（ 1 ）283

日本食品保蔵科学会誌
３
５

VOL．

会
長
編集委員長
編集委員

６

NO．

松本 信二
上田 悦範
石田
裕
寺井 弘文

副

会

長

稲熊 隆博
津久井亜紀夫

上田

悦範

小宮山美弘

早坂

薫

井上 茂孝
藤島 廣二

内野 昌孝
松田 茂樹

竹永

章生

＜報
文＞（英文）
さなぎを用いた新規調味液の製造! …………………………………………………………………………（２８３）／谷口（山田）亜樹子・坂蒔美稔子・菊池修平・"野克己
魚醤より分離したプロテアーゼ生産耐塩性Bacillusについて ………………………………………………（２９１）／野口治子・片山佳子・内野昌孝
石川孝明・プスピタリスディヤンティ・"野克己＜研究ノート＞
低温貯蔵中におけるカンキツ 不知火 果実の糖，有機酸，
アミノ酸，アスコルビン酸およびカロテノイド含量の変化 ……………………………………………（３０１）／松添直隆・圖師一文・森 綾子・有田 愛・我如古菜月
近藤謙介・木村宏和・藤田賢輔・白土英樹
柿葉茶の浸出方法が抗酸化成分含量に及ぼす影響およびその浸出液の安定性 …………………………（３０９）／鶴永陽子・高林由美・鈴木芳孝
西万二郎・松本真悟＜講座＞
身近な野菜・果物〜その起源から生産・消費まで（１０） ニホンナシ（!）……………………………（３１５）／田村文男＜文献抄録＞ ……………………………………………………………………………………………………（３２３）

284

（ 2 ）

Food Preservation Science

CONTENTS OF VOL．
３
５ NO．
６（２
０
０
９）
＜Article＞（English）
Silkworm Pupae for Pruduction of New Liquid Seasoning!
TANIGUCHI YAMADA Akiko, SAKAMAKI Mineko, KIKUCHI Shuhei and TAKANO Katsumi …………（２８
３）
Halotolerant Protease-Producing Bacillus Strains Isolated from Fermented Fish Products
NOGUCHI Haruko, KATAYAMA Yoshiko, UCHINO Masataka,
ISHIKAWA Takaaki, LISDIYANTI Puspita and TAKANO Katsumi ………………………………………（２９１）＜Research Note＞（Japanese）
Changes in Sugar, Organic Acid, Amino Acid, Ascorbic Acid and Carotenoid
Contents of Citrus ‘Shiranuhi’ Fruit during Cold Storage
MATSUZOE Naotaka, ZUSHI Kazufumi, MORI Ayako, ARITA Ai, GANEKO Natsuki,
KONDO Kensuke, KIMURA Hirokazu, FUJITA Kensuke and SHIRATSUCHI Hideki …………………（３０１）
Effects of Exudation Method on Antioxidative Component Content of
Persimmon Leaf Tea and Stability of Its Decoction
TSURUNAGA Yoko, TAKABAYASHI Yumi, SUZUKI Yoshitaka,
NISHI Manjiro and MATSUMOTO Shingo…………………………………………………………………（３０９）＜Serialization Lecture＞（Japanese）
Japanese Pear（Part!）
TAMURA Fumio ……………………………………………………………………………………………（３１５）

（ 3 ）

Food Preservation Science VOL. ３
５ NO. ６ ２００
９ 〔Article〕

285

Silkworm Pupae for Production of New Liquid Seasoning I
TANIGUCHI YAMADA Akiko＊１§，SAKAMAKI Mineko＊２，
KIKUCHI Shuhei＊３ and TAKANO Katsumi＊３＊１ Department of Nutrition and Dietetics, Kamakura Women’s University,
6−1−3, Ofuna, Kamakura-shi, Kanagawa 247−8512＊２ Tokyo Kenbikyoin Foundation, 4−8−32, Kudanminami, Chiyoda-ku, Tokyo 102−0074＊３ Department of Applied Biology and Chemistry, Tokyo University of Agriculture
1−1−1, Sakuragaoka, Setagaya-ku, Tokyo 156−8502

In this study we aimed to use protease and chitinase preparations for the development of a newseasoning solution as a way to effectively utilize silkworm pupae. Seasoning solutions aged for ９
０ days００#contained sufficient amounts of total nitrogen for seasoning purposes ; total nitrogen was １．
０
７#／１
００# in a seasoning solution with thein a seasoning solution with a protease added and １．
０
８# ／１
protease and a chitinase added. Chitinase addition was inferred to increase the amounts of amino acids
and peptides ; formol nitrogen content was ０．
６２％ in the seasoning solution with the protease alone
added and ０．
６
９％ in the seasoning solution with the protease and chitinase added. The seasoning
solution with the chitinase added contained about １．
２ times more free amino acids than the seasoning
solution with the chitinase not added. The seasoning solutions from silkworm pupae contained taurine,
which enhances hepatic function, and ４．
２〜５．
０ times more alanine, a sweetener, than soy sauces. The
１，１-diphenyl-２-picrylhydrazyl （ DPPH ） radical scavenging capacity of the seasoning solutions from０
０!, which was １．
４ times higher than thesilkworm pupae was in the range of ８
０-９
８ !ol Trolox eq.／１
radical scavenging capacity of soy sauces. The seasoning solutions contained １．
２〜１．
８ times more γ００!, and were higher in functionality than soy
aminobutyric acid（GABA）, in the range of ０．
６〜０．
９"／１
sauces. The seasoning solutions from silkworm pupae were clear and light yellow in color tone andsuitable for use in processed food.
（Received Jan. １３, ２００９；Accepted Jul. １５, ２
０
０
９）
Key words：silkworm pupae, new liquid seasoning, production, soy sauce, functionality food
さなぎ，新規調味料，製造，醤油，機能性食品

Sericulture thrived to produce silkworms in theera of high demand for raw silk and silk goods.

we also focus on the functionality of silkworm
pupae as a food material.

Silkworm cocoons are used not only for silk goods

Experimental Methods

but also for other various goods, such as cosmetics,
health food, and bath salts.

However,silkworm

１．Material

pupae, a by-product, have a low use value. Although

Silkworm, Bombyx mori L., pupae（produced in Gifu

silkworm pupae are used for food items, such as

Prefecture）, were dried in air at １００$, for ６ hours

tsukudani（small fishes and shellfishes boiled in soy

and then ground.

sauce）, and for fertilizers and animal feed in some

２．Enzyme preparations

regions of Japan, most silkworm pupae are disposed
The purpose of this study is to effectively apply
protease and chitinase preparations

Protease A（Amano Pharmaceutical Co., Ltd.）from
Aspergillus oryzae and Chitinase（Sigma-Aldrich Japanof an industrial waste.
tosilkworm

K.K.）from Streptomyces griseus were used as enzyme
preparations. Optimum pH was ７．
０ for Protease A

pupae to develop a new seasoning. A pupal test

and ６．
０ for Chitinase ;sample, made up of chitin, can conceivably be

５０$ for Protease A and ２
５$ for Chitinase. Casein

decomposed by chitinase and then converted to a

was used as a substrate for the determination ofgood tasting seasoning by protease. In this study

Protease A activity by the Kunitz method１）. An§ Corresponding author, E-mail：akiko@kamakura-u.ac.jp

optimum temperature was286

enzyme

titer

that

increases

Food Preservation Science

VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

the

of Trolox is used asabsorbance

of

（ 4 ）

an

indicator.

Antioxidant

decomposition liquid at ２
８０!by an equivalent of １

activity was expressed in Trolox equivalent （ " ol"ol of tyrosine at ３
７$ in １ minute was defined as

Trolox／１
００!）calculated from the decrease in the

１ unit. Colloidal chitin was used as a substrate forabsorbance of DPPH solution at ５
２
０!.

the

７．Measurement of γ-aminobutyric acid（GABA）

determinationof

Chitinaseactivitybythemeasurement of decreased absorbance at ６
１
０!. Anenzyme titer that decreased theabsorbance

GABA content was measured for the silkworm

ofpupa seasoning solutions. Samples were prepared inreaction liquid by １％ at ３
７$ in １ minute wasaccordance with the procedure for free amino aciddefined as １ unit.

measurement. HPLC with a ShimPack AMINO-Na

３．Preparation of new seasoning

column, ６ mmI.D. x １
００ mmL.（Shimadzu Co., Ltd.）,To ５
０
０# of ground silkworm pupae, １ L of aand an RF-１
０ AXL spectrofluorophotometric detector

２０％（w／w）salt solution was added. Protease A alone（Shimadzu Co., Ltd.）, was performed for the analysis.

or Protease A and Chitinase were added to the

The mobile phase was a gradient solution made up

mash, which was then aged at ３
５$ for １
２
０ days.

of a sodium citrate buffer solution（pH ５．
９）and aSamples were taken over the aging period for

mixture of a NaClO reagent and an OPA reagent

analysis.

（５０：５０, Shimadzu Co., Ltd.）. Detection was carried

At

mash

preparation, ３，０００ unitsofProtease A and ２
５ units of Chitinase were added.

out at a flow rate of ０．
４!／min, a column temperature

４．Analysis of common components

of ４０$ , an excitation wavelength of ４
７
０! , and a２）

The moisture
with

an

of silkworm pupae was measured

infraredmoisturemeasurement

florescence wavelength of ５
３０!.

deviceResults and Discussion（Mettler, LP １６） at １
３
５$ . The Kjeldahl method３）
was used for determining protein ;the Soxhlet

method４） was used for determining lipid content,
and

the

５）

directashingmethod wasash

content.

A

used

for

１．Common components of raw material
Table １ shows common component values ofsilkwormpupae.

The

valueswere ９．
１％ formeter （ Horiba

moisture, ５６．
０％ for protein, ３２．
１％ for lipid, andLtd.）was used for pH measurement. Total soluble２．
８％ for ash. Lipid content was high. From thenitrogen was determined by the Kjeldahl method３）.

highFormol nitrogen content, acidity, and salt content

consideredwere determined in accordance with soy sauceseasoning. Silkworm pupae are eaten in Nagano

analysis methods６）.

Prefecture and Korea but their component values

５．Measurement of free amino acids

aredetermining

pH

Samples were filtered through a microtube forcentrifugal filtration （ Nihon Millipore Industries K.

proteinnotacontent,
suitable

given

in

silkworm
raw

pupae

material

Standard

for

TablesofwereliquidFoodComposition in Japan.
２．Time-dependent changes in acidity and pH

K. ; cut-off molecular weight, ４，０００）, diluted １
０ times,Fig．
１ gives time-dependent changes in titratable

and NBD-labeled. HPLC with an ODS-８０ TS column,

acidity and pH during the aging of the silkworm

３．
２ mmI. D. ×１
５０ mmL. （Tosoh Corporation）, andpupa seasoning solutions. Both Protease A additiona detector, F-１
０
５
０ spectrophotometer（Hitachi Ltd.）,

and thewas performed for the analysis. The mobile phaseincreased the acidity with aging to ０．
６ and ０．
７,

additionofProteaseAand

Chitinase

was a gradient solution made up of two solutions :respectively, ３０ days later and to １．
１ and １．
２,

a ０．
１ M sodium citrate buffer solution（pH ６．
２）andrespectively, ９０ days later, which were nearly twicea mixture of ５
０％ acetonitrile solution and water

as high as the values ３
０ days later. The data show

（５０：５０）. Detection was carried out at a flow ratethat

acidity

and

pH

chang

duringaging.

Theof １．
０! ／ min, a column temperature of ４３$ , anseasoning solution with Chitinase added was higher

excitation wavelength of ４７
０! , and a florescencein acidity. In contrast, pH remained lower in the

wavelength of ５
３０!.

high-acidity seasoning solution with Chitinase added

６． Measurement of １，
１-diphenyl-２-picrylhydrazyl

than in the seasoning solution with Protease A（DPPH）radical scavenging capacity

alone added during the period from day ３
０ to day

The antioxidant activity of the silkworm pupa

６０. During the initial ３
０ days of aging, the pH

seasoning solutions was measured by the DPPH

changed markedly from ６．
０ to ５．
２ in the seasoning

７）

method , in which the radical scavenging capacity

solution with Protease A added and from ６．
０ to ５．
１

〔Article〕 New Liquid Seasoning of Silkworm Pupae

Table １ Common component values of silkworm pupae％

Moisture
Protein
Lipid
Ash

９．
１
５
６．
０
３
２．
１
２．
８

1.4

6.5
Protease A added

1.2

6

0.3
0.2
Protease A added

0.1

Protease A andChitinase added0ｐH

Acidity

0.4

5.5

0.8
0.6
Protease A added

0.2

Protease A andChitinase added

0

30
60
Days

4.5
4

90

30
60
Days

0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3

Protease A added

0.2

Protease A andChitinase added

0.1
90

0
0

30
60
Days

90

Fig．
２ Changes in total nitrogen content and formol
nitrogen content in soluble fractions of seasoning solutions
from silkworm pupae

5

0.4

0

0.5

0

Protease A andChitinase added

1

0.9

0.6
Formol nitrogen content（g/100g）

Components

287

Total nitrogen content（g/100g）

（ 5 ）

0

30

60
Days

90

inferred to increase the amounts of amino acids andpeptides.
４．Free amino acids

Fig．
１ Changes in acidity and pH in the soluble fractions of
seasoning solution from silkworm pupae

Table ２ gives analytical data on free amino acids
after ９０ days of aging. The amounts of free aminoin the seasoning solution with Chitinase added ; theacids were ８
０
４
４．
７!／１
０
０!in the seasoning solution

pH was ４．
７ in both seasoning solutions ９
０ dayswith Protease A added and ９３
５
９．
３!／１
０
０! in thelater. The seasoning solution with Protease A added

seasoning solution with Protease A and Chitinase

and the seasoning solution with Protease A andadded. Both seasoning solutions were rich with

Chitinase added differed in acidity but approached aalanine, glutamic acid, and leucine. Soy sauces was

pH of ４．
７ during the ９０-day aging. The cause ofparticularly high in glutamic acid. In contrast, thethis was believed to be the buffering capacity ofseasoning solutions from silkworm pupae contained

amino acids and peptides. The seasoning solutions
had nearly the same pH as pHs of commerciallyavailable soy sauces８），９） and were more acidic than

Table ２ Free amino acids of seasoning solutions fromsilkworm pupae（!／１００"seasoning solutions）

fish sauces１０）.
３． Total nitrogen content and formol nitrogencontent
Fig．
２ shows changes in total nitrogen content andformol nitrogen content in the soluble fractions of
the seasoning solutions from silkworm pupae during
aging. Total nitrogen content and formol nitrogencontent

were

somewhathigherinthesolublefraction of the seasoning solution with Protease A
and Chitinase added than in the soluble fractions of
the seasoning solution with Protease A alone added.
The total nitrogen content was １．
０７"／１００"in theseasoning solution with Protease A alone added
after ９０ days of aging, and １．
０
８" ／１
０
０" in theseasoning solution with Protease A and Chitinase
added. The formol nitrogen was content ０．
６２％ in
the seasoning solution with Protease A alone added
and the total nitrogen content was ０．
６
９％ in theseasoning solution with Protease A and Chitinase
added.

