37−技術資料−●全自動高感度エストラジオール（hsE2）測定
試薬の開発
バイオサイエンス事業部 開発部 試薬開発G
開発部 技術開発G
開発部

小崎
木村
新谷松葉
永田

慎矢
淑子
晃司
隆雄
喜彦

薬化を進め、全自動エンザイムイムノアッセイ装置

1．はじめにAIAシリーズを用いた短時間、高感度な測定試薬の開エストラジオールは、主に女性の卵巣から産生・分発を行ったので報告する。

泌されるステロイドホルモンであり、妊娠時には胎盤で大量に産生され、副腎皮質や男性の精巣からも微量に産生される 1,2）。エストラジオールの産生・分泌は2．測定原理と材料

卵巣機能を反映するため、卵巣機能低下症やエストロ

本試薬の測定原理は、ディレイ1ステップ競合蛍光

ゲン産生腫瘍の診断に重要な役割を果たし、また、不酵素免疫測定法であり、磁性ビーズに固定化された抗妊症治療における卵胞成熟や排卵誘発のモニタリング

エストラジオールウサギモノクローナル抗体が、凍結の一手段として有用とされている

2〜4）。さらに、エス乾燥体として試薬カップに封入されている。この試薬トラジオールは下垂体性の卵胞刺激ホルモン（FSH）

カップに分注水と検体を注入すると、凍結乾燥試薬がや黄体形成ホルモン（LH）の分泌刺激やフィードバ溶解し第一免疫反応が開始する。37℃、14分間の反応

ック機構を介してFSH、LH分泌機構に関与するため、後、反応混合物にアルカリ性ホスファターゼ標識エス

LHやFSHと同時に測定することにより、下垂体−卵巣トラジオール誘導体を加えることにより第二免疫反応5,6）系の機能を評価することが可能となるが開始される。再び37℃、10分間反応させた後、未反。

一方、更年期においては、卵巣機能の低下もしくは応の成分をB／F分離により洗浄除去し、酵素基質であ消失により著しいエストラジオールの低下が生じる。

る4−メチルウンベリフェリルりん酸（4MUP）を分注

7）

8）

エストラジオールの低下は筋骨格系 や心血管系 な後、経時的に蛍光強度を測定し単位時間あたりの4−メどの老化を促し、生活習慣病や骨粗しょう症の発症にチルウンベリフェロン（4MU）の生成量を測定するつながるとされている。また、小児期から成長期にお（図１）。基質の蛍光強度は固定化された酵素量に依存

いては、女性の性腺機能のみならず、男性の性腺機能し、さらにエストラジオール抗原量に反比例する。

や骨の成熟、骨量の維持に関しても、大切な役割を果たしていることが確認されている

2,9）

したがって、あらかじめ既知濃度のエストラジオー。エストラジオ

ルを含む標準品を用いその蛍光強度とエストラジオーールの高感度測定は、エストラジオールが微量である

ル濃度による標準曲線を作成し、エストラジオール濃これらの時期の、性腺機能の把握やホルモン補充療法

度未知の患者検体の蛍光強度に相当するエストラジオなどの治療及び予防の観点から有用であるとい えール濃度を標準曲線より算出することによりエストラ

10）ジオールの定量が可能である。測定の際、検体のカッ高感度・高精度のエストラジオール測定法はガスク

プへの分注、一定時間下での抗原抗体反応、B／F分離、ロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーが知られ基質分注、蛍光強度の測定は全自動エンザイムイムノているが、必要な検体量が多く、抽出操作など前処理アッセイ装置（AIA−2000、AIA−1800、AIA−900及び工程が煩雑である。また、免疫反応を利用した高感度AIA−600Ⅱ）により自動で行われ、測定開始から約32測定法であるRIA法やELISA法では、反応時間が長い分後に結果が得られる。（試薬の主な仕様を表１に、ため、多くの検体を処理できないデメリットがある。

