信州医誌，61⑴：３〜11，2013

綜説

遺伝子機能解析ツールとしてのノックアウトマウスの作出とバイオリソース
角田茂

信州大学ヒト環境科学研究支援センター生命科学分野動物実験部門（現所属：東京大学大学院農学生命科学研究科獣医学専攻病態動物医科学講座獣医実験動物学）

Generation of Knock‑out Mice as Research Tools forGene Function and Bioresource Project
Shigeru KAKUTADivision of Laboratory Animal Research, Research Center for Humanand Environmental Sciences, Shinshu University(Present Address : Department of Biomedical Science,
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo)
Key words:knock‑out mice,embryonic stem (ES)cell,genetic engineering,bioresource,interleukin (IL)
ノックアウトマウス，胚性幹（ES）細胞，発生工学，バイオリソース，インターロイキン（IL）

はじめに

γ遺伝子 KO マウスの作製に成功して以来 ，外部の研究者に対しても共同研究という形で KO マウス作

近年，遺伝子改変マウスは基礎医学研究をはじめと製を進めていた。2002年，当時 KO マウス作製プロする様々な生物学の研究に当然のごとく使われる「ツージェクトを担当していた助手の宝来玲子先生の NIHル」となっている。その中でも特に，ノックアウト（KO）への留学に伴い，学位取得と同時に助手のポジション

マウスの普及は，医学・生物学研究のあり方を変えてを引き継ぐという形で作製プロジェクトを担当するこしまったと言っても過言ではない。実際，KO マウスとになった。当時，私が取りまとめるターゲット ESの作製技術を確立した Evans，Capecchi と Smithies

細胞樹立を担うチームと，須藤カツ子博士率いるキメの３博士には，2007年ノーベル生理学・医学賞が与えラマウス作製を中心とした胚操作チームで発生工学グられるなど，その貢献は科学界全体で認められるとこループを形成し，次々と KO マウスを樹立していっろである。遺伝子改変マウスを用いた研究は，技術のた。岩倉研究室では2012年３月の岩倉教授の東大定年確立から20年の間に急速な発展を見せたが，今後はど退職までに総計98アレルの KO マウスの樹立に成功う展開していくのであろうか。

してきたが，その中で私が担当したおよそ９年の間に本稿では，私が東京大学医科学研究所の岩倉洋一郎外部の研究者向けとしては27アレルの KO マウスを教授（現・東京理科大学生命医科学研究所教授）の下樹立した。そして2012年11月現在，そのうち15アレルで行ってきた KO マウスの作製プロジェクトおよびについて論文発表がなされている（表１）

国際 KO マウスプロジェクト，さらには発生工学技研究室自体は感染・炎症・免疫と発生学を中心に研究術の現状について概説したい。

を進めていた研究室であったが，共同研究としては学岩倉研究室での KO マウス作製プロジェクト。岩倉

内外を問わずあらゆる分野の研究者の要望に応えて作製を行っていたのが特徴である。

東京大学医科学研究所の岩倉洋一郎教授の研究室で一方，1998年にそれまでの実験動物研究施設からヒは，田川陽一博士が最初にインターフェロン（IFN）‑ト疾患モデル研究センターへの改組に伴い，遺伝子改別刷請求先：角田茂〒113‑8657

