●マイコプラズマ rRNA 検出試薬
TRCReady® MP の開発
バイオサイエンス事業部

第二開発部

遺伝子グループ

塚本斎藤

悠寿一

TRCReady® − 80、TRCR® 核酸精製キットと組み合わせ

1．はじめにることにより、核酸精製から検出まで全自動で実施可

マ イ コ プ ラ ズ マ ニ ュ ー モ ニ エ（Mycoplasma

能である（図２）。

pneumoniae , MP）は人に感染すると気管支炎と肺炎（以下マイコプラズマ肺炎）といった疾患を引き起こす。非定型肺炎の多くがマイコプラズマ肺炎であり、市中肺炎としての頻度も高い。マイコプラズマ肺炎は①

プロモータープライマー
アンチセンスプライマー
逆転写酵素

呼吸不全などを呈する重症化や合併症を引き起こすこともあることから迅速・適切な治療が必要である。しかし、マイコプラズマニューモニエをはじめとする非定型肺炎起炎菌は通常外来でよく使用されるβ－ラクタム系の抗菌薬が効かないという特徴を有するため、マイコプラズマニューモニエの迅速・確実な検出は臨標的 RNA（＋鎖）2 本鎖 DNA③②プロモータープライマー
アンチセンスプライマー
逆転写酵素

RNA ポリメラーゼ

床上重要である。現在マイコプラズマニューモニエの検出には培養法、抗体検査法、抗原検査法、遺伝子検増幅 RNA（−鎖）査法の４種類が使用されている 1）。培養法は特殊な培④地を使用する必要があり、また時間がかかるため、あINAF プローブ

まり普及していない。抗体検査法は信頼性の高い結果を得るためにペア血清を用いる必要があり、時間がかかる。抗原検査法は近年普及しており、検体採取後30 分以内に結果が得られ迅速性は高いが、感度が低く確実な検出法とは言い難い。遺伝子検査法は検体採取後 1 時間程度で結果が得られ、また感度も高いため注目されているが、現行の検査は煩雑であり抗原検査法と比べ普及していない。
そこで、迅速、簡便、高感度な遺伝子検査法とし①プロモーター配列を付加したプライマー、アンチセンスプライ
マーと逆転写酵素により標的 RNA から 2 本鎖 DNA が合成される②RNA ポリメラーゼにより 標的 RNA の相補鎖 (−鎖 ) が増幅合成される③増幅された RNA の一部からプロモーター配列を付加したプライ
マー、アンチセンスプライマーと逆転写酵素により 2 本鎖 DNAが合成される④INAF (INtercalation Activating Fluorescence) プ ロ ー ブ は 増 幅合成された RNA と特異的に結合し、蛍光強度が増加するて TRC 法 を 用 い たマイコプラズマ rRNA 検出 試 薬

図１

TRCReady® MP を開発したので報告する。

TRC 反応原理図（TRCReady MP）

2．TRC 法の原理と特徴
サンプル

TRC 法は 46℃の一定温度で RNA を増幅する TRC（Transcription − Reverse transcription − Concerted） 反応と標的核酸に特異的に結合する事により蛍光を発す
る INAF（INtercalation Activating Fluorescence）プローブを組み合わせた方法であり、標的 RNA の増幅と検出を 1 本のチューブ内で 20 ～ 30 分で実施できる2 − 3）（図１）。さらに、専用装置である自動遺伝子検査装置

TRCR® 核酸精製キット

図２

自動遺伝子検査装置
TRCReady®−80

TRCReady システム概要

99

TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）上清

3．マイコプラズマニューモニエ検出試薬の開発

喀痰

界面活性剤

マイコプラズマニューモニエの類縁菌としてはマイ懸濁・遠心コプラズマジェニタリウムが知られており、開発において特異性を高くすることが課題であった。この課題を解決するため、マイコプラズマニューモニエの検出ターゲットとして 23S rRNA を選択した。23S rRNA

図３

喀痰検体の前処理の配列には十分な差が見られたため、23S rRNA を検理可能である。

出ターゲットとすることにより高い特異性が期待できた。また、
23S rRNA は１菌あたり約 300 ～ 1000 コピー存在すると言われており、ゲノムを標的とするのに比5．基本性能評価

