茨城県工業技術センター研究報告 第 42 号

納豆菌ファージに感染耐性を有する納豆菌及びチロシン結晶の析出低減化納豆菌に関する研究
久保 雄司 *
１. はじめに茨城県は，納豆の産地として全国的に有名であり，水戸市の平成25 年の1世帯あたりの納豆購入額が全国で 1 位となるなど消費も盛んである。このように，茨城県民には馴染み深い納豆であるが，製造現場においては以前より指摘されてきた問題がいくつかある。
一つ目は納豆菌ファージ（以降，ファージと記載）の問題である。ファージは，人間には無害だが納豆菌に感染し，納豆菌を死滅させてしまう。更に，ファージが生産する酵素により納豆の粘り成分であるガンマ
ポリグルタミン酸(γ-PGA)が分解されて糸引きがなくなり1)，クレームの原因になる等，メーカーにとっては重大な問題となっている。
もう一つ，チロシンが析出する2)という問題がある。
日配品である納豆の賞味期限は製造から10日程度が一般的だが，日が経つに連れ，納豆の表面に白い粒が生じてくることがある。チロシンが主成分の固体であるため食べて害は無いが，生じる前に比べて著しく食味が劣化する。チロシンの結晶が生じることなく熟成が進めば，賞味期限の延長が可能になるだけでなく，納豆の旨みそのものが向上することが期待できる。
上記2点に関する相談は茨城県工業技術センターにも毎年寄せられており，抜本的解決が望まれる課題であった。
２．目的
本研究では製品の製造ラインに万が一ファージが混入しても大事に至らず製品製造が続けられるよう，ファージに対し感染耐性がある納豆菌を開発することを目的とした。納豆菌とは，B. subtilis の中で納豆を製造できる特徴を持った菌株を指す。一方，分類学上同じ種に属し，ファージに感染しない株も存在する。そこで効率は高くないが，納豆菌のコンピテンス 3)を利用して，感染しない株のファージ感染に関与する遺伝子領域を取り込ませ，耐性を付与することを計画した。
納豆菌はアルカリプロテアーゼ(AprE)を始めとして，複数のプロテアーゼを生産する 4)。チロシンの結晶は，納豆菌が持つプロテアーゼにより，大豆のタンパク質が分解されて生じてくると予想された。納豆製造にはプロテアーゼの働きが必須であるが，必要以上の働きを抑えることが出来ればチロシンの析出を抑制し，日持ちのする納豆が製造可能だと考えた。
以上の知見や予測を基に，納豆菌ファージに感染耐性を有する納豆菌及びチロシン結晶の析出が低減する納豆菌の開発に取り組むこととした。
本年度は，納豆菌ファージの課題に関しては，耐性菌株の開発に取り組み，チロシンの課題については，納豆菌の持つプロテアーゼがチロシン析出に与える影*

地場食品部門中川 力夫 *

響の検証に取り組んだ。
３．研究内容3.1 ファージ感染耐性納豆菌株の開発について
3.1.1 ファージ感染耐性菌株の開発
当センターで保有するB. subtilisの中で，LBプレート上におけるコロニー形状が納豆菌と似ていながらファージには感染しない株(No.8と呼称)及びM220株(食品総合研究所提供)のG. DNAを形質転換に利用した。納
豆菌株を試験管に分注した2 mlのSPⅡ培地に植え，37°C，150回/分で振盪しながら一晩前培養した。翌日
新たなSPⅡ培地に植え継いだ。600 nmの吸光度が0.6程度になったところで，培養液をエッペンチューブに回収した。2,800 ×g，20°Cで10分間遠心分離し，菌体を含む液を200 μl程度残して上清を廃棄した。あらかじめ精製しておいたG. DNAを1 μg添加し，滅菌試験管に移した。37°C，150回/分で30分間振盪培養した。500 μlのLB液体培地を添加し更に2時間振盪培養を行った。
NIT1ファージ1)を50 μl (20 pfu/μl)添加し，更に1時間振盪培養を行った。培養後，LB寒天培地に100 μlずつ培養液を塗布し，37°Cで一晩培養した。
翌日，溶菌が起こらず菌の増殖が確認できた箇所を釣菌し，試験管に注いだ 2 ml の LB 液体培地に植菌した。ここに，NIT1 ファージ 1)を 5 μl (20 pfu/μl)添加し，37°C，150 回/分で一晩振盪培養した。菌の増殖が見られた株を耐性株の候補株として単離した。
3.1.2 ファージ感染耐性候補株のファージ感染試験
3.1.1 で単離した株とファージ(NIT11)及び本研究で茨城県内メーカーが販売する干し納豆製品より収集したファージ)を，滅菌後 55°C 程度まで温度を下げた
0.7% LB 寒天 3 ml に添加した。ボルテックスミキサーで混合し，素早く LB 寒天培地に重層した。37°C で一晩培養し，ファージの感染によりプラークが出来るか否か評価を行った。
3.1.3 ファージ感染耐性株の納豆試作試験
ファージ感染耐性株を用いて，納豆の試作試験を行った。使用する菌株は，シェファー寒天培地で培養することであらかじめ胞子化した。大豆は北海道産スズマルを用いた。大豆を 20°C で 16 時間浸漬し，0.18 MPaで 30 分蒸煮した。蒸煮後，蒸煮大豆 1 g に対して胞子数が 104 個になるよう納豆菌胞子液を添加した。
約 50 gずつポリスチレンパック(PSP)に盛り込み，39°C，90%RH で 18 時間，その後 20°C，50%RH で 2 時間発酵させた。5°C で 1 日熟成し，納豆の糸引きや香り外観をチェックした。

