大豆ペプチドによる大豆ペプチドの新規機能性と食品微生物機能改良への利用
食品微生物機能改良の利用• 冷凍パン生地製法におけるパン酵母冷凍耐性の改良• 細胞内リピッドボディ形成の抑制

井 沢 真 吾• 遺伝子発現への影響（マイクロアレイ解析）(京都工芸繊維大学・応用生物)

背景

大豆ペプチドによる酵母冷凍耐性の改善と冷凍パン生地製法への利用
Improvement of tolerance to freeze-thaw stress of baker’s yeast by cultivation with soy peptides

パン職⼈の負担軽減やオンデマンド販売のために冷凍パン⽣地製法が普及↓
冷凍パン⽣地製法による製パン過程では、冷解凍による酵⺟の死滅・発酵⼒の低下がパンの品質を⼤きく左右↓
酵
酵母の冷凍耐性の向上が求められている
冷凍耐性 向上が求められる

1

遺伝⼦組換体を利⽤した⾷品製造は現実的には不可能

酵母冷凍耐性に寄与する因子

トレハロースグリセロール
各種アミノ酸Heat Shock Proteins
ポリ--グルタミン酸

Coutinho et al. (1998) J. Biotechnol.
IIzawaet al.
l (2004) Appl.
A l Microbiol.
Mi bi l Biotechnol.
Bih lTakagi et al. (1997) Appl. Microbiol. Biotechnol.
Kaul et al. (1992) Cell. Mol. Biol.
Yokoigawa et al. (2006) J. Biosci. Bioeng.

遺伝⼦組み換えにより酵⺟冷凍耐性向上は可能
遺伝⼦操作に頼らない技術開発が必要？

遺伝子操作

可食天然成分
食品微生物

OK微生物機能を改良

食品の品質・機能・コストの改善目的

酵母の冷凍耐性を改善する可食天然成分を探索

大豆ぺプチド (Soy peptides)に着目
・ ⼤⾖油の搾りかすをプロテアーゼで分解・ ⾷材・培地として利⽤可能・ 腸からの吸収が容易
高等動物における生理的作用
・ コレステロール軽減作⽤・ 抗脱⽑効果・ 抗酸化能・ 疲労回復効果

Hori et al. (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem.
Tsuruki et al. (2003) FEBS Lett.
Takenaka et al. (2003) Biosci. Biotechnol. Biochem.など多数報告

他の生物種に対する効果や有効利用は限られた情報しかない

酵母に対する効果は ? ? ?

2

酵母の生育に対する大豆ぺプチド培地の効果

大豆ペプチドAsp
ThrSer
Glu
Gly
Ala
Val
Cys
Met
Ile
Leu
TyrPheHis
LysArgPro
Trp

Av. MW = 692

9.71
3.19
4.28
16.0
3.41
3.46
4.01
1.00
1.04
3.85
6.50
3.12
4.41
2.22
5.18
6.36
4.40
1.05

Wet-cell weight (g/550 ml medium)Dry matter
94.1 %
Protein content
83.7 %
free amino acids 27.2 %peptides
pp72.8 %Ash
7.3 %Vitaminbiotin0.421 µg/g
pantothenate
1.5 µg/g
inositol
5.3 mg/g
niacin7.1 µg/g
vitamin B6
1.3 µg/g
riboflavin
1.3 µg/g
thi ithiamine
1 1 µg/g
1.1/MineralZn
35.2 µg/g
Mn15.1 µg/g

Wet-cell weight (g/550 ml medium)

Amino acid (g/100 g SP)

Profile of Soy Peptide

1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0YNB

2.5% CP 2.5% BP 2.5% SP

1.40
1.20CPSP

1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
01.01.52.0

2.53.0 (%)

Cells were cultured at 28 ˚C
C for 80 h (120 rpm) in 800 ml medium
medium.
YNB medium 最小合成培地 (2% glucose)
CP medium
Casein pepton + 2% glucose
BP medium
Bacto pepton + 2% glucose
SP medium
Soy peptides (Av. MW = 692) + 2% glucose

大豆ぺプチド培地による培養で酵母菌体収量が大幅に改善された.

Kitagawa et al. (2008) J. Biosci. Bioeng., 105, 360

酵母の冷凍耐性に対する大豆ぺプチド培地の効果

冷解凍後の生地における残存発酵力（gassing power）の比較

100

Viable cells (%))

80SPDough (70 g) was stored at - 30 ˚C for 7 days,
and then thawed and incubated at 37 ˚C for 3 h.

Non-frozen
doughg6040CP20Frozen/
thaweddoughFrozen/
thaweddoughBPYNB

YNB

2.5% CP

2.5% SP

2.5% BP

2.5% CP

2.5% SP01234567

Period of freezing at -30 ˚C (day)

大豆ぺプチド培地で培養した細胞は、解凍後のパン生地中でも高い発酵力を保持していた

大豆ぺプチド培地による培養で冷凍耐性が大幅に改善された

3

残存発酵力に対する大豆ペプチド濃度の影響

焼成後の食パンの品質
After freeze-thawing

Non-frozen

Frozen/thaweddoughSoypeptides

1.5

2.0

2.53.0 (%)

