非天然型立体構造抗体検出技術の開発
遠大小藤江林

正秀

諭＊ 1
剛＊ 1
峰＊ 1

Development of an Assay System for Detection of Non-native Immunoglobulin GUtilizing the Artificial Peptide
Satoshi ENDO
Seigo OE
Hidetaka KOBAYASHI

Therapeutic immunoglobulin G (IgG) is unstable under various stresses in the manufacturing process, deliveryand storage. When it is exposed to such stress factors, it becomes non-native IgG. If the molecules are present in thetherapeutic IgG productions, they tend to associate with each other and form aggregates. Because such aggregates
not only decrease the pharmacological effect but also become a potential risk for immunogenicity, therapeutic IgG
should contain as small amount of them as possible and rapid analysis of aggregation is required for quality control.
We have developed a novel ELISA system for detection of non-native IgG using AF.2A1 peptide. AF.2A1 is a25-residue artificial peptide which binds specifically to non-native IgG. We also established the same assay systemusing automated assay equipment. This assay is performed in a short period of time. Our results show that AF.2A1
ELISA can detect only non-native IgG generated under acid, heat and freeze/thaw conditions but not native IgG.
Because AF.2A1 recognizes the non-native structure in the fragment crystallizable region (Fc region) of IgG,
this assay can be used to evaluate the various types of IgG. We also found that AF.2A1 ELISA is available for thedetection of much lower amount of aggregates and non-native IgG that could not be detected by previous analyticalmethod. In addition, this technique is effective in monitoring of the early stages of the IgG aggregation process.
These results indicate that AF.2A1 ELISA can be useful for various types of applications such as screening for highperformance cell, process analytical technology, process monitoring and quality control of therapeutic IgG.

1．緒

医薬品よりも安定性が低く、製造、運搬や保管時に様々言なストレス（酸・アルカリ、凍結融解、加熱、撹拌など）

近年のバイオテクノロジー技術の進展に伴い、抗体を受けて抗体分子同士が会合し、凝集体を形成するこ

医薬品を中心とするバイオ医薬品の売り上げが増加しとが知られている 2）。凝集体形成のメカニズムとして、ている。2016 年度におけるブロックバスター上位 10

コロイド安定性の低下により抗体分子同士が会合する品目のうち抗体医薬品が 7 品目を占め、今後も抗体医場合や、ストレスにより部分的に抗体の立体構造が崩

1）

薬品の売り上げの拡大が続くと予想されている 。

壊した非天然型立体構造抗体が核となり、抗体分子と抗体医薬品は従来の低分子医薬品と比較して効果が会合して凝集体が生成する場合があると考えられてい高く、副作用が少ないことを特長とするが、分子量約る 3）。抗体凝集体は医薬としての薬効を低下させるの15 万の免疫グロブリンを主成分とするため、低分子みならず、免疫原性などの副作用の発生が懸念されて＊1

ライフサイエンス研究所

生物機能工学グループ

いることから 4）、抗体医薬品への凝集体の混入は可能な限り少ないことが望ましく、抗体医薬品の品質評価
29

TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）において、迅速に測定可能な凝集体の分析技術が必要2．実とされている。
現行の凝集体分析技術として、サイズ排除クロマト

験［1］ストレス処理抗体の調製グラフィー法（SEC）やフィールド・フロー・フラクショ

非天然型立体構造抗体を含む抗体サンプルは、抗体ネーション法（FFF）、動的光散乱法（DSL）、超遠心溶液を次の a）から e）のストレス処理方法により調分離法（AUC）、ナノ粒子トラッキング解析（NTA）、製した。

共振式質量測定法（RMM）、マイクロフローイメージング（MFI）などの多様な分析法がある 5）。これらのa）酸・アルカリ処理抗体の調製分析法は、抗体分子がすでに会合凝集した二量体以上モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の凝集分子を検出する手法であり、抗体分子の凝集体を、酸性緩衝液（0.1 M グリシン－塩酸緩衝液 pHの核となる非天然型立体構造抗体を検出する手法は未2.0 ～ 3.5）により 0.5 mg ／ mL に調整後、37℃で 16確立であった。

