日本大学歯学部紀要 40，1‑6，2012

亜鉛イオンが骨芽細胞株（Saos‑２）の生細胞およびサイトカイン産生に及ぼす影響（第３報)
横瀬勝美

中野善夫

桑田文幸

Effects of zinc ion on cell viability, IL‑1α and IL‑6 production
by the human osteosarcoma cell line, Saos‑2
Katsumi Yokose, Yoshio Nakano and Fumiyuki Kuwata
Abstract
The effects of zinc ions on cell viability and production of interleukin 1α (IL‑1α) andinterleukin 6(IL‑6)in the human osteosarcoma cell line Saos‑2 were investigated.Cells werecultured in DM EM supplemented with 10% FBS and antibiotics for 24 h before the additionof 0.1 mM ZnCl .Cell viability was assessed by colorimetric assay using LDH cytotoxic test
following incubation for 6, 10, 24 or 48 h. Production of IL‑1α and IL‑6 in Saos‑2 cells wasexamined using ELISA.Incubation with 0.1 mM zinc ions had no effect on cell viability after
48 h. Moreover, addition of zinc ions had little effect on production of IL‑6 in these cells.
Key words: cell viability, IL‑1α production, IL‑6 production, osteosarcoma cell, zinc ion緒

その濃度によっては生体および局所的な部分に言おいて代謝の変化をもたらすものとえられている 。

亜鉛は必須金属元素であり ，他の微量元素よりも高濃度で生体に広く分布し人体では肝著者らは，先に金属イオンが口腔軟組織，と臓，筋肉に多く含まれている。それは亜鉛が数くに上皮組織におよぼす影響を解明する第一ス

多くの金属酵素（metallo‑enzyme）の構成成分テップとして，歯科補綴物の成分であるチタンであることや，生体において細胞分裂やタンパおよびニッケル，歯科修復物の合金中に存在すク質合成に密に関係している。そして DNA，る 亜 鉛 に つ い て，ヒ ト 口 腔 由 来 上 皮 細 胞 株

RNA の生合成に際しては，DNA polymerase，（Ca 9‑22）のコンフルエント後の生細胞数およRNA polymerase および thymidine kinase のび DNA 合成能におよぼす影響について報告し構成成分としてその酵素活性に重要な役割を果た 。本研究では，口腔内口臭予防薬中に含まれたしている。さらに個々の細胞に対しては酵素ている塩化亜鉛を使用し，ヒト骨肉腫由来の株を介し，細胞膜構造に直接働きかけて細胞の機化骨芽細胞（Saos‑２）を使用し，亜鉛を添加し，能を左右している。このように亜鉛は生体に生細胞数への経時変化に及ぼす影響ついて検討おいて必須元素である。そして，亜鉛の欠乏やを行った。さらに，インターロイキン―1α（IL日本大学歯学部化学教室
日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門〒 101‑8310 東京都千代田区神田駿河台１‑８‑13

Department of Chemistry, Nihon University School ofDentistry
Division of Functional M orphology, Dental Research(受理：2012年９月 30日）

Center, Nihon University School of Dentistry
1‑8‑13 Kanda‑Surugadai, Chiyoda‑ku, Tokyo 101‑8310 Japan1

日本大学歯学部紀要 40，1‑6，2012‑1α）および IL‑６ の２種類のサイトカイン産オンの濃度，0.1mM を含む DMEM に交換し，生に及ぼす亜鉛イオンの影響も併せて検討しその作用時間をそれぞれ６，10，24および 48時た。

間として培養を行った。なお，培地中の亜鉛イオンは終末濃度 0.1mM になるように添加し材料および方法た。亜 鉛 イ オ ン を 作 用 さ せ た 後，無 血 清 のDMEM と交換し 24時間培養後，上清を回収す

１. 細胞培養
実験には骨芽細胞として理化学研究所細胞開る。培養上清を回収後，IL‑1α定量用 ELISA

発 銀 行 か ら 購 入 し た Saos‑２ 細 胞 を 使 用 いキット（ BioSource）お よ び IL‑６ 定 量 用た。Saos‑２細胞は，Dullbeccoʼ
s modifiedELISA キット（BioSource）を用いて上清中のEagle medium（DM EM ，旭テクノグラス）に，サイトカイン量を定量した。コントロールは材10％ウシ胎児血清（FBS，旭テクノグラス），50料および方法の２. と同様である。

