『走査走査電子顕微鏡
電子顕微鏡(SEM)(SEM)によるによるナノ粒子の粒子
ナノ粒子の粒子径分布計測プロトコル』
径分布計測プロトコル』

一般社団法人 ナノテクノロジービジネス推進協議会
.

【目次】
【はじめに
はじめに】

1

1.背景
背景

1

2.目的
目的

2

3.SEM
SEM によるナノ粒子の粒子によるナノ粒子子径分布計測フロー
径分布計測フロー2

3-1.
1.試料調製フロー
試料調製フロー

3

3-2.
2.SEM 観察フロー

33-3.
3.画像解析フロー
画像解析フロー3

4.プロトコルの検討
プロトコルの検討

34-1.
1. シリカナノ粒子

444-1-1.試料調製
試料調製

444-1-2.SEM 観察

844-1-3.画像解析
画像解析

12

44-1-4.粒子径分布測定
粒子径分布測定結果
結果

12

4-2.
2. チタニアナノ粒子
ナノ粒子

13

44-2-1.試料調製
試料調製

13

44-2-2.SEM 観察

1544-2-3.画像解析
画像解析

15

44-2-4.粒子径分布測定結果
粒子径分布測定結果

154-3.
3. 凝集、分散状態の異なる画像の粒子径分布計測結果比較と画像解析改善

1544-3-1.シリカ検討画像
シリカ検討画像1544-3-2.画像解析比較結果
画像解析比較結果

16

44-3-3.画像解析の再検討とその結果
画像解析の再検討とその結果

20

44-3-4.まとめ
まとめ

21

5.プロトコル
プロトコル

24

【おわりに
わりに】

27

付録 （事例集）

28

A. シリカの場合の試料調製法、シリカの場合の試料調製法、観察条件
観察条件、画像処理
画像処理法

28

B.. チタニアの場合の試料調製法、観察条件、画像処理法
チタニアの場合の試料調製法、観察条件、画像処理法

30

C. シリカの場合の粒子径分布測定結果
シリカの場合の粒 径分布測定結果

32

D. チタニアの場合の粒子径分布測定結果
チタニアの場合の粒 径分布測定結果

33

E. 画像解析詳細例

34-46
34

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【はじめに】本文書は、本文書は、1nm
1nm から 100nm 以下のナノ粒子を対象にした SEM による粒子径分布測定のためのプロトコルである。
プロトコルである。SEM に着眼したのはナノ材料の観察・計測技術の一つに挙げられに着眼したのはナノ材料の観察・計測技術の一つに挙げられナノ材料の観察・計測技術の一つに挙げられ、簡便・迅速
簡便・迅速
に観察
に観察できることからできることから産業界で広く普及している手法
産業界で広く普及している手法
産業界で広く普及している手法であることがその理由である。
であることがその理由である。
であることがその理由である。試料調製、観試料調製、観察条件、画像解析について、複数の機関による検討を通して、現状、良いと考えられる方法、条件をのせている。前半に、重要なポイントを整理し、できるだけ多くの事例をのせて、その方法、条件にした根拠がわかるようにした。さらに、参考にしてもらえるよう、より詳細な条件を付録に載せ件にした根拠がわかるようにした。さらに、参考にしてもらえるよう、より 詳細な条件を付録に載せた。これまでの検討結果を基に、推奨すべきプロトコをまとめた。用いたナノ粒子は、シリカ、チタ
ニアであるが、これに特化したものでなく、他のナノ粒子にも適用可能と考えている。
なお試料調整法に関してはナノ粒子が適度に分散された試料を用いることを前提としており、試料を観察用基板にセットする際に粒子が再凝集しないような調整法をプロトコルの対象とした。従って分散状態の良い試料調整法には別途、十分な注意が必要である。
1.背景
背景
ナノスケールオーダーで構造や特性を制御したナノ材料や、物質・材料の機能を飛躍的に向上させるナノ製造技術の研究開発等が次世代産業の中核を担う基盤材料・技術として期待されているが、物質としての安全性等については十分に確認されていない。ナノ材料安全管理の必要性から、
必要性から、EU
EU ではナノ粒子のサイズ分布に基づき「ナノ材料」が定義され、この定義に該当する製品について規制が開始されている。
する製品について規制が開始されている。2011 年 10 月に欧州委員会によりナノ材料の定義が以下のように勧告された。
「ナノマテリアルとは、非結合状態、または強凝集体「ナノマテリアルとは、非結合状態、または強凝集体(アグリゲート
アグリゲート)または弱凝集体
または弱凝集体(アグロメアグロメレート)であり、個数濃度のサイズ分布であり、個数濃度のサイズ分布で 50%以上の粒子について以上の粒子について 1 つ以上の外径が以上の外径が 1nm から 100nm のサイズ範囲である粒子を含む、自然の、または偶然にてできた、または製造された材料を意味する。」
この定義は工業製品がナノ材料であるかどうかの該非判定に用いられることから，いかに粒子の子の粒子径分布を計測するかが分布を計測するかが課題となっている。
分布を計測するかがとなっている。
また、
また、ISO TS80004-1
TS80004 及び JIS TSZ0030
TSZ0030-1（用語規格）（用語規格）では、ナノスケールは、ナノスケールは、「およそ 1nm～～100nm の範囲、注記：より大きなサイズの外挿からは予測されない特性がの範囲より大きなサイズの外挿からは予測されない特性がより大きなサイズの外挿からは予測されない特性が主に、この長さの範囲に現れる。」
この長さの範囲に現れる。」と定義されている。
フランス等でナノ材料の登録制度や表示の義務化（ナノラベリング）が開始され、フランス等でナノ材料の登録制度や表示の義務化（ナノラベリング）が開始され、OECD
OECD においては安全性試験のテストガイドライン策定の動
いては安全性試験のテストガイドライン策定の動きが始まっている。その一方で、工業粉体製が始まっている。その一方で、工業粉体製品の粒子サイズ分布の統一された測定法がない。
ナノ材料の観察・計測技術の一つに挙げられる SEM 法は、簡便・迅速にナノ材料の観察が簡便・迅速にナノ材料の観察ができることから産業界で広く普及している手法である。そこで、できることから産業界で広く普及している手法である。そこで、平成平成 27 年～平成 29 年の３年間、の３年間、産業技術総合研究所（産総研）とナノテクノロジービジネス推進協議会(以下、
産業技術総合研究所（産総研）とナノテクノロジービジネス推進協議会 以下、NBCI)が、経済産が、経済産業省委託事業である政府戦略分野に係る国際標準開発活動の一環でナノ材料のサイズ分布
業省委託事業である政府戦略分野に係る国際標準開発活動の一環でナノ材料のサイズ分布測定法に関する国際標準測定法に関する国際標準化を実施し化を実施した。
た。NBCI と産総研で SEM を用いたナノ粒子を用いたナノ粒子の粒子径
粒子径分布
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測定法の開発
測定法の開発を行い、産総研が中心となってを行い、産総研が中心となって ISO/TC229 への規格提案を行ったへの規格提案を行った。（ISIS 19749,
規格名 Nanotechnology --Measurements--Measurements of particle size and shape distributions by scanningelectron microscopy
microscopy, 出版予定)
出版予定
NBCI は、測定法の開発を
測定法の開発を社会受容標準化委員会
測定法の開発を社会受容標準化委員会/ナノ材料の実用的計測評価
社会受容標準化委員会 ナノ材料の実用的計測評価 WG の下で進め
進め、産総研と複数の企業が参加するラウンドロビン試験
産総研と複数の企業が参加するラウンドロビン試験
産総研と複数の企業が参加するラウンドロビン試験（以下、（以下、RRT）を通じてを通じて、SEM は有効
はな方法であることを確認した。その後、粒子径分布計測プロトコルな方法であることを確認した。その後、粒子径分布計測プロトコル WG にて、プロトコル作成をにて、プロトコル作成を実
施した
施した。
2.目的
目的
企業が活用できる企業が活用できるプロトコル
プロトコルを作成する。
を作成する。ただし、標準作業手順書
ただし、標準作業手順書ではなく、
ただし、標準作業手順書ではなく、推奨プロトコルとプロトコルと事例をのせ、
事例をのせ、活用、展開できるようにまとめる。
活用、展開できるようにまとめる。
3. SEM によるナノ粒子の粒子径によるナノ粒子 粒子径分布計測フロー
分布計測フロー
SEM を用いてナノ粒子の粒子径分布を計測するためには画像解析ソフトウェアの利用が必須である。画像解析ソフトウェアは画像の明暗により粒子と背景を区別して、個々の粒子の形
状やサイズなどを解析して分布を導出する。そのためには、粒子の部分と背景との明るさが明確に分かれているコントラストが確保された画像が必要となる。また、明るさの差だけで粒子と背景を区別するアルゴリズムでは粒子同士が重背景を区別するアルゴリズムでは粒子同士が重なったり、接したりしている場合には、それらのなったり、接したりしている場合には、それらの粒子を一つの粒子と誤粒子を一つの粒子と誤認識してしまうことになる認識してしまうことになる認識してしまうことになる。
画像のコントラストや粒子の重なりの問題については画像解析ソフトである程度は補正することができるが、完全な補正はできないので、できるだけ試料調整や SEM 観察の条件を工夫して理想に近い SEM の画像に近づける必要がある。理想的な画像とは、粒子とその背景との明るさの差（コントラスト）が明確で、粒子部分の明るさ（輝度）がそろっていて、個々の粒子がお互いに接することがない（凝集のない、分散された）画像である（図１）。
ただ、粒子の形状や表面の性状により、また、
ただ、粒子の形状や表面の性状により、また、SEM
SEM の二次電子検出器のノイズなどによって輝度を完全に一輝度を完全に一様に保つことは不可能である。また、個々の粒子がお互いに完全に離れるよう様に保つことは不可能である。また、個々の粒子がお互いに完全に離れるように試料を調整することもできない。そのために、画像解析ソフトウェアには平滑化処理などの前処理や重なった粒子を画像上で分離するセグメンテーションなどの補正は必要である。

