29−技術資料−●全自動サイログロブリン測定試薬の開発
バイオサイエンス事業部

1．はじめに開発部

試薬開発 G三澤遠田
新谷孝一
容子
晃司

2．測定原理と材料

サイログロブリン（Tg）は、2 つのサブユニットか開発した Tg 測定試薬（E テスト「TOSOH」Ⅱ（サらなる甲状腺に特異的な分子量約 66 万の糖蛋白で、イログロブリン））は抗原抗体反応を利用し、その反甲状腺濾胞細胞内に貯えられているコロイドの主成分

応に関与する物質が凍結乾燥体として試薬カップに封であり、甲状腺組織内では甲状腺ホルモンの合成、貯入されている。

1）

蔵および分泌に重要な役割をはたしている 。

本試薬の測定原理は 1 ステップサンドイッチ蛍光酵

血中の Tg 濃度が高値を示す疾患には、甲状腺腫、素免疫測定（FEIA）法であり、試薬カップに含まれバセドウ病、亜急性甲状腺炎、橋本病および甲状腺癌

るモノクローナル抗体は各々 Tg 上の異なる部位（エ2），3）。甲状腺乳頭癌など甲状腺分化癌の場ピトープ）を特異的に認識し結合することにより免疫合、甲状腺組織摘出後に血中 Tg 濃度は低値となる一複合体（磁性担体結合抗体−抗原（Tg）−酵素標識抗方、再発、転移が認められる場合には血中 Tg 濃度は体）を形成する（図１）。測定は、試薬カップに抗原上昇を示す傾向にあり、術後の経過観察、術後の再発を含む検体を分注することにより、凍結乾燥体は溶解などがあるや転移の診断に有用とされている

4）
− 10）

され抗原抗体反応が開始する。37℃、10 分間の反応後、。

血中 Tg の測定においては、甲状腺自己抗体である未反応の抗原および酵素標識抗体を B ／ F 分離により抗 Tg 抗体（TgAb）の影響により正確な測定結果が洗浄除去し、酵素基質である 4 −メチルウンベリフェ得られないという問題点もあり

11），12）

リルりん酸（4MUP）を分注後、経時的に蛍光強度を、TgAb の影響を低減した測定試薬が望まれている。従来、自己抗体測定し単位時間あたりの 4 −メチルウンベリフェロンの影響を受け難いキットとして報告のある A 社 IRMA（4MU）の生成量を測定する。基質の蛍光強度は固定（immunoradiometric assay）法 13）− 15） が主として使用化された酵素量に依存し、さらに Tg 抗原量に比例すされてきたが、測定時間の短縮や全自動測定による検る。したがって、あらかじめ既知濃度の Tg を含む標査効率の向上も望まれている。

準品を用い、その蛍光強度と Tg 濃度による標準曲線

今回、我々は血中 TgAb 存在の有無にかかわらず精を作成し、Tg 濃度未知の患者検体の蛍光強度に相当度よく測定できるよう、抗 Tg モノクローナル抗体をする Tg 濃度を標準曲線より算出することにより Tg組合せ、Tg 測定試薬 の AIA 試薬化を進め、全自動エの定量が可能である。測定の際、検体のカップへの分ンザイムイムノアッセイ装置 AIA シリーズを用いた

注、一定時間下での抗原抗体反応、B／F 分離、基質分注、短時間、高感度な測定試薬の開発を行ったので報告す

蛍光強度の測定は全自動エンザイムイムノアッセイ装る。

置により自動で行われ、各試薬ともに測定開始から約18 分後に結果が得られる。
（試薬の主な仕様を表１に、抗体固定化磁性ビーズFreeE

E

E

E

E

E

E

E

検体分注

Bound

E

E

酵素標識抗体酵素基質（4MUP）

基質分注
（洗浄）

図１

E

検体（抗原）

B／F分離（抗原抗体反応）E（蛍光測定）

Tg測定の免疫複合体模式図

酵素反応生成物（4MU）TOSOH Research & Technology Review Vol.56（2012）30

全自動エンザイムイムノアッセイ装置 AIA − 2000 を使

よび希釈直線性は同等であり、TgAb の影響を受け難用したときに得られる検量線の例を図２に示す。）

いキットとして報告のある A 社 IRMA 法、および全自動測定キットである B 社 ECLIA（電気化学発光免疫測定）法と良好な相関性を有し、かつ短時間・高感3．AIA 試薬の開発度な測定試薬を開発することができた。

