５−報文−IL-6RとIL-６から成る新規な融合蛋白質の調製と造血領域への応用
驛
土
飯
三
井
田
中
保
石

田
屋
田
木
出
崎
村
川
黒

悌
滋
大
輝
誠

敬

二
夫
寛
輔
彦
一
誠
清
彦

Preparation of a Novel Fusion Protein of IL-6R and IL-6 and its
Application to Hematopoietic Field
Teiji EKIDA
Shigeo TSUCHIYA
Hiroshi IIDA
Daisuke MIKI
Teruhiko IDE
Seiichi TAZAKI
Makoto NAKAMURA
Kiyoshi YASUKAWA
Takahiko ISHIGURO

Here we report preparation of a novel fusion protein of IL-6R and IL-6 (FP6) with no polypeptide linker, as apotent activator of gp 130. We established the methylotrophic yeast pichia pastoris secreting FP6 and obtained
purified FP6 in isoelectric point as well as molecular weight from the supernatant. Purified FP6 more potently
stimulated the ex vivo expansion of human CD34+ cells than IL-11 or TPO in the presence of stem cell factor(SCF). FP6 was also effective to induction of megakaryopoiesis of human CD34+ cells in the presence of SCF.

1．緒

造血幹細胞や造血前駆細胞の増殖分化には周囲に言存在する細胞が生産するさまざまな蛋白質性のファ

造血幹細胞（hematopoietic stem cell）は血液のおクター（造血因子）が深く関わっている。各種造血

おもとの細胞であり、主に骨髄に存在する。造血幹因子の構造や機能が解明された結果、一部の造血因

細胞は自己再生を行う一方、各種造血前駆細胞を経子は注射薬として応用されるに至った。
一方、造血幹細胞及び造血前駆細胞自身を用いたて、血液細胞（赤血球、白血球、血小板）に分化する。

治療法も進歩した。例えば癌に対する化学療法や術
（ ５ ）

６

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.44（2000）

後の放射線療法は効果的である反面、骨髄における造血機能の破壊を伴う。造血機能の再構築のために

CGTGCCCATGGC-3′;
pIL6B2:は骨髄移植が広く用いられているが、これらの移植
医療は血液の適合性の低さや、ドナーである健常人

AGATTCC-3′;
pIL6F2:に多大な負担がかかるなど問題点が多い。臍帯血は造血幹細胞や造血前駆細胞を多く含む。しかも、ド

5′-AGATCTGGTACCCCCAGGAGA
5′-ATGCGGCCGCTACATTTGCCGAAGAG CCC-3′;

320S333AB:

5′-GATCCCCTCCAGCTGAGAACGAG

ナーの負担がなく、血液の適合性が高いことから、

GTGTCCACCCCCATGCAAGCGCTG

臍帯血移植は新しい移植法として注目されている。

GTAC-3′;

現在世界的には1000以上の実施例がある。国内では

320S333AF:

98年に保険適用を受け、99年の東海村での臨界事故
被爆者の治療も含め、160以上の実施例がある（99年

5′-CAGCGCTTGCATGGGGGTGGACA
CCTCGTTCTCAGCTGGAGGG-3′;

pKN6B38D:

11月現在）。しかし、１回の出産で得られる臍帯血の5′-TCTCGCGATGTAGCCGCCCCAC
AC-3′;

量が限られており、細胞数が十分でなく、希望者のp6RAB112V: 5′-CTCGAGAAGAGGGTTCCCCCCGA

２割（主に体重の軽い子供）しか移植が受けられな

GGAGCCCCAG-3′;い。また、移植後の造血系の回復が遅いという欠点

p344F:をもつ。臍帯血中の造血幹細胞（及び造血前駆細胞）

s5′-TCTCTAGAGAATATTATCATCG-3′

発現ベクターpPIC9-112VADの構築のex vivo増幅（体外増幅）が可能になり、in vitroで

pBluescript KS-（東洋紡）をKpnIで切断し、クレノ細胞数を増やすことができれば、成人にも移植が可

ウフラグメントで処理した後、ライゲーション反応能となる。実際、現行の臍帯血バンクに使われていにより、KpnIサイトが消失したプラスミドpBSを作製る保存容器は、将来のex vivo増幅を想定し、２区画した。