・試料調製により、上記 １次粒子が凝集なく、分散されている状態にする。
・SEM 画像は、粒子とバックグランドの差が大きく、粒子内は一様な明コントラストになるよう観察条件を決める。
図 1. 理想的な粒子分散状態
SEM による粒子径分布計測のフローは図２のように三段階に分類される。
2
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3-1.
1.試料調製フロー
試料調製フロー
当 WG では計測の対象となるナノ粒子は既に分散と濃度調整がされた試料が準備されていることを前提とした。
ることを前提とした。ナノ粒子を固定する基板は、ナノ粒子を固定する基板は、ナノ粒子を固定する基板は、濡れ性を良くするため、濡れ性を良くするため、予め前処理を施して濡れ性を良くするため、予め前処理を施してからから使用する。
使用する。分散液を基板に滴下し、乾燥させる。滴下後
分散液を基板に滴下し、乾燥させる。滴下後
分散液を基板に滴下し、乾燥させる。滴下後から乾燥過程
から乾燥過程で粒子が再凝集しな粒子が再凝集しな
いよう調整することがいよう調整することがポイントになる。
ポイントになる。分散の良い状態
分散の良い状態を保ったまま
分散の良い状態を保ったまま、分散液溶媒を乾燥させる
分散液溶媒を乾燥させる
乾燥
乾燥条件も影響する。
条件も影響する。目標とする観察試料は目標とする観察試料は目標とする観察試料は、粒子の種類に、粒子の種類に依らず
依らず、図 1 に示すように示すように一次粒一次粒子が凝集なく、が凝集なく、分散している状態をつくること
分散している状態をつくること
分散している状態をつくることである。
である。
3-2.
2. SEM 観察フロー
次に基板を SEM の試料台に固定し、観察する。
の試料台に固定し、観察する。観察
観察にあたり、にあたり、著しい粒子の局在がな
著しい粒子の局在がない視い視野を野を選定する。また、画像は、選定する。また、画像は、バックグランド（基板）と粒子のコントラスト選定する。また、画像は、バックグランド（基板）と粒子のコントラスト差が大きく、バックグランド（基板）と粒子のコントラスト
大きく、しかも
しかも粒子の部分部分が一様な明コントラスト
が一様な明コントラストになるよう、観察条件を決める。
が一様な明コントラストになるよう、観察条件を決める。
3-3.
3. 画像解析フロー
画像を取得後、画像を取得後、使用画像を選択する。画像処理、解析に用いるソフトは
使用画像を選択する。画像処理、解析に用いるソフトは特定しない。
使用画像を選択する。画像処理、解析に用いるソフトは 特定しない。
バックグランド処理
バックグランド処理後、画像の２値化、輪郭、画像の２値化、輪郭、画像の２値化、輪郭抽出を行い、抽出を行い、粒子径
粒子径と粒子径分布を算出する。
分布を算出する。
(1) 試料調製フロー① ナノ粒子分散液の準備② 基板の前処理③ 基板への分散液の滴下(2) SEM 観察フロー① SEM 観察条件だし、視野選定② SEM 観察、画像取得(3) 画像解析フロー① 解析準備（使用画像の選択、解析ソフトの準備）② 画像前処理
③ セグメンテーション④ 画像２値化
図 2. 粒子径分布計測フロー図
4. プロトコルの検討
ナノ粒子粒子径分布計測のプロトコルの検討にあたって、ナノ粒子粒子径分布計測のプロトコルの検討にあたって、WG
WG 内でラウンドロビンテスト（
内でラウンドロビンテスト（RRT）
を行うことにした。
を行うことにした。RRT の試料にはチタニア（の試料にはチタニア（d50 約 40nm）とシリカ（）とシリカ（d50 約 60nm
60nm）を使用した。
）を使用した。
シリカナノ粒子は、形状が球状に近く、分散性が比較的良い。ただし、シリカの試料液を基板に滴下して乾燥させようとするとシリカ粒子が基板に固定されないため分散媒の蒸発に伴い粒子が凝集してしまう。一方、チタニアは、形状が複雑で、凝集性が強い扱いにくい試料である。
3
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RRT は２回実施した。第一回の RRT の結果を WG 内で検討した結果、参加機関の間で計測内で検討した結果、参加機関の間で計測の技術に関する知識やノウハウの保有について各社のレベルがそろっていないことが判明したので、重要となるポイントを議論し、以下の様に整理した。
(1)試料調製
試料調製 →ポイントは、凝集の低減と粒子数確保①ナノ粒子分散液（水系）の濃度及び分散助剤①ナノ粒子分散液（水系）の濃度及び分散助剤②基板の親水化処理
基板の親水化処理③粒子の凝集抑制や基板への固着を強化するための添加剤の追加④粒子の凝集抑制のために基板に分散液を滴下した後の処理(2)SEM 観察①加速電圧 →画像のコントラストの最適化②画像のピクセルサイズ（倍率と画素数で決まる） →粒子径計測の精度確保③視野選択（著しい局在がなく、ランダムに配置されている領域を選択）③視野選択（著しい局在がなく、ランダムに配置されているを選択）(3)画像解析
画像解析①ノイズや異物除去のためのフィルタ条件（面積、周囲長など）②連結粒子、画像端粒子を計測に加えていないかを目視などで確認する③凝集（重なり）が多い場合は、粒子が誤分割されたり、輪郭が内側になったりすることにより粒子径が小さく算出されることがある④解析に求められる総粒子数（粒子径分布の精度向上）
これらのポイントについて、RRT
これらのポイントについて、の実施においてどのような方法や条件が良いかをシリカナノ
粒子とチタニアナノ粒子について検討したので、以下４粒子とチタニアナノ粒子について検討したので、以下４-1 節と 4-2 節で述べる。試料調整での凝集対策や SEM の加速電圧の選定などについては、他の試料の応用への参考となるように、
より具体的な検討内容を示した。（事例 1～事例 4 参照）
ただし、
ただし、4-1、、4-2 の RRT の実施においては画像解析のソフトウェアや解析方法の選択は参画機関の判断に委ねられ報告だけが求められた。平均粒子径の各機関間のバラつきは試料
調整、調整、SEM 観察条件などの議論を通じて大きく改善された観察条件などの議論を通じて大きく改善されたなどの議論を通じて大きく改善された。そこで、。そこで、凝集に対する課題を明確
凝集に対する課題を明確にするために、凝集、分散状態の異なる 3 種類の画像群を参画機関に配布して画像解析だけの比較を行うことにした。その結果を 4-33 で述べる。
4-1.
1. シリカナノ粒子
シリカナノ粒子で検討した結果を示す。
4-11-1. 試料調製
①水系分散液
水系分散液の使用と濃度の使用と濃度
観察試料を調製するために、ナノ粒子分散液を用いて作製した。ここでは、ナノ粒子
観察試料を調製するために、ナノ粒子分散液を用いて作製した。ここでは、ナノ粒子粉体
粉体から、ら、分散液を作製する方法については述べない。水系分散液であり、市販のものを用い分散液を作製する方法については述べない。水系分散液であり、市販のものを用い分散液を作製する方法については述べない。水系分散液であり、市販のものを用いているている。
基板上に１次粒子が凝集なく、分散された基板上に１次粒子が凝集なく、分散された試料を得るために、試料を得るために、分散液の分散液の濃度が重要である。
が重要である。高
が重要である。
濃度の分散液を用いると、凝集が起こりやす
濃度の分散液を用いると、凝集が起こりやすい。また、希薄すぎると、い。また、希薄すぎると、撮影にかかる時間が増い。また、希薄すぎると、撮影にかかる時間が増大する。
大する。厳密に最適な濃度を検討したわけではないが、厳密に最適な濃度を検討したわけではないが、厳密に最適な濃度を検討したわけではないが、今回は濃度
濃度を 0.1wt%
0.1wt%とし、これ以降の以降の試料調製法を検討
試料調製法を検討することにすることにした。
4
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②分散液に添加する添加剤
分散液に添加する添加剤
シリカ
シリカナノ粒子
ナノ粒子は、分散状態が良い
分散状態が良い粒子粒子であるが、滴下後、基板上で凝集を抑制するために、であるが、滴下後、基板上で凝集を抑制するために、
HEC
HEC（ヒドロキシエチルセルロース）を（ヒドロキシエチルセルロース）を候補として選び、（ヒドロキシエチルセルロース）を候補として選び、効果を調べた。以下に、シリコンと候補として選び、を調べた。以下に、シリコンと TEM
グリッドを用いた場合に見られた効果を示す。
グリッドを用いた場合に見られた効果を示す。（事例（事例 1 及び事例 2 参照）
シリコン基板を用いた場合の HEC 添加効果
事例 1: シリコン基板を用いた場合[試料処理法
試料処理法]
試料： 微粒子分散水溶液 シリカ（
シリカ（SiO2, 日産化学製）
日産化学製
SiO2 は HEC（和光純薬工業製
HEC（和光純薬工業製 和光一級）1%水溶液を、
和光一級） 水溶液を、0.4%添加
0.4%添加基板： Si 基板

前処理 ： 基板表面をプラズマエッチング装置（日本電子製
基板表面をプラズマエッチング装置（日本電子製 HDT-400） を使用し、を使用し、2 分間
DC プラズマ処理により親水化
プラズマ処理により親水化
試料固定： ガラス毛細管ピペットで約 1μL 滴下。滴下 10 秒後に濾紙で分散液を除去[SEM
SEM 像](1) HEC 添加無しで試料処理した場合のシリカ（
添加無しで試料処理した場合のシリカ（SiO
SiO2）の SEM 観察例（a）ナノ粒子の密度の高い部分（×）ナノ粒子の密度の高い部分（×）ナノ粒子の密度の高い部分（×10k）(b）ナノ粒子の比較的密度の低い部分（×）ナノ粒子の比較的密度の低い部分（×）ナノ粒子の比較的密度の低い部分（×1k）(C) (b)の拡大（×の拡大（×10k）

図 3. HEC 添加無しで試料処理した場合のシリカ（
添加無しで試料処理した場合のシリカ（SiO2）/Si）
基板の SEM 像
5
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(2) HEC 添加有りで試料処理した場合のシリカ（
添加有りで試料処理した場合のシリカ（SiO
SiO2）の SEM 観察例

図 4. HEC 添加有りで試料処理した場合のシリカ（
添加有りで試料処理した場合のシリカ（SiO2）/Si 基板の SEM 像（×30k）
事例 1 から、HEC
から、
添加ない場合（図添加ない場合3））は、ナノ粒子が高密度で凝集
は、ナノ粒子が高密度で凝集する部分、比較的低密度
は、ナノ粒子が高密度で凝集する部分、比較的低密度で凝集する
で凝集する部分が見られる一方、部分が見られる一方、HEC部分が見られる一方、添加をした場合添加をした場合は、粒子密度が高い部分は、集合体の粒子密度が高い部分は、集合体の存在する確率は高いものの、図 3(a),(b)3(a),(b)のような状態はほとんど存在せず、ほぼ全域にわたのような状態はほとんど存在せず、ほぼ全域にわたのような状態はほとんど存在せず、ほぼ全域にわたり高い確率で、
高い確率で、11 次粒子が分離して存在していた。
次粒子が分離して存在していた。（図（図 4）
TEM グリッドを基板に用いた場合の HEC 添加効果について、事例 2 に示す。
グリッドを基板に用いた場合の HEC 添加効果事例 2 : TEM グリッドを基板に用いた場合のここでは、HEC
HEC を添加することによる凝集抑制効果、またその HEC 添加量依存性を検討した。
HEC の 1%水溶性を調整し、水溶性を調整し、0.1wt%のシリカナノ粒子分散液
水溶性を調整し、のシリカナノ粒子分散液 1mL に対し、2,2, 4.5, 10, 30 µL ずつ添加した。フォルムバール支持膜つきの TEM グリッドの支持膜を上に向け濾紙の上に置き、グリッドの支持膜を上に向け濾紙の上に置き、支持膜側から HEC を添加したシリカ分散液をそれぞれ 30 µL 滴下した。この時余剰な分散液
は TEM グリッドから溢れ、敷かれた濾紙により吸い取られる。
グリッドから溢れ、敷かれた濾紙により吸い取られる。TEM
TEM グリッドを 30 分以上自然乾
燥させ、燥させ、SEM 観察を行った。
図 5 に HEC 添加試料の SEM 像（低倍率像：左、高倍率像：右）を示す。TEM
像（低倍率像：左、高倍率像：右）を示す。 TEM グリッド上のシリカナノ粒子が明コントラストで観察され、粒子数は HEC の添加量とともに増加する傾向がみられた。
みられた。10
10 µL/mL の HEC 添加でグリッドほぼ全体がシリ添加でグリッドほぼ全体がシリカナノ粒子に覆われていた。
ナノ粒子に覆われていた。
30 µL/mL の添加ではグリッド外縁部から開口部中央へ向かう明コントラストの模様が観察されるがされるが、このような、このような箇所では粒子の積層が見られた。
箇所では粒子の積層が見られた。
以上より、以上より、HEC
HEC の添加により、TEMの添加により、
グリッド上にシリカナノ粒子を配置する効果があることが示された。また、その添加量により、TEM示された。また、その添加量により、TEM グリッド上の粒子密度をコントロールできることがわかった。
かった。0.1wt%のシリカナノ粒子の粒径計測を行うためにはのシリカナノ粒子の粒径計測を行うためには 4.5µL/mL 程度の HEC 添加をすることで適した密度の粒子が得られる。
本手法は、凝集を抑制しつつ、シリカナノ粒子を TEM グリッド上に配置できる方法である。
凝集抑制メカニズムの詳細は今後の議論であるが、簡便な操凝集抑制メカニズムの詳細は今後の議論であるが、簡便な操作で試料調製を実現できること
作で試料調製を実現できること
6
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から、実用的な手法であるといえる。

