青大豆の抗アレルギー、抗炎症作用の解析と機能性食品素材開発への展望

大豆の機能性成分と主な効果
機
成 分

提唱されている効果

イソフラボン

癌化抑制、癌細胞増殖抑制、骨粗鬆症緩和、更年期障害緩和

サポニン

抗酸化作用、癌細胞増殖抑制

ビタミン類

成長促進作用、抗酸化作用

フィチン酸

癌化抑制

アントシアニン

抗酸化作用

静岡県立大学大学院生活健康科学研究科
日清製粉グループ高次機能性食品探索研究室

タンパク（ペプチド）

血中コレステロール低下作用、血圧上昇抑制 抗酸化作
抑制、抗酸化作用、抗肥満
抗 満

今井伸二郎

脂質HDL増加促進、脂質代謝改善、脳機能改善研究の背景と目的
背景：
大豆はアレルゲンとしての側面が重視され、オリゴ糖等の活性が報告されているだけで、抗アレルギ に着目した研究はあまりなされていな
レルギーに着目した研究はあまりなされていない。
目的：
大豆を中心に雑穀 豆類を対象にした 新規抗大豆を中心に雑穀・豆類を対象にした、新規抗アレルギー機能性食品素材を探索する。

研究概要• 雑穀・豆類に関する新たな機能性を評価するた
めエタノール抽出物ライブラリーを作成。
• IFN-γプロモーター領域にルシフェラーゼ遺伝
IFN γプロモーター領域にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだT細胞様株を用い、IFN-γ亢進
活性評価法を作出した。
活性評価法を作出した• ライブラリーを評価したところ青大豆に活性がライブラリ を評価したところ青大豆に活性が確認された。

青大豆に着目し更なる研究を開始

青大豆概要IFN-γレポータージーンアッセイ

青大豆は、外皮、子葉部の色から２種類に分類。
“外皮・子葉ともに緑色” or “外皮のみ緑色、子葉は黄色”
胚芽も白 黄 黒 暗褐色等がある
胚芽も白、黄、黒、暗褐色等がある。
左から黄大豆（フクユタカ）
青大豆（エチゴミドリ
中国産青大豆モンゴル産青大豆）

IFN-γプロモーター領域にLuciferase遺伝子を組み込んだプ
ラスミドをヒトT細胞様株Jurkat細胞に遺伝子導入し レラスミドをヒトT細胞様株Jurkat細胞に遺伝子導入し、レポーターアッセイ法によるスクリーニングを実施した。
IFNγ Promoter

f1 ori
Panomic社製

導入

Amp r
ｲｿﾌﾗﾎﾞﾝ

ｻﾎﾟﾆﾝ

ｽﾀｷｵｰｽ（ｵﾘｺﾞ糖）

総ｸﾛﾛﾌｨﾙ

ｶﾛﾃﾝ

青大豆
エチゴミドリ

0.36g

0.43g

3.78g

4.0mg

140μg

黄大豆
フクユタカ

0.22g

0.31g

3.14g

‐4μg

レポーター遺伝子導入細胞株樹立

Jurkat株
Luciferase
pUC ori
SV40 polyA

IFN-γプロモーター活性を指標とした探索

各種大豆のIFN-γ遺伝子発現増強活性・実験方法
細胞を測定用の96wellプレートに播種（1.5 x 104cells / well)

刺激無TPA＋PHA

サンプルの添加（終濃度30 µg/ml, 120 µg/mlおよびDMSO)
CO2インキュベーター内で培養（20hr)
細胞溶解剤および発光基質の添加
ルミノメ タ による発光量測定
ルミノメーターによる発光量測定

DMSO(control)Relattive Intensity

2120 µg/ml
30 µg/mlPHA(Positive control)

