３．新しい食中毒原因菌 Staphylococcus argenteus による市販食品等の汚染実態の解明○髙橋 志保
鈴木 忠之

今野 貴之

鈴木 純恵

伊藤 佑歩

熊谷 優子 （秋田県健康環境センター）【研究目的】
ブドウ球菌食中毒の原因菌は黄色ブドウ球菌が一般的であるが、近年、本県を含め国内において類縁菌である Staphylococcus argenteus を原因とする食中毒が報告されている。しかしながら、感染源の特定が難しく、本菌による事例の詳細な解明には至っていない。そこで本研究では、本菌の迅速検出法を確立し、本菌による市販食品等の汚染実態を把握することで、食中毒の予防啓発につなげることを目的とする。
【研究の必要性】
ブドウ球菌が食品中で増殖する際に産生する毒素を原因とする食中毒事例は、時に発症者数が多く甚大な被害を及ぼす場合がある。食中毒の原因究明のためには、病因物質と原因食品を速やかに特定することが重要である。しかし、S. argenteus は 2015 年に黄色ブドウ球菌より細分化された新種 1)であり、明確な鑑別性状は明らかでない。そのため、現在、本菌の同定にはゲノム解析などの特殊な検査が必要とされ、結果が判明するまでに時間を要している。
さらに、S. argenteus を原因とする食中毒は、2018 年に秋田県で確認されているが、国内における事例は過去に 3 例しか報告されておらず、感染源等の詳細も不明であるため、地域の公衆衛生上の新たな脅威となっている（表 1）。食中毒事例発生時に本菌を確実に検出できるようにするためには、本菌の培地上での発育やその特徴を明らかにするとともに、迅速に本菌を検出できる検査法を確立する必要がある。また、本菌の食品等における汚染実態に関する報告はまだ少なく、本菌による食中毒対策を講じる上で食品等の汚染実態を把握することが重要である。

表1 国内におけるS. argenteus 食中毒の発生状況
発生年

発生場所

摂食者数

患者数

2010

東京不明不明2014大阪306462015大阪53342018秋田2318【研究計画】
1.リアルタイム PCR 法を用いた迅速検出法の確立と分離培養法の検討
食品等からの迅速検出法として、S. argenteus 及び黄色ブドウ球菌がともに保有しており、菌種ごとの遺伝子配列の同一性が高いα-haemolysin 遺伝子 2)を対象としたリアルタイムPCR 法を確立する。また、分離後の菌株を同定するため、Multiplex PCR 法を検討する。

食品等から S. argenteus を分離するのに適した増菌培地及び分離培地については、模擬食材を用いて比較検討する。

2.食品等の汚染実態調査
市販されている食品を対象に、リアルタイム PCR により S. argenteus の遺伝子を検索し、食品の汚染状況を把握する。
【実施内容・結果】
1.リアルタイム PCR 法を用いた迅速検出法の確立及び分離培養法の検討＜迅速検出法の確立と同定 PCR 法の検討＞
GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）に登録された S. argenteus 株及び黄色ブ
ド ウ 球 菌 株 の α -haemolysin 遺 伝 子 の 配 列 を 、 オ ン ラ イ ン 解 析 シ ス テ ム の ClustalW（https://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）により比較参照し、両菌種にそれぞれ特異的な配列部分に対応するプライマーとプローブを設計した（表 2）。
当センターで過去に分離された S. argenteus2 株と黄色ブドウ球菌 9 株について、シカジー
ニアス DNA 抽出試薬（関東化学）を用いて DNA 抽出液を作製し、両菌種の検出用プライマーを用いて PCR を行ったところ、それぞれに該当する菌株にのみ増幅反応が見られ、交差反応は見られなかった。また、各菌株の PCR 増幅断片のシークエンス解析（ファスマック）結果は、S. argenteus もしくは黄色ブドウ球菌のα-haemolysin 遺伝子の登録配列と一致することを確認した。
両菌種の検出用プライマーと対応するプローブを用いて試行したリアルタイム PCR では、
S. argenteus 及び黄色ブドウ球菌のα-haemolysin 遺伝子（S. arg hly 及び S. aureus hly）をそれぞれ検出可能であった。さらに、菌数を測定した S. argenteus 及び黄色ブドウ球菌の培養液を用いて検出感度を評価した。培養液をそれぞれ 10 倍段階希釈した希釈液各 100µL からDNA 抽出溶液を作製し（図 1）、同様にリアルタイム PCR を試行した結果、S. argenteus、黄色ブドウ球菌ともに 10cfu/tube まで検出可能であった。また、両菌種を同時に検索できるようにした Duplex リアルタイム PCR では、両菌種が混在していても、設計したプライマーとプローブにより S. argenteus 及び黄色ブドウ球菌を特異的に検出できることを確認した。
分離された菌株の同定には、両菌種が保有する nuc 遺伝子 3)と、α-haemolysin 遺伝子中の S. argenteus に特異的な塩基配列部分及び黄色ブドウ球菌に特異的な eap 遺伝子 4)をターゲットとし、Multiplex PCR として両菌種の鑑別を可能とした（図 2 及び表 3）。

