（ 1 ）151

日本食品保蔵科学会誌
４
３

VOL．

会
長
編集委員長
編集委員

４

NO．

"井 陸雄
太田 英明
稲熊 隆博
古庄
律

副

会

長

井上 茂孝
松田 茂樹

太田

英明

今堀 義洋
宮本 敬久

小宮山美弘

早坂

薫

恩田

鳥居

恭好

匠

＜報
文＞（英文）
ウメ赤肉品種 露茜 果肉中のフェノール性化合物の特徴とラットの食後血糖値への影響 …………（１５３）／堀西朝子・雪本 亮・東出晃平
岸田邦弘・森
一・尾!嘉彦サチャインチオイル摂取による血流依存性血管拡張反応：
機能性食品のヒト血管に対する非侵襲的評価法 …………………………………………………………（１６３）／南 和広・樫村修生・前崎祐二・清柳典子
丹羽光一・相根義昌・渡部俊弘
豆類の生育ステージ，登熟期のGABA量の比較 ……………………………………………………………（１７１）／蓑島良一・椎葉 究＜研究ノート＞（英文）７９）Bifidobacterium longum Strain No.１４―２によるN-acetylsucrosamineの資化性 …………………………（１／李 夢秋・宮沢幸敬・趙!・鈴木公一
川井 泰・増田哲也・小田宗宏＜総説＞
湯葉被膜形成機序の解明と品質ならびに生産性の向上 ……………………………………………………（１８
７）
／国正重乃
＜講
座＞
HACCP教育講座（１６） ヒト試験における有効性評価と高度健康強調表示―プロバイオティクスとプレバイオティクスを中心に― ………………………………………………（１９
３）
／飯野久和

＜文献抄録＞ ……………………………………………………………………………………………………（２０３）＜会
告＞ ……………………………………………………………………………………………………（２０
４）

152

（ 2 ）

Food Preservation Science

CONTENTS OF VOL．
４
３ NO．
４（２
０
１
７）
＜Article＞（English）
Characterization of Phenolics in the Flesh Tissue of ‘Tsuyuakane’,a Red Flesh Type of Japanese Apricot（Prunus mume Sieb. et Zucc.）
and its Effect on Postprandial Blood Glucose Levels in Rats
HORINISHI Asako, YUKIMOTO Ryo, HIGASHIDE Kohei,
KISHIDA Kunihiro, MORI Hajime and OZAKI Yoshihiko ………………………………………（１５３）
Flow-mediated Vasodilation Response to Ingestionof Omega-３-rich Sacha-inchi Oil：A Noninvasive Evaluationof a Functional Food for Human Vascular
MINAMI Kazuhiro, KASHIMURA Osamu, MAEZAKI Yuji, KIYOYANAGI Noriko,
NIWA Koichi, SAGANE Yoshimasa and WATANABE Toshihiro ………………………………（１６３）Comparison of Legumes GABA Levels in Different Growth Stages and Maturity Stages
MINOSHIMA Ryoichi and SHIIBA Kiwamu ………………………………………………………（１７１）＜Research Note＞（English）
N-acetylsucrosamine Utilization by Bifidobacterium longum Strain No. １４―２
LI Mengqiu, MIYAZAWA Yukitaka, ZHAO Gang, SUZUKI Koichi,
KAWAI Yasushi, MASUDA Tetsuya and ODA Munehiro ………………………………………（１７９）＜Review＞（Japanese）
Elucidation of the Formation of Yuba-Films and Improvement of Quality and Productivity
KUNISHO Shigeno ………………………………………………………………………………………（１８７）＜Serialization Lecture＞（Japanese）
Scientific Evidence and Enhanced Health Claim from Human Trial on Probiotics and Prebiotics
IINO Hisakazu ……………………………………………………………………………………………（１９３）

（ 3 ）

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７ 〔Article〕

153

Characterization of Phenolics in the Flesh Tissue of ‘Tsuyuakane’,a Red Flesh Type of Japanese Apricot（Prunus mume Sieb. et Zucc.）
and its Effect on Postprandial Blood Glucose Levels in Rats
HORINISHI Asako＊１, YUKIMOTO Ryo＊１, HIGASHIDE Kohei＊１,
KISHIDA Kunihiro＊１, MORI Hajime＊２ and OZAKI Yoshihiko＊１§＊１ Department of Science and Technology on Food Safety, Faculty of Biology-oriented Science and Technology,
Kindai University, 930 Nishimitani, Kinokawa, Wakayama 649−6493＊２ Industrial Technology Center of Wakayama Prefecture, 60 Ogura, Wakayama, Wakayama 649−6261

The phenolic composition of fruit from the new cultivar of Japanese apricot（Prunus mume Sieb. et
Zucc.）, ‘Tsuyuakane’, was investigated. Comparison of phenolic contents among ‘Tsuyuakane’ and its
parental cultivars suggested that the high level of anthocyanins in ‘Tsuyuakane’ is inherited from oneof its parental varieties, ‘Kasaharahatankyo’, and its high level of chlorogenic acid derivatives is likely
inherited from the other parental variety, ‘Yousei-ume’. One of the characteristic phenolic compounds
found in the fruit of ‘Tsuyuakane’ was neochlorogenic acid. Exogenous ethylene treatment of the fruit,
which is known to increase the red color intensity of ‘Tsuyuakane’ fruit, increased not only
anthocyanin levels but also neochlorogenic acid content. The existence of acetylated sucrose esters ofhydroxycinnamates was suggested by LC-MS analysis. Moreover, the inhibitory effects of ‘Tsuyuakane’
phenolic compounds （TAP） on rat small intestinal disaccharidases and their suppressive effects on
postprandial blood glucose levels in rats were evaluated. TAP inhibited maltase, glucoamylase, andsucrase in vitro. TAP delayed postprandial blood glucose level elevation when rats were fed withstarch, however, no significant effect was observed upon administration with maltose or sucrose.
（Received Nov. １４, ２
０
１６；Accepted Mar. ６, ２
０
１
７）
Key words：Tsuyuakane, Japanese apricot, anthocyanidin, neochlorogenic acid,postprandial blood glucose levels
露茜，ウメ，アントシアニジン，ネオクロロゲン酸，食後血糖レベル
Ume, or Japanese apricot （Prunus mume Sieb. etreportedthat

harvesttime

affected

the

total

Zucc. ） is one of the most popular fruit trees inphenolic and anthocyanin contents of ‘Tsuyuakane’

Japan. This species belongs to the Rosaceae family

fruit２）.

and contains a variety of cultivars. A new cultivar

We previously analyzed the phenolic compoundsof Japanese apricot with unique characteristics hasinbeen bred. Japanese apricot ‘Tsuyuakane’ is anmajority of phenolic compounds in fruit tissue ofinterspecific hybrid cultivar of the Japanese plum

‘Nanko’,thepredominant（Prunus salicina Lindl.）, ‘Kasaharahatankyo’ and theapricot,werehydroxycinnamic

Japanese apricot, ‘Yousei - ume’. The characteristics

including chlorogenic acid, its isomers, and acetylatedof ‘Tsuyuakane’ that accumulate certain amount ofsucrose esters of p-coumaric acid３）. We reported that

anthocyanins not only in the peel tissue but also in‘ Nanko’ phenolics prepared from a by-product of

the flesh tissueumeboshi production had inhibitory effects on rat

is

quite

unique

as

Ume,

and

expected to be used for processing products with１）

red color . OE et al . reported that force-ripening
premature‘Tsuyuakane’

fruit

with

exogenous

Ume

small

fruit,

andintestinal

alreadysuggestedcultivardisaccharidases

that

of

acid

and

the

Japanese
derivatives,

suppressive

effects on elevation of blood glucose levels in rats４）.
In this study, we investigated the composition of

ethylene increased the anthocyanin concentration

phenolic

and red color intensity of the fruit. OE et al . alsochanges in the concentrations of major phenolics§ Corresponding auther, E-mail : ozaki@waka.kindai.ac.jp

compoundsin‘Tsuyuakane’

fruit

and

154

Food Preservation Scienceduring the force-ripening process. Also, the phenolic

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 4 ）

during the force - ripening process of ‘ Tsuyuakane’composition of the ‘Tsuyuakane’ fruit was comparedfruit, ５％ formic acid methanol extract was used.

with

Fresh

those

of

its

parentalvarieties.

Moreover,fruit

harvested

in ２０
１
４ werecut

intoinhibitory effects of these phenolic compounds onquarters and the pair of diagonally opposed pieces

rat small intestinal disaccharidases and suppressive

was ground in ５％ formic acid methanol solution.

effects on postprandial blood glucose level elevation

The suspension was then sonicated for １
０ min andin rats were evaluated.

centrifuged at １
１,８
５０× g for １
０ min at ４℃ . The
extraction was repeated twice and the combined

Materials and Methods

supernatantwasconcentrated

under

reducedpressure to a final volume of ２
５ !.

１．Chemicals and reagents
For standards, gallic acid, chlorogenic acid, caffeic

For other analyses, water extracts of each fruit

were

were used. One hundred milligrams of freeze-dried

purchased from Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）.

flesh powder was extracted twice with ２ ! of

Cyanidin-３-glucoside and cyanidin-３-rutinoside weredistilledpurchased from Tokiwa

acid,p-coumaric

acid,

and

ferulic

acid

water

by

sonication

for ３
０ min.

The

Ltd.

sonicated suspension was then centrifuged at ３０,００×（ Chiba, Japan ）. HPLC-grade methanol and formic

g for １０ min at ４℃ , and the supernatant was

PhytochemicalCo.,acid were purchased from Wako Pure Chemicals

collected and distilled water was added to reach a（ Osaka, Japan ）. All other reagents used in thisfinal volume of ５ !.

study were of analytical grade.

４．HPLC analysis of phenolic compounds

２．Fruit samples

HPLC analysis was performed on a Shimadzu LC

Fruit samples of P. mume cv. ‘Tsuyuakane’ were２
０ A system （Shimadzu Corp., Kyoto, Japan）. The

kindly provided by the Ume Research Laboratory,

Hydrosphere C１８（φ４.６"×２
５０"） column （YMC,

Fruit Tree Experiment Station, Wakayama Research

Kyoto, Japan） was eluted with solvents A （０.５％Center of Agriculture, Forestry and Fisheries, in theformic acid）: B（methanol）at a flow rate of １０. !

harvest season from ２０
１
２ to ２０
１
４. The maturity of/min. The elution was achieved at A : B = ８
０:２０‘Tsuyuakane’ fruit was judged by the surface color

for first １
０ min, then a linear gradient system wasaccording to OE’s coloring index２）. The coloring

applied for ６
０ min that ended at ２
０:８
０. The column

index of fruit harvested as ‘ premature’ was lesstemperature was set at ４
０℃ and the eluate wasthan １０ and that of ‘full-mature’ was over ６
０. Themonitored by determining sample absorption at ２
８０premature

and ５
２
０ !.

‘Tsuyuakane’

fruit

were

then

force -

ripened following the method described by OE et
５）

５．Determination of total phenolic content

al . . Picked premature fruit were placed in a

The total phenolic content of the water extracts

polyethylene bag with the ethylene-generating agent

was determined by the Folin-Ciocalteu method６）. The‘ Uregoro’ （ Japan

resulting values were expressed as mg gallic acid

Fruit

Growers

Cooperative

Association） and stored at ２０℃. For the parental

equivalents per gram dry weight.

varieties, Prunus mume cv. ‘Yousei-ume’, was also

６．Alkaline hydrolysis

providedofThree milliliters of water extract were mixed

Wakayama prefecture in the harvest season of ２
０
１
５,

by

the

Ume

Research

Laboratory

with １! of ４ N NaOH that was deoxidized inand P. salicina ‘Kasaharahatankyo’ was provided byadvance with nitrogen gas bubbling. After ２
０ h oftheNational

Agricultural

and

Food

Research

reaction at room temperature, the reaction mixture

Institute

Fruit

Tree

and

Tea

was acidified by adding ０.２
７ ! of ８
５％ phosphoric

Science （Tsukuba） in the harvest season of ２０
１４.

acid and the reaction volume was brought to ５ !

Organization,ofFruit of ‘Nanko’ harvested at the Ume Researchwith distilled water. The alkaline hydrolysate wasLaboratory in ２０
１
４ was used as a reference cultivar.

analyzed

The samples were separated into flesh and stone

conditions mentioned above. Column elution wasparts manually. The ground powder of freeze-driedcarried out at A : B＝７
５:２
５ isocratically.

flesh

７．LC/MS analysis

wasstored

at

−３
０℃

until

the

phenolic

extraction.
３．Preparation of analytical samples
To analyze anthocyanin and neochlorogenic acid

under

the

slightly

modified

HPLC

The water extracts of flesh were treated with a
Sep-Pak plus C１
８ cartridge （Waters, Milford, MA,
USA ） prior to LC / MS analyses to concentrate（ 5 ）〔Article〕 Phenolic Profile of Japanese Apricot ‘Tsuyuakane’

155

phenolics. LC/MS analyses were performed using an

was diluted with ０１. M sodium maleate buffer（pHExactive６.０） as needed. Fifty microliters of the crude

Orbitrapmass

spectrometerwithsolution

were

mixed

with ５０µ'electrospray ionization （ Thermo Fisher Scientific ）,enzymeinterfaced with an Accela ６００ HPLC （ Thermo

substrate

Fisher Scientific）. The Hydrosphere C１
８（φ４６
. " ×

starch）and ５
０µ' of water extract in a microtube.

solution （ maltose,

sucrose,

or

of

a

soluble２
５０" ） column （ YMC, Kyoto, Japan ） was eluted

After incubation for ３
０-９
０ min at ３
７℃, the enzyme

with solvent C（０２. ％ formic acid）: D（０２
. ％ formic

reaction was terminated by heating in boiling wateracid in methanol）starting at C : D = ８
０:２
０ for thefor ２ min.

first １０ min, then a linear gradient system waslactase activities were determined by assaying theapplied for ７
０ min that ended at ２
０:８
０. Elution wasamount glucose released from each substrate by

Maltase,glucoamylase,

sucraseandachieved at a flow rate of １ !/min and ４
０℃. Mass

HPLC. An Asahipak NH２P-５
０（ φ４.６ " ×２
５ #）measurements

performed

inpositiveandcolumn（Showa Denko Co., Tokyo）was eluted with

mode

an

electrospray

６５％ acetonitrile at a flow rate of １.０ ! / min at

ionization source （ ESI ）. The ESI inlet conditions

４０℃ . The mode of inhibition was determined bynegativewere

ionization

were as follows :withsource voltage, ４ kV ;temperature, ３００℃ ;capillarysheath gas, nitrogen ８
０ psi ;

auxiliary gas （nitrogen） flow rate, １
０ !/min. The
mass

data

software

Lineweaver-Burk plot analysis.
１０．Sugar load test
Male Sprague Dawley （SD） rats were procured

theXcaliburfrom Kiwa Laboratory Animals Co., Ltd., Wakayama,

ThermoFisherJapan. All rats were provided with commerciallywere

processedusing

packageprovidedby

Scientific.

available rat normal pellet diet and water ad libitum

８．Preparation of ‘Tsuyuakane’ phenolics fraction

prior to dietary manipulation. The SD rats （９-１
６

（TAP）

weeks old ） were used to evaluate the effect of‘Tsuyuakane’ flesh（３１.３ &） was separated from

TAP on postprandial glucose levels. After overnightfrozen force-ripened fruit harvested both in ２
０
１
２

fastingand ２０
１
３ and ２.９
６ & of freeze-dried powder was（maltose, sucrose, and starch） was administered at

for １
６ h,

a

single

oral

dose

of

sugar

obtained. A ２
５０-g portion of the freeze-dried powder

a dose of ２%/& body weight（BW）in the absence

was

an

or presence of TAP （５００ $/& BW）. The same

Ultrasonic Homogenizer VP-３００（Taitec Corporation）.

rats were used throughout the experiment. TAP

The sonicated suspension was then centrifuged atand sugar were dissolved in distilled water and

４０,０
０×g for １
５ min. The extraction procedure wasadministrated to rats. Blood glucose levels wererepeated three times. The combined supernatantmeasured from the tail vein, using a handheld blood

was loaded onto a column（φ５５. # ×７０#）, packed

glucose meter（Glutest Neo Super : Sanwa Chemical,

with

HP-２
０

Nagoya, Japan） before sugar administration and ０,（Mitsubishi Chemical Corp.）. UV absorption at ３０
９

３
０, ６
０, and １
２
０ min after administration. This study! and pH of the effluent was monitored. The

was approved by the Animal Care Committee ofcolumnKindai University, and the animals were maintained

extracted

with ４ Lofstyrene-divinylbenzene

waswashedwater,

resin

thoroughly

using

Diaion

with

water

to

remove acids and sugars, and then was further

in accordance with the committee’s guidelines.

eluted１１．Statistical analysis

withmethanol.

The

eluatewas

thenconcentrated under reduced pressure and freeze -Blood glucose levels were expressed as the mean

dried. The freeze-dried powder was used for the± SEfollowing

performed by an unpaired t-test, using IBM SPSS

assay

as

the

‘Tsuyuakane’

phenolics

each

group.

Statisticalanalysiswasstatistics software, version １
９０. （IBM Co., New York,fraction（TAP）.
９．Determining

for

the

inhibitory

actionofwater

extract on disaccharidase activities

USA）and p values less than ０.０
５ were considered
statistically significant.

The suspension of the brush border membrane

Results and Discussion

vesicles isolated from small intestinal mucosa of
male SD rats （Kiwa Laboratory Animals Co., Ltd.,

１．Characterization of phenolics of ‘ Tsuyuakane’

Wakayama, Japan ） in ０.０
１ M sodium phosphate

fruit

buffer（pH ７０. ）was used as crude enzyme solution,

Fig. １ shows４）

as previously reported .The crude enzyme solution

typicalHPLC

profiles

of

water

extracts prepared from the flesh of full - mature

156

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

ʻTsuyuakaneʼ water extract

mAU

（ 6 ）

ʻNankoʼ water extract

mAU

5.0

5.0

520nm
2.5

520nm

2

1

2.5

0.0

0.0
20

10

30

40

3

50
min

280nm

5.0

0

20

10

30

40

50
min

280nm

5.0
3
2.5

2.5

4

4
0

0
0

20

10

40

30

50
min

0

20

10

40

30

50
min

Fig.１ HPLC chromatograms of the water extracts prepared from full-mature ‘Tsuyuakane’ and ‘Nanko’ flesh
Peak １：Cyanidin-３-glucoside（Cy３G）, Peak ２：Cyanidin-３-rutinoside（Cy３R）, Peak ３：Neochlorogenic acid,Peak ４：Chlorogenic acid

‘Tsuyuakane’ and ‘Nanko’ fruits. Two major peaks
with

５
２
０!

absorbance

were

found

in

the

examined,

showed‘Tsuyuakane’

concentrationofchlorogenic

the

acid

highestderivatives,‘Tsuyuakane’ water extract（Fig. １, Peak １ and ２）.

including chlorogenic acid and neochlorogenic acid,

The major anthocyanins in ‘Tsuyuakane’ flesh arefollowed by its parental variety ‘Yousei-ume’.（Table

cyanidin ３-glucoside （ Cy３G ） andcyanidin ３-

１） Although the ratios of neochlorogenic acid to２）rutinoside （Cy３R）.Thus, the retention time, UV /chlorogenic acid were １.４ and ２.３ for ‘Yousei-ume’

VIS,

were

and the reference variety ‘Nanko’, respectively, thiscompared with those of authentic samples of Cy３G

ratio was ７.７ in ‘Tsuyuakane’, due to the highand Cy３R, and found to be identical. Cy３G and Cy３

concentrationofneochlorogenic

acid

R

concentrationofchlorogenic

Owing

and

were

MS

also

spectrum

found

in

of

the

these

peaks

water

extract

of

acid.

and

low

to

its

‘Kasaharahatankyo’. Although peel tissue of ‘Nanko’abundance, neochlorogenic acid is considered one

fruit is known to contain Cy３G and Cy３R７）, theyof the distinct compounds found in ‘ Tsuyuakane’

were not detected for ‘Nanko’ and ‘Yousei - ume’fruit.

under the analytical conditions used in this study.

variety,

The total phenolic contents, as determined by theconcentrations of chlorogenic acid derivatives among

Folin-Ciocalteau method, showed higher values inthe tested cultivars. Thus, thecharacteristic‘Tsuyuakane’ and ‘Kasaharahatankyo’ fruits than inaccumulating

chlorogenic‘Nanko’ and ‘Yousei-ume’ fruits（ Table １）. While‘Tsuyuakane’and‘Kasaharahatankyo’contained

anthocyanins, the concentrations of Cy３G and Cy３R,
asquantified

by

HPLC

analysis,

did

not

fully

On

the

other

hand,

its

showed‘Kasaharahatankyo’,highlevelsotherofparentalthelowestofacid

derivatives in ‘Tsuyuakane’ was likely inheritedfrom ‘Yousei-ume’.
When

the

water

extractsof‘Tsuyuakane’,‘Kasaharahatankyo’, and ‘Yousei-ume’ fruits were

account for the higher values of total phenolics.

hydrolyzed（Table １） This indicates the existence of phenolicconstitutional hydroxycinnamic acids−trans- and cis

compounds other than anthocyanins in the waterp-coumaric acid, caffeic acid, and ferulic acid−wereextract.

produced, which was also previously reported for

A

major

peak

was

observedinthechromatogram at ２８
０ !（Fig. １, Peak ３）.
The retention time and the mass spectrum of‘Nanko’ ３）.

underalkaline‘Tsuyuakane’

concentrationofcaffeiccondition,

showed
acid,

which

the
was

four

highestlikelypeak ３ were consistent with the neochlorogenic acidreleased from chlorogenic acid derivatives（Table １）.

isolated from ‘ Nanko’３）. Among the four cultivars

The p-coumaric acid concentration of ‘Tsuyuakane’（ 7 ）〔Article〕 Phenolic Profile of Japanese Apricot ‘Tsuyuakane’

157

Table １ Content of major phenolics in the water extract prepared from full-mature fruit of ‘Tsuyuakane’ and related
cultivars＊
Content（㎎/g, D.W.）＊
Yousei- Kasaharaumehatankyou

Nanko

８．
８
２
２．
３
１
０．
３
０
０．
０
４
０．
１
０

２．
９
６
１．
０
８
０．
４
７
nd
nd

７．
６
９
０．
１
６
０．
０
２
０．
２
３
０．
５
４

３．
０
２
０．
６
２
０．
４
４
nd
nd

Folin-Ciocalteu method, Gallic acid equivalent
HPLC, Chlorogenic acid equivalent
HPLC
HPLC
HPLC

１．
１
６
０．
０
２
０．
３
８
０．
０
８

０．
４
２
０．
０
３
０．
１
３
０．
０
９

０．
１
５
０．
０
１
０．
０
５
０．
０
０

０．
４
２
０．
０
２
０．
４
１
０．
１
８

HPLC（hydrolysate）
HPLC（hydrolysate）
HPLC（hydrolysate）
HPLC（hydrolysate）

Tsuyuakane
Total phenolics
Neocholorogenic acid＊＊
Cholorogenic acid
Cyanidin-３-glucoside
Cyanidin-３-rutinoside
Constituent phenolic acid
Caffeic acidcis-p-Coumaric acidtrans-p-Coumaric acid
Ferulic acid
＊Values

Analytical method

indicate mean of duplicates.
of Neochologenic acid was measured by HPLC and expressed as chlorogenic acid equivalent８）．

＊＊Quantity

was similar to that observed in ‘Nanko’. It was

fruit that the combination of a hydroxycinnamic

previously

acid moiety and sucrose, with different positions

reportedthat‘Nanko’fruit

contains

p-coumaric acid esters with polyacetylated sucrose,and other hydroxycinnamic acids, including ferulic

acetylated, creates various derivatives.
Although a similar extracted ion chromatogramsimilarpattern was observed in all the samples analyzed inesters ３）. FUJIMOTO et al . reported the existence of

this study, the concentration of these derivatives

such

of

seemed to vary depending on the cultivar. Among

P. mume and the structures of these derivatives

the four hydroxycinnamic acids found in the alkali

were elucidated ９）. According to the molecular masshydrolysates, caffeic acid is suggested to be released

acid

and

caffeic

acid,compounds

insupposedly

the

dried

form

flowerbuds−［M-H］ of the elucidated structures （m /z = ４
８
７.１
４,

mainly from chlorogenic acid derivatives and p-

５
２
９.１
５, ５
７
１.１
６, ６
１
３.１
７, ６
５
５.１
８, and ６
９
７.１９）, thecoumaric acid and ferulic acid from acetylated sugar

extracted

negative

ion‘Tsuyuakane’

and‘Nanko’presented inFig. ２.

chromatogramsofesters called prunose derivatives３）. Differences in

water

are

concentrations of p-coumaric acid and ferulic acid of

These

extracts

molecular

massesthese fruit may indicate

differencesin

prunose−correspond to the ［M-H］
of p-coumaroylsucrose,

derivative content. The parental varieties, ‘ Yousei -monoacetylatedume’

diacetylated

p-coumaroylsucrose,and‘Kasaharahatankyo’,showedandp-coumaroylsucrose, triacetylated p-coumaroylsucrose,

low levelsofp-coumaricacid

tetraacetylatedcomparedtotheobserved

pentaacetylated

andp-coumaroylsucrose,
p-coumaroylsucrose,（Fig. ３）. Characteristic

peaks,

which

levelsrelatively

ferulicinacid‘Nanko’.

respectively

Especially, ‘Kasaharahatankyo’ showed the lowest

wereconcentrations in spite of the highest total phenolicalso

found in the UV chromatogram （ A ） or total ion

concentration. This cultivar belonging to thechromatogram（B）, were detectable in both extracts.

salicina

Multiplesuch as flavonoids, like other plum fruit１０）.

peaks

acetylated

might

dependp-coumaroylsucuroseonorisomers
otherofrelatedcompounds.
These results could indicate that Ume fruit alsoP.

could contain other phenolic compounds,

２．Changes in major phenolics of ‘ Tsuyuakane’
fruit during force-ripening process
Contents of total phenolics, neochlorogenic acid,contains isomers with different acetylated positions,

Cy３G

like FUJIMOTO et al . reported for flower buds. The

hydroxycinnamic acids in different maturation stages

observed peaks shifted to a longer retention timeof ‘Tsuyuakane’ flesh are shown in Table ２.

andC y３R,

andtheconstitutional

along with larger molecular mass（Chromatogram C-

The concentration of anthocyanins in the fruitH）. The observed elution patterns suggest that theincreased approximately three-fold during ripening

unique and complex phenolic composition of Ume

on the tree. When premature fruits were force -158

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

ʻTsuyuakaneʼ water extract（ 8 ）ʻNankoʼ water extract

A

B

C

D

E

F

G

H

Fig.２ UV（A, 309 !）, total ion chromatogram（B）and extracted negative ion chromatograms of m/z 487.13-487.15（C）, m/z 529.14-529.16（D）, m/z 571.15-571.17（E）, m/z 613.16-613.18（F）, m/z 655.17-655.19（G）, and m/z 697.18-698.00（H）of acetylated sucrose esters of p-coumaric acid found in full-mature ‘Tsuyuakane’ and ‘Nanko’ flesh
All the extracted ion chromatograms are plotted using the same scale.

R= H or Ac

ORRO

ripened on the tree, although levels increased upon

OR
O

RO

O

phenolic contents decreased when the fruit wasOO

force-ripening, as shown in Table ２.
Fig. ４ showsOchanges

in

the

major

phenolic

compounds that occurred in the fruit during force-

RO
RO

OH

OR

Fig.３ Structure of polyacetylated p-coumaroylsucrose

ripening with exogenous ethylene gas. Both Cy３G
and Cy３R concentrations increased sharply from thefourthday,concentration
ripened with exogenous ethylene treatment,thewhereastheincreased

neochlorogenic

gradually

from

acid
the

beginning of the force - ripening process. It was

anthocyanin level reached almost ten times higher

previously

than the level observed before the treatment. On

anthocyanins of force-ripened ‘Tsuyuakane’ fruit isthemainly due to increased Cy３G levels when using

other

hand,

neochlorogenic

acid

and

total

reported

that

the

increasein（ 9 ）〔Article〕 Phenolic Profile of Japanese Apricot ‘Tsuyuakane’

159

Table ２ Content of major phenolics in water extract of ‘Tsuyuakane’ fruitContent（㎎/g, D.W.）＊
Premature
fruit
Total phenolics
Neoholorogenic acid＊＊
Cyanidin-３-glucoside
Cyanidin-３-rutinoside
Constituent phenolic acid
Caffeic acidcis-p-Coumaric acidtrans-p-Coumaric acid
Ferulic acid
＊Values

Full-mature Force-ripened
fruit
fruit

analytical method

１
１．
６

８．
８
０

１
３．
０

Folin-Ciocalteu method, Gallic acid equivalent

３．
１
３
０．
０
０
６
０．
０
３
４

２．
２
４
０．
０
２
６
０．
０
９
７

３．
７
８
０．
２
７
６
０．
１
４
８

HPLC, Chlorogenic acid equivalent
HPLC
HPLC

１．
４
５
０．
０
２
０．
３
９
０．
０
５

１．
１
４
０．
０
２
０．
３
７
０．
０
６

１．
６
９
０．
０
７
０．
７
４
０．
０
７

HPLC（hydrolysate）
HPLC（hydrolysate）
HPLC（hydrolysate）
HPLC（hydrolysate）

indicate mean of duplicof Neochologenic acid was measured by HPLC and expressed as chlorogenic acid equivalent８）.

