34

浦上財団研究報告書

Vol.26（2019）＜平成 28 年度助成＞

バイオフィルム剥離効果が高い香辛料抽出物の探索上田晃弘（広島大学大学院 生物圏科学研究科）

緒言

マスタードシード、ローズマリー）を使用した（株式会社ギャバン、エスビー食品株式会社、Amark All

う蝕は口腔内病原性細菌の活動によって引き起こ

Spice Company Inc. 製）。供試細菌には Streptococcus

される。ある種の口腔内細菌は歯の表面にバイオmutans NBRC13955（独立行政法人製品評価技術基フィルムを形成することで強固に付着し、酸を放出盤機構より分譲）を用いた。

することで歯質を脱灰する。虫歯菌 Streptococcus

mutans はバイオフィルム形成能が高く、う蝕を引

２．試料調整き起こす原因細菌の一種であると考えられている。

供試材料の一部は粉砕機（IFM-800、岩谷産業株

バイオフィルムは細菌が放出する粘性多糖類に細菌式会社）を用いて粉砕した。粉砕試料 5 g に 20 mL

自身が取り込まれた膜状構造物であり、細菌の歯表のメタノールを加えて 24 時間振盪した。その後、面での定着性を向上させる。また、細菌はバイオフィ上澄み液をロータリーエバポレーター（N-1300、ルム内でゆっくりと増殖し、バイオフィルム構造をEYELA）で濃縮を行い、終濃度が 1 g/mL となるよ発達させることが知られている。このようにバイオ

うにメタノール抽出物を調整した。次いで、香辛料

フィルムは細菌の定着性や増殖に重要な役割を果た

残渣に 20 mL の蒸留水を加えて 24 時間振盪した。

しているため、う蝕を予防するためには S. mutans

抽出液は凍結乾燥させた後、終濃度が 1 g/mL となのバイオフィルム形成を抑制することや、すでに形るように水抽出物を調整した。

成されたバイオフィルムを剥離させることが重要である。本研究では S. mutans が形成したバイオフィ

３．S. mutans のバイオフィルム形成量

ルムの剥離効果を持つ香辛料抽出物の探索を行っ

TSB 培地（30 g/L Tryptic Soy Broth）中で 37℃、た。S. mutans のバイオフィルム形成阻害効果も併一晩培養を行った S. mutans を TSBS（30 g/L Tryptic

せて検証することで、う蝕予防に効果的な香辛料のSoy Broth、20 g/L sucrose） 培 地 に 濁 度（OD600）同定を試みた。

が 0.05 となるように再懸濁した。この懸濁液を 2 mLチューブに添加し、37℃で 24 時間静置培養を行っ材料および方法た。その後、S. mutans 懸濁液を除去した後、チューブ内に形成されたバイオフィルムに生理食塩水（対１．供試材料照区）、あるいは、濃度が 1%（各抽出物の終濃度は

本研究では 18 種類の香辛料（オレガノ、カイエ10 mg/mL）となるように香辛料抽出物を加えた生ンペッパー、キャッサバ、クミン、クローブス、コ理食塩水（処理区）を添加した。バイオフィルム剥リアンダー、サンショウ、スターアニス、タイム、ター離効果の検証は 37℃、12 時間の静置培養後に行っメリック、トウガラシ、バジル、ピンクペッパー、た。バイオフィルム形成量は既報の通りに行った

ブラックペッパー、ベイリーフ、ホワイトペッパー、（Ueda and Wood, 2009）1）。少なくとも 3 度の反復

バイオフィルム剥離効果が高い香辛料抽出物の探索

表135

定量的遺伝子発現解析に使用したプライマー配列

Gene

Forward primer sequences (5’-3’)

Reverse primer sequences (5’-3’)