（ex vivo増幅用５mlと直接移植用 20 ml）から成る。

IL-6RのcDNAをプライマーp6RAB20Lとp6RF320S

各種造血因子の組み合わせが競争的に評価されるを用いてPCRにより増幅し、XhoIで切断した。これ中で、われわれはIL-6（インターロイキン−６）
IL-6R（インターロイキン−６受容体）

、

1ー2）

、SCF（幹3−6）をpBS（XhoI/EcoRV）（予めpBSをXhoIとEcoRVで切断したpBS、以下同）に挿入し、pBS6Rを得た。

細胞増殖因子）の組み合わせに、顕著なex vivo増幅

IL-6のcDNAをプライマーpIL6B2とpIL6F2を用いて効果を見出した 7−10）。これはgp130刺激剤が造血幹細PCRにより増幅し、Bgl2とNot1で切断した。これを胞のex vivo増幅剤として有用であることを示唆する。

pBS6R（Bgl2／Not1）に挿入し、pBS6R6Sを得た。

更にわれわれは、IL-6とIL-6Rによるgp130の刺激が更に、オリゴヌクレオチド320S333ABと320S333AFを

巨核球分化にも重要であることを見出した 。これはアニールさせたものをpBS6R6S（Bg12／Kpn1）にgp130刺激剤の、現行の血小板輸血に代わる血小板増挿入し、pBS6R6Lを得た。

11）

加剤（注射剤）としての可能性を示唆する。

IL-6のcDNAをpBS6R6LからプライマーpKN6B38D

IL-6とIL-6RはIL-6R・IL-6複合体を形成した後に、とpIL6F2を用いてPCRにより増幅し、Nru1とNot1

細胞表面のシグナル伝達蛋白質gp130を刺激する。IL-で切断した。これをpBS6R6L（Eco473/Not1）に挿6とIL-6RからIL-6R・IL-6複合体の形成は平衡反応で入し、pBS6R6L-38Dを得た。

あり、低い濃度では解離に傾き、gp130に十分な刺激

pBS6R6L-38D（XhoI/NotI）からインサートDNAをが伝わらない。上記欠点を改良すべく、われわれは取り出し、pPIC9（インビトロジェン社）

一分子でgp130を強く刺激する分子として、IL-6Rと（Xho1/Not1）に挿入し、pPIC9-20LADを得た。

IL-6から成る新規な融合蛋白質（FP6; Fusion proteinof IL-6R and IL-6）の調製を試みた。

IL-6RのcDNAをプライマーp6RAB112Vとp344Fを用いてPCRにより増幅し、Xho1とXba1で切断した。
これをpPIC9（Xho1/Avr2）に挿入し、pPIC9-112VL

2．材料および方法を得た。

〔1〕FP6発現株G1の樹立
a

最後にpPIC9-112VL（XhoI/PmaCI）からインサート

オリゴマー

p6RAB20L:

DNAを取り出し、pPIC9-20LAD（XhoI/PmaCI）に挿5′-CTCGAGAAGAGGCTGGCCCCAAGGCGCTGCCC-3′;

p6RF320S:

