研究助成業績報告集

第 25 回（2017 年度）バイエル循環器病研究助成『血栓症予防・治療における新しいアプローチ』

公益財団法人循環器病研究振興財団

No

研

＊

目

次 ＊

究

課

題

研 究 者

頁

1

経カテーテル的大動脈弁留置術を施行する重症大動脈弁狭窄症例における新規血栓形成能モニタリングシステムの有用性に関する検討

石井 正将

１

2

血栓性脳梗塞慢性期の機能回復を促進するミクログリア療法の確立

金澤 雅人

９

3

経カテーテル大動脈弁留置術(TAVI）後の経口抗凝固薬療法の確立

川本 尚紀

15

4

心臓マクロファージを基軸とする新規心内血栓形成機序の解明と新規治療標的の検索

藤生 克仁

20

経カテーテル的大動脈弁留置術を施行する重症大動脈弁狭窄症例における新規血栓形成能モニタリングシステムの有用性に関する検討

熊本大学大学院生命科学研究部循環器内科学
京都大学大学院医学研究科社会健康医学系専攻薬剤疫学

石

井 正 将

に測定された圧力曲線の Area under the curve

Ⅰ．緒 言
従来、重症大動脈弁狭窄症に対する侵襲的治療と(AR-AUC,PL-AUC)を測定することで、血栓形成能

しては外科的大動脈弁置換術が主流であり、高齢での定量的評価が可能である。T-TAS を用いた検討で合併症が多く、手術リスクの高い患者は、手術が困

は、von Willebrand disease の診断や重症度評価を難であったが、経カテーテル的大動脈弁留置術

定量的に行えることが示されている(4,5)。よって、（Transcatheter Aortic Valve Implantation; TAVI）

高ずり応力により vWF 高分子量マルチマーが欠損の普及により高リスクの患者でも治療可能となってし、出血傾向を示す重症大動脈弁狭窄症にも十分応きた。しかしながら TAVI 後の出血性合併症は 1 年用可能と考える。当施設においても T-TAS を用いて以内の死亡率の強い関連因子であることが報告され

directており(1)、出血性合併症に対するリスクコントロー

Edoxaban 服用患者の抗凝固能の定量評価としてのルは解決すべき課題である。また重症大動脈弁狭窄有用性(6)や、冠動脈疾患で抗血小板療法を施行して症に合併する消化管出血（Heyde 症候群）は、そのいる患者の抗血小板効果の評価に有用であること

oral

anticoagulant(DOAC) で あ る

原因が大動脈弁狭窄部での高ずり応力により von(7)を報告してきた。また心房細動に対するカテーテ

Willebrand 因子(vWF)高分子量マルチマーが減少

ルアブレーション周術期の出血合併症の予測にして生じる後天性 von Willebrand 症候群であるこ

T-TAS で測定した AR-AUC が有用であること(8)もとが知られており(2,3)、大動脈弁狭窄症自体が出血報告している。以上より、TAVI 周術期の出血合併の高リスクである。そのため、TAVI の周術期並び症の予測に、T-TAS パラメータ（AR-AUC、PL-AUC）に遠隔期の出血性合併症のリスクを評価することがが有用である可能性がある。

重要であるが、いまだモニタリングシステムが確立

さらに上述したように大動脈弁狭窄症では、そのしていないのが現状である。

高ずり応力が出血傾向と関連しているが、ずり応力

近年、動脈硬化病巣を模したマイクロチップ内ににより発現が制御されている mechanosensitive

おける白色血栓形成の過程を動脈もしくは静脈内のathero-microRNA が知られており(9)、大動脈弁狭血流条件下に総合的かつ、定量的に解析する Total

窄症例においてもいくつかの microRNA の発現がThrombus-Formation Analysis System( 以 下 、

上昇ないし低下しており、新規のバイオマーカーや

T-TAS)が登場し、ごく少量の全血で容易に血栓形成治療ターゲットとなる可能性が報告されている(10)。

能を評価することができるようになった。使用する

本研究では、TAVI 施行前後で変動する microRNA

マ イ ク ロ チ ッ プ に は 2 種 類 あ り 、 AR-chipを模索するとともに、造影 CT を Computational(Atheroma chip)はフィブリンと活性化血小板を主

Fluid Dynamics (CFD)の技術を用いてシェアスト

成分とする混合白色血栓の解析、PL-chip (Platelet

レスの解析も行う。すなわち、TAVI 施行前後でのchip)は活性化血小板を主体とする血小板形成の解シェアストレスの変動による microRNA の遺伝子析が可能である。白色血栓の成長速度や安定性を、発現の変化と、T-TAS による血栓形成能および凝固圧力波形により定量評価することが可能で、経時的能の変化との関連を評価する。

1

Ⅱ．対象・方法

定直前にCaCl2 とコーントリプシンインヒビターと【研究デザイン】前向き観察研究 (NCT03248232)

混合させる。そのうち 450μL を flow rate 10μ【対象患者】2017 年 8 月から 2018 年 3 月の間に熊L/min（initial wall shear rate 600 /sec）で流して本大学医学部附属病院に入院して重症大動脈弁狭窄

血栓形成を観察する。回路が閉塞する過程を圧波形症で TAVI を施行した患者を登録した。除外基準はでモニタリングし、経時的に測定された圧力曲線の以下の通り; 同意の得られなかったもの、同意撤回

30 分間の Area under the curve を AR10-AUC30 とのもの、経心尖部アプローチ症例、膠原病、DIC、表す。PL-chip は、1 型コラーゲンが塗布してある

敗血症など重篤な状態。

幅 40μm、深さ 40μm の capillary を 25 本含むマ

【評価項目】

イクロチップである。全血をヒルジン入りの採血管（主要評価項目）に入れ 1 時間静置後、330μL の全血を flow rate 24

TAVI 施行前後での凝固能(AR-chip)および血小板μL/min（initial wall shear rate 2000 /sec）で流し機能(PL-chip)の継時的変化や従来の血小板機能マて血栓形成を観察する。回路が閉塞する過程を圧波ーカーや凝固マーカーとの比較、TAVI 施行前後で形でモニタリングし、経時的に測定された圧力曲線のシェアストレスおよび microRNA の変動と凝固の 10 分間の Area under the curve を PL24-AUC10

能、血小板機能の比較。

と表す。

（副次評価項目）【vWF 高分子量マルチマー解析】

TAVI 術後合併症（1 週間後）
：デバイス不良、主要

保存血漿検体（クエン酸採血）を株式会社 SRL に

血管合併症、出血合併症、新規ペースメーカー植え

委託し、解析を行った。手順は以下の通り。検体を込み術もしくは伝導障害の出現、開胸手術への移行、

SDS で変成処理後、SDS を含んだアガロースゲル

心タンポナーデ、急性腎障害、弁塞栓症、冠動脈閉

内を電気泳動させた。泳動終了後、ゲルを固定し、塞、大動脈破裂直接ゲル上でペルオキシダーゼ標識抗体を反応させ、

TAVI 術後合併症（1 ヶ月後）
：全死亡、心血管死、発色試薬で染色した。Image J にて定量化し、脳梗塞、一過性脳虚血発作、心筋梗塞、急性腎障害、

multimer の割合を正常血漿との比で算出した。

出血合併症、ペースメーカー植え込み術、心不全増【血漿トロンボポエチンの測定】
保存血漿検体を室温に融解後、Abcam Human

悪【患者背景情報の取得】

Thrombopoietin ELISA kit (ab219632)を用いてト背景因子（性別、生年月日、既往歴、家族歴、生活

ロンボポエチンの血漿濃度を ELISA 法にて測定し歴（喫煙、アルコール）、
入院時および退院時内服薬）、た。

心エコーデータ（左室駆出率、左室径、壁厚、大動【CFD 解析】

脈弁弁口面積、圧較差、弁通過速度など）、リスクパ

TAVI 施行前、TAVI 施行 1 週間後の造影 MDCT 画

ラメータ（Logistic Euroscore, EuroscoreⅡ, STS

像を Cardio Flow Design 社に委託して flow, shear

score, Clinical Frailty Scale）をカルテ情報より収

stress の解析を行った。手順は以下の通り。CT 画集した。

像より、大動脈弁位から下行胸部大動脈までの 3D【検体収集】

画像を構築し、ソフトウェア ANSYS Fluent 18.0

TAVI 施行前日、施行 48 時間後、1 週間後、1 ヶ月

を用いて空間を微小な領域の集合（メッシュ）に分後に肘静脈より血液検体を採取し、T-TAS パラメー

割した。CT 撮像時の血圧や経胸壁心臓超音波検査

タ（AR-AUC、PL-AUC）、PT-INR、APTT、血算、で測定した弁通過血流量を設定し、隣接するメッシ

一般生化学を測定した。血漿検体は凍結保存し、後ュ間で質量と運動量を保存させるようにナビエ・ス

日、一括して血漿トロンボポエチン濃度測定、vWF

トークス方程式を近似的に計算し、TAVI 前後での高分子量マルチマー解析、血漿 microRNA のリアル

大動脈弁および大動脈後壁にかかるシェアストレス

タイム RT-PCR 解析を行った。

(WSS: wall shear stress)の収縮期および拡張期に【T-TAS の測定方法】

おける最大値を算出した。

AR-chip は 1 型コラーゲンと組織トロンボプラスチ【microRNA のリアルタイム RT-PCR 測定】

ンが塗布してある幅 300μm、
深さ 80μm の 1 本の保 存 血 漿 検 体 よ り miRNeasy Serum/Plasma

流路である。全血を 3.2%クエン酸採血管に採取。測Advanced Kit (QIAGEN)を用いて microRNA を抽2

出後、cDNA に変換。SYBR green assay を用いてHypertension

18 (85.7)

下記の primer により標的 microRNA の定量化を行

Dyslipidemia

13 (61.9)

った。miR-122-5p (Cat.No./ID MS00003416)、

Coronary artery disease

12 (57.1)

Previous

3 (14.3)

miR-625-5p(Cat.No./ID

MS00033894)

miR-200c-3p(Cat.No./ID

MS00003752) 、

miR-30e-5p(Cat.No./ID

MS00009401)、

myocardial

infarction、

Previous stroke

3 (14.3)

Previous PCI

9 (42.9)

