細胞及び蛋白質

膜蛋白質の構造研究

岩田

私たちの体は無数の細 胞 で 構 成 さ れて いま す。 細 胞 の 表 面 は細胞膜という脂質の膜 に よ って 覆 わ れてい ま す。 細 胞 に は 多くの蛋白質が存在し、各種の機能を司っています。

想

京都大学大学院医学研究科

細胞蛋白質

原子

手の指を拡大していくと。。

タンパク質とはタンパク質の形

我々の体は２万５０００種類以上の違 っ た タンパク 質 からできています。
タンパク質は２０種類のアミノ酸が決まった順序（配列）に結合し、鎖状に重合したものです。
異なったタンパク
質は違うアミノ酸配列、長さを持っています。

アルファ ヘリックス

ベータ

シート

タンパク質はそのアミノ酸配列により、局所的にヘリックスやシートのような形をとります。その組み合わせにより全体の形が決まります。
異なったタンパク質は異なった形を持っています。

いろいろな形のタンパク質

膜タンパク質そして膜受容体我々がこれまでに構造解析した膜タンパク質の例

細胞の顕微鏡写真• 光合成系II：植物において、光エネルギーを用い水を酸素細胞膜の中に存在しているタンパ
ク 質 を 膜 タ ンパ
ク質と呼びます。
この内、細胞の外から来るホルモン等の物質を受け取り、細胞の機能を調節する蛋白質を膜受容体と呼びます。

細胞膜と水素と水素に分解する蛋白質である。我々の呼吸する酸素は全てこのタンパク質に由来する。将来のクリーンなエネルギー（水素）の生産への応用が期待される。

脂質膜蛋白質

脂質膜蛋白質血液中のホルモンなど

細胞膜

膜受容体
細胞の中を情報が伝わる細胞そして組織の活動を変化させる(例えば、血管を広げて血圧をさげる。）

葉緑体

明反応を行う膜タンパク質群

2H O + CO -> (CH O) + H O + O
222n2

暗反応

2明反応

（でんぷんを作る） （酸素を作る）

全ての空気中の酸素は光化学系IIにより作られるラクトース輸送体

呼吸鎖酵素群•

人間が呼吸した酸素を用い、栄養分を燃焼することによりエネルギーを作る一連の重要な蛋白質である。その欠陥が多くの遺伝病に関係しており、その治療法の開発に構造の知識が不可欠である。

•糖輸送体：細胞の血液からの糖（栄養源）の取り込みを行う蛋白質であり、その構造は糖尿病治療法の開発等への利用が期待される。

テキスト

構造を用いたヒト遺伝病の解析（エクササイズイ
ントレランスの例、 Andreu et al, N. Engl. J. Med.
341,1999）

２１世紀の岩田研の目標

タンパク質の形を決めて健康になろう！
コレステロールを減らす
スタチン: HMG CoA 還元酵
素の阻害剤

血圧を下げる
Cozaar: アンジオテンシン II受容体拮抗薬

Lisinopril: アンジオテンシン
シトクロム
bc1複合体変換酵素 (ACE)の阻害剤

コレステロールの合成経路

アンジオテンシン（ホルモン）(メバロン酸経路)

による血圧調整の仕組み

アセチルCoA( アンジオテンシン前駆体）

アンジオテンシンノーゲン（補酵素の一種、ビタミンのようなもの）

細胞膜薬の結合場
所

レニン

膜貫通領域

アンジオテンシン I

HMG-CoA
HMG-CoA 還元酵素

これらの標的蛋白質は全て膜タンパク質である

スタチン

アンジオテンシン

アンジオテン変換酵素阻害剤

シン変換酵素アンジオテンシン II
ヘム

アンジオテン

コエンザイムQ10

シン II受容体拮抗剤

コレステロール

アンジオテンシンII

アンジオテンシンII

蛋白質（酵素は触媒の働きをする蛋白質）

受容体­１

くすり（標的蛋白質の働きを押さえる）

毛細血管を収縮させる

ホルモン、代謝物などの物質各種作用。受容体­１と拮抗する作用もある

アンジオテンシンII

アンジオテンシン変受容体­2受容体

換酵素 (ACE)

