東京衛研年報 Ann. Rep. Tokyo Metr. Res. Lab. P.H., 51, 197-202,197

2000

天然保存料ペクチン分解物に関する衛生化学的研究
伊藤弘一*，藤田博**，平田飯田司***，斎藤夫***，広憲

和恵子***，植門雅松洋子***，鈴子****，安田和木公美***，男****

Hygienic Studies on Pectin Digests as Natural Preservatives
KOICHI ITO＊, HIROSHI HUZITA＊＊, KEIKO HIRATA＊＊＊, YOKO UEMATSU＊＊＊, KUMI SUZUKI＊＊＊,KENZI IIDA＊＊＊, KAZUO SAITO＊＊＊, MASAKO HIROKADO＊＊＊＊ and KAZUO YASUDA＊＊＊＊Keywords：ペクチン分解物 pectin digests，変異原性 mutagenicity，エームス試験 ames test，サルモネラ
sarumonera typhyi mrium TA100，オリゴガラクチュロン酸 oligogalacturonic acid，高速液体クロマ
トグラフィー HPLC，天然保存料 natural preservatives
はじめにたペクチン分解物（以下試料Ａとする）及び新たに入手

ペクチンは果実や野菜類など多くの植物中に存在するしたオリゴガラクチュロン酸２種，ペクチン分解物１種

植物性多糖類であり，主成分はD−ガラクチュロン酸が（以下試料Ｂ，Ｃ，Ｄとする）を試料に用いた．なおペ

α−1,4結合した高分子の酸性多糖で，ガラクチュロンクチン分解物及びオリゴガラクチュロン酸を総称してペ酸の他中性糖を含有する複合糖類である．

クチン分解物類とする．

竹中ら

１）

及びNakeebら

２）はペクチンを低分子化したペクチン分解物が抗菌作用を有することを明らかにし，
３）２．変異原性試験
１）試薬

システイン（和光純薬社製），亜硫酸水素ナも発酵中のワインでブドウ由来のペクチン分解トリウム（和光純薬社製），スーパーオキシドディス物がエタノールとの相乗効果により有害な細菌の生育をムターゼ（以下ＳＯＤとする）（和光純薬社製），カタ抑制することを明らかにした．この抗菌性により，ペクラーゼ（シグマ社製）．

チンを酵素により分解したペクチン分解物は既存添加物

菌株

横塚ら

Salmonella typhimurium TA100５,６）を普通ブイ

名簿に保存料として記載されている．また同様にペクチヨン（Nutrient broth No.2，OXOID）で一夜培養し用ンを酵素で分解したオリゴガラクチュロン酸も製造用剤いた．これらの株は，B. N. Ames教授（カリフォルニアとして記載されている．いずれもガラクチュロン酸を主大）より分与を受けたものである．

成分としたオリゴ糖の混合物である．

２）試験方法本研究は天然保存料等の安全評価の一環として行われ

ション法

６,７）

Ames法の変法であるプレインキュベーにより行った．代謝活性化には，アロクたプロジェクト研究「天然添加物の品質に関する研究」

ロール1254（ジーエルサイエンス社製）により薬物代におけるテーマ研究「天然添加物の微生物に対する変異謝酵素を誘導した雄性CD系ラット（Crj：CD日本チ原性について」

４）

で変異原性が認められたペクチン分解物について，その変異原性を究明したので報告する．
試料及び方法
１．試料
上記プロジェクト研究ャールス・リバー社製）の肝臓ホモジネートから調製したS９６,７）を用いた．S9mix６,７）中のS９量は，10 %（50u1/プレート）とした．
ペクチン分解物及びオリゴガラクチュロン酸の水溶液

４）において変異原性が認められ＊ ＊ ＊ ＊ 東京都立衛生研究所理化学部微量分析研究科

又は分画溶液0.1mlを小試験管に入れ，代謝活性化する
169-0073

東京都新宿区百人町３−24−１＊ ＊ ＊ ＊ The Tokyo Metropolitan Research Laboratory of Public Health＊ ＊ ＊ ＊ ３−24−１, Hyakunincho, Shinjuku-ku, Tokyo, 169-0073 Japan＊ ＊ ＊ ＊ 同毒性部病理研究科＊ ＊ ＊ ＊ 同生活科学部食品添加物研究科＊ ＊ ＊ ＊ 同生活科学部食品研究科

