日本大学歯学部紀要 38，11‑16，2010

亜鉛イオンが骨芽細胞株（Saos‑２）の生細胞およびサイトカイン産生に及ぼす影響
横瀬勝美

中野善夫

桑田文幸

Effects of zinc ion on cell viability, IL‑1α and IL‑6 production
by the human osteosarcoma cell line, Saos‑2
Katsumi Yokose, Yoshio Nakano and Fumiyuki Kuwata
Abstract
The effects of zinc ions on cell viability and production of interleukin 1α (IL‑1α) andinterleukin 6 (IL‑6)using the human osteosarcoma cell line,Saos‑2,were investigated in thepresent study.Cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and antibiotics for
24 h before the addition of 0.1 mM of (CH COO) Zn . Cell viability was assessed by acolorimetric assay using a LDH cytotoxic test following incubation for 6,12,24 or 48 h.Theproduction of IL‑1αand IL‑6 in Saos‑2 cells was examined using ELISA.The addition of 0.1mM zinc ions did not alter cell viability during 48 h.Moreover,the addition of zinc ions had
little effect on production of IL‑6 in these cells.
Key words: cell viability, IL‑1α production, IL‑6 production, osteosarcoma cell, zinc ion

緒

亜鉛は生体において微量必須元素である。しか言し，亜鉛の欠乏やその濃度によっては生体および局所的な部分において代謝の変化をもたらす

亜鉛はすべての生物の生命維持に必須であるものとことが明らかにされたのは 19世紀半ばであえられている 。

る 。それは亜鉛が数多くの金属酵素（metallo

著者らは，先に金属イオンが口腔軟組織，と‑enzyme）の構成成分であることや，生体におくに上皮組織におよぼす影響を解明する第一ス

いて細胞分裂やタンパク質合成に密に関係してテップとして，歯科補綴物の成分であるチタン

おり，DNA，RNA の生合成に際しては，DNAおよびニッケル，歯科修復物の合金中に存在す

polymerase， RNApolymerase お よ び

る 亜 鉛 に つ い て，ヒ ト 口 腔 由 来 上 皮 細 胞 株

thymidine kinase の構成成分としてその酵素（Ca 9‑22）のコンフルエント後の生細胞数およ活性に重要な役割を果たしているということでび DNA 合成能におよぼす影響について報告しある。さらに個々の細胞に対しては酵素を介し，た 。本研究では，口腔内口臭予防薬中に含まれ細胞膜構造に直接働きかけて細胞の機能を左右ている酢酸亜鉛を使用し，ヒト骨肉腫由来の株することが明らかにされている化骨芽細胞（Saos‑２）を使用し，亜鉛を添加し，。このように

日本大学歯学部化学教室
日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門〒 101‑8310 東京都千代田区神田駿河台１‑８‑13

Department of Chemistry, Nihon University School ofDentistry
Division of Functional M orphology, Dental Research（受理：2010年９月 30日）

Center, Nihon University School of Dentistry
1‑8‑13 Kanda‑Surugadai, Chiyoda‑ku, Tokyo 101‑8310 Japan11

日本大学歯学部紀要 38，11‑16，2010

３. IL‑1αおよび IL‑６産生

生細胞数への経時変化に及ぼす影響ついて検討を行った。さらに，インターロイキン―1α（IL材料および方法の２. と同様に，24穴プレー‑1α）および IL‑６ の２種類のサイトカイン産トに Saos‑２細胞を播種後，24時間後，亜鉛イ生に及ぼす亜鉛イオンの影響も併せて検討しオン（(CH COO）Zn ）の濃度，0.1mM を含た。

む DMEM に交換し，その作用時間をそれぞれ６，10，24および 48時間として培養を行った。

材料および方法

なお，培地中の亜鉛イオン（(CH COO）Zn ）は終末濃度 0.1mM になるように添加した。亜１. 細胞培養
実験には骨芽細胞として理化学研究所細胞開鉛イオンを作用させた後，無血清の DMEM と発 銀 行 か ら 購 入 し た Saos‑２ 細 胞 を 使 用 い交換し 24時間培養後，上清を回収する。培養上た。Saos‑２細胞は，Dullbeccoʼ
s modified

