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細胞機能の変容と循環を視る～可逆性と不可逆性から探る細胞分化の本質～
オーガナイザー
小田 祥久
国立遺伝学研究所新分野創造センター(総合研究大学院大学遺伝学専攻兼任)〒411-8562 静岡県三島市谷田 1111
Yoshihisa Oda
The plasticity and irreversibility of plant cell differentiation
Key words: cell differentiation, dedifferentiation, embryogenesis, single-cell analysis, pluripotency
Center for Frontier Research, National Institute of Genetics
Yata 1111, Mishima, Shizuoka, 411-8540, Japan
細胞分化は多細胞生物の発生の根幹を為す現象です。細胞が個体を形作る機能的な細胞へと分化してゆく現象は、細胞内外の構造から代謝，エピゲノム状態の変化に至る多様なイベントを含み，生命システムを理解する上で重要かつ魅力的なものです。植物ではほとんどの体細胞が細胞壁を介して相互に連結しているため、細胞分化は細胞の分裂パターンと共に時間的，空間的に厳密にかつ柔軟に制御される必要があります。植物の体細胞は比較的容易に脱分化し分化多能性を発揮することから、その高い可塑性は良く知られています。一方で，死細胞あるいは仮死状態となって永く個体の生存に寄与する非可逆的な振る舞いも一部の細胞に見られます。植物が相対的な細胞の位置関係を変えることなく器官を構築して成長することを考えると、このような細胞分化の特性は実に合理的であることが分かります。この細胞分化の特性の背景にある分子的な仕組みはこれでほとんど明らかにされていませんでしたが、近年のバイオイメージングや次世代シークエンサー等の目覚しい技術進歩を背景に、いよいよその仕組みの一端が見えてきました。
こうした状況を踏まえ，日本植物学会第 79 回大会（2015 年 9 月）において「細胞機能の変容と循環を視る～可逆性と不可逆性から探る細胞分化の本質～」と題してシンポジウムを企画しました。
このシンポジウムでは細胞分化の分野で活躍されている若手の研究者にご登壇をお願いし，植物細胞の分化に関して技術的な話題も含め最新の知見を紹介して頂きました。本総説集は，このシンポジウムの内容を再構成したものです。前半の 3 つの総説では細胞分化の制御機構をテーマとして、
師部細胞分化の制御機構、
特殊な環境下を生き抜くコケ植物特有の細胞分化制御機構、傷害に伴う細胞の脱分化の制御機構についてご紹介します。後半の 3 つの総説ではより技術的な側面に着目し、初期胚のイメージング解析技術、木部細胞分化の制御技術、1 細胞解析技術とその細胞リプログラミング研究への応用についてご紹介します。本稿が皆様のご研究の一助となれば幸いです。最後に，シンポジウム開催に当たってお世話になりました大会実行委員の先生方，
本総説集を発表する機会を下さった電子出版物編集委員の先生方に御礼を申し上げます。
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篩要素分化におけるオルガネラ消失のダイナミクス
古田 かおり 1, 2，宮島 俊介 1，中島 敬二 1，Yka Helariutta3,4,51
奈良先端科学技術大学院大学 バイオサイエンス研究科〒630-0192 奈良県生駒市高山町 8916-52
日本学術振興会、〒102-0083 東京都千代田区麹町５－３－１
3Institute of Biotechnology/Department of Biological and Environmental Sciences, University
of Helsinki, FIN-00014, Finland.
4
Cardiff University Cardiff School of Biosciences, The Sir Martin Evans Building,Museum Avenue, Cardiff, CF10 3AX, UK.
5
The Sainsbury Laboratory, University of Cambridge, Bateman Street, Cambridge,
CB2 1LR, UK.
Kaori Miyashima Furuta1,2, Shunsuke Miyashima1, Keiji Nakajima1, Yka Helariutta3,4,5
The dynamics of organelle degradation in Arabidopsis sieve element differentiation
Keywords; Arabidopsis, enucleation, NAC45/86, phloem, sieve element
1
Graduate School of Biological Sciences, Nara Institute of Science and Technology.
8916-5 Takayama, Ikoma, Nara 630-0192, Japan
2
Japan Society for the Promotion of Science. 5-3-1 Koujimachi, Chiyoda-ku,
Tokyo 102-0083, Japan
3
Institute of Biotechnology/Department of Biological and Environmental Sciences, University
of Helsinki, FIN-00014, Finland.
4

Cardiff University Cardiff School of Biosciences, The Sir Martin Evans Building,Museum Avenue, Cardiff, CF10 3AX, UK.
5
The Sainsbury Laboratory, University of Cambridge, Bateman Street, Cambridge,
CB2 1LR, UK.
１．はじめに細胞は細胞分化を経て，各々の細胞機能を獲得する。iPS 細胞などの報告により細胞分化の可塑性が注目される中，不可逆的な細胞分化過程をたどるものがある。特に一部の細胞では，その細胞機能を獲得するためにオルガネラ消失を伴う。哺乳類の赤血球や目の水晶体線維細胞では，酸素の運搬やレンズによる集光というそれぞれの細胞機能に関連して，プログラム
された核の消失が見られる（Nagata 2005）。この核を含むオルガネラの消失は，酸素の運搬における細胞内のヘモグロビン含有量の増大や，集光のためのレンズの透明性の維持に，それぞれ役立っていると考えられている。維管束植物では導管と篩管が，それぞれの細胞内で水や光合成産物を輸送するという輸送管としての細胞機能に関連して，その細胞分化過程で，導管の細胞は細胞壁を残してプログラム細胞死を引き起こし，篩管の細胞は核などのオルガ
ネラを消失する（Esau 1950, Furuta et al. 2014a）。
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維管束の原生篩部は，主に篩要素と篩伴細胞からなる。篩要素は輸送路を形成し，高度に連結する篩伴細胞によって機能的にサポートされている。細胞分化過程で細胞死を起こす木部導管とは異なり，篩要素は生細胞である。篩要素の輸送管としての細胞機能に関連した細胞の特徴は，古くから多くの植物学者によって詳細に記述されてきた（Evert 1977, Cronshaw
1981, Sjolund 1997）。興味深い特徴の一つは，種によって程度は異なるが，篩要素が成熟過程で細胞質成分を簡素化することである。細胞質成分の簡素化において，核の消失，粗面小胞体やゴルジ体の不活性化，細胞質基質の希釈などが起こる（図 1A）。また，細胞質成分の簡素化だけではなく細胞壁成分の形態も機能的に変化し，細胞壁の肥厚や，篩要素間に篩孔を持つ篩板の形成が起こる。さらに，転流を調節するのではないかと推測されている Pprotein など，篩要素特異的な細胞構造の構築が見られる。このような細胞の形質の獲得は，結果的に効率のよい物質輸送に関与していると考えられる。
しかし，細胞分化の側面から見ると，篩要素細胞がこの特徴を獲得するうえでの分子制御機構については，ほとんどわかっていなかった。そこで本稿では，私たちが明らかにした篩
要素の細胞分化の分子制御機構を紹介する。

図１．篩要素の形態（A）篩要素の細胞分化の模式図。
（B）シロイヌナズナの根の原生篩部の篩要素。Furuta et al.（2014a）の図を一部改変。

２．篩要素の不可逆的な細胞分化過程
２－１．核消失
篩要素の細胞分化をその不可逆性から考える上で，大きな特徴の一つにプログラムされた
核消失が挙げられる。真核生細胞におけるプログラム核分解過程は，様々な生物種で見られ，その様式は様々である。哺乳類の赤血球では細胞成熟における核消失過程が一番研究されている例であるが，核はわずかな細胞質とともに細胞から押し出され，押し出された核は
マクロファージにより貪食されることで脱核する（Bessis & Bricka 1952, Sadahira & Mori
1999）。繊毛虫のテトラヒメナでは，飢餓状態などで接合による有性生殖が起こり，このとき減数分裂，接合核の融合，有糸分裂，核分解を経て核の再編成が起こるが，この核の分解にはオートファジーが関与している（Liu & Yao 2012）。水晶体繊維細胞の核消失には動物特
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異的な DLAD という DNA 分解酵素が関与していることが報告されている（Nishimoto et al.
2003）。
篩要素の核消失過程では，これまで切片を用いた観察などにより，細胞分化過程で核小体の断片化やクロマチンの凝集，DNA の切断がみられることは報告されていた（Eleftheriou &Tsekos 1982, Wang et al. 2008）。そこで我々は，シロイヌナズナの根の篩要素の核消失過程を
３次元的な電子顕微鏡解析や蛍光マーカーを用いた生細胞イメージングにより，さらに詳細に観察した。シロイヌナズナの根では，静止中心（QC）付近で，根の放射パターンに沿って細胞系譜が決定されるため，篩要素は一列の細胞列で観察される（Mähönen et al. 2000,
Bonke et al. 2003）。また，メリステムで細胞が生み出され，順々に分化していくので，一細胞列で経時変化を追うことができる（図１B）。
我々は，Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy（SBF-SEM; Denk & Horstmann2004）を用いた３次元的な走査型電子顕微鏡解析を行った。化学固定したシロイヌナズナの根をブロックに埋め，１サンプルごとに 10-20 細胞の篩部要素細胞について，40 nm の間隔で数千から１万枚の SEM 画像を取得した。その後，3View ソフトウェアで３次元構築した。その結果，核消失後も核膜は残ること，核消失と細胞質基質の希釈は近いタイミングで起こるということ，核消失に伴い核の容量が小さくなることなどが見出された（図 2）。残存する核膜様構造が核の残存物であることは，この構造体に核膜孔があることから判断している。

図２．SBF-SEM を用いた篩要素の核消失過程の観察（A）篩要素細胞列。左から順に分化がす
すんだ細胞。徐々に分化がすすむ段階を stage 1，核消失の直前を stage 2，核消失直後を stage
3 と表示。Stage 3 では核消失と細胞質基質の希釈が同時に見られる。
（B）各分化段階の篩要
素細胞を抜き出して表示。核消失後（stage 3）も核膜が残っている様子が見られる。Furuta etal.（2014b）の図を一部改変。
核消失に関与するメカニズムについて，シロイヌナズナのオートファゴソームをマークするマーカーATG8a（Yoshimoto et al. 2004）が細胞分化途中の篩要素で選択的に発現していることを見出し，篩要素の核消失におけるオートファジーの関与が期待された（図 3A）。しかし ATG8a は，細胞質で点様のシグナルとして観察され，テトラヒメナのように核を包むようなシグナルは観察されなかった（図 3B）。同様に，lytic vacuole 形成の核消失への関与も
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考え，液胞マーカーである VAMP711（Geldner et al. 2009）の局在も調べたところ，ATG8aと同様に細胞質に点様のシグナルが観察され，核を包むようなシグナルは見られなかった（図 3C）。さらに，SBF-SEM を用いた解析からも，オートファゴソームや Lytic vacuole の核への関与は見られなかった。
では，どのように核は消失するのだろうか。先述の通り，３次元的走査型電子顕微鏡の観察から，シロイヌナズナの篩要素の核消失では核膜が残ること，また核の容積が小さくなったため，どのように核の内容物が消失するのかを観察した。核の内容物のマーカーとして
YFP 結合型ヒストン 2B（H2B-YFP）を用い，これを篩要素特異的に発現させ，動画解析した。その結果，H2B シグナルは核から細胞質へ拡散し，その後シグナルが消えることがわかった（図 3D）。これにより，核の中身が核外へ出て分解され，核膜は縮小して残るという，
哺乳類の赤血球やテトラヒメナとは異なる過程を経て，核消失が起こるということが明らかになった。

