Aug. 2014

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―4263（ 49 ）日本感染症医薬品協会奨励賞受賞講演会記録
2013 年 10 月 3 日，学士会館 320 号室【2013 年度受賞講演，座長：藤井 毅】

病原真菌における多剤耐性機序の解明と臨床的重要性の評価
宮崎泰可
長崎大学大学院医歯薬学総合研究科感染免疫学講座（第二内科）

はじめにを紹介したい。

臓器移植や免疫抑制薬，抗癌剤などの医療の進
歩や HIV/AIDS 患者の増加に伴い，日和見感染症

侵襲性カンジダ症診療の現状と抗真菌薬耐性が与は増加の一途にある。特に，侵襲性カンジダ症やえるインパクト

侵襲性アスペルギルス症のような深在性真菌症

カンジダ属は，ヒトの皮膚や口腔内，腸管，腟は，有効な抗真菌薬が限られており，治療に難渋などの粘膜に常在しており，皮膚・粘膜バリアのすることも少なくない。そのような中で，多剤耐破綻が起こると，血液中に侵入しカンジダ血症を性病原真菌の出現は，人類において，特に免疫不発症する。主要なリスク因子として，好中球減少

全患者にとってはきわめて重大な問題である。こなどの免疫抑制状態，広域抗菌薬の使用，中心静れまで人類と病原菌の戦いは，新規薬剤開発と耐脈カテーテルの留置などがあげられる 1）。原因菌性菌出現の いたちごっこ であったが，病原真種として最も頻度が高いのは Candida albicans で菌における抗真菌薬耐性機序の解明は，今後の薬

あ り 約 半 数 を 占 め る。次 い で， C. glabrata や剤開発のみならず，既存薬剤の有効利用にも寄与

Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida

するものと考えられる。

krusei などが分離される 2）（図 1）。

筆者らはこれまでカンジダ属やアスペルギルス

カンジダ血症は，初期治療の遅れにより致死率属の薬剤耐性について研究を行ってきた。2013 年が高くなるため，臨床症状を伴う血液培養陽性度の日本感染症医薬品協会奨励賞受賞講演会で患者では，迅速な抗真菌薬投与を検討すべきであは，日常診療で遭遇する頻度が最も高い深在性真る 3〜6）。現在，カンジダ血症に対して使用される菌症である侵襲性カンジダ症に焦点をあて発表を主な抗真菌薬として，アゾール系薬（フルコナ行った。本項では侵襲性カンジダ症診療の現状とゾール，イトラコナゾール，ボリコナゾール），これまでに明らかになっている抗真菌薬耐性機序キャンディン系薬（ミカファンギン，カスポファを概説し，臨床上最も問題視されている Candidaンギン），ポリエン系薬（アムホテリシン B リポ

glabrata の抗真菌薬耐性に関して我々の研究内容ソーム製剤）がある。C. albicans は他のカンジダ［Proceedings］TAIGA MIYAZAKI: Elucidation of multiantifungal resistance mechanisms in pathogenic
fungi and their clinical impacts.

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図 1. 侵襲性カンジダ症の原因菌種

2010 年〜2011 年に臨床分離されたカンジダ 3,107 株の解析（SENTRY サーベイランスプログラム）。（文献 2 をもとに筆者作成）

種よりも病原性は高いが，アゾール系，ポリエンている。わが国や米国の診療ガイドライン 1,9）は，系，キャンディン系の全てに良好な感受性を示

非好中球減少患者でカンジダ血症が疑われる場す。一方，non-albicans Candida は，菌種によって合，C. glabrata や C. krusei が原因菌種であるリス感受性パターンが異なる。一般に，C. glabrata はク（例えば，高齢者や担癌患者，最近のアゾール系アゾール系薬全般に感受性が低い傾向にある。 薬の使用歴など）がなく重症度が低い患者にはフC. krusei はフルコナゾール耐性であるが，ボリルコナゾールを，それ以外の患者にはキャンディコ ナ ゾ ー ル に は 感 受 性 を 示 す こ と が 多 い。 C.