東京都文京区弥生１‑１‑１ 東京大学大学院農学生命科学研究科
獣医実験動物学講座

No. 1, 2013

変マウスをバイオリソースとして積極的に活用する取り組み，すなわち，論文発表済みの系統についての情報公開と遺伝子改変マウスの配布事業も取り組んで来3

角 田
表１

茂

共同研究で作製して論文報告された KO マウス

研究領域

系統名

遺伝子シンボル

表現型

研究責任者

文献

脳・神経系

ALS2 KO

Als2

遺伝性筋萎縮性側索硬化症モデル

池田穣衛

２

Dok7 KO

Dok7

DOK7型筋無力症モデル

山梨裕司

３

PTP‑MEG KO

Ptpn4

運動学習能力と小脳シナプス可塑性
山本雅の減弱４

NR2A‑Y1325F

Grin2a

抗うつ中澤敬信５

Nyap1 KONyap2 KO

6430598a04rik
9430031j16rik

３重欠損により脳萎縮および神経突山本雅

６

Nyap3 KO

Myo16M C2R KO

Mc2r

家族性糖質コルチコイド欠損モデル 久保光正

７

IRS‑1 conditionalIrs1

インスリンシグナル解析ツール

門脇孝

８Vaspin KO

Serpina12

ER ストレス増強による耐糖能異常

和田淳

９LGP2 KO

Dhx58

ウイルス感染防御機能の異常

Glen N Barber

10Tecpr KO

Tecpr1

赤痢菌侵入時のオートファジー異常 笹川千尋

11Kid KOKif22

染色体分配異常山本雅

12

cPGE2 KO

Ptges3呼吸器系異常による新生仔致死

中谷良人

13

ANA KO

Btg3

肺がん発症率上昇山本雅

14

代謝･内分泌系

感染・免疫系

発生系

腫瘍系

⒜

起伸長の減弱⒝

図１ 岩倉研究室における KO マウスの分与件数，IL‑1関係（IL‑1α，β，α/βKO），IL‑17関係（IL‑17A，
RA モデル（HTLV‑I Tg，IL‑1ra KO），IFN（IFN‑γKO），およびその他（TNFα KO，IL‑6 KO）のマウスの⒜ 分与件数の推移（1992〜2011年）と⒝ その割合。
F，A/F KO）

た。現在では，理化学研究所バイオリソースセンター

人Ｔ細胞白血病ウイルス（HTLV）‑I トランスジェ（BRC）や 熊 本 大 学 生 命 資 源 研 究 ・ 支 援 セ ン タ ーニック（Tg）マウス といった関節リウマチモデル（CARD）などの専門の機関が日本国内にも立ち上

マウスが中心であったが，2006年以降は IL‑17KO マがっているが，当時としては画期的な試みであった。

ウス が主流となり，多くの研究者に利用されている初期はIFN‑γKOマウス とインターロイキン（IL）‑1（図１）。2012年３月の岩倉洋一郎教授の東京大学定年

α/βKO マウス に加えて，BALB/c 背景の IL‑1レ

退職に伴い，医科学研究所のラボは完全解散となった

セプターアンタゴニスト（ra）KO マウス とヒト成が，東京理科大学生命医科学研究所に異動し，規模は4信州医誌 Vol. 61

ノックアウトマウスとバイオリソース

図２

ノックアウトマウスプロジェクト立ち上げ時の海外視察

2009年10月，北米のノックアウトマウスプロジェクトについて海外視察を行った。写真は M anitoba Instituteof Cell Biologyにて。カナダのプロジェクト NorCOMM の責任者 GeoﬀHicks 博士（右から３人目）と山村研一団長（右から２人目），そして岩倉洋一郎教授の代理で参加した筆者（左から３人目）。

縮小したものの，現在でも一部の系統についてバイオウスを作製するとなると，莫大な費用と巨大な飼育施リソース事業を継続している。残りのうち112系統を設が必要となるなど，さすがに現実的ではない。その理化学研究所 BRC に寄託作業を行い，現在，BRCため，個体化まで終了した系統は2,023遺伝子に留まっから公開・配布が開始されている。ている。

網羅的ノックアウトマウス作製プロジェクトの展開

このような中，我が国においても熊本大学（代表・山村研一副学長）を中心として東京大学（代表・岩倉洋一郎教授）および大阪大学（代表・岡部勝教授）のしかし，世界に目を向けてみると，我々の研究は規３大学連携で2009年に計画が小規模ながらスタートし模から言えば 家内制手工業 の域を出ず，世界はまた（図２）。さらに2011年，この３大学に九州大学，さに「産業革命」の如き状況となっている。

筑波大学，京都大学，理化学研究所を加えた７つの組KO マウス作製技術が完全に確立したこと，そして織が共同で，「先進的医学研究のための遺伝子改変動

何よりポスト・ゲノム解析として遺伝子の機能の解析

物研究コンソーシアムの設立」計画を提案，実現化をのステージに入ったことが追い風となり，ヨーロッパ目指している。この中では，研究者コミュニティーの（EUCOM M ：European Conditional M ouse Muta-