From

the

data,

ChitinaseadditionwasFree amino
acids

Protease A
added

Ala
Glu
Leu
Val
Asp
Ser
Tyr
I-Leu
Arg
Lys
Phe
Thr
Pro
Gly
His
Met
Cys
Tau

２
１
１
９．
９
１
４
５
６．
２
７
１
８．
８
４
８
４．
４
４
６
３．
４
４
３
９．
０
３
６
５．
３
３
４
０．
９
２
８
４．
８
２
７
９．
８
２
７
６．
５
２
３
１．
８
２
０
０．
０
１
５
３．
１
１
２
７．
４
８
０．
９
２
０．
０
２．
５

Protease A
Comparison
and Chitinase（Soy sauce）
added
２
４
６
６．
２
１
６
９
２．
２
８
２
９．
８
５
６
３．
５
５
４
０．
４
５
１
０．
６
４
２
２．
２
３
９
５．
５
３
２
９．
２
３
２
１．
４
３
２
０．
５
２
６
９．
５
２
５
１．
０
１
７
７．
７
１
４
８．
０
９
３．
６
２
５．
０
３．
０

４
９
０．
１
２
１
３
７．
２
８
１
１．
０
５
１
３．
０
８
９
７．
２
５
９
０．
３
１
４
４．
０
４
１
０．
２
５
２
５．
６
４
３
２．
０
４
１
１．
５
３
１
５．
４
１
０
１．
０
１
１
７．
８
１
５
１．
１
１
８
１．
５
１
０．
０
０．
０

288

Food Preservation Science

VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

（ 6 ）

４．
２〜５ times as much alanine, a sweetener, as soy

amination ratio was about ６４％ in the seasoning

sauces do. The seasoning solutions from silkworm

solution with Chitinase added, which was about ６％

pupae had different amino acid compositions fromhigher than that in the seasoning solution withthose of soy sauces in that the former containedProtease A alone added （ about ５
８％ ）. Also, theless aspartic acid, alginic acid, lysine, phenylalanine,amination

threonine, and methionine and more tyrosine, proline,

solutions than in soy sauces, indicating efficientand cysteine than the latter. The seasoning solutions

amination to amino acids and peptides during thefrom silkworm pupae also contained taurine. Taurine,

aging.

which

６．Colorisrelated

to

bile

acid

metabolism

and

１
１）

effectively enhances hepatic functions , was believed
to make the seasoning solutions functional. Although

ratio

was

tone

of

higherinseasoningbothseasoning

solutionsfromsilkworm pupae
Color tone is also an important factor in thetwo seasoning solutions from silkworm pupae hadcommercial

similar

value

of

a

seasoning

solution.

The

seasoningseasoning solution with Protease A added and thesolution with Chitinase added contained a larger

seasoning solution with Protease A and Chitinase

amount of amino acids. This was believed to be due

added were much lighter in color tone（Table ４）thantoof

soy sauces. The absorbance values of the seasoning

silkworm pupae by Chitinase that made silkworm

solutions at ４
２０!were about １／６ that of those ofpupae more accessible to Protease A. Chitinase

soy sauces. The clear and light yellow color of theadditionseasoning solutions was believed to make themaminochitinacid

compositions,decomposition

was

in

confirmed

to

the

the

outer

increase

layer

amino

acid

content, resulting in the production of a seasoning

applicable to processed food and increase

solution rich with umami.

commercial values.

５．Properties

ofseasoning

solutionsfromsilkworm pupae

their

７．Functional components
The seasoning solutions fromsilkworm

pupae

Table ３ gives the analytical results of seasoning

were examined for antioxidant action by the DPPH

solutions from silkworm pupae that were aged formethod, in which the radical scavenging capacity of

９０ days and filtered. The acidity and pH of the

Trolox is used as an indicator, and GABA content.

seasoning solution with Protease A added were
close

to

those

of

the

seasoning

solutionThe

antioxidant

activity

expressed

in

DPPH

with

radical scavenging capacity （ Table ５） was ９
８"olProtease A and Chitinase added. The seasoning

Trolox eq. ／１
０
０! in the seasoning solution withsolution with Chitinase added was higher in total

Chitinase added, which was about １．
２ times that of

nitrogen content, formol nitrogen content, and amino

８０"ol Trolox eq.／１
０
０! for the seasoning solution

nitrogen content. The data showed that the Chitinasewith Protease A alone added and １．
４ times the

preparation was effective for the production

antioxidantseasoning

solutionsfromsilkwormpupae.

ofThe

activityofsoysauces.

The

data

confirmed that the seasoning solution with Protease
A and Chitinase added was a functional seasoning

Table ３ Analytical results of seasoning solutions fromsilkworm pupae
Analysis
Acidity１）
pH
Salt（％）
Total nitrogen
（g／１
０
０g）
Formol nitrogen
（g／１
０
０g）
Amino nitrogen（％）１）

Protease
A addedProtease A
and Chitinase Comparison（Soy sauce）
added

solution. Functional components are currently the
focus of muchattention in food research. In thisstudy,

wesilkworm

found

that

pupae

have

Decomposition

products

seasoning
a

lot

from

solutionsoffromfunctionality.

chitin,

which

are

１．
１
２
４．
７
２
２．
２

１．
１
３
４．
７
２
２．
７

１．
０
１
４．
７
１
８．
０

considered antioxidants, are expected to be a future

１．
０
７

１．
０
８

１．
４
０

the seasoning solution from silkworm pupae with

０．
６
２

０．
６
９

０．
８
０

５
７．
９

６
３．
９

５
７．
１

research subject.
The GABA content（Table ６）was ０．
９#／１
０
０! in
Chitinase not added, which was higher than theVolume（!）of １ N NaOH sol. Necessary for titration ofsample to pH ８．
５.

GABA content of ０．
６# ／１
０
０! in the seasoning
solutionwith

Chitinaseadded.

The

seasoning

solutions from silkworm pupae were about １．
２〜１．
８
times higher in GABA content and possessed higher
levels of functionality than soy sauces.

（ 7 ）〔Article〕 New Liquid Seasoning of Silkworm Pupae

Table ４ Color tone of seasoning solutions fromsilkworm pupae
Color tone Protease A
added
L
a
b
４
２
０!１）

Protease A and Comparison
Chitinase added （Soy sauce）

６
１．
３
２
４．
４
４
０．
１

６
１．
９
２
４．
１
４
０．
５

１
０．
８
３
１．
５
１
６．
７

０．
３
９

０．
４
０

２．
３
６

１）

Seasoning solutions were １
０ times diluted.

Antioxidant activity
００!）（Trolox "ol／１

Protease A added
Protease A and Chitinase added
Comparison（Soy sauce）

Tokyo）
, p．
１（１
９
８
５）
７）SUDA, I : Methods for Food Function Research.
３-３-９ Antioxidant functions. I. Spectrophotometricevaluation of antioxidant functions（Korin, Tokyo）,
p．
２
１
８（２
０
０
０）
８）KIKUCHI, S. and TANIGICHI YAMADA, A. : Brewingof Soy Sauce from Soybeans Different in Place ofProduction-I, Journal of Soy Sauce Research andTechnology, ３
２, ３
７
９〜３
８
２（２
０
０
６）

Table ５ Antioxidant activity of seasoning solutions fromsilkworm pupae by DPPH method＊
Seasoning solution

289

８
０
９
８
７
０

＊

DPPH method, in which radical scavenging capacity of
Trolox is used as indicator.

Table ６ γ-aminobutyric acid（GABA）of seasoning
solutions from silkworm pupae
Seasoning solution

GABA contents
（#／１
０
０!）

Protease A added
Protease A and Chitinase added
Comparison（Soy sauce）

０．
９
０．
６
０．
５

９）TANIGICHI YAMADA, A., KIKUCHI, S. : Brewing of
Soy Sauce from Soybeans Different in Place ofProduction-II, Journal of Soy Sauce Research andTechnology, ３
３, ３
１〜３
４（２
０
０
７）
１
０）TANIGICHI YAMADA, A., SATO H., MITSUMORI H.,
KIKUCHI, S. and TAKANO, K. : Effect of various
kinds of protease on fish sauce with salmon
Oncorhynchus

keta

of

the

maturation,

Food

Preservation Scientists, ２
９, １
７〜２
３（２
０
０
３）
１
１）SUZUKI, H : Fishery Food, Chapter II, Section
２. Theories of Food function, revised（Dobunshoin
Tokyo）
, p．
７
８（２
０
０
５）

さなぎを用いた新規調味液の製造!
谷口（山田）亜樹子＊１・坂蒔美稔子＊２
菊池修平＊３・!野克己＊３＊１

鎌倉女子大学家政学部管理栄養学科

References

（〒２
４
７―８
５
１
２ 神奈川県鎌倉市大船６―１―３）１）KUNITZ, M. : Protein method, J. Gen. Physiol , ２９,＊２ （財）
東京顕微鏡院
（〒１
０
２―０
０
７
４ 東京都千代田区九段南４―８―３
２）

１
４
９〜１
５
６（１
９
６
９）
２）TSUTSUMI, C. : Food Analysis Handbook（editedby OBARA, T. ）, １. Quantitaive dertermination of＊３

東京農業大学応用生物科学部生物応用化学科

（〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１）

moisture, Food component analyses（Kenpakusha,
Tokyo）
, p．
１
７（１
９
７
２）
３）YANAGIDA,

F. :本研究ではさなぎの食品への有効利用として，カイコ

Brewing

Food

Analytical

Experiment, ３．
３．
２ Protein （ Shokuhin Kenkyusha,
Tokyo）
, p．
２
２
６（１
９
８
５）

のさなぎにプロテアーゼおよびキチナーゼ製剤を用い，良質で機能性のあるさなぎ調味液の開発を行った。
その結果，一般の醤油に比べ，アミノ化率が高いこと

４）TSUTSUMI, C. : Food Analysis Handbook（editedからアミノ酸，ペプチドが多く，また，醤油に含有されby Obara, T. ）, ３. Quantitaive dertermination ofていないタウリンやGABAが１．
２〜１．
８倍多く，機能性のlipid,

あるアミノ酸が多く含有されていることが確認された。

Foodcomponent

analyses （ Kenpakusha,

Tokyo）
, p．
１
１
９（１
９
７
２）

また，抗酸化作用は醤油に比べ１．
４倍高く，このことか

５）IWAO, Y. : Food Analysis Handbook（edited by

らも機能性のある調味液であることが確認された。さな

Obara, T. ）, ５. Quantitaive dertermination of ash,

ぎ調味液の色調は澄んだ淡黄色で，加工食品の利用にもFood component analyses （ Kenpakusha, Tokyo ）,充分利用価値の高いものであった。

p．
２
５
９（１
９
７
２）
６ ） Japan Soy Sauce Research Institute Edition :Methods for soy sauce tests. I. Analytical methods
for soy sauce（Japan Soy Sauce Research Institute,

本研究の結果から，さなぎ調味液の製造にプロテアー
ゼ製剤およびキチナーゼ製剤の利用効果が認められ，さなぎの機能性に富んだ調味液の利用が確認された。
（平成２
１年１月１
３日受付，平成２
１年７月１
５日受理）

（ 9 ）

Food Preservation Science VOL. ３
５ NO. ６ ２００
９ 〔Article〕

291

Halotolerant Protease-Producing Bacillus Strains Isolated
from Fermented Fish Products
NOGUCHI Haruko＊１，KATAYAMA Yoshiko＊２，UCHINO Masataka＊２§，
ISHIKAWA Takaaki＊２，LISDIYANTI Puspita＊３ and TAKANO Katsumi＊２＊１ Biotechnology Research Center, The University of Tokyo, 1−1−1, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 113−8657, Japan＊２ Department of Applied Biology and Chemistry, Faculty of Applied Bioscience, Tokyo University of Agriculture,
Sakuragaoka 1−1−1, Setagaya-ku, Tokyo 156−8502, Japan＊３ Research Center for Biotechnology, Indonesian Institute of Sciences,
Jl. Raya Bogor Km. 46, Cibinong 16911, PO BOX Bogor 422, Indonesia

In this study, Bacillus strains were isolated from fermented fish product and these strains werecharacterized for clarification of the effect of Bacillus strains on fish fermentation. Five fish pastes
produced in Indonesia and six fish sauces produced in Vietnam were used in this study. Halotolerant
protease productive Bacillus strains were isolated from the above mentioned fermented fish products.
The strains existed in all samples and most of these grew in a high salt concentration（２５％ w／v）
and produced protease. In addition, they also grew in low concentration（１％）. Therefore, the isolated
strains were halotolerant bacteria. Phylogenic analysis based on 16 S rDNA sequences indicated thatmost isolated strains belonged to Virgibacillus halodenitrificans. The results of this study show that not
only fish tract protease but also V. halodenitirificans and related species participate in fish fermentation.
（Received May １
１, ２
００
９；Accepted Sep. ２, ２
００
９）
Key words：Virgibacillus halodenitrificans, halotolerance, protease, fermented fish product, identification
Virgibacillus halodenitrificans，耐塩性，プロテアーゼ，魚醤油，同定

Fermented fish sauces and pastes are used as

decomposition of fish meat during fish fermentation.

traditional seasoning in Asia, particularly in Southeast

However, only one strain was reported to explain

Asia. The main component of this seasoning is small

this phenomenon.

fish and salt. Three volumes of fish and one volume

In this study, we isolated halotolerant protease-of salt（w/w）are mixed and fermented for several

producing Bacillus from fish sauce in Vietnam andmonths. After fermentation, the fermented fish isfish paste in Indonesia, measured protease activity

boiled and / or filtrated to produce fish sauce. Inof the isolates in various salt concentrations andaddition, to produce fish paste, fermented fish isdetermined their taxonomical positions.

dried in open air. The mechanism of fish fermentation

Materials and Method

has been reported as the decomposition of fish meat
during an aging period１），２）. The fish meat had been

１． Isolation

thought to undergo autolysis by protease from fish

products

ofbacteria

fromfermented

fish

intestinal tract. On the other hand, various bacteria

A total of eleven fish sauces and pastes were

were reported to be isolated from fermented fishused in this study. Six fish sauces, namely “Nuoc

products３）〜１０）.

Mam ” , were produced in Vietnam and five fishprotease

pastes, namely “Terasi”, were produced in Indonesia.

producing Bacillus strain from fermented fish sauce

Marine Broth ２２
１
６ medium（MB medium ; DIFCO,

in Vietnam１１）. The protease, produced by this strain,

Sparks, Md. , USA ） was used as a basal isolation

decomposed

protease

medium. Bacteria in fish sauce and paste wereactivity in the presence of ２
５％ NaCl similar to fish

isolated using MB medium containing ５％（w／v）of

MURA

et

al .

isolatedcollagenaandhalotolerant

maintained

１２）

sauce . MAEDA et al . concluded that the protease-

NaCl, １％（w／v）of skimmilk, １．
５％（w／v）agar, １％

producing（w／v）of fish sauce（Nuoc-Mam）, and １
０ ppm ofbacteriumwas

involved

inthe§ Corresponding author, E-mail：muchino@nodai.ac.jp

292

Food Preservation Sciencecolistin sulfate, nalidixic acid, and cycloheximide（MA

VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

（ 10 ）

day with shaking. After cultivation, the culture wascentrifuged at ９，０００ x gav. for ２
０ min. Then, themedium）.
An aliquot of fish sauce or a bit of fish paste wassupernatant was concentrated by ultrafiltration（updiluted with saline solution. The diluted solution was

to １／１０ vol, v／v）. The concentrated solution was

spread on MA and incubated at ３
０" for ２ days.

salted out with ９
０％ of saturated ammonium sulfate

After cultivation, the strains, which decomposedand dialyzed in ２
０ mM Mclvain buffer（containing ofcasein and made a clear zone around the colony,

１ mM CaCl２, pH ６．
０）. Then, dialysis solution was

were selected as protease-producing gram-positive

used for enzymatic study as a crude enzyme. The

bacteria.

preparation of enzyme, excluding cultivation, wasTheisolatedstrains

were

generallypreserved on MB agar slant at ４". Gram-staining

performed at ４".

and catalase tests were cunducted using methods

７．Characteristics of protease from the strain

described in a previous report１３）.
２．Growthandprotease

FST-６
７

activityatvariousconcentrations of NaCl

The effect of NaCl concentration on activity wasmeasured by the standard method. The relative

broth

activity of the enzyme was measured at different

withpHs by using ５
０ mM Mclvain buffer（containing of

shaking. After cultivation, the growth and protease

１ mM CaCl２）for the range from pH ５ to １
０. Theactivity were measured as follows. The growth was

effects of temperature on activity and stability were

measured optically（６６０!）. The activity of extra-

determined at the range from ３
０ to ７０" （ thecellular protease was measured by the Azo-Casein

activities at １
０ and ３０" were also determined ）.

