ウイルス二本鎖 RNA 精製キット（動物試料用）
ア イ ソ ヴ ァ イ ラ ス

ISOVIRUS IIマニュアル（第 1 版）
Code No. 312-09091

NIPPON GENE CO., LTD.

I 製品説明ISOVIRUS II（アイソヴァイラス 2）は、動物試料（組織・培養細胞）から選択的にウイルス等に由来する長鎖の二本鎖 RNA（dsRNA）を抽出・精製するためのキットです。
本キットは、dsRNA がセルロース担体へ特異的に吸着する基本原理を利用しており、得られた dsRNA は、RNA シークエンス等のアプリケーションに使用可能です。

＜実験の流れ＞ステップ A：セルロース充填カラムの調製

ステップ B：動物試料からの総 RNA 抽出（操作時間：約 20 分間）（操作時間：約 60 分間）

カラム
Filter Column

動物試料を破砕または溶解Collection Tube↓
Swollen Cellulose を Filter Column に充填

RNase A と Proteinase K の反応↓↓

洗浄DNase I 反応↓↓
エタノールを混合↓

セルロース

遠心分離（夾雑物を除去）
一時冷蔵保存（4℃で 4 時間、-20℃で 16 時間まで）

一時冷蔵保存（4℃で 1 日程度）

オプション B-1：本キット以外の核酸抽出試薬を使用する場合
オプション B-2：dsRNA 溶液を再精製する場合

ステップ C： dsRNA の単離・精製（操作時間：約 70 分間）

総 RNA とEtOH の混合液
セルロース

dsRNA

dsRNA

ssRNA

ssRNA

ssRNA

dsRNA はセルロースへ吸着

1

残存 ssRNA を洗浄精製されたdsRNA
dsRNA を溶出II キット内容
キット構成品

容量（20 回用）

保存温度

500 μl × 1 本－20℃

1,000 units × 1 本－20℃

10×DNase I Buffer

1.2 ml × 1 本－20℃

RNase A30 μl × 1 本

室温

VR Extraction Buffer CT110 ml × 1 本

室温

VR Extraction Buffer 22 ml × 1 本

室温

2×STE Buffer

7 ml × 1 本

室温Filter Column

20 本 × 1 袋室温※3Swollen Cellulose

10 本 × 2 箱

室温エタノール含有

VR Wash Buffer

40 ml × 2 本

室温エタノール含有※4

VR Elution Buffer

4 ml × 1 本

室温Proteinase K
DNase I (RNase free)

備考

長期保存：冷蔵/冷凍※1

※2

（注意）
※1

RNase A は室温保存可能ですが、長期間ご使用にならない場合には、冷蔵（2～10℃）
もしくは冷凍（－20℃）保存して下さい。

※2

VR Extraction Buffer 2 は低温になると成分が析出する場合があります。析出物が生じた場合は、65℃程度に加温し、振り混ぜて完全に溶解してからご使用下さい。

※3

Filter Column は、本キット専用カラムと Collection Tube からなります。

※4

VR Wash Buffer にはエタノールが含まれています。ご使用後は蒸発を防ぐため速やかに蓋を閉め、保管して下さい。

2

III 使用上の注意
・ 本キットは、試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。
・ 試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。
・ 本キットの取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。
・ マニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。
・ 安全性データシート（SDS）は、ニッポンジーン WEB サイト（www.nippongene.com）よりご覧になれます。

