● 2019 新型コロナウイルス RNA 検出試薬
TRCReady® SARS − CoV − 2 i の開発
バイオサイエンス事業部

第二開発部

1．はじめに遺伝子グループ

庄司麻土香
宇根 蔵人
東田悟
塚本悠

反応と増幅 RNA に特異的に結合する事により蛍光を発 す る INAF（INtercalation Activating Fluorescence）

新 型 コ ロ ナ ウ イ ル ス（Severe acute respiratory

プローブを組み合わせた方法であり、標的 RNA の増

syndrome coronavirus 2, SARS − CoV − 2）は 2019 年 12幅と検出を 1 本のチューブ内にて 20 分で実施できる 2）

月に中国の武漢でのアウトブレイクをきっかけに全世（図１）。さらに、専用装置である自動遺伝子検査装置

界に広まり、感染者は未だに増加し続けている。全世

TRCReady® − 80、TRCR® 核酸精製キットと組み合わせ界における現在までの感染者は 2.19 億人、死者は 455ることにより、40 分で核酸精製から検出まで全自動万人に達し、日本においても第 5 波が到来した（2021で実施可能である（図 2）。

年 9 月 9 日現在）
。SARS − CoV − 2 は人に感染すると、発熱、呼吸器症状等を引き起こす。重症化した場合、肺炎を発症し、呼吸器不全を引き起こすケースがある。感染を拡大させない観点からも、迅速かつ確実な①

検出は、必要不可欠である。日本でも感染者の増加に伴い、遺伝子検査が実施されるようになったが、当初は多くの施設で国立感染症研究所発行の「病原体検出

プロモータープライマー
アンチセンスプライマー
逆転写酵素

2 本鎖 DNA

マニュアル 2019 − nCoV Ver.2.9.1（以下、感染研マニュアル）」に準じた方法が採用されていた 1）。感染研マ③

ニュアルに記載の方法は、手動操作が多く、遺伝子検

プロモータープライマー
アンチセンスプライマー
逆転写酵素

査に慣れていない医療施設では人手や技術的な部分で標的 RNA（＋鎖）②実施が困難であった。また迅速性に欠けるといった課RNA ポリメラーゼ

増幅 RNA（－鎖）

題点も発生した。そのため、迅速／簡便という特徴を④もつ TRCReady を用いた専用試薬の製品化が多くの医療機関から望まれていた。

INAF プローブ

そこで、迅速、簡便な遺伝子検査法として TRC 法を 用 い た 2019 新 型 コ ロ ナ ウ イ ル ス RNA 検 出 試 薬
TRCReady® SARS − CoV − 2 i を開発したので報告する。
「すべての人に健康と福祉を」を目標に、本製品は、医療のひっ迫という社会課題に対して、医療負担の軽減に貢献することを目指している。

2．TRC 法の原理と特徴
TRC 法は 46℃の一定温度で RNA を増幅する TRC（Transcription − Reverse transcription − Concerted）①プロモーター配列を付加したプライマー、アンチセンスプライマーと逆転写酵素により標的 RNA から 2 本鎖 DNA が合成される②RNA ポリメラーゼにより標的 RNA の相補鎖（－鎖）が増幅合成される③増幅された RNA の一部からプロモーター配列を付加したプライ
マー、アンチセンスプライマーと逆転写酵素により 2 本鎖 DNA が合成される④INAF プローブは増幅合成された RNA と特異的に結合し、蛍光強度が増加する

図１

TRCReady® SARS－CoV－2 i における
TRC 反応原理図

95

TOSOH Research & Technology Review Vol.65（2021）

N 遺伝子領域 RNA を 5 分以内に検出した。本キットの最小検出感度試験の結果を表１に示す。低い濃度の30 コピー／テストの N 遺伝子領域 RNA まで検出することができ、十分な感度であることが確認できた。
本キットの特異性試験の結果を表 ２に示す。なお、
TRCReady® 核酸精製キット

