Original

Chromatography, Vol.27 No.1 (2006)

Original

グアニジン変性したタンパク質のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー――１．
グアニジン含有リン酸緩衝液溶離系――
吉武朋彦１）、小林伸太郎１）、小川哲朗１）、奥山典生２）

Hydroxyapatite chromatography of guanidine denatured proteins――1. Guanidine containing phosphate buffer system――
Tomohiko Yoshitake*1) , Shintaro Kobayashi1) , Tetsuro Ogawa1) and Tsuneo Okuyama2)
1) New Ceramics Division, PENTAX Corporation 2−36−9, Maeno−cho, Itabashi−ku, Tokyo, 174−8639, Japan
2) Protein Technos institute 99−7 Shimokawa−iri, Atugi−shi, Kanagawa−ken, 243−0206, JapanReceived for review October 14, 2005. Revised manuscript received November 26, 2005. Accepted December 22, 2005.

Abstract
Elution behaviors of guanidine denatured proteins on ceramic hydroxyapatite column with 2 M guanidine containing phosphate buffer systemwere investigated. In phosphate buffer system, the retention time of proteins was increased with the positive charge of the proteins. On theother hand, in guanidine containing phosphate buffer system, the retention time of the proteins decreased with the positive charge of the proteins. Guanidine denatured acidic and neutral proteins were retained on the column, however the most of the basic proteins were not retainedon the column, except cytochrome−c. In sulfonate type cation−exchange chromatography as comparison, showed no retention of cytochrome−c with 2 M guanidine buffer system.
Keywords : denatured protein, renaturation, hydroxyapatite, chromatography

する担体として広く用いられて き た。
[1] さらに球状セラ

１．Introduction
１９５６年にTiselius, Hjertenらがハイドロキシアパタイトを充ミック型の創出により、再現性のある分離・分析が行われる填剤として適用し、クロマトグラフィーによるタンパク質のようになった。[2] また、ハイドロキシアパタイトは変性タン分離を行って以来、ハイドロキシアパタイトは等電点が酸性パク質の分離にも有効であることが知られている。[3] 一般的から塩基性にいたる幅広い範囲の生体高分子類を分離・精製にハイドロキシアパタイトにはリン酸緩衝液の溶離系が適用

１）ペンタックス株式会社 ニューセラミックス事業部〒１７４―８６３９ 東京都板橋区前野町２―３６―９
TEL : 03–3960−1290 FAX : 03–3960–2681
E−mail : tomo.yoshitake@aoc.pentax.co.jp

２）プロテインテクノスインスティテュート
〒２４３―０２０６ 神奈川県厚木市下川入９９―７―１９―

Chromatography, Vol.27 No.1 (2006)

され、リン酸の濃度に依存してその溶離は酸性から塩基性のリン、ヒストン）、または５ mg/ml（ミオグロビン、α−キモ順序で行われることが知られている。[4，5] 一方、硫酸塩がトリプシノーゲンA、チトクロムC）となるように１ mMリ高濃度に存在していてもその溶離に与える影響は少なく、カン酸ナトリウム緩衝液（pH６．
８）を加え、４℃で溶解させルシウムイオン存在下では酸性タンパク質がよりよく保持さた。その後、−３０℃で保存し、使用時に室温で解凍した。

れることも知られている。すでに尿素を溶離液全体に含有す
２）グアニジン処理試料タンパク質溶液

る溶離系 [6，7，8] やグアニジン濃度グラジエント溶離系に凍結乾燥タンパク質標品を１０mg/ml（オバルブミン、α−ついての報告 [9] はいくつかあるものの、グアニジンを溶離キモトリプシン、血清アルブミン、リゾチーム、γ−グロブ

液全体に含有する溶離系についての報告はない。
本報ではタンパク質が変性を起こすような比較的高濃度のリン、ヒストン）、または５ mg/ml（ミオグロビン、α−キモグアニジンを含有する溶離液でもタンパク質のクロマトグラトリプシノーゲンA、チトクロムC）となるように２ Mグアフィーが可能であることを見出した。ここではこのような比ニジン含有１ mMリン酸緩衝液（pH６．
８）を加え室温で溶解