図 5.HEC
HEC 添加法により調製したシリカの粒子試料の SEM 像
HEC 水溶液添加量：(a)水溶液添加量：(a) 2 µL/mL, (b) 4.5 µL/mL, (c) 10 µL/mL, (d) 30 µL/mL
7
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HEC は、シリカ粒子以外の粒子やシリカ粒子以外の粒子や TEM グリッド、シリコン、シリコン以外の基板の場合にも適応できる以外の基板の場合にも適応できる可能性があり、今後の発展が期待される。
可能性があり、今後の発展が期待される。また、HEC
HEC は、水溶性
水溶性の高分子化合物で高分子化合物であり、あり、その水溶液は、増粘
溶液は、増粘溶液は、増粘、懸濁、分散
分散、保護コロイドなどの優れた機能を有し保護コロイドなどの優れた機能を有していることが知られて保護コロイドなどの優れた機能を有していることが知られており、上記事例で述べた効果を裏づけていると考えられる。
③基板についてSEM 観察試料に用いる基板には、シリコンウェハー、
観察試料に用いる基板には、シリコンウェハー、TEM グリッド（銅あるいはモリブデン製
メッシュ上にカーボン支持膜、コロジオン支持膜が付いている
メッシュ上にカーボン支持膜、コロジオン支持膜が付いている）、アルミ箔などがある）、アルミ箔などがある）、アルミ箔などがある。RRT
RRT では
特に指定はしていないが、一般的によく用いられているシリコンウェハーまたは TEM グリッドが使用された。
④親水化処理分散液を基板に滴下後、基板表面にナノ粒子を凝集なく、均一に分散させるために基板の親水化処理は必要である。水系分散液を使用する場合、濡れ性を良くすることにより、凝集を抑水化処理は必要である。水系分散液を使用する場合、濡れ性を良くすることにより、凝集を抑制する効果がある。
親水化処理法は、プラズマ処理、UV
親水化処理法は、プラズマ処理、 オゾン処理がある。プラズマ処理装置などがない場合
は、エタノールによる洗浄や、シリコン基板に限ってはガラス容器中で適度に加温したは、エタノールによる洗浄や、シリコン基板に限ってはガラス容器中で適度に加温したピラニア
ピラニア溶液（例えば濃硫酸 ： 30%過酸化水素水＝30%過酸化水素水＝3：1 (ただし調製や廃棄には十分に注意のこと）
ただし調製や廃棄には十分に注意のこと）
ただし調製や廃棄には十分に注意のこと）に浸す等の方法がある。
⑤滴下後処理、乾燥法について
分散液を基板に滴下後、試料を乾燥する方法
分散液を基板に滴下後、試料を乾燥する方法は、自然乾燥（室温乾燥）、真空乾燥、加熱乾燥、自然乾燥（室温乾燥）、真空乾燥、加熱乾燥がある。
がある。主に、室温にて、室温にて、30 分以上乾燥させている分以上乾燥させている場合が多い。
場合が多い。
4-1--2. SEM 観察①SEM
SEM 観察条件
SEM の加速電圧は、一つの粒子のの加速電圧は、一つの粒子の表面上の表面上のコントラストに影響を与える。ここでは、参考にントラストに影響を与える。ここでは、参考にPS
PS（ポリスチレン）ナノ粒子（平均粒径（ポリスチレン）ナノ粒子（平均粒径 50 nmnm）を用いた場合の粒子内コントラストの加速電圧）を用いた場合の粒子内コントラストの加速電圧依存性について事例
依存性について事例（事例事例 3 参照）を示す。
示す。加速電圧他、観察条件は、事例を参考に最適な条
加速電圧他、観察条件は、事例を参考に最適な条件を決めていただきたい。
シリカの RRT での加速電圧その他の観察条件の事例を加速電圧その他の観察条件の事例を加速電圧その他の観察条件の事例を付録の表
付録の表 A.2 に載せた。
載せた。
②画像のピクセルサイズ
RRT では 100nm 以下の粒子径の測定精度を確保するために、画像のピクセルサイズは、1.5nm/px より小さくすることとした。

8
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加速電圧依存性
ポリカチオンレイヤーを有する鏡面研摩 Si 基板上に PS 粒子を配置し、SEM粒子を配置し、SEM 観察用の試料とした。 SEM 装置は電界放出型電子銃を搭載したアウトレンズ型の SEM 装置を用い、一次電子
エネルギーを変化させながら像観察を行った。
エネルギーを変化させながら像観察を行った。15keV
keV から 1keV での条件では二次電子は試料
チャンバー内壁面に取り付けられた Everhart
Everhart-Thornley
Thornley 型検出器で検出した[型検出器で検出した[図 6.(a)-(l)]。
。
0.5
0.5keV から 0.1keV までの一次電子エネルギー条件では粒子像観察のために必要な分解能を確保するため、試料に負電圧(-2kV)を印加するリターディング条件で観察を行い、二次電子は確保するため、試料に負電圧を印加するリターディング条件で観察を行い、二次電子は試料直上の鏡筒内に設置された TTL 検出器で検出した検出器で検出した[図 6.(m)(m)-(p)]。
一次電子エネルギー
一次電子エネルギー15keV
15keV での二次電子像で PS 粒子は明コントラストの縁取りをもった粒子として現れる子として現れる。粒子のエッジの内側の明るさは粒子のエッジの内側の明るさは Si 基板のそれとほぼ同レベルであることから、エッジ効果の大きな寄与によって PS 粒子の情報がもたらされていることがわかる。
粒子の情報がもたらされていることがわかる。15
15 keV から
5 keV にかけて一次電子エネルギーの低下とともに、縁取り内部のコントラストが増加し、にかけて一次電子エネルギーの低下とともに、縁取り内部のコントラストが増加し、3keV
では粒子全体が均一な明コントラストとして現れる。一次電子エネルギー1keV
では粒子全体が均一な明コントラストとして現れる。一次電子エネルギー keV でも類似した像が得られるが、電子線の収束が難しくなるため、今回用いた SEM 装置では像分解能が大幅に低下する。
低下する。0.5
0.5 keV 以下のリターディング条件では、以下のリターディング条件では、PS
PS ナノ粒子は再び縁取りを伴った粒子として観察されるが、高エネルギー条件とは反対に、て観察されるが、高エネルギー条件とは反対に、PS
PS ナノ粒子中心部は Si 基板に対して明らかな暗コントラストである。また、スキャン方向に平行に線を引いたようなアーティファクトが観察され、これの条件では、試料帯電が発生していることが示唆される。
以上から、粒径 50nm 程度の PS ナノ粒子の計測を行う際には、粒径計測に十分な像分解能が得られる場合は 3kV の加速電圧条件が適しているといえる。この条件下では、エッジ効果による縁取りの形成を抑制し、一様なコントラストでよる縁取りの形成を抑制し、一様なコントラストで PS 粒子を観察することが可能である。このようなコントラストの粒子像はソフトウェアにより容易に自動粒子解析を行うことが可能であろう。
このような条件で十分な像分解能が得られない SEM 装置では、1010-15kV 程度の加速電圧を用
いるが、いるが、PS 粒子のコントラストが十分得られる動作距離
粒子のコントラストが十分得られる動作距離(W.D.)、スキャンスピードや照射電流を、スキャンスピードや照射電流を検討するのが望ましい。
検討するのが望ましい。（次頁に続く）（次頁に続く）9
Copyright © Nanotechnology Business Creation Initiative. All rights reserved図 6. (a)-(h) PSL ナノ粒子の二次電子像コントラストの加速電圧依存性

10Copyright © Nanotechnology Business Creation Initiative. All rights reserved（図図 6 の続き）

図 6. (i)-(p)(i) (p) PSL ナノ粒子の二次電子像コントラストの加速電圧依存性

11
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4-11-3. 画像解析
シリカは、比較的、粒子形状が球形に近い。しかし、シリカは、比較的、粒子形状が球形に近い。しかし、ナノ粒子は、材料によって必ずしも球のナノ粒子は、材料によって必ずしも球のような理想の形状でない場合が多い。従って、ような理想の形状でない場合が多い。従って、粒子径
粒子径をどう測定するかが重要である。そこで、をどう測定するかが重要である。そこで、
粒子を２次元に投影した時の、長径である最大粒子を２次元に投影した時の、長径である最大ｆeret
eret 径、短径である最小径、短径であるferet 径及び投影面の面積から求めた円相当径を粒子径として測定した。
の面積から求めた円相当径をとして測定した。
RRT では画像解析ソフトの種類、解析方法は各参画機関が選択した。その内容は付録の表 A.3 に示した。
解析に要する粒子数の数は、500
解析に要する粒子数の数は、個以上とした。
個以上とした。粒子径分布が広い試料の場合は、より多く分布が広い試料の場合は、より多くの粒子を解析することが望ましい。
4--1-4. 粒子径分布測定結果
粒子径分布測定結果
ここでは、プロトコル
プロトコルの検討により得られた粒子径分布の実力値をの検討により得られた粒子径分布の実力値を RRT 結果
結果を用いて示す。
示す。
試験は、
試験は、2 回行った。1回行った。 回目の試験結果を基に 2 回目の試験条件を決定した。
回目の試験条件を決定した。2 回目の試験条
件
件を下記①～③に示す。
を下記①～③に示す。44-1-1 ～ 4-11-3 で検討した結果が反映される前の 1 回目の結果の結果に比べて 2 回目の方がばらつき回目の方がばらつきの少ない結果となった。ここでは、の少ない結果となった。ここでは、2の少ない結果となった。ここでは、 回目の結果を示した。
①試料調整方法
各機関の試料調整方法を付録の表
各機関の試料調整方法を
表 A.1 に示した。
②②SEM 観察方法
各機関の SEM 観察方法は、付録の表
観察方法
付録の表 A.2 と同じである。
③画像解析方法
各機関の画像解析方法は、付録の表
各機関の画像解析方法は、付録の表 A.3 と同じである。
④④SEM 像
各機関で測定された SEM 像の一部を
像の一部を付録の図 C.1 に示した。
⑤粒子径分布
2 回目 RRT の円相当径分布を付録のの円相当径分布を付録の図 C.2 に示した。円相当径の平均値はに示した。円相当径の平均値は円相当径の平均値は、62.4 ± 3.0 (1σ)) ((nm)
であった。11 回目の RRT による円相当径の平均値は円相当径の平均値は、円相当径の平均値は65.0 ± 5.5 (1σ)) ((nm)
であった。従って、ばらった。従って、ばらつきがつきが改善したと言える。
改善したと言える。

