より低コストなPCR-DGGE解析手法
より低コストなPCR-DGGE解析手法
M M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 91010M M

株式会社リーゾ
株式会社リーゾ
茨城県つくば市天久保2-9-2-B201
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http://www.rizo.co.jp/
http://www.rizo.co.jp/− 45 −

は じ め に

1

はじめに
はじめに

手法のポイント
手 法 の 詳 細⼟壌中の微⽣物相を解析する⼿法は、⼤別して「微⽣物を培養してその性質を調べる⽅法（培養法）」と「培養を経ずに微⽣物群を直接調べる⽅法（⾮培養法）」の２つのアプローチがあり、PCR-DGGE法は後者に該当します。
環境中に存在する微⽣物の⼤半は、培養法では検出が難しいため、⼟壌中の微⽣物相をありのまま観察するためには⾮培養法の⽅が適しています。⾮培養法には、
PCR－DGGE法のようにDNAを利⽤する⽅法のほか、FISH法を始めとする菌体を直接観察する⽅法や、キノンプロファイリングを始めとする化学分析法等、様々な⽅法が開発されています。
ここでは、低コストで⼟壌からDNAを抽出し、PCR－DGGE法で分析する⼿法について解説します。

留意点
その他― 46 ―

手法のポイント2

手法のポイント
手 法 の 詳 細このマニュアルは、PCR-DGGE法による検査サービスを現実化するために、とにかく『低コスト』にすることを⽬的として、農業環境技術研究所により開発された解析マニュアルを改変する形で開発したものです。必要な検査結果がきちんと出ることを確認しながら、⾼額なキットを安価な試薬に置き換え、ステップ数を極限まで減らして、消耗品コストのみならず時間コスト（＝⼈件費）を抑えて作成しています。
あくまでも、⼟壌のDNA検査を低コストでルーチンに⾏うことを⽬的としている
ため、研究等、より⾼品質のDNAや⾼精度の美しい泳動像が必要な場合には、従来の解析マニュアルでの分析をお勧めします。⽬的によって、適宜使い分けていただければ幸いです。

は じ め に手法のポイント留意点その他― 47 ―

は じ め に

3

手法の詳細
手法の詳細

手法のポイント＜PCR-DGGE法による⼟壌微⽣物相の分析法＞

手 法 の 詳 細Ⅰー１

Ⅰ ⼟壌試料からDNAを抽出する
Ⅱ 対象遺伝⼦（rDNA）をPCR増幅する
Ⅲ DGGEにより分析する
Ⅳ バンドパターンを数値化して⽣物多様性指数を算出するという⼿順で⾏う。

⼟壌試料の取り扱い

１）⼟壌は任意の⽅法で採取する。
採取した⼟壌は乾燥しないように気をつけながら２ｍｍ⽬の篩いにかけ、植物残さ等をできるだけ取り除く。⼤きめの容器に⼊れて⼗分に混和する。

留２）マイクロチューブに、１）の⼟壌を0.4ｇ量りとり、DNA抽出まで保冷（１⽇以上かかる場合は冷凍）する。

意（検査機関に送付する場合には、この状態で冷凍便で送付する。0.4ｇを量りとることが難しい場合には、数グラムをジップつきのビニール袋に⼊れて冷凍送付することも可）点その他― 48 ―

DNA抽出意点その他― 49 ―

留【抽出⼿順】
1）ステンレスボール１個とグラスビーズ150μlの⼊った2mlスクリューキャップチューブに0.4gの試料と1100μlのDNAすいすい-Eを加える。
2）粉砕装置にチューブをセットし、粉砕処理を⾏う。（3000rpm、１分）
3）14000rpmで5分間遠⼼し、上清200μlを新しいチューブに移す。
4）上清に200μlのDNAすいすい-Eと100μlの10％酢酸を加えてよく転倒混和し、14000rpmで5分間遠⼼する。
5）遠⼼後のチューブに直接100μlのフェノール：クロロホルム（下層）を加えてゆっくり10回程度転倒混和し（⽩濁する程度）、14000rpmで5分間遠⼼する。
6）上清200μlを新しいチューブに移し、200μlのイソプロパノールを加えてよく転倒混和する。
7）ゲノムDNA⽤カラムにのせて、10000rpmで1分間遠⼼し、流下液を捨てる。
8）400μlの70％エタノールをカラムにのせて、10000rpmで1分間遠⼼し、流下液を捨てる。これを2回⾏う。
9）新しいチューブにカラムをセットし、50μlの滅菌蒸留⽔をカラム中央にのせ10000rpmで1分間遠⼼し、溶出液を回収する。
10）溶出したDNA溶液は5-10μl程度をアガロースゲル(1％)で電気泳動(30分)し、DNAが抽出できていることを確認する。