Anthocyanin（μg/g fresh fruit）

neochlorogenic acid（μg/g fresh fruit）＊＊Quantity

300

transferase

250

caffeoylquinic acid to ３-O-caffeoylquinic acid１３）.

200

capableofconverting

５-O-

CHENG et al . recently reported that the expression

150

of

100

genes

involved

anthocyanidin

50
0

is

in

the

biosynthetic

early

stage

pathway,

of

the

such

as

phenylalanine ammonia lyase （ PAL ） and chalcone
0

1

2

3
4
Time（day）

5

fully mature
fruit

50

synthase（CHS）, of plum fruit were affected by theexogenous ethylene treatment１４）. The expression ofthese genes and the accumulation of anthocyanins in
the fruit were enhanced by ethylene treatment. The

40
Cyanidin-3-glucoside
Cyanidin-3-rutinoside30

timing of expression differs depending on

each

20

gene ; expression of PsPAL significantly increased on

10

the second day of treatment while PsCHI expression

0

increased on the third day. This time lag in gene
0

1

2

5 fully mature
fruit

3
4
Time（day）

Fig. ４ Changes in the major phenolic compounds of theethylene treated fruit
Each value represents the mean ± SD（n＝５）.

expression

relatingtoanthocyanin

biosynthesis

might be involved in the changes of chlorogenic
acid

and

anthocyanin

synthesis

observedin‘Tsuyuakane’ fruit during force-ripening process.
３．Chemical characteristics of TAP
Contents of total sugar, total phenolics, main

１
１）

fruit harvested in ２０
１
２ unlike the trend observed inphenolics, neochlorogenic acid, and the constitutional

this experiment. More investigation is needed tohydroxycinnamic acid in TAP are shown in Table ３.

clarify the reason for this difference in anthocyanin

Thechanges.

contents

offorce-ripened

therefore

the

total

All compounds whose levels increased upon force-composition

of

TAP

reflected

phenolics‘Tsuyuakane’

phenolics,

anthocyanin,

fruit,
andripening with exogenous ethylene treatment wereneochlorogenic acids and constitution caffeic acidproducts

The

contents showed higher values than those observed

biosynthetic pathway of chlorogenic acids has been

in Japanese apricot phenolic extract（JAPE）derived

of

the

shikimicacid

pathway.

partially revealed. It is suggested that chlorogenic

from ‘Nanko’, which was used by KISHIDA et al . toacid（５-O-caffeoylquinic acid）is first converted fromassay postprandial glucose elevation４）.

p-coumaroyl-CoA

via ５-O-p-coumaroylqunic

acid,

４．Inhibitory

effect

of

TAP

on

disaccharidase

then is further isomerized to other chlorogenic acidactivity

derivatives such as neochlorogenic acid in tobacco

TAP showed concentration-dependent inhibitory

１２）

tissues . In coffee beans, quinate hydroxycinnamoyl

activity for maltase, glucoamylase, and sucrase. We

160

Food Preservation Science

Table３ Major phenolic content of ‘Tsuyuakane’
phenolics fraction（TAP）

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 10 ）

intestinal maltase１５），１６）. This suggests that sucrase
inhibition by TAP might be due to the effect ofanthocyanins.

＊Content（㎎/g）５．Delaying effect on postprandial blood glucose

Total sugar
Total phenolics

４
４
４
４
５
４

Neocholorogenic acid
Cyanidin-３-glucoside
Cyanidin-３-rutinoside

１
０
３
１．
９
２
１．
１
２

level in rats
Fig. ６ shows the variation in blood glucose levels
after

starchadministration

in

the

absenceandpresence of TAP. No significant effect of TAP on
postprandial blood glucose levels was observed inConstituent phenolic acid
Caffeic acidcis-p-Coumaric acidtrans-p-Coumaric acid
Ferulic acid
＊Valuesthe maltose and sucrose load test（data not shown）.
３
０．
３
１．
５
１
１．
７
２．
１

The

administrationofstarchcontaining

TAP

suppressed the blood glucose level at ３
０ min afteradministration compared with blood glucose levelsof the control group, and conversely increased theindicate mean of duplicates.

level

at ６
０ min.

This

TPA-induced

glucosea-glucosidase

inhibition

delayedcould not show the numerical value because lactase

carbohydrate

digestionsubsequent

glucoseinhibitory activity was very weak and not stable.

absorption in the small intestine. Even though the

Lineweaver-Burkandsuggests

that

each

total amount of glucose absorbed was not modified

disaccharidase with and without TAP are displayedby TPA administration, delaying glucose absorptioninis beneficial because this can attenuate acute insulin

Fig. ５.

plots

Kineticforanalyses

activity
indicated

of
that

the

inhibitory modes of TAP were mixed or non -secretion.

were

The delaying effect of TAP on the starch load

uncompetitive for glucoamylase. We reported thattest may be explained by its inhibitory action on

JAPE derived from ‘Nanko’ fruit inhibited maltase,glucoamylase observed in the in vitro assay. TAP

glucoamylase, and lactase, but not sucrase activity.

inhibited maltase and sucrase activity, yet TAP did

TAP exhibited non - competitive sucrase inhibition.

not significantly affect the results of the maltose

The

the

and sucrose load test. The discrepancies between

characteristics of TAP phenolic content and JAPE

the in vitro and in vivo results may be attributed tocompetitive for maltase

differencesandsucrase,observed

andbetweencontent included a large quantity of neochlorogenic

the fact that the inhibitory effect（Vmax changes） of

acids and anthocyanins. Cy３G and Cy３R inhibit

TAP on glucoamylase was higher than the effect on

intestinal sucrose more specifically than they inhibit

maltase or sucrase（Fig. ５）. We previously reported

MaltaseSucraseGlucoamulase

m

= 4.1
=51.0

max

m

m

= 1.7
=20.3

= 22.2
=12.8

max

1/V

max

m

= 2.0
=75.5

max

m

= 4.9
=75.2

max

−1
1/S
（mg/ｍℓ）m= 24.9
=19.6

max

−1
1/S
（mM）

Fig. ５ Lineweaver-Burk plot of maltase, glucoamylase and sucrase activities fromrat intestinal mucosa homogenates with １!/!（ ● ）or without TAP（△）
Vmax, expressed as mg of glucose released/!/min ; Km expressed as !/! ; Vmax and Km
were calculated by this Lineweaver-Burk plot.

（ 11 ）

〔Article〕 Phenolic Profile of Japanese Apricot ‘Tsuyuakane’

Blood glucose level（㎎ /dℓ）

250

161

（４）
,４
１
１〜４
１
８（２
０
１
３）（in Japanese）
３）MITANI, T., HORINISHI, A., KISHIDA, K., KAWABATA,＊

200

T., YANO, F., MIMURA, H., INABA, N., YAMANISHI, H.,＊

OE, T., NEGORO, K., MORI, H., MIYAKE, Y., HOSODA,

150

A., TANAKA, Y., MORI, M. and OZAKI, Y. : Phenolics
Profile of Mume, Japanese Apricot （Prunus mume100

Sieb. et Zucc.）fruit, Biosci. Biotechnol. Biochem., ７
７,
１
６
２
３〜１
６
２
７（２
０
１
３）

50

４）KISHIDA, K., SUZUKI, M., HEYA, Y., YAMAZAKI, Y.,
HORINISHI, A. and OZAKI, Y. :

0
0

20

40

60
80
Time（min）

100

120

Phenolic Extractfrom Japanese Apricot Fruit （Prunus Mume Sieb
et Zucc.） Inhibits Disaccharidase Activity in theFig. ６ Suppressive effects of TAP on postprandial blood
glucose levels after administration of starch in rats.
Data are expressed as mean values with SE（n ＝６）−−−△−−−, Control ; ― ● ―, TAP ５
００!/" BW ; Each value
represents the mean±SE（n ＝６）

Small Intestine and Suppresses the Postprandial
Elevation of Glucose Levels in Rats, Food presser.
Sci., ４
０, １
１
９〜１
２
５（２
０
１
４）
５）OE, T., TAKENAKA, M., NEGORO, K., FURUYA, T.
and

MITANI,

T. :

Japan

Kokai

Tokkyo

Koho

１
９
１
８
６
１（Oct. １
１, ２
０
１
２）
that JAPE also inhibits rat small intestinal maltase,６）SINGLETON, VL. and ROSSI, J. :glucoamylase and lactase, and postprandial blood

Total

glucose levels are significantly suppressed when

Phosphotungstic

maltose, sucrose, and starch are administrated torats in combination with JAPE４）. There are somedifferencesin

specificity

betweensuppressive

Phenolics

with

Acid

Colorimetry of

Phosphomolybdic -Reagents,

Am.

J.

Enol.

Viticult., １
６, １
４
４〜１
５
８（１
９
６
５）
７）OE, T., SAKURAI, N., NEGORO, K., KUWABARA, A.,actionandsubstrate

OKAMURO, M. , MITANI,

T.

and

HOSOHIRA,

M. :

and

JAPE.

Further

Relationships

betweenSurface

Blushing

andresearch on the minor phenolics in Japanese apricot

Qualitative

Componentsof（P. mume Sieb et Zucc.）would clarify the reason for（ Prunus mume Sieb. et Zucc. ） ‘Nanko’ Fruit, J.

TAP

these results. The information that TAP derived
from

fruit

‘Tsuyuakane’

disaccharidases

would

be

inhibits
oneofintestinal

the

distinct

properties of this cultivar, as well as its red color.

Japanese

Apricot

Japan. Soc. Hort. Sci. ８
１, １
１〜１
８（２
０
１
２）
８）CHUN, O.K., KIM, D.O. and LEE, C.Y. : Superoxide
RadicalScavenging

Activity

of

the

Major

Polyphenols in Fresh Plums, J. Agric. Food Chem.,
５
１, ８
０
６
７〜８
０
７
２（２
０
０
３）

Acknowledgments

This research was conducted

９）FUJIMOTO, K. , NAKAMURA, S. , MATSUMOTO, T. ,as a part of the Science and Technology Research

OHTA, T. , OGAWA, K. , TAMURA, H. , MATSUDA, H.

Promotion

and YOSHIKAWA, M. : Medicinal Flowers. XXXVIII.

programfor

Agriculture,

Forestry,

Fisheries and Food industry, MAFF, JAPAN.

Structures of Acylated Sucroses and Inhibitory
Effects of Constituents on Aldose Reducatase from

References

the Flower Buds of Prunus mume, Chemical and

１）YAEGAKI, H., YAMAGUCHI, M., HAJI, T., SUESADA,
Y., MIYAKE, M., KIHARA, T., SUZUKI, K. and UCHIDA,

Pharmaceutical Bulletin, ６
１, ４
４
５〜４
５
１（２
０
１
３）
１
０）KIM, D. O., CHUN, O. K., KIM, Y. J., MOON, H. Y. and

M. : New Japanese Apricot Cultivar ‘Tsuyuakane’,LEE, C. Y. :Kajukenkyusyo Kenkyuhoukoku, １
３, １〜６ （２
０
１
２）（in

Their Antioxidant Capacity in Fresh Plums, J.

Quantification of Polyphenolics andAgric. Food Chem., ５
１, ６
５
０
９〜６
５
１
５（２
０
０
３）

Japanese）
２）OE, T., TAKENAKA, M., SAKURAI, N., NEGORO, K.,
FURUYA, T. , OKAMURO, M.

andTSUCHIDA,

Y. :１１）OE, T., TAKENAKA, M., NEGORO, K., KITAMURA, Y.,
MATSUKAWA, T., MITANI, T., AKAGI, T., FURUYA, T.,

Influence of Maturity and Fruiting Condition on

OKAMURO, M. and TSUCHIDA, Y. :Influence ofAccumulationofForce-Ripening

Anthocyanin

Other Functional Components in Japanese Apricot

Accumulation‘Tsuyuakane’ （ Prunus salicina

Lindl. × Prunus‘Tsuyuakane’ （ Prunus salicina × Prunus mume ）mume Sieb. et Zucc.） Fruit, Engeigaku Kenkyu, １
２

Fruit, Engeigaku Kenkyu, １５（４）, ４
３
９〜４
４
４（２
０
１
６）

of

Anthocyanin

andContent

Condition
andContentonofComponents

of

162

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（in Japanese）
１
２）HOFFMAN,

L. ,RITZENTHALER,
POLLET,

B.

BESSEAU,S. ,GEOFFROY,

P. ,MEYER,D. ,LAPIERRE,

C. ,LEGRAND,

M. :Silencing

of

C. ,
and

Hydroxycinnamoyl-Coenzyme
QuinateA

ウメ赤肉品種 ʻ露茜ʼ 果肉中のフェノール性化合物の特徴とラットの食後血糖値への影響
堀西朝子＊１・雪本＊１Shikimate /Hydroxycinnamoyltransferase（ 12 ）

岸田邦弘 ・森Affects＊１

Phenylpropanoid Biosynthesis, The Plant Cell , １
６,

亮＊１・東出晃平＊１
一＊２・尾!嘉彦＊１

近畿大学生物理工学部食品安全工学科

（〒６
４
９―６
４
９
３ 和歌山県紀の川市西三谷９
３
０）

１
４
４
６〜１
４
６
５（２
０
０
４）

＊２

１
３）LALLEMAND, L.A., ZUBIETA, C., LEE, S. G., WANG,

和歌山県工業技術センター

（〒６
４
９―６
２
６
１ 和歌山県和歌山市小倉６０番地）

Y., ACAJJAOUI, S., TIMMINS, J., McSWEENEY, S., JEZ, J.
M, McCARTHY, J. G. and McCARTHY, A. A. :A

新品種のウ メ（Prunus mume Sieb. et Zucc.） 露 茜

Structural Basis for the Biosynthesis of the Major

は，ウメ

Chlorogenic

間交雑種である。果実の成熟に伴い果皮に加えて果肉に

Acids

Found

in

Coffee,Plant

Physiology, １
６
０, ２
４
９〜２
６
０（２
０
１
２）

養青梅

とニホンスモモ

笠原巴旦杏の種

もアントシアニンを蓄積し鮮紅色に着色するという特徴

１４）CHENG, Y. , LIU, L. , YUAN, C. and GUAN, J. :があり，エチレンガスにより，追熟するとさらにアント

Molecular Characterization of Ethylene - Regulated

シアニン量が増加することが知られている。本研究ではAnthocyanin Biosynthesis in Plums During Fruit

露茜

Ripening, Plant Mol Biol Rep, ３
４, ７
７
７〜７
８
５（２
０
１
６）

養青梅

１
５）AKKARACHIYASIT, S., CHAROENLERTKUL, P., YIBCHOK-のフェノール性化合物の特徴を，親品種のウメと日本スモモ

笠原巴且杏 ，主要品種である

南高との比較，および追熟中の変動から解析した。

Inhibitory

露茜

果肉中のアントシアニンの蓄積はその親品種でActivities of Cyanidin and Its Glycosides and

ある

笠原巴旦杏

anun,

S.

and

ADISAKWATTANA,

A. :の形質由来であると推察された。まSynergistic Effect with Acarbose against Intestinal

た， 露茜

α - Glucosidase and Pancreatic α - Amylase, Int. J.

ェノール成分であることは， 養青梅

Mol. Sci. １
１, ３
３
８
７〜３
３
９
６（２
０
１
０）
１
６）ADISAKWATTANA,CHAROENLERTKUL,P.

Cyanidin-３-rutinoside

露茜

S.,

YIBCHOK-anun,

S.,

and

WONGSASIRIPAT,

N. :alleviates

postprandialの特徴であるネオクロロゲン酸が主たるフの特徴であった。

果実の赤色強化法である未熟果のエチレンガスによる追熟処理ではアントシアニン類だけでなく，ネオ
クロロゲン酸濃度も上昇させた。 南高
茜と同様に， 露果肉にもヒドロキシ桂皮酸アセチル化シヨ糖エステ

hyperglycemia and its synergism with acarbose

ル類が存在することがLC-MS分析によって示唆された。

by inhibition of intestinal α-glucosidase, J. Clin.

さらにBiochem. Nutr., ４
９, ３
６〜４
１（２
０
１
１）

ラット小腸二糖水解酵素阻害効果とラットの血糖上昇抑露茜のフェノール性化合物両分（TAP）の制効果について評価した。TAPはマルターゼ，グルコ
アミラーゼとスクラーゼに対して阻害活性を示した。また，ラットにおいてデンプン投与後の血糖上昇を遅延させたが，マルトースとスクロースでは顕著な効果を示さ
なかった。
（平成２
８年１
１月１
４日受付，平成２９年３月６日受理）

（ 13 ）

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７ 〔Article〕

163

Flow-mediated Vasodilation Response to Ingestionof Omega-3-rich Sacha-inchi Oil : A Noninvasive Evaluationof a Functional Food for Human Vascular
MINAMI Kazuhiro＊１§, KASHIMURA Osamu＊２, MAEZAKI Yuji＊３, KIYOYANAGI Noriko＊４,
NIWA Koichi＊１, SAGANE Yoshimasa＊１ and WATANABE Toshihiro＊１＊１ Department of Food and Cosmetic Science, Faculty of Bioindustry, Tokyo University of Agriculture,
196 Yasaka, Abashiri, Hokkaido 099−2493＊２ Faculty of International Agriculture and Food Studies, Tokyo University of Agriculture,1−1−1 Sakuragaoka, Setagaya-ku, Tokyo 156−8502＊３ Nippon Kayaku Food Techno Co., Ltd., 219 Iwahana-cho, Takasaki, Gunma 370−1208＊４ Nippon Kayaku Co. Ltd., 1−1, Marunouchi 2-chome, Chiyoda-ku, Tokyo 100−0005

In this study, we designed a noninvasive method to evaluate functional foods for improvements inendothelial function. Omega-３ fatty acids are known to exert cardio-protective effects, including
improvement of endothelial function. Endothelial dysfunction is an early event in hypertension andarteriosclerosis, and can lead to blood pressure increases and formation of plaques that block blood
flow. The flow-mediated vasodilation（FMD） response is considered to represent endothelial function.
Oil from the seeds of Sacha-inchi（Plukenetia volubilis L.）contains ４
５５. ％ α-linolenic acid（ω３）of total
fatty acid content, while canola oil contains only ９.７％ α-linolenic acid. Twenty healthy subjects （１０males and １０ females ; age ２
１６. ±０８. ３ years）were given a single dose of ３
５
０! Sacha-inchi oil orcanola oil. FMD of the subjects was １
１２. ±２５. ３％ at baseline. Three hours after ingesting Sacha-inchi
oil, the FMD of the subjects increased to １
７.２ ±１.８
２％. Ingesting canola oil resulted in an FMD
increase to only １
１.７ ±２.０
５％. These findings suggest that Sacha-inchi oil can improve endothelial
function. We suggest that FMD-based evaluation of functional foods is a viable tool for assessing theirefficacy in promoting human vascular health.
（Received Oct. ３
１, ２
０１６；Accepted Apr. ２
７, ２
０
１
７）
Key words：Flow-mediated vasodilation, endothelial function, Sacha inchi, functional food, omega-3 fatty acid
血流依存性血管拡張反応，血管内皮機能，サチャインチ，機能性食品，ω３脂肪酸

To

date,

functional

multiplefoods

arteriosclerosis,

studieshavecharacterizedchanges in the susceptibility of the receptor forcanaffecthypertension,vasoactive substrates９）〜１３）.

thatdisease.

Cardiovascular disease（CVD）is the leading cause

However, most of these studies were based on dataandcoronary

arteryof death in the USA and accounts for ３
２％ of allfrom animal and cell culture assays, and only adeaths１４）. In Japan, CVD is the second-leading cause

small number employed human-based tests. In theof death and the most prevalent disease, based onlatter, evaluations relied mainly on measuring bloodnational medical care expenditure data１５），１６）. The

１）〜４）

pressure changes and pulse-wave velocity
assessment

providesindirect. Thisinformationonvasomotor tone, an important indicator of vascularfunction５）〜８） .

prevalence of short-term risk factors for CVD, suchassmoking,

high

blood

pressure,

and

high

cholesterol levels, has recently decreased graduallytheowing to clinical and public health efforts andamount of tension in the smooth muscle insideeducation１７）. However, many adults who are at low

blood vessel walls, particularly in arteries. Manyrisk for CVD in the short term are nonetheless atfactors control vasomotor tone, including vasoactive

high risk over their lifespan１８），１９）. Therefore, daily

substances, structural shift of the vascular wall,

diet appears to be an important factor in reducing

desensitization of the vascular nerve system, andlifetime risk for developing CVD.

endothelial

Vasomotor

tone

is

§ Corresponding auther, E-mail : k1minami@biondustry.nodai.ac.jp

164

Food Preservation Science

（a）

（b）

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 14 ）（c）（d）

Extraction of
the seeds

DryingCold-press andencupsulated ingelcaps

Fig．
１ Sacha-inchi and Sacha-inchi oil capsules（a）Sacha-inchi fruit.（b）Dried Sacha-inchi fruits.（c）Sacha-inchi seeds.（d）Sacha-inchi oil encapsulated in gelcaps.

One of the factors responsible for vasomotor tone,

Materials and Methods

flow- mediated vasodilation （ FMD ）, which is thedilation response of the artery to the shear stress

１．Materialsof blood flow, has been utilized in clinical medicine

Sacha-inchi seeds from Peru （Fig. １） were cold-

for a noninvasive method to examine endothelialpressed to release the oil. The oil was left to standfunction２０，２１）. Vascular endothelial cells produce nitric

for ２
４ h, and the precipitation was removed. The

oxide （NO） in response to the shear stress fromsupernatant was used as Sacha-inchi oil. The oil wasincreased blood flow. NO acts as a trigger for

encapsulated into ３
５０-# softsmooth - muscle action

gelatin containing caramel pigment.

todilatevesseldiameter.

Measuring the FMD has been established as adiagnostic method in which blood flow is arrested

capsulesmadeof

２．Fatty acid contents
The

fatty

acids

in

the

oil

were

esterified

using cuff inflation and released when the cuff is

as follows. Oil samples （４０-６０ # ） and ６ # ofdeflated. This increases blood flow, which results inheptadecanoic acid （ as internal standard ） were

FMD induction. FMD can be detected by diagnostic

dissolved in ２! of hexane in test tubes with screw

ultrasound imaging as a dynamic image of thecaps. After the hexane was evaporated by nitrogen

expanding vessel diameter. Currently, FMD is usedgas, the samples were dissolved with ０.５ M NaCl/

to diagnose the initial symptoms of hypertension

methanoland arteriosclerosis in humans.

nitrogen gas. The samples were heated at １
０
０℃ forandthensealedafter

purgingwithIn this study, we designed a noninvasive method

９ min with periodic shaking. After chilling on ice, ato evaluate the effects of functional foods using anboron trifluoride-methanol reagent was added to the

FMD-based strategy termed FMD-based Evaluation

samples, which were then sealed after purging withof Functional Food for Vascular Health（FEFF-VH）,

nitrogen gas. The samples were heated at １
０
０℃ forin which FMD measurement is conducted under

７ min with periodic shaking and then chilled on ice.

conditions of

this

Next, the samples were mixed with ３! of hexane,

strategy as an evaluation method, we focused on

and ５! of saturated saline solution were added.

omega-３ fatty

The mixture was centrifuged at １,５００ rpm for １０

dietary

restriction.

acids,

becauseTo

assessmultiplestudies,

including primary and secondary prevention clinical

min,

and

the

hexanelayer

wascollected

trials, and some studies which measured FMD,

gas chromatography （GC） withconcluded that the consumption of omega-３ fatty

detection（FID）. The separation was achieved using

flame

for

ionization

acids is an effective dietary strategy to reduce thean InertCap Pure-WAX column, ３
０ m × ０２
.５" ×risk factors of CVD２２）〜２４）. We selected Sacha-inchi oil

０２. ５ !（GL Sciences, Tokyo, Japan）. The split ratio

as an omega-３-rich food, rather than individual fatty

was １：８０ and the carrier gas was helium at １
００acids, because our focus is on establishing thekPa. The injection volume was １０. µ$. The injector

evaluation procedure in functional foods. Additionally,and detector temperature were ２
５
０℃ and ２
６０℃ ,the oil from the seeds of the Inca peanut or Sacha-

respectively. The oven temperature was held at

inchi（Plukenetia volubilis L.） contains high levels of

１
５
０℃ for ５ min and then increased to ２
５
０℃ at aomega-３ fatty
acid２５），２６）.

acids

in

the

form

of

α-linolenic

rate of １
０℃/min ; the temperature was held for ２０min.

（ 15 ）

〔Article〕 FMD-based Test of Functional Foods

Single-dose exposure

165

Measuring the FMD

Day 1Take cereals andmilk as breakfast,
lunch and dinner

UltrasoundCuﬀ inﬂated

Cuﬀ deﬂated
Cuﬀ deﬂated

Cuﬀ inﬂated

Time

Day 2

Inﬂating

Take cereals andmilk as breakfast

Deﬂating

Bloodvelocity

Ultrasound imaging

Ingestion offunctional foodAD（mm）
FMD is measured
3h after ingestion
After release of the cuﬀ, AD is measured from ultrasound imaging
FEFF-VH method（FMD-based evaluation of functional food for vascular health）
Fig．
２ FMD-based Evaluation of Functional Food for Vascular Health（FEFF-VH）method
In this method, a single dose of the functional food to be evaluated is administered under conditions of dietary restriction to
avoid confounding（left）. Flow-mediated dilation（FMD）is then measured（right）. Following food restriction, the subjects were
given a capsule containing the Sacha-inchi oil or a placebo. After ３h, the FMD response was measured. After avascularization
with a cuff for ５ min, blood flow is released by deflating the cuff. Monitoring of the brachial artery by ultrasound imaging is
initiated concurrently with cuff deflation. Arterial diameter （ AD ） is measured from the ultrasound imaging. The FMD is
calculated as（ADmax -ADat rest）/ADat rest.

３．Subjects

Subjects were asked not to take any nutritional

In September ２０１
６, ２
０ healthy students（１０ malesupplements on the day before the test or on theand １
０ female） at Tokyo University of Agriculture

morning of the test, except for ９
０-１
３０ g / meal ofaged １９ to ２
１ years were recruited for the study.

cereal （Flugra, Calbee, Tokyo, Japan） and ６
０
０-８
０
０

We selected healthy subjects without a history of!/dayhypertension, diabetes mellitus, or dyslipidemia, torestriction was to avoid the intake of omega-３ fatty

avoid potential influence on endothelial function. The

acids. Subjects were given a capsule containing ３
５
０

study

" of either the test oil or placebo oil, which wasprotocolUniversity

of

was

approved

Agriculture

by

the

Tokyo

Committee

of

Human

Informed

consent

of

milk.

The

purposeofthedietary

prepared at Nippon Kayaku Food Techno Co., Ltd.

for

（ Takasaki, Japan ）, and FMD was measured ３ hparticipation in the study was obtained from allafter the oil was administered. Before measuring

subjects.

FMD,

Subject

Research

Ethics.

４．FEFF-VH, a combined method of food restriction
and FMD measurement
function,

we

blood

pressurewasmeasuredusing an electronic sphygmomanometer （ ES-P２
０
００,
Terumo, Tokyo, Japan）. To arrest the blood flow inTo evaluate the improvement capacity of vascularendothelial

subjects’

conductedacombined

the brachial artery, pressure （ blood pressure plus
４
０ ! Hg ） was applied to the antebrachial region

method of food restriction and FMD measurement

using the cuff of a mercurial sphygmomanometer（Fig. ２）. The study was performed at the Okhotsk（ Yamasu, Japan ） for ５ min. The pressure wasCampus of Tokyo University of Agriculture between

released by deflating the cuff, and the brachial

September ２０
１
６ and January ２０１
７. Each subject

artery was monitored concurrently by ultrasonic

was randomly administered a single dose of thediagnostic equipment （ LOGIQ P６, GE Healthcare,

Sacha inchi oil or canola oil （as placebo） as a soft

Little Chalfont, UK ）. The arterial diameter （ AD ）capsule in a cross-over manner. The second dosewaswas administered more than a week later.

（Media Cross Co. Ltd, Japan ）. Based on the AD

measured

using

the

FMDscope

software166

Food Preservation Sciencemeasurement, the expansion rate of the FMD （％FMD）was calculated.

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

Table １ Fatty acid contents in the Sacha-inchi oil andcanola oil used as a placebo

５．Serum measurement
High-density lipoprotein （ HDL ） cholesterol andlow-density lipoprotein （ LDL ） cholesterol levels ofthesubjects

weredetermined

using

an

Alere

Afinion AS１
０
０ Analyzer（Alere Inc., Waltham, MA,USA）.
６．Statistical analysis
Thevaluesareexpressed

as

the

mean

（ 16 ）

Fatty acids（％）

Sacha-inchi oil

Canola oil

α-Linolenic acid
Linoleic acid
Oleic acid
Palmitic acid
Stearic acid
Others

４
５．
５
３
３
５．
５
１
０．
４
９
４．
６
１
３．
２
３
０．
６
４

９．
７
２
０．
６
９
５
７．
５
６
４．
７
３
１．
９
１
５．
４
１

±

standard deviation. The differences in mean values

２．Evaluation of Sacha-inchi oil by the FEFF-VH
methodwere assessed with one-way ANOVA followed by
the Bonferroni multiple comparisons test. p ＜０.０
１
was considered statistically significant.

