日本大学歯学部紀要 49，1‒6，2021

人工知能と CRISPR による口腔細菌叢のディスバイオーシス検出方法の検討
渡辺孝康 1,2 ，芝多佳彦 3 ，中野善夫 1,2

Detection of dysbiosis within oral microbiota
by using artificial intelligence and CRISPR
Takayasu Watanabe 1,2 , Takahiko Shiba 3 , Yoshio Nakano 1,2
Abstract

Recently, dysbiosis, which is an imbalance in the state of microbiota in terms of bacterial
composition, has been focused on as a cause of infectious diseases. However, it is difficult toidentify dysbiotic patterns of bacterial composition because the composition originally differs
among individuals. On the other hand, artificial intelligence is a growing technology thatenables the recognition, identification, and/or elucidation of problems using a large amount ofdata. In this study, we detected dysbiosis within oral microbiota by using deep learning, which
is an artificial intelligence method that uses a pattern recognition algorithm with a neuralnetwork. In six patients with periodontitis and four with peri-implantitis, clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat (CRISPR) regions were extracted from the nucleotide
sequence data of microbiota and used for deep learning. The repertoire of CRISPR spacers wasdiverse among the patients and seemed to be almost specific to each patient. Neither
hierarchical clustering nor principal component analysis allowed the patients to be clearly
distinguished according to their diseases. On the other hand, deep learning was able todistinguish the patients according to their diseases with a high degree of accuracy, suggesting
its potential for use as a basic technology in dental sciences for detecting oral dysbiosis.

Key words : microbiota, dysbiosis, CRISPR, deep learning

た。その一方で，細菌がある環境にて生息するはじめに際に，多種類が共生して細菌叢を形成しているう蝕や歯周炎といった細菌感染症では，コッことが明らかとなって以来，細菌叢における細ホの原則として知られる通り，発症の原因をた菌の種類のバランスに生じる乱れ，すなわちだ一種類の細菌に追究する考え方が主流であっディスバイオーシスに病因を追究する考え方が1

日本大学歯学部12

日本大学歯学部総合歯学研究所〒101-8310

3

基礎自然科学分野（化学）
機能形態部門〒113-8510

Dentistry
2

東京都千代田区神田駿河台 1 − 8 −13

東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科

歯周病学分野 ivision of Functional Morphology, Dental Research
DCenter, Nihon University School of Dentistry

東京都文京区湯島 1 − 5 −45（受理：2021年 7 月 8 日）

 epartment of Chemistry, Nihon University School ofD

1-8-13 Kanda-Surugadai, Chiyoda-ku, Tokyo 101-8310, Japan3

 epartment of Periodontology, Graduate School of Medical
Dand Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University
1-5-45 Yushima, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8510, Japan─ 1 ─

日本大学歯学部紀要 49，1‒6，2021

近年広まってきている 1 ）。これを助ける研究手材料と方法法として，次世代高速シーケンサーの技術発展が大いに貢献しており，遺伝子情報として塩基歯周病に罹患した 6 名，およびインプラント配列を決定するのに手間と労力を要したサン周囲炎に罹患した 4 名の患者の炎症病変の細菌ガー法に代わって，一度に大量の塩基配列情報叢検体について次世代高速シーケンサーにて解を取得できるツールとして，いまやマイクロア析した細菌 DNA の塩基配列情報を利用したレイでさえもとって代わられようとしている

2,3）10）。 （https://www.ddbj.nig.ac.jp/; DRA010104）。

しかし，次世代高速シーケンサーで取得した塩解析ソフトウェア CRISPR Recognition Tool

基配列データは，その量的優位性ゆえに，細菌（version 1.2）11）にて，リピート配列・スペー叢がディスバイオーシスであるか否かをデータ

サー配列のいずれも 1 個あたり30〜40塩基対，セットから簡易に視認し判別することが困難でかつ 3 個以上のリピート配列となるような条件ある。

を指定して，データから CRISPR 領域のみをそこで我々は，ビッグデータを用いて事象の抽出した。次いで，得られた CRISPR の中か認識・特定・判別を可能とする人工知能技術にらスペーサー配列のみを選別し，解析ソフト着目した。なかでも深層学習は，脳神経が形成