図３．シロイヌナズナの篩要素の核消失（A）オートファゴソームマーカーpATG8a:GFPATG8a は篩要素細胞列で選択的にシグナルが見られる。野生型と同様の篩要素分化を示す
nac86 変異体背景で PI 染色と二重染色。（bar = 50 μm）（B）オートファゴソームマーカー
GFP-ATG8a の篩要素細胞内での点様の局在。 nac86 変異体背景で DAPI 染色と二重染色。
黄矢印：核消失直前の篩要素細胞，青矢印：核消失直後の篩要素細胞。（C）液胞マーカー
GFP-VAMP711 の篩要素細胞内での点様の局在。 nac86 変異体背景で DAPI 染色と二重染色。黄矢印：核消失直前の篩要素細胞。（D）核マーカーH2B-YFP の篩要素核消失における経時変化。矢印は，核様のシグナルが細胞質へと拡散し消失する様子を示す。Furuta et al.
（2014b）の図を一部改変。

２－２．核以外のオルガネラの形態変化
篩要素の細胞分化において，核以外のオルガネラ形態変化は，いつどのように起こるのだ
ろうか。SBF-SEM を用いて篩要素のオルガネラ形態変化を観察すると，核小体の断片化やオートファゴソームの形成，細胞壁の肥厚，篩板の形成は，篩要素分化の初期にすでに見ら
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れることがわかった。これに対し，ゴルジ体の不活性化は核消失の直前に起こることがわかった。これにより，篩要素の細胞分化過程には，若い篩要素から徐々に起こるイベント（stage 1）と，核消失直前に短時間で起こるイベント（stage 2）の少なくとも２つの段階があると考えられた。

図４．シロイヌナズナの篩要素分化におけるミトコンドリア形態の変化（A）篩要素細胞列の各細胞における代表的な形のミトコンドリアを示す。SBF-SEM で画像から３次元構築した。右の方が分化のすすんだ篩要素細胞。若い篩要素細胞では細長いミトコンドリアが，徐々に丸くなり，核消失後はお椀型になる。（B）篩要素細胞列の各細胞におけるミトコンド
リアの数。ミトコンドリアの断片化を推測させる数の増大はみられなかった。（C）stage 1（cell 2）と stage 2（cell 6）のミトコンドリアの容積と長軸の長さ。Stage 2（cell 6）ではミトコンドリアの長軸の長さが短いものが増えるが，容積は大きくは変わらない。Furuta et al.
（2014b）の図を一部改変。
また興味深いことに，篩要素の分化に伴って，ミトコンドリアの形態が変化していくことを見出した（図 4A）。未分化な篩要素細胞（stage 1）では細長いミトコンドリアが観察されるが，核消失の直前（stage 2）になると丸いミトコンドリアが観察された。核消失後の篩要素（stage 3）では，お椀型のミトコンドリアが観察された。当初は，ミトコンドリアの不活化を伴う断片化がおこっていると考えたが，SBF-SEM により各篩要素細胞内のミトコンド
リアの数を数えたところ，予備的であるが，ミトコンドリアの形が変わってもミトコンドリ
アの数の増加はみられなかった（図 4B）。また，各篩要素細胞のミトコンドリアの容積を調べたところ，未分化な篩要素細胞と核消失の直前の篩要素細胞では，ミトコンドリアの容積
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は大きく違わないことがわかった（図 4C）。これらの結果から，若い篩要素では細長いミト
コンドリアが観察されていたのが，核消失直前に丸いミトコンドリアが観察されるのは，ミトコンドリアの断片化の結果ではなく，形の変化であることが推測された。この形の変化についての生物学的意義は今後解明していきたいと考えている。

３．篩要素分化の分子制御機構
これまでに篩部の形成に必要な因子として MYB 型転写因子の ALTERED PHLOEM（APL）
転写因子が篩部の運命決定に必要な因子として報告されている（Bonke et al. 2003）。この APLは，篩要素と篩伴細胞で発現し，篩要素特異的なマーカーJ0701 や篩伴細胞特異的な AtSUC2の正常な発現に必要である。また apl 突然変異体の根では篩要素の位置に木部の環状要素ができる。しかし，篩部系譜の細胞を作る非対称分裂は起こっていることから，初期の篩部形成はおこっていると考えられる。
私たちは，篩要素の細胞分化過程を制御する機構を明らかにするため，APL の下流の制御因子を探索することを目的とした。野生型と apl 変異体の篩部の細胞のトランスクリプトー
ムをマイクロアレイで比較し，18 個の転写因子を含む篩要素特異的な遺伝子を見いだした。そのうち，NAC ドメイン転写因子の NAC45 と NAC86 は篩要素特異的に発現しており（図 5A, B），その発現は APL 依存的であった。また nac45/86 二重変異体は植物体が小さくなり，強いアレルでは芽生え致死になるという apl 変異体様の表現型を示した。さらに
nac45/86 二重変異体では，篩部輸送に異常があることを明らかにした。
そこで私たちは，篩要素の細胞分化過程に異常があるかどうかを調べた。そこで，まず篩要素の篩板形成を SBF-SEM を用いて調べた。その結果，nac45/86 二重変異体でも，野生型
同様に細胞壁に肥厚や篩板形成は起こることがわかった（図 5C）。次に，nac45/86 二重変異体における細胞内消化を調べるために，核マーカー（H2B-YFP）の篩要素分化過程における挙動を調べた。野生型では篩要素分化に伴い H2B-YFP シグナルが消失するが，nac45/86 二重変異体では伸長した篩要素でも H2B-YFP のシグナルが検出され，核消失が正常に起こっていないことが分かった（図 5D）。さらに，SBF-SEM 解析により，nac45/86 二重変異体では，核小体の断片化やミトコンドリアの形態変化は起こるが，細胞質基質の希釈やゴルジ体の不活性化が正常に起こらないことが分かった（図 5E）。これらのことから，NAC45/86 は篩板形成など篩要素の細胞壁の分化や，比較的若い篩要素で起こる細胞内変化の制御には関与しないが，篩要素分化における細胞内消化を特異的に，かつ統合的に制御することがわかった。
では，NAC45/86 転写因子はどのように篩要素の細胞内消化を制御しているのだろうか。
私たちは，NAC45/86 のターゲット因子を探索するために，マイクロアレイにより野生型とnac45/86 二重変異体の根端のトランスクリプトームを比較した。この解析から，核酸分解ド
メインを持つ核局在タンパク質，NAC45/86-DEPENDENT EXONUCLEASE-DOMAINPROTEIN（NEN4）が同定された。NEN4 は篩要素特異的に発現し，その発現は NAC45/86に依存していた（図６A-C）。そこで，NEN4 の機能を調べるために，nen4 変異体を解析した
ところ，野生型と比べて根がやや短いという表現型が見られた。次に nen4 変異体の篩要素分化における核消失を調べた。野生型では篩要素分化に伴い H2B-YFP シグナルが消失する
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が，nen4 変異体では根の伸長領域の篩要素でも H2B-YFP シグナルが残っていた（図６D,E）。興味深いことに，nen4 変異体の H2B-YFP シグナルは，若い篩要素細胞では楕円形の核に一様のシグナルが見られるが，本来なら核消失が完了していると考えられる篩要素細胞では，核の周縁部でシグナルの強いドーナツ様のシグナルが観察された（図 6D, E）。そこで
SBF-SEM を用いて詳細に nen4 変異体の篩要素を観察したところ，野生型では核の内容物が消失しているが，nen4 変異体では核の内容物が一部核膜に付着するように残っていた（図6F, G）。これは，H2B-YFP のドーナツ様のシグナルと一致すると考えられる。この nen4 変
異体では，細胞質基質の希釈は起こっていた（図 6F）。このことから，NEN4 は核消失の完了に特異的に必要であることが分かった。

図５．NAC45/86 は篩要素分化の細胞内消化を特異的に，かつ統合的に制御する （A と B）
NAC45 と NAC86 の発現場所。pNAC45:GFP-GUS（A）と pNAC86:GFP-GUS（B）のシグナ
ルは篩要素で特異的に見られる。細胞の輪郭は PI 染色。（C）野生型と nac45/86 二重変異体における篩板形成。SBF-SEM で観察した。二重変異体でも篩板は形成される。（D）野生型と nac45/86 二重変異体における核消失。核マーカーH2B-YFP（白矢印）は，野生型では細胞分化に伴い消失する（青矢印）が，二重変異体ではシグナルが残っている（黄矢印）。細胞の輪郭は PI 染色。
（E）野生型と nac45/86 二重変異体における細胞内消化。SBF-SEM で観察した。二重変異体では核消失だけではなく，細胞質基質の希釈もおこらない（stage 3）。
Furuta et al.（2014b）の図を一部改変。

４．おわりに
私たちの研究から，篩要素の不可逆的な細胞分化の象徴とも言える細胞内消化を統合的に，かつ特異的に制御する分子機構が明らかになった。特に同定された NAC45/86 は，核小体の断K. Furuta-7
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片化など篩要素分化の初期イベントは制御しないが，核消失やゴルジ体の不活化，細胞質基

質の希釈など，細胞内消化の最終ステップを開始する因子であると考えられた。また核の内容物が核外へ拡散し分解されるという機構を明らかにし，真核細胞のプログラムされた核消失機構の多様性の新たな理解に貢献することができた。本研究結果は 2014 年に学術誌に報告した（Furuta et al 2014b）。

図 ６ ． NEN4は NAC45/86の 下 流で 核消 失の 完 了に 必 要で ある （ A） NEN4 の 発 現場 所。
pNEN4:erYFPのシグナルは篩要素特異的に見られる。細胞の輪郭はPI染色。（B）NEN4の
NAC45/86依存性。pNEN4:erYFPのシグナルはnac45/86二重変異体では見られなくなる。 細胞の輪郭はPI染色。
（C）NEN4は核に局在する。 pNEN4:NEN4-YFPは篩要素特異的に核にシグナルが見られる。細胞の輪郭はPI染色。
（DとE）野生型とnen4変異体における核消失。核マーカ
ーH2B-YFP（白矢印）は，野生型では細胞分化に伴い消失する（青矢印）が，変異体ではシグナルが残っている（黄矢印）。細胞の輪郭はPI染色。
（FとG）野生型（F）とnen4変異体（G）
における細胞内消化。野生型では核内のクロマチン様構造は見られなくなるが，変異体では核膜付近にクロマチン様構造が見られる（赤矢印）。細胞質基質の希釈やゴルジ体の消失は起こる。 SBF-SEMで観察した。黒矢印は核膜の破れを示す。 Furuta et al.（2014b）の図を一部改変。
篩要素の核消失はダイナミックな現象である。他の生物種の核消失と比べると異様だが，篩要素の輸送管としての細胞機能を獲得するために，NAC45/86 転写因子を含め様々な分子機構によって厳密に制御されていると考えられる。現在私たちは、核消失に異常がある突然変異

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体をスクリーニングしている。すでにいくつかの突然変異体を単離し，原因遺伝子についても同定をすすめている。未だ明らかになっていない実働的な分子制御機構を同定することか
ら，細胞分化の本質に迫りたいと考えている。
また，核小体の断片化やミトコンドリアの形態変化など，NAC45/86 非依存的なプロセスを制御する機構についてもよくわかっていない。篩要素特異的に発現する Callose synthase 7（Cals7）や篩要素で強く発現する CHOLINE TRANSPORTER-LIKE1（CHER1）は正常な篩板の篩孔形成に必要であることが報告されている（Barratt et al. 2011, Xie et al. 2011, Dettmer
et al. 2014）が，細胞壁の肥厚や篩板形成などの篩要素の細胞壁成分の分化を制御する機構は未だ不明である。今後研究が発展することが期待される。

