89●TRC法の術中乳癌リンパ節転移診断への応用
バイオサイエンス事業部 開発部 遺伝子G

尾本 大輔
大仲悟
三苫 恵民の転移もないと判断し下流のリンパ節郭清を省略す

１．はじめにる。このような不必要なリンパ節郭清の回避は、リン

最新の統計によると、現在、日本人女性が最も罹患パ浮腫の発生を抑制し患者の術後QOL向上に繋がる。

しやすい癌は乳癌であり、毎年5万人以上が新たに乳前述のようなSLN理論に基づく術式を成功させるた
めには、手術中に正確なSLN転移診断を実施すること癌と診断されている。
癌の特徴の一つに転移があるが、一般に転移を起こが必須となってくる。しかしながら、現行の一般的転すと予後が著しく不良となることが知られている。乳移診断法である病理検査には高精度且つ迅速な検査法

癌では乳房の周りの所属リンパ節に転移することが多が存在せず、迅速ではあるが精度の低い術中迅速病理

く、その場合リンパ管を通して体中に転移するリスク

検査（迅速病理）と高精度だが長時間を要する永久病が高くなる。そこで、従来の乳癌の手術では、癌の原理検査（永久病理）を併用することで対応している。

発巣だけでなく、周辺組織や所属リンパ節など広範囲

実際には、術中は迅速病理を行い、術後の永久病理をな切除が行われていた。しかしながら、この術式では確定診断としているが、迅速病理陰性/永久病理陽性

乳房喪失に加え、浮腫の発生など整容性が大きく損なの場合、再手術を検討することになり、精神的・体力われ、術後QOLが低下することが問題であった。

的に患者負担が大きくなる（図２）。

近年、多くの薬剤の登場に加え、手術法の改良によ

そこで、迅速病理の迅速性と永久病理の精度を併せり切除範囲は大きく縮小してきた。その中で、リンパ持つ検査法として、遺伝子検査の適用が検討・一部実節郭清に関してはセンチネルリンパ節理論［SLN用化 ３）されている。今回、TRC法によるSLN転移診（Sentinel Lymph Node）理論］に基づく手術が実施さ断試薬を開発し、臨床的有用性を検討したので報告すれるようになった。１，２）本理論に基づく手術では、癌る。

が最も転移している可能性が高いSLN（図１）の転移診断の結果から、所属リンパ節切除の有無を決定する。
つまり、SLNに転移が認められればより下流のリンパ節も郭清し、転移が認められなければ他のリンパ節へ

２．CK19 mRNA測定試薬の開発
論文等の調査から乳癌リンパ節転移の検出ターゲッ
トとしてCK19（Cytokeratin 19）を選択した。さらに、
学会等でCK19 mRNA陰性・低発現乳癌細胞の存在がリンパ管
センチネルリンパ節採取

リンパ節術中迅速病理検査

永久病理検査センチネルリンパ節
転移あり

転移なし

転移あり

手術終了

再手術を検討

転移なし

原発巣
所属リンパ節摘出

手術終了

図１

乳癌原発巣とセンチネルリンパ節

乳癌原発巣周辺のリンパ節のうち、原発巣からこぼれ出た癌細胞がリンパ流の流れに沿って移動したときに、癌細胞が最初にたどり着くリンパ節をセンチネルリンパ節と呼ぶ。
センチネルリンパ節に転移が認められた場合、周辺のリンパ節の追加郭清を実施する。

図２

一般的なセンチネルリンパ節理論に基づく術式

術中迅速病理検査の結果、転移ありの場合、所属リンパ節の追加郭清を実施する。転移なしの場合、永久病理検査を実施。永久病理検査で転移ありとなった場合は、再手術を検討する。

90

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.54（2010）

報告されている ４）ことから、これを補完する目的でヒト由来肺癌細胞および、健常人全血から調製した

CEA（Carcinoembryonic antigen）mRNAを採用した。

リンパ球を用い、それぞれ10,000個および、5×106個

CEA mRNA測定試薬に関してはすでに研究用としての細胞からRNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用い全上市していることから、今回、試薬の基本性能に関しRNAを抽出した後、癌細胞抽出物をリンパ節抽出物ては新たに開発したCK19 mRNA測定試薬に関してので希釈することで希釈系列を作製した。本試作品を用み報告する。

いた測定の結果、癌細胞が0.5、5、50、500cells／テス

CK19はサイトケラチンの一種であり、多くのサブト相当で、それぞれ214±51、6,212±685、68,574±タイプが存在する。そこで、他のサイトケラチンの遺10,597、599,207±53,498コピーと見積もられ、1テス伝子配列との比較から、CK19 mRNAを特異的に増幅ト当たり少なくとも1個以上の癌細胞があれば定量的できるプライマー配列および検出用INAFプローブをに癌細胞を検出可能であることが示された。

設計し、TRC法によるCK19 mRNA測定試薬（試作品）［3］特異性を開発した。

本試薬の特異性を評価するため、他のサイトケラチンに対する交差反応性を調べた。種々のサイトケラチン類の中で、特にCK19と塩基配列の相同性が高く、３．基本性能評価５，６，７）

