茨城県産業技術イノベーションセンター研究報告第 46 号

納豆菌の発酵・ 熟成に関わる遺伝子の機能解析と制御に関する試験研究事業（第 2 報）久保 雄司 *
１. はじめに納豆の賞味期限は製造後 10 日程度で設定されることが多く，作り置きが難しい製品であるため，メーカーは季節や時期を問わず生産を続けなければならない。
賞味期限を既存製品よりも長く設定できる技術を確立すれば，メーカーの製造計画にゆとりが生じて休日や勤務時間帯などの面で従業員の雇用条件が改善される
ことにより，企業価値の向上が期待される。
また，納豆は茨城県の特産品として広く認知されており，土産ものやギフトとしての製品も多く，賞味期限延長技術が確立すれば，土産もの等の製品開発の促進にも繋がる。
本研究では，納豆の発酵・熟成速度を制御して賞味期限延長をめざす。

中川 力夫 *

いことも明らかになった 1)。そこで，本研究では，プロテアーゼではなくペプチダーゼに着目して，納豆の品質保持との関係性を明らかにすることとした。

３．研究内容3.1 ペプチダーゼ遺伝子破壊納豆菌株の作成
3.1.1 ターゲット遺伝子の破壊とクローニング
既報 2) のとおり，遺伝子破壊のターゲットは，pepA,yflG, yqjE, ywaD の 4 遺伝子とした。yqjE 及びywaD を破壊した納豆菌株は，昨年度に作成が完了しているため，残り 2 遺伝子を破壊した納豆菌株作成を行った。
ライゲーション反応とコンピテントセルへの形質転換は，In-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ)を使用した。遺伝子組み換えのゲノム受容体には，宮城野
２．目的菌を使用した。宮城野菌のゲノム DNA を鋳型として，本研究では，納豆の発酵及び熟成に大きく関与する
表 1 に示したプライマー(No.1+No.2, No.3+No.4,と思われる酵素をコードする遺伝子の発現を制御した
No.7+No.8, No.9+No.10)を利用して PCR を行いターゲ際の納豆への影響を評価して各遺伝子の機能解析を進ット領域を増幅した。抗生物質耐性マーカーとして，める。併せて，発酵及び熟成に関与する遺伝子の発現pDG17263)を鋳型にして，スペクチノマイシン耐性カセを制御することで納豆の熟成速度を適度に緩やかにし， ット(SpcR)を表 1 に示したプライマーセット
既存の納豆の2倍となる20日程度まで賞味期限を延長(No.5+No.6, No.11+No.12)で増幅した。PCR 産物はアできる技術を確立する。納豆は製造後も菌が生きた状
ガロースゲル電気泳動で結果を確認すると共に，目的態で存在し，酵素も穏やかに働き続けるため，貯蔵流バンドを切り出し，Nucleo Spin ExtractⅡ通の過程で熟成が進み続ける。納豆菌が生産する酵素(MACHEREY-NAGEL)にて精製した。のうち，納豆の発酵熟成には様々な酵素が相互作用しPCR で増幅した遺伝子の上流部分と下流部分の間にながら働いており，納豆の熟成速度を制御するためにマーカーとなる抗生物質耐性カセットを挟んで連結しは，納豆の発酵及び熟成に関与する主要な酵素の影響た。反応はベクターと 3 つの PCR 産物を 1 ステップでを精査する必要がある。
繋ぎ，コンピテントセルに導入して，クローニングす納豆の品質保持に関わる大きな要因として，納豆表る方法で実施した。
面に生じるチロシンの結晶の問題があることが知られ【クローニング手順】ており，当センターでは，これまでの研究でチロシン①HincⅡ処理した pKF19 ベクター(50ng)と，モル比での析出が起こりにくい納豆菌の開発及びその納豆菌でベクターの 2 倍量の PCR 産物，2μl の 5×In-Fusion HD製造した納豆の評価を行ってきた。チロシンの析出とEnzyme mix(TAKARA BIO)を混合し，滅菌水で全量を納豆菌が持つタンパク質分解酵素の働きは非常に深く10μl とした。
かかわっており，大豆タンパク質の分解速度を制御す②50℃で 15 分間加温した後，2.5μl の反応液と 50μlることが出来れば，チロシンの析出を抑制でき，大豆の Stellar Competent Cells(タカラバイオ)を混合し，タンパク質の分解速度と納豆の品質保持が密接に関わ直ちに氷上に移して，30 分間保持。っていることを確認した。
③42℃で 45 秒間インキュベートして，氷上で 1 分間冷
これまでの研究では，納豆菌が生産する主要プロテ却後，37°C で予温しておいた 500μl の SOC 培地に反アーゼであるアルカリプロテアーゼと中性プロテアー応液を全量添加して 37°C で振盪しながらインキュベゼをターゲットに試験を行ったが，アルカリプロテアート。
ーゼ活性を抑制すると納豆の発酵を抑制することは可④1 時間後，30 μg/ml のスペクチノマイシンを添加し能になるものの，やや抑制が強すぎること，また通常た LB 寒天培地に 200 μl ずつ塗布し，37°C で 24 時の納豆よりも糸引きが極端に弱くなることが問題点と間インキュベート。
して残った 1)。また，中性プロテアーゼ活性を単独で⑤ホワイトコロニーを選択して LB液体培地(30 μg/ml抑制した場合は，日持ちへの影響がほとんど見られなのスペクチノマイシン添加)に植菌し 37°C で振盪培*

