JAPANESE ASSOCIATION FOR LACTOFERRIN

Lactoferrin NEWS日本ラクトフェリン学会ニュースレター�第17号

2016年6月

巻頭言

第7回学術集会の開催にあたって
⽟置 幸道

Yukimichi TAMAKI

朝日大学歯学部教授

1．�巻頭言(第7回学術集会大会長)

第7回学術集会の開催にあたって��
玉置�幸道

2. 学会賞受賞研究紹介
ウシラクトフェリンを周産期の乳牛

わたしとラクトフェリンとの出会いはいまから10年ほど前に遡りますが、当時の非常勤講師の先生からラクトフェリンって知っているか？と尋ねられたことがキッカケでありました。よく調べてみたところ医療系でも腫瘍、肝炎やエイズ等で高い評に給与すると生産性が向上する価を得ていることを知り、歯科医療でも何か役に立つのではとの観点から、徐々�平子�誠に関わりを強めるようになりました。ラクトフェリンについては（株）NRLファーマの故・安藤邦雄博士からいろいろなことを教えていただき、歯科の中でも重度歯周

3． テクニカルノート
�3Dプリンターによるウシラクトフェ
リンN-ローブとC-ローブモデルの作製(その2）����島崎敬一・相沢智康

病に代表される難治慢性疾患や各種炎症への適用、ドライマウスや口臭の改善など幅広く試みてきました。
今までに4回ほど「臨床ラクトフェリンシンポジウム」と称した講演会を開催し、専門に研究をしておられる先生方からラクトフェリンの生体との関わりを解説していただくとともに、臨床の症例に向けての活用方法や効果などを紹介してきました。シンポジウム開催を通して多くの先生方と知り合うことができ、今回このような合同開催という場を設けていただける運びとなりました。合同大会ですので特別講演にはシンガポールの歯科医Dr.Reginaldに講演を依頼し、またシンポジウ
ムでは医療系の大きなテーマでもある超高齢化社会を題材にして、老齢による生理的レスポンスの低下に対するラクトフェリンへの期待で討論をしていきたいと考えています。
最後になりましたが、第7回学術大会に向けては臨床ラクトフェリンシンポジウ
ムのメンバー一同とともに、精一杯の準備を致す所存でございます。どうか盛会となるように多くのご協力を賜りますよう、よろしくお願い申し上げます。

http://lactoferrin.jp/"1

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2016年6⽉

ウシラクトフェリンを周産期の乳⽜に給与すると⽣産性が向上する
平子�誠
Makoto HIRAKO

農業・食品産業技術総合研究機構
畜産研究部門�家畜育種繁殖研究領域

高泌乳牛にはその能力に見合う栄養価の高い飼料（濃厚飼料）を給与する必要がある。しかし、濃厚飼料を多給すると、急速な発酵によって発生した有機酸でルーメン1）液が酸性化し、ルーメンフローラを構成する細菌が死滅して多量のリポポリサッカライド（LPS）が発生するため、潜在性ルーメンアシドーシス2）のリスクが高くなる。そこで、LPS吸着能と抗菌作用を有するラクトフェリンに着目し、飼料添加による泌乳および繁殖性改善効果を検証した。その結果、ルーメン菌叢が安定化して微生物態タンパク質(MCP)3）合成量が増加した。ルーメン液pHの変動が小さくなり、LPS活性値の上昇も抑えられた。また、血液中のLPS結合タンパク質と炎症性サイトカイン濃度の上昇も抑制され、泌乳成績と繁殖成績の両方が向上した。これらのことから、ラクトフェリンの給与は乳牛の生産性向上に寄与することが実証された。

乳牛はアスリートに例えられるほど、その栄養管理にのことから、1回あたりの給与量は50gを超えないように細心の注意が必要である。特に、維持から生産に向けてすべきであると考えられた。

餌が切り替わる周産期の管理が重要で、牧草よりエネ

2. 通常飼養下でのLF50g給与

ルギー価の高い穀類を多く含む飼料（濃厚飼料）の給与

通常飼養のホルスタイン種経産牛を対照区12頭、LF量が少ないと栄養不足になり、多すぎるとルーメン発酵区12頭の2群に分け、LF区には櫛引ら（2008）が子牛に異常をきたし、どちらも周産期疾病の原因となる。そこで行った先行試験で得られた有効量（日量3g）を参考に、で、濃厚飼料多給期のルーメン環境改善と疾病予防を子牛との体重比と予備試験の結果を考慮して分娩後毎目的に、周産期の乳牛にウシラクトフェリン（LF）を給与朝50gのLFを4週間給与した。その結果、期待に反してする飼養試験を行った。