16S rRNACCTACGGGAGGCAGCAGTAGCAACAGAGCTTTACGATCCGAAA

gtfB

AGCAATGCAGCCAATCTACAAATACGAACTTTGCCGTTATTGTCA

gbpB

ATGGCGGTTATGGACACGTT

TTTGGCCACCTTGAACACCT

gbpC

AATTCTGATACTGTTGCAGCACCTA

TTCTGTTGCAGCCGGTTCT

brpAGGAGGAGCTGCATCAGGATTCAACTCCAGCACATCCAGCAAG

実験を行い、その平均値と標準誤差を示した。

パ ー、 マ ス タ ー ド シ ー ド が そ れ ぞ れ 18%、17%、16% のバイオフィルム剥離効果を示した（図２）。

４．定量的遺伝子発現解析

次いで、これらの香辛料抽出物が持つバイオフィ

S. mutans のバイオフィルム形成に関与する遺伝

ルム形成抑制効果を検証した。メタノール抽出物の子群（gtfB, gbpB, gbpC, brpA ）について定量的遺伝中ではローズマリーやクローブス、サンショウがそ子発現解析を行った（表１）。S. mutans から抽出しれぞれ 94%、92%、83% のバイオフィルム形成抑た RNA は Thunderbird SYBR qRT PCR Mix（東洋紡）

制効果を示した（図３）。水抽出物の中ではクローと StepOne Realtime PCR system（Thermo Fisher

ブ ス や ロ ー ズ マ リ ー、 ク ミ ン が そ れ ぞ れ 90%、Scientific）を用いて逆転写と定量的 PCR を行った。

45%、40% のバイオフィルム形成抑制効果を示した

発現量は 16S rRNA 遺伝子を内部標準として、ΔΔCt（図４）。

法を用いて解析した。

以上の結果から、バイオフィルム剥離効果やバイオフィルム形成抑制効果はメタノール抽出物でより結果および考察強く見られた。特にベイリーフやサンショウはバイオフィルム剥離と形成抑制の両方の効果を持つこと18 種類の香辛料から調整したメタノール抽出物が分かったほか、ローズマリーは特に高いバイオと水抽出物を用いて S. mutans のバイオフィルム剥フィルム形成抑制効果を持つことが分かった。ベイ

離効果を検証した。メタノール抽出物の中ではベイリーフについてはこれまでに、その精油成分であるリーフやサンショウ、トウガラシはそれぞれ 26%、オイゲノールがバイオフィルム形成抑制効果を持つ24%、21% のバイオフィルム剥離効果を示した（図ことが示されている。そこでローズマリーとサン１）。水抽出物の中ではスターアニスやブラックペッ

ショウについてさらに詳細な解析を行った。

図1

香辛料メタノール抽出物のバイオフィルム剥離効果

図2

香辛料水抽出物のバイオフィルム剥離効果

36

浦上財団研究報告書

図3

香辛料メタノール抽出物のバイオフィルム形成抑制効果

図5

サンショウメタノール抽出物のバイオフィルム阻害率Vol.26（2019）

図4

図6

香辛料水抽出物のバイオフィルム形成抑制効果

ローズマリーメタノール抽出物のバイオフィルム阻害率

香辛料メタノール抽出物が持つ最小バイオフィル

ローズマリー抽出物が持つバイオフィルム形成抑ム阻害濃度（バイオフィルム形成量が 50% に減少す制機構について考察するため、バイオフィルム形成る濃度）を調べたところ、サンショウでは約 1 mg/に関わる遺伝子群（gtfB, gbpB, gbpC, brpA ）の定量mL、ローズマリーでは約 0.25 mg/mL であること的発現解析を行った。対照区と比較した場合、ローが分かった（図５、図６）。より低濃度でバイオフィ