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Ann. Rep. Tokyo Metr. Res. Lab. P.H., 51, 2000

場合にはS9mix 0.5ml，代謝活性化しない場合にはリン

カラム：Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6mm ×酸緩衝液（pH7.4）0.5mlを加え，更に一夜培養した菌液250mm），移動相：70%アセトニトリル，流速：を0.1ml加え，37℃で20分間の前培養を行った．これに1.0 ml/min，力ラム温度：40℃，検出器：UV検45℃に保温した軟寒天出器（254 nm）

７）

７）

２mlを加え混合後，最少グルに重層した．37℃で２日間培養後，プ分取HPLC：試料Aを１%の濃度となるように移動相レートに生じた復帰コロニーを自動コロニーカウンターに溶解し，力ラムは shodex Asahipak NH2P-50で計数した．

10E

コース寒天培地

各濃度にプレート２枚を用い，結果は，平均値で示し

い，上記の条件で分取を行った．

８）

結果及び考察た．更にMooreら のプログラムによる回帰分析を行い，検定において有意な場合変異原性は陽性とした．

（10mm × 250mm）の分取用力ラムを用

１）ペクチン分解物の変異原性試料Ａは，図1に示し

３．化学分析試験

た様にTA100，S９無添加において復帰コロニー数が１）試薬標準品としてガラクチュロン酸（シグマ社製）増加し変異原性が見られた．この変異原性は，S９をを使用した他，試薬は全て特級品及びHPLCクロマト添加することにより減少したが，完全に失われるもの用を用いた．

ではなかった．なお試料Ａの変異原性は他の試験菌株

２）ペクチン分解物類の性状分析
水分：カールフィッシャー分析計を用いて測定を行った．
pH：１%溶液（固形物として）についてpH計を用いて測定を行った．

であるTA97，TA98及びTA102においても検出されている４）．
２）変異原性の加熱による影響

試料Ａに変異原性が検出されたことから，この変異原性物質を同定するために，まず変異原性物質の性質についての検討を行った．

ガラクチェロン酸：試料0.1gを２Ｍトリフルオロ酢酸

ペクチン分解物は製造過程で加熱されていることかを用いて100℃，2.5時間加水分解後，分解液を濃ら，加熱による影響を調べた．試料Ａを100℃で加熱縮乾固する．残さに一定量の水を加えて検液とすしたところ変異原性は増加する傾向が見られた．ただる．試験管に検液と２%食塩水を取り，振とう後，し，同時に試験に用いた菌の死滅も見られ，高濃度で氷冷して濃硫酸４mlを攪拌しながら徐々に加え，は復帰コロニー数の減少が見られた（図２）．次に加70℃で10分間加熱する．加熱後，水中で20〜30秒

熱時にpHを変えて再加熱を行ったところ酸性下での間冷却し，発色試薬（0.1%3,5−ジメチルフェノ

変異原性の増強が著しかった（図３）．以上の結果かール氷酢酸溶液）を0.2ml加え，10分放置後，ら試料Ａの変異原性物質は，加熱により生成する可能400nmと450nmの吸光度を測定し，450nmの吸光性が考えられ，アミノ酸，糖などの既知加熱生成変異度から400nmの吸光度の差を求め，あらかじめ同原９,10）又はそれらと類似の化合物であると推察された．

様に操作し，作成した検量線（ガラクチュロン酸として20〜80μg）からガラクチュロン酸の含量を求めた．
総窒素：試料約２gをケルダールフラスコにはかり取り，ケルダール分解ペレット（日本ゼネラル社製）及び水を加えて加熱分解する．得られた分解液についてケルダール窒素分析計を用いて総窒素を測定した．
アンモニア性窒素：試料を0.5mol/L NaOHにて処理した後，ケルダール窒素分析計を用いてアンモニア性窒素を測定した．
３）変異原性物質の分析
HPLC分析：各試料を0.01%の濃度となるように移動相に溶解し，HPLC試料溶液とした．HPLC分析
条件は以下に示した．

