湖沼における細菌由来溶存有機物の寄与：
鏡像異性体バイオマーカーを用いた定量法の確立

滋賀県琵琶湖環境科学研究センター
総合解析部門

平成30年度 水質保全研究助成 成果報告会（2019.3.22）

背景：湖沼の難分解DOMの生成源？
・琵琶湖では過去数十年間で、栄養塩やBODは減少して水質改善傾向な一方で、CODは高止まり

湖沼における細菌由来溶存有機物の寄与：
鏡像異性体バイオマーカーを用いた定量法の確立

生物が使いにくい難分解DOCが湖水に蓄積している？
・海洋では、細菌による難分解DOCの生産（微生物炭素ポンプ）の重要性が明らかになってきた
e.g., Tanoue+ (1995); McCarthy+ (1998); Fuhrman (1999); Ogawa+ (2001);
Kaiser & Benner (2008); Yamaguchi & McCarthy (2018); etc..

・湖沼など陸水環境ではデータが限定的
湖沼では微生物炭素ポンプはどのくらい重要なのか？

山口 保彦
滋賀県琵琶湖環境科学研究センター・研究員

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1/15D-アミノ酸濃度による細菌由来DOCの寄与定量

アミノ酸鏡像異性体と細菌
細菌

ペプチドグリカンなど

天然細菌群集の培養実験で放出されたDOC中のD-アミノ酸の規格化濃度を100%の端成分とする

アミノ酸D/L比高濃度のD-アミノ酸（Ala, Glu, Ser, Asp）

L-アミノ酸D-アミノ酸（通常の生物）（細菌に多い）環境試料の濃度値

環境中DOC中の細菌寄与度の定量式
Bacterial C (%) ＝

D-AA Sample
D-AA Bacterial DOC✕ 100

細菌由来DOC寄与度（%）

細菌の細胞やDOCは高濃度のD-アミノ酸を含む

海水中DOCは高いアミノ酸D/L比（数十%）を示す
太平洋中央：McCarthy+ (1998, Science)

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Kaiser & Benner (2008, LO)

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湖沼における細菌由来溶存有機物の寄与：
鏡像異性体バイオマーカーを用いた定量法の確立

滋賀県琵琶湖環境科学研究センター
総合解析部門

先行研究と本研究の目的
淡水湖沼DOCの先行研究（唯一）試料①：天然湖水DOCの採取
・中栄養～貧栄養湖では世界初のデータ

Kawasaki+ (2013, AEM)

・霞ヶ浦DOCに、高濃度のD-アミノ酸を検出

・採取地点：琵琶湖北湖17B（今津沖中央）表層（水深5m）＆深層（水深60m）

・問題点：湖沼細菌DOCの端成分が不明で、細菌寄与度の定量に課題
湖水濾過法の課題
HPLC蛍光法によるD-アミノ酸同定の課題

・採取時期：2018年8月、9月、10月（成層期）
・濾過：

本研究の目的

湖水プランクトンネット（孔径150 μm）

１．「D-アミノ酸バイオマーカーを用いたDOC中の細菌成分寄与度定量法」
を、湖沼環境に適切に応用できるように改良する

ガラス繊維GF/Fフィルター（孔径~0.7 μm）

A. 湖水濾過法、GC-MSによる分析手法の検討・改良

ポリカーボネート製
Nucleporeフィルター（孔径0.2 μm）

B. 琵琶湖の天然細菌を用いた培養実験で、端成分を制約
２．琵琶湖DOC（難分解＆準易分解）中の細菌由来成分の寄与を定量して、微生物炭素ポンプの重要性を調べる

霞ヶ浦の先行研究（Kawasaki+ 2013）では、GF/F濾過のみだったが、本研究では0.2 μm
濾過を行い、細菌細胞を除去したDOCを採取

濾過湖水DOC5/15

試料②：湖沼細菌DOCの端成分のための培養実験

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手法：GC-MSによるアミノ酸D/L比分析
濾過湖水・海水、地下水での実験を基本的に踏襲
・中栄養～貧栄養湖では世界初のデータ

Kaiser & Benner (2008, LO)
Shen+ (2015, Biogeochem)

凍結乾燥で10mL程度から濃縮
アスコルビン酸を添加して、6N塩酸で液相加水分解（110℃, 20h）

加水分解物
北湖17B表層（5m）で2018年9月に採水・濾過

イオン交換樹脂によるアミノ酸様化合物精製

Takano+ (2010, RCM)

