I.

DNA メチル化解析

DNA メチル化解析手法は、(A) メチル化 DNA を濃縮する方法、(B) バイサルファイト処理による塩基置換を利用する方法、(C) メチル化感受性の制限酵素を利用する方法の 3 種類に分類されます。新規ター
ゲットのスクリーニングには(A)の手法が、個別ターゲットの詳細な解析には(B)や(C)の手法がよく用いられています。

B. バイサルファイト処理◆非メチル化シトシンをウラシルに変換◆特定領域の DNA メチル化解析に【1】原理
バイサルファイト処理を行うことで、DNA 中のメチル化されていないシトシン（非メチル化シトシン）はウラシルに変換されます。一方、メチル化シトシン（5mC）はバイサルファイト処理では変換されないため、本処理を行うことでメチル化シトシンと非メチル化シトシンを区別することができます。処理後、非メチル化 DNA とメチル化 DNA は異なる塩基配列を持つことになり、PCR 増幅後にシーケンス解析や制限酵素処理などの方法で DNA メチル化解析を行うことができます。
・MethylEasy™ Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit（終売）
本製品ではバイサルファイト処理の改良法を採用しており、所要時間が短く（約 90 分）、わずか 50 pgの DNA からの処理が可能です。変換 DNA の回収には、取扱いが簡単な精製カラムを使用します。

CpG 配列がメチル化されている場合

CpG 配列がメチル化されていない場合

mCGmCGTCTATGmCGAGGCmCGG

CGCGTCTATGCGAGGCCGG↓

バイサルファイト処理

mCGmCGTUTATGmCGAGGUmCGG↓CGCGTTTATGCGAGGTCGG
GCGCAAATACGCTCCAGCC↓UGUGTUTATGUGAGGUUGG

PCR 増幅↓TGTGTTTATGTGAGGTTGGACACAAATACACTCCAACC

図１. バイサルファイト処理とPCR増幅【2】プロトコール
以下は、大まかな実験の流れです。操作方法の詳細は、該当製品の説明書などをご参照ください。
（１） ゲノム DNA の抽出
NucleoSpin® Tissue によりゲノム DNA を抽出する（「4．各解析に共通の試薬・キット」参照）。
ゲノム DNA の必要量は、その後の解析手法によって異なるが、MethylEasy™ Xceed Rapid DNA
Bisulphite Modification Kit による 1 回の処理には、50 pg～5μg のゲノム DNA を用いる。
（２） バイサルファイト処理（操作方法の詳細は、MethylEasy™ Xceed の製品説明書をご参照ください。
）
エピジェネティクス実験のススメ
DNA メチル化解析 バイサルファイト処理

1/1021041）ゲノム DNA（50 pg～5μg）に NaOH を添加する
2）37℃で 15 分間、インキュベートし、DNA を変性させる
3）キット添付の Reagent #1＆Reagent #2 混合物を添加し、混和する
4）80℃で 45 分間、遮光してインキュベートし、バイサルファイト処理を行う（３） バイサルファイト処理済み DNA の精製
1）キット添付のカラムを用いて精製する
2）12～100μl の Elution buffer で溶出する（４） 脱スルホン酸処理
1）95℃で 20 分間、インキュベートし、脱スルホン酸処理を行う【3】実験例
5 つのゲノム DNA 領域につき、96 クローンのバイサルファイトシーケンス解析を行い、その結果からCpH の変換効率を求めた。どの領域も 99%前後の高い効率で変換されており、合計では 99.07%の変換効率であった。
（実験手法の詳細は、「A-b-i. バイサルファイトシーケンス解析」の項をご参照ください。
）
解析領域

“C”総数

未変換”C”

変換率 (%)

