バイオバンク利活⽤ハンドブック
検体の採取・処理と品質について知っておくべきこと第1版

2024 年 7 ⽉ 11 ⽇
ゲノム創薬基盤推進研究事業
バイオバンク利活⽤推進のための調査研究バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞

⽬次

まえがき

…… 4

略語表
第 1 章 バイオバンク検体の処理⼿順
第 1-1 節 組織の処理⼿順
1-1-1 概要
1-1-2 新鮮凍結
1-1-3 凍結包埋
1-1-4 ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）
1-1-5 その他
第 1-2 節 ⾎液の処理⼿順
1-2-1 概要
1-2-2 全⾎
1-2-3 ⾎清1-2-4 ⾎漿
1-2-5 末梢⾎単核細胞（PBMC）
第 1-3 節 核酸の処理⼿順
1-3-1 概要
1-3-2 組織由来 DNA
1-3-3 ⾎液循環 DNA
1-3-4 ⾎液循環 RNA
第 2 章 バイオバンク検体の研究利⽤
第 2-1 節 ⽣体分⼦アッセイ
2-1-1 ⽣体分⼦アッセイの概要と例
2-1-2 ⽣体分⼦アッセイに⽤いられる検体
第 2-2 節 遺伝⼦変異解析
2-2-1 遺伝⼦変異（遺伝⼦配列）解析の概要と例
2-2-2 遺伝⼦変異解析に⽤いられる検体
第 2-3 節 遺伝⼦発現解析
2-3-1 遺伝⼦発現解析の概要
2-3-2 遺伝⼦発現解析に⽤いられる検体
第 2-4 節 免疫反応測定
2-4-1 免疫反応測定の概要と例
2-4-2 免疫反応測定に⽤いられる検体
第 2-5 節 形態観察
2-5-1 形態観察の概要と例
2-5-2 形態観察に⽤いられる検体

…… 6

…… 11

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…… 22

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…… 31

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞

第 2-6 節 細胞培養
2-6-1 細胞培養の概要と例
2-6-2 細胞培養に⽤いられる検体
第 3 章 検体処理⽅法と品質
第 3-1 節 検体の品質評価⽅法
3-1-1 核酸の品質評価⽅法
3-1-2 核酸以外の⽣体分⼦の品質評価⽅法
3-1-3 保管までの⼯程の記録による品質評価⽅法
第 3-2 節 検体の品質に影響を与える因⼦
3-2-1 概要
3-2-2 被採取者の状態による品質への影響
3-2-3 検体採取から保管までの要因による品質への影響
3-2-4 保管による品質への影響
3-2-5 利⽤時における品質への影響
第 3-3 節 がん遺伝⼦パネル検査における品質（実験結果）
第 3-4 節 OCT 包埋凍結組織の品質（実験結果）
3-4-1 実証実験-1：包埋容器の検証
3-4-2 実証実験-2：包埋容器の検証
3-4-3 実証実験-3：溶媒の検証

…… 35

…… 38

…… 41

…… 46
…… 53

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞

まえがき
⾃分の研究にヒト臨床検体を使⽤したい。しかし、これまでに検体を使⽤したことがな
い、または使⽤したことはあるが経験が少なく、研究計画に適した検体を⼊⼿できるか⾃信がない。このハンドブック『バイオバンク利活⽤ハンドブック 検体の採取・処理と品質について知っておくべきこと』（通称「ハンドブック＜試料編＞」）は、そうした悩みや不安を抱える研究者を対象としています。そして同時に、そうした研究者とのコミュニケーションを改善したいと考えているバイオバンク職員も対象としています。
このハンドブックの公開によって、検体の⼊⼿先としてのバイオバンクが使いやすくな
り、結果としてバイオバンクがより広く使われるようになる。そうなることを念頭に置いて、このハンドブックは特に検体の処理に関する情報を提供しています。
このハンドブックの第 1 章から第 3 章までは次のような内容になっています。バイオバ
ンクで扱う主な検体がどのような⼿順で処理されているのか（第 1 章）、それらの検体がどのような研究で利⽤されるのか（第 2 章）、検体の品質はどのように考えられるのか（第 3 章）。またこれらに加え、このハンドブックを作成するきっかけとなった調査の結果として、検体の⼊⼿に関連した現在の課題は何か（第 4 章）を載せています。
第 1 版では盛り込めなかった内容もありますが、第 1 版へのご意⾒などを踏まえ、改訂を⾏なっていく⾒込みです。ぜひ忌憚のないご意⾒をお聞かせ頂ければと思います。
このハンドブックの第 1 版は、AMED ゲノム創薬基盤推進研究事業「バイオバンク利活⽤推進のための調査研究」（2020〜22 年度）で作成されたものです。ご協⼒頂きました関
係者のみなさんにこの場をお借りして感謝申し上げます。

執筆担当者（五⼗⾳順）
川野 ⻯太郎 （慶應義塾⼤学）
⼩原 有弘（医薬基盤・健康・栄養研究所）

⽵内 朋代（筑波⼤学病院）

⻄原 広史（慶應義塾⼤学）

森⽥ 瑞樹（岡⼭⼤学）

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞

略語表
AMED
BLEIA
cfDNA
cfRNA
CLEIA
CLIA
CNV
DIN
DNA
EAI
EDTA
ELISA
ELISPOT
EVG 染⾊
FEIA
FFPE
FIA
HbA1c
HBOC
HE 染⾊
HPLC
iPS 細胞
ISBER
miRNA
mRNA
MS
NGS
NIPT
NMR
OCT
PAM 染⾊PAS 染⾊
PBMC
PBS
PCR
RIN
RNA
SOP
SPREC
TE バッファー
VUS

Japan Agency for Medical Research and Development（⽇本医療研究開発機構）
Bioluminescence Enzyme Immunoassay（⽣物発光酵素免疫測定法）
cell-free DNA（⾎液循環 DNA）
cell-free RNA（⾎液循環 RNA）
Chemiluminescence Enzyme Immunoassay（化学発光酵素免疫測定法）
Chemiluminescence Immunoassay（化学発光免疫測定法）
Copy Number Variation（コピー数多型）
DNA Integrity Number
Deoxyribonucleic Acid（デオキシリボ核酸）
Enzyme Immunoassay（酵素免疫測定法）
Ethylenediaminetetraacetic Acid（エチレンジアミン四酢酸）
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Enzyme-Linked Immunospot
Elastic van Gieson staining（エラスチカ・ワンギーソン染⾊）
Fluorescent Enzyme Immunoassay（蛍光酵素免疫測定法）
Formalin Fixed Paraffin Embedded（ホルマリン固定パラフィン包埋）
Fluorescent Immunoassay（蛍光免疫測定法）
Hemoglobin A1c（ヘモグロビン A1c）
Hereditary Breast and Ovarian Cancer（遺伝性乳癌卵巣癌症候群）
Hematoxylin Eosin staining
High Performance Liquid Chromatography（⾼速液体クロマトグラフ法）
induced Pluripotent Stem Cell（⼈⼯多能性幹細胞）
International Society for Biological and Environmental Repositories
microRNA（マイクロ RNA）
messenger RNA（メッセンジャーRNA）
Mass Spectrometry（質量分析装置）
Next Generation Sequencer（次世代シークエンサー）
Non-Invasive Prenatal Genetic Testing（出⽣前遺伝学的検査）
Nuclear Magnetic Resonance（核磁気共鳴）
Optimal Cutting Temperature
Periodic Acid-Methenamine Silver staining（過ヨウ素酸メセナミン銀染⾊）
Periodic Acid-Schiff staining（過ヨウ素酸シッフ染⾊）
Peripheral Blood Mononuclear Cells（末梢⾎単核細胞あるいは末梢⾎単核球）
Phosphate-Buffered Saline（リン酸緩衝⽣理⾷塩⽔）
Polymerase Chain Reaction（ポリメラーゼ連鎖反応）
RNA Integrity Number
Ribonucleic Acid（リボ核酸）
Standard Operating Procedures（標準作業⼿順書）
Standard PREanalytical Code
Tris-EDTA バッファー
Variant of Uncertain Significance（臨床的な意義が不明なバリアント）

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞

第 1 章 バイオバンク検体の処理⼿順
第 1-1 節 組織の処理⼿順
1-1-1 概要
バイオバンクに保管される組織検体の形状は、新鮮凍結、凍結包埋、ホルマリン固定パラ
フィン包埋などがある。
組織検体は診療の過程で切除、摘出され、最終的に病理診断に使⽤される。病理診断には使⽤されない部分または使⽤後の残余組織をバンキングすることは、病態を解明するための研究、 診断⽅法や新たな創薬ターゲットを探索するための研究に⾮常に有⽤である。核酸の抽出や形態観察など研究の⽬的に応じて適した保管⽅法が異なるので、どのような研究に使⽤することを想定しているのか、主として保管する形状について事前に検討しておく必要がある。
品質に影響を与える要因としては、阻⾎時間、凍結速度（急速、緩慢）、固定時間、保管
温度、保管期間などが考えられる。これらの要因は実施した内容を記録しておくことが重要となる。また、いくつかの項⽬については⽇本病理学会で策定された「ゲノム研究⽤・診療⽤病理組織検体取扱い規程」[1]に実証データが掲載されているので参考にするとよい。
標準作業⼿順書（SOP）の策定にあたっては、各施設の設備や⼈員、保管する組織の種類（特定の疾患を対象とするか、網羅的に収集するか）、形状といった様々な項⽬を考慮する必要がある。状況に応じて適した SOP を作成し、実施されることが推奨される。
研究⽤の組織採取は病理診断に差し⽀えのない部分を適切に採取しなくてはならない。そのためにも、診断に影響することがなく、かつ状態のよい部分を選択できるよう病理専⾨医
や病理診断に精通した臨床医などの指導を受けること、さらには⽇本病理学会で実施している e-ラーニング（https://pathology.or.jp/genome/e-Learning/）などで研修を受け、バンキ
ング業務に従事することが望ましい。さらに組織が摘出されてから固定や切り出しなどの⼯程を経て、数⽇かけて診断⽤の標本となるまでの過程も理解した上でバンキングが実施されるべきである。
検体処理後の保管にあたっては、クライオチューブ等の⼀次容器に貼付した⼆次元バーコードラベルを読み込むことで収納場所や出⼊庫記録が管理できるシステムを⽤いて試料の管理を⾏うとよい。
＜参考⽂献＞[1] ⽇本病理学会. ゲノム研究⽤・診療⽤病理組織検体取扱い規程. ⽺⼟社, 2019, 160p.

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1-1-2 新鮮凍結
【どのような試料か？】組織⽚を凍結して保管したもので、snap frozen、dry sample ともいう。核酸（DNA、RNA）やタンパク質を抽出して使⽤されることが多い。組織（臓器）の種類にもよるが、⻑期間保管した試料からも PCR やシークエンスに使⽤できる良質な DNA、RNA が抽出できる事例が報告されている[1][2]。処理⼿順が簡単であること、また後述のホルマリン固定
パラフィン包埋サンプルに変換することも可能である*1 といったメリットも多く、組織試料の保管⽅法としては第⼀選択とすることも推奨される。しかし、保管のための設備（超低温庫、液体窒素タンク等）、維持にコストがかかるといったデメリットもある。
【処理⼿順】(1) 採取組織を数ミリ⾓程度の組織⽚に細切する*2。
(2) 組織⽚を 1 ⽚ずつクライオチューブに⼊れる。
(3) 液体窒素で急速凍結する。
【保管】
超低温庫または液体窒素タンクで保管する。
【One Point】*1 凍結組織⽚をそのままホルマリンに浸漬して固定後、パラフィン包埋ブロックを作製することも可能である。ただし、組織（細胞）によっては変性しているものもある。
*2 どの程度の⼤きさに切り分けるか、チューブ何本分を保管するかなどを施設内で決めておく。
＜参考⽂献＞[1] ⽇本病理学会. “実証データ⑧ ⻑期保管温度のゲノム DNA の品質に対する影響”. ゲノム
研究⽤・診療⽤病理組織検体取扱い規程. ⽇本病理学会編. ⽺⼟社, 2019, p. 73-74.
[2] ⽇本病理学会. “実証データ⑨ ⻑期保管温度の RNA の品質に対する影響”. ゲノム研究⽤・診療⽤病理組織検体取扱い規程. ⽇本病理学会編. ⽺⼟社, 2019, p. 75.

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1-1-3 凍結包埋
【どのような試料か？】組織⽚を凍結組織⽤包埋剤で包埋して急速凍結したもので、術中迅速診断でも使⽤される。薄切後に HE 染⾊標本や免疫染⾊標本を作製して組織像の観察に使⽤される。組織像を確認できるため、採取した組織中の病変細胞（がん細胞など）の含有率を把握する指標になる。染⾊を⾏わずに未染標本から核酸やタンパク質を抽出することもできる。1-1-2 で述べた新鮮凍結組織と同様に保管のための超低温庫の購⼊、維持にコストがかかり、また調製も新鮮凍結と⽐べると作業⼯程がやや煩雑になる。
【処理⼿順】(1) 包埋⽫にろ紙を⼊れ、その上に適当な⼤きさに切った組織⽚を置く。
(2) 凍結包埋剤*1 を静かに流し⼊れ、組織を包埋する。
(3) 液体窒素*2 に浮かべて包埋剤が⽩くなるまで凍結させる*3。
【保管】
アルミ箔で包装し*4、密閉性の⾼い容器に収納して超低温庫で保管する。
【One Point】*1 OCT compound（サクラファインテック）、クリオマウント（武藤化学）など各社から販売されており、感染症対策のために抗⽣物質が添加されたものや⾊のついた包埋剤も販売されている。
*2 アセトン/ドライアイスや凍結包埋標本作製⽤の装置および冷却溶剤を使⽤して作製することもできる。しかし迅速診断と異なりバイオバンクでは⻑期保管を⽬的としているため、液体窒素の使⽤が推奨される。
*3 包埋⽫を直接、液体窒素に浮かべるとひびが⼊ってしまうことがあるので、⾦属カップなどに静置した状態で液体窒素に浮かべて冷却するとよい。
*4 試料の乾燥を防ぐためにしっかりと包装する。パラフィルムは⻑期保管により劣化し剥がれてしまうリスクが⾼いため、アルミ箔が推奨される。

1-1-4 ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）【どのような試料か？】

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞

組織をホルマリンで固定した後、段階的に組織中の⽔分や脂肪を除去してパラフィンを浸透させてブロックに包埋したもので、いわゆる FFPE ブロックのことである。組織形態学的観察に優れていることはもちろん、常温で⻑期間の保管が可能であることも利点である。
以前は固定により核酸の断⽚化が⽣じるため核酸を⽤いた解析については適していないと考えられていたが、解析技術が進歩したことから現在ではゲノム解析などでも積極的に使⽤されている[1]。新鮮組織や凍結包埋組織と⽐べると作業⼯程が⻑く試薬も多く必要となるため、バイオバンクで独⾃に調製しているというよりは病理部⾨と連携して試料回収を進めている施設が多い。
【処理⼿順】(1) 組織を適当な⼤きさに切り、ホルマリン固定液に浸漬する*1。
(2) エタノール、キシレンなどの中間溶剤を使って脱⽔、脱脂を⾏いパラフィンに浸透させる*2。
(3) パラフィンで包埋してブロックの成形を⾏う*3。
【保管】
パラフィンブロック保管⽤の容器、チャック付きビニールなどに⼊れ、室温で多湿を避けて保存する。冷蔵（4℃）で保管が可能であればさらによい。
【One Point】*1 固定時間は組織の種類、⼤きさによって検討、調製する。組織量に対して 10 倍量の固定液を使⽤することが望ましい。
*2 ⾃動包埋装置を使⽤する。
*3 薄切断⾯を考慮して、組織の向きに注意して包埋する。
＜参考⽂献＞[1] ⽇本病理学会. “組織の処理”. ゲノム研究⽤・診療⽤病理組織検体取扱い規程. ⽇本病理学会編. ⽺⼟社, 2019, p. 90-120.

