June 2010

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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265 ( 59 )免疫不全マウス Exophiala dermatitidis 全身感染モデル
に対するリポソーム化 amphotericin B のin vivo 抗真菌活性柏本茂樹 1)・竹本浩司 1)* ・山本1)

寛 2)・金澤勝則 1)

大日本住友製薬株式会社・薬理第 2 研究部
2)大日本住友製薬株式会社・製品企画部* Corresponding author（2010 年 3 月 5 日受付）

免疫不全マウス Exophiala dermatitidis 全身感染モデルに対するリポソーム化 ampho-tericin B (L-AMB) の in vivo 抗真菌活性を amphotericin B デオキシコール酸製剤 (D-AMB)と比較することを本研究の目的とした。Cyclophosphamide 投与により免疫不全状態を惹起させた ddY マウスに E. dermatitidis IFM 4827 株と IFM 53409 株の各々の分生胞子を尾静脈内に接種した。 L-AMB および D-AMB の各々の最大無影響量である 10 および 1mg/kg) を 最 高 用 量 と し ， 感 染 4 時 間 後 に L-AMB (0.3⬃10 mg/kg) あ る い は D-AMB(0.1⬃1 mg/kg) を尾静脈内に単回投与した。感染 14 日後までの生存日数と最終生存率ならびに感染 4 日後の組織内菌数を指標に両薬剤の本菌に対する in vivo 抗真菌活性を比較した。L-AMB では両感染モデルにおいて 1 mg/kg 以上の投与群でコントロール群に対する有意な延命効果が認められた。L-AMB の 10 mg/kg 投与群の最終生存率は IFM 4827 株
感染モデルでは 100%，IFM 53409 株感染モデルでは 75% と D-AMB の 1 mg/kg 投与群の20⬃37.5% と比べて高値であった。また，E. dermatitidis IFM 4827 株感染モデルにおいて， L-AMB の 10 mg/kg 投与群の各種組織内菌数（血液，肺，肝，脾，腎）はコントロール群および D-AMB の 1 mg/kg 投与群と比べて有意に低値であった。以上の結果から，E. dermatitidis に対して L-AMB は in vivo 抗真菌活性を示し，その活性は，最大無影響量の比較において D-AMB よりも優れていることが示唆された。

Exophiala dermatitidis は，細胞壁にメラニン色

真菌薬はこれまで，エクソフィアラ属の旧名2) で素を含有し暗色のコロニーを形成することから黒あるホルモデンドラム，ヒアロホーラおよびホル1)色真菌と総称される真菌の一つである 。 E. der-ミシチウムに対する効能を有する amphotericin Bmatitidis などの病原性を持つ黒色真菌が皮膚の外(AMPH-B) デオキシコール酸製剤（ファンギゾ

傷部位から侵入すると深部皮膚真菌症を発症し，ン ®： D-AMB）が唯一あるのみであった。しかし

特に免疫不全患者では全身に播種し重篤な内臓真ながら，D-AMB は腎臓に対する副作用の発現レ1)菌症を発症することがある 。本菌が原因となるベルに応じてその投与量を調節せざるを得ず，治

深在性真菌症に対して本邦で効能を持つ注射用抗療に際して十分量の投薬ができないという問題が

266 ( 60 )THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICSあった。一方，AMPH-B の副作用が軽減されたリ®

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AMB の 5 mg/mL 溶 液 を 0.165 M MOPS 緩 衝

ポソーム化 AMPH-B（アムビゾーム ： L-AMB）

RPMI 1640 培地 (pH 7.0) (RPMI-MOPS) を用いても 2009 年 6 月に本症に対する効能を本邦で取得目的の濃度となるように希釈し，96 穴マイクロプし，本症の治療に L-AMB が使用可能となった。

