Apr. 2012

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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135（ 37 ）住木・梅澤記念賞受賞講演会記録
2011 年 11 月 4 日，学士会館 320 号室【2011 年度受賞講演，座長：長田裕之】

新規生物活性物質探索のための微生物資源の開拓
高橋洋子（北里大学北里生命科学研究所）

1944 年に放線菌 Streptomyces griseus の培養液

た 3〜8）。分離法の工夫では抗生物質耐性を利用しから Streptomycin が発見されて以来，生物活性物た希少放線菌の分離，走化性を利用した運動性放質の探索源として，土壌試料から多くの放線菌が線菌の分離，固形剤としてのゲランガムの利用等分離されてきた。また，新たな菌株を求めてそのである。さらに，土壌の他に，植物の葉や砂漠の分離方法が検討されるとともに，Gentamicin の発砂等を分離源として用いた。このような，微生物見がきっかけとなって Streptomyces 属以外のいわ資源拡大のための研究過程で分類上新規な菌株をゆる希少放線菌分離にも力が注がれてきた。

見出し，1 新科 13 新属 42 新種を提唱した。

これまでに細菌，放線菌あるいは真菌の生産す一方，これら分離放線菌の培養液から見出される二次代謝産物から抗生物質を含む生物活性物質た化合物の中で，医薬，動物薬あるいは試薬としは約 20,000 以上報告された。BERDY の報告 1）にて発展した物質には以下のような化合物があげら

よ る と 1980 年 ま で に 約 5,000， 1990 年 で は 約れる。括弧内には生産菌を示した。抗寄生虫活性10,000，2000 年までに計約 20,000 の化合物が発見を有する Avermectin（新種 Streptomyces avermec-されている。その生産菌の内訳をみると，1960 年

tinius MA-4680T），プロテインキナーゼ阻害活性

代前半は放線菌由来が 70% 前後を占めていた。現を 有 す る Staurosporine（新 種 Saccharothrix aero-

在では放線菌 45%，真菌 38%，細菌は 17% となっ

colonigenes subsp. staurosporeus AM-2282T, 2007ている（表 1）。

年に Lentzea albida に移行），プロテアソーム阻害
北里生命科学研究所の創薬活性を有する Lactacystin（“Streptomyces lactacys-

科学部門を中心にした創薬研究グループは，微生tinaeus” OM-6519），V-ATPase 阻害活性の Setamy-

物由来生物活性物質の探索を行い，約 450 の化合cin （新属新種 Kitasatospora setae KM-6054T），物を発見した 2）。対象としてきた微生物は主に放Hsp90 阻 害 活 性 の Herbimycin （Streptomyces

線菌と真菌であり，演者は放線菌群を中心にそのhygroscopicus AM-3672），アシル CoA 合成酵素阻分離，培養および分類を担当し，新しい微生物資害 活 性 の Triacsin（Streptomyces sp. SK-1894）な源を得るための様々な分離の試みを行ってきどである。

（学）北里研究所[Proceedings] YƿKO TAKAHASHI: Expansion of microbial resources in the search for novel bioactivecompounds.

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表 1. 生物活性物質生産菌 1）

図 1.

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各種培地や培地成分から発生するスーパーオキシドアニオン（O2−）

本講演では，分離方法と分離源に関しての最近の試みと，これら分離菌株の培養液から得られた新物質について報告する。

1. 活性酸素除去による新規放線菌類の分離と分類
これまでに分離された微生物種は自然環境中の数 % 程度であり，多くの未知微生物がいまだ分離されていないといわれている。我々は，これら未A：一般的に細菌の培養に用いられる培地を用いて，チトクローム
C 法により還元型のチトクローム C の蓄積量を測定することによって O−2 を定量した。
B：GPM 培地の培地組成ごとの O−2 発生量を WST-1 法により比較した。

知微生物の分離法を開発すべく検討を行ってきた。その成果の一つとして，一般に研究室で微生市販 SOD でも菌数増加効果が見られ，カタラー物培養のために用いられる寒天培地が活性酸素種

