の影響を明らかにすることを目的として検討を行った。

Prion disease causes less severe lesions inhuman hippocampus than other parts ofbrain（ヒトのプリオン病では海馬の障害が脳の他の部位に比べて少ない）
金子

稔（論文の内容の要旨）【背景と目的】プリオン病は，羊のスクレイピーや牛剥離したカニクイザル ES 細胞（cmES 細胞）のコの牛海綿状脳症（BSE），ヒトのクロイツフェルト・

ロニーは，ピペッティングにて段階的に断片化した。

ヤコブ病（CJD）やゲルストマン・ストロイスラー・

EB はコロニー断片をコニカルチューブにて２またはシャインカー病（GSS）などを含む，神経変性疾患

５日間培養することにより作成し，コラーゲンⅠ，に近縁の一群である。スクレイピー感染マウスなどのMatrigel reduced あるいは Matrigel をコートしたプ

プリオン病動物モデルにおいて，海馬は非常に障害をレートに接着させ，さらに培養することにより分化受けやすく，その終末像では，空胞形成やグリオーシ

した。CYP発現に対する酵素誘導の影響 を 明 ら かスによる重度の海馬硬化を認め，CA1の錐体細胞は完にするために，回収前72時間3‑メチルコラントレン

全に脱落する。一方，ヒト剖検例における海馬病変の（M C）またはリファンピシン（RIF）を培地に添加

重症度について焦点を当てた研究はほとんどみられず，した。

２〜３の研究で海馬の神経病理学的変化は大脳皮質にその結果，百瀬は次の結論を得た。

比して非常に軽度であると簡単に報告されている程１．EB 作成条件の検討で，２日間培養した方が，５度である。本論文では，ヒトのプリオン病の海馬を神日間培養の場合より明らかに肝マーカーの発現レベ

経病理所見やプリオン沈着の観点から検討することをルは高かった。しかし，cmES 細胞断片の大きさに目的とし，孤発性 CJD と硬膜移植後の CJD，家族性よる肝細胞マーカーの発現レベルに顕著な差は見らCJD，GSS を含むプリオン病23例の海馬について，れなかった。

領域ごとに神経病理学的に評価した。

２．ECM としてコラーゲンⅠを使用した場合と比【材料及び方法】孤発性 CJD12例，E200K タイプの家

して，肝細胞マーカーの mRNA発 現 レ ベ ル は族性 CJD7例，２例の P102L と１例の P105L からな

M atrigel で高かった。

る GSS3例，硬膜移植後の CJD1例の計23例を対象と

３．薬物代謝型 CYP 分子種の mRNA 発現レベルは，コラーゲンⅠ使用と比した。ホルマリン固定・パラフィン包埋した剖検脳をして Matrigel で高かった。

薄切した切片に HE 染色，ルクソール・ファスト・

４．誘導実験では，CYP1A1 mRNA の発現レベルは，ブルー染色，ホルツァー染色，抗プリオン抗体染色を

M C 処理によりコラーゲンⅠ，Matrigel reduced 及施し，海馬の領域ごとに，プリオン沈着の分布を定性

び M atrigelで各々誘導された。また，RIF によって的に，病変の程度を半定量的に評価した。

M atrigel reduced 及び M atrigel における CYP3A8【結果】海馬の病変は概して非常に軽度であった。海mRNA の発現レベルは，顕著に誘導された。しか馬支脚で最も高度の病変がみられ，海綿状変化によるし，CYP2C43と CYP2D17 mRNA の発現レベルは，

小さな空胞形成の出現を認めた。CA4ではほぼ全例に，これら化合物によってほとんど変動が認められなか海綿状変化を伴わない星膠細胞の反応や軽度の神経細No. 5, 2009205

審査学位論文要旨

胞脱落を認めた。プリオン沈着は，分子層，海馬支脚，

た，in vitro と in situ の技術は互いに補足しあうべ

CA1‑4で特に多くみられた。びまん性の沈着が CA，きと思われる。

多形細胞層，分子層，放射線維層，網状層，海馬溝に（論文審査の結果の要旨）みられ，顆粒状の沈着は分子層のみにみられた。GSS

プリオン病は，ヒツジのスクレイピーやウシの狂ではプラーク型様のプリオン沈着が分子層に多くみら

牛病（BSE），ヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病れた。プリオン沈着の分布と神経病理学的変化には関（CJD）やゲルストマン・ストロイスラー・シャイン

連がみられなかった。

カー病（GSS）などを含む，神経変性疾患に近似の【結論】海馬は記憶や学習において重要な役割を果た一群である。スクレイピー感染マウスなどの確立されし，アルツハイマー病など多くの認知症では病初期かたプリオン病動物モデルにおいて，海馬は非常に障害

ら明らかに影響を受ける部位である。プリオン病の実を受けやすい。その終末像では，空胞形成やグリオー

験モデルであるスクレイピー感染マウスにおいても海シスによる重度の海馬硬化を認め，CA1の錐体細胞は

馬は非常に障害を受けやすい部位であり，空胞化に星完全に脱落するが，ヒト剖検例における海馬病変の重膠細胞の反応や錐体細胞の脱落を伴い重度の海馬硬化症度について焦点を当てた研究はあまりみられない。

に至る。一方，初老期の進行性の認知症として知られ本論文では，ヒトのプリオン病の海馬を神経病理所見

るヒトのプリオン病においては，末期に至っても海馬やプリオン沈着の観点から検討することを目的とし，体は障害を免れている。プリオン沈着は，多くみられ

孤発性 CJD と硬膜移植後の CJD，家族性 CJD，GSSたため，神経病理学的損傷と関連がなかった。本研究を含むプリオン病23例の海馬について，領域ごとに神結果から次のことが示唆される。すなわち，ⅰ 海馬に

経病理学的に評価した。

おけるプリオン沈着の生化学的特徴は，脳の他の部位

孤発性 CJD12例，E200K タイプの家族性 CJD7例，でみられるものとは異なる可能性がある。あるいは，２例の P102L と１例の P105L からなる３例の GSS，

ⅱ 海馬はプリオン沈着の神経毒性の影響から何らかの

硬膜移植後の CJD1例の計23例を対象とした。ホルマ

機序で保護されている。脳の一定の部位における異常

リン固定しパラフィン包埋した剖検脳を薄切した切片沈着との関連について，神経毒性を解釈することは慎に HE 染色，ルクソール・ファスト・ブルー染色お重にすべきであり，異常プリオン蛋白とプリオン病のよびホルツァー染色を施した。プリオン染色は確立・基本病変との分子病理学上の関係を解明することはこ承認された手順で行った。

の研究の範囲を越える。近年，ニューロンやグリア細胞への，タウや α‑シヌクレインなどの過リン酸化蛋
白沈着が，それぞれアルツハイマー病やレビー小体型

プリオン病海馬について，領域ごとに神経病理学的に評価した。
その結果，海馬にはプリオン沈着は多くみられたが，認知症の病態生理において主要な役割を果たしている

嗅内皮質と比べて病変は明らかに軽度であった。海馬ということが生化学的な研究で示されている。分子遺支脚で最も病変は高度であったが，CA1からは軽微に伝学やタンパク質化学，タンパク質工学の方法が現在なり，網状層（stratum lacunosum）や分子層（stra-

一般に受け入れられ，他の神経変性疾患だけでなく精tum moleculare）には海綿状変化がみられた。海馬神障害のモデルとしても広く用いられている。しかし支脚には海綿状変化による小さな空胞形成の出現を認

生化学的な研究は，タウや α‑シヌクレインが脳のどめた。CA4ではほぼ全例に海綿状変化を伴わない星膠

こから起こるかについてはわずかな洞察しかもたらさ細胞の反応や軽度の神経細胞脱落を認めた。プリオン

ず，多くの研究がこの点について明確にしていない。

沈着は，分子層，海馬支脚，CA1−4で特に多くみら

脳は精巧な複合体であり，異なるタイプのニューロンれた。これらの結果により，以下のことが示唆される。

が１μm の距離で存在しながら，全く異なった物質を海馬におけるプリオン沈着の生化学的特徴は，脳の他産生している可能性がある。海馬体ではそれぞれの領の部位でみられるものとは異なる可能性がある。ある

域が異なった働きをしており，大脳皮質の検体の研究

いは，ヒトの海馬は，プリオン沈着による神経毒性のと海馬の検体の研究とでは全く異なった結果になるこ

影響から防御されている可能性がある。海馬体ではそとも考えられるため，脳の具体的な部位を考慮して研れぞれの領域が異なった働きをしており，大脳皮質の究を行うことが重要である。精神神経疾患の研究では，検体の研究と海馬の検体の研究とでは全く異なった結免疫組織化学と in situ hybridization 組織化学といっ果になることも考えられるため，脳の具体的な部位を206

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

考慮して研究を行うことが重要であると考えられた。

【結果】Cmax 及び AUC 値はともに低用量群で健常

よって，主査，副査は一致して本論文を学位論文とし人投与時の値と酷似しており，高用量群では健常人投て価値があるものと認めた。

与時の10倍以上と著しい乖離を認めた。中性脂肪低下
作用は高用量群では野生型マウスだけに見られたが，Bezaﬁbrate at clinically‑relevant doses
decreases serum/liver triglycerides via
down‑regulation of SREBP‑1c in mice:anovel PPARα‑independent mechanism（臨床用量でのベザフィブラートの中性脂肪低下作用は1c 型ステロール調節領域結合蛋
白の低下に由来する：α型ペルオキシソー
ム増殖剤活性化受容体に依存しない新規薬理作用の発見）
中嶌

