31●高吸着型新規プロテイン A 充塡剤の開発
バイオサイエンス事業部

開発部

セパレーショングループ

藤井中村
中谷智
孝司
茂

きた。特長は抗体に高い選択性を有するため高純度、1．はじめに高回収率で抗体を精製でき、後工程への影響も小さく、近年のバイオ医薬品市場の成長は著しく、2002 年種々の細胞培養液に適応可能なことである。一方、課に 4000 億円弱であった市場が 2012 年には 1 兆円に近題としてはアルカリ耐久性が低いこと、吸着量が低いづきつつある。これには特に抗体医薬品の市場拡大がこと、リガンドが漏れやすいこと等が挙げられる。

大きく貢献し、2012 年の抗体医薬品市場は 4000 億円

当事業部では、Protein A アフィニティークロマトにまで成長している。抗体医薬品は人の防御機構であグラフィー用充塡剤としてアルカリ耐久性を向上させる免疫システムを利用したものであり、高純度で特異た TOYOPEARL® AF − rProtein A − 650F を 2010 年に商性の高いモノクローナル抗体は疾患に関係する抗原だ品化したが、ユーザーからは吸着量のさらなる向上がけを特異的に認識して結合する性質を持ち、多くの診要望されていた。今回、アルカリ耐久性を維持しつつ、

１），２）

断や治療の現場で使用されている。抗体医薬品は吸着量を向上させるとともに、リガンドの漏れを抑え製造コストが高くかつ治療に際し大量投与が必要なた

た TOYOPEARL AF − rProtein A HC − 650F を商品化しめ、治療費用の点で患者負担が大きいのが難点となった。本稿では新商品の基本的な性能について報告する。ており、製造コスト低減が望まれている。抗体医薬品の製造工程は培養と精製工程からなっているが、培養工程では培養技術の進歩により、従来培養液 1 L 当た
り 1 g 未満の発現量から 10 g まで大幅に向上してき

2．実験項［1］試薬、充塡剤た。一方、精製効率はあまり向上しておらず、高コスガンマグロブリン（ポリクローナルヒト IgG）、リトの一因といわれている。図１は抗体医薬品の製造プン酸二水素ナトリウム・二水和物、クエン酸・一水和ロセスの一例を示したが、いわゆるプラットフォーム物、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウムなどの試薬は精製プロセスといわれている。抗体医薬品は動物細胞和光純薬㈱から購入した。

を用いて製造されるが、培養細胞分離後、粗精製工程

モノクローナル抗体および細胞培養液は、Tosoh

として Protein A アフィニティークロマトグラフィー

Bioscience GmbH（ドイツ）から提供を受けた。

が使用される。その後、ウイルス不活化処理され、中［2］静的吸着量の測定

間精製、最終精製工程、ウイルス除去を経て製剤化さ
３），４）

れる

メスピペット内に沈降させて秤量した AF − rProtein
A HC − 650F（約 1 mL）を二方コックを取り付けた。

Protein A とは黄色ブドウ球菌の細胞壁に存在するディスポーザブルカラムに移し、充塡剤の 7.5 倍量のタンパク質で、抗体の Fc 領域に結合する性質を有す

0.1 mol ／ L クエン酸緩衝液（pH 3.0）で洗浄後、充塡るため、充塡剤に固定化され抗体の精製に使用されて剤の 10 倍量の 0.1 mol ／ L リン酸緩衝液（pH 7.0）でCell removal and Clarification
Protein A Affinity chromatography 初期精製
Virus−Clearance

ウイルス不活化（低pH）

Cation Exchange chromatography 中間精製：DNA, HCP, Protein A, Endotoxinの除去
Anion Exchange chromatography 最終精製：DNA, HCP, Endotoxinの除去
ウイルス除去Virus−Clearance
Ultrafiltration and Diafiltration

図１

バッファー交換、濃度調整

抗体医薬品の製造プロセス例

32

TOSOH Research & Technology Review Vol.58（2014）

平衡化した。ガンマグロブリン 150 mg と 0.1 mol ／ L

Column volume（10 CV））、溶出工程（5 CV）、平衡化

リン酸緩衝液（pH 7.0）を添加して、充塡剤 1 mL あ工程（吸着液 7 CV）、洗浄工程 3 CV、15 分）、平衡化たりガンマグロブリンが 20 mg となるように調整後、工程（5 CV）のサイクルを繰り返した。20 回の繰返