12
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4-2.
2. チタニアナノ粒子
シリカナノ粒子と同様に検討した結果を示す。特にチタニアナノ粒子は凝集しやすいため、如何に分散させるかがポイントとなるため、その詳細を「⑤滴下後処理、乾燥法について」
如何に分散させるかがポイントとなるため、その詳細を「⑤滴下後処理、乾燥法について」の項目に目に示した。
4-2--1. 試料調製
①水系分散液の使用と濃度
シリカナノ粒子と同様に濃度は約 0.1wt%
0.1wt%とした。
②分散液に添加する添加剤
チタニアの場合は、添加剤は使用しなかった。
チタニアの場合は、添加剤は使用しなかった。⑤に示すに示す滴下後処理、乾燥法の滴下後処理、乾燥法の滴下後処理、乾燥法の効果が確認できたためである。
確認できたためである。HEC
HEC 添加検討は、未実施である。
検討は、未実施である。
③基板についてシリカナノ粒子と同様である。
④親水化処理シリカナノ粒子と同様である。
⑤滴下後処理、乾燥法について
滴下後処理、乾燥法について
チタニアは、
チタニアは、分散液を基板に滴下後、分散液を基板に滴下後、10分散液を基板に滴下後、10 秒ほど経過したら、濾紙で吸い取ることがポイントである。
ある。滴下後、すぐに分散液を吸い取らないと凝集滴下後、すぐに分散液を吸い取らないと凝集滴下後、すぐに分散液を吸い取らないと凝集が顕著になる。
が顕著になる。（事例が顕著になる。
4 参照
参照）
事例 4： 滴下後の濾紙の吸い取り効果について
試料調製手順は、以下の通りである。
・シリコン基板 使用し、DC プラズマ処理
・シリコン基板を使用し、プラズマ処理を 2min（使用装置
2min
日本電子製:: HDT-400）
行った。
・毛細管ピペット等を使用し、1μL・毛細管ピペット等を使用し、程度の極力少量程度の極力少量を滴下したした。
・・10 秒後、濾紙を使用し濾紙を使用し、、液滴を横から吸い取る。
液滴を横から吸い取る。
（粒子濃度が高い場合には上から濾紙をかぶせる形で、液滴の大部分を吸い取る。
粒子濃度が高い場合には上から濾紙をかぶせる形で、液滴の大部分を吸い取る。
粒子濃度が高い場合には上から濾紙をかぶせる形で、液滴の大部分を吸い取る。）
・・自然乾燥。
この試料のの SEM 観察画像を
画像を、図 7 に示す。

図 7. 濾紙で滴下 10 秒後に濾紙で吸い取った場合の SEM 画像（X30k
X30k , 2kV
2kV）
13
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次に、
次に、滴下後、すぐに吸い取らない場合の例を
滴下後、すぐに吸い取らない場合の例を
滴下後、すぐに吸い取らない場合の例を図図 8 に示す。図図 7 に比べ、凝集が多に比べ、凝集が多くなる傾向になる
なる傾向になることがわかる。
ことがわかる。

(a)

(b)

(b)
図 8. 滴下後、吸い取らない例(a) シリコン基板 10 分 プラズマ処理。分散液 約 10uL 滴下後、自然乾燥
滴下後、
(×100
100k, 0.5kV
0.5kV)(b) 基板上に分散液滴下後、乾燥
分散液滴下後、乾燥(××300k, 3kV))(c) 親水処理した鏡面 Si 基板に分散液を 0.2uL 滴下し，室温で乾燥 (×50k,
0k, 5kV)(d)d) ポリビニルブチラール支持膜付き Cu メッシュに分散液 7μL
L 滴下し、105105℃の乾燥機で℃の乾燥機で水分を蒸発 (×100k,, 3kV)

14
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4-2--2. SEM 観察
基本的
基本的には、シリカナノ粒子と同様である。
シリカナノ粒子と同様である。
シリカナノ粒子と同様である。事例を付録の表
付録の表 B.2 に示す。
4-2--3. 画像解析
基本的には、
基本的には、シリカナノ粒子と同様である。
シリカナノ粒子と同様である。
シリカナノ粒子と同様である。事例を付録の表
付録の表 B.3 に示す。
4-2--4.粒子径分布測定
粒子径分布測定結果
プロトコルの検討により得られた粒子径分布測定の RRT 結果を示す。試験は、結果を示す。試験は、2 回行った。
2 回目の試験条件を下記①～③に示す。
回目の試験条件を下記①～③に示す。4-2-1 から 4-2-3 で検討した結果が反映される前の1 回目の結果に比べて 2 回目の方が回目の方がばらつきの少ない結果となった。
の少ない結果となった。
①試料調整方法
各機関の試料調整方法を付録の表
各機関の試料調整方法を付録の表 B.1 に示した。
②②SEM 観察方法
各機関の SEM 観察方法は、付録の表
観察方法 、付録の表 B.2 と同じである。
③画像解析方法
各機関の画像解析方法は、付録の表
各機関の画像解析方法
付録の表 B.3 と同じである。
④④SEM 像
各機関で測定された SEM 像の一部を
像の一部を付録の図
図 D.1 に示した。
⑤粒子径分布
2 回目の RRT の円相当径
円相当径分布を付録の図
付録の図 D.2
2 に示した。円相当径の平均値は円相当径の平均値は円相当径の平均値は、36.8 ± 6.3 (１σ)) ((nm)であった。
であった。
1 回目円相当径の平均値は、回目円相当径の平均値は36.1 ± 10.6 (１σ)

(nm)

であり、
であり、ばらつきが改善された
らつきが改善された。
らつきが改善された
4-3.
3. 凝集、分散状態の異なる画像の粒子径分布計測結果比較と画像解析改善
4--1 および 4-22 の RRT では計測結果は試料調整法の影響を受けるが、画像解析の方法に大きく依存しないとの想定で行った。
本項目では、画像解析が粒子径分布に与える影響を調査することを目的に、同一画像を
本項目では、画像解析が粒子径分布に与える影響を調査することを目的に、同一画像を用いた複数機関
複数機関によるによる画像解析の画像解析の RRT 試験を行った。具体的には、シリカナノ粒子の凝集の異なる画像を検討した。その結果、凝集性の違いにより画像解析の影響が異なることが確認されたが、凝集の多い画像においても解析方法を工夫することにより粒子径分布が改善されることが確認された。
4-3--1. シリカ検討画像
検討画像
検討した代表的な画像を検討した代表的な画像を図
図 9 に示す。図 9.(A) は凝集が非常に少ない画像、図 9.(C)は凝集がは凝集が多い画像、図 9.(B).(B)はその中間的な凝集を示している。
はその中間的な凝集を示している。

15
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A

B

C
図 9. 解析対象とした
解析対象としたシリカの３種類の３種類の代表 SEM 画像
4-3--2. 画像解析比較結果
画像解析比較
①画像解析方法
各機関の画像解析方法を表 1 に示した。各画像セットは、図 9 の画像を含め 12 枚を用い、粒子数 500 個以上を解析した結果である。
②粒子径分布
各機関で画像解析して得られた最大ｆ各機関で画像解析して得られた最大ｆeret 径、最小 feret 径及び円相当径を図 10～図
図 12 に示す。

16
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機関 解析ソフトa Fiji ver2

b

c

d

e

f

g

h

i

j

処理内容
輪郭抽出の方式
1median 2大津で２値化
2
3 Watershedで分離
Watershedwatershed

フィルタ条件円形度が0.8以上の粒子を抽出

Photoshop7.0
粒子解析 Ver3.5

1.画像前処理：
画像前処理：photoshopによる自動輪郭抽出による自動輪郭抽出
2.Photoshopによる接触粒子の切り離し
2.Photoshopによる接触粒子の切り離し
3.粒子解析ソフトによる２値化
粒子解析ソフトによる２値化
4.粒子解析ソフトにより自動計測
粒子解析ソフトにより自動計測

写真端部で切れた粒子は計測対象外

ImageJ 1.50e
Image Jプラグイン
プラグイン

1.ノイズ除去
ノイズ除去: バイラテラルフィルタ
・モード:: Fiji, Spatial: 3 , Range: 50 (画像A 90)
OpenCV3.1ライブラリ使用
・自作プログラム OpenCV3.1ライブラリ使用
2.２値化処理
２値化処理 大津の２値化
・二値化により、背景と前景（粒子）に分離した画2
3.粒子分離処理
粒子分離処理面積 1200nm 以下の粒子を排除
像を読込む
・二値化画像に対してエロージョン演算を繰り返し不規則度（最大内接円 最大フェレ径） 0.5以下
不規則度（最大内接円/最大フェレ径）
・前景をラベリングし、背景とラベリングした領域の行い粒子を分離
境界を輪郭として取得 輪郭の内側を粒子として の粒子を排除
18回、（画像B）12回、回、（画像C）9回（画像A）18
計算。
エロージョン演算結果に対してボロノイ図作成。
ボロノイ図と二値化画像を 演算し、粒子を分離
ボロノイ図と二値化画像をOR演算し、粒子を分離

Image-Pro
Premier v9.3.2(日本ローパー製
日本ローパー製)① 画像前処理：メディアンフィルター（3×3)
画像前処理：メディアンフィルター（② バンドパスフィルター（ローサイズ（ローサイズ1、ハイサイズ10、強さ、強さ10、回数1）
110～255）③ 大津の自動2値化（閾値110
大津の自動④ 凹凸部による自動分割

粒子解析ソフト自動計測処理-1.前処理：
前処理：γ補正（γ値0.5、画像
画像C 0.3)、
平均化処理（フィルタサイズ5×5）
平均化処理（フィルタサイズ5×5
2.二値化：モード法
二値化：モード法
3.円形分離円形分離
Feret・絶対最大長→最大 Feret径
Ｗｉｎ ROOF ver.3.5 4.計測（1回目）
回目）
・対角幅→最小Feret 径 相当とて報告
・対角幅→最小Feret
5.二値化条件により小粒子数え落としあるため、二値化条件により小粒子数え落としあるため、再度閾値を変更して二値化 画像B）
再度閾値を変更して二値化(画像6.面積フィルタで大粒子排除
面積フィルタで大粒子排除(画像画像B）
7.計測（2回目）
回目） (画像B）
300nm
形状直径範囲：形状直径範囲：20nm～300nm
勾配閾値：
勾配閾値：0.6（画像B 1.2)Arbitrary
SPIP Ver.6.7.2
Detection
ノイズフィルタ：
ノイズフィルタ：4ピクセル（画像円検出（ Circle Detection）法粒子検出
画像B,C 10ピクセル) 円検出（Circle
許容される重複：許容される重複：20％
感度：-5
ノイズ低減
Process/Filters/Gaussian Blur - 5 pixel
(画像A）
2値化
ImageJ 1.51n
Image/Adjust/Threshold - （ほぼ)default（ほぼ
セグメンテーション
Process/Binary/watershed
EDISONによるセグメンテーション
によるセグメンテーション(画像B）
MeanShift:
MeanShift:パラメータEDSION-v1.1
kernel - uniform, space window- 20pixel,
セグメンテーション
color window- 15pixel, Min region - 200pixel
OpenCV v2.4.8
OpenCV findcontour
Weight Mapパラメータ
Map
輪郭検出、粒径算
Gradiation windwow - 5pixel出
粒径算出
ImageJ 1.51n
OpenCV minAreaRect
Gaussian Blur - 3pixel
ノイズ低減 1：Gaussian
2値化：Thresshold(80Thresshold(80近傍)
Opening/Dilation - 3pixel
ノイズ低減 2：Opening/Dilation(画像C）
セグメンテーション： dist_transform、watershed
セグメンテーション：dist_transform
OpenCV v2.4.8(maskの閾値 0.3近傍
近傍)
粒径算出：
粒径算出：minAreaRect
IPPでのカウントの測定オプション
IPPでのカウントの測定オプション
連結 8連結、境界上を除外
連結:
連結、境界上を除外: 全て 穴埋め
背景と粒子の平均輝度の中間点を閾値とし、自動 値化のバイアス: 0、自動2値化: 最小分
自動2値化のバイアス
Image-Pro
IPPカウント機能により粒形抽出（画像輝度のヒス
カウント機能により粒形抽出（画像輝度のヒス
散法 平滑化: 10、拡大、拡大: 0、自動分割: 無し
Premier
トグラムをガウスフィッティングすることによりそれ
2
Ver.9.210nm）以下を除外
面積 78nm （直径10nm
面積:ぞれの平均輝度を算出）
円周（面積から算出）／輪郭＜
円周（面積から算出）／輪郭＜0.95を凝集粒子と見なして除外
１．画像を 8bitグレイスケールに変換
グレイスケールに変換
２．解析領域の指定（スケールバーや文字などの削除）
ImageJ
ImageJ Particle Analysis
３．二値化
Ver.1.50i
４．メディアンフィルタ px)によるノイズ除去
４．メディアンフィルタ(2によるノイズ除去
Watershed
５．Watershed
６．輪郭抽出Single particle mode,
Watershed for irregular structures, thresholdconvexity =0.95
Fiji 1.0 (ImageJ
1.51n)
Area >500px2 (画像B,C 75 px2 ), solidity > 0.5
ParticleSizer 1.09 (画像C minimum solidity=0.5)
Min Feret > 16 px(画像B,C
px(
なし）
他のパラメータは Default
他のパラメータはas2

