No.40

豚病会報

20023

豚コレラウイルスＢ亜型による野外発生と豚腎株化細胞（ＣＰＫ細胞）を用いた
豚伝染性胃腸炎ウイルスの診断法の開発研究
駒庭英夫（栃木県県南家畜保健衛生所：〒３２８−００７５ 栃木市箱森町２２−２７） 
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はじめに藤崎先生から診断用抗原をいただき、２年間管内養栃木県に採用後、私が最初に勤務した家畜保健衛生

豚地帯の豚パルボウイルス伝播状況を調査したところ、所（以下、家保）が宇都宮家保でした。昭和５１年（１９７６

藤崎先生が調査されたとほぼ同様な傾向で豚パルボウ年）のことです。それから２５年余、今回第１０回日本豚イルスの伝播が起きていることが明らかになりました

病研究会藤崎優次郎賞受賞という栄誉を賜り感激して（図１）。

おります。また、今回の私の受賞に際し推薦の労をこの仕事をしてから３年後、今度はつくば市に移転とってくださった三浦康男幹事にお礼申し上げます。

して２年目の家畜衛生試験場にウイルス病の診断研修

私が豚のウイルス病と初めて関わったのは、昭和５１に行くことになりました。当時の研修は５月から翌年年でした。本会の会長である藤崎先生から豚パルボウ２月までの９カ月という長いものでした。私の配属先

イルスＨＡ抗原を分与していただき、宇都宮家保管内は豚コレラ研究室でした。今は組織改編でなくなっての養豚地帯における豚パルボウイルスの伝播状況を調しまいましたが、昭和５５年（１９８０年）当時、研究室は大査しました。当時は豚パルボウイルスの調査をしよう所帯で活気に溢れていました。私はそこで初めて、清と思っても、診断液などは市販されていませんでした。

水実嗣先生から組織培養や豚コレラウイルスの定量法豚パルボウイルスＨＡ抗原を分与していただくため、であるＥＮＤ法について教えていただきました。今回の小平にあった家畜衛生試験場に出かけました。そこで受賞対象となった仕事の大半は、この研究室で学び、初めて藤崎先生にお会いしました。その時先生は私に指導していただきながら行った内容だと思います。

２つのことを注文しました。
「診断用抗原は必要なだ
けあげます。但し、調査結果をきちんとまとめて私に豚コレラウイルスＢ亜型による野外発生報告すること。そして、調査した結果は文章にして残昭和５５年の５月、ウイルス病診断研修のためにつくすこと。」というものでした。その時はよくわかりまば市に長期出張したころ、栃木県では豚コレラは１０年せんでしたが、今思うとあの時の藤崎先生の注文が、間発生がなく（図２）、すでに過去の病気と思われていその後仕事をしたらまとめて報告する、という姿勢にました。全国的に見ても昭和５０年（１９７５年）１１月の神つながったのだと思います。

奈川県での発生を最後に４年間発生がなく、本県と同様な状況だったと思われます。したがって、豚コレラ

100
抗体保有率（％）
予
防注
射実施成績

2000

抗体陽性数

621476164507528

調 査 頭 数8717265645075

28

産012345≧6

産次別抗体保有状況（豚パルボウイルス）（養豚の友、昭和５４年１１月号、１２８巻）

800

80
予防注射接種率70500

50
発生頭数10豚コレ
ラ
発
生頭数

400
300

3020700
600

60（％） 400

図１

3000

10090

50

歴110

生ワクチン使用開始（S.44年)