手 法 の 詳 細【使⽤するもの】カッコ内は平成27年12⽉現在、リーゾで使⽤しているもの（参考）・2mlスクリューキャップチューブ（Watson スクリューチューブ 1392-200-SS-Y）
・４ミリ径ステンレスボール（⾈辺精⼯ GT-1）
・グラスビーズ（アズワン ガラスビーズ BZ-1）
・ゲノムDNA⽤カラム（FavorPrep Gemonic DNA Extraction column）
・DNAすいすい-E（リーゾ DS-0008）
・10％酢酸・フェノール：クロロホルム（1：1）
・イソプロパノール
・70％エタノール・粉砕装置（TAITEC μT-12）
・微量⾼速遠⼼機

手法のポイントⅠー２

は じ め に3

は じ め に3手法のポイント

ⅡPCR【⼀般細菌相】⼀般細菌相の解析⽤プライマーとして、真正細菌16S rRNA遺伝⼦のV6-8可変領域を標的とする以下のプライマーセットを使⽤する。

手 法 の 詳 細Forward Primer : F984GC
5-cgc ccg ggg cgc gcc ccg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg gaa cgc gaa gaa
cct tac-3'（下線部はGC clump）
Reverse Primer : R1378
5'-cgg tgt gta caa ggc ccg gga acg-3ʼ
【PCR条件】
TOYOBO「KOD-Plus」と5×PCRすいすいで作成した2×PCR PremixBufferを使⽤し、以下の条件で反応を⾏う。

留意点そ1) 2×PCR PremixBuffer の組成（1.5ml分）
5×PCRすいすい（リーゾ PS-0002)
10×KOD-Plus-BufferdNTPs(2mM)
MgSO4(25mM)
滅菌蒸留⽔

600μl
300μl
300μl
120μl
180μl2) Primer Mix(F984GC/R1378) の組成（100μl分）
滅菌蒸留⽔
F984GC(100μM)

60μl
20μl

R1378(100μM)

20μlの他― 50 ―

反応液組成(25μl反応系)※節約バージョン
2×PCR PremixBuffer
滅菌蒸留⽔
10×BSA(4mg/ml)
KOD-PlusPrimer Mix(F984GC/R1378) 0.5μl
Template DNA
0.5μl

12.5μl
8.5μl
2.5μl
0.5μl

手 法 の 詳 細

1μl
1μl

25μl
17μl
5μl
1μl

手法のポイント3) 反応液組成(50μl反応系)
2×PCR PremixBuffer
滅菌蒸留⽔
10×BSA(4mg/ml)
KOD-PlusPrimer Mix(F984GC/R1378)
Template DNA

は じ め に3留
そ6) DGGE⽤泳動サンプルを⽤意する。５μlのPCR産物に、９μlの５×PCRすいすいを添加し混合する。５）の泳動像から、増幅量が少ないと思われる場合には、10μlを上限としてPCR産物の量を増やす。同様に、増幅量が多い場合には、半量を下限として減らす。

点5) PCR産物4μl程度をアガロースゲル(2％)で電気泳動(15分)し、産物が得られていることを確認する。

意4) 反応サイクル
94℃-2分 → [94℃-15秒，55℃-30秒，68℃-30秒] ×34の他― 51 ―

は じ め に

3

手法のポイント

ⅡPCR【⽷状菌相】

手 法 の 詳 細⽷状菌相の解析⽤プライマーとして、真正細菌18S rRNA遺伝⼦を標的とする以下のプライマーセットを使⽤する。
Forward Primer : NS15'-gta gtc ata tgc ttg tct c-3'
Reverse Primer : GCFung5'-cgc ccg ccg cgc ccc gcg ccc ggc ccg ccg ccc ccg ccc cat tcc ccg tta ccc gttg-3'（下線部はGC clump）【PCR条件】
TOYOBO「KOD-Plus」と5×PCRすいすいで作成した2×PCR PremixBufferを使⽤し、以下の条件で反応を⾏う。

留意点そ1) 2×PCR PremixBuffer の組成（1.5ml分）
5×PCRすいすい（リーゾ PS-0002)
10×KOD-Plus-BufferdNTPs(2mM)
MgSO4(25mM)
滅菌蒸留⽔

600μl
300μl
300μl
120μl
180μl2) Primer Mix(NS1/GCFung) の組成（100μl分）
滅菌蒸留⽔
NS1(100μM)

60μl
20μl

GCFung(100μM)

20μlの他― 52 ―

0.5μl12.5μl
8.5μl
2.5μl
0.5μl
0.5μl

手 法 の 詳 細反応液組成(25μl反応系)
2×PCR PremixBuffer
滅菌蒸留⽔
10×BSA(4mg/ml)
KOD-PlusPrimer Mix(NS1/GCFung)
Template DNA

