55●低分子化抗体精製向けアフィニティークロマトグラフィー充塡剤 TOYOPEARL® AF − rProtein L − 650F の開発
バイオサイエンス事業部

開発部

セパレーショングループ

小林
荒木

秀峰
康祐

産コストの低減などが期待されている。また、体内半1．はじめに減期が完全長抗体と比較して短くなる傾向があること

抗体医薬品は、高い治療効果と副作用の軽減が期待

や、目的部位への化学的修飾が容易である特徴から、できる疾患関連分子に特異的に結合する抗体を遺伝子

ラジオアイソトープなどを付与したイメージング用途

組換え技術等を応用して作製したものである。2015や 8）、ポリエチレングリコール（PEG）付加により半

年度までに日米欧で承認された抗体医薬品は 40 品目

減期を延長させた医薬品への用途などに使われ始めてを超え 、医薬品の売上げに占める割合は益々増加しいる 9，10）。低分子化抗体は、その目的に応じて Fab、ている。近年、次世代型の抗体医薬品として、抗体の

scFv、Diabody 等、またこれらを連結させた構造（図１）

構造の改良や修飾を施した、低分子型、二重特異性型、のものなど様々な研究、開発がなされている 3）。

1）

融合抗体型などの研究、開発が活発になっている 2，3）。

現行型の抗体は、Fc 領域に高い親和性を持つプロ

現行型の抗体医薬に使われている免疫グロブリン G

テインＡをリガンドとした担体をアフィニティー工程（IgG）は、軽鎖（L 鎖）と重鎖（H 鎖）の 2 つのポリで使用する確立された精製プラットフォームが標準法

ペプチド鎖がそれぞれ 2 本ずつジスルフィド結合を介として利用されている 11）。一方、Fc 領域を含まない

して結合し、Y 字型のヘテロテトラマー構造をしてい低分子化抗体については、精製の標準法が未確立である。次世代型の低分子化抗体は、抗原結合部位であるり、低分子化抗体の工業生産において、汎用のイオン

可変領域（VL、VH）を残して、定常領域などを削り、交換クロマトグラフィー担体や疎水性相互作用クロマ

分子量を小さく改良したものである。抗体は低分子化

トグラフィー担体などを適宜組合せた手法で精製が行をすることで、組織などへの浸透性が向上し、固形ガわれている 12）。そのため、精製工程の構築に、多大

ンや脳などへの投薬として効果を高めることや 4，5）、な労力が必要とされており、アフィニティー工程に使大腸菌などの微生物生産系を用いることでき

6，7）

、生

用可能なクロマトグラフィー担体が望まれている。今重鎖

プロテイン L（κ軽鎖）

軽鎖

プロテイン A

Fc 領域

IgG
150 kDaFab
55 kDascFv
28 kDaIgM
750 kDa

VL domain
15 kDaTandem scFv
55 kDa太矢印：リガンド（プロテイン L、プロテイン A）の結合部位

図１

抗体及び低分子化抗体の代表的な構造

Diabody
55 kDaTOSOH Research & Technology Review Vol.60（2016）

56

回、低分子化抗体の精製に有効とされるκ軽鎖に特異破過曲線の 10 ％ 破過時の試料負荷量から、充塡剤の的な親和性を持つ組換えプロテインＬをリガンドとす

動 的 吸 着 量（Dynamic binding capacity：DBC） を 算

るアフィニティー充塡剤 TOYOPEARL AF − rProtein L出した。

− 650F を新たに商品化した。既存市販品と比較した基［4］静的吸着量の測定

本性能を表１に示す。本稿では本商品の基本的な特徴

充塡剤を 1 mL 計量し、ディスポーザブルカラムに移した。充塡剤の 4 倍量の 0.1 mol ／ L クエン酸ナトについて報告する。

リウム緩衝液（pH 2.2）で洗浄後、4 mL の 0.1 mol ／ L
リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）を用いて溶媒置換

