BIOFLOAT™
Zellkulturoberfläche für die Sphäroidkultur
In vielen Bereichen der biomedizinischen Forschung sind in vitro-Modelle
unerlässlich. Die herkömmlichste Form bildet die zweidimensionale Zellkultur.
Bei der Übertragung der Ergebnisse auf einen gesamten Organismus treten
nicht selten Diskrepanzen auf. Ziel der dreidimensionalen Zellkultur ist es
daher diese Lücke zwischen der in vitro- und in vivo-Situation zu schließen.
Weiterhin kann die Verwendung von dreidimensionalen Zellmodellen dabei
helfen die erschwerte Übertragbarkeit von experimentellen Ergebnissen
zwischen verschiedenen Spezies zu umgehen und damit parallel
Tierversuche zu reduzieren.
Als eine einfache Variante der 3D-Zellkultur bietet Sphäroidkultur die
Möglichkeit eines verlässlichen Modells für die biomedizinische Forschung.
Durch die dreidimensionale Struktur können die Zellen so in vitro
ausgeprägte Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte bilden und es kann somit die
Umgebung im Organismus (in vivo) nachgeahmt werden.
Sphäroidkulturen sind ein weit verbreitetes Kultursystem in der präklinischen
Phase der Arzneimittelforschung, bei toxikologischen Studien sowie in derKrebs- und Stammzellforschung. Hierbei verbessern sie die Effizienz und dieZuverlässigkeit der präklinischen Zellmodelle.
Die SARSTEDT BIOFLOAT™ Zellkulturoberfläche bietet ihnen die
Möglichkeit schnell und reproduzierbar Sphäroide herzustellen. Dabei
wird in der BIOFLOAT™ 96-Well-Zellkulturplatte üblicherweise genau ein
besonders gleichmäßiges, rundes Sphäroid pro Well gebildet. Daher ist
BIOFLOAT™ hervorragend für Hoch-Durchsatz-Analysen geeignet, beidenen es besonders darauf ankommt, genau ein symmetrisches Sphäroid
pro Well zu untersuchen. Um dies zu erleichtern, entspricht die SARSTEDTBIOFLOAT™ 96-Well-Zellkulturplatte standardisierten Abmessungen (ANSI/SLAS Standards) und ist damit geeignet für automatisierte Prozesse.

Im nachfolgenden Protokoll finden Sie empfohlene Arbeitsschritte, die Sie bei der Etablierung von Sphäroidkulturen unterstützen sollen. Die genauen
Parameter, wie Arbeitsvolumen und Zelldichte für die Aussaat, sind abhängig von der verwendeten Zelllinie und geplanten Analysemethode. Deshalb
empfiehlt sich eine sorgfältige Optimierung der Wachstums- und Analysebedingungen vorzunehmen.

Protokoll für die Sphäroidkultivierung
Die Zelldichte bei der Aussaat ist vom Zelltyp, der Dauer der Sphäroidkultivierung sowie der angestrebten Sphäroidgröße zum Analysezeitpunkt
abhängig. Unter Berücksichtigung dieser Faktoren bewegt sich das empfohlene Arbeitsvolumen für die 96-Well-Platte zwischen 100 und 200 µl proWell.
1. Lösen Sie die für die Sphäroidkultur vorgesehenen Zellen mit Ihrer gewohnten Methode (z.B. Trypsin, EDTA) von der Kultivierungsoberfläche ab.
Dabei ist darauf zu achten, dass nach dem Ablösen eine Einzelzellsuspension als Ausgangsmaterial für die Sphäroidkultur vorliegt. Falls nötig,empfiehlt sich hier die Verwendung eines Zellsiebes (Art.-Nr. 83.3945.XXX) um Zellklumpen zu vermeiden.
2. Passen Sie die Zellkonzentration ihrer Einzelzellsuspension an die geplante Zelldichte für die Aussaat an. Der empfohlene Bereich für die 96-WellPlatte liegt zwischen 1.000 und 10.000 Zellen / Well (vgl. Abb. 1).
3. Verteilen Sie die Einzelzellsuspension in den Wells der BIOFLOAT™ 96-Well-Zellkulturplatte (empfohlenes Arbeitsvolumen: 100-200 µl / Well). Ein
Zentrifugationsschritt wird nicht empfohlen. Beachten Sie, dass eine Zentrifugation die Sphäroidbildung mithilfe von BIOFLOAT™ sogar negativ
beeinflussen kann.
4. Inkubieren Sie die Zellen im Inkubator (37°C und 5% CO2 für die meisten Säugetierzellen). Die Sphäroidbildung in der SARSTEDT BIOFLOAT™
Zellkulturplatte erfolgt je nach Zelltyp/-linie in den meisten Fällen innerhalb von 2 bis 24 Stunden. Kontrollieren Sie Ihre Sphäroide täglich
mikroskopisch, um Bildung und Wachstum zu überprüfen.

