国産ゲノム編集技術

CRISPR-Cas3

ゲノム編集関連製品 （第２版）
1. CRISPR-Cas3 について

2. CRISPR-Cas3 システムを用いたゲノム編集
3. CRISPR-Cas3 ゲノム編集関連製品

・Cascade-crRNA複合体作製サービス
・Cascade-crRNA complex, hB2M
・Cas3 protein NLS

4. ゲノム編集関連製品（CRISPR/Cas9）

CRISPR-Cas3ゲノム編集関連製品

5

1. CRISPR-Cas3 について
新しいゲノム編集技術『 CRISPR-Cas3 』について
CRISPR-Cas3技術は、東京大学医科学研究所 先進動物ゲノム研究分野の真下知士教授、大阪大学微生物病研究所の竹田潤二招へい教授らの研究成果を基に開発された日本発のゲノム編集技術です。

Cas7

ガイドRNAcrRNA

CRISPR-Cas3は、
ガイドRNAにあたる「crRNA」（クリスパーRNA）と5種類のCasタンパク質から構成される「Cascade」（カスケード）が複合体を形成し、標的DNA配列を認識して結合します。そこにCas3タンパク質

Cas8が結合することでDNAを切断します。CRISPR-Cas3ではCas3タンパク質が標的配列の上流側を連続的に

7

Cas3
7

11

5

8

Cas6
6

11

Cas11

Cas5

ため、従来のゲノム編集技術の課題であったオフターゲットへの影響も極めて低い特長があります。

3

7

7
8

分解することで標的配列を大きく削ることができる性質を持ち、さらにcrRNAの相補配列が32塩基と長い

77Cascade図1. CRISPR-Cas３機能因子群

Cas3

ヘリカーゼによる
巻き取り反応 (reeling)

標的（PAM）の探索

一本鎖DNA切断（nick導入）認識（R-loop）およびCas3の結合

二本鎖DNA切断

Cas3 translocation

図2. CRISPR-Cas3による二本鎖DNAの切断１）

CRISPR-Cas3 の特長● ゲノムの大規模欠損が可能

Cas3タンパク質が標的配列の上流側を連続的に分解することで、数百〜数千塩基の大規模欠失変異が可能。

● オフターゲット変異のリスクが低く、特異性が高い（安全性の高いゲノム編集技術）
crRNAの相補配列が32塩基と長いため、オフターゲットへの影響が極めて低い。

● シンプルなライセンス

ゲノム編集技術の実用化にむけた戦略が立て易い
表1. CRISPR-Cas3 と CRISPR/Cas9 の比較

CRISPR-Cas3

CRISPR/Cas9

分類

クラス 1＊（タイプ I ）クラス 2**（タイプ II）

構成要素

Cas3 protein、crRNA、Cascade構成protein

Cas9 protein、gRNA

PAM配列

AAG（AGG, GAG, TAC, ATG, TAG）

NGG

相補配列の長さ

32塩基

約20塩基

オフターゲット変異２）

極めて低い

低い

大規模欠損

◎

△

編集効率２）◎◎

切断機構

Cas3の持つヌクレアーゼドメインとヘリカーゼドメインにより一本鎖
DNA の切断が繰り返され、結果的に二本鎖切断が導入される１）

Cas9の持つ２つのヌクレアーゼドメイン（RuvCとHNH）による二本鎖同時切断

特長● crRNAの相補配列が長いため高い特異性を期待できる● 数百〜数千塩基の大規模欠失変異が可能● 実験系の構築が非常に簡単● 1〜数塩基の挿入or欠失が可能

２）■ 参考文献2

１） Yoshimi, K. et al. :Nature Communications, 13:4917（2022）
２） Morisaka, H. et al. :Nature Communications, 10:5302（2019）