謝辞
本研究をすすめるにあたり，共著者のHelsinki UniversityのSatu Lehesranta博士，Ilya Belevich
博士，Jung-ok Heoさん，Ove Lindgren博士，Panu Somervuo博士，Raffael Lichtenbergerさん，Raquel Rochaさん，Sari Tähtiharju博士，Petri Auvinen教授，Eija Jokitalo教授，Indian Institute ofTechnology のShri Ram Yadav博士，Stanford UniversityのAnne Vatén博士，Wageningen UniversityのBert De Rybel博士，Ghent UniversityのGert Van Isterdaelさん，Tom Beeckman教授，Mahidol
UniversityのSiripong Thitamadee博士に感謝いたします。また，技術面で支援してくださった，
Helsinki UniversityのAri Pekka Mähönen博士，Ricardo Siligatoさん，Iris Sevilemさん，Katia
Kainulainenさん，Mikko Herpolaさん，M. Lindmanさん，A. Salminenさん，奈良先端科学技

術大学院大学の乾奈布子さんにも感謝いたします。
また，本稿を書くに当たり，大阪大学の柴岡弘郎名誉教授と東京大学の福田裕穂教授にアドバイスをいただきました。この場を借りてお礼申し上げます。

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K. Furuta-10
BSJ-Review 7:152 (2016)

植物科学最前線 7:153 (2016)ࢥࢣ᳜≀࡟࠾ࡅࡿࢽࢵࢳᡓ␎ࡢࡓࡵࡢ⣽⬊ศ໬㖡ⱏ࡟࠾ࡅࡿ↓ᛶⱆࡢศ໬
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Toshihisa Nomura1, Seiichiro Hasezawa2, Hitoshi Sakakibara1,3
Cell differentiation for niche strategy in bryophytes-Gemma differentiation in copper mossesKeyword: bryophytes, copper moss, gemma, niche, Scopelophila cataractae
1

RIKEN Center for Sustainable Resource Science, 1-7-22 Suehiro-cho, Tsurumi,
Yokohama, Kanagawa 230-0045, Japan2

Department of Integrated Biosciences, Graduate School of Frontier Sciences,

The University of Tokyo, 5-1-5 Kashiwanoha, Kashiwa, Chiba 277-8562, Japan3

Department of Biological Mechanisms and Functions, Graduate School of

Bioagricultural Sciences, Nagoya University, Furo, Chikusa, Nagoya, 464-8601,
Japan㸯㸬ࡣࡌࡵ࡟
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T. Nomura-1
BSJ-Review 7:153 (2016)

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T. Nomura-2
BSJ-Review 7:154 (2016)

植物科学最前線 7:155 (2016)ᅗ㸰㸬࣍ࣥࣔࣥࢪࢦࢣ࡟ࡘ࠸࡚
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Shaw 1994㸧ࠋࡇࡢࡼ࠺࡞ࢥࢣ᳜≀✀ࡀ㸪࡝ࡢࡼ࠺࡟ࡋ࡚㖡ࡢ㇏ᐩ࡞⎔ቃࢆ᥈ࡋ㸪ᐃ╔ࡋ࡚࠸ࡿࡢ࠿ࡣ⏕ែ࠾ࡼࡧ⏕⌮Ꮫⓗ࡟⯆࿡῝࠸ࡀ㸪ࡑࡢᐇែࡣ᫂ࡽ࠿࡟࡞ࡗ࡚࠸࡞࠸ ໭ᕝ1987 ࠋࡲࡓ㸪࣍ࣥࣔࣥࢪࢦࢣ࡛ࡣ㸪᭷ᛶ⏕Ṫࡀ㠀ᖖ࡟⛥࡛࠶ࡾ㸦㬼ἑ & బ➉ 2010, Show 1989 24⣽⬊㸦୺࡟ࡣ3⣽⬊㸧࠿ࡽᵓᡂࡉࢀࡿ↓ᛶⱆ㸦ᅗ2B, C, Nomura & Hasezawa 2011, Rumsey &Newton 1989㸧ࢆ⏝࠸࡚↓ᛶⓗ࡟ศᕸࢆᣑ኱ࡉࡏ࡚࠸ࡿ࡜⪃࠼ࡽࢀ࡚࠸ࡿࠋᚑࡗ࡚㸪࣍ࣥࣔࣥࢪࢦࢣࡣ㸪ࢡ࣮ࣟࢼ᳜ࣝ≀ࡢ⏕ែ◊✲ࡢᑐ㇟࡜ࡋ࡚ࡶ⯆࿡῝࠸✀࡛࠶ࡿࠋ

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T. Nomura-3
BSJ-Review 7:155 (2016)

植物科学最前線 7:156 (2016)2015, ᅗ3E, F㸧ࠋࡇࡢ⤖ᯝࡣ㸪࣍ࣥࣔࣥࢪࢦࢣࡀⓎ㐩ࡢึᮇẁ㝵࡟࠾࠸࡚㸪⎔ቃ୰ࡢ㖡⃰ᗘ࡟ᛂࡌࡓ⣽⬊ศ໬ࡢไᚚᶵᵓࢆ᭷ࡍࡿࡇ࡜ࢆ♧၀ࡍࡿࠋ
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T. Nomura-4
BSJ-Review 7:156 (2016)

植物科学最前線 7:157 (2016)ࡿ࣍ࣥࣔࣥࢪࢦࢣࡢሙྜ㸪㧗⃰ᗘࡢ㖡ࡀ࡞࠸⎔ቃࡣ㸪➇த┦ᡭࡀᏑᅾࡍࡿࡓࡵ㸪⏕⫱࡟୙฼࡞≧ἣ࡜࡞ࡿࠋㄏᑟࡢせᅉࡣ␗࡞ࡿࡀ㸪ୖグࡢ౛࡜㢮ఝࡋࡓᶵᵓ࡟ࡼࡾ㸪↓ᛶⱆᙧᡂࡀㄏᑟ
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BSJ-Review 7:157 (2016)

植物科学最前線 7:158 (2016)ࡑࡢᚋ㸪↓ᛶⱆࡢ⣽⬊ෆᵓ㐀࡟ኚ໬ࡀ㉳ࡇࡾ㸪↓ᛶⱆࡀᡂ⇍ࡍࡿ㸦࠾ࡑࡽࡃࡇࡢ᫬࡟
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T. Nomura-6
BSJ-Review 7:158 (2016)

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T. Nomura-7
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植物科学最前線 7:160 (2016)

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植物の再生現象における分化全能性制御の分子機構
岩瀬 哲，池内 桃子，杉本 慶子
理化学研究所環境資源科学研究センター〒230-0051 神奈川県横浜市鶴見区末広町 2-7-11
Akira Iwase, Momoko Ikeuchi, Keiko Sugimoto
Molecular mechanisms on exerting totipotency in plant regeneration
Key words: callus, dedifferentiation, epigenetics, histone modification,
phytohormone, totipotency, transcription factor,
RIKEN Center for Sustainable Resource Science
1-7-22 Suehiro-cho, Tsurumi-ku, Yokohama-shi, Kanagawa
230-0045, Japan

１．はじめに生物の再生とは，個体の一部分が失われた時に，それに該当する部分が修復されたり，個体の一部から個体全体が作られたりする現象である。傷を負った生物が見せる再生現象にはいつも魅了されるが，そこに生物の生きようとする強い力を感じるためだろう。例えばイモリ(両生類)は切断された脚，傷害を受けた心臓や眼のレンズなども再生させる（Straube & Tanaka 2006）。私達
ヒトでも，傷ついた皮膚や腸管の再生が日常的に起きているし（Staniszewska et al. 2011, van ES &Sato et al. 2012），切り出した肝臓の一部を生体移植できるのも肝細胞に再生能力が備わっているからである（Yimlamai et al. 2014）。その他，非脊椎動物のヒドラ（刺胞動物），プラナリア（扁形動物），ナマコ（棘皮動物），ヤマトヒメミミズ（環形動物），ショウジョウバエ（節足動物）など
様々な生物種で組織レベルや個体レベルの再生現象が報告されている（Galliot et al. 2006, Hyman
1951, Gracia-Arraras et al. 2011,
Yoshida-Noro&Tochinai

2010,

B

A

３ヶ⽉後

Belacortu & Paricio 2011）。
植物も例外ではない（図 1, 筆者の iPhone で撮影）
。寧ろ最も身近な生物と言える植物の再生現象の方が私たちにとってより馴染み深いかもしれない。剪定された街路樹
は，やがて傷口周辺から多くの新芽を出す。挿し木や挿し葉法では，植物体の一部を切り取って土や水に挿しておくが，暫くすると切断面か
らは根や茎葉が出てきて新たな個

図１．傷害ストレスによる植物の再生（A）ウチワサボ
テンの一部を切り取り，外植片としてそのまま土の上に置いておく（点線丸）。
（B）3 ヶ月後, 新しい芽と根が再生していた。この方法は江戸時代の農書にも紹介されている（岩崎 1833，阿部 1837）。Scale: 1 cm。
A. Iwase -1
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体が再生する。このような植物の再生能に基づいた増産法や育種法は園芸や農業で古くからよく利用されており，日本でも江戸時代に諸技術を体系的に纏めた著書も出ている（宮崎 1697, 岩崎
1833, 阿部 1837）。
1 つの細胞が，体を構成するすべての細胞に変化できる能力を分化全能性という。単離した 1つの体細胞から植物体を再生させた歴史的な研究から（Steward et al. 1958, Nagata & Takebe 1971），
植物細胞は一度分化した後も分化全能性を発揮できることが知られている。植物の高い再生能力はこの分化全能性に裏打ちされたものと考えられるが，傷を受けた植物はどのように分化全能性を発揮し，また，通常の発生の過程において，不必要な分化全能性の発揮を抑えているのだろうか。本稿では，植物の分化全能性発揮の分子メカニズムの解明を目指す私たちの最近の取り組み
から見えてきた事例を中心に紹介したい。種々の植物種のカルス（不定形の細胞塊）化，再生現
象や由来となる細胞，それらの分子機構については私たちの他の総説により詳しくまとめているのでそちらも参照されたい（Ikeuchi et al. 2013, 岩瀬ら 2015, 池内ら 2015, Ikeuchi et al. 2016）。

２．再生に寄与する細胞
傷害誘導性の再生様式は参加する細胞の分裂特性によってシンプルに二分できる。一つは傷害部位の周りの細胞が分裂を伴わずに再編成される場合であり，もう一つは新しく細胞分裂によって作られた細胞が参加する場合である。細胞分裂が起こる際には，さらに「幹細胞」（自己複製能と多分化能の両方を併せ持った細胞）の参加の有無でもその様式が分けられる。すなわち，予め存在した幹細胞，もしくは，脱分化などの過程を経て新しく作られた幹細胞が組織や器官を生み出すのか，傷害部位で分裂を再開した細胞が単に失われた部分を埋めるように用いられるかによって区別できる｡ 動物では，これら分裂能の異なった細胞が混在して再生現象が遂行されると考えられている（Tanaka & Reddin 2011）。
動植物を問わず簡単に具体例を挙げてみよう。新しく分裂を伴わない再生は，例えばヒドラの傷修復の一形態として知られているが，既に存在していた細胞が移動して再生に寄与する（Cummings & Bode 1984，Bosch 2007）。この種の再生現象が植物に存在しているのかはよく分
かっていないが，細胞壁同士の接着によってレンガが積み重なるように体が作られ，細胞が移動できない植物においては困難かもしれない。植物で分裂を伴う再生に関しては，例えば部分的に切り込みが入った花茎の切断面を経時的に観察すると，維管束系と表皮の間にある髄（pith）の細胞が細胞分裂をして，切断で生じた空間的なギャップを埋めていく様子が観察される（Asahina et al. 2011，朝比奈 2015）。プラナリアでは身体中に予め散在する幹細胞が傷害部位に集まって再生現象が起こると言われている（Baguna et al. 1989）。先端の芽（頂芽）を失った植物
では脇芽が伸びてくるが，これも予め存在し，休眠状態であった幹細胞が成長を再開することによって起きていることが知られている（Müller & Leyser 2011）。一方，新しく幹細胞が作られる
過程では，一度分化した細胞が脱分化し，分裂能と分化多能性をもった細胞が作られる。イモリの脚の切断時には，「再生芽」という比較的未分化な細胞塊が傷口に作られる（Maden 1976）。
この中では傷害部位に存在していた様々な分化細胞が脱分化して細胞塊を形成しているが，例えば真皮細胞から脱分化した細胞から，もとの真皮細胞のみならず軟骨細胞も再生することが知られている（Kragl et al. 2009）。植物では，再生芽と同様に「カルス」と呼ばれる傷害誘導性の細A. Iwase -2
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胞塊を作り（Birnbaum & Sánchez Alvarado 2009），そこで新しく幹細胞を作って組織を再分化させる。以降，このカルス化を伴う植物の再生に焦点を絞って話を進める。