2．実 験 項［1］試する操作を 2 回繰り返し、平衡化した。150 g ／ L のポ
リクローナル IgG

薬

2 mL と 0.1 mol ／ L リン酸ナトリ

リン酸水素二ナトリウム十二水和物、リン酸二水素

ウム緩衝液（pH 7.5）4 mL 加え、25℃で 90 分間撹拌ナトリウム二水和物、硫酸ナトリウム、クエン酸一水して吸着させた。脱液後、0.1 mol ／ L 硫酸ナトリウム

和物、クエン酸ナトリウムなどの試薬は和光純薬工を含む 0.02 mol ／ L リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）

業㈱、パパインは Sigma − Aldrich 社、ヒト由来ポリクを 4 mL 使用して充塡剤を洗浄する操作を 6 回繰り返

ローナル抗体（ポリクローナル IgG）は広島和光㈱よした。0.1 mol ／ L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 2.4）

り購入した。ヒト化モノクローナル抗体（モノクロー

を 4 mL 加えて通液させた後、0.1 mol ／ L クエン酸ナ

ナル IgG）は、Tosoh Bioscience GmbH から提供されトリウム緩衝液（pH 2.2）を 4 mL 加える操作を 4 回たものを使用した。

繰り返し、吸着したポリクローナル IgG を溶出させた。

［2］抗体のパパイン消化13）

溶出させたポリクローナル IgG 溶液を 250 mL にメス

0.15 mol ／ L 塩化ナトリウム、0.01 mol ／ L システイ

アップし、
280 nm の吸光度を測定し、静的吸着量（Static

ン、0.01 mol ／ L EDTA、0.1 g ／ L パパインを含む 0.05

binding capacity：SBC）を算出した。

mol ／ L リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）にポリク［5］充塡剤のアルカリ安定性

ローナル IgG 又はモノクローナル IgG を 3 g ／ L とな充塡剤を 1 mL 計量し、ディスポーザブルカラムへるように加え、25℃で 17 時間消化させた。消化率を移した。純水で保存溶媒を置換し、続いて 0.1 mol ／ L®

TSKgel G3000SWXL を用いたサイズ排除クロマトグラ

水酸化ナトリウム溶液を 4 mL 用いて 3 回置換し脱フィー分析により確認した後、ヨードアセトアミドを液した。0.1 mol ／ L

添加し反応を停止させた。

えスラリーとして、25℃で撹拌した。所定時間経過後、［3］動的吸着量の測定

実験項［4］に従い、静的吸着量の測定を行い、吸着充塡剤を 4.6 mm I.D. × 50 mm のステンレス製カラムに充塡した。実験項［2］に従い、ポリクローナル

水酸化ナトリウム溶液 4 mL を加量の減少率を算出した。
［6］Fab の精製

IgG の消化物を得た。続いて Fc 領域やλ軽鎖などプ

2 g／L のモノクローナル IgG を原料として実験項［2］ロテイン L へ結合しない成分を取り除いて Fab 成分

に従い、Fc 成分と Fab 成分が含まれるパパイン消化を調製した。調製した Fab 溶液を 0.1 mol ／ L リン酸ナ液を調製した。充塡剤をカラムへ充塡し、液体クロマ

トリウム緩衝液（pH 7.5）で 2 g ／ L の濃度に希釈し、トグラフへ接続し、パパイン消化液を 1.2 mL カラム

試料溶液とした。充塡カラムを液体クロマトグラフへへ添加した。この時、素通り成分を回収した。次に、接続し、UV 280 nm の吸光度をモニタリングしながら、洗浄液として 0.1 mol ／ L クエン酸ナトリウム緩衝液