CRISPR-Cas3ゲノム編集関連製品* クラス1：複数のタンパク質で標的配列を切断** クラス2：単一のタンパク質で標的配列を切断

2. CRISPR-Cas3システムを用いたゲノム編集
細胞でのゲノム編集評価（データ提供：C4U株式会社）
β2-ミクログロブリンをコードするB2M遺伝子をターゲットとして実験を行った。エレクトロポレーション法でHEK293T細胞へCas3 protein NLS（Code No.311-09441）及びCascade-crRNA complex, hB2M（Code No.312-09471）を導入し、培養３日後にFlow CytometoryでB2M遺伝子のノックアウトをHLA-A抗体を使って確認した。
また、B2M遺伝子がどの程度欠損が起きているかをクローニング及びシーケンス解析により確認した。

＜実験方法＞① RNP（Cas3 ‒ Cascade-crRNA複合体）各種を調製↓② 細胞懸濁液を用意（0.3 x 106 cells / well）↓③ 4D-Nucleofector®でエレクトロポレーション（下記：実験条件）↓④ エレクトロポレーション後、3 日目にFlow CytometoryでB2M遺伝子の発現を測定↓⑤ KO率を計算

Deletion（%）

25

B2M

20
15
10
5
0

＜実験条件＞【エレクトロポレーター】4D-Nucleofector® (Lonza社)【 Pulse Code 】DG150
胞 】HEK293T細胞【 細【 細 胞 数 】0.3 x 106 cells / well
【 R N P 】100 pmol each / well
【 プ レ ー ト 】6 well plate

1

2

3

4

Cas3+

Cas3ｰ

Flow CytometoryによるB2M遺伝子のノックアウト（KO）率
Cas3 ‒ Cascade-crRNA複合体を導入した試験区では平均して18.1%の細胞にB2M遺伝子が発現していないことを確認した。(n=3)

5

6

7

M

8

9

10

11

12

13

14

1.2 k

14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

bp

：配列情報を取得できた領域：欠損領域

シーケンス解析による欠損領域の確認

B2M遺伝子がどの程度欠損が起きているか、TAクローニングおよびシーケンス解析により確認した。

CRISPR-Cas3ゲノム編集関連製品

33. CRISPR-Cas3 ゲノム編集関連製品
crRNA（クリスパーRNA）配列設計およびカスケード複合体作製サービス

Cascade-crRNA複合体作製サービス
本サービスは、CRISPR-Cas3ゲノム編集用のcrRNAの設計およびcrRNAとCasタンパク質の複合体(Cas complex for antiviral defence, Cascade-crRNA複合体)を作製するサービスです。Cascadeを構成する5種のタンパク質と1種のcrRNAを共発現し、精製したCascade-crRNA複合体を納品いたします。
また、Cascadeを構成するタンパク質（Cas11, Cas7, Cas6）は、核移行シグナル（NLS）を有しています。本サービスで作製したCascade-crRNA複合体と、切断活性をもつCas3 protein NLS（Code No.311-09441）
を組み合わせることで、CRISPR-Cas3システムに利用することができます。

