技術レポート
残留農薬分析業務における分析法の検討 2（マンジプロパミド試験法の導入のための妥当性検証）
安本明弘１, 加藤直樹１,中村圭介１, 鈴木徹也２, 山田篤司２
葛原茂広３, 臼井裕一３
厚生労働省のマンジプロパミド試験法（農産物）について導入可能か,各試験所においてシングルラボラトリーバリデーションを行い,妥当性が確認されたことから導入できると考えられた.
言

2．試料および添加濃度

マンジプロパミドは平成 21 年 6 月に国内登録さ緒

試料は,「平成 24 年度

国内産農産物における農れたマンデル酸アミド系の殺菌剤で,ばれいしょ,薬の使用状況及び残留状況調査」による農薬使用履

トマトの疫病や大豆,ぶどう,はくさいなどのべと歴データより,マンジプロパミドの使用頻度の高い病に効果がある.

農産物であるほうれんそう,はくさいおよびトマト

農薬実態調査課では,農林水産省が行っているを選択した. トマトは小平のみ試験した.

「国内産農産物における農薬の使用状況及び残留添加回収用試料および添加標準溶液は,各試験室

１）

状況調査」の残留農薬分析を実施しており,平成がそれぞれ調製したものを用いた.

24 年度の本調査における野菜・果実類の試料のう添加濃度は 0.1 ppm,0.01 ppm の 2 濃度とした.

ち,マンジプロパミドは 22 件の使用履歴があったが試験法の妥当性確認をしていないため分析を行

3.試薬等
マンジプロパミドは Dr.Ehrenstorfer 社製の農わなかった.

薬分析用標準品を使用した.

農林水産省から使用履歴のある農薬については抽出,精製過程の有機溶媒は,残留農薬試験用を分析対象にするよう要請されていることから,厚生労働省のマンジプロパミド試験法（農産物） （以使用した.

２）

下「通知試験法」という.）について,新規分析対象LC/MS の移動相のアセトニトリルは,LC/MS 用を農薬に加えることを目的とし試験法の妥当性確認使用した.

を行った.

その他試薬は,残留農薬試験用または特級を使用材料および方法した.
オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム

1.検証を行った試験室
以下の 3 つの試験室で検証を行った.

（1000 mg）は,Waters 社製の Sep-Pak Vac 6cc(1 g)

・（独）農林水産消費安全技術センター（以下「FAMIC」

C18 Cartrideges,グラファイトカーボンミニカラという.）農薬検査部

農薬実態調査課（以下「小ム（500 mg）は, SIGMA-ALDRICH 社製の SUPELCO

農薬実態調査課（以下「横カゲルミニカラム（690 mg）は,Waters 社製の平」という.）・FAMIC 本部横浜事務所

Supelclean ENVI-Carb SPE Tube 0.5 g ,6 mL,シリ浜」という.）・FAMIC 神戸センター

Sep-Pak Plus Silica Cartrideges を使用した.
農薬実態調査課（以下「神戸」という.）
１

独立行政法人農林水産消費安全技術センター農薬検査部

２

独立行政法人農林水産消費安全技術センター本部横浜事務所

３独立行政法人農林水産消費安全技術センター神戸センター78

4．前処理方法

注入し,溶出液を 40℃以下で減圧濃縮し,溶媒を留4．1． 抽出

去した.この残留物をアセトニトリル,ギ酸及び水

試料 20.0 g を量り採り, 添加濃度となるように（500：1：500）混液に溶解し,正確に 4 mL とした

調製した標準溶液を 1 mL 加えた.これにアセトニトものを試験溶液とした.

リル 100 mL を加え,ワーリングブレンダー型またはポリントロン型ホモジナイザーを使用しホモジナ

5．測定条件イズした後,吸引ろ過した.ろ紙上の残留物にアセLC/MS/MS の条件を表１に示した.

トニトリル 50 mL を加えてホモジナイズし,上記と同様にろ過した.得られたろ液を合わせ,アセトニ

表 1．LC/MS/MS の条件

トリルを加えて正確に 200 mL とし,この 2 mL を採LC conditions

り,これに水 6 mL を加えた.

ColumnODS(i.d.×length,particle size)
2.1×50mm, 1.8µm4．2． 精製①オクタデシルシリル化シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー及びグラファイトカーボンカラムクロマトグラフ

Column temp.

40℃

Injection volume2µL

Mobile phaseィー

Acetonitrile:Formicacid:water

500:1:500（1000 mg）にアセトニトリル及び水各 5 mL を順次

Flow rate

0.2 mL/min

注入し,コンディショニングした.グラファイトカ

MS conditions

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムーボンミニカラム（500 mg）にアセトニトリル及び水各 5 mL を順次注入し,コンディショニングした.
オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムに,4.1 で得られた溶液を負荷した後,さらにアセトニトリル及び水（1：1）混液 5 mL を注入し,流出液

Ionization

ESI

Date acquisition mode

MRM

Precursor ion

m/z 412

Product ion

m/z328(quantitative)

は捨てた.次いでこのカラムの下部にグラファイト

positive mode

m/z 124 (qualifier)カーボンミニカラムを接続し,アセトニトリル及び水（7：3）混液 10 mL を注入し,流出液は捨てた.

6．試験法の妥当性評価方法

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムを除厚生労働省の「食品中に残留する農薬等に関する去した後,グラファイトカーボンミニカラムにアセ試験法の妥当性評価ガイドライン」３）（以下「ガイトニトリル及び水（9：1）混液 10 mL を注入し,流ドライン」という.）に基づき,各センター・事務所出液は捨てた.次いでアセトン 20 mL を注入し,溶出において単一試験室による妥当性確認を行った.

