信州医誌，59⑷：281〜284，2011

蛍光の時代

蛋白尿をみる

信州大学医学部病理組織学講座

江原 孝

史

近年，生きたままの細胞の状態をみることが可能に使われている。くわしくは成書を参照されたい。またなった。ライブセルイメージングなどと呼ばれる。さ近年では GFP 以外にもさまざまな特徴を持った蛍光らに分子の機能が可視化できるようになった。蛍光標

タンパクが新しくでてきている。いくつか例をあげる

識した癌細胞の転移や移動を生体で観察することがでと，コモンサンゴから得られたケイマという蛍光蛋白きる。これにはノーベル化学賞を授与された下村先生

は励起光と発せられる蛍光との波長差が大きく生体間が発見し分離生成したオワンクラゲからの GFP をは相互作用を高感度，定量的に測定できる。これを発展じめとするさまざまな蛍光蛋白質や蛍光プローブの発させて１つの励起光で６色同時に蛍光を得る事が可能

見と開発とともにレーザー顕微鏡の発展と関連するテになった 。またカエデという蛍光蛋白はヒユサンゴ

クノロジーの進歩も大きく関わっている。蛍光を使っから得られたもので，紫外線照射で蛍光が緑から赤にた研究の隆盛をみると現代は蛍光の時代ともいえる。

変わるという photoconversion という特性をもって蛍光物質の発展いる（図１）。この蛍光タンパクを発現させた細胞の一部にのみ紫外線をあてるだけで，細胞全体が緑から蛍光プローブとしては，フルオレセイン系がよく用赤に変化し，任意の細胞を任意の時に標識が可能であいられているが，それをさらに発展させた新しいフルることが明らかになった（図２，３） 。このため特オレセイン類（TokyoGreens）によって，生体分子定の神経細胞だけに紫外線をあて，複雑な突起の中かや活性酸素などを標識することができるようになっら照射した細胞由来の突起を同定でき，複雑な神経回た 。βガラクトシダーゼに対する蛍光プローブで癌路の研究などに応用されている 。ミトコンドリアの細胞を標識して体内での移動が詳しくわかるようになっ研究でこの蛍光タンパクを用いて調べた結果，高等植た 。GFP は緑色蛍光タンパクの略で，基質を必要と物のミトコンドリア同士が頻繁に融合分裂して内容をせずリアルタイムで他の蛋白質との融合蛋白としても交換しあっていることが解明された 。さらにこの蛍検出が可能な特徴を活かして現在いろいろな用途に光タンパクを発現するトランスジェニックマウスを作

図１ 緑から赤に変わる蛍光タンパク
蛍光蛋白「カエデ」を発現する HeLa 細胞の細胞質の一部分（左上，丸の部分）に紫外線を１秒間照射すると，photoconversion により赤色に変換した「カエデ」タンパクが時間の経過とともに細胞質全体に広がるのが観察された。理化学研究所脳科学総合研究センターより許可引用
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最新のトピックス

図２

特定の細胞のみを赤く蛍光標識する「カエデ」を発現する海馬神経細胞の培養（左，すべての細胞が緑色）において，一つの神経細胞の細胞質の一部分に紫外線パルスを与えたところ，細胞質と突起全体が赤くなった（右，隣同士の神経細胞を色で区別できる）。理化学研究所脳科学総合研究センターより許可引用

図３ 図２右写真の拡大
神経細胞同士が複雑にからみあっている様子が明らかになる。

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最新のトピックス成することにも成功した。このマウスを使い鼠径リンサスレッドで蛍光標識した低分子デキストランが静注パ節を紫外線照射してリンパ球を赤く標識することでされた後に糸球体からボウマン腔に原尿として出る様リンパ球の動態を追跡することもできるようになった。