Thestrains

were

cultivatedcontaining ２
５％ NaCl

in

LB

at ３
０" for ３ days

１
４）

method . In addition, the strains, which grew inBoth２
５％ NaCl and produced protease, were also tested

determined for two sodium chloride concentrations

in １％ and １
５％ NaCl using the same medium andof ０ and １
５％.

temperature

method after a day of cultivation with zero saltpH

dependences

were

Results

concentration.
３．DNA extraction and purification

and

１．Isolation and phenotypical characteristics

DNA was extracted and purified using a previously
１
５）

A total of forty strains of protease-producing

described method . The purity and concentration ofbacteria were isolated from eleven fish sauces and

DNA were determined photometrically１６）.

pastes. Eighteen strains were isolated from Vietnamese

４．DNA sequences and phylogenetic analysis
Determination

of

the

taxonomic

samples and twenty-two strains were isolated from

relationships

Indonesian samples. All strains were gram-positive,

between the isolates was performed on the basisi ofrod-shaped, catalase-productive bacteria and have the１
６S rDNA sequences. Sequencing of １
６S rDNA wascapability to degrade skimmilk. These characteristics

１
７）
,１
８）

.

show that the strains have characters typical of theof 16S

genus Bacillus２１）. These results show that protease-carried out using methods previously reported
The

approximately 300bp

rDNA

from

each

analyzedtobetween

these

upper

regionwassequenced

isolatedetermine

phylogenetic

isolates.

The

relationships

construction
１９）neighbor-joining phylogenic tree

and
of

a

was carried out

with the CLUSTAL X program２０）.
５． Effect

of

NaCl

on

growthproducing Bacillus strains exist in fish sauces andpastes.
２． Growth and protease productivity in various
salt concentrations
Out of ４
０ strains, １
５ strains grew in LB medium

andproteaseproduction of FST-６
７

containing ２
５％ NaCl and produced protease（Table１）, but the other ２
５ strains did not grow in theandsame medium. The optical density at ６
６０! was inprotease productivity were determined using thethe range from ０．
９１ to １．
９
５, and the average wasabove method. The salt concentration was in the

１．
３
４. These protease activities were in the range

range from １ to ２５％ NaCl. In addition, proteasefrom ４．
０×１
０−２ to ２
２．
０×１
０−２ U／!, and the average

productivities in ２０％ and ２
５％ NaCl were measured

was １
０．
３×１
０−２ U ／ ! . From １
５ protease-producing

Growthatvarioussalt

concentrations

for a week.

strains,

６．Crude enzyme preparation from strain FST-６
７

productive bacterium in the tested fifteen strains

Bacterial strain was cultivated in LB broth for athough its growth was very slow. All strains tested,thestrain ６
７ was

the

most

protease〔Article〕 Protease-Producing Bacillus from Fermented Fish

（ 11 ）

293

Table １ Growth and protease activity of isolated strains in various salt concentrations
NaCl conc.

２
５％Vietnamese sample

Indonesian sample

Sample Strain

１％
＊

−２

１
５％

G

０ ）
PA（
V １

G

PAV

G

PAV

A

３
３
３
６

０．
９
５
１．
３
５

６．
０
１
４．
０

２．
２
１
２．
４
１

１．
５
７
１．
１
０

１．
９
１
２．
１
８

０．
２
８
０．
２
９

B

４
６
４
８

１．
８
６
１．
８
０

５．
０
８．
０

２．
２
２
２．
１
０

１．
０
１
１．
６
１

２．
３
３
２．
２
６

０．
２
８
０．
７
４

４
９

０．
５
６

７．
０

２．
３
３

１．
７
３

２．
４
０

０．
４
１

５
０

１．
８
７

１
２．
０

２．
４
１

１．
４
２

２．
２
４

０．
３
７

C

５
３

１．
３
５

４．
０

２．
３
２

１．
５
９

２．
０
９

０．
４
１

D

６
５

１．
３
９

２
０．
０

２．
４
７

１．
６
３

２．
０
７

０．
１
３

E

６
７

１．
３
３

２
２．
０

２．
１
６

１．
７
８

２．
２
０

０．
３
７

F

７
０
７
１

１．
４
２
１．
９
５

６．
０
１
６．
０

２．
３
１
２．
４
０

２．
０
９
１．
７
９

２．
２
９
２．
２
４

０．
５
０
０．
６
７

７
２

１．
５
２

６．
０

２．
４
５

１．
８
８

２．
２
５

０．
４
１

G

７
５

０．
５
４

１
２．
０

２．
３
７

１．
２
２

１．
２
１

０．
５
２

H

７
７

０．
９
１

１
２．
０

２．
２
８

０．
８
４

１．
２
１

０．
３
７

I

８
１

１．
３
５

５．
０

２．
２
７

１．
４
２

２．
２
１

０．
３
３

Abbreviations : G, Growth（O. D. at ６
６０!）；PAV, Protease Activity（U／!-culture）

which grew in ２
５％ NaCl medium, grew also inand salt concentration was increased from time to

１％ NaCl medium and produced protease （ Table

time. Therefore, the protease productive bacterium１）. The optical density at ６
６０! in １％ NaCl was

grew well and produced a significant amount ofin the range from ２．
１
０ to ２．
４
７, and the average

protease. At the middle and latter stages, the solid

was ２．
３
１. The protease activity was in the range

part was decomposed and most of the fish saucefrom ０．
８
４ to ２．
０
９ U／!, and the average was １．
５１

components had a high salt concentration. The

U／!under the same salt condition. In addition, thehalotolerant Bacillus grew in fish fermentation andprotease activity was increased to about ７ to ３
５

thetimes that in ２
５％ NaCl. The strain ６
７ grew well

produced protease.

and had high protease activity under this condition.

３．Phylogenic relationships of halotolerant proteaseInaddition,thestrain ６
５ also

grew

well

and

halotolerant

protease

Bacillus

productive

productive Bacillus strains

produced a lot of protease like the strain ６
７. TheThe １
６S rDNA sequences of １
５ of halotolerantstrains that grew in ２
５％ NaCl were also tested forprotease productive strains were determined andgrowth and production of protease in １
５％ NaCl

the phylogenic tree is shown in Fig.１. All strains

medium（Table １）. The optical density at ６
６０!inbelonged to the genus Bacillus. １
４ strains were１
５％ NaCl was in the range from １．
２
１ to ２．
４０, andidentified as Virgibacillus halodenitrificans with over

the average was ２．
０
７. The protease activity was in

９７．
７％ sequence similarity to the type strain of thisthe range from ０．
１
３ to ０．
７
４ U／!, and the average

species.

In

addition,one

strainisolatedfrom

was ０．
４
１ U／! in １
５％ NaCl. The protease activity

Vietnam was identified as Bacillus circulans.

was about ３．
３ to １８．
５ times that in ２
５％ NaCl. The

４．Halotolerant and protease productivity of FST-

strains ６
７ and ６
５ grew well but the production of

６
７ in various NaCl concentrations

protease

The

was

low

in １％ NaCl.

However,therelationshipbetweengrowthandsaltprotease production in １
５％ NaCl was gigher thanconcentration of media is shown in Fig. ２（A）. The

that in ２
５％ NaCl.

strain FST-６７ grew well in sodium chloride in the

The salt concentration of fish sauce was changed

range from １ to １０％ NaCl. However, the growth induring fish fermentation. At the first stage, the１
５％ NaCl was one-fifth that in １％ NaCl underliquid part was saturated by salt and the solid part

optical conditions. Weak growth was confirmed inwas subjected to lysis induced by salt and protease,２
５％ NaCl（data not shown）but protease activity

294

Food Preservation Science

VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

（ 12 ）

FST70
FST71
FST65
FST67
FST75
FST77
FST81
FST33*
FST36*FST46*FST48*FST49*
FST50*FST53*

FST72
0.02

Fig．
１ Phylogeny tree of the isolates and reference strains on the basis of１
６S rDNA sequences

2.0

1.2
1.0
0.6
0.5

1

5 10 15 20 25
NaCl concentration（%））
Protease activity（U/

1.5

0

0.12

1.8
: Growth（O.D. at 660nm）: Protease activity（U/）

The relationship was draw using clustal W ver１．
６and NJ plot.
Abbreviations : ＊ ,the strain isolated from Indonesian fish paste ; no mark, the strain isolated from
Vietnamese fish sauce. t ; DDBJ／EMBL／GenBank Accession No.

0.10
0.08
0.06
0.04

NaCl
20%
25%

0.02
0

0

1
3
7
Incubation Time（day）

Fig．
２（A） Growth and protease activity of FST-６
７
in various NaCl concentrations

Fig．
２（B） Growth and protease activity of
FST-６
７in various NaCl concentrations

Both data determined after a day cultivation. The growth
was measured photometrically. The protease activity
was determined by the standard method.

The protease activity was measured by thestandard method in２０％ NaCl（○）and２５％ NaCl（●）.

increased day by day（Fig. ２ B）.

Therefore, the maximum allowable temperature was

５．Characteristics of Protease from FST-６
７

６０!. The thermostability of protease from FST-６
７

The effect of NaCl on protease activity is shownis shown in Fig４（B）. Protease activity was confirmed

in Fig ３. Optimum activity occured in ０％ NaCl

to be over ９０％ until ４０! but under １０％ from ６０With!. Similar thermostable curves were determined forincreasing salt concentration, there was a linear

the two salt concentrations, ０％ and １５％ NaCl.

decrease in activity. The optimum temperature was

However, over ２０％ activity ratio was maintained at

５０! and about ４
５％ of activity remained at ３０ and

５０!. The activity of protease was maintained at a

６０!（Fig.４ A）. At a high concentration, the activity

wide pH range from pH ５．
５ to １０．
０（ Fig ５ A ）.

curve of protease was shifted up by ten degrees.

However, in １５％ NaCl, the activity was low underandminimum

activity

occuredin ２
５％ .

〔Article〕 Protease-Producing Bacillus from Fermented Fish

（ 13 ）

weak

100

acid

and

295

weak

alkalineconditions.

The

Relative activity（%）

stability of protease at various pH levels is shownin Fig．
５ B. This enzyme was very stable in the80

ranges from pH ５ to １
０ with over ６
０％ of activity
residue. In two salt concentrations, ０ and １５％

60

NaCl, the stabilities were not different. The activity
40

towards various substrates is shown in Table ２.
Most of the substrates were decomposed by the20

protease from FST-６
７ and the activity was low in
１
５％ NaCl.

0
0

5

10

15

20

The

activity

towordelastaseandcollagenase（substrate is collagen）were increased in25high NaCl concentration compared with low NaCl

NaCl concentration（%）

concentration.

Two

carboxypeptidases

were

not

Fig．
３ Preotease activity of FST-６
７in various NaCl
concentrations

detected in both salt concentrations. The effect of

The activity in various NaCl concentrations was measured withthe standard method.

shown in Table３. All metals tested in this study

various metals and inhibitors on protease activity is
did not affect the activity. However, some inhibitors

100Relative activity（%）

Relative activity（%）

decreased the activity, particularly, PMSF and o-

100
80
60
40
20
0

10

20

30 40 50 60 70
Temperature （C˚）

100
80
60
40
20
0

30

40
50
60
70
Temperature（C˚）Fig．
４（A） Effect of temperature on proteaseactivity

Fig．
４（B） Thermostabilityof the FST-６
７protease

The relative protease activity of the enzyme wasdetermined at various temperatures．
５０mM TrisHCl buffer（pH７．
５）with１mM CaCl２was used.
The reaction was induced in ０％ NaCl（●）and
１５％ NaCl（○）.

Enzyme in Tris-HCl buffer （５０ mM, pH ７．
５）
containing １ mM CaCl ２ was incubated at various
temperatures and residual activities were assayed by
the standard assay method. The stability wasdetermined in ０％ NaCl（●）and１５％ NaCl（○）.

Relative activity（%）

Relative activity（%）

100
80
60
40
20
0

5

6

7
pH

8

9

10

Fig．
５
（A） Effect of pH on protease activity
The relative protease activity of the enzyme wasdetermined at various pHs. The typical reaction
buffers covered the range of pHs. The reaction
was occurred in ０％ NaCl（● ） and １
５％ NaCl
（○）
.

100
80
60
40
20
0

5

6

7

8

9

10

pH
Fig．
５
（B） Stability of protease activity at
various pHs
Enzyme was incubated at various pHs at ４ ! ．
Residual activities were assayed by the standard
assay method.The stability was determined in ０％
NaCl（●）and１５％ NaCl（○）.

296

Food Preservation Science

VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

Table ２ Substrate specificity of protease from FST-６
７

Substrate

Amino peptidase!Leu-pNA"Gly-pNA#L-Pro-pNA$Gly-Pro-pNA･Tos
Carboxyl peptidase%Z-Gly-Phe&Bz-Gly-Arg'Bz-Gly-Gly-Gly
Trypsin(BZ-Arg-pNA
Chymotrypsin)BZ-Tyr-pNA
SH protease*Pyr-Phe-Leu-pNA
Elastase+suc-Ala-Ala-Ala-pNA,Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA
Collagenase-Azocoll.Collagen

Activity in
０％ NaCl（U／!）

Activity in
１
５％ NaCl
（U／!）

８．
９
４
１．
４
２
０．
４
１
０．
５
１

６．
７
２
ND
ND
０．
０
６

ND＊
ND
１．
４
７

ND
ND
ND

３．
０
０

０．
２
５

０．
８
０

０．
０
４

０．
３
６

０．
４
３

０．
８
４
１
９．
２
６

１．
７
１
２
２．
７

０．
２
７
１
１．
２
８

０．
０
７
２
０．
６
４

（ 14 ）

Table ３ Relative levels of inhibition of protease bymetal ions and inhibitor
Compound% of residual activity

None
Metals
CoCl
HgCl
AlCl
ZnCl
MgCl

１
０
０

NaCl
KCl
CuCl
FeCl
CaCl
MnCl
Inhibitor
PMSF
PCMB
Monoiodeacetic acidDAN
EDTA
o-Phenanthroline

１
０
０
１
０
２
１
０
２
１
０
３
１
０
６
１
０
６

８
９
９
１
９
８
９
９
１
０
０

６
０
９
２
９
１
８
４
８
１
２４

The enzymatic analyses of various substrates are described inMaterials and Methods.

＊

ND : Not Detectedfish

phenanthroline.

Discussion

Bacillus,

Clostridium,

Debaryomyces,

Hansenula

Micrococcus,
３）
，
２
２）
，
２
３）

etc.

.

However, the role of the above microorganisms infishperiodoffish

halotorelant microorganisms effects fish fermentation.
２． Role of Virgibacillus halodenitrificans

in fishfermentation
Our result shows that all the fish sauces fromthus

Vietnam and fish pastes from Indonesiaused in this. MAEDA et al . reported protease property

study included V. halodenitrificans. The species V.

fermentation

has

not

been

reported

２）
，
２
４）
，
２
５）

far

the

This result shows that weak protease reaction by

Many microorganisms have been isolated from
Pediococcus,

However,tested can grow and produce protease in ２５％ NaCl.

