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温度数 K の色素分子の３次元イメージング技術の設計と実現
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東工大院 理工 ・京大院 医 ・東工大院 生命理工 ・東医歯大 生材研112311○虎谷 泰靖 ・丸尾 美奈子 ・稲川 博敬 ・喜井 勲 ・林 宣広 ・細谷 孝充・松下 道雄 ・藤芳 暁
1Single-molecule fluorescence imaging of three-dimensional localization of dye molecules at 1.5 K.
1Graduate School of Science and Technology, Tokyo Tech・2Graduate School of Medicine, Kyoto University・3Graduate School of Bioscienceand Biotechnology, Tokyo Tech・4Institute of Biomaterial and Bioengineering, Tokyo Medical and Dental University○Y. Toratani1・M. Maruo1・H. Inagawa1・I. Kii2・N. Hayashi3・T. Hosoya4・M. Matsushita1・S. Fujiyoshi1
生化学的手法の発達により、タンパク質選択的で、高効率な細胞内色素修飾法が提案されている[1]。これを用いれば、複合体形成をする複数のタンパク質に異なる色の色素を修飾したり、１つのタンパク質の観測したい部位に複数の色素を修飾したりできる。もし、光学顕微鏡によって修飾した色素同士の相対位置を数 nm の精度で 1 分子決定すれば、細胞内におけるタンパク質̶タンパク質間の複合体の形成課程や、タンパク質自身の立体構造の多様性を１分子レベルで観測することが可能になるはずである。しかし、原理的には色素同士の位置を数 nm の精度で決定できるが、色素によるタンパク質の立体構造の１分子観察には誰も成功していない。光学原理から、限界性能を持つ対物レンズを用いても、得られる色素 1 分子の可視蛍光スポットは、図 1 のような、有限の幅(Γ = 500 nm)を持つ。タンパク質の大きさが数 nm であるので、可視光を使って、タンパク質の立体構造の 1 分子観測は不可能のように思えるが、スポットを綺麗に測定すれば、その重心σは、Γよりもはるかに高い精度で決定できる[2]。よって、それぞれの色素の重心を 1 分子ごとに決定することで、タンパク質の立体構造の 1 分子観測が可能になる。例えば、複合体形成する２つのタンパク質のそれぞれに、色の異なる色素を一つずつ修飾する。励起波長を選択ことで片方ずつ光らせると、図 1 のように、２つの輝点が見えるはずである。その相対位置を決定することで、タンパク質の複合体構造が 1 分子観察できるはずである。このような実験の提案は、1999 年に S. Weiss の総説[3]で提案されているが、実現していない。
実現が困難なのは、（１）タンパク質およびその複合体の立体構造を知るには、3 次元情報の取得が必要である
ことと（２）3 次元方向に対して数 nm の精度を得るためには長時間の積算時間が必要なため、分子を固定する必要があることに由来する。我々はこれら２つの条件を満たす方法として、温度数 K における色素分子の 3 次元イメージング技術の開発をおこなっている。試料は、数 K に凍結することで固定する。また、顕微鏡において最も重要な部品である試料と対物レンズの機械的ドリフトを 1 nm 以下に抑えることに成功している[4]。さらに、
数 K に凍結することで色素の光退色が抑えられるため、数時間にわたり 1 分子の測定を続けることが可能になる。
一方、これまで我々が開発した顕微鏡[5,6]では、焦平面方向 xs, ys（図 2 参照）の情報しか得られない。
そこで、図 2 のような数 K の 3 次元レーザー走査型の蛍光顕微鏡を新たに開発したので報告する。開発した顕微鏡は多色解析を可能にするために、反射光学系で構成されている。
図 2A の左および中央のように、原点に集光した光を 2 次元方向に走査するには、入射する角度Δθを変えれば良い。光学の原理から、対物レンズの焦点をfobj とすると、光の焦点は、Δxs = fobjΔθx（Δys = fobjΔθ y）の位置に移動する。この時、θが変わっても対物レンズの瞳位置（2 個の赤丸で表す）をレーザービームが通るようにする必要がある。一方、zs 走査する場合には、図 2A 右のように、瞳位置におけるビームの直径を変えずに、レーザー光の広がり角を変化させる必要がある。これを実現するため、新しい顕微鏡（図 2B）では、CM1〜CM4 の４枚の球面鏡を用いた。4 枚の球面鏡以外は、これまでに開発した反射型共焦点顕微鏡の設計を踏襲している[5,6]。