Previous CABG

0 (0)患者背景、検査データ、処方薬剤、手技に関する因Peripheral artery disease

2 (9.5)子を、記述統計の手法を用いて要約する。カテゴリ

Atrial fibrillation

6 (28.6)

ー変数は数と割合、連続変数は中央値と４分位範囲

Chronicを用いて要約する。TAVI 施行前後の経時的観測デ

pulmonary diseaseータに関しては、ウィルコクソンの符号付き順位検

Pulmonary hypertension

定またはフリードマン検定を行い、群間の多重比較

STS score, %8.373 [5.965-10.631]

についてはボンフェローニ法にて補正した。血栓形

Logistic EuroSCORE, %13.57 [9.09-23.20]

成性に及ぼす因子を検討するために、各パラメータ

EuroSCOREⅡ, %3.72 [2.67-4.63]

ーと AR-AUC の相関関係を調べた。欠測データにClinical Frailty Scale

4 [4-4]miR-423-3p (Cat.No./ID MS00004179)は内部コントロールに使用した。
【統計解析】

obstructive

3 (14.3)
3 (14.3)

ついては多重代入法を用いて解析を行った。両側

Laboratory data

5％を有意水準とし、統計ソフト SPSS ver23 を用Crea, mg/dL

1.12 [0.88-1.44]

いた。

Alb, g/dL

3.7 [3.6-4.0]

PT-INR

1.09 [1.01-1.39]

APTT, sec

30.6 [28.4-36.3]

D-dimer, μg/mL

1.70 [0.98-3.20]

Hgb, g/dL

10.8 [9.75-11.8]

Ⅲ．結 果【患者背景】
2017 年 8 月から 2018 年 3 月までの間に熊本大学医学部附属病院に入院し、重症大動脈弁狭窄症で

3

TAVI を施行した連続症例 23 例を登録した。そのう

Plt, x10 /μL

170 [139-212]

ち 2 例は検体採取困難で除外とした。本研究の患者

BNP, pg/mL

357.4 [126.5-534.1]

Echocardiographic parameters

背景を表 1 に示す。年齢は中央値 87 歳で女性は57.1%であった。術前の大動脈弁の平均圧較差の中

Left

央値は48.2mmHg、
弁口面積は0.53 cm2 であった。

fraction, %ventricularejection

61.4 [50.5-65.3]

リスクスコアである EuroSCOREⅡの中央値はAortic valve area, cm20.53 [0.45-0.66]

3.72%、Clinical Frailty Scale の中央値は 4 であっMean

48.2 [37.8-65.4]

た。

pressure

gradient,

mmHg

表１ 患者背景Overall (n=21)
Patient characteristics
Age, years

87.0 [84.0-90.5]

Female12 (57.1)

Max velocity, m/sec

4.57 [4.12-5.20]

Mean velocity, m/sec

3.20 [2.81-3.96]

TRPG, mmHg

26 [23-36]

Aortic regurgitation≥mild

14 (66.7)

Mitral regurgitation≥mild

11 (52.4)

Medication before TAVI

Body surface area, m2

1.43 [1.31-1.57]

Aspirin

17 (81.0)

Body mass index

23.2 [19.9-24.9]

Clopidogrel

7 (33.3)

NYHA class Ⅲ or Ⅳ

6 (28.6)

Prasugrel

1 (4.8)Diabetes

5 (23.8)

DAPT

7 (33.3)

3

Warfarin

3 (14.3)

Echoparameters

after

TAVI

DOACs

3 (14.3)(POD7)

ACE inhibitor / ARB

17 (81.0)

Mean pressure gradient, mmHg

11.3 [9.7-12.9]

β-blockers

5 (23.8)

Max velocity, m/sec

2.45 [2.05-2.63]

CCBs

9 (42.9)

Mean velocity, mmHg

1.54 [1.39-1.63]

Statins

10 (47.6)

Aortic regurgitation≥mild

10 (47.6)

Proton pump inhibitors

17 (81.0)

Mitral regurgitation≥mild

12 (57.1)

Medication after TAVI
【血栓形成能、凝固マーカー、血算の経時的変化】

Aspirin20 (95.2)

Clopidogrel

14 (66.7)

Prasugrel

1 (4.8)DAPT

14 (66.7)

Warfarin

3 (14.3)を認めなかった。
vWF 高分子量マルチマーは術前にDOACs

3 (14.3)

比べ 48 時間後に有意に上昇していたが、1 週間後、ACE inhibitor / ARB

17 (81.0)

1 ヵ月後は有意ではないものの上昇傾向であった。

βblockers

4 (19.0)

APTT は術前に比べ 48 時間後に有意に延長し、1

CCBs

13 (61.9)

ヵ月後には低下していた。D-dimer は術前に比べ 1

statins

10 (47.6)

週間後をピークに上昇し、1 ヵ月後には低下していProton pump inhibitors

19 (90.5)

た。Hgb は術後 48 時間後、1 週間後に比べ、1 ヵ月

血栓形成能に関するパラメータを TAVI 前日、48 時
間後、1 週間後、1 ヵ月後に計測した(図 1）。
AR10-AUC30 は、TAVI 前より 48 時間後に有意に低下し、1 ヵ月後には有意に上昇し、術前と有意差

後に有意に上昇していた。血小板数は 48 時間後に最も低下し、1 週間後、1 ヵ月後には再上昇してい【手技に関する背景因子】

たが、術前に比べると有意に低かった。血漿トロン

表 2 に TAVI の手技に関する背景因子を示す。本研

ボポエチンは術前に比べ 48 時間後、1 ヵ月後に有意究に参加した患者においては全例、経大腿動脈アプに上昇していた。PL24-AUC10、PT-INR は有意なローチであった。経カテーテル的人工弁は、Sapien

変化を認めなかった。

3 23mm, 26mm がそれぞれ 6 例ずつ、Evolut R が23mm 3 例、26mm 2 例、29mm 4 例であった。

表 2 手技に関する背景と術後のエコー所見

Overall (n=21)
Transcatheter valves
Sapien 3
23mm

6 (28.6)26mm

6 (28.6)29mm

0 (0.0)Evolut R
23mm

3 (14.3)

26mm

2 (9.5)29mm

4 (19.0)

ApproachTransfemoral

21 (100)

図 1 T-TAS パラメータ、凝固脳、血算、vWFmultimer、トロン

Transapical0 (0.0)

ボポエチンの経時的変化

4

【CFD 解析によるシェアストレスの変化】【血栓形成能、凝固能、血小板機能と圧較差の比較】

本研究の対象者で腎機能が保たれていた 5 症例(年TAVI 前の血栓形成能、凝固能、血小板機能のパラ

齢 中央値 87 歳)に対して 1 週間後に造影 CT を施メータと圧較差の関連をみるために相関関係を調べ

行し、TAVI 前後で、大動脈弁および上行大動脈にた。AR10-AUC30 は平均および最大圧較差と中等

かかる wall shear stress (WSS)を解析した(図 2)。

度 の 逆 相 関 を 認 め た (r=-0.47, -0.48) 。 一 方 、大動脈弁尖および大動脈後壁に上昇を認めていた

PL24-AUC10、血小板数、vWFmultimer と圧較差

WSS の最大値は、TAVI 後に有意に低下した。

は有意な相関を認めなかった。

図 2 TAVI 前後でのシェアストレスの変化【microRNA の発現】既報(10)では microRNA-200c-3p がコントロールと比較し上昇し、microRNA-122-5p, 30e-5p, 625-5pが低下することが知られている。本研究ではいずれも有意差は認めなかったものの、miR200c-3p は経時的に低下傾向であった。

図 4 血栓形成能パラメータと圧較差の相関【TAVI 術後アウトカム】
TAVI 術後の心エコーのパラメータと術後アウトカ
ムを以下に示す(図 5、
表 3)。
図5 に示すとおり、
TAVI
術前に比べて術後に有意に平均および最大流速、圧較差は低下した。7 日以内の主要血管合併症は 2 例(9.5%)、出血合併症は 1 例(4.8%)、心タンポナーデ
は 1 例(4.8%)であった。30 日以内の全死亡は 2 例(9.5%)、
心血管死は1 例(4.8%)、
脳梗塞は1 例(4.8%)、
恒久的ペースメーカー植え込み術は 1 例(4.8%)、心図 3 TAVI 周術期の microRNA の経時的変化

不全増悪は 3 例(14.3%)であった。

5

Ⅳ．考 察本研究では、TAVI 施行前後で変動する血栓形成
能を T-TAS や vWF 高分子量 multimer、既存の血算や凝固能の指標で評価し、そのメカニズムとしてCFD によるシェアストレスの変化と microRNA の遺伝子発現の変化を評価した。
重症大動脈弁狭窄症には、その狭窄部での高ずり応力により vWF 高分子量マルチマーが減少し、易出血性を示すが(2,3)、TAVI によって狭窄が解除されると vWF 高分子量マルチマーおよび血小板機能（アデノシン二リン酸による閉鎖時間：CT-ADP）が弁留置直後から正常化することが報告されている(11)。しかし、経大腿アプローチによる TAVI 周術期の 30 日以内主要出血合併症の割合は、11.3%であり、外科的大動脈弁留置術(30 日以内の主要出血合併症 22.7%)に比較して少ないものの(1)、経皮的冠動脈インターベンションと比較すると高い(12)。すなわち、TAVI によって狭窄部が解除され、速やか

図 5 TAVI 前後での心エコーパラメータの変化に vWF 高分子量 multimer や CT-ADP で評価される血小板機能が改善しているにも関わらず、周術期

表 3 7 日、30 日以内のアウトカム発生の出血合併症が多いことは、その他に周術期の易出

Overall (n=21)

血性に影響を与える要因があると思われる。

7-day events

AR10-AUC30 は、カテーテルアブレーション周術

Devise unsuccess

0 (0.0)Major vascular complication

2 (9.5)

Bleeding complication

1 (4.8)

New PMI / conduction disorder

9 (42.9)

血栓形成能が低下し、TAVI 術後の易出血性を反映

Conversion to open surgery

0 (0.0)

していると考えられるが、出血合併症の発症割合がCardiac tamponade

1 (4.8)