1-1-5 その他
【どのような試料か？】

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核酸の抽出、初代培養、異種移植など採取時に使⽤⽬的が決まっている場合には、その⽬的に適した形（1-1-2、1-1-3、1-1-4 以外の組織形態）で保管することや利⽤者へ提供することもある*1。
【処理⼿順】
１．核酸抽出⽤組織
保管試料を⽤いて DNA の塩基配列解析や RNA を⽤いた遺伝⼦発現解析を⾏うためには
品質劣化を低減するために核酸安定化試薬等を⽤いて凍結することが望ましい。そのため、
1-1-2 の要領で細切した組織⽚を核酸採取・保存⽤の試薬に浸漬して、凍結する。
２．初代培養、異種移植⽤組織
初代培養や免疫不全動物への異種移植を実施する場合には⽣きた細胞・組織を凍結することが必要である。そのため、1-1-2 の要領で細切した組織⽚（初代培養⽤はさらに細かく組織をミンスしてもよい）を培養細胞凍結保存⽤溶液に浸漬して緩慢凍結する。もし、組織を利⽤者に速やかに提供することができる場合は、組織を PBS や培養液に浸漬しておく（凍結しない）。
【保管】
核酸採取・保存⽤試薬または培養細胞凍結保存⽤溶液に浸漬して凍結した組織は、超低温庫もしくは液体窒素タンクで保管する。⾮凍結組織は使⽤者に提供するまでの間、冷蔵庫または氷冷状態で保管する【One Point】*1 最近、既存試料のみならず使⽤者の要望に沿った形で検体を採取し、提供するオンデマ
ンド型の提供スタイルを実施するバイオバンクが増えている（代表例：筑波⼤学、岡⼭⼤学、神⼾⼤学）。その際には、検体の処理⼿順や保管⽅法もオンデマンド型に対応できるよう様々な形態が採⽤されている。なお、オンデマンド型バイオバンクの⼀
覧はクリニカルバイオバンク学会のホームページ[1]から公開されている。
＜参考⽂献＞[1] クリニカルバイオバンク学会. “診療施設併設型バイオバンク”. クリニカルバイオバンク
学会. http://www.clinicalbiobank.org/#partner, (参照 2024-06-04).

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第 1-2 節 ⾎液の処理⼿順
1-2-1 概要
バイオバンクに保管されている⾎液検体には、全⾎、⾎清、⾎漿、バフィーコート、末梢⾎単核細胞（PBMC）などがある。
⾎液中には⾚⾎球、⽩⾎球、タンパク質、電解質などが含まれ、⾚⾎球、⽩⾎球、⾎⼩板
を細胞成分（⾎球成分）、それ以外の⽔に溶解した成分を液性成分と⼤別する。バフィーコ
ートや PBMC には細胞成分が、⾎清や⾎漿には液性成分が、全⾎にはすべてが含まれる。
また、⾎液は採取後に凝固するが、この凝固した部分を除いたのが⾎清であり、凝固しないようにして遠⼼分離をした上清が⾎漿である。
⾎清と⾎漿の成分は似ているが、上で述べたように異なるところもある。また、⾎清では凝固を促進させるための薬剤（凝固促進剤）、⾎漿では凝固をさせないための薬剤（抗凝固剤）が⽤いられているため、⾎清や⾎漿にはこれらの薬剤の混⼊があり、また、これらの薬剤によって変化する成分もある。測定対象によってはこれらのことを検討に含めることが望
ましい*1。
⾎液検体の品質は、保管前や保管中の条件の影響を受ける。保管前の条件としては、採⾎をしてから処理を開始するまでの時間、その間の温度などがある*2。また保管中の条件としては、保管温度、保管の際の凍結融解の有無・回数などがある*3。
バイオバンクで保管を開始する際には、採⾎容器（特に抗凝固剤の種類）、採⾎場所から処理場所までの運搬ルート、採⾎から処理開始までの温度、遠⼼分離時の遠⼼⼒・時間・温度・ブレーキの有無、保管温度、保管⽤チューブの種類、チューブあたりの分注量などを決め、SOP として定める。
【One Point】*1 臨床検査の場合には、試薬会社や検査会社によって検査項⽬ごとに適した薬剤が事前に検討されており、⽤いる採⾎管などの指定が検査項⽬ごとにカタログに記載されている。
*2 温度によって変化する成分、増える成分、減る成分などがあり[1]、すべての成分にとって望ましい温度はない。
*3 ⼀般に、凍結・融解は繰り返さないことが望ましく、これを防ぐためにはチューブあたりの分注量を少なくする。しかし⼀⽅で、分注数が増えるので、使⽤できる保管スペースとの兼ね合いで分注量と分注数のバランスを決めることになる。

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞＜参考⽂献＞[1] ⽇本臨床検査医学会 標準化委員会（2012-2013 年度）. “検体の保存安定性”. 臨床検査のガイドライン JSLM2021. ⽇本臨床検査医学会ガイドライン作成委員会編. 宇宙堂⼋⽊書店, 2021, p. 31-36.

1-2-2 全⾎
【どのような試料か？】
全⾎は、⾎液中のすべての成分を含んだ検体である。⾎液は採取して体外に出るとすぐに凝固するため、全⾎の保管を⽬的とした場合には抗凝固剤が⼊った採⾎管を使⽤する。採⾎後に全⾎のまま放置をすると変化をしていく*1 ので、速やかに凍結をすることが望ましい。
全⾎は遠⼼分離などが不要なため⾎清や⾎漿などと⽐べて保管時間は短く済むというメリットがあるが、検体量が多くなり保管場所を取るというデメリットがある。バイオバンクとしては後者のデメリットは⼤きな問題となるため、⾎液検体の保管⽅法の第⼀選択にはなりに
くく、特定の研究において⼿間を減らすためなど特殊な事情において採⽤が検討されることがある。
【処理⼿順】(1) 抗凝固剤⼊りの採⾎管で採⾎する。
(2) 採⾎後すみやかに 5 回以上の転倒混和をする。
(3) 必要に応じてクライオチューブに分注する。
【保管】
超低温庫、液体窒素タンクで保管する。
【One Point】*1 採⾎後の⾎液を放置すると、⾚⾎球の解糖系の働きによって、ブドウ糖が減少し、乳酸やピルビン酸が増加する。また、含窒素化合物の分解によりアンモニアが増加するな
どする[1][2]。
＜参考⽂献＞[1] 村本良三. “検体保存”. 最新臨床検査学講座 臨床化学検査学 第 2 版. ⼾塚実・奥村伸⽣・
浦⼭修・松下誠・⼭内⼀由・⼤川⿓之介編. 医⻭薬出版, 2022, p. 30-32.

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞[2] ⽶久保功. “静脈採⾎（シリンジ採⾎）”. カラー版 ⽬でみる検体採取・取り扱いマニュア
ル. Medical Technology 編集委員会編. 医⻭薬出版, 1998, p. 463-472.

1-2-3 ⾎清【どのような試料か？】
⾎清は、凝固した⾎液を遠⼼分離した後に上清として得られる⻩⾊い液体成分である。このとき、下部の固形成分は⾎餅（けっぺい）と呼ばれ、⾎漿中のフィブリノゲン（⾎液凝固因⼦の１つであるタンパク質）と⾎球成分（⾚⾎球、⽩⾎球、⾎⼩板）からなる。最終的に得られる⾎清の量は、採⾎した⾎液の量の 2 分の 1 程度になる。
【処理⼿順】(1) 凝固促進剤⼊りの採⾎管で採⾎する。
(2) 採⾎後すみやかに 5 回以上の転倒混和をする。
(3) 室温でしばらく静置する*1。
(4) 遠⼼分離し、上清をクライオチューブに分注する。
(5) 凍結する。
【保管】
超低温庫、液体窒素タンクで保管する。
【One Point】*1 採⾎後の凝固が不⼗分だと⾎清にゼリー状の物質（フィブリン）が析出し、⾎清をピペットで吸い上げるときに邪魔になる。このため、凝固促進剤が⼊った採⾎管を使⽤して採⾎し、採⾎後に室温でしばらく静置してから遠⼼分離をする。

1-2-4 ⾎漿【どのような試料か？】⾎漿は、全⾎（抗凝固剤⼊り）を遠⼼分離した後に上清として得られる⻩⾊い液体成分である。下部の固形成分には⾚⾎球が含まれ、また⾎漿と⾚⾎球の間のバフィーコート（⽩⾎球層、軟層）*1 と呼ばれる薄い層には⾎⼩板と⽩⾎球が含まれる。⾎漿には（⾎清には含まPage 13 of 56
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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞

れない）フィブリノゲンが含まれる。最終的に得られる⾎漿の量は、採⾎した⾎液の量の 2
分の 1 程度になる。
抗凝固剤にはいくつかの種類があり、使⽤⽬的によって選択される[1]。主なものは
EDTA、クエン酸、ヘパリンである。EDTA とクエン酸はキレート剤として使⽤され、⾎液が凝固する際に必要なカルシウムイオンを捕捉することで⾎液の凝固を防⽌する。ヘパリンは⽣体内の凝固阻⽌因⼦であるアンチトロンビンに結合してその機能（⾎液凝固の抑制）を強化する作⽤があり、この作⽤によって⾎液の凝固を防⽌する。
⾎漿中に含まれる核酸（DNA、RNA）は⾎液循環 DNA/RNA（cfDNA/RNA）と呼ばれ、臨床応⽤が進んでいる。妊娠中の⺟体の⾎漿には胎児の cfDNA が含まれるため[2]、胎児の出⽣前遺伝学的検査（NIPT）に使⽤される。また、がん患者の⾎漿にはがん細胞から遊離した cfDNA および cfRNA が含まれるため[3]、1-3-1 にあるようにがん遺伝⼦パネル検査に使⽤される。いずれも採⾎のみで済むため侵襲性が低いことが臨床において重要な要素となっている。
【処理⼿順】(1) 抗凝固剤⼊りの採⾎管で採⾎する*2。
(2) 採⾎後すみやかに 5 回程度確実に転倒混和する。
(3) 遠⼼分離し*3、上清をクライオチューブに分注する。
【保管】
超低温庫、液体窒素タンクで保管する。
【One Point】*1 ⾚⾎球と⾎⼩板は無核細胞であるのに対し⽩⾎球は有核細胞であるため、⽩⾎球を多く含むバフィーコートは、少ないサンプル量からでも多くの DNA を抽出することができる。なお、バフィーコート（buffy coat）の buff とは⻩褐⾊のことであり、バフィーコートは通常このような⾊をしている層であることからこの名称となった。
*2 ⾎液の量と抗凝固剤の⽐は⾎液検査の結果に影響を及ぼすことが知られており、このため採⾎管ごとに推奨の採⾎量が定められている。しかし採⾎の際に推奨される⾎液量が得られないこともあり、もしそうした⾎漿検体を研究に⽤いる場合には測定結果に影響を及ぼすことがあるため、注意が必要である。

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞*3 遠⼼分離が不⼗分だと⾎漿中に⾎球成分が混⼊しやすく、そのため遠⼼分離の遠⼼⼒（回転数）や時間は不⾜しないように注意する必要がある。また、必要に応じて２回⽬の遠⼼分離を⾏うことで、さらに夾雑物を除去することもできる。
＜参考⽂献＞[1] 東克⺒, “抗凝固剤の種類と使い⽅”. 最新臨床検査学講座 ⾎液検査学 第 2 版. 奈良信雄編.
医⻭薬出版, 2021, p. 74-75.
[2] Lo Y. M. et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 1997, vol.
350, p. 485-487.
[3] Crowley E. et al. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviewof Clinical Oncology. 2013, vol. 10, no. 8, p. 472-484.

1-2-5 末梢⾎単核細胞（PBMC）【どのような試料か？】
末梢⾎単核細胞（PBMC）は、主にリンパ球と単球が含まれる液体成分である*1。⽩⾎球
は核を持った⾎球の総称であるが、形状の違いから、顆粒球、単球、リンパ球に⼤別される*2。よって、⽩⾎球をさらに分離して得たものが PBMC であり、細胞性免疫系の臨床検査

ではリンパ球の機能を検討するために⽤いられる[1]。
全⾎あるいはバフィーコートの密度勾配遠⼼を⾏うと、上層に⾎漿、中間層に PBMC、下層に⾚⾎球および顆粒球へと分離される。PBMC の分離においては、⽐重液（分離液）
として 1950 年代に Pharmacia 社（現 Cytiva 社）で開発された化合物 Ficoll®や、その後に開発された Ficoll-Paque™、Lymphoprep™、Percoll™などが使⽤されることが多い。この
場合、PBMC と⾚⾎球・顆粒球の層の間に⽐重液の層ができる。
PBMC の分離処理が容易になるチューブや専⽤採⾎管も販売されており、⽬的に応じて使⽤される。
PBMC を凍結保管する場合には、緩慢凍結法が⽤いられる。
【処理⼿順】(1) 抗凝固剤⼊りの採⾎管で採⾎する。
(2) 採⾎後すみやかに 5 回程度確実に転倒混和する。
(3) ⾎液に同量の PBS を加え混和する。
(4) 空のチューブに⽐重液を⼊れ、その上から混ざらないように静かに⾎液を⼊れる。

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞(5) 遠⼼分離し、上層（⾎漿）を捨て、次の層を PBMC として回収する。
(6) PBMC に 3 倍以上の PBS を加え、穏やかに懸濁させる。
(7) 遠⼼分離し、上清を捨て、ペレット（PBMC）を PBS に懸濁させる。
(8) 遠⼼分離し、上清を捨て、ペレット（PBMC）を細胞凍結保存液に懸濁させる。
(9) クライオチューブに分注する。
(10) プログラムフリーザーあるいは凍結保管容器を⽤いて緩慢凍結を⾏う。
【保管】
超低温庫、液体窒素タンクで保管する。
【One Point】*1 PBMC は様々な研究に利⽤される。細胞増殖、サイトカイン放出、iPS 細胞の樹⽴などにも使⽤されるため、保管されている PBMC のうち⽣きた細胞の割合（⽣細胞率）
が重要になる。
*2 リンパ球を分離する場合には、PBMC からさらに分離をする以外に、免疫磁気ビーズを⽤いた⽅法や、リンパ球以外に結合するモノクローナル抗体によって不要な細胞を除く⽅法がある。
＜参考⽂献＞[1] 窪⽥哲朗. “免疫不全症関連検査”. 最新臨床検査学講座 免疫検査学. 窪⽥哲朗・藤⽥清
貴・細井英司・梶原道⼦編. 医⻭薬出版, 2017, p. 212-215.