遊離アミノ酸＋αGF/F濾過湖水（< 0.7 μm,細菌細胞含む）
暗所・20℃で培養
1:50希釈合成無機培地＋炭素源（グルコース）＋窒素源（硝酸塩）＋リン源（リン酸塩）

TFA-iPr誘導体化
液々抽出による精製

0.2 μm濾過を行い、・DOC濃度・アミノ酸濃度・アミノ酸D/L比を分析（27日目）

McCarthy+ (2013, GCA); Yamaguchi & McCarthy (2018, GCA)
Veuger+ (2005, LO Meth)

誘導体化アミノ酸
使用機器：Agilent 7890A GC + 5975C MSD（シングル四重極）
GC-MS分析

注入法：温度プログラム気化（PTV）法GCカラム：Agilent CP-Chirasil-L-Val（長さ25m,内径0.25 mm, 膜厚0.12 μm）

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総合解析部門

手法：GC-MSによるアミノ酸D/L比分析

結果：湖水DOC中アミノ酸のDL分離

・GC-MS分析の諸条件を最適化

2018年10月17B-60m試料のGC-MSクロマトグラム

・従来のHPLC蛍光検出法による主要4種アミノ酸（Ala, Glx, Asx, Ser）に加えて、さらに6種のアミノ酸（Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Tyr）のDL分離検出が可能
・検出限界は注入量10fmol程度（HPLC法と同等）で、湖水バルクDOC分析に充分な感度となった

選択イオン検出のAbundance

D-Thr
D-Val
L-Ala
D-Ala

L-Thr

L-Val

D-Leu

L-Leu

Gly
D-Ile L-Ile

L-Nle(I.S.)

D-Ser
L-Ser

m/z 140.0 (Ala)m/z 168.1 (Val)m/z 152.0 (Thr)m/z 182.1 (Ile, Leu, Nle)m/z 138.0 (Ser)DL-アミノ酸標準試料の分析（～1.8 pmol注入）

GC保持時間（min）

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結果：アミノ酸D/L比

結果：DOC中のD-アミノ酸相対濃度

・琵琶湖DOCは、全体的に霞ヶ浦DOCより高く、海洋遠洋域DOC並みのD/L比
培養実験

・HPLC法でDOC中に未報告のD-アミノ酸を、新たに有意に検出

文献値

本研究 文献値

琵琶湖本研究海洋・霞ヶ浦

文献値
既知のDOC中主要4種アミノ酸

新たに検出されたD-アミノ酸
霞ヶ浦データ： Kawasaki+ (2013)
北太平洋データ：Kaiser & Benner (2005)

B-DOM (Ocean) : Kaiser & Benner (2008)
B-DOM (Groundwater) : Shen+ (2015)

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North Pacific: Kaiser & Benner (2008)
霞ヶ浦：Kawasaki+ (2013)12/15

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鏡像異性体バイオマーカーを用いた定量法の確立

滋賀県琵琶湖環境科学研究センター
総合解析部門

議論：細菌由来DOCの分布

結果：DOC中細菌寄与度
・琵琶湖深層DOC（難分解DOC）では30-40%程度で、海洋遠洋や霞ヶ浦と近い値

・夏季表層の準易分解DOCの蓄積は、細菌以外（植プラ？）が主・8-9月表層で生産・蓄積されたDOC（準易分解）では、細菌寄与度は20%以下

・秋にかけて、細菌が生産したDOCが表層にも蓄積・10月の表層で生産・蓄積されたDOCでは、細菌寄与度は47±20%

夏季（8-9月）
細菌由来以外の難分解DOC

細菌由来以外の準易分解DOC

細菌由来の難分解DOC

細菌由来の準易分解DOC

秋季（10月）表層（5m）

2成分混合モデルを仮定して計算した、表層生産DOCの値

琵琶湖水の難分解
DOCの値を代表すると仮定

深層
（60m）
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まとめ
１．本研究による成果
・GC-MS分析法、0.2 μm濾過、微生物培養実験などにより、D-アミノ酸分析から湖DOC中の細菌寄与度を見積もるアプローチを新たに確立
・中栄養～貧栄養湖では世界初の、DOC中D-アミノ酸のデータ
・D-Alaから計算した細菌寄与度は、琵琶湖北湖の難分解DOCで30-40%程度、夏季表層の準易分解DOCでは20%以下
・湖沼でも、海洋と同程度に微生物炭素ポンプが働いている可能性
２．今後の展望・琵琶湖での深度分布の年間季節変動から、細菌由来DOCの消長を追跡
・河川流入と底質溶出に由来するDOC中のD-アミノ酸の分析

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