福岡県工業技術センター
研究報告 No.29 (2019)

骨代謝細胞の新規低酸素・閉鎖系培養技術の開発（第一報）－破骨細胞分化誘導系での解析結果－
古賀 慎太郎 *1

石川 智之 *1

金沢 英一 *1

緒方 貴宏 *2

坂井 孝則 *2

朴 晶淑 *2

Development of Hypoxic and Closed Culture System
Optimized for Bone-metabolizing Cells- Analysis of Osteoclastogenesis Shintaro Koga, Tomoyuki Ishikawa, Eiichi Kanazawa, Takahiro Ogata, Takanori Sakai and Piao Jingshu

生体内に近い環境で細胞培養や機能解析を行う技術が，骨代謝細胞の研究や骨再生医療において求められている。
しかし通常の細胞培養では，生体内に比べて高酸素，また開放系であり，骨代謝細胞が存在する骨髄環境とは大きく異なっている。そこで，骨代謝細胞をより生体内に近い環境で培養・解析を行うため，低酸素・閉鎖系培養を取り入れた骨代謝細胞の新たな培養法の確立と，当該培養法による細胞の機能解析を行った。RAW264.7細胞を用いて解析した結果，低酸素依存的な細胞増殖の低下と破骨細胞顕著な分化阻害，骨吸収抑制が認められた。抑制のメカニズムについて，細胞死が亢進することや，分化に必要な転写因子の発現が低下することが明らかになった。また試作した閉鎖系培養容器で破骨細胞の分化誘導を行い，容器の課題を見出すことができた。

1 はじめにそこで，低酸素・閉鎖系培養を取り入れた骨代謝細骨は脊椎動物の骨格を形成する組織で，体の支持や胞の新たな培養法の確立と，当該培養法による細胞の血中ミネラルの恒常性，造血環境の提供など，生命維機能解析を行った。第一報では破骨細胞分化誘導系を持に必要な多様な機能を担っている。骨組織は常に骨用いた解析結果を報告する。

吸収と骨形成（骨代謝）を繰り返しており，正常組織ではこの骨代謝がバランスよく維持されている。しか2 研究，実験方法

し骨代謝のバランスが崩れ正常な骨代謝が行われない

2-1 細胞培養

場合，骨 粗しょ う症や 関節 リウマチ をはじ めとし た

マウスマクロファージ細胞株 RAW264.7 は ATCC より様々な疾患を引き起こすことが知られている。

購入し，EMEM (イーグル MEM 培地「ニッスイ」③，日

骨吸収を担う破骨細胞は単球・マクロファージ系の水製薬)に NEAA（非必須アミノ酸，和光純薬）と 10%細胞より分化し，酸やタンパク質分解酵素の分泌によ分の FBS（ウシ胎児血清，Corning）を添加した培地

り骨成分を分解する。対して骨形成を担う骨芽細胞はで培養を行った。大気酸素の場合は CO 2 インキュベー間葉系の前駆細胞から分化し，コラーゲンやリン酸カター（SCA-165DRS，アステック），低酸素はマルチガルシウムなどの骨基質を形成する。これら骨代謝を担スインキュベーター（APM-30D，アステック）を用いう細胞の分化・機能メカニズムを分子レベルで明らかて培養し，酸素濃度は窒素ガスをインキュベーター内にすることが，骨代謝の理解や骨関連疾患の病態解明に導入することにより調整を行った。CO 2 濃度はいずに必要不可欠である。

れの条件でも 5.0%とした。

細胞・分子生物学的な研究において細胞培養は根幹

2-2 細胞増殖の評価技術であり，生体（骨髄）内に近い環境下で細胞の培

RAW264.7 細 胞 を 1 × 10 5 cells/well で 6-well

養と解析を行うことが，骨代謝メカニズムの正確な解

plate に播種し，培養を開始した。3 日後に細胞を剥明へとつながる。しかし従来の培養方法は大気酸素，が し ， 細 胞 数 を Coulter Particle Counter Z1