110,48187

99.17

216,7239599.43

316,566

10699.36

423,49027398.84

519,13624198.74

合計

86,39680299.07

本解析は、京都大学 iPS 細胞研究所よりご依頼いただきました。

下記の項目もご参照ください。
バイサルファイトシーケンス解析
MSP (Methylation Specific PCR)COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis)【4】製品リスト
NucleoSpin® Tissue（製品コード 740952.10/.50/.250）
MethylEasy™ Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit（終売）

エピジェネティクス実験のススメ
DNA メチル化解析 バイサルファイト処理

2/102104

d. バイサルファイトシーケンス解析◆バイサルファイト処理済み DNA のシーケンス解析◆特定領域の DNA メチル化を一塩基の解像度で解析【1】原理
バイサルファイト処理後に、解析目的のゲノム DNA 領域を PCR 増幅し、クローニングしてシーケンス解析を行います。
・TaKaRa EpiTaq™ HS (for bisulfite-treated DNA)
バイサルファイト処理後の PCR には、TaKaRa EpiTaq™ HS (for bisulfite－treated DNA) をお勧めします。バイサルファイト処理した DNA にはウラシルが含まれており、α型の DNA ポリメラーゼでは効率良く増幅することができませんのでご注意ください。
CpG 配列がメチル化されている場合

CpG 配列がメチル化されていない場合

mCGmCGTCTATGmCGAGGCmCGG

CGCGTCTATGCGAGGCCGG↓バイサルファイト処理

mCGmCGTUTATGmCGAGGUmCGG↓CGCGTTTATGCGAGGTCGG
GCGCAAATACGCTCCAGCC↓UGUGTUTATGUGAGGUUGG

PCR 増幅↓TGTGTTTATGTGAGGTTGGACACAAATACACTCCAACC

図2．バイサルファイト処理とPCR増幅【2】プロトコール（操作方法の詳細は、各製品の説明書をご参照ください）（１） ゲノム DNA の抽出
NucleoSpin® Tissue によりゲノム DNA を抽出する（「4．各解析に共通の試薬・キット」参照）。
（２） バイサルファイト処理
MethylEasy™ Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit によりバイサルファイト処理を行う（「A-b. バイサルファイト処理」参照）。
（３） TaKaRa EpiTaq HS (for bisulfite-treated DNA) による PCR 増幅
1）以下の反応液を氷上で調製する。
試薬使用量
最終濃度
TaKaRa EpiTaq HS (5 units/μl)
0.25μl1.25 units
10× EpiTaq PCR Buffer (Mg2+ free)
5μl
1×25 mM MgCl25μl
2.5 m
dNTP Mixture (2.5 mM each)
6μl 0.3 mM each
Forward Primer (20μM)
1μl
0.4μM
Reverse Primer (20μM)
1μl
0.4μM
DNA<100 ng
滅菌精製水Up to 50μlエピジェネティクス実験のススメ
DNA メチル化解析 バイサルファイト処理

3/102104

2）以下の条件で PCR 増幅を行う。
98℃ 10 秒
55℃ 30 秒
72℃ 30 秒～1 分 *1
（30～40 サイクル）*2*1 伸長反応時間は、1 kb/1 分を目安に設定する。増幅効率が悪い場合は、時間を延長すると改善することがある。
*2 増幅量が少ない場合は、サイクル数を増やす。

3）アガロース電気泳動により増幅産物の確認を行う（４） DNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞によるクローニング
1） プラスミドベクターおよび PCR 産物を含む DNA 溶液 5～10μl を用意する
2） 1）の DNA 溶液と等量の Ligation Mix (5～10μl) を添加し、よく混合する
3） 16℃で 30 分間、保温する
4） 100μl のコンピテントセルに 10μl の反応液を加え、形質転換を行う
5） 形質転換後、37℃にて一晩培養する（５） シーケンス解析
24 個以上*5 のクローンについて、定法によりシーケンス解析を行う*5 正しい解析結果を得るには、多数のクローンについてシーケンス解析を行う必要がある。定性的な解
析の場合にも、少なくとも 24 個以上のクローンの解析を行うことが望ましい。

