（ 1 ）215

日本食品保蔵科学会誌
３
７

VOL．

会
長
編集委員長
編集委員

５

NO．

高井 陸雄
上田 悦範
石田
裕
津久井亜紀夫

副

会

長

稲熊 隆博
東尾 久雄

上田

悦範

小宮山美弘

早坂

薫

井上 茂孝
古庄
律

今堀 義洋
松田 茂樹

竹永

章生

＜報
文＞
水耕栽培における施肥管理および栽培時期がミツバ（Cryptotaenia japonica Hassk.）の収量および品質に及ぼす影響 ………………………………………………………………………………（２１７）／嘉悦佳子・森川信也・磯部武志
中村謙治・阿部一博
未成熟パパイア（Carica papaya L.）の果実品質に及ぼす貯蔵条件の影響 ……………………………（２２７）／照屋 亮・前田剛希・広瀬直人
大城良計・秋永孝義＜報文＞（英文）
ダイコン（Raphanus sativus L.）のポリフェノール酸化酵素の精製と性質 ……………………………（２３３）／アンディ ヌル ファイダ ラーマン・太田真由美
李 英杰・中谷一哉・林 信行・藤田修二＜研究ノート＞
ケフィアグレイン菌株を用いたグレインの生成とケフィアの比較 ………………………………………（２４１）／長谷川真由美・綿貫仁美・林 一也
馬場 修・小原直弘
小麦（ハルユタカ）粒中のプロテインジスルフィドイソメラーゼ（PDI）の分離精製 ………………（２４５）／野口智弘・新井智美・野口治子
内野昌孝・!野克己＜講座＞
身近な野菜・果物〜その起源から生産・消費まで（１４）パインアップル 伝来と産業化および国内生産の現状について ………………………………………（２４９）／正田守幸＜文献抄録＞ ……………………………………………………………………………………………………（２５７）

216

（ 2 ）

Food Preservation Science

CONTENTS OF VOL．
３
７ NO．
５（２
０
１
１）
＜Article＞（Japanese）
Effect of Fertilizer Application Method and Cultivation Season on Yield andQuality of Solution-cultured Japanese Hornwort（Cryptotaenia japonica Hassk.）
KAETSU Keiko, MORIKAWA Shinya, ISOBE Takeshi,
NAKAMURA Kenji and ABE Kazuhiro …………………………………………………………………（２１７）Effect of Storage Conditions on the Quality of Immature Papaya（Carica papaya L.）FruitTERUYA Ryo, MAEDA Goki, HIROSE Naoto,
OOSHIRO Yoshikazu and AKINAGA Takayoshi ………………………………………………………（２２７）＜Article＞（English）
Purification and Characterization of Polyphenol Oxidasefrom Japanese Radish（Raphanus sativus L.）Root
ANDI Nur Faidah Rahman, OHTA Mayumi, LI Yunge,
NAKATANI Kazuya, HAYASHI Nobuyuki and FUJITA Shuji …………………………………………（２３３）＜Research Note＞（Japanese）
Comparison of the Kefir Uses Strain of Kefir Grains
HASEGAWA Mayumi, WATANUKI Hitomi, HAYASHI Kazuya,
BABA Osamu and OHARA Naohiro ……………………………………………………………………（２４
１）
Purification of Protein Disulfide Isomerase from Wheat（Haruyutaka）Grain
NOGUCHI Tomohiro, ARAI Satomi, NOGUCHI Haruko,
UCHINO Masataka and TAKANO Katsumi ……………………………………………………………（２４５）＜Serialization Lecture＞（Japanese）
Pineapple
SHODA Moriyuki……………………………………………………………………………………………（２４９）

（ 3 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１ 〔報

文〕

217

水耕栽培における施肥管理および栽培時期がミツバ（Cryptotaenia japonica Hassk.）の収量および品質に及ぼす影響
嘉 悦 佳 子＊１・森 川 信 也＊１・磯 部 武 志＊１
中 村 謙 治＊２・阿 部 一 博＊３＊１ 大阪府環境農林水産総合研究所＊２ エスペックミック（株）＊３ 大阪府立大学大学院生命環境科学研究科

Effect of Fertilizer Application Method and Cultivation Season on Yield andQuality of Solution-cultured Japanese Hornwort（Cryptotaenia japonica Hassk.）
KAETSU Keiko＊１，MORIKAWA Shinya＊１，ISOBE Takeshi＊１，
NAKAMURA Kenji＊２ and ABE Kazuhiro＊３
Research Institute of Environment, Agriculture and Fisheries, Osaka Prefectural Government,
442 Shakudo, Habikino, Osaka 583−0862＊２ Especmic Corp, 3−11−17 Ikeda, Neyagawa, Osaka 572−0039＊３ Graduate School of Agriculture and Biological Science, Osaka Prefecture University,
1−1 Gakuen−cho Naka−ku, Sakai, Osaka 599−8531＊１

In order to reduce excessive nitrate ion concentrations in vegetables, which may be one of thecauses of high blood levels of methemoglobin, the effect of organic fertilizer on yield in hydroponics
and the nitrate ion concentration in Japanese hornwort cultivated using the deep-flow technique was
evaluated. To investigate seasonal variability, one series of experiments was conducted in threeseasons, namely, spring, summer, and autumn. The nitrate ion concentration in Japanese hornwort
decreased with the increasing proportion of organic fertilizer to total fertilizer applied ; Japanese
hornwort plants grown in culture medium containing both organic and chemical fertilizers were able
to reduce the nitrate concentration compared with those grown in culture medium containing only
chemical fertilizer. In spring and autumn, the nitrate concentration of Japanese hornwort grown in
culture medium containing only organic fertilizer was the lowest, although plant height was the lowest.
Additionally, when using hydroponics with Japanese hornwort cultured in medium containing only
organic fertilizer, it was necessary to lower the temperature of the hydroponic solution to below２
５℃.
These results suggest that a reduction in nitrate ion concentration, whilst maintaining the yield ofhydroponically grown plants, is possible in Japanese hornwort when chemical fertilizer is used together
with organic fertilizer.
（Received Oct. ６, ２０
１０；Accepted Jul. １１, ２
０
１
１）
Key words：cultivation season, hydroponics, Japanese hornwort, nitrate ion concentration, organic fertilizer
栽培時期，水耕栽培，ミツバ，硝酸イオン濃度，有機質肥料

大阪府では，大阪の食文化に根差した農産物の中から，府内で一定量の生産があり，独自の栽培技術で生産され

＊１
§
＊２
＊３

ている２
１品目を「なにわ特産品」として認証されている１）〜３）。ミツバは「なにわ特産品」の中で主要な作物で

〒５
８
３―０
８
６
２ 大阪府羽曳野市尺度４４２Corresponding author, E-mail : kaetsuk@mbox.epcc.pref.osaka.jp
〒５
７
２―０
０
３
９ 大阪府寝屋川市池田３―１
１―１
７
〒５
９
９―８
５
３
１ 大阪府堺市中区学園町１―１

218

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

あり，大阪府内では泉州地域を中心に生産されており，（ 4 ）２．設定試験区

全国第７位の出荷量および全国第８位の作付面積を誇

春作は，元肥と追肥ともに有機質肥料のみを施用したる４）。生産者は，昭和４０年代からミツバの水耕栽培に取

有機区，有機質肥料と化学肥料を元肥とし，有機質肥料

り組み，現在，大阪府産ミツバの多くは湛液型水耕栽培のみを追肥したハイブリッド１
００区，有機質肥料５０％と（作付面積の約８５％）で生産されている５），６）。

化学肥料５０％を追肥したハイブリッド５
０区，化学肥料の

しかし，水耕栽培で生産したミツバでは，硝酸イオン

みを施用し有機区と同量の全窒素換算量の化学肥料を追濃度が約８，
０００ppmとなったとの報告がある７）。植物は，肥した無機区，施肥の窒素量を考慮せず慣行法と同様に窒素肥料の過剰供給や日照不足が要因となって，硝酸イ

ECで化学肥料を施用した対照区の５試験区で栽培を行

オンを葉に蓄積する性質がある８），９）。硝酸イオンは，多った。

量摂取によりメトヘモグロビン血症や生殖機能障害など

また，夏作は，春作と同様である有機区，ハイブリッ

１０）の健康に悪影響があることが報告されていることから ，

ド１
００区，ハイブリッド５
０区，無機区の４試験区に，有ミツバに含まれる硝酸イオン濃度を低下させる栽培技術

機質肥料と化学肥料を元肥として，追肥に有機質肥料の開発が求められている。

１０％と化学肥料９０％を施用したハイブリッド１
０区，化学

筆者らは，これまでに「なにわの伝統野菜」の一種である

毛馬

キュウリの湛液型水耕栽培において，慣行法である化学肥料の代わりに有機質肥料を施用すると毛馬

キュウリ果実中の硝酸イオン濃度を低下することを報告した１１）。

肥料のみを追肥したハイブリッド０区の２試験区を加えた６試験区で栽培を行った。
秋作は，夏作と同様の６試験区で行った。
３．施 肥 管 理
春作の対照区および春作・夏作・秋作の無機区の元肥そこで，本研究では，ミツバの湛液型水耕栽培においは，化学肥料であるマツザキ１号と２号（N１
０．
４％，P２

て，化学肥料の代わりに有機質肥料を施用して，慣行のO５ ２．
１％，K２O １
４．
４％）を大塚A処方１２）で施用した。対

化学肥料を施用した水耕栽培と比較することにより，有照区は，培養液をEC約３．
０dS／mで管理し，これに従っ

機質肥料の施用がミツバに含まれる硝酸イオンに及ぼすて追肥した。春作・夏作・秋作の有機区，ハイブリッド

影響を明らかにした。また，ミツバを春作と夏作ならび

１
０
０区，ハイブリッド５
０区，ハイブリッド１
０区，ハイブに秋作で栽培することで，栽培時期の差異が有機質肥料

リッド０区に施用した有機質肥料は，コーンスターチをを施用した水耕栽培におけるミツバの品質に及ぼす影響

生産する際の産業廃棄物であるコーンスティープリカーを検証した。

（N３％，P３％，K２％）（以 下，CSL）を 施 用 し た。
篠原らが開発した有機質肥料を施用する養液栽培技術

実験材料および実験方法（並行複式無機化法）を参考にし１３），有機質肥料である
CSLを１
６５!および土壌１
６５!を投入し，有機態窒素が硝

１．栽 培 方 法
白茎三酸態窒素に分解するまで約２週間曝気した。ハイブリッ

ツ葉 （タキイ種苗）を１ブロックあたり２０粒程度となド１
００区，ハイブリッド５
０区，ハイブリッド１
０区，ハイるよう播種した。立枯病と根腐病対策として播種の前日

ブリッド０区では，対照区の元肥の窒素供給量と同量にに種子の殺菌を行った。播種後，人工気象器（気温：なるように化学肥料を施用して窒素を補った。追肥は並２５℃）内で育苗して，１試験区あたり６２ブロックずつ定行複式無機化法を参考にし１３），３日に１回，規定量の有植し，循環型湛液水耕栽培を行った。栽培装置は，栽培

機質肥料および化学肥料を培養液に添加した。また，無槽と貯水槽には樹脂製容器を使用した。栽培槽中に十分

機区には有機区に追肥した窒素供給量と同量の化学肥料

な溶存酸素が存在するようにエアーポンプによる曝気をを追肥した。

行い，栽培槽とその下部に設けた貯水槽の間をポンプに

４．測 定 項 目

３００ブロックのウレタンマット２枚にミツバ

より常時培養液を循環させて栽培を行った。なお，栽培

栽培期間中は，ミツバの生育調査および培養液のEC槽と貯水槽の水量と合わせると，試験区の水量は１１０"とpHならびに無機塩類濃度（調査項目：硝酸イオン濃であった。

度，亜硝酸イオン濃度，アンモニウムイオン濃度）を定

春作は，２
０
０
９年２月２
４日に播種し，同年３月１２日に定期的に測定した。

植した。栽培期間中の施設内の平均気温は１
５．
２℃で，平

全試験区から平均的な生育を示した１０ブロックずつを

均相対湿度は６２．
５％であった。また，夏作は，２００
９年５収穫し，収穫物の調査（調査項目：草丈，根長，地上部

月１３日に播種し，同年６月５日に定植した。栽培期間中

生体重および乾物重，水分含量，根部乾物重，葉身のの施設内の平均気温は２８．
７℃で，平均相対湿度は７２．
１％

SPAD値）を行った。

であった。秋作は，２
０
０
９年９月１
８日に播種し，同年１０月

また，収穫したミツバをナイフで細かく刻み，成分分

５日に定植し，栽培期間中の施設内の平均気温は１８．
９℃

析に供した。それぞれを含量によって５〜３０倍の純水をで，平均相対湿度は７４．
２％であった。

加えるこ と に よ っ て 希 釈 し，ホ モ ジ ナ イ ザ ー（PROScientific Inc．製

PRO２００Homogenizer）で 粉 砕 後，

（ 5 ）〔報

小型反射式光度計（Merch社製

文〕 施肥管理とミツバ品質変化

219

期に約２
０
０ppmであったが，栽培中に低下し，栽培開始

RQフレックス）で，
１
４）

各部位に含まれる硝酸イオン濃度を測定した 。それぞから２週間後および収穫時には検出されなかった。また，れの測定は，３反復行った。

他の４試験区の硝酸イオン濃度は，栽培初期には同様に

春作は２
０
０
９年４月２
５日に，夏作は同年７月２
３日に，秋
作は同年１
１月１
３日に収穫し，上記の測定を行った。
300

１．ミツバ湛液型水耕栽培【春作】（１）生育および収量

栽培中のミツバ草丈の変化

をFig．
１−!に示した。ハイブリッド１
０
０区とハイブリッド５０区および無機区と対照区の４試験区は同様に生長し，収穫時の草丈も同等であった。しかし，有機区は，他のPlant height (mm)

実験結果

I

250
200
150
100
50

４試験区と比較して，生長が遅延した。また，春作にお0ける水耕栽培装置中の培養液温度は，栽培期間を通じて

3/17

約２
０℃で推移した（Fig．
１−"）
。

3/24 3/31 4/7 4/14 4/21
Measurement date (month/day)

ブリッド１
０
０区とハイブリッド５０区で最も高く，ついで，無機区と対照区で，最も低かったのは有機区であった。
また，根は有機区で最も長かった。次に，地上部生体重は，ハイブリッド１
００区とハイブリッド５
０区，対照区で最も大きく，ついで，無機区で，最も小さかったのは有機区であった。地上部乾物重は，ハイブリッド１
０
０区と
ハイブリッド５０区，無機区，対照区で同等であり，有機区のみが小さかった。また，水分含量は全試験区で同等であった。根部乾物重は，有機質肥料を施用した割合が高い有機区とハイブリッド１
００区，ハイブリッド５
０区で

Nutrient solution temperature（℃）

収穫物の調査結果をTable１に示した。草丈は，ハイ

大きく，無機区と対照区で小さかった。葉身のSPAD値

II

30
25
20
15
10
5
0
3/12 3/19 3/26 4/2 4/9 4/16 4/23
Measurement date (month/day)

Fig ．
１ Changes in plant height of Japanese hornwort（I）and temperature of the hydroponic solution（II）inspringは，有機区で最も小さく，ついで，ハイブリッド１
０
０区とハイブリッド５
０区で，最も大きかったのは無機区と対照区であった。
（２）培養液に含まれる窒素形態

35

I ： ○ ： Organic fertilizer（１００％ ）； ● ： Hybrid （ additionalorganic fertilizer１００％ ）； △ ： Hybrid （ additional organic
fertilizer［５０％］and chemical fertilizer［５０％］）；▲：Chemicalfertilizer（１００％）；□：Chemical fertilizer（１００％，conventional
method）

春作のミツバ湛

液型水耕栽培の培養液に存在する硝酸イオン濃度と亜硝酸イオン濃度ならびにアンモニウムイオン濃度の推移結果をFig．
２に示した。有機区の硝酸イオン濃度は栽培初

Table１ Effect of the fertilizer application method on yield and quality of Japanese hornwort in spring
Leaf and leafstalkFertilizer
application
methodPlant height（㎜）

Root length
（㎜）

O

２
０
３．
４ cz

H１
０
０
H５
０
C
CC

２
８
７．
５ a
２
９
１．
１ a
２
６
７．
３ b
２
７
４．
２ b

２
４
４．
５ a
１
７
５．
０ ab
１
９
０．
７ ab
１
４
９．
８ c
１
６
２．
１ bc

Root

Fresh weight（#）

Dry weight（#）

Water content（％）

Dry weight
（#）

SPAD

１
９．
２ c
３
３．
０ ab
３
３．
５ a
３
０．
９ ab
２
９．
４ b

１．
３ b
２．
２ a
２．
３ a
２．
３ a
２．
０ a

９
３．
３ a
９
３．
４ a
９
３．
３ a
９
２．
７ a
９
２．
９ a

０．
７
６ a
０．
７
２ a
０．
６
３ ab
０．
４
４ b
０．
４
３ b

２
９．
２ d
３
４．
８ bc
３
４．
６ bc
３
５．
９ ab
３
６．
６ a

z：Different letters indicate significant difference between themeans at a５％ level（Fisher’s least significant difference［LSD］
test）.
O：Organic fertilizer（１００％）
H１００：Hybrid（additional organic fertilizer［１
０
０％］）
H５
０：Hybrid（additional organic fertilizer［５０％］and chemical fertilizer［５０％］）C：Chemical fertilizer（１００％）
CC：Chemical fertilizer（１００％，conventional method）

2,000

Ⅰ: Nitrate ion

1,600
1,200
800
400

Concentration （ppm）

ND
3/12 3/21 3/30 4/8 4/17 4/26
Measurement date (month/day)100

Ⅱ: Nitrite ion

5,000
4,000
3,000
2,000
1,000
ND

O

H100
H50
C
CC
Fertilizer application method

Fig ．
３ Effect of the fertilizer application method on
nitrate ion concentration in Japanese hornwort inspring

60
40
20

60

（ 6 ）

6,000

80

ND
3/12 3/21 3/30 4/8 4/17 4/26
Measurement date (month/day)

Concentration (ppm)

Nitrate ion concentration (ppm)

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

Concentration （ppm）

220

Ⅲ: Ammonium ion

Values are the means of three replicates and bars represent
the S. E. The horizontal axis represents the fertilizer
application method shown in Table１.

