フィールド・フロー・フラクショネーション（FFF）

Eclipse

蛋白質・高分子・ナノ粒子の分離システム

URL

https://www.shoko-sc.co.jp

FFF-MALS法による絶対キャラクタリゼーション
フィールド・フロー・フラクショネーション（FFF）は、高分子やナノ粒子をサイズ分離する手法です。単一の分 離 チャン ネ ル 内 の 流 量 を 変 更 す る の み で 1 〜
1,000 nm 以上の範囲全体にわたる高分子、微粒子、エマルジョンなどを優れた分解能で分離できます。
FFF システム Eclipse と多角度光散乱検出器 DAWN、示差屈折率検出器、UV/Vis 検出器等を組み合わせることで、試料の分子量 *、濃度、形態、組成などを明らかにします。
（* 溶解している高分子のみに適応します）

FFF-MALSの分離＆分析対象物● 遺伝子ベクター、ウイルス、DDSナノ粒子● ナノプラスチック、金属ナノ粒子、無機微粒子● 蛋白質とその会合・凝集体● 高分子

オンライン分析だけでなく、分画した試料を採取すること
で、オフラインで、他の評価手法による解析も可能にします。

先進的な技術
Eclipseは、感度、再現性、機能性、操作性において、従来の装置よりも大幅に進歩し、更に以下の新機能が追加された最先端のFFFシステムです。
希釈コントロールモジュール（DCM）：試料濃度を最大10倍まで高め、感度と分画量を高めます。
Mobility：電場式非対称フローFFF（ EAF4）法による分離を実現させ、サイズごとのゼータ電位を求めることができます。
分離チャンネルデザインの向上：温調機能が追加され、回収率、安定性、圧力安定性に優れます。
システムヘルスインジケーター：タッチパネルスクリーン上でシステムの状態を確認できます。

Eclipseの特長
優れた信頼性と操作性、高機能信頼性の高い
高性能ポンプ1台でシステムを制御することにより、安定した送液を実現

SECスイッチング
超音波洗浄機（オプション）
により、COMETを内蔵し、同一システムでFFF-MALSとSEC-MALSのセル洗浄が可能
双方の測定に対応

システムヘルス
インジケーターとトラブルシューティング
ガイダンスにより安定した運転をサポートします

溶媒マネジメント機能による溶媒のリサイクルにより、溶媒使用量を削減

水系緩衝液、有機溶媒に対応

全ての流路の流量をリアルタイム測定し、優れた精度と再現性を実現インテリジェンスを体験できます
システム状態を反映するフロントパネルは、スマートサービスの入口です。

分離チャンネルの状態
分離チャンネルの状態はグラフィック表記され、各流路の現在の状態を直感的に確認することができます。また、ストリップチャートグラフは、システムパラメータがどのように変化したかと設定値とのずれも表記します。

システム準備モニター
システムの平衡化が不完全であったり、状態に異常を生じたことにより、測定を無駄にすることはありません。
システム準備モニターは、全てのパラメータが最適であるかどうかを継続的にチェックしています。
問題が発生した場合は、警告を発し、システムを最善の状態にするために何をする必要があるかについて実用的なガイダンスを提供します。

リアルタイムヘルスインジケーター
システム準備モニターは、システム全体を表示していますが、より詳細情報はリアルタイムヘルスインジケータ
ーで確認できます。問題が発生した際に何が起こっているかを表示するだけでなく、解決策を表示します。

コレクションモード
測定中、ディスプレイには、現在の測定の状況を示す進行状況バーや、一連の測定の完了までの残り時間など、実験に関する包括的な情報が表示されます。

FFF法の分離Eclipseは、非対称フロー・フィールド・フロー・フラクショネーション（F F F）法 により、高 分 子 や 微 粒 子を分メソッドの最適化離するシステムです。FFFは、単相の分離技術で、細くFFF法における試料の保持時間 t R は、物理学上、以下リボン 状 の チャンネ ル 内 に 以 下 の 2 つ の 流 れ を 発 生の式の通り、試料の拡散係数D t 、チャンネルの高ささせ、制 御 することにより、高 分 解 能 の 分 離を実 現し