岳郎

低用量群では野生型及び PPARα欠損マウスで同様に観察された。高用量群では PPARαの著明な活性化とそれに伴う標的遺伝子群の発現誘導が認められた。
一方，低用量群では1c 型ステロール調節領域結合蛋白（SREBP‑1c）mRNA 量の減少に伴う脂肪酸合成
関連酵素群の発現低下とミクロソーム運搬蛋白の発現低下が PPARα非依存的に生じていた。低用量群では PPARα，β，γ標的遺伝子の発現はいずれも誘導されておらず，PPAR の活性化が全く生じていない
ことが見出された。
【結論】臨床用量でのベザフィブラートの中性脂肪低（論文の内容の要旨）

下作用は，PPARαの活性化に起因していなかった。

【背景と目的】ベザフィブラートは脂質異常症，特に一方，本研究では SREBP‑1c 転写活性の抑制という

高中性脂肪血症に対する代表的治療薬である。また原

新規薬理作用を発見するに至った。本研究はベザフィ

発性胆汁性肝硬変やタモキシフェン誘発性非アルコー

ブラートの臨床での薬理作用を理解する上で，有用な

ル性脂肪肝炎に対する有効性も報告されている。これ

情報を提示するものと考えられた。

らのベザフィブラートの薬理作用は，核内受容体 α（論文審査の結果の要旨）

型ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（PPARα）

ベザフィブラートは脂質異常症，特に高中性脂肪血の活性化に起因するものとみなされてきた。しかし，症に対する代表的治療薬である。また原発性胆汁性肝その根拠となった動物実験での投与量（約100mg/

硬変やタモキシフェン誘発性非アルコール性脂肪肝炎

kg/day）は日常臨床での投与量（約10mg/kg/day）に対する有効性も報告されている。これらのベザフィと 著 し い 乖 離 が あ る。さ ら に 本 剤 は PPARβ及 び

ブラートの薬理作用は，核内受容体 α型ペルオキシ

PPARγの活性化作用も併せ持つことが報告されておソーム増殖剤活性化受容体（PPARα）の活性化に起り，ベザフィブラートの血中脂質低下作用が本当に因するものとみなされてきた。しかし，その根拠とPPARαの活性化に起因するのか不明である。今回なった動物実験での投与量（約100mg/kg/day）は日

我々は，臨床用量のベザフィブラートをマウスに投与

常臨床での投与量（約10mg/kg/day）と著しい乖離し，その薬物動態と作用機構，特に PPARαの活性がある。さらに本剤は PPARβ及び PPARγの活性化との関連を検討した。

化作用も併せ持つことが報告されており，ベザフィブ【材料及び方法】野生型及び PPARα欠損オスマウス

ラートの血中脂質低下作用が本当に PPARαの活性（16週齢，Sv/129系統）を各々コントロール群，低用化に起因するのか不明である。今回我々は，臨床用量

量（臨床用量）群，高用量群に分け（各群６匹），１％のベザフィブラートをマウスに投与し，その薬物動態

カルボキシメチルセルロース溶液に懸濁したベザと作用機構，特に PPARαの活性化との関連を検討

フィブラート10mg/kg/dayを低用量群に，100mg/kg/

した。

dayを高用量群にそれぞれ７日間経口投与した。コン

野生型及び PPARα欠損オスマウス（16週齢，Sv/

トロール群にはベザフィブラートを含まない同溶液

129系統）を各々コントロール群，低用量（臨床用量）を投与した。血漿中薬物濃度を LC/MS/M S法で測群，高用量群に分け（各群６匹），１％カルボキシメ

定し，濃度推移曲線を作成後，最高血漿中薬物濃度

チルセルロース溶液に懸濁したベザフィブラート10（Cmax）及び濃度時間曲線下面積（AUC）を算出しmg/kg/dayを低用量群に，100mg/kg/dayを高用量た。肝臓中の mRNA 及び蛋白発現量はそれぞれ定量

群にそれぞれ７日間経口投与した。コントロール群にPCR 法及びイムノブロット法を用いて解析した。

はベザフィブラートを含まない同溶液を投与した。血No. 5, 2009207

審査学位論文要旨

漿中薬物濃度を LC/M S/MS 法で測定し，濃度推移

でも「皮」マークを付して注意を喚起している。しか曲線を作成後，最高血漿中薬物濃度（Cmax）及び濃度

しながら，NMP 曝露による健康影響について十分な

時間曲線下面積（AUC）を算出した。肝臓中の mRNA

知見はなかった。本研究では，NM P 曝露作業による及び蛋白発現量はそれぞれ定量 PCR 法及びイムノブ

健康影響について検証することを目的とした。

ロット法を用いて解析した。

【対象と方法】NMP に曝露する男性作業者15名（曝その結果，「中嶌岳郎」は次の結論を得た。

露群），NMP に曝露しない男性作業員15名（対照群）

１．Cmax 及び AUC 値はともに低用量群で健常人投を選定した（ただし１名は調査当日不参加）。これら

与時の値と酷似しており，高用量群では健常人投与の対象者に NMP 個人曝露濃度及び尿中代謝物濃度時の10倍以上と著しい乖離を認めた。

測定を行い曝露指標とし，健康影響指標として尿検査，

２．中性脂肪低下作用は，高用量群では野生型マウ

血液検査（生化学，血算），アンケートによる自覚症

スだけに見 ら れ た が，低 用 量 群 で は 野 生 型 及 び

状調査，神経伝導速度測定，神経行動学検査を行った。

PPARα欠損マウスで同様に観察された。

【結果】作業者の年齢は曝 露 群（33.8±10.0歳）（平

３．高用量群では PPARαの著明な活性化とそれに伴う標的遺伝子群の発現誘導が認められた。

均±標準偏差），対照群（34.1±9.7歳）で差はなく，
学歴，飲酒喫煙習慣にも両群で差はなかった。曝露

４．低用量群では1c 型ステロール調節領域結合蛋白群のシフト５日間の作業後の NMP個人曝露濃度の（SREBP‑1c）mRNA 量の減少に伴う脂肪酸合成

平均値は0.14〜0.26ppm，尿中 NM P濃度は0.17〜

関連酵素群の発現低下とミクロソーム運搬蛋白の発0.22mg/l だった。またシフト中の NMP 個人曝露濃現低下が PPARα非依存的に生じていた。

度の最大値は0.8ppm で，日本産業衛生学会が勧告す５．低用量群では PPARα，β，γ標的遺伝子の発現る曝露濃度（occupational exposure limit；OEL）ではいずれも誘導されておらず，PPAR の活性化がある１ppm を下回った。対照群は曝露していなかった。

全く生じていないことが見出された。

NMP 以外に取り扱い溶剤に含まれていたキシレンは

これらの結果より，臨床用量でのベザフィブラート

個人曝露濃度，尿中代謝物共に検出限界値以下だった。

の中性脂肪低下作用は，PPARαの活性化に起因して健康影響指標として行ったアンケートによる自覚症状

いないことが示唆された。一方，本研究ではSREBP‑

調査，神経伝導速度検査，神経行動学検査は，曝露群

1c 転写活性の抑制という新規薬理作用を発見するにと対照群との間に差は見られなかった。

至った。本研究はベザフィブラートの臨床での薬理作【結論】曝露群のシフト５日間の NM P 個人曝露濃度

用を理解する上で，有用な情報を提示するものと考えは0.14〜0.26ppm，最大値が0.8ppm に曝露する作られた。よって，主査，副査は一致して本論文を学位業者において，アンケートによる自覚症状調査，神経論文として価値があるものと認めた。

伝導速度検査，神経行動学検査について曝露群と対照群との間に差が見られず，この曝露濃度で健康影響は

A Cross ‑Sectional Observation of Eﬀect
of Exposure to N ‑Methyl‑2‑Pyrrolidone(NMP)on Workersʼ
Health（N‑メチル‑２‑ピロリドン（NM P）曝露が作業者の健康に及ぼす影響の時間断面研究）西村

繁

検知できなかった。
（論文審査の結果の要旨）
N ‑メチル‑２‑ピロリドン（N ‑methyl‑２‑pyrrolidone; NM P）は，従来広く用いられてきた有機塩
素系溶剤が成層圏オゾン層破壊性を理由に製造・使用が禁止されつつある中，それらの代替物質として使用を広げている。NMP は皮膚からの吸収が非常に強い（論文の内容の要旨）とされ，日本産業衛生学会でも（皮）マークを付して【背景と目的】N‑メチル‑２‑ピロリドン（N‑methyl‑

注意を喚起している。しかしながら，NMP 曝露によ２‑pyrrolidone; NMP）は，従来広く用いられてきる健康影響について十分な知見は無かった。本研究でた有機溶剤（特に有機塩素系化合物）がオゾン破壊性は，NMP 曝露作業による健康影響について検証するを理由に製造・使用が禁止されつつある中，それらのことを目的とした。

代替物質として急速に使用を広げている。NM P は皮NM P に曝露する男性作業者15名（曝露群），NMP

膚からの吸収が非常に強いとされ，日本産業衛生学会に曝露しない男性作業員15名（対照群）を選定した。

208

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

これらの対象者にNM P個人曝露濃度及び尿中代謝物

immunohisotochemical method.

