●プリオン病――［ II ］プリオン蛋白の代謝とプリオン複製

1．正常プリオン蛋白の機能
小野寺

節＊，作道

章一＊＊

プリオン病は牛海綿状脳症，スクレイピーやクロイツフェルト・ヤコブ病等が含まれる致死的な神経変性疾患である．これらの原因は，本来生体内に含まれる正常プリが，何らかの翻訳後修飾を受けて構造変換を起こし，β シートの多オン蛋白質（PrPC）に変化することにより起こると考えられている．正常型
い異常プリオン蛋白質（PrPSc）
は神経細胞や免疫担当細胞内に存在することが知られている
プリオン蛋白質（PrPC）
が，その機能についてはほとんど分かっていない．
われわれはプリオン遺伝子（Prnp）欠損神経細胞株を樹立し，PrPC がアポトーシスを抑制することを明らかにした．また，アポトーシス抑制関連因子（Bcl-2，Bcl-xL および SOD）との相互作用について検討した．Prnp 欠損神経細胞株に上記の bcl-2，
bclxL，SOD-1 cDNA を導入したところ，Prnp cDNA を導入した細胞株で認められる無血清培地下でのアポトーシス抑制効果が認められた．さらに，Prnp を再導入した細胞株における Bcl-2，Bcl-xL および SOD 蛋白の産生を検討したところ，産生に変化は認
められなかったが SOD 活性の上昇が認められた．
PrPC は銅結合蛋白であることから，銅の代謝を制御することにより細胞内 SOD 活性が上昇したと考えられた．
これらの結果により，PrPC は活性酸素を消去する働きにより神経細胞の生存維持に関わっていることが示唆された．このことは同時に，プリオン感染時にみられる PrPCの欠乏が神経細胞の酸化ストレスに対する抵抗性を弱め，神経細胞死をもたらす可能性を示唆している．

Function of cellular prion protein
TAKASHI ONODERA Department of Molecular Immunology, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyoおのでら・たかし：東京大学大学
院農学生命科学研究科応用免疫学
教授．昭和49年東京大学農学系研究科博士課程修了．昭和52年米国
国立衛生研究所上級研究員．昭和61年農林水産省家畜衛生試験場
免疫研究室長．平成３年現職．主研究領域／ウイルス学，免疫学，
プリオン病．
＊＊
さくどう・あきかず：東京大学
大学院農学生命科学研究科応用免
疫学．
＊

48 第 121 回日本医学会シンポジウム

Key words

アポトーシス
プリオン蛋白質神経細胞株

ウ ト マ ウ ス は，1992 年 に 世 界 で は じ め て
Weissmann らにより作製された4）．このマウ

1．プリオン蛋白質

スは行動異常を示さなかったが，プリオン病

正常型プリオン蛋白質（PrPC）
は，グリコシ

原体を接種しても発病しないため，プリオン

ルホスファチジルイノシトール
（GPI）
アン

感染に PrP 遺伝子が必須であることを証明

カー型細胞表面糖蛋白であり，N 末端の P（Qした5）．さらに，このマウスを用いて大脳海

!
H）
GGG
（G!
−）
WGQ の 5 回繰り返し配列（オ

馬の CA1 領域（学習と記憶に関連）の長期増

クタリピート領域）
において銅イオンと結合

強（long term potentiation）の遅延が報告されする1）．銅は PrPC のエンドサイトーシスを誘ている．また，Manson らにより作製されたC導することから，PrP は銅の代謝を制御する
2）

Npu マウスでは，日内リズム調節異常が報告

機 能 を 持 つ 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る ．まされている．坂口らは Ngsk マウスにおいて，た，ラ ミ ニ ン レ セ プ タ ー 前 駆 体 蛋 白 質，

