●プリオン病――［IV］プリオン研究における新展開

2．PrPSc 特異抗体の開発
品川

森一＊

プリオンは宿主の膜蛋白であるプリオン蛋白 PrPc の構造異性体である PrPSc を主構成員としている．特異性・反応性の高い mAb，とりわけ PrPSc の特異構造を認識する抗体はその構造解析，診断法の開発，治療等に新たな途を開くことが期待できる．
新たに反応性の高い抗体が作成されるとともに，プリオン蛋白検出の感度が向上し，プリオンの生物学に新知見が加えられてきた．ただ，これまで PrPSc を特異的に認識する抗体はただ 1 例報告されているだけであり，この抗体の詳細は明らかでない．われわれは PrPSc を含めて，各種抗 PrP 特異抗体の作成を行っている．
プリオン蛋白ノックアウトマウスを mAb 作成に用いた．組換えマウス PrP および未変性マウス PrPSc を抗原とした．ハイブリドーマのスクリーニングに組換えマウス
PrP および未変性マウス PrPSc を，mAb の性状およびエピトープの解析にはさらに組換えヒツジ，ウシ，ハムスター PrP，組換えマウス欠損 PrP，ヒツジおよびウシ PrPSc並びにペプスポット膜を用いた．
34 mAb は認識エピトープから 9 群分類された．33 mAb は組換え PrP および変性
これらは培養細胞の IFA により，mAb は反応する部位のPrPSc と ELISA で反応した．
違いから 3 群に分けられ，存在部位による PrPc の構造の違いが示唆された．1 つのmAb 6 H 10 は未変性の PrPSc と反応するが，組換え PrP と反応しなかった．このmAb は PrP 分子を認識する一般の抗体と異なり，proteinase K 処理した精製マウス
スクレイピー PrPSc を免疫沈降した．しかし，変性剤により PrPSc の構造が破壊されるにつれて反応性が低下し，ウエスタンブロットでは反応しなかった．ヒストブロットで正常およびプリオン蛋白ノックアウトマウス脳とも弱く反応した．このことから，
mAb 6 H 10 は PrPSc の構造を認識するが，神経系組織に存在する類似した構造の宿主分子とも反応することが示唆された．
この抗体の性状については現在なお検討している．

Development of a PrPSc specific monoclonal antibody
MORIKAZU SHINAGAWA Laboratory of Veterinary Public Health, Department of Veterinary Medicine,
Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine

しながわ・もりかず：帯広畜産大
学畜産学部獣医公衆衛生学教授．
昭和39年北海道大学獣医学部卒
業．昭和45年同講師．昭和50年米国メリーランド大学医学部生化学
ポスドク．昭和63年現職．主研究
領域／ヒツジスクレイピーの早期診断法の開発とヒツジプリオン遺伝子の解析，アデノウイルス DNAの構造解析と分子疫学．
＊Key words

PrPSc の構造認識
モノクローナル抗体※平成14年10月より動物衛生研究所プリオン病研究センター長

プリオン病 109

大腸菌で発現させた．
封入体から rPrP をニッ

はじめに

ケルキレートアフィニティーカラムおよび逆プリオンは，宿主の膜蛋白であるプリオンcSc相 HPLC で精製した．精製 PrPSc あるいは全蛋白 PrP の構造 異 性 体 で あ る PrP を 主 構

長の rPrP を Prnp0!0 のマウスに免疫した．精成員としている．これまでプリオン蛋白に対製 PrPSc お よ び 全 長 の rPrP を 抗 原 と し た

する抗体の作成は，感染脳から精製したプリELISA で mAb のスクリーニングを行った．

オンを変性させたもの，プリオン蛋白の一部

mAb の エ ピ ト ー プ 解 析 に 欠 損 お よ び 変 異のアミノ酸配列に一致した合成ペプチド，あrPrP と，2 アミノ酸ずつずらして全 PrP 領域

るいは組換えプリオン蛋白が抗原としてポリをカバーする 13 アミノ酸からなるペプチド

クローナル抗体またはモノクローナル抗体を結合させた Pep-spot 膜を用いた．

（mAb）が作成されている．特異性・反応性の高い抗体が作成されるとともに，プリオン蛋白検出の感度が向上し，プリオンの生物学に2．成績新知見が加えられてきた．現在，PrPC 特異な解析の終わった 34 mAb の性状を表 1 に示不連続エピトープを認識する抗体も得られてす．エピトープ解析から，rPrP および変性いる1）が，PrP の解析，プリオン病の診断ある

PrPSc を認識するが，未変性 PrPSc を認識しな

いは治療の試みなどに用いられている抗 PrP

い 8 群と，逆に未変性 PrPSc だけを認識する 1

抗体は，PrP の連続あるいは不連続エピトー群の計 9 群に分けられた．前者の 8 群は，間Scプを認識するものである．PrP を特異的に認

接蛍光抗体法による染色部位から 4 群に分識する抗体のエピトープは，PrPSc の特異構造けられた．細胞膜を染色する抗体を，プリオScと推定され，そのような抗体は PrP の構造

