Feb. 2010

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

63—_181 ( 81 )日本抗生物質学術協議会奨励賞受賞講演会記録
2009 年 11 月 11 日，富国生命ビル 28 階会議室
【2009 年度受賞講演，座長：岩田敏】

抗インフルエンザ剤耐性頻度と，耐性インフルエンザ株に対する臨床的治療効果
─特にオセルタミビル耐性株に注目して─
齋藤玲子（新潟大学大学院医歯学総合研究科国際感染医学講座公衆衛生分野）

1. はじめにンフルエンザウイルスが検出されることが知られインフルエンザは毎年冬に大流行を起こす。ていたが，最近は全く内服歴のない患者に耐性イ2009 年には新型インフルエンザ H1N1 が世界大流

ンフルエンザが検出され，しかも，そのウイルス行（パンデミック）を起こし，社会的に大きな影は，世界的に伝播感染し，国際間で流行している響を与えたことが記憶に新しい。インフルエンザことが明らかとなった。一方で，これまで耐性株の予防，治療はワクチンと抗インフルエンザ剤がが出現しないと言われていた薬剤に対しても耐性用いられる。わが国では，抗インフルエンザ剤と株が検出されてきており，状況は刻々とかわりつして，M2 阻害剤であるアマンタジン（シンメトつある。さらには，2009 年に世界大流行を起こし

レル ®）と，ノイラミニダーゼ阻害剤である，オた H1N1pdm 自体が全てアマンタジンに対して耐セルタミビル（タミフル ®），ザナミビル（リレ性である。本稿では，当教室で約 10 年間調査をンザ ®）が健康保険認可されている。しかし近年，続けた日本の耐性インフルエンザの状況を中心に，薬剤耐性インフルエンザウイルスが，市中株にお国際的な耐性株の現状について報告する。

いて増加していることが問題となっている。耐性
インフルエンザは，HIV と同様に，ウイルス蛋白

2. インフルエンザウイルスと薬剤耐性機序

中の特定の 1 アミノ酸変異によって，蛋白の構造インフルエンザウイルスは，核蛋白の抗原性かがわずかに変化することによって生じる。これまら，A 型，B 型，C 型に大別される。主に人の間で，シンメトレルやオセルタミビルに対して，薬で大流行を起こすのは A 型，B 型である。インフ剤内服後の患者で，数⬃30% ほどの割合で耐性イ

ルエンザは，マイナス一本鎖の RNA ウイルスで[Proceedings] REIKO SAITO: High prevalence of antiviral resistant inﬂuenza, and reduced clinical effectiveness of the antivirals against resistant inﬂuenza strains.

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あり，ウイルス遺伝子は全長約 16,000 塩基，8 本の患者に，M2 蛋白の 26, 27, 30, 31 位のいずれかのセグメントにわかれており，それぞれのセグメのアミノ酸変異による耐性が出現する。

ントが 1, 2 個の機能蛋白をコードしている。イン

一方，ノイラミニダーゼ阻害剤は（オセルタミ

フルエンザは， RNA 一本鎖のため，塩基変異をビル，ザナミビル），A 型，B 型インフルエンザの起こしやすいことと，遺伝子セグメントの組み替双方に有効である。ウイルスが宿主細胞で増殖しえによる，新しいタイプのウイルスが出現しやすた後，細胞から遊離する際に使うノイラミニダーいことが特徴である。このため，宿主の免疫を逃ゼ蛋白ポケットを，宿主側のシアル酸と競合的にれる抗原性の変化が頻繁であり，一生涯に何回も奪い合うことで増殖を阻害する。化学構造上，大罹患する特徴がある。

きなカルボキシル基側鎖のあるオセルタミビルのA 型インフルエンザの予防治療薬である， M2ほうが，ザナミビルに比して内服後耐性が出現し阻害剤（アマンタジン）は A 型インフルエンザのやすい。ノイラミニダーゼ蛋白の 274 位，292 位，M2 蛋白を特異的に阻害する。M2 チャンネルはウ294 位， 119 位などのアミノ酸変異で耐性が生じイルス粒子内へ水素イオンの流入をもたらし，ヘる（図 2）2)。 A 型インフルエンザ H1N1 と H3N2

マグルチニン蛋白による膜融合を促進するが，アでオセルタミビル内服後に，数 %⬃20% 程度耐性

マンタジンはこの過程をブロックし，ウイルスのが出現することが報告されているが3)，ザナミビ1)。アマンタジンは内服後，増殖を阻害する（図 1）

ルはこれまで，ほとんど耐性株が検出されなかっ耐性が出現しやすいことが知られており，約 1/3た。

図 1.