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5. Je nach Kultivierungsdauer und / oder Zelltyp/-linie muss kontinuierliche Nährstoffversorgung der Sphäroide durch (teilweises) Wechseln desNährmediums gewährleistet werden. Um die Sphäroide nicht zu beschädigen, sollte das Abnehmen und Hinzufügen des Mediums am Rand
des Wells erfolgen. Außerdem empfiehlt es sich, ein geringes Restvolumen des alten Mediums von ca. 10 bis 20 µl im Well zu belassen. Geben
Sie anschließend frisches Nährmedium bis zum gewünschten Arbeitsvolumen hinzu. Durch den Mediumwechsel oder eventuelles Berühren derOberfläche mit der Pipettenspitze wird die anti-adhäsive Eigenschaft der BIOFLOAT™ Oberfläche nicht beeinträchtigt.

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Beispiele für Sphäroidkultur in SARSTEDT BIOFLOAT™ Zellkulturplatten

BIOFLOAT™
750 Zellen / Well

1.500 Zellen / Well

unbeschichtet

3.000 Zellen / Well

6.000 Zellen / Well

6.000 Zellen / Well

Abb. 1: Zellen einer Fibroblastenzelllinie (3T3) wurden in verschiedenen Zellzahlen auf der BIOFLOAT™ Zellkulturplatte ausgesät. AlsKontrolle diente eine unbeschichtete Platte. Die Ergebnisse wurden nach drei Tagen mikroskopisch dokumentiert. Es ist deutlich zu sehen,dass durch BIOFLOAT™ erfolgreich Sphäroide gebildet werden. Außerdem lässt sich die Größe des Sphäroids durch die ausgesäte Zellzahl
pro Well beeinflussen. Auf der unbeschichteten Oberfläche hingegen können die Fibroblasten an der Oberfläche der Platte adhärieren undbilden keine Sphäroide. Maßstabsbalken = 400 µm.

Tag 0Tag 2Tag 4Tag 8BIOFLOAT™

Abb. 2: Pro Well wurden 100 µl einer
Suspension primärer humaner Hepatozyten
mit einer Konzentration von 25.000 Zellen / mlausgesät (entspricht 2.500 Zellen / Well). Nach
Sphäroidformierung wurden je 50 µl Medium
alle 48 - 72 h ausgetauscht. Maßstabsbalken =200 µm.

Tag 550.000 Zellen

100.000 Zellen

BIOFLOAT™

BIOFLOAT™

Tag 3

Tag 7

Tag 9Abb. 3: Immortalisierte humane Astrozyten
wurden in einer Konzentration von 10.000
Zellen / Well ausgesät. Anschließend wurde dieZellviabilität an mehreren Tagen mithilfe einer
Fluoreszenzfärbung sichtbar gemacht. Hierbei
wurden lebende Zellen mit Calcein (grün) undtote Zellen mit Propidiumiodid (rot) angefärbt.
Maßstabsbalken = 200 µm.

Abb. 4: Mit BIOFLOAT™ generierte
Kokultursphäroide aus Osteoblasten (rot) undHUVEC-Zellen (grün). Maßstabsbalken = 250 µm.

BIOFLOAT™
Cell culture surface for spheroid culture
In many areas of biomedical research, in vitro models are indispensable.
The most conventional form is the two-dimensional cell culture. However,discrepancies often occur in the transfer of the results to an entire organism.
The aim of three-dimensional cell culture is therefore to close this gap
between the in vitro and in vivo situation. Moreover, the use of three
dimensional cell models can help to overcome hurdles in the transferabilityof experimental results to different species and thereby reduce animalexperiments.

Spheroid culture, as a simple variant of 3D cell culture, offers a reliable invitro model for biomedical research. Given the three-dimensional structure,
the establishment of pronounced cell-cell and cell-matrix interactions isfacilitated – realistically imitating the in vivo microenvironment.
Spheroid cultures are a widely used culture system in drug development,
toxicological studies as well as cancer and stem cell research, thereby
improving efficiency and reliabilty in these phases of preclinical research.