３．カルスは再生現象に寄与する傷害部位で作られるカルスは傷口を覆って塞ぐだけでなく，再生組織・器官に細胞を供給したり，新しく幹細胞を作ったりする場となる（Bostock& Stermer 1989，Stobbe et al. 2002，Ikeuchi et al. 2013，
池内ら 2015，長谷部 2015，Melnyk & Meyerowitz 2015）。組織培養条件下では，カルス形成がより顕著に観察される。20 世紀半ばの金字塔とも呼べる研究から，２つの植物ホルモン，すなわちオーキシンとサイトカイニンのバランスが植物細胞の脱分化と再分化に重要な働きを持ち，これらのバランスを変えることでカルスをカルスのまま培養したり，カルスから根や茎葉を人為的に再生させたりできることが分かった（Skoog & Miller 1957）。植物組織を切り小片に分けた外植片を植物ホルモンを含む培地で培養する方法は，現在でも植物組織培養法の基本法となっている。
一般的には，オーキシンの比率が高いと根に，サイトカイニンの比率が高いと茎葉への再分化が見られる。また，高濃度のオーキシンを用いてカルスを誘導した後に，オーキシンを含まない培地でカルスを培養することで不定胚と呼ばれる体細胞由来の胚も誘導できる（Zimmerman 1993）。
不定胚形成は，体細胞から植物が有する全ての幹細胞が再形成されることから，分化全能性発揮の指標となる。一度分化した細胞を単離して，分化全能性の証明を行った研究においても組織培養条件下でまずカルスを形成させている（Steward et al. 1958, Nagata & Takebe 1971）。従って，カルス誘導時には分化多能性や全能性を獲得する機構が存在することが考えられる。

４．傷害ストレスで発現する因子がカルス化を促進する
組織培養による再分化を利用した膨大な研究は，これまで半世紀以上，基礎科学にも応用科学にも貢献してきたが（Thorpe 2007），植物が様々な刺激に対してどのように分化多能性や全能性を発揮するのか，その分子メカニズムは近年になって漸く明らかになってきた。
私たちは植物細胞の脱分化状態を規定する因子を単離する目的で，モデル植物で

A

B

C

D

あるシロイヌナズナ植物体とカルス由来の培養細胞の遺伝子発現比較解析を行い（Iwase et al. 2005），培養細胞で高発現している植物特異的 AP2/ERF ファミリーの転
写

因

子

WOUND

INDUCED

DEDIFFERENTIATION 1（WIND1）を単離した。驚いたことに，植物体全体で恒常的に発現するプロモーターを用いて WIND1
遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナ
植物体（WIND1 過剰発現株）では，植物ホルモンを含まない培地でも葉，胚軸，根からカルスを形成する（図 2）。このカルスは

図２．WIND1 遺伝子はカルスの誘導とカルスの維持に機能する（A）シロイヌナズナ野生株（21 日
齢）。
（B）WIND1 過剰発現株（48 日齢）。
（C）過剰発現株から単離したカルス。
（D）21 日後のカルス。全て植物ホルモンフリーの培地で培養した。
Scale: 3 mm（A, B），3 cm（C, D）。

A. Iwase -3
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継代培養可能であり（Iwase et al. 2011a），この原稿を著している今日現在，8 年を超えてホルモン
フリーで継代培養している WIND1 誘導カルス株が存在している。このことは，WIND1 がカルス
誘導だけでなくカルス状態を維持する働きを有していることを示している（図 2）。
WIND1 は傷害応答性の遺伝子として他のグループの研究でリストアップされていたことから（Delessert et al. 2004），傷をつけた植物体で WIND1 やパラログ遺伝子である WIND2，WIND3，
WIND4 の遺伝子発現を経時的に調べたところ，これらの遺伝子は傷害ストレスによって数時間内に発現誘導されることが分かった。実際，WIND1 のプロモーター活性は傷害部位やカルスで特異的に高い。さらに WIND1 過剰発現株（通常条件ではカルス化しない弱い形質の個体）では，胚軸の傷害部位におけるカルス形成が促進され，逆に WIND1 機能抑制変異体では抑えられる。植物
ホルモンとの関連を調べるためにオーキシン濃度とサイトカイニン濃度を変えた種々の培地を用い，胚軸切片の組織培養アッセイを行ったところ WIND1 機能獲得変異体では野生株と比べてサ
イトカイニン応答が高まり，逆に機能抑制変異体では抑えられていることが分かった。サイトカ
イニン応答を正に制御する Type-B ARR 転写因子の機能欠損変異体では，WIND１過剰発現によるカルス化が抑制される。また，野生株の胚軸の傷害部位では，Type-B ARR 転写因子依存的に反応する TCS プロモーターの活性が高まるが，WIND1 機能抑制変異体では抑えられる。WIND1 を過剰発現させて誘導したカルスでは ARF 転写因子依存的なオーキシン応答性 DR5 プロモーターの活性はみられない上，組織培養のアッセイにおいても WIND1 機能獲得および抑制変異体の両方でオーキシン応答に顕著な変化は見出せなかった。これらの検討から，WIND 転写因子群は少なくとも Type-B ARR 依存的なサイトカイニン応答を高めることによって植物細胞のカルス化を促進する重要な因子であることが明らかになった（Iwase et al. 2011a, Iwase et al. 2011b）。WIND1 過剰発現株では，野生株と比べてサイトカイニン合成系の遺伝子発現が促進し，実際サイトカイニン合成が促進していることから，WIND1 は傷害部位でサイトカイニン合成を高める機能を有している可能性が示唆される（Iwase et al. 2011a）。
傷害ストレスによって発現が上昇し，未分化性の高い細胞塊形成に関与する転写因子は，動物においても報告されている。例えば，この稿の冒頭に取り上げた動物の傷害ストレスによる再生現象においても，哺乳類の iPS 細胞誘導技術で用いられるいわゆる Yamanaka-factors（Oct3/4，Sox2，
c-Myc，Klf4，Takahashi & Yamanaka 2006）のホモログ遺伝子が発現してくるという報告がある。
イモリのレンズと脚の再生時には Sox2，Klf4，cMyc のホモログ遺伝子が（Maki et al. 2009），また，
ゼブラフィッシュ尾の再生とアメリカツメガエルの脚の再生における再生芽形成時には Oct3/4，
Sox2，c-Myc，Klf4 のホモログ遺伝子が発現することが報告されている（Christen et al. 2010）。傷害
ストレスによる細胞脱分化関連因子の発現という機構は，動植物に共通であることを示している。

５．カルス誘導の分子経路
一口にカルスと言っても，その生成機構や生理状態は多岐に渡る（Ikeuchi et al. 2013, 岩瀬ら
2015）。シロイヌナズナでは，少なくとも２つのカルス誘導経路があることが分かってきた。シロ
イヌナズナで頻繁に用いられているカルス誘導培地（CIM）条件では，カルスは傷口のみならず
傷口から離れた非傷害部位にも形成される。非傷害部位のカルス化では，根の幹細胞形成に関与するマーカー遺伝子が強く発現することが見出され（Atta et al. 2009, Sugimoto et al. 2010），実際，
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側根形成ができなくなる変異株では，非傷害部位からのカルス誘導が抑制される（Sugimoto et al.
2010, Iwase et al. 2011a）。一方，傷害部位に誘導されるカルスではこれらの根のマーカー遺伝子の発現は見られず，さらに側根形成ができなくなる変異株でも傷害部位でのカルス化は起こる(Iwase et al. 2011a)。これらの観察から，非傷害部位で形成されるカルスは側根形成の分子経路を介して作られるが（Sugimoto et al. 2010），傷害部位で作られているカルスは，側根形成経路とは(少なくともある一部分は)異なる経路で作られていることが明らかとなった（Iwase et al. 2011a）。
側根形成はオーキシンシグナルの制御下にあり，実際，上記した側根形成ができなくなる変異株の原因遺伝子はオーキシン応答性である。側根形成を正に制御するオーキシン応答性の LBD 転
写因子を過剰発現することで，ホルモンフリーの培地でもカルスが形成される（Fan et al. 2012）。
この結果は側根原基形成経路を介したカルス化経路が実際に存在することを実証している。前述
したように，WIND は傷害部位でサイトカイニン応答を高めていることから，この２つの分子経路はオーキシン応答優位な経路とサイトカイニン応答優位な経路として区別できるのかもしれない。

６．再生における WIND の分子機能とその応用
最近の私たちの研究から，WIND1 の役割は単にカルス形成を促進するだけでなく再分化を制御することも明らかになってきた。これについて記述する前に，まずシロイヌナズナの組織培養法と，現在考えられている組織培養の再生過程における生理的反応ステップについて紹介したい。
シロイヌナズナの再分化誘導には 2 段階の培養法が広く用いられている（Valvekens et al.， 1988，

A

野⽣⽣
株

B

野⽣⽣株

35S: WI ND1

D

35S: WI ND

WI ND1-‐‑‒SRDXF

WI ND1-‐‑‒SRDX

Ozawa et al. 1998，Che et al. 2002）。具体的には，根や胚軸の切片をオーキシンに富んだカルス誘導培地(CIM)で数日間培養し，その後組織片をサ
イトカイニンに富んだ茎葉再分化培地（SIM）や

C

WT

オーキシンに富んだ根誘導培地（RIM）に移植・培養して再分化を促進するという方法である（Valvekens et al. 1988）。オーキシンとサイトカイ
ニンの適度な配分を設定すれば 1 段階の培養でEもカルス化と再分化を連続的に誘導できるため（Lloyd et al. 1986），必ずしも 2 段階の培養が必須というわけではない。組成を変えた複数の培地を段階的に用いる方法は，再分化までの時間短縮や再分化頻度を高めるために検討されてきた結果である。しかしこの事実は，分化した細胞の再分化過程には段階があることと，それぞれの段階には作用するホルモンと組み合わせに適性がある
ことを示唆している。セイヨウヒルガオの再分化系を用いた実験から，組織培養環境下の器官再分

図３．傷害処理による WIND1 の発現は再分化能の獲得に寄与する（A~F）7 日齢のシロ
イヌナズナ植物体を根の切断あり、なしで処理して CIM で 4 日間処理した後, SIM で
21 日間培養した。WIND1 過剰発現株（35S:WIND1）では切断処理なしでも茎葉の再生がみられ, 逆に WIND1 機能を抑制した株（WIND1-SRDX）では切断処理をしても茎葉の再分化は抑えられた。Scale: 3mm。Iwase et al.（2015）より許可を得て改変, 転載。