Tg の測定試薬として TgAb の影響を受け難く、かな お、 標 準 品 の Tg 濃 度 は、IRMM（Institute for

つ短時間、高感度な測定試薬の開発をするために Tg

Reference Materials and Measurements）CRM457 をへの親和性の高いマウスモノクローナル抗体を組み合基準として決定した。

わせることとした。固定化抗体について固定化量等の条件を最適化し、酵素標識抗体については酵素を結合させる架橋試薬の使用量等を最適化し十分な感度を得られるようにした。

4．基本性能評価 16）（1）感度試験

免疫反応液組成について、検体中に含まれる可能性

自社 TgAb 測定試薬（E テスト「TOSOH」Ⅱ（TgAb））のある異好性抗体（Heterophilic Antibodies）との非にて 13.6 IU ／ mL を基準値として、TgAb が陰性であっ特異的反応を抑えるためにブロッキング剤を添加し、た 15 例の低 Tg 濃度試料を 5 日間に渡り 1 日 2 回各 1

また、安定性を向上すべく各種蛋白質を最適化した。

重測定することで、各試料 10 個の測定値を得た。なお、その結果、TgAb 陰性・陽性例にかかわらず再現性お使用した試料は 1 回の測定分を小分け分注し使用まで− 80℃にて凍結保存した。結果、変動係数（coefficientof variation：CV）が 20％の理論値を実効感度として算出したときの濃度は 0.08 ng ／ mL を示した（図３）。

10080300
CV ％蛍光強度［nmol／（L・s）］

400

200

100060CV20％：0.08ng／mL

40200200

400

600

800

1000

1200

1400

00.00

Tg濃度［ng／mL］

図２0.100.15

Tg濃度［ng／mL］

図３

Tg測定試薬の検量線例

表１
測定項目
測定原理0.05

実効感度Tg 測定試薬の主な仕様

血中サイログロブリン
1 ステップサンドイッチ蛍光酵素免疫測定法（抗サイログロブリンマウスモノクローナル抗体）
測定装置
全自動エイザイムイムノアッセイ装置（AIA−2000, AIA−1800, AIA−21, AIA−900, AIA−600Ⅱ, AIA−360）
免疫反応温度・時間 37℃・10 分
酵素反応温度・時間 37℃・5 分
測定対象検体血清または血漿（ヘパリン血漿）
測定範囲
0.1〜1,000ng ／ mL
検体量／分注水量30μL ／ 100μL
標準品形状
凍結乾燥品（6 濃度）
濃度単位
ng ／ mL

0.200.25

東ソー研究・技術報告第 56 巻（2012）31（3）希釈直線性試験（2）再現性試験
同時再現性および日差再現性について、自社 TgAb

自社 TgAb 測定試薬にて TgAb が陰性であった Tg

測定試薬にて TgAb が陰性であった Tg 濃度の異なる

濃度の異なる 3 種の血清および血漿（ヘパリン血漿）

3 種の血清および血漿（ヘパリン血漿）と、TgAb がと、TgAb が陽性であった Tg 濃度の異なる 3 種の血陽性であった Tg 濃度の異なる 3 種の血清を用いて清を用いて行った。各々の試料を専用希釈液で 5 段階行った。使用した試料は 1 回の測定分を小分け分注の希釈系列を作製し測定した結果、TgAb 陰性試料（図し使用まで− 80℃にて凍結保存した。5 重同時測定に４）、TgAb 陽性試料（図５）ともに原点に収束する良よる再現性試験の結果、TgAb 陰性試料を測定したと好な希釈直線性性能を有していることが認められた。

きの CV は 2.3 ～ 3.4％、TgAb 陽性試料を測定したと
きの CV は 2.2 ～ 3.6％であった（表２）。1 日 2 回各（4）共存物質および抗凝固剤の影響

2 重測定し、試薬、装置を変えずに 20 回繰り返して検体中に含まれる可能性のある各物質を高濃度で、行った日差再現性試験の結果（検量線作成後 95 日間）、自社 TgAb 測定試薬にて TgAb が陰性であるプール血TgAb 陰性試料を測定したときの CV は 3.3 ～ 3.7％、清およびプール血漿（ヘパリン血漿）へ添加し、測定