老齢期に小脳プルキンエ細胞の変性脱落，小GFAP，Hsp60，N-CAM，Bcl-2，nNOS 等が PrP

脳性運動失調がみられたとしている6）．われと結合することが報告されている．しかし，

わ れ も PrP 遺 伝 子 ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス

その相互作用の機能的意味合いはほとんど分（Rikn）
を作製し，解析を行った．このマウス

かっていない．また，最近プリオン遺伝子のは老齢期の行動異常が確認された．

近傍にプリオン蛋白質
（PrP）
様蛋白質
（Doppel : Dpl）
をコードする遺伝子（Prnd ）が発見され，これらの蛋白質の比較から機能を探る
試みもなされている3）．なお，PrPC の機能に関する報告を表にまとめた．

3．プリオン遺伝子欠損神経細胞株の作製と正常型プリオン蛋白質による神経細胞死抑制
われわれは Rikn PrP 遺伝子ノックアウト

2．プリオン遺伝子ノックアウトマウス
を用いた解析

マウスの胎児の海馬領域より神経細胞を分離・培養し，がん遺伝子である SV40 large T
抗原遺伝子をレトロウイルス法で導入するこ

世界で 6 系統の PrP 遺伝子ノックアウトとにより，継代培養が可能なプリオンレス神

マウス（Zrch I，Npu，Ngsk，Rcm0，
Zrch II，

経細胞株 HpL3-4，
HpL3-2 を樹立した7）．同様

Rikn）が作製されている．PrP 遺伝子ノックアに，野生型マウスからも野生型神経細胞株

表

PrP の機能と関連する報告

PrP の機能文献

大脳海馬の CA1 領域の長期増強
日内周期や睡眠周期の維持
神経組織の酸化ストレスに対する耐性
T リンパ球のマイトジェンに対する反応に PrP が必要
銅が PrP のエンドサイトーシスを誘導する
髄鞘の維持
α-PrPAb で PrP を重合させると Fyn が活性化
PrP と laminin 結合が細胞接着及び神経突起伸長に関連
PrP 様蛋白 Dpl の毒性の PrP による中和
Bax 誘導細胞死を PrP が抑制

Collinge J, 1994
Tobler I, 1996
Brown D, 1997
Mabbott N, 1997
Pauly P, 1998
Nishida N, 1999
Mouillet-Richard, 2000
Graner E, 2000
Rossi D, 2001
Bounhar Y, 2001

プリオン病 49

6

12

HW8

図1

24

6

12

24

HpL3-46

12

24

HpL3-4TR

野生型神経前駆細胞株とプリオン遺伝子欠損神経前駆細胞株

野生型神経前駆細胞株（HW8），プリオン遺伝子欠損神経前駆細胞株（HpL3-4），HpL3〜4 株にプリオン遺伝子（Prnp ）を導入した株（HpL3-4TR）．これらの細胞株を 6 時間，12 時間，24
時間無血清培地で培養後に DNA を抽出し，電気泳動により DNA の断片化を観察した．プリオン遺伝子欠損細胞にのみ DNA 断片化がみられ，Prnp 遺伝子再導入により DNA 断片化が抑制
される．

（HW8，HW18）を作製した．野生型神経細胞株

的な役割を果たしていることが示唆された．

HW8 とプリオンレス神経細胞株 HpL 3-4 への無血清培地下での影響を調べた．無血清培
地 置 換 24 時 間 後 に お い て HW8 は 形 態 を4．アポトーシス誘導経路の解析保っているが，一方 HpL3-4 では細胞の円形

次に，PrPC の神経細胞死抑制機構解析のた化，剥離が観察された．無血清培地置換 6，12，めの基礎的データを得るために，プリオンレ

24 時 間 後 に 細 胞 よ り DNA を 回 収 し，DNAス神経細胞株が無血清培地下で示すアポトーの断片化について調べたところ，HpL3-4 で無シスの誘導経路について解析を行った．
まず，血清培地置換後 12 時間後より DNA の 断 片