面積400nm 以下を除外=1x1排除(6の時)・ピクセル=1x1・面積>400の粒子を排除の粒子を排除・得られた輪郭が実際の画像と一致しない箇所を手動で排除2

イメージの端を含む面積300nm 以下の粒子を排イメージの端を含む面積
除-・30nm以下のサイズで異常形
以下のサイズで異常形・顕著な凹形・顕著な凹形(ヒョウタン形等)
上記を目視により削除
・画像の端(エッジ
エッジ)に接触する粒子は削除に接触する粒子は削除-

2

面積: 78nm （直径10nm）以下を除外）以下を除外円周（面積から算出）／輪郭＜0.95 を凝集粒子
円周（面積から算出）／輪郭＜0.95と見なして除外(画
像C) 自動分割のオプション：カウント時に測定図形を分割、分割方法 Watershed、凹部サイズ
形を分割、分割方法:、凹部サイズ:40

50nm 2 の粒子を排除
・面積＜50nm

異常分割された輪郭を目視で除外(画像B,Cはこ
異常分割された輪郭を目視で除外の処理なし）

17
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a
b
c
d
a
e
f
g
h
i
j

図 10. 画像 A の各解析方法に対する最大 Feret 径、円相当径、最少 Feret 径
図中の記号 a～～j は、表１の機関に対応は、表１の機関に対応。以下の図。以下の図 11,図 12 も同様。

18
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a
b
c
d
e
f
g
h
i
j

図 11.
11 画像 B の各解析方法に対する最大 Feret 径、円相当径、最少 Feret 径

a
b
c
d
a
e
f
g
h
i
j

12 画像 C の各解析方法に対する最大 Feret 径、円相当径、最少 Feret 径
図 12.
19
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各画像セットの上記の円相当径の全体の平均値とばらつきは、
画像 A

62.7±1.862.7(1σ)) ((nm)

画像 B

63.4±2.763.4(1σ)) ((nm)

画像 C

58.3±5.258.3(1σ)) (nm)となった。画像 A,B は、ほぼ同じ値になり、ばらつきも１ピクセル相当になっている。一方、画像C は、平均値が A,B より小さく、ばらつきが数倍大きい結果となった。
画像 C の粒子径
粒子径が小さくなる理由としては、図が小さくなる理由としては、図 13 に示すように、粒子の重なり部のコントラストが暗くなる影響で、輪郭が内側にとられ、空隙ができたように見える。そのため、みかけの粒子が小さく算出されてしまう。さらに、粒子内コントラストの影響で、複数の粒子を分割してしまう誤分割や一つの粒子自体をより小さく見積もってしまう誤検出が原因である。その他、重なり粒子を一つの粒子として検出しまう場合もある。これらにより、平均粒子径なり粒子を一つの粒子として検出しまう場合もある。これらにより、平均 粒子径が小さくなり、まが小さくなり、またた粒子径分布ばらつきが大きくなると考えられる。
分布ばらつきが大きくなると考えられる。
一方、平均粒子径が良く一致している画像 A、B においても、図 10．や図．や図 1111．の粒子径分布
径分布の形状は大きく異なっているものが見られる。特に粒子径の小さい方へ分布が引きずられたものが目立つので、粒子の面積や形状などのフィルタでノイズや異物を排除することも必要であると考えられる。

図 13.. 凝集が多い場合の誤分割、誤検出
凝集が多い場合の誤分割、誤検出のの事例
4-3-3.
3. 画像解析の再検討とその結果
図 9.の画像
画像 C において、他の画像 A,B よりも平均粒径とそのばらつきが大きくなったよりも平均粒径とそのばらつきが大きくなったことか
ことから、ら、再試験を実施した。
再試験を実施した。
①画像解析方法
凝集が画像全体に多くなると、粒子重なり部及び粒子内部のコントラストにより、誤検出、凝集が画像全体に多くなると、粒子重なり部及び粒子内部のコントラストにより、誤検出、誤分割を生じる。輪郭を内側にとらないこと、誤分割、誤検出を減らすことによる改善が可能かを調べた。
調べた。各機関の画像解析方法を表
各機関の画像解析方法を表 2 に示した（機関数は（機関数は 2 機関減少）。表
機関減少） 表 1 に対して変更された点を記載したれた点を記載した。表 1 と比較すると、輪郭抽出を 2 段階処理したり（機関
段階処理したりg,hg,h）、機械学習によ、機械学習による輪郭抽出を新たな画像解析ソフトの導入により行なう方法
る輪郭抽出を新たな画像解析ソフトの導入により行なう方法(機関機関 j)、形状フィルタの条件を見、形状フィルタの条件を見直したり直したり(機関機関 a,c,g,i)、誤検出を避けるために目視で手動による排除をする、誤検出を避けるために目視で手動による排除をする(機関、誤検出を避けるために目視で手動による排除をする 機関 b,g,i)などの方などの方法を取り入れていることなど高度化している法を取り入れていることなど高度化していることがわかる。
ことがわかる。
表 1,表 2 には記載されていない画像解析手順の詳細については、付録 E にいくつかの事例
20
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を載せた。
②粒子径分布
各機関で画像解析して得られた最大ｆ各機関で画像解析して得られた最大ｆeret 径、最小 feret 径及び円相当径の粒径分布結果
径及び円相当径の粒径分布結果をの粒径分布結果
図 14 に示す。
示す。円相当径の平均値は、円相当径の平均値は、
62.0±±2.1 (1σ) (nmnm)
であり、画像 A,B と同程度にできることがわかった。
同程度にできることがわかった。
4-3-4.
4.まとめ
精度の高い粒子径分布を得るためには、ある程度凝集の少ない画像が必要であることが確認された。凝集が多い画像解析では、粒子のセグメンテーションが不十分であったり、微小
コントラストを粒子と誤認しまったり、凝集粒子の分
コントラストを粒子と誤認しまったり、凝集粒子の分割がうまくいかず
割がうまくいかず、見かけ上小さな値が得割がうまくいかず 見かけ上小さな値が得られたと考えられる。これら箇所を手動で取り除くられたと考えられる。これら箇所を手動で取り除く、フィルタ条件を、フィルタ条件を変更することなどにバラツキ、フィルタ条件をことなどにバラツキを減少することができた。

21
Copyright © Nanotechnology Business Creation Initiative. All rights reserved表 2. 画像 C の再解析方法 （表 1 の方法との変更点を記載）の方法との変更点を記載）
機関 解析ソフト

処理内容
輪郭抽出の方式
OpenCV
OpenCVを使ってWatershed
Watershedで分離
変更なし
Watershedで分離
さらに、
さらに、境界をFuijiでWatershed
1.粒子解析ソフトにより粒子領域自動選択
粒子解析ソフトにより粒子領域自動選択
2.粒子解析ソフトにより接触粒子の切り離し
粒子解析ソフトにより接触粒子の切り離し
手動2値化処理
値化処理（手動）
1.Waka segmentation v3.2.20
Gui上で前景と背景を画像に上書きする要領で指定
上で前景と背景を画像に上書きする要領で指定
変更なし
2.
し、処理する事で分離。

a

変更なし

b

変更なし

c

ImageJ 1.51s

e

変更なし

g

R version 3.3.1
・R
EBImage v4.16.0
・EBImage- Imageprocessing andanalysis for Rh

画像前処理、輪郭抽出、1次粒子以外の除去
画像前処理、輪郭抽出、次粒子以外の除去①バンドパスフィルターローサイズ： ，ハイサイズ：①バンドパスフィルターローサイズ：5，ハイサイズ：
Image-Pro Premier 5，強さ：
IPP），強さ：100，回数：1（IPP
Ver.9.2②二値化①の画像を 値化（Photoshop）②二値化①の画像を2値化（
Photoshop CS
Photoshop） →③画像修正元画像 ②の画像（Photoshop③画像修正元画像×②の画像（
8bitグレー
グレー（粒子間の分割を容易にするための画像処理）

フィルタ条件円形度が0.85以上の粒子を抽出
以上の粒子を抽出
写真端部で切れた粒子とノイズと考えられるコント
写真端部で切れた粒子とノイズと考えられるコント
ラストは計測対象外

2

面積 215nm 以下の粒子を排除

J
粒子分離処理 Image JのWatershed
Opening - 5pixel
・ノイズ低減：Opening
・ノイズ低減：・セグメンテーション
distmap - 距離マップからseed作成
0.3
距離マップから
閾値 0.3近傍
propagate - 距離と輝度勾配のtrade-off
距離と輝度勾配のtrade-off 0.001
粒径算出： computeFeatures
粒径算出：computeFeatures

EBImage paintObjects

変更なし

・サイズfilter
500pixel以下の粒子
面積500pixel
・顕著な凹形(ヒョウタン形等
ヒョウタン形等)を目視により削除
を目視により削除
・画像の端(エッジ
エッジ)に接触する粒子は削除に接触する粒子は削除

一次粒子以外の除去

2

変更なし

i

j

Fiji 1.0 (ImageJ
1.51n)
Waka
segmentation(v3.2.21)

・画像前処理BG除去
除去 (Rolling ball radius 80 px)
Bilateral filter (spatial radius 3px, range radius 50
px)
・セグメンテーション
ImageJ Particle Analysis
SiO2_007
SiO2_007を用いてclassifierclassifierをトレーニング
をトレーニング(粒,BG共に40,000 px程度）、これを全ての画像に適子,BG程度）、これを全ての画像に適用し解析
・画像二値化
Probability mapをStatisticalmap Statistical region merging (Q=4)
で多値化、その後二値化

