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フォトトロピン LOV2 ドメインの光反応短寿命中間体の揺らぎ（京大院理 1、マリンガ大 2、大阪府立大院 3）黒井邦巧
黒井邦巧 1・佐藤フランシエーレ 2・中曽根祐介 1・直原一徳 3・徳富哲 3・寺嶋正秀 1

Fluctuation of short-lived
short lived intermediates during the photoreaction of the LOV2
domain of photoropin(Kyoto Univ.1, Univ. of Maringa2, Osaka Prefecture Univ.3）○Kunisato
Kunisato Kuroi11, Francielle Sato2,Yusuke Nakasone1, Kazunori Zikihara 3, Satoru Tokutomi3, Masahide Terazima 1【序】タンパク質分子は一般に不完全なパッキングにより生じる多くのキャビティーを持つため、その構造はその構造は自由度の高い自由度の高い柔らかな構造と言えるだろう。このような構造の柔らかさは柔らかな構造と言えるだろう。このような構造の柔らかさは柔らかな構造と言えるだろう。このような構造の柔らかさはタンパク質
タンパク質に自発的な揺らぎを与え、タンパク質機能と密接な関係があると指摘されているに自発的な揺らぎを与え、タンパク質機能と密接な関係があると指摘されている。このようなタ
このようなタンパク質分子の柔らかさ
ンパク質分子の柔らかさの実測は困難を伴うがの実測は困難を伴うがの実測は困難を伴うが、圧力圧力摂動に対する応答に対する応答を捉えることでその検出を捉えることでその検出が可能であるが可能である。実際に音速分散測定実際に音速分散測定や高圧実際に音速分散測定や高圧 NMR などによってこうしたこうした揺らぎの揺らぎの研究がながなされているが、が、これらの研究
これらの研究は定常状態定常状態の測定に限られており、の測定に限られており、生体反応におけるの測定に限られており、生体反応における短寿命短寿命中間体中間体に対しては適用が不可能であった。そこで我々はては適用が不可能であった。そこで 我々は高い時間分解能で揺らぎを捉えるべく、高い時間分解能で揺らぎを捉えるべく、高い時間分解能で揺らぎを捉えるべく、過渡回折格子
過渡回折格子法（Transient
Transient Grating; 以下 TG 法）および過渡レンズ法（法）
過渡レンズ法（Transient
過渡レンズ法（Transient Lens; 以下 TrL 法）による測定を高圧条件下で行ったを高圧条件下で行った。これらの手法（。これらの手法（TGTG 法、TrL 法）はタンパク質法）はタンパク質反応に伴うに伴う溶液の屈折率変溶液の屈折率変化を検出する化を検出するため、、反応過程における体積反応過程における体積反応過程における体積変化量を算出算出することが可能であすることが可能であるる。さらにその圧力その圧力依存性からから中間体の等温圧縮率中間体の等温圧縮率変化を求め中間体の等温圧縮率を求めることができるが、ることができるが、この等温圧縮率はこの等温圧縮率は
この等温圧縮率は『体積揺らぎ』『体積揺らぎ』と直接結びつくパラメーターであるため、と直接結びつくパラメーターであるため、中間体における中間体におけるタンパク質分子の柔らかさ
タンパク質分子の柔らかさ
タンパク質分子の柔らかさを定量的にを定量的に評価することが可能である。
本研究では
本研究では植物由来の植物由来の青色光センサータン
青色光センサータン
パク質であるフォトトロピンの LOV2-Jααドメインの光反応インの光反応に伴うに伴う圧縮率の変化を検出変化を検出したした。
LOV2-Jααドメインはドメインは LOV2 ドメインと Jαと呼ばと呼ばれる C 末端末端ヘリックスから成り、ヘリックスから成り、図１のような光反応を起こす光反応を起こすことが知られている。すなわちことが知られている。すなわち
光励起後
後トリプレット
トリプレット L660 を形成し、続いてを形成し、続いて発色団と LOV ドメイン内部のシステイン残基がドメイン内部のシステイン残基が共有結合を形成して S390 状態となり、最終的にJαがアンフォールディングを起こがアンフォールディングを起こしてシグナがアンフォールディングを起こ してシグナリング状態 T390 となる[1,2]。今回これら各中間となる
今回これら各中間体が持つが持つ圧縮率を検出することに成を検出することに成功し、基底を検出することに成功し、基底状態よりも大きく揺らいでいることが示唆されたので本討論会でたので本討論会で報告する。
報告する。

図１ LOV2-JaJa の光反応。の光反応。D447 において緑で示した部位が LOV ドメインでありドメインであり、赤で示し赤で示した部位が JαＣ末端ヘリックスである。