子があざやかに捉えられた。さらにストレプトゾトシ

この結果，リンパ球が鼠径リンパ節から同側の腋下リンによってラ氏島が破壊され糖尿病をおこしたラット

ンパ節へ主に移動し，細胞の種類では CD4陽性Ｔ細の糸球体に出入りする輸出入動脈の形の変化も捉えら胞が中でも多く移動することがわかった 。このマウれた 。他にレーザーを応用した顕微鏡としては全反スをモデルに応用して，接触皮膚炎を調べたところ，射蛍光顕微鏡がある。これはレーザー光が全反射され制御性Ｔ細胞が皮膚炎症の治癒に大きく関わっているた場合に生じるエバネッセント光を励起光として利用ことが明らかになった。さらに，末梢組織とリンパ節した蛍光顕微鏡で，エバネッセント光は数100nm 程間の細胞の移動の過程が初めて明らかになった 。こ度しかとどかないのでバックグラウンドのない蛍光像

れら以外にも最近では小動物用にプロテアーゼ活性やが得られる。

脈管や骨リモデリング観察のためのイメージング試薬

レーザー光を応用した技術が市販されている。

FRET（Fluorescence resonance energy transfer，レーザー顕微鏡の発展

蛍光共鳴エネルギー移動）とは蛍光分子の励起エネル

レーザー顕微鏡はレーザー光を試料にあてて出てきギーが別の分子に移動する現象で，生体分子間の相互た蛍光を検出する一種の蛍光顕微鏡で従来から通常の作用，構造変化を研究するのに使われる。これを使用

蛍光顕微鏡よりもすぐれた蛍光画像が得られることがしてアポトーシスをおこした細胞が貪食される過程に知られていた。しかし，これらは１光子によって励起おける低分子量Ｇ蛋白 Rac1と Rab5の活性化と制御される蛍光で，励起光が深部まで届かずまた試料の焦機構が明らかになった 。FCS（Fluorescence corre-点面以外でも励起光が照射されるため，生きた状態のlation spectroscopy，蛍光相関分光法）ではレーザー臓器の観察には制限が大きかった。つまり，深部の組光を絞って，焦点に微小領域をつくりこの領域から織は観察できないのである。この弱点を多光子レー発せられる蛍光のシグナルをゆらぎとして観測，ゆらザー顕微鏡は克服した。多光子レーザー顕微鏡ではぎのパターンから蛍光色素でラベルされた生体分子長波長のレーザーを高密度かつ短時間，フェムト秒の大きさや拡散に関する情報を得る。FCCS（Fluores-（1,000兆分の１秒，１/10 ）程度のごく短時間で照cent cross correlation spectroscopy，蛍光相互相関射することによって，１個の細胞ないし分子が同時に分光法）は注目する２つの分子に異なる蛍光を発する

２個の光子で励起される状態を作り出すことが可能に色素をラベルする。蛍光色素を同時に励起し２色の蛍なる。多光子励起で励起される蛍光は，焦点からの距光シグナルのゆらぎを比離の２乗に反比例するため，焦点面でのみ蛍光が発生

FCS が苦手とする同じような分子サイズの相互作用する。そのため，従来のレーザー顕微鏡に必要であっの解析が可能である。すでに述べた蛍光蛋白ケイマはたピンホールがいらなくなった。また長波長のレーザー一種類の励起光でケイマとそれ以外の蛍光蛋白を同時

光はエネルギーも低くかつ組織透過性がすぐれていに励起しうるため，同時に波長の異なる蛍光を得られるため，組織や臓器のより深部の観察が生きたまま可るために FRET や FCCS にとって欠かせない物質と能になった。脳では表面から200ミクロン程度の深部なっている。

（相互相関を定量）し，まで観察が可能で，腎臓の糸球体は以前から皮質のごこれらの蛍光蛋白，レーザー顕微鏡の進歩によってく表面の糸球体を観察できたが，多光子レーザー顕微

これからますますライブセルイメージの研究が発展す鏡によってより深部の糸球体や尿細管の観察が可能とることが期待される。

なった。多光子レーザーを用いた最近の研究ではテキ
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