（ 1 ）235

日本食品保蔵科学会誌
４
２

VOL．

会
長
編集委員長
編集委員

６

NO．

!井 陸雄
太田 英明
稲熊 隆博
古庄
律

副

会

長

井上 茂孝
松田 茂樹

太田

英明

今堀 義洋
宮本 敬久

小宮山美弘

早坂

薫

恩田

竹永

章生

匠

＜研究ノート＞（英文）コメ，トウモロコシ，コムギ，サツマイモおよびジャガイモデンプン粒表層タンパク質の抽出と同定 ……………………………………………………（２３７）／塩野弘二・辻井良政・野口智弘
佐藤広顕・髙野克己
紀州鯖なれずしの網羅的および単離法による微生物菌叢の解析 …………………………………………（２４３）／中川智行・川瀬貴斗・早川享志＜技術報告＞
遺伝子発現に基づくホウレンソウの鮮度評価法の開発 ……………………………………………………（２４７）／永田雅靖・平賀智子・竹田尚子＜文献抄録＞ ……………………………………………………………………………………………………（２５５）＜本会記事＞ ……………………………………………………………………………………………………（２
５６）

236

（ 2 ）

Food Preservation Science

CONTENTS OF VOL．
４
２ NO．
６（２
０
１
６）
＜Research Note＞（English）

Extraction and Identification of Rice, Maize, Wheat,
Sweet Potato and Potato Starch Granule Surface Protein
SHIONO Kouji, TSUJII Yoshimasa, NOGUCHI Tomohiro,
SATO Hiroaki and TAKANO Katsumi ………………………………………………………………（２３７）
Analysis of Bacterial Biota Determined Using MiSeq
Sequencing and Culture-based Investigations in Kishu saba-narezushi（mackerel narezushi）
NAKAGAWA Tomoyuki, KAWASE Takato and HAYAKAWA Takashi ……………………（２４３）<Technical Report＞（Japanese）
A Gene Expression Method for Evaluating Freshness of Spinach（Spinacia oleracea L.）Leaves
NAGATA Masayasu, HIRAGA Tomoko and TAKEDA Naoko …………………………………（２４７）（ 3 ）

Food Preservation Science

VOL．
４
２ NO．
６ ２
０
１
６ 〔Research Note〕

237

Extraction and Identification of Rice, Maize, Wheat,
Sweet Potato and Potato Starch Granule Surface Protein
SHIONO Kouji＊１, TSUJII Yoshimasa＊１§, NOGUCHI Tomohiro＊２,
SATO Hiroaki＊３ and TAKANO Katsumi＊１＊１ Department of Applied Biology and Chemistry, Faculty of Applied Bioscience, Tokyo University of Agriculture,1−1−1 Sakuragaoka, Setagaya-ku, Tokyo 156−8502＊２ Food Processing Center, Faculty of Applied Bioscience, Tokyo University of Agriculture,1−1−1 Sakuragaoka, Setagaya-ku, Tokyo 156−8502＊３ Department of Food and Cosmetic Science, Faculty of Bio-industry, Tokyo University of Agriculture,
196 Yasaka, Abashiri-city, Hokkaido 099−2493

Starches are a major commercial food source, and different starches have distinct properties that
result in part from their associated proteins. We examined the starch surface proteins（SSPs）of rice,maize, and wheat, sweet potatoes and potatoes. We identified a strong correlation between the color（b＊）of various starches stained with Coomassie Brilliant Blue（CBB）and their protein content（r =０９.６５）. Protein was extracted from various starches using ０１. % sodium hydroxide. The percentage ofthe decreased protein using this procedure differed depending on the source : Rice, maize, wheat,sweet potato, and potato yielded ７
１６
. ,２
９８
. ,２
１６
. ,６
００
. , and ４
００. % of their SSP, respectively. The SSPs
were separated to １
９ protein bands by gel electrophoresis, and we successfully identified １６ of the １
９proteins. A granule-bound starch synthase or precursor was identified from each starch. The wheat
SSPs included an alpha - amylase inhibitor. The potato SSPs included aspartic proteinase inhibitor
homologue and cysteine protease inhibitor ７. Furthermore, several storage proteins were identified
among the SSPs, including glutelin and prolamin from rice, gamma zein from maize, globulin from
wheat, and sporamin from sweet potato. Since storage proteins are commonly hydrophobic, we suggestthat these proteins affect the pasting characteristics of various starches.
（Received Aug. １８, ２０
１６；Accepted Sep. ２１, ２
０
１
６）
Key words：starch granule, starch granule surface protein LC/MS/MS
デンプン粒，デンプン粒表層タンパク質

Starches are a major commercial food source.

capacity, and gel formation） and the granule as a

Starch granules are synthesized and stored withinwhole１２），１３）.

amyloplasts, and differ depending on their plant of

Wheat

origin.

For

example,granuleboundproteins . Soft wheat possesses more starch surface
protein（SSP）than hard wheat, and this protein isplants１）〜３）. These factors affect the pasting properties

associated with a softer endosperm texture１５）. In

andaddition, Nierle et al . reported that removal of

the

raw

starchsize,

starchamyloseof

granulecontains

content, and crystallinity of starch differs between
digestion

thestarch１４）byamylase ;４）

however, the relationship is not well understood .

wheatStarch granules contain amylose and amylopectin,

dodecyl sulfate （ SDS ） increased viscosity１３）. This

starchSSPs

bytreatment

withsodiumalong with small quantities of other components

result led the authors to suggest that SSP mightsuch as proteins, lipids, and minerals５）〜８）. Cereal

affect the properties of the wheat starch granules.

starches are approximately ０〜０.２５ % protein, andHowever, it has since been suggested that SDS

up to １０
. % lipid, while root and tuber starches（e.g.

might interact with amylose and amylopectin, andfrom sweet potato and potato ） are

０〜０.０
５%

that these interactions might explain the effects ofprotein and ００. ５〜０１. % lipid１），９）〜１１）. Even though the

SDS on the properties of starch１６）. Accordingly, theprotein and lipid quantities are minor, they affecteffects that SSPs have on the properties of a given

bothstarch are completely unknown. Therefore, it isthepasting

properties （viscosity,

swelling§ Corresponding author, E-mail：96tsujii@nodai.ac.jp

238

Food Preservation Science VOL．
４
２ NO．
６ ２
０
１
６

important to understand the relationship between
SSPs and the properties of commercially important

３．Measurement of protein content in starch
The protein content was determined by based on
nitrogenstarches.

（ 4 ）

and

carboncontent

using

CN

coder

We previously elucidated the relationship between（Yanaco Technical Science Co., Japan）. The amounts

SSP and raw maize starch digestion by alpha-of nitrogen from ５００! （dry weight） of the ０.１ %１７）amylase .

We

discovered

interactedwithalpha-amylase

maize

SSPs

NaOH treated and control starches were measured,affectedtheand the amount of protein in each was calculated

digestion of the starch ; we also proposed that SSPs

using the appropriate conversion factor （rice, ５.９
５;

that
and

１
７）

affect the starch granule characteristics . To date,maize, sweet potato, and potato, ６２. ５; wheat, ５７. ０）.

there have been relatively few studies examining

４．Staining the starch surface

SSPs. In this study, in order to better understandCoomassie Brilliant Blue （CBB） staining solution

the relationship between SSPs and starch properties,

was prepared by mixing ０２. ５ %（w/v） Coomassie

we extracted the SSPs from rice, maize, wheat,

Brilliant Blue R-２
５０（WAKO Co., Japan） dye, ５０%sweet potatoes, and potatoes using a ０１
. % sodium（v/v）methanol（Kanto Chemical Co., Japan）and １０hydroxidethe% acetic acid （ Kanto Chemical Co. , Japan ）. The

composition of the SSPs from these starches using

CBB staining solution （１!） was added to ０.１ %liquid chromatography coupled with quadrupole time

NaOH treated and control starch samples （１００!

-of-flight mass spectrometry（Q-TOF）（LC-MS/MS）.

dry weight）, and the mixtures were incubated forsolution.

We

then

determined

３
０ min at room temperature. The solutions wereMaterials and Methods

centrifuged at １
６０
,００× g for １ min at ４℃, and the

１．Materials

resulting supernatants were discarded. Subsequently,

Rice starch was purchased from Sigma-Aldrich Co.
（ Japan ）, andmaize,

wheat,

andsweet

potato１! of destaining solution（５０ %（v/v）methanol, １０% （v/v） acetic acid ） was added to each of the

starches were purchased from WAKO Co. （Japan）.

precipitates,

Potato starch was purchased from Nacalai Tesquemixing. The centrifugation process was repeated asCo.（Japan）.

described, and the precipitates were again obtained.

２．Preparation of starch surface protein（SSP）

The

Starch surface protein solutions were preparedfromvariousstarches

followingthemethods
１
８）

and

they

centrifugation

were

and

resuspended

resuspension

with

cycle

was

repeated five times before the pellets were finallyresuspended in １! of water. The color of each

described by SHUJUN et al . with minor modifications .

resulting

Various starches（１０g, dry weight） were added tospectrophotometer（Konica Minolta Co., Japan）, and１
５０! of pure water, and the mixtures were left at

the b* values were determined for each slurry.

room temperature for ２
０ min. The supernatants

５． Sodium

were discarded after a ５ min centrifugation （９,０００slurrywasdodecylanalyzed

sulfate

using

a

CM-５

polyacrylamidegelelectrophoresis（SDS-PAGE）

× g） at ２
０℃, and the above steps were repeated.

The extracted SSPs were dissolved in １０ mM

The precipitates were then resuspended in ０.１ %MES buffer （pH ６.０）, and the supernatants were

NaOH solutions（１００!）by stirring at ４℃ for １
２ h.

collected after a centrifugation at １
６,０
００× ｇ for １

The

min atsupernatants

werecollected

after

another

４℃. Laemmli sample buffer was added toThe

the supernatant SSP solution, and the SSPs weresupernatants were then each separately dialyzed

resolved by SDS-PAGE in a ５〜２
０ % polyacrylamide

against pure water using Spectra / Por ３ Dialysis

gradient gel （ATTO Co., Japan） according to theMembrane Standard Grade RC Tubing （ molecular

Laemmli method１９）. The gels were then stained withweight cut-off ３５,００ Da）. The resulting SSP solutions

CBB staining solution, and subsequently destained

wereusing destaining solution.