較的高濃度のイオン性物質の存在状態を保持する条件、すなさせた。同様に４ Mグアニジン含有１ mMリン酸緩衝液（pHわち２Mグアニジンを含有する溶離液でのハイドロキシアパ６．
８）を加え室温で溶解させた。その後、室温で２４時間以上タイトクロマトグラフィーを様々なタンパク質の分離につい保持した後使用した。て検討した結果について報告する。
２―１―２ クロマトグラフィー溶離液の調製法
２．Materials and methods

リン酸緩衝液は、初期溶離液（A）：１ mMリン酸（リン酸

２―１ 試薬二水素ナトリウム二水和物０．
１５６g、リン酸水素二ナトリウ

リン酸二水素ナトリウム二水和物（試薬特級）、リン酸水

ム・１２水０．
３５８g）、後期溶離液（B）：４００mMリン酸（リン酸

素二ナトリウム・１２水（試薬特級）、グアニジン塩酸塩（生二水素ナトリウム二水和物６２．
４０g、リン酸水素二ナトリウ

化学用）は全て和光純薬工業株式会社より購入した。

ム・１２水１４３．
２０g）を秤量し、それぞれをイオン交換水で１Table１に使用したタンパク質標品を示す。

Lにメスアップした。

充填剤は、セラミックハイドロキシアパタイト充填剤（以グアニジン含有リン酸緩衝液は、初期溶離液（C）：２ Mグ

下HAp）
（CHT Type−Ⅱ, 粒子径：４０µm, Bio−Rad Laboratories,アニジン−１ mMリン酸（グアニジン塩酸塩１９１．
０６g＋リンInc.）を使用した。この充填剤は分取を基本目的とするもの

酸二水素ナトリウム二水和物０．
１５６g、グアニジン塩酸塩であるため分析目的には適しているとは言えないが、市販さ

１９１．
０６g＋リン酸水素二ナトリウム・１２水０．
３５８g）、後期溶れている充填剤が分取用のみであるため追試のしやすさを考離液（D）：２ Mグアニジン−４００mMリン酸（グアニジン塩

えてこの充填剤を用いた。なお、比較実験にはSulfonate type酸塩１９１．
０６g＋リン酸二水素ナトリウム二水和物６２．
４０g、グ陽イオン交換樹脂（以下Sulfonate type）（Macro−Prep High

アニジン塩酸塩１９１．
０６g＋リン酸水素二ナトリウム・１２水S Support, 粒子径：５０µm, Bio−Rad Laboratories, Inc.）を使用

１４３．
２０g）を秤量し、それぞれをイオン交換水で１ Lにメスした。

アップした。
２つの水溶液を混合し、pHメーター（カスタニーATC pH

２―１―１ 試料タンパク質溶液の調製法

メーターD−２４：株式会社堀場製作所）を用いてpH６．
８に調１）試料タンパク質溶液製した。調製した緩衝液は０．
２２µmフィルター（Millipore ex-

凍結乾燥タンパク質標品を１０mg/ml（オバルブミン、α−press

membrane : MilliporeCorporation）で 吸 引 濾 過 し、１２１℃、２０分の条件でオートクレーブ（BS−２４５：トミー精キモトリプシン、血清アルブミン、リゾチーム、γ−グロブ

Table 1. A list of proteins subjected to the hydroxyapatite chromatography.
ProteinSourceSupplier(a) Ovalbumin(b) Serum albumin(c) γ−Globlin(d) Myoglobin(e) α−Chymotrypsinogen−A(f) α−Chymotrypsin(g) Trypsin(h) Lysozyme(I) Cytochrome−c(j) Histone

avium
bovinebovineequine heart
bovin pancreas
bovin pancreasswine pancreas
avium
equine heart
calf thymus nuclei

SIGMA Chemicals Co. (USA)
SIGMA Chemicals Co. (USA)ICN Biomedicals, Inc. (USA)
SIGMA Chemicals Co. (USA)
SIGMA Chemicals Co. (USA)
SIGMA Chemicals Co. (USA)Gibco BRL (USA)
SIGMA Chemicals Co. (USA)
SIGMA Chemicals Co. (USA)ICN Biomedicals, Inc. (USA)―２０―Chromatography, Vol.27 No.1 (2006)

