口腔内及び食品関連有害細菌に対するハーブ・スパイス抽出物のバイオフィルム殺菌活性
塚谷忠之 *1

坂田文彦 *1

黒田理恵子 *1 赤尾哲之 *2

Biofilm Eradication Activity of Herb and Spice Extracts Alone and in Combination
Against Oral and Food-Borne Pathogenic Bacteria
Tadayuki Tsukatani, Fumihiko Sakata, Rieko Kuroda, Tetsuyuki Akao

微生物が産生するバイオフィルムは，う蝕や歯周病などの感染症，食品変敗，食中毒の大きな要因となっている。
そこで，本研究では新たに開発したバイオフィルム殺菌活性スクリーニング法を用いて，104種類のハーブ及びスパイスのエタノール抽出液から口腔細菌（う蝕菌，歯周病菌）及び食中毒菌（大腸菌，黄色ブドウ球菌）が産生するバイオフィルムに対して殺菌活性を有する素材の選抜を試みた。その結果，クローブとユーカリ，あるいはクローブとローズマリーのエタノール抽出液を併用することで，相加的あるいは相乗的殺菌効果により口腔細菌及び食中毒菌産生バイオフィルムの制御が可能であることが明らかとなった。クローブ，ユーカリ，ローズマリーの主要活性成分はそれぞれオイゲノール，マクロカルパール類，カルノシン酸と推定された。

1 はじめにインキュベーションし，96ピンへバイオフィルムを形バイオフィルムとは，微生物が菌体外に多糖類を中成させた。バイオフィルム産生菌として，大腸菌心とする成分を産生することで固体表面に付着して堆Escherichia

coli

積し，除去しにくい固まりの状態になった微生物の集Porphyromonas gingivalis JCM12257 ， 黄 色 ブ ド ウ 球合体のことである。バイオフィルムは，虫歯や歯周病

菌 Staphylococcusなどの口腔内疾病の大きな要因となっている。また，

Streptococcus mutans NBRC13955を用いた。

食品業界でも食品の変敗や食中毒を防止するためにバ2-2 バイオフィルム殺菌活性の測定

NBRC15034 ， 歯 周 病 菌aureus

NBRC13276 ， う 蝕 菌

イオフィルムの制御は大きな課題となっている。このミュラーヒントンブロス(MHB)190 μl及びエタノーため，特に安全性の高い食材から抗バイオフィルム素ル抽出液10 μlを分注した96ウェルマイクロプレート材を探索する研究が活発化している。

へ，バイオフィルムを形成させた96ピンマイクロプレ

そこ で， 本研 究で は96ピン マイ クロ プレ ート （フート（フタ）を被せ，20時間インキュベーションした。

タ）へのバイオフィルム形成法と水溶性テトラゾリウ

さらに，96ピンに形成させたバイオフィルムを滅菌生

ム塩WSTを用いた微生物検出法を組み合わせたバイオ理食塩水で3回洗浄後，WST検出試薬含有MHBへ移し，フィルム殺菌活性スクリーニング法を使用して，ハー一定時間反応させた。2～5時間反応後，マイクロプレブ及びスパイスのエタノール抽出液からバイオフィルート リー ダを 用い て受 けプ レー トの 吸光 度測 定 (460

ム殺菌活性を有する素材の探索を行った。

nm)を行った。阻害率はコントロールの吸光度に対するサンプルの吸光度の比から求めた。阻害率99%以上

2 研究，実験方法

をバイオフィルム殺菌活性ありと判定した。また，阻

2-1 バイオフィルムの形成

害率99 %以上を示す被検試料の最小濃度を最小バイオ96ウェルマイクロプレートへバイオフィルム形成用フィルム殺菌濃度（MBEC）とした。

培地で調製した微生物懸濁液を分注し，これに96ピン

2-3 併用効果

マイクロプレート（フタ）を被せて37 ℃で一定時間

併用効果は Fractional Inhibition Concentration(FIC) index を用いて算出した。FIC は，相乗：≤0.5，相 加 ： >0.5 ， 1.0< ， 不 関 ： ≥1.0 ， 4.0< ， 拮 抗 ： ≥4.0

*1 生物食品研究所*2 株式会社久留米リサーチ・パークと定義した。
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3 結果と考察

