2019 No.1（通巻251号）
ISSN 0285-2446

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―
山本 卓 03● ゲノム編集の歴史と基礎

佐藤 守俊 07● 生命現象の光操作技術の創出

高橋 宏和、堀尾 京平
小堀 俊郎、岡村 好子 12● ローリングサークル増幅によるRNA直接検出
トピックス

次世代型核酸医薬の創製：
マイクロRNAの化学修飾と創薬への展開

URL http://www.kanto.co.jp

北出 幸夫 18

KANTO CHEMICAL CO., INC.

新 年を迎えて代表取締役社長

野澤 学

あけましておめでとうございます。

をアップしております。ご利用いただいているお客様か「THE CHEMICAL TIMES」
をご愛読の皆様におかれらは、電子版ならではの検索機能、抽出機能などの面かましては、つつがなく良い新年を迎えられたこととお慶ら概ね好評を得ており、さらに今年４月には、皆様からび申し上げます。

の様々なご意見を反映させて、より使い易いサイトにリ
ニューアルを予定しています。また、同時に電子版の有昨年は、各地で自然災害が立て続けに発生した大変

機試薬専用カタログを新たにリリースする準備を進めな１年でした。被災された皆様には心よりお見舞いを申ているところです。有機試薬カタログの新機能として、し上げます。

母骨格や官能基での抽出、用途による抽出、分子量順で昨今の日本経済は緩やかに成長し、日経平均株価はの並べ替えなどが付加されます。電子版試薬総合カタ

一時２４，４００円を超え、
１９９１年１１月以来約２７年振りのログをサポートする強力な化合物検索ツールとしてご高値となり、バブル崩壊後の最高値圏に到達しました。

活用頂ければと思います。今後も内容の充実、使い易さ

しかし、昨年１０月米国の金利上昇による世界株安連鎖を向上させて参りますので、忌憚のないご意見を頂けの影響を受けて以来、株価は不安定な状況が続き、サウれば幸いです。

ジリスクによる原油供給も経済の不確実化を引き起こ

科学技術創造立国を目指す日本の技術力の発展にしております。一方、企業は長引く景気後退局面に際しは、試薬や分析機器の技術革新も大きく貢献しておりまて、ムダを廃し、効率を重視した結果、利益を生み出せるす。今後も新たな産業を作り出す基盤業界として責任を構造となり、雇用情勢が改善、有効求人倍率や賃金が上果たして参る所存です。

昇しております。今年１０月には消費増税が予定されて本誌は科学の最新の話題を提供するようにますますおりますが、むしろ東京オリンピック、IoTや自動車など充実した内容にする様引き続き取り組んで参りますのの成長産業の需要による景気拡大を期待したいところ

で、皆様のご指導、ご鞭撻を何卒よろしくお願い申し上

です。

げます。

ところで、
１０月には明るいニュースが飛び込んで参りました。京都大学名誉教授の本庶佑先生がノーベル
医学生理学賞を受賞、日本人の同賞の受賞は５人目であり、トータルでは２６人目のノーベル賞受賞者となりました。受賞理由は、「 免疫抑制の阻害による癌治療法の発見」
であり、免疫反応にブレーキをかけるタンパク質
PD-1の発見・機能の解明が、新しいがん免疫療法に道を開いたということが評価されました。本庶先生の栄えある受賞を祝し謹んでお喜び申し上げますとともに、今後のご活躍を心よりお祈りいたします。
さて、当社では昨年より紙媒体の試薬総合カタログ
を廃止し、ホームページ上に「電子版試薬総合カタログ」

2

この一年が皆様にとって光輝に満ちた幸多い年でありますように祈念しております。

特集

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

ゲノム編集の歴史と基礎
History and Basics of Genome Editing Technology

広島大学大学院理学研究科 教授

山本 卓

Takashi Yamamoto, PhD (Professor)
Graduate School of Science, Hiroshima University

キ ーワード01

CRISPR-Cas9、TALEN、Gene knockout、ゲノム編集治療

はじめにある細菌のもつ制限酵素に着目した。制限酵素は、侵入してきた外来DNA(ファージなど)を切断・不活性化するために細菌がもつ防御システムに利用されるタンパク質である。多く

ゲノム編集は、人工のDNA切断システムを利用して正確にの制限酵素は4塩基あるいは6塩基の特定の配列（認識配列）

遺伝子を改変するバイオテクノロジーである。これまで狙ってを認識して、2量体となってDNAを切断する。例えば、制限酵

改変ができなかった培養細胞株や生物種において、遺伝子ノッ
クアウトや遺伝子ノックインが可能であることから、基礎から応用の幅広い分野での利用が期待されている。本稿では、
ゲノム

素のBam HIを哺乳類の細胞や植物の細胞内で働かせると、

Bam HIの認識配列は染色体DNAはバラバラになってしまう。

GGATCCであり、4,000〜5,000塩基対に1箇所の頻度で現編集の開発の歴史とその基本原理を紹介すると共に、ゲノム編れるため、30億塩基対を持つヒトのゲノムはバラバラになって集の応用分野で可能性について紹介する。

しまう。そこで、より長い塩基配列に特異的に結合して切断できる酵素が人工で作れるようになれば、ヒトで2万以上ある遺02

伝子の中から選んで特定の遺伝子を改変できると考えられた。

ゲノム編集技術の開発の歴史

この目的で開発されたのが、人工の制限酵素である。1996年

ゲノム編集の開発の歴史は、基盤となる人工DNA切断酵素

ンからなるキメラタンパク質である(図1)4)。ジンクフィンガーはに開発された第一世代のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)
は、DNAの認識・結合を行うドメインとDNAを切断するドメイ（ゲノム編集ツールとも呼ばれる）の開発の歴史と言える。古
くから、細胞内のDNAが切断を受けると、これが原因となって突然変異が誘導されることが知られていた。放射線による変異導入は1950年以降に農作物で開始され、「ゴールド二十世紀」など多くの品種が作られてきた。目的の遺伝子に変異（点変異や欠失挿入変異）が導入された個体を、PCRを利用して効率的
しかしながら、に選別する方法(Tilling法)も確立されている1)。
これらの方法では、基本的にDNAへランダムに切断や修飾が起こり、その結果、変異が導入される。また、複数の遺伝子へ同時に変異が導入されることもしばしばである。そのため、標的遺伝子の塩基配列(A, G, C, Tの４つの塩基の並び順)に応じて、特異的に切断を導入する方法の開発が重要であると考えられてきた。一方、DNAの切断を介さない改変法として遺伝子ター
ゲティングが開発されてきた2)。遺伝子ターゲティングは、相同組換え(HR)修復を利用したDNAの切断を介さない方法であり、大腸菌や酵母、ニワトリのDT40細胞、マウスES細胞、ヒメツ
リガネゴケなどに限られた生物種で可能な技術である。この方法は正確な改変が可能な一方、HR修復活性の低い生物種では利用できないという問題があった。
そこで研究者は、特定の塩基配列を認識・切断する酵素で

図1 様々な人工DNA切断システム
FokIはフラボバクテリウム属細菌の制限酵素であり、そのDNA切断ドメインが
ZFNやTALENのDNA切断ドメインとして利用される。

3

THE CHEMICAL TIMES

特集

多くの生物で転写因子のDNA結合ドメインに利用されるドメ

断する
（図1）
。Cas9の切断には、sgRNAの結合に加えて、PAMインである。1フィンガーが3塩基を認識・結合し、複数のフィン配列と呼ばれるCas9切断のために認識する配列が必要とさ

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

ガーを連結することによって長い配列に特異的に結合させるこれる。化膿レンサ球菌のSpCasのPAM配列は5’-NGG-3’であとができる。例えば、4フィンガーのZFNは12塩基を認識してり、黄色ブドウ球菌のSaCas9のPAM配列は5’-NNGRRT-3’で結合する。制限酵素は1組で働くので、ZFNペアで24塩基の特ある。CRISPR-Cas9を用いたゲノム編集は、2013年初頭から異性で働かせることができる。24塩基の連続する配列は哺乳次々と報告され、2014年以降は毎週のようにCRISPR-Cas9を類ゲノムであれば理論的には一箇所しか現れないため、標的遺使った論文が発表されている。

伝子のみに切断を導入することが可能になる。ZFNは分子サ
イズが小さいというメリットある一方で、特異性の高いZFNの作製が難しく、一部の企業に作製を頼らざるを得なかった。私の研究室では、2008年以降にZFNの作製システムを導入し、ウニ胚でのゲノム編集に取り組んできた。ZFNによる標的遺伝子の切断によって蛍光遺伝子を挿入し、初期胚で骨を作る遺伝
子の発現をモニターすることに成功している5)。

03

ゲノム編集による遺伝子改変

細胞内のDNAは、自然放射線や化学物質などによって切断を受けるだけでなく、DNAの複製においても切断されることが2010年には、米国のグループから第二世代のゲノム編集

知られている。切断されたDNAは、そのままにしておくと遺伝ツールとしてターレン（TALEN）
が発表された6)。ZFNに比べ子が分断された状態となり致命的である。そのため、細胞内でると格段に作製が簡便であり、切断特異性が高いことも特徴

は、切断されたDNAは速やかに修復される。高い確率でよってである。TALENは植物病原細菌キサントモナスが作る転写因

正確に元通りにつなぎ合わされる一方で、修復のエラーが起こ

子様エフェクター（TALEタンパク質）を利用した人工制限酵素

る場合がある。この修復エラーは、疾患の原因になる可能性がである。TALEタンパク質には、34アミノ酸残基を単位とする

あるが、品種改良や生物の進化の原動力となっている。

DNA結合リピート(TALEリピート)が存在し、この部分で標的

ゲノム編集は、TALENやCRISPR-Cas9などのゲノム編集

遺伝子の塩基配列と結合する（図１）。TALEリピートの繰返し

ツールによる標的遺伝子の切断とその修復エラーを利用した

数は、TALENでは15〜20と長いので、一組で作用させる場合

技術である
（図2）
。細胞内でツールを導入することによって、目30〜40塩基の標的配列を認識して切断させることが可能で的の遺伝子の切断を繰返し、修復エラーを誘導し遺伝子を破ある。私の研究室では、
アミノ酸配列の改変によって、高活性型

壊する（遺伝子ノックアウト）。また、切断箇所に挿入する外来

TALEN(Platinum TALEN)を開発し、様々な生物種での高効

DNAを入れておくと切断箇所に高い確率で外来DNAを挿入

率での改変を報告した 。現在では、モジュールライブラリーをすることが可能である（遺伝子ノックイン）。これらゲノム編集

使って3日間でPlatinum TALEN構築することが可能である。

ツールを利用した遺伝子改変は、ゲノム編集とよばれる。後者

7)

しかし、作製する数にはよるが、一からTALENを作製するとなの遺伝子ノックインは、外来DNAを挿入するので、遺伝子ノッ

ると、かなりの労力を必要とする。そのため、TALENを使った研クイン個体は遺伝子組換え体となる（培養細胞は組換え体から究を考える場合は、作製に慣れている研究グループと共同研究除外される）。

で進めることを推奨している。
TALENの開発によってゲノム編集は使いやすくなってきた
ものの、依然として作製には煩雑な作業が必要とされた。このような状況は、2012年のCRSIPR-Cas9の開発によって大きく変わった。CRISPR-Cas9は、簡便かつ高効率なことに加えて、基礎研究であれば自由に使うことができた。そのため、2013年
からはZFNやTALENに変わってCRISPR-Cas9が急速に広がった。CRISPR-Cas9は、細菌の獲得免疫機構を利用したシステムである。米カリフォルニア大学バークレー校のジェニファー・ダ
ウドナ博士と独マックスプランク研究所のエマニュエル・シャル
パンティエ博士のグループが共同開発し、2012年にScience
誌に発表した8)。同年リトアニアのヴィリュニュス大学のヴィル
ギニユス・シクスニス博士もCRISPRシステムでのDNA切断をウイルス（バクテリオファージとよば発表している9)。細菌には、れる）が感染するが、このウイルスを不活性化するのが獲得免疫機構として働くCRISPR-Cas9システムである。細菌は、感染したウイルスのDNAをCRISPR遺伝子座へ取り込み、再び感染

