研究速報

成蹊大学理工学研究報告
J. Fac. Sci. Tech., Seikei Univ.
Vol.44 No.２ (2007) pp.5-7（研究速報）

抗癌剤 5-FU 感受性遺伝子群の探索
内田麻里恵*1, 久富

寿*2

5-fluorouracil-inducible mRNAs in a colorectal cancer cell line
Marie UCHIDA*1, Hisashi HISATOMI*2(Received September 26, 2007)

１．背 景各タンパク質を翻訳する mRNA の発現量を測定し，タンパク質発現量との比較をおこなった。

代表的な抗癌剤であるフルオロウラシル(5-FU)は，腫２．材料と方法

瘍細胞内でウラシルと同じ経路でフルオロデオキシウリ1)ジル酸(F-dUMP)に転換される 。F-dUMP は dUMP とチミジル酸合成酵素(TS)からデオキシチミジル酸(dTMP)

1.0 µM の 5-FU(協和醗酵)に 24，48，72 時間暴露したに合成される反応と拮抗して，DNA 合成を阻害する。まヒト大腸癌細胞株 WiDr (約 106 個) を-20℃の 70 %エタ

た，同時に RNA の合成も阻害する。しかし，正常細胞ノールで固定し，Propidium iodide(PI) 染色後，フローサの DNA および RNA 合成も阻害してしまうため，吐き気，イ ト メ ト リ ー (Epics XL / XL-MCL SystemIIv3.0

めまい，全身倦怠感などの重篤な副作用が誘発される。

BECKMAN COULTER)にて細胞周期を測定した(Fig.1)。

これら作用機序で機能するいくつかの因子を標的にし，また，同様な培養条件で得られた 120 µL の細胞懸濁液

その活性を抑制または促進させる事ができれば副作用の(ヒト大腸癌細胞株 WiDr 約 106 個)に ISOGEN 700 µL，軽減や投薬効果の向上への道が開かれる。テーラーメー
Table1. Primers for semi-quantification of each mRNA.

ド医療の第一歩は既存の薬剤の投与量や投与期間を患者ごとに細かく設定することであるため，既存薬が誘導すmRNA exon

る細胞内シグナルを同定することは極めて重要な研究対Hsp60

象である。現在，TS を含む多くの薬剤の標的となる細胞内シグナルの解析研究が盛んに行われている 2-5)。このよ

Hsp70

うな状況下で我々は 5-FU によって発現量が変動するタ
P4HB

ンパク質を４種類 (heat shock 60 kDa protein 1(Hsp60)，
heat shock 70 kDa protein 5 (Hsp70)，thyroid hormone

LDH-A

binding protein precursor (P4HB)，Lactate dehydrogenase
A(LDH-A))同定し，本研究報告で発表した 5)。報告では

GAPDH

Hsp60，Hsp70，P4HB タンパク質は 5-FU への暴露時間

sequence

65’-CTCTAAGTACACTCGTCTTGAATA-3’85’-GGTCAATCCCTCTTCTCCAAAC-3’65’-TGTGCTCTCTCTGGTGATCAAGATA-3’85’-GATGATTGTCTTTTGTCAGGGGTC-3’15’-AAGTACCTGCTGGTGGAGTTCT-3’25’-TGTATATTCCTTGGGGGAAGCC-3’

55’-TTCACAAGCAGGTGGTTGAGAG-3’

75’-AAGACATCATCCTTTATTCCGTAAA-3’

6-7 5’-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3’
85’-TCAGGTCCACCACTGACACGTT-3’bp
149
224
228
175
313の経過とともに増加する傾向があり，逆に LDH-A タン

クロロホルム 120 µL を添加後，撹拌した。その後 4℃,

パク質は時間経過に伴い減少傾向が確認された。これら

12000 rpm, 15 分間遠心分離し，上澄み液を 700 µL イソ

４種類のタンパク質は 5-FU の代謝経路には関与しないプロパノールに添加し，total RNA をエタノール沈殿にて因子であるため，薬剤投与による治療効果を伴った細胞析出させた。析出した total RNA を 70 %エタノールで洗内変動とは別の影響を誘導している可能性がある。本報浄し，精製した。random primer にて cDNA を合成後，30

告は，これら 5-FU 投与により発現が誘導されたタンパµL の PCR Mixture(10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 50 mM KCl ,ク質における転写活性の調査を目的とした。そのため，

1.5 mM MgCl2, 0.25 mM dNTP , 0.02 U/µL Taq DNA*1

Polymerase (Roche Diagnostics, Germany), 0.67 pM Forward*2：工学研究科応用化学専攻博士前期課程：物質生命理工学科准教授

Primer , 0.67 pM Reverse Primer)用いて PCR 反応を 40 サ－5－Table2. Up-or down-regulated factors after 5-FU treatment.

