有性生殖クマムシの進化的背景解明に向けた生殖行動と配偶子形態観察2020 年度

杉浦 健太

学位論文 博士(理学)

有性生殖クマムシの進化的背景解明に向けた生殖行動と配偶子形態観察2020 年度
慶應義塾大学大学院理工学研究科

杉浦 健太

目次
第 1 章 序論
1-1. 生殖がもたらす進化への影響

1

1-2. 緩歩動物クマムシ

21-3. クマムシの生殖様式とその研究

71-4. 本研究の目的

9

第 2 章 有性生殖クマムシの交尾行動観察2-1. 緒言112-2. 材料及び方法
2-2-1. 実験動物の飼育

142-2-2. メスの成熟度判定

14

2-2-3. 雌雄の判定

15

2-2-4. 交尾行動の観察

152-2-5. 酢酸オルセイン染色

162-2-6. 交尾から産卵まで、及び産卵から孵化までの所要時間計測

16

2-2-7. DAPI 染色

162-3. 結果
2-3-1. 交尾行動の観察

18i

2-3-2. 交尾後の現象観察

21

2-3-3. 染色体動態

242-4. 考察27

2-5. 結言31

第 3 章 Macrobiotus shonaicus の日本分布
3-1. 緒言

32

3-2. 材料及び方法
3-2-1. クマムシの採取と飼育35

3-2-2. DNA バーコーディングと系統解析

36

3-2-3. 形態観察

37

3-2-4. 核型観察と交尾行動

373-3. 結果
3-3-1. Macrobiotus shonaicus 日本分布

403-3-2. 形態の多様性解析

40

3-3-3. 核型と交尾行動

463-4. 考察47

3-5. 結言50ii

第 4 章 クマムシの配偶子形態変化と比較
4-1. 緒言

51

4-2. 材料及び方法
4-2-1. 実験動物の飼育と交尾観察53

4-2-2. 精子形態観察

534-2-3. SEM による観察53

4-3. 結果
4-3-1. 精巣内精子の形態

554-3-2. 貯精嚢内精子の形態

554-3-3. 卵母細胞と卵の SEM 観察

59

4-4. 考察63

4-5. 結言72

第 5 章 結論

73

参考文献

77

公刊論文及び学会発表の目録

94

謝辞

iii

第 1 章 序論
1-1. 生殖がもたらす進化への影響
生殖は生物が次世代を産生する過程であり、生命の始まりを司る極めて重要なプロセスである。このプロセスは複数の遺伝情報の混合を伴うか否かによって有性生殖と無性生殖に二分できる。この 2 つは生殖コストと遺伝的多様性のトレードオフを孕んでおり、一般的な有性生殖生物では雌雄配偶子の融合を行うことで遺伝的多様性を獲得することができる (Crow, 1994)。オスとメスが異個体として生存する雌雄異体種では配偶子の融合のために他個体を探索、交尾を行う必要があり、生殖コストが高い。
一個体内で雌雄配偶子双方を産生可能な雌雄同体種では、自らの配偶子を受精させる
自家受精と、他個体の配偶子と融合する他家受精の両者を行うことで、生殖コストと遺伝的多様性のトレードオフで生じるギャップを小さくすることができる (Tomlinson,
1966; Clark, 1978)。有性生殖による遺伝的多様性は、生物の環境への適応を許容し、また進化の起爆剤ともなり得る (Hamilton et al., 1990)。一方で一個体から次世代を産生できる無性生殖生物では、一般的に遺伝的多様性に乏しいものの、生殖コストが低く増殖に優れており、個体数を増やすことで生存の可能性を高めている。このように生殖様式の選択はその種の存続と繁栄、また進化にも大きな影響を与えている (Bell,1982; Bengtsson, 2003)。
さらに、有性生殖を行う生物には、近縁種間での交雑によって更なる遺伝的多様性の獲得もあり得ることから、無性生殖と比較して進化を促進する可能性を秘めている(Hamilton et al., 1990; Harrison, 1990)。2 種間の親集団での交雑によって産生されたハイブリッドが環境への高い適応度を持つ場合、そのハイブリッドは新たな種として分化する可能性がある。一方でハイブリッドの適応度が低ければ、親集団より優位とならずにハイブリッドは持続しない (Ayala & Fitch, 1997)。ハイブリッドの産生と種として

1

の分化は、個体間の不稔性を示す生殖隔離によって左右されることも論じられている(Schluter, 2001)。同集団の稔性に対する異集団間の稔性が生殖隔離の強弱の指標となり、異集団間での稔性が低い場合は生殖隔離が強いと表現される (Merrel, 1950;
Malagolowkin-Cohen et al., 1965)。親集団の 2 種間の生殖隔離が強ければハイブリッドの産生そのものが望めず、親集団の種分化を完結させる方向に自然選択がはたらく(Arnold, 1997)。ハイブリッドと親集団の生殖隔離が弱い場合は、ハイブリッドが親集団から分離されず、種分化を阻害する (Servedio & Noor, 2003)。Drosophila 属では種の閾に重要な生殖隔離について様々な観点から報告されている。行動的な観点からは求愛行動に種差が生じていることが明らかとなっており、異種間での余分な交尾を阻害していると考えられている。また交尾器にも形態的差異があり、異種間での雌雄交尾器の結合が物理的に困難となっている例が報告されている (Carmel et al., 2016)。生殖隔離による種の分化は、生物が生息する地域の違いに依存した個体間の出会いの減少によっても引き起こされる (Endler, 1977; Coyne & Orr, 2004)。例えばアメリカ大陸に生息する Drosophila 属では、山脈を境に西側に Drosophila athabasca、東側にDrosophila mahican が分布しており、地理的な隔離が種分化を促進したと推測されている (Yukilevich et al., 2018)。このように種の分岐を論ずる上で生殖行動、生殖能における差異を多面的に理解することは極めて重要で、生物の進化的背景を考察するために生殖プロセスの知見を拡充する必要がある (斎藤ら, 2012)。

1-2. 緩歩動物クマムシ
緩歩動物門の生物は、総称してクマムシと呼称される。体長が 1 mm 以下のクマム
シは、顕微鏡の発達により Goeze が 1773 年に発見し (Goeze, 1773)、Doyère によって1840 年に緩歩動物門 (phylum Tardigrada) と名付けられた (Doyère, 1840)。緩歩動物門に属する全ての生物は 4 対 8 本の脚を有し、その脚に節がないことが特徴である。緩2

歩門は異クマムシ綱 (Heterotardigrada)、真クマムシ綱 (Eutardigrada) と中クマムシ綱(Mesotardigrada) の 3 綱を含むとされてきたが、2019 年の再編により Apotardigrada が新設された (Guil et al., 2019)。現在 8 目 31 科 150 属から 1339 種と 34 の亜種が確認されており (Degma et al., 2020, Table 1-2-1)、その種数は増え続けている。海産種、陸生種ともに存在するが、主に水中に生息する。海産種はほぼ全て異クマムシ綱に分類される。
形態的特徴は各綱間で顕著に異なる (Fig. 1-2-1)。真クマムシの身体は長球状で、脚部以外に目立った装飾がない (Fig. 1-2-1A)。頭部には口と、それに付随した咽頭があり、食物の摂取を行う。第三脚と四脚間の腹部側に、排泄と産卵を行う総排泄孔を持ち、外生殖器がない (Altiero et al., 2018)。Apotardigrada は真クマムシと比較してややシャープな長球状で、口部に感覚器と考えられているひだを持つ (Fig. 1-2-1B)。真ク
マムシと同様に腹部に総排泄孔を持ち、外生殖器がない (Altiero et al., 2018)。異クマ
ムシは種によって形態が大きくことなる。寸胴状の種や平板状の種が存在し、また体部に様々な装飾を持つことが多い (Fig. 1-2-1C)。腹部に排泄孔、腹部または側部に生殖孔を独立して持つ (Suzuki & Kristensen, 2014; Altiero et al., 2018)。
異クマムシ、中クマムシを除く多くの陸生種が実験環境下で飼育可能であり、様々な研究に用いられている。多くの陸生種は土中や枯葉、コケの中といった、湿潤と乾燥を繰り返す環境に生息している。これらのクマムシは周囲に水がある湿潤条件下で生理活動を行い、乾燥時には身体を縮めたタル状態となる。タル状態では体内の水分を減らし、代謝を止めることができる。再水和とともにタル状態から復帰し、生命活動を再開させる。このタル状態下では高低温、高圧、真空、放射線の被曝や地球外環境でも生き残ることができる極限耐性を獲得し (Horikawa et al., 2006; 2008; 2009; 2012;2013; Jönsson et al., 2005; Rebecchi et al., 2007; Jönsson et al., 2008; Persson et al., 2010;3

Altiero et al., 2011; Jönsson et al., 2013; Hashimoto et al., 2016; Jönsson et al., 2016; Yoshida
et al., 2017)、個として長い期間生存することが可能である。

4

Table 1-2-1. 緩歩動物門
Phylum (門)Class (綱)Order (目)Family (科)Genus (属)†Anisonychidae

Anisonyches

Archechiniscidae

Archechiniscus

Batillipedidae

Batillipes

Coronarctidae

Species (種)†Batillipes noerrevangi

Coronarctus
Trogloarctus
Halechiniscus

Halechiniscidae

Wingstrandarctus

Orzeliscus belopus

Orzeliscus など
Arthrotardigrada

Heterotardigrada

Neoarctidae

Neoarctus

Neostygarctidae

Neostrygarctus

Renaudarctidae

Tardigrada

Echiniscoidea

Nodarctus
Renaudarctus

Stygarctidae

Stygarctus など

Styraconyxidae

Angursa など

Tanarctidae

Actinarctus など

Echiniscoididae

Echiniscoides など

Carphaniidae

Carphania

Oreellidae

Oreella など

Echiniscidae

Pseudoechiniscus

Echiniscusなど
Mesotardigrada

Thermozodia

Thermozodiidae

Thermozodium

Apotardigrada

Apochela

Milnesiidae

Milnesium など

Echiniscoides sigismundi

Echiniscus japonicus
Echiniscus testudo
Thermozodium esakii
Milnesium tardigradum
Milnesium inceptum
Milnesium pacificum

Eohypsibioidea

Eutardigrada

Eohypsibiidae

Eohypsibius など

Calohypsibiidae

Calohypsibius

Hypsibiidae
Hypsibioidea

Hypsibius

Hypsibius exemplaris

Acutuncus など

Acutuncus antarcticus

Microhypsibiidae

Microhypsibius

Ramazzottiidae

Ramazzottius など

5

Ramazzottius varieornatus

Table 1-2-1. 緩歩動物門 (continued)
Phylum (門)Class (綱)Order (目)Isohypsibioidea

Family (科)Genus (属)†Species (種)†Doryphoribiidae

Thulinius など

Thulinius itoi

Halobiotidae

Halobiotus

Hexapodibiidae

Hexapodibius など

Isohypsibiidae

DianeaIsohypsibius など
Macrobiotus

Tardigrada

Eutardigrada

Macrobiotidae

Paramacrobiotus
Xerobiotus など

Macrobiotoidea

Murrayidae

Murrayon など

Richtersiidae

Richtersius など

Beornidae

Beorn

Necopinatidae

Necopinatum

Isohypsibius dastychi
Macrobiotus shonaicus
Macrobiotus hufelandiParamacrobiotus richtersi
Xerobiotus pseudohufelandi

Richtersius coronifer†属以降は著名な属、種のみを記載した

Fig. 1-2-1. 様々なクマムシ
真クマムシの Macrobiotus shonaicus (A)、Apotardigrada の Milnesium pacificum (B)と異ク
マムシの Echiniscus sp. (C)。走査型電子顕微鏡写真。右側が頭部。
Scale bars: = 50 µm。

6

1-3. クマムシの生殖様式とその研究クマムシにおける生殖システムは生殖様式の差異と産卵方法によってグループ化することができる。種によって有性生殖、無性生殖の二通りの生殖様式を使い分けており、無性生殖種はメスがメスのみで産卵を繰り返す単為生殖を行う。一方で産卵方法
は、メスが環境中に産卵する自由産卵種と (Fig. 1-3-1A)、メスが産卵と脱皮を同時に行い自らの脱皮殻内に産卵する脱皮殻産卵種に二分できる (Fig. 1-3-1B)。生殖様式と産卵方法に相関はなく、有性生殖を行う自由産卵種、脱皮殻産卵種と、単為生殖を行う自由産卵種、脱皮殻産卵種の 4 通りが存在する。

Fig. 1-3-1. クマムシの産卵
自由産卵する M. shonaicus (A)と、脱皮殻産卵をする Mil. pacificum (B)。
Scale bars: = 100 µm。