試料溶液を所定の流速でカラムへ負荷した。得られた（pH 6.5）を UV 280 nm の吸光度がベースラインに戻

表１

TOYOPEARL AF−rProtein L−650F の基本性能

項目

TOYOPEARL AF−rProtein L−650F

他社市販品

ベースゲル
リガンド
粒子径
IgG 静的吸着量
保存溶媒

親水性ポリマー
組換えプロテイン L
30−60 μm（平均 45 μm）
64 g ／ L 以上
20 ％エタノール

架橋アガロース
組換えプロテイン L（平均 85 μm）
45 g ／ L 以上
20 ％エタノール

・その他項目：生菌数、エンドトキシン、異物、溶出物の規格値は既存製品と同一。
・本商品、及び他社市販品の基本性能は、製品カタログより転載。

東ソー研究・技術報告

るまで通液させた後、溶出液とした 0.1 mol ／ L クエン

第 60 巻（2016）［2］アルカリ安定性タンパク質医薬品の精製工程では、定置洗浄（CIP）

酸ナトリウム緩衝液（pH 2.5）に切り替え、吸着成分®

57を回収した。回収した各画分について、TSKgel UP −に 0.1 mol ／ L 水酸化ナトリウムが標準として使用され

SW3000 を用いてサイズ排除クロマトグラフィー分析ている。そこで、実験項［5］に従い、充塡剤を 0.1を行い、LC データ収集アプリケーション（LC − 8020

mol ／ L 水酸化ナトリウムへ浸漬して評価を行い、経Model II Ver. 5.04）を用いて計算を行った。

過時間後の IgG 静的吸着量の保持率を調べた結果を図［7］カラム圧力損失２に示す。9 時間の浸漬処理において 90 ％の吸着量

充塡剤を 4.4 cm I.D. カラムに充塡し、純水を所定の流量で通液した際の圧力損失を測定した。

を維持しており、他社市販品の吸着量の低下速度との比較では 1 ／ 2 となり、高いアルカリ安定性を示した。
［3］パパイン消化液からの Fab の分離精製
分離精製時のクロマトグラムを図３に示す。精製前

3．結果と考察の試料、素通り画分、溶出画分をサイズ排除クロマト
グラフィーで分析した結果を図４に示す。ピークの同［1］タンパク質の吸着量
ポリクローナル IgG に対する静的吸着量、及びポリ

定は SDS − PAGE による分子量の確認、及びプロテイ

クローナル IgG から調製した Fab に対する動的吸着

ン A 担体に対する吸着性の確認により行った（デー

量を評価した結果を表２に示す。他社市販品と比べて、静的吸着量では 1.7 倍、動的吸着量はカラム内滞留時

1000
素通り画分

間 4 分において 1.8 倍以上となり、優れた吸着量を有していることを確認した。
UV280nm（mV）

IgG 静的吸着量比率（％）

110
TOYOPEARL
AF−rProtein L−650F

100
90
他社市販品

80

400

0

60
50
0

2

溶出液切換

4
6
NaOH 溶液浸漬時間（h）

8

0

10

0.1 mol ／ L 水酸化ナトリウム中での吸着量の保持率

表２

10

図３

30
時間（min）

40

Fab 精製クロマトグラム

静的吸着量及び動的吸着量

TOYOPEARL
AF−rProtein L−650F

他社市販品

静的吸着量（g ／ L）

7142

動的吸着量（g ／ L）

49
33

26
19

項目

20

50

カラムサイズ：5.0 mm I.D.×50 mm（充塡剤量：1 mL）
流速：0.25 mL ／ min.
吸着液：0.1 mol ／ L リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）、0.15 mol ／ L 塩化ナトリウム
洗浄液：0.1 mol ／ L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）
溶出液：0.1 mol ／ L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 2.5）
試料：2 g ／ L ヒト化モノクローナル抗体のパパイン消化液、1.2 mL
検出：UV 280 nm

浸漬溶液：0.1 mol ／ L NaOH
温度：25 ℃

図２

600

200

70

40

溶出画分

800

備考

滞在時間 4.0 分
滞在時間 3.3 分・静的吸着量負荷 IgG：充塡剤 1 mL 当たり 300 mg
吸着液：0.1 mol ／ L リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）
脱着液：0.1 mol ／ L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 2.2）及び（pH 2.4）
・動的吸着量カラムサイズ：4.6 mm I.D.×50 mm
負荷 Fab：2 g ／ L（0.1 mol ／ L リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.5）
吸着量：10 ％破過量TOSOH Research & Technology Review Vol.60（2016）

