光合成研究
第19巻第 1号（通巻54号）2009年4月

NEWS LETTER Vol. 19 NO. 1 April 2009
THE JAPANESE ASSOCIATION FOR PHOTOSYNTHESIS RESEARCH
巻頭言

池内昌彦

1

植物の多様性を支える多様な側面

2

青色光受容体フォトトロピンに依存した植物の生長制御
井上晋一郎、武宮淳史、島崎研一郎

4

第９回日本光合成研究会公開シンポジウム

トピックス

トピックス

解説

解説

解説

解説

光合成膜ガラクト脂質合成経路の多様性
粟井光一郎

9

池内昌彦

13

光化学系複合体の結晶解析の歴史とタンパク質結晶解析の初歩

光化学系IIの例から見る膜タンパク質複合体の結晶化と構造解析
沈 建仁・川上

恵典

19

福山恵一

26

栗栖源嗣

31

不安定なタンパク質を見る

タンパク質相互作用を見る

集会案内

学術創成研究合同シンポジウムのご案内
光合成の色素系と反応中心に関するセミナーXVII 開催予告

35

新刊図書

36

「光合成研究法」出版のご案内
事務局からのお知らせ

3740

日本光合成研究会会員入会申込書
日本光合成研究会会則
幹事会名簿

41
42
44

編集後記

45

賛助法人会員広告

光合成研究19 (1) 2009

巻頭言

ご挨拶

２００９年より、２年間、日本光合成研究会の代表をお引き受けすることになりました。つ
きましては、簡単な挨拶を述べさせていただきます。
日本光合成研究会は１９７９年に発足して以来、ちょうど３０年になりました。その間、日本を含めて光合成研究は順調に発展を続けてきて、日本光合成研究会の活動もその一翼を担ってきたと思います。また、昨今はエネルギー・食糧問題、地球温暖化問題、また経済活動の世界的な失速などさまざまな問題に直面しており、社会から光合成研究への期待はますます大き
くなっています。また、光合成研究が植物科学やバイオテクノロジーにより広く組み込まれることによって、より広い分野の人たちに受け入れられつつあります。このような時代には、日本光合成研究会の役目は自ずから変わらざるを得ないかもしれません。現在、ちょうど「研究会」から「学会」への移行の是非を議論していますが、その結論はともかくとして、私たちはより開かれた研究会として、他分野や社会との連携をはかりつつ活動を進めていく必要があります。
また、若い人にとっては、光合成研究と他の分野との研究での境界があいまいになってきています。光合成研究はいうまでもなく総合科学です。人工光合成から生物物理学、生化学、分子生物学、細胞学、生理学、生態学、地球環境科学まで多岐にわたっています。これらの研究と研究者の情報交換と切磋琢磨を目指すことはいうまでもありません。日本光合成研究会はこれらの問題に積極的に取り組み、光合成研究のますますの発展を目指します。
このような時期に、代表を引き受けた小身としましては、その責務に耐えられないのではないかという皆様の不安を払拭すべく、会の運営と発展に力を尽くして行きたいと考えています。
当面は、事務局・鹿内さんと多くの常任幹事の方々と協力して運営していく方針です。また、そのためには会員の皆様にもご尽力をお願いすることも多々あるかと思います。どうぞよろしく
お願いいたします。

池内昌彦

1光合成研究 19 (1) 2009

第9回日本光合成研究会公開シンポジウム

植物の生産性を支える多様な側面
2009年5月29日〜30日（ 東京大学数理科学研究棟大講義室（駒場キャンパスI））

プログラム（敬称略）
5月29日（金）
13:00

はじめに

13:10~13:50

芦刈基行（名大）「イネの多様性研究から育種へ」

13:50~14:10

石田宏幸（東北大）「暗処理葉における葉緑体のオートファジー」

14:10~14:25

Chosen from poster presenters

ポスター紹介、ブレイク＆ポスターViewing
16:30~17:20

総会

17:20~18:00

牧野周（東北大）「イネの個葉光合成と生産性」

18:00~

総合討論（１）

18:20~

懇親会

5月30日（土曜日）
8:30~

ポスター賞発表＆授賞式

9:00~9:40

小川健一（岡山生物研）「グルタチオンによる C O 2 固定回路の制御と収量性」

9:40~10:20

井澤毅（生物研）「イネの収量性における出穂期制御や概日時計の役割」

ブレイク
10:35~11:15

野口航（東大）「植物の呼吸と物質生産」

11:15~11:35

坂本光（九大）「植物の塩ストレス耐性に関与するアンキリンリピートタン
パク質ITN1」

11:35~11:50

Chosen from poster presenters

11:50~

総合討論（２）

12:30~13:00

ポスター撤去閉会2

光合成研究オーガナイザー：小川健一（岡山生物研）、牧野

19 (1) 2009

周（東北大）

例年通り、優秀ポスター賞を互選します。沢山のポスター発表申し込みをお待ちしています。
またポスター発表の中で希望する方の中から、オーガナイザーが2題を選び、口頭発表（15分）
を行っていただく予定です。
参加ご希望の方は、電子メール（photosymposia@bio.c.u-tokyo.ac.jp)でご登録をお願いします。
シンポジウムは誰でも参加できます。整理の都合上、事前登録締切りは５月１６日ですが、当日参加も受け付けます。ポスター発表は、事前登録のみとし、会員に限らせていただきます。
（発表を希望される方はご入会ください。シンポジウム当日ご入会いただくことも可能です）。
近日中にWeb上（http://wwwsoc.nii.ac.jp/photosyn/index.html）でも詳細をお知らせ致します。

電子メールでの登録内容

氏名：
所属：連絡先（住所、電話／FAX、E-mail）：
懇親会参加希望（一般有無ポスター発表：有無ポスター発表を行う場合の口頭発表希望：有

無3,000円、学生 2,000円の予定）：

ポスタータイトル：
発表者氏名・所属：
内容（2〜3行程度）：

3

光合成研究 19 (1) 2009

TOPICS
青色光受容体フォトトロピンに依存した植物の生長制御
九州大学・理学研究院
井上晋一郎、武宮淳史、島崎研一郎*
はじめに
植物は太陽光を光合成に必要なエネルギー源として利用するのみならず、光の質と量の違いを環境情報として利用することにより、刻々と変化する光環境下において生長が最適となるよう応答する。光を感知する
図1

受容体には、フィトクロム、クリプトクロム、フォト

フォトトロピンが制御するシロイヌナズナの青色光反応

トロピン等がある。このうち、フィトクロムは主に赤

図中の青い矢印は、方向性のある青色光を示し、その大小で色光と遠赤色光を、クリプトクロムは青色光を受容

青色光強度を表している。青い稲妻は、方向性のない青色光

し、多様な光形態形成反応に関与する。これに対し、を示す。

青色光を受容するフォトトロピンは光屈性、葉緑体の光定位運動、気孔の開口、葉の平坦化、葉の光定位運

く取り込むための応答であると考えられてきた。しか動などを誘導する。フォトトロピンが制御するこれらしながら、実際にフォトトロピンを介した反応が植物の応答は、植物が光を出来るだけ多く吸収し、光合成の光合成を向上させるかどうかの直接的証拠は得られを増大させる働きを持つ。本稿では、フォトトロピンていなかった。我々はフォトトロピン変異株を用い、が青色光をシグナルとして利用し、植物の生長を促進

フォトトロピンが実際に光合成を増大させ、植物の生する機構について概説する。また、最近明らかになり長を促進することを実験的に示した4）。

つつあるフォトトロピン自身の活性制御についてもふ

シロイヌナズナの野生株を25 µmol m-2 s-1の赤色光れる。

下と、同じ強さの赤色光に0.1 µmol m-2 s-1の微弱な青色光を添加した混合光条件下で4週間生育させ、生重

1. フォトトロピンに依存した植物の生長促進量を比較した。その結果、混合光下で生育させた植物

フォトトロピン(phot1、phot2)は植物特有の青色光

は、赤色光のみで生育させた植物に比べ生重量が約3受容体で、青色光に依存して上記の生理反応を誘導す倍増加した(図2 )。この微弱な青色光による劇的な生る（図1） 1 - 3）。光屈性、葉の光定位運動（個々の葉長促進は、フィトクロムやクリプトクロム変異株でもが、青色光に対し垂直に葉面を向ける運動）は、植物観察されるが、phot1 phot2 二重変異株では観察され体が光の方向に向かって成長・運動し、葉面を光に垂ず、フォトトロピンにより仲介されていることが分か直に向ける反応である。葉緑体光定位運動は、弱い光る。この光条件下では、青色光によって野生株では葉のもとでは葉緑体が光と垂直な細胞面に集まり、強い緑体が光と垂直な細胞面に集まり、気孔が開き、葉が光のもとでは葉緑体が光と平行な細胞面に逃げる反応

平らに展開したのに対し、phot1 phot2 二重変異株でである。気孔開口は、大気と植物体内とのガス交換にはこれらの反応が全く見られなかった。このフォトト用いられる表皮の穴「気孔」を開かせる反応である。

ロピンに依存した生長促進は、照射する赤色光の強度

葉の平坦化とは、葉が巻くのを防ぎ、平らにする反応が増加するにつれ減少した。つまり、フォトトロピンである。これらの反応は、植物が光合成に必要な光をは上記の生理応答を同時に誘導することにより植物の効率よく集め、炭酸固定に用いる二酸化炭素をより多光合成を最大にし、弱い光環境のもとで生長を促進す* 連絡先

E-mail: kenrcb@mbox.nc.kyushu-u.ac.jp4

光合成研究

図2

図3

青色光に依存した生長促進(A) 赤色光 25 µmol m-2 s-1

19 (1) 2009

nph3 変異株の青色光に依存した生長促進

図2と同じ光条件で5週間生育させたnph3 変異株の写真(A)と(RL)、赤色光 25 µmol m-2 s-1と青生重量比較(B)。

色光 0.1 µmol m-2 s-1の混合光 (RL+BL) 条件下で5週間生育させたシロイヌナズナ（野生株、phot1 phot2 二重変異株）の写

トトロピンが制御する各々の生理応答に特有の情報伝

真達因子を同定することがこの機構の解明において重要(B) 同光条件で4週間生育させた植物における生重量比較

であり、各生理応答の生長促進への寄与の理解にも役

phot1 phot2 はフォトトロピンを欠く変異株。

立つだろう。
ることが示された。

3. フォトトロピンの自己リン酸化と生理応答
2. 各フォトトロピン生理応答の生長への寄与

フォトトロピンは、N末端に青色光を受容する2つのフォトトロピンは複数の生理応答を同時に誘導する

LOVドメイン(LOV1、LOV2)を持ち、C末端にはSer/ことで、光合成の増大・生長を促進するが、どの反応

T h rキナーゼドメインを持つ受容体型のキナーゼであが最も生長促進に貢献しているのか、手がかりが得らる(図4-A) 5)。最近、大阪府立大学の徳富グループは、れつつある。以前に著者らは、葉の光定位運動が損な

以下のようなフォトトロピン分子の活性化モデルを提わ れ た 変 異 株 の ス ク リ ー ニ ング を 行 い 、 n p h 3

唱した6, 7)。暗黒下ではLOV2ドメインがキナーゼドメ(NONPHOTOTROPIC HYPOCOTYL3) 変異株を単離しインに結合し、キナーゼ活性を阻害している。青色光た 2 ) 。この変異株は、胚軸の光屈性の変異株としてすの受容によってL O V 2ドメインがキナーゼドメインかでに単離されていたものであったが、葉の光定位運動

ら解離すると、同時に阻害も解除され、キナーゼドメにも関与していることが明らかになった。

インが活性化する。青色光を受容して活性化したフォn p h 3変異株を前述した混合光条件下で生育させる

トトロピンのキナーゼドメインは、自身をリン酸化すと、赤色光のみの条件下で生育させた場合と比較しる「自己リン酸化」反応を示すようになる(図4 - B ) 8 ,て、 1 . 5 倍程度しか生長が促進されなかった ( 図9 ) 。フォトトロピンは元来、青色光に依存してリン酸3)。nph3変異株では、この条件下で正常な葉緑体光定化される蛋白質として細胞膜中に発見された。そし位運動と気孔の開口反応が観察されるが、葉の平坦化て、この自己リン酸化の程度が、光屈性反応や気孔開は誘導されず、下向きにカールした葉の形になった

口に関わる反応と正の相関を示すことから10-13)、自己2 ) 。つまり、葉の平坦化と葉の光定位運動が損なわれリン酸化自体が生理応答に必須であると考えられてきるだけで、野生株で観察された劇的な生長促進は大きたが、長い間この自己リン酸化の生理学的意味は不明

く減少するのである。この結果は、葉の平坦化と光定のままであった 3) 。最近筆者らは、この問題を解決す

位が弱光下での生長促進に大きく貢献していることをべく、フォトトロピンの植物体内における自己リン酸示している。今のところ、葉緑体光定位運動や気孔開化部位を同定し、機能解析を行った。

口の生長に対する正確な貢献度は明らかでなく、おそ

青色光を照射したシロイヌナズナの芽生えから免疫

らく、生育条件における光強度の違いによって各反応

沈降法等により p h o t 1 蛋白質を単離し質量分析を行の貢献度も異なるものと思われる。一方、フォトトロい、phot1の自己リン酸化部位を8箇所同定したピンを介する情報伝達においてNPH3が葉の平坦化やA) 14)。そのうち3つがLOV1ドメインより上流のN末端

光定位運動に関与するものの、葉緑体光定位運動や気領域に、3つがLOV1とLOV2の間のHinge 1 領域に、1孔開口に関与しないことは明らかである。今後、フォつ（または2つ）がキナーゼドメインに、1つがキナー

5

(図4-

光合成研究 19 (1) 2009
ゼより下流のC末端領域に位置していた。キナーゼド
メインのリン酸化は、質量分析の結果からはSer-849とSer-851のどちらがリン酸化されているのか区別出来なかった。以前の間接的な方法を用いた研究から、オートムギのphot1aにおいて、N末端とHinge 1 領域が複数箇所ずつ自己リン酸化されるとされていたが15)、今回得られたものとその部位は異なっていた。今回の研究で初めてC末端側のキナーゼドメインの中にもリン酸化部位が同定され、その部位はキナーゼドメイン

図4の特にアクティべーションループに位置していた。こシロイヌナズナのphot1で同定された自己リン酸化部位(A) フォトトロピンのドメイン構造と同定された自己リン酸のようにして決定されたp h o t 1のリン酸化部位の役割

化部位を以下のように解析した。まず、同定されたリン酸化

N末端側には2個のLOV (Light、Oxygen、Voltage) ドメイン部位に1つずつ、または2つ以上同時にアミノ酸置換をが、C末端側にはセリン／スレオニンキナーゼドメインがあ導入したphot1蛋白質を発現するための遺伝子コンスる。LOV1より上流をN末端、LOV1とLOV2の間をHinge 1、キナーゼドメインより下流をC末端と呼ぶ。青色光を照射しトラクトを作製する。ついで、この遺伝子を、フォトた植物体からphot1蛋白質を集めて質量分析にかけ、リン酸

トロピンを欠いた phot1 phot2 二重変異株で発現さ化部位を同定した。

せ、変異phot1蛋白質が上記の生理応答を正常に誘導(B) フォトトロピンの自己リン酸化反応を示すオートラジオ

できるか調べた。もし、正常な反応が回復されれば、グラフィ変異させたリン酸化部位は重要な役割を果たしていな

シロイヌナズナの野生株の黄化芽生えを 3 2 P正リン酸でラベいことになる。その際、リン酸化部位を A l a に置換ルし、青色光 (100 µmol m-2 s-1、30秒) を照射した。phot1蛋

し、そのアミノ酸の脱リン酸化状態をミミック

白質を免疫沈降法で集め、SDS-PAGEにかけ、オートラジオ
グラフィでリン酸化を検出した。

し、Aspに置換することにより、擬似リン酸化状態とした。その結果、今回同定されたリン酸化部位のうの認識に重要であることが知られている 1 6 ) 。S 8 4 9 A

ち、キナーゼドメインのアクティべーションループにS851A-6 株では、生理応答がほとんど誘導されないに位置するS e r - 8 4 9とS e r - 8 5 1を同時にA l aに置換したも関わらず、この変異p h o t 1は植物体内でほとんど正phot1発現株 (S849A S851A-6株) のみが光屈性、気孔常な自己リン酸化活性を有していた（図5-A） 14) 。つ

開口、葉緑体光定位運動、葉の平坦化の全てを回復し

まり、この部位の変異は、キナーゼ触媒活性そのものなかった。また、意外なことに、リン酸化部位のうちには影響を与えず、下流への情報伝達に影響を与えて

S e r - 8 4 9とS e r - 8 5 1以外の全てをA l aに置換した変異いることを示唆している。このことから、p h o t 1におphot1蛋白質は、野生型phot1と同様にどの生理応答もいてアクティべーションループのリン酸化は、下流の正常に誘導した。さらに、Ser-849とSer-851の両方を基質蛋白質を認識し、リン酸化するために重要な役割

Aspに置換したphot1擬似リン酸化株 (S849D S851D-3

をもっていると考えられる。

株) では、どの生理応答もほぼ正常に誘導した。これ

さらに、このアクティべーションループ中のSer-851

らの結果は、多くのフォトトロピンの自己リン酸化部のリン酸化を、特異的抗体を用いて確認し位の中で、アクティべーションループの自己リン酸化

た。Ser-851は、暗黒下でもある程度リン酸化されてのみが下流に情報を伝達するために必須で、フォトト

いるが、青色光に依存して1分以内にリン酸化レベル

ロピンが制御する生理応答に共通して必要であることが増加した(図5 - B )。また、触媒活性を無くした変異を意味している。

p h o t 1 蛋白質においては、この青色光に依存した

4.

