信州医誌，61⑹：419〜444，2013

信州大学において審査された医学博士論文要旨
氏
名(所属講座)

学位授与
番
号

授与年月日

博

士

論

文

名

学位審査委員主査

副査

大 野 康 成 乙第1145号 24. 7.11 Temporary auxiliary partial orthotopic liver 田 中 榮 司 角 谷 眞 澄（外科学⑴）
西澤理
transplantation using a small graft for famil（家族性アミロド
ial amyloid polyneuropathy
ポリニューロパチーに対する過小グラフトを用いた自己肝温存部分肝移植術）
茂 木 英 明 乙第1146号 24. 9.12 TECTA mutations in Japanese with mid fre- 福 嶋 義 光 小 池 健 一
（耳鼻咽喉
本田孝行
quency hearing loss aﬀected by zona pel科学）
lucida domain protein secretion（Zona pellucida ドメインタンパクの分泌障害によって引き起こされる中音域難聴：日本人難聴者における TECTA 遺伝子変異の解析）
土 屋 広 行 乙第1147号 24. 9.12 Evaluation of human embryonic stem cell‑ 池 田 宇 一 久 保 惠 嗣（分子薬理学
山田充彦
derived hepatocyte‑like cells for detection of（薬剤））
CYP1A inducers（ヒト ES 細胞由来肝細胞のCYP1A 誘導検出系としての評価）
若 林 雅 人 乙第1148号 24. 9.26 Fatty acid accumulation and resulting 駒 津 光 久 池 田 宇 一（代謝制御学）中山
淳
PPARα activation in ﬁbroblasts due totrifunctional protein deﬁciency（三頭酵素欠損症由来の繊維芽細胞における脂肪酸蓄積とPPARα活性化）
塩澤
律 乙第1149号 24. 9.26 Comparison of Splinting Versus Nonsplinting 松 尾（運動機能学）in the Treatment of Pediatric Trigger Finger（小児弾発指におけるスプリント治療と非スプリント治療の成績比 ）清 小池健一森泉哲次

関口
和 乙第1150号 24.11.14 Elevated serum granulysin and its clinical 小 池 健 一 中 山
淳（内科学⑵）
本田孝行
relevance in mature NK‑cell neoplasms（成熟 NK 細胞腫瘍における血清 granulysin と病態との関連）
山本裕香（眼科学）

乙第1151号 25. 1.16 Age‑Related Decrease of the Retinal Vas- 中 山
culature Area Identiﬁed with a Novel Computer‑Aided Analysis System（新 し い コ ン
ピュータ支援システムを用いた加齢に伴う網膜血管領域狭細化の解析）

淳 池田宇一田中榮司

福 島 万 奈 乙第1152号 25. 1.30 Distinct Cytoplasmic Expression of KL‑6 本 田 孝 行 森 泉 哲 次（病態解析）
菅野祐幸
M ucin in Chromophobe Renal Cell Carcinoma :A Comparative Immunohistochemical Study with Other Renal Epithelial Cell
Tumors（嫌色素性腎細胞癌における KL‑6の特異的な細胞質発現様式：他の腎上皮性腫瘍との免疫組織化学的比 検討）
No. 6, 2013419

審査学位論文要旨

伊 坪 敏 郎 乙第1153号 25. 1.30 Eﬀects of repeated crush injuries on motor 多 田（運動機能学）
functional recoveryof the sciatic nerve（坐骨神経反復損傷が運動機能に与える影響について）

剛 山田充彦本郷一博

宮川麻衣子 乙第1154号 25. 1.30 Prevalence and Clinical Features of Hearing 福 嶋 義 光 小 池 健 一
（耳鼻咽喉
村田敏規
Loss Patients with CDH23 Mutations: A
科学）
Large Cohort Study（CDH23 遺伝子変異による難聴の頻度と臨床的特徴について：大規模コホート研究）
丸 山 順 也 乙第1155号 25. 2.13 Diﬀerentiation of Monkey Embryonic Stem 佐々木克典 本 田 孝 行（分子薬理学樋口京一
Cells to Hepatocytes by Feeder‑free Disper（薬剤））sion Culture and Expression Analyses of
Cytochrome P450 Enzymes Responsible forDrug M etabolism（無フィーダー分散培養によるサル胚性幹細胞の肝細胞への分化と薬物代謝に関与するチトクロムＰ450酵素の発現解析）児玉亮 乙第1156号 25. 2.27 ROS‑generating oxidases Nox1 and Nox4 竹 下 敏 一 谷口俊一郎
（分子細胞
塩沢丹里
contribute to oncogenic Ras‑induced pre生化学）
mature senescence（Nox1および Nox4から産生された活性酸素は Ras 癌遺伝子が誘導する
セネセンスに寄与する）
村 田 貴 弘 乙第1157号 25. 3.13 G protein‑coupled estrogen receptor agonist 本 郷 一 博 大 橋 俊 夫
（脳神経
山田充彦
improves cerebral microvascular function
外科学）
after hypoxia/reoxygenation injury in maleand female rats（雌雄ラットにおいてＧ蛋白
共役型エストロゲン受容体作動薬は低酸素・再酸素化障害後の脳微小血管機能を改善させる）
小 林 孝 至 乙第1158号 25. 3.13 A phase II trial of erlotinib in patients with 本 田 孝 行 宮 川 眞 一（内科学⑴）
塩沢丹里
EGFR wild‑type advanced non‑small‑celllung cancer（野生型 EGFR 遺伝子をもつ進行
非小細胞肺癌患者におけるエルロチニブ治療の第 相試験）
小 池 剛 史 乙第1159号 25. 3.27 Cultured epithelial grafting using human am- 池 田 宇 一 塩 沢 丹 里
（歯科口腔
菅野祐幸
niotic membrane: The potential for using
外科学）
human amniotic epithelial cells as a cultured
oral epithelium sheet（羊膜を用いた培養上皮移植に関する実験的研究：ヒト羊膜上皮細胞による上皮シート作成の可能性）
金 子 智 喜 乙第1160号 25. 3.27 New visual rating system for medial tempo- 天 野 直 二 池 田 修 一（画像医学）
本郷一博
ral lobe atrophy:a simple diagnostic tool forroutine examinations（内側側頭葉萎縮の新たな肉眼的評価方法：日常臨床における簡便な診断手法）
岸本
恭 乙第1161号 25. 3.27 Postoperative suppression of inﬂammatory 天 野（外科学⑵）
cytokines after distal gastrectomy in elderly
patients（高齢者における幽門側胃切除後の炎
症性サイトカイン産生抑制について）420

純 宮川眞一田中榮司

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

Temporary auxiliary partial orthotopic liver transplantation using a small graft for familial amyloid
polyneuropathy（家族性アミロドポリニューロパチーに対する過小グラフトを用いた自己肝温
存部分肝移植術）
大

野

康

成

（論文の内容の要旨）

APOLT 群の予測 GV，予測 GV/SLV は LDLT 群に【背景・目的】肝移植ではドナー不足が大きな問題で比べ有意に小さかった。APOLT 群ではドナー全肝容ある。信州大学ではこれまでの検討により，肝移植を積に対する GV の比率は35％以下と小さく，右葉を安全に行うためにはグラフト肝容積（GV）がレシピ摘出すると残肝容積が小さくなりすぎて，ドナーのリ

エントの標準肝容積（SLV）の30％以上必要と考えスクが高いと考えられた。また，APOLT 群ではレシている。左葉グラフトで不十分な場合には右葉グラフ

ピエント平均身長，体重は，ともに LDLT 群より有トを選択することがあるが，右葉切除をするとドナー

意に大きく，GV，GV/SLV はいずれも LDLT 群にの残肝容積が小さくなるためドナーのリスクが上がる

比して有意に小さかった。レシピエント手術時間はと考えられる。一方，家族性アミロイドポリニューロ

APOLT 群で有意に長かったが，出血量，術後合併症

パチー（FAP）は，主として肝臓で産生される異常には有意差は認められなかった。術後総ビリルビンとトランスサイレチンが変化して全身にアミロイドとしプロトロンビン時間は APOLT 群が LDLT 群に比して沈着する遺伝性疾患であり，疾病の進行を止めるたて低値であり，より早期に肝機能が改善していた。

めに，現時点では肝移植が唯一の治療法と考えられて

APOLT 手術から自己肝摘出までに FAP に関連したいる。この疾患では異常トランスサイレチンの産生

新たな症状の出現はなかった。１年，５年患者生存率，以外の肝機能は正常であるので，移植の際に自己肝およびグラフト生着率は，両群間に有意差はなかった。

の一部を温存すると（自己肝温存生体部分肝移植術：【結語】FAP に対して APOLT を行うことで，GV/，30％以下の過小グラフトが移植された場
APOLT）

SLV＜30％の過小グラフトでも通常の LDLT と同等

合も，術後早期には温存した自己残肝がグラフト機能の有用性と安全性で肝移植を行い得ることを示した。

を補助することにより術後肝不全を防ぐことができる。

FAP に対するこの術式はドナー選択の幅を広げるの

ただし，自己肝が残存する限り異常トランスサイレチに有用な術式であると思われた。

ンの産生が続くので移植後一定期間を経て自己肝の摘（論文審査の結果の要旨）出が必要となる。当科ではこのような考えで2000年【背景・目的】信州大学ではこれまでの検討により，以降，FAP に対する生体肝移植においてドナーから肝移植を安全に行うためにはグラフト肝容積（GV）

摘出する左葉グラフトが SLV の30％以下と過小な場がレシピエントの標準肝容積（SLV）の30％以上必合には APOLT を行ってきた。今回，FAP に対する要と考えている。左葉グラフトで不十分な場合には右APOLT 施行例と通常の生体部分肝移植（LDLT）施葉グラフトを選択することがあるが，右葉切除をする

行例を比 して，APOLT の有用性および安全性を検とドナーの残肝容積が小さくなるためドナーのリスク討した。

が上がると考えられる。一方，家族性アミロイドポリ【対象・方法】FAPの診断にて当科で生体肝移植をニューロパチー（FAP）は主として肝臓で産生され

施 行 し た36例 を 対 象 と し て，APOLT を 施 行 し たる異常トランスサイレチン（TTR）が変化して全身

APOLT 群13例と従来の LDLT を施行した LDLT 群にアミロイドとして沈着する遺伝性疾患であり，疾病23例に分けて比検討した。APOLT 群では移植手術の進行を止めるために現時点では肝移植が唯一の治療の際に自己肝の門脈血流は遮断し，術後自己残肝を法である。この疾患では異常 TTR の産生以外の肝機徐々に萎縮させ，グラフトの増大を図る。約２カ月後能は正常であるので，移植の際に自己肝の一部を温存に CT でグラフト肝容積を測定しグラフトが十分に肥すると（自己肝温存生体部分肝移植術：APOLT），

大し，アシアロシンチグラフィーでグラフトの肝機能30％以下の過小グラフトが移植された場合も，術後が十分であることを確認し，自己肝を摘出する。

早期には温存した自己残肝がグラフト機能を補助する【結果】ドナーの体格は両群間で有意差はなかったが，ことにより術後肝不全を防ぐことができる。ただし，No. 6, 2013421

審査学位論文要旨

自己肝が残存する限り異常 TTRの産生が続くので群で有意に長かったが，出血量，術後合併症には有意移植後一定期間を経て自己肝の摘出が必要となる。

差は認められなかった。術後 T. Bil と PT ‑INR は

当科では2000年以降，FAPに 対 す る 生 体 肝 移 植 に

APOLT 群が LDLT 群に比して低値であり，より早おいて左葉グラフトが SLVの30％以下の過小の場

期に肝機能が改善していた。APOLT 群では移植手術

合にはAPOLTを行ってきた。そこで，FAPに対するの際に自己肝の門脈を切離し，２カ月後に自己残肝の

APOLT 施行例と通常の生体部分肝移植（LDLT）施

萎縮とグラフトの肥大を確認後，自己肝を摘出した。

行例を比

患者生存率およびグラフト生着率は両群間に有意差はして APOLT の有用性と安全性を検討し

た。

なかった。

【結果】ドナーの体格は両群間で同等であったが，本研究から，FAP に対して APOLT を行うことで，

APOLT 群の予測 GV，予測 GV/SLV は LDLT 群に

GV/SLV＜30％の過小グラフトでも通常の LDLT と比べ有意に小さかった。また，APOLT 群では，レシ同等の有用性と安全性を確保し得ることが示された。

ピエントの平均身長，体重ともに LDLT 群より有意

主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値に大きく，GV，GV/SLV はいずれも LDLT 群よりがあるものと認めた。

有意に小さかった。レシピエント手術時間は APOLTTECTA mutations in Japanese with mid frequency hearing loss aﬀected by zona pellucida domain
protein secretion（Zonapellucidaドメインタンパクの分泌障害によって引き起こされる中音域難聴：日本人難聴者における TECTA 遺伝子変異の解析）
茂木（論文の内容の要旨）

英明

１．遺伝子解析【研究目的】TECTA 遺 伝 子 は 常 染 色 体 優 性 形 式 を

TECTA 遺伝子変異を３家系より見出した。既報告

とる感音難聴の原因遺伝子として報告されており，内（Iwasaki et al. 2002）家系も含め139家系から４変異

耳蝸牛蓋膜を形成するタンパクのひとつである α‑を同定，日本人における頻度としては2.9％（４/139

tectorin をコードしている。現在までに TECTA 遺家系）であることを明らかにした。また聴力別の解析

伝子変異による難聴が複数見出されており，また遺伝において中等度難聴（41‑70dB）では7.7％（４/52

子変異の部位により聴力像にバリエーションがあるこ

家系）に認められた。臨床情報との比とが報告されている。今回，常染色体優性遺伝形式を

伝子の変異の部位により表現型が異なることが明らか

とる感音難聴139家系に対し本遺伝子変異の解析を行となった。これは他の人種で見出された遺伝子型／表い，日本人における頻度を明らかにすること，また現型の報告とも合致しており，日本人においても変異TECTA 遺伝子変異に特徴的な中音域の難聴を呈する部位により難聴のパターンが異なることが確認された。

メカニズムを解析することを目的とした。

２．培養細胞系を用いた TECTA 遺伝子変異の機能検討より，遺【研究方法】

解析

１．遺伝子解析：139家系を対象とし，直接シーケン

野生型ではタンパクは細胞膜に局在するのに対し，

ス法にて TECTA 遺伝子変異の解析を行った。

変異型では，細胞質に凝集した状態で局在し細胞膜に２．培養細胞系を用いた TECTA 遺伝子変異の機能移行しないことが明らかとなった。

解析：特徴的な中音域の難聴を来す zona pellucida【考察】日本人における TECTA 遺伝子変異による難（ZP）ドメインの変異に着目し，野生型および変異聴の頻度を初めて明らかにした。特に中等度難聴では型 ZP ドメインを含むＣ末端領域をクローニングし7.7％と高頻度に認められ，常染色体優性遺伝形式を