清 を 回 収 後，IL‑1α 定 量 用 ELISA キット

Eagle medium（DM EM ，旭テクノグラス）に，（BioSource）および IL‑６定量用 ELISA キッ

10％ウシ胎児血清（FBS，旭テクノグラス），50ト（BioSource）を用いて上清中のサイトカインU/ml ペニシリンおよび 50μg/ml ストレプト量を定量した。コントロールは材料および方法マイシン（Sigma）を加えた培地を用い，37°C，の２. と同様である。

５％CO の湿潤条件下で培養を行った。

成

２. 細胞障害率（経時的変化）
生細胞へのチタンイオンによる経時的変化の績

１. 細胞障害率（経時変化）影響を調べるために，24穴プレートに Saos‑２

Saos‑２細胞に亜鉛イオン（(CH COO）Zn ）細胞１×10 個/cm を播種し，500μl の DM EM

0.1mM 濃度を添加した影響を第１図（経時的（10％FBS および抗生物質を含有）で培養を開変化（細胞障害率）に示した。

始した。Saos‑２細胞播種後，24時間後に亜鉛イ

第１図では，亜鉛イオン（(CH COO）Zn ）オン（(CH COO）Zn ）を含む無血清の DM EM濃度 0.1mM ，作用時間６，10，24および 48時（抗生物質を含有）に交換した。生細胞への亜鉛間として培養を行った。亜鉛イオン添加によりイオン経時的変化の影響を調べるためにその作細胞障害率は，コントロールでは 0.3％，６時間用時間をそれぞれ６，10，24および 48時間とし

で は 2.0％，10時 間 で は 3.6％，24時 間 で はて培養を行った。なお，培地中の亜鉛イオン（(CH COO）Zn ）は終末濃度 0.1mM になるように添加した。亜鉛イオンを作用させた後，無血清の DM EM と交換し 24時間培養後，上清を回収する。回収した上清は 3000rpm，５分遠心し，LDH―Cytotoxic Test（和光純薬）を用
い細胞障害率を比色測定した。また，実験は２連で行い，結果は平値で示した。金属イオン

経時変化を比較するため，亜鉛イオン無添加の場合をコントロールとし，DM EM（10％FBS および抗生物質を含有）で 24時間培養を行った。

12第１図 Saos‑２細胞の細胞障害率に及ぼす亜鉛イオンの影響

骨芽細胞と亜鉛イオン

第２図 Saos‑２細胞 48時間後の control形態

第３図

亜鉛イオン 0.1mM ６時間作用させたときの細胞形態

第５図

亜鉛イオン 0.1mM 24時間作用させたときの細胞形態

第６図

亜鉛イオン 0.1mM 48時間作用させたときの細胞形態

ずかに細胞障害率が増加した。各週の細胞状態をコントロールと亜鉛イオン作用時間（コントロール，６時間〜48時間）を比較し，細胞状態を図２〜６に示した。各週のコントロールと亜鉛イオン添加を比較すると亜鉛イオン添加していると細胞の増殖に大きな変化はなかった。
２. IL‑1α産生
コンフルエントに達した後の Saos‑２細胞のIL‑1α産 生 に お よ ぼ す 亜 鉛 イ オ ン（(CH第４図COO）Zn ）0.1mM 濃度の経時的変化の影響

亜鉛イオン 0.1mM 10時間作用させたときの細胞形態を調べた結果を第１表に示した。
Saos‑２細胞の IL‑1α産生におよぼす亜鉛6.6％，48時間では 7.3％の細胞障害率であっイオン（(CH COO）Zn ）濃度の経時的変化のた。亜鉛イオン添加後ではコントロールからわ影響を調べた結果，IL‑1α産生量は亜鉛イオン13日本大学歯学部紀要 38，11‑16，2010

第１表 Saos‑２細胞の IL‑1αの産生に及ぼす亜鉛イオンの影響

第２表 Saos‑２細胞の IL‑６産生に及ぼす亜鉛イオンの影響

IL‑1α量（pg/ml）

IL‑６量（pg／ml）

作用時間
６ h
10 h
24 h
48 h

平値

作用時間

Cont.
Ti

＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

Cont.

＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

Ti＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

Cont.
Ti

＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

Cont.
６ h
10 h
24 h
48 hCont.

＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

Ti＜0.80 ＜0.80 ＜0.80＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

平値

0.95

0.440.69

1.11
1.88
2.17

1.111.83
2.03

1.11
1.86
2.10

2.61

2.75

2.68

＜0.80 ＜0.80 ＜0.80pg/ml と なった。IL‑６ 産 生 量 は 時 間 と 共 に徐々に増加がみられた。

察（(CH COO）Zn ）濃度 0.1mM コントロールは測定検出限界以下のため測定不可であった。

亜鉛は必須金属元素であり，他の微量元素よ３. IL‑６産生

りも高濃度で生体に広く分布し，人体では，肝Saos‑２細胞の IL‑６産生におよぼす亜鉛イ臓，および筋肉に多く，全血液中には 900μg/dlオン（(CH COO）Zn ）濃度の経時的変化の影含まれているといわれている

響を調べた結果を第２表，第７図に示した。

するとラットにおいて発育遅延，脱毛症および。亜鉛が欠乏

Saos‑２細胞の IL‑６産生におよぼす亜鉛イ皮膚粘膜の肥厚や角化などを呈することが報告

オン（(CH COO）Zn ）濃度の経時的変化の影され，上皮の代謝にも重要な役割を担っている響を調べた結果，IL‑６産生量は亜鉛イオンことが示唆される。また，亜鉛は，いろいろな（(CH COO）Zn ）濃度 0.1mM ，６時間作用さ金属酵素の構成成分として，亜鉛フィンガー，せ培養した場合で 1.11pg/ml，10時間で 1.86

亜鉛クラスターおよび亜鉛ツィストの３種類のpg/ml，24時間で 2.10pg/ml，48時間で 2.68

結合様式を形成し DNA などと結合していること ，また，亜鉛は癌の抑制効果からの研究がなされており ，紫外線が関与した活性酸素の生成による皮膚の細胞毒性,さらには発癌性を防御する効果があるという報告もある 。このように生体において微量必須元素でありながら，その濃度によっては生体および局所的な部分において悪影響を与えるとえられる金属イオンに亜鉛イオンがあげられる。
著者らは一般的な細胞毒性試験による金属イオンの生細胞数に及ぼす影響に加えて，より感度の高い DNA 合成に及ぼす影響も併せて検討

第７図 Saos‑２細胞の IL‑６の産生に及ぼす亜鉛イオンの影響した結果から，金属イオンに対するわずかな反14骨芽細胞と亜鉛イオン応性も提える可能性を示唆することができたとめ，亜鉛イオンが Saos‑２細胞の IL‑1αの産える 。本研究ではより詳細な検討を加える

生を促進するかどうか調べた。その結果，Saosために，口腔内口臭予防薬中に含まれている酢‑２細胞の IL‑1α産生におよぼす亜鉛イオン酸亜鉛を使用し金属イオンを作用させる時間を（(CH COO）Zn ）濃度の経時的変化の影響を変化させて骨芽細胞株（Saos‑２）に対する影響調べた結果，IL‑1α産生量は表１，に示したよを検討した。

うに，各週コントロールは測定検出限界以下の生細胞数に及ぼす影響を生細胞障害率の測定ため測定不可であった。IL‑６産生量の測定は，には LDH 測定法を用いた。本測定の LDH−

IL‑６は B 細胞刺激因子として純化されたサイ

Cytotoxic Test は細胞毒性を簡便に測定できトカインであるが，骨芽細胞るばかりでなく，細胞が細胞膜に障害を受けてれ，IL‑1α，TNF，PTH，などによりその産生細胞から遊離した LDH（乳酸脱水素酵素）活性が促進され間接的に破骨細胞の活性化をも促進

でも産生さを測定することができ，生理活性物質による細するため，亜鉛イオンが Saos‑２細胞の IL‑６胞障害や細胞性免疫による細胞障害，補体依存産生を促進するかどうかを調べた。その結果，性細胞障害，抗体依存性細胞障害の他，細胞のSaos‑２細胞の亜鉛イオン添加による，IL‑６産生存率にも利用できることからこの方法を用い生量は，表２，第 11図に示したように IL‑６産た。コントロールは血清培地で 48時間培養を行

生量は時間と共に徐々に増加がみられた。

い，上清を回収する前の 24時間を無血清培地と以上のことから亜鉛イオンによるヒト骨肉腫交換し上清を回収し測定を行った。同時に血清由来の株化骨芽細胞への影響は，短時間亜鉛イ培地中で細胞状態を観察した。

