膜蛋白質のX線結晶構造解析-系統的・網羅的解析の重要性
受容体，トランスポーター，チャネル，接着分子は創薬における重要なターゲット「構造に指南された創薬戦略（Structure Guided Drug Development）」の基盤づくり

抗体を用いた膜蛋白質結晶化技術の確立-現在の技術水準では著しく難度が高い
とくに哺乳類由来の内在性（複数回膜貫通）膜蛋白質

42,000岩田

125

想

京都大学大学院医学研究科

8

膜蛋白質の生産だけでは構造は解けない！
-結晶化の確率が低い (20%)-例えとけても分解能が低く創薬に使えない

2007年5月時点でのPDBの全構造データ（X線, NMR, 電顕を含む）

独立な膜蛋白質の構造（細菌からヒトまで）

哺乳類由来の内在性膜蛋白
質

良好に精製された膜蛋白質結晶化の結果結晶化リガンドとしての抗体の有用性

Antibody Fragments for Membrane Protein Crystallography
Fv-膜蛋白質の親水性表面が拡大して結晶性が向上する-抗体部分を用いた分子置換によって構造が解ける-得られた抗体はイメージングや抗体医薬にも応用可能

yeast
cytochrome bc1
complexbacterial
cytochrome coxidase
Iwata, Michel et al. (1995)

Fv

Hunte, Michel et al. (2000)

Fab

Fab

Fab

結晶化リガンドを用いた膜蛋白質の結晶化の原理
右は実際に抗体を用いて結晶化された細菌シトクロム酸化酵素の結晶中のパッキング．水色の分子が結晶化リガンドである．

Iwata et al.(1995)
Nature 376:660-669

なぜ未変性膜蛋白質に対する抗体が必要か？

-フユージョン蛋白質やタグに対する抗体は結晶化に不適当抗体
タグ

フュージョンやタグに対する抗体では、一見安定な複合体を作るよ
うに見えても、膜蛋白質に対して拡張した部
分の位置が定まらず結晶化を逆に妨げてしまう

抗体

未変性の蛋白質だけを認識し、変成した
蛋白質を認識しない抗体を用いると構造
的に膜蛋白質と一体となった複合体を形成し結晶化を促進する

bacterial
K+ channel(KcSA)
MacKinnon et al. (2001)

bacterialchloride channel(ClC) MacKinnon et al. (2003)

human !2
adrenergic
receptor

Kobilka et al. (2007)

Fab

達成目標
- 任意の膜蛋白質（特に哺乳類由来）に対して高い特異性と親和性（10-9 Mオーダーの解離定数をもつ）を兼ね備えた抗体を生産するための一連の技術を開発する- その技術を用いて本プロジェクト期間中に膜蛋白質／抗体複合体の新規構造を，2Å付近での高分解能で決定する

開発すべき3つの要素技術-抗体以外で膜蛋白質の結晶化に一般的に有効である事が証明された技術はない-良好な抗体さえ取れれば、膜結晶化に有効である事は証明されている(1) 膜蛋白質の機能的構造（天然のコンフォメーション）を保持したままマウスに免疫する技術(2) 結晶化リガンド候補のハイスループットスクリーニング系(3) 生体免疫系から得られた抗体を進化分子工学の手法により高機能化する技術

KcsAカリウムチャンネル

CLC塩素イオンチャンネル

シトクロムbc１複合体

KvAPカリウムチャンネル唯一の問題点：哺乳類の未変性膜蛋白質に対する抗体は極めて取得しにくい

1.ターゲット蛋白質の生産抗体を用いた膜蛋白質結晶化の流れ

我々の開発した出芽酵母の系を主に用いて80種類以上のほ乳類由来のトランスポーターの発現試験を行い、このうち良好に精製できるものを（初期）ターゲッ
トとして設定した。

3
ハイブリドーマ
細胞のスク
リーニング

1

2

ターゲッ

5

マウスの

ト蛋白質の

複合体の調
製／結晶化

免疫

生産

4 Fab抗体

7.0

6.5

10

4.0

3.8

10

3.5

4.5

6.0

ND

8.0

ND

5.5

ND

6.5

10

ND

4.5

4.5
ND

ファージライ
ブラリーのス
クリーニング

今回の報告する蛋白質

P41(3)22, a=b=78, c=181, 3.5 Å

ラット／ヒトグルコーストランスポーター(rGLUT5, hGLUT7) - ターゲット

ヒトアデノシンA2A受容体（hAA2a) - 技術開発用モデル

２.マウスの免疫: 各種免疫法の検討

２.マウスの免疫: 免疫法による抗hAA2a血
清価上昇度の違い-膜蛋白質を安定かつ多量に免疫する方法を検討した-リポソーム免疫が最も効果的であることが分かった

精製抗原免疫

リポソーム免疫バキュロウイルス免疫

バキュロ／spg64T
精製抗原／lpr

リポソー+ アジュバンド(百日咳毒素)ム免疫+ アジュバンド

酵母膜／Balb/c
酵母膜／lpr(リピッドA)

リポソーム／lpr
リポソーム／アゴニスト／lpr

リポソーム／Balb/c
リポソーム／アゴニスト／Balb/c

MRL/lpr または BALB/c マウス

ハイブリドーマ法／ファージディスプレイ法によるスクリーニング

hAA2aの各種抗原を免疫した場合の抗体作製状況の比較（ハイブリドーマ法）
No.

