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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）＜平成 28 年度助成＞

納豆製造モデルを用いたう蝕原性バイオフィルム抑制物質の探索～納豆によるう蝕リスク低減化をめざして～

成澤直規（日本大学 生物資源科学部食品生命学科）

背景と目的

方法

う蝕とは、歯の硬組織が口腔内細菌の産生する酸S. mutans はヒト臨床分離株 FSM11 株を使用しにより脱灰される口腔疾患の一つである。口腔常在た。納豆菌は高橋株、宮城野株、成瀬株および市販

細 菌 で あ る Streptococcus mutans は 酸 耐 性・ 酸 生

納豆分離株 3 株（No. 30, No. 69, No. 111）を用いた。

産性に優れ、かつ歯面上へ強固なバイオフィルムを納豆製造は大豆としてユキシズカを用い、蒸煮後、形成することから、主要なう蝕原因菌である。う蝕各種納豆菌を植菌し、37℃で一晩発酵させた。発酵リスクを低減するには、S. mutans のバイオフィル

後、製造された納豆に滅菌水を加え、ストマッキンムをコントロールすることが最重要である。一般にグを行うことで可溶性画分の抽出を行い、0.22µm

バイオフィルムとは担体表面上に付着した微生物のフィルター除菌後に各種実験に供した。プロテアー

フィルム状構造体のことを指し、細胞は菌体外多糖

ゼ活性評価は、アゾカゼインを基質とし、1 分間あ等に囲まれており、物理的処理や抗生物質等の化学

た り に A440 を 0.001 上 昇さ せ る活 性 を 1unit とし的処理に対して高い耐性を示し、主に医療分野におた。スクラーゼ活性はスクロースを基質とし、1 分いて問題とされている。よって、S. mutans のバイ間にグルコースを 10µg 増加させる量を 1unit としオフィルム形成を制御するためには、耐性菌を作らた。バイオフィルムの形成は 0.25% スクロース添加ず安全で安価な食品素材を用いることが有効であ

Tryptic soy broth without dextrose（TSB）液体培地

る。

を使用し、96 well titer plate に S. mutans を 1% 量

我々は納豆中の可溶性画分が、S. mutans のバイ植 菌 し、37 ℃、5%CO2 条 件 で 20 h 培 養 し た。 必

オフィルム形成を強く阻害する効果を有することを要に応じて納豆抽出液を 50% 量添加した。培養後、明らかにし、さらに本現象は生菌には影響しないこ

well 底部に付着した細胞をサフラニン溶液で染色とも確認している。抑制因子は納豆中で主要なセリし、70% エタノールで色素抽出後、492nm の吸光ン型プロテアーゼであるナットウキナーゼと類似し度を測定しバイオフィルム形成量とした。ていることを報告した。一方で、納豆抽出液中

1、2)のバイオフィルム形成抑制物質は複数種存在するも結果のと予想され、その全容は明らかとなっていない。
そこで本研究では、各種納豆菌を用いてバイオフィ納豆中のバイオフィルム形成抑制物質の探索にあルム形成抑制効果の高い納豆を作出し、抑制因子のたり、大豆品種ユキシズカを用いて納豆製造を行っ探索を行った。

た。納豆菌として市販納豆分離株 3 株、高橋株、宮城野株、成瀬株の計 6 菌株を用いた。納豆作成後の抽出液のバイオフィルム形成抑制効果を Figure 1 に示す。宮城野株、成瀬株、高橋株で製造された納豆

納豆製造モデルを用いたう蝕原性バイオフィルム抑制物質の探索～納豆によるう蝕リスク低減化をめざして～

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Figure 1. Effect of natto extract and soybean extract on S. mutans biofilm formation.

Figure 2. Effect of culture supernatant of B. subtilis natto on S. mutans biofilm formation.

由来の抽出液中に強いバイオフィルム形成抑制効果るものと考えられる。培養液、および培養ろ液中のが認められた。一方で、分離株 3 株の場合では抑制各種成分を調べた結果、各菌株間で生菌数と pH に効果はわずかであった。

大きな違いは認められなかった（data not shown）。

原料大豆には抑制効果は確認されなかったことか

一方で、バイオフィルム形成の促進因子の一つであら（Figure 1）、抑制効果の違いは納豆菌の特性の違るスクロース量には各試料間で違いが認められ、納いに関連するものと考え、各種納豆菌の培養液成分

豆菌 No.69 と No.111 において残存量が多いことがに注目して分析を行った。各納豆菌の培養ろ液は、確認された（Figure 3A）。濃縮・精製後の抽出液をTSB 培地 +0.25% スクロースにて培養を行い、フィ対象としてバイオフィルム形成抑制因子であるプロルター除菌により取得した。培養ろ液のバイオフィテアーゼ、およびスクラーゼ活性を測定した結果、

ルム抑制効果は菌株間で大きく異なり、宮城野株、菌株間で違いが認められ、プロテアーゼは高橋株で、成瀬株、高橋株で強い阻害効果が確認された（Figure

スクラーゼに関しては宮城野株と成瀬株で高い活性

2, Gray bars）。この結果は先の納豆抽出液の抑制効が認められた（Figure 3B and 3C）。

果とよく類似している。これら培養ろ液を硫安沈殿

納豆菌のスクラーゼ生産条件を明らかにするたおよび透析により濃縮・精製を行った結果、いずれめ、培養液中のスクロース量を変化させた際の活性の試料においてもバイオフィルム形成抑制効果が増を評価した。高橋株を対象として、スクロース濃度加した（Figure 2, Black bars）。このことから、各種を 0 から 10% 量の範囲内で解析を行った結果、0%培養ろ液にはバイオフィルム形成促進因子も存在す

ではスクラーゼ活性が認められなかったのに対し、

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Vol.25（2018）（Ａ）Sucrose（crude supernatant）（Ｂ）Protease activity（ammonium sulfate fraction）（Ｃ）Sucrase activity（ammonium sulfate fraction）

Figure 3. Characterizations of culture supernatant.