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化は３つの段階に分けられることが示された （Christianson & Warnick 1983, 1985）。すなわち 1.
応答能の獲得（acquisition of competence），2. 器官形成の誘導（organogenesis induction），3. 形態的な分化（morphological differentiation）である。このうち第 1 のステップは幅広い組成のホルモン培地が適用できるのに対して，第 2 のステップでは最適なホルモン組成の範囲が狭く，方向性を持った再分化誘導にはホルモンの種類やバランス条件の詳細な検討が必要になる。第 3 のステッ
プでは外因性のホルモンの影響を受けにくくなるため（Christianson & Warnick 1983, 1985,
Sugiyama 2015），ホルモンを含まない培地がよく用いられる。いわゆる脱分化と呼ばれる過程は第 1 のステップ，すなわち反応能の獲得に含まれると考えられており，シロイヌナズナの系ではCIM での処理がそのステップに該当する（Che et al. 2006, Duclercq et al. 2011, Sugiyama 2015）。さらにカルス化や再分化が抑制される一連の変異株の解析から，第 1 の応答能の獲得のステップには細胞増殖能の獲得と分化能の獲得が含まれると考えられている（Sugiyama 2000, Ohatani &Sugiyama 2005, Ohtani et al. 2013）。
カルス化を促進するという WIND1 の機能は，組織培養における器官再分化の段階において応答能の獲得ステップに働くことが予想される。そこで，組織培養条件の再分化過程における傷害処理と WIND1 の役割をより明確に理解するために，傷害処理なしの組織培養と，WIND1 機能をコントロールした植物体での組織培養を行った。すなわち WIND1 の発現が CIM における処理を代替できるかについて検討した。
驚いたことに，野生株では，地上部を残した状態の無傷の根からは CIM（カルス誘導培地）処
理後に SIM（茎葉誘導培地）で培養しても茎葉の再分化は全く見られず，代わりに多くの側根の形成が観察された（図 3）。この原因は，例えば地上部からもたらされる物質やシグナルによる影
響など様々な原因が考えられるが，植物組織の切断処理によって誘導される因子が茎葉への再分化能の獲得を促進していることが一つの原因として考えられた。切断によって発現促進するWIND1 の働きが分化能獲得の実体であるという仮説を検証するために，WIND1 の弱い過剰発現体（35S:WIND，育成してもカルス化までは起こらない）を同様に無傷のまま SIM で処理したところ，予想通り根から茎葉の再分化が起こった（図 3）。さらに，WIND1 の遺伝子発現誘導系植物（外部から薬剤を処理することによって WIND1 が発現する配列をゲノムに導入した植物体）を用いて，ホルモンフリーの培地で WIND1 の発現誘導あり・なしの比較実験を行ったところ，やはり誘導時のみで無傷の植物体の根から SIM で茎葉の再分化が起こった。逆に WIND 機能を抑制した植物体（WIND1-SRDX）では，通常の切断処理を行った培養を行っても茎葉再分化がほとん
ど起こらなかった（図 3）。これらの結果から，組織培養における組織の切断処理は WIND1 のよ
うな傷害応答性の脱分化因子を発現させる役割があること，また WIND1 には分化能の獲得機能もあり，CIM の処理を実際に代替できることが明らかとなった（Iwase et al. 2015）。切断処理を行っても，CIM での処理をしないと茎葉の再分化には大幅な時間がかかるが（Valvekens et al. 1988），
WIND1 の発現を誘導した植物体では，短時間の誘導でも続く SIM の処理で茎葉が再分化する（Iwase et al. 2015）。組織培養では，一般的に植物組織の切断と，多数の組織片の培地への植え替えが必要であり，処理行程の煩雑さを招いている。WIND1 のような因子の機能利用によって，切断処理を必要とせず，且つ培養時間を短縮させた簡便で効率的な組織培養が可能になるかもしれない。
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CIM を利用したシロイヌナズナのカルス化には少なくとも 2 つの経路があることは前項で述べた。CIM-SIM の 2 段階培養の系では茎葉の再生が傷害部位と非傷害部位の両方のカルスから見られる。面白いことに，WIND1 機能抑制変異株では非傷害部位のカルスからも茎葉の再分化が抑えられる（Iwase et al. 2015）。非傷害部位のカルスでいつ WIND1 が発現してくるのかについては，
より詳細な検討が必要であるが，この結果は WIND1 が非傷害部位でのカルスでも再分化能を付与していることを示している。
WIND1 の発現が CIM 処理の代替となるように，他の分化関連転写因子が次のステップである器官形成の誘導を担えるかもしれない。そして，WIND1 と組み合わせて発現させることで，効率が良く再分化の方向性が明確な分化転換を誘発できるのではないか。このような考えに基づいて，
B3 ドメイン転写因子 LEAFY COTYLEDON2（LEC2）転写因子を WIND1 と発現させる実験を行った。LEC2 は過剰発現によって不定胚を誘導できることが報告されている（Stone et al. 2001）。
私たちの行った黄化芽生えを用いた実験でも，遺伝子発現誘導系を用いて LEC2 を過剰発現することで不定胚を誘導することができた。しかし，ここでの不定胚誘導は，脱分化傾向が強いと考えられる傷害部位か，茎葉分裂組織周辺の比較的分化度合いが低いと考えられる組織に限られていた（図 4）。LEC2 を発現誘導する前に WIND1 を誘導すると，予想通り変化の起きる領域が広がり，用いた胚軸組織全体から不定胚の形成がみられた（図 4）。これは，再分化の応答能を有していなかった分化細胞が WIND1 によって再分化の応答能を獲得し，続く LEC2 の制御による不定胚形成の誘導を可能にした結果だと考えられる。これらの発見から，複数の転写因子をスイッチとして用いることで外因性の植物ホルモンなしで細胞の脱分化と再分化をコントロールできることが実証された（Iwase et al. 2015）。

図４．WIND1 と LEC2 の 2 段階の誘導は体細胞胚誘導を促進する（A~C）7 日齢のシロイヌナズナ
黄化植物体を胚軸部分で二分し、地上部側を培養した。
（A）WIND1 誘導系植物体（XVE:WIND1）
を誘導剤（17β-estradiol）を含む植物ホルモンフリー培地で 25 日間培養した。
（B）LEC2 誘導系植物体（35S:LEC2-GR）を誘導剤（dexamethasone）を含む植物ホルモンフリー培地で 25 日間
培養した。
（C）WIND1 と LEC2 を両方誘導可能な植物体（XVE:WIND1/35S:LEC2-GR）を 17βestradiol 入り培地で 4 日間培養後、dexamethasone 入り培地で 21 日間培養した。2 段階誘導の植物体では, 胚軸部分からも盛んに不定胚を形成するカルスが生じている。Scale: 1 mm。Iwase etal.（2015）より許可を得て改変, 転載。

７．WIND 遺伝子と機能の保存性
シロイヌナズナ近縁種である Thellungiella halophila（salt cress）の WIND1 オルソログ（ThWIND1L）は，傷害応答性があり，ThWIND1-L を発現させたシロイヌナズナはホルモンフリーの培地で
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カルス化することが他の研究グループから報告された（Zhou et al. 2012）。これは，近縁種の WIND1
オルソログ遺伝子でも私たちの研究結果が再現できることを示している。WIND 因子が植物界に広く保存されていれば，傷害によるカルス化が植物の進化上いつ獲得されたのかを推測することができる。また様々な作物で組織培養を用いた応用研究にも展開できるかもしれない。このような興味から，Reciprocal BLAST 法による簡易的なオルソログサーチを行い WIND 転写因子群の植物界における保存性を調べた。
ゲノム情報が明らかになっている 20 種の植物，すなわち，双子葉植物 12 種，単子葉植物 4 種，
シダ植物 1 種，コケ植物 1 種，緑藻類 2 種について解析を行った結果，緑藻類であるクラミドモ
ナス（Chlamydomonas reinhardtii）とボルボックス（Volvox carteri）以外の植物には，WIND1 オル
ソログが存在していることが示唆された（図 5）。AP2/ERF 転写因子は緑藻には既に存在していることが知られているため（Magnani et al. 2004），AP2/ERF 転写因子の中でも WIND クレードの遺伝子は陸上化とともに獲得されたのかもしれない。さらに，これらの遺伝子配列をアミノ酸に変換し，保存ドメインを比較すると，シダの一種 Selaginella moellendorffii や コケ植物蘚類の一種
Physcomitrella patens のオルソログでは高等植物間で保存性の高いアミノ酸配列が見られないことが分かった。ゼニゴケの WIND1 オルソログをシロイヌナズナで発現させてもカルス化はみられなかったことから，この 2 種のアミノ酸配列の差異の中にシロイヌナズナでのカルス化に関わる領域があると考えられる（岩瀬 未発表）
。コケ植物においては，苔類，蘚類，ツノゴケ類において，それぞれ植物ホルモンを用いてカルスが得られ培養細胞化されているが（Ono 1973, Sokal etal. 1997, Ono et al. 1992），例えば蘚類ヒメツリガネゴケの葉状体の切断処理では，傷害部位の細胞から原糸体の幹細胞が直接誘導され，明瞭なカル
ス 化 は み ら れ な い（Ishikawa et al. 2011, 石
川 2015）。苔類ゼニゴケでは，葉状体の切断面から葉状体が再生するが（ Kubota et al. 2013,
Nishihama et al. 2015）, この際一度小さな細胞塊が傷害部位で生じるものの,すぐに形態形成に移行するようである。コケ植物
における株化されたカルス細胞は, 外因性の植物
ホルモン処理によって再分化への移行が抑えられている状態なのかもしれない。

図５．シロイヌナズナ WIND のオルソログは広く種子植物に保存されている シロイヌナズナの他の AP2/ERF 転写因子である BBM
遺伝子をアウトグループとして分子系統樹を作成した。赤字はシロイヌナズナ WIND（WND1~WIND4）。枝分かれ上の数字はブートストラップ確率を示している（500 replicates）。枝分かれの先
は種々の植物の遺伝子名を記してある。Iwase et al.（2013）より許可を得て改変、転載。
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WIND のオルソログが種子植物に広く保存されているならば，それぞれの植物が保持するWIND 因子群の機能も保存されており，それらやシロイヌナズナの WIND を利用することによって作物の組織培養の効率が改善できるはずである。実際，シロイヌナズナ WIND1（AtWIND1）の発現誘導系や過剰発現用のコンストラクトを導入したナタネ（Brassica napus），トマト（Solanum
lycopersicum）やタバコ（Nicotiana tabacum）では，シロイヌナズナと同様に，ホルモンフリーの培地でもカルス形成が観察された(Iwase et al. 2013)。この結果は，WIND によって促進される細胞
脱分化のカスケードが少なくともある範囲の植物種で保存されていることを示している。シロイ
ヌナズナにおける AtWIND1 の分化能の獲得機能に関しては前項で述べたが，作物でも再分化の効率化が起こせるのかを調べるために，発現誘導系を導入したナタネで組織培養条件下での茎葉再分化実験を行った。 この結果，再分化能が低く外植片としては通常用いない，茎葉分裂組織から離れた部位の胚軸切片において，WIND1 の誘導をかけた培地では，誘導をかけなかった場合と比べて 1 切片あたり 20~50 倍という高い頻度で再分化組織が得られることが分かった。芽生えの胚軸を用いた通常のナタネの形質転換法では，再分化能の比較的高い茎頂分裂組織に近い胚軸切片が限定的に用いられたりするが，その限定的な組織を用いた通常法と比べても，上記の結果は10 倍以上の高い再分化効率であった（Iwase et al. 2015）。この結果は，シロイヌナズナでみられた結果と同様に，WIND1 の誘導によって再分化能の低い組織に応答能の獲得と再分化能の付与がなされたためだと考えられる。また，少な
くともナタネのような近縁種の作物でも，シロイヌナズナの WIND1 機能による再分化の効率化が可能である事を実証するものである。

８．分化状態の維持には脱分化因子の発現を能動的に抑える必要がある
傷害ストレスによるカルス化は，傷害部位で局所的にみられる反応である。細胞の脱分化を傷害部位のみで進める機構があり，その一端を WIND が担っていることを私たちは明らかにしてきた。一方で，分化全能性を発揮し易い植物でも，通常の発生・成長の過程では特殊な構造と生理機能を有した多細胞の体を維持するために，不D C B C PRC2 変異体では根毛細胞も図６．シロイヌナズナ
DAPI 染色ならない。そこには能動的な抑制機構があ 脱分化する（A）野生株の根毛細胞の().
像。核（青）が一つ見える。
（B）PRC2 変異体の根2()
るはずである。
毛細胞の DAPI 染色像。根毛の中に核が複数存在
2R
2（C）PRC2 変異体の根毛
私たちはカルス化が促進する変異株の Iしていることが分かる。
6細胞から生じたカルス。
（D）PRC2 変異体の根毛A(
6
解析を進める中で（Ikeuchi et al. 2013, 岩瀬 細胞から生じたカルスから不定胚様の組織が生じA
P 2
ら 2015），
驚くべき現象を見出した（図 6）。 ている。