7

単為生殖種はその増殖スピードに有意性があり、緩歩動物におけるモデル生物として単為生殖種の Hypsibius exemplaris Gąsiorek, Stec, Morek & Michalczyk, 2018 やRamazzottius varieornatus Bertolani & Kinchin, 1993 が様々な研究に用いられている。
Hypsibius exemplaris は産卵から孵化までが約 4.5 日とクマムシの中では短いこと、孵化率がほぼ 100%で孵化日数の個体間分散が少ないこと、世代日数が約 1 週間とショー
トスケールであることから (Yoshida et al., 2019)、発生生物学における研究やゲノミク
スに盛んに用いられている (Tenlen et al., 2012; Smith et al., 2016; Arakawa et al., 2016;
Gross et al., 2017; Yoshida et al., 2017)。一方で H. exemplaris に比較して R. varieornatus
は極限環境耐性が顕著に高く (Horikawa et al., 2008)、乾燥時の遺伝子発現量解析や細胞、DNA 保護タンパク質の単離、同定といった目的に多様されている (Yamaguchi etal., 2012; Tanaka et al., 2015; Hashimoto et al., 2016; Yoshida et al., 2017)。
有性生殖を行う種では、生殖に関係する報告がいくつかなされている。交尾と考えられる行動は 6 種で観察、報告され (von Erlanger, 1895; Henneke, 1911; von Wenck,
1914; Marcus, 1929; Baumann, 1961; Kristensen, 1979; Bertolani & Rebecchi, 1999; Suzuki,
2008; Bingemer et al., 2016)、その内 5 種は脱皮殻産卵種、残り 1 種は自由産卵を行う異クマムシであった。2000 年代までの報告では、雌雄のクマムシが近接している、もしくはオスがメスの付近をしきりに徘徊する、といった観察の報告に留まっていた。
Bingemer らは脱皮殻産卵を行う真クマムシ Isohypsibius dastychi Pilato, Bertolani &Binda, 1982 を用いて、射精の瞬間を動画で捉えられることに成功し、クマムシの射精を含む交尾行動を包括的に記載した初めての報告をした (Bingemer et al., 2016)。以降、I. dastychi は脱皮殻産卵を行うクマムシの生殖行動を明らかにするための材料として研究対象となり、メスが産卵するタイミングに合わせてオスがアプローチを開始す
ること、また交尾成功率はオスとメス間の距離依存的に低下することが明らかになっ8

た (Bartel & Hohberg, 2020)。一方で自由産卵を行うクマムシでは、射精まで含めた交尾行動の記載はなかった。
クマムシにおける生殖隔離に関する実験は、2020 年に Stec らによって初めて報告された。Paramacrobiotus areolatus Murray, 1907 に近縁な 2 群体間にて、異群体間の交配では産卵率が減少傾向となること、またヘテロ接合体の産生が示されたが、これらの群体は DNA マーカー、並びに形態比較では別種と区別されていない (Stec et al.,2020)。
有性生殖種に特徴的な雄性配偶子の形態報告も、複数の種を用いて行われてきた(Rebecchi & Guidi, 1991; 1995; Guidi & Rebecchi, 1996; Rebecchi, 1997; 2001; Rebecchi etal., 2003; 2011; Bertolani et al., 2014; Suzuki & Kristensen, 2014; Guidetti et al., 2019)。チョ
ウメイムシ科 (Macrobiotidae) のクマムシ Paramacrobiotus、Diaforobiotus 属では先体が長いのに対し、Macrobiotus、Xerobiotus、Mesobiotus 属では先体が短く、精子の概形は属によって異なることが示唆されており、Suzuki らの報告では Orzeliscus cf. belopus の核傍小胞 (paranuclear vesicle) が排出管内で崩壊すると示唆された。一方で単一の種を用いて生殖行動と配偶子形態を含めた生殖プロセスを網羅的に明らかにした研究はな
かった。

1-4. 本研究の目的
現在緩歩動物門クマムシには約 1400 種が確認されており、陸海問わず地球上に広く生息している。多くの陸生種は極限環境耐性を持ち、個としての生存能力を高めてきた。一方で種としての生き残りを左右するのは、その個体数を増殖させる現象であ
る生殖である。単為生殖では効率の良い個体数の増殖を見込めるが、多様性を産み出す有性生殖は種数の繁栄に欠かすことできない。クマムシの繁栄にはこれらのような個として、そして種としての生存を懸けた戦略があるものと考えられるが、有性生殖9を行うクマムシ 1 種における、生殖行動から配偶子の形態、また受精メカニズムに関する網羅的な知見は皆無に等しかった。本研究では自由産卵を行う有性生殖真クマム
シ Paramacrobiotus sp.と Macrobiotus shonaicus Stec et al., 2018a を用いて交尾行動と配偶子の形態、加えて産地の異なる個体間での生殖隔離の有無を観察し、有性生殖システ
ムを包括的に解明することで、クマムシの種の繁栄と進化的背景に迫る基盤の作成を目的とした。
まず第 2 章では自由産卵種の生殖行動を明らかにするため、2 種の求愛、交尾行動
を観察、録画し、詳細な交尾記録の記載を行った。第 3 章では M. shonaicus の日本国
内における地理分布を調査し、雌性配偶子の形態の比較と群体間の交尾行動を観察した。第 4 章では上記 2 種を用いて配偶子の形態観察することで、2 種間で雌雄配偶子の形態比較と、生殖プロセス中の動態を調べた。第 5 章では総括と今後の展望を述べた。

10

第 2 章 有性生殖クマムシの交尾行動観察2-1. 緒言
生殖行動は有性生殖動物にとって、雌雄配偶子の出会いを左右する極めて重要な生
命活動の一つである。Drosophila 属では種によって、メスに対するオスの求愛行動が異なることが報告されており (Ferveur, 2010)、行動の差異が個体間での交尾数を減少させることにより生殖隔離が強まり、種としての独立と進化を促してきたと考えられている。
クマムシは種によって、メスのみで産卵を繰り返す単為生殖と、オスとメスの遺伝的混合を伴う有性生殖を使い分けている (Bertolani, 2001)。単為生殖種では減数分裂を行う種と行わない種が存在する (Bertolani and Buonagurelli, 1975; Bertolani, 2001)。有性生殖の中でも雌雄の配偶子を一個体内で産生できる雌雄同体種は、真クマムシの数属と海に生息する異クマムシで観測されており (Bertolani, 2001; Šatkauskienė, 2012;
Suzuki and Kristensen, 2014)、その内の 2 種では自家受精を行っていると示唆されている (Bertolani and Rebecch, 1999; Rebecchi et al., 2000a)。有性生殖においてオスとメスが別個体として生息する種では、単為生殖や自家受精と比較して遺伝的多様性は拡充すると考えられるが、生殖を行う相手を見つけなくてはならない。配偶個体を探索、また生殖を行うために、求愛行動や交尾行動は極めて重要であり、個体数の増減を左右する大きな要因である。
クマムシにおいて交尾と見られる行動は 6 種で観察、報告されてきた (vonErlanger, 1895; Henneke, 1911; von Wenck, 1914; Marcus, 1929; Baumann, 1961; Kristensen,
1979; Bertolani and Rebecchi, 1999; Suzuki, 2008; Bingemer et al., 2016)。Bingemer らは脱皮殻産卵種 I. dastychi を用いて交尾行動の録画、記録を行った。当該報告によると一連の交尾行動はメスの脱皮によって誘発される。卵巣内に卵母細胞を充填したメスが11

脱皮を開始すると、近辺をオスが徘徊する。その後オスはメスの頭部にしがみつき、
腹部を屈曲させる。メスの産卵が始まると、オスは総排泄孔から精子を水中に放出する (Bingemer et al., 2016)。メスの脱皮に伴うオスの交尾行動の開始は、メスからの距離に依存する (Bartel & Hohberg, 2020)。メスから 1.0 mm の距離にいるオスは 90%以上
が交尾行動を開始するのに対し、4.0 mm の距離にいるオスが交尾行動に至ったのは約40%であった (Bartel & Hohberg, 2020)。以上のことから I. dastychi のメスは、交尾行動誘発に必要な性フェロモンを分泌しているものと示唆された。また I. dastychi の精子は産卵後に放出されるため、脱皮殻内の卵と受精に至ると推測され、受精は体外で起きると示唆された。
いくつかの自由産卵種は卵母細胞を保持する卵巣と、産卵孔である総排泄孔を結ぶ
輸卵管に、精子を貯蓄する貯精嚢が付随しているため (Altiero et al., 2018, Fig. 2-1-1)、
受精は体内で進行するものと考えられてきた (Bertolani & Rebecchi, 1999; Bertolani,
2001; Rebecchi, 1997; Rebecchi & Guidi, 2000)。しかしながら自由産卵種における交尾行動の詳細な記載、また録画はなく、生殖プロセスの多くは未解明だった。

Fig. 2-1-1. メス体内の貯精嚢の位置
メス体内では貯精嚢は卵巣と総排泄孔を繋ぐ輸卵管に付随している。黄丸は卵母細胞を示す。右図赤点線はメス(左図)の拡大図。

12

そこで本章では有性生殖を行う自由産卵クマムシの生殖プロセスを明らかにするた
め、実験室環境で飼育、培養が可能な Paramacrobiotus sp.と M. shonaicus を用いて交尾行動の観察を試みた。加えて交尾前後、産卵前後での染色体挙動を明らかにすること
で、雌雄配偶子の核融合の有無から受精のタイミングに迫った。また両種の生殖、発生におけるタイムスパンを明らかにすることで、有性生殖を行う自由産卵種のモデル生物として活用するための基盤を作成することを目指した。

13

2-2. 材料及び方法
2-2-1. 実験動物の飼育
本研究に用いた Paramacrobiotus sp.は東京大学 國枝武和博士によって 2006 年に、
また M. shonaicus は慶應義塾大学 荒川和晴博士によって 2016 年に 1 組の雌雄から系統化されたものを用いた。
1.2% Agarose ゲルを敷いた 90 mm、もしくは 30 mm のプラスチックシャーレに、飼育水として Volvic®、餌としてクロレラ Chlorella sp. (Recenttec)とワムシ Lecane
inermis Bryce, 1892 を混合して撒き、20℃、暗室内にてクマムシを飼育した (Suzuki,
2003; Horikawa et al., 2008; Ito et al., 2016)。飼育水は 3–5 日に、シャーレは 2–3 週に一度交換した。クマムシの観察には Mz95 実体顕微鏡(Leica)、もしくは SZH10 (Olympus)を用いた。

2-2-2. メス成熟度の判定
メスの成熟度は背部に見える卵母細胞の大きさを基準に、以下のように分別した(Rebecchi and Bertolani, 1994, Fig. 2-2-2-1)。Stage1: 卵母細胞が卵巣にない、Stage 2: 卵
黄形成は始まり、卵巣が顕微鏡下で観察できる、Stage 3: 卵母細胞が大きく育ち、卵巣内に密に充填されている、Stage 4: Stage 3 より母体が脱皮を行なった状態。

14

Fig. 2-2-2-1. 卵母細胞の成熟度によるメスのステージング
Stage1: 卵母細胞が卵巣にない、Stage 2: 卵黄形成は始まり、卵巣が顕微鏡下で観察できる、Stage 3: 卵母細胞が大きく育ち、卵巣内に密に充填されている、Stage 4: Stage 3より母体が脱皮を行なった状態 (Rebecchi and Bertolani, 1994)。

2-2-3. 雌雄の判定
Paramacrobiotus richtersi Murray, 1911 にて精巣が背部に透けて観察できることが報
告されており (Rebecchi and Bertolani, 1994)、これに準じて雌雄の判断は精巣の有無にて行なった。用いた 2 種での雌雄比を測定するため、卵 50 個を 1 組として 3 組、計約150 個の卵を性成熟するまで飼育した。統計学的検定は統計分析ソフト R を用いてStudent’s t-test にて行なった (R core team, 2016)。

2-2-4. 交尾行動の観察
交尾行動の観察の前に、オスとの交尾を妨げるために Stage 2 のメスを飼育プールから選び出し、メスのみを 1 週間以上個別のシャーレで飼育した。Stage 4 のメスとオスを 1 匹ずつ、30 mm シャーレに 1.2% Agarose ゲルを敷いて Volvic®で満たした環境に入れ、倒立位相差顕微鏡 IX70 (Olympus) にて観察した。各種 15 ペア観察し、撮影
はコンパクトデジタルカメラ TG-5 (Olympus) に接眼レンズアタッチメント (NYTGV、Microscope Network) を付属したものを用いて行なった。

15

Paramacrobiotus sp.、M. shonaicus それぞれについて、交尾行動開始からオス、メスが接触するまでの間を撮影し、ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij) にて雌雄間の距離を測定した。種特異性を見せた交尾行動に関してその回数を測定し、統計解析ソフト R
v3.3.1 の chisq.test 関数にてカイ二乗検定を行った (R core team, 2016)。

2-2-5. 酢酸オルセイン染色
貯精嚢内の精子を観察するため酢酸オルセイン染色を行なった (両種 n=3,
Rebecchi, 1991)。交尾後 5 分経過したメスを酢酸メタノール固定液 (Acetic acid
1:Methanol 3) に 3 時間浸し、酢酸オルセイン染色液 (3% orcein、30% acetic acid、60%
lactic acid) にて 20 分染色した。Lactic acid で脱色洗浄、スライドグラスへの封入を行い、正立顕微鏡 Axio Imager M1 (ZEISS) で観察した。