濃度測定を行い曝露指標とし，健康影響指標として血Methods: Male wild‑type or GFP‑transgenic

液生化学検査，尿検査，アンケートによる自覚症状調

rats, 4 weeks of age, were used in this experiment.

査，神経学検査を行った。今回の研究は NMP の健

The upper ﬁrst molar was extracted with a pair of

康影響調査の中で，１）一般的作業環境に相当する低dental forceps under anesthesia. The tooth was

濃度の NM P 曝露に関して曝露群と対照群を比，

immediately rinsed in physiologic saline and then

２）生活習慣のような交絡因子を調整，３）神経学検

was repositioned into the original socket. At 5 and査も含めた多くの検査項目を実施，という３点をクリ

14 days after replantation, the maxillae were dis-

アした初の疫学研究である。

sected and after ﬁxation,decalciﬁcation,and embed-

その結果，西村は次の結論を得た。

ding in paraﬃn,sections were cut for HE stain and

１．曝露群のシフト５日間の作業後の NMP 個人曝

immunohistochemistry of OPN, BSP, DSP, BMP4,

露濃度の平均値は0.14〜0.26ppm，尿中NMP濃度

Smad4,Runx2,Osterix,alpha‑SMA.To clarify theは0.17〜0.22mg/l だった。またシフト中の NMP

origin of hard tissue formative cells,we transplant-

個人曝露濃度の最大値は0.8ppm で，日本産業衛生

ed upper ﬁrst molars of GFP‑transgenic rats into

学会が勧告する曝露濃度（occupational exposure

the corresponding tooth sockets of wild‑type rats.

limit；OEL）である１ppm を下回った。対照群はAfter ﬁxation, decalciﬁcation, and embedding in

曝露していなかった。

paraﬃn,sections were used for immunohistochemis-

２．健康影響指標として行った血液生化学検査，尿検

try of GFP.

査，神経行動学検査，神経伝導速度，アンケートにResults:At 5 days after replantation, degenerat-

よる自覚症状調査において，曝露群と対照群との間

ed odontoblasts were lining the pulp cavity. At 14に差は認められなかった。

days,dentin‑ or bone‑like tissue was present in the

最大値が0.8ppm に曝露する作業者において，アン

pulp cavity. Immunoreactivity for osteopontin

ケートによる自覚症状調査，神経学検査について曝露(OPN) and bone sialoprotein (BSP) was strong in

群と対照群との間に差が見られず，この曝露濃度で健

the bone‑like tissue, but weak in the dentin‑like

康影響は検知できなかったことから，日本産業衛生学

tissue. Conversely, dentin sialoprotein (DSP) was会が勧告している１ppm の許容濃度の妥当性を裏付

localized in the dentin‑like tissue, but not in the

けるものと考えられる。

bone‑like tissue. Cells positive for BMP4, Smad4,以上のことから，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

Runx2, and Osterix were found around the bloodvessels of the root apex at 5 days.At 14 days,thesecells were also localized around the bone‑like tis-

Immunohistochemical study of hard tissue
formation in the rat pulp cavity after tooth
replantation（歯の再植後の歯髄腔内に形成される硬組織に関する免疫組織化学的研究）
趙（論文の内容の要旨）

sue. Cells expressing alpha‑smooth muscle actin(SM A) were seen around the newly formed bone‑
like tissue,whereas no such cells were found aroundthe newly formed dentin‑like tissue.
At 14 days after transplantation, the bone‑liketissue consisted of cells positive or negative for
GFP. Almost half of these cells showed positive

Objective:While mineralized tissue is formed inlabeling. On the other hand, cells lining the newly

the pulp cavity after tooth replantation or trans-

formed dentin ‑like tissue were always im-plantation, little is known about this hard tissue

munopositive for GFP.

formation.The aim of the study is to evaluate hard

Conclusions: Bone‑ and dentin‑like matrices

tissue formation in the pulp cavity after tooth re-were formed in the pulp cavity after tooth replanta-

plantation and to examine the diﬀerentiation proc-

tion.The dentin‑like tissue might have been formed

ess of hard tissue formative cells byhistological andby pulp cells; and the bone‑like tissue, by donor

No. 5, 2009209

審査学位論文要旨

pulp cells and host mesenchymal cells. Dental pulp

pulp cells as well as in the smooth muscle cells

cells may have potential application in tissue engi-

and pericytes. At 14 days, there were numerous

neering, because they possess the ability to formalpha‑SM A‑positive cells around the newly for-mineralized tissue.

med bone‑like tissue;whereas these positive cells（論文審査の結果の要旨）
Dental pulp has the ability to form mineralized

were hardly seen adjacent to the newly formed
dentin‑like tissue.

hard tissue in response to a variety of external5)At 14 days after replantation,the bone‑like tissue

stimuli.After tooth replantation or transplantation,

consisted of cells positive or negative for GFP.

mineralized tissue is formed in the pulp cavity,little

Almost half of these cells showed positive labe-

is known of this hard tissue formation. Dr.Zhaoling. On the other hand, cells lining the newly

conducted histological and immunohistochemical

formed dentin‑like tissue were always im-

evaluations of hard tissue formed in the pulp of rat

munopositive for GFP.

maxillary molars after tooth replantation.

Bone‑ and dentin‑like matrices were formed in

The results from Dr.Zhao are as follows:

the pulp cavity after tooth replantation.The dentin1)At 14 days after replantation and transplantation,‑like tissue might have been formed by pulp cells;

two type of hard tissue were formed in the rat

and the bone‑like tissue, by donor pulp cells andpulp cavity. One resembled bone matrix contain-

host mesenchymal cells.Dental pulp cells may haveing numerous structures similar to osteocyte

potential application in tissue engineering, because

lacunae. This tissue was bone‑like tissue. The

they possess the ability to form mineralized tissue.

other was dentin‑like tissue that formed in con-

主査，副査は一致して本論文を学位論文として十分

tact with the dentin.

な価値を有するものと認めた。

2)At 14 days after replantation,the matrix of bone
‑like tissue demonstrated immunoreactivity for
OPN and BSP,but not for DSP.While the dentin‑like tissue demonstrated immunoreactivity for
DSP, labeling for OPN and BSP was seen on theregion between the newly formed dentin‑likematrix and the original dentin.
3) At 5 days after replantation, ﬁbroblastic cells

Therapeutic and preventive eﬀects ofmethotrexate on zymosan‑induced arthritis in SKG mice（SKG マウスのザイモザン
誘発関節炎に対するメトトレキサートの治療
的及び予防的効果）
長

手

寿

明

positive for BM P4, Smad4, Runx2, and Osterix（論文の内容の要旨）

were found around blood vessels in the pulp cav-

【背景と目的】関節リウマチは，関節の慢性炎症を特

ity at the root apex. At 14 days, numerous cells

徴とする病態であり，軟骨及び骨の進行性の破壊をもshowing immunoreactivity for antibodies against

たらし，罹患患者は生活の質が低下するだけでなく生BMP4, Smad4, Runx2, and Osterix were seen

命予後にも影響がある重要な病態である。関節リウマ

around the bone‑like tissue. In contrast, cells

チを治療する新薬は近年盛んに開発されているが，そadjacent to dentin‑like matrix scarcely showed

こで重要な役割を演ずるのは関節リウマチの疾患モデ

immunoreactivity indicating BM P4, Smad4, and

ル動物である。しかしながら，これまで開発されてきOsterix. Weakly nuclear labeling for Runx2 was

た多くのモデル動物は，必ずしもヒトにおける関節リ

seen in several odontoblast‑like cells.

ウマチの病態を完全には反映していないとの指摘も多

4) Prior to replantation, there was no immunor-

く，よりヒトの病態に近く信頼性の高い新しいモデル

eactivity for alpha‑SM A in the pulp cavity,の開発が，よりよい新薬開発のために望まれている。

except in smooth muscle cells and pericytes

本研究の目的は，新たなヒトの関節リウマチのモデル

around blood vessels. At 5 days after replanta-

動物である SKG マウスのザイモザン誘発関節炎の病

tion, alpha‑SM A‑positive reactivity was seen in

態を検索し，新薬開発のスクリーニング系として信頼210

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

性の高いモデルであるということを証明することであっ１群：非接種，２群媒体のみ，３群：MTX１ mg/kg

た。また対照薬として，ヒトでも標準的に用いられて予防的投与，４群：MTX 10mg/kg予防的投与，５群：

いるメトトレキサート（M TX）を用いた。

M TX １mg/kg 治療的投与，６ 群：M TX 10mg/kg【方法】試験は SKG マウス（メス，７週齢）30匹を治療的の各処置を行った。１群以外の動物は全て観察

以下の６群（各５匹）に群分けし，それぞれの処置を開始初日にザイモザンを２mg/bodyになるように腹行った。

腔内投与し，動物の発症を惹起した。３群及び４群は１群接種の翌日から，５群及び６群は病態がほぼ完全に形

無処置

２群 ザイモザン４mg/ml を腹腔内投与後，翌日より毎日一回，媒体のみを腹腔内投与成された接種後20日からそれぞれの用量の MTX を投与された。その結果，以下の結論を得た。