地場食品部門茨城県産業技術イノベーションセンター研究報告第 46 号

養 後 ， Mini Plus Plasmid DNA Extraction System(Viogene)を用いてプラスミドを精製。
⑥精製したプラスミドの内，pKF19-pepA::SpcR は Sma
Ⅰ (NEW ENGLAND BioLabs) で ， pKF19-yflG::SpcR はEcoRⅠ(NEW ENGLAND BioLabs)で消化し，次からの形質転換に使用。
表1 PCRに使用したプライマー一覧
No.

上段：オリゴ名
下段：配列

mer

1

pepA +50F1(In-Fusion pKF19)
5'-GCATGCCTGCAGGTCCAAATACCCATTACGTTAGG

352

pepA +852R1(In-Fusion pKF19)
5'-TCCGACGACGTCTTCCCATT

203

pepA +858F2(In-Fusion pKF19)
5'-CGGGAAAGGAATTACCTTTGACAC

244

pepA +1570R2(In-Fusion pKF19)
5'-GGATCCTCTAGAGTCCTTCTTCCAATGTAAATCGC

355pepA +M69221F3(In-Fusion)
5'-GGAAGACGTCGTCGGAATCGATTTTCGTTCGTGA

346pepA +M69221R3(In-Fusion)
5'-GGTAATTCCTTTCCCGCATATGCAAGGGTTTATTG

357yflG -82F1(In-Fusion pKF19)
5'-GCATGCCTGCAGGTCTTCCCAGGCCCGTGTGTTTC

358yflG +339R1(In-Fusion pKF19)
5'-ACCGAGCACAAATGAGATGCCTG

239yflG +340F2(In-Fusion pKF19)
5'-GAAGGAGAAGAACGCCTTCA

2010yflG +839R2(In-Fusion pKF19)
5'-GGATCCTCTAGAGTCCTGTGCATTGCAAGACCTCCTC

3711yflG +M69221F1.1(In-Fusion)
5'-TCTCATTTGTGCTCGGTATCGATTTTCGTTCGTGA

3512yflG +M69221R1(In-Fusion)
5'-GCGTTCTTCTCCTTCCATATGCAAGGGTTTATTGT

353.1.2 degQ破壊株(NAFM73)への形質転換
degQ を破壊してコンピテンスを高めた B.subtilis
NAFM73(△degQ::ErR)（国立研究開発法人 農業・食品
産業技術総合研究機構 食品研究部門 微生物機能ユニットから提供）の形質転換を行った。
リンコマイシンを 12.5 μg/ml 及びエリスロマイシンを1 μg/mlとなるよう添加した SPⅡ培地 4)にNAFM73株を植え，37℃で 24 時間振盪して前培養を行った。前培養液を新たな SPⅡ培地に植え継ぎ，600 nm の吸光度が 0.6 程度になったところで，培養液をエッペンチューブに回収した。2,800 ×g，20℃で 10 分間遠心分離し，菌体を含む液を 200 μl 程度残して上清を廃棄した。ここに 3.1.1 で調製したサンプルを約 1 μg になるよう添加してピペットで良く懸濁し，滅菌試験管に移し，37℃，150 回/分で 30 分間振盪培養した。500 μlの LB 液体培地を添加し更に 1 時間振盪培養を行った。
300 μg/ml のスペクチノマイシンを添加した LB 寒天培地に 200 μl ずつ塗布し，37℃で 24 時間培養した。
順調に生育したコロニーを 300 μg/mlのスペクチノマイシを添加した LB 寒天培地及び液体培地に植菌して培養し，ゲノム DNA を精製した。