要望を取り入れながら疾患に関連した2,000遺伝子をgenesis Program）とアメリカ（CSD と Regeneron，選別し，遺伝子変異マウス（ラット）を作製，新たな，カ ナ ダ（NorCOM M ：North AmericanTIGM ）治療法開発への手がかりを得ることを目的としている。

Conditional Mouse M utagenesis Project）が 参 加

医学研究に特化し，かつ個体化を行い解析とセットです る 国 際 コ ン ソ ー シ ア ム（IKMC：International進める点で海外と差別化を図っている。しかしながら，

Knockout M ouse Consortium）が結成され，網羅的昨今の厳しい財政事情のため，実現はかなり厳しい状

KO マウス（ES 細胞クローン）作製を行う国際プロ況となっている。

ジェクトが2006年にスタートした 。このプロジェク

なお，世界の流れは既に網羅的に「作る」から網羅

トにより，本稿執筆時点（2012年11月）で既に18,099的に「解析する」のステージに突入しており，2010年遺伝子の変異 ES クローンが作製され，HP に公開，に Genentech 社が表現型解析までセットにした472系研究者への提供が行われている。これらにより，既に統におよぶ分泌/膜型KOマウスライブラリーの構築を予測されている遺伝子の大部分の変異 ES 細胞ができ報告 したのに引き続いて，2011年には国際マウスたことになる。まさにカネとマンパワーにモノを言わ表現型解析コ ン ソ ー シ ア ム（IMPC：Internationalせた力技の世界である。ただし，全遺伝子の KO マM ouse Phenotyping Consortium）がスタートしてい

No. 1, 2013

5

角 田

茂る 。IKM C で開発した KO マウスについて，マウこのような表現型の違いの原因となる背景遺伝子の探ス表現型解析パイプラインによって共通基準による網索は，遺伝子機能の解析において重要である。岩倉研

羅的な表現型解析を行い，その結果をデータベース化

でも90年代後半に西城忍博士（現・千葉大真菌医学セし，世界中の研究者に情報と KO マウスを提供するンター）が中心となって，HTLV‑I Tg マウスの系を計画となっている。なお，日本では理化学研究所バイ用いて BALB/c と C57BL/6の関節リウマチ発症に影オリソースセンターが参画している。2016年までに響を及ぼす背景遺伝子のポジショナルクローニングを5,000系統が目標となっており，極めて大規模なプロ試みた。しかし，QTL 解析により複数の候補領域がジェクトであると言える。

あることまでは確認できたものの，責任遺伝子の同定

KO マウス解析から見えてきた遺伝的背景の重要性には至らなかった。まだマウスゲノム配列が未解読の時代であったことから，シークエンス技術やデータベースが充実した現在に比べるとその労力は比 にな

KO マウスプロジェクトの中で昨年発足した国際マらず，逆遺伝学（reverse genetics）を主戦場とする

ウス表現型解析コンソーシアムでは網羅的な表現型解

我々に は 荷 が 重 い プ ロ ジ ェ ク ト で あ っ た。最 近，析が進行中であるが，この中では C57BL/6N を標準UTHSC の Gu らの研究グループにより，岩倉研で樹系統とするなど，世界的には C57BL/6という近交系立した BALB/cA 背景の IL‑1ra KO マウスを用いて，マウスに偏向した解析が進められようとしている。しDBA/1背景（コラーゲン誘導関節炎感受性であるが，かしながら，近交系マウスで解析する以上，特定の遺関節リウマチは自然発症しない系統）を対照とした背伝子セットの中での機能を解析しているに過ぎない。

景遺伝子のポジショナルクローニングの試みがなされそれに対して私たちは，古典的な実験動物学の立場ており，関節炎発症を規定する責任遺伝子が明らかにから C57BL/6以外の遺伝的背景でも解析を行うことなりつつある 。マウス系統一塩基多型（SNP）デーを基本として研究を進めてきた。そのきっかけとなっタベースを駆使して研究が行われており，この10数年たのは，岩倉教授が開発した 関 節 リ ウ マ チ モ デ ルの研究基盤の充実ぶりには感服する思いである。