サービスの流れと概要
お客様

当社❶ ご注文（配列情報提供）❷ crRNA配列設計

配列情報提供書（当社WEBサイトからダウンロード）をご記入の上、メール送付してください。

お客様よりご提供いただく標的遺伝子周辺の配列情報をもとに、C4U株式会社にて1遺伝子につき1〜3箇所のcrRNAの候補配列（32塩基）を設計いたします。

【P.5 参照】設計をご依頼頂く際の補足情報

S TE

当社

❺ 納品物の出荷

P 1

ST

EP

お客様

2

❸ crRNAのご選択

crRNA

納品物（1配列あたり1箱にまとめて納品）
Cascade-crRNA複合体

10 µL×出来高*

検査報告書（PDF）

-

11

Cas6
6

11

Cas11

＊お客様ご自身で設計されたcrRNA配列を使用することもできます。

STEP

保存温度：- 80℃

✓

☝

1本

Cas5

5

お客様へ1遺伝子につき1〜3箇所のcrRNA
候補配列を報告します。候補配列から複合体を作製するcrRNA配列をご選択いただき
当社へご返信ください。

5

基質プラスミド**

8

7

EP

容量

7

7
8

ST

構成品

Cas8

7

7

7

STEP 3

Cas7

Cascade-crRNA複合体を配送します。

納期：1〜2週間

4

当社❹ Cascade-crRNA複合体作製

納期：3〜4ヵ月

kbp

お客様から指定された1〜3種の配列に対して、Cascade-crRNA複合体を作製します。

M

1

2

3

10.0
4.0
2.0
1.0
0.5
0.1

作業
納期（目安）● crRNA発現プラスミドの構築
1配列：作製3か月● crRNA発現プラスミドのシーケンス解析
2配列：作製3か月半● Cascade-crRNA複合体を大腸菌で発現および精製
3配列：作製4か月● Cascade-crRNA複合体の濃度測定● 基質プラスミドによるヌクレアーゼ活性確認（DNA切断試験）● SDS-PAGEによる純度確認

Lane
1
2
3

Cas3 protein+ｰ+Plasmid DNA（未切断DNA）

Cascade-crRNA+ｰ+

Plasmid DNA+（標的配列）+（標的配列）+（非標的配列）

in vitroでの基質DNAの切断確認

Cascade-crRNA複合体
起源

遺伝子組換え大腸菌

保存温度- 80 ℃

濃度

25 µg/µL Cascade-crRNA複合体

収量目安

10 µL×1本〜出来高分*／1配列あたり状

20 mM HEPES-NaOH（pH7.0）,350 mM NaCl

物

Cascade-crRNA複合体、基質プラスミド**、検査報告書（PDFをメール送付）形
納品* 製造した出来高分を出荷いたします。目安として1配列あたり6〜15本程度を見込んでおりますが、保証はいたしかねます。
** 本サービスで作製したCascade-crRNA複合体は、PAMおよび標的配列を含むPlasmidの切断実験で活性を確認します。
この in vitro 試験に使用した
Plasmidを同梱します。

4

CRISPR-Cas3ゲノム編集関連製品

設計をご依頼頂く際の補足情報：①削りたい方向性（PAM配列と切断の方向）
CRISPR-Cas3システムでは、設計したcrRNAの位置からPAM配列の方向にDNAを削ります。設計をご依頼いただく際に、標的DNAに対して削りたい
方向性をご選択いただきます。
▼ 候補領域から下流向きに削る▼ 候補領域から上流向きに削る

AAG

非相補鎖（NTS） 5’
crRNA 5’
相補鎖（TS） 3’

32塩基

TTC

CTT

5’

3’

32塩基

3’

5’

5’

3’ 相補鎖（TS）
crRNA
5’

GAA

非相補鎖（NTS）

下流向きに削る

上流向きに削る← AAG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NN

NN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN GAA →設計をご依頼頂く際の補足情報 ：②crRNA配列を抽出するための候補領域
配列情報提供書「2. 標的遺伝子情報」の入力項目「候補領域（5ʼ→3ʼ）」には、crRNA配列を抽出するための候補領域をご入力ください。
✓ Cas3の特性としてPAMから約150 base先から欠損が開始されるため、標的の周辺配列から150 baseほど空けた500 base前後が望ましいです。
✓ 基本的にExonを狙うようにターゲットを選択します。選択したcrRNAによって活性が異なります。
▼ crRNA配列を抽出するための候補領域

遺伝子名 ＊1）

B2M

候補領域から下流向き

対象遺伝子の機能 ＊1） 血清タンパク質
Homo sapiens

由来生物種 ＊1）
Accession No. ＊1）

NC̲00015.10（ 44,711,517..44,718,145）
CCCCCCGACAAATCAACAGAACAAAGAAAATTACCTAAACAGCAAGGACATAGGGAGGAACTTCTTGGCACA
GAACTTTCCAAACACTTTTTCCTGAAGGGATACAAGAAGCAAGAAAGGTACTCTTTCACTAGGACCTTCTCTGA{