2-2-6. 交尾から産卵まで、及び産卵から孵化までの所要時間計測
交尾から産卵までの時間を計測するため、交尾したメスを 1 時間まで 1 分ずつ、6時間まで 10 分ずつ、それ以降は日毎に観察して産卵の有無を調べた (Paramacrobiotus
sp.: n=9、 M. shonaicus: n=12)。40 個以上の Paramacrobiotus sp.、 M. shonaicus の卵を日毎に観察し、孵化の有無を調べた。

2-2-7. DAPI 染色
染色体観察のために 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) を用いた。メス成熟度ス
テージに従って個体を、また産卵後 5 分以内の卵を採取し、酢酸メタノール固定液で3 時間固定した。スライドグラス上に個体乗せ、60% 酢酸滴下した後 26G ニードル
(Terumo) を用いて破砕した (Rebecchi et al., 2002)。風乾後 1/1000 DAPI/PBS (phosphatebuffered saline) で 5 分染色、PBS で 2 度洗浄し Fluoro-KEEPER Antifade Reagent Non-

16

Hardening Type (Nacalai Tesque) にて封入した。観察は蛍光顕微鏡 Axio Imager M1 で行なった。統計学的検定は統計分析ソフト R を用いて Mann-Whitney U-test を行なった(R core team, 2016)。

17

2-3. 結果
2-3-1. 交尾行動の観察
両種ともオスとメスをシャーレに投入してから数秒から数十分後に交尾を始めた。
Paramacrobiotus sp.のオスは数分間メスの後を追尾した後 (Fig. 2-3-1-1A)、口部でメスの総排泄孔を触り (Fig. 2-3-1-1B)、メスの腹側に潜り込む行動を複数回繰り返した。
その後メスは行動を停止し、オスは腹部を屈曲させながら射精をした (Fig. 2-3-11C)。精子は水中に放出され、メス総排泄孔へ泳いで移動していた (Fig. 2-3-1-1D)。メスは射精中から射精後数分間、尾部を収縮させるような行動をした (Fig. 2-3-1-1E)。
Macrobiotus shonaicus を用いた行動観察でも、オスは Paramacrobiotus sp.と同様にメスの総排泄孔に複数回接触した後、腹部を縮めて射精に至った (Fig. 2-3-1-1F-I)。一方で Paramacrobiotus sp.と異なり、オスはメスの腹側に潜り込む行動をせず、また射精からその後にかけてメスは尾部を反り上げていた (Fig. 2-3-1-1I, J)。
両種ともにオスがメスの尾部に接触してから射精に至るまでは数分から数十分を要し、ペアごとにまばらであった。

18

Fig. 2-3-1-1. Paramacrobiotus sp.と M. shonaicus の交尾行動
Paramacrobiotus sp. (A–E) と M. shonaicus (F–J) の交尾行動。オスはメスの総排泄孔に触れ(A, F)、メスの下腹部に潜り込む (B)。M. shonaicus のオスは潜り込みを行わない(G)。射精時のオスは腹部を屈曲させ (C, H)、Paramacrobiotus sp.のメスは下腹部を浮かし (C)、M. shonaicus のメスは尾部を背側に反り上げる (H)。精子は水中を遊泳してメス体内に入り込み (D, I の矢尻)、メスは射精後尾部を収縮させたまま行動を停止する (E, J)。
それぞれの画像は交尾開始と判断してからから A: 5 秒、B: 1 分 26 秒、C: 1 分 57 秒、
E: 2 分 32 秒、F: 1 分 24 秒、G: 2 分 7 秒、H: 8 分 5 秒後、J: 8 分 31 秒後のもの。
Do: Dorsal、Ve: Ventral、An: Anterior、Po: Posterior。
Scale bars: (A, B, E–G) = 300 µm; (C, H, J) = 100 µm; (D, I) = 50 µm。

19

交尾行動開始から雌雄間の距離は徐々に近づき、その速度の平均値はParamacrobiotus sp.で 26.8 μm/s、M. shonaicus で 33.1 μm/s だった(Fig. 2-3-1-2, n=5)。交尾行動はオスの潜り込みを行う回数と、射精時にメスが尾部を反り上げる回数を測定した。Paramacrobiotus sp.では 86.7%のオスが潜り込みを行ったのに対し、M. shonaicus
では 23.1%で、有意に Paramacrobiotus sp.のオスが多く潜り込みを行っていた (Chisquared test, n>13, p<0.003, Fig. 2-3-1-2)。一方でメスの尾部の反り上げは、Paramacrobiotus sp.のメスで 6.7%だったのに対し、M. shonaicus では 81.3%で、M.
shonaicus のメスが反り上げる回数が有意に多かった (Chi-squared test, n>30, p<1.7e-8,
Fig. 2-3-1-2)。

Fig. 2-3-1-2. 交尾行動の定量化
交尾行動中における Paramacrobiotus sp. (A) と M. shonaicus (B) の雌雄間距離の推移。
各プロットは 1 秒毎の距離の平均値で、エラーバーは分散を示す。Paramacrobiotus sp.
と M. shonaicus の交尾行動における潜り込み行動と反り上げ行動の回数 (C)。
*: p<0.01 (Chi-squared test)。

20

2-3-2. 交尾後の現象観察
交尾後のメスに対する酢酸オルセイン染色によって、第 3–4 脚間に貯精嚢が観察できた。貯精嚢は左右片側に見られ、約 20 μm ほどであった (Fig. 2-3-2-1)。

Fig. 2-3-2-1. メス体内の貯精嚢
酢酸オルセイン染色によるメス体内貯精嚢の観察。Paramacrobiotus sp. (A, B) と M.
shonaicus (C, D)。第 3–4 脚の間に精子塊が存在する (B, D の矢尻)。
Scale bars: (A, C) = 50 µm; (B, D) = 20 µm。

21Paramacrobiotus sp.のメスは交尾後 16 分から 70 分で産卵したのに対し、M.
shonaicus のメスは 5 時間から 2 日程度を要した (Table 2-3-2-1)。それぞれ孵化率は84.9±19.6%、79.1±28.0%で (Table 2-3-2-2)、またそれぞれ 14 日、9.5 日を孵化に要した(Fig. 2-3-2-2)。雌雄比は Paramacrobiotus sp.で 31.4:68.6、M. shonaicus で 82.7:17.3 (メス:オス) であり、種間で顕著な差異があった (Table 2-3-2-3, Student t-test, p<0.05)。

Table 2-3-2-1. 交尾から産卵までの時間

種

交尾から産卵までの時間

Paramacrobiotus sp.

16, 29, 32, 34, 35, 36, 50, 58, 70 (min)M. shonaicus

5, ~24, ~24, ~24, ~24, ~24, ~24, ~24, ~24, ~24, ~48, ~48 (hrs)Table 2-3-2-2. 孵化率

Paramacrobiotus sp.

計
平均±分散

M. shonaicus

孵化数

産卵数

孵化率 (%)

孵化数

産卵数

孵化率 (%)

7

11

63.6

9

9

100.0

8

9

88.9

9

10

90.0

5

5

100.0

9

10

90.0

4

7

57.1

6

7

85.7

6

6

100.0

3

10

30.0

5

5

100.0

35

43

36

46

84.9±19.6%

2271.9±28.0%

Fig. 2-3-2-2. 孵化日数と孵化数
孵化日数に対する孵化数のヒストグラム (A) と、孵化日数の箱ひげ図 (B)。

Table 2-3-2-3. 雌雄比

Datasets

Paramacrobiotus sp.

オス メス

メス率 (%)

計

1

31

19

62.0

38.0

50

2

34

10

77.3

22.7

44

3

32

16

66.7

33.3

48

68.6±7.831.4±7.8

平均±分散

M. shonaicus

オス率 (%)

1

11

39

22.0

78.0

50

2

9

41

18.0

82.0

50

3

6

44

12.0

88.0

50

17.3±5.0

82.7±7.8

平均±分散

23

2-3-3. 染色体動態
Stage 2 の卵母細胞は減数第一分裂前期のレプトテン、ザイゴテン、パキテン、ディプロテン、そしてディアキネシス期にあたる染色体像が観察できた (Fig. 2-3-3-1)。
Stage 3 ではまとまった同サイズの染色体塊が観察でき、Paramacrobiotus sp.では 5 本(Fig. 2-3-3-1E)、M. shonaicus では 6 本の染色体塊が存在した (Fig. 2-3-3-1J)。

Fig. 2-3-3-1. 減数第一分裂
卵母細胞形成過程での減数第一分裂進行。Paramacrobiotus sp. (A–E) と M. shonaicus(F–J)。卵母細胞の成熟に従い減数第一分裂が進行し、ディプロテン期ではキアズマが形成される (D, I の矢印)。前中期では Paramacrobiotus sp.では 5 本 (E の矢尻)、M.
shonaicus では 6 本の染色体塊が存在する (J の矢尻)。
Scale bar: 20 µm。

24

Stage 4 では 4 つの染色分体を持つ減数第一分裂中期の染色体が正軌道面に整列していた (Fig. 2-3-3-2A, B)。交尾後のメスも減数第一分裂中期の染色体像が観察され、卵母細胞に対する減数第一分裂中期率は交尾前後で変化がなかった (Fig. 2-3-3-2C、Mann Whitney U-test, p>0.05)。

Fig. 2-3-3-2. 減数第一分裂中期と交尾前後での分裂進行比較
Paramacrobiotus sp. (A) と M. shonaicus (B) の染色体像。Stage 4 から交尾後で両種とも減数第一分裂中期で停止している (C)。
n.s.: no significant difference (Mann Whitney U-test, p>0.05)、Scale bar: 10 µm。

25

加えて産卵直後の卵に対して同様のプロトコルで DAPI 染色を行なったところ、それぞれ 5 本、6 本の卵細胞染色体と (Fig. 2-3-3-3B, C, F, G)、ヒモ状の精子核が卵殻の内側に付着している様子が観察でき (Fig. 2-3-3-3D, H)、雌雄配偶子の融合は起きていなかった。

Fig. 2-3-3-3. 卵に対する精子の付着
Paramacrobiotus sp. (A–D) と M. shonaicus (E–H) の卵。産卵直後の DAPI による観察では卵核と (C, G)、精子核が見え (D, H)、減数第一分裂中期から進行していない。
Scale bars: (A, B, E, F) = 20 µm, others = 5 µm。

26

2-4. 考察
本報告は自由産卵を行う真クマムシにおいて初の交尾行動の観察となった。この観察より、クマムシの交尾行動は以下の 5 つのステップに分けることができると考えられる。[1]追尾: オスはメスを見つけ、メスの歩いた後を追いかける、[2]接触: オスは口部でメスの総排泄孔に触れる、[3]行動停止: メスは動きを停止し交尾の終了を待つ、[4]射精: オスは腹部を屈曲させ、射精する、[5]緊縮: 射精後メスは数分間尾部を収縮させる。用いた 2 種の交尾行動では[3]行動停止、[4]射精中に差異が見られた。
Paramacrobiotus sp.のメスは[3]行動停止からオスの[4]射精中に下腹部を地面から浮かせるような格好で行動を停止するが、M. shonaicus のメスは下腹部を反り返していた。
用いた 2 種のメスは双方とも精子を第 3–4 脚の間にある総排泄孔から体内へ取り込むが (Altiero et al., 2018)、水中を遊泳した精子を効率よく取り込むため、総排泄孔付近のスペースを確保するための行動であると考えられる。また Paramacrobiotus sp.のオ
スは射精前にメスの下腹部に潜り込むような行動を見せたが、これは総排泄孔付近のスペースを確保するための行動であると考えられる (Fig. 2-4-1A)。一方で M. shonaicusのメスは尾部を反り返すことで総排泄孔付近のスペースを十分に確保できるため、オスは潜り込みを行う必要がないものと考えられる (Fig. 2-4-1B)。自由産卵種ではほとんどの行動が保存されているものの、一部で異なり、多様性があることが明らかとなった。

27

Fig. 2-4-1. 交尾行動の違い
通常の歩行時 (A) と Paramacrobiotus sp. (B) と M. shonaicus (C) の交尾行動の違い。
通常の歩行時 (A) に対して Paramacrobiotus sp.のメスは総排泄孔を浮かすのに対し(赤点線)、M. shonaicus のメスは反り上げる (赤点線)。黄丸は卵母細胞を示す。

本研究で使用した 2 種で[4]射精前に[2]接触にてオスが口部でメスの総排泄孔を盛んに触れる行動が観察できた。また[1]追尾ではオスがメスを認知して追いかけているように見受けられることから、メス総排泄孔からオス誘引フェロモンが分泌されている可能性が示唆された。クマムシでは性フェロモンの分子構造は同定されていないが、他の生物での先行研究より、小分子、ペプチド、またタンパク質を性フェロモン
として用いているものと考えられている (Butenandt et al., 1961; Wyatt, 2014; Bartel &Hohberg, 2020)。渡辺、竹内は、本研究に用いた Paramacrobiotus sp.、M. shonaicus において、多くのメスのみを飼育して得られた飼育水をオスにアッセイすることで性フェロモンの存在を示した (渡辺, 2020; 竹内, 2020)。Paramacrobiotus sp.の性フェロモンは3 kDa から 10 kDa のペプチド、もしくはタンパク質で、熱安定性を持つことが示唆されている。加えてメスがオスを誘引するための誘引フェロモンと、オスの行動を制御する興奮フェロモンを使い分けていること、それぞれ誘引フェロモンは極性の高い分子、興奮フェロモンは極性の低い分子であることが示唆されている (渡辺, 2020)。一方で M. shonaicus の性フェロモンは 3 kDa 以下の熱安定性、極性が高い物質であることが示唆され、Paramacrobiotus sp.、M. shonaicus の 2 種間では交尾行動は観察されな

