福岡県工業技術センター
研究報告 No.29 (2019)

骨代謝細胞の新規低酸素・閉鎖系培養技術の開発（第二報）－骨芽細胞分化誘導系での解析結果－
古賀 慎太郎 *1

石川 智之 *1

金沢 英一 *1

緒方 貴宏 *2

坂井 孝則 *2

朴 晶淑 *2

Development of Hypoxic and Closed Culture System
Optimized for Bone-metabolizing Cells- Analysis of Osteoblastogenesis Shintaro Koga, Tomoyuki Ishikawa, Eiichi Kanazawa, Takahiro Ogata, Takanori Sakai and Piao Jingshu

生体内に近い環境で細胞培養や機能解析を行う技術が，骨代謝細胞の研究や骨再生医療において求められている。
しかし通常の細胞培養では，生体内に比べて高酸素，また開放系であり，骨代謝細胞が存在する骨髄環境とは大きく異なっている。そこで，骨代謝細胞をより生体内に近い環境で培養・解析を行うため，低酸素・閉鎖系培養を取り入れた骨代謝細胞の新たな培養法の確立と，当該培養法による細胞の機能解析を行った。MC3T3-E1細胞を用いて解析した結果，低酸素環境は骨芽細胞分化を抑制する一方，継代培養時の分化能維持に良い影響を与えることが分かった。また分化過程で低酸素が細胞死を亢進することや，分化シグナルを抑制することが明らかになった。また試作した閉鎖系培養容器で骨芽細胞の分化誘導を行い，容器の課題を見出すことができた。

1 はじめにそこで，低酸素・閉鎖系培養を取り入れた骨代謝細骨は脊椎動物の骨格を形成する組織で，体の支持や胞の新たな培養法の確立と，当該培養法による細胞の血中ミネラルの恒常性，造血環境の提供など，生命維機能解析を行った。第二報では骨芽細胞分化誘導系を持に必要な多様な機能を担っている。骨組織は常に骨用いた解析結果を報告する。

吸収と骨形成（骨代謝）を繰り返しており，正常組織ではこの骨代謝がバランスよく維持されている。しか2 研究，実験方法

し骨代謝のバランスが崩れ正常な骨代謝が行われない

2-1 細胞培養

場合，骨 粗しょ う症や 関節 リウマチ をはじ めとし た

マウス頭蓋骨由来細胞株 MC3T3-E1 は理研バイオリ

様々な疾患を引き起こすことが知られている。

ソースセンターより購入し，MEMα（アスコルビン酸

骨吸収を担う破骨細胞は単球・マクロファージ系の不含 ，GIBCO） に Penicillin-Streptomycin （ 和光 純細胞より分化し，酸やタンパク質分解酵素の分泌によ薬）と 10% 分の FBS（ウシ胎児血清，Corning）を添り骨成分を分解する。対して骨形成を担う骨芽細胞は加した培地で培養を行った。培養用インキュベーター，間葉系の前駆細胞から分化し，コラーゲンやリン酸カ各種ガス濃度の調整については，前報「骨代謝細胞のルシウムなどの骨基質を形成する。これら骨代謝を担新規低酸素・閉鎖系培養技術の開発（第一報）」と同う細胞の分化・機能メカニズムを分子レベルで明らか様に実施した。にすることが，骨代謝の理解や骨関連疾患の病態解明

2-2 細胞増殖の評価
MC3T3-E1 を 5×104 cells/well で 6-well plate にに必要不可欠である。
細胞・分子生物学的な研究において細胞培養は根幹播種し，培養を開始した。3 日後に細胞を剥がし，細技術であり，生体（骨髄）内に近い環境下で細胞の培胞 数 を Coulter Particle Counter Z1 （ Beckman

養と解析を行うことが，骨代謝メカニズムの正確な解Coulter）により計数した。

明へとつながる。しかし従来の培養方法は大気酸素，2-3 骨芽細胞の分化誘導と評価開放系であり，生体内の環境（低酸素，閉鎖系）とはMC3T3-E1 細胞を用いた分化誘導法とアルカリフォスファターゼ（ALP）染色は既報に従い実施した 1) 。