Sample 1 Sample 21.510.50DMSO

sample1120µg/ml

sample130µg/ml

sample2120µg/ml

sample230µg/ml

PHA

青大豆抽出物にのみIFN-γ遺伝子発現増強活性確認

Th１、２ in vitro評価系

青大豆抽出物はIL-4を濃度依存的に抑制

・Th1（IFN-γ）
Th1（IFN-γ）
Jurkat E細胞(2 x 106 cells/ml) をプレートに播種

青大豆をEtOH抽出したサンプルを使用

食品サンプル添加（final conc. 30 µg/ml)および刺激物質（PHA 2.5 µg/ml, TPA 5 ng/ml）添加

aIL-４（ELISA）
aCO2インキュ
インキュベーター内で培養（48hr)
タ 内で培養（48hr)
ELISA＆Real-Time PCRにより測定

b・Th2（IL-4)

bcc

マウス（Balb/c）より脾臓摘出後、脾臓細胞懸濁液を調製
2 x 106 cells/ml に調製し、プレートに播種
食品サン ル添加（食品サンプル添加（finalconc. 30 µgµg/ml)および)およびTPA (0.5ng/ml) & A23187 (0.5µM)による刺激
CO2インキュベーター内で培養（20hr)
μg/ml

ELISAにより測定

P < 0.01, means ± SEM
None: without stimulation, Control: with stimulation,

エチゴミドリの抽出画分別活性
青大豆抽出法エチゴミドリ粉砕品
ヘキサン抽出エチゴミドリ熱水抽出物の活性IL-4（ELISA)

IFN-γ

IL-4

*
*

*

*

*

酢酸エチル抽出
エタノ ル抽出エタノール抽出N.D

熱水（95℃）抽出μg/ml/ lμg/mlg/ml* P < 0.01, means ± SEM

熱水抽出物はIFN-γ産生を増強、IL-4産生を抑制する* P < 0.01, means ± SEM
None: without stimulation, Control: with stimulation,

None: without stimulation, Control: with stimulation,

エチゴミドリ熱水抽出物分画スキーム
大豆熱水抽出物(1g)
H2O 20ml添加
1mol/L HCl添加,pH4.6に調整遠心分離（1500,15min）ppt

熱水抽出物フラクション別の活性エチゴミドリ（青大豆）supH2O wash
MeOH添加 50%
遠心分離（1500 15min） 遠心分離（1500,15min）
遠心分離（1500,15min）
遠心分離（1500 15 i ）フクユタカ（黄大豆）

*
*
**

ppt
∥
凍結乾燥
Fraction A

supsupppt∥
凍結乾燥
Fraction B

主要成分
Fr A；高分子のタンパク
Fr.A；高分子のタンパク
Fr.B；多糖類
Fr.C； プチド及びオリゴ糖（高分子）Fr.C；ペプチド及びオリゴ糖（高分子）Fr.D；ペプチド及びオリゴ糖（低分子）H2O 10ml添加
G-25分画高分子∥
凍結乾燥
Fraction C低分子∥
凍結乾燥
Fraction D
主要成分
Fr.A；高分子のタンパク
Fr.B；多糖類
Fr.C；ペプチド及びオリゴ糖（高分子）Fr.D；ペプチド及びオリゴ糖（低分子）in vivo試験概要（共通項目）
試験動物
投与方法
試験匹数
OVA処理内容
測定項目

Balb/c ♂5week♂5 eek
AIN-76に5%混餌
36匹 OVA感作後24匹をIgEにて群分け
OVA 1μg/head アジュバントAl（OH）3 2mg/headを腹腔投与
血清OVA特異的IgE・脾臓細胞培養上清・MLN IL-12b IFN-γ IL-40week

予備飼育

3weeks

7weeksサ プ 投与期間
サンプル投与期間

感作期間

解剖
各種測定

OVA処理
処理 OVA処理
処理 IgE測定
測定

採血serum IgE(ng/mml）

2500.02000.01500.01000.0
500.00.0

17 21 33 25 34 31 26 8 24 30 13 14 10 16 28 7 35 32 6 15 18 27 11 1 23 43

2 19 36 9 12 20 29 5 22

含有量に則した濃度で試験（Fr. A 150 µg/ml, Fr. B 24 µg/ml,Fr. C 22 µg/ml, Fr. D 144 µg/ml)

