59−技術資料−●動的高吸着充填剤Toyopearl GigaCap S-650Mの特性
南陽研究所 HLC充填剤グループ

１． 背久保 雄二
坂根光
中村 孝司

マガード（バクスター社製）を用いた。ガンマガード

景には少量のアルブミンが添加されているため、近年、医薬品用途等で生体高分子であるタンパク質、rProtein A Sepharose FF（GE Healthcare社製）を用酵素、核酸等に対する需要が急激に増加している。バ

い て IgGを 精 製 し た 後 、 使 用 し た 。 rProtein A

イオ医薬品の製造は一般的に、培養による生産工程と、Sepharose FFを7.5mm I.D.×7.5cmのステンレスカラその後の分離・精製工程とに大別される。医薬品の製ム に 充 填 後 、 流 速 1.5mL/min、 吸 着 buffer

造では特にその純度や安全性の管理が重要であり、そ（20mmol/L リン酸buffer, pH7.0）で平衡化した。ガンの精製は幾つもの複雑な工程を経て綿密に実施されてマガード2.5gを吸着buffer 50mLに溶解し、1mL注入しいる。分離・精製工程は、一般的に3ステップた。アルブミンが溶出した後、カラムに吸着したIgG（Capture, Intermediate Purification, Polishingなどのクを脱着buffer（0.1mol/L 酢酸buffer, pH3.0）で溶出、1 ）， 2 ）。

回収した。得られたIgG溶液を0.1mol/L 酢酸buffer

Capture工程は、目的物質を迅速に粗精製する工程で（pH4.7）で希釈し、IgG溶液（タンパク質濃度；あるが、近年培養工程におけるタンパク質発現レベル1mg/mL, pH; 4.7）を調製した3）。

ロマトグラフィー工程）で実施されているが高くなっていることから、充填剤の特性として高吸各種カチオン交換体を6.0mm I.D.×4cmのステンレ

着量、高流速使用、高耐久性などの性能が必要とされスカラムに充填し、吸着buffer（0.1 mol/L酢酸buffer,1）ている 。当社はトヨパール等の各種充填剤を有してpＨ4.7）を流速1.0mL/minで送液し平衡化した。上記

いるが、Capture工程に適した吸着量の高い充填剤をで 調 製 し た IgG溶 液 （ 濃 度 1mg/mL） を 流 速有していないことより高吸着量で且つ通液特性に優れ1.0mL/min.（線速度212cm/hr）でカラムに送液し破た充填剤の開発を行った。

過曲線を得た。充填剤の動的吸着量（Dynamic

本稿では、新しく開発した動的高吸着充填剤

binding capacity : DBC）は得られた破過曲線の10％破Toyopearl GigaCap S−650M（カチオン交換体）の基過点の溶出容量から算出した。吸着したIgGは脱着

本的性質、特徴について紹介する。

buffer（0.1mol/L 酢酸buffer＋1.0mol/L NaCl, pH 4.7）を用い溶出回収し、そのUV吸光度（280nm）から回２．実収量を算出し、DBCの値に対する割合を回収率（％）

験とした。

［1］ 試薬、充填剤

リゾチームのDBCの測定も同様な方法で測定した。

ヒトIgGはバクスター社製ガンマガードもしくは化

リゾチームの場合、吸着buffer （50mmol/L グリシン,血研製ガンマグロブリンを購入し用いた。リボヌクレ

pH 9.0）に溶解し5mg/mL溶液を調整した。得られた

アーゼA、チトクロームC、リゾチームはシグマアル溶液を、それぞれ106cm/hr、212cm/hr、424cm/hrのドリッチ（株）から購入した。酢酸、NaCl、NaOHな線速度でカラムにロードし、破過曲線を取得後、どの試薬は和光純薬（株）から購入した。