28

かったことからも、性フェロモンには種特異性があることが明らかとなっている (竹内, 2020)。
メス体内の卵母細胞形成過程において減数第一分裂が進行し、交尾前の Stage 4 では減数第一分裂中期で停止していることが明らかとなった。これまで複数のクマムシ
種で卵母細胞内の染色体像が観察されており、メス体内では減数第一分裂中期で停止していることが示唆されてきたが (Bertolani, 1972a; b; 1975; 1979a; b; 1982; 2001;
Rebecchi, 1991; Rebecchi et al., 2003)、本研究でも同様の結果を得られた。加えて交尾後の卵母細胞も Stage 4 と同様の染色体像を有したことから、少なくとも産卵後まで減数
第一分裂中期で停止していることが分かった。
産卵直後の卵には貯精嚢から排出されたと考えられる精子が付着しており、精子と卵の核は融合していなかった。現在までチョウメイムシ科では、卵が排出される総排泄孔と卵巣を繋ぐ卵管に付随して貯精嚢が存在するため、受精は体内で行われていると考えられてきたが (Bertolani and Rebecchi, 1999; Bertolani, 2001; Rebecchi, 1997;
Rebecchi et al., 2000b)、本研究により、産卵直後の時点で卵殻内に付着している精子核のみが観察でき、受精は産卵後に完了することが明らかとなった。
雌雄異体の生物では、性決定様式を二つに分けることができる。性染色体に代表されるような雌雄で異なる遺伝情報を持ち、その分配によって性決定を行う様式を遺伝的性決定と呼び、温度や栄養状態などの環境的な要因によって性決定を行う様式を環
境依存的性決定と呼ぶ (Bull, 1985)。クマムシでは複数種で雌雄の染色体像が観察されているが、染色体の形態差はなく、性染色体、また染色体レベルでの雌雄差は不明である (Altiero and Rebecchi, 2003)。クマムシで雌雄の遺伝情報に差異があるならば、雌雄のゲノム比較を行うことで検出することができると考えられる。一方で一般的に性染色体のランダムな分配による性決定方式では雌雄比は 1:1 に収束するが、用いた 2
種のクマムシではそれに反していたことから環境依存型の性決定を行っている可能性29

もある。環境依存型性決定を行う Daphnia 属のミジンコでは、幼若ホルモン様物質を飼育環境中に暴露することで、産生する子を全てオスにすることができ (Kato et al.,2011)、湊は同ホルモン様物質を Paramacrobiotus sp.と M. shonaicus に暴露すること
で、Paramacrobiotus sp.ではオスの産生を促進、M. shonaicus ではオスの産生を抑制することを見出した (湊, 2019)。この結果は、ホルモン様物質がそれぞれの種で多い方の性の産生を増長させることを表しており、性決定様式が Daphnia 属のような環境依存型であること、加えて性決定機構にホルモン様物質に近似したホルモンが関与を示唆している。

30

2-5. 結言
本章では Paramacrobiotus sp.、M. shonaicus の 2 種を用いて、有性生殖を行う自由産卵種において初めてとなる交尾行動の詳細な記載を行った。交尾行動は[1]追尾、[2]接触、[3]行動停止、[4]射精、[5]緊縮の 5 ステップで構成され、2 種の間では[3]行動停止、[4]射精中に、交尾行動の差異が見られた。[1-2]の求愛行動中では、他種のクマム
シにて示唆されているオスを誘引する性フェロモンの存在が、本研究で用いた 2 種でも示唆された。[4]射精では脱皮殻産卵種と同様に、オスの総排泄孔から放出された精子が水中を遊泳していた。自由産卵種では精子は水中を遊泳してメスの総排泄孔に向かい遊泳し、メス体内に進入することが初めて明らかとなった。
雌雄配偶子の核の挙動を観察することで、受精は産卵後まで完了せず、減数第一分
裂中期以降は体外で進行することを示唆した。今までメス体内の卵巣と貯精嚢の位置関係から体内受精を行うと考えられてきたが、受精のタイミングについて新たな知見をもたらした。
2 種を用いて交尾後の産卵まで、また孵化までの時間計測を行い、生殖プロセスのタイムスパンを初めて明らかにした。また 2 種間共に性比は 1:1 ではなく、性比に偏りがあり、種によって性比が異なっていることを明らかにし、Paramacrobiotus sp.とM. shonaicus を生殖の研究に用いる上で欠かせない知見を得ることができた。

31

第 3 章 Macrobiotus shonaicus の日本分布
3-1. 緒言
現在までに緩歩動物門には約 1400 種が記載されており (Degma et al., 2020)、その種判別は簡易的な形態特徴の記載に依存していた。1981 年に Pilato が、咽頭管の長さを指標に各部位の長さの割合 ( pt 値) を比較する形態比較法を確立した (Pilato,1981)。さらに Michalczyk と Kaczmarek によって計測すべき部位が明確に記述され(Michalczyk & Kaczmarek, 2013)、より明瞭な種記載のために現在も更新され続けている (Kaczmarek & Michalczyk, 2017; Stec et al., 2018a, Fig. 3-1-1, 2)。加えて 2010 年前後か
ら DNA の配列比較による種の比較法が整備され (Michalczyk et al., 2012; Stec et al.,2015; Guidetti et al., 2019; Stec et al., 2020)、分子系統解析が可能となった。分子系統解
析には主に、かねてより用いられてきた 18S rDNA、28S rDNA 塩基配列と、Internal
Transcribed Spacer 2 (ITS-2) 配列、ミトコンドリアゲノムの Cytochrome oxidase subunit Ⅰ(COⅠ) 配列が複合的に用いられるようになった。これらの結果、特に Milnesium
tardigradum Doyère, 1840、P. richtersi、Macrobiotus hufelandi C.A.S. Schultze, 1834 と報告されてきたクマムシの中に複数の種が潜在していたことが明らかとなった。

32

Fig. 3-1-1. クマムシ (チョウメイムシ科) の種判別に必要な個体の計測箇所
クマムシ (チョウメイムシ科) の種判別に用いられる個体の身体と (A)、咽頭管 (B)、
爪の計測箇所 (C)。①Body length; ②Buccal tube length; ③Stylet support insertion point;④Buccal tube external width; ⑤Buccal tube internal width; ⑥Ventral lamina length;⑦Macroplacoid 1; ⑧Macroplacoid 2; ⑨Microplacoid; ⑩Macroplacoid row; ⑪Placoid row;
⑫Primary branch length; ⑬Secondary branch length (Kaczmarek & Michalczyk, 2017)。

Fig. 3-1-2. クマムシ (チョウメイムシ科) の種判別に必要な卵の計測箇所
クマムシ (チョウメイムシ科) の種判別に用いられる卵の全体と (A)、卵殻表面突起の計測箇所 (B)。①円部直径; ②全直径; ③突起高; ④突起幅; ⑤天盤幅; ⑥突起間隔(Stec et al., 2018a)。

33

日本では 170 種のクマムシの生息が確認されている (Suzuki 2017; Stec et al., 2018a;
Morek et al. 2019; Sugiura et al., in press)。2018 年に記載された M. shonaicus は、山形県庄内地方で発見され、1 組の雌雄から系統化された。電子顕微鏡レベルでの形態観察と DNA 配列による分子系統解析も合わせて記載された (Stec et al., 2018a)。またその記載情報から、M. hufelandi に極めて近縁なグループ、hufenlandi group に属することも明らかとなった。日本で hufenlandi group に属するクマムシは他に M. hufelandi のみしか確認されていないが (Mathews 1937; Hatai 1956; Utsugi 1996; Suzuki et al., 2018)、その多くは簡易的な種判別手法に則っており、種を同定したとは言い難い状態であった。
本章では、第 2 章で交尾行動を観察した M. shonaicus の地理的生殖隔離と生息分布を解明することを目標とした。まず日本全国 19 地点からクマムシを採取し、形態比較と分子系統解析により種を同定することで、M. shonaicus の生息分布を明らかにした。
加えて各地域のサンプルと、タイプ系統である庄内産 M. shonaicus を交尾させ、出産
地による交尾行動誘発の有無を調査した。

34

3-2. 材料と方法
3-2-1. クマムシの採取と飼育
全国 19 箇所で晴れ、もしくは曇りの日に蘚類と苔類を含むコケを採取し (Table 32-1-1)、シャーレ内で 20 分以上 Volvic®に浸した。実体顕微鏡下でチョウメイムシ科に属するクマムシを選出した。採取したクマムシは産地ごとに 2 章と同様の手法で飼育した。各実験の前には 1 週間以上飼育プールから単離した。

Table 3-2-1-1. クマムシの採集地点
ID

サンプリング地点

緯度経度

HOKKAIDO-1

北海道、忍路43.2097 N, 140.8608 E

HOKKAIDO-2

北海道、北海道大学

43.0810 N, 141.3429 E

HOKKAIDO-3

北海道、北海道大学

43.0723 N, 141.3411 E

HOKKAIDO-4

北海道、水穂大橋

43.0626 N, 141.3739 E

HOKKAIDO-5

北海道、新千歳空港

42.7858 N, 141.6771 E

HOKKAIDO-6

北海道、臼尻41.9272 N, 140.9451 E

ORITSUME

岩手県、折爪岳

40.2685 N, 141.3719 E

HIYOSHI

神奈川県、慶應義塾大学

35.5518 N, 139.6533 E

KAMIYOSIDA

山梨県、上吉田35.4816 N, 138.7821 E

SHIZUOKA

静岡県、駿河34.9606 N, 138.4038 E

KYOTO

京都府、河川敷35.0133 N, 135.7719 E

ROKKO

兵庫県、六甲山

34.7780 N, 135.2654 E

BIZAN

徳島県、眉山34.0668 N, 134.5378 E

OKI

島根県、隠岐島

36.2037 N, 133.3351 E

KAGOSHIMA

鹿児島県、霧島31.7406 N, 130.7830 E

OKINAWA-1

沖縄県、那覇空港

26.2067 N, 127.6520 E

OKINAWA-2

沖縄県、小禄26.1964 N, 1276671 E

OKINAWA-3

沖縄県、漫湖26.1940 N, 127.6868 E

OKINAWA-4

沖縄県、石垣島

24.3402 N, 124.1554 E

35

採集地点情報海岸沿い、コンクリートに繁茂蘚類
市街地、コンクリートに繁茂蘚類
市街地、コンクリートに繁茂蘚類
川にかかる橋、コンクリートに繁茂蘚類 (ギンゴケ)
駐車場、コンクリートに繁茂蘚類 (ギンゴケ)
森林、土壌に繁茂蘚類
山岳地帯、土壌に繁茂蘚類 (ギンゴケ)
市街地、コンクリートに繁茂蘚類 (ギンゴケ)
市街地、コンクリートに繁茂蘚類 (ギンゴケ)
市街地、コンクリートに繁茂蘚類 (ギンゴケ)
川の河川敷、コンクリートに繁茂蘚類
山岳地帯、コンクリートに繁茂蘚類
山岳地帯、コンクリートに繁茂蘚類 (ギンゴケ)
海岸沿い、コンクリートに繁茂蘚類
市街地、コンクリートに繁茂蘚類
駐車場、木の表面に繁茂
苔類
市街地、コンクリートに繁茂蘚類 (ギンゴケ)
湖の河川敷、コンクリートに繁茂苔類
海岸近く、コンクリートに繁茂
蘚類

採集時期
4月
8月
8月
8月
8月
4月
6月
4月
4月
5月
2月
12 月
7月
6月
5月
12 月
12 月
12 月
12 月

3-2-2. DNA バーコーディングと系統解析
ゲノム DNA の抽出は Arakawa らの手法を一部改変して行なった (Arakawa et al.,2016)。実験に用いるクマムシは絶食、並びに 1% streptomycin 混合培地で 24 飼育した。できるだけ少量の水と共にチューブに移し、100 μl の 1% 2-mercaptoehanol / cell
lysis solution (QIAGEN) を加え、-80℃と 42℃の凍結融解サイクルを用いてクマムシを破砕した。その後は Mini Plus Column (VIOGENE) を用いて DNA を精製した。
続いて COⅠ と ITS-2 領域増幅のため Polymerase chain reaction (PCR) を行なった。PCR に用いたプライマー配列は Table 3-2-2-1 に示した。サイクル条件は 94℃、2分; (94℃、30 秒; 50℃、30 秒; 68℃、75 秒) ×40 サイクル; 68℃、7 分とし、ポリメラー
ゼには Quick-Taq (TOYOBO) を用いた。PCR 産物は pGEM T-easy vector (promega) へ
形質転換後、Eurofins genomics にてサンガー法によりシーケンスした。得られたシー
ケンスデータの読み取り、及びトリミングは GENETYX-MAC v17.0.0.を用いた。
分子系統解析には Table 3-2-2-2 に示した Macrobiotus 属のクマムシと、アウトグル
ープとして Milnesium 属のクマムシを用いた。MAFFT v7.222 にてアライメント (Katoh
et al. 2002; Katoh & Toh 2008)、MEGA7 にてトリミングと p-distance の算出を行なった(Kumer et al., 2016)。PartitionFinder v2.1.1 を用いて COⅠでは GTR+I+G、ITS-2 では
GTR+G が最適進化モデルを推測された (Lanfear et al., 2016)。最尤法による系統解析(ML) には RAxML v8.0.0 を用い (Stamatakis, 2014)、1,000 回ブートストラップ法により分岐の評価を行なった。ベイズ推定法による系統解析 (BI) では MrBayes v3.6.2 を用
いて 1,500,000 回世代、マルコフ連鎖を 1,000 世代ごとにサンプリング、収束が p<0.01になったことを確認した (Ronquist & Huelsenbeck 2012)。推定された系統樹は FigTreev1.4.3 にて可視化した (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)。遺伝的種限界は Poisson
Tree Processes (PTP) による推定を行う bPTP server にて行なった (Zhang et al., 2013,https://species.h-its.org/ptp/)。設定は 100,000 マルコフ連鎖モンテカルロ世代、シニング

