特集

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

ローリングサークル増幅によるRNA直接検出
Directly RNA detection by rolling circle amplification

広島大学大学院 先端物質科学研究科

高橋 宏和

広島大学大学院 先端物質科学研究科

堀尾 京平(独)農業・食品産業技術総合研究機構 食品研究部門

小堀 俊郎

広島大学大学院 先端物質科学研究科

岡村 好子

Hirokazu Takahashi, PhD (Researcher)
Graduate School of Advanced Sciences of Matter, Hiroshima University

Kyouhei Horio (Graduate student)
Graduate School of Advanced Sciences of Matter, Hiroshima University

Toshiro Kobori, PhD (Senior researcher)
Food Research Institute, National Agriculture and Food Research Organization

Yoshiko Okamura, PhD (Associate professor)
Graduate School of Advanced Sciences of Matter, Hiroshima University

キ ーワード01

Rolling circle amplification、phi29 DNA polymerase、RNA detection

はじめに

近年、抗生物質耐性の病原性細菌や、新興または再興の人畜共通感染ウイルスの出現により、迅速診断法やポイントオブケ
アテスト（POCT）の開発が進められている。これら病原体による被害を最小にし、治療や拡散防止処置、感染経路の特定を円滑に行うためには、先ず初めに菌種の同定と病原性および伝染性の有無の確認を迅速かつ正確に行うことが何よりも重要である。これら病原体を特定する技術としては、ルーチンを主とす
る検査部門
（病院等）
や食品産業においては、感度が高いこと、
ランニングコストが低いことが重視されて、培養法が標準的な分析方法として採用されてきたが、培養可能な菌種に限定さよる核酸検出、例えばLAMP法が分子生物学的な微生物検出方法として期待されているが、等温とはいえ60-65℃といった比較的高い反応温度が必要であり、
かつ、PCRで問題に挙げられているキャリーオーバーコンタミネーションによる擬陽性の問題を克服できていない。そのため、キャリーオーバーコンタ
ミネーションに対して耐性がありつつ、かつ室温程度で反応可能な核酸検出法、特に開発途上の国や地域での使用可能となる方法に注目が集まっている。
我々の研究グループではこれまで主に、Phi29 DNA ポリメ
ラーゼを用いた全ゲノム増幅法を利用した、微生物1細胞のゲノム解析の研究を行っている1)。その一方で、Phi29 DNA ポリ
メラーゼのもう一つの主な利用方法である、ローリングサーク
ル増幅(rolling circle amplification; RCA)法による、RNAのれ、かつ時間が掛かるという大きな欠点がある。
しかし、
ウイル

直接検出方法の開発も行っている。Phi29 DNA ポリメラーゼ

スの場合、その多くが培養できないため、短時間かつ高い正確を利用したRCA法は、室温程度(25-37℃)において等温反応性で病原を特定可能な方法の開発が求められている。

が可能で、かつ簡便なシステムであることから、新たな核酸配培養法に替わる最も代表的な診断法は、抗原抗体反応を利列検出方法として、現在注目と期待が集まっている。本稿では、用したイムノクロマト法だが、検出感度が低く、擬陽性が発生しPhi29 DNA ポリメラーゼを用いたRCA法による、特定の微生

易い、微生物の生死判定ができないなどの理由から、必ずしも物検出方法について概説する。

普及しているという状況では無い。また、PCR法を用いた微生物のDNAやRNAを対象とした分子生物学的測定法は、迅速で正確性や感度に優れている一方で、実施に必要な機材(サーマ
ルサイクラーなど) の導入コストや、増幅産物のキャリーオー
バーコンタミネーションなどによる擬陽性を防止するための専用施設(クリーンルーム)の設置やその維持のためのコスト負担が大きい。このため普及の妨げとなっている。
近年は高価なサーマルサイクラーが不要な、等温増幅法に
1202ローリングサークル増幅(RCA)