12）
ウェア CD-HIT（version 4.8.1）
を用いて，互するニューラルネットワークを応用してパターいに類似したスペーサーを整理した。この情報

ン認識のためのアルゴリズムを利用する技術をもとに，患者ごとに保有するスペーサーの種で，画像認識など幅広い分野にて利用されてい類を調べ，ヒートマップとして図示した。また，る4,5）。本研究では，歯の周囲に生じる歯周炎，階層クラスタリングおよび主成分分析により，ならびに歯科インプラントの周囲に生じるイン保有するスペーサーの種類に基づく患者間の近プラント周囲炎の細菌叢データから，深層学習縁性を調べた。さらに，歯周炎とインプラントを用いてディスバイオーシスを検出する方法を周囲炎の識別程度を，解析ソフトウェア R パッ検討した。その際，細菌叢データの中でも特に，ケージ h2o（version 3.32.0.1）を用いた深層学細菌がウイルスなどの感染を受けた履歴，すな習にて調べた。以上の解析には，東京大学医科

わち獲得免疫を担う遺伝領域としてゲノム内に学研究所ヒトゲノム解析センターのスーパーコ保持している clustered regularly interspaced

ンピュータを利用した。

short palindromic repeat（CRISPR）を用いた6-8）。

CRISPR は，等間隔に並んだ同一のリピート配結果列，およびその間に挟まる形で位置する様々なスペーサー配列から構成される。スペーサー配歯周炎およびインプラント周囲炎の患者計10列は，過去に感染したウイルスなどの遺伝子の名から，合計で2,525個のスペーサー配列が抽一部を保存しておく役割があり，免疫記憶領域出された。スペーサー数は最小の患者で41個，であるといわれる。スペーサー配列のバリエー最大の患者で615個であった。2,525個のスペーションは，同じ種類の細菌であっても株ごとにサーにおいて，互いに類似したスペーサーを調多様であるため 9 ），これに対して深層学習を適べたところ，2,052種類に整理された。その保用すれば，ディスバイオーシスの検出に役立つ有状況をヒートマップにて図示すると，1,934ものと考えた。

種類のスペーサーは 1 人の患者のみに認められ，残りのうち115種類は 2 人， 3 種類は 3 人
─ 2 ─

人工知能と CRISPR による口腔細菌叢のディスバイオーシス検出方法の検討

図 1 ．患者毎のスペーサー分布

図 3 ．主成分分析による患者間の類似性
表 1 ．深層学習における活性化関数毎の正解率活性化関数

Dropoutなし

Dropoutあり

Tanh80. 060. 0

Rectiﬁer

80. 070. 0

Maxout90. 070. 0をベースとした 6 種類の活性化関数のうち，Tanh に dropout を付加した活性化関数において
図 2 ．階層クラスタリングによる患者間の類似性の患者に共通して認められた（図 １ ）。

最も低い正解率60.0% となった。一方，Maxoutに dropout を付加しなかった活性化関数において最大の正解率90.0% となった（表 １ ）。

患者間の類似性に関する解析では，階層クラスタリングにおいて，歯周炎の患者とインプラ考察

ント周囲炎の患者は明確なクラスターとして分割されず，両者は樹形図において混在していたゲノム解読されている細菌のうち，CRISPR（図 ２ ）。主成分分析でも同様に，個々の患者をは 5 割の真正細菌， 9 割の古細菌が保有する表すプロットは歯周炎とインプラント周囲炎とこ と で 知 ら れ 7 , 13）， 例 え ば 歯 周 病 原 細 菌

で明確なクラスターを形成せず，両者が座標平Porphyromonas gingivalis では，ゲノム内に最面上で混在する分布となった（図 ３ ）。

大 で 4 ヶ 所 の CRISPR を 有 し， 1 ヶ 所 のここで，深層学習をスペーサーデータに対しCRISPR あたりのスペーサー数は多い場合でて適用し，歯周炎とインプラント周囲炎の識別100個を超えることもある 9 ）。本研究ではまず，程度を調べた。その際，患者 1 名のデータだけスペーサーの種類を整理した段階で，2,052種を除外して学習させ，除外データの疾患を予測類のうち94.2% にも上る1,934種類のスペーサーさせるアルゴリズムを，除外患者を変更しながが 1 人の患者のみから抽出された。このことから繰り返した。その結果，Tanh, Rectifier, Maxout