べ、高い感度が期待できた。

マイコプラズマニューモニエ 23SrRNA 溶液を開発した TRCReady MP で測定した結果を図４に示す。な

4．検体前処理方法の開発

お、図４において横軸は反応開始からの時間を示し、マイコプラズマニューモニエの遺伝子検査には咽頭

縦軸は蛍光強度比（蛍光強度／初期蛍光強度）を示し拭い液と喀痰の 2 種類の検体が使用されていることがている。そして、蛍光強度比が 1.5 を超えた時間を検知られている。このため、それぞれの検体種に対し適出時間とした場合、TRCReady MP は 103 ～ 108 コピー

切な前処理方法を開発する必要があった。咽頭拭い液／テストの 23S rRNA を 7 分以内に検出した。更に低®

に対しては TRCR 核酸精製キットにスワブを懸濁す

い濃度の 23S rRNA を測定した結果、10 コピー／テスることにより、核酸を精製することが出来た。一方喀

トの 23S rRNA まで検出することができた４）。

痰検体に関しては TRCR® 核酸精製キットにて精製す

TRCReady MP の特異性試験の結果を表１に示す。

る前に、前処理を行う必要があった。今回前処理方法

なお、判定は反応開始後 20 分以内に蛍光強度比が 1.5として、界面活性剤を用いて喀痰中のマイコプラズマ以上になった時に陽性、1.5 未満の時を陰性とした。

®

ニューモニエを溶菌させ、その上清を TRCR 核酸精

結果、TRCReady MP はマイコプラズマニューモニエ製キットに持ち込むことで、喀痰由来の阻害成分を除以外のマイコプラズマ属菌、肺炎原因菌を含む 25 菌き、マイコプラズマニューモニエの核酸のみを精製で種について、106 CFU または 23S rRNA 1010 コピーをきる、従来法と比べ迅速、簡便な方法を開発した（図測定したところ、全て陰性となった。

３）。本前処理法により、喀痰検体を 10 分程度で前処

表１
菌種

100

株名

特異性試験
株名

判定

Achromobacter xylosoxidans

NBRC 15126

陰性 Acinetobacter baumannii判定

菌種

ATCC 19606

陰性

Acinetobacter lwoffii

NBRC 109760

陰性 Escherichia coli

JM 109陰性

Alcaligenes faecalis

NBRC 14479

陰性 Haemophilus influenzae

IID 983

陰性

Chryseobacterium indologenes

NBRC 14944

陰性 Klebsiella pneumoniae

ATCC 13883

陰性

Empedobacter brevis

NBRC 14943

陰性 Legionella pneumophila

ATCC 33152

陰性

Flavobacterium odoratum

NBRC 14945

陰性 Pseudomonas stutzeri

NBRC 14165

陰性

Moraxella catarrhalis

ATCC 25238

陰性 Serratia marcescens

ATCC 13880

陰性Pseudomonas aeruginosa

NBRC 12689

陰性 Staphylococcus aureus

ATCC 700699

陰性Pseudomonas fluorescens

NBRC 14160

陰性 Staphylococcus epidermidis

ATCC 51625

陰性Mycoplasma hominis

NBRC 14850

陰性 Streptococcus pneumoniae

IID 554

陰性Mycoplasma salivarium

NBRC 14478

陰性 Streptococcus pyogenes

GTC 262

陰性

Mycoplasma fermentans

NBRC 14854

陰性 Mycoplasma genitalium

ATCC 33530

陰性

Mycoplasma orale

NBRC 14477

陰性東ソー研究・技術報告[ 評価結果 ]16.014.0

TRCReady MP と既承認品の相関性試験結果を表２12.0に示す。全体一致率は 95.0％、陽性一致率が 100％、10.0
蛍光強度比

第 62 巻（2018）8.06.04.0
2.00.0

陰性一致率が 93.6％と 90％以上の良好な相関が得ら

Negative1000300010^410^510^610^710^8れた。TRCReady MP にて陰性となった検体で既承認品陽性となったものは無く、TRCReady MP の感度が高いことが示唆された。乖離した 11 検体のうち、9検体に関しては配列解析を行い、TRCReady MP の増幅産物からマイコプラズマニューモニエ 23S rRNA 配0510152025

