日本大学歯学部紀要 36，17‑24，2008

チタンイオンが骨芽細胞株（Saos‑２）の生細胞およびサイトカイン産生に及ぼす影響（第３報)
横瀬

勝美

桑田

文幸

Effect of titanium ion on cell viability, IL‑1α and IL‑6 production
by the human osteosarcoma cell line, Saos‑2
Katsumi Yokose and Fumiyuki Kuwata
Abstract
The present study investigated the effects of titanium ion on cell viability and production
ofinterleukin 1α(IL‑1α)and interleukin 6(IL‑6)using the human osteosarcoma cell line Saos
‑2.Cells were cultured in DM EM supplemented with 10% FBS and antibiotics for 24 h before
the addition of 0.1 mM of TiCl . Cell viability was assessed following incubation for 1, 2, 3,
or 4 weeks by a colorimetric assay using a LDH cytotoxic test. In addition, the productionof IL‑1αand IL‑6 in these cells was examined using ELISA.The addition of 0.1 mM titanium
ion did not alter cell viability during week 1, but induced cell did not death after more than
2 weeks.M oreover,the addition of titanium ions had little effect on IL‑1αand IL‑6 production in these cells. These results indicate that the addition of 0.1 mM titanium ion induces
osteosarcoma cell did not death, but increase cytokine production.
Keywords: cell viability,IL‑1αproduction,IL‑6 production,osteosarcoma cell,titanium ion

緒にあると言える。口腔内にはそれ以外にも，各言種の溶出要因が共存しており，歯肉から浸出す

近年インプラント医療が普及し，歯科治療にる体液・食べかすによる電解質の存在・細菌がおいても歯が喪失した場合，歯科補綴修復物の産出する酸や硫化水素・温度や酸素の濃淡など

他，インプラント治療が行なわれる。その際，の変化・咬む力が働く部分の金属に起こる応力

歯科用金属は生体中に長期間埋入される。この腐食や咬耗などがある

ように金属材料と生体は密接に接触するように

ト材料として優れた実績を有しているチタン

なり，局所的為害作用に加え全身的為害作用まは，有床義歯，架橋義歯や欠損補綴材料としてでに至っているとえられる。金属材料は口腔も幅広く使用されているが，そのような環境下

内で唾液や飲食物などが電解質として作用し，で使用されている歯科用金属の中でも特に，生pH 変化や各種イオン等による腐食性変化を生体親和性に優れている金属の一つとしてよく知じ，長時間のうちに溶出され，口腔内においてられている。しかし，そのインプラント材とし様々な要因が複雑に絡み合い極めて過酷な環境て使用されている金属によるアレルギーを訴え

日本大学歯学部化学教室
日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門〒 101‑8310 東京都千代田区神田駿河台１‑８‑13

Department of Chemistry, Nihon University School of
Dentistry
Division of Functional M orphology, Dental Research(受理：2008年９月３日）

Center, Nihon University School of Dentistry
1‑8‑13 Kanda‑Surugadai, Chiyoda‑ku, Tokyo 101‑8310, Japan17。歯科用イオンプラン

日本大学歯学部紀要 36，17‑24，2008

る 患 者 が 近 年 増 え，臨 床 報 告 も 増 加 し て い

５％CO の湿潤条件下で培養を行った。

る

２. 細胞障害率（経時的変化）。
著者らは，先に歯科用金属の金属イオンが口生細胞へのチタンイオンによる経時的変化の

腔軟組織，とくに上皮組織におよぼす影響を解

影響を調べるために，24穴プレートに Saos‑２

明する第一ステップとして，歯科補綴物の成分

細胞１×10 個/cm を播種し，500μl の DMEMであるクロムおよびニッケル，歯科修復物の合（10％FBS および抗生物質を含有）で培養を開金中に存在する亜鉛について，ヒト口腔由来上始した。Saos‑２細胞播種後，24時間後にチタン

皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞数および DNA 合イオン（TrCl ）を含む DMEM（10％FBS およ