全自動エンザイムイムノアッセイ装置AIA−2000を使る 。

今回、独自に高い親和性と特異性を有するウサギモノクローナル抗体11）を作製し、本抗体を用いてAIA試用したときに得られる検量線の例を図２に示す。）

38

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.55（2011）

抗体固体化磁性ビーズ
酵素標識エストラジオール誘導体
Bound

検体（エストラジオール）
酵素基質（4MUP）

検体分注

酵素反応生成物（4MU）（第一免疫反応）
FreeBound
酵素標識試薬分注

基質分注

B／F分離
（第二免疫反応）図１

表１（洗浄）（蛍光測定）

高感度エストラジオール測定原理

高感度エストラジオール測定試薬の主な仕様

測定項目
測定原理
反応関与成分血中エストラジオール
ディレイ1ステップ競合蛍光酵素免疫測定法
抗エストラジオールウサギモノクローナル抗体
アルカリ性ホスファターゼ標識エストラジオール誘導体
測定装置
全自動エンザイムイムノアッセイ装置（AIA−2000、AIA−1800、AIA−900及びAIA−600Ⅱ）
第一免疫反応温度・時間 37℃・14分
第二免疫反応温度・時間 37℃・10分
酵素反応温度・時間
37℃・5分
測定対象検体血清または血漿（ヘパリン）
測定範囲
7〜1,000 pg／mL
検体量／分注水量75μL／25μL
酵素標識試薬量50μL
標準品形状
液状品
標準品濃度
0、25、50、100、500、1,100 pg／mL（6点）
濃度単位
pg／mL

定試薬の開発をするために、測定原理の最適化と一次抗体である抗エストラジオール抗体の作製及び選定を
B／B0＝測定対象の蛍光量／
E2ゼロ濃度の蛍光量×100行った。
まず、測定原理の最適化に関しては、既存の自社エストラジオール測定試薬であるEテスト「TOSOH」
Ⅱ（E2）で採用している1ステップ競合法から、ディレイ1ステップ競合法への切替えを行った。1ステップ競合法では、検体を試薬に分注した際に検体中のエストラジオールと試薬中の酵素標識されたエストラジオールが一斉に競合反応を起こす。一方、ディレイ法では一次抗体のみが封入された試薬と検体を一定時間反応させた後に、酵素標識されたエストラジオールを追

図２

高感度エストラジオール測定試薬の検量線例加してさらに反応させる。この手法により、検体と一次抗体の反応時間が最適化され、高感度化に多大な効3．AIA試薬の開発
短時間反応で高い感度を有するエストラジオール測果をもたらした。
また、一次抗体に関しては、エストラジオールに対して高い親和性と特異性を有するウサギモノクローナ

東ソー研究・技術報告 第55巻（2011）39

ル抗体を技術開発Gで作製及び選定した。酵素標識抗原に関しては、エストラジオール誘導体から有機合成

50.0

的手法により、酵素（アルカリ性ホスファターゼ）に40.0用量を最適化することで、短時間で十分な感度を得られるようにした。
免疫反応液組成について、検体中に含まれる可能性のある異好性抗体（Heterophilic Antibodies）との非特異的反応を抑えるためにブロッキング剤を添加し、濃度CV［％］結合させた。さらに、固定化抗体と酵素標識抗原の使CV20％：4.2 pg／mL
CV10％：9.1 pg／mL

30.0

20.010.0

また、アルブミンなどの結合蛋白質の影響による反応阻害を緩和するために遊離剤の濃度を最適化した。
標準品はそのベースとして、脱エストラジオール処

0.00.010.0

20.030.040.0

エストラジオール濃度［pg／mL］

理したヒト血清を使用することで、高精度・高感度測図３定法である同位体希釈ガスクロマトグラフ／質量分析

感度：実効検出感度法（ID−GC／MS法）と同等の検体測定値を得られるようにした。

表２

その結果、Eテスト「TOSOH」Ⅱ（E2）と比較して約4倍、他社エストラジオール測定試薬と同等以上の実効検出感度を有したエストラジオール測定試薬として、Eテスト「TOSOH」Ⅱ（hsE2）を開発することができたので、評価結果を以下に報告する。

4．基本性能評価（1）感度

本法
自社既存EIA法
他社CLIA法
他社CLEIA法−1
他社CLEIA法−2

実効検出感度比較
実効検出感度［pg／mL］
CV10％
CV20％
9.1
4.2
36.0
17.3
26.5
12.7
39.1
111.1
137.1
30.5