GFP 融合タンパクを発現するプラスミドを構築しとる難聴者に対する本遺伝子解析の重要性を示した。

た。これらを COS7細胞に導入して細胞内の局在を

また難聴のメカニズムに関する検討では，野生型と変レーザー励起蛍光顕微鏡下で観察，野生型と変異型

異型で細胞内局在に違いがあることを明らかにした。

での比 を行った。

α‑tectorinは細胞外へ分泌，重合し内耳蓋膜として機【研究結果】
422

能を果たすタンパクであり，野生型が細胞膜に移行す
信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨るのに対し変異型では細胞質に凝集し膜へ移行しない

遺伝子変異の部位と表現型である聴力像を比 検討しことから，α‑tectorin タンパクが分泌されないことたところ，ZA ドメインにおける変異では高音域の難により機能が損なわれ難聴となることが推測された。

聴を呈し，ZP ドメインにおける変異では中音域の難（論文審査の結果の要旨）聴を呈する傾向が見られ，今まで欧米から報告されて先天性難聴は1,000人に１人の割合で発症し，その60％程度に遺伝子異常が関与すると考えられている。

いた遺伝型と表現型の関係が，日本人における本遺伝
子変異においても成り立つことが示された。

TECTA 遺伝子変異は常染色体優性遺伝形式を取る難TECTA 遺伝子がコードするアルファ・テクトリン

聴の中で比 的頻度が高い原因遺伝子変異として報告のうち，野生型および難聴を来す変異型 ZP ドメインされている。また遺伝子変異の部位により高音域また部分を GFP 発現ベクターにサブクローニングし，培は中音域に難聴を来す特徴があることが知られている。

養細胞（cos７）に導入，野生型と難聴を来す変異型

特に臨床上，比

ZP ドメイン‑GFP 融合タンパクを発現させ，細胞内的稀な中音域の難聴を来す遺伝子変異として注目されている。

局在に違いがあるかを検討した。その結果，野生型で本論文において茂木英明は，日本人におけるTECTA

は細胞膜への発現が認められる一方，変異型では細胞遺伝子変異の頻度調査，遺伝子型と表現型の比 ，お質内に凝集するパターンを示し，遺伝子変異によりタよび難聴を来す変異タンパクを細胞導入し，その局在

ンパク分泌が障害され難聴を来す可能性が示された。

について野生型タンパクとの違いに関する検討を行っ

本論文は，日本人における常染色体優性遺伝形式をた。頻度調査を行った結果，常染色体優性遺伝形式をとる難聴者の原因遺伝子の診断として TECTA 遺伝

とる両側感音難聴患者139例のうち，以前に本学耳鼻子変異に着目すべきであること，また中等度難聴や特咽喉科学教室で解析を行った既報告（Iwasaki et al.

徴的な聴力像をもつ場合には特に本遺伝子の解析を行

2002）を含め４例（2.9％）に本遺伝子変異を認めた。

う必要性が高いことを示ししたことは臨床診断上，非特に聴力別の検討では，中等度難聴（41〜70dB）では常に有用な情報である。加えて分子生物学的な手法で7.7％（４/52例）と比的高頻度に認められたこと

難聴のメカニズム解析を行い，一定の知見が得られたより，常染色体優性遺伝形式をとる中等度感音難聴患ことは今後の研究の上で非常に重要な発見であると考者においては，まず TECTA 遺伝子に着目し遺伝学えられる。以上より，主査，副査は一致して本論文を的検査を実施する必要があることが示唆された。また，

学位論文として価値があるものと認めた。

Evaluation of human embryonic stem cell‑derived hepatocyte‑like cells for detection of CYP1A
inducers（ヒト ES 細胞由来肝細胞の CYP1A 誘導検出系としての評価）
土

屋

広

行

（論文の内容の要旨）

いは医薬品開発における安全性試験への利用が期待さ【目的】薬物治療において薬物相互作用は大きな問題れている。薬物代謝酵素の中でも CYP1A は薬物の解の一つであり，相互作用が起きにくい医薬品の開発が毒作用のみならず，発癌性物質の代謝的活性化に深くなされている。薬物相互作用の中でも薬物代謝酵素の関与していることから，その酵素誘導の予測は非常に阻害作用は初代肝細胞や肝ミクロソームを利用するこ重要である。そこで，本研究ではヒト ES 細胞を肝細とで予測は比 的容易である。一方，薬物代謝酵素の胞へと分化させ，薬物代謝酵素 CYP1A の誘導評価系

誘導作用は発現調節領域の遺伝子配列だけでなく，受を確立することを目的とした。

容体や転写因子など多くの因子が関係しているため，【方法】ヒト ES 細胞の肝細胞への分化誘導は Activin

予測が困難である。このような研究にヒト肝臓を利用

A，Wnt3a などの分化因子を加え，22日間培養するする際，倫理的な問題に加えて，新鮮な肝臓の入手がことによって行った。分化の指標は肝細胞特異的に発困難であるとともに，使用する肝臓により個体差が生現するタンパク質であるアルブミン（ALB），薬物代

じるなどの問題がある。胚性幹細胞（ES 細胞）は，

謝酵素 CYP1A1，CYP1A2，CYP3A4等の mRNA発

無限に増殖し，生体を構成するあらゆる細胞に分化可現量をリアルタイム PCR 法にて行った。また，ヒト能であることから万能細胞とも呼ばれ，再生医療ある

ES 細胞を上記の方法により肝細胞へと分化させた後，No. 6, 2013423

審査学位論文要旨

CYP1Aの代表的な誘導剤であるオメプラゾール（OME）

khES‑3細胞を使用し，Activin A，Wnt3a，オンコス

や3‑メチルコラントレン（3‑MC）を培地に添加しタチンＭ（OSM ），デキサメタゾン（DEX）などの72時間培養することにより薬物代謝酵素を誘導した。

分化誘導因子を用いて22日間培養し，ヒトES細胞由来

CYP1A1，CYP1A2の mRNA 発現量をリアルタイム

肝細胞を作成した。分化の指標は，albumin（ALB），

PCR法にて測定し，誘導剤添加による mRNA発現量，薬物代謝酵素の CYP1A2，
α‑fetoprotein（AFP）の上昇を評価した。また，CYP1A2の典型的基質であCYP3A4，CYP3A7等 の mRNA 発 現 量 の 解 析 を リるフェナセチンを培地に添加し，代謝物のアセトアミ

アルタイムPCR法により行った。また，ヒト ES細胞

ノフェンの生成量を測定することにより代謝酵素活性を上記の方法により肝細胞へと分化させた後，CYP1A（フェナセチンＯ‑脱エチル化活性）を測定した。

の代表的な誘導剤であるオメプラゾール（OME）【結果・考察】ヒト ES 細胞に Activin A，Wnt3a なや3‑メチルコラントレン（3‑MC）を培地に添加しどを加えて分化培養した細胞からは ALB や α‑feto-

72時間培養することにより薬物代謝酵素を誘導した。

protein（AFP）の 他，CYP1A2や CYP3A4な ど の

CYP1A1，CYP1A2の mRNA 発現量をリアルタイム

CYP の mRNA 発現が確認された。しかしながら，PCR 法にて測定し，誘導剤添加による mRNA 発現

CYP1A2や CYP3A4の発現量はヒト成人肝細胞の発量の上昇を評価した。また，CYP1A2の典型的基質で現パターンよりも，ヒト胎児肝細胞の発現パターンにあるフェナセチンを培地に添加し，代謝物のアセトア類 似 し て い た。CYP1A の 誘 導 剤 と し て OM E，3‑

ミノフェンの生成量を測定することにより代謝酵素活MC を加え，CYP1A1，CYP1A2の mRNA 発現量の性（フェナセチンＯ‑脱エチル化活性）を測定した。

変化，フェナセチンＯ‑脱エチル化活性の変化に関しその結果，土屋は次の結論を得た。

てそれぞれ検討した結果，CYP1A1の mRNA 発現量

１．ヒト ES 細胞から，誘導因子を組み合わせて用いは OM E 処理により35倍，3‑M C 処理により48倍の上ることにより得られたヒト ES 細胞由来肝細胞から昇が認められた。また，CYP1A2の mRNA 発現量はは，肝細胞マーカーである ALB と胎児肝細胞で発OM E 処理により3.5倍，3‑MC 処理により3.2倍の上現が見られる AFP の mRNA が認められた。

昇が認められた。一方，フェナセチンＯ‑脱エチル化

２．ヒト ES 細胞由来肝細胞には，薬物代謝酵 素 で活性は OME 処理によっては2.7倍の上昇に留まった

ある CYP の各分子種である CYP1A1，CYP1A2，

一方で，3‑MC 処理により48倍の上昇が見られた。こCYP3A4，CYP3A7等の mRNA の発現が確認されれらの結果から，ヒト ES 細胞由来肝細胞は，今後成た。

人肝細胞に近い細胞にするための効率的な分化培養条

３．ヒト ES 細胞由来肝細胞の CYP1A1，CYP1A2の件を検討する必要があるが，CYP1A の誘導剤評価系

mRNA 量は OME，3‑MC の処理により上昇が見として使用可能であることが示唆された。

られた。

（論文審査の結果の要旨）
薬物代謝酵素の誘導作用の研究にヒト肝臓を利用す

４．ヒト ES 細胞由来肝細胞の CYP1A2に特異的なフェナセチンＯ‑脱エチル活性が OME，3‑MC のる際，新鮮な肝臓の入手が困難であるとともに，高価

処理により上昇が見られた。

である，使用する肝臓により個体差が生じるなどの問

土屋は，ヒト ES 細胞を用いて，内胚葉組織への分題がある。胚性幹細胞（ES 細胞）は，あらゆる細胞化誘導因子，形態形成因子を組み合わせて用いることに分化できる能力を有していることから，肝細胞へとにより，効率的に肝細胞への分化誘導に成功した。そ分化させ，再生医療あるいは医薬品開発における安全の性質を幾つかのタンパク質の mRNA 量で検討した性試験へ利用することが期待されている。薬物代謝酵

結果からは，ヒト ES 細胞由来肝細胞は，成人肝細胞素の中でも CYP1A は薬物の解毒作用を有している一まで成熟していると判断することは出来なかった。次方で，様々な化合物によって酵素誘導を受けやすく，

いで，機能的な検討として，薬物代謝酵素の誘導能にまた，発癌性物質の代謝的活性化に深く関与している

ついて，CYP1A 誘導能評価系としての有用性を検討ことから，その酵素誘導の予測は非常に重要である。

したところ，CYP1A2特異的な反応である酵素活性のそこで，土屋はヒト ES 細胞を肝細胞へと分化させ，誘導が認められた。これは，ここで分化誘導されたヒ

薬物代謝酵素 CYP1A の誘導評価系を確立することをト ES 細胞由来肝細胞は薬物代謝酵素，特に CYP1A

目的とした。ヒト ES 細胞は京都大学より提供されたに関しては mRNA 量だけでなく，機能的にもその変424

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

動を示すことが可能であることを示唆するものである。

応用できる可能性があることが示唆された。以上の内これらのことから，ヒト ES 細胞から分化誘導した肝容から，主査，副査は一致して本論文を学位論文とし細胞が，CYP1A 誘導能をもつ化合物を検出する系へて価値があるものと認めた。

Fatty acid accumulation and resulting PPARα activation in ﬁbroblasts due to trifunctional protein
deﬁciency（三頭酵素欠損症由来の繊維芽細胞における脂肪酸蓄積と PPARα活性化）
若

林

雅

人

（論文の内容の要旨）された。この結果は，三頭酵素欠損症患者細胞におい【背景と目的】代謝制御学講座では，主にマウスを用て，過剰な脂肪酸を除去しようとする代償機能の存在

いて，各臓器・組織における脂肪酸蓄積の影響についを示唆した。さらに，三頭酵素欠損症患者細胞において研究してきた。１例として，脂肪酸は主にアルブミて，アシルCoA脱水素反応を触媒する３種のアイソザンと結合して体内を循環しており，アルブミンと共にイム（VLCAD・LCAD・M CAD）は同調的に発現亢

糸球体から濾過されると，近位尿細管細胞内に取り込進していた。これらの３種のアイソザイムは PPARα

まれ，脂肪酸 β酸化を受け ATP 合成に利用される。

の標的遺伝子であることから，過剰な遊離脂肪酸をリ

マウス腎臓にアルブミン結合型脂肪酸負荷をかけた動ガンドとした PPARα活性化が生じていることが推物モデルにおいて，尿細管細胞でのアポトーシス・炎察された。ぺルオキシソーム増殖剤応答因子（PPRE）

症反応などの細胞毒性が誘発されることが見出された。

への結合解析や培養細胞に対する MK886（PPARα

加えて，ミトコンドリア脂肪酸 β酸化能を制御する核

アンタゴニスト）とフェノフィブラート（PPARαアゴニ

内受容体：PPARαが近位尿細管細胞の炎症抑制の重スト）投与の結果から，PPARα活性化が生じている

要な因子となることがわかった（Y. Kamijo, et al.,

ことが確認された。PPARα活性化を介するアシル

JASN, 18：3089‑3100，2007）。しかし，動物モデル

CoA 脱水素反応活性の上昇は，PPARαの生体保護の問題点として近位尿細管細胞の炎症は散在的に生じ的作用の現出と推察された。一方，PPARα活性化をており，臓器レベルでの表現型変化の機構解明には不介する細胞増殖の促進や酸化ストレスの増加が見出さ

均一性という難点が併存することも見出された。そこ

れ，三頭酵素欠損症の特徴的臨床症状である肥大性心で，均一な反応を期待できる培養細胞を用いて脂肪酸筋症・軽度肝肥大・肝機能障害・骨格筋機能低下・肝障害の機構解析を試みた。

性脳症の発症原因と推察された。以上の結果から三頭【方法】脂肪酸 β酸化三頭酵素はミトコンドリア脂肪酵素欠損症の新たな治療法の可能性が考えられた。す酸 β酸化系の第２段階から第４段階の３反応を触媒す

なわち，MK886（PPARαアンタゴニスト）の投与

る酵素複合体であり，三頭酵素欠損症の存在が知られは，細胞増殖促進や酸化ストレス増大を抑制することている。三頭酵素欠損症の病因となる遺伝子変異が同で，三頭酵素欠損症の臨床症状改善に繫がる可能性が定されているが，血液検査所見や身体所見は多様であ示唆された。

