MALDI-TOF MSを用いた細菌同定 - MALDIバイオタイパー2023年10月20日 第24回 遺伝子・プロテオミクス技術セミナー 実技編

ブルカージャパン株式会社
Microbiology & Diagnostics

グラム陰性/陽性細菌、酵母様真菌、糸状菌などがもつ特徴的なタンパク質を質量分析することにより同定します。
Bacillus subtilis

Escherichia coli

Candida albicans

Aspergillus fumigatus© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |2

MALDIバイオタイパーの基本原理
MALDI-TOF MS [MALDI-TOF質量分析法]© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |3

MALDIバイオタイパーの基本原理
MALDI-TOF MS [MALDI-TOF質量分析法]
MALDI-TOF MS ；マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法；Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization

マトリックスと試料の混合結晶レーザーによるマトリックスの励起脱離およびイオン化（プロトン化）

全ての質量分析計は試料をイオン化するイオン化部とイオンを分離するレーザー質量分析部からなります。

H+

MALDIはタンパク質のイオン化に適したイオン化法の一つです。

マトリックスによりソフトなイオン化、多価イオンを生成しにくい© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with integrity |9/15/2023|

4

MALDIバイオタイパーの基本原理
MALDI-TOF MS [MALDI-TOF質量分析法]
検出器

4. 検出器に衝突・検出

3. 質量の小さいイオンほど速く飛行参考）E=(1/2)mv2
Eは質量に関わらず一定

2. 電極間に電圧をかけてイオンを加速レーザー

ターゲットプレート© 2021 Bruker

20～30kV

1. レーザー照射＆イオン化-Bruker Confidential-

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |54364.06

ribosomal Protein
RL36
RS32
RL34
RL33meth.
RL32
RL30
RL35
RL29
RL31
RS21

50006254.64

3000

6410.905096.01

測定質量範囲:2,000-20,000 Da

7157.657273.876315.49

4000

7870.62

2000m/z4364,335095,82
5380,396255,396315,196410,60
7157,74
7273,457871,06
8368,761000

8368.995380.64

菌株に含まれる主なタンパク質(リボゾームタンパク質)ピーク
パターンを再現性よく同定します。

Intens. [a.u.]

MALDIバイオタイパーの基本原理
質量スペクトル04000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000m/z© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |6

MALDIバイオタイパーによる同定の原理
MSPコンセプト-パターンマッチングによるスコア計算-

4,000種以上のライブラリに対し、試料菌株のスペクトルをマッチングさせます。

スコア 2.0 – 3.0

独自のアルゴリズムでスコアを評価し、近似性の高い菌株から順に表示します。

© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

スコア

1.70 – 1.99

スコア

0 – 1.69

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |7

MALDIバイオタイパーによる同定
同定結果の解釈
各試料に対しスコアバリューをもとにした上位10候補のランキングリストを確認することができます。
このランキングリストから同定結果の信頼性を評価することができるため、最終的な菌名を判断する重要な情報となります。

高い信頼性
低い信頼性
同定不能

© 2021 Bruker-Bruker Confidential-Innovation with Integrity | 15 September 2023 |8

MALDIバイオタイパーによる同定
難同定の菌株への対応

レポートの中に表示されるマッチングヒントの例
これらの分類が難しい菌株やスペクトルのパターンが非常に近いもの等においては、同定結果のレポート中に”マッチングヒント” としてコメントが加えられます。最終的な同定の判断材料となるコメントが含まれますので、常に確認することをお勧めします。
© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |9

MALDIバイオタイパーによる分析
リファレンスライブラリ
Bruker MBT Compass Library:
2023年✓ 11,897 MSPs
✓ 4,274 菌種
糸状菌 Ver5.0✓ 779 MSPs
✓ 222 菌種グループ
抗酸菌 Ver7.0✓ 1,069 MSPs
✓ 182 菌種
その他、ユーザーライブラリの作成や、Web上でのCDC MicrobeNet ライブラリも使用可能© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |10

MALDIバイオタイパーによる分析
分析試料装填と分析
1. 未知試料を釣菌

12543

2. ターゲットプレートに試料と試薬を塗布
3. MALDIバイオタイパーにて分析
4. パターンマッチングによりライブラリーと照合し菌種の判明

5000
4000
3000
2000
1000
04000
4500
5000
5500
6000
6500
7000
7500
8000m/z5. 同定結果を最終判断

