2023年8⽉作成（初版）

抗体・抗体薬物複合体（ADC）の分析サービス
株式会社 東レリサーチセンター
バイオメディカル分析研究部

1

分析メニュー⼀覧① ペプチドマップ（全アミノ酸配列解析）② 翻訳後修飾の解析（脱アミド、酸化、末端解析）③ 分⼦量測定④ 薬物抗体結合⽐（DAR）の測定⑤ 抗体薬物複合体（ADC）の薬物結合位置解析⑥ LC-MS/MSを⽤いた抗体医薬品の定量⑦ LC-MS/MSを⽤いたADCの定量⑧ ADCC（抗体依存性細胞障害）活性⑨ CDC（補体依存性細胞障害）活性⑩ 免疫チェックポイント阻害活性

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2

ペプチドマップ（全アミノ酸配列解析）

抗体

分析の流れ
還元
アルキル化

断⽚化
複数の酵素や化学分解も併⽤可能です

Orbitrap Fusion Lumos（FT-MS）(ThermoFisher Scientific)
⾼分解能、⾼分⼦量測定、ETD搭載
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LC-MS/MS
測定timsTOF Pro (Q-TOF)(Bruker)
⾼分解能、⾼分⼦量測定
イオンモビリティ搭載

3

解析

⾃動解析だけでなく、⼿動での解析やシーケンサーを組み合わせた解析が可能です

ZenoTOF 7600（Q-TOF）（AB SCIEX）
⾼分解能、EAD搭載

ADC

ペプチドマップ（全アミノ酸配列解析）

抗体

ADC

装置に搭載された機能の特徴
TIMS（Trapped Ion Mobility Spectrometry） EAD(電⼦励起解離) / ETD(電⼦移動解離)
イオンのかさ⾼さの違いを利⽤して同⼀のm/z値を持つ分⼦を識別できるラジカル反応によりタンパク質を開裂させる。CIDとは開裂位置が異なる。

MS1b c
CH3
R

モビリティ

Ion mobility

⼤H2N

モビリティ

⼩O

構造異性体の分離が可能
クリーンナップ効果により微量のペプチドを検出可能

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CH3RCNHCOH
NOOHR 3CHy ｚ
ETD、EADの開裂位置※反応効率はCIDの⽅が⾼いNat Methods 17, 1229–1236 (2020)より引⽤し改変••HN

CIDの開裂位置m/z

CHR 3O••糖鎖などの修飾基が外れにくい
CIDで識別できないアミノ酸を識別可能（LeuとIle、AspとisoAsp等）

4

ペプチドマップ（全アミノ酸配列解析）

抗体

ADC

分析結果の例（Orbitrap Fusion Lumos を使⽤）
L鎖のカバレッジマップ

抗体医薬品（Trastuzumab）のペプチドマップ
100

5.71

NL: 3.84E857.50

90

Orbitrap Fusion Lumos(ThermoFisher Scientific)

Relative intensity

80

24.03

70
60

28.59
43.15
38.12

7.83

50

38.91
32.28
44.73

33.47

30
20100

5.08 8.30
2.311020BPC

45.51

21.39
20.12

40

54.12

30

40

52.00 59.85
60.87
72.03
51.32
85.33
65.63
75.25
92.23 102.82
5060
RT (min)

7080

90

100

y111075.5365

100

y121162.5674

80
y112+
60
40
20y14
b111188.5541

357.1768

y1
175.1187

y4
y92+
446.2362b5
589.2658b6
717.3248

1391.6735
a151504.7046

y16
825.89132+

y161650.76680検出したペプチドでカバーできる配列が表⽰されます
様々な修飾を考慮した解析が可能です
配列のカバー率も同時に算出可能です
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538.2728

b2229.1181

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600m/z

任意のペプチドのMS/MSスペクトルを確認することも可能です5ペプチドマップ（全アミノ酸配列解析）

抗体

ADC

ご報告の内容基本的な内容ペプチドマップ
カバレッジマップ（⾃動解析）• 配列カバー率（⾃動解析）••

オプション
多検体のペプチドマップの拡⼤⽐較図
任意のペプチドのMS/MSスペクトル
各ピークの詳細解析結果（⾃動解析、マニュアル解析）• 配列に帰属できないピークの分取、プロテインシーケンサーによる配列解析結果• 修飾されたペプチドの存在⽐（MSのピーク⾯積に基づく）•••

詳細解析結果の例
Peak TimeNo. (min)Accurate
mass

12
3

11.84
15.11
21.82

868.3498
748.3902
487.3006

423.652134.9614

525.412140.0735

628.71903.4814

731.28

1874.9196

834.712286.1757

Error
(ppm)