時間静置した。酸処理した抗体溶液に適当量の 1 M

そこで我々は、産業総合技術研究所の本田らが開トリス－塩酸緩衝液（pH 8.0）を添加して中和し、6）発した 25 個のアミノ酸から成るペプチド AF.2A1 の酸処理抗体サンプルとした。また、同様の抗体をア応用を試みた。AF.2A1 は物理的、化学的ストレスにルカリ性緩衝液（0.1 M リン酸緩衝液 pH 8.0）によより発生した非天然型立体構造抗体の定常（Fc）領り 0.5 mg ／ mL に調整後、酸処理抗体と同条件で処域に特異的に結合するペプチドである（Fig. １）。表理し、アルカリ処理抗体サンプルとした。

面プラズモン共鳴法（SPR）による結合性解析から、

b）加熱処理抗体の調製

AF.2A1 はストレスを受けていない天然型立体構造抗抗 体 を PBS（Phosphate buffer saline）（pH 7.4）体には結合しないのに対し、酸や加熱などのストレスにより 0.5 mg ／ mL に調整後、恒温槽で 50℃またはにより発生した非天然型立体構造抗体に対して特異的55℃にて静置し、加熱処理抗体サンプルとした。

6）に結合する性質を持つことが明らかとなっている 。

c）凍結融解処理抗体の調製

本稿では AF.2A1 を利用し、抗体凝集体だけではなく、抗体を PBS（pH 7.4）により 0.5 mg ／ mL に調整後、その形成の核となると考えられている非天然型立体構－ 30℃フリーザーまたは液体窒素中で完全に凍結し造抗体を検出する特徴を有する、現行の分析技術とはた。続いて凍結した抗体溶液を室温（25℃）に静置異なる新規な非天然型立体構造抗体検出システムの開して完全に融解した。この凍結融解処理を 10 回繰

発および全自動測定装置での検出に成功したので報告

り返し、凍結融解処理抗体サンプルとした。

する。

d）撹拌処理抗体の調製抗体を PBS（pH 7.4）により 0.5 mg ／ mL に調整後、Aggregates
Native IgG

Non-native IgG
Stressloses native
tertiary structure
No binding

Binding

AF.2A125-residue artificial peptide
Binds specifically to the Fc region of
non-native IgG but not to native IgG

The atomic coordinates and structure factors (code 2RT4)
have been deposited in the Protein Data Bank (http://wwpdb.org/).

Fig.１

30

Mechanism of IgG aggregation and AF.2A1 binding to non-native IgG

東ソー研究・技術報告第 62 巻（2018）

マグネチックスターラーを用いて 25℃で 16 時間撹

体サンプルを用いて希釈系列を作製し、自動測定装置拌し、撹拌処理抗体サンプルとした。

により測定した。測定条件として、サンプル結合反応e）振とう処理抗体の調製（20 分）と二次抗体結合反応（20 分）の 2 段階反応を抗体を PBS（pH 7.4）により 0.5 mg ／ mL に調整後、行うプログラムを用いた。二次抗体としてアルカリ恒温振とう機により 500 rpm、25℃で 16 時間振とフォスファターゼ標識された抗体を使用し、酵素反応うし、振とう処理抗体サンプルとした。

により基質が発するシグナルを測定した。
また、既存技術との比較として、同じ抗体サンプル［2］ELISA法による非天然型立体構造抗体検出系の構築を TSKgel® G3000SWXL（東ソー製）を用いたサイズ排ELISA（Enzyme − Linked Immuno Sorbent Assay）

除クロマトグラフィー（SEC）法により測定し、非天法 は、 サ ン ド イ ッ チ 法 に よ り 構 築 し た（Fig. ２）。

然型立体構造抗体と凝集体の検出範囲および検出限界

AF.2A1 固定化プレートは、固相合成法により合成しを比較した。

た AF.2A1 をグルタルアルデヒドによりウェルに固定化した後、ブロッキングを施し作製した。

［4］各種ストレス処理抗体を用いた評価

測定は、濃度を調整した抗体サンプルをウェルに添ヒトモノクローナル抗体に対して酸、アルカリ、加加し、サンプル中の非天然型立体構造抗体を AF.2A1

熱、凍結融解、撹拌および振とうによるストレス処理に結合させた。続いて結合した非天然型立体構造抗を施した抗体サンプルを用いて、ELISA 法により非天体に対してアルカリフォスファターゼ標識抗ヒト IgG然型立体構造抗体量を測定した。比較として同じ抗体

