35●改変型 Fc レセプターの量産技術の開発
ライフサイエンス研究所
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1．緒

蛋白改変グループ
培養技術グループ
蛋白改変グループ
培養技術グループ

寺尾
今泉
山中
半澤陽介
暢直紀
敏

ターには pTrc99A を用い trc プロモーターの下流にシ言

グナルペプチド遺伝子、改変型 FcR 遺伝子、固定化

近年、抗体を治療薬として利用する抗体医薬品の開タグ遺伝子の順に遺伝子を挿入した。なお、シグナル発が大きく進展しており、抗体医薬品が医薬品売り上ペプチドは発現量向上の為、既知の pelB シグナルにげトップ 10 の上位半分を占めるに至っている。抗体

当社独自の改変を行ったもの 15）、固定化タグはチオー

医薬品の市場は、全世界で 5 兆円（2015 年）規模となっル基の高い反応性を利用してトヨパールに結合させるており、年率 10％弱の伸びで 2020 年には 8 兆円に達ためシスチンを含むペプチドを用いた 16）。発現菌株に1）すると予想されている 。

は、大腸菌 W3110 株を用いた。これらベクターと大抗体医薬品は動物細胞の培養などで製造され、各種腸菌ともに安全性が確認され経済産業省の GILSP リフィルターろ過やカラムクロマトグラフィーを利用しストに掲載されている。マスターセルバンク 30 本をて精製後、製品化される。カラムクロマトグラフィー作成し、その 1 本からワーキングセルバンク 50 本をによる精製では、ProteinA ゲル（GE ヘルスケア社製）作成し、－ 80℃で凍結保存している。

によるアフィニティークロマトグラフィーの利用が一般的となっている（シェア～ 80％）
。東ソーにおいて®

も TOYOPEARL AF − rProteinA HC − 650F が昨年上市［2］培養工程（高密度培養による FcR 高生産）ワーキングセルのうち 1 本を用いてラボスケールの3 L 培養槽での前々培養、100 L 培養槽での前培養を経され、注目をされている。
Fc レセプター（以下、FcR）は、体内の免疫機構て 1.5 m3 培養槽にて培養する。最終的に菌体量は 100に関与し、免疫グロブリン分子（IgG）の Fc 領域にg ／ L に達し、菌体内に 1.1 ～ 1.3 g ／ L の FcR が蓄積し結合する一連のタンパク質である 2）。FcR は、生体内た 17 − 19）。の多様な分子の存在下で抗体と選択的に結合して免疫応答を司ることから、抗体精製用のアフィニティーク択性を発揮することが期待されている。これまでに天組換え大腸菌廃液

ロマトグラフィー用リガンドとして従来品より高い選界面活性剤
酸，アルカリ菌体

然型 FcR の耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性を向上させた改変型 FcR※3 − 6）、改変型 FcR をトヨパールゲルへと効率的に固定化する方法 7 − 8）、微生物による FcR の廃液製造方法を開発してきた 9 − 14）。本報では、東京研究所

前培養培養払出3の技術実証設備（主反応槽 1.5 m ）を用いて構築した①培養工程

FcR 量産技術について述べる。

抽出酸処理

清澄化

②粗精製工程前半

緩衝液

2．製造方法詳細※

図１に、構築した量産方法の概略図を示した。

精製FcR

廃液

［1］発現菌株
FcR は、FcR 遺伝子を導入した組換え大腸菌を用いて、高密度培養により大量発現させている。発現ベク

膜濃縮

加水ろ過

③粗精製工程後半

図１

清澄化

カラム精製
④精製工程

量産方法の概略図TOSOH Research & Technology Review Vol.58（2014）36と進む。

［3］粗精製工程（抽出、酸処理、各種分離操作による粗精製）
高密度培養液を遠心分離して大腸菌菌体を回収し、［4］精製工程（カラムクロマトグラフィー分離による界面活性剤等の薬剤によって FcR を抽出する。薬剤精製）には、陽イオン界面活性剤と非イオン性界面活性剤を粗精製FcRは、陽イオン交換（TOYOPEARL® CM−650M

組み合わせた独自の動物原料フリーの抽出試薬を作製：CM カラム精製）と疎水性相互作用（TOYOPEARL®

した 20）。

Phenyl − 650M：phenyl カラム精製）クロマトグラフィー

さらに、抽出液の純度を向上させるため、酢酸での 2 本のカラムクロマトグラフィーで高収率に精製さpH を 3 ～ 4 として FcR 以外の夾雑タンパク質を沈殿れる（図２及び図３）。大腸菌は細胞膜にエンドトキさせる。pH 調整前と比較し FcR の純度が 10 倍以上

シンを含むため、人体に投与すると発熱源となり残存向上し21）、また、抽出液中の残存大腸菌も殺菌される。

が大きな問題となるが、クロマトグラフィーに使用すさらに限外ろ過膜による濃縮と脱塩を行い次工程へる水を全て脱エンドトキシン水を用いることでエンドト
キシンは管理規格値 20 EU ／ mg 以下に低減される 22）。

CMカラム精製

160
mAu

タンパク質吸光度［mAU］

3500

％B

3000

［5］製品分析

140120製造した FcR の品質目標として以下の表１に示す
溶離液割合［％］

4000

2500

100

2000

80

1500

60

1000

40100500

207500100020406080kDa

120

800

80400

406080150

電気泳動後CBBによりタンパク質を染色。M：分子量サイズマーカー、1：抽出液、2：酸処理液、3：濃縮液、4：CMカラム精製溶出液、5：Phenylカラム精製溶出液。