200
10000
39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59

年度

図２ 本県における豚コレラの発生と予防注射の実施状況

4Proc Jpn Pig Vet Soc No.40 2002

研究室に配属になってもさほどの緊張感もなくのんびに食い止める必要があります。

りと構えていました。それが突然、研修の始まった５

図４に、熱性疾患で病性鑑定依頼のあった６件の体月に千葉と茨城県で豚コレラの発生があり、８月には温と白血球数を示しました。３件（No.４〜６）は豚コ

愛知、１０月には宮崎、島根、埼玉、山形、福島の各県で発生、１１月には北海道の上川と十勝で発生が確認されました。そしてついに本県でも１２月に入り、６戸の農家に本病の発生が確認されました。
当時、豚コレラウイルスの分離・抗体検査には豚精巣細胞を培養して行っていました。たまたま私がＴＧＥウイルスの仕事をするのに、福所先生からいただいた豚腎由来の株化細胞（あとでＣＰＫ細胞と名前が付けられました）が豚コレラウイルスにも感受性のあることがわかり、そのＣＰＫ細胞を使い、豚コレラウイルスのマイクロ法による定量・中和試験の仕事をすることにな り ま し た。こ の 仕 事 は１９８
１年 の Natl.Inst. Anim.
Health Q. に載せていただきました。そして、昭和５５年から５６年にかけて本県で発生したＢ亜型ウイルスによる豚コレラについて、ＣＰＫ細胞を用い開発したマイクロＥＮＤ法により調査を行いました。今回は、その概要について報告します。
豚コレラの検査手順は図３に示したとおりです。
臨床検査で集団検査とあるのは、１〜２頭の検査で済ますのではなく、少なくとも１０頭以上を対象に検査を行うということです。また、発熱している豚の少なくとも１０頭以上について血液検査を行います。特に白血球数が１万個／裔以下の個体が４割を超えるような場合は豚コレラを疑い、迅速に病勢を決定するとともに、万全な初動防疫体制を構築して病気の伝播を最小

図４

熱性疾病における体温・血球数

臨床検査（集団検査）
群に40℃以上の豚がどれ位いるか。
①体温
②食欲廃絶
③チアノーゼ（下腹部、四肢内側）④ twisting, pile up
剖検（各所の点状出血に注意）

血液検査

①白血球数

（発熱している豚の少なくとも10頭以上）
１万個／ｍｍ3を基準
１万個／ｍｍ3以上

１万個／ｍｍ3以上②血液塗抹標本（核の左転）

ほかの疾病も疑ってみる（現地での見落としや調査漏れはなかったか）
豚コレラを疑う鑑定殺

図３

豚コレラの検査手順

ウイルス分離（扁桃、血清）
病理組織学的検査

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2002

5

レラと診断され、残りの３件（No.１〜３）は豚コレラがＴＧＥウイルスに高い感受性を有することがわかりま以外の熱性疾患と診断されました。

したので、中和試験のマイクロ化とウイルス分離法の体温については、No.１，２及び６が全頭４０℃以上の発熱、No.４と５が８０％以上、No.３では３３％に発熱が認められました。一方、白血球数は No.４，５及び６では全頭が、No.２では３３％が１万個／裔以下でしたが、No.１と３では白血球数の減少は認められませんでした。
次に、昭和５５年から５６年にかけて本県で発生したＢ開発を試みました。今回はＴＧＥウイルス分離法の研究について説明します。
表 １ は、細 胞 に 馴 化 し て い な いＴＧＥウ イ ル ス
Toyama 株の培養法を検討した成績です。
表１

回転培養とトリプシン添加によるＴＧＥウイルスの増殖効果

亜型ウイルスによる豚コレラの野外発生例について、罹患豚の臨床症状、体温、白血球数を調査するととも細胞に、ＣＰＫ細胞を用いたマイクロＥＮＤ法により、豚コレラウイルスに対する血清中の抗体価を測定しました。

トリプシン添加
維持培地

有１）

有２）
無473.0３）
1.0

58.05.5

無有無127.5
2.551.00.0

有48.04.5

無1.50.0

有19.50.0

無0.50.0

ＣＰＫ

また同時に、罹患豚血清中からの豚コレラウイルスの分離も試みました（図５）
。

培養方法

接種材料

有ＳＫ無回転静置１） 接種材料は１０裹／ｍＬ（ＳＫ細胞は５裹／ｍＬ）のトリプシンで３７℃３０分処理した後、細胞に接種
２） 細胞は0.5裹／ｍＬのトリプシンを添加したイーグ
ルＭＥＭ（ｐＨ7.4）で培養
３） 特異蛍光陽性細胞数／0.2ｍＬ、接種後３日目のカバースリップ２枚の平均値