ゼとの併用で更なる効果が得られた。さらに，分を発生する場合があり，その除去物質（ラジカル離に用いた寒天培地からスーパーオキシドアニオスカベンジャー）を培地に添加することで出現コン（O−2 ）が検出されたことから，これまで生育困ロニー数が飛躍的に増大することを見出した。

難であった活性酸素感受性菌が分離されてきたとこの発見は土壌試料中の優先種微生物の代謝産考えられる 4,7,9,10）。

物に注目したことがきっかけとなった。すなわ

以下に，1-1. 培地から発生する活性酸素種の検ち，環境中の微生物フローラに着目し，土壌中に出と定量，1-2. ラジカルスカベンジャーを用いて優先的に棲息する微生物は他の微生物になんらか分 離 さ れ た 菌 株 の 分 類， 1-3. 新 属 新 種 Patuli-の影響を与える物質を生産するのではないかと考

bacter minatonensis 近縁菌の土壌試料中におけるえ，まず優先種微生物を分離しその培養液を培地分布頻度，について報告する。に添加し，再度同じ培地を用いて分離を行った。

1-1. 培地から発生する活性酸素種の検出と定量

その結果，優先種微生物として分離した 2 菌株の上述したように，分離培地に SOD を添加する培養液に出現コロニー数の増加効果があることをことによりコロニー増加がみられたので，細菌や見出した。この培養液中のコロニー増加因子を解放線菌の分離に一般に用いられる Glucose Pep-

析したところスーパーオキシドジスムターゼ

tone Meat extract （GPM, 1.0% D-glucose, 0.5%（SOD）であることがわかった。牛赤血球由来のpeptone, 0.5% meat extract, 0.3% NaCl, 1.2% agar）

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65—2137（ 39 ）培地が活性酸素種を発生するのではないかと考

ゼ添加では 6.2×107 コロニー /g と無添加の約 2 倍

え，O−2 の定量を試みた。すなわち，Cytochrome Cのコロニー数が得られた。分離菌株を比較したと−法を用いて GPM 寒天培地からの O2 発生による還ころ無添加では 8 菌種，添加では 14 菌種とその種元型 Cytochrome C の蓄積量を定量した。その結類においても活性酸素除去効果が得られた。

果，反応液に加えた寒天培地の量と反応時間に対培地から O−2 が発生しラジカルスカベンジャー応しての蓄積量が増加し，培地自体が O−2 を発生添加で新たな菌株が分離できることがわかったの9）することが明らかになった 。

GPM 培 地 の 他 に Nutrient Broth や Tryptic Soy−

で，その分離株の一つ KV-614T 株の詳細な分類学的研究を行った。本菌株の分類学的特徴を図 2 にBroth からも O2 の発生が見られた。また，GPM 培示した。長い鞭毛を有する桿菌でありメナキノン−

地組成中の肉エキスに O2 の高い発生が見られた

組成として Actinobacteria 綱（Gram-positive high（図 1）。さらに，GPM 培地から発生する活性酸素

G＋C bacteria）では当時としては報告例の少な−種を特定したところ O2 ，過酸化水素（H2O2），さかった demethylmenaquinone-7（DMK-7）を含んらに活性酸素分子種の中で最も毒性が高いと考えでいる。16S rRNA 遺伝子の塩基配列による系統られるヒドロキシラジカル（･OH）が検出された。 樹では Actinobacteria 綱の根元に位置し分離例が一重項酸素は検出されなかった 11）。

極めて少ない一群に位置しており，新科 Patuli-bacteraceae を 設 け Patulibacter minatonensis KV1-2. ラジカルスカベンジャーを用いて分離された菌株の分類

614T と命名し提唱した 12）。
図 3 は，デ ー タ ベ ー ス に 登 録 さ れ て い る 16S

埼玉県の水田土壌を用いて放線菌類の分離をrRNA 遺伝子塩基配列の中から Patulibacter mina-行った例では，GPM 培地のみでの出現コロニー

tonensis KV-614T に近い 20 位までを選択して系統数は 2.9×107/g であるのに対し SOD とカタラー樹を作成したものである（2006 年データベース）。

