島根医学 :5第5巻 :第 <=号 4G〜H頁(4>34)4CD
67894;>34?@A4<B3?3
EFD 301223456789:!"#$%&'()*+ ,./0123.456
789-::;,<89-::=>?@ A<B'CDEFGHIHJKLM(NOたけ竹した下はる治お男キーワード：/0-!
$22, 自己免疫疾患, 遺伝子多型, L0M, 酵素プロモーター活性;<

自己免疫疾患との関連が示唆されている /$.N"+&O.P)'($-!
$22(/0-!
$22) 遺伝子内の非同義置換型 L0MQ座位と R1関連 L0MK座位について, 広範な集団調査と遺伝子型―活性相関解析を実施した｡ その結果, 非同義置換型 L0MQ座位に関して, 今回調査した集団では著しく遺伝的多様性が乏しいことが明らかとなった｡ さらに, これら L0Mの%&P.+-(($($に対応するアミノ酸置換型 /0-!
$22の性状解析から, L0M 1KJS$(,T4J<U, R4FJ
V及び W54
4X$+% における %&P.+-(($($によって不活性な /0-!
$22酵素
3FK
3Y,が産生されることが明らかとなった｡ 一方, R1関連 L0MK座位については, I
I
3>E
EY, I
5F>
1, Z4E5>X, 及び ZE45K
Y -(($($は低血清 /0-!
$22活性レベルと関連していることが明らかとなった｡ さらにこのうち遺伝子上流域に存在する L0M5座位が有意にプロモーター活性変化を惹起することから, これらのヒト /01L[4内プロモーター領域の L0Mはプロモーター活性低下によって血清 /0-!
$22活性を減少させることがはじめて示唆された｡

!

"

#

$体の産生を抑える役割を果たすものとして/0-!
$が想定されており, なかでもリソソーム

従来より, 細胞死に伴い産生される核抗原を含酸性加水分解酵素である /0-!
$22は食作用によっめた細胞残渣のクリアランスが !
"!
#$%&'()*)!て取り込まれた死細胞残渣に含まれる /01分解$+"#,$%-#.!
)!のような自己免疫疾患の発症阻に関与することが報告されている3)｡ 近年, マウ止に寄与することが示されてきた｡ これに関連し,スにおける /0-!
$22欠損の誘導はヒトのリュー核抗原のうち /01を分解・消去し, 抗 /01抗マチ性関節炎に類似した慢性多発性関節炎を引き$22欠損起こすことが示された4)｡ さらに, /0-!

%&'()*+,-.%/*+
島根大学医学部法医学教室
連絡先：〒EF5I
JK>3 出雲市塩冶町J
FI3

マウスではマクロファージ内の未分解 /01の蓄積によって致死的な貧血が発症する5)｡ このよう

: W 2B
4\に, !"#$%&&は自己免疫疾患などとの関連が示

PQRS

T@:U

唆されてきたが, それを検証するための遺伝医学!"#$%&'

的解析は未だなされていない｡()*+$!"#$%&&遺伝子(!"#$%&)には "'(&)*+",T 5V:
42:WXY:
5Z2:[\

アジア人集団 (日本人@24名, 韓国人@
A2名, 中)##*#$%上いくつかの +",が同定されており,

国人@
3名, モンゴル人232名, チベット人254名,その内の .座位が非同義置換型 +",である｡ さタマン人5:名, タミル人5@名, シンハラ人5@名),

らに, +/0患者に認められる腎不全との相関がアフリカ人集団 (オバンボス人>@名, ガーナ人B@ある変異として +",1234&が報告されている5)｡名, コーサ人>
B名), ヨーロッパ人集団 (ドイツ

しかしながら, これら +",について未だ多型性人A.名, トルコ人2A3名), 及びメキシコ人集団の確認もなされておらず, 広範な集団調査は実施(ウイチョル人>
4名, ナワトル人A:名, メスティーされていない｡ 特に, これら +",に基づくアミゾ人BA名) について, 少なくとも自己免疫疾患のノ酸置換の酵素活性への影響は明らかにされてい罹患歴のない健常人から採取した血液試料からない｡ !"#$%&
&遺伝子が自己免疫疾患等の発症!"9を分離し, +",遺伝子型判定に使用した｡の遺伝的背景を形成する因子となりうるかを検証