DBCを測定した。

SP Sepharose XLはGE Healthcare社製の製品を用いた。Fractogel SE HiCapはMerck社製の製品を用いた。

［3］ 静的吸着量の測定0.1mol/L 酢酸buffer（pＨ4.7）で平衡化した充填剤

Toyopearlは東ソー（株）製の製品を用いた。

1mLを300mL三角フラスコに入れ、ここに平衡化［2］ 動的吸着量の測定bufferで調整した化血研製ガンマグロブリン溶液（濃ヒトIgGの動的吸着量の測定では、試料としてガン度5mg/mL）を52mL添加した。得られた懸濁液を、（ 59 ）

60

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.50（2006）

振とう恒温槽を用い、25℃で3時間(振とう速度：−1品用途などで需要が多く、市場の成長率も大きいヒト85min ）振とうした。上清の残存IgG量をUV吸光度IgGを用いて実施した４）。ヒト IgGとしてガンマガー（280nm）の測定値から算出し、その値をIgGの総仕ド（バクスター社製）を用いて評価を行ったが、アル込み量から差し引いて充填剤の静的吸着量（Static

ブミンが少量含まれているため、r Protein Aカラムで

binding capacity : SBC）とした。

精製したのち使用した。DBCの測定結果をTable 1に［4］タンパク質溶出挙動品であるToyopearl SP650CやSP550Cよりも、大幅に示した。Toyopearl GigaCap S−650Mは、東ソー既存
6mm I.D.×4cmのステンレスカラムに各充填剤を充抗体の吸着量が高くなり、市販の高吸着能充填剤と比填 し 、 ポ ン プ に 接 続 し た 。（ 東 ソ ー 製 C C P M −Ⅱ ）

較しても高い吸着能を有していることがわかった。

20mmol/Lリン酸buffer（pH7.0）にリボヌクレアーゼ

DBCを測定したときの破過曲線をFig.1に示した。

A（10 mg/mL）、チトクロームC（3.5 mg/mL）、リゾDBCは10％破過高さにおける溶出容量から計算した。

チーム（6.5 mg/mL）を溶解しサンプル溶液を調整した。サンプル100μLをカラムにロードし、リニアー［2］ヒト IgGの静的吸着量

グラジエント条件でタンパク質を分離した。（グラジ

Toyopearl GigaCap S−650M及びToyopearl SP−650C、エント条件：buffer A 20mmol/Lリン酸buffer（pH7.0）、SP550CのSBCをバッチ方式で測定した。各充填剤のbuffer B 20mmol/Lリン酸buffer（pH7.0）＋1.0mol/L

SBCとDBCの比較結果をFig.2に示した。Toyopearl既NaCl、60分リニアーグランエント、流速1.0mL/min.）

存品では、SBCに対するDBCの値は減少率50％以上

測定装置はSC−8020（東ソー製）を用いた。検出器はと大きく低下した。これに対し、開発品である

UV8020（東ソー製）を用い280nmでモニターした。
［5］圧力損失の測定

155
135

PEEKカラム（22mm I.D.×20cm）に各種充填剤を

SP Sepharose XL115mAU充填した。充填溶媒は純水を用い、線速度400cm/hrで充填した。得られた充填カラムに純水を流しながら、9575Fractogel SE HiCap.

55

各線速度での圧力を測定した。その値から空のカラム35で測定した圧力を差し引いて充填剤の圧力損失としGiga Cap15た。

S−650M−5050100150200

Time［min.］３．結果と考察

Fig.１［1］ヒトIgGの動的吸着量
開発品Toyopearl GigaCap S−650Mの動的吸着量（DBC：Dynamic Binding Capacity）の評価は、医薬

10％height breakthrough curves of human IgG oncation exchange resins. Column size : 6mm I.D. ×4cm bed height. Sample : polyclonal human IgG(1mg/mL). Buffer : 0.1mol/L acetate buffer(pH 4.7). Flow velocity : 212 cm/hr. Detection :UV 280 nm

Table１ Dynamic binding capacity for polyclonal human IgG

Toyopearl SP650C
Toyopearl SP550CSP Sepharose XL
Fractogel SE HiCap
Toyopearl GigaCap S−650M

Particlesize（μm）

Ion exchange
capacity（meq/mL）

Dynamicbinding capacity（mg/mL-gel）

Recovery50−15050−15050−15040−9050−100

0.12
0.13
0.17
0.08
0.16

1214
140
68
145

989898
97
98％

Dynamic binding capacity is determined from 10％ breakthrough curve. Column size : 6 mm
I.D.×40mm height. Sample : polyclonal human IgG (1 mg/mL). Buffer : 0.1mol/L acetate buffer(pH4.7). Flow velocity : 212 cm/hr. Detection : UV 280 nm. Elution buffer : 0.1mol/L acetatebuffer (pH4.7)＋1.0mol/L NaCl.