Ser-851のリン酸化が観察されず14)、情報伝達に重要なアクティべーションループの自己リン酸化とアクティべーションループのSer-851は青色光に依存しキナーゼ活性の制御て自己リン酸化されることが確かめられた。phot1擬

一般的に、プロテインキナーゼのアクティべーショ

似リン酸化株S849D S851D-3では、アクティべーショ

ンループのリン酸化は、触媒活性の増加と基質蛋白質

6

光合成研究19 (1) 2009

ンループの自己リン酸化状態をミミックしたが、この株の変異phot1蛋白質は暗黒下ではどの部位も自己リ
ン酸化活性を示さず（図5-A）、どの生理応答も誘導しなかった14)。これらの結果は、フォトトロピンの情報伝達には青色光によるアクティべーションループの

図6

自己リン酸化が必要であるが、この自己リン酸化だけ

生長では不十分であり、リン酸化されてかつ青色光が当

全ての植物は、白色光50 µmol m-2 s-1 で3週間生育させた。

たっている必要があることを示している。青色光によ

黒いバーは、1 cmを示す。

るフォトトロピンの自己リン酸化とLOVドメイン等のアクティべーションループのリン酸化変異株におけるン依存の反応に必要であるという結果に対応してい構造変化が同時に起こることが、下流の基質蛋白質のた。一方、S849A S851A-6 株の生長の低減が phot1

リン酸化に必要なのかもしれない。

phot2 二重変異株と同じであることは、アクティべー
ションループのリン酸化が損なわれると、全てのフォ

5. フォトトロピンの自己リン酸化と生長促進

トトロピン制御応答が起こらず、光合成活性が低下し最後に、S849A S851A-6株とS849D S851D-3株におてしまい、生長が損なわれることを示唆している。

ける通常生育条件（50 µmol m-2 s-1の白色光）下の生長を示した（図6）。野生型phot1を発現するWT-11株

おわりにでは、野生株と変わらない生長を示した。これに対

フォトトロピンは青色光に依存して多様な反応を制し、S849A S851A-6株では、phot1 phot2 二重変異株と御し、これらの全てが光合成を増大させ、生長促進に差が見られない程生長が著しく損なわれた。S 8 4 9 D

寄与することが証明され、とりわけ、葉の平坦化と光S851D-3株ではWT-11と差が見られない。以上のこと

定位運動が大きな役割を果たしていることが分かっは、自己リン酸化反応が、調べた全てのフォトトロピ

た。しかし、同じフォトトロピンという光受容体がまるで異なる反応を引き起こす機構は謎に満ちている。
例えば、最も良く解明されている気孔開口と葉緑体光定位運動を比較すると、今までのところフォトトロピ
ン以外の共通因子は見いだせない。各反応はフォトト
ロピンの直下の成分から分岐しているのだろうか、それともフォトトロトロピン以外の共通成分が存在するのだろうか。研究の焦点の一つはこの反応分岐のメカ
ニズムである。もう一つの重要な課題はフォトトロピ
ンのリン酸化の基質探しである。世界中の多くの研究者の努力にも拘わらず、フォトトロピンの基質と呼べるものは未だ同定されておらず、この基質の解明がこの分野にブレークスルーをもたらすと期待されてい図5

アクティべーションループの自己リン酸化とキナーゼる。

活性への影響(A) アクティべーションループのリン酸化変異株における自参考文献

己リン酸化活性1. Briggs, W, R., Christie, J, M. (2002) Phototropins 1 and
2: versatile plant blue-light receptors. Trends. Plant.
Sci. 7, 204-210.
2. Inoue, S., Kinoshita, T., Takemiya, A., Doi, M.,
Shimazaki, K. (2008) Leaf positioning of Arabidopsis
in response to blue light. Mol. Plant 1, 15-26.
3. Christie, J, M. (2007) Phototropin blue-light receptors.
Annu. Rev. Plant Biol. 58, 21-45.
4. Takemiya, A., Inoue, S., Doi, M., Kinoshita, T.,

各植物の黄化芽生えに青色光 (100 µmol m-2 s-1、30秒) を照射
して、植物体内におけるp h o t 1の自己リン酸化反応を測定した。Phot1が自己リン酸化すると14-3-3蛋白質と結合することを利用し、phot1に結合する14-3-3蛋白質の量をFar-Western
blotでモニターした。
(B) リン酸化されたSer-851を特異的に認識するpSer-851抗体
を用い、青色光 (100 µmol m-2 s-1、30秒) に対するこの部位のリン酸化の変化をImmunoblotにより調べた。

7

光合成研究 19 (1) 2009

Shimazaki, K. (2005) Phototropins promote plant
growth in response to blue light in low lightenvironments. Plant Cell 17, 1120-1127.
5. Huala, E., Oeller, P, W., Liscum, E., Han, I-S., Larsen,
E., Briggs, W, R. (1997) Arabidopsis NPH1: A protein
kinase with a putative redox-sensing domain. Science
278, 2120-2123.
6. Matsuoka, D., Tokutomi, S. (2005) Blue light-regulated
molecular switch of Ser/Thr kinase in phototropin.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102,13337-13342.
7. Tokutomi, S., Matsuoka, D., and Zikihara, K. (2008)
Molecular structure and regulation of phototropin
kinase by blue light. Biochim. Biophys. Acta 1784,
133-142.
8. Christie, J, M., Reymond, P., Powell, G., Bernasconi,P., Railbekas, A, A., Liscum, E., Briggs, W, R. (1998)
Arabidopsis NPH1: A flavoprotein with the propertiesof a photoreceptor for phototropism. Science 282,
1698-1701.
9. Sakai, T., Kagawa, T., Kasahara, M., Swartz, T, E.,
Christie, J, M., Briggs, W, R., Wada, M., Okada, K.
(2001) Arabidopsis nph1 and npl1: Blue light receptors
that mediate both phototropism and chloroplast
relocation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6969-6974.
10. Reymond, P., Short, T, W., Briggs, W, R., Poff, K, L.
(1992) Light-induced phosphorylation of a membraneprotein plays an early role in signal transduction forphototropism in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 89, 4718-4721.
11. Palmer, J, M., Short, T, W., Briggs, W, R. (1993)
Correlation of blue light-induced phosphorylation tophototropism in Zea mays L. Plant Physiol. 102,
1219-1225.
12. Salomon, M., Zacherl, M., Rüdiger, W. (1997)
Asymmetric, blue light-dependent phosphorylation of a
116-kilodalton plasma membrane protein can becorrelated with the first- and second-positive
phototropic curvature of oat coleoptiles. Plant Physiol.
115, 485-491.
13. Kinoshita, T., Emi, T., Tominaga, M., Sakamoto, K.,
Shigenaga, A., Doi, M., Shimazaki, K. (2003) Bluelight- and phosphorylation-dependent binding of a
14-3-3 protein to phototropins in stomatal guard cell of
broad bean. Plant Physiol. 133, 1453-1463.
14. Inoue, S., Kinoshita, T., Matsumoto, M., Nakayama, K,
I., Doi, M., Shimazaki, K. (2008) Blue light-induced
autophosphorylation of phototropin is a primary stepfor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105,5626-5631.
15. Salomon, M., Knieb, E., von Zeppelin, T., Rüdiger, W.
(2003) Mapping of low- and high-fluence
autophosphorylation
sites
inphototropin
1.
Biochemistry 42, 4217-4225.
16. Nolen, B., Taylor, S., Ghosh, G. (2004) Regulation ofprotein kinases: controlling activity through activation
segment conformation. Mol. Cell. 15, 661-675.

8光合成研究19 (1) 2009

TOPICS
光合成膜ガラクト脂質合成経路の多様性
静岡大学・若手グローバル研究リーダー育成拠点
粟井

光一郎*

そして唯一のリン脂質であるホスファチジルグリセ

１．はじめに酸素発生型光合成を行う生物のチラコイド膜は、ロール（P G）が存在する。この脂質組成は、植物や例外なく多量のガラクト脂質、モノガラクトシルジ

藻類の葉緑体からラン藻まで保存されており、光合成

アシルグリセロール（M G D G）とジガラクトシルジ装置の類似性や、葉緑体ゲノムの存在などと合わせ、アシルグリセロール（ D G D G ）を含んでいる（図細胞内共生説の 1つの根拠となっている 1 ) 。なぜこの

1）。MGDGとDGDGは、それぞれチラコイド膜の約ような脂質組成が保存されているのかは明らかとなっ

5 0 %、3 0 %を占め、両ガラクト脂質を合わせると約ていないが、複雑な膜系であるチラコイド膜の構築80%に達する。これは、細胞膜や葉緑体以外のオルガに、光合成産物である糖を利用することにより、貴ネラ膜、光合成を行わない生物全般の生体膜が主に重な資源であるリンを浪費しないための植物の戦略

リン脂質で構成されていることと大きく異なっていだとする説が有力である。

る。我々哺乳類も含め、身近な生物全般がリン脂質

近年、光合成タンパク質複合体の結晶構造解析がを主要な膜構成脂質とすることから、ガラクト脂質

進んだ結果、複合体内部に多数の脂質分子が取り込

はマイナーな脂質と思われがちだが、植物や藻類、まれていることがわかってきた2)。光化学系I複合体のラン藻など、光合成生物のバイオマスを考えると、実モノマーには4分子の脂質（1分子のMGDGと3分子のは地球上で最も豊富に存在する「メジャー」な脂質

PG）、光化学系II複合体のモノマーには25分子の脂である。チラコイド膜には他に、酸性糖脂質である質 3 ) （1 1分子のM G D G、7分子のD G D G、5分子のスルホキノボシルジアシルグリセロール（SQDG）、

SQDG、2分子のPG）、LHCIIのモノマーあたり1分子

図１ チラコイド膜脂質
α、βは糖の配位する方向を示している。
* 連絡先 E-mail: dkawai@ipc.shizuoka.ac.jp9光合成研究 19 (1) 2009のDGDGと1分子のPG、b6f複合体には2分子のMGDGの遺伝子を同定した際に用いた、簡単な「比較ゲノが結合していると予測されている。これらの結果か

ム学的」解析法を紹介し、破壊株を用いた解析からら、ガラクト脂質はチラコイド膜の構築だけでなわかった、光合成膜におけるガラクト脂質の機能にく、光合成タンパク質複合体の機能発現を通して、ついて論じる。

光合成機能に深く関わっていると考えられている。
植物のMGDGおよびDGDG合成酵素遺伝子は既に

２．ラン藻ガラクト脂質合成酵素遺伝子の同定単離され、それらを用いた逆遺伝学的解析から、各

これまで、ラン藻が植物と異なる経路でM G D Gを

脂質の生理学的機能が明らかとなりつつある4)。しか合成していることが、生化学的解析により明らかにさし、植物のガラクト脂質は、葉緑体外にも局在するれていた5,8)。そこで、全ゲノム配列の明らかとなってことが分かってきており、他のオルガネラの機能といた単細胞性ラン藻Synechocystis sp. PCC 6803と糸状も関係している。チラコイド膜でのガラクト脂質の性ラン藻Anabaena sp. PCC 7120を用いて、MGlcDG合

生理学的役割を明らかにするためには、より単純な

成活性を調べたところ、確かに両ラン藻で保存されて系であるラン藻で合成酵素遺伝子を同定し、その破おり、同様の糖脂質合成経路が存在することがわ

壊株を用いた解析を行う必要があった。

かった。ラン藻のS Q D GおよびP G合成酵素遺伝子群

酸素発生型光合成生物で共通に保存されているガはすでに明らかとなっており、両ラン藻間で相同性

ラクト脂質だが、その合成経路はラン藻と植物ではが 高 い こ と が わ か って い た 。 つ ま り 、 ラ ン 藻 の異なることが知られている（図２）。植物では、ジ

MGlcDG合成酵素遺伝子やDGDG合成酵素遺伝子もラ

アシルグリセロールと U D P - ガラクトースを基質とン藻間で高い相同性で保存されていることが期待されし、M G D Gが合成される。一方ラン藻では、ジアシた。そこで、①糖転移酵素モチーフを持つこと、②ラルグリセロールとUDP-グルコースを基質とし、モノン藻間で保存されていること、③機能未知であるこ

グルコシルジアシルグリセロール（MGlcDG）が合成と、の 3 条件に当てはまる遺伝子を、ゲノムサイズのされた後、異性化酵素によってM G D Gへと変換され比較的小さいSynechocystis sp. PCC 6803のアノテー

る5)。実際、植物のMGDG合成酵素遺伝子と有意な相ションデータから抽出したところ、候補を4遺伝子ま同性をもつ遺伝子は、ラン藻のゲノム上には存在しなで絞り込むことができた。これらを大腸菌で発現さい。これに対して、DGDGはラン藻、植物共にMGDG

せ、活性測定を行った結果、そのうちの 1 つからとUDP-ガラクトースを基質として合成されると考え

MGlcDG合成酵素活性を検出することができた6)。まられている5)。しかし、植物のDGDG合成酵素遺伝子

た、残りの3遺伝子のうちの1つがDGDG合成酵素遺伝と有意な相同性を持つ遺伝子もラン藻ゲノム上に存子であることもわかった7)。

在しないことから、ラン藻と植物では、同じ構造のこの解析方法は、ゲノム配列の明らかとなっている

脂質を異なる酵素で合成していると予測されてい数種の生物間で、酵素活性（機能）が保存されていれた。

ば、どのような生物にも応用可能である。解析のポイ

我々のグループでは、全ゲノム配列の明らかとなっントは、モチーフ検索でどの程度絞り込めるかであろていた2種のラン藻、Synechocystis sp. PCC 6803およう。実際の解析は、ダウンロードしたアノテーション

びAnabaena sp. PCC 7120を用いて比較ゲノム学的解析

データから目的の機能をもつと考えられる候補遺伝子を行い、ラン藻のガラクト脂質合成を担う糖転移酵を見つけ出すことから始まる。我々の場

素遺伝子を明らかにしてきた 6 , 7 ) 。本稿では、これら合、Synechocystis sp. PCC 6803から糖転移酵素モチー
フをもつ遺伝子を選んだが、解析の当初、相同性の指標である E Value が10以下のモチーフ全てを調べた
ため、Synechocystis sp. PCC 6803の全遺伝子に与えられたアノテーション数は3 3 , 0 0 0以上になってしまった。これら全てを丸 2 日かけてチェックし、候補を270遺伝子まで絞り込んだ。ファイル検索機能を使って候補遺伝子を見つけ出すことも可能であったが、

図２

植物とラン藻のガラクト脂質合成経路10

光合成研究19 (1) 2009

見落としの恐れを考え、検索機能でピックアップさ

４．チラコイド膜におけるガラクト脂質の生理れなかった遺伝子に関しては、「人力」検索を行っ的役割た。この候補遺伝子に対してB l a s t検索を行い、ラン

ラン藻のガラクト脂質合成酵素遺伝子を同定でき藻で保存されている遺伝子を抽出した。このような作たことから、破壊株を用いた解析が可能となっ業は骨が折れるが、最近では同様の検索を行うことた。MGDG合成の初発反応を触媒する、MGlcDG合成が出来る便利なサーバも存在するので 9) 、それらを積

酵素遺伝子をSynechocystis sp. PCC 6803で破壊するこ

極的に活用すると、労力を節約できるだろう。

とを試みたが、残念ながら、全ゲノムコピーが完全に破壊された株を単離することは出来なかった。植物

３．ガラクト脂質合成経路の進化

でも、主要なMGDG合成を担うMGD1遺伝子を破壊す同定されたラン藻のガラクト脂質合成酵素遺伝子

ると、seedlingのうち、MGlcDG合成酵素遺伝子は、その合成経路がlethalになることが報告されている11)。MGDGはチラコイド膜の約半分を占め、DGDG合ラン藻でしか見つかっていないこともあり、他の生成の基質にもなることから、光合成膜には欠くこと物で有意な相同性のある遺伝子は見つからなかっが出来ないと思われる。

た。一方DGDG合成酵素遺伝子は、ラン藻間で保存さ

DGDG合成酵素遺伝子（dgdA）は、我々と同時期れていたのに加え、原始紅藻の葉緑体ゲノムにも相同に東京大学の佐藤直樹教授のグループでも同定さ性の高い遺伝子が保存されていることがわかった。全

れ、Synechocystis sp. PCC 6803で破壊株が単離されてゲノ ム 配 列 の 明 ら か と な っ て い る 原 始 紅 藻

いる7,12)。dgdA変異株は通常の生育条件では、野生株

Cyanidioschyzon merolaeでは、植物型のDGDG合成酵と比べ生育に変化は見られず、DGDGは通常の培養条素遺伝子のオルソログは見つかっておらず、恐らくこ件では必須の脂質ではないことがわかった。しかの葉緑体ゲノム上に存在する、ラン藻型のDGDG合成

し、強光条件やリン酸欠乏条件では生育が阻害され酵素がガラクト脂質合成を担っていると考えられる。

ることから 7,13) 、ストレス条件下で必要な機能を担っ

興味深いことに、C. merolaeの核ゲノムには植物型のているのかもしれない。通常、ラン藻が生育する環M G D G合成酵素遺伝子がコードされており 7 , 1 0 ) 、C .

