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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）＜平成 28 年度助成＞

日本人の食嗜好に最適化した水稲品種「つや姫」の良食味ファインチューニング

星野友紀（山形大学 農学部食料生命環境学科）

研究背景・目的

本研究では、いまだ明らかではない「つや姫」の良食味を支配する第 4 のファクターについては、あ

近年の自由貿易の加速化により、日本における食えて標的とせず維持したまま、「つや姫」を対象に品生産の維持は、非常に困難であると予想される。

非遺伝子組み換え法を用いて人工的にデンプン代日本の食品生産が生き残るためには、海外のような謝を操ることで、「つや姫」の良食味をさらに強化大規模栽培や大量加工による大量流通のモノマネですることを目指す。
「つや姫」の良食味は維持しつはなく、日本にしかできない、きめ細やかな独自のつ、デンプン代謝をピンポイントで改良するため対抗策が必要である。本研究は、その解決策の一つに、「つや姫」を遺伝背景とする突然変異集団を構として、日本産食品の代表格であるコメに着目し、築し、その集団からさらなる良食味に有用な変異ア世界的に最も食嗜好に敏感な日本人の嗜好能力を生リルを見つけ出すことが有効であると考えられる。

かし、日本人の食嗜好に最適化したコメの改良、つ本研究では、変異アリルの探索法として、より現実まり「コメの良食味ファインチューニング」を提案的な品種改良を行うために、遺伝子組み換えによらする。

な い Targeting Induced Local Lesions In Genomes

山形県で育成された水稲品種「つや姫」は、良食(TILLING) 法を導入し、デンプン代謝に関係する突味ブランド米として知られ、日本穀物検定協会が実然変異体の探索を行った。デンプン代謝に関与する施する官能食味ランキングで、平成 28 年まで 7 年

遺伝子 1, 2) の突然変異体を網羅的に単離し、白米中連続で最高ランク「特 A」評価を受け続けているのアミロース含量をファインチューニングすること（http://www.kokken.or.jp）。これまでの米の嗜好にによって、日本人の食嗜好に最適化された「つや姫」関する研究により、米のおいしさは、デンプンの構の良食味強化の可能性について議論したい。

成成分であるアミロースと、タンパク質および水分の 3 つの含量比率で決定されることが知られている。

材料および方法

米の嗜好を判定する官能食味試験の結果、「つや姫」は日本のブランド米の元祖である「コシヒカリ」と・新規な「つや姫」突然変異集団の構築比べて食嗜好スコアが高く、より良食味であると判

山形大学農学部附属やまがたフィールド科学セ

定されているが、その理由は明確ではない。少なくンターの圃場において、エチルメタンスルホン酸とも、これまで常識であった食味に関係する 3 つの（EMS）とジエポキシブタン（DEB）処理を施した突成分については、「つや姫」と「コシヒカリ」でほ然変異 M2 系統を栽培し、それぞれ合計で 4,529 とぼ同等な値を示しており、「つや姫」の良食味を決4,326 系統の個別の DNA と突然変異体種子からなる定する第 4 のファクターについて、その解明が期待新規な突然変異体ライブラリーを構築した（図 1）。

されている。

日本人の食嗜好に最適化した水稲品種「つや姫」の良食味ファインチューニング

85単離した。得られた変異体候補についてシークエン
ス解析を行い、変異の生じた部位を特定した。

・デンプン代謝突然変異体の食味値評価とその要因メカニズムの解明
TILLING 法で得られた突然変異体群について、イネの食味に強く関与するアミロース含量の定量を行った。また、アミロース含量の低下メカニズムを 解 明 す る た め に、 定 量 的 リ ア ル タ イ ム RT-PCR（AriaMx, Agilent Technologies） に よ っ て、GBSSI遺伝子の発現量を比較した。また、ウエスタンブ
ロット法 5) を用いて、野生型と突然変異体における
図1

GBSSI タンパク質の定量解析を行った。

つや姫突然変異集団の構築

・TILLING 法 に よ る デ ン プ ン 代 謝 突 然 変 異 体結果および考察の単離本研究では、遺伝子組み換えに頼らずに、より「つや姫」の良食味をファインチューニングす現実的に新たな食料開発を目指すために、突然変る 遺 伝 資 源 の 獲 得 を 目 指 し、Os06g0133000 と異集団から DNA レベルで変異を検出することが可