回の測定分を小分け分注し使用まで凍結保存した。5重同時測定による測定内再現性試験の結果、各試料のエストラジオール濃度0濃度の標準品を5重測定し、測定値の変動係数（coefficient of variation；CV）は得られた蛍光量より最小検出感度を算出した結果、00.4〜1.5％であった。1日2回各2重測定し、試薬、装置濃度試料の平均値−2倍標準偏差（SD）を最小検出限を変えずに20回繰り返して行った測定間再現性試験の界値としたときの濃度は1.9 pg／mLであった。また、結果（検量線作成後95日間）、各試料の測定値のCVはエストラジオール低濃度血清検体をデキストラン・チ3.2〜4.5％であった（表３）。

ャコール処理して調製したエストラジオール濃度0濃度の血清を用いて、15段階に希釈した試料を5日間2重（3）希釈直線性

測 定 し た 。 得 ら れ た 変 動 係 数 （ coefficient of

希釈直線性試験を濃度の異なる3種の血清検体およvariation：CV）が10％または20％の理論値を実効検びヘパリン血漿検体を用い4重測定にて行った。各々

出感度として算出したときの濃度は、それぞれ9.1の検体を専用希釈液で5段階の希釈系列を作製し測定pg／mL（CV＝10％）と4.2 pg／mL（CV＝20％）となした結果、血清検体、ヘパリン血漿検体ともに良好り（図３）、自社既存EIA法であるEテスト「TOSOH」

な希釈直線性性能を有していることが認められた

Ⅱ（E2）と比較して約4倍の実効検出感度を有してい（図４）。

ることが確認された。また、他社エストラジオール測定試薬と比較しても2倍以上の良好な感度を有していることが確認された（表２）。

（4）共存物質および抗凝固剤の影響
検体中に含まれる可能性のある各物質を高濃度でプール血清およびプール血漿（ヘパリン）へ添加し、測（2）再 現 性定値への影響を確認した。共存物質としてはヘモグロ測定内再現性、測定間再現性試験を濃度の異なる3ビン、遊離型ビリルビン、抱合型ビリルビン、脂質、種のプール血清およびプール血漿（ヘパリン）を用いヒト血清アルブミン、アスコルビン酸を、抗凝固剤とて行った。使用した3種（Low、Middle、High）は1

してはクエン酸、ヘパリン、EDTAを各々表４に記載

40TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.55（2011）

表３

測定内および測定間再現性

エストラジオール［pg／mL］
Pooled serum
Pooled heparinized plasma
Low
MiddleHighLow
MiddleHigh
測定内再現性（n＝5）
mean
SD
CV［％］
測定間再現性（n＝5）
mean
SD
CV［％］

68.2
1.0
1.4

246.5
2.5
1.0

795.4
3.5
0.4

68.6
0.7
1.0

238.1
3.5
1.5

763.0
11.6
1.5

66.5
2.9
4.3

247.8
8.7
3.5

795.9
27.1
3.4

66.7
33.0
4.5

24.21
7.8
3.2

764.0
25.7
3.4

1400

（b）ヘパリン血漿検体

血清−A y＝1242.5x−12.4，r＝1.00
血清−B y＝1082.3x−8.8，r＝1.00
血清−C y＝1052.3x−3.8，r＝1.00

1200

エストラジオール濃度［pg／mL］

エストラジオール濃度［pg／mL］（a）血清検体

1000
800
600
40020001400

血清−A y＝1064.3x＋0.4，r＝1.00
血清−B y＝1005.0x＋15.6，r＝1.00
血清−C y＝1056.0x＋5.9，r＝1.00

1200
1000
800
600
400
20000.00.2

0.40.60.8

1.00.00.20.4

希釈率
図４0.60.81.0

希釈率
希釈直線性：（a）血清検体、（b）ヘパリン血漿検体の濃度まで添加し測定した結果、未添加に対して測定ECLIA法（x）、及びID−GC／MS法（x）でそれぞれ測値はいずれも±10％以内であり、これらの物質による定した。測定値の比較を行った結果（図５）、Eテス影響は認められないと判断した。