300nm の粒子を排除
面積 ＜300nm
・形状フィルタリング：
周長＞K*2*√（√（π* 面積）の粒子を排除
同面積の円周のＫ倍よりも大きな周長の粒子を1.15
排除 Ｋ＝1.15

誤検出粒子の手動除去※ 機関 d,f は、再解析未実施

22
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a

b
c
e
g
h
i
j

(a) 各機関の最大フェレ径(b) 各機関の円相当径(c) 各機関の最小フェレ径

図 14. 画像 C の再解析後の粒子径分布の再解析後の分布

23
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5.プロトコル
プロトコル
4章章で検討した結果から、推奨されるプロトコルを以下に示す。
で検討した結果から、推奨されるプロトコルを以下に示す。
5.1.試料調製
試料調製①ナノ粒子分散液を準備する。（濃度の目安は①ナノ粒子分散液を準備する。（濃度の目安は 0.1wt%）
0.1w②基板②基板（シリコン、（シリコン、TEM グリッド）を用意する。
グリッド）を用意する。
③③滴下時の下敷きとして、および、滴下時の下敷きとして、および、滴下後の分散液を吸い取るための濾紙を用意する。
滴下時の下敷きとして、および、滴下後の分散液を吸い取るための濾紙を用意する。
④基板の親水化処理を行う。
⑤⑤ピペットなどで分散液をピペットなどで分散液を④④の処理を施した基板に約の処理を施した基板に約 1μL 滴下する。
シリカなど基板への付着力が弱い粉体の場合、⑤を実施する前に、以下の添加剤を含む溶液を準備し、分散液に添加する。この添加剤は分散剤が乾燥する間に粒子が凝集するのを防ぐとともに、粒子が基板に付着するのを助けると考えられる。
・HEC（ヒドロキシエチルセルロース）（ヒドロキシエチルセルロース）（ヒドロキシエチルセルロース）1wt%水溶液を作製する。
水溶液を作製する。（溶けにくい場合
水溶液を作製する。 溶けにくい場合は超音波
は超音波
振盪や湯煎すると良い。）
振盪や湯煎すると良い。
基板に TEM グリッドを使用する場合は、グリッドを使用する場合は、2-5uL/mL
5uL/mL の量を目安にするのが良い。
量を目安にするのが良い。
・基板が基板が TEM グリッドの場合、滴下時に、グリッドの場合、滴下時に、下に敷く濾紙は定量濾紙の目の粗いもの
下に敷く濾紙は定量濾紙の目の粗いもの（7-8μμm）が良い。
⑥⑥滴下後、濾紙を用いて分散液を吸い取る。
滴下後、濾紙を用いて分散液を吸い取る。
チタニアなど凝集性が高い場合は、分散液が乾燥中する間に粒子が凝集するのを防ぐためにこの操作を入れる。以下の条件が良い。
・滴下後、すぐに吸い取る。１０秒程度の時間が目安である。
滴下後、すぐに吸い取る。１０秒程度の時間が目安である。
・濃度が高い場合は、上から被せるように吸い取り、濃度が希薄な場合は、横から吸い取るのが良い。
⑦室温で乾燥させる。
⑦室温で乾燥させる。30 分以上、自然乾燥するのが良い。
⑧⑧導電コートは必要があれば施すは必要があれば施す。
は必要があれば施す⑨⑨上記、試料調整
試料調整条件、方法と条件、方法と実施日実施日を記録しておくを記録しておくことが好ましいことが好ましい。
5.2. SEM 観察①①調製した試料を
試料を治具に固定し、固定し、試料台
試料台にセットする。
にセットする。SEM 操作方法は、使用する装置のマニュアルに従う。
②②予備観察を行い、粒子が著しい局在がなく予備観察を行い、粒子が著しい局在がなく予備観察を行い、粒子が著しい局在がなく分散されていることされていることを確認する。それと同時に大されていることを確認する。それと同時に大
まかな粒子径
粒子径分布を把握する。
分布を把握する。
③③微小粒子も十分なコントラストが得られるよう加速電圧他、条件を調製する。
微小粒子も十分なコントラストが得られるよう加速電圧他、条件を調製する。
④④計測用画像を撮影する
計測用画像を撮影する。
。
・撮影する SEM 画像のピクセルサイズは 1.5 nm/px 以下とする。
・できるだけ粒子がランダムに存在する視野を選択できるだけ粒子がランダムに存在する視野を選択できるだけ粒子がランダムに存在する視野を選択し、撮影する。
し、撮影する。
・後の画像解析のため後の画像解析のため、必要な対象粒子数を考慮し、必要な対象粒子数を考慮し、必要な対象粒子数を考慮し、必要な画像数とする。
、必要な画像数とする。
24
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必要な粒子数の目安は、粒子径分布が必要な粒子数の目安は、分布が比較的シャープ
比較的シャープな場合でな場合で 500 個程度である
個程度であるががそれより多い粒子が好ましい。
⑤⑤参考まで、以下の項目を記録しておく
以下の項目を記録しておく
以下の項目を記録しておくことが好ましいことが好ましい。
・使用装置
使用装置
・検出器名
検出器名
・加速電圧
加速電圧(試料入射時
試料入射時) /kV・リターディング電圧
リターディング電圧 /kV
・照射電流
照射電流 /pA
・観察倍率
観察倍率
・倍率校正法（校正試料）
倍率校正法（校正試料）、校正実施日
倍率校正法（校正試料） 校正実施日
・観察実施日
観察実施日・SEM 画像サイズ (pixel)
・ピクセルサイズ
ピクセルサイズ (nm/pixel)
55-3. 画像解析(粒子解析
画像解析 粒子解析)
解析手順の詳細例は、表解析手順の詳細例は、 1,表２及び表２及び付録を参照
を参照いただき、ここではポイントとなる内容を、ここではポイントとなる内容を
示す。
①
①解析準備
使用画像の選択、解析ソフトウェアの準備
使用画像の選択、解析ソフトウェアの準備をする。
をする。
使用するソフトウェアやアルゴリズムは任意とする②②画像前処理
画像前処理
バックグランド処理の実施。
バックグランド処理の実施。
③③セグメンテーション
セグメンテーション
接触粒子の輪郭線が内側に後退するのを避けるよう閾値などを設定する。
含まれる場合には、画像前処理、フィルタ処理や目視判定などでこれを除く。
④④画像２値化
画像２値化
⑤
⑤輪郭抽出
輪郭トレースは、自動 あるいは手動で行う。
輪郭抽出は自動画像処理で行う。画像分割などの前処理は手動でも構わない。
得られた粒子輪郭に明らかな誤分割や誤検出が含まれないことを確認する。
⑥自動計測の場合にはサイズフィルタや二値化条件に起因する粒子の検出漏れがない
自動計測の場合にはサイズフィルタや二値化条件に起因する粒子の検出漏れがない
自動計測の場合にはサイズフィルタや二値化条件に起因する粒子の検出漏れがないか確認する。数落としがある場合には二段階処理等の対策を行い、数落としを最小限に抑え確認する。数落としがある場合には二段階処理等の対策を行い、数落としを最小限に抑える。
⑦⑦粒子径分布算出
分布算出
粒子数の目安は、の目安は、500
500 個以上とする。
とする。粒子径分布が広い粒子の場合は、より多くの粒子分布が広い粒子の場合は、より多くの粒子数による解析が望ましい。
25
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⑧⑧解析について、以下の項目を
解析について、以下の項目を参考に、解析について、以下の項目を参考に、記録しておくことが好ましい。
記録しておくことが好ましい。
・解析ソフト解析ソフト
・輪郭抽出の方式
輪郭抽出の方式
・自動処理内容
自動処理内容・計測粒子数
計測粒子数
・撮影視野数
撮影視野数
・個々の粒子データとして最大・最小
個々の粒子データとして最大・最小 Feret 径、面積、円相当径を求める。
径、面積、円相当径を求める。(表 3 参照)
参照
表 33．データ表（例）．データ表（例）画像 No.

粒子 ID

1

1

1

2

粒子

粒子

Max.
Max..Feret 径

Min. Feret 径

Area

Perimeter
erimeter

X 座標

Y 座標

(nm)

(nm)

(nm2)

(nm)

・
・
・
n

500

・
・
・

26
Copyright © Nanotechnology Business Creation Initiative. All rights reserved【おわりにおわりに】シリカ
シリカ、チタニアナノ粒子を用いて、試料調製法から画像解析の検討を行った。試料調製は、チタニアナノ粒子を用いて、試料調製法から画像解析の検討を行った。試料調製は検討の討の余地はあるものの余地はあるものの、目標とすべき状態に近づけることはできた。画像解析法の検討から、目標とすべき状態に近づけることはできた。画像解析法の検討から凝集の多い試料においても分布を改善することができた。
凝集の多い試料においても分布を改善することができた。この結果から、精度の良い
この結果から、精度の良い
この結果から、精度の良い粒子径
粒子径分布
計測が SEM によっても可能であることを示すことができた
によっても可能であることを示すことができたと言える。
。
推奨プロトコル及び事例を参考にすることで、推奨プロトコル及び事例を参考に することで、他材料のナノ粒子
他材料のナノ粒子の計測に展開することが可能の計測に展開することが可能であると考えられであると考えられ、、本文書を役立てていただければ幸いである。
役立てていただければ幸いである。

27
Copyright © Nanotechnology Business Creation Initiative. All rights reserved付録 （事例集）
A.シリカの場合のシリカの場合の試料調製法、観察条件、画像処理法
シリカの場合の試料調製法、観察条件、画像処理法

表 A.1
基板
分散液に添加基板前処理
エラスチックカーボン 分散液2ml中にHEC1%水溶液 DCプラズマ
1 メッシュ（ELS-C10） を 5μμl添加（超音波分散10分l添加（超音波分散10分間）
2 TEMメッシュ
HECを添加分散液滴下と後処理

乾燥法

その他処理

分散液を接触一昼夜
分散液(0.1wt)を超音波分散処
真空乾燥 理（10分間）

基板に滴下

自然乾燥 蒸着処理

3 シリコンウェハー

1%HEC水溶液を添加

4 シリコンウェハー

HEC1%水溶液を約0.4%添加

5 シリコン

分散液 40mlに1％HEC水溶液
親水化処理
を数滴添加、超音波分散

濃度高で粒子が固まったため、Si基板上に滴下、ブロアー
自然乾燥 分散液(HEC添加）に蒸留水を入で表面の溶液を除去れ、10倍希釈し、再度同じ処理

１％HEC水溶液を添加：
3μL/mL

1μL滴下、10秒後
L滴下、10秒後 濾紙
で吸い取る

室温乾燥

滴下後、余剰分散液を濾紙で吸い取り自然乾燥

6

シリコンウェハー
（鏡面）

7 シリコン8

分散液を数uL滴下
自然乾燥
親水化処理
ガラス毛細管ピペットで約12min
μL滴下、滴下10秒後濾紙
L滴下、滴下10秒後濾紙
自然乾燥（JEOL DATUM： で分散液を除去
HDT-400）

UVオゾン処理15分

1％ HEC水溶液をシリカ分散液
親水化処理
に添加

TEMグリッド（フォル 1%HEC水溶液を添加 (3µムバール支持膜） L/mL)

ろ紙の上に基板を乗せ、滴
室温乾燥
下

28
Copyright © Nanotechnology Business Creation Initiative. All rights reserved表.A.2
使用SEM装置（メーカー）
装置（メーカー） 検出器名

加速電圧 照射電流
観察倍率 倍率校正法
(pA)
(kV)
3
193 x70,000 メーカーにて実施
標準マイクロスケール
3
60 x25,000
HJ-1000

