PRESS RELEASE

2024 年 2 ⽉ 29 ⽇

報道関係者各位
⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター／⽣理学研究所
東海⼤学
科学技術振興機構（JST）

⽣きた動物の⼤脳⽪質から⼩脳までを⾼精細かつ⻑期的に光イメージングできる⼿法を開発
ー⾼分⼦ナノ薄膜と光硬化性樹脂による超広範囲な観察窓ー
研究の概要
東京理科⼤学先進⼯学部の髙橋泰伽 助教（兼任：⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター（ExCELLS：エクセルズ）特別訪問研究員）、ExCELLS／⽣理学研究所の根本知⼰ 教授、⼤友康平 准教授のグループは、東海⼤学マイクロ・ナノ研究開発センター／⼯学部応⽤化学科の岡村陽介 教授、天津⼤学の張宏 准教授、⽣理学研究所の鍋倉淳⼀ 教授、揚妻正和 准教授と共同で、⾼分⼦ナノ薄膜*1 と光照射によって状態変化する光硬化性樹脂*2 を⽤いた透明な素材で頭蓋⾻を代替する⼿法（NIRE 法）を開発し、マウスの⼤脳⽪質から⼩脳までの頭頂部広域の神経細胞を６ヶ⽉以上の⻑期間に渡って⼆光⼦励起顕微鏡法*3 で観察することに世界で初めて成功しました。開発された⼿法により、⽣きた動物の⼤脳⽪質から⼩脳までの多数の神経細胞を⻑期間観察できるようになるため、複数の脳領域の協調的な活動が関与する⾼次脳機能の解明につながることが期待されます。
本研究成果は、2024 年 3 ⽉ 4 ⽇に国際科学雑誌「Communications Biology」に掲載されます。

発表のポイント1.

⾼分⼦ナノ薄膜と光硬化性樹脂を⽤いた透明な素材で広範囲の頭蓋⾻を代替して観察窓を作成する⼿法を開発しました。

2.

⼤脳⽪質から⼩脳までの多領域に位置する神経細胞を同⼀マウスから可視化する⼿法を確⽴しました。

3.

従来の技術よりも広範囲の脳領域を同時に光計測できるようになるため、⾼次脳機能の理解や神経疾患の機序解明につながることが期待されます。

1. 背景ヒトを含む⾼等⽣物の脳機能は、脳全体の多数の神経細胞によって構成される多細胞ネットワークが担っています。そのため、脳機能の解明には複数の脳領域に存在する神経細胞の⼀つ⼀つを同時に観察することが必要となります。近年、⼆光⼦励起顕微鏡法によって、⽣きたままの動物の脳内に存在する個々の神経細胞の形態や活動を観察できるようになりました。⼀般的に、⽣きた状態の動物の神経細胞を⼆光⼦励起顕微鏡法で観察する際には、光の透過を妨げる頭蓋⾻をカバーガラスで置換し、透明性の⾼い観察窓を作成するオープンスカル法が⽤いられています。しかし、この⼿法で広範囲の観察窓を作成する場合には、汎⽤的なカバーガラスが平坦かつ硬質であるために、表⾯が曲⾯である脳組織を圧迫してしまう課題がありました。この課題を解決するために、曲げたカバーガラスや柔軟なシリコンゴムなどを⽤いて脳への圧⼒を減らした広範囲の観察窓の作成⼿法が報告されていますが、⼤脳⽪質の観察のみを⽬的として成形済みの素材を⽤いており、複雑な表⾯形状と⾼い曲率を有する⼩脳までを観察対象に含む広範囲の観察窓作成⼿法は報告されていませんでした。
2. 本研究の内容
本研究グループでは、⾼い柔軟性、接着性、透明性を有する⾼分⼦ナノ薄膜と紫外線の照射によって硬化する光硬化性樹脂を組み合わせ、マウスの広範囲の頭蓋⾻を透明な素材で代替することで観察窓を作成する⼿法を開発し、NIRE（Nanosheet Incorporated into light-curable REsin）法と名付けました（図1）。
NIRE 法では、⽌⾎と炎症防⽌効果を有する PEO-CYTOP ナノ薄膜*4 を脳表⾯に貼りつけたのちに、液体状の光硬化性樹脂をナノ薄膜表⾯に滴下してから紫外線照射により硬化させることで頭蓋⾻の⼀部を透明な素材で置き換えます。この⼿法の特徴として、脳組織と⽣体に害のある物質の接触を防ぐ保護膜としてナノ薄膜を利⽤することにより、液体から固体へ状態変化する特性を持った光硬化性樹脂を観察窓の素材として活⽤できる点があります。これにより、⼩脳などの複雑な曲⾯を持つ領域を観察対象とする場合においても脳組織を圧迫することなく、脳組織にフィットした観察窓の作成が可能となっています。また、先⽴って報告した PEO-CYTOP ナノ薄膜のみを観察窓の素材とする⼿法と⽐較して、光硬化性樹脂によって観察窓の機械的強度を強化することでマウスの体動による視野ブレの発⽣を防いだ安定的な観察が NIRE 法により可能となりました。
実際に NIRE 法を⽤いて作成した観察窓を通じてイメージングを⾏った結果、⼀匹のマウスにおいてミクロな神経細胞のスパイン構造からマクロな多数の神経細胞群までマルチスケールに観察することに成功しました（図 2）。さらに、⼤脳⽪質から⼩脳までの広範囲における脳領域の神経細胞の形態を、6 ヶ⽉以上の⻑期間に渡って経時的に観察することに世界に先駆けて成功しました（図 3）
。