すべての参加者から文章で同意を得ており, さらするためには, '()')*!"#$%&&酵素活性レベルに, 本研究は当該施設の倫理委員会等で承認を得の変動を生じる可能性のある非同義置換型 +",ている｡と自己免疫疾患罹患との相関が明らかにされなけ(,*-./012345

れ ば な ら な い ｡ こ れ に 関 連 し て , +67
8ら は各 +",に つ い て ,';C;D/,法 ま た は E7$
C!"9+0:の +",が韓国人 +/0患者の腎障害に

E#F6%),';C;D/,法B) によって, それぞれの$<=らはドイ関与していることを5), さらに, ;<$遺伝子型を判定した｡ なお, 各 +",の #==%=%にツ人において, プロモーター領域 +",が ;9と相当する E<)%
=F<8$
GHF-を従前の方法に従い相関していること>)を報告している｡ しかし, こ作製し, 遺伝子型判定の際のコントロールとしてれらの報告された +",>座位についての広範な使用した｡

集団調査も実施されておらず, 自己免疫疾患の発(6*78 9.:;<!=>?@AB

症機序に関与していると推測される血清 !"#$%

日本人2B.人の血清中 !"#$%&&活性を $78I=%&&活性との関連性も未だ明らかにされていない｡

G#)7#=%
8JKE%)7LLH$
7<8 (+;0!) 法A) によって

本研究では, 自己免疫疾患との関連性が報告されている 上記 +", (図?) に着目し, ①アジア定量した｡(C*DEFGFHIJK人, アフリカ人, ヨーロッパ人及びメキシコ人に

上 流 域 +", C
23>2
M＞9, C
24..
M＞', 及 び

おける集団調査, ②血清 !"#$%&&活性と遺伝子C@349＞'に関するハプロタイプ MM9に対応す型の相関の精査, ③血清 !"#$%&&活性と有意なる :@42*Nの !"9 断片を増幅し, NM/@C*#$
7
F相関が認められた上流域 +",@座位とプロモー

O%
F<G(,G<E%I#) に挿入した｡ これを鋳型としター活性の相関の精査, を実施した.)｡て, 日本人において認められたハプロタイプである 9'', MM', 9'9, 及 び M'9 の G%
N<G-Z[\] ^F<_^ X`<UH<abc<XdH<efaH
JHf F!
"#$%&'!
% を ()*+,'$ .'%/01#1$
2$ (2%

性レベルを $
2
#01&/@2/- 1#L
491 @2=='$2"#(3"4"5") を 用 い て 作 製 し た ｡ こ れ ら の !
"#+(K7M*) 法N)によって定量した｡$%&'!
%及 び 678+3( (,&"910/) を ヒ ト 肝 癌
由 来 細 胞 株 :16;<に 導 し , *'/+
8'!
2=1&/$
1
71
6&
"%
1&>$
$/4$
4$
%
1
9 (,&"910/) を用いて2=1&/$1活性を測定した｡'!

34!5#'()*+! 6(789:&;<.=>!"#$%&内の J座位の非同義置換型 KA,およ!"#$%& '()*+!,-./012

び今回着目した 7>関連 KA,D座位 (図O) に?2@+%461 *A/$1BB!
*A> の !
"@2#0 &102"#

ついて, 92$9/%!
P1@,C7+,Q8,法による遺伝に 相 当 す る *A> 断 片 を ヒ ト 脾 臓 由 来 %"%/-子型判定法を確立した｡ 各 KA,の /11に相当7A>を鋳型として 73+,C7によって増幅した：する 9"@1-!
"#$%&'!
%を用いたところ, 同法で6&291&として, D
E+33CC3;;>3CCC>;CCCCはそれぞれの /11を再現性良く容易に識別でき>3>;C>;+
FE($1#$1) とD
E+C>3>C3C;>;CCた｡ さらに, 遺伝子型判定結果の正確性は幾人か>C3;C>CC3;;CC+FE(/#%2$
1#$1) を使用しの被験者由来の *A>試料の $1
R'1#!
2#0によるた ｡ 得 ら れ た *A> 断 片 を 6!
*A>FGHI1!
%"&