り，発症機序に関する解明は進んでいない。三頭酵素（論文審査の結果の要旨）

欠損症患者の皮膚由来の繊維芽細胞は，通常の培養条

脂肪酸 β酸化三頭酵素は長鎖脂肪酸に基質特異性が件で旺盛な増殖能を示し，扱いやすい利点を有する。

あり，ミトコンドリア脂肪酸 β酸化系の第２から第４６名の患者から得られた増殖能の高い繊維芽細胞を用反応までの３種類の酵素活性を有する酵素複合体であい，３名の健常人から得られた繊維芽細胞と比 するる。三頭酵素欠損症は遺伝子変異によりこれら３種類

方式で，脂肪酸毒性の生化学的・分子生物学的解析をの酵素活性が欠如し，長鎖脂肪酸の β酸化障害を来す。

行った。

三頭酵素欠損症患者の血液検査所見や身体所見は多【結果・考察】三頭酵素欠損症患者の繊維芽細胞中に様であり，発症機序に関する解明は進んでいない。

は遊離脂肪酸が有意に蓄積し，三頭酵素欠損症の臨床

本論文は，三頭酵素欠損症患者６名の皮膚由来の繊症状の一つである脂肪肝との関連が示唆された。また，

維芽細胞と健常人３名の皮膚由来の繊維芽細胞を用いミトコンドリア脂肪酸 β酸化系の第１段階の反応であて生化学的・分子生物学的解析を行い，脂肪酸毒性のるアシル CoA 脱水素反応活性が上昇することが検出

発現機構解明を試みたものである。その結果，三頭酵

No. 6, 2013425

審査学位論文要旨

素欠損症患者細胞において，遊離脂肪酸の蓄積，ミトした酸化ストレス増大に繫がっていることを見出した。

コンドリア脂肪酸 β酸化系のアシル CoA 脱水素反応

この PPARα活性化を介した細胞増殖促進や酸化ス

活性の上昇，アシル CoA 脱水素反応を触媒する３種

トレス増大が，三頭酵素欠損症の特徴的臨床症状であのアイソザイム（VLCAD・LCAD・M CAD）の同調

る肥大性心筋症・軽度肝肥大・肝機能障害・骨格筋機的な発現亢進，PPARαのぺルオキシソーム増殖剤応

能低下・肝性脳症などの発症原因の一環であることを答因子（PPRE）への結合活性の亢進，およびMK886

導出している。そして本論文では，MK886の投与に（PPARαアンタゴニスト）存在下での MCADの発現より PPARα活性化を低下させることで細胞増殖促低下を見出し，三頭酵素欠損症患者細胞において蓄積

進や酸化ストレス増大を抑制し，三頭酵素欠損症の臨した遊離脂肪酸を内因性リガンドとしたPPARα活性床症状改善に繫がる可能性があると論じ，三頭酵素欠化が生じていることを明らかにした。この中でPPARα損症の新たな治療法の可能性として M K886の投与を活性化を介するアシル CoA 脱水素反応活性の上昇

提唱している。

が生じていることは，過剰な脂肪酸を除去しようとこれらの研究成果は医学領域の発展に貢献するもの

する代償機能の存在であることを示唆した。さらに，

であり，主査，副査は一致して本論文を学位論文とし

PPARα活性化が細胞周期調節因子の発現亢進を介して価値があるものと認めた。

た細胞増殖促進や酸化ストレス産生系の発現亢進を介Comparison of Splinting Versus Nonsplinting in the Treatment of Pediatric Trigger ﬁnger（小児弾
発指におけるスプリント治療と非スプリント治療の成績比 ）塩澤律（論文の内容の要旨）

中７指が治癒，改善が１指，不変は15指であった。４【背景と目的】小児における母指以外の弾発指（pedi-

例９指で症状の再発を認めた。改善の１指と不変の14

atric trigger ﬁnger，以下PTFと略す）の頻度は強剛

指に手術を行った。スプリント群での治癒率は非スプ

母指の10〜20％と稀である。本症の自然経過とスプリント群の治癒率と比 して統計学的に有意に高かっ

リント治療の有効性については報告が少なく意見が一た（ ＝0.01）。

致していない。今回 PTF における自然経過およびス【考察】PTF の自然経過についてはいくつかの報告がプリント治療の効果を検討するために後ろ向き調査をあるが，自然経過率は諸家により０〜100％と大きく行った。

異なっている。本研究では非スプリント群の治癒率は【対象と方法】1981年から2010年までに関連施設を受30％であった。また，自然治癒したと考えられた者

診した PTF 患者24例34手47指を調査した。性別は男のうち３分の１で２〜５年後に症状の再発があった。

児が10人，女児が14人であった。両手罹患が24人中11

PTF におけるスプリント治療については報告が少な

人で，複数指罹患例は14人であった。罹患指の内訳はい。工藤らは８指中３指が治癒したと報告している。

示指が４指，中指が28指，環指が11指，小指が４指で本研究では，スプリント治療を行った24指中16指（67あった。初診から最終経過観察までの期間は２年から％）に治癒が認められ，経過観察のみの非スプリント

18年，平均６年２カ月であった。Static splint を用い群と比 すると，有意に治癒率が良好であった。

て治療したスプリント群は24指，経過観察のみを行っ

手術治療を行った22指については，全例で深指屈筋

た非スプリント群は23指であった。治療開始６カ月後腱，浅指屈筋腱のどちらかあるいは両方に紡錘状肥厚

も，痛みを伴う自動弾発型（を認めた。従来報告されているような腱の解剖学的破型），他動弾発型（型）および強直型（ 型）が残存する場合は手術を行格は認められなかった。A1プーリーの切除と A2プーい，

リーの近位部分切開を行い，全例で治癒した。本研究型， 型で痛みのない場合は小学校入学前後に手術を勧めた。

の限界は，１）後ろ向き研究であり症例が少ない，【結果】スプリント群では24指中16指が治癒，改善が２）スプリント装着群と非装着群の分別は患者の両親

４指，不変が４指であった。改善３指と不変の４指のの意思に委ねられているため，両群を無作為に分別化

合計７指に手術を行った。非スプリント群では，23指していない，３）スプリント装着をどの程度厳密に行っ426

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

たか，スプリント装着時間などのコンプライアンスは
家族からの聞き取りによるため不正確である，４）患児全例を成長終了まで追跡調査していないので，再発例が含まれる可能性がある，などがあげられる。

４指が改善，４指が不変であった。
３．スプリント治療開始から治癒までの期間は５年から５カ月，平均10カ月であった。
４．非スプリント群は23指で，７指（30％）が治癒，本研究から PTF の治療方針を述べると，まず少な
くとも６カ月間就寝中にスプリントを装着することでおよそ３分の２の患者は治癒すると考えられる。深刻な有害事象もなく，保存的治療における初期治療としては有効と考えられる。

１指が改善，15指が不変であった。
５．非スプリント群の初診から治癒までの期間は３カ月から13年，平均４年11カ月であった。
６．非スプリント群で治癒と診断されたもののうち９指で症状の再発を認めた。

（論文審査の結果の要旨）

７．スプリント群での治癒率は非スプリント群の治

小児における母指以外の弾発指（pediatric trigger

癒率と比

ﬁnger，以下 PTF と略す）は強剛母指の10〜20％で

0.01）
。

して統計学的に有意に高かった（＝

稀である。本症の自然経過とスプリント治療の有効性

８．手術を要した指数はスプリント群７指と非スプリについては報告が少なく意見が一致していない。そこ

ント群15指であった。手術を要した率はスプリント

で塩澤らは今回 PTF における自然経過およびスプリ

群が非スプリント群より統計学的に有意に低値であっント治療の効果を検討するために後ろ向き調査を行った（ ＝0.01）。

た。

以上より，小児弾発指の治療においては経過観察のその結果以下の成績を得た。

みと比してスプリント治療が有用であると考えられた。

１．全47指中，自動弾発型（ 型）が19指，他動弾発型（ 型）が19指，強直型（ 型）が９指であった。

したがって主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

２．スプリント群は24指で，16指（67％）が治癒，

Elevated serum granulysin and its clinical relevance in mature NK‑cell neoplasms（成熟 NK 細胞腫
瘍における血清 granulysin と病態との関連）
関口

和（論文の内容の要旨）が保存されていた症例について血清 granulysin の測【目的】成熟 NK 細胞腫瘍は，WHO 分類・第４版で定を行った。測定は ELISA 法で行い，コントロール

は，節外性 NK 細胞リンパ腫，鼻型（ENKL），アグ

としての健常者34例と比 した。また，パラフィン切

レッシブNK細胞白血病（ANKL），NK細胞慢性リン

片による組織学的検討では，TIA‑1，granzyme B，

パ増殖異常症（CLPD‑NK）の３疾患に分類されている。

perforin，granulysin の免疫染色を施行し，これらのGranzymes や perforin といった細胞障害性蛋白は，発現の違いを検討した。

細胞障害性Ｔ細胞やNK細胞の細胞障害性顆粒内に存【成績】血清中の granulysin の測定を行い，健常者34

在し，NK/Ｔ細胞性の腫瘍を診断する際に，それら例と各疾患で比の検出は有用な情報となっている。Granulysin は近

ng/ml，ENKL 2.85ng/ml，ANKL 39.0ng/ml，

年新しく認識された細胞障害性蛋白で，自然免疫におCLPD‑NK 2.8ng/ml であり，各疾患群ではコント

いて細胞障害性蛋白や炎症性蛋白として作用すること

ロールに比していずれも有意に高値を示し，ANKLが報告されている。種々の疾患との関連が示されてい群で最も高値であった。EBV 関連疾患である ANKL

るが，NK 細胞腫瘍における役割や他の細胞障害性蛋と ENKL において，血中の EBV ウイルス量と血清白との関連は不明な点が多い。本研究では，成熟 NK

granulysin値は相関を認めた（細胞腫瘍における granulysin と病態との関連につい鑑別が時に困難なstage４のENKL（n＝５）とANKLて検討を行った。

（n＝８）の比【方 法】ENKL 18例，ANKL 10例，CLPD ‑NK 12あった（ ＝0.02）。治療前後で血清granulysinを測定

例を対象とした。初発時または再発時で治療前の血清可能であった症例では，治療前に比No. 6, 2013

したところ，中央値は健常例1.35＝0.005）。臨床的にでは，ANKLが有意差をもって高値でし治療後に低427審査学位論文要旨

値を示した（ ＝0.03）。組織学的検討では，ENKL

行し，それらの発現の違いを検討した。

13例，ANKL ７例，CLPD‑NK ５例のパラフィン

その結果，関口は以下の結論を得た。

切片にて細胞障害性蛋白（TIA‑1，Granzyme B，

１．血清中のgranulysinの中央値は，健常例1.35ng/

perforin，granulysin）の発現を確認した。TIA‑1に関

ml， ENKL 2.85ng/ml， ANKL 39.0 ng/ml，

しては全例に発現がみられ，granzyme B，perforin，

CLPD‑NK 2.8ng/mlであり，各疾患群ではコント

granulysin で は 疾 患 ご と に 発 現 の 違 い を 認 め た。

ロールに比していずれも有意に高値を示し，ANKL

Granulysin が陽性と陰性の症例間での検討では，各群で最も高値であった（ ＜0.001）。

種検査で有意差は認められなかった。ENKL症例では，２．EBV 関連疾患である ANKL と ENKL において，granulysin 陽性の症例で血管浸潤との関連が示唆さ

血中の EBVウイルス量と血清 granulysin値は相関れた（を認めた（ ＝0.005）。

＝0.03）。ENKLと ANKLで granulysin陽性の症例において，granulysinとEBERの二重染色にて

３．臨 床 的 に 鑑 別 が 時 に 困 難 な stage４ の ENKL

腫瘍細胞は granulysin 陽性であることを確認した。

（n＝５）とANKL（n＝８）の比 では，ANKLが有

CLPD‑NK では，granulysin 陽性症例において合併

意差をもって高値であった（ ＝0.02）。

症が多い傾向が認められた。

４．治療前後で血清 granulysin が測定可能であった【考案】今回の検討で，疾患背景が類似しているENKL

症例では，治療前に比と ANKL において血清 granulysin 値に差が認めら（ ＝0.03）。

れたことは，これらの腫瘍細胞の起源や腫瘍細胞の活５．組織学的検討では，ENKL 13例，ANKL ７例，性化状態などの違いを示し，病勢を反映している可能

CLPD‑NK ５例のパラフィン切片にて細胞障害性性が考えられた。また，granulysin が血管浸潤や組織蛋白（TIA‑1，granzymeB，perforin，granulysin）

壊死に関連する可能性が示唆された。

の発現を確認した。TIA‑1に関しては全例に発現が【結語】成熟 NK 細胞腫瘍において，granulysin は病みられ，granzyme B，perforin，granulysin では疾態・病勢と関連し，今後 biomarker となりうる可能

患ごとに発現の違いを認めた。

性が示唆された。

し治療後に低値を示した

６．ENKL 症例では，granulysin 陽性の症例で血管（論文審査の結果の要旨）

浸潤との関連が示唆された（ ＝0.03）。

成熟 NK 細胞腫瘍は，WHO 分類・第４版では，７．ENKL と ANKL で granulysin 陽性の症 例 に お

節外性 NK 細胞リンパ腫，鼻型（ENKL），アグレッ

いて，granulysin と EBER の二重染色にて腫瘍細シブ NK 細胞白血病（ANKL），NK 細胞慢性リンパ胞は granulysin 陽性であることを確認した。

増殖異常症（CLPD‑NK）の３疾患に分類されてい８．CLPD‑NK では，granulysin 陽性症例においてる。NK 細胞腫瘍における役割や他の細胞障害性蛋白

合併症が多い傾向が認められた。

との関連はいまだ不明な点が多く，本研究では，成熟今回の研究は成熟 NK 細胞腫瘍における血清 gran-NK 細胞腫瘍における granulysin と病態との関連に

ulysin 値の検討と，各疾患における細胞障害性蛋白のついて検討を行った。ENKL 18例，ANKL 10例，発現の相違を確認した最初の研究である。血清 gran-

CLPD‑NK 12例を対象とし，初発時または再発時でulysin 値は病勢との関連があると考えられ，また組織

治療前の血清が保存されていた症例について血清

学的には細胞障害性蛋白が疾患ごとに異なる発現であgranulysin の測定を行った。測定は ELISA 法で行い，ることを発見し，今後の成熟 NK 細胞腫瘍の病態やコントロールとしての健常者34例と比した。また，