Fab フラグメント抗体、およびアルカリフォスファサンプルを用いて、静的光散乱（SLS）測定を行った。

ターゼ基質を用いて検出した。
［5］凝集体形成過程に対する検証
凝集体形成の核となる非天然型立体構造抗体を測定［3］磁性ビーズを用いた自動測定装置による検出系のすることで、将来の抗体の凝集発生予測が可能である構築
前述［2］で構築した非天然型立体構造抗体の ELISAかを検証するため、ELISA 法と凝集粒子を測定する検出系を、当社が開発したエンザイムイムノアッセコールターカウンター法（Beckman coulter 製）とのイ（EIA） 法 に よ る 自 動 測 定 装 置 に 適 用 す る た め、比較試験を行った。加熱処理（55℃）および未処理（4℃）

AF.2A1 を固定化した磁性ビーズを作製した。AF.2A1のヒトモノクローナル抗体サンプルを用いて、加熱処固定化磁性ビーズを測定に必要な試薬と混合した後、理開始から 4 時間後、1 日後、3 日後、7 日後、15 日

凍結乾燥処理を施し、試薬カップを調製した。

後に採取し、非天然型立体構造抗体および凝集体（3酸処理前後の CHO 細胞由来ヒトモノクローナル抗µm 以上の粒子数）を検出、測定した。
AF.2A1 peptide

Glutaraldehyde

Bottom of the plate

Activation of
the solid phase

Immobilizationof AF.2A1 peptide

Substrate

EnzymeNon-native IgG

Blocking

Fig.２

Binding of
non-native IgG

Coloring
Anti-IgG(Fab)antibody

Detection of
non-native IgG

Preparation of AF.2A1 immobilized plate and detection of non-native IgG

31TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）［6］抗体医薬品分野への検討

は、いずれも沈殿形成や白濁、あるいは着色すること（1）ヒトモノクローナル抗体の評価はなく、目視で観察できる凝集体は生成しなかった。

加熱ストレス処理におけるモノクローナル抗体の安定性を評価した。0.5 mg ／ mL に調整した 3 種類の市販ヒトモノクローナル抗体（mAb_A, B, C, いずれもサ［2］ELISA 法による非天然型立体構造抗体検出系の性能検証

ブクラス 1）に加熱処理（50℃）を施し、処理開始か

AF.2A1 固定化プレートを用いた ELISA 法の結果から 5 時間後、24 時間後、120 時間後に ELISA 法で測ら、添加した抗体濃度とシグナルの関係を Fig. ３に示定した。それぞれの抗体サンプルのシグナル変化からす。酸処理を施した抗体は 0.001 〜 10 µg ／ mL の範囲

非天然型立体構造抗体が発生する様子を観察することにおいて、抗体濃度依存的にシグナルが変化した。一で、熱に対する構造安定性を比較した。

方、酸処理しなかった抗体は、濃度によらずシグナルは低い値のまま一定であった。このことから、ELISA法により酸処理抗体に含まれる非天然型立体構造抗体（2）ヒト免疫グロブリン G（IgG）サブクラスの測定ヒト免疫グロブリン G（IgG）のサブクラス 1, 2, 3を特異的に検出できることを確認した。

および 4 に対して ELISA 法による測定が可能であるかを検証した。酸処理および未処理の IgG の各サブクラスをサンプルとし、希釈系列を作製し ELISA 法で測定した。対照として AF.2A1 を固定化していないウェルで並行測定した。

［3］自動測定装置による非天然型立体構造抗体検出系の性能検証
酸処理前後の抗体サンプルを、AF.2A1 を固定化した磁性ビーズを用いて自動測定装置により測定した（Fig. ４）
。未処理抗体は抗体濃度によらずシグナルが（3）アフィニティクロマトグラフィーによる精製抗体低い値であったのに対し、酸処理抗体は抗体濃度依存的にシグナルが変化した。自動測定装置を用いた場合の安定性評価
抗体産生 CHO 細胞培養液をプロテイン A 担体の充も ELISA プレートによる検出系と同様に、酸ストレ塡カラムに通過させ、抗体を吸着させた。吸着させたスにより発生した非天然型立体構造抗体を特異的に検抗体に対して、それぞれ pH の異なるリン酸緩衝液、出可能であることを確認した。