また、腫瘍マーカーとしても汎用されるCK18および［1］定量性及び迅速性

CK20の標準RNAを調製し、本試薬との交差反応性をin vitro で合成したCK19 RNA（標準RNA）の希釈調べた。その結果、CK18およびCK20標準RNAは1×溶液を本試薬で測定し、検量線を作成した［図３］。

10 10コピー／テストでも検出せず、本試薬の高い特異全ての測定は20分以内に終了し、1テストあたり5×10性が示された。また、臨床評価における増幅産物の塩5基配列解析も実施し、増幅産物がCK19 mRNAに由来−3×10 コピーの間で、検出時間とRNA濃度の間に高2することを確認した。

い直線性（R ＝0.9973）が認められ、本試薬によりCK19 RNAを迅速に定量可能であることが示された。
［2］培養癌細胞における感度

４．臨床評価５，6，７）

正常リンパ節（CK19 mRNAは発現していない）に少数の癌細胞が転移しているモデルを想定し、リンパ［1］評価方法

球抽出物で希釈した癌細胞抽出物の希釈系列における（1）センチネルリンパ節

CK19 mRNAを測定することで癌細胞の検出を試みた。

帝京大学医学部附属病院においてインフォームドコ
ンセントが得られた初期乳癌患者131名を対象にセン（b）（a）
2.85.02.66.0蛍光強度比2.2
陰性コントロール
5x10コピー
3x102コピー
3x103コピー
3x104コピー
3x105コピー

2.01.81.61.41.2

検出時間（min）

2.47.08.09.010.01.00510152011.0

反応時間［min］

12345

CK19 RNA［コピー数／テスト］

図３

標準RNA測定結果（a） 増幅反応における蛍光強度比の時間変化
蛍光強度比＝（蛍光強度）／（初期蛍光強度）（b）検出時間とRNA濃度から作成した検量線
縦軸：検出時間（min）＝図（a）において、蛍光強度比1.2（点線で示す）を越えたときの反応時間
横軸：CK19 RNAコピー濃度＝1テストあたりの標準RNAコピー数の対数表記

6東ソー研究・技術報告 第54巻（2010）91

チネルリンパ節生検を実施し、センチネルリンパ節巣の大きさ別に大型転移（2.0mm以上）、微小転移264個［平均2個（1〜5個）］を同定した。センチネル（0.2−2.0mm）を転移陽性、遊離癌細胞（0.2mm以下）

リンパ節の同定はRI／色素併用法（99m

Tc phytate／を転移陰性と判断した。
［2］病理検査の結果［表１（a）］

Lymphazurin）で行った。
（2）転移診断（図４）

迅速病理では12.5％（33／264）、永久病理では17.8％

SLN転移診断は病理検査とTRC測定によって実施し（47／264）が転移陽性であった。両検査共に陽性が29た。病理検査では、迅速病理（HE染色：Hematoxylin

例、偽陰性（永久病理陽性・迅速病理陰性）が18例、and Eosin stain）と永久病理（HE染色および抗サイト偽陽性（永久病理陰性・迅速病理陽性）が4例認めら

ケラチン抗体AE1／AE3を用いた免疫染色）を実施しれ、迅速病理は十分な精度が得られていないことが明た。TRC測定ではCK19、CEA mRNAの測定および、らかとなった。尚、偽陽性4例に関しては、全割面の内部標準としてハウスキーピング遺伝子の1種である検索を実施し転移陰性であることを確認した。

PBGD（Porphobilinogen deaminase）mRNAの測定を［3］TRC測定の結果および病理検査との比較［表１（b）］実施した。尚、ゴールデンスタンダードは永久病理で

SLN転移診断では、癌細胞を確実に検出することにあり、現在の乳癌取扱いガイドラインに即して、転移加えて、偽陽性の回避、つまり本来は追加郭清が必要ない患者に郭清を実施する不利益を回避することが重要である。そこで、そのような観点からTRC測定およリンパ節び、永久病理の結果から、カットオフ値をCK19陽性
術中迅速病理検査は61コピー／テスト以上に、CEA陽性は329コピー／テHE染色スト以上とした。尚、内部標準であるPBGD mRNA発

122分割

34

TRC測定

現量が1,000コピー／テスト以下と見積もられた検体にCK19／CEA関してはRNA抽出不良と判断し、再抽出・再測定を実施した。

56永久病理検査

次に、今回測定したCK19およびCEA mRNAの発現

HE染色／免疫染色量と永久病理の結果を比較した（図５）。現在、学会

連続切片の作製等で転移巣の大きさに関する臨床的意義について検討
図４されており、遺伝子検査においても転移巣の大きさをSLN切片の作製と検査方法

SLNを2分割した後、上下逆になる様に並べ、連続切片を作製し、連続する6切片から1,3枚目を術中迅速病理検査に、2,4枚目をTRC測定に、5,6枚目を永久病理検査に供した。
TRC測定では切片からRNeasy Mini Kit（QIGEN）を用いてRNA抽出を行い、50μLの抽出物のうち1テストあたり5μLを使用した。
迅速病理およびTRC測定には凍結切片を、永久病理にはパラフィン包埋切片を使用。迅速病理および永久病理には5μm切片、TRC測定には15μm切片を使用。

