今井大達さん（博士前期課程２年）が第 55 回生命科学夏の学校で最優秀デザイン賞を受賞しました	 	  	 	  8 月 28 日から 8 月 31 日に、サンシャイン白子（千葉県長生郡）で行われた生化学若い研究者の会／第 55 回生命科学夏の学校において、大学院自然科学研究科生命・食料科学専攻基礎生命科学コース・博士前期課程２年の今井大達さんの研究発表が最優秀デザイン賞として表彰されました。	 	 
発表者：今井大達（新潟大学大学院自然科学研究科・博士前期課程２年）、	 	  	  	  	  （指導教員：内海	 利男	 教授、伊東	 孝祐	 助教）	 
演題名：ストークタンパク質を介した翻訳制御機構の研究	 

リンク：http://www.seikawakate.org/natu/dai55	 	 
リボソームストークタンパク質を介した翻訳伸長因子の作用機構	 	 ◯ 今井 大達1、三好 智博2、村上 僚1、伊東 孝祐1、石野 良純3、内海利男1（1新潟大学大学院・自然科学研究科、2新潟大学・超域、3九州大学大学院・農学研究院）	 Summary概要	 

ストークタンパク質複合体は、あらゆる生物のリボソーム大サブユニットに存在する構造体であり、タンパク質の合成活性に不可欠である。しかしながら、ストークタンパク質複合体を含む完全なリボソームの結晶構造は未だ報告されておらず、その作用機構には不明な点が多く残されている。古細菌のストークタンパク質複合体は、リボソームタンパク質aP0上に、aP1ホモ二量体が三対結合した七量対構造をとる。また、aP1は、二量体化に必要なN末端部位と、保存性の高いC末端部位から構成されている。さらに、aP1のC末端部位は一定の構造を取らず、ヒンジ部位を介して約125 Åという広い範囲に柔軟に運動する性質を持つことが知られている。

近年、当研究室では、単離したaP1の柔軟なC末端部位が、翻訳伸長因子であるaEF1AおよびaEF2と直接結合し、その酵素活性を促進することを明らかにした。翻訳の伸長段階では、aEF1A、aEF2と呼ばれる二種類のGTP結合型翻訳伸長因子が、リボソームへ交互に作用する。この際、それぞれの因子が、rRNAの機能部位の一つであるsarcin/ricin loop (SRL) に結合すると、GTPの加水分解が起こり、伸長反応の駆動力となる。従って、SRLとaEF1A、aEF2の円滑な相互作用サイクルは、タンパク質を効率よく合成するための基本現象であると考えられる。しかしながら、翻訳伸長段階において柔軟に運動するaP1のC末端部位と、aEF1A、aEF2のSRL作用機構の関係は明確にされていない。この点の解明はストークタンパク質複合体による翻訳促進機構の全貌を理解する鍵になると考え、rRNAフットプリント法による解析を行った。その結果、aEF1AおよびaEF2の両因子がrRNAのSRLに結合するために、aP1のC末端部位との相互作用が必須であることを明確に示す結果が得られた。aP1のC末端部位は、リボソーム周辺に存在するaEF1AおよびaEF2を捕獲し、SRLへリクルートすることで、両因子の効率的な機能発現を可能にすると考えられる。	  研究の目的

Discussion
ストークタンパク質aP0、aP1の柔軟なC末端部位は、リボソーム周辺に「翻訳伸長因子とaP0、aP1間の結合」と「翻訳伸長因子とSRL間の円滑な相互作用サイクル」の関連性の解明	 	 Fig. 1