成能に及ぼす影響について報告した。また，

び抗生物質を含有）に交換した。生細胞へのチ

チタンイオン高濃度，短時間における生細胞へ

タンイオン経時的変化の影響を調べるためにその経時的変化を調べた。チタンは歯科インの作用時間をそれぞれ１，２，３および４週間

プラントに代表されるような金属であり，深部として培養を行った。なお，培地中のチタンイ

組織内に長期埋植する生体材料である。
しかし，

オン（TiCl ）は終末濃度 0.1mM になるようにチタンの症例報告などから解るように，チタン添加した。チタンイオンを作用させた後，無血インプラント装着後数年してアレルギー症状が清の DMEM と交換し 24時間培養後，上清を回現れ，その多くが遅延型である。使用されてい収する。回収した上清は 3000rpm，５分遠心し，る金属は長期間深部組織内に埋入されることかLDH‑Cytotoxic Test（和光純薬）を用い細胞ら，本研究はヒト骨肉腫由来の株化骨芽細胞

障害率を比色測定した。また，実験は２連で行（Saos‑２）を使用し，低濃度のチタンを５日間い，結果は平まで添加し，生細胞数への経時変化およびサイ化を比較するため，チタンイオン無添加の場合

トカイン産生に及ぼす影響ついて検討を行っをコントロールとし，DMEM（10％FBS およびた 。

抗生物質を含有）で４週間培養を行った。

値で示した。金属イオン経時変

３. IL‑1αおよび IL‑６産生

本研究ではチタンの影響をヒト骨肉腫由来の株化骨芽細胞（Saos‑２細胞）を使用し，更に長材料および方法の２. と同様に，24穴プレー

時間添加し経時的変化およびインターロイキン

トに Saos‑２細胞を播種後，24時間後，チタン‑1α（IL‑1α）およびインターロイキン‑６（IL

イオン（TiCl ）の濃度，0.1mM を含む DMEM

‑６) の産生に及ぼすチタンイオンの経時的変に交換し，その作用時間をそれぞれ１，２，３化もあわせて検討した。

および４週間として培養を行った。その後，無血清の DMEM と交換し，24時間後それぞれの材料および方法

培養上清を回収後，IL‑1α定量用 ELISA キット（BioSource）お よ び IL‑６ 定 量 用 ELISA

１. 細胞培養
実験には骨芽細胞として理化学研究所細胞開キット（BioSource）を用いて上清中のサイトカ

発 銀 行 か ら 購 入 し た Saos‑２ 細 胞 を 使 用 い

イン量を定量した。コントロールは材料およびた方法の２. と同様である。

。Saos‑２細胞は，Dullbeccoʼ
s modified

Eagle medium（DM EM ，旭テクノグラス）に，10％ウシ胎児血清（FBS，旭テクノグラス），50
U/ml ペニシリンおよび 50μg/ml ストレプト