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図 1. ナノ薄膜と光硬化性樹脂を⽤いた観察窓の作成法「NIRE 法」
A. ナノ薄膜、⾷品⽤ラップ、カバーガラスの厚さ⽐較。ナノ薄膜の厚さは⾷品⽤ラップのわずか 100分の１程度。
B. PEO-CYTOP ナノ薄膜の模式図。
C. 光硬化性樹脂の模式図。
D. NIRE 法の実施⽅法。

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図 2. 同⼀個体での多数の神経細胞群から微細なスパイン構造までカルシウムイメージング
A. ⼤脳⽪質のおよそ 2mm 四⽅の広範囲で多数の神経細胞の観察結果。
B. 図 2A 中の各細胞のカルシウム濃度変化のヒートマップ。
C. ⼤脳⽪質の神経細胞の細胞体、樹状突起、微細構造の樹状突起スパインの観察結果
D. 図 2C に数字で⽰された領域にて検出された神経細胞の活動データ。

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図 3. ⼤脳⽪質から⼩脳までの頭頂部広域の⼆光⼦イメージングによる神経細胞の可視化
⼤脳⽪質から⼩脳までのおよそ直径 9 mm を⼆光⼦励起顕微鏡法でイメージングした観察結果。ここでは、神経細胞に蛍光タンパク質 YFP を発現するマウスに NIRE 法を施したのち観察を⾏った。広域を観察後、⾼倍率の対物レンズを使⽤して四⾓で⽰した⼤脳⽪質、中脳および⼩脳の神経細胞の微細形態を観察した。

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3. 本研究の意義と展望
本研究の成果により、従来よりも広範囲で⽣体組織の光学計測が可能になることから、これまで観察できなかった複数の脳領域の同時計測を実現し、⾼次脳機能の解明や複数の脳領域が発症に関与する精神・神経疾患の機序解明への貢献が期待されます。また、本研究の技術は、表⾯形状や個体差に合わせて観察窓を作成可能であるため、⽣体内の⽣理的条件を阻害せずに計測を⾏うことができます。加えて、⼀個体の⽣体組織を微⼩領域から広域までシームレスかつ⻑期的に観察できるため、分⼦レベルから細胞、臓器、個体レベルまでの多階層性を有する⽣体システムの異常によって起こる癌をはじめとした種々の疾病のメカニズムの解明、治療法や創薬の研究の進展にもつながります。
現在、国内外の研究グループや企業によって広視野イメージングの関連技術の開発が進められている中で、光硬化性樹脂の観察窓素材としての活⽤⽅法は例が無く、今後新しい派⽣技術や新規材料の開発が⾏われる可能性があります。