Results
１．Fatty acid contents in Sacha-inchi oil

To assess the oil’s capacity to improve vascularendothelial function, we used the noninvasive FEFFHV evaluation method （Fig. ２）. The characteristicsof the subjects are shown in Table ２. Whole - day
food restriction was used to prevent the effects

The fatty acid contents in the oil were analyzedof diet on vascular endothelial function. Fig. ３（a ）by GC （ Table １）. The most abundant fatty acidshows the typical AD dilation response to ingestion

was α-linolenic acid（４５５. ％）, an omega-３ fatty acid,offollowed by linoleic acid（３５.５％）, an omega-６ fatty

maximal value ６０ sec post-cuff release. Based on the

Sacha-inchi

oil.

The

FMD

response

reachedacid. The fatty acid contents in the canola oil

maximum AD （ ADmax ） and baseline AD （ AD atplacebo were also analyzed. The most abundantrest ; AD immediately before arresting the blood

fatty acid in the canola oil was oleic acid （５７.６％）

flow by cuff）, the expansion rate of the FMD was
calculated as（ADmax - ADat rest）/ADat rest（Fig. ３（b））.

（Table １）. α-linolenic acid comprised only ９.７％ of
the total fatty acids. Fatty acid contents in Sacha-

Fig. ４ shows the mean expansion rate in subjects

inchi oil have been previously analyzed２６），２７） ; these（ stratified by gender ） at baseline and following

reports also characterized the oil as omega-３-rich.

ingestion of Sacha-inchi oil or placebo. At baseline,
the subjects’ AD expansion rate was ９.７ ± ２.４
９％（males）,１
２４. ± １９. ４％（females）, and １
１２. ± ２５. ３％

Table２ Baseline characteristics of study participants（±standard deviation）
Parameter

Male（n＝１０）

Female（n＝１０）

Total（n＝２０）

Age（years）
Height（㎝）Weight（㎏）Systolic blood pressure（㎜Hg）
At baseline
After ingesting placebo
After ingesting Sacha-inchi oil
Diastolic blood pressure（㎜Hg）
At baseline
After ingesting placebo
After ingesting Sacha-inchi oil
High-density lipoprotein（HDL）cholesterol（㎎/d!）
After ingesting placebo
After ingesting Sacha-inchi oil
Low-density lipoprotein（LDL）cholesterol（㎎/d!）
After ingesting placebo
After ingesting Sacha-inchi oil

２
１．
６±０．
９
７
１
７
１．
８±６．
１
６
６
７．
０±６．
１
６

２
１．
５±０．
７
１
１
６
２．
３±４．
０
０
５
１．
１±３．
３
０

２
１．
６±０．
８
３
１
６
７．
１±７．
０
２
５
９．
０±９．
４
７

１
２
９．
６±１
３．
０
１
１
２
８．
７±８．
９
４
１
２
５．
９±９．
６
５

１
１
６．
５±１
２．
９
７
１
１
５．
３±１
２．
６
４
１
１
１．
９±１
０．
１
５

１
２
３．
１±１
４．
３
２
１
２
２±１
２．
６
８
１
１
８．
９±１
２．
０
２

６
６．
１±５．
２
４
７
０．
９±１
１．
７
９
７
５．
１±１
４．
０
７

５
９．
３±１
２．
６
８
７
２．
７±８．
１
４
６
６．
６±６．
９
８

６
２．
７±１
０．
０
６
７
０．
９±９．
９
０
７
０．
９±１
１．
６
５

６
６．
４±１
２．
８
２
６
６．
０±１
６．
２

７
５．
２±２
１．
２
８
７
３．
５±２
１．
４
８

６
８．
３±１
６．
８
３
６
７．
５±１
８．
７
１

８
５．
３±１
８．
７
１
８
２．
８±２
２．
４
２

７
１．
０±１
０．
０
７
７
２．
８±５．
３
０

７
８．
２±１
６．
６
５
７
７．
８±１
７．
０
４

（ 17 ）

〔Article〕 FMD-based Test of Functional Foods

4.5

20
4.0

FMD（%）

AD（㎜）

**
**

25

AD max

（a）

3.5

167

**
**

**
**

15
10
5

3.0
20

0

40
60
80
100
Time afrer cuﬀ deﬂation（sec）

Male
Baseline（b）% FMD =

AD maxFemale
Total
Placebo
Sacha-inchi oil

Fig．
４ Expansion rate of the FMD at baseline and after
a single-dose administration of Sacha-inchi oil or placebo− AD at rest

AD at rest

Data represents the mean of all subjects, and the error bars
indicate the standard deviation.＊＊, p＜０．
０
１.

Fig ．
３ A representative measurement of the flow mediated dilation（FMD）response in a subject who
ingested Sacha-inchi oil（ a ） A representative line graph recording the arterial
dilation （AD） mediated by the increase in blood flow.
The AD was measured by the method illustrated in Fig.
３.
（ b ） Formula for calculating the expansion rate of the
FMD. ADmax is defined as the maximum AD reduced byan increase in blood flow, and ADat rest is defined as the
AD at baseline.

（total）. Normal endothelial functions are defined as
an AD expansion rate greater than ６％, and rates
lower than ６％ are considered to indicate endothelial２８）dysfunction（Fig. ５（a））. Thus, all subjects in thisstudy

exhibited

normal

FMD

response.

Afteringestion of the Sacha -inchi oil, the AD expansion
rate increased significantly to １
７３
. ±１５
. ４％（males ;
p＜００
. １）
,１
７１
. ± ２０. ５％（females ; p＜００
. １）, and １
７２
.
± １.８
２％ （ total ; p ＜０.０１）. Since the significant
increase of the expansion rate was not induced by

（a）

2

4

6

Endothelial dysfunction Borderline

8

10 %FMD

Normalimprove endothelial function
Sacha-inchi oil（b）prevent endothelial
dysfunction

Hypertension

Red blood cells
NormalEndothelial
dysfunction

Increased bloodpressure

Arteriosclerosis
Plaqueformation
Fig．
５ Schematic model for the effect of the Sacha-inchi oil on vascular health（a）Normal endothelial functions are defined as an expansion rate（％ flow-mediated dilation［FMD］）＞６％. We
ofund that consumption one-time dose of Sacha-inchi oil improves the expansion rate in healthy subjects.
（b）Improving endothelial function would theoretically prevent cascade effects leading to cardiovascular disease.

168

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

ingestion of the placebo, the vessel dilation was

Acknowledgement

induced by the Sacha-inchi oil rather than by otherthank Mr. Miyakawa.

（ 18 ）

The

authors

would

like

to

capsule components.
References

３．Discussion
FMD-based

１）KIM, J. A., FORMOSO, G., LI, Y. , POTENZA, M.A. ,noninvasive method to evaluate the effects of omega-３

MARASCIULO, F.L., MONTAGNANI, M. and QUON, M.J. :fatty acid - rich Sacha - inchi oil on vascular health.

Epigallocatechin gallate, a green tea polyphenol,

The vascular endothelium is a tissue that responds

mediatesNO-dependent

to shear stress caused by varying blood flow andsignaling

pathwayspressure, thereby maintaining appropriate vasomotor

requiring reactive oxygen species and Fyn, J. Biol.

In

this

study,

we

designedantone. Endothelial dysfunction is therefore one of theearly signs of hypertension and arteriosclerosis, andvasodilationinvascularusing

endothelium

Chem., ２
８
２, １
３
７
３
６〜１
３
７
４
５（２
０
０
７）
２）KAWASAKI, T., SEKI, E., OSAJIMA, K., YOSHIDA, M.,

is a factor in the pathogenesis of CVD. Hence, we

ASADA,

focused on endothelial function in evaluating the oil.

Antihypertensive effect of valyl-tyrosine, a short

Endothelial dysfunction is closely related to thechain

FMD response２０），２１）. Vessel dilation may be affectedhydrolyzate, on mild hypertensive subjects, J. Hum.

by consumables

such

as

dairy

products,

curry,

K.,

MATSUI,

peptideT.

derivedandfrom

OSAJIMA,sardineY. :muscleHypertens., １
４, ５
１
９〜５
２
３（２
０
０
０）

coffee, and polyphenols from cranberries and grape

３）CHEN, X., TOUYZ R. M., PARK, J. B. and SCHIFFRIN,

seeds２９）〜３２）. Therefore, in this study, we restricted

E. L. : Antioxidant effects of vitamins C and E arefood intake to exclude these confounders.

associatedwithalteredNADPH

oxidase

and

As

shown

in

Fig. ５（a）,

functionallynormalendothelium exhibits an FMD > ６％ , and lower

activation

superoxideofvasculardismutaseinstroke-prone SHR, Hypertension, ３８, ６０６〜６１１（２００１）

expansion rates may indicate endothelial dysfunction.

４）CICERO,

A.

F.,

Since all subjects in our study had functionally

BACCHELLI,S.,VERONESI,

normal vascular endothelium, we demonstrated that

BORGHI, C. : Lactotripeptides effect on office and ２４

Sacha-inchi oil can increase the vasodilation capacity-hof the artery in healthy subjects. Additionally, thestress response, pulse wave velocity and cardiac

consumption of Sacha-inchi oil did not affect blood

output in patients with high-normal blood pressurepressureor first-degree hypertension : a randomized double-

atbaseline

without

theinductionofambulatory

ROSTICCI,

blood

M.,

M.,

GEROCARNI,STROCCHI.

pressure,

blood

E.

B.,
and

pressure

increased blood flow （Table ２）. This indicates thatblind clinical trial, Hypertens. Res., ３
４, １
０
３
５〜１
０
４
０

the Sacha -inchi oil's effect on vasodilation depends

（２
０
１
１）

on

simply５）AMES, R. P., BORKWSKI, A. J., SICINSKI, A. M. andincreasing blood flow capacity. Ingestion of thechangesinblood

LARAGH, J. H. : Prolonged infusions of angiotensin IIplacebo canola oil, which contained low levels ofand balance and aldosterone and cortisol secretion

omega-３ fatty

in normal man and in cirrhosis with ascites, J.

acid,

flow,

did

rathernotthanresultin

FMD

improvement, implying that a threshold level ofomega-３

fatty

acid

is

requiredforClin. Invest., ４
４, １
１
７
１〜１
１
８
６（１
９
６
５）

FMD

６）
CHEN H.-I. and LI, H-.T. : Physical conditioning can

improvement or it could imply that combination

modulate endothelium-dependent vasorelaxation inwith omega-６ fatty acid is required for beneficial

rabbits, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., １
３, ８
５
２〜８
５
６

effects, although the function of the omega-６ fatty

（１
９
９
３）

acid on the vascular function is remained unclear.

７）CHERRY, P. D. , FURCHGOTT, R. F. , ZAWADZKI, J.V.

Vascularendothelial

dysfunction

can

lead

to

and JOTHIANANDAN, D. : Role of endothelial cells in

conditions such as hypertension and arteriosclerosis

relaxation of isolated arteries by bradykinin, Proc.

３
３）
，
３
４）

Natl. Acad. Sci. USA, ７
２, ２
１
０
６〜２
１
１
０（１
９
８
２）

（Fig. ５（b））. Therefore, improving vasodilatory

capacity in response to changes in blood flow may８）RUBANYI, G. M. , CARLOS, R. J. and PAUL, M. V. :reduce risk for CVD. Additionally, our FEFF-VH

Flow-induced release of endothelium-derived relaxing

method is adaptable to individuals in pre-disease or

factor, Am. J. Physiol ., ２
５
０, １
１
４
５〜１
１
４
９（１
９
８
６）

disease stages, to assess the effects of functional

９）DELP, M. D., MCALLISTER, R. M. and LAUGHLIN, M.

foods on CVD.

H. : Exercise training alters endothelium-dependentvasoreactivity of rat abdominal aorta, J. Appl.

（ 19 ）

〔Article〕 FMD-based Test of Functional Foods

polyunsaturated fatty acid, J. Nutr. Biochem., ２
１,

Physiol ., ７
５, １
３
５
４〜１
３
６
３（１
９
９
３）
１
０）FLEMING, I., BAUERSACHS, J. and BUSSE, R. : Paracrine
functions of the coronary vascular endothelium,
Mol. Cell Biochem., １
５
７, ２
３
７〜２
４
５（１
９
９
６）
flow on vascular endothelial intracellular calcium
signaling of rat aortas ex vivo, J. Appl. Physiol ., ８
９,
１
６
５
７〜１
６
６
２（２
０
０
０）

in cardiovascular disease : do they really work ?
Eur. Heart J ., ３
３, ４
３
６〜４
４
３（２
０
１
２）
２
４）WANG, Q., LIANG, X., WANG, L., LU, X., HUANG, J.,
CAO, J., LI, H., and GU, D. : Effect of omega-３ fatty

１２）MARCHENKO, S. M. and SAGE S. O. : A novel
cationic

channelfromtheendothelium of rat aorta, J. Physiol ., ４
９
８, ４
１
９〜４
２
５

acids supplementation on endothelial function : ameta - analysis

ofrandomized

controlled

trials,Atherosclerosis, ２
２
１, ５
３
６〜５
４
３（２
０
１
２）
２
５）HAMAKER, B.R., VALLES, C., GILMAN, R., HARDMEIER,

（１
９
９
７）
１
３）MINAMI, K. and KASHIMURA, O. : Acute exercise
inhibits

７
８
１〜７
９
２（２
０
１
０）
２
３）KROMHOUT, D., YASUDA, S. , GELEIJNSE, J. M. and
SHIMOKAWA, H. : Fish oil and omega-３ fatty acids

１１）JEN, C. J., JHIANG, S. J., and CHEN, H. I. : Effects ofmechanosensitive169

vasoconstriction

of

the

rat

R. M. , CLARK, D. , GARCIA, H. H. , GONZALES, A. E. ,pulmonary

KOHLSTAD, I., CASTRO, M., VALDIVIA, R., RODRIGUEZ,

artery, J. Exerc. Sports Physiol ., １
１, ６
９〜７
５（２
０
０
４）

T. and LESCANO, M. : Amino acid and fatty acid（in Japanese）

profiles of the Inca peanut （Plukenetia volubilis ）,１４）NHLBI. Fact Book, Fiscal Year ２０
１２, National
Institutes of Health, ３
５（２
０
１
３）

Cereal Chem., ６
９, ４
６
１〜４
６
３（１
９
９
２）
２
６）MAURER, N.E., HATTA-SAKODA, B., PASCUAL-CHAGMAN,

１５）Ministry of Health, Labour and Welfare, Vital

G. and RODRIGUEZ-SAONA, L.E. : Characterization andstatistics of Japan ２
０
１６, Tokyo, Japan（２０１６）

authentication of a novel vegetable source of１６）Ministryof

Health,LabourandWelfare,Estimates of national medical care expenditure
２０
１４, Tokyo, Japan（２０１４）

omega-３ fatty acids, sacha inchi（Plukenetia volubilisL.）oil, Food Chem., １
３
４, １
１
７
３〜１
１
８
０（２
０
１
２）
２
７）GUILLEN, M. D., RUIZ, A., CABO, N., CHIRINOS, R.

１７）BERRY, J. D. , DYER, A. , CAI, X. , GARSIDE, D. B. ,and PASCUAL, G. : Characterization of Sacha inchi

NING, H., THOMAS, A., GREENLAND, P., HORN, L.V.,（Plukenetia volubilis L.） oil by FTIR spectroscopy

TRACY, R. P. and LLOYD -JONES, D. M. : Lifetime risks

and H NMR. Comparison with linseed oil, J. Am.

of cardiovascular disease, New Eng. J. Med., ３
６
６,

Oil Chem. Soc., ８
０, ７
５
５〜７
６
２（２
０
０
３）

３
２
１〜３
２
９（２
０
１
２）

１

２
８）OZKAYAR, N., PISKINPASA, S., AKYEL, F., TURGUT,

１８）BERRY, J. D., LIU, K., FOLSOM, A. R., LEWIS, C.E.,

D., BULUT, M., TURHAN, T. and DEDE, F. : Relation

CARR, J. J., POLAK, J. F., SHEA, S., SIDNEY, S., O’LEARY,

between serum cathepsin D levels and endothelial

D.H., CHAN, C. and LLOYD-JONES, D. M. : Prevalence

dysfunction

and progression of subclinical atherosclerosis ininpatients

withchronic

kidneydisease, Nefrologia, ３
５, ７
２〜７
９（２
０
１
５）

younger adults with low short-term but high２９）NAKAYAMA, H., TSUGE, N., SAWADA, H., MASAMURA,

lifetime estimated risk for cardiovascular disease,

N. , YAMADA, S., SATOMI, S. and HIGASHI, Y. : A

Circulation, １
１
９, ３
８
２〜３
８
９（２
０
０
９）

single consumption of curry improved postprandial

１９）MARMA, A. K., BERRY, J. D., NING, H., PERSELL, S. D.

endothelial function in healthy male subjects : aand LLOYD-JONES, D. M. : Distribution of １０-year andrandomized, controlled crossover trial, Nut. J ., １
３,

lifetime predicted risks for cardiovascular disease

６
７（２
０
１
４）

in US adults : findings from the National Health

３０）BUSCEMI, S., VERGA, S., BATSIS, J. A., DONATELLI,

and Nutrition Examination Survey ２００
３ to ２００６,

M., TRANCHINA, M. R., BELMONTE, S. , MATTINA, A.,

Circ Cardiovasc Qual Outcomes, ３, ８〜１４（２０１０）

RE, A. and CERASOLA, G. : Acute effects of coffee

２０）CHARAKIDA, M., MASI, S., LUSCHER, T.F., KASTELEIN,

on endothelial function in healthy subjects, Eur. J.

J. J. P.

and

DEANFIELD,

J. E. : Assessmentofatherosclerosis : the role of flow-mediated dilatation,
Eur. Heart J., ３
１, ２
８
５
４〜２
８
６
１（２
０
１
０）

Clin. Nutr., ６
４, ４
８
３〜４
８
９（２
０
１
０）
３
１）OCHIAI, R., SUGIURA, Y., OTSUKA, K., KATSURAGI, Y.
and

HASHIGUCHI,

T. : Coffee

beanpolyphenols

２１）KELM, M. : Flow-mediated dilatation in humanameliorate postprandial endothelial dysfunction incirculation : diagnostic and therapeutic aspects, Am.

healthy male adults, Int. J. Food Sci. Nutr. , ６
６, ３
５
０

J. Physiol. Heart Circ. Physiol ., ２
８
２, １〜５（２
０
０
２）

〜３
５
４（２
０
１
５）

D. S. : Mechanisms

３２）LABONTÉ, K., COUILLARD, C., MOTARD-BÉLANGER, A.,

underlying the cardioprotective effects of omega-３

PARADIS, M. - E. , COUTURE, P. and LAMARCHE, B. :２２）ADKINS,Y.

andKELLEY,170

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 20 ）

Acute effects of polyphenols from cranberries and

私たちは，血管機能を向上させる働きのある機能性食

grape seeds on endothelial function and performance

品を評価するための非侵襲的ヒト対象試験法を構築した。

in elite athletes, Sports, １, ５
５〜６
８（２
０
１
３）

ω３脂肪酸は，血管機能を向上させる機能があることが３３）RAJENDRAN, P. , RENGARAJAN, T. , THANGAVEL, J. ,知られている。そこで，本研究では，ω３脂肪酸を多く

NISHIGAKI, Y. , SAKTHISEKARAN, D. , SETHI, G. and含むことで知られるサチャインチオイルを使用した。血

NISHIGAKI, I. : The vascular endothelium and human

管内皮機能障害は，高血圧や動脈硬化などの心血管疾患

diseases, Int. J. Biol. Sci., ９, １
０
５
７〜１
０
６
９（２
０
１
３）

の初期症状である。近年，血管内皮機能は，血流依存性

３４）DEANFIELD, J. E., HALCOX, J. P., and T RABELINK,

血管拡張反応（FMD）の測定によって評価できること

T.J. : Endothelial function and dysfunction : testingが明らかとなっている。本試験に使用したサチャインチ

and clinical relevance, Circulation １
１
５, １
２
８
５〜１
２
９
５

オイルは，リノレン酸が，全脂肪酸の４５．
５％と高い ω３

（２
０
０
７）

脂肪酸含量を示した。サチャインチオイル（３５０㎎）を健康な被験者（男性１０人・女性１０人：平均 年 齢２
１．
６±

サチャインチオイル摂取による血流依存性血管拡張反応：
機能性食品のヒト血管に対する非侵襲的評価法
南和広＊１・樫村修生＊２・前崎祐二＊３・清柳典子＊４０．
８３歳）に経口投与したところ，摂取３時間後のFMD
が１
１．
２±２．
５
３％（通常時）から，１
７．
２±１．
８
２％に上昇した。一方，プラセボとしてキャノーラオイル（９．
７％リノレン酸含有）を投与してもFMDは，１
１．
７±２．
０
５％へ

丹羽光一＊１・相根義昌＊１・渡部俊弘＊１の上昇にとどまった。以上の結果は，サチャインチオイ＊１

ルが，ヒトの血管内皮機能を向上させることを示してい東京農業大学生物産業学部

（〒０
９
９―２
４
９
３ 北海道網走市八坂１９６）る。私たちは，本研究の成果から，FMDを基礎とした＊２

本法を，ヒト血管機能を増進させる機能性食品の簡便で

東京農業大学国際食料情報学部

（〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１）＊３日本化薬フードテクノ㈱

（〒３
７
０―１
２
０
８ 群馬県高崎市岩鼻町２
１
９）
＊４

日本化薬㈱

（〒１
０
０―０
０
０
５ 東京都千代田区丸の内２―１―１）

効果的な評価法として提案する。
（平成２
８年１
０月３
１日受付，平成２
９年４月２
７日受理）

（ 21 ）

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７ 〔Article〕

171

Comparison of Legumes GABA Levels
in Different Growth Stages and Maturity Stages
MINOSHIMA Ryoichi＊１§，＊２ and SHIIBA Kiwamu＊２＊１ Central Research Laboratory, The Nisshin Oillio Group Ltd., 1 Shinmei-cyo, Yokosuka 239−0832＊２ Department of Science and Engineering, Tokyo Denki University, Hatoyama, Hiki-gun, Saitama 350−0394

γ-Aminobutyric acid（GABA）was widely present in many legumes. Soybean GABA was present infully mature stages, but productions also occurred during both the germinating and the grain embryo
stages. Soybean GABA was produced in both immature legumes pod shells and seeds. Soybean GABA
and glutamate may be produced in pod shells in early embryo stage and accumulated in seed during
the late embryo stage. Soybean GABA was produced in immature legumes pod shells, possibly
because of germination and / or reductive enzymatic conditions. Comparisons of chemical properties of
the GABA contents between germinated and immature soybean reveled an optimum temperature
difference for GABA production of ２
０℃. The optimum pH for the germinated soybean slurry was
similarly pH ６, but the immature soybean slurry was stable at a wider pH range. These results may
indicate that two different GAD isomers existed during soybean growth.
（Received Sep. ２６, ２０
１６,；Accepted May １
８, ２
０
１
７）
Key words：soybean，growth stage，GABA，immature，pod shell
大豆，生育ステージ，GABA，登熟期，莢

γ-Aminobutyric acid（GABA）is widely present inthebiosphere

resulting
acid

from

group

in

and

is

generatedtheremovalglutamate

of

in
a

reducing

effectonstresswereGreen soybeans, black soybeans, mung beans,adzuki beans, chickpeas, kidney beans and lentil

GABA’s depressive effect on high blood pressure１）
and

１．Materials

glutamatedecarboxylase（GAD）catalyzed reaction.
２）

Materials and Methods

brain

α-carboxylic

thethroughthereportedpreviously as its primary physiological functions.

were purchased at the Tokyo Metropolitan Central
Whole sale Market.
２．Analysis of free amino acids

Brown rice , soybean , pumpkin , eggplant , andAfter the addition of ２
５
０ ! of ０.５ M phosphate

potato７） are known as GABA-rich foods. GABA

buffer solution（pH ６０. ）to ５０ g of sample in ５００-!

produced by Lactobacilli under anaerobic conditions

stainless steel cup, the suspension was homogenized

３）

４）

５）

６）

８）

９）

has been found in Japanese pickles , kimuchi

andusing a high-speed homogenizer at ６,５００×g for ２
min. ５ ! of trichloroacetic acid solution was added

fermented dairy products１０）.
Additionally, GABA is present in the cotyledons

to ５ g of the homogenate in a ５
０- ! test tube,

Shirayama-dadacha

and centrifuged for １
０ min. at １００
,００×". After

seeds１１）. However, there are no reports on GABA

centrifugation, the supernatant was removed with acontent changes in different bean growth stages or

pipette, filtered with a １０
. ! membrane filter. The

differences in the GABA content between immature

resulting filtrate was analyzed using a Hitachi high-bean pod shells and seeds.

speed amino acid analyzer L-８
８０
０A（Tokyo, Japan）.

and

hypocotylsofimmature

This study compared

in

the

GABA

contents

３．Preparation for germinating soybeans
Theamong a wide range of bean species during theirbeansampleswerewashed

twice

with

GABA

distilled water and ７
０％ ethanol. Then, １
００" of

production during oxidative and reductive reactions.

bean samples were added to １０,０
０ ! of distilled

growthstages.

Additionally,it

revealed

water and soaked at ２
５℃ for ６ h. After soaking
they were placed at ２
５℃ for ３ h. Subsequently,§ Corresponding author, E-mail：r-minoshima@nisshin-oillio.com

172bean samples were

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

with

are

coveredwater - soaked

producedby（ 22 ）

enzymatic

reactionswere

medical gauze （ Hakujuji Co. , Ltd. , Tokyo, Japan ）measured using high-speed amino acid analyzer （L-and water was added.

８８００A, Hitachi）.

The germination time was ２
４ h for soybean and

To determine the optimum pH, samples of amung bean, and ４
８ h for the green and black

homogenized soybean slurry were prepared withsoybeans. At least ８０％ of the germinated beans

１０
０ mM citric acid buffer solution at pH ４５. , acetic

had roots were ≧０.５ ! in length and there wereacid buffer solution at pH ５.０, phosphate buffer

placed for ６ days in a ２
５℃ thermostatic chamber tosolution at pH ６.０, phosphate buffer solution at pH

produce soybean sprouts（roots ６
０ ! or longer）in

７.０, Tris-HCl buffer solution at pH ７.５, Tris - HCl

the dark.

buffer solution at pH ８.０ and Tris - HCl buffer

４．Soil cultivation of a soybean cultivar

solution at pH ８５. .

Beans of the soybean cultivar Tachinagaha（Glycine

To determine the thermal stability, a soybean

max Merr., ２００
９ crop）were soaked in water for １
２

slurry was prepared in １
０
０ mM phosphate buffer

h at ２５℃, covered with soil to produce a seedbed,

solution （ pH ６０
. ）,

and

slurrysamples

were

and then germinated in a thermostatic chamber for

incubated for ５ min. in the thermostatic chambers

２ weeks at ２
５℃with enough water. The soybeans

set temperatures in the range from ２
０℃ to ６５℃.

that sprouted in the seedbed were transplanted to a

７．GABA - producing reaction in soybean slurryfield in Yokosuka, Japan. The first soil covering was
performed after ３ weeks, and a second soil covering

under anaerobic and aerobic conditions
To

investigate

theGABA-producing

reactions

was performed ２ weeks later. Beans at the early

under aerobic and anaerobic conditions, １００ # of aembryo stage of ripening were harvested on the ２０soybean slurry was added to a ３
００-! Erlenmeyer

th day after flowering. Beans at the later embryo

flask, which was placed in a thermostatic chamber

stage of ripening were harvested on the ３
５th day

at ４
０℃

after flowering , and fully ripened beans were（perforated by two glass tubes）.
To

harvested on the ８
０th day after flowering.

andstopperedmaintainaerobic

witharubberplug

conditions,aerationwas

Germinated soybeans were soaked in warm water

performed using an air pump （ Nisso NPS −００３）,

for ６ h at ２
５℃, and excess moisture in the air was

and, to maintain anaerobic conditions, one glass tube

replaced every ３ h. Next, the beans were covered

was perfused with nitrogen gas.

with water-soaked medical gauze （type １, Hakujuji

８．Statistical analysis

Co. Ltd., Tokyo, Japan）, and left in a thermostatic

The data were expressed as mean ± standard

chamber for １
５ h at ２
５℃.

error （ SE ） andanalyzedbyTukey - kramer’s

５．Crude enzyme extractions

multiple comparison post hoc test. The analysis was

The soybean slurries, germinated soybean andcarried out using SSRI （version １.０
３ for windows,

immature soybean, were obtained by mixing beans

SSRI Co., Ltd., Tokyo）. Differences were consideredwith １００ mM phosphate buffer solution（pH ６０. ）in

to be significant at P ＜００. ５.

a １:１（w/w）ratio, followed by fragmentation in a

Results and Discussion

homogenizer for ３ m in. at ６℃ . The pod shells,
which

were

separated

from

the

seeds,

were

１．GABA contents of legumes obtained from thesubjected to a similar fragmentation process towholesale markets

produce pod shells slurries.