成績

１. 細胞障害率（経時変化）

マイシン（Sigma）を加えた培地を用い，37°
C，
18

Saos‑２細胞にチタンイオン（TiCl ）0.1mM

骨芽細胞とチタンイオン

濃度を添加した影響を第１図（経時的変化（細養を行った。チタンイオン添加により細胞障害

胞障害率））に示した。

率は，コントロールでは 15.0％，１週間では

第１図では，チタンイオン（TiCl ）濃度 0.1

22.1％，２ 週 間 で は 22.9％，３ 週 間 で は

mM ，作用時間１，２，３および４週間として培

24.25％，４ 週 間 で は 14.6％の 細 胞 障 害 率 で第１図 Saos‑２細胞の細胞障害率に及ぼすチタン
イオンの影響第４図

第２図

Saos‑２細胞 control形態

第５図

チタンイオン 0.1mM２週間作用させたときの細胞形態

チタンイオン 0.1mM３週間作用させたときの細胞形態

第３図

チタンイオン 0.1mM１週間作用させたときの細胞形態第６図

19

チタンイオン 0.1mM４週間作用させたときの細胞形態日本大学歯学部紀要 36，17‑24，2008

あった。チタンイオン添加後ではコントロール

2.99pg/ml，になり，徐々に増加した。

から徐々に細胞障害率が増加し，４週間後は細３. IL‑６産生

胞障害率はコントロールとほぼ同じ状態になっ

Saos‑２細胞の IL‑６産生におよぼすチタ

た。チタン作用時間（コントロール，１週間〜４ンイオン（TiCl ）濃度の経時的変化の影響を調週間）ごとの細胞状態を図２〜６に示した。

べた結果を第２表，第８図に示した。
Saos‑２細胞の IL‑６産生におよぼすチタン

２. IL‑1α産生
コンフルエントに達した後の Saos‑２細胞のイオン（TiCl ）濃度の経時的変化の影響を調べ

IL‑1α産生におよぼすチタンイオン（TiCl ）た結果，IL‑６産生量はチタンイオン（TiCl ）0.1mM 濃度の経時的変化の影響を調べた結果

濃度 0.1mM コントロールでは 1.19pg/ml，１

を第１表，第７図に示した。

週間作用させ培養した場合で 2.58pg/ml，２週間で 2.90pg/ml，３週間で 3.66pg/ml，４週間

Saos‑２細胞の IL‑1α産生におよぼすチタ
ンイオン（TiCl ）濃度の経時的変化の影響を調で 4.73pg/ml となった。IL‑６産生量は時間とべ た 結 果，IL‑1α産 生 量 は チ タ ン イ オ ン

共に徐々に増加がみられた。

（TiCl ）濃度 0.1mM コントロールは測定検出

察

限界以下のため測定不可であったが，１週間作用させ培養した場合は 1.14pg/ml，２週間で本研究に使用したチタンはさまざまな医療材

2.07pg/ml，３週間で 2.99pg/ml，４ 週 間 で料に使用されており，その化合物は皮膚病の治第１表 Saos‑２細胞の IL‑1αの産生に及ぼす
チタンイオンの影響

第２表 Saos‑２細胞の IL‑６産生に及ぼすチタン
イオンの影響IL‑1α量(pg/ml)

作用時間

平

IL‑６量

値

作用時間

(pg/ml)平値

Cont.
１ week２ week３ week

＜0.80
1.210
1.945
2.99

＜0.80
1.060
2.180
2.99

0.00
1.14
2.07
2.99

Cont.
１ week２ week３ week

1.906
2.610
2.842
3.56

1.923
2.543
2.965
3.76

1.91
2.58
2.90
3.66

４ week

2.99

2.99

2.99

４ week

4.78

4.67

4.73

第７図 Saos‑２細胞の IL‑1αの産生に及ぼすチタンイオンの影響

第８図 Saos‑２細胞の IL‑６産生に及ぼすチタン
イオンの影響20

骨芽細胞とチタンイオン

療薬，化粧品，食品添加物としも使用されてい（抗原）となり，マクロファージなどに取り込まるため，安全性についての試験がいくつかなさ

れ，様々な免疫反応が起こり遅延型アレルギーれており，毒性は低いとの報告が数多いとして発症すると報告されている

。し

。このよ

かし，ラットにチタンを吸入，経気道的暴露しうにチタンは生体親和性に優れているとされてた実験結果では，肺癌が検出されたという報告きたが，金属アレルギーの症例報告も多く，チもされている

タンが生体内で様々な作用をしていると

。

えら

れる。

生体に必須な微量金属であってもそれ自信や
環境化学物質との共存下で発癌性を示す場合が

著者らは，歯科用インプラント材として使用あり，それら金属は活性酸素を生成させ DNA

されているチタンについて口腔由来上皮細胞株を損傷させることにより発癌に関する危険性が（Ca 9‑22）を 使 用 し チ タ ン の 影 響 を 検 討 しあるとた

