土壌 DNA 抽出キット

ISOSPIN Soil DNA
マニュアル（第 2 版）

Code No. 310-09151

NIPPON GENE CO., LTD.

I

製品説明

「ISOSPIN Soil DNA」
（アイソスピンソイル DNA）は、スピンカラムを用いて土壌サンプルから DNA を抽出・精製するためのキットです。スピンカラムによる DNA 精製方法を採用しており、フェノールやクロロホルム等の毒性有機溶媒を使用しないで、簡便に土壌サンプルから高純度な DNA 溶液を得ることができます。
非火山灰土壌はもちろん、これまで困難とされてきた火山灰土壌（黒ボク土）からも DNAの抽出が可能です。
ISOSPIN Soil DNA は DNA の抽出方法として界面活性剤による化学的な溶菌と Beads
Beating による物理的な菌体破砕の併用を採用しています。これによって、強固な細胞壁を持つ微生物からも DNA を抽出することができ、実際の土壌微生物叢を反映した土壌 DNA を得ることができます。したがって、抽出した土壌 DNA は NGS を用いた土壌細菌叢解析等に適しています。

II キット内容ISOSPIN Soil DNA （Code No. 310-09151）
キット構成品

容量（50 回用）

Lysis Solution BB

30 ml × 1 本

Lysis Solution 20S

5 ml × 1 本

Lysis Solution A

5 ml × 1 本

SE Buffer

3 ml × 1 本

SB Buffer

62 ml × 1 本

SW Buffer

36 ml × 1 本

TE (pH8.0)

5 ml × 1 本

RNase A (100 mg/ml)

0.5 ml × 1 本

Beads Tube

50 本 × 1 袋

Spin Column

50 本 × 1 袋

備考※

エタノール含有長期保存の場合、冷蔵/冷凍
上部パーツ：カラム
下部パーツ：Collection Tube

※ Lysis Solution 20S 中に結晶が析出する場合がありますが、品質、性能に問題はありません。このような場合には、容器ごと 65℃程度でインキュベートし（ときおり混和する）、結晶を完全に溶解させてからご使用ください。

1

III

保存

室温保存
・ RNase A は室温保存可能ですが、長期間使用しない場合は冷蔵保存（4℃）もしくは冷凍保存（－20℃）してください。

IV 使用上の注意
・ 本品は、試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。
・ 試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。
・ 本品の取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。
・ マニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。
・ 製品安全データシート（SDS）は、ニッポンジーン Web サイト（www.nippongene.com）
よりご覧になれます。
・ 本品は、東京大学 TLO が所有する特許のライセンスを受けて製造販売しております。

V プロトコール＜キット以外に必要なもの＞
機器： ・ビーズ式破砕装置（2 ml チューブ対応のもの）
・遠心分離機・ボルテックスミキサー
器具： ・マイクロピペット・ピペットチップ
・1.5 ml マイクロチューブ
試薬： ・エタノール（96～100％）2

＜標準プロトコール＞
ビーズ式破砕装置（2 ml チューブ対応のもの）が必要です。遠心操作は全て室温で行えます。
①

0.5 g の土壌サンプルを秤量し、Beads Tube に入れる。

②

600 µl の Lysis Solution BB（＊1）、100 µl の Lysis Solution 20S（＊2）、100 µl の Lysis Solution A、10 µl の RNase A を添加する。
（＊1）オプション SP1（p.4 参照）（＊2）NGS 用プロトコール（p.4 参照）

Beads Beat（4～6 m/s で 45 秒間×2 回または 4,200～6,800 rpm で 3 分間）③する。
注） 蓋のゆるみは Beads Beating 中の液漏れの原因となるため、Beads Tube の蓋がしっかり閉まっていることを確認してください。

④

遠心（12,000×g, 15 分間）する。

⑤

上清 400 µl を新しい 1.5 ml マイクロチューブに移す。
注） 土壌サンプルの水分含量が少ない場合、400 µl の上清を回収できない場合があります。その場合は、ステップ⑥で添加する試薬の液量比を維持してスケールダウンしてください。