U/ml ペニシリンおよび 50μg/ml ストレプト成マイシン（Sigma）を加えた培地を用い，37°C，５％CO の湿潤条件下で培養を行った。

績１. 細胞障害率（経時変化）

２. 細胞障害率（経時的変化）

Saos‑２細胞に亜鉛イオン 0.1mM 濃度を添

生細胞へのチタンイオンによる経時的変化の加した影響を第１図（経時的変化（細胞障害率）

影響を調べるために，24穴プレートに Saos‑２に示した。

細 胞 １×10 個/cm を 播 種 し，500 μL の第１図では，亜鉛イオン濃度 0.1mM ，作用時

DM EM（10％FBS および抗生物質を含有）で培間６，10，24および 48時間として培養を行っ養を開始した。Saos‑２細胞播種後，24時間後にた。亜鉛イオン添加により細胞障害率は，コン亜鉛イオン（ZnCl ）を含む無血清の DM EM（抗トロールでは 0.3％，６時間では 0.8％，10時間生物質を含有）に交換した。生細胞への亜鉛イで は 1.0％，24時 間 で は 1.4％，48時 間 で はオン経時的変化の影響を調べるためにその作用4.4％の細胞障害率であった。亜鉛イオン添加後時間をそれぞれ６，10，24および 48時間としてではコントロールからわずかに細胞障害率が増培養を行った。なお，培地中の亜鉛イオンは終加した。各週の細胞状態をコントロールと亜鉛末濃度 0.1mM になるように添加した。亜鉛イイオン作用時間（コントロール，６時間〜48時オンを作用させた後，無血清の DM EM と交換間）を比較し，細胞状態を図２〜６に示した。

し 24時間培養後，上清を回収する。回収した上清は 3000rpm，５分遠心し，LDH―CytotoxicTest（和光純薬）を用い細胞障害率を比色測定した。また，実験は２連で行い，結果は平値で示した。金属イオン経時変化を比較するため，亜鉛イオン無添加の場合をコントロールとし，DM EM （10％FBS および抗生物質を含有）で24時間培養を行った。
３. IL‑1αおよび IL‑６産生材料および方法の２. と同様に，24穴プレー

第１図 Saos‑２細胞の細胞障害率に及ぼす亜鉛イオンの影響

トに Saos‑２細胞を播種後，24時間後，亜鉛イ2骨芽細胞と亜鉛イオン

第２図

第３図

Saos‑２細胞 48時間後の control形態

第５図

亜鉛イオン 0.1mM 24時間作用させたときの細胞形態

亜鉛イオン 0.1mM ６時間作用させたときの細胞形態

第６図

亜鉛イオン 0.1mM 48時間作用させたときの細胞形態

きな変化はなかった。
２. IL‑1α産生
コンフルエントに達した後の Saos‑２細胞のIL‑1α産生におよぼす亜鉛イオン 0.1mM 濃度の経時的変化の影響を調べた結果を第１表に示した。
Saos‑２細胞の IL‑1α産生におよぼす亜鉛イオン濃度の経時的変化の影響を調べた結果，
IL‑1α産生量は亜鉛イオン濃度 0.1mM コン
第４図

亜鉛イオン 0.1mM 10時間作用させたとトロールおよび作用時間６，10，24および 48時

きの細胞形態間すべて測定検出限界以下のため測定不可であった。
３. IL‑６産生各週のコントロールと亜鉛イオン添加を比較す

Saos‑２細胞の IL‑６産生におよぼす亜鉛イると亜鉛イオン添加した場合と細胞の増殖に大3日本大学歯学部紀要 40，1‑6，2012

第１表 Saos‑２細胞の IL‑1αの産生に及ぼす亜鉛イオンの影響

オン濃度の経時的変化の影響を調べた結果，ILIL‑1α量（pg/mL)‑６産生量は亜鉛イオン濃度 0.1mM ，６時間作

作用時間
６ｈ

10 ｈ

平24 ｈ
48 ｈ

用させ培養した場合で 1.11pg/mL，10時間で値

Cont.
Zn＜0.80＜0.80＜0.80＜0.80＜0.80＜0.80

Cont.