図 2. 新科新属 Patulibacter minatonensis KV-614T の分類学的特徴

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図 3. Patulibacter minatonensis KV-614T に近縁として 16S rRNA 遺伝子塩基配列データベースから選択された配列との系統樹

この中には，一般に微生物分離に用いられる培地分離を行った。その結果，これら低分子物質にもの 200 倍希釈寒天培地で 3 カ月間培養して得られ効果があることがわかった。表 2 には，無添加で13）た菌株（図中で Ellin と表示） や土壌中の DNAは分離されなかった菌株の分類学的研究から新分クローンのみが知られているいわゆる uncultured類群の提唱に至った菌株と用いられたラジカルス

16S rRNA 遺伝子配列（図中で Clone と表示）が多カベンジャーを示した。本方法によって，1 新科

く含まれていた 14,15）。環境中より得られた遺伝子を含む 4 新属，8 新種の提案を行い承認名となっからは存在が示唆されるものの分離例が極めて少た。

ないことを示している。
水田土壌の他に，東京の青山墓地，奄美大島などで採取した計 8 種類の土壌試料を用いて GPM

1-3. 新属新種 Patulibacter minatonensis 近縁菌の土壌試料中における分布頻度

培地に SOD，カタラーゼ，SOD＋カタラーゼ，さ上述の活性酸素除去法により分離された新科新らに，活性酸素除去効果が期待される低分子物質

属 の Patulibacter minatonensis KV-614T は，こ れのアスコルビン酸やルチンを添加して放線菌類のまで，ほとんど分離例のない，いわゆる uncul-Apr. 2012

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65—2139（ 41 ）表 2. 分離培地にラジカルスカベンジャーを添加して分離された新分類群の Actinobacteria

tured Actinobacteria に近縁であった。そこで，本出 さ れ， 16S rRNA 遺 伝 子 配 列 解 析 よ り 5 コ ロ

菌株の土壌中における分布を調べることを目的

ニーが Patulibacter minatonensis と同種（相同性がに，本属および近縁属（Conexibacter と Solirubro-99〜100%）で，2 コロニーは Conexibacter 属の菌bacter）に特異なプライマーを設計し，土壌から株であった。後者 2 菌株は新種と考えられたので直接 DNA を抽出して PCR を行い 590 bp の特異バ

分類学的研究を進め Conexibacter arvalis を提唱

ンドが検出される頻度をみた（図 4）。その結果， し承認名となった 24）。
東京，埼玉，茨城，千葉，沖縄等で採取した 43 土

これらの結果は，これまで分離されなかった菌壌中 31 試料から本菌株近縁菌由来の PCR 産物が株が実は自然界に広く分布しており，方法を工夫検出された。採取した環境も田んぼ，畑，砂，大することによって分離可能になることを示してい木の下など様々であり，実に 72% の土壌試料中にる。

Patulibacter 属近縁属の菌株が存在していることを示している。

自然環境と実験室との間には大きな隔たりがあることは改めて述べるまでもない。Yeast Extract

しかし，この結果のみでは，土壌試料中に生息

Broth が蛍光灯の光に晒されると O−2 や H2O2 を発しているのか DNA のみ存在しているかの判別は生するとの報告 25）や栄養源の豊富な培地を高圧つかない。そこで，バンドが検出された埼玉県の滅菌すると H2O2 が発生し，この培地上で viable

水田土壌を用いて分離を行った。プレート 1 枚にbut non-culturable（VBNC）状 態 に な っ た Vibrio

出現した 91 個のコロニーについてコロニー PCR

vulni¿cus がカタラーゼ添加で生育可能になったを行ったところ，7 コロニーから目的バンドが検との報告がある 26）。

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図 4.