クエン酸緩衝液、グリシン－塩酸緩衝液、酢酸緩衝液

また、未処理抗体に一定の割合で凝集体を混合したを用いて溶出させ、中和処理を行った。各溶出液の抗サンプルを、自動測定装置および SEC 法により測定

体濃度を 0.1 mg ／ mL に調整し、溶出液中に含まれるした（Fig. ５）。SEC 法の結果では、サンプルに含ま非天然型立体構造抗体を ELISA 法により測定した。

れる凝集体量が 1 ～ 1000 µg ／ mL の範囲において二量体以上の凝集体ピークが判別可能であり、検出限界は 1 µg ／ mL であった。一方、自動測定装置による結3．結果と考察

果では、凝集体量が 0.001 ～ 1 µg ／ mL の範囲において凝集体濃度とシグナルの相関が見られ、検出限界は［1］抗体サンプルの各種ストレス処理
ヒトモノクローナル抗体とポリクローナル抗体溶液0.001 µg ／ mL 以下であった。このことから、AF.2A1に対して、酸、アルカリ、加熱、凍結融解、撹拌およ

固定化磁性ビーズを用いた自動化装置による測定でび振とうによるストレス処理を施した抗体サンプル

は、SEC 法の約 1000 倍の感度で凝集体および非天然

2OD 595 nm

Acid-stressed

0.2
Without stress

0.020.0001

Fig.３

320.001

0.10.01
IgG conc (µg/mL)

110

AF.2A1 ELISA of IgG with and without stress treatment

東ソー研究・技術報告第 62 巻（2018）250
Acid-stressed

Intensity

200150100

Without stress50010040.8
0.16 0.032 0.0064
IgG conc (µg/mL)

0EIA of IgG with and without acid treatment using automated equipment

1000100000

Automatedassay system(EIA)

10010000
1000

10SEC(HPLC)

110010Peak area / HPLC

Fig.４

Intensity / EIA

2010.10.00001 0.0001 0.001 0.01
0.1110100 1000 10000
Non-native IgG / Aggregates conc (µg/mL)

Fig.５

Detection of non-native IgG and aggregates (EIA vs SEC)

ではシグナルが増大したが、SLS 法では変性中点温度型立体構造抗体を検出可能であることが示された。に変化がなかった。従って、SLS 法で測定できなかった微量の非天然型立体構造抗体を ELISA 法により検［4］各種ストレス処理抗体を用いた評価測定の結果（Fig. ６）から、ELISA 法では pH 4 以出できることが示された。

下のストレスを与えた場合、pH 5 以上の場合より高いシグナルを示し、また SLS 法においても pH 5 以上

［5］凝集体形成過程に対する検証の場合より変性中点温度の低下が認められ、ELISA 法

ヒトモノクローナル抗体を加熱処理（55℃）およびと SLS 法による結果に相関が見られた。一方、凍結未処理（4℃）条件下で静置したときの、非天然型立融解や 50℃の熱ストレスを加えた場合は、ELISA 法

体構造抗体および凝集体量（3 µm 以上の粒子数）の55

pH 7.470
pH 8pH 7 pH 6

pH 5SLS / Tm (℃)

SLS / Tm (℃)

6050
pH 4454000.51AF.2A1 ELISA / OD 595 nmFig.６

1.537℃

65Shaking

25 ℃ 4℃
Stirring

6055050℃
FreezeThaw(slow)

FreezeThaw(fast)

