Dec. 2019

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

301（ 31 ）72―4〈研究報告〉
高粘稠性 Klebsiella pneumoniae に対するリファンピシンの有用性
並川浩己 1）・老沼研一 2,3）・金子幸弘 2,3）・掛屋弘 3,4）

大阪市立大学大学院医学研究科総合医学教育学／総合診療センター

1）

大阪市立大学大学院医学研究科細菌学

2）大阪市立大学大学院医学研究科感染症科学研究センター

3）

大阪市立大学大学院医学研究科臨床感染制御学

4）（2019 年 10 月 10 日受付）
近年，日本を含めた東・東南アジアを中心として，高粘稠性の Klebsiella pneumoniae（hvKP）が臨床上問題となっている。本菌の高病原性には，莢膜多糖合成遺伝子である

regulator of mucoid phenotype A（rmpA）等の働きによる莢膜多糖の過剰産生が関与している。今まで hvKP の高病原性のメカニズムに関する研究は数多くされてきているが，抗病原性療法に焦点をあてた研究はない。我々は，hvKP の高粘稠性を抑制することができる薬剤を既存の抗菌薬の中から探索した。結果，リファンピシン（RFP）に強い粘稠性抑制作用があることを発見した。また RFP は莢膜の厚さを減少させ，さらにrmpA を中心とした莢膜関連遺伝子の転写を抑制することが判明した。以上のことから，リファンピシンが本菌による難治性感染症に対する治療薬として役立つ可能性があることが示唆された。

HvKP は，菌血症，肝膿瘍，肺炎，眼内炎そしてI. 序文

髄 膜 炎 を 含 む 重 篤 な 感 染 症 を 引 き 起 こ す 2）。

HvKP による菌血症患者は，non-hvKP による菌血Klebsiella pneumoniae は市中・院内感染症の原症患者と比較して，死亡率が有意に高いことが報因として，ありふ れ たグラム陰 性 菌 である。K.

告されている 3,4）。HvKP は，一般的に知られていpneumoniae は主に肺炎，尿路感染症ならびに胆道る K. pneumoniae と 同 様 の 抗 菌 薬 感 受 性 を 示 す

感染症を引き起こす日和見感染菌として知られてが，上記のような高病原性を持ち，さらに感染局いる。しかしながら近年，日本を含めた東・東南ア所より菌が排除されにくいことから，治療に難渋ジアを中心として，極めて病原性の高い高粘稠性のする場合が多い。実際に我々は，治療に難渋した

K. pneumoniae （hypermucoviscous K. pneumoniae:

hvKP による感染症を 2 例経験している 5）。

hvKP）が臨床上問題となっている 1）。高粘稠性の高病原性には，菌体外多糖から成る粘性物質の有無は string test により判断される。HvKP は膿瘍関与が指摘されている 6）。高粘稠性関連遺伝子とを 形 成 し 多 臓 器 に 感 染 し や す い 特 徴 を 持 つ。 し て，莢 膜 合 成 に 関 与 し て い る mucoviscosity-302（ 32 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

associated gene A（magA）および転写活性に関与

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間の差を水の流下時間で除した値）を算出した。

し て い る regulator of mucoid phenotype A（rmpA）が知られている 7）。今まで hvKP の高病原性のメ

4. 顕微鏡による菌体外多糖の観察

カニズムに関する研究は数多くされてきている

墨汁染色法を用いて，標準株，RFP 未処理のが，抗菌薬による高粘稠性抑制療法に焦点をあて

hvKP 株，RFP 処理後の hvKP 株を光学顕微鏡にてた研究はない。我々は，hvKP の高粘稠性抑制が直接観察した。

治療の鍵となる可能性があるのではないかと考えた。研究の結果，リファンピシン（RFP）に hvKP

5. リアルタイム PCR による転写量の測定に対する強い粘稠性抑制効果があることを発見し先行研究 9）を参考にし，RFP 未処理の hvKP とた。 本 稿 で は， 最 近 International Journal of