w 、及 び チャン ネ ルフ ロ ーとクロスフ ロ ー の 比 率ます。

F x /F ch にのみ関連しています。

● チャンネルフロー：メンブレンに平行で長辺方向の流れ● クロスフロー：ナノ孔メンブレンを透過する垂直方向の流れ
クロスフローは、試料を底壁に押し付ける力場として機能しますが、試料の拡散力は、それに対し反力を示し、その為、分離メソッドの検討において、クロスフローを調整するだけで、分離を最適化できます。クロスフ
ロープログラムは、直線形及び指数勾配に対応します。

試料をチャンネルの中央に向かって分散させます。これらの力のバランスにより、メンブレン上に、粒子の拡散係数（つまり流体力学的な大きさ）のみに依存する指数関数的な濃度プロファイルが生み出されます。
チャンネルフローは、層流であり、チャンネルの中央部が早く、壁面が遅い、放物型微分速度プロファイルを発生させます。従ってメンブレンより、より上部にある小さな粒子が先に溶出し、追って低い位置にある大きな成分が溶出します。
Eclipseは、フォーカスゾーンモードとチップインジェクFFFによる分離は、固定相が無く、表面積が非常に少ションモードの2種の注入手法を実装しています。前者ないため、試料をせん断することがなく、かつSEC分は、AF4分離に最適なモードで、後者は、SECモードで離に比べ、相互作用も少なくなります。

必要になります。

機能アップ可能なオプション
新しいレベルのパフォーマンスを追加します。

希釈制御モジュール（DCM）
希釈制御モジュール（DCM）は、試料を含まない上壁付近のチャンネルフローの一部を厳密に調整された方法で分割することにより、分離チャンネルから溶出する試料の濃度を標準FFFの最大10倍まで上げることができます。
最大5倍までは、分解能を保つことができます。

DCMの特長● 低濃度試料の高感度検出が可能● 分取試料の濃縮が可能● 動的光散乱検出の測定精度が向上● 検出器の流速を制御することにより、溶出時間の再現性が向上

DCMは、試料の損失や分解能を落とすことなく、試料が含まれない溶媒を除去することにより、検出器での試料濃度を高めます。
上のデータは、ウシ血清アルブミン（BSA）をDCM機能を用いて分離し、UV検出したものの重ね書きです。
スプリット比の増加に比例して、ピークが大きくなっています。

SEC切り替え機能
同一のシステムで、配管等を交換する必要なく、FFF-MALSとSEC-MALS測定の双方を実行できます。FFF分離チャンネル
使いやすさと性能を向上させたデザイン

全てのアプリケーションに適した分離チャンネル

上面

Eclipseは、様々な試料負荷量と分離要件に対応する数種のFFF分離チャンネルを用意しています。ショートチ

Oリングャンネルは、殆どのアプリケーションに適しています。

スペーサー

ロングチャンネルは、大きな粒子または、高分子の分離メンブレン
フリットを低クロスフローで行うことができ、メンブレンとの相互作用を最小限に抑えることができます。セミ分取チャOリング

ンネルは、mg範囲までの試料負荷量を可能にします。

土台

凝集しやすい試料の場合、フォーカス作業を伴う分離手法が適さないことがあります。そのような試料には、温度調整フォーカス作業の必要が無いディスパージョンインレットチャンネルが最適です。

優れた性能を継続

ロングチャンネルの分解図

優れた再現性分離チャンネルは、材質にSUS316を使用し、測定実行再現性の高い保持時間を維持するには、分離チャンネ中または、その間に、湾曲やズレたりすることの無いよ

ルの硬直性に加えて、安定した温度制御も重要です。全うに硬直に設計されています。このことが、全てのタイてのEclipseチャンネルには、温調機能が付属しており、プの溶媒との互換性を維持しながら、前例のない信頼周囲温度から最大50℃までチャンネル内部の温調が性と検出器の信号の品質の向上に繋がります。