入することにより、pPIC9-112VADを得た。
d5′-A G A T C T G G A T T C T G T C C A A G G

換

（ ６ ）

pPIC9-112VADによるピキアパストリスの形質転東ソー研究・技術報告 第44巻（2000）

ピキア・パストリスGS115株（インビトロジェン社）

７（pH6.4）を線速毎時110cmで溶出させ、ELISAによりからコンピテントセルを調製し、Bgl2によって線状

活性画分を集めた。

化したpPIC9-112VADで酵母を形質転換し、得られたs

ゲルろ過
上記活性画分を限外ろ過膜ペリコンXL（日本ミリ

酵母を最小栄養培地で培養してヒスチジン要求性を失った形質転換体を選別した。得られた形質転換体

ポア社製）で21mlに濃縮した後、50mM

NaCl、

をMDプレート（1.34％（w/v）YNB、0.00004％ビオ

１mMPMSF、10mM２メルカプトエタノール、20mM

チン、２％（w/v）グルコース）とMMプレート

酢酸塩緩衝液（pH6.0）で平衡化したG3000SW（東ソ（1.34％（w/v）YNB、0.00004％ビオチン、0.5％（v/v）

ー、21.5mmIDx30cm）に、流速５ml/minでアプライ

メタノール）にそれぞれ接種し、各形質転換体に対した。ELISAでの活性測定及び280nmにおける吸収をし、mut+であるかmutsであるかを調べた。mutsのうち指標として、活性画分を集めた。

１株（G1と命名）を以後の実験に用いた。

d〔2〕FP6発現株G１の培養
a

陽イオン交換HPLC
上記活性画分を、１mMPMSF、10mM２メルカプト

エタノール、５％（v/v）グリセロール、20mM酢酸

前培養
100mlのBMGY（１％（w/v）Bacto Yeast Extract,

塩緩衝液（pH5.5）で５倍に希釈し、同液で平衡化し２％（w/v）BactoPeptone、1.34％（W/V）YNB、

たSP５PW（東ソー、7.8mmIDx7.5cm）に流速１100mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）、１％（v/v）

ml/minでアプライした。送液後、同液でカラムを洗浄

グリセロール、0.00004％ビオチン）培地に100μlの

し 、 ０ mM〜 200mM NaClの 濃 度 勾 配 を か け た 。

20％グリセロール凍結株G１を接種し、市販の培養装

ELISAでの活性測定及び280nmにおける吸収を指標と置（NBS社製、G-20型）にて28℃、200rpmの条件でして、活性画分を集めた。

24時間培養した。

fs

陰イオン交換HPLC
上記活性画分を0.1％Tween20、10mM２-メルカプ

本培養
8rのBMGY（1.5％（w/v）Bacto Yeast Extract、

トエタノール、20mM Tris-HCl（pH7.6）で12倍に希３％（w/v）Bacto Peptone、その他は上記BMGYと同釈し、同液で平衡化したDEAE5PW（東ソー、一組成）培地に前記培養液100mlを接種し、16rのジ21.5mmIDx15cm）に流速４ml/minでアプライした。

ャー（NBS社製、SF-116型）にて28℃、350rpm、通送液後、同液でカラムを洗浄し、０mM〜100mM

気量１vvmの条件で溶存酸素濃度をモニタリングしつ

NaClの濃度勾配をかけた。280nmにおける吸収を指標として、活性画分を集めた。

つ培養を行った。
培養開始から14時間後、溶存酸素濃度が急激に上昇したことによりグリセロールの枯渇を確認し、培〔4〕アッセイa

ELISA

地にメタノール300ml、Bacto Yeast Extract 15g、抗ヒトgp130抗体AM64 12）を固定化してブロッキン

BactoPeptone 30gの混合水溶液2rを添加し、FP６のグした96穴イムノプレートに、可溶型gp130発現ピキ

発現を誘導した。メタノール添加後24時間で培養を

アパストリスの培養上清を添加して、gp130を結合さ終了し、培養液を集めた。

せた。これに検体を加えて４℃で３時間インキュベ〔3〕FP6の精製ートした。gp130に結合したFP6は、１次抗体としてa

ウサギ抗ヒトIL-6ポリクローナル抗体、２次抗体とし吸着流動床
培養液10rを１mM EDTA、１mM PMSFになるよてアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギIgG抗うに調製した後、水に対して3.5時間透析した。次に、体、基質にp-ニトロフェニルリン酸を用いて発色させ、終濃度が５mMになるように酢酸ナトリウムを添加

参照波長を492nmとしたときの405nmの吸光度で測定し、更に酢酸を加えpH5.5にした。

した。

ストリームライン-SP（カラム；STREAMLINE C-s

BAF130の増殖

50 ; 5cm ID x 100cm、ゲル；ストリームライン用BAF130細胞の懸濁液を、96穴プレートに５x10５細SP；600ml、アマシャムファルマシアバイオテク社）

