奈医誌. (J.NaraMed.Ass.
)40，630‑635，平 1(630)

コロイド金標識 N
ontransformedtypeandrogenreceptorの組織細胞化学的研究
奈良県立医科大学第 2解剖学教室
中 山 正 成 ， 橋 本 研 二 ， 奥 田 喜 一 ， 山 本 浩 司

HISTOCYTOCHEMICALSTUDYO NNONTRANSFORMEDTYPE
ANDROGENRECEPTORLABELEDWITHCOLLOIDALGOLDINRATTESTISMASANARINAKAYAMA，KENJIHASHIMOTO，YOSHIKAZUOKUDA
andHIROSHIYAMAMOTO
The2ndDφartment01A向。tomy，NaraMedicalUniversityReceivedAugu
st2
9，1989Summary: Asdescr
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dandrogenrecept
or，ctro
nmicroscopicstudy

緒 言
先の奈良医学雑誌〔第 40巻 3号)')でジヒドロテスト
ステロン

アフィニテー

カラムで単離精製した活性型には 2種類あると考えられている.即ち，一つはステロイドホノレモンにより活性化されたレセプターホノレモン複合体で， DNA能結合を持ち，これがホノレモン応答遺伝子のアクセプタ一部位に作用して遺伝子発現に働いているのtr
ansformedtypeandrogenreceptorの組織化学的活性型のアンドロゲンレセプターで，ndrogenhor
moneに結合する両ドメ
性状は DNAと aンはメタノレ結合フィンガー構造をとっていると考えられDNA結合ドメイインを持つことを示し，これまでに報告されているアン

る2) もう一つはホノレモンにより活性化されていない非ドロゲンレセプターの性状と一致していることを示し活性型の nontransformedtypeのレセプターであり，現た.このアンドロゲンレセプターの細胞内での存在形態

在その複合体はモリフデン酸存在下で安定化された状態

コロイド金標識 Nontransformedtypeandrogenreceptorの組織細胞化学的研究(631)で単離されており 3)，ホノレモンが結合しても活性化されカラムで FPLCsystem(PharmaciaCo)にて分画した.

ないタイプである.この非活性型のアンドロゲンホノレモ

分画流速は 0.
5ml/minで行った.ゲ、ノレ源過の分子量測定

ンレセプターの研究はステロイドホノレモンの作用とレセatalase(M.Wニ240，000)，Oval
加b叩ul1江mi
泊n(MはCプタ一の活性イ化と機構， きらにはその遺伝子発現の調節機∞00ω0ω)，CytochromeC (M汎「人.
=1ロ2，5ω00⑪〉の保持時間を指構の研究にとつて重要である.このステロイドホノルレモン

測則定した.
標として tre巴n巴(1984)らによりレセプターの作用発現モデノレは G(2) 電子顕微鏡学的研究

ihy‑
報 告 さ れ て い る 4) 今 回 モ リ ブ デ ン 酸 存 在 下 で d(a) 固定と包埋

drotestosteroneaffinitycolumnによりラット精巣の非ラットをエーテノレ麻酔し，精巣を摘出後すぐに氷冷し活性型のアンドロゲンレセプターを単離し，その性状を.
5%glutaraldehyd巴一O.lMphosphatebuffer(pH7た2組織細胞化学的に検討した結果を報告する

4)溶液中で 1‑2mm'に細切した.この組織片を 4'
Cで 2材料と方法時間固定した. 0.25MSucrose溶液で一昼夜十分に洗浄し，上昇アルコーノレシリーズで脱水後， LRwhiteresin(LondonChemicalCO.
)で 60'C，24時間重合包埋した.

材料

ウイスター雄ラット (4‑6週令〉の精巣 (LotNo.
2449)
はPel‑Freezより購入した. 5a‑dihydrotestosterone:

BSAは MakorChemicalCo.より， DNaseI(TypeII，frombovinepancr巴as) および T
estosteron
巴は Sigma

超薄切片を作成し， 200‑
300meshの Nickelgrid(VecoCo.
) に戴せ，使用時まで 4'Cで保存した.
(b) Nontransforme
dandrogenr
eceptorのコロイド金標織ChemicalCo.より， Trypsin(203unit/mg)は Millipore17nmコロイド金は Rothら(1987)の5)方法により作Co目より購入した.その他の試薬類は試薬特級，電子顕微mlに 10μg成した.即ち， pH未調整のコロイド金溶液 2鏡用試薬を用いた.のnontr
ansformedandrogenreceptorを加え，数分後

方法

5%polyethyleneg
lycol存(20，000)を 40μl加えて安定(1) Nontransformedtyp
巴 androg巴nreceptorの単化させた.