試験① 青大豆の抽出方法による影響
EtOH抽出物：
全粒青大豆を粉砕し、10倍量のEtOHで24時間抽出し、濃縮乾固
熱水抽出物
全粒青大豆を10倍量熱水（95℃）にて1時間加熱抽出し、凍結乾燥
OVA特異的血清IgEの変化-1week*P < 0.05, **P < 0.01 (vs. control), means ± SEM

P＜0 05
P＜0.05

試験結果① 青大豆の抽出方法による影響
Th1/Th2への影響
Spleen IFN-γ（ELISA)（Spleen IL-4（ELISA)（

試験結果② 青大豆と黄大豆の比較
黄大豆 愛知県産フクユタカ
青大豆 山形県産エチゴミドリ
上記の2種を熱水抽出（95℃,1hour）したものを飼料に混合
OVA特異的血清IgEの変化
P＜0.05

Mesenteric lymph nodes（mRNA)

試験結果② 青大豆と黄大豆の比較試験結果③ 部位別の比較
種皮（8%）

Serum total IgG(ELISA)

種皮：主な成分は繊維
胚芽：イソフラボン、サポニンを多く含む

Mesenteric lymph nodes（mRNA）
（）
子葉部
88%

胚芽（4%)

子葉：たんぱく質子葉
く質 主にグリシニンとグリシβ‐コングリシニン
炭水化物 デンプンはわずか
デ プ はわずかオリゴ糖が主な成分
脂質

不飽和脂肪酸が約80％
リノール酸、オレイン酸、リノレン酸など

青大豆の胚芽、種皮、子葉の3部位に分けたものを粉砕し青大豆の胚芽
種皮 子葉の3部位に分けたものを粉砕しそれぞれを熱水抽出（95℃,1hour）し、飼料に混合試験結果③ 部位別の比較

抗アレルギー効果総括
青大豆に関して抗アレルギー効果を期待しTh2サイトカイン抑制効果を評価したところ 以下の結果を得た
カイン抑制効果を評価したところ、以下の結果を得た。

 Jaukat 細胞でのIFN-γ亢進効果
γ
 マウス脾臓細胞でのIL-4抑制効果
 OVA感作モデルでのIgE産生抑制活性

青大豆摂取はアレルギー抑制効果が青大豆摂取はアレルギ抑制効果が期待される。
子葉部 活性を持 も子葉部に活性を持つものが存在している可能性が示唆される存在る可能性
唆される

活性成分本体、作用メカニズムに関しては不明な点が多く、活性成分本体
作用メカニズムに関しては不明な点が多く
今後検討予定青大豆の抗炎症効果

方法：in vitro 抗炎症評価法• 抗アレルギー素材として青大豆が着目さ抗アレルギ 素材として青大豆が着目されたことからその他の機能を探索した。
• また、各種物理化学的加工を青大豆に加また 各種物理化学的加工を青大豆に加え機能性評価を行った。
• その結果青大豆に光照射することで抗炎症効果が確認された。

光照射青大豆の抗炎症効果検討

ヒトT細胞様株Jurkat 5×105/well↓
TCR代替刺激 PMA+A23187添加↓Sample添加 37℃ 18時間↓
Culture Sup Interleukin-2測定
IL 2測定：ELISA
IL-2測定：ELISA

物理的加工による活性化の検討

青大豆品種特異的 IL-2 産生抑制効果
800
700
600
500
400
300
200
1000

青大豆

黄大豆

その他大豆

600400200

疾患モデル動物を用いた in vivo 試験による検証へ

EtOH抽出物蛍光灯照射によるIL-2の経時変化

RRelativee IL-2 % for C
Control

120
100
2cm 70klux
14cm 12.5klux
30cm 3.7klux
57cm 11.7klux
7klux
No treatment

8060
402000102030

Exposed time (hr)