36

を 100、burn-in は 0.1 とした。ハプロタイプネットワーク作成には TCS 解析と可視化
を、PopART v1.7 を用いて行なった (Clement et al. 2002; Leigh & Bryant 2015)。

Table 3-2-2-1. プライマー配列
PrimerSequence (5'-3')Target

参考文献

HCO2198

TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

COⅠ

Folmer et al., 1994

LCO1490GGTCAACAAATCATAAAGATATTG

COⅠ

Folmer et al., 1994

ITS3

GCATCGATGAAGAACGCAGC

ITS-2

White et al., 1990

ITS4

TCCTCCGCTTATTGATATGC

ITS-2

White et al., 1990

3-2-3. 形態観察
成体と卵を 30 個ずつ形態観察に用いた。各サンプルはスライドグラス上にてホイ
ヤー氏液を用いて封入し (Stec et al., 2018a)、60℃で 5 日以上かけ硬化させた。位相差
顕微鏡 Axio Imager M1 にて観察を行い、Pilato、Kaczmarek と Michalczyk、Stec らによって報告された観測点に対し、ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij) にて形態測定を行なった (Pilato, 1981; Kaczmarek & Michalczyk, 2017; Stec et al., 2018a, Fig. 3-1-1, 2)。測定した形態情報は主成分分析 (PCA) にて解析した。PCA は統計的解析ソフト R v3.3.1 のprcomp 関数にて、描画は ggbiplot 関数にて行なった (R core team, 2016)。分散分析(ANOVA) にて統計学的検定を行なった。加えて False discovery rate (FDR) を制御して多重比較検定補正を行うため、Benjamini-Hochberg 法を用いた。

3-2-4. 核型観察と交尾行動
核型の観察と交尾行動の観察、撮影は 2 章と同様の条件で行なった。

37

Table 3-2-2-2. 系統解析に用いたクマムシとそのシーケンスデータ
COI
種名
Macrobiotus cf. hufelandi
Macrobiotus hufelandi
C.A.S.
Macrobiotus kristenseni

記載論文

Accession number

参考文献

Schultze,
1834
Schultze,
1834
Guidetti
et al., 2013

HQ876589–94,
HQ876596
HQ876584,
HQ876586–8

Bertolani et al.,
2011
Bertolani et al.,2011
Guidetti et al.,2013
Cesari et al.,
2009
Bertolani et al.,2011
Stec et al.,2018b
Stec et al.,2015
Roszkowska
et al., 2017

KC193575–6
FJ176203–17

Macrobiotus macrocalix

Bertolani &Rebecchi,
1993

HQ876571
MH057767

Macrobiotus paulinae
Macrobiotus polypiformis
Macrobiotus sandrae
Macrobiotus scoticus

Macrobiotus terminalis

Macrobiotus vladimiri
Macrobiotus canaricus
Macrobiotus cf. recens
Macrobiotus hannae
Macrobiotus polonicus
Macrobiotus sapiens
Macrobiotus papei

Stec et al.,2015
Roszkowska
et al., 2017
Bertolani &Rebecchi,
1993
Stec et al.,
2017
Bertolani &Rebecchi,
1993

Macrobiotus shonaicus OKI

KT951668
KX810011–2
HQ876566–70,
HQ876572–83
KY797267
JN673960,
AY598775

Bertolani etal., 2011
Stec et al.,
2018

HM136931–4,
HQ876568

Cuénot, 1932

MH057768–9

Nowak &
Stec, 2018
Pilato et al.,2003
Binda &
Pilato, 1984
Stec et al.,2018

Macrobiotus shonaicus
Macrobiotus shonaicus
ORITSUME
Macrobiotus shonaicus
HIYOSHI
Macrobiotus shonaicus
KAMIYOSHIDA
Macrobiotus shonaicus
SHIZUOKA
Macrobiotus shonaicus
KYOTO
Macrobiotus shonaicus
ROKKO
Macrobiotus shonaicus
BIZAN

ITS-2

MH057765–6

MH057764
MH057763
MG757136–7

Stec et al.,
2018

Bertolani et al.,2011
Stec et al.,2017
Cesari et al.,2011;
Guidetti et al.,
2005
Bertolani et al.,2011
Stec et al.,
2018dStec et al.,
2018d
Nowak & Stec,
2018

Accession number

参考文献

-

-

-

-

-

-

MH063931

Stec et al.,2018b

KT935500
KX810010--

KY797268

Stec et al.,
2017

-

-

-

-

MH064927–8
MH063932–3
MH063923-

HM150647-

GQ403680

Stec et al.,
2018c
Stec et al.,2018a

MH063921
MG757134–5

LC431582

LC431591

LC431583

LC431592

LC431584

LC431593

LC431585

Stec et al.,
2018dStec et al.,
2018d
Nowak &
Stec, 2018
Wełnicz
et al., 2011
Schill et al.,2010
Stec et al.,
2018c
Stec et al.,2018a

LC431594
本研究

本研究

LC431586

LC431595

LC431587

LC431596

LC431588

LC431597

LC431589

LC431598

38

Stec et al.,2015
Roszkowska
et al., 2017

Table 3-2-2-2. 系統解析に用いたクマムシとそのシーケンスデータ (continued)
COI
種名

記載論文

Macrobiotus shonaicus
KAGOSHIMA
Milnesium berladnicorum
Milnesium variefidum

Accession number

ITS-2
参考文献

LC431590
Ciobanu
et al., 2014
Morek et al.,2016

KT951659
KT951663

39

Accession number

参考文献

LC431599
Morek et al.,2016
Morek et al.,2016

KT951662
KT951666–7

Morek et al.,2016
Morek et al.,2016

3-3. 結果
3-3-1. Macrobiotus shonaicus 日本分布
全国 19 箇所のうち、沖縄県と北海道を除く、岩手県、山梨県、神奈川県、静岡県、京都府、兵庫県、島根県、徳島県、鹿児島県の 9 箇所から M. shonaicus の採取に成功した (Fig. 3-3-1-1)。
系統解析では全ての個体群がタイプ系統と近接しており、COⅠ は 8 ハプロタイプ(Fig. 3-3-1-2A)、ITS-2 は 11 ハプロタイプ存在した (Fig. 3-3-1-2B)。タイプ系統との遺伝的距離はそれぞれの DNA マーカーで平均して 0.61%と 0.75%であり、遺伝的に極めて近似していた。
ML 系統樹、BI 系統樹共に全ての個体群がタイプ系統と同クレードに帰属されることを示し (Fig. 3-3-1-3)、加えて PTP server による種限界推定でも同一種と強く推定された。

3-3-2. 形態の多様性解析
成体の形態情報を用いた PCA での PC1、2 の寄与率はそれぞれ 23.1%、9.3%だっ
た (Fig. 3-3-2-1A)。PC1 には全ての爪の長さ成分によって構成されており、PC2 は咽頭間付近の形態によって構成されていた。14 の測定した部位のうち 10 点で有意な差があった (ANOVA、q<0.05)。一方で卵での PCA は PC1、PC2 の寄与率はそれぞれ
39.8%、21.4%で (Fig. 3-3-2-1B)、PC1 は卵全直径、突起高、突起幅、天盤幅で構成されていた。全ての計測部位で有意な差があった (Fig. 3-3-2-1C, ANOVA、q<0.001)。

40

Fig. 3-3-1-1. Macrobiotus shonaicus の国内分布
Macrobiotus shonaicus の国内分布。●: M. shonaicus のタイプ産地、○: 発見した新たな生息地。描画は GMT v6 を用いた (Wessel et al., 2019)。

41

Fig. 3-3-1-2. ハプロタイプネットワーク
COⅠ (A) と ITS-2 (B) のハプロタイプネットワーク。H1、H2 は Stec et al., (2018a) に相同。枝上部の数字は変異数。

42

Fig. 3-3-1-3. COⅠと ITS-2 の連結系統樹
COⅠと ITS-2 の連結配列のベイズ推定法による分子系統樹。枝脇の数値はベイズ事後確率を示す。Scale bar: 塩基置換率。

43

44

Fig. 3-3-2-1. 形態比較
成体形態 (A) と卵形態 (B) の PCA による比較と、卵の形態 (C)。
Scale bar: 20 μm。

45

3-3-3. 核型と交尾行動
全ての個体群にて核型は n=6 で、タイプ系統と同型であった (Fig. 3-3-3-1)。
タイプ系統のメス、各個体群のオスの交尾行動、並びにタイプ系統のオスと個体群のメスの交尾行動を観察したところ、全てのオスが射精に至った。交尾行動の詳細も
第 2 章で報告したものと差異はなかった。全てのメスは 1 週間以内に産卵に至り、孵化も観察できた。

Fig. 3-3-3-1. 核型解析
矢尻はそれぞれの染色体を示す。
Scale bar: 10 μm。

46

3-4. 考察2017 年まで日本における hufenlandi group に属するクマムシは、M. hufelandi 1 種のみしか生息報告がなかった (Suzuki, 2017)。報告例では北海道から沖縄に至るまで幅広く生息しているとされていたが、これらの報告での種同定は極めて簡易的な手法でのみ行われてきた。Stec らは 2018 年に M. shonaicus を庄内地方から発見、記載を行なったが、当記載は電子顕微鏡レベルでの形態観察と DNA バーコーディングが行われ、M. hufelandi グループに帰属されることを明らかにし、並びに他種との明確な比較を可能にした (Stec et al., 2018a)。本報告では M. shonaicus が本州、四国と九州地方にも生息していることを明らかにし (Table 3-2-1-1, Fig. 3-3-1-1)、またその過程で M. hufelandiが見つからなかったことから、現在までに M. hufelandi とされてきた日本のクマムシが誤って記載されている可能性を示唆した。
成体の形態に比べて卵の形態の方が高い多様性を見せた (Fig. 3-3-2-1)。同様の卵形
態的多様性は他種でも報告されており (Bertolani & Rebecchi, 1993; Guidetti et al., 2013;
Kaczmarek & Michalczyk, 2017; Stec et al., 2018a; d)、産卵場所嗜好性等による最適化が関与していると考えられてきた (Stec et al., 2016)。一方で近年、卵表面に精子が付着している様子が観察されており (Guidetti et al., 2019)、特に有性生殖種においては、卵の突起と精子の形状の間に効率良く受精を行えるようにする形態的関係性の存在が示唆される。加えて成体の形態と比較して卵の形態の進化速度が早いことが示唆され、これはチョウメイムシ科全体を俯瞰して、成体の形態より卵の形態の多様性が高いこととも矛盾しなかった (Kaczmarek & Michalczyk, 2017)。本研究では生殖に関係する卵の形態が多様であり、進化速度が速いことを示したが、生殖プロセスに関与する遺伝子や免疫反応に関わる遺伝子もその他の遺伝子に比較して進化速度が速いことが報告されており (Swanson & Vacquier, 2002)、Drosophila 属で精子貯蔵に関与する Acp26Aa(Tsaur & Wu, 1997)、哺乳類で精子の先体反応を受容する Zp3 (Swanson et al., 2001)、緑47

