Oct. 2016

〈総THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―5301（ 1 ）説〉
カイコ感染実験系の有用性と課題―ライソシン E の研究を中心として―浜本洋

帝京大学医真菌研究センター（2016 年 6 月 27 日受付）
従来の試験管内での抗菌活性を指標とした探索によって見出された抗生物質は，その大部分が体内動態や毒性の問題から感染個体に対し治療効果を示さない。従って，動物実験による治療効果の評価が必須となるが，近年では倫理的，コストの面から，実験動物代替モデルが必要とされてきている。そこで我々は，コストが安く倫理的な問題が無いため，多数の個体を感染実験に供することができるカイコに着目し，細菌感染モデルを用いた抗生物質の定量的な治療評価系を確立した。これまでの我々の研究から，カイコモデルを用いて抗生物質の治療効果，及び毒性が，哺乳動物と同等に評価可能であることを明らかにしている。カイコの様々な利点は，治療効果を指標とした新規抗生物質の探索に応用可能である。そこで本モデルを用いて，我々は実際に治療効果を指標とした探索を実施し，新規抗生物質ライソシン E を発見した。本総説ではカイコを利用した感染症治療薬開発法，及び，その利点と課題について解説する。

現し，深刻な問題になりつつある。従って，これ

1. はじめに感染症は，今なお全世界において主要な死亡原まで以上に抗生物質の乱用を防ぐだけでなく，新たな治療薬の開発が必要とされている。

因であり続けている。また抗生物質の乱用によ一方，新しい抗菌薬の探索は，その採算性に対り，多剤耐性菌が蔓延し社会的な問題となっていする疑問から製薬会社が二の足を踏んでいるのがる。2013 年 の ア メ リ カ 疾 病 管 理 予 防 セ ン タ ー

現状であり，新しい抗生物質の上市は年々減少し（CDC）の推計によれば，米国では多剤耐性菌にている。このような現状を打開するため，米国で少なくとも 200 万人以上が感染し，2.3 万人が亡

は抗生物質の開発に対して優先審査の実施や，独くなっていると報告されている。中でも多剤耐性占期間の延長などのインセンティブを設けてい黄色ブドウ球菌により，1 万人以上が亡くなってる。すでに，いくつかの抗生物質の開発に，この

1）いると推計されている 。さらに，近年，既存のインセンティブが与えられている。我が国におい抗生物質が全く効果を示さないスーパーバグが出ても，先の伊勢志摩サミットで新規抗生物質の開302（ 2 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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発に 8 億円をかけるなどの対策が公表されている。 物の治療効果を評価することが肝要であると考えしかしながら，新規作用機序を有する抗生物質られる。しかしながら，これまで治療効果の評価の開発は容易ではない。このような抗生物質の開に用いられてきたマウスなどの哺乳動物モデル

発が困難な理由として，以下のような点があげらは，コストが高く，倫理的なハードルも高いため，れている。

気軽に用いることは不可能である。そこで，我々（1）新規抗菌薬を発見したとしても，体内動態やは新たな動物モデルとしてカイコに着目した。

毒性などに問題がある，いわゆるドラックラ
イクでない化合物が大部分を占めること。

2. カイコモデルの利点（2）これまで，新規の抗生物質の発見を支えてきカイコは，古来より絹の生産に用いられてきたた，細菌の二次代謝産物からの，既存の物質産業昆虫である。蚕糸農家においては，桑の葉をの再発見率が高くなり，新規クラスの抗生物利用して，夏の季節に多数の個体を安価に飼育す質の発見が困難になってきたこと。

る方法が確立されている。一方で，カイコを研究（3）化合物ライブラリーからの探索においては， に用いるためには，個体差が少なく，健康な個体標的指向的な探索によって同定された化合物を，一年中得ることができるシステムの確立が必が細菌のトランスポーターで排泄されたり要である。カイコは，これまでの様々な研究から（特にグラム陰性菌では深刻な問題である）， 人工飼料を利用した，無菌的な飼育法が確立して標的特異性が低かったりするなどの理由によおり 2），哺乳動物における Speciﬁc pathogen freeり，抗菌活性を示さないものが大部分である。 （SPF）に似たような個体を得ることができる。
このような問題を克服するためには，新しい我々の研究室においても，主な病原体の感染経路アッセイ系を用いて，開発の早い段階で候補化合である手指の消毒を注意することで，安定してば

