コルチゾール測定試薬用高性能モノクローナル抗体の単離
小三堀宮松新林
谷田内葉谷龍俊秀ゆ隆
晃司＊ 1介＊ 2樹＊ 2か＊ 1雄＊ 1司＊ 3

Isolation of a Novel Monoclonal Antibody for the Detection of Cortisol.

Ryuji KOBAYASHI
Shunsuke MITANI
Hideki HORITA
Yuka MIYAUCHI
Takao MATSUBA
Koji SHINTANI

Cortisol plays an important role in controlling blood sugar and blood pressure in the body. However, thedevelopment of tumors in adrenal gland and pituitary gland can cause the disorder of its blood level. To diagnosesuch diseases, it is necessary to accurately examine the blood level of this hormone. But it is hard to obtain anantibody that can accurately diagnose the blood level of it from market. Then we decided to isolate a monoclonal
antibody that can be used for the diagnosis. To isolate the monoclonal antibody, we first examined the linker
introduction site of cortisol to make antigens. And we next examined the strains of mouse for immunization. Asa result, we found that immunization of balb/c with antigens made from cortisol having linker at 3rd place in thesteroid structure made antibodies that specifically bound to cortisol. And we could isolate a monoclonal antibody that
met the required performance from this mouse. Then we made AIA-CL reagent using this antibody and evaluatedits performance. As a result of this evaluation, we confirmed that this newly developed AIA-CL reagent showed thesame sensitivity as the AIA reagents. Furthermore, the AIA-CL reagents showed improved specificity over AIAreagents.

割を果たすホルモンとして知られている 1）。しかしこ

1． 背景のホルモンは、副腎や下垂体での腫瘍の発生など様々副腎皮質から分泌されるステロイドホルモンの一種な疾患によってその血中濃度が異常になる 2）。そのたにコルチゾールがある。コルチゾールには血糖値や血めこれらの疾患を診断するためには、このホルモンの圧をコントロールする作用があり、生体内で重要な役血中濃度を正確に調べることが必要となる。

＊1
＊2＊3

ル抗体を用いた競合法 3）によって測定されている（図バイオサイエンス事業部
バイオサイエンス事業部
バイオサイエンス事業部

第一開発部
第一開発部
第一開発部

技術グループ試薬グループコルチゾールの血中濃度は一般的に、抗コルチゾー
１）。この方法ではまず、固相化された抗コルチゾー
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TOSOH Research & Technology Review Vol.64（2020）

なお本研究により、SDG ｓの掲げる「すべての人

Blood level of cortisol is low

labeled cortisolの健康と福祉」という社会課題の解決へ向けた貢献が期待できる。

cortisolwash

Blood level of cortisol is high2．検討内容及び実験結果［1］抗原作成時のリンカー導入部位の検討

α-cortisol antibody

Fig.１

コルチゾールのように分子量の低い化合物は、それAssay principle of cortisol measurement

単独で免疫しても抗体が作られにくい。このような場合、アルブミンなど分子量の大きなキャリアタンパクル抗体をアルカリホスファターゼ（ALP）などの酵素質へ結合させてから免疫を行うことが必要となる。しで標識されたコルチゾール（標識コルチゾール）と検かしこの時、コルチゾールのどこへリンカーを導入し体との混合液に加えて反応させる。その後これを洗浄てキャリアタンパク質へ結合させれば特異性の高い抗し、固相に結合している標識コルチゾールから出るシ体が得られるかは分かっていない。そこでまずこのリグナルを測定する。検体中のコルチゾール濃度が低いンカー導入部位について検討することにした。

時には多くの標識コルチゾールが固相に結合して強いコルチゾールとその類似化合物の構造を比較した結シグナルがでる。しかし検体中のコルチゾール濃度が果、コルチゾールの 3 位か 21 位へリンカーを導入し高い時には固相に結合する標識コルチゾールが減り、て免疫抗原を作製すると特異性の高い抗体が得られる弱いシグナルとなる。このシグナル変化の割合を調べと予想された。そこでこれらの部位へリンカーを導入ることにより、血中のコルチゾール濃度が測定される。