境は、実験室の培養条件に比べてリン酸濃度が低い

merolaeは植物型とラン藻型両方のガラクト脂質合成

ことから（およそ1 0 0分の1）、リン酸の少ない環境

酵素を使う中間タイプであるといえる。高等植物や苔でチラコイド膜を構築するために、DGDGは重要なの類、緑藻では、植物型のガラクト脂質合成酵素遺伝であろう。dgdA変異株の光化学系II複合体ではDGDG

子が保存されていることから、ラン藻から葉緑体へとは検出されず、酸素発生複合体を形成する膜表在タン転換される過程で、ガラクト脂質合成経路も変化してパク質が解離している12)。また、dgdA変異株では光阻いったのであろう。現在のところ、なぜその様な変害からの回復にも影響が見られることから、DGDGの化が起こったのか、論理的な説明は出来ていない。

欠乏によってマンガンクラスターが解離しやすくなった結果、光阻害を受けやすくなり、強光条件での成育が阻害されていると予測されている13)。

５．おわりに
最近、他のラン藻種でd g d A遺伝子の破壊を試みた
ところ、全ゲノムコピーを完全に破壊することが出来なかった（牧野、渡辺ら、未発表）。このことは、ラン藻でも種によってはDGDGを必須脂質とすることを示している。実際、ラン藻種によって脂質要求性が異なることが報告されており14)、それぞれの種によっ
図３ ガラクト脂質合成経路の分布
M : MGDG合成酵素遺伝子
D : DGDG合成酵素遺伝子
緑字が植物型、青字がラン藻型を示す。

て、光合成タンパク質複合体内で、脂質が必須の機能を担う場所が異なるのかもしれない。この脂質要求性と光合成機能の関係を明らかにするため、現在、11光合成研究 19 (1) 2009
各ラン藻種から光合成タンパク質複合体を精製し、結photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC6803
under phosphate limitation, Plant Cell Physiol. 48,
1517-1523
8. Sato, N., and Murata, N. (1982) Lipid biosynthesis in
the blue-green alga (Cyanobacterium), Anabaena
variabilis
III.
UDP
glucose:diacylglycerol
glucosyltransferase activity in vitro, Plant Cell Physiol.
23, 1115-1120.
9. Sato, N. (2009) Gclust: trans-kingdom classification ofproteins using automatic individual threshold setting,
Bioinformatics 25, 599-605.
10. Sato, N., and Moriyama, T. (2007) Genomic andbiochemical analysis of lipid biosynthesis in theunicellular rhodophyte Cyanidioschyzon merolae: lackof a plastidic desaturation pathway results in the
coupled pathway of galactolipid synthesis, Eukaryot.
Cell 6, 1006-1017.
11. Kobayashi, K., Kondo, M., Fukuda, H., Nishimura, M.,
and Ohta, H. (2007) Galactolipid synthesis inchloroplast inner envelope is essential for proper
thylakoidbiogenesis,
photosynthesis,
andembryogenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104,
17216-17221.
12. Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., and Sato, N.
(2007) Digalactosyldiacylglycerol is required forstabilization of the oxygen-evolving complex inphotosystem II, Plant Physiol. 145, 1361-1370.
13. Mizusawa, N., Sakurai, I., Sato, N., and Wada H.
(2009) Lack of digalactosyldiacylglycerol increases thesensitivity of Synechocystis sp. PCC 6803 to high lightstress, FEBS Lett. 538, 718-722.
14. Aoki, M., Sato, N., Meguro, A., and Tsuzuki, M. (2004)
Differing
involvementofsulfoquinovosyl
diacylglycerol in photosystem II in two species ofunicellular cyanobacteria, Eur J Biochem. 271,685-693.

合する脂質の組成を調べている。

参考文献
1. Joyard, J., Maréchal, E., Miège, C., Block, M. A.,
Dorne, A. J., and Douce, R. (1998) Structure,
distribution and biosynthesis of glycerolipids fromhigher plant chloroplasts, in Lipids in photosynthesis:
Structure, function and genetics (Siegenthaler, P. A.,
and Murata, N., eds) pp 21-52, Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht, The Netherlands.
2. Jones, M. (2007) Lipids in photosynthetic reaction
centres: Structural roles and functional holes, Prog.
Lipid Res. 46, 56-87.
3. Guskov, A., Kern, J., Gabdulkhakov, A., Broser, M.,
Zouni, A., and Saenger, W. (2009) Cyanobacterial
photosystem II at 2.9-Å resolution and the role ofquinones, lipids, channels and chloride, Nature Struct.
Mol. Biol. 16, 334-342.
4. Ohta, H., and Benning, C. (2005) Three enzyme
systems for galactoglycerolipid biosynthesis arecoordinately regulated in plants, J. Biol. Chem. 280,2397-2400.
5. Sato, N., and Murata, N. (1982) Lipid biosynthesis in
the blue-green alga, Anabaena variabilis. I. Lipidclasses, Biochim. Biophys. Acta 710, 271-278.
6. Awai, K., Kakimoto, T., Awai, C., Kaneko, T.,
Nakamura, Y., Takamiya, K., Wada, H., and Ohta, H.
(2006) Comparative genomic analysis revealed a genefor monoglucosyldiacylglycerol synthase, an enzyme
for photosynthetic membrane lipid synthesis incyanobacteria, Plant Physiol. 141, 1120-1127.
7. Awai, K., Watanabe, H., Benning, C., and Nishida, I.
(2007) Digalactosyldiacylglycerol is required for better12

光合成研究19 (1) 2009

解説
光化学系複合体の結晶解析の歴史とタンパク質結晶解析の初歩
東京大学・大学院総合文化研究科・生命環境科学系
池内昌彦*
１．はじめにけに、他の紅色細菌 Rhodobacter sphaeroides の反応中タンパク質の結晶構造解析はいうまでもなく、タン

心の解析、カロテノイドなどの解析など詳しい研究がパク質の構造と機能を明らかにするもっとも直接的進んでいる。

な手法の１つである。しかし、他の生化学や物理化

次の転換点は、光化学系 Ⅰ 複合体の結晶構造解析で学的測定とはかなりちがうため、分野外の人々にはあった。1 9 8 7年にF o r dらは好熱性シアノバクテリア

ややわかりにくい。とくに結晶解析の解釈、つまりPhormidium laminosus から単離した光化学系Ⅰ複合体の構造モデルは直観的にわかりやすいデジタル的である結晶化を報告したが 3) 、最初の構造モデルは別の好熱

ため、別の意味で誤解しやすい。というか、私のよ

性シアノバクテリア Thermosynechococcus elongatus 由

うな素人には誤解と驚きの連続である。それでも敢来の系 Ⅰ 複合体で、独のWittらのグループが1992年にえてこの稿を書くのは、結晶解析に限りない魅力を名古屋での国際光合成会議で初めて報告した 4)。Ford

感じるためである。したがって、正確で系統的な記述

らの解析が成功しなかったのは、重原子置換によるができないことはご容赦いただいて、光合成関連の結位相決定ができなかったことによる。Wittらの系 Ⅰ は晶構造解析のイントロダクションとして、初歩的な構12個のサブユニットからなる巨大複合体であったが、造解析のポイントと光化学系複合体の構造解析の歴

当初の分解能は 6 Å と低く、アミノ酸残基の同定ど史を簡潔に概説する。

ころかタンパク質サブユニットの同定もされておらず、わずかに21本の膜貫通αヘリックス、45分子のク（１）光化学系複合体の結晶解析

ロロフィル a、３個の鉄イオウクラスタが同定できた

光合成における結晶構造解析の転換点はいうまでのみであった(表１)。しかし、この結果は、従来の構もなく 1 9 8 4 年の D e i s e n h o f e rらの光合成細菌

造推定がまちがっていないことを実証するとともに複Rhodopseudomonas viridis (現在は Blastochloris と改名)

雑な超複合体の構造解析に大きな希望を持たせた。

の光化学反応中心の結晶化と構造決定であった1) 。こ

当時、会場で発表を聞いていて、非常に興奮したことの論文はNatureに投稿したがrejectされたという。彼をよく覚えている。その後、1996年に 4 Å の分解能でらはこの解析を進めて、構造を初めて詳細に解いて反決定された構造モデルが発表された 5) 。このとき、ほ

応中心の構造を初めて決定した。Deisenhoferら(1985)

ぼタンパク質サブユニットが同定されたが、まだビタ

Natureの論文2)は1988年のノーベル賞の対象となった

ミンK 1など重要な補因子の所在は不明であった。さことで有名である。このときの分解能は 3.0 Å で、アらに、2001年に 2.5 Å の分解能の構造モデルがほぼ最

ミノ酸側鎖の決定には不十分であった。そのため、終版として2000年のブリスベーンでの国際光合成会議

著者のMichelは平行して各サブユニットの遺伝子をクで提出された 6) 。この高分解能の構造の決定には宇宙

ローニングし、これによってアミノ酸配列を決定して空間の無重力状態での結晶化も含めてなさまざまないた。当初の標品は、電子受容体 Q B キノンが失われ試みがされたというが、最終結果に貢献したかどうていたが、本来のユビキノンが結合したもの、阻害かは、私の英語力では判然としなかった。ともか

剤の結合したもの、アミノ酸残基をさまざまに置換

く、この高分解能の構造によって、ビタミンK 1 の位したものの構造も決定している。また、これをきっか* 連絡先

E-mail: mikeuchi@bio.c.u-tokyo.ac.jp13

光合成研究 19 (1) 2009
表1 光化学系複合体の構造モデルの比較
PDB ID 解像度TM*1

refereneces

タンパク質 補因子(Chl*2を除く)

Chl

Krauss et al. 1993

PSI

なし

6Å

21 TM

?

3 FeS

45 ChlKrauss et al. 1996

PSI

1PPS

4Å

31 TM

11 protein

3 FeS

65 ChlJordan et al. 2001

PSI

1JB0

2.5 Å 32 TM

12 protein

3 FeS, 2 VK1, 22 carotenoid, 4
lipid, 1 Ca

96 ChlZouni et al. 2001

PSII

1FE1

3.8 Å 36 TM

17 protein

1 NH-Fe, 2 Phae, 2 heme, 4 Mn 32 Chl

Kamiya and Shen 2003 PSII

1IZL

3.7 Å 36 TM

20 protein

1 NH-Fe, 2 Phae, 2 heme, 4 Mn 36 Chl

Ferreira et al. 2004

PSII

1S5L

3.5 Å 35 TM

19 protein

1 NH-Fe, 2 Phae, 2 heme, 4 Mn,
36 Chl7 carotenoid

Loll et al. 2005

PSII

2AXT

3.0 Å 36 TM

20 protein

1 NH-Fe, 2 Phae, 2 heme, 4 Mn,
35 Chl11 carotenoid, 14 lipid

Guskov et al. 2009

PSII

3BZ1

2.9 Å 36 TM

20 protein

1 NH-Fe, 2 Phae, 2 heme, 4 Mn,
35 Chl12 carotenoid, 14 lipid

Ben-Shem et al. 2003

PSI-LHCI*3

1QZV

4.4 Å 45 TM

16 protein

2 VK1, 3 FeS

167 ChlAmunts et al. 2007

PSI-LHCI

2O01

3.4 Å 45 TM

17 protein

2 VK1, 3 FeS, 5 carotenoid

168 Chl*1 TM: 膜貫通ヘリックス、*2 Chl: クロロフィル、*3 LHCI: light-harvesting chlorophyll complex of Photosystem I.

置やP700を形成するspecial pairの一方がクロロフィル

ついては疑問もある。しかし、単量体の結晶化はこa エピマーであることなど詳細が初めて判明した。まれまで成功していない。

た、それ以前の構造モデルにはなかったP s a Xタンパ

シトクロムb 6 f複合体も2002年に構造が解かれた。

ク質が登場して、私は非常に驚いた。

その材料は好熱性シアノバクテリア

Mastigocladus

一方、光化学系 Ⅱ の構造解析は光化学系 Ⅰ の解析

laminosusとともに常温性の緑藻クラミドモナスでもができると分かってからでも困難を極めた。それは成功している14, 15)。前者の場合、Cramerグループの長M nクラスタを含む水分解系の安定性に問題があった

年の苦労の積み重ねがあったが、栗栖の参画で結晶ためである。1 9 9 0年代後半は２次元結晶の電子顕微化が初めて実現した。そのポイントは、精製された鏡像から構造を解く試みが為されたが 7, 8)、最終的に複合体から必要な脂質が除かれているため結晶化しなは2000年のZouniらの３次元結晶の高分解能X線構造

いという予想外の点にあった。一方、クラミドモナ

解析がブレイクスルーとなった 9 ) 。この標品もまた好スのものはヒスタグを導入した株を用いて、マイルド

熱性シアノバクテリア Thermosynechococcus elongatusな条件での精製が有効であった。ともかく驚いたこ

BP-1由来であったが、当初の分解能 (3.8 Å) と、不十とには、どちらの複合体にもクロロフィル a やβカロ

分な電子密度のため、あるはずの表在性P s b Uタンパ

テン、新規のc型ヘムが特定の部位に結合していた。

ク質が全く見えていないなど問題も多かった。これ

生化学的には脂溶性のクロロフィルの膜タンパク質標を契機として、酸素発生活性を保持した光化学系 Ⅱの品への混入と特異的な結合を識別することは至難で結晶構造解析は、日本の沈・神谷グループ、ロンドンある。しかし、構造解析によってクロロフィルの位置のBarberグループ、ベルリンのSaengerグループの激しがシアノバクテリアと緑藻で保存されていることが明い競争になっている 1 0 - 1 2 ) 。まだ、その分解能は 2 . 9

らかになり、その機能は不明であっても、単なる

Å〜3.6 Å で十分ではないが、さまざまな手法と組み

artifactではなく進化的に意味があると考えられる。

合わせて、詳細な構造が解明されつつある。なお、材（２）解析の流れ

料は Thermosynechococcus elongatus だけでなく近縁のT. vulcanus も使われ、近年はさまざまな突然変異体の結晶解析実験の流れは次のようになる。

結晶構造解析もされている13)。これらの構造解析され目的タンパク質の精製→結晶化→X線回折→位相決定→電子密度マップ→構造モデル→精密化

たものはすべて二量体構造であるが、本来の構造に

14

光合成研究19 (1) 2009

このうち、回折データの取得からモデルの精密化に

播磨のSPRING-8などの大型放射光で高輝度X線を至るプロセスは素人にはなかなか理解できないこ

用いて、ビームを絞ることで、微少な結晶であってもと、最終結果が「構造モデル」であることが、いろ十分な回折データを取得できる。また、大型放射光

いろ誤解を生みやすい。

ではX線の波長を変えて回折像を撮ることで、重原子の位置を知ることもできる。一方、 X 線照射による精製

Mnクラスタの破壊やフラビンの還元などのartifactも結晶すなわち純粋なものといわれているが、不純物起こるので、酸化還元タンパク質の解析にはとくに注があっても結晶化するものも多い。学生のころ、ル意が必要である16)。

ビスコの粗抽出品がすぐに結晶化することを知ってと位相決定ても驚いたことを新鮮に記憶している。また、不純物が結晶化で除かれることも多いので、結晶化ステッ

X線の回折像から電子密度マップを作成するとき、プを精製ステップとして利用している例もある。シア

必要な作業である。ペルーツが考案した重原子置換

ノバクテリアの光化学系 Ⅱ 標品にはアロフィコシア

法だけでなく、セレノメチオニンを利用する方法や既ニンがしつこく混入しているが、結晶化で除かれるこに決定されている類似の構造を元に解く同型置換法なとはよく知られている。また、必要以上に精製をくりどがあり、技術の進歩は日進月歩である。われわれ

返すと、タンパク質分解が起きたり、複合体が解体しの光受容体タンパク質は重原子置換できなかったが、たりすることもあり、どこまで精製するのか判断はアポタンパク質の構造決定から同型置換で構造が解け難しい。凝集は結晶化の大敵である。ヒスタグを利たことには非常に驚いた。

用して金属アフィニティークロマトグラフィーで精製

電子密度マップ

すると、金属が共溶出してタンパク質の凝集を引き起こすことがある。また、シトクロムb 6 f複合体では、素人が解釈できる一種の生データである。この

むしろ精製されたものが結晶化しにくかったとい

マップに合うように原子を置いていくことで、構造モう。

デルが得られる。しかし、この重要なデータは通常は論文には含まれておらず、特別な議論をするときのみ結晶化

その一部だけが提示されることが多い。このようなタンパク質の溶液（通常 10 mg mL–1 以上）を結晶化

データが公開されない理由はモデル化のための解釈がスクリーニング溶液と混合した後、水をゆっくり除難しいものが含まれているからかもしれない。また、

去して、析出するタンパク質を結晶として取得する

電子密度マップに含まれるすべての密度が構造モデル

が、不規則な凝集は使いものにならない。結晶の成に取り込まれているわけではないことに留意する必要

長速度も標品によってさまざまである。結晶の大きさがある。

は 20 µm 以上あれば解析できるというが、大きい方構造モデルが扱いやすい。しかし、見かけが大きく美しい結晶であっても高い分解能の回折像が得られないことも構造モデルは電子密度マップの解釈である。分解ある。また、異なる結晶が融合した混晶は解析でき能が高いときは両者はよく一致しているので、あまりないが、その結晶を小さく分割することで、単結晶問題はないが、分解能が低いときは気をつける必要として解析できることも多い。とにかく困るのは、前がある。私自身の苦い経験としては、Kraussら(1996)

もって目的タンパク質が結晶になるかどうか予測できの光化学系 Ⅰ の結晶構造に、当時私たちが研究していないことである。PCRで増幅し大腸菌で発現したとこたサブユニットが存在していなかった 5 ) 。それ以外の

ろ、PCRエラーを含むタンパク質は結晶化したが、正構造は 4 Å の分解能にしては精細で、非常に困惑ししい配列のタンパク質は結晶化しなかったという例また。ともかく、当時は基礎知識がなかったので、私である。

たちの標品に問題があると判断して研究をその時点で止めてしまった。ところが、Jordanら(2001)では同じ標品の 2.5 Å モデルでそのサブユニットが PsaX とし

X線回折

15

光合成研究 19 (1) 2009てモデルに登場し6)、愕然とした記憶がある。

の分解能が必要である。これが識別できないと、グ同様の混乱は、光化学系 Ⅱ でも起きている。たと

ルタミン残基などのアミドの向きを特定できない。

えば膜貫通ヘリックスの数と位置がモデルごとに異アミドではこれらの原子の位置がわからないと、水なっている。これは、標品に含まれるサブユニット組

素結合の有無を議論できない。多くの構造モデルで成のちがいによるのか、分解能のちがいによるのは、より安定な構造をとるようにアミドの向きを指か、解釈のちがいなのかまだ判然としない。