胞／ml、５x10 ４細胞／ウエルとなるように添加し、を20mM酢酸塩緩衝液（pH5.5）で平衡化し、上記精FP6を０〜500ng/mlの濃度範囲で添加した。20時間後、製原料を線速毎時250cmで送液した。20mM酢酸塩緩Cell Counting Kit（和光純薬工業）で１時間発色させ、衝液（pH5.5）で洗浄後、250mM NaCl、５％（v/v）

参照波長を600nmとしたときの405nmの吸光度を得

グリセロール、１mMPMSF、20mMリン酸塩緩衝液

た。FP6非添加時の吸光度とFP6を過剰量加えたとき

（ ７ ）

８

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.44（2000）の吸光度の半値を示すFP6の濃度を１unit/mlと定義した。
dロニーの同定を行った。

3．結果および考察

コロニー形成細胞の増幅
ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞（BioWhittaker社）〔1〕各種リンカー配列を有するIL-６R・IL-６融合蛋
白質の活性比較

2500個と各種造血因子を含む無血清培地Stem Span
SFEM（Stem Cell社）１mlを24穴ウエルに分注し、通常、一本のポリペプチド鎖から成る融合蛋白質

37℃、５％CO２、湿度100％の条件で浮遊培養した。

においては、２つの蛋白質がそれぞれ本来の構造を

０、３、５、７、10日後、細胞500個と40％メチル

とりうるように、間に自由度の高いアミノ酸から成

セルロース、30％ウシ胎児血清アルブミン、１％るポリペプチドリンカーが挿入される。実際、他のBSA、0.01mM２-メルカプトエタノール、SCF

グループから報告されているIL-６R・IL-６融合蛋白（100ng/ml）、TPO（４ng/ml）、EPO（２U/ml）、IL-３

質はリンカー配列（ArgGlyGlyGlyGlySerGlyGly（20ng/ml）、IL-６（100ng/ml）、G-CSF（10ng/ml）を

GlyGlySerValGlu）を含む13）。しかし、リンカー配列

含むα-MEM１mlを35mm浮遊培養用プラスチック培

は生体にとって異物であるから、リンカー配列をも養皿に分注し、37℃、５％CO２、湿度100％の条件でたない構造である方が、体内投与時に抗原性の低下

半固定培養を行った。２週間後、倒立顕微鏡下の観を期待できるので望ましい。
われわれはリンカー配列をもたないIL-６R・IL-６

察でコロニーの同定を行った。
f融合蛋白質でも、立体障害を起さず十分な活性を有

巨核球の誘導Mega Cult-C complete kit without cytokines（Stem Cell

するようなIL-６RとIL-６の結合箇所がありうるとの社）を用い、専用チャンバーあたりCD34陽性細胞仮説をたてた。これを実証するために、Fig.１に示す

5000個と各種造血因子を加えて培養した。12日後、ようにリンカー配列を有する12種類のIL-６R・IL-６

抗ヒトGP2b3a抗体を用いたAPAAP染色法により、融合蛋白質（FP6）とリンカー配列をもたない12種類

巨核球３個以上の集まりをコロニーとして巨核球コのFP6をデザインした。それぞれをピキアパストリス

Relative activity（％）

100

10

1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

C-terminal residue Polypetide linker
of IL-6R
L344
SSELV
A323
GGGGS
A333
GGGGS
A323
GGGGSGGGGSA333
GGGGSGGGGSI343
GGGGSGGGGSA333
GGGGSGGGGSGGGGS
L334
P
A333
GG
A333
GGGG
I343
GG
I343
GGGG

No.
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24

C-terminal residue Polypeptide linker
of IL-6R
S361
─
D358
─
T352
─
R346
─
I343
─
I343
─
K338
─
K338
─
T335
─
L334
─
A333
─
A323
─

The N-terminal residue of IL-6 is P29 for No.18 and 20,V30 for No. 22 ,and A28 for the others.

Fig.１ Cell growth assay of the supernatant of Pichia pastoris transformed with each IL-6R/IL-6 fusion
protein. N-terminal of IL-6 is Pro(29) for No. 18 and 20, Val(30) for No. 22, and Ala(28) for
the others. Data represent the average of 5-14 independent Pichia pastoris transfectants.