Our SARSTEDT BIOFLOAT™ cell culture surface offers fast and highly
reproducible generation of perfectly round-shaped spheroids. Formation ofa single, symmetrical spheroid per well of our SARSTEDT BIOFLOAT™ 96well plate qualifies BIOFLOAT™ as an excellent choice for high throughput
analyses. Furthermore, the SARSTEDT BIOFLOAT™ 96-well plate satisfies
the standardized dimensions (ANSI/SLAS standards) and is therefore
suitable for automated processes.

The following protocol describes exemplary working steps to support the establishment of spheroid culture. Exact growth medium volume and cellseeding density depend on cell line/type and the type of downstream analyses. Therefore, careful optimization of growth and analysis conditions isrecommended.

Protocol for spheroid generation and culture
Cell seeding densitiy depends on cell line / type, duration of spheroid cultivation and desired spheroid dimensions at the time of analysis. Taking theseparameters into account, the recommended working volume per well of a 96-well plate ranges from 100 to 200 µl.
1. Detach your cells from the culturing surface using your regular protocol (trypsinization, EDTA etc.). To seed cells for spheroid culture, a single cellsuspension is recommended. If necessary, cell aggregates may be removed by straining the cell suspension through a cell strainer (83.3945.
XXX).
2. Adjust the cell concentration according to the desired seeding density. The recommended density ranges from 1,000 to 10,000 cells per well (seeFig. 1).
3. Distribute the cell suspension into the wells of the BIOFLOAT™ 96-well plate (recommended working volume: 100 - 200 µl). A centrifugation step
is not recommended. Note that centrifugation may even negatively affect spheroid formation using BIOFLOAT™.
4. Incubate the plate in a humidified incubator (37°C and 5% CO2 for most mammalian cells). For most cell types, spheroid formation in theSARSTEDT BIOFLOAT™ plate is accomplished within 2 to 24 hours. Carefully monitor spheroid formation and growth under the microscope on adaily basis.
5. Depending on duration of spheroid cultivation and cell line/type, continuous nutrient supply needs to be ensured by (partial) growth medium
exchange. Removal or addition of growth medium should be performed at the side of the well to prevent spheroid damage. Furthermore, it isrecommended not to remove the complete volume of growth medium, but leave a residual 10 to 20 µl in the well. The anti-adhesive properties ofthe BIOFLOAT™ surface are not damaged by medium exchanges or accidental contact of the surface with the pipet tip.

Examples of spheroid cultures in SARSTEDT BIOFLOAT™ cell culture plates

BIOFLOAT™
750 cells / well

1,500 cells / wellNon-coated3,000 cells / well

6,000 cells / well

6,000 cells / wellFig. 1: 3T3 fibroblasts were seeded onto BIOFLOAT™ cell culture plates at different densities. As a control, a non-coated plate was used.
After three days, successful spheroid formation in the BIOFLOAT™-coated plate could be confirmed by microscopic imaging, whereas
the fibroblasts adhered to the non-coated control plate and failed to form spheroids. Furthermore, it could be demonstrated that keeping
culturing time constant, the spheroid size strongly depends on the initial seeding density. Scale bar = 400 µm.

Day 0Day 2Day 4Day 8

BIOFLOAT™

Fig. 2: Primary hepatocytes (C. lupus familiaris)
were seeded onto BIOFLOAT™ 96-well plates(2,500 cells per well) and microscopicallymonitored for spheroid formation over thecourse of eight days. After spheroid formation,50 µl of growth medium was exchanged every
48 - 72 h. Scale bar = 200 µm.

Day 3

Day 5Day 9

BIOFLOAT™

Fig. 3: Immortalized human astrocytes wereseeded onto BIOFLOAT™ 96-well plates at adensity of 10,000 cells / well. Subsequently,
cell viability was determined over several days
using fluorescenct staining. Viable cells werelabelled with calcein (green) and dead cells withpropidium iodide (red). Scale bar = 200 µm.

50,000 cells
BIOFLOAT™

Day 7

100,000 cells
Fig. 4: BIOFLOAT™-induced co-culture
spheroids containing osteoblasts (red) andHUVEC cells (green). Scale bar = 250 µm.