雑穀の穀粒における鉄、亜鉛のミネラル含有に対する生体キレーター
ムギネ酸類とニコチアナミンの貢献を明らかにする37＜平成 28 年度助成＞

雑穀の穀粒における鉄、亜鉛のミネラル含有に対する生体キレーター
ムギネ酸類とニコチアナミンの貢献を明らかにする
中西玲子（東京大学大学院 農学生命科学研究科）の鉄の長距離輸送にも重要な役割を持つ。そして、背景と目的

ムギネ酸類の生合成前駆体であるニコチアナミンも鉄と亜鉛は哺乳動物にも高等植物にも必須の金属金属のキレーターであり、二価鉄、亜鉛、マンガン、元素である。イネ科作物の間では穀粒に蓄積してい銅の種子への輸送時に機能している。日本食品標準る金属の量が異なることは、食品栄養の観点からは成分表（七訂）によると、雑穀である精白粒ヒエとよく知られている。しかし、主要穀物（イネ、トウ

精白粒アワは精白米に比べ、鉄を 2 ～ 6 倍、亜鉛を 1.6

モロコシ、ソルガム、オオムギ）以外の雑穀の種子～ 1.8 倍含有する。一方、精白粒ハトムギは精白米への金属動態に関する知見は少ない。イネ科植物がより鉄も亜鉛も含有量が少ない。鉄や亜鉛の吸収や合成するムギネ酸類は、三価鉄などの重金属のキ体内移行に必要なムギネ酸類とニコチアナミンにおレーターである。鉄は土壌中には豊富に存在していける差が、これらの含有量の差につながっている可るが、酸化的な環境では三価の不溶態となり可溶性能性が高い。そこで本研究では、アワ、ヒエ、ハトの形ではほとんど存在しない。イネ科植物は、根かムギといったイネ科雑穀の穀粒での、鉄と亜鉛の集らムギネ酸類を分泌することで土壌中に不溶化した積におけるニコチアナミンやムギネ酸類の貢献度を鉄を「三価鉄−ムギネ酸類」の複合体として可溶化明らかにすることを目的とし、生合成されるムギネし、それを根の細胞内へと取り込む。これまでに 9酸類を同定し、アワにおいては鉄欠乏条件における種のムギネ酸類が同定された（図１）。ムギネ酸類

ムギネ酸類やニコチアナミンの含有量と、それらのの合成と分泌は鉄欠乏によって大きく誘導される。

生合成遺伝子の発現との相関を調べた。

さらにムギネ酸類は、植物体内での葉や種子などへ

図１

ムギネ酸類の生合成経路
これまでに同定されているムギネ酸類 9 種のうち、7 種の構造を示した。NAS、ニコチアナミン合成酵素：NAAT、ニコチアナミン・アミノ基転移酵素：DMAS、デオキシムギネ酸合成酵素：IDS2 と IDS3、ムギネ酸類水酸化酵素。

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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）

アワ、ヒエ、ハトムギにおけるDMA から AVA へ変換する酵素は未だ同定されてい分泌ムギネ酸類の同定ない（図１）。

水耕栽培で十分な大きさに育てた植物を、1 週間鉄栄養のみを除いた水耕液で育てることで鉄欠乏ス

アワのムギネ酸類合成酵素遺伝子群の鉄欠乏ストレスによる発現変動トレスを与えた。そして日の出前後 4 時間の根の分泌物を回収した。根からの分泌物をイオン交換樹脂

アワのゲノム配列情報はすでに公開されている。

で精製・濃縮し、HPLC 分析を行った。アワでは、ムギネ酸類合成に重要なニコチアナミン合成酵素

ムギネ酸（MA）、デオキシムギネ酸（DMA）に加え、（NAS）、ニコチアナミン・アミノ基転移酵素（NAAT）、アベニン酸 A（AVA）が、55％、44％、1％未満存デオキシムギネ酸合成酵素（DMAS）のいずれにつ在した（図 2）。ハトムギでは、主に MA が分泌されいても、既知のムギネ酸類合成に関わる酵素（図 1）ていた（図 3A）。しかしヒエにおいては、未知のピーの遺伝子とホモロジーの高いものが存在した。鉄欠

クが主であった（図 3B）。このピークが出現する位

乏 1 日目、4 日目、6 日目、10 日目の経時的なサン置から、ヒドロキシムギネ酸（HMA）かヒドロキシプルから RNA を抽出し、各遺伝子の発現変化を定量デオキシムギネ酸（HDMA）であることが推定され、PCR 法により測定した。２つの NAS 遺伝子、NAAT