定しているが、あくまでも仮定である。タンパク質全構造決定の論文ではモデルと実際の構造は渾然と体の安定化において水素結合などのローカルな安定構

記述されていることが多い。正確には、論文の筆者は造を必ずとっているという保証はない。

区別しているが、分野外の読者にはわかりにくいとい

酸化還元物質の安定性

うべきかもしれない。解釈が微妙な場合でも、その結果がかなり重要なことでも記されていないことも多光合成や呼吸の反応の多くは酸化還元反応であい。時々、論文に掲載されている電子密度マップ図はり、その反応に関与する物質はしばしば X 線の照射

微妙な解釈の妥当性を議論することよりも、論文のによる還元を受けることがある。たとえば、光化学重要な結論をモデルだけでなく生データでも示すケー系 Ⅱ のMnクラスタは X 線によって容易に破壊されスの方が多いように思える。粗い分解能ではアミノる。また、フラビンのイソアロキサジン環も還元さ

酸側鎖の同定ができないことも多い。そのため、ポれ、周囲の配位構造も変化するという。このため、リアラニンとしてペプチド鎖をモデル化してあること

結晶の照射部位を変えたり、結晶を頻繁に取りえたも多い (PDBではUNKとなっている)。

りして、X 線の照射時間を短縮する努力が払われている。

（３）結晶解析論文を読む決定できない構造

分解能

高分解能の構造であっても注意すべき点がいくつか分解能に応じて、組み立てられるモデルの精度が異ある。すべての構造は均等に見えているわけではななっている。たとえば、光化学系 Ⅰ 複合体の最初の構い。電子密度を明瞭にとらえられるのは結晶内の繰造である 6 Å 分解能の構造モデルでは、αヘリックス

り返しユニットの構造がそろっているところである。

のような特徴的な構造がかろうじて見えているだけで逆にいえばループなど構造がふらふらしているところあって、アミノ酸残基どころか、ループ領域のほとんだけでなく調節酵素のように構造が変化したり、複どは見えていない。クロロフィルのポルフィリン環は数のコンフォメーションが共存したりするところは分子が大きく扁平で同定しやすいが、それでも半分以はっきり見えない。典型的な例では、シトクロムb c 1

下しか捕らえられていない。しかしながら、このレベ複合体のリースケ型鉄イオウタンパク質が有名であルであっても特徴的な鉄イオウクラスタの位置とそのる。つまり、その鉄イオウクラスタが電子を受取る

配置、さらにその直下にある special pair を形成してシトクロムbに近い位置と、電子を渡すシトクロムc 1いるクロロフィル分子などを識別することができる画に近い位置の２つの像が同時に得られた17)。このこと期的なものであった。表１には、各光化学系の複合から、鉄イオウタンパク質が約 16 Å 移動して電子を体の探索結果の概略を示したが、分解能の向上とと伝達すると考えられている。また、キノンの結合の首もに帰属される補因子やタンパク質の数の増加が見て振り運動も構造解析から直接推定することができ

とれる。

た。
タンパク質の構造が正常に決定されても、特定の部

原子の識別
多くの構造データでは、電子密度が低いH原子はほ位の構造を決定できないこともよくある。結晶構造

とんど見えていない。1.0 Å 以上の分解能が必要であは規則的な繰り返し構造として解かれるので、非対称る。また、電子密度をみているので、 H + は見えない

ユニットごとに微細構造が異なっていると解けなことになる。

い。その典型例は膜タンパク質複合体の中の脂質分子の位置である。光化学系 Ⅱ や系 Ⅰ の構造内に同定さ生物学では重要なNとO原子の識別にも 1.6 Å 以上

16

光合成研究19 (1) 2009

れている脂質分子の数は、標品の化学分析で得られる

た。結晶系が異なるある結晶では、 1 0 量体のうちの数値よりもはるかに低いのはこのためである。一１つのサブユニット、他方では2つのサブユニットが方、シトクロム酸化酵素では化学定量に一致した脂上記の Met93 と Trp91 の配置が TePixD の場合と逆の質分子が構造内に同定されている。これは分解能が高関係になっていたのである。これは分子内の特定のいことにもよるだろうが、標品から弱く結合した脂部位がおおまかには２種の安定な構造を取ることを質が取り除かれていることを示している。

示唆しており、非常に興味深い。このような構造の多分子内の局所的な構造の不均一性も構造決定をあ型の理由は10量体の結晶内のパッキングにおいて、こ

いまいにするが、分解能が高いデータでは、ひとつの逆転したサブユニットがとくべつな歪みが加わったの構造モデルに２種の構造を同時に記載していること

ことと説明されている。なお、論文での解釈は、このもある。これは論文の本文に書かれていないことも多歪みを受けたサブユニットの構造が本来のもので、他

く、PDBデータをみて初めて分かることもある。ともの多数のサブユニットの構造が光で活性化された型とかく既成概念に反する構造モデルに精密化によって到している。ともかく、活性調節を受けるタンパク質は達することも時々あり、PDBデータをみる楽しみでも構造変化を起こしやすいと考えられ、そのvariationにある。

は注意する必要がある。
また、上で述べたシトクロムb c 1 複合体の鉄イオウ

非対称ユニット間のちがいタンパク質の２つの異なる像は、非対称ユニット内の結晶構造は、単位結晶格子の繰り返し構造であ構造が２種類あることを示している。

り、これにX線を照射したときの回折像は単位格子のタンパク質間の境界

回折の積算データとして得ていることになる。さて、この単位格子が１個のタンパク質であればわかりやす

タンパク質複合体において、サブユニット間の境界

いが、複数個入っていることも多い。このような単位領域における活性部位の形成は構造解析によって初め格子内の分子セットを非対称ユニットという。非対て理解できるわかりやすい例である。古くは、ルビ称ユニット内に複数の同一タンパク質が存在する場

スコの活性部位が RbcL ホモ二量体の境界にあること

合、それぞれの構造は別々に解かれる。これは非常は有名である。高等植物のサブユニット構造はL 8 S 8に手間のかかる作業であるが、重要な情報をもたらであるが、光合成細菌では L 2 型で存在しており、こすことがある。そのもっとも有名な例は、F1-ATPase

れが酵素としての最小単位である。またシトクロムである。F1の αβ 三量体が γ サブユニットとの相互作

b 6 f 複合体のホモ二量体におけるリースケ型タンパク

用によって３種の異なる構造をとっていて、ATP 加水

質の鉄イオウクラスタドメインは二量体の相手方の単分解の異なる状態を反映していると考えられている量体と相互作用している。このため複合体を単量体に18)。

すると電子伝達の活性が失われる。このようなしくわれわれが発表したフラビン型光受容体 Te P i x D

みが進化においてどのように獲得されたのかよく分(Tll0078) は分子質量 16.5 kDa の小さい水溶性タンパ

かっていないが、多くのタンパク質で見つかっていク質であるが、10量体で単離され、その構造は 2.0 Åる。一方、光化学系 Ⅱ 複合体はシアノバクテリアかの分解能で解くことができた。この構造を詳細にみら高等植物まで広くホモ二量体が分布しているが、単ると、分子内シグナリングにおいて重要な役割を果た量体でも活性があり、二量体でなければならない理

している Met93 残基と Trp91 残基の配置はサブユニッ

由は分かっていない。また、光化学系 Ⅰ 複合体はシア

トごとに微妙にちがっており、そのうちの１つは Met

ノバクテリアでは3量体であるが、真核の緑色植物で側鎖の向きが大きく異なっていた。これらは論文中は単量体であり、3量体化にかかわる PsaL サブユニッ

では述べていないが、分子内シグナリングにおけるこトの役割も議論されているが、この遺伝子はなぜか高れらの残基の動きを反映しているのかもしれない。さ等植物にも存在している。

らにこの後、このタンパク質のホモログ (Slr1694 もし

もうひとつ驚くべき例として、クロロフィル分子のくは SyPixD) の結晶構造も決定されたが19)、この構造結合部位がある。紅色細菌の光化学系やシアノバクテ

モデルには T e P i x D とは異なる重大なちがいがあっ

リアの系 Ⅱ 複合体では、クロロフィル分子は各サブ

17光合成研究 19 (1) 2009
ユニットの内部に埋め込まれており、クロロフィルを

Nature, 411, 909-917.
7. Nakazato, K., Toyoshima, C., Enami, I., and Inoue, Y.
(1996) Two-dimensional crystallization and cryoelectron microscopy of photosystem II, J. Mol. Biol.,
257, 225-232.
8. Rhee, K. H., Morris, E. P., Barber, J., and Kuhlbrandt,
W. (1998) Three-dimensional structure of the plant
photosystem II reaction centre at 8 Å resolution,
Nature, 396, 283-286.
9. Zouni, A., Witt, H.T., Kern, J., Fromme, P., Krauss, N.,
Saenger, W., and Orth, P. (2001) Crystal structure ofphotosystem II from Synechococcus elongatus at 3.8 Å
resolution, Nature, 409, 739-743.
10. Kamiya, N., and Shen, J. R. (2003) Crystal structure ofoxygen-evolving
photosystem
II
fromThermosynechococcus vulcanus at 3.7-Å resolution,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100, 98-103.
11. Ferreira, K. N., Iverson, T. M., Maghlaoui, K., Barber,J., and Iwata, S. (2004) Architecture of thephotosynthetic oxygen-evolving center, Science, 303,
1831-1838.
12. Guskov, A., Kern, J., Gabdulkhakov, A., Broser, M.,
Zouni, A., and Saenger, W. (2009) Cyanobacterial
photosystem II at 2.9-Å resolution and the role ofquinones, lipids, channels and chloride, Nat. Struct.
Mol. Biol., 16, 334-342.
13. Kawakami, K., Iwai, M., Ikeuchi, M., Kamiya, N. andShen, J. R. (2007) Location of PsbY in oxygenevolving photosystem II revealed by mutagenesis and
X-ray crystallography, FEBS Lett., 581, 4983-4987.
14. Kurisu, G., Zhang, H., Smith, J. L., and Cramer, W. A.
(2003) Structure of the cytochrome b6f complex ofoxygenic photosynthesis: tuning the cavity, Science,
302, 1009-1014.
15. Stroebel, D., Choquet, Y., Popot, J. L., and Picot, D.
(2003) An atypical haem in the cytochrome b6f
complex, Nature, 426, 413-418.
16. Yano, J., Kern, J., Irrgang, K. D., Latimer, M. J.,
Bergmann, U., Glatzel, P., Pushkar, Y., Biesiadka, J.,
Loll, B., Sauer, K., Messinger, J., Zouni, A., andYachandra, V. K. (2005) X-ray damage to the Mn4Ca
complex in single crystals of photosystem II: a casestudy for metalloprotein crystallography, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 102, 12047-12052.
17. Zhang, Z., Huang, L., Shulmeister, V. M., Chi, Y. I.,
Kim, K. K., Hung, L. W., Crofts, A. R., Berry, E. A.,
and Kim, S. H. (1998) Electron transfer by domain
movement in cytochrome bc1, Nature, 392, 677-684.
18. Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R. and Walker, J.
E. (1994) Structure at 2.8 Å resolution of F1-ATPasefrom bovine heart mitochondria, Nature, 370, 621-628.
19. Yuan, H., Anderson, S., Masuda, S., Dragnea, V.,
Moffat, K., and Bauer, C. (2006) Crystal structures of
the Synechocystis photoreceptor Slr1694 reveal distinct
structural states related to signaling, Biochemistry, 45,
12687-12694.

結合しないサブユニットと厳然と分かれている。ところが、光化学系Ⅰ複合体には、予想外のサブユニット(PsaF、PsaK、PsaL、PsaM)が11個のクロロフィルのMgイオンと配位している6)。系 Ⅱ では、このような反応中心以外のサブユニットにはクロロフィルが全く結合していないことを考えると、系 Ⅰ と系 Ⅱ は異なる
方向へ進化したと考えざるを得ない。もっと驚くべ
きことは、高等植物の系 Ⅰ — LHCI 超複合体にある。
この構造を見ると、膜を３回貫通する典型的な L H C
サブユニット内部にクロロフィルが結合しているだけ
でなく、LHCサブユニットと系 Ⅰ コア複合体の境界に10分子のクロロフィルが結合している。これは、LHC
サブユニットが系 Ⅰ のアンテナとして超複合体を形成する進化を遂げたとき、LHCから系 Ⅰ へのエネルギー
転移の効率化のためさらなるクロロフィルの結合が平行して進化したことを意味している。このようなクロロフィルの存在は生化学的なサブユニットの解体実験では実証することができないもので、超複合体の構造解析で初めて明らかになるといえる。

参考文献
1. Deisenhofer, J., Epp, O., Miki, K., Huber, R., andMichel, H. (1984) X-ray structure analysis of amembrane protein complex. Electron density map at 3
Å resolution and a model of the chromophores of thephotosynthetic
reaction
centerfrom
Rhodopseudomonas viridis, J. Mol. Biol., 180, 385-398.
2. Deisenhofer, J., Epp, O., Miki, K., Huber, R., andMichel, H. (1985) Structure of the protein subunits inthephotosynthetic
reaction
centreofRhodopseudomonas viridis at 3Å resolution., Nature,
318, 618-624.
3. Ford, R. C., Picot, D., and Garavito, R. M. (1987)
Crystallization of the photosystem I reaction center.,
EMBO J., 6. 1581-1586.
4. Krauss, N., Hinrichs, W., Witt, I., Fromme, P., Pritzkow,
W., Dauter, Z., Betzel, C., Wilson, K. S., Witt, H. T. andSaenger, W. (1993) Three-dimensional structure ofsystem I of photosynthesis at 6 Å resolution, Nature,361, 326-331.
5. Krauss, N., Schubert, W. D., Klukas, O., Fromme, P.,
Witt, H. T., and Saenger, W. (1996) Photosystem I at 4
Å resolution represents the first structural model of a
joint photosynthetic reaction centre and core antenna
system, Nat. Struct. Biol., 3, 965-973.
6. Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger,W., and Krauss, N. (2001) Three-dimensional structureof cyanobacterial photosystem I at 2.5 Å resolution,18

光合成研究19 (1) 2009

解説
光化学系IIの例から見る膜タンパク質複合体の結晶化と構造解析
岡山大学・大学院自然科学研究科
沈
１．はじめに

建仁* ・川上恵典

活性状態、純度・均一性の評価方法、タンパク質の安

生体内で膜タンパク質及びその複合体は多くの重要定性に応じた結晶化方法の最適化による結晶の分解能な機能を担っている。しかし、水溶性タンパク質に比の向上について紹介し、さらにPSII変異体の構造解析

べ、立体構造が解析された膜タンパク質の数はまだ少の一例を紹介する。なお、タイトルでは「膜タンパクない。現在タンパク質立体構造データベース（PDB）質複合体」という言葉を用いたが、以下特に記述がなに登録されているタンパク質の構造数は５万個を超

い限り膜タンパク質とその複合体は同じように扱うこ

え、配列相同性が30%以下の「独立」のタンパク質構とにする。

造数は約8500個になっているが、そのうち膜タンパク

２．光化学系II複合体

質として帰属されるものは8 0 0未満で、「独立」の膜タンパク質の構造数は1 8 0程度のみである。即ち、構

シアノバクテリア由来のPSIIは17個の膜貫通サブユ

造解析が行われた膜タンパク質の数はPDB登録数の中ニットと 3 つの膜表在性サブユニットにより構成さの約2 %であり、これは、配列が決定された各種生物

れ、分子量約350 kDaの単量体が2個結合した二量体との全ゲノムにおいて膜タンパク質が全タンパク質の2 5して存在している。 3 つの膜表在性タンパク質は親水〜30%を占めていることから考えると、極めて小さい性なので、PSIIは膜タンパク質と親水性タンパク質を割合であると言わざるを得ない。

含む複合体であることになる。これまで好熱性シアノタンパク質の立体構造解析の主な手法はX線結晶構バクテリア Thermosynechococcus elongatus 及び T.