藻類で交尾型か否かを決定する mid1 などが知られている (Ferris et al., 1997)。精子競
争、メスの配偶者選択、性的対立といった要因が、この速度をもたらす駆動力として考えられており、この現象は例えば受精時における認識を妨げることで生殖隔離を生じさせ、種分化に繋がる可能性が指摘されている。
卵形態に多様性が確認された一方で、各群体間とタイプ系統の間では交尾も観察でき、第 2 章で示した交尾行動の 5 ステップも全て行われたこと、また産卵と孵化が観察できていることから、各群体とタイプ系統間に交尾行動までの段階で隔離は生じていないと考えられる。しかしながら本実験では交配実験に処女メスを用いていないた
めに、現存の結果から生殖隔離の有無を完全に断定できない。貯精嚢が空の処女メスからも同様に産卵、孵化が確認できれば、M. shonaicus では生殖隔離がなく、群体ごとの卵形態差異による受精への影響もないことを明らかにすることができる。加えて、生殖関連遺伝子の速い進化速度による分子的な受精の阻害もないことが示唆される。
一方で産卵はするが孵化をしない場合は受精が阻害されているものと考えられ、卵形態の相違による阻害、もしくは分子間での選択が行われることで阻害されていることが示唆される。産卵も行わない場合は卵形態に依存した阻害より、むしろメスの貯精
嚢内にて分子間相互作用、もしくは精子形態の違いによって配偶者を選んでいることが示唆される。クマムシにおける異種交配実験は、DNA マーカー COⅠ では異種と推定されるが ITS-2 では同種と判断される Paramacrobiotus areolatus group に属する 2 群
体間にてのみ報告されている (Stec et al., 2020)。異群体間交配では産卵率が減少傾向となることが報告されたが、交尾行動を始めとした生殖過程の詳細な観察は行われていない。日本では M. shonaicus の他に 7 種の Macrobiotus 属のクマムシが生息していると報告されており (Mathews 1937; Hatai 1956; Utsugi 1986; 1987; 1988; 1995; 1996; Utsugi etal., 1997; Ito 1997, 1999; Biserov et al., 2001; Ishida & Matsui 2007; Suzuki, 2017; Suzuki etal., 2018)、これらを採取し、M. shonaicus と明確に別種であると確認した上で異種交配

48

実験を行うことで、交尾ステップをどこまで行うことができるか、また次世代産生能を検証し、クマムシにおける生殖隔離と地理的分離の関係を明らかにできると期待できる。

49

3-5. 結言
本章では M. shonaicus が北海道と沖縄を除く、本州、四国、九州と離島に広く生息していることを示した。このことより、M. shonaicus は飼育環境のみならず、自然界での生態や分布、地域差を調査するのに適したクマムシであることを示した。
地域差という観点から、本章では形態と染色体数、交尾行動に着目して実験を行った。染色体数には差がなく、全群体で n=6 だった。地域間での成体と卵の形態測定比
較より、卵の形態がより多様化していることを明らかにし、成体の形態より卵の形態の進化速度が早いことが示唆された。交尾行動にも地域差がなく、タイプ系統と各群体間での交尾を観察できたことから、M. shonaicus 内では地理的に遠縁であることに起因する生殖行動段階での隔離は起きていないと示唆された。処女メスを用いて産卵と孵化の可否を調べることで、卵の形態による選択が交配能に及ぼす影響を明らかにすることが求められる。Macrobiotus shonaicus が海や山を隔てて広く生息していることから、大陸間に調査域を広げ分布の調査を行うこと、また日本国内に生息するであろう
近縁種との地理的生殖隔離の可能性を推察するための基盤を構築することができた。

50

第 4 章 クマムシの配偶子形態変化と比較
4-1. 緒言
有性生殖を行う生物の生殖プロセスにおける、最後のステップは受精である。オスとメスで産生されたそれぞれの配偶子が融合することで、一つの個体としての始まりとなる受精は極めて重要である。多くの動物では精子が卵にアプローチし、両配偶子の融合をもって受精の完了とされており、雌雄同体、異体動物双方において生じる現象である。受精の様式は体内に取り込まれた精子と卵が融合する体内受精と、両配偶子が体外に放出されそのまま融合する体外受精に大きく二分される。
クマムシでは Bingemer らによる I. dastychi における交尾行動観察より、脱皮殻産
卵種では産卵後に射精に至り、発生することから体外受精を行っていると考えられている (Bingemer et al., 2016)。一方で自由産卵種では、貯精嚢が卵巣と総排泄孔を結ぶ
卵管に付随しており(Altiero et al., 2018)、その位置関係から貯精嚢に蓄えられた精子と卵母細胞はメス体内にて受精し、産卵に至る、体内受精を行うと考えられてきた(Rebecchi, 1997; Bertolani & Rebecchi, 1999; Rebecchi & Guidi, 2000; Bertolani, 2001)。しかし第 2 章で報告した結果より、産卵された卵内部では精子と卵の核の融合は起きておらず、受精の完了は体外であることが明らかとなった (第 2 章, 2-3-3)。精子と卵の接触については Guidetti らが報告しているが (Guidetti et al., 2019)、単に精子が卵殻上に乗っていると述べられているのみで、受精との関係や詳細な接触点の観察は未だか
つて知見がなかった。
卵の形態は、種の記載の際に観察することが必須であり (Kaczmarek & Michalczyk,
2017)、種によって形態が異なることが報告されている。一方で精子の形態記載は限られている (Rebecchi & Guidi, 1991; Guidi & Rebecchi, 1996; Rebecchi, 1997; 2001; Rebecchi& Guidi, 1995; Rebecchi et al., 2003; 2011; Bertolani et al., 2014; Suzuki & Kristensen,51

2014)。Rebecchi によって Xerobiotus pseudohufelandi Iharos, 1966 では、貯精嚢内の精子の観察も行われており、貯精嚢内では精子遊泳に必須な尾部が消失している様子が報告されている (Rebecchi, 1997)。これらは重要な知見であるものの、生殖プロセス内での機能や役割と結びつけるために、単一の種における個体の行動と配偶子の形態、動態などの生殖プロセスの網羅的な解明が求められてきた。
本章ではクマムシにおける受精の詳細なメカニズムを明らかにし、生殖プロセスを網羅的に解明するための足がかりとして、また配偶子の形態進化を生殖システムと関連付けて考察するための基盤を作成するために、本論文で交尾行動を詳細に報告した
有性生殖クマムシ、Paramacrobiotus sp.と M. shonaicus を用いて、精子の形態観察と比較を行った。続いて生殖ステップに従い交尾後と産卵直後の卵を観察し、雌雄配偶子の結合の有無を調べた。

52

4-2. 材料と方法
4-2-1. 実験動物の飼育と交尾観察
実験動物 Paramacrobiotus sp.と M. shonaicus、また交尾行動の観察は 2 章の手法と同様に行った。Paramacrobiotus sp.の卵の形態測定は 3 章の手法と同様に行った。

4-2-2. 精子形態観察
精巣内精子はオス、貯精嚢内精子は交尾後のメスをそれぞれ解剖し、観察を行った。poly-L-lysine をコートしたスライドグラス上にクマムシを置き、26G ニードルで破砕後、2.5% glutaraldehyde/PBS にて 1 時間固定した。PBS にて洗浄後、1/1000
DAPI/PBS で 10 分間染色、2 章と同様に封入して観察を行った。各種 8 匹のオスから
計 50 個の精子を選択し、尾部、中片、核、先体に分けて ImageJ にて長さの定量を行った (Rebecchi, 1997, Fig. 4-2-2-1)。配偶子の統計学的形態比較は統計分析ソフト R を用いて多重分散分析 (MONOVA) にて行った (R core team, 2016)。

4-2-3. SEM による観察
精子の形態と卵巣内の卵母細胞を SEM にて観察するため、カバーグラス上に
26G ニードルを用いて展開した。1% OsO4/0.1 M Na-cacodylate buffer (pH 7.2) で 45 分
固定後、100% Ethanol に置換、乾燥させた (Rebecchi & Guidi, 1991)。卵母細胞観察には交尾後のメスを用いた。
産卵後の卵は 100% Ethanol に 3 時間浸透後、tertiary-butyl alcohol に一晩置換し、JFD-320 (JOEL) を用いて凍結乾燥させた。
全ての SEM 用サンプルはアルミニウム試料台に乗せ、スパッターコーティグ
後、JSM6510 (JOEL) にて観察した。

53

Fig. 4-2-2-1. 精子形態の計測箇所①先体; ②核; ③中片; ④尾部 (Rebecchi, 1997)。

54

4-3. 結果
4-3-1. 精巣内精子の形態用いた両種とも精子は尾部、中片、コイル上の核、先体にて構成されていた (Fig.
4-3-1-1)。中片は Paramacrobiotus sp.で腎臓状 (Fig. 4-3-1-1A, A’)、M. shonaicus は棒状だった (Fig. 4-3-1-1B)。
各部位の長さには種間で有意な差があった (Fig. 4-3-1-2A, MANOVA、p<2.2e-16)。
特に先体の長さが大きく異なっており、平均して Paramacrobiotus sp.で 37.6 μm だったのに対し、M. shonaicus では 1.5 μm だった (Table 4-3-1-1)。

Table 4-3-1-1. 精子の各部位の長さ

Paramacrobiotus sp.

M. shonaicus

(μm)

最短

最長

平均

分散

最短

最長

平均

分散

尾部

13.0

29.4

19.3

4.2

9.4

24.2

15.8

3.3

中片

1.5

6.6

3.7

1.1

1.1

3.6

2.3

0.6

核

13.2

35.0

21.4

4.3

6.2

18.2

10.8

2.5

先体

24.5

52.6

38.5

6.7

0.6

2.9

1.6

0.5

4-3-2. 貯精嚢内精子の形態
メス体内、貯精嚢内精子は両種で尾部が 5 μm ほどに短縮化していた。他の部位は精巣内精子と差異はなかった (Fig. 4-3-2-1)。

55

Fig. 4-3-1-1. 精子の SEM 像
Paramacrobiotus sp. (A) と M. shonaicus (B) の SEM 像。A’は A の拡大図。t: 尾部、m:
中片、n: 核、a: 先体。Scale bars: (A) = 10 μm、(B) = 2 μm、(C) = 5 μm。

56

Fig. 4-3-1-2. 精子と卵の形態比較
精子 (A) と卵 (B) の計測部位ごとの形態比較。P: Paramacrobiotus sp.、M: M.
shonaicus。

57

Fig. 4-3-2-1. 貯精嚢内の精子 SEM 像
Paramacrobiotus sp. (A) と M. shonaicus (B) の貯精嚢内精子。尾部の短縮化が起きている(矢尻)。A’は A の拡大図。rt: 短縮された尾部、m: 中片、n: 核、a: 先体。
Scale bars: (A) = 10 μm、(A’) = 2 μm、(B) = 5 μm。

58

4-3-3. 卵母細胞と卵の SEM 観察
卵母細胞は両種で未発達な卵殻突起を有していた。22 個の Paramacrobiotus sp.、20
個の M. shonaicus の卵を観察し、精子の付着は観察できなかった (Fig. 4-3-3-1)。
産後 5 分以内において、Paramacrobiotus sp.で 44% (8/18)、M. shonaicus で 40%(6/15) の卵表面に精子が付着しているものが見つかった (Fig. 4-3-3-2, 3)。付着した精子は尾部が短縮化しており、貯精嚢内の精子と同じ形態で、卵表面の突起に接着していた (Fig. 4-3-3-2B, C, 3B, C)。先体の先端は卵突起間の卵殻表面部に進入していた(Fig. 4-3-3-2D, 3D)。
産卵後 1 日以上経過した卵の表面に精子が見られなかった (Fig. 4-3-3-4, n>14)。また卵形態測定による MANOVA では、2 種間の卵形態に有意な差が見られた (Fig. 4-31-2B, p<2.2e-16)。

Fig. 4-3-3-1. 卵母細胞の SEM 像
Paramacrobiotus sp. (A) と M. shonaicus (B) の卵母細胞。
Scale bar: = 10 μm。

59

Fig. 4-3-3-2. Paramacrobiotus sp.の産卵直後の卵
Paramacrobiotus sp.の産卵直後の卵 (A)。表面に精子が付着しており (A, B)、貯精嚢内精子と同様に尾部短縮化が起きている (C)。先体の先端は卵殻内部に進入している(D)。B は A の、C、D は B の拡大図。青と緑は個々の精子を示す。rt: 短縮された尾部、m: 中片、n: 核、a: 先体。
Scale bars: (A) = 10 μm、(B) = 5 μm、(C, D) = 1 μm。

60

Fig. 4-3-3-3. Macrobiotus shonaicus の産卵直後の卵
Macrobiotus shonaicus の産卵直後の卵 (A)。表面に精子が付着しており (A, B)、貯精嚢
内精子と同様に尾部短縮化が起きている (C)。先体の先端は卵殻内部に進入している(D)。B は A の、C は B の、D は C の拡大図。緑で精子を示す。rt: 短縮された尾部、
m: 中片、n: 核、a: 先体。
Scale bars: (A) = 10 μm、(B) = 5 μm、(C, D) = 1 μm。

61

Fig. 4-3-3-4. Paramacrobiotus sp.、M. shonaicus の卵
産卵後 1 日以上が経過した Paramacrobiotus sp. (A) と M. shonaicus (B) の卵。
Scale bars: (A, B) = 10 μm。