Tomohiko Yoshitake, Shintaro Kobayashi, Tetsuro Ogawa and Tsuneo Okuyamaを適用した。

工株式会社）にかけた。その後、室温で保存した。

３．Results and discussion

２―２ カラムと装置

３―１ ２ Mグアニジン含有系におけるタンパク質のクロマ

２―２―１ カラム充填方法
ステンレス管（４．
０I.D.×１００mm、フィルターサイズ：２トグラムµm：株式会社杉山商事）にHApを乾式充填法で充填した。

タンパク質の構造はグアニジン濃度によって変化する可能ステンレス管の片側のみにエンドフィッティングを取り付性があるため、本報では溶離液に定常的に２ Mグアニジン

け、ステンレス管重量を測定した。ステンレス管にロートをを含む系を用いてタンパク質のクロマトグラフィーを検討し接続し、ステンレス管を軽くタッピングしながらHApを充填た。またここでは試料注入後、さらに初期溶離液（A）またはした。その後、ロートを取り外し、カッターの刃をスライド（C）を３分間流すことにより、タンパク質がカラムに保持ささせて充填層表面を平らにした。この状態で重量を測定し、れていることを確かめた。Figure １（a−１〜i−１）は未変性充填されたHAp重量を記録した。充填したHApの量は０．
８０g

タンパク質溶液をHApカラムに注入し、標準系（初期溶離±０．
０１であり、再現性が得られた。最後にもう片方のエンド液：A、後期溶離液：B）で溶離したクロマトグラムである。

フィッティングを取り付けた。また、HApカラムの理論段数

標準系では今回使用した全てのタンパク質がHApカラムに保はオバルブミン（１０mg/ml、５０µl注入）を用いてisocratic elu-

持され、酸性タンパク質、中性タンパク質、塩基性タンパク

tion system（４００mMリン酸緩衝液pH６．
８）で評価し、カラム質の順に溶出する傾向を示した。の充填状態を確認した。

Figure １（a−２〜i−２）は未変性タンパク質溶液をHApカラムに注入し、グアニジン含有系で溶離したクロマトグラム

２―２―２ 高速液体クロマトグラフィーシステムである。この結果から分かるように、オバルブミン（a−２）、高速液体クロマトグラフィーシステムは、Biologic Duoflow

血清アルブミン（b−２）、γ−グロブリン（c−２）、ミオグロ（Bio−Rad Laboratories, Inc.）を使用した。この装置は全て付ビン（d−２）は保持されたが、α−キモトリプシノーゲンA属の制御プログラム（Biologic Duoflow system version５．
０）（e−２）、α−キモトリプシン（f−２）、トリプシン（g−２）、によって管理され、試料は測定ごとに１００µlマイクロシリン

リゾチーム（h−２）は保持されなかった。つまりグアニジンジ（株式会社伊藤製作所）を用い、５０µlをインジェクショ含有系におけるタンパク質の溶出傾向は標準系とは異なり、ンバルブに注入した。検出にはBioLogic QuadTec UV−Vis De-

酸性と中性タンパク質はHApカラムに保持されたが、標準系tector（Bio−Rad Laboratories, Inc.）を使用し、タンパク質はで一番強く保持される塩基性タンパク質が保持されなかっ２８０nm、ヒストンは２１５nmで検出した。また、回収率は解た。これはHApのリン酸塩基と相互作用する塩基性タンパク

析ソフトPeak Fit v４．
１２ for Windows（SeaSolve Software,質が溶離液中のグアニジウムイオンと競合するためと考えらInc.）を使用して求めた。

れる。しかし、例外としてチトクロムC（i−２）は塩基性タンパク質ではあるがHApカラムに保持され、３本のピークと２―３ クロマトグラフィー操作法なった。これはチトクロムCがヘムタンパク質であるため、初期溶離液（A）または（C）で１分間カラムを平衡化した後、通常の塩基性タンパク質とは異なった機構でHApと相互作用インジェクションバルブをLoadに切り替え、試料をあらかしているものと考えられる。また、血清アルブミンはグアニじめ５０µl注入した１．
０mlサンプルループ内に１分間流し、イジンの存在によってHApとの相互作用が高くなっている。こンジェクションバルブをInjectに切り替えた。初期溶離液（A）

れはグアニジウムイオンがリン酸塩基と相互作用することにもしくは（C）で３分間溶離した後、１５分間のリニアグラジエよりカルシウムサイトに相当するグアニジンサイトを形成しント溶離を行い、最後に後期溶離液（B）もしくは（D）で５分たため保持しやすくなったと考えられる。