必要な分化全能性の発揮を抑えなければ

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シロイヌナズナの PRC2（Polycomb repressive complex 2）というタンパク質複合体の機能が欠損した PRC2 変異体の根では，根毛細胞をはじめとする様々な細胞が分裂を開始し，カルスのみならず不定胚様の組織を形成したのである（Ikeuchi & Iwase et al. 2015）。驚きの主な要因は 2 点あった。第一に，この変化は培地に植物ホルモンを添加することなく通常の培養条件で起こること。
第二に，根毛細胞という高度に分化した細胞が，あるタンパク質複合体の機能が損なわれただけ
で，脱分化したことである。根毛細胞は根の表皮細胞の一部が伸長成長によって巨大化した 1 個の細胞であり，水分や無機塩類を土壌中から吸収する高度に機能化した最終分化細胞である。シロイヌナズナの根毛細胞では，核内倍加と呼ばれる現象，すなわち細胞の分裂を経ずに DNA 複製のみが進行する特殊な細胞周期が起こっており，これによって核の中の DNA 量が増加し，細胞の巨大化が引き起こされる。核内倍加はシロイヌナズナの根端において，細胞分裂を盛んに行う分裂組織の細胞が分裂を止め，細胞伸長に移行する際に起こる現象であることから細胞分化の１つの指標となっている（Breuer et. al. 2014）。
PRC2 変異体では，最終分化細胞の分化状態の維持ができずにカルス化や不定胚様組織の形成が起きているという仮説のもと，核の大きさの比較や分化マーカーの発現の有無など種々の検討を行った。この結果，PRC2 変異体の根毛細胞は，野生株と同様に一旦は核内倍加を伴う正常な細胞分化を行っており，PRC2 変異体のみが時間の経過とともに DNA 合成期(S 期)を伴う細胞周期で分裂してカルス化していることが明らかとなった（Ikeuchi & Iwase et al. 2015）。
PRC2 はどのように細胞の脱分化を抑えているのだろうか。PRC2 は真核生物に広く保存されており，ヒストン H3 タンパク質を構成するアミノ酸のうち 27 番目のリジンをトリメチル化（H3K27me3）する働きを持っている（He et al. 2013）。このメチル化されたヒストンは結果としてクロマチン構造を閉じた状態に変え，その領域にある遺伝子発現を抑える。つまり，PRC2 変
異体では H3K27me3 による遺伝子発現抑制機構が働かないために，不用意な遺伝子発現を起こしやすい状態になっていることが考えられる。そこで，PRC2 変異体の根でカルス形成に関与する遺伝子を調べたところ，カルス化
促進因子の WIND1 ， WIND2 ，の LEC2 遺伝子の発現が上昇していることが分かった。シロイヌナ
ズナの根のゲノム上で，どの遺伝

細胞分化

WIND3 遺伝子や胚発生制御因子

子が PRC2 による発現抑制を直接ところ，WIND3 や LEC2 などの遺伝子領域が H3K27me3 でマークされていること ，すなわちPRC2 の直接のターゲットになっていることが分かった。 さらにWIND3 または LEC2 遺伝子を強制的に発現させることでも，根毛細胞分裂裂受けているかを網羅的に調べた

図７．PRC2 は、分化した根毛細胞や根の細胞においてWIND や LEC2 などの遺伝子の発現を，直接的（実線）または間接的（破線）に抑えることで，細胞の脱分化を抑え，分化が完了した状態を維持している。
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細胞を分裂させられることを確認した。これらの結果から，根毛細胞などの一度分化が完了した植物細胞には遺伝子発現レベルで脱分化を抑えるメカニズムがあり，それがヒストンのメチル化を介したクロマチン構造の制御によって行われていることが分かった（図 7, Ikeuchi & Iwase et al.
2015）。つまり通常の細胞分化には WIND や LEC2 のような全能性発揮関連因子の発現を抑える機構が必要だということである。WIND3 や LEC2 遺伝子の過剰発現によって引き起こされる根毛細胞のカルス化の頻度は PRC2 変異体よりも低い。また，これらの因子の発現抑制による PRC2変異体の表現型の抑圧も完全でないことから，PRC2 変異体で観察される根毛細胞の脱分化には，
他にもさまざまな因子が関与していることが予想される。実際 PRC2 のターゲットとなる遺伝子はシロイヌナズナで 4000 以上に登るとも考えられており（Zhang et al. 2007），今後，さらなる関連因子の探索を継続することで，植物細胞が PRC2 を通してどのように分化状態を維持するのか，
その分子メカニズムのさらなる詳細が明らかになると期待している。

９．終わりに
私達のこれまでの WIND や PRC2 に関する研究成果から，傷害ストレスによって局所的に誘導される細胞脱分化の機構や，通常の発生・分化の段階で脱分化を抑える機構が見えてきた。そこでは遺伝子発現を制御する転写因子が重要因子として存在し，その発現がヒストンの修飾を介したクロマチンレベルで制御されていることも分かってきた。私たちは WIND1 が制御する遺伝子の解析も網羅的に進めているが，WIND1 の下流には別の転写因子も数多く存在しており，転写因子ネットワークが存在していることが明らかにされつつある（Iwase et al. in preparation,
Ikeuchi et al. in preparation）。今後ネットワークに関与する因子について，網羅的に捉えるアプロ
ーチと因子同士一つ一つの関係性を明らかにしていくアプローチを両方進めて行き，植物細胞の脱分化と再分化に関わる分子ネットワークを着実に明らかにして行きたい。
また，WIND を軸とした脱分化誘導現象において，ストレスとヒストン修飾によるクロマチ
ン変化の関連が浮かび上がってきたことから，ストレスとエピジェネティックな変化がどのように関連し，細胞の脱分化を促進するのかという次なる問いも生じる。種々のストレスがヒストン
修飾の変化を誘導し，クロマチン構造を変化させて脱分化関連転写因子の発現を促進するという仮説のみならず，ストレス誘導性の転写因子によってクロマチン構造が変化し，種々の脱分化関
連因子の発現が促進するという仮説も立てることができる。ほ乳類の分化した細胞では，iPS 細胞誘導技術で用いられる転写因子群（Yamanaka-factors）が複数の階層のエピジェネティックな発現抑制制御を受けていることが分かってきた（Hawkins et al. 2010）。さらに，発現誘導された
Yamanaka-factors は，「パイオニア転写因子」としてヌクレオソームに結合し閉じたクロマチン構造を開き，自身を始め下流遺伝子群の転写活性を促進する働きを有する可能性が示唆されている（Soufi et al. 2015）。様々な刺激に対してエピゲノムがどのように変化し，ゲノム上のどの遺伝
子領域が転写制御を受けやすくなるのか，または受けにくくなるのかについて網羅的に理解することは，細胞の分化や脱分化を理解するため今後益々重要なアプローチとなる。ストレス誘導時や脱分化関連転写因子の誘導時におけるクロマチン構造の変化を経時的かつゲノムワイドに捉える研究を進めることで，植物の分化全能性発揮のダイナミズムを明らかにして行きたい。
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謝辞
本稿で紹介した著者らの研究は，農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業，新学術領域研究（22119010，26291064），科学研究費助成事業（24770053，15K18565，15K18564），および理化学研究所基礎科学特別研究員制度の支援を得て遂行した。

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植物の初期胚イメージング系の発展
植田 美那子
名古屋大学トランスフォーマティブ生命分子研究所(名古屋大学大学院理学研究科生命理学専攻生殖分子情報学研究室 兼任)〒464-8602 名古屋市千種区不老町
Minako Ueda
Recent innovations of embryo imaging methods
Key words: Arabidopsis, cell fate, embryogenesis, geometric analysis, live-cell analysis
Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM) & Division of Biological Science, Graduate
School of Science, Nagoya University
Furo-cho, Chikusa-ku, Nagoya, Aichi 464-8402, Japan
１．はじめに被子植物は複雑な形態を有するが，それらはすべて受精卵に由来する。形づくりの基盤となる
体軸は初期胚で確立され，特に，頂端—基部軸（上下軸）は最初に形成される。この軸に沿って受精卵は不等分裂し，生じた頂端細胞と基部細胞が個々の運命にしたがって発生することで，植物体の茎頂—根端パターンが構築される（図１）。つまり初期胚発生には，体軸形成・運命獲得・パターン形成といった，発生の基盤をなす仕組みが詰まっていると言えるが，被子植物の胚発生は母組織の奥深くで進行するという特性から，発生過程を詳細に解析する手法は乏しく，個々の細胞の分裂動態や，それを制御する仕組みについてはほとんど研究されてこなかった。
しかし近年，
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）において，コンピューター解析による胚の三次元構造の再構築や，胚珠の in vitro 培養によるライブセル解析など，さまざまな研究が進んできた。そこで本稿では，これらの最新手法を紹介することで，今後の胚発生研究の展望について考えたい。

図１．シロイヌナズナの胚発生
シロイヌナズナの受精卵から初期胚が発生する様子を示した。点線は頂端細胞と基部細胞の系譜の境界面を示す。

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２．シロイヌナズナ胚の細胞形態を三次元的に解析する手法の確立
近年，胚の観察画像をコンピューター解析するというジオメトリック（幾何学）解析法が開発され，さまざまな発生ステージの胚において，個々の細胞がどのような容積をもち，どの方向に分裂するかといった特徴を三次元的に理解できるようになった（Yoshida et al. 2014）。この手法では，蛍光色素（FM4-64 あるいは propidium iodide）によって細胞輪郭を可視化した胚を透明化し，それを 0.1 µm 間隔という高密度で観察する。得られた光学切片を三次元画像解析ソフトウェア（MorphoGraphX）で処理することで，胚内部の個々の細胞の形態やサイズ，細胞分裂面の位置やその面積など，多様な情報を統計的に解析することができる（Kierzkowski et al. 2012）。古くから，
細胞は分裂面の面積が最小になるように分裂すると考えられてきたが，この様式での分裂パター
ン予測と実際の胚の三次元再構成画像を比較したところ，細胞分裂面は常に最小面積になるわけ
ではないことが判明した（Yoshida et al. 2014）。例えば，4 細胞期胚や 8 細胞期胚が形成される際の分裂面は最小面積になる位置に形成されるものの，8 細胞期胚の各細胞が非対称分裂して胚の内層と外層が生じる際の分裂面は，平面的ではあるものの，最小面積にはならない位置に形成される（図２の上段）。一方，ドミナントネガティブ型の BODENLOS（オーキシン応答の制御因子）
を強制発現させることでオーキシン非感受性にした株では，8 細胞期胚の各細胞は分裂面が最小面積になる位置で分裂するため，胚に内層と外層が形成されない（図２の下段, Hamann et al. 1999）。
オーキシンが蓄積することが知られている他の胚細胞でも同様の結果が得られたことから，胚の細胞は本質的には細胞分裂面を最小面積にする性質をもつものの，オーキシン応答を用いた制御機構によって分裂面の位置が調整されることで，内外層の分離といった胚のパターン形成が実現すると考えられる。
図２．細胞分裂面の制御様式
シロイヌナズナ胚の三次元立体構築によって判明した，
8 細胞期胚から 16細胞期胚になる際の細胞分裂の様式（上段）。オーキシンに応答できない
株では等分裂になる（下段）。

