−報3

文−

転移性乳がん患者からの血中循環がん細胞の検出と 1 細胞遺伝子解析
森
飯
最
秋
片
二

本
嶋
上
山
山
見

篤
和
聡
泰
晃

史＊ 1
樹＊ 2
文＊ 1
之＊ 1
治＊ 2
達＊ 1

Detection and Single Cell Genomic Analysis of Circulating Tumor Cells
from Metastatic Breast Cancer Patients
Atsushi MORIMOTO
Kazuki IIJIMA
Toshifumi MOGAMI
Yasuyuki AKIYAMA
Koji KATAYAMA
Toru FUTAMI

Circulating tumor cells (CTCs) are tumor cells that occur at very low concentrations in the blood of patients withmetastatic cancer. The detection and analysis of CTCs is expected to be utilized as a tool for non-invasive real-timemonitoring of response to therapy and the selection of individual treatment options.
However, tumor cells are extremely complicated and heterogeneous which is the major obstacle thecharacterization and eradication of metastasis.
The techniques required to detect and analyze CTCs are as follows：
1) High-sensitive technique for detecting various types of CTCs independently from their expression markers.
2) Technique for single cell analysis that allows the characterization of malignant tumor cells to develop novel agentsfor cancer diagnosis and targeted therapy.
In this study, we describe detection and single cell genomic analysis of CTCs from metastatic breast cancer
patients using a CTC detection and analysis system based on dielectrophoretic microwell array technology (Tosohresearch and technical review 2014).
Fifteen advanced breast cancer patients and 2 healthy donors were recruited at National Cancer Center Hospital.
CTCs were generally defined as epithelial marker, cytokeratin/CK-positive and DAPI stained nucleus and whiteblood cell marker CD45-negative cells. However it is known that CK is not expressed in some tumors duringmetastases. Our system also discriminates CK-negative CTC candidates to exclude all normal cells with image
analysis software.
In 15 blood samples from patients, our system could detect CTC candidates including CK-negative cells in all
samples. In 2 blood samples from healthy donors, no CTCs were detected. Moreover, single cell genomic analysis
demonstrated that both CK-positive and CK-negative cells had at least one mutation in cancer-associated genes
indicating that the detected cells were possible CTCs. The results of the clinical study show that single cells isolated
by our system are useful for further genomic analysis. In addition, the result of mutation analysis of isolated single
CTCs suggested that CTCs have heterogeneity in cancer-related genes.
＊1

ライフサイエンス研究所／細胞診断グループ＊2

ライフサイエンス研究所／装置開発グループ

TOSOH Research & Technology Review Vol.59（2015）

4

1．緒

開発し、本システムを用いた前臨床・原理検証実験結言果を報告した 22。本報告では、本システムを用いた国

末梢血中に極微量に存在する血中循環がん細胞

立がん研究センターでの臨床実験において、転移性乳（Circulating Tumor Cells：CTCs）の検出解析技術は、がん患者からの CTCs 検出と 1 細胞遺伝子解析を行っ

低侵襲かつリアルタイムでのがん治療効果の判定やたので報告する。

適切な治療薬の選定ツールとして期待されている

1−6。

2004 年に CellSearch® システム（Janssen Diagnostics製）が、転移性乳がん、転移性前立腺がん及び転移性

2．技術概要大腸がん症例の予後予測、治療の効果判定に利用可能

本システムは、全血から① CTCs 濃縮、②誘電泳動

な CTC 検査装置として米国食品医薬品局（FDA）認による微細孔アレイへの細胞捕捉、③細胞標識・検出、可され、現在に至るまで上記がん種以外にも非小細胞④ 1 細胞採取と CTCs に代表される希少細胞の効率的

肺がん、小細胞肺がん、胃がん等からの CTCs の検出

な分離・検出ならびに性状解析のための単離操作を一および臨床的意義の検証が進められている

7 − 11。しか連で実施することが可能である（Fig. １）。

®

しながら、CellSearch システムは、がん細胞表面に上皮細胞接着分子（Epithelial Cell Adhesion Molecule,［1］CTCs 濃縮

EpCAM）が発現している一部の限られた CTCs しかCTCs は自社で開発した専用構造体を用いて濃縮し検出できないこと、また CTCs の計数に特化した装置

た（Fig. ２）。Lymphoprep 比重差分離液（密度：1.077

であり、治療選択に利用できる情報が得られないこと± 0.001 g ／ ml, 浸 透 圧：280 ± 15 mOsm ／ kg − H2O,が普及の妨げとなっていた。