1μl

25μl
17μl
5μl
1μl1μl手法のポイント3) 反応液組成(50μl反応系)
2×PCR PremixBuffer
滅菌蒸留⽔
10×BSA(4mg/ml)
KOD-PlusPrimer Mix(NS1/GCFung)
Template DNA

は じ め に3留そ6) DGGE⽤泳動サンプルを⽤意する。５μlのPCR産物に、９μlの５×PCRすいすいを添加し混合する。５）の泳動像から、増幅量が少ないと思われる場合には、10μlを上限としてPCR産物の量を増やす。同様に、増幅量が多い場合には、半量を下限として減らす。

点5) PCR産物4μl程度をアガロースゲル(2％)で電気泳動(15分)し、産物が得られていることを確認する。

意4) 反応サイクル
94℃-2分 → [94℃-15秒，50℃-30秒，68℃-30秒] ×35の他― 53 ―

は じ め に

3

手法のポイント

Ⅲ

DGGE

表1

泳動条件

DGGEにはBioRad社製DCodeシステムを⽤いる。

手 法 の 詳 細条件

⼀般細菌相⽤

⽷状菌相⽤

ゲル濃度

６％

７％

変性濃度勾配50％→70％20％→45％

泳動温度

58℃

60℃

泳動電圧

50V

50V

泳動時間

18時間

20時間

＜ゲルストック溶液の作成＞
表2の組成に従い、ゲルストック溶液を調製する。

留表2
⼀般細菌相⽤

⽷状菌相⽤

70％変性

20％変性

45％変性

40％アクリルアミド／ビス
37.5：115ｍｌ

15ｍｌ

17.5ｍｌ17.5ｍｌ50×TAE

2ｍｌ

2ｍｌ

2ｍｌ

2ｍｌ

ホルムアミド

20ｍｌ

28ｍｌ

8ｍｌ

18ｍｌ

尿素

21ｇ

29.4ｇ

8.4ｇ

18.9ｇ

超純⽔

to 100ml

to 100ml

to 100ml

to 100ml

意

50％変性

点その他

― 54 ―

ゲルの組成（細菌相⽤）
⾼濃度
70％変性

50％変性

16ml

ゲルストック

144μl

10％APS

144μl

TEMED

14.4μlTEMED

14.4μl点

ゲルの組成（⽷状菌相⽤）
⾼濃度
ゲルストック

低濃度
20％変性

16ｍｌ

ゲルストック

16ml

144μl

10％APS

144μl

TEMED

14.4μlTEMED

14.4μlの10％APS

そ45％変性意

10％APS

留16ｍｌ

ゲルストック

表4

低濃度

手 法 の 詳 細表3

手法のポイント＜ゲルの作成＞
１）DCodeのマニュアルに従い、プレートを組み⽴て、キャスティングスタンドに固定して、ゲル注⼊⽤のチューブをプレートの中央部にテープで固定する。
２）10％過硫酸アンモニウム溶液を調製する（冷凍保存が可能）。
３）表3、表4に従い、清潔なビーカー等にゲル溶液を調製する。
４）直ちにシリンジに吸い取り、チューブを装着してグラジエントフォーマーにセットし、各チューブの端を１）の注⼊⽤チューブとY-フィッティングでつなげる。
５）グラジエントゲルフォーマーのホイールを⼿前⽅向にゆっくり回してゲルを注⼊する。
チューブを外してコームを差し込む。
６）チューブとシリンジを洗浄する（ゲルが固まらないうちに）。
７）3時間以上重合させる。

は じ め に3

他― 55 ―

は じ め に

3

手法のポイント
手 法 の 詳 細＜泳動＞
１）1×TAEバッファーを7リットル作成し、泳動槽のFill-Runの間まで注ぐ。ヒーターをONにして設定温度を泳動時の温度＋5℃に合わせる。
２）ゲルからコームを抜き取り、ゲルのかすなどを取り除き、ウェル部を洗浄する。
３）ゲル板をDCodeのコアに取り付ける。300ml分のバッファーを取り分けてから、泳動槽にセットする。取り分けたバッファーをコア上部に戻す。
４）ポンプをONにしてバッファーを泳動槽のMaximumラインまで満たす。泳動時の温度より2℃⾼めに設定し、温度が安定するまで待つ。
５）上部ユニットを取り外し、各ウェルにサンプルをアプライする。両端にはマーカーをアプライする（細菌⽤：DGGEマーカーⅢ、⽷状菌⽤：DGGEマーカーⅣ、ニッポンジーン社製）。
６）設定温度を表１の泳動条件に合わせ、ポンプをONにする。温度が安定したら、表1の泳動条件に従って泳動を開始する。