造解析法であり、この方法によって解析された立体構

vulcanus から、3.8-3.0 Å分解能のPSII構造が報告され

造はPDBに登録されているものの86％を占めている。

ている4-7) (図1)。分解能が不十分であること、及び回膜タンパク質の X 線結晶構造解析は 1 9 8 4 - 1 9 8 5年に折実験におけるX線損傷の問題から、現在のPSII構造

Michel, Deisenhoferらによって紅色光合成細菌の反応中

では、水分解・酸素発生反応の機構を十分詳細に解明

心の立体構造解明が最初の例である1-3)。膜タンパク質することができず、結晶分解能の向上とX線損傷を抑の構造解析に際して、界面活性剤を用いて高純度・安制した構造解析が試みられている。以下我々が行って定で、活性を保ったままの膜タンパク質を調製するこきた T. vulcanus 由来PSIIの結晶化を中心に紹介する。

と、及びそれを結晶化することが重要なステップであ３．PSIIの精製

り、構造解析のボトルネックであるとも言われている（水溶性タンパク質についても同じことが言える）。

結晶化に適した膜タンパク質を得るには、対象とな膜タンパク質複合体の場合、バクテリアや昆虫を用いるタンパク質を、活性のある、安定な状態で生体膜かた発現ができないため、複合体の解体なしに適切な界ら取り出すことのできる界面活性剤を選択しなければ面活性剤を選んで精製すること、及び得られた標品のならない。膜タンパク質複合体の場合、複合体本来の結晶化条件を見つけることがさらに重要な課題にな

組成を解離させずに精製することが重要である。精製る。

には一般に非イオン性界面活性剤を用いるが、結晶化

本稿では好熱性シアノバクテリアの光化学系I I複合を目的とした場合、できるだけ結晶化に用いる界面活体（以下PSIIとする）の精製・結晶化を例に挙げ、可性剤と同じものを使用することが望ましい（やむをえ

溶化・精製の各段階に応じた界面活性剤の選択と、精ない場合は精製と結晶化に異なった界面活性剤を用い製標品から良質な結晶を得るための重要な因子である

ることもある）。これまでに膜タンパク質の結晶化に* 連絡先

E-mail: shen@cc.okayama-u.ac.jp19光合成研究 19 (1) 2009

図１

光化学系II (PSII)の3.0 Å分解能の結晶構造7)。

破線はそれぞれサイトプラズム側とルーメン側のチラコイド膜表面を示す。

成 功 し た 界 面 活 性 剤 と して、

C

1

2

E

換クロマトグラフィーによって結晶化に適した高純度

9なPSII標品を精製した9)。

(polyoxyethylene(9)dodecyl ether), β-OG (n-octyl-β-Dglucoside), β-DDM (n-dodecyl-β-D-maltoside), α-DDM,
UDM(n-undecyl-β-D-maltoside),glucoside),

OM

NG

４．精製標品の評価(n-nonyl-β-D-(n-octyl-β-D-maltoside),

MEGA10結晶化スクリーニング実験を始める前、及び結晶化(decanoyl-N-methylglucamide),

LDAO

において、精製した標品が結晶化に適しているかどう(Lauryldimethylamine-N-oxide)などが挙げられ8)、そのかを常に分析し、評価することは、精製が容易でない

内αヘリックスタイプの膜タンパク質の結晶化におい

膜タンパク質にとって特に重要である。精製膜タンパて成功例が最も多いのはβ-DDMで、その次はβ-OGでク質が結晶化に適しているかどうかを判定するためにある 8 ) 。一般に糖とアルキル基をベースにした界面活は、標品の活性、純度、均一性、安定性を分析し、評性剤において、アルキル鎖が長いほど形成されるミセ価する必要がある。以下 P S I I を例にそれらの分析手ルが大きく、それによって作られる結晶は水の含量が法、評価基準について述べる。

高く、結晶の質が低くなる傾向がある。しかし、アルキル鎖が短い界面活性剤ほど可溶化力が強い傾向があ４．１．活性り、膜タンパク質が不安定、あるいは複合体が解体さ

X線構造解析の目的は活性を保った状態のタンパクれやすい傾向がある。

質の立体構造を解明することであるので、結晶化に用従って、実際の精製と結晶化においては、常用の界いるタンパク質が十分な活性を保っているかどうかを面活性剤から、対象となる膜タンパク質（複合体）の常に分析し、モニターすることが必要である。活性が活性と安定性を最大限に保てるものを選択しなければ低いことは、タンパク質の純度が低い、あるいは構造ならない。

が一部変性、あるいはnative構造と異なっている、とPSIIの精製において、我々はLDAOとβ-DDMの2つ言ったことの現われでもあるので、このような標品はの界面活性剤を用いた。チラコイド膜にはPSII以外に良質な結晶を与えることが困難であると考えた方がよ

多くのタンパク質複合体が存在しており、特に光化学い。細胞内の最適状態での活性を知ることは通常難し

系I複合体（PSI）の除去がβ-DDMのみを用いた可溶化

いが、複数回の精製を通して目的タンパク質の最大活では困難であるため、まずLDAOによりPSIIをチラコ性を把握し、そのような、あるいはそれに近い活性をイド膜から選択的に可溶化し、得られた粗PSII標品を持つものを結晶化に用いることを心がけるべきであ

β - D D M によって再可溶化した後、 T O Y O P E A Lる。PSIIの場合、総合的な活性として飽和光による酸DEAE650MまたはQ Sepharose HPを用いた陰イオン交20光合成研究

図２

19 (1) 2009(A) シアノバクテリア T. vulcanus 由来PSII二量体の結晶。バーは0.5 mmを示す。(B) 結晶前と結晶化後のPSII二量体のタン

パク質組成。結晶化後のP S I Iは数個の結晶を溶解して分析したもの。矢印で示したバンドは、結晶化前の溶液試料に存在するが、結晶化された試料になくなった侠雑物である。

素発生の活性を測定し、これまでの経験から T .

不純物を含んだものでも結晶になりうることを示してvulcanus から3000 µmoles O2/mgchl/ml 以上の活性を持いる。不純物の量を正確に見積もることは容易ではな

つ標品を結晶化に用いている。それよりも活性の低い

いが、おそらく5 %程度以内と思われる。言い換えれものは最高分解能の結晶を与えていない。

ば、95%程度の純度であれば結晶化に用いることができる。

４．２．純度しかし、不純物は析出される結晶の質に影響を与え結晶化には標品の純度が高いほどよいが、複合体のることが考えられ、PSII結晶の分解能が低かったのは場合、精製度を上げるにつれ、結合が弱いサブユニッ

不純物の存在が一因と思われたので、現在は再結晶化

トの部分的解離が起こるという複合体特有の問題があによって不純物を除去し、当初より良質な結晶を得る

る。オリゴマーを形成するタンパク質についても、精ことに成功している。

製条件を強くすることによってオリゴマー構造が破壊

４．３．均一性されるなど類似の問題があり、精製手順をどこで止めて結晶化に入るかを適宜判断する必要がある。標品の純度は通常複合体の結晶化にとって、純度よりも均一性が重要(BN-な因子であると考えるべきである。これは、結晶が均(CN-PAGE)10)、ゲルろ過な一な粒子から形成されることを考えると当然であろどを用いて評価する。サブユニットの解離が活性を低う。同じ組成の複合体であっても、凝集物や変性物の下させる場合は活性測定も1つの手段となる。我々が混在により均一な標品ではなくなる。タンパク質の均結晶化に用いたPSIIの純度を図2Bに示した。図から明一性には電気的な均一性と粒子サイズの均一性から分らかなように、結晶化に用いたPSIIには他のタンパク

析・評価する必要がある。

SDS-PAGE、Blue

PAGE)、clear native PAGE

nativePAGE

質のバンドがいくつか残っており（矢印）、必ずしも電気的な均一性は、タンパク質の表面電荷に左右さ純度の十分高いものではなかった。カラムクロマトグ

れ、タンパク質の固有の性質の1つであるので簡単にラフィーのステップを追加してこれらコンタミのバン

制御できない。通常、イオン交換クロマトグラフィー

ドを除こうとする場合、PSII表在性タンパク質の一部を用いて単一ピークとして精製した標品は、電気的にが脱落するなどintactなPSIIが得られなくなる問題がも均一であるとみなすことができる。各種タグを利用あった。これ以上精製できないと判断したので、このしてアフィニティクロマトグラフィーによって調製し標品を用いて結晶化を行ったが、ある程度良質な結晶た標品は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて電が得られ(図２A )、結晶中にはコンタミのバンドがな

荷的に均一なピークかどうかチェックしておいた方がくなっていた（図2B、レーン2）9)。これは、ある程度よい。必要であればイオン交換カラムを用いてさらに21

光合成研究 19 (1) 2009

図3

T. vulcanusより精製したPSII二量体と単量体のBlue native-PAGE (A)とゲルろ過パターン(B)。

ゲルろ過はSuperdex 200 PC 3.2/30カラムを用い、SMART systemで行った。

精製する。等電点電気泳動を用いて分析してもよい

良質な結晶を得るためには、結晶化溶液の過飽和度

が、等電点電気泳動自身は結晶化標品の精製に適してをできるだけ低く抑え、時間をかけてゆっくり結晶をいないので、それによって電気的に均一でないものが析出させる方がよい。しかし、精製タンパク質、特に混在していると分かった場合、やはりイオン交換クロ

膜タンパク質やその複合体は多くの場合不安定なの

マ ト グ ラ フィ ー を 用 い た さ ら な る 精 製 が 必 要 で あで、できるだけ短時間で結晶化したいことが多い。一る。PSIIの場合、陰イオン交換クロマトグラフィーを般的に結晶化は4−20˚C、数日―数週間かけて行うの用いて単量体と二量体を分離し、二量体の単一ピーク

で、精製タンパク質が結晶化条件で十分安定かどうかを分取して結晶化に用いている。

をチェックする必要がある。安定性のチェックには、複合体の粒子サイズはサブユニット解離の有無、オ

活性測定、SDS-PAGEによる成分の分解の有無、BN-

リゴマー状態、凝集物・侠雑物の有無などによって影PA G E、ゲルろ過によるオリゴマー状態の変化などが響を受け、結晶化に大きな影響を及ぼす。通常、ゲル考えられる。PSIIの場合、20˚C、1−2週間程度かけてろ過、BN-PAGE、CN-PAGEを用いて粒子サイズの均結晶化を行っていたが、酸素発生活性とSDS-PAGEに一性を評価する。動的光散乱(Dynamic Light Scattering,

よる分析から、3−5日以上静置すると、表在性タンパ

D L S )も粒子サイズの分布を評価するのによく用いらク質の1つである12kDaサブユニットが分解し始め、酸れ、水溶性タンパク質の場合、monodispersityが高い試

素発生活性も低下した(図4 )。これは、回収した結晶料（monodisperseと判断された試料）はほとんど結晶の分析からも明らかになった(図2B)。Glycerol、ベタ化可能、という報告もある11)。膜タンパク質及びそのイ ン、 プ ロ テ ア ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の 添 加 に よ複合体の場合、界面活性剤のミセルが測定の妨げになり、12kDaの分解を抑制できたが(未発表データ)、酸るので、タンパク質とミセル由来のピークを見分ける

素発生活性の低下を完全に抑制することはできなかっことが必要である。PSIIの場合、BN-PAGEとゲルろ過た。Glycerolは溶液の粘性を増やし、結晶核の析出をによって粒子の均一性を評価した（図 3 ）。ゲルろ過

抑え、結晶をゆっくり成長させることによって結晶のにおいて、図3Bに示したような、対称性の高い、狭い質を高める効果があるが、十分なサイズの結晶が析出

単一ピークを示す二量体はよい結晶を与えるが、わずするまでの時間を長くし、不安定なタンパク質に対しかな広がりを見せるピークを持った標品は良質な結晶て必ずしも十分な安定化効果を持っておらず、さらにを与えない。また、C N - PA G E分析において、高分子

Glycerolの存在によりできた結晶の含水量が高く、結量側に凝集物を与えるPSIIはやはり良質な結晶を与え晶の質が悪くなるなどの可能性がある。従っない。

て、Glycerolなどの添加剤を使用するかどうかは個々のケースで判断する必要がある。PSIIの場合、結晶化

４．４．安定性

条件を改良し、4˚C、5日以内に析出させることによっ22

光合成研究

図４

19 (1) 2009

20℃、暗黒におけるPSII二量体の安定性。

(A) コントロール条件 (30 mM Mes pH 6.0, 20 mM NaCl, 3 mM CaCl2)におけるPSIIサブユニットの分解。(B) 各種条件下における酸素発生活性の変化。①コントロール (30 mM Mes pH 6.0, 20 mM NaCl, 3 mM CaCl2); ②通常の結晶化条件 (コントロール+15%
glycerol＋5-6% PEG1,450); ③コントロール＋8% glycerol＋1.0 M Betaine; ④コントロール＋1 mM PMSF; ⑤コントロール＋2%ベン
ズアミジン。

て、これまで最良の結晶を与えることが分かった。

行われた5)。しかし、上述したように、20˚C、1−2週
間では12 kDaサブユニットの分解が起こり、酸素発生

５．PSIIの結晶化

活性が部分的に低下したので 9 ) 、これ以上の分解能のタンパク質の結晶化方法は様々あり、最もよく使わ向上は見られなかった。そのため、透析法よりも短期れているのは蒸気拡散法としてのハンギング・ドロッ

間で結晶を析出させることができるハンギング・ド

プ法またはシッティング・ドロップ法である。他にはロップ蒸気拡散法を用いて、高純度・高活性の試料かバッチ法、二液バッチ法、透析法、界面拡散法などがら3−4日で結晶を析出させることによって、分解能3.3ある。膜タンパク質の場合、蒸気拡散法は沈殿剤ととÅの回折データを得た。さらに4˚Cで結晶化を行い、1もに試料中の界面活性剤も濃縮されるので、それに日で析出した結晶を回収し、オイルバッチ法を用いた

よって相分離が起こり、結晶化の妨げになることがあ再結晶化と抗凍結剤置換の条件を最適化することにる。一方、バッチ法や透析法は最終条件をコントロー

よって、最高分解能 2.74 Åの回折スポットを与え（図ルでき、界面活性剤が濃縮されることはないが、バッ5）、フルデータセットとして 3.0 Å 分解能を与える結

チ法では結晶析出の範囲が狭く、透析法はセッティン晶を析出させることに成功した。

グに時間がかかったり多くの条件を一斉にスクリーニ

６．PSII変異体の結晶構造解析

ングしにくいと言った問題があり、いずれも初期結晶化条件のスクリーニングには適していない。従って、PSIIは 5 kDa 前後の「低分子量」サブユニットを13

どの方法を使うかは扱うタンパク質の安定性や結晶析

個持っており、そのうちの多くの機能は解明されてい出の再現性などを検討する必要がある。結晶化の際のな い 。 さ ら に 現 在 報 告 さ れて い る 結 晶 構 造 に お い

温度も重要なパラメーターの1つであり、通常4 ˚ Cとて、 3 つの膜貫通ヘリックスの帰属が決定されていな

20˚Cを試す。

い。変異体の結晶構造解析によって、サブユニットのP S I Iの場合、初期の結晶化は2 0 ˚ C、キャピラリー

位置や機能に関する情報を取得することが可能であチューブを用いた微量透析法でサンプル溶液として4.0

り、我々はPsbY欠失株からPSII二量体を精製し、野生mg chl/ml, 20 mM Mes (pH 6.0), 10 mM CaCl2, 20 mM

株とほぼ同様の条件で結晶化し、野生株との差フーリ

NaCl, 20 mM MgSO4、外液に20 mM Mes (pH 6.0), 20

エ図から、PsbYは 3.0 Å 分解能の構造におけるX1に対mM NaCl, 10 mM CaCl2, 40 mM MgSO4, 0.015% β-DDM,

応 す る こ とを 同 定 し た ( 図 6 ) 。 現 在 の 分 解 能 でPEG1450を用いて行った9)。その結果、1−2週間

は、PsbYの欠失によるPSII変異体の構造変化を特定すで1.0 x 0.5 x 0.1-0.2 mmサイズの結晶ができ、3.7 Å分

ることはできないが、分解能の向上により変異体にお解能の回折データが得られ、それに基づき構造解析がける構造変化を検出し、PSIIにおけるPsbYの機能を明

5-7%

23

光合成研究 19 (1) 2009

図5

PSII結晶のＸ線回折像(左)とその一部の拡大図(右)（最高分解能2.74 Åの回折点を矢印で示した）。

らかにすることができると期待している。

保ったまま生体膜から取り出して高純度な標品を精製し、そのタンパク質に見合った結晶化条件・方法を見

７．終わりにつけるかにかかっている。そのため、実験材料が大量

タンパク質の結晶化のため、スクリーニングキットに入手できることを前提に、可溶化に適した界面活性が複数市販され、微量の試料を扱うことができる結晶剤の選択、各精製段階の最適化による高純度、高均一化ロボットも利用できるようになり、さらに放射光技性、高活性標品の精製、そしてタンパク質の安定性を術や解析技術の進歩により、構造解析の速度が著しく保った条件下での最適結晶化条件・方法の探索が重要速くなり、タンパク質の大量構造解析の時代が到来しな課題になる。

たという感がある。膜タンパク質に関しても、Michel

PSIIの結晶構造の現在の分解能は3.0 Åであり、このらが光合成細菌反応中心の結晶化に初めて成功した時分解能ではPSIIの全アミノ酸残基の側鎖構造を決定すには、構造解析された膜タンパク質が数年に1個、あるには不十分である。特に酸素発生反応の中心である

るいは1年に1個程度であったが、最近では年に十個をMn 4 Caクラスターは、Ｘ線照射による損傷を受けるた

超える数が報告されるに至った。膜タンパク質及びそめ、十分詳細な構造が解明されていないのが現状であの複合体の結晶化は、いかにタンパク質の立体構造をる。再現性良く 2.7 Å 分解能を超える結晶を析出させることが出来れば、複数の結晶を用いて1個の結晶あたりに照射するＸ線ドーズを著しく低く抑えること
で、損傷をより低減したMn 4 Caクラスターの構造を解明することができると期待されている。

参考文献
1.

2.

3.
図６ A. 野生株PSIIからPsbY変異株PSIIを差し引いた差フー
リエ電子密度図。緑はプラスの電子密度を、青はマイナス4.

の電子密度を表す。B. Aの電子密度を3.7 Å分解能のPSII結晶
構造5)と重ね合わせたもの。

24

Deisenhofer, J., Epp, O., Miki, K., Huber, R., andMichel, H. (1984) X-ray structure analysis of amembrane protein complex: electron density map at 3
Å resolution and a model of the chromophores of thephotosynthetic
reaction
centerfrom
Rhodopseudomonas viridis, J. Mol. Biol. 180,
385-398.
Deisenhofer, J., Epp, O., Miki, K., Huber, R., andMichel, H. (1985) Structure of the protein subunits inthephotosynthetic
reaction
centerfrom
Rhodopseudomonas viridis at 3 Å resolution, Nature
318, 618-624.
Deisenhofer, J., and Michel, H. (1985) The
photosynthetic reaction center from the the purple
bacterium Rhodopseudomonas viridis (Nobel Lecture),
EMBO J. 8, 2149-2170.
Zouni, A., Witt, H. T., Kern, J., Fromme, P., Krauß, N.,光合成研究

5.

6.

7.

8.