＜0.80＜0.80＜0.80＜0.80＜0.80＜0.80Cont.
Zn＜0.80＜0.80＜0.80＜0.80＜0.80＜0.80Cont.
Zn＜0.80＜0.80＜0.80＜0.80＜0.80＜0.80

Zn

Saos‑２細胞の IL‑６産生におよぼす亜鉛イ1.86pg/mL，24時間で 2.10pg/mL，48時間で2.68pg/mL となった。IL‑６産生量は時間と共に徐々に増加がみられた。

察
亜鉛はすべての生物の生命維持に必須金属元素であることが明らかである。そして他の微量元素よりも高濃度で生体に広く分布し，人体では，肝臓，および筋肉に多く，全血液中には 900μg/dL 含まれているといわれている。亜鉛

第２表 Saos‑２細胞の IL‑６産生に及ぼす亜鉛イオンの影響が欠乏するとラットにおいて発育遅延，脱毛症

IL‑６量（pg/mL)が報告され，上皮の代謝にも重要な役割を担っ作用時間

平および皮膚粘膜の肥厚や角化などを呈することていることが示唆される。また，亜鉛は，いろ値Cont.
６ ｈ0.951.110.441.110.69
1.1110 ｈ
24 ｈ
48 ｈ

1.882.172.61

1.83
2.03
2.75

1.86
2.102.68

いろな金属酵素の構成成分として，亜鉛フィンガー，亜鉛クラスターおよび亜鉛ツィストの３種類の結合様式を形成し DNA などと結合していること，また，亜鉛は癌の抑制効果からの研究がなされており ，紫外線が関与した活性酸素の生成による皮膚の細胞毒性,さらには発癌性を防御する効果があるという報告もある 。このように生体において微量必須元素でありながら，その濃度によっては生体および局所的な部分において悪影響を与えるとえられる金属イオンに亜鉛イオンがあげられる。
著者らは一般的な細胞毒性試験による金属イオンの生細胞数に及ぼす影響に加えて，より感度の高い DNA 合成に及ぼす影響も併せて検討した結果から，金属イオンに対するわずかな反第７図 Saos‑２細胞の IL‑６の産生に及ぼす亜鉛イオンの影響応性も提える可能性を示唆することができたとえる。本研究ではより詳細な検討を加えるために，口腔内口臭予防薬中に含まれている酢オン濃度の経時的変化の影響を調べた結果を第酸亜鉛を使用し金属イオンを作用させる時間を２表，第７図に示した。

変化させて骨芽細胞株（Saos‑２）に対する影響
4骨芽細胞と亜鉛イオン

ルは測定検出限界以下のため測定不可であっを検討した。
生細胞数に及ぼす影響を生細胞障害率の測定た。IL‑６産生量の測定は，IL‑６は B 細胞刺激には LDH 測定法を用いた。本測定の LDH―因子として純化されたサイトカインであるが，Cytotoxic Test は細胞毒性を簡便に測定でき骨芽細胞るばかりでなく，細胞が細胞膜に障害を受けてPTH，などによりその産生が促進され間接的に細胞から遊離した LDH（乳酸脱水素酵素）活性破骨細胞の活性化をも促進するため，亜鉛イオを測定することができ，生理活性物質による細ンが Saos‑２細胞の IL‑６産生を促進するかど胞障害や細胞性免疫による細胞障害，補体依存うかを調べた。その結果，Saos‑２細胞の亜鉛イ性細胞障害，抗体依存性細胞障害の他，細胞のオン添加による，IL‑６産生量は，表２，第 11図生存率にも利用できることからこの方法を用いに示したように IL‑６産生量は時間と共に徐々た。コントロールは血清培地で 48時間培養を行に増加がみられた。

でも産生され，IL‑1α，TNF，い，上清を回収する前の 24時間を無血清培地と以上のことから亜鉛イオンによるヒト骨肉腫交換し上清を回収し測定を行った。同時に血清由来の株化骨芽細胞への影響は，短時間亜鉛イ培地中で細胞状態を観察した。

オンを作用させた場合 IL‑６サイトカイン産生細胞障害率は第１図に示したように，亜鉛イ量をわずかに増加させた。炎症性サイトカイン

オン添加後ではコントロールから徐々に細胞障である IL‑１α，IL‑６への影響を見るためには害率は 48時間まで僅かに増加した。
亜鉛作用時

亜鉛イオンを長時間作用させる必要があると間後の細胞状態をコントロール，６時間〜48時えられる。

間ごとの細胞状態（図２〜６）を示した。亜鉛謝

イオンを添加していると細胞の増殖がやや劣っているが，大きな変化はみられなかった。

辞本研究の一部は平成 21，22年度日本大学歯学サイトカイン産生に及ぼす影響をチタンイオ部佐藤研究費によって行われたことを付記す

ンの経時的変化にあわせて検討した。インターる。

ロイキン―1α（IL‑1α）は単核球が産生する歯文

骨細胞刺激因子の主成分であることが明らかに献されて以来，IL‑1αの骨代謝・骨疾患との関連

１）Sommer AL, Lipman CB (1926)Evidence onが検討されて，最も強力な骨吸収促進因子の１

the indispensable nature of zinc and born forhigher green plants.Plant.physiol,1,231‑249