図2 ゲノム編集による遺伝子改変した場合にCRISPR遺伝子座から転写される短鎖RNA（シング
ルガイドRNA：sgRNA）
を利用してウイルスDNAを切断する。

4

上述のゲノム編集には、複数のDNA修復経路が関与する。

ダウドナとシャルパンティエは、sgRNAとCas9ヌクレアーゼ

遺伝子ノックアウトでは、DNAの修復経路には切断末端を保護を利用して試験管内において標的遺伝子を切断できることをし、末端を連結する非相同末端結合(NHEJ)修復のエラーが利示したのである。sgRNAは標的遺伝子と20塩基長で結合し、用される。NHEJ修復エラーでは多くの場合、数塩基から数十sgRNAと複合体を作るCas9ヌクレアーゼがDNA二本鎖を切塩基の欠失が誘導され、遺伝子の読み枠にずれが生じ、正常なTHE CHEMICAL TIMES

な開発につながることは言うまでもない。国内外において、組換えによって修復される。これにより、正確な改変や外来遺伝

様々な農水畜産物でのゲノム編集が競って進められている。

子のノックイン（蛍光遺伝子の挿入など）が可能となる。

国内では穂の多いイネや毒のないジャガイモ10)など農作物で

04

（SIP）
で進められている。水畜産物では、筋肉細胞の増殖を抑遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

農作物でのゲノム編集は、食料問題などの解決のため重要端の削り込みが起こる一方で、鋳型となるDNAを介した相同特集

タンパク質が合成できなくなる。遺伝子ノックインでは、切断末のゲノム編集が内閣府の戦略的イノベーション創造プログラム

培養細胞や生物個体でのゲノム編集

えるミオスタチン遺伝子を破壊した肉付きのよいタイ
（マッス
ルマダイ）
が京都大学の木下らによって作出され、広島大学の堀内らは、アレルゲン物質の原因遺伝子をノックアウトしたニワ

ゲノム編集技術（特にCRISPR-Cas9）の開発によって、これまトリを作出している。

で遺伝子改変ができなかった培養細胞、動物や植物での遺伝
子ノックアウトや遺伝子ノックインが可能となった。培養細胞の遺伝子改変は簡単に思われがちだか、ゲノム編集以前の技術を使った場合、効率的な改変ができる細胞種は限られていた。
マウスES細胞やニワトリDT40細胞は、相同組換えによって目

06

ゲノム編集の医学分野での利用的の遺伝子を薬剤耐性遺伝子に置き換え、遺伝子を破壊する

ゲノム編集は、医学研究および創薬において大きく期待され遺伝子ターゲティングが可能な数少ない細胞であった。原理的ている。医学研究では、培養細胞や動物を用いた疾患モデルのにはこの方法によって、薬剤耐性を指標としてノックイン細胞を作製にゲノム編集技術は重要である。単に原因遺伝子を遺伝子得ることが可能であるが、HR修復活性が低い細胞種での遺伝

ノックアウトするだけでなく、疾患の原因変異を正確に再現する

子ノックイン細胞の取得はこれまで困難であった。この問題をことも最近では可能となってきた。特に人工多能性幹細胞(iPS)

解決したのがゲノム編集である。ゲノム編集ツールによるDNA細胞での疾患モデル細胞の作製や、疾患患者から樹立したiPS

切断は、相同組換え活性を上昇させ、現在多くの細胞種での遺細胞での変異の修復において、ゲノム編集の利用価値は高い。

伝子ノックインを実現している。さらに、ゲノム編集ツールの発iPS細胞で疾患変異を再現することによって、疾患の発症メカニ

現ベクターあるいはタンパク質の導入によって多くの細胞種にズムを解明することも可能となる。これらの細胞を利用した低おいてNHEJを介した遺伝子ノックアウトが報告されている2)。

分子化合物スクリーニングを行うことによって、今後薬の候補

最近では単なる遺伝子破壊と挿入に加えて、同じ染色体を2箇となる物質を見つけ出すことが効率的に進められると期待され所切断することによって大きな欠失変異を導入できることが確る。

認されている。また、異なる染色体を同時に切断することによって、がん細胞株で転座が誘導されることも報告されている。
動物個体でのゲノム編集は、基本的には受精卵へゲノム編
集ツールを導入することによって可能である。例えば、マウス
であれば、ゲノム編集ツールの形状は、DNA、mRNAあるいは

ゲノム編集を利用した遺伝子治療は、既に米国や中国で進められている。ゲノム編集治療は、生体内(in vivo )ゲノム編

11)
（図3）
。
集と生体外(ex vivo )ゲノム編集の２つに分けられる

in vivo ゲノム編集は、ゲノム編集ツールをウイルスベクターやナノ粒子などを利用して体内に直接導入する方法である。米国

タンパク質のどれを使っても一定の効率で改変が可能である。

では、血友病やムコ多糖症に関して、
ウイルスベクターを介し

特に、遺伝子ノックアウトは簡便かつ高効率であり、CRISPR-て対象タンパク質をコードする遺伝子を肝臓でノックインする

Cas9を使ったノックアウトマウス作製がES細胞を利用したマウことによって、不足したタンパク質を血中へ分泌させる方法を

ス作製に置き換わっている。これまで1年近くかかっていたES細胞を使った遺伝子ターゲティングが、今ではCRISPR-Cas9を使って数ヶ月から半年で可能である。

05

ゲノム編集の産業利用

ゲノム編集の利用が期待される産業分野は、生物工学、農水畜産学や医学など幅広い。微生物は、様々な機能性物質を産生するが、産業利用においてはその生
産量や性質をコントロールすることが必要になる。この目的では産業微生物において自在に遺伝子改変を加えることが重要である。
しかしながら、大腸菌や酵母などのモデル微生物では、遺伝子改変は自在であるものの、産業微生物については必ずしも自在な改変法は確立していない。そのため、ゲノム編集ツールの導入やゲノム編集効率化などの技術開発が今後必要と考えられる。

図3 ゲノム編集を利用した遺伝子治療の戦略
文献2)から引用5

THE CHEMICAL TIMES

特集

行っている。一方、
ex vivo ゲノム編集は、取り出した細胞をゲノム編集によって改変し、体内へ移植する方法である。HIVの共受容体であるCCR5遺伝子を遺伝子ノックアウトすることによっ遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―て作製したT細胞を移植することで、HIVウイルス量が低下する効果が得られている。この方法のメリットは、正確にゲノム編集ができた細胞を選別することが可能な点にある。最近ゲノム編
集では予期せぬ変異導入（オフターゲット作用）や大きな欠失が起きる可能性について指摘されている。これらの問題を解決するため、オフターゲット作用を低減させた様々なCas9ヌクレ
オフターゲット変
アーゼの変異体が開発されている12)。さらに、
異導入の有無をゲノムワイドに評価する方法（GUIDE-seq法13）やDigenome-seq法14)など）も確立されている。

072） 山本卓, ゲノム編集の基本原理と応用 (裳華房, 東京, 2018).
3） Y. G. Kim, J. Cha, S. Chandrasegaran, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
93(3), 1156-1160 (1996).
4） M. Christian, T. Cermak, E. L. Doyle, C. Schmidt, F. Zhang, A. Hummel,
A. J. Bogdanove, D. F. Voytas, Genetics 186(2), 757-761 (2010).
5) H. Ochiai, N. Sakamoto, K. Fujita, M. Nishikawa, K. Suzuki, S. Matsuura,
T. Miyamoto, T. Sakuma, T. Shibata, T. Yamamoto, Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 109(27), 10915-10920 (2012).
6） T. Sakuma, H. Ochiai, T. Kaneko, T. Mashimo, D. Tokumasu, Y. Sakane,
K. Suzuki, T. Miyamoto, N. Sakamoto, S. Matsuura, T. Yamamoto, Sci
Rep 3, 3379 (2013).
8） M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna, E.
Charpentier, Science , 337(6096), 816-821(2012).
9） G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys, Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 109(39), E2579-E2586 (2012).

おわりに

ゲノム編集は、開発から数年でライフサイエンス分野では必要不可欠な技術となってきた。基礎研究目的であれば世界中に配付される仕組み（オープンイノベーション）が整っており、基礎研究では誰もが自由に使える。国内のゲノム編集技術開発は遅れ気味ではあるが、新しいゲノム編集ツールも開発されつ
つあり、
日本の巻き返しには多くの研究者の参入が不可欠である。筆者らは、国内のゲノム編集の研究推進および情報共有を図る目的で、平成26年に日本ゲノム編集学会を設立した。1人でも多くの若い研究者がこの技術に興味を持って導入してくれることを願っている。

6

参考文献
1） C. M. McCallum, L. Comai, E. A. Greene, S. Henikoff, Nat. Biotechnol .
18(4), 455-457 (2000).

10）S. Sawai, K. Ohyama, S. Yasumoto, H. Seki, T. Sakuma, T. Yamamoto, Y.
Takebayashi, M. Kojima, H. Sakakibara, T. Aoki, T. Muranaka, K. Saito,
N. Umemoto, Plant Cell 26(9), 3763-3774 (2014).
11) D. B. T. Cox, R. J. Platt, F. Zhang, Nat. Med. 21(2), 121-131 (2015).
12) H. Mitsunobu, J. Teramoto, K. Nishida, A. Kondo, Trends Biotechnol .
35(10), 983-996 (2017).
13) S. Q. Tsai, Z. Zheng, N. T. Nguyen, M. Liebers, V. V. Topkar, V. Thapar,
N. Wyvekens, C. Khayter, A. J. Iafrate, L. P. Le, M. J. Aryee, J. K. Joung,  
Nat. Biotechnol. 33(2), 187-197 (2015).
14) D. Kim, S. Bae, J. Park, E. Kim, S. Kim, H. R. Yu, J. Hwang, J. I. Kim, J. S.
Kim. Nat. Methods 12(3), 237-243 (2015).