３群 ザイモザン４mg/ml を腹腔内投与後，翌日よ⑴ 試験期間中，１群の動物は発症が認められなかっり毎日一回，MTX １mg/kg を腹腔内投与たのに対し，２群，５群及び６群の動物は接種11日

４群 ザイモザン４mg/ml を腹腔内投与後，翌日よ

目頃にほぼ均質に関節炎を発症し，それから10日前

り毎日一回，MTX 10mg/kg を腹腔内投与

後で病態を形成した。３群及び４群の動物では病態

５群 ザイモザン４mg/ml を腹腔内投与後20日目よの形成は MTX の投与量依存的に抑制され，特にり毎日一回，MTX １mg/kg を腹腔内投与

４群においてはほぼ完全に抑制した。５群及び６群

６群 ザイモザン４mg/ml を腹腔内投与後20日目よの動物においても，用量依存的な病態の抑制が認めり毎日一回，MTX 10mg/kg を腹腔内投与

られ，６群においては投与開始10日目にはその抑制

３群と４群とにおいては MTX の予防的効果を，

は統計学的に有意となった。

５群と６群とにおいては M TX の治療的効果の評価⑵ 投与開始から30日後に動物を安楽死させ，その左を目的とした。全ての動物は定法に則り毎日手根骨間足関節の病理組織学的な検索を行ったところ，１群

関節及び足根骨間関節を臨床的に評価された。さらに，

においては特別な所見は見出されなかったが，２群投与開始から30日後に全ての動物に安楽死をもたらし，においては，骨糜爛，骨新生，パンヌス形成，軟骨

病理組織学的な評価を行った。

破壊，滑膜細胞増殖，炎症性細胞浸潤，関節周囲線【結果】各動物は病態の発現において均質な振る舞い

維化及び浮腫が著しく見られた。投薬された動物にを示した。臨床的評価項目において，MTX は予防的

おいては全ての所見でほぼ用量依存的に改善が見らにも治療的にも有意に足関節及び手関節の関節炎の病れた。

態形成を抑制した。また病理組織学的にも，同様の抑⑶ 免疫組織化学的検索を行った結果，炎症局所に浸制が見られた。本病態は顆粒球を豊富に含む肉芽組織

潤していた免疫担当細胞は顆粒球が最も多く，ついの存在が特徴的であった。

でＴ細胞，Ｂ細胞の順であった。単球及びマクロ【結論】SKG マウスのザイモザン誘発関節炎においてファージは殆ど見られなかった。

MTX はヒトの関節リウマチでも示されているのと同以上より，SKG マウスにおけるザイモザン誘発関様な病態の 抑 制 を 再 現 し た。こ れ ら の 結 果 か ら，節炎は，ヒトの関節リウマチの新たなモデル動物とし

SKG マウスは関節リウマチの病態モデル動物としてて，特に医薬品開発におけるスクリーニング系として信頼性の高い評価系であること，及びその際の比 対

極めて有用である可能性が示唆された。MTX をこれ照薬として M TX が使用されうることが示された。

までこのモデル動物に投与したというデータは無く，（論文審査の結果の要旨）

M TX を対照薬として本モデルを用いた標準データを

関節リウマチの疾患モデル動物である SKG マウス

与えた本研究の意義は高いものと考えられ，主査，副について，その抗リウマチ薬のスクリーニング系とし査は一致して本論文を学位論文として価値があるものての有用性の有無を明らかにするため，ヒトの関節リと認めた。

ウマチにおける標準薬であるメトトレキサート（M TX）をこの動物に対して予防的及び治療的に投与し，関節炎の病態の進行と病理組織学的な評価を行った。
SKGマウスは各群５例，６群に群分けし，それぞれ
No. 5, 2009211

審査学位論文要旨確認した。人工培地による培養を試みたが，SH6株

Phylogeny of a Novel “
Helicobacter heilmannii” Organism from a JapanesePatient with Chronic Gastritis Based on
DNA Sequence Analysis of 16S rRNA andUrease Genes（日本人の慢性胃炎患者から検出された新規 Helicobacter heilmannii の
16S rRNA 遺伝子と Urease 遺伝子の DNA
塩基配列解析に基づいた系統発生論）
松本

竹の培養は成功しなかった。16S rRNA 遺伝子配列を用いた相同性解析を行った結果，SH6株はチーター由
来 HHLO C4E に対して99.4％（1,437/1,445bp）と最も高い相同性を示し，urease 遺伝子配列においては，HHLO C4E に81.7％（1,240/1,516bp）と最も高い相同性を示した。また ureA と ureB 間に存在す
る intergenic spacer region には GAA の3bp が介在することが判明した。SH6株と既知のヒト由来 HHLO
である H. heilmannii type1， H. heilmannii

久

type2，H. felis との Urease アミノ酸配列に対する（論文の内容の要旨）

相同性解析では，UreAに対し，それぞれ81.8％，【はじめに】 Helicobacter heilmannii はヒト胃粘膜

86.3％，88.5％の一致率を示し，UreB ではそれぞに感染する人工培養不可能のグラム陰性のらせん菌

れ92％，91.3％，95％の一致率を示した。

であり，Helicobacter pylori と比 すると大型でねじ【考察】慢性胃炎患者から検出された HHLO である

れが強い Helicobacter 属菌である。人工培養不可能

SH6株 は，16S rRNA 遺 伝 子 配 列 の 相 同 性 解 析 にの菌であることから生化学的性状をはじめ菌が有するて チ ー タ ー 由 来 HHLO C4Eと C2S に 対 し 99.4％

細胞毒性など多くが未だ解明されていない。我々は，（1,437/1,445bp）と最も高い相同性を示したが， H.

慢性胃炎患者の胃粘膜に，これまで知られていない

heilmannii，
Helicobacter heilmannii ‑like organism（HHLO）

に対しても高い相同性が示され，16S rRNA 遺伝子

SH6株を観察した。本研究では，初めて我々が観察配列に基づく系統解析では SH6株の分類学的位置のした SH6株について，透過型電子顕微鏡による SH6

特定は不能であった。urease 遺伝子配列の相同性解

株の形態学的解析に加えて，16S rRNA遺伝子と析で，最も相同性の高いものでも HHLO C4E 81.7

urease 遺伝子の配列に基づいた系統解析を行い，ど％（1,240/1,516bp）であるなど，相同率が低いことのような菌種に近縁であるかを明らかにすることを目から，Urease 遺伝子配列に基づく系統解析では SH6的とした。

株が新しい HHLO の菌種に分類されることが示され【材料と方法】SH6株を保有する患者の胃生検材料をた。intergenic spacer region は H. pylori の3bp と同

ホモジ ナ イ ズ し，経 口 的 に speciﬁc‑pathogen‑free

じ塩基数であったが，H. pylori の構成する塩基はマウスに接種し，電子顕微鏡を用いてマウス胃粘膜へ

TGC であるのに対し，SH6株は GAA と異なっておの感染の有無の確認を行った。SH6株感染マウスのり，SH6株 と 一 致 す る 菌 種 は な か っ た。SH6株 の胃粘膜をサンプルとして人工培地（５％ヒツジ血液寒UreB のアミノ酸配列には，ニッケルの結合と酵素活

天培地，チョコレート寒天培地，ヘリコバクター寒天性に重要な役割を担うヒスチジン残基とシステイン残培地）を用いて培養を試みた。SH6株の系統解析を行

基の保存された部位が存在することが分かり，SH6

うため，感染マウスの胃粘膜からDNAを抽出し，16S

株の UreB の酵素活性が保たれていることが推測されribosomal RNA 遺伝子と urease（ureA と ureB）遺た。本研究により得られた解析結果は，SH6株がヒ伝子の PCR 増幅・シーケンス解析を行った。ほぼ全ト胃粘膜に感染する Helicobacter heilmannii の中長の16S ribosomal RNA 遺伝子配列1,445bp，部分

でも新しい分類群に属することを示唆するものであっ的な urease 遺伝子配列1,483bp を用いて，BLAST

た。

検索による相同性解析，CLUSTAL W を用いた系統樹の作成を実施した。また SH6株と既知のヒト由来
HHLO との UreA と UreB のアミノ酸配列を比し，，H. felis（98.2％）
type2（98.1％）（論文審査の結果の要旨）
Helicobacter heilmannii はヒト胃粘膜に感染する人工培養不可能のグラム陰性のらせん菌であり，相同性解析を実施した。

Helicobacter pylori と比 すると大型でねじれが強い【結果】透過型電子顕微鏡により大型でねじれが強い

Helicobacter 属菌である。人工培養不可能の菌である菌体が観察され，SH6株のマウス胃粘膜への感染をことから生化学的性状をはじめ，菌が有する細胞毒性212

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨など多くが未だ解明されていない。本研究は，慢性合成され，血中のアポＥと比べてシアル化アポＥの比胃炎患者の胃粘膜に感染していた Helicobacter heil-が高いことが知られている。シアル化は，その結合蛋，SH6株の透過型
mannii ‑like organism（HHLO）

白の生物学的な機能を担っていることから髄液中アポ電子顕微鏡による形態学的解析に加えて，16S rRNA

Ｅのシアル酸（SA）残基も脂質代謝や輸送に関して遺伝子と urease 遺伝子の配列に基づいた系統解析を何らかの機能を担っていると考えられる。髄液中アポ行った。

Ｅはアルツハイマー病（AD）の病理学的特徴の一つ

１．透過型電子顕微鏡により，複数本の鞭毛を持ち，である老人斑の主成分である β‑アミロイドと結合し大型でねじれの強い Helicobacter heilmannii 様て沈着することから，シアル化アポＥは，生物学的機の菌体が確認された。