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3.2 チロシン析出低減化納豆菌株の開発について
3.2.1 AprE 破壊納豆菌株の作成（過程）3.2.1.1 aprE の PCR による増幅と精製NAFM51)を培養し，G. DNA を精製した。aprE の増幅には表 1 のプライマー及び，KOD-Plus (TOYOBO)を用いた。
PCR の条件は，95°C で 5 分熱変性後，95°C，30 秒，50°C，30 秒，68°C，4 分のセットを 30 サイクル行った。反応終了後，1%アガロースゲル電気泳動により結果を確認すると共にゲルを切り出し，NucleoSpin ExtractⅡ(MACHEREY-NAGEL)を用いて PCR 産物を精製した。
表 1 aprE の PCR に用いたプライマー

3.2.1.2 増幅した aprE の pBlueScriptⅡへのライゲーション，コンピテントセルへの導入及びプラスミドの精製
SmaⅠ処理した pBlueScriptⅡ (50ng)と PCR 産物をモル比で 1:4 程度になるよう混合し，トータルを 10 μlに調整した。そこに，2×Ligation convenience kit(ニッポンジーン)を 10 μl 添加し，16°C で 1 時間インキュベートしてライゲーションを行った。Escherichia coli DH5α(RecA(-))を 150 μl に，ライゲーション反応液を 10 μlずつ添加し混合した。氷上で 10 分間保った後，37°Cで予温しておいた SOC 培地に上記 160 μl の反応液を添加して 37°C で 1 時間振盪しながらインキュベートした。LB 寒天培地(1 μmol/ml のイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)，40 ng/ml の 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-GAL)，及び 100 μg/ml のアンピシリンを添加)にインキュベート
した SOC 培地を 200 μl ずつ塗布し 37°C で一晩インキュベートした。ホワイトコロニーを選択して LB 液体培地(100 μg/ml のアンピシリン添加)に植菌し 37°C で振 盪 培 養 し た 。 翌 日 ， FlexiPrep Kit(AmershamBiosciences)を用いてプラスミドを精製した。
3.2.1.3 カナマイシン耐性(KmR)カセットの精製
5 μl の pDG780，
2 μl の 10×L バッファー，
1 μl の SmaⅠ
及び 12 μl の滅菌水を混合し，30°C で 1 時間インキュベートした。その後，1.1 μl の 10×H バッファー及び 1μl の HincⅡを添加し 37°C で 1 時間インキュベートした。反応終了後，1%アガロース電気泳動に供し結果を確認すると共に，カナマイシン耐性(KmR)カセットを切り出し，Nucleo Spin ExtractⅡ(MACHEREY-NAGEL)を用いて精製した後，濃度を測定した。
3.2.1.4 aprE::KmR を持つプラスミドの構築
FlexiPrep Kit(Amersham Biosciences)を用いて 3.2.1.2で培養した菌からプラスミドを精製した。5 μl の精製したプラスミド，1 μl の MroⅠ，2 μl の 10×L バッファー及び 12 μl の滅菌水を混合し，37°C で 1 時間インキュベートしてプラスミドを消化した。熱処理とエタノール沈殿により精製した後，KOD で処理して消化末端の 5’突出部分のギャップを埋め，平滑末端化した。平
滑末端化したプラスミド消化物と KmR カセットがモル比で 1:4 程度になるよう混合し，トータルを 10 μlに調整した。そこに，2×Ligation convenience kit(ニッポンジーン)を 10 μl 添加し，16°C で 1 時間インキュベートしてライゲーションを行った。150 μl の E. coli DH5α(RecA(-))に，ライゲーション反応液を 10 μl 添加し混合した。氷上で 10 分間保った後，37°C で予温しておいた SOC 培地に上記の反応液を添加して 37°C で 1 時間振盪しながらインキュベートした。LB 寒天培地(30μg/ml のカナマイシンを添加)にインキュベートした
SOC 培地を 200 μl ずつ塗布し 37°C で一晩インキュベー ト し た 。 翌 日 生 育 し た コ ロ ニ ー か ら FlexiPrepKit(Amersham Biosciences)を用いてプラスミドの精製を行った。精製後，5 μl のプラスミド，2 μl の10×TOYOBO TA バッファー，2 μl の 0.1% BSA，1 μlの AhdⅠ及び 10 μl の滅菌水を混合し，37°C で 1 時間インキュベートした。65°C で 20 分処理した後，エタノール沈殿を行い消化したプラスミドを精製した。結果は 1%アガロースゲルを用いた電気泳動で確認した。
４．研究結果と考察
4.1 ファージ感染耐性納豆菌株の開発について
4.1.1 ファージ感染耐性菌株の開発
ファージ耐性を獲得させる元株として，当センター保有の納豆菌株No.19, No.40及びIBARAKI-C1を使用した。ファージ耐性候補株として合計50株の菌株を釣菌した。ファージ感染に使用した菌株菌株，G.DNAの採取元となる株及びファージ耐性候補株として採取した菌株数を表2に示した。
表2 ファージ耐性候補株の元株と使用G.DNAの組み合わせ
G.DNAのファージ耐性候補株
試験No. ファージ感染に使用した菌株 採取元となる株 として採取した菌株数
1No.19No.8122No.19M22073No.40

