平成18年度〔2006〕No.51
宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報告

県内未利用資源を活用した脱窒に関する研究
溝添 暁子＊1，里岡 嘉宏＊1，地頭所 眞美子＊2，中田 一則＊1
The Research on the Denitrification which Utilized Prefecture Unused Resources
Akiko MIZOZOE , Yoshihiro SATOOKA, Mamiko JITOUSYO and Kazunori NAKATA
県内未利用資源について，脱窒能の調査を行った。その中で脱窒能の高かった竹粉についてさらに詳細な検討を行った結果，脱窒は竹粉由来の微生物群によるものであることが明らかになった。竹粉および微生物群を利用して土壌中の硝酸態窒素の分解試験を行い，その効果を確認し，実証試験を行った。また，竹粉による硝酸分解の菌叢をPCR-DGGE法により解析した。
キーワード：脱窒，竹，微生物
１

はじめに生杉おがくずおよび竹粉を用意した。

県内には，木炭，竹炭のようにその特性が解析

２−１−２硝酸除去（脱窒）試験

され，すでに利用されているものもあるが，杉，上記未利用資源を用いて，硝酸除去（脱窒）試

竹等そのものの機能性はほとんど研究されていな験を行った。硝酸カリウム溶液（30mg/l）50ml

い。なかでも竹は，全国的に放置竹林が問題になにサンプルを１g浸漬させ，経時的にイオンクロっており，県内にも多数存在する。しかし，竹は，マトグラフ（ダイオネクス社製：DX-500）で硝成長が早いことから注目される資源でもあり，そ酸イオン，亜硝酸イオン濃度を測定した。の有効利用が求められている現状がある。一方，

なお，これより先の試験については，硝酸カリ農業の過剰施肥，家畜排泄物の不適正な処理によウム溶液の濃度を，適宜調製した。

り硝酸体窒素等が土壌，地下水を汚染し問題とな

２−２っている。

２−２−１

微生物による硝酸分解確認
硝酸塩還元試験

この研究は，県内未利用資源について調査を行竹粉による硝酸分解試験を行い，その培養液をい，それを活用して脱窒処理剤等を開発すること１ml取り，新たな硝酸溶液の入った試験管に加により，土壌および地下水の汚染防止ならびに林え，硝酸分解試験を行った。処理後の試験管に産業における竹等の付加価値の向上，消費量の増α-ナフチルアミン溶液とスルファニル酸溶液を加に寄与することを目的とする。

添加し，その反応の確認を行った。
２−２−２

２

実験方法

２−１

滅菌した竹粉と通常の竹粉を用いて，硝酸分解試料の選択

２−１−１滅菌試験

未利用資源試験を行った。
２−３

添加物試験

県内において利用が可能と思われる試料とし硝酸カリウム溶液（100mg/l）100mlに対し，て，シラス，コットンリンター，土壌，活性炭，1%量の炭酸カルシウムを添加し，その有無による硝酸分解試験を行った。サンプルには，伐採時

＊１

資源環境部

期，竹齢，製造方法の異なる孟宗竹21種類を用い＊２

資源環境部（現 産業技術総合研究所関西センター）た。

3

県内未利用資源を活用した脱窒に関する研究

２−４

びん培養試験

以上の吸着は見られなかった。シラス，農試土壌，土壌中における硝酸態窒素分解試験の検討を行

コットンリンターおよび杉おがくずについては，った。250mlのポリ瓶に過剰濃度の硝酸イオン硝酸イオン除去能は見られなかった。しかし，竹（25mg/100g）を含む滅菌土壌を取り，0.5%重に粉については，２日で硝酸イオンが消失した。こあたる竹粉を上乗せし，経時的に土壌中の硝酸イれらの結果より，手に入り易く，また取り扱いのオン濃度をイオンクロマトグラフにて測定した。

便利さなどを考慮し，竹粉を研究の資料として選土壌と竹粉を混合したものについても，同様に試択することにした。

験を行った。
２−５

土壌改良材の試作

竹粉を土壌脱窒剤として応用するために土壌改良材としての試作を行った。バインダーには，ゼオライトを用いた。
２−６

圃場試験

土壌中における硝酸態窒素分解を確認するために圃場試験を行った。対照作物は，人参とし，収穫３週間まえに散布を行った。人参畑を①対照区，②竹粉混合区，③土壌改良材混合区，④土壌改良材上乗せ区（×１倍量区），⑤土壌改良材上乗せ