ルーメン液中のリポポリサッカライド（LPS）活性値が対1. In vitroでの予備試験照区より高くなる個体が認められた。血液中のTNFα濃乳牛へのLFの給与量を決めるため、in vitroで予備試度の上昇は抑えられていたことから、日量50gのLF給与験を行った。ルーメン液に0.01〜5g/LのLFを添加してでは、免疫賦活効果は覗われるものの、一部の牛には培養したところ、5g/Lで繊維分解菌の増殖が大幅に抑用量が多すぎてルーメン菌叢に悪影響があったものと考制された。ルーメン液の総量はおよそ50L程度なので、えられた。一方、本飼養試験と並行して高橋ら（2011）250g給与するとルーメン内の繊維消化率が低下するとが行ったウシ子宮内膜上皮細胞培養系におけるLFの添考えられた。また、ルーメン液を長時間培養すると、1g/加効果を調べる実験において、0.1g/LのLFが1㎎/LのL（給与量として50g相当）以下では菌叢構造が無添加

LPSによるプロスタグランジン産生刺激を抑制することと変わらなかったのに対し、5g/Lでは大きく変化し適切が明らかになった。そこで、次の飼養試験はLFの給与をなルーメン発酵が行われない可能性が示された。これら

日量10gに低減して実施することにした。

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2016年6⽉

38%区
30%区
LF区

図1�分娩後各週次におけるルーメン液中LPS活性値
� エラーバーはSEM��a,b: 同時期の異文字間に有意差（P<0.01）

3. 濃厚飼料多給下でのLF10g給与され、LFの給与によりこれらの悪影響が緩和される可能性が示された。

ホルスタイン種経産牛32頭を供試し、分娩後飼料中4. 分娩前からのLF10g給与の中性デタージェント繊維（NDF）4）の水準を38％（粗飼料多給）に設定した38％区（12頭）、30%（濃厚飼料多ホルスタイン種経産牛を対照区とLF区の2群（各12給）に設定した30％区（10頭）および30％区と同様の飼頭）に分け、分娩前は濃厚飼料の給与量を徐々に増やす

料にLF10gを含む補助飼料を添加したLF区（10頭）のリードフィーディングを行い、分娩後はやや濃厚飼料多給3群に分け、飼養試験を行った。乾物摂取量に差はなかっ状態となるNDF33%の飼料を給与した。LF区のみ分娩たが、分娩後の体重減少は38％区が大きく、体重の回前3週から分娩後12週まで飼料にLF10gを添加した。

復も遅かった。乳量は38％区が少なく、LF区、30％区

乾物摂取量と体重に差はなかったが、LF区では分娩前の順に多くなった。乳成分では38％区の乳脂率が30％後の餌が切り替わる時期のルーメンにおける菌叢構成と区に比べて高く、LF区は両者の中間であった。ルーメン

pHの変動が小さく、泌乳早期の微生物態タンパク質

液中LPS活性値は、30％区が38％区に比べて高く、LF（MCP）合成量が多かった（図2）。また、血液中のLPS結区は30％区よりやや低値で推移した（図1）。血液中の合タンパク質濃度の上昇が対照区より緩やかで、そのTNFαおよびIFNγ濃度は30％区がLF区および38％区後も低値で推移した。乳量は対照区と比べて有意に多く、より高値で推移した。繁殖成績はいずれも有意ではなかっ

乳脂率、乳タンパク質率等の乳成分値も高かった。繁殖

たが、初回排卵は30％区が38％区に比べて早かった。

成績は対照区と比べてやや良好であったが、有意では一方、初回授精日数、空胎日数は38％区が30％区になかった。前回の飼養試験の結果と比較すると、分娩前比べて短く、LF区は38％区と同等であった。また、試験からLFを給与すると分娩前後のルーメン環境改善に効期間内の受胎頭数はLF区が最も多かった。これらの結果を発揮し、泌乳期には濃厚飼料多給下でより顕著な果から、濃厚飼料の多給により泌乳には良好な効果が効果が現れると考えられた。

認められるものの、繁殖には悪影響を及ぼすことが推察

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対照区
LF区

図2�分娩後各週次におけるルーメンMCP合成量（最小二乗平均値）
�* 対照区とLF区の間に有意差（P<0.05）

5. 結論

脚注

�3回の飼養試験で得られた結果を総合すると、乳牛

1）ルーメン：第一胃、反芻動物の4つある胃のうち最初に位置への適量のLF給与は、周産期の餌が切り替わる時期のし、食道が変化したもの。容積が最も大きく、乳牛ではドラム缶