表2 プライマー及びプローブ

表2 リアルタイム PCR用プライマー及びプローブ
配列（5'ｰ3'）

プライマー・プローブ

S. argenteus

黄色ブドウ球菌

Staph hly FTATAGAGTYTATAGCGAAGAAGG

S. arg hly R-1n

GTATCATCAGCACTGATGCTG

S. arg hly Probe-MGB

5'FAM-CTGGCATGGCCTTCTGCT-MGB

Staph hly FTATAGAGTYTATAGCGAAGAAGG

S. aureus hly R-1

TCATCACCAGTMACRTTACCG

S. aureus hly Probe-MGB

5'HEX-AAGGTACAGTTGCAACT-MGB

表3 同定用Multiplex PCR

希釈液または培養液100µL↓ 13,000rpm、1min 遠心
上清を除去後、滅菌生理食塩水100µL添加↓ 13,000rpm、1min 遠心上清を除去↓シカジーニアスDNA抽出試薬100µL添加↓ インキュベート
13,000rpm、1min 遠心↓
上清をDNA抽出溶液とする

図2 Multiplex PCRバンドパターン
M:100bp DNA ladder
1,2:S. argenteus
3,4:S. aureus
N:Negative control

図1 DNA抽出溶液の作製方法

表3 同定用Multiplex PCR
標的遺伝子
nuceaphly配列（5'ｰ3'）

備考

参考文献

ATGACAGAATACTTWTTAAGTGCTS. argenteus 632bp

TCTTTTTTYGCTTGTGCTTCACT

S. aureus 641bp

TAMTAAYGAAGCRTCTGCC
TTAAATCGATATCACTAATACCTCGGGAAAATCGGCGGACAAATTGGYGG
GTGCTTTTCTGTCCATCACWAG＜分離培養法の検討について＞
食品中の S. argenteus を検出するのに適した増菌培地を検討するため、BHI で一晩培養した S. argenteus 培養液を添加した 3 種類の模擬食材（表 4）を用意した。選択増菌培地は、既報

3230bp

4を改変

328bp

本研究

表4 培養までの模擬食材の保存条件①

培養液添加後、4℃で保存②

培養液と枯草菌芽胞液③

培養液添加後、－20℃で保存(※)

添加後、4℃で保存（※)夾雑菌として添加5,6)を基に、7.5%NaCl・1%ピルビン酸ナトリウム加 TSB と 10%NaCl 加 BHI の 2 種類を用いた。模擬食材 25g に選択増菌培地 100mL を加え、37℃で 18 時間培養した。増菌培養後の S. argenteusの菌数測定では、3 種類の模擬食材とも大きく違わなかったが、10%NaCl 加 BHI での培養と比較して、7.5%NaCl・1%ピルビン酸ナトリウム加 TSB で培養した模擬食材のほうが増菌効率はよかった。この結果をふまえ、流通する食品においては加熱調理されたものや冷凍もしくは解凍されたものも多いことから、損傷菌を修復させることを目的としてピルビン酸ナトリウムが添加された 7.5%NaCl・1%ピルビン酸ナトリウム加 TSB を増菌培地として選択することとした。
また、増菌培養後の選択分離培地として、通常の食品検査で使用される卵黄加マンニット食塩培地とベアードパーカー寒天培地の 2 種類を用いて、S. argenteus と黄色ブドウ球菌の塗抹培養を行い、比較した。卵黄加マンニット食塩培地上では両菌種ともレシチナーゼ

表4 汚染

反応が見られるものの、S. argenteus は白色コロニーを、黄色ブドウ球菌は黄色コロニーを形成し、容易に区別することができた。一方、ベアードパーカー培地上のコロニーは、両菌種ともに卵黄反応を示し、またブドウ球菌特有の黒色集落を形成するため、同一平板内に混在している場合、区別することができなかった。両平板を比較した結果、S. argenteusの分離培地として卵黄加マンニット食塩培地を選択した。