図１．ペクチン分解物のAmes試験における変異原性
TA100−S9, ●：−S9, ○：＋S9東京衛研年報51,199

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なお，今回のペクチン分解物とは製法が異なるがペクチンの加熱分解物が変異原性を示すことが報告11）されている．
３）ペクチン分解物液液分画抽出物の変異原性

変異原物質を調べる目的で，チャート１に示すように試料Ａを液液分画処理し12），いずれの画分に変異原性があるかを調べた．画分ａには極性の強い中性物質及び両性物質が抽出される．この画分において変異原性が認められたため，変異原性物質は極性の強い中性物質又は両性物質であることが推察された．
４）ペクチン分解物類の性状と変異原性

試料Ａの性状と変異原性の関係を解明するため，市販品３種（Ｂ，図２．ペクチン分解物の加熱処理時間による変異原性
TA100−S9, ●：0min, ▲：60min, ■：120min．

Ｃ，Ｄ）と試薬のガラクチュロン酸を比較対照として分析し，表１に示した．各試料の名称はメーカーの表
示によって分類した．ペクチン分解物，オリゴガラク
チュロン酸及びガラクチュロン酸はpH ２〜３の酸性を示した．またガラクチュロン酸の含有量は55〜82%であり，日本食品添加物協会が定めたペクチン分解物の含量規格13）50%をいずれも上回っていた．日本食品添加物協会のガラクチュロン酸測定法は力ルバゾー
ル法14）を採用しているが，本法は中性糖の影響を受けやすいため，本調査ではこれらの影響の少ない3,5−ジメチルフエノール法15）を改良して用いた．広門らは試料Ａのカルバゾール法での測定値を109％と報告している 16）が，著者らが3,5−ジメチルフェノール法で測定したところ66％であった．このことにより試料Ａには中性糖が含有されていることが推察された．各試

図３．100℃, 90分加熱処理時のpHによる変異原性の変化
ペクチン分解物 20mg/plate．TA100−S9, ControlはDW．

チャート

料の総窒素量を測定したところ試料Ａが高い含有量を示し，同様の形状である試料Bと比較すると約８倍の１．ペクチン分解物類の分画抽出物の変異原性（a,＋）：ａ画分抽出物の変異原性は陽性を示す

200Ann. Rep. Tokyo Metr. Res. Lab. P.H., 51, 2000

表１．ペクチン分解物の性状及び変異原性A

試料B

ペクチン分解物
化合物形状C

オリゴガラクチュロン酸 オリゴガラクチュロン酸

茶褐色液体

茶褐色液体

ベージュ色粉末DE

ペクチン分解物

ガラクチュロン酸

淡黄白色鱗片

白色粉末

水分(％)

3738

−

−

−

pH

2.83

3.68

2.46

3.49

2.47

ガラクチュロン酸(％)

66.4＊

78.2＊

82.4

55.3

100

総窒素量(％)

0.54030.0682＊0.18230.04280アンモニア性窒素(％)

0.0154＊0.0366＊0.00430.0000

0

還元糖＋

−

−

−−

変異原性＋−−−−＊＊：固形物換算値含有量であった．また各試料を希NaOH溶液により加水分解後ケルダール法により窒素を測定したところ，試料Ａ，Ｂ，Ｃにおいてアミド基由来のアンモニア性窒素を検出した．一方変異原性は試料Ａの他に，試料Cのオリゴガラクチュロン酸においても弱い活性が認められた．
ペクチン分解物類の製造原料のペクチンは植物原料よりの製造過程の違いにより３種類がある．ペクチンはポリガラクチュロン酸が部分的にメチルエステル化したものであるが，エステル化度の大きい高メトキシルペクチンとエステル化度の小さい低メトキシルペクチンがある．また低メトキシルペクチンにはアミド基を分子中に持つアミド化タイプのものがある．
表１により，変異原性を示す試料Ａは加水分解によるアンモニア性窒素を検出することにより，アミド基を分子中に持っていると思われる．このことにより，

図４．ペクチン分解物の変異原性の抑制
ペクチン分解物 20mg/plate, TA100 −S9.
A : スーパーオキシドディスムターゼ200μg, B : カタラーゼ100μgC : システイン5mg, D : 亜硫酸水素ナトリウム5mg