ミナトカモジグサの根分泌物と同時に HPLC 測定を遺伝子、DMAS 遺伝子は、根でも地上部でも鉄欠乏行うことで、HDMA であることが確認された（図によって強く発現誘導を受け、鉄欠乏処理 1 日目か3C）。

ら発現が増加し、10 日目までこの発現上昇は続いた。

ムギネ酸類の測定結果から、アワとハトムギには、この発現様式は、イネとよく似ており、トウモロコオオムギのみから同定されているムギネ酸類水酸化

シとは異なっていた。イネもトウモロコシもムギネ

酵素 IDS3 と相同な遺伝子があると予想された（図酸類として DMA しか合成しないが、イネやムギ類１）。また、ヒエでは鉄欠乏下で働く IDS2 様の水酸は C3 型の光合成を行い、トウモロコシ、アワ、ヒ化酵素遺伝子が存在するはずであるが、エピ体はほエ、ハトムギはいずれも C4 光合成機構を持つ。イぼ合成しない酵素であるようだ。AVA はエンバクに

ネ科植物に共通のムギネ酸類を利用した鉄獲得機構おける主要ムギネ酸類として初めて同定されたが、は、光合成機構が分離する以前に確立したと推測す

図２

図３

鉄欠乏アワの根分泌物の同定
A. 通常の HPLC 解析（上段）と次亜塩素酸（ハイポ）添加なしのときの分析（下段）の結果。ハイポを添加しないときにはピークが現れないことで、ムギネ酸類であることが確認できる。ピーク 1から 3 はムギネ酸類と推測された。B. ムギネ酸類と思われるピーク部分の拡大（左上）。同じサンプルに各標準化合物を添加（+MA、+DMA、+AVA）した場合、3 つのピークの比率が変わり、ピーク
1 は MA、2 は DMA、3 は AVA と同定された。

鉄欠乏ハトムギと鉄欠乏ヒエの根分泌物の同定
A. ハトムギの根分泌物の HPLC 分析。矢印で示したピークが MA と同定された。B と C. ヒエの根分泌物の HPLC 分析。B. ピーク 2 はDMA と同定された。C. 鉄欠乏ミナトカモジグサが分泌するムギネ酸類は epiHDMA、HDMA、DMA である（下段のピークの左から）。
ヒエとミナトカモジグサの根分泌物のサンプルを同量混ぜると、ピーク 1 が増加した（中段）ので、ピーク 1 は HDMA と同定された。

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図４

アワの IDS3-like 遺伝子の鉄欠乏における発現変化
オオムギのムギネ酸類水酸化酵素 IDS3 に相同な遺伝子３つに IDS3like1~3 と名付け、地上部と根における発現変化を定量 PCR で調べた。発現量は、コントロール区の地上部 1 日目における発現量を１とした相対値で表した。IDS3-like1 は根では経時的な発現上昇をしているが、地上部では鉄欠乏処理 10 日目以前はあまり誘導が顕著でない。

図５39

HPLC によるアワの内生ムギネ酸類の検出
１、MA； 2、HAVA と推定（未同定）； 3、DMA； 4、AVA。
コントロール区の葉と根には、HAVA らしきピークが見られる。
右に予想される合成経路を表した。

や葉ではニコチアナミンを検出できなかった。鉄欠乏条件ではムギネ酸類合成遺伝子群の発現上昇に付ると、アワとトウモロコシのムギネ酸類合成におけ随して、ムギネ酸類合成が盛んとなり積極的にニコる遺伝子制御の差は、光合成機構が分離した後に生チアナミンが消費されたと考えられる。ムギネ酸類じたことになり、非常に興味深い。の測定では、根分泌物にあった MA、DMA、AVA に

ア ワ の IDS3 様 遺 伝 子 の 3 種 に つ い て も 遺 伝 子

加え、MA のごく近傍にピークが増加した（図 5）。

発現解析を行い、タンパク質配列が最も近い IDS3-それぞれの存在比にはサンプル間で顕著に差があ

like1 遺伝子が NAS 遺伝子などと同様に、根で鉄欠り、新規のピークはコントロール区の葉と根で顕著乏により経時的に強く発現誘導を受けることを確認に存在した。新しく出現したピークは、その位置かした（図 4）。しかし、この IDS3-like1 の葉におけらヒドロキシアベニン酸（HAVA）と考えられた。