（ ８ ）東ソー研究・技術報告 第44巻（2000）９で発現させ、上清中のFP6の生物活性をBAF130株にた結果（データは示さず）、38番目のAsp残基を選んより調べた。

だ。すなわち、N末端側の222アミノ酸残基はIL-６R

Fig,１から明らかなように、IL-６RのC末端が338番

領域（IL-６RのN末端112番目バリン残基から333番目

目のリジン残基（No.20）、335番目のトレオニン残基のアラニン残基まで）でC末端側の175残基はIL-６領（No.21）、334番目のロイシン残基（No.22）、333番目

域（N末端38番目Aspから212番目のMetまで）であり、のアラニン残基（No.23）、323番目のアラニン残基

２つ領域の間にリンカー配列をもたず、397アミノ酸（No.24）の５種類のFP６は、リンカー配列を有する残基の一本のポリペプチドであるFP６を以下の実験

ものにほぼ匹敵する活性を示した。この結果はFP６に用いた。

が活性を示すのにリンカー配列は不要であることを〔2〕FP6の調製示す。Fig.２にリンカーをもたないFP6（a）とリンカ

a

分子量及び等電点的に均一なFP6の精製
FP6発現ピキアパストリス株G１を16リットルジャ

ーを有するFP6（b）の、予想される構造を示す。
われわれはIL-６RのC末端として333番目のアラニーで培養して得られた培養上清から、４段階のHPLC

ン残基を選んだ。更にIL-６のN末端の最適化を行っにより、精製を試みた。HPLCの最終段階である
DEAE５PWの溶出パターンをFig.３に示す。

（a）FP6（pI6.4a）とFP6（PI6.4b）はDEAE５PWでは溶NH２

出位置が異なり、等電点の違いが示された。しかし、
IL-6

後にFig.４に示すように、等電点電気泳動から得られ
CO

O

H

IL-6R

た等電点はいずれも6.4であった。
16リットルジャー１バッチから得られる各ステージでの収率をTable１にまとめた。
s

等電点の異なる成分間の比較

pI6.7
（b）

pI6.4aNH２

pI6.4b

IL-6

pI6.1

OD280

pI5.9

CO

O

H

IL-6R

100mM
pI5.6

0

150

300

450

600

［NaCl］
0 mM
750

vol

Fig.３ Elution pattern of FP6 on DEAE5PW. A profile ofabsorbance at 280 nm of the DEAE5PW column
chromatography is shown. The isoelectric point ofeach peak obtained by the isoelectric focusing is
indicated.

polypeptide linker

Fig.２ Schematic illustration of FP6 without (a) or with(b) polypeptide linker between IL-6R and IL-6.

Table１ Purification of FP６
Purification step

Volume(ml)FP6(mg)Recovery(％)

Harvest Culture

9，900

232

100

Streamline-SP

342

102

44

G3000SW

31

28

12

SP-5PW

14

24

10

DEAE-5PW

35

16*

6.7*

*Data represent FP6(pI6.7)alone, but not FP6(pI6.4a), FP6(pI6.4b), FP6(pI6.1),
FP6(pI5.9) or FP6(pI5.6).

（ ９ ）

10

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.44（2000）

untreated
Specific activity（units/mg × 10 - 7 ）

）

b）

6 .1

6 .4

）

a）

6 .7

6 .4

pI
6（

pI
6（

pI
6（

FP

FP

FP

pI
6（

FP

Endoglycosidase H
digestion

100− ＋ − ＋ − ＋ − ＋

53 kDa
46 kDaFig.４ SDS/PAGE of FP6. Each of FP6(pI6.7), FP6(pI6.4a),FP6(pI6.4b), and FP6(pI6.1) with or without
endoglycosidase H digestion was analyzed byelectrophoresis on a 0.1％ SDS/12％ polyacrylamide
gel under a reducing condition.

digested withendoglycosidase H

10

1
PI
6（

PI
6（

PI
6（

PI
6（

FP

FP

FP

FP

）

a）

）

b）

6.7

6.4

6.4

6.1

）

b）

6.1

6.4

）

a）

6.7

6.4

pI
6（

FP

pI
6（

FP

pI
6（

FP

pI
6（

FP

Endoglycosidase H
digestion

Fig.６ Specific activity of FP6 by BAF130 cells assay.
The specific activity of each of FP6(pI6.7),
FP6(pI6.4a), FP6(pI6.4b), and FP6(pI6.1) withor without endoglycosidase H digestion was
obtained by the method described in thematerials and methods.