つである。IL‑1αはきわめて低濃度で，ヒト骨２）Williams RJP (1989) An introduction to the髄細胞より歯骨細胞を誘導する作用をもち，更biochemistry of zinc, Mills CF, Zinc in
human biology, Springr‑Velag, London, 15に骨芽細胞を介して間接的に歯骨細胞の活性化を促進する。一方，IL‑1αはヒト骨芽細胞の‑31３）岡田正，高木洋治（1984）亜鉛と臨床，朝倉書DNA 合成促進作用を示し，コラーゲン合成に関しては少量で促進，大量で抑制作用を示すた

店

め，亜鉛イオンが Saos‑２細胞の IL‑1αの産４）Leccia MT,Richard MJ,Beani JC,Faure H,生を促進するかどうか調べた。その結果，SaosMonjo AM, Cadet J, Amblard A Favier‑２細胞の IL‑1α産生におよぼす亜鉛イオン(1993)Protective effect of selenium and zincon UV‑A damage in human skin fibroblasts.

濃度の経時的変化の影響を調べた結果，IL‑1α

Photochem Photobiol, 58(4), 548‑553

産生量は表１，に示したように，各週コントロー
5日本大学歯学部紀要 40，1‑6，2012

５）横瀬勝美，桑田文幸（2001）口腔由来細胞株（Ca 9‑22）の生細胞数および DNA 合成能に及

human and animals, both normal and dwarfed. Clin Orthopaed Metabol 17, 205‑212

ぼす金属イオンの影響．研究紀要日本大学歯学

12）Vallee BL, Colman JE (1991) Zinc fingers,
zinc clusters,and zinc twists in DNA‑binding部（一般教養），29，37‑44
６）Bridgewater LC, M anning FC, Woo ES,

protein domins. Proc Natl Acad sci USA,
88(3), 999 ‑1003

Patierno SR (1994) DNA polymerase arreseby adducted trivalent Chromium. M ol Carcinog, 9(3), 122‑13313）Koizumi T,Li ZG,Tatsumoto H (1992)DNA７） Spyrou P, Papaioannou S, Hampson G,cells, a target cell population for cadmium

Brandy K, Palmer RM , M cdonald F (2002)
Cytokine release by osteoblast‑like cell cul-

carcinogenesis in the rat testis.Toxicol.Lett,
63(2), 211‑220

tured on implant discs of varying alloy
composliions.Cline Oral Imp Res 13,623‑630

14）Sauder DN, Kilian PL, McLane JA, Quickdamaging activity of cadmium in Leydig

TW,Jakubovic H,Davis SC,Eaglestein WH,Mertz PM (1990) Interleukin‑1 enhances８）Fogh J, Wright WC, Loveless JD (1977)
Absece of HeLa cell contamination in 169

epidermal wound healing. Lymphokine Res9, 465‑473

cell line derived from human tumors. J Nat
Cancer Inst 58, 209 ‑21415）Kupper TS (1990) The activated ker-９）Dunsomore SE,Rubin JS,Kovacs SO,Dhedid

atinocyte a model for inducible cytokine
production bynon‑bone marrow‑derived

M, Parks WC, Welgus HG (1996) M echanisms of hepatocyte growth factor stimula-cells in cutaneous inflammatory and immune
responses. J Invest Dermatol 94, 146s‑150stion of keratinocyte metalloproteinase production. J Biol Chem, 271, 24576‑24582

16）Aida Y, Maeno M, Suzuki N, Nanba A,10）Samachson J and andSchmitz A (1968) Thereactions of H and Zn

Motohasi M, Matsumoto M, Makimura M,
Matsumura H (2006) The effect of IL‑1βonwith he surfaces ofbone and bone matabolism, Biochem Biophys Acta, 170, 409 ‑419

the expression of inflammatory cytokines
and their receptors in human chondrocytes.
Life Sci 79, 764‑771

11）Schor RA (1974)Trace levels of manganese,copper, and zinc in rib cartilage to age in6