少なく、AR10-AUC30 との関連を検討するには至Acute kidney injury

0 (0.0)らなかった。AR10-AUC30 はフィブリンと活性化

Valve embolization

0 (0.0)

血小板を主成分とする混合白色血栓の解析に用い、

Coronary obstruction

0 (0.0)

それに用いているshear rateは大動脈の壁シェアス

Aortic rupture

0 (0.0)トレスを反映しており、一方、PL24-AUC10 は活期の出血合併症の予測に有用であることが示されているが(8)、本研究でも TAVI 後 48 時間後、1 週間
後は、
術前や 1 ヵ月後に比べて有意に低下しており、性化血小板を主体とする血小板形成の解析に用い、30-day events
All-cause death

2 (9.5)細小血管の壁シェアストレスを反映する。本研究でCardiovascular death

1 (4.8)は、PL24-AUC10 は術前より低値であり、術後のStroke1 (4.8)

経時的な有意な変化は認めなかったが、これは抗血TIA

0 (0.0)

小板薬の服用や血小板数の低下によりMyocardial infarction

0 (0.0)

Acute kidney injury

0 (0.0)Bleeding, life-threatening

0 (0.0)Bleeding, major

0 (0.0)

Pacemaker implantation

1 (4.8)Worsening heart failure

3 (14.3)

PL24-AUC10 が低下するため、floor 効果で TAVI
介入による血小板血栓の形成能の変化を捉えられなかったことや TAVI で介入する大動脈弁とその近傍の大動脈の変化が、細小血管の生理的条件が反映されている PL24-AUC10 では評価しにくいことなどが考えられる。

6最近、TAVI 後の血小板数減少についていくつか改善したにも関わらず、総合的な血栓形成能および報告されており(13-15)、血小板数は TAVI 後 2-4 日

血小板数が有意に低下していた。AR10-AUC30 低

後に最も低下し、重症で 5 万-10 万/μL まで低下す

下は出血合併症の予測に有用であることから TAVI

ることがわかっている。またこの重症な血小板減少においても有用である可能性があり、今後、さらなが主要な血管合併症や出血合併症、1 年後の全死亡る検討が必要である。

の独立した予測因子であることが報告されている(14,15)。本研究でも TAVI 前の 17 万/μL より 48

Ⅵ．研究協力者

時間後に有意に血小板数は低下し、中央値 9.4 万/辻田賢一 熊本大学大学院生命科学研究部・循環器

μL であった。その後、1 ヵ月後には 14.4 万/μL で内科教授

改善するものの、TAVI 前よりは有意に低下してい海北幸一 熊本大学大学院生命科学研究部・循環器

た。血小板減少の一般的な原因として血小板の消耗

内科准教授の亢進、生産の減少、輸血などによる希釈性などが老松優 熊本大学医学部附属病院循環器内科・医員あるが(15)、TAVI では他の PCI などの血管内治療

満瀬達郎 熊本大学医学部附属病院循環器内科・医よりも術後の血小板減少の頻度が多く、詳細な作用

員機序については不明である。本研究では血小板の前駆細胞の分化・増殖に関与するトロンボポエチンのⅦ．参考文献

血漿濃度を測定し、術前より術後に有意に上昇して、

1.

Genereux P, Cohen DJ, Williams MR et

血小板産生の反応を認めた。しかしながら、それで

al. Bleeding complications after surgical

も血小板数が低下していたことは、反応性の血小板

aortic valve replacement compared with

産生が相対的には低下していることや血小板の消費

transcatheter aortic valve replacement:

が産生を上回っていることが推察され、さらに詳細

insights from the PARTNER I Trial

な機序の解明が必要である。

(Placement

ofAorticTranscatheter

Valve). Journal of the American College

本研究では、TAVI 前後のシェアストレスの変化

of Cardiology 2014;63:1100-9.

を評価するために数値流体解析(computational
fluid dynamics, CFD)を行った。CFD では、患者ご

2.

Loscalzo J. From clinical observation toとの造影 CT から 3 次元形状を構築し、そのモデル

mechanism--Heyde's

における血流の様相をコンピューターを用いて流体

New

シミュレーションで再現して解析を行う(16,17)。患

2012;367:1954-6.

者ごとの造影 CT の他にも心エコーによって計測し3.

Englandsyndrome.

journalofThe

medicine

Vincentelli A, Susen S, Le Tourneau T et

た心拍出量や弁口面積など患者条件や生理的条件を

al. Acquired von Willebrand syndrome in

加味した上で解析を行い、できるだけ生体内の状況

aortic stenosis. The New England journalに近づけている。本研究では TAVI 前後でシェアス

of medicine 2003;349:343-9.
4.

トレスが変動する箇所として大動脈弁や上行大動脈

Daidone V, Barbon G, Cattini MG et al.

の後壁であること、またそれを定量的に評価するこUsefulnessとができた。シェアストレスの改善は vWF 高分子

Thrombus-Formation Analysis System

量 multimer の改善に寄与していると思われるが、(T-TAS)

本研究で調べた microRNA では、TAVI 前後で低下

characterization

傾向を示したものがあるものの有意差は認めなかっ

disease. Haemophilia : the official journal

た。microRNA の発現調整には、シェアストレス以of the World Federation of Hemophilia

外の要因があることやサンプルサイズが少なかった

2016;22:949-956.
5.

こともあるため、今後、さらに症例数を増やしての

of
in

the
of

the

Total

diagnosisvonandWillebrandNogami K, Ogiwara K, Yada K et al.
Assessing the clinical severity of type 1

検討が必要である。

von Willebrand disease patients with amicrochip flow-chamber system. Journal

Ⅴ．結 論
本研究では、TAVI48 時間後に vWFmultimer はof thrombosis and haemostasis : JTH

7

2016;14:667-74.
6.

et al. The causes of thrombocytopenia

novel quantitative assessment of wholeafter

blood thrombogenicity in patients treatedimplantation.

with a non-vitamin K oral anticoagulant.

2017;156:39-44.

journalofcardiology

14.

pre-existing

Assessment

thrombocytopenia

platelet-derived
with

the

total

clinical

impactandofacquiredfollowingtranscatheter aortic valve replacement.

coronary

patients

interventions : official journal of thereceiving antiplatelet therapy. Journal ofSociety for Cardiac Angiography &thrombosis and haemostasis : JTH

Interventions 2015;85:118-29.

arterydisease15.

andcardiovascular

Dvir D, Genereux P, Barbash IM et al.

Ito M, Kaikita K, Sueta D et al. Total

AcquiredThrombus-Formation Analysis Systemtranscatheter aortic valve replacement:(T-TAS)

clinical correlates and association withCan Predict Periproceduralthrombocytopenia

Bleeding Events in Patients Undergoingoutcomes.

Catheter Ablation for Atrial Fibrillation.

2014;35:2663-71.

of

the

American

16.

Heart

European

heart

after

journal

Numata S, Itatani K, Kanda K et al.

Association 2016;5.

Blood flow analysis of the aortic arch

Kumar S, Kim CW, Simmons RD, Jo H.

using computational fluid dynamics.

Role of flow-sensitive microRNAs in

Europeanendothelial

andsurgery : official journal of the European

mechanosensitive

Association for Cardio-thoracic Surgery

dysfunction

athero-miRs. Arteriosclerosis, thrombosis,

journalofcardio-thoracic

2016;49:1578-85.
17.

and vascular biology 2014;34:2206-16.

Miyazaki S, Itatani K, Furusawa T et al.

Coffey S, Williams MJ, Phillips LV,

Validation

Galvin IF, Bunton RW, Jones GT.

methods in aortic arch using 4D Flow

Integrated microRNA and messenger

MRI.

RNA analysis in aortic stenosis. Scientific2017;32:1032-1044.

reports 2016;6:36904.
Van Belle E, Rauch A, Vincentelli A et al.
Von Willebrand factor as a biologicalsensor

of

blood

flow

to

monitorpercutaneous aortic valve interventions.
Circulation research 2015;116:1193-201.
12.

and

Catheterization

atherosclerosis:

11.

research

thrombus-formation analysis system in

Journal

10.

valve

Flaherty MP, Mohsen A, Moore JBt et al.

Arima Y, Kaikita K, Ishii M et al.
ofaorticThrombosis

Predictors

2016;14:850-9.

9.

transcatheter

2015;197:98-100.

thrombogenicity

8.

Mitrosz M, Kazimierczyk R, Sobkowicz B

Sueta D, Kaikita K, Okamoto N et al. A

International
7.

13.

Oimatsu Y, Kaikita K, Ishii M et al. Total
Thrombus-formation Analysis System
Predicts Periprocedural Bleeding EventsinPatients

DiseaseWith

Coronary

Undergoing

ArteryPercutaneousCoronary Intervention. Journal of theAmerican Heart Association 2017;6.