１．Microbial specificity
fermented fish ;fermentation.

fermentation is generally several months. The strain

produced by Bacillus vietnamensis １
１- ４ isolated byhalodenitrificans

wasinitiallysuggested

to

be

was

“Bacillus halodenitrificans ”, as described by DENARIAZ

enzymological participation of the protease during

et al .２６）. However, some Bacillus strains including thisfish fermentation１１），１２）. In this study, we isolated

species were transferred by YOON et al . on the

halotolerant

microorganisms

basis of １
６ S rDNA sequence information２７）. Strainsfrom fermented fish. One or more strains existed inbelonging to this species are halotolerant （ in the

all samples and their strains grew not only in arangehigh salt concentration but also a low one. Thisdenitrification

result shows that all the isolates are halotolerantcasein were hydrolized by protease produced fromand not halophilic. In addition, extracellular protease

the strain in this species. Our strains identified as V.

activity of the isolates was detected in all salt

halodenitirificans

concentrations. The activities decreased with sodium

productivity,

MURA

et

al .

and

proteaseconcluded

productive

that

there

from ０．
３
５ to ４．
２
５ M ） andactivity.

had
andFurthermore,

Gelatinhalotorelance,

nitrateexhibitreduction

andproteasebutnochloride concentration. Fermented fish sauce has

denitrification activity（data not shown）. Our data

２
５％ sodium chloride. Therefore, the protease of the

supported that these strains were V. halodenitrificans

strains isolated did not seem to have an effect on

on

the

basis

of

not

only

phylogeny

but

also

〔Article〕 Protease-Producing Bacillus from Fermented Fish

（ 15 ）

297

phenotypic characteristics. In addition, this report is

productive

Bacillus

strains

anddeterminedvery important in terns of providing information on

halotolerance,

protease

activity,

andtaxonomical

V. halodenitrificansas reports on this species

areposition. It was found that all fish sauce and paste

scarce２６），２８），２９）. Another isolate, FST-７２, was identified

samples had halotolerant protease productive Bacilli

as B. circulans on the basis of １
６S rDNA sequences.

strains. In addition, most of the strains isolated

In this study, we used Vietnamese and Indonesian

were identified as V. halodenitrificans. Therefore, thefish sauces as samples. All samples except for FST-

strains belonging to B. halodenitifiricans were found７
２ were clustered in the V. halodenitrificans branch

to be involved in the decomposition of fish meaton the phylogenic tree and not divided. This result

during fish fermentation.

indicated that Bacilli in fermented fish have very
similar characteristics even though their forms are

Acknowledgement

different.

Kitazume for his technical assistance.

We would like to thank Mr. K.

３．Protease property
The protease from V. halodenitrificans is also a

Referencehalo-sensitive enzyme. Optimum and stable pH and

１）GILDBERG, A. : Utilization of male Arctic capelintemperature

were

similar

to

those

of

BacilliandAtlantic

codintestines

for

fish

previously reported（optimum at pH ７〜１１．
３ andproduction-evaluation

２
４〜７
０! and stable at pH １〜１
２．
７ and ２２〜７
０!

Bioresour. Technol ,. ７
６, １
１
９〜１
２
３（２
０
０
１）

cited

from

BRENDA ；３０）.

Additionally,

optimum

２ ） SAISITHI, P. :offermentation

sauce

conditions,

Traditional fermented fish :fishtemperature and thermo-stability of the proteasesauce production．（MARTIN, A. M., ed . : Fisheries

wasprocessing biotechnological application）（Chapmanchanged

in

high

salt

concentration.

Most

protease activities decreased with increasing sodium
chloride concentration. This result shows productiveand Hall, London）
, pp．
１
１
１〜１
２
９（１
９
９
４）
３）CRISAN, E. V. and SANDS, A. : Microflora of four

proteases were not halotolerant enzymes. However,fermented fish sauces, App. Microbiol , ２
９, １
０
６〜１
０
８

the

（１
９
７
５）

activities

of

one

elastaseandcollagenase

increased in １
５％ NaCl. This result was related to４）GILMOUR,

D. :Halotolerant

andhalophilic

the different conformation of the substrate. The

microorganisms（EDWARD, C., ed . : Microbiology ofeffect of various metal ions on protease activity was

extreme environments ）（ Open University Press,

negligible, similar to general conditions. Addition of

Buckingham）
, pp．
１
４
７〜１
７
７（１
９
９
０）

the inhibitors, PMSF and o-phenanthroline decreased

５）CHOORIT, W. and PRASERTSAN, P. : Characterization

active-site serine residue protease activity. Theseofresults show that the enzyme produced has serine

identified

proteolytic

residue on the active site and that there is metal infermented

fish （ Budu ）,the enzyme. These enzymatic properties are similar

Biotechnol ., ８, ２
８
４〜２
８
６（１
９
９
２）

３
１）

to the enzyme of Subtilisin .

proteaseproduced

by

newly

isolated

microorganisms
World

J.

and
from

Microbiol.

６）ITOH, H. , TACHI, H. and KIKUCHI, S. :Fish

The above results show that V. halodenitrificans

fermentation technology in Japan （ LEE, C. H. ,was present during fish sauce fermentation and is

Steinkraus, K. H. and Reilly, P. J. A., eds. : Fishimportant in fish sauce manufacturing. In addition,

Fermentation

the region of this species was not limited to only
one country. This species may exist in seawaterTechnology ）（ United

University Press, NY）
, pp．
１
７
７〜１
８
６（１
９
９
３）
７）LEE, C. H., STEINKRAUS, K. H. and REILLY, P.

because the componentss of fish sauce, mainly small

J. A. :

fish or shrimp, and salt, are gathered from sea.

NationsUniversity Press, NY）
（１
９
９
３）

However, V. holodenitrificans has not been reported
thus far. It is necessary to study this species.

Conclusion
Fish sauce was produced by decomposition of fishmeat by protease of the fish digestive tract. Many
Bacillus strains have been isolated from fish sauces.
In this study, we isolated halotolerant

protease

NationsFishfermantation

technology. （United８）THONGTHAI, C., MCGENITY, T. J., SUNTINANALERT,P.

andGRANT,

W.

characterizationofarchaeobacterium

from

an

D. :

Isolationandextremely

halophilic

traditionallyfermented

Thai fish sauce（nam pla）, Lett. Appl. Microbiol ., １
４,
１
１
１〜１
１
４（１
９
９
２）
９）LOPETCHARAT, K. and PARK, J. W. : Characteristics
of fish sauce made from pacific whiting and298

Food Preservation Science

VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

surimi by-products during fermentation stage, J.

Windows

Food Sci., ６
７, ５
１
１〜５
１
６（２
０
０
２）

multiple

１０）NGEI, K. T., EONG, Y. S., KWANG, L. H. and THENG,
C. A. G.

:

Fermented fish sauce in Southeast

Asia （ Marine
Southeast

Fishers

Asian

Research

Fishers

Department,

Development

Center,（ 16 ）

interface :sequence

Flexiblealignment

strategies

aided

by

for

qualityanalysis tool, Nucleic Acids Res. , ２
４, ４
８
７
６
３〜４
８
８
２
（１
９
９
７）
２
１）CLAUS, D. and BERKELEY, R. C. : Genus Bacillus
Cohn １８７２（SNEATH, P. H. A., MAIR, N. S., SHARPE,
M. E. and HOLT. J. B. , eds. : Bergey’s manual ofSingapore）
（２
０
０
３）
１
１）MURA, K., MAEDA, H., TANAKA, H., KOIZUMI, K.
and YANAGIDA, H. : Isolation of protese-productive
bacteria from fish sauces collected in Vietnam, J.
Food Pres. Sci., ２
６, ２
６
３〜２
７
１（in Japanese）
（２
０
０
０）

systematic bacteriology, vol．
２）
（Williams and Wilkins,
Baltimore）
, pp．
１
１
０
５〜１
１
３
９（１
９
８
６）
２
２） SAISITHI, P. , KASEMSARN, B. O. , LISTON, J. and
DOLLAR, A. M. :Microbiology and chemistry of１２）MAEDA, H., MURA, K., HORIUCHI, H. and TAKANO,

fermented fish, J. Food Sci., ３
１, １
０
５〜１
１
０（１
９
６
６）

K. : Purification and properties of extracellular

２３）YOON, J.-H., KANG, S.-S., LEE, K.-C., KHO, Y. H.,

Bacillusfrom

CHOI, S. H., KANG, K. H. and PARK, Y.-H. : Bacillus

Vietnamese fish sauce, J. Food Pres. Sci., ２
６, ３
０
７〜

jeotgali sp. nov. , isolated from jeotgal, Korean３１３（in Japanese）
（２
０
０
０）

traditional fermented seafood, Int. J. Syst. Evol.

proteaseof

sp. １
１- ４ isolated

１３）GORDON, R. E., HAYNES, W. C. and PANG, C. H.
N. : The genus Bacillus. Agriculture handbook no.
４
２
７（ Department

ofAgriculture,

Washington,

DC）
（１
９
７
３）

Microbiol ., ５
１, １
０
８
７〜１
０
９
２（２
０
０
１）
２
４）IJONG, F. G. and OHTA, Y. : Physicochemical andMicrobiological Changes Associated with Bakasang
Processing-A

Traditional

Indonesian

Fermented

１４）SARATH, G., MOTTE, R. S. de la and WAGNER, F.

Fish Sauce, J. Sci. Food Agric., ７
１, ６
９〜７
４（１
９
９
６）

W. : Protease assay Methods（BEYOND, R. J. and

２５）KUDA, T., OKAANO, K. and YANO, T. : Population

BOND, J. S., eds. : Proteolytic enzymes : a practicalof halophilic bacteria in salted fish products madeapproach（Oxford : IRL Press, Oxford）, pp．
２
５〜５
５

in the Loochoo Islands, Okinawa and the Noto

（１
９
８
９）

Peninsula, Ishikawa, Japan, Fish, Fish. Sci., ６
８, １
２
６
５

１
５）NOGUCHI, H., UCHINO, M., SHIDA, O., TAKANO, K.,
NAKAMURA, L. K. and KOMAGATA, K. :Bacillus

〜１
２
７
３（２
０
０
２）
２
６）DENARIAZ, G., PAYNE, W. J. and GALL, J. L. : Avietnamensis sp. nov. , a moderately halotolerant,

halophilic denitrifier, Bacillus halodenitrificans

aerobic, endospore-forming bacterium isolated fromnov., Int. J. Syst. Bacteriol ., ３
９, １
４
５〜１
５
１（１
９
８
９）

Vietnamese fish sauce, Int. J. Syst. Evol. Microbiol .,２７）YOON, J. H., OH, T. K. and PARK, Y. H. : Transfer

６, ２
１
１
７〜２
１
２
０（２
０
０
４）

sp.

of Bacillus halodenitrificans Denariaz et al. １
９
８
９ to

１
６）WEISSBACH, A. and WEISSBACK, H. : Methods for

the

genus

Virgibacillus

as

Virgibacillus

Plant Molecular Biology （ Academic Press, NY ）halodenitrificans comb. nov. , Int. J. Syst.

（１
９
８
８）

Microbiol ., ５
４, ２
１
６
３〜２
１
６
７（２
０
０
４）

Evol.

and

２
８）CHEN, C. J., LIU, M. Y., CHANG, T., CHANG, W. C.,

Proposal for two new genera,

WANG, B. C. and LE, G. J. : Crystal structure of a

Brevibacillus gen. nov. and Aneurinibacillus gen. nov,

nucleoside diphosphate kinase from Virgibacillus

Int. J. Syst. Bacteriol ., ４
６, ９
３
９〜９
４
６（１
９
９
６）

halodenitrificans : Coexpression of its activity with

１７） SHIDA,O. ,TAKAGI,KOMAGATA, K. :H. ,KADOWAKI,

K.

１８）TAKAGI, H., SHIDA, O., KADOWAKI, K., KOMAGATA,
K. and UDAKA, S. :Characterization of Bacillus

brevis, with descriptions of Bacillus migulanus sp.
choshinensis

２９）GHAURI, M. A., KHALID, A. M., GRANT, S., GRANT,

Bacillus

W. D. and HEAPHY, S. : Phylogenetic analysis ofparabrevis sp. nov. , and Bacillus galactophilus sp.

bacterial isolates from man-made high-pH, high-salt

nov. Int. J. Syst. Bacteriol ., ４
３, ２
２
１〜２
３
１（１
９
９
３）

environments and identification of gene-cassette-

nov. ,

Bacillusa Mn-superoxide dismutase, J. Struct. Biol . , １
４
２,
２
４
７〜２
５
５（２
０
０
３）

１
９） SAITOU, N. and NEI, M. :method :anewmethodsp.

nov. ,

A neighbor-joining

associated open reading frames, Curr. Microbiol ., ５
２,

for

４
８
７〜４
９
２（２
０
０
６）

reconstructing

phylogenetic trees, Mol. Biol. Evol ., ４, ４
０
６〜４
２
５
（１
９
８
７）
２
０） THOMPSON, J. D. , GIBSON, T. J. , PLEWNIAK, F. ,JEANMOUGIN, F. and HIGGINS, D. G. : The Clustal X

３０ ） BRENDA,

The

Comprehensive

EnzymeInformation System（http : ／／www.brenda-enzymes.
info／）
３
１）RAO, M. B., TANKSALE, A. M., GHATGE, M. S. and（ 17 ）

〔Article〕 Protease-Producing Bacillus from Fermented Fish

DESHPANDE, V. V. E. : Molecular and Biotechnological
Aspects of Microbial Proteases, Microbiol. Molecul.
Biol. Rev., ６
２, ５
９
７〜６
３
５（１
９
９
８）

299

魚醤より分離した
プロテアーゼ生産耐塩性 Bacillus について
野口治子＊１・片山佳子＊２・内野昌孝＊２・石川孝明＊２
プスピタリスディヤンティ＊３・!野克己＊２＊１

東京大学生物生産工学研究センター

（〒１
１
３―８
６
５
７ 東京都文京区弥生１―１―１）＊２

東京農業大学応用生物科学部生物応用化学科

（〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１）＊３

Research Center for Biotechnology, Indonesian

Institute of Sciences（Jl. Raya Bogor Km. ４６, Cibinong １
６
９
１
１, PO BOX
Bogor ４２
２, Indonesia）
本研究では魚醤よりBacillus属細菌を分離し，その性質を決定し，魚醤発酵過程中における本菌の役割を明らかにすることを目的とした。インドネシア産５種およびベトナム産６種の魚醤を試料とした。これらの試料から耐塩性でプロテアーゼ生産性のBacillusを分離した。すべての試料にこれらの菌が存在し，その多くが２５％の食塩濃度で生育し，プロテアーゼを生産した。また，低塩濃度（１％）でも生育が認められた。そのため，これら分離株は耐塩性菌と考えられた。１
６ S rDNAに基づく
系 統 解 析 の 結 果，ほ と ん ど の 分 離 菌 株 はVirgibacillus
halodenitrificansであった。本結果より，魚醤の魚醤発酵
過程では魚消化管プロテアーゼだけでなく，本菌種や類縁菌の同酵素が関与していることが明らかとなった。
（平成２
１年５月１
１日受付，平成２
１年９月２日受理）

（ 19 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９ 〔研究ノート〕

301

低温貯蔵中におけるカンキツ 不知火 果実の糖，有機酸，
アミノ酸，アスコルビン酸およびカロテノイド含量の変化
松 添 直 隆＊１§・圖 師 一 文＊２・森
綾 子＊１・有 田
愛＊１・我如古菜月＊１
近 藤 謙 介＊１・木 村 宏 和＊３・藤 田 賢 輔＊４・白 土 英 樹＊１＊１ 熊本県立大学環境共生学部＊２ 尚絅大学短期大学部＊３ 尚絅大学生活科学部＊４ 熊本県農業研究センター

Changes in Sugar, Organic Acid, Amino Acid, Ascorbic Acid and Carotenoid
Contents of Citrus ‘Shiranuhi’ Fruit during Cold Storage
MATSUZOE Naotaka＊１§，ZUSHI Kazufumi＊２，MORI Ayako＊１，ARITA Ai＊１，GANEKO Natsuki＊１，
KONDO Kensuke＊１，KIMURA Hirokazu＊３，FUJITA Kensuke＊４ and SHIRATSUCHI Hideki＊１
Faculty of Environmental and Symbiotic Sciences, Prefectural University of Kumamoto,3−1−100, Tsukide, Kumamoto-shi, Kumamoto 862−8502＊２ Shokei University Junior College，2−6−78, Kuhonji, Kumamoto-shi, Kumamoto 862−8678＊３ Faculty of Living Science, Shokei University, 2−6−78, Kuhonji, Kumamoto-shi, Kumamoto 862−8678＊４ Kumamoto Prefectural Agricultural Research Center, 3801, Sakae, Koshi-shi, Kumamoto 861−1113＊１