3

IV プロトコール＜Contents＞
詳細プロトコールステップ A：

セルロース充填カラムの調製

p. 5

ステップ B：

動物試料からの総 RNA 抽出

p. 6

ステップ C：dsRNA の精製
① セルロースへの dsRNA 吸着

p. 7② カラムの洗浄

p. 8③ dsRNA の溶出

p. 9B-1：

本キット以外の核酸抽出試薬を使用する場合

p. 10

B-2：

dsRNA 溶液を再精製する場合

p. 11

オプション

＜キット以外に必要なもの＞
・ マイクロピペット
・ ピペットチップ
・ ペッスル（動物組織用）
・ 1.5 ml マイクロチューブ
・ 遠沈管（培養細胞用）
・ 卓上低速遠心機
・ 低温遠心分離機（13,000×g、4℃）
・ 恒温槽（65℃）
・ 恒温槽（37℃）
・ ボルテックスミキサー（Swollen Cellulose 懸濁用）
・ 氷・ エタノール（100～95％ Ethanol）
・ RNase フリー水（ニッポンジーン Code No. 316-90101, 等）＜必要に応じて用意するもの＞
・ 液体窒素（ステップ B で凍結粉砕試料を使用する場合）

4

ステップ A：セルロース充填カラムの調製*1)

Filter Column

Swollen Cellulose をボルテック

Swollen Cellulose 懸濁液を 1 本全量添加*1)スミキサー等でよく懸濁してからデカンテーション等で Filter

静置 1～3 分間（蓋を開けて）*2)

Column に 1 本全量（約 800 µl）

ろ液自然落下アプライする。液残りが気になる場合はハサミで先端を切った*3)

スピンダウン 3 秒間（蓋を閉めて）ろ液を捨てる

チップを用いる。

*4)*2)（この時点で、一時保存可能）*5)

Filter Column の蓋を閉めきると、ろ液が落下しない。空気が500 µl VR Wash Buffer をゆっくりと添加*6)入るように開けておく。
*3)

静置 3～5 分間（蓋を開けて）カラムの蓋を閉めてからスピンろ液自然落下

ダウンを行う。

スピンダウン 3 秒間（蓋を閉めて）*4)

ろ液を捨てるカ ラ ム を 取 り 外 し 、 Collection

900µl VR Wash Buffer をゆっくりと添加

Tube の中に集まったろ液を捨てる。カラムを再度 Collection

静置 3～5 分間（蓋を開けて）Tube に戻してから次の操作にろ液自然落下進む。
（以降の「ろ液を捨てる」
でも同様に行う）

カラムの蓋を閉める（乾燥防止）*5)*7)少なくとも 1 週間は冷蔵で保存セルロース充填カラム（冷蔵一時保存）可能。
（カラムの蓋は閉める）

セルロース*6)
充填した Swollen Cellulose の表面を乱さないようにする。
*7)ステップ C・①（p.7）へ進む

乾燥しすぎないようカラムの蓋を閉めた状態で 1 日程度は冷蔵で一時保管可能。

5ステップ B：動物試料からの総 RNA 抽出
動物試料*8)

組織：100 mg 以下*8)

7

動物試料を 1.5 ml マイクロチュ

培養細胞：1×10 cells 以下ーブの中に採取する（培養細胞の場合は遠沈管に採取する）。新500 µl VR Extraction Buffer CT1
ペッスルを用いて試料をよくすり潰す*9)

鮮試料または液体窒素中で凍結粉砕した試料を使用する。

（培養細胞の場合はよく懸濁する）
1 µl RNase A
転倒混和*9)20 µl Proteinase K

チューブの形状に応じたペッス

転倒混和（激しい撹拌は避ける）

ルを使用する。不十分なホモジナイズは低収量につながる。

65℃で 15 分間加温（5 分毎転倒混和） *10)*10)100 µl VR Extraction Buffer 2

インキュベートの間、5 分おきに転倒混和転倒混和する。ボルテックスミ
キサー等による激しい撹拌は避ける。

室温で 3 分間静置
60 µl 10×DNase I Buffer*11)

30 units DNase I (RNase free)

終濃度約 16％のエタノール混合転倒混和液になる。
*12)