したコルチゾールをそれぞれ化学合成した。そしてここのような測定試薬を作る際、その試薬性能に大きれらのコルチゾールをキャリアタンパク質へそれぞれな影響を与えるのが、抗体である。抗体とは、標的抗結合させ、免疫抗原とした。用意した実験動物（マウ原に対して特異的かつ高い親和性で結合する性質を有ス、balb ／ c）へこれらの免疫抗原を定法に従い免疫し、する分子である。しかし血中のコルチゾール濃度は非抗血清をそれぞれ取得した 5）。そしてこの抗血清に含常に低い。またこのホルモンはステロイド骨格を持っまれる抗体とコルチゾール類似化合物との交差反応性ているため、血中にはこれとよく似た構造を持つ類似を全自動エンザイムイムノアッセイ装置 AIA600II（東化合物が数多く存在している（図２）。そのためこのソー株式会社製）で調べた。

測定試薬を作るためには、抗原との親和性のみでなく実験の結果、3 位へリンカーを導入したコルチゾー

特異性の点においても高い性能が求められる。しかし

ルで作製した免疫抗原を用いると、コルチコステロ

このような要求を満たす抗体を市場から入手することンとの交差反応性が大幅に低く抑えられると分かった

4）は非常に難しい 。そこで我々は AIA − CL 試薬用とし（図３）。一方、プレドニゾロンとの交差反応性について高性能な抗コルチゾールモノクローナル抗体を自社ては、リンカー導入部位に関わらず非常に高い傾向に開発することにした。

あると分かった（図３）。

OH
182112 Me 20

HO1911 13
Me21103O

45981714

Me O

OOH

MeMe

Me O
OH

16O

15

O

Progesterone

7617α-Hydroxyprogesterone

Cortisol
OHHO
MeMe OMeOHOH

Me O
OH

Me O
OHOO

C orticosterone

11-Deoxycortisol

Fig.２48OH
Me OOHOMeHOMeOOCortisone

Prednisolone

Structures of cortisol and its analogous compounds東ソー研究・技術報告第 64 巻（2020）

Cross reactivity（％）

80
60
4020

Pr
edniCorti
costeronesolone0□:Antigens made from cortisol having linker at 3rd place in the steroid structure■:Antigens made from cortisol having linker at 21th place in the steroid structure

Fig.３

Results of studies on the linker introduction site

免疫するとコルチゾールへの特異性が高い抗体を得ら［2］免疫動物の検討れやすいと考えられた。そこでこのマウスから下記の使用するマウスの系統によってコルチゾール類似化通りモノクローナル抗体を単離することにした。

合物との交差反応性に違いが出る可能性もある。そこ
でマウスの系統を変えて交差反応性にどのような影響まず免疫したマウスを安楽死させ、脾臓細胞を摘出がでるか調べることにした。尚ここでは、抗体単離でした。そしてこの細胞とミエローマ細胞とを定法によく使用されている balb ／ c と A ／ J の 2 系統で比較を従って融合し 5, 6）、ハイブリドーマを作成した。この行った。

ハイブリドーマを細胞培養液へ懸濁してから 384well

3 位からリンカーが導入されているコルチゾールでプレートへ播き、37 ℃、5 ％ CO2 の環境下で培養した。

作成した免疫抗原を定法に従ってそれぞれのマウスへ

その後この培養上清を各ウェルから少量回収し、その5）免疫し、抗血清を取得した 。そしてこの抗血清に含中に分泌されている抗体の性能（抗原検出感度・反応まれる抗体とコルチゾール類似化合物との交差反応性特異性）を下記の ELISA で評価した。
この評価ではまず、α mouse IgG（0.5 μ g ／ ml）がを全自動エンザイムイムノアッセイ装置 AIA600II（東ソー株式会社製）でそれぞれ調べた。