第 1-3 節 核酸の処理⼿順
1-3-1 概要
検査で正確な結果を得るためには⾼品質の核酸を⽤いることが重要である。⾎液循環
DNA と組織由来 DNA があるが、組織由来 DNA の検体には新鮮凍結検体や FFPE 検体があり、汎⽤性の観点から⽇常的には FFPE を使⽤することが多いと思われる。FFPE 検体から核酸を抽出するには、各プロセスにおいて重要なポイントがある。⾼品質の核酸を得る段
階は固定前プロセスと固定後プロセスに集中している。
分析前⼯程として、ホルマリンによる組織の固定前プロセス、固定プロセス、固定後プロ
セスがあり、固定前プロセスは検体採取時から固定液に⼊れるまでのプロセスを指す。重要

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なポイントは切除した組織をできるだけ早く固定液に浸漬することである。 検体処理など
で固定液への浸漬が難しい場合は冷蔵庫などでの保管が望ましい。
固定プロセスは、検体が固定液に浸漬してから病理部⾨における検体処理までのプロセスを指す。検体は組織の体積の 10 倍量相当の 10%中性緩衝ホルマリン固定液に 6〜48 時間固定することが推奨されている。酸性ホルマリンは使⽤すべきでない[1][2]。ホルマリンの検体への浸漬速度は 1 mm/h 程度といわれており、⼤きな⼿術検体などでは割を⼊れて固定することも必要である。
固定後プロセスは、検体の切り出し、組織プロセッサーを経て、FFPE 検体が作製されるまでのプロセスを指す。このプロセスでは、品質管理の観点から、検体のコンタミネーショ
ンを避けることに注意を払う必要がある。⾻などの硬組織が含まれる検体の場合は、脱灰⽅法に注意を払う。ギ酸などの酸脱灰は急速に脱灰を完了させられるメリットはあるが、これを⾏うと核酸が断⽚化してしまい、正確な結果を得ることが不可能になる。EDTA 脱灰な
どの中性脱灰液を使⽤することが望ましい。
アナリシス段階として、病理医による適切な FFPE 検体の選定と臨床検査技師による未染標本作製がある。FFPE 検体は作製されてから 3 年以内のものが望ましく、これより古いものは核酸の断⽚化による影響で解析の成功率が低下する。未染標本は検査に必要な核酸量が確保できるだけの枚数を薄切する必要がある。検査によって必要な核酸量は異なるが、FoundationOne® CDx（Foundation Medicine, Inc.）では 50 ng の核酸量が必要になる。
⾎液循環 DNA は、保険収載されているがん遺伝⼦パネル検査として FoundationOne
Liquid® CDx （Foundation Medicine, Inc.）に使⽤可能である。
新鮮凍結検体や細胞株からは FFPE よりも良質な核酸抽出が期待できるので、⼊⼿可能な検体であれば検討するのが望ましい。
＜参考⽂献＞[1] ⽇本病理学会. “ホルマリン固定パラフィン包埋標本の適切な作製・保管⽅法”. ゲノム研
究⽤病理組織検体取扱い規程. ⽇本病理学会編. 2016-03-01.
https://pathology.or.jp/genome/kitei.html, (参照 2024-06-06).
[2] ⽇本病理学会. “ホルマリン固定パラフィン包埋組織・細胞検体の適切な取扱い”. ゲノム
診療⽤病理組織検体取扱い規程. ⽇本病理学会編. 2018-03-01, p. 3-11.
https://pathology.or.jp/genome_med/pdf/textbook.pdf, (参照 2024-06-06).

1-3-2 組織由来 DNA

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞【準備するもの】
・ DNA 抽出⽤キット（凡例として Promega 社 Maxwell® RSC FFPE Plus DNA Kit を使⽤）・ FFPE 切⽚・ 1.5 mL 遠⼼チューブ
・ 70℃設定のヒートブロック
・ ボルテックスミキサー
・ 微量⾼速遠⼼機
・ ピペットマン（P-20、P-200、P-1000）
・ ピペットチップ
・ Proteinase K 溶液
・ 使い捨て⼿袋
・ 消毒剤（70%エタノール、オスバン等）【処理⼿順】
凡例として Promega 社 Maxwell® RSC FFPE Plus DNA Kit を使⽤した場合の処理⼿順[1]を記載する。
１．サンプルの前処理(1) FFPE 切⽚（Total 2 mm³まで）をサンプルチューブに移す。
(2) 遠⼼分離してサンプルをチューブの底に集め、溶液（Proteinase K 20 µL と Incubationbuffer 180 µL）を加える。
(3) キャップを閉め、70℃オーバーナイトでインキュベーションする。
(4) チューブをヒートブロックから取り出し、Lysis Buffer 400 µL を加え、ボルテックスにより攪拌する。
(5) チューブを室温にて保管する。
２．カートリッジの準備(1) 検体数分のカートリッジを Maxwell® RSC Deck Tray にセットする。
(2) 同数の Elution Tube をセットし、Nuclease-Free Water 50 µL を加える。
(3) カートリッジのウエルにプランジャーを置く。
(4) ライゼートをカートリッジのウエルに添加する。
(5) Maxwell® RSC Deck Tray を本体にセットし、精製操作を開始する。

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞

３．精製終了後の操作(1) Maxwell® RSC Deck Tray を取り出し、Elution Tube を保管する。
(2) 保管には TE バッファーによる冷蔵（2〜8℃）保管が推奨される。
(3) DNA を超低温（‒70℃以下）で⻑期間保管する場合には、凍結融解・凍結乾燥を避けるため、分注して密閉保管することが推奨される。
＜参考⽂献＞[1] Promega. “Maxwell RSC FFPE Plus DNA Kit Technical Manual”. Promega.
https://www.promega.jp/resources/protocols/technical-manuals/500/maxwell-rsc-ffpeplus-dna-kit-protocol-tm574/, (参照 2024-04-15).

1-3-3 ⾎液循環 DNA【準備するもの】
・ DNA 抽出⽤キット（凡例として Promega 社 Maxwell® RSC Whole Blood DNA Kit を使
核酸安定化剤⼊り採⾎管・ 抗凝固剤（EDTA など）⼊り採⾎管・ 1.5 mL 遠⼼チューブ
・ ローテーター
・ マイクロピペット（P-200、P-1000）
・ ピペットチップ
・ 使い捨て⼿袋
・ 消毒剤（70%エタノール、ベンザルコニウム塩化物液等）【処理⼿順】
凡例として Promega 社 Maxwell® RSC Whole Blood DNA Kit を使⽤した場合の処理⼿順[1]を記載する。
１．サンプルの前処理(1) ⾎液サンプルを少なくとも 5 分間室温で撹拌する（ローテーターなど利⽤）。
２．カートリッジの準備(1) 検体数分のカートリッジを Maxwell® RSC Deck Tray にセットする。

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞(2) 同数の Elution Tube をセットし、Elution Buffer 60 µL を加える。
(3) カートリッジのウエルにプランジャーを置く。
(4) 5 分間の撹拌が完了した⾎液をカートリッジのウエルに添加する。
(5) Maxwell® RSC Deck Tray を本体にセットし、精製操作を開始する。
３．精製終了後の操作(1) Maxwell® RSC Deck Tray を取り出し、Elution Tube を保管する。
(2) 保管には TE バッファーによる冷蔵（2〜8℃）保管が推奨される。
(3) DNA を超低温（‒70℃以下）で⻑期間保管する場合には、凍結融解・凍結乾燥を避けるため、分注して密閉保管することが推奨される。
＜参考⽂献＞[1] Promega. “Maxwell RSC Whole Blood DNA Kit Technical Manual”. Promega.
https://www.promega.jp/resources/protocols/technical-manuals/101/maxwell-rscwhole-blood-dna-kit-protocol/, (参照 2024-04-15).

1-3-4 ⾎液循環 RNA【準備するもの】
・ RNA 抽出⽤キット（凡例として Promega 社 Maxwell® RSC simply RNA Blood Kit を使
⽤）・ 抗凝固剤（EDTA など）⼊り採⾎管・ 15 mL 遠⼼チューブ・ 微量⾼速遠⼼機
・ ピペットマン
・ RNase-free ピペットチップ【処理⼿順】
凡例として Promega 社 Maxwell® RSC simply RNA Blood Kit を使⽤した場合の処理⼿順[1]を記載する。
１．サンプルの前処理(1) ⾎液サンプル全⾎ 2.5 mL を抗凝固剤⼊り採⾎管から滅菌 15 mL チューブに移す。

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞(2) 7.5 mL の Cell Lysis Solution を加え、チューブを 5 〜 6 回転倒混和する。⾚⾎球が溶解され、⽩⾎球はそのまま残る。
(3) 室温で 10 分間インキュベートする。インキュベーション中に 2 回反転して混合する。
(4) チューブを 3,000 × g で 10 分間遠⼼する。
(5) ⽬に⾒える⽩いペレットを乱さないように、できるだけ多くの上清を取り除いて廃棄する。チューブの底に残った液体をピペットで取り除き、上澄みを捨てる。
(6) 冷却した 1-Thioglycerol/Homogenization 溶液 200 µL をペレットに加える。ボルテッ
クスでよく混ぜる。
(7) 再懸濁したペレットに 200 µL の Lysis Buffer と 25 µL の Proteinase K を加える。20 秒
間ボルテックスして混合する。
(8) 室温で 10 分間インキュベートする。
(9) Maxwell® RSC Simply RNA Blood Cartridge のウエルに 10 µL の DNase Solution を加える。
(10) Maxwell® RSC Simply RNA Blood Cartridge のウエル にライセートを追加する。
２．カートリッジの準備(1) 検体数分のカートリッジを Maxwell® RSC Deck Tray にセットする。
(2) プランジャーを各カートリッジのウエルに⼊れる。
(3) 空の 0.5 mL Elution Tube をセットする. Nuclease-Free Water 50 µL を各 Elution Tubeに注⼊する。
(4) Maxwell® RSC Deck Tray を本体にセットし、精製操作を開始する 。
＜参考⽂献＞[1] Promega. “RSC simplyRNA Blood Kit Technical Manual”. Promega.
https://www.promega.jp/resources/protocols/technical-manuals/101/maxwell-rscsimplyrna-blood-kit-protocol/, (参照 2024-04-15).

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第 2 章 バイオバンク検体の研究利⽤
第 2-1 節 ⽣体分⼦アッセイ
2-1-1 ⽣体分⼦アッセイ概要と例【⽬的】
⽣体分⼦アッセイは、⽣体内の⾎液を含む様々な体液や尿、便などの排泄物、細胞を含む
⽣体組織などを⽤いて⽣体中に存在する分⼦（被測定物）の存在、量、または機能活性を定性的に評価あるいは定量的に測定することを⽬的として、様々な解析が実施される*1。解析の対象とする分⼦（被測定物）には、ペプチドを含むタンパク質が主なものとして挙げられるが、その他にも DNA、mRNA、miRNA などの核酸や代謝物などの化合物も解析対象となる。解析の⽅法として主なものはクロマトグラフィ、分光光度計、質量分析装置、表⾯プ
ラズモン共鳴、NMR、次世代シークエンサーなどがある。抗原抗体反応を⽤いる解析⼿法（第 2-4 節で解説する）もその⼀つと⾔える。
【⼿法】
⽣体内に存在する特定分⼦の量的変化を解析する際には、クロマトグラフィ、分光光度計などが⽤いられ、特定分⼦の存在を解析する時には質量分析装置などが⽤いられる*2。
１．クロマトグラフィ
クロマトグラフィは量的変化を解析したい分⼦に着⽬して、その科学的・物理的な性質や相互作⽤を利⽤して分⼦を分離させる⼿法である。したがって、量的変化を解析するためには⽬的の分⼦を分離できるようにし、親和性のある担体で分離できるような実験系をカスタマイズする必要がある。それぞれの試料に含まれる⽬的分⼦の⽐較定量を⾏うことができる
が、既知の濃度の⽬的分⼦溶液を調製することが出来れば絶対定量も可能となる。
２．分光光度計
分光光度計は⽬的分⼦の吸光特性を利⽤した⼿法である。タンパク質量を測定する⽅法などが代表的であるが、主なタンパク質定量法には紫外吸収法、Bradford 法（クーマシーブルー法）、Lowry 法（フェノール試薬法）、ビシンコニン酸法（BCA 法）などがある。それぞれに⻑所、短所があり、また同じサンプルでも定量法によって結果に⼤きな差が⾒られることがある。したがってそれぞれの特徴を知り、⾃分の実験にあった⽅法を選択し、⼀連の実験では同じ測定法を使⽤することが望ましい[1]。この分光光度計を⽤いた⼿法も検量線を作成することにより絶対定量が可能となる。タンパク質以外にも DNA、RNA の量を

