17−技術資料−●自動リポ蛋白分析計 HLC® − 729LP Ⅱの開発
バイオサイエンス事業部 開発部 システムグループ
バイオサイエンス事業部 CS センター メディカル技サグループ
バイオサイエンス事業部 開発部 システムグループ

バイオサイエンス事業部 CS センター 技術管理グループ
東ソー・ハイテック株式会社 生産技術課

真仁田 大輔
廣渡祐史
庄司 孝四郎
杉山茂孝
土方浩
後藤浩二
秋山聖
大野雄成
菅野詠子
岩崎修次
池田貴文
野中一功

開発を進め、1 検体当たりの測定時間で 5.2 分を実現

1．はじめにした。本稿では、測定原理、仕様、基本性能などにつ動脈硬化の進展は、心筋梗塞、脳梗塞、腎障害、網いて報告する。

膜症などの発症の原因となることが知られている。動脈硬化の危険因子としては、高血圧、脂質異常症、喫煙、肥満、糖尿病が知られている。これらの疾患を治2.

療することは、動脈硬化性疾患の予防のために重要
1）である 。

装置概要
LP Ⅱの外観を図１に、主な仕様を表１に示す。装置は、サンプラー部（サンプラー、注入バルブ）、送国内の脂質異常症患者は潜在的な患者も含めて液部（溶離液ポンプ、反応液ポンプ、パージバルブ、2000 万人を超えると推計されている 2），3）。脂質異常スタティックミキサー）、カラムオーブン、検出部（リ症は糖尿病や高血圧に並ぶ代表的な生活習慣病であアクター、可視検出器）、コントローラーからなる構り、その治療のための精度の高い検査が望まれている。

成とした。

脂質異常症の診断には、中性脂肪、及びリポ蛋白中のコレステロール (HDL コレステロール、LDL コレステロール）が用いられる 1）。

3.

測定原理

リポ蛋白は、コレステロール、中性脂肪、リン脂

陰イオン交換クロマトグラフィーにより、リポ蛋白質、タンパク質の複合体であり、比重と粒子径により、の表面に有する電荷の違いにより分離を行う。血清試

HDL、LDL、VLDL などに分類される4），5）。リポ蛋白料を注入すると、リポ蛋白がゲル表面にある正電荷をの量を把握するためには、各リポ蛋白を分離し、その中のコレステロールを定量する。リポ蛋白を分離する標準法として超遠心分離法が挙げられるが、操作の煩雑さ、血清使用量の多さや測定時間の長さ（最低 3 日間）が理由で一般的ではない。リポ蛋白を分離、分析する手法として電気泳動法（アガロースゲル電気泳動等）やゲルろ過クロマトグラフィー法が用いられているが、分離能力が不十分である。
我々は、陰イオン交換クロマトグラフィーとポストカラム法によるコレステロール検出を組み合わせた手法により、リポ蛋白を迅速かつ高精度に分離するシステムの開発を行ってきた 6）。
専用の液体クロマトグラフィー装置 HLC − 729LP Ⅱ（LP Ⅱ）、および専用のカラム、溶離液、反応試薬の本体とコントローラー（PC）から構成される。

図１

HLC®−729LPⅡの外観

TOSOH Research & Technology Review Vol.58（2014）18

表１

LP II の主な仕様

仕様
測定項目

血清中のリポ蛋白分画

測定対象

血清

測定原理

高速液体クロマトグラフィーによる分画／酵素反応によるコレステロール発色

試料使用量200μL

処理速度5.2 分／検体（プレアクションを含まない）

送液部
送液ポンプ

溶離液用 3 台（高圧グラジエント、0.625mL ／分）
反応液用 1 台（0.25mL ／分）

アナライザー
検出方法
検出セット方法
最大検体搭載数
注入方法

可視吸光検出（590nm）
サンプルラック
100 検体（標準、コントロール等を含める）
サンプルループ計量方式による注入

データ処理部
通信機能
定量計算
制御及びデータ処理

USB 通信（双方向）
ピーク面積による検量線法
コントローラー

カラム・溶離液・反応液
カラム

TSK−gel Lipopropak®−AEXⅡ

溶離液

LP II 溶離液
LP II 溶離液
LP II 溶離液

反応液

HLC−テスト「TOSOH」リポプロパック ®
（体外診断用医薬品）

もつ交換基に結合する。過塩素酸濃度の異なる 3 種の溶離液のステップグラジエントによる塩濃度依存的な溶出により、HDL、LDL、IDL、VLDL、Other の順で第1液
第2液
第3液a）＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋リポ蛋白が溶出される。Other 画分はカラムを洗浄した際の画分であり、血中で濃度の低い複数のリポ蛋白HDLであるカイロミクロン、カイロミクロンレムナント及びリポプロテイン（a）（Lp（a））が含まれると考えられ