レートに 100 m L/well で分注した。菌株をポテト種々の教科書や総説においては，D-AMB あるいデキストロース寒天培地（日本ベクトン・ディッ

は L-AMB が本症治療の選択肢の一つとして推奨

キンソン株式会社）を用いて 35°C で 7 日間培養

1,3,4)，D-AMB と比較して L-AMB のし，生理食塩液への懸濁とフィルター濾過により有用性を検証した非臨床試験あるいは臨床試験の分生胞子懸濁液を調製した。この分生胞子懸濁液報告はない。

を RPMI-MOPS を用いて希釈し，上記 96 穴マイされているがそこで，本研究では免疫不全マウス E. dermati-

クロプレートに 100 m L/well で分注した（最終接tidis 全身感染モデルに対する L-AMB と D-AMB。35°C で 3 日間培
種菌量は 2⬃3⫻103 conidia/mL）の in vivo 抗真菌活性を比較検討した。

養した後，肉眼的に真菌の発育が認められない最小濃度を MIC とした。

材料および方法
5. 免疫不全マウス E. dermatitidis 全身感染モデ
1. 使用薬剤ル®

L-AMB（アムビゾーム 点滴静注用 50 mg，大Cyclophosphamide（エンドキサン®，塩野義製

日本住友製薬株式会社）および D-AMB（ファン薬株式会社） を感染 2 日前に 200 mg/kg ， 感染®

ギゾン ，ブリストル・マイヤーズ株式会社）を

1 日後に 100 mg/kg をマウスの背部皮下に投与す使用した。なお，本論文では L-AMB および D-ることで白血球数減少状態を惹起させた。免疫不AMB 濃度は AMPH-B 濃度として示した。

全マウスに分生胞子懸濁液を 0.2 mL/mouse で尾静脈内接種することで全身感染モデルを作製し2. 使用動物た。E. dermatitidis IFM 4827 株および IFM 53409

5 週齢の ddY 系雄性マウス（日本エスエルシー） 株 の 接 種 菌 量 は そ れ ぞ れ 1⫻10 7 お よ び 5⫻10 6を用いた。大日本住友製薬株式会社研究本部「動物実験規約」に従い，動物実験を実施した。

conidia/mouse とした。
感染 4 時間後に L-AMB では最大無影響量 6) である 10 mg/kg 以下の投与量 (0.3, 1, 3, 10 mg/kg)

3. 使用菌株

で，D-AMB では最大無影響量 6) である 1 mg/kg 以

千葉大学真菌医学研究センターより分与された下の投与量 (0.1, 0.3, 1 mg/kg) で尾静脈内に単回Exophiala dermatitidis IFM 4827 株および E. der-投与した。感染後 14 日間マウスの生死を観察す

matitidis IFM 53409 株を使用した。

ることで両薬剤の延命効果ならびに救命効果を検討した。また，両薬剤の組織内生菌数減少効果を

4. In vitro 抗真菌活性測定試験検討するために，感染 4 日後の感染マウスから，最小発育阻止濃度 (MIC) の測定は Clinical and

血液，肺，肝臓，脾臓および腎臓を無菌的に採取

Laboratory Standards Institute M38-A2 2008 に準し，それらのホモジェネート希釈液をポテトデキ

5)じた微量液体希釈法にて実施した 。添付文書にストロース寒天培地に塗抹することで組織内菌数従い調製した L-AMB の 4 mg/mL 溶液および D-を測定した。

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6. 統計解析

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267 ( 61 )側 5% とした。

50% Effective dose (ED50) とその 95% 信頼区間
は probit 法を用いて算出した。各群間の生存日数結果

は log-rank test を用いて比較した。各群間の組織内菌数は Student’s t test を用いて比較した。これ

1. In vitro 抗真菌活性 (MIC)

らの解析には “The SAS system for Windows Re-E. dermatitidis IFM 4827 株および IFM 53409 株

lease 8.02” のソフトウェアを用い，有意水準は両に対する L-AMB の MIC はそれぞれ 0.5 およびFig. 1. Survival curves of ddY mice infected intravenously with E. dermatitidis IFM 4827 at
1⫻107 conidia/mouse (n⫽10/group).