のは約３００ppm存在した有機区であった。

50

２．ミツバ湛液型水耕栽培【夏作】

40（１）生育および収量

栽培中のミツバ草丈の変化

30

をFig．
４−!に示した。春作と同様に，ハイブリッド１
０
０

20

区，ハイブリッド５
０区，ハイブリッド１
０区，ハイブリッ10

ド０区および無機区の５試験区は同様に生長した。しかND
3/12 3/21 3/30 4/8 4/17 4/26
Measurement date (month/day)

し，有機区は，他の５試験区と比較して生長が遅延・停止して販売規格に達さなかったために，最終的に収穫できなかった。夏作における水耕栽培装置中の培養液の水

Fig．
２ Changes in nitrate（I）, nitrite（II）and ammonium（III）ion concentrations of the hydroponic solution inspring

栽培後期には約３０℃以上であった（Fig．
４−"）
。

○：O；●：H１００；△：H５０；▲：C；□：CC（shown in Table１）

量中に占める有機質肥料割合の高い順に高かった。有機

温は栽培初期に約２５℃であったが，栽培期間中に上昇し収穫物の調査結果をTable２に示した。草丈は全施肥
質肥料および化学肥料を施用した中で，草丈は，最も有機質肥料の割合が高いハイブリッド１
００区で最も高く，推移していたが，栽培が進むにつれてその差が現れて，ついで，ハイブリッド５
０区，ハイブリッド１
０区，ハイブ

栽培後期には全施肥量中の有機質肥料の割合が高い順に

リッド０区の順で高く，最も低かったのは無機区であっ小さかった。よって，全施肥量中の有機質肥料の割合がた。また，根長，地上部生体重および乾物重，根部乾物

高いほど，培養液中の硝酸イオン濃度が低かった。亜硝重は，全ての試験区ともほぼ同等であり，施肥管理との酸イオン濃度は，有機区とハイブリッド１
００区およびハ関連は見られなかった。次に，水分含量はハイブリッド

イブリッド５０区で栽培中に低下し栽培後期には検出され１００区が最も多く，ついで，ハイブリッド１
０区で，最もなかった。無機区と対照区では栽培中に検出されなかっ少なかったのはハイブリッド５０区とハイブリッド０区なた。アンモニウムイオン濃度は全試験区で栽培中に低下

らびに無機区の３試験区であった。葉身のSPAD値は，し，栽培後期には検出されなかった。

ハイブリッド１
０区が最も大きく，他の４試験区は同等の（３）ミツバに含まれる硝酸イオン濃度

春作のミ結果であった。

ツバ湛液型水耕栽培における収穫物中の硝酸イオン濃度（２）培養液に含まれる窒素形態の測定結果をFig．
３に示した。ミツバ中の硝酸イオン濃液型水耕栽培の培養液中に存在する硝酸イオン濃度と亜度は，約５，
９００ppm存在した対照区で最も高く，ついで，硝酸イオン濃度ならびにアンモニウムイオン濃度の推移

無機区で約４，４
００ppm，ハイブリッド５０区で約３，
００
０ppm，

結果をFig．
５に示した。硝酸イオンは有機区では栽培中

ハイブリッド１
００区で約２，
５００ppmであり，最も低かったに検出されなかった。また，他の５試験区の硝酸イオン

夏作のミツバ湛

〔報Plant height (mm)300文〕 施肥管理とミツバ品質変化

Concentration （ppm）

（ 7 ）

I

250
200
150
100

6/13 6/21 6/29 7/7

7/15

1,200

7/23
Concentration （ppm）

II

30
25
20
15

400

100

Ⅱ: Nitrite ion

80
60
40
20
ND
6/5 6/12 6/19 6/26 7/3 7/10
Measurement date (month/day)

10
5

60

6/15
6/25
7/5
7/15
Measurement date (month/day)

Concentration (ppm)

0
6/5

800

ND
6/5 6/12 6/19 6/26 7/3 7/10
Measurement date (month/day)

Measurement date (month/day)35

Ⅰ: Nitrate ion

1,600

50
0
6/5

Nutrient solution temperature
（℃）

2,000

221

Fig ．
４ Changes in plant height of Japanese hornwort（I）and temperature of the hydroponic solution（II）insummerI ： ○ ： Organic fertilizer （１００％ ）； ● ： Hybrid （ additionalorganic fertilizer ［１００％ ］）； △ ： Hybrid （ additional organic
fertilizer［５０％］and chemical fertilizer［５０％］）；▲：Hybrid（ additional organic fertilizer ［１０％ ］ and chemical fertilizer［９０％］）；□：Hybrid（additional chemical fertilizer［１００％］）；■：Chemical fertilizer（１００％）

Ⅲ: Ammonium ion

50
40
30
20
10
ND
6/5 6/12 6/19 6/26 7/3 7/10
Measurement date (month/day)Fig．
５ Changes in nitrate（I）, nitrite（II）and ammonium（III）ion concentrations of the hydroponic solution insummer○：Organic fertilizer１０
０％；●：H１００；△：H５０；▲：H１０；□：H０；■：C（shown in Table２）

Table２ Effect of the fertilizer application method on yield and quality of Japanese hornwort in summer
Leaf and leafstalkFertilizer
application
methodPlant height（㎜）

Root length
（㎜）

H１
０
０

２
８
５．
５ az

H５
０
H１
０
H０
C

２
４
０．
５ b
２
５
１．
５ b
２
２
５．
０ c
２
０
６．
０ d

１
２
６．
０ b
１
３
２．
５ b
１
６
３．
０ a
１
２
６．
０ b
１
２
４．
５ b

Root

Fresh weight（!）

Dry weight（!）

Water content（％）

Dry weight
（!）

SPAD

２
５．
４ a
２
３．
８ ab
２
６．
３ a
１
９．
８ b
２
４．
４ ab

２．
１ b
２．
６ ab
２．
５ ab
２．
３ ab
２．
８ a

９
１．
９ a
８
９．
２ c
９
０．
６ b
８
８．
２ c
８
８．
６ c

０．
４
９ a
０．
３
６ b
０．
３
６ b
０．
４
６ a
０．
４
７ a

３
７．
１ b
３
８．
４ b
４
０．
６ a
３
６．
６ b
３
８．
５ b

z：Different letters indicate significant difference between themeans at a５％ level（Fisher’s least significant difference［LSD］
test）.
H１
００：Hybrid（additional organic fertilizer［１
０
０％］）
H５
０：Hybrid（additional organic fertilizer［５０％］and chemical fertilizer［５０％］）H１０：Hybrid（additional organic fertilizer［１０％］and chemical fertilizer［９０％］）H０：Hybrid（additional chemical fertilizer［１００％］）C：Chemical fertilizer（１
０
０％）

222

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

6,000

約１
０ppm以下であった。アンモニウムイオン濃度は，有機区では検出されず，他の５試験区では栽培初期には同様に推移していたが，栽培後期には全施肥量中の有機質
肥料の割合が高い順に小さくなった。
（３）ミツバに含まれる硝酸イオン濃度

夏作のミツバ湛液型水耕栽培における収穫物中の硝酸イオン濃度の測定結果をFig．
６に示した。
ミツバ中の硝酸イオン濃度は，約４，５００ppm存在した無機区で最も高く，ついで，ハイブリッド０区で約４，３００Nitrate ion concentration (ppm)

濃度は，栽培後期に，全施肥量中の有機質肥料の割合が高い順に低くなった。亜硝酸イオン濃度は，全試験区で

5,000
4,000
3,000
2,000
1,000
ND
H100

ppm，ハイブリッド１
０区で約４，
１
００ppm，ハイブリッド
５
０区で約３，
８００ppmであり，最も低かったのは約３，０００ppm存在したハイブリッド１００区であった。よって，春作と同様に全施肥量中の有機質肥料の割合が高いほど，培養液中の硝酸イオン濃度が低かった。
夏作におけるミツバ中の硝酸イオン濃度は，全施肥量中に占める有機質肥料の割合の増加に伴い，培養液中の

（ 8 ）

H50
H10
H0
Fertilizer application method

C

Fig ．
６ Effect of the fertilizer application method on
nitrate ion concentration in Japanese hornwort insummerValues are the means of three replicates and bars represent
the S. E. The horizontal axis represents the fertilizer
application method shown in Table２.

硝酸イオン濃度が低下し，ミツバ中の硝酸イオン濃度も低下することが明らかになり，この結果は，春作と同様
であった。

300

（１）生育および収量

栽培中のミツバ草丈の変化

をFig．
７−!に示した。栽培中のミツバの生育は，栽培
初期は全試験区とも同様に生長した。その後，有機区は栽培中期から収穫時まで生長が遅延し，その他の５試験区は同様に生長した。秋作における水耕栽培装置中の培Plant height (mm)３．ミツバ湛液型水耕栽培【秋作】

200
150
100

養液温度は，栽培初期から中期まで約２５℃を維持したが，50

栽培後期には約２０℃まで低下した（Fig．
７−"）
。

0
10/5 10/12 10/19 10/26 11/2 11/9
Measurement date (month/day)

収穫物の調査結果をTable３に示した。草丈は，ハイの順となり，最も低かったのは有機区であった。また，根長は，施肥管理との関連はみられなかった。
一方，地上部生体重および乾物重，水分含量，根部乾物重は，全試験区とも同様の結果であったが，葉身のSPAD値は有機区で最も小さく，その他の５試験区は同等であった。ハイブリッド１
０
０区は草丈が高いが地上部
生体重が他の試験区と同等で，徒長傾向にあった。
（２）培養液に含まれる窒素形態

秋作のミツバ湛

液型水耕栽培の培養液中に存在する硝酸イオン濃度と亜硝酸イオン濃度ならびにアンモニウムイオン濃度の推移
結果をFig．
８に示した。栽培初期の硝酸イオン濃度は，有機区以外の５試験区では約８００ppmで同等であったが，栽培中に変化し，最終的には全施肥量中の有機質肥料の割合が高い順に低かった。一方，有機区の硝酸イオン濃度は栽培期間をとおして，約４００ppm以下で推移した。
よって，春作と同様に全施肥量中の有機質肥料の割合が高いほど，培養液中の硝酸イオン濃度が低かった。亜硝酸イオン濃度は，有機区で栽培初期に約１００ppmで最もNutrient solution temperature（℃）

ブリッド１
０区で最も高く，ついで，ハイブリッド５
０区な
らびにハイブリッド１
００区，ハイブリッド０区，無機区

I

250

35

II

30
25
20
15
10
5
0
10/5 10/12 10/19 10/26 11/2 11/9
Measurement date (month/day)Fig ．
７ Changes in plant height of Japanese hornwort（I）and temperature of the hydroponic solution（II）inautumn
I ： ○ ： Organic fertilizer （１００％ ）； ● ： Hybrid （ additionalorganic fertilizer ［１００％ ］）； △ ： Hybrid （ additional organic
fertilizer［５０％］and chemical fertilizer［５０％］）；▲：Hybrid（ additional organic fertilizer ［１０％ ］ and chemical fertilizer［９０％］）；□：Hybrid（additional chemical fertilizer［１００％］）；■：Chemical fertilizer（１００％）

（ 9 ）〔報文〕 施肥管理とミツバ品質変化

223

Table３ Effect of the fertilizer application method on yield and quality of Japanese hornwort in autumn
Leaf and leafstalkFertilizer
application
methodPlant height（㎜）

Root length
（㎜）

O

２
３
９．
０ dz

H１
０
０
H５
０
H１
０
H０
C

２
７
６．
０ ab
２
７
６．
０ ab
２
８
２．
０ a
２
６
６．
０ bc
２
５
２．
５ cd

１
６
１．
０ b
１
０
８．
０ c
１
７
３．
５ b
２
０
１．
５ a
１
７
２．
５ b
１
９
９．
５ a

Root

Fresh weight（!）

Dry weight（!）

Water content（％）

Dry weight
（!）

SPAD

１
７．
１ b
１
８．
４ ab
２
０．
２ ab
２
１．
５ a
１
９．
８ ab
１
７．
６ ab

０．
６ b
０．
８ ab
０．
８ ab
０．
９ a
０．
８ ab
０．
８ ab

９
６．
３ a
９
５．
９ ab
９
６．
０ a
９
５．
９ ab
９
６．
０ a
９
５．
４ b

０．
１
５ a
０．
１
１ ab
０．
０
９ bc
０．
１
０ bc
０．
０
５ cd
０．
０
３ d

３
１．
７ b
３
５．
２ a
３
４．
８ a
３
５．
０ a
３
５．
１ a
３
６．
２ a

z：Different letters indicate significant difference between the

2,000

大きく，栽培中に低下して収穫時には検出しなかった。
Ⅰ: Nitrate ion

また，ハイブリッド１
００区，ハイブリッド５
０区，ハイブ1,600

リッド１
０区，ハイブリッド０区の４試験区は有機区と同1,200様に低下傾向であった。無機区では栽培中に検出しなか800った。アンモニウムイオン濃度は，有機区以外の５試験
区は栽培初期に約４０ppmで同等であったが，栽培中に低

400
ND
10/5

下し，収穫時には４試験区とも約１０ppmであった。有機
10/15

10/25

11/4

11/14

Concentration （ppm）

Measurement date (month/day)
100（３）ミツバに含まれる硝酸イオン濃度

秋作のミ

ツバ湛液型水耕栽培における収穫物中の硝酸イオン濃度の測定結果をFig．
９に示した。
ミツバ中の硝酸イオン濃度は，約５，１００ppm存在した無機区で最も高く，ついで，ハイブリッド０区で約４，
６
０
０

60

ppm，ハイブリッド１
０区で約４，
０００ppm，ハイブリッド
40
20
ND
10/5
60

Concentration (ppm)

Ⅱ: Nitrite ion

80

区は栽培期間をとおして約１０ppmを維持した。

6,000
10/15 10/25
11/4
11/14
Measurement date (month/day)
Ⅲ: Ammonium ion

50
40
30
20
10
ND
10/5

Nitrate ion concentration (ppm)Concentration （ppm）

means at a５％ level（Fisher’s least significant difference［LSD］
test）．
O：Organic fertilizer（１００％）
H１００：Hybrid（additional organic fertilizer［１
０
０％］）
H５
０：Hybrid（additional organic fertilizer［５０％］and chemical fertilizer［５０％］）H１０：Hybrid（additional organic fertilizer［１０％］and chemical fertilizer［９０％］）H０：Hybrid（additional chemical fertilizer［１００％］）C：Chemical fertilizer（１
０
０％）

5,000
4,000
3,000
2,000
1,000
ND

10/15 10/25
11/4
11/14
Measurement date (month/day)Fig．
８ Changes in nitrate（I）, nitrite（II）and ammonium（III）ion concentrations of the hydroponic solution inautumn○：O；●：H１００；△：H５０；▲：H１０；□：H０；■：C（shownin Table３）

O

H100
H50
H10
H0
Fertilizer application method

C

Fig ．
９ Effect of the fertilizer application method on
nitrate ion concentration in Japanese hornwort inautumnValues are the means of three replicates and bars represent
the S. E. The horizontal axis represents the fertilizer
application method shown in Table３．

224

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

（ 10 ）

５０区で約３，
９００ppm，ハイブリッド１
００区で約３，
３００ppm

りして，本研究で明らかになった有機質肥料のみを施用であり，最も低かったのは約２，９００ppm存在した有機区

した水耕栽培の問題点を解決する技術の確立が必要であ

であった。

る。

秋作におけるミツバ中の硝酸イオン濃度は，全施肥量以上の結果から，ミツバにおける有機質肥料と化学肥中に占める有機質肥料の割合の増加による培養液中の硝料を併用した栽培では，慣行の化学肥料による栽培と同酸イオン濃度の低下に伴って，低下することが明らかに等の収量が得られたことに加えて，ミツバ中の硝酸イオなり，この結果は，春作と同様であった。

