STQ 法における繰り返し抽出定容法の検討〇佐々野僚一 1、小西賢治 1、高良浩司 2、久野恵子 21（株）アイスティサイエンス、2 和歌山県環境衛生研究センター【目的】食品中残留農薬分析STQ法では、操JEOL製)、GC/MS/MS:7000B(Agilent製)。

作効率の良いQuEChERS法の抽出工程を取り入

LC/MS/MS:Quatro UltimaPt(JASCO製)、れて、その液液分配抽出液から分取して固相API3200(AB SCIEX製)。

カートリッジによる精製を行っている。しか【結果と考察】繰り返し抽出定容法の工程をしながら、その抽出操作は一度だけであり、Scheme１ に 示 す 。 本 実 験 で は 定 容 量 を 10、また、その抽出液をそのまま分取している。

15、20mLとして検討を行った。

そこで、演者らは定量性と抽出効率を高める

1.液量について：１回目の抽出操作で得られことを目的としてSTQ法における繰り返し抽た抽出液量と２回目の抽出操作で目的の定容出定容法の検討を行ったので報告する。

量に合うように追加したアセトニトリル量を【方法】試料:ほうれん草、玄米、大豆。添表に示す。10mL定容では、ほうれん草や玄米
表 １回目の抽出液量と２回目に追加したアセトニトリル量

加濃度:0.02ppm,0.04ppm。固相:Smart-SPE、作物

ほうれん草・玄米

大豆

1回目抽出液量

95.5～6.5

2回目に 定 10追加した 容 15
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ量 量 20

14～35

8.5～7.5

自 動 前 処 理 装 置 :ST-L300、 GC大 量 注 入 口 装
置：LVI-S200(AiSTI製)。

GC/MS: Q1000GC(

試料 10g（ほうれん草）、5g（玄米・大豆）
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ 10mL

10添加 水 10mL

13～12
単位：mLの場合追加したアセトニトリル量が1mLであホモジナイズ・振とうり、２回目に抽出するための液量が少なかっ
食塩 1g
ｸｴﾝ酸3Na2水和物 1g

た 。 ま た 20mL定 容 で は 、 希 釈 率 が 上 が る た

ｸｴﾝ酸水素2Na1.5水和物 0.5g

め、定量限界が懸念された。よって液量にお無水硫酸ﾏｸﾞﾈｼｳﾑ 4g

いては15mL定容が妥当であると判断した。
振とう（液液分配）

2.回 収 率に つい て ：添 加回 収 試験 の結 果は遠心分離（5分, 3500rpm）

10mL, 15mL, 20mLのそれぞれの繰り返し抽出
アセトニトリル層①残さ（ 1 回目抽出液）

定容において、大きな差は見られなかった。
追加 ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ（定容量-ｱｾﾆﾄ層量①）mL

試料 別 では 、ほ う れん 草と 玄 米は 平均 で約振とう（液液分配）90%の良好な回収率を得られた。大豆は平均遠心分離（5分, 3500rpm）で約70～85％の回収率であった。

アセトニトリル層②STQ法において繰り返し抽出定容法を用い（ 2 回目抽出液）定容 15 mLることでその定量性と抽出効率を高めること≪自動前処理装置≫

参照文献１）が可能となった。
GC法、ＬＣ法

1) 佐々野ら、日本食品衛生学会第100回学術講演会要旨集
Scheme 1. 抽出溶液の調製法

STQ法における繰り返し抽出定容法の検討○ 佐々野僚一1)

小西賢治1)

1) 株式会社アイスティサイエンス

高良浩司2)

久野恵子2)

2) 和歌山県環境衛生研究センター

目 的
ＳＴＱ法において定量性と抽出効率を⾼めることを目的として、繰り返し抽出定容法の検討を⾏った。

■ 繰り返し抽出定容法の検討① 定容量の検討

・10 ｍＬ、15 ｍＬ、20 ｍＬのそれぞれの操作性と回収量の評価② 繰り返し抽出回数の検討
・１回目、２回目、３回目のそれぞれの回収量の評価■ ＳＴＱ法における繰り返し抽出定容法の評価① 添加回収試験による評価② 外部精度管理⽤試料を⽤いた評価前処理（抽出）試料 10 g（ほうれん草）、5 g（玄米・大豆）
アセトニトリル 10mL

添加 水 10mL（膨潤）ホモジナイズ・振とう

繰り返し抽出食塩 1g
クエン酸3Na2水和物 1g
クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5g
無水硫酸ﾏｸﾞﾈｼｳﾑ 4g