No.8124No.40

M220105

IBARAKI-C1No.856

IBARAKI-C1M22044.1.2 ファージ感染耐性候補株のファージ感染試験
4.1.1 で得たファージ耐性候補株について，改めてファージに感染試験を実施したところ，表 2 に記載の試験の中で，試験 No.1(No.19(菌株)- No.8(G.DNA))の候補株から 1 株と試験 No.5(IBARAKI-C1(菌株)- No.8(G.
DNA))の候補株から 4 株の合計 5 株について，プレー茨城県工業技術センター研究報告 第 42 号

ト上で菌の溶原化によるプラークが出来ず，ファージ感染耐性を持つことが確認された(図 1)。

4.2.1.2 増幅した aprE のpBlueScriptⅡへのライゲーション，コンピテントセルへの導入及びプラスミドの精製
pBluescriptⅡにaprEをライゲーションしたベクター
をE. coli DH 5α(RecA(-))に導入したところ，形質転換体が得られたため，プラスミドを精製した。精製したプラスミドをBamHⅠで消化し，アガロースゲル電気泳動に供して，目的のプラスミドが得られているか確認した(図3)。pBluescriptⅡは約3 kbpで増幅したaprEは約2kbpであり，5 kbp付近にバンドが確認できたことから，ライゲーション反応が上手く行ったことが確認できた。
Mr

図 1 従来の納豆菌(左)とファージ感染耐性菌(右)のファージ感染試験
左のシャーレのみファージによる溶菌(プラーク)が見られた。
4.1.3 ファージ感染耐性株の納豆試作試験
4.1.2 で得られた 5 株で納豆を試作したところ，全ての納豆菌株において，糸引きや香り外観に関して問題なく納豆を製造することが可能だった。特にこの内の1 株で製造した納豆の糸引きは他よりも強い印象だった。試作品の評価及び分析については，今後の課題である。
また，安全性を担保する意味から，菌株のどこに変異が入ったのか明らかにすることも，今後取り組むべき重要な課題である。
4.2 チロシン析出低減化納豆菌株の開発について
4.2.1 AprE 破壊納豆菌株の作成（過程）
4.2.1.1 aprEのPCRによる増幅と精製
PCRによるaprEの増幅後，アガロースゲル電気泳動を実施した結果を図2に示した。2,100bp付近に産物のバンドが確認され，増幅反応が進行したことが確認された。
bp

Mr

bp
8000
6000
4000
3000
2000
1500
1000

500
400
300
200100

図3 pBluescriptにaprEをライゲーションした産物のアガロース電気泳動結果
Mr, マーカー; 1, pBluescriptにaprEをライゲーションした産物(BamHⅠ消化)4.2.1.3 カナマイシン耐性(KmR)カセットの精製
pDG780 を制限酵素消化した後，アガロースゲル電気泳動で確認した(図 4)。KmR カセットは約 1,500bp であり，制限酵素による反応が上手く行き，目的の産物が得られていることが確認できた（図 4 の矢印）。
Mr112000
10000
8000
6000
4000
3000
2000
1500