予後の解明につながると考えられる。よって，主査，

パラフィン切片による組織学的検討では，TIA‑1，

副査は一致して本論文を学位論文として価値があるもgranzyme B，perforin，granulysin の免疫染色を施のと認めた。

428

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

Age‑Related Decrease of the Retinal Vasculature Area Identiﬁ
ed with a Novel Computer‑Aided
Analysis System（新しいコンピュータ支援システムを用いた加齢に伴う網膜血管領域狭細化の
解析）
山

本

（論文の内容の要旨）

裕

香

とした。

【背景と目的】眼底写真では，非侵襲で網膜血管を観【結果】条件を満たした161名（18歳〜87歳，男56名女

察し，網膜微小循環の状態を観察する事が可能である。

105名，49.5±18.7歳）の眼底写真で，総血管面積と網膜血管の局所的な動脈の狭窄や，口径不同，血管壁

加齢および MABP との相関を分析した。総血管面の反射亢進，その他出血や硬性白斑などの所見は動脈積と加齢（Ｒ＝‑0.63），総血管面積と MABP（Ｒ＝硬化や高血圧に伴う所見として，以前から Wagener‑0.44）はそれぞれ相関を認めた。この両者の関係を評や Scheie らに代表される眼底所見分類が報告されて価するため，重回帰分析に基づくパス解析を行ったと

おり一般に使用されている。しかし，経験豊富な眼科

ころ，標準（偏）回帰係数：SPR が，総血管面積と医であっても，高い再現性をもってこれらの所見を評

加齢では SPR＝‑0.54であり，総血管面積と MABP

価するのは困難である。

では SPR＝‑0.20であったため，血管面積は加齢に，近年，コンピュータ支援解析（CAD：computer‑より依存して変化していることが分かった。我々はまaided diagnosis）システムの技術の向上により，分た，最高血圧が140以上または最低血圧が120以上とな

析と診断について定量的なアプローチが可能となってるグループを高血圧群として，これを除外した群128

きた。特にここ20年程度で CAD は高画素にもなりソ人のみで相関を解析したところ，Ｒ＝‑0.64と強い相

フトも進歩している。心循環器系疾患と脳卒中は網膜関が認められた。さらに条件をしぼって最高血圧120の動静脈血管径から推測が可能であるという報告もあ以上または最低血圧を80以上という条件の群を除外しり，網膜血管の評価はアメリカの ARIC（The Ather-

た残りのグループ72人においても，Ｒ＝‑0.58というosclerosis Risk in Communities study）グループで相関が認められた。また，回帰直線の傾斜を比 したも解析が行われている。しかし，網膜血管の変化は，

ところ，60歳以下の群での相関の方が，60歳以上の群

高血圧のない高齢者でも観察されることが知られていでの相関よりも有意差をもって急峻であった。更にる。今回の研究で我々は，眼底写真に占める網膜血管

我々は，動脈と静脈を分けて各年代別３グループ（30の面積を，独自に作成した CAD システムで解析し，歳未満・40‑50歳・60歳以上）からランダムで抽出し加齢の眼底所見における影響を明らかにした。

た計27名の解析を行った。結果，総動脈面積について【対象と方法】249人のボランティア（18歳から87歳

はＲ＝‑0.82，総静脈面積についてはＲ＝‑0.78という53.2±19.8歳）を対象として研究を行った。

加齢との相関が認められた。一方，各血管面積と平均

眼底写真は，デジタル，カラーで黄斑部を中心とし血圧の相関は認められなかった（動脈：Ｒ＝‑0.34静た画角45度の範囲を撮影し，画素は2048×1536pixel

脈：Ｒ＝‑0.26）。

で，JPEG 形式で保存した。対象者の写真を確認し，【考察】眼底写真の全範囲の血管面積を CAD システ

網膜出血や硬性白斑，微小動脈瘤や進行した白内障，

ムで測定した所，総血管面積は加齢と強く相関して減脈絡膜萎縮などの患者は今回の解析対象から除外した。

少し，この相関は血圧とは独立していた。また，高齢１枚の写真に撮影されたすべての網膜血管を CAD で者であるほど血管面積は少ない＝血管が狭窄している

認識・解析した。血管の抽出については様々なアルゴ傾向があった。一方，60歳以下の群については，血圧リズムがあり，光量とキャプチャー時の状態・検者と血管面積の相関が有意であり，血圧の影響が眼底所の技術に影響されやすいため，それらを補正できる

見に現れやすいと考えられた。このことは，75歳以上

ようにプログラムを作成した。血圧は，自動血圧計をの高齢者は，眼底所見から全身疾患や心循環系疾患を用いて測定した。平均血圧（MABP）は，最高血圧×予測する点で劣るという近年された報告と矛盾しない。

0.33＋最低血圧×0.67で求めた。最高血圧が140以上

網膜血管は，ある程度全身的な高血圧や循環疾患を反または最低血圧が90以上のグループを高血圧グループ

映すると考えられるが，加齢に伴って，他の全身疾患

No. 6, 2013429

審査学位論文要旨がなくとも血管径は細くなっていくという傾向がある。

最高血圧×0.33＋最低血圧×0.67で求めた。最高血圧

私たちは，網膜血管が加齢と相関して有意に細くなるが140以上または最低血圧が90以上のグループを高血ということを，独自の CAD システムを用いて見出し

圧グループとし，比 検討した。結果を以下に示す。

た。高齢者の眼底検査を行う場合に，加齢による血管

１．総血管面積と加齢，総血管面積と M ABP はそれ

変化を高血圧のためであると安易に評価しないように配慮すべきである。

ぞれ相関を認めた。
２．両者の関係を評価するため，多重回帰分析に基づ（論文審査の結果の要旨）

くパス解析を行ったところ，血管面積は加齢に，よ

眼底写真は，非侵襲で網膜血管を観察する事が可能である。動脈硬化や高血圧に伴う所見として，以前かり依存して変化していることが分かった。
３．血圧の低い群のみで相関を検討しても，加齢と総ら Wagenerや Scheieらに代表される眼底所見分類が血管面積との相関を認めた。

検診など一般に使用されているが，近年，コンピュー４．60歳未満の群では MABP と総血管面積との相関

タ支援解析（CAD：computer‑aided diagnosis）シが認められたが，60歳以上ではこの両者の相関が認

ステムの技術の向上により，分析と診断について定量

められなかった。

的なアプローチが可能となってきた。近年，網膜血管

５．動静脈別での検討を行い，動脈・静脈ともに加齢の変化は，高血圧のない高齢者でも観察されることがと総血管面積に高い相関を認めた。

報告されている。今回の研究で我々は，眼底写真に占これらの結果より，総血管面積と血圧・加齢は互いめる網膜血管の面積を，独自に作成した CAD システに影響因子となるが，総血管面積は，加齢と強く相関ムで解析し，加齢の眼底所見における影響を明らかにして減少していることが考えられた。また，高齢者でした。

あるほど血管面積は少ない＝血管が狭窄していること

249人のボランティア（18歳から87歳53.2±19.8歳）が考えられた。網膜血管は，全身的な高血圧や循環疾を対象として，眼底写真は，デジタル・カラーで黄患を反映するが，加齢とも相関して有意に細くなると斑部を中心とした画角45度の範囲を撮影し，画素はいうことが示唆された。

2048×1536pixelで，JPEG形式で保存し新しいプログ
ラムで作成したCADソフトを用いて解析した。血圧は，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

自動血圧計を用いて測定し，平均血圧（MABP）は，

Distinct CytoplasmicExpression ofKL‑6 Mucin in ChromophobeRenalCellCarcinoma:A Comparative Immunohistochemical Study with Other Renal Epithelial Cell Tumors（嫌色素性腎細胞癌における KL‑6の特異的な細胞質発現様式：他の腎上皮性腫瘍との免疫組織化学的比 検討）
福島（論文の内容の要旨）

万奈に比 ，検討した。

．はじめに．材料と方法

嫌色素性腎癌は腎上皮性腫瘍の一つで，大型で微細

嫌色素性腎癌14例（通常型10例，好酸性型４例），

網状の細胞質を有する細胞より成る通常型と，主としオンコサイトーマ７例，淡明細胞癌９例，未熟腎４例て細胞質が好酸性の細胞より成る好酸性型に亜分類さ（未熟児剖検例）について，ホルマリン固定・パラフィれる。嫌色素性腎癌の細胞質はコロイド鉄染色に陽性

ン包埋切片を用い，KL‑6と sialyl‑MUC1の免疫染色で，細胞質内のシアル化糖蛋白の存在を反映しているを施行した。これらの免疫染色に対するシアリダーゼとされる。形態的，免疫組織化学的に嫌色素性腎癌は消化の影響も検討した。正常腎組織を免疫染色の陽性

遠位尿細管，集合管や集合管介在細胞との，オンコサ

コントロールとした。

イトーマは集合管介在細胞との，また淡明細胞癌は近．結果位尿細管との類似性を示す腫瘍とされている。本研究

正常成人腎組織では，KL‑6と sialyl‑M UC1の発現では，これらの腎腫瘍組織，正常腎組織および未熟腎は近位尿細管や糸球体には認められず，遠位尿細管と組織におけるシアル化糖蛋白の発現を免疫組織化学的

集合管に強く認めた。多くは上皮の管腔面に発現して430

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

いるが，集合管介在細胞では細胞質がびまん性に染色（未熟児剖検例）について，ホルマリン固定・パラされた。未熟な腎組織は，成人と異なり，近位尿細管

フィン包埋切片を用い，シアル化糖蛋白である KL‑6の管腔面にも KL‑6と sialyl‑MUC‑1の発現がみられとsialyl‑MUC1の免疫染色を施行した。これらの免疫た。

染色に対するシアリダーゼ消化による効果も検討した。

腎腫瘍においては，嫌色素性腎癌の通常型と好酸

正常腎組織を免疫染色の陽性コントロールとした。

性型で，KL‑6および sialyl‑M UC1は細胞質にびまん

その結果，以下の結論を得た。

性に，また管状構造を示す部分では管腔面にも発現し

１．KL‑6と sialyl‑M UC1は，正常集合管介在細胞，ていた。オンコサイトーマでは KL‑6および sialyl‑

嫌色素性腎癌の通常型と好酸性型では細胞質にびま

MUC1はしばしば細胞質が顆粒状に染色され，核近くん性に染色され，一方，オンコサイトーマでは核周に分布する傾向がみられた。淡明細胞癌では KL‑6お囲の細胞質に局在して陽性像が観察されたことから，

よび sialyl‑MUC1は細胞膜の一部に発現していた。

シアル化糖蛋白の発現の点からこれらの類似性が確

シアリダーゼ消化後，sialyl‑M UC1の染色性はほぼ認された。

消失したが，正常の集合管介在細胞や嫌色素性腎癌の２．シアリダーゼ消化により，sialyl‑MUC1の染色性

通常型，好酸性型，オンコサイトーマでは，KL‑6のはほぼ消失したが，KL‑6は抵抗性であった。シア

細胞質の染色性が残存した。

リダーゼ消化後の KL‑6の細胞質の染色性は，嫌色．考察

素性腎癌の通常型よりも正常集合管介在細胞，好酸以上の結果から，シアル化糖蛋白の発現様式の点か性型やオンコサイトーマでより目立つことから，嫌ら嫌色素性腎癌とオンコサイトーマには集合管介在細色素性腎癌好酸性型やオンコサイトーマはより集合胞との類似性が確認された。シアリダーゼ消化により管介在細胞に類似した表現型を示しているものと考

sialyl‑MUC1の染色性はほぼ消失したが，KL‑6は抵えられた。

抗性であった。その理由として，KL‑6はシアル化糖

３．淡明細胞癌では，KL‑6と sialyl‑MUC1が細胞膜蛋白以外にも0グリコシド型糖鎖と反応する可能性がの一部に発現していた。KL‑6と sialyl‑MUC1は成報告されている。シアリダーゼ消化後の KL‑6の細胞

人の近位尿細管には発現していないが，未熟腎組織

質の染色性は，嫌色素性腎癌の通常型よりも好酸性型

では近位尿細管の内腔面に発現が認められることかやオンコサイトーマでより目立つことから，後者はよら，淡明細胞癌における KL‑6と sialyl‑M UC1の発り集合管介在細胞に類似した表現型を示しているもの

現は腫瘍胎児性発現と考えられた。

と考えられた。また，淡明腎細胞癌における KL‑6発

本研究により，嫌色素性腎癌の通常型と好酸性型，

現は腫瘍胎児性発現と考えられた。

オンコサイトーマは，シアル化糖蛋白の発現様式から（論文審査の結果の要旨）

集合管介在細胞との類似性が示され，特にシアリダー

嫌色素性腎癌の細胞質は組織化学的にコロイド鉄染

ゼ消化後の KL‑6の染色性は，より集合管介在細胞に色に陽性で，細胞質内のシアル化糖蛋白の存在を反映

類似した表現型を示していると考えられた。これらのしているとされる。本研究では，シアル化糖蛋白の発結果は，KL‑6と sialyl‑MUC1の免疫染色が腎上皮性現に着目して，嫌色素性腎癌（通常型，好酸性型），

腫瘍の病理組織学的分類や病理診断に役立つのみでな

淡明細胞癌，正常腎組織および未熟腎組織を免疫組織

く，KL‑6が腎腫瘍の腫瘍マーカーとなりうる可能性

化学的に比 ，検討した。

を示唆するものである。よって，主査，副査は一致し嫌色素性腎癌14例（通常型10例，好酸性型４例），て本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

オンコサイトーマ７例，淡明細胞癌９例，未熟腎４例

Eﬀects of repeated crush injuries on motor functional recoveryofthe sciatic nerve（坐骨神経反復損
傷が運動機能に与える影響について）
伊

坪

敏

郎

（論文の内容の要旨）

損傷実験モデルでは，１回の強い圧迫を神経に加えて【背景・目的】末梢神経損傷に対するこれまでの圧迫いるものが多く，反復圧迫損傷後の病態を分析した研No. 6, 2013431