37℃で 15 分間加温（5 分毎転倒混和）

沈殿物や液表面の析出物を取ら

35 µl ddWater（RNase フリー水）

ないように、上清を新しいマイ35 µl 2×STE Buffer

クロチューブに回収する。
（上清は、900 µl 程度回収できる）。回143 µl エタノール*11)

収する液量が少ない場合は再度遠心する。

転倒混和*13)

氷上で 10 分間静置

新しいマイクロチューブに回収した上清は、4℃で 4 時間、もし遠心（13,000×g, 5 分間, 4℃）

くは–20℃で 16 時間の一時保管

上清（16%EtOH 混合液）を回収*12)可能。
（エタノールの蒸発を防ぐ*13)

ため、蓋をよく閉めておく）

蓋を閉める（冷蔵一時保存）
ステップ C・①（p.7）へ進む

6

ステップ C：dsRNA の精製（①セルロースへの dsRNA 吸着）

ステップ B で回収した上清（またはオプション B で調製した溶液）には、dsRNA と残存一本鎖 RNA と残存 DNA が含まれている。このステップで、dsRNA はセルロース担体へ特異的に吸着する。
*14)

ステップ A で調製したセルロース充填カラム

カ ラ ム を 取 り 外 し 、 Collection

スピンダウン 3 秒間Tube の中に集まったろ液を捨ろ液を捨てる *14)

てる。カラムを再度 Collection
Tube に戻してから次の操作にステップ B の 16％EtOH 混合液を全量添加進む。
（以降の「ろ液を捨てる」
でも同様に行う）

静置 3～15 分間（蓋を開けて）ろ液自然落下 *15)*15)試料に含まれる RNA や夾雑物のスピンダウン 3～5 秒間（蓋を閉めて）濃度に依存して自然落下にかかる時間は異なる（目安：3～15分間）。15 分以上かかる場合はス

ろ液をマイクロピペットで吸い取り
再度カラムへアプライ*16)

ピンダウンに進む。
気泡の発生などによりセルロー
スが浮いてくる場合は、カラム

静置 3 分間以上（蓋を開けて）の蓋を 2～3 回開け閉めするか、スピンダウン 3～5 秒間（蓋を閉めて）指ではじく、または机の上にチューブを軽く打ち付けてカラムの中のセルロースを沈降させろ液をマイクロピペットで吸い取り再度カラムへアプライ*16)る。
*16)

静置 3 分間以上（蓋を開けて）

カ ラ ム を 取 り 外 し 、 Collection

スピンダウン 3～5 秒間（蓋を閉めて）

Tube の中に集まったろ液をマろ液を捨てる

イクロピペットで吸い取って回収する。Collection Tube の上にカラムを再度戻してから回収しステップ C・②（p.8）へ進むたろ液をアプライする。

セルロース（dsRNA 吸着）

7

ステップ C：dsRNA の精製（②カラムの洗浄）

VR Wash Buffer による 3 回の洗浄で、セルロース充填カラムに残存している一本鎖 RNAや残存 DNA を洗い流す。
*17)

ステップ C・①（p.7）からの続き

VR Wash Buffer をアプライした

800 µl VR Wash Buffer*17)

時、気泡の発生などによりセルロースが浮いてくる場合は、カラムの蓋を 2～3 回開け閉めする

静置 5 分間（蓋を開けて）か、指ではじく、または机の上

スピンダウン 3 秒間（蓋を閉めて）にチューブを軽く打ち付けてカろ液を捨てる

ラムの中のセルロースを沈降させる。

800 µl VR Wash Buffer*17)

静置 5 分間（蓋を開けて）
スピンダウン 3 秒間（蓋を閉めて）ろ液を捨てる800 µl VR Wash Buffer*17)

静置 5 分間（蓋を開けて）
スピンダウン 5 秒間（蓋を閉めて）ろ液を捨てる
カラムを取り外し、新しい 1.5 ml マイクロチューブにセット
ステップ C・③（p.9）へ進む

