技術紹介

株式会社同仁化学研究所

マイクロプレートを用いた
新たなバイオフィルム評価方法
高 橋政 孝，高 口唯 奈，江 藤

1 は じ め に陽 介，中 尾美紀子

2 バイオフィルム測定法

1･1 バイオフィルムとはバイオフィルム内の菌やバイオフィルム形成量の評価

バイオフィルムは，細菌などの微生物が産生する菌体には，その対象に応じて種々の方法が存在する．例え

外多糖が堆積して高次元構造体を形成したものであり，ば，菌を測定対象にした手法では，コロニー形成法の水が存在する様々な固体の表面などに発生する．微生物

他，顕微鏡やコールターカウンター，フローサイトメーはバイオフィルム内に身を置くことで外の環境から守らターによる計数，代謝活性を指標にテトラゾリウム塩をれ， よ り 生 存 し や す い 環 境 を 得 る こ と が で きる（図用いた手法，ATP 測定法などがある．また，総乾燥量

1）

1） ．

やクリスタルバイオレット（以下，CV）法などはバイオフィルム形成量の評価に用いられる．いくつかの手法を表 1 に示すが，バイオフィルムの分析手段は非常に多岐にわたっているために，標準化が進んでいないことが課題である．
一般的に微生物や菌の測定は，コロニー形成法のように操作が煩雑でトレーニングが必要とされている．一方，バイオフィルム評価で幅広く利用される CV 法は，比色試薬を用いた吸光度測定により結果が得られるた
図1

バイオフィルムの形成

め，コロニー形成法などの計数作業で発生しがちな属人的な測定誤差を抑えられるといった利点がある．しか1･2 近年のバイオフィルム研究の背景

し，CV 法は万能ではなく，バイオフィルム形成後およ近年，バイオフィルムが要因となる感染症が報告されびその後の CV 染色後に洗浄の工程があるが，洗浄操作

2）3），医療分野や歯科分野で問題視され始めていで物理的にバイオフィルムが担体表面から剥離してしまる．これは，バイオフィルムが感染症の原因菌などのバうことでデータのバラつきを生じ易い．更に，検体数がリアーとなることで，そのマトリックス内に存在する菌増えると操作工程が多くなり測定に時間を要するため，に対して高い薬物耐性を示すことが理由と考えられてい慎重な操作と同時に効率性が要求される．このように，る．例えると，一度，バイオフィルムが形成されると，これらの操作はまだまだ煩雑で，また，そこから生じる菌にとっては頑丈な家の中に住むことになり，外敵（薬測定誤差の問題は，多検体を処理する分析現場で用いる剤）が来ても何ら怖くないという状況になってしまうのにはハードルとなり，このような課題はバイオフィルムである．

研究の大きな妨げにもなっている．ておりこのため，バイオフィルムの危険性が潜む様々な分野において，バイオフィルムの形成阻害や分解のメカニズム解明に焦点を向けた研究が進められている．例えば，長期間患者の体内に埋め込まれる医療器具やカテーテルなど手術用医療器具，また歯科材料やその周辺器具などは，高度な感染症防止策が要求される．その他，私たちの生活に身近な浴室や台所など住環境および食品の衛生管理・向上を目指して，多くの研究機関や企業が研究を加速している．
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表 1 バイオフィル評価方法の種類4）
プレートカウント（コロニー計測），顕微鏡
直接的な方法 による細胞計数，コールター細胞計数，フローサイトメトリー，蛍光顕微鏡など
乾燥質量，全有機炭素，クリスタルバイオ
レ ッ ト（CV） 法， テ ト ラ ゾ リ ウ ム 塩 法，関節的な方法
ATP 生物発光法，総タンパク質測定法，水晶振動子（QCM）など
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3 バイオフィルム測定法の改良
前述の通り，バイオフィルム評価方法に対する要望
は，多検体処理，簡便さ，迅速さである．ここでは，これらの課題を克服した三つの異なる測定手法を紹介する．
まず，96 穴マイクロプレート内でバイオフィルムを形成する既存法を改良し，「バイオフィルム形成能」または「バイオフィルム内に存在する菌の代謝活性」を評
価する二つの手法を解説する．これらは，主にバイオフィルム形成阻害剤や抗菌剤等の開発・評価に利用される．一方で，バイオフィルムが形成する担体側に着目した研究アプローチも行われている．そこで三つ目の手法
として，バイオフィルムが形成しにくい（または形成し易い）素材開発や素材の表面改良に対応できるよう，任意の素材を用いて評価ができる手法を紹介する．