特集

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

生命現象の光操作技術の創出
Manipulating living systems by light

東京大学大学院総合文化研究科 教授佐藤 守俊

Moritoshi Sato, PhD (Professor)
Graduate School of Arts and Sciences、The University of Tokyo

キ ーワード01

光操作、ゲノム編集、CRISPR-Cas9システム

はじめに菌類のように光を利用して生きている生物は光受容体と呼ばれるタンパク質を持っている。光受容体は、光を吸収すると大きく構造変化したり、別のタンパク質と相互作用することにより蛍光タンパク質の実用化を契機として、1990年代以降、光を下流に情報を伝えている。つまり光受容体は、光による入力を使ったバイオイメージング技術が世界中の研究室で利用されタンパク質の構造変化や相互作用といった力学的シグナルとるようになった。
しかし、ライフサイエンスにおける光技術の将して出力できるのだ。
しかし、野生型の光受容体は、光応答性や来は、必ずしもバイオイメージングに限定されない。光を使って
生命現象を
「見る」
だけでなく、それらを光で
「操る」
ことができ
るとしたら、
ライフサイエンスや医療はどうなるだろう？例えば、反応速度などに問題を抱えていることが多い。筆者らは、アカが有する光受容体（Vivid）に
パンカビ（Neurospora crassa ）対して多角的にプロテインエンジニアリングを施してその性質

細胞内シグナル伝達を光で操作できるようになれば、代謝、分を大幅に向上したり、新しい機能を付与するなどして“Magnet

泌、細胞増殖、細胞分化、細胞死等の生命機能を自由自在にコ

1)
。
システム”
と称する光スイッチタンパク質を開発した（図2）

ントロールできるようになるかもしれない。ゲノムの塩基配列を光で自由自在に書き換えたり、遺伝子のはたらきを自由自在に制御できるようになったらどうだろう？光が得意とする高い時
間・空間制御能をもってすれば、狙ったtime windowのみで、狙った生体部位のみで、様々な生命機能や疾患をコントロール
できるかもしれない（図1）。このような未来を実現すべく、筆者らは新しい技術の開発を行ってきた。

図2 光スイッチタンパク質“Magnetシステム”
青色の光を照射すると二量体を形成し、光照射をやめると元の単量体に戻る。その分子量は緑色蛍光タンパク質（GFP）の3分の2程度と非常に小さい。
Magnetシステムを連結すれば二種類のタンパク質（A、B）の相互作用や活性を光照射のON/OFFでコントロールできる。

Magnetシステムに様々なタンパク質やペプチド（例えばAとB）
を遺伝子工学的に連結することにより、それらを光刺激で近図1 生命現象の光操作の概念図

02

光操作の基盤技術“Magnetシステム”の開発

筆者らがまず重要と考えたのは、操り人形で言えばヒモとか接させることができる。光刺激をやめればMagnetシステムは解離するので、AとBも元のようにバラバラになる。このようなMagnetシステムの特徴を利用してタンパク質の活性を光で自由自在にコントロールすることにより、ゲノムの塩基配列を光刺激で書き換えたり、
ゲノム遺伝子の発現を操作することが可能になった。以下では、
このようなゲノムの光操作技術について、筆者らの最近の研究を紹介したい。

棒に相当する、汎用性の高い基盤ツールの開発である。植物や7

THE CHEMICAL TIMES

特集

03

CRISPR-Cas9システムの光操作技術

ムを応用した光操作技術の新しい展開を模索していた筆者らは、2013年初頭からCRISPR-Cas9システムとMagnetシステ
ムを組み合わせた新しい技術の開発研究を開始した。

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

2012年、原核生物のCRISPR-Cas9システムに基づくゲノ

ゲノム編集を行うためには、ゲノム上の狙ったDNA配列をム編集（genome editing）
が報告されて以来、当該技術は爆切断する必要がある。よく知られているように、Cas9はガイド

発的な勢いで発展し、すでに世界中の研究室で利用されている

RNAが指定するDNA配列を切断する酵素である。
しかし、その（図3）。CRISPR-Cas9システムの報告を受け、Magnetシステ

DNA切断活性は常にONであり、外部からコントロールすることはできなかった。このため、狙ったタイミングや狙った時間、組織の中の狙った細胞でのみゲノム編集を実行することができないなど、既存のゲノム編集技術には様々な制約が課せられていた。このような背景から、筆者らはCas9の活性を制御できる技術の開発が必要と考えた。CRISPR-Cas9システムに基づくゲノム編集技術が発表された当時、筆者らの研究室では、上述した光スイッチタンパク質“Magnetシステム”の開発が佳境を迎えていた。このMagnetシステムを使えばゲノム編集を自由自在に光で操作できるとの確信から、光駆動型のゲノム編集
ツール“PA-Cas9（photoactivatable Cas9）”の開発研究に
2)
。
着手した
（図4）

筆者らは、Cas9のDNA切断活性をON/OFF制御するために、まず、Cas9タンパク質を二分割してそのDNA切断活
性を不活性化した。さらに、二分割により活性を失った“splitCas9”のN末端側断片（N-Cas9）とC末端側断片（C-Cas9）にMagnetシステム（pMagおよびnMag）を連結した。このよ
図3 CRISPR-Cas9システムによるゲノム編集
ゲノムのDNAは、Cas9により部位特異的に切断されると、細胞内で修復される。この修復経路には、非相同末端結合（NHEJ）
による修復（図の左のボック
ス）と相同組換え（HR）による修復（図の右のボックス）が知られている。Cas9で切断されたDNAの末端は欠失や挿入を起こやすい。欠失挿入（indel）
を起こしたあと非相同末端結合（NHEJ）
により修復されると、当該遺伝子にフレーム
シフトやindel変異が導入され、その機能は破壊される（遺伝子ノックアウト）。
一方、
ドナーDNAを共存させておくと、切断部位は相同組換え
（HR）
による修
復され、当該遺伝子にドナーDNAの塩基配列を導入できる（遺伝子ノックイン）。このように、Cas9による部位特異的なDNA切断と細胞内でのDNA修復を利用してゲノムの塩基配列を書き換えるのがゲノム編集技術である。

うにsplit-Cas9にMagnetシステムを連結して開発したのがPA-Cas9である。Magnetシステムは青色の光に応答して結合する光スイッチタンパク質である。青色の光を照射すると、Magnet システムの結合に伴って、split-Cas9も互いに近接し結合する。これにより、split-Cas9は本来のCas9タンパク質のようにDNA切断活性を回復し、標的の塩基配列を切断できる
ようになる。そして、光照射を止めるとMagnetシステムは結合力を失うため、split-Cas9は元のようにバラバラになり、DNA

図4 PA-Cas9（A）
PA-Cas9の原理 二分割により活性を失わせたsplit-Cas9のN末端側断片（N-Cas9）とC末端側断片（C-Cas9）にMagnetシステム（pMagとnMag）
を連結する。
青色光を照射すると、Magnetシステムの二量体化に伴ってN-Cas9とC-Cas9も互いに近接し結合する。これにより、N-Cas9とC-Cas9は本来のCas9タンパク質のよ
うにDNA切断活性を回復し、標的の塩基配列を切断できるようになる。光照射を止めるとMagnetシステムは結合力を失うため、N-Cas9とC-Cas9も離れ離れになり、DNA切断活性は消失する。このため光を照射している間だけ、ゲノム編集を実行できる。
（B）
Cas9の結晶構造 青：N-Cas9に相当する部分、赤：C-Cas9に相当する部
分、緑：ガイドRNA、黄：DNA。

8

THE CHEMICAL TIMESの制御に関わっているのかを明らかにするには、ゲノム上に散らばったそれぞれの遺伝子の発現を自由自在にコントロールする技術が必要である。この目的のために筆者らは、新たなゲ

5’末端の塩基配列（20塩基程度）を設計することにより、
どの遺

3)
（図6）
を開発し
ノムエンジアリングツール（Split-CPTS2.0）

伝子を光操作するのかをあらかじめ指定できる。

た。Split-CPTS2.0はゲノムの塩基配列を改変する上述のPA-

PA-Cas9により、光で指令を与えて意のままにゲノム遺Cas9とは大きく異なり、ゲノムにコードされた遺伝子の発現を

伝子の機能を破壊（knockout）
したり、別の塩基配列で置換

自由自在に光で操作するツールである。
しかもその効率が著し（knockin）
できるようになった。筆者らは、主としてHEK293T

く高いことが大きな特徴であり、既存のツールでは実現困難細胞を用いて様々な検討を行っている。例えば、当該細胞の染だった新たな応用が可能になる。

色体にコードされたEMX1 遺伝子とVEGFA 遺伝子を、光照射

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

ガイドRNAはゲノム上での案内役をつとめるRNAであり、その特集

切断活性は消失する。このようにPA-Cas9は、DNA切断活性を光照射で自由自在にコントロールできるツールである。なお、

で同時にゲノム編集できることを示した。その効率をCas9のゲノム編集効率と比べると、両者にそれほど大きな差がないことが明らかになった。さらに、PAM配列や標的配列に対する選択性なども、PA-Cas9とCas9ではほとんど差がないことがわかった。上述のようにPA-Cas9は、Cas9を真っ二つにするという、
かなり荒っぽい手法で開発されているが、そのDNA切断活性や配列特異性がCas9とそれほど変わらないというのは、筆者らにとって驚きであった。
このように筆者らは、CRISPR-Cas9システムを光照射のON/OFFで制御する技術を開発し、光によるゲノム編集の制御を実現した。既存の技術では、狙ったタイミングや狙った時間
でのみゲノム編集を実行することは不可能だったが、PA-Cas9を用いればDNA切断活性の持続時間を非常に短く制御できるため、オフターゲット（off-target）
に関する既存技術の問題を低減できるかもしれない。また、既存の技術ではゲノム編集を空間的に制御することは不可能だったが、PA-Cas9を用いれば、
例えば脳における神経細胞のように、組織の中で狙った細胞単位でのゲノム編集が実現するかもしれない。このようにPACas9は、ゲノム編集の応用可能性を大きく広げることが期待
される。

04

ゲノム遺伝子の発現を光操作する技術

分化や発生、代謝、免疫、記憶・学習など、私たちの生体でみ

図6 Split-CPTS2.0の原理
dCas9の二分割体（split-dCas9）とMagnetシステムを用いて、3種類の異なる転写活性化ドメイン（VP64、p65、HSF1）
を合計9つ、標的ゲノム遺伝子の転写開始点の上流領域に光刺激によって集積することにより、そのゲノム遺伝子の転写を高い効率で活性化できる。

Split-CPTS2.0の開発においては、
まずCas9に変異を導入
してヌクレアーゼ活性を欠失させたdCas9を作成し、さらにこのタンパク質を二分割してN末端側断片とC末端側断片をられる多様な生命現象は、さまざまな遺伝子の発現によって成作製した。この両断片（split-dCas9）に、筆者らが開発した光

り立っている（図5）。それぞれの遺伝子がどのように生命現象

スイッチタンパク質のMagnetシステムと転写活性化ドメイン（VP64）を連結した。さらに、アプタマーと呼ばれるRNA配列を挿入したガイドRNA（sgRNA2.0）、MS2タンパク質（アプタ
マーと結合するタンパク質）と転写活性化ドメイン（p65およびHSF1）の融合タンパク質を用いた。なお、sgRNA2.0は標的遺伝子の転写開始点の上流領域に結合するように設計する。青色光を照射すると、split-dCas9とsgRNA2.0が標的遺伝子の転写開始点の上流領域に集積し、転写活性化ドメインの働きにより、当該ゲノム遺伝子の転写を活性化する。光照射をやめると、上述のsplit-dCas9とsgRNA2.0は再びバラバラになり、標的遺伝子の転写は停止する。このように、光照射の有無によって、標的遺伝子の発現をコントロールできる。筆者
らが開発した一世代前の技術（CPTS: CRISPR-Cas9-based

図5 遺伝子の発現遺伝子（DNA）の塩基配列はRNAの塩基配列に転写され、さらにタンパク質のアミノ酸配列に翻訳される。このアミノ酸配列に基づいてタンパク質は折りたた
まれ、成熟したタンパク質となる。このような遺伝子の発現こそが生命現象や疾患には重要な役割を果たす。

4)では、光刺激に
photoactivatable transcription system）

より、1種類の転写活性化ドメイン（p65）を1つだけ、ゲノム遺伝子の上流領域に呼び寄せていたが、Split-CPTS2.0では、3種類の異なる転写活性化ドメイン（VP64、p65、HSF1）
を合計
9

THE CHEMICAL TIMES

特集

9つ同時にゲノムに集めたため（split-dCas9にVP64を一つ導入。sgRNA2.0にはアプタマーが二つ導入してあり、一つのアプタマーにMS2 -p65-HSF1は二つ結合。従って、VP64×1、