40

H237℃
37＋℃
Visib
lelight

No

抗炎症機能を有する可能性O
2controAilrbub
bling
Visib
lelig
ht
UVlig
ht

0tre

青大豆EtOH抽出物に青大豆特異的，かつ，各種銘柄・産地の青大豆に共通なIL-2産生抑制活性

800

H2O2

＊くらかけ・長野子葉部は緑色 音更大振袖は皮のみ緑色

1000

Cont
rolatment

各種大豆を添加したときのIL-2産生量

1200
IL-2 pg/ml

cont
rol
有C機
青 ontr
大ol
豆・中
ひ
た
国
し豆・宮ひ
た
城
し豆越・中
後
み国
どり・山ひた形
し豆・福ひ
中た国島し青大 豆･
山豆形
粉末・中国
黒神
秋・山試
み
形
どキ り・ 秋
ヨ田
ミド
岩
リ・福手
み
岡
どり・岩
青丸
くん 手くら ・ 岩
手
かけ
・長野
秘伝
秋・山田
み音
形
ど更り
大袖 ・秋
丹
田
振
天 波産
・北日
海
黒乾
道
大
燥
大 豆・
丹
黒波
豆
さ・北とう
海
い
道らず
・宮
城
赤豆
茶 ・山形
大豆・秋
エ
ン
田
レ
イ・北
祝
陸
黒・北海
道
茶豆
ス
契・山ズ
約
ヒ形
栽
メ・北培
契約
海
大栽
道
豆培
・北手
海
光
よ道
黒り・北豆
海
大道
豆・北ふ
くゆ海道
たか・袋
井Nega

物理的加工
酸化 ：H2O2 添加，エアーバブリング 48hr
光照射 ：蛍光灯照射48hr，UV灯照射48hr：蛍光灯照射48hr UV灯照射48hr
加温 ：37℃ 48hr
評価対象：青大豆EtOH抽出物
評価対象
青大豆EtOH抽出物
1400

tiveIL-22(pg/mL)

各種大豆品種の活性比較

蛍光灯またはUV灯照射によって活性化．

青大豆サンプル調製方法
乾燥種子粉砕（ミキサー）↓ヘキサン脱脂
↓
脱脂残渣
↓（乾燥）
5倍量エタノール添加↓
2時間撹拌抽出（室温）
↓吸引濾過
↓
上清
↓
濃縮乾燥（収率 2%）
エタノール抽出物

乾燥種子粉砕（ミキサー）↓5倍量熱水添加↓1時間撹拌抽出（97℃）↓遠心（13,300×g，20分）
↓
吸引濾過
↓
上清
↓
凍結乾燥（収率 25%）
熱水抽出物
熱抽 物

結果：皮膚炎症状比較

方法：in vivoアトピー性皮膚炎モデル

コントロール群

動物 ： NC/Ngaマウス （♂） 8匹／群 ・・・ アトピー性皮膚炎を発症しやすい
抗原 ： コナヒョウヒダニエキス （ビオスタAD）
耳介，背中に塗付

青大豆摂取群① 無処理群② コントロール群
群③ 光照射青大豆エタノール抽出物 （5％混餌）摂取群④ 光照射青大豆熱水抽出物 （5％混餌）摂取群

エタノ ル抽出物群
エタノール抽出物群

試験食摂取開始
馴化 (21 days) 6/4

抗原（0 day）

6/11

6/18

6/25

7/2

7/9

7/16

抗原
（7 days）

抗原（14 days）

抗原（21 days）

抗原（28 days）

抗原（35 days）

解剖（42 days）

測定項目：体重，アトピー性皮膚炎スコア

結果：皮膚炎スコアの比較

熱水抽出物群か皮（びらん・潰瘍）
か皮（びらん潰瘍）の発生

表皮剥離
発赤10箇所以上

無症状

コントロール群皮膚症状の変化（同一個体での経時変化） エタノール群

コントロール群

青大豆（エタノール）群

6週目（スコア５）

6週目（スコア５）

7週目（スコア６：明確な増悪
週 （明確な増悪 ）7週目（スコア３：治癒傾向）
週目（治癒傾向）Derm
matitis scoree

654

*

3

*

2
10**

**

5回目
6回目
7回目

皮膚炎スコア
０：無症状
１：表皮剥離，発赤4箇所以下
２ 表皮剥離 発赤5箇所以上
２：表皮剥離，発赤5箇所以上
３：表皮剥離，発赤10箇所以上
４：弱いびらんの発生
皮（びら 潰瘍） 発
５：か皮（びらん・潰瘍）の発生
６：か皮（びらん・潰瘍） 2箇所以上**, p < 0.01, * p < 0.05 vs. control. Steel's multiple comparison test