8

ofnumerical

Heart

and

simulation
vessels

血栓性脳梗塞慢性期の機能回復を促進する
ミクログリア療法の確立

新潟大学脳研究所神経内科分野・講師

金 澤 雅 人Ⅰ．緒 言

以上の状況を踏まえ，我々はミクログリアを用いた

脳梗塞に対する治療は，急性期の閉塞動脈の再灌流

新しい細胞療法について検討を行った．ミクログリア

療法と，慢性期の再発予防療法および機能回復を目指に着目した理由は，1. VEGF，トランスフォーミング

した治療に大別される．再灌流療法として，血栓溶解

増殖因子(TGF)-，マトリックス・メタロプロテアー療法が行われおり，著者らは，これまで再灌流療法にゼ(MMP)-9 といったリモデリング因子の分泌源とな伴う出血合併症を抑制し，その治療適応患者の増加をること，2. 脳梗塞後に病変辺縁に集まる性質がある

目指す研究を行ってきた 1-4)．一方，慢性期の治療としこと 14,15)，3. M2 ミクログリアという保護的な性質をての機能回復を目指したリハビリテーションでは，半持つタイプも存在する 16,17)ため，より効果が期待でき数が障害を残し 5)，他に有効な後遺症改善を促進するるためである．検討の結果，薬剤を使用せず，適度の治療もないため，新しい治療の開発が期待されている．

低酸素低糖刺激(OGD)により，ミクログリアを M2 化

脳梗塞の機能回復を目指す戦略のひとつとして，梗

できること，そしてラット tMCAO モデルにおいて，塞部位の血管新生を促進させるという考えがある 6)．

そのミクログリアを亜急性期に投与することで，機能血管新生を促進させる成長因子（血管・組織リモデリ

予後を改善できることを明らかにした(図１)18)．今回，ング因子)の一つとして，血管内皮増殖因子(VEGF)がこの技術をさらに簡便な臨床応用とするため，これまあり，VEGF の全身投与で，血管新生と機能予後の改で仔マウスから得ていたミクログリアを成体脳から

善がラット一過性局所脳虚血(tMCAO)モデルで示さ単離できるかを検討した．さらに，細胞保護効果につれている 7)．しかし，VEGF は全身投与により，低血いてOGDが低酸素あるいは低糖刺激より有効である

圧・頻脈の副作用 8)や，急性期では脳浮腫・出血合併かどうかを検討し，脳梗塞後の機能回復を目指したが生じうる 7)．また，脳には血液脳関門(BBB)がある

OGD 刺激後の M2 ミクログリア細胞療法の確立につため，特に蛋白製剤は脳内に届かず，作用しない恐れ

いて，検討した．

もある．そのため，血管新生を促進する治療には，副作用がなく，脳内に有効に到達する手法の開発が求められる．
近年，脳梗塞の亜急性期以降に，複数の治療標的に作用する多面的な保護効果を期待する幹細胞療法がいくつか報告されてきた 9-13)．代表的な細胞として骨髄由来間葉系幹細胞があり，細胞投与後，脳梗塞病変部において VEGF などの成長因子を分泌し，血管新生を促進することで機能を回復させる 12,13)方法であ

図 1 M2 ミクログリア投与による脳梗塞後の機能回復

る．効果が期待される治療法である一方，骨髄由来のM2 ミクログリア（micro）を投与した群は，OGD 刺激アストロサイト細胞を用いるため，脳梗塞後の抗血小板療法，抗凝固群（細胞対照群，astro）（## P<0.01）と非細胞治療介入群（no cell,

療法下で採取が困難であること，十分な細胞数を得る**P<0.01）と比べて，コーナーテストによる評価で，虚血 28 日後にため専用の細胞調整センター(CPC)を要することな機能を回復した．

どが，臨床応用の普及の妨げになっている．

9

単離したミクログリアはポリ-D-リジン 10μg/mL

Ⅱ．対象・方法

でコーティングした 6 穴プレートに 1×106 cells/well

１． 動物実験モデル
本研究は，新潟大学動物実験倫理委員会及び新潟大で播き，一晩インキュベートした．

学倫理委員会の承認を受け，新潟大学動物実験指針と研究に関する倫理指針に従って実施した．オス 8 週令

３． 末梢血単核球分画分離

Sprague-Dawley ラット（体重 300～370g）
を用いて，ミクログリアに類似した単球/マクロファージを含1.0％イソフルレン，笑気 70％，酸素 30％で麻酔維持有する単核球を分離するため，ヒト健常ボランティア

し，手術を実施した．

から末梢血 50mL を採血し，Ficoll による分離を行っ

一過性局所脳虚血は Koizumi のモデルを用い 19)，

た．GE ヘルスケアジャパン Ficoll-Paque Premium

左中大脳動脈閉塞により 90 分間の局所脳虚血を負荷

1.084 のデータシートに従い，分離した．

した．手術用顕微鏡の直視下に前頚部を正中切開後，４.

左総頸動脈・外頸動脈・内頸動脈を露出し，外頸動脈を 3-0 絹糸で結紮し，断端を切断した．その後，外頸細胞染色

ミクログリアの染色では，メタノールで固定後，動脈断端を切開し，ここよりナイロン糸の先端にシリ

FITC-conjugated マウス・モノクローナル抗 CD11b

コンコーティーングを施して，直径 0.35mm とした抗体（Abcam，1:100）を用いて，4℃で一晩反応させ塞栓糸を挿入し，左内頸動脈から中大脳動脈起始部にた．その後，DAPI で核染色を行い，全 DAPI 陽性中留置した．90 分後に塞栓糸を 15mm 引き抜き，中大の CD11b 陽性細胞数を 400 倍にて検鏡，計測した．

脳動脈の閉塞を解除した．このモデルは，虚血中心と５．Oxygen-Glucose Deprivation（OGD）

その辺縁の虚血性ペナンブラを再現性よく作製できることが報告されている 20).

初代培養細胞を低酸素・低グルコース(OGD)条件に晒すことで，
生体内での虚血状態を再現した．
OGD の

虚血中は直腸温をモニターし，常温群は体温調節マ
ットと温熱ランプにて 37.0±0.5℃に維持した．

標準的な条件は，Milner らの方法に従った 21)．OGD
を負荷する前に，血清入り培養液を除き，リン酸緩衝液で 2 回洗浄した．その後，無血清培地（4mM L-グ

２． 初代ミクログリア細胞培養
初代ミクログリアの培養に ，生後 0~1 日のルタミン, ペリシリン, ストレプトマイシン, N1 培地

C57/BL6 マウス新生児の大脳皮質を用いた 18,21)．細を含む DMEM）を添加した．この時，コントロール

かく刻んだ大脳皮質をパパイン溶液(Worthington

群には高グルコース（4.5mg/L）培地，OGD 群には低Biochemical Corporation)で，37℃30 分間インキュベ

グルコース（1.0mg/L）培地を使用した．OGD 群は低ートした後，300×g で 5 分間遠心し，細胞ペレットをグルコース培地に置換後，低酸素チャンバーに入れ，回収した．そこに 10%ウシ胎児血清を加えたダルベ

1 時間チャンバー内に 5%二酸化炭素 95%窒素の混合

ッコ改変イーグル培地(DMEM）（(D6546, Sigma

ガスを流し続けた．1 時間後，チャンバーを完全に密Aldrich)を添加し，ポリ-D-リジン 5μg/mL でコーテ

封し，37℃で 18 時間および 24 時間インキュベート

ィングしたフラスコに細胞を播き，14 日間培養した．

した．この方法により，チャンバー内の酸素は培養 14 日目，フラスコを 130rpm で 15 分間振動さ

0.1~0.4%となった 18)．コントロール群は，高グルコー

せ，培養上清中に剥がれてきた細胞をミクログリアとス培地，ルームエアーに（21％酸素）5%二酸化炭素，

した．この手法により得られたミクログリアの純度はを加え，培養した（Normoxia 群）．

99%であることがフローサイトメトリー解析により示されている 21)．

６． 乳酸脱水素酵素（LDH）アッセイ

脳虚血 3 日後から，脳虚血病変周囲にミクログリア

OGD 後 の 細 胞 死 を 調 べ る た め に lactateが集簇することを報告している 4)．成体脳梗塞ラット

dehydrogenase(LDH)アッセイを行った 18)．LDH はからのミクログリアの単離では，この脳虚血 3 日後の細胞質に存在し，通常は細胞膜を通過しないが，細胞

大脳皮質を分離し，以下細かく刻んだ大脳皮質をパパが傷害を受けることで細胞外に放出される酵素であイン溶液で培養し，遠心処理を行い，培養 14 日目，る．この LDH の性質を利用して，培養上清と細胞内130rpm で 15 分間，フラスコを振動させ，ミクログに含まれる LDH 量を 100%とした時の，培養上清にリアを単離した．

放出されたLDH 量を測定し，細胞傷害率を算出した．

10

LDH アッセイキット(Roche Diagnostics GmbH)を同様に，OGD 刺激後も，成体ラット由来のミクログ用いて，添付の説明書に従い測定を行った．

リアは，仔マウス由来の細胞より有意に細胞死が増加していた（P<0.01）（図２）．

７． ウェスタンブロット法
ビシンコニン酸法にて，蛋白量を 5 g に調整したサンプルを Tris-glycine SDS-PAGE にて電気泳動した 1-3)．その後，PVDF 膜に転写し，5%スキムミルクと 0.1% Tween-20 でブロッキングした．1 次抗体はラビット・ポリクローナル抗 VEGF 抗体（Santa Cruz，
1:200）を用いて，4℃で一晩反応させた．リン酸バッ

図２ 仔マウスと成体脳梗塞ラット由来ミクログリアの OGD 刺激後

ファーで洗浄後，horseradish peroxidase (HRP)標識の細胞障害度（**：P<0.01）

抗ラビット 2 次抗体を室温で 1 時間反応させ，OGD 刺激後の保護的サイトカイン VEGF

Chemiluminescent HRP 基質(GE ヘルスケアジャパ

３．

ン )にて目的とする蛋白バンドを検出した．内部コン分泌トロールとして，アクチン，トランスフェリンを用い

OGD 刺激後の培養上精を用い，VEGF のウエスタン

た．

ブロットを行ったところ，OGD 刺激によって，仔マ
ウス由来・成体ラット由来のミクログリアどちらも
VEGF の分泌量が増加した．また，OGD 刺激後の８． 統計解析

VEGF 分泌量に関して，
仔マウス由来と成体ラット由

数値の解析には one-way ANOVA 法および two-

来では，差を認めなかった（図３）．

way ANOVA 法を，頻度の解析には Fisher 法を用いた．全ての検定において，確立値(p)が 0.05 未満のものについて有意差ありとした．結果は平均値±標準誤差で示した．

Ⅲ．結 果
１． 成体脳梗塞ラットからのミクログリアの単離
これまで，仔マウス脳からミクログリアを単離していたが，未検討であった成体脳梗塞ラットからミクログリアを単離することができれば，ヒトの疾患脳から

図３ 仔マウスと成体脳梗塞ラット由来ミクログリアの OGD 刺激後も単離が可能となる．脳虚血 3 日後のラットから，プの VEGF 分泌量

ロトコールに従い，ミクログリアを単離した．その後，
OGD 刺激は，低酸素刺激，低糖刺激よりもミクログリアのマーカーCD11b で細胞染色を行った．

４．

結果，99％以上の細胞が，CD11b 陽性細胞であった．

勝る保護効果を示す可能性がある
OGD 刺激は，ミクログリアを保護的な M2 分画に

２． 仔マウスと成体脳梗塞ラットから単離した

極性を変えることを我々は報告している．この刺激効

ミクログリアの OGD 刺激の違い

果が，低酸素刺激，低糖刺激より勝る相乗効果がある

一般的に，初代細胞培養では，胎児や仔由来の細胞かを検討するため，低糖刺激として，培地を低グルコを用いる．成体脳から得た細胞との，viability を比較ース濃度に変えて，
低酸素刺激を行わなかった群（GDするため，OGD 後 LDH アッセイにて評価した．