血清除去下でのアポトーシス抑制因子の発現が検出され，アポトーシスによる細胞死が起変化を調べた．プリオンレス神経細胞（HpL

こっていることが示唆された
（図 1）
．さらに，

3-2）を 0，6，
12，
24 時間無血清培地で培養し，この現象がプリオン遺伝子の発現の有無によ

蛋白質を抽出した．得られた蛋白質を抗マウることを確認するために，マウスプリオン遺ス Bcl-2 抗体，抗マウス Bcl-x 抗体，抗マウス

伝子を HpL3-4 に再導入し，プリオン蛋白を

Cu!
Zn SOD 抗体を用いたウエスタンブロッ

安定発現させたプリオン遺伝子導入細胞株

ティングにより解析した．ミトコンドリアのHpL3-4TR を 作 製 し た．こ の HpL3-4TR はアポトーシス誘導経路に関わっているアポHW8 同様，無血清培地下で生存した．これら

トーシ ス 抑 制 因 子 で あ る Bcl-2，
Bcl-xL の 発

Cの結果により，PrP が細胞の生存維持に間接
50 第 121 回日本医学会シンポジウム

現量が血清除去 12 時間より低下することが

A

0

6

12

24

B

（h）

hyg

bcl2

Bcl-2
Bcl-2
hyg

bclxL

Bcl-xL
Bcl-xLhyg

SOD

Cu/Zn SOD
Cu/Zn SOD
C

1,000

0

1,000
DNA content

0

1,000
DNA content

M1

0

1,000
DNA content

図2

1,000
DNA content

0

1,000
DNA content

0h

0 Cell count 200
0

0 Cell count 200

0 Cell count 200

0 Cell count 200

DNA content

0

1,000
DNA content

0

1,000
DNA content

0 Cell count 200

0

SOD

bclxL
0 Cell count 200

0 Cell count 200

0 Cell count 200

bcl2

24 h

hyg

血清除去による Bcl-2，Bcl-xL の低下と bcl-2，bcl-xL，SOD-1 遺伝子の過剰発
現による細胞死の抑制

A．プリオン遺伝子欠損神経細胞株 HpL3-2 を無血清培地で培養後，細胞を回収しウエスタン
ブロッティングを行った．Bcl-2，
Bcl-xL は時間依存的に発現が低下した．

bcl-xL，SOD-1 遺伝子を pIREShyg ベクターを用いて導入した．空ベク
B．HpL3-2 に bcl-2，
ター pIREShyg を導入した細胞（hyg），bcl-2 遺伝子を導入した細胞（bcl2），bcl-xL 遺伝子を導入した細胞（bclxL），SOD-1 遺伝子を導入した細胞（SOD）を作製した．上記の細胞を抗 Bcl-2 抗体，抗 Bcl-xL 抗体，抗 Cu!
Zn SOD 抗体を用いたウエスタンブロッティン
グによりそれぞれ導入された遺伝子の過剰発現の確認を行った．

C．血清除去 0，24 時間後の細胞を Propidium iodide 染色後，フローサイトメトリー解析により，アポトーシス細胞の検出を行った．空ベクター導入細胞（hyg）においてアポトーシ
スに特徴的な細胞群が検出された．bcl-2，bcl-xL，SOD-1 を導入した細胞ではアポトーシ
スが抑制されていることが示唆された．
M1 に示す領域の細胞群がアポトーシス細胞である．

プリオン病 51

示唆された（図 2 A）．そこで，さらに bcl-2，

唆された．

bcl-xL および SOD-1 遺伝子の過剰発現により解析を行うことにより，ミトコンドリアのアポトーシス誘導経路や細胞内活性酸素の発5．PrPc 産生量と SOD 活性の関係