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測定することが可能である。また臨床検体（⾎液、尿など）の⽣化学検査⾃動分析装置は、
主に分光光度計を⽤いた吸光光度法によって定量分析・定性分析を⾏っている。このため、酵素、脂質、腎機能・電解質など多くの測定項⽬がキットによって⾃動分析される。
３．質量分析装置（MS）
質量分析装置は⽬的分⼦の存在を確認するために⽤いられることが多い⼿法であり、⽬的分⼦の質量あるいは⽬的分⼦の断⽚の質量測定をもとに、その存在を確認することが出来る[2]。また、微量にしか存在しない分⼦であってもその検出感度は⾮常に⾼く、⾼感度分析が可能である。原理は、分⼦をイオン化しその質量電荷⽐（m/z）を測定することによって分⼦を特定するものである。装置は試料導⼊部、イオン源、分析部、イオン検出部、データ処理部から構成される。試料導⼊部には⾼速液体クロマトグラフィ（HPLC）やガスクロマ
トグラフィ（GC）、キャピラリー電気泳動（CE）などが⽤いられ、試料分離を⾏う。イオ
ン源と分析部は質量分析装置の重要構成装置であり、それぞれ試料に電荷を持たせる（イオン化する）部分、イオン化された試料を分離する部分であり、多くのイオン化法（電⼦イオン化法、MALDI 法、ESI 法など）、分析型（四重極型、⾶⾏時間型など）が開発されているので、⾃分の試料や⽬的分⼦の分析にあったイオン化法と分析型を選択する必要がある。
４．表⾯プラズモン共鳴
分⼦間相互作⽤の分析に⽤いられ、抗原-抗体、タンパク質-タンパク質、ペプチド-タン
パク質、低分⼦化合物-タンパク質などの相互作⽤分析が可能である[3]。
５．核磁気共鳴（NMR）
尿をはじめとする体液中の代謝物分析（メタボロミクス分析）に活⽤されており、疾患特異的な代謝物の存在を分析することなどに活⽤されている[4]。
６．次世代シークエンサー（NGS：Next Generation Sequencer）
ゲノム解析に威⼒を発揮する解析技術であるが、近年は患者から⾎液などの体液を採取し、その中に含まれているがん細胞由来の物質（ctDNA、miRNA など）を解析する技術（リキッドバイオプシー）にも活⽤されており、新たな疾患バイオマーカー解析技術として注⽬されている[5]。
【One point】

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞*1 試料の種類と解析⼿法の組み合わせによって様々な⽣体分⼦アッセイが可能であるが、検体の採取条件、前処理、保管状態などによって結果に⼤きく影響することが多いので、扱う検体の状態には⼗分な注意を払う必要がある。
*2 量的な変化を捉える⽅法、存在を確認する⽅法としたが、装置を組み合わせることによって定性・定量を⾏うことが出来る分析技術もある。LC/MS や GC/MS などは分離能⼒に優れたクロマトグラフィと定性能⼒に優れた質量分析装置を結合した装置で、ス
キャン測定より得られるマススペクトルでは溶出成分に分⼦量と構造情報を与えることで定性・定量が可能となる。
【使⽤例】
⾼速液体クロマトグラフ法（HPLC）を⽤いて⾎液中の HbA1c を定量することが可能である。HbA1c は糖尿病患者において⾼値を⽰すバイオマーカーであり、糖尿病関連研究において有⽤な⼿法として活⽤されている[6]。また、カテコールアミン（副腎髄質ホルモ
ン：ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン）の測定にも HPLC が⽤いられ、褐⾊細胞腫（カテコールアミン産⽣腫瘍）、神経芽細胞腫の診断・解析に⽤いられている[7]。
分光光度計は⾃動分析装置にも搭載され、開発が進んだ分析機器であるが、より⾼感度な
⾎液あるいは体液中の⽣体分⼦・病原性分⼦の定量化するための研究開発が⾏われている。
質量分析装置や NGS を⽤いた研究においては、疾患に由来する⽣体分⼦を⾼感度に検出する⼿法の開発が盛んに進められており、今後疾患の早期発⾒などに役⽴てられると考えられている。
＜参考⽂献＞[1] 鈴⽊祥夫. “総タンパク質の定量法”. ぶんせき / ⽇本分析化学会 編 2018 (1), p. 2-9.
[2] J. H. グロス. “マススぺクトロメトリー 原著 3 版”, ⽇本質量分析学会出版委員会訳，丸善出版 (2020)[3] 岡本隆之, 梶川浩太郎. “プラズモニクス−基礎と応⽤”, 講談社 (2010)[4] 福原清，⼤野彰⼦．”NMR メタボロミクスを利⽤した疾患関連バイオマーカーの探索”
昭和学⼠会誌 vol. 75, No. 3, p. 288-295 (2015)[5] 加藤俊介. “総説―我が国のがんゲノム医療・Precision Medicine―”, ⽇本内分泌外科学
会雑誌, 2020, vol. 37, no. 2, p. 106-109.
[6] 東野功嗣. “HPLC 法の素敵な部分と酵素法のチャームポイント”. ⽣物試料分析, 2020,
vol. 43, no. 4, p. 224-230.

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞[7]⾓⽥誠, 今井⼀洋. “カテコールアミンの⾼選択的⾼感度定量法の開発と応⽤”，分析化学.
2003, vol. 52, no. 12, p. 1081-1089.

2-1-2 ⽣体分⼦アッセイに⽤いられる検体
様々な分析⼿法が考えられるが、その対象検体としては、⾎液、尿をはじめとする液体成分が主な検体となる。
その他の体液（唾液、胸⽔、腹⽔など）なども特殊な解析を⾏う場合には対象となる。
組織や細胞に含まれる⽣体分⼦を測定する場合には、⽣体分⼦を抽出して測定に⽤いる場
合がある。

第 2-2 節 遺伝⼦変異解析
2-2-1 遺伝⼦変異（遺伝⼦配列）解析の概要と例【⽬的】
遺伝⼦変異の種類には、「置換 substitution」「⽋失 deletion」「逆位 inversion」「増幅amplification」「挿⼊ insertion」「フレームシフト frameshift」「融合 fusion」「コピー数多型 CNV」などがある。
がんに関連する遺伝⼦変異は、がん細胞内のみで⽣じる体細胞遺伝⼦変異（somatic
mutation）と、患者の正常細胞が⽣まれながらにしてもっている遺伝⼦バリアントである⽣殖細胞系列遺伝⼦変異（germline mutation）に⼤別される。
【遺伝⼦変異の例】
・ 置換 substitution：1 つの塩基が他の 1 つの塩基で置換された変化。
例：EGFR L858R c.2573T>G
アミノ酸変化：p.Leu858Arg
・ ⽋失 deletion：1 つまたは複数の塩基が⽋失した変化。
例：EGFR exon19 deletion c.2240_2254delTAAGAGAAGCAACAT
アミノ酸変化：p.Leu747_Thr751del・ 逆位 inversion：複数の塩基が元の配列の逆相補配列になる変化。
例：ACGTC→CTGCA
・ 増幅 amplification：遺伝⼦の数（コピー数）が増える変化。
例：ERBB2 amp (copy number=32)

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・ 挿⼊ insertion：1 つ以上の塩基が挿⼊され、なおかつ、その挿⼊部の 5ʼ側直前配列のコ
ピーではない変化。
例：ERBB2 c.2326_2327insTAG
アミノ酸変化：p.Ala775_Gly776insVal・ フレームシフト frameshift：塩基の変化によりコドンの枠がずれた場合のアミノ酸配列
や C 末端位置の変化。
例：SMAD4 p.S411fs*17
・ 融合 fusion：2 つの遺伝⼦が染⾊体転座によって融合する変化。
例：ETV6-NTRK3・ 遺伝⼦コピー数変異 Copy Number Variation：個体間でコピー数が異なる遺伝⼦領域が、ゲノム全般にわたって存在すること。
例：segmental duplication、deletion variants【Germline バリアントの解釈】
・ Pathogenic：疾患に関連することが知られているバリアント。
例：遺伝性乳癌卵巣癌症候群（HBOC）における BRCA1/2
例：Lynch 症候群における MLH1、MSH2、MSH6、PMS2
・ Likely pathogenic：疾患に関連すると考えられるが、確定的ではないバリアント。
・ Variant of Uncertain Significance（VUS）：臨床的・⽣物学的に意義がわかっていないバ
リアント。疾患に関連するものかどうか、さらなる検討が必要とされている。
・ Likely benign：疾患にはおそらく関連しないと考えられるバリアント。
・Benign：疾患には関連しないと考えられるバリアント。
【Germline バリアントの解釈】
・ Pathogenic：疾患に関連することが知られているバリアント。
例：遺伝性乳癌卵巣癌症候群（HBOC）における BRCA1/2
例：Lynch 症候群における MLH1、MSH2、MSH6、PMS2
・ Likely pathogenic：疾患に関連すると考えられるが、確定的ではないバリアント。
・ Variant of Uncertain Significance（VUS）：臨床的・⽣物学的に意義がわかっていないバ
リアント。疾患に関連するものかどうか、さらなる検討が必要とされている。
・ Likely benign：疾患にはおそらく関連しないと考えられるバリアント。
・ Benign：疾患には関連しないと考えられるバリアント。

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞【⼿法】
遺伝⼦配列を決定する機器はシークエンサ−と呼ばれる。シークエンサ−により DNA 塩
基配列を読み込み、リファレンス配列と⽐較することで変異を同定する。
Sanger 法を利⽤したシークエンス⽅法を第⼀世代のシークエンサーと呼ぶのに対して、⼀度に⼤量の塩基配列データをシークエンスできるものを第⼆世代のシークエンサーと呼び、現在ではナノポアシークエンサーなどの第三世代のシークエンサーも登場している。⼀般的には第⼆世代以降のシークエンサーを総称して次世代シークエンサーNGS としている。NGS はショートリードシークエンサーとロングリードシークエンサーに⼤別される。
１．ショートリードシークエンサー
数百 bp 程度の⻑さの DNA 配列をシークエンスリードとして、数百万〜数⼗億本を同時に読み取ることが可能である。塩基読み取りの正確性は 99.9%以上とされており、⾮常に⾼い精度を誇る。代表的な機械に Illumina シークエンサーや MGI シークエンサーがある。
２．ロングリードシークエンサー
PCR などの DNA 増幅をせずに 1 分⼦の核酸の配列を読み取ることが可能であり、数⼗kbp 以上の配列を 1 本のシークエンスリードとしてシークエンスできる。遺伝⼦配列解析を⾏う際に有⽤な機器であり、代表的な機械に PacBio シークエンサーや Nanopore シークエ
ンサーがある。
メリットはショートリードシークエンサーでは検出困難な数 kbp にわたる繰り返し配列
や、重複や転座といった構造変異を効率よく検出することが可能な点である。デメリットはNanopore シークエンサーの塩基読み取りの正確性が 90%程度であり、ショートリードシー
クエンサーに対して精度で劣る点である。⼀⽅、PacBio シークエンサーは塩基読み取りの正確性が 99.9%以上とされており、ショートリードシークエンサーと同等の精度を誇る。

2-2-2 遺伝⼦変異解析に⽤いられる検体
・組織
・⾎液
・尿
・体腔液
・洗浄液

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第 2-3 節 遺伝⼦発現解析
2-3-1 遺伝⼦発現解析の概要【⽬的】
複数のサンプル間で複数の遺伝⼦の発現レベルを網羅的に⽐較する⼿法。⼀例として薬剤の細胞に対する影響を調べるために使⽤される。
【⼿法】
１．マイクロアレイ
スライドガラスの基盤上に DNA 断⽚を⾼密度に配置し、これと蛍光標識した測定試料由来の DNA ライブラリーをハイブリダイズさせることで、DNA 断⽚の遺伝⼦発現量を⼤量並列的に定量する⽅法。
２．次世代シークエンサー（NGS）
前節で紹介した NGS は遺伝⼦発現解析にも⽤いられる。ショートリードシークエンサーとロングリードシークエンサーのいずれも使われる。
３．リアルタイム PCR
定量的な分析を可能にした PCR 法。DNA の増幅反応サイクルをモニタリングすること
で鋳型 DNA を定量できる。逆転写酵素（reverse transcriptase）によって RNA を cDNA に転写した後、それを鋳型とすることで定量的な遺伝⼦発現量の解析が可能。
４．デジタル PCR
絶対定量を可能にした PCR 法。PCR 反応を「ある（1）」「なし（2）」のデジタルデー
タに落とし込み、微量の鋳型 DNA 量を「DNA 鎖が n コピー」と絶対的に定量する解析法。

2-3-2 遺伝⼦発現解析に⽤いられる検体
・ 組織
・ ⾎液
・ 尿
・ 体腔液

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・ 洗浄液

第 2-4 節 免疫反応測定
2-4-1 免疫反応測定の概要と例【⽬的】
免疫反応測定は、抗原抗体反応を利⽤して検体に含まれる抗原あるいは抗体を測定する。
測定対象が⾎液や尿などの液体の場合には、含まれる⽣体分⼦（タンパク質やステロイドなど）の存在の定性的な測定や、その⽣体分⼦の量を定量的に測定するために利⽤される。これを応⽤して細胞の存在や機能を評価するために⽤いられる場合もある。抗原抗体反応を⽤いることで、⾮常に微量の⽣体分⼦でも測定できることや*1、様々な⽣体分⼦が混在する検体から対象の⽣体分⼦を特異的に測定できることが強みである。⼀⽅、測定対象が組織や細胞の場合には、細胞の形態や細胞内の分⼦の局在を観察するために利⽤される。これらは第2-5 節で解説する。
【⼿法】
液体に融解している⽣体分⼦を測定する場合、代表的な⽅法として、ウェスタンブロッテ
ィング法、ELISA 法、イムノクロマトグラフィ法、ELISPOT 法などがある。
１．ウェスタンブロッティング法（イムノブロット法）
ウェスタンブロッティング法、⽣体分⼦の混合物を電気泳動によって分離した後、特定の⽣体分⼦に特異的に結合する抗体を⽤いることでその⽣体分⼦の存在を検出する⽅法である。また、その⽣体分⼦の存在の検出だけでなく、その⽣体分⼦の量がわかっているコント
ロールを同時に測定することによって、検体中に含まれる⽣体分⼦の相対的な量を計算することができる（⽐較定量）。
２．ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）法
ELISA 法は、抗体（⼀次抗体）を固定したマイクロプレートに⽣体分⼦の混合物を⼊れて抗体に抗原（測定対象の⽣体分⼦）を反応、次いで酵素標識をした抗体（⼆次抗体）をマ
イクロプレートに残った抗原に反応させ、さらに発⾊する基質を加えて⽐⾊法で酵素活性を測定することで、抗原（測定対象の⽣体分⼦）の絶対量を定量する⽅法である*2。酵素活性を利⽤しない測定⽅法もある*3。また、⼀次抗体をマイクロプレートではなくビーズに固定