【3】受託サービスのご案内
次世代シーケンサーを用いたバイサルファイルシーケンス解析サービスを行っております。
ゲノム DNA を提供いただき、バイサルファイト処理後、シーケンスライブラリーを作製し、全ゲノムをシーケンスします。取得したシーケンスリードを参照配列にマッピングし、3 種類のシトシン(CpG, CHH,CHG)ごとにメチル化率を算出します。また、サンプル間で統計学的有意差を示すシトシンの検出や、その領域(DMRs)を同定します。
バイサルファイト処理後、PCR にてターゲット領域を増幅し、シーケンスを行う特定領域バイサルファ
イトシーケンス解析も行っております。各検体のメチル化レベルを統計解析し、全体像をビューワで表示します。

バイサルファイトシーケンス解析

エピジェネティクス実験のススメ
DNA メチル化解析 バイサルファイト処理

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＜全ゲノムバイサルファイトシーケンス 納品データ例>
シトシンタイプ別にメチル化率をまとめたリスト＜特定領域バイサルファイトシーケンス解析 納品データ例＞
メチル化率ヒートマップ【4】製品リスト
NucleoSpin® Tissue（製品コード 740952.10/.50/.250）
MethylEasy™ Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit（製品コード ME002）
TaKaRa EpiTaq™ HS (for bisulfite-treated DNA)（製品コード R110A/B）
DNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞（製品コード 6023）
T-Vector pMD20（製品コード 3270）

E. coli HST08 Premium Competent Cells（製品コード 9128）
EpiScope® Methylated HeLa gDNA（製品コード 3520）

エピジェネティクス実験のススメ
DNA メチル化解析 バイサルファイト処理5/102104

【4】製品リスト
NucleoSpin® Tissue（製品コード 740952.10/50/250）
MethylEasy™ Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit（終売）
TaKaRa EpiTaq™ HS (for bisulfite-treated DNA)（製品コード R110A/B）
DNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞（製品コード 6023）
TaKaRa T-Vector pMD20（製品コード 3270）

E. coli HST08 Premium Competent Cells（製品コード 9128）
EpiScope® Methylated HeLa gDNA（製品コード 3520）
EpiScope® Methylated HCT116 gDNA（製品コード 3522）
EpiScope® Unmethylated HCT116 DKO gDNA（製品コード 3521）

e. Methylation Specific PCR (MSP)◆メチル化／非メチル化 DNA 特異的 PCR◆多検体の解析や微量メチル化 DNA の検出に最適【1】原理
バイサルファイト処理により CpG 配列のメチル化状態に応じて配列が変化する箇所にメチル化 DNA 検出用と非メチル化 DNA 検出用のプライマー（M primer および UM primer）を設計し、PCR 増幅を行います。エンドポイント検出の PCR を行う場合は、電気泳動で増幅の有無を確認します。リアルタイム
PCR ではメチル化 DNA の半定量的な解析も可能です。

エピジェネティクス実験のススメ
DNA メチル化解析 バイサルファイト処理

6/102104

・EpiScope® MSP Kit
本製品は MSP 専用の PCR キットです。バイサルファイト処理されたウラシルを含む DNA を鋳型として効率のよい PCR 増幅が可能な専用酵素と最適化された組成のバッファーにより、高い増幅効率で、従来の PCR 試薬と比較してメチル／非メチルの識別能が大幅に向上した MSP 解析を行うことができます。
リアルタイムモニタリングに適した濃度の TB Green を含んだ状態で反応系が至適化されており、半定量的な解析が可能なリアルタイム PCR と電気泳動で増幅の有無を確認するエンドポイント PCR の両方に同じ反応条件で使用することができます。
【2】プロトコール（操作方法の詳細は、各製品の説明書をご参照ください）1