ト「TOSOH」Ⅱ（E2）に対して相関係数0.996、回帰係数1.14、y切片−38.3、他社ECLIA法に対して相関係（5）健常者の濃度分布数0.995、回帰係数0.83、y切片−3.4と良好な相関性が健常者373例（女性：277例，男性：96例）について、認められた。特に高感度・高精度のエストラジオール

血清中のエストラジオール濃度を測定した結果を表５

測定法であるID−GC／MS法に対しては相関係数0.997、に示す。

回帰係数1.00、y切片−1.5、と最も良好な相関性が認められた。

（6）エストラジオール測定法との相関性
血 清 検 体 を 本 法 で あ る E テ ス ト 「 T O S O H 」Ⅱ（hsE2）（y）とEテスト「TOSOH」Ⅱ（E2）（x）、他社

表４

共存物質および抗凝固剤の影響

プール血清
ヘモグロビン［mg／dL］
450
遊離型ビリルビン ［mg／dL］
17
抱合型ビリルビン ［mg／dL］
9脂質
415［mg／dL］
ヒト血清アルブミン ［g／dL］
1.25
アスコルビン酸
20［mg／dL］
ヘパリン
100［U／mL］

プール血漿4501794150.75
20100

表５検体群
女性
卵胞期
排卵期
黄体期
閉経後
妊娠前期
妊娠中期
妊娠後期
男性

健常者の濃度分布
参考基準範囲［pg／mL］
15.6〜297.1
45.4〜528.4
16.6〜337.6≦40.2
990〜3,928
7,156〜16,114
9,703〜42,845≦42.0

東ソー研究・技術報告 第55巻（2011）

1200

1200
y＝1.14x−38.3
r＝0.996
n＝101

1000

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（hsE2）［pg／mL］

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（hsE2）［pg／mL］

41800

600

400

200

y＝0.83x−3.4
r＝0.995
n＝1011000800600400200000200400600800100012000200

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（E2）［pg／mL］

400600800

10001200

他社ECLIA法［pg／mL］

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（hsE2）［pg／mL］

1200
y＝1.00x−1.5
r＝0.997
n＝33

1000

800

600

40020000200

400600

800

1000

1200

ID−GC／MS［pg／mL］

図５

エストラジオール測定法との相関性（7）血清検体と血漿検体の相関性試験

ラジオールを除去した検体に表７に示す化合物を添加

血漿は血液凝固を伴わないためサンプル調製に要すして本高感度エストラジオール測定試薬で測定した。

る時間の短縮、被検体回収量などの点から血清より優評価した全てのステロイド及び薬剤で交叉反応性がれている。そこで、血漿検体（ヘパリン血漿）へ対応3％以下を示し、特にエストロンやエストリオールな可能であるか検討した。同時に同一人物から採取した血清とヘパリン処理採血から得られた血漿との相関性1200試験を行った結果（血清（x）、ヘパリン血漿（y））、116例での相関係数1.000、回帰係数1.02、y切片0.4と高感度エストラジオール測定試薬は血清、血漿のマトリックスの違いによる測定値の差は認められず、いずれの検体種にも同等な測定値を与える試薬であることが明らかとなった。

ヘパリン血漿［pg／mL］

良好な相関性が認められた（図６）。したがって、本

y＝1.02x＋0.4
r＝1.000
n＝116

1000
800
600
4002005．交叉反応性試験

00

血中に存在する種々のステロイドや不妊治療で用いられる薬剤との交叉反応性を評価するために、エスト

図６200

400600800
血清［pg／mL］

1000

血清検体と血漿検体の相関性

1200

42TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.55（2011）

表６

交叉反応性

交叉反応性［mol％］
Eテスト「TOSOH」Ⅱ Eテスト「TOSOH」Ⅱ［μg／mL］（hsE2）（E2）
0.040.012
17.2
0.30.14.90.08
10.010.00410
添加濃度

交叉反応物質17α−estradiol
EstroneEstriol17β−estradiol−17−glucuronide
17β−estradiol−3−glucuronide
10−17−sulfate
117β−estradiol−3−sulfate
0.01
17α−ethynylestradiol
10
Hydrocortisone
10Progesterone
10
Testosterone
17β−estradiol−3−sulfate
10−17β−D−glucuronide
117β−estradiol 17−propionate
117β−estradiol 17−valerate
10
Estriol 3−sulfate
10d−Aldosterone
10
Androstendion
10
5α−androstane−3α, 17β−diol
10Cortisone
10Danazol
10DHEA10
DHEA−S
1
Equilin
10Ethisterone
1017α−hydroxypregnenolone
1017α−hydroxyprogesterone
0.1
Mestranol
10
Norethindrone acetate
10
Clomiphene citrate salt
10Tamoxifen＊N.D.：検出限界以下（Not detectable）＊＊N.T.：未評価（Not tested）

N.D.