Axis − Shield 製）を下部構造体に充填した後、上部構®

こ の よ う な CellSearch シ ス テ ム の 課 題 に 対 し、造体と下部構造体を連結した。連結した上部構造体のCTCs と血球細胞（赤血球、白血球）との細胞径の違開口部から 3mL の血液と赤血球・白血球凝集抗体試

12 − 14や赤薬 で あ る RosetteSep Human CD45 depletion Cocktail

血球を溶血した試料（白血球、CTCs）をスライドに（STEMCELL Technologies 製）、3mL の生理食塩水をいにより CTCs をフィルターに捕捉する技術
15 − 16、マイクロデ

加えた後、遠心した（2000 × g、5 分、25℃）。遠心後、などが開発されたことで不要な赤血球および一部の白血球が沈降した下部構造

CTCs が腫瘍組織と同様に多様性に富んだ極めて複雑体を取り外し、上部構造体の上蓋を開放することによな集団であることが明らかになってきている。そしてり上部構造体の下部から上部の画分をすべて回収し

近年、がんの多様性解析による治療抵抗性を有する悪た。回収液にわずかに混入する赤血球は溶血試薬（9.0性腫瘍細胞の特定など転移メカニズム解明に向けた 1

g ／ L NH4Cl, 1.0 g ／ L KHCO3, 0.037 g ／ L EDTA − 4Na）

細胞解析技術に注目が集まり、マイクロマニピュレーを添加することで破砕し、CTCs と残存白血球は遠心

ターやセルソーターを用いた 1 細胞採取と次世代シーケ（300 × g、10 分、25℃）により回収した。上清を除塗布し、レーザースキャンする技術
バイスを用いた分離技術

17 − 19

ンサによる網羅的遺伝子解析が検討されている

20 − 21。

去した回収画分は、300mM マンニトール水溶液でのそのような技術背景のなか、昨年、我々は血球細胞洗浄と遠心（300 × g、5 分、25℃）を 2 回実施した。

と CTCs の比重差を利用した濃縮から誘電泳動力によ

洗浄後の上清を除去し、最終液量が 1 ～ 2mL の CTCs

る細胞アレイ、蛍光顕微鏡を用いた画像検出、CTCs

濃縮液を得た。

の 1 細胞採取が可能な新規の細胞分離解析システムを②Dielectrophoretic
entrapment①Enrichment

Fig.１③Detection④Cell collection

Workflow of CTC detection and single cell analysis

東ソー研究・技術報告

Cap

第 59 巻（2015）

5

Blood sample

Upperchamber

Centrifugation

Tumor−enrichedfraction

Lower
chamber

Enrichment kit

Fig.２

Density gradient medium

Enrichment of CTCs with density gradient centrifugation［2］誘電泳動力による微細孔アレイへの細胞捕捉
CTCs 濃縮液を Fig. ３に示した細胞捕捉チャンバー

ある CD45 を用いて CTCs と区別する。臨床測定においては、1％ BSA、0.05％ Tween20、FITC 標識−抗に導入した後、矩形波交流電圧（3 MHz、20 Vp − p）

CK 抗体（クローン CK3 − 6H5）、Alexa Fluor 488 標識

を 3 分間印加し、誘電泳動力により細胞を微細孔ア−抗 Pan − CK 抗体（クローン AE1 ／ AE3）、PE 標識−抗レイに捕捉した（Fig. ４）。交流電圧を印加したまま、CD45 抗体（クローン J33）、DAPI、及び FcR ブロッ

0.01％ポリ− L −リジン含有の 300mM マンニトール水

キング試薬含有の標識試薬を細胞捕捉チャンバー内に溶液を細胞捕捉チャンバーに導入し 3 分間静置するこ導入し、室温で 30 分間静置することで細胞標識を実とで細胞を微細孔底面に静電的に接着した。次に交流施した。標識工程後の細胞捕捉チャンバーは、蛍光顕