群），低酸素刺激として，培地は変更せず，チャンバー

OGD 刺激前の O2 21%，高グルコース濃度の状態

内で低酸素に置換した群（OD 群），OGD 刺激を行っでも，成体ラット由来のミクログリアでは，仔マウスた群，通常の糖濃度培地で，O2 21％で培養した群由来の細胞より半数以上が細胞死を認めた（P<0.01）．

（Nor 群）の 4 群を用いて，ミクログリアに類似した

11

単球/マクロファージを含む末梢血中単核球を用い，いると考える．その刺激効果は，VEGF 誘導に関して

刺激後の培地中の VEGF のウエスタンブロットを行

は，低糖刺激が強力であった．しかし，GD よりもった（図４）．OGD 群は，Nor 群と比べて，VEGF 分

OGD 刺激により，より VEGF が誘導され，刺激時間

泌量が増加していた（P<0.01）．また，GD 群は Norの検討が必要であるものの，短時間で細胞調整が行え群と比べて VEGF 分泌量が増加しているものの，有る点からは，OGD の刺激が最適である．

意差はなく（P=0.059），OD 群も Nor 群と違いなかミクログリアのみらなず，末梢血由来単核球でも，OGD 刺激で，保護的な増殖因子 VEGF の誘導を確認った．

できた．臨床応用を目指す点で，末梢血由来の細胞を用いることはとても簡便で，有益である．現在，ミクログリアのみならず，ミクログリアに性質の類似した末梢血由来の細胞成分による脳梗塞治療の可能性を検討を開始した．
Ⅴ．結 論
図４ 低酸素低糖刺激（OGD），低糖刺激（GD），低酸素刺激（OD）と成体脳梗塞ラット由来の細胞でもミクログリアを

通常酸素通常糖刺激（Nor）後の培地中の VEGF 発現のウエスタンブ

OGD 刺激により保護的な分画に変えることができる．

ロット

また OGD 刺激は，短時間で VEGF 分泌に十分な刺激を与えることができる．

Ⅳ．考 察
臨床応用を目指したとき，ミクログリアをいかに得

Ⅵ．研究協力者

るかが重要である．これまでは，仔マウス由来の細胞

下畑享良・岐阜大学医学部神経内科/老年科・教授を単離していたが，成体脳梗塞ラットから採取するこ

高橋哲哉・西新潟中央病院神経内科・医長とができれば，治療応用の可能性が広がる．今回，仔

畠山公大・新潟大学脳研究所神経内科・大学院生

マウス由来のミクログリアの単離プトロコールに従二宮格・新潟大学脳研究所神経内科・大学院生

い，成体脳梗塞ラットから，CD11b 陽性ミクログリ

小野寺理・新潟大学脳研究所神経内科・教授

アを単離できることがわかった．しかし，成体脳梗塞

尾前薫・臨床研究情報センター・専門職

ラットから採取した細胞は，仔マウス由来の細胞と比木村泰子・臨床研究情報センター・専門職

べて，viability が低下する可能性があることもわかった．ウエスタンブロットの結果では，仔マウス由来

Ⅶ．参考文献と成体ラット由来のミクログリアの OGD 刺激後の

1)

Kanazawa M, Igarashi H, Kawamura K, et al.

VEGF 分泌量は，違いがなかった．しかし，成体ラッInhibition

ト由来では死細胞が増加する（図 2）影響もあるのか

attenuates hemorrhage after tPA treatment. J

of

VEGF

signaling

pathway

Cereb Blood Flow Metab 2011; 31: 1461–1474.

もしれない．今後，成体ラット由来のミクログリア投2)

与による，脳梗塞治療の効果の検証が必要である．まKawamura K, Takahashi T, Kanazawa M, et

た，脳梗塞後のミクログリアの極性は，日単位でダイ

al. Effects of angiopoietin-1 on hemorrhagic

ナミックに変化することが示されている 17,22)．どの時

transformation and cerebral edema after

点で，ミクログリアを得るかによっても，治療結果がtissue plasminogen activator treatment for

変化する可能性は十分にあり，経時変化の検討も必要

ischemic stroke in rats. PLoS One 2014; 9:である．また、ES 細胞や iPS 細胞からもミクログリ

e98639.
3)ア様細胞，ミクログリアに分化できることが，近年示

Kanazawa M, Kawamura K, Takahashi T, et

された 23,)．このような幹細胞からミクログリアに分

al. Multiple therapeutic effects of progranulin

化誘導し，治療効果を検討することも臨床応用につな

on experimental acute ischaemic stroke. Brain

がるかもしれない．

2015; 138: 1932–1948.

OGD 刺激は，GD や OD と比べて，保護的な成長

4)

因子 VEGF を誘導することから，治療応用に適して

Kanazawa M, Takahashi T, Nishizawa M, et al.
Therapeutic

12

strategies

toattenuatetissueenhances neurogenesis via angiogenesis in aplasminogen activator treatment for acutemouse model. J Clin Invest 2004; 114: 330–338.

ischemic stroke. J Atheroscler Thromb 2017;14) Imai F, Suzuki H, Oda J, et al. Neuroprotective

hemorrhagic

5)transformation

after

24: 240–253.

effect of exogenous microglia in global brain

Winstein CJ, Stein J, Arena R, et al.; American

ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 2007; 27:
488–500.

Heart Association Stroke Council, Council on
Cardiovascular and Stroke Nursing, Council15) Wattananit S, Tornero D, Graubardt N, et al.

on Clinical Cardiology, and Council on Quality

Monocyte-derived macrophages contribute toof Care and Outcomes Research. Guidelines for

spontaneous long-term functional recovery

Adult Stroke Rehabilitation and Recovery: A

after stroke in mice. J Neurosci 2016; 36: 4182–

guideline for healthcare professionals from the4195.
16) Hu X, Li P, Guo Y, et al. Microglia/macrophage

American Heart Association/American Stroke
6)

Association. Stroke 2016; 47: e98–169.

polarization dynamics reveal novel mechanism

Arai K, Jin G, Navaratna D, et al.. Brainof injury expansion after focal cerebral

angiogenesisindevelopmental

ischemia. Stroke 2012; 43: 3063–3070.

and17) Perego C, Fumagalli S, De Simoni MG.

pathological processes: neurovascular injury

7)and angiogenic recovery after stroke. FEBS J

Temporal2009; 276: 4644–4652.

colocalization

Zhang ZG, Zhang L, Jiang Q, et al. VEGF

phenotype markers following brain ischemicenhances angiogenesis and promotes blood-

injury in mice. J Neuroinflammation 2011; 8,

brain barrier leakage in the ischemic brain. J

174.

expression

andmicroglia/macrophage

Yang R, Thomas GR, Bunting S, et al. Effects

Microglia preconditioned by oxygen-glucoseof the vascular endothelial growth factor on

deprivation promote functional recovery inhemodynamics and cardiac performance. J

ischemic rats. Sci Rep 2017; 7: 42582.
19) Koizumi J, Yoshida Y, Nakazawa T, et al.

Cardiovasc Pharmacol 1996; 27: 838–844.
9)

of

of

18) Kanazawa M, Miura M, Toriyabe M, et al.

Clin Invest 2000; 106: 829–838.
8)pattern

Honmou O, Houkin K, Matsunaga T, et al..

Experimental studies of ischemic brain edema.

Intravenous administration of auto serum-

1. A new experimental model of cerebral

expanded autologous mesenchymal stem cells

embolism in rats in which recirculation can bein stroke. Brain 2011; 134: 1790–1807.

introduced in the ischemic area. Japan J.
Stroke 1986; 8: 1–8.

10) Taguchi A, Sakai C, Soma T, et al. Intravenous20) Memezawa H, Smith ML,

Autologous Bone Marrow Mononuclear Cell

SiesjoBK.

Transplantation for Stroke: Phase1/2a Clinical

Penumbral tissues salvaged by reperfusion

Trial in a Homogeneous Group of Stroke

following middle cerebral artery occlusion in

Patients. Stem Cells Dev 2015; 24: 2207–2218.

rats. Stroke 1992; 23: 552-559.

11) Ishizaka S, Horie N, Satoh K, et al. Intra-21) Milner R, Hung S, Wang X, et al. Responses ofarterial cell transplantation provides timing-

endothelial cell and astrocyte matrix-integrin

dependent cell distribution and functional

receptors to ischemia mimic those observed inrecovery after stroke. Stroke 2013; 44: 720–726.

the neurovascular unit. Stroke 2008; 39: 191–

12) Andres RH, Horie N, Slikker W, et al. Human

197.

neural stem cells enhance structural plasticity

22) Kanazawa M, Ninomiya I, Hatakeyama M, etand axonal transport in the ischaemic brain.

al. Microglia and monocytes/macrophages

Brain 2011; 134: 1777–1789.

polarization

13) Taguchi

A, SomaT,

TanakaH, etal.

revealnovel

therapeuticmechanism against stroke. Int J Mol Sci

Administration of CD34+ cells after stroke

2017;18: E2135.

1323) Muffat J, Li Y, Yuan B, et al. Efficientderivation of microglia-like cells from humanpluripotent stem cells. Nat. Med. 2016, 22,
1358–1367.

