E テスト「TOSOH」® Ⅱ●新規卵巣がんマーカー（TFPI2）
バイオサイエンス事業部

第一開発部

技術グループバイオサイエンス事業部

第一開発部

探索グループ

明庭 昇平
大竹 則久
千々岩信勝
新谷 晃司

テオーム解析により TFPI2 が新たな卵巣がんマーカー

1．はじめに候補として見出され 8）、婦人科腫瘍患者の血清 TFPI2

本邦における年間の卵巣がん患者は、罹患数が約濃度を測定したところ、卵巣がん、とりわけ明細胞癌

13,000 人、死亡数が約 5,000 人と推定され、婦人科悪の患者で高い値を示すことが確認された 9,10）。また、性腫瘍で最も死亡数が多い疾患である。卵巣がんは、卵巣がん組織検体を用いた免疫組織学的解析において病理学的な特徴に基づき主に 4 種類の組織型（漿液性、も、TFPI2 は明細胞癌症例において特徴的に発現上昇粘液性、類内膜、明細胞）に分類される。中でも明細することが明らかとなっている 11）。

胞癌は、本邦において発生頻度が高く（欧米：約 8％、今回、我々は自動免疫測定装置（AIA® シリーズ）

日本：約 24％）、他の組織型と比べて抗がん剤が効きを用いて簡便かつ迅速に TFPI2 を測定可能な試薬を1）にくい予後不良例が多いとされている 。また、明細開発し、基本性能および卵巣がん診断における臨床的胞癌は良性疾患である子宮内膜症を母地として高頻度有用性を検証したので、報告する。なお、本技術は全2）世界で増加傾向にあるがんという疾患に対し、適切なに発生することが知られている 。
卵巣がんは自覚症状に乏しいため、発見時には進行している場合も少なくない。一般的な卵巣がん診断の診断や治療を提供するための一助として医療に貢献することを目指すものである。

流れとしては、超音波画像診断で骨盤内腫瘍が認められた患者について、血液検査や MRI などを実施して良性か悪性かが推定される。組織型によって性質が異2．測定原理と材料なるため治療方針の策定にあたって腫瘍の病理学的分2016 年 に 開 発 し た TFPI2 測 定 系 は、2 種 類 の 抗類は非常に重要であるが、卵巣は体深部に存在し生検

TFPI2 抗体（TF01 − 04、TF11 − 03）を用いたサンドイッが困難であるため、手術前に組織型の鑑別はできない

チ EIA 法である。磁性ビーズに固定化したラット抗のが現状である。

TFPI2 抗体（TF11 − 03）とアルカリ性ホスファターゼ

卵巣がんの血液検査では、CA125 を主として複数標識されたマウス抗 TFPI2 抗体（TF01 − 04）が、凍結3）の項目を適宜組み合わせることが推奨されている 。

乾燥体として試薬カップに封入されている。この試薬

CA125 は卵巣悪性腫瘍全般における陽性率は高いもの

カップに検体（血清）と分注水を注入すると、凍結乾4）により過剰燥試薬が溶解されて免疫反応が開始される。37℃、10治療を生じるケースがあり問題となっている。一方で分間の反応後、未反応の酵素標識抗体と検体成分を洗明細胞癌など一部の組織型では感度が低く、それに伴浄除去する（B ／ F 分離）。酵素基質である 4 −メチルう癌の発見や治療介入の遅れ、再発率の上昇が臨床上ウンベリフェリルりん酸（4MUP）を分注後、経時的の課題となっている。に蛍光強度を測定して単位時間あたりの 4 −メチルウの、子宮内膜症や腹膜炎などでの偽陽性TFPI2（Tissue Factor Pathway Inhibitor 2） は、 胎ンベリフェロン（4MU）の生成量を測定する（図１）。

