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匂いで食欲を惹起させる脳内回路メカニズムの解明＜平成 28 年度助成＞

匂いで食欲を惹起させる脳内回路メカニズムの解明
眞部寛 之 １）・ 村 田

航 志 ２）（ １）同志社大学 研究開発推進機構、 ２）福井大学 医学部脳形態機能学分野）

１．目的
街中でふと漂ってくるうなぎのかば焼きの匂いや

２．方法と結果
２−１．逆行性トレーサーを用いた、カレーの匂いを嗅ぐと食欲が惹起され、積極的な摂視床下部に直接投射する嗅皮質亜領域の探索

食行動を取りたくなるのは誰しもが経験する現象で視床下部外側野は摂食関連ペプチド分泌ニューロある。本研究は、匂いによって食欲を惹起し、摂食ンなどが局在し、摂食行動の出力に重要な領域と考行動を引き起こす脳内回路とその機構を見いだすこえられている。視床下部外側野に直接投射する嗅皮とを目的とした。特に、嗅覚受容体から最短経路で質亜領域を同定するため、軸索末端から逆行的に摂食行動まで至る神経回路を明らかにするのが狙い

ニューロンに取り込まれるトレーサーである、コレである。この経路を見つけることは、特定の感覚入ラトキシンサブユニット B（CTB-Alexa555）を視床力と出力される行動とを結びつける、いわゆる「ゾ下部外側野に投与し、逆行的に染色される嗅皮質亜ンビ経路 」を発見することにつながり、食欲を強領域を蛍光顕微鏡・共焦点レーザー顕微鏡を用いて力に惹起させる匂い分子の探索等につながるだけで探索した。

１）なく、我々の複雑な脳機能を理解するため、また、CTB-Alexa555 を視床下部外側野に注入し（図１a、脳の進化を考える上でも非常に重要であると考えらb）、１週間待ったのち灌流固定、20μm 厚の冠状断れる。

切片を作成した。その結果、嗅皮質の最も rostral 部、我々はこれまで、嗅覚系情報処理機構の解析を前嗅核下部、テニアテクタと前梨状皮質に挟まれた行ってきた。特に、嗅覚二次中枢である嗅皮質の機領域のニューロン群が染色された（図１c、d 黄丸）。

能解析を積極的に進めており、匂いで惹起される摂嗅結節の直上にあるため、線条体の一部の可能性が食行動モチベーションを担当する領域などを見いだあり、これを確かめるために線条体のマーカーでしてきた 。嗅皮質は、嗅覚受容体からの情報が脳ある DARPP32 の免疫染色を同時に行ったが陰性でに入力される最初の領域である嗅球から直接投射をあった（図１e）。この亜領域はこれまでに報告がな受ける領域であり、嗅皮質から摂食行動に関わる視く、新しい嗅皮質亜領域として、「嗅皮質 X」と名付床下部領域に直接投射する嗅皮質亜領域を見いだせ

けた。

２）

れば、匂いを摂食行動に変換する最短経路を見いだすことにつながる。

２−２．嗅皮質 X ニューロンの投射先の検証
嗅皮質 X のニューロンが、視床下部外側野のどの領域に出力しているのかを確かめた。嗅皮質 X
ニューロンを染色するため、視床下部外側野に Cre組換え酵素を搭載した逆行性レンチウイルス（FuG-EMSCV-nCre）を注入し、嗅皮質 X に Cre 存在下チャ

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図１：嗅皮質 X

図 2：嗅皮質 X ニューロンの視床下部外側野への投射

ネルロドプシンと蛍光タンパクである EYFP が結ホルモン（MCH）の蛍光抗体染色を行った（図２c

合したタンパク質を発現する、アデノ随伴ウイル〈orexin〉、２d〈MCH〉）。嗅皮質 X ニューロンの軸ス（AAV2-hSyn-DIO-ChR2-EYFP） を 注 入 し た（ 図索は、orexin ニューロン、MCH ニューロン近傍に２a）。この操作により、視床下部外側野に投射す達していた。実際にこれらのニューロンとコンタクる嗅皮質 X ニューロンだけが選択的に蛍光を発すトしているかどうかは、電子顕微鏡による解析等、るようになった（図２b）。注入 1 週間後灌流固定

さらなる解析が必要であるが、本研究でも実際にコし、20μm 厚脳切片を作成し、EYFP と摂食関連ペンタクトしていると思われる像が確認されており、プチドであるオレキシン（Orexin）とメラニン凝集

嗅皮質 X とこれら摂食関連ペプチド含有ニューロン

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図３：嗅皮質 X ニューロンの細胞種が作る回路が、嗅覚入力から最短経路で摂食行動を惹起する回路である可能性がある。

２−４．嗅 皮 質 X が 嗅 球 か ら 直 接 入 力 を 受 け ているかどうかの検証
視床下部外側野に投射する嗅皮質 X ニューロンが２−３．嗅皮質 X ニューロンの細胞種の解析

直接嗅球ニューロンから投射を受けていれば、嗅覚

嗅皮質 X は今回初めて同定された新規領域であり、入力から視床下部外側部に至る最短経路を見いだし嗅皮質 X ニューロンがどのような特徴を持つニューたことになる。この検証のため、遺伝子改変狂犬病

ロンであるかは不明である。視床下部外側野へ投射

ウ イ ル ス を 用 い た TRIO（Tracing the relationship

する嗅皮質 X ニューロンが興奮性ニューロンなのか、between input and output）法３） を用いて、視床下抑制性ニューロンなのかを確かめるために、興奮性部外側野に直接投射する嗅皮質 X ニューロンの一ニューロンのマーカーである VGluT1 および、抑制つ上流のニューロンを同定した。この手法は、狂犬性ニューロンのマーカーである GAD65/67 の in situ