ＣＰＫ細胞とＳＫ細胞を用い、回転培養及び静置培養のそれぞれについて、接種材料並びに維持培養液にトリプシンを添加した群と無添加の群を設け、接種材料中
図５

B 亜型ウイルスによる豚コレラの野外発生例のウイルスの検出効率を比較しました。その結果、接種材料のトリプシン処理と維持培地へのトリプシン添中和抗体陰性の１１頭中４頭は起立困難や横臥などの加を行った場合、回転培養ではカバースリップ当たり重篤な臨床症状を示しましたが、残り７頭は腰がふらＣＰＫ細胞で４７３個、ＳＫ細胞で４８個の感染細胞が検出さつく程度の臨床所見であり、検温後初めて発熱に気づれました。しかし、静置培養では感染細胞の検出はＣきました。これら１１頭の白血球数は全頭が１万個／裔ＰＫ細胞で５８個、ＳＫ細胞で4.5個でした。そのほかの方以下であり、１１頭すべての血清から無希釈で豚コレラ法によるウイルスの検出効率は、いずれも前述の回転ウイルスが分離されました。中和抗体価１倍以上、培養と接種材料のトリプシン処理、維持培地へのトリ２５６倍の群で体温の上昇が認められたものは２８頭中２２プシン添加という系に比べて劣っていました。

頭（７８％）、白血球数の減少が認められたものは２９頭中以上の結果から、トリプシン処理→維持培地へのト２１頭（７２％）でした。また、３０頭中１１頭の血清からウリプシン添加→回転培養の系とＣＰＫ細胞を用いる方法イルスが分離されました。ウイルスは無希釈の血清かが、ＴＧＥウイルスの検出に最も優れていることが明ららは分離できず、希釈した血清の材料からは分離できかになりました。

るという現象が認められました。

次に、ＴＧＥウイルスのＣＰＥ出現に及ぼすトリプシンの影響について、ＣＰＫ細胞と細胞に馴化していないＴ

豚腎株化細胞（ＣＰＫ細胞）を用いた豚伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）ウイルスの診断法の開発研究
従来ＴＧＥの診断は、豚腎初代培養細胞（ＳＫ細胞）を用いた試験管法により行われてきましたが、ＣＰＫ細胞

ＧＥウイルスＴｏｙａｍａ株を用いて調べました。
接種材料のトリプシン処理・非処理、維持培地へのトリプシン添加・無添加及び回転培養の組み合わせで実験を行いました。

6Proc Jpn Pig Vet Soc No.40 2002

表２ ＴＧＥウイルスのＣＰＥ出現に及ぼすトリプシンの影響
細胞変性効果（ＣＰＥ）の出現

トリプシン添加
接種材料

維持培地
２）

有１）

継１３）

代数
３２４４）

−−＋（５） ＋（２） ＮＤ−−＋（５）有−＋（５） ＋（２）

無−

−＋（５）

いた回転培養ではＢ農場の成豚を除き、糞便材料を接種後４日から６日目にかけてＣＰＥが認められました。

有無無数は４個から1,360個と幅がありましたが、試験管を用ＮＤ
ＮＤ

１） 接種材料は１０裹／ｍＬのトリプシンで３７℃３０分処理した後、細胞に接種
２） 細胞は0.5裹／ｍＬのトリプシンを添加したイーグ
ルＭＥＭ（ｐＨ7.4）で培養
３） −は正常細胞、＋はＣＰＥの出現を示す。（ ）内の数字はＣＰＥが初めて認められた日を示す
４） 検査せず

これら８例の初代培養上清をトリプシンで処理し継代したところ、８例すべてに培養２日目からＣＰＥが認められウイルスが分離されました。
なお、ＣＰＫ細胞とトリプシン処理→維持培地へのトリプシン添加→回転培養の系を用い、ＴＧＥウイルスの分離を試みる過程で、ＣＰＫ細胞にＣＰＥを示して増殖するアデノウイルス、レオウイルスが分離されました（表４）。
表４ ＣＰＫ細胞を用いた豚下痢便からのＣＰＥを示すウイルスの分離

表２に示したように、トリプシンを維持培地へ添加発症豚

した群では無添加群に比べて１〜２代早期にＣＰＥが認農場

められました。以上の結果から、ＣＰＥの発現においてＡも、トリプシンの維持培地への添加と回転培養が有効Ｂであることが明らかになりました。
次に、野外の豚下痢便材料について、ＣＰＫ細胞とトリプシン処理、維持培地へのトリプシン添加、回転培養という方法を応用し、ＴＧＥウイルスの分離を試みました（表３）。
表３ ＣＰＫ細胞を用いた豚下痢便からのＣＰＥを示すＴ
ＧＥウイルスの分離
発症豚