免疫原

免疫マウス

screening方法

1

BV＋精製抗原gp64 Tg/
BALB/c系

1.精製抗原ELISA
2.BV ELISA

5

2

精製抗原

MRL/lpr1.精製抗原ELISA
2.BV ELISA

26

3

liposome
アンタゴニスト添加

MRL/lpr1.liposome ELISA
2.精製抗原ELISA
3.BV ELISA＞80

4liposome
アンタゴニスト添加

BALB/c1.liposome ELISA
2.精製抗原ELISA
3.BV ELISA＞80

5liposome
アンタゴニスト無添加

MRL/lpr1.liposome ELISA
2.精製抗原ELISA
3.BV ELISA＞80

liposome
アンタゴニスト無添加

BALB/c1.liposome ELISA
2.精製抗原ELISA
3.BV ELISA＞80

6

選別well数

評価系；精製抗原固相化
ELISA
抗血清濃度；1000倍希釈

３.ハイブリドーマ細胞のスクリーニング:
構造認識抗体のスクリーニング法
未変性蛋白質を用いた結合アッセイ（ELISA)と変性蛋白質を用いた結合

アッセイ（ウエスタンブロットWBまたはドットブロットDOT）を組み合わせることにより、構造認識抗体を選択できる。

好ましくない抗体

好ましい抗体（構（配列認識抗体）

造認識抗体）

膜蛋白質

ELISA +, WB/DOT -膜蛋白質

ELISA +, WB/DOT+ELISA -, WB/DOT +３.ハイブリドーマ細胞のスクリーニング:
リポソームELISA法（L-ELISA)

３.ハイブリドーマ細胞のスクリーニング:
構造認識抗体の選別(1)-L-ELISA/DOT
L-ELISA＋、DOT-の構造認識抗体を得ることができた

Y-ELISAプレート上での膜蛋白質変性を防ぐ
ハイブリドーマ!"#

培養上清

ビオチン化脂質（$%&'()*+,-./(01#(#23

構造認識抗体ハイブリドーマ
抗原蛋白質をビオチン化脂質を含むリポソームに再構成

配列認識抗体培養上清を24561
法で検定

リポソームをストレプトアビ
ジンコートプレートに固定

24561&(
789:;/(11<=>4*?+@+;A(
7'B(希釈培養上清(C+D&($''-9:;/(6C6>EA-=D8FAE(11<=(7'B(希釈培養上清

上清の添加

３.ハイブリドーマ細胞のスクリーニング:
構造認識抗体の選別(2)-Biacore- 構造認識抗体の内、安定な複合体を形成する物だけを選択
抗体（培養上抗原膜蛋白質清）の添加の結合／解離抗GPCR抗体
抗ターゲット抗体

抗マウスFc抗体

４.Fab抗体ファージライブラリーのスクリーニング- ハイブリドーマを使う系に比べて、迅速に抗体をスクリーニングできる
マウスBリンパ球由来の抗体遺伝
子cDNAをファージディスプレイ用
ベクターに組み込む

GPCR(アナライト)
抗原膜蛋白質センサーチップFabフラグメントを提示した
ファージ集団の形成

107 - 108 クローン

解離が遅い!!"#$#%&'(#)'% "#$%$#%&',#-

解離が早い!!"#*#%&'+#)'% "#$%&#%&'.#-

結合が弱い

Screening Cycle of Fab Phages by Panning" Library: pComb3XSS-based anti-hAA2a Fab pahges (Library size: 3!107 cfu)
" Bait: hAA2a-SBP captured on streptavidin-coated ELISA plates" Buffer containing 0.05% DDM and 0.01% CHS