（ 60 ）

Fig.２

61250

180
160
140120100
8060
40200SBC

DBC［mg/ml−gel］

hIgG binding capacity［mg/m /gel］

東ソー研究・技術報告 第50巻（2006）

DBC

200
150
100
500SP−550C

GigaCapS−650MSP−650C0200

400600Flow rate［cm/h］

Comparison between Static binding capacity andDynamic binding capacity for human IgG.

Fig.３

GigaCap S−650MではDBCは殆ど低下せず、SBCと同

Flow−rate dependence of Dynamic binding
capacity for Lysozyme. △ : Giga Cap S−650M,□ : Toyopearl SP−550C, ○ : Toyopearl SP−650M［4］タンパク質の溶出挙動等の値を示した。この結果より、開発品はタンパク質開発品のタンパク質溶出挙動については、他社品のを動的に吸着させるような精製プロセスに適した充填高吸着能充填剤と比較した。結果をFig.4に示したが、剤であることがわかった。

タンパク質としてはモデル物質としてリボヌクレアー

Toyopearl既存品では、タンパク質の動的吸着条件

ゼA、チトクロームC、リゾチームに対する溶出挙動

下では、充填剤の細孔深部までタンパク質が拡散しにを比較した。タンパク質の分離溶出挙動は、NaClのくいため、細孔内部表面に固定化されたイオン交換基リニアーグラジエント溶出により測定した。開発品のが十分に有効活用されず、結果としてSBCに比べ溶出挙動は他社品であるSP Sepharose XLとほぼ同等DBCは大きく低下したものと考えられる。これに対の溶出挙動を示し、Fractogel SE HiCapの溶出挙動は、し開発品では、動的吸着条件下でもイオン交換基がタ他の2つとは異なった。この分離選択性の相違は、インパク質に対し有効に作用するよう設計しているたオン交換基導入状態の違いによるものと考えている。

め、DBCの低下が小さいと推測している。

Fractogel SE HiCapは、スルホエチル基を有するイオン性モノマーを充填剤にグラフト重合することによ［3］リゾチーム動的吸着量の流速依存性り調整されている。このためイオン交換基は近接して東ソー既存品及び開発品のリゾチームに対する導入され、タンパク質を多くのイオン交換基で吸着すDBCを測定した。リゾチームのDBCは、サンプル溶ることで保持力が強くなり、分離選択性に影響したと液の通液速度（線速度）を変えて測定した。結果を推測している。

Table2に示した。GigaCap S−650MのDBC線速度依存性は、既存品であるToyopearl SP−650Mと同等である［5］ 充填剤の物理的強度事を確認した（Fig.3）。但し、開発品は相対的にDBC

物理的強度が小さい充填剤（柔らかい充填剤）は、の値が高く高流速下でも、そのDBC値の低下は小さ

大型カラムで使用すると充填剤が自重で圧縮され、細かった。

孔容積が減少し、吸着量の低下及びカラム閉塞などの問題が生じる。このような充填剤ではカラム高さを低Table２ Flow-rate dependence of Dynamic binding capacity for Lysozyme

Particlesize（μm）
Toyopearl SP650M
Toyopearl SP550C
GigaCap S−650M

40−90
50−15050−100DBC
Ion exchange
DBCDBC
at 106cm/hr at 212cm/hr
capacity
at 424cm/hr（meq/mL） （mg/mL-gel）（mg/mL-gel）（mg/mL-gel）
0.13−0.170.14−0.18
0.1650111
2034881190