96試料を約40分以内で分析可能© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |11

MALDIバイオタイパー
専用アクセサリー・消耗品●マトリックス試薬
Matrix HCCA potioned
包装：250μL x 10本
品番：8255344
備考：溶媒の準備が必要●キャリブレーションスタンダード:
Bacterial Test Standard (BST)
包装：50μL x 5本
品番：8255343
備考：試薬のため培養不要●ディスポーザブルターゲット:
Disposable MBT Biotarget 96
包装：20枚
品番：1840375
備考：シングルユース96スポット© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with integrity |9/15/2023|

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MALDIバイオタイパー
ターゲットプレート
ターゲットプレートは数種類から選択が可能
Biotarget 96 (シングルユース)
1枚ごとに異なるバーコードでトレーサビリティを支援します。
全てのスポットを利用する事が出来、スポットを無駄にすることがありません。
アンカーチップ™ により効果的な液体濃縮により、サンプル前処理を簡便にします。

polished steel 48/ polished steel 96 (リユース)
表面を研磨しているPolished steelターゲットです。
バリデーションされたターゲット洗浄手順: 80% トリフルオロ酢酸を使用します。
48wellターゲットのみ：キャリブレーションスタンダードを載せるスポット(+マーク)があります。

© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with integrity |9/15/2023|13

MALDIバイオタイパーによる分析
容易かつ迅速な標準的分析試料の調製法

次の3方法はMALDIバイオタイパーでの分析において標準的な試料調製法です。
寒天培地上に単離されたコロニーや集菌された菌株の分析に用います。

●セルスメア法
ターゲットプレートに試料を直接塗布
対象；グラム陰性菌と、ほとんどのグラム陽性菌●ギ酸オンプレート法(スメア・ギ酸法)
ターゲットプレートに試料を直接塗布後、70%ギ酸を上乗せ添加
対象；酵母様真菌など細胞壁が強固な菌株●エタノール/ギ酸抽出法
菌体からタンパク質を抽出して分析
対象；セルスメア法、ギ酸オンプレート法で同定が困難な菌株© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |14

MALDIバイオタイパーの分析試料調製方法①セルスメア法◎作業工程
寒天培地上のコロニーから釣菌↓ターゲットプレートに塗布↓
マトリックスを1uL添加し、乾燥↓
MALDIバイオタイパー に装填☞塗布時のPoint
・菌量は少量でOK・培地をひっかかない：コロニーが薄く広がっているときは白金耳で菌を集めてからつまようじでピックアップ
・菌を塗布後、マトリックスは30分以内を目安に添加・液体の試薬・検体は必ず自然乾燥で乾かす© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with integrity |9/15/2023|

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MALDIバイオタイパーの分析試料調製方法➁ギ酸オンプレート法(スメア・ギ酸法)◎作業工程
寒天培地上のコロニーから釣菌↓
ターゲットプレートに塗布↓
70%ギ酸を1μL添加し、乾燥↓
マトリックスを1μL添加し、乾燥↓
MALDIバイオタイパー に装填☞ギ酸オンプレート法が有効な菌種
酵母様真菌、嫌気性菌、ムコイド型コロニーを形成する菌、カサカサコロニーの菌など© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with integrity |9/15/2023|

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MALDIバイオタイパーの分析試料調製方法➂エタノール/ギ酸抽出法◎作業工程
寒天培地上のコロニーから釣菌↓
dH2O 300μLに懸濁↓13,000 r.p.m.で2分間遠心分離↓
上清を廃棄、70%ギ酸とアセトニトリルを添加↓
13,000 r.p.m.で2分間遠心分離↓
上清1μLをターゲットプレートに添加し、乾燥、マトリックスを1μL添加し、再度乾燥↓
MALDIバイオタイパーに装填

300uL dH2O

900uL

+ 試料

エタノール

ペレット

懸濁し抽出 上清を分析☞本法は、セルスメア法、ギ酸オンプレートで分析が難しい場合に適応します。
細胞内のタンパク質を抽出し、直接、分析する方法となります。
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Innovation with integrity |9/15/2023|

17

血液培養ボトルからの直接同定
MALDI Sepsityper kit

本法は、血培陽性ボトルから検出された菌を迅速に同定するソリューションです。
MALDI Sepsityper kitは、血培陽性ボトル中の菌を簡便に集菌することができる前処理キットです。
集菌した菌は、セルスメア法、ギ酸オンプレート法、エタノール/ギ酸抽出法により試料調製することが可能です。
7－17分間で分析試料の調製が可能
血液培養陽性後 30分以内に同定可能© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |18

血液培養ボトルからの直接同定
MALDI Sepsityper kit◎作業工程
陽性ボトルから培養液1mLをチューブに分取↓
Lysis Bufferを200uL添加し、10秒間攪拌
↓
13,000 r.p.m.で2分間遠心分離後、上清を除去↓
Washing Bufferを1mL添加し、よく攪拌↓
13,000 r.p.m.で1-2分間遠心分離後、上清を除去↓
沈査を回収