結果によって検証された｡(B#I2%&"01#社製) に組み込み, ?2@+%461!
"#+ !?#@ABCDEF '()*+!89:G.HIJ$%&'!
%とした｡ さらに, 同 !
"#$%&'!
%を鋳型としK$%& 6(7.89:&LMて$2%
1+@2&1!
%
1@9'%
/01
#1$
2$によって J種類の1B
B遺伝子内のT異なるS集団における *A/$

KA,の 92#"&/11に対応するそれぞれのアミ非同義置換型 KA,の遺伝子型分布を前項の遺伝

ノ酸置換型 !
"#$%&'!
%を作製した｡ これら発現ベ

子型判定法を用いて調査した｡

クターを C)K+J細胞に遺伝子導入後, 発現した

日本人 (HUU名) 集団では, KA,7<FB, >DN@1,*A/$
1B
B酵素の細胞抽出液及び培養上清中の活:HN
N7, VHWU
B, V<NX., 7<W
N8及び YF<<%
1&9NO

PQ '()*+!89:RSTIJK$%& 6(7.LMK W $.
<\PQRS

T0<U

T KV<%$<WXY<KZ$<[\について, それぞれ !"##, !$%$, &'#(, !'##,残基をもった ?)!@#,,を A6"B5CDE#として, そ!')*, !"*"(及び +"*#,!""#"#のホモ接合体のみれぞれの ()*における 26
43F!"
"
#"
#に対応するが観察された｡ アフリカ人集団についてもオバンアミノ酸置換型 ?)!@#,
,を作製した｡ それぞれ

ボス人$%%名及びガーナ人&'名では, コーカソイを >G(5.細 胞 で 発 現 さ せ , 細 胞 抽 出 液 中 のド人集団についてもトルコ人&'名及びドイツ人?)!@#,,活性を測定した (図-)｡ H<0,, I$
J
JH$%%名では, 日本人集団と同様に, 全てホモ接合B5C
DE#と同レベルの酵素活性及び +$&%,は A6"体であった｡ 一方, 韓国人集団&'名では, ()*を有し, ?)!@#,
,タンパクにおける H<0, I$
JJ+$&%,について !'##ホモ接合体以外に !'#
#-

及び +$
&%のアミノ酸置換は酵素活性に影響ない&'##ヘテロ接合が-名に観察された：!'##-ものであった｡ 他方, +<J
K及び H<&Jの L#
C及!'#
#と !'
##-&'
##の遺伝子型頻度はそれぞれび M#
Nへの置換は酵素活性を著しく減弱させて/1％であった｡ なお, 他の非同義置換&.
/&％, 0おり,()*では他の集団と同様にすべて 23435
!"
"
#
"
67

O0
<<=#
F
2 では酵素活性は検出されず, 従ってな分布を示した｡ 従って, 他の8集団では単一の両アミノ酸残基及び酵素タンパクの >末端側<<

ハプロタイプ !"##-!$%$-&'#(-!'##-!%)*-

残基は酵素活性発現に必須なものであることが明!"*"(-+"*#,が観察されたが, 韓国人集団の-らかとなった｡

さらに,欠 損 変 異 型 :1JB#
"及 び％ に は そ れ に 加 え ハ プ ロ タ イ プ !"#
#-!$
%$-

次に, ()*に対応するそれぞれのアミノ酸残&'#(-&'##-!%)*-!"*"(-+"*#,が分布してい基の酵素活性への関与を明らかにするため, 一連た｡のアミノ酸置換型 ?)!@#,
,を作製し, その酵素!"#$%&'()*+ ,-./
0!1234 5678

活性を測定した｡ H<0を :"!(H<0:) または I6@

9-:;123<=>(H<0I) に置換しても, 酵素活性に変動なく,自己免疫疾患との関連性が報告されている

従って<0番アミノ酸残基は酵素活性に関与してい()*1座位について, 異なる$'集団において遺伝子型分布を調査した｡ アジア人集団においては, 5$&1$
9, 5$%''9, 50&%:, ;<'0%=, 及び ;'
<019!"
5"#"#が, ヨーロッパ人集団およびメキシコ人集団
では5$&1$:, 5$%''>, 50&%>, ;<'0%>, 及 び;'<01>!""#"#が優位であった｡ 他方, アフリカ人集団においては, ヨーロッパ人集団やメキシコ>, ;<0'%>,人集団と同様, 5$&1$:, 5$%''>, 50&%
及び ;'<01>!""#"#が優位である傾向が認められた｡!?
#@ABCD< 9-:(EFG+HIJKCD; ,-./0! LMNOP;QR
初めに, 主要ハプロタイプに相当するアミノ酸