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

p65×4、HSF1×4が光刺激によりゲノム遺伝子の上流領域に集積）、著しく高い効率でゲノム遺伝子の発現を光操作できるよ
うになった。なお、sgRNA2.0の5’末端の塩基配列（20塩基程度）
は、ゲノム上でのSplit-CPTS2.0の結合部位を決定する因子である。sgRNA2.0の設計を通じて、任意のゲノム遺伝子を選択し、それを自在に光操作できることもSplit-CPTS2.0の大きな特長である。複数の異なるガイドRNAを細胞に導入しても良い。Split-CPTS2.0は同時に複数の標的遺伝子を光操作することも可能である。
筆者らは、Split-CPTS2.0をiPS細胞の分化を光操作するツールとして応用している（図7）。Split-CPTS2.0をiPS細胞に

図8 PA-Creの原理
Split-CreとMagnetシステムからなるPA-Creは青色光で活性化するDNA組換え酵素である（上図）。遺伝子もしくは遺伝子群をloxPで挟むことにより、当該遺伝子・遺伝子群を光刺激でノックアウトできる（左下図）。また、転写停止配列（STOP）
をloxPで挟むことにより、遺伝子の発現を光刺激で活性化できる
（右
下図）
。

組換えシステムであり、DNA組換え酵素のCreはloxP と呼ばれる34bpの塩基配列に結合して2つのloxP 配列の間での組図7 Split-CPTS2.0による細胞分化の光操作（A、B）
Split-CPTS2.0を用いてiPS細胞のNEUROD1 遺伝子の発現を光刺激で強く活性化し、iPS細胞から神経細胞への分化を光操作（A：暗所、B：4日間の光照射後）。細胞をDAPI（青）と神経細胞のマーカーであるβ-III tublinの抗体
（マ
ジェンタ）
で染色。

導入し、神経細胞への分化を制御するNEUROD1 遺伝子を光操作すると、上述の先行技術（CPTS）と比べて2000倍強く、

NEUROD1 遺伝子の発現を光刺激で活性化できる。このため、Split-CPTS2.0ではiPS細胞を光刺激で神経細胞に分化させる

NEUROD1 遺伝子のことが可能になる。一方、先行技術では、発現を光刺激で操作することはできるが、その効率が十分でな
いため、iPS細胞を神経細胞に分化させることはできない。このように、遺伝子発現の効率を著しく高めたSplit-CPTS2.0では、ゲノム遺伝子発現の光操作に基づく新たな応用が可能になった。

05

同様に、Creタンパク質を二分割してそのDNA組換え活性を不活性化した。次に、二分割により活性を失った“split-Cre”のN末端側断片（N-Cre）とC末端側断片（C-Cre）のそれぞれにMagnetシステムを連結した。筆者らは、培養細胞での評価系
でこのツール（PA-Cre）
をテストすると共に、マウスでの検証も行なっている（図9）。
マウスでの検証では、
まず、PA-Creをコードするプラスミドとレポーターのプラスミドをマウスの尾静脈に導入して、肝臓に当該プラスミドを導入した。レポーターはDNA組換え反応
によりルシフェラーゼが発現するように設計しているので、マウスの肝臓の細胞の中でPA-Creが活性化すれば、その様子
をEM-CCDカメラを用いて可視化できる。PA-Creは非常に感度が良いため、生体外からの光照射でもDNA組換え反応をコントロールできる。青色LEDをアレイ化した光源（470 ± 20nm）を用いてマウスの腹側から光照射したところ、ルシフェ

Cre-loxP システムの光操作技術

最後に、ツール開発の方法論について触れたい。上述のCRISPR-Cas9システムを用いた二つの光操作技術（PACas9、Split-CPTS2.0）
は、Cas9タンパク質を二分割して両断片の会合をMagnetシステムでコントロールするというアプローチに基づいている。ツール開発のために我々が導入したこのアプローチは一般性が高く、Cas9以外のタンパク質を利用した光操作ツールの開発にも応用できることが極めて重要と筆者らは考えている。この観点から、CRISPR-Cas9システムに続く第二の例として、今やライフサイエンスには欠くことのできないツールとなったCre-loxP システムとMagnetシステムを組み合わせてDNA組み換え反応の光操作を可能にしたツール

5)。
（PA-Cre）
について紹介する（図8）

Cre-loxP システムはバクテリオファージP1が有するDNA

10換え反応を触媒する。筆者らはまず、CRISPR-Cas9のケースとラーゼの明るい生物発光が肝臓から観察された。興味深いことに、30秒間程度のパルス照射を生体外から施すだけでも、
PA-Creの活性化を十分に誘起できることが分かった。一方、暗所ではルシフェラーゼの生物発光は全く観察されず、DNA
組換え反応は起こらない。また、通常の部屋の明るさでも、暗所の場合と同様に、マウスの肝臓ではPA-Creは活性化せず、DNA組換え反応は全く起こらないことが分かった。このツール（PA-Cre）
は、暗所ではほとんど活性を示さず、青色光を照射すると速やかに強いDNA組換え活性が出現する。つまり、PACreを使えば光刺激によって自由自在にDNA組換え反応を時空間制御できる。

THE CHEMICAL TIMES
しれない。このような期待から、化学や生命科学に携わる国内外の研究者が筆者らの技術に関心を寄せている。

本稿で紹介したCRISPR-Cas9システムやCre-loxP システムと光遺伝学の出会いは、
ライフサイエンスの可能性を大きく広げ“Magnetシステム”
について触れる共に、CRISPR-Cas9シス

ると筆者らは考えている。その試みは始まったばかりであり、技テムとCre-loxP システムの光操作技術に関する研究事例を紹術のさらなる応用や改良・展開が可能だろう。さらに、筆者らの介した。筆者らが開発した技術により、ゲノムの塩基配列を自由ツール開発のアプローチは一般性・汎用性が高く、今後、様々な自在に光刺激で書き換えることが可能になった。加えて、染色光操作ツールの設計・開発に貢献するだろう。上述したツールや体にコードされた遺伝子の発現を光刺激で自在に活性化、つまツール開発の方法論が読者のみなさんのアイディアを刺激し、りゲノム情報を光で読み出すことが可能になった。例えば、
ヒト

化学や生命科学の諸分野の研究に役立てば幸いである。

の脳では約860億個、マウスの脳では約7,000万個の神経細胞がそれぞれの役割を持って活動している。細い光ファイバー

参考文献

を使ってマウスの脳にピンポイントで光を当てて特定の神経細1) F. Kawano, H. Suzuki, A. Furuya, M. Sato, Nat Commun 6, 6256
(2015).

胞の特定の遺伝子の働きを操作した上で、マウスの行動等がどのように変化するのかを観察すれば、光刺激で狙った神経細胞

2) Y. Nihongaki, F. Kawano, T. Nakajima, M. Sato, Nat. Biotechnol. 33(7),755-760 (2015).

の遺伝子が脳の中でどのような役割を持っているのかを解明

3) Y. Nihongaki, Y. Furuhata, T. Otabe, S. Hasegawa, K. Yoshimoto, M.
Sato, Nat. Methods 14(10), 963-966 (2017).

できるかもしれない。また、同様のアプローチで、生体内で生じたゲノムや遺伝子の異常（変異や欠失など）が、どのようにガン4) Y. Nihongaki, S. Yamamoto, F. Kawano, H. Suzuki, M. Sato, Chem. Biol.
22(2), 169-174 (2015).

や精神疾患などの様々な疾患に繋がるのかを解明できるかも

5) F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato, Nat. Chem. Biol. 12(12),1059-1064 (2016).

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

本稿では光操作の基盤技術としての光スイッチタンパク質

特集

06

おわりに

図9 PA-Creを用いて生体深部の遺伝子の働きをコントロール（A）
DNA組換え反応によりルシフェラーゼを発現するレポーターを用いて、PA-Cre によるDNA組換え反応の青色光依存性を培養細胞で評価。
（ B）
DNA組換え反応
によりルシフェラーゼを発現するレポーターとPA-Cre をコードするcDNAをマウスの肝臓に導入した後、LEDを用いてマウスに生体外からの非侵襲的に青色光を照射。
（C）
青色光によりマウスの肝臓でDNA組換え反応が誘起されレポーターからルシフェラーゼが発現する様子を可視化。24時間の光照射はもとより、30秒間という短時間の光照射でも肝臓で遺伝子発現が観察された。一方、暗所や室内の明るさでは全くルシフェラーゼの発現は観察されなかった。

11

特集

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

ローリングサークル増幅によるRNA直接検出
Directly RNA detection by rolling circle amplification

広島大学大学院 先端物質科学研究科

高橋 宏和

広島大学大学院  先端物質科学研究科

堀尾 京平(独)農業・食品産業技術総合研究機構 食品研究部門

小堀 俊郎

広島大学大学院 先端物質科学研究科

岡村 好子

Hirokazu Takahashi, PhD (Researcher)
Graduate School of Advanced Sciences of Matter, Hiroshima University

Kyouhei Horio (Graduate student)
Graduate School of Advanced Sciences of Matter, Hiroshima University

Toshiro Kobori, PhD (Senior researcher)
Food Research Institute, National Agriculture and Food Research Organization

Yoshiko Okamura, PhD (Associate professor)
Graduate School of Advanced Sciences of Matter, Hiroshima University

キ ーワード01

Rolling circle amplification、phi29 DNA polymerase、RNA detection

はじめに

近年、抗生物質耐性の病原性細菌や、新興または再興の人畜共通感染ウイルスの出現により、迅速診断法やポイントオブケ
アテスト（POCT）の開発が進められている。これら病原体による被害を最小にし、治療や拡散防止処置、感染経路の特定を円滑に行うためには、先ず初めに菌種の同定と病原性および伝染性の有無の確認を迅速かつ正確に行うことが何よりも重要である。これら病原体を特定する技術としては、ルーチンを主とす
る検査部門
（病院等）
や食品産業においては、感度が高いこと、
ランニングコストが低いことが重視されて、培養法が標準的な分析方法として採用されてきたが、培養可能な菌種に限定さよる核酸検出、例えばLAMP法が分子生物学的な微生物検出方法として期待されているが、等温とはいえ60-65℃といった比較的高い反応温度が必要であり、
かつ、PCRで問題に挙げられているキャリーオーバーコンタミネーションによる擬陽性の問題を克服できていない。そのため、キャリーオーバーコンタ
ミネーションに対して耐性がありつつ、かつ室温程度で反応可能な核酸検出法、特に開発途上の国や地域での使用可能となる方法に注目が集まっている。
我々の研究グループではこれまで主に、Phi29 DNA ポリメ
ラーゼを用いた全ゲノム増幅法を利用した、微生物1細胞のゲノム解析の研究を行っている1)。その一方で、Phi29 DNA ポリ
メラーゼのもう一つの主な利用方法である、ローリングサーク
ル増幅(rolling circle amplification; RCA)法による、RNAのれ、かつ時間が掛かるという大きな欠点がある。
しかし、
ウイル

直接検出方法の開発も行っている。Phi29 DNA ポリメラーゼ

スの場合、その多くが培養できないため、短時間かつ高い正確を利用したRCA法は、室温程度(25-37℃)において等温反応性で病原を特定可能な方法の開発が求められている。

が可能で、かつ簡便なシステムであることから、新たな核酸配培養法に替わる最も代表的な診断法は、抗原抗体反応を利列検出方法として、現在注目と期待が集まっている。本稿では、用したイムノクロマト法だが、検出感度が低く、擬陽性が発生しPhi29 DNA ポリメラーゼを用いたRCA法による、特定の微生

