メラミン分析法の自動化の検討〇小西賢治、佐々野僚一
株式会社アイスティサイエンス【目的】メラミンは、主にメラミン樹脂の原測定条件料として使用されるほか、ラミネート、接着

分析カラム

TSK-GEL AMIDE-80 2.0×150ｍｍ（東ソー）

装置

LC：Prominence(島津製作所)

剤など様々な工業製品に利用されているが、食品には使用されない。しかし、2007年に中国製ペットフード、2008年に中国製乳幼児用調製粉乳にメラミンが不正に混入され、メラ

MS/MS：API3200 system(エービー・サイエックス)
移動相

A：2mMギ酸アンモニウム+0.1%ギ酸
B：アセトニトリル

流速0.3ml/min

注入量5uL

イオン化モード ESI Positive
測定モード

MRM(Multiple Reaction Monitoring)

ミンが原因と思われる健康被害が多数報告さ

イオン化条件Q1Q3

メラミン（定量）

12785れた 1) 。このような健康被害に素早く対応すメラミン（確認）12768

るた め 、 簡 便か つ 迅速 な 前 処 理 を 目的 とし【結果と考察】て、自動前処理装置を使用した分析法の開発

1．抽出および除タンパク操作を試みた。

液体試料（牛乳）からの抽出溶媒にアセトニ【方法】試料：牛乳(市販品)、標準試薬：メトリルを選択した。試料にアセトニトリルをラミン標準品（関東化学）、固相カートリッ加えることでタンパク質が凝固し遠心分離に

ジ：Smart-SPEシリーズ（アイスティサイエ

よる簡便な除タンパク操作が可能であった。

ンス）、自動前処理装置：全自動固相抽出装

2．固相抽出操作

置ST-L300（アイスティサイエンス）、超純厚生労働省通知 2) に記されている試験法を参

水製造装置：PURELAB Ultra（オルガノ）

考に、固相ミニカラムPSAによる夾雑物の除前処理フロー

去、およびSCXによるメラミンの保持、溶出牛乳5gを行った。抽出溶媒にアセトニトリルを使用

添加 アセトニトリル 10mL
振とう（1min）

したため、脂溶性の夾雑物も同時に抽出され遠心分離（3500rpm，5min）

ると考えられた。そこで脂用性夾雑物の除去

上澄み分取 1.5mL
添加 水 0.5mL

自動前処理追加した。

分取 1mL

3．添加回収試験

C18-50
PSA-30洗液 アセトニトリル-水（1/1） 1mL
流出液を目的として、C18ミニカラムによる精製を添加 0.1M HCl 2mL

SCX-300.5mg/kgとなるように牛乳に標準溶液を添加し、添加回収試験を行った。5併行の平均回収率は90%、RSD=3.0%と厚生労働省通知に記

乾燥 20秒
溶出 28%アンモニア/メタノール（5/95） 0.9mL
定容 1mL（メタノールで調製）された要件を充分満たしている。
1) 食 安 委 , 『 メ ラ ミ ン 等 に よ る 健 康 影 響 に つ い

分取 0.1mLて』 ,(2009 年 )定容 1mL（メタノールで調製）

2)厚生労働省通知食安監発第 1002003号 (平成 20 年 )第107回食品衛生学会
学術講演会 A-17

メラミン分析法の自動化の検討○小西賢治、佐々野僚一
株式会社アイスティサイエンス

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メラミンについて
メラミン：Melamin（2,4,6-トリアミノ-1,3,5-トリアジン）

NH2
N
H2N

N
N

NH2

基準値：乳製品
その他食品

1 mg/kg
2.5 mg/kg

本物質は、主にメラミン樹脂の原料として使用されるほか、ラミネート、接着剤など様々な工業製品に利用されている。
しかし、2007年に中国製ペットフード、2008年に中国製乳幼児用調製粉乳にメラミンが不正に混入され、メラミンが原因と思われる健康被害が多数報告された。

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従来の分析フロー
簡便かつ高精度な分析（＝自動化）はできないか？

試料 5g
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ-水(1/1) 25mL

SCX 500mg

ホモジナイズ・遠心分離分取5mL

PSA 500mg
洗液

ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ-水(1/1) 1mL

洗浄

0.1mol/L 塩酸 2mL
メタノール1mL

溶出25%ｱﾝﾓﾆｱ/ﾒﾀﾉｰﾙ(5/95) 5mL

減圧濃縮・転溶（ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ-水(1/1)10mL）
分取1mL

流出液
添加

1mol/L塩酸130uL

添加

ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ-水(1/1) 1mL

LC-MS/MSで測定第107回食品衛生学会
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抽出フロー
試料5g