3.0
Phage ELISA

2.5

A415nmhAA2astreptavidin

2.0

一次スクリーニング
磁気ビーズ表面に固定化したターゲット膜蛋白質に対して特異的に結合するファージを選抜する（バイオパニング）

20 - 300 クローンターゲット膜蛋白質

二次スクリーニング
大腸菌培養上清に産生させたFabフラグ
メントを用いてELISA/DOT

1.0
0.5
0
pa

d
d
nd
ed
nd
nn roun rou rou roundt2n
3rd 4th1s

磁気ビーズ

5 - 15 クローンDiversity of an Anti-hAA2a Fab Library" DNA sequence analysis of randomly selected 10 Fab pahge clones from a library" Deduced a.a. seq of VL-CDR
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3-------------------------------------------------------# 1
KASQSVGTNVAWASNRHTGQYSSYPLTF# 2
KASQNVGTNVAWASNRFTGQYSSSPLTF# 3
KASQNVDTNVAWASNRFTGQYSSSPFTF# 4
KASQNVGTDVSWASNRFTGQYSNSPLTF# 5
KASQNVGNIIAWASYRYSGQYSNSPYTF# 6
KASQNVGTNVAWASNRFTGQYSSSPFTF# 7(Frame Shift) (Frame Shift)(Frame Shift)# 8
KASQNVGTNVAWASNRFTGQYSSSPLTF# 9
KASQNVGTNVAWASNRFTGQYSSSPLTF#10
KASQNVGTNVAWASNRFTGQHYSSPLTF****.*.. ::*** *.:**: . * **" Deduced a.a. seq of VH-CDR

1.5

un

Fab抗体ファージライブラリー

CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3--------------------------------------------------------# 1
DDYMH
RIDPANGNTKYAPKFQD--------YYAMDY
# 2
SSWMN
RIYPGDGDTNYNGKFKG
SE--------GFAY
# 3
GYNMH
YIDPYNGATNYNQKFKGSYYGYYSYDLPFAY
# 4
GYNMN
NINPYYGSTSYNQKFKGGRIYYGDYEGAMDY
# 5
SSWMN
RIYPGDGDTNYNGKFKG
EN-GE----WAMDY
# 6
GYYMH
LIIPYNGGTSNNQKFKG
C-----ARATPFAY
# 7
DDYMH
RIDPANGNTQYTPKFQD
P--GDYGGNWYFDV
# 8
DDYMH
RIDPANGNTKYAPKFQD
G----YSNYWYFDV
# 9
GYFMN
RINPYNGDTFYNQKFKGSYYGYYSYDLPFAY
#10
DYGMH
YISRGSSTIYYADTVKG
A--------LPVDY
. *:
*
.
..:.
.

膜蛋白質-Fab複合体の調製／結晶化(1)：rGLUT5-Fab複合体

４.Fab抗体ファージライブラリーのスクリーニング:
大腸菌を用いたリコンビナントFabの生産

M 1

ゲル濾過

2

LH4IJM(- rGLUT5とFabの安定な複合体を調製できた。
このFabはhGULT7とも複合体を形成できる-抗原と安定な複合体を形成できるリコンビナントFabを生産できた

LH4IJM>K=G
LH4IJM

FH4IJ7>K=G

kD

FH4IJ7

CtaA-Fab複合体

62
Fab

49

- Fabフラグメント

38

FH4IJ7
6G;1(NOA9=,PA(Q+-DF+/3

H鎖 (VH-CH1)

28

Fraction number
M 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 54 F

K=G

L鎖 (VL-CL)

18
14

K=G

150
100
75
50
37

6

Fab

25

3

- CtaA20

1.還元条件15

2.非還元条件

CtaA:古細菌ヘムA合成酵素（モデルタンパク）A2a-Fab結晶の構造解析

膜蛋白質-Fab複合体の調製／結晶化(2)：アデノシンA2a受容体／Band3
アデノシン1<=受容体

K=G

K=GS1<=

X線

1<=＋K=G
1<=に量を

1<=

変えてK=G

1<=

脂質？

を添加

回折

K=G

K=G
N6T6が切れアデノシン1<=受容体>

非還元ゲル

)=-ER

結晶

シンクロトロン放射光

ている）

2.7Å

K=G複合体結晶

構造認識抗体との複合体により熱安定が向上0#Uアッセイによ

K=G)=-ER＋K=G

)=-ER
＋K=G

)=-ER

K=G

MR Fab のphase

る熱安定性測定

SK=G

計算

>K=G

抗体医薬／イメージングへの応用

A2a-Fab結晶構造
Crystal packing

GLUT（グルコース輸送体）抗体による

GPCR抗体（アロステリックインバース

GLUT5/7のラクトース輸送活性の阻害

アゴニスト）による細胞のイメージング

Fructose transport (pmol)- GLUT5は乳がん細胞特異的に発現
rGLUT5+C45085Fab+C45118Fab
GFP(control)

Fructose transport (pmol)

非結合型：3.4Å

hGLUT7

C40010+2nd Ab(+Alexa546)