In this study, we investigated the changes in the sugar, organic acid, amino acid, ascorbic acid andcarotenoid contents of citrus ‘Shiranuhi’ fruit stored at ５" and packaged in polyethylene film for ５
months. Fruit weight slightly decreased during the storage. A significant reduction in organic acidcontent was observed with no significant change in sugar content. Consequently, sugar-acid ratio
increased significantly during the storage. Sucrose content showed no change during the storage,
whereas glucose and fructose contents decreased. The organic acids detected were citric acid andmalic acid. Both citric acid and malic acid contents decreased during the storage. Asparagine, arginine
and aspartic acid were the major amino acids detected. No significant change in total amino acidcontent was observed throughout the storage ; however, the changes in the amounts of all aminoacids tested differed. A small change in L-ascorbic acid content was observed during storage with adecrease in dehydroascorbic acid content. β-Carotene and β-cryptoxanthin were the main carotenoids
detected. No significant change in β-cryptoxanthin content was observed. β-Carotene content increased
markedly and, after five months of storage, reached a value approximately threefold higher than thatat the initial storage time.
（Received Aug. ２０, ２００８；Accepted May ２
０, ２
０
０
９）
Key words：citrus, cold storage, fruit quality, polyethylene packaging, Shiranuhi
果実品質，カンキツ，不知火，低温貯蔵，ポリエチレン包装
カンキツ

不知火

は，１
９
７
２年に晩生のタンゴール

清見

を種子親として早生のマンダリン

野３号に交配し育成されたマンダリン系の交雑種で，熟期は２月中旬から３月上旬である。カンキツ産業にお果実の大きさは２００〜２８０!，カラー（デコ）を有する倒いて生産量の伸びが大きく，販路拡大の目的から低温で

＊１
§
＊２
＊３
＊４

ポンカン中

卵形である１）。果皮はやや粗いが剥皮性はよく，果肉は橙色で柔軟多汁であり，じょうのう膜も薄く食べやすい。

〒８
６
２―８
５
０
２ 熊本県熊本市月出３―１―１
０
０
Corresponding author, E-mail：matsuzoe@pu-kumamoto.ac.jp
〒８
６
２―８
６
７
８ 熊本県熊本市九品寺２―６―７
８
〒８
６
２―８
６
７
８ 熊本県熊本市九品寺２―６―７
８
〒８
６
１―１
１
１
３ 熊本県合志市栄３
８
０
１

302

日本食品保蔵科学会誌 VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

約２〜３か月貯蔵されることが多くなっているが，貯蔵（ 20 ）

動相溶液のpH緩衝剤とする１００µM EDTA・２Naを含臭の発生，貯蔵後の腐敗の多発など大きな問題を抱えてむ５mM p-トルエンスルホン酸水溶液を用いてポストいる。

カラム誘導体化させ，電気伝導度計（CCD-６A，島津製

不知火

果実では貯蔵方法としてポリエチレンフィ

作所）で行った。

ルム包装の検討も行われている２），３）。しかし， 不知火

アミノ酸の分析は，Shim-pack FC-ODSカラム（４．
６

果実の貯蔵中における成分変化に関する知見は少なく，# I. D.×７
５#，島津製作所）を用い，オルトフタルアル

筆者らは， 不知火

デヒド（OPA）とメルカプトプロピオン酸を用いたOPA

果実の低温長期貯蔵技術の確立を目指し，貯蔵方法が果実品質に与える影響について研究

プレカラム誘導体化法により行った。カラム温度は５０$，を進めている。本研究では，ポリエチレン包装，貯蔵温

流速を１．
０!／minとし，移動相にはA液として１０mMリ

度５$の条件下における果実の糖，有機酸，

ン酸（ナトリウム）緩衝液（pH６．
９），B液としてアセト

アミノ酸，アスコルビン酸ならびにカロテノイドの変化

ニトリルを用い，ステップワイズグラジエント条件（初を明らかにすることを目的とした。

期条 件A／B＝９
５／５，２分；A／B＝９２．
５／７．
５，４分；A／不知火

実験方法
１．分 析 試 料
熊本県農業研究センター果樹研究所において無加温ハ

B ＝９
０／１
０，８ 分 ； A ／ B ＝８
８／１
２，９ 分 ； A ／ B ＝８
５／
１
５，１
２．
５分；A／B＝７
９／２
１，１
５分；A／B＝７
７／２
３，１
７．
５
分；A／B＝５０／５０，１
８．
５分；A／B＝２０／８
０，２１．
５分；A／B＝２０／８０）で分析した。検出は蛍光検出器（RF-１０A，島ウスで栽培された果実を用いた。供試果実は，２００１年２津製作所）を用い，励起波長３５０!，蛍光波長４
５
５!で行

月９日に収穫し，予措終了後に熊本県農業研究センターった。

果樹研究所の光センサーで測定し，可溶性固形物含量

また，プロリンの分析はMAGNEら４）の方法で行った。

（糖度）が１３〜１５度の個体のものとした。貯蔵袋には厚糖および有機酸の分析で用いた試料液５００"に蒸留水をさ０．
０２
５#のポリエチレンフィルム包装を用いた。１袋

５００"加えて１!とし，これに６０％酢酸に溶解した１％ごと１個の果実を果梗部を上にしてポリエチレンフィル

ニンヒドリンを２!加えて撹拌後，８０$の恒温槽で１時ム袋に入れ，口を軽くひねり，果実の下に折り込んで貯間反応させた。その後室温まで冷却し，トルエン５!を

蔵温度５$±１$に設定した冷蔵庫（MEDICOOL MPR

加えて激しくエマルジョンを起こすまで撹拌した。分離

-３
１
１D（H）
，SANYO）に暗黒状態で貯蔵した。２００
１年

後，上層を取り出しその溶液の５
２０!の吸光度を分光光

３月１日を貯蔵開始時とし，４月１日（貯蔵１か月），
５

度計により測定した。

月１日（貯蔵２か月），６月２日（貯蔵３か月），７月１

３．アスコルビン酸の抽出および分析

日（貯蔵４か月），８月１日（貯蔵５か月）の 計６回，

果実１０個体のじょうのうを室温で解凍し，市販の茶パ

各試験区１５個の果実をサンプリングした。果実は，メスックに入れて搾汁した後，搾汁液を遠心分離（１
０，
０
０
０

を用いて果皮を剥皮後，じょうのうを取り出し，−８０$rpm，４$，１５min）した。得られた上澄１!に１０％メの 冷 凍 庫（ULTRA LOW MDF-３
９
２AT，SANYO）でタリン酸１!を加えた後，５％メタリン酸で１０!に定容分析に使用するまで保存した。

し，フィルターろ過（DISMIC-２５０．
４５"，東洋濾紙）し２．糖，有機酸およびアミノ酸の抽出および分析たものをHPLCに供した。HPLC分析は，Shim-pack SCR

じょうのうを室温で解凍後，ガーゼに包み搾汁した。

-１
０
１Nカラム（７．
９# I. D.×３
０
０#，島津製作所），を用い

搾 汁 液 を 遠 心 分 離（５，０００rpm，２５$，１５min）し，上た ポ ス ト カ ラ ム 法 に よ り 行 っ た。移 動 相 に は１mM澄を得た。その上澄を蒸留水で５０〜１００倍に希釈後，フEDTA・２Naを含む１０mMシュウ酸ナトリウム緩衝溶

ィルターろ過（DISMIC-２
５，孔径０．
４５"，東洋濾紙）し液（pH３．
８），反応液には５０mM水素化ホウ素ナトリウたものを高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供し，ムを含む５０mM水酸化ナトリウムを用いて，カラム温度

果汁中の糖，有機酸およびアミノ酸の含量を定量した。

４０$，流速は移動相が１．
０!／min，反応液が０．
５!／minまた，糖含量はスクロース，グルコースおよびフルクトとした。検出にはUV検出器（SPD-１
０AD，島津製作所

ースの合計，有機酸含量はクエン酸とリンゴ酸の合計と製）を用い，検出波長は３００!で行った。

した。

４．カロテノイドの抽出および分析

糖の分析には，Shim-pack SCR-１
０
１Cカラム（７．
９# I.

抽出および分析方法は隅田ら５）の方法に従った。果実

D.×３
００#，島津製作所）を用いた。移動相は蒸留水と１０個体のじょうのうに炭酸マグネシウム，エタノールおし，カラム温度を８０$，流速を０．
８!／min，検出は示差

よび石英砂を加え乳鉢で磨砕した。HPLC分析には，

屈折計（RID-１
０A，島津製作所）を用いて行った。

Carotenoid５µC３０カ ラ ム（４．
６# I. D.×２
５
０#，YMC有 機 酸 の 分 析 は，Shim-pack SCR-１
０
２Hカ ラ ム（７．
９社）を用いた。移動相には０．
１％酢酸アンモニウムを添# I. D.×３
０
０#，島津製作所）を用いた。移動相は５mM加したメタノール：t-ブチルメチルエーテル（９２：８）

p-トルエンスルホン酸水溶液を用い，カラム温度を４０$，を用いて，カラム温度２７$，流速は１．
０!／minで分析し，流速を０．
８!／minとした。反応液に２０mM Bis-Trisを移検出には紫外可視多波長検出器（SPD-１
０A，島津製作

（ 21 ）

〔研究ノート〕 カンキツ 不知火 の果実成分変化303所）を用い，検出波長は４５０!で行った。

タミン，セリン，バリン，スレオニン），増加するもの

５．統 計 処 理

（アルギニン，プロリン，アラニン，フェニルアラニン，得られた実験データは平均値±標準誤差（Means±

グリシン），減少するもの（アスパラギン酸とグルタミ

SE）で表した。各群間の比較はTukey-Kramer法で多重ン酸）の３つのパターンがみられた。Fig．
３にそれぞれ比較検定を行い，危険率５％未満を有意差とした。

代表的なパターンのアミノ酸（アスパラギン，アルギニ
ン，アスパラギン酸）を示した。

実験結果

アスコルビン酸の変化をFig．
４に示した。L（＋）ア

貯蔵中の果重の減少率（％），糖含量，有機酸含量なス コ ル ビ ン 酸（ASA）と デ ヒ ド ロ ア ス コ ル ビ ン 酸

らびに糖酸比の貯蔵中の変化をTable１に示した。貯蔵（DHA）が検出された。ASA含量は貯蔵を通じて４９．
９に伴って果実重量はほぼ直線的に減少し，貯蔵５か月に

〜６
１．
８#／１
０
０!の範囲内にあり，有意な変化はみられな

おいては２．
３
２％の減少率を示した。果汁中の糖含量は有かったが，DHA含量は貯蔵１か月目より有意に減少し意な変化がみられなかったが，有機酸含量は貯蔵に伴いた。

減少し，５か月目には貯蔵開始時の約０．
７倍の値になった。したがって，糖含量と有機酸含量の比である糖酸比の値になった。
組成別糖含量の変化をFig．
１に示した。貯蔵開始時はスクロース６
６．
５#／!，グルコース２
６．
２#／!，フルクトース３
２．
３#／!であったが，貯蔵５か月目にスクロース

組成別有機酸含量の変化をFig．
２に示した。クエン酸
含量は貯蔵開始時に１
２．
３#／!であったが，貯蔵開始以降，徐 々 に 減 少 し，３か 月 目 で 有 意 な 差 と な っ て 現

果汁に含まれる遊離アミノ酸は，含量の多い順にアスパラギン（５
００"／!以上），アルギニン，アスパラギン
酸，γ-アミノ酪酸，プロリン，グルタミン，セリン，グ

ab

b

ab

bc

b

ab

a

40
20

Glucose

80
60
40
20

bc

c

Fructose

80
60
40

bc

c

bc

abc

ab

a

0

1

2

3

4

5

20
0

ルタミン酸，バリン，アラニン（５
０〜５
０
０"／!）
，フェ
ニルアラニン，スレオニン，グリシン（５０"／!以下）Storage time（month)であった（Table２）。貯蔵を通して，果汁中の総遊離

Fig．
１ Changes in the sucrose, glucose and fructose
contents of ‘Shiranuhi’ fruit during storage

アミノ酸含量の有意な変化はみられなかった（Fig．
３）
。
一方，個々のアミノ酸については，貯蔵期間の経過に伴い変化しないもの（アスパラギン，γ-アミノ酪酸，グル

ab

60

100
Sugar content（mg/ ）

有意に減少し５か月目には１．
３
４#／!となった。

ab0

れ，５か月目には８．
３
９#／!となった。リンゴ酸含量は
貯蔵開始時に２．
０
５#／!であったが，貯蔵２か月目から

a100
Sugar content（mg/ ）した。

80

0

含量はほとんど差がなかったものの，グルコース，フル
クトース含量は各々２
１．
１#／!，２
７．
４#／!と有意に減少

Sucrose100
Sugar content（mg/ ）

は増加傾向を示し，５か月目には貯蔵開始時の約１．
４倍

Values with different letters are significantly different, p＜０．
０５.

Table １ Changes in fruit weight loss, sugar content, acid content and sugar-acid ratio of ‘Shiranuhi’ fruit during storage
Storage time（Month）

Fruit weight loss（％）

Sugar content（#／!）

Organic acid content（#／!）

Sugar-acid ratio

０
１

０．
０
０
０．
３
１±０．
０
３

１
２
５．
０±２．
５ ab
１
３
０．
９±１．
９ a

１
４．
３±０．
６ a
１
３．
５±０．
６ ab

８．
９±０．
４ a
９．
９±０．
５ ab

２
３

０．
８
４±０．
０
３
１．
３
３±０．
０
６

１
３
１．
０±２．
１ a
１
２
５．
７±２．
１ ab

１
１．
７±０．
５ bc
１
１．
１±０．
４ cd

１
１．
４±０．
５ bc
１
１．
５±０．
４ bc

４

１．
８
３±０．
１
０

１
２
６．
５±２．
１ ab

９．
８±０．
３ d

１
３．
１±０．
５ c

５

２．
３
２±０．
０
７

１
２
０．
０±１．
８ b

９．
７±０．
３ d

１
２．
５±０．
４ c

Fruit weight loss is expressed as percent of fruit weight before the storage.
Values are means±standard error（n＝１５）.
Values with different letters are significantly different, p＜０．
０
５.

14
12
10
8
6
4
2
0

Citric acid
c
bc

bc

ab

a

a

Malic acid

d

cd

bc

ab

ab

a

0

1

2

3

4

5

Amino acid content（µg/ ）

Malic acid content（mg/ ）

14
12
10
8
6
4
2
0

Total amino acid content（mg/ ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

Citric acid content（mg/ ）

304

Values with different letters are significantly different, p＜０．
０５.