低塩濃度

LDL

VLDL

HDL，LDL，IDL，VLDL，Otherの順に溶出

高る 7），8）。リポ蛋白溶出の模式図を図２− a に示す。なお、リポ蛋白とゲルの結合は、リポ蛋白の表面電荷だけで９）なく、表面の疎水性も関与していると考えられる 。
カラムから溶出された各リポ蛋白中のコレステロー
ルを酵素法によって発色させ、可視検出器で検出する。
酵素による反応を図２− b に示す。
グラジエント条件と脂質異常症患者血清のクロマトグラムの溶出パターンを図３に示す。検体注入の 2.9分後から検出が開始され、8.1 分後に検出が終了する。
検出に要する時間は 5.2 分であり、連続測定では 5.2分毎に結果が得られる。

b）
エステル型コレステロール ＋ H2O
遊離型コレステロール ＋ O2
2H2O2 ＋ 4−AA ＋ HDAOS

CECOD
POD

遊離型コレステロール ＋ 脂肪酸⊿4−コレステノン ＋ H2O2
4H2O ＋ キノン色素a）リポ蛋白溶出の模式図b）リポ蛋白中のコレステロール検出反応式
CE：コレステロールエステラーゼ
COD：コレステロールオキシダーゼ
POD：ペルオキシダーゼ

図２

LPⅡの測定原理

東ソー研究・技術報告

300
200
100

2.5

3.5

4.5

5.56.5
Time［min］

7.5

8.51（4.9）

BC0

リポ蛋白のクロマトパターンの一例を実線で示した。1検体の測定当たり5.2分を要する（2.9〜8.1分）。
また、各リポ蛋白の溶出に該当する溶出液中の過塩素酸ナトリウム濃度を点線で示した。

図３191（3.8）

AConcentration of NaClO4
in Eluate［mM］

Absorbance at 590 nm

400

第 58 巻（2014）

1（6.0）

2（6.8）

D1（6.2）LDL（4.9）

脂質異常症患者のリポ蛋白5分画のクロマトグラムとグラジエント条件の例

E

VLDL（6.8）

HDL（3.8）

IDL（6.0）

4.

1（7.4）

F

基本性能評価結果［1］再現性試験と希釈直線性試験

2.5

3.5

（1）同時再現性試験（n ＝ 10）
HDL、LDL、IDL、VLDL、Other、そして総コレステロール（TC）のコレステロール濃度に関して、変動係数 CV（％）はそれぞれ、0.6、0.3、1.3、0.6、4.3、0.3％であった。
（2）日差再現性（n ＝ 10）

Other（7.3）

4.5

5.5
6.5
Time［min］

7.5（A）超遠心分離法により得られたHDL画分（比重：1.063g／mL＜d）、（B）LDL画分（比重：1.019g／mL＜d＜1.063g／mL）、（C）IDL画分（比重：1.006g／nL＜d＜1.019g／mL）、（D）VLDLとカイロミクロン画分（比重：d＜1.006g／mL）、（E）血清検体、（F）血清より精製されたLp（a）をそれぞれ測定した。
括弧内の数値は溶出時間を示す。

図４

超遠心分画サンプルとLp（a）の溶出位置と血清リポ蛋白5分画の溶出位置の比較

HDL、LDL、IDL、VLDL、Other、 そ し て TC の コ
レステロール濃度に関して、変動係数 CV（％）はそ
れぞれ 4.2、2.4、3.3、4.2、9.2、1.6％であった。

重：1.006 < d < 1.019g ／ mL）、VLDL とカイロミクロン（3）希釈直線性試験（比重：d < 1.006g/mL）に分画し、各リポ蛋白中のコ健 常 人 血 清 を 用 い て、HDL、LDL、IDL、VLDL、レステロール量を算出した。これらの値と LP Ⅱによっ