組織染色（マウス脳）

time(s)拮抗薬結合型：2.7 Å

培養細胞

-Ab

-Ab
+C45085Fab+C45118Fab
一次抗体（＋）
time(s)一次抗体（ー）New structures (1)G-protein coupled receptors
Human Adenosine A2aR-Fab
complex(Nature
2012)
IV
III

Human Histamine H1R
a(Nature 2011)

ECL3

ECL2

b
ECL1

S-S

ECL1
ECL2

N
S-S

PO43Doxepin

II
Antagonist
Doxepin(ZM241385)

ECL3

D107
W428

VII II

V VI
IV

VII

VI

I

c

NPxxY

D(E)RY

ICL2

C

C

I
H 1R N
!2AR

IV

III
A2a
ECL1
ECL2
receptor

VIII

V

VIII
ICL3

VIII

V

III

CWxP

Human Muscarinic acetylcholine M2R(2012)VI VII

ICL1

C

II

Doxepin
ECL3 i3-loop

I
N
H 1R
D3R

Fig.1

Mouse sugartransporter Fv complex

1.9Å

Human
erythrocyte
anionexchanger 1(Band 3) - Fabcomplex

Antibody FabFragm
ent

Antihistamine (Doxepin)

Inverseagonist

CDR-H3New structures (2)  Supplementary Figure !"#
1

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MmRce1
!"
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Fab (L)!#)#!!"# &#*"#$"#!"#$%&

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1 Structureof the MmRce1-Fab645-2
Rce1 Supplementary
protease-Figure
Fabcomplex(Nature complex. Overall ribbon
NapA&#sodium/H+ antiporter &#diagram of the MmRce1-Fab645-2 complex, with MmRce1 viewed parallel to the

-#

2013)

membrane. MmRce1 is depicted in blue, the antibody Fab fragment heavy chain [Fab(H)] in yellow and the antibody Fab fragment light chain [Fab(L)] in green. MmRce1
interacts with Fab645-2 via its cytoplasmic side.

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-#

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(Nature2013)'#%!3'#(456+!,-./!0)*12#䠄ி㒔኱Ꮫ኱Ꮫ㝔་Ꮫ◊✲⛉䚷ᩍᤵ䠅

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90°

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Diffraction imageat SACLA

28

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30

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32

結晶化リガンドとしての抗体の有用性◊✲䛾ὶ䜜

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問題点：未変性膜蛋白質に対する抗体は極めて取得しにくい

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結晶化リガンドを用いた膜蛋白質の結晶化の原理
右は実際に抗体を用いて結晶化された細菌シトクロム酸化酵素の結晶中のパッキング．水色の分子が結晶化リガンドである．

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Iwata et al.(1995)
Nature 376:660-669

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34

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35

細胞膜

くぼみ#
（$%&!活性部位）

抗体フラ
グメント
図３ Ｒｃｅ１の立体構造
36

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"#

#&'!"

௒ᚋ䛾ᒎ㛤
Ｒｃｅ１の酵素活性中心部位の「くぼみ」!
の構造情報が明らかになった!
Ｒｃｅ１の酵素活性を阻害する、あるいは調節できる!
薬剤の探索・設計の可能性!
抗体フラグメントの構造情報、および抗体の遺伝子を活用!
Ｒｃｅ１の活性を制御する抗体ベースの薬剤の設計の可能性!

細胞膜ペプチド（#$%の一部分）

ファルネシル
基（#$%に結合している）

図４

膜たんぱく質の結晶化を促進する!
抗体フラグメント作製技術の活用!

ペプチド（#$%の一部分）
ファルネシル基（#$%に結合している）

Ｒｃｅ１の活性部位

立体構造解析が難しかった多くの膜たんぱく質の構造そして機37

能解析の迅速化（市販の医薬の!"％以上は膜たんぱく質を標的とするが、その構造はほとんど知られていない）!!"

Gタンパク質共役型受容体（GPCR）とは？

モデルGPCR: ヒトA2aアデノシン受容体

800種類

パーキンソン病の創薬ターゲット
比較的安定で扱いやすい

製薬企業等から高親和性の拮抗薬

市販薬の５０％2008年に構造が得られている

大量生産・結晶化が難しく、2007年までヒトGPCRの詳細構造は「０」V. Jaakola et al. (2008) Science 322, 1211-1217

ヒトA2aアデノシン受容体の発現精製抗体による活性阻害

Pichia pastoris

FLAG

選別した２４種類のモノクローナル抗体

大量培養（５L）

拮抗薬結合活性阻害

作動薬結合活性阻害

セルの破砕

ヒト アデノシンA2a受容体
N/FLAG, C/His10
N154Q
C-terminal deletion (317-412)