25℃で 90 min 振盪して吸着させた。脱液後、充塡剤し毎に抗体濃度 5 mg ／ mL の吸着液で 10％破過の動の 10 倍 量 の 0.02 mol ／ L リ ン 酸 緩 衝 液（pH 7.0） で的吸着量を測定した。

充塡剤を洗浄した。充塡剤の 7.5 倍量の 0.1 mol ／ L ク［6］カラム圧力損失

エン酸緩衝液（pH 3.0）で吸着したガンマグロブリン

22 mmI.D. × 30 cm リザーバーを取り付けた 22を溶出させて溶出液を 250 mL メスフラスコに収集しmmI.D. × 20 cm のポリカーボネート製カラム（出入た。メスアップ後、280 nm の UV 吸光度を求め、そ口フィルター：10 m）を 50％スラリー濃度の充塡剤の数値、抗体の吸光度係数及び充塡剤量から静的吸着で満たし、純水 10 mL ／ min で充填した。20 分後、純量（Static binding capacity：SBC）を計算した。

水の送液を止めて、カラム圧力が大気圧まで低下した［3］動的吸着量の測定

後、カラムをリザーバーと切り離し、入口側フィルター充塡剤を 5 mmI.D. × 50 mm のガラスカラムに充を取り付けてカラムを作製した。定量ポンプの送液ラ塡して用いた。吸着液に 0.02 mol ／ L リン酸、0.15

インにカラム入口と並行にデジタル圧力計を取り付

mol ／ L NaCl 緩衝液（pH 7.4）を、脱着液に 0.1 mol ／け、純水を送液して１分後の圧力計指示値を読み取っL クエン酸緩衝液（pH 3.0）を用いた。上記吸着緩衝た。さらに、ポンプの流速設定値を変更し、１分後の液にガンマグロブリンを希釈して濃度 1、5 および 10圧力計指示値を読み取った。この操作を繰り返し、流mg ／ mL の吸着液を調製した。充塡したカラムに送速と圧力の関係を調べた。また、充塡剤を含まない空液ポンプと UV 検出器を接続し、吸着液で平衡化後、カラムを接続した場合のシステム圧力損失をそれぞれ調製したガンマグロブリン溶液を 0.2、0.3 および 0.5の流速であらかじめ測定しておき、測定したカラム圧

mL ／ min で負荷した。負荷濃度の 10％破過容量か力損失から、システム圧力損失を引いて正味のカラムら、充塡剤の動的吸着量（Dynamic binding capacity：圧力損失を求めた。

DBC）を算出した。
［4］細胞培養液からの抗体の分離精製
充塡剤を 5 mmI.D. × 50 mm のガラスカラムに充塡して用いた。吸着液に 0.02 mol ／ L リン酸、0.153．結果と考察［1］高吸着型 AF − rProtein A HC − 650F の商品化

mol ／ L NaCl 緩衝液（pH 7.4）を、溶出液に 0.1 mol ／表１に今回開発した AF − rProtein A HC − 650F と旧L クエン酸緩衝液（pH 3.0）を、洗浄液に 0.1 mol ／ Lタイプの比較を示す。粒子径は同一とし、吸着量を向NaOH を用いた。充塡したカラムに送液ポンプと UV上させるために基材のポロシティーすなわち空孔率を検出器を接続し、吸着液で平衡化後、モノクローナル大きくした。また、リガンドである Protein A は、改抗体と細胞培養液から調製した抗体濃度既知の細胞培変型 IgG 結合ドメインの六量体で、抗体に対する配向養液を一定量負荷させ、素通り画分を溶出させて、ク性も改良されたものを使用した。Protein A は両者とロマトグラムのベースラインが下がるまで吸着液で洗も多点結合により基材に結合させた。これらの改良に浄した。次に溶出液 5 mL をカラムに負荷させ吸着物