58

タ不掲載）。回収した各画分に含まれる成分のピーク

0.4

面積比を表３に示した。溶出画分には Fab（P2）、及び Fab 分解成分（P4、P5）のみが回収され、Fc（P1）、
素通り画分に Fab 成分（P2、P4、P5）は検出されなかった。
［4］カラム圧力損失
カラムサイズ 4.4 cm I.D. × 28 cm における圧力損

0.3
圧力（MPa）

及び Fc 分解成分（P3）は検出されなかった。また、

0.2

0.1

失を図５に示す。少なくとも線速度 1,000 cm ／ h までの範囲で通液が可能であり、その範囲において急激な圧力損失の上昇は見られなかった。一般的にアフィニ
ティークロマトグラフィーを用いた目的物の吸着、溶出はベッド高さ 15 ～ 20 cm に充塡し、滞留時間 3 ～

0.0

0

200

400

600
800
線速度（cm ／ h）

1000

1200

カラムサイズ：4.4 cm I.D.×28 cm
通液：純水

図５

6 分で行われており、カラム高さ 16.5 cm の場合では流速と圧力損失の関係

滞留時間 3 分は線速度 300 cm／h に相当することから、
本充塡剤は、大型カラムへスケールアップした際におルカリ耐久性に優れている結果が得られた。また、Fc

いても、実用的な線速度範囲で使用できることが確認

領域への結合性は認められず、κ軽鎖を持つ Fab を効できた。

率的に分離精製することが可能であった。本商品が次世代型抗体医薬品の候補として開発が広がっている低分子化抗体の標準的な精製工程の確立に寄与すること

4．まとめが期待される。

本稿では、低分子化抗体のアフィニティー精製を可能とする新商品 TOYOPEARL AF − rProtein L − 650F の性能を紹介した。他社市販品と比べて、吸着量及びア5．引用文献１）国立医薬品食品衛生研究所 website(http://www.

700

UV 280 nm（mV）

nihs.go.jp/dbcb/TEXT/Mab_T1.pdf)

P2

600

２）赤羽、政策研ニュース、47、6-11(2016)

500
400

４）T. Yokota et al., Cancer Res ., 52, 3402-3408(1992)

P3

素通り画分

５）J. Niewoehner et al., Neuron , 81(1), 49-60(2014)

P2

200

0

1(3), 1-52(2015)

P1

300

100

３）C. J. Payes et al., Rev. Cell Biol. Mol. medicine ,

P4 P5

溶出画分

10

６）A. Frenzel et al., Front. Immunol ., 4, 1-20(2013)

P1

注入試料
（パパイン消化物）

７）O. Spadiut et al., Trends Biotechnol ., 32(1), 54-

P3 P4 P5
15
時間（min）

60(2014)

20

カラム：TSKgel UP−SW3000、4.6 mm I.D.×15 cm×2 本
流速：0.2 mL ／ min
溶出液：20 ％アセトニトリル、0.15 ％トリフルオロ酢酸、0.1％ ギ酸
試料：パパイン消化物、図３の各画分、10 μL
検出：UV 280 nm

図４各画分のサイズ排除クロマトグラフィー分析

８）A. C. Freise et al., Mol. Immunol ., 67, 142-152(2015)９）A. P. Herrington-Symes et al., Adv. Biosci.

Biotechnol ., 4, 689-698(2013)10）Y. Liu et al., J. Pharm. Sci ., 97(6), 531-545(2008)11）A. A. Shukla et al., J. Chromatogr . B, 848, 2839(2007)

表３

注入試料
素通り画分
溶出画分

12）M. Spitali, Process scale purification of antibodies ,各成分のピーク面積比

P1

P2

P3

P4

P5

27.89
80.84
n.d.

58.02
n.d.
89.37

6.53
19.16
n.d.

4.11
n.d.
5.65

3.55
n.d.
4.98

n.d.：検出限界以下（not detected）

単位：（％）

349-372(2009)13）S. M. Andrew et al., Curr. Protoc. Cell Biol. , 16.4.116.4.10(2003)