可溶化（DDM+CHS)
アフィニティー精製
ゲルろ過精製

２ mg/LT. Kobayashi et al. (2009) B.B.R.C., 380, 271-276

作動薬結合（％）

His

拮抗薬結合（％）

膜画分の調製

３ 複合体精製／共結晶化技術の開発

複合体精製と共結晶化抗体による活性阻害
拮抗薬結合活性阻害±拮抗薬でそれぞれ精製結晶化

作動薬結合活性阻害

拮抗薬あり

結晶化キット（Memsys, Memgold） 5 x 96 well

拮抗薬なし

微結晶

作動薬結合を阻害する機能性抗体が得られた！

展開２: 24 detergent additives,
4 ppt concns, 1 x 96 plates

A280 nm

A280 nm

展開１: pH vs ppt concentration
1 x 96 plate

展開３: 96 additives, 1 x 96 plate

不活性型アデノシン受容体を用いて免疫とスクリーニング
不活性型構造を認識して結合し、構造を固定化
Elution volume (mL)

抗体医薬への展開

Elution volume (mL)

特願2009-254463号

RESEARCH LETTER

A2a-Fab結晶の構造解析

A2a-Fab結晶構造

Antagonist

a

b

120

Crystal packing
X線

回折

Maximal specific[3H]-ZM241385 binding

Specific binding(nmol mg–1 of A2AAR)

12,00010,000
8,000
6,000
4,000
2,000

100
80
60
40
20
0

0
0

10

15

–10

20

Concentration of [3H]-ZM241385 (nM)結晶

Agonistd

MR Fab のphasee12,000Specific binding(nmol mg–1 of A2AAR)

2.7Å

120

Maximal specific[3H]-ZM241385 binding

シンクロトロン放射光510,000
8,000
6,000
4,000
2,000

100
80
60
40
20

0

計算

0

100

200

300

400

500

0

–10 –

600

Concentration of [3H]-NECA (nM)

拮抗薬結合型：2.7 Å 非結合型：3.4Å
Figure 1 | Effect of Fab2838 on A AR–ligand binding. a, Saturation
2A

binding curves for an antagonist [3H]-ZM241385 binding to A2AAR with (opencircles) or without (filled circles) Fab2838. b, c, Inhibition of [3H]-ZM241385
binding by the antagonists theophylline (b) and SCH442416 (c) with (opencircles) and without (filled circles) Fab2838. The binding of [3H]-ZM241385 in

and with Thr 412.39 as observed in the A2AAR-T4L structure (Supplementary Fig. 5b). Because of the insertion of the water moleculeGlu 2286.30 shifts towards the cytoplasmic space, as compared with theequivalent residue in rhodopsin (Glu 2476.30), resulting in the forma
tion of a salt bridge with Arg 220 in the short helical turn of ICL3. ThisVI

A2A Adenosine
Receptor - FabComplex Structure(2.7Å)ECL2

ECL3

A2316.33 I2927.57
293
K22766.29 R293

ECL1

EXT

ICL3

A2A
Adenosine
R

III

II

IV
V

VII

VI

N34
L33
S35
N36
L37
ICL1
N39
39

Antagonist(ZM241385)

R1023.50
I

Ligand L110
binding site

IN

VIII

i3-loop

ICL2
CL2

ICL1

G114
N113
N11

T412.392.40
N422.4IIICL3Fab(H)

VIII

Q297
Q297
E294
T298
T298
8
K301

S2
S223
R222
R2
A2
A221
E219
E

H3

H2

Fab(L)

L1

H1

Fab

L2

Fab(L)
Fab(H)

VII
1292

7.57

T412.39

L2356.37
A2316.33

N39ICL1

S107

N36ICL1

N422.40
G105I
R1023.50

E2286.30
K2276.29

D104
O

W2

O

Y103

T412.39

W1

NH

Y103
O

Y102
O

NH

N101
T2246.26

O

NH

G105

W2
III
W1

K2276.29

d in the G-protein
CDR-H3
I2928.46
binding site

L37ICL1

A2316.33
VI
E2286.30

IVII
N422.40

O

R1023.50

Antibody
Fabfragment

NH

L2356.37

HN

N39ICL1

G106

O

NH

S107
V108

O

NH

R109
NH

c

NH

Crystal packing

O

Antagonist(ZM241385)

L2356.37
30
E22866.30
T2246.26

NH

A2a• Including the intracellularloop 3 (i3), where the Gprotein (Gs) binds.
•Antibody binds to the Gprotein binding site and locks
the receptor into the inactive
conformationb

ZM241385

O

拮抗薬

a

O

A2a-Fab構造（リガンド結合部位）

L37ICL1ONH

N36ICL1

Agonistd-Fab2838 locks A2A adenosine receptor into
the inactive conformation

O201N19+-*@DV(+-/.(G*-E@(D+(DLA(=Q,PA(
W+F;3

Specific binding(nmol mg–1 of A2AAR)