A 型インフルエンザ M2 チャンネルの模式図とアマンタジンによるブロック1)M2 チャネル内面の 26, 27, 30, 31 位のアミノ酸変異でアマンタジン耐性化する

アマンタジンはインフルエンザ膜蛋白の一つである M2 蛋白をブロックして，インフルエンザウイルスの内部の pH 低下による膜融合を阻止する。チャンネルの内面のアミノ酸の 1 つ（26, 27, 30, 31 位）が変異するとアマンタジン耐性となる。

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図 2.

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83 ( 83 )ノイラミニダーゼ阻害剤に対するインフルエンザウイルスの耐性化 2)A 型及び B 型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼの 1 アミノ酸変異により，活性部位周辺の構造が変化し，大きな側鎖をもつオセルタミビルは入り込めなくなる。天然のシアル酸の構造に近いザナミビルはアミノ酸変化があっても活性部位に入り込み，競合的にシアル酸の作用を阻害し，インフルエンザの遊離を阻害する。

3. 薬剤耐性インフルエンザの流行の変異は同年にベトナムで採取されたアマンタジ

近年，薬剤耐性 A 型インフルエンザが非常な勢ン耐性株と共通していた。さらには，2005–06 年

いで増えている。最初に大流行を起こしたのは，に日本で流行した H3N2 株の 65.3% は， M2 遺伝

アマンタジン耐性株である。2003 年以降，アジア

子 31 位に変異をもつアマンタジン耐性株であっを中心に，A/H3N2 株において M2 蛋白 31 位変異。それらの株が全てヘマグルチニン遺伝
た（表 1）

によるアマンタジン耐性インフルエンザが急増し子の S193F と D225N 変異を有していたことから，

4)た 。我々は，2005 年秋に長崎県でみられたイン

このグループを Clade N と命名した 6)。ここに至フルエンザの地域小流行株が，アマンタジン耐性

り，薬剤耐性株がこれまでの常識を打ち破って世A/H3N2 により引き起こされ，さらに M2 遺伝子界的に大流行し，さらには，特有のヘマグルチニ変異のみならず，ヘマグルチニン遺伝子に S193Fングループ（⫽ 同一抗原性）を形成することが，と D225N の変異を有することを見いだした5)。こ初めて明らかになった。その後，日本の A/H3N2

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63—_1Feb. 2010のアマンタジン耐性は増加の一途をたどり，

表 1.

当教室調査による本邦インフルエンザ A/H1N1 及び A/H3N2 におけるアマンタジン耐性及びオセルタミビル耐性頻度

2007–08 年以降，H3N2 は 100% がアマンタジン耐性である。日本のみならず，世界的にも同様の傾向で，2008–09 年に至るまで H3N2 は全てアマン
タ ジ ン 耐 性 で あ る （ WHO, http://www.who.int/

csr/disease/inﬂuenza/2008-9nhemisummaryreport/
en/index.html）。一方，A/H1N1 においても，アマン タ ジ ン 耐 性 株 が 2006 年 か ら 増 加 し は じ め ，2006–07 年の本邦流行 H1N1 中の 65.6% が M2 遺伝子の 31 位に変異をもつアマンタジン耐性株であった（表 1）。これらの株は，H3N2 と同様にヘマグルチニン遺伝子が特有のグループを形成し，192 位， 193 位， 197 位に変異をもつ特徴があった7)。これら，H1N1 や H3N2 のアマンタジン耐性株は，ほぼ同時期に流行した様々な同一サブタイプのインフルエンザのウイルスセグメントが複雑に組み合わさった遺伝子再集合で出現していることが判明した。この遺伝子再集合により，感受性株を凌駕する増殖能を持ったアマンタジン耐性インフルエンザウイルスが出現したと考えられるが，どの部位が最も関連しているか，まだ明かでない。
さらには，A/H1N1 のアマンタジン耐性に代わるようにして，2007–08 年は，ヨーロッパを中心にオセルタミビル耐性株が大流行し，大きな話題となった。これらのオセルタミビル耐性株は全てノイラミニダーゼ遺伝子の 274 位がヒスチジン(His) からチロシン (Tyr) に代わる変異により耐性を生じていた。
大流行した耐性株の特徴は，患者本人には薬剤が投与されなくとも，耐性ウイルスが伝播感染したことである。アマンタジン耐性に関しては，アジアを中心として出現したことから，中国で人や家禽にアマンタジンを過剰に投与したためと考えられている。オセルタミビルに関してはヨーロッパでの処方量は低く，むしろ日本が世界の半分以上を消費していたため，なぜオセルタミビル耐性株がヨーロッパを中心として大流行を来したのか，