審査学位論文要旨

究は少ない。本研究では，ラット坐骨神経に複数回のと，Ｂ群では２，３週後では有意に筋線維横径が小圧迫を加え，この反復損傷が運動機能の回復と神経線

さいものの４週後にはＡ群と同程度まで回復したの維の再生に及ぼす影響について明らかにすることを目に対し，Ｄ群では４週後まで有意に小さいままであっ

的とした。

た。

【方法】12〜14週齢の雌の Wistar 系ラットの左臀部３．神経筋接合部の再支配率：Ｂ群（１回圧迫），Ｄを切開し左坐骨神経を露出後，鉗子による強い圧迫損群（１週間隔で３回圧迫）双方において，最終圧迫傷を加えた。圧迫は鉗子にて180秒間行った。損傷回の２，３，４週後のシナプトフィジン陽性神経終末数の違いにより，Ａ〜Ｄ群のラットを作成した［Ａ群数は徐々に増加し，神経筋接合部における神経の再（control），Ｂ群（１回圧迫），Ｃ群（１週間隔で２回

支配率の増加が確認された。Ａ群（control）と比圧迫），Ｄ群（１週間隔で３回圧迫）］。全ての群におすると，Ｂ群，Ｄ群ともに２，３週後の再支配率

いて最終圧迫部位を大腿骨大転子の高さとし，反復損は有意に低値であったが，４週後には有意差は確認

傷群（Ｃ‑Ｄ群）では，回数に応じて圧迫を7.5mm

されなかった。また，Ｄ群の再支配率は３週後におずつ遠位から開始した。各群において最終圧迫の８週

いてＢ群と比 して有意に低かった。

後まで，毎週ラットの後肢両足の foot print を採取し【結論】坐骨神経に対する反復圧迫損傷では，１回のた。採取した foot print から第１‑５指間距離と第２‑圧迫損傷と比 して運動機能の回復が遅く，３回以上

４指間距離を測定し，Static Sciatic Index（SSI）値の圧迫では筋線維径の回復遅延および神経線維の再生を算出し運動機能を評価した。SSI 値は‑100〜０で算遅延により，最終的に正常運動機能が得られないこと出される数値で，‑20以上を正常機能と判断した。まが示唆された。

た，１回圧迫（Ｂ群）と３回圧迫（Ｄ群）の比 を行（論文審査の結果の要旨）

うため，最終圧迫の２，３，４週後に採取した前脛骨

末梢神経損傷に対するこれまでの圧迫損傷実験モデ

筋から凍結切片を作成し，筋線維横径の計測と免疫染

ルでは，１回の強い圧迫を神経に加えているものが多色（神経終末：抗シナプトフィジン抗体，アセチルコ

く，反復圧迫損傷後の病態を分析した研究は少ない。

リンレセプター： αブンガロトキシン）による神経筋

本研究では，ラット坐骨神経に複数回の圧迫を加え，接合部の再支配率（シナプトフィジン／ αブンガロト

この反復損傷が運動機能の回復と神経線維の再生に及キシン）の計測を行い，坐骨神経反復損傷による影響

ぼす影響について検討した。ラットの左坐骨神経に鉗について評価した。

子による強い圧迫損傷を加え，損傷回数の違いにより，【結果】

Ａ〜Ｄ群のラットを作成した［Ａ群（control），Ｂ群

１．SSI 値：Ａ群（control）では実験期間中に歩行（１回圧迫），Ｃ群（１週間隔で２回圧迫），Ｄ群（１障害は認められず，すべての計測において SSI 値

週間隔で３回圧迫）］。各群において最終圧迫の８週後は‑20以上の正常値を示した（‑15.6〜‑4.1）。坐骨まで，毎週ラットの後肢両足の foot print を採取し神経損傷群（Ｂ‑Ｄ群）では，最終圧迫１週後の時

Static Sciatic Index（SSI）値を算出して運動機能を点ですべてのラットにおいて高度な運動機能障害評価した。また，最終圧迫の２，３，４週後に採取しを認め，SSI 値は‑80以下であった（（Ｂ，‑95.4±た前脛骨筋から凍結切片を作成し，筋線維横径の計測

3.4；Ｃ，‑96.1±3.9；Ｄ，‑94.9±3.5）。これら３と免疫染色（神経終末：抗シナプトフィジン抗体，ア群では，次第に SSI 値の回復が認められたが，Ｂ

セチルコリンレセプター： αブンガロトキシン）によ群（１回圧迫）に比 してＣ群（１週間隔で２回圧る神経筋接合部の再支配率の計測を行い，坐骨神経反迫），Ｄ群（１週間隔で３回圧迫）では回復の遅延

復損傷による影響について評価した。

が認められた。また，Ｂ群では４週後に，Ｃ群ではその結果，以下の結論を得た。

６週後に SSI 値が正常域に達したのに対し，Ｄ群

１．SSI 値：Ａ群（control）では実験期間中に歩行では８週後においても正常域まで回復しなかった。

障害は認められず，すべての計測において SSI 値

２．筋線維横径：Ｂ群（１回圧迫）の前脛骨筋の筋線は‑20以上の正常値を示した（‑15.6〜‑4.1）。坐骨

維横径は，Ｄ群（１週間隔で３回圧迫）と比 する

神経損傷群（Ｂ‑Ｄ群）では，最終圧迫１週後の時と，最終圧迫の２，３，４週後すべてにおいて有意点ですべてのラットにおいて高度な運動機能障害をに大きかった。また，Ａ群（control）と比認め，SSI 値は‑80以下であった。これら３群では，

432

する

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

次第に SSI 値の回復が認められたが，Ｂ群（１回の２，３，４週後のシナプトフィジン陽性神経終末圧迫）に比してＣ群（１週間隔で２回圧迫），Ｄ

数は徐々に増加し，神経筋接合部における神経の再群（１週間隔で３回圧迫）では回復の遅延が認めら支配率の増加が確認された。Ａ群（control）と比れた。また，Ｂ群では４週後に，Ｃ群では６週後にすると，Ｂ群，Ｄ群ともに２，３週後の再支配率

SSI 値が正常域に達したのに対し，Ｄ群では８週後は有意に低値であったが，４週後には有意差は確認においても正常域まで回復しなかった。

されなかった。また，Ｄ群の再支配率は３週後にお２．筋線維横径：Ｂ群（１回圧迫）の前脛骨筋の筋線

いてＢ群と比 して有意に低かった。

維横径は，Ｄ群（１週間隔で３回圧迫）と比 する

今回の研究では，坐骨神経に対する反復圧迫損傷でと，最終圧迫の２，３，４週後すべてにおいて有意は，１回の圧迫損傷と比 して運動機能の回復が遅く，に大きかった。また，Ａ群（control）と比する

３回以上の圧迫では筋線維径の回復遅延および神経線と，Ｂ群では２，３週後では有意に筋線維横径が小維の再生遅延により，最終的に正常運動機能が得られさいものの４週後にはＡ群と同程度まで回復したのないことが示唆された。また，本実験モデルは軽度反に対し，Ｄ群では４週後まで有意に小さいままであっ復圧迫や持続圧迫モデルとして応用できる可能性があた。

る。したがって，主査，副査は一致して本論文を学位

３．神経筋接合部の再支配率：Ｂ群（１回圧迫），Ｄ論文として価値があるものと認めた。

群（１週間隔で３回圧迫）双方において，最終圧迫

Prevalence and Clinical Features of Hearing Loss Patients with CDH23 Mutations:A Large Cohort
Study（CDH23 遺伝子変異による難聴の頻度と臨床的特徴について：大規模コホート研究）
宮川（論文の内容の要旨）

麻衣子
臨床像（聴力レベル，難聴の進行性，めまい，耳鳴の【研究目的】先天性難聴は出生児1,000人に１人に見ら有無）について検討を行った。

れる頻度の高い先天性疾患である。先天性難聴には【研究結果】直接シーケンス法による第一次スクリーニン

100種類以上の遺伝子が関与しているとされ，すでにグの結果，26種類の病的変異と考えられるアミノ酸置換

様々な遺伝子について，変異の頻度，種類，表現型にが同定された。これには，既に報告されているp.P240L

ついての報告がなされている。

変異，p.R301Q変異，p.Q1716P変異，p.R2029W 変異

今 回，宮 川 ら は Usher 症 候 群 と 非 症 候 群 性 難 聴も含まれていた（Wagatsuma et al., 2007）。次に，（DFNB12）の原因遺伝子である CDH23 遺伝子につ

第二次スクリーニング（Taqman assayによる）では，

いて，日本人における遺伝子変異の頻度およびこれら

1,396名中52名（＝2.1％）（ホモ接合体：10名，コンの変異を有する症例の臨床像を明らかにするために大パウンドへテロ接合体：13名，ヘテロ接合体：29名）

規模集団を用いた検討を行った。

において，CDH23 遺伝子変異を認めた。10種類のア【対象と方法】第一次スクリーニングとして日本人難

ミノ酸置換については変異と考えられ，残りについて

聴遺伝子データベース（全国33施設より集められた難は病的変異かどうかの結論は得られなかった。臨床像

聴遺伝子家系発端者1396名）のうち，常染色体劣性遺を検討したところ，１）発症年齢は０歳（先天性）か伝による難聴の可能性のある304名について CDH23

ら60歳までと幅広いこと，２）低音部に残存聴力を認

遺伝子を直接シーケンス法による解析を行った。そのめること，３）進行性であること，４）p.R2029W変異

結果，病的変異と考えられる26個のアミノ酸置換が同の症例では成人発症であることが明らかとなった。ま定された。次に，第二次スクリーニングとして1,396名

た，補聴器や人工内耳を装用している例が多く認めら（第一次スクリーニングの304名を含む）を対象に，れた。

Taqman SNP Genotyping Assays（Applied Biosys-【考察】日本人非症候群性難聴患者において，高頻度tems）により，26種類の変異の有無をスクリーニン

で認められる GJB2 遺伝子や SLC26A4 遺伝子の変グした。この第二次スクリーニングにより検出された

異に次いで，CDH23 遺伝子変異の頻度が高いことが

CDH23 遺伝子変異の頻度と変異が同定された症例の明らかとなった。変異は機能上重要な部位（DRE，No. 6, 2013433

審査学位論文要旨

DXNDN，DXD モチーフ）に多く認められた。中でまず，難聴患者1396家系における頻度を検討した。

も P240L 変異の頻度が高く，創始者効果が関与して

CDH23 遺伝子は，69エクソンもの巨大な遺伝子であいることが示唆された。また，ヘテロ症例の表現型はるため，２段階スクリーニングを行った。その結果，

ホモ変異，コンパウンドへテロ変異症例の表現型と類10種類のミ ス セ ン ス 変 異 を 認 め，1396家 系 中 52家似しており，もう一方の変異の存在が示唆された。ヘ系（＝2.1％）（ホモ接合体10家系，コンパウンドヘ

テロ変異症例を含めると難聴患者の3.7％，常染色体

テロ接合体29家系，ヘテロ接合体29家系）において劣性遺伝形式をとる難聴の5.7％を占める頻度の高い

CDH23 遺伝子による非症候群性難聴を認めた。

責任遺伝子であることが明らかとなった。

次に，ホモ接合体/コンパウンドヘテロ接合体23家【結 論】今 回 の 大 規 模 研 究 に よ り 日 本 人 に お け る

系26症例の臨床像を検討したところ，先天性高音障害

CDH23 遺伝子変異の頻度および臨床像がより明確と型難聴が多く，徐々に低音域聴力が低下する傾向を認なり，この遺伝子変異を持つ患者への詳細な情報提供

めた。また，変異ごとに検討したところ，p.T1368Mが可能となったと考えられる。

変異や p.R2029W 変異は高齢発症であった。実験動（論文審査の結果の要旨）物として最も良く用いられているC57BL6/Jマウスの先天性難聴は1,000人に１人の割合で発症し，その加齢性難聴の原因遺伝子は Cdh23 であり，本論文の60％程度に遺伝子変異が関与すると考えられている。

結果により，CDH23 遺伝子がヒトの加齢性難聴にも比 的高頻度で認められる GJB2 遺伝子や SLC26A4

関与することが明らかとなった。

遺伝子の他に，100種類以上の遺伝子が関与しているとされている。

また，27％の症例が人工内耳を装用していた。補聴器を装用している症例についても高音障害型難聴でそのうち，CDH23 遺伝子は，常染色体劣性遺伝病

あることから，現在，信州大学が申請した高度医療での責任遺伝子であり，欠失挿入変異/スプライス変異/ある「残存聴力活用型人工内耳」のよい適応であるこ

ナンセンス変異により Usher 症候群（難聴＋網膜色とがわかった。

素変性症＋めまい）が起こり，またミスセンス変異に

本論文により，日本人における非症候群性難聴者のより非症候群性難聴（難聴のみ）がおこることが知ら

原因遺伝子として CDH23 遺伝子変異の頻度が高く，れている。2007年に信州大学耳鼻咽喉科学教室より

特徴的な臨床像を示すことが明らかとなった。一定のCDH23 遺伝子による非症候群性難聴について報告し知見が得られたことは今後の研究の上で非常に重要なている（Wagatsuma et al.）。

発見であると考えられる。以上より，主査，副査は一

本論文にお い て 宮 川 麻 衣 子 は，日 本 人 に お け る
CDH23 遺伝子変異の頻度およびこれらの変異を有す

致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

る症例に関する臨床像について大規模調査を行った。

Diﬀerentiation of Monkey Embryonic Stem Cells to Hepatocytes by Feeder‑free Dispersion Culture
and Expression Analyses ofCytochromeP450 Enzymes Responsiblefor Drug Metabolism（無フィーダー分散培養によるサル胚性幹細胞の肝細胞への分化と薬物代謝に関与するチトクロムＰ450
酵素の発現解析）丸

山（論文の内容の要旨）順也類）であるカニクイザルが実験用動物として広く用【目的】胚性幹細胞（ESCs）は，あらゆる細胞に分化いられている。当研究室では，カニクイザル ESCs

可能な万能細胞であり，再生医療だけでなく薬物動（cmESCs）から胚様体（EB）を形成し，いくつかの態試験を含む創薬研究への利用にも大いに期待されて因子を添加することで肝細胞に分化させることを報告いる。しかし，ヒト ESCs（hESCs）は受精卵を使っしている。しかしながら，EB を形成する分化培養法て樹立するため，生命倫理上の問題から，国内ではは，同時に多数の検体を用いる場合に効率的ではない。

hESCs を用いた研究は一部の研究機関に限られてい一方，無フィーダー分散培養法は，未分化な細胞をよる。現在，ヒトに系統発生学的に最も近い種（霊長り効率的に得ることが可能である。また，cmESCs

434

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

を分散培養系で，Rho キナーゼ阻害薬（Ｙ‑27632）

スが抑制されることが示され，また cmESCs 由来肝を添加するとアノイキスを抑制することが報告されて細胞は，分化の最終段階において肝細胞に特有な多核いる。しかしながら，分散培養法が cmESCs の肝細な形態を示した。ALB は，成熟した肝細胞で合成さ胞への分化誘導に効果的であるか否かは不明である。