500 base 前後（最大3配列）150 base （候補領域）

crRNA候補
crRNA候補
crRNA候補

Exon 1GCTGTCCTCAGGATGCTTTTGGGACTATTTTTCTTACCCAGAGAATGGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCAAG

500 base前後の候補領域を入力

CTGTAGTTATAAACAGAAGTTCTCCTTCTGCTAGGTAGCATTCAAAGATCTTAATCTTCTGGGTTTCCGTTTTCTCGAATGAAAAATGCAGGTCCGAGCAGTTAACTGGCTGGGGCACCATTAGCAAGTCACTTAGCATCTCTGGGGCC

候補領域（5ʼ→3ʼ）

AGTCTGCAAAGCGAGGGGGCAGCCTTAATGTGCCTCCAGCCTGAAGTCCTAGAATGAGCGCCCGGTGTCCCA
AGCTGGGGCGCGCACCCCAGATCGGAGGGCGCCGATGTACAGACAGCAAACTCACCCAGTCTAGTGCATGCC

150 base程度空ける（この欄に入力しない）

TTCTTAAACATCACGAGACTCTAAGAAAAGGAAACTGAAAACGGGAAAGTCCCTCTCTCTAACCTGGCACTGC
GTCGCTGGCTTGGAGACAGGTGACGGTCCCTGCGGGCCTTGTCCTGATTGGCTGGGCACGCGTTTAATATAAG

Exon 1（この欄に入力しない）

TGGAGGCGTCGCGCTGGCGGGCATTCCTGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTT

Exon 1（この欄に入力しない）
AGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGC
削りたい方向性 ＊2）

500 base 前後 150 base
（候補領域）

crRNA候補
crRNA候補
crRNA候補{▼ 配列情報提供書の「2. 標的遺伝子情報」の入力例

候補領域から上流向き（最大3配列）候補領域から下流向き*1) ニッポンジーン 遺伝子組換え実験安全委員会への申請に必要な情報となります。
*2) 削りたい方向性をプルダウンから選択して下さい。

製品名

Cascade-crRNA複合体作製サービス[ 注意事項 ]容量

希望納入価格（税別）

納期（目安）

1配列

照会

1-2週間（設計)＋3ヵ月(複合体作製)

2配列

照会

1-2週間（設計)＋3.5ヵ月(複合体作製)

3配列

照会

1-2週間（設計)＋4ヵ月(複合体作製)※2023.9.29版＜カスケード複合体の設計・作製について＞・ 本サービスは、専門のスタッフが最善を尽くして設計・作製を行いますが、ゲノム編集実験の成功を保証するものではありません。

・ 標的配列にリピート配列が含まれる場合など、標的部位やその配列によっては複合体の切断活性が著しく低くなったり、作製効率に大きく影響が出る可能性があります。
＜サービスについて＞・ 本サービスは研究目的でのみ利用することができます。それ以外の目的で利用することはできません。

・ 納品物のカスケード複合体は、ご注文されたお客様もしくは共同研究先（特定の第三者）が使用できます。

・ 実施の際は、当社 組換えDNA安全委員会の審査が必要となります。本サービス提供書に必要事項を漏れなく記入して下さい。

・ 提供書の内容や記入漏れにより、組換えDNA安全委員会の承認を得られない場合は、サービスが行えませんのでご了承下さい。
・ ご依頼数が多い場合、あるいはご依頼が集中している場合は、通常の納期では終了しない場合もありますのでご了承下さい。

・ お客様からお預かりした遺伝子情報や設計結果は、契約書の有無に関わらず秘密保持に万全を期し、お客様の同意があった場合、また法律等によって要求された場合を除き、弊社およびC4U株式会社以外の第三者に対して情報を提供することは一切ありません。

・ お客様の個人情報は、弊社、C4U株式会社、富士フイルム和光純薬株式会社ならびに販売代理店からの事務連絡等に使用させていただく場合があります。

CRISPR-Cas3ゲノム編集関連製品

5

3. CRISPR-Cas3 ゲノム編集関連製品
Cascade-crRNA複合体（ヒト B2M遺伝子）

Cascade-crRNA complex, hB2M
本品は、CRISPR-Cas3ゲノム編集用のCascadeタンパク質とcrRNAの複合体で、複数の核移行シグナル（NLS）が付与されています。crRNAはヒトの
beta-2-microglobulin（B2M）遺伝子を標的としています。Cas3 protein NLS（Code No.311-09441）と組み合わせることで、標的配列を含むDNAを切断することができます。