図１

未利用資源による硝酸分解試験区（×５倍量区）の５区画に区切った。収穫後，収量，人参中の硝酸イオン濃度等の調査を行った。
２−７

竹粉は，伐採後，枝等を切り落とし割ったもの

PCR−DGGE法による菌叢解析をおがくず製造機にかけ，乾燥したものを試料と硝酸分解パターンの異なる２つの竹粉を用いした。また，竹粉は，宮崎県林業技術センターにて，硝酸分解試験を行い，経時的に硝酸イオンおより提供していただいた。

よび亜硝酸イオンをイオンクロマトグラフにて測

３−２定し，その際にサンプリングをし，PCR-DGGE法により，菌叢解析を行った。

竹粉による硝酸分解経日変化

硝酸カリウム溶液濃度を100mg/lに調整し，竹粉による分解試験を行った。その結果，硝酸イオ

すなわち，タカラバイオ社製DNA抽出キット

ンは２日で消失し，硝酸イオンの減少とともに亜にて，DNA抽出を行った。それを鋳型として硝酸イオンが発生するものの，これも試験開始か

Primer 5F，531Rを用いてPCRにより遺伝子断片

ら３日で消失した（図２）。これより，硝酸除去の増幅を行った。

は硝酸吸着ではなく，微生物による脱窒ではない

アクリルアミド濃度は８%，変性剤濃度40〜かと推察された。

70%（変性剤100%は７M尿素，40%ホルムアミドに相当）に調製した。PCR-DGGEには，DCODE SYSTEM（Bio Rad社）を用い，泳動条件
は，電圧120V，泳動槽温度60℃，泳動用緩衝液
1×TAEで２時間半行い，菌叢の経時的変化を調査した。
３

結果および考察

３−１

試料の選択

硝酸除去能の結果を図１に示す。活性炭は，硝酸イオン吸着能を示すものの，頭打ちになりそれ4

図２

竹粉による硝酸分解経日変化

県内未利用資源を活用した脱窒に関する研究

３−３

微生物による硝酸分解確認試験結果

３−３−１

硝酸塩還元試験結果

図５−１から５−４は，伐採時期，竹齢，製造法の異なる孟宗竹21種類の竹粉を用いて，それぞ

硝酸塩還元試験は，硝酸塩が亜硝酸塩に還元されについて石灰添加の有無による硝酸分解試験をれたとき，α-ナフチルアミン溶液とスルファニ行った結果であり，４つの傾向に区別することがル酸溶液を添加することにより，赤変し，その還できた。すなわち，①石灰を添加することにより，元を示す。滅菌した硝酸溶液に竹粉の培養液を濃勝利能が大きく向上するもの，②硝酸と亜硝酸を度を変えて添加することにより，微生物による硝同時に分解するもの（石灰添加は関係なし），③酸塩還元を確認した。その結果，薄黄透明であっ石灰添加の有無にかかわらず，処理能に変化がなた硝酸溶液が所定の試薬の添加により，赤変した。

いもの，④石灰を添加することにより，処理能が（図３）若干向上するもの，であった。この原因としては，竹齢，伐採時期の違いによる竹に含まれる成分の差，さらには，そのことに起因する微生物叢の違いによるものと推測されたが，はっきりとした相関関係は得られなかった。
→

図３
３−３−２

硝酸塩還元試験

滅菌試験の結果

次にオートクレーブ（121℃，15分）にて滅菌した竹粉と通常の竹粉を用いて硝酸分解試験を行った。その結果を図4に示す。通常の竹粉は，硝酸図５−１を分解するが，滅菌した竹粉はまったく硝酸分解が見られなかった。この結果と上記硝酸塩還元試
験の結果より，竹粉による硝酸分解は竹粉由来の微生物によるものであることが明らかになった。

図５−２

図４３−４

滅菌確認試験

条件の異なる竹粉による硝酸分解の傾向

竹粉由来の微生物による硝酸分解の処理速度，培養等の様々な検討を行った結果，石灰を添加することにより処理速度が向上することが明らかになった。

図５−３5県内未利用資源を活用した脱窒に関する研究

人参畑を対照区，竹粉混合区，試料混合区，試料上乗せ区（×１倍区），試料上乗せ区（×５倍区）に区切り，試験を行った。（図８）
その結果を表１に示す。収穫後，収量に差はなく，また，人参中の硝酸イオン濃度等についても大きな差は見
図５−４
図５られなかった。原因と硝酸分解の４つの傾向（孟宗竹21種）

