Contents: 180413

１ 大腸菌のことを知ろう！ （株、生育、増殖曲線、クローン、処理方法）	

2 生命科学の進め方：変異体の意味	

3 遺伝子のクローン化の実際(pomAの例）	
ライブラリ、クローン、シングルコロニーの意味、相補	大腸菌：遺伝学のツール

単細胞、核がない、外膜と内膜・ペリプラズム・サイトプラズム、細胞壁（ペプチドグリカン）	
生命科学のモデル生物：クローニングホスト、タンパク質大量発現、えさ（線虫）	
でも、分かっていないこともたくさんある！	

さまざまな大腸菌株
K-12	
1922年にアメリカの病院で快復期のジフテリア患者の便から分離、Stanfordで保存	
DH5αやJM109などのクローニングホストはK-12株由来	

B株	
1942年にファージT1, T7の研究から名前がつけられた	
プロテアーゼ遺伝子lon, ompTを欠損しているので、タンパク発現用に使われる	BL21(DE3)など	

病原性大腸菌	
腸管病原性大腸菌（EPEC, enteropathogenic）小腸に感染、下痢、腹痛等急性胃腸炎をおこす	
腸管侵入性大腸菌（EIEC, enteroinvasive）大腸に感染、赤痢様の症状をおこす	
毒素原性大腸菌（ETEC, enterotoxigenic）小腸に感染し下痢をおこす。毒素を産生	
腸管出血性大腸菌（EHEC, enterohemorrhagic）腹痛、下痢、血便をおこし、ベロ毒素産生により溶血性尿毒症症候群（HUS）、脳症をおこす。O157など。	

大腸菌を生育させる
必要な元素	
Carbon (C): エネルギー源、細胞のメインの構成要素、細胞の乾燥重量の50%	
Nitrogen (N): タンパク質や核酸、細胞の乾燥重量の14%	
Sulfur (S): タンパク質、細胞の乾燥重量の4%	
Phosphorus (P): タンパク質や核酸、細胞の乾燥重量の4%	
trace elements (Fe, Cu, Zn, molybdenumなど、cofactorに使われる）	

M9 medium	

LB medium	bacto-tryptone	
Na2HPO4	
KH2PO4	
bacto-yeast extract	
M9	  salt	
NaCl	NaCl	NH4Cl	Glucose	
MgSO4	
(ビタミン、アミノ酸を加える場合もある)	
CaCl2	

震盪培養する！	  
（酸素が必要）	

シングルコロニー形成

１つの細胞から１つのコロニーが形成される（シングルコロニー）	  つまり、シングルコロニー内の菌は遺伝的に同一のクローンである	
コンタミしたり、おかしなことが起こったら、シングルコロニーに戻って解析しなおす	（シングルコロニーには、	
（シングルコロニーには、数億から数１０億個の菌が存在する）	

生育曲線

遊泳解析	

タンパク発現	

コンピテントセル	

終夜培養	オートクレーブ

高温の蒸気を循環させる	

タンパク質内の水素結合が壊れて、凝固する。	

細胞の機能が失われて死滅	100ºCの蒸気を海面から１気圧上（2気圧）におくと121ºCになる。
この条件で２０分おくと、完全に死滅する(121.7ºCで107.8 kPa: TOMY）	

生命科学の基本手法：変異体の取得
生命現象を分子レベルで理解したい：「分かった」と言えるには？	
現象に関わる遺伝子・タンパク質は何か？	
遺伝子の同定、クローニング、塩基配列決定	
タンパク質の発現（時期・量・位置）	
遺伝子・タンパク質の働きは？	
タンパク質の機能残基、立体構造、発現の制御機構	  タンパク質の相互作用する相手、ネットワーク	  細菌はどうやって泳ぐのか？	
「べん毛」という装置はどんな素子で出来ているのか？	
各素子の役割は？	
素子（部品）は、壊れると機能が推測できる	 変異体の単離がスタート

細菌べん毛の変異体
変異処理した菌を	  堅いプレートにまく	

コロニーをひとつずつ	  柔らかいプレートに植える	

mutagenesis	
細胞に変異源（UVや化学試薬）	  を与えて変異を誘発する	

処理した細胞を一旦プレートの上で	  培養する。このとき一つ一つの集落	  がひとつの細胞由来になる	  １つの細胞由来の集落	  コロニーという	  FliGの例	