Applications for Functional/Therapeutic
Antibodies and for Imaging

12,00010,000-Cell imaging using antibodies against A2A
adenosine receptor

8,000
6,000
4,000
2,000

Cultured cells

100

200

300

400

500

600
III

b

ICL3

Mouse brain

BI-167107–10 –9–8IIlog[adenosine (M)] III

VII

–7

–6

VII

V

30
E22866.30
T2246.26

ECL2
ECL1

EXT

S2
S223
R222
R2
ICL3 A2
A221
E219
E
III
V

VII

VI

IN

VII

II

VII

I

III

ICL1

7.57 R135
III

6.33

6.29
6

II

VIII

E228

I

II ICL1

III

ICL1

CDR-H3

ICL2

IV

IV

VI

VII

V

ICL1

VIII
I

III R131

II

ICL2

IV

ICL2

ICL3

VI

VII

VIII

I

II

I

ICL2

VI

VII

V

R131

IV

E247

VIII

V

IV

ICL1

V

ICL3

VIII

VI
E228

II ICL1

III R102
ICL2

I

IV

2

2A

0 0 M O N T H 2 0 1 2 | VO L 0 0 0 | N AT U R E | 3

L110
G114
N113
N11
ICL2
CL2

Fab(L)

2.39

H2

Fab2823(A2AAR)

H1

Fab(H)

2.40
2.4

Nb80($2 AR)cdT412.39
Ionic Lock
I2928.46
VII
IV
L2356.37
N422.40
Supplementary Figure 8: Comparison of the structures of !2AR and
A
AR2A
II
1292
2.39
G105
I
2.40
R1023.50
N39ICL1
Fab2838. a, Superposed structures of the inactive!2AR-T4LT41and AN42
AR抗体
2A
HN
L2356.37
R1023.50
L37ICL1
Fab2838. The T4L structure is omitted for clarity.
A2316.33 b. Superposed structures
G106
D104
ICL1
L37
O
VI
NH
Only
the CDR3 andof the active !2AR-Nb80 and the inactive A2AAR-Fab2838.
A2316.33
NH
O
NH
O
G105
W2
W2
N39ICL1
Y103
S107
N36ICL1
CDRH3 are shown for Fab2328 and Nb80, respectively.
Y103
III
W1
6.30
7.57

O

O

NH

O

Y102

K2276.29

O

NH

N101
NH

T2246.26

O

G100

CDR-H3NH
CDR H3
Hydrogen bonds

Y110

V108

O

NH

R109
NH

E2286.30

OO

K2276.29

N36ICL1

NH

S107

NH

W1

O

E228

T2246.26

–3

I

ICL3

CDR-3

2

ICL3

Fab2823(A2AAR)

–4

II

2

I
VIII

Fab(H)–5

I

2A

R1023.50

ICL1

Comparison of Active $2ARNb80 and Inactive A2AARFab2838 Structures

–6

2A

II

IV

ZM241385–7

log[NECA
III (M)]

VI

E268

ICL3

ZM241385
ECL3–8interaction may be important in the formation of the helical str
in ICL3. The ionic lock has not been observed in the crystal stru
of other inactive GPCRs6–11, including A2AAR-T4L, except for
dopamine receptor12. This may be because the ICL3 loops in th
structures
were modified
toA2Astabilize
protein.
While this pap$2 adrenergic receptor-Nb80
Adenosine thereceptorcomplex (Rasmussen et al.,complex (2.5 Å,complex (Scheerer et al.,underreview,
the crystalFab2838
structuresof thermostabilized A
3POG,
activestate)
inactivestate)
3DQB, active state)mutants with native ICL3 were published18,19. The antagonistinactive structures have the ionic lock19. Thus, the ionic lock of A
A231
I292
VIII
R293
293
seems to stabilize the inactive conformation of the protein, w
K227
Q297
Q297
E294
why the receptor has a low basal activity.
T298
T298
8
K301
Fab2838 binds on the intracellular side of the receptor (Fmembrane. Bound ligands are shown as stick models in b AR and A AR. The
Figure 3 | Comparison of the structures of the opsin–GaCT, b AR–Nb80
CDR-H3isinunusuallylongpenetrates
a pocket fright panels show of
the Fab2838
and A AR–Fab2838 complexes. Left, middle andresidues involved
the ionic lock formation
are alsoand
shown. Nitrogenandstructures of an active form of opsin (green) in complex with GaCT (yellow), an oxygen atoms are coloured blue and red, respectively. b, Cytoplasmic views ofinhelicescomplex with Nb80
active form of b AR (brown) bound agonist BI-167107
the complexes.
Surface representationsof cytoplasmicof thebyII,
III,
VI c,andVII (Fig.
2b).surfaces
CDR-H3interacts w
CDR-3 (blue) and an inactiveN34
form of A AR (blue-grey) bound antagonist
receptors. Surfaces within 4 Å of GaCT, CDR-3 or CDR-H3 are coloured red.
ZM241385 in complex with Fab2838 CDR-H3 (red).
a, Views parallel to the helices by forming six hydrogen bonds and eig
surrounding
L33
S35
der Waals contacts (Fig. 2c, d). The most extensive interactio
N36
L37
ICL1
with helix II (mainly through hydrogen bonds) and helix VI (
N39
39
T41
N42
through van der Waals contacts). In addition, a hydrogen bonIIwork including two water molecules is observed between CDR-H
新たなGPCRの阻害機構を明らかにすることに成功
helices III and VI (Fig. 2c, d). This hydrogen bond network to
H3with the van der Waals interactions seem to stabilize the modifie
L1
lock interaction between Glu 2286.30 (helix VI) and Arg 1023.50
L2受容体III) discussed above. Other complementarity-determining r
further stabilize the A2AAR–Fab2838 complex by forming 14
Fab(L)
gen bonds with helices VI and VIII and ICL1, ICL2 and ICL3 (FICL2