病ウイルスがシナプスを逆行的に飛び越えて上流のハイブリダイゼーションと逆行性トレーシング、抗ニューロンに感染することを利用する方法で、4 種体染色を組み合わせた多重蛍光標識を行った。

類のウイルスを組み合わせることで、目的のニューVGluT1 陽性細胞は前嗅核に主に発現しており、ロンの一つ上流のニューロンを同定できる方法で嗅 皮 質 X は ほ ぼ 陰 性 で あ っ た（ 図 ３a、c 上 段 ）。

ある。視床下部外側野に Cre 組換え酵素を搭載しGAD65/67 陽性細胞は前嗅核とその下部である嗅た 逆 行 性 レ ン チ ウ イ ル ス（FuG-E MSCV-nCre） を皮質 X が陽性であった（図３b、c 下段矢印）。CTB-

注入し、嗅皮質 X に改変型狂犬病ウイルス受容体

Alexa555 陽性ニューロンの約半数が GAD65/67 陽TVA（AAV2-CAG-Flex-TVA-mCherry）、 お よ び 狂 犬性であり、視床下部に直接投射する嗅皮質 X ニュー病 ウ イ ル ス 増 殖 に 必 要 な ravies glycoprotein を 搭

ロンの多くが抑制性ニューロンであることが分かった。

載した Cre 依存型アデノ随伴ウイルス（AAV2-CAGFlex-rabiesG）を注入した。2 週間後、エンベロープ

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図４：嗅球から嗅皮質 X ニューロンへの直接投射を EnvA に 偽 型 し、 増 殖 遺 伝 子 G を 欠 損 し、 代 わ手法、光遺伝学的手法を導入し、当該ニューロンのりに EGFP を搭載した改変型狂犬病ウイルス（SAD-みを選択的に刺激または抑制し、その機能を検証す

dG-EGFP+EnvA）を嗅皮質 X に注入した（図４a）。

る。現段階で技術は確立しており、今後、この技術

１ 週 間 後、 脳 を 取 り 出 し、20μm 切 片 を 作 成 し、を用いて、匂いで惹起される摂食行動における嗅皮EGFP、TVA-mCherry、DARPP32（嗅皮質 X）、また質 X ニューロンの機能について検証する。また、光は EGFP、OCAM（嗅球）の多重免疫染色を行った。

遺伝学的手法と電気生理学的手法を組み合わせた手

嗅皮質 X に狂犬病ウイルスが感染したスターター法を用いて、視床下部外側野に直接投射する嗅皮質細胞が作られ（mCherry と EGFP が共発現する、図X ニューロンを in vivo のまま同定し、その回路機能４b 矢印）、嗅球の僧帽細胞が EGFP 陽性となったこに迫る研究を行っている。こちらの技術も本研究期とから（図４c）、嗅球の僧帽細胞から視床下部外側間で確立しており、今後、研究を展開させる予定で部に直接投射する嗅皮質 X のニューロンへ直接投射ある。

していることが明らかとなった（図４d）。
謝３．今後の研究の展開
本研究では、視床下部外側野に直接投射する嗅皮質 X を発見し、解剖学的特徴について明らかにし

辞本研究を遂行するにあたり、多大なご支援を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に心より御礼申し上げます。

た。嗅球→嗅皮質 X →視床下部外側野の回路は、匂いを摂食行動に変換する最短経路である可能性があ参考文献

る。今後は、嗅皮質 X ニューロンの機能について

１）C Koch and F Crick Nature, 411: 893 (2001)
２）K Murata et al. J Neuroscience, 35(29): 10581-99(2015)
３）LA Schwarz et al. Nature, 524: 88-92 (2015)

明らかにする。視床下部外側野に直接投射する嗅皮質 X ニューロンをターゲットとして、遺伝薬理学的Analysis of the neuronal circuits of odor-induced eating behavior in mice

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Analysis of the neuronal circuits of odor-induced eating
behavior in mice
Hiroyuki Manabe1), Koshi Murata2)
1)
Organization for Research Initiatives and Development, Doshisha University
2)
Division of Brain Structure and Function, Faculty of Medical Science, University of Fukui
Food odors strongly induce eating behavior. To address how central olfactory
neuronal circuits regulate eating behavior in mice, we performed a retrograde
tracing of the lateral hypothalamus. We observed the labeled cells located in thecaudo-ventral region of the olfactory peduncle. This region was located between
the ventral tenia tecta and the anterior piriform cortex, and under the anterior
olfactory nucleus and just rostral to the nucleus accumbens. We referred to thisregion as olfactory cortex area X (“area X”). Area X was distinguishable fromthe ventral striatum as a DARPP32 negative region. Most of the cells in area X
were VGluT1 mRNA negative, whereas roughly half of the cells of area X, which
project directory to the lateral hypothalamus, were GAD65/67 mRNA positive,
suggesting that many of the cells in area X are GABAergic neurons. Anterograde
tracing from area X confirmed that the axons of area X neurons project tothe lateral hypothalamus. We observed that the axons of area X neurons werelocated near orexin and MCH neurons, supporting the idea that area X neurons
have synaptic connections with these neurons. Rabies virus-mediated neuralpathway labeling (TRIO assay) revealed that area X neurons projecting to thelateral hypothalamus have synaptic connections from projection neurons in theolfactory bulb. These results suggest that the olfactory cortex has a subregion
that projects directly to the lateral hypothalamus, which might contribute toodor-induced eating behavior.