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63—_185 ( 85 )謎である。耐性株の流行には，抗インフルエンザと DNA 複合体のみが破壊され，クエンチャーが剤は関連ないとの考えもあるが，特にオセルタミはずれて，蛍光色素を検出することでテンプレー

ビルの場合は，遺伝子データベース中には 2000

トの増幅数を検出できる8)。Wild と Mutant など，年以前にオセルタミビル耐性に相当する変異株のある特定部位の 1 塩基変化を検出する場合は，登録がないことから，薬剤による選択圧がある程FAM と ROX の 2 種類の蛍光プローブをそれぞれ度働き，そこに遺伝子変異や再集合が起こることのプローブに割り当てることで，検体中に Wild とにより，薬剤耐性株の大流行が生じたと考えられMutant のどちらが優位であるか，検出できる。

る。

TaqMan 法によく似ているが， RNA-DNA 複合体を使うため，より特異性が高い。我々は，

4. 2008–09 年シーズンの本邦の耐性インフルエ
ンザ出現頻度A/H1N1 と H3N2 において， M2 遺伝子の 31 位がSer(AGT) から Asn(AAT) に変異したアマンタジ

我々は，2008–09 年シーズン中，全国 7 県（北ン耐性株を特異的に検出する方法を開発した8)。

海道，群馬，新潟，京都，兵庫，鳥取，長崎）

さらには，オセルタミビル耐性である季節性の 18 内科・小児科に受診したインフルエンザ患

A/H1N1 のノイラミニダーゼ遺伝子の 274 位が者を対象としてインフルエンザの検体採取を行い，His(TAT) から Tyr(CAT) に変異した株を特異的に薬剤耐性インフルエンザの頻度調査を行った。

検出する方法を開発し，現在，新型インフルエン

患者から採取した咽頭・鼻腔検体から，MDCK細胞を用いてインフルエンザウイルスを分離し，

ザ H1N1 のオセルタミビル耐性検出に対しても，設定を行い同法を使用している。

リアルタイム PCR を用いたサイクリングプローブ

2008–09 年シーズンは，全体として H1N1 が主法によって，オセルタミビル耐性変異（ノイラミ流の流行を示しており，流行株の 62.6%（ 693/ニダーゼ蛋白 274 位），あるいはアマンタジン耐1106 株）をしめた（表 2，図 3）。次に H3N2 が多性変異（M2 蛋白 31 位）を検査した。ノイラミニ

く 26.7%（ 295/1106 株）であり， B 型が 118 株

ダーゼ阻害剤に対する薬剤感受性（表現型）検査（ 10.7%）であった。 H1N1 は全て，ノイラミニとしては，オセルタミビルとザナミビルをそれぞダーゼ蛋白 274 位の変異をもつウイルスであった

れ使ったノイラミニダーゼ阻害試験 (IC50) を用いが，アマンタジンには感受性であった（表 2）。一て耐性株の確認を行った。検出された耐性株は，方， H3N2 は全て M2 蛋白遺伝子変異をもつアマ感受性株と合わせて， HA 遺伝子とノイラミニンタジン耐性株であった。ノイラミニダーゼ阻害