L2356.37

不活性型–10 –9

II

VIII

GαCT

III

b

–3

VI

VI
E247

V

VI

–4

VI
V at 100%. d, As in a, but for the agoni
the absence
ofVIIa competitor was set
R102
R131
VII
NECA.
e, f, As inc and d, but for the agonists
adenosine (e) and NECA
VIII
E268
VIII
E228
data are the mean
6
s.e.m.
ofthree
independent
experiments perform
CDR-3
CDR-H3duplicate.

and with Thr 412.39 as observed in the A2AAR-T4L structure (Supplementary Fig. 5b). Because of the insertion of the water molecule,Glu 2286.30 shifts towards the cytoplasmic space, as compared with theequivalent residue in rhodopsin (Glu 2476.30), resulting in the forma- G#CT (C-terminaltion of a salt bridge with Arg 220 in the short helicalOpsinc turn of ICL3. This
peptide of the G-protein)Control

–5

V

I

R135

Nb80($2 AR)

0

活性型

0

Concentration of [3H]-NECA (nM)

a

[3

[3

活性型構造との比較

a00with 1ry antibody

f

e

V
R135
Figure 1 | Effect of Fab2838 on A2AAR–ligand binding. a, SaturationVI(openbinding curves for an antagonist [3H]-ZM241385 binding to A2AAR with VIII
3 E247
circles) or without (filled circles) Fab2838. b, c, Inhibition of [ H]-ZM241385
GαCT
binding by the antagonists theophylline (b) and SCH442416ICL3(c) with (opencircles)
and without(filled circles) Fab2838. The binding of [3H]-ZM241385 in
GFP(control)
C40010+2nd Ab(+Alexa546)

XU<Y$RZ7N1-D=9+-*@DV(Q=-(G*-E(D+(DLA(*-=Q,PA(W+F;3

binds in a similar position to CDR-H313 (Supplementary Fig. 10).
The conformationalchanges of a5 together with the Gas amino0
terminal region induced by the activated receptor has been proposed
to result in a nucleotide exchange from GDP to GTP in Gas and to–3. Thus, thesubsequentdissociation–10 –9of the–8subunit–7 from–6 the–5receptor–4 20–3
binding pocket formed by helices
II, III, VI and VII
log[SCH442416(M)]seems to be the keysite for the signal transfer between GPCRs and G proteins.
A possible inactivation mechanism of A2AAR by Fab2838 issummarized as follows. Agonist binding induces large displacementsof the intracellularends of helices III, VI and VII16,18, which are essen120
tial to form the G-protein binding pocket13,20 (Supplementary Fig. 1).
This indicates
100 that the signal from the ligand-binding pocket is transferred through these helices and the conformations of the two pockets
80coupled. Our agonist- and antagonist-binding experiare strongly
ments indicate that this coupling also allows signal transfer in the60
reverse direction,from the G-protein-binding pocket to the ligandbinding pocket (Fig. 1). CDR-H3 of Fab2838 locks the positions ofhelices III, 40
VI and VII from the cytoplasmic side, leading to an inactive
conformation of the extracellular ligand-binding pocket to which
20 bind, probably because of the rearrangement of theagonists cannot

