平成29年度
文部科学省 国家課題対応型研究開発推進事業
英知を結集した原⼦⼒科学技術・⼈材育成推進事業【テーマ２】放射線影響に係る基礎基盤研究

放射線影響モデル動物を利⽤した
⽣物影響解明のための多元的アプローチ
弘前⼤学
三浦富智・吉⽥光明*・葛⻄宏介・有吉健太郎*
東北⼤学
鈴⽊正敏・篠⽥壽・⽊野康志・岡壽崇*
新潟⼤学
⼭城秀昭
北海道科学⼤学 中⽥章史
量研機構・放医研 柿沼志津⼦・飯塚⼤輔・尚奕・鶴岡千鶴*採択時の所属
Kaho T,
ManomeMiura
Hirosaki Univ.

研究⽬標
2011年から採取・保存してきた⽣体試料を有効活⽤するとともに継続的な調査を⾏い、放射線汚染地域に⽣息する野⽣動物（アカネズミ、ニホンザル、アライグマ、ヤマメ）と実験マウスを⽐較し、多元的な⽣物影響解析を⾏う。

① ⽣物試料の採取と線量評価② 低線量慢性被ばくによる酸化ストレス応答③ ⽣物種間の放射線感受性⽐較④ DNAおよび染⾊体損傷⽐較による放射線応答の解明⑤ ⽣殖・受精能に及ぼす影響の解明⑥ 放射線被ばく影響からの回復メカニズム解析動⑦ 物⽣体試料・樹⽴細胞株のアーカイブ化
Miura T, Hirosaki Univ.

①線量評価：IP法による内部被ばく解析
アカネズミ顎⾻棚塩 2017秋-2018春

摘出した上下顎切⻭
下顎切⻭

10000
8000
6000
4000
20000上顎切⻭

122017秋

2018春

354678⼤腿四頭筋 137Cs (Bq/kg)

サンプルNo.

切⻭QL値 vs ⼤腿四頭筋 137Cs
8000
y = 3.5563x ‐ 968.08
R² = 0.8186

6000
4000
200000500

1000
1500
切⻭QL値

20002500

本⼿法を応⽤し、数mgの試料の線量評価が可能な⽅法を開発した。
Miura T, Hirosaki Univ.

10000γ ray8000

β ray206000

¹³⁷Cs

4000

10200000(Bq/kg)

30137Cs concentration40(μGy/day)Internal dose rate

①線量評価：内部被ばく線量の推定（アライグマ）
精密なモデルでの計算
精密に被ばく量を推定するためにアライグマ2頭（体重:4.20 kg,6.34 kg）のボクセルファントムを作製し、数値シミュレーションにより被ばく線量を推定(μGy/day)Internal dose rate30

アライグマのファントムを新たに構築● β ray◆ γ ray

20

MuscleKidney

Liver

10

Lung
Heart

00

2000

4000

Spleen
6000

8000

137Cs concentration (Bq/kg)

Miura T, Hirosaki Univ.

①線量評価：外部被ばく線量の推定（アライグマ）

不適

ヒトで⽤いられるエナメル質の炭酸ラジカル測定をアライグマに適⽤複数回の化学処理によるESRスペクトルの改善（アライグマ）アライグマの⻭におけるESR検量線より低い線量評価が可能になった
Miura T, Hirosaki Univ.

②低線量慢性被ばくによる酸化ストレス応答
野⽣動物肝臓中の酸化ストレスマーカー8-oxo-dG解析
アカネズミ肝臓中の8-oxo-dG濃度

8‐oxo‐dG (ng/mL)

8‐oxo‐dG conc. (ng/mL)

8‐oxo‐dG conc. (ng/mL)

アライグマ肝臓中の8-oxo-dG濃度

050
100
150
External dose (mGy/day)

200

0500

1000
1500
2000
QL value (Incisors)

2500
⼤熊⼩丸

弘前

酸化ストレスマーカーである8-oxo-dGのアライグマ肝臓中の濃度は、硬組織のQL値および推定外部被ばく線量と正の相関を⽰した。また、アカネズミの肝臓においても、空間線量の違いを反映していた。
Miura T, Hirosaki Univ.

