Dec. 2017

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70―6325（ 35 ）検査系学生の便中薬剤耐性グラム陰性桿菌の保有状況
木戸直徳 1,2,4）・村谷哲郎 2,3,4）・大野潤一 4）・鏡優衣 1）・永岡沙祐里 1）

美萩野臨床医学専門学校

1）

ひびき臨床微生物研究会

2）（株）キューリン検査部

3）

ひびき AMR 研究会

4）（2017 年 6 月 13 日受付）
平成 26 年 4 月から平成 27 年 1 月までに健康な検査系学生の便検体を用いて，薬剤耐性腸内細菌科の保菌状況を調査した。期間中に 40 名 50 検体から 86 株の腸内細菌科が検出され，Escherichia coli が 54 株（63%）と最も多かった。第 3 世代セファロス
ポリン系薬剤またはキノロン系薬剤に耐性が認められたのは E. coli のみであり，他の菌種では認められなかった。また病院実習前後で新たな薬剤耐性菌が検出された
学生はいなかった。キノロン耐性 E. coli は 14 株（26%）で，非感受性株 2 株を含めると E. coli 全体の 30% であった。基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ（ESBL）産生 E. coli
は 4 名から 5 株検出され，全菌株中の 5.8%, E. coli 全体の 9.3%，全学生中の 10.0%（4/40）であった。いずれも Cefotaxime（CTX）に耐性を示し，塩基配列を決定した
ところ，CTX-M-14 が 4 株，CTX-M-27 が 1 株であった。5 株のパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）パターンは同一患者由来株を含め，いずれも全く異なるパターンを示し関連性は認められなかった。今回の結果より，キノロン耐性 E. coli および

ESBL 産生 E. coli はすでに健康成人にも広がっていることが示された。このような耐性菌保菌調査を行い，結果を公表することは，学生に薬剤耐性菌に対する共通認識を持たせるとともに，自分がいつ何時でも保菌者・感染者に成り得ることを自覚させることができるため重要であると考える。

Escherichia coli をはじめとする腸内細菌科の菌

Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis は，セフェ種はヒトの腸管内常在菌として存在するだけでな

ム系に感受性であり，耐性株は稀であったが，欧く，免疫力が正常な宿主においても膀胱炎を引き

米では 1990 年以降，基質特異性拡張型β-ラクタ起こす病原性を有しており，胆道感染症，皮膚軟マ ー ゼ（extended-spectrum β-lactamase; ESBL）

部組織感染症，腹腔内感染症の主要な起炎菌でもを保有する株が増加し問題となった。本邦においある。また院内肺炎の起炎菌ともなり，血液培養ても 2000 年以降増加傾向にあり，厚生労働省院からの分離頻度も高い菌種である。特に染色体上内感染対策サーベイランス事業（JANIS）の集計の AmpC β-lactamase が通常発現していない E. coli

では 20% 前後がセファロスポリン耐性と報告されや染色体上に AmpC β-lactamase を有していないている 1）。さらに欧米では，カルバペネム分解酵

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表 1. 学生アンケート素を有する腸内細菌科（Carbapenemase-producingていることが報告されており，家畜におけるキノEnterobacteriaceae; CPE）が問題となっており，ギリロン耐性 E. coli の増加も問題視されている 7）。

シャなど一部の国では K. pneumoniae の半数以上

今回，健康成人の薬剤耐性腸内細菌科の保菌状が CPE であり，その多くがカルバペネムに耐性を況を調査することを目的に，検査系学生ボラン示すカルバペネム耐性腸内細菌科（Carbapenem-ティアの便検体を用いた検討を行った。なお本調

resistant Enterobacteriaceae; CRE）であることが報査研究は，侵襲性を伴わない試料を用いた観察研

告されている 2）。一方，腸内細菌科の菌種は，ヒ究として試験計画書を作成し，平成 26 年 2 月 14

トだけでなく家畜の腸管内常在菌であり，排泄物日の施設内での教官会議で審査の上，平成 26 年 3を介して広く環境中にも分布している。近年家畜月 25 日付で文書による校長の許可を得た。またを含む環境中から，ESBL 産生株，CPE などが分

学内に平成 26 年 4 月 14 日から 5 月 2 日と 9 月 29 日。これらの耐性菌はから 10 月 18 日までの計 2 回募集要項を掲示し，院内感染の原因菌として重要であることはもちろ