HMG CoA 還元酵素

(膜受容体)

G蛋白共役複合体(GPCR)

血圧以外にも問題が。。。

•• 各種ホルモン、神経伝達物質等が細胞に情報を伝達する場
細胞表面の細胞膜中に存在する毛根細胞において男性ホルモンからアンドロ

ジェ ン の 産 生を阻害する薬（プロペシア）が効果をあげている。

ホルモン、神経伝達物質

細胞外G蛋白質共役
膜受容体

細胞膜効果器（アデニレートシクラーゼ、ホスホリパーゼ等）（GPCR）

G蛋白質!

"#細胞!

膜GTPGDPGTP

二次伝達物質（cAMP, Ca2+など）

蛋白質の機能修飾

減量前(2003)

減量後(2006)

細胞内細胞活動の変化

７回膜貫通GPCR受容体（GPCR)と創薬
膜受容体は最も多く存在するヒトの膜蛋白質（１０００種以上）です。市販されている薬の５０％以上が膜蛋白質、特に膜受容体に結合して働くことが知られています。

Membrane Proteins: the Last Frontierin Structural Biology• Only ~190 unique membrane protein structures• Less than 10 unique mammalian membrane proteinstructures

膜受容体 30%
30%

その他
47%

1%
1%2%4%

7%

4%
4%

ウシロドプシン（光受容体）

Soluble Proteins (1960-1980)
Membrane proteins from prokaryotes
Membrane proteins from eukaryotes

Coordinates in Protein
Data Bank (PDB)

各種膜蛋白質医薬のターゲットの内訳
膜受容体をターゲットとする医薬の例
抗アレルギー剤、胃潰瘍治療薬、 降圧薬、心不全治療薬、抗不整脈薬、 喘息治療薬、抗うつ薬、片頭痛治療薬、 パーキンソン病治療薬、抗精神病薬など