青大豆にアトピー性皮膚炎症状を抑制する効果があることを病態モデルにおいて確認できた．

追試験：青大豆のアトピー性皮膚炎抑制効果検証

方法：追試験 青大豆のアトピー性皮膚炎抑制効果検証
動物 ： NC/Ngaマウス （♂） 8または6匹／群

大豆サンプル調製方法

抗原 ： コナヒョウヒダニエキス
ナ ウ ダ
キ （（ビオスタAD）オ タ ）大豆（青大豆または黄大豆）↓ 熱水処理（加水7倍，90℃以上1時間）
熱水処
水 倍℃
時

試験群：
１． コントロール（AIN76）
ントル（）
２．光照射 青大豆 5.0%
３．光照射 青大豆 2.5%
４．光照射
光 射 黄大豆黄大 5.0%↓ 噴霧乾燥

試験食摂取開始↓ 粉砕
生大豆粉

５ 光未照射青大豆 5.0%
５．光未照射青大豆
６．光未照射青大豆 2.5%
７．光未照射黄大豆 5.0%
光射黄2.5%
８．光未照射黄大豆馴化 (5 days)

大豆粉末↓ 光照射：蛍光灯下10日間
大豆粉末 → 青大豆でのIL-2産生抑制性の増強を確認抗原投与（0 day）

測定項目：体重，背皮膚肥厚，アトピー性皮膚炎スコア

１．青大豆のアトピー性皮膚炎抑制効果の検証ー追試験【抗炎症効果総括】

皮膚炎スコアin vitro

4321*0Control

青 5％ 青 2.5％

光照射

黄 5％

青 5％

青 2.5％

黄 5％

黄 2.5％

皮膚炎スコア
０：無症状
１：表皮剥離，発赤4箇所以下
２：表皮剥離，発赤5箇所以上
表皮剥離，発赤 箇所以
３：表皮剥離，発赤10箇所以上
４：弱いびらんの発生
５：か皮（びらん・潰瘍）の発生
６ か皮（びらん 潰瘍） 2箇所以上
６：か皮（びらん・潰瘍）

未照射* p < 0.05 vs. control by Steel’s multple comparison test.

① 青大豆摂取群では皮膚炎が抑制された．→再現性
青大豆摂取群では皮膚炎が抑制された →再現性
② 青大豆の皮膚炎抑制効果は濃度依存的であった．
③ 黄大豆と比べて青大豆の効果大．→青大豆の優位性
果④ 光照射なしでも効果あり．

１ 青大豆エタノ
１．
青大豆エタノール抽出物は
ル抽出物は，光照射によりIL-2産生
光照射によりIL-2産生抑制活性が増強する
２． 活性は光照度、照射時間に比例し増加する
３． この効果は青大豆品種特異的

in vivo
１． アトピー性皮膚炎病態モデルマウスを用い、光照射青大豆に 皮膚炎症状抑制効果を確認
２ 再現性を確認
２．
３． 依存性を確認
３ 黄大豆に対する優位性を確認
３．
４． 光照射なしでも in vivoでは効果を確認

解剖（53 days）

青大豆開発における今後の予定• 青大豆抗炎症効果の有効性成分の単離同定• 抗炎症効果の作用メカニズム解析• 他の抗炎症モデルによる評価• 光照射代替加工方法の模索