可能です。この機能は、特に実験室内の温度が変動しやすい夜間などに実験を行う際に有用です。

更に、新しいチャンネルスペーサーは、微視的な漏れの無い最適なシーリングを保証し、最大の試料回収率を提供します。
Mobilityチャンネルを含む、全てのチャンネルは、DCMに対応します。

左から、ショート、ロング、ディスパージョンインレット、セミ分取、電場式FFF用分離チャンネル

Mobility™
EAF4法での粒子径と電荷による分離を実現します。

Mobilityは、Eclipseシステムと組み合わせ、内部に電Mobilityを用いることにより、同じ大きさの粒子で極を追加した特殊なFFF分離チャンネルを利用するこの電荷の違いで分離することができます。とで、電場式非対称フローFFF（EAF4）を実現させます。
EAF4は、ナノ粒子や高分子の大きさだけではなく、電気移動度も決定します。
異種試料の場合、EAF4は、各試料のゼータ電位も測定できます。

EAF4の利点
電荷は、蛋白質やオリゴヌクレオチドだけでなく、ナノ粒子においても重要な特性で、コロイドの安定性や相互作用に深く関係します。故にナノ医療の有効性や安全性の研究において、重要なパラメータになります。
EAF4は、各成分の大きさ、電荷、もしくはその双方によ電場による溶出時間のズレから各ピークの電気移って区別されるかは関係なく、複雑な試料内の各成分動度とゼータ電位を決定することができます。ここでの大きさと電荷の両方を同時に決定できる手法です。

は、3種のポリスチレンラテックス粒子の混合試料をEAF4で測定した結果を示しています。各粒子の粒子径とゼータ電位の双方を決定できます。

Mobilityでできること● 試 料 中 の 全ての 成 分 が 同じ化 学 表 面であるか否かの確認● 薬物と核酸デリバリー用ナノ粒子のN/P比の評価● バイオ医薬品の化学的もしくは物理的劣化の評価

EAF4の分離機構

EAF4では、クロスフローと平行の電場が印加され、試電場を掛けない場合の保持時間から流体力学径を計料は、その電荷に比例した力を受けます。試料の極性算できますが、印加した電場に対する保持時間のシフに応じて、その力は上方もしくは下方に向けられ、メントの大きさから、電気泳動移動度とゼータ電位を導きブレン上の平衡化の高さが変わります。これに対応し、出せます。この分析は、フラクトグラム内の各ピークにその保持時間は、電場を掛けないAF4からズレを生じ対して行えます。

ます。

リポソームの測定

リポソームを0、-12、-23 V/mの電場を掛けて測定した

VISION DESIGNは、左図のデータから、各成分の粒子径、際のフラクトグラムです。電場を掛けないAF4のみの分電気移動度、正味電荷、ゼータ電位を計算することがで離では、単一成分のように見えますが、負の電場を掛きます。

けることでショルダーピークとなり、更に負の電場を強この測定により、ゼータ電位で約2.5倍異なる成分があるめることで、ゼータ電位の異なる2成分が混在していることが明らかになりました。

ことが明らかになりました。

インターフェースソフトウェアVISIONと解析ソフトウェアASTRAVISIONASTRA

VISIONは、Eclipseと多角度光散乱検出器DAWNで構成されたFFF-MALSシステムのインターフェースソフト

ASTRAは、MALS、DLS、RI、UV検出器の信号を収集

ウェアで、システム制御から、分析メソッドの作成、最適し、解 析を行えます。絶 対 分 子 量、粒 子 径 の 決 定 の化、実行、記録に至るまでを行います。

他、以下の情報を提供します。

VISION DESIGN、VISION RUNの2つのモジュールで構成されます。

・粒子濃度の計算と粒子形状もしくは構造の評価
・高分子のコンフォメーション、分岐度の決定・ウイルスベクターの核酸含有量もしくはPEG化蛋

VISION DESIGN:FFF分離条件の最適化のために、物理的なFFFの分離理論とコンピュータの演算から、分離シュミレーションを実行します。また、AF4とEAF4の測定値から拡散係数とゼータ電位も計算できます。