2.5% 大豆ぺプチド培地で培養した細胞が解凍後のパン生地中で最も良好な発酵力を示したCasein pepton

細胞内遊離アミノ酸の比較

nmole/mg cellss

⼤⾖ペプチドで培養した酵⺟を⽤いた冷凍パン⽣地は・ 解凍後も⼗分に発酵・膨張した
焼成後のパンの外観・⾷感・⾵味も良好
⾷感 ⾵味も良好
・ 焼成後のパンの外観

5 mm
Casein pepton

大豆ぺプチド培地で培養した酵母を利用した冷凍パン生地は焼成後も良好な外観・食感・風味を呈した

要約
⼤⾖ペプチド培地は・ 酵⺟の培養効率・菌体収量を改善した
・ 酵⺟の冷凍耐性を改善した

Soy peptides

CPSP

2015
1050AspPro

Val

AlaArg

遺伝子組換えに頼らない食品微生物の機能改良
大豆ぺプチド培地で培養した酵母細胞は細胞内プロリンレベルが上昇

4

Yeast = Eukaryote

酵母細胞に対する大豆 プチドの作用機構の解析
酵母細胞に対する大豆ペプチドの作用機構の解析

細胞内リピッドボディ形成の抑制

ダイナミックな酵母オルガネラ形態の変化
FragmentedRound

熱ショック
エタノール
低浸透圧vacuoles

酵母リピッドボディ (脂肪滴)Lipid body
Lipid droplet
Lipid particle

高浸透圧

Czabany et al., J. Biol. Chem., 283, 17065 (2008)

Lipid body

Microdomain

Mitochondria

過剰なステロールとジアシルグリセロール(DAG)は脂肪酸とエステル化されて、それぞれステロールエステル(SE)とトリアシルグリセロール(TAG)として脂肪滴(LB)に隔離・貯蔵される. LBは小胞体膜上で形成されると考えられている. LBは単層のリン脂質膜に包まれ、膜上にはTAGリパーゼやSE加水分解酵素など約40種のタンパク質が局在する.

5

酵母のTAG・SE代謝経路

酵母リピッドボディ形成に対する大豆ぺプチド培地の効果

PtdOH

Zymosterol

Nile Red staining

Erg6p
Erg6p
Pah1p
Dpp1p
Lpp1p

Dgk1p
LoggphaseDAG

Erg2p
Erg3p
Erg5pErg4p

Acyl-CoA Ergosterol
Phospholipid

Tgl3p
Tgl4p
Tgl5p

Stationaryphase

YNB(TAGリパーゼ)(TAGリパゼ)

2 5% SP
2.5%

2.5%%CCP

Dga1p
Lro1p

Tgl1p
Yeh1p
Yeh2p

Are1p
Are2p

((SEリパーゼ)リ)(アシル基転移酵素)

SE

TAG

大豆ぺプチド培地による培養はリピッドボディ(LB)の形成を抑制した

青字 主にLB膜上に局在
赤字 主にER膜上に局在

脂質代謝関連遺伝子の転写レベルに対する影響

中性脂質レベルの比較

Logarithmic Stationary
Y C S
Y C S

DGA1

FAT1

LRO1

FAA1

ARE1

FAA2

ARE2

FAA3

TGL3

FAA4

TGL4

FAS1

TGL5

FAS2

ERG6rRNA

エルゴステロール

TAG
Relative amount ( per mg ccells)

Logarithmic Stationary
Y C S
Y C S

2001001005000

FAT FAA

脂肪酸の輸送と活性化因子

YNB
FAS

脂肪酸合成酵素

CPSP

YNB

CP

SP

大豆ぺプチド培地により総TAG量・エルゴステロール量が減少した

6脂肪酸組成への影響

脂質代謝関連酵素の細胞内局在の変化
Erg6p-GFP

100

Faa4p-GFP

Tgl3p-GFP

etc.

80

C18:1 Oleic acid

YNB

C18:0 Stearic acid60

C16:1 Palmitoleic acid
C16:0 Palmitic acid40

CPLeft bars : Logarithmic-phase
Right bars : Stationary-phase

20

SP0YNB

CP

SP
小胞体に局在

液胞に局在

大豆タンパク質由来成分の検討

液胞に局在

要約

Nile Red staining

大豆ペプチドによる酵母細胞の培養で・ リピッドボディの形成が抑制
・ 細胞内中性脂質レベルが低下
・ 定常期におけるアシルトランスフェラーゼ遺伝子DGA1とTAG lipase遺伝子TGL3の転写レベルが低下

SPAmino acids

大豆の主なタンパク質成分

7S

11S

LP( conglycinine)(-conglycinine)(glycinine)(lipophilic proteins)

7S (約30%） 11S (約30-50%) LP (約30%）

大豆ぺプチド培地と同じアミノ酸組成の合成培地や、7S β-コングリシニン由来ペプチド培地ではリピッドボディ形成は抑制されなかった・ 同組成のアミノ酸培地にはリピッドボディ形成抑制効果無し
・ リピッドボディ形成の抑制効果は11S or LPタンパク質由来→→→ DAGおよび脂肪酸の代謝系に対する影響を検討予定→→→ 11SやLP由来の機能性ペプチドの存在を示唆

7

DNAマイクロアレイ解析からのアプローチ

転写レベルに見られる影響

全6000遺伝子の転写量について、カゼインペプトン培地と大豆ペプチド培地培養条件下で比較

酵母のグリコーゲン生合成系

大豆ペプチド培地での培養により• small HSPs遺伝⼦の転写活性化• グルコース取り込み系の抑制• グリコーゲン合成系の活性化

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展望

出芽酵母を用いた解析により• 細胞レベルでの新規機能性の探索• 分⼦レベルでの作⽤機構の解析• 応⽤分野への活⽤を効率的に遂行することが可能

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