易い、微生物の生死判定ができないなどの理由から、必ずしも物検出方法について概説する。

普及しているという状況では無い。また、PCR法を用いた微生物のDNAやRNAを対象とした分子生物学的測定法は、迅速で正確性や感度に優れている一方で、実施に必要な機材(サーマ
ルサイクラーなど) の導入コストや、増幅産物のキャリーオー
バーコンタミネーションなどによる擬陽性を防止するための専用施設(クリーンルーム)の設置やその維持のためのコスト負担が大きい。このため普及の妨げとなっている。
近年は高価なサーマルサイクラーが不要な、等温増幅法に
1202ローリングサークル増幅(RCA)

まず初めにRCA法について説明しておく。RCA法は1995年にA. Fire(後にRNA干渉に関する研究でノーベル賞を受賞している)らが提唱2)した、環状DNAをゲノムとして持つウイルス

THE CHEMICAL TIMES
ことを鑑みて、迅速診断システムの構築に適していると考えら

環状の1本鎖DNA(ssDNA)を鋳型として、鋳型にハイブリダイれている。
余談ではあるが、P. Lizardiらの開発したHRCA法の増幅メ
カニズムは、その後R. Laskenらのグループにより、
ランダムプにDNAポリメラーゼが戻ってきたとき、前方にあるDNA鎖をライマーを利用した非特異的増幅法であるmultiply-primed

ポリメラーゼが2本鎖DNAを引き剥がしながらDNAを合成す

RCA (MPRCA)8) 法に発展していった。この増幅方法は、操作

る鎖置換(strand displacement)をしながらDNA合成を続手順が非常に簡便で、かつPhi29 DNA ポリメラーゼの高い正け、環状DNAの相補鎖配列がタンデムな状態で並んだ長鎖の確性のため増幅配列にエラーがほとんど含まれないことなどか

ssDNAを合成する方法である（図1a）。この反応の鍵はDNAら、サンガーシークエンス用の鋳型調整方法として世界のシーポリメラーゼの鎖置換活性にある。PCRのような反応温度サイ

クエンス解析拠点で重用されていた。さらに、MPRCA法はランクルが不要なので、全て等温で反応可能であり、従って酵素は

ダムプライマーを利用するため対象配列がほとんど不明でも耐熱性である必然性は無い。

増幅可能なことから、未知の環状DNAゲノムのウイルス検出

このDNA増幅方法が特に注目され始めたのは、1998年におよび3’末端の配列に標的核酸との相補鎖
P. Lizardiら が5’3)配列を持つ南京錠型のパドロックプローブ(Padlock probe;等に利用されている9)。また、大腸菌等のホスト経由ではクロー

さらには近年話
ニングが難しい配列のin vitro cloning10-11)や、題の合成生物のゲノム構築にも利用されている12)。

PLP)を利用したlinear RCA法(これ以降、単にRCAと書いた

また、HRCA法の増幅システムはさらにその後、例えばヒト

場合はこのlinear RCAを指す、図１b) 、さらにはRCAで合成

ゲノムの様な直鎖状ゲノムでも全ゲノム増幅が可能である

されたssDNAに対する2種類の増幅用プライマーを加えたMultiple displacement amplification (MDA)法13)へと発Hyperbranched-RCA(HRCA) 法（図１c）を発表したことによ展しており、現在最も信頼度の高く、また使用頻度の高い方法

ることが大きい。特に、1分子の目的DNA配列の存在をRCA増となっている。

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―ズしたプライマーの3’末端を基点にDNAポリメラーゼがDNAを合成していき、環状の鋳型を一周してプライマーの5’末端特集やプラスミドDNAの複製を模倣したDNAの合成方法である。

幅産物(rolling circle product; RCP)として増幅し、蛍光の検
出プローブによって可視化したことが発端となっている。この論文以降、検出対象はDNAのみならず、抗原抗体反応のシグナル増幅(immuno-RCA)4-6)、生体小分子の有無など多岐にわたっており7)、特に近年はmiRNAの特異的検出に関する論文が多く、全体の8割以上を占めている。

03

RCAでの微生物mRNA直接検出

RCA法を利用したウイルスや微生物の検出は、多少煩雑な特筆すべきは、RCA法では初期に投入したサンプルとRCPと手順を踏むが、検出対象のDNA配列に対するPLP14)を利用したの間では、増幅の開始に関わる核酸の3’末端の数は変化しな方法が報告されていた。
しかしながら、DNAを検出対象とした

いことである。そのため、PCRやLAMP法とは異なり、例えキャ

場合、微生物の生死判定はできず、またRNAを検出対象としたリーオーバーコンタミネーションを起こしても、次の増幅結果

場合には、一度逆転写反応が必須となる。一方、
Phi29 DNA ポに与える影響は小さいことから、施設整備等の初期投資が少な

リメラーゼはDNAだけでなくRNAも、プライマーとしてDNA

くて済むことが期待されている。またPhi 29 DNA ポリメラー合成に利用できる。そのため、検出対象をDNAからRNAに代ゼを利用したRCA法は、室温程度(25-37℃)の等温反応である

替することは理論上可能である。
しかし、RNAとPLPがハイブリ
ダイズを形成(RNA/PLP)しても、既存のT4 DNAリガーゼ(T4Dnl)
でPLPのシール（プローブの末端を結合して環状化）を試みたとき、DNAのそれと比べシール効率が著しく悪化することが他の研究報
告から解っていた 1 5 ) 。そ のため、RNAは逆転写を経てcDNAに変換されて、従来法が適用されていた。
そこで 我 々 は R N A 検 出 用 プ
ローブをPLPから変更し、予め環状化させたDNAプローブを用いることを検討した。予めプローブを環状化しておけば、RNA/PLP
シール効率は無視できるためである。
しかしそれまでのDNAの環状化は、PLPをシール用のオリゴ

図１ Rolling circle amplification (RCA)(a) RCAの基本的な増幅システム(b) パドロックプローブ(padlock probe; PLP)を用いたlinear RCA(c) Hyperbranched-RCA(HRCA)の増幅模式図

DNAとハイブリダイズさせた後、T4Dnlでシールし、その後シール用オリゴDNAをエクソヌクレアー
13THE CHEMICAL TIMES

特集

ゼ等で除いていたが、除去が完全では無く、残存したシール用
オリゴDNAそのものがノイズの原因と考えられるシグナルノ
イズ比(SN比)の悪化が問題視されていた。
しかし我々は、直04

RPRCA法の実施における問題点

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

接オリゴDNAを環状化できるCircLigaseを利用して、環状化

RPRCA法が微生物のmRNA検出に有効であることが確認

DNAプローブを作成することとした。CircLigaseを用いて事されたが、実際に病原性微生物等を検出するに当たっては問前に目的のオリゴDNAプローブを環状化しておき、未反応（す

題があることが、それ以降の検討で次第に明らかにもなった。

なわち直鎖状）のオリゴDNAは、直鎖状DNAのみを分解する

その問題とは、第一に微生物mRNAの3’末端配列の情報が極Exonuclease I等で処理して予め除くことで、SN比の向上を

端に少ないこと、第二にゲノム配列情報からの3’末端配列の予試みた。そして、この環状化DNAプローブと、標的微生物が発測、すなわち転写終結の予測にブレが大きいことである。

現しているmRNAの3‘ 末端を利用して、RCA反応を起こさせ

次世代シークエンサー(NGS)の登場により、微生物でも多数のるRNA-primed RCA(RPRCA)法として確立した(図2) 。原RNAseqと呼ばれるmRNA配列解析が行われているが、真核16)生物とは異なり、mRNA配列にpoly(A)配列を持たないため、逆転写反応はランダムプライマーで行われている。その結果、RNAseq解析のデータからは、微生物mRNAの3‘末端配列が欠損することとなる。従って、膨大な数のRNAseq解析データがあるにも拘わらず、
この情報はRPRCA反応には全く利用できない。
さらに、対象微生物の全ゲノム情報が公開され、mRNA中のタンパク質のコーディング配列は記載されていても、転写終結配列がどこであるかは記載されることは無い。実際、微生物mRNAの転写終結に関わる配列、特に大腸菌で転写終結のシステムとして提唱されている、20 nt程度の逆方向反復配列(inverted repeats)や、転写終結に関わるρ因子の結合部位(rho loading site)を予測しいくつか予備実験を行ったが、あまり研究が進んでいない分野であり十分な精度で予測ができず、全く使えない可能性が推察された。
また多少予測がズレていても、Phi29 DNAポリメラーゼは‘
3 -5’
リボエクソヌクレアーゼ活性を持つとされ、その相補鎖形成していない余りの部分を分解してRPRCA反応が進むことを期待していたが、我々の研究室のみならず他の研究グループ

もこの活性は全く確認できず 17)、予測が間違っていてRPRCA
反応が開始しないのか、mRNAが無いから動かないのかの区

別が全く付かなくなってしまった。以上のことから、微生物の
図2 RNA-primed RCA(RPRCA)による微生物mRNA検出法の模式図

核微生物のmRNAの3‘末端には、真核生物のmRNAのような

mRNAを検出対象としても、検出できるのは転写終結配列の解析まで明らかとなっている極僅かなmRNAに限られてしまうこととなり、汎用性が低いことが明らかとなった。

poly(A)テールが存在しないため、個々のmRNAの区別に利用
でき、mRNAそのものを直接RCA法におけるDNA合成開始のプライマーとして利用出来ると考えたからだ。
このシステムで、mRNAを特異的に検出可能かどうかを、蛍光タンパク質GFPを発現している大腸菌を用いて確認した。ネガティブコントロールとしては、GFP発現用のプラスミドを保持しているが、GFP mRNAは発現していない菌体を用いた。そ05

RNase H-assisted RCAよる
RNA直接検出法の汎用化

1) RNase H-assisted RCA

そこで我々は、対象RNA配列の位置情報に依存すること無の結果、本システムはGFP mRNAのみを特異的に検出できる

く、プローブをmRNA上に任意に設定できるようにRPRCA反ことが確認された16)。

応システムを見直すこととした。もし任意にプローブ位置を設

このシステムはこれまでのRNA検出システムとは異なり逆転定できれば、mRNA分子内部配列のRNAseqデータも、また真写反応の必要が無く、またRT-PCR等では必須であったRNA抽

核生物のように末端配列にpoly(A)配列があっても全て検出対出時のDNase処理も必要がなく、それまでのRNA検出法に比象として利用できることとなる。

べ、RNA抽出時や検出時の操作が簡便であることが特色であ

ここで我々は、環状DNAプローブとハイブリダイズしたる。
しかしながら、検出感度は1反応当たり109コピーと、PCRやRNA の内部配列をRNase Hで切断、ニックを入れることによ

LAMP法と比べるとかなり見劣りすることも確認されたが、このり強制的に3’末端を作成し、
この3‘ 末端からDNA合成を開始

検出感度の詳細については後述することとする。

させることを思いついた。手始めにin vitro 転写によって作成したGFP mRNAの内部配列に対してプローブを設計し、環状DNAプローブを作成、RNase H存在下・非存在下でRCA反応14

THE CHEMICAL TIMES
濃度が10 µMの時に僅かにPLPを環状化することができたが、上にプローブを設定でき、
かつRCPが確認できた18)。

ATP濃度が高くなると、全くシールすることができず、これについては既報通りであった。一方で、T4RNL2は、いずれのATP
濃度においてもPLPを環状化することができず、
これは複数の認されてしまった。これは環状DNAプローブにミスマッチハイ

リガーゼの基質特異性を比較した既報 15)と同じ結果であり、ブリダイズを起こした他のRNAに対してもRNase Hがニック

RCA反応にT4Rnl2が利用できるとした既報とは真逆の結果を作り、そこからDNA合成が開始されRCA反応が起きているであった。この結果から、我々のRNA検出用のRCAの反応にはものと予想されたため、環状プローブの配列等を色々と変更しSplintRを利用することとした。