電圧を切り、ホルムアルデヒドとエタノールの混合液

微鏡（IX 71、オリンパス製）の自動ステージ上に設でチャンバー内の液交換をし、細胞固定と細胞膜透過

置し、EM − CCD カメラ（ADT − 100、フローベル製）

処理を行った。続いて、1％牛血清アルブミン（BSA）、により微細孔アレイ全域の画像を取得した。なお画像

0.05％ Tween20 含有の PBS 溶液で洗浄することでホは蛍光 3 波長（DAPI、FITC（Alexa Fluor 488）、PE）

ルムアルデヒド・エタノールを除去した後、同溶液をの蛍光画像および明視野画像が取得可能である。

充填し、室温で 10 分間静置することで非特異標識ブ
ロッキングを実施した。

［4］１細胞採取
本システムでは、蛍光標識による CTCs の輝点から細胞捕捉チャンバー内での正確な位置情報が保存され［3］細胞標識・検出
一般的に CTCs は血管内に浸潤した上皮性細胞（本る。上蓋を外した細胞捕捉チャンバーを本システムの来は血液中に存在しない細胞）として検出するため、ステージに設置し、ソフトウェア上で目的の CTCs を

CTCs の検出には上皮性マーカーであるサイトケラ

選択することでステージに搭載した細胞採取機構（吸チン（CK）をターゲットにする。一方、CTCs とと引ポンプ式の精密ピペット、Fig. ５）によって CTCs

もに混入してくる白血球は、白血球表面マーカーでを１細胞単位で採取することができる。

AC voltage
ON
30mm

Outlet

Inlet

70mm

Fig.３

Cell entrapment chamber

Microwell size：Φ30μm（depth：40μm，interval：50μm）

Fig.４

Dielecrophoretic entrapment of cells in microwells

TOSOH Research & Technology Review Vol.59（2015）6

66.7％、診断閾値：＞ 2 個 /7.5mL 血液）、本システム
では全症例で CTCs の可能性のある細胞を検出でき（陽性率 100％、診断閾値：＞ 1 個 /3mL 血液）、先行
Micropipette

技術に対する優位性を示すことができた（Table １）。
なお健常者 2 症例では両システムともに CTCs は検出されず、偽陽性がないことを確認した。一方、同一検体における検出 CTCs 数については両システム間でPCR tube

Fig.５

相関は認められなかった。この理由として、CTCs のSingle cell picking unit

濃縮方法の違いが挙げられる。CellSearch® システムが採用する濃縮法は、血液中における CTCs の生存も3．臨床測定［1］検しくは死滅の状態に関わらず細胞の形態が維持されており（DAPI 陽性）、細胞表面に EpCAM が存在する体

国立がん研究センターにて、インフォームドコン

CTCs を選択的に濃縮する。しかしながら前述のようセントを得た転移性乳がん患者 15 症例（43 ～ 74 歳）に EpCAM や CK の発現量はがん種や転移の過程で大および健常者 2 症例から血液 3mL を EDTA − 2K 真空きく変化すること、またモデル実験での報告によると

採血管（VP − DK050K、テルモ製）に採血し測定を実原発巣から血管内に遊出したがん細胞のほとんどはア施した。

ポトーシス（細胞死）によって死滅し、最終的に転移を成立させる悪性腫瘍は 0.1％未満であることから 26、
CellSearch® 法では本質的な悪性度を正確に診断でき［2］CTC 測定
乳がん患者検体を用いた臨床測定により本システていないことが懸念される。それに対し、本システム

ムの性能を評価した。蛍光画像解析により、CK 陽

では、比重差分離により CTCs の保有するマーカーの性 ／ DAPI 陽 性 ／ CD45 陰 性 の 細 胞 を CTCs と 判 定

発現量に依存せず、かつ血液中で生存している CTCs

し、一方で CK 陰性／ DAPI 陽性／ CD45 陽性の細胞を選択的に濃縮可能であるため、より転移や予後のリを白血球と判定した。また転移の過程において、一スクを反映した診断が期待できる。今後、臨床検体デー

部の CTCs に上皮間葉転換（Epthelial − Mesenchymal

タ数を蓄積し、患者予後と照らし合わせながら統計的Transition, EMT）が起きる結果、CK や EpCAM などに解析することで本システムの臨床的有用性を検証しの上皮性マーカーが消失することが知られているたていく予定である。

め23 − 25、本システムでは CK 陽性に加え、CK 陰性のCTCs 候補（DAPI 陽性／ CD45 陰性）を自社開発のソフトウェアを用いて抽出した（Fig. ６）。なお、検®