ら，10名の患者におけるスペーサーのバリエー─ 3 ─日本大学歯学部紀要 49，1‒6，2021

ションはやはり患者ごとに特有であることが示絞り込んだことによって，却って疾患ごとの特唆された。すなわち，本研究は解析対象を歯周徴を見出しにくいデータセットになったものと炎・インプラント周囲炎という 2 種類の疾患に考えられる。また，深層学習を適用せずに，従限定したにもかかわらず，疾患の種類に関係な来多用されてきた階層クラスタリングや主成分

く，患者ごとに特有なスペーサー保有パターン分析のような解析手法を用いるだけでは，患者を示したものといえる。

を疾患ごとに識別することが困難であるといえ次いで，患者間におけるスペーサーの種類のる。

類似性を調べる際，歯周炎には歯周炎特有の，一方，深層学習を適用すると，主要なパラ

インプラント周囲炎にはインプラント周囲炎特メーターの一つである活性化関数によって正解

有のスペーサー保有パターンが，何らかの形で率に60.0% から90.0% の開きがあるものの，総現れると期待された。しかし予想に反して，階じて高い正解率のもとで患者を歯周炎・インプ層クラスタリングでは，歯周炎・インプラントラント周囲炎に識別することがわかった。深層周囲炎の患者が混在する樹形図となった。階層学習では，視覚的な識別が困難なデータパター

クラスタリングは近縁の患者同士を階層的に整ンを認識・識別することができるため，本研究理する手法で，特定のクラスターが認められるのように患者ごとの特異性が高く疾患ごとの特9）徴を見出しにくいスペーサー情報というデータが，本研究ではそのような結果は得られなかっであっても，精度よく疾患の識別ができうるこた。このような，疾患にかかわらず患者が混在とが示された。CRISPR のみに絞り込んだデーするという結果は，階層クラスタリングとは異タセットは，前述の通り従来の解析手法では疾なるアルゴリズムを用いる主成分分析でも同様患ごとの特徴を見出しにくかったにもかかわらであった。主成分分析は，1,934種類のスペーず，CRISPR データと深層学習を用いることでサーの保有状況という多次元データを，視覚的疾患の高精度な識別を成し得たといえる。

場合，樹形図でクラスター間の枝長が長くなるに理解が容易な 2 次元に縮約するための手法で，本研究では第 １ 主成分には本来の分散のまとめ18.3% が，第 2 主成分には15.8% が縮約された。
主成分分析の座標平面上では，プロットが近い

細 菌 叢 に 由 来 す る DNA デ ー タ の 中 で も，ほど患者間のスペーサー保有パターンの類似性

CRISPR におけるスペーサー情報は患者ごとのが高いことを示すため，例えば歯周炎の患者の特異性が高いとみられ，歯周炎・インプラントプロットとインプラント周囲炎患者のプロット

周囲炎の特徴を見出しにくいデータセットでが離れた位置にそれぞれ集積していれば，疾患あった。このことは特に，従来用いられてきたごとに明確なクラスターが形成されたことを示

階層クラスタリングや主成分分析といった解析す。しかしながら，本研究ではそのような明確手法の適用下では顕著であった。その一方で，なクラスターは観察されなかった。

深層学習を用いることによって，スペーサー情

これまでの研究では，細菌叢由来の DNA な報に基づいて高精度で疾患を識別し得ることがらびに RNA データを解析すると，歯周炎とイ示され，細菌叢におけるディスバイオーシス検ンプラント周囲炎とで異なる特徴が見出される出の一手法として今後，対象患者数を充実させことが報告されているが14-16），以上の結果をまつつ適用方法や精度向上などを探究する必要がとめると，本研究では解析対象を CRISPR にあると考えられる。また，CRISPR にはスペー─ 4 ─

人工知能と CRISPR による口腔細菌叢のディスバイオーシス検出方法の検討

サーだけでなくリピート配列にも細菌の種類ご（SEO）by using hybrid modified MCDM

17）との多様性があることが知られており ，これmodels. Artif Intell Rev 53, 1 -16.

を対象とした深層学習の適用にも検討の余地が6 ）Marraffini LA, Sontheimer EJ（2010）ある。本研究は，深層学習という人工知能の一CRISPR interference: RNA-directed adaptive手法を，細菌叢に由来するビッグデータに適用

immunity in bacteria and archaea. Natした研究であり，人工知能とビッグデータを歯Rev Genet 11, 181-190.