寄附講座シーズ評価研究概要
厳選候補食品素材を各種免疫細胞を用いてサイトカイン産生を評価し、最適な
in vivo 評価により免疫学的特徴を明らかに（プロファイリング）。その後、更に有評価により免疫学的特徴を明らかに（プロファイリング） その後 更に有効性を疾患モデルで評価することにより、機能性食品として可能性を検証する。

プロファイリングin vitro 評価

in vivo 評価

病態モデル評価

機能性食品

IL-4,IL-13↓
IL-12↑IgE↓

Nc/Nga
PCA etc

アレルギー
予防食品

TNFα ↓IL-17↓↓IL-10↑LPS induced
inflammatory

DDSinducedColitis

抗炎症性食品Infection
model

免疫賦活化
食品

IFN↑
TGFβ↑

IgA ↑

静岡県立大寄附講座における機能性食品素材開発への展望
能性食 素• 免疫機能に影響する食品素材の探索★ サイトカインプ
サイトカインプロファイルによる食品素材のファイルによる食品素材の機能性追求★ 的確なin
的確なi vivoによる有効性確認
i による有効性確認• 光照射など物理的加工による機能性亢進
機★ 光照射は新規な加工技術として新規素材の可能性を拡大する事が期待される• 抽出法による有効性の拡大★ 亜臨界抽出等マイナー成分の機能性拡大

静岡県立大学日清製粉グル プ寄附講座
静岡県立大学日清製粉グループ寄附講座
2010年9月で終了した第Ⅰ期寄附講座を引き継ぎ、年 月 終了した第 期寄附講座を引き継ぎ、2010年10月開設。
第Ⅰ期寄附講座では免疫、抗疲労、抗ストレスをキーワードに研究が進められ研究が進められ、アレルギー体質改善に有効な青大豆等の機能ギ 体質改善 有効な青大豆等 機能性を有する食品を見出した。
第Ⅱ期寄附講座では これら成果を更に商品化に繋げることを第Ⅱ期寄附講座では、これら成果を更に商品化に繋げることを目指して、関連研究を展開予定。
 開設期間：2010年10月1日～2014年3月31日
 寄付金及び研究費：総額 1億1200万円
 期待される研究成果：期待される研究成果① 食品成分による免疫疾患の予防② 食品成分による免疫担当細胞を介した生活習慣病予防

寄附講座スタッフ

共同研究体制
免疫関連
学内各研究室
活性測定
化学分析
別途合成
単離精製

*青大豆：
青大豆：第Ⅰ期寄附講座が見出した新たな機能性素材！

免疫微生物学教室（薬）アドバイザー

寄附講座
サイトカインプロファイリング
免疫評価系構築
免疫評価系構築
疾患モデル評価
T細胞分化制御研究青大豆活性成分分析

微生物学研究室（生）免疫学的評価生化学研究室(生）

青大豆＊関連アポトーシス

食品分子工学研究室(生）
プロテオミクス

生物薬品化学教室（薬）老化制御

生：生活健康科学研究科

薬：薬学研究科

協力研究機関
• 株式会社日清製粉グループ基礎研究所• 日清ファルマ株式会社健康科学研究所
寄附講座連絡先静岡県立大学大学院 生活健康科学研究科
日清製粉グループ寄附講座高次機能性食品探索研究室〒422 8526 静岡県静岡市駿河区谷田52-1〒422-8526
静岡県静岡市駿河区谷田52 1
TEL/FAX 054-264-5824
E-mailE
mail imaish@uimaish@u-shizuoka-ken.ac.jp
shizuoka ken.ac.jp (連絡先：今井）URL
静岡県立大学 http://www.u-shizuoka-ken.ac.jp/
寄附講座
http://sfns.u-shizuoka-ken.ac.jp/nissin/index.html

教 授
客員准教授
ポスドク
客員研究員
研究補助員
アドバイザー

中山 勉
農学博士
今井 伸二郎
医学博士
彭 徳子
医学博士
安井 謙介
農学修士
田口今日子 亀岡葉子 伊藤知子
田口今日子、亀岡葉子、伊藤知子
伊勢村 護
理学博士 静岡県立大学名誉教授