②低線量慢性被ばくによる酸化ストレス応答
アライグマにおける⾎液、組織中の酸化ストレスマーカー解析
酸化ストレス状態（MDA濃度）
⾎漿⼤腿筋1.6

肝臓腎臓2221.51.51.5対照群
被ばく全体
被ばくオス
被ばくメス

0.80.60.4

1MDA (µM/mg)

MDA (µM/mg)

1110.50.50.5000
被ばくメス

被ばくオス

被ばく全体

対照群

被ばくメス

被ばくオス

被ばく全体

対照群

被ばくメス

被ばくオス

被ばく全体

被ばくメス

被ばくオス

被ばく全体

0

対照群

0.2
対照群

MDA (µM)

1.2

MDA (µM/mg)

1.4

被ばく群でMDA濃度が低下傾向を⽰す
Miura T, Hirosaki Univ.

③⽣物種間の放射線感受性⽐較
コロニー形成法による感受性試験

DNA損傷（γH2AX）消失速度

種間で放射線感受性が異なるが、種間の差以上に個体差が⼤きい
Miura T, Hirosaki Univ.

④DNAおよび染⾊体損傷⽐較による放射線応答の解明
野⽣動物（アカネズミ・アライグマ）における不安定型染⾊体異常解析
アカネズミアライグマ
Comparison
QL value (incisors)
Frequency of cells QL value (Tibia)
with CA
Cs‐137 activity
vs.
External dose
8‐oxo‐dG conc.
QL value (incisors)
QL value (Tibia)
Dic frequency
vs.
Cs‐137 activity
External dose
8‐oxo‐dG conc.
QL value (incisors)
QL value (Tibia)
ace frequency
vs.
Cs‐137 activity
External dose
8‐oxo‐dG conc.
QL value (incisors)
chtg frequency QL value (Tibia)
Cs‐137 activity
vs.
External dose
8‐oxo‐dG conc.
QL value (incisors)
chtb frequency QL value (Tibia)Cs‐137 activity
vs.
External dose
8‐oxo‐dG conc.

r
0.0707‐0.0400‐0.1473
0.02240.24540.43630.61070.93270.4724‐0.1500
0.41870.4358‐0.1612‐0.2454‐0.5224‐0.1442‐0.1697‐0.2532
0.39380.3198‐0.2311‐0.1634
0.30220.20570.0728

AS791_#136

AS791_#148

⼤熊町の空間線量率：>30μGy/h（捕獲地域付近では>100μGy/h）
しかし、⼆動原体染⾊体（Dic）は観察されない
⼀⽅、⼤熊町のアカネズミ捕獲地点より空間線量が低い地域で捕獲されたアライグマでは、Dicが観察された。
Dic誘導において種間で差が認められる
Miura T, Hirosaki Univ.

④DNAおよび染⾊体損傷⽐較による放射線応答の解明
野⽣動物（ニホンザル）における安定型染⾊体異常（転座）解析

3.0p < 0.01

Tr/100 cells eq

2.5

2.0

1.5

1.0

0.50.0

対照地域

福島県

福島県産ニホンザルのリンパ球における染⾊体転座頻度は対照地域に⽐べて有意に⾼いMiura T, Hirosaki Univ.

⑤⽣殖・受精能に及ぼす影響の解明
アライグマにおける精巣の成熟と精⼦形成

⾮繁殖期及び繁殖期のアライグマ精巣の染⾊像
⾮繁殖期：(A)弘前及び⽯狩 (B)福島
繁殖期：(C)弘前及び⽯狩 (D)福島
Spg, 精原細胞; Spc, 精⺟細胞; Spm, 円形精⼦細胞;
Espm, 伸⻑精⼦細胞. Scale bar = 100 μm

⾮繁殖期及び繁殖期のアライグマ精巣の精細管内の精細胞数と伸⻑精⼦細胞の割合(A)繁殖期の精細胞数の割合 (B) ⾮繁殖期の精細胞数の割合(C)繁殖期の伸⻑精⼦細胞数の割合 (D) ⾮繁殖期の伸⻑精⼦細胞数の割合
p < 0.05 (a vs. b)

福島県で繁殖期に捕獲されたアライグマでは、精細管内の伸⻑精⼦細胞の割合が有意に増加した。
Miura T, Hirosaki Univ.