る発現誘導は非常に弱かったことから、アワにおけこれら 3 つのピークが重なった状態を改善できな

る MA 合成は主に根で起こると想定された。

かったため、MA と DMA も定量ができなかった。

IDS3-like1 がコードするタンパク質が MA 合成をアワの内生ムギネ酸類とニコチアナミン量行うとすると、アワでの MA 合成は鉄欠乏の根で顕著で、鉄欠乏の葉では少ないと考えられる。内生ム鉄欠乏区と鉄十分のコントロール区の、若い葉とギネ酸類の分析では、鉄欠乏の若い葉では DMA が根における内生ムギネ酸類とニコチアナミン量の定MA よりも多く存在し、根では MA が DMA よりも量を行った。熱水で抽出した抽出液を根分泌物と同多く存在していたので、やはり鉄欠乏の葉では MA様に精製・濃縮処理をした後、HPLC 分析を行った。

合成はあまりされないようだ。また、コントロールムギネ酸類の前駆体であるニコチアナミンは、コン区の葉では MA は見られず、HAVA と思われる未知

トロール区の根では 3.9 ± 0.2 nmol/g FW で、葉での物質が主であった。今後、これらの 4 種のピークは 58.8 ± 4.6 nmol/g FW 存在した。鉄欠乏区の根を分離するように改善することに加え、アワにおけ40

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る AVA の合成に関わる酵素を明らかにしていきたい。
アワ穀粒内におけるムギネ酸類やニコチアナミンの分析も試みたが、現在までのところ成功していない。

まとめ
穀粒への鉄や亜鉛の蓄積は、植物が根から吸収した鉄イオン、亜鉛イオンがイオン状態を保ちながら種子へと輸送された結果である。イネ科植物では生体キレート物質として、ムギネ酸類とその前駆体であるニコチアナミンが、重金属イオンの種子への輸送に不可欠である。鉄欠乏ストレスを与えた植物では、ニコチアナミンとムギネ酸類の合成が特に顕著に増加するが、通常の栽培条件の植物でも体内での鉄の欲求性が高まると合成の増加が起こり、必要なだけの鉄が根圏から吸収され、運ばれる。種子が形成される際の鉄の欲求性と鉄欠乏時の遺伝子発現には相関がある。本研究では鉄欠乏条件の遺伝子変化を指標に、アワのムギネ酸合成酵素を探索した。アワでは複数のムギネ酸類の存在が明らかになった。
今後、これらを合成するムギネ酸類水酸化酵素や開環酵素の解明が、アワ、ヒエ、ハトムギの穀粒に蓄積される鉄や亜鉛の量差を解明するために重要となるだろう。

Vol.25（2018）

謝辞
研究を遂行するにあたり、多大なご支援を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼申し上げます。

Contribution of Mugineic Acid Family Phytosiderophores andNicotianamine to Iron and Zinc Storage in Grains of Millet Species

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Contribution of Mugineic Acid Family Phytosiderophores andNicotianamine to Iron and Zinc Storage in Grains of Millet Species
Reiko Nakanishi
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo
Graminaceous plants utilize mugineic acid family phytosiderophores (MAs)and nicotianamine (NA) for the transport of heavy metals, such as uptake
from soil of iron (Fe) and zinc (Zn), as well as their translocation inside theplant body. Foxtail millet and Japanese barnyard millet contain more Fe andZn in their polished grains than rice, while pearl barley contains less of bothmetals. Accordingly, in this study, foxtail millet, Japanese barnyard millet,and pearl barley were used to elucidate the contribution of MAs and NA in
Fe and Zn uptake, translocation, and storage in millet grains. First, varietiesof MAs secreted from roots were determined using Fe-deficient plants byHPLC. Foxtail millet secreted MA, deoxymugineic acid (DMA), and avenic acid
A (AVA), while Japanese barnyard millet secreted hydroxy-deoxymugineic
acid and DMA. Only MA was secreted from the roots of pearl barley. Gene
expression of the predicted genes, including NA synthase, NA aminotransferase,and DMA synthase was strongly induced by Fe deficiencies in both the roots
and shoots of foxtail millet. On the other hand, a gene similar to barley IDS3 ,whose product converts DMA into MA, was strongly induced in roots but not
in shoots, indicating that the synthesis of MA in foxtail millet is limited inroots. Endogenous MAs in roots and young leaves of control and Fe-deficient
foxtail millet showed that it may utilize four types of MAs inside the plant body.
Further investigation to identify the genes for AVA synthesis and MAs synthesis
in millet species is necessary to clarify differences in metal accumulation.