大きく異なっている。

骨形成の指標であるアリザリンレッド染色（石灰化評*1 生物食品研究所*2 （株）アステック 細胞科学研究所- 13 -

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価セット，PG リサーチ）は，キットのプロトコール省略）。このことから，MC3T3-E1細胞は低酸素によるに従い実施した。

増殖の低下はあるものの，RAW264.7細胞よりも安定な2-4 骨芽細胞分化過程のモニタリング状態で維持可能であることが分かった。

細胞のモニタリングは，培養細胞観察システム（CCM-1.4XYZ，アステック）により実施した。MC3T3E1 を分化密度で播種後，分化開始後 11 日目から 14日目まで，10 分間隔でタイムラプス撮影を行った。
2-5 リアルタイム PCR による遺伝子発現解析
リアルタイム PCR による解析は前報「骨代謝細胞の新規低酸素・閉鎖系培養技術の開発（第一報）」と同様に実施した。解析した遺伝子と使用したプライマー配列は以下の通りである。

Runx2-f5’-GCCCAGGCGTATTTCAGA-3’

Runx2-r5’-TGCCTGGCTCTTCTTACTGAG-3’

Osterix-f5’-CTCCTGCAGGCAGTCCTC-3’

Osterix-r

5’-GGGAAGGGTGGGTAGTCATT-3’

Alp -f5’-CGGATCCTGACCAAAAACC-3’

Alp -r5’-TCATGATGTCCGTGGTCAAT-3’

Col1a-f5’-CCAGCCGCAAAGAGTCTACA-3’

Col1a-r5’-TTCCACGTCTCACCATTGGG-3’

図1

低酸素が細胞増殖へ及ぼす影響

3-2 低酸素が骨芽細胞分化と機能に及ぼす影響
骨芽細胞分化と機能への影響を調べるため，各酸素条件で分化させて検討した。
a)b)
大気酸素

大気酸素

10% O22% O2βactin-r5’-AAGAAGGAAGGCTGGAAAAGAG-3’

2-6 閉鎖系培養容器の試作と骨芽細胞の分化

ALP

5’-TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’
Alizarin red

βactin-f

ALP

Osteocalcin -r 5’-CGCCGGAGTCTGTTCACTAC-3’

Alizarin red

Osteocalcin -f 5’-TGACCTCACAGATGCCAAGC-3’

閉鎖系培養容器は前報「骨代謝細胞の新規低酸素・0.5cm閉鎖系培養技術の開発（第一報）」と同じ試作容器を

図2

骨芽細胞分化過程における低酸素の影響5使用した。1 容器あたり 6.6×10 cells の MC3T3-E1

180323 OBgenesis for 7 days, KP-11細胞を播種し，翌日に培地交換して分化誘導を開始し

171124 OBgenesis for 7 days, KP-10

171128 OBgenesis
for 14 days, KP-9
180420OBgenesis for 14 days, KP-7
分化期間を通して低酸素環境（2%,10%）で培養し，た。以後の分化スケジュールは開放系培養と同様に実7日目に骨芽細胞分化の指標であるALP染色，14日目に施した。

機能の指標であるAlizarin red染色を行った（図2：黒い部分が染色部）。コントロールの大気酸素条件と3 結果と考察比較した結果，10% O 2 では分化・機能ともにほぼ同等

3-1 低酸素が細胞の増殖に及ぼす影響であったが（図2-a)），2% O2 では顕著に阻害が認めら本研究においては，MC3T3-E1細胞を骨芽細胞前駆細れた（図2-b)）。

胞株として用いた。図1に酸素濃度と細胞増殖との関

また，骨芽細胞分化中に24時間間隔での間欠的な低酸素暴露を行い,分化能を検討したが，10%と2% O 2 条係について示す。
その結果，10% O2 では大気酸素と同等，あるいは増件ともに分化の促進は認められず，むしろ大気酸素条殖が良い傾向であったが，2% O 2 では前報のRAW264.7件よりも抑制されていた（データ省略）。これらの結細胞と同様に増殖が低下した。しかし顕微鏡観察によ果からMC3T3-E1細胞の骨芽細胞分化・機能について，る細胞の状態は大気酸素とほとんど変わらず，また継特に2% O 2 では，暴露期間に関わらず阻害されること代を繰り返しても細胞の増殖は安定していた（データが分かった。