ゲノム DNA の抽出
NucleoSpin® Tissue によりゲノム DNA を抽出する（「4．各解析に共通の試薬・キット」参照）。

2

バイサルファイト処理
MethylEasy™ Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit によりバイサルファイト処理を行う（「1. b. バイサルファイト処理」参照）。

3

EpiScope® MSP Kit による PCR 増幅
3.1以下の反応液を氷上で調製する。
試薬使用量

最終濃度

2× MSP Buffer

12.5μl1X

TB Green Solution (×100)

0.25μl1X *1

PCR Forward Primer (10μM)

0.75μl

0.3μM

PCR Reverse Primer (10μM)

0.75μl

0.3μM

MSP Enzyme0.6μl

DNA
滅菌精製水
Total2μl*28.15μl*225μl*1 エンドポイント PCR（電気泳動による解析）の場合にも必ず TB Green Solution (×100)を添加すること。
TB Green を添加した状態で最も高い識別能が得られる。
*23.2

DNA 濃度によって適宜調整可能。通常、バイサルファイト処理済み DNA 10～50 ng 程度を使用する。

以下の条件で PCR 増幅を行う。
リアルタイム PCR 検出、エンドポイント検出とも同じ PCR 条件で反応を行う。
95℃ 30 秒
98℃ 5 秒55℃ 30 秒

40～45 サイクル

72℃ 1 分（~200 bp）
融解曲線分析（リアルタイム PCR の場合）
エピジェネティクス実験のススメ
DNA メチル化解析 バイサルファイト処理

7/102104

3.3

リアルタイム PCR 装置による検出または電気泳動による増幅産物の確認を行う。

【3】実験例HeLa ゲノムおよびメチル化 HeLa ゲノム（EpiScope® Methylated HeLa gDNA）
各 1 g を MethylEasy™

Xceed を用いてバイサルファイト処理した。これらを鋳型として、CDH1、CDKN2A、MLH1 各遺伝子のプロモーター領域で本キットを用いた MSP を行った。リアルタイム PCR には Thermal Cycler Dice®
Real Time System を用い、エンドポイント検出では TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice®で反応後の反応液をアガロースゲル電気泳動に供して結果を確認した。
HeLa ゲノム

メチル化 HeLa ゲノム
CDH1

CDKN2A

MLH1― M primer

プライマー

メチル化 HeLa ゲノム

HeLa ゲノム123
M UM M UM M UM

123
M UM M UM M UM

… UM primer

図 4. Methylation Specific PCR 結果
メチル化 HeLa ゲノムを鋳型とした場合、3 種のターゲットすべてで M primer での増幅が見られ、UM primer では増幅が確認されなかった。それに対し、Native な HeLa ゲノムを鋳型とした場合には CDKN2A、MLH1 で UM primer での増幅が見られ、この領域はメチル化されていないことが確認できた。クロス反応はほとんどなく、メチル／非メチルの識

エピジェネティクス実験のススメ
DNA メチル化解析 バイサルファイト処理

8/102104別が明確にできていることが分かる。

【4】製品リスト
NucleoSpin® Tissue（製品コード 740952.10/.50/.250）
MethylEasy™ Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit（終売）
EpiScope® MSP Kit（製品コード R100A/B）
EpiScope® Methylated HeLa gDNA（製品コード 3520）
EpiScope® Methylated HCT116 gDNA（製品コード 3522）
EpiScope® Unmethylated HCT116 DKO gDNA（製品コード 3521）

f. COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis)◆特別な解析装置を必要としないコストパフォーマンスに優れた手法◆特定領域の DNA メチル化解析に【1】原理
COBRA 法では、バイサルファイト処理後にメチル化 DNA と非メチル化 DNA に共通のプライマーを用いて解析対象領域を PCR 増幅後、メチル化 DNA と非メチル化 DNA で配列が異なる箇所を認識する制限酵素で処理します。
・TaKaRa EpiTaq™ HS (for bisulfite-treated DNA)
バイサルファイト処理後の PCR には、TaKaRa EpiTaq HS (for bisulfite-treated DNA)がお勧めです。
バイサルファイト処理した DNA にはウラシルが含まれており、α型の DNA ポリメラーゼでは効率良く増幅することができませんのでご注意ください。