ンを低減することが示唆された。

考

察

要

約

本研究では，ミツバの湛液型水耕栽培において，施用

メトヘモグロビン血症の原因といわれている野菜に含する有機質肥料の割合が多いほど，収穫物の硝酸イオン

まれる硝酸イオンの低減を目的とし，化学肥料の代わり濃度が低下した。葭田らは，ホウレンソウの土耕栽培にに有機質肥料を施用したミツバの湛液型水耕栽培を行っ

おいて，有機質肥料を施用すると，土壌中の硝酸イオン

た。また，栽培時期の差異が有機質肥料を施用したミツ濃度が低下したため，化学肥料を施用した慣行栽培より

バ水耕栽培およびミツバの品質に及ぼす影響について検

収穫物に含まれる硝酸イオン濃度が低下したと報告して討した。

いる１５）。また，ホウレンソウの水耕栽培において，供給

ミツバの硝酸イオン濃度は，全施肥量中に占める有機

される硝酸態窒素が少なくアンモニア態窒素が多い場合，

質肥料割合の増加に伴い低下した。有機質肥料のみを施

植物体はアンモニア態窒素を多く吸収することが報告さ用してミツバを栽培すると化学肥料のみを施用する慣行

１６）れている 。一方，本試験の春作と秋作の結果から，有法に比べ作物中の硝酸イオン濃度は著しく低減できるが，機質肥料のみを施用すると，培養液中の硝酸イオン濃度

明らかな生長遅延を生じた。しかし，有機質肥料と化学が低い状態で，アンモニウムイオン濃度や亜硝酸イオン

肥料を併用すると慣行法と同等に生長し，作物体中の硝濃度が栽培初期に増加して消長した（Fig．
２，Fig．
８）。

酸イオン濃度を慣行法に比べ低下させることができた。

このことから，ミツバが硝酸イオンの代わりにアンモニ

夏季の高温時を除き，春作や秋作では，有機質肥料のみ

ウムイオンと亜硝酸イオンの窒素形態で吸収したと考えを施用したミツバの湛液型水耕栽培を行うことができた。

られた。したがって，ミツバの湛液型水耕栽培において，

したがって，ミツバの湛液型水耕栽培において，有機有機質肥料を施用すると，ミツバに蓄積する硝酸イオン

質肥料と化学肥料を併用することで収量を維持しつつミが低減したと考えられた。

ツバの硝酸イオン濃度を低下することが示唆された。

栽培時期について，春作や秋作では，培養液温度が約
文

２
０℃から約２５℃までに維持し，有機質肥料のみを施用し献てミツバを水耕栽培できた。しかし，夏作では，日中の

１）なにわ特産品産地育成協議会協議会：なにわ特産品

培養液温度が３０℃以上になり，有機質肥料のみを施用し（な に わ 特 産 品 産 地 育 成 協 議 会 協 議 会，大 阪），２てミツバを水耕栽培することはできなかった。有機質肥

（１
９
９
３）

料を分解する硝化菌は高温で死滅すると報告されており，

２）小林宏至：南大阪の野菜と果物，関西国際空港が拓

これにより，夏の高温時は硝化菌の働きが安定せず，有く南大阪の可能性／堺・南大阪地域学の世界，６，１
０３

機質肥料の分解ができなかったことが原因と考えられた１３）。また，高温のため有機物が腐敗した可能性もあり，水温が上昇しやすい夏季の高温条件においては栽培管理の不安定さが明確になり，有機質肥料を水耕栽培で施用することは困難であった。したがって，有機質肥料のみを施用した水耕栽培には，培養液温度を約２５℃以下で管理することが重要であった。
また，有機質肥料のみを施用したミツバの水耕栽培は，

〜１
１
１（２
０
０
７）
３）大阪府環境農林水産部農政室：大阪産（大阪府環境農林水産部農政室，大阪）
，４（２
０
０
９）
４）農水省統計部：平成１
７年度野菜生産出荷統計（農水省統計部，東京）
，７
３（２
０
０
７）
５）泉州農と緑の総合事務所：泉州の特産作物（泉州農と緑の総合事務所，大阪）
，２
１〜２
２（２
０
０
２）
６）山崎基嘉・瓜生恵理子・嘉悦佳子・瓦谷光男・根来

化学肥料での栽培に比べ生長が遅延することから，篠原淳一・西田真子：種子温湯処理方法の違いがミツバ種

らが報告している規定の有機質肥料施用量では湛液型水

子の発芽率に及ぼす影響，大阪環農水研報，２，２
９〜

耕栽培のミツバの生育に不十分と考えられた。有機質肥

３
１（２
０
０
９）

料のみを施用した水耕栽培でのミツバの生産の安定化に

７）中原光久：ミツバ水耕栽培における液体ケイ酸カリ

向けて，より多くの有機質肥料を施用するためには，よ

肥料の添加が生育及び硝酸イオン濃度に及ぼす影響，り多くの曝気を行って硝化に必要な溶存酸素量を増加し

農業環境工学関連７学会合同大会講演要旨集，９６
４たり，有機質肥料の施用を３日に１回ではなく，タイマ

（２
０
０
５）

ー等を使用し１日数回等の時間単位で小まめに投入した

８）王子善清・高祖明・脇内成昭・岡本三郎・河本正（ 11 ）

〔報文〕 施肥管理とミツバ品質変化

彦：野菜中での硝酸塩及び亜硝酸塩の集積と亜硝酸塩の毒性，神大農研報，１
６，２
９
１〜２
９
６（１
９
８
４）

８
１，７
５
３〜７
６
４（２
０
０
６）
１
４）建部雅子：作物栄養診断にための小型反射式光度計

ル（野菜茶業研究所，三重）
，１〜１
４
５（２
０
０
６）
１
０）国包章一：硝酸性窒素および亜硝酸性窒素の健康影システムによる硝酸及び還元型アスコルビン酸の簡易測定法，土肥誌，６
６，１
４
７〜１
１
２（１
９
９
５）

響，水環境学会誌，１
９，９
６
５〜９
６
８（１
９
９
６）
１
１）嘉悦佳子・森川信也・磯部武志・中村謙治・阿部一
馬信：有機質肥料の養液栽培−並行複式無機化法による養液内微生物生態系構築法，農業および園芸，

９）野菜茶業研究所：野菜の硝酸イオン低減化マニュア

博：水耕栽培における施肥法および培地の差異が

１
３）篠原

225

毛

キュウリ（Cucumis sativus L. cv. Kema）の苦味発現および品質に及ぼす影響，日食保蔵誌，３
６，２
２
７
〜２
３
３（２
０
１
０）
１
２）池田英男：用水と培養液の調整，日本施設園芸協会編，最新養液栽培の手引き（誠文堂，東京）
（１
９
９
６）

１
５）葭田隆治・有賀利光：作物における硝酸態窒素の吸収・同化とその制御１．
有機質肥料と硝酸含量，日作記，
５
８，７
６〜７
７（１
９
８
９）
１
６）岩田正利：窒素形態の差異と蔬菜の生育３，園学雑，
３
１，３
９〜５
２（１
９
６
２）
（平成２
２年１
０月６日受付，平成２
３年７月１
１日受理）

（ 13 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１ 〔報

文〕

227

未成熟パパイア（Carica papaya L.）の
果実品質に及ぼす貯蔵条件の影響
亮＊１§・前 田 剛 希＊２・広 瀬 直 人＊１
大 城 良 計＊１・秋 永 孝 義＊３

照屋＊１ 沖縄県農業研究センター＊２ 沖縄県農業研究センター宮古島支所＊３ 元琉球大学農学部生物生産学科

Effect of Storage Conditions on the Qualityof Immature Papaya（Carica papaya L.）FruitTERUYA Ryo＊１§，MAEDA Goki＊２，HIROSE Naoto＊１，
OOSHIRO Yoshikazu＊１ and AKINAGA Takayoshi＊３＊１＊３

Okinawa Prefectural Agricutural Reseach Center, 820 Makabe, Itoman, Okinawa 901−0336＊２ Okinawa Prefectural Agricultural Research Center Miyakojima Branch,2071−40 Taira, Miyakojima, Okinawa 906−0012
Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus, 1 Senbaru, Nishihara, Okinawa 903−0213

Immature papaya（green papaya）is used as a vegetable in Okinawa, Japan. However, there is little
information regarding its storage. We investigated the relationship between storage temperature andthe respiratory rate of vegetable papaya, and estimated a suitable storage temperature. Next, we
examined the effect of storage conditions on the quality of papaya fruit. Chilling injury, fungal decay,and shriveling affected the quality of vegetable papayas during storage. The verified suitable storage
conditions were １
３℃ with a relative humidity of ９０％. Under these conditions, the fruit maintained agood quality for３weeks. During storage, the contents of maric acid and ascorbic acid in vegetable
papaya increased, whereas the sugar content decreased. Furthermore, the vegetable papaya showed nosurface discoloration, increased respiratory rate, or decrease in fruit firmness during storage at thesuitable temperature.
（Received Apr. ４, ２０
１
１；Accepted Jul. ２０, ２
０
１
１）
Key words：vegetable papaya, storage, chilling injury, fungal decay, shrivring
野菜用パパイア，貯蔵，低温障害，カビ害，萎び

パパイア（Carica papaya L.）は，パパイア科パパイ

肉が黄化する前の状態の果実である。調理法としては，

ア属の常緑性小高木の熱帯果樹であり，日本では沖縄県

果皮と種子を取り除いた果肉を千切りにし，水さらしし

１）や南九州などで栽培されている 。沖縄県におけるパパたものを炒め物にする３）。また千切りしたものは食感がイア生産は，施設栽培の普及によってウイルスや台風被大根に近く，東南アジアではサラダや和え物にして食す害を軽減できるようになったことから近年生産量が増加

る４）。

２）

し，２
０
０
５年の出荷量は１，１２０tである 。この値は，成熟，

ところで，パパイア栽培においては，開花期の高温や未成熟果を含めた値であるが，大半は未成熟果が占める

低温によって奇形花や花落ちが発生し，収量に直接影響と考えられる。沖縄県で伝統的に野菜として利用される

することが知られている５）。沖縄県では，夏季の高温遭

未成熟パパイア（以下，野菜用パパイア）は，果皮や果遇に起因した開花・結実不良による，冬春期の収穫量減

＊１
§
＊２
＊３

〒９
０
１―０
３
３
６ 沖縄県糸満市８２０Corresponding author, E-mail : teruyary@pref.okinawa.lg.jp
〒９
０
６―０
０
１
２ 沖縄県平良市字西里２
０
７
１―４
０
〒９
０
３―０
２
１
３ 沖縄県西原町千原１

228

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

（ 14 ）

少が生じている。また一方では，夏秋期に収穫量が増加（４）呼吸速度の測定

し取引単価も下落するなど，周年での安定生産が困難な

り出し，試験１と同様にデシケーター内雰囲気の二酸化状況にある６）。このため多収穫期に対応した，野菜用パ

炭素排出量を測定した。

パイアの貯蔵技術と，関連する基礎的研究が必要である（５）評価方法

が，パパイアの鮮度保持に関する研究例は，成熟果に関び，果皮色を指標に測定した。カビ害は，供試果に発生する文献が多く７）〜１４），野菜用パパイアに関する報告は少するカビの程度を，目視で５段階評価した。すなわち，ない。

評点１＝変化なし，評点２＝軸部にわずかに発生，評点試験区あたり供試果３個を取

果実品質は，カビ害，低温障害，萎そこで本報では，野菜用パパイア貯蔵のための基礎的

３＝果実表面積の５％以内に発生，評点４＝５％〜１０％，

知見を得ることを目的とし，貯蔵温度と呼吸速度の関係

評点５＝１０％以上，とした。低温障害は，PROUXらの報を求め貯蔵適温を推測した。つぎに異なる温湿度での貯告８）を参考に，供試果に発生する窪み（ピッチング），色

蔵試験を行い果実の生理的・化学的変化を調査すること

むらを５段階評価した。すなわち，評点１＝変化なし，

によって，野菜用パパイアの貯蔵条件を検討した。

評点２＝わずかに発生，評点３＝果実表面積の５％以内に発生，評点４＝５％〜１
０％，評点５＝１０％以上，とし

実験方法
試験１た。萎びは，QUINTANAらの報告９）を参考に，供試果に発異なる貯蔵温度における野菜用パパイアの呼吸
速度

（１）試

生する萎びを５段階評価した。すなわち，評点１＝変化なし，評点２＝わずかな萎び，評点３＝明確な萎び，評

料

２
０
０
５年６月に，沖縄県農業研究センタ

ー内ガラスハウスで栽培された

台農５号 （両性株，

点４＝果実の軟化を伴う萎び，評点５＝強い軟化を伴う
萎び，とした。果皮色は，黄化の程度を５段階評価した。

平均４
４
０g±９
１g）
， フルーツタワー （雌株，平均９０１g

すなわち，評点１＝果実全体が緑色，評点２＝果実表面±７３g）および'KC−１
６ （雌株，沖縄農研センター選抜

積の５％以内が黄化，評点３＝５〜１
０％，評点４＝１０％

系統，平均１，０４０g±９６g）を用いた。供試果の熟度は，〜５０％，評点５＝５０％以上，とした。各評価は，全供試

一部着色した果実の３〜４節ほど上部にある緑色果実を果に対して行い，平均評点２を商品限界とした。

収穫し，傷や病害のない果実を選別した。

試験３（２）測定方法

成分の変化

呼吸速度は，密閉雰囲気中における単位時間あたりの二酸化炭素濃度上昇を測定し算出した。

異なる貯蔵温度における野菜用パパイアの内容

（１）試

料

２
０
０
７年８月に，沖縄県豊見城市で栽培

台農５号 （雌株，平均６９４#±５９#）とし，試

すなわち，供試果実１個を９．
７$容のデシケーターに入された

れ，恒温恒湿装置内で品温を安定させた。その後，デシ験１と同様に選別し，収穫した。

ケーターを密封して２０分〜１時間静置し，容器内雰囲気（２）貯蔵条件の二酸化炭素排出量を，赤外線ガス分析計（島津製作所

つ段ボール箱に静置して，平均７．
０℃，１
３．
３℃，１
８．
２℃

製：CGT−７０００）を用いて測定した。測定開始時の品（相対湿度：８６％RH±３％）に調整したコールドロール

温は５〜７℃であり，そこから品温を３〜５℃ずつ上昇

ボックスに貯蔵した。試験期間中は定期的に４個をサンさせて測定し，最終的に４１〜４３℃に至るまで測定を行っプリングし，分析に供した。

た。測定後は，果実の体積および重量を測定し，単位時（３）内容成分の測定条件

間・重量あたりの二酸化炭素排出量として算出した。

有機酸，糖類，アスコルビン酸（還元型）を測定した。

試験２

果肉硬度は，供試果の赤道部を約２"幅に切断し，切断異なる貯蔵条件における野菜用パパイア外観品
質の変化

（１）試

料

供試果は１試験区２０個とし，１
０個ず

内容成分は，果肉硬度，

面中央部を３か所測定した。分析機器は，果肉硬度計
２００
６年７月，２００
８年１０月に，沖縄県豊見城市で栽培された

台農５号 （雌株，平均７
１
４±１
０
３

（藤原製作所：KM−１）に，直径１２!の円錐形プランジャーを装着して使用した。有機酸は，試料に対し１０倍#）を用い，試験１と同様に選別し，収穫した。

量の蒸留水（w／v）を加え，ホモナイザーで磨砕，抽出（２）異なる温度による貯蔵条件

１試験区につき供した後，メンブレンフィルターで濾過したものを分析用

試果１
０個を段ボール箱（７
６
０!×４
６
０!×３
１
５!）に静置試料とした。分離は，２
５０!×内径７．
８!の有機酸分析カ

し，平均７．
１℃，１
３．
２℃，１
７．
９℃，２
３．
３℃（相対湿度８４％

ラム（島津製作所製：SPR-H）を２本連結して行った。

±２％）に調整したコールドロールボックス（ヤンマー

移動相は５mM p―トルエンスルホン酸，緩衝液は５mM

社製：CRB１F）に貯蔵した。

p―トルエンスルホン酸，
０．
１mM EDTA，
２０mM Bis-Tris
試験は２回反復であり，流速は移動相，緩衝液ともに０．
７!／min，注入であり，１試験区につき供試果１０個を使用し，段ボール量は１０"とした。検出は電気伝導度検出器（島津製作所

