58

浦上財団研究報告書

Vol.26（2019）＜平成 28 年度助成＞

食中毒原因菌であるカンピロバクター属細菌に特異的な生育阻害剤の探索

大利徹（北海道大学大学院 工学研究院）

与する遺伝子（menF, menD, menC ）のオルソログ

１．研究目的が存在しないことを発見した。また Helicobacter 属
メナキノン（MK）は、人間にとって血液凝固に細 菌、Campylobacter 属 細 菌 に お い て も、 生 育 に必須なビタミン（ビタミン K）であり、また微生物MK が必要であるにもかかわらず、men 遺伝子のオにおいては呼吸の際の電子伝達系の補酵素として働ルソログが存在しなかった。これらの事実から、一き、生育に必須な物質である。その生合成は、大腸部の微生物では MK が新規の経路により生合成され菌や枯草菌においてはコリスミ酸から o -スクシニルている可能性が示唆された。そこで当研究室では、安息香酸（OSB）を経る経路で生合成されることがBLAST 解析により新規経路保有微生物にのみ存在す明らかにされている。しかし当研究室で、ゲノム解る遺伝子を選別し、さらに、それら候補遺伝子破壊

析が終了していたグラム陽性菌である放線菌の 2 株、株を用いて新規経路の解析を行った。その結果、生Streptomyces coelicolor および Streptomyces avermitilis

合成中間体としてフタロシンを経る新たな MK 生合のゲノムを精査したところ、呼吸鎖で MK を使うに成経路が明らかになり、フタロシン経路と命名したもかかわらず、o -スクシニル安息香酸の生合成に関（図１）。

図1

メナキノン生合成既知経路（左）とフタロシン経路（右）食中毒原因菌であるカンピロバクター属細菌に特異的な生育阻害剤の探索

59

ピロリ菌（Helicobacter pylori ）は、胃炎、胃潰瘍、育阻止円の形成の有無で判定した。LB 寒天培地に、十二指腸潰瘍、さらには胃癌の原因として知られ、被検菌を含む軟寒天を重層した二層からなる培地を人に悪影響を及ぼす細菌である。現在ピロリ菌に対用いた。軟寒天の上に、上記サンプルを染みこませし有効な抗生物質は存在するが、非特異的であるたた濾紙を置いて 30℃で一晩培養し、阻止円を観測めに、ピロリ菌だけでなく大腸菌や乳酸菌などの有した。

用な腸内細菌をも死滅させてしまい、服用者の腸内B. halodurans にのみ活性を示したサンプルについ環境が乱れることが問題となっている。また、夏場て、MK 添加による生育阻害回復アッセイを行った。

におけるカンピロバクター属細菌に起因する食品の選別されたサンプルがフタロシン経路を阻害してい微生物汚染は、毎年報道されているように依然大きる場合、経路の最終生産物である MK を添加すればな社会問題である。これらの予防・駆除には、原因菌の生育は回復すると考えられる。そこで液体培養

菌の増殖を特異的に抑える抗菌剤の開発が望まれで、菌体＋サンプル、および菌体＋サンプル＋ MKる。両病原菌はゲノム解析が終了しているが、そので試験し、後者で生育が回復したものを候補サンプ

ゲノム中に既知経路の生合成遺伝子である menF~Cルとした。

遺伝子オーソログが存在せず、フタロシン経路遺伝子群のオーソログを持つ。そのため、両株は新規フ

３．結果

タロシン経路により MK を合成していると推定される。従って、フタロシン経路のみを阻害する化合物

3-1．ペーパーディスクアッセイ結果

は、大腸菌や乳酸菌などの既知経路保持株を阻害せ放線菌とカビの培養液、3,200 サンプルについてずにピロリ菌のみ阻害できる特異的な抗生物質になペーパーディスクアッセイを行った結果、18 のヒッる可能性がある。そこで候補化合物を微生物培養液

トサンプルを得た。この中で、MK 添加によりクリに探索した。

アに生育が回復した No.SF2910 を選抜し、活性本体の精製を行った。

２．研究方法
3-2．活性化区分の単離・生成
当研究室では病原菌であるピロリ菌を扱うことがNo.SF2910 生産菌を 15 ml のシード培地（スターで き な い た め、 フ タ ロ シ ン 経 路 保 有 株 と し て

チ 2.5%, グルコース 2.0%, ポリペプトン 0.7%, 小麦

Bacillus halodurans を、 既 知 経 路 保 有 株 と し て

胚芽 0.6%, yeast extract 0.45%, soybean meal 0.3%,

Bacillus subtilis を用いて、フタロシン経路阻害剤を

Lab-Lemco powder〔Merck, Darmstadt, Germany〕

放線菌とカビの培養液に探索した。

0.3%, CaCO3 0.2%, pH 7.2, 100 mL フラスコ使用）
で 28 ℃、3 日間培養後、一部を 80 ml の生産培地

2-1．使用した菌株と培養条件（モルトシロップ 4.0%, soybean meal 2.0%, cotton

B. subtilis は Sigma-Aldrich の LB 培 地 を 用 い てseed meal 1.0%, sungrain F2 0.5%, 大 豆 油 0.3%,37℃で培養した。他方、B. halodurans は NaCl 2%