任意に被験者を募集して説明・同意を得られた学んであるが，近年 ESBL 産生株の市中における報生 40 名の参加により実施した。

離され話題となっている告例が散見され

3,4），その増加が危惧されている。

5,6）

また ESBL 産生株の多くがキノロン耐性を獲得しDec. 2017

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70―6327（ 37 ）表 2. 検体採取学生の年齢分布

表 3. 検出菌 86 株の内訳

材料と方法

チャースワブ ®，日本ベクトン・ディッキンソン）にて，下痢便でない自己便にスワブを 2〜3 回穿刺させ自己採取させた。

1. 検体採取検査系学生に試験計画を十分に説明し，同意が得られた学生に検体輸送用培地付きスワブ（カル2. 検査期間
平成 26 年 4 月〜平成 27 年 1 月の間に合計 40 名の

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表 4. 病院実習前後両方に便を提出した 10 名の結果学生に参加してもらった。そのうち 3 年生 10 名は研化学）を用いて微量液体希釈法にて薬剤感受性

病院実習前後の 2 回提出をしてもらい，他の 3 年試験を実施した。同一菌種であっても，明らかに生 1 名は実習後のみの提出であった。事前に表 1

コロニー性状が異なる場合は 2 株として扱った。に示すアンケートを配布し，検体提出時に一緒に提出してもらった。

4. ESBL 確認試験
薬剤感受性試験に関しては CLSI（米国臨床検

3. 培養同定および感受性試験
便検体を BTB 乳糖加寒天培地および DHL 寒天査標準協会）の M100-S228）の ESBL スクリーニン
グ 基 準 に 従 っ て 実 施 し， E. coli, K. pneumoniae,

培 地 に 接 種 し 35°C, 18〜24 時 間 培 養 を 行 っ た。 Klebsiella oxytoca, P. mirabilis の 4 菌 種 に 関 し てBTB 乳糖加寒天培地および DHL 寒天培地に発育

Cefotaxime （ CTX ）， Cefpodoxime （ CPDX ），した性状の異なるコロニーを釣菌し，グラム陰性Ceftazidime（CAZ），Aztreonam（AZT）のいずれ桿菌をスクリーニング陽性株とした。スクリーニ

かによりスクリーニング陽性と判定された株につング陽性株については，API20E（シスメックス・いて，CAZ および CTX 単剤およびクラブラン酸ビオメリュー）にて同定し，腸内細菌科の菌種を （CVA）配合ディスク（栄研化学）を用いて ESBL対象株とした。対象株はドライプレート DP31（栄確認試験（ディスク拡散法）を実施した。

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70―6329（ 39 ）表 5. MIC distribution for Escherichia coli against various antibacterial agents

5. ESBL 型の決定

6. パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）

ESBL 確認試験により ESBL 産生株と判定されESBL 産生株については，全遺伝子の NotI によた 株 に つ い て は，CTX-M-9/14, TEM, CTX-M-2,る切断パターンを PFGE により比較検討した。1%SHV, CTX-M-3 の 5 種 類 と プ ラ ス ミ ド 性 AmpC

アガロースを用い，14°C TBE 中で initial time 3 sec,β-lactamase で あ る DHA-1 の 6 種 類 のβ-lactamaseﬁnal time 60 sec, 200 V, 22 hr 泳 動 後，エ チ ジ ウ ムについて PCR（Polymerase Chain Reaction）法をブロマイド染色をし，UV 照射下で撮影した。

実施した。また PCR 陽性株については，既報に従って 9）sequence primer を用い構造遺伝子の塩基結果配列を決定した。
期間中に検査した 40 名（50 検体）から腸内細菌

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表 6. MIC distribution for Enterobacteriaceae except E. coli

図 1.