VISION RUN:
FFFメソッドを実行するための包括的なソフトウェアです。ポンプ、オートサンプラー、Eclipse、検出器、ASTRAをシームレスに動かします。 またVISION DESIGNでの診断と分析のために、FFF,電気、UV信号を記録します。

白質のPEG含有量の評価
・複数試料の測定結果のグラフ化と平均値、標準偏差を計算し表形式の結果表示することが可能

統合ワークフロー
メソッド開発からデータの解析まで

VISIONは、試料を測定する前に、FFFのフロープログラムをコンピュータで開発及び最適化することから始まり、試料のシーケンスを実行、データ処理、分離条件の改良、レポートの作成、データの統合に至るまで、幾つかの簡単なステップで、シームレスなワークフローを提供します。

メソッドのデザイン● 試料の粒子径を推定● スペーサーとフロープロファイルを選択

VISION DESIGN● FFF分離理論に基づき、シュミレーション、分離パターンを予測

最適化されたメソッドの転送

測定の実行● 流速、電場、UVデータの取得

VISION RUN● 分画の収集● システムの監視と診断

ASTRAとの同期

データ処理とレポートの作成● プロジェクトファイルの照合● MALS-DLS-UV-RI検出器による● 保持時間から粒子径の計算

データ解析● 分離メソッドの改良

VISION DESIGN● ゼータ電位の決定● 図表の作成

ASTRA● レポートの作成

FFF分離条件の作成
VISION DESIGN

PC内でのシュミレーション機能
VISION DESIGNを使用することにより、FFFの分離条件検討に、膨大な時間を費やす必要はなくなります。試料の推定粒子径をリスト化し、FFF分離チャンネル、メンブレン、スペーサーの種類を選択し、クロスフローグラジエントを設定するだけです。VISION DESIGNは、FFFの基本理論に基づいて保持時間を計算し、予想されるフラクトグラムを表示します。
様々なクロスフローの流速と時間の影響を調べて分解能を向上させ、最適な分離条件を見つけるのに数分しか掛かりません。全て、デスクワークで実行できます。

分析条件の改良
最終的に決定した測定条件は、クリックするだけで、VISION RUNに転送され、実行できます。
最初に設定が実試料に適さなかった場合、測定結果をVISION DESIGNにフィードバックし、測定条件を改良することができます。通常、1回のテスト測定で最適化に十分な情報を得ることができます。

FFFシステムのコントロール
VISION RUNVISION RUNは、Eclipse FFFシステムの洗練されたコントロールセンターです。ダッシュボードには、装置の状態がリアルタイムで表示され、システムの機器構成や試料のシーケンスを直接確認できます。また、装置に異常が発生した場合は、ヘルスインジケーターに警告が表示され、実用的な推奨対応事項が表示されます。VISION RUNは、Agilent 1260シ
リーズの機器制御フレームワークを使用しています。オートサンプラー、送液ポンプ、各種検出器、フラクションコレクターに至るまで、サポートできます。

シーケンス
VISION RUNで、FFF-MALSの分析メソッドを含む試料シーケンステーブル作成後、測定を開始します。測定は、解析ソフ
トウェアASTRAと同期し、全自動で行われます。また、必要な場合、システムヘルスインジケーターが、介入し、無駄な実行を防ぐように警 告します。実 行 中 のシーケンスに更 に試 料を追 加 する場 合 は、テーブル に行を作 成 するだ けで、VISION RUNに追加の試料が組み込まれます。

FFFデータ解析
VISION DESIGN

粒子径分布
VISION DESIGNは、VISION RUNで取り込んだフラクトグラムを読み込み、試料の保持時間と、FFFの分離理論に基づいた計算もしくは、標準粒子を用いて作成した較正曲線から、試料の流体力学的半径を求めることができます。
この機能から得られる詳細な高分解能粒子径分布は、FFF-MALSや動的光散乱法のデータを補完します。

ポリスチレン標準粒子の実測のフラクトグラム及び較正曲線（赤）と理論値より計算したフラクトグラムと較正曲線（緑）の比較

電気伝導移動度とゼータ電位
VISIONは、様々な印加電場で行われたEAF4測定から、電気泳動移動度とゼータ電位を計算できます。データ処理は、自動化され、ベースライン、ピークの選択に加え、ピーク保持時間と電場によるシフトまで含みます。

