金ナノ粒子標識を用いた腸管出血性大腸菌の迅速検出法の開発

107＜平成 28 年度助成＞金ナノ粒子標識を用いた腸管出血性大腸菌の迅速検出法の開発

椎木弘（大阪府立大学大学院 工学研究科物質・化学系専攻応用化学分野）

背景の表面に存在する特定化学種（O157 抗原）と結合するレセプターを導入した金ナノ粒子を作製した。

細菌を要因とした食中毒の予防や被害拡散の抑制

金はナノサイズ化によって局所表面プラズモン共鳴のためには、衛生管理や品質管理など日常的な自主に起因する特徴的な光学特性を発現する。例えば、管理と、発生の早期段階における細菌の迅速な検出

金ナノ粒子は分散状態においてステンドグラスや切が必要である。従来の菌数計測法では、選択培養や子などに特徴的な赤色を呈するが、凝集すると青色、増菌培養など、検出に至るまでに多くの工程と時間そして黒い沈殿となる。これらは、金ナノ粒子の分（最低数日）を必要とする。従って、速やかな「食散状態に基づいた光学特性の変化によるものであの安全」の確保のためには、迅速な検出を可能にする。この特性を利用して、簡便かつ迅速な検出法のる新しい手法の開発が必要である。

開発を目指すものである。本法によれば食品試料中近年、アデノシン三リン酸（ATP）に着目した化に含まれる極少量の E. coli O157 をワンステップで学発光法により、迅速な検出が達成されている。ル

検出することができるため、一次生産から消費までシフェラーゼがルシフェリンを特異的に酸化し、オの各段階における自主管理に基づく食の安全確保がキシルシフェリンを生成する。オキシルシフェリン可能になり、生産者・消費者の双方に重大な被害をが励起状態から基底状態になるときに黄緑色の発光もたらす食中毒の予防、被害拡散の抑止、および食を生じる。その発光量を測定することで ATP の定量料・食品の安定供給が実現できるものと考えられる。

が可能になるもので、HACCP における有用なツールとなっている。一方、ATP は微生物に共通した指標

我々は、アミノ酸やペプチドなどの生体分子をテであるため、特定細菌の検出には不向きである。まンプレートとした分子鋳型の形成に関する研究をた、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）

行ってきた。分子鋳型は分子構造に基づいた結合部法では遺伝子情報に基づいた高精度な細菌の特定が位を持ち、優れた分子認識能を示した。分子鋳型法可能であるが、装置が高額、試薬調製や機器操作のは、目的物質をテンプレートとして重合反応中に共ための人的リソースの確保など、コスト面で課題が存させ、テンプレートに選択性のある結合部位をある。従って、一次生産から消費まで様々な現場にポリマーに構築する方法で、テンプレートの溶出おける迅速な検出には、いつでも、どこでも、誰でにより鋳型が形成されるため、化学構造と相互作も計測できる方法を新規に開発する必要がある。そ用する官能基の配置により優れた分子認識能を発こで、生物機能によらず、細菌の表面構造に着目し

現 す る。 こ の 技 術 を 応 用 し、E. coli O157:H7 の 鋳た新しい概念に基づく迅速な検出を目指し、細菌表型形成について検討したところ、この細菌鋳型は、面の多種多様な分子群を定性、定量する独創的手法E. coli O157:H7 にのみ応答し、緑膿菌や黄色ブドウの開発について研究を行っている。

球菌のみならず、異なる大腸菌（E. coli O26、O111

本研究では、腸管出血性大腸菌 O157（E. coli O157）など）も識別したことから、細菌のサイズや形状だ

108

浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）

けでなく、細菌表面の複雑な化学構造を認識する高用いて細菌濃度が 2.0 × 109cells mL-1 となるように精度な鋳型の形成が達成されたものと推察された。

調整した。また、本研究ではベロ毒素非産生大腸菌

このことは、細菌の表面構造に着目することで、生PV856（O157:H7）、PV276（O157:HNM）、および物機能によらない検出が可能であることを意味して

PV01-198（O26:H11）を使用した。

いる。そこで、細菌に特徴的な抗原に着目した検討を行った。抗原は細菌細胞を覆うリポ多糖であり、抗原鋳型粒子を用いた細菌の検出

菌種によって特徴的な糖鎖配列を持つ。従って、特抗 原 鋳 型 粒 子 分 散 液（0.5mL） と 細 菌 懸 濁 液

定の糖鎖に特異結合する鋳型を金ナノ粒子表面に形（0.5mL）とを混合し、撹拌した。混合分散液（0.01mL）

成することができれば、特定細菌を金ナノ粒子によをガラススライド上にピペットで移して乾燥させたり標識することが可能である。

後、ガラススライド上の細菌を暗視野顕微鏡により観察した。その際、ミニグレーティングスペクトロ

方法

抗原鋳型粒子の作製
抗 原 鋳 型 の 形 成 に は、E. coli O157 か ら 抽 出 しメータを用いて光散乱スペクトルを測定した。

結果と考察たリポ多糖（LPS）をテンプレート、モノマーとし抗原鋳型は、ポリマー骨格を形成するモノマーとて N -isopropylacrylamide（NIPAm）、acrylic acid