ダーゼ遺伝子のシーケンスを行い樹形図解析によ試験 (IC50) を行ったところ，274 位の変異をしめりウイルス遺伝子の近縁性を検討した。

したウイルスはオセルタミビルに対する薬剤阻止

なお，本調査で用いたサイクリングプローブ法

濃度が 949 nM と，感受性株に対して 400 倍以上

は，リアルタイム PCR の変法で，1 塩基変異を非上昇しており，オセルタミビル耐性であった（図常に特異的に検出できる方法であり，当教室で薬4）。しかし，ザナミビルに対しては感受性であっ剤耐性インフルエンザ検出のために開発したものた。ヘマグルチニン遺伝子とノイラミニダーゼ遺である。まず，問題となる 1 塩基部位のみを RNA伝子の樹形図解析を行ったところ， 2008–09 年に置換した 10–15 mer 程度の蛍光 DNA プローブをシーズンの H1N1 は，全て WHO 分類の Clade 2B設計する。PCR 増殖中にプローブがテンプレートに属し，ノイラミニダーゼ遺伝子の 274 位と 357に水素結合した際に， RNAseH が作用し， RNA位に変異をもち， HA 遺伝子には 193 位に変異が86 ( 86 )THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

図 3.

図 4.

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2008–09 シーズンにおけるインフルエンザウイルスの流行株（当教室調査）

2008–09 年に採取された A/H1N1–H274Y 変異株の NA 阻害剤感受性試験 (IC50) の結果

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表 2.

63—_187 ( 87 )2008–09 シーズンにおけるインフルエンザウイルスの薬剤耐性株発生頻度生じており，一つの特徴的な群を形成していたしたアマンタジン耐性 H1N1 及び H3N2 と共通し6)（ Subclade 2B.II と命名） （図 5）。前シーズンのていることは興味深い。しかし， Subclade 2B.II

2007–08 年には，本邦ではアマンタジン耐性株で群のオセルタミビル耐性株は，アマンタジン耐性ある Clade 2C 群と，感受性株とオセルタミビル耐株とは異なり，遺伝子再集合ではなく，ウイルス性が混在する Subclade 2B.I 群が主流の流行が見遺伝子に多数の変異が生じることで発生したことられた。しかし，同シーズン中から特にオセルタが，我々の解析で判明した。

ミビル耐性頻度が高く，ノイラミニダーゼ遺伝子の 357 位に変異が入ったウイルスが北欧諸国を中9)

心に報告されていた 。翌シーズンの 2008–09 年

5. オセルタミビル耐性株に対するオセルタミビ
ルの治療効果に，日本で流行したオセルタミビル耐性 H1N1 は，2008–09 年，オセルタミビル耐性株に感染した

基本的にはこの北欧系に属し，ヘマグルチニン遺小児に対して，オセルタミビル又はザナミビルに伝子の 193 位にさらに変異が見られていた (Sub-よる薬剤治療を行った際の熱型を検討した。

clade 2B.II)。この 193 位の変異は，以前に大流行方法としては，小児患者において，保護者に依88 ( 88 )THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

図 5.

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2008–09 年シーズンの H1N1 の遺伝子解析（HA 遺伝子，NA 遺伝子）

頼して 1 日 3 回の体温測定を行った記録用紙を回療の無効性は，小さい子ほど顕著で 7 才未満の小収し，オセルタミビル投与群，ザナミビル投与群，児で明らかであった。オセルタミビル耐性株によ無投与群について， 1 日 3 回計測のうちの最高体るオセルタミビルの無効化は日本国内の他のグ温を算出し，統計解析して 3 群間での有意差検定

ループの調査においても同様の結果を示した10)。

を行った。また，過去に行った同様の調査の結果

274 位変異ウイルスでは，約 400 倍のオセルタミを用い，オセルタミビル感受性の場合の治療群とビルの阻止濃度上昇がみられ（平均 950 nM），オ無治療群の熱型比較を行った。

セルタミビルの血中濃度 (350–900 nM) とほぼ同

オセルタミビル耐性株に対して，オセルタミビ
ル治療を行った群では，熱型が無治療群とほぼ同等か，それ以上となってしまったため，効果が減弱したと考えられる。

様の経過となっており，治療効果が減弱している。一方，ザナミビルは，速ことが判明した（図 6）
やかな解熱を示した。それに対して，過去のオセ6. 2008–09 年アジア各国のオセルタミビル耐性
H1N1 頻度