５ min centrifugation （９,０００× g ） at ２
０℃ .

freezedried.

The

precipitates

from

the

centrifugation were washed using pure water until

６．Statistical analysis

they reached pH ７. These washed starches wereAnalysis of variance was conducted using Statcel

then freeze dried. Control starch samples weresoftware （ OMS Publishing Inc. , Saitama, Japan ）.

prepared

using

the

same

procedure,

with

the

Data

exception that

they

were

resuspended

in

pure

（ ANOVA ）, and if the means were significantly

water rather than ０１. % NaOH before centrifugation.

different（p ＜００. ５）, they were then compared using

were

subjected

toanalysisofvariance（ 5 ）〔Research Note〕 Identification of Various SSPs

Fisher’s

protected

leastsignificant

difference（ PLSD ） test. Pearson’s correlation coefficient wasalso calculated２０）.
７．Protein identification by LC-MS/MS
The protein bands separated by SDS-PAGE weredigested in - gel with trypsin. The gel fragments

Table １ Relationship the b＊ value and the amount ofprotein remaining on starch granules after ０１. %sodium hydroxide（NaOH）treatment
Results are the means calculated from three experimental
replicates. Data marked with the same superscript letter
within a column are not significantly different based on the
results of Fisher’s PLSD test（p＜００. ５）.

were excised from the gel, and were then decoloredwith a solution of ３
０ % （v/v） acetonitrile and ２
５mM ammonium hydrogen carbonate. The fragments
were then reduced
dithiothreitol

with

a

and ２
５ mM

solution

of １
０ mM

ammoniumhydrogencarbonate, and alkylated with a solution of ５
５ mM
iodoacetamide

and ２５ mM

ammoniumhydrogencarbonate. The treated gels were then digested
with trypsin（Promega Co., Japan）.

239

Amount of protein（mg per g starch）
Samplesb＊ value

Control

０１. ％ NaOH
treatedControl

０１. ％ NaOH
treated

Rice
Maize

０６
. ７a
０５
. ７b

０１
. ９f
０４
. ０g

−３
７１
. a
−３
０３
. b

−３
２１
. f
−２
８５
. g

Wheat
Sweet potato

０３
. ７c
０１
. ５d

０２
. ９h
００
. ６i

−２
２１
. c
−１
６７
. d

−１
８０
. a
−１
２５
. h

potato

０１
. ０e

００
. ６i

−５７
. e

−３５
. i

All of the mass spectrometry experiments were
performed

onanAgilent ６５,３０

Accurate-Masssignificantly decreased by treatment with

０.１ %Quadrupole Time-of-Flight （ Q-TOF ） LC / MS / MS

sodium hydroxide（Table 1）. The amount of protein

coupledhigh-removed during sodium hydroxide treatment waspressure liquid chromatography system （ Agilent

toancalculated for each starch type as a percentage ofTechnologies, Santa Clara, CA, USA）. The analytical

the total protein in the starch, based on the protein

columnC１
８content of the appropriate untreated control. Ricecolumn with a １.０ ㎜ internal diameter and ３!

starch had the highest protein loss （７１.６ ％ ）,was

Agilent １２,６
０ Infinity

a １
０
０㎜

lengthLC

InertSustain

particle size （GL Sciences Co., Japan）. The mobile

followed by sweet potato（６００. ％）, potato（４
００
. ％）,

phase was ０１. % formic acid （WAKO Co., Japan）

maize（２９８. ％）, and lastly wheat（２１６. ％）. Overall,withacetonitrile （ Kanto

the amount of SSP that dissolved in ０１. % sodium

Chemical Co., Japan）. The injection volume was ５０.

varyingamountsofhydroxide differed depending on the starch source.

µ#. Peptide separation was carried out at ７０ µ#/

These results suggest that maize and wheat SSPs

min with a mobile phase linear gradient of ２〜９０ %may be more hydrophobic and therefore less soluble

acetonitrile for ３
０ min, followed by ９
０ % acetonitrilein the sodium hydroxide solution. Additionally, thefor ５ min. The mass spectra were compared to theb* values were also highly correlated with thesubset in the NCBInr database using an in - houseprotein content, with the exception of rice starch.

MASCOT search engine.

Thiscontent

andb*valueswas

expected,

and

the

small

amount of rice SSP that remained after sodium

Results and Discussion
１． Protein

correlationhydroxide treatment may explain the difference inofvariousstarches

the degree of CBB staining.
２．Identification of individual SSPs

The protein content（" protein per g of starch）

The SSPs were separated and visualized by SDS-

and color（b*）of ０１. % sodium hydroxide treated

PAGE（Fig. 1）. Several proteins migrating at distinct

starches and untreated starches were analyzed, andmolecular weights were evident from each SSP

the results are shown in Table 1. In untreatedsample. We analyzed １
９ bands by MS（numbered １-

starch, the protein content was highest for rice,１
９ in Fig. 1）, and successfully identified １
６ proteins

followed by maize, wheat, sweet potato, and lastly（ Table ２）. A granule - bound starch synthase orpotato. These results are similar to the findings ofprecursor thereof was present in each SSP sample.

１）
，
９）
〜１
１）

previous reports. The b* values were highlyAnalpha - amylase

inhibitor

was

also

identified

correlated with the protein content（r = ０９
.６５）, andamong the wheat SSPs. Both aspartic proteinase

this result suggests that the b* value of CBB-stained

inhibitor homologue and cysteine protease inhibitor

starch is an accurate indicator of starch protein

７ were identified among the potato SSPs（Table ２）.

content.

Furthermore, we identified several storage proteins

The protein content of various starches was

including glutelin and prolamin from rice, gamma

240

Food Preservation Science VOL．
４
２ NO．
６ ２
０
１
６

R

（kDa）Mw

SP

W

M

suggest that the hydrophobicity of storage proteinsP

likely affects the pasting properties of the starch

250

granules. In addition, some of the potato surface

150
100
75

protein that matches on the database was not （１
５,
5

37

8

6

analysis of these protein.

11

15
16

12

17

13

18
19

9

2

15
10

１
７ and １
９ bands : Fig.１）. It will be necessary to

14

1

50

25
20

（ 6 ）

We examined rice, maize, wheat, sweet potato,
and potato starch surface proteins. The protein
contents of their starch granules were different, and

3
4

7

10

there was a strong correlation between b* values incolorimetric analysis following Coomassie staining
and protein content. Treatment with ０１. % sodium

Fig．
１ Analysis of SSPs by SDS-PAGE

hydroxide

The SSPs from rice （R）, maize （M）, wheat （W）, sweet
０ %potato （SP）, and potato （P ） were resolved on a ５―２
gradient polyacrylamide gel and visualized with coomassie
brilliant blue dye. Molecular weight markers were loaded forreference（Mw）, and their sizes are indicated along the leftedge of the gel（Mass）. Numbers indicate individual protein
bands that were excised for further analysis.

decreased

theproteincontent,

andaccordingly b* value, for each of the starch types.
However,theamountofproteinextracted

bysodium hydroxide was different for each starch type,
and we hypothesize that this difference reflects thevariation in hydrophobicity among the SSPs of eachstarch.

Further,

weidentified

proteins

includingstarch synthases and storage proteins among thezein（glutelin-２）from maize, globulin ３ from wheat,

SSPs. Storage proteins are commonly hydrophobic,

and sporamin A from sweet potato. Collectively,

which may explain why SSP content affects thethese results indicate that SSPs are primarily madepasting properties of starch granules.

up of storage proteins. HAMAKER et al . reported that
REFERENCES

adding dithiothreitol to reduce disulfide bonds in２
１）

rice powder slurry decreased the viscosity , and

１）SWINKELS, J. J. M. : Composition and properties

DERYCKE et al . showed that SSPs covering starchof commercial native starchess, Starch/Stärke, ３
７, １〜

２
２）

granules interfered with water absorption .

We

５（１
９
８
５）

Table ２ Identification of various SSPs with LC/MS/MS
Individual protein bands identified following SDS-PAGE were excised and digested with trypsin before analysis. The proteins
were identified by comparing their resulting mass spectra to NCBInr database using a MASCOT search engine.

Samples
Rice

Maize

Wheat

Sweet
potatoPotato＊Identified protein

Data baseaccession number

MatchedpeptidesMASCOTscore

granule-bound starch synthase［Oryza sativa japonica Group］
glutelin［Oryza sativa japonica Group］
glutelin［Oryza sativa japonica Group］
prolamin［Oryza sativa japonica Group］
granule-bound starch synthase precursor［Zea mays］
gamma zein［Zea mays］
legumin １［Zea mays］
granule-bound starch synthase precursor［Triticum aestivum］
globulin 3［Triticum aestivum］
alpha-amylase inhibitor［Triticum aestivum］
granule-bound starch synthase precursor［Ipomoea batatas］
sporamin A［Ipomoea batatas］
sporamin A precursor［Ipomoea batatas］
granule-bound starch synthase isoform X2［Solanum tuberosum］
aspartic proteinase inhibitor homologue［Solanum tuberosum］
cysteine protease inhibitor ７［Solanum tuberosum］

gi｜７
７
９
８
５
５
１
gi｜１
１
９
３
９
５
１
８
８
gi｜２
２
５
７
１
０
gi｜１
８
４
２
１
７
６
gi｜３
３
３
２
１
０
４
７
gi｜１
６
８
６
９
５
gi｜１
６
３
０
５
１
４
４
gi｜４
７
６
０
５
８
２
gi｜２
１
５
３
９
８
４
７
０
gi｜１
２
３
９
６
３
gi｜２
９
１
４
６
１
６
０
８
gi｜２
１
５
３
９
８
４
７
０
gi｜１
６
８
２
７
８
gi｜５
６
５
３
５
３
７
０
４
gi｜９
７
５
２
３
５
gi｜２
０
１
３
７
６
８
４

９
９
７
３
７
９
２
０
１
７
３
１
６
１
３
３
７
３
２
８
５
２
１
６
２
０
２
５
４

１
５
４
６
３
２
８
４
３
５
６
４
２
０
５
６
７
１
１
０
５
８
８
５
２
４
３
４
３
２
７
５
８
６
３
５
２
８

Band＊
１:
２:
３:
４:
５:
６:
７:
８:
９:
１
０:
１
１:
１
２:
１
３:
１
４:
１
６:
１
８:

１
５, １７ and １９ bands were no significant hits.

