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QM/MM計算に基づいた一酸化窒素を還元する酵素活性部位の非調和振動解析
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理研・杉田理論分子科学，2理研・計算科学研究セ，3理研・生命機能科学研究セ○山田健太1，八木清1，杉田有治1,2,3

Anharmonic vibrational analysis on the active site of nitric-oxide reductase:a QM/MM study
1○Kenta Yamada1, Kiyoshi Yagi1, Yuji Sugita1,2,3
TMS, RIKEN, Japan; 2R-CCS, RIKEN, Japan; 3BDR, RIKEN, Japan【Abstract】We have developed a QM/MM module in a MD program, GENESIS, to perform
anharmonic vibrational analysis of large biological molecules by combining external QM
software and SINDO, a molecular vibrational program. Using this package, such an analysis
was applied to a nitric-oxide (NO)-bound state of cytochrome P450 NO reductase (P450nor).
P450nor is a heme-containing enzyme that catalyzes NO reduction in soil-dwelling fungi andyeast. The intermediate NO-bound state has a six-coordinate low-spin ferric (Fe3+) hemenitrosyl complex. QM/MM optimization and vibrational analysis were carried out for several
representative structures, prepared using MD simulations on the basis of X-ray crystal structure(PDBID: 5Y5H). We found the following: 1) hydration causes an increase in the N–O stretchingfrequency; 2) in the previous study, the contribution of anharmonicity to N–O stretchingvibration was overestimated; 3) N–O stretching frequency calculated here is higher than theexperimental value by about 100 cm–1.
【序】われわれは、QM/MM 計算に基づいた非調和振動解析を実施するために、汎用量子化学計算プログラム、および、分子振動解析プログラム SINDO[1]用のインターフェイスを分子動力学計算プログラム GENESIS[2]に組み込んだ[3]。このプログラムパッケージによる
QM/MM 計算の適用例として、これまでに広く研究されてきた生体分子の１つである、脱窒カビ一酸化窒素(NO)還元酵素 P450nor の NO 結合状態(Figure 1)[4]に対する計算を実施した。
Figure 1. Active site of P450nor
P450nor は、NO２分子を亜酸化窒素(N2O)に還元する and the surrounding protein and酵素である(2NO + NADH + H+ → N2O + NAD+ + H2O)。 water molecules in XtalW. Theseshown, respectively, in stick,
この還元反応の中間体である NO 結合状態では、活性 arecartoon, and sphere representations.
部位である ferric heme に NO１分子が配位している。通常、６配位 ferric heme–NO unit は∠Fe–N–O(θFe–N–O)≈180°（直線型）を示すが、結晶構造(PDBID: 5Y5H)によれば θFe–N–O=158°と屈曲しており(Figure 1)、この主因は軸配位子
Cys352 による強いトランス影響だと考えられている。また、溶液中と結晶での分光実験によって、NO 配位子の N–O 伸縮振動数はほぼ変化しないことが示されている[5]。
そこで、結晶構造、ならびに、溶液中の P450nor をモデリングした構造に対し、QM/MM 構造最適化と非調和振動解析を行い、それらの環境間における NO 配位子とCys352 の構造変化、それに伴う N–O と Fe–NO 伸縮振動数の変化を調査した。