■ 特長● CRISPR-Cas3システムの実験系立ち上げの際の予備実験に使用可能● 本品とCas3 protein NLSを組み合わせることで標的配列を含むDNAを切断することが可能● ヒト beta-2-microglobulin（B2M）遺伝子を標的としたCascade-crRNA複合体● 核移行シグナル（NLS）
を付与
起

源

遺伝子組換え大腸菌

hB2M遺伝子情報

濃度

25 µg/µL Cascade-crRNA複合体（hB2M）

由

形

状

20 mM HEPES-NaOH(pH7.0), 350 mM NaCl

遺伝子名

保 存 温 度- 80℃

標的配列情報分396,819

子量(アミノ酸配列より算出)

配

来

列

Homo sapiens (human)beta-2-microglobulin (B2M)
5ʼ- AAG GCA TGC ACT AGA CTG GGT GAG TTT GCT GT -3ʼ

Code No.

製品名

容量

希望納入価格（税別）

312-09471

Cascade-crRNA complex, hB2M

250 µg98,000円

高純度、高濃度のCas3タンパク質

Cas3 protein NLS
本品は、Escherichia coli 由来のCas3タンパク質です。Cas3遺伝子を有する組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞を使用して発現・精製を行ったものです。核移行シグナル(NLS)をN末端とC末端に有しており、crRNAとCasタンパク質の複合体（Cascade-crRNA複合体）と組み合わせることにより、CRISPR-Cas3ゲノム編集に利用することができます。

■ 特長● 15 µg/µLの高濃度品● Cascade-crRNA複合体と組み合わせることでゲノムの大規模欠損が可能● 核移行シグナル（NLS）
を付与

6

起

源

遺伝子組換えバキュロウイルス

濃度

15 µg/µL Cas3 protein NLS

形

状

20 mM HEPES-NaOH(pH7.0), 200 mM NaCl, 1 mM DTT, 50% Glycerol

保 存 温 度- 20℃

分103,698

子量(アミノ酸配列より算出)

Code No.

製品名

容量

希望納入価格（税別）

311-09441

Cas3 protein NLS

150 µg90,000円

CRISPR-Cas3ゲノム編集関連製品

使用例：in vitroでの基質DNAの切断確認
Cas3 protein NLS（Code No.311-09441）および Cascade-crRNA complex, hB2M（Code No.312-09471）を用いて、PAM配列（AAG）と32塩基の標的配列を含むPlasmid DNAの切断確認を行った。
＜反応液組成＞
5 mM HEPES-KOH (pH7.5)
60 mM KCl
10 mM MgCl2
10 μM CoCl2
2.5 mM ATP
0.24 μM Cas3 protein NLS（Code No.311-09441）
0.20 μM Cascade-crRNA complex, hB2M（Code No.312-09471）
100 ng Plasmid DNA↓＜反応条件＞
37℃、5分間反応↓
Loading Buﬀer（SDS含有）を反応液に添加＊1↓
アガロースゲル電気泳動＊1）正確な泳動結果を得るため、SDSを含むLoading Buﬀer（Code No.313-90111等）の使用をお勧めします。

M

kbp

1

2

3

4

5

6

10.0
4.0

Plasmid DNA

2.0
1.0
0.5
0.1

1% Agarose S
M : Gene Ladder Fast 2（Code No.314-06991）
レーン

Cas3 protein

Cascade-crRNA

Plasmid DNA

2

ｰ

ｰ

+（標的配列）

1

+

+

3

+

+

5

ｰ

+

4
6

ｰ

+

ｰ
ｰ

+（標的配列）+（非標的配列）+（非標的配列）+（標的配列）+（標的配列）＜結果＞
PAM配列 および 標的配列を含むPlasmid DNA（レーン１）において切断を確認した。一方、非標的配列を含むPlasmid DNA（レーン3）において切断は確認されなかった。
■ 参考文献Yoshimi, K. et al. :Nature Communications, 13:4917（2022）