0.003

0.03
3.6
N.D.
N.D.
N.D.

0.31
2.3
N.D.
N.D.
0.001

N.D.

N.T.

0.10
0.044
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
0.008
N.D.
N.D.
N.D.
0.17
N.D.
N.D.
N.D.

N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.
N.T.

どのエストロゲンに対する交叉反応性がEテスト

響を受けにくいこと、血清、血漿（ヘパリン）両検体「TOSOH」Ⅱ（E2）と比較して大きく改善していたを同等に測定可能なことが確認された。交叉反応性試

ことから、エストラジオールに対して高い特異性を有験結果から本試薬はエストラジオールに対する特異性していると判断できた。

が非常に高く、他のステロイドや不妊治療における薬剤に対する交叉反応をほとんど示さなかった。相関性

6．ま と め今回開発したEテスト「TOSOH」Ⅱ（hsE2）について、基本性能を確認した。

試験において、Eテスト「TOSOH」Ⅱ（E2）や他社エストラジオール測定試薬と良好な相関性を示し、特に高感度・高精度のエストラジオール測定法である
ID−GC／MS法に対しては最も良好な相関性を示した。

2SD法による最小検出感度は1.9 pg／mLで、実効検以上のことから、本高感度エストラジオール測定試

出感度は9.1 pg／mL（CV＝10％）及び4.2 pg／mL

薬は、高感度且つ高精度でエストラジオールを測定可（CV＝20％）と、既存の自社エストラジオール測定試能であることが確認された。卵巣機能低下の際に実施薬であるEテスト「TOSOH」Ⅱ（E2）と比較して約4されるホルモン充填療法においては、骨量の維持及び倍、他社エストラジオール測定試薬と比較して約2倍

子宮内膜病変リスクの軽減から血中エストラジオール以上の実効検出感度を有していることが確認された。

濃度を30〜50 pg／mLにコントロールすることが望ま

測定内、測定間再現性は5％以内で、検体の希釈直線しいとされており、高感度エストラジオール試薬の性性も良好であった。検体中の共存物質や抗凝固剤の影能としてそれに応じた実効検出感度が要求される12）。

東ソー研究・技術報告 第55巻（2011）

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（hsE2）は前述の要求される感度を十分有しており、不妊治療のモニタリング等に加え、低濃度を十分な精度で評価する必要がある小児や更年期における性腺機能把握などへの応用が期待される。

7．謝辞

本開発において健常者の濃度分布の確認に対してご協力していただいた先生に厚く御礼申し上げます。
東京ベイレディースクリニック院長：大塩達弥 先生

東京ベイレディースクリニック・検査部
：松永文

陽子 先生

献１）井上聡、他、臨床検査、52、1265−1269（2008）
２）Cunningham FG., et al., Williams Obstetrics 23rd

Edition,（2009）３）Nader S., et al., Fertil. Steril., 45, 75−78（1986）
４）Ben−Rafael Z., et al., Fertil. Steril., 45, 51−57（1986）５）Abraham GE., et al., J. Clin. Endocrinol., 34, 312−318（1972）
６）Goisk J., et al., Recent Progress in Hormone

Research, 42, 297−329（1986）
７）Richette P., et al., Joint Bone Spine, 70, 257−262（2003）
８）Rossouw JE., et al., JAMA, 288, 321−333（2002）
９）Sundeep K., et al., Endocrinol. Metab. Clin. N.

Am., 32, 195−218（2003）
10）Nichols K., et al.,Obstet. Gynaecol. Survey, 39,230−245（1984）
11）松葉隆雄、他、東ソー研究・技術報告、52、3−9（2008）
12）五十嵐正雄、他、産婦人科最新診断治療指針、399 （1996）

43