ストークタンパク質複合体は細胞の生育とタンパク質合成に必須	 

ComplexaEF2Complex

翻訳伸長

リボソームストークタンパク質複合体
タンパク質合成に不可欠である（FIg.1）

作用機構は不明のまま	 

SRLは翻訳因子のLarge

GTP加水分解に重要

aP0にaP1 dimerが3対結合した7量体構造 aP0 (aP1)2 (aP1)2 (aP1)2 をとる(aP1)2(aP1)2

真核aP1オルソログのNMR

aP0	 

(aP1)2
ヒンジ部位

aEF2
aP0、aP1の共通C末端部位はaEF1A、aEF2と直接結合する（Fig. 2）

SRL：あらゆる生物に高度に保存されたRNAループ

GTP加水分解を経て機能を発揮

GTP型aEF1A、aEF2はaEF1A、aEF2と結合しaP0、aP1のC末端部位との相互作用を介してSRLへ結合（Fig. 4）①WT

小サブユニット

10 minaEF1A GDPCP Phe-tRNA
またはaEF2	

●10 minQuench

Primerextension
aEF1A
aEF2DMSaEF1ASequence-++++++

GTP加水分解活性とタンパク質合成活性を
古細菌リボソームを用いて測定（60-70 ºC）
GTP加水分解活性-A2665

aEF2

3’5ʼSRL

2 315ʼ

伸長因子

23

伸長因子
結合部位

4 5 63’伸長因子はrRNAを化学修飾から保護

120- ＋ 伸長因子

4 5 6 rRNAを化学修飾

456100

SequenceC U AG

aP1- + + + + + + aEF1A GDPCP-G2659-A2660-A2665806040SRL
修飾されたrRNAaEF2SRL

ハイブリッドリボソーム

aEF1A

ペプチド添加により相互作用をキャンセル（pmol）

2 3

共通C末端ペプチド(aP1)2

aP1
aEF2 GTP-G2659-A2660

∆CTD

1	 

●DMSフットプリント法でSRLと翻訳因子の結合を検出
1	 5 minC U AG②
変異導入型

大サブユニット
小サブユニット
ストークタンパク質複合体
tRNA

aEF2

Small	 

Fig. 5 aEF1A、aEF2が作用するにはaP0、aP1との相互作用が必要

GTP型aEF1A、aEF2がSRLに結合するには、aP0、aP1との相互作用が必要

Large

野生型

その後、GTP加水分解を経てそれぞれの機能を発揮（Fig. 5）

GTP加水分解を誘導（Fig. 3）

リボソーム大サブユニット(大腸菌由来)108〜 KEEEVSEEEA L AG L SA LF G

Sarcin/Ricin Loop (SRL)

aP0、aP1に変異を導入したハイブリッドリボソームを再構成	 

91

Small

aEF1A、aEF2はSRLと結合後	  Fig. 4	 

GTP�

aP0-C末端部位

aP1-C末端部位
sarcin/ricin loop (SRL)	 

Lee et al. (2013) Nucleic Acids Res.

23S rRNA	 

aEF1A

tRNAの運搬ペプチド結合形成	 	 

リボソーム転座反応

超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii のストークタンパク質複合体

あらゆる生物のリボソーム大サブユニットに存在完全なリボソームの構造は未解明

GDP�

aEF2

翻訳終結

Nomura,N. et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci.

ストークタンパク質複合体を含むGTP�

aEF1A(aP1)2aP1

Uchiumi et al. (2002) J. Biol. Chem.
Dawid et al. (2006) Mol. MicroBiol.

GDP�

aEF2
GTP�

aEF1A
aEF2

aP1

In vitroタンパク質
合成活性測定 →各因子の結合部位は共通

翻訳開始aEF1A↑ 酵母の生育実験	 Fig. 3

翻訳の伸長段階ではリボソームとaEF1A、aEF2が交互に相互作用

aEF2

aEF1AP0∆	 

両因子の効率的な機能発現を可能にすると考えられる

Fig. 2 aP0、aP1の共通C末端部位は翻訳伸長因子aEF1A、aEF2と直接結合

ストーク欠損による翻訳活性の消失

WT	 

存在するGTP結合型aEF1A、aEF2を捕獲し、SRLへリクルートすることでストークタンパク質複合体が担う翻訳促進機構の全貌を理解する

20Poly-Phe
141214121010886644200

未添加+ WTペプチド

図	  受賞したポスター（左）と表彰状（右）	 

タンパク質合成活性

aEF1A
181620+ F107Sペプチド