Saenger, W., and Orth, P. (2001) Crystal structure ofphotosystem II from Synechococcus elongatus at 3.8 Å
resolution, Nature 409, 739-743.
Kamiya, N., and Shen, J. R. (2003) Crystal structure ofoxygen-evolving
photosystem
II
fromThermosynechococcus vulcanus at 3.7-Å resolution,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 98-103.
Ferreira, K. N., Iverson, T. M., Maghlaoui, K., Barber,J., and Iwata, S. (2004) Architecture of thephotosynthetic oxygen-evolving center, Science 303,
1831-1838.
Loll, B., Kern, J., Saenger, W., Zouni, A., andBiesiadka, J. (2005) Towards complete cofactor
arrangement in the 3.0 Å resolution structure ofphotosystem II, Nature 438, 1040-1044.
Iwata, S. (2003) Crystallization informatics of

19 (1) 2009

membrane proteins, In Iwata, S. (ed.), Methods andResults in Crystallization of Membrane Proteins, pp.
281-297, International University Line, La Jolla,
California.
9. Shen, J.-R., and Kamiya, N. (2000) Crystallization andthe crystal properties of the oxygen-evolving
photosystem II from Synechococcus vulcanus,
Biochemistry 39, 14739-14744.
10. Wittig, I., Karas, M., and Schägger, H. (2007) High
resolution clear native electrophoresis for in-gel
functional assays and fluorescence studies ofmembrane protein complexes, Mol. Cell. Proteomics,
6, 1215-1225.
11. Ferré-D’ Amaré, A.R., and Burley, S.K. (1997)
Dynamic light scattering in evaluating crystallizabilityof macromolecules, Methods in Enzy. 276, 157-166.

25

光合成研究 19 (1) 2009

解説
不安定なタンパク質を見る
大阪大学・大学院理学研究科
福山恵一*
が多様であったり、経時的に構造変化すると、該当

１．はじめに領域の電子密度はぼやけ、ひどくなると電子密度が全タンパク質の機能や性質を理解する上で、その立体

くみえなくなる。

構造情報は極めて重要で、必須ともいえる。このこと
は光合成分野に限らず、生物科学の広い分野に共通し一般に、タンパク質分子は溶液中でも結晶中でも構ていえることであろう。立体構造をみることにX線結造がゆらいでおり、さらに基質等の小分子や他のタ晶解析が果たしている役割が非常に大きいことに異論

ンパク質やD N Aと相互作用すると、大きな構造変化はないであろう。

が起こるのが普通である。それではX線結晶解析といところで、タンパク質を代表とする生体巨大分子やう方法で、どのようにしてタンパク質の構造をみれば複合体の立体構造は静止していない。「機能する」といいか、動きを捉えられるのか、またこの方法からいうことは、他の分子と相互作用し、構造変化をして得られた結果をどう評価したらいいかについて概説

いることに他ならない。X線結晶解析がなされると確する。

かに「ある状態の構造」がみえるが、タンパク質分子３．例１：化学的に不安定な分子をみる1,2)

がどのように構造変化し、これが機能とどう結びつく

この種の分子の構造をX線結晶解析でみる場合、結かを理解したいという欲求がさらに生ずるのも自然晶を構成する分子を立体的に均一にし、回折実験中

な流れである。このようなことにX線結晶解析法でど不変に保つことが必要である。つまり、変化しやす

こまで迫れるのか、どのようなことをクリアーすればい分子を「どの状態に揃えるか」がポイントになる。

達成できるかをここで述べてみたい。

ここでは、不安定な鉄硫黄（FeS）クラスターを保持したIscUタンパク質を例にあげ、どのようにして立体

２．X線結晶解析で何がみえているのか？

構造をみることができたか、そしてこの構造から得ら

X線結晶解析は、調製した結晶にX線を照射し、それた知見の科学的評価を述べる。

こから散乱（回折）される X 線を記録し、この回折データから原子位置などの構造情報を得る方法であF e Sクラスター形成やF e Sタンパク質の成熟化にはる。この方法は、構造決定しようとしている分子が結タンパク質群が関与しており、その一つがISCマシナ

晶状態であることを前提にして、理論が組み立てられリーである（図１A）3)。IscUはISCマシナリーの必須ている。結晶とは、同一の立体構造をとった分子がの成分であり、他の成分タンパク質と協調的に働

周期的に配列したものである。X線結晶解析で直接みき、FeSタンパク質をアポ型からホロ型へと成熟化さえるものは「空間的および時間的平均」の電子密度せる。FeSクラスターには[2Fe-2S]や[4Fe-4S]等があるである。結晶中の分子配列に乱れが無く、実験中にが、ISCマシナリーはどのタイプのクラスターにも対構造変化しなければ、この方法は分子を構成する各応するという特徴がある。これまでの分子遺伝学や原子の位置を極めて正確に（誤差が0.01 Å以下の精度

生化学的解析から、IscU中でFeSクラスターが一時的で）決定できる。タンパク質のような巨大分子でも、に形成され、これがアポ型FeSタンパク質に渡される

最もみえにくいとされる水素原子をもみることがでとされている。このような機能から容易に想像がつくきる。しかし反面、局所的にせよコンフォメーション

ように、IscUは様々な状態をとり、構造（状態）変化* 連絡先

E-mail: fukuyama@bio.sci.osaka-u.ac.jp26

光合成研究19 (1) 2009

図１．ISCマシナリーとその成分タンパク質IscUの構造(A)

大腸菌ではiscSUAhscBAfdxはオペロンをなし、対応するタンパク質が協調的に働くことによってFeSタンパク質がホロ型になる。IscUはscaffoldタンパク質である。成分間に引いた線は様々な方法で検出された相互作用を示す。(B)[2Fe-2S]クラスターを結合したIscU（D38A変異体）の非対称な三量体構造。同一のポリペプチドでありながら互いに異なるコンフォメーションをとり、一つのサブユニットのみがFeSクラスターを結合している。(C)[2Fe-2S]クラスター近傍の構造。緑がBサブユニット、赤がAサブユニットを示す。Cys36とHis106が一方の鉄原子に、Cys63とCys107が他方の鉄原子に結合している。BとCは文献２より転載。

しやすいが故に「機能的」であるといえる。我々は寄与しているように見え、同じポリペプチドでありな

FeSクラスターを保持した状態のIscU（FeS-IscU）のがらそれぞれのサブユニットは異なる役割を果たして構造をみることがIscUの分子機構解明の第一歩であるいると考えられた。詳細は省略するが、IscUの生化学と位置づけ、この構造を捉えることに焦点をあてた。

的解析と合わせて、I s c Uはオリゴマー状態を変えてそれまでの経験から大腸菌FeS-IscUはきわめて不安定

FeSを形成・転移させているという、新しい分子機構であったので、以下のように順次取り組んだ。

を提唱した。

1 )幾つかの生物種について、安定なF e S - I s c Uをスク

図１ C に F e S クラスター近傍の構造を示したようリーニングし、Aquifex aeolicus 由来のIscUを選択しに、FeSには３つのCys残基と一つのHis残基が配位した。

ている。これらの残基に加えて、 A s p 3 8 （ここでは2)このIscUを大腸菌で発現させるとFeSクラスター特D38A変異体なのでAla38となっている）をはじめFeS

有の色を持つタンパク質が生成した。嫌気的条件下でクラスターを結合しうるアミノ酸残基が近くに点在す

操作すると、このFeSタンパク質が精製できたが、かる（図１C中赤破線）。IscUの機能から、FeSがIscU

なりの割合でFeSが分解しているようであった。

に結合する様式は幾つかあり、形成された（されつ3)さらに安定化させるため、Azotobacter vinelandii のつある）FeSクラスターはIscUの中で順次移動して、IscUに倣って、A. aeolicus のIscUにD38Aという変異を最終的にターゲットとなるアポ型FeSタンパク質に渡導入した。この結果、このF e S - I s c Uはより安定になるのであろう。D 3 8 Aは形成されたF e Sクラスターがり、嫌気チャンバー内で操作することにより精製と結固定される変異体で、このため安定になったと解釈

晶化に成功した。この結晶は、大気中ですばやく急できる。事実、この変異によりIscUの機能が損なわれ

速凍結すれば、その後は通常の結晶と同様に扱ってる。本解析では、機能しているIscUの一つのスナップも長期間安定であった。

を捉えたと考えている。

本X線結晶解析から、予期していなかった構造が現IscUに限らず、タンパク質が働く様を動画としてみれた。それまではIscUの二量体の中央でFeSが形成さたいのであれば、各状態の構造を捉え、これらを繋れると考えられていたが、FeS-IscUは非対称な三量体ぐ必要がある。映画の場合と同じである。

を形成し、一つのサブユニットの表面に F e S が結合

４．例２-１：酵素反応の中間体を捉える4)

し、残る二つのサブユニットはFeSを持たずに、別のサブユニットが持つF e Sを覆っていた（図１B）。す

図２Aに示すように、γ-グルタミルトランスペプチ

なわち、一つはFeS形成の場を提供し、残る二つは異ダーゼ（GGT）は２段階で、基質中のγ-グルタミル基なるコンフォメーションをとってFeSの保護や転移にを加水分解・転移する反応を触媒する5) 。一般に、２27光合成研究 19 (1) 2009

図２．GGTの反応と構造(A)

GGTの２段階反応。一段階目の反応後に、GGTの活性残基（Thr）と基質に由来するγ-グルタミル基が結合したγ-グルタミ

ル酵素中間体が生成する。(B) ２段階反応における３状態の構成比率の経時変化。(C) 大腸菌GGTの立体構造。中央（赤丸）に活性残基Thr391がある。緑：L-サブユニット、青：S-サブユニット。(D) GGT結晶を基質溶液に一定時間ソーキングした後の電子密度。

段階反応の場合、反応前、中間体、反応後にある状

ながっている電子密度がみえた（図２C,D）。すなわ

態の構成比の経時的変化は図２Bのようになる。X線

ち、γ-グルタミル-酵素中間体を捉えたといえ、どの結晶解析では、時間的・空間的平均の電子密度がみようにγ-グルタミル基がGGTに認識されているかが明えるのであるから、回折測定に供する結晶中の分子

らかになった。なお、本解析より前に、ヒトG G Tで種（の大多数）をいずれかの状態に揃えれば、それ機能が損なわれる変異体が幾つか報告されていたが、がみえることになる。

ここで指摘されていたアミノ酸残基はα位のアミノ基よく知られているように、タンパク質結晶はかなりとカルボキシル基を認識している残基であった。本構の割合で水を含んでおり、タンパク質分子間には小分造解析で特筆すべきは、この中間体のカルボニル炭子やイオンが浸透できる水路がはり巡らされているよ

素を攻撃するに適した位置に水分子（図 2 D 左中のうなものである。酵素結晶を低分子基質の溶液に浸W 2）がみえていることである。また、カルボニル酸

せば、もし反応部位が水路に面していれば結晶中で反素は２つのG l y残基のN Hと水素結合し、この後この応が起こり、これによって結晶を壊すような構造変化

中間体が加水分解される際にとる四面体形遷移状態がなければ、X線結晶解析できる。

を安定化するオキシアニオンホールの位置にある。よここでは大腸菌由来G G T結晶を、基質であるグル

り 長 く グル タ チ オ ン 溶 液 に 浸 し た G G T 結 晶 でタチオンの溶液に様々な時間浸し、それぞれの結晶

は、Thr391Oγとγ-グルタミル基との間の結合は切れてを急速凍結して反応を停止させた。それぞれの結晶にいた（図２D右）。ここではγ-グルタミル基のCα-Cβ

ついて回折データを収集し、構造解析したところ、約とCβ−Cγ結合のねじれ角が変化しており、加水分解後

1 0 秒間グルタチオン溶液に浸した場合に、活性残基はこのように生成物が構造変化・遊離し、酵素は休

Thr391のOγ原子にγ-グルタミル基がエステル結合でつ止状態に戻るのであろう。

28

光合成研究19 (1) 2009

このような一連の解析から、G G Tでは一段階目のでHOはO2をどのように選択しているのであろう？HO

反応が早く、２段階目の反応が遅い（結晶中で遅く中のヘムにC Oが結合しにくい分子機構はいくつかあなった）といえ、これ故に中間体が捉えられた。こるが 8 ) 、これに関連して、発生したC O を一時的にトこでとった方法では、 G G T とグルタチオンとの E S -ラップする部位がHO中にあるのではないか、あるとcomplexの構造を捉えることは無理であった。なお、すればどこだろう？

中間体の電子密度がみえたが、結晶中で何%がこの状

この疑問に答えるため、我々は以下のように結晶態にあるか、結晶の表面と中心部での構成比率につ解析法で取り組んだ。ここでは酵素反応でC Oを発生

いて定量的なことは何ともいえない。この結晶の場させる代わりに、HO中のヘムにCOを結合させ（CO-合、予想以上に早く基質が結晶中に浸透し、これがheme-HO）、これにレーザー光を照射してCOを解離

幸いして中間体が捉えられたという印象は強い。

させることにした。CO-heme-HO結晶を回折計にマウントし、低温（〜35K）で、まず薄暗くして回折デー

５．例２-２：より不安定な酵素反応の途中の状タを収集した。次に、この結晶にレーザー光を照射態を捉える6)しながら、他は全く同じ条件で回折データを収集しここではヘムオキシゲナーゼ（H O）を用いて、よた。これら２セットのデータ間の差（Filluminated-Fdark）

り不安定な状態を捉えた方法を紹介する。HOはヘムを係数にした電子密度を図３Bに示す。予想通り、ヘ代謝で主要な役割を担っている酵素で、 O 2 と還元力

ム鉄に結合していたC Oの箇所は、レーザー光照射にを利用して、ヘムのα位を特異的に開裂させる反応を

よって電子密度が減少し、ヘムから少し離れた箇所で触媒する。この反応は３段階からなり、各段階で O 2

電子密度が高くなった。このうちsite-2は疎水性のアを一分子用い、最終的にビリベルジン、C O、F e 2 + をミノ酸側鎖に囲まれたキャビティーであった。この結生じる（図３A）7)。ヘムはHOにとって基質であると果から、光解離した C O （の一部）はこの部位にト

共に、補酵素でもある。注目すべきは２段階目で生ラップされたといえる。電子密度の高さから、このじるCOである。よく知られているように、COはO2よ実験条件では約10%のCOがヘム鉄から解離し、そのりはるかに強くヘムやその誘導体に結合する性質を約半分がこの部位にトラップされたと見積もられ持っている。発生したC Oが存在する中で、３段階目

た。単一の結晶を用いて、レーザー光照射の有無以外

図３．HOが触媒する反応とCOの行方(A) HOの３段階反応。HOは各段階で一分子のO2を用い、２段階目でCOが生成する。(B) CO-heme-HO結晶の暗所とレーザー光
照射の差の電子密度。レーザー光照射により減少した電子密度を赤で、増加した電子密度を青で示す。Bは生化学 77, 634-638(2005)より許可を得て転載。

29

光合成研究 19 (1) 2009は全く同じ条件で測定した（電子密度のノイズを下げた）ので、このようなわずかな電子密度変化（水素原
子の電子密度の高さに相当）を検知できたといえよう。ちなみに、heme-HO結晶にXeガスを充満させ加2.

圧した後急速凍結させると、同じ部位にX eに由来する電子密度が明瞭にみえる。なお、 C O の代わりに
CN - を使った同様の実験では注目している部位に電子3.

密度はみえなかったことから、この部位はイオンをトラップしないといえよう。これらの結果から、酵素反応で生じるC Oもこの部位に一時的にトラップされ、これによってC Oが幾らかでもヘム鉄に結合することを防いでいると考えている。

4.

６．おわりにX線結晶解析法が生来もつ制約（結晶でなければならない）の中で、不安定な分子の構造をみた例を幾つか紹介した。これらの例からわかるように、この5.

ような制約にどう対応するか、すなわち立体的に均一な分子が規則正しく配列した結晶をどう調製する
かがキーポイントである。現在のX線解析技術で、結6.

晶中の分子を同期させて同じように構造変化を起こすことができれば、ミリ秒オーダーの反応でも各スナップを捉えることができる。タンパク質分子の種類7.

にかかわらず、適切な試料（結晶）が準備できたかど
うかが成否を分け、これをクリアーした場合にはこの8.

方法からきわめて重要かつ豊富な情報が得られる。

参考文献
1. Shimomura, Y., Kamikubo, H., Nishi, Y., Masako, T.,
Kataoka, M., Kobayashi, Y., Fukuyama, K., and30

Takahashi,Y.
(2007)
Characterizationandcrystallization of an IscU-type scaffold protein withbound [2Fe-2S] cluster from the hyperthermophile,
Aquifex aeolicus, J. Biochem. 142, 577-586.
Shimomura, Y., Wada, K., Fukuyama, K., andTakahashi, Y. (2008) The asymmetric trimericarchitecture of [2Fe-2S] IscU: Implication for its
scaffolding during iron-sulfur cluster biosynthesis, J.
Mol. Biol. 383, 133-143.
Tokumoto, U., Kitamura, S., Fukuyama, K., andTakahashi, Y. (2004). Interchangeability and distinct
properties of bacterial Fe-S cluster assembly systems:
Functional replacement of the isc and suf operons inEscherichia coli with the nifSU-like operon from
Helicobacter pylori, J. Biochem. 136, 199-209.
Okada, T., Suzuki, H., Wada, K., Kumagai, H., andFukuyama, K. (2006) Crystal structures of γglutamyltranspeptidase from Echerichia coli, a key
enzyme involved in glutathione metabolism, and its
reaction intermediate, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103,
6471-6476.
鈴木秀之，和田啓，福山恵一（2009）γ-グルタミ
ルトランスペプチダーゼの立体構造に基づいた成熟化と酵素反応機構，
54,245-251.
Sugishima, M., Sakamoto, H., Noguchi, M., andFukuyama, K. (2004) CO-trapping site in heme
oxygenase revealed by photolysis of its CO-boundheme complex: Mechanism of escaping from productinhibition, J. Mol. Biol. 341, 7-13.
杉島正一（2007）ヘムの代謝にかかわる酵素の構
造生物学，
49, 99-106.
Sugishima, M., Sakamoto, H., Noguchi, M., andFukuyama, K. (2003) Crystal structures of ferrous andCO-, CN--, and NO-bound forms of rat heme
oxygenase-1 (HO-1) in complex with heme: Structural
implications for discrimination between CO and O2 in
HO-1, Biochemistry 42, 9898-9905.