⑥実験動物を対象とした慢性被ばく影響評価研究※QSTにて照射

染⾊体異常の動態解析、酸化ストレス応答解析
⽣殖巣の組織学的解析・精⼦の機能評価・DNA修飾解析・遺伝⼦発現解析
病理組織学的解析・発⽣腫瘍のDNA変異解析
Miura T, Hirosaki Univ.

⑥DNAおよび染⾊体損傷⽐較による放射線応答の解明
実験照射マウスにおける不安定型染⾊体異常解析
⼆動原体染⾊体頻度の変化••

Dic頻度：LDR-IR > HDR-IR
LDR-IRマウスにおいて28および35⽇齢でDic頻度が増加し、その後減少した。

Excess acentric fragment の変化••

過剰染⾊体断⽚：LDR-IR > HDR-IR
LDR-IRマウスにおいて、連続照射期間中は過剰染⾊体断⽚頻度が増加し、照射中⽌後減少した。
Miura T, Hirosaki Univ.

⑥⽣殖・受精能に及ぼす影響の解明
実験照射マウスにおける精巣への影響
精巣管直径（μm）
3002001000*

35⽇齢

100⽇齢

総⽣殖細胞数（個）3002001000*

35⽇齢

100⽇齢

総細胞数（個）

Sham

LDR

Sham

LDR

3002001000*

35⽇齢

35⽇齢

100⽇齢

Sham

LDR

100⽇齢

*p < 0.05

低線量照射35⽇齢では、分化段階の⽣殖細胞が減少していたが、セルトリ細胞数は増加傾向にあった。
100⽇齢では精巣の成熟および精⼦形成が回復した。
Miura T, Hirosaki Univ.

⑥⽣殖・受精能に及ぼす影響の解明
実験照射マウスにおける卵巣への影響
マウスの平均体重4030

卵胞数（個/mm2）

卵巣切⽚の平均⾯積＊＊

10010＊＊＊＊

ShamLDR-IRHDR-IR

＊
＊

＊

30

正常卵胞の割合(%)*p < 0.0520205500010100035⽇齢

100⽇齢

35⽇齢

100⽇齢

Sham > LDR-IR, HDR-IR

35⽇齢

100⽇齢

Sham > LDR-IR ≒ HDR-IR（100⽇齢）

35⽇齢

100⽇齢

Sham > LDR-IR ≒ HDR-IR

低線量放射線はマウスの妊孕性を低下させ、不妊の原因となり得る
Miura T, Hirosaki Univ.

⑥実験動物を対象とした慢性被ばく影響評価研究
慢性被ばくによる放射線の影響解析：肝臓でのKi-67陽性細胞数の変化
肝臓におけるrepresentativeなKi-67染⾊像

LDRの変化は本事業で初めて観察• Ki-67陽性細胞率（⾯積あたりの陽性細胞数も同様）は被ばくにより増加するが、成⻑が⽌まる時期（35⽇齢）では被ばくの影響は全く⾒られなくなる。
• ⾯積当たりの肝細胞数は被ばくの有無によりかわらないことから、HDR-IRやLDR-IRでは代償性の増殖が起こっていると⽰唆される。
• Caspase-3（アポトーシス細胞死）、p53（DNA修復や細胞増殖停⽌、アポトーシスに関与）、γH2AX（DNA⼆重鎖切断）解析では、特筆すべき変化は認められない。

Miura T, Hirosaki Univ.

⑦動物⽣体試料・樹⽴細胞株のアーカイブ化
放射能環境動態・影響評価ネットワーク共同研究拠点〜筑波⼤学が運⽤するアーカイブサイト〜

量研機構・放医研に構築されているJ-SHARE〜動物実験病理情報⽀援システム〜

野⽣動物実験の資料・情報をアーカイブ化

ラボマウス実験の資料・情報をアーカイブ化
Miura T, Hirosaki Univ.