14

経 カ テ ー テ ル 大 動 脈 弁 留 置 術 (TAVI)後の経口抗凝固薬療法の確立
国立循環器病研究センター・心臓外科医師

川 本 尚 紀Ⅰ．緒言えられる。そこで、本研究では、経カテーテル的大経カテーテル的大動脈弁留置術（TAVI）は、超高動脈弁留置術（TAVI）施行後の抗血小板・抗凝固療

齢など高リスクを有する重度大動脈弁狭窄症に対す法として、経口抗凝固薬療法の安全性と有効性を抗る画期的な治療として急速に普及しつつある。その血小板療法単独療法と比較することで検証する。ま中で、TVAI 人工弁置換に伴う血栓形成とそれに伴うた、同時に、止血関連因子の変化を定量的に測定す

塞栓性合併症、そしてそれに対する抗血小板療法・ることで、TAVI 術後の血栓・出血性合併症に関わる

抗凝固療法に伴う出血性合併症が大きな課題となっrisk 因子を探索することを目的とする。

ている。現行の欧米のガイドラインでは、TAVI 施行
後早期には、抗血小板剤二剤併用療法(DAPT)を施行

Ⅱ．対象・方法し、その後、抗血小板剤単剤（アスピリンもしくは本研究は、レジストリデータを用いた観察研究であチエノピリジン系薬物）投与を推奨している（参考り、経カテーテル的大動脈弁置換術関連学会協議会

文献 1）が、DAPT 投与群で単剤投与群に比べて有意の TAVI registry のデータベースを用いて、今までに出血性合併症が多いという報告もあり（参考文献に日本で行われている TAVI 術後の抗血小板療法、
抗2,3）、まだ十分に確立されているとは言い難い。一

凝固療法の現状について調査し、抗凝固療法併用群

方、ワルファリンもしくは直接作用型経口抗凝固薬と抗血小板療法単独群での心機能の推移、血行動態(DOAC)を用いた抗凝固療法が、TAVI に関連した血栓の変化、合併症の頻度、予後について統計学的解析

弁に対して有効であったという報告もあり（参考文を加え比較検討する。合併症の評価に関しては

献 4,5）、TAVI 術後早期から遠隔期における経口抗凝VARC-2（参考文献７）に基づいて評価する。また、固薬療法の有用性が示唆されている。

抗凝固療法併用群での虚血性もしくは出血性合併症

当院では 2011 年に TAVI を導入し、以降 200 例以を起こす risk 因子を抽出する。同様に、抗血小板療

上の TAVI を施行してきた。当初は、ガイドラインに

法単独群での虚血性もしくは出血性合併症を起こす

従い DAPT を施行したものの、脳出血など重篤な出血risk 因子を抽出する。

性合併症が見られたため、現在では clopidogrel 単

また、 TAVI registry データベースを使用出来ない剤による術後抗血小板療法を施行している。現時点場合は、2011 年 12 月から 2017 年 12 月までの当セ

では、本治療による出血性・血栓性合併症を認めてンターにおいてTAVIを施行された277例の患者に対いないものの、TAVI 成績の向上のためには、より高して、同様の解析を施行する。
具体的には2011 年 12 月以降に大動脈弁狭窄症

いエビデンスのもとに術後抗血小板・抗凝固療法をに対する TAVI 単独もしくは補助的な治療を併用し確立することが望まれる。

て治療した症例について、後方視的に以下の項目に

一方、生体弁による弁置換後の血栓形成には、術ついて観察し検討する。

後トロンビン生成の増加が関与していると報告されており（参考文献 6）、術後のトロンビンを含めた多

1) 年齢、性別 、体表面積 (BSA)

くの止血関連因子の変化が、抗血小板療法や抗凝固療法と関連して、血栓・出血イベントに繋がると考152) 術前STS risk of mortality、STS morbidity or mortality、

年齢 (才）

83.6±5.4

83.7±4.8

0.63

男性

51(27%)

41(47%)

0.001

7.2±6.0

8.1±7.1

0.16

Euro score2

4.5±6.4

5.2±4.3

0.004

高血圧

159(84%)67(77%)0.16

糖尿病

52(27%)

28(32%)

0.42

脂質異常症

122(64%)52(60%)

0.44(Hb)、Fibrinogen値, D-dimer値, FDP値, AT3活ASO

31(16%)

23(26%)

0.06

性値

COPD

65(34%)

36(41%)

0.26

脳血管疾患

40(21%)

19(22%)

0.89(EF)、僧帽弁閉鎖不全症 (MR)、大動脈弁閉鎖不慢性心房細動4(2%)

23(26%)<0.0001

全症 (AR)、大動脈弁口面積 (AVA)、経大動脈弁

Fibrinogen360±76366±800.55

平均圧較差 (mPG)D-dimer

1.87±2.0

1.6±1.6

0.01

FDP

4.9±3.0

4.3±2.3

0.28

AT3102±12

98±14

0.16

Ccr

42±15

40±14

0.27

Euro Score 2

STS risk of3) 既往歴：高血圧、脂質異常症、糖尿病、閉塞性動

mortality

脈硬化症 (ASO)、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、脳血管疾患 (CVD)、心房細動 (発作性、慢性)、PCI
既往、肝硬変、術前手術既往
4) 術前止血関連因子；血小板数、ヘモグロビン数5) 術前心機能；左室拡張末期径 (LVDd)、駆出率

6) TAVI：種類 (Sapien XT, Sapien 3, Core valve, Corevalve evolute R)・径
7) 併施手術；冠動脈バイパス術

Ⅲ．結果

8) 術後経過:手術死亡・入院死亡、VARC-2に基づい

TAVI registry のデータベースからのデータの抽た出血性合併症、梗塞性合併症、脳血管障害、心出は現在申請中の為、2011 年 12 月から 2017 年 12

筋梗塞、感染、その他の重篤な合併症（参考文献

月までの当センターにおいて TAVI を施行した 277

7）例の患者に対する解析結果を報告する。
術後の抗凝固療法併用群は 87 例で、抗血小板療法9) 術後抗血小板療法、抗凝固療法の種類

単独群は 189 例であった。1 例は、抗凝固療法・抗10) 術後心機能の推移： LVDd、EF、MR、AR、mPG、血小板療法のどちらも施行されなかった。

大動脈弁有効弁口面積 (EOA)

平均フォローアップ期間は抗凝固療法併用群で1.5±1.1 年で、抗血小板療法単独群で 1.7±1.2 年

上記項目について、患者群を術後抗血小板療法単独であった。

群と抗凝固療法併用群で2郡に分け、統計学的解析を

抗凝固療法併用群と抗血小板療法単独群の術前背行う。2群間の術前因子の比較にはχ2乗検定（もしく景を表 1 に示した。

は、Mann-Whitney U-test、Student’s t-test）を用いた。

病院死亡は抗血小板療法単独群で 2 例に認められまた、術後心機能の推移の比較には混合効果モデルをたが、抗凝固療法併用群では認められなかった。

用いた。生存率・MACCE回避率はKaplan-Meier法を術後の経大動脈弁圧較差の推移を図１に示す。術用いて評価し、log-rank 検定で有意性を検討した。出直後では、抗凝固療法併用群と抗血小板療法単独群

血性合併症・虚血性合併症に関するrisk因子の抽出にでは有意差がないが、術後 1 年時には、抗凝固療法

はCox hazard検定を用いた。

併用群で 8.5mmHg, 抗血小板療法単独群で 10.6mmHgと抗凝固療法併用群で有意に低下した(p=0.02)。
術後の EOA の推移を図 2 に示す。術直後では、抗表１ 抗血小板療法単独群と抗凝固療法併用群における術前患者

凝固療法併用群と抗血小板療法単独群では有意差が背景ないが、術後 1 年時には、抗凝固療法併用群で抗血小板療法

抗凝固療法

1.83cm2, 抗血小板療法単独群で 1.6cm2 と抗血小板

p16

療法単独群で有意に低下した(p=0.001)。

因子を探索したところ、術前慢性心房細動、術前脳
血管疾患、術前 EF 低値が risk 因子と判明した（表3）。

抗凝固療法併用群

抗凝固療法併用群 87 例においては、
フォローアッ
抗血小板療法単独群

プ期間中に、６例の出血性合併症が起こり、4 例の虚血性合併症が認められた。表 4 に抗凝固療法併用

1613群における、出血性合併症を起こす risk 因子示す。
9.9

10.6

9.5

8.5

Cox hazard 解析を用いて同様に探索したところ、術107

前 fibrinogen 値の低い患者、術後ワーファリンの内服をしている患者で、有意に出血性合併症が多いことが判明した。また、抗凝固療法併用群における、

4
術直後

半年後

1年後

虚血性合併症の risk 因子を探索したところ、有意な
risk 因子は検出されなかった。

図１ 抗血小板療法単独群と抗凝固療法併用群における、術後
表 2 抗血小板療法単独群における出血性合併症を引き起こす

経大動脈弁平均圧較差の推移

risk 因子

抗凝固療法併用群
抗血小板療法単独群
2

1.83

1.71

P値

CI

HR

糖尿病

0.007

1.6-50.3

7.3

脳血管疾患

0.034

1.1-26.3

5.1

DAPT

0.002

2.3-243.1

12.9

表 3 抗血小板療法単独群における虚血性合併症を引き起こす
1.5

1.6

1.66

risk 因子

1
術直後

半年後

1年後

P値

CI

HR

慢性心房細動0.05

0.93-151.2

19.04

脳血管疾患

0.02

1.4-227.9

11.3

術前 EF

0.03

0.86-0.99

0.92

表 4 抗凝固療法併用群における出血性合併症を引き起こす

図 2 抗血小板療法単独群と抗凝固療法併用群における、術後大risk 因子動脈弁 EOA の推移

P値

CI

HR

1 年生存率は抗血小板療法単独群で 94.7%、
抗凝固術前 Fibrinogen 値

0.02

0.96-0.99

0.97

療法併用群で 94.6%であった(log rank p=0.38)。ま術後ワーファリン

0.03

1.1-132.8

6.9

た、MACCE の 1 年回避率は抗血小板療法単独群で87.3%、抗凝固療法併用群で 80.9%であった（log rank

Ⅳ．考 察

p=0.57）。

現在のガイドラインでは、TAVI 術後には脳梗塞の抗血小板療法単独群 189 例中、フォローアップ期

risk を低下させる目的で血小板療法が推奨されて間中に８例の出血性合併症が起こり、4 例に虚血性いる(参考文献 8、9)。しかしながら、TAVI を施行さ合併症が認められた。表 2 に抗血小板療法単独群にれる患者の約 30%に Af を合併しており、抗凝固療法