開放系であり，生体内の環境（低酸素，閉鎖系）とは（Beckman Coulter）により計数した。

大きく異なっている。

2-3 破骨細胞の分化誘導と評価
RAW264.7 細胞を用いた分化誘導法と酒石酸耐性酸*1 生物食品研究所*2 （株）アステック 細胞科学研究所- 9 -福岡県工業技術センター
研究報告 No.29 (2019)
性フォスファターゼ（TRAP）染色は既報に従い実施した 1)。また骨吸収の評価は，細胞を予めリン酸カルシウムで被膜したガラス板上に播種し，破骨細胞へ分化後に細胞を除去，被膜部の分解箇所を破骨細胞による
骨 吸 収 部 と し た 。 吸 収 部 は ImageJ ソ フ ト ウ ェ ア（NIH）により定量化を行った。
2-4 破骨細胞分化過程のモニタリング

図1

閉鎖系培養容器

細胞のモニタリングは，培養細胞観察システム（ CCM-1.4XYZ ， ア ス テ ッ ク ） に よ り 実 施 し た 。

1 容器あたり 3.3×10 5 cells の RAW264.7 細胞を播RAW264.7 細胞を分化密度で播種後，分化開始時から 4種し，翌日に培地交換して分化誘導を開始した。以後日後まで，5 分間隔でタイムラプス撮影を行った。の分化スケジュールは開放系培養と同様に実施した。

2-5 リアルタイム PCR による遺伝子発現解析
各細胞の分化段階における遺伝子発現をリアルタイ

3 結果と考察ム PCR に よ り 解 析 し た 。 細 胞 か ら の RNA 抽 出 は3-1 低酸素が細胞の増殖に及ぼす影響

NucleoSpin RNA Plus （ タ カ ラ バ イ オ ） を 使 用 し ，

本研究においては，RAW264. 7細胞を破骨細胞前駆PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （ タ細胞株として用いた。図2に酸素濃度と細胞増殖とのカラバイオ）により逆転写反応を行うことで cDNA を関係について示す。

作 製 し た 。 PCR 反 応 は TB Green Premix Ex Taq II（タカラバイオ）を用いたインターカレーター法で，95℃ 5 秒→60℃ 30 秒で 40 サイクルの増幅条件により，Thermal Cycler Dice Real Time System II 装置（タカラバイオ）を用いて解析した。解析した遺伝子と使用したプライマー配列は以下の通りである。

Rank-f5’-CATCTTCGGCGTTTACTACAGG-3’

Rank-r

5’-TCCACTTAGACTACTGCAAGCA-3’

Trap-f5’-TCCTGGCTCAAAAAGCAGT-3’

Trap-r5’-ACATAGCCCACACCGTTCTC-3’

DC-STAMP-f 5’-TCCTCCATGAACAAACAGTTCCAA-3’

図2

低酸素が細胞増殖へ及ぼす影響

DC-STAMP-r 5’-AGACGTGGTTTAGGAATGCAGCTC-3’
Ctsk-f5’-CAGTAGCCACGCTTCCTATCC-3’

計数した結果，10% O2 で大気酸素と同等，あるいはCtsk-r5’-GAGACAGAGCAAAGCTCACCA-3’

増殖が良かったが，2% O 2 では明らかな増殖低下が認

NFATc1 -f5’-CAAGTCTCACCACAGGGCTCACTA-3’

められた。5% O 2 でも同様に増殖が低下した（データNFATc1 -r5’-GCGTGAGAGGTTCATTCTCCAAGT-3’省略）。また培養中の細胞の状態が非常に悪くなり，

βactin-f5’-TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’

継代を繰り返すほど増殖が不安定になることが分かっ

βactin-r5’-AAGAAGGAAGGCTGGAAAAGAG-3’