50 µl の SE Buffer を添加し、ボルテックスミキサーで十分に混合する。

⑥

注） SE Buffer の添加量は、上清の液量に対して 0.125 倍量です。
（例えば、上清が 360 µl の場合、SE Buffer は 45 µl 添加します。
）⑦

遠心（20,000×g, 5 分間）する。

⑧

上清 400 µl を新しい 1.5 ml マイクロチューブに移す。
注） 400 µl の上清を回収できない場合（または 400 µl より多く回収できた場合）は、ステップ⑨で添加する試薬の液量比を維持してスケールダウン（またはスケールアップ）してください。
注） 沈殿物が見えない場合は、全量を回収します。

30 µl の SB Buffer と 350 µl のエタノールを添加し、ボルテックスミキサー⑨で十分に混合する。
注） SB Buffer の添加量は、上清の液量に対して 0.075 倍量です。
エタノールは、0.875 倍量添加してください。

↓3

⑨の混合液を全量 Spin Column に添加し、遠心（13,000×g, 30 秒間）する。

⑩注） ⑨の混合液に析出物が生じた場合は、析出物もカラムに添加してください。

Spin Column のカラムを外し、Collection Tube の中のろ液を捨てた後、⑪カラムを同じ Collection Tube の上に戻す。
↓600 µl の SB Buffer を Spin Column に添加し、遠心（13,000×g, 1 分間）す⑫る。
⑬

ろ液を捨てて、カラムを Collection Tube に再度戻す。

⑭

ステップ⑫と⑬をもう一度行う。（600 µl の SB Buffer を添加し、1 分間遠心後、ろ液を捨てて空にした Collection Tube の上にカラムを戻す）↓
600 µl の SW Buffer を Spin Column に添加し、遠心（13,000×g, 1 分間）⑮する。
ろ液と Collection Tube を捨てる。

⑯↓⑰カラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上に移す。

⑱

100 µl の TE (pH8.0)をメンブレン中央に滴下した後、3 分間室温で静置する。

⑲

遠心（13,000×g、1 分間）する。

⑳

DNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブの中に回収される。

＜オプション SP1＞（火山灰土壌の場合）
火山灰土壌から DNA を抽出する場合はステップ②で添加する Lysis Solution BB の代わりに
Lysis Solution BB SP1（別売り：Code No. 313-06221）を使用することで DNA 収量を向上させることができます。Lysis Solution BB SP1 は、黒ボク土などのアロフェン質を非常に多く含む土壌からの DNA 抽出用に開発されたオプション溶液です。Lysis Solution BB SP1 に変える以外は、標準プロトコールと同様に操作してください。
＜NGS 用プロトコール＞
NGS（Next Generation Sequencing）による菌叢解析を行う場合は、ステップ②で添加する
Lysis Solution 20S の添加量を 10 µl にしてください。Lysis Solution 20S の添加量を変える
以外は、標準プロトコールと同様に操作してください。

4＜簡易プロトコール＞（簡易プロトコールは、標準プロトコールの表記を簡略化したものです。
）
ビーズ式破砕装置（2 ml チューブ対応のもの）が必要です。
遠心操作は全て室温で行えます。
Beads Tube に 0.5 g の土壌サンプルを入れる＊1600 µl の Lysis Solution BB を添加 ＊1
100 µl の Lysis Solution 20S を添加 ＊2＊2100 µl の Lysis Solution A を添加
10 µl の RNase A を添加

オプション SP1：
Lysis Solution BB の代わりに別売のLysis Solution BB SP1 (Code No.
313-06221) を使用する。
NGS プロトコール：
Lysis Solution 20S の添加量を10 µl にする。