より新商品は旧タイプの 1.6 倍の静的吸着量を有してを溶出させ、メスシリンダーに回収した。回収した溶いることを確認した。

出画分の溶出量と吸光度から求めた回収量と負荷した［2］抗体の動的吸着量抗体量から回収率を求めた。さらに、回収した溶出画抗体の粗精製工程では抗体を速やかに分離・濃縮す分をサイズ排除クロマトグラフィー分析より抗体のることを目的としている。充塡剤の能力は処理速度とピーク面積比率から回収画分純度を求めた。

処理容量が重要な因子となり、動的吸着量は充塡剤の［5］充塡剤のアルカリ耐久性能力を示す重要な指標となる。

充塡剤を 5 mmI.D. × 50 mm のガラスカラムに充2010 年に商品化した AF − rProtein A − 650F と今回商

塡 し て 0.1 mol ／ L NaOH を 用 い た Cleaning in place

品化した AF − rProtein A HC − 650F 及び競合品の抗体（CIP）によりアルカリ耐久性を評価した。吸着液にの動的吸着量を IgG 濃度＝ 1 mg ／ mL、カラム内滞留

0.02 mol ／ L リ ン 酸、0.15 mol ／ L NaCl 緩 衝 液（pH時間 2、3.3、5 min で評価した。結果を図２に示した。

7.4）を、溶出液に 0.1 mol ／ L クエン酸緩衝液（pH 3.0）各滞留時間で既存製品（AF − rProteinA − 650F）に比べを、洗浄液に 0.1 mol ／ L NaOH を用いて吸着工程（101.6 倍以上の高い吸着量を有していることを確認した。

東ソー研究・技術報告第 58 巻（2014）33

TOYOPEARL AF−rProtein A−650F と AF−rProtein A HC−650F の IgG 静的吸着量比較

表１rProtein A−650F

rProtein A HC−650F

TOYOPEARLTOYOPEARL

30−6030−60

担体
粒子径 [μm]
空孔率 [%]
固定化リガンド

7686

組換え Protein A（改変型 C ドメイン四量体）

組換え Protein A（改変型 C ドメイン六量体）
配向性改良型

多点結合

多点結合

5080

結合方法
IgG 静的吸着量［g ／ L］

吸着液：0.1 mol ／ L リン酸緩衝液、pH 7.0
脱着液：0.1 mol ／ L クエン酸緩衝液、pH 3.0

また、IgG 濃度＝ 5、10 mg ／ mL の試料の動的吸着量後、吸着成分を溶出させたクロマトグラムを図４に示を IgG 濃度＝ 1 mg ／ mL の結果と合わせて、図３にす。回収した溶出画分の溶出量と吸光度から求めた抗示した。負荷する抗体濃度が増加しても動的吸着量が体の回収率は 98.5％であった。さらに、回収した溶出低下することはなかった。

画分を分析したサイズ排除クロマトグラフィーの抗体［3］細胞培養液からの抗体の分離精製のピーク面積比率は 97.4％であった。クロマトグラム

抗体を含む細胞培養液を負荷して素通り画分を溶出を図５に示す。
2500

70AF−rProtein A HC−650F60

A社アガロース系
プロテインAゲル

5040

AF−rProtein A−650F

3020UV 280nm［mAu］

IgG動的吸着量［g／L−gel］

80

1500
1000
500
001234
滞留時間［min］

56

図２50100

150
200
Time［min］

250300

カラムサイズ：5 mmI.D.×50 mm（充塡剤量：1 mL）
流速：0.2 mL／min.
試料：1.0 g／L ヒト化IgG1／40 mL 細胞培養液
吸着液：0.02 mol／Lリン酸、0.15 mol／L NaCl緩衝液、pH 7.4
溶出液：0.1 mol／Lクエン酸緩衝液、pH 3.0
洗浄液：0.1 mol／L NaOH
検出：UV 280 nm

TOYOPEARL AF−rProtein A−650FとAF−rProtein
A HC−650FのIgG動的吸着量

図４

細胞培養液からの抗体の分離精製

200701mg／mL

60505mg／mL

4010mg／mL

3020

UV 280nm［mAu］

80

150
1050

10023.35

滞留時間［min］

00TOYOPEARL AF−rProtein A HC−650FのIgG動的吸着量
IgG負荷濃度の影響

510
溶出時間［min］

カラム：TSKgel G3000SWXL，7.8 mmI.D.×30 cm
流速：1.0 mL／min.
溶出液：0.1 mol／Lリン酸、0.3 mol／L NaCl、pH 6.8
試料：抗体画分、2 μL
検出：UV 280 nm