4，000rpm 2'C，この溶液を目立 RP65Tローターで， 2離精製(a) cytosol

40分間遠心し，ベレットを得た.このベレットを 2mlのラット精巣 27grを 100mlの 10mM Tris‑HCl(pH7.

0.
05%polyethyleneglycol，5%glycerol，0.
0
1%NaN，6)， 1.5mMβ‑mercaptoethanol，1.5mMEDT
A，20mM溶液に再懸濁し， 10‑30%の glycerin linear density'
C下で Warring
sodium molybdate (TMEM) で か 24，gradientに 重 層 し ， 目 立 RPS40Tロ ー タ ー で 1blenderによりホモゲナイズした.これを chees
巴c10thOOOrpm，4'
C，30分間遠心して金粒子径を揃えた.

で組織片を除去し，目立 RPS65Tローターで 10
5，000X

g，2'
Cで 90分間超遠心した.脂肪を除去後，ラット精巣の上清を得た. これを cytosol分間とした.

(b) Affinitychromatography
5a‑dihydrotestosteroneaffinitycolumnの作成，お(c) DNaseIのコロイド金標識
DNaseIのコロイド金標識は Bendayan(1981)ら 6)の方法に準じて 5nmコロイド金で作成した.
(d) 染色法

ostembedding法による一重染色(1) P

よびレセプターの溶出は先の論文に記載された方法で作

ridを 0.
05%TritonX‑
100を含超薄切片の載った gytosol分画を dihydrotestosteroneaffinity成した 1) chosphatebufferedsaline (TBS) (pH7.4)で 10分むpcolumnに吸着させ， TMEM緩衝液で、十分に洗浄後，カ間前処理し，最適染色像が得られるように同溶液で希釈00μg/mlの testosteron
巴をラムよりゲ、ノレを取り出し， 1ontransformedandrogenrece
したコロイド金標識 n'
Cで 6時 間 以 上 置 い含む TMEM緩衝液中にゲノレを 4ptorを室温下で 30‑90分間反応させ， 0.
05% Tween20た.ゲノレ溶液を再度カラムにつめ，過剰のテストステロを含む PBS(pH7.
4)で15分間 3回洗浄した.蒸留水で回ンホノレモンを加えることにより遊離してきたタンパク質

洗浄後，酢酸ウラニーノレ， レイノノレド溶液で染色し，透を回収し，蒸留水により透析後凍結乾燥により乾燥させ過型電子顕微鏡 (TEM) (日本電子 1200EX，JEOL) でTこ観察した.

(c) Gelchromatography(2) Trypsin処置.
2mlに溶かした蛋白分画を同溶液でTMEM緩衝液 0超薄切片の載った gridを PBSにトリプシンを 10μg/平衡化した Sup巴rose™12 (分画範囲 300，000以下〉ゲノレ5分間前処置し，mlになるように溶かした液で 3TCで 1

(632)

中 山 正 成 ( 他 3名〉

TBSで洗浄後 (d)の(1)で述べた一重染色を行った.

次にこの非活性型ァ γ ドロゲンレセプターをコロイド(3) Postembedding法による同一面での二重染色金標識し，その組織への結合により生物学的性状を検索

Gridの前処理は一重染色の場合と同じである.前処理

した. コロイド金標識 nontransformedandrogenrece.

.4)で、希釈した 5nmコロイド金標識 DNase
後 TBS(pH7ptor(NTRG)でラット精巣を染色すると精細管内にあIで 3TCで，30分間，湿箱中で反応させた.反応後， TBSるセノレトリ細胞，精子形成細胞群のほとんどの細胞に染で 5分間， 3回，洗浄後， TBSで一重染色と同倍率に希色が認められたが，染色体の凝縮がみられる精子では金釈 し た 17nmコ ロ イ ド 金 標 識 nontransfor
med an.