ライセンス
CRISPR-Cas3技術は、C4U株式会社の創業メンバーである東京大学医科学研究所 先進動物ゲノム研究分野の真下知士
教授、大阪大学微生物病研究所の竹田潤二招へい教授らの研究成果を基に開発された日本発のゲノム編集技術です。
当社はC4U株式会社とライセンス契約を締結し研究用途のCas3関連製品を提供しています。
本製品（Cas3 protein NLS、Cascade-crRNA complex, hB2M および Cascade-crRNA複合体作製サービス）は、東京大学医科学研究所 先進動物
ゲノム研究分野の真下知士教授、吉見 一人講師、理化学研究所放射光科学研究センター（生物系ビームライン基盤グループ）の竹下浩平先生の技術支援のもとに開発されました。

製品詳細は当社HPをご覧ください。
ニッポンジーン Cas3

CRISPR-Cas3ゲノム編集関連製品

7

4. ゲノム編集関連製品（CRISPR/Cas9）
ニッポンジーンでは、CRISPR/Cas9によるゲノム編集関連製品も幅広くラインアップしています。
ガイドRNA合成（in vitro転写）

Step

ガイドRNAを正確かつ大量に合成

CUGA®7 gRNA Synthesis Kit

CRISPR/Cas9
関連製品
ラインアップ野生型Cas9タンパク質

Cas9 Nuclease protein NLS (3 µg/µl)
Cas9 Nuclease protein NLS (15 µg/µl)
オフターゲット効果の抑制に

Cas9 Nickase protein NLS (15 µg/µl)

Code No.

変異導入の確認

Cas9タンパク質を細胞導入

遺伝子変異を簡便に検出

T7 Endonuclease I reaction Mix
遺伝子変異検出に必要な試薬がセットにRapid Indel Detection Kit

転写抑制研究などに高感度にCas9タンパク質を検出

dCas9 protein NLS (15 µg/µl)

Anti-Cas9 Monoclonal Antibody

製品名

容量

希望納入価格（税別）

ライセンス

50 回用

¥54,000

in vitro 転写でのガイドRNA合成キット

CUGA
CUGA® 7 gRNA Synthesis Kit

314-08691

野生型Cas9ヌクレアーゼ ＜高純度・高濃度＞

319-08641

Cas9 Nuclease protein NLS (3 μg/μl)

ライセンス

75 μg

¥23,000

316-08651

Cas9 Nuclease protein NLS (15 μg/μl)

ライセンス

300 μg¥75,000

Cas9 Nickase protein NLS (15 μg/μl)

ライセンス

300 μg¥75,000

dCas9 protein NLS (15 μg/μl)

ライセンス

300 μg¥75,000

T7 Endonuclease I reaction Mix

50 μｌ¥15,000

Rapid Indel Detection Kit

50 回用¥30,00050 μg¥55,000

改変型Cas9ニッカーゼ

317-09161
不活性型dCas9タンパク質314-09171

ミスマッチ切断酵素 ＜変異導入の確認＞

313-08801
迅速変異導入検出キット

313-08921【関連製品】抗Cas9モノクローナル抗体（Cas9タンパク質の検出）

310-08431

Anti-Cas9 Monoclonal Antibody

ライセンス
CRISPR/Cas9 ゲノム編集技術に関して、ERS Genomics 社よりライセンス許諾を受けて製造・販売しております。

●本文に収載しております製品は試験研究用試薬です。医薬品の用途には使用しないでください。
●表示価格に消費税は含まれておりません。

〒930‐0834 富山市問屋町二丁目7番18号
TEL： 076‐451‐6548 FAX： 076‐451‐6547
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本社 〒540-8605 大 阪 市 中 央 区 道 修 町 三 丁 目 1 番 2 号 TEL ：06-6203-3741 (代表)東京本店 〒103-0023 東京都中央区日本橋本町二丁目4番1号 TEL ：03-3270-8571 (代表)
フリーダイヤル

0120-052-099

フリーファックス

0120-052-806

20240331HT

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