TgAb 陽性試料を測定したときの CV は 3.3 ～ 3.9％で値への影響を確認した。共存物質としてはヘモグロビあった（表３）。

ン、遊離型ビリルビン、抱合型ビリルビン、脂質、ヒ
表２同時再現性表３

TgAb 陰性試料（13.6 IU ／ mL 以下）
TgAb
血清Tg 平均値
SD［IU ／ mL］ ［ng ／ mL］ ［ng ／ mL］
A5.3
20.60.7
B6.4
220.55.9
C12.7
767.721.2
血漿TgAbTg 平均値SD［IU ／ mL］ ［ng ／ mL］ ［ng ／ mL］
A
1.3
21.90.7
B3.5
212.7
4.9
C1.4781.3
18.3
TgAb 陽性試料
血清Tg 平均値
SDTgAb［IU ／ mL］ ［ng ／ mL］ ［ng ／ mL］
D
579.4
11.9
0.4
E230.7
51.3
1.1
F
121.9
229.5
5.2

TgAb 陰性試料（13.6 IU ／ mL 以下）
TgAb
血清Tg 平均値
SD［IU ／ mL］ ［ng ／ mL］ ［ng ／ mL］
A
5.3
21.2
0.8
B
6.4
215.5
7.9
C12.7
737.8
25.3

CV［％］
3.3
2.72.8
CV［％］
3.4
2.3
2.3血漿TgAb
Tg 平均値SD［IU ／ mL］ ［ng ／ mL］ ［ng ／ mL］
A
1.3
22.60.8
B
3.5
210.97.3
C
1.4765.2
26.2
TgAb 陽性試料
血清Tg 平均値
SDTgAb［IU ／ mL］ ［ng ／ mL］ ［ng ／ mL］
D
579.4
11.7
0.5
E
230.7
51.6
1.7F
121.9
220.2
7.6

CV［％］
3.62.22.3（a）血清
1,000

CV［％］
3.3
3.4
3.4
CV［％］
3.9
3.3
3.5

血漿−D（TgAb濃度：3.2 IU／mL）
y＝41.6x＋0.3，r＝1.00
血漿−E（TgAb濃度：2.3 IU／mL）
y＝284.6x＋4.6，r＝1.00
血漿−F（TgAb濃度：1.2 IU／mL）
y＝875.5x＋5.9，r＝1.00

800
Tg［ng／mL］

Tg［ng／mL］

600

CV［％］
3.6
3.7
3.4（b）ヘパリン血漿
1,000

血清−G（TgAb濃度：1.3 IU／mL）
y＝62.4x＋0.7，r＝1.00
血清−H（TgAb濃度：3.2 IU／mL）
y＝422.4x＋0.9，r＝1.00
血清−I（TgAb濃度：6.2 IU／mL）
y＝876.8x＋6.6，r＝1.00

800

日差再現性

400
200

600
400
200

000.00

0.25

0.50

0.75

1.00

0.00

0.25

希釈率

図４

希釈直線性（TgAb陰性）：（a）血清、（b）ヘパリン血漿0.50
希釈率

0.75

1.00

TOSOH Research & Technology Review Vol.56（2012）

32（c）血清25045

血清−D（TgAb濃度：579 IU／mL）
y＝11.6x−0.2，r＝1.00
血清−E（TgAb濃度：231 IU／mL）
y＝51.1x−0.3，r＝1.00
血清−F（TgAb濃度：122 IU／mL）
y＝223.1x−0.6，r＝1.00

150403530
頻度200
Tg［ng／mL］

50252015100

10550

0〜5〜10 〜15 〜20 〜25 〜30 〜35 〜40 〜45
Tg濃度［ng／mL］

00.00

0.250.50

0.75

1.00

図６

健常者の濃度分布

希釈率

図５

希釈直線性（TgAb陽性）：（c）血清片− 3.117 であり、TgAb 陰性・陽性例にかかわらず、
A 社 IRMA 法と良好な相関性が認められた（図７）。

ト血清アルブミン、アスコルビン酸を、抗凝固剤とし185 例の血清検体を使用し、全自動測定キットの Bてはヘパリンを各々表４に記載の濃度範囲で添加し測社 ECLIA 法（x）と本試薬（y）との相関性を Deming定した結果、未添加に対する測定値はいずれも 100 ±法による回帰分析で確認した結果、自社 TgAb 測定試10％以内であり、これら物質による影響は添加量上限