Os09g0252700 遺伝子を標的に突然変異体を探索

能な TILLING 法を導入し、アガロース電気泳動法、した結果、全て 1 塩基置換を有する突然変異体が、

あ る い は 高 解 像 度 融 解 曲 線 分 析（AriaMx, Agilent

EMS 集団から 39 系統、DEB 集団から 10 系統単離Technologies）
により塩基置換の検出を行った（図 2） 。

された（表 1）。興味深いことに、EMS から見出さ新規に作出した「つや姫」突然変異集団群を対れた変異は、39 系統中 35 系統でトランジション変

象 に、 食 味 に 関 係 す る ア ミ ロ ー ス 含 量 を 司 る 遺異であったのに対して、DEB から見出された変異は、

3,4)

伝 子 と し て 知 ら れ る Os06g0133000（GBSSI） とOs09g0252700

2)について、網羅的に突然変異体を

図2

10 系統中 9 系統でトランスバージョン変異であった。本研究で用いた 2 種類の変異源は、DNA の変異

TILLING 法の概略図

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浦上財団研究報告書

表1Vol.25（2018）

EMS および DEB 突然変異集団から得られた突然変異体と変異パターンの比較

図3

EMS および DEB 突然変異集団から得られた GBSSI 突然変異体様式に異なる作用点を持ち、いずれの変異源においそのうち 5 系統ではエキソン内に 1 塩基置換を有しても、遺伝子機能に影響を及ぼすことが予想されるており、そのうち 4 系統で非同義置換が確認された非同義置換変異を生じさせることが明らかとなり、（図 3）。一方、DEB 変異集団からは、独立した 5 系

本研究で作出した「つや姫」突然変異集団の有効性統の突然変異体が得られ、そのうち 3 系統ではエキが示された。

ソン内に 1 塩基置換を有しており、そのうち 2 系統

Os06g0133000（GBSSI） 遺伝子では、EMS 変異で非同義置換が確認された（図 3）。これらの突然集団から独立した 11 系統の突然変異体が得られ、変異体では、GBSSI タンパク質の構造が変化するこ日本人の食嗜好に最適化した水稲品種「つや姫」の良食味ファインチューニング

図587

野生型と同義置換変異体 Tya-1478 におけるGBSSI 遺伝子の発現量の比較

伝子発現解析を行った。
塩基配列解析の結果、野生型と変異体の cDNA 配
図 4 GBSSI 突然変異体における白米中のアミロース含有率列に違いはなかった（結果省略）。発現解析の結果、同義置換変異体 Tya-1478 における GBSSI 遺伝子のとにより、酵素活性が低下し、アミロース含量の低発現量は、出穂 2 週後では変化がなかったものの、下が予想される。そこで、先行して得られた DEB 由

出穂 4 週後の胚乳において、野生型と比較して有意来の突然変異体を対象に、食味形質に関係するアミに増加していた（図 5）。

ロース含量を測定した。

これらの結果より、同義置換変異体におけるアミ白米中のアミロース含量を測定した結果、非同義ロース含有率の低下は、1 塩基置換によって生じた置換変異体 Tya-0767、-1373、および -0699 のア翻訳効率の低下に起因することが推察された。出穂ミロース含有率は、野生型が平均 18.4％対して、変4 週後に認められた GBSSI 遺伝子の発現量の増加は、異体は 6.2％、6.7％、および 16.6％と、有意に低1 塩基置換によって生じた翻訳効率の低下により、下していた（図 4）。GBSSI 遺伝子の機能が消滅する正のフィードバック調節が働いていることが原因でとアミロース含有率は 0％になることから、今回得はないかと考え、同義置換変異体 Tya-1478 におけられた突然変異体は、アミノ酸置換によって遺伝子る GBSSI タンパク質の定量を行った。

機能が一部低下したことにより、アミロース含有率ウエスタンブロット解析の結果、野生型と同義置が低下したと考えられる。さらに、いずれの変異体

換変異体 Tya-1478 の GBSSI タンパク質量に明確なにおいてもアミノ酸置換は生じているが、アミロー差は認められなかった（図 6）。本変異体は、野生型

ス含有率の低下に系統間差が認められたことから、

GBSSI 遺伝子における突然変異の生じる部位、あるいは突然変異の形態によって、様々なアミロース含量を示す突然変異体を取得できることが示された。
一方、同義置換変異体 Tya-1478 では、興味深いことに、野生型のアミロース含有率 17.1％と比較し、変異体で 15.3％と有意に低下した（図 4）。アミロー
ス含有率の決定には、GBSSI 遺伝子の発現量やタンパク質量が影響を与えることが知られているため 1)、
同義置換変異体 Tya-1478 におけるアミロース含有率低下の原因を探るために、塩基配列解析および遺図6