盤中に豊富に存在する分泌型セリンプロテアーゼイン

基質の蛍光強度は TFPI2 を介して固相に固定化されヒビターとして報告された分子量約 29kDa の糖タンた酵素量に依存するため、予め既知濃度の TFPI2 を5）パク質である 。詳しい分子生物学的機能は不明だが、含む標準品を用いて、その蛍光強度と TFPI2 濃度にヘパリン結合性を有し妊娠周期に伴い血中濃度が上昇よる標準曲線を作成し TFPI2 濃度未知の患者検体のすることから、周産期における血液凝固系への関与が蛍光強度に相当する TFPI2 濃度を標準曲線より算出推察されている 6,7） 。卵巣がん細胞株培養上清のプロすることにより TFPI2 の定量が可能となる。測定の89

TOSOH Research & Technology Review Vol.65（2021）

Free： 抗体固定化磁性ビーズ： 酵素標識抗体

Bound： 検体（抗原（TFPI2））（抗原抗体反応）： 酵素基質（4MUP）

基質分注

B/F分離

検体分注

： 酵素反応生成物
（4MU）
（洗浄）

図1

（蛍光測定）TFPI2 測定原理図

際、検体のカップへの分注、一定時間下での反応、B／ F 分離、基質分注蛍光強度の測定は東ソー株式会社
製の自動免疫測定装置（AIA − 2000、AIA − 1800、AIA− 900、AIA − 600 Ⅱ、AIA − 360）により自動で行われ、測定開始から約 20 分後に結果が得られる。

3．基本性能評価［1］測定下限
妊娠していない健常者検体 241 例（男性 102 例、女表２

測定内および測定間再現性試験
血清Low
300
6.572.2

血清Middle
1890
50.12.7

血清High2670
1672.2

測定間再現性試験 血清（n＝20、93 日間） Low
Mean［pg/mL］
319
SD ［pg/mL］ 7.58
CV ［％］
2.4

血清Middle
1998
61.0
3.1

血清High7527
2032.7

測定内再現性試験（n＝5）
Mean［pg/mL］
SD ［pg/mL］
CV ［％］性 139 例）を測定したところ、ノンパラメトリック法による 95％信頼区間は 62.1 〜 211.4 pg ／ mL、最小値の範囲内であった。各検体を 93 日間の 2 重測定にてが 42.6 pg ／ mL だったため、臨床的に必要とされる濃行った測定間再現性試験の結果、各検体の測定値の度範囲の下限は 10 pg／mL で十分であると考えられた。

CV は、2.4 ～ 3.1 ％の範囲内であった。

TFPI2 標準品の測定値から検量線を作成し、標準品［3］希釈直線性試験（1）の蛍光単位（FU）の［平均値＋ 2 × SD（5 回測TFPI2 濃度の異なる 3 種の血清検体を用い、希釈直定の標準偏差）］に対応する濃度として低濃度検出限線性試験を行った。各々の検体を専用希釈液で 5 段階界（minimum detectable concentration；MDC） を 算の希釈系列を作製し 4 重測定した結果、良好な希釈直出した。以上の操作を、4 ロットの TFPI2 測定試薬を線性を有することが示された（図２）。

用いて実施した結果、いずれのロットを用いた場合も［4］共存物質の影響試験

MDC は 2.7 pg ／ mL 以下となり、10 pg ／ mL を測定す

検体中に含まれる可能性のある各物質を高濃度で血ることが十分可能であることが確認された（表１）。

清へ添加し、測定値への影響を確認した（表３）。共［2］再現性試験

存物質としてヘモグロビン、遊離型ビリルビン、抱合測定内再現性および測定間再現性試験を TFPI2 濃度の異なる 3 種の血清検体を用いて行った（表２）
。使用

9000

した 3 検体（Low、Middle、High）は 1 回の測定分を小分け分注し、使用時まで凍結保存した。5 重同時測変動係数（coefficient of variation；CV）は、2.2 ～ 2.7％