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Patulibacter 属およびその近縁属に特異的なプライマー

太字：Patulibacter 属の属する亜綱 Rubrobacteridae の中で最も近い 2 属にも共通な配列を示す。

これらの報告と上述した我々のデータは，未知Streptomyces 属の占める割合は低く，希少放線菌微生物や VBNC 状態の菌株の中には酸化ストレが数多く分離された。植物によってその優位な属スに弱い菌株が多数存在しており，見落とされては異なるもののその種類も豊富であった。植物試きた可能性を示唆している。

料 4 番のキンギンソウの場合を見てみると計 80株分離され，Micromonospora 属 28.8%（23 株，82. 植物内生放線菌の分離と分類および新規物質の探索種）， Polymorphospora 属 16.3% （13 株， 1 種），

Sphaerisporangium 属 11.3%（9 株，2 種）の順で多2-1. 植物の根からの放線菌の分離数を占め，土壌中で最も頻度の高い Streptomyces

生物活性物質探索のための新たな微生物資源を属は 4 株のみであった。さらに，このなかには，得るために，植物の根に注目し放線菌の分離を行

新 属 Phytohabitans suffuscus K07-0523T と 命 名 しい，種レベルのフローラを調べるとともに，新規提唱した 27）菌株が含まれており，この菌株と同一性の高い菌株について分類学的研究を進めた。ま菌株が 9 株分離された。本属は Micromonosporaceae

た，これら分離菌株を物質生産培地で培養し培養科に属し本属の最も大きな特徴は細胞壁ジアミノ液から新物質探索を行った。

酸として meso- ジアミノピメリン酸と L-リシンの19 種類の植物の根を採取し，表面殺菌後，すり2 種類を含んでいることである。本属の菌株は，潰して試料とし，内生放線菌を分離した。この中他の場所で採取したキンギンソウ，スイバ，ドクの 6 試料については，その根の周囲に付着した土ダミ等からも分離され，分類学的研究の結果新た壌つまり根圏土壌から分離を行い，16S rRNA 遺に 3 種を提唱し承認された 28）。また，もう一つの伝子配列解析による簡易同定を行った。

特徴として，植物の根から Actinoallomurus 属の菌

図 5 には，各試料から分離された菌株の推定属株が高頻度に分離されることがわかった。シュと そ の 数 を 示 し た。多 く の 植 物 試 料 に お い てロ，リュウノヒゲ等からも分離され，Actinoallo-

植物の根から分離された放線菌の属の分布と新物質 Spoxazomicin の構造

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根圏土壌：根の周囲に付着していた土壌矢印：提唱した新属新種

図 5.
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murus radicium K08-0182T 29）を新たに提唱し承認

ロチニンおよびスラミンに比較し 14 〜 21 倍の強された。

い活性を示した。

一方，これらの根の周囲，すなわち根圏土壌 6以上のように，植物から分離された放線菌は分試料においては，Streptomyces 属が優位を占め， 類学的にも生物活性物質探索源としても有用であ
希少放線菌の分離頻度は低く根内部とは異なるフることが示唆された。

ローラを示した。一般の土壌試料から分離される放線菌の 90% 以上が Streptomyces 属を占めると言われており

30），根圏土壌からの分離の結果は

3. マングローブ域由来希少放線菌培養液からの新規物質取得

Streptomyces 属が多いという点で一般土壌と同様汽水域に生育するマングローブ林には多様な微であった。根圏土壌と植物の根内部のフローラが生物が生息することが知られている。そこで西表大きく異なることの要因は未解明である。

島のマングローブ林堆積泥 5 試料を採取し，65 株の放線菌を分離した。16S rDNA 部分塩基配列に2-2. 植物内生放線菌を用いた生物活性物質探索

よる簡易同定を行ったところ，Micromonospora

植物内生放線菌の培養液代謝産物について各種属が 44 株と最も多く，次いで Actinomadura 属，生物活性試験とケミカルスクリーニングの一つとVerrucosispora 属等の希少放線菌が分離され合わしてドラーゲンドルフ反応試験を行った。その結せて 51 株（83%）を占めた。これら希少放線菌の果，生 物 活 性 評 価 系 で は Dinactin, Sinefungin,二次代謝産物の取得を試みた。4 種類の生産培地