Table ２ Amino acid contents of juice of Shiranuhi’fruit０and５months after storage
Content（!／!）
Amino acid
０month５months

Alanineγ-Aminobutyric acid
Arginine
Asparagine
Aspartic acid
Cysteine
Glutamic acid
Glutamine
GlycineHistidine
Isoleucine
LeucineLysineMethionine
ProlinePhenylalanine
SerineThreonine
Tyrosine
Valine

９
５．
９（ ３．
７）
２
４
３．
４（ ９．
４）
３
５
９．
９（１
３．
８）
７
４
６．
７（２
８．
７）
３
５
４．
８（１
３．
６）
N.D.
１
２
５．
９（ ４．
８）
１７
６．
１（ ６．
８）
１
７．
０（ ０．
７）
N.D.
N.D.
２．
８（ ０．
１）
N.D.
N.D.
１
８
５．
１（ ７．
１）
２
１．
１（ ０．
８）
１
５
２．
２（ ５．
９）
１
９．
９（ ０．
８）
N.D.
１
０
２．
０（ ３．
９）

１
７
８．
８（ ６．
０）
３
４
２．
６（１
１．
５）
８
１
８．
４（２
７．
４）
６
６
０．
２（２
２．
１）
７
５．
５（ ２．
５）
N.D.
４
６．
４（ １．
６）
２
６
８．
０（ ９．
０）
２
１．
９（ ０．
７）
N.D.
２．
４（ ０．
１）
１
８．
４（ ０．
６）
N.D.
N.D.
２
６
９．
９（ ９．
０）
２
７．
６（ ０．
９）
１
５
０．
６（ ５．
０）
２
３．
６（ ０．
８）
１９．
２（ ０．
６）
１
０
６．
０（ ３．
５）

Total amino acid

２６
０
０．
０
（１
０
０％） ２
９
８
９．
５
（１
０
０％）

The values in parentheses represent the % contribution ofindividual compounds to the total free amino acid composition.
Values are means（n＝５）.
N.D.=not detected.

Amino acid content（µg/ ）

Fig．
２ Changes in the citric acid and malic acid contents of‘Shiranuhi’ fruit during storage

Amino acid content（µg/ ）

Storage time（month）

4（ 22 ）

Total amino acid

3
2
1
0
1200
1000

Asparagine

800
600
400
200
0
1200
1000

Arginine

800

bc

600
400

a

c

bc

bc

bc

ab

a

3

4

5

b

200
0
1200

Aspartic acid

1000
800
600
400

d

d

c

200
0
0

1

2

Storage time （month）
Fig．
３ Changes in the total amino acid, asparagine, arginine
and aspartic acid contnts of ‘ Shiranuhi’ fruit duringstorage
Values with different letters are significantly different, p＜０．
０５．

カロテノイド含量の変化をFig．
５に示した。主要なカ
ロテノイドとしてβ-クリプトキサンチンとβ-カロテンが検出された。β-クリプトキサンチンの含量は貯蔵を通し
て１
４
１．
１〜２
３
４．
３!／１
０
０"の範囲にあり，有意な変化はみられなかった。β-カロテン含量は貯蔵開始時で７
０．
５!／
１
０
０"であったが，貯蔵開始以降，徐々に増加し，３か月目で有意な差となって現れ，５か月目では貯蔵開始時の約３倍に増加した。β-クリプトキサンチンとβ-カロテンの含量はともに果実による差が大きかった。

考
本実験では， 不知火

察
果実の貯蔵条件の改善を図る

ために，果実をポリエチレンフィルム包装し，５#で５

80
Dehydroascorbic acid
60
40
20

c

ab

a

b

ab

ab

0
80
60

ab

b

Ascorbic acid
ab

a

a

a

40
20

β-Cryptoxanthin content（µg/100 g）〔研究ノート〕 カンキツ 不知火 の果実成分変化

300

305

β-Cryptoxanthin

250
200
150
100
50
0
300

β-Carotene content（µg/100 g）

Ascorbic acid content Dehydroascorbic acid content（mg/100 ）（mg/100 ）（ 23 ）

c

β-Carotene

250

bc

200

bc
ab

150

a

a

0

1

100

0

50
0

0

1

2

3

4

5

2

3

4

5

Storage time（month）

Storage time（month）

Fig．
４ Changes in the dehydroascorbic acid and ascorbic
acid contnts of ‘Shiranuhi’ fruit during storage

Fig ．
５ Changes in the β-cryptoxanthin and β-carotene
contents in ‘Shiranuhi’ fruit during storage

Values with different letters are significantly different, p＜０．
０５．

Values with different letters are significantly different, p＜０．
０５.

か月間貯蔵したときの果汁中の糖，有機酸，アミノ酸組

れは成，さらに，アスコルビン酸，カロテノイドの変化を調はグルコースとフルクトースへと分解されず，グルコー

査した。貯蔵期間を通して果実の糖含量には有意な変化

スとフルクトースが呼吸基質として消費されたことを示がみられず，有機酸含量は有意に減少し，糖酸比は有意唆している。

に増加した。有機酸が減少した結果として糖酸比が増加

不知火

果実のスクロースは本実験の貯蔵条件で貯蔵期間を通して，果汁内の総遊離アミノ酸含量の有果実の甘みをより意な変化はみられなかった。果汁内で検出される主な遊

強く感じられることが期待される。糖，有機酸含量の貯

離アミノ酸はアラニン，γ-アミノ酪酸，アルギニン，ア

蔵中の変化は，貯蔵果実による呼吸や水分蒸散による濃スパラギン，グルタミン酸，グルタミン，プロリン，セ

縮効果に影響される。しかし，本実験においては貯蔵を

リン，バリンなどであった。 不知火したことから，貯蔵により

不知火

果汁中には，ウ９）

通した果実重の減少率に有意な変化がみられなかったた

ンシュウミカン と比較するとγ-アミノ酪酸，アスパラめ，水分蒸散は考慮する必要がないと思われる。果実のギン，グルタミン，バリンの含量が多く，プロリンの含糖，有機酸は呼吸基質であるが，貯蔵果実では，糖より量が少なかった。γ-アミノ酪酸は血圧上昇抑制作用１０），１１），

有機酸が呼吸基質として使われる場合が多い６），７）。本実

精神安定作用１２），脳機能改善作用１３）をもつことが報告さ

験でも同様な傾向を示した。

れ，近年，注目されている機能性成分の一つである。土

カンキツ類の主要糖組成はグルコース，フルクトース
８）およびスクロースであることが報告されている 。冨永
６）田ら１４）は軽症高血圧者に対するγ-アミノ酪酸摂取の効果
は，１日約２０"の摂取が妥当であろうと報告している。
果汁中には貯蔵開始時で２４
３．
４!／!含まれてら は，中晩生カンキツ類果実４種類をポリエチレンフ

不知火

ィルム包装し，５$で貯蔵すると４種類ともに果汁中のおり， 不知火

の果重が２
０
０〜２
８
０#であることを考え

１）

スクロース含量は減少したが，グルコースとフルクトー

ると ，１個の摂取で前述の機能性が十分期待でき， 不ス含量は変化しなかったと報告している。そしてこれは知火グルコースとフルクトースは呼吸基質として消費されるられる。

はγ-アミノ酪酸の供給源として有効であると考えが，スクロースが分解されグルコースとフルクトースが貯蔵期間の経過に伴う果汁内の遊離アミノ酸含量変化

補充されるため結果的にスクロースのみが消費されたよはアミノ酸の種類によって異なることが明らかとなった。

うにみえると推察している。本実験において認められた

それらアミノ酸の中で貯蔵に伴い増加するものは，多い

貯蔵中の果汁内の糖組成変化はスクロース含量は変化せ順からアルギニン，プロリン，アラニン，減少するものず，グルコースとフルクトース含量の減少であった。こは，アスパラギン酸，グルタミン酸，有意な変化がみら306

日本食品保蔵科学会誌 VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

（ 24 ）

れないものはアスパラギン，γ-アミノ酪酸であった。鈴ンチン含量は増加傾向を示すことが報告されている２７）。

木ら１５）はウンシュウミカン果実のCA貯蔵中の，橋永ら１６）

しかし，本実験におけるはキンカンとポンカン果実の成熟中の，冨永１７）はポンカ

サンチン含量は個体間差が大きく，貯蔵期間に伴う有意ン果実の成熟中のアミノ酸含量について報告し，いずれな変化は認められなかった。森永ら２８）は，ウンシュウミ

もアルギニンとプロリンの増加を認めている。また，冨カンにおいて周年マルチ点滴かん水同時施肥法で管理す

１
７）

不知火

果実のβ-クリプトキ

永 はアルギニンとプロリンはアミノ基転移反応系で末ると露地栽培に比べ，β-クリプトキサンチン含量が約端に位置しているため，果実内に蓄積されやすいものと１．
５倍に増加したことを報告している。さらに，前述の考察しており，本研究における貯蔵中の

不知火

果実

ように

不知火

果実のβ-クリプトキサンチン含量は約のアルギニンとプロリン含量の増加も同様であると考え

０．
３"／１
０
０#という報告がある一方で，YANOら２９）は１．
１られる。γ-アミノ酪酸はグルタミン酸がグルタミン酸脱"／１００#であったと報告している。したがって， 不知

炭酸酵素により脱炭酸されることにより生成するとされ火ている１８）。津志田ら１９）は茶の嫌気的条件下でアスパラギ

境や栽培管理によって変動することが推察され， 不知

ン酸とグルタミン酸が減少し，γ-アミノ酪酸とアラニン

火が増加することを，杵淵ら２０）はアスパラギン酸がアスパ理の制御をしたうえで行うことが重要であると考えられ

ラギン酸アミノトランスフェラーゼの働きでグルタミンる。

果実に含まれるβ-クリプトキサンチン含量も栽培環
果実の貯蔵法を検討する場合には栽培環境や栽培管酸となり，γ-アミノ酪酸の生産につながることを報告し

β-カロテンやβ-クリプトキサンチンはカロテノイドのている。本実験においても貯蔵期間の経過に伴いアスパ一種であり，カロテノイドは強い抗酸化性をもつ物質とラギン酸は減少したが，γ-アミノ酪酸は増加傾向を示し

して，近年その機能性に関して多くの研究がなされてい２
１）

たものの有意な差は認められなかった。一方，大久らる３０）。IKOMAら３１）はは籾発芽玄米の５０$および６０$の過熱処理でアラニンが含量は品種あるいは成熟期と貯蔵法により異なるものと増加することを確認し，この場合グルタミン酸からγ‐

考えられたと報告している。本実験で貯蔵期間の経過に

アミノ酪酸が合成されるよりも，グルタミン酸のアミノ伴いβ-カロテン含量の増加が認められたことから，より基転移によりアラニンが合成される方向に変化すると報詳細な貯蔵条件を検討することにより告している。本実験においても貯蔵期間の経過に伴い，高品質化が可能になると期待される。

アラニンが増加しグルタミン酸が減少したことから，同にお い て，β-カ ロ テ ン

不知火

果実の

要 約

様の代謝が行われたと推察される。片桐ら２２）はダイズもやしを低温（５$）かつ脱酸素空気中で保管することに

宮川早生

不知火

果実にポリエチレン包装を用いて低温（５よりγ-アミノ酪酸含量の低下を防ぐことを報告している。

$）で５か月間貯蔵し，貯蔵中における糖，有機酸，ア

本実験においてミノ酸，アスコルビン酸ならびにカロテノイドの変化を

不知火のγ-アミノ酪酸含量は５か月間の貯蔵期間中に２
４
３．
４〜３
４
２．
６!／!の範囲で有意に変化しなかったことから，本実験で用いた５$，ポリエチ
レンフィルム個包装という貯蔵条件は

不知火

のγ-ア

調査した。
貯蔵期間を通して果実重量はわずかながら減少した。
有機酸含量は有意に減少したが糖含量に有意な変化はみ
みられず，糖酸比が有意に増加した。

ミノ酪酸含量の維持に有効であると考えられる。
本実験において，果汁内の総ビタミンC含量（ASA+

貯蔵期間を通して，果汁中の組成別糖含量はスクロー

DHA）は６８"／１
０
０!で，同じカンキツ類のネーブルオ

ス含量は変化せず，グルコースとフルクトース含量は減

レンジ（６
０"／１
０
０#）と同程度の含量であった２３）。ブラ

少した。

ッドオレンジ

TAROCCO を８$で８５日間貯蔵した後の果汁中のASA含量の変化はみられなかったが２４），本貯蔵条件においても，貯蔵期間に伴うASA含量の有意貯蔵期間を通して，果汁中の組成別有機酸含量はクエン酸とリンゴ酸ともに減少した。
果汁中の主な遊離アミノ酸は多い順にアスパラギン，
アルギニン，アスパラギン酸，γ-アミノ酪酸，グルタミな変化は認められなかった。
根角ら２５）は，カンキツ類に含まれるβ-クリプトキサン

ン，プロリン，グルタミン酸，セリン，バリンおよびアチン含量について調査し，果汁中にほとんど含まないもラニンであった。貯蔵期間の経過に伴う果汁内の総遊離

のから１．
８"／１
０
０#含む品種があり， ジミカン ， 興津

アミノ酸含量の有意な変化はみられなかったが，アミノ

早生 ， シカイカン ， 杉山温州酸の種類によっては含量の変化が異なることが明らかとなどのマンダリン品

種で多かったことを報告している。本実験における
知火

"／１
０
０#で あ っ た。矢 野 は，品 種
２
６）

火

不

果実のβ-クリプトキサンチン含量は収穫時で０．
１
４
清見

と

不知

果実には約０．
３"／１
０
０#のβ-クリプトキサンチンが含まれていたと報告しており，本実験の結果はやや少なかった。 青島温州

では，貯蔵に伴いβ-クリプトキサなった。
貯蔵期間に伴うL（＋）アスコルビン酸（ASA）含量の有意な変化はみられなかったが，デヒドロアスコルビン酸（DHA）含量は減少傾向を示した。
貯蔵期間に伴うβ-クリプトキサンチンの含量の有意な変化はみられなかった。

（ 25 ）

〔研究ノート〕 カンキツ 不知火 の果実成分変化

貯蔵期間に伴いβ-カロテン含量は増加し，５か月目で307

川節・松林恒夫：血圧が高めの健常者および軽症高血圧に対するγ-アミノ酪酸高含有クロレラの効果，日本

は貯蔵開始時の約３倍の値まで増加した。

栄養・食糧学会誌，５
６，９
７〜１
０
２（２
０
０
３）
文

献

１）松本亮司：晩生カンキツ

１５）鈴木忠直・久保直哉・萩沼之孝・田村真八郎：温州

不知火 ，果樹試験場報

食総研報，３
７，９
０〜９
７（１
９
８
０）

告，３
５，１
１
５〜１
２
０（２
０
０
１）
開・岩崎守光・高濱純雄： 不知

１６）橋永文男・伊藤三郎：キンカンとポンカン果実の成の生産技術の確立（第２報）果実の貯蔵方法，園熟及び貯蔵中の遊離アミノ酸含量とエセホン処理の影

２）猪原健一・重岡
火

ミカンのCA貯蔵中における遊離アミノ酸含量の変化，

響，鹿大農学術報告，４
０，３
７〜４
２（１
９
９
０）

芸学会九州支部研究収録，３，２
３〜２
４（１
９
９
４）
不

１
７）冨 永 茂 人：ポ ン カ ン（Citrus reticulata Blanco）果の導入と栽培技術確立（第３報）果実の貯蔵性

実の品質向上に関する研究，鹿大農学術報告，３９，１
７３）藤田賢輔・平山秀文・磯部知火

暁：カンキツ品種について，園芸学会九州支部研究収録，２，１
１〜１
２

〜８
７（１
９
８
９）
１
８）STREETER, J. G. and THOMPSON, J. F. : Anaerobic

（１
９
９
３）
４）MAGNE, C. and LARHER, F. : High sugar content

accumulation of γ-aminobutyric acid and alanine inof extracts interferes with colorimetric determination

radish leaves（Raphanus sativus L.）, Plant Physiol.,of amino acids and free proline, Anal. Biochem., ２
０
０,

４
９，５
７
２〜５
７
８（１
９
７
２）
１
９）津志田藤二郎・村井敏信・大森正司・岡本順子：γ-

１
１
５〜１
１
８（１
９
９
２）
５）隅田孝司・濱田智・東誠広・小川浩史・多田幹郎：C３０カラムによる温州ミカン果汁中のβ-クリプトキ
サンチン定量法，食科工，４
６，４
６
７〜４
７
２（１
９
９
９）
６）冨永茂人・大東宏：中晩生カンキツの貯蔵温度とポリエチレンフィルム包装が果実の品質に及ぼす影響，
四国農業試験場報告，４
０，９
２〜１
２
７（１
９
８
２）
送，食糧技術普及シリーズ，１
０，１〜１
０
３（１
９
７
７）
宏・冨永茂人：瀬戸内地域における中晩生カ

