III. 遺伝子発現解析
DNA メチル化やヒストン修飾が遺伝子発現に及ぼす影響を解析します。個々の遺伝子の発現解析には、リアルタイム RT-PCR が有用です。網羅的な遺伝子発現解析には、マイクロアレイが用いられます。

A. リアルタイム RT-PCR◆エピジェネティクスと遺伝子発現の相関を解析◆簡便で正確な定量が可能なリアルタイム RT-PCR がお勧め
◆プライマーは Perfect Real Time サポートシステムで【1】原理
通常、CpG アイランドがメチル化されている遺伝子は、mRNA の発現が抑制されています。実際に mRNAの発現量を定量するには、簡便で正確なリアルタイム RT-PCR がお勧めです。

・リアルタイム PCR 専用の逆転写キット-PrimeScript™ RT reagent Kit (Perfect Real Time)-PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)-PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)
本 製品は 、リア ルタイム RT-PCR に最適 化され た逆転 写反応 キットで す。伸 長性能 に優れた
PrimeScript™ RTase を使用し、37℃ 15 分の短時間反応で効率良くリアルタイム PCR 用の鋳型 cDNAを合成することができます。実験操作も簡単でハイスループットな解析にも適しています。ゲノム
DNA 除去反応をプラスした gDNA Eraser 添付タイプも便利です。
エピジェネティクス実験のススメ
遺伝子発現解析 リアルタイム RT-PCR

1/41712

・TB Green 検出系（インターカレーター法）リアルタイム PCR 試薬- TB Green® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)- TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)- TB Green® Premix DimerEraser™ (Perfect Real Time)
TB Green Premix シリーズは、増幅効率と反応特異性に優れた TB Green 検出用のリアルタイム PCR試薬です。
増幅効率と特異性のバランスが取れた TB Green® Premix Ex Taq™ II を 1st choice として、増 幅 効 率 抜 群 の TB Green® Premix Ex Taq ™ や 極 め て 反 応 特 異 性 の 高 い TB Green® Premix
DimerEraser™を組み合せて使用することにより、あらゆるケースで成功率の高いリアルタイム PCR を実現します。
・遺伝子発現解析用リアルタイム PCR プライマー-Perfect Real Time サポートシステム
ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ニワトリ、イネ、シロイヌナズナ の RefSeq 登録 遺伝子または Ensembl Plants 登録遺伝子 に対するリアルタイム RT-PCR 用プライマーの合成受託サービスです。オンラインで簡単に検索＆ご注文が可能で、プライマーの配列はご購入後に開示されます。TB
Green Premix シリーズに最適なパラメータで設計されており、組み合せて使用することにより成功率の高い実験が可能となります。
・リアルタイム PCR 装置-Thermal Cycler Dice® Real Time System シリーズ
「使いやすさ」「コストパフォーマンス」「安心のサポート」をコンセプトに開発されたリアルタイム
PCR装置です。日本語／英語両言語対応ソフトの他、タッチパネル搭載でスタンドアロン制御を可能にし、使いやすさを追求しています。最高のコストパフォーマンスで、初めてリアルタイムPCR装置を導入される場合にも、2台目以降の購入をご検討中の場合にも、幅広く推奨できる装置です。

【2】プロトコール（操作方法の詳細は、各製品の説明書をご参照ください。
）
逆転写反応
PrimeScript™ RT reagent Kit (Perfect Real Time)を使用する場合（１）以下の反応液を氷上で調製する
試薬

使用量

最終濃度

5×PrimeScript Buffer (for Real Time)

2.0μl

1×PrimeScript RT Enzyme Mix I

0.5μl

Oligo dT Primer (50μM)

0.5μl

25 pmol

Random 6mers (100μM)

0.5μl

50 pmol

total RNA

2.0μl

*1

RNase Free dH2O

4.5μl

*1

Total

10.0μl*1total RNA 濃度によって適宜調整可能。通常、リアルタイム PCR の鋳型として、1 反応あたり 10～50 ng（totalエピジェネティクス実験のススメ
遺伝子発現解析 リアルタイム RT-PCR2/41712