⑧放射線被ばく影響からの回復メカニズム解析
ニホンザルにおける染⾊体転座頻度の変化
捕獲⽇と転座頻度

事故後の⽣存期間と転座頻度

3.03.0
福島県

2.5

2.5

対照地域

福島県

2.0

Tr / 100 CE

Tr / 100 CE

2.0

1.5

1.0

対照地域

1.51.0

0.5

0.5

0.0

0.04.0捕獲⽇

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

事故後の⽣存期間（年）転座頻度において、累積性の増加が認められない
東電福島第⼀原発事故後、転座頻度は減少傾向にある
Miura T, Hirosaki Univ.

⑧放射線被ばく影響からの回復メカニズム解析
実験照射マウスにおけるマーカー染⾊体頻度の変化

マーカー染⾊体
染⾊体転座等により形成される

⾼線量率急性照射群（HDR-IR）：半減期は⻑く、500⽇齢まで検出される
低線量率連続照射群（LDR-IR）：照射期間中は累積性の増加、その後減少し、半減期はHDR-IRよりも短い
Miura T, Hirosaki Univ.

⑧放射線被ばく影響からの回復メカニズム解析
実験照射マウスにおける⽣殖細胞の回復
マウスでは低線量放射線によって精巣精巣の発育不良

分化段階の⽣殖細胞の減少

卵巣⽀持細胞である
セルトリ細胞は増加傾向

卵巣の発育不良

卵胞数、正常卵胞率の減少

卵胞発育が未発育段階で停⽌

これらの影響はこれらの影響は放射線照射の停⽌後に精⼦形成が正常に回復

放射線照射の停⽌後も⻑期化

精⼦の先体は正常であり、受精能がある

⾼線量放射線被ばくと同程度

Miura T, Hirosaki Univ.

研究成果と解決すべき課題(１)
低線量慢性被ばくの⽣物影響解明【野⽣動物】【ラボマウス】• 放射線被ばくにより誘導される染⾊体 福島県放射線汚染地域よりも数⼗倍線量率が⾼い• 不安定型染⾊体異常頻度は慢性被ばく期間中に増加するが、異常型は種間で異なる可能性• 放射線汚染地域では加齢⾮依存性に転 被ばく後は減少• 造⾎細胞障害による造⾎系構築が遅延• 若齢期の慢性被ばくでは、放射線被ばくの⽣物学的影響が• 被ばく線量依存性に肝臓中の8‐oxo‐dG 顕在化濃度が増加する。
• 急性被ばくと低線量慢性被ばくでは、DNA突然変異プロファイルが異なる
今後の課題• 慢性的な酸化ストレスの増加がもたらす影響について解析が必要• 各エンドポイントの被ばく形態と検出限界の関係性を明らかにする• 線量率効果を詳細に解析する必要がある• 造⾎系の再構築プロセスの詳細な解析が必要• バイオマーカーの個体レベルでの意義の解明
座頻度が有意に増加• 低レベルながら酸化ストレスが持続

Miura T, Hirosaki Univ.

研究成果と解決すべき課題(２)⽣殖・発⽣における放射線被ばく影響【野⽣動物】【ラボマウス】

精巣精巣• アライグマ精⼦の先体は⼀部⽋損している割合が⾼い。
• 若齢マウスにおいてダメージを受けた精細胞は、100⽇齢に達した後は精⼦形成が回復。
• 繁殖期のアライグマ精巣の精細管内における精原細胞・精⺟細胞及び伸⻑精⼦細胞は、正常に分化・退⾏ • 精巣におけるIzumo1発現は、精⼦形成の退⾏に依存。
している。
卵巣卵巣