追加 アセトニトリル（定容量 ― ①アセトニトリル層量）mL

振とう （液液分配）

振とう （液液分配）

遠⼼分離（ 3500rpm 5分間 ）遠⼼分離（ 3500rpm 5分間 ）①アセトニトリル層②アセトニトリル層

残さ（試料層・水層）

定容 15 mL（アセトニトリルで調整）

残さ（試料層・水層）

前処理（精製）★ GC対象農薬抽出液 1.5 mL + 水 0.5 mL≪ ⾃動前処理装置 ≫分取 1 mL（試料：0.5 g 相当）
Smart-SPE C18-30 mg：精製
下液

洗液 ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ-水（4/1）1mL
混液 10%食塩水 20mL

⾃動前処理装置：ST-L300（AiSTI SCIENCE）★ LC対象農薬≪ ⾃動前処理装置 ≫分取 1.5 mL（試料：1 g 相当）
Smart-SPE C18-30 mg + PSA-30mg：精製

Smart-SPE C18-50mg：保持
乾燥（窒素ガス）
連結 Smart-SPE PSA-30mg：精製
溶出 ｱｾﾄﾝ-ﾍｷｻﾝ（15/85）1mL
ﾌｪﾅﾝﾄﾚﾝd体 + 0.1%PEG(300)/ｱｾﾄﾝ 20uL
定容 1 mL（ ｱｾﾄﾝ-ﾍｷｻﾝで調製）
GC/MS, GC-MS/MS（大量注⼊25 uL, 試料：12.5mg相当）

下液

洗液 ﾒﾀﾉｰﾙ 0.5mL
混液 水 1 mL

Smart-SPE C18-50mg：精製
洗液 ﾒﾀﾉｰﾙ-水（4/1）1mL
下液
定容 4 mL（ 水で調製）
LC-MS/MS（注⼊5 uL, 試料：1.25mg相当）GC対象農薬測定条件
GC/MS : アイスティサイエンス
PTV Injector
Injector Temp.

LVI-S200(AiSTI Science) ； Spiral Insert
70℃（ 0.3） -120℃ /min-240℃ -50℃ /min-290℃（ 38min, 33min）
0.27 min (150mL/min)

Solvent Purge Time
Auto Samplor

CombiPAL; 25 µL Syringe (AMR)

7693(Agilent)

25 µL （ 1 injection）

Injection Volume
GC

GC-MS/MS：和歌山県環衛研

Agilent 6890N

Agilent 7890A

Column

BPX5, 0.25mm i.d.×30m, df; 0.25µm

DB-5ms, 0.25mm i.d.×30m, df; 0.25µm

Column Oven Temp.

60℃ （ 4min） -20℃ /min-160℃ -3℃/min-235℃ -6℃ /min-310℃ （ 8min）

50℃（ 4min） -25℃ /min-125℃ -10℃ /min300℃ (6min)-25℃ /min-310℃（ 8.1min）
290℃℃

MS Interface Temp.
MSMS Method

JMS-Q1000GC（ JEOL）

7000B(Agilent)

SCAN; 70 - 420 m/z

MRMLC対象農薬測定条件

LC
ColumnLC-MS/MS：アイスティサイエンス

LC-MS/MS：和歌山県環衛研

Prominence(SIMADZU)

Alliance 2795(Waters)

L-column2 ODS, 2.0mm×150mm, 3µm

Capcell Pak C18 MG3, 2.0mm×100mm, 3µm

A： 0.5mM 酢酸アンモニウム水溶液

A： 10mM ギ酸アンモニウム水溶液

B： 0.5mM 酢酸アンモニウム含有メタノール B： 0.05%ギ酸含有メタノール
ギ酸 含有メタノール
Flow

0.2mL/min

0.25mL/min

5 µL

5 µL

API 3200 system (AB SCIEX)

Quattro Ultima Pt (Micromass)

Ion Mode

ESI Positive

ESI Positive

MS Method

MRMMRM

Inj. VolumeMS

定容量について（操作性）

例）ほうれん草 15mL定容

９
1回目
①

表 １回目の抽出液量と２回目に追加したアセトニトリル量
作物

ほうれん草・玄米

1回目抽出液量

大豆

95.5～6.5

14～35

8.5～7.5

1013～12Ⓐ5mL
９定 10容 15

2回目に追加した
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ量 量 20

単位：mL

2回目
５Ⓐ追加アセトニトリル量 ＝ 定容量 ー ①1回目抽出液量②10mL定容では2回目に抽出するときの液量が少ない。
20mL定容では希釈率が上がるため、定量限界が懸念される。
15mL定容が妥当であると判断。

定容
15定容量と回収量について回収量(ng)

試料：ほうれん草

定容量

農薬名 (LogPOW)

定容量と回収量について回収量(ng)

試料：大豆

定容量

農薬名 (LogPOW)

抽出回数と回収量について
試料：ほうれん草

回収量
回収量(ng)