（ 7 ）〔Research Note〕 Identification of Various SSPs

２）NODA,

T. ,TAKAHARA,Y.

and

NAGATA,

T. :

241

１
５）SULAIMAN, B. D. and MORRISON, W. R. : Proteins

Factors Relating to Digestibility of Raw Starch byassociatedAmylase, Denpun Kagaku, ４
０（３）
,２
７
１〜２
７
６（１
９
９
３）

granules purified by centrifuging through caesium３）CELIA, M. L., FRANCO, SAO JOSE dO RIO PRETO

with

the

surfaceof

wheat

starchchloride, J. Cereal Sci., １
２, ５
３〜６
１（１
９
９
０）

and CESAR, F. CIACCO. : Factors that Affect the１６）DEBET, M. R. and GIDLEY, M. J. : Three classes

Enzymatic Degradation of Natural Starch Granules.

of starch granule swelling : Influence of surface

Effect of the Size of the Granules, Starch/Särke, ４４proteins and lipids, Carbohydrate Polymers, ６
４, ４
５
２〜

（１
１）
,４
２
２〜４
２
６（１
９
９
２）

４
６
５（２
０
０
６）

４）XIANGLI, K., PING, Z., ZHONGQUAN, S. and JINSONG,
B. : Physicochemical properties of starches from

１７）NOGUCHI, T., KANEKO, M., OKA, D. and TAKANO,
K. :Confirmation of the Presence of Amylase -diverse rice cultivarsvarying in apparent amylose

binding Protein on Maize Starch Granules andcontent and gelatinisation temperature combinations.

Characterization of the Enzyme, Food Preser. Sci.,
３
８（２）
,６
７〜７
１（２
０
１
２）

Food Chemistry, １
７
２, ４
３
３〜４
４
０（２
０
１
５）
５）DAVID,

R. L. :

Current

concepts

ofstarch１８）WANG, S., LUO, H., ZHANG, J., HE, Z. and WANG,

structure and its impact on properties, J. Jap. Soc.

S. : Alkali-induced Changes in Functional properties

Starch Sci., ３
３（１）
,８
０〜８
８（１
９
８
６）

and in Vitro Digestibility of Wheat Starch : The

６）ZOBEL,H.

F. :Molecules

togranules :A

comprehensive review, Starch/Stärke, ４０（２）,４４〜５０Role of Surface Proteins and Lipids, J. Agric Food
Chem., ６
２, ３
６
３
６〜３
６
４
３（２
０
１
４）
１
９）LAEMMLI, U. K. : Cleavage of structural proteins

（１
９
８
８）
７）IMBERTY, A., BULÉON, A., TRAN, V. and PÉREz, S. :Recent advances in knowledge of starch structure,
Starch/Stärke, ４
３（１
０）
,３
７
５〜３
８
４（１
９
９
１）
８）RING, S. G. :during the assembly of the head of bacteriophage
T４, Nature, ２
２
７, ６
８
０〜６
８
５（１
９
７
０）
２
０）YANAI, H. : ４-steps Excel statistics. OMS publishing

Stiff tests for designer starches,

Chem. Brit., ４, ３
０
３〜３
０
７（１
９
９
５）

Inc., Saitama, pp.１５
１〜１
７
５（１
９
９
８）
２
１）HAMAKER, B. R. and GRIFFIN, V. K. : Effect of９）SEGUCHI, M. : Oil-binding capacity of prime starch

disulfide bond-containing protein on rice starchfrom chlorinated wheat flour, Cereal Chem., ６
１, ２
４
１

gelatinisation and pasting. Cereal Chem., ７０（４）,３
７
７

〜２
４
４（１
９
８
４）

〜３
８
０（１
９
９
３）

１
０）SKERRITT, J. H., FREND, A. J. ROBSON, L. G. and

２２）DERYCKE, V., VERAVERBEKE, W. S., VANDEPUTTE, G.

GREENWELL, P. : Immunological homologies between

E., DE, MAN, W., HOSENEY, R. C. and DELCOUR, J.

wheat

A. : Impact of proteins on pasting and cooking

glutenandstarchgranuleproteins,

J.

Cereal Sci., １
２, １
２
３〜１
２
６（１
９
９
０）

properties

１１）SUURS, L. and RAEDTS, P. : Isolation of proteinsofnonparboiled

andparboiledrice,

Cereal Chem., ８
２, ４
６
８〜４
７
４（２
０
０
５）

from potato-starch granules using a composite gelon the model ２３０A micropreparative electrophoresis
system,in

Biosystems

Reporter １
８,

Applied

Biosystems, Warrington, UK pp. ６〜７（１９９３）

コメ，トウモロコシ，コムギ，サツマイモおよびジャガイモデンプン粒表層タンパク質の抽出と同定
塩野弘二＊１・辻井良政＊１・野口智弘＊２

１２）SEGUCHI, M. and YAMADA, Y. : Study of proteinsextracted

from

the

surfaceofwheat

佐藤広顕＊３・!野克己＊１

starchgranules with sodium dodecyl sulfate, Cereal Chem.,

＊１

６
６, １
９
３〜１
９
６（１
９
８
６）
１
３）NIERLE, W. El BAYÄ, A. W., KERSTING, H. J. and東京農業大学応用生物科学部

生物応用化学科

（〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１）＊２

東京農業大学応用生物科学部食品加工技術センター

MEYER, D. : Lipids and rheological properties of

（〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１）

starch. Part II. The effect of granule surface＊３material on viscosity of wheat starch, Starch/Stärke,東京農業大学生物産業学部食品香粧学科

（〒０
９
９―２
４
９
３ 北海道網走市八坂１
９
６）

４
２（１
２）
,４
７
１〜４
７
５（１
９
９
０）
１
４）LOWRY, G. D. A., SARGEANT, J. G. and SCHOFIELD,

デンプン粒は，起源によって粒子径，形状，アミロー

D. : Wheat starch granule protein : The isolation

ス含量およびデンプン分解酵素の作用性が異なることでand characterisation of a salt - extractable protein

性状の違いがある。さらにデンプン粒の性状にデンプンfrom starch granules, J. Sci. Food Agric., ３
２, ３
７
１〜

粒表層のタンパク質（SSP）の関与が推察されており，

３
７
７（１
９
８
１）

SSPを減少させたデンプンは糊化特性に変化が生じるこ242

Food Preservation Science VOL．
４
２ NO．
６ ２
０
１
６

とが報告されている。しかし，SSPを構成するタンパク（ 8 ）らデンプン合成酵素が同定されたほか，コムギSSPから質に関する研究例は少ない。そこで私たちは，コメ，トはαアミラーゼインヒビター，ジャガイモからはアスパ

ウモロコシ，コムギ，サツマイモおよびジャガイモのSSP

ラギン酸およびシステインプロテアーゼインヒビターとを同定することを試みた。デンプン粒のタンパク質含量

いった酵素阻害剤が同定された。また，コメからはグルは起源によって異なり，その値はデンプン粒のクマシー

テリンおよびプロラミン，トウモロコシからはゼイン，＊

ブリリアントブルー（CCB）による染色度（b 値）とコムギからはグロブリン，サツマイモからはスポラミン

高い相関がみられた。０．
１％水酸化ナトリウムによるデといった貯蔵タンパク質が同定された。一般的に貯蔵タ

ンプン粒中のタンパク質の減少率はデンプンの起源によ

ンパク質は疎水性の高いタンパク質であり，これら貯蔵って異なり，コメ，サツマイモ，ジャガイモ，トウモロ

タンパク質が各起源のデンプン粒の性状に影響を与えて

コシ，コムギの順で高かった。SDS-PAGEにより，各起いる可能性が示唆された。

源のSSPが１９のタンパク質バンドに分離され，そのうち１
６のタンパク質を同定した。その結果，各起源のSSPか

（平成２
８年８月１
８日受付，平成２
８年９月２
１日受理）

（ 9 ）

Food Preservation Science

VOL．
４
２ NO．
６ ２
０
１
６ 〔Research Note〕

243

Analysis of Bacterial Biota Determined Using MiSeq
Sequencing and Culture-based Investigations
in Kishu saba-narezushi（mackerel narezushi）
NAKAGAWA Tomoyuki＊§, KAWASE Takato＊and HAYAKAWA Takashi＊＊ Faculty of Applied Biological Science, Gifu University, Yanagido, 1−1, Gifu

501−1193

The microbiota of Kishu saba-narezushi （mackerel, Scomber japonicus ）, which is manufactured in the
Hidaka region of Wakayama Prefecture, Japan, was analyzed using MiSeq sequencing and culturebased investigations. The dominant microbiota in Kishu saba-narezushi was Lactobacillales （９８％）, and all
isolated strains were identified as Lactobacillus plantarum. From these findings, we concluded that
Lactobacillales including Lb. plantarum is the major component of microbiota in late stage forfermentation of Kishu saba-narezushi.
（Received Jul. ２５, ２０
１６；Accepted Oct. ２
７, ２
０
１
６）
Key words：Kishu saba-narezushi, the Hidaka region of Wakayama Prefecture, bacterial biota,
lactic acid bacteria, Lactobacillus plantarum
紀州鯖なれずし，和歌山県日高地方，微生物菌叢，乳酸菌，Lactobacillus plantarum

Narezushi is a fermented food made from salted fish,people’s homes during the autumn season in the

mammal, or bird flesh with a cooked carbohydrate,

Hidaka region of Wakayama Prefecture （ Kishu ）,usually rice, and it is found only in regions of Sout-

Japan. In the case of Kishu saba-narezushi, salted

heast and Northeast Asia１）. In Japan, narezushi is asaba is placed on cooked rice, wrapped up in leaves

traditional local food, and thus several types ofof Arundo donax （Fig. １）, and then placed in layers

narezushi have been developed by the indigenous

in a wooden tub while being weighted down. Kishu

populations using various kinds of local fish, e. g. ,saba-narezushi is fermented from a week to several

２）

samma （ saury, Cololabis saira ） , ayu （ sweetfish,

months under anaerobic conditions. As a result of３）
Plecoglossus altivelis altivelis ）, aji （ horse mackerel,

this process, the flavor of Kishu saba-narezushi is

４）〜７）

Trachurus japonicas ）, saba （ mackerel, Scomber

distinctive compared with that of other narezushi.