60,000200

50,000150

40,00030,000100

20,00050

10,000
085

90

9500
Year

05

060 65 70 75 80 85 90 95 00 05
Yearタンパク質構造解析の手順

ERATO岩田ヒト膜受容体構造プロジェクト
受容体構造決定の流れ（２、３、４のプロセスがボトルネック）
1 目的の受容体の遺伝子の単離（クローニング）

遺伝子のクローニング

タンパク質生産

X線回折データの測定

精製

結晶化

構造モデルの構築2受容体蛋白質の大量生産

43結晶化

結晶からの X 線 回 折データの測定

5受容体の構造決定

複数のボトルネックを解消する技
術を平行して開発し、５年間で５­１０個程度の創薬に重要な膜受容体の構造解析を目指す。

最終構造Data Collection

英国放射光実験施設ダイアモンド膜蛋白質研究室

京都研究室 における技術開発

における技術開発(インペリアルカレッジと協力）

膜蛋白質の結晶化を促進す
る技術の開発をめざします。

膜受容体を酵母などを用いて大量に生産する技術の確立をめざします。

自動化により、少ないサンプルから迅速に膜蛋白質結晶を得る技術を確立します。

受容体結晶からのX線回折デ­タを測定する高精度システムの開発をめざします。

結晶化を促進する蛋白質

結晶

受容体

ヒトタンパク質の大量生産

研究体制：受容体発現精製グループ• ２００個程度のヒトGPCRを酵母／昆虫細胞を使って発現させる。

• ５０個程度のヒトGPCRを安定にかつ大量（数mg-数十mg）に精製する技術を確立する。

クローニ発現ング

精製<300200/50

結晶化25

データ

構造測定

解析

105-10- ヒトから大量に取ることはできないので、他の生物を使い生産する。

目的のタンパク質を精製する

S. cerevisiae overexpression screen strategy
サッカロマイセス（パン酵母）を使った(Newstead et al. PNAS 2007)

GPCR生産目的のタンパク

3.0

2.5

2.0

1.5

目的のタンパク

1.0

0.5

G
AL

31ft1

A1R

SsH

KH

1RU
D

3N

AL4

TP
O
4G
A4

DARU

M
PH

3p

XT
1M
1XT
3H

N

H

H

3062
W
IT
R
1Shr

Sec61

YO
L141Is
c1Azr

sp
H

Fur

S. cerevisiae overexpression screen strategy
タンパク質がGFP（蛍光タンパク質）とAG
P10

蛍光標識された膜タンパク質の精製

Hisタグ（精製のための標識）との融合
MP-TEV-GFP-8Hisタンパク質として生産される膜タンパク質後にTEVプロテアー

菌体

GFP
8His

パク

純度確認の電精製に用いるタグ

これまでに酵母で発現に成功している
GPCRと創薬• セロトニン受容体 抗うつ薬、片頭痛治療薬• アデノシン受容体 パーキンソン病治療薬、虚血性心疾患治療薬• タキキニン受容体 気管支喘息治療薬• オピオイド受容体 麻酔薬、麻薬性鎮痛薬、薬物依存治療薬• ヒスタミン受容体 抗アレルギー剤、消化性胃潰瘍治療薬• ドーパミン受容体 パーキンソン病治療薬、抗精神病薬• アドレナリン受容体 降圧薬、心不全治療薬、抗不整脈薬、 気管

精製タン-融合蛋白-最終標品

気泳動-GFP
蛍光イメージC

２２２２２２２２２２支喘息治療薬

タグを用いた精製で可溶化

TEV 10Hisゼで切断

N

界面活性剤

タンパク染色結晶創成グループ• ヒトGPCRの結晶性を飛躍的に向上させる抗体フラグメントまたはバインダー（人工抗体）作成する技術を確立する。

• 発現量の低い(数mg程度）ヒトGPCRに対し、すべての主要な結晶化条件（１０万条件程度）でスクリーニングを行える微少量膜蛋白質結晶化技術を確立する。

• ２５個程度のヒトGPCRの結晶を得ることを目指す
クローニ

発現ング

精製

<300

200/50

結晶化
25データ

構造測定

解析

105-10

達成目標

結晶化リガンドとしての抗体の有用性- 任意の膜蛋白質（特に哺乳類由来）に対して高い特異性と親和性（10-9 Mオーダーの解離定数をもつ）を兼ね備えた抗体を生産するための一連の技術を開発する-抗体が結合することによって膜蛋白質と安定化な複合体を形成する-膜蛋白質／抗体複合体の全体としての親水性表面が拡大して結晶性が向上する- その技術を用いて本プロジェクト期間中に膜蛋白質／抗体複合体の新規構造を，2Å付近での高分解能で決定する

開発すべき3つの要素技術(1) 膜蛋白質の機能的構造（天然のコンフォメーション）を保持したままマウスに免疫する技術(2) 結晶化リガンド候補のハイスループットスクリーニング系(3) 生体免疫系から得られた抗体を進化分子工学の手法により高機能化する技術
Iwata et al.(1995)
Nature 376:660-669

結晶化リガンドを用いた膜蛋白質の結晶化の原理
右は実際に抗体を用いて結晶化された細菌シトクロム酸化酵素の結晶中のパッキング．水色の分子が結晶化リガンドである．

開発すべき要素技術 (1)ヒト赤血球膜バンド３と抗体の共結晶化の実例

膜蛋白質の機能的構造を保持したままマウスに免疫する技術

Antibody BRAC17 (Western negative)

ヒト膜蛋白質の不安定さと抗原性の低さを解決する方法
モノクローナル抗体作製例

膜蛋白質を発芽型バキュロウイルスにディスプレイして，ウイルス外被タンパク質(gp64)のトランスジェニックマウスに免疫する。ターゲットをノックアウトしたマウスを使うとさらに有効。