えられている。その反面微量金属の発。本研究ではチタンの影響が遅延型であ癌における防御的作用として，細胞の恒常性をるという症例報告

維持すると同時に遺伝子の損傷を修復すること

トに代表されるような深部組織内に長期埋植すもあり，歯科インプラン

により癌化の抑制にも関与している。微量金属

る生体材料でもあるため，生細胞数への経時変が，癌化または癌抑制のどちらに作用するかは，化およびサイトカイン産生におよぼす影響をヒ

その種類，量および環境化学物質との共存など

ト骨肉腫由来の株化骨芽細胞（Saos‑２）を使用

により大きく異なる。また DNA 損傷を検出す

し，長期間作用させた検討を行った。

ることにより微量金属による発癌の危険性の評

生細胞数に及ぼす影響を生細胞障害率の測定

価を簡易に行うことは，癌の初期予防に貢献すに は LDH 測 定 法 を 用 い た。本 測 定 の LDH

るだけでなく，薬理作用を検証するうえでも非‑Cytotoxic Test は細胞毒性を簡便に測定でき常に重要であるといえる。

るばかりでなく，細胞が細胞膜に障害を受けて歯科治療にも様々な歯科用金属が使用されて細胞から遊離した LDH（乳酸脱水素酵素）活性

いるが，それらの多くは合金として歯科用修復を測定することができ，生理活性物質による細物，補綴物，矯正用材料等に使われている。歯胞障害や細胞性免疫による細胞障害，補体依存科治療の技術の発展にともない歯科用金属は歯性細胞障害，抗体依存性細胞障害の他，細胞のの硬組織への局所的修復だけでなく，歯科イン生存率にも利用できることからこの方法を用いプラントに代表されるような深部組織内に長期た。コントロールは血清培地で４週間培養を行埋植する生体材料が使用されるようになった。

い，上清を回収する前の 24時間を無血清培地と歯科においてチタンは歯科用インプラント材と交換し上清を回収し測定を行った。チタンを添して優れた実績を有しているが，近年チタンイ

加し作用させた細胞はチタン作用時間後同様にンプラント材が原因で発症したと思われる金属

無血清飢餓状態 24時間行い，上清を回収し測定

アレルギーの症例報告があるを行なった。同時に血清培地中で細胞状態を観。生体適合性察した。

が優れているチタンでも金属アレルギーを引き起こす患者が増えている。口腔内の様々な要因

細胞障害率は第１図に示したように，チタンが総補的に起きている可能性があるが，そのメイオン添加後ではコントロールから徐々に細胞カニズムの一つとして，金属の一部がイオン化

障害率は３週間までは増加したが，４週間後でし，これが表皮や粘膜上皮のケラチンなどのタは細胞障害率がコントロールと同じになった。

ンパクと結合することによって異質のタンパク

チタン作用時間後の細胞状態をコントロール，
21日本大学歯学部紀要 36，17‑24，2008

１週間〜４週間ごとの細胞状態（図２〜６）をSaos‑２細胞の IL‑６産生量はチタンイオン

観察すると，低濃度では細胞障害率が３週間ま

低濃度（0.1mM ）添加後，IL‑1αが徐々に増加

では時間と共に，細胞の萎縮した部分が少し見し，それに対処するように Saos‑２細胞の ILられるが，４週間では細胞が密になり細胞の萎‑６産生量も僅かずつ増加した。
以上のことからチタンイオンによるヒト骨肉

縮した部分があまり見られなくなっていた。
サイトカイン産生におよぼす影響をチタンイ腫由来の株化骨芽細胞への影響は，長時間チタオンの経時的変化にあわせて検討した。インンを作用させた場合サイトカイン産生を増加さ

ターロイキン‑1α（IL‑1α）は単核球が産生すせた。炎症性サイトカインである IL‑1α，IL‑６る歯骨細胞刺激因子の主成分であることが明ら

は破骨細胞性骨吸収の促進作用をもつため，骨かにされて以来，IL‑1αの骨代謝・骨疾患との吸収サイトカインともよばれていることから，関連が検討されて，最も強力な骨吸収促進因子

本研究により Saos‑２細胞がチタンイオンによの１つである。IL‑1αはきわめて低濃度で，ヒり産生された IL‑1α，IL‑６が破骨細胞に影響

ト骨髄細胞より歯骨細胞を誘導する作用をもを及ぼす可能性がち，更に骨芽細胞を介して間接的に歯骨細胞の

えられる。

謝

活性化を促進する。一方，IL‑1αはヒト骨芽細辞胞の DNA 合成促進作用を示し，コラーゲン合本研究の一部は平成 19，20年度日本大学歯学成に関しては少量で促進，大量で抑制作用を示