沈査をセルスメア法、ギ酸オンプレート法、エタ
ノール/ギ酸抽出法などで分析試料の調製を行いMALDIバイオタイパーに装填する。
© 2021 Bruker-Bruker Confidential-#8270170 MALDI Sepsityper kit 50tests
Lysis buffer, Washing buffer, Tube
試薬調製不要Innovation with Integrity | 15 September 2023 |19

MALDIバイオタイパーとSepsityper kitを導入した検査工程

従来法

MALDIバ
イオタイ
パー法

1日目

2日目

3日目

4日目

検体到着
血液培養開始血液培養陽性グラム染色
性状確認試験

同定試験開始同定最終報告検体到着
血液培養開始血液培養陽性
同定最終報告時間・コスト削減
抗菌薬の適正選択介入※血液培養が24時間で陽性となった場合です。
※従来法よりサブカルチャー工程は除いています。

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Innovation with Integrity | 15 September 2023 |20

MALDIバイオタイパーの分析試料調製方法
抗酸菌の同定Vortex +30 分ボイル:
熱処理で菌の不活性化

1200 µL
培養液

上清除去、乾燥MGITTM medium+ 900 µL
Ethanol

300 µL H2O に菌体を懸濁+ ジルコニアシリカビーズ+ アセトニトリル-> vortex

Löwenstein–Jensen medium

・マイコバクテリアを熱処理により不活性化 →安全性を考慮・シリカビーズ(直径0.5 mm)を使用することで菌体の破砕をサポート
・個体培地、液体培地ともに共通のワークフロー© 2021 Bruker+ 70% ギ酸-> Vortex +Target preparation(using supernatant)-Bruker Confidential-Innovation with Integrity | 15 September 2023 |21

MALDIバイオタイパーの分析試料調製方法
糸状菌の同定菌糸、分生子、胞子など生育状態の違い

Intens. [a .u.]

糸状菌同定の難点
x10 4

As perg illus nig er 03 0:E6 MS R a w

0.80.60.4

As perg illus nig er 09 0:E12 MS R a w

8000
6000
4000
2000

Intens. [a .u.]

ルに変化が生じ、再現性が低かった。

0.2

Intens. [a .u.]

によって発現タンパクが異なりスペクトAs perg illus nig er 11 0:G2 MS R a w

8000
6000
4000

Intens. [a .u.]

2000

x10 4

As perg illus nig er 12 0:G3 MS R a w

1.00
0.75
0.50

Intens. [a .u.]

0.25
As perg illus nig er 14 0:G5 MS R a w

8000
6000
4000

Intens. [a .u.]

2000

As perg illus nig er 15 0:G6 MS R a w
6000
4000
2000

4000

© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000
m /z

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |22

MALDIバイオタイパーの分析試料調製方法
糸状菌の同定均一な菌体を得るためにローテーターを用いて液体回転培養をします。

液体培養を行った糸状菌の菌体

この培養方法により再現性の高いライブラリー登録試料の作製が可能となりました。
糸状菌同定の培養試料としても利用できます。

※ローテーターなどは適した培養温度を維持するためにふ卵器内に設置します。

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Innovation with Integrity | 15 September 2023 |23

MALDIバイオタイパーによる分析
薬剤耐性の分析

MALDIバイオタイパーで細菌の薬剤耐性を検出するソリューションには、2つの方法があります。
薬剤耐性関連ピークによる耐性菌の検出
・耐性菌に特異的なタンパク質のピークを検出します。
・機能拡張ソフトウエアによって自動的に行われます。
薬剤の分解による耐性菌の検出

6000
4000

・分解される薬剤を検出します。

2000

・試薬キットを使用し薬剤耐性を検出します。

04x103202330340350360370380390400410420m/z

10© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |24

MALDIバイオタイパーによる耐性菌の分析
薬剤耐性関連ピークによる耐性菌の検出

本法は、機能拡張ソフトウエアをMALDIバイオタイパーシステムにインストールすることにより、耐性菌の因子のピークを自動的に探索し、耐性菌の可能性の有無を報告します。
拡張機能、MBTサブタイピングモジュールは、対象菌種がスコア緑で同定された場合、目的のピーク(もしくはピークパターン)を自動で 探索し、検出された場合のみレポートへ表示します。

本機能を使用するにあたり、特別な前処理や試料調製は必要ありません。

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Innovation with Integrity | 15 September 2023 |25