間溶離した。その後、初期溶離液（A）または（C）に戻し、２０

Figure １（b−３〜i−３）はタンパク質をあらかじめ２ Mグ分間カラムを平衡化した。流速は１．
０ml/minである。温度はアニジンで溶解し、これをグアニジン含有系（初期溶離液：室温で行った。

C、後期溶離液：D）で溶離したクロマトグラムである。オ

本報では基本的にリン酸の濃度変化により溶離する系を用

バルブミンは沈殿が生ずるため、クロマトグラフィーを行っいたが、グアニジンを含まない溶離液で溶離する系を標準系ていない。ほとんどのタンパク質は未変性のタンパク質をグと定義し、グアニジンを含む溶離液、つまり標準系の溶離液アニジン含有系で溶離した場合とほぼ同様の結果となったにグアニジンを添加した溶離液で溶離する系をグアニジン含が、ミオグロビン（d−３）は保持されない部分と保持される有系と定義した。なお、グアニジン含有系においては高濃度部分が存在し、保持された部分は標準系での溶離位置付近にのイオンが存在するため、電気伝導度でリン酸グラジエント広がったピークが得られた。

を確認できない。そのため、Fig．
１、２、３、４におけるグ

Figure １（a−４〜i−４）はタンパク質をあらかじめ４ Mグ

アニジン含有系の電気伝導度（R軸）は標準系の電気伝導度アニジンで溶解し、これをグアニジン含有系（初期溶離液：―２１―Chromatography, Vol.27 No.1 (2006)―２２―Chromatography, Vol.27 No.1 (2006)

Tomohiko Yoshitake, Shintaro Kobayashi, Tetsuro Ogawa and Tsuneo Okuyama

Figure 1. Chromatogram of proteins on HAp column with 2 M guanidine containing buffer system.
Proteins were loaded on the HAp column and eluted by standard system (eluent A : 1 mM Sodium phosphate buffer, eluent B : 400
mM Sodium phosphate buffer pH 6.8, 0% to 100% B in 15 minutes flow rate : 1.0 ml/min)・・(a−1~i−1) and guanidine containingsystem (eluent C : 1 mM Sodium phosphate−2 M guanidine buffer, eluent D : 400 mM Sodium phosphate−2 M guanidine buffer pH
6.8, 0% to 100% D in 15 minutes ; flow rate : 1.0 ml/min)・・(a−2~i−4). The effluent was monitored at 280 nm. (a−1~i−1) Chromatogram of proteins with standard system. (a−2~i−2) Chromatogram of proteins with guanidine containing system. (b−3~i−3) Chromatogram of 2 M guanidine treated protein with guanidine containing system. (a−4~i−4) Chromatogram of 4 M guanidine treated protein with guanidine containing system. (a) ovalbumin, (b) serum albumin, (c) γ−globlin, (d) myoglobin, (e) α−chymotrypsinogen−A,(f) α−chymotrypsin, (g) trypsin, (h) lysozyme and (i) cytochrome−c.

―２３―Chromatography, Vol.27 No.1 (2006)

ニジンを含む系を用いてヒストンのクロマトグラフィーを検Table 2. Recovery of proteins subjected to the hydroxyapatite
chromatography.

Protein(a) Ovalbumin(b) Serum albumin(c) γ−Globlin(d) Myoglobin(e) α−Chymotrypsinogen−A(f) α−Chymotrypsin(g) Trypsin(h) Lysozyme(I) Cytochrome−c討した。ヒストンをHApカラムに注入し、リニアグラジエント溶出法で溶離した。この溶離系では、試料注入後の３分間

Recovery [%]0M2M
4M(Guanidine concentration)
9059100891009610010095−631001001009110099100のイソクラティック溶離は行っていない。Figure ２（j−１）
は標準系（初期溶離液：１０mMリン酸緩衝液pH６．
８、後期溶離液：６００mMリン酸緩衝液pH６．
８、リニアグラジエント：86678310010094100100100１５min）で溶離したクロマトグラムである。なお、リン酸緩衝液に溶解したヒストンは完全に溶解しなかったため、試料には上精を使用した。標準系においてヒストンは素通り部分と保持部分では５本のピークが確認された。
Figure ２（j−２）はヒストンをHApカラムに注入し、グアニジン含有系（初期溶離液：２ Mグアニジン−１０mMリン酸緩衝液pH６．
８、後期溶離液：２ Mグアニジン−６００mMリン酸緩衝液pH６．
８、リニアグラジエント：１５min）で溶離しC、後期溶離液：D）で溶離したクロマトグラムである。ほたクロマトグラムである。同様にFigure ２（j−３）はヒスト