部佐藤研究費によって行われたことを付記す

すため，チタンイオンが Saos‑２細胞の IL‑1αる。

の産生を促進するかどうか調べた。

文

その結果，Saos‑２細胞の IL‑1α産生におよ献

ぼすチタンイオン（TiCl ）濃度の経時的変化の１) Brune D (1986) Metal release from dental

影響を調べた結果，IL‑1α産生量は表１，第７biomaterials. Biomaterials 7, 163‑167
２) 井上昌幸，山中秀夫編著（1993）歯科と金属ア

図に示したように，コントロールは測定検出限

レルギー．デンタルダイヤモンド社，東京

界以下のため測定不可であったが，１週間以降

３) 佐藤温重編（1997）歯科材料の副作用と安全性．

は徐々に増加した。しかし，産生量は少なく 0.1

学健書院，東京

mM の低濃度ではチタンの添加により，少量ではあるが IL‑1α産生量があったことを

４) John CW (2000) Biocompatibility of dental

え併せ，IL‑６産生量の測定を行った。IL‑６は B 細casting alloys. Areview J Prosth Dent 83(2),223‑234

胞刺激因子として純化されたサイトカインであ５) 五島孜郎，糸川嘉則（1994）生体内金属元素．

るが，骨芽細胞光生館，東京，155‑156

でも産生され，IL‑1α，６) 不破敬一郎（1982）生体と重金属．講談社，東TNF，PTH，などによりその産生が促進され間

京，52‑53

接的に破骨細胞の活性化をも促進するため，チ

７) Bridgewater LC, Manning FC, Woo ES,

タンイオンが Saos‑２細胞の IL‑６産生を促進

Patierno SR (1994) DNA polymerase arrese

するかどうかを調べた。
そ の 結 果，Saos‑２ 細 胞 の チ タ ン イ オ ンby adducted trivalent Chromium. 9(3), 122‑133（TiCl ）添加による，IL‑６産生量は，表２，第８) 横瀬勝美，桑田文幸（2001）口腔由来細胞株

８図に示したように IL‑６産生量は時間と共に（Ca 9‑22）の生細胞数および DNA 合成能に及
ぼす金属イオンの影響．日大歯研紀（一般教育）

徐々に増加がみられた。
22

骨芽細胞とチタンイオン

29，37‑44

ide atmospheric hydrolysis products for two９) 横瀬勝美，桑田文幸（2002）亜鉛イオンが口腔

years. Toxicol Appl Pharmacol 83, 3019) Ahing‑Hsin K, Dominique PP, Martin B,

由来上皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞数，DNA

Petre JG (2002), Effect of different Ti‑6Al‑4V surface treatments on osteoblasts behav-

合成能およびサイトカイン産生に及ぼす影響．
日大歯研紀（一般教育）30，49‑58
腔由来上皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞およびサ

iour. Biomaterials 23, 1447‑1454
20) 今井敏夫，岩上徳志，白川正順（2003）骨芽細イトカイン産生に及ぼす影響．日大歯紀 31，９胞の細胞増殖機構に及ぼすチタンの影響につ‑1611) 横瀬勝美，桑田文幸（2004）チタンイオンが口いて．Biomed Rse Trace Elements 14，
374‑376

腔由来上皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞およびサ

21) 井上孝，秦暢宏，才藤純一，下野正基（2000）

10) 横瀬勝美，桑田文幸（2003）クロムイオンが口

イトカイン産生に及ぼす影響．日大歯紀 32，

インプラントと金属アレルギーの25‑34

科評論，101‑110

察．日本歯12) 横瀬勝美，桑田文幸（2005）チタンイオンが口22) 細川隆司，赤川安正（2002）チタンインプラン

腔由来上皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞およびサトも対する金属アレルギーのリスク．広大歯誌
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イトカイン産生に及ぼす影響
（第２報）
．日大歯

23) 長島義之，吉永修，森永博臣，岡松加恵，山本

紀 33，19‑28
13) 横瀬勝美，桑田文幸（2006）チタンイオンが骨

勝巳，森田雅之，城戸寛史，松浦正朗（2004）

芽細胞株（Saos‑２）の生細胞およびサイトカイ

他院で埋入後経過不良のためインプラントをン産生に及ぼす影響．日大歯紀 34，７‑14

撤去した症例の臨床的検討および撤去後の補14) Spyrou P, Papaioannou S, Hampson G,

綴処置について．日口腔インプラント誌 17，
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