生を抑制することで細胞死が抑制できるかを

プリオンレス神経細胞とプリオン遺伝子再調べた．空ベクタートランスフェクタント

導入株の比較を行うことにより，PrPC の神経

HpL3-2-phyg（hyg），bcl-2 遺伝子トランスフェ

細胞死抑制機構の解析を行った．まず，プリクタント HpL3-2-bcl2（bcl 2），bcl-xL 遺伝子

オン遺伝子再導入株を作製し，PrPC の産生をトランスフェクタント HpL3-2-bclxL（bclxL），

確認した．
これらの細胞の Bcl-2，
Bcl-xL，
Cu!
Zn

および SOD-1 遺伝子トランスフェクタント

SOD 産生量をウエスタンブロッティングに

HpL3-2-SOD（SOD）の Bcl-2，
Bcl-xL，Cu!
Zn

より測定した．プリオン遺伝子再導入株とプSOD の蛋白産生量をウエスタンブロッティ

リオンレス細胞の Bcl-2，
Bcl-xL，Cu!
Zn SODングにより解析し，それぞれのアポトーシ抑量に有意な差はみられなかった（図 3 A）．ま

制因子の過剰発現を確認した（図 2 B）．次に，

た，同様にプリオン遺伝子ノックアウトマウ

血清除去 24 時間後の細胞の核を DAPI で染ス脳と野生型マウス脳の Bcl-2，
Bcl-xL，Cu!

色し，核の凝縮および断片化を蛍光顕微鏡で

Zn SOD量に有意な差はみられなかった（図 3B）．

調べた．HpL3-2-phyg においてアポトーシス

ところが，SOD 活性を比較したところ，プリ細胞に特徴的な核の凝縮および断片化が確認

オン遺伝子再導入株で有意に SOD 活性の上され，HpL3-2-bcl2，HpL3-2-bclxL および HpL

昇がみられた（図 3 C）．そこで，血清除去下3-2-SOD ではアポトーシス細胞の 割 合 が 低での活性酸素の発生量を，フリーラジカル特く，アポトーシスが抑制されていることが示

異的蛍光プローブを用いたフローサイトメト

唆された．さらに，上記のトランスフェクタ

リー解析により調べた．SOD は 2O2・−＋2H＋ントを血清除去 0 時間および 24 時間で培養→H2O2+O2 の反応を触媒する酵素であり，活し，Propidium iodide 染色後フローサイトメ

性酸素を消去して過酸化水素に変換する．Di-

トリーによりアポトーシスの解析を行った．

hydroethidium により細胞内活性酸素を蛍光

Sub-G1!
G0 領域に出現するアポトーシス細染色し，フローサイトメトリーにより測定し胞が HpL 3-2-phyg において検出され，HpL3-

たところ，プリオンレス神経細胞でみられる

2-bcl2，HpL3-2-bclxL お よ び HpL 3-2-SOD で

活性酸素の発生が，プリオン遺伝子再導入株

はアポトーシス細胞の割合が低く，アポトー

では低下していることが示唆された．さらにシスが抑制されていることが示唆された（図

2 ,7 -dichlorofluorescein diacetate 染 色 に よ2 C）．
また，培地への SOD の添加は細胞死をり過酸化水素量の測定を行ったところ，プリ抑制しなかったので，培地中に放出された活オン遺伝子再導入株において過酸化水素の蓄性酸素が周りの細胞の細胞死を誘導するので積がみられた．以上の結果から，プリオン遺はなく，個々の細胞内で活性酸素が発生し，伝子の再導入により SOD 活性が上昇し，活性個々の細胞の細胞死を誘導していることが示

酸素の消去および過酸化水素の蓄積が起きて唆された．以上の結果から，プリオンレス神いることが示唆された．

経細胞は細胞内で活性酸素が発生したのち，ミトコンドリアのアポトーシス誘導経路を介してアポトーシスが誘導されていることが示
52 第 121 回日本医学会シンポジウム

おわりに1997 年ノーベル医学・生理学賞を受賞し

A

1

2

3

B

WT

KO

PrP

PrP

Bcl-2

Bcl-2

Bcl-xL

Bcl-xL

Cu/Zn SOD

Cu/Zn SODC

SOD activity [U/mg]

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

HpL3-4

図3

HpL3-4PrPNo3

HpL3-4PrPNo7

Prnp の再導入による抗酸化活性の上昇（HpL3-4：lane1）
およA．ウエスタンブロッティングにより，プリオン遺伝子欠損神経細胞株（HpL3-4PrPNo3：lane2；HpL3-4PrPNo7：lane3）の PrP，Bcl-2，
Bcl-xLび Prnp 再導入株の蛋白産生量を比較した．Prnp の再導入により Bcl-2，Bcl-xL，Cu!
Zn SOD の蛋白質産生
量に変化はなかった．
（WT）
およびプリオン遺伝子ノックアウトマウス脳（KO）の Bcl-2，
B．同様に野生型マウス脳
Bcl-xL，Cu!
Zn SOD の蛋白質産生量を比較したが，差はみられなかった．
（HpL3-4PrPNo3，HpL3-4PrPNo 7）
C．Prnp の再導入による SOD 活性の上昇．Prnp 再導入株がプリオン遺伝子欠損神経細胞株（HpL3-4）よりも有意に高い SOD 活性を示した．