ン系薬を初期治療薬として推奨している。2012 年

parapsilosis は，他のカンジダ種と比較して in vitroに公表された欧州の診療ガイドライン 10）は，わがでのキャンディン感受性が低い。C. tropicalis は， 国や米国の考え方とは若干異なり，フルコナゾー

C. albicans 同様に 3 系統全ての抗真菌薬に感受性

ルの推奨度を下げ，比較的どのカンジダ種にも有を示すことが多いが，特に好中球減少患者では病効なキャンディン系薬を初期治療薬として推奨し

7）原性が高いことが報告されている 。その他，稀ている。キャンディン系薬は安全性も高く使用しに分離される菌種として，Candida lusitaniae がアやすいため，実際わが国でもカンジダ血症治療薬

ムホテリシン B に，Candida guilliermondii が，フとして最も使用されている。日本医真菌学会のガルコナゾールやイトラコナゾール , キャンディン

イドラインが推奨しているカンジダ血症の標的治系薬に低感受性であることが多い。2000 年代前半

療薬を表 1 に示す。しかし，予想通りキャンディの米国におけるカンジダ血症の菌種別死亡率をみ

ン耐性株が近年増加しており 11），なかでもアゾーると，C. glabrata や C. krusei が原因菌種の場合， ル系とキャンディン系の両系統に耐性を示す C.
他の菌種よりも死亡率が高いことが示されていglabrata の増加は特に問題視されている 12,13）（図る 8）。患者背景の違いはあるものの，これら 2 菌2）。当然のことながら，多剤耐性株が増加すると種が他菌種よりも病原性が強いわけではないた

治療薬の選択肢はきわめて限られてくる。このよめ，当時頻用されていたフルコナゾールに対してうに，抗真菌薬耐性は侵襲性カンジダ症の予後と低感受性であることが要因の一つとして推察され治療薬の選択に大きな影響を及ぼしている。

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表 1. カンジダ血症の標的治療

好中球減少患者と非好中球減少患者に分けて，原因カンジダ種に対する初期治療薬を推奨度（A 〜 C）とエビデンスレベル（I 〜 III）の組み合わせで示す。カンジダ属検出（菌種不明）とは，血液培養で酵母様真菌が検出されたが菌種がまだ同定されていない時点を指す。第一選択薬を下線あり，代替薬を下線なしで示す。空欄は使用が推奨されない場合である。
略語：F-FLCZ, fosfluconazole; VRCZ, voriconazole; ITCZ, itraconazole; L-AMB, liposomal amphotericin B; MCFG, micafungin; CPFG,caspofungin。（文献 9 をもとに筆者作成）

抗真菌薬の作用機序とカンジダ属における抗真菌ゾール耐性を獲得する 14）。薬剤排出ポンプには，薬耐性機序

ATP-binding cassette（ABC）transporter と major（1）アゾール系薬

facilitator superfamily（MFS）transporter が あ り，アゾール系薬の作用機序は，真菌細胞膜の主要基質特異性などに違いがある。ABC transporter と成分であるエルゴステロールの合成阻害である。 して代表的なものに Cdr1 と Cdr2 があるが，前者

ERG11 遺 伝 子 に よ っ て コ ー ド さ れ て い るの方が重要な役割を担っている。複数の耐性機構

lanosterol 14Į-demethylase が標的分子であり，静が同時に存在すると，より高度な耐性が誘導され（表 2）。また，カンジダ
真 菌 的 に 作 用 す る。こ れ に 対 し カ ン ジ ダ は， ることも知られている 12）

ERG11 の変異による薬剤親和性の低下，ERG11が血管内デバイスなどに付着しバイオフィルムをの発現亢進，ERG3 遺伝子の変異による有害ステ形成すると，キャンディン系やポリエン系薬と比ロール蓄積の回避，薬剤排出ポンプの活性化によ較してアゾール系薬の抗真菌効果は著しく低下する細胞内薬剤濃度の低下などの機序によってアる。

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図 2. フルコナゾール耐性 Candida glabrata のキャンディン系薬に対する感受性の推移

2001 年〜2004 年と 2006 年〜2010 年の期間に分離されたフルコナゾール耐性（MIC≧64 μg/ml）C. glabrata の中で，キャンディン系薬に耐性および中等度耐性株の割合を示す。なお，フルコナゾール耐性株の 98.8% がボリコナゾールにも非感受性であった。
略語：ANFG, anidulafungin; CPFG, caspofungin; MCFG, micafungin; MIC, minimum inhibitory concentration（μg/ml）。
（文献 13 をもとに筆者作成）

表 2. Candida albicans におけるアゾール耐性機序と MIC の関連薬剤標的である ERG11 の変異は，ヘテロ変異よりもホモ変異の場合に，より感受性が低下する（DSY3604 vs. DSY3083）。薬剤排出ポンプの活性化と ERG11 変異の両者が存在すると，より高度な耐性が誘導される（DSY296）。
略語：MIC, minimum inhibitory concentration; VRCZ, voriconazole; FLCZ, fluconazole。（文献 12 をもとに改変）（2）キャンディン系薬