ン持続感染細胞（I 3!
I 5-9）に加えて培養する解析あるいは診断法の開発に新たな途を開くとプリオンが除去された．細胞膜以外を染色ことが期待できる．現在，プリオンあるいはする抗体には，このような性質はみられな

Sc

PrP の特異な構造を認識する抗体がこれまかった．

でただ 1 例報告されている2）が，この抗体の各種抗体と PrPSc との反応性を調べた．PK

利用等詳細は明らかでない．われわれは反応

未処理の精製 PrPSc を抗原とした場合，ELISA性の高い抗 PrPmAb をはじめ，PrPSc を特異的でどの抗体も反応するが，mAb 6 H 10 以外のに認識する mAb の作製を実施している．

抗体は PK 処理 PrPSc と反応しなくなった（図1 A）．また，PK 処理した PrPSc をグアニジン塩で変性させると，変性が進むにつれて6H10

1．材料と方法との反応性が低下し，逆に他の抗体は反応性安楽死させた死線期のスクレイピー Obi-が増加した（図 1 B）．すなわち，6 H 10 は PK

hiro 株感染マウスの脳から界面活性剤抽出，処理の有無にかかわらず，未変性 PrPSc とだ

分 画 遠 心 お よ び 必 要 に 応 じ て proteinase K

け 反 応 し た．6 H 10 以 外 の 抗 体 は pep-spot

Sc（PK）処理によって PrP を精製した．マウス

膜を用いてエピトープを推定できたが，6 H

PrP 遺 伝 子 の コ ド ン 23-231（成 熟 PrPC の 全10 はこのような方法でエピトープの解析が長），部分的に欠損させたもの，S-S 結合を阻できなかった（表 1）．細胞膜を染色する mAb

止するため，シスチンをアラニンに置換した

31 C 6 と異なり，未変性 PrPSc と反応す る 6

変異 PrP 遺伝子を作製し，His-tag を付加してH 10 は，予測されたように SDS で変性され110 第 121 回日本医学会シンポジウム

表１

抗 PrPmAb の性状PK（＋）PrPSc

mAb
Group

EpitopeClonesrPrP

Denatured（GdnSCN）

Nondenatured¿
ÀÁÂÃ
ÄÅ
Æ
Ç

56― 89, L
119―127, L
137―145, L
143―153, L
161―169, L
219―229, L
155―231, D
89―231, D
Unknown

6
12
4
1
3124
1＋＋＋＋＋＋＋＋−＋＋＋＋＋＋＋＋−−（±）−−−−−−−＋

A

0.6

0.4

0.2

0.2
040 80 120 160 200 240 280 320
Proteinase K（μg/mL）

図1B

mAb 6H10mAb 31C6mAb 72-5mAb KLH

0.60.40.0

Cell membrane
ER-Golgi
ER-Golgi
Cell membrane
Golgi
Intracellular（undefined）
Cell membrane
Cell membrane
NA0.8
OD405

0.8
OD405

1.0mAb 6H10mAb 31C6mAb 72-5 Pan-PrP mAbmAb 44B1mAb KLH（N. C.）

IFA（Localization）

0.0012345GdnHCl（M）

6ELISA 法で解析した各種 mAb の PrPSc との反応性

A : Proteinase K（PK）
未消化精製 PrPSc を，各種濃度の PK で消化したものとの反応性を mAb間で比較した．未消化 PrPSc とは全ての抗 PrP 抗体は反応するが，6 H 10 以外は PK 消化された PrPSc との反応性が消失した．
B : PK 消化された PrPSc を塩酸グアニジンの濃度を高めて変性を進めると，6 H 10 の反応性は低下消失するが，他の抗体では変性が進むと反応性が増加した．
KLH：抗ヘモシアニン抗体（陰性対照抗体）．

た試料を用いるウエスタンブロットでは反応

び非感染マウス脳乳剤から PrPc を沈降させしないが，PK 処理した精製 PrPSc を免疫沈降た（図 3）．さらに，6 H 10 はスクレイピーヒした（図 2 A，B）．また，Obihiro 株とともにツジおよびウシ海綿状脳症（BSE）ウシの脳乳I 3!
I 5 株のスクレイピー感染マウス脳乳剤か剤からも PrPSc を沈降させた（図 4）．

ら直接および PK 処理した後の乳剤のいずれからも PrPSc を免疫沈降させたが，非感染マウス脳から PrPc を沈降させなかった（図 3）．
一方 31 C 6 は，PK 処理をしない感染およ3．考察
PrPSc を特異的に認識する抗体として，ウシ
プリオン病 111