HTLV‑I Tg マウスであった。HTLV‑I Tg マウスはこのように KO マウスの解析において遺伝的背景

当初 C3H /HeN で 作 製 さ れ た が，関 節 リ ウ マ チ のは極めて重要である。この点に注目し，日本版 KO発症率は40％程度であっ た。し か し，C57BL/6J，マウスプロジェクトの中で熊本大 CARD のグループ

BALB/cA にそれぞれ戻し交配を行ったところ，C57は，日本オリジナルのリソースである日本産野生マウ

BL/6J では全く発症せず，逆に BALB/cA では80％

ス MSM /Ms 系統の利用をすることを進めており，以上の発症率となるなど，疾患発症は遺伝的背景の既に ES 細胞の樹立も完了している 。M SM /Ms は影響を強く受けることを見出した 。同様に IL‑1ra

一般的な実験用マウスと遺伝的に大きく異なっており，

KO マウスは，当初作製・解析した129 B6交雑や C57新しい遺伝子機能の発見に有用であると考えられていBL/6J 背景では削痩 や脱肛の自然発症といった表る。しかしながら，MSM /M s は俊敏かつ攻撃的であ現型であるのに対して，BALB/cA 背景ではリウマりハンドリングが極めて難しいことから，一般の研究チ様関節炎 や血管炎 ，乾癬様皮膚炎 といった者への普及は困難であることも予想されている。

多彩な自己免疫様疾患を自然発症する（図３） 。また，感染に対する感受性も系統によって大きく異なり，私たちの作出した IL‑17A/F 二重欠損マウスは黄色

今後の KO マウスの展望：コンディショナ
ル KO

ブドウ球菌の日和見感染により鼻膿瘍を形成するがIKMC においては，網羅的にコンディショナル KO（図４） ，これは129 B6交雑や C57BL/6J 背景の場マウスを作ることを標榜している 。コンディショナ合であり，BALB/cA 背景では黄色ブドウ球菌に対ル KO とは，Cre/loxP システムに代表される配列特する感受性はやや高くなるものの膿瘍形成には至らな異的組換え酵素（SSR：site‑speciﬁc recombinase）い。

を用いて，細胞種特異的あるいは時期特異的に標的遺このように，背景遺伝子により表現型は大きく異な伝 子 で 組 換 え を 起 こ さ せ KO す る 方 法 で あ る（図る場合があり，C57BL/6背景でのみの解析で，遺伝５） 。すなわち，特徴的な８塩基のコア配列の両側子の機能を評価してしまうのは早計である。ちなみに，に13塩基のパリンドローム様 繰 り 返 し 配 列 を 持 つ6

信州医誌 Vol. 61

ノックアウトマウスとバイオリソース⒜⒝

図３ C57BL/6J および BALB/cA 背景の IL‑1ra KO マウス⒜ C57BL/6J背景では削痩および脱肛が認められ，⒝ BALB/cA背景ではリウマチ様関節炎と乾癬様皮膚炎を自然発症する。

⒜

⒝

WT

IL‑17A/F KO

図４ IL‑17A/F KO マウスにおける黄色ブドウ球菌の日和見感染
129 B6交雑系統の IL‑17A/F KO マウスに発症した⒜ 鼻部腫脹と⒝ その膿瘍病変部位から分離された黄色ブドウ球菌

図５ Cre/loxP システムを用いたコンディショナル KO の原理
loxP 配列を標的遺伝子のエキソンを挟むように挿入したコンディショナルアレルに Cre リコンビナーゼが作用すると組換えが生じ，KO アレルが生み出される。
No. 1, 2013

7

角 田茂

loxP 配列を標的遺伝子の必須エキソンを挟むようにまた，Cre リコンビナーゼ以外にもほ乳類細胞内で挿入（コンディショナルアレル）しておくと，バクテ

機 能 す る SSR が 次々開 発 さ れ て お り，Flp/FRT，リオファージ P1由来 SSR Cre リコンビナーゼを発現

Dre/rox システム が既に実用化されている。また，したときのみ組換えが生じ，KO 状態になる。また，

φC31インテグラーゼ/偽 attP 部位による部位特異的エストロジェン受容体のリガンド結合部位（変異型）遺伝子挿入システム も応用価値が高いと思われる。との融合型 Cre を用いることにより，合成ステロイ