（⽤語説明）*1 ⾼分⼦ナノ薄膜
数⼗〜数百ナノメートルの厚さに対して、数平⽅センチメートル以上の⾯積を有する⾼分⼦からなる極薄の薄膜。⾼い柔軟性と接着性を有しており、接着剤を使⽤せず物理吸着のみで貼付できる。⽣分解性⾼分⼦を素材とした⽣体組織の創傷保護材や、乾燥防⽌効果を有する⾼分⼦を素材としたサンプル保定材などの⽤途で利⽤がなされている。
*2 光硬化性樹脂
特定の波⻑の光により光重合開始材が反応することでモノマーやオリゴマーの重合が起こり、液体から固体に変化する樹脂。光学部品の接着剤や⻭科治療の材料、3D プリンターの素材など様々な⽤途の製品が販売されており、多岐に渡る分野で利⽤されている。
*3 ⼆光⼦励起顕微鏡法
励起光の２つの光⼦を蛍光分⼦が同時吸収して励起状態に遷移する⾮線形光学現象を利⽤した蛍光顕微鏡法の⼀種。⽣体組織透過性の⾼い近⾚外光を励起に⽤いるために光が強く散乱する厚い組織や⽣体内をサブミクロンの空間分解能で観察することが可能であり、従来の蛍光顕微鏡法と⽐べ、⽣体組織のより深い領域を低侵襲的に観察できるといったメリットがある。
*4 PEO-CYTOP ナノ薄膜
⽣体脳組織のイメージング⽤に開発されたナノ薄膜。⾼い光透過性、⽔の屈折率に近い屈折率（1.34）を有するフッ素系樹脂 CYTOP を主な構成素材としている。さらに、CYTOP 層が脳組織と接着する⾯には炎症抑制効果を持つ⽣体適合性⾼分⼦ polyethylene oxide（PEO）を修飾することで、撥⽔・撥油性を有する CYTOP 表⾯を親⽔化し、湿った環境の⽣体組織への接着⼒を⾼めている。

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研究サポート
本研究は、AMED ⾰新脳プロジェクト（JP19dm0207078 根本知⼰; 19dm0207087 岡村陽介;19dm0207086 揚妻正和）、科学研究費補助⾦（“Resonance Bio” JP18H04744 岡村陽介; “Advanced
Bioimaging Support” JP16H06280, JP22H04926 根 本 知 ⼰ 、 鍋 倉 淳 ⼀ 、 揚 妻 正 和 ; JP20H05669,
JP22K21353 根本知⼰; JP21J14773, JP23K14294 髙橋泰伽; JP21H02801, JP22H05081, JP22H05519
揚妻正和; JP21K19346, JP22H02756 ⼤友康平）、 科学技術振興機構（JST） CREST（JPMJCR20E4⼤友康平）、JST ACT-X（JPMJAX2228 髙橋泰伽）、私⽴⼤学戦略的研究基盤形成⽀援事業 2014-2018（岡村陽介）、⽣理学研究所共同利⽤研究（20-121, 22NIPS131 岡村陽介）、ExCELLS 共同利⽤研究（23EXC601 根本知⼰; 23EXC337 髙橋泰伽）の⽀援を受けて実施されました。
掲載論⽂
雑誌名: Communications Biology
論⽂名: Large-scale cranial window for in vivo mouse brain imaging utilizing fluoropolymer nanosheet
and light-curable resin
著者: Taiga Takahashi, Hong Zhang, Masakazu Agetsuma, Junichi Nabekura, Kohei Otomo, Yosuke
Okamura, Tomomi Nemoto* (*責任著者)
DOI: 10.1038/s42003-024-05865-8＜お問い合わせ先＞（本資料の内容に関するお問い合わせ）
⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター／⽣理学研究所教授 根本知⼰
TEL: 0564-59-5255
E-mail: tn_at_nips.ac.jp
東京理科⼤学助教 髙橋泰伽TEL: 03-5876-1717
E-mail: tt_at_rs.tus.ac.jp
東海⼤学 マイクロ・ナノ研究開発センター／⼯学部応⽤化学科
教授 岡村陽介
TEL: 0463-58-1211
E-mail: y.okamura_at_tokai-u.jp※_at_は@にご変更ください。

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（JST 事業に関すること）
科学技術振興機構 戦略研究推進部 先進融合研究グループ
宇佐⾒健
TEL: 03-6380-9130 FAX: 03-3222-2066
E-mail: act-x@jst.go.jp（広報に関するお問い合わせ）
⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター 研究戦略室
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E-mail: press@excells.orion.ac.jp
⾃然科学研究機構 ⽣理学研究所 研究⼒強化戦略室TEL: 0564-55-7722 FAX: 0564-55-7721
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