3-3 ハーブ及びスパイス成分の最小バイオフィルム殺菌3-1 バイオフィルム殺菌活性を有するハーブ及びスパイ濃度

スの探索

クローブ，ユーカリ，ローズマリーの代表的なエタ

ハーブ及びスパイスのエタノール抽出液104種類を

ノール可溶性抗菌成分であるオイゲノール，マクロカ

本スクリーニング法へ適用し，大腸菌，歯周病菌，黄ルパール類，カルノシン酸の最小バイオフィルム殺菌色ブドウ球菌，う蝕菌産生バイオフィルムに対する殺濃度(MBEC)を表3に示す。オイゲノールは大腸菌及び菌活性を測定した。4菌株のうち1菌株以上に対して殺歯周病菌へ活性を示した。マクロカルパール類及びカ菌活性（99 %以上）を示したハーブ・スパイスは18種

ルノシン酸は，歯周病菌，黄色ブドウ球菌，う蝕菌へ類であった。このなかで，クローブは大腸菌，歯周病活性を示した。

菌，う蝕菌のバイオフィルムに対して，ユーカリは歯周病菌，黄色ブドウ球菌，う蝕菌のバイオフィルムに

表3 ハーブ及びスパイス成分の最小バイオフィルム

対して，ローズマリーは歯周病菌及びう蝕菌のバイオ殺菌濃度フィルムに対して99 %以上の殺菌活性を示した。しか活性成分

大腸菌

歯周病菌

黄色ブドウ球菌う蝕菌

クローブ

し，4菌株すべてのバイオフィルムに殺菌活性を有す

オイゲノールるハーブ・スパイスは得られなかった。

ユーカリ

3-2 ハーブ・スパイスの併用によるバイオフィルム制御

マクロカルパールA
マクロカルパールB
マクロカルパールC

そこで，大腸菌，歯周病菌，黄色ブドウ球菌，う蝕800

800>800>800>8006.255025>8003.1255050>80012.550400>80025200

ローズマリー

菌の産生バイオフィルムに対して，クローブとユーカ

カルノシン酸リ，あるいはクローブとローズマリーのエタノール抽

12.5(μg/ml)

出液の併用効果を検討した。表1に示すように，クローブとユーカリの併用では，歯周病菌のFIC=0.38，うさらに，4菌株に対するオイゲノールとマクロカル蝕菌のFIC=0.50であり，相乗効果を示した。大腸菌及パール類，あるいはオイゲノールとカルノシン酸の併

び黄色ブドウ球菌に対するFICは0.5～1.0であり，相用効果を調べた（データ未掲載）。オイゲノールとマ加効果を示した。

クロカルパール類の併用では，歯周病菌及びう蝕菌に相乗効果，大腸菌及び黄色ブドウ球菌に相加効果を示

表1

クローブとユーカリ抽出液の併用効果した。一方，オイゲノールとカルノシン酸の併用では，いずれの菌株についても相加効果を示した。この結果

クローブ

ユーカリ

MBEC
(μg/ml)MBEC(μg/ml)MBEC(μg/ml)FIC

併用効果

は，表1及び2のエタノール抽出液の結果と一致してお大腸菌

871

>1572

435.5 /786

>0.5 and <1.0

相加り，クローブ，ユーカリ，ローズマリーの主要活性成

歯周病菌

435.5

49.1

54.4 / 12.3

0.38

相乗

黄色ブドウ球菌

>1742

393

108.9 / 196.5 >0.5 and <1.0

相加う蝕菌

871393217.8 / 98.3

相乗バイオフィルム
産生菌

クローブとユーカリの併用

0.50

分はそれぞれオイゲノール，マクロカルパール類，カルノシン酸と推定された。

一方，クローブとローズマリーの併用では，いずれ4 まとめも菌株に対しても FIC は 0.5～1.0 であり，相加効果クローブ（オイゲノール）とユーカリ（マクロカルを示した（表 2）。

パール類），あるいはローズマリー（カルノシン酸）の併用は，幅広い菌種のバイオフィルム制御に有効で

表2クローブとローズマリー抽出液の併用効果あることが明らかとなった。

クローブ

ローズマリー

MBEC(μg/ml)

MBEC(μg/ml)

MBEC(μg/ml)

FIC

併用効果

大腸菌

871

>1564

435.5 / 782>0.5 and <1.0相加

歯周病菌

435.5

195.5

217.8 / 6.1>0.5 and <1.0相加

黄色ブドウ球菌

>1742

1564

871 / 782

>0.5 and <1.0相加

う蝕菌

871

97.8

435.5 /1.50.52

相加

バイオフィルム
産生菌

クローブとローズマリーの併用

5 掲載論文Current Microbiology, Vol. 77, No. 9, pp. 24862495 (2020)- 30 -