しては，当初，過剰であった土壌中の硝酸イ

３−５

びん培養試験結果

土壌中の硝酸分解試験を行うのに，びん培養試オンが天候−雨などに図８圃場風景より流出してしまったた

験法を用いた。その結果，土壌に竹粉を上乗せしめではないかと考えられたもの，土壌と竹粉を混合したもの，ともに３週た。このことにより，圃場試験の試験法は，再検間程度で土壌中の硝酸を分解した。また，処理能討が必要であると考えられた。に差はほとんど見られなかった。この試験より，

表１

土壌中硝酸分解が可能であることが確認された。

圃場試験結果NO3− タンパク質（ppm） （%）

Sample

N（%）

水分（%）

対照区

31.8

2.00.3389.4

竹粉混合

39.5

2.80.4689.7

試料混合

45.2

3.70.6090.2

試料上乗せ×１33.5

4.00.6088.4

〃

27.9

2.90.4789.6×５３−７PCR-DGGE法による菌叢解析試験に用いた竹Ａおよび竹Ｂの硝酸分解経日変図６

びん培養試験結果化のグラフを図９に示す。また，竹Ａおよび竹ＢのPCR-DGGEによる菌叢パターン写真を図10に３−６圃場試験示す。竹Ａの①，②および竹Ｂの⑦，⑧は，硝酸圃場試験に先立ち，竹粉を簡便に扱うために土分解の途中であり，亜硝酸イオンがまだ発生して壌改良材の試作を行った。種々の検討の結果，竹いない地点である。竹Ｂの⑨は，硝酸イオンと亜粉とバインダーを１対１で混合するのが最も良か硝酸イオンが混在する地点であり，その他の③〜ったので，この割合を採用した。（図７）⑥，⑩〜⑬は亜硝酸イオンが存在し，その分解過程であることが分かる。それぞれの地点は，図10の番号①〜⑬に対応し，その地点の菌叢を示している。図10の①の下部に２本の濃いバンドが見え，②に至るとその上部にさらに２〜３本のバンドが出現する。これは，硝酸分解を行う菌が増えたことを示しており，そのうちの１つは，⑦，⑧においても同レベルに確認できることから，同じ菌で図７6試作した土壌改良材あると推定される。竹Ａの③は，上部バンドと下県内未利用資源を活用した脱窒に関する研究部バンドが入り交じっていることから，硝酸イオン分解から亜硝酸分解へいたる菌叢であることが見てとれる。また，④〜⑥，⑨〜⑬においては，ほぼ上部のみのバンドで構成されることから，このあたりの菌叢が亜硝酸分解を行っている菌叢であると推測される。また，④〜⑥には，やや中部に濃いバンドが見られるが，⑨〜⑬には少々薄いのが確認できるものの，④〜⑥のほどにははっきりとは見られない。このことは，竹Ａの処理速度が高く，竹Ｂの処理速度が劣ることより，このバンドを示す菌に寄るものであると推察され，菌叢が異なることを示すものでもある。この試験により，竹粉由来の微生物は，大部分は，同じである

図10

PCR-DGGE法による菌叢解析

ものの，その濃度，また，一部の菌叢の違いにより，処理速度に差が出ていることが確認された。
４

まとめ１）県内の未利用資源を調査した結果，竹粉においては，硝酸が２日で消失し，それは竹粉由来の微生物によるものであることが確認された。
２）孟宗竹21種による硝酸分解は，種々の試験の結果，４つの傾向に分類できた。また，それは竹の伐採時期，竹齢の違いによる成分の差およびそれに伴う菌叢のちがいによるものと推察されたが，はっきりとした相関関係は得られなかった。
竹Ａの硝酸分解経時的変化

３）竹粉由来の微生物により，土壌中の硝酸分解は可能であった。
４）圃場試験の結果，人参中の硝酸イオンの減少は確認できず，試験法の再検討が必要であると考えられた。
５）PCR-DGGE法による菌叢解析の結果，硝酸イオン分解の菌叢と亜硝酸イオン分解の菌叢が確認できた。また，その処理能においても，菌叢に違いがあることが確認された。

竹Ｂの硝酸分解経時的変化
図９

竹粉Ａ，Ｂの硝酸分解経時的変化

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