セルロース（dsRNA 吸着）

8

ステップ C：dsRNA の精製（③ dsRNA の溶出）

セルロース担体に吸着している dsRNA を溶出する。
溶出液として、RNase フリー水（ニッポンジーン Code No. 316-90101, 等）か、VR Elution
Buffer（1 mM EDTA を含む弱アルカリ性溶液）が使用できる。

ステップ C・②（p.8）からの続き*18)
溶出液をセルロース全体に行き50 µl 溶出液の滴下*18)わたるように滴下する。
高濃度の dsRNA 溶液を得たい

静置 5 分間 *19)

場合、溶出液の滴下量を 25 µlまで減らせる。
スピンダウン 3 秒間*19)

ろ液をマイクロピペットで吸い取り再度カラムへアプライ

静置中、蓋は開いていても、閉*16)まっていても、どちらでも構わない。

静置 3 分間*20)

スピンダウン 3 秒間精製された dsRNA 溶液がマイクロチューブの中にろ液としてろ液をマイクロピペットで吸い取り回収される。–20℃で保管可能。

別のチューブに移す（dsRNA 溶液） *20)
*21)

カラムをマイクロチューブの上に再度戻す

二回目の溶出操作で得られたdsRNA 溶 液 は 、 上 記 *20) の50 µl 溶出液の滴下 *18)

dsRNA 溶液より核酸濃度は比較的薄くなる。得られた二つのろ

静置 5 分間 *19)

液を混ぜて総量 100 µl の精製
dsRNA 溶液にする（あるいは、スピンダウン 3 秒間別々に保存してもよい）。

ろ液をマイクロピペットで吸い取り*22)

再度カラムへアプライ *16)

VR Elution Buffer で 溶 出 し た
dsRNA 溶液の脱塩・バッファー

静置 3 分間交換は、ISOSPIN PCR Product(Code No. 315-08001) を用いた

スピンダウン 3 秒間精製で可能。

dsRNA 溶液 *21), *22)
9

オプション B-1：本キット以外の核酸抽出試薬を使用する場合
本キット以外の核酸抽出試薬＊を用いて動物試料から抽出した総 RNA 溶液あるいは総核酸溶液から、dsRNA を精製できます。
＊ ISOGEN（Code No. 311-02501）、ISOSPIN Cell & Tissue RNA（Code No. 314-08211）等

総核酸溶液（100 µl 以下、液量を 100 µl に合わせる必要はない）
500 µl VR Extraction Buffer CT1
1 µl RNase A
転倒混和
静置 5 分間20 µl Proteinase K
転倒混和（激しい撹拌は避ける）
37℃で 15 分間加温（5 分毎転倒混和） *10)
100 µl VR Extraction Buffer 2
転倒混和
60 µl 10×DNase I Buffer
30 units DNase I (RNase free)
転倒混和
37℃で 15 分間加温（5 分毎転倒混和）
35 µl ddWater（RNase フリー水）
35 µl 2×STE Buffer
143 µl エタノール（終濃度 16％の EtOH 混合液になる）
転倒混和
氷上で 10 分間静置遠心（13,000×g, 5 分間, 4℃）
上清（16%EtOH 混合液）を回収
蓋を閉める（4℃で 4 時間、もしくは–20℃で 16 時間の一時保管可能）
ステップ C・①（p.7）へ進む（以降の操作は同じ）
10

オプション B-2：dsRNA 溶液を再精製する場合
ステップ C で精製した dsRNA 溶液が低純度の場合、再精製することができます。
dsRNA 溶液（350 µl 以下）
総量 350 µl になるよう水で希釈
350 µl の 2×STE Buffer を加え、総量 700 µl にする
133 µl のエタノールを添加し、終濃度 16％にする
ボルテックスミキサーで混和
16%EtOH 混合液
蓋を閉める（4℃で 4 時間、もしくは–20℃で 16 時間の一時保管可能）
ステップ C・①（p.7）へ進む