31C650 20

6H10PK

KLH− ＋31C6− ＋supppt
6H10mAb
31C6KLH

B
ControlAmAb
6H1034.7
29.8
34.7
18.2(kDa)

29.8

18.2(kDa)

図2mAb 6 H 10 の反応性

A : PrPSc を SDS-DTT により変性後ウエスタンブロットにより抗体の反応性を比較した．mAb
31 C 6 と違い，6 H 10 は変性 PrPSc とは反応しない．
B : PK 消化した精製 PrPSc を磁性ビーズに固定した mAb と混合して免疫沈降を行い，沈降物と上清の蛋白をウエスタンブロット解析した．6 H 10 は PrPSc と反応し沈降させたが，31 C 6は陰性対照抗体（KLH）と同様に PrPSc を沈降させなかった．

ppt

ppt

34.729.8PK(＋)
6H1031C6168(NC)31C6168(NC)PK(−)
6H10PK(＋)

Homogenate

6H10PK(−)

31C6168(NC)
6H1031C6168(NC)Homogenate

Homogenate

6H1031C6168(NC)MoPrPSc(PK＋)

ppt

34.7
29.8

18.2

18.2(kDa)(kDa)
非感染マウス脳図3

Obihiro株感染マウス脳I3/I5株感染マウス脳

スクレイピー感染および非感染脳乳剤を用いた mAb による免疫沈降

2 株のスクレイピー感染および非感染マウス脳乳剤を，PK 消化前および消化後に磁性ビーズ
結合 mAb と混合し，免疫沈降を行い，沈降物をウエスタンブロットで解析した．6 H 10 は陰性対照抗体（168）と同様，非感染マウス脳乳剤から PrP を沈降させなかったが，いずれの感染脳乳剤からも，PK 消化にかかわらず PrPSc を沈降させた．31 C 6 は PK 感受性の PrPc を沈降させた．

112 第 121 回日本医学会シンポジウム

認識した．このことから，6 H 10 は PrPSc に共通した構造を認識すると推定されるが，正確PK(＋)

なエピトープを明らかにできなかった．間接

168(NC)

168(NC)

PK(−)
6H10

6H10PK(＋)
168(NC)

168(NC)

6H10PK(−)

ppt

蛍光抗体法により正常な神経系の培養細胞と6H10pptも反応することから，類似構造を持つ正常蛋白が存在することが示唆された．
これまで，プリオン病の免疫学的診断には
PrPc と PrPSc を区別せずに PrP のアミノ酸配34.7列を認識する抗体が用いられてきた．構造を29.8認識する新たな抗体の使用により，たとえばPK 処理を省略した新たな PrPSc の検出法のScrapie（ヒツジ脳）図418.2開発が可能となり，また PrPSc の複製および(kDa)構造解析のための有用な道具となることが予

BSE（ウシ脳）想される．

スクレイピー感染ヒツジおよび BSE ウシの脳乳剤中の PrPSc の免疫沈降
図 3 と同様に，感染ヒツジおよびウシ脳乳剤から免疫沈降を行った．6 H 10 は感染マウスの場合と同様に，両者から PrPSc を免疫沈降した．

おわりに
本研究は堀内基広，石黒直隆，狩野綾子，キム・チャンランとの共同研究である．

〔文献〕

rPrP を抗原として作製された mAb 15 B 3 が唯一報告されている2）．この抗体は，ヒトと含めてプリオン病の脳乳剤から PrPSc を免疫沈降するが，プリオン病に罹っていない個体の脳乳剤からは PrPc も沈降させない．mAb

1）Yokoyama Y, Kimura KM, Ushiki Y, et al . : In vivo
conversion of cellular prion protein to pathogenic isoforms, as monitored by conformation-specific antibodies. J Biol Chem 2001 ; 276 : 11265―11271.
2）Korth C, Stierli B, Stierli P, et al . : Prion（PrPSc ）specific epitope defined by a monoclonal antibody .
Nature 1997 ; 390 : 74―77.

15 B 3 は，pep-spot 膜でエピトープが推定されている．しかし，詳細な情報あるいはこの抗体を使用した研究成績などが入手できない質ため，詳細はわからない．われわれは，スク疑応答

レイピー Obihiro 株感染マウス脳から精製された未変性 PrPSc を免疫して，特異的に PrPSc

座長（永井） 品川先生，ありがとうございを認識する mAb 6 H 10 を得た．6 H 10 は，ました．まだ時間がありますので，ご質問を34 mAb のうち，スクリーニングの段階で PK

どうぞ．

Sc

処理精製 PrP と反応するが，rPrP と反応し山内一也（日本生物科学研） 大変期待できない抗体として分離された唯一のものである成績だと思いますが，これは免疫組織化学る．こ の mAb は，マ ウ ス Obihiro 株 の PrPSc