粒子はほとんど認められなかった.精細管内細胞全体でdrogenreceptorを 37"C，30分間，湿箱中で反応させた.の各細胞をみるとコロイド金の分布は染色される細胞の.
05%Tween20を含む PBS(pH7A)で 15分反応後， 0核 と 細 胞 質 を 比 較 す る と 核 に 特 異 的 で 核 に 80%以 上間， 3回洗浄し，一重染色と同じ方法でカウンター染色(P<O.Ol)の金粒子が認められ，核に特異的に親和性を示

し， TEMにて観察した.

した.核内での分布を見ると Fig.
1に示すように，セノレト(e) 金粒子数のカウントと面積の測定

リ細胞の核ではグロマチンが分散した状態がほとんど

コロイド金粒子の数はコロニーカウンターにて数え

で，凝縮したクロマチンはほとんど認められない.このた.核と細胞質の面積の測定はライツ半自動画像解析装分散した F ロマチンの境界部に主として金粒子が認めら

Leitz‑A.S.MJ にて測定した.
置 (elsenfeld(1986)ら9)れた.この分散したクロマチンは F

結果と考察
ラット精巣をモリブデン酸存在下でホノレモゲナイズずの モ デ ル で は 30nm fiberである solenoidから 10nm巴rである beadsonastr
ingの状態であり，この高次fib構造の変化が遂伝子の転写活性に重要な働きをしているることにより，非活性型の，安定化した Nontransformedと考えている.金粒子の分布しているこのクロマチンのtypeandrogenreceptorを， onestepmethodにより得境 界 部 の 径 は 平 均 20nm以 下 で あ る の で 恐 ら く

7grのラット精巣を 3倍量の TMEM緩衝た.即ち，約 2solenoidtypeが beadsonastringの状態，即ち転写活.
液でホモゲナイズし，超遠心後の上清〔蛋白量として 2性の盛んな状態にあると思われる所にこの金粒子が存在

5gr) からアンドロゲンホノレモンレセプターを 5a‑dihy.

ig.
2で示すようにグロマチしていると考えられる.又 F

drotestosteron
巴affinitycolumnで精製した.収量は約olenoidtypeがさらにンが凝縮している所，すなわち s200μgであり，非活性型のアンドロゲンレセプターのゲ凝縮した高次構造である condens巴dchromatinの転写00，000以下〉での分子量の測定では
ル鴻過〔分画範囲 3不活性な部位と考えられる領域にはこの金粒子が存在しvoidvolume付近で溶出したので，約 300，000か，それ以ていないので，非活性型のアンドロゲンレセプターの核上の分子量を持ったものであろう.これまでに報告され内での存在場所も活性型のアンドロゲンレセプターの存

1985)7)らは顎下線から得た非活性たなかで， Nemoto(在場所とほぼ一致したところにあるのかもしれない.こ型のアンドロゲンレセプターは沈降係数約 8Sでゲノレ糠のことはアンドロゲンレセプターが常にホノレモン応答遺20，000であると報告している.また最近，
過の分子量は 2伝子かあるいは近くに存在して，ホノレモンによりレセプRowley(1986) ら8) は沈降係数が 9St
ype(M.W.=270，ターが活性化されるとこの活性型レセプターが応答遺伝

000‑300，000)と 7.
7Styp巴の 2種類の非活性型を報告し，子の転写を制御している領域(アクセプターからプロモ

前者は 4.
4Sァ γ ド ロ ゲ ン レ セ プ タ ー の oligomerでター領域〉の構造に変化を与え，転写系酵素の働きを促

DNAへの結合能はないが，後者は 4.
4S monomerが進するのかもしれない.

RNAと複合体を作り， DNAへの結合能を持った中間体

次にこの非活性型のアンドロゲンホノレモンレセプターであると報告している.今回得たモリブデン酸安定化ホの結合相手が DNAかタンパグ質か何かを探るために，

慮過で得た分子量測定からはノレモンレセプターはゲノレ irypsin処理後に NTRG染色すると Fig.
精巣の切片を tRowleyらの報告している 2種類の型のうち，後者の 7.

3に示すように金粒子はほとんど核内に存在せず，非特yp巴のものを得たと7Stypeよりももっと高分子の 9St異的な染色のみであったことから，非活性型のアンドロ考えられる.今回この分子量約 300，000の安定化した非ゲンレセプターは核タンパク質に親和性を持つことを示

rot巴olys
isなしに得活性型のアンドロゲンホノレモンを pig.4に示すように精巣の切片を 5nmコロした.さらに Fnestepmethod0
こより，ることができた最大の理由は oイド金標識 DNase1で 前 染 色 し ， 次 に 同 一 表 面 上 で短時間にアンドロゲンレセプターを他のタンパク質から17nmNTRGで後染色した結果， Fig.lで示した場合の分離した結果で、あると考えられる.