Aranciamycin, Juvenimicin A3 等 の 既 知 物 質 が 検で培養し，LC/UV, LC/MS 解析により生産物質の出された。一方，ケミカルスクリーニングでは多様性を比較した。この中から比較的生育が良好

Spoxazomicin と命名した新物質を単離することで新規性が期待される生産物質を含んでいるができた（図 5）31）。本物質の生産菌の分類学的研Lechevalieria sp. K10-0216 を選択し，可溶性デン究を進めたところ Streptosporangium 属に属するプン，脱脂小麦胚芽を主成分とする培地で 27°C，新種であることがわかり Streptosporangium oxa-7 日間の培養を行った。15 L の培養液をエタノー

Tzolinicum K07-0460 を提唱し承認された32）。本

ルで処理して，酢酸エチル抽出物よりサイクロペ

物質は抗トリパノソーマ活性を有し，既存薬エフンタデカン骨格を有する新規物質 Mangromicin A

図 6. 新物質 Mangromicin A および B

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143（ 45 ）および B を得た（図 6）。両物質は抗トリパノソー検討や，代謝産物プロファイル等々，吟味して選マ活性を有し，特許出願を行った。

択した菌株に集中して取り組んだこと。もう一つは，生物活性に加えケミカルスクリーニング的手まとめ法を用いたこと，であると考えている。生物活性評価による選択はその時々の評価系の種類や感度微生物資源拡大を目的に分離源，分離法を開等に左右される。ケミカルスクリーニングはその拓，工夫することによって分離し提唱した 13 新微生物の能力を最大限に生かそうとする研究者の属は，16S rDNA 塩基配列による系統的位置にお執念が問われる。

いても，グラム陽性高 G＋C バクテリア（Actino-微生物は研究者の想像を超える多彩な構造物をbacteria 綱）の中の広範囲に分布する。いわゆる， 提供してくれることを信じて，今後とも菌株 1 株
菌糸の伸長や胞子を形成する従来の放線菌に加ごとにじっくりと向き合い，新規生物活性物質のえ，桿菌状の菌群等様々である。この中には，活探索研究に貢献していきたい。

性酸素除去によって分離された 4 新属 8 新種や植物の根から分離された 1 新属 7 新種が含まれてい謝辞る。ほんの一部であるが，これまで分離されな微生物由来の生物活性物質探索研究において菌かった菌株を分離できたことを示している。今株の分離，培養，分類の重要性を常に説いて下さ

回，土壌中に優先的に生息していると思われる細り，ご指導とご支援を賜った大村

菌が菌体外に多量の SOD を生産することを見出北里研究所名誉理事長に深く感謝申し上げます。

したことは幸運であった。自然環境中の微生物間また，長年に渡り研究へのご助言とご支援をいた相互作用や，実験室と自然環境とのギャップに思だきました岩井

いを巡らし，自然に学ぶことを忘れずに，多様性研究所客員教授に感謝いたします。に富んだ新規微生物の分離に今後とも取り組んで本講演の内容は，（社）北里研究所いきたい。

NEWMAN ら

譲，現智，現（学）北里大学北里生命科学
生物機能研究所時代から，現在の北里生命科学研究所在籍の33）に よ る と 1981 年 か ら 2006 年 の約 10 年間に行われたものであり，ともに研究を25 年間に米国 FDA（United States Food and Drug行った松本厚子博士および多くの研究員，大学院

Administration）で認可された医薬品の低分子化合感染制御科学府の稲橋佑起君と多くの学生の方々

物 974 のうち天然物や天然物がヒントとなって生に厚くお礼申し上げます。また，化合物の構造決まれた物質は 63% を占める。また，その構造も多定では，塩見和朗教授，岩月正人博士，抗トリパ様性に富んでいる。

ノソーマ活性評価では乙黒一彦博士に大変お世話今回示した，Spoxazomicins や Mangromicins はになりました。

有機化学の先生にお聞きしても興味深い構造であるということである。これらの物質を発見できた

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THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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65—2

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