1 JSM-7800F (JEOL)

UED検出器3 Merlin(Zeiss）
Merlin(Zeiss

InLens

4 日立 SU-8230

UPPER（レンズ内（レンズ内
2次電子検出器）
次電子検出器）29SU8200Upper検出器（
検出器（SE)(日立ハイテクノロジーズ）
日立ハイテクノロジーズ）

5

40

5

6 JSM-7610F

SEI,上方検出器
上方検出器

5

8

7 日立S5500
S5500

ET検出器

3

8

8 GeminiSEM 500 (ZEISS) InLens-SE

330

画像サイズ ピクセルサイズ(pixel)(nm/pixel)
1280 x 960
1.34096 x 2820

1.1

x30,000 Cristal Dimennsion

5120 x 3840

0.8

x35,000 マイクロスケール

2560 x 1920

1.4

1280 x 1024

1.22560 x 1920

1.0

2048 x 1536

1.1

社内基準のスケールを使用
Standard Microscale
x50,000
Type 595-4706(日立）
595-4706(日立）
x50,000 ZEISS社標準の方法
ZEISS社標準の方法
x80,000

表 A.3
解析ソフト (ver.)
輪郭抽出の方式
Adobe社製
Ver7.0）社製 Photshop（Ver7.0
1 住友金属テクノロジー社製
自動、手動（一部）
Ver3.5）
粒子解析（Ver3.5
2 LUZEX AP
二値化画像処理
3 Fiji (ImageJ 1.49m)
自動4 Image-Pro Premier Ver.9.2
自動
自動
5 Image-Pro Premier 3D （9.2.1
9.2.1）（多角形自動トレース）

6 VLFeat v0.9.20

自動7 ImageJ (1.50i)

自動

8 SPIP version 6.6.3

自動

9 ImageJ (1.50g)

自動/視野処理の内容 （自動の場合）
計測粒子数 撮影視野数 粒子数/視野
Photshop自動選択ツールより粒子抽出
Photshop自動選択ツールより粒子抽出
1262
98
13
（ 部手動により粒子の切り離し）後、粒子（1部手動により粒子の切り離し）後、粒子解析により二値化→自動計測572
964
手動（自動は輪郭がぼやけて抽出不可）
1042
16
65
二値化 > remove outlines > watershed
Min Variance
767
23
33
エッジ部を指定するとそこからエッジ部に
750
10
75
沿って粒子を自動にトレースする
Quick Shift法によりセグメンテーションをShift法によりセグメンテーションを実施した後、 次の形状モーメント値でフィ実施した後、2次の形状モーメント値でフィ
1430
12
119
ルタリングを行い、極端な凹図形、突起をもつ図形、ほぼ矩形・台形の図形を削除
した
508
11
46
二値化, watershed, 輪郭抽出
二値化,
Threshold( 閾値は自動設定（主たる平面と最大(注)閾値は自動設定（主たる平面と最大
847
31
27
値との高さの差の値との高さの差の20％）,単独の粒子と思単独の粒子と思Area Of Interest）を設Interest
われる箇所にAOI（Area
われる箇所にAOI
定despecle,
3470
86
40
二値化（手動で TH決定），despecle,
二値化（手動でTH
watershed, 輪郭抽出
9923
100
99

29
Copyright © Nanotechnology Business Creation Initiative. All rights reservedB チタニアの場合のチタニアの場合の試料調製法、観察条件、画像処理法
試料調製法、観察条件、画像処理法

表.B.1.B.1 試料調製法
基板

分散液滴下と後処理
パスツールピペットで約1µL滴下、滴下
パスツールピペットで約滴下、滴下10秒
1 シリコンウエハー
後、ろ紙で分散液を除去µL滴下、基板をエタノールに 時間浸漬
基板をエタノールに24時間浸漬
パスツールピペットでSi基板上に約1µL
パスツールピペットでSi
2 シリコン
滴下 秒後にろ紙で分散液を除去
滴下10秒後にろ紙で分散液を除去µ
濃硫酸と過酸化水素水
濃硫酸と過酸化水素水(30%)の混合溶液の混合溶液 分散液をピペットで 1 µL滴下し、10秒後に濾
秒後に濾
3 シリコン（容積比 4：1）に浸漬し、）に浸漬し、100℃・℃・10分間の 紙で除去
加熱
親水化処理 2min
ガラス毛細管ピペットで約
ガラス毛細管ピペットで約1µL滴下
4 シリコンJEOL DATUM：HDT-400）
DATUM
（JEOL
滴下 秒後濾紙で分散液を除去
滴下10秒後濾紙で分散液を除去
アルコール洗浄滴下 10秒後、濾紙で吸い取る
秒後、濾紙で吸い取る
5 シリコン
Si基板に試料をシリコンウエハー UVオゾン処理
オゾン処理 15分
基板に試料を1µL滴下、滴下、10秒後
秒後 濾紙で分
6
（鏡面）
散液除去
親水化処理
分散液を滴下 余剰分散液を濾紙で吸い取り
7 シリコン
1µL滴下後、ブロアーで表面の溶液を除去
親水化処理
滴下後、ブロアーで表面の溶液を除去
8 シリコン
9

基板前処理
プラズマ処理 2分

シリコンウエハー プラズマ処理
（鏡面）

乾燥法

その他処理

室温乾燥
室温乾燥
室温乾燥

導電コート (10mA, 20秒
秒)
Pdの導電コートの導電コート（サンユー電子 SC-MC）

室温乾燥
室温乾燥
実験室雰囲気
で室温乾燥
自然乾燥
自然乾燥

チタニア分散液（濃度0.1％）
チタニア分散液（濃度％）を超音波分散（を超音波分散（5min）

分散液を1µL滴下．数秒後余剰分散液をろ紙
分散液を滴下．数秒後余剰分散液をろ紙
室温乾燥
で吸い取る

30
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表B
B.2 SEM 観察条件
加速電圧 照射電流
観察倍率 倍率校正
/kV
/pA

画像サイズ
(pixel)ピクセルサイズ(nm/pixel)

100000 x100,000 装置メーカー方法 ( * )1280 x 960

0.99

2

15000 x100,000 銅メッシュ/目開き
目開き25µm

1280 x 960

1

SE検出器

5

20 x150,000 ゲラー社 S2009ST

1024 x 768

0.83

4 SU-8230/日立
SU-8230/

UPPER(レンズ内2次電子
次電子
検出器)

2

9

x30,000 Cristal Dimennsion

5120 x 3840

0.82

5 S-4800/日立
S-4800/

SE(U)

2.5

x100,000 グレーチング試料観察

2560 x 1920

0.5

6 JSM-7610F/JEOL

SEI, 上方検出器

51280 x1024

0.31

7 日立S5500
S5500

ET検出器

3

2560 x 1920

1.01

8 GeminiSEM 500 (ZEISS) InLens-SE

2.5

8 x300,000 社内基準のスケールを使用
Standard Microscale Type
8 x50,000
595-4706（日立）（日立）
30 x50,000 ZEISS社 標準の方法

2048 x 1536

1.1

SU8200 /9日立ハイテクノロジーズ

Upper検出器（SE)
SE)

5

40

x35,000 マイクロスケール

2560 x 1920

1.42

10 JSM-7100F/JEOL

LED検出器774

x70,000 ISO16700準拠
準拠 (MRS-6)

2560 x 1920

0.67

使用装置
使用装置/メーカー

検出器名

S-4800/日立ハイテクノロジーズ

Upper検出器 (SE)3

2 S-5500/日立
S-5500/SE検出器

3 JSM-6320F/JEOL

1*)25.4µmののCuメッシュを用いてメッシュを用いて1,000倍率で観察、装置の測長機能を使用して校正
倍率で観察、装置の測長機能を使用して校正

表 B.3 画像解析
解析ソフト (ver.)1 MAC-View (ver.4)
2 Mac-View Ver.3
Abobe Photoshop (トレースから(トレースから
3
二値化まで ) ImageJ (1.50i)
二値化まで)
4 Image-Pro Premier Ver.9.2
5 LUZEX APEDSION v1.1
（セグメンテーション）
6
OpenCV v2.4.8(輪郭抽出、粒径算出）
輪郭抽出、粒径算出）

輪郭抽出の方式 処理の内容（自動の場合）
手動
手動

7 ImageJ (1.50i)

自動

8 SPIP version 6.6.3

手動
自動
手動
自動

自動

自動
9
（多角形自動Image-Pro Premier 3D （9.2.1） トレース）
手動
10 ImageJ (1.50g)

Min Variance
Mean Shift法でセグメンテー
法でセグメンテー
ションを実施した後、目視確認により明らかな分割ミスの図形を削除
二値化,, watershed, 輪郭抽出
Threshold(注)閾値は自動設定（主たる閾値は自動設定（主たる平面と最大値との高さの差の20％）,単独の粒子と思われる単独の粒子と思われる
Area Of Interest）
Interest）
箇所にAOI（Areaを設定
エッジ部を指定するとそこからエッジ部に沿って粒子を自動にトレースする

計測粒子数 撮影視野数 粒子数/視野
586
25
23
517
10
52
777
1121
587

15
12
30

52
93
20

324

12

27

503

4

126

1199

30

40

564
772

11
34

51
23

31
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C. シリカの場合の粒シリカの場合の粒子径分布測定結果
径分布測定結果 – SEM 像と粒子径分布 –図 C.1 粒径分布測定に使用したシリカ
粒径分布測定に使用したシリカの SEM 画像事例

Normalized freaqency (a.u)

シリカ 円相当径 粒径分布
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

20

40

60

80 100 120 140 160

Equivarent circular diameter (nm)図 C.2 シリカ
シリカの円相当径の円相当径の粒径分布
粒径分布
表 A.3 の各解析事例に対応した結果を示している。

32
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D.チタニアの場合の粒子径分布測定結果
チタニアの場合の粒子径分布測定結果 – SEM 像と粒子径分布 –図 D.1 粒径分布測定に使用したチタニア
粒径分布測定に使用したチタニアの SEM 画像事例

チタニア 円相当径 粒径分布
Normalized freaqency (a.u)

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

20 40 60 80 100 120 140 160
Equivarent circular diameter (nm)
図 D.2 チタニア
チタニアの円相当径の円相当径の粒径分布
粒径分布

表 B.3 の各解析事例に対応した結果を示している。
33
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E.画像解析
画像解析詳細手順例
手順例

E.1（本文 表 1 機関 e の詳細）-----------------------------------------------------------------------------1.1 計測視野に ROI をかける
元画像をロード。
元画像をロード。長方形 ROI ツールで
計測視野（
計測視野（SEM
SEM 像下のデータバーを除いた、観察視野部分）に ROI をかける。

1.2 γ値補正
上部メニューバー＞前処理＞強調＞ルックアップテーブル変換＞ガンマ補正を選択し、ガンマ値を入力。
この機関の場合は 0.5 入力。各機関によって 0.3～0.5 を選択。

1.3 明るさ、コントラスト調整
上部メニューバー＞前処理＞強調＞＞
明るさ・コントラスト＞明るさ、コント
ラストを調整。
この機関の画像では明るさ -20,コント
コント
ラスト 10。各機関によって明るさ。各機関によって明るさ-20～。各機関によって明るさ ～5,コントラスト
コントラスト 10～50 を選択。