アプリケーション
ウイルスベクターと会合体

DNA/RNAと脂質ナノ粒子

FFF-MALSは、AAV、アデノウイルス、レンチウイルス

mRNA、siRMA、プラスミドDNAなどは、脂質ナノ粒子などのウイルスやウイルスベクターの粒子径や濃度（LNP）などの非ウイルスベクターに取り込まれ、ドラ情報を提供します。上図は新鮮（青）なアデノウイル

ッグデリバリーに用いられることがありますが、ナノスと時間経過(赤）したアデノウイルスの測定結果で粒子に内包されたDNA/RNAの量を知ることは非常す。核酸治療薬の安全性を評価するために必要な、に 重 要で す。ここで は、F F F により、フリー の R N AとmRNA-LNP複合体を分離し、フリーのRNAを定量で凝集体の評価を行えます。

きることを示しています。また、MALS-UV-RI検出を行うことにより、LNPの粒子径分布や核酸の内包率も知ることができます。

ラテックス粒子の分離測定
Geometric Radius vs. Time

DukeB_01
1st order

200

Geometric Radius (nm)

分岐高分子の測定

15010050010203040Time (min)506070

粒子半径25〜150 nmまで、5種のポリスチレンラテッ

分岐高分子の分岐度や分子形態を適切に解析するためにクス標準粒子をFFFで分離し、MALS検出器で各々のは、正しくサイズ分離を行うことが重要です。SECカラムで粒子径を測定した例です。一般的に使用されるバッは、時折、分岐高分子の溶出が遅れることがありますが、チ式の動的光散乱測定では、得られない高分解能粒FFFでは、そのような試料でも正確にサイズ分離を行うこと度分布測定を実現させます。UV検出器などのHPLCができます。
ここでは、同一の分岐高分子をSEC-MALS測定検出器と接続することで、粒子の定量分析にも対応しで行った場合とFFF-MALSで行った場合のコンフォメーショます。

ンプロットを示しています。
SECでは、高分子成分の溶出が遅れることにより直線性が得られていませんが、FFFでは直線性が得られ、より正確な分岐高分子の解析が行えます。

仕 様
Eclipse
対応溶媒水系(pH = 2〜12）及び有機溶媒（THF、トルエン、etc.)

接液部材質

316ステンレス鋼、FFKMパーフルオロエラストマー、FR3ステンレス鋼、ベスペル

クロスフロー制御

0.03〜6.67 ｍL/min

チャンネルフロー流速正確さ

0.1％（with DCM)

通信

Ethernet

分離チャンネル
種類

ショート、ロング、ディスパージョンインレット、セミ分取

最大圧力30 bar (全チャンネル）温調

室温〜50℃

接液部材質

316ステンレス鋼、フューズドシリカ、FFKMパーフルオロエラストマー、アルミナセラミック、ポリカーボネート（水系）、Mylar（有機溶媒）

スペーサー

250〜1,000 μm（チャンネル種類に依存）、FFKMパーフルオロエラストマー（水系）、Mylar（有機溶媒系）

メンブレン

再生セルロース、ポリエーテルスルフォン

出荷時オプション

DCM（希釈制御モジュール）、SECスイッチング

電場式FFF

Mobility（追加オプション、pHセンサー、電導度センサー内蔵）

最大付加電力±30 V

最大付加電流±30 mA

接液材質

プラチナ、チタン、ポリエーテルイミド、アルミナセラミック、PTFE、バイトン、PEEK、ポリカーボネート

寸法58 ㎝（L)×36 ㎝（W）×26 ㎝（H)

＊送液ポンプ、脱気装置、オートサンプラーorマニュアルインジェクターが別途必要です。
■仕様およびデザインは、改良のため予告なく変更される場合があります。

販売代理店

ホームページ https://www.shoko-sc.co.jp
E-mail会員募集中

ホームページ＞お問合せ＞「総合お問い合わせフォーム」
よりお申し込みください。
WyCa3.0-2104-3000-PP①