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V トラブルシューティング
トラブル

予想される原因

対策

・ VR Extraction Buffer CT1 中での試料の試料の粉砕が不十分

ホモジナイゼーションまたは溶解を十分に行う。

低収量

試料量が多すぎる・ 試料量を半分に減らす。

エタノールの添加量が不・ 終濃度 16％になるようエタノールを添足している加する。
・ 溶出効率は pH 値に依存する。溶出にRNase フリー水が中性でRNase フリー水を使用する場合には pHない（pH 値が 5.0 以下）が中性であることを確認する。
・ VR Elution Buffer で溶出する。

試料量が多すぎて抽出溶液の粘性が増し、遠心分離による夾雑物の除去が不低純度

・ 試料量を半分に減らす。

十分・ 上清を再度、遠心（13,000 x g、5 分間、4℃）して、できるだけ油分や不溶物を夾雑物の混入除去する。
・ 試料量を半分に減らす等、上記の対策を自然落下しない粘性が高い、夾雑物が多い行う。
・ ステップ C の*15)を参照する。

由来生物や組織により一本鎖 RNA が混入しやすく一本鎖 RNA の混入なる・ オプション B-2 を参照して dsRNA の精製を再度行う。
・ 精製 dsRNA 溶液に対して、一本鎖 RNA

上記、またはその他特異的分解酵素処理を行い、「ISOSPINPCR Product」で精製する。

DNA の混入DNA 量が多い試料を使用した・ 精製 dsRNA 溶液に対して、DNase 処理を行い、「ISOSPIN PCR Product」で精製する。

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VI 参考文献
Urayama S, Doi N, Kondo F, Chiba Y, Takaki Y, Hirai M, Minegishi Y, Hagiwara D, Nunoura T.
(2020)
Diverged and active partitiviruses in lichen.
Front. Microbiol. 11: 561344
Ryo Okada, Eri Kiyota, Hiromitsu Moriyama, Toshiyuki Fukuhara, Tomohide Natsuaki (2015)
A simple and rapid method to purify viral dsRNA from plant and fungal tissue.
J Gen Plant Pathol 81: 103-107
Ioannis E. Tzanetakis, Robert R. Martin (2008)
A new method for extraction of double-stranded RNA from plants.
J Virol Methods 149: 167-170
Morris, T.J., Dodds, J.A. (1979)
Isolation and analysis of double-stranded RNA from virus-infected plant and fungal tissue.
Phytopathology 69: 854-858.
Richard M. Franklin (1966)
Purification and properties of the replicative intermediate of the RNA bacteriophage R17.
Proc Natl Acad Sci U S A. 55: 1504-1511.
Syun-ichi Urayama, Yoshihiro Takaki, Shinro Nishi, Yukari Yoshida-Takashima, Shigeru
Deguchi, Ken Takai, Takuro Nunoura (2018)
Unveiling the RNA virosphere associated with marine microorganisms.
Mol Ecol Resour 18: 1444-145513

VII 関連製品
Code No.

製品名

包装単位

316-90101

Distilled Water, Deionized, Sterile

100 ml318-90105

Distilled Water, Deionized, Sterile

500 ml

314-08071

DNase I (RNase free)

2,000 units

318-06391

RNase A (100 mg/ml)

0.5 ml × 5315-08001

ISOSPIN PCR Product

100 回用

310-08811

ISOVIRUS（植物・真菌用）

20 回用

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VIII 備考
本製品は、新学術領域研究“ネオウイルス学”の研究成果をもとに開発されました。

マニュアル記載内容や製品仕様、価格に関しては予告なしに変更する場合があります。

お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
研究試薬部 学術営業課
TEL
URL

076 - 451 - 6548
https://www.nippongene.com/siyaku/

お問い合わせは、お電話もしくは WEB フォームより承っております。

ISOVIRUS II マニュアル（第 1 版）2105nd

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