箱 に 静 置 し た。貯 蔵 条 件 は，平 均５．
１℃お よ び１
３．
３℃

製：CDD−６A）を使用した。糖類は，有機酸の測定に（相対湿度９０％RH±１％）に調整したコールドロールボ

使用した試料をそのまま使用した。分離は，２
５０!×内

ックスおよび，平均５．
３℃および１３．
０℃（相対湿度４０％

径４．
６!のアミノカラム（昭和電工社製：Asahipak-NH±２％）に調整した低温貯蔵庫内に貯蔵した。

２P−５０４E）を用いた。移動相は７５％アセトニトリ ル（３）異なる温湿度による貯蔵条件

（ 15 ）

〔報文〕 未成熟パパイアの貯蔵条件（v／v）であ り，流 速 は１．
０!／min，注 入 量 は１０µ$と し試験２229

異なる貯蔵条件における野菜用パパイア外観品
質の変化た。検出は蒸発光散乱検出器（島津製作所製：ELSDLT）を使用した。アスコルビン酸（還元型）は，試料

野菜用パパイアの貯蔵温度における，カビ害，低温障

に対し１０倍量（w／v）の５％メタリン酸を加えてホモジ

害，萎びおよび果皮色の変化をFig．
２に示した。カビ害

ナイズし，メンブレンフィルターで濾過し測定用試料とは２３℃および１８℃で早く進行し，特に２３℃では貯蔵１
０日
目に平均評点が２を超えた。一方，７℃と１
３℃では２
４日

製作所製：Wakosil−!５C１
８，）を使用した。移動相は，に平均評点が２以上となった。また本試験で発生したカ

５mMリン酸であり，流速は１．
０!／min，注入量は１０"

ビ害は，果実用パパイアに頻発する炭疽病や軸腐れ病１２）とした。検出は，フォトダイオードアレイ検出器（島津とは様相が異なり，初期は果梗部に灰褐色の菌糸を認め，製作所製：SPD−２０A）を使用し，波長２４６"の吸光度

その後除々に拡大した。低温障害は７℃で顕著に発生を測定した。

し，７日目に商品性を失った。その一方で，１３℃以上の結果および考察試験１

異なる貯蔵温度における野菜用パパイアの呼吸速度

野菜用パパイア３品種の貯蔵温度による呼吸速度について，化学反応式の一種であるアレニウス式を適用し，近似線を作成した（Fig．
１）
。近似線は３本であり，その交点は約２５℃および１３℃であった。秋永１５）は，近似線の１６）交点が植物生理の変曲点であるとし，田尻 は，マンゴーの呼吸速度の変曲点から貯蔵適温を推測し，立証した。
また，果物用パパイアの貯蔵では１０℃以下で低温障害がRespiration rate （CO2mg/kg/hr）

し た。分 離 は，２５０#×内 径４．
６#のODSカ ラ ム（島 津

1,000

頻発することや１０），３
０℃以上では果実の正常な追熟が困

100

10

1
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
Reciprocal number of absolute temperature (10-3K-1)

難である１１）と報告されていることから，１３℃以下は低温49.6

障害が発生しやすくなり，２５℃以上では呼吸速度の増加
による果実品質の急速な劣化が起こると推測した。

12.7

5

4

Shriveling

Fungal decay

30.0 21.1

3

4
3
2

1
5

1
5

4

4
Color

2

3

3
2

2
1
0

5

10
15
20
25
Storage time (days)

4.8

-2.7

(℃)

Fig．
１ Temperature dependency of respiration rate for
immature papaya fruit of three cultivars （ Eq.
Arrhenius）

5

Chilling injury

39.5(●) ; ʻFruit Towerʼ (△) ; ʻTainong No5ʼ (□) ; ʻOkinawa KC-16

30

1

0

5

10
15
20
25
30
Storage time（days ）(○) 7℃ ; (△)13℃ ; (■)18℃ ; (●)23℃ ;Fig．
２ Quality characteristics of ‘ Tainong No５’ immature papaya fruit stored atvarious temperatures
The dotted line corresponds to the limit of salability.

230

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

（ 16 ）

16

試験区では発生が認められなかったことから，試験１でWeight loss（%）の推測を一部立証する結果となった。萎びは貯蔵温度が高 い ほ ど 早 く 進 行 し，２３℃で１４日 目，１８℃で２
１日目，７℃，１３℃では２４日目以降に貯蔵限界となった。果
皮色は，カビ害の顕著な２３℃で速やかに黄化し，１８日目に貯蔵限界となった。

1284

重量減少率と呼吸速度の変化をFig．
３に示した。重量
0減少率は，２
３℃で１
２日目，１
８℃で２
１日目，１
３℃，７℃でRespiration rate （mg CO2/kg/hr）

２
８日目に約８％となった。果実用パパイアでは，重量減
少率８％以上となった場合，萎びが顕著になり，商品限界に至ると報告されており１７），本試験でも同様の結果となった。呼吸速度は２３℃で４日目以降上昇したが，他の試験区は安定的に推移した。また７℃と１３℃を比較すると，７℃で呼吸速度が高く推移した。収穫後の青果物は，損傷を受けると呼吸速度が増大することが知られている１８）。２３℃では顕著なカビ害，７℃では低温障害が発生しており，このために呼吸速度が増加したと推測した。
また果実用パパイアは，典型的なクライマテリック型果１
９）

実で ，追熟とともに呼吸速度が急速に上昇することが

10
15
20
25
Storage time (days)

30

0

5

10
15
20
25
Storage time (days)

30

60
40
20
0

(○) 7℃; (△)13℃; (■)18℃; (●)23℃;

られなかった。

Fig ．
３ Weight loss and respiration rate changes in'Tainong No５ immature papaya fruit during storageat various temperatures

つぎに，貯蔵温湿度が野菜用パパイアの品質に与える
影響について検討した（Fig．
４）
。カビ害は，低湿度でほ

5

5

4

4
Shriveling

Chilling injury

580

知られているが，本試験においてそのような現象は認め

3
2

3
2
1

1
0

5

10

15

20

25

5

0

5

10

15

20

25

0

5

10

15

20

25

14
12

4

Weight loss (%)

Chilling injury

0

3
2

10
8
6
4
2

1

0
0

5

10

15

20

25

Storage time (days)
Low humidity ; (○) 5℃ ; (△)13℃

Storage time (days)
High humidity ; (●)5℃ ; (▲)13℃

Fig．
４ Quality characteristics of ‘ Tainong No５’ immature papaya fruit stored atvarious temperatures and humidity
The dotted line corresponds to the limit of salability.

〔報文〕 未成熟パパイアの貯蔵条件

300

150

2.5
2.0

1.5

100

1.0

50

0.5

0

5

10

15

20

25

30

Maric acid : (●) 7℃; (▲)13℃; (■)18℃;
Citric acid : (○) 7℃; (△)13℃; (□)18℃;

4
Firmness (kg)

Sugar
(g/100g. fresh weight)

200

0

231

3.0

250

3
2
1
0
0

5

10

15

20

25

30

0.0

Ascorbic acid（mg/100g. fresh weight）

Organic Acid
(mg/100g. fresh weight)（ 17 ）

0

5

10

15

20

25

30

Glucose : (●) 7℃; (▲)13℃; (■)18℃;
Fructose : (○) 7℃; (△)13℃; (□)18℃;

35
30
25
20
15
10
5
0
0

5

10

15

20

25

30

(●) 7℃; (▲)13℃; (■)18℃;

Fig ．
５ Changes in organic acid, sugar, firmness, and ascorbic acid contents of‘Tainong No５’ immature papaya fruit during storage at various temperatures
Data are the mean±S.D.

とんど進行が認められなかったが，高湿度で は 進 行

試験では追熟に特有な現象は認められないことから，ア

し，１
３℃で２
１日目に商品限界となった。低温障害は，湿スコルビン酸は追熟時だけではなく，通常の代謝によっ

度によらず，同様の傾向となった。すなわち，５℃におても増加すると推測した。

ける増加が顕著であり，低湿度では１
４日目，高湿度では以上のことから，野菜用パパイアの貯蔵において，商１
８日目に商品限界となった。萎びは，低湿度の１３℃で速品性を損ねる主な要因はカビ害，萎び，低温障害であり，やかに上昇し，貯蔵１
４日目に商品限界を超えた。同様に，

貯蔵温湿度では，相対湿度９０％，１３℃貯蔵で，約３週間

重量減少率も低湿度で速やかに上昇し，１
３℃で１
４日目，

良好な品質を維持した。また貯蔵中の果皮色，呼吸速度

５℃で２１日目に約８％となった。

および果肉硬度は大きく変化しないことから，野菜用パ

試験３

パイアは，貯蔵中に追熟するまでには至らず，安定した異なる貯蔵温度における野菜用パパイアの内容成分の変化状態で貯蔵できることが示された。

低温貯蔵時における野菜用パパイアの有機酸，糖類，

本報では，沖縄県内で主に野菜用として用いられてい果肉硬度，アスコルビン酸の変化をFig．
５に示した。本る

試験において，貯蔵温度と成分変化の間に明確な差異はアにおいては，専用品種は皆無であり，ほとんどが果実認められず，同様な変化を示した。有機酸はリンゴ酸と用品種の未成熟果を利用している。パパイアの成熟特性

台農５号を中心に試験を実施した。野菜用パパイ

クエン酸を検出し，リンゴ酸は３
０〜２
２
０!／１
０
０"，クエ

については，果実用パパイアの追熟進行における品種間

ン酸は６〜７０!／１
００"新鮮重で推移した。このうちクエ差が報告されている７）。成熟が進行し，果肉が黄化した

ン酸は安定的に推移し，リンゴ酸は増加傾向を示した。

野菜用パパイアは，商品価値が低くなることから，今後

糖類は果糖とブドウ糖を検出し，果実用パパイアの主要は品種毎の収穫適期の把握が技術的課題になると思われ糖類であるショ糖 は検出されなかった。果糖は０．
３"る。また，収穫後病害であるカビ害対策については，果

〜１．
２"／１
０
０"，ブドウ糖は１．
２"〜１．
９"／１
０
０"で推移

実用パパイアにおいて，加熱処理による防除法が報告さし，減少傾向を示した。果肉硬度では，１
８℃で２
３日目に

れている２１）。本技術についても，野菜用パパイアを用い硬度の低下が認められた。この現象については，供試果た検討が必要になるものと思われる。

１
３）の一部にカビが発生し，これに伴う果肉崩壊が進んだた
めと考えた。一方，１３℃，７℃では試験開始から終了時
まで約２．
７#前後で安定的に推移した。アスコルビン酸
はすべての試験区で増加する傾向を示した。果実用パパ

文献１）石畑清武・岩川文寛：園芸果樹大百科１
７熱帯特産果樹（農文教，東京）
，pp．
１
３
３〜１
４
９（２
０
０
０）

イアでは，追熟期間中にアスコルビン酸が前駆体から生

２）沖縄総合事務局：農林水産部統計資料，
（２
０
０
５）

合成され，増加することが明らかとなっている１４），２０）。本

３）森枝卓士：世界の食文化４ベトナム・カンボジア・232

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

ラ オ ス・ミ ャ ン マ ー（農 文 教・東 京）
，p．
１
１
１

（ 18 ）

１３） GOMEZ, M. , LAJOLO, F. and CORDENUNSi, B. :

（２
０
０
３）

Evolution４）尚papaya fruit and its relation to sweet taste, J.

弘子・上江洲菊子・新島正子・金城清朗：日本の食生活全集４
７聞書・沖縄の食事（農文教，東京）
，
pp．
２
３
２〜２
３
３（１
９
８
８）

of

solublesugarsduringripening

Food Sci., ６
７, ４
４
２〜４
４
７（２
０
０
２）
１
４）LAZAN, H., ALI, Z. M., LIANG, K. M. and YEE, K.

５）NAKASONE, H. Y., 出花幸之介・井上裕嗣訳：パパ
イヤにおける果実の着生と発達

沖縄農業，３
２，６
８〜

L. :

Polygaracturonase activity and variation inripening of papaya fruit with tissue depth andheat treatment, Physiolosia Planntarum, ７
７, ９
３〜９
８

８
８（１
９
９
３）
６）玉城盛俊：パパイアの施設栽培による安定生産技術，
施設と園芸，１
３
９，３
１〜３
３（２
０
０
７）
７ ） ZHANG, L. X. and PAULL, R. E. :

（１
９
８
９）
１
５）秋永孝義・和田博幸・國府田佳弘：沖縄県産熱帯性Ripening

behavior of papaya genotypes, Hort. Sci., ２
５, ４
５
４〜

果実の呼吸特性に関する研究，琉球大学農学部学術報
告，４
１，１
６
１〜１
６
７（１
９
９
４）
１
６）田尻貴巳・秋永孝義・川崎聖司：沖縄県産マンゴー

４
５
５（１
９
９
０）
８）PROULX, E., CECILIA, M., NUNES, N., EMOND, J. P.
and BRECHT, J. K. :Quality attributes limiting（アーウィン）の完熟果と緑熟果の最適貯蔵温度，農
業施設，２
７，６
５〜７
０（１
９
９
６）

papaya postharvest life at chilling and non-chilling

１７）PAULL, R. E. and CHEN, N. J. : Waxing and Plastic

temperatures, Proc. Fla. State. Hort. Soc., １
１
８, ３
８
９〜

wraps influence water loss from papaya fruit

３
９
５（２
０
０
５）

during storage and ripening, J. Amer. Soc. Hort.

９）QUINTANA, M. E. G. and PAULL, R. E. : Mechanicalinjuryduringpostharvest

handlingof‘ Solo’papaya fruit, J. Amer. Soc. Hort. Sci., １
１
８, ６
１
８〜６
２
２
（１
９
９
３）
.
１
０）CHEN, M. M. and PAULL, R. E. : Development andprevention chilling injury in papaya fruit, J. Amer.
Soc. Hort. Sci., １
１
１, ６
３
９〜６
４
３（１
９
８
６）
１
１）AN, J. F. and PAULL, R. E. : Storage temperatureand ethylene influence on ripening of papaya fruit,
J. Amer. Hort. Sci., １
１
５, ９
４
９〜９
５
３（１
９
９
０）
１
２）ALVAREZ, A.M. and NISHIJIMA, W. T. : Postharvest
disease of papaya, Plant Disease, ７
１, ６
８
１〜６
８
６
（１
９
８
７）

Sci., １
１
４, ９
３
７〜９
４
２（１
９
８
９）
１
８）西條了康：果樹園芸大百科２
１品質・鮮度保持（農文
協，東京）
，pp．
９
１〜９
８（２
０
０
４）
１
９）上野陽一郎：果実の鮮度保持マニュアル（流通シス
テム研究センター，東京）
，p．
１
６
９（２
０
０
０）
２
０）BARATA, S. A. D., GOMEZ, M. L. P. A., MESQUITA,
C.

H.

and

LAJOLO,F.

M. :Ascorbicacid

biosynthesis : precursor study on plants, Braz. J.
Plant Physiol ., １
６, １
４
７〜１
５
４（２
０
０
４）
２
１）矢口行雄・中村重正：パパイア軸腐病に対する温湯ならびに蒸熱処理の効果，熱帯農業，３
７，１
６
７〜１
７
０
（１
９
９
３）
（平成２
３年４月４日受付，平成２
３年７月２
０日受理）

（ 19 ）

Food Preservation Science

VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１ 〔Article〕

233

Purification and Characterization of Polyphenol Oxidasefrom Japanese Radish（Raphanus sativus L.）Root
ANDI Nur Faidah Rahman＊１，＊２，＊３，OHTA Mayumi＊２，LI Yunge＊２，
NAKATANI Kazuya＊２，HAYASHI Nobuyuki＊２，FUJITA Shuji＊２，§＊１ United Graduate School of Agricultural Sciences, Kagoshima University,
1−21−24, Kourimoto, Kagoshima−shi, Kagoshima 890−0065, Japan＊２ Faculty of Agriculture, Saga University, 1, Honjou−machi, Saga−shi, Saga 840−8502, Japan＊３ Department of Food Science and Technology, Hasanuddin University, Makassar 90245, Indonesia

Polyphenol oxidase （ PPO ） was purified from the Japanese radish root by ammonium sulfate
fractionation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and gel filtration using
phloroglucinol as a substrate. The enzyme was purified about １
９２-fold with a recovery rate of １
５％．
The purified enzyme appeared as a single band on SDS-PAGE. The molecular weight of the purified
PPO was estimated to be about ４
４ kDa by gel filtration and ４
５．
７ kDa by SDS-PAGE. The purified
enzyme quickly oxidized phloroglucinol（１, ３, ５-trihydroxybenzene）
with a Km of ２ mM. The enzyme alsooxidized １, ２, ３-trihydroxybenzenes, such as pyrogallol and gallic acid ; however, it did not oxidize o diphenols, such as chlorogenic acid and dopamine. Peroxidase（POD）activity was also present in the
purified enzyme preparation with the final preparation having a purification and recovery rate of ２
５
９fold and ２
０％ , respectively. The optimum pH for the PPO and POD activities was ８．
０ and ５．
０,respectively, and the measured activities were stable at ５℃ for ２
０ h in the pH ranges of ３．
０〜１
０．
０
and ３．
０〜１
１．
０, respectively. Both enzyme activities were stable up to ５
０℃ after heat treatment for １０
min and were strongly inhibited by treatment with sodium diethyldithiocarbamate, potassium cyanide,
L-ascorbic acid, chlorogenic acid, and hydroquinone at a final concentration of １
０ mM.
（Received May ９, ２０１１；Accepted Jul. ２０, ２
０
１
１）
Key words：Japanese radish, polyphenol oxidase, phloroglucinol oxidase, peroxidase, characterization
ダイコン，ポリフェノール酸化酵素，フロログルシノール酸化酵素，パーオキシダーゼ，精製と性質

The undesirable browning of damaged tissues infruitsandenzymatic

３-trihydroxybenzene）and phloroglucinol（１, ３, ５-oxidation of polyphenols. Such oxidation is mainly

trihydroxybenzene）but do not oxidize o -diphenols.

caused by polyphenol oxidase （ EC １．
１
０．
３．
１； o-

However, a novel type of PPO, which only oxidizes

diphenol :oxygen oxidoreductase, PPO ）. Because

１, ３, ５-trihydroxybenzenes, such as phloroglucinol

browning can decrease the marketability of variety

and phloroglucinol carboxylic acid, was found by our

of

have

laboratory in Satsuma mandarin１４）, cabbage１５），１６）, andinvestigated PPO with the goal of preventing thisturnip１７）. These purified phloroglucinol-oxidizing PPOs

fruitsvegetables

andoccursvegetables,

by

the

burdock１２） and soybean１３） oxidize pyrogallol（１, ２,

manystudies

１）〜９）

discoloration. PPOs that originate from distinct（PhOs）also have strong peroxidase（EC １．
１
１．
１．
７；

plant sources display different substrate specificities.