【2】プロトコール（操作方法の詳細は、各製品の説明書をご参照ください）（１）ゲノム DNA の抽出
NucleoSpin® Tissue によりゲノム DNA を抽出する（「4．各解析に共通の試薬・キット」参照）。
（２）バイサルファイト処理
MethylEasy™ Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit によりバイサルファイト処理を行う（「A-b. バイサルファイト処理」参照）。

エピジェネティクス実験のススメ
DNA メチル化解析 バイサルファイト処理

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（３） TaKaRa EpiTaq™ HS による PCR 増幅
1）以下の反応液を氷上で調製する。
試薬
使用量
最終濃度
TaKaRa EpiTaq HS (5 units/μl)
0.25μl1.25 units
10× EpiTaq PCR Buffer (Mg2+ free)
5μl
1×25 mM MgCl25μl
2.5 mM
dNTP Mixture (2.5 mM each)
6μl 0.3 mM each
Forward Primer (20μM)
1μl
0.4μM
Reverse Primer (20μM)
1μl
0.4μM
DNA<100 ng
滅菌精製水
Up to 50μl2）以下の条件で PCR 増幅を行う。
98℃ 10 秒
55℃ 30 秒
72℃ 30 秒～1 分 *1
（30～40 サイクル）*2*1 伸長反応時間は、1 kb/1 分を目安に設定する。増幅効率が悪い場合は、時間を延長すると改善することがある。
*2 増幅量が少ない場合は、サイクル数を増やす。

3）PCR 後、5μl をアガロース電気泳動し増幅状態の確認を行う。
（４）PCR 産物の精製
PCR 産物精製キットなどを用いて精製し、50μl 程度の容量にする。
（５）制限酵素処理
1）以下の反応液を氷上で調製する。
試薬使用量

最終濃度

10×Buffer

5μl

1×

制限酵素

適宜

10～20 U

精製済 PCR 産物

20～40μl

滅菌精製水

適宜

Total50μl2）至適温度で 4 時間以上、制限酵素処理を行う。
（６） エタノール沈殿による濃縮
1）制限酵素処理後の反応液に以下の試薬を加える。
4μl
Gen とるくん™エタ沈キャリア
5μl
3 M 酢酸ナトリウム, pH 5.2125μl
エタノール（>99％）
2） 12,000 rpm、4℃、15 分間遠心し、上清を除去する。
3） 250μl の 70%エタノールを添加しリンスする。
エピジェネティクス実験のススメ
DNA メチル化解析 バイサルファイト処理

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4） 12,000 rpm、4℃、5 分間遠心し、上清を完全に除去する
5） 沈殿を乾燥させ、10μl の滅菌精製水に溶解する。
（７）電気泳動による確認
3% PrimeGel™ Agarose PCR-Sieve アガロースゲルで電気泳動を行う。