表 1. カイコと他のモデル動物との比較

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69―5303（ 3 ）らつきの少ない個体を毎週 5000 頭のカイコを飼重要な鍵を握っている。カイコにも哺乳動物と同育できている。このような動物はカイコ以外には等の薬物動態に関わる臓器が存在している。例えないのではないかと考えている（表 1）。

ば，薬物の吸収に関わる腸管や，薬物の代謝やエまた，カイコは昆虫であることから，いわゆるネルギー代謝に関わる肝臓に相当する脂肪体，薬動物愛護の対象になっておらず，産業利用におい物の排泄に関わる腎臓に相当するマルピーギ管がて倫理的な問題も規制もないという利点がある。 存在している（図 1）。また，薬物動態に関わる
また，カイコは昆虫の中でも比較的大きく，動き4 つの因子である，吸収・分布・代謝・排泄につも緩慢であることから，ヒトの手で扱うことが容いて，モデル薬物のカイコでの挙動を解析した結易であり，使い捨ての注射器を用いて注射実験を果，哺乳動物とよく一致していることを我々の研簡便に行うことができる。また，臓器や体液の分究から明らかにしている。例えば，ヒトにおける離も特別な器具を使わずでき，簡単な薬理試験も薬物の腸管からの吸収には，化合物の分子量と疎可能である。さらに，カイコは古来より人間によ水性が影響することがわかっている。カイコでもり飼育されてきたことから，さまざまな変異系統同様の因子が腸管吸収性に影響することを報告しが保存されているなど，遺伝学的な研究にも利用ている 3,4）。実際，抗生物質でも分子量が高く水溶されている。つまり，他の昆虫と異なり，系統管性が高いバンコマイシンやカナマイシンはヒトで理が行われており，実験の再現性も得られやすも経口吸収性がないが，カイコでも経口吸収性をい。他の昆虫は，ショウジョウバエなどの優れた示さなかった。また，カイコを用いてプロドラッモデルを除き，カイコほどには容易に実験に利用クの腸管吸収性の評価も可能である。水溶性が高することは簡単ではなく，再現性にも問題がある

く腸管を透過できない抗生物質セフカペンナトリ

場合が多い。従って，カイコは昆虫の中でも，医ウムと，経口薬として市販するためにプロドラッ薬品の開発研究を行う上で，理想的なモデルであグ化されたセフカペン ピボキシルを，カイコにると言える。

おいて評価した。その結果，プロドラッグは腸管を透過しカイコの体液中の濃度が上昇するが，元3. カイコにおける薬物動態の化合物は腸管透過性が低いことがわかった（図

薬の効果の発揮には，個体における薬物動態が2）。また，経口投与における治療効果はプロド

図 1. カイコの薬物動態に関わる体の構造304（ 4 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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図 2. プロドラッグのカイコ腸管の透過性ラッグ化した方が高いことも明らかにしている。 ある 6）。ただし，神経毒性や呼吸毒性を示す化合さらに，カイコにおいても，シトクロム P450 によ物などについては，乖離が認められることがわ

る第 1 相反応の後，抱合酵素による第 2 相反応がかっている 5）。これは，カイコの神経に発現する起こり，薬物が糞に排せつされるなど，ヒトと同受容体の種類が哺乳動物と異なっているためであ様な薬物代謝反応が起こることを見いだしている。また呼吸に関して，カイコは受動呼吸で，能る 。従って，カイコを用いることで抗生物質の動呼吸の哺乳動物とは異なるため，呼吸中枢に作薬物動態を加味した治療効果の評価を行うことが用する薬物の評価が難しい場合がある。ただし，できると考えられる。

Na＋ チャンネル阻害薬であるテトロドトキシン

5）は，カイコを哺乳動物と同様に殺傷する。すべて

4. カイコを用いた毒性試験の呼吸抑制によって死に至る化合物が評価できなカイコを用いて毒性試験も可能である。細胞毒

いのではなく，その作用点によってカイコでも哺性を示す化合物 5）や，経済協力開発機構（OECD） 乳動物と同様な毒性を示す場合がある。従って，のガイドラインに記載されている化合物をカイコ