Position

Sequence

937.15

1989.9908

1037.44575.3067-1.0 L 208-214 SFNRGEC-0.5 L 19-24 VTITCR-3.2 L 104-107 VEIKVDNALQSGNSQES-1 L 150-169
VTEQDSKHKVYACEVTHQG
0.7 L 189-207
LSSPVTK-3.2 L 143-149 EAKVQWKVYACEVTHQGLSS
1 L 191-207
PVTK
ASQDVNTAVAWY-1 L 25-45
QQKPGKAPKASQDVNTAVAWY
2 L 25-42
QQKPGK-3.4 L 146-149 VQWK

1138.60

2676.2627-0.6 L 146-169

VQWKVDNALQSG
NSQESVTEQDSK

分析に必要な情報
• 検体数
• 分⼦量
• アミノ酸配列（ペプチドマップ取得のみの場合は不要です）• タンパク質の修飾の有無（糖鎖，薬物など）
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••••6

試料の形態（粉末、液体など）試料の溶媒（⼜は可溶な溶媒）試料に含まれる分析対象の純度
タンパク質濃度

翻訳後修飾の解析

抗体

修飾
LC-MS/MS
測定

同じ配列のペプチド

Intensity

ペプチドマップで検出したペプチドごとに翻訳後修飾の有無や割合を解析することが可能です
Area算出受託実績のある修飾の例
••
•
•

存在
⽐ ＝time

豊富な前処理技術（例︓脱アミド化解析）

脱アミド化（Asn、Gln）
酸化（Met、Trp）
N末端のアセチル化
N末端のピログルタミル化

⾼機能な装置による異性体の識別

脱アミド化率[%]Asnを含むペプチドについて脱アミド化率を⽐較
2.5
2.0
0.3
0.2

⼀般的な条件
2.3

A社
キット
独⾃の前処理法

0.1
0.00.05

0.23

B社
キット0.06• 市販のキットと同等以上に前処理中の⼈為的な脱アミド化を抑制（試料本来の情報に近い）• 様々な酵素での消化が利⽤可能（配列によらず解析可能）※他社キットでは酵素が限定される
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Orbitrap Fusion Lumos

ZenoTOF 7600

ETD搭載

EAD搭載

（FT-MS）(ThermoFisher Scientific)（Q-TOF）（AB SCIEX）

衝突誘起解離(CID)法を⽤いる質量分析計では識別できないAspとiso-Aspなどの識別が可能

7

翻訳後修飾の解析

抗体

ご報告の内容基本的な内容ペプチドマップ（UVクロマトグラム、トータルイオンクロマトグラム）• カバレッジマップ（⾃動解析）• 修飾されたペプチドの位置、アミノ酸配列•

オプション
修飾されたペプチドの抽出イオンクロマトグラム
及びMS/MSスペクトル• 修飾されたペプチドを含むピークの詳細解析（⾃動解析⼜はマニュアル解析）• 修飾されたペプチドの存在⽐（⾃動解析⼜はマニュアル解析、UV⼜はMSのピーク⾯積に基づく）•

分析に必要な情報••••

検体数
分⼦量
アミノ酸配列タンパク質の修飾の種類、位置

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•••
•
8

試料の形態（粉末、液体など）試料の溶媒（⼜は可溶な溶媒）試料に含まれる分析対象の純度
タンパク質濃度分⼦量測定⼤まかな分⼦量が知りたい場合

抗体

ADC

正確な分⼦量が知りたい場合（夾雑物が含まれる等）

SDS-PAGEにより分⼦量を確認します。泳動像から、タンパク質のおおよその存在⽐がわかります
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Orbitrap Fusion Lumos（FT-MS）(ThermoFisher
timsTOF Pro (Q-TOF)
Scientific)(Bruker)
⾼分解能、⾼分⼦量測定 ⾼分解能、⾼分⼦量測定
異性体分離

Autoflex speed(MALDI-TOF/MS)(Bruker)

質量分析計を⽤いて⾼精度に質量を検出します
脱糖鎖処理の有無、還元処理の有無で⽐較も可能です9分⼦量測定

抗体ADC

ご報告の内容• 測定結果（UVクロマトグラム、マススペクトル）• Deconvolution結果（FT-MS、Q-TOFのみ）• 予想される分⼦量（情報がある場合）との誤差
105

100

22m/z
0

Relative Intensity• 電気泳動像• タンパク質の存在⽐（ソフトによる⾃動解析）

正確な分⼦量が知りたい場合

Intensity

⼤まかな分⼦量が知りたい場合

1000

2000

3000

4000

試料のマススペクトル

5000

0

Mass
148000148500149000Deconvolution結果分析に必要な情報
••
•
•

検体数
予想されるおおよその分⼦量タンパク質の修飾の有無（糖鎖，薬物など）
糖鎖遊離や還元処理後の測定をご希望か
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•••
•
10