れるタンパク質であり，AFPは内胚葉の分化マーカー

そこで，本研究では，cmESCs をＹ‑27632存在下

であると同時に初期の胎児肝細胞マーカーで，肝細胞で，分散培養法を用いて肝細胞への分化誘導を行い，の成熟と共に発現レベルは減少する。したがって，本分化した細胞を用いて肝細胞マーカー遺伝子やチトク研究において分化誘導した cmESCs 由来肝細胞は，

ロムＰ450（CYP）酵素の発現とＰ450の薬物代謝の成熟細胞よりむしろ未成熟な細胞の可能性が示唆され応答性に関して解析を行った。

た。また，カニクイザルの肝臓における主要な CYP【方法】サルESCsは，田辺製薬より供与されたcmESCs

分 子 種 の 発 現 は，cmHCsと 比（CMK6）を使用した。細胞培養に関しては，Ｙ‑27632

肝細胞では低かった。しかしながら，本研究で得らを添加した分散培養法にて未分化細胞のみを分取した

れた cmESCs 由来肝細胞は，cmCYP3A4（3A8）を後，HGF，OSM ，DEXを添加したランフォード培地

mRNA および酵素活性レベルで発現していることがにて肝細胞へ分化させた。肝細胞マーカー遺伝子およ明らかとなり，また RIF による酵素誘導も確認され

び CYP酵素の mRNAの発現解析は，real‑time PCRた。

し て cmESCs由 来法にて行った。cmCYP3A4（3A8）の酵素活性は，テ以上の結果より，Ｙ‑27632存在下で分散培養法を用

ストステロン6β‑水酸化酵素活性によって評価した。

いて cmESCs 由来肝細胞を分化誘導する方法を確立

酵素誘導能に関しては，cmCYP3A4（3A8）の強力なした。今後更なる改良が必要であるが，薬物代謝研究

誘導剤であるリファンピシン（RIF）を用いて，cm

における肝細胞の安定的な供給源となり得る可能性が

CYP3A4（3A8）の mRNA および酵素活性によってあると考えられた。

評価を行った。比対照として，BIOPREDIC社より購入したカニクイザル初代培養肝細胞（cmHCs）を（論文審査の結果の要旨）
胚性幹細胞（ESCs）は，あらゆる細胞に分化可能用いた。

な 万 能 細 胞 で あ る。当 研 究 室 で は，カ ニ ク イ ザ ル【結果】肝細胞への分化誘導27日後には，肝 細 胞 に

ESCs（cmESCs）から胚様体（EB）を形成し，肝細特徴的な形態（多核で多角形）を示した。また，Ｙ‑胞に分化させることを報告している。また，無フィー

27632は，分散培養 条 件 下 cmESCsの 生 存 に 効 果 的

ダー分散培養法は，未分化な細胞をより効率的に得るであった。cmESCs 由来肝細胞におけるアルブミン

ことが可能であり，cmESCs を分散培養系で，Rho（ALB）のmRNA発現レベルは，cmHCsの約１/80でキナーゼ阻害薬（Ｙ‑27632）を添加するとアノイキス

あったが， α‑フェトプロテイン（AFP）はcmHCsと比を抑制することが報告されている。そこで，cmESCs

べて16倍高かった。CYP1A1，cmCYP2B6（2B30），

をＹ‑27632存在下で，分散培養法を用いて肝細胞への，cmCYP2D6（2D17），cmCYP3
cmCYP2C9（2C43）

分化誘導を行い，分化した細胞を用いて肝細胞マーカー

A4（3A8）およびcmCYP3A5（3A66）はカニクイザル

遺伝子やチトクロムＰ450（CYP）酵素の発現とＰ450の肝臓における主要な CYP 分子種であり，cmESCsの薬物代謝の応答性に関して解析を行った。

由来肝細胞におけるこれら CYP 分子種の mRNA 発

１．肝細胞への分化誘導27日後には，肝細胞に特徴的

現レベルは cmHCs と比して，それぞれ386倍，7.4

倍，284倍，1.6倍，136倍，5.9倍低かった。cmESCs
由来肝細胞における cmCYP3A4（3A8）のテストスな形態（多核で多角形）を示した。
２．Ｙ‑27632は分散培養条件下 cmESCs の生存に効果的であった。

テロン6β‑水酸化酵素活性は，cmHCsの約１/６であっ３．cmESCs由来肝細胞におけるアルブミン（ALB）

た。また，cmESCs由来肝細胞における cmCYP3A4の mRNA 発現レベルは，カニクイザル初代培養肝（3A8）の酵素誘導能を解析したところ，cmCYP3A4細胞（cmHCs）の約１/80であったが， α‑フェト（3A8）の mRNA 発現および酵素活性は RIF によっ

プロテイン（AFP）はcmHCsと比べて16倍高かって有意に増強された。

た。

【考察】本研究において，Ｙ‑27632の添加に よ り 無

４．カニクイザルの肝臓における主要なCYP分子種にフィーダー分散培養条件下で，cmESCs のアノイキ

ついて，cmESCs 由来肝細胞におけるこれら CYP

No. 6, 2013435

審査学位論文要旨

分子種の mRNA 発現レベルは cmHCs と比

して

低かった。

分散培養条件下で，cmESCsのアノイキスが抑制された。また，cmESCs由来肝細胞は，cmCYP3A4（3A8）５．cmESCs由来肝細胞における cmCYP3A4（3A8）を mRNA および酵素活性レベルで発現していることのテストステロン6β‑水酸化酵素活性は，cmHCs

が明らかとなり，RIF による酵素誘導も確認された。

の約１/６であった。

以上の結果より，Ｙ‑27632存在下で分散培養法を用い６．cmESCs由来肝細胞における cmCYP3A4（3A8）て cmESCs 由来肝細胞を分化誘導する方法を確立し，の酵素誘導能を解析したところ，cmCYP3A4（3A8）の

薬物代謝研究における肝細胞の安定的な供給源となりmRNA発現および酵素活性はリファンピシン（RIF）

得る可能性があると考えられた。

によって有意に増強された。

主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値

本研究により，Ｙ‑27632の添加によって無フィーダーがあるものと認めた。

ROS‑generating oxidases Nox1 and Nox4 contribute to oncogenic Ras‑induced premature senescence（Nox1および Nox4から産生された活性酸素は Ras 癌遺伝子が誘導するセネセンスに寄与する）
児

玉（論文の内容の要旨）

亮
ゼ活性，細胞増殖停止，p53や p16といった癌抑【背景と目的】齧歯類やヒトの線維芽細胞において癌

制蛋白の増加といった，RasV12によるセネセンスに遺伝子が活性化するとセネセンス，すなわち非可逆的関連した現象は減少した。このことは，Nox が産生

な細胞増殖停止状態となる。最近の研究において Ras

した活性酸素が p53経路や p16

癌遺伝子が誘導する活性酸素はセネセンスを引き起こことでセネセンスのシグナルを伝達していることを示

すことが示唆された。しかしながら，この活性酸素が唆する。さらに，Nox1や Nox4の siRNAは Rasによ媒介するセネセンスを制御する分子メカニズムに関しる DNA損傷反応と p38MAPKの活性化を抑制し，まては十分わかっていない。そこで活性酸素によるセネ

た Nox1や Nox4の過剰発現だけでセネセンスが誘導

センス誘導のメカニズムを解明することを目的とし，された。Ras が誘導するセネセンスにおいて Nox1が

特に NADPH オキシダーゼ（以下，Nox）より産生関与していることは Nox1欠損マウス由来の胎児線維される活性酸素に焦点をあてて研究を行った。

芽細胞においても確認された。これらの所見は Nox1

【方法】培養細胞にレトロウイルス感染を用いて Ras

や Nox4が産 生 す る 活 性 酸 素 が，DNA 損 傷 反 応 や癌遺伝子を導入し，cell growth 解析，セネセンス関

p38M APK シグナル経路を含め，Ras が誘導するセ連 βガラクトシダーゼ活性試験，各種癌抑制蛋白に対す

ネセンスにおいて重要な役割を果たしていることを示

る抗体を用いた Western blot 解析，および Luminol

唆する。

試験を行い，セネセンスと活性酸素の関連を検討し経路を活性化する（論文審査の結果の要旨）た。また，Noxの役割を確認するために Noxに対す

Ras 癌遺伝子が誘導する活性酸素はセネセンスを引る Chemical inhibiter，Nox siRNAによる Nox発現

き起こすことが示唆されているが，活性酸素の由来との抑制，Nox遺伝子導入，Noxノックアウトマウス由セネセンス誘導のメカニズムに関しては不明である。

来のMEFを用いた実験を行った。さらに，Noxの下

そこで児玉らは，セネセンスの現象がみられる培養細流のシグナル伝達を解明するために p38MAPK のリ

胞株３株を用いて，レトロウイルスベクターを用いてン酸化やヒストンのリン酸化を Western blot 解析でRas 癌遺伝子を導入しセネセンスを誘導し，セネセン

検討した。

スと活性酸素，および Nox の関連を検討した。

【結果と考察】Ras 癌遺伝子により M EK/ERK 経路

その結果，児玉らは以下の結果を得た。

を通して活性酸素産生酵素，すなわちラット REF52

１．H‑RasV12を導入した細胞を，Nox 阻害剤であ細胞においては Nox1，ヒト肺 TIG‑3細胞においてる DPI や抗酸化剤である Apocynin で処理するこは Nox4の発現が亢進する結果，細胞内の活性酸素レとにより，SA‑βgal 陽性細胞数は減少した。

ベルが上昇することを示した。siRNA により Nox1

２．REF52細胞では Nox1と Nox4が発現しているが，や Nox4の発現を抑制したところ， βガラクトシダー

H‑RasV12を transfection することで Nox1は発現436

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨が増加した。一方，TIG‑3細胞では Nox4が発現し７．Nox1やNox4をレトロウイルス感染によりREF52ており，H‑RasV12により Nox4の発現が増加した。

と TIG‑3で過剰発現させたところ，細胞内の活性このとき M EK 阻害剤を処理することで，Ras によ

酸素は増加し，p38MAPKを活性化され，p19やp16とり誘導される Nox が減弱したことから Ras によりいった腫瘍抑制 pathwayを介して Seneacence が

M EK/ERK pathwayを介して Nox が発現してい誘導された。

ることを示した。

８．Nox1ノックアウトマウス由来のMEFにH‑RasV12

３．Noxに対する siRNAを H ‑RasV12が発現した細を発現させたところ，活性酸素の産生は減少し，セ胞にtransfectionしたところ，セネセンスの誘導がネセンスの誘導は野生型マウス由来の MEF に比べ抑制された。

減少した。

４．H‑RasV12を発現した細胞において活性酸素の増加

これらの結果より，Ras癌遺伝子はMEK/ERK path-を認めた。一方，Nox阻害剤であるDPIやApocynin，wayを介してNox1やNox4の発現を増加させ，Nox1

Nox に対する siRNA により，ROS 産生は有意にや Nox4による ROS産生が増加した結果 DNAダメー

減少した。

ジやp38MAPKの活性化を引き起こし，p19‑p53‑p21

５．H ‑RasV12を発現した細胞において DNA損傷

pathwayと p16pathwayの両方が活性化され，Sene-を示唆する γ‑H2A.X が増加した。一方，Nox のscence のシグナルを送っている，というモデルが想siRNA により H2A.X のリン酸化は抑制された。

定された。本研究は，癌遺伝子によるセネセンス誘導

６．H ‑RasV12を発現した細胞において p38MAPKの分子メカニズムの解明に寄与した。よって，主査，のリン酸化は増加した。一方，Noxの siRNAによ

副査は一致して本論文を学位論文として価値があるもり p38MAPK のリン酸化は抑制された。

のとして認めた。

G protein‑coupled estrogen receptor agonist improves cerebral microvascular function after hypoxia/
reoxygenation injuryin maleand femalerats（雌雄ラットにおいてＧ蛋白共役型エストロゲン受容体作動薬は低酸素・再酸素化障害後の脳微小血管機能を改善させる）
村

田

貴

弘

（論文の内容の要旨）

用し，各種阻害薬，GPER 拮抗薬Ｇ15及び血管内皮【背景と目的】脳血管障害は性差があり，成人女性に障害血管を用いて，その作用機序を調査した。また虚おいては閉塞性脳血管障害の危険性及びその重症度は血・再灌流障害における血管機能障害を調べるために，低いものの，閉経後に急速に増加する。これはエスト細動脈を１時間の低酸素環境下（pO ＜２％）におき，ロゲンの神経及び脳血管保護作用よるものと考えられ

その後再酸素化（pO ＝21％）して低酸素・再酸素化ている。近年，特異的なＧ蛋白共役型エストロゲン受

障害血管を作成した。低酸素・再酸素化障害血管に容体（GPER）が同定され，この受容体を介したエス

GPER 作動薬Ｇ‑1または活性酸素捕捉剤 MnTBAP

トロゲンの様々な調節作用が示唆されている。しかしを１時間投与し，血管内皮依存性のカリウムチャンネ

脳細動脈における GPER を介したエストロゲンの血ルを介した血管拡張を引き起こすアデノシン三リン酸

管反応やその機序は不詳である。また，GPER を介（ATP）の血管拡張作用が改善するかどうかを調べた。

した虚血・再灌流障害後の血管保護作用も明らかでな【結果と考察】GPER 作動薬Ｇ‑1は雌雄ラット細動脈い。よって本論文では，GPER 作動薬による血管運に有意の血管拡張を起こした。その血管拡張作用は動作用及びその作用機序，そして低酸素・再酸素化障

血管内皮一酸化窒素合成酵素（eNOS）阻害薬と空気

害後の細動脈機能の改善作用について調査した。

塞栓による内皮障害のみが部分的に有意に抑制した。

【方法】雌雄 SDラット（14‑20週齢，240‑450g）の中またこれらの血管拡張抑制は雌ラットの細動脈で雄大脳動脈より分枝し脳内を穿通する細動脈（レンズ核よりも有意に強く，性差を認めた。正常血管において線条体動脈）を摘出し，ガラス製のマイクロピペット