能だけでなく AD の発症メカニズムを解明する上で２．16S rRNA 遺伝子配列を用いた相同性・系統解重要と考えられる。本研究では，SA 定量法を高感度析を行った結果，チーター由来 H. heilmannii

化し，それを用いて髄液中のアポＥ含有リポ蛋白のよC4E， C2Sに対し，99.4％と最も高い相同性を示し，り詳細な性状とリポ蛋白粒子の形成に及ぼす SA 残基

ネコ由来 H. felis 98.2％，ヒト由来の影響について解析した。

H. heilma-

nnii type2 98.1％など，高い相同性が示され，これら４菌株との区別をつけられなかった。

【材料及び方法】
同時に採取された患者髄液と血清（ｎ＝14）を試料

３．urease 遺伝子配列を用いた相同性解析を行ったとして匿名化して使用した。SA は p‑アミノ安息香

結果，既知の Helicobacter 属菌に対し，いずれも酸エチルエステル誘導体に変換し HPLC で測定した。

80％程度の低い相同率を示した。系統解析の結果，本法の正確性，精密性，直線性，検出限界の検討を行独立した位置に分類された。また ureA ・ ureB 間

い，その基礎性能を評価した。血清及び髄液中のアポの intergenic spacer region は GAA の3bp であり，

Ｅ含有リポ蛋白は超遠心分離後のリポ蛋白画分をヘパ

既知の Helicobacter 属菌と異なった。

リンセファロースカラムに注入し分取した。血清中，４．UreB アミノ酸配列解析では，ニッケルの結合と髄液中，およびアポＥ含有リポ蛋白中の SA，総蛋白

酵素活性に必須のアミノ酸配列を保有していた。

（TP），総コレステロール，リン脂質，各種アポ蛋白，

これらの結果より，SH6株は今までに報告のない

それぞれの濃度を測定した。また，髄液を試料として

urease 遺伝子を保有している H. heilmannii であ等電点電気泳動と抗アポＥ抗体を利用したウエスタンり，ヒト胃粘膜に感染する

ブロット法によりアポＥのフェノタイピングを行った。

H. heilmannii の中でも，新しい分類群に属すると考えられた。

髄液中アポＥ含有リポ蛋白の粒子径は，ウラニル酢酸

今後の H. heilmannii 感染症研究において H.

でネガティブ染色を行い透過型電子顕微鏡で撮影しheilmannii SH6も解析する必要があることを示した像を計測して求めた。全てのデータは３重測定し，た。

平均±標準誤差で表し，Welch のｔ検定にて有意差

よって，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

（p＜0.05）の有無を判定した。
【結果】
今回確立した高感度 SA 定量法は，本研究を遂行しSialic acid moiety of apolipoprotein E andits impact on the formation of lipoprotein
particles in human cerebrospinal ﬂuid
（ヒト脳脊髄液中リポ蛋白粒子の形成におけるアポリポ蛋白Ｅのシアル酸残基の影響）
川

崎

健

治

（論文の内容の要旨）【背景と目的】得る十分な性能を有していた。髄液中の SA 濃度と血清中の SA 濃度はそれぞれ25.9±1.5mol/L，2209±
196mol/L であり，髄液中の SA 濃度は血清中のおよ
そ1/85であったが，髄液と血清それぞれの TP 濃度で
SA 濃度を補正すると，髄液と血清の SA 濃度はそれ
ぞれ，142.6±14.4mol/g TP，39.1±4.7mol/g TPとなり，髄液中の補正 SA 濃度は血清のおよそ3.6倍であった。
若年者グループ（5.4±2.3歳）と高齢者グループ

脳脊髄液（髄液）中のアポリポ蛋白Ｅ（アポＥ）は（72.0±3.2歳）の髄液中の補正 SA 濃度は高齢者グ

リポ蛋白粒子の構成成分として主にアストロサイトでループで低値傾向が見られた。また，性差，アポＥフェ

No. 5, 2009213

審査学位論文要旨

ノタイプによる髄液中の SA濃度の違いは見られな

有リポ蛋白粒子の性状解析として SA，総コレステ

かった。

ロール，リン脂質の各濃度，透過型電子顕微鏡による血清に比べ髄液中のアポＥ含有リポ蛋白の SA 濃度は，有意に高値であった（p＜0.002）。髄液中アポＥ
含有リポ蛋白の SA 濃度は，髄液中の総 SA 濃度の５％程度であったが，髄液中のアポＥ濃度と相関性が認

リポ蛋白粒子の観察を行った。
その結果，川崎健治は次の結論を得た。
１．高感度 SA 定量法は，本研究を遂行し得る十分な性能を有していた。

め ら れ た（ｒ＝0.924，p＜0.001）。一 方，髄 液 中 の２．血清中の SA 濃度は髄液中の SA 濃度よりも高値

アポＥ含有リポ蛋白の SA/アポＥ濃度比（SA/アポであったが，髄液と血清それぞれの総蛋白濃度でＥ）と髄液中アポＥ含有リポ蛋白中の総脂質濃度は逆

SA 濃度を補正すると，髄液中の補正 SA 濃度は血相関を示した（ｒ＝0.847，p＜0.001）。さらに，SA/

清中よりも高値であった。

アポＥと総脂質濃度はリポ蛋白の粒子サイズに影響し３．若年者グループ（5.4±2.3歳）と高齢者グループており，SA/アポＥが高く総脂質濃度が低いアポＥ含（72.0±3.2歳）の髄液中の補正 SA 濃度は高齢者グ有リポ蛋白の粒子サイズ（17.5±0.2nm）と SA/ア

ループで低値となる傾向が認められた。

ポＥが低く総脂質濃度が高いアポＥ含有リポ蛋白の粒

４．アポＥ含有リポ蛋白中のSA/アポＥ濃度比（SA/

子サイズ（12.0±0.1nm）には明らかな有意差が認アポＥ）と総脂質濃度は逆相関を示した。SA/アポめられた（ｐ＜0.001）。

Ｅが高く総脂質濃度が低いアポＥ含有リポ蛋白の【結論】

粒子サイズ（17.5±0.2nm）と SA/アポＥが低く

中枢神経組織の SA は主として蛋白質に結合した状

総脂質濃度が高いアポＥ含有リポ蛋白の粒子サイズ態で存在していた。その濃度は加齢によって減少する（12.0±0.1nm）間には明らかな有意差が認められ傾向が認められ，SA 濃度の減少はその結合蛋白質のた。

生物学的機能に影響を与え，加齢が病因の一つとして中枢神経組織の SA は主として蛋白質に結合した状考えられる AD などの発症や進行に重要であると考態で存在している。その SA 濃度は加齢によって減少えられた。本研究で観察された SA に富むアポＥは脂する傾向が認められ，結合蛋白質の生物学的機能に影

質量の少ない未成熟なリポ蛋白に含まれており，SA響を与えていると考えられた。SA に富むアポＥは脂の少ないアポＥは脂質量が多いリポ蛋白に存在してい質量の少ない未成熟なリポ蛋白に含まれており，SAた。これらの知見からアポＥ含有リポ蛋白中の SA は，の少ないアポＥは脂質量が多いリポ蛋白に存在してい中枢神経組織のリポ蛋白の粒子形成およびコレステ

たことから，アポＥ含有リポ蛋白中の SA は，中枢神ロールの排泄機構をはじめとする脂質輸送の制御に関

経組織のリポ蛋白の粒子形成およびコレステロールの係していることが示唆された。

排泄機構をはじめとする脂質輸送の制御に関係してい（論文審査の結果の要旨）
脳脊髄液（髄液）中のアポリポ蛋白Ｅ（アポＥ）は血中のアポＥと比べてシアル化アポＥの存在比が高いることが示唆された。
よって，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

ことが知られている。本研究では，髄液アポＥ中のシアル酸（SA）定量法を高感度化し，本法を用いて髄液中のアポＥ含有リポ蛋白のより詳細な性状とリポ蛋
白粒子形成に及ぼす SA 残基の影響について解析した。
髄液と血清が同時に提出された患者14名の検体を匿名化して使用した。SA は p‑アミノ安息香酸エチル
エステル誘導体に変換し HPLC で測定した。本法のCharacterization of cysteine and homocysteine bound to human serum transthyretin（ヒト血清トランスサイレチンに結合したシステインとホモシステインの特徴について）
羽生

登

性能評価として正確性，精密性，直線性，検出限界の（論文の内容の要旨）検討を行った。血清及び髄液中のアポＥ含有リポ蛋白【背景と目的】システイン（Cys）とホモシステイン