製造原料はアミド化タイプの低メトキシルペクチンで果，ＳＯＤ，システイン，亜硫酸水素ナトリウムで変あることが推察できる．また総窒素量が高い試料Aに異原性の抑制が見られた．これはメイラード反応生成変異原性が認められ，低い試料Bには認められないこ物に類似の反応性であることから，ペクチン分解物のとは，ペクチン分解物製造時にアミド基由来の含窒素

変異原性物質は，メイラード反応生成物である可能性化合物が生成し，変異原性物質が生じたと思われる．

が推察された．

５）メイラード反応生成物の変異原性

試料Ａの変異原

ペクチンにはグルコース及びフルクトースは含まれ性は加熱により増加し，また本試料にアミノ基が含まてはいない17)が，試料Ａからはそれらが検出されたこ

れていること，広門らが本試料より還元糖であるグルとにより，本試料の原料であるペクチンには物性等をことにより，ア調整するためにショ糖が添加されていると思われる18)．

ミノ・カルボニル反応であるメイラード反応により変すなわちペクチン分解物の製造の最終段階で使用した異原性物質が生じた可能性がある．メイラード反応生酵素を失活させるために加熱処理を行う際，ショ糖が成物は加熱生成変異原性物質の一種であるが，この変オリゴガラクチュロン酸酸性下で加熱分解され，還元異原性の発現には活性酸素が関与しているとの報告が糖であるグルコースとフルクトースが生成されたもの

コース及びフルクトースを検出した

16）

10)

ある ．そこで試料Ａについてもそれらとの類似性を検討するために，活性酸素の作用を抑制する酵素及び化合物を添加し変異原性試験を行った(図４）．その結と思われる．
６）ペクチン分解物類のHPLC分析

表１に示した各試料についてHPLC分析を行った．上記の条件で行った

東

京衛

研

年

報

51,

201

2000

ところ，図５に示すように試料Aのペクチン分解物にピーク１にはガラクチュロン酸及び糖類が溶出する

おいて保持時間約13分に他の試料には見られない特が，この画分に溶出する物質の変異原性はコントロ異なピークを検出した．

ールと等しく，変異原性は認められなかった．一方

７）ペクチン分解物の分取HPLC

試料ＡのHPLC分析

ピーク２については変異原性があり，本ピーク画分における保持時間13分のピークについて分取を行い，に溶出する物質が変異原性を示す原因物質の一つで得られた物質について変異原性試験を行った．分取あることがわかった．得られた物質は淡黄白色の粉クロマトグラムと変異原性試験結果を図６に示す．

末で，UVスペクトルは270nmに吸収を示した．
まとめ

天然保存料の安全性評価の一環としてペクチン分解物の変異原性試験を行ったところ陽性を示す製品が認められた．そこでその原因究明のため，ペクチン分解物中の変異原性物質の究明及びペクチン分解物の品質評価のための成分分析法の改良を行った．
１．変異原性陽性試料の変異原性はS9無添加の場合に観察され，加熱によりさらに増加した．またＳＯＤ，システイン，亜硫酸水素ナトリウムを加えることにより変異原性は減少した．
２．本試料について液液分画し，得られた抽出物の変異原性を調べたところ，変異原性物質は極性の強い中性物質又は両性物質であることが推察された．
３．ペクチン分解物について変異原性陽性試料と陰性試料を比較検討をしたところ，陽性試料には還元糖であるグルコースが存在し，試料中のペクチン分解
図５．ペクチン分解物類のHPLCクロマトグラム
分析条件：カラム：Shodex Asahipak NH2P-50 4E(4.6mm× 250mm), 移動相：70％アセトニトリル，流速：1.0ml/min，カラム温度：40℃，検出：UV検出（254nm）

物は分子中にアミノ基を有した．このことにより変異原性物質はペクチン分解物製造時のメイラード反応物質であることが推察された．

図６．分取HPLC画分の変異原性

202

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４．ペクチン分解物の規格項目であるガラクチュロン酸の分析を3,5-ジメチルフェノール法により行ったとこ
ろ中性糖の影響を受けずに定量を行うことができた．
文１）竹中哲夫，武藤品工業学会

一寿，他：日本食誌, 41, 785-792, 1994.

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18）食品化学新聞社編：天然添加物と新食品素材'88，64-65，1988,食品化学新聞社，東京．