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する⽅法もあり、こうすることで同時に複数の⽣体分⼦を測定することができる（マルチプ
レックスアッセイ）。
３．イムノクロマトグラフィ法（免疫クロマトグラフィ法）
イムノクロマトグラフィ法は、クロマトグラフィ法*4 によって⽣体分⼦の混合物を分離した後、特定の⽣体分⼦に対する抗体を⽤いることでその⽣体分⼦を検出する⽅法である。クロマトグラフィ法には、ガスクロマトグラフィ（GC）、液体クロマトグラフィ（LC）、⾼速液体クロマトグラフィ（HPLC）などがあるが、イムノクロマトグラフィ法はインフルエ
ンザウイルス抗原検査のように簡便に対象とする⽣体分⼦の存在の有無を検出することを⽬的としているため、キット化された液体クロマトグラフィが⽤いられる[1]。
４．ELISPOT（Enzyme-Linked Immunospot）法
ELISPOT 法は、⼀次抗体を結合させたマイクロプレートに細胞を⼊れ、細胞に刺激を与えることで産⽣される⽣体分⼦を ELISA 法の原理によって検出する⽅法である。こうする
ことで細胞が存在していることを評価する、あるいは細胞の機能を評価することができる。
つまり、知りたいことは細胞の情報であるが、測定をするのは細胞から産⽣される⽣体分⼦である。抗原に特異的な T 細胞からのサイトカインの放出など、抗原特異的な免疫応答の基礎研究（がん、感染症など）やワクチン開発などに⽤いられる。
【One point】*1 ⽣体分⼦が検体中に多く含まれている場合には、分光光度法（⼊射光に対する透過光の減少を利⽤した測定法）によって測定することもできる。分光光度法による測定に必
要な⽣体分⼦の濃度は、⼀般的には 10‒6 mol/L 以上と⾔われる[2]。
*2 ⽐⾊法による標識酵素活性の測定以外に、蛍光基質を⽤いた蛍光酵素免疫測定法（FEIA：Fluorescent Enzyme Immunoassay）、化学発光基質を⽤いた化学発光酵素免疫測定法（CLEIA：Chemiluminescence Enzyme Immunoassay）、⽣物化学発光基質を⽤いた⽣物発光酵素免疫測定法（BLEIA：Bioluminescence Enzyme Immunoassay）
がある。これらの酵素で標識した抗体を⽤いた測定法は酵素免疫測定法（EAI：
Enzyme Immunoassay）と総称される。
*3 検出のために酵素を⽤いない⽅法として、蛍光を⽤いる蛍光免疫測定法（FIA：
Fluorescent Immunoassay）、化学発光を⽤いる化学発光免疫測定法（CLIA：
Chemiluminescence Immunoassay）がある。

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞*4 クロマトグラフィ法は、⽣体分⼦の混合物を固定相（固体または液体）の中で移動させ、その移動速度の差によって分離する⽅法の総称である。⽣体分⼦の混合物は移動相（液体または気体）と呼ばれる。
【研究の例】
ウェスタンブロッティング法や ELISA 法は、検出対象とする⽣体分⼦の抗体がこれらの⼿法⽤に販売されていれば実施でき、様々な研究に広く利⽤されている。イムノクロマトグ
ラフィ法は簡便に対象とする⽣体分⼦の有無を確認できることが強みとなるため、研究以外にもインフルエンザウイルスや⾷中毒（腸管出⾎性⼤腸菌 O157）の迅速診断キットなど、
主に感染症の臨床検査として利⽤されている。ELISPOT 法は細胞から放出されるサイトカ
インの検出に⽤いられており、たとえば HIV 罹患による免疫応答の低下やワクチン接種による免疫応答の増加の評価といった利⽤ができる。他に、感染症、がん免疫、アレルギー、
⾃⼰免疫疾患などの研究で利⽤されている。
＜参考⽂献＞[1] 望⽉照次. “標識免疫測定法”. 最新臨床検査学講座 免疫検査学. 窪⽥哲朗・藤⽥清貴・細井英司・梶原道⼦編. 医⻭薬出版, 2017, p. 126-133.
[2] 松下誠. “分析法の選択”. 最新臨床検査学講座 臨床化学検査学. 浦⼭修・奥村伸⽣・⼾塚
実・松下誠編. 医⻭薬出版, 2016, p. 37-38.

2-4-2 免疫反応測定に⽤いられる検体
ウェスタンブロッティング法、ELISA 法、イムノクロマトグラフィ法での測定では、測定に⽤いる検体は溶液でなければならない。
⾎清、⾎漿、尿、体腔液（唾液、胸⽔、腹⽔、⺟乳など）、脳脊髄液、細胞培養上清などの液性検体を測定に⽤いる場合には、必要に応じて緩衝液（バッファー）による希釈や遠⼼分離をして測定に⽤いる。⺟乳の場合には、遠⼼分離によって脂肪層、中間層（溶液部分）、沈殿層の３層に分かれるので、中間層を⽤いる。
組織や細胞に含まれる⽣体分⼦を測定する場合には、これらを破壊して⽣体分⼦を抽出して測定に⽤いる。⼀連の作業によって細胞や組織から得られた溶液を細胞ライセート（溶解物）や組織ライセート（組織溶解物）と呼ぶ。
ELISPOT 法は細胞の量や活性を測定するため、PBMC を⽤いる。

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第 2-5 節 形態観察
2-5-1 形態観察の概要と例【⽬的】
バイオバンクに保管される検体は、組織や細胞の形態学的特徴を観察する、特定の細胞や細菌などの微⽣物を検出する、といった⽬的で染⾊を施して観察に使⽤することがある。また、細胞の増殖や増殖因⼦、薬剤刺激に対する挙動などを観察する⽬的で、細胞を培養して観察することもある。
【⼿法】
形態観察を実施するためには、病理診断で使⽤されている染⾊を施して組織や細胞を観察する⽅法、培養した⽣きた状態の組織や細胞を観察する⽅法がある。どのような⽅法で形態観察を⾏うかによって保管⽅法が異なるため、あらかじめ検討した上で適切な保管法を選択する必要がある。
１．病理組織診断で使⽤される主な⽅法(1) HE 染⾊：形態観察のための⼀般的な染⾊。
(2) エラスチカ・ワンギーソン（EVG）染⾊：結合組織の染⾊。結合組織の中の弾性線維と膠原線維を染め分ける。
(3) PAS 染⾊：多糖類の染⾊。グリコーゲン、粘液タンパクなどの染⾊法として最も多く⽤いられている。
(4) マッソン・トリクローム染⾊：結合組織の染⾊。EVG と組み合わせて使⽤されることが多い。
(5) アルシアンブルー染⾊：多糖類の染⾊。PAS と組み合わせて使⽤されることが多い。
(6) 免疫染⾊：抗体を⽤いて細胞に存在する抗原を検出（可視化）する⽅法。
(7) その他：グラム染⾊、グロコット染⾊などの病原体を染⾊する⽅法、腎臓の染⾊に使⽤する PAM 染⾊も多く⽤いられている。
２．病理細胞診断で使⽤される主な⽅法(1) パパニコロウ染⾊：細胞診標本の染⾊に最も広く⽤いられている。核と細胞質（⾓化扁
平上⽪、⾮⾓化扁平上⽪）を染め分けることができる。重積した細胞や核構造が詳細に観察できる。

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞(2) ギムザ染⾊：⾎液、⾻髄標本の染⾊法として⼀般的に⽤いられている。核クロマチンや細胞質顆粒の観察に適している。
３．培養細胞を観察する⽅法(1) 位相差観察：無⾊透明な試料に明暗のコントラストをつけて観察する⽅法。
(2) 蛍光染⾊法：試料に蛍光⾊素を導⼊して観察する⽅法。抗体染⾊などで⽬的の細胞を⽣きた状態で可視化できる。
【研究の例】
形態観察のために染⾊を施した組織や細胞、培養をした細胞は次のような研究に使⽤される。
・病変部と⾮病変部の組織・細胞像を⽐較する研究[1]・病態変化を観察する研究[2][3]・疾患特有の形態学的特徴を解析する研究[4]さらに染⾊を施した像より⽬的の部分を抽出、特定の細胞を選択して遺伝⼦解析などへ応⽤されることもある。
＜参考⽂献＞[1] Budinská E, et al. Molecular portraits of colorectal cancer morphological regions. eLife.
2023, vol. 12, RP86655.
[2] Kumar N, Verma R, Chen C, Lu C, Fu P, Willis J, Madabhushi A. Computer-extracted
features of nuclear morphology in hematoxylin and eosin images distinguish stage II and
IV colon tumors. Journal of Pathology. 2022, vol. 257, no. 1, p. 17-28.
[3] Păun I, Costin AI, Constantin VD, Lomaca I, Ianoşi NG, Socea B, Tutunaru CV, Zlatian
OM, Ianoşi SL, Neagoe CD, Crafciuc AV, Stancu MI. Romanian Journal of Morphology
and Embryology. 2020, vol. 61, no. 4, p. 1129‒1141.
[4] Ciereszko A, Dietrich MA, Słowińska M, Nynca J, Ciborowski M, Kaczmarek MM,
Myszczyński K, Kiśluk J, Majewska A, Michalska-Falkowska A, Kodzik N, Reszeć J, Sierko
E, Nikliński J. Application of two-dimensional difference gel electrophoresis to identify
protein changes between center, margin, and adjacent non-tumor tissues obtained from
non-small-cell lung cancer with adenocarcinoma or squamous cell carcinoma subtype.
PLOS ONE. 2022, vol. 17, no. 5, e0268073.

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2-5-2 形態観察に⽤いられる検体
１．組織(1) 凍結包埋
HE 染⾊、EVG 染⾊などの特殊染⾊、免疫染⾊に使⽤する。必要に応じて薄切後にホルマリンなどで固定を⾏う。FFPE より形態は劣るが、免疫染⾊などの後に⽬的の細胞をマイ
クロダイセクション法で採取して核酸を抽出することが可能である。
(2) FFPE
病理診断のためにルーチンで作製されているので、形態観察には適しており HE 染⾊、
EVG 染⾊などの特殊染⾊、免疫染⾊に使⽤する。凍結包埋より効率は下がるが、核酸の抽出も可能である。ゲノム抽出に適したホルマリンを含まない固定液も販売されており、形態像も FFPE に劣らない。ただし試薬コストが⾼価なため、症例を選んで使⽤することが推奨される。
(3) 新鮮組織
主に培養に使⽤され、培養細胞の位相差観察、蛍光染⾊などを⾏う。また、腫瘍組織⽚を免疫不全マウスに移植して腫瘍形成を観察する⽅法、組織をスライドグラスに押し付けて捺印細胞診標本を作製し、染⾊をして観察する使⽤法もある[1][2]。
２．組織以外(1) ⾎液⾎液をスライドグラス上に薄く伸ばして染⾊し、観察する。また、密度勾配遠⼼法を利⽤
して単核球を分離し、培養やフローサイトメトリーに使⽤されることもある。
(2) 気管⽀洗浄液、胸⽔、腹⽔など穿刺液
採取した液を遠⼼分離し、沈渣をスライドグラスに薄く伸ばして染⾊し、観察する。
【検体処理⽅法の注意点】
組織、細胞を⽤いて染⾊を⾏う際は、染⾊⽅法により適した固定の⽅法が異なるので病理標本作製の教科書などでよく調べてから実施するとよい。スライドグラスにマウントする組織の厚みや細胞の塗抹も染⾊標本のできあがりに影響を及ぼすので注意する。免疫染⾊に使⽤する抗体の中には FFPE では使⽤できないものもあるので、抗体を購⼊する際はデータ
シートをよく確認する。
組織、細胞を培養に使⽤する際は、採取してからできる限り速やかに処理を開始する（第2-6 節 細胞培養 参照）。

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞＜参考⽂献＞[1] Yagishita S, Kato K, Takahashi M, Imai T, Yatabe Y, Kuwata T, Suzuki M, Ochiai A,
Ohtsu A, Shimada K, Nishida T, Hamada A, Mano H. Characterization of the large-scale
Japanese patient-derived xenograft (J-PDX) library. Cancer Science. 2021, vol. 112, no.
6, p. 2454-2466.
[2] ⽷⼭雅⼦, 中村純⼦, 佐藤元, ⽯⽥圭⼦, 榎本利⾹, ⿃居良貴, ⽯川恵理, 井出良浩, 渡邊隆
弘, 廣⽥誠⼀. オンサイト迅速細胞診における湿固定簡易ギムザ染⾊の有⽤性. ⽇本臨床細胞学会雑誌, 2021, vol. 60, no. 3, p. 141-149.

第 2-6 節 細胞培養
2-6-1 細胞培養の概要と例【⽬的】
⽣きた状態の細胞を観察するため、オンデマンド型分譲などバイオバンクで前向きに採取する試料を⽤いて細胞培養を⾏うことがある。細胞培養は組織などの⽣体試料から分離した細胞を⽣体外で⼈⼯的に増殖、維持することであり、細胞を培養することで⽣体内の現象を単純な系で再現することができる。培養中の細胞には薬剤の添加や様々な刺激を負荷することが可能になるので、医学・創薬研究に⼤変有⽤である。
【⼿法】
組織検体に酵素処理を施して細胞を分離、または組織⽚を培養⽫に静置して細胞を増殖させる⽅法がある[1][2]。がん由来組織から分離したがん細胞は、⽐較的容易に培養ができるので研究利⽤されることが多い。間葉系組織由来の線維芽細胞、⾎管内⽪細胞、平滑筋細胞、⼼筋細胞などの細胞も広範に培養に使⽤される。また、末梢⾎、臍帯⾎、⾻髄から分離した単核球なども培養に使⽤される。
【研究の例】(1) 細胞株の樹⽴細胞培養を継続する（継代）と細胞が変異を起こし、無限増殖性を獲得することがある。
または遺伝⼦導⼊やウイルス感染により、細胞が特異な性質を持つことがある[3]。このような細胞系を作る（樹⽴）⽬的で使⽤されることがある。
(2) 3 次元培養

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細胞を平⾯的ではなく、⽴体的な構造をもたせて培養する⽅法[4]。細胞を旋回して細胞塊を形成させる⽅法、細胞をコラーゲンゲルなどのゲル内で培養する⽅法、特殊な培養担体を⽤いて培養する⽅法などがある。
(3) 特定細胞集団の分離
細胞表⾯マーカー（がん細胞マーカー、幹細胞マーカーなど）を⽤いてフローサイトメト
リーで⽬的の細胞を分画し、その細胞集団の挙動を解析する[5]。
(4) 細胞遊⾛解析
細胞の移動を評価する⽅法[6]。様々な⼤きさのメンブレンインサートを⽤いて、メンブ
レンの上下の異なる環境下での細胞挙動を解析する⾛化性アッセイ、⾛触性アッセイ、コン
フルレント状態の細胞表⾯を引っかき無細胞となった場所に移動、増殖する細胞を解析する
創傷治癒アッセイ、細胞外マトリックスをコートしたメンブレンインサートを⽤いて細胞の浸潤を観察する細胞浸潤アッセイなどがある。
＜参考⽂献＞[1] 藤井万紀⼦. “患者⼿術材料からの培養”. 細胞培養・組織培養の技術第 4 版. ⽇本組織培養学会編. 朝倉書店, 2023, p. 209-211.
[2] Hayflick L. “Subculturing Human Diploid Fibroblast Cultures”. Tissue Culture methods
and applications. Academic Press, 1973, p. 220-223.
[3] 清野透. “細胞株の樹⽴”. 細胞培養・組織培養の技術第 4 版. ⽇本組織培養学会編. 朝倉書店, 2023, p. 128-133.
[4] ⽵澤俊明ら. “3 次元培養法”. 細胞培養・組織培養の技術第 4 版. ⽇本組織培養学会編. 朝
倉書店, 2023, p. 140-203.
[5] 嶋本顕ら. “⽣物検体からの初代培養”. 細胞培養・組織培養の技術第 4 版. ⽇本組織培養
学会編. 朝倉書店, 2023, p. 90-133.
[6] ⽮野元, 佐邊壽孝. “細胞運動観察法”. 実験医学別冊 改訂培養細胞実験ハンドブック. ⿊⽊
登志夫監修. ⽺⼟社, 2009, p. 172-176.