［3］１細胞遺伝子解析
15 症例中 5 例の検体から検出された CTCs のうち、

出 CTCs 数については先行技術である CellSearch シ

計 16 個（CK 陽性 CTCs：8 個、CK 陰性 CTCs：8 個）

ステムとの比較を行った。

を本システムで 1 細胞採取し、市販の PCR チューブ®

その結果、CellSearch システムでは全 15 症例中に回収した。PCR チューブに回収した 1 細胞 CTC 由

5 例で CTCs が検出できなかったのに対し（陽性率：

来のゲノム DNA の配列解析を行うために、Ampli1™

Bright Field

Nucleus（DAPI） CTCs（CK−FITC） WBCs（CD45−PE）

CK（＋）
CTC

CK（−）
CTC

30μm

Fig.６

Captured images of CK−positive and −negative CTCs

東ソー研究・技術報告第 59 巻（2015）

7

Number of detected CTCs ／ 3mL of peripheral blood

Table１TOSOH
Patient
Clinical IHC（Primary tissue）
CellSearch
Sex AgeNo.
stage HER2ERPgR CK（＋）CTC CK（−）CTC Total system
1

F

57

Ⅳ

−

1＋

−

1

4

5

7

2

F

74

Ⅳ

−

2＋

2＋

7

5

12

45

3

F

70

Ⅳ

−

3＋

2＋

0

4

4

0

4

F

60

Ⅳ

−

−

−

0

12

12

2

5

F

52

Ⅳ

N.E

N.E

3＋

4

19

23

73

6

F

62

Ⅳ

−

−

1＋

0

6

6

16

7

F

68

Ⅳ

1＋

1＋

2＋

0

5

5

2

8

F

62

Ⅳ

−

1＋

2＋

0

3

3

N.E

9

F

63

Ⅳ

−

3＋

−

0

1

1

0

10

F

52

Ⅳ

−

2＋

1＋

0

5

5

0

11

F

66

Ⅳ

1＋

3＋

2＋

0

18

18

3

12

F

48

Ⅳ

−

3＋

3＋

2

0

2

0

13

F

61

Ⅳ

−

3＋

3＋

2

36

38

40

14

F

43

Ⅳ

−

3＋

3＋

5

6

11

56

15

F

53

Ⅳ

−

3＋

3＋

2

8

10

9

N.E：Not Evaluated

全ゲノム増幅キット（Silicon Biosystems 製）を用い

EGFR ／ KRAS ／ BRAF など 50 種のがん関連遺伝子変異て全ゲノム DNA の増幅を行った。アガロースゲル電の有無を確認した。

気泳動により全ゲノムが十分に増幅されていることをその結果、CK 陽性および CK 陰性 CTCs のそれぞ確認した後、30 ～ 100 ng の全ゲノム増幅産物を鋳型

れから少なくとも 1 種以上のがん関連遺伝子の変異をとしてライブラリーを作製後、次世代シーケンサ（Ion

検出することができた（Table ２）。CK 陽性 CTCs に

Personal Genome Machine™（Ion PGM™））System,

加え CK 陰性 CTCs が遺伝子解析により、がん細胞のLife Technologies 製）により遺伝子配列解析を行い、可能性を支持できたことで本システムが CellSearch®

Table２CTC
types

Sequence analysis of single CTCs in breast cancer

Patient CTC
No.
No.

H1047R

99.5

1886

2

TP53

D281H

99.4

23511

3

CSF1R

−

100

52

PIK3CA

H1047R

91.2

3799

TP53

D281H

85.6

1746

4

CK（＋）CTCs
5
14

13
CK（−）CTCs

14
15

Amino acid
Variant
Total
Mutation Frequency（％） Read

PIK3CA

1
2

Gene

5

HRAS

H27H

71.4

7

6

MLH1

V384D

100

8

7

APC

−

100

6

8

MET

−

100

380

9

APC

−

97.4

1946

10

KIT

K546K

100

1991

11

KIT

K546K

55.4

1106

12

TP53

−

94.1

1875

13

MLH1

V384D

100

1990

14

SMARCB1

Unknown

44.1

810

15

HRAS

H27H

100

339

16

APC

P1442P

100

1992

TOSOH Research & Technology Review Vol.59（2015）8

システムでは検出できない上皮性マーカーが消失しの倫理委員会の承認を得て実施された。また独立行政

た CTCs を検出可能であると証明することできた。各

法人新エネルギー・産業技術開発機構（NEDO）によ

CTC の遺伝子変異プロファイルを詳細に解析すると

るがん超早期診断・治療機器の総合研究開発プロジェ

同一検体（Patient No.2）から採取した異なる CK 陽

クト、血中循環がん細胞検出技術【CTC 検出自動化】

性 CTCs（CTC No.1, 2, 4）は、共通したがん関連遺（2010 年～ 2015 年）の助成を受け実施された。

伝子変異（PIK3CA、TP53）を保有していた。同様にPatient No.13 から採取した異なる CK 陰性 CTCs（CTC
No.10, 11）でも共通のがん関連遺伝子（KIT）を検出