Treatment with (a) L-AMB or (b) D-AMB was started 4 h after infection.
*, Signiﬁcantly different from control (p⬍0.01 by the log-rank test).
¶, Signiﬁcantly different from 1 mg/kg of D-AMB (p⬍0.05 by the log-rank test).

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1 m g/mL であり，D-AMB の MIC はそれぞれ 0.25および 0.5 m g/mL であった。 L-AMB の in vitro 抗63—_3June 2010

2. 免疫不全マウス E. dermatitidis 全身感染モデ
ルに対する in vivo 抗真菌活性

真菌活性は D-AMB の 1/2 であり，JESSUP らが報告

E. dermatitidis IFM 4827 株感染モデルおよび E.

している Exophiala 属に対する両薬剤の in vitro 抗

dermatitidis IFM 53409 株感染モデルにおける各薬

真 菌 活 性 デ ー タ (L-AMB, 1 m g/mL; D-AMB,剤投与群のマウスの生存曲線をそれぞれ Fig. 1 お0.25 m g/mL)7) と同等であった。

よび Fig. 2 に示した。 D-AMB では， E. dermati-tidis IFM 4827 株感染モデルでは 0.3 mg/kg 以上の投与群で，E. dermatitidis IFM 53409 株感染モデ

Fig. 2. Survival curves of ddY mice infected intravenously with E. dermatitidis IFM 53409 at
5⫻106 conidia/mouse (n⫽8/group).

Treatment with (a) L-AMB or (b) D-AMB was started 4 h after infection.
*, Signiﬁcantly different from control (p⬍0.01 by the log-rank test).

June 2010

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS63—13269 ( 63 )ルでは 1 mg/kg 投与群でコントロール群に対する53409 株感染モデルにおいては， L-AMB の 10有意な延命効果が認められた。この結果は POLAKmg/kg 投与群と D-AMB の 1 mg/kg 投与群の生存が報告した E. dermatitidis 感染モデルに対して D-日数に有意差は認められなかったが， L-AMB の8)AMB が有効性を示した結果と一致していた 。一10 mg/kg 投与群の最終生存率 (75%) は D-AMB の方， L-AMB では，使用した 2 菌株のいずれの E.

1 mg/kg 投与群 (37.5%) よりも高値であった。

dermatitidis 感染モデルにおいても 1 mg/kg 以上の各薬剤投与群の組織内菌数を Table 1 に示した。

投与群でコントロール群に対して生存日数が有意

D-AMB の 1 mg/kg 投与群では，肺を除く他の組に延長し，延命効果が認められた。L-AMB の 10織においてコントロールに対する有意な組織内菌mg/kg 投与群では，最終生存率が IFM 4827 株感数減少効果が認められた。L-AMB の 10 mg/kg 投染モデルでは 100%， IFM 53409 株感染モデルで与群では，すべての組織においてコントロール群は 75% であり，優れた救命効果が認められた。最に対して組織内菌数が有意に低く，組織内菌数減

終生存率から求めた L-AMB の ED50（95% 信頼区少効果が認められた。特に L-AMB の 10 mg/kg 投間）は E. dermatitidis IFM 4827 株感染モデルでは与群の血液内菌数は検出限界未満であった。 L-3.63 mg/kg (2.32⬃6.47 mg/kg), E. dermatitidis

AMB の 10 mg/kg 投与群は D-AMB の 1 mg/kg 投IFM 53409 株感染モデルでは 5.08 mg/kg (2.35⬃

与群に比べて，すべての組織において菌数が有意30.1 mg/kg) であった。一方，D-AMB の最大無影に低く，組織内菌数減少効果がより優れているこ響量である 1 mg/kg 投与群の最終生存率はいずれとが示された。したがって， L-AMB の 10 mg/kgのモデルにおいても 50% 未満であり，D-AMB の投与群では， D-AMB の 1 mg/kg 投与群よりも優ED50 を算出することができなかった。