でご覧になったことはありますか．

以外に，他のマウス馴化スクレイピー株，ヒSc

ツジスクレイピーおよび BSE ウシの PrP も品川

ちょっと試したことはありますが，まだ成績が出るような段階ではありません．
プリオン病 113

片峰茂（長崎大） 大変すばらしいお仕事しいと思いますが，それを使った成績が全くだと思います．まず確認させていただきたい

出ていません．詳細が全くわからない状況にのですが，proteinase K は抗体と反応させるなっています．

前に免疫沈降処理をされるわけですね．そし金子

エピトープのマッピングをして，そて proteinase K を 失 活 さ せ る と い う こ と でのパネルを使ってやっておられて，あれにはしょうか．

全く反応が出なかったのでしょうか．

品川

そうです．

片峰

わかりました．プリオンを構成する

品川

あの方法では出てきません．

金子

IgG の分子の大きさとプリオンの分

PrP 以外のものがそこに存在していて，それ子の大きさを考えて，どういうかたちで立体を認識している可能性もまだ少しは残ると思構造を認識できる可能性があるか，先生は何います．非常に難しいと思いますが，先生はかお考えですか．

感染細胞か何かで biosynthetic にラベルをし品川

まだそこまで考えておりません．いて免疫沈降をした場合に，PrP 以外のものがま先生から質問をいただきましたので，何と落ちてくる，こないというデータをお持ちでか考える方法があるかを検討してみます．
湯浅龍彦（国立精神・神経セ国府台病院）

すか．
品川

まだそこまでは検討しておりませ磁性ビーズの材料が何かということと，そのん．
ただ ELISA の反応では，proteinase K の濃分子の大きさはどのくらいのものであるかを度をかなり上げて，PrPSc の量がうんと少な教えてください．それは生体でたとえば血液くなるまで処理して，十分に消化して，付随脳関門を越えうるものなのでしょうか．
また，している非特異的な蛋白がほぼなくなってい画像化ができる可能性があるかも教えてくだると思われるものを使っても反応していまさい．

す．ですから 100％ とはいえませんが，かな

品川りの確率で構造認識をしていると考えています．
座長

ヒトの CJD の PrP も認識するので血液脳関門を越すようなレベルのものではなく，非常に大きなものです．静置す
るとそのままで徐々に沈降します．その程度の大きさのものです．

すか．
われわれは獣医学領域に属している

八谷如美（国立精神・神経セ神経研） 抗体ため，ヒト脳の材料がないものですから，そはプリオンの β シート構造を認識している

こはまだ調べておりません．と考えてよろしいのでしょうか，もっと大き品川

金子清俊（国立精神・神経セ神経研） 大変な PrPSc の 構 造 を 認 識 し て い る の で し ょ う

すばらしいお仕事をありがとうございましか．また，β シートの場合，プリオンの特異性，た．この抗体は IgG でしょうか，IgM でしょう

あるいはほかのアルツハイマーやパーキンソか．というのは，1997 年ごろスイスのグルーンの集合体を認識する可能性はあるのでしょ

プが，あのタイプは IgM だったと発表しましうか．

た．それは再現性の問題があって本当かどう品川

今日話さなかったのですが，蛍光抗かわかりませんが，構造解析の点からも非常体で調べますと，非感染の神経系の細胞のとに興味深いと思いますので，もしご存じでし

ころで弱くクロスリアクトするようなものがたら教えてください．

何かあるようです．ですから部分的にプリオ

品川

これは IgG です．スイスのグループ

ンと同じような構造を持っている何かがあるから出ている抗体はある意味で非常にすばらと思って，これを何とか取り出して調べよう

114 第 121 回日本医学会シンポジウム

と思っていますが，強く反応するものではな

感染系の培養細胞に加えて長期間置くと，いのでまだ成功しておりません．それで実際

PrPSc の原料になる PrPc がなくなってなくなに認識しているエピトープはどこかをはっきるというかたちの効き方です．この抗体は予り言うことができない状態です．

備的にやったところでは，あらかじめ感染性座長

昨日の金子先生のお話にもかかわりのあるものとウイルスの中和試験のようなかますが，治療薬としてはどうでしょうか．in

たちで混ぜておいて接種すると，潜伏期が延vivo は こ れ か ら だ と 思 い ま す が，in vitro長することを観察しています．ですから現象の感染実験のようなもので，これを投与してとしていわゆる中和が部分的にあるのかなとおくと予防効果があるかどうか．

思いますが，これを使って予防ということは品川

その実験もいま進行中です．ここはクローズドですからごく一部をちらっと漏ら

ちょっと難しいと思います．
座長

ありがとうございました．

しますと，金子先生が話された抗体は，持続プリオン病 115