ディスク拡散法を実施した E. coli 5 株の表現型科 86 株が分離された。40 名の内訳は男性 24 名，女性 16 名，年齢 19 歳〜39 歳（中央値 21 歳）であった。
学生の年齢分布を表 2 に，検出菌 86 株の内訳を表 3に示す。また 3 年生で病院実習前後の 2 回検体を提出した学生 10 名の検出菌の内訳を表 4 に示す。E.

coli が 54 株（63%）と 最 も 多 か っ た。次 い で K.
pneumoniae が 13 株（15%），Enterobacter cloacae,
Citrobacter freundii が そ れ ぞ れ 4 株（5%）， K.
oxytoca, Hafnia alvei がそれぞれ 2 株（2%），Proteusvulgaris, Enterobacter aerogenes, Edwardsiella tarda,
Serratia liquefaciens, P. mirabilis, Citrobacterbraakii, Morganella morganii がそれぞれ 1 株（1%）
で，すべてが腸内細菌科であった。
カルバペネム系薬剤耐性株はいずれの菌種から

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70―6331（ 41 ）

図 2. ESBL 5 株の PCR 法の結果も確認されなかった。E. coli とそれ以外の菌種の型を図 1 に示す。いずれの株も CTX 単剤と CVA

薬剤感受性分布を表 5, 6 に示す。Flomoxef（FMOX） との合剤の阻止円の差が 5 mm 以上拡張しておりに関しては Latamoxef（LMOX）の基準に従った。 ESBL と 判 定 さ れ た。ま た ESBL5 株 の う ち 4 株
第 3 世代セファロスポリン系薬剤やキノロン系 （80%）がキノロン系薬剤耐性であった。ESBL5
薬剤に耐性が認められたのは E. coli のみであり， 株に関して耐性遺伝子を PCR 法にて解析を行った。
他の菌種では認められなかった。また表 4 より病

北部九州・山口地区で多く検出されている ESBL

院実習前後の 2 回検体を提出した学生 10 名に関遺伝子型（DHA-1, CTX-M-9/14, TEM, CTX-M-2,して 1 名が 2 回とも ESBL 産生 E. coli が検出されSHV, CTX-M-3）の 6 種類と rRNA のプライマーをたが，実習後で新たな薬剤耐性菌が検出された学設定した。各プライマーの塩基配列を表 7 に示す。

生はいなかった。

上記 6 種と rRNA をマルチプライマーとして PCR

キノロン系薬剤耐性 E. coli は 14 株で E. coli 全法を実施し，320 bp の rRNA マーカーと 807 bp の体の 26% 検出され，中間型 2 株も含めると E. coli

CTX-M-9/14 に共通のバンドが確認された。シン

全 体 の 30% で あ っ た。E. coli, K. pneumoniae, K.

グルプライマーによる各遺伝子を再検査した結果，oxytoca, P. mirabilis の 4 菌種に関して ESBL 産生他のプライマーにバンドは確認されず CTX-M-疑いの菌株に対してディスク拡散法を実施した結9/14 のみで陽性であった。ESBL 5 株の PCR 法の果，E. coli のみから 5 株（4 名）が陽性となり全菌結果を図 2 に示す。この 5 株を（株）キューリン

株中の 5.8%, E. coli 全体の 9.3% であった。4 名のに依頼し，ESBL 遺伝子の精査と PFGE を行った。

内訳は 3 年生 1 名（男性），2 年生 1 名（男性），1 年

学生 2 は CTX-M-27 が検出され，他の 4 株は CTX-生 2 名（男性，女性）であった。いずれも CTX に耐M-14 であった。遺伝子精査の結果と薬剤感受性性を示し，CAZ は中間型が 2 株で，耐性は見られ結果および PFGE の結果を表 8，表 9，図 3 に示す。

なかった。ディスク拡散法を実施した 5 株の表現

PFGE はいずれも異なったパターンを示し，関連332（ 42 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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表 7. 各種プライマーの塩基配列

表 8. ESBL 産生 E. coli 5 株性は示唆されなかった。ESBL 5 株の遺伝子精査性は 1 名（1 株）のみであり，残り 13 株は直近のの結果と ESBL 産生 E. coli が確認された学生 4 名

抗菌薬使用歴は認められなかった。の家族に医療従事者はいなかった。3 年生 1 名は調査期間 1 年以内に大学病院に入院歴があったが考察抗菌薬投与歴はなかった。1 年生 1 名は感冒様症状で Cefditoren pivoxil（CDTR-PI）が処方中であっ今回検査系学生より 5 株の ESBL 産生 E. coli がたが，残り 2 名は 1 年以内の入院歴や抗菌薬投与検出され E. coli 全体の 9.3% であった。またキノ歴はなかった。抗菌薬使用歴のある 3 名はいずれロン系薬耐性 E. coli は 14 株で E. coli 全体の 26%も E. coli が検出されているが，キノロン系薬剤耐検出され，中間型 2 株も含めると E. coli 全体のDec. 2017