【3】実験例HeLa S3 ゲノム DNA およびメチル化 HeLa ゲノム DNA（EpiScope® Methylated HeLa gDNA）
各 2.6μg を MethylEasy™ Xceed でバイサルファイト処理し、処理後のゲノム DNA 80 ng を鋳型として
MLH1 の CpG アイランド領域の一部を TaKaRa EpiTaq HS (for bisulfite-treated DNA) 用いて増幅した。PCR 産物（増幅サイズ：384 bp）をスピンカラム精製して 50μl で溶出した。そのうち 20μl を制限酵素処理（Taq I；T↓CGA、65℃ 4 時間）し、エタノール沈殿で 10μl に濃縮した後、電気泳動に供した。
GTAAGGGGAGAGGAGGAGTTTGAGAAGYGTTAAGTATTTTTTTYGTTTTGYGTTAGATTATTTTAGTAGAGGTATATAAGTTYGGTTTYGGTATTTTTGTTTTTATTGGTTGGATATTTYGTATTTTTYGAGTTTTTAAAAAYGAATTAATAGGAAGAGYGGATAGYGATTTTTAAYGYGTAAGYGTATATTTTTTTAGGTAGYGGGTAGTAGTYGTTTTAGGGAGGGAYGAAGAGATTTAGTAATTTATAGAGTTGAGAAATTTGATTGGTATTTAAGTTGTTTAATTAATAGTTGTYGTTG
AAGGGTGGGGTTGGATGGYGTAAGTTATAGTTGAAGGAAGAAYGTGAGTAYGAGGTATTGAGGTGATTGGTTGAAGGTATT図 5. MLH1 の COBRA 検出系の設計
MLH1 の CpG アイランドの PCR 増幅領域（384 bp）をバイサルファイト処理変換した配列を示す。配列中の Y は、バイサルファイト処理によりメチル化状態に応じて C または T に変化する塩基である。黄色で示したのが Taq I の認識配列であり、C がメチル化されている場合には TCGA となり切断されるが（128 bp と 254 bp）、非メチルなら TTGA に変換されるため切断されない。なお、ピンク色は PCR プライマー位置である。

M12M

図 6. COBRA の結果
レーン 1 : メチル化 HeLa ゲノム DNA
レーン 2 : HeLa S3 ゲノム DNA
レーン M : 100 bp DNA Ladder 200 ng
メチル化 HeLa ゲノム DNA 由来の PCR 増幅産物は予想通りのサイズに切断されたが、HeLa S3 ゲノム DNA 由来の PCR増幅産物は切断されておらず、HeLa S3 細胞の MLH1 遺伝子の解析対象領域は非メチル化状態であると考えられる。

エピジェネティクス実験のススメ
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【4】製品リスト
NucleoSpin® Tissue（製品コード 740952.10/.50/.250）
MethylEasy™ Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit（終売）
TaKaRa EpiTaq™ HS (for bisulfite-treated DNA)（製品コード R110A/B）
EpiScope® Methylated HeLa gDNA（製品コード 3520）
EpiScope® Methylated HCT116 gDNA（製品コード 3522）
EpiScope® Unmethylated HCT116 DKO gDNA（製品コード 3521）
制限酵素各種Gen とるくん™エタ沈キャリア（製品コード 9094）
PrimeGel™ Agarose PCR-Sieve（製品コード 5810A）

g. ビーズアレイ解析◆イルミナ社ビーズアレイを用いたヒト CpG サイトのメチル化解析【1】原理
ゲノム DNA をバイサルファイト処理し、Infinium MethylationEPIC BeadChip（イルミナ社）を用いた網羅的解析を行います。Infinium MethylationEPIC BeadChip は、85 万以上のメチル化サイトを搭載し、大規模なゲノムワイドでのメチル化解析が行えます。

【2】受託サービスのご案内
ゲノム DNA をご送付いただき、イルミナ社の推奨方法に従い、ターゲットの作製、ハイブリダイゼーシ
ョン、スキャニングなどの一連の作業を行い、GenomeStudio Data Analysis ソフトウェアを用いた解析データを納品いたします。検体ごとの標準化とメチル化レベルの算出までを行います。

データマイニングサービスでは、プローブ、遺伝子、CpG Island 毎のメチル化率の算出、メチル化レベル(AVG_Beta 値)に有意差のあるデータの抽出を行います。

DNA メチル化解析（ビーズアレイ）＜納品データ例＞

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DNA メチル化解析 バイサルファイト処理

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＜データマイニング解析

納品物例＞

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DNA メチル化解析 バイサルファイト処理

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エピジェネティクス実験のススメ
DNA メチル化解析 バイサルファイト処理

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