2-6-2 細胞培養に⽤いられる検体【組織】
前向きに採取した新鮮組織を培養に使⽤する。組織から消化酵素を⽤いて細胞を分散して培養する⽅法*1[1]、細切した組織⽚を培養⽫に静置して組織⽚から遊⾛、増殖した細胞をPage 36 of 56
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培養する⽅法がある*2[1]。また、腫瘍由来の組織⽚を免疫不全マウスに移植し、マウスの中でがん細胞を増殖させる⽅法もある（患者由来がんモデル）[2]。
【組織以外】(1) ⾎液
末梢⾎から単核球細胞を分離して EV ウイルスを感染させて不死化する⽅法[3]、フロー
サイトメトリーで分画した細胞を培養する⽅法[3]などがある。
(2) 胸⽔、腹⽔
遠⼼分離して得た細胞ペレットから⾚⾎球を除去して培養を⾏う。
【One Point】*1 組織の種類により使⽤する消化酵素、操作⼿順が異なるので⽂献などを参考にするとよい。
*2 培養⽫に静置した組織⽚は乾燥しないように注意する。
＜参考⽂献＞[1] 藤井万紀⼦. “患者⼿術材料からの培養”. 細胞培養・組織培養の技術第 4 版. ⽇本組織培養学会編. 朝倉書店, 2023, p. 209-211.
[2] 井上正宏. “CTOS と PDX のシャトルシステム”. 細胞培養・組織培養の技術第 4 版. ⽇本
組織培養学会編. 朝倉書店, 2023, p. 223-226.
[3] 寛⼭隆, 中村幸夫. “末梢⾎細胞の培養法”. 細胞培養・組織培養の技術第 4 版. ⽇本組織培養学会編. 朝倉書店, 2023, p. 326-330.

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第 3 章 検体処理⽅法と品質
第 3-1 節 検体の品質評価⽅法【概要】
バイオバンクで保管する検体の使⽤⽬的として、検体中に含まれている核酸をはじめタン
パク質など様々なものを解析するといったことが想定される。その⽬的を達成するためには出来る限り⽣体の状況を反映した結果が得られることが重要であり、検体の品質劣化を避け、確実な結果を得るために、検体の品質をしっかりと評価しながら使⽤することが必要となる。
3-1-1 核酸の品質評価⽅法【代表的な核酸の品質評価⽅法】
・吸光度（OD260、OD260/280 ⽐）
核酸の濃度・純度を測定する⽅法として、分光光度計を⽤いて 260 nm の吸光度と 280
nm の吸光度する⽅法[1]が記載されている。分光光度計を⽤いた測定は核酸の量が多く、試料中の夾雑物が少ない場合にシンプルで正確であるとされており[1]、260 nm の吸光度か
ら核酸濃度を算出でき、OD260/280 ⽐によって核酸純度を算出できる。DNA であれば
OD260/280 が 1.8、RNA であれば OD260/280 が 2.0 で純度が⾼いとされる。
【その他の核酸に関する品質評価⽅法】
１．DIN
DNA Integrity Number（DIN）は Agilent Technologies 社の Agilent 2200/4200
TapeStation システムを⽤いた Genomic DNA ScreenTape assay で測定したデータを gDNAの分解度に応じて 1〜10 にスコア化された値であり、FFPE 検体の DNA 品質評価が可能である[2]。
２．Ct 値/ΔCt 値
Ct 値/ΔCt 値はリアルタイム PCR（DNA）もしくはリアルタイム RT-PCR（RNA）法により得られる Ct 値を⽤いて核酸品質を評価する⽅法で、特殊な機器を必要としない簡便な⽅法である。DNA 品質評価では、異なる⻑さの 2 種のアンプリコンサイズ（例：50〜
100 bp 程度の短鎖アンプリコンと、100〜300 bp 程度の⻑鎖アンプリコンなど）から得られる Ct 値の差（ΔCt 値）を指標とする⽅法が、⼀般に⽤いられている。国内⼤規模ゲノムスクリーニング研究（SCRUM-Japan/GI-SCREEN 試験）においては、2,000 例を超える。

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FFPE 検体を⽤いて、Thermo Fisher Scientific 社が開発した ΔCt 値アッセイ[3]が⾏われ、その有⽤性が⽰されている[2]。
３．Q-ratio
Q-ratio は FFPE から得られる DNA の品質を評価するための指標の１つであり、qPCRを⽤いて３つの⻑さの異なる DNA 断⽚（short (41 bp) 、medium (129 bp) 、large (305bp)）を増幅し、その⽐率から DNA 断⽚化の程度を評価する⽅法であり、Q129 /Q41 andQ305 /Q41 の値が低いほど断⽚化していると評価できる[4]。
４．Q-value
Q-value は国⽴がん研究センター中央病院が開発した DNA の品質指標であり、qPCR 測
定 DNA 量／蛍光報測定 DNA 量⽐で表される。Q-value が 0.2 以上のシークエンス（NCC
オンコパネル v2 使⽤時）の成功率は約 85%と報告されている[2]。
５．DV200
DV200 はイルミナ社が開発した RNA の品質指標であり、Agilent Technologies 社のFragment Analyzer または Agilent 2100 bioanalyzer を⽤いて、200 ヌクレオチド以上のRNA 断⽚の割合を算出する。DV200 による品質区分は、＞70%の場合は High、50〜70%の場合は Medium、30〜50%の場合は Low、＜30%は Too degraded としており、＜30%のFFPE 検体では RNA シークエンスのライブラリー調製への使⽤を推奨していない[2]。
６．RIN
RNA Integrity Number（RIN）は Agilent Technologies 社 BioAnalyzer で得られる RNA
分解の指標となる数値で、分解が⾒られない状態が 10 で、分解の進⾏に応じて 1〜10 に分類される[5]。
＜参考⽂献＞[1] 柴⼭祥枝. 核酸（DNA・RNA）の定量法. ぶんせき. 2018, vol. 7, p. 268-274.
[2] ⽇本病理学会. “ホルマリン固定パラフィン包埋組織・細胞検体の適切な取扱い”. ゲノム
診療⽤病理組織検体取扱い規程. ⽇本病理学会編. 2018-03-01, p. 11.
https://pathology.or.jp/genome_med/pdf/textbook.pdf, (参照 2024-06-06).

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞[3] 岩⽥英紘ら. 良好な核酸品質保持のためのホルマリン固定条件の検討―Friday biopsy や⻑期休暇前に採取された⽣検検体を想定して―. 医学検査. 2021, vol. 70, no. 4, p. 724‒
732.
[4] Kapa Biosystems. Technical Data Sheet (KAPA Human Genomic DNA Quantification
and QC Kit, KR0454 ‒ v2.16), 2016.
[5] Schroeder A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to
RNA measurements, BMC Mol Biol. 2006, vol. 7, 3.

3-1-2 核酸以外の⽣体分⼦の品質評価⽅法
核酸以外の⽣体分⼦には、ペプチドを含むタンパク質が主なものとして挙げられる。これ
らの品質評価⽅法としては確⽴された⼿法はないものの、採取から保管までの時間、保管温度と期間、測定までの前処理⽅法などによって影響を受けることが明らかとなっている。
検体をプロテオーム解析する場合においては、AMED が実施した「オミックス研究⽤⽣体試料の取扱いに関する報告書」において報告されており、保管状態で変動するペプチド、
遠⼼分離までの時間で変動するペプチドを品質評価のマーカーペプチドとして品質評価に⽤いることが提案されている。また、タンパク質を医薬品としているようなバイオ医薬品においては、ペプチドマッピングという⼿法が⽤いられている。ペプチドマッピングは、タンパ
ク質の指紋（フィンガープリント）と表現することができ、酵素的または化学的消化を受けて⽣成したペプチド断⽚から様々な情報を得ることができる。

3-1-3 保管までの⼯程の記録による品質評価⽅法
保管検体の品質は、次の第 3-2 節でも述べるように、その保管処理や保管状況などの影響を受ける。たとえば、⾎液を採取後にそのまま室温で 1 ⽇静置すると、多くの⽣体分⼦の測定結果が変化する[1]。そこで検体の品質を評価するために、検体を採取してから研究に使⽤するまでにどのように扱われたのかという記録を⽤いることがある。
バイオバンクの国際学会 ISBER が作成・公表している SPREC [2]では、表 4-1 のように検体処理・保管の⼯程などを整理している。このうち⼀部の項⽬は標準作業⼿順書（SOP）として事前に定めてある項⽬であり（採取容器の種類、遠⼼分離の条件など）、残りは個々の検体の処理をした際に記録をする項⽬である（採取から処理までの時間、遠⼼分離から保管までの時間など）。この表にはないもので、他に重要な項⽬には、SOP からの逸脱、輸送の条件（温度、時間）などがある。

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これらの⼯程の記録を検体の品質の評価に使⽤する利点は、どの施設であっても、⼤きな
⼿間とコストをかけずにすべての検体について記録が残せる点にある。⼀⽅、前項までに記載した⽣体分⼦の品質の評価をすべての検体について実施するには、そのために⼿間とコストをかける必要が⽣じ、多くの場合に現実的ではない。このため、⼯程の記録は AMED バ
イオバンク横断検索[3]において検体の品質情報として利⽤されており、表 4-1 の項⽬のう
ちのいくつかを検体の検索条件に含めることができるようになっている。
表 3-1 SPREC における検体処理・保管の⼯程に関する項⽬
検体の種類

液性検体
（⾎液、尿、体腔液など）

固形検体（組織、⻭、髪など）

項⽬
採取容器の種類
採取から処理（遠⼼分離など）までの時間
遠⼼分離の条件（温度、時間、遠⼼⼒、ブレーキの有無）
遠⼼分離から保管までの時間
保管の条件（保管容器の種類、保管温度）
採取⽅法
温阻⾎の条件（時間）
冷阻⾎の条件（温度、時間）固定の条件（⽅法、時間）凍結の⽅法
保管の条件（保管容器の種類、保管温度）＜参考⽂献＞[1] ⽇本臨床検査医学会 標準化委員会（2012-2013 年度）. “検体の保存安定性”. 臨床検査のガイドライン JSLM2021. ⽇本臨床検査医学会ガイドライン作成委員会編. 宇宙堂⼋⽊書店, 2021, p. 31-36.
[2] ISBER Biospecimen Science Working Group. “Standard PREanalytical Code (SPREC)”.
International Society for Biological and Environmental Repositories (ISBER).
https://www.isber.org/general/custom.asp?page=SPREC, (参照 2023-11-02).
[3] AMED ゲノム医療実現バイオバンク利活⽤プログラム. “バイオバンク横断検索システム”. ⽇本医療研究開発機構（AMED）. https://biobanksearch.megabank.tohoku.ac.jp/v2/, (参照 2023-11-02).

第 3-２節 検体の品質に影響を与える因⼦

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3-2-1 概要
ヒト検体を⽤いた分析は、⼤きく３つの⼯程に分けられる。分析前⼯程（preanalyticalphase）には、検体の採取[1]や保管のための処理などが含まれる。分析⼯程（analyticalphase）には、保管検体の分析から結果を得るまでが含まれる。分析後⼯程（postanalyticalphase）には、得られた結果の分析や残余試料の処理などが含まれる。どの⼯程にも最終的な結果に影響を及ぼす要因が存在する。バイオバンクにおいては特に分析前⼯程の理解が重要である。
なお、あらゆる研究で最良となる検体の処理や保管の⽅法は実現が困難であるため、⼤切なことは、⼯程と品質の関係を把握し、研究の⽬的に合わせて適切な処理や保管検体を選択することである。

3-2-2 被採取者の状態による品質への影響
⽣体内の環境は様々な要因によって影響を受けているため、検体採取をどのような⼈から
どのようなタイミングで⾏ったかによって検体の分析結果は異なり得る。
年齢、性別、⼈種によって濃度や活性が異なる⽣体分⼦が存在する。⽇内周期（サーカディアンリズム）による変化もあり、測定値が採取した時間帯によって異なるものもある。また、検体を採取する前の⾷事や運動によっても影響を受ける。健康診断においては、検査前の 10 時間以上の絶⾷が指⽰される[2]。臨床検査の「空腹時採⾎」とは、12 時間以上[3]あるいは 10〜14 時間[4]の絶⾷後の採⾎を指している。⾷事の他には、カフェイン、飲酒、常⽤している薬剤によって影響を受ける⽣体分⼦がある[3]。
これら以外にも影響を与える要因はあるため、研究において対象とする⽣体分⼦が決まっている場合には、何の影響を受けるかを事前に可能な範囲で調べておくことが望ましい。網羅的な解析を⾏う場合には、使⽤する検体間でどの条件が揃っていなければならないかなどを事前に検討しておくことが望ましい。
⽇常診療の際に検体を採取するバイオバンクにおいては、すべての要因を記録しておくことは困難である。しかし、カルテの記録から確認できる要因もあるので、保管検体を使⽤する際には、⾃分たちの研究に必要な要因が記録されているかをバイオバンクに確認するとよい。
＜参考⽂献＞

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞[1] ⽇本臨床検査医学会 標準化委員会（2012-2013 年度）. “検体検査のサンプリング”. 臨床検査のガイドライン JSLM2021. ⽇本臨床検査医学会ガイドライン作成委員会編. 宇宙堂
⼋⽊書店, 2021, p. 6-10.
[2] 厚⽣労働科学研究費補助⾦ 健康診査の精度管理に関する研究班（主任研究者 渡邊清明）. “健康診査における精度管理の在り⽅”. 標準的な健診・保健指導プログラム（確定版）. 厚⽣労働省 健康局. 2007, 添付資料.
[3] Guder WG, Narayanan S, Wisser H, Zawta B. 正しい検査の仕⽅‒検体採取から測定まで‒. 宇宙堂⼋⽊書店, 1998.
[4] シー・アール・シー よくある検査のご質問. “「空腹時」採⾎とは、⾷事後何時間経てばいいでしょうか？”. CRC グループ. https://www.crc-group.co.jp/crc/q_and_a/06.html,(accessed 2023-11-07).