液を 40℃以下で減圧濃縮し,溶媒を留去した.この農産物ごとに,試験対象である農薬等を含まない残留物に酢酸エチル及び n-ヘキサン（1：4）混液 5

試料（ブランク試料）に試験対象の農薬等を添加した試料（添加試料）を,試験法に従って試験し,そのmL を加えて溶かした.

結果から以下の性能パラメータを求め,それぞれの目標値（表 2）等に適合していることを確認した.

②シリカゲルカラムクロマトグラフィー

試験は枝分かれ実験計画（併行条件=2,室内再現シリカゲルミニカラム（690 mg）に酢酸エチル及条件=5）に従い行った.

び n-ヘキサン（1：4）混液 5 mL を注入し,コンディショニングした.このカラムに①で得られた溶液

6．1． 選択性を負荷した後,さらに酢酸エチル及び n-ヘキサン

ブランク試料を試験法に従って試験を行い,定量（1：4）混液 5 mL を注入し,流出液は捨てた.次にを妨害するピークの有無を確認した.

酢酸エチル及び n-ヘキサン（2：3）混液 10 mL を79

6．2． 真度（回収率）

おわりに添加試料 10 検体を試験法に従って試験し得られすべての試験室,農産物において,単一試験室でた試験結果の平均値の添加濃度に対する比を求めの妥当性評価の性能パラメータが,それぞれの目標た.

値等に適合していることを確認した.

6．3． 精度以上の結果から,検証を行ったすべての試験室に添加試料の試験を繰り返し,得られた試験結果のおいて,通知試験法を導入できると考えられた.

標準偏差および相対標準偏差を求め,併行精度およ
引用文献

び複数の分析者または分析日による室内精度を評価した.

１）http://www.maff.go.jp/j/press/syouan/
nouyaku/140716_1.html

6．4． 定量限界（2014 年 10 月 30 日閲覧）

標準溶液を機器分析したクロマトグラムのピー
クとノイズから S/N=10 相当の濃度を定量限界とし２）http://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/
iyaku/syoku-anzen/zanryu3/dl/2-233.pdf

た.
結果および考察（2014 年 10 月 30 日閲覧）
３）http://www.mhlw.go.jp/ topics/bukyoku/

1．妥当性評価の結果

iyaku/syoku-anzen/zanryu2/dl/101224-1.pdf

1．1． 選択性
ブランク試料について試験を行ったところ,すべ（2014 年 10 月 30 日閲覧）ての試験室において,いずれの試料でもマンジプロ４）AOAC Inc.(2005).Appendix D : Guidelines for

パミドの定量を妨害するピークは認められず,選択Collaborative Study Procedures to Validate性に問題がないことを確認した.

Characteristics of a Method of Analysis. In Official

1．2． 真度（回収率）および精度

Methods of Analysis of AOAC Int.18ed.

すべての試験室で,真度（回収率）および精度（併Gaithersburg,MD,USA行精度および室内精度）は,いずれの試料でもガイドラインに示された目標値を満たしていた.表 3-5に各試験室の結果をまとめた.（表 3：小平, 表 4：
横浜, 表 5：神戸）
1．3． 定量限界
定量限界は通知試験法に示された 0.01ppm よりもすべての試験室で低かった.
2．室間再現精度
小平,横浜および神戸の室間再現精度について,ほうれんそうおよびはくさいの添加回収試験の結果より調査した. （単一試験室妥当性確認に用いた各試験室におけるすべてのデータを併行データとした.）結果を表 6 に示した.
HORRAT 値４）を算出した結果,ほうれんそうでは,低濃度添加回収試験で 0.24,高濃度添加回収試験で0.28,はくさいでは,低濃度添加回収試験で 0.31,高濃度添加回収試験で 0.20 となり,2 を下回っており,通知試験法は,FAMIC 農薬実態調査課において十分な精度を持つことが確認された.

80

表 2．単一試験室妥当性確認の真度,併行精度および室内精度の目標値
Spike level (ppm)

Recovery %RSDr%

RSDR %

0.001＜～≦0.01

70 ～ 120

25 ＞

30 ＞

0.01＜～≦0.1

70 ～ 120

15 ＞

20 ＞

表 3．小平における真度,併行精度および室内精度
Recovery %Samplen=10RSDr

RSDR %%

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Tomato

95.1

96.1

6.8

5.4

7.6

5.6

Spinach

92.2

98.9

7.2

3.5

7.8

5.9

Chinese cabbage

94.6

93.1

4.6

2.8

8.0

3.0

表 4．横浜における真度,併行精度および室内精度
Recovery %SampleLow conc.

n=10RSDr

High conc.

Low conc.

RSDR %%High conc.

Low conc.

High conc.

Spinach

96.3

95.6

3.7

5.1

8.1

8.3

Chinese cabbage

99.8

97.7

9.0

4.4

9.8

5.5

表 5．神戸における真度,併行精度および室内精度
Recovery %Sample

n=10RSDr

RSDR %%

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Spinach

90.0

94.0

3.8

2.6

6.0

4.4

Chinese cabbage

90.1

93.4

3.5

1.6

8.9

1.7

RSDr %RSDR %PRSDR %

HORRAT

表 6．FAMIC における真度,併行精度および室間再現精度
SampleSpinachChinese cabbge

Spike level

Mean level

Recovery %

(ppm)

(ppm)

n=30

0.01

0.00928

92.8

7.2

7.6

32.0

0.24

0.1

0.0962

96.2

6.1

6.4

22.6

0.28

0.01

0.00948

94.8

8.6

9.8

32.0

0.31

0.1

0.0947

94.7

3.8

4.5

22.6

0.20

81