光合成研究19 (1) 2009

解説
タンパク質相互作用を見る
東京大学・大学院総合文化研究科
栗栖源嗣*
１．はじめに体試料とする場合とがある。勿論、十分なタンパク質

タンパク質の構造と機能の相関を研究する上でタン量を確保する必要があるため、調整法と精製度に制限

パク質の立体構造は、 “ 分子がどのようにして機能しがかかるケースも多い。結晶化実験は沢山の条件検索ているか？ ” という疑問に対して多くの情報を与えてを行う為、十分量のタンパク質を用意することが第一くれる。筆者がこの分野で研究を開始した17年前と比条件となろう。

較して X 線結晶構造解析法の技術的な進歩は目覚し

結晶構造解析を専門としない研究者の中には、時折く、現在データベース上に登録されているタンパク質「タンパク質の結晶化条件はタンパク質と一対一で対の立体構造は50,000件を優に超える。結晶化・構造解応している」と勘違いされている方がおられる。実際

析した情報を基に、部位特異的変異の導入や化学修飾には、あるタンパク質が硫酸アンモニウムで結晶化すを施して、タンパク質分子の相互作用部位を同定するるからと言って、そのタンパク質を含むタンパク質複ことは非常に一般化したと言えよう。このような研究

合体が硫酸アンモニウムで結晶化するとは限らない。

の延長線上で、タンパク質が機能している複合体状態

複合体の結晶化実験には一からの条件検索が必須なので構造解析し、もっと直接的に「タンパク質の相互作である。タンパク質複合体を形成する主な相互作用と用を見よう」という試みがなされている。X線結晶構して、「疎水性相互作用」「静電相互作用」「ファン造解析法は複数の構成成分を含む複合体状態でも、単デアワールス相互作用」などが挙げられる。結晶化実結晶にすることさえできれば構造解析することが可能

験を始める前に実験対象とするタンパク質複合体が主であり、実際に複合体結晶構造からは複合体形成によにどのような相互作用により形成されているかを生化り誘発される構造変化やタンパク質分子間の相対配置

学的に確認しておくことは、結晶構造解析を進める上など、単体タンパク質の立体構造からは計り知れないで大変重要である。タンパク質複合体の結晶化実験も新たな構造情報を得ることができる。データベースに通常タンパク質の結晶化実験と同じように、硫酸アン

登録されている実際の複合体構造解析例は少ないもの

モニウムやポリエチレングリコール（PEG）等の結晶の、今後の構造生物学研究の目指す方向性の一つであ化用試薬を使う。その為、複合体の形成様式によってることは間違いない。本稿では、これまでに研究対象は使用する結晶化試薬に制約が生じるからである。

とされたタンパク質 - タンパク質複合体を例に複合体個々の結晶化条件は非常に個別的で、タンパク質複合結晶の調製方法の概略と得られる具体的な構造情報に体の結晶化に特別な傾向は見出せないが、一般に静電ついて紹介する。

的な相互作用により複合体が安定化される場合は、硫酸アンモニウムなどの塩を使わずにPEGを沈殿剤して複合体結晶が調製される事が多い。一方、分子間相互２．複合体状態でのタンパク質結晶化の特徴
タンパク質複合体には、相互作用が非常に強く、特作用の大部分が疎水的相互作用の場合は、リン酸塩や定の相手とだけ強く相互作用する場合と、相互作用は硫酸塩などの塩類が沈殿剤として用いられている。

弱いのだが解離会合を繰り返しながら複数の相手と複

それでは、次に、実際のタンパク質複合体の結晶化

合体を形成する場合とが存在する。試料調整の方法で例を見ていきたいと思う。本稿では、特定の相手とだ

見てみると、片方のタンパク質にだけタグを導入する

け強く結合するタイプの複合体として、１）ビタミン

だけで、複合体試料として調製できる場合と、それぞ

B 1 2 輸送体と細胞毒素のレセプター結合ドメインの構

れ別に精製したサンプルをモル比で等量混合し、複合造について、そして解離会合を繰り返しながら複数の* 連絡先

E-mail: gkurisu@xtal.c.u-tokyo.ac.jp31

光合成研究 19 (1) 2009

相手と複合体を形成するタイプの代表として、２）電（R135:BtuB=1.25:1）で混合した後に、サンプルを濃子伝達タンパク質フェレドキシン（Fd）と Fd 依存性

縮することにより得た。結晶化には異なった界面活性

酵素との複合体形成について構造研究の概要をご紹介

剤を用いることにより異なった結晶系の結晶が得られする。

たが、最終的に構造解析可能であったのはLDAOを界面活性剤に用いた結晶であった。構造解析は単体の

３．特定の相手とだけ強く結合するタイプの複合体

BtuBの構造をサーチモデルにした分子置換法で行い、コリシンE3はバクテリオシンと呼ばれる551残基か子密度が得られた。最終的にR135と分子BtuBが1対1

解析の初期段階の差フーリエ上にR 1 3 5に対応する電らなる抗菌性タンパク質で、大腸菌の 2 つの膜レセプで結合した複合体を 2.75 Å 分解能で精密化した。

ターを利用することにより菌内に入り込み，rRNAを特異的に加水分解し大腸菌を殺す活性を持っている構造と機能得られた複合体の構造は予想以上に興1 ) 。その構造は膜透過の為のT-ドメインとレセプター

味深いものであった。BtuBは22本のβストランドから結合の為のR-ドメイン、そして RNAase 活性を持つC-なるβバレル構造の中に130残基からなる“コルク”様ドドメインの 3 ドメインから構成されている。遺伝学実メインが存在している。R135は、このコルクの構造を験により、大腸菌外膜に存在するビタミンB 1 2 レセプ

変えることなく先端のわずかなアミノ酸だけでBtuBとター（ B t u B： 5 9 4残基）とチャンネルタンパク質

結合していた。結合は主にBtuBのループを介して行わ

OmpF（340残基）を介して膜内に入り込むことは判っ

れ、R135のαヘリックスは膜面に対して、約40°斜めにていたが、レセプターはそれぞれ分子量1 , 3 0 0および

傾いて結合していた。コリシンE3の全体構造を重ね合

6 0 0程度の小分子を輸送するタンパク質であり、分子

わせてみると、膜透過に必須のT-ドメインが膜側に配量6万を超えるコリシンE 3がどのようにして大腸菌の置しており、R135はT-ドメインを運ぶクレーンの役目

外膜を通り抜けていくかは不明のままであった。そこを担っていることが推察された（図１）。コリシンE3で、筆者は米国 Purdue 大学の W. A. Cramer 教授グのT-ドメインがOmpFチャンネルを塞ぐという電気生

ループにおいて、135残基からなるコリシンE3のレセ

理データから、レセプター結合ドメインのBtuBへの傾プター結合ドメイン とBtuBの複合体を 2.75 Å 分解能

いた結合がコリシンの T - ドメインを 2 番目のレセプで構造解析した2)。

ターであるOmpFへと運ぶクレーンの役割を果たし、さらに複合体形成に誘発される形で T - ドメインの結晶化と構造解析 実験に用いたコリシンE3のレセ

Unfoldingを引き起こして膜を通過する2レセプターメ

プター結合ドメイン（R135）とBtuBは、それぞれ別にカニズムを提唱することができた。

大腸菌により大量発現させて H i s タグにより精製した。BtuBは膜タンパク質であるため、結晶化用のサン３．解離会合を繰り返しながら複数の相手と複

プルはすべて界面活性剤の存在下で調製した。結晶化

合体を形成するタイプの複合体

用 の 複 合 体 は タ ンパ ク 質 を 一 定 の 割 合

フェレドキシン（F d）は光化学系Ⅰ複合体から電子を受け取り、解離会合を繰り返しながら炭素、窒素、硫黄の各代謝系へ光還元力を分配する電子伝達タンパク質である。改変体を用いた相互作用解析から、電子を受け取る側の Fd 依存性酵素群は、各々 Fd の異なったアミノ酸残基を認識していることが判っている。電子伝達複合体の形成が光還元力の分配機構と密接に係わっていると考えており、筆者は大阪大学の長谷俊治
教授の研究グループと共同で電子伝達複合体の構造研究を進めてきた。Fdと相手タンパク質はソフトな相互作用を基に複合体を形成するが、我々はX線結晶解析の手法を用いて複数の複合体を構造解析し、Fdの持つ複合体形成様式の詳細を明らかにした3, 4)。

図１．R135とBtuBの複合体結晶構造を基に作図したコ
リシンE3とBtuBの結合状態

32

光合成研究

結晶化と構造解析

19 (1) 2009

実験に用いたトウモロコシFdとFNRの試料は大腸菌による大量発現系により得られた5) 。結晶化に用いたFdとFNRとの複合体は３種類の方

法 に よ り 調 製 し た 。 ま ず、 ゲル ろ 過 ク ロ マ ト グ ラ
フィーにより複合体を精製する方法。次にFdを過剰に加えた混合溶液を分画分子量30 Kの膜を用いて濃縮、希釈を繰り返す事により、過剰量加えた分子量12 KのFdを素通りさせる方法（複合体の分子量は約47 K）、
そして最後に等モルになるよう濃度計算し単純に混合させる方法である。結果的にどの方法で調製した複合体でも同じような結晶を得ることが出来た。Fdを中心
図２．FdとFNRの複合体構造とした電子伝達反応系では全ての Fd 依存性酵素で静電的な相互作用によりタンパク質・タンパク質複合体ていないものであった。複合体を形成していない単体を形成する。このことは分子表面の電荷をもった残基状態のFdでは Arg 40 の側鎖が Glu 29 の側鎖と分子内を中性の残基に置換した改変体が電子伝達複合体を形に塩橋を形成し、 [2Fe-2S]クラスターを取り囲んでい成しないことによって確認されている 6 ) 。したがっるループ構造を安定化している。今回の複合体構造中て、色々な平均分子量のPEG溶液を沈殿剤に選択し、では Arg 40 と Glu 29 の分子内塩橋が開裂し、FNRの結晶化条件の検索を進めたところ、100 mM NaCl を含

Glu 29 および Lys 304 と新たに分子間に塩橋を形成しむ 20 %(w/v) PEG4000 を沈殿剤とした時に薄茶色の結ていた。現在のところ、FNRとの複合体形成に伴う塩晶を得た。Fdは[2Fe-2S]クラスターを有する濃い赤色

橋の架け替えが、Fdの持つ[2Fe-2S]クラスターの酸化を、一方のFNRはフラビン酵素であるため鮮やかな黄還元電位をさらに約 90 mV 低下させるという従来の色をした酵素である。得られた結晶は薄茶色を呈して報告に対応する構造変化であると考えている 7 ) 。次におり、２種類のタンパク質の混合物であることは明白

Fdが結合していない単体FNRの立体構造と複合体FNRであった。分子置換法による構造解析を進めたとこの立体構造を比較したところ、興味深い構造変化を確ろ、解析の初期段階で差フーリエ上にFdに対応する電認することが出来た。FNRの Glu 312 はFAD近傍に存在する保存残基で活性中心に位置している。また、こ子密度を確認できた。最終的にFdとFNRの両方の座標の Glu 312 の側鎖はFNR内部にある Ser 96 と共にを精密化していき、2.59 Å 分解能での立体構造を決定

NADP(H)のニコチン環と水素結合することが報告されした。

ている8)。フリー状態のFNRでは Glu 312 は Ser 96 と2.59 Å 分解能で得られた電子伝達タンパク質複合体

離れているが、複合体になることにより Ser 96 の方への立体構造を図2に示す。この複合体構造中ではF N R

約 2 Å 近づいて水素結合可能な距離に移動していた。

の酸化還元中心であるFADと、Fdの酸化還元中心であGlu 312 側鎖は、結合したFdと立体障害を起こすことる[2Fe-2S]クラスターの最短距離は 4.1 Å であった。

により分子内部へと押し込まれた形になっていたのでさらに酸化還元中心近傍に疎水的な情況を作り出しある。これは複合体形成により F N R の活性残基がて、補欠分子族間での直接電子伝達に適した環境とNADP(H)と特定の相互作用をする為に必要な配置へとなっていた。この疎水的な領域を取り囲む形で、21残構造変化したと考えられる。

基の電荷を持ったアミノ酸が存在していた。このうち
5 対のアミノ酸が分子間に塩橋を形成して複合体を安４．今後の課題と展開

定化し、F dとF N Rの相対的立体配置決定の主要因に具体例として紹介させていただいた複合体状態のビなっていた。FdとFNR間の静電的相互作用に関して、

タミンB12輸送体と電子伝達複合体の両構造とも、X線

生化学実験からその重要性が指摘されていたアミノ酸

構造解析以外の物理化学的手法による相補的な複合体

残基は、すべて複合体構造中の会合領域に位置してい解析が行われている。前者のビタミン B 1 2 輸送体の場た。しかしながら、今回新しく見出されたFdの Arg 40

合、 C D スペクトルを測定して、複合体形成によりとFNRの Glu 154 による塩橋の形成は、全く予想され

R135のαヘリックス含量が約14％減少し、コリシンE333

光合成研究 19 (1) 2009にUnfoldingを伴う構造変化が起きている事を示唆するデータが得られている 2 ) 。また、後者の電子伝達複合体の場合、 1 5 N でラベルした F d の化学シフトを同定し、F N Rを滴定した時の化学シフトの変化からN M R

4.

でもX線でもほぼ同じアミノ酸を使って複合体を形成していることを確認している 4 ) 。このように、タンパ
ク質複合体の構造解析と、種々の物理化学的手法を相5.

補的に併用することにより、より信頼度の高い情報を得る努力が必要であろう。今後、光合成研究をはじめ
特定のテーマ毎に的を絞ったタンパク質複合体のデー6.

タが蓄積し、高次の生命現象を複合体分子構造ベース
で議論される事を希望してやまない。

参考文献
1. Soelaiman, S., Jakes, K., Wu, N., Li, C. and Shoham,
M. (2001) Crystal structure of colicin E3: implications
for cell entry and ribosome inactivation, Mol. Cell 8,1053-1062.
2. Kurisu, G., Zakharov, S.D., Zhalnina, M.V., Bano, S.,
Eroukova, V.Y., Rokitskaya, T.I., Antonenko, Y.N.,
Wiener, M.C. and Cramer, W.A. (2003) The structure of
BtuB with bound colicin E3 R-domain implies atranslocon, Nat. Struct. Biol. 10, 948-954.
3. Kurisu, G., Kusunoki, M., Katoh, E., Yamazaki, T.,

7.

8.

34

Teshima, K., Onda, Y., Kimata-Ariga, Y. and Hase, T.
(2001) Structure of the electron transfer complex
between ferredoxin and ferredoxin-NADP(+) reductase,Nat. Struct. Biol. 8, 117-121.
Hanke, G. T., Kurisu, G., Kusunoki, M., and Hase, T.
(2004) Fd:FNR electron transfer complexes:
Evolutionary refinement of structural interactions,Photosyn. Res. 81, 317-327.
Hase, T., Kimata, Y., Yonekura, K., Matsumura, T. and
Sakakibara, H. (1991) Molecular cloning anddifferential expression of the Maize ferredoxin genefamily, Plant Physiol. 96, 77-83.
Akashi, T., Matsumura, T., Ideguchi, T., Iwakiri, K.,
Kawakatsu, T., Taniguchi, I. and Hase, T. (1999)
Comparison of the electrostatic binding sites on thesurface of ferredoxin for two ferredoxin-dependent
enzymes, ferredoxin-NADP(+) reductase and sulfite
reductase, J. Biol. Chem. 274, 29399-29405.
Batie, C.J. and Kamin, H. (1981) The relation of pH
and oxidation-reduction potential to the association
state of the ferredoxin . ferredoxin:NADP+ reductase
complex, J. Biol. Chem. 256, 7756-7763.
Deng, Z., Aliverti, A., Zanetti, G., Arakaki, A.K.,
Ottado, J., Orellano, E.G., Calcaterra, N.B., Ceccarelli,E.A., Carrillo, N. and Karplus, P.A. (1999) A productive
NADP+ binding mode of ferredoxin-NADP + reductase
revealed by protein engineering and crystallographic
studies, Nat. Struct. Biol. 6, 847-853.