農場
ＡＢ

Ｃ

年齢

カバースリップ上の蛍光陽性細胞数１）

継代数２）

分離ウイルス

継代数１）

年齢
成 豚

アデノウイルス

１２）
1/8（４）

２
8/8（４）

４カ月齢
５カ月齢

レオウイルスレオウイルス

1/8（７）
3/8（７）

4/6（３）
8/8（４）

１） 継代には、培養上清を１０裹／ｍＬのトリプシンで
３７℃３０分処理した後、細胞に接種。細胞は0.5裹
／ｍＬのトリプ シン を 添 加 し た イーグ ル ＭＥＭ（pH7.4）で培養
２） 分母は使用した試験管数、分子はＣＰＥの出現した
試験管数、（ ）内の数字はＣＰＥが初めて認められた日を示す

Ａ農場では成豚と子豚の散発的な下痢と嘔吐が認められ、成豚の下痢便からアデノウイルスが分離されま２した（写真１）。Ｂ農場では４カ月齢と５カ月齢の肥育

３）

１

１
５日齢

1,360

6/6（４）

6/6（２）

豚が一斉に下痢を呈し、その下痢便材料からレオウイ

２
０日齢

4

1/6（５）

6/6（２）

ルスが分離されました（写真２）
。

成豚

28

0/6（６）

8/8（２）

４カ月齢
５カ月齢

136
123

2/8（６）
2/8（６）

8/8（２）
8/8（２）

６カ月齢

121/8（６）8/8（２）

２日齢

510

2/6（６）

8/8（２）

２日齢368

2/6（６）

8/8（２）

以上、主に昭和５０年代から６０年代にかけて行った仕事の内容について説明しました。少しでも皆様の仕事

１） 蛍光陽性細胞数／0.2ｍＬ、接種後２０時間。接種材
料は１０裹／ｍＬのトリプシンで３７℃３０分処理した後、細胞に接種
２） 継代には、培養上清を１０裹／ｍＬのトリプシンで３７℃３０分処理した後、細胞に接種。細胞は0.5裹
／ｍＬの ト リ プ シ ン を 添 加 し た イ ー グ ルＭＥＭ
（pH7.4）で培養
３） 分母は使用した試験管数、分子はＣＰＥの出現した試験管数、（ ）内の数字は培養日数またはＣＰＥが初めて認められた日を示す

表３に示したように、ＴＧＥウイルスはＡ農場の１５日齢と２０日齢の哺乳豚、Ｂ農場の４〜６カ月齢の肥育豚と成豚、Ｃ農場の２日齢の新生豚から分離されました。
培養２０時間目のカバースリップ上の特異蛍光陽性細胞

写真１ アデノウイルス粒子（×250,000）

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2002

7文献

１．駒庭英夫（１９７９）豚の死流産実態調査．養豚の友．
１２８：１４-１８．
２．Hideo, K., et al. (1981) Micro Method for Performing Titration and Neutralization Test of Hog Cholera
Virus Using Established Porcine Kidney Cell Strain.
Natl. Inst. Anim. Health Q. (Jpn.) 21(4) : 153-158
３．駒庭英夫ら（１９８３）点数方式による豚コレラ診断の試み．家畜診療．２４６：２９-３
２．
４．駒庭英夫ら（１９８４）Ｂ亜型ウイルスによる豚コレらの野外発生例．家畜診療．２
４７：１９-２１．
５．駒庭英夫ら（１９８５）栃木県における豚下痢便から
写真２ レオウイルス粒子（×150,000）のウイルス分離成績．家畜診療．２
６
９：２
７-３１．
６．Hideo, K., et al. (1986) Isolation of Trans-missibleに役立てば幸いです。
なお、今回説明した内容については下記の雑誌等に掲載されていますので参考にしてください。

Gastroenteritis Virus from Feces of Diarrheic Pigs inRoller Culture of CPK Cells in the Presence ofTrypsin. Jpn. J. Vet. Sci. 48(6) : 1245-1248
７．Hideo,K., et al. (1987) Micro-Method for Neutralization Test of Transmissible Gastroenteritis Virus
Using Porcine Kidney Cell Line, CPK Cells. Jpn. J.
Vet. Sci. 49(1) : 141-144