Fig. １ shows the GABA contents of the fully

６．Measurement of GABA - producing enzymatic

matured legumes. The GABA contents in mungreactionsbean and in green bean were １
６８
. "/１
０
０# and １
４.

To measure GABA-producing enzymatic reactions,

６ " /１
０
０# , respectively. The GABA content in

２
０ g of soybean slurry was added to a ５０- !

soybean was the lowest, at approximately ４２
. "/１
０
０

Erlenmeyer flask, which was placed in thermostatic# , among the fully matured legumes that werechamber and heated from ２
０℃ to ６５℃ . Sampling

investigated.

was performed at different time points.

２．Changes

The

reactionwasstoppedbyadding５％trichloroacetic acid at a １:１（w/w） ratio, and freeamino acid concentrations, such as GABA, whichinsoybean

GABA

contents

atdifferent growth stages
Fig. ２ shows the changes in the GABA contents
duringsoybeangrowth.

Significant

increaseof

〔Article〕 GABA Levels of Legumues

100

20

GABA and Glutamate contents（mg / 100g）

GABA content（mg /100 g）（ 23 ）

15
10
5
0
①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

173

a

80

a
b

60

c

c
d

40
e

f

20

c

c

d

e

f

0
Early Late Fully 1 day 3 days 5 days Sprout
ﬁlling ﬁlling ripe⑧

Fig. １ GABA contents in fully matured legumes! : green soybean, " : black soybean, # : soybean, $ : chickbean, % : kidney bean, & : red bean, ' : mung bean, ( : lentil.
The legumes were obtained from the wholesale markets.
Mean±SE ; n＝７

GABA contents were observed during the early
embryo period and the sprout period ; P＜０.０
０１）.

Fig. ２ GABA and glutamate contents in soybean
cultivar Tachinagaha（Glycine max Merr.） growth stages
Filled bar : GABA, white bar : glutamate. The days indicatedare days after germination. Early embryo : ２０th day after
flowering, Late embryo : ３５th day after flowering. Fully ripe :８
０th day after flowering. Sprout : ７ days after germination.
Different superscript letters indicate significant differences at
P ＜００. ５. Mean ± SE : n＝５

The GABA content exhibited a １.４-fold increase
theAdditionally,

early

and

significant

lateembryostages.

in

GABA

decreases

thecontent were observed during the late embryo
period and the fully ripe period. The GABA content
showed a ４.７％ decrease rapidly during the lateembryo period and the fully ripe period. After that,
the GABA contents showed a significant ６.８-foldincrease during the fully period and ５ days period.
In addition, during the sprout period and the lateembryo period, the GABA content showed a ３９
. -fold
increase.

AKIHIROetal .

reported

that

150.0
GABA and glutamate contents（mg / 100g）

during

125.0

＊＊＊

100.0

＊＊＊

75.0
50.0
25.0
0.0
Pod shell

GABA

increased in tomato fruits after flowering, reaching amaximum level during the mature green stage andrapidly decreasing after the beaker stage１２）. Our
results were similar, but the underlying mechanisms
are not clearly understood.

＊＊＊
＊＊＊

Seed

Pod shell

Early embryo

Seed

Late embryo

Fig. ３ GABA and glutamate contents in soybean pod
shells and seeds in the early embryo stages and inlate embryo stages at ２
５℃
Filled bar : GABA, White bar : glutamate. Mean±SE ; n＝５
＊＊＊
P ＜００
. ０１.

３．Changes in GABA and glutamate contents insoybean pod shells and in soybean seeds during
the early and late embryo stages

embryo stage. In contrast, the GABA content wasFig. ３ shows the changes in the GABA andglutamate contents in pod shells and inseeds

lower in pod shells than in seeds in the lateembryo stage. These resultsmayindicate

that

GABA was induced in pod shells during the early

during embryo stages.
Significant decreases in the GABA contents wereobserved in pod shells （ P＜０.００１）. The GABA
contents showed ５
１３. ％ decrease during the embryo

embryo stage and accumulated in seeds the lateembryo stage.
We hypothesize that GABA plays a role in thestages of the pod shells. There was a significant

defenseincrease in the GABA content during the early andduring soybean embryo development. GABA haslate embryo stages in seeds（P＜００.０１）. The GABA

previously been reported

content

showeda １３. -fold

increaseduringtheagainst１
３）

invertebrate

１
４）

to

pests
have

and
roles

insects
in

pH

１
５）

and

regulation , nitrogen use , plant development

embryo stages in seeds. The GABA content wasplant defence１６），１７）. Recently, GABA was reported togreater in pod shells than in seeds in the earlyplay roles in reducing herbivory by invertebrate

174

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

25
GABA content（mg / 100g）

60GABA content（mg / 100g）（ 24 ）

50
40
30
20
10

20
15
10
5
0

0
0

1

2

0

3

1

2

3

Time（h）
Germinated slurry

Time（h）
Immature slurry

Fig. ４ Thermal stability of GABA production in soybean slurries● : ２０℃, ■ : ３５℃, ▲ : ４０℃, □ : ４
５℃, ○ : ５５℃, △ : ６５℃.
Left : immature soybean slurry, Right : germinated soybean slurry.

pests１６）

were two different characteristic

GAD

pathogens in tomato . Our results are similar to

GAD ! in the nervous system

and GAD " inthose found in tomato. However, determing thethe liver２１）, heart and blood２２）.

andresistanceagainst s

necrotrophic

１
７）

exact

roles

of

GABA

accumulationinplants２０）

isoforms,

However, there are no reports on the number ofrequires future research.

GAD isoforms in plants. The roles of GABA and４．Comparison of GABA s chemical properties in

GAD in plants requires further study.

germinated and immature soybean

５．Effect of anaerobic and aerobic conditions on（１）Thermal stabilitytheAs shown in Fig. ４ the GABA content of theimmature

soybeanslurryexhibited

incerase

at ３
５℃

over ３ h.

free

amino

acids

in

the

slurriesThe

production

of

free

amino

acids

from

germinatedgerminated soybean slurries maintained for ２ h at
４
０℃ under anaerobic and aerobic conditions arefold increase at ６
５℃ over １ h. The difference in theshown in Fig. ６.

temperature

for

the

of

soybean slurry, the GABA content exhibited a ３.９optimumIn

a ４.４- foldproduction

GABA

production

Under anaerobic conditions, significant increases in

between germinated and immature soybean slurries

the GABA and aspartate contents were observed.

was ２
０℃.

In contrast, significant decreases in the glutamate

We hypothesize that the GABA-producing enzyme

and alanine contents were observed.

GAD should be stable at ３
５℃ to ６５℃, or that there

The GABA contents were increase ２３. -fold during

are two different optimum temperatures for GAD,

００
. -０５
. h（P＜００. １）, １２. -fold during ０５. -１０. h（P＜００. ５）,

one for the germinated soybean slurry and one for

１.２-fold during １.０-１.５ h （P＜０.０５） and ３.３−foldthe immature soybean slurry.

during ０.０-１.５ h （P＜０.０
０１）. Additionally, the（２）Optimum pH

aspartate content was increased １.３-fold from ０.０ h

As shown in Fig. ５, the optimum pH for both the

to １５. h（P ＜００
. ５）.

immature and germinated soybean slurries was pH

In contrast, the glutamate content showed a６, but the immature soybean slurry was stable at a７６９
. ％ decrease from ００. h to ０５. h（P ＜００
. ５） andwider pH range.

a７３３. ％ decrease from ０５. h to １５. h（P ＜００
. ５）. In

The

optimumpHlevels

for

GAD

may

be

different in germinated and immature soybean.

addition,thealaninecontent

showeda ８００. ％decrease from ００. h to ０５. h and a ６５０. ％ decrease

Thus, there were two different characteristics forfrom ０５. h to １５. h（P ＜００
. １）.

GAD during the soybean growth phase. Similarly,

Under aerobic conditions, significant increases in

１
８）

the GABA and aspartate contents were observed,

there are two kinds of GAD in Escherichia coil,eight kinds of GAD in Aspergillus oryzae１９） and two
１
９）kinds of GAD in mushroom . In mammals, there

and significant decreases

in

the

glutamateandalanine contents were observed. The GABA content

〔Article〕 GABA Levels of Legumues

100

Relative GABA activity（%）

Relative GABA activity（%）（ 25 ）

80
60
40
20

100
80
60
40
20

0
4

5

6

7

8

175

0

9

4

5

6

7

8

9

pH

pH

Fig. ５ Optimum pH for GABA production in soybean slurries

a

40

b
b

30

d
c

c
b

20

10

a

a

a

a

c
b

b

b
0

d

c

c

b

0

1
Time（h）

2

Free amino acid contents（mg / 100g）

Free amino acid contents（mg / 100g）

Left : immature soybean slurry, Right : germinated soybean slurry.

a

40

a
b

b

b

b

b

30
b

20

b
a
a

a

b

b

a

a

b

b

b

0

0.5

1
1.5
Time（h）

2

10

a

0

Fig. ６ Free amino acids contents in a germinated soybean slurry■ : GABA, ▲ : glutamate, ◆ : alanine, ● : aspartate.
Left : Under anaerobic conditions, Right : Under aerobic conditions.
Mean±SE, n＝５. Different superscript letters indicate significant differences at P ＜００. ５.

showed a １８
. -fold increase from ００. h to ０５. h（P ＜conditions, glutamate and aspartate are primarily

００. ５）. Also, the aspartate content showed a １.４-foldproduced from alanine. Similar results were reported

increase from ０５. h to １０. h（P ＜００
. １）. In contrast,

by SAWAI et al . using green tea under anaerobic

the glutamate content showed a ７
４.４％ decrease

and aerobic conditions１３）.

between ０ h to １０. h（P ＜００
. ５）
. The alanine content

６．Differences

showed a ７００. ％ decrease between ０ h to １５
. h（P
＜００
. ５）
.

in

the

GABA

content

betweensoaked and germinated soybeans
Fig. ７ shows a comparison of the GABA content

There was a greater conversion of glutamate to
GABA

under

aerobicconditions.

anaerobic

conditions

However,

than

lower

under

level

of

between germinated and soybeans, soaked for １
２ h.
Significant differences in the GABA contents wereobserved between the soaking treatment and theconversion from aspartate to alanine occurred undergermination

anaerobic and aerobic conditions.

content of the soaking treatment was １５. -fold higher

Thus, under anaerobic conditions, GABA may be
primarily

producedfromglutamatethroughtreatment （P＜００
. ５）.

The

GABA

than that of the germination treatment.
The

GABA

content

washigherinsoakedaspartate in a GAD catalyzed enzyme reaction, withsoybeans, which reflect the higher GABA content

alanineunder anaerobic conditions. KATAGIRI and SHIMIZU

also

increasing.

However,under

aerobic

Food Preservation Science

GABA and glutamic acid contents（mg / 100g）

176

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

25

（ 26 ）

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９
６
３〜９
７
２（２
０
０
２）

10

２）KANEHIRA, T. , NAKAMURA, Y. , NAKAMURA, K. ,HORIE, K., HORIE, N., FURUGORI, K., SAUCHI, Y. and5

YOKOGOSHI, H. : Relieving occupational fatigue by
consumption of a beverage containing γ - amino

0
SoakingGermination

butyric acid, J. Nutr. Sci. Viatminol . , ５
７, ９〜１
５

Fig. ７ Free amino acids contents in soaking andgerminated soybean
Filled bar : GABA, White bar : glutamate.
Mean±SE, n＝７. ＊P ＜００
.５

（２
０
１
１）
３）KINEFYCHI, M. , SEKIYA, M. , YAMAZAKI, A. andYAMAMOTO, K. : Accumulation of GABA in brownrice by high pressure treatment, Nippon Shokuhin
Kagaku Kogaku Kaishi, ４
６, ３
２
３〜３
２
８（１
９
９
９）（ insuggested that adding a deoxygenation agent would
be effective in preventing the GABA content of
４）Japanese）
４）KATAGIRI, M. and SHIMIZU, S. :Metabolism ofsoybean sprouts from decreasing during storage ,GABA formation in soybean sprouts treated withand our results supported this hypothesis.

carbon dioxide gas and changes in the GABA
content during storage of the rich GABA soybean

Conclusion
GABA

production

dependedsprouts,onthesoybeanJapan

Association

of

Food

Preservation

Science, ２
０, １
８
１〜１
８
５（１
９
９
４）
（in Japanese）

growth stages and the legume species. Soybean

５）UZAWA, M., OKUYAMA, S., MURATA, M., SATO, R.

GABA was produced in the fully mature stages, but

and OMORI, M. : Development of manufacturing

productions

theprocess of squash products rich in γ-aminobutyric

germinating and the grain embryo stages. Soybean

acid, and an effect of the products on the blood

GABA was produced in both immature legume podpressure

shells and seeds.

Nippon Shokuhin Kagaku Kougaku Kaishi, ４
９, ５
７
３〜

also

occurred

duringboth

Soybean GABA and glutamate may be producedinpodshells

in

the

early

embryo

stage

and

of

spontaneouslyhypertesive

rats,

５
８
２（２
０
０
２）
（in Japanese）
６）HORIE, H. , ANDO, A. and SAITO, T.

:

The

accumulated in the seed during the late embryo

Contents of γ-aminobutyric acid in eggplant andstage. Soybean GABA was produced in immatureits

legumes pod shells, possibly because of germination

Shokuhin Kagaku Kougaku Kaishi, ６
０, ６
６
１〜６
６
４

accumulation

with

heat

treatment,

Nipponand/or reductive enzymatic conditions. Comparisons

（２
０
１
３）
（in Japanese）

of the chemical properties of GABA production

７）NOGUCHI, T. , NAKAMURA, K. and KOGA, H.
γ-aminobutyric:

between germinated and immature soybean reveled

Methods

an optimum temperature difference of ２
０℃ for（GABA）in potato tubers. Nippon Shokuhin Kagaku

GABA production. This result may indicate thattwodifferentsoybean

GAD

growthisomers

period.

existed

Immatureduringthesoybeanforincreasingacid

Kougaku Kaishi, ５
４, ４
４
７〜４
５
１（２
０
０
７）
（in Japasese）.
８）UENO, Y., HIRAGA, K., MORI, Y. and ODA, K. :pod

Isolation and utilization of a Lactic bacterium,

shells contained ７００. ％（w/w） of dietary fiber andproducing a high level of γ-aminobutyric acidlow amounts of proteins and fats. Thus, high-purity（ GABA ）. Seibutu-Kougau Kaishi, ８
５, １
０
９〜１
１
４

GABA powder could be easily obtained with a

（２
０
０
７）
（in Japanese）

higher yield.

９）CHO, Y. R., JI, Y. C. and HAE, C. C. : Production of

We will study the use of immature soybean pod

gammav-aminobutyric acid（GABA）by Lactobacillus

shells during the early embryo stage to produce abuchnerihigh-purity GABA powder.

neuroprotective effect on neuronal cells. J.Microbiol.

isolatedfromkimchiandits

Biol.technol ., １
７, １
０
４〜１
０
９（２
０
０
７）
１
０）NOMURA, M., KIMOTO, H., SONEYA, Y., FURUKAWA,

（ 27 ）

〔Article〕 GABA Levels of Legumues

S. and SUZUKI, I. : Production of γ-aminobutyric177

glutamate decarboxylase, at the expression sites.

acid by cheese starters during cheese ripening. J.

Journal of Japanese Biochemoical Society., ８
７, ３
３
３〜

Dairy Sci., ８
１, １
４
８
６〜１
４
９
１（１
９
９
８）

３
３
６（２
０
１
５）
（in Japanese）

１
１） ABE, T. and TAKEYA, K. :Difference in γ-

２０） PETROFF, O. A. :GABA and glutamate in theaminobutyric acid content in vegetable soybean

human brain. Neuroscientist, ８, ５
６
２〜５
７
３（２
０
０
２）

seed. Nippon Shokuhin Kagaku Kougaku Kaishi, ５２,２１） KIM, H. Y. , YOKOZAWA, T. , NAKAGAWA, T. and
SAKAI, S. : Protective effect of γ-aminobutyric acid

５
４
５〜５
４
９（２
０
０
５）
（in Japanese）
１
２）AKIHIRO, T., KOIKE, S., TANI, R., TOMINAGA, T.,against glycerol-induced acute renal failure in rats.

WATANABE, S. , IIJIMA, Y. , AOKI, K. , SHIBATA, D. ,Food

ASHIHARA, H., MATSUKURA, C., AKAMA, K., FUJIMURA,

（２
０
０
４）

T. and EZURA, H. :Biochemical mechanism on

GABA accumulation during fruit development in

Chemical Toxicology. ４
２, ２
０
０
９〜２
０
１
４

and

２
２）GORDON, F.J. and SVED, A. F. : Neurotransmittersin central cardiovascular regulation :Glutamatetomato. Plant and cell physiology, ４
９, １
３
７
８〜１
３
８
９

and GABA. Clin. Exp. Pharmacol Physiol ., ２
９, ５
２
２〜

（２
０
０
８）

５
２
４（２
０
０
２）

１
３） TSUSHIDA, T. and MURAI, T. :Conversion of

glutamic acid to γ-aminobutyric acid in tea leaves
under anaerobic conditions. Agric. Biol. Chem. ５
１,

豆類の生育ステージ，登熟期のGABA量の比較
蓑島良一＊１，＊２・椎葉

２
８
０
５〜２
８
７
１（１
９
８
７）
１
４）BOWN, A.W. and SHELP, B. J. : The metabolisum
and functions of γ-aminobutyric acid. Plant Physiol .,＊１

FROMM, H. :日清オイリオグループ!中央研究所

（〒２
３
９―０
８
３
２ 神奈川県横須賀市神明町１番地）

１
１
５, １〜５（１
９
９
７）

＊２

１
５）BAUM, G., CHEN, Y., ARAZI, T., TAKATSUJI, H. andA plant glutamate

究＊２

東京電機大学理工学研究科

（〒３
５
０―０
３
９
４ 埼玉県比企郡鳩山町石坂）

decarboxylase

containing a calmodulin binding domain. J. Biol.
Chem, ２
６
８, １
９
６
１
０〜１
９
６
１
７（１
９
９
３）

γ-アミノ酪酸（GABA）は多くの豆類に存在していることはすでに明らかになっている。本研究では大豆の生

１６） BOWN, A. W. , MACGREGOR, K. B. and SHELP,

育や登熟期の部位のGABA含量についての検討を行った。

against

完熟大豆のGABA含量は他の豆類より低いが，発芽期

intertebrate pests? Trends in Plant Science, １
１, ４
２
４

や登熟期でGABAが増加する傾向があった。また，特に

〜４
２
７（２
０
０
６）

登熟期にGABA含量が増加する傾向があり，登熟前期にB. J. :

Gamma-aminobutyrate :defense１
７） SEIFI, H. S., CURVERS, K., VLEESSCHUWER, D. D.,

莢中に多く存在し，登熟後期にかけてのGABA含量は，

DELAERE, I., AZIZ, A. and HOFTE, M. : Concurrent

莢中が減少し，豆中に増加する傾向があった。 登熟大overactivation

glutamine

豆中のGABAは，登熟前期に莢中で生成し，登熟後期にsynthetase and the GABA shunt in the ABA -豆中に移行すると考えられる。また，
登熟大豆中のGABA

deficientの機能としては，虫の食害や病原菌から未熟種子を防御ofsitiensthemutantcytosolicoftomatoleadtoresistance against Botrytis cinerea. New Phytologist,
１
９
９, ４
９
０〜５
０
４（２
０
１
３）

している可能性が考えられた。
登熟大豆と発芽大豆のスラリー中のGABA生成の最適

１８）TRAMONTI, A., CANIO, M., DELANY, I., SCARLATO, V.

温度が約２０℃異なっていた。また，登熟大豆スラリーのtranscription

最適pHは幅広く安定であったが, 発芽大豆ではpH６０. にactivation Exerted by Gad X and Gad W at the

ピークが存在した。このことより, 大豆の発芽期と登熟

and
gad

BIASE,D. :A and gadglutamate - based

MechanismsofBC gene promoters ofthe期でGABAを生成する酵素（グルタミン酸デカルボキシ

acid

in

ゲナーゼ：GAD）の性質が異なっている可能性が示唆

resistancesystemEschericha coli. J. Bacteriol , １
８
８, ８
１
１
８〜８
１
２
７（２
０
０
６）
１
９）UENO, H : Role of GABA-synthesizing enzyme,

された。
（平成２
８年９月２
６日受付，平成２
９年５月１
８日受理）

（ 29 ）

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７ 〔Research Note〕

179

N-acetylsucrosamine Utilization
by Bifidobacterium longum Strain No.１４-２
LI Mengqiu＊, MIYAZAWA Yukitaka＊, ZHAO Gang＊, SUZUKI Koichi＊,
KAWAI Yasushi＊, MASUDA Tetsuya＊ and ODA Munehiro＊§＊ Graduate School of Bioresource Sciences, Nihon University, 1866 Kameino Fujisawa, Kanagawa

252−0880

Utilization of a newly synthesized disaccharide, N -acetylsucrosamine（SucNAc ; Fruβ２-１αGlcNAc）, by
bifidobacteria was studied by culturing bifidobacteria in SucNAc - containing GAM（４０） broth andmonitoring growth over time. Three bifidobacteria strains that demonstrated higher growth in SucNAccontaining culture medium compared to growth in standard GAM（４０） culture medium were
investigated in more detail. The growth characteristics of one of these strains, Bifidobacterium longum
strain No. １
４-２, was studied using semi-synthetic medium containing both glucose （０.１
２％ w/v） and
SucNAc （０.５％ w/v）. This strain stopped growing after １２ hours of incubation （Growth Phase １）,
following glucose depletion and before any SucNAc was utilized. After ３
６ to ４８ hours incubation,
Growth Phase ２ began, with SucNAc consumption and hydrolysis （diauxic growth）. Although thisstrain cannot utilize SucNAc on its own, it could utilize SucNAc in the presence of glucose.
Cell-free extracts were prepared after culturing Bif. longum strain No. １
４-２ with i）a single carbon
source（either glucose or sucrose）, and ii）a mixed medium of glucose and SucNAc. Analysis of thehydrolyzing activity of the cell-free extract towards various sugars（disaccharides and oligosaccharides）
found no hydrolyzing activity when glucose or sucrose was used as the single carbon source. In
contrast, when grown in the presence of both glucose and SucNAc, the cell-free extract showed awide range of hydrolyzing activity towards disaccharides and oligosaccharides, including the newly
synthesized SucNAc.
Elucidating the mechanism underlying this utilization is important for understanding the diverse
sugar-utilization abilities of bifidobacteria.
（Received Dec, ７, ２０
１
６；Accepted Mar, ６, ２
０
１
７）
Key words：Bifidobacteria, N-acetylsucrosamine, oligosaccharide, sugar metabolism, diauxic growth
ビフィズス菌，N-アセチルスクロサミン，オリゴ糖，糖代謝，ジオーキシ

ofThe digestion and absorption of ingested foodbreast-andformula-fed

infants

shows

that

primarily occurs in the small intestine. Some dietarybifidobacteria are the dominant bacteria in breast -components, however, may reach the colon, such as

fed infants２） and that HMOs act as key growthindigestible sugars（dietary fiber）that are resistantfactors for bifidobacteria３）.

to digestive enzymes and which represent important

HMOs have many varied core structures, consistingenergy sources for microorganisms inhabiting theofcolon. Human milk oligosaccharides （HMOs） reach（GlcNAc）,

the colon undigested by human digestive enzymes.

metabolize each of these HMO structures. Studies

Once in the colon, bifidobacteria use HMOs as aonnutrient source with byproduct conversion to acetic

therefore, could provide new insights into HMO

acid and lactic acid, which are then likely further

metabolism.

metabolized by the human host.

glucose,galactose,
with

and

bifidobacteria

sugar-hydrolyzing

enzymesN -acetylglucosamine
being
in

able

to

bifidobacteria,

In the present study, we screened for bifidobacteria

Lactose （５５ to ７０ g / L ） is the main sugar incapable of utilizing a newly synthesized disaccharide,human milk, with a wide variety and large amountN -acetylsucrosamine（SucNAc）, as a carbon source.

of HMOs （５ to ８ g/L） also present１）. In contrast,

Bifidobacterial strains capable of utilizing SucNAc

cow’s milk （ common milk ） contains few sugars

wereaside from lactose. Comparison of the intestinal flora

bifidobacterial sugar metabolism.

§ Corresponding author, E-mail：munehiro@brs.nihon-u.ac.jp

furtherstudiedtobetterunderstand180

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 30 ）

０３. # ammonium sulfate, ０３. # potassium dihydrogen

Materials and Methods

phosphate, ０.４
８ # potassium hydrogen diphosphate,
２０ " magnesium sulfate. ７ H２O, １ " manganese

１．Strains
The following ２
１ bifidobacteria strains （ obtained（II）sulfate. ５H２O, １ " ferrous（II）sulfate. ７H２O, １

from Meiji Co. Ltd., Kanagawa, Japan） were used in" sodium chloride, and ５
０ " Tween ８
０. The pH ofthis study : Bifidobacterium adlescentis（Strain Nos.１〜

all media was adjusted to pH ６.８ and sterilized at４）, Bif. pseudocatenulatum （ Strain Nos.５〜８）, Bif.

１
２
１℃ for １
５ minutes. The L-cysteine hydrochloride

bifidum （Strain Nos.９〜１１）, Bif. longum （Strain Nos.

solution

１
２〜１
４, １
４-２）, Bif. infantis （Strain Nos.１
５〜１７）, andseparately. After thawing the stock bacterial strains,

Bif. breve（Strain Nos.１
８〜２
０）
.

the bacteria were inoculated into GAM broth and２．Sugars

incubated for ２
４ hours as the preculture. The

Glucose, galactose, fructose, N-acetylglucosamine

wasfiltered

aseptically

and

added

starter culture comprised a ２％ v/ v inoculum of（GlcNAc）, sucrose, kestose, nystose, inuline, andthe preculture in SSM containing

raffinose were purchased from Wako（Osaka, Japan）.

which was incubated for ７
２ hours to provide the

N-Acetyllactosamine

wasAldrich （USA）.

Trehalose

Hayashibara

Ltd. （Okayama,Co.,purchased
was

from
a

Sigma -

gift

from

Japan）
.

N-

added

sugar,

main culture.
（３）Utilization of SucNAc in the presence of
glucoseA SucNAc-utilizing strain was incubatedAcetylsucrosamine（SucNAc ; Fruβ２-１αGlcNAc）wasin the presence of glucose using the same method

synthesized according to the method developed bydescribed above. Time-course changes over ７
２ hours

HIRANO et al .４）.

were monitored.

３．Cell culture（４）Measurement of growthTurbidity （ Mini

For all cultures, an AnaeroPack Kenki（Mitsubishi

Photo ５
１
８R, TAITEC Corp., Tokyo, Japan） at ６
６０

Gas Chemical Company, Inc. , Tokyo, Japan ） was! was measured to confirm culture growth. Before

placed inside an AnaeroPack jar and used for static

measuring

growth,cultivation at ３７℃.

uniformly

dilutedthree- tofive-foldmedium.

Turbidity

was

the

culturemediumwith（１）Screening of SucNAc-utilizing bacteria in theculturepresence of glucose

SucNAc-utilizing bacteria

triplicate.

were

GAM

（５）Measurement of culture medium pH

screened

using

broth

（ Nissui

was
fresh

measuredinThe

Pharmaceutical Co. , Ltd. , Tokyo, Japan ） as thepH of each culture medium was measured using apreculture medium. GAM broth was diluted withpH meter（HM-５S, TOA-DKK Co., Tokyo, Japan）.

saline solution to produce GAM （４０）, which was

４．Determination of culture medium sugar content

４０％ of the concentration of regular culture medium.

Sugars in the culture medium were quantitatively

For the main culture, SucNAc was added to GAM

measured by sampling the culture medium at given（４０）to a final concentration of １％ w/v to produce

time points, centrifuging the sample （１０,０００×g, ５GAM（４０）＋ SucNAc.

min, ４℃）, and assaying the supernatant.

GAM（４０） alsocontained

glucose at ０１. ２％ w/v. All media were sterilized at

Theamount

of

sugar

was

determined

１
２
１ ℃ for １
５ minutes. Frozen stock bacterial strains

amperometrically with an ICS-３
００
０ chromatographic

were thawed, used to inoculate the GAM broth, andsystem （ Dionex, Osaka, Japan ）, equipped with athen each incubated for ２
４ hours. The main culture

Carbo Pac MA-１ column, using isocratic elution with

was inoculated with ２％ v/v of this starter culture０５. M NaOH at a flow rate of ０３. !/min５）.

and then incubated for ７
２ hours.