して NIPAm を用い、AAc、TBAm、および BIS から（AAc）、N -tert-butylacrylamide（TBAm）、 お よ びなる共重合体をマトリクスとして形成される。こN 、N ’-methylenebisacrylamide（BIS）、 酸 化 剤 あれらのモノマー溶液に、標的糖鎖を持つテンプレーる い は 開 始 剤 と し て chloroauric acid、ammonium

ト物質として E. coli O157 から抽出したリポ多糖をpersulfate、tetramethylethylenediamine を 用 い た。

添加した。この溶液に、酸化剤あるいは開始剤を加反応溶液は充分に脱ガスし、窒素流入により嫌気雰えると重合が進行し、反応溶液は金ナノ粒子の生囲気において 18 時間重合した。反応の後、テンプ成を示す赤色に変化した。ポリマー粒子を TEM 観

レートおよび未反応物は 313K で 4 日間透析するこ察すると、粒径約 100nm の粒子の中に金ナノ粒子とで取り除いた。このようにして、共重合体をマトの生成が認められた（図 1a）。重合反応においてリクスとした抗原鋳型の形成が可能である。作製しchloroauric acid は酸化剤として機能し、自らは還元たポリマー粒子を透過型電子顕微鏡（TEM）により、されることで金ナノ粒子が生成されたものと推察さ形状やサイズの評価を行った。

れる。
また、暗視野顕微鏡によりポリマー粒子を観察し各種細菌試料の調製たところ、光散乱強度は金ナノ粒子の形成により 4各種細菌の培養、および細菌を用いたすべての実倍程度増強することが確認された（図 1b）。このポ験は、病原体など安全管理規定に基づくバイオセー

リマーは温度感応性ポリマーとして知られている。

フティーレベル 2 区域として整備・管理された実験

そこで、相転移温度における粒子の色の変化につい室で行った。菌株は寒天増殖培地を用い、303K でてスペクトル測定を行った（図１c）。室温（298K）

18 時間培養した。単一のコロニーを液体増殖培地

では、金ナノ粒子の分散液と同様、530nm に金ナ（30mL）に抽出し、303K で 18 時間インキュベー

ノ粒子に特徴的な吸収が観察された。ポリマー粒子トした。 培養懸濁液（10mL）を遠心分離し、沈殿分散液の温度を 313K まで加温すると、溶液は白濁物をリン酸緩衝液（10mL）に再懸濁させた。このした。白濁によるバックグラウンドの増大がみられ処置を 3 回繰り返した。最終的に、リン酸緩衝液をたが、金ナノ粒子に基づく吸収に変化はみられな金ナノ粒子標識を用いた腸管出血性大腸菌の迅速検出法の開発

109

図1 ポリマー粒子のTEM 像(a)と光散乱スペクトル(b)、および吸収スペクトルの温度依存性(c)とポリマー相転移の概念図(d)かった（図１c のスペクトル 2）。再度、室温まで降（誘電率 1.3）と周囲空気（誘電率 1.0）との間に生温したところ元のスペクトル１（図１c）と一致しじる屈折率が小さいためである。しかしながら、ポた。つまり、相転移によって LPS テンプレートがポリマー粒子により標識された細胞は、強い散乱光をリマーより吐き出される過程で、ポリマー粒子中の生じ、明確な光スポットとして観察された。これは、金ナノ粒子が安定して存在することが明らかになっポリマー粒子中の金ナノ粒子に基づいて生じるものた。

であり、ポリマー粒子を標識として用いることで単このポリマー粒子分散液と細菌懸濁液の混合分散一細胞の高感度な計測が可能になった。

液をガラススライド上に滴下し、室温において暗視

さらに、このポリマー粒子の選択的結合性につい野顕微鏡観察を行った（図２）。暗視野下での観察ても評価した。異なる表面構造を有する E. coli（O26，において、E. coli O157 はぼんやりとしたロッド状のO-rough）などを用いて同様の実験を行った。各種

光スポットとして観察された。これは、細胞内の水大腸菌懸濁液にポリマー粒子を添加して暗視野顕

図2 E. coli O157の暗視野像(a)と光散乱スペクトル(b)図3 各種 E. coli の暗視野像(a)と光散乱強度に基づいた選択性の評価(b)110

浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）微鏡観察を行った（図３a）。E. coli O157:HNM は、以上、細菌細胞表面の化学構造に基づいた細菌のE. coli O157:H7 同様、強い散乱スポットとして観察特定が達成され、迅速で高感度、高選択的な検出がされ、ポリマー粒子の選択的結合は細菌表面で顕著実現したことで、これまでにない方法論としてそので あ っ た。 一 方、E. coli O26:H11 や E. coli O-rough原理を構築することができた。今後、ポリマー粒子は弱い光スポットとして観察され、ポリマー粒子の改良によって、特定細菌の存在が目視で判断可能は細胞と結合せず、基板上に観察された（図３a 矢になるよう研究を進め、いつでも、どこでも、誰で印）。このように、ポリマー粒子は表面に形成されたも正確に検出できる方法を開発したい。