62

4-4. 考察
チョウメイムシ科の卵殻突起の形態は種判別に用いられるため、その形態情報は充実している (Kaczmarek & Michalczyk, 2017)。そのうち精子の形態も明らかにされている種について、分子系統樹に従って Fig. 4-4-1 に示した。精子、卵ともに記載されているおおよその形状は、ほぼ属内で保存されている。Paramacrobiotus、Diaforobiotus 属
では先体が長いのに対し、Macrobiotus、Xerobiotus、Mesobiotus 属では先体が短い(Rebecchi & Guil, 1991; Guidi & Rebecchi, 1996; Rebecchi, 1997; 2001; Rebecchi et al., 2011;
Bertolani et al., 2014)。本章で用いた Paramacrobiotus sp.、M. shonaicus も先行研究と同様に先体の長短が観察でき (Fig. 4-3-1-1, 2)、これらの形態は属内で保存されているものと考えられる。またそれぞれの長さの精子は、進化の過程で獲得し、淘汰に勝ち抜いてきた性質であると考えられることから、生殖プロセスにおいて有益な機能を保持しているものと考えられる。以下では生殖プロセス中での精子と卵の形態の関係について、2 つの仮説を示す。本研究ではクマムシの精子と卵が先体を介して結合している様子を初めて撮影することに成功した (Fig. 4-3-3-2, 3)。先体は卵突起間の卵殻表面部に刺さっており、精子のその他の部位は卵突起に接着していた。卵巣内の卵母細胞、また産卵直後の卵の表面の突起は、産卵後 1 日以上経過したものより未発達であり (Fig. 4-3-3-1, 4)、産卵後に時間をかけて発達していくものと考えられる。第一の仮説は、産卵後の精子が卵突起に接触した状態で卵突起の膨張が起きるために、精子の長短が進化的に変動するという仮説である。産卵後に突起の突出によって精子が持ち上げられることが予想され、先体での卵殻への接着や結合が物理的に阻害される可能性がある。有性生殖における極めて重要な現象である両配偶子の結合に対する阻害は、その種の存続をも脅かしかねない。そこで、属レベルで形態が大きく異なる卵突起に対し、より配偶子の結合が効率よく行われる精子の形態を獲得するという共進化の結果、主に先体の長短により精子の長さが異なるクマムシが生き残ってきたと考え63られる。一方で第二の仮説は、貯精嚢に蓄えられた精子が卵に絡まって産卵に至るという仮説である。現在までの知見では精子と卵の接触のタイミングは明らかでないが、卵巣と総排泄孔の間に貯精嚢が付随していることから (Fig. 2-1-1)、輸卵管を移動する卵に貯精嚢内の精子が付着して産卵に至る可能性がある。その場合、総排泄孔から産卵される際に精子が解離しないようにする必要があり、そのために卵突起は未発達ながらも精子が絡まるように、精子の長さが共進化してきたと考えられる。

Figure 4-4-1. チョウメイムシ科の配偶子の形態とその系統関係
チョウメイムシ科のクマムシで精子と卵の形態が記載されている種を、Bertolani らによって作成された系統樹に従って列挙した (Bertolani et al., 2014)。本研究で使用した 2種は緑色で示す。図左側が精子、右側が卵の形態の概略図。精子の形態は赤: 先体、
青: 核、緑: 中片、黒: 尾部と色分けした。

64

用いた 2 種では、精子の尾部は水中を遊泳するために用いられるが、その後貯精嚢内に蓄えられ受精に至るまでは不必要であると考えられる。また容量の限りある貯精
嚢を効率良く使用するため、交尾後には精子尾部の短縮化が起きるものと考えられる(Fig. 4-3-2-1)。同現象はチョウメイムシ科の X. pseudohufelandi にて観察されており(Rebecchi, 1997)、チョウメイムシ科の 3 属で観察できたことから、科内で保存された現象であることが示唆された。
精子の形態と機能に関して分かっていることは少ないが、精子の形態差をもたらす
要因は生殖様式や、卵と受精するために複数の精子が競合する現象である精子競争への適応と言われている (Jamieson, 1987; Pizzari & Birkhead, 2002)。多くの Muridae (ネズミ科) の精子では、精子の先端がフック状になっていることが報告されている (Immler
et al., 2007)。Immler らは、種間での先端のフック構造の曲率と精巣の大きさを比較し、精巣が大きいほどフックの曲率が大きく、長くなる傾向にあることを見出した。
精巣が大きいということは、多量の精子が産生されることと同義であり、精子競争が盛んになるが、ネズミにおけるフック構造の形態差異は精子競争への一般的な適応であると示唆された。加えてフック状の構造によって他の精子と絡まりあうことで精子群が形成され、単体よりも遊泳速度が早くなることが明らかにし、精子が協調している可能性を示唆した (Immler et al., 2007)。また種内で複数の精子を産生する生物も知られており、カイコガ Bombyx mori Linnaeus, 1758 では核を持つ有核精子と核を持たない無核精子が産生される (Sakai et al., 2019)。古くから無核精子の機能について考察がなされ、メス貯精嚢に蓄えられる際に、他個体との精子競争に勝ち抜くために存在していると考えられてきた。Sakai らは Sex-lethal のノックアウトにより無核精子の産生を阻害し、有核精子のみを持つオスを作成した。有核精子のみを持つオスと、メスの交配から受精卵が得られなかったことから、無核精子には精子競争ではない新たな機能があることが明らかにされた (Sakai et al., 2019)。本研究では Paramacrobiotus sp.の65

精子は長く、それに比べて M. shonaicus の精子は短いことを見出した。種ごとに形態の異なる精子は、遊泳時やメス総排泄孔から体内へ移動する時、また卵殻に付着する
際に精子群を形成し、交尾から受精までのプロセスを効率良く行わせる機能がある可能性がある。精子競争という面では、長く体積の大きい精子はメス貯精嚢内の容積を圧迫し、他個体間との精子競争を優位に進めることができると考えられる。一方で体積の小さい精子は大きいものより多く産生できると考えられ、その量でメス貯精嚢を圧迫でき得る。しかしながら、精子の尾部が短縮化する現象は貯精嚢内で多くの精子を貯蔵するためであるとも考えられるため、精子の体積を大きくして貯精嚢を圧迫す
るように適応したということは考えにくい。
Guidetti らは Paramacrobiotus spatialis Guidetti et al., 2019 で卵の表面に精子が付着していることを見出したが (Guidetti et al., 2019)、その精子の形態や状態は定かでなかった。本研究より、産卵後の卵に付着した精子が尾部を短縮化されていたことから、貯精嚢から排出された精子であると考えられる (Fig. 4-3-3-2, 3)。また先体の先端が卵殻に埋もれていたことから、先体反応のために卵殻に突き刺さっている状態であることも示唆された。卵殻に卵門のような構造は見受けられず、硬い卵殻を貫通させるためのメカニズムが存在すると考えられる。多くの生物で受精の際、卵に最初に結合する部位は先体で、先体の接触によって先体反応が起きる。クマムシの先体内部にも先体反応に必要な分泌物が含まれていると考えられ、それらが卵殻の貫通、並びに受精の開始を卵に伝達している可能性があり、今後の解明が求められる。
現在は、チョウメイムシ科の別属、Mesobiotus を用いて、交尾行動の多様性と配偶子形態の観察を進めている。Mesobiotus sp.は 2018 年に静岡県下田市にて採取、雌雄 1組から系統化した自由産卵型有性生殖種である。Macrobiotus shonaicus と同様に、染色体数は n=6 で、貯精嚢があり、産卵後も減数第一分裂が進行していない (Fig. 4-4-2)。
交尾行動は Paramacrobiotus sp.や M. shonaicus と同様に 5 ステップで後生されており、

66

射精時のメスの尾部の反り上げは観察できなかった。Mesobiotus sp.は他の 2 種と異なり、ステップ 2 から 4 の接触、停止、射精を 1 回の交尾で 2 回以上、平均で 3 回繰り返した (n=8)。またその射精時におけるメスとオス間の距離、射精継続時間を初回の射精、2 回目以降、最後の射精に分け測定すると、Fig. 4-4-3 のように、初回の射精では雌雄間の距離が遠く、また射精時間も短いこと、一方で最後の射精では雌雄間の距
離が近くなり、射精時間も延長することが明らかとなった (Fig. 4-4-3, n=27, ANOVA
にて検定)。メスがオスの射精中に動き出しその場を離れた際は、射精された精子が射精開始時にメスの総排泄孔のあった場所に向けて遊泳し、凝集することも観察できた(Fig. 4-4-4, n=1)。精子は先体、核、中片、尾部で構成され、核はねじまき状、またParamacrobiotus sp.や M. shonaicus と比較して中片が長い傾向に見られた (Fig. 4-45A)。産卵直後の卵殻表面には精子が付着しており (Fig. 4-4-5B, B’)、卵は円錐状の突起の先端に細く伸びた組織を有していた (Fig. 4-4-5C, C’)。卵突起の形状や大きさは極めて多様で、先端の形状が太く長い、細く短い、太く短い、細く長いの 4 パターンが観察できた。本研究で使用した Paramacrobiotus sp.と M. shonaicus をモデルとして
Mesobiotus sp.で行ったように比較を行なっていくことで、チョウメイムシ科内、またクマムシ全体にまで範囲を広げて、生殖に関わる形態、動態の多様性を明らかにしていくことが期待される。

67

Fig. 4-4-2. Mesobiotus sp.の染色体と貯精嚢、産卵後の卵
Mesobiotus sp.の卵母細胞の染色体と (A, 矢尻)、貯精嚢 (B, 矢尻は精子を示す)。産卵直後の卵では卵の核が観察でき (C)、減数第一分裂で停止している (C’, 矢尻)。C’は
C の赤点線内を拡大した図。
Scale bars: (A, B) = 10 μm、(C) = 20 μm、(C’) = 2 μm。

68

Fig. 4-4-3. Mesobiotus sp.の射精距離と継続時間
Mesobiotus sp.のオスが射精した際の雌雄間距離 (A) と射精継続時間 (B)。
アスタリスクは有意差を示す。***: p<0.01, *: p<0.05 (ANOVA)。

69

Fig. 4-4-4. Mesobiotus sp.オスの射精と精子の凝集
オス射精を開始した際にメスの総排泄孔があった場所に精子が凝集する様子。A は射精開始時、B-H は 8 秒後から 2 秒毎の写真。白点線でメスがいた場所、矢尻で精子の凝集を示す。
Scale bar: 100 μm。

70

Fig. 4-4-5. Mesobiotus sp.の配偶子
Mesobiotus sp.の精子 (A)、産卵直後の卵 (C) とそれに付着した精子の拡大図 (B’, 緑
で精子を示す)。A のアルファベットはそれぞれ a: 先体、n: 核、m: 中片、t: 尾部を示す。B’は B の赤点線の拡大図。C1-4 は産卵後数日経過した卵で、C1’-4’はそれぞれの卵突起の拡大図。
Scale bars: (A) = 5 μm、(B) = 5 μm、(B’) = 2 μm、(C) = 10 μm、(C’) = 5 μm。

71

4-5. 結言
本章では 2 種のクマムシ、Paramacrobiotus sp.と M. shonaicus において配偶子の形
態観察を行い、精子の形態、卵の形態が 2 種間で大きく異なることを明らかにした。
用いた Paramacrobiotus sp.、M. shonaicus の両配偶子形態の大まかな特徴は、それぞれの同属近縁種と似ており、属内で保存された形態であることを示唆した。
貯精嚢に蓄積した精子は鞭毛が消失しており、これはチョウメイムシ科内で保存された性質であると示唆された。また、この脱鞭毛した精子が先体を介して卵と結合している様子を初めて撮影することに成功した。結合した精子と卵突起の位置的関係から、受精効率を向上させるために精子の形態に共進化が起きてきたことを示唆した。
本研究によりクマムシのより詳細な生殖プロセスに加え、配偶子の形態と挙動について、進化的保存性に関する知見を得ることができた。

72

第 5 章 結論
第 2 章では Paramacrobiotus sp.、M. shonaicus を用いて、有性生殖を行う自由産卵種において初めてとなる交尾行動の詳細な記載を行った。交尾行動は[1]追尾、[2]接触、[3]行動停止、[4]射精、[5]緊縮の 5 ステップで構成され、2 種の間では[3]行動停止、[4]射精中に、Paramacrobiotus sp.のメスは下腹部を地面から浮かせるような格好で行動を停止するが、M. shonaicus のメスは下腹部を反り返している差異が見られた。種間による交尾行動の差異は生殖隔離をもたらす要因のひとつと考えられており、今後同属他種、同科他属のクマムシの交尾行動の記録を蓄積、比較することで、種を分かつ特異的な行動とその多様性を明らかにできると期待できる。また I. dastychi にて示
唆されている性フェロモンの存在が (Bartel & Hohberg, 2020)、本研究で用いた 2 種でも示唆された。性フェロモンの構造差異は、交尾の誘発の有無を左右することから生殖隔離の要因の一つとなる。本研究で用いた Paramacrobiotus sp.、M. shonaicus においてはすでに、この両種の異性同士は交尾に至らないこと、性フェロモンと考えられる物質の分子量が異なることが示唆されており (渡辺, 2020; 竹内, 2020)、これは近縁な属間でさえも分子構造が異なることを示している。性フェロモンの単離、構造決定を行い、さらに同属内の複数種とその構造を比較することで、生殖隔離を引き起こす要因である異性誘引物質の種差にアプローチできる。また I. dastychi を始めとして、他科のクマムシと性フェロモンの構造を比較すること、加えてそのフェロモンを受容す
る受容体の分化を明らかにすることで、緩歩動物門全体の進化的背景を考察できると期待される。
[4]射精では脱皮殻産卵種 I. dastychi と同様に (Bingemer et al., 2016)、オスの総排泄孔から放出された精子が水中を遊泳していた。脱皮殻産卵種では産卵された卵に対して射精を行うのに対し、自由産卵種では精子に水中を遊泳させてメス体内へ向かわせることが初めて明らかとなった。生殖行動の成否の肝となる雌雄配偶子の出会いに対73