ST@ABCD 9-:(U+HIJKCD;,-./0! LMNOP;QR

KLMN O:,PO -Q,C",RST,-U",VW

EF

R">:W ;

@ABCDCG: ;,<H0123(IJない｡ また, !"##の $%&(!"##') または ()*伝子型, 及び 血清中 56*&.77酵素活性を精査(!"##() への置換は酵素活性に効果がなく, "##した (図@)｡ A"2;"
B, A"C??
B, A:2C(, D,?
:CE,番アミノ酸残基における塩基性アミノ酸は酵素活及びD?
,:;B *)).
).を有する対象群は, 有意に性発現に必須ではなかった｡ 他方, +,#-を他の56*&.77酵素活性が低下していることが明らか

疎 水 性 ア ミ ノ 酸 ()* (+,#() ま た は $.
/となった｡ これらのうち, 上流域に存在する(+,#$) に置換しても, +,#-0 と同様に, 低F6G:座位は酵素活性により高い相関が認めら

い酵素活性しか示さず, 従って, ,#-番アミノ酸れた｡ また, 韓国人 F$H患者においては, 腎障残基として疎水性アミノ酸のうち +*)が十分な害を伴う患者群の A"C?
?B, D,?:
CE, 及び D?
,:;B

酵素活性発現には必須であった｡ さらに, 1,2#*)).
).保有率は腎障害がみられない患者群よりもを他の塩基性アミノ酸に置換した場合 (1,2#!

高く-)さらに, ドイツ人では, 日本人対象群におま た は 1,2#') , 疎 水 性 ア ミ ノ 酸 へ の 置 換

いて酵素活性低下がみられた A"2;"B, A"C?
?B,(1,2#$または 1,2#$) と同様に, 酵素活性は著A:2C(, D,?
:CE, 及び D?
,:;B *)).
).は健常人よ

しく減弱しており, ,2#番アミノ酸残基は塩基性

りも 1(患者群で高頻度に認められた;)｡アミノ酸のうち (34が十分な酵素活性発現には!7#89: ;,<=>?(@ABCDC234(78必須であることが明らかとなった｡ 56*&.756

末 端 領 域 に 関 し て , 8末 端 9 残 基 を 欠 失 し た

日本人における遺伝子型の血清 56*&.77活性(::;<.
3= では十分な酵素活性を有したことから,へのより強い影響が認められた上流域@座位につ少なくとも酵素タンパクの 8末端側9アミノ酸いて, 日本人に多く認められたハプロタイプであ残基に相当する領域は酵素活性に関与しないことる BB(, (88, BB8, (8(, 及び B8( のプが明白である｡ なお, マウス及びラット 56*&.

ロモーター活性への影響を調べた (図I)｡ 主要77ではヒト酵素の 8末端側":残基が欠失しておハ プ ロ タ イ プ で あ る BB( の 全 て が 置 換 し たり, 今回の結果を支持するものである｡(88では約"J>倍のプロモーター活性が認められ!"#$%&'()* +,-.
/!01234(56た｡ A:2C8への置換がみられる BB8や, A"2;"(血清を採取することができた日本人">?人の遺及び A"C??
8の置換体である (8( においてもプ$ W ".
B\PQRS#$T;:UT BV:#":WXY:
BZ":[\%&'()*+,-./0/123+45

ロモーター活性上昇が確認された｡ 他方, !
"#$$%カ 人 , モ ンゴ ル 人 及 び ネ パー ル 人 に つ い て ものみが置換した &%'では, 主要ハプロタイプと*)- A"
D#,を解析したが, 韓国人で見られたほぼ同様のプロモーター活性が認められた｡

'%
##J?
?
0?
0は認められなかった｡ 従って, *)-!