図２

自動遺伝子検査装置
TRCReady®－80

TRCReady システム概要

判定は反応開始後 20 分以内に蛍光強度比が 1.30 以上になった時に陽性、1.30 未満の時を陰性とした。結果、本キットは新型コロナウイルス以外の菌およびウイルスについて、107 Colony Forming Unit または RNA 105
コピーを測定したところ、全て陰性となり、十分な特3．新型コロナウイルス RNA 検出試薬の開発異性をもつことが確認できた。

ウイルスは変異が起こりやすいため、試薬開発にお6.50

いては変異発生率の低い領域を選択することが課題で5.50あった。また、他のウイルスを検出しないために、特異性を高くすることも課題であった。この 2 つの課題
トとして Nucleocapsid タンパク質をコードする遺伝子（以下、N 遺伝子）領域を選択した。N 遺伝子領域

10^44.50
蛍光強度比を解決するため、新型コロナウイルスの検出ターゲッ

10^610^3300

3.50

100502.50を検出ターゲットにすることにより、新型コロナウイルスの安定的な検出や高い特異性が期待できた。

Negative閾値 1.30 →0.5004．試薬性能の向上に向けた取り組み
新型コロナウイルスの遺伝子検査には、鼻咽頭拭い3）液、鼻腔拭い液、唾液が用いられる 。鼻咽頭拭い液、鼻腔拭い液と比較し、唾液には様々な夾雑物が多く含

5101520時間（分）
新型コロナウイルス N 遺伝子領域 RNA を 1 テストあたり50 ～ 10 6 コピーとしたときの、各蛍光強度比。横線は
閾値 1.30 を示す

図３

各コピー数における蛍光強度比

まれるため、検出感度が著しく低下する課題があった。
我々は検出感度の低下要因の一つとして、宿主由来の表１

核酸がプライマー、プローブと非特異的な結合を形成し、TRC 反応を阻害している可能性を考え、この非特異的な結合を最小とするプライマー、プローブを設計、検討することで、阻害感受性の低い配列を見出すことができた。この配列を用いることにより、鼻咽頭拭い液、鼻腔拭い液と同程度の感度で唾液検体を測定

最小検出感度

コピー／テスト
300
100503010

陽性数／テスト数
6／66／66／66／63／6

可能となった。

6．模擬検体を用いた評価
5．基本性能評価［評価方法］

新型コロナウイルス N 遺伝子領域 RNA 溶液を開発

国立医薬品食品衛生研究所から公表された「模擬した本キットにて測定した結果を図３に示す。なお、

ウイルスを用いた核酸増幅検査薬の一斉試験」の評

図３において横軸は反応開始からの時間を示し、縦軸価にならい、模擬ウイルス「AccuPlex SARS − CoV − 2は蛍光強度比 ( 蛍光強度／初期蛍光強度 ) を示してい(full genome)」(SeraCare 社 ) を 170 コピー／ mL からる。蛍光強度比が 1.30 以上となった時間を検出時間

43,000 コピー／ mL となるように PBS を用いて希釈し6とした場合、本キットは 50 ～ 10 コピー／テストの96たものをサンプルとし、検体持ち込みから RNA 抽出、

東ソー研究・技術報告

表２

第 65 巻（2021）

菌 種
Achromobacter xylosoxidans
Acinetobacter baumannii
Acinetobacter lwoffii
Alcaligenes faecalis
Legionella pneumophila subsp. Pneumophila
Chryseobaterium indologenes
Empedobacter brevis
Escherichia coli
Flavobacterium odoratum(Myroides odoratus)
Haemophilus influenzae
Klebsiella pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae(M129)
Bordetella pertussis
Moraxella catarrhalis
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas stutzeri
Serratia marcescens
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Legionella longbeachae
Adenovirus(71 starain)
Parainfluenza virus 1Enterovirus 68
Respiratory syncytial virus subtype A
Respiratory syncytial virus subtype BRhinovirus
Human Coronavirus OC43
Human Coronavirus 229E
SARS Coronavirus (2003)
MERS Coronavirus
Influenza A H1N1
Influenza A H3N2
Influenza B

模擬ウイルスを用いた評価例

表３

特異性試験
判定陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性
陰性陰性陰性
陰性
陰性陰性陰性
陰性陰性陰性
陰性
陰性
陰性
陰性
陰性
陰性陰性
陰性
陰性