試料の形態（粉末、液体など）試料の溶媒（⼜は可溶な溶媒）試料に含まれる分析対象の純度
タンパク質濃度薬物抗体結合⽐（DAR）の測定
Lys結合型、Cys結合型のいずれも受注実績があります
検出強度

Lys結合型ADCのDARを算出する場合

薬物

薬物の結合様式①Lys結合型②Cys結合型など
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質量分析計でマススペクトルを取得します

DAR︓4.2

検出強度

抗体m/z

Deconvolution

リンカー

糖鎖ADC

Da

11

分⼦量を算出しピーク⾯積からDARを算出します薬物抗体結合⽐（DAR）の測定

ADC

ご報告の内容Lys結合型ADCの場合• 測定結果（UVクロマトグラム、マススペクトル）• Deconvolution結果• DARの算出結果

Cys結合型ADCの場合• 測定結果（UVクロマトグラム、マススペクトル）• Deconvolution結果• DARの算出結果• 予想される薬物結合位置に基づくサブユニットとの質量誤差（2D-LC/MSによる分析⽅法のみ）分析に必要な情報
••••
•

検体数
結合様式（Lys結合型、Cys結合型など）推定される薬物結合位置分⼦量（抗体、薬物）
タンパク質の修飾の有無（糖鎖など）
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•••••
13

試料の形態（粉末、液体など）試料の溶媒（⼜は可溶な溶媒）試料に含まれる分析対象の純度
タンパク質濃度
⾼活性物質など、取り扱いの注意点

抗体薬物複合体（ADC）の薬物結合位置解析

ETD(電⼦移動解離) / EAD(電⼦励起解離)

CIDによる薬物結合ペプチドのMS/MS解析結果
547.2199

100

Relative Abundance

東レリサーチセンター保有の質量分析計の特徴的な開裂⽅法により薬物結合位置解析を⾼精度に実施できます

ADC

薬物

薬物由来のプロダクトイオン

50

ペプチド
0200

400

600

800

1000

1200m/z

薬物由来のプロダクトイオンのみが観測され薬物結合位置が特定できない
ETDによる薬物結合ペプチドのMS/MS解析結果

Orbitrap Fusion Lumos

ZenoTOF 7600

ETD搭載

EAD搭載

（FT-MS）(ThermoFisher Scientific)（Q-TOF）（AB SCIEX）

タンパク質をマイルドに開裂させるため薬物を保持したままペプチドを観測できる
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Relative Abundance

100

Lys+薬物
Lys+薬物
500c6c5z3z2200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

m/z

薬物が結合したアミノ酸を含むc、zイオンにより薬物結合位置が特定できる

141800抗体薬物複合体（ADC）の薬物結合位置解析

ADC

ご報告の内容基本的な内容• ペプチドマップ（UVクロマトグラム、トータルイオンクロマトグラム）• カバレッジマップ（⾃動解析）• ⾃動解析で検出された薬物結合ペプチドのMS/MS解析結果（MS/MSスペクトル、プロダクトイオンによる結合位置の推定結果）

オプション• 抽出イオンクロマトグラムを⽤いたマニュアル解析（予想される薬物結合ペプチドが⾃動解析で検出されなかった場合など）分析に必要な情報•••••

検体数
結合様式（Lys結合型、Cys結合型など）推定される薬物結合位置
分⼦量（抗体、薬物）タンパク質の修飾の有無（糖鎖など）
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•••••
15

試料の形態（粉末、液体など）試料の溶媒（⼜は可溶な溶媒）試料に含まれる分析対象の純度
タンパク質濃度
⾼活性物質など、取り扱いの注意点

抗体

LC-MS/MSを⽤いた抗体医薬品の定量
ペプチドマッピング（サロゲートペプチドの選定）
UV 214 nm

TOFMS
FTISADTSK

マウス⾎清中抗体医薬品濃度測定
マウスに抗HER2ヒト化モノクローナル抗体を単回静脈内投与し、⾎清中濃度をLC-MS/MSを⽤いて測定





サロゲートペプチド︓FTISADTSK（⾃社で合成）
内標準物質︓
F(+10)TI(+7)SADTSK（⾃社で合成）
投与量︓1 mg/kg，10 mg/kg
⾎清使⽤量︓
20 μL
採⾎時点︓
投与後0.5，1，4，8，24，48，96，168，336，504 hr（10時点）

マウス⾎清中抗体医薬品濃度の経時推移

MS/MSの質量スペクトルにマッチするペプチドを検索
抗体医薬品（重鎖可変領域）のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAT
GKGLEWVAR(50)IYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKG(125)PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK

分⼦量変化を伴うメチオニン（酸化）やアスパラギン及びグルタミン（脱アミド）が含まれないことに注意
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⾎清中抗体医薬品濃度（μg/mL）

1000

10 mg/kg投与群
1 mg/kg投与群

100101051015

投与後時間（day）

162025ADC

LC-MS/MSを⽤いたADCの定量
ラット⾎漿中のADC濃度測定

作業フロー

ラットにトラスツズマブエムタンシンを単回静脈内投与し，⾎漿中濃度をLC-MS/MSで定量

サロゲートペプチドの選定プリカーサーイオンの選択

群構成
投与量
採取⽅法
抗凝固剤
採⾎時点

プリカーサーイオンの決定
定量性評価（直線性、再現性）
濃 度 測 定サロゲートペプチドの選定+MCC_DM1
cz+MCC_DM1

c1 +1

Lys+MCC_DM1

c2 +1z17 +2z18 +2
Lys+MCC_DM1

Plasma conc. (µg/mL)

ETDによるMS/MSスペクトル（Lumos使⽤）

ラット⾎漿中ADC濃度の経時推移

1009080706050403020100

Rat A（コントロール）
Rat B（コントロール）
Rat C（コントロール）
Rat D (担癌)

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コントロール（n=3）, 担癌（n=1）
静脈内投与︓5 mg/kg, 2 mL/kg
頸静脈より採⾎後、⾎漿を分離
ヘパリンナトリウム
投与後0.04, 0.25, 1, 3, 7, 10, 14,21, 28 d

171020Sampling point (day)

30

抗体

ADCC（抗体依存性細胞障害）活性ADCC活性とは標的細胞の抗原に抗体が結合，その抗体をNK細胞などがアポトーシスを誘導
ルシフェラーゼバイオアッセイ
FcRγIIIa遺伝⼦及びルシフェラーゼ遺伝⼦を導⼊した細胞をエフェクター細胞として使⽤
エフェクター細胞

エフェクター細胞
NFAT-RE
Luc
標的細胞

FcRγIIIa

Her2陽性乳癌細胞株とエフェクター細胞に抗Her2抗体を添加

中和抗体

中和抗体の中和活性測定に応⽤可能
3000

3000

Her2/neu陰性2500

ヒト乳癌細胞株

2000

Her2/neu陽性

1500

抗原が存在すると発光する

ヒト乳癌細胞株

1000

応⽤Luminescence (RLU)

3500

Luminescence (RLU)

⽶PROMEGA社とライセンス契約締結
www.promega.com

ヒト化抗Her2抗体のみ
2000

中和抗体が存在すると発光しない＋中和抗体添加

1000

500
000.1

11010010000.001

10000

0.1110100

ヒト化抗Her2抗体濃度（ng/mL）

ヒト化抗Her2抗体濃度（ng/mL）
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0.01

181000CDC（補体依存性細胞障害）活性抗体

CDC活性とは標的細胞の抗原に抗体が結合，その抗体に補体が結合して補体系が活性化し標的細胞が溶解補体
 Classical pathway
 Alternative pathway
 Lectin pathway

標的細胞

 リンパ腫細胞株と⾎清由来補体に抗CD20抗体を添加
 死細胞由来のプロテアーゼを測定
 放射性元素を⽤いないタンパク質など放出Luminescence (RLU)

溶解

死細胞が存在するとプロテアーゼが増加→発光
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抗CD20抗体
抗体添加なし抗CD20抗体濃度（ng/mL）

19

抗体

免疫チェックポイント阻害活性
Blockade Bioassay
共抑制分⼦の遺伝⼦及びルシフェラーゼ遺伝⼦を導⼊した細胞を使⽤
免疫チェックポイント阻害剤（抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体など）によって、エフェクター細胞が活性化するとシグナルが得られる。
エフェクター細胞

抗PD-1抗体

NFAT-RE Luc

コントロール抗体

PD-1 など
TCR

免疫チェックポイント阻害剤

MHC

抗体濃度（μg/mL）

PD-L1 など
抗CTLA-4抗体

抗原提⽰細胞コントロール抗体

免疫チェックポイント阻害剤の濃度依存的にシグナルが上昇
⽶PROMEGA社とライセンス契約締結
www.promega.com
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抗体濃度（μg/mL）20

お問合せ先ワンストップサービス
特性解析
薬物濃度
測定

ペプチド
合成

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URL︓https://www.toray-research.co.jp/
ライフサイエンス営業部
関⻄営業部（ライフサイエンス）
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21

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bunseki.trc.mb@trc.toray