被ばくによる発がんゲノム変異を定量できる
新規放射線発がん高感受性マウスを用いた
低線量・低線量率発がんリスクの解明(受託者)国立大学法人広島大学(研究代表者)笹谷めぐみ 原爆放射線医科学研究所(再委託先)国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構(研究期間)平成 27 年度～29 年度

１．研究の背景とねらい
東京電力福島第一原子力発電所事故（福島原発事故）以降、放射線の人体に与える影響に関する社会的関心は高く、低線量・低線量率放射線を長期にわたり被ばくした場合の発がんリスク評価は緊急の課題といえる。しかしながら、ヒト放射線発がんにおける低線量域のリスクや、一般に総線量が同じ場合、線量率が下がると引き起こされる生物学的効果が減弱するという線量率効果の有無については十分に解明されておらず、疫学調査のみによるリスク解明には限界がある。
そのため、動物実験で得られる低線量・低線量率発がんに関する知見を大規模疫学調査結果と統合することで、リスク評価の信頼性向上が期待さ
Minアリル

れる。

正常側アリル
小腸腫瘍

そこで、本研究では、放射線発がん高感受性モデルマウスを用いて、低線量・低線量率放射線MinMinによる発がんリスクを評価し、しきい線量の有無や線量率効果のゲノム的基盤の解明を通じて、新しい放射線防護体系の基盤確立に貢献することを目指す。

図１ Apc Min/+マウスの特徴

これまで我々は、放射線高発がん性モデルマウスの開発に注力してきた。その中でも、ヒト大腸腺腫症（Adenomatous Polyposis Coli、APC）のモデルマウスとして開発された ApcMin/+マウス
は、放射線や化学物質に対し発がん感受性が高いマウスとして知られている。原爆被爆者の疫学調査でも大腸がんのリスクは高く、放射線発がん♀

♂

Apc Min/+(C57BL/6(B6))

Apc +/+(B6-Ch18MSM)

研究において ApcMin/+マウスの有用性は疑う余地が無い。我々はこれまで、ApcMin/+マウスにおいて低線量放射線により小腸腫瘍が高率に発生し、かつ、その腫瘍において放射線に特有の遺伝子変異（放射線の爪痕）が検出できることを明らかにしている。また、このモデルマウスでは、一匹のマB6/B6-Ch18MSM-F1 Apc Min/+B6/B6-Ch18MSM-F1 Apc +/+ウスの小腸に数十～百数十個の腫瘍が発生する。
これらの腫瘍は独立して生じるため、膨大なマウ

18番染色体スを用いることなく多数の腫瘍を用いた分子生物学的解析が可能となる（図 1）。さらに我々は、

ApcMin/+マウスと日本古来の MSM マウス由来の 18番染色体を持つコンソミックマウスとの F1 マウMSM

ス（B6/B6-Ch18 -F1 ApcMin/+マウス）（図 2）を系統
Apc アリル

B6 MSM
Min 正常図２ B6/B6‐Ch18MSM‐F1 Apc Min/+マウスの作成

用いることで、より高感度に腫瘍増加が検出できることを見出している。これらの事から、
B6/B6-Ch18MSM-F1 ApcMin/+ マウスを用いることにより、遺伝子変異を指標とした低線量・低線量率
放射線被ばくによる発がんリスク評価が可能になるものと期待される。
さらに近年、発がん過程には、遺伝的（ジェネティック）変異に加えて、異常な DNA のメチル化や、DNA の構造変化を制御するヒストン蛋白質のメチル化、アセチル化などのエピジェネティック変異が蓄積していることが報告されている。しかしながら、放射線発がんにおけるエピジェネティック変異の関与については、未だほとんど解明されていない。そのため、次世代シークエンサーを用いて、B6/B6-Ch18MSM-F1 ApcMin/+ マウス小腸腫瘍におけるエピジェネティック変異を網羅的に解析し、放射線に特有のエピジェネティック変異の有無を検索する。
２．これまでの研究成果

60

No. of intestinal
adenoma/ mouse

2.1 低線量放射線発がん実験
100 mGy 以下の被ばくにおける発がんリスク評価を行うため、C57BL/6N(B6) ApcMin/+メスマ
ウスと B6/B6-Ch18MSM Apc+/+オスマウスをかけあわせて得られる B6/B6-Ch18MSM-F1 ApcMin/+マウス

50403020を用いて発がん実験を行った。生後 11 日目に、100、20 mGy の放射線照射を行った。その後、約0020Dose (mGy)19 週齢まで飼育し、小腸を採取した。採取した小腸は、アルカリフォスファターゼ染色を行い、図３ 低線量放射線照射によって誘発された小腸腫瘍小腸腫瘍数を計測した。本研究結果結果を図 3に示す。B6/B6-Ch18MSM-F1 ApcMin/+マウスで検出される小腸腫瘍数は、線量依存的に増加した（図3）。20 mGy 照射群では、非照射群と比較して、有意な増加が検出されなかった。また、本研究結果とこれまでに得られた研究結果を併せて解析を行った結果、本実験モデルにおいて、マウス 1匹あたりの腫瘍数は、線量に応じて直線的に比例することを明らかにした。
p<0.05p<0.01

低線量放射線発がんリスクにおける線量率の影響を明らかにするため、総線量を一定にし、線量率を変えて放射線発がん実験を行った。2.1 と同様に、B6 ApcMin/+メ

No. of intestinal
adenoma/ mouse

2.2 低線量率放射線発がん実験

スマウスと B6-Ch18MSM Apc+/+オスマウスをMin/+マウスを実験に用いた。生後 11 日目に、総線量 100 mGy、線量率 262 Gy/day、403020100