５．Preparation of crude enzyme samples（２）Utilization of monosaccharides and disaccharides
A semi-synthetic medium（SSM）, containing either

Sugarhydrolyzing

activity （ assay

described

below） was not detected in the culture supernatantglucose or another sugar as the single carbon

but was detected in bacterial cells.

source, was used to study bifidobacterial utilization（１）Defatted cellsof various sugars. SSM was prepared by adding

was cultured in SSM containing glucose（０６. ２％ w/sugars （０.５％ w/ v） to culture medium with thev） or glucose（０１. ２％ w/v）＋SucNAc（０５. ％ w/v）.

Bif. longum strain No. １
４-２

following composition（１００ !）: ０５
. # yeast extract

Cultured bacterial cells were collected at given time

（BactoTM ）, ０.５ # Bactopeptone （Difco）, ０.２ # Na-points, pelleted by centrifugation（１０,０００×g, ５ min,Acetate. ３H２O, ０.０
２ g L - cysteine

４ ℃）, defatted twice using acetone, and then driedhydrochloride,（ 31 ）

〔Research Note〕 The Utilization of N-acetylsucrosamine by Bifidobacteria

in vacuo. Defatted cells were resuspended in PB（２０

ResultsmM phosphate buffer, pH ６８. ）and used as a crude
enzymesample.

Hydrolyzing

activity

per

unit

181

１．Screening of SucNAc - utilizing bacteria in thebiomass （１ unit of biomass provides an OD６６
０ ofpresence of glucose

１.０） was measured, and the turbidity （OD６
６
０） of

All ２
１ bifidobacteria strains were cultured in

the culture medium at each of the given time

both GAM（４０） and GAM（４０）＋ SucNAc. Culture

points was subsequently multiplied to obtain theturbidities were measured at OD６
６
０ after ７
２ hours

total hydrolyzing activity.

incubation, as shown in Fig. １（ A ） and （ B ）. Bf.

（２）Cell-free extract

Bif. longum strain No. １
４-２

longum strains No. １
２ and No. １
４-２, Bif. infantis

was cultured in SSM containing glucose（０５. ％ w/v）,

strain No. １
６, and Bif. breve strain No. １
８ grew

sucrose （０.５％ w/v）, or glucose （０.１
２％ w/v）＋

better in GAM（４０）＋ SucNAc than in GAM（４０）,

SucNAc（０５. ％ w/v） for ５
０ hours, after which thesuggesting they utilize SucNAc as a carbon source.

cells

washedOf these strains, three were studied further : i）Bf.

twice with PB, and disrupted using a French-press

longum strain No. １
４-２（chosen because it showedwere

harvestedbycentrifugation,（ type FA-０７
８, Aminco, NJ, USA ） at ２
５,０
０
０ psi

improved growth compared to B. longum strain No.

（ twice ）. The cell-free extract was obtained by

１２）, ii）Bif. infantis strain No. １
６, and iii） Bif. brevecentrifugation of the disrupted cell mixture at １００,００

strain No. １
８. The ability of these strains to utilize

×g for １
０ min and dialyzed against PB at ４℃ .

SucNAc was tested in the presence of glucose.

Following dialysis, the protein content of the cell -２．Bifidobacterial utilization of monosaccharides

free extract was adjusted to an OD２
８
０ of ５.０ andand disaccharides

the sugar hydrolyzing enzyme activity measured

The ability of the three selected bifidobacterial

thereafter.
６．Measurement

of

sugar

hydrolyzing

enzyme（A）

activity

2.0

Sugar hydrolysis produces reducing sugars, which
Therefore, the sugar hydrolyzing activity in the
crude enzyme sample was assessed by quantifying

1.5
OD660

can be quantified to measure hydrolysis activity６）.

the production of reduced sugars. A sugar substrate

0.5

solution （０.５％ w/v, ２５０ µ"） was prepared in PB,

0.0

mixed with １
５０ µ" of PB and incubated at ３
７℃

＊＊

1.0

＊ ＊＊
＊
1

2

for ５ minutes. Defatted cell suspension or cell-free
extract （１５０ µ" ） was added and reacted for ９０
2.0（cell-free extract）. Somogyi’s copper reagent （５
５
０

1.5

µ"）

was

subsequently

added,

thecentrifuged （１０,０００× g, ５ min, ４℃ ）,sample
and

the

OD660

minutes （ defatted cell suspension ） or ３
０ minutes

supernatant was placed in a test tube and heated

0.0

A １!

aliquotofin boiling water for １
０ minutes. After cooling, ５００µ" of Nelson solution was added and the sample
was mixed well （ Somogyi’s copper reagent andNelson solution, Wako ）. Lastly, １
１ ! of distilledwater was added, the sample mixed and allowed to
stand

for

at

least １５ minutes.

The

solution’s

absorbance was subsequently measured at ６
６
０ !
（UVmini-１
２
４０, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan）.

5 6 7
Strain No.

8

9

10 11

（B）
＊＊＊

1.0

this

collected.

4

＊ ＊＊

＊＊
0.5

supernatant

3

＊

＊＊
＊
12

13

14 14-2 15 16 17
Strain No.

18

19

20

Fig. １ Growth of bifidobacteria in GAM（４０） and GAM（４０）＋SucNAc（１％ w/v）broth
Cells were cultured at ３
７℃ for ７
２ h under anaerobic
conditions in an AnaeroPack jar containing an AnaeroPack
Kenki. Growth was measured by monitoring the opticaldensity（OD） of the medium at ６６０ nm in triplicate. Error
bars show the standard deviation of the mean.
（A）: strain Nos. １〜１
１,（B）: strain Nos. １２〜２０. Symbols :□ , GAM（４０）; ■ , GAM（４０）＋ SucNAc. P values were
determined using Student’s t-test. ＊ : P ＜００. ５, ＊＊： P ＜００. １,＊＊＊: P ＜００.０１

182

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 32 ）was

SucNAc）; and iii） SSM with ０.６
２％ w/ v glucose

assessed by growing each strain for ７２ hours in（Glc ０.６２％）. As shown in the growth curves in

SSM

or

Fig. ３（ A ）, cells grown in Glc ０.１２％ entereddisaccharide as the single carbon source. As shownstationary phase after １
２ hours of incubation, whilst

in Fig. ２（A）, the monosaccharides glucose, fructose,

in Glc ０６. ２％, rapid growth was observed between ８

and galactose were utilized by all strains, whereas

and １
２ hours of incubation, with cells only entering

GlcNAc was not. Similarly, the disaccharides lactose

stationary phase after ２
４ hours. In contrast, cells

and sucrose were utilized by all strains, whereas

grown in Glc + SucNAc showed a growth pattern

SucNAc was not. The utilization of GlcNAc and（Growth Phase １） similar to that observed in Glc

SucNAc was next examined using SSM containing

０.１
２％ up to ３
６ hours of incubation. This was

０.１
２％ w / v glucose. None of the three strains

followed by a new growth phase（Growth Phase ２）,

utilized SucNAc when it acted as the sole carbon

followed by another stationary phase after ４
８ hours.

source, yet all strains could utilize it when glucose

Cells grew to the highest density in Glc ０６. ２％ and

was also present in the SSM culture medium as

to a considerably lower density in Glc + SucNAc.

shown in Fig. ２（B） In contrast, GlcNAc could stillThis

not be utilized by any of the three strains.

consumed （ as discussed below ）, and instead the

３．Utilization of SucNAc

fructose produced by SucNAc metabolism is utilized.

strainstoutilize

containing

variouseithercarbonasourcesmonosaccharide

As noted above, all three strains showed similar

This

may

be

suggests

becauseSucNAc

was

not

fully

that

GlcNAcisnotutilizedbywhen

SucNAcisconsumed （ assugar utilization characteristics. Bif. longum strain No.

bifidobacteria

１
４-２ was this chosen as the reference strain for

mentioned above）. For these reasons, growth in Glc

studying time-course changes by measuring culture+SucNAc stops at a lower cell density than growth

growth, the amount of residual sugar, pH, and thein Glc ０６. ２％.
An examination to determine if glucose is thehydrolysis of SucNAc.
（１）Growth curves

A comparative investigation

only co-existing sugar that allows SucNAc utilization

was conducted using three culture media : i） SSM

showed diauxic growth with both fructosewith ０１. ２％ w/v glucose（Glc ０１. ２％）; ii） SSM withgalactose（data not shown）.

０１. ２％ w / v glucose ＋０５. ％ w / v SucNAc （ Glc +（２）Amount of residual sugar

The amount ofresidualmedium3.0

in

Glc + SucNAc

duringcultivation was measured as shown in Fig. ３（ B ）.

（A）

（B）

2.5

＊＊＊
＊＊＊
＊＊＊

2.0

Growth Phase １ was complete after １２ hours of
incubation and all

glucose

was

fully

consumed.

Growth Phase ２, from ３
６ to ４８ hours, resulted in a

1.5

rapid decrease in SucNAc concentration. Clearly,

1.0

when SucNAc and glucose are both present, glucose

0.5

is consumed first, followed by SucNAc. However,0.0

almost

Co

nt
r
Gl ol
uc
o
Fr se
uc
Ga os
la e
ct
o
Gl se
cN
A
La c
ct
o
Su se
cr
o
Su se
cN
Gl
A
uc
G
c
os luc
e+ os
Gl
uc
e
G
os lcN
e+
A
Su c
cN
A
c

OD660

sugar

and

Strain No.14-2

Strain No.16

Strain No.18

Fig. ２ Growth of bifidobacteria in semi - synthetic
medium containing the indicated individual sugars（０.５％ w / v ）（ A ） and in semi - synthetic medium
containing GlcNAc （０.５％ w / v ） or SucNAc （０.５％w/v）with glucose（０１. ２％ w/v）（B）oCells were cultured at ３
７ C for ７
２ h under anaerobic
conditions in an AnaeroPack jar containing an AnaeroPack
Kenki. Growth was measured by monitoring the OD of themedium at ６６
０ ! in triplicate. Error bars show the standard
deviation of the mean. P values were determined using
Student’s t-test. ＊ : P ＜００. ５, ＊＊：P ＜００. １, ＊＊＊ : P ＜００
.０
１

half

the

SucNAcremainedunusedforreasons unknown, which could be why the growthlevel in Glc+SucNAc medium is low.
（３）pHFig. ３（ C ） shows the pH of Glc +SucNAc medium measured during the incubation
period. The cultures showed a gradual decrease inpH, which was reflective of cell growth.
（４）Hydrolysis of SucNAc by defatted cells
Cells growing in Glc + SucNAc medium consume
glucose first, after which SucNAc is utilized at ３
６ to
４
８ hours.

This

growthpatternsuggests

theinduction of a SucNAc-hydrolyzing enzyme, thereby
allowing SucNAc utilization. SucNAc hydrolysis bybifidobacteria grown on Glc + SucNAc medium and
Glc ０.６
２％ medium was investigated using each

OD660102030 40 50 60
Time（h）

70

8
7
6
5
4
3
2
1
0

OD660

2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0

20

40
60
Time（h）

5.0
4.0

1.5

3.0

1.0

2.0

0.5

1.0

80

（C）

（B）

2.0

0.0
0

2.5

2.5

3.5

0

10

20

30 40 50 60
Time（h）

70

（D）

0.5

3.0

0.4

2.5
2.0

0.3

1.5

0.2

1.0

0.1

0.5
0.0
0

80

0.0
80

0.0
10 20 30 40 50 60 70 80

Total Enzyme Activity（OD660）

（A）

OD660

3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

183

Sugar Content（g/ℓ）

〔Research Note〕 The Utilization of N-acetylsucrosamine by Bifidobacteria

pH

OD660

（ 33 ）

Time（h）

Fig. ３ Growth of Bif. longum strain No. １４-２ in semi-synthetic medium containing ０１. ２％ w/v glucose（Glc
０１
. ２％）
, ０１
. ２％ w/v glucose＋０５. ％ w/v SucNAc（Glc+SucNAc）, and ０６
. ２％ w/v glucose（Glc ０６. ２％）
Cells were cultured at ３７oC for ７
２ h under anaerobic conditions in an AnaeroPack jar containing an AnaeroPack
Kenki. Samples were removed at the times indicated and growth was measured by monitoring the OD６６０. The
amount of glucose and SucNAc was amperometrically determined. SucNAc hydrolysis was determined bymeasuring the formation of reducing sugars using a crude enzyme sample（see Materials and Methods）.
（ A ） Growth ; growth was measured as turbidity at ６６
０ ! in triplicate. Values represent mean and bars
represent the standard deviation of the mean. Symbols : ■, Glc ０１. ２％ ; ▲, Glc+SucNAc ; ●, Glc ０６. ２％.
（B）Sugar content ; measurement of sugars in medium containing Glc+SucNAc, culture samples in triplicate werecombined into one and the sample was analyzed by a chromatographic system. Symbols : ▲, Growth ; ●,glucose ; ■, SucNAc.
（ C ） pH ; measurement of the culture solution pH containing Glc + SucNAc. Triplicate culture samples werecombined into one and the solution pH was measured. Symbols : ▲, Growth ; ◆, pH.
（D） Hydrolytic activity ; hydrolyzing activities were analyzed by measuring in triplicate the reducing sugars
formed by the hydrolytic activity of defatted cells towards SucNAc. Values represent mean and bars represent
the standard deviation of the mean. Symbols : ▲, Growth and ■, SucNAc-hydrolysis activities of defatted cells
grown in Glc+SucNAc. ●, Growth and ◆, SucNAc-hydrolysis activities of defatted cells grown in Glc ０６. ２％.

defatted cell suspension. As shown in Fig. ３（D）, noprepared from cells grown with either glucose orhydrolysis of SucNAc was observed in Glc+SucNAc

sucrose as the single carbon source （ CFE - Glc or

mediumThe

CFE - Suc ） did not hydrolyze any of the sugars

highest hydrolysis activity was recorded after ４
８

as substrates. However, cell-free extract preparedhours of incubation, when SucNAc utilization wasfrom cells grown in the presence of glucose andinitiated, with activity decreasing after ７
２ hours.

SucNAc （CFE-Glc/SucNAc） as the carbon sources

Cells grown in Glc ０.６
２％ medium exhibited very

demonstrated the following hydrolyzing activities :

until

the

glucosewasconsumed.

little SucNAc - hydrolysis activity, despite the highsucrose（１００）, SucNAc（４３）, kestose（６８８）, nystose

growth level.

（３５１）, inulin （３７）, and raffinose （３８）, where the４．Hydrolysis of sugar by cell-free extract

numbers inside the brackets represent the relative

The hydrolyzing activities of Bif. longum strain No.
１
４-２ cell-free

extracts

onvarioussugarswere

investigated by preparing cell - free extracts from
cells cultured in the presence of various carbon
sources. As shown in Table １, cell-free extracts

activity when the hydrolyzing activity of sucrose
was set as １
００％. Trehalose was not hydrolyzed.

Discussion
Twenty - one strains of six bifidobacteria species

184

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 34 ）

Table １ Substrate specificity of cell-free extracts from Bifidobacterium longum strain No.１４-２
Relative activity
Substrate!

CFE-Glc

CFE-Suc"

CFE-Glc/SucNAc#

０
０
０
０
０
０
０

０
０
０
０
０
０
０

１
０
０
４
３
６
８
８
３
５
１
３
７
３
８
０

SucroseSucNAcKestoseNystoseInulinRaffinose
Trehalose!CFE-Glc :Cell-free extract from Bif. longum strain No. １４-２ cultured in SSM containing glucose.
Cell-free extract from Bif. longum strain No. １４-２ cultured in SSM containing sucrose.
#CFE-Glc/SucNAc : Cell-free extract from Bif. longum strain No. １
４-２ cultured in SSM containing
glucose and SucNAc.
The hydrolyzing activity per protein contents of the cell-free extract （OD２８
０ of ５.０） was
measured in triplicate. Values represent mean of the activity relative to sucrose taken as １
０
０％.
"CFE-Suc :were screened ; of these, three bifidobacteria species

being trehalose. During our studies, we found Bif.

（one strain each of Bif. longum, Bif. infantis, and Bif.

pseudocatenulatum JCM １
２
０
０ assimilated SucNAc as abreve ） were studied in more detail to identify

sole carbon source, whereas Bif. catenulatum JCM

bifidobacteria capable of utilizing SucNAc in the

１１
９
４ utilized SucNAc in the presence of glucose.

presence of glucose. These three bifidobacteria are

Similar investigations into the hydrolyzing activities

frequentlyof CFEs from these strains were also carried out.

isolated

from

the

intestinal

flora

of

infants and utilize lacto-N -biose I７）.

Athough, CFE-Glc and CFE-Suc from Bif. catenulatum

The growth curve of Bif. longum strain No. １
４-２

JCM １
１
９
４ hydrolyzed kestose and nystose, CFE-Glc/

demonstrated that SucNAc was utilized ２
４ hours

SucNAchydrolyzed

after glucose depletion and is similar to the diauxic

substrates,withgrowth curve observed when Escherichia coli

iscontrast, CFE-Suc from Bif. pseudocatenulatum JCM

grown in the presence of glucose and lactose８）.

１
２
０
０ only hydrolyzed sucrose, whereas CFE-Glc andHowever, in the case of E. coli, both glucose and

CFE-SucNAc hydrolyzed sucrose, SucNAc, kestose,

lactose are used as single carbon sugar sources, andnystose, and inulin（data not shown）. Depending on

when

the carbon source, there are clear differences in thepresent

together,glucose

is

first

used,

six

inulin

the

seven

being

the

exception.

expression

enzyme activities. These differences and changes

despite the fact that glucose is the only carbon

also differ between culture strains.

SucNAc
can

be

used

if

present

alone,

but

be

The

characteristics

of

of

In

curve was observed with Bif. longum strain No. １
４-２

cannotinduction

sugar

followed by lactose. In contrast, a diauxic growthsource that could be used on its own :

and

of

sugar-hydrolyzing

thesugar-hydrolyzing

activity of CFE-Glc/SucNAc of Bif. longum strain No.

consumed once the glucose has been depleted from１
４-２ was studied

inthe growth medium.

observation

Sucrose （ Fruβ２-１αGlc ） and

SucNAc-hydrolyzing activity of defatted cells wasmade.

detailwith

thefollowing

SucNAc（Fruβ２-１αGlcNAc）differ by one sugar unit

detected during Growth Phase ２, when SucNAc was（ glucoseutilized by Bif. longum strain No. １
４-２ grown in thehydrolyzing activity of the cell-free extract towards

presence of both glucose and SucNAc. It would be

SucNAc is half that of sucrose. In contrast, theinteresting to investigate the regulatory mechanismhydrolyzing activity of the cell-free extract towards

innytose（Fruβ２-１Fruβ２-１Fruβ２-１αGlc）, which has aaction,toestablish

whethertheco-existingand

GlcNAc,respectively ）,

yet

the

glucose induces a SucNAc - hydrolyzing enzyme, orhigh molecular mass, was half that of kestose（Fruβinduces the SucNAc transporter.

２-１Fruβ２-１αGlc）. The ratio for the cell-free extract’s

CFE-Glc and CFE-Suc of Bif. longum strain No. １
４-hydrolyzing activity of kestose and nystose was ２:１.

２ did not hydrolyze any of the seven sugars（Table

The cell-free extract’s hydrolyzing activity of inulin

１） used as a substrate. However, CFE-Glc/SucNAc［Fruβ２（- １Fruβ２-）
１Fruβ２-１αGlc］, which has a highernhydrolyzed six of the seven sugars ; the exception

fructose content than nystose, is one tenth of that（ 35 ）

〔Research Note〕 The Utilization of N-acetylsucrosamine by Bifidobacteria

185

for nystose. The most readily hydrolyzed substrate

ROSE, C.S., RUELIUS, H.W. and ZILLIKEN, F. : Bifidus

was kestose suggesting that with an increase of the

Factor. IV. Preparations obtained from humanmolecular size of the sugar substrate, there was amilk, Arch. Biochem. Biophys., ４
８, ２
１
４〜２
２
４（１
９
５
４）

sharp decrease in the hydrolyzing activity of the４）HIRANO, T., WADA, T., IWAI, S., SATO, H., NODA,

cell-free extract. This was further indicated by theM. ,JUAMI,M. ,NAKAMURA,

M. ,KUMAKI,Y. ,low hydrolyzing activity of cell-free extract towards

HAKAMATA, W. and NISHIO, T. : Synthesis of β-D-

raffinose （Galα１-６Glcα１-２βFru） and the inability tofructofuranosyl-（２→１）-２-acetamido-２-deoxy - α - D -hydrolyze trehalose （ Glcα１-１βGlc ）. The cleavage

glucopyranoside （ N - acetylsucrosamine ） using β-sites of the substrates were not investigated in thisfructofuranosidase-containing

study ; however, a future detailed investigation ismycelia as a whole - cell catalyst, Carbohydr. Res. ,Aspergillus

oryzae

３
５
３, ２
７〜３
２（２
０
１
２）

planned.
The substrate specificity of purified Bif. infantis β -５）IWATA, H., MIZUSHIMA, D., KOBAYASHI, Y., OOKURA,

fructofuranosidase was studied by IMAMURA et al .９）,

T., OGIHARA, J., KATO, J. and KASUMI., T. : Two

who reported that the hydrolyzing activity of thistransaldolase isogenes from Moniliella megachiliensis

enzyme towards kestose and nystose was three tobehave in a different way depending on thefour times greater than towards sucrose. Similarly,

stress class, J. Biosci. Bioeng., １
１
９, １
４
８〜１
５
２（２
０
１
５）

１
０）

MURAMATSU et al .

found that cell-free extracts

prepared from four culture strains （Bif. longum, Bif.
adolescentis, Bif. breve, and Bif. infantis ） exhibited

６）SOMOGYI, M. : Notes on sugar determination, J.
Biol. Chem., １
９
５, １
９〜２
３（１
９
５
２）
７）XIAO,

J. - Z. ,TAKAHASHI,

S. ,NISHIMOTO,

M. ,hydrolyzing activity towards kestose several times

ODAMAKI,（one-and-a-half to seven-fold） higher than towards

KITAOKA, M. : Distribution of in vitro fermentation

sucrose.

ability of lacto-N -biose I, a major building block ofFromdiscussed

these

above,

thereports,andourhydrolyzing

results

enzymesofoligosaccharides from many species of bifidobacteria
seem

to

exhibitsubstratecertain

specificities,

identical

especiallyproperties
high

in

activities

towards kestose and nystose.

human

T.,

milk

YAESHIMA,

T.,

oligosaccharides,

IWATSUKI,

in

K.

and

bifidobacterial

strains, Appl. Environ. Microbiol ., ７
６, ５
４〜５
９（２
０
１
０）
８）
LOOMIS, W. F. and MAGASANIK, B. : Glucose-lactose
diauxie in Escherichia coli. J. Bacteriol ., ９
３, １
３
９
７〜
１
４
０
１（１
９
６
７）

This study was an investigation using cell - free９ ） IMAMURA, L. , HISAMITSU, K. and KOBASHI, K. :β-extracts of Bif. longum strain No. １
４-２ and thus it is

Purificationunclear whether the observed sugar - hydrolyzing

fructofuranosidase from Bifidobacterium infantis, Biol.

activities were due to a single or multiple enzymes.

Pharm. Bull ., １
７, ５
９
６〜６
０
２（１
９
９
４）

The

findingthat

CFE-Glc / SucNAc

hydrolyzed

andcharacterizationof１０）MURAMATSU, K. , ONODERA S. , KIKUCHI, M. andβ-multiple disaccharides and oligosaccharides indicates

SHIOMI,

that SucNAc may have induced multiple sugar -fructofuranosidase from Bifidobacterium spp., Biosci.

hydrolyzing

Biotech. Biochem., ５
６, １
４
５
１〜１
４
５
４（１
９
９
２）

enzymes,

includinga

SucNAcN.

:

The

productionofhydrolyzing enzyme. A very interesting research
topic

that

emerged

from

this

study

is

that,

Strain No.１
４-２によるdepending on the sugar composition, there appears-acetylsucrosamineの資化性

to be a large difference in the induction of cellularsugar-hydrolyzing activity, even between disaccharides.

李

夢秋＊・宮沢幸敬＊・趙
川井

References
１）KUNZ, C., RUDLOFF, S., BAIER, W., KLEIN, N. and
STROBEL, S.

:＊!＊・鈴木公一＊

泰＊・増田哲也＊・小田宗宏＊

日本大学生物資源科学部大学院

（〒２
５
２―０
８
８
０ 神奈川県藤沢市亀井町１８６６）Oligosaccharides in human milk :structural, functional, and metabolic aspects, Annu.
Rev. Nutr., ２
０, ６
９
９〜７
２
２（２
０
０
０）
２）MITSUOKA, T. and KANEUCHI, C. : Ecology of theビ フ ィ ズ ス 菌 に よ る，新 規 に 合 成 さ れ た N acetylsucrosamine （Fruβ２-１αGlcNAc, SucNAc）の資化性について検討した。ビフィズス菌を，SucNAcを含

bifidobacteria, Am. J. Clin. Nutr. , ３
０, １
７
９
９〜１
８
１
０

むGAM（４０）培地（通常培地の４０％濃度，グルコースを

（１
９
７
７）

０１
. ２％含む）に培養し，増殖が促進されるかどうかを調

３）GAUHE, A., GYORGY, P., HOOVER, J. R., KUHN, R.,

べた。その結果，GAM（４０）培地と比較 し，SucNAc

186

Food Preservation Science

VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 36 ）（１０. ％）を添加した培地における増殖性が明らかに高い

sucroseを単一炭素源とした場合には，いずれの糖質菌株がみられた。次いで，B. longum strain No.１
４-２を

（disaccharide, oligosaccharide）に対しても分解活性は用い，半合成培地にglucose（０１. ２％）とSucNAc（０５. ％）認められなかったが，glucoseとSucNAcを共存させた場

を添加し，培養の経時変化を調べた。本菌株は，培養１
２

合には，SucNAcを含め多種の糖質を分解した。

時間で培地中のグルコースを消費し，一旦増殖が止まっ本菌株はSucNAcを単独では資化できないものの，グた（第１の増殖相）。しかし，共存するSucNAcは全く

ルコース共存下では資化できること，そして，菌体内に消費されなかった。その後，培養３６時間より４８時間にかは多様な糖質分解活性がみられるようになったことなど，

けて第２の増殖相がみられた（ジオーキシ）が，これは糖質分解酵素の発現・誘導が使用する炭素源により異な

SucNAcが消費されたことによるものであった。

ることがわかった。したがって，ビフィズス菌の糖質代半合成培地にglucoseまたはsucroseを単一炭素源とし謝の多様さが示されたことになるが，どのような糖質て，さらに，glucoseとSucNAcを同時に炭素源としてB.