The extensive interactions explain the high affinity of Fab2838 (dissociation constant, Kd 5 4.4
0 nM) (Supplementary Fig. 8).
The binding site of Fab2838 CDR-H3 in A2AAR is similar to those of
Nb80 CDR-3 in b2AR2 and GaCT in opsin1. A critical difference is that–10 –9 –8–7 the–6–5recog–4
05
10
15 stabilizes
20 an inactive conformation
Fab2838
whereasothersnize active (nM)
conformations of the receptors.
These structures (M)]are comConcentration of [3H]-ZM241385
log[theophylline
pared in Fig. 3. In the opsin structure, GaCT, which forms a shorta-helix, fits into a large pocket formed by helices II, III, V, VI and VIIinteracting with the Arg residue of the D/ERY motif in helix III (Fig. 3,
left panels). CDR-3 of120
Nb80 in the b2AR structure binds in a similar
position to GaCT although CDR-3 forms a b-hairpin1 (Fig. 3, middle
panels). CDR-H3 of Fab2838
also forms a b-hairpin but induces a100
differently shaped binding pocket (Fig. 3c). In the b2AR structure,80
CDR-3 of Nb80 is positioned
between helices III and VI, whereas in
the A2AAR structure CDR-H3 of Fab2838 is ,6 Å closer to helices II
60
and VII (Fig. 3b and Supplementary
Fig. 9). This allows the close
association of helices III and VI and the formation of the modified
ionic lock between Arg 40
1023.50 in helix III and Glu 2286.30 in helix VI,
consequently stabilizing the inactive conformation. In the b2AR/Gs20 the C-terminal a-helix (a5) of Ga also
protein complex structure,s

Maximal specific[3H]-ZM241385 binding0

Maximal specific[3H]-ZM241385 binding

2,000

Y110

O

Hydrophobic contacts

Figure 2 | Structure of the A2AAR–Fab2838 complex. a, Overall str
viewed parallel to the membrane. A2AAR and the Fab light (Fab(L)) an(Fab(H)) chains are shown in blue-grey, cyan and magenta, respective
three disulphide bonds in the extracellular loops (ECLs) are represent
yellow sticks. The bound antagonist ZM241385 in the ligand-binding p
shown as a space-filling model. The CDRs of Fab2838 are coloured as
CDR-H1, yellow; CDR-H2, orange; CDR-H3, red; CDR-L1, green; CD抗体
purple; CDR-L3, marine
blue. EXT,
extracellular; IN, intracellular. b,
新規薬剤結合部位候補
representation of the interface between A2AAR (top) and Fab2838 (boRelative to a, A2AAR has been rotated 90u around a horizontal axis, w
アロステリック・インバースアゴニスト抗体
Fab2838 is shownin the same orientation. c, View of the interface bet
A2AAR (green residues) and CDR-H3 (orange residues). The main ch
A2AAR is shown as ribbon representation as in a. Red spheres show th
positions of water molecules. Red dotted lines indicate hydrogen-bondinteractions. d, Schematic representation of the interface between A2A
CDR-H3.

2 | N AT U R E | VO L 0 0 0 | 0 0 M O N T H 2 0 1 2

Nature nature10750.3d 11/1/12 12:42:55

作動薬、拮抗薬、アロステリック・インバースアゴニスト

e 8: Comparison of the structures of !2AR and A2AARed structures of• theinactive !2AR-T4L and A2AAR作動薬が結合すると受容体は活性化され、情報が伝達される。
• for
拮抗薬は作動薬の結合を阻害するが受容体の状態は固定されないため活性が残る。
ucture is omitted
clarity. b. Superposed structures• インバースアゴニストは受容体を不活性型に固定するため、活性は完全に消失する。
80 and the inactive
A2AAR-Fab2838. Only the CDR3 and• 抗体はアロステリック部位に結合しており、A2a受容体に特異的な分子標的薬である。
Fab2328 and Nb80,
respectively.

拮抗薬

作動薬

X

細胞外

自然に変化で

X

固定

きる
細胞内

Gタンパク質結合、細胞内
情報伝達

活性型受容体アロステリック・インバー
スアゴニスト抗体

不活性型受容体
T. Hino et al. (2012) Nature, 482, 237-240これまでの研究成果／今後の展開• 研究成果／進捗状況– 良好な抗原用／結晶化用のほ乳類トランスポーターの生産– リポソームを用いた膜蛋白質に適した免疫法の確立– リポソームELISA法、Biacore法等の構造認識抗体スクリーニング法の確立– Fab抗体ファージライブラリーを用いたリコンビナント抗体の作成法の確立– ７種類の膜蛋白質に対する構造認識抗体を作成– ターゲット／抗体複合体の調製、結晶化• 今後の展開– 複合体の構造解析（抗体構造を使った分子置換）– 他のターゲットに対する抗体の作成– 活性測定等をスクリーニングに組み込み、抗体医薬等に使用可能な機能性抗体を選択する技術を確立