3-2-3 検体採取から保管までの要因による品質への影響
検体の採取から保管までの要因としては、すべての検体に共通の要因として、採取から処理開始までの温度と時間がある。他に、採取容器の種類、処理中の条件など様々な要因がある。
採取から処理開始までの時間は短い⽅がよい。ただし⾎清の場合には、遠⼼分離をする前の⾎液を凝固させる時間を確保することが重要であるため、この時間よりも短くすることができない点に注意する。温度は室温か冷蔵（4℃）のいずれかになるが、このどちらがよい
かは測定対象の⽣体分⼦によって異なる[1]。このため、測定対象が決まっている場合には条件検討の対象となる。検体の採取から検体処理をする場所（バイオバンクなど）は通常は離れている。このため、搬送の⽅法や、搬送するまでの⼀時保管の⽅法によってもこれらは影響を受ける。何らかの研究によって検体を前向き収集する場合には、その研究で実施する解析の内容に合わせて、事前に採取から検体処理までの流れを詰めておく必要がある。
液性検体の場合には遠⼼分離の条件も影響をする。遠⼼⼒あるいは遠⼼時間が不⾜していると、⼗分に分離がされないことがある。確実な分離のために、遠⼼分離を２回⾏うこともある。冷蔵（4℃）で遠⼼できる遠⼼分離機もあるが、室温と冷蔵のどちらがよいかは分析
対象による。また、多くの遠⼼分離機は短時間でロータを停⽌するためにブレーキ機能が付いているが、ブレーキをかけることでたとえば細胞の回収率が下がるなどの影響を受ける場
合がある。研究において測定対象とする⽣体分⼦がこれらの影響をどのように受けるのか、
事前に把握しておくことが望ましい。

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組織検体の場合には保管の前に何らかの⽅法で固定（組織の中で起こる⽣化学反応を停⽌）する。具体的には、ホルマリンなどの固定⽤の試薬（固定液）に漬けたり、凍結したりする。固定の種類や、固定液に漬けられていた時間などが組織検体の状態に⼤きく影響する。⼀般には液体窒素を⽤いて瞬間的に凍結をする⽅法（スナップフリーズ）が最もよいが、その後に HE 染⾊標本を作成したり細胞培養を⾏ったりしたい場合にはそれらに適した処理⽅法を選択する。
検体採取の際に添加物が⼊った容器（採⾎管など）を使⽤することがある。たとえば⾎漿の場合には、抗凝固剤が⼊った採⾎管を使⽤するが、1-2-4 に記載したように抗凝固剤には
いくつかの種類があり、そのどれを使⽤するかによって影響を受ける⽣体分⼦が異なる[2][3]。このため、測定対象とする⽣体分⼦がどのような影響を受けるのか、使⽤する検体はどのような容器が⽤いられたかを確認することは重要である。
また、容器の材質の影響を受けることもある。タンパク質などの⽣体分⼦が容器に吸着し、濃度が低くなることがある。検体中にごく微量しか含まれていない⽣体分⼦を測定する
場合には、特にその影響を受けることが考えられる。低吸着の容器が開発され販売されているが、その必要性と価格のバランスによって検討することになる。
他に検体採取の⼿技など様々な要因があるが、それらは検体を採取する医療従事者（臨床検査技師、看護師など）に委ねられ、検体を採取する施設におけるガイドライン遵守率などが重要な要因である。
＜参考⽂献＞[1] ⽇本臨床検査医学会 標準化委員会（2012-2013 年度）. “検体の保存安定性”. 臨床検査のガイドライン JSLM2021. ⽇本臨床検査医学会ガイドライン作成委員会編. 宇宙堂⼋⽊書店, 2021, p. 31-36.
[2] 東克⺒, “抗凝固剤の種類と使い⽅”. 最新臨床検査学講座 ⾎液検査学 第 2 版. 奈良信雄編.
医⻭薬出版, 2021, p. 74-75.
[3] Guder WG, Narayanan S, Wisser H, Zawta B. 正しい検査の仕⽅‒検体採取から測定まで‒. 宇宙堂⼋⽊書店, 1998.

3-2-4 保管による品質への影響
検体の保管の条件によって⽣体分⼦は影響を受ける。最も重要な要因は保管温度である。
保管中に酵素活性や化学活性が残存していると徐々に検体の状態が変化する。⼀般に温度は低ければ低い⽅がよく、⽔のガラス転移点（‒137℃）以下での保管が特に望ましいとされPage 44 of 56
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る[1]。⽣体試料の保管にはディープフリーザー（‒80℃）や液体窒素（気相、‒150℃以下）が⽤いられることが多い。この場合、それらの温度帯での保管のために販売されている保管容器を使⽤する必要があり、もし適していない容器を使⽤した場合には、凍結の過程あるいは保管中に容器が破損する恐れがある。
ただし核酸の保管では、冷蔵が選択されることがある。これは 1 つのチューブから少しずつ繰り返し検体を使⽤する可能性がある場合である。凍結での保管の場合は、使⽤するたびに凍結と融解を繰り返す（freeze-thaw cycle）ことによって核酸が分解される。核酸溶解
液に酵素活性を阻害する分⼦（EDTA など）が含まれた状態であれば、冷蔵での⻑期間（10 年以上の）の保管も可能である[2]。EDTA が中に含まれる TE バッファー中でのDNA の分解速度は、超純⽔中と⽐べて 1,700 倍遅くなるとの報告もある[3]。ただし、冷蔵保管中にカビが発⽣することがあり、特に⽇本は湿度が⾼いためこの点に注意を要する。
なお、検体の種類によらず、凍結・融解を⾏うことで保管検体の品質は劣化するため、注意が必要である。凍結保管している検体を何らかの理由で意図的に凍結・融解している場合もあり得るが、この場合、その検体が研究に利⽤できるかを判断できるようになるためにはその記録（ログ）が残されている必要がある。また、⼊出庫の繰り返しや停電などによって、保管庫の中の温度が上昇することがある。多くの場合は品質には⼤きな影響はないと思われるが、状況によっては品質に影響が⽣じるくらいの上昇となっている可能性があるた
め、注意を払う必要がある。
保管検体の使⽤前に、どの温度帯で何年間の保管がされた検体なのか、凍結・融解が何回された検体なのかなどを確認することが望ましい。あるいは、もし保管検体を⽤いた解析の結果の解釈に疑問が⽣じた場合には、保管中の何らかの事象により検体品質に影響が出た可能性を検討することも必要である。この際には保管中の記録を確認することになる。
＜参考⽂献＞[1] International Society for Biological and Environmental Repositories (ISBER). “液体窒素保管システム”. ISBER ベスト・プラクティス：リポジトリに対する推奨事項 英語版 第4 版 ⽇本語対応版. International Society for Biological and Environmental Repositories(ISBER), 2018, p. 21-22.
[2] QIAGEN FAQs. “Do you have stability data for genomic DNA isolated with the QIAamp
DNA Blood Mini Kit?”. QIAGEN.
https://www.qiagen.com/us/resources/faq?id=a2c87908-90a6-41bc-bae7582f6ad69c26&lang=en, (accessed 2023-11-07).

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞[3] Fattorini P., et al. Producing standard damaged DNA samples by heating: pitfalls andsuggestions. Analytical Biochemistry. 2018, vol. 549, p. 107-112.

3-2-5 利⽤時における品質への影響
バイオバンクに保管された検体を研究に使⽤する際には、バイオバンクから研究を実施する場所まで輸送が必要になる。その際、温度管理が重要である。温度管理が不⼗分な場合、凍結検体の輸送中凍結・融解の繰り返し、完全融解が起きることがあり得る。輸送時中における想定温度帯からの逸脱の把握のためには温度ロガーを同梱する。また融解を確実に防ぐには、輸送会社や輸送⽅法を慎重に選定する。混載便は安価だが融通が利かない⼀⽅で、チャーター便は⾼価だが細かい⽇時指定ができるなどの利点がある。また、検体によっては振動で質に影響を受けることがあるが、この場合には振動抑制可能な容器を持っている輸送会
社を選ぶ。
保管された検体を⼊⼿して測定をする前には、保管検体をどのように扱うかも結果に影響する。検体をそのまま測定装置にかける場合もあるが、多くの場合には何らかの処理が必要となる。たとえば、⾎漿検体からアルブミンなどのタンパク質を除いたり、組織検体から核酸の抽出をしたりする場合である。この際の⼿技や使⽤する機器・キットが結果に影響を及ぼすことがある。
細胞の培養などのために凍結された状態の保管検体を使⽤する場合、融解⽅法によって活性に違いが⽣じる。急速に融解をした⽅がよい場合と、緩慢に融解した⽅がよい場合のいずれもある。また、培地の種類によっても異なる。このため、使⽤する検体ではどのように融解することが推奨されているか、事前に調べておくべきである。

第 3-3 節 がん遺伝⼦パネル検査における品質（実験結果）
本節の内容は、すべて論⽂報告[1]された内容および⽇本病理学会が発刊したゲノム研究⽤・診療⽤病理組織取り扱い規程[2]に記載された内容を元に記述したものである。ここで⽤いられている試薬や機器、及び詳細な⼿順については、[1][2]の⽂献を参照して頂きたい。
【⽬的】
FFPE 検体を⽤いたがん遺伝⼦パネル検査による DNA 品質とシークエンス成功率を検証し、がん遺伝⼦パネル検査に適した条件を探索する。

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バイオバンク利活⽤ハンドブック＜試料編＞【材料・⽅法】
１．材料
慶應義塾⼤学病院の乳腺外科、呼吸器外科、肝胆膵外科、⽿⿐咽喉科、下部消化器科、脳神経外科、婦⼈科、⻭科⼝腔外科、⽪膚科、泌尿器科、整形外科、上部消化器科の 12 の臨
床科から提出された検体で作製した FFPE 計 1,417 検体を対象とした。
検体の内訳は、乳腺外科（P：n=6、A1：n=332）、呼吸器外科（P：n=31、A1：n=48）、肝胆膵外科（P：n=16、A1：n=42）、⽿⿐咽喉科（P：n=5、A2：n=6）、下部
消化器科（P：n=50、A 2：n=92）、脳神経外科（P：n=38、A2：n=21）、婦⼈科（P：n=109、A2：n=153）、⻭科⼝腔外科（P：n=22、A2：n=3）、⽪膚科（P：n=11、A2：
n=15）、泌尿器科（P：n=134、A2：n=73）、整形外科（P：n=32、A2：n=25）、上部
消化器科（P：n=42、A2：n=111）であった。P、A1、A2 の意味は次節で説明する。
２．固定プロセス
FFPE の作製条件の違いにより３群に分けた。⼿術の際に摘出された病理検体から腫瘍部の⼀部を 5 mm×5 mm×3 mm に切り出し、速やかに 10％中性緩衝ホルマリンに浸漬し、24 時間固定。固定後は⾃動固定包埋装置にて脱⽔、脱アルコール、パラフィン浸透させ、パラフィン包埋した FFPE をゲノム検査⽤ FFPE：P（Prospective）群とした。⼿術で摘出された臓器をホルマリンに浸漬し、⼗分に固定されたタイミングで切り出してカセットに⼊れ、⾃動固定包埋装置にて脱⽔、脱アルコール、パラフィン浸透させ、パラフィン包埋した
病理診断⽤アーカイブ FFPE：A（Archive）群とした。A 群の中で 10％中性緩衝ホルマリ
ンで固定した呼吸器外科、乳腺外科、肝胆膵外科の検体は A1 とし、20%中性緩衝ホルマリ
ンで固定した下部消化器科、脳神経外科、婦⼈科、⽿⿐咽喉科、⻭科⼝腔外科、整形外科、⽪膚科、泌尿器科、上部消化器科の検体は A2 とした。固定時間は 48 時間以上であり、肝胆膵外科だけが 1 週間以上であった。
３．核酸抽出作製された FFPE をミクロトームにて 3 µm の厚さに薄切し、HE 染⾊標本を作製した。
HE 染⾊標本は病理医が鏡検し、腫瘍細胞含有率の算定と、必要な場合は腫瘍部位のマーキ
ングを⾏った。腫瘍細胞含有率は（腫瘍細胞数）/（有核細胞数）とし、DNA を抽出する
部位のマッピングを⾏う。病理医の鏡検により、ゲノム検査に適していると判断された
FFPE から 10 µm の厚さの未染標本を 10 枚作製した。HE 染⾊標本のマッピングに従い、未染標本から腫瘍部位をダイセクションし、マイクロチューブに回収した。回収した FFPE