4049164

Column size : 6 mm I.D.×4cm bed height. Sample : lysozyme (5mg/mL). Buffer : 50mmol/Lglycine (pH9.0). Flow velocity : 106, 212, 424 cm/hr. Detection : UV 280 nm（ 61 ）

62

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.50（2006）

Table３160

CIP Study of GigaCap S-650M

Cyto C
LysozymemAU

120

RNase A

DBC for Lysozyme (g/L-resin)

Giga Cap S−650M

80

GigaCap S-650M
SP Sepharose XL

After 50 Cycles

167

163

Column cycled 50 times including a 1.0M NaOH cleaning(exposure time at least 1hr. per cycle) Flow-rate 280cm/hr

40
Fractogel SE HiCap00Fig.４

Prior to NaOH

102030Retention time［min］

40

剤は、繰り返し使用している間に、その選択性や吸着

Resolution of protein separation. Column size : 6mm I.D.
× 4cm bed height. Flow-rate : 1.0 mL/min. Sample :ribonuclease A (10 mg/mL), cytochrome C (3.5mg/mL) and lysozyme (6.5mg/mL). Sample load : 100μL
Gradient : 60-min linear gradient from buffer A to buffer
B. Buffer A : 20mmol/L phosphate (pH 7.0). Buffer B :20mmol/L phosphate＋1mol/L NaCl (pH7.0)
Detection : UV (280nm)

能が低下することがある。通常、充填剤のアルカリ洗浄には0.5〜1.0M NaOHが使用されているが、開発品のアルカリ安定性は1.0M NaOHを用い調査した。リ
ゾチームのDBCを測定した後アルカリ洗浄を行い、50回繰り返し使用した前後での吸着能の変化を測定した。結果をTable 3に示した。結果より、開発品のア
ルカリ安定性は良好で、50サイクル使用した後でもその吸着能は、殆ど低下しないことを確認した。

Back Pressure［MPa］

0.4
0.350.3

４．ま と め0.250.2

本検討では、タンパク質などの精製工程、特に0.15Capture工程での使用に有益な、高い吸着能を有し、0.1且つ高流速下でも使用可能な充填剤を開発することが0.05できた。本開発品の吸着能は、当社既存品である

00500

10001500Toyopearl SPタイプと比較しても格段にその性能が改Linear Velocity［cm/h］

Fig.５

良されており、又他社品と比較しても、圧力損失が小Pressure-flow properties for cation exchange resins.
Column size ; 22 mm I.D. × 20 cm. Mobile phase ;distilled water. Temp.;25°. △ : Toyopearl Giga Cap
S650M. ○ : Toyopearl SP650M. □ : SP Sepharose XL

さく、より高流速下での使用が可能であるという優れた特徴を有している事が確認できた。
本開発品を用いることによりタンパク質の精製速度が著しく速くなり、生産性が格段に向上することが期

くし、流速を下げることが必要となるが、生産性の低待できる。

下に繋がる。従って、生産規模の精製では、充填剤の物理的強度は重要な性能の一つとなっている。充填剤の物理的強度は、Fig.５に示すように、充填剤をカラムに充填した後、溶離液を流し、カラムの圧力損失を参考文献
１）Gail Sofer, Handbook of Process Chromatography，測定することで評価した。開発品は既存品、他社品と比較して高流速下でも圧力損失が小さく、大型カラム

10−55（1997）
２ ） Arne Staby， Jan H. Jacobsen， Journal ofchromatography A, 1118,168（2006）

での使用も可能である。

３）Kuniyo Inouye，Iori Ueno， Biochem .,131,97［6］ アルカリ耐性（2002）

タンパク質の精製に使用された充填カラムは、非特４）（財）国際医学情報センター機関紙、22(4)、27,

異的に吸着し溶出してこないタンパク質を完全に脱着させるためや、カラムの殺菌のため、通常NaOHによ（2002）
５）Kiessling Matthias, Mack Margot., Analyticalる定置洗浄操作（CIP操作）が実施され、再使用される

５）。この時、NaOHに対する安定性の低い充填（ 62 ）Sciences, 7, 199（1991）