6．謝辞した。さらに Patient No.14 から採取した CK 陽性と本研究開発の実施にあたり、技術的なご指導・ご助

陰性 CTCs から、がん関連遺伝子 MLH1 が検出できた言をいただいた都立駒込病院の小泉史明先生、澤田武

ことから、CTC 間で比較的共通した性質を有してい

志先生、和歌山県立医科大の洪泰浩先生ならびにご協ることが推測された。今後、個々の CTCs の遺伝子や力いただいた方々に対し深く感謝いたします。

タンパク発現プロファイルを詳細に解析し、原発巣および転移巣のがん細胞と比較することで CTCs が薬効評価や治療選択に利用可能か検証するとともに転移に関与する悪性 CTCs の解明、新規マーカーの探索を実施していく予定である。

引用文献（ 1 ）澤田武志、小泉史明、がん分子標的治療、13、1（2015）（ 2 ）M. Yu, S. Stott, M. Toner, S. Maheswaran, DA.

4．総

Haber, J. Cell Biol., 192, 373（2011）括（ 3 ）ES. Lianidou, Clin. Chem., 58, 805（2012）

国立がん研究センターで実施した末期乳がん患者
15 症例を対象とした臨床測定において、本システム
では全ての症例から CK 陽性および CK 陰性の CTCs®

を検出することができ、先行技術 CellSearch システ
ムに対する優位性を示すことができた。また 1 細胞採取した CK 陽性、陰性 CTCs の両者からがん関連遺伝（ 4 ）C. Alix − Panabieres, K. Pantel, Clin. Chem., 59,
110（2013）（ 5 ） TM . G o r g e s , K . P a n t e l , C a n cer I mmu n o l.
Immunother., 62, 931（2013）（ 6 ）E. Heitzer, M. Auer, P. Ulz, JB. Geigl, M.
Speicher, Genome Med., 5, 73（2013）

子の変異を検出したことから、遺伝学的にも両細胞は（ 7 ）W. Jeffrey Allard, J. Matera, M. Miller, M.

がん細胞であることが確定できた。以上の臨床測定結Repollet, MC. Connelly, C. Rao, AG. J. Tibbe, JW.

果から本システムは CTCs の保有するマーカーに依存

Uhr, LW. M. M. Terstappen, Clin Cancer Res., 10,

することなく、転移に関与する可能性のある CTCs を6897（2004）

検出することができ、さらに採取した 1 細胞は遺伝子（ 8 ）MG. Krebs, R. Sloane, L. Priest, L. Lancashire,

解析に利用可能であることが証明できた。本システム

JM. Hou, A. Greystoke, TH. Ward, R.Ferraldeschi,は希少な細胞を効率的に分離・濃縮する工程から目的

A. Hughes, G. Clack, M. Ranson, C. Dive, FH.

細胞を高感度に検出し、1 細胞レベルでの精密採取まBlackhall, J. Clin. Oncol., 29, 1556（2011）

でをトータルで実現できるため臨床および研究双方の（ 9 ）JM. Hou, MG. Krebs, L. Lancashire, R. Sloane, A.

ニーズに応えることのできるシステムである。近年、Beckon, RK. Swain, LJ. Priest, A. Greystoke, C.

CTCs の臨床（診断・治療）、創薬応用に向け、CTCs

Zhou, K. Morris, T. Ward, FH. Blackhall, C. Dive,の多様性解析や 1 細胞からの DNA、RNA の網羅的解

J. Clin. Oncol., 30, 525（2012）

析が進められ CTC 研究が激化しているなかで本シス（10）T. Naito, F. Tanaka, A. Ono, K. Yoneda, T.