科医療に応用する上での基礎的知見として将来

7 ）渡辺孝康，中川一路，丸山史人（2013）原的な応用が期待されるであろう。

核生物の新規な獲得免疫機構 CRISPR/Cas
システム．化学と生物，51, 440-443．
8 ）渡辺孝康，村瀬一典，中川一路，丸山史人

謝辞（2015）原核生物の獲得免疫に見られる新本論文に記載した研究は，令和元年度および機構から紐解かれてきたゲノム進化．化学

令和 ２ 年度日本大学歯学部佐藤奨学金研究費，療法の領域，31, 118（2240）-128（2250）．

公益財団法人富徳会研究者助成金，および公益9 ）Watanabe T, Nozawa T, Aikawa C,

財団法人ロッテ財団奨励研究助成の援助を受け

Amano A, Maruyama F, Nakagawa I

た。

（2013）CRISPR regulation of intraspecies
diversification by limiting IS transposition
and intercellular recombination. Genome【参考文献】

Biol Evol 5, 1099-1114.
1 ）Rosier BT, Marsh PD, Mira A（2018）10）Komatsu K, Shiba T, Takeuchi Y,

Resilience of the oral microbiota in health:Watanabe T, Koyanagi T, Nemoto T,

mechanisms that prevent dysbiosis. J

Shimogishi M, Shibasaki M, Katagiri S,Dent Res 97, 371-380.

Kasugai S, Iwata T（2020）Discriminating2 ）Loman NJ, Constantinidou C, Chan JZ,

microbial community structure between

Halachev M, Sergeant M, Penn CW,

peri-implantitis

Robinson ER, Pallen MJ（2012）High-integrated metagenomic, metatranscriptomic,

throughput bacterial genome sequencing:and network analysis. Front Cell Infectan embarrassment of choice, a world ofMicrobiol 10, 596490.

opportunity. Nat Rev Microbiol 10, 599-

andperiodontitis

with11）Bland C, Ramsey TL, Sabree F, Lowe M,

606.

Brown K, Kyrpides NC, Hugenholtz P3 ）渡辺孝康（2018）ヒトの口腔内菌叢解析の（2007）CRISPR recognition tool（CRT）: a

特徴と応用事例．ペット栄養学会誌，21,

tool for automatic detection of clustered154-157．

regularly interspaced palindromic repeats.

4 ）Bolón-Canedo V, Remeseiro B（2020）
Feature selection in image analysis: a

BMC Bioinformatics 8, 209.
12）Fu L, Niu B, Zhu Z, Wu S, Li W（2012）

survey. Artif Intell Rev 53, 2905-2931.

CD-HIT: accelerated for clustering the5 ）Tsuei HJ, Tsai WH, Pan FT, Tzeng GH（2020）Improving search engine optimization─ 5 ─

next-generation

sequencing

Bioinformatics 28, 3150-3152.

data.

日本大学歯学部紀要 49，1‒6，202113）Bhaya D, Davison M, Barrangou R（2011）

Distinct interacting core taxa in co-

CRISPR-Cas systems in bacteria andoccurrence networks enable discriminationarchaea: versatile small RNAs for adaptiveof polymicrobial oral diseases with similar

defense and regulation. Annu Rev Genet

symptoms. Sci Rep 6, 30997.

45, 273-297.

16）芝多佳彦，竹内康雄，渡辺孝康，小柳達郎，

14）Maruyama N, Maruyama F, Takeuchi Y,丸山緑子，加地博一，村瀬一典，丸山史人，

Aikawa C, Izumi Y, Nakagawa I（2014）

中川一路，和泉雄一（2017）インプラント

Intraindividual variation in core microbiota

周囲炎と歯周炎の細菌学的な違いを科学すin peri-implantitis and periodontitis. Sci
Rep 4, 6602.

る．歯界展望，129, 823-826．
17）Sorek R, Lawrence CM, Wiedenheft B

15）Shiba T, Watanabe T, Kachi H, Koyanagi（2013）CRISPR-mediated adaptive immune

T, Maruyama N, Murase K, Takeuchi Y,systems in bacteria and archaea. AnnuMaruyama F, Izumi Y, Nakagawa （I 2016）

Rev Biochem 82, 237-266.

─ 6 ─