３．シロイヌナズナ胚珠の in vitro
培養による胚のライブイメージ
ング
前述した胚の三次元解析によって，個々の細胞の形態や分裂面を詳細に比較することが可能となった。しかし，これは多数の固定胚による解析であるため，細胞分裂の所要時間や分裂順序といった時間情報や，どのような位置や形の細胞が実際にどのように分裂してどの組織になるかという系譜を知ることはできない。これらを知るには，一つの胚の発生を追跡できるラM. Ueda-2
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イブイメージング系が必要になる。これまで，タバコの単離受精卵を in vitro 培養して植物体まで成長させる方法は報告されているが，多様な変異体や分子マーカーが整備されたシロイヌナズナ
では，受精卵を培養できる方法はいまだ確立されていない（He et al. 2007）。しかしながら，シロ
イヌナズナでは，胚を含む母組織（胚珠）を単離して in vitro 培養する方法は報告されている（Sauer& Friml 2004）。この方法では，受精卵や若い胚を用いた際の植物体の発生率は低く，初期胚の形成過程のライブイメージングには適さなかったが，近年，培地の組成を変えることで，成功率を大幅に改善できることが明らかになった（Gooh et al. 2015）。さまざまな成分検討の結果，Nitsch
培地とトレハロースを組み合わせることで，胚珠の生存率と胚の発生率がともに向上したのである。この系を用いて，胚の核と細胞膜のそれぞれを蛍光標識した株の胚珠を顕微鏡下で培養することで，受精卵が後期胚まで発生する様子を一連の過程としてライブイメージングすることが可能となった（Gooh et al. 2015）。この際，胚珠は成長にともなって肥大するので，数日にわたるラ
イブイメージングでは，胚珠が視野から逃げるという問題が生じるが，ポリジメチルシロキサン類（PDMS）を素材とするマイクロピラーアレイを培地容器に被せ，そのなかに胚珠を置くこと
で，胚珠を定位置に保持することができる（Gooh et al. 2015, Park et al. 2014）。この in vitro 胚珠培養系を用いることで，受精卵を起点とする細胞系譜を追跡できるだけでなく，それぞれの細胞分裂の所要時間や，発生運命が次第に確立される様子も観察することが可能となった。例えば，基部細胞系列（胚柄）の発生に重要であることが知られている WOX8 遺伝子の発現を蛍光標識したマーカーをライブイメージングすると，受精卵ですでに蛍光シグナルが検出され，その不等分裂後（1 細胞期胚）に頂端細胞と基部細胞の両方で蛍光が観察されたあと，次の細胞分裂後（2 細胞期胚）にようやく基部細胞の系列に限局した（Ueda et al. 2011）。一方，WOX8 とは逆に胚の頂端領域で働く DRN 遺伝子のマーカーでは，受精卵では蛍光が観察されず，不等分裂後に頂端細胞で発現が始まり，その系譜で発現が受け継がれた（Cole et al. 2009）。これらの観察結果から，頂端と基部の運命は一律に決定されるのではなく，受精卵から発現している遺伝子や，不等分裂後に発現し始める因子の働きによって，次第に細胞性質が確立されていくと考えられる。

４．胚の特定細胞を狙った破壊による細胞運命の転換
上記のライブイメージング中の胚に対し，長波長の近赤外光を用いたフェムト秒パルスレーザ
ーを照射することで，発生中の胚内部にある単一細胞だけを狙って破壊することも可能となった（Gooh et al. 2015）。この系を用いて 1 細胞期胚の頂端細胞のみを破壊した場合，残された基部細胞の系譜から頂端細胞の様式で細胞分裂を始めるものが現れた（図３）。この際，基部細胞は一旦分裂して細胞数を増やしたのち，上部の細胞のみを頂端細胞に転換させるという動態が観察されたことから，基部細胞を保持しつつ，頂端細胞を補填するという発生戦略が読み取れる。このとき，基部細胞系譜の上部にある細胞では，前述の WOX8 の発現は失われ，かわりに DRN の発現が始まったことから，細胞運命が分子レベルで切り替わったと考えられる（図３）。頂端細胞は，植物体のほとんどを生み出す胚体のもととなる始原細胞であることから，胚の補助組織である胚柄の中から新たな頂端細胞が生まれて胚体が補償されるという制御は，植物の発生戦略として理にかなっていると言える。発生の進んだ胚に対しても同様のレーザー照射をおこない，胚体と胚柄の境界を分断したところ，球状胚期では残された胚柄から二次胚が生じるが，より後期の初期
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心臓型胚期では，胚柄はもはや分裂しないことも明らかとなった（Liu et al. 2015）。このことから，胚柄がもつ胚体の補償能力は発生ステージに依存することが明らかになった。胚柄は発生後期には縮退して死滅するので，胚体が充分に成長したあとで補償能力を失うことで，胚柄としての役割を終えると考えられる。

図３．細胞破壊による運命転換の誘導
シロイヌナズナ初期胚へのレーザー照射実験の結果を模式的に示した。上段は通常状態（レーザー照射なし）の発生様式を，下段はレーザー照射後の発生様式を示す。桃色は DRN 遺伝子を発現する細胞，緑色は WOX8 遺伝子を発現する細胞，灰色は死滅した細胞を表す。

５．今後の展望
本稿では，コンピューター解析を用いた胚の細胞形態の詳細な比較，ライブ観察による時空間的な動態変化，単一細胞を狙った破壊による運命転換という，３つの最新手法について紹介した。
今後は，これらを組み合わせることで，より精緻な解析が可能になると考えられる。例えば，細胞の運命が転換する際，遺伝子発現や分裂パターンだけでなく，細胞の形態や容積も変わると考えられるので，それらを時系列に沿って詳細に比較することで，細胞のどのような変化が端緒となって細胞運命の転換に至るかを明らかにできるかもしれない。さらに，細胞形態や遺伝子発現の変化の解析に加え，細胞内構造（細胞骨格やオルガネラなど）や生理状態（代謝活性やエピジェネテッィク制御など）についても，時空間的かつ定量的に解析する手法が確立されれば，胚内部のそれぞれの細胞がどのように変化することで，胚全体としての発達に貢献しているかについても，包括的に理解できると期待される。

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シロイヌナズナにおける道管分化誘導系の発達小田 祥久
国立遺伝学研究所新分野創造センター〒411-8540 静岡県三島市谷田 1111
Yoshihisa Oda
Experimental systems for xylem differentiation using Arabidopsis cells
Key words: Arabidopsis, cell culture, secondary cell wall, tracheary element, xylem vessel
Center for Frontier Research, National Institute of Genetics
Yata 1111, Mishima, Shizuoka 411-8540, Japan
１．はじめに植物の体は多様な細胞が集積するようにして発達する。それぞれの細胞の形態や機能は細胞を取り囲む細胞壁に大きく依存しており，細胞壁の成分や沈着パターン，厚みは細胞の形態や機能に強く影響する。道管や木部繊維などの木部組織は，木部細胞が二次細胞壁を厚く沈着すること
により個体を支え導管液の輸送に耐える物理的な強度を獲得しており，細胞壁による細胞の機能
分化の分かりやすい例と言える。さらに，道管における二次細胞壁の沈着は細胞内で厳密に制御されており，原生木部道管では環状や螺旋状，後生木部道管では網目状や孔紋状に二次細胞壁を沈着することにより異なった性質の道管を作り出している。道管細胞は二次細胞壁を形成した後に細胞内容物を消化することにより中空の死細胞である管状要素となり，穿孔および壁孔を介して導管液を通すことができるようになる。残された二次細胞壁はリグニン化することにより物理的にも化学的にも強固なものとなり，長期間にわたって通同組織の支えとして機能する（図 1）。
このように道管は木部細胞の非可逆的な分化により形成されているが，このような細胞分化のプロセスを解析することは，道管分化が深部の限られた領域で起こることから技術的な困難を伴う。ヒャクニチソウの単離葉肉細胞を用いた管状要素分化 誘 導 系 （ Fukuda &Komamine 1980）は高頻度
かつ同調的に管状要素分化を誘導することが可能であり，その高い再現性

図 1. シロイヌナズナの道管 （A）シロイヌナズナの根の道管。
（B,C）原生木部（B）と後生木部（C）における管状要素分化の模式図。
ここでは環状と孔紋状の二次細胞壁パターンを示す。Bar = 10 µm.

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植物科学最前線 7:183 (2016)から国内外で長く利用され，道管を含む維管束形成機構の解明に大きく貢献してきた。2000 年代に入ると，シロイヌナズナを用いた研究が維管束形成の遺伝子レベル，分子レベルでの理解に貢献するようになってきた。その中で，シロイヌナズナを用いて道管分化を in vitro で誘導する試み
もなされてきた。本稿では，シロイヌナズナを用いた道管分化誘導法とその成果について概説する。