時間［min］

図２525
溶離液割合［％］タンパク質吸光度［mAU］

160％B

40

450

1200

203200mAu

0235

Phenylカラム精製

1600

01150

時間［min］

2000

M

図３

カラム精製クロマトグラム（CM＆Phenyl）

表１

各工程でのSDS−PAGEによるタンパク質鈍度分析結果

品質管理規格値と分析結果

分析項目

規格値

分析値
Lot A

Lot B

Lot C

GPC 分析

95％以上

99％99％

96％

RP−HPLC 分析

95％以上

97％

99％

98％

SDS−PAGE 分析

単一バンド単一

単一

単一

吸光スペクトル 280 ／ 250 の比

1.2 以上2.02.22.4

タンパク質濃度10 g ／ L

10.111.210.9

エンドトキシン濃度

20 EU ／ mg 以下

0.53.00.02

伝導度

2 mS ／ cm 以下

1.30.81.7

東ソー研究・技術報告表２37

安全性試験結果

試験法
被験動物等

項目

第 58 巻（2014）

検体

結果

急性毒性

ラット静注

30 mg ／ mL 水溶液 LD50＞600 mg ／ kg（死亡例なし）

変異原性

AMES

30 mg ／ mL 水溶液 陰性

抗原性

全身アナフィラキシー試験（モルモット）

1μg ／ mL 水溶液
10μg ／ mL 水溶液

1μg ／匹（3μg ／ kg）：抗原性−※10μg ／匹（30μg ／ kg）：抗原性＋※呼吸障害、不安行動等。30 分後に回復

管理規格値を作成した。技術実証設備では 3 回の試作安定に保存できることを確認することが出来たを行ったが、すべてのロットで規格値を満たす純度が（図４）
。

得られた。

3．まとめ

［6］安全性製造された FcR を固定したゲルは、ユーザー（製抗体医薬精製用アフィニティークロマトグラフィー

薬メーカー等）により、抗体医薬品製造の精製工程に使用するゲルのリガンドとして、FcR の製造方法のに使用されるため、FcR 自体の安全性（急性毒性、変構築、ラボスケールからパイロットスケールへのス異原性、抗原性）が求められる。そこで、急性毒性、ケールアップの検討、パイロットプラントを使用して変異原性、抗原性を外部委託で分析した。その結果、FcR の製造を実施した。製造した FcR は製品規格を

FcR の安全性に問題ないことが確認できた（表２）。

満たすことが確認され、1 年間安定に保存可能であることも確認できた。FcR を固定化した FcR ゲルは 1 L
あたり 50 g の IgG を吸着し（動的吸着量）、200 回以［7］安定性
精製 FcR には当初保存中に凝集・沈殿が発生する上繰り返し使用できる。

問題があった。原因を追究したところ、FcR の溶解度はある種のイオンに強く影響を受けることが判明した。そこで、製造した FcR を純水に対して十分に透析することでこの問題を解決した 23）。

4．謝辞
培養技術の構築に当り多数のご助言を頂きました中製造した FcR 水溶液の保存安定性を継続的に観察

部大学教授の山根恒夫先生に感謝いたします。さらにした。低濃度、高濃度での FcR 溶液を作製し、各種筆者らと共に本技術の開発に携わった村山敬一主席研条件にて保存安定性を確認したところ、4℃以下での究員、井出輝彦副理事、大江研究員、小林研究員、田保存条件下で約 1 年にわたり、分解等は認められず、中研究員、朝岡研究員、野口研究員他多数の皆様に感謝いたします。

35

5．参考文献30

濃度［g／L］25１）西島正弘、バイオ医薬品、化学同人、1 − 6（2013）20２）J.V.Racetch, et al ., Annu. Rev. Immunol ., 9, 457（1991）

15３）畑山10耕太、朝岡義晴、田中亨、井出輝彦、

特開 2011 − 206046

5４） 寺 尾0024681012

保持期間［ヶ月］
保存条件：△＝30 g／L，−20℃； ＋＝30 g／L，4℃；◯＝10 g／L，−20℃； ×＝10 g／L，4℃

図４

保存安定性

陽 介、 半 澤敏、 今 泉

暢、 特 開 2013 −146234
５） 半 澤敏、 今 泉

暢、 寺 尾陽 介、 特 開 2013 −義晴、田中亨、小林秀峰、井出112640
６）朝岡畑山耕太、特開 2014 − 27916

輝彦、TOSOH Research & Technology Review Vol.58（2014）38７） 田 中亨、 井出輝彦、飯田寛、特開 2010 −126436
８）田中 亨、小林 秀峰、朝岡 義晴、井出 輝彦、
大江正 剛、 豊 嶋俊 薫、 伊 藤

博 之、 特 開2013 − 59313
９） 穂 谷恵、井出輝彦、田中亨、特開 2008 −10）小林秀峰、井出輝彦、特開 2009 − 201403

11）田中亨、井出

12）朝岡義晴、井出輝彦、特開 2011 − 72246

13）畑山耕太、穂谷恵、井出245580
輝彦、特開 2009 − 278948
輝彦、田中亨、

特開 2011 − 97898
14）寺尾陽介、半澤敏、特開 2011 − 200147

15）特許出願中
16）朝岡
井出義晴、田中亨、小林秀峰、大江正剛、輝彦、特開 2014 − 187993

17）今泉暢、半澤敏、特開 2012 − 3459118）今泉暢、半澤敏、特開 2013 − 8553119）今泉暢、半澤敏、特開 2013 − 18814120）寺尾陽介、半澤敏、山中直紀、寺尾陽介、半澤陽介、半澤敏、特開 2014 − 118402

直紀、特開 2013 −252099
21）山中敏、特開 2014 −90709
22）寺尾23）特許出願中