0.2
0.4
0.6
0.8
AF.2A1 ELISA / OD 595 nm

1Correlation between AF.2A1 ELISA and static light scattering

33

TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）

経時変化を、AF.2A1 を用いた ELISA 法およびコールグナルであった。mAb_C は、未処理抗体と比べてやターカウンター法により測定した（Fig. ７）。ELISAや高いシグナルを示したが、処理時間の経過によるシ法では、処理開始 1 日目から加熱処理抗体で高いシググナルの変化は見られなかった。一方、mAb_A は加ナルとなり、非天然型立体構造抗体を検出した。一方、熱処理開始 5 時間後の時点で未処理抗体よりも高いシコールターカウンター法では、処理開始 3 日目まではグナルを示し、処理時間経過に伴い増大した。このこほぼ凝集体が検出されなかったが、7 日目以降、加熱とから、mAb_A は mAb_B と mAb_C に比べて熱に対処理抗体で凝集体が急激に増大した。また、未処理抗して構造が不安定であり、非天然型立体構造抗体が発体を ELISA 法、コールターカウンター法で測定した生しやすいことが示された。ELISA 法により、特定の場合、いずれの場合もシグナルが増加せず、非天然型ストレス条件下における抗体の構造安定性を比較評価立体構造抗体および凝集体は検出されなかった。以上できると考えられた。の結果、ELISA 法では、加熱処理後短時間で非天然型立体構造抗体が検出され、その後コールターカウン（2）ヒト免疫グロブリン G（IgG）サブクラスの測定

ター法で凝集体が検出されたことから、凝集体の核と酸処理を施したヒト IgG サブクラス 1, 2, 3 および 4なる非天然型立体構造抗体を検出することで、抗体凝の AF.2A1 を用いた ELISA 法の結果を Fig. ９に示す。

集体形成の早期予測が可能であると考えられた。

AF.2A1 を固定していないプレートでは抗体濃度によらずシグナルは低い値のまま変化しなかった。一方、［6］抗体医薬品分野への検討

AF.2A1 固定化プレートではいずれのサブクラスも抗（1）ヒトモノクローナル抗体の評価

体濃度依存的にシグナルが変化し、非天然型立体構加熱処理（50℃）および未処理（4℃）条件下で 3造抗体を検出できることが示された。同様に未処理の種類のヒトモノクローナル抗体（mAb_A, B, C）を静IgG サブクラスについても測定したが、抗体濃度によ置し、継時的に AF.2A1 を用いた ELISA 法で評価した

らずシグナルはほぼ一定であり非天然型立体構造抗体（Fig. ８）。mAb_B は、5 時 間 後 か ら 120 時 間 後 ま では検出されなかった（Data not shown）。サブクラス

シグナルの変化が見られず、未処理抗体と同程度のシの種類によりシグナル変化に違いが見られたが、それ

Coulter counter
Heat-stressed

AF.2A1 ELISA
Heat-stressed

1800000

0.8600000

0.6400000

0.4200000

0.20AF.2A1 ELISA
Without stress

4 hr

Fig.７

1 day

3 days7 daysCoulter counter
Without stress□ Without stress (4℃）
■ Heat-stressed (50℃)

mAb̲A

1015 days

Correlation between AF.2A1 ELISA and Coulter counter

1.2

OD 595 nm

1000000
Particle number; >3 µm/Coulter counter [line]

OD 595 nm / ELISA [bar]1.20.80.6mAb̲BmAb̲C0.40.205 hr

24 hr 120 hr

Fig.８345 hr

24 hr 120 hr

5 hr

24 hr 120 hr

Heat-stability of several types of monoclonal IgG

東ソー研究・技術報告

ぞれのサブクラスの酸ストレス条件下における非天然第 62 巻（2018）

有用であると考えられた。

型立体構造抗体の発生しやすさが異なること、あるいは AF.2A1 との結合性が異なることが影響していると推察された。

4．まとめ
凝集体形成の要因となる非天然型立体構造抗体に（3）アフィニティクロマトグラフィーによる精製抗体特異的に結合するペプチド AF.2A1 を利用した抗体医薬品分析用の ELISA 法を開発した。AF.2A1 を用いたの安定性評価
抗 体 溶 出 時 に 用 い た 緩 衝 液 の pH や 種 類 に よ り

ELISA 法により、酸や加熱などのストレス処理を施しELISA 法 の シ グ ナ ル 強 度 差 が あ り、 精 製 抗 体 溶 液た抗体に含まれる非天然型立体構造抗体を特異的に検の非天然立体構造抗体の含有比率が異なっていた出可能であることを確認した。SEC 法または SLS 法（Fig.10）。pH 3.5 の溶出液を用いた場合、グリシン－との比較により、開発した ELISA 法が既存の凝集体塩酸緩衝液と酢酸緩衝液に比べてリン酸緩衝液とクエ検出技術、抗体安定性評価技術と相関があり、さらにン酸緩衝液を用いた方が非天然型立体構造抗体の発生既存分析技術では検出限界以下の凝集体やその核とな量が少なかった。このことから、pH 3.5 で抗体を溶る非天然型立体構造抗体を高感度に検出できる点にお出する場合、ストレスが最も抑えられる緩衝液はリンいて優位であることを確認した。また、コールターカ酸緩衝液またはクエン酸緩衝液である可能性が示されウンター法との比較試験の結果から、ELISA 法によりた。抗体の凝集抑制を目的とした最適な緩衝液選択の凝集体形成前の立体構造変化を検出することで、凝集ための判断指標として、AF.2A1 を用いた ELISA 法が体形成の早期段階をモニタリングでき、凝集予測に有(b) IgG 2(a) IgG 12AF.2A1 (+)
OD 595 nm