そして TC に関して、5 倍希釈までの直線性を確認して得られた HDL コレステロール、LDL コレステロー

た。また、希釈倍率に対する換算濃度と比較して、そル、IDL コレステロール、そして VLDL コレステロー

れぞれ 10％以内の正確性を確認した。

ルと Other コレステロールの量をそれぞれ比較した。

［2］他の測定法との比較（1）超遠心分離法との相関試験

続いて、別の 36 検体の患者血清を超遠心分離により、VLDL とカイロミクロン画分（比重：d < 1.006g ／超遠心分離は、リポ蛋白の比重の違いで分画し、そmL）を取得しコレステロール分画（アガロース電気の特性や機能が研究されてきた。現在もリポ蛋白の基泳動／コレステロール染色）と LP Ⅱで測定を行い、準となる測定には、超遠心分離法が使われている。

VLDL とカイロミクロン（Other）について比較した。

図４ A − E では、血清を超遠心分離法により各リポ

なお、Lp（a）の比重は HDL から LDL にかけて広く蛋白分画に分離し、LP Ⅱで測定した結果を示した。

分布することが知られているため 10）、この相関試験に各リポ蛋白の溶出位置と一致していることから、このおいては、Lp（a）が低値（Lp（a）タンパク質量 40mg ／方法の特異性の高さが示されている。図４F は、ヒトdL 以下）の検体を用いている。

血清より精製されたLp（a）を LP Ⅱで測定した結果を示した。Lp（a）コレステロールは、Other のピーク中に含まれることが確認された。

相関試験の結果を図５に示す。
全てのリポ蛋白とも良好な相関関係を示した。
（2）直接法との比較

超遠心分離法と LP Ⅱの測定結果を比較した。35 検

脂質異常症の診断は、HDL コレステロール、LDL体の患者血清を超遠心分離により、HDL（比重：1.063g

コレステロール、中性脂肪（トリグリセライド：TG）／ mL < d）、LDL（比重：1.019 < d < 1.063g ／ mL）、IDL（比の値を用いる。

TOSOH Research & Technology Review Vol.58（2014）

20B

A300

y＝0.92x＋0.13
r＝0.97n＝35

LDL−C（mg／dL）
HLC−729LP II

HDL−C（mg／dL）
HLC−729LP II

12080

y＝0.99x＋7.99
r＝0.92n＝35200

1000

40004080

01200

HDL−C（mg／dL）
超遠心分離法100200300

LDL−C（mg／dL）
超遠心分離法CD120

y＝0.58x＋7.68
r＝0.58n＝35

VLDL−C＋Other−C（mg／dL）
HLC−729LP II

IDL−C（mg／dL）
HLC−729LP II60

402000204080

40060

y＝0.87x＋2.51
r＝0.94n＝350IDL−C（mg／dL）
超遠心分離法240

45

y＝1.07x−3.96
r＝0.99n＝36Other−C（mg／dL）
HLC−729LP II

VLDL−C（mg／dL）
HLC−729LP II

80

120

FE

160

80

0080

160

240

y＝0.74x＋3.76
r＝0.92n＝3630150

VLDL−C（mg／dL）
コレステロール分画

図５40

VLDL−C＋Chylomicron−C（mg／dL）
超遠心分離法0153045

Chylomicron−C（mg／dL）
コレステロール分画

超遠心分画との相関試験とコレステロール分画（VLDLとカイロミクロン分画）との相関試験

現在、複数の試薬メーカーから、HDL または LDLに対して、界面活性剤や酵素のリポ蛋白選択性を利用を用いた。
（3）電気泳動法との比較し、酵素反応でそれぞれのリポ蛋白中のコレステローリポ蛋白分画の臨床検査法として、電気泳動法が使ルを検出するホモジニアス法（直接法）が発売されて用されている。アガロースゲル電気泳動で分離し、コいる。

レステロールを染色するコレステロール分画、アガそ こ で、LP Ⅱ の 測 定 値 と、HDL − C（ 直 接 法 ）、ロースゲル電気泳動で分離し、脂質を染色するリポ蛋

LDL − C（直接法）の各測定値との相関を確認した

白分画、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動で分（図６）。いずれにおいても高い相関性が確認された。