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研究報告 No.29 (2019)の破骨細胞と同様に，骨芽細胞においても低酸素によ継代培養環境

継代回数

Bgenesis for 7 days, KP-14

考える。上記モニタリング結果に加えて，2% O 2 では骨芽細胞の分化特異的に急激な細胞傷害が生じることがLDH放出測定により判明しており，この可能性を裏付けている（データ省略）。
10-14d Atm(p5) vs. 10%(p6) vs. 2%(p2)0000-0072-0144-0288

9回目

OBgenesis for 7 days, KP-7

る細胞増殖の停止と細胞死が分化・機能阻害の要因と

2% O2

2回目

大気酸素

撮影開始（11日目）

図3

24時間後

48時間後

大気酸素

1 cm

12時間後

骨芽細胞分化における低酸素の影響

10% O2（低酸素での継代培養の影響）続いて上記とは異なる条件での低酸素の影響を調べ
る た め ， 以 下 の 実 験 を 行 っ た 。 低 酸 素 （ 2% O 2 ） で2% O2

MC3T3-E1細胞を継代，維持培養を続け，その細胞を大気酸素条件で骨芽細胞へと分化させ，7日目にALP染色によりコントロールと比較を行った。その結果，大気200 μm

酸素下での継代培養は，培養期間依存的に骨芽細胞への分化能を低下させるのに対し，2% O 2 での継代培養

図4

骨芽細胞分化過程のモニタリングはその低下を明らかに抑制することが分かった（図3）。
このことはMC3T3-E1細胞において，低酸素が骨芽細胞3-4 低酸素培養における遺伝子変動の解析分化能を維持する効果があることを示している。また

低酸素が骨芽細胞分化過程における細胞の遺伝子発

この結果 は前述 した分 化過 程での低 酸素の 影響（ 図

現にどのような影響を与えているか調べるため，リア2）と逆で，低酸素が細胞の未分化段階と分化・機能ルタイムPCRにより代表的な遺伝子群の解析を行った。

段階で果たす役割が異なることが推察される。

解析した遺伝子の概要は以下の通りである。

Runx2, Osterix ：骨芽細胞分化に必須の転写因子。

3-3 細胞のモニタリングによる低酸素の影響解析

ALP, Col1a ：分化初期～中期に発現する遺伝子。

次に骨芽細胞分化過程における低酸素の影響を詳細に解析するため，培養中の細胞のモニタリングを行っ

Osteocalcin ：分化後期に発現する遺伝子。

た。骨芽細胞の分化過程は破骨細胞のようにダイナミ

各時点での遺伝子発現量はリファレンス遺伝子 β-ックな細胞の形態変化が起きないことから，分化後期actin で補正を行い， Osteocalcin のみ4日目，その他過程の骨形成（リン酸カルシウム結節の形成）に着目の遺伝子は0日目（分化開始前）の発現量を1として，し，タイムラプス撮影を行った。

その相対変化を算出した（ Osteocalcin は0日目で全くその結果を図4に示す。大気酸素環境において骨検出できなかったため）。

芽細胞は，撮影開始（11日目）から細胞の周囲に急激各遺伝子の発現変動を図5に示す。解析の結果，な骨形成（図4の黒色部）が進み，24時間後にはプラ

Runx2 の発現は大気酸素と2% O 2でほとんど変わらず，トーに達した（図4上段）。10% O 2 でも骨形成が起きる

Osterix は逆に2% O 2の方が分化後期で発現上昇するこ

ものの，非常に緩やかで大気酸素とは明らかな差が生とが分かった（図5上段）。しかし ALP , Col1a,じた（図4中段）。さらに2% O 2 においては，全く形成