おける、出血性合併症を起こす risk 因子示す。Coxの適応があるといわれている（参考文献 10）。実際、

hazard 解析を用いて探索したところ、術前糖尿病、当院においても、約 1 割の患者に慢性心房細動を認術前脳血管疾患、術後 DAPT の内服をしている患者で、め、発作性心房細動も併せると、約 3 割の患者に抗有意に出血性合併症が多いことが判明した。また、凝固療法が併用されている。ワルファリンもしくは抗血小板療法単独群における、虚血性合併症の risk17

直接作用型経口抗凝固薬(DOAC)を用いた抗凝固療法を行っていく必要がある。

は、TAVI に関連した血栓弁に対して有効であったと

Ⅴ．結論

いう報告があり（参考文献 4,5）
、TAVI 術後早期から遠隔期における経口抗凝固薬療法の有用性が示唆さ

抗凝固療法併用群では術後 mPG の低下や EOA

れているが、抗血小板療法と抗凝固療法の術後心機の上昇が認められたが、術後の生存率や合併症発生能を比較した報告はされていない。今回、抗血小板率に関しては、抗血小板療法単独群と抗凝固療法併療法単独群と抗凝固療法併用群での術後の心機能を用群では有意差はなかった。また、抗血小板療法単比較検討したが、術直後 mPG は両群で有意差は認め

独群における DAPT 内服患者では出血性合併症がられなかったが、その後、抗凝固療法群では徐々に上昇し、脳血管疾患や慢性心房細動・術前低心機能低下するのに対し、抗血小板療法単独群では、徐々のある患者では、抗凝固療法併用をすることで虚血に上昇することが判明した。また、有効弁口面積も性合併症の risk を低下させる可能性がある。また、

術直後は両群で有意差が無いのに対して、その後、抗凝固療法併用群においても、ワーファリンの使用

徐々に抗血小板療法単独群では減少することが判明ではなく、NOAC の使用をすることで出血性合併症した。術後の mPG の上昇や EOA の低下は血栓形成をの risk を低下させる可能性がある。

示唆している可能性があるが(参考文献 10)、抗凝固療法は術後の mPG の上昇や EOA の低下を抑制する可Ⅵ．研究協力者

能性が示唆される。

小林順二郎・国立循環器病研究センター・院長

TAVI 術後の合併症の頻度は、抗血小板療法単独群

藤田知之・国立循環器病研究センター・心臓外科部と抗凝固療法併用群で差はなかった。TAVI 術後の出長血性合併症は DAPT の使用や、
経心尖アプローチでの福嶌五月・国立循環器病研究センター・心臓外科医

割合が高いといわれているが（参考文献 11）、術後

長の抗血小板療法・抗凝固療法は多様であり、抗血小島原佑介・国立循環器病研究センター・心臓外科医

板療法単独群、抗凝固療法併用群それぞれでの出血

師性・虚血性合併症を引き起こす risk 因子の報告は

久米悠太・国立循環器病研究センター・心臓外科医

ほとんどない。今回、抗血小板療法単独群での出血

師性合併症を引き起こす risk 因子として、
アプローチ

松本順彦・国立循環器病研究センター・心臓外科医

方法は検出されなかったが、術後の DAPT の内服に強師い相関が認められ、DAPT の内服は抗血小板療法単独

山下築・国立循環器病研究センター・心臓外科医師

群における出血のリスクを増大させると考えられる。
また、抗凝固療法併用群での出血性合併症を引き起Ⅶ．参考文献こす因子としては、ワーファリンの内服が検出され

1)

Vahanian A, Alfieri O, Andreotti F, Antunes

たが、
抗凝固療法併用群でも NOAC の使用による出血

MJ, Baron-Esquivias G, Baumgartner H, etのリスクは抑えられる可能性が示唆された。
一方で、al. Guidelines on the management of

TAVI 術後の虚血性合併症には、低心機能や心房細動

valvular heart disease (version 2012): The

や小さい弁などが risk 因子として報告されている

Joint Task Force on the Management of（参考文献 12）
。今回、抗血小板療法単独群での虚Valvular Heart Disease of the European

血性合併症の risk 因子として、慢性心房細動、脳血Society of Cardiology (ESC) and the

管疾患や術前低心機能などが検出されたが、このよEuropean Association for Cardio-Thoracic

うな術前背景のある患者に対しては、抗血小板単独

Surgery (EACTS). Eur Heart J 2012; 33:

ではなく抗凝固療法の併用を考慮する必要があると

2451-2496.
2)

考えられた。

Hassell ME, Hildick-Smith D, Durand E,

今回、術後出血性合併症・虚血性合併症の risk

Kikkert WJ, Wiegerinck EM, Stabile E, et al.

因子を検出したが、両群において出血性合併症・虚Antiplatelet therapy following transcatheter

血性合併症を起こした患者数は非常に少なく、今後、

aortic valve implantation. Heart. 2015

TAVI registry データベースを用いて大規模な研究

Jul;101(14):1118-25.

18

3)

Gandhi S, Schwalm JD, Velianou JL,

Yu Y. Risk factors for post‐TAVI bleeding

Natarajan MK, Farkouh ME. Comparison ofaccording to the VARC‐2 bleeding definition

Dual-antiplatelet Therapy toand effect of the bleeding on short‐termMono-antiplatelet Therapy Aftermortality: a meta‐analysis. Can J Cardiol.

Transcatheter Aortic Valve Implantation:

2017;33:525–534.

Systematic Review and Meta-analysis. Can J
4)12) Davlouros PA, Mplani VC, Koniari I,

Cardiol. 2015 Jun;31(6):775-84.

Tsigkas G, Hahalis G. Transcatheter aortic

Pache G, Blanke P, Zeh W, Jander N. Cusp

valve

thrombosis after transcatheter aortic valve

comprehensive review. Journal of Geriatricreplacement detected by computed

Cardiology.2018;15(1):95-104.

tomography and echocardiography. Eur HeartJ. 2013 Dec;34(46):3546.
5)

Ruparelia N, Panoulas VF, Frame A,
Sutaria N, Ariff B, Gopalan D, et al.
Successful

Treatment

of

Very

Early

Thrombosis of SAPIEN 3 Valve with Direct
Oral Anticoagulant Therapy. J Heart Valve
Dis. 2016 Mar;25(2):211-213.
6)

Makkar R.R, Fontana G, Jilaihawi H,
Chakravarty T, Kofoed K.F, De Backer O, etal. Possible subclinical leaflet thrombosis inbioprosthetic aortic valves. N. Engl. J. Med.
2015; 373:2015-2024.

7)

Kappetein AP, Head SJ, Genereux P, Piazza
N, van Mieghem NM, Blackstone EH, et al.
Updated standardized endpoint definitions
for transcatheter aortic valve implantation:
the Valve Academic Research Consortium-2
consensus document. J Thorac Cardiovasc
Surg. 2013;145: 6–23.

8)

Lung B, Rodes-Cabau J. The optimal
management of anti-thrombotic therapy
after valve replacement: certainties anduncertainties. Eur Heart J 2014;35:2942-9.

9)Holmes DR Jr., Mack MJ, Kaul S, et al. 2012
ACCF/AATS/SCAI/STS expert consensus
document o transcatheter aortic valve
replacement.

J

Am

Coll

Cardiol

2012;59:1200-54
10) Anna F, Thomas P, Alan GH, Jonas L,
Masahiko A, Fabien P, et al. Transcatheter
aotric valve thrombosis: incidence, clinicalpresentation and long-term outcomes. Eur
Heart J 2018;19:361-68.
11) Wang J, Yu W, Jin Q, Li Y, Liu N, Hou X,

19replacement

andstroke:a心臓マクロファージを基軸とする新規心内血栓形成機序の解明と新規治療標的の検索ﾞ―アンフィレグリンによる心機能制御機構―

東京大学医学部附属病院 循環器内科 特任准教授

藤 生 克
Ⅰ．緒 言
心臓にトラブルが生じた際には様々な全身のトラブルが生じる。心臓のポンプ失調による低拍出症候群が最も典型的であるが、それ以外にも心臓内の血栓形成によると塞栓症も患者の転機に大きな影響を与える。前者は心不全、後者は心房細動を原因とする心原性脳塞栓症という病名がつくことによって診療が展開される。我々はこれまでに心筋細胞や血管内皮細胞といった心血管疾患における中心的な細胞群ではない、非心筋細胞、非内皮細胞に着目して、非心筋細胞や自然免
疫細胞であるマクロファージに着目してさまざ
まな生活習慣病の新しい疾患発症機序について検討を行ってきた 1-11。この検討の中で、マクロファージを除去したマウスの心臓内に血栓が存在することを見出した。このことはマクロファー
ジが直接的、あるいは間接的に心臓内血栓形成に関与していることを示唆する。そもそも、心臓マ
クロファージが定常状態や心臓への圧負荷などのストレス時にどのような役割をしているかなどは不明であり、本研究計画では、心臓マクロフ
ァージが心臓の恒常的な状態でどのような役割をしているかについて検討することを目的とする。

仁時には、心臓内にマクロファージを中心とする炎症細胞の増加が生じるが、このマウスでは生じていなかった。すなわち、本マウスは①心臓へのストレス時に心臓マクロファージが増加しない、②心機能が低下、および③心腔内血栓の出現するという 3 点が同時に生じているマウスである。
本マウスを用いて、心臓マクロファージと心機能、心内血栓の関係性を分子生物学的手法等を用いて解析した。

Ⅲ．結 果
腎臓集合管上皮細胞特異的 Klf5 ノックアウトマ
ウスの心機能と血栓形成の時間経過を詳細に検討したところ、心内血栓の出現時期は TAC 後 2 か月以降であったが、それよりも早い 30 日の段階で心機能低下が表れていた（図１）。このことから、心機能低下の結果、心内血栓が生じているものと考えた。

Ⅱ．対象・方法

図 1

腎臓集合管特異的 Klf5 ノックアウトマウス

今回の検討ではすべてマウスを用いて検討した。

（ CD:collecting duct epithelial cell- Klf5KO）は心機能が低下し心臓疾患モデルとして腎臓集合管上皮細胞特異的

早期に死亡する。心内血栓の出現に先行して心機能が著名に低下

Klf5 ノックアウトマウスを用いる。このマウスは、する。

心臓にストレスを加えた際にストレス応答遺伝子でさらに、病理像を検討したところ TAC 後 30 日ではある Klf5 が腎臓集合管上皮細胞で発現増加するた

心内血栓だけではなく、冠動脈内にも血栓像はなく、め、同細胞でノックアウトマウスを作成したところ、

本マウスの心機能低下は血栓形成に先行することが心 臓 圧 負 荷 モ デ ル （ TAC: Transverse Aortic

明らかとなった（図２）。さらに、圧負荷によって通Constriction）を同マウスに行うと、心機能低下と常生じる心肥大や線維化がほとんど生じていなかっ心腔内血栓が生じた。その原因として心臓の圧負荷たため、このマウスの死亡原因は圧負荷によって生20