（炭素源）が，どのような機序で多様性をもたらすのか

longum strain No.１
４-２を培養し，得られた培養菌体よは興味ある課題と考える。

り各々のcell-free extractを調製した。それらの各種糖質に対する分解活性を調べたところ，glucoseあるいは

（平成２
８年１
２月７日受付，平成２９年３月６日受理）

（ 37 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７ 〔総

説〕

187

湯葉被膜形成機序の解明と品質ならびに生産性の向上
平成２８年度日本食品保蔵科学会技術賞

国 正 重 乃＊§＊ !ミツトヨElucidation of the Formation of Yuba-Films
and Improvement of Quality and Productivity
KUNISHO Shigeno＊§＊

Mitutoyo Co., Ltd., 2200, Shimoguri-cho, Utsunomiya-shi Tochigi

321−0923

Key words：yuba-films, oleosins, disulfide bond, sodium chloride
湯葉被膜，オレオシン，ジスルフィルド結合，塩化ナトリウム

湯葉は，豆乳を加熱すると形成される被膜であり，近塩基性サブユニット（GB）およびβ-コングリシンのα,

年では精進料理の素材として，また健康食品として食さ

α′, βサブユニット分子同士の結合挙動について対角線れている。湯葉作りは，加熱豆乳の表面に形成された被電気泳動法にて解析を試みた。豆乳４０!を９０℃で加熱し，膜を引き上げる簡単な操作であるが，その品質は様々なタンパク質被膜を形成させた。タンパク質被膜１００㎎を要因が関与し硬さや収量が安定せず，品質および生産性

５M尿素溶液１
０!にて溶解し，Leammli法４），５）に てSDS-の低下に繋がっている。また，引き上げた生湯葉には耐PAGE（一次元：非還元）に供したところGAおよびGB

熱性芽胞菌が存在するため，腐敗が早く消費拡大の隘路の他高分子量バンドが確認された。さらに，サブユニッとなっていた。このためレトルト殺菌が必要であるが，トの解析を行うため，ジチオスレイトール（DTT）に

同殺菌によって湯葉が溶解するなど，製造上解決されててSS結合を還元処理した後に二次元目のSDS-PAGEにいない課題が多く存在する。湯葉の形成については，岡供した（図１）。その結果，対角線上にはα, α′, βサブ

本らが大豆分離タンパク質（SPI）溶液を用い，湯葉形

ユニットおよびGAおよびGBが確認され，分子内結合を成においては，大豆の主要タンパク質のβ-コングリシニ

示す対角線右上にはタンパク質のバンドはみられなかっ

ンンおよびグリシニンがジスルフィルド結合（SS結合）
１次元（非還元処理）

によって重合化したものが存在することを報告１），２）している。このことから，湯葉はこれらのタンパク質がSS結合することによって形成するとされてきたが，その後挙動，重合物の会合による被膜化の機序，湯葉中にタンパク質に次いで約１
４％含有３）する脂質の湯葉形成への影
響など湯葉形成の詳細な機序は未だに解明されていない。
そこで湯葉形成に関し，より詳細なタンパク質の会合

200

70

37

15

LMW

（kDa）
２次元（還元処理）

詳細な検討は行われず，両タンパク質のサブユニットの

HMW

200
150
100
75

機序ならびに脂質との関係性の解明を行うとともに，そ50の成果を基に製造工程の改良，さらにはレトルト耐性を

37

β
GA

付与した高品質湯葉の製造技術の開発を行った。

１．湯葉被膜形成におけるタンパク質
サブユニットの結合挙動
湯葉被膜中の骨格であるタンパク質を構成する大豆主要タンパク質のグリシニンの酸性サブユニット（GA）
，
＊ 〒３
２
１―０
９
２
３ 栃木県宇都宮市下栗町２２００§ E-mail : shigeno̲kunisho@mitutoyo.co.jp

25
20
15

17kD
a

GB

GB
t＝15％

図１ 湯葉（豆乳）被膜のタンパク質の２次元目電気泳動

188

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

た。一方で，分子間SS結合を示す対角線左下には一次元目のSDS-PAGEにおける２００kDaおよび７
０kDaを示 す分子量に２つのレーンが確認され，２００kDaはα, α′
, GA
および１
７kDa，７０kDaはGA，GBおよび１７kDaのバンド

表１ 各種試薬添加湯葉被膜の重量およびタンパク質含量
被膜重量（g/乾物重）タンパク質w/w％（湿重）

０．
４
２±０．
０
３

１
５．
１

EDTA

２
０
５
０
１
０
０

―
―
―

―
―
―

尿素

１
０
０
０
２
０
０
０
５
０
０
０

０．
３
６±０．
０
２
０．
３
２±０．
０
３
０．
２
２±０．
０
２

１
３．
１
１
１．
４
７．
６

NaCl

５
０
２
０
０
３
０
０

０．
５
８±０．
０
２
０．
５
７±０．
０
２
０．
５
６±０．
０
１

１
７．
２
１
６．
５
１
５．
９

NaSCN

５
０
１
０
０
２
０
０

０．
５
４±０．
０
３
０．
６
２±０．
０
２
０．
４
８±０．
０
４

１
８．
３
１
８．
２
１
８．
３

添加試薬濃度（mM）
無添加が検出された。湯葉中にこれらのタンパク質分子が１分子ずつSS結合にて結合した。これら大きさの異なる２つの加熱複合体が存在することが明らかにできた。
以上，豆乳を加熱すると大豆タンパク質のα, α′
, GA
および１
７kDa，またGA, GBおよび１７kDaのタンパク質
間でSS結合が形成され，これらの加熱複合体が被膜の骨格となっていることが明らかになった。さらに，これらの加熱複合体同士および加熱複合体と他のタンパク質が会合し湯葉の被膜となることが推察された。

２．湯葉形成におけるタンパク質分子間相互作用について湯葉が形成されるためには，２００kDaおよび７０kDaの複合体が凝集することが必要である。そこで，複合体の（ 38 ）

平均値±標準偏差

凝集に関わる分子間相互作用の影響について，SS結合以外の分子間相互作用について検討を行った。タンパク
質の分子間結合に関与するキレート結合，水素結合，イオン結合および疎水性相互作用の湯葉形成に及ぼす影響

表２ 豆乳タンパク質の表面疎水性度および遊離SH基量に及ぼすNaCl，NaSCN添加の影響を検討した。それぞれの結合に影響を与えるエチレンジ

表面疎水性度遊離SH基量
添加試薬濃度（蛍光強度/タンパク質㎎）（µmol/タンパク質g）（mM）

アミン四酢酸二ナトリウム（EDTA），尿素，塩化ナト

無添加

リウム（NaCl）およびチオシアン酸ナトリウム（NaSCN）
をそれぞれ豆乳に添加し，湯葉の形成性状態を観察する

５
０
２
０
０
３
０
０

２
０．
０
２
１．
７
２
３．
３

２
１
５．
７
２
１
４．
２
２
１
３．
８

NaSCN

５
０
１
０
０
２
０
０

１
７．
８
１
８．
７
１
９．
８

１
９
９．
６
２
０
７．
６
２
０
９．
８

EDTAでは２０mM添加によって豆乳中のタンパク質が葉重量は１Mで８
６％，２Mで７
６％，５Mで５２％と濃度の

１
９
８．
４

NaCl

と共に重量，タンパク質量を測定した（表１）。
沈殿し，湯葉は形成されなかった。尿素の添加では，湯１６．
８増 加 に よ っ て 低 下 し た。NaCl（５０〜３００mM）お よ び
NaSCN（５０〜２００mM）の添加で，湯葉の重量は約１０〜４０％およびタンパク質量は約５〜２０％増加した。EDTA

添加によってタンパク質の表面疎水性度はそれぞれ約によりキレート結合を阻害すると被膜は形成されず，塩１．
１および約１．
２倍，遊離SH基は５０mM NaSCNでは増加

凝固性の大豆タンパク質の特性に対し二価の金属との結はみられなかったが，２００mM NaSCNでは約１．
１倍に増合が重要であることが示唆された。水素結合はタンパク

加した。このような現象は，NaClがタンパク質分子間質分子の立体構造の基本的な結合であり，尿素による水のイオン結合を弱め，またNaSCNによる疎水性相互作

素結合切断の増加に従い依存的に被膜形成が低下したこ

用の低下によってタンパク質分子間の会合力が小さくなとから，水素結合の総量が被膜形成に影響を与えるもの

り，分子表面に露出するシステイン残基（遊離SH基）と推察した。大豆タンパク質に親水性を付与するNaClが増加したものと推察した。

および疎水性相互作用低下剤のNaSCNによって湯葉形
成性が向上した。これらは，大豆タンパク質の親水性の増加および疎水性相互作用の低下によって湯葉形成性が３．湯葉被膜形成におけるタンパク質と脂質の相互作用の影響向上したので，その要因を探るためNaClおよびNaSCN

湯葉形成に対するタンパク質と脂質との関係性を検討を添加した豆乳においてタンパク質表面疎水性度をした。Naganoらの方法８）に従い調製したSPI溶液に大豆

６）

Nakaiらの方法 にて，遊離SH基量を７-クロロ-４-ニトロ
７）より抽出した油を０〜３％乳化させ被膜を形成した結果

ベンゾ-２-オキサ-１，３-ジアゾ−ル（NBD-Cl）法 にて測定

（図２）
，SPIのみから形成された被膜では，薄く半透明した（表２）。５０および３００mMのNaCl添加によってタンな脆弱な膜を形成した。一方，豆乳から形成した湯葉は，パク質の表面疎水性度は，それぞれ約１．
２および１．
４倍に，黄白色で厚い被膜を形成し，脂質を含むことで重量およ

遊離SH基は約１．
１倍増加した。５０および２００mMのNaSCN

び破断力が増加し（図３），湯葉としての物性および品（ 39 ）

〔総

湯葉（豆乳）被膜説〕 湯葉形成機序の解明と品質向上

SPI被膜

SPI+大豆油１%被膜

189

SPI+大豆油２%被膜

SPI+大豆油３%被膜

図２ 豆乳（湯葉）被膜および脂質添加SPI被膜の外観

35

破断力（gf）

質が存在することによりこのような構造になることが推

a

a

30

察された。

a

そこで，脂肪とタンパク質の結合状態を解明するため，

c

25

超遠心分離を用い１２）豆乳中の油層画分を分析したところ，

20

油層画分の１
７kDaに特徴的なタンパク質が得られた。こb

15のタンパク質は，湯葉タンパク質の二次元電気泳動解析

10より得られた，グリシニンおよびコングリシニンとSS結5合を形成していたタンパク質と同一であると考えられた

0
膜
被

膜

％

れた（表３）。大豆オレオシンには，このほかに２
４kDa，
１
８

豆

油

油

２

３

％

被

kDaが存在するが１３），このうちオレオシン１-likeのみシス

I＋

大

豆
大

SP

I＋
SP

SP

I＋

大

豆

油

１

％

被

膜

I

豆

SP

乳

ため，この１
７kDaタンパク質をLC-MS/MSにより同定を行った結果，１
６．
５kDaの大豆オレオシン１-１-likeと同定さテイン残基を有する１４）。また，オレオシンは植物組織に

図３ 豆乳（湯葉）被膜および脂質添加SPI被膜の破断強度

おいて油貯蔵体の膜を構成するタンパク質で１５），親和性

平均値±標準偏差（n＝１０）
アルファベットの文字はTukey-Kramer法により有意差があることを示す（ p＜０．
０５）

環境下の中で脂質を安定的に存在させている１６）ことが報質に大きな影響を与えることが推察された。

葉の骨格タンパク質 α，α′およびGA，GBとSS 結合する

告されている。
以上の結果より，湯葉の構成成分である脂質はオレオシンで覆われ油滴として存在し，オレオシン１-likeが湯ことにより湯葉中に取り込まれていることが明らかにな

次に，湯葉被膜におけるタンパク質と脂質の存在状態った。

を確認するため，豆乳，SPIおよび大豆油添加SPI湯葉
９）

被膜の断面を電子顕微鏡にて観察した （図４）
。豆乳の４．NaCl添加による品質向上
および生産の効率化

湯葉被膜では気相に接した表面（A）が密な組織になっていたが，溶液に接していた液面（B）は多孔質な層になっていることが確認された。一方，SPIのみでは薄く，最後に，得られた湯葉形成機序の基礎的知見を基に，被膜全体の組織が密であり，豆乳の被膜とは構造が大き

湯葉生産性向上技術の開発を試みた。NaCl添加によっく異なっていた。大豆油添加SPI被膜では，豆乳より調て，湯葉形成性の向上が明らかとなったことから，豆乳

製した被膜と同様の構造を示したことから，湯葉被膜がにNaClを添加しその形成性の検討を行った。その結果，多層な構造を形成することに脂質の存在が重要であるこ

従来のNaCl無添加豆乳では，当社の製品基準をクリアーとが明らかになった。湯葉被膜の断面が，多孔質になるする湯葉は１バッチ当たり８枚であったが，NaClを添

１
０）
，
１
１）

ことは既に報告されているが加することによって１
０枚/バッチと湯葉の回収効率が向，今回の実験では，脂

A

A

A
B
B

500μm

500μm

湯葉（豆乳）被膜断面

SPI被膜断面B

SPI＋大豆油 2 % 被膜断面A：表面（気相）側

図４ 各種被膜の顕微鏡観察

500μm

B：液面側

190

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 40 ）

表３ LC/MS/MSによる豆乳および湯葉１
７kDaタンパク質の同定
試料名

アミノ酸配列豆乳１
７kDa

・・・・・ＧＳＹＳＹＧＴＳＹＧＡＰＹＧＴＴＹＥＴＮＸＳＩＮＮＰＰＳＲ・・・・・

湯葉１
７kDa

・・・・・ＧＳＹＳＹＧＴＳＹＧＡＰＹＧＴＴＹＥＴＮＳＳＩＮＮＰＰＳＲ・・・・・＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊

オレオシン１-like

１ ＭＡＴＩＳＴＤＱＰＲＧＳＹＳＹＧＴＳＹＧＡＰＹＧＴＴＹＥＴＮＳＳＩＮＮＰＰＳＲＱＴＶＫＦＩＴＡＡＴＩ
５
１ ＧＩＴＬＬＬＬＳＧＬＴＬＴＧＴＶＩＧＬＩＩＡＴＰＬＬＶＩＦＳＰＩＬＶＰＡＡＦＶＬＦＬＶＡＳＱＦＬＦＳ↓
１０
１ ＧＧＣＧＶＡＡＩＡＡＬＳＷＩＹＮＹＶＳＧＮＱＰＡＧＳＤＴＬＤＹＡＫＧＹＬＴＤＫＡＲＤＶＫＥＲＡＫＤＹ
１５１ ＧＳＹＡＱＱＲＩＮＥＡＴＱＧＴＹ

オレオシン１-like：GI ９
５
５
３
２３
５
３
１
MW １
７
４６
９
＊：matched peptides，↓：システイン残基相同性

文

上した。さらに，NaCl 添加湯葉のレトルト耐性試験を行った結果，NaCl 添加５０mM以上では湯葉の溶解がみら

１）白井正澄・渡辺

５
０
１
０
０
１
５
０
１
６
６

（NCBl-BLAST）
豆乳１
７kDa
９７％
湯葉１
７kDa
１
００％

献

研・岡本

奨：大豆１
１S，７Sグロ

れず，従来レトルトによる形状不良率が１０％であったもブリンからの湯葉状皮膜の生成と膜質について，日本のが２％へと大きく減少することに成功し，大幅な生産

食品工業学会誌，２
１，３
２
４〜３
２
８（１
９
７
４）

性の向上と高品質化を実現化した。

５．お わ り に２）岡本

奨：伝統食品の研究ゆばの科学，日本伝統食品研究会誌，１
０，４
３〜４
９（１
９
９
１）
３）国正重乃・柳沼

勲・野口智弘・髙野克己・内村信

古くから精進料理や日本食において利用されてきた湯宏・青柳吉紀：ゆばの褐変ならびにグルタチオンの抑

葉は，職人の勘に頼る伝統的な製造方法で長年にわたり

制効果，日本食品保蔵科学会誌，２
８，３
３
１〜３
３
６（２
０
０
２）

作られてきた。これまでの研究では詳細な湯葉被膜形成

４） LAEMMLI, U.K. : Cleavage of structural proteins

機構は未解明であり，また湯葉に多く含まれる脂質とのduring the assembly of the heard of bacteriophage

関係性などは検討されていなかった。
本研究によって湯葉形成に関与する大豆タンパク質分

T４, Natute., ２
２
７, ６
８
０〜６
８
５（１
９
７
０）
５）岡田雅人・宮崎香：「無敵のバイオテクニカルシリ

子およびそれらの相互結合の様子を詳細に明らかにするーズタンパク質実験ノート（下）一次構造の決定まと共に，タンパク質被膜に脂質が取り込まれることによで」第３版（羊土社，東京）
，pp．
１
４〜２
３（１
９
９
６）

って，破断力が増加し，膜厚になることが確認できた。

６）HAYAKAWA, S. and NAKAI, S. : Relationships ofまた，大豆オイルボディーの被膜タンパク質であるオレHydrophobicity and Net Charge of the Solubility

オシン１-likeと豆乳中のα，α′，GAおよびGBタンパク質of Milk and Soy Proteins, J. Food Sci. ５
０, ４
８
６〜４
９
１

分子がSS結合にて会合することによって，湯葉組織に

（１
９
８
５）

脂質が取り込まれる機序を明らかにすることができた。

７）ANDREWS, D.C., CALDWELL, R.A. and QUAIL, K.J. :以上，湯葉形成に関してタンパク質被膜のより詳細な形成機序ならびに脂質との関係性を解明するとともに，その成果を基に製造工程の改良およびレトルト耐性を付

Sulfhydryl

Analysis.

I.

Determination

of

Free

Sufhydryls in Wheat Flour Doughs, Cereal Chem.,
７
２（３）
,３
２
６〜３
２
９（１
９
９
５）

与した高品質湯葉を開発し，廃棄される湯葉および豆乳

８）NAGANO, T., HIROTSUKA, M., MORI, H., KOHYAMA,

量が減ることにより生産性の向上に繋げることができた。

K. and NISHINARI, K. : Dynamic Viscoelastics study
on the gelation properties of Β-conglycinin, J. Agric.

謝

辞

この度は，栄誉ある技術賞を賜り，ご推薦頂

きました先生方々および選考委員の皆様に深く感謝申し上げます。このような研究に取り組むことができましたのも，一重にご指導を賜りました東京農業大学応用生物
科学部の髙野克己教授をはじめ野口智弘教授のお陰と思Food Chem., ４
０（６）
,９
４
１〜９
４
４（１
９
９
２）
９）渡辺

研・岡本

奨：湯葉皮膜の組織とその形成について，日本食品工業学会誌，２
２，３
２
５〜３
３
０（１
９
７
５）
１
０）岡本

奨：ゆば膜生成と利用，日本調理科学会誌，

９，１
３
５〜１
４
１（１
９
７
６）

っております。改めまして心より感謝申し上げます。ま１１）高宮和彦・関口みつえ：大豆分離タンパク質の湯葉た，研究を支えて頂きました東京農業大学応用生物科学

様皮膜の膜質と中間組織の形成，日本食品科学工学会

部食品加工技術センターの卒業生にこの場をお借りしま
して，厚く御礼を申し上げます。

誌，２
９，６
０
５〜６
１
０（１
９
８
２）
１
２）ONO, T., MURAYAMA, T., KAKETA, S. and ODAGIRI.
S. : Changes in the protein composition and size（ 41 ）

〔総説〕 湯葉形成機序の解明と品質向上

191

distribution of bovine casein micelles induced byproteins, Biochim. Biophys. Acta., １
３
４
５, １〜４（１９９７）

cooling, Agric. Biol. Chemi., ５
４, １
３
８
５〜１
３
９
２
８（１
９
９
０）

１
５）HUANG, A. H. C. : Oil bodies and oleosins in seeds,

１３）GUSTAV, W., BIRGITTA, S., THOMAS, A.V. and ANN,

Annu. Rew. Plant Physiol. Plant Mol. Biol ., ４
３, １
７
７〜

J. : Soybean Oleosomes Behavior at the Air-Water

２
０
０（１
９
９
２）

Interface, J. Phys. Chem., １
１
６, １
０
８
３
２〜１
０
８
４
１（２
０
１
２）

１
６）鈴木美葉子・中村朋之・岡井直子・小川智久・村本

１４）ROWLEY, D. L. and HERMAN, E. M. : The upstream

光二：大豆プロテオリピド―アポたん白質とオレオシ

domain of soybean oleosin genes contains regulatory

ンの分子構造的相関性，大豆たん白研究会会誌，４，２
７

elements

〜３
２（２
０
０
１）

similar

to

those

of

legumestorage（ 43 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７ 〔講

座〕

193

HACCP教育講座（１
６）

講

座

ヒト試験における有効性評価と高度健康強調表示―プロバイオティクスとプレバイオティクスを中心に―
飯 野 久 和＊§＊ 昭和女子大学大学院生活機構研究科

Scientific Evidence and Enhanced Health Claimfrom Human Trial on Probiotics and Prebiotics
IINO Hisakazu＊§＊

Graduate School of Science for Living System, Showa Women’s University,
1−7−57 Taishido, Setagaya-ku, Tokyo 154−8533

平成３年（１９９１年）に食品の三次機能に着目し，そのは１２,３８品目を数え，売り上げは６５,００億円に迫っている１）。

生理機能を根拠に健康維持，疾病予防などトータル的な

現在では各国においても同様の健康表示制度が設けられ

QOL向上を目的とした「特定保健用食品（トクホ）」制ているものの，トクホと同様に個別評価型のものもあれ度が策定された。これは世界に先駆け，食品中に含有さば，規格基準型，届出制型とまちまちとなっている２）。

れる有効成分とその作用メカニズムが明らかにされ，ヒ

しかし，健康を訴求する消費者が科学的根拠のないサ

トにおいて科学的に有効性が証明され，安全性が担保さ

プリメントを「健康食品」情報から利用し，効果を実感れた個々の食品に高度健康強調表示として「保健の用できない例や，健康被害も報告された３）。消費者委員会

途」表示が許可された。２０
１
６年３月末でトクホ許可食品

による平成２
４年度の健康食品利用実態調査で一般消費者

表１ 健康強調表示制度の国際比較

栄養機能表示規格基準型
国などが成分規格（上限値，下限値など）を設定し，企業がその規格を守ることで機能性表示が可能となる。

日 本
Ｅ Ｕ
韓 国
台 湾
ASEAN

個別評価
企業からの申請に基づき，国などが個別に食品の有効性や安全

韓 国

性ついての評価・許可する。

台 湾

届出型
企業自ら食品の機能性を評価・

その他の機能表示（高度機能表示）
構造・機能表示

韓 国
台 湾

日 本
Ｅ Ｕ
韓 国
中 国
台 湾
ASEAN
日 本
（機能性表示食品）

表示し，その内容を国などに届ける。
消費者庁HPより転載

＊ 〒１
５
４―８
５
３
３ 東京都世田谷区太子堂１―７―５
７§ E-mail : iino@swu.ac.jp

アメリカ疾病リスク低減表示

アメリカ
Ｅ Ｕ
韓 国

日 本
Ｅ Ｕ
韓 国
ASEAN

194

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 44 ）

表２ 「機能性表示食品」と従来制度の違い
機能性食品表示

特定保健用食品

栄養機能食品

健康強調表示構造機能

保健の用途（保健機能）
疾病リスク低減

栄養素機能

個別評価型/
規格基準型

事業者責任で
表示可能

個別評価型
規格基準型

規格基準型

届出登録制/
申請認証制

届出制（発売予定60日前）

申請認証制

な し

科学的根拠

事業者責任で安全性を確保する前提として最終製品，または機能性成分に関する情報事業者が，最終食品にて表示される効果や安全性を求め，科学的根拠として消費者庁審査を受ける。

日本人の食事摂取基準

認証マーク

届出番号

表示例

○×○×…の方の健康に役立つことが報告されています。

な し○×○×…が気になる方に…

○×○×…の健康維持を助ける栄養素です。

消費者庁HPより転載の約６割が健康食品を購入し，その１/４はほぼ毎日利による資料の提出が求められる。事業者にとっては「最用し，購入に際しての情報収集はテレビなどのCMに依終製品又は機能性関与成分に関する研究レヴュー」とし存することが報告された４）。また，規制改革会議では米て，既に公表された研究論文の定性または定量的なシス

国ダイエタリー・サプリメントの表示制度を参考に，企テマティックレヴューによって総合的な観点から評価し，業の責任において科学的根拠に基づいた食品の機能性表

科学的根拠とする。すなわち事業者の能力次第で届け出

５）

示の新たな制度の必要性 が示された。このことは医療可能となり，表示は企業の責任によってなされる。

費負担が深刻な課題となる中で，医療費削減を目的とし食品の科学的根拠は単にヒト臨床試験のみで示される

たセルフメディケーションの推進より，「国民の健康増

ものではなく，有効性発現に至るメカニズムをも明確な進」，「医療費の削減」，「新産業の創設」の目論見のもと

科学的根拠として示されなければならない。特にメカニ

平成２７年４月１日食品表示法が施行され，「機能性表示ズムを解明する試験系では，近年の分子生物学的手法の食品」制度がスタートした。健康強調表示を付加した食発展からトクホ制度化前後とは大きく異なり，その論拠

品は従来の栄養機能食品，トクホ（特別用途食品）に機となる科学的根拠のとらえ方にも差異が生じてきている。

能性表示食品が加わり，３種が保健機能食品となった６）。

その顕著な例として腸内細菌叢と関連するプロバイオテ

本来これらの食品は国民の健康維持・向上を目的とし

ィクス，プレバイオティクスについては，１
９
９
０年のヒト

たものであるが，どのような目的で利用するかは表示か

ゲノム計画宣言前後からの分子生物学的手法による解明

ら読み取れるものの，どのように利用するのかという点

は，方法論の本質的違いから大きな変貌が見て取れる。

からの消費者の理解が十分とはいえない。そのため消費

すなわちオミクス科学の発展に伴い，その手法の先駆的者が効果を実感できないなど，その科学的根拠に基づく研究者グループがヒトゲノム計画終了後は次なる研究タ

表示に不信感を覚える例も多い。現行ではいずれの事業

ーゲットとしてヒトゲノムを凌駕するゲノム情報が集積者もその科学的根拠を各社HPに公開されたものから，する活性汚泥，土壌，口腔，消化管のゲノム解析から微その科学的根拠を理解することとなるが，この際「用生物生態学的アプローチ，またメタボローム解析，トラ法」に関しては薬事法の絡みから表示できないため，ヒンスクリプトーム解析へと進め，革新的な方法・結果をト臨床試験におけるデザイン上から読み取ることとなる。

積み上げ，現在では極めて斬新な微生物生態解析技術とこれら科学的根拠はヒト有効性発現のみが求められる

して認知されている。

わけではなく，そのメカニズム，定性・定量法，安全性，

ここではいわゆる機能性食品として多数の食品が販売

容量依存性，動物試験等から示され，食品個々で審査後，される中，プロバイオティクス，プレバイオティクスと

高度健康強調表示としての「保健の用途」が許可される。

して知られる乳酸菌やビフィズス菌およびオリゴ糖など

これに対し既に１,０００品目に迫ろうとする機能性表示食の生理機能である整腸効果を有する食品の科学的根拠の品では「最終製品を用いたヒト臨床試験」と「最終製品一つである腸内細菌の解析法の変遷を示すとともに，現又は機能性関与成分に関する研究レヴュー」のいずれか

在の解析法の主流となる分子生物学的技術からの導き出（ 45 ）

〔講座〕 有効性評価と高度健康強調表示

195

機

能

作用機構
機能性食品

腸内フローラのバランス改善プロバイオティクス
生菌類

プレバイオティクス
オリゴ糖
食物繊維

バイオジェニックス
免疫賦活物質
フラボノイド
生理活性ペプチド
ビタミンA，C，E
DHA，EPA，CPP

腸内フローラの代謝活性の改善

発がん物質，変異原，
腐敗物質，過酸化，物質生成の抑制，高脂血症の抑制，
免疫刺激

生体機能調節
ストレス
食欲・吸収
生体防御
免疫
抗アレルギー
疾病予防
下痢・便秘
がん・糖尿病
高脂血症
老化抑制
長寿

図１ 機能性食品とその作用機構

された差異について概説する。

プロバイオティクスとプレバイオティクス

主因が微生物の産する腐敗産物の自家中毒説を提唱し，その後ブルガリア旅行の見聞からヨーグルトと長寿に関心を持ち，ヨーグルトあるいはヨーグルト由来乳酸菌のいわゆる善玉菌優勢に腸内細菌叢をすることから健康普及に貢献したことは広く知られている。その後多くの効果へ導く乳酸菌，ビフィズス菌あるいはオリゴ糖など研究者により細菌性食中毒の関連研究として腸内細菌のの科学的根拠が示される中，両語とも１９９０年前後に提唱研究がされたもののゆっくりとした歩調であった。腸内された７），８）。前者は「腸内フローラのバランスを改善す

細菌叢の生態学的アプローチはMITSUOKA et al .１０）〜１２）にることによって宿主に有益に働く生きた微生物」，後者

よる偏性嫌気性菌培養法の確立と，Bifidobacteriumが優は「腸内の有用菌の増殖を促進したり，その活性を高め

先菌群であることの発見に始まり，「腸内菌叢培養法のたりすることにより宿主の健康に有利に作用する物質」

確立」「腸内嫌気性菌の分類・同定法の確立」「人の健康と定義される。また，「生体に直接作用する体調調節物

における腸内細菌叢の役割」などが明らかにされ，腸内質（生理活性物質）により，生体調節，生体防御，疾病

細菌学という境界領域の学問分野が樹立された１２）。この予防・快復等の体調調節効果を発現する物質」をバイオ研究が基礎となって，機能性食品（プロバイオティクス，

９）

ジェニックスと定義されている 。

プレバイオティクス，バイオジェニックス）の主たる生

プロバイオティクスとプレバイオティクスを経口的に理効果が解明された。同時に腸内細菌による免疫刺激，

摂取し腸内菌叢改善により様々な生理効果が報告されて腸内菌叢研究に分子生物学手法の導入，腸内菌叢の宿主いるが，必ずしもヒトでの有効性が認められているわけに及ぼす影響とその作用機構などの研究がすすめられてではない。食品表示制度では薬事法の制約から「お腹の

きた。

調子」
（整腸効果）のみの表示が付加されていることか・腸内細菌叢検索法：腸内細菌叢の試料はヒト糞便となら，必ずといっていいほど腸内細菌叢の検索が行われてるが，糞便に限らずいずれの試料の微生物菌相解析の手いる。
「保健の用途」を便性改善等の整腸効果とするガ

法は，基本的にプレートカウント法（平板希釈法）を上

イドラインを示したが，動物試験，ヒト試験において糞法とする。これに比較し，分子生物学的手法では試料に便の菌叢解析・化学分析，排便性状が必須となり，同様包含される微生物由来DNAあるいはRNAを対象としたの機能を謳う食品も同様の試験系を用いている例が多い。

方法である。

また近年プロバイオティクスでの研究トレンドとなって・培養法：腸内細菌のほとんどは偏性嫌気性菌であるたいる免疫関係でも腸内細菌叢を対象とした解析が行われめ試料の適宣な運搬，均質化の後，プレートカウント法ている。

にて十数種の選択／非選択培地を用い，偏性嫌気／微好腸内細菌研究の歩み
メチニコフは免疫学（細胞性免疫）的研究から老化の気／好気培養し，出現コロニー性状，グラム染色，限定された生理試験などから簡易同定することにより，糞便試料の微生物叢を把握する方法である。

196

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 46 ）

表３ 腸内菌叢検索に用いられる培地
培地の種類
非選択培地
EG
BL
TS
選択培地
BS
ES
NBGT/バクテロイデス
FS
PS
NN/CW
PO/PNC
変法LBS
DHL
TATAC
PEES
PDA