カイコを用いて候補化合物の毒性評価を行う際と，哺乳動物（主にラット）におけは，これらの生物学的な違いを考慮する必要があに投与する

6）

る LD50 値とほぼ同程度の結果が得られることがる。

わかっている（図 3）。その相関係数は 0.66 であReduction，Reﬁnement）のうち Replacement にあ

5. カイコにおける抗生物質の治療効果の評価たる実験動物代替モデルとして十分に利用可能で当研究室の垣内らにより，カイコを用いた黄色り，実 験 動 物 の 基 準 で あ る 3R （Replacement，Oct. 2016

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69―5305（ 5 ）図 3. カイコと哺乳動物における急性経口毒性の比較

表 2. カイコにおける抗生物質の治療効果

ブドウ球菌と緑膿菌の感染モデルが確立してい量（ED50 値）を求めたところ，カイコモデルとマた 。これまでに示したカイコの薬物動態の解析ウスモデルでの値はよく一致していた（表 2）3）。

結果から，カイコにおいても哺乳動物と同様な抗従ってカイコモデルを用いて，候補化合物の治療生物質の治療効果が期待できる。実際に，黄色ブ効果を定量的に評価可能であると考えられる。カ

ドウ球菌に感染したカイコに，臨床で使用されてイコモデルは倫理的な問題がなくコストが安いといる抗生物質を投与すると例外なく治療効果を示いう利点を活かして，多数の個体を用いて，治療した。その 50% の生存に必要な体重あたりの薬剤効果が明らかではない細菌の培養上清の治療効果

7）306（ 6 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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を簡便に評価できると考えた。そこで，我々はカこで，我々は治療効果を示した培養上清を，カイイコ感染モデルを利用した治療効果を指標とした

コ感染モデルにおける治療効果を指標に分画し，抗生物質の探索を実施した。

治療活性物質を精製し同定することとした。治療活性を示す画分に存在する化合物の分子量を測定

6. カイコ細菌感染モデルを利用した
新規抗生物質の同定

し，その物性とともに，抗生物質データベースと著者らは，日本各地から採集した土壌細菌からを生産する培養上清を探索した。その結果，沖縄調製した培養上清のうち，抗菌活性を示した全ての土壌から分離した Lysobacter 属に分類される菌のサンプルについて，カイコモデルで治療効果をから，新規抗生物質ライソシン E を同定すること評価した。その結果，分離した約 14,000 株のうに成功した 8）。

比較することで，これまでに報告がない抗生物質

ち，3,800 株が抗菌活性を示したが，カイコモデルで治療効果を示したのはたったの 27 株であった。

7. ライソシン E の作用機序

従って，カイコモデルを利用することで，治療効

ライソシン E は，分子量が 1617 とやや大きく，果を示さない抗菌化合物を候補から除くことがでその構造から環状リポペプチド系抗生物質に属すき，治療効果を示すサンプルにリソースを集中する（図 4）。リポペプチド系抗生物質の仲間で臨床ることができる。

において使用されているものにダプトマイシンが今日では，培養上清の二次代謝産物の網羅的なあるが，構造が全く異なることから，その作用機質量分析解析を行い，未知物質を同定する手法が序は異なっていると考えられた。ライソシン E は確立しているが，未知物質があったとしても抗菌黄色ブドウ球菌に対してダプトマイシンと同様に活性を示すか，さらには治療効果を示すかは，あ膜障害性を有したが，ダプトマイシンが 60 分ぐる程度の量を精製しないことには判明しない。そらいで殺菌活性を示すのに対して，ライソシン E

図 4. ライソシン E とダプトマイシンの構造

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69―5307（ 7 ）表 3. 黄色ブドウ球菌に対するライソシン E の殺菌活性は薬剤の添加直後，すなわち 1 分以内という短時う低用量で良好な治療効果を示した。そこでマウ間に，99.99% の菌を殺菌するという強力な殺菌スモデルにおける治療効果を評価したところ，ほ活性を示す（表 3）。そこで，変異原処理した黄色ぼ同等な用量で治療効果を示した。このことか