し、外生殖器を持たないクマムシは、精子を遊泳させることで解決を図っていることが分かった。また本研究により、極めて自然環境に近い状態の射精された精子の運動を顕微鏡下で観察できることを見出した。スーパースローカメラ等を用いることで精子の挙動を詳細に明らかにし、精子の遊泳パターンをトレースすることで精子遊泳の走化性や方向性、遊泳自体の運動性を明らかにできると考えられる。
雌雄配偶子の核の挙動より、産卵後も受精は完了しておらず、減数第二分裂は体外で進行することを示唆した。メス体内の卵巣と貯精嚢の位置関係から体内受精を行うと考えられてが、受精のタイミングについて新たな知見をもたらした。ライブイメー
ジングを用いてより詳細な受精のタイミング、また減数分裂の進行を追うことが今後の課題である。
2 種を用いて交尾後の産卵まで、また孵化までの時間計測を行い、生殖プロセスのタイムスパンを明らかにした。産卵までの卵、精子の挙動や、発生過程の動態を調査する上で重要な知見となると考えられる。また 2 種間では性比が異なっていた。クマムシにおける性決定様式は未だ解明されていないが、雌雄それぞれのゲノム解読により染色体依存である可能性を検証することができると考えられる。一方で環境依存型の節足動物を参考にしたホルモン様物質の投与により性比が変動していることから、
環境依存型の性決定を行っている可能性もある (湊, 2019)。性決定様式の解明は一般的な有性生殖を行うクマムシの雌雄を決定する要因のみならず、単為生殖集団からのオス産生が報告されているクマムシ、Milnesium inceptum Morek et al., 2019 でのオス産
生メカニズムにも寄与できると考えられる。
第 3 章では M. shonaicus が北海道と沖縄を除く、本州、四国、九州と離島に広く生息していることを、形態情報と分子系統解析によって明らかにした。この結果から M.
shonaicus は日本国内に広く分布する種であると言える。先行研究にて M. hufelandi と74

記載されている個体にも M. shonaicus が潜在している可能性を示唆し (Suzuki, 2017)、
再解析が望まれる。
成体と卵の形態測定結果より、地域ごとに形態に微差が生じていること、また成体の形態多様性と比較して、卵の形態がより多様化していることを明らかにした。このことより進化速度が成体の形態より卵の形態のほうが早いことが示唆された。卵形態の差が群体間で大きくなることは他種のクマムシでも報告されているが (Stec et al.,2016)、一方で雄性配偶子である精子の形態について、群体間での比較を行った報告はなく、今後は両配偶子の形態進化を考察する上で、精子の形態を詳細に記載することが重要であると考えられる。
染色体数は M. shonaicus の全ての群体間で一致し、n=6 だった。また交尾行動も地域差がなく、M. shonaicus 内では少なくともタイプ系統と各群体間では交尾行動の差異による生殖隔離は起きていないと示唆された。生殖隔離の有無を証明するため、処女メスを用いた交配実験を行う必要がある。日本での M. hufelandi の生息の真偽は疑わし
いが、報告されている Macrobiotus 属のクマムシを採取できれば、生殖隔離と地理的分離の関係性を検証することができ、クマムシの進化的背景の知見を蓄積できると期待される。
第 4 章では 2 種のクマムシ、Paramacrobiotus sp.と M. shonaicus において配偶子の形態観察を行い、精子の形態が種間で大きく異なることを明らかにした。卵の形態差も外見的に明らかであり、配偶子の形態に共進化が起きている可能性が示唆される。
一方でその進化の要因、また形態の有意性は未解明である。この解明のためには、配偶子の重要な役割である受精における有意性と、産卵後の自然環境中における発生への影響を合わせて考察する必要があり、今後の課題である。
貯精嚢に蓄積した精子は鞭毛が消失しており、これはチョウメイムシ科内で保存された性質であると示唆された (Rebecchi, 1997)。この脱鞭毛のメカニズムは明らかにな

75

っていないが、小さい貯精嚢を持つクマムシにとって、そのスペースを十分に使用するために進化の過程で獲得した現象であると考えられる。
卵と最初に結合する部位である先体の長さは、種間で大きく異なっていた。またク
マムシにおいて、先体と卵が結合している様子を初めて撮影することに成功した。生命の始まりである受精において、特にその第一段階である先体反応のメカニズムを明らかにすること、またその反応に関わる先体の形態進化の背景は、クマムシの種としての存続に大きく関わる要因として、今後も探究が望まれる。
最も種数の多い動物分類群は節足動物門で、約 130 万種が記載されている (Zhong,2013)。節足動物門は脱皮を行うことで成長する生物で、他の脱皮を行う動物とともに上記の分類階級とは別に脱皮動物群に分類される。脱皮動物群は線形動物門、類線形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、動吻動物門、鰓曳動物門、胴甲動物門によって構成され、線形動物は 5 番目、緩歩動物は 13 番目に種数の多い動物門である (Zhong,2013)。既知の生物の約 84%が脱皮動物に含まれることから、現存する動物の中で脱皮動物が最も繁栄した生物とも解釈できる。脱皮動物の中で 3 番目に種数の多い緩歩動
物門クマムシの、繁栄と進化を支える生殖生物学的知見は非常に興味深い。本研究がその知見拡充の一端を担えるだろう。

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渡辺 絵莉 (2020) 緩歩動物クマムシの交尾行動に関わるフェロモンの研究. 慶應義塾大学大学院 2019 年度 修士論文.
湊 廣輝 (2019) クマムシの性決定に対する幼若ホルモン様物質フェノキシカルブの影
響. 慶應義塾大学大学院 2018 年度 修士論文.

93公刊論文及び学会発表の目録

本論文に関する原著論文
第2章
Sugiura K, Minato H, Suzuki AC, Arakawa K, Kunieda T and Matsumoto M (2019)
Comparison of Sexual Reproductive Behaviors in Two Species of Macrobiotidae(Tardigrada: Eutardigrada).
Zoological Science, 36 (2): 120–127.

第3章
Sugiura K, Arakawa K and Matsumoto M (2020)
Distribution of Macrobiotus shonaicus Stec, Arakawa & Michalczyk, 2018 (Tardigrada:
Eutardigrada: Macrobiotidae) in Japan.
Zootaxa, 4767 (1): 56–70.
Erratum: Zootaxa, 4778 (3): 600.

第4章
Sugiura K and Matsumoto M (in press)
Spermatozoa morphology changes during reproduction and first observation of acrosomal
contact in two dioecious species of Macrobiotidae (Tardigrada: Eutardigrada).
Zygote, accepted (July 18th, 2020).

94その他の論文
Sugiura K, Minato H, Matsumoto M and Suzuki AC (in press)
Milnesium (Tardigrada: Apochela) in Japan: the First Confirmed Record of Milnesium
tardigradum s.s. and Description of Milnesium pacificum sp. nov.
Zoological Science, accepted (May 31st, 2020).
Yoshida Y, Sugiura K (co-first), Tomita M, Matsumoto M and Arakawa K (2019)
Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching
coordination.
BMC Developmental Biology, 19: 24.
Suzuki AC, Heard L and Sugiura K (2018)
御蔵島の陸生緩歩動物(第 1 報).
Mikurensis, 7: 3–8.

国際学会発表口頭
Sugiura K, Minato H, Suzuki AC, Arakawa K, Kunieda T and Matsumoto M.
Comparison of sexual reproductive behaviors in two species of Macrobiotidae.
The 14th International Symposium on Tardigrada. 2018 年 7 月, Denmark.

ポスター
Sugiura K, Yoshida Y, Onoda K, Suzuki AC, Arakawa K and Matsumoto M.
Sex determination in Tardigrada for evolutionary insight.
The joint meeting of the 22nd International Congress of Zoology and the 87th Meeting ofthe Zoological Society of Japan. 2016 年 11 月, 沖縄.

95

国内学会発表
口頭杉浦健太, 松本緑. クマムシの交尾も、味わい深い.
日本動物学会第 90 回大阪大会. 2019 年 9 月, 大阪.
杉浦健太, 松本緑. クマムシの交尾も、味わい深い.
第 4 回クマムシ学研究会. 2019 年 9 月, 大阪.
杉浦健太, 荒川和晴, 國枝武和, 松本緑. 生殖からみるクマムシの世界.
日本動物学会第 89 回札幌大会. 2018 年 9 月, 札幌.
杉浦健太, 湊廣輝, 松本緑. ショウナイチョウメイムシは”ショウナイチョウメイムシ”
か.
第 3 回クマムシ学研究会. 2018 年 9 月, 横浜.
杉浦健太, 松本緑. 生殖からみるクマムシの進化.
Evo-Devo 青年の会. 2018 年 8 月, 東京.
杉浦健太, 吉田祐貴, 國枝武和, 鈴木忠, 荒川和晴, 松本緑.
緩歩動物クマムシの有性生殖 -雌雄の違いと求愛・交尾行動の観察-.
日本動物学会第 88 回富山大会. 2017 年 9 月, 富山.
杉浦健太, 松本緑. クマムシの生殖戦略. 第 6 回生殖若手の会. 2018 年 3 月, 下田.
杉浦健太, 湊廣輝, 松本緑. 有性生殖クマムシの交尾行動.
第 2 回クマムシ学研究会. 2017 年 8 月, 東京.
杉浦健太, 松本緑. 日吉マムシ谷に生息するクマムシとその生殖様式.
第 1 回クマムシ学研究会. 2016 年 4 月, 横浜.

96

ポスター
杉浦健太, 梁瀬隆二、柴小菊、稲葉一男、松本緑.
ショウナイチョウメイムシ(Macrobiotus shonaicus)の生殖戦略.
日本動物学会関東支部会第 72 回大会. 2020 年 3 月, 横浜.
K Sugiura, R Yanase, K Shiba, K Inaba and M Matsumoto.
Transition of gametes structures on reproductive process in tardigrades Macrobiotus
shonaicus.
ABiS Symposium 電子顕微鏡イメージングの最先端と未来. 2020 年 2 月, 岡崎.
杉浦健太, 松本緑. クマムシの精子の形態変化が与える生殖への影響.
日本進化学会第 21 回大会. 2019 年 8 月, 札幌.
杉浦健太, 松本緑. クマムシの精子の形態変化が与える生殖への影響.
第 0 回進化学若手の会. 2019 年 8 月, 札幌.
杉浦健太, 松本緑. クマムシにおける DM ドメイン遺伝子の進化.
日本進化学会第 20 回大会. 2018 年 8 月, 東京.
杉浦健太, 松本緑.緩歩動物クマムシの性差をもたらす分子基盤の解明.
2017 年度生命科学系学会合同年次大会. 2017 年 12 月, 神戸.
杉浦健太, 松本緑. 緩歩動物クマムシの有性生殖.
第 1 回慶應ライフサイエンスシンポジウム. 2017 年 8 月, 横浜.
杉浦健太, 吉田祐貴, 小野田海道, 國枝武和, 鈴木忠, 荒川和晴, 松本緑.
クマムシの生殖戦略 -雄分化の謎に挑む-.
Hiyoshi Research Portfolio 2016. 2016 年 11 月, 横浜.

97謝辞
本論文は、著者が慶應義塾大学大学院理工学研究科 後期博士課程在学中に行なった研究成果をまとめたものです。研究の遂行に対して終始ご指導いただき、加えて研究者として課題に向き合う姿勢をご教示いただいた同大学理工学部 准教授 松本緑 博
士に心より感謝の意を表します。また近年稀にみる困難な状況の中、学位請求論文審査において貴重なご助言、ご指導をいただいた同学部 教授 清水史郎 博士、教授 土居信英 博士、准教授 堀田耕司 博士に深く感謝申し上げます。
本研究で用いた Paramacrobiotus sp.は東京大学理学系研究科 准教授 國枝武和 博士に、Macrobiotus shonaicus は慶應義塾大学環境情報学部 准教授 荒川和晴 博士に分与いただき、さらに本研究内外でもご指導、ご助言いただきました。慶應義塾大学医学部 准教授 鈴木忠 博士には本研究内外でご指導いただいたことに加え、著者がクマム
シを題材として研究を始めるきっかけを作っていただきました。本研究を論文化するにあたり East Tennessee State University の Dr. Diane Nelson、Jagiellonian University の Dr.
Łukasz Michalczyk には貴重なご助言をいただきました。本研究を遂行するにあたり、お世話になった多くの方々に心より御礼申し上げます。
著者は研究室、所属、年齢に関係なく多くの若手の同士に刺激をいただき、また濃密で実りある学生生活を満喫することができました。共に研究生活を過ごした松本研究室の皆様、生命情報学科の皆様、並びに研究生活を通じて知り合った友人の皆様に心より感謝申し上げます。
最後に博士過程への進学を快く受け入れ、このような充実した機会を与えてくださった家族、親族に感謝いたします。
なお本研究の一部は日本学術振興会 特別研究員奨励費(JP18J21345)、文部科学省科学研究費助成事業 先端バイオイメージング支援プラットフォーム(19C-010-L08)の支援を受けて遂行しました。