これらの技術を組み合わせることにより，in vivo でドを投与したときのみ Cre 組換え酵素が核移行し，より詳細に遺伝子機能を評価できると期待される 。

時期特異的に KO 遺伝子座が生じる誘導型システムも開発されている 。なお，こうしたコンディショナ
ル KO マウスを用いた実験の鍵は，いかに自分の実今後の遺伝子改変動物の展望：第二世代遺伝
子ターゲティング技術の開発

験目的に適合した Cre ドライバーマウスを入手する

相同組換え技術に基づいた標的遺伝子変異の場合，かに掛かっているが，世界中でデータベース化が積極

基本的にはES細胞を介さないとKO動物の作製はでき的に進められており ，以前より格段に入手し易い状ない。しかし近年，ZFNs（Zinc‑Finger Nucleases）

況になりつつある。

を用いた全く異なる方法論による標的遺伝子破壊法がさらに近年，Cre リコンビナーゼや loxP 配列の改

ほ乳類動物において実用化された（図６） 。

良が精力的に進められており，Ｎ末端とＣ末端を分割

Cys ‑His Zinc‑Finger はおよそ30アミノ酸からなし制御配列を付加した Split‑Cre を別々のプロモーり Zn 依存的に３塩基対（5ʼRNN）を認識するドターによって発現させることによりダブルポジティブ

メインで，ほ乳類の場合，全遺伝子の約２％（4,000細胞でのみ組換えを起こさせる方法

や，マイクロドメイン/700タンパク）に存在することが知られていサテライト不安定性を利用した体細胞突然変異モザイる。これら Zinc‑Finger ドメインを認識配列ごとにク発現型 Creが開発されたほか，変異 lox 配列を整理し，制限酵素（FokI）と組み合わせることによ利用したモザイク発現系 など，多様な研究への応用り，標的配列特異的制限酵素 ZFNs を作り出すこが期待されている。とができるようになった。これを細胞内に導入すると⒜⒝

図６ ZFNs の原理と受精卵へのマイクロインジェクション法⒜ ZFNs の原理。３塩基対ずつ認識する Zinc‑ﬁnger ドメイン（Ｆ1〜3）と Nuclease ドメインをタンデムに配置した人工制限酵素を作製することにより標的遺伝子座に二重鎖切断を引き起こさせる。⒝２種類の ZFNs
mRNA を受精卵にマイクロインジェクションすることにより遺伝子破壊動物を作出する。
8

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ノックアウトマウスとバイオリソース

標的配列部位に二重鎖切断を導入し，その修復過程でりも使い勝手がよいと考えられ，今後利用が拡大して変異（欠損）を導入することができる。そして，受精いく可能性が高いと考えている。

卵への ZFNs mRNA のマイクロインジェクションができれば標的遺伝子変異動物を作出することができる

上述した技術以外にも，点変異やレポーター遺伝子ようになり，マウス以外の動物での KO 動物作出にを導入するノックイン技術や，双方を組み合わせたコ大きく道を開くことになった。

ンディショナルノックイン技術など ，発生工学技術

近年，さらに塩基認識ドメインが１塩基認識となっの進歩により，さらに複雑なことが可能となってきてている植物病原性細菌 Xanthomonas 由来の TAL‑いる。そして一般の研究者にとっても作製あるいは入eﬀector ドメインを用いた TALENs（TAL eﬀector

手が格段に容易となっている 。ES 細胞が生み出しnucleases）標的遺伝子破壊法も開発されている 。

た「KO マウス」は，生命科学・基礎医学分野で今後TALENs は認識配列に制約がないことから ZFNs よますます重要な役割を担うようになると思われる。

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10

信州医誌 Vol. 61

ノックアウトマウスとバイオリソース
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2012（Ｈ 24.12.17 受稿）

No. 1, 201311