とんどのタンパク質は先ほどの２ Mグアニジンで溶解したンをあらかじめ２ Mグアニジンで溶解した場合のクロマトタンパク質と同様の結果となったが、α−キモトリプシノー

グラム、Figure ２（j−４）はヒストンをあらかじめ２ MグアゲンA（e−４）とα−キモトリプシン（f−４）は保持されニジンで溶解した場合のクロマトグラムである。グアニジンる部分も現れ、標準系での溶出位置付近にピークが観察され含有系においては未変性ヒストン、２ Mグアニジンで溶解た。このようにグアニジン含有系でもタンパク質によってはしたヒストンと４ Mグアニジンで溶解したヒストンのいずHApカラムに保持されるものがあると確認できた。以上の結れも保持部分は存在し、グアニジン含有系でもヒストンが果から、HApカラムではグアニジン含有系でもタンパク質のHApカラムに保持されることがわかった。

電荷の違いによる分離が行われているものと推察されるが、３―３ Sulfonate typeカラムの２ Mグアニジン含有系におけその挙動はタンパク質とHApとの相互作用に対する影響や、タンパク質の高次構造に対する影響などと考えられる。まるクロマトグラム

た、グアニジンで溶解したタンパク質でもグアニジン含有系

一般的なイオン交換カラムの例としてSulfonate typeカラムにおける回収率はほぼ１００％であった（Table ２）。

を取り上げ、グアニジン含有系（初期溶離液：C、後期溶離液：D）においてHApカラムと同様の溶離条件でチトクロム

３―２ ヒストンの２ Mグアニジン含有系におけるクロマトCの分離挙動を比較した。Figure ３はチトクロムCをHApカ
ラムとSulfonate typeカラムに注入し、グアニジン含有系で溶グラムヒストンをハイドロキシアパタイトカラムにかけグアニジ離したクロマトグラムである。また、ここでは試料注入後３ン濃度リニアグラジエント溶離を適用すると、いくつかの画分間（C）液を流すことで、タンパク質がカラムに保持されて分に分離することが報告されている。
[9]いることを確かめた。その結果、グアニジン含有系においてそこで、２ MグアFigure 2. Chromatogram of histone on HAp column with 2 M guanidine containing buffer system.
Histone was loaded on the HAp column and eluted by standard system (eluent E : 10 mM Sodium phosphate buffer, eluent F : 600mM Sodium phosphate buffer pH 6.8 , 0% to 100% F in 15 minutes ; flow rate : 1.0 ml/min)・・(j−1) and (eluent G : 10 mM Sodium
phosphate−2 M guanidine buffer, eluent H : 600 mM Sodium phosphate−2 M guanidine buffer pH 6.8, 0% to 100% H in 15 minutes ; flow rate : 1.0 ml/min)・・(j−2~j−4). The effluent was monitored at 215 nm. (j−1) Chromatogram of histone with standard system. (j−2) Chromatogram of histone with guanidine containing system. (j−3) Chromatogram of 2 M guanidine treated histone withguanidine containing system. (j−4) Chromatogram of 4 M guanidine treated histone with guanidine containing system.

―２４―

Chromatography, Vol.27 No.1 (2006)