薬にて 13.6 IU ／ mL を基準値として分類した TgAb 陰まで認められないと判断した。

性 128 例（TgAb；0.2 ～ 11.8 IU ／ mL）では相関係数（r）0.999、回帰係数 1.050、y 切片 2.818、TgAb 陽性 57 例

（5）健常者の濃度分布（TgAb；13.6 ～ 25,300 IU ／ mL）では相関係数（r）0.999、健常者 142 例について、血清中の Tg 濃度を測定し回帰係数 1.014、y 切片− 0.552 であり、TgAb 陰性・陽た結果のヒストグラムを図６に示す。ノンパラメト性例にかかわらず B 社 ECLIA 法と良好な相関性が認リック法による 95％基準範囲を求めた結果、2.68 ～められた（図８）。

33.2 ng ／ mL であった。
（7）血清検体と血漿検体の相関性（6）他社キットとの相関性

血漿は血液凝固を伴わないため、サンプル調製に要77 例の血清検体を使用し、TgAb の影響を受け難する時間の短縮、被検体回収量などの点から血清よりいと報告のある A 社 IRMA 法（x）と本試薬（y）と優れている。そのため、本試薬が血漿（ヘパリン血漿）の相関性を Deming 法による回帰分析で確認した結を検体とすることができるか検討した。同時に同一人

果、自社 TgAb 測定試薬にて 13.6 IU ／ mL を基準値と物から採取した血清とヘパリン処理採血から得られたして分類した TgAb 陰性 45 例（TgAb；0.7 ～ 12.8 IU

血漿との相関性を Deming 法による回帰分析で確認し／ mL）では相関係数（r）0.999、回帰係数 0.917、y 切た結果（血清（x）、ヘパリン血漿（y））、127 例での片 0.847、TgAb 陽 性 32 例（TgAb；14.5 ～ 2,960 IU ／相関係数（r）0.999、回帰係数 1.018、y 切片− 0.655 とmL）では相関係数（r）0.996、回帰係数 0.924、y 切良好な相関性が認められた（図９）。したがって、本

表４

共存物質および抗凝固剤の影響
添加量

ヘモグロビン
遊離型ビリルビン
抱合型ビリルビン
脂質
ヒト血清アルブミン
アスコルビン酸
ヘパリン

22〜450［mg ／ dL］
0.9〜17.0［mg ／ dL］
0.9〜17.9［mg ／ dL］
83〜1,660［mg ／ dL］
0.3〜5.0［g ／ dL］
1.0〜20.0［mg ／ dL］
5.0〜30.0［U ／ mL］

プール血清回収率［％］97.5〜101.7
97.1〜104.7
98.0〜105.0
96.4〜103.1
94.1〜103.2
100.2〜104.6
91.5〜101.6

プール血漿回収率［％］99.2〜104.5
97.3〜103.1
96.4〜102.2
96.3〜103.5
93.5〜100.4
98.3〜104.7
90.9〜105.5

500

y＝0.917x＋0.847
r＝0.999n＝45400
300
200
10000

100200400500

A社 IRMA法［ng／mL］

図７

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（サイログロブリン）［ng／mL］

300

y＝1.050x＋2.818
r＝0.999
n＝128800
600
400
200
00200400600800

1,000

B社 ECLIA法［ng／mL］

図８33（b）TgAb陽性例
500

y＝0.924x−3.117
r＝0.996n＝3240030020010000100200300400500

A社 IRMA法［ng／mL］

A社 IRMA法との相関性：（a）TgAb陰性例、（b）TgAb陽性例（a）TgAb陰性例
1,000

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（サイログロブリン）［ng／mL］（a）TgAb陰性例

第 56 巻（2012）

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（サイログロブリン）［ng／mL］

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（サイログロブリン）［ng／mL］

東ソー研究・技術報告（b）TgAb陽性例
1,000

y＝1.014x−0.552
r＝0.999
n＝57800600
40020000200400600

800

1,000

B社 ECLIA法［ng／mL］

B社 ECLIA法との相関性：（a）TgAb陰性例、（b）TgAb陽性例

試薬は血清、血漿のマトリックスの違いによる測定値1,000の差は認められず、どちらの検体種にも同等な測定値

6．まとめ
今回開発した Tg 測定試薬について基本性能を確認した。
実効感度として CV が 20％の理論値を算出したときの濃度は 0.08 ng ／ mL であった。甲状腺癌術後の経過観察、術後の再発や転移の診断では、Tg 値 0.1 ～ 1
ng ／ mL を基準とするガイドラインもあるが 7），9）、本ヘパリン血漿［ng／mL］を与える試薬であることが明らかとなった。