RFP 処理後の hvKP の全 RNA を抽出し，magA お

Antimicrobial Agents 誌上で発表した内容

よび rmpA 遺伝子の転写量の変化を，リアルタイ

8）を中心として，我々の研究成果を概説する。

ム PCR により測定し比較した。

II. 材料と方法
1. 使用菌株
大阪市立大学医学部附属病院にて患者検体より

図 1. 標準株と hvKP 株の粘度の比較

分 離 さ れ た hvKP 4 株 を 主 な 研 究 対 象 と し て，non-hvKP である ATCC 700603（標準株）を比較対象としてそれぞれ使用した。

2. 使用薬剤
Benzylpenicillin, ampicillin, meropenem,metronidazole, streptomycin, kanamycin, gentamicin,amikacin, ciprofloxacin, ofloxacin, azithromycin,clarithromycin, tetracycline, chloramphenicol, RFP,vancomycin, polymyxin B, colistin の 計 18 種 の 抗 菌薬を使用した。

3. 多糖抽出液の粘度測定
最小発育阻止濃度より 2 管低い濃度の抗菌薬を
含 む 液 体 培 地（Mueller Hinton II）で，標 準 株 とhvKP 株を培養した（37°C, 一晩）。その培養液を界面活性剤の添加後熱処理し，菌体外多糖を可溶化した。本サンプルを遠心分離とろ過により透明化した後，オストワルド粘度計を用いた粘度測定に供し比粘度（サンプルの流下時間と水の流下時

図 2. hvKP 株に対する RFP の粘性抑制効果

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図 3. 墨汁染色法を用いた莢膜の観察

図 4.

莢膜関連遺伝子の転写量に及ぼす RFPの効果判明した（図 3）。
最後に，RFP は magA, rmpA の両遺伝子の転写を抑制することが判明した（図 4）。

IV. 考察本研究の目的は，菌の発育抑制とは異なるメカニズムにより，hvKP の粘稠性を抑制することができる抗菌薬を発見することである。この目標を達成するために，我々はまず，hvKP の粘稠性を評価する方法を確立することを試みた。これまでの研究では，主に string test, 細菌培養液の遠心分離後の OD600 測定，莢膜の成分であるグルクロン
magA は 4 回，rmpA は 6 回の独立した実験による結果。
バーは標準偏差を示している。
検定は Mann-Whitney U test を使用し，* は P＜0.05, ** は P＜0.01 を示す。

酸定量が，hvKP の粘稠性の評価法として使用され て き た 10,11）。String test や OD600 測 定 は，定 量性・再現性に乏しい方法のため，本研究では用いなかった。またグルクロン酸量の測定に関してIII. 結果

は，莢膜多糖の粘稠性を正確に反映するものかどうかの確証がなかったため，今回は使用を見送った。既存の方法のかわりに，我々は粘度計を用いまず第一に，hvKP 株は標準株と比較して，粘た菌体外多糖の直接的な粘性評価を試みた。実際

稠 度 が 約 10 倍 高 か っ た（図 1）。さ ら に RFP にには，粘度計で測定した比粘度を OD600 値で除しhvKP 4 株全てに対して強い粘稠抑制効果があるた値を，粘稠性抑制効果の比較に使用した。このことを確認した（図 2）。

方法は，定量性・再現性に優れており，hvKP の次に，hvKP 株は標準株と比較して，莢膜が厚粘稠性を評価するのに十分なものであった。このいことを確認した（図 3）。また，RFP で処理する方法は，抗菌薬の粘稠抑制を評価するのに理想的ことにより，hvKP の厚い莢膜が消失することがであり，結果として我々は hvKP に対する RFP の304（ 34 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

高い粘稠抑制作用を見出すことに成功した。

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本研究は緒に就いたばかりであり，臨床応用の次に hvKP に対する RFP の効果を評価するため実現に向け，今後多くの課題に取り組んでいく必に，墨汁染色を用いて莢膜の厚さを光学顕微鏡で要がある。例えば，RFP の作用機序に関しては，直接確認した。墨汁染色は，古くから顕微鏡にて未だ不明な点が多く，今後解明していく必要があ

莢膜の存在を確かめるために使用されてきた 12）。 る。また，hvKP に対する RFP の効果は in vitro のこの方法を用いることで，莢膜は菌周囲の clearみでしか確認できていない。今後，動物モデルをhalo として観察することができる。墨汁染色は非使用して，hvKP に対する RFP の効果を確認する常に簡便かつ有用な方法であるにもかかわらず， 必要がある。
今まで墨汁染色を用いて hvKP と non-hvKP の莢