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1.4 平均化フィルタ
上部メニューバー＞前処理＞フィルタ＞平均化でフィルタサイズ 5＊5 を選
択。

1.5 自動二値化
上部メニューバー＞前処理＞抽出＞自動 2 値処理＞自動 2 値化＞しきい値決定
方法をモード法に設定。粒子部分だけが選択される程度に閾値を調整。

1.6 円形分離
上部メニューバー＞前処理＞モフォロ
ジー＞円形分離を選択。
分離境界は直線状に分けられる。

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1.7 誤検出粒子を手動で除去
上部バーの消しゴムツールで自動抽出の輪郭が不一致の箇所、円形分離が正し
くできていない粒子を目視で判断し手動で除去

1.8 単粒子除去
上部メニューバー＞
上部メニューバー＞2 値処理＞モフォロ
ジー＞孤立点除去（除去対象：明るい点）
を選択

1.9 キャリブレーション
上部メニューバー＞
上部メニューバー＞編集＞計測環境
編集＞計測環境＞＞
キャリブレーションで 1pixcel の数値を入力してキャリブレーション
1.10 視野の端の粒子を計測から除く
上部メニューバー＞編集＞計測環境＞
ボックスモード＞境界線上の物体を上下左右の境界ごとに区別して処理する＞上下左右すべて処理しないを選択
1.11 計測
上部メニューバー＞計測＞形状特徴＞
面積、絶対最大長、対角幅、周長、始点を出力

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E.2（本文 表 1 機関 a の詳細）

解析の準備
使用する解析ソフト：
使用する解析ソフト：imageJ
imageJ (Fiji)
解析対象画像
解析対象画像:粒状物

1. 画像前処理
１．必要な領域を切り出し。
makeRectangle(0, 0, 1280, 960);
２．画像の平坦化。
run("Subtract Background...", "rolling=100
sliding");

３．ごま塩ノイズ等を減らす。

run("Median...", “radius=2");
orrun(“run(“Despeckle");Despeckle");37
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2. セグメンテーション
１．必要なら、
１．必要なら、opencv や機械学習等を試してみる。
２．もしくは手動。

3. 画像二値化
１．大津法で閾値を決め、二値化。
setAutoThreshold("Otsu dark");

２．上手く行かない場合は他の方法で閾値を決め、二値化。

setAutoThreshold("RenyiEntropy dark");38
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３．以上で３．以上で上手くいかない
上手くいかない場合は手動で上手くいかない場合は手動で閾値を決め
閾値を決め、二値化。
二値化。

setThreshold(46, 255);

4. 粒子輪郭抽出
１．上記の二値化で不十分な場合はwatershed で境界を抽出。
run("Watershed");

２．もしく
２．もしくは opencv や機械学習で検討。
３．
３．上手くいかない場合は上手くいかない場合は手動で抽出。
上手くいかない場合は手動で抽出。

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E.3（本文 表 2 機関 j の詳細）の詳細---------------------------------------------------------------------------解析の準備
使用する解析ソフト：Fiji (ImageJ)
使用する解析ソフト：Fiji・基本的な操作については下を参照
ImageJ.net
http://imagej.net/Welcome
ImageJ 日本語情報
http://seesaawiki.jp/w/imagej/
・使用する Fiji プラグイン
Bilateral filter
Trainable Weka Segmentation
http://imagej.net/Trainable_Weka_Segmentation
Statistical Region Merging
http://imagej.net/Statistical_Region_Merging
解析対象
本文書は右の様な比較的凝集度の高い
SiO2 粒子画像からなる画像セット（画像解析
RRT データセット f）を想定して、）を想定して、Fiji を用いた
粒径分布解析手順を各段階での画像を示しながら説明する。
なお、画像は Fiji macOS 版 ver. 2.0.0/1.51sを使用しを使用した例である。
た例である。

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1. 画像前処理
1.1 画像のトリミング
Fiji(ImageJ)
Fiji(ImageJ)で元画像をロード。
で元画像をロード。Rectangle
で元画像をロード。 Rectangle ツー
ルで解析範囲を選択し、Image > Crop
で字幕部を除去する。

1.2 Background 除去
上部メニューより
Process > Subtract background
Rolling ball radius: 80 pxを実行し、バックグラウンドを除去する。

1.3 Bilateral filter
フィルタ処理により画像の平滑化を行う。上部
フィルタ処理により画像の平滑化を行う。
メニューのPlug--ins
ins > Process >Bilateral filterを実行。パラメータは以下を入力。
spatial radius: 3px
range radius: 50 px
得られた画像を Tiff 形式で保存する。
上記 1.の作業を全ての画像に対して実施する。
の作業を全ての画像に対して実施する。

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2. セグメンテーション. 画像二値化 1.3 で保存した画像を１枚選択し、この画像を教示データとして用い trainableclassifier をトレーニング・画像解析を行い、背景から粒子を分離した probability map を得る。
2.1 セグメンテーションプログラムを起動
1.3 で保存した画像を 1 枚開いた状態で、枚開いた状態で、上部メニューのPlug
Plug-ins
ins > Segmentation >Trainable Weka Segmentation
を実行。

2.2 Classifier のトレーニング(1)のトレーニング(1)
教示データ作成“ Polygon

selection ” や ” Freehand

selection
selection”、”FreehandFreehand Line”” ツールで背景
ツールで背景/粒 子 に 対 応 す る 範 囲 を 選 択 し 、 ” Add toclassclass”ボタンで対応する”ボタンで対応する class に登録。これにより学習に使われる教示データが作成される。この例では背景が class 1（赤）粒子が1 （赤）粒子がclass 22（緑）。
2.3 Classifier のトレーニング(2)のトレーニング(2)“TrainTrain classifierclassifier”ボタンでセグメンテーション”ボタンでセグメンテーションを実行。学習に基づく Classifier の判断により画像全体が薄い赤、緑に色分けされる。

2.4 Classifier のトレーニング(3)のトレーニング(3)粒子を選択・分離ができるようになるまで、教示データとなる領域を増やしながら 2.2, 2.3を繰り返す。各クラスのデータ数（ピクセル数）は同じくらいとするのが良い。
各クラスのデータ数は log ウィンドウに“## of pixels selected as class 1: xxxx”
xxxxと し て 表 示 さ れ る 。 RRT で は 各 ク ラ ス 約
40,000 px を教示データとして使用した。
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2.5 Probability map の作成“Get
Get probability
probability”ボタンから”ボタンから Probability mapを作成する。
を作成する。2 枚の画像がスタックした 32 bitのグレースケール画像が出力されるので、これを tiff 形式で保存。
Probability map はそのピクセルが Class 1(Class 2)2)である確率をグレースケールで表示である確率をグレースケールで表示している。
2.6 他の画像の解析
トレーニングした classifier を他の画像にも適用 し Probability map を 得 る 。 “ Applyclassifierclassifier” ボタンより、1.3
ボタンより、で保存した画像を選択、”選択、”Create
Create probability maps instead ofsegmentation?
segmentation?”に対しては「”に対しては「YesYes」で進む。
」で進む。
選択した画像の Probability map が出力されるのでこれを tiff で保存する。
この操作を繰り返し、全ての画像について
Probability map を得る。
解析対象となる画像の特徴が、トレーニングに用いた画像と大きく異なると、解析が上手
くいかない場合がある。このような場合には特徴の似た画像ごとにトレーニング・解析を行うなどの処理が必要となる。
3. 画像二値化セグメンテーションで得られた Probability map を Statistical region merging で一旦多値化してから二値化し、粒子輪郭抽出の為の準備を行う。
3.1 Probability map の 8 bit 化
2.で得たで得た probability map を開いた状態で上を開いた状態で上部メニューのImage > Type > 88-bitを選択し、画像を 8bit 化する。

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3.2 Stack の分割
上部メニューのImage > Stacks > Stack to image
を実行し、を実行し、classclass 1 および class 2 の独立した probability map に分割する。
粒子が黒く表示される方の画像(class
粒子が黒く表示される方の画像 (class 1)
1)を
tiff 形式で保存する。
3.3 画像多値化
3.2 で保存した画像に対して上部メニュー
から
Plug
Plug-ins
ins > Segmentation > Statistical
Region Merging
Q:4
として実行。数段階にグレースケールで色分けされた画像が 32 bit で出力される。これを 3.1 同様にImage > Type > 88-bit
より 8 bit 化する。
3.4 画像二値化
閾値を選択し、上で得られた画像を二値化する。
Image > Adjust > Thresholdより、右の閾値設定ウィンドウを表示する。
粒子は黒であるので、粒子は黒であるので、”Dark”Dark backgroundbackground”のチェックを外し、下側のスライダーで適切に上限を調節しに上限を調節し”Apply”ボタンを押し画像
ボタンを押し画像を二値化する。二値化した画像を tiff 形式で保存する。

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4. 粒子輪郭抽出
ImageJ のビルトイン機能を用いて粒子の輪郭抽出、粒径計測を行う。
4.1 測定項目の設定
上部メニューのAnalyze > Set Measurements
より、出力される測定量を設定する。右の
画像は RRT の時の例。

4.2 ピクセルサイズの設定
上部メニューのAnalyze > Set Scaleよりピクセルサイズを設定する。右の画像
は RRT の時の例。
場合によっては”場合によっては”Click
Click to Remove Scale”でScale”でピクセルサイズ情報を除去して、単純に pxで出力させることもできる。この場合、最終的な報告値の単位に注意する。
4.2 粒子解析
上部メニューのAnalyze > Particles
より粒子解析を実行する。
Size, Circularity はそれぞれサイズフィル
タ、真円度フィルタであり、指定した範囲内の粒子のみを検出する。サイズフィルタを利用する場合には単位に注意する。

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4.3 粒子解析結果の表示
解析処理が完了すると、粒子輪郭像、解析結果表
析結果表(Results)(Results)、ROIROI manger が表示されるので、必要に応じてこれらを保存する。

.4 誤検出粒子の手動除去
粒子輪郭像を見ながら明らかな誤分割・誤検出を除去する。
[表計算ソフト
表計算ソフト]4.3 で得られた解析結果表を Excel などの表計算ソフトで開き、輪郭像を見ながら誤分割・誤検出された粒子を選別する。
[ROI Manager]
4.3 で出力された輪郭像をアクティブにした状態で、状態で、ROIROI Manager のリストを選択すると対応する粒子輪郭が強調表示される。誤分割・誤検出粒子は、分割・誤検出粒子は、ROI
ROI Manager の”DeleteDelete”ボタンでこれを除く。誤検出粒子を”ボタンでこれを除く。誤検出粒子を除去後、除去後、ROIROI Manager 上の全ての粒子を選択し、”選択し、”Measure
Measure”ボタンで、これらの粒子”ボタンで、これらの粒子についての解析結果が出力される。この結果は 4.3 の Results
esults の表に追記されるので注意。事前に表を選択し上部メニューのResults > Clear Results
で表の内容を消去しておくなどすると良い。
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2019 年 4 月
一般社団法人 ナノテクノロジービジネス推進協議会
社会受容・標準化委員会
ナノ材料の実用的計測評価 WG / 粒径分布計測プロトコル WG------------------------------------------------------無断配布、本書の改編、改ざん及び転売を禁じます。
無断配布、本書の改編、改ざん及び転売を禁じます。
引用する場合は、必ず出展を明記願います。
〒101-0062
0062
東京都千代田区神田駿河台 1-8-11
11
東京 YWCA 会館 3 階
03-3518
3518-9811（代表）（代表）
http://www.nbci.jp/
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