てみたが、結果は全く改善されなかった。
そこで、環状化プローブの使用は諦めて、PLPを利用したRCA法に切り替え、新たにRNase H-assisted RCA(RHa-

3)プローブの設定箇所の検討

次に、PLPの設定箇所がmRNA上の位置によって、そのシー

RCA)法19)として確立することとした。標的RNAとハイブリダイ

ル効率に影響を与えるかどうかを検討した。Circligaseを利用ズしたPLPのみ環状化すれば、例えPLPに非対象のRNAがハイ

しプローブを予め環状化した場合には、プローブのmRNA上ブリダイズしRNase Hによってニックが形成されても、RCA反の位置は基本的に環状化効率に影響を与えない。
しかし、PLP応による永続するDNA合成は起こらないはずである(図3a)。

の設定位置により、例えばRNAの二次構造によるハイブリダイ
ズの効率や、RNA配列そのものがシール効率に大きく影響を

2)リガーゼの検討

この方法を用いるに当たって問題なのは、前述の通りT4Dnl

与えるようであれば、任意の配列をプローブとしては設定できないことになる。

ではシール効率がRNA/PLPを対象とした場合に低いことにあ

そこで、GFP mRNAの内部配列中にプローブを5箇所設定る。そこで、当時新たにNew England Biolabs社から販売がし、環状化効率を確認した。その結果、環状化効率に若干の差開始され、RNA/PLPも環状化可能であると推測されたSplintRはあるものの、どの位置のプローブも環状化することが可能でリガーゼ(SplintR)を利用して、PLPの環状化を行い、T4Dnl

あり(図3b, d)、RNase Hの添加によりRCPが生成されることと比較することとした。また同時に、他の論文でRNA/PLPをが確認された。今回の結果から、例えばRNAseqのデータのよ

シールできる能力があると報告のあった、T4 RNAリガーゼ２

うに、mRNAの配列の一部しかない無い情報からでも、基本的(T4Rnl2)20)も比較対象として検討した。その結果、SplintRのみにはRHa-RCA用のPLPを設計することが可能であることが示

が効率良くRNA/PLPでもPLPの環状化が可能であり、反応液

唆された。

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

しかしRNAサンプルをGFP mRNAを発現した大腸菌の全RNAに変更したところ、GFPの発現の有無に関係なくRCPが確

特集が起こるかどうか確認した。その結果、予想通りに任意の配列

中のATP濃度にも依存しなかった(図3c)。また、T4DnlはATP

図３(a) RHa-RCAによるRNAの検出模式図(b) 設定したP1-P5 プローブの、GFP mRNA上の位置、および5‘末端と3’末端の塩基(c) ライゲースの環状化効率の比較。各レーン上の数字はATP濃度を示す。Linearは未反応のオリゴヌクレオチド、CircularはCircLigaseで環状化したssDNAコント
ロール。Mはサイズマーカー。黒矢印は直鎖状ssDNA、青矢印は環状化ssDNA、赤矢印はヌクレアーゼ処理によるデブリ。
(d) 各 プローブの環状化効率の比較。Lは未反応のオリゴヌクレオチド、CはCircLigaseで環状化したssDNAコントロール。Mはサイズマーカー。黒矢印は直鎖状
ssDNA、青矢印は環状化ssDNA、赤矢印はヌクレアーゼ処理による破片。

15

THE CHEMICAL TIMES

特集4)RNase Hの濃度の検討

RCPが確認され、おおよそ10〜20 ngの極微量のRNAからで次に、RNase H濃度が濃すぎると、PLPにハイブリダイズしも特異的に検出できることが確認された(図4b)。また、GFPを

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

たRNAが全て分解されてしまい、DNA合成が開始できない恐

誘導していない大腸菌のRNAからは、一切のRCPが検出されれがあったため、至適なRNase H濃度を決定することを試みていないことから、
GFP mRNAのみを特異的に検出しているこ

た。PLPとしてはGFP mRNAで設定したP4プローブを用い、とが確認された。

RNaseH濃度を変え、最終的なRCP量で比較した。
その結果、おおよそRCA一反応当たり0.06〜0.3 unitsが至適であり、0.6 units以上の時は予想通りRNAの分解のためにRCP量が減少することも確認された。
4)検出限界の算定

06

RCA法の検出限界について

RPRCAも今回開発したRHa-RCAも共に検出限界が、
おおよ

次に、RHa-RCA法の検出限界を、大腸菌から抽出した全in vitro 転写した濃度が既知のGFP mRNAを加えRNAに、て検討した。また、本RHa-RCA法が、RPRCA法で用いた環状

PCRやLAMP法には遠く及ばない。
そ109 copies/反応であり、
しかしこれは、RCA法の検出限界では無く、実際の所は、検出に使用するSYBR Green IIの検出限界によるところが大きい。

DNAプローブとは異なり、対象mRNA以外のRNAやDNAのRCA反応で合成されるDNAは、既存のPCR等のDNA増幅

影響を受けないことを、GFP mRNAを加えていない全RNAを方法とは異なり、指数関数的な増幅を示さない。基本的に、1つ用いて確認した。

の環状DNAプローブから作成されるssDNAは、DNA合成酵

その結果、検出限界は設定したPLPによって多少異なるもの

素の[合成速度]×[時間]で決定されている。Phi29 DNAポリメの、概ね1〜5 fmol、おおよそ1反応当たり10 コピーあること

ラーゼの合成速度は〜200 nt/secであると推測されており、から、以前のRPRCA法と比べて遜色が無いことが確認された

市販されているDNA合成酵素の中でも非常に早い。
しかし、例(図4a)。また、GFP mRNAを添加していない全RNAからは、一え200 nt/secでも、2時間のRCA反応で合成できるssDNA

切のRCPが検出されていないことから、GFP mRNAのみを特は1個のRCP当たり1.44×10 6 baseであり、重さとしては僅異的に検出していることが確認された。

か約1.4 fgにすぎない。SYBR Green IIの検出限界は電気泳

9さらに実際にGFP遺伝子をプラスミドの形で保有している大動のバンドで約2 ng程度であり、RCPが拡散した液中での検腸菌を用いて、GFP mRNAを誘導、および非誘導の状態で培

出感度はそれより劣ることが容易に推測される。従って、SYBR

養後に全RNAを抽出し、RHa-RCA法によりGFP mRNAの検出

Green IIを使った場合の検出感度は、
どう頑張っても10 6 〜を試みた。その結果、GFPを誘導した大腸菌のRNAからのみ、

107 copies/反応を超えることができないものと推測される。

in vitro のRCA法の検出系では、様々な方法で極微量
現在、のRCPを検出する方法が多数報告されており、検出システムに工夫を行えば、RCA法はより高感度化が可能であると考えている。

07in situ RHa-RCAによる微生物検出

一方で前述のように、RCA法は1分子のRCPを可視化できるために注目を浴びたと記述したが、これは主に蛍光顕微鏡下などでの観察によるものである。実際in situ でRCA反応を行い、RCPを検出用蛍光プローブで検出する系では、ゲノム中の1分
子のDNA配列やmRNAなどを可視化している報告が既に複数ある17)。RCPはin situ の検出において、PCR産物のようには拡散しにくく、またRCPはPLPの相同配列のタンデムリピートであり、70 baseのPLPの場合、PCRは2時間の反応で約2万回もの繰り返し配列となっており、蛍光プローブで検出するのに適した状態となっている。
そこで、今回開発したRHa-RCA法を大腸菌内で発現しているGFP mRNAの検出に適応可能かどうか試してみた。その結果、GFPを誘導した大腸菌内でスポット状に蛍光シグナルが観察された(図5)。また、非誘導の大腸菌ではシグナルが全く確認できない。従って、例え検出対象の配列をDNAとして保持し
図４ RHa-RCAによるGFP mRNAの検出(a) In vitro 転写したmRNAを用いた各プローブの検出感度の検定。反応が終了したPCRプレートに青色光を当て、SYBR Green IIを可視化している。
(b) 大腸菌全RNAを用いたGFP mRNAのリアルタイム検出。

16ていても、蛍光シグナルは観察されないことから、RHa-RCAは
RNAのみを特異的に検出していることが明らかとなった。大腸
菌内の蛍光シグナルがスポット状に観察されたことから、
これ

THE CHEMICAL TIMES

では菌叢全体の大まかな情報は得られるが、各々の微生物のin situ
役割を明らかにすることは難しい。今回我々が開発した、

うことができれば、菌叢において「誰が何をやっているか？」が解明できるかもしれないと期待している。
本研究は、JST戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（CREST）、「 藻類・水圏微生物の機能解明と制御によるバイ
オエネルギー創成のための基盤技術の創出」、およびJST・
図５ RHa-RCAによる大腸菌で発現しているGFP mRNAのin situ 検出
RHa-RCA後に、Alexa-568で標識したオリゴヌクレオチドでRCPを検出。明視
野像と蛍光像をマージして示している。

までのin situ RCAの報告を踏まえれば、
これら一つ一つのス
ポットシグナルが、それぞれ一つ一つのmRNA由来である可能

A-STEPの支援によって実施した。
参考文献
1) 髙橋宏和, 岡村好子, 小堀俊郎, THE CHEMICAL TIMES 238, 22-27(2015).

性がある。
しかし、我々の保有している顕微鏡の解像度では、そ

2) A. Fire, S. Q. Xu, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92(10), 4641-4645(1995).

れぞれのスポット数を計測することは、大腸菌の細胞が小さす

3) P. M. Lizardi, X. Huang, Z. Zhu, P. Bray-Ward, D. C. Thomas, D. C. Ward,
Nat. Genet. 19(3), 225-232 (1998).

ぎるため残念ながら難しい。細胞の大きさがもっと大きい真核生物のmRNAを検出した場合、これらの個々のシグナルが、1分子のmRNAに対応しているかどうかが明らかになるものと思われる。
1分子のmRNAに1分子の蛍光標識プローブでラベルを行っても十分なシグナルが得られない為、これまでの微生物でのFluorescence in situ hybridization (FISH)は、主に細胞内で分子数の多い16S rRNAを対象とすることが一般的であった。
しかし、16S rRNAを対象とした場合には菌種が解るのみである。これまでにも、微生物のみならずmRNAを対象としたFISH法では、検出プローブをHorseradish peroxidase(HRP) でラベルし、シグナル増幅を行う方法が開発されてきたが、これらの方法はシグナルそのものが細胞内に拡散しやす
く、少なくともmRNAの定量性は無かった。定量性を持たせるために開発された、single molecule FISH (smFISH)法21)は、1種類のmRNAに対し50以上の相補鎖配列で、かつ同一蛍光標識プローブでFISHを行うことにより、1分子のmRNAに多数の蛍光標識をハイブリダイズさせることで実現可能となったが、プローブ作成のコストが高い。

in situ RHa-RCAとFISHの組み
今回我々が開発している、

合わせは、簡便でありながら、
コストはsmFISHに比べて格段に低く、未だ詳細な検討が必要な部分は残っているものの、
smFISH並みにmRNAの定量ができる可能性がある。

084) B. Schweitzer, S. Wiltshire, J. Lambert, S. O’Malley, K. Kukanskis, Z.
Zhu, S. F. Kingsmore, P. M. Lizardi, D. C. Ward, Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S. A. 97(18), 10113-10119 (2000).