※試料：チョコレート、クッキー

添加 アセトニトリル-水（1/1） 25mL

牛乳5g
添加 アセトニトリル 10mL

振とう（1min）

振とう（1min）

遠心分離（3500rpm, 5min）

遠心分離（3500rpm, 5min）

上澄み分取 0.2mL

上澄み分取 1.5mL

添加 アセトニトリル-水（1/1） 1.8mL

自動固相抽出装置による自動精製

添加 水 0.5mL

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牛乳の場合

ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ-水(1/1)による抽出では遠心分離をの効果が薄く、全体が白濁したのみであった。

抽出溶媒をアセトニトリルに変更することで、牛乳中のタンパク質が変性・凝固し、遠心分離による除タンパクが可能となった。

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精製フロー
自動化

分取 1mLC18-30mg
PSA-30mg
洗液 アセトニトリル-水（1/1） 1mL
流出液
添加 0.1M HCl 2mL
SCX-30mg
乾燥 20sec
溶出 28%ｱﾝﾓﾆｱ/ﾒﾀﾉｰﾙ（5/95） 0.9mL
定容 1mL※牛乳の場合はさらに10倍希釈

通知法ではPSA、SCXのみを使用しているが、無極性夾雑物の除去を目的としてC18ミニカートリッジを追加した。

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自動前処理装置

全自動固相抽出装置 ST-L300• 少量固相Smart-SPEによる前処理の省力化• コンディショニングから精製まで全自動• 熟練度による個人差がでない第107回食品衛生学会
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自動化による精製フロー
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ-水C18
PSAHCl

SCX★除去物質
・無極性夾雑物
・コレステロール・トリグリセリﾄﾞ

NH3/ﾒﾀﾉｰﾙ★除去物質
・高級脂肪酸・色素★保持・メラミン★溶出・メラミン

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自動化による精製フロー
メラミン

NH2
N
H2N

N
N

NH2

LogPow：-1.37、-1.14
解離定数：5.00（25℃）, 5.16（20℃）

C18・・・無極性ミニカラム
無極性夾雑物を除去。極性化合物であるメラミンは素通りできる。

PSA・・・弱陰イオン交換
自身はプラス電荷をもちやすいため、マイナス電荷をもつ化合物とイオン結合を形成しやすい。メラミンはプラス電荷をもつため、PSAには保持されない。
SCX・・・強陽イオン交換カラム
常にマイナス電荷を帯びており、プラス電荷をもつ化合物とイオン結合を形成する。メラミンはpH<3でプラス電荷をもつため、保持される。

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LC-MS/MS測定条件
装置

LC：Prominence(SIMADZU)MS/MS：API3200 system(AB SCIEX)TSK-GEL AMIDE-80 2.0×150 (TOSOH)
A：0.1％ギ酸+2mMギ酸アンモニウム水溶液
B：アセトニトリル
0.3ｍL/min
5uL
ESI Positive
5500 V
350℃
MRM(Multiple Reaction Monitoring)
Q3 SCAN(m/z 60-500)
Q1/Q3：127/85

分析カラム
移動相
流速
注入量
イオン化モード
イオンスプレー電圧
イオンソース温度
測定モード
測定イオン
グラジエント条件
Time(min)A conc.(%)
B conc.(%)

0595

11090

24060

44060

64456

790
1012901012.11090

171090

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標準溶液の直線性0.1、0.5、1、5、10、50、100ppbの7濃度を各n=5で測定し平均値でプロットしたが、50、100ppbではサチュレーションが観測されたため、バイアル中濃度を0.1~10ppbまでとした。R2=0.999と非常に良好な直線性を示した。

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各試料毎の結果

牛乳

チョコレートクッキー

各試料ともn=5、試料中0.1ppmで添加回収試験を行い、回収率および併行精度を算出した。
各試料とも良好な回収率と併行精度を示した。

牛乳
チョコレート
クッキー

平均回収率
(%)
90.087.994.8

RSD(%)
3.03.89.8第107回食品衛生学会
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まとめ
• 自動前処理装置によるメラミン分析の自動化を検討した。
• 液体試料からの抽出溶媒にアセトニトリルを用いることで遠心分離による除タンパクが可能となった。
• 脂溶性夾雑物の除去を目的としてC18ミニカラムによる精製を追加した。
• 添加回収試験により、良好な回収率及び再現性が確認された。

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謝辞
~本発表のきっかけ~

江崎グリコ株式会社
グリコ食品安全センター様~ TSK-GEL AMIDE-80 2.0×150 ~東ソー株式会社様~ピュアラボウルトラ（超純水装置）~

オルガノ株式会社様

ありがとうございました。