イクル行った(94℃/25 秒，60℃/30 秒，72℃/25 秒)。反応終了後，PCR 増幅産物を 2 %アガロースケゲルに供し，Hsp60

Hsp70

P4HB

LDH-A

電気泳動を行った(Fig.2)。なお，PCR primer の塩基配列

proteinup

up

up

down

は，National Center for Biotechnology Information(NCBI) かmRNAup

no change

no changedownら各 mRNA の完全長配列を得た後，各 mRNA に特異的な配列を BLAST Search の結果を考慮して決定した(Table４．考 察1)。なお，内部標準物質として glyceraldehyde-3- phosphate
dehydrogenase (GAPDH) mRNA を検出した。

本実験における 5-FU 投与量および投与期間の妥当性
は，アポトーシスが誘導されずに細胞周期が停止してい３．結 果ることから証明された。5-FU によって細胞内の DNA 合成が阻害され，S 期に十分量の DNA が複製されないまま1.0 µM 5-FU の投与により，細胞の G2/M 期への同調がG2/M 期に移行し，細胞増殖の停止が誘導されたことが確 認 さ れ た (Fig. １ ) 。 ま た ， い ず れ の 投 与 時 間 で も示唆された。

Apoptosis は確認されなかった。また，Hsp60，Hsp70，

本実験では，5-FU 投与によりタンパク質の発現量とP4HB および LDH-A mRNA の 5-FU 投与による量の変化

mRNA の発現量の変動に差異が確認されたものが発見

を Fig.2 に示した。5-FU 投与からの時間経過に伴い Hsp60

された。Hsp60 および LDH-A では mRNA 量の変動が，mRNA 量のみが減少傾向を示した。一方，LDH-A mRNAそのままタンパク質量の変動に直結しているが，Hsp70

量は時間経過に伴い増加傾向を示した。Hsp70 およびおよび P4HB では mRNA 量に依存しない経路でタンパクP4HB mRNA 量に顕著な差異は確認されなかった(Table

質量が増加している。つまり，この結果は転写レベルで2)。同様の実験を PCR 反応 25 サイクルで確認したとこの変動と翻訳レベルでの変動に差異がある因子が存在すろ，同じ傾向の結果が得られた(data not shown)。なお，ることを意味する。本研究結果は，各々の因子の発現量内部標準物質である GAPDH mRNA は全てのサンプルか変化が転写レベルだけで行われていない事を明らかにし，らほぼ等量検出された(data not shown)。

5-FU による細胞内シグナル伝達の多様性が推測された。
また，同じ種類のストレス応答タンパク質である Hsp60
および Hsp70 が，一方は転写レベルで，他方は翻訳レベルで発現量を調節していることは興味深い。ストレス応
答タンパク質は，その緊急性 7)から翻訳レベルの発現量調節が一般的と考えられているが，Hsp60 に関しては転写レベルの発現調節機構も存在することが明らかとなった。
現時点では，本実験で対象とした４種類の因子の 5-FU投与による副作用への影響は不明である。しかし，本実験のように，投薬による細胞内シグナル因子の発現調節の解明により，副作用の軽減をはじめとする新たな目的を伴った薬の使用方法が可能となる。それはまさに，テーラーメード医療への応用に他ならない。今後は遺伝子導入法や RNAi 8,9) などを用いて Hsp60，Hsp70，P4HB おFig.1. Cell cycle analysis of WiDr cells after 5-FU treatment.
WiDr cells were treated with 1.0 µM 5-FU for 0, 24, 48 or
72 h. The cells arrest in G2/M following 5-FU treatment.

よび LDH-A の発現を調節し，5-FU 投与による細胞内変化を調査する必要がある。さらにこれら因子の挙動が細胞周期の停止に依存しているわけではないことを証明するために，これら４種類のタンパク質や mRNA の発現量の変化を別の薬剤で細胞周期を停止させて測定する必要もある。

Fig.2. Time course of several mRNA expresion.
Detection of mRNA for Hsp60, Hsp70, P4HB andLDH-A using RT-PCR analysis. At time points, cells weretreated with 1.0 µM 5-FU. M, molecular weight marker.

本実験で明らかとなった，抗癌剤 5-FU 投与おける転写あるいは翻訳レベルでの発現調節の存在は，同時にこ－6－れら因子の発現を促進あるいは抑制する場合において，ただ単純に転写のみを促進あるいは抑制すれば良いわけではないことを意味する。従来の概念に基づいた発現調
節では細胞内シグナルの変動を再現できないことを，実験データとして示したことも本研究の意義であると考える。

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