Tomohiko Yoshitake, Shintaro Kobayashi, Tetsuro Ogawa and Tsuneo Okuyama

フィーを行った。Figure ４（a）はチトクロムCをHApカラムに注入し、グアニジン含有系（初期溶離液：C、後期溶離液：D）で溶離させ、溶出液を画分したクロマトグラムである。
画分は試料注入後、４．
５ml通液した時点で開始し、溶出液は１．
５mlマイクロチューブに１．
１mlずつ画分した。画分A、B、Cはそれぞれ４．
５〜５．
６ml、６．
７〜７．
８ml、７．
８〜８．
９mlの部分である。Figure ４（b）に示すこれらの画分は、それぞれチトクロムCの赤色を示した。
Figure ４（c）は回収したそれぞれの画分A、B、CをHApカラムに５００µl注入し、グアニジン含有系（初期溶離液：C、後期溶離液：D）で溶離したクロマトグラムである。なお、再クロマトグラフィーの試料として使用した画分A、B、Cはリン酸濃度の調節を行っていない。画分A、B、Cはそれぞれが元の溶出位置ごとに溶出すると思われたが、画分AとBは元の位置に溶出せず、画分A、B、C全てがCの位置に溶出した。
Figure ４（d）はそれぞれの画分A、B、CをHApカラムに３００µl注入し、標準系（初期溶離液：A、後期溶離液：B）で溶離したクロマトグラムである。画分A、B、Cはいずれも同位置に溶出したが、その溶出位置はグアニジン含有系の場合とは異なり、未変性チトクロムCを標準系で溶離した場合と同じ溶出位置であった。
４．Conclusion
ハイドロキシアパタイトカラムは一般の合成樹脂系イオン交換カラムと異なり、比較的高濃度のイオン性物質が存在するグアニジン含有系でもクロマトグラフィーが可能であるこFigure 3. Comparison of chromatogram of cytochrome−c for HApcolumn and Sulfonate type cation−exchange column
with 2 M guanidine containing buffer system.
Cytochrome−c was loaded on two different type of column andeluted by guanidine containing system. (a) HAp column(4.0 I.D.×100 mm, particle size : 40 µm). (b) Sulfonate type column(4.0 I.
D.×100 mm, particle size : 50 µm).とが確認できた。その溶出傾向は標準系とは異なり、酸性タンパク質と中性タンパク質は保持したが、塩基性タンパク質は保持しなかった。しかし、塩基性タンパク質でもチトクロムCだけは保持し、グアニジンで溶解したチトクロムCを標準系のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに適応すると、その溶出位置は未変性チトクロムCの溶出位置と同じであった。

チトクロムCはSulfonate typeカラムに保持されなかった（Figure ３−b）。一方、HApカラムは２ Mグアニジンという比較Reference的高濃度条件下でもチトクロムCを保持し、３つのピークが[1]確認された（Figure ３−a）。以上の結果から、HApカラムはTiselius, A. ; Hjerten, S. ; Levin, Ö. Arc. Biochem. Biophys. 1956, 65, 132−155.

塩基性の強いグアニジン含有系においてSulfonate typeカラム[2]

Kadoya, T. ; Isobe, T. ; Ebihara, M. ; Ogawa, T. ; Oku-

[3]

Lundahl, P. ; Watanabe, Y. ; Takagi, T. J. Chromatogr.

[4]

Gorbunoff, M. J. Anal. Biochem. 1984, 136, 425−432.

では保持できないタンパク質を保持することが確認され、

yama, T. J. Liq. Chromatogr. 1986, 9, 3543−3557.

HApカラムは比較的高濃度のイオン性物質が存在するグアニジン含有系においてもクロマトグラフィーを行うのに有効で1992, 604, 95−102.

あると言える。
３―４ ２ M グ ア ニ ジ ン 含 有 系 に お け る ク ロ マ ト グ ラ[5]Gorbunoff, M. J. Anal. Biochem. 1984, 136, 433−439.

[6]

門屋利彦 ; 黒須泰行 LC Family 1988, 23, 9−13.

[7]

門屋利彦 ; 奥山典生 分析化学 1983, 32, 664−669.

グアニジン含有系においてチトクロムCが３つのピークに[8]

Li, M. ; Su, Z. Chromatographia 2002, 56, 33−38.

分離したためそれぞれのピークを画分し、再クロマトグラ[9]

三井東圧化学株式会社、技術資料７、ヒストンの精製

フィー画分の再クロマトグラフィー―２５―

Chromatography, Vol.27 No.1 (2006)

Figure 4. Rechromatography of denatured cytochrome−c on HAp column.
Cytochrome−c was fractionated by HAp column with guanidine containing system. The each fraction was rechromatographed on HApcolumn with guanidine containing system and standard system. (a) Chromatogram of cytochrome−c with guanidine containing system.
(b) Fraction A, B, C and buffer. (c) Chromatogram of fraction A, B, C (500 µl) with guanidine containing system. (d) Chromatogramof fraction A, B, C (300 µl) with standard system.

―２６―