3.1.3 宮城野菌への形質転換
3.1.2で精製したゲノムDNAを用いて，最終的なターゲットである宮城野菌株に形質転換を行った。形質転換の方法は，SPⅡ培地にスペクチノマイシンを添加しないこと，SPⅡ培地で培養する株がNAFM73ではなく宮城野菌であること以外は3.1.2と同じである。pepAとyflGを破壊した，それぞれの試験区において生育の見られた菌株を単離し，遺伝子組み換えのターゲットとした領域について，表1のプライマー(pepA : No.1+No.4,yflG : No.7+No.10)を用いてPCRを行った後，アガロー
スゲル電気泳動にて結果を確認した。
3.2 合成ペプチド基質への分解活性
4箇所のペプチダーゼ遺伝子を破壊した宮城野菌株(△yqjE，△ywaD，△yflG及び△pepA)と，対象としてプロテアーゼ遺伝子を破壊した宮城野菌株(△aprE及び△nprE)1)，及び非遺伝子組み換えの宮城野菌株(WT)の合計7株を試験に供した。
基 質 に は ， 3 つ の 合 成 ペ プ チ ド （ ① L-Proline
p-nitroanilide trifluoroacetate salt(Pro-pNA), ②
Glycyl-L-proline p-nitroanilide hydrochloride(Gly-Pro-pNA), ③L-Leucine p-nitroanilide(Leu-pNA)）を使用し，試験菌株の培養上清(粗酵素液)が基質に対し，どの程度の分解活性を示すか測定を行った。Pro-pNA及びGly-pro-pNAは滅菌水に，Leu-pNAは50%メタノールに溶解し，1mMの溶液を調製した。
粗酵素液となる培養上清は，必要な抗生物質を添加した30mlのLB培地中，37℃で1晩，振盪しながら前培養した後，同様に新たな30mlのLB培地中で18時間培養し，遠心分離して調製した。
200μlの1M Tris-Cl(pH7.5)，1,100μlの滅菌水，200μlの培養上清及び500μlの基質を混合して反応液とした。
分光光度計にスターラーバーを入れたセルをセットし，セルを37℃に温調した。
セル内で反応液を調製し，410nmで15分間測定を行った。測定は3連で実施し， WTを1とした場合の比で基質に対する分解活性を評価した。
3.3 ペプチダーゼ遺伝子破壊納豆菌株での納豆試作
国産のスズマルを0.18MPaで23分蒸煮した後，容器に入れて121℃で15分オートクレーブすることで完全滅菌した。種菌は，4株のペプチダーゼ遺伝子破壊宮城野菌株(△yqjE，△ywaD，△yflG及び△pepA)及び対照として非遺伝子組み換えの宮城野菌株(WT)を使用した。
それぞれの菌株をLB培地中，37℃で振盪培養後，滅菌水で600nmの吸光度が0.02程度になるよう合わせた。蒸煮大豆をPSP容器に50g充填し，種菌の水溶液を500μlずつ添加した。被膜を掛けた状態で良く混合し，42℃の恒温器中で18時間発酵した。発酵終了後，4℃で20日間保存し，チロシンの析出やアンモニア態窒素の発生量を測定するためのサンプルとした。
3.4 ペプチダーゼ遺伝子破壊納豆菌株を使用した納豆の評価
3.3の納豆について，4℃で20日間保存した後，目視によるチロシンの析出の有無及びかき混ぜた際の糸引茨城県産業技術イノベーションセンター研究報告第 46 号

きの強さを評価した。また，納豆の貯蔵中に増加するアンモニア態窒素の量を，アンモニアテストワコー(和光純薬)を使用して測定した。サンプルとなる納豆は，30メッシュの裏ごし器で2回裏ごしし，約100mgを秤量した後，50mlにメスアップした。この素溶液を試験サンプルとして用いた。尚，測定のプロトコルは添付のマニュアルに従い，3連で測定を実施した。