y＝1.018x−0.655
r＝0.999
n＝127800

600

400

20000

試薬の感度はその基準の下限を満たす性能であり、臨床上の有用性も高いと思われる。同時再現性、日差再現性は TgAb 陰性例で CV 2.3 ～ 3.7％、陽性例で CV200400600800

血清［ng／mL］

図９

血清検体と血漿検体の相関性

1,000

TOSOH Research & Technology Review Vol.56（2012）34

2.2 ～ 3.9％であり、TgAb 陰性例と陽性例で有意差は認められなかった。希釈直線性についても TgAb 陰性・陽性例にかかわらず良好であった。検体中の共存物質や抗凝固剤の影響については、検討した範囲内におい

５）Schlumberger M., et al, Eur J Endocrinol, 138, 249− 252（1998）
６）Schlumberger M., et al, J Clin Endocrinol Metab ,92, 2487 − 2495（2007）て測定系に影響を及ぼさないことが確認できた。他社

７）浜田昇、日本臨床、65、2061 − 2067（2007）

キットとの相関性試験は、TgAb の影響を受け難いと

８）絹谷清剛、臨床核医学、41、8 − 11（2008）

される A 社 IRMA 法と TgAb 陰性・陽性例いずれも良９）Zucchelli G., et al, J Nucl Med, 53, 482 − 489（2009）

好な相関性であり、また、全自動測定キットである B

10）Pelttari H., et al, Eur J Endocrinol , 163, 757 − 763

社 ECLIA 法においても同様に良好な相関性が認めら（2010）れた。検体種については血清、血漿（ヘパリン血漿）11）Spencer CA.，et al, Clin Chem , 42, 164 − 173（1996）の両検体で同等の測定結果を得ることができた。

12）Spencer CA.，et al, J Clin Endocrinol Metab , 90,

今回の結果では、TgAb 陽性例においても IRMA 法

5566 − 5575（2005）

や ECLIA 法に対する相関性は良好であり、TgAb の13）池窪勝治、他、ホルモンと臨床、41、111 − 121（1993）

影響の差は認められなかった。しかし、IRMA 法に14）佐藤かづ末、他、核医学技術、13、23 − 28（1993）

おいて TgAb の影響を受ける場合があるとの報告も

15）中込俊雄、他、核医学技術、15、68 − 72（1995）

あり 17）、Tg 測定値への信頼性を判断するためには、

16）武市藍、他、日本臨床検査自動化学会会誌、38、

TgAb の 影 響 も 十 分 考 慮 す る 必 要 が あ る。 今 後 は、
TgAb の影響についてさらに検証していきたい。

17）才木康彦、他、核医学技術、15、332 − 334（1995）

既に製品化されている E テスト「TOSOH」シリー
ズの甲状腺関連ホルモン（TSH，T4，FT4，T3，FT3）や抗甲状腺自己抗体（TgAb，TPOAb，TRAb）との同時測定が可能なことから、日常検査に加え、診療前検査にも有用であり、甲状腺疾患の診断において今後さらに幅広い用途が期待できる。

7．謝辞

本試薬の開発に対してご協力していただいた各先生方に厚く御礼申し上げます。
群馬大学大学院 医学系研究科 臨床検査医学
群馬大学医学部附属病院 検査部
：

村上正己

教授

森村匡志

先生

古田島伸雄

先生

群馬大学医学部附属病院 検査部：
群馬大学医学部附属病院 検査部：

文献１）Vassart G., et al, Mol Cell Endocrinol , 40, 89 − 97（1985）
２）内村英正、他、核医学、20、867 − 874（1983）
３）Torrens JI., et al, Utility in Clinical Practice.,

Endocrinologist , 6, 125 − 144（1996）
４）Barsano CP., et al, Arch Intern Med , 142, 763 − 767（1982）109 − 113（2013）