た Prusiner 博士は，!プリオン病の病原体はによる PrPC の機能解析により，PrPC は活性単一のプリオンという蛋白質だけからなり，酸素を消去する働きにより神経細胞の生存維

DNA や RNA を 含 ま な い こ と，" PrPSc が持に関わっていることが示唆された．このこCC

PrP と接触し，PrP をプロテアーゼ抵抗性のとは同時に，プリオン感染時にみられる PrPC

PrPSc に変換して脳内に蓄積することによりの欠乏が神経細胞の酸化ストレスに対する抵8）

発病するというプリオン仮説を提唱した ．

抗性を弱め，神経細胞死をもたらす可能性を

しかしながら，プリオン病原体感染動物の脳示唆している．

Sc

Sc

では PrP の蓄積だけでなく，PrP への変換
による PrPC の枯渇も起きており，PrPSc の蓄C積と PrP の枯渇のどちらがプリオン病でみられる神経細胞の脱落の原因であるか分かっていない9）．われわれが解析した in vitro 系〔文献〕
1）Brown DR, Qin K, Herms JW, et al. : The cellular prion
protein binds copper in vivo . Nature 1997 ; 390 :684―687.

プリオン病 53

2）Pauly PC, Harris DA : Copper stimulates endocytosisof the prion protein. J Biol Chem 1998 ; 273 : 33107―
33110.
3）Moore RC, Lee IY, Silverman GL, et al . : Ataxia inprion protein（PrP）-deficient mice is associated withupregulation of the novel PrP-like protein doppel .
J Mol Biol 1999 ; 292 : 797―817.
4）Bu!eler H, Fischer M, Lang Y, et al. : Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cellsurface PrP protein. Nature 1992 ; 356 : 577―582.
5）Bu!eler H, Aguzzi A, Sailer A, et al. : Mice devoid of
PrP are resistant to scrapie. Cell 1993 ; 73 : 1339―
1347.
6）Sakaguchi S, Katamine S, Nishida N, et al. : Loss of
cerebellar Purkinje cells in aged mice homozygous fora disrupted PrP gene. Nature 1996 ; 380 : 528―531.
7）Kuwahara C, Takeuchi AM, Nishimura T, et al. : Prions prevent neuronal cell-line death. Nature 1999 ;400 : 225―226.
8）Prusiner SB : Prions. Proc Natl Acad Sci USA 1998 ;
95 : 13363―13383.
9）Yokoyama T, Kimura KM, Ushiki Y, et al. : In vivo
conversion of cellular prion protein to pathogenic isoforms, as monitored by conformation-specific antibodies. J Biol Chem 2001 ; 276 : 11265―11271.

山内

Doppel が出ていても，PrPC があればアポトーシスを抑制すると考えておられるのでしょうか．
小野寺

そうです．おそらく Doppel 自身もある程度アポトーシスを進めるのでしょう
が，PrPC がある程度 overwhelming に発現していれば，アポトーシスは抑えられるということだと思います．
八谷如美（国立精神・神経セ神経研） 教えていただきたいのですが，プリオンのノック
アウトマウスでアポトーシスを起こした場合に，具体的にミトコンドリアの形態の変化などを観察されたことがありますか．
小野寺

電子顕微鏡ではまだ見ておりません．ミトコンドリアに関してはチトクロム Cなどいろいろありますので，そういうことも見なければいけないと思っていますが，いまのところアポトーシス状態を見ているだけです．
八谷

もう 1 点，プリオンに戻すと，SODの発現は変わらず，活性だけが上がるとおっしゃられました．メカニズムとして cofactorを活性化しているのか，活性だけが上がるこ