れた組織内菌数減少効果を示すことが，より高い

L-AMB と D-AMB の in vivo 抗真菌活性を最大延命効果に寄与していると考えられた。

無影響量で比較すると，E. dermatitidis IFM 4827株感染モデルにおいて，L-AMB の 10 mg/kg 投与

考察

群は D-AMB の 1 mg/kg 投与群に対して有意に優れ た 延 命 効 果 を 示 し た 。 E. dermatitidis IFM

黒色真菌とはメラニン色素を含有し暗色のコロ

Table 1. Tissue fungal burdens of ddY mice infected with E. dermatitidis IFM 4827.

a)Mice were infected with 1⫻107 conidia of E. dermatitidis IFM 4827 via intravenous inoculation. Antifungals were administered intravenously 4 hr after infection (n⫽6/group). The numbers of E. dermatitidis intissue were determined 4 days after infection. The values represent the mean ⫾ standard deviation.
b)
Signiﬁcantly different from control ( p⬍0.05 by Student’s t test).
c)
Signiﬁcantly different from 1 mg/kg D-AMB ( p⬍0.005 by Student’s t test).

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ニーを形成する真菌の総称であるが，分類学的に
1)

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mg/kg よりも優れた延命効果，救命効果ならびにまとまった分類を示すものではない 。黒色真菌

組織内菌数減少効果を示した。本研究結果から両による感染症は，健常人に対して発症する皮膚真薬剤の臨床効果を予見するには薬物動態学と薬力菌症に加え，クロモミコーシス，フェオヒフォミ学 (PK-PD) を考慮する必要があると考えられる。

コーシスおよび菌腫の 3 つに分類される深部皮膚両薬剤の薬効はいずれも PK-PD パラメータの真菌症が主なものであるが，免疫不全状態を伴うCmax /MIC と相関することが示唆されていることか

1)

患者では深在性真菌症を発症する場合がある 。

ら13,14)，両薬剤間の Cmax /MIC を比較することにし黒色真菌による播種性真菌症の死亡率は 79% とた。ddY マウスにおける両薬剤の Cmax データは免極めて高く，その主たる原因真菌の一つとして疫不全マウス Candida 全身感染モデルを用いて取Exophiala 属が知られている 。黒色真菌症治療の得しており， L-AMB の 10 mg/kg では 201 m g/

第一選択薬はイトラコナゾールを始めとするアmL14)，D-AMB の 1 mg/kg では 2.31 m g/mL（未公ゾール系抗真菌薬であるが，深在性真菌症の重症表データ）であった。これらのデータと本研究で例では AMPH-B も第二選択薬として推奨されて用いた E. dermatitidis 2 株に対する MIC データかいる3)。しかしながら，黒色真菌による播種性真ら，免疫不全マウス E. dermatitidis 全身感染モデ菌症 72 例のケースレポートをまとめた総説によれ

ルにおける L-AMB の 10 mg/kg の C max /MIC は9)

9)ば ，Exophiala 属が原因となる深在性真菌症に対201⬃402 であり，D-AMB の 1 mg/kg (4.62⬃9.24)

して D-AMB 治療の生存率は 50%（ 4 例中 2 例）と比べて 44 倍高いと考えられた。ヒトでの L-であり，D-AMB の臨床効果は必ずしも満足され

AMB の 10 mg/kg お よ び D-AMB の 1 mg/kg の，臨床的なCmax はそれぞれ 119.6 m g/mL15) および 1.7 m g/mL16)

エビデンスはほとんどないものの， L-AMB はであり，本研究で用いた E. dermatitidis 2 株が原

AMPH-B よりも副作用が軽減していることからよ因真菌と仮定した場合，臨床における L-AMB のり高用量が投与可能であり，AMPH-B よりも高い10 mg/kg の Cmax /MIC (119.6⬃239.2) は D-AMB臨床効果が得られるであろうと記載されている。の 1 mg/kg (3.4⬃6.8) と比べて 35 倍高いと推察さ実際には， Exophiala 属が原因となった深在性真れた。このように本感染モデルと臨床における両菌症に対して L-AMB の使用例がアゾールとの併薬剤間の Cmax /MIC の比率は同レベルであることるものではない。種々の総説では用で 2 報あるのみであり