た。この結果から，RAW264.7細胞は5% O 2 以下の低酸

2-6 閉鎖系培養容器の試作と破骨細胞の分化素により細胞の増殖が低下することが分かった。
3-2 低酸素が破骨細胞分化と機能に及ぼす影響

閉鎖系培養容器は 5 cm×5 cm 角の容器で，厚さが1, 2, 4 mm の 3 種類を試作した。辺縁部はガス透過

破骨細胞分化への影響を調べるため，各酸素条件で性のシリコンゴムでシールし，2 ヵ所の細胞・培地導分化させ，分化の指標であるTRAP染色を行った。低酸入口を持つ（図 1）。細胞の導入や液体の入れ替え・素にする時期は分化開始時からと，分化後半の3日目除去作業は，全てシリンジを用いて慎重に実施した。

からの2条件検討した。

- 10 -福岡県工業技術センター
研究報告 No.29 (2019)a) 大気酸素

分化開始時から10%

分化3日目から10%細胞の骨吸収活性により，培養基板上のリン酸カルシウム化合物が分解され穴が生じる（図4-a)）。この穴の面積を定量化して比較した結果，大気酸素条件では4～5日目にかけて吸収面積の増大が認められるのに対し，2% O2 では顕著に抑制されていた（図4-b)）。このb) 大気酸素

分化開始時から2%

分化3日目から2%ことから，低酸素はRAW264.7細胞の破骨細胞分化だけでなく，骨吸収も抑制することが分かった。
3-3 細胞のモニタリングによる低酸素の影響解析
これまでの結果から，低酸素により破骨細胞の分化は抑制されることが明らかとなった。その影響につい200 μm

図3

破骨細胞分化における酸素濃度の影響て詳細に解析するため，破骨細胞の分化過程における細胞の挙動をタイムラプス撮影により観察した。

0-3d Atm(p2) vs. 2%(p2)0000-0288-0576-0804

2%および10% O2 での結果を図3に示す。コントロー
分化開始時

1日後

2日後

3日後

大気酸素

ルの大気酸素条件では，TRAP陽性の多核の成熟破骨細胞が多数形成される（図3左列）。しかし低酸素ではどの酸素濃度でも，また低酸素暴露の時期に関わらず，破骨細胞分化は阻害されることが分かった（図3）。ま2% O2

たこの現象は酸素濃度が低いほど，あるいは低酸素暴露期間が長いほど顕著で，分化開始時から2% O 2 にし180612,13 TRAP, HAp (2％O2 from 4,5day, KP11)

た場合，多核の破骨細胞はほとんど形成されない（図100 μm3-b)）。この結果から，低酸素環境はRAW264.7の破骨

図5

破骨細胞分化過程のモニタリング細胞分化を顕著に阻害することが分かった。
破骨細胞分化過程のモニタリング結果を図5に示す。
a)b)

大気酸素環境における破骨細胞分化は，細胞増殖や活4

骨吸収面積（相対比）

3.5200 μm※白く抜けた箇所が骨吸収部分

大気酸素を形成する（図5上段）。しかし2% O2 では，分化開始12.5
2日後までは大気酸素と同様の挙動であったが，それ以1.5

降は細胞死が亢進して細胞数が減少し，多核の破骨細10.5胞はほとんど形成されなかった（図5下段：矢印は死

04日目

図4

発な遊走を経て細胞融合し，最終的に巨大な多核細胞

2% O23細胞を示す）。また，培地中へのLDH放出を指標とした

5日目

低酸素が骨吸収活性に及ぼす影響

細胞傷害活性の測定を行った結果，2% O 2 では破骨細胞分化過程の中期において，顕著な細胞傷害が生じて次に骨吸収活性について検討を行った。特に，破骨いることが判明した（データ省略）。これらの結果を細胞分化において最も顕著な変化が見られた2% O 2 条

合わせて，低酸素環境は分化の中期段階で過剰な細胞件に着目し，実験を行った。図3の結果から，破骨細死を誘導し，破骨細胞の分化を顕著に抑制することが胞分化阻害による骨吸収低下の影響を極力排除し，成考えられる。