POD）activities. While purified soybean PPO１３） has

Most PPOs oxidize o-diphenols, such as catechol,been shown to have dual PPO and POD activities,

chlorogenic

and ４ -

edible burdock PPO５） was not found to have POD

methylcatechol. For example, purified PPOs from

activity. PhO activity was found in crude extracts

acid,
５）

dopamine,

DL - dopa,

６）

and

of the Japanese radish （ Raphanus sativus L. ） root,

apple７） are known to strongly oxidize chlorogenic

which is considered a cruciferous vegetable similar

edibleacid,burdock ,while

dopamine.

Ingarlandbananachrysanthemum ,PPO１０），１１）

contrast,

purifiedstrongly
PPOsofoxidizes

to cabbage and turnip. Interestingly, PPO that was

ediblepurified from the Japanese radish root was found to§ Corresponding author, E-mail : fujitas@cc.saga-u.ac.jp

234

Food Preservation Science

have dual PPO and POD activities, which is similar
１
３）

VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

（ 20 ）

３．Purification of the enzyme

１
５）
，
１
６）

１
７）

All steps were carried out at ５℃. Whole roots

characterizationoffrom the Japanese radish（１０ kg；９〜１
０ radishes）

Japanese radish root PPO has not previously been

were homogenized with a Japanese - style grater

conducted. In the present study, Japanese radish

withoutroot PPO was purified using phloroglucinol as ahomogenate through a cotton cloth, the filtrate wassubstrate, and the properties of the purified enzyme

centrifuged at １０，
３００× g at ４℃ for ２
０ min. The

to that of soybean , cabbage
PPOs ;

however,adetailed, and turnip

using

buffer.

Afterfiltration

of

the

supernatant was then brought to ８
０％ saturation

were investigated.

with ammonium sulfate. Precipitated protein wasMaterials and Methods

collected by centrifugation（１０，３００×g ）, dissolved in

１．Materials

a small volume of ０．
０
１ M phosphate buffer （ pHFresh Japanese radish （ Raphanus sativus

L. cv.

７．
０）, and then dialyzed against the same buffer for

Aokubi soufuto-L.）root was purchased from a local

３
６ h with the four changes of the dialysis buffer.

market in Saga City. DEAE-Toyopearl ６５０-M, Butyl

After another round of centrifugation（１０，３００×g ）,

Toyopearl ６
５０- M, and Toyopearl HW ５
５- s were

the dialyzed solution was applied to a DEAE -obtained from Tosoh

Toyopearl ６
５０- M column （４．
５×１
５ cm ） that was

Co. ,Tokyo,

Japan.

Other

reagents were purchased from Wako Pure Chemical

equilibrated

Industries, Ltd., Osaka, Japan.

７．
０） and eluted with the same buffer. Fractions

２．Measurement of enzyme activity

containing active PPO, which were not adsorbed（１）PhO activity

PhO activity was measured

onto the column, were pooled, brought to １ M

by a spectrophotometric method that was based onsaturation with ammonium sulfate, and then applied

１８）with ０．
０
１ M

phosphatebuffer （ pHmixturesto a Butyl-Toyopearl ６
５０-M column（１．
６×１５ cm）thatconsisted of ０．
５ ! of ２
０ mM aqueous phloroglucinol,

was equilibrated with ０．
０
１ M phosphate buffer（pH１．
４ ! of ０．
１ M phosphate buffer （ pH ７．
０）, and７．
０）containing １ M ammonium sulfate. The column

０．
１ ! of each fraction obtained by chromatography.

was eluted using a linear gradient of ammonium

differencesinspectra.

The

reaction

After incubation for １
０ min at ３
０℃, ０．
５ ! of thesulfate （１ to ０ M ammonium sulfate in ０．
０
１ M

reaction mixture was removed and added to ４．
５!

phosphate buffer, pH ７．
０）. Fraction containing PPO

of distilled water. The absorbance of the sample

activity were pooled and dialyzed with ０．
０
１ M

was then measured at ２７
２ nm against an enzyme

phosphate buffer （ pH ７．
０）. The dialyzed solution

blank. One unit of enzyme activity was expressed

was concentrated using a membrane filter（Amicon

as an increase in absorbance at ２７
２ nm（∆A２７２）of

YM-１
０, Millipore Japan Co., Tokyo, Japan）, added to０．
１ per min in a １-cm light path.

a Toyopearl HW ５
５-s column（１．
６×８０ cm）that was（２）PPO activity

equilibrated with ０．
１ M phosphate buffer, and thenbyacolorimetric

PPO activity was measured
method１０），１９），２０）.

The

reaction

eluted using the same buffer. Fractions containing

mixtures consisted of ０．
５! of １０ mM aqueous

enzymesolutionenzyme characterization.

ofvariouspolyphenols, ４!

of ０．
１ M

phosphate buffer （ pH ７．
０）, and ０．
５! of enzyme

activitywerecollected

and

used

for

４．Determination of protein

solution. After a ５- min incubation at ３
０℃ , theProtein content was determined using the method

at ４
２０ nm （ ∆A４２０ ） wasof HARTREE２１） with bovine serum albumin （ BSA,

measured. One unit of enzyme activity was defined

fraction V ; Katayama Chemical, Industries Co., Ltd.,as ０．
１ ∆A４２０ per min（１-cm light path）.

Osaka,（３）POD activity

chromatography,

increaseinabsorbance

POD activity was determined
１
５）

Japan ） usedasproteinastandard.

In

wasexpressedasby a colorimetric method . The reaction mixtures

absorbance at ２８０ nm.

contained ０．
５! of a ０．
１ M aqueous solution of

５．Molecular weight determination

guaiacol，４．
１! of ０．
１ M phosphate buffer（pH ６．
０）,

Molecular weight of the purified enzyme was０．
２! of ０．
１％ hydrogen peroxide, and ０．
２! of thedetermined by gel filtration and sodium dodecyl

enzyme solution. After incubation for ２ min at ３
０℃,

sulfatethe increase in absorbance at ４７
０ nm（∆A４７０）was

PAGE）. Gel filtration was performed following themeasured. One unit of enzyme activity was defined

method of ANDREWS２２） with the use of α-globulin（１
６
０

as ０．
１ ∆A４７０ per min（１-cm light path）.

kDa）, serum albumin（bovine；６
５ kDa）, ovalbuminpolyacrylamidegelelectrophoresis （ SDS -（ 21 ）

〔Article〕 Characterization of Japanese Radish PPO

235（ chicken egg ；４４ kDa ）, and cytochrome c （１２．
４contained a specific activity that was increased １
９２-kDa）as marker proteins. SDS-PAGE was carried out

fold compared to that of the initial homogenate withas described by WEBER and OSBORN２３） with the use

a recovery rate of １
５％.

of myosin （２０
９ kDa ）, β - galactosidase （１２
４ kDa ）,

（２）Characterization of the purified enzyme

serum albumin（bovine；８０ kDa）
, ovalbumin（chicken

The purified enzyme appeared as a single band

egg ；４
９．
１ kDa ）, carbonic anhydrase （３４．
８ kDa ）,

on SDS - PAGE （ Fig ．
２）. As shown in Fig ．
３, thesoybean trypsin inhibitor（２８．
９ kDa）, and lysozyme

molecular weight of PPO was estimated to be about（２０．
６ kDa）as marker proteins.

４
４ kDa by gel filtration and ４
５．
７ kDa by SDS PAGE. These results

Results and Discussion（１）Purification of the enzyme

indicate

that

the

purifiedenzyme is monomeric. While the molecular weightFig．
１ shows aof the purified Japanese radish root

PPO

was

typical elution pattern of PPO on a gel filtration

１
３）
similar to soybean PPO（４７ kDa）and leaf lettuce

column. Enzyme activity eluted in one peak, and

２
４）
PPO （４
６ kDa ）, it differed from those of edible

the

were

５）
１
５）
burdock（４０ kDa）, cabbage F-IA（４０ kDa）, cabbage

stepwise

１
６）
１
７）
F-IB（４
３ kDa）, turnip（２７ kDa）, Japanese pear

purification of PPO is shown in Table １. After the

２
０）
２
５）
（５
６ kDa）, broccoli（５７ kDa）
, and Turkish blackpeakpooledfinal

fractionsfrompurifiedenzyme.

aspurification

steps,

severaltheAcolumns
typicalenzyme2.0

0.30

preparation

２
６）
radish（６６ kDa）.

0.5
MW (kDa)

0.25

1.0

0.15

0.10

0.3

0.2

E

209

PPO activity (unit/㎖)

0.20

0.4
POD activity (unit/㎖)

Protein (A280 nm)

1.5

MP

124
80

49.1

0.5
0.1

0.05

34.8
0.0

0.00
0

28.9

0.0

10 20 30 40 50 60

20.6

Fraction No (5 ㎖/tube)
Fig ．１ Elution pattern of
Toyopearl HW ５
５-s column

theenzymefromFig．
２ SDS-PAGE of the purified enzyme

theMW, molecular weight ; MP, marker protein ; E, Enzyme.

（"）fraction pooled；（○）PPO activity；（■）protein；（∆）POD activity.

Table １ Purification of the Japanese radish root enzyme
Phloroglucinol Oxidase（PhO）

Peroxidase（POD）

EnzymeVolume
（!）

Total
Total
Specific
Total
Specific
Purification Recovery
Purification Recovery
Activity Protein Activity
Activity Activity（fold） （％）（fold） （％）（Units） （!） （Unit／!）（Units） （Unit／mg）

Crude Extract
Crude Enzyme
DEAE-Toyopearl ６５０-M
BUTYL-Toyopearl ６５０-M
Toyopearl HW ５
５-s

６，
８
９
０
４
９
０
１，
２
２
５
９
３
１
１，
２
５
０

６
８
９，
３
４
５ ３
５，
８
１
２
３
０
２，
９
６
７ ２，
３
７
９
３
７
９，
９
２
２
２
６
６
１
４
３，
４
２
１
５
０
１
０
３，
１
６
７
２
８

１
９
１
２
７
１，
４
２
８
２，
８
７
５
３，
６
９
４

１．
０
６．
６
７
４．
２
１
４
９．
４
１
９
２．
０

１
０
０
４
４
５
５
２
１
１
５

１，
３
０
２，
２
１
０
３
６
５
１
４，
３
３
８
２
１
６
４
５
６，
４
０
４ １，
７
１
６
３
２
８，
６
９
６ ６，
５
８
９
２
６
２，
９
３
８ ９，
４
１
５

１．
０
６．
０
４
７．
２
１
８
１．
２
２
５
９．
０

１
０
０
４
０
３
５
２
５
２
０

236

Food Preservation Science

VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

（ 22 ）

Table ２ Substrate specificities of Japanese radish root PPO

5.5

Phloroglucinol１
Phloroglucinol carboxylic acid１

5.0
Log MW

2

３，
６
９
４
１，
６
９
２

Pyrogallol２
Gallic acid２
Catechol２

P 3

4.5

Specific Activity（Unit／mg）

Substrate

(A)

1

９
１
１
６
０
０

Chlorogenic acid２
DL-Dopa２

4
4.0
1.25

1.35

1.45
Ve/Vo

０
０

Dopamine２
Resorcinol２

1.55

０

１

Measured by a spectrophotometric method
differences in spectra１８）
２
Measured by a colorimetric method１０），１９），２０）

based

on

5.5
1

(B)

2

14

5.0

12
4

5

P

4.5

10

1/V (unit)−1

Log MW

3

6

8

m

=2 mM

6

7
4
4.0

2
0.0

0.5
Relative mobility

1.0

Fig．
３ Molecular weight estimation of the enzyme bygel filtration on a Toyopearl HW ５
５-s column（A）andby SDS-PAGE（B）（A） Vo, void volume of the column ; Ve, elution volume ofthe substance ; MW, molecular weight：１．α-globulin（１６０kDa）, ２．serum albumin（bovine；６５ kDa）, ３．ovalbumin（ chicken egg ；４４ kDa ）, and ４．cytochrome c （１
２．
４
kDa）
；P, purified enzyme.
（B） MW, molecular weight in kDa：１．myosin（２０９ kDa）,２．
β-galactosidase（１２４ kDa）, ３．serum albumin（bovine；８０kDa）, ４．ovalbumin（chicken egg；４
９．
１ kDa）, ５．carbonic
anhydrase（３４．
８ kDa）, ６．soybean trypsin inhibitor（２
８．
９
kDa）
, and ７．lysozyme（２０．
６ kDa）；P, purified enzyme.

−1

0

−0.5

0
0.5
1/s (mM−1)

1

1.5

Fig．
４ Lineweaver-Burk plots of phloroglucinol oxidationby the enzyme

phloroglucinol

carboxylic

acid.

The

Michaelis

constant（Km ）of the enzyme for the oxidation ofphloroglucinol was ２ mM（Fig．
４）. This value differedfrom that of other plant PPOs, specifically, Satsuma
１４）mandarin PPO （０．
６７ mM ）, cabbage PPO F - IA
１
５）
１
６）
（６．
４ mM）
, and cabbage PPO F-IB（８．
５ mM）.

PPO purified from the Japanese radish root alsooxidized １, ２, ３ - trihydroxybenzenes,
Most PPOs oxidize o -diphenols, such as catechol,
chlorogenic

acid,

dopamine,

DL - dopa,

and ４ -

methylcatechol. PPOs purified from edible burdock５）,
garlandchrysanthemum６） ,oxidizechlorogenic

acid,

and
while

apple７） strongly
banana

PPO１０），１１）

pyrogallol and gallic acid ;

such

as

however, it did notoxidize o - diphenols, such as catechol, chlorogenic
acid,

and

dopamine,orp - diphenols,

such

as

resorcinol. This enzyme was found to share asimilarsubstrate
１２）

specificity

as

that

of

edible１３）strongly oxidizes dopamine. As shown in Table ２,

burdock PPO

purified Japanese radish root PPO strongly oxidizes

substrate specificities of these three enzymes were１, ３, ５-tryhdroxybenzenes, such as phloroglucinol anddifferent from the PPOs of Satsuma mandarin１４）,

and soybean PPO . However, the（ 23 ）

〔Article〕 Characterization of Japanese Radish PPO

237

cabbage１５），１６）, and turnip１７）, which only oxidized １, ３,

stability of both PPO and POD activities of the５-trihydroxybenzenes.

purified enzyme are shown in Fig．
５. The optimalThe

purifiedJapaneseradishroot

enzymepH for PPO and POD activities was ８．
０ and ５．
０,

preparation was red in color with an absorption

respectively（Fig．
５ A）. The effects of changes in the

maxima at ４０５, ４
９０, and ６
３０ nm, which was similar

pH on PPO and POD activities of the PPO enzyme

to that of soybean PPO１３）. Similar results were

have also been demonstrated for PPOs in soybean１３）,

１
４）

obtained using purified PPOs of Satsuma mandarin ,Satsuma mandarin１４）, cabbage１５），１６）, and turnip１７）. The

cabbage１５），１６） ,turnip１７） ,iron.

optimal pH for the activity of the Japanese radish

Soybean, Satsuma mandarin, cabbage, and turnip

root PPO enzyme was similar to PPOs purified

enzymes had dual PPO and POD activities. Asfrom soybean１３）, cabbage F - IA１５）, cabbage F - IB,shown in Fig．
１, activities of both PPO and POD

cabbage F-II１６）, and turnip１７）, which were shown towere detected in the same peak fraction with thefunction best in the optimal pH range of ７．
４〜７．
６.

final purification of the Japanese radish root enzyme.