は超遠心分離後のリポ蛋白画分をヘパリンセファロー（Hcy）は，側鎖に硫黄基（SH 基）を有する含硫ア

スカラムに注入し分取した。血清中，髄液中，およびミノ酸であり，他のアミノ酸，ペプチド，生体金属，

アポＥ含有リポ蛋白中の SA 濃度を行った。アポＥ含

蛋白中の含硫アミノ酸などと親和性を有している。ま214

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

た，血中含硫アミノ酸濃度が動脈硬化症やアミロイドー

布点に残存を認めた。DTT，L‑Cys 処理では，TTR

シスの発症と関係していることが報告されているが，は２量体または単量体として検出されたが，ブロード

その機序の詳細は不明である。含硫アミノ酸は酸性アなバンドや塗布点への残存は認めなかった。上記，各

ミノ酸であり，S‑S2重結合を生成しやすい性質を持

種還元剤を精製 TTR に反応させ質量分析を行った

つことから，蛋白質中の Cys 残基に結合し蛋白の構ところ，還元剤未処理の TTR の質量分析は，Cys‑

造や性質に変化を及ぼし，蛋白の生理的機能に影響す

TTR のピーク（m/z 13885）と他の小分子が結合しることが考えられる。最近，質量分析により Cys がた ピ ー ク が 検 出 さ れ た。DTT 処 理 TTR と L‑Cys

血清トランスサイレチン（TTR）に結合しているこ

処理 TTR の質量分析は，Cys未結合 TTR の質 量 でとが報告された。TTR は T3，T4やビタミンＡの輸ある m/z 13761のピークが増加し，Cys‑TTR のピーク送に関与し，臨床検査としては，栄養評価の短期的なは減少した。しかし，Cys‑HCl 処理 TTR の質量分析

蛋白代謝の指標として用いられている。一方，TTR

は，Cys‑TTR のピークは残り，還元剤未処理 TTR

は老人性アミロイドーシスの原因蛋白の一つであること同様のピークを示した。

とが知られている。近年，TTR アミロイドーシスで【結論】血中 Cys，Hcyは４℃の保存で，総量に変化

Cys 結合型 TTR（Cys‑TTR）が関与していることはなく，遊離型が減少し結合型が増加した。同様に，が報告されており，TTR への含硫アミノ酸の結合意

TTR への Cys，Hcyの結合も増加した。このことか

義が注目されている。今回，ヒト血清中 TTR の分子

ら，含硫アミノ酸の蛋白への結合は非酵素的に引き起多様性と含硫アミノ酸結合による性質の変化について

こされ，含硫アミノ酸の血中濃度に関連することが推検討した。

察された。Cys‑HCl のみの処理では，TTR から Cys【方法】血液中総Cys，総Hcy（遊離型＋蛋白結合型）

が乖離することなく単量体に変化することが示唆されと遊離型 Cys，遊離型 Hcy濃度の測定は蛍光色素標た。他の還元剤では単量体への乖離の際に Cys の結識プレカラムラベル HPLC 法で分析した。TTR の合も乖離しており，Cys‑HCl のみの処理ような重合分析は，分子多様性の検討を行うために，等電点電気体のような変性は引き起こされなかった。このことか

泳動法（IEF），SDS‑ポリアクリルアミドゲル電気泳ら，Cys‑TTR が酸性化で単量体に乖離することが，動法（SDS‑PAGE）を用い，抗 TTR 血清を用いた

荷電および分子量の極端な変化をもたらし，凝集しやイムノブロッティングで検出した。また，Cys‑TTR

すい性質を有することが示唆された。

の検出はマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行
時間型質量分析（MALDI‑TOF MS）を用いた。

（論文審査の結果の要旨）
システイン（Cys）とホモシステイン（Hcy）は含【結果】新鮮血漿および血清を４℃で保存したところ，

硫アミノ酸であり，その血中濃度は動脈硬化症やアミCys，Hcyともに総量の変化はなかったが，経時的にロイドーシスの発症に関係していることが報告されて遊離型が減少し結合型が増加した。新鮮血清を４℃でいる。また，T3，T4やビタミンＡの輸送に関わる血保存し，経時的に抗 TTR 血清を加え免疫沈降を行い，

清トランスサイレチン（TTR）は，老人性アミロイ

沈降物の Cys，Hcyの定量を行ったところ，最終的にドーシスの原因蛋白の一つとして注目されており，特は Cys は約２倍に，Hcyは約1.5倍に増加した。IEFに，Cys 結合型 TTR（Cys‑TTR）のアミロイドー

では，精製 TTR は等電点（pI）が4.8〜5.5にかけて

シスへの関与が報告されている。本研究では，含硫ア４本の主要なバンドを検出した。精製 TTR にジチオ

ミノ酸の結合によるヒト血清中 TTR の分子多様性とスレイトール（DTT），L‑Cys，Cys‑HCl の還元剤

性質の変化について検討を行った。

を反応させたところ，主要バンドの一部消失などの変

血中総 Cys，Hcyおよび遊離型 Cys，Hcyを蛍光化が認められた。しかし，Cys‑HCl のみの処理では色素標識プレカラムラベル HPLC 法で分析し，４℃

主要バンドの一部消失だけではなくバンドの陰極側に

保存下での総および遊離型の Cys，Hcyの経時変化

ブロード状のバンドが出現し，一部は塗布点に残存しを観察した。同様に，４℃保存での TTR への Cys，た。SDS‑PAGE では，精製 TTR に各種還元剤を反Hcyの結合の経時変化を観察した。また，血清 TTR応させた後，分子量の変化を分析したところ，Cys‑を分析するために，各種還元剤（ジチオスレイトール

HCl のみの反応では TTR は単量体のバンド以外に，（DTT），L‑Cys，Cys‑HCl）を加え等電点電気泳動

単量体より高分子側にブロードなバンドを，一部は塗法（IEF），SDS‑PAGE で分析を行い，その検出に

No. 5, 2009215

審査学位論文要旨

はイムノブロッティング法を用いた。さらに，Cys‑ない。Helicobacter 属菌の培養ガス環境は微好気環境

TTR の検出にはマトリックス支援レーザー脱離イオが一般的であるが，好気環境でも可能という報告もあり，

ン化飛行時間型質量分析（M ALDI‑TOF M S）を用

最適培養条件は未だ定まっていない。Helicobacter 属

いた。

菌は培養初期にらせん形を呈するが，３〜４日目から

その結果，羽生は次の結論を得た。

球形へと変化する。球形の菌体について詳細は不明で

１．新鮮血漿および血清の４℃保存の経時変化で Cys，

あるが，培養不能で，感染性を持たないと考えられて

Hcyは総量は変化せず，遊離型が減少し結合型がいる。本研究では，H. felis の形態学的性状を考慮し，増加した。

培養における至適ガス環境について検討した。

２．血清の４℃保存下での TTR への Cys，Hcyの結【方法】H. felis は ATCC 49179，ATCC 51211の２株

合量は，最終的に，Cys は約２倍，Hcyは約1.5倍を用いた。常法に従い３日間培養した H. felis を生理の増加を認めた。

食塩水にて10 cfu/ml に調整し，その希釈液を血液寒３．還元剤処理によって，TTR の IEF および SDS‑

天培地に塗布した。血液寒天培地はガス環境が調整さ

PAGE の 泳 動 パ タ ー ン は 変 化 し た。特 に，Cys‑

れた専用容器へ入れ，37℃のインキュベーターで培

HCl のみの処理により IEF では主要バンドの陰極養を行った。５つのＯ 濃度，０，１，６，12，18％，

側にブロード状のバンドや塗布点のへの残存を，

および４つの CO 濃度，５，10，15，20％を組み合

SDS‑PAGE では単量体よりも高分子側や塗布点へ

わせ16の条件（condition A〜P）について検討した。

の残存を認めた

コロニー数，コロニー直径，および全菌数に対するら

４．質量分析より，還元剤である DTT および L‑Cys

せん形の割合について，培養５日目と７日目に評価をの処理で Cys は TTR から乖離したが Cys‑HCl の行った。コロニー数は t‑test，コロニー直径と全菌数

みの処理では Cys は TTR に結合していた。

に対するらせん形の割合には Tukey‑Kramer multi-

これらの結果より，TTR への含硫アミノ酸の結合

ple comparison test を用いて統計学的に検討した。

は，非酵素的に引き起こされ，含硫アミノ酸の血中濃度【結果】ATCC 51211株は培地上を遊走する現象が認と関連することが示唆された。含硫アミノ酸（Cys）

められたため評価不能であった。したがって，ATCC

結合型 TTR は，単量体では荷電および分子量の極端49179株 の み の 結 果 と な っ た。Ｏ 濃 度 ０％ で は，な変化をもたらし，凝集しやすい性質を有することが

CO 濃度にかかわらず H. felis の発育は認められな示唆された。よって主査，副査は一致して本論文を学かった。それ以外の13条件では H. felisの発育が認め位論文として価値があるものと認めた。

られ，５日間および７日間培養においてコロニー数に有意差は認められなかった。一方，５日間培養から７Laboratory appraisal of optimal gaseousconditions for growth of zoonotic Helicobacter felis ATCC 49179 （Helicobacter felis
ATCC 49179株の培養における至適ガス環境に関する検討）塩原真弓日間培養にかけて，13条件すべてにコロニー直径の増大を認めた。５日間培養においてコロニー直径が大きかったのは，condition K（Ｏ 12％，CO 10％）
で，２番目にコロニー直径が大きかった condition H（Ｏ ６ ％，CO 15％）とは有意差がなかったが，他の11条件との間には有意差を認めた（ｐ＜0.01）。コ
ロニー直径が1.0mm 前後と比的大きかったのは，（論文の内容の要旨）