まず初めにRCA法について説明しておく。RCA法は1995年にA. Fire(後にRNA干渉に関する研究でノーベル賞を受賞している)らが提唱2)した、環状DNAをゲノムとして持つウイルス

THE CHEMICAL TIMES
ことを鑑みて、迅速診断システムの構築に適していると考えら

環状の1本鎖DNA(ssDNA)を鋳型として、鋳型にハイブリダイれている。
余談ではあるが、P. Lizardiらの開発したHRCA法の増幅メ
カニズムは、その後R. Laskenらのグループにより、
ランダムプにDNAポリメラーゼが戻ってきたとき、前方にあるDNA鎖をライマーを利用した非特異的増幅法であるmultiply-primed

ポリメラーゼが2本鎖DNAを引き剥がしながらDNAを合成す

RCA (MPRCA)8) 法に発展していった。この増幅方法は、操作

る鎖置換(strand displacement)をしながらDNA合成を続手順が非常に簡便で、かつPhi29 DNA ポリメラーゼの高い正け、環状DNAの相補鎖配列がタンデムな状態で並んだ長鎖の確性のため増幅配列にエラーがほとんど含まれないことなどか

ssDNAを合成する方法である（図1a）。この反応の鍵はDNAら、サンガーシークエンス用の鋳型調整方法として世界のシーポリメラーゼの鎖置換活性にある。PCRのような反応温度サイ

クエンス解析拠点で重用されていた。さらに、MPRCA法はランクルが不要なので、全て等温で反応可能であり、従って酵素は

ダムプライマーを利用するため対象配列がほとんど不明でも耐熱性である必然性は無い。

増幅可能なことから、未知の環状DNAゲノムのウイルス検出

このDNA増幅方法が特に注目され始めたのは、1998年におよび3’末端の配列に標的核酸との相補鎖
P. Lizardiら が5’3)配列を持つ南京錠型のパドロックプローブ(Padlock probe;等に利用されている9)。また、大腸菌等のホスト経由ではクロー

さらには近年話
ニングが難しい配列のin vitro cloning10-11)や、題の合成生物のゲノム構築にも利用されている12)。

PLP)を利用したlinear RCA法(これ以降、単にRCAと書いた

また、HRCA法の増幅システムはさらにその後、例えばヒト

場合はこのlinear RCAを指す、図１b) 、さらにはRCAで合成

ゲノムの様な直鎖状ゲノムでも全ゲノム増幅が可能である

されたssDNAに対する2種類の増幅用プライマーを加えたMultiple displacement amplification (MDA)法13)へと発Hyperbranched-RCA(HRCA) 法（図１c）を発表したことによ展しており、現在最も信頼度の高く、また使用頻度の高い方法

ることが大きい。特に、1分子の目的DNA配列の存在をRCA増となっている。

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―ズしたプライマーの3’末端を基点にDNAポリメラーゼがDNAを合成していき、環状の鋳型を一周してプライマーの5’末端特集やプラスミドDNAの複製を模倣したDNAの合成方法である。

幅産物(rolling circle product; RCP)として増幅し、蛍光の検
出プローブによって可視化したことが発端となっている。この論文以降、検出対象はDNAのみならず、抗原抗体反応のシグナル増幅(immuno-RCA)4-6)、生体小分子の有無など多岐にわたっており7)、特に近年はmiRNAの特異的検出に関する論文が多く、全体の8割以上を占めている。

03

RCAでの微生物mRNA直接検出

RCA法を利用したウイルスや微生物の検出は、多少煩雑な特筆すべきは、RCA法では初期に投入したサンプルとRCPと手順を踏むが、検出対象のDNA配列に対するPLP14)を利用したの間では、増幅の開始に関わる核酸の3’末端の数は変化しな方法が報告されていた。
しかしながら、DNAを検出対象とした