GPER 拮抗薬Ｇ15はＧ‑1による拡張作用を有意に抑を内腔に直接カニュレーションし，内圧負荷下で血管制したが，内皮障害血管では抑制されなかった。以上

内径を顕微鏡下で測定した。GPER 作動薬Ｇ‑1を使の結果は，エストロゲンが GPER を介して脳内細動No. 6, 2013437

審査学位論文要旨

脈の血管拡張を起こすことを意味している。その作用機序は，古典的なエストロゲンレセプター α及び βが意の血管拡張を起こす。
２．その拡張作用は血管内皮一酸化窒素（NO）産生

eNOS 経路や内皮由来過分極因子，アラキドン酸カ経路に部分的に依存していた。

スケードなどの関与を認めているのに対し，GPER

３．血管内皮一酸化窒素合成酵素阻害薬と空気塞栓には血管内皮において eNOS 経路のみの関与と考えらよる内皮障害はＧ‑1の血管拡張を部分的に抑制するれた。また eNOS 阻害・内皮障害では部分的な抑制が，その抑制は雌ラットの細動脈で雄よりも有意にであることから，脳内細動脈血管平滑筋への直接的な強く，性差を認めた。

血管弛緩作用があると考えられ，その機序は平滑筋細４．その拡張作用にアラキドン酸代謝経路や血管内皮

胞内カルシウム貯蔵庫からのカルシウム放出抑制，過分極因子は関与していない。

protein kinase C 抑制や extracellular signal‑regu-

５．GPER 作動薬Ｇ‑1は脳細動脈の血管平滑筋にもlated kinase １/２抑制など幾つかの経路が推測された。

直接的に作用し血管拡張または弛緩を引き起こす。

一方，低酸素・再酸素化障害後の雌ラットの細動脈は６．この血管平滑筋における拡張作用にprotein kinase

雄より血管緊張を強く来し，性差を認めた。雌雄ラッA，protein kinase Ｇやカリウムチャンネルは関与

トの低酸素・再酸素化障害血管において ATP によるしていない。

血管拡張作用は，normoxia（正常酸素 pO ＝21％環

７．低酸素・再酸素化障害後の雌ラットの細動脈は雄境下）による対照群と比 して有意に抑制されていた。

より血管緊張を強く来し，性差を認めた。

血管拡張を引き起こさない閾値以下の低濃度Ｇ‑1また８．雌雄ラットの低酸素・再酸素化障害血管においては低濃度 MnTBAP を１時間投与したところ，両者

アデノシン三リン酸（ATP）による血管拡張作用

とも，低酸素・再酸素化障害血管の ATP による拡張（血管内皮依存性のカリウムチャンネルに依存）は，作用を著明に回復させた。以上の結果は，GPER 作

normoxia（正常酸素pO ＝21％環境下）による対照

動薬Ｇ‑1の活性酸素捕捉作用を強く示唆していた。

群と比 して有意に抑制されていた。

（論文審査の結果の要旨）

９．血管拡張を引き起こさない閾値以下の低濃度Ｇ‑1

エストロゲンには閉塞性脳血管障害時の神経及び脳または低濃度の活性酸素捕捉剤 M nTBAP を１時

血管保護作用があると考えられている。近年，特異的間投与したところ，両者とも，低酸素・再酸素化障

なＧ蛋白共役型エストロゲン受容体（GPER）が同定

害血管の ATP による拡張作用を著明に回復させた。

され，この受容体を介したエストロゲンの様々な調節

以上より，GPER 作動薬は脳細動脈において，血作用が示唆されているが，脳血管における血管調節作

管内皮 NO 依存及び血管平滑筋に依存した血管拡張用やその機序は不詳である。また，GPER を介した作用があり，並びに低酸素・再酸素化障害後の血管内

虚血・再灌流障害後の血管保護作用も明らかでない。

皮機能を改善させており，活性酸素捕捉作用があるとそこで村田は⑴ GPER 作動薬Ｇ‑1による脳細動脈の考えられた。GPER はエストロゲンによる虚血・再血管運動作用及びその作用機序，⑵ GPER 作動薬Ｇ‑

灌流障害時の脳血管保護作用において重要な役割を果

1による低酸素・再酸素化障害後の脳細動脈機能の改たしていると推測され，その作動薬はヒトにおける閉

善作用，について調査した。

塞性脳血管障害時の治療薬の候補となる可能性がある。

その研究により以下の結果を得た。

従って主査，副査は一致して本論文を学位論文とし１．GPER 作動薬Ｇ‑1は雌雄ラットの脳細動脈に有て価値があるものと認めた。

A phaseII trial oferlotinib in patients with EGFR wild‑typeadvanced non‑small‑celllung cancer（野生型 EGFR 遺伝子をもつ進行非小細胞肺癌患者におけるエルロチニブ治療の第 相試験）
小

林

孝

至

（論文の内容の要旨）に対して高い腫瘍縮小効果を示すが，EGFR 変異を【背景と目的】エルロチニブは上皮成長因子受容体持たない（野生型）場合にはその奏効率は低いとされ（EGFR）チロシンキナーゼを阻害する分子標的治療

る。EGFR 遺伝子野生型の非小細胞肺癌には，プラ薬であり，EGFR 遺伝子変異を有する非小細胞肺癌

チナ系抗癌剤を含む二剤併用化学療法が初回の標準治438

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨療とされるが，種々の殺細胞性抗腫瘍薬に耐性となっ

PFS，OS は，過去の２次治療以降における殺細胞性た場合の治療法は確立しておらず，日常診療でも難渋

抗腫瘍薬を用いた大規模試験の結果に匹敵するものでする。エルロチニブは内服薬で忍容性が高いことから，あり，登録された症例の多くが既に多剤の殺細胞性抗実地診療において EGFR 野生型の非小細胞肺癌患者

腫瘍薬による化学療法を施行されていたことを考慮すに対しても同意の上で治療を試みられることはある。

ると，エルロチニブ投与は有用な治療法であると考え

しかし，野生型 EGFR 遺伝子患者に対するエルロチ

られた。また，ILD を２例に認めたが，致死的な有ニブの治療効果を前向きに検討した臨床研究の報告は

害事象はなく制御可能であり，忍容性にも優れているない。今回われわれは，野生型 EGFR 遺伝子を有し，と考えられた。

殺細胞性抗腫瘍薬が非適応または種々の殺細胞性抗腫【結語】以上の結果より，野生型 EGFR 遺伝子の非小瘍薬に治療耐性となった非小細胞肺癌に対する，エル細胞肺癌であっても，殺細胞性抗腫瘍薬が無効となっロチニブの有効性および忍容性について検討する前向た症例においては，エルロチニブは有用な治療選択肢き研究を行った。

の一つになると考えられた。

【対象と方法】対象はEGFR遺伝子野生型の病期Stage
，の進行性および術後再発の非小細胞肺癌患者で，（論文審査の結果の要旨）
エルロチニブは上皮成長因子受容体（EGFR）チエルロチニブ150mg/日の内服による治療が，病勢増悪

ロシンキナーゼを阻害する分子標的治療薬であり，（PD）または許容できない有害事象が生じるまで施行

EGFR 遺伝子変異を有する非小細胞肺癌に対して高された。主要評価項目は病勢コントロール率（DCR）

い腫瘍縮小効果を示すが，野生型の場合には奏効率がであり，副次的評価項目は奏効率（RR），有害事象，

低いと報告されている。しかし，野生型 EGFR 非小

無増悪生存期間（PFS），生存期間（OS）である。

細胞肺癌に対する３次治療以降の標準治療は確立して【結果】2008年１月から2011年６月までの間に，当院おらず，日常診療において治療薬剤の選択に難渋する

および長野県内の関連病院において31症例が登録されことが多い。今回，野生型 EGFR 遺伝子を有し，殺た。年齢中央値は71歳（31‑89歳）であり，組織型では細胞性抗腫瘍薬が非適応または種々の殺細胞性抗腫瘍

21例が腺癌，９例が扁平上皮癌，１例が大細胞癌であっ薬に治療耐性となった非小細胞肺癌患者を対象として，た。Eastern CooperativeOncologyGroup（ECOG）のエルロチニブによる治療の有効性と忍容性に関して前

performance status は０が10例，１が９例，２が８方視的に検討した。主要評価項目を病勢コントロール

例，３が４例であった。２例で高齢のため初回治療と率（DCR），副次的評価項目を奏効率（RR），有害事

してエルロチニブが用いられたが，他の症例は殺細胞

象，無増悪生存期間（PFS），全生存期間（OS）とし，性抗腫瘍薬による治療歴を有しており，４次治療以降

エルロチニブ150mg/日の内服による治療を施行した。

となる症例が９例（29.0％）存在した。エルロチニ

その結果，以下の成績を得た。

ブの投与期間中央値は70日（10‑463日）であった。有１．31症例が登録され，年齢中央値は71歳（31‑89歳），

害事象として皮疹が80.6％，下痢が38.7％に認められ組織型では腺癌が21例，扁平上皮癌が９例，大細胞た。２例（6.5％）で間質性肺疾患（ILD）を発症した癌が１例であった。２例が初期治療でエルロチニブ

が，いずれもエルロチニブ投与の中止と副腎皮質ステを用いられ，29例は殺細胞性抗腫瘍薬による治療歴

ロイドによって回復し，治療関連死を認めなかった。

を有していた。

抗腫瘍効果は，評価前に投与が早期中止となった２例
を除く，29症例において検討された。１例において完

２．エルロチニブの投与期間中央値は70日（10‑463日）であった。

全奏効（CR）が得られ，４例が部分奏効（PR），安

３．有害事象として，皮疹が80.6％，下痢が38.7％

定（SD）は８例で，RR と DCR はそれぞれ17.2％，に認められた。２例（6.5％）で間質性肺疾患を発

44.8％であった。PFS 中央値は2.1カ月，OS 中央値症したが，いずれも適切な治療で回復し，治療関連は7.7カ月，１年生存率は44.2％であった。SD 以上

死を認めなかった。

の病勢コントロールが得られた症例では，PD 群に比して，有意な PFS および OS の延長（それぞれ4.0カ
月，20.4カ月）が認められた。
【考察】今回の前向き研究において示された DCR や
No. 6, 2013

４．RRは17.2％，DCRは44.8％，PFS中央値は2.1
カ月，OS 中央値は7.7カ月であった。
５．病勢コントロールが得ら れ た 症 例 群 に お け る
PFS は4.0カ月，OS は20.4カ月であった。
439

審査学位論文要旨

今回の前向き試験は，登録された症例の多くが既に遺伝子の非小細胞肺癌に対しても，いくつかの殺細胞

多剤の殺細胞性抗腫瘍薬による化学療法を施行されて性抗腫瘍薬が無効となった症例においては考慮されうおり，Phase

る治療法の１つであることを示唆する重要な研究と考ではあるものの，過去の２次治療以降における大規模試験の結果に匹敵するものであった。

えられる。

有害事象に関しては，致死的なものはなく概ね制御可能であり，忍容性にも優れていると考えられた。本論

したがって主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

文は，エルロチニブによる化学療法が野生型 EGFR

Cultured epithelial grafting using human amniotic membrane:The potential for using human amniotic
epithelial cells as a cultured oral epithelium sheet（羊膜を用いた培養上皮移植に関する実験的研
究：ヒト羊膜上皮細胞による上皮シート作成の可能性）
小

池（論文の内容の要旨）

剛史

作製し組織学的に比検討。⑷ 正常口腔粘膜および【背景と目的】羊膜にはさまざまな機能細胞へ分化す

hAECs 培養上皮シートの免疫組織標本＜CK10/13，

る潜在能や創傷治癒機構とともに免疫学的な特性が科，
Ki‑67，CK19，Zonula occludens protein‑1（ZO‑1）学的に証明され，細胞移植治療や角膜移植への応用な

occludin＞を作製し比 検討した。

ど再生医療の分野で研究が進められている。最近では【結果】単離した hAECs は均一な大きさの細胞であ

骨髄，臍帯血に続く第３の組織バンクとして再生医療

り，１枚の羊膜から80万から500万個の hAECs が得支援機構により「羊膜バンク」が設立された。本実験られた。hAECs は無血清・低カルシウム培地中でもはヒト羊膜上皮細胞（hAECs）を用いた培養重層上増殖を続け各継代の細胞増殖能の比 では，２継代目

皮シートの作製を試み，同種移植片として口腔への移hAECs の倍加時間が最も早く最終的に約５継代まで

植応用の可能性について検討を行った。

培養可能であった。MTT アッセイ法による hAECs【方法】本研究は信州大学医学部医倫理委員会の承認の細胞増殖曲線分析では，計測後２〜５日目に対数増のもと，提供者に十分なインフォームドコンセントを殖期が認められた。

行い各種感染症検査などで安全性が確認できた帝王切

組織学的検討では，hAECs を liquid interface 環境

開時の羊膜を使用した（n＝20）。hAECs の単離は以にて４日間培養を行った場合では，上皮の重層化は認下の操作により行った。① 羊膜を絨毛膜より剥離・められず，羊膜本来の解剖学的形態である単層上皮構

洗浄，PBS（−）/ヒアルロニダーゼ/DNase I 混合造であった。しかし air‑liquid interface 環境に培養

溶 液 に 浸 漬 し 細 切。② 羊 膜 片 を DMEM /Trypsin‑

条件を変更し３週間培養を行うことにより多孔性セル

EDTA 混合溶液中に浸漬し撹拌。③ hAECs を含んだ

ロース膜上でほぼ均一な10層以上からなる非角化重層細胞浮遊液を濾過しトリプシン非活処理後，5.0×10

上皮化が認められた。

cells/cm の細胞密度にて培養用ディッシュに播種。

免疫組織学的検討では，diﬀerentiation marker で

上記②〜③の操作を７〜８回繰り返し行い hAECs を

ある CK10/13，stem‑cell や proliferation marker で採取した。単離させた hAECs は Boyce & Ham の方

ある CK19や Ki67では，培養上皮シートの全層で陽法に準じた無血清・低カルシウム MCDB153培地にて性細胞の発現が認められた。さらに上皮のタイトジャ

培養し，以下の項目について検討した。⑴ 各継代別

ンクション（TJ）マーカーである ZO‑1および occlu-の平均細胞総数の計測（n＝10）。⑵ ２継代目 hAECs

din では，正常口腔上皮組織とほぼ同様の発現パターの細胞増殖能を M TT アッセイ法により計測（n＝ンが認められた。

４）。⑶ ２〜３ 継 代 行 っ た hAECs を M illicell cell

【考察】培養上皮シート開発に関する研究では，作

culture plate insert 内に播種し liquid interface 環

製時にウシ血清やマウス feeder layer を使用する

境にて４日間培養。その後，無血清培地のカルシウム

Rheinwal ＆ Green の方法に準じた報告が散見される濃度を上げ air‑liquid interface 環境に培養条件を変が，FDA のガイドラインではプリオンや未知ウイル