離し、脂質を染色するリポ蛋白分画（PAG 法）の 3

なお検体は TG が 400mg ／ dL 以下の条件を満たすもの

手法が保険収載されている。健常者では、これらの測東ソー研究・技術報告第 58 巻（2014）

A

21

B
240
y＝0.98x−3.13r＝0.99
N＝72

LDL−C＋IDL−C（mg／dL）
HLC−729LP II

HDL−C（mg／dL）
HLC−729LP II1208040004080

y＝0.99x＋9.15
r＝0.96
N＝72160800120080

HDL−C（mg／dL）
直接法

160240LDL−C（mg／dL）
直接法

HDL−CとLDL−Cに関して直接法との相関を比較した。なお、HLC−729 LP IIで測定されたLDL−CとIDL−Cの測定値の和がCDC基準法（BQ法）によるLDL−Cに相当する。

図６

直接法との比較

定法で、HDL、LDL、VLDL の分離が可能であるが、一 方 で、HLC-729LP Ⅱ の ク ロ マ ト グ ラ ム で は、脂質異常症では LDL と VLDL の分離不良が見られる

LDL、VLDL ともに高い分離能を有することがわかる。

場合がある。
脂質異常症患者の LP Ⅱによるクロマトグラムと各5.

種電気泳動法による分離パターンを図７に示した。コ

HLC − 729LP Ⅱによる臨床評価の一例

レステロール分画とリポ蛋白分画では、LDL と VLDL

健常者について、血清中のリポ蛋白 5 分画のコレスの 分 離 が 出 来 て い な い こ と が わ か る。 リ ポ 蛋 白 分

テロールと他の検査項目（Body mass index（BMI）、画（PAG 法 ） で は、MIDBAND が 検 出 さ れ て い る。

空腹時血糖（FPG）、ヘモグロビン A1c（HbA1c）、推MIDBAND は IDL、VLDL2 など様々なリポ蛋白が含定 GFR（eGFR））の相関を評価した。

まれており、このピークが検出されることで LDL とVLDL の量の把握が困難となる

健 常 者 (189 名、25 ～ 59 歳、 男 性、TC：183 ±12）24mg ／ dL、TG：74 ± 28mg ／ dL）を測定対象とした。

。

HLC−729LP II60
LDL4030IDL10Other4.95.9
時間（min）

図７7.9

リポ蛋白分画（ディスク）

HDLβ（LDL）

Pre−β（VLDL）

HDLα（HDL）

VLDL

リポ蛋白分画6.9

電気泳動法の分離パターン比較

VLDL

3.9

MIDBAND

02.9
コレステロール分画

VLDL

HDL

20

LDL

電圧値（mV）

50
HDL：45.0mg／dL
TC：226.5mg／dL
TG：276mg／dL
LDL（F式）：126.3mg／dL

TOSOH Research & Technology Review Vol.58（2014）22表２

リポ蛋白 5 分画測定値と検査項目値の相関
BMI

FPG

HbA1ceGFRHDL−cholesterol−0.28＜0.00010.039
NS0.036
NS0.057
NS

LDL−cholesterol

0.35＜0.0001

0.18＜0.050.18＜0.05−0.19＜0.01

IDL−cholesterol

0.26＜0.00010.14
NS0.10NS−0.31＜0.0001

VLDL−cholesterol

0.28＜0.00010.020
NS0.030
NS−0.19＜0.01

Other−cholesterol

0.037
NS0.021NS0.081NS0.11NS

Lipoprotein data by HLC−729LPII

健常者 189 人の血清検体を HLC−729LP II で測定した。リポ蛋白 5 分画と他の検査項目（BMI，FPG，HbA1c，eGFR）との相関を評価した。上段に順位相関係数、下段に P 値を記した。P 値が 0.05 以上に関しては NS と表示した。

採血は東ソー株式会社東京研究センターに勤務する

ポ蛋白分画（HPLC 法）、保険点数は 130 点である 13）。

従業員に対して実施し、空腹時に行った。健常者は、脂質異常症の新しい検査として市場から注目・期待さ脂質異常症を除外し、更に、収縮期血圧 140mmHgれている。

以上、拡張期血圧 90mmHg 以上、FPG130mg ／ dL 以
上、HbA1c（NGSP）6.9 ％ 以 上、AST（GOT） ま た
は ALT（GPT）が 30U ／ L より高値、eGFR が 60mL ／7.