11,12)

4,10)，本症における L-から，本研究結果は臨床における両薬剤の臨床効AMB の D-AMB に対する臨床的優位性は明確で果をある程度反映していると考えられた。以上のはない。そこで我々は，免疫不全マウス E. der-ことから，L-AMB は E. dermatitidis が原因となる

matitidis 全身感染モデルに対する L-AMB と D-播種性真菌症に対して D-AMB と同等以上の臨床AMB の in vivo 抗真菌活性を比較することにした。 効果を示すことが期待され，総説等に記載された我々が知る限り，Exophiala 属に対する L-AMBの in vivo 抗真菌活性を検討した報告は本報がはじ

L-AMB の有用性を支持する実験結果であると考えられた。

めてである。免疫不全マウス E. dermatitidis 全身本研究では L-AMB を感染 4 時間後という比較

感染モデルに対して L-AMB は臨床投与量 (2.5⬃5的早期の感染ステージで投与していることから，mg/kg) を下回る 1 mg/kg の投与量から延命効果をE. dermatitidis に対する L-AMB の empiric 治療に示した。また，L-AMB の最大無影響量である 10おける効果を動物モデルで検証したものと考えら

mg/kg 投与群は D-AMB の最大無影響量である 1れる。今後，がん治療の進歩や臓器移植などの増June 2010

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63—13271 ( 65 )6) TAKEMOTO, K.; Y. YAMAMOTO, Y. UEDA, et al.:Comparative studies on the efﬁcacy of Am患者が増加していくものと考えられる。よって臨Bisome and Fungizone in a mouse model of
床現場においては上記のような免疫不全患者に対
disseminated aspergillosis. J. Antimicrob.
し真菌感染症の予防あるいは治療を目的とした抗Chemother. 53: 311⬃317, 2004
7)
JESSUP, C.; G. REYES, A. FOTHERGILL, et al.: AE.
dermatitidisなどの黒真菌剤投与を行うなかで
head-on comparison of the in vitro antifungal
色真菌が原因となるブレイクスルー感染症のリス
activity of conventional and lipid-based
クが高まるものと予想される。今回の結果は，こamphotericin B: a multicenter study. J.のような状況において L-AMB を empiric に使用すChemother. 12: 22⬃29, 2000
ることにより， E. dermatitidis による真菌症を防8) POLAK, A.: Antimycotic therapy of experimental infections caused by dematiaceous
止できることを示唆するデータとも捉えることがfungi. Sabouraudia 22: 279⬃289, 1984
できる。
9) REVANKAR, S. G.; J. E. PATTERSON, D. A. SUT以上，本研究から，免疫不全マウス E. dermatiTON, et al.: Disseminated phaeohyphomycotidis 全身感染モデルに対して L-AMB は in vivo 抗sis: review of an emerging mycosis. Clin. Infect. Dis. 34: 467⬃476, 2002
真菌活性を示し，その活性は，最大無影響量の比
10)
R
EVANKAR, S. G.: Dematiaceous fungi. My較において D-AMB よりも優れていることが示唆
coses 50: 91⬃101, 2007
された。
11) AL-OBAID, I.; S. AHMAD, Z. U. KHAN, et al.:Catheter-associated fungemia due to Exophiala oligosperma in a leukemic child and
参考文献
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ophiala species. Eur. J. Clin. Microbiol. In症 第 4 版。 pp. 251⬃256，南山堂，東京，fect. Dis. 25: 729⬃732, 2006
2007
12)
ALABAZ, D.; F. KIBAR, S. ARIKAN, et al.: Sys2) MCGINNIS, M. R.; L. SIGLER & M. G. RINALDI:
temicphaeohyphomycosis due to Exophiala
Some medically important fungi and their(Wangiella) in an immunocompetent child.
common synonyms and names of uncertain
Med. Mycol. 47: 653⬃657, 2009
application. Clin. Infect. Dis. 29: 728⬃730,13)
A
NDES, D.; T. STAMSTED & R. CONKLIN: Phar1999
macodynamics of amphotericin B in a3) CHAPMAN, S. W. & D. C. SULLIVAN: Miscellaneutropenic-mouse disseminated-candidiasis
neous mycoses and algal infections. Harrimodel. Antimicrob. Agents Chemother. 45:
son’s principles of internal medicine. 17th ed.
922⬃926, 2001
1263⬃1267, McGraw-Hill Book Companies
14)
T
AKEMOTO, K.; Y. YAMAMOTO & Y. UEDA:
Inc., New York, 2008
Evaluation of antifungal pharmacodynamic
4) REVANKAR, S. G.; D. A. SUTTON & M. G.
characteristics of AmBisome against CanRINALDI: Primary central nervous system
dida albicans. Microbiol. Immunol. 50:
phaeohyphomycosis: a review of 101 cases.
579⬃586, 2006
Clin. Infect. Dis. 38: 206⬃216, 2004
15)
W
ALSH, T. J.; J. L. GOODMAN, P. PAPPAS, et al.:5) Clinical and Laboratory Standards Institute.
Safety, tolerance, and pharmacokinetics
Reference method for broth dilution antifunof high-dose liposomal amphotericin B
gal susceptibility testing of ﬁlamentous(AmBisome) in patients infected with Asfungi—Second Edition: Approved Standard
pergillus species and other ﬁlamentous fungi:
M38-A2. Clinical and Laboratory Standards
maximum tolerated dose study. Antimicrob.
Institute, Wayne, Pa. 22(16) 2008
加により，重度の免疫不全状態が長期に持続する272 ( 66 )THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