"A"D#,における '%
##J?
?
0?
0は韓国人特異な J?
!
?
0?
0と考えられた｡ 以上の結果より, ()JO0,,

本研究では, ()'*+ ,,内の全ての非同義置

遺伝子内における非同義置換型 *)-.座位につ換 型 *)-.座 位 に つ い て , 新 規 に 確 立 し た

いて, 遺伝的多様性は極めて低いことが明らかと/01234561/法によって広範囲な集団調査を実施なった｡

し, その遺伝的背景を初めて明らかにした｡ 今回()JO0,,活性発現には, 一般酸塩基触媒とし調査した7大人種を含む8集団において, *)-て作用する @D.及び @:D<とともにタンパクの9:;,, '<=>0?
, @"==9, A:=B
C, 9:D=E及びフォールディングに関与する @"";が必須であF;::G0H
I は全て I212!
J?
?
0?
6Kであり, 多型性るD) ｡ 非同義置換型 *)-によって置換されるアはないことが明らかとなった｡ 他方, )%L,デーミノ酸残基のうち, 9:
D=のみが他生物種由来の?
0?
0,
タベースでは, *)-9:;,における !"##J?

全 て の ()JO0,,に お い て 保 存 さ れ て い る"#) ｡@"==
9における $%#&J?
?
0?
0および A:=B
C にお*)-9:D=Eに対応したアミノ酸置換によって酵

ける '()*J?
?
0?
0はそれぞれ#M#=$, #M#::, #M#";

素活性は殆ど消失し, さらに他の塩基性アミノ酸と低頻度で分布しているが, 今回調査した集団にE4Oまたは @6Oでは 'H/の代替とならなかった｡

はそれらのヘテロ接合体は認められなかった｡ ま従って, 酵素タンパクにおける:D=番アミノ酸残た, *N61らは韓国人集団で新規な非同義置換型

基は負電荷ではなく 'H/残基自身が酵素活性発*)-A"D#,を見出した$)；今回調査した韓国人集

現に必須である｡ 他方, *)-9:;,, @"==9及び団でも同様な遺伝子型分布を示した｡ なお, アジA"
D#,が係るアミノ酸残基はすべて多生物種由来

ア人集団として, チベタン人, 中国人, スリラン

酵素には保存されていないことから酵素活性発現TUVW XE8Y

X =Z8P;
8[\]8=^;
8_`[;4F` 4には関与していないことが推測されるが, これら)いる｡ !"#$%&"#$ヘテロ接合体の '()')**+,-の置換体が !"#$%&'()と同レベルの酵素活性を示.
.活性は低下していると考えられ, !"#$,##)#)

した今回の結果と一致する｡ *+,).
.には共同は自己免疫疾患の危険因子となる可能性がある｡

して活性部位を構成する二か所の (/0(/0#"(,)

さらにこれまで, *+C9K8内における DC関* 10&"
2(3456733及び 8435978:;) が含有さ連 9+?F座位は自己免疫疾患との関連性が報告れており, 後者に隣接する <8:=はよく保存されさ れ て お り=,F) , 本 研 究 で は , 新 規 に 確立 し た:=の他アミノ酸への置換は活性部ている;;) ｡ <8L)
>0&'(">L法によって広範囲な集団調査を実施

位への影響を介して活性レベルを変動させるものし, その遺伝的背景を初めて明らかにした｡ これと 推 察 さ れ た が , 今 回 の 結 果 か ら 活 性 発現 にらのM座位では, 今回調査した;N集団すべてにお<8:=が必須であることが確認された｡

いて多型性が認められた｡ 特に, アジア人集団は7,!,>)らは ?0#'(.
)@(0#'(A) で処置した後,*+,).
.を欠損させるとマウスにヒトのリューマチ性関節炎に類似した慢性多発性関節炎が惹起

アフリカ人, ヨーロッパ人, 及びメキシコ人集団とは異なる頻度分布を示すことが確認された｡
日本人において, 遺伝子型と 血清 *+,).
.