テムが CTCs の性質を明らかにし、転移診断および治Takahashi, H. Murakami, Y. Nakamura, A. Tsuya,

療に寄与することが期待される。

H. Kenmotsu, T. Shukuya, K. Kaira, Y. Koh, M.
Endo, S. Hasegawa, N. Yamamoto, J. Thorac.

5．その他
本研究開発は、（旧）独立行政法人国立がん研究セン
ター（現 国立研究開発法人国立がん研究センター）

Oncol., 7, 512（2012）（11）S. Matsusaka, K. Chìn, M. Ogura, M. Suenaga, E.
Shinozaki, Y. Mishima, Y. Terui, N. Mizunuma, K.
Hatake, Cancer Sci., 101, 1067（2010）

東ソー研究・技術報告（12）F. Farace, C. Massard, N. Vimond, F. Drusch, N.

第 59 巻（2015）（22）最上聡史、森本篤史、飯嶋和樹、秋山泰之、片Jacques, F. Billiot, A. Laplanche, A. Chauchereau,

山晃治、二見達、東ソー研究・技術報告

L. Lacroix, D. Planchard, S. Le Moulec, F. André,

巻（2014）

K. Fizazi, JC. Soria, P. Vielh, Br. J. Cancer, 105,
847（2011）

9

第 58（23）M. Yu, A. Bardia, BS. Wittner, SL. Stott, ME. Smas,
DT. Ting, SJ. Isakoff, JC. Ciciliano, MN. Wells, AM.

（13）HK. Lin, S. Zheng, AJ. Williams, M. Balic, S.

Shah, KF. Concannon, MC. donaldson, LV. Sequist,

Groshen, HI. Scher, M. Fleisher, W. Stadler, RH.

EBrachtel, D. Sgroi, J. Baselga, S. Ramaswamy, M.

Datar, YC. Tai, RJ. Cote, Clin. Cancer Res., 16,

Toner, DA. Haber, S. Maheswaran, Science., 339,

5011（2010）

6119,（2013）（14）M. Hosokawa, H. Kenmotsu, Y. Koh, T. Yoshino,（24）S. Wu, S. Liu, Z. Liu, J. Huang, X. Pu, J. Li, D. Yang,

T. Yoshikawa, T. Naito, T. Takahashi, H.

H. Deng, J. Xu, PLoS ONE., 10, 4,（2015）

Murakami, Y. Nakamura, A. Tsuya, T. Shukuya,（25）G. Kallergi, MA. Papadaki, E. Politaki, D. Mavroudis,

A. Ono, H. Akamatsu, R. Watanabe, S. Ono, K.

V. Georgoulias, S. Agelaki, Breast Cancer Res., 13,Mori, H. Kanbara, K. Yamaguchi, T. Tanaka, T.

3（2011）

Matsunaga, N. Yamamoto, PLoS One., 8, 6（2013）（15）M. Wendel, L. Bazhenova, R. Boshuizen, A.
Kolatkar, M. Honnatti, E.H.Cho, D. Marrinucci, A.
Sandhu, A. Perricone, P. Thistlethwaite, K. Bethel,J. Nieva, M. Van den Heuvel, P. Kuhn, Phys.Biol.,9（2012）（16）J. Nieva, M. Wendel, M.S. Luttgen, D. Marrinucci,
L. Bazhenova, A. Kolatkar, R. Santala, B.
Whittenberger, J. Burke, M. Torret, K. Bethel, P.
Kuhn, Phys.Biol., 9（2012）（17）E. Ozkumur, AM. Shah, JC. Ciciliano, BL.
Emmink, DT. Miyamoto, E Brachtel, M. Yu, P.
Chen, B. Morgan, J. Trautwein, A. Kimura, S.
Sengupta, SL. Stott, N. M. Karabacak, TA. Barber,
JR. Walsh, K. Smith, PS. Spuhler, JP. Sullivan, RJ.
Lee, DT. Ting, X. Luo, AT. Shaw, A. Bardia, LV.
Sequist, DN. Louis, S. Maheswaran, R. Kapur, DA.
Haber, M. Toner, Sci. Trans. Med., 5（2013）（18）金田祥平、荒木文子、中村寛子、藤井輝夫、生産研究65 巻（2013）（19）Khoo BL, Warkiani ME, Tan DS, Bhagat A A ,Irwin D, Lau DP, Lim AS, Lim KH, Krisna SS, Lim
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EM. Hoffmann, S. Lax, J. Waldispuehl − Geig, O.
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