However, the optimal pH for our purified Japanese

Furthermore, the purified enzyme was visualized asradish root PPO differed from that of butter lettuce

a single protein band on SDS - PAGE （ Fig ．
２）.

８）
９）
PPO（pH ５．
５）
and vanilla bean PPO（pH ３．
０）
. The

Therefore, we reasoned that the Japanese radish

optimalroot enzyme has dual PPO and POD activities,

Japanese radish root enzymatic preparation was alsosimilar to the soybean１３）, cabbage１５），１６）, and turnip１７）

similar to that of Satsuma mandarin１４）, and turnip１７）,

enzymes.

The

and

final

which

preparation

containofthepurifiedenzyme showed a ２
５９-fold increase in POD activity
and had a recovery rate of ２
０％ for POD（Table １）.
characterization

in

our

purifiedbut it differed from cabbage enzyme F - IA （ pH
１
５）
１
６）
６．
４）
, and F-II（pH ６．
７）.

As shown in Fig ．
５ B, both PPO and POD
activities of the Japanese radish root enzyme werewasstable in wide pH ranges. Eighty percent of the

conducted. The effects of pH on the activity and

PPO and POD activities was retained in the pH

enzymatic

PPO

activity

POD

the

the

POD

and

120

120

(B)

(A)

100

100

Relative activity (%)

of

of

for

preparation

activities

Relative activity (%)

Further

pH

80
60
40

80
60
40
20

20

0

0

0

2

4

6
pH

8

10

12

0

2

4

6

8

10

12

pH

Fig．
５ Effects of pH on the activity（A）and stability（B）of the enzyme（○）PPO activity；（●）POD activity（A）PPO and POD activities were measured at ３０℃ in McIlvaine buffer in the pH
range ３．
０〜８．
０ and in Atkins-Pantin buffer in the pH range ９．
０〜１１．
０. Activity
was expressed as a percentage of the maximum activity level.
（B）The enzyme was pre - incubated in McIlvaine buffer at different pH values,
ranging from ３．
０〜８．
０ or in Atkins - Pantin buffer at different pH values,
ranging from ９．
０〜１
１．
０ at ５℃ for ２０ h. Residual PPO and POD activities
were measured under standard conditions（PPO : pH ７．
０, ３
０℃ and POD : pH
６．
０, ３０℃）. Activity was expressed as a percentage of the maximum activity
level.

238

Food Preservation Science

ranges ３．
０〜１０．
０ and pH ３．
０〜１
１．
０, respectively.

VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

（ 24 ）

both PPO and POD activities at １
０ mM but not at

The ranges of pH stability for both PPO and POD

１ mM. CuSO４ inhibited PPO activity, but did not

activities differed slightly from those of cabbage F-

inhibit POD activity. Remarkably, MnCl２ was found

IA PPO１５）, in which both activities were stable into activate PPO in edible burdock１２）, cabbage１５），１６）,

the range of pH ５．
０〜１
１．
０．Similar results were

and turnip１７） ; however, little activation was found

found for Satsuma mandarin

PPO１４） andturnip１
７）

for Japanese radish root PPO. Both PPO and POD
activities were markedly inhibited by chlorogenicPPO .

The PPO

enzymefrom

Satsuma１
４）mandarin ,o-diphenol ） andacid （ anp-hydroquinone （ acabbage１５），１６）, and turnip１７） had a very high thermal

diphenol）which is similar to studies using purified

stability. Fig．
６ shows the thermal stability of thefrom Satsuma mandarin１４） and cabbage１５），１６）.

purified Japanese radish root PPO enzyme. AfterIn conclusion, Japanese radish root PPO washeating at ８
０℃ for １
０ min, only ２
０％ of the PPO

purified using phloroglucinol as a substrate. The

activity

purified

remained ;however,

POD

activitywas

enzymequickly

３,

５-

as

oxidized １ ,phloroglucinol

and

acid,

and １ ,

３-almost completely lost. The thermal stability of thistrihydroxybenzenes,

preparation of PPO enzyme was lower than that ofphloroglucinol

the above enzymes （ specifically, that of Satsuma

trihydroxybenzenes, such as pyrogallol ; however, it

mandarin１４）, cabbage１５），１６）, and turnip１７）. In contrast,thesoybeanenzyme１３） hadasimilarthermalsuch

carboxylic２,

did not oxidize o-diphenols, such as chlorogenic acidand dopamine, which was similar to edible burdock

stability of PPO and POD activities as the Japanese

PPO１２） andradish root enzyme.

substratesoybeanspecificities

PPO１３） .

Furthermore,ofenzymes

these

the

differed

Table ３ shows the effects of different compounds

from those of Satsuma mandarin PPO１４）, cabbage

on the PPO and POD activities of the purified

PPO１５），１６）, and turnip PPO１７）, which only oxidized １, ３,

enzyme. Both the PPO and POD activities were５-trihydroxybenzene. POD activity was also found in

markedly inhibited by sodium diethyldithiocarbamate

the purified Japanese radish root PPO. Due to theand potassium cyanide when used at a １
０ mM final

different effects of pH, temperature, and various

concentration. Additionally, L-ascorbic acid inhibitedcompounds on PPO and POD activities ofthepurified Japanese radish root enzyme, it probable120

that this enzyme has separate active sites for PPO
and POD activities, and this may also be the case

100
Table ３ Effects of various compounds on PPO and
POD activities

Relative activity (%)

80

Relative Activity（％）

60

Compounds

PPO activitya

POD activitya０mM １mMa １
０mMa
１mM １

40

20

0
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Temperature (°C)
Fig ．
６ Effects of temperature on the stability of the
enzyme（○）PPO activity；（●）POD activity.
The enzyme preparation was heated at temperatures ranging
from ２０℃〜８０℃ for １
０ min. Residual PPO and POD activities
were measured under standard conditions（PPO : pH ７．
０, ３０℃
and POD : pH ６．
０, ３
０℃ ）. Activity was expressed as apercentage of the maximum activity level.

None
Sodium diethyldithiocarbamate
KCN
EDTA
NaF
NaCl
MnCl２
CuSO４
BaCl２
ZnSO４
L-ascorbic acid
Chlorogenic acidResorcinol
Hydroquinone
aFinal

１
０
０
１
１
８
７
９
８
１
０
５
１
０
３
１
２
８
３
７
１
１
５
１
０
９
１
０
９
２
１
１
１
６
２
８

concentration of compound

１
０
０
０
３
２
９
４
１
１
０
１
０
０
１
３
２
１
３
９
７
１
０
７
０
１
６
１
０
４
２
６

１
０
０
８
９
０
９
４
１
０
３
９
７
９
３
１
１
１
１
０
８
１
０
５
９
７
４
８
１
０
４
３
３

１
０
０
３
３
０
９
２
８
３
９
２
９
０
９
６
１
１
９
１
０
３
１
１
９
６
１

（ 25 ）

〔Article〕 Characterization of Japanese Radish PPO

for soybean１３）, cabbage１５），１６）, and turnip１７） PPOs.

purification

and

239

characterizationofpolyphenol

oxidase from banana（Musa sapientum L.）Peel, J.
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１
４
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５〜

１
４）FUJITA, S. and Tono, T. : Peroxidase activity of

２
３
９（２
０
０
６）
Purification

andproperties

ofpolyphenol

oxidase from loquat fruit, J. Agric. Food Chem., ４
６,of４ ） GUO, L. , MA, Y. , SHI, J. and XUE, S. :and:Purification

andsoybeanoxidase,Nipponfrom

Satsumamandarin

fruits and effect of metal ions on the enzyme
activity, Nippon Nogeikagaku Kaishi. , ５
４, ２
０
１〜２
０
８
（１
９
８
０）
１
５）FUJITA, S., SAARI, N., MAEGAWA, M., TETSUKA, T.,

４
１
４
４〜４
１
４
９（１
９
９
８）
Purification

K.

phloroglucinoloxidase３）DING, C.-K., CHACHIN, K., UEDA, Y. and IMAHORI,
Y. :HARAGUCHI,

characterization

of

The

HAYASHI,

N.

and

TONO,

T. :

Purificationandpolyphenol

properties of polyphenol oxidase from cabbage

oxidase from green bean （ Phaseolus ulgaris L. ）,（ Brassica oleracea L. ）, J. Agric. Food Chem. , ４
３,

Food Chem., １
１
７, １
４
３〜１
５
１（２
０
０
９）

１
１
３
８〜１
１
４
２（１
９
９
５）

５）HAN, Y.-Z., MAMIYA, A., NKYA, E., HAYASHI, N. and

１６）FUJITA, S., SAARI, N., MAEGAWA, M., TETSUKA, T.,

FUJITA, S. :Purification and characterization of

HAYASHI,chlorogenic

acid

characterization of two phloroglucinol oxidase fromoxidasefromedibleburdock

N.

and

TONO,

T. :

Isolationand（Arctium lappa L.）, Food Preser. Sci., ３
２, ２
７
５〜２
８
１

cabbage（Brassica oleracea L.）, J. Agric. Food Chem.,

（２
０
０
６）

４
５, ５
９〜６
３（１
９
９
７）

６）NKYA, E., KOUNO, C., LI, Y.-J., YANG, C,-P., HAYASHI,
N. and FUJITA S. : Purification and characterizationofpolyphenol

oxidasefromgarlandchrysanthemum（Chrysanthemum coronarium L.）, J.
Agric. Food Chem., ５
１, ５
４
６
７〜５
４
７
１（２
０
０
３）

and

TONO,

Phloroglucinoloxidase

S.

from

T. :

Purification

turnip

and

of
its

Properties, Nippon Nogeikagaku Kaishi., ５
４, ４
２
９〜４
３
５
（１
９
８
０）
１
８）FUJITA, S., KAWAHARA, H., NAZAMID, S. and TONO,

７ ） MURATA, M. , KUROKAMI, C. and HOMMA, S. :Purification and properties of chlorogenic

１７） FUJITA,

acid

T. :

Spectrophotometricdeterminationofphloroglucinoloxidase activity based on differenceoxidase from apple（Malus pumila）, Biosci.Biotechnol.

spectra, Bull. Fac. Agric. Saga Univ. , ７
４, ８
１〜８
８

Biochem., ５
６, １
７
０
５〜１
７
１
０（１
９
９
２）

（１
９
９
３）

８ ） Gawlik - DZIKI, U. , ZLOTEK, U. and Ś WIECA, M. :１９）TONO, T., FUJITA, S., KAWASAKI, H. and LI, Z. :Characterization of polyphenol oxidase from butter

Purification and high L-epicatechin oxidase activity

lettuce（Lactuca sativa var. capitata L.）, Food Chem.,in polyphenol oxidase of Japanese pear, Nippon

１
０
７, １
２
９〜１
３
５（２
０
０
８）

Nogeikagaku Kaishi., ６
０, ７
０
５〜７
１
２（１
９
８
６）

９）WALISZEWSKI, K.N., MÁRQUEZ, O., PARDIO, V. T. :２０）FUJITA, S. and TONO, T. : Purification and some

Quantification and characterization of polyphenol

properties

oxidase bean, Food Chem., １
１
７, １
９
６〜２
０
３（２
０
０
９）

（Solanum melongena ）, J. Sci. Food Agric., ４
６, １
１
５〜

１
０） YANG, C. - P. , FUJITA, S. , ASHRAFUZZAMAN, MD. ,NAKAMURA, N. and HAYASHI, N. : Purification andcharacterizationofpolyphenol

oxidaseofpolyphenol

oxidasein

eggplant

１
２
３（１
９
８
８）
２
１） HARTREE, E. F. : Determination of protein : afrommodification of Lowry method that gives a linear

banana （ Musa sapientum L. ） pulp, J. Agric. Foodphotometric response, Anal. Biochem., ４
８, ４
２
２
２〜４
２
７

Chem., ４
８, ２
７
３
２〜２
７
３
５（２
０
０
０）
１
１）YANG, C.-P., FUJITA, S., KOHNO, K., KUSUBAYASHI,
A., ASHRAFUZZAMAN, Md. and HAYASHI, N. : Partial

（１
９
７
２）
２
２） ANDREWS, P. :The gel - filtration behavior ofprotein related to their molecular weight over

240

Food Preservation Science

VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

wide range, Biochem. J ., ９
６, ５
９
５〜６
０
５（１
９
６
５）

ダイコン（ Raphanus sativus L.）のポリフェノール酸化酵素の精製と性質

２３）WEBER, K. and OSBORN, M. : The reliability ofmolecular weight determination by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, J. Biol. Chem.,
２
４
４, ４
４
０
６〜４
４
１
２（１
９
６
９）

アンディ ヌル ファイダ ラーマン＊１，＊２，＊３・太田真由美＊２李２４）HAN, Y., HAYASHI, N. and FUJITA, S. : Purification
and Properties of polyphenol oxidase from leaf

英杰＊２・中谷一哉＊２・林＊１

信行＊２・藤田修二＊２

鹿児島大学連合農学研究科

（〒８
９
０―０
０
６
５ 鹿児島市郡元１−２
１−２
４）

lettuce（Lactuca sativa）, Food Preser. Sci., ３
１, ２
９
５〜
３
０
１（２
０
０
５）

（ 26 ）＊２

佐賀大学農学部

（〒８
４
０―８
５
０
２ 佐賀市本庄町１番地）

２
５）GAWLIK-DZIKI, U., SZYMANOWSKA, U. and BARANIAK,
B. : Characterization of polyphenol oxidase from＊３

ハサヌディン大学食糧科学工学部

（〒９
０
２
４
５ インドネシア国マカッサル市）

broccoli （ Brassica oleraceae var. botrytis italica ）florest, Food Chem., １
０
５, １
０
４
７〜１
０
５
３（２
０
０
７）
２
６）ŞIŞECIOG!
LU, M., GÚ´LÇIN, I., ÇANKAYA, M., ATASEVER,` ZDEMIR, H. :A., ŞEHITOG!
LU, M.H., KAYA, H.B. and Ò

ダイコンのポリフェノール酸化酵素（PPO）をフロ
ログルシノールを基質として，硫安分画，イオン交換ク
ロマト，疏水クロマトおよびゲル濾過により精製した。

peroxidase

本酵素は１９２倍に精製され，回収率は１５％であった。精from Turkish black radish（Raphanus sativus L.）, J.