RNA 相当量）の cDNA を使用する。リアルタイム PCR に 2μl を鋳型として添加するなら、cDNA 濃度が 5～25 ng/μl になるようにすると良い。なお、効率良く逆転写できる total RNA の上限量は、上記の 10μl 反応系で 500 ng までである。

（２）逆転写反応を行う
37℃
15 分
85℃
5秒
4℃
Hold

（逆転写反応）（逆転写酵素を熱失活させる）（３） 必要に応じて cDNA（逆転写反応液）を希釈する
EASY Dilution (for Real Time)*2 を使用すると、低濃度まで正確に希釈できる。
*2

PrimeScript™ RT reagent Kit (Perfect Real Time)に添付されている。単品でも購入可能。

リアルタイム PCRTB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)を使用する場合（１）以下の反応液を調製する
試薬

使用量

最終濃度

TB Green Premix Ex Taq II (2×)

12.5μl1×

PCR Forward Primer (10μM)

1.0μl

0.4μM*1

PCR Reverse Primer (10μM)

1.0μl

0.4μM*1cDNA

2.0μl

*2

滅菌精製水

8.5μl

*2Total25.0μl

*1 最終 primer 濃度は 0.4μM で良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は 0.2～1.0μM の範囲で最適な濃度を検討すると良い。
*2 cDNA 濃度によって適宜調整可能。逆転写反応液の持ち込みは、2.5μl を上限とする。

（２）以下のプログラムでリアルタイム PCR を行う
Hold（初期変性）
Cycle：1
95℃30 秒

2 Step PCR
Cycle：40
95℃

5秒

60℃

30～60 秒

Dissociation

エピジェネティクス実験のススメ
遺伝子発現解析 リアルタイム RT-PCR

3/41712

【3】実験例
HeLa S3 細胞、A549 細胞から total RNA を抽出し、それぞれ 600 ng を鋳型として PrimeScript™ RT
reagent Kit による逆転写反応を行った。次に、1 反応あたり cDNA 20 ng（total RNA 相当量）を鋳型として TB Green® Premix Ex Taq™ II によるリアルタイム PCR を行った。解析対象遺伝子は、
EpiScope® Promoter qPCR Array (Human) （終売）に搭載されている25種で、該当遺伝子のリアルタ
イム RT-PCR 用プライマーは Perfect Real Time サポートシステムで入手した。
HeLa S3 DNA Methylation
0%

20%

40%

60%

80%

HeLa S3 mRNA Expression
100%

1.0E-12APC
BNIP3BRCA1

CADM1CCNA1

CCND2CDH1CHFR

DAPK1
DKK3

ESR1FHIT

FT%
EL%

GSTP1

LOXMGMTMLH1PTGS2RARBRASSF1RB1SFRP1VHL
WT1GAPDH

1.0E-101.0E-08

1.0E-06

1.0E-04

APC
BNIP3BRCA1CADM1CCNA1CCND2CDH1CHFR
DAPK1
DKK3
ESR1FHITGSTP1LOXMGMT
MLH1PTGS2RARBRASSF1RB1
SFRP1VHLWT1GAPDH

図 1. DNA メチル化と遺伝子発現の相関
左に EpiXplore™により濃縮したメチル化 DNA をリアルタイム PCR で解析した結果を、右にリアルタイム RT-PCR による遺伝子発現解析の結果を示す。遺伝子発現量は、Ct 値をΔΔCt 法により定量値に換算した値で表した。DNA メチル化と遺伝子発現の間に相関が認められる。

【4】製品リスト
NucleoSpin® RNA（製品コード 740955.10/.50/.250）
PrimeScript™ RT reagent Kit (Perfect Real Time)（製品コード RR037A/B）
PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)（製品コード RR036A/B）
PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)（製品コード RR047A/B）
TB Green® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR420S/A/B）
TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR820S/A/B）
TB Green® Premix DimerEraser™ (Perfect Real Time)（製品コード RR091A/B）
Perfect Real Time サポートシステム
Thermal Cycler Dice® Real Time System III（製品コード TP950/TP970/TP980/TP990）
EASY Dilution (for Real Time)（製品コード 9160）

エピジェネティクス実験のススメ
遺伝子発現解析 リアルタイム RT-PCR

4/41712