• 低線量慢性被ばくマウスでは卵巣の発育不良、卵胞数減少、正常卵胞減少、卵胞発育が未発育段階で停⽌。
• 繁殖期および⾮繁殖期のアライグマ卵巣では、卵胞発育と卵⼦形成が観察され、対照⽐較して、形態的な差 • 被ばく後75⽇経過してもそれらは回復しない。
は認められない。
• 低線量放射線はマウスの妊孕性を低下させ、不妊の原• 被災アカネズミ凍結保存精⼦を⽤いて体外受精を⾏っ因となり得る。
た結果、正常に受精し、かつ2細胞期まで発⽣。
今後の課題• 慢性被ばくにおける不妊リスクの解析• 精巣と卵巣における各幹細胞の詳細な解析が必要• 遺伝⼦発現変化とエピジェネティックな変化の解析
Miura T, Hirosaki Univ.

研究成果と解決すべき課題(３)
放射線被ばくからの回復プロセス【ラボマウス】【野⽣動物】• 事故発⽣年度から空間線量の減少に伴い、染⾊体 • 急性被ばくマウスでは、400⽇齢以降の体重増加が抑制
異常頻度が減少• 空間線量率減少後も軽度な酸化ストレスの変動が • 肝臓組織では、被ばく後、増加した細胞増殖活性が継続
継続• 酸化ストレス状態の継続による軽微なDNA損傷が • 放射線被ばく後も精⼦幹細胞が残存し、増殖・分化して精⼦形成能を回復蓄積する可能性
環境回復により、個体への放射線影響は回復するものの、発達期での影響⼤
今後の課題• 回復プロセスの評価に有⽤なエンドポイントの開発• 発がんプロセス等の晩発影響の解析• DNA変異プロファイルの詳細な解析

Miura T, Hirosaki Univ.

本事業の⾃⼰評価
 得られた成果と⽬標との関係性
本事業で新たな知⾒が得られ、当初想定を上回る成果が得られた。

 成果の新規性、⾰新性【技術開発】
・微量試料IP解析法の開発
・異種間受精能解析法の開発
・ESR解析⽤試料のノイズ除去法の開発【特筆すべき新規知⾒】
・野⽣動物における放射線感受性には個体差がある。
・放射線被ばくしたマウス肝臓において代償性の肝細胞増殖が認められる・若齢期に低線量率放射線に暴露したマウスでは精巣の発達が遅滞するが、その後回復する。
・雌マウスでは、低線量率放射線暴露が妊孕性を低下させ、不妊の原因となり得る。
・⽣物学的半減期が⻑いとされている染⾊体転座において、累積性の増加が認められない。

 研究の効果（原⼦⼒の基礎基盤の強化への効果等を記載）
低線量率慢性被ばくによる⽣物影響が認められるが、細胞の代償性増殖や異常細胞の寿命による排除により、環境回復とともに⽣体内の放射線影響が正常化されることが確認された。⼀⽅で、ラボマウスに⽤いた線量率で若齢期の個体が連続被ばくした場合は、卵⼦形成に障害を及ぼす可能性があることから、避難誘導を含めた放射線防護の強化に努める必要がある。
 今後の発展の⽅向性 次項参照
Miura T, Hirosaki Univ.

今後実施すべき事項
 若齢個体における⽣殖影響の線量並びに線量率依存性の解明
若齢マウス被ばくモデルを野⽣動物における被ばく線量率を含む複数の線量率において同様の解析を⾏い、若齢個体の放射線⽣物影響における線量・線量率依存性を明らかにする必要がある。

 放射線影響における外部被ばくと内部被ばくの⽐較
放射線被ばくの健康影響を明らかにするためにも、⾼⾃然放射線地域での解析を含め、外部被ばくと内部被ばくの⽐較が必要となる。

 放射線の個体（⼈）感受性に関する研究
本研究において野⽣動物の放射線感受性における個体差が顕在化した。放射線個体（⼈）感受性に影響を及ぼす因⼦の解明は、放射線の健康リスクを評価するうえで、重要な課題の⼀つである。

 染⾊体異常の⽣物学的半減期
被ばく時の年齢や線量率により染⾊体異常の⽣物学的半減期が異なると推測される。放射線の健康リスク評価や被ばく線量推定において重要な課題である。
Miura T, Hirosaki Univ.