８）
〜１
０）
japonicus ）, and other fishes, and these recipes

FUJII et al . reported on the bacterial biota in Kishu

have been handed down to successive generations

saba-narezushi, and its dominant microbial flora wasin each of the regions for many years.
Generally, narezushi is processed by lactic acidfermentation. In this fermentation process, lactic acidbacteria play an important role. Lactic acid bacteria
produce a large amount of lactic acid in various
narezushi, and the pH of the narezushi is kept low
after the fermentation process. Therefore, narezushi
utilizes one of the best preservation methods for
perishable proteinaceous foods, especiallyfishes１１）.

Indeed, bacterial biotas in several types of narezushi
from some regions have been analyzed, and lactic
acid bacteria were the dominant organisms in all ofthese narezushi２）〜９）.
Kishu saba-narezushi

is mainly manufactured in§ Corresponding author, E-mail：t̲nakaga@gifu-u.ac.jp

Fig. １ Image of Kishu saba-narezushi （narezushi made ofmackerel）（A）fish portion （saba ［ mackerel ］）, （ B ） rice portion, and（C）leaves of Arundo donax.

244

Food Preservation Science VOL．
４
２ NO．
６ ２
０
１
６

composed of Lactobacillus （５３％ ） and Streptococcus（ 10 ）

Results and Discussion（３３％）strains９）. However, these strains were identified
only by phenotypic characteristics, and there is no

At first, we performed a general chemical analysis,

detailed data on the microbial population in the Kishu

i.e., the pH and contents of organic acids. The pHsaba-narezushi.

of Kishu saba-narezushi was ３.９
３±０.０
８. FUJII et al .

In this study, we analyzed microbial biota of Kishu

previously reported that the pH of Kishu saba-saba-narezushi in the Hidaka region of Wakayama

narezushi was ３.９５（ fish portion ） and ３.７５（ ricePrefecture, using MiSeq sequencing and conducted９）
portion ）. Additionally, the organic acid contents

culture-based investigations using the １６S rRNA

such as lactic acid and acetic acid in the fish portion

gene sequence.

were ９８. ５±０１. ５ !/g and ０５. １±００. ２ !/g, respectively,
and those contents in the rice portion were ８.７
０±Materials and Methods
１．

０.０
０ !/g and ０.４
８±００. ５ !/g, respectively. Thesesample and contents oforganic acids

findings are similar to the data obtained fromcommercially available samples reported by CHANG

Kishu saba-narezushi, the fermentation and maturation

et al .（lactic acid, １
１４. ±０７. ６ !/g ; and acetic acid,periods of which were ５ days （２０１５, Nov ２
６-３
０）,

１
０）
２０
. ６±０１. ２ !/g）. These results suggest that lactic

was collected from a local manufacturer in theacid fermentation occurred in Kisyu saba-narezushi

Hidaka region of Wakayama Prefecture.

and that the lactic acid contributes a sour taste toContents of organic acids of Kishu saba-narezushi
were analyzed by the method described in theStandard

MethodsofAnalysisinFood

Kisyu saba-narezushi, as it does in other narezushi.
Next, we tried to determine the count of viable

Safetylactic acid bacteria in Kishu saba-narezushi. In Kishu

Regulations . In this study, we used two samples ofsaba-narezushi samples, the maximum viable plate

Kishu saba-narezushi （n ＝２）. Thus data was shown

counts were ３３. ×１
０９±２×１
０８ CFU/g.

１
２）

as average of measured values and absolute error.

We also identified the microbial biota in Kishu

２．Isolation and identification of lactic acid bacteriasaba-narezushi. For our sample of Kishu saba-narezushi,

Samples （１０g ） of

Kishu

were

saba-narezushi

８３９,５
９ sequenceswere

obtainedandanalyzed

emulsified in ９
０! of sterile water and blended forphylogenetically. These clones were classified into

６
０ s （ Stomacher ４０
０ Circulator, Seward, London,

３
３
６ OTUs. However, only two major orders wereUK）
. The sample suspensions were diluted in sterilefound in the bacterial biota of Kishu saba-narezushi :water and appropriate dilutions were spread on

the dominant order was Lactobacillales （９８％） andMRS

theplate （ Lactobacilli

MRS

Agar ;

Becton,

other

was

Bacillales（ Table １）
. The

most

dominant family was found to be Lactobacillaceae

Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ）.
The １
６ S rRNA genes of isolated lactic acid（８５.４％）, followed by Leuconostocaceae （３.７％） andbacteria were amplified from the colonies via the

Streptococcaceae （３.６％ ）（ Table １）. However, thecolony PCR method using the primers ２０F and １
５００genus for most reads belonging to Lactobacillaceae

R１３）.

could not be identified （７８.９％ ）, although these

３．MiSeq sequencing
Fromsamplesofreads did include the genus Pediococcus （４.０％ ）,Kishu

saba-narezushi,weLactobacillus （２.５％）, and Weissella （０.１％）（Table

extracted total DNA using a NucleoSpin Soil kit

１）. From these results, it was suggested that Kishu（Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany）. The

saba-narezushi

V３-V４ variable region of the １６S rRNA gene was

microbiota.

amplified

from

the

total

DNA

using

the １
６S

containsaLactobacillales - dominantFinally, we attempted to identify the dominant

metagenomic sequencing library protocol （ Illumina,

species

１
４）
San Diego, CA ）
. The

were

selected １
２ single colonies from the narezushi using

assembled using fastq-join（ea-utils version １１
. ２
. -５３
７）.

the MRS plate, and the １
６S rRNA sequences of all

The primary processing of sequencing reads andstrains had high homologies with the sequence ofclustering into operational taxonomic units （OTUs）

Lb. plantarum

were accomplished in the context of Quantitative

９
９％）（Fig. ２）. On the other hand, strains of genera

Insights Into Microbial Ecology （ QIIME, version

Leuconostoc, Streptococcus and Pediococcus were not

１
５）

１８
. ０
. ）.

paired-end

reads

isolated

in

from

Kishu

saba-narezushi.

subsp. plantarum

Kishu

We

randomly

NBRC１
５
８
９
１T （ ＞

saba-narezushi,

although １
６S

（ 11 ）

〔Research Note〕 Bacterial Biota of Kishu saba-narezushi

245

Table １ Read statistics of Kishu saba-narezushi
Order（number of reads）
８
２２
,５
９（９
８％）

Lactobacillales

１,６
０
７（１９
. ％）

Bacillales

Family（number of reads）

Genus（number of reads）

Lactobacillaceae

７
１６
,８
８（８
５４
. ％）

not identified
Pediococcus
Lactobacillus
Weissella

７
１６
,８
８（７
８９
. ％）
３,３
９
４（４０
. ％）
２,０
７
２（２５
. ％）
７
９（０１
. ％）

Leuconostocaceae

３,１
０
７（３７
. ％）

not identified
Leuconostoc

２,５
８
２（３１
. ％）
４
４
６（０５
. ％）

Streptococcaceae

３０
.１
５（３６
. ％）

Lactococcus

３,０
０
４（３６
. ％）

Enterococcaceae

６
０
４（０７
. ％）

Enterococcus

６
０
４ （０７
. ％）

Staphylococcaceae

１,６
０
１（１９
. ％）

Staphylococcus

１,６
０
１ （１９
. ％）

Fig. ２ Phylogenic relationships of the isolated strains from Kishu saba-narezushi andseveral related species based on １
６S rRNA gene sequences
The branching pattern was generated by the neighbor-joining method.
The bar indicates ００. ５ nucleotide substitutions per site. The sequence data are cited from
GenBank.

rRNAs from these genera were identified in the

From all findings in this study, we concluded thatsample.

Lactobacillales including Lb. plantarum is the major

These

metagenomic

findings

analysis

support

that

is

a

the

resultof

Lactobacillales -componentofmicrobiota

in

late

stage

for

fermentation of Kishu saba-narezushi. It was reported

dominant microbiota in Kishu saba-narezushi.
In this study, we showed that the dominantthat the dominant microbial flora of Kishu saba-

microbial biota in Kishu saba-narezushi was lactic

narezushi was Lactobacillus （５３％） strains, and theyacid bacteria, Lactobacillales （９８％ ）. Recently, thewere identified as Lb. plantarum, Lb. alimentaria, andmicrobiota of several narezushi have been reported ;Lb. coryniformis via the colony picking method９）. In

insaba-narezushi８） ,Mie-narezushi２） ,ayu-

contrast, MATSUI et al . reported that the most

funazushi１６）

abundant species found in Mie saba-narezushi was Lb.

samples, Lactobacillales was the dominant microbial

８）
curvatus （５１１. ％）. At this time, we are not able tobiota just as it was in Kishu saba-narezushi. Taking

determine the exact cause for the difference inthese reports together, our results indicate thatmicrobial biota between Mie and Kishu saba-narezushi.

bacteria belonging to the Lactobacillales may play

We speculate that one of the causes

important roles in the fermentation of various types

difference is related to the leaves, Arundo donax,

of narezushi.

which are used for wrapping up the salted saba

Mie

３）

narezushi ,Notoaji-narezushi４）〜７）,

and

Mie

Moreover, all strains isolated from Kishu sabanarezushi were identified as Lb. plantarum （Fig. ２）.

for

this

that is placed on the cooked rice. Our next study
will

focus

on

! identifying

theorigin

of

the

246

Food Preservation Science VOL．
４
２ NO．
６ ２
０
１
６

（ 12 ）

microbial biota of Kishu saba-narezushi, ! observing

Gakkaishi Jpn., ５
８, ８
９
１〜８
９
４（１
９
９
２（
）in Japanese）

transitions of microbial biota in Kishu saba-narezushi

１０）CHANG, C. M. , OHSHIMA, T. and KOIZUMI, C. :during its fermentation process, and " refermenting

Changes in free amino-acid, organic-acid, and lipid

the saba-narezushi using isolated Lb. plantarum strains.

compositions of fermented mackerel sushi during
processing, Nippon Suisan Gakkaishi Jpn., ５
８, １
９
６
１〜

Acknowledgements

The authors thank Mrs. Junko

Nakagawa who provided Kishu saba-narezushi samples

１
９
６
９（１
９
９
２（
）in Japanese）
１
１）COOKE, R. D., TWIDDY, D. R. and REILLY, A. P. J. :Lactic fermentation of fish as a low-cost means ofto us.
References
１）ISHIGE, N. : Cultural aspects of fermented fish
products in Asia. In :Lee CH, Steinkraus KH,

Reilly APJ, eds. Fishfermentation

food preservation. In :Lee CH, Steinkraus KH,

Reilly APJ, eds. Fishfermentation

technology.