アガロースゲル電気泳動で確認すると計算通りの大きさのPCR産物がシングルバンドで得られ(図2)，pepA及びyflGを破壊した納豆菌株が完成したことを確認した。
miyagino(△yflG::SpcR) miyagino(△pepA::SpcR)bp

４．研究結果と考察
4.1 ペプチダーゼ遺伝子破壊株の作成
3.1.1で実施したクローニング結果の確認を行った。
計画通りのクローニング産物が得られていれば，pepAを導入したベクターは，約4,920bpとなるはずである(表1のプライマーセットのNo.1+No.2から約800bp,No.3+No.4から約720bp，スペクチノマイシンカセットが約1,200bp，pKF19 K-2が約2200bpなので，合計で約4,920bp)。一方の yflG を導入したベクターは，約4,310bpとなるはずである(表1のプライマーセットのNo.7+No.8から約420bp, No.9+No.10から約490bp，スペクチノマイシンカセットが約1,200bp，pKF19 K-2が約2200bpなので，合計で約4,310bp)。
アガロースゲル電気泳動で確認すると計算通りの大きさのPCR産物がシングルバンドで得られた(図1)ことから，目的のクローニング産物が得られていることを確認した。

bp
12,00010,000
8,000
6,000
4,000
3,000

2,000
1,500

1,000500

図1 クローニング結果の確認
宮城野菌へ形質転換を行った際にも，最終目的株が得られているか否かについて，ターゲット遺伝子のPCRとアガロースゲル電気泳動で確認した。先述のとおり，△pepA株は，表1のプライマーセットのNo.1+No.4で増幅した場合，約2,720bpとなるはずである(表1のプライマーセットのNo.1+No.2から約800bp, No.3+No.4から約720bp，スペクチノマイシンカセットが約1,200bpなので，合計で約2,720bp)。一方の△yflG株は，表1のプライマーセットのNo.7+No.10で増幅した場合，約2,110bpとなるはずである(表1のプライマーセットのNo.7+No.8から約420bp, No.9+No.10から約490bp，スペクチノマイシンカセットが約1,200bpなので，合計で約2,110bp)。

12,00010,000
8,000
6,000
4,000
3,000
2,000
1,500
1,000

500

図2 宮城野菌への形質転換結果の確認
このことから，昨年度作成した△yqjE及び△ywaD株と共に，納豆の日持ち向上に寄与するか否かの試験に供した。
4.2 合成ペプチド基質への分解活性ペプチダーゼ遺伝子を破壊した宮城野菌株(△yqjE，△ywaD，△yflG及び△pepA)と，対象としてプロテアーゼ遺伝子を破壊した宮城野菌株(△aprE及び△nprE)1)，及び非遺伝子組み換えの宮城野菌株(WT)の合計7株全ての試験サンプルで， 600nmの吸光度を測定すると最も生育の遅いpepA破壊株で2.13，最も生育の良いaprE破壊株で2.67となり，特に生育速度に大きな差や生育が不良な株は無かったが，比活性を算出する際， WTの菌数に合わせて結果を補正した。
試験した4株全ての破壊株で合成基質①Pro-pNA, ②
Gly-Pro-pNA,には分解活性を示さず，③Leu-pNAに対してのみ分解活性を示すことが確認された。
3つの合成ペプチド基質に対する試験菌株の活性の測定結果を図3に棒グラフで示した。結果は，WTの活性を1とした場合における，それぞれの株の活性を比で表している。また，菌の増殖具合を示す，O.D.(600nm)の結果を図3に折れ線グラフで示した。
WTと比較して，程度は互いに異なるもののLeu-pNAに対して分解活性が抑制される傾向にあることが確認されたが，試験結果のバラつきは大きかった。唯一，△ywaD株でLeu-pNAの分解活性が極端に低くなっており，納豆のタンパク質分解が抑制されることで発酵終了後の品質の変化が抑制され，賞味期限延長に寄与することが期待された。