し殺菌的に作用する。ȕ1,3-D-グルカン合成酵素

カンジダの細胞壁はȕ- グルカン，マンナン，キは，それぞれ FKS 遺伝子と RHO 遺伝子によってチンなどの多糖類で構成されており，キャンディコードされている触媒サブユニットと調節サブユン系薬はこの中のȕ1,3-D-グルカンの合成を阻害

ニットからなる複合タンパクであるが，FKS 遺伝Aug. 2014

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67―4267（ 53 ）子産物がキャンディン系薬の標的分子である。 サブユニットはこの複合体と結合することによっ

FKS1 や FKS2 遺伝子の変異が主要なキャンディて自己抑制ドメインによる触媒部位の抑制が解か

ン耐性機序として知られている。

れ，カルシニューリンが活性化される 17）。活性化されたカルシニューリンは，標的分子である Crz1（3）ポリエン系薬転写調節因子を脱リン酸化する。細胞質内で脱リアムホテリシン B 製剤の作用機序は，細胞膜エン酸化された Crz1 は，その後核内に移行し，標的ルゴステロールの直接破壊といわれている。他系遺伝子の転写を調節することによって種々の細胞統の薬剤よりも腎障害などの副作用が多い。C.

反応を促進する 18〜20）。

lusitaniae のようなごく一部の菌種を除き，ほと我々は，C. glabrata のカルシニューリン情報伝

んどのカンジダ種はアムホテリシン B に対して良達経路と抗真菌薬耐性の関連を調べるため，カル好な感受性を示す。

シニューリンの制御サブユニットをコードしている CNB1 遺伝子，およびカルシニューリンの標的

カルシニューリン情報伝達経路と抗真菌薬耐性転写因子をコードしている CRZ1 遺伝子の欠損株

こ れ ま で に ， C . a l b i c a n s や A s p e rg i l l u sをそれぞれ作製し，その表現型の解析を行った 21）。

fumigatus, Cryptococcus neoformans などいくつか

各 C. glabrata 株 に 対 す る ア ゾ ー ル 系 薬 の 最 小の主要な病原真菌において，カルシウム依存性タ発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration:ンパク質脱リン酸化酵素であるカルシニューリンMIC）を表 3 に示す。カルシニューリン欠損株（ǻが，種々のストレス応答に重要な役割を担っていcnb1）は，野生株と比較して高いアゾール感受性15,16）。カルシニューを示したが，Crz1 転写調節因子欠損株（ǻcrz1）でリンは，触媒サブユニット（CNA）と制御サブユはアゾール感受性の増強は認められなかった。こニット（CNB）によるヘテロダイマーを構成してのことより，C. glabrata のカルシニューリンはおり，どちらか一方でも欠けると，その酵素活性Crz1 非依存性の機序でアゾール耐性に関与してることが明らかにされているは失われる

17）。ある種のストレスを受けた細胞で2＋いる可能性が示唆された。次に我々は，標準的な濃度が上昇し，カルモデュリン-

time-kill assay22）を用いて，フルコナゾール存在下Ca2＋複合体が形成される。カルシニューリン触媒での経時的な生菌数のモニタリングを行った（図は細胞内 Ca

表 3. Candida glabrata のカルシニューリン欠損株（Δcnb1）とΔcrz1 欠損株のアゾール系薬に対する感受性

アゾール系薬の MIC は，酵母真菌薬剤感受性キット ASTY（極東製薬工業，東京）を用いて，微量液体希釈法で測定した。
（文献 21 をも
略語：MIC, minimum inhibitory concentration; FLCZ, fluconazole; ITCZ, itraconazole; VRCZ, voriconazole。とに改変）

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図 3. Candida glabrata のカルシニューリン欠損株に対するフルコナゾールの殺真菌効果