運動能欠損株	

screening	
柔らかい寒天培地の上にコロニーを	  接種する。運動能をもつ株は広がる	  ことができる（左図）	   characterization	
identification	
変異遺伝子とその変異アミノ酸を	  同定する	  べん毛の機能に関係する遺伝子が	  同定できる	

mutagenesis	 UV, mutagen (EMS), transposon	
selection (screening)	
どんな変異体を、どうやって単離するのか？	

characterization	
単離した変異体の特徴付け	cloning	
変異部位の同定、遺伝子のクローン化	

sequencing	
expression	Na+駆動型べん毛モーター固定子

Na+-type	

H+-type	
S	

遺伝子pomA, pomBはどのようにしてクローン化されたのか？	

pomAB をクローン化した人たち

浅井友香子	

小嶋誠司	

奥西勲	

西岡典子	

川岸郁朗	

本間道夫	

べん毛モーター固定子の変異体とは？
親株（運動能野生型：VIO5株）の細胞	  に変異源（UVや化学試薬）を与えて	  変異を誘発する	

柔らかい寒天プレートに接種し	  運動能が全くないものを選抜	
-­‐ べん毛が生えていない	-­‐ べん毛は生えているが泳がない	

VIO586株の取得	
（固定子欠損変異体の候補株）	

変異体形質の相補変異体形質の解釈	
モータータンパク質が故障したために、べん毛は形成するが回転できない	モータータンパク質をコードする遺伝子に欠損（変異）が生じ、故障したタンパク質が	  つくられてしまった、あるいはタンパク質そのものが作られなかった	変異株に、プラスミドにコードされた正常な遺伝子を導入し発現させれば、	  正常なタンパク質が作られてモーターは回転するようになるのでは？（相補する、という）	

染色体	

軟寒天培地	  運動リング	

pomA	

pomA	

pomA	

野生型	

変異	変異	
pomA	

X	

X	

運動能を相補する	  プラスミドを	  単離すれば良い	  遺伝子ライブラリーの作成
VIO586株の運動能を相補する遺伝子をもつプラスミドをどうやって単離するか？	
親株VIO5の染色体には、故障していない遺伝子があるはず	
親株VIO5の染色体を小さく切断し、それぞれプラスミドに組み込む	
あるプラスミドには、変異のない元の遺伝子が組み込まれている	

VIO5株染色体	
制限酵素で切断	  (EcoRI,	  HindIIIなど）	

ligaseで	  プラスミドに	  接続	VIO5株染色体上の各遺伝子が	  個々のプラスミドに乗った集まり	  （ライブラリという）	  運動能欠損変異を相補するプラスミドの単離
pomA	

X	

変異	

ポイント	
一つの細胞にはひとつのプラスミド	  しか導入することができない	  （不和合性という）	

遺伝子ライブラリを	  VIO586株へ導入する	
プラスミドには薬剤耐性遺伝子が乗っているので、薬剤入り培地で生える細胞は	  プラスミドを持っていることになる。	
pomA	

pomA	

pomA	

pomA	

変異	

変異	

変異	

変異	

X	

X	

X	

X	

当たり	
どうやってこの細胞だけを選び出す？	  
（単離する、という）	

運動能欠損変異を相補するプラスミドの単離
pomA	

pomA	

pomA	

pomA	

変異	

変異	

変異	

変異	

X	

X	

X	

薬剤入り軟寒天培地に植えると。。	

X	

当たり	

このように	  広がってくる	
シングルコロニー形成	

プラスミド単離	
（クローン化成功！）	

ポイント	
１つの細胞が分裂を繰り返し集落（コロニー）を形成する。つまり各シングルコロニーは	  １つの細胞に由来する遺伝的に同一の集団（クローンという）である。	  
シングルコロニーに含まれるプラスミドは同一であり、このコロニー１個から培養を行い	  プラスミドを単離すれば、目的の遺伝子をもつプラスミドのクローンを得られる。	  クローン化の道筋
さまざまな染色体のDNA断片が含まれる	  （ショットガンクローニング）	

野生型 VIO5	
EMS mutagenesis	

Eco RI 断片	

VIO5株の染色体DNA	pSU21にライゲーション	

pomA欠損株の単離(VIO586)	
運動能が欠損！	
エレクトロポレーション	

VIO586/pYA2032	
運動能が回復！（相補という）	

クローニングベクター：pSU21

pSU21にクローン化されたpomA
VIO5の染色体を断片化（Hind III と Eco RI)	VIO586の運動能を相補したプラスミド	
Hind III : pYA101	
Eco RI : pYA201	
制限酵素マップを作成	
最小断片をもつpYA2032の挿入配列をシークエンス(pomA)	
ホモロジーサーチで、後ろにmotB に似た配列が！	
最初にpYA101で単離していたDNAに戻って、Sac I 断片部分をシークエンス、pomB を発見