Tokyo : United Nations University Press ; pp.２
９
１
〜３
０
０（１
９
９
３）

technology.

１２）Ministry of Health, Labour and Welfare. Chapter

Tokyo : United Nations University Press, pp.１
３〜

１３
. lipids. In : Japan Food Hygiene Association, ed.,

３
２（１
９
９
３）

Standard Methods of Analysis in Food Safety
al . :

Regulation. Tokyo : pp.４
２〜６
３（２
０
０
５（
）in Japanese）

Diversity of the bacterial community found in

１３）NAKAGAWA, T., FUJIMOTO, Y., UCHINO, M. et al . :２）MATSUI, H. , TSUTIYA,

R. ,ISOBE,

Y.

etsamma-narezushi （saury narezushi ） revealed by the

Isolation

andcharacterizationofpsychrophiles

１
６S rRNA gene clone library, Biocontrol Sci., １３, ９
７

producing cold - active β-galactosidase, Lett. Appl.

〜１
０
２（２
０
０
８）

Microbiol ., ３
７, １
５
４〜１
５
７（２
０
０
３）

３）MATSUI, H., SAKA, E. , ISOBE, Y. et al . : Comparison

１
４）
PARK, S. H., LEE, S. I. and RICKE, S. C. : Microbialof the bacterial community structures of Ayu-

populations in naked neck chicken ceca raised onnarezushi produced by two different manufacturers,

pasture flock fed with commercial yeast cell wall

Biocontrol Sci., １
５, ６
３〜６
８（２
０
１
０）

prebiotics via an Illumina MiSeq Platform, PLoS４）AN, C., TAKAHASHI, H. and KIMURA, B., et al . :Comparison of PCR-DGGE and PCR-SSCP analysis

One, １
１, e０
１
５
１
９
４
４（２
０
１
６）
１
５）CAPORASO, J. G., KUCZYNSKI, J., STOMBAUGH, J. et al.

for bacterial flora of Japanese traditional fermented:

fish products, aji-narezushi and iwashinukazuke, J.

community sequencing data, Nat. Methods. ７, ３
３
５〜

Sci. Food. Agric., ９
０, １
７
９
６〜１
８
０
１（２
０
１
０）

６（２
０
１
０）

５）KOYANAGI, T. , NAKAGAWA, A. , KIYOHARA, M. etal . :

Pyrosequencing analysis of microbiota

in

QIIME

１
６） ISOBE,

allowsY.,

analysis

MIZUHASHI,

T.

ofhigh - throughput

and

NARITA,M. :Microbial flora of funazushi （pickled crusian carp）,

Kabura-zushi, a traditional medieval sushi in Japan.

Nippon Kasei Gakkaishi Jpn., ５
３, ６
１〜６
４（２
０
０
２）
（ in

Biosci. Biotechnol. Biochem., ７
７, ２
１
２
５〜２
１
３
０（２
０
１
３）

Japanese）

６）KOYANAGI, T., KIYOHARA, M., MATSUI, H. et al . :Pyrosequencing survey of the microbial diversity

紀州鯖なれずしの網羅的およびof ‘ narezushi’, an archetype of modern Japanese

単離法による微生物菌叢の解析

sushi, Lett. Appl. Microbiol ., ５
３, ６
３
５〜６
４
０（２
０
１
１）

中川智行＊・川瀬貴斗＊・早川享志＊

７）KIYOHARA, M., KOYANAGI, T., MATSUI, H. et al . :Changesinfermentation

microbiota
ofnarezushi

populationasduringrevealedby＊岐阜大学応用生物科学部応用生命科学課程（〒501-1193

岐阜県岐阜市柳戸1-1）

pyrosequencing analysis, Biosci. Biotechnol. Biochem.,
７
６, ４
８〜５
２（２
０
１
２）

本研究では，和歌山県日高地方の紀州鯖なれずしの微

８）MATSUI, H. , TSUTIYA, R. , ISOBE, Y. , et al . :生物菌叢について，網羅的および単離法により同定した。

Analysis of bacterial community structure in Saba-

紀州なれずしでは，ラクトバチルス科が９８％を占める支Narezushi （Narezushi of Mackerel） by １
６S rRNA

配的な微生物群であり，単離法にて同定した１
２株すべて

gene clone library, J. Food. Sci. Technol ., ５
０, ７
９
１〜

がLactobacillus plantarumであった。これらのことから，

７
９
６（２
０
１
３）

Lb. plantarumを含むLactobacillusが紀州なれずしの主要

９）FUJII, T., SASAKI, T. and OKUZUMI, M. : Chemicalcomposition and microbial flora of saba-narezushi（ fermented mackerel with rice ）, Nippon Suisan

発酵菌であることが明らかになった。
（平成２
８年７月２
５日受付，平成２
８年１
０月２
７日受理）

（ 13 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
２ NO．
６ ２
０
１
６ 〔技術報告〕247

遺伝子発現に基づくホウレンソウの鮮度評価法の開発
永 田 雅 靖＊１，＊２§・平 賀 智 子＊１，＊３・竹 田 尚 子＊１，＊４＊１ 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構野菜茶業研究所＊２ （現所属）国立研究開発法人農業・食品産業総合研究機構食品研究部門＊３ 退職＊４ 三重県立津高校

A Gene Expression Method for Evaluating Freshness
of Spinach（Spinacia oleracea L.）Leaves
NAGATA Masayasu＊１,＊２§, HIRAGA Tomoko＊１,＊３ and TAKEDA Naoko＊１,＊４＊１＊２

NARO National Research Institute of Vegetables and Tea Science,
360, Kusawa, Ano, Tsu, Mie 514−2392
Present address : NARO Food Research Institute, 2−1−12, Kannondai, Tsukuba, Inaraki＊３ Retired＊４ Tsu High School, 3−1−1, Shinmachi, Tsu, Mie 514−0042

305−8642

To date, the freshness of vegetables is evaluated mostly by appearance. In addition, several qualityrelated compounds are used to estimate the freshness ; however, this approach is challenging because
the initial amount of these compounds is affected by the cultivar or environmental conditions. In thisstudy, we demonstrate a new method to evaluate the freshness of vegetables based on gene
expression. Subtracted cDNA libraries were prepared from spinach（Spinacia oleracea L.）leaves before
and after storage. Nucleotide sequences of these genes were determined. Expression of these genes
was verified by northern blot analyses of RNA samples from leaves with different storage period.
Specific marker genes, suitable for evaluating freshness, were selected. We developed a method ofsemi-quantitative multiplex PCR with combinations of these genes that can visualize the changes infreshness during storage. Using this technique, detection of the physiological changes in spinach waspossible, even before the appearance of leaf yellowing. Application of this method enables the detectionof differences in freshness under different packaging conditions based on gene expression.
（Received Aug. １８, ２０
１６；Accepted Nov. ７, ２
０
１
６）
Key words： freshness evaluation, gene expression, spinach, subtraction, multiplex PCR
鮮度評価，遺伝子発現，ホウレンソウ，サブトラクション，マルチプレックスPCR

消費者は，青果等の農産物を購入する際に鮮度を重要

少が，鮮度低下の指標として用いられることが多い３）。

視している１）。しかし，青果物の鮮度は，その多くが外

この場合，周年供給される野菜などでは，栽培条件によ観による評価であり，色，つや，張りなどが主観的に評って，収穫時の含量が大きく変動することが知られてい価されるため，評価者による違いが生じやすい。また，る。例えば，ホウレンソウのアスコルビン酸は，夏期に冷水等によって外観や物理性を回復させる，いわゆる蘇

は２
０㎎／１
０
０g，冬期には６０㎎／１
００gであり４），栽培環境に生を経たものをどのように評価するのか，鮮度の定義がよって収穫時の濃度が異なっているため，測定された含

定まっていないのが現状である。これまでに，鮮度に関量の絶対値からは，鮮度低下による減少量を知ることは

２）

して，複数の考え方が述べられてきた 。

できない。

鮮度評価のひとつとして，流通・貯蔵に伴うクロロフ

これらの欠点を解決して青果物の鮮度を推定する方法

ィルなどの色素や，アスコルビン酸などの栄養成分の減として，これまで２つの取り組みが知られている。ひと

＊１
＊２
§
＊３

〒５
１
４―２
３
９
２ 三重県津市安濃町草生３
６
０
〒３
０
５―８
６
４
２ 茨城県つくば市観音台２―１―１
２Corresponding author, E-mail：masayasu.nagata@affrc.go.jp
〒５
１
４―０
０
４
２ 三重県津市新町３―１―１