Beads Beat（4～6 m/s で 45 秒間を 2 回または 4,200～6,800 rpm で 3 分間）
遠心（12,000×g, 15 分間）
上清 400 µl を新しい 1.5 ml マイクロチューブに移す
50 µl の SE Buffer を添加し、ボルテックスミキサーで十分に混合遠心（20,000×g, 5 分間）
上清 400 µl を新しい 1.5 ml マイクロチューブに移す
30 µl の SB Buffer を添加
350 µl のエタノールを添加し、ボルテックスミキサーで十分に混合混合液 780 µl（全量）を Spin Column に添加
遠心（13,000×g, 30 秒間）ろ液を捨てる
600 µl の SB Buffer を Spin Column に添加
もう一度行う遠心（13,000×g, 1 分間）
ろ液を捨てる600 µl の SW Buffer を Spin Column に添加
遠心（13,000×g, 1 分間）

ろ液を捨てる（ろ液がカラムに付かないよう注意する）
カラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上に移す
100 µl の TE (pH 8.0)をメンブレン中央に滴下
室温静置 3 分間
遠心（13,000×g, 1 分間）
DNA 溶液5

VI

トラブルシューティング

トラブル

考えられる原因
土壌微生物が少ない。

土壌 DNA の収量が少ない。

考えられる対策
できるだけ新鮮な土壌を使用してください。

土壌中のアロフェ Lysis Solution BB の代わりに Lysis Solution BB
ン 質 が 非 常 に 多 SP1（別売り：Code No. 313-06221）を用いて抽い。

出操作を行ってください。
（オプション SP1 参照）

Spin Column への ステップ⑨で、添加する混合液の液量比を守り、よ吸着が不十分。
Beads Beating の物理的衝撃によりDNA がせん断さ土壌 DNA の分子量 れている。
が小さい。

NGS プロトコー
ル の 実 施 （ LysisSolution 20S の添加量が 10 µl）。

Lysis Solution 20S
中に白い結晶が折出している。

低温によって試薬が析出している。
溶出した DNA 溶
液中に SW Buffer（エタノール含得られた DNA 溶液 有）が残留していを用いた実験がう る。
まくいかない。

く撹拌してから Spin Column へ添加してください。
Beads Beating によるせん断を避けたい場合には、界面活性剤下での加熱抽出法を採用しているISOIL（Code No. 316-06211）を使用してください。
ビーズ破砕しているのである程度のせん断は免れない。より高分子の DNA を抽出したい場合には、
Lysis Solution 20S を 100 µl 添加してください。
65℃程度でインキュベートし、結晶を完全に溶解させてからご使用ください。品質、性能には問題ありません。
SW Buffer で洗浄した後のステップ⑯では、カラムにろ液が付着しないよう慎重にコレクションチューブを取り外してください。
カラムにろ液が付着した場合は、Spin Column を空回ししてから、次のステップで新しいチューブを装着してください。

土壌サンプル由来の酵素反応阻害物質が残留してい得られた DNA 溶液を希釈して使用してください。

る。

6VII データ
標準プロトコールと NGS 用プロトコールで、非火山灰土壌と黒ボク土（火山灰土壌）からDNA を抽出し、以下のアプリケーションに使用しました。

1. 土壌サンプルからの DNA 抽出（電気泳動結果と吸光度データ）
2. 土壌 DNA の PCR 検出
3. NGS を用いた土壌細菌叢解析

実験結果について、詳細はニッポンジーンの WEB サイトをご参照ください。
https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isospin-soil-dna/isospin-soil-dna.html

土壌は様々な鉱物、粘土などの無機物、様々な植物および植物遺体、腐植物質をはじめとする土壌有機物、そしてそこに生息する多様な微生物から成り立っています。そのため、一つとして同じ土壌はないと言えます。
土壌は極めて多様なサンプルであることから、土壌の種類や状態によっては収量が上がらない可能性があります。
本キットで抽出した土壌 DNA の収量が少ない場合、試薬や操作上の問題だけでなく、土壌サンプルが他にはない特異な性質を有している可能性も考慮してください。

マニュアル記載内容や製品仕様、価格に関しては予告なしに変更する場合があります。

お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
研究試薬部 学術営業課
TEL
URL

076 - 451 - 6548
https://www.nippongene.com/siyaku/

お問い合わせは、お電話もしくは WEB フォームより承っております。

ISOSPIN Soil DNA マニュアル（第 2 版）202206CNi

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