⾼極性農薬→特に２回抽出効果あり

農薬名(LogPOW)

抽出回数と回収量について回収量
回収量(ng)

試料：大豆

大豆は極性によらず２回抽出効果あり

農薬名(LogPOW)

大豆のアセトニトリル層の量について
大豆 においては同じ試料でも操作の違いによりアセトニトリル層の量が異なる場合がある。
★アセトニトリル層の量を多くするためのコツ
１．セラミックホモジナイザーと食塩とクエン酸類を⼊れた後、15秒間、振とうする。
２．無水硫酸マグネシウムを⼊れ、2分間、強く振とうする。
３．5分程放置して、その後に遠⼼分離機にかける。

セラミックホモジナイザー添加回収試験
添加回収率の分布表（単位：成分数）

試料

ほうれん草

大豆

玄米

試料量

10g

5g

5g

添加濃度

0.02ppm

0.04ppm

0.04ppm

対象農薬

GC対象

LC対象

GC対象

LC対象

GC対象

2222
51335
112121982

140912020343

回収率 （%以上 - %未満）

120 70 - 120
50 - 70
30 - 50＊２回繰り返し抽出の15mL定容外部精度管理（定量結果）

本法による外部精度管理⽤ほうれん草ペーストの分析結果
農薬名

報告値

アイスティサイエンス23

和歌山県環衛研

平均

標準偏差 %

Chlorpyrifos

0.191

0.033

0.185 0.183 0.194 0.187

0.187 0.193 0.192

0.191

Flutoranil

1.12

0.138

1.08

1.01

1.01

1.03

1.02

1.05

1.09

1.06

Malathion2.020.482

1.48

1.39

1.30

1.39

1.64

1.66

1.69

1.66

＊２回繰り返し抽出の15mL定容1（単位：μg/g）

平均123

平均

外部精度管理（定量・定性結果）
1.75E+04
1.5E+04
1.25E+04
130502H-S12
標準試料 1.0E+04
200.000 7.5E+03
5.0E+03
2.5E+03m/z 314
S-G(3)
定量値=200.00
ピーク強度=19113.25
面積値=90452
保持時間=17.75
ピークの裾(左)=17.69
ピークの裾(右)=17.81

1.75E+04
1.5E+04
1.25E+04
130502H-S13
標準試料 1.0E+04
7.5E+03
80.0005.0E+03
2.5E+03m/z 314
S-G(3)
定量値=80.00
ピーク強度=6373.75
面積値=29475
保持時間=17.75
ピークの裾(左)=17.69
ピークの裾(右)=17.81

1.75E+04
1.5E+04
1.25E+04
130502C-A11
定量試料 1.0E+04
185.030 7.5E+03
5.0E+03
2.5E+03m/z 314
S-G(3)
定量値=185.03
ピーク強度=17170.00
面積値=82845
保持時間=17.75
ピークの裾(左)=17.69
ピークの裾(右)=17.81

1.75E+04
1.5E+04
1.25E+04
130502C-A12
定量試料 1.0E+04
182.763 7.5E+03
5.0E+03
2.5E+03m/z 314
S-G(3)
定量値=182.76
ピーク強度=17593.75
面積値=81693
保持時間=17.75
ピークの裾(左)=17.69
ピークの裾(右)=17.81

1.75E+04
1.5E+04
1.25E+04
130502C-A13定量試料 1.0E+04
193.878 7.5E+03
5.0E+03
2.5E+03m/z 314
S-G(3)
定量値=193.88
ピーク強度=18537.50
面積値=87341
保持時間=17.75
ピークの裾(左)=17.69
ピークの裾(右)=17.81

17.40

17.50

Standard200ppb

Standard80ppb

試料①mz

試料②

試料③

17.60

17.70

17.80

17.90mz

18.00

R.TimeChlorpyrifosの定量イオンクロマトグラム⽐較

試料スペクトルとライブラリスペクトル⽐較

まとめ
定容量（10mL、15mL、20mL）について・それぞれの定容量で回収量に大きな差は⾒られなかったが、操作性等を考慮して15mL定容が最適であると判断した。

繰り返し抽出回数（１回目、２回目、３回目）について
・ほうれん草においては１回目の抽出で大部分が回収されていたが、大豆においては２回目の抽出でも20％近くの回収があった。本法では操作性等も考慮して２回の繰り返し抽出が最適であると判断した。

添加回収試験および外部精度管理⽤試料による評価
・ほうれん草、大豆、玄米において良好な回収率と再現性を得ることができた。
・ChlorpyrifosおよびFlutlanilにおいて良好な測定結果を得ることができた。

ＳＴＱ法において繰り返し抽出定容法を⽤いることでその定量性と抽出効率を⾼めることが可能になった。