Osteocalcin の発現は2% O2で明らかに低下しており，を確認することが できなか った（図 4下段）。また2%

特に ALP と Osteocalcin は顕著な低下が認められる（図O2 では分裂する細胞が非常に少なく，撮影後半には分5下段）。これらの結果から骨芽細胞分化過程において，裂も停止し，死細胞が急激に増える様子を観察するこ

低酸素は転写因子 Runx2, Osterix の発現を抑制せずに，とができた（データ省略）。これらの結果から，前報

ALP , Col1a, Osteocalcin の発現を低下させることが- 15 -福岡県工業技術センター
研究報告 No.29 (2019)分かった。これらの骨芽細胞分化マーカーは Runx2 と開放系のT25フラスコでは見られなかった（図6-a)）。

Osterix によって発現が制御されることが知られてい顕微鏡で観察すると，容器の全面に細胞は接着している。低酸素誘導転写因子であるHIF-1αが他の転写因るものの，一様に骨芽細胞の分化が認められるT25フ子の機能を直接制御する報告もあり，HIF-1αを中心ラスコに対して，試作容器では中心部で顕著に骨芽細とした直接的，間接的なシグナル伝達が骨芽細胞分化胞分化が阻害されていた（図6-b)）。逆にガス交換部制御に関わっていると考える。に近い辺縁部では骨芽細胞分化が進行しており，4 mm厚の容器ではT25フラスコと同等であった（図6-b)）。
これらの結果から，試作した閉鎖系培養容器は，開放系培養と比べて全体的な骨芽細胞分化は低下，分化の偏りが見られ，特に容器中心部での分化が阻害されていることが分かった。前述の低酸素培養で得られた研究結果と，容器中心部の骨芽細胞の表現型が類似していることから，辺縁部と中心部の溶存酸素量の違いにより分化に差が生じた可能性が高い。

図5

骨芽細胞分化過程における遺伝子変動解析

4 まとめ
本研究により，低酸素がMC3T3-E1細胞の分化シグナ

3-5 閉鎖系培養容器を用いた骨芽細胞分化の解析

ルを抑制して，顕著に骨芽細胞の形成と機能を阻害す

前報の破骨細胞の解析と同様に，試作容器での骨芽ることが分かった。一方で，骨芽細胞分化能力の維持細胞分化について調べた。まず試作容器へのMC3T3-E1には，低酸素で継代培養した方が良いという結果も得

細胞の接着性についは，T25フラスコと同等で異常はられた。この低酸素の役割の違いから，酸素濃度によ認められなかった。また分化途中の細胞についても顕り前駆細胞の増殖や分化の指向性を調整できる可能性

骨芽細胞分化 (MC3T3-E1細胞、分化7日目)
微鏡観察を行ったが，RAW264.7細胞とは異なり，明らが考えられる。
2018.3.23,
KP-11

かな細胞死は観察できなかった（データ省略）。

また閉鎖系培養容器の開発において，今回の試作容器では骨芽細胞の不均一な分化を生じることが判明しa)た。このことは，細胞の酸素消費量を賄うには今回のガス交換方法では不十分であることを示している。

左：閉鎖系培養容器
右：T25フラスコ

今後は本研究成果を間葉系幹細胞などに適用して研究することで，骨再生医療に必要とされている，良質T25

t 4 mmt 2 mmな骨芽細胞の培養が可能な細胞培養装置の技術開発にt 1 mm活かしたいと考えている。

中心付近b)

謝辞

辺縁部

本研究は筆頭著者を研究代表者とし，柿原科学技術研究財団 科学技術研究助成事業の支援を受け実施したものです。
200 μm

図6

閉鎖系培養容器における骨芽細胞分化

5 参考文献1)古賀慎太郎：福岡県工業技術センター研究報告，No.

MC3T3-E1細胞を分化刺激後7日目にALP染色した結果，試作容器の辺縁部と中心部で，細胞染色像に顕著な差があることが分かった（図6-a)）。このような現象は，- 16 -20，pp. 22-25 (2010)