3･1 ピンプレートを用いたバイオフィルム測定
菌がバイオフィルムを形成する条件は菌種によって様々で，菌液の濃度や培養時間・培地組成などを検討する必要がある．そこで，96 穴マイクロプレートを用い

図3

バイオフィルム形成量評価方法の比較たバイオフィルム評価手法が，比較的簡便な操作で，複数の条件検討が同時にできることから普及し始めた．し浸されるため，培養後は各ピンの表面にバイオフィルムかしながら，この手法はマイクロプレートのウェルに菌が形成される．既存法と同様に，ウェルの内壁や底にも液を入れて菌を培養して，バイオフィルムがウェルの内バイオフィルムは形成されるが，カルガリーバイオフィ

壁と底面に形成されるため，その後の工程で培養後の菌

ルムデバイス法ではピン表面のバイオフィルムのみを測液や洗浄液および CV 染色液を各ウェルからピペット等定に用いる．これによって，バイオフィルム形成後にバを使用して出し入れする操作が必要になる．また，菌種イオフィルム表面に付着する培地成分を洗浄する際に，や培養条件によっては，バイオフィルムが内壁や底面かあらかじめ，新しいマイクロプレートに洗浄液を入れたら剥がれやすい場合があり，工程中のバイオフィルムのものを用意し，これにピンプレートを移してピンを洗浄

剥離は吸光度測定に影響するため，洗浄工程では慎重な液に浸すことで，一度にすべてのバイオフィルムを洗浄操作が要求される．

することができる．前述した既存法の様にウェルごとにそこで，近年，ピン（またはペグ）と呼ばれる突起物を有する独特なマイクロプレートの蓋（以下，ピンプレート：図 2）を利用する改良法（カルガリーバイオ5）

洗浄をする必要がないため，簡便性・迅速性向上に寄与する手法となった（図 3）．
図 4 に黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を用いフィルムデバイス法）が開発された ．この手法では，て既存法とカルガリーバイオフィルムデバイス法を比較

96 穴マイクロプレートの各ウェルに菌液を入れた後，した結果を示した．CV 染色と洗浄操作を行った後のバピンプレートで蓋をするとピンの先端から一部が菌液にイオフィルムを観察したところ，既存法はバイオフィル，カルガリーバイオムが一部剥離したが（図 4 写真左）フィルムデバイス法では，ほとんど剥離しなかった（図4 写真右）．また，染色後の CV をエタノールに抽出して吸光度を測定した結果，カルガリーバイオフィルムデバイス法は既存法と比べて同一サンプルにおける吸光度のバラつきを抑えることができ，このことは洗浄操作の過程で生じるバイオフィルムの剥離の少なさが寄与していると推察した（図 4 下図）．
実例として，黄色ブドウ球菌に ε-Poly-l-lysine を作用さ せ た 場 合 の「 最 小 バ イ オ フ ィ ル ム 形 成 阻 害 濃 度：
図 2 ピン付きマイクロプレートの蓋
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minimum biofilm inhibitory concentrations（MBIC）」の測
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3･2 バイオフィルム内の生菌代謝活性評価
次に，前述のカルガリーバイオフィルムデバイス法を応用し，バイオフィルム内の生菌の代謝活性を測定する技術を紹介する．
生菌の検出方法には，菌を培養し生じたコロニーを計数する寒天平板培地法，蛍光色素で菌を染色する蛍光染色法，増殖能を持つ菌を検出する DVC 法，特定の菌を検出する FISH 法や遺伝子増幅法等が存在し，目的に応じて使い分けられるが，ここでは菌のエネルギー代謝活動に関与する補酵素 NADH（NADPH）の還元能を利用した手法を採用した．還元性発色試薬と一種として知られるテトラゾリウム塩 WST-1 は，電子メディエー

ターと共存することで NADH（NADPH）から電子を受け取り還元され，ホルマザンと呼ばれる有色（橙色）の物質となる．そのため，生成したホルマザン量と吸光度には相関が有り，この吸光度を測定することで菌の代図 4 バイオフィルム形成評価の比較
黄色ブドウ球菌の CV 染色後のバイオフィルム（既存法：写真左，カルガリーバイオフィルムデバイス法： 写真右）．CV 抽出後のエタノール溶液の吸光度比較（下図）．