光合成研究19 (1) 2009

集会案内
学術創成研究合同シンポジウムのご案内
2009年7月10日午後〜11日午前、京都大学におきまして日本光合成研究会の協賛で学術創成研究の合同シンポ
ジウムを行います。これは、現在進行中の三室守、鹿内利治、高橋裕一郎の三つの学術創成研究の成果を積極的に公開することを目指すもので、数名のゲストスピーカを加えて、最近の光合成研究の進展について議論したいと思います。場所は、10日は時計台記念館大ホール、11日は国際交流大ホールです。多数の会員の皆様の参加をお待ちしております。詳細が決まり次第、電子メール、ホームページによりお知らせいたします。なお、本シンポジウムに引き続き、11日午後〜12日に光合成の色素系と反応中心に関するセミナーXVIIが開催されます。
問い合わせ先：三室守

mamo-mi@mm1.mbox.media.kyoto-u.ac.jp

光合成の色素系と反応中心に関するセミナーXVII 開催予告
期日

平成21年7月11日（土）午後4時から7月12日（日）午後4時まで

場所

京都大学

人間・環境学研究科

地下講義室 (23A、23B 室)

開催の目的：
光合成の光反応系に関して、物理学、化学、生物学を融合した討論を行う。 また、光合成生物、光化学反応系の進化に関する事項についても討論する。
内容：
１．初習者のための基礎講座（講義）２．ポスター発表（図１枚を使い、３分間以内で要旨の説明を行う）

３．口頭発表（討論を含めて一人１５分を予定）

平成21年7月10日午後（金）、11日午前（土）に予定されている「学術創成

研究合同シンポジウム」（三室、鹿内、高橋の３つのプロジェクトの合同シンポジウム）（京大構内にて開催）に引き続いて開催の予定です。基
礎講座は例年に比べて縮小し、ポスター討論、口頭発表に重点を置く予定です。
申込：
発表申し込み締め切り（予定）平成21年7月3日（金）参加申し込み締め切り（予定）平成21年7月7日（火）参加費：（7月11日の懇親会費、7月12日の昼食代を含む）
一般 5,000円（予定）

学生 3,000円（予定）

問い合わせ先：
今後の案内の配布を希望される方は京都大学大学院地球環境学堂、三室まで お知らせ下さい。案内は総て電子
メールにて配布します。
(e-mail address: mamo-mi@mm1.mbox.media.kyoto-u.ac.jp)35

光合成研究 19 (1) 2009

新刊図書

Photosynthesis in silico
Understanding Complexity from Molecules to Ecosystems
Series: Advances in Photosynthesis and Respiration, Vol. 29
Laisk, Agu; Nedbal, Ladislav; Govindjee (Eds.)
Springer 2009, Approx. 520 p., Hardcover
ISBN: 978-1-4020-9236-7
http://www.springer.com/life+sci/plant+sciences/book/978-1-4020-9236-7

Primary Processes of Photosynthesis
Principles and Apparatus
Series: Comprehensive Series in Photochemical & Photobiological Sciences, Vol. 8
Renger, Gernot (Ed.)
Royal Society of Chemistry 2008, 1088 p. In 2 volumes, not available separately., Hardcover
ISBN: 978-0-85404-364-4
http://www.rsc.org/shop/books/2007/9780854043644.asp
Tetrapyrroles
Birth, Life and Death
Series: Molecular Biology Intelligence Unit
Warren, Martin J.; Smith, Alison G. (Eds.)
Springer 2009, XX, 406 p. 157 illus., 2 in color., Hardcover
ISBN: 978-0-387-78517-2
http://www.springer.com/life+sci/plant+sciences/book/978-0-387-78517-2
Phenology of Ecosystem Processes
Applications in Global Change Research
Noormets, Asko (Ed.)
Springer 2009, Approx. 315 p. 83 illus., Hardcover
ISBN: 978-1-4419-0025-8
http://www.springer.com/environment/global+change+-+climate+change/book/978-1-4419-0025-836光合成研究19 (1) 2009

新刊図書
「光合成研究法」出版のご案内

1 9 8 1年に光合成研究会が中心となり「光合成研究法」（加藤栄、宮地重遠、村田吉男編、共立出版）が出版されました。この本は残念ながら絶版となりましたが、今でも多くの方に利用されています。しかし、光合成をめぐるその後の発展は目覚しく、新しい手法も多く取り入れられました。また、この間、植物科学の分野だけでなく、地球環境や工学など多くの研究者が光合成に興味を持つよ
うになりました。これらを背景に、光合成研究会の幹事会を中心に議論を重ね、多くの会員の協力を得ながら、新しい「光合成研究法」の出版に至りました。 6 8 4 ページの総カラー版で、美しく仕上
がっています。項目も、材料の入手から、バイオインフォマティクスに至るまで、広く取り扱っています。この本は、一般販売しませんが、ウェブ上に公開いたしますので、研究者や学生、産業人など必要な人々はだれでも容易に利用できます。また、日本光合成研究会の会員の方には、5月の連休明けに冊子をお届けする予定です。これを機会に、多くの方に、日本光合成研究会を紹介していただければ幸いです。

Low Temperature Science

低
温
科
学

光
合
成
研
究
法

低温科学
第 67 巻 ● ISSN 1880―7593 ● 2008 vol.67

光合成研究法北海道大学 低温科学研究所
INSTITUTE OF LOW TEMPERATURE SCIENCEHOKKAIDO UNIVERSITY, SAPPORO, JAPAN 060― 0819
http://www.lowtem.hokudai.ac.jp

2008 vol.67

北海道大学低温科学研究所・日本光合成研究会 共偏
Edited by Institute of Low Temperature Science, Hokkaido University and
The Japanese Association for Photosynthesis Research

09010081̲表紙.indd 1

09.3.21 11:25:18 AM「光合成研究法」の内容については、次項からの目次をご覧下さい。2009年度の日本光合成研究会会員で本書を希望される方には、「光合成研究法」を配布予定です。（無料または送料のみ負担）「光合成研究法」はウェブページでも公開されています。一括でダウンロードする（サイズは1 6 . 7
Mb）か、項目ごとにダウンロードすることが出来ます。それぞれのサイトは以下の通りです。
一括ダウンロード：http://www.lowtem.hokudai.ac.jp/LTS/index.html

項目ごとダウンロード：

http://eprints.lib.hokudai.ac.jp/bulletin/lowtemp/37

光合成研究 19 (1) 200938

光合成研究39

19 (1) 2009

光合成研究 19 (1) 2009

事務局からのお知らせ★日本光合成研究会新役員のお知らせ
平成2 1年1月付けで、池内昌彦（東京大学）新会長の下、新たな常任幹事として、沈建仁（岡山大学）、佐藤直樹（東京大学）、和田元（東京大学）、寺島一郎（東京大学）、増田建（東京大学）が就任しました。
★入会案内
本会へ入会を希望される方は、会費（個人会員年会費：￥1,500、賛助法人会員年会費：￥50,000）
を郵便振替（加入者名：日本光合成研究会、口座番号：00140-3-730290）にて送金の上、次ページの申し込み用紙、または電子メールにて、氏名、所属、住所、電話番号、ファックス番号、電子メール
アドレス、入会希望年を事務局までお知らせください。
★会費納入のお願い
光合成研究会は会員の皆様からの会費1,500円により成り立っております。しかし、残念ながら会費の滞納が多い状態が続いております。原因の一つは、皆様がご自身の会費納入状況を把握しにくいシ
ステムにあったかと思います。光合成研究会の会費徴収を適正化するために、いくつかのお願いがございます。まず、2003年以前の会費納入の義務を免除することをお認めください。滞納年がとびとびの方がおられて、事務局での管理が困難なためです。ご本人も未納の記憶がないと思われます。さらに今後は、5年の会費滞納者には個別に会費納入のお願いを差し上げます。お支払いいただけない場
合は、次年度は退会とさせていただき、自動的に5年以上の滞納者はおられなくなります。また5年未満の滞納年のある方には、会誌送付時に封筒に会費未納の判が押してあり、未納年が記されております。また、未納年がある場合、納められた会費は、最も古い未納年に充当させていただきます。納入
状況が虫食いになることを避けるためです。会費納入状況などにつきましては、ご遠慮なく事務局（shikanai@pmg.bot.kyoto-u.ac.jp）までお問い合わせください。会員の皆様のご理解とご協力をお願い
申し上げます。

記事募集
日本光合成研究会では、会誌に掲載する記事を会員の皆様より募集しています。募集する記事の項
目は以下の通りです。
○トピックス：光合成及び関連分野での纏まりのよいトピックス的な記事。
○解説：光合成に関連するテーマでの解説記事。
○研究紹介：最近の研究結果の紹介。特に、若手、博士研究員の方々からの投稿を期待しています。
○集会案内：研究会、セミナー等の案内。
○求人：博士研究員、専門技術員等の募集記事。
○新刊図書：光合成関係、または会員が執筆・編集した新刊図書の紹介。書評も歓迎いたします。
記事の掲載を希望される方は、会誌編集担当、増田（ctmasuda@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp) まで御連絡下さい。

40

光合成研究19 (1) 2009

日本光合成研究会会員入会申込書
平成

年

月

日

日本光合成研究会御中
私は日本光合成研究会の趣旨に賛同し、平成年より会員として入会を申し込みます。

[]内に会員名簿上での公開承諾項目に○印をつけてください[]

氏名（漢字）（必須）
氏名（ひらがな）
氏名（ローマ字）

[

] 所属

[

] 住所1
〒

[

] 住所2（自宅の方または会誌送付先が所属と異なる場合にのみ記入）〒[] TEL1[] TEL2 (必要な方のみ記入）

[

] FAX

[

] E-mail

個人会員年会費

1,500円

(会誌、研究会、ワークショップなどの案内を含む）

賛助法人会員年会費

50,000円(上記と会誌への広告料を含む）（振込予定日：平成年月日）（会員資格は１月１日〜１２月３１日を単位とします）＊複数年分の会費を先払いで振り込むことも可能です。その場合、通信欄に（何年度〜何年度分）とお書き下さい。
連絡先〒153-8902

東京都目黒区駒場3-8-1

東京大学 大学院総合文化研究科 広域科学専攻 生命環境科学系
池内・成川研究室内

日本光合成研究会

TEL: 03-5454-6641, FAX: 03-5454-4337
E-mail: photosyn@bio.c.u-tokyo.ac.jp
ホームページ: http://photosyn.c.u-tokyo.ac.jp

郵便振替口座加入者名：日本光合成研究会

口座番号：00140-3-730290

41光合成研究 19 (1) 2009

日本光合成研究会会則
第１条

名称

本会は日本光合成研究会（The Japanese Association for Photosynthesis Research）と称する。
第２条

目的

本会は光合成の基礎および応用分野の研究発展を促進し、研究者相互の交流を深めることを目的
とする。
第３条

事業

本会は前条の目的を達成するために、シンポジウム開催などの事業を行う。
第４条

会員

１．定義
本会の目的に賛同する個人は、登録手続を経て会員になることができる。また、団体、機関
は、賛助会員になることができる。
２．権利会員および賛助会員は、本会の通信および刊行物の配布を受けること、本会の主催する行事に参加することができる。会員は、会長を選挙すること、役員に選出されることができる。
３．会費
会員および賛助会員は本会の定めた年会費を納めなければならない。
第５条

組織および運営

１．役員
本会の運営のため、役員として会長１名、事務局長１名、会計監査１名、常任幹事若干名をおく。役員の任期は２年とする。会長、常任幹事は連続して二期を越えて再任されない。事務局長は五期を越えて再任されない。会計監査は再任されない。
２．幹事
幹事数名をおく。幹事の任期は４年とする。幹事の再任は妨げない。
３．常任幹事会
常任幹事会は会長と常任幹事から構成され、会長がこれを招集し議長となる。常任幹事会は本会の運営に係わる事項を審議し、これを幹事会に提案する。事務局長と会計監査は、オブザーバーとして常任幹事会に出席することができる。
４．幹事会
幹事会は役員と幹事から構成され、会長がこれを招集し議長となる。幹事会は、常任幹事会
が提案した本会の運営に係わる事項等を審議し、これを決定する。
５．事務局
事務局をおき、事務局長がこれを運営する。事務局は、本会の会計事務および名簿管理を行う。
６．役員および幹事の選出
会長は会員の直接選挙により会員から選出される。事務局長、会計監査、常任幹事は会長が幹事の中から指名し、委嘱する。幹事は常任幹事会によって推薦され、幹事会で決定され42

光合成研究19 (1) 2009

る。会員は幹事を常任幹事会に推薦することができる。
第６条

総会

１．総会は会長が招集し、出席会員をもって構成する。議長は出席会員から選出される。
２．幹事会は総会において次の事項を報告する。
１）前回の総会以後に幹事会で議決した事項
２）前年度の事業経過
３）当年度および来年度の事業計画
３．幹事会は総会において次の事項を報告あるいは提案し、承認を受ける。
１）会計に係わる事項
２）会則の変更
３）その他の重要事項
第７条

会計

本会の会計年度は１月１日から１２月３１日までとする。当該年度の経理状況は、総会に報告され、その承認を受ける。経理は、会計監査によって監査される。本会の経費は、会費および寄付金
による。

付則
第１

年会費は個人会員1,500円、賛助会員一口50,000円とする。

第２

本会則は、平成１４年６月１日から施行する。

第３

本会則施行後第一期の会長、事務局長、常任幹事にはそれぞれ、第５条に定める規定にかかわらず、平成１４年５月３１日現在の会長、事務局担当幹事、幹事が再任する。本会則施行後第一期の役員および幹事の任期は、平成１４年１２月３１日までとする。

日本光合成研究会の運営に関する申し合わせ
1. 幹事会：
幹事は光合成及びその関連分野の研究を行うグループの主催者である等、日本の光合成研究の発展に顕著な貢献をしている研究者とする。任期は4年とするが、原則として再任されるものとする。
2. 事務局：
事務局長の任期は2年とするが、本会の運営を円滑に行うため、約5期（10年）を目途に再任されることが望ましい。
3. 次期会長：
会長の引き継ぎを円滑に行うため、次期会長の選挙は任期の1年前に行う。
4. 常任幹事会：
常任幹事会の運営を円滑におこなうため、次期会長は常任幹事となる。

43

光合成研究 19 (1) 2009

幹事会名簿

浅田浩二 福山大学生命工学部

園池公毅 東京大学大学院新領域創成科学研究科

池内昌彦 東京大学大学院総合文化研究科

高市真一 日本医科大学生物学教室

池上勇 帝京大学薬学部

高橋裕一郎 岡山大学大学院自然科学研究科

泉井桂 近畿大学生物理工学部生物工学科

田中伊藤繁 名古屋大学大学院理学系研究科

都筑幹夫 東京薬科大学生命科学部

歩 北海道大学低温科学研究所

井上和仁 神奈川大学理学部

寺島一郎 東京大学大学院理学系研究科

臼田秀明 帝京大学医学部

徳富(宮尾)光恵

榎並

勲 東京理科大学理学部

農業生物資源研究所
光合成研究チーム

大岡宏造 大阪大学大学院理学研究科

豊島喜則 関西学院大学理工学部

大杉

南後

立 東京大学大学院農学生命科学研究科

太田啓之 東京工業大学

守 名古屋工業大学応用化学科

西田生郎 埼玉大学大学院理工学研究科

バイオ研究基盤支援総合センター

野口

巧 筑波大学大学院数理物質科学研究科

大政謙次 東京大学大学院農学生命科学研究科

長谷俊治 大阪大学蛋白質研究所

小川健一 岡山県生物科学総合研究所

林

小野高明 茨城大学工学部生体分子機能工学科

秀則 愛媛大学
無細胞生命科学工学研究センター

小俣達男 名古屋大学大学院生命農学研究科

原登志彦 北海道大学低温科学研究所

垣谷俊昭 名城大学理工学部教養教育/

彦坂幸毅 東北大学大学院生命科学研究科

総合学術研究科久堀

徹 東京工業大学資源化学研究所

金井龍二 埼玉大学（名誉教授）

檜山哲夫 埼玉大学理学部（名誉教授）

坂本

福澤秀哉 京都大学大学院生命科学研究科

亘 岡山大学資源生物科学研究所

櫻井英博 早稲田大学（名誉教授）

藤田祐一 名古屋大学大学院生命農学研究科

佐藤和彦 兵庫県立大学大学院生命理学研究科

前佐藤公行 岡山大学（名誉教授）

牧野周 東北大学大学院農学研究科

佐藤直樹 東京大学大学院総合文化研究科

増田

建 東京大学大学院総合文化研究科

佐藤文彦 京都大学大学院生命科学研究科

松浦克美 首都大学東京都市教養学部

鹿内利治 京都大学大学院理学研究科

三室

重岡

宮地重遠 海洋バイオテクノロジー研究所

成 近畿大学農学部

忠彦 東北大学大学院農学研究科

守 京都大学大学院地球環境学堂

島崎研一郎 九州大学大学院理学研究院

村田紀夫 基礎生物学研究所

嶋田敬三 首都大学東京都市教養学部

山本

沈

山谷知行 東北大学大学院農学研究科

建仁 岡山大学大学院自然科学研究科

杉浦昌弘 名古屋市立大学

横田明穂 奈良先端科学技術大学院大学

大学院システム自然科学研究科
杉田泰 岡山大学大学院自然科学研究科

バイオサイエンス研究科

護 名古屋大学遺伝子実験施設

和田

杉山達夫 中部大学生命健康科学研究所
鈴木祥弘 神奈川大学理学部

44

元 東京大学大学院総合文化研究科

光合成研究19 (1) 2009

編集後記
前任者の野口先生より引き継ぎ、今年より会誌編集を担当することになりました。池内会長の下、新体制になったのを機に、会誌の更なる充実を図っていきたいと考えています。一つの試みとして、もし会員の皆様からお認めいただければ、会誌の編集委員会を立ち上げたいと考えています。光合成に関連する、より広い分野からの記事の収集を図るとともに、若手の研究者や大学院生の記事に編集委員がピアレビューを行うことで、若手の論文執筆訓練の登竜門として会誌が機能するとともに、執筆者も査読付きの業績として生かすことができ、さらに内容のレベルアップが図れることを期待しています。会誌に関するご意見、ご要望などがありましたら、ctmasuda@mail.ecc.u-tokyo.ac.jpまでお寄せください。会員の皆様とともに、より良い会誌にしていきたいと考えております。さて新体制での第１号は、昨年の植物学会シンポジウム「初歩から最新までのタンパク質の結晶構造解析」の演者を中心とした解説の特集や「光合成研究法」出版のお知らせなど、いきなり盛り沢山の内容になりました。お楽しみいただけたでしょうか？
＜東京大学

増田

建＞

******************************************************************************************

日本光合成研究会 2008-2009年役員会長

池内昌彦（東京大学）

事務局

鹿内利治（京都大学）

常任幹事
常任幹事
常任幹事
常任幹事
常任幹事
常任幹事
常任幹事

沈 建仁（岡山大学）（日本光生物学協会）
和田 元（東京大学）（会誌担当）
増田 建（東京大学）（会誌担当）
佐藤直樹（東京大学）（ホームページ担当）
寺島一郎（東京大学）（企画担当）
高市真一（日本医科大学）（企画担当）
小川健一（岡山県生物科学総合研究所） （企画担当）

会計監査小池裕幸（中央大学）******************************************************************************************
光合成研究 第19巻 第1号 （通巻54号） 2009年4月30日発行

日

本

光

〒153-8902

合

成

研

究

会

東京都目黒区駒場3-8-1

東京大学 大学院総合文化研究科 広域科学専攻 生命環境科学系
池内・成川研究室内

日本光合成研究会

TEL: 03-5454-6641, FAX: 03-5454-4337
E-mail: photosyn@bio.c.u-tokyo.ac.jp
ホームページ: http://photosyn.c.u-tokyo.ac.jp
郵便振替口座加入者名：日本光合成研究会

口座番号：00140-3-730290

45