スクロースの添加量を増加させることで活性の増加フィルム形成を阻害するものと考えている。

が確認され、10% 量存在下では 600unit 程度であっ

また、納豆中のバイオフィルム抑制効果は、スクた。一方、納豆菌の近縁種である枯草菌においては、ロースの残存量にも強く影響するものと考えられスクロース 10% 量ではほとんどスクラーゼが誘導さる。バイオフィルム形成に影響するプロテアーゼやれなかった。このことから、納豆菌は低濃度のスクスクラーゼ、そしてスクロースの存在は、使用するロース存在下によりスクラーゼが誘導可能であるこ

大豆品種の違いに加え、納豆菌の特性に強く影響すとが明らかとなった。我々は 10% スクロース存在下るものと考えられる。現在、納豆製造に用いられてで誘導される遺伝子について、マイクロアレイ解析、いる納豆菌は大きく高橋株、成瀬株、宮城野株のいおよび定量 PCR により評価した。その結果、既知のずれかに由来するものであるが、近年ではメーカースクロース代謝に関わる遺伝子発現に加え、いくつごとに独自の納豆菌を開発し、それぞれ特徴ある商かのアミノ酸代謝に関わる遺伝子発現量の差異が確品を創出している。今回使用した納豆分離株は、い認された。

ずれもスクラーゼ生産性が乏しいことが明らかとなった。また過去の報告から、市販納豆の製造過程考察においてスクラーゼは発酵初期に誘導されるが、その存在量はごくわずかであるとの報告もある。スク

S. mutans のバイオフィルム形成は、スクロースラーゼの誘導にはスクロースの存在が必要であるの代謝により形成される粘着性不溶性グルカン合成が、一方でスクロースはバイオフィルム形成促進効に依存する。本研究の納豆製造モデルを用いた解析果を有することから、必ずしも有効な手段とはなら結果から、納豆中のバイオフィルム形成抑制因子のないと推測される。今後、他のスクラーゼ誘導条件一つはスクラーゼであることを提示する。我々は、を明らかにすることで、バイオフィルム形成抑制効スクラーゼが S. mutans に代謝される前にスクロー果の高い納豆の創出が可能になるものと期待されスを分解し、不溶性グルカン合成阻害によりバイオる。

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謝辞
研究助成のご支援をいただきました公益財団法人

浦上食品・食文化振興財団に深く御礼申し上げます。
また、本研究遂行にご協力いただいた、日本大学大学院生 中村知世さん、岩本理さん、学部 4 年生 秋
田谷聖希さん、石原麻衣さん、大野深紅さん、食品資源利用学研究室の皆様に御礼申し上げます。

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参考文献

1) Iwamoto, A., Nakamura, T., Narisawa, N, Kawasaki Y.,
Abe S., Torii Y, Senpuku H., and Takenaga F.
The Japanese fermented foo d natto inhibits
sucrose-dependent biofilm formation by cariogenic
streptococci. Food Sci. Tech. Res., 2018, In press.
2) Narisawa, N., Kawasaki, Y., Nakashima, K., Abe, S.,Torii, Y., and Takenaga, F.
Interference effects of proteolytic nattokinase on
biofilm formation of cariogenic streptococci. Foodpresser. Sci., 2014, 40, 273-278.

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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）

Cariogenic biofilm inhibition by Japanese fermented natto
Naoki Narisawa
Department of Food Bioscience and Biotechnology,
College of Bioresource Sciences, Nihon University
Natto, a traditional Japanese non-salt-fermented food product made fromsoybeans, has been popular for more than 1,000 years and is currently oneof the most widely consumed fermented foods in Japan. Our previous study
indicated that natto extracts inhibited sucrose-dependent biofilm formation bycariogenic S. mutans without affecting the growth rate of the bacterium. The
effects of natto extracts on S. mutans were correlated with protease activity.
However, there have been no reports on the effect of the other factors present
in natto against biofilm formation by cariogenic streptococci. The objective of
this study was to investigate the putative factors in natto that inhibit biofilm
format ion by cariogenic strepto co cci. Six natto starters (Bacillus subtilis
natto with strains Miyagino, Takahashi, and Naruse, and isolate strains No.
30, No. 69, and No. 111) were used for the production of natto. Treatmentswith cell-free extracts derived from natto with strains Miyagino, Takahashi,and Naruse significantly reduced the biofilm formation of S. mutans FSM11.
We investigated the sucrose, protease, and sucrase content of each culturesupernatant. The effects of culture supernatant on S. mutans were correlatedwith both sucrase and protease activity. The natto extracts made from nattowith the isolate strains, but not with strains Miyagino, Takahashi, and Naruse,included sucrose, which is the main agent involved in biofilm formation. The
purification of the sucrase from natto may be useful for developing oral careproducts such as toothpaste. Further investigation is required to elucidate themechanisms by which this enzyme exerts its anti-biofilm effects.