茨城県産業技術イノベーションセンター研究報告第 46 号
比活性O.D. (600nm)
31.50
1.25

2.51.00

20.75

1.50.5010.25

0.50.00△ywaD △yqjE △yflG △pepA △aprE △nprE WT0試験菌株

図3 遺伝子破壊株のLeu-pNAに対する分解活性4.3 ペプチダーゼ遺伝子破壊納豆菌株を使用した納豆の評価
3.3の納豆について，発酵終了直後の納豆の見た目，糸引きを確認したところ，大豆表面に均一に菌膜が張り，十分な糸引きが確認されたことから，試験サンプ
ルとして申し分ないと判断した。
4℃で20日間保存した後，目視によるチロシンの析出の有無，かき混ぜた際の糸引きの強さ及びアンモニア態窒素含量を測定した結果を表2に示す。
試験に供した4株全てのペプチダーゼ破壊納豆菌株
で，量の多少はあるもののアンモニア態窒素の量がWTよりも増加する結果となった。かき混ぜた際の粘りの強さは，△yqjE株でやや弱く感じた以外はWTと遜色なかったものの，大豆表面のチロシンの析出は，多くなっている印象だった。合成基質であるLeu-pNAに対する分解活性は△ywaD株で大幅に低下していたため，大豆由来のタンパク質の分解が抑制され，アンモニア態窒素の生産減少を始めとして，賞味期限の延長に寄与することを期待したが，期待とは異なる結果となった。
表2 アンモニア態窒素含量，チロシンの析出及び糸引きの強さの評価結果
菌株

アンモニア態窒素含量
チロシンの析出(mg/100g 納豆)

糸引きの強さ△ywaD

253 ± 8++

++

△yqjE

278 ± 7++

+

△yflG

219 ± 3++

++

△pepA

237 ± 1++++WT

205 ± 2+++

５．まとめ
5.1 ペプチダーゼ遺伝子破壊納豆菌株の作成
宮城野菌へ形質転換を行った後，最終目的株が得られているか否かについて，ターゲット遺伝子のPCRとアガロースゲル電気泳動で確認した。アガロースゲル電気泳動の結果，計算通りの大きさのPCR産物がシングルバンドで得られた(図2)ことから，pepA及びyflGを破壊した納豆菌株が完成したことを確認した。
5.2合成ペプチド基質への分解活性
ペプチダーゼ遺伝子を破壊した4株の宮城野菌株(△yqjE，△ywaD，△yflG及び△pepA) は，合成基質①Pro-pNA, ②Gly-Pro-pNA,には分解活性を示さず，③Leu-pNAに対してのみ分解活性を示すことが確認された。また，△ywaD株でLeu-pNAの分解活性が大幅に低くなっており，納豆のタンパク質分解が抑制されることで発酵終了後の品質の変化が抑制され，賞味期限延長に寄与することが期待された。
5.3 ペプチダーゼ遺伝子破壊納豆菌株を使用した納豆の評価
ペプチダーゼ遺伝子を破壊した4株の宮城野菌株(△yqjE，△ywaD，△yflG及び△pepA)で試作した納豆を4℃で20日間保存した後，目視によるチロシンの析出の有無，かき混ぜた際の糸引きの強さ及びアンモニア態窒素含量を測定したところ，全体にアンモニア態窒素の量がWTよりも増加した他，大豆表面のチロシンの析出は，多い印象であった。合成基質であるLeu-pNAに対する分解活性は△ywaD株で大幅に低下していたた
め，賞味期限の延長に寄与することを期待したが，期待とは異なる結果となった。
６．今後の課題
引き続き，納豆菌の遺伝子の中で，賞味期限延長に寄与する領域の特定を進める。同時に，紫外線処理などにより，変異を誘発し，賞味期限延長を可能にする納豆菌の育種を進める。
７．謝辞
本研究の研究推進に御協力頂きました国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 食品研究部
門 微生物機能ユニットの木村啓太郎氏並びに酵素機能ユニットの舟根一美氏(現山梨大学)に感謝致します。
８．参考文献1) 久保雄司, 中川力夫, 納豆菌ファージ耐性納豆菌やチロシンが析出しにくい納豆菌に関する研究, 茨城
県 工 業 技 術 セ ン タ ー 平 成 27 年 度 研 究 報 告 , 44,45-48(2016)2) 久保雄司, 中川力夫, 納豆菌の発酵・熟成に関わる遺伝子の機能解析と制御に関する試験研究事業, 茨城
県 工 業 技 術 セ ン タ ー 平 成 28 年 度 研 究 報 告 , 45,17-20(2017)3) Guerout-Fleury, A., Shazand, K., Frandsen, N.
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4) Albano, M., Hahn, J., and Dubnau, D., Expressionof competence genes in Bacillus subtilis. J.
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