248

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
２ NO．
６ ２
０
１
６

（ 14 ）

つは，中野らによる膜脂質中の過酸化物の割合から鮮度

cDNAを合成した。次にPCR-Select cDNA Subtractionを評価するものである。膜脂質中の過酸化物の割合は，Kit（Clontech Laboratories, Inc.）を用いて，４日間の収穫後の温度，貯蔵期間に伴って増加し，正の相関があ貯蔵で発現が増加する遺伝子のcDNAおよび，４日間の５）ることが示されている 。もうひとつは，筆者らによる貯蔵で発現が減少する遺伝子のcDNAを得た。これらは，遺伝子発現を基礎としたものである６）。青果物は，収穫TA Cloning Kit, Dual Promoter, with pCRII Vector

によって，それまで生育していた栽培環境下から，水，（Invitrogen）を用いてプラスミドに組み込み，常法に光，養分の補給のない収穫後の環境下に移される。そのよりE. coli DH５αを用いてライブラリーを作成して，ため，収穫した青果物では，水ストレスや暗黒ストレス，illustra PlasmidPrep Mini Spin Kit（GEヘ ル ス ケ ア）

切断傷害ストレス等に反応して，鮮度低下に伴う様々なを用いて，各クローンのプラスミドを抽出，精製した６）。

遺伝子が発現し，それらがタンパク質に翻訳されて，酵得られたプラ ス ミ ド 液 は，核 酸 濃 度 を 測 っ た 後，

素活性が変化し，エチレンの生成やアスコルビン酸の減BigDye Terminator V３．
１ Cycle

少など品質成分が変動し，結果的にクロロフィルの分解（Applied Biosystems）のマニュアルに従ってシークエ

を経て黄化などの現象につながるものと考えられる。こンス反応と精製を行い，３７
３
０ DNA Analyzer（Applied

れ ま で 植 物 の 老 化 に 伴 う 遺 伝 子 発 現 の 変 化 は，Biosystems）を用いて塩基配列を取得した。

ArabidopsisやBrassica napus等を用いて，それらの生育

Sequencing

Kit

これらの遺伝子配列を用いてBlast検索を行い，既知ステージの変化に伴う遺伝子の変化が調べられてきの遺伝子とのホモロジーを調べた。

た７），８）。これらの試験に用いられた植物は，根がついた

３．遺伝子発現解析

intactな状態の植物体が，正常な生育に伴う葉の老化に得られたサブトラクションクローンから塩基配列の異つながる現象を調べたものであった。一方，青果物としなる２７個を選んで（表１），貯蔵に伴う遺伝子発現の変て市場に出回っている野菜や果物は，先に述べたように化をノーザンブロットで確認した。これら２７個の遺伝子収穫によって地上部と地下部あるいは果実が植物体からを，DNA Data Bank of Japan（DDBJ）に登録するに切り離されるなどにより，生育中とは異なるストレスにあたり，上記のサブトラクションで得られた候補遺伝子

よって葉の黄化など老化が促進されるが，これまで，収クローンのうち，同一の配列を含むものは統合するとと穫によって人為的に開始される遺伝子発現の変化を実際

もに，DDBJの指導に従って末端のベクター配列の削除の野菜の鮮度評価に用いる観点では詳しく調べられてこ等を行ったため，特許出願時の配列長とは異なったが，なかった。

アノーテーションと類似度については，特許出願時のそこで，収穫後の代謝変化に伴って起こる遺伝子発現

Blast結果を示した。

の変化に基づいた鮮度評価法を開発することを目的に実サンプルは，貯蔵初期の遺伝子 発 現 を 比 較 す る た

験を行った。具体的には，ホウレンソウを材料に，貯蔵

め，１０℃で，０，１，２，３，４日 間PE袋 で 折 り こ み

前後のRNAに由来するcDNAを使ってサブトラクショ

包装し，貯蔵した市販のホウレンソウを用いた。発現のンを行い，発現量が増加あるいは減少する遺伝子を多数

解析にはDIG RNA probe（Roche Diagnostics）を用い特定するとともに，黄化が始まる前の段階でそれらの発た６）。すなわち，１µgのtotal RNAを５．
４％のホルムアル

現量の変化を検出することができた。さらに，マルチプデヒド液（Wako純薬）を含む０．
０２M MOPSバッファー

レックスPCRによって，貯蔵中の遺伝子発現の変化を可（pH６）中で，１．
０％アガロースゲルを用いて電気泳動し視化し，包装による鮮度保持効果を比較することができた 後，バ キ ュ ー ム ブ ロ ッ ト（VacuGene XL Vacuum

たので報告する。

Blotting System，フ ァ ル マ シ ア）でHybond N＋メ ン

材料および方法
１．材

料

ブレン（Amersham Biosciences）に転写した。それぞれ の ク ロ ー ン に 対 応 し たDIGラ ベ ル 化RNAプ ロ ー ブ（Roche Diagnostics）を調製してノーザンハイブリダイ

ホウレンソウは，市販のホウレンソウ４束（２００
９年５ゼ ー シ ョ ン を 行 い，Anti-Digoxigenin AP conjugate

月１１日購入）を用いた。ポリエチレン袋（PE袋，２８０!

（Roche Diagnostics）とCDP Star（Roche Diagnostics）

×３
９
０!×０．
０
３!）に折りこみ包装して１０℃で貯蔵した６）。

の組合せでシグナルの検出を行い，Fuji X-Ray Film

ホウレンソウは，貯蔵０日と，葉の一部にやや黄化が（Fuji Film）に感光させた後，暗室用自動現像機，富士認められる４日に可食部をサンプリングして，分析まで

メディカルフィルムプロセサー FPM１
０
０（富士フィル

−８
０℃で保管した。

ム）を用いて現像した。

２．遺伝子解析

４．マルチプレックスPCRによる検出

貯 蔵０日 と４日 の サ ン プ ル を 材 料 に，RNeasy

ノーザンブロット解析で，遺伝子発現に変化がみられ（Qiagen）を用いてRNAを抽出した。貯蔵０日と４日のた遺伝子の一部を用いて，PCRによって半定量的に検出

試 料 か ら 抽 出 し たtotal RNAは，Super SMART PCRする方法を試みた６）。

cDNA Synthesis Kit（Clontech Laboratories, Inc.）でまず，遺伝子発現が変化する遺伝子の内部配列を増幅

（ 15 ）

〔技術報告〕 遺伝子発現に基づく鮮度評価法

249

表１ ホウレンソウ鮮度判別マーカー候補遺伝子のBlast解析
クローン名 Accession # 配列長
SO̲F１
３
０
SO̲F１
６
７
SO̲F１
７
５
SO̲F１
８
５
SO̲F１
８
８
SO̲F３
０
４
SO̲F３
０
８
SO̲F３
０
９
SO̲F３
２
５
SO̲F３
２
６
SO̲F３
２
７
SO̲F３
３
２
SO̲F３
３
７
SO̲F３
４
７
SO̲F３
７
２
SO̲F３
７
６
SO̲F３
８
２
SO̲F３
９
２
SO̲F４
０
２
SO̲F４
１
０
SO̲F４
２
２
SO̲F４
４
０
SO̲R１
３
７
SO̲R１
４
１
SO̲R１
５
６
SO̲R１
６
３
SO̲R１
６
９
注

LC１
６
４
１
９
２
LC１
５
０
０
４
３
LC１
６
４
１
９
３
LC１
６
４
１
９
４
LC１
５
０
０
４
４
LC１
６
４
１
９
５
LC１
６
４
１
９
６
LC１
６
４
１
９
７
LC１
５
０
０
４
２
LC１
６
４
１
９
８
LC１
６
４
１
９
９
LC１
６
４
２
０
０
LC１
６
４
２
０
１
LC１
６
４
２
０
２
LC１
６
４
２
０
３
LC１
６
４
２
０
４
LC１
６
４
２
０
５
LC１
６
４
２
０
６
LC１
６
４
２
０
７
LC１
６
４
２
０
８
LC１
６
４
２
０
９
LC１
６
４
２
１
０
LC１
６
４
２
１
１
LC１
５
０
０
４
１
LC１
６
４
２
１
２
LC１
６
４
２
１
３
LC１
６
４
２
１
４

４
６
９
９
５
１
５
７
７
８
２
１
３
９
３
７
７
３
４
２
９
７
７
７
１
３
１
７
７
８
７
６
１
８
７
９
９
６
１
３
１
２
３
６
８
１
７
７
４
０
５
５
５
３
６
１
７
７
５
５
８
６
５
７
９
５
５
３
５
０
７
８
０
１
８
０
４
６
６
９
７
４
０

植物種

アノーテーション（酵素・タンパク質等）
germin-like protein
cysteine proteinase-like protein
metallothionein
catalasesalt-induced hydrophilic protein
ATP-binding cassette transporter
phospholipase C
formate dehydrogenase
polygalacturonase precursor
calcium dependent protein kinasesalt-induced AAA-Type ATPase
esterase/lipase/thioesterase family
drought-stressed
２-alkenal reductase
copper ion binding protein
aspartic proteinase
S-adenosyl-L-methionine synthaselactoylglutathione lyase
germin-like protein
wound-induced protein
vacuolar ATPase subunit G
endo-１４, -beta-glucanase
uv excision repair protein
chlorophyll a/b binding proteintranslation elongation factor
stress-associated protein ３
CP１
２

Beta vulgaris
Ipomoea batatas
Amaranthus cruentus
Suaeda maritima
Atriplex nummularia
Ricinus communis
Arabidopsis thaliana
Quercus robur
Ricinus communis
Populus trichocarpa
Mesembryanthemum crystallinum
Arabidopsis thaliana
Populus tremula x Populus alba
Artemisia annua
Ricinus communis
Theobroma cacao
Atriplex nummularia
Ricinus communis
Beta vulgaris
Ricinus communis
Mesembryanthemum crystallinum
Ricinus communis
Ricinus communis
Spinacia oleracea
Arabidopsis thaliana
Solanum lycopersicum
Spinacia oleracea