対照となる主な微生物

培養法!
多くの偏性嫌気性菌と通性嫌気性菌#
多くの偏性嫌気性菌と通性嫌気性菌，出現コロニーに特徴 "#があることから菌群レベルの検出に使用$
好気性菌

偏性嫌気培養

!
%
#
#
#
"
#
#
#
%
$

偏性嫌気培養

!
%
#
"
#
%
$

好気培養

Bifidobacterium
Eubacterium（EG/BLで計測不能時）（EG/BLで計測不能時）

Bacteroidaceae
Fusobacterium
Peptococcaceae
Clostridium r（＋）
Clostridium r（−）
Lactobacillus
Enterobacteriaceae
Streptococcus
Staphylococcus
yeasts/fungi（EG/BLで計測不能時）

腸内細菌の研究では分離培地により総菌数が異なるこ（EG/BLで計測不能時）（EG/BLで計測不能時）

好気培養

微好気培養

位については糞便の均質化にて解決できるものの，試料とから，如何に菌数を多く計測できる培地設計について

によって均質化は困難である。

労力が割かれた時期があった。その後ほとんどの構成菌

・分子生物学的手法：糞便試料より微生物由来DNAあが偏性嫌気性菌であることから総菌数として最も多く検

るいはrRNAを対象とする分子生物学的手法から腸内細出できる血液寒天培地（EG，BL）が開発され，各種選菌叢を微生物群集としてとらえる方法で，コロニーハイ

択培地も考案された。一般に培養法で用いられる選択培

ブリダイゼーション法，FISH法，クローンライブラリ

地の選択性は必ずしも高くなく，対象とする菌群以外のー法，DGGE法/TGGE法，T-RFLP法，定量的PCR法，細菌も生育するため，出現コロニーの簡易同定は必須とDNAマイクロアレイ法，メタゲノム解析がある。

なる。また，構成菌のほとんどが偏性嫌気性菌であるこ

これらの方法はマニュアル化されていることや，市販とから温度と環境を考慮した新鮮便の取り扱いと運搬法，キット等を用いるため経験等の熟練を必要とせず個人差前処理（希釈・塗抹），培養に際して，常に酸素暴露時が極めて低いこと，時間と労力が少ないこと，手法によ間を考慮し行うことになる。開発当初は嫌気ジャー法，

り低位構成菌群の把握が容易なこと，凍結便を試料とす

ロールチューブ法，プレートインボトル法（スチールウるなどが利点として挙げられる。しかし抽出物またはール法）などが行われてきたが，それぞれの方法での検PCR産物にバイアルがあること，生菌死菌の区別できな

証，解析が行われ，より簡便なGas Pak法（BBL），Gas

いこと，高額であることなどが欠点として挙げられる。

Generating（Oxoid）を経て，現在はより簡便で安価な

また，定量性の有無は手法による。

脱酸素剤を用いたアネロパック法（三菱ガス化学）によ

AMMAN et al.１３）は細菌共通プライマーから土壌，海水，り培養が容易になった。また，同時期に密閉環境内を炭淡水などの各種環境中の微生物数の検証し，培養できる

酸ガス置換し嫌気度制御が可能なグローブボックス（パ微生物は１％未満であり，ほとんどが未培養であると報スボックス付）が考案され，前処理から培養まで同一環告した。ヒト消化管内での培養可能な細菌は，その手法

境内で完了することができるようになった。

により差異はあるものの約２０％といわれ，全構成微生物

本法は希釈法であることから優先菌群の把握に適し，を容易に把握できる分子生物学的手法は極めて優れたも低位構成菌には不適であること，培養できる菌群のみののと認識されている。また，従来の微生物分類学も分子検出であること，新鮮便であること，同定に際し経験等

生物学的手法により系統学的解析がなされたほか，分の熟練が必要であること，多大な時間と労力を要するこ

離・同定というステップを踏まずに難培養微生物の系統となど欠点が挙げられる。また，採取部位あるいは糞便解析が可能となったことからgenome speciesが創設さの保管方法等により細菌叢や化学分析値に差異がある。

れた。

保管輸送に関しては炭酸ガス置換あるいは脱酸素環境下

下記にプロバイオティクス，プレバイオティクスの評の容器を用い，低温保持より解決した。しかし，採取部価に用いられ，主に定量性のある分子生物学的手法を記（ 47 ）

〔講座〕 有効性評価と高度健康強調表示

表４ 全ての微生物は培養できているか？
―分子生物学手法と既知種―
環 境

既知種（％）

海 水
湧 水
中温湖水
清澄汽水
活性汚泥

１
１．
０
０
１―０．
０．
２
５
０．
１―１
０．
１―３
１―１
５

堆積汚泥
土 壌

０．
２
５
０．
３

AMANN et al.１５）より一部改変

197

２．DGGE 法 / TGGE 法 （ Denaturing

Gradient

Gel

Electorophoresis / Temperature

Gradient

Gel

Electorophoresis）
各種生物の塩基組成としてGC含量が用いられることはよく知られている。このGC含量は二本鎖DNAが一本鎖に解離する変性条件と相関関係があることから，二本鎖DNA変性条件を利用した方法がDGGE法/TGGE法である１４）。
DGGE法での変性条件は，ホルムアミドおよび尿素な
どの化学変性剤による濃度勾配によるもの，変性剤の濃度勾配を持つアクリドアミドゲル中での電気泳動により実施される。一方，TGGE法は変性条件を温度勾配とした電気泳動を行う。両法とも同一の原理であり，微生物
由来DNAを鋳型にしたPCR産物を用いる。PCR反応用す。
１．FISH（FluorescentHybridization）

プライマーは ′５側にGCの富む配列を付加したものを用FISH法側の分子生物学的手法と大きく異なり，微生いる。反応後のPCR増幅物は片側にGCクランプを持っ物菌体からの核酸を抽出することなく検出する方法であたものが得られる。このPCR産物を変性剤濃度勾配ゲル，る。一定量の糞便試料を鑑賞液に懸濁後，低いgにて遠あるいは温度勾配にて電気泳動を行った場合，GCクラ

沈し微生物懸濁液を，この微生物を無菌濾過膜上に乗せ，ンプを残し二本差は一本差に解離する。この際解離した蛍光色素をつけたオリゴヌクレオチドプローブとハイブ

一本鎖DNAは移動速度が極めて小さいため，移動速度

リダイズさせ，蛍光顕微鏡下にて検出する方法である。

が遅くなる。例えば糞便微生物由来DNAを鋳型にした

現在のラボ内にある顕微鏡画像撮影装置は高感度CCD

PCR増幅物を両法にて電気泳動をした場合，糞便構成細カメラであることから，Cy３，Cy５，DAPIなどの蛍菌群により泳動バンドパターンが異なってくる。この泳

光色素とプローブの組み合わせにより全菌数，各構成菌

動バンドパターンを画像解析ソフトにより主成分分析を群別等の定量が可能となる。しかし，顕微鏡による定量行うことにより類似度を表すデンドログラム化したクラということからスライドグラス標本上の微生物絶対数にスター分析が可能となる。基本的に両法は定性的手法とより観察像が得られず，理論的には１０７/g以上の微生物

されるが，１レーンのバンドの吸光光度から各バンドの細胞数が必要となるほか，細胞内のrRNA量により検出感度が落ちること，プローブの細胞膜透過性などの問題
が誤差の要因となる。FISH法はスライドガラス上で行われるが，マイクロコロニー法と組み合わせたマクロコ
ロニーFISH法，DVD法と組み合わせたDVD-FISH法などがある。本法は，高額な施設・設備，試薬に比較し，属/種に特異的反応であることから品質管理用のキットも販売されている。

図２ FISH法（Bifidobacterium×1,000）
細菌細胞を回収・固定し，Cy３で蛍光ラベル

図３ FISH法（Bifidobacterium×1,000）
細菌細胞を回収・固定し，Cy３で蛍光ラベル

198

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 48 ）

按分を求めることができる。予め培養可能な菌群の属レ時として無理が生じる。またPCR産物のPCRバイアスもベル，種レベルの電気泳動移動度を求めることにより限指摘されている。

定された属あるいは種のバンド位置を決定することがで

４．定量的PCR法（q-PCR）

きるため，また特定の菌群の按分比率を求められるため，標的となる細菌DNAあるいはrRNAを用い，そのPCR

半定量性があるとも解説される。また未知バンドは切りあるいはRT-PCR反応のサイクル毎のPCR産物を測定し，出し等により回収し，DNAシーケンサーにより細菌種得られた検量線より標的細菌DNA量を求めるものであを同定できる。

る。PCR産物の測定にあたってはSYBR Greenなどの蛍本法はPCR反応産物を利用することから，PCRバイア

光色素，TaqManプローブが用いられる。細菌種を定量スが指摘されるとともに，試料中の全微生物に対し１％的に評価することが可能となるが，腸内細菌のように極以上存在する菌群が検出できる。比較的安価であること，

めて多菌種から構成される試料では各種構成菌種の特異手技等も容易であることから，各種環境，発酵食品，食プローブの設計・充実が必須となるばかりか，難培養微品の微生物汚染/工程管理，あるいは変異株の検証等に

生物の定量はできない。

１
３）
，
１
５）
〜１
７）

一 般 に 定 量 的PCRの 検 出 限 界 は１０５/gと さ れ る が，用いられ，汎用性は高いとの評価もある。

３．T-RFLP 法 （ Terminal

Fragment

Restriction

rRNAを標的としたRT-PCRの方がその検出限界は１０
０倍

Length Polymorphism）

ほど高くなる１９）。

DGGE法/TGGE法と同様に，腸内細菌の研究に先駆

５．メタゲノム解析（Genome Analysis）

け土壌，活性汚泥等の微生物生態学的研究領域にて導入

メタゲノム解析とは細菌ゲノムを抽出後，網羅的に解された手法である。１
６S rRNAを標的とし，末端を蛍光析し，バイオインフォマッティクス技術と融合し，得ら標識したプライマーを用いPCR増幅物を得，それに制限れた遺伝子情報の機能性をダイレクトに解明することで酵素処理をする，制限酵素による切断部位は菌種固有のある２０）。既にヒト腸内細菌叢のメタゲノム的アプローチ

ものとなる。菌種固有の断片（T-RF）電気泳動をかけから腸内細菌叢の代謝機能と肥満２１），糖質代謝と腸内細ると断片長により移動度が異なる。この原理を利用し末菌由来遺伝子機能解析２２）など報告されている。また，従端標識DNA断片のキャピラリー電気泳動並びにDNAシ

来の培養法でも指摘されていた腸内細菌叢の形成並びにークエンサーにて蛍光標識したDNA断片を読み取り解機能は食事成分に依存すること，腸内細菌の消化管での析する。構成微生物の多様性はピーク数，菌種・菌量は棲息適応には環境に対する適応能があることなども報告

ピーク位置・面積から知ることができる。

された２３）。このような研究報告は，物語として提示され本法は数多くの制限酵素を用いることで全ての腸内構たものとは違い，遺伝子解析の結果であることを理解す

成菌の検出が可能となる。しかし，現実的には４，５種べきである。このような腸内構成菌のオミックス科学的の制限酵素の全てに断片部位を持つ菌種のみで分析条件アプローチは特有の疾患，ストレスなどその研究ターゲが設定され，属レベルでの構成菌群解析に用いられていットの展開は目を見張るものがある。

る。また，腸内を構成する３４２菌種の専用データベース

次世代シークエンサーでは難培養微生物も含め腸内構も構築されていることから，これに基づく腸内細菌叢の成菌を門レベルから種レベルまで網羅的解析が可能とな解析が進められている１８）。先に挙げたDGGE法/TGGE法

り，そのリード数から定量も可能となる。しかし，費用５に比較し簡便であり，その検出限界は１０/!とされていが高いという難点はあるものの，極めてコストパフォーる。しかし，近縁種でのDNA断片長が近い場合がある

マンスが高い手法である。単なる菌叢解析として使用すことから菌種判別が困難になり，種レベルでの解析にはるにも解析ソフトの習熟が必要となり，インフォマティ

菌種によって異なるピークが得られる

T-RFLP プロファイルから推定される各菌群のピーク面積比の変化⑨ 27.86① 5.55 ② 9.62推定される菌群③ 16.06⑧ 1.59⑦ 0.71④ 0.29⑥ 26.73⑤ 11.29① Biﬁdobacterium③ Bacteroides⑤ Clostridium cluster IV⑦ Clostridium cluster XI⑨ others② Lactobacillales 目④ Prevotella⑥ Clostridium subcluster XIVa
⑧ Clostridium cluster XVIII

図４ T-RFLP例：ヒト糞便菌叢（−80℃凍結便使用）

（ 49 ）

〔講座〕 有効性評価と高度健康強調表示

199
TK85前
TK85後
TK4前
TK4後
TK83後
TK74前
TK63前
TK63後
TK55前
TK55後
TK33前
TK50前
TK50後
TK32前
TK33後
TK18前
TK18後
TK25前
TK56前
TK56後
TK45前
TK45後
TK76後
TK7前
TK76前
TK73後
TK19前
TK78前
TK47前
TK78後
TK23前
TK43前
TK7後
TK19後
TK47後
TK1前
TK1後
TK74後
TK2前
TK2後
TK32後
TK73前
TK51前
TK51後
TK79後
TK43後
TK79前
TK83前
TK93前
TK25後
TK93後
TK23後
TK34前
TK34後
TK37前
TK37後
TK26前
TK26後

図５ 各検体のT-RFLPプロファイルに基づくクラスター解析
明朝体：試験食群（n＝14）
ゴシック体：プラセボ群（n＝15）：試験前後でピーク面積比のクラスター変動が大きい被験者
・プラセボ群（8/15）
・試験食群（3/14）

クス経験者の参加があればより高度な研究アプローチが

棡原村（現上野原市棡原地区）ではその食生活で雑穀，可能となる。ヒト常在菌のゲノム解析については国際的

豆類，イモ類，野菜・山菜類の利用が多かった。その後

なコンソーシアムのもと大規模に実施され，今後様々なの調査で高齢者の腸内細菌叢はビフィズス菌優勢でウェ報告がなされると思うので注視したい。

ルシュ菌劣勢であった。また，母乳栄養児と人工栄養児の腸内菌叢の差異，また加齢に伴う変化，ストレスと腸ヒトが生きていく上では「食べる」ことは必須であり，内菌叢などの研究から，乳酸菌やビフィズス菌などを善

欠食，過食あるいは食事の質と健康は密接な関係がある

玉菌，ウェルシュ菌などの腐敗産物を産生するものを悪ことはいうまでもない。

玉菌と呼ぶようになった。この過程で，便通と腸内菌叢

かつて半世紀以上前に長寿村として紹介された山梨県との関連が調べられ，便秘者は悪玉菌が多く善玉菌が少200

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

なく，便秘者には変異原となる腐敗産物が多く，それに（ 50 ）

html）
（２
０
１
７年３月）

関わる酵素活性が多いなどが多数報告された。また，善５）規 制 改 革 実 施 計 画（http://www8cao.go.jp/kisei-

玉菌などの優先な糞便では短鎖脂肪酸が多く，プロバイ

kaikaku/kaigi/publication/150630/item.pdf）（２０
１７年

オティクスやプレバイオテックス摂食は，善玉菌優先菌叢とし，短鎖脂肪酸も多く，便通改善が認められる整腸効果があることから「健康に良い」との概念が普及した。
その結果が，トクホ許可品や機能性表示食品へと繋がっ

３月）
６）食品表示一元化情報（http : //www.caa.go.jp/foods/
index18.html）
（２
０
１
７年３月）
７）FULLER, R. : Probiotics in man and animals, J.
Appl. Bacteriol, ６６, ３６５〜３７８（１９８９）たわけである。
一方，次世代シーケンサーを用いたヒト腸内菌叢菌叢解析から，アメリカ人や中国人に多く見いだされ，低炭

８）GIBSON,

G. R.

and

ROBERFROID,

of

the

human

modulation

M. B. : Dietarycolonic

microbiota

水化物，高タンパク質の食餌タイプであるバクテロイデ

introducing the concept of prebiotics, J. Nutr, １２５,ス型（１型），アジア人や中南米，アフリカで多く見出

１
４
０
１〜１
４
１
２（１
９
９
５）

される高食物繊維の食餌タイプのプレボテラ型（２型），

９）MITSUOKA, T. : Significance of dietary modulation

日本人やスウェーデン人などに見いだされる動物性タンof

パク質と脂肪の多い食餌タイプのルミノコッカス型（３Bifidobacteria Microflora, １
９, １
５〜２
５（２
０
０
０）

intestinal

flora

and

intestinal

environment,型）の３つのエンテロタイプに類別できると報告した２４）。 １
０）MITSUOKA, T. SEGA, T. and YAMAMOTO, S. : Eine
また，アジアの３０
３名の児童のエンテロタイプを日本，

verbesserte

台湾，中国ではビフィドバクテリウムーバクテロイデス

quantativen Analyse der Darmflora von Menschen

Methodotik

derqualitativen

und型（BB-type），他 域 を プ レ ボ テ ラ 型（P-type）の２タ

und Tieren, Zbl Bakt Hyg I Orig, １
９
５, ４
５
５〜４
６
９

イプに類別し，炭水化物分解系と胆汁酸生合成系など食

（１
９
６
５）

事性との関連が示唆された２５）。
メタボロミクス研究では，腸内細菌の代謝産物である

１１）Mitsuoka, T., OHONO, K., BENNO, Y., SUZUKI, K.
and NAMBA, K. : Die Faekalflora bei Menschen. !.

短鎖脂肪酸のうちプロピオン酸と過敏性大腸炎との関連

MItteilung.

が指摘され，酢酸と炎症反応の中心的役割を担う好中球

Verfahrens mit dem bisherigen Verfahren zur

発現に関与している等の報告がある。このような研究方

Darmfloraanalyse, Zbl Bakt Hyg I Orig, ２
３
４, ２
１
９〜

向が多数出されていることから，２
１世紀突入と時を同じverleichdesneu

entwickelten

２
３
３（１
９
７
６）

くし多くの臨床的研究が進められている。現在は消化管

１２）光岡知足：腸内菌の世界，（叢文社，東京）（１
９
８
０）

での疾病のほか，臓器，精神疾患との関連など大きな期

１３）AMMAN, R., LUDWING, W. and SCHLEIFER, K. H. :待が寄せられている２５）。

Phylogenic identification and in situ detection of

このような腸内細菌叢評価の結果として，従来の伝統的な培養法によって構築された「ビフィズス菌，乳酸菌と健康」という概念は，次世代シークエンサーを用いた

individual

microbial

cells

without

cultivation,

Microbiol Rev, ５
９, １
４
３〜１
６
９（１
９
９
５）
１
４）MUYZEL,

G.

andSMALLA,

K. : Applicationof

マルチオミクス科学的アプローチから導かれる論理とは

denaturing gradient gel electrophoresis （ DGGE ）必ずしも一致するわけではない。すなわち，腸内細菌とand健康は密接に関係しているものの，培養法から導き出さ（TGGE）in microbial ecology, Antonie Van Leewenhoek,

れた論理は当てはまらないことを意味し，近い将来メタ

７
３, １
２
７〜１
４
１（１
９
９
８）

ゲノム解析研究から新しい腸内細菌と健康との関連が明temperature

gradient

１５）ALFREIDER, A. ,gel

PERNSTHALER,

electrophoresis

J. ,AMMAN,

R. ,確になり，プロバイオティクス・プレバイオティクスの

SATTLER, H., GLOCKNER, F., WILLE, A. and PSENNER,

新たな地位が確立するものと期待する。

R. : Community

analysisofassemblages in the winter
文献１）公益財団法人日本健康栄養食品協会：トクホ市場規模（http : //www.jhnfa.org/tokuho-0.html）

layers

of

a

high

mountainthebacterial

cover

and

pelagic

lake

by

in

situ

hybridization, Appl Environ Microbiol, ６
２, ２
１
３
８〜２
１
４
４
（１
９
９
６）

２）消費者庁：諸外国における機能性表示制度（http :１６）MARUYAMA, A. and SUNAMURA, M : Simultaneous//www.caa.go.jp/foods/pdf/140502̲sanko¥3¥3.pdf ）direct counting of total and specific microbial cells

（２
０
１
５年１
１月）

in seawater, using a deep-sea microbe as target,３）「健康食品」の安全性・有効性情報査（https : //hfnet.

Appl Environ Microbiol, ６
６, ２
２
１
１〜２
２
１
５（２
０
０
０）

nih.go.jp/contents/indiv.html）（２
０
１
７年４月）
４）健 康 食 品 利 用 実 態 調 査（http : //www.cao.go.jp/
consumer/iinkaikouhyou/2012/houkoku/201205̲report.

１７）KITAGUCHI, A., YAMAGUCHI, N., TANI, K. and NASU,
M : Enumeration of respiring Pseudomonas spp. inmilk

within ６ hours

byfluorescence

in

situ

（ 51 ）

〔講座〕 有効性評価と高度健康強調表示

hybridization following formazan reduction, Appl
Environ Microbiol, ７
１, ２
７
４
８〜２
７
５
２（２
０
０
５）

201

２
２）KROKAWA, K., ITOH, T., KUWAHARA, T., OSHIMA, K.,
TOH, H. , TOYODA, A. , TAKAMI, H. , MORITA, H. ,１８）MATSUMOTO, M., SAKAMOTO, M., HAYASHI, H. andSHARMA, V., SRIVASTAVA, T, Taylar, T., NOGUCHI, H,

BENNO, Y. : Novel phylogenic assignment databaseMori H., OGURA, Y., EHRICH, D., ITOH, K., TAKAGI,

for

terminal

polymorphism

restriction
analysisoffragment

lengthT. , SAKAI, Y. , HAYASHI, T. and HATTORI, M, :humancolonic

Comparative

microbiota, J Microbiol Method, ６
１, ３
０
５〜３
１
９（２
０
０
５）
１
９）MATSUDA, K., TSUJI, H., ASAHARA, T., KADO, Y.
and NOMOTO, K. : Sensitive quantitative detectionof commensal bacteria by rRNA-targeted reverse
transcription-PCR, Appl Environ Microbiol, ７
３, ３
２〜
３
９（２
０
０
７）
哲也・黒川

顕・伊藤武彦・桑原知己：ヒト腸内細菌叢のゲノムシーケンス，腸内細菌学
雑誌，２
１, １
８
７〜１
９
７（２
０
０
７）

commonly

DNA Res, １
４, １
６
９〜１
８
１（２
０
０
７）
２
３）HATTORI,

M.

and

Taylar,T. : The

human

intestinal microbiome : a new frontier of humanbiology, DNA Res, １
６, １〜１
２（２
０
０
９）

E.

and

GORDON,gut microbiome, Nature, ４
７
３, １
０
５〜１
０
８（２
０
１
１）
２
５）NAKAYAMA,

J.,

et

al. : The

human

intestinal

microbiome : a new frontier biology, Sci Rep, ５,

２１）TURNBAUGH, P., LEY, R., MAHOWALD, M., MAGRINI,
MARDIS,

revealed

２４）ARUMUGAM, M. , et al. : Enterotypes of human２０）服部正平・林

V. ,metagenomics

enriched gene sets in human gut microbiomes,

J. : Anobesity -associated gut microbiome with increased capacity
for energy harvest, Science, ３
１
２, １
３
５
５〜１
３
５
９（２
０
０
６）

８
３
９
７〜８
４
１
１（２
０
１
５）
２
６）福田真嗣：メタボロミックスが解き明かす腸内細菌叢の機能，腸内細菌学，２
９，１
４
５〜１
５
５（２
０
１
５）

（ 53 ）

〔文献

液状１-MCPは洋ナシの追熟を遅延させる効果がある

抄

録〕

203

CA貯蔵は３段階で収穫したリンゴ果実の代謝を抑制して香気成分含量を高める

ESCRIBANO, S., et al. : Postharvest Biol. Technol., １２６, ５７THEWES, F. R., et al. : Postharvest Biol. Technol., １
２
７,
〜６
６（２
０
１
７）
１〜１
３（２
０
１
７）
１-MCPはエチレンの作用を抑制するので追熟遅延効
３段階の熟度（収穫時の澱粉の状態を基準：未熟果，
果を有するが，本研究では洋ナシを供試材料として液
適熟果，過熟果）で収穫したリンゴ果実を，［１］CA状１-MCP（処理時間０，１
５，３
０，４
５，６
０秒，濃度２５０，
貯蔵 : O２-１２. kPa+CO２-２０. kPa，［２］CA＋１-MCP（０６
.２
５
５
０
０，７
５
０，１
０
０
０µgL−１）と ガ ス 状１-MCP（０６. µLL−１）の効µLL−１），［３］RQ（呼 吸 商）１３
. を 基 準 に し たCA，果を比較した。２箇所の果樹園から３段階（適熟早期， ［４］RQ１５. を基準にしたCA，で９か月間貯蔵（１５. ℃）
適熟，適熟晩期）の熟度で収穫した果実を処理後に１℃し，昇温（２０℃）７日間の貯蔵後のエチレン濃度や果で５週間貯蔵した後に２０℃で追熟（１８日間）させた。
肉硬度と香気成分含量（エステル２
５種，アルコール１
８
収穫熟度に関係なく１-MCP 処理は，エチレン生成とCO２
種，アルデヒド６種等）を測定した。
［４］の果汁の香
排出量の増加を抑制し，果肉の軟化も遅延させたが，１気成分含量が最も多く，［３］と［４］の過熟果のエス
MCPの状態の差異は明確でなかった。液状１-MCPは濃テル含量が最も多かった。
［２」の果実の香気成分の生度が高く，処理時間が長い場合に抑制効果が高かった
成 が 抑 制 さ れ エ ス テ ル 含 量 が 少 な か っ た。
［３］とが，果皮色の市場性等を考慮すると適熟果と適熟晩期［４］の貯蔵条件は果実内エチレン濃度，エチレン生成の果実への液状の１-MCPで濃度５００µgL−１が最適処理で量，呼吸量は抑制したが，この代謝低下は，香気成分あることを明らかにした。
の生成には影響を及ぼさなかった。
（阿部一博）（阿部一博）

ブロッコリーとダイコンの幼植物体は安全であり生理活性のあるフィトケミカルに富む

塩およびエタノール添加がゼイン‐デンプン生地とパンの品質に与える影響

BAENAS, N., et al. : Postharvest Biol. Technol., １
２
７, ６
０〜
６
７（２
０
１
７）
カイワレ（原著ではsproutsと表記されており，発芽８日の幼植物体の意であるが本項ではカイワレとする。
）状態のブロッコリー（BS）と赤ダイコン（BR）
は，健康上重要な食材であることが認識され始めているが，これらの品質保持には低温流通が必須であるので，微生物とフィットケミカル含量（辛味成分やフェノール物質等）の貯蔵中（５と１０℃で１４日間）の変化を調べた。収穫直後のBSとBRには，バクテリアは存在するが，感染症を引き起こす微生物（サルモネラや大腸菌等）は存在せず，両者とも貯蔵中には増殖しなかった。BSとBRの貯蔵中のフェノール物質含量は漸減し，辛味成分は貯蔵中に急激に減少した。これらの減少
は，５℃貯蔵より１０℃で顕著であったので，低温流通の必要性が明らかになった。
（阿部一博）

SMITH, B. M., et al. : Journal of food science, ８
２, ６
１
３
〜６
２
１（２
０
１
７）
ゼイン（２
０％）とトウモロコシデンプン（８０％）から成るパン生地および焼成後のパンの品質に寄与する因子を同定するために，NaSCN，NaCl，Na２SO４を０〜２Mの濃度で添加し試験を行った。その結果，低濃度のNaSCN添加はより柔らかい生地を形成することが明らかになった。また，無塩下でのエタノール添加は，
柔らかく，より実用的な生地を形成することが明らかになった。さらに，NaClとNa２SO４の濃度が増加するに従って，生地が形成されなくなるという結果が得られた。ゼイン−デンプンパンの比容積は，NaCl 添加濃度が減少するに従い増加し，５％エタノール添加によってパンの品質が向上することが明らかになった。
（風見真千子）抽出方法の違いがカメリナ種子の酸化安定性に及ぼす影響

９種類のナナカマド属果実の生物活性物質と抗酸化能

２,
BELAYNEH, H. D., et al. : Journal of food science, ８
６
３
２〜６
３
７（２
０
１
７）
オメガ３脂肪酸を豊富に含んでいるカメリナ種子油の酸化安定性を抽出段階で改良する目的で，エタノー
ルを用いた改良型超臨界二酸化炭素（SC-CO２）抽出法，
コールドプレス法，ヘキサン抽出法によって抽出した
カメリナ種子油の酸化安定性を示差走査熱量計を用いて解析した。改良型SC-CO２に用いるエタノール濃度を高濃度にするにつれて酸化安定性は増加し，１０％ エタ
ノールSC-CO２抽出法で得られたカメリナ油が最も高い
酸化安定性を示した。これらの酸化安定性は，フェノール化合物とリン脂質の種類と量に依存することが明らかになり，フェノール化合物は酸化防止剤として作用し，一方で，リン脂質量の増加によって酸化安定性が減少することも明らかになった。
（風見真千子）MIKULIC-PETKOVSEK, M., et al. : Journal of food
２, ６
４
７〜６
５
８（２
０
１
７）
science, ８
９種類のナナカマド遺伝子型由来果実（‘Konzentra’,‘Krasavica’, ‘Burka’, ‘Alaja krupnaja’, ‘Granatowa’,‘Businka’, S. torminalis, ‘Titan’, S. discolor）の 生 化 学的特性について解析した。その結果，S. torminalisは他の遺伝子型に比べて１７. 〜４１. 倍高いグルコース量を示した。また，総ヒドロキシケイ皮酸は，解析した総フェノール類の５４〜７６％を占めており，‘Krasavica’, ‘Alaja
krupnaja’, ‘Businka’, ‘Titan’ で最も高含有量を示した。
特に ‘Businka’ は，総フェノール量が他の遺伝子型由来
果実に比べ高値（３７
６
８ !/"）であり，結果的に最も高い抗酸化能（５７６. mM TE/" FW）を示すことが明らかになった。
（風見真千子）204

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７ 〔会

告〕

（ 54 ）

会

告（公財）飯島藤十郎記念食品科学振興財団
平成２９年度 研究者の海外派遣援助募集要領
１

趣

５

旨

申請方法及び選考方法

米麦その他の主要食糧等を原料とする食品の生産・加所定の申請書に必要事項を記入のうえ，指定研究分野

工・流通及び食品科学等の研究の国際交流推進し，食生に関連のある学会を経由して当財団事務局宛ご送付下さ

活・食文化の向上，健康の増進及び食品産業の発展に寄い。なお，申請には会議での発表内容の要旨及び招請状

与するものとします。

を添付して下さい。
（要旨は英文，和文何れでもよく，

２印刷されたものがあれば，そのコピーでも可）選考は事

援助の対象
平成３
０年４月から平成３
１年３月までの間に海外で開催される国際学術会議等に出席し，指定分野に係る食品科

務審査の後，選考委員会の議を経て理事会で決定します。
６

学会推薦の締切：平成２９年１０月２０日（金）必着う研究者（企業の研究者は除く）で，指定研究分野と関連のある学会から推薦を受けた方とします。各学会の推

申請期間
平成２
９年９月１日（金）〜１
２月１日（金）必着学等の研究成果について，特別講演または研究発表を行
７

援助決定の通知及び交付採否の結果は平成３０年３月末日までに文書にて通知

薦者は２名以内とし，１国際学術会議につき１名とします。但し，当該国際学術会議，所属研究機関等から旅費し，４月に交付予定。

を支給される方，国内の他機関から援助費を受けられる

８

報

告

方は除外します。また，本年度に当財団の他の助成を申援助費受領者は，海外での目的を果たし，帰国後３ヵ請する方，及び本援助をすでに２回受けられた方は申請月以内に講演・発表等の要旨及びプログラムのコピーをできません。

添えた研究発表報告書及び援助金の使途報告書を提出し３ていただきます。なお，研究発表報告書は当財団の年報

研究分野
米麦その他の主要食糧等を原料とする食品に関して次の!〜#に掲げる分野に係る食品科学等の研究!