表１

マーカーの定量値から識別できることが求められている。今回の結果から、CK19およびCEA mRNAの発現量は転移巣の大きさに比例して大きくなる傾向にあり、適切なカットオフ値によって、転移なし／遊離癌細胞群と微小転移／大型転移群を区別できることが示

SLN転移診断の結果（a）病理検査の結果
永久病理 一致率（％）
陽性 陰性 陽性 陰性陽性 294
迅速病理61.7 98.2
陰性 18213（b）病理検査とTRC法の比較
迅速病理＊ 一致率（％） 永久病理陽性 陰性 陽性 陰性 陽性 陰性陽性 284320
CK1996.6 98.3
陰性217122715陽性 1916350TRC CEA
65.5 93.1
陰性 1021512217
CK19 陽性 29
18470100 92.2／CEA 陰性
21302170＊永久病理陰性の4検体を除く一致率（％）
陽性 陰性
68.1

10074.5

100100100

92TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.54（2010）

転移陰性

転移陽性

106

発現量［コピー／テスト］

105104

CK19 陽性
CK19 陰性CEA 陽性CEA 陰性103
CEAカットオフ102

CK19カットオフ

101
1
転移なし

遊離癌細胞

微小転移

大型転移

＜0.2mm0.2〜2.0mm＞2.0mm永久病理検査図５

結果

転移巣の大きさとTRC測定の結果

縦軸：1テストあたりのCK19あるいはCEAコピー数（対数表示）
横軸：永久病理検査の結果された。また、微小転移・大型転移群でもCK19ある限定される。したがって、転移巣のリンパ節内におけいはCEA mRNAの発現量が低い検体が存在することる局在に起因する偽陰性が指摘されてきた。８）しかしが明らかとなった。

ながら、遺伝子検査では、リンパ節を丸ごと破砕して上記のカットオフ値から、CK19陽性は12.1％（32／264）、CEA陽性は13.3％（35／264）、CK19、CEAの両方が陽性は7.6％（20／264）、CK19、CEAの両方またはいずれかが陽性は17.8％（47／264）であった。

検索できるため、そのようなサンプリングエラーは起きないという利点がある。
一方、遺伝子検査では癌細胞が発現するmRNAを指標としてその存在を検出するため、どのmRNAを標的TRC測定の結果を迅速病理と比較すると、CK19のとするのかが非常に重要となる。本研究でも、一般的陽性一致率が96.6％（28／29、永久病理陰性の4例を除に乳腺細胞マーカーと考えられているCK19 mRNAのく）と非常に高く、CK19の単独測定で迅速病理と同みでは感度不足であり、これを補完するCEA mRNA等の精度が得られていることが示された。次に、永久も標的に加えたことで永久病理と匹敵する感度を達成

病理との比較では、CK19あるいはCEA単独測定ではできた。このことは、学会でも議論されているが、偽陰性がそれぞれ15および12例認められたが、両マー

CK19 mRNA陰性・低発現乳癌細胞の存在が無視できカー併用で陽性一致率100％（47／47）が達成できた。

ないことを示している。多くのマーカーを使用すると今回使用したRNA抽出キットによる所要時間は15高精度になることは自明であるが、簡便さやコスト面分程度、TRC測定は20分で終了する。その他の準備時からできるだけ少数のマーカー使用が望ましい。その間等を合わせても1時間以内に実施可能であり、術中意味でも、今回ダブルマーカーで100％の一致率を得診断に適用可能であると考えられた。

られたことは意義がある。
また、今回、病理学的検査法による転移巣の大きさ

５．考察

リンパ節切片を顕微鏡で観察する従来の病理学的検査法では、時間的制約から術中に検索可能な切片数がを、TRC法によりある程度定量可能であることが示された。このことは、単なる癌細胞の有無だけではなく、治療方針の決定に役立つ更なる情報を提供できる可能性があることを示唆している。

東ソー研究・技術報告 第54巻（2010）

６．ま と め
迅速・簡便にCK19 mRNAを測定可能な試薬を開発した。また、乳癌センチネルリンパ節転移診断において、TRC法によるCK19およびCEA mRNA測定が永久病理検査と同等の精度を有し、その迅速性から術中迅速診断へと応用可能であることが示唆された。

７．謝辞

本研究は、帝京大学医学部外科

飯沼久恵先生との共同研究によって実施された。臨床評価の実施に対し、厚く御礼申し上げます。

参考文献
１）AE. Guiliano et al., Ann Surg., 220, 391（1994）
２）JB. Richard, Cancer, 103, 444（2005）３）M. Tsujimoto et al., Clin. Cancer Res., 13, 4807
（2007）
４）PG. Chu et al., Histopathology, 40, 403（2002）
５）尾本大輔他、第56回日本臨床検査学術集会抄録集、296（2009）６）田村純子他、第68回日本癌学会学術集会抄録集、437（2009）７）尾本大輔他、日本臨床検査自動化学会第41回大会抄録集、578（2009）８）K. Dowlatshahi et al., Cancer, 80, 1188（1997）

93