豚病会報
総No.
66 2015

1説
コロナウイルスの病原性因子の解析
神谷亘（大阪大学微生物病研究所・感染症国際研究センター・臨床感染症学研究グループ）
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キーワード：コロナウイルス、非構造蛋白質、
shutoff、遺伝子発現制御質）が存在することであり、このウイルス粒子の外殻構造がコロナウイルスの由来である。コロナウイルスのウイルス粒子は主に３つの構造タンパク質（Sタンはじめにパク質、M タンパク質、Eタンパク質）から構成されコロナウイルスは、RNAをそのウイルスゲノムとており、その中に、おおよそ３０，０００塩基の RNAがウして持つエンベロープウイルスである。コロナウイル

イルスゲノムとして取り込まれている。このウイルス

スはニドウイルス目に分類され、その中にコロナウイゲノムは、RNAウイルスの中で最長であり、これがコルス科、そして、コロナウイルス亜科とトロウイルスロナウイルスの１つの特徴である。しかしながら、こ亜科に分類される。コロナウイルス亜科はさらに、アのように長いウイルス RNAゲノムを有するため、他ルファコロナウイルス属、ベータコロナウイルス属、の RNAウイルスで用いられている逆遺伝子操作系のガンマコロナウイルス属の３つの属に分類される。ア

取り扱いが非常に複雑で煩雑である。そのため、コロルファコロナウイルス属には、ヒトコロナウイルス

ナウイルスの分子ウイルス学的な解析は、他の RNA

２２９Eや豚流行性下痢ウイルスなどが含まれる。ベーウイルスに比べて遅れているように思われる。

タコロナウイルス属には、２００２年度に流行した重症急性呼吸器症候群（SevereAcuteRespirator
ySyndrome

SARSコロナウイルスの非構造タンパク質:SARS）コロナウイルスが含まれる。また、SARSコ

２００２年度にアジアを中心に拡がった重症急性呼吸器

ロナウイルスの発生から、おおよそ１０年後の２０１２年度

症候群の原因ウイルスである SARSコロナウイルスは、より中東で感染が拡がっている、中東呼吸器症候群

WHOが終息宣言をするまでの僅か一年間の間に、お（MiddleEastRespiratorySyndrome:MERS）コロナ

およそ８，０００人が感染したと報告されている。SARSウイルスなどが含まれる。ガンマコロナウイルス属にコロナウイルスが突如としてヒトコロナウイルスの中は、主に鳥類由来のコロナウイルスが含まれる。

でどのようにして強い病原性を保持するようになった

ヒトにおいて、コロナウイルス感染症は、SARSコか調べるために、我々のグループは、SARSコロナウ

ロナウイルスの発生以前では、風邪の原因ウイルスのイルスの非構造タンパク質に注目して研究を行ってい１つとして考えられており、強い病原性を示すウイルる。

ス感染症ではなかった。そのため、SARSコロナウイ

SARSコロナウイルスは、９本のウイルス由来の

ルス発生以前のコロナウイルス研究はマウス肝炎ウイ

RNAが細胞内に侵入した際にウイルスゲノムから合ルスの研究が牽引してきた。

成される。ウイルス RNAは cap構造と polyA構造を一方、獣医学領域においては、牛コロナウイルス、有しており、そのまま mRNAとして翻訳に利用される。

猫コロナウイルス、犬コロナウイルスなどそれぞれのウイルス RNAのおおよそ 2/3を占める ORF
１abには、動物種で固有のコロナウイルスが存在している。また、ウイルスの複製に必要なウイルスタンパク質がコード

豚流行性下痢ウイルスも重要なウイルス感染症の１つされている。この ORF
１abからは、最終的に１６個の非であり、最近では２０１３年より日本国内において発生し構造タンパク質が産生される。この１６個の非構造タンている。

パク質は、nsp１から nsp
１６タンパク質であり、それぞコロナウイルスのウイルス学的特徴は、ウイルス粒れ、RNA依存性 RNAポリメラーゼ活性など、固有の子表面に特徴的な王冠様の構造物（スパイクタンパク機能を持っている。我々のグループは、非構造タンパ

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ク質の中で最も５’末端側にコードされている nsp１タにcap構造と polyA 構造を有する RNA からのルシンパク質に注目し、以下のように nsp１タンパク質固有フェラーゼ・タンパク質の合成量を指標に、nsp１タンの機能を見出した。