生産・加工・流通に関する基礎的研究"

製造技術及び品質保持技術の開発に関する研究#
４

等に掲載し公表します。
＊応募お問い合わせ，申請書請求，申請書送付先（公財）飯島藤十郎記念食品科学振興財団
〒２
７
２―０
０
３
４ 千葉県市川市市川１丁目９番２号

安全・衛生，栄養・機能等に関する研究

サンプラザ３
５ビル６F

援助の金額

TEL：０
４
７―３
２
３―５
５
８
０，５
５
８
１

派遣期間は１週間以内で，１件につき５０万円を限度とFAX：０４
７―３
２
３―５
５
８
０

して６件内外を援助します。援助額は，開催都市，時期，URL：http : //www.iijima-kinenzaidan.or.jp

期間等を考慮して決定します。

E-mail：info@iijima-kinenzaidan.or.jp
担

当：細谷（ほそや）（公財）飯島藤十郎記念食品科学振興財団
平成２９年度 学術研究助成募集要領
１

助成の目的
この助成は，米麦その他主要食糧等を原料とする食品

２

助成対象

（１）助成対象となる研究分野の生産・加工・流通並びに食品科学等に関する研究を行

米麦その他の主要食糧等を原料とする食品に関して次う研究者及び研究グループに対し，研究助成金を交付し，の!〜#に掲げる分野に係る食品科学等の研究で，別紙研究等の推進を通じて食生活・食文化の向上，健康の増に示す研究の分類項目のいずれかに該当すること。

進及び食品産業の発展に寄与することを目的とします。

!

生産・加工・流通に関する基礎的研究

（ 55 ）

〔会"

製造技術及び品質保持技術の開発に関する研究#

安全・衛生，栄養・機能等に関する研究

告〕で，８件内外とします。
５

助成対象となる費用
研究に直接必要な経費。但し，以下に記載した費用は，（２）助成対象となる研究者，研究グループ
日本国内の国公私立大学，公的研究機関において食品

原則として対象外とします。
!

化学，栄養学，食品機能学，食品工学，食品衛生学，調"助成申請要件!

６

いこと。他の民間の助成との重複助成は行いません。

#

所属研究機関（大学，大学学部，大学院研究科及助成期間
助成期間は，原則として１ヵ年（平成３０年４月から３
１

究課題で他の民間の助成を受ける予定になっていな"

汎用性のある機器（例：パソコン，ファクシミリ，複写機）の購入費

申請研究課題に係る研究実績が１年以上あり，下
記６に示した助成期間中に，同一又は類似内容の研申請者及び共同研究者が所属する組織の間接費・管理費・共通経費

理科学等の研究を行う研究者及び研究グループ
３205年３月）とします。
７

申請方法

び研究所等をいう。
）の長の推薦が得られること。

当財団のホームページ（http : //www.iijima-kinenzaidan.

所属研究機関の長の推薦件数は，個人研究３件以

or.jp）から学術研究助成金交付申請書をダウンロード

内，共同研究１件以内とする。但し，同一研究室

し，申請書記入要領に従って正確に記入のうえ，書面に（分野）からのものでないこと。

より１部提出願います。

$

８

本助成金の交付が３回までの研究者とします。ま助成における申請者（「代表研究者」）以外の研究者（「共同研究者」）も申請者と同様としますが，助成金の交付が無い場合は，助成回数に含みません。
%
４

当財団の他の助成事業と重複申請は出来ません。
助成の種類並びに規模等

学術研究助成は個人研究助成及び共同研究助成の２種類に分類され，助成金総額は１億円とします。なお，個々の助成額は，査定により申請額から減額されることがあります。
!

"

個人研究助成申請期間
平成２９年９月１日（金）〜平成２
９年１０月２０日（金）必着

た，３年連続の助成は行いません。なお，共同研究
９

選考方法
事務審査の後，当財団の学術研究助成選考委員会の議を経て理事会で決定します。
１
０ 決定通知採否の結果は平成３０年３月末日までに文書にて申請者および推薦者に通知します。
１
１ 助成金の交付予定
平成３
０年４月
１
２ 報
!

告

等

助成期間終了後，研究成果及び助成金の使途につ主として若手研究者，例えば准教授，講師及び助き，平成３
１年４月末日までに報告すること。なお，

教，などによる単独研究を対象とし，１件当たり１００

研究成果の報告については当財団の年報等に掲載し万円から２００万円で，４０件内外とします。

公表します。

共同研究助成専門領域及び研究機関（大学，学部，大学院研究"平成３０年４月に予定している助成金贈呈式へ出席すること。

科及び研究所等）を異にする複数の研究者が，同一＊応募お問い合わせ，申請書送付先

テーマに関し，広範に共同研究する場合を対象とし（公財）飯島藤十郎記念食品科学振興財団

ます。また，代表研究者は教授級の研究者とし，申

〒２
７
２―０
０
３
４ 千葉県市川市市川１丁目９番２号

請時の研究費の分担は，代表研究者は１００万円以上

サンプラザ３
５ビル６Fとする他，研究機関の異なる１００万円以上の研究者

TEL/FAX：０４
７―３
２
３―５
５
８
０

が一人以上加わることとします。なお，個人研究助

E-mail：info@iijima-kinenzaidan.or.jp

成申請者及び企業の研究者を共同研究者とすること

担は で き ま せ ん。１件 当 た り２
００万 円 か ら５００万 円

当：細谷（ほそや）

206

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

（ 56 ）（公財）飯島藤十郎記念食品科学振興財団
平成２９年度 国際学術会議等開催援助募集要領
１

趣

５

旨

申請方法及び選考方法

米麦その他の主要食糧等を原料とする食品の生産・加所定の申請書に必要事項を記入のうえ，当財団事務局

工・流通及び食品科学等の研究の国際交流推進し，食生宛送付して下さい。また，国際会議開催要領，募金趣意

活・食文化の向上，健康の増進及び食品産業の発展に寄書等を添付して下さい。
選考は事務審査の後，選考委員会の議を経て理事会で与するものとします。
２

援助の対象

決定します。

指定研究分野に係る食品科学等の研究に関連のあると６

平成２
９年９月１日（金）〜１
２月１日（金）必着認められる!国際学術会議又は"海外からの講師を招聘して開催されるシンポジウム等が，原則として，平成３０７!の場合は，その運営費（含む講師招聘費）の一部を４月に交付予定。
８"の場合は，海外からの講師招聘費の一部を助成する。
研究分野

告りまとめた報告書及び使途報告書を提出していただきます。なお，報告書は当財団の年報等に掲載し公表します。

米麦その他の主要食糧等を原料とする食品に関して次の!〜#に掲げる分野に係る食品科学等の研究

４

報

当該国際会議終了後３ヵ月以内に開催結果の概要をと

助成する。
３

援助決定の通知及び交付採否の結果は平成３０年３月末日までに文書にて通知し，

年４月から平成３
１年３月までの間に日本で開催される場
合に援助します。

申請期間!

生産・加工・流通に関する基礎的研究"

製造技術及び品質保持技術の開発に関する研究#

安全・衛生，栄養・機能等に関する研究＊応募お問い合わせ，申請書請求，申請書送付先（公財）飯島藤十郎記念食品科学振興財団
〒２
７
２―０
０
３
４ 千葉県市川市市川１丁目９番２号
サンプラザ３
５ビル６F
TEL：０
４
７―３
２
３―５
５
８
０，５
５
８
１

援助の金額

FAX：０４
７―３
２
３―５
５
８
０

１件につき５０万円以内とし，６件内外とします。

URL：http : //www.iijima-kinenzaidan.or.jp
E-mail：info@iijima-kinenzaidan.or.jp
担

当：細谷（ほそや）（公財）飯島藤十郎記念食品科学振興財団
平成２９年度 飯島藤十郎賞募集要領
１目

的

米麦その他の主要食糧等を原料とする食品の生産・加工・流通及び食品科学等に関する研究及び技術開発の推します。
３

飯島藤十郎賞の種類
飯島藤十郎賞は飯島藤十郎食品科学賞及び飯島藤十郎進を図り，もって，食生活・食文化の向上，健康の増進

食品技術賞とする。

及び食品産業の発展に寄与することを目的とします。

（１）飯島藤十郎食品科学賞は，上記２に示す研究分野

２

授賞の対象
食品科学，特に米麦その他の主要食糧を原料とする食に関し，学術上特に優秀な研究業績をあげた研究者に授与する。

品の素材，加工技術，品質，安全性，栄養，機能その他（２）飯島藤十郎食品技術賞は，上記２に示す研究分野

に関する学術上の研究及び食品の技術開発に優れた業績

に関し，食品の技術開発において優れた業績をあげたが認められる活躍中の研究者又は研究グループを対象と研究者又は研究グループ（企業研究者を含む）に授与

（ 57 ）

〔会

８

する。
４

告〕

授賞の件数及び褒賞（１）飯島藤十郎食品科学賞は，１件内外とし，賞状，
賞牌及び研究奨励金１件当たり５００万円を贈呈します。
賞牌及び研究奨励金１件当たり２００万円を贈呈します。
推薦者及び推薦方法

飯島藤十郎賞選考委員会の議を経て，理事会で決定し
９

決定通知
受賞者の決定通知は理事会の承認を得て平成３０年３月末日までに推薦者に通知します。
１０ 飯島藤十郎食品科学賞及び飯島藤十郎食品技術賞の授与（１）当財団が指定する学会又は当財団の理事，評議員，学術研究助成金贈呈式（平成３０年４月予定）に併せて

飯島藤十郎賞選考委員からの推薦を必要とします。
（２）推薦者は受賞候補者名等に関し，所定の推薦書に

選定方法

ます。

（２）飯島藤十郎食品技術賞は，２件内外とし，賞状，
５

207

行います。

必要事項を記載のうえ，当財団事務局宛ご送付願いま＊お問い合わせ，推薦書送付先す。

（公財）飯島藤十郎記念食品科学振興財団

６

推薦件数

〒２
７
２―０
０
３
４ 千葉県市川市市川１丁目９番２号

推薦件数は各々の学会，理事，評議員，飯島藤十郎賞

サンプラザ３
５ビル６F

選考委員ともに，飯島藤十郎食品科学賞及び飯島藤十郎

TEL：０
４
７―３
２
３―５
５
８
０，５
５
８
１

食品技術賞それぞれ１件以内とします。

FAX：０
４
７―３
２
３―５
５
８
０

７

URL：http : //www.iijima-kinenzaidan.or.jp

推薦期間
平成２
９年９月１日（金）〜１
２月１日（金）必着

E-mail：info@iijima-kinenzaidan.or.jp

学会推薦の締切：平成２９年１０月２０日（金）必着担当：細谷（ほそや）（公財）飯島藤十郎記念食品科学振興財団
平成２９年度 外国人留学生研究助成募集要領
１$中国，台湾，韓国，アセアン諸国をはじめとするア

助成の趣旨

ジア地域等の国籍で日本に留学している者であるここの助成は，在日する外国人留学生の研究環境を改善と。

し，研究内容の向上，充実を通して，食生活・食文化の%上記３に指定する研究分野を専攻する大学院生（博向上，健康の増進及び食品産業の発展に寄与するとともに，助成を受けた留学生が帰国後，行政機関，民間企業，

士課程後期相当）であること。

学界等における活動を通じて出身国に貢献されることを

なお，平成３
０年４月に博士課程後期等へ進学する者

期待して実施するものです。

も含める。

２

&平成３
０年４月１日の年令が満４０才未満の者であるこ

助成対象

と。

本財団が指定する分野の食品科学等に関する研究を行う外国人留学生であって，当該外国人留学生の指導教授'当該外国人留学生の指導教授の所属する機関長（研の申請に基づき，指導教授に研究助成金を交付します。

究科長以上）の推薦が得られること。なお，機関長

なお，平成２
８年度助成より要件を緩和し，国費留学生の推薦件数は２件以内とします。但し，連合農学研も対象に含めることとしております。

究科においては，構成大学全体で２件とし，推薦は３

構成大学毎にとること。

助成対象となる研究分野(留学生本人が当該助成を過去に受けていないこと。

米麦その他の主要食糧等を原料とする食品に関して次)当財団の他の助成事業と重複申請はできません。まの!〜#に掲げる分野に係る食品科学等の研究

４!

生産・加工・流通に関する基礎的研究"

製造技術及び品質保持技術の開発に関する研究#

安全・衛生，栄養・機能等に関する研究
申請要件

次の要件のすべてを満たす留学生および指導教授とします。

た，他の民間研究助成との重複助成は行いません。
５

助成金額及び助成期間等$助成金額は１件当たり１００万円以内とし，８件内外を助成します。
%助成金額は，留学生の研究計画及びその研究に要する経費などから，適切な必要額を算出します。

208

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
３ NO．
４ ２
０
１
７

#助成期間は交付後，原則１ヵ年（平成３０年４月〜平
６

指導教授より連絡願います。また，研究活動が不可能と申請方法認められる場合及び所定の事務手続きを行わなかった場!指導教授は，当財団のホームページ（http : //www.

合は，助成金の返還を求めます。

iijima-kinenzaidan.or.jp）から申請書をダウンロー

１
２ 指導教授が交替された場合より提出願います。
"申請書には留学生本人の申込書を添付して下さい。
申請期間
平成２９年９月１日（金）〜平成２
９年１２月１日（金）必着
８

国等により研究活動に支障が生じると見込まれる場合は，

成３１年３月）とします。

ドし，記入要領に従って正確に記入のうえ，書面に７（ 58 ）

選考方法
事務審査の後，選考委員会の議を経て理事会で決定し交替が確実になった時点で，新指導教授の所属，氏名を速やかに当財団に連絡して下さい。
１
３ 助成金の交付予定
助成決定後，助成金贈呈式（平成３０年４月予定）を開催し，その後速やかに交付します。
１
４ 報

告

研究成果及び助成金の使途については，平成３
１年４月

ます。

末日までに報告願います。なお，研究成果の報告につい９ては当財団の年報等に掲載し公表します。

決定通知
採・否の結果は平成３
０年３月末日までに文書にて申請者および推薦者に通知します。
１
０ 助成金交付の手続＊応募お問い合わせ，申請書請求，申請書送付先（公財）飯島藤十郎記念食品科学振興財団
〒２
７
２―０
０
３
４ 千葉県市川市市川１丁目９番２号!助成金交付に関する事務手続き，必要書類等は助成決定後お送りします。
"助成金は原則として１ヵ年分をまとめて指導教授に交付します。
１
１ 助成金の返還等
助成決定後であっても，留学生の長期欠席，休学，帰サンプラザ３
５ビル６F
TEL：０
４
７―３
２
３―５
５
８
０，５
５
８
１
FAX：０４
７―３
２
３―５
５
８
０
URL：http : //www.iijima-kinenzaidan.or.jp
E-mail：info@iijima-kinenzaidan.or.jp
担

当：細谷（ほそや）

（ 59 ）

209

日本食品保蔵科学会会則
第１条（名称および本部）

本学会は，日本食品保蔵科

２

物応用化学科食料資源理化学研究室内（東京都世田谷

役員選出のため役員選考委員会を置く。委員会の規程は別に定める。

学会と称する。本部は東京農業大学応用生物科学部生
３

会長は，理事が推薦した候補者の中から役員選考委

区桜丘１―１―１）に置き，必要な地域に支部を置くこ員会にて次期会長候補者１名を選出し，総会の承認をとができる。

得て決定する。

第２条（目的）

本学会は，食品保蔵に関する基礎的研４

理事，評議員及び監事は役員選考委員会にて選出し，究並びに応用に関する研究を推進し，生産，貯蔵，加総会の承認を得る。ただし，評議員は理事を兼ねるこ

工，流通等の技術及びこれらに関する機器の改善を図とはできない。

り，もって食品流通の合理化と食の安心，安全並びに５

副会長は理事より選出し，総会の承認を得る。

安定を期することを目的とする。

６

事務局長は理事より選出し，会長がこれを委嘱する。

第３条（事業）本学会は，前条の目的を達成するため，第７条（役員の職務）

次の事業を行う。

とする。

!

会誌の発行

!

"

研究発表会，講演会等の開催#

情報交換，研究調査，資料の収集と頻布$

研究業績及び本学会への功績に対する授賞%

その他，本学会の目的達成に必要とする事業

第４条（会員）"#$%&多年にわたり本学会の発展に寄与した

正 会 員

本学会の趣旨に賛同し，正会員会費を学生会員

第９条（顧問）

団体会員
維持会員

第１
０条（総会）
２

定期総会は毎年１回開く。臨時総会は理事会が必要と認めた場合に開く。

本学会の事業を賛助するため入会し，本学会には次の役員を置く。

総会は定期総会及び臨時総会とし，会長がこれを主宰する。

本学会の事業を賛助するため入会し，維持会費を納めた企業又は団体等。
第５章（役員）

会運営上の事項について会長の諮問に応ずる。

大学院，大学及び短期大学又はこれに団体会費を納めた教育・研究機関，協会，企業等。
&

本学会には顧問を置くことができる。

顧問は，理事会の議を経て会長がこれを委嘱し，本学準ずる学校に在籍し，学生会員会費を納めた学生。
%

役員の任期は２カ年とする。ただし再任は妨げない。

納めた個人。
$

監事は会計及び会務の状況を審査する。

第８条（役員の任期）

り総会の承認を得た者。
#

評議員は評議員会を構成し，理事会の諮問に応ずる。

に諮り，総会の承認を得た者。
者であって，理事会の推薦に基づき，評議員会に諮

理事は理事会を構成し，会長の付議する事項について審議する。

本学会に特に功績のあった者，又は学終身会員

事務局長は会長を補佐し，学会運営に関する実務を統括する。

識経験者であって，理事会の推薦に基づき評議員会"

副会長は会長を補佐し，会長に事故あるときはその職務を代行する。

会員は，食品保蔵科学に関する調査，名誉会員

会長は本学会を代表して会務を統括し，理事会及び評議員会を召集する。

情報の提供その他の便宜を受けることができる。
!

本学会の役員の職務は次の通り

３

総会の議決は出席者の過半数をもって決する。

４

総会は次の事項について審議又は議決する。

!

会

長

１名

!

会則の変更

"

副 会 長

３名

"

会費の決定又は変更

#

事務局長

１名

#

事業計画・報告及び収支予算・決算

$

常任理事

若干名

$

事業計画及び収支予算の審議

%

理

事 ４
０名以内

%

その他理事会において必要と認めた事項&

評 議 員 ８
０名以内

'

監

事

理事会は定期理事会及び臨時理事会とし，会長が召集し，議長を務める。

２名

第６条（役員の選出）する。

第１１条（理事会）

本学会の役員は正会員より選出

２

定期理事会は毎年１回開く。

３

臨時理事会は会長が必要と認めたとき，又は理事の

210（ 60 ）

３分の１以上の要求があったときに開く。
４第１５条（会計）

もって当てる。

理事会は，理事の３分の２の出席により成立するものとし，過半数をもって決する。

５

２

６

３

理事会は次の事項について審議又は決定する。
!

事務局（以下事務局）を置く。
２

事務局長は事務局を統括する。

総会の決議した事項の執行に関すること。

３

事務局に幹事若干名を置くことができる。

#

会務を執行するための計画，組織及び管理運営に

４

幹事は理事会の議を経て，会長がこれを委嘱する。

５

幹事は事務局長を補佐し，庶務，会計の実務を行う。

$

細則，諸規程の制定又は改廃に関すること。

%

その他理事会において必要と認めた事項。

第１２条（運営役員会）

本学会の会務を執行するために

第１７条（職員）

運営役員会は，会長，副会長及び第１４条に定める委を置くことができる。
て変更することができる。
付則
１．本会則は昭和４９年７月６日から施行する。

第１１条の６に定める事項を審議し，理事会の議を経て

２．本会則は昭和５６年５月２６日に改正する。

これを執行する。

３．本会則は昭和６１年２月２２日に改正する。

監事は必要に応じて運営役員会に出席し，意見を述

第１３条（評議員会）

評議員会は会長が召集し，会長が４．本会則は昭和６２年２月２１日に改正する。
５．本会則は平成元年２月１０日に改正する。
６．本会則は平成２年５月２６日に改正する。
７．本会則は平成３年５月２５日に改正する。

議長を務める。
理事及び監事は，評議員会に出席し意見を述べるこ

８．本会則は平成５年６月５日に改正する。
９．本会則は平成７年６月３日に改正する。

とができる。
評議員会は会務について会長の付議する事項を審議し，意見を述べることができる。

１
０．本会則は平成８年５月２５日に改正する。
１
１．本会則は平成９年５月２４日に改正する。

本学会は事業の遂行のために必要と

１
２．本会則は平成１３年６月１５日に改正する。

する委員会を置くことができる。委員会の規程は別に

１
３．本会則は平成１６年６月２６日に改正する。

定める。

１
４．本会則は平成１９年６月２３日に改正する。

第１４条（委員会）

２

本学会の会則は総会の議によっ

員会の委員長にて構成する。必要に応じ会長が召集しべることができる。

３

本学会には会長の委嘱により，事務員

第１８条（会則の変更）

運営役員会を置く。

２

本学会の事務処理のため，本部"関すること。

３

本学会の会費規定は別に定める。

第１６条（本部事務局）

総会に付議すべき事項及び総会の召集に関すること。

２

本学会の会計年度は，毎年４月１日に始まり３月３１日に終る。

監事は必要に応じて理事会に出席し，意見を述べることができる。

本学会の経費は，会費その他の収入を委員会は役員若干名によって構成し，委員は理事会の推薦により会長がこれを委嘱する。

１
５．本会則は平成２０年６月２１日に改正する。

在

〒

題（英文）

地

所

属

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備 考

別 刷

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T E L.

報

稿
文

研究ノート

状

受付年月日

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年

技術報告

料

情

報

月

日（

本
文
英文要旨
原 同 和 訳
稿
枚 原図・写真
数 図説明原稿
表

資

説

）

枚
枚
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枚

日本食品保蔵科学会

総「日本食品保蔵科学会誌」投稿規定
第１条 本誌は本学会規約に基づき，総説，報文，研究
ノート，技術報告，資料，情報，その他編集委員会が必要と認めたものを掲載する。
第２条 投稿は本会会員に限る。ただし共著者はこの限りではない。
第３条 投稿は本会編集委員会事務局宛とし，到着日をもって受付日とし，審査終了日をもって受理日とする。
第４条 論文は和文または英文とする。
第５条 総説は，原則として編集委員会より依頼する。
報文，研究ノートおよび技術報告は原著とし，他誌に未発表のものに限る。研究ノートは報文にまとめ得な
いが，公表することにより学会に寄与するものとする。
技術報告は，報文にまとめ得ないが，有用なデータを含み，本学会関連分野の技術向上に寄与するものとする。資料は，調査，統計などをその内容とし，本会員の研究に役立つものとする。情報は，解説記事，国内外の食品産業の動向，国際会議報告，研究所の紹介記
事など本会員に有用なものとする。
第６条 報文その他の掲載は，原則として受理順とするが，その採否および順序は編集委員会の判定による。
第７条 編集委員会は，投稿原稿の内容および字句について不適当と認めた場合は，著者に訂正または検討を求めることがある。
第８条 再提出を求められた原稿は，返送日から２カ月以内に編集委員会事務局へ返却する。２カ月以上経過した場合は，新規受付として取り扱う。
第９条 １）報文，技術報告，資料および情報は刷り上がり６頁以内，研究ノートは４頁以内（図，表を含む）とする。これを超えた場合は，１頁につき２０，０００円を徴収する。図はトレースする必要のない鮮明な原稿を添付する。トレースが必要な場合およびカラー写真を掲載するときなどは実費を徴収する。
２）審査終了後，編集委員会において英文校閲を専門機関に依頼する。なお，費用については実費を徴収する。
第１０条 原 稿 は「投 稿 論 文 記 載 要 領」
（毎 年１号 に 記載）に従い作成し，原稿の他，鮮明なコピー２部を添付する。なお，原稿には和英両文の題目，著者名，所属などを記入した送状（学会誌に綴じ込みのもの）を添付する。
第１１条 原稿はワープロソフトを用いて作成し，
掲載可に
なった後，
そのフロッピーディスクを事務局へ送付する。
第１２条 初校の校正は，著者が行う。その際，投稿原稿は送付しない。
第１３条 別刷りは実費を徴収する。
第１４条 本誌に掲載された論文の著作権は，日本食品保蔵科学会に属する。
付 記
原稿送付先は次の通りとする。
〒１
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２ 東京都世田谷区桜丘１−１−１
東京農業大学 生物応用化学科
食料資源理化学研究室内「日本食品保蔵科学会」
編集委員会 事務局
（平成２
２年５月２
２日一部改正）平成２２年１０月１日改正施行◆複写される方へ◆■別刷代金■
本誌に掲載された著作物を複写したい方は，"日本複権セン
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和
文
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ターと包括複写許諾契約を締結されている企業の従業員以外は，
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図書館も著作権者から複写権等の行使の委託を受けている次の
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団体から許諾を受けて下さい。著作物の転載・翻訳のような複
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写以外の許諾は，直接本会へご連絡下さい。
〒１０７―００５２ 東京都港区赤坂９―６―４１ 乃木坂ビル
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学術著作権協会（注）端数部の場合でも，上記金額となります。
TEL：０３―３４７５―５６１８ FAX：０３―３４７５―５６１９
E―mail : info@jaacc.jp◆アメリカ合衆国における複写については次に連絡して下さい。
Copyright Clearance Center, Inc.
２２２ Rosewood Drive, Danvers, MA ０
１９２３ USA
Phone：（９７８）７５０―８４
００ FAX：（９７８）７５０―４７
４４■会費規定■

正会員会費
学生会員会費
団体会員会費
維持会員会費

年額
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年額
１，
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０円
年額１口 ２０，０００円
年額１口 ５０，０００円

日本食品保蔵科学会誌 第４３巻第４号 平成２９年７月３１日印刷発行
編集発行者

発行取扱所

一般社団法人日本食品保蔵科学会
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東京農業大学 生物応用化学科 食料資源理化学研究室内
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銀 行 口 座 三井住友銀行経堂支店 普通５
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００１１ 東京都文京区千石 ４
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（亜細亜印刷）