製酵素はSDS-PAGEで単一バンドを呈した。本酵素の分Medical Plants Res., ４, １
１
８
７〜１
１
９
６（２
０
１
０）

子量はゲル濾過で４４ kDa，SDS-PAGEで４５．
７ kDaと推Purification

andcharacterizationof

定された。本酵素は１，３，５―トリヒドロキシベンゼンであるフロログルシノールを強く酸化し，それに対するKm値は２ mMであった。本酵素は同時に１，２，３―トリヒドロキシベンゼンであるピロガロールおよび没食
子酸を酸化したが，クロロゲン酸やドーパミンのような
o―ジフェノール類は酸化しなかった。本酵素はパーオ
キシダーゼ（POD）活性を同時に有し，PODとしては
２５９倍に精製され，回収率は２０％であった。本酵素のPPO
およびPOD活性の最適pHはそれぞれ８及び５であり，PPOはpH ３．
０〜１０．
０の範囲で，PODは３．
０〜１
１．
０の範囲
で５℃，２
０時間安定であった。熱安定性においては両活
性とも５０℃まで安定であった。また，両活性とも終濃度
１０ mMにおいて，ジエチルジチオカルバミン酸ナトリ
ウム，シアン化カリウムのような金属酵素阻害剤，還元剤であるL―アスコルビン酸およびジフェノール類であるクロロゲン酸やヒドロキノンにより強く阻害された。
（平成２２年５月９日受付，平成２
３年７月２
０日受理）

（ 27 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１ 〔研究ノート〕

241

ケフィアグレイン菌株を用いた
グレインの生成とケフィアの比較
長谷川真由美＊１§・綿 貫 仁 美＊１・林
一 也＊１
馬場
修＊１・小 原 直 弘＊２＊１ 東京家政学院大学現代生活学部＊２ 東京農業大学応用生物科学部

Comparison of the Kefir Uses Strain of Kefir Grains
HASEGAWA Mayumi＊１§，WATANUKI Hitomi＊１，HAYASHI Kazuya＊１，
BABA Osamu＊１ and OHARA Naohiro＊２＊１ Tokyo Kasei−Gakuin University,
22, Sanbancho, Chiyoda−ku, Tokyo 102−0075＊２ Tokyo University of Agriculture,1−1−1 Sakuragaoka, Setagaya−ku, Tokyo 156−8502
The microflora of kefir grains is highly varied Seven varieties of microflora with varying properties
were compared in this study. A previous report suggested that Candida kefir, one of the main yeast
species in kefir,causes opportunistic infections. Different combinations of the strains,exept Candida kefir,present in kefir grains were examined. ! The weight of kefir grains increased at all combinations.
The kefir grain weight,except those of the genus Candida,showed an increase. " Although it wasthought that yeast played a role in imparting rigidity to the kefir grains, Lactobacillus kefiri GKL―２ and８ were found to play the main role in imparting rigidity.
L. kefiranofaciens GKL―２（Received Oct. １３, ２０
１０；Accepted Jul. １１, ２
０
１
１）
Key words：kefir, kefir grains, Candida, rigidity, culture
ケフィア，ケフィアグレイン，キャンディダ，粘性，培養

ケフィア（英：Kefir露：Ke"!p）とは，ケフィアグ

ケフィアグレインの基本的な菌は乳酸菌・酵母をはじめ，

レインという種菌を用いて発酵させた乳飲料である。ケ

連鎖状球菌・酢酸菌・芳香微生物も含まれ構成されるとフィアグレインとは，ケフィランという多糖類の粘性物

いわれている５）。

質に，多くの乳酸菌や酵母が共生してできたポップコー
ンのような形をした菌塊である１）。
起源はコーカサス地方で，山羊の乳を運んでいる最中，

このケフィア中の微生物については，グルジア由来のケフィアグレイン中に３種の酵母と４種の乳酸菌が主要菌として生育していることが明らかになっている３），６）。

乳酸菌や酵母が入り込み，自然発酵してできたとされて特に，ケフィア特有の粘性物質の生成にはLactobacillus

いる。ケフィアの最大のポイントは，酵母と乳酸菌がkefiriやLactobacillus kefiranofaciensが関与していること

共生が明らかになっている２），７），８）。

発酵していることにある。酵母と乳酸菌の共生

発酵は，単にエタノールの入ったヨーグルトというだけ

今回，ケフィアグレイン中の菌を殺菌し，新たに菌種ではなく，酵母に豊富に含まれるビタミンや酵母などが（３種類の酵母と４種類の乳酸菌）の組み合わせを変え分解する糖やタンパク質を利用して，難生育性の乳酸菌て植菌し，ケフィアグレインの増加や，ケフィアの性状が生育していることにあるとされている２）〜４）。

にどのような影響があるかを検討した。また，近年ケフ

ケフィアには何種類もの微生物が複雑に共生しており，

ィアの主要酵母であるCandida kefyrが日和見感染菌とす

それら微生物は共生発酵して働いている。自然発酵では，るような報告９），１０）がなされたため，この菌を除いた菌相

＊１ 〒１
０
２―０
０
７
５ 東京都千代田区三番町２２§ Corresponding author, E-mail : hasegawa@san.kasei-gakuin.ac.jp
＊２ 〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１

242

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

のケフィアグレインでのケフィア生成を試みたので報告する。

（ 28 ）

３．乳酸菌と酵母の組み合わせ
７種類の菌体の組み合わせをつくるために，まず，乳酸 菌 を 組 み 合 わ せ た２種 類（A）L. kefiri GKL―２，L.

実験方法

kefiranofaciens

１．使 用 培 地

GKL ― ２
８，（B） L.

lactis と Leuc.

mesenteroides Gme―１
７，酵母を組み合わせた（C）Sacch.

使用した培地の組成を表１に示した。乳酸菌の前培養

unisporus GKY―７
５とC. holmii GKY―５７を作製した。

培地にはカビの生育を防ぐためにアジ化ナトリウム１００その後，７種類の菌体の組み合わせを作製した。７種

ppmと，共生していると思われる酵母の生育を防ぐため類の菌体の組み合わせを表２に示した。No．
１は既報６）ににシクロヘキシミド１００ppmを添加した。

よってケフィアグレインから分離した乳酸菌および酵母

また，酵母の前培養培地にはYM培地を用いた。さらに，サンプル中に混在している乳酸菌などの細菌の生育を防ぐためにクロラムフェニコール１
００ppmを添加した６）。

の全ての菌株を組み合わせ，No．
７は無接種とした。
４．培 養 方 法
No．
１からNo．
６までの菌体の組み合わせをつ く り，
WYAP培地５０!に接種し，３０℃で２４時間培養した。培

２．菌株および培養方法（１）乳酸菌および前培養方法

ケフィアグレインか

養後に遠心分離をし，集菌した。集菌した菌体を再び，ら 分 離 し た 乳 酸 菌Lactobacillus kefiri GKL―２，

WYAP培地１
００!で３０℃，２４時間培養した。遠心分離でLactobacillus kefiranofaciens GKL―２
８，Lactococcus lactis,

集菌したものを，７０％エタノールに１週間浸けて殺菌後，

６）

Leuconostoc mesenteroides Gme―１７の前培養方法は既報

生理食塩水で３回洗浄したケフィアグレイン１
０gに接種

に従った。

し，牛乳１
０
０!添加後，２２℃で２日培養した。No．
１から（２）酵母および前培養方法

ケフィアグレインか

No．
７の組み合わせの菌のグレインは２日ごとに新しいら 分 離 し た 酵 母Saccharomyces unisporus GKY―７５，牛乳を入れ替え２２℃で培養した。植え替えはグレイン重Candida holmii GKY―５
７，Candidakefyr GKY―４０の 前 培量測定を検討する為に３６回行い，HPLC測定，粘度測定

６）は１５回植え替え後に行った。

養方法は既報 に従った。

５．分 析 方 法
（１）グレイン重量測定

表１ 培 地 組 成GYPglucose（#）
１．
０
yeast extract（#）
１．
０
malt extract（#）
peptone
（#）
０．
５
０．
２
Na-acetate・３H２O （#）＊１salts solution（!）
０．
５
Tween８０solution （!）
１．
０
water
（!） １
０
０
whey
（!）
Yeast autolysate （!）
pH
６．
８
CaCO３
（#）
０．
５
Agar
（#）
１．
２

WYAP

YM

０．
５

１
０．
３
０．
３
０．
５

（２）HPLC測定

乳糖，エタノール，乳酸の測定

は，１５回植え替え後のケフィアを対象に，HPLC（Waters
Millennium ２０１０ Chromatography Manager（Waters））
を使用し，検出器は示差屈折計（RI）を用いて行った。
乳 糖，エ タ ノ ー ル の 分 析 に はShim-pack SCR―１
０
１N
（７．
９!I．
D．
×３
０
０!，島津製作所）カラムを用い，カラ
ム温度は６０℃，移動層は超純水，流速は０．
８!／minで行

１
０
０
８
０
２
０
５．
５

５．
５

１．
２＊２

１．
５

っ た。乳 酸 の 分 析 に はTSKgel OApak−P＋TSKgel
OApak−A（６．
０!I．
D．
×４
０!＋７．
８!I．D．×３
００!，東MgSO４・７H２O ４０"・MnSO４・４H２O ２"・FeSO４・
７H２O２"・NaCl ２"が含まれる。
＊２ 継代培養の際にはCaCO３ ０．
５％を加えたものを使用した。
＊１

０，１
５，３
６回植え替え後のグレイン重量を測定した。

ソー）カラムを用い，カラム温度は４０℃，移動相は０．
７５mM硫酸，流速は０．
８!／minで行い，もとの牛乳中に含まれる乳酸を差し引いた後，３回測定平均値を求めた。
（３）粘度 測 定

粘 度 測 定 は，１
５回 植 え 替 え 後 のNo．
１からNo．
７のグレインを２
２℃で０．
２
４．
３
６．
４
８時間培養
したケフィアをステンレスふるいでろ過後，ろ液の粘度

表２ 接種菌体組み合わせ
菌体No.
１
２
３
４
５
６
７

接種菌体
（A）
＋
（B）
＋
（C）
＋Candida kefyr GKY−４０（A）＋Lactococcus lactis+Saccharomyces unisporus GKY−７５（A）＋Lactococcus lactis+Candida holmii GKY−５
７（A）＋Leuconostoc mesenteroides Gme−１
７＋Sacch.unisporus GKY−７
５（A）＋Leuconostoc mesenteroides Gme−１
７＋Candida holmii GKY−５
７
（A）
＋
（B）
＋
（C）
無菌

（ 29 ）

〔研究ノート〕 再構築ケフィア菌相の比較243

を 測 定 し た。粘 度 の 測 定 に はViscometer LVDV-IP

GKL―２
８が不可欠であることを既報によって明らかにし（Brookfield）を用いた。

ている３）が，今回の結果，No．
１と比較すると，No．
３およ（４）官能検査

官能検査は１
５回植え替え後のケフ

びNo．
５の３
６時間後の粘度に 大 き な 変 化 が み ら れ た。

ィアNo．
１〜No．
６を用いて行った。パネルは女子大学生
エタノール

g/100㎖
2.5 2.22

１
５名，官能評価の内容は甘さ・香り・舌触り・酸味・粘り・炭酸味・食味・総合評価とし，−３（弱い・悪い）から＋３（強い・良い）の段階で評価した。評価項目ご2とに平均値を求めた。ただし，No．
７は無菌のものとし

1.5

1.3

て官能検査を行わなかった。

0.73 0.79 0.65

1

実験結果および考察

0.53

0.5
0

１．グレイン重量測定

01

グレイン増加量を図１に示した。グレインの重量測定

2から，ブランクと比較してすべての組み合わせでグレイ

3
4
5
グレイン No.

ンの増加が認められた。このことから，C. kefyrがなく

乳g/100㎖5

ともグレインの増加が行われることが明らかとなった。
また，ブランクであるNo．
７のグレインは３６回植え換え4.45 4.34

２．HPLC測定

4.81
3.97
3.31

3

乳糖，乳酸量の１００!中に含まれる量（!）を図２に示した。

1

各サンプルのエタノール・乳糖・乳酸量をみてみると，

01

乳糖の減少とエタノールの増加は，ほぼ比例していた。

2

これは，乳糖が分解されエタノールが生成されていると

3
4
5
グレイン No.

いうことを示していると考えられた。無菌接種のNo．
７

乳g/100㎖
1.2

は，十分消毒したグレインを使い，クリーンベンチの無菌状態の中で植え替えを行ったが，乳糖の低下と乳酸値1の上昇がみられた。このため，植え替えに使用した牛乳からの乳酸菌の持ち込みがあったのではないかと考察し0.8た。しかし，エタノールが検出されず，顕微鏡観察でも0.6

酵母が認められなかったことから，ブランクとして成立

0.4

していると考えられた。

3.28

2.08

液体クロマトグラフィーを用いて測定したエタノール，
2

7

糖

4

時には，形状を保てずに崩れた状態であった。

6

6

7

酸
1.08

0.93 0.96 0.89

0.87

0.68 0.68

0.2

３．粘 度 測 定

0

粘度測定の結果を図３に示した。ケフィアの粘性物質

12

生 産 に は，
（A）のL. kefiri GKL―２とL. kefiranofaciens

345
グレイン No.

67

図２ 植え替え１
５回後に含まれるエタノール・乳糖・乳酸量35

粘度︵cP︶

グレイン
︵ ︶

g

30
25
20
15
10
5
0

1

2

3

4

グレイン
0回

15回

5

6

7

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1

2

3

No.

4

5

6

7

グレイン No.
36回

図１ ケフィアグレインの植え替えによる重量変化

0h

24h

36h

48h

図３ 植え換え１
５回後の各種ケフィアの粘度変化

244

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

総合評価
食味

No.1

No.2

No.3

甘さ
3
1
-1
-3

甘さ
3
1
-1
-3

甘さ
3
1
-1
-3

炭酸味

総合評価
食味

（ 30 ）

香り
舌ざわり
酸味

総合評価
食味
炭酸味

総合評価

香り

食味

舌ざわり

炭酸味

酸味
粘り

粘り

No.4

No.5

No.6

甘さ
3
1
-1
-3

甘さ

甘さ
3
1
-1
-3

炭酸味

舌ざわり
酸味

総合評価

2

食味

-3

炭酸味

香り

総合評価

舌ざわり
酸味

食味

舌ざわり
酸味

粘り

香り

香り

炭酸味

香り
舌ざわり
酸味

粘り

粘り

粘り
図４ 各種ケフィアの官能検査

文No．
３およびNo．
５に は，酵 母 菌 のC.holmii GKY―５
７が 入っており，粘り生成にはC.holmii GKY―５
７も深く関わっていると考えられた。また，培養が進むとすべてにおいて粘度が低下したが，pHの上昇によって粘性物質が沈澱し，その為に粘度が低下したと思われた。本件に関しては今後の検討課題と考える。
４．官 能 検 査
官能検査の結果を図４に示した。No．
１は，香り，甘献１）戸羽隆宏：ケフィール・ヨーグルトの乳酸菌，乳酸菌研究集談会誌，２，６
８〜７
３（１
９
９
２）
２）小原直弘：ケフィールの機能と今後の課題，食品と
開発，２
９（８）
，８〜１
０（１
９
９
４）
３）小崎道夫：乳酸菌―健康を守る発酵食品の秘密（八坂書店，東京）
，pp．
６
５〜６
６（２
０
０
２）
４）足立

達・伊藤敞敏・戸羽隆宏・有原圭三・向井孝

さがやや高く，粘りが少ない評価だった。No．
２は，甘夫：乳 酸 菌 の 生 態―Lactobacillus kefiranofaciensにさの評価が低く，舌触りも低い結果であったが，総合評よるケフィール粒の形成を例として―，微生物，６，１
５価は一番良い結果であった。No．
３は，炭酸，甘さと酸味が非常に低く，粘りの評価結果が高かった。また，
No．
２と同じく総合評価が一番よい結果であった。
No．
４は甘さ，炭酸，酸味のバランスがとれており，食味の評価が高い結果であった。No．
５は，甘みの評価
が低く他の評価も０〜１前後と低く，酸味のみが非常に高い結果であった。

〜２
７（１
９
９
０）
５）乳酸菌研究集談会：乳酸菌の科学と技術，pp．
２
７
０
〜２
７
４（２
０
０
０）
６）小原直弘・内村泰・駒形和男：凍結乾燥，水浸漬

および継代培養ケフィアグレイン（グルジア）の酵母
菌相の比較，日食誌，２
６，６
９〜７
４（２
０
０
０）
７）小原直弘・鈴木正人・岡田早苗・内村

泰・小崎道

No．
６は，甘さ，香り，粘りが高く，食味，炭酸味，

雄・駒形和男：凍結乾燥ケフィアグレイン（グルジ

酸味，舌触りが非常に低い結果であった。また，No．
２ア）より分離した乳酸菌の同定，日食微誌，１３，１６５

およびNo．
３の評価が高かったが，総体的な味の差はあ

〜１
７
１（１
９
９
７）

まりみられなかった。No．
２およびNo．
４はCandida属を８）戸羽隆宏．足立達：ケフィール粒の微生物学，バ

用いておらず，Candida属なしでもケフィアの特徴とも

イ オ サ イ エ ン ス と イ ン ダ ス ト リ ー，４
７，３
８
３〜３
８
６

いえる粘りが形成できることを明らかにした。さらに，

（１
９
８
９）

粘性物質の生成には，乳酸菌だけではなく，酵母も深く

９）西川朱實：カンジダの菌学，真菌誌，４
３，１
２
６〜１
２
８

関与していると推察できた１），７）。

（２
０
０
７）

０） KURTZMAN, C. P. : The Yeasts, A Taxonomic
今後は，ケフィア中の菌の組み合わせを変えたときの， １
機能性やより高い多糖の生成条件，好まれる味を作る為

Studyの培養条件などを明らかにしていく必要があると考える。

Technology, Amsterdam）, pp.９〜１
２（１
９
９
８）

Fourthedition （ Elsevier

Science

and

（平成２
２年１
０月１
３日受付，平成２
３年７月１
１日受理）

（ 31 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１ 〔研究ノート〕

245

小麦（ハルユタカ）粒中のプロテインジスルフィド
イソメラーゼ（PDI）の分離精製
野 口 智 弘＊１§・新 井 智 美＊２・野 口 治 子＊２
内 野 昌 孝＊２・! 野 克 己＊２＊１ 東京農業大学応用生物科学部食品加工技術センター＊２ 東京農業大学応用生物科学部生物応用化学科

Purification of Protein Disulfide Isomerase from Wheat（Haruyutaka）Grain
NOGUCHI Tomohiro＊１§，ARAI Satomi＊２，NOGUCHI Haruko＊２，
UCHINO Masataka＊２ and TAKANO Katsumi＊２
Food Processing Center, Faculty of Applied Bioscience, Tokyo University of Agriculture,1−1−1 Sakuragaoka, Setagaya−ku, Tokyo 156−8502
Department of Applied Biology and Chemistry, Faculty of Applied Bioscience, Tokyo University of Agriculture,1−1−1 Sakuragaoka, Setagaya−ku, Tokyo 156−0−8502＊１＊２