− ＋ − ＋ − ＋ − ＋
pI 6.7
pI 6.4pI 6.1活性の差は認められなかった（Fig.６）。
このことは、糖鎖の有無や糖鎖の電荷の違いは、

Fig.5

Isoelectric focusing of FP6. Each of FP6(pI6.7),
FP6(pI6.4a), FP6(pI6.4b), and FP6(pI6.1) with orwithout endoglycosidase H digestion was analyzed
by a pre-cast polyacrylamide gel for analyticalisoelectric focusing.

活性に影響しないことを示す。
〔3〕FP6の薬効以下の検討は、糖鎖を有するFP6（pI6.7）を用いて行った。
a

ex vivo増幅効果

単離された主要４成分（FP6（pI6.7），FP6（pI6.4a），

FP6及び他のサイトカインによる、市販のヒト臍帯

FP6（pI6.4b），FP6（pI6.1））のSDS/PAGEのパターン

血由来CD34陽性細胞を無血清で浮遊培養させたときをFig.４に、等電点電気泳動のパターンをFig.５にその造血前駆細胞の増幅効果を調べた。培養前の造血れぞれ示す。

前駆細胞の数と培養後の造血前駆細胞の数をそれぞ

Fig.４から明らかなように、どの成分も分子量は53kDaであったが、エンドグリコシダーゼHを用いたれコロニーアッセイで求め、造血前駆細胞の増幅率を求めた。

N型結合糖鎖の切断により、46kDaに移行した。また、Fig.７から明らかなように、FP6あるいはSCFは単

Fig.５から明らかなように、成分間で異なっていた等

独では効果を示さない。しかし、FP6+SCFでは顕著

電点は、N型結合糖鎖の切断により、すべて6.7になな効果が認められた。その効果はFP6の代わりにIL-11

った。このことは、成分間で等電点が異なる原因は、

あるいはTPOを用いたときを上回った。このことは造N結合型糖鎖の電荷の違いによるものであり、FP6

血幹細胞や造血前駆細胞の大部分が、gp130陽性であ（pI6.7）の糖鎖は電荷をもたないことを示す。実際、

るが、IL-11R陰性であることを示唆する。また、

ピキアパストリスが生産する組換え蛋白質では、ハ

gp130の刺激はTPOからの刺激よりもex vivo増幅に有イマンノース型糖鎖にリン酸基がホスホジエステル

効であることを示す。

結合している成分の存在が報告されている 。
14）

最近、各種サイトカインの組み合わせでヒトCD34

次に、上記４成分の比活性をBAF130細胞により求陽性細胞を培養して、NOD/SCIDマウス（免疫不全マめた。その結果、成分間で比活性の差はなかった。

ウス）に移植した場合に、一生涯にわたって血球細更に、どの成分についても、糖鎖切断除去による比胞を供給し続けるか、すなわち、移植したCD34陽性（ 10 ）

東ソー研究・技術報告 第44巻（2000）

20

3- 20 cells/colony
21- 49 cells/colony＞50 cells/colony

35

Day３
Day５
Day７
Day10

Number of megakaryocyte colonies

30

15

Fold increase

11

10

25
20

15

10

5

5

0
61

/m

ng

0n

61

O
10
0n
SC
l＋

m
F

F

SC

l＋

m

SC
l＋

g/

g/

0n

l

l

m

m

g/

0n

10

10
g/

m

g/

0n

0n

10

25

11

6

−

TP

IL

FP

F
SC

6

FP

−

l
m
g/
0n
l
10
m
F
g/
SC
0n
l＋
10
F
/m
l
SC
ng
m
l＋
50
g/
n
m
O
0
g/
TP
10
l
0n
F
10
/m
SC
g
11
l＋
−
0n
/m
IL
10
F
ng
l
SC
50
/m
g
l＋
62
0n
/m
FP
10
ng
l
CF
00
m
S
g/
61
l＋
m
FP
0n
g/
10
F
SC
l＋