固定化された ELISA プレートをスキムミルクが 1％実験の結果、コルチゾール類似化合物との交差反応含まれる PBS 溶液でブロッキングした。その後この性は A ／ J よりも balb ／ c の方が全体的に低く抑えられELISA プレートへ先ほど回収した培養上清を一定量ずる傾向にあると分かった（図４）。

つ加えて反応させた。次にこのプレートへ①標識コルチゾール溶液、②標識コルチゾールとコルチゾールの混合溶液（コルチゾールによる競合）、③標識コルチ［3］抗体のスクリーニング

ゾールとコルチゾール類似化合物の混合溶液（コルチているコルチゾールで免疫抗原を作成して balb ／ c へゾール類似化合物による競合）のいずれかをそれぞれ

12010080604020l
rti
sosone11-Deoxycorti
Coeerstrti
coprxyro
ydCoogester

ononeneesteroog
Pr17
α-Hedinisolone0Pr

Cross reactivity（％）

これまでの検討から、3 位からリンカーが導入され□ : Antiserum made from balb/c , ■ : Antiserum made from A/JFig.４

Results of studies on the strains of mouse

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加え、反応させた。その後未反応の標識コルチゾール量線を描くことが確認できた（図６）。またこの AIA −を洗浄して除き、ALP の基質である４－メチルウンベ

CL 試薬では、コルチゾール類似化合物との交差反応リフェリルリン酸を加え、それぞれ蛍光強度を測定し性が従来の AIA 試薬より大幅に改善される傾向にあるた。そして①標識コルチゾールのみ添加した時の蛍光ことも確認できた（図７）。

強度（B0）を 100 ％とし、②コルチゾールや③コルチゾール類似化合物で競合させた時の蛍光強度（B）をそれぞれ相対的な値（B ／ B0 × 100（%））として算出した。

3．まとめ
従来の AIA 試薬では、コルチゾール類似化合物と実験の結果を図５に示す。この図では、②コルチの交差反応が課題となっていた。しかし今回新たに作ゾールと競合させた際の B ／ B0 を横軸にとり、③コル成した AIA − CL 試薬では、自社開発した高性能なモチゾール類似化合物と競合させた際の B ／ B0 を縦軸にノクローナル抗体を利用することによってこの課題をとっている。また、それぞれの円の大きさは①標識コ改善することができた。今後はこの抗体を使って AIAルチゾールとだけ反応させた際のシグナル強度の大き試薬の改良にも取り組み、その性能を向上させていく。

さを表している。このようなスクリーニングにより、またコルチゾール以外の項目についても高性能なモノ要求性能を満たすモノクローナル抗体が単離できた。

クローナル抗体の開発に取り組み、試薬性能の更なる向上を図っていく。

［4］試薬性能の評価単離したモノクローナル抗体を用いて AIA − CL 試薬

謝辞を作成し、その性能を評価した。その結果、今回作成した AIA − CL 試薬は従来の AIA 試薬とほぼ同等の検本研究の様々な実験でお世話になった相馬麗さんに感謝いたします。

12080
AIA-CL80
B/B0（％）

60
4060

AIA

40
20200080

90

100110120

110Fig.６60

Cross reactivity（％）

50
40
30
20
101.2
10.8
0.60.40.2

lerestroog

yp

17
α-H

ydr

ox

ycoeo
x11-DCortisorti
soneneerostrti
coCoone0nisoloneediPr

Calibration curve of AIA-CL and AIA reagents

PrCross reactivity（％）

Results of ELISA screening0□ : AIA-CL , ■ : AIA

Fig.７

50

1000

Concentration of cortisol [ng/ml]

B/B0（％）

Fig.５

100

ne70

ero60

gest

B/B0（％）

100

Reaction specificity of AIA-CL and AIA reagents

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引用文献
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