オンを作用させた場合 IL‑６サイトカイン産生細胞障害率は第１図に示したように，亜鉛イ量をわずかに増加させた。炎症性サイトカイン

オン添加後ではコントロールから徐々に細胞障である IL‑1α，IL‑６への影響を見るためには害率は 48時間まで徐々に増加した。
亜鉛作用時

亜鉛イオンを長時間作用させる必要があると間後の細胞状態をコントロール，６時間〜48時えられる。

間ごとの細胞状態（図２〜６）を示した。亜鉛謝

イオンを添加していると細胞の増殖がやや劣っているが，大きな変化はみられなかった。

辞本研究の一部は平成 21，22年度日本大学歯学サイトカイン産生に及ぼす影響をチタンイオ部佐藤研究費によって行われたことを付記す

ンの経時的変化にあわせて検討した。インターる。

ロイキン−1α（IL‑1α）は単核球が産生する歯文骨細胞刺激因子の主成分であることが明らかに献されて以来，IL‑1αの骨代謝・骨疾患との関連

１）Sommer AL, Lipman CB (1926)Evidence onが検討されて，最も強力な骨吸収促進因子の１

the indispensable nature of zinc and born forhigher green plants.Plant Physiol,1,231‑249

つである。IL‑1αはきわめて低濃度で，ヒト骨２）Williams RJP (1989) An introduction to the髄細胞より歯骨細胞を誘導する作用をもち，更biochemistry of zinc. In Zinc in human biology, Mills CF ed, Springer‑Verlag, London,に骨芽細胞を介して間接的に歯骨細胞の活性化を促進する。一方，IL‑1αはヒト骨芽細胞の15‑31３）岡田正，高木洋治（1984）亜鉛と臨床，朝倉書DNA 合成促進作用を示し，コラーゲン合成に関しては少量で促進，大量で抑制作用を示すた
15

日本大学歯学部紀要 38，11‑16，201011）A.Schor R (1974)Trace levels of manganese,店，東京
４）Leccia T, Richard M J, Beani JC, Faure H,copper, and zinc in rib cartilage to age in

Monjo AM , Cadet J, Amblard P, Favier A

human and animals, both normal and dwarfed. Clin Orthopaed Metabol 17, 205‑212(1993)Protective effect of selenium and zinc
on UV‑A damage in human skin fibroblasts.

12）Vallee BL, Colman JE (1991) Zinc fingers,zinc clusters,and zinc twists in DNA‑binding

Photochem Photobiol 58(4), 548‑553５）横瀬勝美，桑田文幸（2001）口腔由来細胞株

protein domins. Proc Natl Acad Sci USA 88(3), 999 ‑1003（Ca 9‑22）の生細胞数および DNA 合成能に及ぼす金属イオンの影響．日大歯研紀，29，37‑4413）Koizumi T,Li ZG,Tatsumoto H (1992)DNA６）Bridgewater LC, M anning FC, Woo ES,

damaging activity of cadmium in Leydig

Patierno SR (1994) DNA polymerase arresecells, a target cell population for cadmiumby adducted trivalent chromium. M ol Carcinog 9(3), 122‑133

carcinogenesis in the rat testis.Toxicol Lett63(2), 211‑220７）Spyrou P, Papaioannou S, Hampson G,14）Sauder DN, Kilian PL, McLane JA, Quick

Brandy K, Palmer RM , M cdonald F (2002)
Cytokine release by osteoblast‑like cell cul-TW,Jakubovic H,Davis SC,Eaglestein WH,Mertz PM (1990) Interleukin‑1 enhances

tured on implant discs of varying alloy
composliions.Cline Oral Imp Res 13,623‑630

epidermal wound healing. Lymphokine Res
9, 465‑473

８) Fogh J, Wright WC, Loveless JD (1977)

15）Kupper TS (1990) The activated ker-Absece of HeLa Cell contamination in 169

atinocyte a model for inducible cytokine
production bynon‑bone marrow‑derived

cell line derived from human tumors. J Nat
Cancer Inst 58, 209 ‑214
９）Haumont S, M cLeam FC (1966) Zinc andcells in cutaneous inflammatory and immune
responses. J Invest Dermatol 94, 146s‑150s

physiology of bone. In Zinc M etabolism,16）Aida Y, Maeno M, Suzuki N, Nanba A,Prasad AS ed, Charles C Thomas, Springfield, 169 ‑186

Motohasi M, Matsumoto M, Makimura M,
Matsumura H (2006)The effect of IL‑1βon10）Samachson J, Schmitz A (1968) The reac-the expression of inflammatory cytokines

tions of H and Zn

with the surfaces ofbone and bone matabolism. Biochem Biophys Acta 170, 409 ‑419

16and their receptors in human chondrocytes.
Life Sci 79, 764‑771