【実験実験】フォトトロピン
フォトトロピン試料溶液を試料溶液をシリコンチューブが付いたインナーセルに封入して高圧光シリコンチューブが付いたインナーセルに封入して高圧光学セル[3][3]内で TG 信号および TrL 信号を測定した。
測定圧力範囲は 0.1 MPa から 200 MPa であり、

この圧力下ではタンパク質の変性が起こらないことこの圧力下ではタンパク質の変性が起こらないことを確認したを確認した。TG 信号の測定
信号の測定には励起パルス光
は励起パルス光に波長 46460 nm の色素レーザーを用い、連続プローブ光として波長 840 nm のダイオードレーザーを用いた。
を用いた。TrL 信号の測定には連続プローブ光として波長 633 nm の He-Ne レーザーを用いレーザーを用い、体積変化量の算出はの算出は同一条件下で測定した同一条件下で測定した熱参照試料の信号強度
同一条件下で測定した熱参照試料の信号強度との比較により行った
熱参照試料の信号強度との比較により行ったとの比較により行った。
【結果と考察と考察】図 2 に圧力を 0.1 MPa から 200 MPa まで変えて測定した TrL 信号を示す。この信号を示す。この減衰曲線は約は約 1 ms の時定数で起こる Jαヘリックスヘリックスの20

アンフォールディングに伴う体積変化に起因アンフォールディングに伴う体積変化に起因し、てその圧力依存性を解析することにより、その圧力依存性を解析することにより、その圧力依存性を解析することにより、圧縮率（体積揺らぎ）の（体積揺らぎ）の変化を求めることができる。そ変化を求めることができる。そ15

ITrL / a.u.

その信号強度信号強度は体積変化量に比例する。したがっ体積変化量に比例する。したがっ0.1 MPa
50 MPa75 MPa100 MPa
150 MPa
200 MPa105の結果、ヘリックス崩壊の結果、ヘリックス崩壊過程にお過程における体積揺らぎ
体積揺らぎ
0の変化は変化は−240−240 (ml/mol)/mol)2 であると求められた。
であると求められた。さらに遅い時間スケールの信号強度に対して同様に遅い時間スケールの信号強度に対して 同様の解

0.00.51.0
1.5
2.0time / ms析を行った結果、析を行った結果、T390 状態（シグナリング状態）と基 底 状 態 の 体 積 揺 ら ぎ の 差 が 求 め ら れ 、 +1902(ml/mol) であった。すなわちった。すなわち T390 状態は基底状態基底状態

られた TrL 信号。(S信号。 390 から T390 の過程過程)5で測定した TG 信号を示す。この信号は LOV ドメ

4移る過程に移る過程において体積揺らぎ
おいて体積揺らぎがが−50−500/mol)2 とい−500 (ml/mol)
う大きなう大きな変化を起こすこを起こすことが分かった。とが分かった。
以上の結果から以上の結果から図
図 4 のように各中間体における体積揺らぎを基底状態からの差として得ることができた。
た。初期過程において大きく増幅し、その後において大きく増幅し、その後

ITG / a.u.

次に図 3 に 0.1 MPa から 1500 MPa までの圧力範囲

り、信号の圧力依存性から L660 状態から状態
S390 状態に3.0

図 2 0.1 MPa から 200 MPa までの範囲で取よりも大きく揺らいでいることが分かった。

インと発色団の間の共有結合形成過程を捉えてインと発色団の間の共有結合形成過程を 捉えてお2.50.1 MPa
25 MPa50 MPa100 MPa
150 MPa

3210-81010-7-610time / s-510-410徐々に減少する様子が観測されたが、これは分子内

図 3 0.1 MPa から 150 MPa までの範囲で取らのキャビティー量の変化や、溶媒分子との水和状態溶媒分子との水和状態れた過渡レンズ信号。(Lれた過渡レンズ信号。(L660 から S390 の過程)が反応に伴い変化した結果であると考えられる。X
線結晶解析では LOV ドメイン自身は光励起で大きドメイン自身 光励起で大きな構造変化を起こさないことが知られているが、今回の結果今回の結果から平均構造平均構造が変わらなくともが変わらなくともが変わらなくとも励起状態においてより柔らかな構造となっていることが示唆され示唆され、それがフォトトロピンのフォトトロピンの大きな構造変フォトトロピンの 大きな構造変化を引き起こすトリガーにな化を引き起こすトリガーになっていっているのではないるのではないかと推測される。
【参考文献参考文献】

図 4 体積揺らぎ変化を反応座標に対してプ[1]Harper
Harper et al. Science. (2003) 301:1541-4.
301:1541

ロットしたダイアグラム。各値は基底状態か[2]Nakasone et al. J Mol Biol. (2007) 367:432-42
367:432 42らの差として求めてある。

[3]Hoshihara et al. Rev Sci Instrum. (2008) 79