図6

微生物代謝活性の検出原理（WST 法）定結果を示した（図 5）．ε-Poly-l-lysine 濃度が高くなるに従って CV 由来の 590 nm の吸光度が減少したことで，黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成が阻害され，そのMBIC 濃度は約 250 μg/mL であることが確認された．
このようにカルガリーバイオフィルムデバイス法は，バイオフィルム形成評価において簡便性と正確性を向上した手法として利用され，様々な薬剤感受性試験の事例が報告されている6）7）．

図 5 S. aureus バイオフィルム形成阻害評価

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図7

微生物代謝活性の測定方法
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謝活性を評価することができる（図 6）．
尚，この WST-1 ホルマザンは，水溶性が高いため培の他の手法との併用を考慮する必要がある．

地中でも不溶化することが無く，また，発色後の退色も3･3 試験片を用いたバイオフィルム測定

ほとんど無いため，吸光度測定に適した試薬として知らピンプレートを用いた手法は，バイオフィルムが形成れ，動物細胞の代謝活性をはじめ種々な生体試料の測定される担体（ピン）の素材がポリスチレン（PS）であ試薬に幅広く採用されている．

るため，バイオフィルム形成能を素材の性質で制御する本手法は，カルガリーバイオフィルムデバイス法のような機能性素材開発のニーズに対応ができなかった．

CV 染色・洗浄工程が WST 溶液を用いた発色反応に替そこで，カルガリーバイオフィルムデバイス法を改良しわる以外は，同様にピンプレートを移動させる操作を行て，任意の素材でもバイオフィルム形成能を評価できるう．そのため，バイオフィルムの剥離を抑えられ，ま手法をここで紹介する．

た，CV 法でも用いる比色のマイクロプレートリーダーを使用することができる（図 7）．

素材開発の現場では，対象の素材を任意の大きさで平板状に加工した「試験片」と呼ばれるものが使用されてテトラサイクリン系抗生物質である minocycline が，バいる．評価方法は，試験片をビーカー等の容器の底に平イオフィルムを形成した黄色ブドウ球菌に与える薬剤効置きし，これに菌液を加えて試験片表面にバイオフィル果を評価した結果を図 8 に示した．同一のマイクロプムを形成させ，その後，バイオフィルムを剥離させないレートで minocycline 濃度および薬剤暴露時間を変えて，よう慎重に試験片を扱いながら測定する．また，対象と各 条 件 に お け る WST-1 ホ ル マ ザ ン 由 来 の 吸 光 度

なる素材は，業種や研究分野で様々あり，プラスチック（450 nm）を測定した．Minocycline 濃度が低い領域ではのように成型し易いものばかりではなく，金属やセラ薬剤暴露時間が長くなるに従って吸光度が高くなるが，ミックなども存在する．そのため，カルガリーバイオ

これは minocycline が黄色ブドウ球菌の代謝活性に与えフィルムデバイス法のような 96 穴マイクロプレートにる影響が弱く，薬剤暴露中も菌が生存して増殖し続けて対応したピンプレートを対象の素材で作成することは，いると考えられる．この結果から黄色ブドウ球菌の代謝コスト面・技術面ともハードルが高く，実現の可能性は活性に影響を与える minocycline 濃度と暴露時間が判り，低かった．

eradication concentrations（MBEC）」は，約 1000 μg/mLの 蓋（ 以 下，TestPiece Holder） を 開 発 し た（ 図 9）．

また，「最小バイオフィルム撲滅濃度 minimum biofilmということが確認された．

そこで，任意の試験片を脱着可能な 24 穴プレート用
TestPiece Holder に試験片を取り付けることで，カルガ

この手法は，生菌の代謝活性を評価することに便利でリーバイオフィルムデバイス法と同様の洗浄・染色操作あるが，前述の通り，バイオフィルムはマトリックス内が可能となり，バイオフィルムが剝がれにくく，多検体の菌を薬剤や外的要因から保護するため，試薬（WST処理に対応した手法となった（図 10）．