表１
免疫反応試薬標準品セットMean［nM/S］
SD ［nM/S］
MDC［pg/mL］

90

Lot－B
Lot－b0.030
0.007
1.5

Lot－C
Lot－c0.045
0.010
2.76000
50004000
3000
2000

測定下限に関する試験
Lot－A
Lot－a
0.018
0.003
0.6

7000
TFPI2［pg/mL］

定による測定内再現性試験の結果、各検体の測定値の

血清－1
血清－2
血清－3

8000

1000

Lot－D
Lot－d0.038
0.007
1.7

00％

20％

40％

60％

80％

希釈倍率

図２

希釈直線性試験

100％

120％

東ソー研究・技術報告第 65 巻（2021）

型ビリルビン、脂質、ヒト血清アルブミン、アスコ（良性 77 例、悪性 274 例）について、TFPI2 と CA125

ルビン酸、卵巣がんの治療に使用される薬剤の主成分、の濃度分布および良性／悪性判別の受信者動作特性

TFPI2 と類似の構造を有するタンパク質を各々表３に（receiver operating characteristic：ROC）解析結果を記載の濃度まで添加して測定した結果、未添加に対し

図４に示す。て測定値はいずれも± 10％以内であり、これら物質

TFPI2 は CA125 と同様に、卵巣悪性腫瘍全般で有による影響は添加濃度まで認められないと判断した。

意に上昇した。良性腫瘍を陰性、悪性腫瘍を陽性と［5］検体の凍結保存安定性

した ROC 曲線の曲線下面積（areas under the curve：

血清検体 37 例について、凍結前後および− 80℃でAUC）は TFPI2（0.749）と CA125（0.761）で同等で11 ヶ月～ 2 年 7 ヶ月凍結保存後の測定値を比較した。

あり、TFPI2 はカットオフ 191pg ／ mL において感度相関係数、相関の傾きのいずれも良好な結果であり、（54.4％）では CA125 に劣るものの、非常に優れた特検体の凍結と長期間凍結保存による TFPI2 測定値へ異度（85.7％）を示した。この結果は、良性腫瘍におの影響は認められなかった（図３）。

ける偽陽性の発生頻度が低い 12） ことに起因するものと考えられる。
一方で、TFPI2 と CA125 の間には相関がなく、卵4．臨床上の有用性確認

巣悪性腫瘍の検出において互いに補完関係にあると考［1］卵巣腫瘍における良性／悪性の判別性能

共存物質の影響試験

共存物質
ヘモグロビン
遊離型ビリルビン
抱合型ビリルビン
脂質
ヒト血清アルブミン
アスコルビン酸
カルボプラチンシスプラチン
クロトリマゾール
シクロホスファミド
デキサメタゾン
ドキソルビシンテガフール
メルファラン
メトトレキサート
バクリタキセルイリノテカンヘパリン
ヒト TFPI
ヒト HAI－2A

77 例

274 例

10000077 例

2000.01800.01600.01400.0y ＝ 0.9409x ＋ 9.9328

1200.0r ＝ 0.9976

1000.0
800.0
600.0
400.0
200.0
0.0

0.0

500.0

1000.01500.02000.0未凍結卵巣腫瘍血清 TFPI2（pg/mL）
2000.01800.01600.01400.0y ＝ 1.0051x － 4.0842

1200.0r ＝ 0.9941

1000.0
800.0
600.0
400.0
200.0
0.0

0.0

500.0

1000.01500.02000.0短期凍結保存血清 TFPI2（pg/mL）

図３

検体の凍結保存安定性

TFPI2
CA125

100274 例

300

200

Sensitivity ％10000

CA125（U/mL）

TFPI2（pg/mL）

6000
5000
4000
3000
2000
1000
400

回収率［％］
添加濃度454.5 ［mg/dL］ 99.1～102.3
19.8 ［mg/dL］ 97.6～104.3
18.5 ［mg/dL］ 98.2～105.5
1666.7 ［mg/dL］ 97.0～101.4
98.6～108.5
5.0 ［g/dL］
20.0 ［mg/dL］ 96.9～106.6
500.0 ［μg/mL］ 96.7～107.4
200.0 ［μg/mL］ 90.3～101.9
1.0 ［μg/mL］ 93.8～106.7
500.0 ［μg/mL］ 97.1～107.1
10.0 ［μg/mL］ 97.8～104.9
10.0 ［μg/mL］ 92.6～104.9
10.0 ［μg/mL］ 99.3～106.2
10.0 ［μg/mL］ 96.1～105.1
100.0 ［μg/mL］ 95.0～108.8
1.0 ［μg/mL］ 97.1～106.3
10.0 ［μg/mL］ 95.9～107.7
100.0 ［U/mL］ 95.9～102.6
500.0 ［ng/mL］ 94.8～103.3
500.0 ［ng/mL］ 95.5～101.6