類似度

２
８
３/３
５
４
（７
９％）
４５
６/６
５
３
（６
９％）
２
１
２/２
６
０
（８
１％）
３
９
５/４
５
１
（８
７％）
１
７
８/２
５
６
（６
９％）
３
６
４/４
９
２
（７
３％）
３
２
６/４
２
９
（７
５％）
５
０
５/６
２
５
（８
０％）
６
０
７/８
７
１
（６
９％）
５
７
９/７
４
０
（７
８％）
５
４
２/６
１
１
（８
８％）
４３
８/６
４
４
（６
８％）
１
１
８/１
３
４
（８
８％）
５
５
８/７
４
３
（７
５％）
４
３
１/６
０
６
（７
１％）
４
９
８/６
６
５
（７
４％）
５１
７/５
５
７
（９
２％）
１
２
４/１
６
６
（７
４％）
５
３
６/６
６
０
（８
１％）
２
６
３/３
６
０
（７
３％）
３
０
８/３
８
１
（８
０％）
４
０
２/５
５
１
（７
２％）
１
３
３/１
６
０
（８
３％）
７
０
１/７
１
７
（９
７％）
２
１
０/２
３
７
（８
８％）
１
３
５/１
７
１
（７
８％）
５
１
６/５
２
１
（９
９％）

各遺伝子の配列長は，Blast検索後，Accession#登録前に同一配列を含む遺伝子の統合と末端のベクター配列削除を行ったため，特許出願時の配列長（文献６）とは異なる。植物種，アノーテーション（酵素・タンパク質等），類似度は出願時のもの。

するプライマーを設計し，貯蔵日数の異なる試料のRNA

表３に示す条件で行った。PCR産物は，２％ Agarose Sに由来するcDNAをテンプレートとしてTaq polymerase（ニッポンジーン）を用いて，１×TBEで電気泳動を行（TaKaRa Ex Taq HS，タカラバイオ株式会社）を用い，EtBrで染色して増幅されたDNAのバンドを検出し

いてPCRを行い，貯蔵に伴う変化として検出可能かどうた。
さらに，開発した方法を用いて，１０℃で７日間異なるか検討した（データ省略）。

貯蔵条件で貯蔵したホウレンソウ（品種さらに，各遺伝子に対応して増幅される断片の長さがソロモン異なる組合せで，それらの増幅が独立して行われるか，（サカタのタネ），野菜茶業研究所安濃圃場にて慣行条件

あるいはそれらのプライマーの最適な混合比等を検討し

で栽培，２
０
１
５年２月１
０日収穫）のサンプルについて，比た。検出に用いた配列を表２に示す。

較試験を行った。貯蔵試験では，ポリエチレン袋（PEPCRは，サーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal

袋，２
８
０!×３
９
０!×０．
０
３!）に直径５!のパンチ穴を８Cycler Dice, TP６００，タカラバイオ株式会社）を用いて，個開けたもの（ポジティブコントロール），PE折りこみ表２ RT-PCRによるホウレンソウ鮮度判別マーカーの検出に用いた遺伝子クローン名および，
プライマー配列と増幅されるフラグメント長
クローン名

センス側塩基配列

アンチセンス側塩基配列

フラグメント長

SO̲R１
４
１
SO̲F３
２
５

TTCTAAgAACCgTgAgCTTgAggTg
CCggAACACgATTTgAAgAATTACAAggTTAgTTgCgAAAgACCAAgCATgAgTgACAgggTCCAgAgAATTTgA

５
０
９
４
０
３

SO̲F１
６
７
SO̲F１
８
８

gATCTAAATCCgTCCCACACTCTCC
TAgTAgACgCggTTCCCgTATTCATACAgAgTTCgACgAAggTTgTgAAg
AACCAAAgCAAACCCAAgCAATAAT

３
０
９
１
７
０

250

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
２ NO．
６ ２
０
１
６
表３ PCR反応液組成およびPCRプログラム（ 16 ）

また，Rシリーズでは，クロロフィルa/b結合タンパク質などが得られた。

PCR反応液０５. µ!
１２. ５ µ!
１０. µ!
３２. ５ µ!

Template
１
０ X bufferdNTP
Mixed primers＊
H２O
Ex Eaq

６４
. µ!
０１
. µ!

Mixed primers＊濃度

混合割合

Blast検索で，既知の遺伝子配列との類似性が低く，No
significant similarity foundとなったものが４８個あったが，これらは今後，鮮度低下にどのように関与しているのかさらなる解析が待たれる。
２．ノーザンブロット解析
上記で得られたクローンの中から，表１に示す２７個のクローンについて，貯蔵に伴う遺伝子発現の変化をノーSO̲R１
４
１ センス側 ２
０µM
SO̲R１
４
１ アンチセンス側 ２
０µM
SO̲F３
２
５ センス側 ５
０µM
SO̲F３
２
５ アンチセンス側 ５
０µM
SO̲F１
６
７ センス側 ２
０µM
SO̲F１
６
７ アンチセンス側 ２
０µM
SO̲F１
８
８ センス側 ２
０µM
SO̲F１
８
８ アンチセンス側 ２
０µM

２
２
８
８
２
２
１
１

ザンブロット分析で調べたこところ，貯蔵に伴って発現が明らかに増加するクローンとして，SO̲１
３
０，SO̲F１
６
７，
SO̲F３
０
４，SO̲F３
０８，SO̲F３
２
５，SO̲F３
３
２，SO̲F３
７
２，
SO̲F４
０
２，SO̲F４
１
０，SO̲R１
３
７が 得 ら れ た（図１）。また，貯蔵に伴って発現が減少するクローンとして，SO̲R１
４
１，SO̲R１
５
６，SO̲F１８５が得られた。一方，SO̲F１
７５やSO̲F１８８のように，発現量変化が少ないクローンも存在した。SO̲Fの系列は貯蔵に伴って発現が増加する遺伝子，RO̲Rの系統は貯蔵に伴って発現が減少する遺伝子を濃縮したライブラリーであるが，一部，逆の発現パ

PCRプログラムターンを示すクローンがあり，ノーザン解析を行って，

９
６℃
９
６℃
６
２℃

２ min
３
０ sec
１ min

発現パターンを確認することによって，逆の発現パター

７
２℃
７
２℃
４℃

１５
. min
７ min
∞

ンを示す遺伝子クローンを排除することができた。
２
５ cycles

貯蔵に伴って遺伝子発現が増加する遺伝子では，システインプロテアーゼ（SO̲F１
６７）やポリガラクチュロナ
貯蔵期間（日）0 1 2 3 4

包装，PE密閉包装して，各７日経過したサンプルおよ

貯蔵期間（日）0 1 2 3 4

SO̲F130

SO̲F372

SO̲F167

SO̲F376

SO̲F175

SO̲F382

SO̲F185

SO̲F392（GelAnalyzer.com）を用いて行った。

SO̲F188

SO̲F402

結果および考察

SO̲F304

SO̲F410SO̲F308

SO̲F422

SO̲F309

SO̲F440

び，貯蔵開始時（０日）のサンプルを，−８０℃で凍結保存し，上記と同様の方法でRNAを抽出後，１µgのRNAからcDNAを合成してPCRのテンプレートとして用いた。
ゲル電気泳動の数値化は，撮影されたゲルのJPEGフ
ァ イ ル を，ゲ ル 解 析 ソ フ トGelAnalyzer ２０１０a

１．サブトラクションにより得られたクローン
ホウレンソウの貯蔵に伴って発現量が変化する遺伝子のライブラリーを用いて，得られたクローンの塩基配列を解析し，発現が増加する候補遺伝子のライブラリー

SO̲F325（Fシリーズ）から１５３個，発現が減少する候補遺伝子のライブラリー（Rシリーズ）から３９個の遺伝子配列が得られた。

SO̲F326

SO̲R137

SO̲F327

SO̲R141

SO̲F332

SO̲R156

SO̲F337

SO̲R163

SO̲F347

SO̲R169

それらのすべてについてBlast検索を行ったところ，
何らかの類似遺伝子がヒットした遺伝子のうち，Fシリーズでは，プロテアーゼをコードしていると考えられる
ものが２７クローン，糖加水分解酵素をコードしているものが６クローン，その他にもアルコールデヒドロゲナー
ゼや，酸化還元酵素，感染特異的タンパク質，キナーゼ，
イオンチャンネルをコードしている遺伝子などがあった。

図１ ホウレンソウ鮮度判別マーカー候補遺伝子のノーザンブロット分析

（ 17 ）

〔技術報告〕 遺伝子発現に基づく鮮度評価法

ーゼ前駆体（SO̲F３２５）などが確認できた。一方，貯蔵（A）に伴って発現が減少する遺伝子では，クロロフィルa/b
これらの結果から，発現が増減するタイミングが異なが可能と考えられた。すなわちこれらの遺伝子を，鮮度判別マーカーとして複数の遺伝子の発現を比較すること

（B）
貯蔵期間
（日）
0 1 2 3 4

結合タンパク質（SO̲R１
４１）などが確認できた。
る遺伝子を組み合わせることによって，鮮度の段階づけ

251

SO̲R141

貯蔵期間（日）
0 1 2 3 4

SO̲F325
SO̲F167

によって，鮮度低下の進み具合をとらえることができるものと考えられた。
また，鮮度の外観評価では，黄化など外観の変化が起きて初めて鮮度低下が認知されるが，今回検討している

SO̲F188
図２ ホウレンソウ鮮度判別マーカー遺伝子のノーザンブロット（A）と半定量的マルチプレックスPCR（B）との対応

方法では，黄化に先だって遺伝子発現量が変化する過程を検出しているため，外観に変化が現れる前に鮮度低下に，窒素のリサイクルに関係するシステインプロテアーの進み具合を段階別に検出しており，黄化してからわかゼ遺伝子や，多糖の分解酵素遺伝子の発現が増加する現るのではなく，早期に黄化の兆候をとらえることができ象がそれぞれ異なるタイミングで起きており，これらをることは，最適貯蔵条件を設定するうえでもメリットが組み合わせることにより，貯蔵開始から葉の黄化が始まあると考えられた。