CaCO3 0.3%, FeSO4 0.001%, CoCl2 0.0001%, NiCl2（w/v）含有 LB を用いて 30℃で培養した。

0.0001%, pH 7.2, 500 mL フラスコ使用）に移植し、220 回転、28  ℃ で 5 日間培養した。培養後、遠心2-2．スクリーニング
微生物培養サンプル 50 ml をペーパーディスクに染み込ませ、バイオアッセイに用いた。
抗菌活性は、ペーパーディスクアッセイによる生機で菌体を除去後、上清を等量の酢酸エチルで 3 回抽出し、エバポレーターで濃縮した。少量のアセトニトリルで溶解後、逆相の HPLC で分離を行った（カラ ム : 関 東 Mightysil Aqua RP-18 column〔250 ×60

浦上財団研究報告書

図2Vol.26（2019）

チランダマイシンの構造4.6 mm〕; 移動相 : 0.1% ギ酸を含むアセトニトリル

今回、その候補としてチランダマイシンを単離・同37%; 流 速 : 1 ml /min; 検 出 190–400 nm）210 nm定した。予備的に、その作用機序を検討した結果、で検出されたピークを全て分画後、バイオアッセイ

MK の生合成上、ナフトキノン骨格形成後にプレニで活性区分を同定し、繰り返し分離を行うことで最ル側鎖を付加する酵素を阻害していると推定され終的に、淡い黄色の結晶 3.9mg を得た。

た。チランダマイシンの阻害活性は医薬品として開本化合物の分子式は、高分解能質量分析により発できるほど高くはなかったが、本スクリーニング

C22H27NO8 と推定された。次いで、NMR（ H と C）

法が目的化合物を取得可能であることを示せた点でと二次元 NMR（COSY, HSQC, HMBC）により、最終は意義のある成果と考えられる。

1

13的に既知化合物である、チランダマイシンと決定した（図２）。
同様の手法で、aplasmomycin と boromycin もフタロシン経路を阻害することを明らかにした。

謝辞
本研究は、公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団の援助を受けて実施しました。この場を借りて厚くお礼申し上げます。

４．考察
参考文献

本新規経路はピロリ・カンピロバクター菌等に特異的な経路であり、乳酸菌など有用な腸内細菌群は既知経路のみを有している。従って、ピロリ菌のように迅速な診断方法が確立されている病原菌であれば、この新規経路の阻害剤を探索することにより、副作用がない有用な抗生物質の開発が期待できる。

1) Y. Ogasawara, K. Kondo, A. Ikeda, R. Harada and T.
Dairi. Identification of tirandamycins as specificinhibitors of the futalosine pathway. J. Antibiot. 70,798-800 (2017).
2) Y. Shimizu, Y. Ogasawara, A. Matsumoto, and T. Dairi.
Aplasmomycin and boromycin are specific inhibitorsof the futalosine pathway. J Antibiot. doi: 10.1038/
s41429-018-0087-2 (2018).

Screening of compounds specifically inhibiting the new menaquinone biosynthetic pathway

61

Screening of compounds specifically inhibiting
the new menaquinone biosynthetic pathway
Tohru DAIRI
Graduate School of Engineering, Hokkaido University
Menaquinone (MK) is an essential compound, due to its role as an obligatorycomponent of the electron transfer pathway in microorganisms. In Escherichia
coli , MK has been shown to be derived from chorismate by eight enzymes,
designated as menA to H . However, we discovered that an alternative pathway,
which we named the futalosine pathway, operates in some microorganisms,
including Helicobacter pylori and Campyobacter jejuni , which cause gastriccarcinoma and food poisoning, respectively. Since both humans and some
useful intestinal bacteria, such as lactobacilli, possess the classical pathway,
and MK biosynthesis is essential for microorganism survival, the futalosine
pathway is an attractive target for the development of specific anti-H. pyloriand -C. jejuni drugs. In this study, we attempted to obtain such compounds
from the culture broth of actinobacteria and fungi.
As test organisms, we used two types of Bacillus strains, Bacillus subtilis andBacillus halo durans , which possess the classical and futalosine pathway,
respectively. Using a paper disk assay, we found that a culture broth of anact inobacterium specifically inhibited the g rowth of B. halodurans . After
purifying the active compound and determining its structure, we confirmed thatit consisted of tirandamycin A and B. Similarly, aplasmomycin and boromycin
were also shown to inhibit the futalosine pathway.