いことである。そのため、PCRやLAMP法とは異なり、例えキャ

場合、微生物の生死判定はできず、またRNAを検出対象としたリーオーバーコンタミネーションを起こしても、次の増幅結果

場合には、一度逆転写反応が必須となる。一方、
Phi29 DNA ポに与える影響は小さいことから、施設整備等の初期投資が少な

リメラーゼはDNAだけでなくRNAも、プライマーとしてDNA

くて済むことが期待されている。またPhi 29 DNA ポリメラー合成に利用できる。そのため、検出対象をDNAからRNAに代ゼを利用したRCA法は、室温程度(25-37℃)の等温反応である

替することは理論上可能である。
しかし、RNAとPLPがハイブリ
ダイズを形成(RNA/PLP)しても、既存のT4 DNAリガーゼ(T4Dnl)
でPLPのシール（プローブの末端を結合して環状化）を試みたとき、DNAのそれと比べシール効率が著しく悪化することが他の研究報
告から解っていた 1 5 ) 。そ のため、RNAは逆転写を経てcDNAに変換されて、従来法が適用されていた。
そこで 我 々 は R N A 検 出 用 プ
ローブをPLPから変更し、予め環状化させたDNAプローブを用いることを検討した。予めプローブを環状化しておけば、RNA/PLP
シール効率は無視できるためである。
しかしそれまでのDNAの環状化は、PLPをシール用のオリゴ

図１ Rolling circle amplification (RCA)(a) RCAの基本的な増幅システム(b) パドロックプローブ(padlock probe; PLP)を用いたlinear RCA(c) Hyperbranched-RCA(HRCA)の増幅模式図

DNAとハイブリダイズさせた後、T4Dnlでシールし、その後シール用オリゴDNAをエクソヌクレアー
13THE CHEMICAL TIMES

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ゼ等で除いていたが、除去が完全では無く、残存したシール用
オリゴDNAそのものがノイズの原因と考えられるシグナルノ
イズ比(SN比)の悪化が問題視されていた。
しかし我々は、直04

RPRCA法の実施における問題点

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

接オリゴDNAを環状化できるCircLigaseを利用して、環状化

RPRCA法が微生物のmRNA検出に有効であることが確認

DNAプローブを作成することとした。CircLigaseを用いて事されたが、実際に病原性微生物等を検出するに当たっては問前に目的のオリゴDNAプローブを環状化しておき、未反応（す

題があることが、それ以降の検討で次第に明らかにもなった。

なわち直鎖状）のオリゴDNAは、直鎖状DNAのみを分解する

その問題とは、第一に微生物mRNAの3’末端配列の情報が極Exonuclease I等で処理して予め除くことで、SN比の向上を

端に少ないこと、第二にゲノム配列情報からの3’末端配列の予試みた。そして、この環状化DNAプローブと、標的微生物が発測、すなわち転写終結の予測にブレが大きいことである。

現しているmRNAの3‘ 末端を利用して、RCA反応を起こさせ

次世代シークエンサー(NGS)の登場により、微生物でも多数のるRNA-primed RCA(RPRCA)法として確立した(図2) 。原RNAseqと呼ばれるmRNA配列解析が行われているが、真核16)生物とは異なり、mRNA配列にpoly(A)配列を持たないため、逆転写反応はランダムプライマーで行われている。その結果、RNAseq解析のデータからは、微生物mRNAの3‘末端配列が欠損することとなる。従って、膨大な数のRNAseq解析データがあるにも拘わらず、
この情報はRPRCA反応には全く利用できない。
さらに、対象微生物の全ゲノム情報が公開され、mRNA中のタンパク質のコーディング配列は記載されていても、転写終結配列がどこであるかは記載されることは無い。実際、微生物mRNAの転写終結に関わる配列、特に大腸菌で転写終結のシステムとして提唱されている、20 nt程度の逆方向反復配列(inverted repeats)や、転写終結に関わるρ因子の結合部位(rho loading site)を予測しいくつか予備実験を行ったが、あまり研究が進んでいない分野であり十分な精度で予測ができず、全く使えない可能性が推察された。
また多少予測がズレていても、Phi29 DNAポリメラーゼは‘
3 -5’
リボエクソヌクレアーゼ活性を持つとされ、その相補鎖形成していない余りの部分を分解してRPRCA反応が進むことを期待していたが、我々の研究室のみならず他の研究グループ