OD 595 nm

20.2
AF.2A1 (-)
0.02
0.01
0.1
110100Acid-stressed IgG conc (µg/mL)

0.2
AF.2A1 (-)
0.02
0.010.1
110100Acid-stressed IgG conc (µg/mL)(c) IgG 3(d) IgG 42AF.2A1 (-)

0.02
0.01
0.1
110100Acid-stressed IgG conc (µg/mL)

Fig.９

10.90.80.70.60.50.4
0.30.2
0.10Fig.10

OD 595 nm

AF.2A1 (+)

0.2

OD 595 nm

OD 595 nm

2AF.2A1 (+)

AF.2A1 (+)
0.2
AF.2A1 (-)
0.02
0.01
0.1
110100Acid-stressed IgG conc (µg/mL)

Detection of human IgG subclass

Phosphate
CitrateGly-HClAcetate

pH 2.5pH 3.0pH 3.5IgG stability in elution buffer of affinity chromatography

35TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）

用であることを示した。
AF.2A1 を用いた ELISA 法により、抗体医薬品の創薬研究や製造プロセス開発における分析、製剤化へ向けた条件検討、製品の品質管理といった様々な場面へ

3a）Roberts, CJ., Trends in Biotech ., 32（7）, 372 − 380（2014）3b）Roberts, CJ., Current Opinion in Biotech ., 30, 211 −217（2014）の適用が可能である。創薬研究では、多数の候補抗体4a）Rosenberg, AS., AAPS J ., 8（3）, E501-E507（2006）の中から高安定性抗体を選抜する、あるいは目的の抗4b）Singh, SK., J. Pharm. Sci ., 100（2）, 354 − 387（2011）

体を最も安定した状態で産生できる細胞をスクリーニ5a）Mahler, HC, Friess, W, Grauschopf, U. & Kiese, S.,

ングするなどの利用法が考えられる。また、製造プロ

J. Pharm. Sci ., 98（9）, 2909 − 2934（2009）

セス開発では構造安定性が高い抗体を得られるような5b）Arakawa, T., Philo, JS., Ejima, D., Tsumoto, K. &培養パラメータや精製プロセスの最適化に、製剤化にArisaka, F., Bio Process International , 4（10）, 42 −おいては抗体濃度や保存溶液の種類などの条件最適化

43（2006）のために利用可能である。さらに、製造プロセスの工5c）Arakawa, T., Philo, JS., Ejima, D., Tsumoto, K. &程管理や製剤の品質管理において凝集体形成リスクをArisaka, F., Bio Process International （2007）評価するためにも利用できる。

5c）Arakawa, T., Philo, JS., Ejima, D., Tsumoto, K. &Arisaka, F., Bio Process International （2007）

5．謝

辞

本研究の一部は、経済産業省の「平成 25 年度産業技術実用化開発事業費補助金（個別化医療に向けた次世代医薬品創出基盤技術開発（国際基準に適合した次世代抗体医薬等製造技術））」及び平成 26 年度産業技術実用化開発事業費補助金（次世代医療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業（国際基準に適合した次世代抗体医薬等製造技術））」、及び国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）の「次世代医療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業」の支援によって行われた。
また、本技術の開発にあたり、多数のご助言、ご協力を頂きました木津奈都子研究員および国立研究開発法人産業技術総合研究所バイオメディカル研究部門の本田真也氏、渡邊秀樹氏、千賀由佳子氏、宮房孝光氏に大変感謝いたします。

6．参考文献1a）Volkin, D., Hershenson, S., Ho, R., Uchiyama, S.,
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