更しさらに３週間培養。それぞれのＨ‑Ｅ染色標本をスの混入の可能性があるため推奨されていない。そこ

440

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

で本研究は未知因子を除外した air‑liquid interface

更しさらに３週間培養。それぞれのＨ‑Ｅ染色標本を環境による培養法を選択した。羊膜は羊水を保持して組織学的に比いる膜であり通常空気に暴露されることはないが，培養上皮シートを免疫組織学的に比 検討。

hAECs は air‑liquid interface 環境でも細胞死するこ

その結果，小池らは次の結論を得た。

となく増殖を続け，約３週間培養を継続することによ検討。⑷ 口腔粘膜組織および hAECs

１．hAECs は無血清・低カルシウム培地中でも増殖

り重層上皮化し得ることが明らかになった。air‑liq-

を続け各継代の細胞増殖能の比

uid interface 法による培養は，表層の細胞間𨻶を減hAECs の倍加時間が最も早かった。

少させ TJ 構造，即ち上皮バリヤ機能の獲得に有利なでは，２継代目

２．MTT assayによる hAECs の細胞増殖曲線分析

方法とされているが，免疫組織学的所見において本培

では，計測後２〜５日目に対数増殖期が認められた。

養上皮シートは口腔粘膜上皮組織と類似の TJ 構造の３．組織学的検討では，hAECs を liquid interface 環

獲得が確認された。さらに本培養上皮シートは正常口境にて４日間培養を行った場合では上皮の重層化は腔粘膜上皮組織と比 し，より高い細胞活性と増殖能認められなかったが，air‑liquid interface 環境にを有していることが判明した。hAECs はクリーンな培養条件を変更し３週間培養を行うことにより10層

培養重層上皮シート開発における有望な細胞供給源と以上からなる非角化重層上皮化が認められた。

なり得ることが示唆される結果であり，hAECs を用

４．免疫組織学的検討では，CK10/13・ CK19・ Ki67

いた培養シートは，歯科医療のみならず熱傷治療など

は培養上皮シートの全層で陽性細胞の発現が認めら

幅広い分野において臨床応用できる可能性を有していれた。ZO‑1・ occludin は口腔上皮組織とほぼ同様

ると考える。

の発現パターンが認められた。

（論文審査の結果の要旨）

hAECs は air‑liquid interface 環境でも細胞死する

羊膜にはさまざまな機能細胞へ分化する潜在能や創ことなく増殖を続け，約３週間培養を継続することに傷治癒機構とともに免疫学的な特性が科学的に証明さより重層上皮化し得ることが明らかになった。air‑

れ，再生医療の分野で研究が進められている。本実験

liquid interface法による培養は，タイトジャンクショ

はヒト羊膜上皮細胞（hAECs）を用いた培養重層上ン（TJ）構造の獲得に有利な方法とされているが，皮シートの作製を試み，同種移植片として口腔への移本培養上皮シートは口腔粘膜上皮組織と類似の TJ 構

植応用の可能性について検討を行った。

造の獲得が確認された。さらに本培養上皮シートは口単離させた hAECsは無血清・低カルシウム MCDB

腔粘膜上皮組織と比 し，より高い細胞活性と増殖能

153培地にて培養し，以下の項目について検討した。

を有していた。hAECs は培養重層上皮開発における⑴ 各継代別の平均細胞総数の計測。⑵ ２継代目hAECs

有望な細胞供給源となり得ることが示唆される結果での細胞増殖能を M TT assayにより計測。⑶ ２〜３あった。よって主査，副査は一致して本論文を学位論継代行った hAECs を liquid interface 環境にて４日

文として価値があるものと認めた。

間培養後，air‑liquid interface 環境に培養条件を変New visual rating system for medial temporal lobe atrophy: a simple diagnostic tool for routine
examinations（内側側頭葉萎縮の新たな肉眼的評価方法：日常臨床における簡便な診断手法）
金

子

智

喜

（論文の内容の要旨）

連続158名を対象とした。DSM ‑ を診断基準として，【目的】STIR（short TI inversion recovery）法で撮

アルツハイマー病と確定診断された55名，認知機能が像された M RI（M R 画像）を利用した，内側側頭葉

正常である患者55名を抽出した。その後，M MSE が萎縮の簡便な肉眼的評価システムについて，有用性を施行されていない，およびSTIR法による撮像が行わ評価する。

れていない症例を除外し，アルツハイマー病患者34名，【方法】

認知機能に異常がない19名を対象とした。

対象：2005年５月から2007年６月までに，信州大学医

M RI：0.3Ｔ，0.4Ｔおよび1.5Ｔ磁場強度の撮像装置

学部附属病院精神科を受診し頭部 MRI を撮像されたを利用し，機器の選択はランダムに行われた。撮像シー

No. 6, 2013441

審査学位論文要旨

ケンスは STIR 法を用い，スライス厚は4.0mm とし利用し難い。肉眼的な評価法として，Scheltens らがた。海馬に直行する冠状断を撮像し，評価用画像とし1992年に報告した手法が広く利用されている。しかし，た。

評価者間，評価者内の判定にぶれが生じやすいという

評価者：２名の放射線科医師が，患者情報を与えられ問題点があった。そこで，金子は MRI の撮像方法とない状況下で別個に評価を行い，そのうち１名は２カ

評価画像の選別，および評価方法を明確化した新たな月後に再評価した。

肉眼的評価方法を考案し，⑴ 評価の一致率，⑵ アル

肉眼的評価方法：海馬とその周囲の脳脊髄液腔の形状

ツハイマー病と診断された患者と認知機能に異常がなを比い患者における評価点数の有意差，⑶ 本法による内することで内側側頭葉の萎縮の程度を評価した。

なお，本法における海馬とは，海馬台の上部に位置す
る灰白質構造（アンモン角，歯状回を含む）とした。
海馬周囲の脳脊髄液腔を，海馬の外側，上部，内側の３部位に分け，それぞれ海馬と比し以下に示す０‑

側側頭葉萎縮の診断能，について検討した。
その結果以下の成績を得た。
１．評価者間の κ統計量は右：左：両側＝0.65：0.52：0.68でありmoderate‑good，評価者内では右：左：３の４段階で評価した。

両 側＝0.83：0.76：0.79で あ り good‑excellent で０点：脳脊髄液腔はスリット状，あるいは点状。

あった。

１点：脳脊髄液腔は海馬より小さい。

２．アルツハイマー病患者の評価点数は，右側5.21±

２点：脳脊髄液腔は海馬とほぼ同じ形状を呈する。

1.96，左 側4.88±1.61，両 側 合 計10.09±3.35，認

３点：脳脊髄液腔は海馬と比 し明らかに広い。

知機能に問題がない群は，右側3.26±1.15，左側【結果】評価者間の評価点数の一致率は fairから good，

3.00±1.05，両側合計6.26±1.97でであった。いず評価者内一致率は good から excellent であった。

れも p＜0.001でアルツハイマー病患者において，

アルツハイマー病患者の評価点数は，右側5.21±
1.96，左側4.88±1.61，両側合計10.09±3.35，コ ン

有意に得点が高かった。
３．ROC 解析では，右側，左側ともにカットオフ値

トロール群は，右側3.26±1.15，左側3.00±1.05，両を４点とした場合，右側：感度85.3％/特異度72.7％，

側合計6.26±1.97でであった。両側合計のカットオフ

AUC 0.833，左 側：感 度 76.5％/特 異 度 94.7％，

値を７点とした場合，ROC 解析では感度88.2％/特AUC 0.868。両側合計のカットオフ値を７点とした

異度78.9％，AUC 0.883であった。

場 合，感 度88.2％/特 異 度78.9％，AUC 0.883で【結論】本法は，日常臨床検査において内側側頭葉のあった。両側を評価基準とした場合に最も高い感度

萎縮を簡便に肉眼的に評価するシステムとして，有用を得ることが出来た。

である。

以上の結果より，金子が考案した内側側頭葉の萎縮（論文審査の結果の要旨）を肉眼的に評価する方法は，評価画像と評価方法の基

アルツハイマー病患者では，嗅内野を主体として内準を明確化したことで，既存の評価方法と比 して評側側頭葉に萎縮が生じることが特徴とされる。MRI

価の一致率は高く，既存の評価方法と比 して同程度は組織コントラストが高い上に，任意方向の断面像を以上の診断能を得ることが可能となった。簡便である撮像出来るため，内側側頭葉の形態的な評価に広くことから臨床的にも利便性の高い評価方法であり，今用いられている。形態的な評価方法として，Voxel‑

後認知症に対する簡便な画像検査法の一つとして臨床

based morphometry（VBM ）法，Region of interest

応用される可能性がある。したがって，主査，副査は（ROI）法および肉眼的評価方法がある。VBM 法，

一致して本論文を学位論文として価値があるものと認

ROI 法は客観性の高い評価手法であるが，撮像時間めた。

が長く画像処理にも時間がかかるため，日常臨床には442

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

Postoperative suppression of inﬂammatory cytokines after distal gastrectomy in elderly patients（高齢者における幽門側胃切除後の炎症性サイトカイン産生抑制について）
岸

本（論文の内容の要旨）

恭に差はなかった。

【背景と目的】近年，平均寿命が延長するとともに，【考察】炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカイン

高齢者に対する手術件数が増加し若年者と同じようにのバランスが保たれていれば生体は恒常性を維持でき癌の手術が安全に行われる一方，高齢者においては術るが，もしこのバランスが崩れれば恒常性を維持でき

後合併症や死亡率が高いことが指摘されている。サイなくなる。炎症性サイトカインが優位な状態を SIRS

トカインは外科的侵襲に対する生体反応において重要（systemic inﬂammatory response syndrome），抗炎

な位置を占めているが，高齢者における外科的侵襲に症性サイトカインが優位な状態を CARS（compensa-

対するサイトカインの反応はいまだ明らかにされていtory anti‑inﬂammatory response syndrome）と呼び，ない。本研究では，幽門側胃切除後のサイトカイン動

SIRS はショック，多臓器不全を引き起こし，CARS

態を調べることにより，高齢者と若年者の外科的侵襲

は免疫抑制状態になり感染のリスクをあげる。本研究に対する生体反応を比 検討した。

で，高齢者における幽門側胃切除後にサイトカインの【患者と方法】1999年から2000年の間に147人の胃癌動態を検討した結果，高齢者で炎症性サイトカインが患者が幽門側胃切除術を受けたが，そのうち糖尿病や低値を示す一方で，抗炎症性サイトカインに関しては腎不全，心不全といった全身に影響を与えるような既差が認められず，単球の活性が抑制されていたことか往歴のある患者や，癌が進行した患者（Stage３，４）

ら，高齢者においてはより CARS になりやすい傾向を除外した21人を対象とした。この21人を年齢で２つがあることが明らかとなり，術後感染症や敗血症といっのグループに分け，75歳以上の10人を高齢者群とし，た合併症の一因となっている可能性が示唆された。

65歳以下の11人を若年者群とした。両群間で，性別，（論文審査の結果の要旨）

Performance status，手術時間，麻酔時間，出血量といった患者背景に差は認められなかった。

高齢者に対する外科的治療が増加している一方，一般的に高齢者では若年者と比 して術後合併症の頻度

血液サンプルは術前，第１，３，７病日に採取し，や死亡率が高いと言われている。サイトカインは外科

そのサンプルを２つに分け，１つは血清中の炎症性サ的侵襲に対する生体反応において重要な位置を占めてイトカインである IL‑6，IL‑8と，抗炎症性サイトカ

いるが，高齢者における外科的侵襲に対するサイトカインである IL‑10，soluble TNF receptors（sTNF‑

イン反応の研究はなされていない。本研究では幽門側

R）p55/75，IL‑1 receptor antagonist（IL‑1ra）を胃切除後のサイトカイン反応を調べることにより，高測定した。もう１つのサンプルは単球の活性を調べる

齢者と若年者の間にその反応性に違いがあるかどうかために，全血を E. Coli lipopolysaccharide（LPS）

を比 検討した。

で24時間，37度で刺激した後，TNF‑αと IL‑1βを

1999年から2000年の間に幽門側胃切除術を受けた患測定した。

者147人のうち，糖尿病や腎不全など全身に影響を与【結果】炎症性サイトカインである IL‑6濃度は両群とえるような合併症や，癌が進行してその影響が出る懸も第1病日がピークであり，その後第７病日にかけて念がある患者（Stage３，４）を除外し，最終的に21減少した。IL‑6は両群間に有意差を認め，第１病日名を対象とした。これら21人を年齢で２グループに分において高齢者群が若年者群と比 し有意に低値を示

け，75歳以上の10名を高齢者群，65歳以下11名を若年した。IL‑8に関しては差を認めなかった。抗炎症性者群とした。術前，第１，３，７病日に血液サンプル

サイトカインの IL‑10，sTNF‑Rp75/55，IL‑1ra にを採取し，炎症性サイトカインである IL‑6，IL‑8，は有意差を認めなかった。LPS 刺激後の前炎症性サ

抗炎症性サイトカインである IL‑10，sTNF‑R，IL‑1

イトカインに関しては TNF‑αが，第１病日においra の血中濃度を計測した。また E.coli lipopolysac-て高齢者で低値を示したが，IL‑1βは有意差を認めcharide（LPS）を用いて24時間の incubation を行っなかった。術後の白血球数と CRP に関しては両群間たのち，前炎症性サイトカインである TNF‑α，IL‑1

No. 6, 2013443

審査学位論文要旨

βを測定，単球の新たな刺激に対する反応性がどのよ

インに関しては差が認められず，さらに単球の活性もうに変化するかを検討し，以下の結果を得た。

抑制されていることが明らかとなった。一般的に，炎１．炎症性サイトカインでは IL‑6が高齢者群では若症性サイトカインが優位な状態を SIRS（systemic

年者群と比 し，第１病日において有意に低値を示，抗炎症性サイト
inﬂammatory response syndrome）

した。IL‑8に関しては有意差を認めなかった。

カインが優位な状態を CARS（compensatory anti‑

２．抗炎症性サイトカインに関してはすべてにおいて

inﬂammatory response syndrome）と呼ぶが，今回有意差を認めなかった。

の結果は高齢者においてはより CARS になりやすい

３．前炎症性サイトカインに関しては TNF‑αで第傾向があることが示され，術後感染症や敗血症といっ

１病日において高齢者群で有意に低値を示した。

た合併症の頻度が高い一因となっている可能性が示唆

IL‑1βに関しては TNF‑αと同様の傾向を示した

された。

ものの，有意差は認められなかった。
本研究から，高齢者においては術後早期に，炎症性以上のことから，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

サイトカインが低値を示す一方で，抗炎症性サイトカ

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信州医誌 Vol. 61