カラムサイズ：5 mmI.D.×50 mm（充塡剤量：1 mL）
負荷IgG溶液：0.02 mol／Lリン酸、0.15 mol／L NaCl緩衝液 、pH 7.4
動的吸着量：10％破過容量

図３07

カラムサイズ：5 mmI.D.×50 mm（充塡剤量：1 mL）
負荷IgG：1 mg／mL（0.02 mol／Lリン酸、0.15 mol／L NaCl、pH 7.4）
動的吸着容量：10％破過量

IgG動的吸着量［g／L−gel］

2000

図５

精製抗体のサイズ排除クロマトグラフィー分析

15

TOSOH Research & Technology Review Vol.58（2014）

34分は線速度＝ 200 cm ／ hr に相当する。AF − rProtein A［4］充塡剤のアルカリ耐久性
抗体を溶出させた後の充塡剤の洗浄には、細胞培養液由来の汚染物質を除去するためにアルカリ性水溶液

HC − 650F 充填剤はこの線速度領域で使用できることを確認した。などの使用が望ましい。AF−rProtein A HC−650F の 0.1mol ／ L NaOH の CIP 繰り返しによる動的吸着量変化を図６に示す。0.1 mol ／ L NaOH による CIP 繰り返し

4．まとめ

では 200 回繰り返し後の動的吸着量変化は 10％以下

本稿では、抗体の初期精製に有効な新商品 Protein

であり、安価で効率的なアルカリ溶液に対する耐久性A アフィニティークロマトグラフィー用充填剤が高いことを確認した。

TOYOPEARL AF − rProtein A HC − 650F 充 塡 剤 の 性［5］カラム圧力損失

能 を 紹 介 し た。 先 に 商 品 化 し た TOYOPEARL AF

22 mmI.D. × 20 cm カ ラ ム サ イ ズ の AF − rProtein− rProtein A − 650F は 機 械 的 強 度 が よ り 高 く、 ハ イ

A HC − 650F と AF − rProtein A − 650F 充塡剤のカラム

ス ル ー プ ッ ト 型 と し て、 一 方、 新 た に 商 品 化 し た

圧力損失を図７に示す。AF − rProtein A HC − 650F のTOYOPEARL AF − rProtein A HC − 650F は高吸着型とカラム圧力損失は AF − rProtein A − 650F に比べて高線して抗体の初期精製に適した充塡剤である。

速度領域で若干高くなるが、線速度＝ 500 cm ／ hr 程

抗体医薬品市場の成長は著しく、今後も成長を続け度までは同等であり、0.1 MPa 以下である。Proteinると予測されている。これらの充塡剤が抗体医薬品のA 充塡剤を用いて行う抗体の吸着、溶出は、一般的に生産性向上、製造コスト低減及び精製純度の改善に寄20 〜 25 cm ベッド高さのカラムを用いて、滞留時間与することが期待される。

3 〜 6 分で行われており、カラム高さ 20 cm の場合、IgG動的吸着量比率［％］

滞留時間 3 分は線速度＝ 400 cm ／ hr に、滞留時間 6120１）金子佳寛、生物工学，91，9，511 − 513（2013）100２）松崎淳一、生物工学，91，9，495 − 498（2013）80３）山本修一、BIO INDUSTRY，28，7，35 − 46（2011）60４）J.Strube, Chemical Engineering and Processing，

4044，1123 − 1137（2005）

2000204060

80 100 120 140 160 180 200 220
CIP繰り返し回数

カラムサイズ：5 mmI.D.×50 mm（充塡剤量：1 mL）
サイクル 吸着工程：10カラム容量（CV）、溶出工程：5 CV、平衡化工程：7 CV、洗浄工程：3 CV、平衡化工程：5 CV
IgG濃度：5 mg／mL
動的吸着量：10％破過容量

NaOHのCIP繰り返しによるIgG 動的吸着量変化

図６0.4
カラム圧力損失［MPa］

引用文献

0.3
rProtein A HC−650F
0.2
rProtein A−650F
0.1
00500

1000
線速度［cm／hr］

カラムサイズ：22 mmI.D.×20 cm
通液：純水

図７

カラム圧力損失

1500