CM1〜CM3 は同じ焦点距離 fCM (= 125 mm)のものを用いた。CM4 の焦点距離 fCM4 は任意である。実際の実験では fCM4 = 2fCM とした。対物レンズ-CM1間の距離を 2fCM、CM1-CM2 間を 2fCM、CM2-CM3間を fCM +fobj、CM3-CM4 間を fCM +fCM4 に配置する。
この配置で CM4 と M1 を同時に zCM 方向へ動かすと、
2Δzs = ΔzCM・(fobj / fCM)という関係で、焦点がΔzs 移動する。また、CM2 をxCM またはｙCM 方向に移動すると、

Δxs = ΔxCM・(fobj+ Δzs) / fobj,
Δys = ΔyCM・(fobj+ Δzs) / fobjと、焦点がΔxs またはΔys 移動する。この３次元レーザー走査機構を量子ドット Qdot705 の 1 分子イメージングにより実証した。
Qdot705 は、検査に用いた波長 405、532、635nm の励起光を全て吸収し、波長 700 nm で発光する。図 3 は、1 個の Qdot705 の 3 次元発光イメー
ジである。また、同様のイメージを zs = ̶3 μm から 3 μm まで 1 μm 間隔で測定し、フィティングにより第一暗環半径 R1st と z プロファイルの半値全幅Γz[7]を求めた。それぞれ、製作した光学顕微鏡のxy 方向の分解能、z 方向の分解能に対応する。これ
らの実験値を、光学設計ソフト Zemax により計算した反射対物レンズ単体の 3 次元の点像分布関数と比較した。その結果（表 1）、最もズレが大きい波長 405nm でも、光学シミュレーションからのズレが 10%以内であり、ほぼ理想的な３次元走査が実現した。
励起光に 532 nm と 635 nm を用いた場合の位置決定精度の見積もりをおこなった。Qdot705 はどちらの波長も吸収するために、装置の機械的揺れや、有限の信号ノイズ比から来る偶発誤差がなければ、2波長で観測されるスポットは一致するはずである。
つまり、２つのスポットの位置ズレの分布が、位置決定精度に対応する。
3 次元位置決定では、測定する軸以外は原点に止めて測定した。例えば、zs に対して蛍光強度を測定する
時には、 xs = ys = 0 μm とした。図 4A に zs 走査の結果を示す。上段が 635 nm 励起、下段が 532 nm励起の結果である。横軸は zs の位置であり、100 回の測定を 2 次元で表している。各データごとにガウス関数でフィティング解析し、各回ごとの中心位置を求めた（図中の実線）。図 4B に、635 nm 励起の位置 zs(Red)と 532 nm の zs(Green)の差、zRG =zs(Red) - zs(Green)、をプロットする。これら 100回の測定から、zRG の平均値<zRG>を出した。このような測定を xyz 軸に対しておこなった。xyz 全ての軸に対しての測定にかかった時間は約 100 分であった。
これを 17 個の Qdot705 に対して測定した。その結果を図 4C にしめす。図 4C の標準偏差が、相対位置の決定精度になる。得られた精度は、xs 方向で 2.8 nm、ys 方向で 3.1 nm、zs 方向で 18 nm であった。xy 方向はタンパク質の大きさと同程度であり、目標とする精度を達成した。これに対して、z 方向は 18 nmと目標を達成できなかった。位置決定精度は分解能の 1 次に比例する[2]。表１のように、z の分解能Γzは、xy の分解能 R1st よりも 1 桁悪い。そこで分解能を向上させ、3 次元方向に対して数 nm の精度を得るため、NA = 0.97 という理論限界(= 1)に限りなく近い反射対物レンズの開発をおこなっている[8]。
1. I. Kii et al.; Org. Biomol. Chem., 8, 4051 - 4055 (2010).
2. Bobroff; Rev. Sci. Instrum., 57, 1152 - 1157 (1986).
3. S. Weiss; Science 283, 1676 (1999).
4. T. Hinohara, Y.I. Hamada, I. Nakamura, M. Matsushita, S.
Fujiyoshi; Chem. Phys. 419, 246 (2013).
5. S. Fujiyoshi. M. Fujiwara, M. Matsushita; Phys. Rev. Lett.
100, 168101 (2008).
6. S. Fujiyoshi, M. Hirano, M. Matsushita, M. Iseki, M. Watanabe; Phys. Rev. Lett. 106, 078101 (2011).
7. 原点を中心とした半径 R1st の円の中に入る光強度を zs に対してプロットし、その半値全幅をΓz とした。
8. 稲川 博敬, 松下 道雄, 藤芳 暁; 分子科学討論会 2013､3P087