長期凍結保存血清 TFPI2（pg/mL）

表３

凍結卵巣腫瘍血清 TFPI2（pg/mL）

国内 5 施設で収集した卵巣腫瘍患者の血清 351 例

100010050TFPI2

10

100

001

卵巣良性腫瘍

卵巣悪性腫瘍

図４

卵巣良性腫瘍

卵巣悪性腫瘍

CA125

cutoff 191pg／mL 35U／mL
AUC
0.749
0.761
感度54.4％
72.3％
特異度
85.7％
61.0％
050

100

100％－Specificity ％TFPI2 および CA125 による卵巣腫瘍の良性／悪性判別性能

912418（例）100000

明細胞癌

1000

2156

65

48

21760

31

24

粘液性

31

類内膜

60

漿液性（Ⅱ～Ⅳ）7

漿液性（Ⅰ）

21

明細胞（Ⅱ～Ⅳ）48

明細胞（Ⅰ）

65

境界悪性

56

子宮内膜症

その他

21

CA125（U/mL）

18（例）

10000
1000
100
10

その他

粘液性

1
類内膜

漿液性（Ⅱ～Ⅳ）

漿液性（Ⅰ）明細胞（Ⅰ）

悪性明細胞（Ⅱ～Ⅳ）

良性

境界悪性その他

子宮内膜症

100

良性図５悪性その他

TFPI2（pg/mL）

10000

子宮内膜症

TOSOH Research & Technology Review Vol.65（2021）

卵巣腫瘍組織型別濃度分布

えられる 10）。卵巣悪性腫瘍 274 例の陽性率を TFPI2、床に近いものと考えられる。

CA125、両者の組合せで比較すると（表４）、CA125

また、明細胞癌の発生母地とされる子宮内膜症とののみでは 73.0％であったのに対し TFPI2 を組み合わせ鑑別性能の ROC 解析（明細胞癌 69 例 vs 子宮内膜症

ると 82.1％（＋ 9.1％）に向上した。特に CA125 陰性21 例）の結果、TFPI2（AUC：0.855）は CA125（AUCの割合が高まるステージ初期（Ⅰ期）では、TFPI2 と：0.520）と比較して非常に優れた結果を示し（図６）、の組合せにより陽性率が 56.2％から 70.4％（＋ 14.2％）

CA125 で課題とされている子宮内膜症の適切な診断にに向上し、より高い効果を示した。

おいて有用となり得る可能性が示唆された 12）。

［2］卵巣明細胞癌の判別性能
卵巣腫瘍患者 351 例について、TFPI2 と CA125 の組織型別濃度分布を図５に示す。
100で高値傾向を示した。CA125 はⅡ期以上の漿液性癌で非常に高く、その他の組織型も高値傾向にあったが、明細胞癌と粘液性癌は比較的低値を示し、良性腫瘍で有意に上昇傾向にある子宮内膜症や境界悪性腫瘍と同程度の分布となった。
TFPI2 に よ る 明 細 胞 癌 判 別 の ROC 解 析（ 明 細 胞Sensitivity ％TFPI2 は他の組織型に比べて明細胞癌（Ⅱ期以上）：TFPI2：CA125
TFPI2500CA125

cutoff 270pg／mL 35U／mL
AUC0.8550.520
感度43.5％ 62.3％
特異度 100.0％ 28.6％050

100100％－Specificity ％図６

子宮内膜症と明細胞癌の判別性能

癌 69 例 vs 明細胞癌以外の卵巣腫瘍 282 例）の結果、AUC が 0.699、カットオフ 270pg ／ mL における感度43.5％、特異度 84.8％となり、先行研究 9,10） と比較しCA125て感度が低いものの、高い特異性を有することが確認された。感度低下の要因としては、明細胞癌における漿液性がん（Ⅲ・Ⅳ期）
1000 ＊
U/mL