ルーメン菌叢を安定化させ、MCP合成量を増加させるこ

1本分（200L）にも達し、微生物の発酵により繊維を分解すると、ルーメンpHの変動を抑え泌乳前期のLPS活性値の発酵槽の役割を担う。循環ポンプの働きをする第二胃とあわ上昇を抑えること、免疫機能を良好に保つことなどによせて反芻胃という。

り、泌乳成績と繁殖成績の両方を向上させることが示唆2）潜在性ルーメンアシドーシス：ルーメン液の局所的な酸性化された。

によってルーメン壁が傷つき、バリア機能が失われてLPS等の有害物質が体内に吸収され、不顕性の障害が進行していくこ

参考文献と。慢性肝機能障害、乳量・乳質の低下、繁殖障害等、生産性の低下を招く。

Kushibiki S. et al.: Effect of bovine lactoferrin
feeding on lipopolysaccharide-induced metabolic andhormonal disturbances in preruminant calves. Anim Sci3）微生物態タンパク質（MCP）：微生物の菌体を構成するタンJ 79: 375-381, 2008.

パク質、牛が摂取したアミノ酸やタンパク質の大部分は、ルー高橋ひとみ他: ラクトフェリンはリポポリサッカライドによるウメンに棲息する微生物が一度分解し、菌体タンパク質として再シ子宮内膜上皮細胞のプロスタグランジンF2α産生促進作用構成される。牛はこれを下部消化管に送り、消化・吸収して利を緩和する. ラクトフェリン2011(日本医学館・日本ラクトフェリ用する。ルーメン微生物はアンモニアや尿素からアミノ酸を合ン学会第4回学術集会実行委員会編）pp121-125.

成できるので、反芻動物は単胃動物より窒素の利用効率が高い。MCP合成量はルーメン発酵の健全性の指標ともなる。

謝辞
本研究は農林水産省農林水産技術会議事務局の「新たな農4）中性デタージェント繊維（NDF）：中性の界面活性剤で可溶

林水産政策を推進する実用技術開発事業」および「農林水産化しない繊維成分、植物の細胞壁を構成するセルロース、ヘミ業・食品産業科学技術研究推進事業」の助成を得て行われセルロース、リグニンなどからなる。ルーメン発酵により分解さた。

れて揮発性脂肪酸となり、ルーメン壁から吸収されて栄養源と本研究の遂行にあたり、飼養試験および各種分析を担当したして利用される。

神奈川県の秋山清博士、同部門の櫛引史郎博士、真貝拓三博士、高橋ひとみ博士をはじめとする共同研究者の諸氏に深謝する。

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３Dプリンターによるウシラクトフェリン
N-ローブとC-ローブモデルの作製（その２）島崎�敬一�

�� 相沢 智康����

Keiichi SHIMAZAKI

���� Tomoyasu AIZAWA

北海道大学名誉教授

北海道大学��先端生命科学研究院

3Dプリンターによるラクトフェリン分子モデルの作成過程を、前稿（ニュースレター第15号）で紹介しましたが、本稿ではその詳細および背景について補足します。

5. ラクトフェリン立体構造データの選択ではないかと考えました。しかし、3Dプリンターのシステ
ムでは両ローブの複数の接触部位をそれぞれ連続体と�タンパク質の立体構造データはRCSB Protein Data

して認識するために両ローブは固定されてしまうことが分Bank(PDB)のサイトからダウンロードします（登録なし、かり、N-ローブとC-ローブそれぞれに分けて作成すること無料）。検索欄に"lactoferrin"あるいとしました。

は、"lactotransferrin"と入力すると100件以上のデー作成する各ローブは個別に表示して3Dプリンターにデータがヒットしますので、ウシラクトフェリンに絞るためにタを渡すようにします。PyMol (7) その他の分子表示ソ