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

図 3. ESBL 5 株の PFGE の結果

70―6333（ 43 ）500 mg, 1 日 1 回×3 日 間 で あ る。以 前 は LVFX
100 mg, 1 日 3 回の低用量で長期間使われていたた
め，病原菌を死滅させず却って耐性菌を増加させることが指摘されており 13），市中尿路感染症では地域における薬剤感受性結果の把握と培養検査の重要性が示唆された。仁木らの報告では 14），医療系学生の 7.5% から ESBL 産生菌が検出され，我々の報告もほぼ同じ数値であり，健常人の ESBL 産生菌のモニタリングの重要性が指摘されている。
神奈川県内の市販食用鶏肉の 50.0% から，また市中医療機関を受診した下痢症患者便の 5.6% から ESBL 産生菌が検出され，鶏肉を介した感染拡大が示唆されている 15）。今回，学生 4 名中 2 名は入院歴や抗菌薬使用中でその影響も考慮されたが，その他の 2 名は医療従事者との接触や抗菌薬使用等も確認されず，薬剤耐性菌の感染経路はいずれも特定できなかったが，食品からの伝播等も十分に考えられるものであった。また検出された

ESBL の type 別 は CTX-M-27 が 1 株 で 他 は CTXM-14 であり，北部九州・山口地区においても多く検出されるものであった 16）。PFGE の結果より感染経路は特定できないが，校内での同一クローンの伝播は考えにくく，同地区での蔓延も示唆された。

30% にも上った。2003 年に尿路感染症と診断され美萩野臨床医学専門学校は臨床検査技師を育成た患者から検出された E. coli のキノロン系抗菌薬する専門学校として 40 年以上の歴史を持ち，日々の耐性率は 15.7% であり，2001 年以降増加傾向を進歩する医療技術や知識・情勢に遅れないよう学。村谷らの報告では健康成人の便中生を指導することを常としている。今回の検討をからもキノロン耐性大腸菌が 8% 程度分離されてお校内での報告会で発表することにより，学生に薬り 11），食用動物への使用や外来での汎用が懸念さ剤耐性菌に対する共通認識を持たせるとともに，れている。キノロン系抗菌薬は，若い女性に好発自分がいつ何時でも保菌者・感染者に成り得るこする単純性膀胱炎の第一選択薬であるが，今回のとを自覚させることにつながると考えている。ま

結果から，Empiric therapy（初期治療）としてのた，将来病院実習や本格的に医療現場で従事する使用には注意が必要である。単純性膀胱炎の原因ときに，自分が感染源となって薬剤耐性菌を拡大菌として E. coli が最も多く，日本感染症学会およさせないという認識を持たせるための指導を学生示している

10）

び日本化学療法学会によるガイドライン

では推12）

奨される第一選択薬としては Levoﬂoxacin（LVFX）のうちに行うことが重要であると考える。

334（ 44 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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Dec. 2017表 9. ESBL 産生 5 株の各種薬剤感受性

利益相反
利益相反自己申告：申告すべきものなし。

引用文献
1）厚生労働省院内感染対策サーベイランス事業（JANIS）〈https://janis.mhlw.go.jp/index.asp〉
2）European Center for Disease Prevention andControl（ECDC）〈http://ecdc.europa.eu/en/Pages/
home.aspx〉
3）石井良和：家畜および食肉から分離されるESBL 産生菌。Chemical Times. 2010; 216: 9–12.
4）中村寛海，安福 潔，平山照雄，平井有紀，藤原佐美，西尾孝之：食品あるいはその製造環境から分離されたグラム陰性桿菌の薬剤耐性状 況。日 本 食 品 微 生 物 学 会 雑 誌 2016; 33:
61–8.
5）権 泰史，大坪亮一，村瀬 翔，朴 貴瑛，中澤健一郎，原 斉：基質特異性拡張型βラクタ