The protein disulfide isomerase（PDI）enzyme is involved in the formation of disulfide bonds. Here
we attempted to purify PDI from wheat grain（Triticumaestivum cv. Haruyutaka）．As a result of
DEAE-Sepharose Fast Flow and affinity chromatography purification，３０．
７４units of PDI activity／１
００g
of wheat grain were observed in the adsorbed fraction from the affinity chromatography column. The
molecular weight of this fraction was６
３kDa as determined by SDS-PAGE analysis. N-terminal aminoacid sequencing of this６
３−kDa protein showed that the sequences of wPDI and this６
３−kDa protein
shared７
９％identity. On the basis of this result, we assumed that the６
３−kDa protein that we purified
from wheat（Haruyutaka）grain is the same as wPDI, which we used for genetic information, and that
our expression of this protein was successful.
（Received Mar. ３
１, ２
０１
１；Accepted Jul. ２１, ２
０
１
１）
Key words：Protein Disulfide Isomerase, PDI, Wheat, Disulfide Bond, Dough
プロテインジスルフィドイソメラーゼ，PDI，小麦，ジスルフィド結合，生地

小麦は主に製粉され小麦粉として利用されている。小タンパク質のリフォールディングを触媒する酵素である。

麦粉は水を加えて練ることで，他の穀類にはみられない

PDIは様々な生物でその存在が明らかにされており，小独特の粘弾性を示す生地を形成することから，パンや麺，

麦のPDIについても様々な研究が行われている。近年，菓子など様々な食品に加工されている。この生地は小麦

小麦粉内在PDIをコードするcDNAが分離され１）さらにの主要構成タンパク質であるグリアジンとグルテニンに

小麦PDIについてその種類や詳細な遺伝子解析が行われ水を加えて混捏することで形成するグルテンによるものている２）。一方で，小麦より部分精製されたPDIとアスである。

コルビン酸を同時に添加することで，生地の物性が向上

グルテンの形成は，様々な分子間相互作用や結合が関することも示されている３）。筆者らは，これまでに小麦与していると考えられているが，中でもジスルフィド結

mRNAからリコンビナントPDI（wPDI）の発現・精製

合が最も重要であると考えられている。しかしながら，に成功し，その性状を報告している４）。しかしながら，生地混捏時の物理的作用のみでジスルフィド結合が形成

小麦よりPDIを分離精製し取得した報告は，これまでにされるとは考えにくい。

ない。そこで，国内産小麦のハルユタカを用い小麦粒かProtein Disulfide Isomerase（PDI ; EC５．
３．
４．
１）は

＊１ 〒１
５
６−８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１−１−１§ Corresponding author, E-mail : tomo@nodai.ac.jp
＊２ 〒１
５
６−８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１−１−１

らのPDIの分離精製を試みた。

246

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

試料および実験方法
１．試料（ 32 ）

溶解後，１N水酸化ナトリウムにてpH８．
０に調整後，５０mMトリス塩酸緩衝液（pH８．
０）にて定容し調製した。
試 験 管 に０．
４Mリ ン 酸 カ リ ウ ム 緩 衝 液（pH７．
５）０．
２
５

試料には，北海道産ハルユタカ（Triticumaestivum cv!，８mM EDTA０．
２
５!，インスリン溶液０．
１!，純水
０．
２
８
４!をとり，小麦粒から抽出した酵素溶液０．
０５!をHaruyutaka）を用いた。

加 え た 後，５mM DTT０．
０
６
６!を 加 え，全 量 を１．
０!

２．酵素の抽出
酵素の抽出はKAINUMA５）（１９９８）らの方法を用いた。

（終濃度：０．
１Mリン酸カリウム緩衝液（pH７．
５），２mM

小麦全粒を，マルチビーズショッカーにて破砕し，４倍EDTA，１$／!イ ン ス リ ン，０．
３
３mM DTT）と し容（w／v）の５mMジチオトレイトール（DTT），５
０mM

て，２
５℃で６
０分間酵素反応を行った。生じたインスリン塩化ナトリウム，１０mMエチレンジアミン―N, N, N, N―の濁度を吸収波長６５０nmにて測定した。酵素力価はpH

テトラ酢酸（EDTA），２mMフッ化フェニルメチルス

７．
５，２５℃でDTT存在下において１mg／!のインスリンルホニル（PMSF），０．
１％（w／v）Triton X―１
０
０を含む

のA６
５
０を１分間に０．
０１変化させる力価を１Uとした。

５０mMトリス塩酸緩衝液（pH８．
０）を加え，ヒストコロ

な お，酵 素 液 中 の タ ン パ ク 質 量 は，Coomassie" Plus

ン（日本医理科機械製作所製）にてさらに破砕し，遠心

Protein Assay Reagent Kit（PIERCE社 製）お よ び

分離（１
０，
０
０
０rpm，２
０min，４℃）により得られた上澄

Lowryの改良法にて測定した。

液を粗抽出液（F１）とした。F１を２０％飽和硫酸アン

５．SDS-PAGEおよびウエスタンブロットによる解析

モニウムにて塩析し，氷冷下で１時間静置した後，遠心

アフィニティークロマトグラフィーで分離した画分は，

分離（１
５，
０
０
０rpm，２
０分間，４℃）後，得られた上澄液

SDS-PAGEに供しタンパク質の分子量の解析を行うととを分画分子量２５，０００の透析膜を用い，２０mMトリス塩酸

もにウエスタンブロットにてPDIの検出を行った。タン（pH８．
０）に て１晩（４℃）透 析 す る こ と で，PDI活 性

パク質の染色は銀染色（銀染色!キットワコー，和光純に 近 似 し た 活 性 を 示 す 分 子 量１
３，０
００の タ ン パ ク 質

薬工業社製）にて行い，ウエスタンブロットの検出には，

６）Thioredoxin や低分子の還元物質を取り除き，遠心分離

１次 抗 体 に 小 麦PDIポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体（mouse

（１
５，
０
０
０rpm，２
０分間，４℃）後の上澄液 を 粗 酵 素（FAntiserum to wPDI）を用い，２次抗体は，MouesIgG,２）とした。

Horseradish Peroxidase Linked Whole antibody from

３．小麦PDIの精製

sheep（GE Healthcare社 製），検 出 試 薬 はAmersham

PDIの 分 離 精 製 は，２０mMト リ ス 塩 酸 緩 衝 液（pH

ECL

Plus

Westernblotting

reagent

pack （ GE８．
０）にて平衡化したDEAE-Sepharose Fast Flowカラ

Healthcare社製）を用いて，得られたシグナルを化学蛍

ム（φ２
０×１
６
０#，GEヘ ル ス ケ ア 社 製）に，F２を 供 し

光検出機（Gel-Doc Bio Rad社製）にて検出した。

た。溶出条件は１．
０!／min，５．
０!／tubeにて行い，未吸６．N末端アミノ酸配列解析

着画分を溶出後，吸着画分をNaClを含む同緩衝液にてSDS-PAGE後のゲルをセミドライブロッティングによステップワイズ（０．
１，０．
２，１．
０M）を行った。PDI活

りPVDF膜に転写，CBB染色した。得られた精製酵素バ

性 が 確 認 さ れ た 画 分 は，さ ら に 抗PDI抗 体（mouse

ンドを切り出した後，プロテインシークエンサー（PPSQ

Antiserum to wPDI）を用いたアフィニティークロマ

−２
１／２
３，shimadzu社製）に供しEdman法にてN末端ア

トグラフィーに供し精製を行った。カラムにはHi Trap

ミノ酸配列を解析した。

NHS-activated HP（５!，GEヘルスケア社製）を用い，結果および考察

遺伝子情報より発現調製した小麦リコンビナントPDI４）を抗原として作成したPDIポリクローナル抗体をリガン

１．陰イオン交換体クロマトグラフィーおよび抗PDI抗ド と し て 用 い た。先 のDEAE-Sepharose Fast Flowに体アフィニティークロマトグラフィーを用いた小麦てPDIの 活 性 の 得 ら れ た 画 分 を２０mMリ ン 酸，０．
１
５M

PDIの分離精製

NaCl，pH７．
０にて平衡化したカラムにアプライ後，未DEAE-Sepharose Fast FlowカラムにF２を供し分離

吸着画く分を溶出させた後，１．
０Mグリシン−塩酸，０．
５精製を行った結果，未吸着画分（A１）および吸着画分

M NaCl，pH４．
０にて溶出を行った。なお，溶出は１．
０!

（A２，〜４）の 計４つ の タ ン パ ク 質 ピ ー ク が 得 ら れ／min，２．
０!／tubeにて行い，酵素活性の保持のため，

（Fig．
１）
，これら各画分（A１〜４）のPDI活性 を 測 定あらかじめフラクションチューブに１．
０Mトリス塩酸緩したところ（Table１），A３にて１５
６．
６units／小麦粒１００

衝液（pH７．
０）を１．
０!入れ溶出した。

%と最も高い活性を確認した。そこで，次に小麦PDIポ

４．PDI活性測定法

リクローナル抗体（mouse Antiserum to wPDI）をリ
７），
８）

PDIの活性測定は，ARNEらの方法に従いのインス

ガンドさせた抗PDI抗体アフィニティークロマトグラフ

リンを用いた方法にて行った。基質である１％（w／v）

ィ ー（Hi Trap NHS-activated HP）を 用 い，A３画 分

インスリン溶液はインスリン（和光純薬社製）を５０mMのさらなる精製を試みたところ，未吸着画分（C１）おトリス塩酸緩衝液（pH８．
０）に懸濁し，１N塩酸を加えよび吸着画分（C２）にタンパク質ピークを確認した

（ 33 ）

〔研究ノート〕 小麦粒PDIの分離精製

0.8

2

0.6

A-4

A-2

0.4

A-3

1
0.5

0.2

0

0
0

50

100

C1
0.05

150

A280

1.5

0.06

NaCl
（M）

1

2.5
Ａ280

20 mMphosphate, 0.15 1.0 M glycine-HCl, 0.5 1.0 M glycine-HCl, 0.5
M NaCl（pH 7.0）
M NaCl（pH 4.0）
M NaCl（pH 3.0）

1.2

3.5 A-1
3

247

0.04
C2

0.03

190

0.02

Fraction No. (5 ㎖/tube)
Fig ．１ DEAE - Sepharose chromatography
extracted from Haruyutaka grain

of

PDI

Column：DEAE-Sepharose Fast Flow（φ２
０×１６
０mm）
Buffer：２０mM Tris-HCl buffer（pH８．
０）
Speed：１!／min.

0.01
0
0

5

10
15
20
Fraction No. (2㎖/tube)

25

Fig ．２ Antibody affinity chromatography of pooled
eluates （ A ３ ） fromthe
DEAE - Sepharose
chromatography column
Column：HiTrap NHS-activated HP（５!）
Speed：１!／min

Table１ Purification summary of PDI fromHaruyutakagrain

Step

PDI Activity（U）

Protein（!）

Specific
activity（U／!）

Purification
rate

Yield
（％）

F１
F２
A１
A２
A３
A４
C１
C２

６
４
２．
２
３
２
３．
９
N.D
５
９．
１
１
５
６．
６
N.D.
N.D.
３
０．
７

２
９
４
８．
８
１
５
６
５．
４
７
１
４．
８
２
５
９．
８
１
５
０．
６
２
１．
１
８．
５
０．
４

０．
２
２
０．
２
１
−
０．
２
３
１．
０
４
−
−
７
４．
８

１
０．
９
５
−
１．
０
４
４．
７
７
−
−
３
４
１

１
０
０
５
０．
４
−
９．
２
２
４．
４
−
−
４．
８

（Based on １００g Wheat grain）

（Fig．
２）
。C１お よ びC２のPDI活 性 測 定 を 行 っ た 結 果

（Fig．
４）
。その結果，６
３kDaタンパク質のN末端配列は，（Table１），アフィニティークロマトグラフィーの吸着筆者らが遺伝情報より発現に成功したリコンビナント小画分であるC２において３０．
７４units／小麦粒１
０
０"の活性

４）
麦PDI（wPDI）の２６残基目からと７９％の相同性を示しが得られた。

たことから，６
３kDaタンパク質は，小麦粒中に存在する

２．SDS-PAGEおよびウエスタンブロットを用いた解析

PDIであることが明らかとなった。

アフィニティークロマトグラフィーによって得られた各画分をSDS-PAGE（Me＋）に供し銀染色にてタンパ

要約

ク質の検出を行ったところ（Fig．
３A），C２にて５０およ

国内産パン用小麦であるハルユタカの小麦粒より，

び６
３kDaのタンパク質バンドを確認した。さらに，小麦Protein Disulfide Isomeraseの 分 離 精 製 を 試 み た。

PDI抗体を用いたウエスタンブロットにて，PDIのシグ

DEAE-Sepharose Fast Flowおよび抗PDI抗体アフィニ

ナルを確認したところ（Fig．
３B），６
３kDaに強いシグナ

ティークロマトにて検討を行ったところ，アフィニティ

ルが得られ，この６
３kDaのバンドが小麦粒中のPDIであークロマトグラフィーの吸着画分に，３０．
７４units／小麦ることが示唆された。

粒１００gのPDI活性が得られた。さらに，SDS-PAGEおよ

３．N末端アミノ酸配列解析

びPDI抗体を用いたウエスタンブロットにより６
３kDaのSDS-PAGEおよびウエスタンブロッドにて確認した６３タンパク質にPDIのシグナルが確認された。また，このkDaタ ン パ ク 質 のN末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 を 解 析 し た

６
３kDaタンパク質のN末端アミノ酸配列を解析したとこ

248

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
５ ２
０
１
１

（ 34 ）BA（kDa） M

C1（kDa） M

C2

250
150
100
75

C1

C2

180
116
97
63 kDa58

50

63 kDa

39

37

29
25
20

20

（T=12.5％；Me+）Fig ．
３ SDS - PAGE （ A ） and western blot （ B ） of antibody affinity
chromatography ofHaruyutaka grain
M : Molecular standard, C １ and C ２ ： Eluted fractions by Antibody affinity
chromatography.

Puriﬁed PDI from Haruyutaka
grain; C2 (63 kDa)

1

20

ＰＥＡＡＡＡＥＥＡＡＡＡＰＩＬＶＡＴＸＨ ･･･

26

Recombinant PDI

47

ＥＥＡＡＡＡＥＥＡＡＡＡＰＥＡＶＬＴＬＨＡＤ ･･･
N-terminal amino acid homology: 79%

Fig．
４ N-Terminal amino acid sequence of recombinant PDI and purified PDI from
Haruyutaka grain

ろ，小麦遺伝情報より取得したwPDIの配列と７９％の相K. : Purification and characterization of protein

同性が得られたことから，ハルユタカ粒より取得した６
３

disulfideisomerase

from

wheat

expressedinkDaタンパク質は，小麦PDIであることが明らかとなっ

Escherichia coli. , Japan Food Preservation Sci. , ３
７,

た。

１
７
３
１
８
３（２
０
１
１）
５）KAINUMA, K., OOKURA, T., KITTA, K., MANABE, M.,
文

献and KAWAMURA, Y. : Protein Disulfide Isomerase１）SHIMONI, Y., ZHU, X., LEVANOY, H., SEGAL, G., ZHU,
X. and GALILI, G. :Purification, characterization,

andlocalization

Activity of Some Plant Seeds, Biosci. Biotechnol.
Biochem., ６
２, ３
６
９
３
７
１（１
９
９
８）

glycosylated６）PIGET, V. P. and SCHUSTER, B. J. : Thioredoxin -Protein Disulfide Isomerase from wheat grains,

catalyzed refolding of disulfide-containing proteins,

Plant Physiol ., １
０
８, ３
２
７〜３
３
５（１
９
９
５）

Proc. Nadl. Acad. Sci. USA, ８
３, ７
６
４
３
７
６
４
７（１
９
８
６）

intracellular２ ） CIAFFI,M. ,PAOLACCI,

A. R. ,

ofD’ALOISIO,

E. ,TANZARELLA, O.A. and PORCEDDU, E. : Cloning and

７）ARNE, H. : Thioredoxin Catalyzes the Reduction of
Insulin

Disulfides

byDitiothreitol

andcharacterization of wheat PDI （ protein disulfide

Dihydrolipoamide, J. Bio. Chem. , ２
５
４, ９
６
２
７
９
６
３
２

isomerase ） homoeologous

（１
９
７
９）

genes

and

promotersequences, Gene, ３
６
６, ２
０
９〜２
１
８（２
０
０
６）

８ ） JOHANNA. L.

and

ARNE. H. : Protein

Disulfide -３ ） EVERY, D. , SIMMONS, L. D. and ROSS, M. P. :isomerase Is aSubstrate for ThioredoxinReductase

Distribution of Redox Enzymes in Millstreams andand Has Thioredoxin-like Activity., J. Bio. Chem.,

Relationships to Chemical and Baking Properties

２
６
５, ９
１
１
４
９
１
２
０（１
９
９
０）

of Flour, Cereal Chem., ８
３, ６
２〜６
８（２
０
０
６）
４）ARAI, S., NOGUCHI, T., UCHINO, M. and TAKANO,

（平成２
３年３月３
１日受付，平成２
３年７月２１日受理）