Requirements欄のOrganismでBos taurusを選択しま

フトでラクトフェリン分子の部分構造を表示するには、求す。このように非常に多くの立体構造データがあるので、める構造を構成しているアミノ酸配列の範囲を指定する

ラクトフェリン分子全体のデータ、N-ローブあるいはC-ロことで行います。また、エディターなどでpdbファイルを開ーブのデータ、リガンドとの複合体のデータ、ミルク由来いて必要なデータ部分と不要な部分を選択して編集すか組換え体かなど、目的によって選べるメリットはありまる方法もあります。そのようなやり方で編集している画面す。さらに解像度の違いや、解析方法がX線結晶解析かをコピーして示そうとしたのですが、ラクトフェリシンNMR（核磁気共鳴）かも選択できます。上述のB（Phe17-Phe41）の25残基分だけでも膨大な量（200Requirements欄のExperimental MethodにはX-rayと行以上）となりますので省きました。

solution NMRとがあり、そこでNMRを選択すると、ラクトフェリシン(lactoferricin)やラクトフェランピン(lactoferampin)などの数KDaのフラグメントに絞られま

7. pdbデータから3Dプリンターへす。本稿ではニュージーランドのE.N.Bakerらのグループ

pdbデータに基づいて3Dプリンターで分子モデルを作成が解析した1BLF.pdb (6) を用いています。

させるためには、まずpdb形式の立体構造データを分子構造表示ソフト（ここではPyMolを使用）に読み込み、表

6. 表示する構造部位の選択・表示示させた分子モデルの形態をVRML（Virtual RealityModeling Language）フォーマットで保存し（拡張子は3Dプリンターでラクトフェリンの表面モデル(surfacewrl）、これをやはりフリーウエアのMeshLab(8) を用いてstructure)を作るに当たって、分子全体をプリント（作STL（Standard Triangulated Language）フォーマット

成）するとN-ローブとC-ローブがその接続部（Thr334-に変換してから3Dプリンター制御ソフトに渡すという手順Arg344）を蝶番のようにして開いたり閉じたりできるの

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8. 立体モデルとそれに対応するグラフィックス表示��図5(a-c)に3Dプリンターで作成した分子モデルと、分子構造表示ソフトで表示したものをそれぞれ対応させて示しました。5-aに示したN-ローブとC-ローブの各モデルの径は共にほぼ5㎝で、重量は46gでした。5-bは5-aに相当するグラフィックスで、5-cはラクトフェリン全体の分子です。赤で示した部分は両ローブの連結部分で3回転のα-へリックス構造をとり、11残基（Thr334Arg344）で構成されています。Arg344はC-ローブ側にあるVal345と結合しており、Val345のほとんどは分子内に埋没していることが分かります。さらにbとcでは識別しやすいように、ラクトフェリシン部分（Phe17-Phe41）を黄色で示しました。また、bではC末端残基（Arg 689）を青で示してありC-ローブでは確認できますが、全分子モデルでは見えなくなっています。そのため、C末端残基は両ローブの接合部位に位置して比較的アクセスされ難い

図5�完成したウシラクトフェリンのN-ローブとC-ローブおよび分子構造表示ソフトで表示した図の比較環境に位置していることが分かります。

9.ウシラクトフェリン分子の糖鎖結合部

a. 3Dプリンターで作成したN-ローブ（左）とC-ローブ位（右）。共に直径はほぼ5㎝で、重量は46 g。
b. Rasmol (9) のsurface modelで表示したN-ローブ

�ラクトフェリンは糖タンパク質ですが、今回作成したとC-ローブ。N-ローブの赤色はローブ間の連結部位

分子モデルでは糖鎖は省きました。糖タンパク質の結合（Thr334-Arg344）でC-ローブの赤色はVal345、様式には、アスパラギンのアミド基に糖鎖が結合したN-青色はC末端残基（Arg 689）。黄色の部位はラクトフェ
リシンB（Phe17-Phe41）を示す。

グリコシド結合型（N-結合型）と、セリンやトレオニン（スレc. Rasmolのsurface modelで表示したラクトフェリン分オニン）のOH基に結合したО-グリコシド結合型（О-結合子全体。着色部分はbと同じ。

型）とがありますが、ラクトフェリンの場合はN-結合型です。ラクトフェリンに含まれるAsn残基は分子中に30個近て、それぞれはAsn368-GlcNAc, Asn476-

くありますが、その中でシークオン（sequon）配列すなわ(GlcNAc)2-Man, Asn545-(GlcNAc)2-(Man)4となっ

ちAsn-X-SerまたはAsn-X-ThrのAsn残基に糖鎖が結ています。しかし、4か所に結合していると記述している合します。ウシラクトフェリンの場合、糖鎖結合部位は論文もあります。これら糖鎖の組成や結合部位の違い

Asn233, 281, 368, 476, 545の5か所あり、これらのが、ラクトフェリン分子の不均一性の一要因となっていま部位は全て分子表面に存在しています（図6-a）。また、す。なお、ヒトラクトフェリンの場合は3か所（Asn137,Asn-(GlcNAc)2-Man-(Man-GlcNAc)2-(Man)nなど479, 624）の内のAsn137と478に糖鎖が結合していがウシラクトフェリンにおける主な糖鎖として報告されてると報告されています（11）。