パク質によるタンパク質合成阻害能を検討した。使用した nsp１タンパク質は、大腸菌発現系を用いて GST融SARSコロナウイルスの nsp１タンパク質合タンパク質として発現させた後、精製過程で GSTをSARSコロナウイルスの nsp１タンパク質は、１８０個の除去したものを用いた。その精製した nsp１タンパク

アミノ酸からなる分子量約２０kDaの細胞質に局在する質をウサギ網状赤血球翻訳システムの反応系に加え、タンパク質である。この nsp１タンパク質を発現する

nsp１タンパク質によるタンパク質合成阻害効果を評

プラスミドを培養細胞内に導入すると、細胞内で宿主価した。の mRNAの分解が促進されることを明らかにした3)。

その結果、nsp１タンパク質は cap依存性翻訳だけでさらに、nsp１タンパク質を発現するプラスミドを導入なく、IRES依存性翻訳を抑制することを明らかにしした培養細胞では、インターフェロンの mRNAも分解た。また、このウサギ網状赤血球翻訳システムにおいさ れ る こ と を 明 ら か に し た5)。当 然、宿 主 細 胞 のて、nsp１タンパク質は RNAの分解促進を引き起こさ

mRNAが SARSコロナウイルスの nsp１タンパク質にないでタンパク質の合成を阻害することを明らかにしより分解されるため、その結果として、宿主細胞のタた。

ンパク質量も減少することを確認した。上述のようにさらに、このウサギ網状赤血球翻訳システムを用い

SARSコロナウイルスの nsp１タンパク質は、感染細胞た解析により、nsp１タンパク質は翻訳阻害を引き起こ内において宿主 mRNAを分解することで、抗ウイルスすために、リボゾームの構成ユニットの１つであるタンパク質であるインターフェロンなどの宿主応答を４０Sリボゾーム複合体と結合することを明らかにした。

抑制する機能を持つことを明らかにした。

つまり、この４０Sリボゾームと nsp１タンパク質との結合により、６０Sリボゾームのリクルートを阻害し、結SARSコロナウイルス nsp１タンパク質とリボゾーム
我々のグループは、SARSコロナウイルスの nsp１タ

果的に８０Sリボゾームが形成されないことを明らかにした4)。

ンパク質の機能解析をさらに推し進めるために、タン先に述べたように、このウサギ網状赤血球翻訳シスパク質合成過程のみを解析するのに適したウサギ網状テムにおいて、nsp１タンパク質は RNAの分解促進を赤血球翻訳システムを用いた。Invi
troで合成したル引き起こさないことがわかっている。このことは培養シフェラーゼをレポーター遺伝子としてもち、両末端細胞を用いた実験と異なる結果であった。この矛盾点

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3を解き明かすために、さらなる解析を行った結果、ウルスの中で最長の RNAをウイルスゲノムとして有し

サギ網状赤血球翻訳システムにおいて、nsp１タンパクているため、任意の変異を導入できる遺伝子操作系を質は、少なくとも５’末端の近傍で RNAを切断してい確立するにはより複雑・煩雑な操作が必要となる。こることを明らかにした。我々の研究成果から、少なくの理由から、コロナウイルスの遺伝子操作系は海外のとも nsp１タンパク質は、それ自身では RNAを分解す

7)
ごく限られたグループで使用されていたが1,、我々のる活性を保持していないため、おそらく宿主の RNAグループは、コロナウイルスの研究を推し進めるうえを分解する機構を利用していると思われる。我々は、で、我が国においても、コロナウイルスの遺伝子操作ウサギ網状赤血球翻訳システムでは、RNA切断に続系の必要性を痛感した。そこで、既報に基づいてコロいて起こる、RNA の分解機構が欠如しているため、ナウイルの遺伝子操作系の立ち上げを試みている。現

nsp１タンパク質はウサギ網状赤血球翻訳システムに在、我々が使用している方法は、LuisEnjuanes博士ら

おいて RNA分解を引き起こさないと推測している。

が開発した BacterialArtificialChromosome（BAC）

いずれにしても、SARSコロナウイルスの nsp１タンを用いる遺伝子操作系である1)。

パク質は、４０Sリボゾームを標的として、タンパク質

BACは、大腸菌内でコピー数が少なく、巨大な DNA合成阻害と RNA分解促進を引き起こすことを明らかを維持するのに優れている。我々は、まず、この BACにした（図１参照）。