かけあわせて得られる B6/B6-Ch18MSM-F1Apc50

図４0 mGy0.2262(Gy/ day)

100 mGy

低線量率放射線照射によって誘発された⼩腸腫瘍

0.2 Gy/day の放射線照射を行った。
その後、
約 19 週齢まで飼育し、小腸を採取した。採取した小腸は、アルカリフォスファターゼ染色を行い、小腸腫瘍数を計測した。
その結果、照射により、線量率 262 Gy/day 群、0.2 Gy/day 群ともに非照射群と比較して有意な小腸腫瘍数の増加が観察された（図 4）。また、262 Gy/day 群、0.2 Gy/day 群で検出された小腸腫瘍数に有意な差は検出されなかった。昨年度は総線量 500 mGy において線量率効果の検討を行ったが線量率効果はみられなかった。今年度は、総線量を下げて 100 mGy における線量率効果の検討を行ったが、本実験モデルにおいては、今回用いた線量率領域では、線量率効果はみられなかった。
2.3 遺伝子変異解析
我々のこれまでの研究から、ApcMin/+マウスでは、Apc 遺伝子領域近傍の欠失が放射線照射に遺伝⼦変異の分類
正常より誘発された腫瘍で検出されることから、こ正常側アリルの全欠失

Apcの下流での正常側アリルの一部欠失

Apc近傍での正常側アリルの一部欠失

両アリル
存在

Mis-segregation

Mitotic
recombination

Deletion

Unidentifiedのマウスを用いることにより、放射線に特有の0遺伝子変異を検出することができる。

10LOH解析

そこで、図 5 に示すようなヘテロ接合性の喪

20304050失（LOH）解析やゲノムのコピー数を定量できる定量 PCR（qPCR）法を用いて、腫瘍サンプルを60

遺伝子変異の種類

R-typeS-type解析した。その結果、今回解析した腫瘍組織に（放射線誘発腫瘍に特有）

Unidentified

図５ 遺伝⼦変異解析

おいて、図 5 に示す R-type と定義した遺伝子変異が、放射線の線量依存的に増加した。
2.4 エピジェネティック解析
がん細胞におけるがん抑制遺伝子の高メチル化や、がん遺伝子の低メチル化による発現異常など

プロモーターから、発がんにおけるエピジェネティック異常がMe Me Me重要であることが明らかにされている。多段階発プロモーター

がん機構の研究が進んでいる大腸がん等において

遺伝子
プロモーター：遺伝子の発現量を調節する領域
DNAがメチル化されていない状態

も、発がん過程におけるエピジェネティック異常の関与が明らかにされている。そこで、エピジェ遺伝子

Me

図６

DNAがメチル化されている状態

DNAのメチル化による遺伝⼦発現制御

ネティック変異が放射線発がんに果たす役割を明らかにするため、ApcMin/+マウスの小腸腫瘍における Apc 遺伝子のプロモーターのメチル化状態を解析した。非照射群および照射群の両者とも、本研究で解析した腫瘍からは、Apc 遺伝子のプロモーターのメチル化は検出されなかった。このことから、Apc 遺伝子のプロモーターのメチル化は、ApcMin/+マウスの自然発症および放射線誘発腫瘍においてほとんど関与しないことが示唆された。
2.5 リスクモデルの構築
長期低線量被ばくのリスク評価には、一般的にポアソン回帰の統計モデルが用いられる。ポアソン回帰モデルでは、毎年の被ばく線量が加算され、それを累積した累積線量が解析に用いられる。このモデルでは、同じ線量の被ばくによるリスク増加は、被ばく時点によらず一定という仮定のもとで累積線量が加算されている。

しかしながら、原爆被爆者における疫学調査からは、1Gy あたりの ERR は被ばく時年齢によって大きく変化することが報告されている。そのため、被ばく時年齢によってリスク増加が変化できるようなモデルの改良を継続した。さらに、2.1 で得られた研究結果から ERR を算出し、本モ
デルマウスで得られた ERR/Gy と広島、長崎原爆被爆者の疫学研究から得られた ERR/Gy との比較を行った。
３．今後の展望
B6/B6-Ch18MSM-F1 ApcMin/+マウスを用いて、低線量・低線量率発がん実験を行った。その結果、本実験モデルおよび照射条件において、発がんリスクは、直線、しきい値なしと示唆された。本
研究結果は、広島、長崎原爆被爆者による疫学研究結果を補完する知見といえる。また、我々は、

ApcMin/+マウスの遺伝的背景が放射線発がん頻度や誘発される遺伝子変異パターンへ影響を及ぼすという知見を得ている。そのため、本研究とは異なる遺伝的背景を持つ ApcMin/+マウス用いた低線量・低線量率発がん実験を行うことにより、ヒトへ外挿するための動物実験による知見提供を継続していきたい。
また、ApcMin/+マウスでは、遺伝的背景が線量率効果に影響を及ぼすことを明らかにしている。
これらの研究を継続することにより、線量率効果の分子機構解明を目指したいと考えている。本
研究結果は、現在議論されている線量・線量率効果係数(DDREF)の数値策定に重要な知見を提供することが期待できると考えている。
４．参考文献笹谷めぐみ, 飯塚大輔, 河合秀彦, Zaharieva Elena, 神谷研二, “放射線発がん高感受性モデルマウスを用いた放射線誘発腫瘍の遺伝子変異解析”広島医学press, (2017)

原子爆弾後障害研究会講演集, in