min/1.73m2 以下のいずれかにあてはまる場合には除外した。
リポ蛋白 5 分画と、各検査項目との相関を表２に示した。
BMI は HDL − C と負の相関が確認され、LDL − C、総括

今回開発した HLC − 729LP Ⅱが、高い再現性と優れた分離性能を有することを確認した。また、本システ
ムによって得られたリポ蛋白 5 分画の測定結果は、超遠心法や直接法とも高い相関を有し、脂質異常症患者の高脂血症分類の診断、治療観察に利用できる 13）。

IDL − C、そして VLDL − C と正の相関が確認された。

HDL や LDL と比較して、IDL や VLDL の機能や役FPG 及び HbA1c は LDL − C と正の相関が確認された。

割はまだ未解明な部分が多い。本システムが臨床現場

eGFR は LDL − C、IDL − C、そして VLDL − C と負の相に適用され、HDL、LDL のみならず、IDL、VLDL の関が確認された。eGFR は、慢性腎臓病（CKD）の診測定が動脈硬化性疾患や糖尿病合併症の治療や予防に断指標に用いられ、腎機能の評価として用いられる。

大きく貢献することを期待する。

また、透析患者のリポ蛋白プロファイルの特徴として
高 IDL が知られており 12）、このことが透析患者の動脈硬化進展の原因であると考えられている。本システ

8.

その他

ムにより測定が可能となった IDL − C は、腎機能の低本研究で用いた検体は、東京慈恵会医科大学または下した患者の動脈硬化性疾患の予防のための検査値と東ソー株式会社の倫理委員会の承認を得て実施されして有用である可能性が示唆された。

た。採血には同意書による確認の元に実施され、個人名を削除し別の符号で管理されて検討を実施した。

6.

保険適用
本システムの装置 HLC − 729LP Ⅱは医療機器にあた

本 報 告 中 に あ る“HLC”、“ リ ポ プ ロ パ ッ ク ”、“TSKgel”、“Lipopropak”は日本における東ソー株式会社の登録商標です。

り、反応試薬 HLC −テスト「TOSOH」リポプロパッ
ク ® は体外診断用医薬品にあたる。これまで、多くの大学病院において臨床評価を行い、その有用性を確認してきた。
本システムは、日本動脈硬化学会の推薦により新項目（E3）として保険適用を取得した。検査名称はリ

9.

謝

辞

本装置の研究及び開発は、東京慈恵会医科大学と産学協同で進めてきた。
ご協力いただいた各先生方に厚く御礼申し上げま東ソー研究・技術報告

13）中医協す。
東京慈恵会医科大学附属柏病院
吉田博

中央検査部

先生

東京慈恵会医科大学附属柏病院
多田紀夫

先生

印西総合病院
黒澤秀夫

検査部先生

参考文献
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JSLM2012

検査値アプローチ / 症候 / 疾患、日本臨床検査医学会、37 − 42、2012
２）第 5 次循環器疾患基礎調査、厚生労働省
３）平成 22 年国民健康・栄養調査、厚生労働省
４）Dominiczak MH. Apolipoproteins and lipoproteinsin human plasma. Handbook of lipoprotein testing
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５）リポタンパク質の分画・精製．新生化学実験講座
４第 58 巻（2014）

脂質Ⅰ中性脂肪とリポタンパク質、日本生化学会編

東京化学同人．181 − 228，1993６）Hirowatari Y, et al., Measurement of cholesterolof major serum lipoprotein classes by anion −exchange HPLC with perchlorate ion − containing
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lipid Res., 40, 2255 − 2263, 1999
11）黒沢 秀夫、他、新規 HPLC 法により分離定量された各リポ蛋白中コレステロール値と midband、
RLP- コレステロールとの関連性 臨床病理、52、
737 − 741、2004
12）Shoji T, et al., Intermediate-density lipoprotein as
an independent risk factor for aortic atherosclerosis
in hemodialysis patients. J Am Soc Nephron., 9,1277 − 1284, 1998

総− 12325. 6. 26, 第 244 回中央社会保険医療協議会総会資料