もこの活性は全く確認できず 17)、予測が間違っていてRPRCA
反応が開始しないのか、mRNAが無いから動かないのかの区

別が全く付かなくなってしまった。以上のことから、微生物の
図2 RNA-primed RCA(RPRCA)による微生物mRNA検出法の模式図

核微生物のmRNAの3‘末端には、真核生物のmRNAのような

mRNAを検出対象としても、検出できるのは転写終結配列の解析まで明らかとなっている極僅かなmRNAに限られてしまうこととなり、汎用性が低いことが明らかとなった。

poly(A)テールが存在しないため、個々のmRNAの区別に利用
でき、mRNAそのものを直接RCA法におけるDNA合成開始のプライマーとして利用出来ると考えたからだ。
このシステムで、mRNAを特異的に検出可能かどうかを、蛍光タンパク質GFPを発現している大腸菌を用いて確認した。ネガティブコントロールとしては、GFP発現用のプラスミドを保持しているが、GFP mRNAは発現していない菌体を用いた。そ05

RNase H-assisted RCAよる
RNA直接検出法の汎用化

1) RNase H-assisted RCA

そこで我々は、対象RNA配列の位置情報に依存すること無の結果、本システムはGFP mRNAのみを特異的に検出できる

く、プローブをmRNA上に任意に設定できるようにRPRCA反ことが確認された16)。

応システムを見直すこととした。もし任意にプローブ位置を設

このシステムはこれまでのRNA検出システムとは異なり逆転定できれば、mRNA分子内部配列のRNAseqデータも、また真写反応の必要が無く、またRT-PCR等では必須であったRNA抽

核生物のように末端配列にpoly(A)配列があっても全て検出対出時のDNase処理も必要がなく、それまでのRNA検出法に比象として利用できることとなる。

べ、RNA抽出時や検出時の操作が簡便であることが特色であ

ここで我々は、環状DNAプローブとハイブリダイズしたる。
しかしながら、検出感度は1反応当たり109コピーと、PCRやRNA の内部配列をRNase Hで切断、ニックを入れることによ

LAMP法と比べるとかなり見劣りすることも確認されたが、このり強制的に3’末端を作成し、
この3‘ 末端からDNA合成を開始

検出感度の詳細については後述することとする。

させることを思いついた。手始めにin vitro 転写によって作成したGFP mRNAの内部配列に対してプローブを設計し、環状DNAプローブを作成、RNase H存在下・非存在下でRCA反応14

THE CHEMICAL TIMES
濃度が10 µMの時に僅かにPLPを環状化することができたが、上にプローブを設定でき、
かつRCPが確認できた18)。

ATP濃度が高くなると、全くシールすることができず、これについては既報通りであった。一方で、T4RNL2は、いずれのATP
濃度においてもPLPを環状化することができず、
これは複数の認されてしまった。これは環状DNAプローブにミスマッチハイ

リガーゼの基質特異性を比較した既報 15)と同じ結果であり、ブリダイズを起こした他のRNAに対してもRNase Hがニック

RCA反応にT4Rnl2が利用できるとした既報とは真逆の結果を作り、そこからDNA合成が開始されRCA反応が起きているであった。この結果から、我々のRNA検出用のRCAの反応にはものと予想されたため、環状プローブの配列等を色々と変更しSplintRを利用することとした。

てみたが、結果は全く改善されなかった。
そこで、環状化プローブの使用は諦めて、PLPを利用したRCA法に切り替え、新たにRNase H-assisted RCA(RHa-