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⽚にミネラルオイルを添加し、ボルテックスで攪拌して、80℃で 2 分間インキュベーショ
ン後に室温になるまで静置した。その後、Promega 社のプロトコル通りに作成した mastermix（Lysis buffer、Proteinase K、Blue Dye）を加え、ボルテックスで攪拌後、層分離のため遠⼼し、ヒートブロックで 56℃、30 分間静置後、80℃、4 時間静置した。その後、
RNase を添加し、静置後に遠⼼。Maxwell RSC DNA FFPE Kit（Promega #AS1450）の精製キットに液層を移し、磁気シリカビーズ法を原理とした⾃動核酸精製システム Maxwell
RSC Instrument（Promega #AS4500）にて DNA を抽出した。
抽出した DNA は、dsDNA BR（broad range） Assay Kit（Thermo Fisher Scientific#Q32853）を⽤いて、Qubit™ 4 Fluorometer（Thermo Fisher Scientific）で濃度を測定
し、DNA の断⽚度の指標である DIN（DNA Integrity Number）を Genomic DNA Screen
Tape（Agilent #5067-5365）と Genomic DNA Reagents（Agilent #5067-5366）を⽤いてAgilent 4200 TapeStation（Agilent #G2991AA）で測定した。
４．ライブラリー作製とシークエンス
DIN≧2.0 かつ、DNA 濃度測定可能域内の DNA 濃度の検体は 16 µL を⽤いて、GeneRead DNAseq Targeted Panels V2 Human Comprehensive Cancer Panel（QIAGEN＃
NGHS-501X-96）、GeneRead DNAseq Panel PCR Kit V2（QIAGEN＃181942）によりサーマルサイクラーで反応させた後、磁気ビーズ AMPure XP（Beckman #A63882）とマグネ
ットスダンドで精製を⾏った。精製したアンプリコンを TapeStation D1000 Screen Tape
（Agilent #5067-5582）、TapeStation D1000 Reagents（Agilent #5067-5583）を⽤いてAgilent 4200 TapeStation でアンプリコン濃度を測定した。アンプリコンが 100 ng になる
よう濃度を調製し、GeneRead DNA Library I Core Kit の End Repair buffer、End Repair
enzyme を添加して、サーマルサイクラーで反応させ、末端処理を⾏った。その後、GeneRead DNA Library I Core Kit の A-addition buffer、Klenow Fragment を添加して、サーマルサイクラーで反応させ、A 付加を⾏った。次に GeneRead DNA Library I Core Kit のLigation buffer、T4 DNA Ligase と NEXTflex™ DNA Barcodes ‒ 48（BIOO Scientific#NOVA-514104）で、あらかじめ決めた番号のアダプターを添加してサーマルサイクラーで反応させ、アダプターを結合させた。アダプターを結合させた後は、磁気ビーズ
AMPure XP とマグネットスダンドで精製を⾏った。精製したライブラリーを GeneRead
DNA Library I Amp Kit を⽤いて、サーマルサイクラーで反応させ、ライブラリーを増幅させた。増幅させたライブラリーを磁気ビーズ AMPure XP とマグネットスダンドで精製した。作製したライブラリーは、TapeStation D1000 Screen Tape（Agilent #5067-5582）、TapeStation D1000 Reagents（Agilent #5067-5583）を⽤いて、Agilent 4200 TapeStation

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でグラフのピークが 150 bp 前後にあることを確認し、ライブラリー濃度を測定した。ライ
ブラリー濃度が 1.8 nM になるよう調製し、0.2 N ⽔酸化ナトリウムで変性後、pH 7.0 トリ
ス緩衝液で中和した。20 pM Phix とともに NextSeq 500/550 Mid Output Reagent
Cartridge v2 に移した。NextSeq にフローセルとカートリッジ、Buffer をセットして測定を⾏った。NextSeq で得られた FASTQ ファイルを三菱電機ソフトウエア社に送り、⾃動解析
パイプラインにて解析・アノテーションを⾏った。
５．シークエンス結果の評価
DNA 抽出後の濃度が測定閾値以下である場合、または DIN＜2.0 の場合を「検体不適」と判定した。次に、ライブラリー濃度が測定閾値以下であった場合も「検体不適」と判定した。さらに、バイオインフォマティクス解析にて、リード残存率≧70％、QV≧30 の領域が50％以上存在し、かつペアリードも同じ条件を満たすリードが存在する場合で、この条件をクリアした有効リード数≧3000000 リードの場合をデータ品質良好とした。この条件に満たない場合は、データ品質が不良として「品質不適」と判定した。不適と判定された症例
はその原因ごとに数値化した。
【結果と考察】P、A1、A2 群の抽出した DNA の DIN や濃度、解析結果の⼀覧は表１及び表２に記載した通りであった。またこれらをまとめたグラフを図 4-1 に⽰す。P では 496 検体中 408 検
体で全体の 82.3％が検体品質良好かつ解析成功であり、37 検体で 7.5％が DIN≦2.0 による検体不適、10 検体で 2.0％が DNA 濃度不⾜による検体不適、41 検体で 8.2％がバイオイン
フォマティクス解析での品質不良であった。
A1 では 422 検体中 333 検体で全体の 78.9％が検体品質良好かつ解析成功であり、55 検
体で 13.0％が DIN≦2.0 による検体不適、2.4％が DNA 濃度不⾜による検体不適、24 検体
で 5.7％がバイオインフォマティクス解析での品質不良であった。
A2 では 499 検体中 353 検体で全体の 70.7％が検体品質良好かつ解析成功であり、106 検
体で 21.2％が DIN≦2.0 による検体不適、8 検体で 1.6％が DNA 濃度不⾜による検体不適、32 検体で 6.4％がバイオインフォマティクス解析での品質不良であった。
10％中性緩衝ホルマリンを使⽤し固定時間が 24 時間に統⼀された P と、固定液は同じ
10％中性緩衝ホルマリンを使⽤し固定時間が 24 時間以上である A1 での検査成功率の差
は、3.4％pt となった。固定液の種類が異なる A1 と A2 での検査成功率の差は 8.2％pt であった。

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P と A1 で最も差がみられたのは DIN≦2.0 の検体が占める割合であり、固定時間が⻑時間となる A1 で DIN≦2.0 の検体が占める割合が⼤きく、ホルマリン過固定により DNA の断⽚化が進⾏したことが⽰唆された。また、固定液の種類が異なる A1 と A2 では、DIN≦
2.0 の検体が占める割合に差がみられ、より⾼濃度ホルムアルデヒドが含まれる固定液を使⽤した A2 で DIN≦2.0 の検体が占める割合が⼤きく、⾼濃度ホルムアルデヒドによる
DNA の断⽚化が進⾏したことが⽰唆された。
⼀⽅、ゲノム研究⽤・診療⽤病理組織検体取扱い規程[2]に従い作製したゲノム検査⽤
FFPE（P）であっても、ゲノム解析成功率が 100％とはならなかったことについても考察した。我々は、固定液の種類や固定時間以外にも検体の品質に影響を及ぼす因⼦があると考え、検体を提出した臨床科ごとに検査結果を表 4-2、表 4-3 と図 4-2 に⽰した。
ゲノム解析成功率は、乳腺外科（P=100％、A=78.9％）、呼吸器外科（P＝93.5％、A＝89.6％）、肝胆膵外科（P=56.3％、A＝66.7％）、⽿⿐咽喉科（P=100％、A=83.3％）、
下部消化器科（P=92.0％、A=69.6％）、脳神経外科（P＝89.5％、A＝90.5％）、婦⼈科（P=87.2％、A=64.1％）、⻭科⼝腔外科（P=86.4％、A=100.0％）、⽪膚科（P=81.8％、A=86.7％）、泌尿器科（P=75.4％、A=79.5％）、整形外科（P=75.0％、A＝40.0％）、上部消化器科（P=73.8％、A=74.8％）であった。
【結論】
FFPE で、がんゲノム解析を 98%以上成功させるために必要な条件は、抽出した DNA が
DIN≧3.0 かつ DNA 濃度≧40 ng/µL であった。本検討においても固定時間とホルマリンの種類が DNA の品質に影響を与えることが明らかであり、ゲノム研究⽤・診療⽤病理組織検
体取扱い規程[2]の推奨通り、可能な限り 10%中性緩衝ホルマリンでの 24 時間固定が望ましい。
そのためには、検体の摘出⽅法や、臓器による組織構造、脱灰操作の有無など、臨床科に特異的な要因を考慮する必要がある。今後は患者の低侵襲・低負荷を優先し、⽣検検体や細胞診検体、リキッドバイオプシーによるゲノム解析の需要が⾼まっているため、検体の種類
や⼤きさなどに応じたバイオインフォマティクス解析の品質基準も必要だと考えられた。

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表 4-2 ゲノム検査⽤ FFPE を⽤いた検査成功率と不成功の原因内訳

表 4-3 アーカイブ FFPE を⽤いた検査成功率と不成功の原因内訳

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図 4-1 FFPE 作製条件別の検査結果と検査失敗原因の内訳

図 4-2 臨床科別の検査結果と検査失敗原因の内訳＜参考⽂献＞[1] Yanagita E, Yamada H, Kobayashi T, Aimono E, Nakamura K, Hirasawa A, Nishihara H
The DNA integrity number and concentration are useful parameters for successful

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comprehensive genomic profiling test for cancer using formalin-fixed paraffin embedded
tissue. Pathology International. 2023, vol. 73, no. 5, p. 198-206.
[2] ⽇本病理学会. ゲノム研究⽤・診療⽤病理組織検体取扱い規程. ⽺⼟社, 2019, 160p.

第 3-4 節 OCT 包埋凍結組織の品質（実験結果）
3-4-1 実証実験-1：包埋容器の検証【⽬的】
OCT 包埋凍結組織の作製時に使⽤する包埋⽫について、⾦属製とプラスチック製のもの
を⽤い、凍結するまでの時間及び標本の仕上がりについて⽐較した。
【材料と⽅法】
１．材料
筑波⼤学附属病院の呼吸器外科から提出された肺がん検体を使⽤した。包埋剤はティシュー・テック O.C.T.コンパウンド（サクラファインテックジャパン）、冷媒は液体窒素を使
⽤した。
た。
２. ⽅法
⾦属製の包埋⽫（サクラファインテックジャパン, 包埋⽫, #4164）とプラスチック製の包埋⽫（サクラファインテックジャパン, クリオモルド, #4728）でそれぞれ標本を作製、包埋⽫を直接液体窒素に浮かべて凍結した場合、⾦属容器（茶筒の蓋を利⽤）に静置して凍結した場合を⽐較した。
1-1：⾦属製包埋⽫を直接、液体窒素に浮かべて作製
1-2：プラスチック製包埋⽫を直接、液体窒素に浮かべて作製
1-3：⾦属製包埋⽫を⾦属製容器に⼊れ、容器を液体窒素に浮かべて作製
1-4：プラスチック製包埋⽫を⾦属製容器に⼊れ、容器を液体窒素に浮かべて作製【結果】
結果を表 4-4 に⽰した。
表 4-4 包埋容器の検証結果の概要
⽅法

凍結するまでの時間

出来上がった標本の状態

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1-1

40 秒〜1 分

OCT コンパウンドに⻲裂が⽣じた

1-2

25 秒〜30 秒

OCT コンパウンドに⻲裂が⽣じた

1-3

1 分 40 秒〜2 分

⻲裂もなくきれいな仕上がり

1-4

1 分 30 秒〜1 分 40 秒

⻲裂もなくきれいな仕上がり【結論】・ プラスチック製の包埋⽫の⽅が中⼼部まで固まる時間が 10 秒程度短い。
・ プラスチック製の包埋⽫の⽅が使⽤しているコンパウンドの量が少ないため凍結までの時間が短いと考えられる。

3-4-2 実証実験-2：標本を乾燥から防ぐための⽅法について検証【⽬的】
OCT 包埋凍結組織標本を超低温庫で保管する際の乾燥を防ぐために適した梱包材を検討する。アルミ箔とパラフィルムのどちらで標本を覆うとよいか検討した。
【材料と⽅法】
１．材料
筑波⼤学附属病院の呼吸器外科から提出された肺がん検体を使⽤した。包埋剤はティシュー・テック O.C.T.コンパウンド（サクラファインテックジャパン）、冷媒は液体窒素を使⽤した。標本の梱包にはアルミ箔とパラフィルムを使⽤した。
２. ⽅法
OCT 包埋凍結組織標本を作製し、アルミ箔またはパラフィルムで標本を覆い、超低温庫で保管し、半年後の状態を検証した。
【結果】
・ 作りたての標本をパラフィルムで覆うと破れてしまった。
・ パラフィルムは保管試料の出庫時に劣化して破れてしまっているものもあった。
・ アルミは半年保管しても劣化、破けなどの変化は認められなかった。
【結論】

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・ パラフィルムは⼿で伸ばすため、標本に触れる⾯の温度が上昇することも考えられる。
・ 半年間の凍結保管後にパラフィルムは劣化していたものもあったが、アルミは変化がな
く、超低温庫における保管に有⽤であることがわかった。

3-4-3 実証実験-3：溶媒の検証【⽬的】
OCT 包埋凍結組織標本を作製する⽅法として、液体窒素とアセトン/ドライアイスどち
らの溶媒を使⽤するとよいか検討した。
【材料と⽅法】
１．材料
筑波⼤学附属病院の呼吸器外科から提出された検体を使⽤した。包埋剤はティシュー・テ
ック O.C.T.コンパウンド（サクラファインテックジャパン）、冷媒は液体窒素またはアセトン/ドライアイスを使⽤した。
２. ⽅法
OCT 包埋凍結組織標本を作製し、液体窒素またはアセトン/ドライアイスで凍結した
後、超低温庫で保管し、2 週間、1 ヶ⽉、1 年後に標本を薄切して組織像を⽐較した。
【結果】
１. 液体窒素・ あまり時間を費やすこともなく、容易に準備ができた。
・ 保管後、2 週間、1 ヶ⽉、1 年後に標本を薄切して組織像を⽐較したところ、保管期間による形態変化はあまり認められなかった（図 4-3 A、B）。
２. アセトン/ドライアイス
・ アセトンが⼗分に冷えるまでに少し時間がかかった。
・ 保管後、2 週間、1 ヶ⽉、1 年後に標本を薄切して組織像を⽐較したところ、1 ヶ⽉後、1 年後の標本は、薄切を⾏なって 1 ヶ⽉以内に染⾊した標本と⽐較して核の空砲化が顕著であった（図 4-3 C、D 1 ヶ⽉後の標本は画像なし）。
・ 1 ヶ⽉以上保管した後の標本はシャーベット状になっているものや OCT コンパウンドがゴム状に柔らかくなっているものもあり、薄切しにくいものもあった。

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・ 作製後、1 ヶ⽉程度はアセトン臭が強く、冷凍庫内に充満していた。
A

B

C

D

図 4-3 標本作製時の溶媒と経過年数による標本の⽐較
A. Sample No. 535、液体窒素で作製、保管期間 2 週間（×100）
B. Sample No. 535、液体窒素で作製、保管期間 1 年（×100）
C. Sample No. 537、アセトン/ドライアイスで作製、保管期間 2 週間（×200）
D. Sample No. 537、アセトン/ドライアイスで作製、保管期間 1 年（×200）【結論】・ 液体窒素を使⽤して標本を作製した⽅が準備も容易であり、保存状態も良い。
・ アセトン/ドライアイスを使⽤して作製した標本は 1 ヶ⽉以上保存すると品質の低下が認められる。

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