70%以上の NTRGの金粒子が核内に認められた.同希コロイド金標識 Nontransformedtypeandrogenreceptorの組織細胞化学的研究
釈率でアッセイしたにもかかわらず約 7割が残ったこと

(633)

文 献はD
NaseI感 受 性 領 域 DNAや nuclearmatr
ixの 主要タンパク質であるアクチンが NTRGの受容体ではな

1)中山正成，奥田喜一，別府謙一，橋本研ニ，山本浩

い こ と を 示 し て い る と 同 時 に 約 3割 の こ の 受 容 体 が司 奈 医 誌 .40:315，1989.

DNsaeIにより結合阻害されることを示している.この自en，M.，Hinck，L.andRin自gold，G.M.:2)DanielCell57:1
131，1989.

ことは精製したレセプタータンパク質の純度を示していlot，J.，Brinkman，A.
O. and3) De Boer，W.，Bると考えられる.一方このモリブデン酸安定化レセプタ
ーの欠点は，モリブデンがレセプターの DNA結合ドメ

E.
:BiochimicaetBiophysicaActa889:
Mulder，インを構成するシステイン残基に強 L、親和性を示し叫

986.
240，1DNA結合活性を消失させる性質を持つことである.従.
L.
:Natur
巴307:745，4) King，W.J.andGreene，Golenoidや beadsonas
tringを構って， この複合体が s1984.

成する核タンパク質と DNAの両方に同時に結合能を持.，Bendayan，M.andOrci，L.目].Histo‑5) Roth，J
978.
chem.Cytochem.2
6:1074，1っているかどうか木明であるが，低イオン強度下で非活.Histochem. Cytochem 29:6) Bendayan，M.:]性型の複合体は現在のところ単離されていないため，今目owley(1986)ら8) は回の実験では確認できなかったが R981.
531，19St
ypeのアンドロゲンレセプターには DNA結合活性7) Nemoto，T.，Ohara‑Nemoto，Y.，Sato，N.，Kya‑は無いと報告しており，我々が得たレセプターも DNAkumoto，S. and Ota，M.: BiochimicaetBio‑

結合活性はないかもしれない.

985.
physicaActa839:249，18) Rowley，D.R.，Premont，R.
T.，Johnson，M.P.，

以上のことから非常性型のアンドロゲンレセプターは00，000で，アンドロゲンと核タンパク質に親分子量約 3Young，C.
Y.
F.andTinda，lID.
J. Biochemistry

和性のあるものを on
巴 stepmethodにより得たと考え

986.
25:6988，1目9)Felsenfeld，G.andMcGhee，J.
D.・Cell44・375，られる.
この論文の一部は第 94回日本解剖学会総会(1989年宮崎〉にて発表した.

1
986.J.，Grate，J.
H.andSchrauzer，G.
10)Whethers，Boc.10
1:917，1
979.
N.・].Am.Chem.S

Figurelegends
Fig.
1‑2.Postembeddingmethodwitha colloidalgold(17nm)labelednontransformedan‑lNucleolus(NO)，fibrilarshell(Fs)，fibrilardrogenreceptor(NTRG)inaSertol
icel.

ranularregion(G)，basementm巴mbrane(BM)，h巴trochromatin(HC)，center(Fc)，gnucleus(N)andcytoplasm(Cyt).Bar，1μm
aNTRG(arrow)st
aini
naSe
rtolicellwascarr
ie
dou
ti
nthe
Fig.3.A
ftert
r
yp
sint
r
eatment，
samec
oncentrationasshowninF
ig.1‑
2 Bar，lμm
目

Fi
g.4.D
oublelystain
巴dpostembeddingmethodi
naSer
tolicell. Themethodwasd
esr
ibedonmaterialsandmethods. Thearrowheadwas5nmDNaseIgoldandt
hearrowwas17ucleolus(NO)，interchromatingr
anulesCIG).
nmNTRG. Basementmembrane(BM)，nBar，1μm

(634)

中 山 正 成 ( 他 3名〉

コロイド金標識 Nontr
ansformedtypeandrogenrec巴ptorの組織細胞化学的研究(635)