3)プローブの設定箇所の検討

次に、PLPの設定箇所がmRNA上の位置によって、そのシー

RCA)法19)として確立することとした。標的RNAとハイブリダイ

ル効率に影響を与えるかどうかを検討した。Circligaseを利用ズしたPLPのみ環状化すれば、例えPLPに非対象のRNAがハイ

しプローブを予め環状化した場合には、プローブのmRNA上ブリダイズしRNase Hによってニックが形成されても、RCA反の位置は基本的に環状化効率に影響を与えない。
しかし、PLP応による永続するDNA合成は起こらないはずである(図3a)。

の設定位置により、例えばRNAの二次構造によるハイブリダイ
ズの効率や、RNA配列そのものがシール効率に大きく影響を

2)リガーゼの検討

この方法を用いるに当たって問題なのは、前述の通りT4Dnl

与えるようであれば、任意の配列をプローブとしては設定できないことになる。

ではシール効率がRNA/PLPを対象とした場合に低いことにあ

そこで、GFP mRNAの内部配列中にプローブを5箇所設定る。そこで、当時新たにNew England Biolabs社から販売がし、環状化効率を確認した。その結果、環状化効率に若干の差開始され、RNA/PLPも環状化可能であると推測されたSplintRはあるものの、どの位置のプローブも環状化することが可能でリガーゼ(SplintR)を利用して、PLPの環状化を行い、T4Dnl

あり(図3b, d)、RNase Hの添加によりRCPが生成されることと比較することとした。また同時に、他の論文でRNA/PLPをが確認された。今回の結果から、例えばRNAseqのデータのよ

シールできる能力があると報告のあった、T4 RNAリガーゼ２

うに、mRNAの配列の一部しかない無い情報からでも、基本的(T4Rnl2)20)も比較対象として検討した。その結果、SplintRのみにはRHa-RCA用のPLPを設計することが可能であることが示

が効率良くRNA/PLPでもPLPの環状化が可能であり、反応液

唆された。

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しかしRNAサンプルをGFP mRNAを発現した大腸菌の全RNAに変更したところ、GFPの発現の有無に関係なくRCPが確

特集が起こるかどうか確認した。その結果、予想通りに任意の配列

中のATP濃度にも依存しなかった(図3c)。また、T4DnlはATP

図３(a) RHa-RCAによるRNAの検出模式図(b) 設定したP1-P5 プローブの、GFP mRNA上の位置、および5‘末端と3’末端の塩基(c) ライゲースの環状化効率の比較。各レーン上の数字はATP濃度を示す。Linearは未反応のオリゴヌクレオチド、CircularはCircLigaseで環状化したssDNAコント
ロール。Mはサイズマーカー。黒矢印は直鎖状ssDNA、青矢印は環状化ssDNA、赤矢印はヌクレアーゼ処理によるデブリ。
(d) 各 プローブの環状化効率の比較。Lは未反応のオリゴヌクレオチド、CはCircLigaseで環状化したssDNAコントロール。Mはサイズマーカー。黒矢印は直鎖状
ssDNA、青矢印は環状化ssDNA、赤矢印はヌクレアーゼ処理による破片。

15

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特集4)RNase Hの濃度の検討

RCPが確認され、おおよそ10〜20 ngの極微量のRNAからで次に、RNase H濃度が濃すぎると、PLPにハイブリダイズしも特異的に検出できることが確認された(図4b)。また、GFPを

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たRNAが全て分解されてしまい、DNA合成が開始できない恐

誘導していない大腸菌のRNAからは、一切のRCPが検出されれがあったため、至適なRNase H濃度を決定することを試みていないことから、
GFP mRNAのみを特異的に検出しているこ