るまでの外観から判別しにくい時期でも，遺伝子発現を

３．マルチプレックスPCR法

調べることによって，鮮度低下の進み具合を検出できる

複数の遺伝子の発現変化を簡便に検出可能な方法としものと考えられた。

ては，マルチプレックスPCRによる検出が適当と考えら

貯蔵条件による比較では，貯蔵７日で，パンチ穴を開れたため，貯蔵に伴って発現が減少するクロロフィルa/

けたPE袋では，ほとんどの最外葉が黄化した。折り込

b結合タンパク質（SO̲R１
４
１），貯蔵に伴って発現が増みでは一部の最外葉にわずかに黄化がみられ，密閉では加するシステインプロテアーゼ（SO̲F１
６
７）
，ポリガラ

ほとんど黄化がなかった。貯蔵開始時に多く発現していクチュロナーゼ前駆体（SO̲F３
２
５），および貯蔵に伴うたSO̲R１４
１は，コントロールのパンチ穴を開けたPE袋

発現変化が小さい塩誘導疎水性タンパク質（SO̲F１８８）では発現が減少する一方で，SO̲F１
６
７が強く発現し，SOをコントロールとして用いて，それらをひとつのPCR反̲F３
２５が 弱 く 発 現 し た。電 気 泳 動 し た ゲ ル お よ び，

応系で検出可能な方法を検討した。

GelAnalyzer２０１０aによるデンシトメトリー解析の結果

具体的には，ターゲット遺伝子ごとに，異なるPCRフを図３に示す。貯蔵開始時に比べ，PE密閉包装の遺伝

ラグメントが増幅されるように，プライマーを設計した子発現変化がいちばん少なく，次いでPE折りこみ包装（表２）。これらのプライマーセットごとに設計どおりのの順であった。このことは，PE密閉包装が比較的強いフラグメントが半定量的に増幅されるか確認した後，各Modified atmosphere（MA）状態になり，次いでPE折組を混合してPCR反応をしても交差反応が起きないこと

りこみ包装が弱いMA状態，パンチ穴を開けたPEでは，を確認した（データ省略）。さらに，各遺伝子の発現を空気と同じガス組成のためMAによる鮮度保持効果はな

検出する場合に，最大の発現量が大きく異ならないよういものと考えられた９），１０）。SO̲R１
４
１は，クロロフィルa/に，各プライマーセットを，表３に示す割合で混合し，b結合タンパク質をコードしていることから，外観にお同じく表３に示す条件でPCRを行った。貯蔵したホウレ

ける緑色保持を反映しているものと考えられた。また，

ンソウを用いて，各遺伝子の発現を比較した結果を図２

SO̲F１
６７は，システインプロテアーゼをコードしているに示す。

ことから，植物の老化に伴うアミノ酸のリサイクルに関クロロフィルa/b結合タンパク質をコードしているSO与していると考えられ，SO̲F３
２
５はポリガラクチュロナ

̲R１
４
１は，ノーザンブロット分析と同様に，半定量的PCRーゼ前駆体をコードしていることから，細胞壁多糖の分でも貯蔵に伴って発現が減少した。一方，システインプ

解に関与しているものと推察される。

ロテアーゼをコードしているSO̲F１
６７は，貯蔵１日目か

ノーザン解析には，比較的多量のRNAが必要で，検ら発現がみられたのに対し，ポリガラクチュロナーゼ前出するまでの実験手順が煩雑で時間がかかるうえに，

駆体をコードしているSO̲F３
２５は，貯蔵２日目から発現

個々の遺伝子についてそれぞれ個別に検出する必要があが増加した。また，塩誘導疎水性タンパク質SO̲F１
８
８は， った。それに対して半定量的PCRでは，必要なRNA量
貯蔵に伴って発現量の変化が少なく，PCR反応の確認のが少なく，分析の操作が簡単で，さらにマルチプレックために使用できるものと考えられた。

ス化することによって，一度に複数の遺伝子の発現につこれらの結果は，貯蔵中のホウレンソウでは，鮮度が低下して外観に黄化の変化が現れるまでに，クロロフィ
ル結合タンパク質遺伝子の発現が徐々に低下するとともいて比較的短い時間で可視化することができるメリットが考えられた。
以上のように，ここでは４つの遺伝子の組合せによっ252

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
２ NO．
６ ２
０
１
６

（A）

M

0

A

B

C

（ 18 ）

詳しいデータを集積する必要がある。

M

1k bp

要

500 bpSO̲R141
SO̲F325
SO̲F167
SO̲F188約

これまで，野菜の鮮度は外観によって評価されることが多かった。さらに，品質にかかわる様々な成分が鮮度の推定に使われたが，品種や栽培条件によって初期の含量が大きく異なるために，含量だけで鮮度を推定することは困難であった。今回の試験で，私たちは，遺伝子発現を利用して野菜の鮮度を評価する新しい方法を検討した。ホウレンソウを用いて，収穫前後のサブトラクショ

相対的シグナル強度

（B）

4,000
3,000
2,000
1,000
0
4,000
3,000
2,000
1,000
0
4,000
3,000
2,000
1,000
0
4,000
3,000
2,000
1,000
0

ンcDNAライブラリーを調製し，貯蔵の前後で発現が変SO̲R141化する遺伝子の塩基配列を調べた。異なる貯蔵日数のサンプルから抽出したRNAを用いてノーザンブロット分
析で遺伝子発現を確認して，鮮度評価に適したマーカー

0
SO̲F325

A

B

Cとなる複数の遺伝子を選定した。これらの遺伝子を組み合わせて，半定量的マルチプレックスPCRを行うことによって，貯蔵に伴う鮮度の変化を可視化する方法を開発

0
SO̲F167A

BCした。この方法を用いることによって，外観上は葉の黄化が始まる前の段階で，ホウレンソウの中で収穫後の変化に関連する遺伝子の変化を検出が可能であった。さらに，この方法を用いて，包装貯蔵条件の異なるサンプル

0
SO̲F188

A

B

Cにおける鮮度低下の程度の違いを，遺伝子発現を基礎として検出することができた。
文

0

A

B

C

図３ 包装条件の異なるホウレンソウ試料を７日間１０℃で貯
蔵 し た 場 合 の 鮮 度 判 別 マ ー カ ー 遺 伝 子 の 発 現（A）とGelAnalyzer２０１０aを用いたデンシトメトリー解析結果（B）
０：貯蔵開始，A：パンチ穴のあるポリエチレン（PE）包装，
B : PE折りこみ包装，C : PE密閉包装，M：マーカー

献１）岐阜県農産物流通課・農産園芸課・保健医療課：農産物購入・食生活に関するアンケート調査結果，１〜
１
１（２
０
１
５）
（http : //www.pref.gifu.lg.jp/kensei/kohokocho/iken-teian/１
１１０３/monitor-anketo.data/２
０
１
５̲０
５
―１̲nousanbutu.pdf）（参照２
０
１
６―４―１
８）
２）椎名武夫：食品の鮮度とは何か―生鮮品―，食品鮮度・食べ頃事典（サイエンスフォーラム，東京）
，pp．
２
３

て，貯蔵開始から，わずかな黄化がみられるまでの段階を検出することができたが，今後は別の遺伝子クローン

〜３
７（２
０
０
２）
３）日坂弘行・小倉長雄：貯蔵中のホウレンソウ部位別の組合せにより，さらに精密なステップで鮮度低下の進のアスコルビン酸含量の変化，日食工誌，３
８，４
１〜４
３

み具合を検討できるものと推察される。

（１
９
９
１）

今後，これらの遺伝子発現の情報は，植物の代謝にお４）文部科学省：野菜類，日本食品標準成分表（http :ける役割や制御関係を考慮することによって，より鮮度//www.mext.go.jp/a̲menu/syokuhinseibun/１
３
６
５
２
９
７.

低下の少ない貯蔵条件の設定にも用いることが可能と考えられる。さらに，発現マーカーである鮮度判別マーカーの情報をもとに，鮮度低下の主要因となる遺伝子が特定できれば，従来の育種や遺伝子組換えの手法１１）を利用

htm）
（参照２
０
１
６―４―１
８）
５）中野浩平：青果物の鮮度評価方法，特許第５
３
２
６
１
６
６
号，２
０
１
３．
８．
２（２
０
１
３）
６）永田雅靖：青果物の鮮度評価方法および鮮度評価用

して，飛躍的に鮮度保持性に優れた青果物の品種育成に

プ ラ イ マ ー セ ッ ト，特 許 第５
６
５
２
７
７
８号，２
０
１
４．
１
１．
２
８

つながる可能性もある。今後の研究の広がりにも期待し

（２
０
１
４）

たい。

７）BUCHANAN-WOLLASTON, V. : The molecular biology

今回，遺伝子発現の変化を検出，可視化することを報of leaf senescence, J. Exp. Botany, ４
８, １
８
１〜１
９
９

告したが，将来的にはこのような鮮度低下に伴って起こ

（１
９
９
７）

る変化を非破壊的に検出できれば，流通の現場やスーパ

８）GEPSTEIN, S., SABEHI, G., CARP, M. J., HAJOUJ, T.,ーの店頭でも利用される可能性がある。そのための基礎

NESHER, M. F. , YARIV, I. , DOR, C. , BASSANI, M. :としても，遺伝子発現による鮮度評価について，さらにLarge-scale

identification

of

leaf

senescence -（ 19 ）

〔技術報告〕 遺伝子発現に基づく鮮度評価法

associated genes. Plant J ., ３
６, ６
２
９〜６
４
２（２
０
０
３）
９）WATADA, A. E., KIM, S. D., KIM K. S. and HARRIS,

253

Food Sci. Technol ., ４
３, ３
８
１〜３
９
２（２
０
１
０）
１
１）日本学術会議編：植物における新育種技術（NPBTT. C. : Quality of green beans, bell peppers and: New Plant Breeding Techniques）の 現 状 と 課 題，

spinach stored in polyethylene bags. J. Food Sci.,（http : //www.scj.go.jp/ja/info/kohyo/pdf/kohyo-２
２

５
２, １
６
３
７〜１
６
４
１（１
９
８
７）

−h１
４
０
８
２
６.pdf）
（参照２
０
１
６―４―１
８）

１
０）SANDHYA :Modified atmosphere packaging of

fresh produce : Current status and needs. LWT-

（平成２
８年８月１
８日受付，平成２８年１１月７日受理）