MALDIバイオタイパーによる耐性菌の分析
MBTサブタイピングモジュールによる耐性菌の検出

MBTサブタイピングモジュールにより拡張される機能
Result of first calculation (ID)Result of second calculation (MBT Subtyping)

Staphylococcus aureus

PSM-mec由来タンパク質ピークの検出によりMRSAの推定

Bacteroides fragilis

cfiA由来タンパク質ピークの検出によりMBL産生B. fragilisの推定

腸内細菌目細菌

blaKPC 由来タンパク質ピークの検出によりKPCの推定

Listeria species

Listeria monocytogenesとその近縁種の鑑別

Mycobacterium chimaera/intracellulare complex

M. chimaera/M. intracellulareの鑑別Elizabethkingia species

Elizabethkingia anopheles/ E. meningoseptica/ E. miricolaの鑑別拡張機能MBTサブタイピングモジュールは、腸内細菌目細菌のblaKPCやStaphylococcus aureusのPSM-mec 、Bacteroides fragilisのcfiAの存在を同定の結果を受けて自動的に迅速検出し、報告するため”早期警戒システム”として機能します。

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Innovation with Integrity | 15 September 2023 |26

MALDIバイオタイパーによる耐性菌の分析-研究者からの報告Journal of Medical Microbiology

腸内細菌目細菌の検討においてBlaKPC遺伝子を有するカルバペネム耐性株をMBTサブタイピングモジュールで検出することができます。分析したスペクトルの中から特異的なピークの有無を検出しました。

Anna F. Lau, et al. A Rapid Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization–Time of Flight Mass Spectrometry-Based Method forSingle-Plasmid Tracking in an Outbreak of Carbapenem-ResistantEnterobacteriaceae
J Clin Microbiol. 2014 Aug; 52(8): 2804–2812.

© 2021 Bruker

Klebsiella pneumoniae:• BLUE: KPC with blaKPC related peak
• RED: ESBL-Bruker Confidential-

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |27

MALDIバイオタイパーによる耐性菌の分析
薬剤の分解による耐性菌の検出

Selective Testing of Antibiotic Resistance – Beta Lactamaseβ–lactam 系抗菌剤耐性菌の選択試験+ H2O- 44 Da+18 Da抗生物質-活性物質-代謝物 A-非活性物質-代謝物 B-非活性物質-β–lactam 系抗菌剤のβ–lactamase 酵素による加水分解
これらの質量シフトは、MALDI-TOF MSで検出が可能です。

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Innovation with Integrity | 15 September 2023 |28

MALDIバイオタイパーによる耐性菌の分析
薬剤の分解による耐性菌の検出 MBT STAR-BL

MBT STAR-Carba 薬剤パウチ 20～58(最大)試料

MBT STAR-Cepha 薬剤プレート 96 ウェルプレート

抗菌薬と溶解緩衝液がセットになっているため秤量が不要です。
低分子領域測定用キャリブレーションスタンダードが含まれます。
© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

MALDI Biotyper® & IR Biotyper® | 15 September 2023 |29

MALDIバイオタイパーによる耐性菌の分析
薬剤の分解による耐性菌の検出 MBT STAR-BL
MBT STAR-Carba/ Cepha kitの作業手順
必要に応じて通常の同定 (MBT)

血培陽性検体Sepsityperの沈査または培地上のコロニー

培養

1μL白金耳分の菌体

抗菌薬液に懸濁Enterobacteriaceae andPseudomonas spp.,
33-37°Cで30分
Acinetobacter spp
33-37°Cで60分

MALDIバイオタイパーで分析

MBT STAR-BLモジュール
データ解析© 2021 Bruker

遠心分離-Bruker Confidential-

上清ターゲットプレートに塗布
MALDI Biotyper® & IR Biotyper® | 15 September 2023 |30

MALDIバイオタイパーによる耐性菌の分析
コンビネーションワークフローの所要時間
Day1

従来法

Day2

Day3
24時間培養18時間培養血培陽性

コンビネーション
ワークフロー

グラム染色

コロニー形成AST

菌種同定
MALDI Sepsityper kit

同定と抗菌薬の選択介入が同日に可能！

15-90分間酵素活性の有無MBT STAR Carba/ Cepha© 2021 Bruker

報告

報告-Bruker Confidential-Innovation with Integrity | 15 September 2023 |31

MALDI バイオタイパー sirius
および MALDI バイオタイパー sirius one
MALDI バイオタイパー sirius

MALDI バイオタイパー sirius one

高静粛性コンパクト軽い本体© 2021 Bruker-Bruker Confidential-

Innovation with Integrity | 15 September 2023 |32

Innovation with Integrity