ンキツ果実の品質に関する研究，第２報

化，６
１，８
１
７〜８
２
２（１
９
８
７）
２
０）杵淵美倭子・関谷美由紀・山崎

果汁中糖組

彬・山元皓二：高圧処理を利用した玄米中へのγ-アミノ酪酸（GABA）の蓄積，食科工，４
６，３
２
３〜３
２
８（１
９
９
９）
２
１）大久長範・大能俊久・森

７）農林水産省食品総合研究所：温州ミカンの貯蔵と輸
８）大東

アミノ酪酸を蓄積させた茶 の 製 造 と そ の 特 徴，農勝美：発芽玄米と籾発芽

玄米のγ-アミノ酪酸および遊離アミノ酸含量，食科
工，５
０，３
１
６〜３
１
８（２
０
０
３）
２
２）片桐充昭・清水純夫：大豆もやし生育中の二酸化炭
素ガス処理によるγ-アミノ酪酸（GABA）生成と低温

成と含量の時期別変化，四国農業試験場報告，３
７，５
３

保存中におけるGABAの消長，日食保蔵誌，２
０，１
８
１

〜６
１（１
９
８
１）

〜１
８
５（１
９
９
４）

９）大東

宏・冨永茂人：ウンシュウミカンの異なる樹形における着果部位別の果実品質，特に糖，有機酸およびアミノ酸組成について，園学雑，５
０，１
４
３〜１
５
６
（１
９
８
１）

２
３）香川芳子監修：「五訂食品成分表２００２」（女子栄養大学出版部，東京）
（２
０
０
２）
２
４）RAPISARDA, P., BELLOMO, S. E. and INTELISANO, S. :Storage temperature effects on blood orange fruit

洋・中川聡史・梶本佳孝・早川和

quality, J. Agric. Food Chem., ４
９, ３
２
３
０〜３
２
３
５（２
０
０
１）

仁・木村雅行：GABA含有はっ酵乳製品の正常高値血

２５）根角博久・中野睦子・吉田俊雄：カンキツのフラベ

圧者に対する降圧効果，食科工，５
１，７
９〜８
６（２
０
０
４）

ドおよび果汁に含まれるβ-クリプトキサンチン含量の１０）梶本修身・平田

１１）大森正司・矢野とし子・岡本順子・津志田藤次郎・
村井敏信・樋口満：嫌気処理茶（ギャバロン茶）による高血圧自然発症ラットの血圧上昇抑制作用，農
化，６
１，１
４
４
９〜１
４
５
１（１
９
８
７）
励・高

橋丈夫：γ-アミノ酪酸蓄積脱脂コメ胚芽の経口投与における更年期障害及び初老期精神障害に対する効果，
食科工，４
７，５
９
６〜６
０
３（２
０
０
０）
１
３）茅原

紘・杉浦友美：近年のGABA生理機能研究―

脳機能改善作用，高血圧作用を中心に―，食品と開発，３６，４〜６（２
０
０
１）
１
４）土田

〜１
４
４（２
０
０
２）
２
７）矢野昌充：ウンシュウミカンの一般成分と機能性

１２）岡田忠司・杉下朋子・村上太郎・村井弘道・三枝貴代・堀野敏郎・小野田朋彦・梶本修身・高橋

品種間差異，園学雑，６
７（別２）
，１
０
８（１
９
９
８）
２
６）矢野昌充：カンキツによるがん予防，食科工，
４
９，
１
３
９

隆・益子研土・山田勝彦・平塚秀雄・島田孝

男・板垣雪絵・藤沼秀光・鮫島浩二・中村寿雄・長谷（津志田藤二郎編：地球農産物の品質・機能性成分総覧）（サ イ エ ン ス フ ォ ー ラ ム，東 京）
，pp．
３
１
２〜３
１
４
（２
０
０
０）
２
８）森永邦久・吉川弘恭・中尾誠司・関野幸二・村松
昇・長谷川美典：露地栽培ウンシュウミカンにおける周 年 マ ル チ 点 滴 か ん 水 同 時 施 肥 法 の 効 果，園 学
研，３，３
３〜３
７（２
０
０
４）
２
９）YANO, M., KATO, M., IKOMA, Y., KAWASAKI, A.,
FUKAZAWA,

Y. ,SUGIURA,M. ,MATSUMOTO,

H. ,OOHARA, Y., Akihiko NAGAO, A. and OGAWA, K. :

308

日本食品保蔵科学会誌 VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

Quantitation of carotenoids in raw and processed

OMURA,

fruits in Japan, Food Sci. Technol. Res., １
１, １
３〜１
８

Expression of a phytoene synthase gene and

（２
０
０
５）

characteristic

３０）西野輔翼：食品成分によるがん予防，農林水産技術
研究ジャーナル，２
９，３
１〜３
７（２
０
０
６）
３
１）IKOMA, Y., KOMATSU, A., KITA, M., OGAWA, K.,

M. ,

YANO,

（ 26 ）

M.

carotenoidand

MORIGUCHI,

accumulation

T. :duringcitrus fruit development, Physiologia Plantarum, １
１
１,
２
３
２〜２
３
８（２
０
０
１）
（平成２
０年８月２
０日受付，平成２
１年５月２
０日受理）

（ 27 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９ 〔研究ノート〕

309

柿葉茶の浸出方法が抗酸化成分含量に及ぼす影響
およびその浸出液の安定性
鶴 永 陽 子＊１・高 林 由 美＊１・鈴 木 芳 孝＊２
西 万 二 郎＊３・松 本 真 悟＊４§
＊１ 広島文教女子大学＊２ 高知県農業技術センター＊３ 西会本部＊４ 島根大学

Effects of Exudation Method on Antioxidative Component Content of
Persimmon Leaf Tea and Stability of Its Decoction
TSURUNAGA Yoko＊１§，TAKABAYASHI Yumi＊１，SUZUKI Yoshitaka＊２，
NISHI Manjiro＊３ and MATSUMOTO Shingo＊４＊１ Hiroshima Bunkyo Women’s University,
1−2−1, Kabehigashi, Asakita-ku, Hiroshima-shi, Hiroshima 731−0295＊２ Kochi Agricultural Research Center, 1100, Hataeda Nankoku-shi, Kochi 783−0023＊３ Nishi-kai, 1−39−13, Sakashita, Itabashi-ku, Tokyo 174−0043＊４ Shimane University, 2059, Kamihonjou-cho, Matsue-shi, Shimane 690−8504
We examined the effect of the exudation method on the levels of ascorbic acid, astragalin, and total
polyphenols of persimmon leaf tea, and on the stability of these components in decoction. We foundthe optimum exudation method for obtaining high levels of these components differed depending on
the component. The study revealed that the optimum exudation method for maintaining a high levelof ascorbic acid was either exuding the persimmon leaf tea in ５! tap water for １
０〜６
０ minutes or in
６
０〜１
０
０! tap water for over ３ minutes. The optimum storage temperature for maintaining a highascorbic acid content in the decoction was ５! . The rates of exudation of astragalin and total
polyphenols were increased by a high pressure treatment. Though the thermostability of ascorbic acidin the decoction was low, that of both astragalin and soluble polyphenol was excellent. Even when thedecoction was preserved at ９０! for ２
４ hours, the astragalin content decreased by only about １
０％
and the total polyphenol content did not decrease significantly.
（Received Apr. １３, ２００９；Accepted Sep. ２
４, ２
０
０
９）
Key words：persimmon leaf tea, exudation method, ascorbic acid content, polyphenol content, astragalin content
柿葉茶，浸出方法，アスコルビン酸含量，ポリフェノール含量，アストラガリン含量

カキ（Diospyros kaki. Thunb）の葉は，アスコルビン
１）
，
２）

４）
，
５）

抗酸化性

もに，柿葉茶の製造工程１０），１１）がそれらの含量に与える影などの機能性について

響について報告した。これらの研究成果を利用した柿葉

６）
，
７）

，抗アレルギー性

茶が，島根県内の製茶業者を中心に製造，販売され，多くの報告がなされている。
著者らは，これまでに柿葉茶に関する一連の研究を行
８）９）い，柿葉の採取時期 および採取部位 の違いによるアス
＊１
＊２
＊３
＊４
§

コルビン酸などの抗酸化成分含量の差異を検討するとと，また，育毛効果 ，酸やポリフェノール含量が高く

３）

年々販売額が増加している。これはビタミンCをはじめとする抗酸化成分含量の高いことが，消費者の購買意欲

〒７
３
１―０
２
９
５ 広島県広島市安佐北区可部東１―２―１
〒７
８
３―０
０
２
３ 高知県南国市廿枝１
１
０
０
〒１
７
４―０
０
４
３ 東京都板橋区坂下１―３
９―１
３甲子ビル２F
〒６
９
０―１
１
０
２ 島根県松江市上本庄町２０５９Corresponding author, E-mail : smatsu@life.shimane-u.ac.jp

310

日本食品保蔵科学会誌 VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

につながっているためと考えられる。

（ 28 ）

試料液とした。また，アスコルビン酸は，酸化および分

しかし，実際にお茶を飲用する際は，茶葉に含まれる解を防ぐ目的で，上記の試料液に等量の４％メタリン酸

成分を浸出させる必要がある。そのため，柿葉茶の抗酸を添加し，分析に使用した。アストラガリンおよびアス化成分を効率よく摂取するためには，飲用する際の茶のコルビン酸のHPLCの分析条件は前報９）に従い，総ポリ浸出方法が非常に重要な要素となる。

フェノール含量はフォリン・チオカルト法１２）を用いた。

そこで，本研究では，柿葉茶の浸出方法とアスコルビン酸，アストラガリンおよび総ポリフェノール含量につ

測 定 値 は，す べ て 乾 燥 茶 葉１００%（乾 物 重，以 下DW）あたりに換算した含量で示した。

いて検討した。柿葉茶の浸出方法と成分について報告し結果および考察た例はあるが５），浸出温度および時間の影響を詳細に検討した報告はない。併せて，煮出した柿葉茶浸出液中の成分の安定性についても報告する。

実験方法
１．材

料

１．アスコルビン酸浸出量
図１に柿葉茶のアスコルビン酸量に及ぼす浸出温度および時間の影響について示した。温度の違いにかかわらず，いずれも速やかにアスコルビン酸が冷水もしくは熱水中に浸出した。また，水道水および純水で浸出させた
場合のアスコルビン酸含量を，１００&，１０分間処理区で西会本部）より柿葉乾燥物を入手した。柿葉乾燥物比較したところ，両者とも１，
１
０
０$／１
０
０%DWで両者間は，市販品と同様の形状にするため，ブレンダーで粉末の差は認められなかった。５&における１〜５分間の浸化し，１．
０#目の篩を通したものを試験に供した。

出では，ほかの温度区と比較して，アスコルビン酸の浸析に供した。また，蒸留水と純水での浸出効率を比較す
るため，１
０
０&で１
０分間浸出する処理区については純水による浸出も行った。
３．浸出液の安定性
茶葉４%に９００!の熱水（水道水，１００&）を加え，１０
分間室温で静置したのち１，０
００!に定容したものを直ちにろ過した。５０!容のメスフラスコに４０!ずつ分注し，各温度（５，３０，６０，９０&）に静置し，浸出液における抗酸化成分の保存性を検討した。保存中の水分蒸発およびコンタミネーションを防止するため，保存中はメスフラスコをアルミ箔で覆い，分析直前に水道水で５０!に定容した。サンプリングは，保存開始１，３，６，１
２，２
４
時間後に行った。また，浸出液の褐変度の測定は，波長５００!の吸光度を測定して求めた。
４．アスコルビン酸，アストラガリン，総ポリフェノールの測定
上記で得られた浸出液を０．
４５"でフィルター濾過したものをアストラガリンおよび総ポリフェノール測定用の

総アスコルビン酸含量（mg/100gDW）

ートクレーブの予熱時間は約１０分，放熱時間は約８分であった。各処理区で得られた浸出液は直ちにろ過し，分

0℃
煮
加 沸
圧
浸
出

&，５分）を用いた加圧浸出法についても検討した。オ

0分

圧調理器による浸出を想定して，オートクレーブ（１
２
１

200

60

６
０分間の煮沸加熱を要した。以下，６
０分煮沸区）と，加400℃

量になるまで煎じる方法（本試験では半量になるまでに

600

10

さらに，健康茶で一般的に用いられる浸出方法として半800℃

加えて，５&条件下で２４時間静置した処理区を設定した。

1,000

80

浸出させる製品があることから，茶葉に５&の水道水を

A

1,200

60

また，ティーパックでは，冷蔵庫内で一晩かけて成分を

1,400

区

（１，３，５，１
０分間）放置後，直ちに５０!に定容した。

5℃

道 水 を４０!添 加 し，室 温（約２０&）で 一 定 時 間照

２００$の柿葉茶粉末に，各温度５，６
０，８
０，１
０
０&の水

対

２．柿葉茶の浸出方法

総アスコルビン酸含量 （mg/100gDW）

材料は，島根県江津市桜江町桑茶生産組合製造（販売
元

1,200
B

1,000
800
600
400
200
0

0

500
1,000
浸出時間（分）1,500

図１ 柿葉茶のアスコルビン酸量に及ぼす浸出温度および時間の影響
棒は標準偏差（n＝３）
Ａ：２００$の柿葉茶粉末に各温度の水道水を４０!加え，室温（約２０&）で静置後５０!に定容
対照区は２％メタリン酸で浸出
Ｂ：２００$の柿茶葉粉末に５&の水道水を４０!加え，５&で静置後
５
０!に定容
3
5
10
浸出時間（分）： 1

（ 29 ）

〔研究ノート〕 柿葉茶浸出液の抗酸化成分含量

311

出が１
０％程度低かったが，１０分間後にはほかの温度区ととを明らかにしている。本試験においても高温ほどアス同レベルになった。５$で保存したアスコルビン酸含量

コルビン酸の残存量が低下しており，分部らの結果と一は，加水１時間後に最大となり，その後斬減し，２４時間致した。また，浸出液を高温下で保存すると柿葉茶浸出

後に９
５
０"／１
０
０#DWとなった。また，６
０分煮沸区およ液の褐変化が著しく促進されたことから（図３），アス

び加圧浸出区では，アスコルビン酸含量がそ れ ぞ れ

コルビン酸の分解に２つの褐変反応の関与が考えられた。

５
５
０，３
０
０"／１
０
０#DWでほかの処理と比較して著しく低アミノ酸が関与する褐色反応は，酸性で分解されフルフかった。２％メタリン酸で浸出した含量が１，
１
８
０"／１
０
０

ラールを形成し，アミノ化合物と反応して褐変物質のメ#DWであったことから考えると，６０分煮沸区および加ラノイジンを生成する非酸化的反応経路（アミノカルボ

圧浸出区を除いた処理区では，８
４
０"〜１，
１
０
０"／１
０
０#

ニル反応）と，酸化型であるデヒドロアスコルビン酸かDWの範囲であり，通常家庭でお茶を入れる方法で，十ら２，３−ジケトグロン酸を経由し，その後，分解反応

分にアスコルビン酸を摂取できることが明らかとなった。

により着色する酸化的反応がある１４），１５）。本実験からは，また，家庭でお茶を飲む際は，魔法瓶などに保存して少これらの反応がアスコルビン酸の減少にどの程度関与し量ずつ飲用する場合がある。そこで，柿葉茶浸出液の保たかは明確にできなかった。しかし，両者とも酵素が関