Ｏ ６％，12％の条件で，コロニー直径が0.6mm 前【はじめに】Helicobacter felis（H. felis）はネコやイ後と小さいＯ １％，18％の培養条件に対して有意差

ヌの胃に生息し，時に胃炎を引き起こす原因菌としてを認めた（ｐ＜0.01）。５日間培養において，らせん

知られていたが，ヒトへの感染は非常に稀と考えられ形の割合が最も高かったのは，condition N（Ｏ 18ていた。しかし，近年，ペットからヒトへの感染が報％，CO ５％）で，他の12条件に対して有意差を認め告され，現在では H. felis 感染症は人畜共通感染症とた（ｐ＜0.001）。５日間培養から７日間培養にかけて，考えられている。今までの報告では H. felis 感染の証

すべてのガス条件でらせん形の割合が減少した。

明は，病理組織的もしくは PCR 法による遺伝子学的【考察】５日間培養にて，最もコロニーが大きかったな手法で行われており，菌を培養して診断した報告はのは condition K（Ｏ 12％，CO 10％）であった。

216

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

コロニーの大きさは菌数を反映するため，この環境で３．コロニー直径は，Ｏ １％，18％の条件と比しは H. felis の増殖が速く，らせん形から球形への変化て，Ｏ ６％，12％の条件で有意に大きかった（ｐも速いと考えられた。コロニーは小さいが，らせん形＜0.01）。コロニーの大きさはＯ 濃度に依存し，の割合が高かったのは condition N（Ｏ 18％，CO

CO 濃度との関連は認められなかった。

５％）であった。実際の感染では球形の菌体はほとん

４．Ｏ 18％の条件は他の条件と比して，有意にど観察されていないことから，この環境は胃での感染

らせん菌の割合が高かった（ｐ＜0.001）。生体内で状態を示していると考えられた。７日間培養では，５はらせん形の菌体のみが認められており，そのらせ

日間培養と比 してコロニーの増大を認めるが，らせん菌の割合が最も高い条件はＯ 18％，CO ５％でん形の割合は減少していた。これらの結果から，コロあった。

ニーの大きさのみから判断すると，H. felis の至適培

従来 H. felis は微好気環境で培養が行われてきたが，養ガス条件は condition K（Ｏ 12％，CO 10％）

感染にとって重要な要素である形態に注目すると好気となるが，感染力の弱い菌が多く含まれる可能性が環境であるＯ 18％，CO ５％が最適な条件であるこ

高く，感染実験のような研究には最適な条件ではなとを明らかにし，H. felis の培養に際しては，研究目いと思われる。H. felis の培養は目的に応じた培養条

的に応じてガス環境を設定する必要性が示された。主

件の設定が必要で，従来，微好気環境で培養が行われ査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があてきたが，形態に注目するとＯ 濃度18％，CO 濃度５％

るものと認めた。

が最適な条件であった。H. felis を含めた胃感染の
Helicobacter 属菌は，もともと近縁種のCampylobacter属菌と同じ条件での培養が可能であったことから微好気環境での培養がなされてきたが，本研究より得られた培養条件を試みる必要がある。
（論文審査の結果の要旨）
Helicobacter felis（H. felis）はネコ，イ ヌ，ヒ トの胃に感染を起こす人畜共通感染症と考えられている。
H. felis のヒトへの感染は病理組織学的および遺伝子学的手法で診断されており，菌の分離培養による報告はない。Helicobacter 属菌は培養過程で，増殖能およReﬂexive contraction of the levator palpebrae superioris muscle to involuntarily
sustain the eﬀective eyelid retraction
through the transverse trigeminal
proprioceptive nerve on the proximal
Muellerʼs muscle:veriﬁcation with evoked
electromyography（ミュラー筋近位部を横走する三叉神経固有感覚神経を介した，不随意に有効な眼瞼退縮を維持する上眼瞼挙筋の反射的収縮：誘発筋電図による検証）

び活動性を有するらせん形から有さない球形へと菌の伴形態が変化するため，２つの形態を区別して評価する必要がある。本研究は，H. felis の形態学的性状を考慮し，至適培養ガス環境について検討した。

緑也（論文の内容の要旨）【目的】

H. felis ATCC 49179株を10 cfu/ml に調整し，希開瞼は，随意的な上眼瞼挙筋の収縮で始まるが，そ釈液をヒツジ血液寒天培地へ塗布した。ガス濃度を調の後の開瞼は不随意的に維持されている。そのメカニ

整し，37℃のインキュベーターで培養を行った。ガス

ズムをわれわれは次のように仮説している。上眼瞼挙環境はＯ 濃度０，１，６，12，18％，および CO 濃筋速筋の随意的収縮によりミュラー筋機械受容器が伸度５，10，15，20％を組み合わせ，16種類の条件に展されて三叉神経固有感覚を誘発する。生じた三叉神

ついて検討した。培養５日目と７日目に，コロニー数，

経固有感覚は動眼神経を介して眼瞼挙筋遅筋を反射的

コロニー直径，全菌数に対するらせん形の割合についに収縮させる。そうして，開瞼は，上眼瞼挙筋の随意て評価を行った。

的収縮と反射的収縮で維持させている。すなわち，開その結果，塩原は以下の結果を得た。
１．H. felis はＯ ０％の条件では発育は認められず，
嫌気環境は培養に適さなかった。

瞼の不随意的な維持は，三叉神経・動眼神経反射として眼瞼挙筋遅筋の反射的収縮によると仮説している。
一般的に骨格筋では，筋紡錘の機械受容器と運動

２．コロニー直径が最も大きかったのは，培養５日目，ニューロンを繫ぐ固有感覚神経の求心性な電気刺激に

７日目共にＯ 12％，CO 10％の条件であった。

より，いわゆるホフマン反射が生じる。そこで我々は

No. 5, 2009217

審査学位論文要旨

三叉神経・動眼神経反射の存在を確認するため，ミュニューロンや介在ニューロンを介した反射は全身麻酔

ラー筋近位部を横走する三叉神経固有感覚神経の求心下では誘発されないため，今回の検証において LLR

性な電気刺激により，上眼瞼挙筋にもホフマン反射とは計測されなかったものと考えられた。

同様な筋電図反応が生じるかどうか検証した。
【方法】

手術，外傷そして腫瘍などによる生じる説明のつかない眼瞼下垂は，三叉神経固有感覚神経損傷による三検証は重度の Meige 症候群患者12名における閉瞼叉神経・動眼神経反射の減少，消失による上眼瞼挙筋

筋切除手術時に行った。全身麻酔下に筋弛緩薬の効果の反射的収縮の減少，消失により生じるものと考えらが消失した後，ミュラー筋近位部を横走する三叉神経れた。

固有感覚神経を電気刺激し，上眼瞼挙筋の電気生理学
的活動性を計測した。
【結果】（論文審査の結果の要旨）
開瞼は，随意的な上眼瞼挙筋の収縮で始まるが，その後の開瞼は随意的だけでなく不随意的反射的に維持

三叉神経固有感覚神経の電気刺激側により被験者12人

され，そのメカニズムを次のように仮説している。上中10人に，刺激側同側の上眼瞼挙筋に short‑latency

眼瞼挙筋速筋の随意的収縮によりミュラー筋機械受容（潜時：2.8＋/−0.3ms）が誘発されresponse（SLR）

器が伸展されて三叉神経固有感覚を誘発する。生じたた。両側の眼瞼挙筋において long‑latency response

三叉神経固有感覚は動眼神経を介して上眼瞼挙筋遅筋（LLR）は認められなかった。

を反射的に収縮させる。そうして，開瞼は，上眼瞼挙【考察】筋の随意的収縮と反射的収縮で維持されている。すな

三叉神経固有感覚神経の電気刺激により同側上眼瞼

わち，開瞼の不随意的反射な維持は，三叉神経・動眼挙筋に誘発された SLR は骨格筋におけるホフマン反神経反射として上眼瞼挙筋遅筋の反射的収縮によると射に相当し，この三叉神経・動眼神経反射が上眼瞼挙仮説している。一般的に骨格筋では，筋紡錘の機械受

筋の反射的収縮を引き起こしていると考えられた。今

容器と運動ニューロンを繫ぐ固有感覚神経の求心性な回計測された上眼瞼挙筋の三叉神経・動眼神経反射の電気刺激により，いわゆるホフマン反射が生じる。そ潜時は2.8±0.3ms であり，ヒト閉口筋のホフマン反こで三叉神経・動眼神経反射の存在を確認するため，

射 monosynaptic SLR（６−８ms），ヒト眼輪筋反射

ミュラー筋近位部を横走する三叉神経固有感覚神経ののoligosynaptic SLR（10−13ms）より速い。よって同求心性な電気刺激により，上眼瞼挙筋にもホフマン反側上眼瞼挙筋に生じた SLR は pseudomonopolar で射と同様な筋電図反応が生じるかどうか検証した。

ある三叉神経固有知覚ニューロンから動眼神経ニュー検証は重度の Meige 症候群患者12名における閉瞼

ロンを介した monosynaptic 反射であると推察された。

筋切除手術時に行った。全身麻酔下に，ミュラー筋近手術中にミュラー筋を伸展させると80％の患者にお位部を横走する三叉神経固有感覚神経を電気刺激し，いて両側上眼瞼挙筋の反射的収縮が誘発され，サルに上眼瞼挙筋の電気生理学的活動性を計測した。