B3+FabAnti-PepT1 mAb

B3+FabFabB3

PepT1:
H+依存型オリゴペプチドトランスポーター
12回膜貫通，ヒト由来樹立されたモノクローナル抗体の特異性
ゲル濾過
AsPC-1(ヒト膵癌細胞株)
PepT1 mRNA +++BxPC-3 (ヒト膵癌細胞株)
PepT1 mRNA -ゲル濾過• 結晶化プレートから直接X線回折データを計測し結晶最適化条件をスクリーニングするシステムを開発する。

微小で回折の弱い膜蛋白質結晶から回折データを得られる超低ノイズのデータ測定系を開発する。

• １０個程度の良好な回折データ、５!１０個程度のヒト
GPCR構造を得ることを目指す。

発現

ング

精製

<300

200/50

結晶化
25

B3

B3

データ

構造測定

解析

105-10結晶化

Fab

フローサイトメトリー陽性の（抗PepT1抗体を産生する）ハイブリドーマ 47クローンを樹立

クローニBlue Native PAGE

B3+FabFab

GREEN: ( + ) Ab, Red: ( - ) Ab•

ゲル濾過フラクションのSDS-PAGE

FITCPepT1

データ計測技術開発グループ

結晶化

Antibody BRAC18 (Western negative)

B3+FabFITC
PepT1

B3

Fab

ゲル濾過フラクションのSDS-PAGE

Blue Native PAGE

ダイアモンド膜タンパク研究室（Diamond-MPL)ダイアモンド放射光実験施設 （日本の非常に強いX線を発生させる装置

Spring-８に相当）
Diamond
X-rays from Diamond will
be 1,000,000,000,000 times
brighter than froman X-ray tube !
X-ray tube

研究室のX線源より一兆倍強い！

60W bulb
Candleダイアモンド膜タンパク研究室

全自動結晶化装置（Diamond-MPL)

Vision unit #1

Honeybee 16+1

Vision unit #2

Nov 2006

Monitors will be reduced to 1
And mounted on Strongarmsealers
STAR and accessories
50 plate Input/Output hotel

March 2007

April 2007生産された膜タンパク質の結晶化
A

高速結晶スクリーニングシステム• 結晶条件の最適化が現在構造解析の律速になっている。
• 結晶化プレートを直接回折計にマウントし、Ｘ線回折データを測定する。結晶化条件最適化の時間を1/100程度に短縮できる可能性がある（１!２年ー＞数日／週間）。

CB

500.00Absorbance

結晶A

400.00B（~0.1mm)300.00旧来法

X線回折実験
ル!プにマウントして凍結（マニュアル、数分）

200.00100.00

C0.00
0.00

5.00

10.00

15.00

Volume (mL)

20.00

25.00

９６穴結晶化プレート
新高速スクリーニングシステム

超低ノイズデータ測定システム•英 国 の 新 シ ン ク ロ ト ロ ン”Diamond”において、微結晶から高精度データを測定するミク
ロフォーカスビームラインを建設中。

•多数の結晶を一度にマウントしたグリッドからデータを測定する。テストの結果
このシステムを使うことにより、分解能を1Å以上向上できる可能性があることがわかった。

グリッド
グリッドマウントされた微結晶

回折像

本研究の波及効果
医学、創薬

受容体発現
精製

- 副作用の少ない医薬の開発- SNPsの構造上での解釈に基づ
くテーラーメイド医療

膜蛋白結晶化技術

受容体構造構造解析技術

細胞生物学、分子生物学- 構造に基づく情報伝達研究- 各種ヒト膜蛋白質構造解析

私たちの暮らしとの関わりについて薬が作用する膜受容体の形を正確に知ることにより、副作用の少ない薬を作ることができる様になります。
一人一人の遺伝子の違いによる薬の効果の違いが予測できるようになり、その人に最も適した治療を行うことがが可能になります。
標的受容体

旧来の手法を用いて作られた非特異的な薬

他の受容体（副作用を引き起す）受容体の構造をもとに正確に設
計された薬

計算機科学
データ計測技術- 構造未知受容体のモデリング- オーファン受容体のリガンドの推定

コハク酸脱水素酵素（SQR）
コハク酸
FADH
クエン酸回路

FADH2

SQR

フマル酸

どうしてここだけFADH2?