溶液）も薬剤と同様，バイオフィルムの内部に存在する本法と既存法を比較したところ，既存法は洗浄操作に菌に対して試薬が作用し難いことが推察される．そのたより試験片からのバイオフィルムの剥離が発生し，試験め，バイオフィルムの表面付近に位置する菌の代謝活性片同士でも剥離の程度に差があることが確認された（図を反映している可能性には留意しなければならない．詳11 写真左）．一方，本法は，洗浄操作を注意深く行うこ細な評価のためには，バイオフィルムに超音波処理等をとは既存法と同様であるが，バイオフィルムの剥離は抑施してバイオフィルム内部の菌も分散した試料を用意えられ，試験片同士の差も殆ど見られなかった（図 11

し，WST-1 による代謝活性評価や寒天平板培地法など

写真右）．CV 抽出エタノール溶液の吸光度測定からも，そのバラつきが抑えられたことが確認された（図 11 下図）．
次 に， 素 材 の 種 類 が 異 な る 試 験 片（ ポ リ ス チ レ ン［PS］，ポリプロピレン［PP］，繊維強化プラスチック

図 8 黄色ブドウ球菌由来バイオフィルムに対する minocyclineの MBEC 評価
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図 9 TestPiece Holder に固定した試験片79図 12 素材毎のバイオフィルム形成量評価
各素材表面に形成した黄色バイオフィルムの CV 染色（上図写真）．CV 抽出後のエタノール溶液の吸光度比較（下図）．

［FRP］， ス テ ン レ ス［SUS］， フ ロ ー ト ガ ラ ス［GL］，
図 10 素材毎のバイオフィルム形成量評価
各素材表面に形成した黄色バイオフィルムの CV 染色（上図写真）．CV 抽出後のエタノール溶液の吸光度比較（下図）．

シリコンゴム［SLC］）を用いて黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成量を評価した．筆者らの培養および測定条件においては，FRP および SLC が他の素材と比較して，バイオフィルムがより形成されたことが分かった（図 12）．このように，本法と試験片を用いることで，種々の素材評価を効率良くまた定量的に行うことが可能となった．

4 ま と めバイオフィルムの評価方法は，これまでに試行錯誤を経ながら，カルガリーバイオフィルムデバイス法などの改良が進められてきたが，今回，筆者らは実際の測定現場の声を元に，検体数や測定条件の検討数の多さ，煩雑な操作，測定値のバラつき等の既存法が抱える課題を克服する測定手法の開発および実用化を行った．
ここで紹介した実施例は，特定の菌を用いた基礎的な評価であり，実際には，私たちの体の中や生活環境中に存在する菌の種類は非常に多く，また，それらが混在した状態で存在する．そのため，バイオフィルムが形成される環境を実験室で如何に再現できるかは，バイオフィルムの評価を行う方々にとって重要な要素であり，様々な条件検討が要求される．このために，今回紹介した測図 11 バイオフィルム形成評価（試験片）の比較
黄色ブドウ球菌の CV 染色後のバイオフィルム（既存法：写真左，本法：写真右）．CV 抽出後のエタノール溶液の吸光度比
較（下図）．

定手法が，この分野の研究・開発に役立ち，多くの産業の発展に寄与できることを期待している．
謝辞
本技術を開発するにあたり，甚大なるご協力を賜りました福80

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岡県工業技術センター 生物食品研究所 塚谷忠之氏，坂田文彦

高口唯奈（Yuina Kouguchi）
株式会社同仁化学研究所（〒861 ─ 2202

氏に深く感謝いたします．

熊本県上益城郡益城町田原 2025 ─ 5）．
E ─ mail : y-kouguchi@dojindo.co.jp

文献1） H. C. Flemming, J. Wingender, U. Szewzyk, P. Steinberg, S. A.
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●●江藤陽介（Yosuke Eto）中尾美紀子（Mikiko Nakao）
株式会社同仁化学研究所（〒861 ─ 2202
熊本県上益城郡益城町田原 2025 ─ 5）．
E ─ mail : u-mikiko@dojindo.co.jp

高橋政孝（Masataka Takahashi）
株式会社同仁化学研究所（〒861 ─ 2202
熊本県上益城郡益城町田原 2025 ─ 5）．
E ─ mail : m.takahashi@dojindo.co.jp

株式会社同仁化学研究所（〒861 ─ 2202
熊本県上益城郡益城町田原 2025 ─ 5）．
E ─ mail : eto@dojindo.co.jp

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