じて起こる代償機構としての心肥大・線維化が生じ

行っても心臓マクロファージが増加しないマウスにないために早期に死亡しているものであろうと思わ

対して野生型マウスから採取した心臓マクロファー

れた。

ジを強制的に移植し、心臓マクロファージの数を増加させておくと心機能の低下を生じないのかを検討したところ、野生型マウスを Ly6cloF4/80hi マクロフ
ァージで強制的に心臓マクロファージを増加させておけば、圧負荷時に十分な代償性心肥大が生じ生存できた。一方で未分化な心臓マクロファージである
Ly6chiF4/80lo マクロファージで心臓マクロファージを強制的に増加させても、心肥大は生じずに、マウスは圧負荷後に死亡した。以上から、心臓への圧負荷によって心臓内の十分に分化したマクロファージ
腎臓集合管特異的 Klf5 ノックアウトマウスが増加することが心機能を維持し、心内血栓を生じ（ CD:collecting duct epithelial cell- Klf5KO）は圧負荷に対するさせないという恒常性維持に必須であることを示唆

代償現象である心肥大や心臓線維化が生じない。また、TAC 後のしている。さらに、十分に分化した心臓マクロファ

30 日では心内血栓や冠動脈内血栓は認めなった。

ージがどのように心筋細胞に対して心肥大を生じさ次に、このマウスは TAC 時に心臓の炎症細胞が増せるかを検討した。次世代シーケンサーを用いた網

加しないが、どのような細胞が増加しないのかをフ羅的解析によって、心臓内では分化したマクロファ

ローサイトメーターを用いて検討した（図 3）。

ージ特異的、他の臓器のマクロファージと比較して

図 2

も心臓マクロファージ特異的に発現している分泌タ
ンパクとしてアンフィレグリン（Areg）を同定した。
（図４、図５）

図 3

腎臓集合管特異的 Klf5 ノックアウトマウス（ CD:collecting duct epithelial cell- Klf5KO）は圧負荷時にLy6CloCD11b+F4/80hiLy6G-細胞（心臓内の常在マクロファージ）

図3の増加生じない。

ージの発現と一致している。

マウス心臓でのアンフィレグリンの発現、心臓マクロファ

その結果、心臓内にもともと存在してる心臓マク
ロファージが通常は TAC によって数倍に増加するが、この増加が全く生じないことを見出した。
また、
このマクロファージの増加は TAC 後 1 週間程度がピークであることから、心臓マクロファージの増加が生じないこと、心機能の低下が生じること、心内血栓が生じることは、この順に生じていることが明らかになった。
続いて、腎臓集合管特異的 Klf5 ノックアウトマウ

図4

アンフィレグリンは心臓内では常在マクロファージのみ、

スにおいて、圧負荷時に心臓マクロファージが増加

また常在マクロファージの中では多臓器には発現がなく、心臓のしないことが、心機能低下、その後の血栓形成に寄みに発現している。圧負荷によってアンフィレグリンの発現が増与しているかを検討するために、腎臓集合管特異的加する。

Klf5 ノックアウトマウス、すなわち心臓に圧負荷をアンフィレグリンの欠損した骨髄細胞を用いて、骨21

ージが増加することを見出した（図 7）。

髄移植を行うと、
心臓マクロファージは存在するが、アンフィレグリンの欠損した心臓マクロファージが存在する心臓を作ることができる。このアンフィレ
グリンの欠損した心臓マクロファージは心臓への圧負荷によって十分に増加はしたが、心機能の改善はなく、早期に死亡した（図 5）。このことから、心臓マクロファージは増加するだけではなく、アンフィ
レグリンが存在していることがその心臓保護的作用に必須であることが明らかとなった。

図 7 心臓への圧負荷ストレスは迷走神経求心路、脊髄後根を経由する痛覚神経の 2 経路によって脳に伝達され、そのから交感神経
β2 を経路によって腎臓集合管上皮細胞が活性化され、最終的に腎
臓血管内皮細胞から CSF2 が血中に放出され、心臓マクロファージの初期の増加が生じる。

以上から、心臓への圧負荷時に心臓・脳・腎臓の連携によって、心臓マクロファージが活性化し、心臓マクロファージが分泌するアンフィレグリンによって心臓の圧負荷応答が起こり、圧に対抗している
図 5 Areg ノックアウトマウスを用いて骨髄細胞特異的 Areg ノ

ことを明らかにした。この系の何れかが欠損するとックアウトマウスを作成。常在心臓マクロファージの Areg が欠損

心機能低下から心不全死、あるいは心内血栓が生じすると、圧負荷時に心機能が低下し、早期に死亡する。

ることを明らかにした 12。

アンフィレグリンの心筋細胞への直接作用を検討

Ⅳ．考 察

するため、アンフィレグリンのリコンビナントタン
パクを用いてマウス心筋細胞の初代培養に添加した

本研究によって心臓内にわずかしか存在していな

ところ、非常に強い心筋細胞肥大作用があることをい心臓マクロファージの生理的機能を明らかにした。

確認し得た（図 6）。

また、この心臓マクロファージの機能が十分に発揮されるためには、心臓・脳・腎臓といった多臓器間連携が重要であることも見出した。このことは、従来心臓は全身疾患であること、心不全を改善する薬
剤は腎臓にも効果的であること。腎臓が悪くなると心臓も悪くなるという心腎連関という概念などを説明し得る概念であり、今後ヒトでの検証も必要かと
思われる。

Ⅴ．結 論
今回私は、心臓の新しい恒常性維持機構として心図 6 アンフィレグリンを培養心筋細胞に添加すると心肥大が生臓マクロファージを中心とした心臓・脳・腎臓を介じる。

した経路を発見した。この経路の障害は、心機能低さらに、もともと本実験の予備的結果として腎臓下から心不全死、あるいは心機能低下から心内血栓集合管特異的 Klf5 ノックアウトマウスは心臓圧負の出現を惹起し、疾患発症に関与している可能性を荷時に心臓マクロファージが増加しないという知見示唆している。

から始まったが、その腎臓と心臓をつなげる経路についても多くの実験を行い心臓へのストレスが神経Ⅵ．研究協力者の求心路を伝わり脳・腎臓と伝わり、最終的に腎臓

中山 幸輝・東京大学医学部附属病院・助教の血管内皮細胞から CSF2; colony stimulating

小島 敏弥・東京大学医学部附属病院・助教

factor 2 が血中に分泌されることで心臓マクロファ

荷見 映理子・東京大学医学部附属病院・助教

22

8.

杉田 純一・東京大学医学部附属病院・特任臨床医

Tan X, Fujiu K, Manabe I, et al.: Choroidal
neovascularization is inhibited via an

松田 淳・東京大学大学院医学系研究科・大学院生

intraocular decrease of inflammatory cells in

Ⅶ．参考文献mice lacking complement component c3. Sci

1)

Rep 2015;5:15702.

10ポイントMS明朝 英数字century 10ポイ
ント MS 明朝 英数字 century 10 ポイント

2)

9.

Tan X, Fujiu K, Manabe I, et al.: Choroidal

MS 明朝 英数字 century 10 ポイント

neovascularization

10ポイントMS明朝 英数字century 10ポイ

splenic-denervated or splenectomized mice

ント MS 明朝 英数字 century 10 ポイントwith a concomitant decrease in intraocularMS 明朝 英数字 century 10 ポイント

macrophage. PLoS One 2016;11:e0160985.

isinhibitedin

10. Wang JH, Eguchi K, Matsumoto S, et al.:The omega-3 polyunsaturated fatty acid,1.

Fujiu K, Manabe I, Ishihara A, et al.:eicosapentaenoic acid, attenuates abdominal

Synthetic retinoid am80 suppresses smoothaorticmuscle phenotypic modulation and in-stent

suppression of tissue remodeling. PLoS One

neointima formation by inhibiting klf5. Circ

2014;9:e96286.

Res 2005;97:1132-1141.
2.

3.

Influence of periostin-positive cell-specificduct epithelial cells regulate inflammation in

klf5 deletion on aortic thickening in doca-salt

tubulointerstitial damage in mice. J Clin

hypertensive

Invest 2011;121:3425-3441.

2016;39:764-768.

Fujiu K, Manabe I, Sasaki M, et al.:Hypertens

Res

Nickel-free stainless steel avoids neointima

heart-brain-kidneyformation

stent

adaptation to cardiac stress through tissue

Mater

macrophage

followingSci

coronary

TechnolAdv

Iwata H, Manabe I, Fujiu K, et al.: Bonesmooth muscle cell lineages. Circulation
2010;122:2048-2057.
Ogata F, Fujiu K, Koshima I, et al.:Phenotypic modulation of smooth muscle
cells in lymphoedema. Br J Dermatol
2015;172:1286-1293.
Ogata F, Fujiu K, Matsumoto S, et al.:Excesslymphangiogenesis

cooperatively

induced by macrophages and cd4(+) t cells
drives the pathogenesis of lymphedema. J
Invest Dermatol 2016;136:706-714.
Shen H, Eguchi K, Kono N, et al.: Saturated
fatty acid palmitate aggravates neointima
formation by promoting smooth muscle
phenotypic modulation. Arterioscler Thromb
Vasc Biol 2013;33:2596-2607.

23

network

activation.

2017;23:611-622.

inflammation but do not differentiate into

7.

mice.

12. Fujiu K, Shibata M, Nakayama Y, et al.: A

marrow-derived cells contribute to vascular

6.

via

11. Zempo H, Suzuki JI, Ogawa M, et al.:2012;13:064218.

5.

development

Fujiu K, Manabe I, Nagai R: Renal collecting

implantation.
4.

aneurysm

Natcontrols
Med