質

疑

応

答

とをどのような機構でお考えでしょうか．
小野寺

座長（品川） ありがとうございます．それではどなたかご質問はありますか．

難しいところですね．SOD に銅がつけば活性は上がるだろうと思いますが，細胞の膜の上，ラフトのようなところなのか，

山内一也（日本生物科学研） プリオンレス

細胞の中なのかはわかりません．ただ，David

マウスでレスキューを行う場合，アポトーシ

Brown らの論文で，彼らは初代培養細胞でスは Doppel が起こしていると考えているわ

行っていますが，SOD の活性がノックアウト

けですね．

のセルフカルチャーで下がっているときは，

小野寺

Doppel とプリオンがないことと細胞中の銅の濃度も下がっているといってい二重にメカニズムが働いていると思います．

ます．彼らのシステムが生きているのだった山内

レスキューされた細胞は Doppel もC

PrP も発現していて，ワイルドタイプとは違うわけですね．ワイルドタイプには Doppel
は出ていませんね．
小野寺

そうです．ですから，いま Doppel

が出ていない 1 型のプリオンレスセルライ
ンをつくっている最中です．
54 第 121 回日本医学会シンポジウム

ら，細胞の中に銅が入るか入らないかが重要だと思います．
八谷

この場合，ミトコンドリア の マ ト

リックスのマンガン SOD などの変化について観察されたことはありますか．
小野寺

実はマンガンも入れた別の実験がありまして，プライマリーカルチャーで，ある濃度で銅を入れればアポトーシスが起きます．そして，マンガンを入れてアポトーシス

MnSOD にしても差が出ません．
小野寺

こちらのほうが，in vivo でも表が起きるか起きにくいかということも実験し現型が少しきついような気がします．麻痺がています．1 型のノックアウトマウスと 2 型

来て，そのまま痙攣して苦しんで死んでしまのノックアウトマウス両方で行っています

うから，
ちょっときついかなと思います．
ノッ

が，マンガンの影響はあまりなかったので，クアウトマウスが違うのか，
あとは細胞分画，

マンガンは関係ないだろうと思っています．

細胞膜の分画の問題かどちらかだと思います．

茂（長崎大） 私たちは似たような仕

岸本忠三（日本医学会副会長） 私の見間違事を，マウスを使って in vivo で行っていま

いかもしれませんが，ノックアウトしたセル

す．いまのご質問に関係すると思いますが，ラインに，アポトーシスを誘導する TNF を入

私たちはプルキンエ細胞が死ぬ表現型をレスれると余計セルバイアビリティが増えて，アキューする活性で追っています．いろいろな

ポトーシスをブロックすると解釈されていま

PrP のミュータントでレスキューをかけた場

すが，どういうメカニズムでしょうか．アポ片峰合に，唯一レスキューがかからないのが，コトーシスを誘導する TNF が，逆にアポトーシ

ドンナンバーでいうと 26 番から 90 何番のスをブロックするというのはどういうことでところの欠損ミュータントです．

すか．

小野寺

オクタリピートがないところですある程度の至適濃度があるのですが，ウエスタンブロッティングや mRNA レベ

ね．
片峰

小野寺

ええ．そこに先生が問題にされていルで Bcl-2，Bcl-xL，SOD，全部見ていますが，るオクタリピートががっちりあります．そこ

特に Bcl-2 のレベルがウエスタンブロッティのファンクションがなかなか難しいのです

ングで上がっているから，
Bcl-2 の量が増えてが，いまのところ先生が言われたように銅結アポトーシスが抑制されるのかなと思ってい合領域であります．銅に結合するという活性ます．ただ，それだけかというのが難しいとが唯一知られています．ですから，そこが非ころで，いろいろサイトカインを使ってみる常に重要であるということがいえると思いま必要があると思います．

す．ただし，私たちのデータ で は，in vivoの脳の組織では何回やっても SOD の活性に座長

よろしいでしょうか．小野寺先生，

どうもありがとうございました．

差 が 出 ま せ ん．こ れ は 銅 亜 鉛 に し て も，

プリオン病 55