留意点

＜染⾊＞
１）コアを解体してガラスプレートを取り出す。
２）スペーサーを端からゆっくり持ち上げるようにして、ガラス板（⼩）をはがす。
３）ガラス板（⼤）に張り付いた状態のゲルを慎重にはがし取り、染⾊⽤の容器に移す。
ゲルを適当量の精製⽔で洗浄する。
４）80mlの1×TAEバッファーと8μlのSYBR GreenⅠを加え、穏やかに振とうしながら20分間染⾊する。
５）撮影装置のマニュアルに従って泳動像を画像化する。

その他― 56 ―

⽣物多様性指数の算出

手 法 の 詳 細１）泳動像のデータを画像処理して、バンドの数と、各バンドの強さを数値化する。このとき、検出感度と検出範囲を適宜調整する。
２）⽣物多様性指数算出⽤のエクセルファイルに数値を⼊⼒する。
３）4種類の⽣物多様性指数が算出される。
Shannon Wienerʼs index（Hʼ）＝ -∑Pi LN Pi
Simpson index（1-D）＝1- Σ(Pi)2
Richness：the number of bands
Evenness：Hʼ/ln(Richness)

手法のポイントⅣは じ め に3

留意点

←泳動中の様⼦

その他

バンド検出の例（左の画像から検出）

泳動像の例（細菌相）― 57 ―

は じ め に

4

留意点

留意点

手法のポイント【留意点】

・DNAが取れない、量が極端に少ない→DNAすいすい-Eを室温に⻑く放置するとｐHがアルカリ性に傾き、シリカカラムにDNAが吸着しにくくなることがある。⼟の種類や状態によっては、微⽣物量が少なく、DNAの量も少ない可能性がある。

手 法 の 詳 細・抽出したDNA溶液が着⾊している→腐植の多い⼟壌では、抽出したDNA溶液が薄茶⾊に⾒えることがある。PCRがかからない場合には、市販のDNA精製カラム等で再度精製する。
・PCRで増幅しない→鋳型DNAの濃度もしくは精製度が疑われる場合には、DNAを再度精製する。
→PCR⾃体がうまく⾏かない場合には、使⽤しているバッファー、プライマー、滅菌⽔等を刷新してやり直す。ネガティブコントロールに増幅が⾒られる場合も同様。

留意
点・ゲルの作成がうまくいかない→ゲルが固まる前に漏れる場合には、キャスティングがうまくできていないことが原因であることが多い。ガラス板とスペーサーの底⾯をしっかり揃えてクランプで固定する。
→ゲルが固まらない・固まるのが遅い原因としては、APSが古くなっている、TEMEDが少ない、室温が低い等が考えられる。APSは⽤事調製するのが望ましい。
→ガラス板が汚れていると、ゲル注⼊時に気泡が残る場合がある。しっかり洗浄し、乾燥させてから使⽤する。

その・上部バッファーが抜け落ちる→コアを⼀度引き上げ、ガラス板を外してセットしなおす。コアとプレートの間に隙間なくガスケットが挟まっていることを確かめる。

他― 58 ―

・泳動がうまくいかない→規定時間で終了しているのに泳動が進みすぎる場合には、TAEバッファーの劣化が考えられる。1回ずつ捨てる必要はないが、状態を⾒ながら数回ごとに新しいものに変える。

・バンドがぼんやりする→DCodeの⼿前側のゲルのみを使⽤する（奥側にはスペーサーもゲルも⼊っていないダミープレートを設置する）。

留意・パターンがゆがむ→両端のレーンはゆがみやすいので、出来るだけ使わない。
→変性勾配が歪んでいる可能性がある。アクリルアミドの重合がゆっくり進むよう、ガラスプレートとゲル溶液を冷やし、できれば室温を低めに設定する。

手 法 の 詳 細・染⾊時にゲルが破れてしまう→ガラス板からゲルをはがす際、乾燥すると破れやすいので、細く絞った⽔道⽔や洗ビンなどで⽔をかけながらはがす。染⾊バットに移す際、折りたたんで持ち上げることが難しければ、多めの⽔で流すように移しても良い。

手法のポイント【留意点】（つづき）

は じ め に

4点
その他

― 59 ―

は じ め に5

その他
その他

手法のポイント

本マニュアルを⽤いた解析に関するご質問、ご相談につきましては、株式会社
リーゾまでご連絡ください。⽣物多様性指数算出⽤のファイルもご提供可能です。
解析機器をお持ちでないお客様には、解析代⾏サービスも提供しております。詳
しくは、リーゾのウェブサイトをご覧ください。

手 法 の 詳 細株式会社リーゾ
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Mail：info@rizo.co.jp

留意点
その他

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2016/2/9― 60 ―