存温度および時間とアスコルビン酸含量について検討し与しない化学反応であるため，温度が高いほど反応が速

た。１
０
０$で１
０分間静置して得られた浸出液について保やかに進み，結果的にアスコルビン酸の消失が高温ほど存試験を実施した。浸出温度は，冷蔵庫内，室内および早かったものと推察された。以上のことから，柿葉茶にポットでの保存を想定して，５，３
０，６
０および９
０$の処

含まれるアスコルビン酸を効率よく摂取するには，水温理区を設定した。図２に浸出液の保存温度および時間とが５$では１
０分間以上，６
０$以上では３分間以上浸出さアスコルビン酸含量の結果を示した。保存温度が５$でせ，浸出後は速やかに飲用し，作り置きする場合には５は，２４時間後も浸出直後の約９０％のアスコルビン酸が残$程度の低温下で保存することが好ましいと考えられた。

存したが，３０$区の場合は，１時間で８８％に減少し，２４

２．アストラガリンおよび総ポリフェノール浸出量

時間後には３２％となった。保存温度６０$では１時間で柿葉茶のアストラガリン量に及ぼす浸出温度および時

５０％まで減少し，２
４時間後にはアスコルビン酸が全く残間の影響を図４に，総ポリフェノール含量に及ぼす影響存しなかった。また，保存温度９０$では１時間で約２０％を図５に示した。いずれの浸出温度においても，浸出時まで減少し，６時間後には完全に分解された。このよう間が長いほど，アストラガリンおよびポリフェノール含に，保存温度が高いほど，浸出液中のアスコルビン酸は量が高かった。また，１００$，１０分間処理区について純

早く分解された。分部ら１３）は，還元型および酸化型のア

水で浸出させた場合のアストラガリンおよびポリフェノール含量を水道水と比較したところ，両者の差異は認められなかった。６０〜１
００$のアストラガリン含量が９
０〜

残存率が９
３％であったのに対し，９０$保存では１
７％とな

１
８
０"／１
０
０#DWであったのに対し，５$では４８〜７５"／り，高温下でアスコルビン酸残存率が著しく低下するこ

１
０
０#DWと少なかった。また，総ポリフェノール含量

1,200

0.4

1,000

褐変度（500nm）

総アスコルビン含量（mg/100gDW）

スコルビン酸試薬を用いて，１
０
０!／!水溶液における保存温度の影響を検討した結果，５$保存では５時間後の

800
600
400

0.3

0.2

0.1
200

0

0
0

4

8

12

16

20

24

0

4

8

12

16

20

24

保存時間（時間）

保存時間（時間）
図２ 柿葉茶浸出液のアスコルビン酸量に及ぼす保存温度および時間の影響

図３ 柿葉茶浸出液の褐変度に及ぼす保存温度および時間の影響

浸出条件：４#の柿葉茶粉末に９００!の水道水（１００$）を加え，１０
分間室温で静置後１，０００!に定容
5℃
30℃
60℃
90℃
保存温度：

浸出条件は図２と同様
5℃
保存温度：

30℃

60℃

90℃

200
150
100
50

80
℃
10
0
60 ℃
分
煮
加 沸
圧
浸
出

総ポリフェノール含量

160

60
℃

対
照
区

5℃

0

B

140
120
100
80
60
40
20

10,000
8,000
6,000
4,000
2,000
0

6,000
B

5,000
4,000
3,000
2,000
1,000
0
0

0
0

500

1,000

図４ 柿葉茶のアストラガリン量に及ぼす浸出温度および時間の影響
棒は標準偏差（n＝３）
Ａ：２０
０!の柿葉茶粉末に各温度の水道水を４０!加え，室温（約２０#）で静置後５０!に定容
対照区は８０％メタノール，３
０分間加熱浸出Ｂ：２
００!の柿茶葉粉末に５#の水道水を４０!加え，５#で静置後
５
０!に定容
3
5
10
浸出時間（分）： 1

500

1,000

1,500

浸出時間（分）1,500

浸出時間（分）

60
℃
80
℃
10
6 0 0℃
分
煮
加 沸
圧
浸
出

250

A

12,0005℃

300（ 30 ）

14,000対照区

総ポリフェノール含量

A

350（mg カテキン相当量/100gDW）

アストラガリン含量（mg/100gDW）

400（mg カテキン相当量/100gDW）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

アストラガリン含量（mg/100gDW）

312

図５ 柿葉茶の総ポリフェノール量に及ぼす浸出温度および時間の影響
棒は標準偏差（n＝３）
浸出条件は図４と同様
3
浸出時間（分）： 1

5

10したところ，８０#以上で顕著にその活性が高まることを明らかにしている。また，沖ら１８）はサツマイモ葉部にお
ける６
０〜１
０
０#の熱水浸出時の温度と抗酸化活性の関係について調べ，浸出温度が高いほど，活性の高い浸出液が得られることを報告している。これらのことは，レモ

は，６
０〜１
０
０#で は２，
９
０
０〜３，
８
０
０!／１
０
０"DWで あ っ たンバーム，ブラックペパーミント，サツマイモ葉部などの に 対 し，５#で は１，
９
０
０〜２，
６
０
０!／１
０
０"DWと 少 なに含まれる抗酸化成分は，高温ほど浸出されやすいこと

く，５#に比べて６０#以上ではアストラガリンおよび総を示している。本実験の柿葉茶に含まれるアストラガリ

ポリフェノールの水溶液中への浸出が優れていた。さらンおよび総ポリフェノールも同様で温度が高いほど浸出に，６０分煮沸区および加圧浸出区では浸出効率が高く，されやすい成分であると考えられる。

それぞれ２
７
０!／１
０
０"DW，９，
４
５
０〜１
０，４
８
０!／１
０
０"DW

浸出液のアストラガリン量および総ポリフェノール量であった。一般的に浸出効率が優れ，ポリフェノールのに及ぼす保存温度と時間の影響を図６，図７に示した。

分析で使用されることが多い８０％メタノール１６）で３
０分加

アストラガリン含量は，３
０，６
０および９
０#区の２
４時間後

熱還流した場合のアストラガリンおよび可溶性ポリフェには，それぞれ８３，８１および７８％に低下した。一方，総ノール含量が，それぞれ３
３０!／１
００"DW，１１，１００!／

ポリフェノール含量は，保存温度および時間にかかわら

１
０
０"DWであったことから，６
０分煮沸区および加圧浸ず変化が小さかった。筆者らは，桑茶において粗抽出液

出区では，溶媒が水であっても高い浸出効率が得られる

（pH６．
８）と０．
１％ギ酸添加液（pH４．
２）におけるポリフ

ことがわかった。溶媒温度が高いほど，ポリフェノール

ェノールの安定性を４
０，６
０および８
０#において比較した成分や抗酸化成分の浸出効率が高まる報告はいくつかあところ，後者では大幅に安定性が向上し，桑葉ポリフェる。柚木崎１７）らは，レモンバームおよびブラックペパー

ノールは，酸性側で安定することを報告した１９）。本試験

ミントの乾燥物を用いて，浸出温度と抗酸化活性を検討で用いた柿葉茶浸出液のpHは浸出液保存開始から終了

（ 31 ）

〔研究ノート〕 柿葉茶浸出液の抗酸化成分含量とから，３０"以上でアストラガリンが減少したにもかか

アストラガリン含量（mg/100gDW）

200

わらず，総ポリフェノール含量が保持されたのは，柿葉160

茶中のポリフェノールの主成分が熱に安定な成分である
ため，その含量が減少しなかったためと考えられた。以120上のことから，柿葉茶に含まれるアストラガリンおよび
80

ポリフェノール成分を効率よく摂取するには，浸出は加圧条件下で行い，５"で保存するのが最もよい方法と考40えられた。しかし，浸出液を魔法瓶やポットで２４時間保温した場合でも，両成分とも熱による損失が少ないこと

0
0

4

8

12
16
保存時間（時間）2024

図６ 柿葉茶浸出液のアストラガリン量に及ぼす保存温度および時間の影響
浸出条件は図２と同様
5℃
保存温度：

総ポリフェノール含量（mgカテキン相当量/100gDW）

313

が明らかになった。

要

約

柿葉茶の浸出方法および浸出液の保存方法が，アスコ
ルビン酸，アストラガリンおよび総ポリフェノール含量

30℃

60℃

90℃

に及ぼす影響を検討した。その結果，成分により効率よく浸出するのに適する入れ方は異なった。アスコルビン

6,000

酸は，５"の冷水の場合は１
０〜６
０分間，６
０〜１
０
０"の熱
水の場合は，３〜１
０分間程度置く方法が適していた。一5,000

方，アストラガリンおよび総ポリフェノールは，半量に4,000なるまで煮詰める方法や加圧浸出などの方法を用いるこ

3,000とによって浸出効率は高まった。また，浸出液中のアスコルビン酸は５"程度の低温下で保存する方法が最も含2,000量が保持された。しかし，アストラガリンおよび可溶性
1,0000

ポリフェノールは高温条件下の保存でも安定性に優
0

4

8
12
16
保存時間（時間）

20

24

れ，９
０"で２
４時間保存した場合でも，アストラガリン含量の減少は約１０％の減少にとどまり，総ポリフェノール
含量はほとんど減少しなかった。

図７ 柿葉茶浸出液の総ポリフェノール量に及ぼす保存温度
および時間の影響
浸出条件は図２と同様
5℃
保存温度：

30℃

60℃

90℃

文

献

１）水野瑞夫：日本薬草全書（新日本法規，
東京）
，
pp．
１
４
３
〜１
４
５（１
９
９
５）
２）奥田拓道：健康，栄養食品辞典（東洋医学舎，東時点まで４．
５付近であった（データ省略）。柿葉は，アスコルビン酸，タンニン酸などに富み，pHが低いことが
１
９）

京）
，pp．
３
８
５〜３
８
６（２
０
０
２）
３）桑名隆一郎・伊達あけみ・沢村豊・盛岡雅史：毛佐伯ら によって報告されている。本実験ではアスコル

乳頭を め ぐ る 育 毛 剤 の 新 し い 研 究 開 発，Fragrance

ビン酸が完全に消失した後も，柿葉自体が含有するアス

Journal，２
３，４
１〜４
８（１
９
９
５）

コルビン酸以外の酸性物質が浸出液の低pH状態を保持

４）棟久美佐子・井上知明・小松正幹：日本茶及び「健し，加熱によるアストラガリンおよびポリフェノール含康茶」浸出液の抗酸化作用について（!），京都府保量の低下を抑制したと考えられる。３０"以上の保存では，

環研年報，４
４，２
０〜２
５（１
９
９
９）

アストラガリン含量が減少しているにもかかわらず，ポ５）SAKANAKA, S. , TACHIBANA, Y. and OKADA, Y. :リフェノール含量は一定であった。柿葉のポリフェノー

Preparation and antioxidant properties of extracts

ル成分で報告があるのは，イソケルシトリン８），カテキ

of Japanese persimmon leaf tea （ kakinoha - cha ）,

４）
，
２
１）

ン

２
１）

２
２）

，エピガロカテキンガレート ，ルチン があるが，Food Chem., ８
９, ５
６
９〜５
７
５（２
０
０
４）

本研究におけるHPLC分析ではエピガロカテキンガレー

６）小谷麻由美・藤田晃人・田中敏郎：ヒト好塩基球細トやルチンは検出されなかった。また，タンニン系物質

胞およびマウスにおける柿の葉抽出物のアレルギー抑やロイコアントシアニンが含まれていることも示唆され

制 効 果，日 本 栄 養・食 糧 学 会 誌，５
２，１
４
７〜１
５
１

２
１）

ている 。さらに筆者らは，時期別に採取した西条柿の

（１
９
９
９）

葉について，フォリン・チオカルト法による可溶性ポリ７）松本元伸・小谷麻由美・藤田晃人・田中敏郎：柿葉フェノール含量に占めるアストラガリンの割合は低抽出物のNC/Ngaマウスにおけるアトピー性皮膚炎抑８）く，２〜３％であることを報告している 。これらのこ制作用，日本栄養・食糧学会誌，５
４，３〜７（２
０
０
１）

314

日本食品保蔵科学会誌 VOL．３
５ NO．
６ ２
０
０
９

８）鶴永陽子・松本敏一・倉橋孝夫・持田圭介・板村裕
之：収穫時期の違いがカキ

西条の葉における機能性成分含量に及ぼす影響，園芸学研究，５，３
２
１〜３
２
４

（ 32 ）

京）
，pp．
１
３
７〜１
４
１（２
０
０
８）
１
６）津志田藤二郎：ポリフェノールの分析技術，食品と
開発，４
０，１
１〜１
３（２
０
０
５）
１
７）柚木崎千鶴子・小村美穂・小坂妙子・堂園真澄：乾

（２
０
０
６）
９）TSURUNAGA, Y., MATSUMOTO, T. , KURAHASHI, T. ,燥温度及び抽出法の違いによるハーブ類の抗酸化活性，

MOCHIDA, K. and ITAMURA., H. : Effects of Shoot

宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研Length on Amounts of Functional Components of

究報告，４
９，６
９〜７
５（２
０
０
５）

LeavesandShoots

for

Tea

from

Japanese

１
８）沖

智之・古田

収・西場洋一・増田真美・納美由

Persimmon ‘Saijo’, Food Preser. Sci., ３
２, １
４
７〜１
５
２

紀，小林美緒・須田郁夫：サツマイモ「シモン１号」

（２
０
０
６）

葉部熱水抽出液のラジカル消去活性，日本食品科学工１０）鶴永陽子・松崎一・持田圭介・板村裕之：製造工程の違いが柿葉茶の機能性および機能性成分に与える影響，日本食品科学工学会誌，５
１，４
０
１〜４
０
５（２
０
０
４）
１
１）鶴永陽子・松崎

学会誌，４
９，６
８
３〜６
８
７（２
０
０
２）
１
９）KATSUBE, T. ,TSURUNAGA,

Y. ,SUGIYAMA,

M. ,FURUNO, T. and YAMASAKI, Y. : Effect of air-drying

一・持田圭介・松本敏一・板村裕

temperature on antioxidant capacity and stability

之：蒸熱加熱および焙煎処理が保存中の柿葉茶の総ア

of polyphenolic compounds in mulberry （ Morus

スコルビン酸含量およびラジカル捕捉活性に与える影

alba L．
）leaves, Food Chem., １
１
３, ９
６
４〜９
６
９（２
０
０
９）

響，日本食品科学工学会誌，５
２，３
９
１〜３
９
７（２
０
０
５）

２
０）佐伯俊子・丸山悦子・中西洋子・梶田武俊：緑葉ク

１２）SWAIN, T. and HILLIS, W. E. :constituentsofprunusThe phenolicdomestica.

I.

The

quantitative analysis of phenolic constituents, J. Sci.

ホーレン草および柿葉について，調理科学，２
０，１
２
５〜１
２
９（１
９
８
７）
２
１）曽根原直子・泉敬子：柿葉のビタミンCとポリフ

ェノール成分との関係，日本栄養・食糧学会誌，
４
４，
２
１
３

Food Agric., １
０, ６
３〜６
８（１
９
５
９）
１
３）分部麻希・村上千秋・丸山武紀・新谷ロロフィルの熱安定性に関する研究!：野菜ジュース調整時の還元型及び酸化型ビタミンCの変化，
日本調理科学雑誌，３
３，２
２
１〜２
２
８（２
０
０
０）
１
４）江角彰彦：食品学総論実験（同文書院，
東京）
，
p．
１
９
０
（２
０
０
７）
１
５）森田潤司・成田宏史編：食品学総論（化学同人，東

〜２
１
９（１
９
９
１）
２
２）木村俊之・山岸賢治・鈴木雅博・八巻幸二・新本洋
士：柿の葉のラジカル消去成分，東北農業研究，
５
６，
２
６
７
〜２
６
８（２
０
０
３）
（平成２
１年４月１
３日受付，平成２１年９月２４日受理）