ルタミビル感受性株罹患児では，オセルタミビル

我々は，国際的な薬剤耐性インフルエンザの調治療により，無治療群に比して，有意な解熱を示査を独自に行っている。 2008–09 年は，ロシアしており，オセルタミビルの治療効果が確認され（ウラジオストック），ミャンマー，ベトナム，レた（図 7）。このため，ノイラミニダーゼ遺伝子バノンで耐性頻度調査行った。H1N1 のオセルタ

274 位変異によるオセルタミビル耐性株に感染しミビル耐性頻度は，レバノン 100%，ロシア（ウた小児では，あきらかにオセルタミビルによる治ラジオストック）70%，ベトナム 66.6%，ミャン療効果が減弱し，無治療群と同じ熱経過になってマー 4% であった（図 8）。ヘマグルチニン遺伝子いたことが判明した。なお，耐性株に対する，治とノイラミニダーゼ遺伝子の樹形図解析では，海Feb. 2010

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63—_189 ( 89 )図 6. オセルタミビル耐性 H1N1 感染に対するオセルタミビル，ザナミビルの治療効果（15 才以下小児）* ザナミビル対無治療群 p⬍0.05，† オセルタミビル対ザナミビル p⬍0.05

図 7.

オセルタミビル感受性 H1N1 感染に対するオセルタミビルの治療効果（15 才以下小児）‡

オセルタミビル対無治療群 p⬍0.01

90 ( 90 )図 8.

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アジア各国の 2008–09 年におけるオセルタミビル耐性 H1N1 頻度（当教室調査）

外のオセルタミビル耐性株はすべて日本と同様にンタジン耐性がもともとあったところへ，ノイラ

Subclade 2B.II に属した。ここで判明したのは，オミニダーゼ蛋白の 274 位の変異が生じたと考えら

セルタミビル耐性頻度が，国によってかなり違っれた。香港，カンボジアで同様の二重耐性株の報ており，必ずしも，欧米や日本の頻度（H1N1 は告があり，アジア起源と考えられる11,12)。ザナミ

100% オセルタミビル耐性）と同様ではないこと

ビルとアマンタジン二重耐性の H3N2 は，これまである。特にミャンマーでは，他の地域より半年でに報告がない。樹形図解析上はアマンタジン耐はやい採取時期（ 2008 年 6–9 月）であったため性株に属するため，もともとアマンタジン耐性でか，オセルタミビル耐性頻度が低かった。中国であった株に，ノイラミニダーゼ遺伝子 136 位変異は同時期にオセルタミビル感受性株が流行していが生じたと考えられる。

たとの情報から，中国の流行株の影響を受けやす

これまで，一笑に付されていた薬剤耐性インフいか，あるいは耐性頻度が高かった欧米からの伝ルエンザの流行が，現実のものとなった。ウイル

播の影響が強いかにより，各国の耐性頻度に相違

スの耐性化は，細菌の抗生剤への耐性化の機序とがあったと考えられる。

は全く異なるが，インフルエンザにおいても，二我々の調査により，ミャンマーの検体から，ザ重耐性，三重耐性となる日も近いかも知れない。

ナミビルとアマンタジンの二重耐性 H3N2 株や，このため，これまでと全く異なる機序の新しい薬オセルタミビルとアマンタジンの二重耐性 H1N1剤の開発が強く望まれる。

株が検出された。これまで多剤耐性インフルエンザ株の報告はほとんどなかったため，今後国際的謝辞な注目を集めると考えられる。オセルタミビルと日本抗生物質学術協議会奨励賞を賜りましたこ

アマンタジンの二重耐性 H1N1 は，Clade 2C のアとを心より感謝いたします。国内外の多数の臨床

マンタジン耐性株の集団に属しているため，アマ医の先生方，教室の諸先生方のご協力のお陰でこFeb. 2010

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICSのような栄えある賞をいただくことができました。
特にこれまでご指導いただいた鈴木宏教授に深謝いたします。

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8)

9)

10)

11)

12)

63—_191 ( 91 )incidence of adamantane-resistant inﬂuenza
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