2.食品等の汚染実態調査
汚染実態調査は、秋田県内に流通する食品を対象とした。食品 25g をストマッカー袋に無菌的に採取し、7.5%NaCl・1%ピルビン酸ナトリウム加 TSB100mL を加え、よく混和して試料液とした。直接分離培養として、各試料液 100µL ずつを 2 枚の卵黄加マンニット食塩培地にコンラージで塗布し、37℃で 48 時間培養後、レシチナーゼ反応が見られるコロニーを釣菌し、同定用 Multiplex PCR にて確認した。残りの試料液は 37℃で 18 時間増菌培養を行い、培養液各 100µL をマイクロチューブに分取し、DNA 抽出溶液を作製後（図 1）、リアルタイム PCR を行った。S. arg hly が検出された培養液については、卵黄加マンニット食塩培地に塗抹し、S. argenteus の分離を試みた。
調査した食品は、食肉（鶏肉、牛肉、豚肉等）120 検体、生菓子 31 検体、惣菜・漬物 25検体、計 176 検体（表 5）で、直接分離培養では 14 検体から黄色ブドウ球菌が分離されたが、S. argenteus は分離されなかった。増菌培養後のリアルタイム PCR では、S. arg hly は 3検体から、S. aureus hly は 59 検体から検出された。S. arg hly が検出された 3 検体（鴨モモ肉、鶏モモ肉、鶏砂肝）からは同時に S. aureus hly も検出され、卵黄加マンニット食塩培地上に白色及び黄色コロニーを形成した。
Multiplex PCR を行ったところ、それぞれ S. argenteus及び黄色ブドウ球菌であった。
表5 汚染実態調査

real-time PCR

直接分離培養*2種類

検体数

鶏肉（鴨肉含む）

74

牛肉

3656241

生菓子

313

惣菜

1531

漬物

1011計

176

5914

豚肉
その他の肉*1

S. arg hly(+)

S. aureus hly(+)

3443111*1：馬肉、牛豚、ラム肉*2：S. aureus が分離された検体数【考察と今後の課題】
ブドウ球菌エンテロトキシンを産生する場合がある S. argenteus と黄色ブドウ球菌の鑑別が可能で、かつ迅速性に優れた Duplex リアルタイム PCR 法は、ブドウ球菌食中毒が疑われる際に原因食品を迅速に推察することができ、被害の拡大を最小限にとどめることが期待できる。また、食品残品がなくとも調理前の食材等が残っていれば、増菌培養と併用することで汚染源の推定につなげることも可能である。
食品等の汚染実態調査の結果、S. argenteus による汚染源として、若林ら 6)の報告と同様に鶏肉等が示唆された。しかしながら、S. argenteus を原因とする食中毒事例について、感染源等の詳細な情報はまだ十分に蓄積されていないため、食品の汚染が鳥肉等の原材料に由来しているのか、ヒトもしくは環境中から混入する可能性もあるのか、という点については、今後の食中毒対策として明らかにしていかなければならない課題であると思われる。
また、S. argenteus が検出された検体からは S. aureus hly も検出されていた。黄色ブドウ球菌の汚染度合いの高い食品には、S. argenteus も存在している可能性がある。特に、S. aureus hlyは生菓子や惣菜等から検出されることがある。食肉類と違い、生菓子や惣菜等はそのまま喫食されるものがほとんどであり、購入後の保存条件が不適切であると食中毒を引き起こす可能性を含んでいる。今後、本法の利用により、ブドウ球菌食中毒の原因菌として黄色ブドウ球菌のみならず S. argenteus についても確実に検出し、本菌による食中毒の実態解明と予防啓発のための情報発信をしていくことが重要である。
【参考文献】
1)Tong S.Y.,et al.：Novel staphylococcal species that form part of a Staphylococcus aureus-related
complex: the nonpigmented Staphylococcus argenteus sp. nov. and the non-human primateassociated Staphylococcus schweitzeri sp. nov., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 65, 15–22, 20152)Aung M.S.,et.al. ： Molecular characterization of Staphylococcus argenteus in Myanmar :identification of novel genotypes/clusters in staphylocoagulase, protein A, alpha-haemolysin andother virulence factors , J. Med. Microbiol. , 68 , 95-104 , 20193)髙橋志保 他：食中毒事例で分離された Staphylococcus argenteus の同定と性状解析，日本
食品微生物学会雑誌，37(1)，20-23，2020
4)Hussain M.,et.al.：eap gene as novel targfet for specific identification og Staphylococcus aureus, J.
Clin. Mirobiol. , 46(2) , 470-476 , 20085)松村浩介 他：畜水産食品からの黄色ブドウ球菌検出のための選択分離培地および選択増菌培地の検討,日本食品微生物学会雑誌,26(1),23-27,20096)若林友騎 他：市販食品における Staphylococcus argenteus の汚染状況調査,第 40 回日本食品微生物学会学術総会,2019【経費使途明細】
使途金

額

プライマー・プローブ

61,534 円

シークエンス解析料

11,968 円

食品購入費

49,626 円

試薬代（リアルタイム PCR 用試薬、DNA 抽出試薬、粉末培地等）

182,699 円

合計

大同生命厚生事業団助成金

305,827 円
300,000 円