【計算方法】結晶構造、水和した結晶構造、そして NVT 計算のトラジェクトリから５つの代表構造を取り出し、それぞれ XtalV, XtalW, NVT1-5 とした。これらを求める
MD 計算には CHARMM36 力場[6]を用いたが、NO 配位子とその配位によって生じるFe–NO 結合伸縮項などの力場パラメータは存在しない。そのため、既存研究で提案されたパラメータや結晶構造に基づいて作成したパラメータを使用した[3, 7]。
QM 領域を、ferric heme–NO unit と軸配位子 Cys352 の側鎖に選び（QM 原子数は79）、その他は MM 領域とした（全 MM 原子数は 123,286）。構造最適化計算では、NOligand から 20 Å 以上離れた水分子の座標を固定した（固定する MM 原子数は 115,914）。
QM 計算は、B3LYP 汎関数と D3(BJ)分散力を用いた。基底関数は全電子基底 def2svpを採用し、Fe 原子に配位する N、S 原子と NO 配位子の O 原子には diffuse 関数を加えた（基底関数の数は 892）。この計算の実行には、Gaussian09 プログラム[8]を使用した。MM 計算には、MD 計算と同じ力場を使った。Cys352 の Cβ–Cα 結合間の QM—MM境界領域では、QM 領域の Cβ 原子にはリンク H 原子を付加し、MM 領域の Cα 原子を含むグループ内のすべての原子電荷は 0.0 とした。
Macro/micro-iteration scheme によって求めた QM/MM 最適化構造を用い、heme のFe 原子、Cys352 の S 原子、NO 配位子の N、O 両原子の４原子に対して基準振動解析を実施した。その後、全１２振動モードから S 原子に大きく関わる３つのモードを除く９モードに対して 3MR-QFF と 1MR-grid ポテンシャルをつくり、VQDPT2 計算によって、非調和振動数を求めた。
Table 1. Typical structural parameters and stretchingfrequencies of the P450nor active site from QM/MM
calculations, together with the experimental results.
QM/MM (Closed-shell 1et)Exptl.
XtalVXtalW
NVT2
rFe–NOa
1.680
1.672
1.665
1.67
arN–O
1.146
1.143
1.140
1.15
rFe–Sa
2.287
2.301
2.296
2.33
b
θFe–N–O
155.7
158.3
161.9
158c
ωN–O
1946.2
1967.6
1988.9–νN–Od1913.4
1932.1
1956.81853
ωFe–NOc
605.1
607.2
614.9–
νFe–NOd
587.7
585.6
596.2
530

【結果・考察】Table 1 に QM/MM 計算によって求めた、代表的な構造パラメータと振動数をまとめた。結晶構造から、水和によるタンパク質構造の緩和を考慮すると、NO 配位様式が直線型に近づいた。それに対応して、νN–O とνFe–NO は高くなった。これは Cys352 によるトランス影響が、水和により弱まったためだと考えられる。非調和と調和振動数の比(νN–O/ωN–O)はおよそ 0.983であり、既存研究において非調和振動数を見積もるために使われた比 0.9614は、この振動の非調和性を過大評価す aBond lengths in Å. bBond angles in degree. cHarmonicる結果を与えることが分かった。
frequencies in cm–1. dVQDPT2 frequencies in cm–1.
計算で求めた νN–O には、実験結果と異なり、結晶と溶液中の間に 20–70 cm–1 の差が存在した。また、NVT1-5 では実験値
より 100 cm–1 程度高くなった。XtalW より NVT1-5 において水和の効果が強くなる一因として、NVT 計算によって ferric heme–NO unit の位置が変化することが考えられる。結果ならびに考察の詳細は当日発表する。
【参考文献】[1] Yagi, K., Mol Sci 2016, 10, A0085. [2] Jung, J.; Mori, T., et al., WIREs Comput Mol Sci 2015, 5, 310. [3]Yagi, K.; Yamada, K.; Sugita, Y., To be submitted. [4] (a) Obayashi, E., et al., J Am Chem Soc 1998, 120,12964.; (b) Riplinger, C., et al., Chem Eur J 2014, 20, 1602.; (c) Goodrich, L. E., et al., Inorg Chem 2010,49, 6293. [5] (a) Obayashi, E., et al., J Am Chem Soc 1997, 119, 7807; (b) Tosha, T., et al., Nat Commun
2017, 8, 1585. [6] Best, R. B., et al., J Chem Theory Comput 2012, 8, 3257. [7] (a) Meuwly, M., et al.,Biophys Chem 2002, 98, 183.; (b) Mishra, S., et al., Biophys J 2009, 96, 2105 [8] Frisch, M. J., et al.,Gaussian 09 Rev. D.01, Gaussian Inc., Wallingford, CT, 2009.