野生型と同義置換変異体 Tya-1478 におけるGBSSI タンパク質量の比較

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浦上財団研究報告書と比較して、アミロース含量が約 2％低下しておりVol.25（2018）謝辞（図 4）、その差が非常に小さいため、仮に我々の仮本研究の遂行にあたり、貴重な研究助成を賜り説が正しかったとしても、ウエスタンブロット解析ました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団おでの定量は難しかったのかもしれない。今後は、よよび関係者の皆様に厚く御礼申し上げます。また、り詳細な定量解析を行うことで、我々の仮説の正誤

GBSSI タンパク質の抗体は、秋田県立大学の藤田直を検証する必要がある。

子教授に分与いただきました。ここに深く御礼申し上げます。本研究データは、山形大学大学院農学研

まとめ究科修士課程 2 年の川上珠恵さんによって実施されました。また、山形大学大学院農学研究科修士課程

山形県で育成された水稲品種「つや姫」は、安定

1 年の飯島信繁さん、山形大学農学部 4 年の畑昌和

収量かつ高品質で、粒ぞろいや炊飯米の光沢、食味さんには研究補助として本研究に参画いただきましなど、「コシヒカリ」を上回る優良な形質を有してた。ここに御礼申し上げます。

いる。アミロースは、炊飯米の食味特性に関与しており、その含有率が低下すると炊飯米に柔らかさや強い粘りをもたらし、高い食味値を示すことが知られている。つまり、「つや姫」のアミロース含有率を人為的に低下させることによって、さらなる食味評価の向上が期待できると考えられる。そこで本研
究では、「つや姫」の優良形質は維持しつつ、「つや姫」のさらなる良食味化を目指し、遺伝子組み換え技術に頼らない逆遺伝学的手法として TILLING 法を採用し、新規な変異アリルを探索した。本研究において、「つや姫」を遺伝背景とした GBSSI 遺伝子の新規変異アリルによって、「つや姫」白米のアミロース含有率のバリエーションを増大できることが示された。本研究で得られたこれら新規な変異アリルは、遺伝子組み換えで得られたものではないため、即座に品種改良に利用可能である。これら有用な変異アリルは、日本人の食嗜好に最適化した「つや姫」食味評価向上のためのファインチューニングにとって、貴重な遺伝資源になると考えられる。今後は、本研究で得られた有用アリルを、実際の品種改良に利用することにより、「つや姫」のさらなる食味強化を実現させたい。

参考文献

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Development of the ‘Tsuyahime’ mutant libraries and isolation of starch biosynthetic mutants
using a reverse genetics approach for the enhancement of rice eating quality

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Development of the ‘Tsuyahime’ mutant libraries and isolation ofstarch biosynthetic mutants using a reverse genetics approachfor the enhancement of rice eating quality
Tomoki Hoshino
Department of Food, Life and Environmental Sciences, Faculty of Agriculture,
Yamagata University‘ Tsuyahime’ rice has been cult ivated w ith care in Yamag ata Prefecture
over the course of 10 years, w ith the aim of rivaling Koshihikari as thequintessential Japanese rice brand. Tsuyahime’s most characteristic feature
is its delicious taste. The Japan Grain Inspection Association, which conducts
evaluations of rice taste, found ‘Tsuyahime’ to be glossy, even-grained, anddelectable in its flavor examination. Amylose content is widely recognized
as an important determinant of rice eating quality, because it reflects thefunctionality of the rice grain’s starch. It is thought that an enhancement of riceeating quality can be expected by reducing the amylose content of ‘Tsuyahime’.
In this study, we developed EMS and DEB-treated ‘Tsuyahime’ mutant libraries,
and isolated starch biosynthetic mutants using a reverse genetics method,
Targeting Induced Local Lesions In Genomes (TILLING). Because the GranuleBound Starch Synthase I (GBSSI) enzyme is required for amylose synthesis
in rice, we targeted a GBSSI gene for enhancement of ‘ Tsuyahime’ eatingquality. We identified 16 independent mutations within the GBSSI gene in the‘Tsuyahime’ background from 8,855 M 2 plants by TILLING screening. Since
there were missense mutations, inducing amino acid substitutions among thosemutants, we expected that they would influence enzyme activity. To clarify thecontributions of the missense mutant alleles to the amylose content in ricegrains, we determined the amylose content of these mutants. By using novel
GBSSI mutant alleles, we successfully generated ‘Tsuyahime’ with variations inamylose content (6-17%). The reverse genetics approach employed in this study
offers both a non-transgenic alternative for the efficient generation of novel
genetic resources and perfect markers for conventional breeding programs. In
future studies, we would like to make enhancements of the eating quality of‘Tsuyahime’ using these novel GBSSI mutant alleles.