熟破骨細胞における骨吸収活性を見る必要があった。

3-4 低酸素培養における遺伝子変動の解析

そこで，成熟破骨細胞が形成される分化4日目までは低酸素が破骨細胞分化過程における細胞の遺伝子発大気酸素条件で分化誘導し，その後5日目まで2% O 2 条

現にどのような影響を与えているか調べるため，リア件で培養した。

ルタイムPCRにより代表的な遺伝子群の解析を行った。

骨吸収活性の結果を図4に示す。グラフは4日目の吸

なお各時点での遺伝子発現は，リファレンス遺伝子 β

収面積を1とし，その相対比として示している。破骨-actin で補正を行い，0日目の発現を1として相対比を- 11 -

福岡県工業技術センター
研究報告 No.29 (2019)算出した。各遺伝子の概要は以下の通りである。

うな現象はT25フラスコでは見られなかった。これら

RANK ：破骨細胞分化に必須の受容体。の結果から，試作した閉鎖系培養容器において，NFATc1 ：破骨細胞分化に必須の転写因子。

RAW264.7の破骨細胞分化は阻害され，特に中心部ではTRAP, DC-STAMP , CTSK ：分化依存的に発現上昇するそれが顕著であることが分かった。前述した低酸素培遺伝子で，破骨細胞分化や骨吸収に必要。

養での解析結果と試作容器中心部での破骨細胞の表現

破骨細胞分化 (RAW264.7細胞KP-9、分化3日目)

型が類似していることから，溶存酸素量の違いにより破骨細胞分化 (RAW264.7細胞、分化4日目)

辺縁部と中心部で分化に偏りが生じた可能性が高い。

図6t1 mm

t2 mm

t4 mm

T25

破骨細胞分化過程における遺伝子変動解析

各遺伝子の発現変動を図6に示す。解析の結果，

RANK の発現には影響がなかったが，分化初期において200 μm

NFATc1 発 現 は 低 下 し て お り ， ま た 分 化 後 期 の TRAP,

図7

閉鎖系培養容器における破骨細胞分化DC-STAMP, CTSK の発現も顕著に低下していた。これらの結果から，低酸素環境では破骨細胞分化初期のシグ4 まとめナル伝達が抑制され，必要な遺伝子群の発現が低下し本研究により，低酸素は破骨細胞の分化シグナルをたことが考えられる。

抑制し，細胞死を誘導，顕著に破骨細胞の形成と骨吸3-5 閉鎖系培養容器を用いた破骨細胞分化の解析収機能を阻害することが分かった。また閉鎖系培養容

最後に，試作した閉鎖系培養容器で破骨細胞分化の器の開発において，今回の試作容器では低酸素が原因解析を行った。開放系培養との比較のため，同じ培養と思われる破骨細胞の分化阻害や，不均一な分化が生面積を持つT25培養フラスコを用意し，比較を行った。

じることが判明した。本成果は均質な細胞状態を維持

まず試作容器への細胞の接着性について調べた結果，する培養容器の開発に活かし，低酸素培養を組み合わT25フラスコと同等の接着性を示し，生着細胞の数やせた新たな培養法の確立を目指したい。

形態にも異常は認められなかった（データ省略）。
図7に3種類の試作容器（厚さ1, 2, 4 mm）とT25フ

謝辞

ラスコにおける破骨細胞分化の結果を示す。分化開始

本研究は筆頭著者を研究代表者とし，柿原科学技術4日目にTRAP染色を行った結果，閉鎖系培養容器では研究財団 科学技術研究助成事業の支援を受け実施し破骨細胞分化が阻害されており，特に1 mmと2 mm厚でたものです。

は阻害が顕著であった。また，4 mm厚容器では分化は認められるものの，多核の破骨細胞が明らかに少なか

5 参考文献った（図7）。培養中の細胞を観察した結果，1 mmと21)古賀慎太郎：福岡県工業技術センター研究報告，No.

mm厚の培養容器では分化途中で多くの細胞が死んでい19，pp. 41-44 (2009)

ることが判明した（データ省略）。さらに閉鎖系培養容器では，辺縁部と中心部で破骨細胞の分化の進行に偏りがあり，ガス交換部に近い辺縁部の方が分化していることが確認された（データ省略）。なお ，このよ- 12 -2018