おける片側の動眼神経ニューロンが両側上眼瞼挙筋をその結果，三叉神経固有感覚神経の電気刺激側によ

神経支配するという報告がある。しかし，本実験におり被験者12人中10人に，刺激側同側の上眼瞼挙筋にいて LLR は両側の上眼瞼挙筋に誘導されなかった。

short‑latency response（SLR）（潜時：2.8＋/−0.3

これらの結果を説明するには，両側で有効な開瞼するms）が誘発された。両側の眼瞼挙筋において long ‑際に以下の様な機序が働いているものと解釈された。

latency response（LLR）は認められなかった。

随意的な開瞼のため，前頭眼野の興奮は動眼神経核複三叉神経固有感覚神経の電気刺激により同側上眼瞼

合体の正中尾側核を刺激する。これは両側上眼瞼挙筋

挙筋に誘発された SLR は骨格筋におけるホフマン反を神経支配し（Heringʼs law of equal innervation）

射に相当し，この三叉神経・動眼神経反射が上眼瞼挙両側の上眼瞼挙筋を随意的収縮させる。この収縮は，筋の反射的収縮を引き起こしていると考えられた。今それぞれのミュラー筋機械受容器を伸展させることに回計測された上眼瞼挙筋の三叉神経・動眼神経反射のより三叉神経固有感覚を誘発し，pseudomonopolar

潜時は2.8±0.3ms であり，ヒト閉口筋のホフマン反ニューロンを介して SLR を生じ，それぞれの上眼瞼挙

射 monosynaptic SLR（６−８ms），ヒト眼輪筋反射

筋を反射的収縮させて，不随意的開瞼を維持する。中の oligosynaptic SLR（10−13ms）より速い。よって

脳にある三叉神経感覚神経細胞を介する，multipolar

同側上眼瞼挙筋に生じた SLR は pseudomonopolar で218

信州医誌 Vol. 57

審査学位論文要旨

ある三叉神経固有知覚ニューロンから動眼神経ニュー埋め込んだ。骨欠損のみのもの，TCFW のみのも

ロンを介した monosynaptic 反射であると推察された。

のをコントロールとした。術後４週で腸骨を採取し，Pseudomonopolar 三叉神経固有感覚ニューロンを介

レントゲン像，組織像を評価した。

したミュラー筋機械受容器と動眼神経ニューロン間の【結果】

三叉神経・動眼神経反射の存在を確認した。随意的な① TCFW の生体親和性；マウスの背筋内に埋植され上眼瞼挙筋の収縮により誘発されたこの反射により，た TCFW のインプラントは，術後１週では，イン上眼瞼挙筋は反射的収縮し，不随意的に開瞼を維持す

プラントの周囲にマクロファージ，線維芽細胞などることができると考えられた。

の炎症性細胞が浸潤していた。シートの中央では細本研究は以上のような新知見を明らかにしたもので胞成分はまばらになっていた。術後２週では，細胞あり，主査，副査は一致して本論文を学位論文としてはシート中央まで浸潤しており，異物巨細胞が観察価値があるものと認めた。

され，異物肉芽腫を形成していた。術後６週ではインプラントの内部に多くの新生血管の形成を認めた。

A Thin Carbon Fiber Web as a Scaﬀold forBone Tissue Regeneration（骨再生の足場
材料として機能する細いカーボンファイバー
網）
青

木

薫

（論文の内容の要旨）【背景と目的】周囲の筋組織に壊死や強 い 炎 症 反 応 を 認 め ず，
TCFW による明らかな組織毒性を認めなかった。
② TCFW による骨形成；rhBMP‑2をそれぞれ0.1，
0.5，1.0，5.0μg 使用したインプラントの術後３週の単純レントゲン写真では，0.1μg 使用群ではTCFW 群もコントロールのコラーゲン群も骨の形成を認めなかった。rhBMP‑2を0.5μg 以上使用した群では TCFW 群，コラーゲン群ともに骨梁構造

再生医療には細胞の足場となる材料（scaﬀold）がの形成を認めた。単純レントゲン写真では両群に明必要である。現在，scaﬀold としてはⅠ型コラーゲン

らかな差を認めなかった。形成された異所性骨の骨が広く使用されているが，生体内で分解されるため細塩量，骨密度は両群とも rhBMP‑2の用量に応じて胞や成長因子の維持が制限される。また，使用される

増加し，各用量でコラーゲン群に比し TCFW 群のコラーゲンは生物由来蛋白質のためアレルギーや感染方が有意に高値を示した。

症などの副作用を生じる可能性を否定できない。

rhBMP‑2を5.0μg 使用した群の術後１週の形成

われわれは，電気紡糸法により径１μm のカーボン

骨の組織標本では，インプラントの周囲に未熟な骨ファイバーからなる Thin Carbon FiberWeb（TCFW）

基質が形成されていた。コラーゲン群ではコラーゲを開発し，非生体分解性の骨再生の scaﬀold としてン線維が残っており，両群ともインプラント中央での機能を評価した。

は細胞成分は疎になっていた。術後３週では，骨基【方法】

質は成熟し骨髄組織も完成していた。コラーゲンは① TCFW の生体親和性；径５mm の TCFW のイン

吸収されていたが，TCFW のカーボン繊維は残存プラントをマウス背部皮下に埋め込み，術後１，２，していた。カーボン繊維は骨基質と接して存在して６週でインプラントを周囲の筋組織とともに採取し，いた。術後３週後の TCFW 群で形成された異所性組織像を評価した。

骨から凍結割断法によって作製した走査型電子顕微② TCFW による骨形成；組み換えヒト骨形成蛋白質

鏡標本では，骨基質と密に接して存在するカーボン（rhBMP‑2）を染み込ませてフリーズドライした繊維が確認された。

TCFW およびⅠ型コラーゲンのインプラントをマ③ TCFW による骨欠損の修復；ラットの腸骨に作成

ウスの背部皮下に埋め込み，術後３週で形成されたした径３mm の骨欠損の修復実験では，Control の異所性骨を採取した。採取した異所性骨のレントゲ

単純骨欠損群，TCFW 群では単純レントゲン上，ン像，骨密度，組織像を評価し比 した。

骨欠損の修復を認めなかったが，BMP‑TCFW 群③ TCFW による骨欠損の修復；rhBM P‑2を染み込ませてフリーズドライした TCFW のインプラント
を，ラット腸骨に作製した径３mm の骨欠損部にNo. 5, 2009では骨欠損は修復されていた。ラット腸骨の組織【結論】
われわれの開発した TCFW は生体親和性に優れて
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審査学位論文要旨

おり，rhBM P‑2の担体として，骨再生療法 の scaf-の，TCFW のみのものをコントロールとした。術後

fold として有用である可能性がある。

４週で腸骨を採取し，レントゲン像，組織像にて骨欠（論文審査の結果の要旨）
再生医療には細胞の足場となる材料（scaﬀold）が損の修復を評価した。
その結果，青木は次の結論を得た。

必要である。現在，scaﬀold としてはⅠ型コラーゲン

１．マウスの背筋内に埋植された TCFW のインプラが広く使用されているが，生体内で分解されるため細ントは，異物肉芽腫を形成していたが，周囲の筋組胞や成長因子の維持が制限される。また，使用される織に壊死や強い炎症反応を認めず，TCFW による

コラーゲンは生物由来蛋白質のためアレルギーや感染明らかな組織毒性を認めなかった。

症などの副作用を生じる可能性を否定できない。

２．rhBMP‑2を用いた骨形成実験では，TCFWのカー

われわれは，電気紡糸法により径１μm のカーボ

ボン繊維に密接して骨組織が形成されることを確認

ン フ ァ イ バ ー か ら な る Thin Carbon Fiber Web

した。レントゲン写真では TCFW 群とコントロー（TCFW ）を開発し，非生体分解性の骨再生の scaf-

ル群に明らかな差を認めなかったが，骨塩量，骨密fold としての機能を評価した。

度は TCFW 群の方が有意に高値を示した。

径５mm の TCFW のインプラントをマウスの背３．ラットの腸骨に作成した径３mmの骨欠損に部皮下に埋め込み，術後１，２，６週でインプラント

rhBMP‑2を含ませた TCFW のインプラントを移を周囲の筋組織とともに採取し，組織像を評価して植することにより，作成した腸骨の骨欠損は修復さ

TCFW の生体親和性を評価した。また，組み換えヒれた。

ト骨形成蛋白質（rhBM P‑2）を染み込ませてフリー

これらの結果により，TCFW は，生体親和性に優ズドライした TCFW およびⅠ型コラーゲンのインプれており，Ⅰ型コラーゲンよりも優れた骨形成能を有

ラントをマウスの背部皮下に埋め込み，術後３週で形していると考えられ，また，rhBMP‑2を用いること成された異所性骨を採取した。採取した異所性骨のレによりクリティカル・サイズの骨欠損を修復すること

ントゲン像，骨密度，組織像にて骨形成能を評価した。

ができた。以上より，TCFW は骨欠損の修復など，

さらに，rhBMP‑2を染み込ませてフリーズドライし骨形成療法の scaﬀold として臨床的に極めて有用でた TCFW のインプラントを，ラット腸骨に作製したある可能性が示唆された。よって，主査，副査は一致

径３mm の骨欠損部に埋め込んだ。骨欠損のみのもして本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

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信州医誌 Vol. 57