２．継代培養細胞を用いた分化誘導系
シロイヌナズナの継代培養細胞は Col-0 株，MM2d 株, T87 株等が知られているが，これらはオーキシン存在下で培養することにより半永久的に継代することが可能である。一般的に，培養細胞は均一な細胞集団の調製が容易なこと，自家蛍光が少なく顕微鏡での蛍光観察がし易いことから，細胞生物学的，生化学的アプローチに有用な材料である。また，細胞株によっては，ヒャク
ニチソウでは困難であったアグロバクテリウム法による遺伝子導入が容易であることも重要な利点である。これまでにシロイヌナズナの継代培養細胞を用いた管状要素分化誘導系が複数の研究グループから報告された。一例目は筆者が携わった研究のひとつであり，Col-0 培養細胞株を用いて開発した実験系である。この実験系では細胞を 2,4-D，brassinolide 存在下で培養することにより， 36-48 時間で 30%程度の細胞を管状要素に分化させることができた（Oda et al. 2005）。この細胞株には微小管マーカーである GFP-TUB6 を恒常的に発現させており，管状要素分化における表層微小管の挙動を生きた状態で観察することがはじめて可能となった。これまで管状要素分化における表層微小管の観察は電子顕微鏡あるいは間接蛍光抗体染色法による静止状態での観察に限られていたが，この実験系により表層微小管が徐々に束となってゆく様子，微小管に沿って二次細胞壁の沈着が進む様子が明らかとなった（Oda et al. 2005, Oda & Hasezawa 2006）。同時期にCol-0 培養細胞をホウ酸と brassinolide の存在下で培養することにより，７日間で 50％ほどの細胞を管状要素に分化させる手法が報告された（Kubo et al. 2005）。この実験系を用いたマイクロアレ
イ解析により， NAC ファミリーに属する VND１～VND7 が木部道管に特異的に発現する転写因子群として同定された。
これらの転写因子のうち VND7 あるいは VND6 を異所的に発現させると，それぞれ原生木部道管様，後生木部道管様の二次細胞壁肥厚を誘導し，逆に SRDX を付加したドミナントネガティブ型の導入により道管の分化が遅延した。このことから VND7 および VND6 がそれぞれ原生木部道管，後生木部道管の分化を誘導する転写因子であることが示された。後に，
VND7 は後生木部を含む道管分化に広く関わっており，道管分化を制御する主要な転写因子であることが報告された（Yamaguchi et al. 2011）。ホウ酸を用いた管状要素の分化誘導はカルスにも用いられた（Kwon et al. 2010）。この研究ではシロイヌナズナの野生型および RabG3b の変異体から新たにカルスを単離し，ホウ酸と brassinolide 存在下で培養することにより管状要素の分化を誘導している。野生型由来のカルスでは 15%程度の細胞が管状要素に分化したのに対し，恒常活性型
RabG3b 導入株由来のカルスでは 40%以上，不活性型 RabG3b 導入株および RabG3b RNAi 導入株
由来のカルスでは 5%以下の細胞が管状要素に分化したことから，RabG3b が管状要素分化を促進していると考えられている（Kwon et al. 2010）。
2010 年には新規のシロイヌナズナ培養細胞株を用いた管状要素分化誘導系が報告された（Pesquet et al. 2010）。
この研究ではシロイヌナズナの植物体から新規に培養細胞株を樹立し，
NAA，
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BAP（6-benzylaminopurine），epibrassinolide を培養液に添加することにより 96 時間で 30~40%の細胞を管状要素へ分化させている。植物の継代培養細胞株は多くの場合オーキシン存在下で細胞の増殖を維持するが，この培養細胞株はオーキシン非存在下で増殖する細胞をカルスから選抜して樹立したものであり，ホルモンフリーの培地で維持されている。この性質がこの細胞株の分化能と何らかの関係があるのかもしれない。Pesquet ら（2010）はこの実験系を用いて微小管付随タン
パク質の発現を網羅的に調べ，MAP70-5 が管状要素分化時に特異的に発現することを突き止めた。
この実験系では螺旋型，網目および孔紋型の二次細胞壁が混在して形成されるが，MAP70-5，あるいはその相互作用因子である MAP70-1 の発現を抑制すると孔紋型の二次細胞壁の割合が増加
し，逆にこれらの遺伝子を過剰に発現させると，螺旋型の二次細胞壁の頻度が増加した。このことから，MAP70-5 が二次細胞壁の沈着パターンの制御因子の一つであることが示唆された（Pesquet et al. 2010）。最近になり，この実験系を用いた微小管付随タンパク質のプロテオミクス
解析により，MAP65 や AIR9, CSI1 など多数の微小管付随タンパク質も二次細胞壁のパターンに関与していることが報告された（Derbyshire et al., 2015）。このプロテオミクス解析は細胞を多量に調製することが容易な培養細胞の特性を活かした研究例と言えよう。
2010 年には分化誘導に転写因子の活性を利用した新しいタイプの分化誘導系が報告された。
Yamaguchi ら （2010）は VND7 に転写活性化因子およびグルココルチコイド受容体を融合した
VND7-VP16-GR をタバコ BY-2 細胞株に導入し，その培養液に dexamethasone を添加することにより，4～5 日で 80%を超える高頻度で原生木部様の管状要素を分化誘導することに成功した（Yamaguchi et al. 2010）。筆者は共同研究者らと共に，Col-0 培養細胞に VND6 を発現させることにより管状要素を分化させる実験系の開発に取り組んだ。その結果，VND6 をエストロゲンによる発現誘導系の制御下に置き，17β-estradiol および brassinolide を培養細胞の培養液に添加することにより，およそ 36 時間で 80%ほどの細胞を後生木部道管様の管状要素に分化させることができるようになった（図 2, Oda et al. 2010）。また，アグロバクテリウム法による高頻度の遺伝子導入も可能になり，抗生物質による選抜をすることなく数日で GFP 等との融合タンパク質の局在を分化過程の細胞内で観察することができるようになった。筆者らはこの方法を用いて道管分化時に顕著に発現するタンパク質の細胞内局在を網羅的に解析し，微小管付随タンパク質MIDD1 が局所的に表層微小管の脱重合を促進することにより壁孔の形成を誘導していることを突き止めた。さらに，MIDD1 は局所的に 活 性 化 し た ROP
GTPase により細胞膜にアンカーされ，微小図２.VND6 導入 Col-0 株を用いた管状要素分化誘導系 （A）VND6 を導入した Col-0 培養細胞株。
（B）分化誘導後の蛍光顕微鏡像。赤いシグナ
ルは蛍光色素で染色した二次細胞壁。Bar = 20 µm

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管脱重合活性を持つ Kinesin-13A と相互作用することにより働いていることを明らかにした（Oda& Fukuda 2012, 2013）。また，機能未知の coiled-coil タンパク質である VETH1 および VETH2 が
COG2 タンパク質と相互作用することにより，表層微小管に exocyst 複合体サブユニットである
Exo70A1 をリクルートしていることを報告した（Oda et al. 2015）。exocyst 複合体は膜輸送経路の目的地の決定に関わっており，EXO70A1 の機能欠損変異体では二次細胞壁の沈着パターンに異常を生じたことから，VETH 経路は表層微小管に沿った細胞壁成分の輸送に関わっているのと考えられる。これらの研究に加え，この実験系は道管分化におけるプログラム細胞死に関する知見にも寄与した（Han et al. 2012, Ohashi-Ito et al. 2010）。

３．植物体を用いた実験系
シロイヌナズナの個体や組織を用いた実験系として，胚軸を用いた実験系が報告された（Sawaet al. 2005）。この実験系では，暗所で育てたシロイヌナズナの芽生えから胚軸を切り出し，2,4-D，kinetin，brassinolide を含む培地中で６日ほど培養することにより，管状要素が胚軸内に異所的に形成される。
最近になり，葉の組織を用いた斬新な分化誘導法が報告された（Kondo et al. 2015）。この手法では，シロイヌナズナの本葉から直径 1 mm のディスク状に組織を切り出し，2,4-D，kinetin に加え，GSK3 キナーゼの阻害剤である bikinin を添加した培地中で培養することにより，３日程で葉肉細胞を管状要素へと分化させている。GSK3 キナーゼは，CLE ペプチドシグナル下流のブラシノス
テロイドシグナル経路で働く BES1 転写因子を介して道管分化を阻害している（Kondo et al. 2014）。
bikinin はこのシグナル経路を阻害することにより木部道管への分化を促進していると考えられている（Kondo et al. 2014）。この実験系では培養開始後 24 時間ほどで前形成層マーカーの発現が見られ，48 時間後では木部細胞マーカーの発現が見られるようになる。従って，この実験系は前形
成層細胞から道管へ至る全過程を再現していると考えられ，木部細胞分化の仕組みを明らかにする上で強力なツールになると期待される。
シロイヌナズナの個体に転写因子を一過的に発現させることにより異所的に体細胞の道管分化を誘導する手法も成果を上げている。Yamaguchi ら（2010）は VND6-VP16-GR あるいは VND7VP16-GR を導入したシロイヌナズナの芽生えを 4 日間 dexamethasone で処理することにより，個体内で広い範囲の体細胞をそれぞれ後生木部道管様，原生木部道管様の管状要素に分化させている。特に VND7 を用いた誘導系では個体全体の白化を引き起こすほど大部分の体細胞が道管に分化する（Yamaguchi et al., 2010）。この実験系を用い，二次細胞壁のリグニン化について新知見が報告された。この研究ではリグニンの合成に必要な酸化酵素である LAC4 および LAC17 が二次細胞壁合成部位に特異的に局在していることが示され，木部道管において二次細胞壁が特異的にリグニン化される仕組みの一端が明らかとなった（Schuetz et al. 2014）。また，この分化誘導系は高精細なライブイメージングにも用いられた。セルロース合成酵素複合体のマーカーを導入し，道管へと分化している表皮細胞を観察することにより，二次細胞壁形成におけるセルロース合成酵素複合体の詳細な挙動が明らかにされた（Watanabe et al. 2015）。この観察によると，二次細胞壁の合成領域では一次細胞壁を合成している領域に比べ，セルロース合成酵素複合体の密度が高く，また細胞膜上での移動速度も速い。細胞膜上でのセルロース合成酵素複合体の移動はセルロース
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微繊維の合成に依存していると考えられており，この結果は二次細胞壁の形成を担うセルロース
合成酵素複合体の高いセルロース合成能を示唆していると言える。このような二次細胞壁のセル
ロース合成酵素複合体の性質が管状要素分化における急速な二次細胞壁形成を可能にしていると考えられている（Watanabe et al. 2015）。
このように木部細胞分化を制御する転写因子が明らかとなってきたことから，転写因子の活性を人為的に制御し，特定のタイプの木部細胞を様々な細胞から分化させることが可能となってきた。さらに，道管を含む通同組織の細胞分化を制御する転写因子は VNS（VND/NST/SMB）ファ
ミリーとして陸上植物に広く保存されており（Xu et al. 2014），転写因子を利用した通同組織の分化誘導はシロイヌナズナのみならず幅広い植物で応用できると期待される。

４．今後の展望
これまで述べてきたように，この 10 年の間にシロイヌナズナを用いた様々な道管分化誘導系が発達してきた。材料としては個体や組織，培養細胞といった選択肢があり，誘導法に関しても
植物ホルモンや阻害剤に加え，転写因子の発現を誘導する方法がある。植物ホルモンと阻害剤を用いて誘導する手法は，既存のマーカーラインや変異系統をそのまま利用することができる強みがある。一方，転写因子を利用した方法では特定のタイプの木部道管を高頻度で分化させる特異性に秀でている。材料に培養細胞を用いた実験系は，ハンドリングの速さやイメージング，生理学的な実験との親和性が高い一方で，安定した培養を維持するには実験者の修練が必要な点，長期保存の難しさが欠点と言える。実験系の性質を考慮し，状況に適した実験系を導入することが効果的に成果を得る上で重要であろう。道管分化を研究するためのツールは明らかに充実してきており，以前と比較して容易に道管分化の研究に取り組むことができる環境が整いつつある。今後，これらの実験系のユーザーが増えることにより，その再現性や効率がさらに改善され，道管分化の研究に一層貢献すると期待される。また，今後は木部道管以外の維管束組織の分化誘導系
や，シロイヌナズナ以外の植物種での分化誘導系など，新しい実験系の開発も望まれる。このよ
うな取り組みにより，道管分化のみならず維管束全体の形成機構やその進化的な側面，さらには細胞分化という現象の根本的な理解にも繋がると期待される。

謝辞
本稿で述べた Col-0 培養細胞の管状要素分化誘導系は馳澤盛一郎教授（東京大学）のご指導の下で開発したものです。また，VND6 導入 Col-0 株を用いた後生木部道管分化誘導系の開発とそれを用いた一連の研究は福田裕穂教授（東京大学）のご指導，ご支援の下で行いました。VND6 の扱いに関して出村拓教授（奈良先端科学技術大学院大学），山口雅利准教授（埼玉大学）にご助言，ご支援を頂きました。培養細胞の扱いや形質転換に関しては三村徹郎教授（神戸大学），梅田正明
教授（奈良先端科学技術大学院大学）にご助言を頂きました。この場を借りて御礼申し上げます。

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Minoru Kubo
Single cell transcriptome analysis using next generation sequencers: Toward studying mechanismsof reprogramming in plant cells
Key words: next generation sequencer, reprogramming, single cell, totipotency, transcriptome
Division for Research Initiative, Nara Institute of Science and Technology
8916-5 Takayama, Ikoma, Nara, 630-0192 JapanGF  ʊŠKǮǣŅFLˉmRNA a±ŭG8?ʆìǯǣKɖȖʡaǚŉ:]4G.ˉʛÈŃKÛ/èėaɲP]ȈȘƀǎKªCG8EŉȄ8E)]"ŤòLÖÌXĤňˉȱȼ-[ʱV?Ɨ µg -[Ɨą µg K total RNA aÏB? RNA r¤¦ˆ©v§¦ˇǎJZ\ˉˊ-[ƗÖKʛÈŃJC)EʛÈŃǺǫʡKǚŉ.ə`^E)?"=Kũˉ£¢©|ʓʤĐůˆPCRˇǎKƠďJÉ)ˉ£d¤fŉʡ PCRˆreal time qPCRˇǎ.ʧǺ6^ˉZ\ŬʡK 10 -100 ng ȒţK RNA -[FWʛÈŃǺǫʡKǚŉ.ĔɈGI\ˉÀƜFWŢ1ǰ)[^E)]"1990 ŠÄJå]Gˉm¢yıǿ¬J DNA ƙǢa˄ŎţJy8?\ˉıƭ¬Fėż8?\8?fo¦d¥fXx©§.ǻĴ8?"4^[aǰ)]¹JZ\ˉÍĆˉÍ«ÖWKʛÈŃJC)EʛÈŃǺǫʡaªţJɥƮ:]ˉȷȿǽʛÈŃǺǫɥƮ.ĔɈGIB?"8-8ˉǮǣȔ5
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