FP

FP

0

l

l

m

m

g/

0n

l

g/

0n

m

g/

0n

10

10

F

10

FIg.８ Megakaryocyte colony formation in non-serum
containing suspension cultere of CD34＋ cells
supplemented with single factors or combinations.
Data represent mean of four cultures.

Fig.７ Generation of total progenitor cells in non-serum
containing suspesion culture of CD34＋ cells
supplemented with single factors or combinations.
Data represent mean of triplicate cultures.

細胞中に造血幹細胞が存在するかどうかを調べる方

4．結論

法が報告されている15，16）。ここでも、gp130を刺激す

本研究により、ポリペプチドリンカーをもたないるサイトカインを含む組み合わせの有効性が示され直結型の組換えIL-６R・IL-６融合蛋白質（FP6）がている。これらの結果と合わせると、FP6+SCFはex

gp130の強い刺激剤として調製された。FP6はピキア

vivo増幅に最適の組み合わせであると思われる。

パストリス種の酵母で発現され、分子量的にも等電s

点的にも均一な状態にまで精製された。精製FP6は幹巨核球誘導効果
血小板は巨核球が分裂して生じる。FP6の巨核球誘細胞増殖因子（SCF）存在下で、浮遊培養中のヒト造導効果を、既に血小板増加剤として米国で認可され血前駆細胞を顕著に増殖した。将来的には、FP6はているIL-11及び現在血小板増加剤として開発中のSCFとの併用で、造血幹細胞のex vivo増幅剤として

TPOと比較した。

臨床応用されることが期待できる。また、FP6は巨核

Fig.８から明らかなように、FP６はIL-11より強い効果を、またTPOとほぼ同等の効果を示した。このこ

球前駆細胞から巨核球への分化を誘導する効果を有することも示された。

とはCD34陽性細胞中に含まれる造血前駆細胞の一種である巨核球前駆細胞はgp130陽性であるが、IL-11R

文

陰性であることを示唆する。また、gp130の刺激は

１）保川

TPOからの刺激と同様に、巨核球への分化に重要であ献清，浅越義弘，斉藤貴司，丸尾直子，三宅俊男；東ソー研究報告，32，161（1988）
２）Yasukawa, K. and Saito, T. Biotech. Lett., 12，ることを示す。
未分化な細胞が未分化な状態を保ったまま増幅す

419（1990）

るのにgp130の刺激が有効であることは、造血系細胞

３）保川だけでなく、神経細胞

４）Vollmer, P., Peters, M., Ehlers, M., Yamage, H.,

17，18）や胚性幹細胞

19）でも報告

清；免疫薬理，10，398（1992）

Matsuba,

されている。

（ 11 ）

T.,

Kondo,M.,

Yasukawa,

K.,

12

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.44（2000）

Buschenfelde, K., and Rose-John, S.;J. Immunol.

Meth., 199，47（1996）
５）保川

T.; Blood, 93，2525（1999）
12）Saito, T., Taga, T., Miki D., Futatsugi, K.,清，斉藤貴司，二木研輔，鈴木浩；東Yawata, H., Kishimoto, T., and Yasukawa, K.; J.

ソー研究報告，35，77（1991）

Immunol. Meth., 163，217（1993）

６）Yasukawa, k., Saito, T., Fukunaga, T., Sekimori,13）Fischer, M., Goldschmitt, J., Peschel, C.,

Y., Koishihara, Y., Fukui, H., Ohsugi, Y.,

Brankenhoff, J. P. G., Kallen, K-J., Wollmer, A.,

Matsuda, T., Yawata, H., Hirano, T., Taga, T.