システムを用いて、SARSコロナウイルスの cDNA全長を保持する BACの作製に取り組んだ。SARSコロ

SARSコロナウイルス nsp１タンパク質とウイルス

ナウイルス cDNAの両末端に、サイトメガロウイルス

RNAのプロモータ配列と polyA配列を付加することで、培SARSコロナウイルスの nsp１タンパク質がリボゾー養細胞内でサイトメガロウイルスのプロモータによりムとの結合や RNA分解により、強力に宿主の遺伝子完全長の SARSコロナウイルス由来の mRNAが合成

発 現 を 抑 制 す る こ と を 明 ら か に し た。と こ ろ が、される。そして、
この mRNAからウイルスタンパク質

SARSコロナウイルスのウイルス RNA は、宿主のが翻訳され、最終的に感染性粒子が産生される仕組み

mRNAと同じように cap構造と polyA構造をもつこである。実際に、我々のグループは、完全長の SARSコとが知られている。そこで、我々は、nsp１タンパク質

ロナウイルスの cDNAを保持する BACの作製に成功がどのように宿主 RNAとウイルス RNAを区別し、さし、その後、培養細胞に導入することで、感染性粒子らに宿主の遺伝子発現のみを特異的に抑制できる機構を回収することに成功している。また、SARSコロナを明らかにしようと試みた。

ウイルスのアクセサリー遺伝子の１つである、７ab領

まず、はじめに nsp１タンパク質が RNAと結合する域を GFPに置き換えることにより、GFP遺伝子を有性質に着目した。他の研究グループの報告によると、する SARSコロナウイルスの作製にも成功している。

nsp１タンパク質は RNAと結合することが示唆されてこのようなレポーターウイルスの作製は、より簡便な2)いる 。また、SARSコロナウイルスは、感染細胞内でコロナウイルスのアッセイ系への応用に繋がると思わ９本のウイルス由来の RNAを合成するが、その９本れる。の RNAの両末端には、共通する配列が存在している。

また、SARSコロナウイルス以外にも、MERSコロ

そこで、nsp１タンパク質がウイルス由来の RNAと結ナウイルスや豚流行性下痢ウイルス、さらに猫コロナ合するかどうかを検証した。

ウイルスに対しても、同様の方法を用いて遺伝子操作

その結果、nsp１タンパク質はウイルス由来の RNA6)系を確立するプロジェクトが進行している。コロナウと特異的に結合することを明らかにした 。さらに、イルスに対する遺伝子操作系を我々のグループ自身でnsp１タンパク質は、ウイルス由来 RNAとの結合を介確立することは、今後のコロナウイルスの発展に大きして、ウイルス由来の RNAに対しては、タンパク質く貢献できると確信している。

合成の阻害や RNA分解を引き起こさないことを明らかにした。

おわりにコロナウイルスの遺伝子操作系年で終息を迎えたが、その発生から約１０年後に MERS

周知のとおり、SARSコロナウイルスは幸運にも一コロナウイルスはすでに述べたように、RNAウイコロナウイルスの発生、そして、豚流行性下痢ウイル

4ProcJpn Pi
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66 2015スの発生など、コロナウイルスによる感染症は、これ

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hafull-からも注意しなければならない感染症の１つである。

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今回の内容は、コロナウイルスの基礎ウイルス学に

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偏った内容であるが、基礎ウイルス研究者として、今U SA,
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1299513000.

後はヒト・動物コロナウイルスを問わず、少しでも基礎研究を通してコロナウイルス感染症の征圧に向けて努力したい。
最後に、第８６回日本豚病研究集会で特別講演をさせていただいたことに感謝申し上げます。今回の講演にあたり、お世話になりました動物衛生研究所鈴木亨先生ならびに世話人の先生方にこの場を借りてお礼申し上げます。
また、本研究を実施していただいた、田中智久博士（山梨大学）、坂井祐介博士（大阪大学）、寺田豊博士（山口大学）に心から感謝申し上げます。

引用文献
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