O157 抗原の鋳型によって、細胞表面の O 抗原、つまり糖鎖配列を正確に識別できることが示された。

謝辞

さらに、E. coli O157 細胞表面に特異結合した複研究遂行にあたり、ご助言いただきました大阪府

数のポリマー粒子は細胞の光散乱強度を高め、600立大学大学院工学研究科 長岡勉教授、ならびにベロ

nm における強度（I ）は、ポリマー粒子の結合して毒素非産生大腸菌をご提供いただきました生命環境いない細胞（I o）の 4 倍程度（＝ I/I o）となった。一方、科学研究科 三宅眞実教授に御礼申し上げます。本研

その他の菌種では、ポリマー粒子は結合しないため、究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公益財団

光散乱強度に変化はみられず、細胞のサイズのばら法人 浦上食品・食文化振興財団ならびに関係者の皆つきに対応した± 10％（0.2 ＝ I/I o）の誤差のみが様に厚く御礼申し上げます。

観察された。つまり、ポリマー粒子は細胞表面に非特異吸着することなく E. coli O157 を標識し、30 倍

参考文献以上の選択性を示すことが明らかになった。

1) T. Kinoshita, D. Q. Nguyen, D. Q. Le, K. Ishiki, H.
Shiigi, T. Nagaoka, Shape Memory Characteristicsof O157-Antigenic Cavities Generated on
Nanocomposites Consisting of CopolymerEncapsulated Gold Nanoparticles, Anal. Chem, 89(8),4680-4684 (2017).
2) X. Shan, T. Yamauchi, Y. Yamamoto, S. Niyomdecha,
K. Ishiki, D. Q. Le, H. Shiigi, T. Nagaoka, Spontaneousand specific binding of enterohemorrhagic
Escherichia coli to overoxidized polypyrrole-coatedmicrospheres, Chem. Commun., 53, 3890-3893(2017).
3) K. Ishiki, H. Shiigi, T. Nagaoka, Optical ElementalAnalysis of Metals Using Shewanella oneidensis,Anal. Sci., 33(5), 551-553 (2017).

実サンプルにおける E. coli O157 検出について検討を行った。牛ミンチからストマッキングにより得 ら れ た 細 菌 溶 液 に は E. coli O157 の 存 在 は 認 められなかったため、細菌濃度が一定になるようにE. coli O157 を添加し、試料溶液を調製した。種々の細菌を含む試料溶液において、ポリマー粒子は選択的に E. coli O157 に結合し、暗視野下において明瞭に観察され、試料中の E. coli O157 の菌数計測が容易であった。このとき、分析誤差は± 4.0％であった。また、一定視野（約 50cells の細胞が存在する）における散乱強度を測定したところ、標識された E. coli O157 の増大に伴って強度は直線的に増大し、試料中の E. coli O157 の定量が達成された。
（R2=0.9827）

Development of a rapid detection method for enterohemorrhagic
Escherichia coli using a gold nanoparticle label

111

Development of a rapid detection method for enterohemorrhagic
Escherichia coli using a gold nanoparticle label
Hiroshi Shiigi
Department of Applied Chemistry Division of Materials Science and Engineering,
Graduate School of Engineering Osaka Prefecture University
N a n o m e t e r- s i z e d c o m p o s i t e p a r t i c l e s c o n s i s t i n g o f g o l d n a n o p a r t i c l e se n c a p s u l a t e d b y a n N - i s o p r o p y l a c r y l a m i d e c o p o l ym e r w e r e s u c c e s s f u l l ysynthesized using a one-step process. Shape complementary cavities oft h e O 1 5 7 - a n t i g e n , w h i c h a c t s a s a n a r t i f i c i a l a n t i b o d y, w e r e f o r m e d o n
the composite by utilizing temperature-dependent affinity changes of thecopolymer. The composite bound to enterohemorrhagic Escherichia coli (E. coli )O157 at 298 K and enhanced the light-scattering intensity of these cells dueto the optical properties of the gold nanoparticles. Moreover, the composite
displayed excellent selectivity (> 30) versus other types of E. coli , such as
O26 and O-rough. Recognition of the O157-antigen ceased upon heating to313 K, but was restored upon cooling to 298 K. During repeated temperature
cycling around the phase transition temperature of the copolymer (305 K),
the composite reproducibly displayed a recognition behavior at 298 K. As thebinding ability of the composite could be reversibly switched, it was concluded
that the molecular structure of the O157-antigen had been memorized by thecomposite, rather than being molded into it. This technique is applicable not
only for the detection of a target bacterium, but also for the identificationof new bacterial threats through the simple formation of a specific antigenimprinted composite.