た。PLPとしてはGFP mRNAで設定したP4プローブを用い、とが確認された。

RNaseH濃度を変え、最終的なRCP量で比較した。
その結果、おおよそRCA一反応当たり0.06〜0.3 unitsが至適であり、0.6 units以上の時は予想通りRNAの分解のためにRCP量が減少することも確認された。
4)検出限界の算定

06

RCA法の検出限界について

RPRCAも今回開発したRHa-RCAも共に検出限界が、
おおよ

次に、RHa-RCA法の検出限界を、大腸菌から抽出した全in vitro 転写した濃度が既知のGFP mRNAを加えRNAに、て検討した。また、本RHa-RCA法が、RPRCA法で用いた環状

PCRやLAMP法には遠く及ばない。
そ109 copies/反応であり、
しかしこれは、RCA法の検出限界では無く、実際の所は、検出に使用するSYBR Green IIの検出限界によるところが大きい。

DNAプローブとは異なり、対象mRNA以外のRNAやDNAのRCA反応で合成されるDNAは、既存のPCR等のDNA増幅

影響を受けないことを、GFP mRNAを加えていない全RNAを方法とは異なり、指数関数的な増幅を示さない。基本的に、1つ用いて確認した。

の環状DNAプローブから作成されるssDNAは、DNA合成酵

その結果、検出限界は設定したPLPによって多少異なるもの

素の[合成速度]×[時間]で決定されている。Phi29 DNAポリメの、概ね1〜5 fmol、おおよそ1反応当たり10 コピーあること

ラーゼの合成速度は〜200 nt/secであると推測されており、から、以前のRPRCA法と比べて遜色が無いことが確認された

市販されているDNA合成酵素の中でも非常に早い。
しかし、例(図4a)。また、GFP mRNAを添加していない全RNAからは、一え200 nt/secでも、2時間のRCA反応で合成できるssDNA

切のRCPが検出されていないことから、GFP mRNAのみを特は1個のRCP当たり1.44×10 6 baseであり、重さとしては僅異的に検出していることが確認された。

か約1.4 fgにすぎない。SYBR Green IIの検出限界は電気泳

9さらに実際にGFP遺伝子をプラスミドの形で保有している大動のバンドで約2 ng程度であり、RCPが拡散した液中での検腸菌を用いて、GFP mRNAを誘導、および非誘導の状態で培

出感度はそれより劣ることが容易に推測される。従って、SYBR

養後に全RNAを抽出し、RHa-RCA法によりGFP mRNAの検出

Green IIを使った場合の検出感度は、
どう頑張っても10 6 〜を試みた。その結果、GFPを誘導した大腸菌のRNAからのみ、

107 copies/反応を超えることができないものと推測される。

in vitro のRCA法の検出系では、様々な方法で極微量
現在、のRCPを検出する方法が多数報告されており、検出システムに工夫を行えば、RCA法はより高感度化が可能であると考えている。

07in situ RHa-RCAによる微生物検出

一方で前述のように、RCA法は1分子のRCPを可視化できるために注目を浴びたと記述したが、これは主に蛍光顕微鏡下などでの観察によるものである。実際in situ でRCA反応を行い、RCPを検出用蛍光プローブで検出する系では、ゲノム中の1分
子のDNA配列やmRNAなどを可視化している報告が既に複数ある17)。RCPはin situ の検出において、PCR産物のようには拡散しにくく、またRCPはPLPの相同配列のタンデムリピートであり、70 baseのPLPの場合、PCRは2時間の反応で約2万回もの繰り返し配列となっており、蛍光プローブで検出するのに適した状態となっている。
そこで、今回開発したRHa-RCA法を大腸菌内で発現しているGFP mRNAの検出に適応可能かどうか試してみた。その結果、GFPを誘導した大腸菌内でスポット状に蛍光シグナルが観察された(図5)。また、非誘導の大腸菌ではシグナルが全く確認できない。従って、例え検出対象の配列をDNAとして保持し
図４ RHa-RCAによるGFP mRNAの検出(a) In vitro 転写したmRNAを用いた各プローブの検出感度の検定。反応が終了したPCRプレートに青色光を当て、SYBR Green IIを可視化している。
(b) 大腸菌全RNAを用いたGFP mRNAのリアルタイム検出。