ブドウ球菌からライソシン E に対する耐性菌を取ら，カイコモデルを用いて探索された治療有効な得し，その変異遺伝子の解析したところ，黄色ブ化合物は，マウスモデルでも同様な治療効果を示

ドウ球菌の電子伝達系の唯一の補酵素であるメナすと考えられ，カイコモデルの創薬における有用キノンの合成経路の遺伝子であることがわかっ性を明らかにできたと考えている。

た。一方で，ライソシン E はメナキノン合成を阻

また，先にも述べたが，ライソシン E を ED50 値害しなかったことから，標的はメナキノン合成経の 500 倍以上の用量を単回投与してもマウスは殺路のタンパク質ではないと考えられた。また，培傷されず，高い安全性を示した。従って，ライソ地にあらかじめメナキノンを加えておくとライソ

シン E は臨床応用可能な抗生物質であると期待さ

シン E の抗菌活性が抑制されたこと，さらに，ラれ，現在初期検討を行っている。

イソシン E とメナキノンを混合すると白濁が認められたことから，ライソシン E はメナキノンそのまとめものと直接相互作用すると考えられた。そこで，多剤耐性菌に対して有効な抗菌薬の開発は非常それらの相互作用についてマイクロカロリメトに重要な課題となっているが，現在の製薬会社のリーを用いて定量的に解析したところ，1 : 1 で相パイプライン上にある化合物は，既存薬の改良に互作用すること，及び Kd 値が MIC と比較してもとどまっているものが多く，新しいメカニズムを矛盾しないことが明らかになった。さらに，哺乳もつ新規のクラスの化合物は極めて限られてい動物の電子伝達系の補酵素であるユビキノンとはる。著者らが確立したカイコモデルは，従来の試全く相互作用を示さなかった。このことは，ライ験管内での探索では同定され得なかった，ライソ

ソシン E は細菌に対して高い選択毒性を示す理由

シン E のような新しいメカニズムを有する抗生物を説明している。以上の結果から，ライソシン E質を発見するのに有用であると考えられる。まは，これまでの抗生物質とは全く異なるメカニズ

た，本アッセイ系で同定されたライソシン E につムで抗菌活性を示していることがわかった。

いては，日本発の新規抗生物質の実用化を目指したいと考えている。

8. ライソシン E の治療効果について
ライソシン E はカイコモデルで，0.3 mg/kg とい

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謝辞
本総説は，2016 年 3 月 24 日に学士会館で開催された「メディカル・サイエンスセミナー」の講演内容をまとめたものである。本講演の機会を頂きました理化学研究所の長田裕之先生に改めて感謝申し上げます。また，総説の執筆の機会を頂いた，日本感染症医薬品協会の佐原久世様にも深く感謝申し上げます。
利益相反の開示
開示すべき事項なし。

文献1）CDC: Antibiotic Resistance Threats in theUnited States, 2013. 2013
2）ITO, T.: Nutritive values of carbohydrates for thesilkworm, Bombyx mori. Nature 187: 527, 1960
3）HAMAMOTO, H.; K. KUROKAWA, C. KAITO, et al.:Quantitative evaluation of the therapeuticeffects of antibiotics using silkworms infectedwith human pathogenic microorganisms.

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E is a new antibiotic that targets menaquinone
in the bacterial membrane. Nature Chem. Biol.
11: 127〜133, 2015

Advantage and issue of silkworm model fordevelopment of anti-infective agents
HIROSHI HAMAMOTO
Teikyo University Institute of Medical Mycology
We established silkworm infection model for developing a novel antibiotic. Silkworm model
has less ethical issues and is low cost compared to mammalian model, thus allow us to use a lotof individuals for screening assay. In addition, we can evaluate therapeutic activity and toxicity ofcandidate samples because silkworm has similar pharmacokinetics as mammals. Using thissystem, we identiﬁed a novel antibiotic named “Lysocin E”. In this review article, we describe
advantages of silkworm model for development of antimicrobial agents.