1bp

8000
6000
4000
3000
2000
1500

1000

1000

500
400300200100500
400300200100

図2 aprEのPCR実施後のアガロース電気泳動結果
Mr, マーカー; 1, aprE増幅産物

1

図4
pDG780をSmaⅠ及びHincⅡ消化した産物のアガロース電気泳動結果
Mr, マーカー; 1, pDG780をSmaⅠ及びHincⅡ消化した産物
矢印で示したバンドが目的のKmRカセット

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4.2.1.4 aprE::KmRを持つプラスミドの構築精製したプラスミドをAhdⅠ処理し，電気泳動した結果を図5に示した。反応が想定したとおりに進めば，6.6 kbp付近にバンドが確認できるはずであるが，3.4kbp付近に主要なバンドがあるのみで，目的とする反応産物は生成していないことが明らかになった。全く想定していない大きさであるため，どういう配列の産物であるか想定できないが，反応が上手く行かなかった
理由として，3.2.1.4で実施したKODによるインサート末端の平滑化が進行しなかった可能性が疑われた。
bpMr

112000
10000
8000
6000
4000
3000
2000
1500
1000

500
400300200100

図5 精製したプラスミドの泳動結果Mr, マーカー; 1, 作成したプラスミド(aprE::KmR配列を持っていることを期待した。)
５．まとめ
5.1 ファージ感染耐性納豆菌株の開発について(1)納豆菌の持つコンピテンスを利用し，納豆菌と同種で，納豆製造能はないがファージ耐性を持つ菌株のG. DNAを取り込ませることで，ファージ耐性納豆菌株の開発を行った。
(2)プレート上で確認した限りにおいてファージの感染が起こらない株を5株育種し，全ての株で納豆の製造が可能であることを確認した。
5.2 チロシン析出低減化納豆菌株の開発について(1)プロテアーゼがチロシンの蓄積と析出に与える影響を検証すべく，納豆菌のaprE破壊株作成に取り組んだ。
(2)aprEをKmRマーカーで破壊し，pBluescriptⅡに組み込みベクターを構築することを試みた。しかし，ライゲーションが上手く行かず，本年度中の完了には至らなかった。
６．今後の課題
6.1 ファージ感染耐性納豆菌株の開発について
今回育種した5株のファージ耐性納豆菌株は，当初の予想通りであれば，ファージの感染に関与する遺伝子が，性質の変換に利用したG. DNAと入れ替わった可能性が高い。しかし，それがどの領域か分かっておらず，また，場合によっては予想とは違った機構でファージ耐性を獲得した可能性がある。今後，遺伝子の変異箇所の解析を進め，ファージ耐性を獲得した要因を明らかにする。
6.2 チロシン析出低減化納豆菌株の開発について
aprE破壊納豆菌株の作成が完了しなかったため，次年度，続きから再挑戦するか，別な方法でaprE破壊納豆菌株を作成し，プロテアーゼがチロシンの蓄積と析出に与える影響を検証する。最終的に，組み換えに依らない方法で，既存納豆菌株よりもチロシン析出が起こりにくい納豆菌株を育種する。
７．謝辞
本研究は，特別電源所在県科学技術振興事業補助金により行ったものであり，感謝いたします。
また，本研究の推進に御協力頂きました(独)農業・食品産業技術総合研究機構 食品総合研究所 発酵細菌ユニットの舟根和美様，並びに，木村啓太郎様に感謝いたします。
８．参考文献1) Kimura, K. and Itoh, Y., Characterization ofpoly-γ-glutamate hydrolase encoded by a bacteriophage
genome: possible role in phage infection of Bacillus subtilisencapsulated with poly-γ-glutamate. Appl. Environ.
Microbiol., 69, 2491–2497 (2003).
2) 木内幹, 品質管理, 「納豆の研究法」, 初版, 永井利郎, 木村啓太郎, 小高要, 村松芳多子, 渡辺杉夫編,( 恒星社厚生閣, 東京), p.130 (2010) .
3) Ashikaga, S., Nanamiya, H., Ohashi, Y. and Kawamura,F., Natural genetic competence in Bacillus subtilis natto
OK2. J. Bacteriol., 182, 2411–2415 (2000).
4) Nagami, Y., and Tanaka, T., Molecular cloning andnucleotide sequence of a DNA fragment from Bacillus natto
that enhances production of extracellular proteases andlevansucrase in Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 166, 20–28(1986).