時間［分］マイコプラズマニューモニエ 23S rRNA を 1 テストあたり 103 〜108 コピーとしたときの、蛍光強度比の推移。横線はカットオフ値 1.5 を示す行われていない。

7．まとめ

蛍光強度比の推移

図４列が検出された。残りの 2 検体に関しては配列解析が既承認の他社遺伝子検査キットに比べ、マイコプラズマニューモニエを迅速、簡便に測定可能な試薬を開6．実検体を用いた評価 4 − 5）発した（表３）。また、臨床検体を用いた評価でも既[ 評価方法 ]承認品と同等以上の感度、特異度を有していた。

マイコプラズマニューモニエ感染が疑われた症例にて、全 220 検体（咽頭拭い液 110 検体、喀痰 110 検体）を使用し図５に示すフローにて評価した。TRC 法は
TRCReady® MP と自動遺伝子検査装置 TRCReady® −®

8．謝

辞

本研究は下記施設との共同研究又は受託研究として80、TRCR 核酸精製キットを組み合わせて精製、検実施されました。臨床評価の実施に際し、厚く御礼申出を行った。既承認 LAMP 法キットは株式会社ビー・し上げます。

エム・エルにて測定を行った。

千葉大学真菌医学研究センター：
石和田
適格性判断
同意取得

稔彦

先生

千葉大学医学部附属病院小児科：
長澤耕男

先生、菱木はるか先生

千葉市立海浜病院小児科：
阿部
喀痰前処理

克昭先生

喀痰
咽頭拭い液

変性チューブ

表２

相関性試験
既承認品

全検体＋−＋

47

11−

0162

（−20℃で保存）
TRCReady MP
TRCR®核酸精製キットによる核酸抽出
核酸抽出

・既承認法
・PCR法

必要に応じて配列解析

必要に応じて検体の再測定得られたデータの解析と評価

TRCReady MP

評価のフロー＋−＋

39

9−062

既承認品

喀痰検体

TRCReady MP

図５

既承認品

拭い液検体

TRCReady MPにて測定

＋−＋

82−

0100

101

TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）

表３

既承認キットとの比較

TRCReady MP（東ソー）

A社

B社

検査対象

RNA（23S rRNA）

DNA（SDC1 遺伝子）DNA（23S 遺伝子）

測定原理

TRC法
（INAFプローブによるリアルタイム蛍光検出）

LAMP 法

PCR 法

所要時間

45 分（拭い液）
50 分（喀痰）50 分（拭い液）
100 分（喀痰）60 分（拭い液）

検体

喀痰・拭い液最小検出感度 RNA 1000 cp ／テスト

喀痰・拭い液

咽頭拭い液

DNA 15 cp ／テストDNA 25cp ／テスト

感度100％（対既承認 LAMP 法キット）

100％（対既承認 LAMP 法キット） 100％（対既承認 LAMP 法キット）

特異度93.6％（対既承認 LAMP 法キット）

100％（対既承認 LAMP 法キット） 95.8％（対既承認 LAMP 法キット）

他社キットの性能は添付文書より抜粋。所要時間は試算。

千葉市立海浜病院臨床検査科：
静野健一

先生

国立病院機構刀根山病院：
北田清悟

先生

国立病院機構東京医療センター小児科：
込山修先生

国立病院機構東京医療センター総合内科：
森伸晃

先生

参考文献
１）肺炎マイコプラズマ検査マニュアル、国立感染研究所（2011）２）T. Ishiguro et al., Anal. Biochem ., 314（1）, 77 − 86（2003）
３）斎藤寿一、臨床病理、66（5）、515 − 521、（2018）
４）N. Ishiwada et al., Jpn J Antibiot ., in press
５）森伸晃ら、第 92 回日本感染症学会学術講演抄録（2018）

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