フルコナゾール存在下で培養した Candida glabrata 野生株，遺伝子欠損株，回復株の生菌数を経時的に解析した。
（文献 21 をもとに筆者作成）

3）。C. glabrata の野生株，ǻcrz1 株，各遺伝子回ディン系薬の他に，ȕ-D- グルカンとキチンのファ

復株は，高濃度のフルコナゾールに曝露されてもイバー形成を阻害する Congo red やキチンのポリ増殖を続けることが可能であった。一方，ǻcnb1

マー形成を阻害する FDOFRÀXRUZKLWH なども細胞株は，通常の培養環境では野生株と同等の増殖能壁ストレスを誘導する薬剤として知られている。

を示すが，フルコナゾール存在下では生菌数の有ǻcnb1 株ではこれらの薬剤に対する寛容性が著し意な減少が確認された。アゾール系薬による真菌く低下しており，カルシニューリンは細胞壁スト細胞の増殖抑制は，通常静菌的作用であり，このレス応答にも重要な役割を担っていることが示唆ことが耐性菌を生み出す一因ともされている。今された（図 4）。一方，CRZ1 の欠損は，ǻcnb1 株

回の実験結果から，カルシニューリンを阻害するとほぼ同等のミカファンギン感受性を誘導したことによって，フルコナゾールに殺菌的作用を誘が，Congo red に対してはわずかに感受性を高め導できることが確認された。

たのみで，FDOFRÀXRUZKLWH 感受性に対しては全くまた，C. glabrata におけるカルシニューリンの影響を及ぼさなかった。このことより，細胞が受欠損は，キャンディン系薬ミカファンギンに対すけたストレスの種類に応じて，カルシニューリンる感受性も高めることが確認された 21）。キャンは Crz1 依存性および非依存性の機序でストレスAug. 2014

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67―4269（ 55 ）図 4. Candida glabrata のカルシニューリン欠損株（Δcnb1）とΔcrz1 の細胞壁ストレスに対する感受性

10 倍ずつ段階希釈した Candida glabrata 細胞をコントロール培地および薬剤含有培地に接種し，30°C で 48 時間培養後に増殖能を評価した。（文献 21 をもとに改変）

図 5.

低濃度ミカファンギンへの曝露により誘導されたミカファンギンおよびアゾール系薬に対する感受性の低下曝露解除株は，ミカファンギンを含まない培地で 20 日間継代培養し作製した。10 倍ずつ段階希釈した Candida glabrata 細胞をコントロール培地および薬剤含有培地に接種し，30°C で 48 時間培養後に増殖能を評価した。
最小発育阻止濃度は，酵母真菌薬剤感受性キット ASTY（極東製薬工業，東京）を用いて，微量液体希釈法で測定した。
略語：MCFG, micafungin; FLCZ, fluconazole; ITCZ, itraconazole; VRCZ, voriconazole。

応答に関与していることが示唆された。

を阻害することによって，フルコナゾールによる

C. glabrata はアゾール系薬に低感受性であるこ

殺菌作用を誘導し，また，他のアゾール系薬やミとが最も重要な問題であるが，カルシニューリンカファンギンに対しても感受性を高めることが可270（ 56 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS能であった。

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謝辞

2013 年度の日本感染症医薬品協会奨励賞受賞
C. glabrata における多剤耐性機序の解明
上述したように C. glabrata は臨床上重要な菌種であるが，加えて，本真菌を用いた分子生物学にあたり，これまでご指導いただいた長崎大学第二内科の河野 茂教授および諸先生方，本賞の選考委員の先生方に心より感謝申し上げます。

的研究には以下のような利点がある。
（1）haploidであり遺伝子操作が比較的容易であること，（2）文献

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キャンディン系薬の使用頻度が増加するにつれて，キャンディン低感受性あるいは耐性を示す C.

glabrata 株が臨床現場で分離されるようになってきた。そのため実験的に，C. glabrata の野生株をin vitro でミカファンギンに曝露したところ，容易にミカファンギン低感受性の C. glabrata 細胞を創りだすことができた。さらに驚くことに，このC. glabrata 細胞は，キャンディン系薬とは作用機序が異なるアゾール系薬（フルコナゾール , イト
ラコナゾール , ボリコナゾール）に対しても高度耐性を獲得していた（図 5）。その後ミカファンギンを含まない培地で 20 日間継代培養しても，耐性を保持していた。この耐性獲得株は，キャン
ディン系薬とアゾール系薬の標的遺伝子であるFKS 遺伝子や ERG11 に変異を有していなかったため，未知の耐性機序によるものと推察された。
今後は，カルシニューリンとの関連なども含め，詳細なメカニズムを分子生物学的に解明していく必要がある。また，海外の共同研究者と協力しながら臨床分離株の解析を行うことで，臨床的な重要性も評価していく予定である。

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THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICSSURVSHFWLYHQDWLRQZLGHVXUYHLOODQFHVWXG\&OLQ
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