16ていても、蛍光シグナルは観察されないことから、RHa-RCAは
RNAのみを特異的に検出していることが明らかとなった。大腸
菌内の蛍光シグナルがスポット状に観察されたことから、
これ

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では菌叢全体の大まかな情報は得られるが、各々の微生物のin situ
役割を明らかにすることは難しい。今回我々が開発した、

うことができれば、菌叢において「誰が何をやっているか？」が解明できるかもしれないと期待している。
本研究は、JST戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（CREST）、「 藻類・水圏微生物の機能解明と制御によるバイ
オエネルギー創成のための基盤技術の創出」、およびJST・
図５ RHa-RCAによる大腸菌で発現しているGFP mRNAのin situ 検出
RHa-RCA後に、Alexa-568で標識したオリゴヌクレオチドでRCPを検出。明視
野像と蛍光像をマージして示している。

までのin situ RCAの報告を踏まえれば、
これら一つ一つのス
ポットシグナルが、それぞれ一つ一つのmRNA由来である可能

A-STEPの支援によって実施した。
参考文献
1) 髙橋宏和, 岡村好子, 小堀俊郎, THE CHEMICAL TIMES 238, 22-27(2015).

性がある。
しかし、我々の保有している顕微鏡の解像度では、そ

2) A. Fire, S. Q. Xu, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92(10), 4641-4645(1995).

れぞれのスポット数を計測することは、大腸菌の細胞が小さす

3) P. M. Lizardi, X. Huang, Z. Zhu, P. Bray-Ward, D. C. Thomas, D. C. Ward,
Nat. Genet. 19(3), 225-232 (1998).

ぎるため残念ながら難しい。細胞の大きさがもっと大きい真核生物のmRNAを検出した場合、これらの個々のシグナルが、1分子のmRNAに対応しているかどうかが明らかになるものと思われる。
1分子のmRNAに1分子の蛍光標識プローブでラベルを行っても十分なシグナルが得られない為、これまでの微生物でのFluorescence in situ hybridization (FISH)は、主に細胞内で分子数の多い16S rRNAを対象とすることが一般的であった。
しかし、16S rRNAを対象とした場合には菌種が解るのみである。これまでにも、微生物のみならずmRNAを対象としたFISH法では、検出プローブをHorseradish peroxidase(HRP) でラベルし、シグナル増幅を行う方法が開発されてきたが、これらの方法はシグナルそのものが細胞内に拡散しやす
く、少なくともmRNAの定量性は無かった。定量性を持たせるために開発された、single molecule FISH (smFISH)法21)は、1種類のmRNAに対し50以上の相補鎖配列で、かつ同一蛍光標識プローブでFISHを行うことにより、1分子のmRNAに多数の蛍光標識をハイブリダイズさせることで実現可能となったが、プローブ作成のコストが高い。

in situ RHa-RCAとFISHの組み
今回我々が開発している、

合わせは、簡便でありながら、
コストはsmFISHに比べて格段に低く、未だ詳細な検討が必要な部分は残っているものの、
smFISH並みにmRNAの定量ができる可能性がある。

084) B. Schweitzer, S. Wiltshire, J. Lambert, S. O’Malley, K. Kukanskis, Z.
Zhu, S. F. Kingsmore, P. M. Lizardi, D. C. Ward, Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S. A. 97(18), 10113-10119 (2000).