Grotzinger, J. and Rose-John, S.; Nature Biotech.,and Kishimoto, T.; J. Biochem. 108，673（1990）

15，142（1997）７）保川
村清，家亀晴彦，井出輝彦，田崎誠一，中14）Montesino, R., Nimtz, M., Quintero, O., Garcia,

誠，村山敬一，勝浦公男；東ソー研究報告，

R., Falcon, V., and Cremata, J. A.; Glycobiology,

41，23（1997）

９，1037（1999）８）Sui X., Tsuji K., Tanaka, R., Tajima, S.,15）Kollet, O., Aviram, R., Chebath, J., Nagler, H.,

Muraoka, K., Yashida, M., Ebihara, Y., Ikebuchi,

Shultz, L., Revel, M., and Lapidot, T.; Blood,K., Yasukawa, K., Taga, T., Kishimoto, T., and94，923（1999）

Nakahata, T.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92，16）Ueda, T., Tsuji, K., Yoshino, H., Ebihara, Y.,2859（1995）

Yagasaki, H., Hisakawa, H., Mitsui, T., Manabe,

９）Kimura, T., Sakabe, H., Tanimukai, S., Abe, T.,
Urata, Y., Yasukawa,A., Tanaka, R., Kobayashi, K., Ito, M.,

K., Okano, A., Taga, T.,

Yasukawa, K., and Nakahata T.; J. Clin. Invest.,

Sugiyama, H., Kishimoto, T., and Sonod, Y.

Blood, 90，4767（1997）

105，1013（2000）
17）Ikeda, K., Kinoshita, M., Tagaya, N., Shinojima,

10）Tajima, S., Tsuji, K., Ebihara, Y., Sui, X.,

T., Taga, T., Yasukawa, K., Suzuki, H., andTanaka, R., Muraoka, K., Yoshida, M., Yamada,K., Yasukawa, K., Taga, T., Kishimoto, T. andOkano, A. Brain Res. 726，91，（1996）
18）滝沢琢己、柳澤亮、保川清、石黒敬彦、中Nakahata, T.; J. Exp. Med., 184，1357（1996）

島欽一、田賀哲也；日本分子生物学会（1999）

11）Sui X., Tsuji K., Ebihara Y., Tanaka, R.,19）Yashida, K., Chamber, I., Nichols, J., Smith, A.,

Muraoka,K.,

Yoshida,M.,

Yamada,K.,

Saito, A., Yasukawa, K., Shoyab, M., Taga, T.

Yasukawa, K., Taga, T., Kishimoto, T., Nakahata,

and Kishimoto, T.; Mech. Dev., 45，163（1994）（ 12 ）

東ソー研究・技術報告 第44巻（2000）

著者

氏名 驛 田 悌 二
Teiji EKIDA著

者

氏名 土 屋 滋 夫

著

者

氏名 飯 田Shigeo TSUCHIYA

13

著
寛

者

氏名 三 木 大 輔

Hiroshi IIDA

Daisuke MIKI

入社 昭和59年４月２日

入社 平成８年４月１日

入社 昭和63年４月１日

入社 昭和62年４月１日

所属 東京研究所

所属 東京研究所

所属 東京研究所

所属 東京研究所

バイオ有機分野

バイオ有機分野

バイオ有機分野

バイオ有機分野

主任研究員

副主任研究員

主任研究員

主任研究員

著

著

著

著

者

氏名 井 出 輝 彦
Teruhiko IDE

者

氏名 田 崎 誠 一

者

氏名 中 村Seiichi TAZAKI

誠

Makoto NAKAMURA

者

氏名 保 川清

Kiyoshi YASUKAWA

入社 平成元年４月１日

入社 昭和60年３月16日

入社 平成２年３月16日

入社 昭和59年４月２日

所属 東京研究所

所属 東京研究所

所属 東京研究所

所属 東京研究所

バイオ有機分野

バイオ有機分野

バイオ有機分野

主任研究員

著

バイオ有機分野
主任研究員

者

氏名 石 黒 敬 彦
Takahiko ISHIGURO
入社 昭和58年４月１日
所属 東京研究所
バイオ有機分野
主席研究員（ 13 ）