00(/"#,にされることを報告した8)｡ さらに, *B活性を調査した結果, 主要な %;3F;O, %;PNNO,おいて, *+,).
.と高分子 *+C のクリアラン%
E3PC, Q8NE
P6, 及び QN
8EFO ,##)#)を有する対ス が 免 疫 能 の 維 持 に 不 可 欠 で あ る;8) ｡ ま た ,象群は, %;3F;C, %;PNN
A, %E3PA, Q8N
EPA, 及びD00#らは, *+,).
.遺伝子発現調節領域におQN8EF
Aを有する対象群より低い酵素活性を示す

ける 9+?がリューマチ性関節炎の発症と関連すことが判明した｡ 特に, 上流域に存在する 9+?E).
.は細胞内にることを報告している;E) ｡ *+,-座位では, 酵素活性に対する効果がより大きいこ取り込まれた高分子 *+Cの分解に直接関与してとが示された｡ 9/">らは, 韓国人 9HK患者におおり, *+,).
.活性の消失あるいは機能不全にいて, %;PNN
O＞A, Q8N
EP6＞A, 及び QN8EFO＞A

よる, 自己抗体産生の免疫原としての *+Cのクの遺伝子型頻度分布を分析し, %;PN
NO, Q8N
EP6,リアランス障害は自己免疫疾患発症につながるも及び QN8EFO ,##)#)を保有する患者群は, 保有し).
.活性のと推察されている;E) ｡ 従って, *+,-ない患者群よりも高い頻度で腎障害を伴っているレベルの変動が自己免疫疾患発症に関与すると考;PN
NO,ことを見出した=) ｡ 本研究においても %えられ, その遺伝的背景としてアミノ酸置換を介Q8N
EP6, 及び QN8EFO ,##)#)が血清 *+,).
.活して酵素活性変動を惹起しうる非同義置換型性を減少させていることが判明しており, これら9+?に着目した｡ 今回 *+,).
.遺伝子内の非同の ,##)#)が 9HK腎障害発症に関与していること

義置換型 9+?のうち, 9+?CF:$)#, <8:=G,が推定される｡ 特定の遺伝子型の 9HK発症頻度

D83:H及び IE886)
B
1 における 1">0B,##)#)がへの影響を明らかにするため, 9HK発症に関す

不活性な *+,).
.酵素を産生することを明らか

るR
,)
%
R0>&
B
0#&
S$'が必要である｡ さらに,にした｡ 特に, 9+?<8:=G について, 今回の調

D00#らはドイツ人において, 健常人群と DC査集団では見出されなかったが, +AJ.データ

患者群について ,##)#)及び遺伝子型頻度を調査し,ベースでは 1">0B,##)#)!"#$の分布が示されて

E3
PC, Q8NE
P6, 及び QN8EFO%;
3F;O, %;PNN
O, %O n 4]Us

ghij

k1+lk Nm+
P4+nop+
Nq4+
rs!"
"
#"
#が有意に $%と関連することを報告した&)｡'(!)#**タンパクを直接産生させることはない｡

本 研 究 に お い て も , こ れ ら の !""#"#が 血 清これらの上流域 -(.1座位は '(%-2+のプロ'(!)#**活性減少を誘発していることが証明さ

モーター活性の変動によって惹起される遺伝子発れた｡ '(!)#*
*欠損マウスではヒトの $%に類現を介して酵素産生量の変化によって血清似する慢性多発性関節炎を引き起こすことが示さ'(!)#**活性の変化が引き起こされたと考える#**低下
れており+) , これらの知見は血清 '(!)のが妥当である｡ そこで, 我々は上流域 -(.1が $% のような自己免疫疾患発症に関係するこ座位のプロモーター活性への影響を調査した｡ そとを示唆している｡ したがって, 血清 '(!)#**の結果, 日本人において優位に認められたハプロ活性減少が自己免疫疾患発症の分子学的要因の,タイプ //%は最も低いプロモーター活性を示し,つではないかと考えられる｡ この推測を検証する%00は最も高いプロモーター活性を示した｡ こためには, 今後, 健常人および自己免疫疾患患者の結果は, 血清 '(!)#*
*酵素活性レベルと一致における '(!)#**酵素活性を分析する必要があしており, $% 関連 -(.が関与する '(%-2+る｡

プロモーター活性が有意に血清酵素活性に影響し上記の $%関連 -(.遺伝子型と血清 '(!)#**ていることが明らかとなった｡ また, 各ハプロタ活性の調査より, 上流域のハプロタイプ //%はイプのプロモーター活性の比較から, $% 関連

低酵素活性型, また %00は高酵素活性型に相当-(.のうち主としてプロモーター領域の -(.

すると考えられる｡ しかし, これらの -(.は遺345&4/＞%が '(%-2+プロモーター活性変化に伝子上流域に座位し, 酵素活性の変化した関与しているであろうと推測された｡

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