Ⅰ期症例の割合が高かったためと推察されるが、一定明細胞がん以外の卵巣がん期間の適格症例を無作為に収集した本試験結果が実臨

明細胞がん（Ⅰ期）
良性腫瘍の一部

表４

臨床病期別の陽性率

卵巣悪性腫瘍の陽性率［％］
項目
CA125
TFPI2
CA125＋TFPI2
Ⅰ期
56.2
41.470.4
Ⅱ期
95.2
58.395.8
Ⅲ期
98.3
74.6
100.0Ⅳ期
96.686.2
100.0
Ⅰ～Ⅳ期
73.0
54.7
82.1

92

明細胞がん

35U/mL

良性腫瘍
健常191pg/mL

270pg/mL

TFPI2＊漿液性がんⅢ～Ⅳ期の判別値としておりますが、本試験結果から仮に設定した値です。

図７

組合せによる卵巣腫瘍分類モデル

東ソー研究・技術報告

5．まとめ
今回開発した TFPI2 測定試薬について、基本性能と臨床的有用性を確認した。
試薬性能としては、十分な感度を有しており、再現性や希釈直線性も良好であった。また、検体の凍結保存や共存物質による影響がないことも確認された。
臨床的意義については、TFPI2 測定により①卵巣腫瘍における良性／悪性判別（カットオフ 191 pg ／ mL）と②卵巣悪性腫瘍における明細胞癌判別（カットオフ270 pg ／ mL）が可能であり、診断上有用であると考えられた。さらに、TFPI2 と CA125 と組み合わせるこ

第 65 巻（2021）

５）Y. Miyagi, Journal of biochemistry , 116（5）, 939 −942（1994）
６）K. Udagawa, Placenta , 23（2）,145 − 153（2002）
７）M. Ogawa, Placenta, 28（2）,224 − 232（2007）８）N. Arakawa, Journal of proteome research , 12（10）,4340 − 4350（2013）９）N. Arakawa, PLOS ONE , 11（10）, e0165609（2016）10）大竹則久、東ソー研究・技術報告、62、23 − 28（2018）11）Y. Ota, Oncology Reports , 45（3）,1023 − 1032（2021）
12）E. Miyagi, International Journal of ClinicalOncology , 26, 1336 − 1344（2021）とにより図７のような分類が可能となり、卵巣腫瘍患者の個別化診療の一助になることが期待される。
なお、これらの性能・有用性が認められ、本試薬は2020 年 6 月に体外診断用医薬品として製造販売承認を取得し、TFPI2 は新規腫瘍マーカーとして 2021 年4 月に保険収載された。また、これまでプロテオーム解析技術に基づくマーカー探索で臨床応用に至った例はほぼなく、本成果に対して日本プロテオーム学会より研究開発功績賞（2020 年度）が授与された。
今後は、未知な部分も多い TFPI2 について基礎的な研究を推進し、更なる有用性向上や臨床応用につなげていきたいと考えている。試験参加施設とは現在も継続的に臨床研究を実施しており、病態や治療との経時的な相関や子宮内膜症がん化との関係性などについて評価を進めていく予定である。

6．謝辞
本開発において、基礎検討から臨床評価、そして保険適用に至るまでの幅広いご協力、ならびに多くのご助言をいただいた横浜市立大学大学院医学系研究科産婦人科学・宮城悦子教授、医療法人平治会ミズクリニ
ックメイワン病院長・小林浩先生に厚く御礼申し上げます。

7．文献１）T. Sugiyama, Cancer , 88（11）, 2584 − 2589（2000）
２）H. Kobayashi, International Journal of

Gynecological Cancer , 17（1）,37 − 43（2007）３）日本産婦人科学会、産婦人科診療ガイドライン−
婦人科外来編 2020、腫瘍、72 − 75（2020）４）小林浩、日本産婦人科学会誌、40（4）、467 − 472（1988）
93