います（10）。�ここで用いたX線結晶解析データ
GlcNAc, N-アセチルグルコサミン（pdbではNAGと表記）（1BLF.pdb）ではC-ローブの3か所に糖鎖が付いていhttp://lactoferrin.jp/

Man, マンノース"6⽇本ラクトフェリン学会ニュースレター

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10.次回はリボンモデルの作成です
ラクトフェリン分子モデル作成の目的は、モデルを手に取って立体構造を実感し、さらに多機能性発現のメカニズムについて何らかのヒントを得ようとすることでした。
3Dプリンターによる表面モデルとコンピューターグラフィックスとを併用することによってかなり想像の翼を拡げることはできますが、より深く知るためにリボンモデルも作成しましたので、次回で紹介いたします。
�なお、コンピューターグラフィックスによるタンパク質分子の表示では自由に色調をコントロールできますが、ここで用いた3Dプリンターでは完成した分子モデルに筆で彩色するしかありません。しかし調べてみると、既にキャノンからカラー3Dプリンター（インクジェット粉末積層方式）が販売されていることが分かりましたので付記します。

図6�ラクトフェリン分子と糖鎖 (a) およびNローブとC-ローブ接触面の貫通部 (b)N-ローブはgray90、C-ローブはlight blue、両ローブ接続

参考文献・参考サイト

部分をsalmon、糖鎖結合部位のアミノ酸残基（Asn）をblue、（文献番号は前回からの継続）糖残基をgreenで示した（PyMolで作成）。なお、このラクト

6. Moore et al., (1997) J. Mol. Biol., 274,
222-236.

フェリン分子ではAsn233とAsn281に糖鎖は結合していな
い。また、分子を異なる方向から眺めると、N-ローブとC-ロー

7. PyMol（https://www.pymol.org/）ブの接触面に少なくとも2か所の貫通部分（bの矢印で示し

8. MeshLab (http://meshlab.sourceforge.net/)た部分）があることが分かる。

9. RasMol（http://www.openrasmol.org/OpenRasMol.html）
10. Spik et al., (1988) Biochimie, 70,1459-1469.

�また、N-ローブとC-ローブの接触面を図5-aでみると

11. Harridas et al., (1995) Acta Crystallogr.,
D51, 629-646.

ゴツゴツしていて多数の隙間があります。図6-bにそれらの内の2つの貫通部分を示しました。大きい方の穴のサ
イズをPyMolの機能を使って推定すると5-10Å程度となり、水分子（直径がほぼ3Å）よりも大きい分子でも自由に出入りできることが分かります。

http://lactoferrin.jp/"7⽇本ラクトフェリン学会ニュースレター

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第７回学術集会のご案内
本会の第7回学術集会が下記の概要で開催されます。今回の学術集会は、「2016年度臨床ラクトフェリン研究会」との合同大会です。演題登録などの詳細は、下記の大会専用ホームページで、順次ご案内する予定です。会員の皆様には、奮ってご参加くださいますようお願い申し上げます。

場 所 ：昭和大学 旗の台キャンパス�

日本ラクトフェリン学会ニュースレター
第17号（2016年6⽉発⾏）
ニュースレター編集
日本ラクトフェリン学会
広報委員会

���������（東京都品川区旗の台1-5-8)
高山会 期 ：10月30日（日)喜晴

農業・食品産業技術総合研究

大会長：玉置 幸道（朝日大学歯学部）

機構

畜産研究部門島崎敬一

������������http://lactoferrin.jp/2016/
プログラム：招待講演�����������������シンポジウム�����������������一般講演�����������������ポスターセッション�����������������ランチョンセミナー�����������������企業展示�����������������懇親会（学会賞・冨田賞表彰式）

北海道大学名誉教授

日本ラクトフェリン学会
事務局〒232-0024
横浜市南区浦⾈町4-57

連絡先：臨床ラクトフェリン研究会事務局
�������〒142-8555
東京都品川区旗の台1-5-8
昭和大学歯学部歯科理工学教室内�������電話（直通）03-5706-5895
info@clinical-lactoferrin.com

横浜市⽴⼤学附属市⺠総合医療センター

TEL: 045-261-5656

�����

内線1871
FAX: 045-253-9902
E-mail:lacto@yokohama-cu.ac.jp

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