コピー／ mL（検体持ち込み量 200μL）

陽性数／テスト数

43,00017,000
4,300
1,700
430
170
0

6／6
6／6
6／6
6／6
5／6
1／60／6

せた陽性検体 10 例、および陰性検体 15 例を測定した 5）。検体は、鼻咽頭拭い液、鼻腔拭い液、唾液の前処理済試料にウイルス模擬物を規定量添加したものを用いた。あわせて、感染研マニュアルに記載の標準法であるリアルタイム one-step RT-PCR 法（以下、PCR 法）との比較検討を実施した。
［評価結果］
本キットと PCR 法の相関性試験結果を表４に示す。
鼻咽頭拭い液、鼻腔拭い液、唾液いずれの検体においても、全体一致率は 100％、陽性一致率が 100％、陰性一致率が 100％と 90％以上の良好な相関が得られた。本キットは、PCR 法と同等の性能を有しているものと推察される。また、本キットの検出時間と PCR法の Ct 値の関係を図４に示す。本キットの検出時間と PCR 法の Ct 値に一定の相関があることを確認できた。

表４

相関性試験

PCR 法
陽性陰性
100
陽性015
陰性
陽性一致率：100％（10 ／ 10）
陰性一致率：100％（15 ／ 15）
全体一致率：100％（25 ／ 25）

鼻咽頭拭い液試薬／反応系までを含めた検査系全体を評価した 4）。

本キット［評価結果］
本キットを用いた評価例を表３に示す。国立感染症研究所が提示する検査法を用いた場合に 50 コピー／反応に相当する 4,300 コピー／ mL の検体を 100％（6 ／ 6）「陽性」と判定した。

本キット

7．模擬検体を用いた評価［評価方法］
国立感染症研究所から公開された「新型コロナウイルス（2019 − nCoV）の遺伝子検査法の性能評価について」に基づき、新型コロナウイルス RNA コピー数を、10 コピーから 200,000 コピーの範囲内で均等に分布さPCR 法
陽性
陰性
100
陽性
015
陰性
陽性一致率：100％（10 ／ 10）
陰性一致率：100％（15 ／ 15）
全体一致率：100％（25 ／ 25）

鼻腔拭い液

唾液
本キット

PCR 法
陽性
陰性
100
陽性
015
陰性
陽性一致率：100％（10 ／ 10）
陰性一致率：100％（15 ／ 15）
全体一致率：100％（25 ／ 25）

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TOSOH Research & Technology Review Vol.65（2021）

ka/corona-virus/2019-ncov/9482-covid14-15.html
10

本キット検出時間（分）

98唾液
鼻腔拭い液
鼻咽頭拭い液76543220.025.0

30.0

35.040.0

Ct 値

図４

本キットの検出時間と Ct 値の相関図

8．まとめ
PCR 法に比べ、新型コロナウイルスを迅速、簡便に測定可能な試薬を開発した（表５）。また、模擬検体を用いた評価でも PCR 法と同等の感度、特異度を有していた。本キットは、高い評価を得て多くの施設で導入され、医療のひっ迫という社会課題に対して医療負担の軽減に貢献している。

表５

感染研マニュアルとの比較

感染研マニュアル 本キット
検出法
PCR 法
TRC 法
検査時間※1
約 210 分40 分
核酸抽出工程用手法
自動
核酸増幅工程用手法
自動※1：核酸抽出から測定完了までの時間

参考文献
１）国立感染症研究所、病原体検出マニュアル 2019 −nCoV Ver.2.9.1[online]https://www.niid.go.jp/niid/images/labmanual/2019-nCoV20200319.pdf
２）T. Ishiguro et al., Anal. Biochem ., 314（1）, 77 − 86３）厚生労働省、新型コロナウイルス感染症（COVID− 19）病原体検査の指針 第 4 版
４）国立医薬品食品衛生研究所、COVID − 19 診断用
核酸増幅検査約一斉試験の結果報告（公開版）[online]https://www.mhlw.go.jp/000746161-1.pdf
５）国立感染症研究所、新型コロナウイルス（2019 −nCoV）の遺伝子検査法の性能評価について[online] https://www.niid.go.jp/niid/ja/diseases/
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