マーゼ（ESBL）産生大腸菌による市中発症髄膜炎の 1 高齢者例。臨床神経学 2012; 52: 12–7.
6）松本哲哉：多剤耐性菌の細菌学と臨床対応〜
多剤耐性緑膿菌，多剤耐性アシネトバクター，NDM-1 産生菌を中心に〜。日本内科学会雑誌
2011; 100: 3072–8.
7）田村 豊：わが国の食用動物由来耐性菌対策と 耐 性 菌 の 現 状。モ ダ ン メ デ ィ ア 2015; 61:1–8.
8）Clinical Laboratory and Standards Institute:
Performance Standerds for Antimicrobial
Susceptibility Testing; Twenty-SecondInformation Supplement. CLSI, M100-S229）Emergence and prevalence of β-lactamaseproducing Klebsiella pneumoniae resistant tocephems in Japan. Intern J Antimicrob Agents.
2006; 27: 491–9.
10）熊本悦明，塚本泰司，松川雅則，国島康晴，広瀬崇興，茂田史朗，他：尿路感染症分離菌に

Dec. 2017

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

対する経口ならびに注射用抗菌薬の抗菌力比
較（26 報 2004 年）その 1 感受性について。
Jpn J Antibiot. 2005; 58: 518–43.
11） 村谷哲郎：キノロン耐性大腸菌の現状と対策。アボット感染症アワー。2009.
12）JAID/JSC 感染症治療ガイド・ガイドライン作
成委員会：XI 尿路感染症。JAID/JSC 感染症治療ガイド 2014: 203–5.
13）山本 章：介護老人保健施設における尿路感染症と ESBL 産生（多剤耐性）大腸菌：患者背景の解析と治療効果についての経験。日本老年医学会誌 2011; 48: 530–8.

70―6335（ 45 ）

14）仁木真理恵，平井 至，山本容正：医療系学
生における基質特異性拡張型β ラクタマーゼ
産生腸内細菌保持率。日本環境感染学会誌
2011; 26: 154–6.
15）石原ともえ，古川一郎，黒木俊郎，神山 務：
市販鶏肉および市中病院外来患者におけるESBL 産生菌の検出状況。日本食品微生物学会雑誌 2011; 28: 123–7.
16）村谷哲郎：北部九州地区における ESBL 産生菌等多剤耐性菌の検出動向とその要因分析。
化学療法の領域 2011; 27: 30–6.

336（ 46 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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Prevalence of the drug-resistant Gram-negative rods
isolated from feces in medical students
Naonori Kido1,2,4）, Tetsuro Muratani2,3,4）, Jun-ichi Ohno4）,
Yui Kagami1）and Sayuri Nagaoka1）
1）

Mihagino College of Medical Technology
Hibiki Research Group for Clinical Microbiology
3）
Kyurin Medical Laboratory
4）
Hibiki AMR Laboratory

2）

From April 2014 to January 2015, we investigated the prevalence of antimicrobial resistantEnterobacteriaceae isolated from feces in healthy volunteers who is Japanese medical student.
Eighty-six Enterobacteriaceae were isolated from 50 specimens obtained from 40 students.
Escherichia coli accounted for 63%（54/86）of isolated Enterobacteriaceae, which were mostcommon species. There are no resistant isolates to 3rd generation cephalosporins and/or quinolones
except E. coli. In addition, there were no students whom new drug-resistant isolates were detected
after hospital training. The quinolone-resistant E. coli accounted for 26%（14/54）of isolated E.
coli, it accounted for 30% when they included two non-susceptible strains. Extended-spectrum
β-lactamase（ESBL）-producing E. coli strains were isolated 5 strains from 4 students, the strainsaccounted for 5.8% of all of isolates, 9.3% of all E. coli isolates, and 10% of all students. ESBL
producing E. coli consisted of two kinds of genotype; those were CTX-M-14 and CTX-M-27. The
pulsed ﬁeld gel electrophoresis（PFGE）patterns of 5 ESBL-producing E. coli strains including
isolates from same student showed quite different each other.
These results showed that quinolone-resistant E. coli and ESBL-producing E. coli had alreadyspread through the healthy adult. It is considered that surveillance of drug resistant isolates inhealthy students gives students the common recognition for drug resistance. It is important to tellstudents using this data that anyone can become a drug-resistant bacterial carrier or an infectedpatient.