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

RHa- RCAによる微生物mRNAを可視化し、かつ定量化まで行特集

ゲノム解析や、RNAseqが行われている。
しかし、これらの手法5) Y. Gusev, J. Sparkowski, A. Raghunathan, H. Ferguson Jr., J. Montano,N. Bogdan, B. Schweitzer, S. Wiltshire, S. F. Kingsmore, W. Maltzman,
V. Wheeler, Am. J. Pathol. 159(1), 63-69 (2001).
6) T. Kobori, A. Matsumoto, H. Takahashi, S. Sugiyama, Anal Sci 25(12),1381-1383 (2009).
7) M. Stougaard, S. Juul, F. F. Andersen, B. R. Knudsen, Integr Biol (Camb)3(10), 982-992 (2011).
8) F. B. Dean, J. R. Nelson, T. L. Giesler, R. S. Lasken, Genome Res. 11(6),1095-1099 (2001).
9) A. Rector, R. Tachezy, M. Van Ranst, J. Virol. 78(10), 4993-4998(2004).
10) C. A. Hutchison, 3rd, H. O. Smith, C. Pfannkoch and J. C. Venter, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(48), 17332-17336 (2005).
11) H. Takahashi, K. Yamamoto, T. Ohtani, S. Sugiyama, BioTechniques ,47(1), 609-615 (2009).
12) C. A. Hutchison, R.-Y. Chuang, V. N. Noskov, N. Assad-Garcia, T. J.
Deerinck, M. H. Ellisman, J. Gill, K. Kannan, B. J. Karas, L. Ma, J. F.
Pelletier, Z.-Q. Qi, R. A. Richter, E. A. Strychalski, L. Sun, Y. Suzuki,
B. Tsvetanova, K. S. Wise, H. O. Smith, J. I. Glass, C. Merryman, D. G.
Gibson, J. C. Venter, Science , 351(6280), aad6253 (2016).
13) F. B. Dean, S. Hosono, L. Fang, X. Wu, A. F. Faruqi, P. Bray-Ward, Z. Sun,
Q. Zong, Y. Du, J. Du, M. Driscoll, W. Song, S. F. Kingsmore, M. Egholm,
R. S. Lasken, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(8), 5261-5266 (2002).
14) J. Banér, M. Nilsson, M. Mendel-Hartvig, U. Landegren, Nucleic Acids
Res. 26(22), 5073-5078 (1998).
15) D. R. Bullard, R. P. Bowater, Biochem. J. 398(Pt1), 135-144 (2006).
16) H. Takahashi, A. Matsumoto, S. Sugiyama, T. Kobori, Anal. Biochem.
401(2), 242-249 (2010)17) C. Larsson, I. Grundberg, O. Söderberg, M. Nilsson, Nat. Methods 7,395-397 (2010).

おわりに現状のin vitro のRHa- RCA法では、未だ検出レベルが、PCR

やLAMP法に比べ使用に耐えうるものでは無いが、検出方法に

18) T. Kobori, H. Takahashi, Anal Sci 30(1), 59-64 (2014).
19) H. Takahashi, M. Ohkawachi, K. Horio, T. Kobori, T. Aki, Y. Matsumura,
Y. Nakashimada, Y. Okamura, Sci Rep 8, 7770 (2018).
20) Y. Cheng, X. Zhang, Z. Li, X. Jiao, Y. Wang, Y. Zhang, Angew Chem
Weinheim Bergstr Ger 121(18), 3318-3322 (2009)21) A. Raj, P. van den Bogaard, S. A. Rifkin, A. van Oudenaarden, S. Tyagi,
Nat Methods , 5(10), 877-879 (2008)

何らかのアイデアが加われば、理論的には1分子の対象RNA配in situ RHa- RCAで列の検出が行えると期待している。また、

あれば、1細胞レベルでmRNA配列を指標に微生物を特定可能であり、培養やRNA抽出を行わずに病原微生物やRNAウイル
スを、比較的簡便に検出することが可能であると考えている。
細胞内でのmRNAの検出・定量化は、遺伝子発現の正しい理解には必須である。近年環境から、特に腸内細菌叢や土壌細菌叢などの、「培養できない微生物」
を含む細菌叢において、
メタ17トピックス
次世代型核酸医薬の創製：
マイクロRNAの化学修飾と創薬への展開
Creation of new-type nucleic acid medicine:
Chemical modification of microRNA and development to drug discovery

愛知工業大学 工学部応用化学科 教授／株式会社 e-NA Biotec 代表取締役

北出 幸夫

Yukio Kitade (Professor / Representative Director)
Aichi Institute of Technology / e-NA Biotec Inc.

キ ーワードマイクロRNA医薬、次世代抗がん薬、補充療法、RNA干渉、
ノックダウン効果

RNAウイルスなど一部を除き、地球上のほぼ全ての生

1990年には、ヒトの遺伝情報を全て読解しようとする、物はDNAに遺伝情報を保存している。この遺伝情報は、

ヒト・ゲノムプロジェクトが開始された。このプロジェクトはRNAを介してタンパク質へ伝達され、タンパク質が生命

2003年に終了したが、ヒトの遺伝子数は予想に反して少な維持の中心的な役割を果たすと考えられる。この考えは、

く約22,000であった。これは、ヒトゲノムの僅か2%であり、1958年にF. Crick によってセントラルドグマ
（図１）
と提唱

残りの98%は不要なnon-coding領域と考えられた。
しかされた1)。

し、近年のRNA研究により、non-coding領域の大部分のDNAは、実際にはRNAに転写され、生成したnon-coding RNA (ncRNA) が多様な機能を示すことが分かってきた2)。その後、ncRNA研究は飛躍的に進み、次々と新しい 生 命 現 象 が 解 明されてきた。
ncRNAには、
タンパク質の翻訳工場であるリボソームを構成するリボソームRNA(rRNA)、タンパク質の翻訳に必要なアミノ酸をリボソームに運搬するための転移
RNA (tRNA)、核内低分子RNA（発生や図1 セントラルドグマ

分化に関与するmicroRNA (miRNA)）などが含まれる。
二 本 鎖 R N Aに由 来 するR N A 干 渉(RNA interference; RNAi) は、1998
年にA. FireとC. Melloらによって発見され、彼らは2006年にノーベル生理学・医学賞を受賞している。RNA干渉は、生体内遺伝子の発現抑制機構として重要な働きをし、mRNAの遺伝子発現を抑制す
3), 4)。siRNAをはじめとする短鎖る（図２.）

二本鎖RNAは、RNA干渉 (RNAi) によって配列特異的に標的のmRNAに作用し、遺伝子の発現を抑制することから、がんなどの難治性疾患の治療薬としての応用が期待される。RNA干渉を利用した核酸医
薬は、疾患に関わるタンパク質を標的とする抗体医薬とは異なり、mRNAを標的とする。そのため、疾患遺伝子の配列さえ分
図2 RNA干渉機構とPAZドメインはダングリングエンド部分を放出

18

かれば、容易に遺伝子制御分子を設計すTHE CHEMICAL TIMES

ることができると考えられ、抗体医薬の次に来る新たな革新

バエにおいて、siRNA二本鎖の切断にはDicer2が関与して的医薬として注目されている。 細胞に取り込まれた長鎖二おり、Dicer1は関与しないことが分かっている。Dicer1は

本鎖RNA（dsRNA）
はDicerによって切断されてsiRNAとな

もう一つのRNA干渉経路であるmiRNA機構において、Pri-る。siRNAはRNA誘導型サイレンシング複合体 (RISC) を

miRNAからDrosha (Dicerと同様RNaseⅢ活性を有する)構成するArgonaute2 (Ago2) タンパクに取り込まれ、一によって変換され、ステムとヘアピンループ構造を有する

本鎖化し、成熟化RISCを形成する。その後、成熟化RISCは標

Pre-miRNAを成熟型miRNAへと変換することが示されて的mRNAと二本鎖を形成し、標的mRNAを切断することで

いる
（図４）
｡

遺伝子発現を抑制する。

ヒトにはAgo1−Ago4までの4種のArgonauteタンパク

RISCの主要構成タンパク質であるAgo2タンパクは4つが存在する。その中でAgo2のみが切断活性を有しており、のドメインから構成され、5’-末端はMIDドメインとPIWIド

Ago2以外はその活性中心のアミノ酸が保存されておらず、メインの境界で認識、固定化されている
（図３）
。3’
-末端に位

切断活性を消失している。ArgonauteタンパクのRNA切断

置するダングリングエンド部はPAZドメインで固定化されは、siRNAアンチセンス鎖の10塩基目と11塩基目の間で正ている。固定されたアンチセンス鎖が標的mRNA(Target

確に標的mRNAを切断する。X線結晶構造解析によりPIWIドmRNA)を認識した後、PAZドメインはダングリングエンド部

メイン近傍にあるリン酸結合ポケットにガイド鎖の5'-末端の分を放出することで、アンチセンス鎖は標的mRNAと完全リン酸基が固定されており、そこからPIWIドメインの切断活

相補的に結合し、mRNA鎖の切断が起こる
（図２）
。切断され

性中心までの距離によって、切断位置が決定されていると考たmRNA鎖が排出された後、ダングリングエンド部は再びえられている
（図３. A）。

PAZドメインの疎水性アミノ酸から形成されているポケッ

22塩基程度の機能性短鎖RNAであるmiRNAをコードトに固定化され（図２）、新たなmRNAを取り込むことで、する遺伝子は様々な生物種のゲノム中に多数存在し、発現mRNAが切断され遺伝子発現抑制が繰り返し起こる5)。この様にRNA干渉機構の中で、siRNAのダングリングエンド部
が遺伝子発現に重大な関与をすることが示唆されたため、著者らの研究室ではダングリングエンド部に着目したRNA分子の新規化学修飾法の開発研究を行ってきた。
Dicerは、二本鎖RNAを約21−23塩基のsiRNAに分解するRNaseⅢファミリーのエンドヌクレアーゼである。ヒトや線虫では1種類であるが、ショウジョウバエには2種類存在
し、それぞれDicer1、Dicer2と呼ばれている。ショウジョウ

は時期や組織特異的に制御されている。miRNAがヒトを含む多くの生物種に存在することが明らかにされたことでmiRNA研究が急速に進展してきた。そしてmiRNAは、線虫の他にショウジョウバエ、
ゼブラフィッシュ、
マウス、植物など
様々な生物種における遺伝子の発現制御に重要であることが明らかとなった。特定の標的mRNAの翻訳を3'-非翻訳領
域 (3'-UTR) にmiRNAが結合することで抑制する遺伝子発現調節因子として認識されている（図３. Bと 図4）。miRNAの標的mRNAの認識に関して、ガイド鎖3'-末端側のミス

図３ siRNAや、miRNAとmRNAとの複合体(A)siRNAとmRNAの複合体、(B)miRNAとmRNAの複合体。ミスマッチ部分を含む。

19

マッチよりも5'-末端側のミスマッチの方が抑制活性に大きく出部位であるダングリングエンド部にデオキシチミジン残基影響を与えると報告されている。また、
RNAiで標的の識別にを二つ導入したDNA修飾型（TT）
siRNAが天然型siRNAと重要な役割をするのは、22塩基程度のmiRNAのうち5’-末（図
比べて強いノックダウン効果を示すと報告している6), 7)。

端から数えて2番目から8番目までの7塩基であることも明ら

５. A）
本修飾はmiRNAにも有効と考えられるが、miRNAのかとなっている｡ この領域はシード領域と呼ばれ、9番目以降臨床展開には、siRNAの場合と同様、i) 核酸分解酵素耐性、の塩基も標的の選択に関わるがそれほど重要ではないとさii) 標的細胞への効率的な輸送システム、iii) オフターゲットれている。このことから、1つのmiRNAは複数のmRNAを認効果の回避、などの克服が重要である。