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

RHa- RCAによる微生物mRNAを可視化し、かつ定量化まで行特集

ゲノム解析や、RNAseqが行われている。
しかし、これらの手法5) Y. Gusev, J. Sparkowski, A. Raghunathan, H. Ferguson Jr., J. Montano,N. Bogdan, B. Schweitzer, S. Wiltshire, S. F. Kingsmore, W. Maltzman,
V. Wheeler, Am. J. Pathol. 159(1), 63-69 (2001).
6) T. Kobori, A. Matsumoto, H. Takahashi, S. Sugiyama, Anal Sci 25(12),1381-1383 (2009).
7) M. Stougaard, S. Juul, F. F. Andersen, B. R. Knudsen, Integr Biol (Camb)3(10), 982-992 (2011).
8) F. B. Dean, J. R. Nelson, T. L. Giesler, R. S. Lasken, Genome Res. 11(6),1095-1099 (2001).
9) A. Rector, R. Tachezy, M. Van Ranst, J. Virol. 78(10), 4993-4998(2004).
10) C. A. Hutchison, 3rd, H. O. Smith, C. Pfannkoch and J. C. Venter, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(48), 17332-17336 (2005).
11) H. Takahashi, K. Yamamoto, T. Ohtani, S. Sugiyama, BioTechniques ,47(1), 609-615 (2009).
12) C. A. Hutchison, R.-Y. Chuang, V. N. Noskov, N. Assad-Garcia, T. J.
Deerinck, M. H. Ellisman, J. Gill, K. Kannan, B. J. Karas, L. Ma, J. F.
Pelletier, Z.-Q. Qi, R. A. Richter, E. A. Strychalski, L. Sun, Y. Suzuki,
B. Tsvetanova, K. S. Wise, H. O. Smith, J. I. Glass, C. Merryman, D. G.
Gibson, J. C. Venter, Science , 351(6280), aad6253 (2016).
13) F. B. Dean, S. Hosono, L. Fang, X. Wu, A. F. Faruqi, P. Bray-Ward, Z. Sun,
Q. Zong, Y. Du, J. Du, M. Driscoll, W. Song, S. F. Kingsmore, M. Egholm,
R. S. Lasken, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(8), 5261-5266 (2002).
14) J. Banér, M. Nilsson, M. Mendel-Hartvig, U. Landegren, Nucleic Acids
Res. 26(22), 5073-5078 (1998).
15) D. R. Bullard, R. P. Bowater, Biochem. J. 398(Pt1), 135-144 (2006).
16) H. Takahashi, A. Matsumoto, S. Sugiyama, T. Kobori, Anal. Biochem.
401(2), 242-249 (2010)17) C. Larsson, I. Grundberg, O. Söderberg, M. Nilsson, Nat. Methods 7,395-397 (2010).

おわりに現状のin vitro のRHa- RCA法では、未だ検出レベルが、PCR

やLAMP法に比べ使用に耐えうるものでは無いが、検出方法に

18) T. Kobori, H. Takahashi, Anal Sci 30(1), 59-64 (2014).
19) H. Takahashi, M. Ohkawachi, K. Horio, T. Kobori, T. Aki, Y. Matsumura,
Y. Nakashimada, Y. Okamura, Sci Rep 8, 7770 (2018).
20) Y. Cheng, X. Zhang, Z. Li, X. Jiao, Y. Wang, Y. Zhang, Angew Chem
Weinheim Bergstr Ger 121(18), 3318-3322 (2009)21) A. Raj, P. van den Bogaard, S. A. Rifkin, A. van Oudenaarden, S. Tyagi,
Nat Methods , 5(10), 877-879 (2008)

何らかのアイデアが加われば、理論的には1分子の対象RNA配in situ RHa- RCAで列の検出が行えると期待している。また、

あれば、1細胞レベルでmRNA配列を指標に微生物を特定可能であり、培養やRNA抽出を行わずに病原微生物やRNAウイル
スを、比較的簡便に検出することが可能であると考えている。
細胞内でのmRNAの検出・定量化は、遺伝子発現の正しい理解には必須である。近年環境から、特に腸内細菌叢や土壌細菌叢などの、「培養できない微生物」
を含む細菌叢において、
メタ17