ズマリー処理区では gtfB 遺伝子の発現量がおよそルム阻害効果を示したことから、ローズマリー抽出1.9 倍に増加したほか、gbpC 遺伝子の発現量が 0.3

物にはバイオフィルム形成抑制効果を持つ物質が含倍に減少していることが分かった（図７）。gtfB 遺まれることが分かった。同濃度のローズマリーを

S. mutans 培 養 液 に 添 加 し た と こ ろ、 生 育 量 が 約11％減少していたことから、ローズマリー抽出物には弱いながらも S. mutans に対する抗菌作用があることが分かった（表２）。
表2

ローズマリー抽出物の S. mutans の生育への影響

処理区

細菌数（Log10 CFU/mL）

培養開始時

4.63 ± 0.17

培養 10 時間後（対照区）

5.70 ± 0.28

培養 10 時間後
（ローズマリー処理区）

5.05 ± 0.25

図7

ローズマリー抽出物が S. mutans バイオフィルム関連
遺伝子群の発現に及ぼす影響

バイオフィルム剥離効果が高い香辛料抽出物の探索

図837

ローズマリー抽出物が S. mutans 培養時の凝集に及ぼす影響。（左）対照区、（右）ローズマリー処理区

伝子産物は細胞外多糖類であるグルカンの生産に関謝辞与しており（Koo et al., 2003） 、ローズマリー抽本研究の遂行にあたり研究助成を賜りました公益

出物処理下では gtfB による多糖類の生産性が向上す財団法人 浦上食品・食文化振興財団と財団関係者のることが示唆された。一方で、gbpB 遺伝子や gbpC皆様に深く感謝いたします。また、本研究に従事し、遺伝子はグルカン結合タンパク質の生産に関わって精力的に研究を推進してくださった広島大学大学院

おり、これらのタンパク質は細胞同士の凝集作用に生物圏科学研究科 守屋拓真君と広島大学生物生産学

関 わ っ て い る こ と が 分 か っ て い る（Zhu et al.,部 上山梨絵さんに心より感謝いたします。

2）2009） 。細胞凝集もまたバイオフィルム形成を促
3）

進することが知られているが、S. mutans 培養時における細胞同士の凝集程度はローズマリー添加時には抑制されていた（図８）。なおデータを掲載していないものの、サンショウでも細胞凝集を抑制する作用が示されている。
以上の結果から、いくつかの香辛料抽出物はS. mutans のバイオフィルム制御に有効であることが示された。引き続き、S. mutans のバイオフィル
ム制御に効果的な香辛料の探索とその有効成分の同定を行うことで、香辛料の有効利用に貢献できると期待される。

参考文献

1) Ueda, A., Wood, T.K. (2009) Connecting quorum
sensing, c-di-GMP, pel polysaccharide, and biofilm
formation in Pseudomonas aeruginosa throughtyrosine phosphatase TpbA (PA3885). PLoSPathogens 5(6):e1000483.
2) Koo, H., Hayacibara, M.F., Schobel, B.D., Cury, J.A.,Rosalen, P.L., Park, Y.K., Vacca-Smith, A.M., Bowen,W.H. (2003) Inhibition of Streptococcus mutans
biofilm accumulation and polysaccharide production
by apigenin and tt -farnesol. Journal of Antimicrobial
Chemotherapy 52: 782-789.
3) Zhu, M., Ajdić, D., Liu, Y., Lynch, D., Merritt, J., Banas,J.A. (2009) Role of the Streptococcus mutans irvA
gene in GbpC-independent, dextran-dependent
agg reg at ion and biofilm format ion. Applied
Environmental Microbiology 75(22): 7037-7043.

38

浦上財団研究報告書

Vol.26（2019）

Screening of effective spice extracts for biofilm dispersal
Akihiro UEDA
Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima UniversityAbstract
D e n t a l c a r i e s a r e c a u s e d b y b i o f i l m - f o r m i n g o r a l b a c t e r i a . A c c o r d i n g l y,controlling both biofilm formation and dispersal is important to decrease therisk of tooth decay. The aim of this study was to screen effective spice extracts
to induce the dispersal of S. mutans biofilm. Methanol and water extracts
prepared from 18 spices were tested to evaluate their ability to induce biofilm
dispersal. Methanol extracts from bay leaf, Japanese pepper, and chili pepper
induced the dispersal of S. mutans biofilm by 26%, 24%, and 21%, respectively.
Inhibition of biofilm formation was also studied using these spice extracts, withthe results showing that methanol extracts from rosemary, cloves, and Japanesepepper strongly inhibited biofilm formation by S. mutans . Among these effective
spice extracts, the minimal inhibitory concentration against S. mutans biofilm
was determined for rosemary (0.25 mg/mL) and Japanese pepper (1 mg/mL).
At 0.25 mg/mL, rosemary inhibited the growth of S. mutans by 11% during a
10 h culture. A quantitative expression analysis showed that both rosemary andJapanese pepper suppressed the expression of the gbpC gene. The GbpC protein
participates in cell aggregation, which strongly promotes biofilm establishment
by S. mutans . Thus, our results indicated that these spice extracts are effectivein the control of S. mutans biofilm by dispersal and/or inhibit ion of cellaggregation.