識するとされている。さらに、
標的mRNAは比較的長い3’-非そこで先ず我々は、一つ目の課題である、核酸分解酵素

翻訳領域を持ため、1つのmRNAが複数のmiRNAによって耐性の増強に取り組んだ。様々な置換基をRNA3’-末端に導制御を受ける可能性もあると考えられている。

入し、先ず結合活性やノックダウン効果への影響について詳

PAZドメインは疎水性アミノ酸残基からなるポケットが存細な検討を加えた（図５. B, C）。
ヌクレアーゼによる分解耐在し、アンチセンス鎖（ガイド鎖）の3’-末端ダングリングエン性の向上を期待してヌクレオシド部を芳香族化合物である

ド部を認識する（図３）。一方、Tuschlらは、3’-末端2塩基突

ベンゼン誘導体やピリジン誘導体に置換したRNA誘導体を

図4 miRNAのRNA干渉機構

図5 ダングリングエンド部の様々な化学修飾

20THE CHEMICAL TIMES

開発した8)。PAZドメインとダングリングエンド部との結合能も成功した。さらに、核酸塩基を除いたリボース体11)やデオは、
ヒト遺伝子組換えPAZドメインを作成し、RNAを持たな

キシシボース体12)も開発し、そのノックダウン活性を評価しいダングリグエンド部のみとの結合能を等温滴定カロリー

た。これら化合物は、ヌクレアーゼ耐性の増強を確認するこ

メータ
（ITC）
にて評価するシステムを立ち上げた 。チミジとができたことから、ユニバーサルなダングリングエンド部

ン糖部をベンゼン骨格に置換したアナログや、ベンゼン誘導としての利用が可能である（図５. B）。

9)

体やピリジン誘導体を連結した、核酸塩基部を持たないシン

ダングリングエンドの 5 ′- 末 端 側から、ベンゼン、ピ

プルなアナログも開発した（図５. C）。これらも、未修飾型チリジンの順でRNAに置換したBP修飾miRNA-143 (4,ミジンと比較したところ、ITCの解析結果からほぼ同等の結

X=CH, Y=N)は、顕著な抗がん活性を示した。このBP修飾

合活性を示した。この様に核酸塩基をもたない疎水性の置miRNA-143誘導体とパッセンジャー（センス）鎖の配列を最換基を導入しても、RNA干渉能（ノックダウン効果）が低下す適化した誘導体から形成した２本鎖は、優れたヒト大腸がん

ることなく酵素分解耐性が増強されることを見出した。ノッ

細胞（DLD-1）
増殖抑制活性を示した。さらにヒト大腸がん

クダウン効果は、HeLa 細胞を用いたDual-Luciferase™

細胞を移植したヌードマウスに対し、BP修飾型miRNA-143

reporter assay にて評価した。siRNAやmiRNAの3’-末端誘導体を全身投与したところ顕著な抗がん活性を示した13)。

ダングリングエンド部の化学修飾試薬として、ベンゼンやピ

化学修飾miRNAによる抗がん作用は、図７に示したmiRNA

リジン誘導体のホスホロアミダイト試薬やCPG樹脂を関東による補充療法で説明できる。すなわち、何かしらの原因で

化学（株）で市販している（図６）。また、負電荷を帯びている発現低下したmiRNA-143によりがん遺伝子とがん抑制遺細胞表面との相互作用などを期待して正電荷を帯びたアミ

伝子とのバランスが崩れてがん化したのをヌクレアーゼ耐ノ糖であるグルコサミンに置換したRNA誘導体 の合成に性でノックダウン効果を示す化学修飾miRNA-143を補充

10)

図6 関東化学（株）より発売した化学修飾試薬

図7 miRNAの補充療法のメカニズム

21

することで崩れたバランスをもとに戻し、正常化するものと部への週１、２回の計７回の局所投与で、１0例中３例で完全考えている。

寛解を示す優れた抗がん活性を示した（図８）。

負電荷の核酸を陽性荷電脂質などとリポプレックスを形

この様にヌクレアーゼ耐性の付与がRNA医薬の開発に有成させて細胞内に導入するリポフェクション法を用いた全身用であることから、
さらにダングリングエンド部のヌクレアー

投与では、毒性や疾患細胞選択性などの問題が未解決であゼ耐性増強を目的に、先に示したBP修飾体のベンゼン残基る。そこで、副作用が少ないと考えられる局所投与による治とピリジン残基とのリン酸ジエステル結合をウレア結合に変療を実施するため、皮膚ガンであるメラノーマに着目した。

換したBuP誘導体も開発した。この修飾体は、
ヒト血清中でmiRNA-205は、
ヒト・メラノーマにおいて発現低下が顕著の優れた安定性を示したことから国際特許も取得した17)。こながん抑制遺伝子であることが分かってきた。また、ヒトとのウレア修飾miRNAの有効性に関しては今後詳細に検討し同様イヌのメラノーマにおいても同様のmiRNA-205の発報告する予定である。

現低下が確認された。そこで、ヌクレアーゼ耐性を示すBP修

次の課題である、標的細胞への効率的輸送システムの開飾miRNA-205を合成し抗がん活性を評価したところ、優れ発にも取り組んでいる。一方で我々は、RNA医薬の開発にたヒト・メラノーマ細胞の増殖抑制効果を示した14)-16)。自然は将来RNA分子の体内動態の解析が必要となると考えた。

発生メラノーマで放射線治療後に再発したイヌでの臨床試が置換したPET
半減期が非常に短い放射性原子（ 18F, 11C）

験を、岐阜大学動物病院の森崇教授らのもとで実施していラベル化分子の導入には、最終段階でのクリック反応の利用頂いた。著者らが開発したBP修飾miRNA-205を用いて、患が最適と考えた。そこで、RNA分子の3’-末端にエチニル基を導入し、アジド基を修飾したPETラベル化分子をクリック
反応で架橋することで、PETラベル可能なRNA誘導体の効（図９）。今後、RNA医薬の開率的合成法の開発に成功した18)発が進んだ場合に、RNA医薬の体内動態の解析に有効と考えている。なお、RNAへのエチニル基の導入に必要な試薬も開発ずみであり、関東化学（株）より市販している。
さらに我々は、本法を用いて、がん細胞膜などに存在する
特異的レセプターやトランスポーターを認識することが可
能な様々なアジド修飾化リガンドを合成した。次いで、アジド修飾化リガンド体とエチニル基を有するRNA分子とをクリック反応して連結したパッセンジャー鎖（センス鎖）
を合成した。種々のリガンドをRNA分子に架橋することで様々な

図8 化学修飾miR-205の抗メラノーマ活性

DDS機能を付与したRNA分子のライブラリー化が容易にできることとなった（図１０）。本法により、著者らは現在種々の図9 関東化学（株）より発売した標識体導入試薬22

THE CHEMICAL TIMES

図10 クリック反応によるDDS機能を有するRNAの創製リガンドが結合したとパッセンジャー鎖とヌクレアーゼ耐性

参考文献を有するガイド鎖（アンチセンス鎖）からなる２本鎖RNAの簡

1) F. H. C. Crick, Symp Soc Exp Biol. 13, 138–163 (1958).

易的なライブラリー化に成功した。このライブラリーが充実すれば、臓器選択性やがん細胞選択性を有するmiRNAやアンチセンスなどの核酸医薬の開発を容易にするものと考えている。
予備的検討の結果、
ヒト乳がん細胞を選択的に認識するリガンドの探索にも成功しており、現在その抗がん活性や細胞膜透過性などを詳細に検討している。本研究が進めば、リポフェクション試薬なしに全身投与可能なRNA医薬の開発に繋がることが期待される。これら核酸の高機能化が、将来RNA医薬の実現に大きく寄与すること期待して本稿を閉じる。

2) J. D. Watson, DNA: The Secret of Life , New York, Alfred a Knopf,
Inc., 2003.
3) A. Fire, S. Xu, M. K. Montgomery, S. A. Kostas, S. E. Driver, C. C.
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4) J.J. Song, S.K. Smith, G.J. Hannon, T.L. Joshua, Science 305, 1434–
1437 (2004)
5) E. Elkayam, C.D. Kuhn, A. Tocili, A.D. Haase, E.M. Greene, G.J.
Hannon, L. Joshua-Tor, Cell . 150, 100‒110 (2012).
6)

S. M. Elbashir, W. Lendeckel, T. Tuschl, Genes Dev. 15, 188-200(2001).

7) J.B. Ma, Y. R. Yuan, G. Meister, Y. Pei, T. Tuschl, D. J.Patel, Nature
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10) X. Luo, T. Sugiura, R. Nakashima, Y. Kitamura, Y. Kitade, Bioorg.
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11) K. Taniho, R. Nakashima, M. Kandeel, Y. Kitamura, T. Kitade, Bioorg. Med. Chem. Lett . 22, 2518-2521 (2012).
12) Y. Nagaya, Y. Kitamura, R. Nakashima, A. Shibata, M. Ikeda, Y.
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13) Y. Akao, Y. Nakagawa, I. Hirata, A. Iio, T. Itoh, K. Kojima, R.
Nakashima, Y. Kitade, Cancer Gene Ther. 17, 398-408. (2010).
14) M. Kandeel, Y. Kitade, PLoS One 8, e57140 (2013).
15) M. Kandeel, Y. Kitade, J. Comput. Aided Mol. Des . 27, 605-614(2013).
16) M. Kandeel, A. Al-Taher, R. Nakashima, T. Sakaguchi, A. Kandeel, Y.
Nagaya, Y.Kitamura, Y.Kitade, PLoS One 9, e94538 (2014).
17) Y. Kitamura, Y. Masegi, S. Ogawa, R. Nakashima, Y. Akao, Y. Ueno,
Y. Kitade, Bioorg. Med. Chem. 21, 4494-4501 (2013).
18) T. Shiraishi, Y. Kitamura, Y. Ueno, Y. Kitade, Chem. Commun. 47,
2691-2693 (2011).

23

キ ーワード解 説
ゲノム編集
ゲノム上の特定の遺伝子を改変する技術である。人工のDNA切断酵素を用いて標的遺伝子を切断し、その切断面が修復される過程において、標的遺伝子を破壊したり、別の遺伝子を挿入することができる。初期のゲノム編集は手間・コストがかかり、一部の研究者にしか利用されなかったが、
最近のゲノム編集ツールの発展により研究者が広く利用できる技術になってきている。近年、遺伝子治療や農作物・家畜の品種改良への応用が急速に進んでいる。

全ゲノム増幅ゲノムDNA全体を増幅する方法であり、微量あるいは貴重なゲノムDNAでも全ゲノム増幅を行うことで様々な解析に利用することができる。PCRをベースにした方法とphi29 DNAポリメラーゼを用いた方法に大別される。PCRをベースにした増幅法はホルマリン固定した組織片など断片化されたゲノムDNAでも増幅し易い。一方、
phi29 DNAポリメラーゼを用いた増幅法は非常に長いDNAを正確に合成できるという特徴がある。
●

D：日本語ではデオキシリボ核酸と呼ばれ、
A,T,C,Gと略される4種類のデオキシヌクレオチドから成る直鎖状ポリ NA（Deoxyribonucleic acid）

マーである。生物の遺伝情報はこの物質を介して保存される。
●●

ゲ ノム：ある生物が持つ全ての遺伝情報を指す。

遺 伝子 ：ゲノム上のあるタンパク質に翻訳される遺伝情報が含まれる領域を指す。タンパク質に翻訳されない機能性RNAに対応する遺伝情報を含む場合もある。

関東化学の遺伝子工学用試薬

phi29 DNAポリメラーゼ
信頼性の高い微量DNAの増幅に特長● シングルセルからのDNAを増幅可能です。
● 残存DNAを極限まで除去しました。
● 全ゲノム増幅反応時に非特異増幅を抑制します。

核酸修飾用試薬
ダングリングエンド修飾試薬

標識体導入試薬※各種製品のパンフレットをご希望の方はご連絡ください。
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2019 年 1 月発行