結論として，RFP は rmpA を中心とした莢膜関連膜の厚さを比較した研究はなかった。もし莢膜の遺伝子の発現を強力に抑制し，莢膜多糖産生を減厚さが hvKP の高病原性に関連するのであれば， 少させることで，hvKP に対して強い粘稠抑制作用
墨汁染色は高病原性スクリーニング法に適した方を示すことが明らかとなった。In vivo の実験でそ法であるかもしれない。の効果が証明されれば，RFP が hvKP 感染症に対す

K. pneumoniae の 莢 膜 多 糖 合 成 遺 伝 子 ク ラ ス

る治療薬の選択肢の一つとなる可能性がある。

ターは，少なくとも 3 つのプロモーターを含んでいる。それらは galF, wzi そして manC の上流領域に位置する。RmpA はこれらすべてのプロモー

13）

ターの活性を増加させる役割を持つ。本稿には

14）

謝辞
研究奨励金を交付いただいた，公益財団法人日本感染症医薬品協会に深謝致します。

デ ー タ は 示 し て い な い が，本 研 究 で は RFP をhvKP に作用させることにより，magA と rmpA だ

利益相反

けでなく，galF, wzi そして manC の転写も抑制すなし

ることを確認している 8）。以上のことから，hvKPに対する RFP の効果は，rmpA の発現抑制を介し 〔この研究報告は，2018 年度奨励賞受賞者並川て発揮されるものと考えられる。しかしながら， 浩己先生が受賞後の研究をまとめたものです。〕
その機序の解明は十分ではなく，今後更に研究を進めていく必要がある。

K. pneumoniae の莢膜は好中球や補体の貪食作用に対する抵抗力を増加させる 15）。莢膜多糖の過剰産生は膿瘍形成や多臓器への転移と強く関連している 16）。これらのことから，RFP により hvKP の粘稠性を抑制することで，hvKP 感染症の効率的な治療が可能になると推察される。K. pneumoniae は一般的には RFP に感受性は示さない。そのため，hvKP の治療として RFP 単独では効果がないと考えられる。従って，K. pneumoniae に対し有効な他の一般抗菌薬との併用が選択肢にあがる可能性がある。

引用文献
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Usefulness of rifampicin against hypermucoviscous
Klebsiella pneumoniae
Hiroki Namikawa1）, Ken-Ichi Oinuma2,3）,
Yukihiro Kaneko2,3）and Hiroshi Kakeya3,4）
1）

Department of Medical Education and General Practice,
Osaka City University, Graduate School of Medicine,
1–4–3 Asahi-machi, Abeno-ku, Osaka 545–8585, Japan2）
Department of Bacteriology, Osaka City University,
Graduate School of Medicine,
1–4–3 Asahi-machi, Abeno-ku, Osaka 545–8585, Japan
3）
Research Center for Infectious Disease Sciences, Osaka City University,
Graduate School of Medicine, 1–4–3 Asahi-machi,Abeno-ku, Osaka 545–8585, Japan
4）
Department of Infection Control Science, Osaka City University,
Graduate School of Medicine,
1–4–3 Asahi-machi, Abeno-ku, Osaka 545–8585, JapanIn recent years, the increase in the incidence of hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae（hvKP）infections has become a clinical concern worldwide. The high pathogenicity of hvKP isin part attributed to the overproduction of capsular polysaccharide（CPS）, which is achieved by

the action of a positive regulator of capsular polysaccharide synthesis genes, named rmpA. There
have been many studies on the mechanism of hvKP virulence, but no study has focused on thedevelopment of anti-virulence therapies. We tried to identify antimicrobial drugs that can
suppress the hypermucoviscosity of hvKP. As a result, we found that rifampicin（RFP）has astrong anti-mucoviscous activity against hvKP. RFP treatment caused a drastic reduction in thethickness of the CPS layer around hvKP cells and suppressed transcript levels of capsule-related
genes including rmpA. Our data suggest that RFP may be useful as a potential anti-virulence
agent for intractable infections caused by hvKP.