48

コハク酸脱水素酵素（SQR）の結晶構造解析

フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD)

フラビンHis
SQRの場合FAD

アデニンはヒスチジンと共有結合を作っ二電子還元反応
FADは共有結合していて酵素から離れない。では
電子はどこに行くのか？ている。

Yankovskaya et al, Science 2003
4950

コハク酸脱水素中の補酵素

コハク酸脱水素酵素（SQR）の全体構造
コハク酸脱水素酵素は膜蛋白質４個の蛋白質サブユニット中で（ShdAShhD)、オキザロ酢酸からコエンザイムQまで長い電子伝達経路を形成していた。
オキザロ酢酸（コハク酸の競争阻害剤）

Å

フラビンアデニンジヌクレオチド

Å
三種類の鉄Å
内側内側

Å
細胞
膜細胞
膜

外側

外側

3種類の鉄イオウクラスター[2Fe-2S]

イオウクラスターÅÅヘムb
Å
コエンザイムQ（ユビキノン）
補酵素間の一番近い距離が15 Å以下だと電子の受け渡しができる。

コエンザイムQの結合部位は細胞膜中にある[4Fe-4S]. [3Fe-4S]はこのFeが一つ抜けたもの

コエンザイムQ（ユビキノン、UQ）

ヘムb

いずれも複数の酸化還元状態を持ち電子の受け渡しができる

53

UQ:コエンザイムQ

コハク酸脱水素酵素は呼吸鎖電子伝達系に直接電子を渡す
呼吸鎖電子伝達系

クエン酸回路コハク酸

電子伝達経路

複合体V複合体III

複合体I(ATP合成酵素）

フマル酸
FAD[2Fe-2S]

2e-[4Fe-4S]

クエン酸回路より[3Fe-4S]

複合体IV

複合体II
コハク酸脱水素酵素はクエン酸回路の一部であると共

呼吸鎖
酸化型コエン

還元型コエン

ザイムQ

ザイムQ

細胞膜内

電子伝達系へに、呼吸鎖電子伝達系の複合体IIであり、コハク酸から電子を受け取り、コエンザイムQを還元しミトコンドリ
ア膜中に放出する。これ以外のクエン酸回路からの高エネルギー電子はNADHの形で、複合体Iに電子を伝達する。

コハク酸脱水素酵素のMev-1変異はC.elegans線虫の加齢を加速する。

Mev-1はコエンザイムQの結合部位の変異である。
アルギニンへの変異がヒトの腫瘍を引き起こす

疎水性残基がコエンザイムQを挟- 高い酸素濃度で加速され、細胞内の活性酸素濃度が上昇する- ラジカル補足剤（ラジカルスカベンジャー）により通常の寿命を回復する

み込んでいる- 同じ部分の変異は人間では腫瘍を引き起こす（Hereditary paragangliomaやpheochromocytoma)
Mev-1変異ではグルタミン酸になっている

機能しなくなったコエンザイムQの結合部位が高エネルギー電子の漏洩を引き起こし、活性酸素が生じる。

電子の漏洩

脂質、蛋白、DNAのダメージ

活性酸素

スーパーオ
キシドディ
スムターゼ

ミトコンドリア病、腫瘍、加齢

カタラーゼ

コハク酸の酸化能力は残っているが、コエンザイムQ（UQ)に電子を渡せなくなるため、受け取った電子がFAD（唯一外部に露出）から酸素に渡され活性酸素が生じる。