Agents Chemother. 45: 3487⬃3496, 200116) HEINEMANN, V.; D. BOSSE, U. JEHN, et al.:Pharmacokinetics of liposomal amphotericin

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B (Ambisome) in critically ill patients. Antimicrob. Agents Chemother. 41: 1275⬃
1280, 1997

In vivo activity of liposomal amphotericin B against Exophiala
dermatitidis in a murine lethal infection model
SHIGEKI KASHIMOTO1), KOJI TAKEMOTO1)*, YUTAKA YAMAMOTO2)
and KATSUNORI KANAZAWA1)
1)

Pharmacology Research Laboratories, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
2)
Product Management and Promotion Planning,Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
* Corresponding author

This study evaluated the in vivo activity of liposomal amphotericin B (L-AMB) and deoxycholate
amphotericin B (D-AMB) in a murine model of disseminated infection caused by Exophiala
dermatitidis. Cyclophosphamide-treated neutropenic ddY mice were inoculated intravenously withconidial suspensions of E. dermatitidis IFM 4827 or IFM 53409. The maximum tolerated doses ofL-AMB and D-AMB were set at 10 mg/kg and 1 mg/kg, respectively. Four hours after infection, a single
dose of L-AMB (0.3 to 10 mg/kg) or D-AMB (0.1 to 1 mg/kg) was administered intravenously. The
efﬁcacy of the antifungal treatment was assessed by the survival time over two weeks and the tissue
fungal burdens 4 days after infection. L-AMB at a dose of ⱖ1 mg/kg signiﬁcantly prolonged the survival
time of mice infected with either strain compared with that of the control group. Percent survivals in the10 mg/kg L-AMB-treated group (100% and 75%) were higher than those in the 1 mg/kg D-AMB-treatedgroup (20% and 37.5%) in the IFM 4827 and IFM 53409 models, respectively. In the IFM 4827 model,
10 mg/kg L-AMB exhibited greater efﬁcacy than 1 mg/kg D-AMB in terms of reducing the tissue fungal
burdens (blood, lung, liver, spleen, and kidneys). These ﬁndings suggest that L-AMB was effective inthe treatment of experimental disseminated E. dermatitidis infection, and the efﬁcacy of L-AMB wassuperior to that of D-AMB.