TALK ABOUT 21
独立行政法人産業技術総合研究所 環境管理技術研究部門 グループ長
鳥村 政基

環境微生物の新たな解析技術の開発を目指して

１ はじめに
環境分析技

環境微生物解析の技術開発はこれからとも言える。

術の分野にお環境微生物の解析とは，わかりやい て は， 種 々すく表現するならば「どんな微生物の高精度分析が何匹いるか？」を知ることである。

技術が開発さ生活環境（食品を含む）や医療の現れ， 環 境 中 に場では，有害無害有用を問わず微生放出された化学物質を精度良く測る物の検査手法の必要性が高い。検査こ と が 可 能 に な っ て き た。 一 方 で，と言っても，微生物の場合，複数の環境の主役として存在する微生物の他の微生物と複合系を構築して存在分析に目を向けてみると，残念ながしている場合が多い。また，医療のらその技術はまだまだ未熟であると現場における有害菌の場合にはその言わざるを得ない。「近年の分子生物

微 生 物 は（ 遺 伝 子 が 残 っ て い て も ）学的手法の発展でその問題は解決さ死んでいれば問題ないが，食品生産れているのでは？」と思う方々も多における主役を担う微生物では生きいかも知れない。名前がついた既知ていてもらわなければならない。すの微生物についての分析では，こうなわち，その診断には「どんな微生した分子生物学的手法も威力を発揮物が何匹いて，それは死んでいるのする。このことは抗原抗体反応を利か生きているのか？」までを提示で用した種々の分析方法にも当てはまきる能力が要求される。

る。しかし，近年認知されている「環これまでも，また現在も微生物計境中に実際存在する微生物種のほと測技術として培養法が利用されていんど（99%以上）が培養困難な微生る。これは，培養できる菌がそもそ物」から考えるに，本当の意味でのも 1%以下しか存在しないことからキャピラリー検出部

サンプル導入口著者略歴
1999年 京都大学大学院農学研究科博士課程修了(博士(農学))1999年 工業技術院生命工学工業技術研究所
NEDO産業技術研究員
2001年 独立行政法人産業技術総合研究所
環境管理研究部門 研究員
2006年 独立行政法人産業技術総合研究所
環境管理技術研究部門 主任研究員
2010年 独立行政法人産業技術総合研究所
環境管理技術研究部門 グループ長
主な学会活動日本分析化学会 電気泳動分析研究懇親会（委員）
日本ポーラログラフ学会（評議員）

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SCAS NEWS 2011-Ⅰ

細胞

細胞膜

A

細胞

B

DNA
リボソーム
細胞壁

鞭毛

図１ キャピラリー電気泳動を用いた微生物分離の概念図

電気浸透流

環境微生物の新たな解析技術の開発を目指して

0510

Time / min

図２ 10種類のモデル微生物サンプルの分離エレクトロフェログラム

考えれば，残り 99%以上の微生物

図３ マイクロチップ電気泳動による乳酸菌と酵母の分離の様子

２ 微生物細胞の分離技術のエレクトロフェログラムからわかは 本 法 で の 計 測 対 象 に な り 得 な い。

微生物の表層には各種糖タンパクるように，ピーク形状がシャープな

また，分子生物学的手法として微生質ポリマーが存在しており，生理的ものもあれば，非常にブロードでポ物の持つ特定遺伝子配列を測定する

環境下においてはマイナスの電荷をリマー添加前と比べて変化のないも方法では，前出の培養法とセットで帯びている。キャピラリー電気泳動の も あ る。 こ の 条 件 で は，10 種 類行われるケースも多いが，その場合（CE：Capillary Electrophoresis）の微生物のうち 6 種類くらいは分離には測定結果に２つの大きなバイアが持つイオン化学種に対する高効率できているが，残りの 4 種類程度はスがかかる。一つは培養であり，ひ分離技術をそのまま微生物細胞のよピークが完全に重なっているものととつは遺伝子増幅反応である。前者

うな生きた荷電粒子に適用してみて考えられる。

は生死判別の根拠にはなるが，生死はどうだろう（図１）。最初の我々の小さなガラス板などに溝をつくっの割合の議論ができない。後者は増試みは分離効率という意味ではあまてこれを電気泳動の分離場として幅反応の設計図の書き方にも依存すり芳しくなく，実験モデルの大腸菌用いるマイクロチップ電気泳動のるが，共存物質の影響も生じるバイと他のモデル微生物を分離するには技 術 も， 多 く の ア プ リ ケ ー シ ョ ン

アスの大きさを左右する。また，微至らなかったが，キャピラリー内部が 蓄 積 さ れ て き て い る。 我 々 も マ

生物の細胞表層を抗原として，抗原で電場の中を泳動する微生物細胞のイクロチップでの微生物の迅速分抗体反応に基礎を置く測定方法が各生命活動を同時に観察することに成離を試みた ３）。マイクロチップでは種開発されている。

功した １）。

注入エリアに導入された微生物のこれらの技術はすでにいろいろな

その後，微生物細胞の分離効率を混合物が分離されるプロセスを顕場面で活躍しているが，未知微生物向上させるために種々検討したとこ

微 鏡 下 で 観 察 す る こ と が で き る が，の解析にまで踏み込んだ手法とはな

ろ，泳動液に微量の陰イオンポリマー

こ こ で は わ ず か １ 秒 間 で， 乳 酸 菌り得ない。我々はこれまで，こうしを添加することにより飛躍的に分離（Streptococcus thermophilus

た手法とは異なる原理に基づく解析効率を高めることができることを見

510，Lactobacillus delbrueckii２）法の構築を目指してきた。微生物を出した 。ただし，これらのポリマー

subsp. bulgaricus B-5b）と酵母分離する技術，そして同定する技術，の添加効果も万能とは言えず，効果細胞（清酒酵母 K-9）が完全分離ささらにそれらを組み合わせた方法にが認められる微生物とそうでない微れることが確認できた（図３）。このついて検討してきたことの一部をこ生物がある。図２に実験室で準備しように，分離条件を最適化することこで紹介したい。

た 10 種類のモデル微生物を混合しで目的微生物の迅速分離を達成できたサンプルを分離した例を示す。こる。一方，おそらく表面構造が似てSCAS NEWS 2011-Ⅰ4TALK ABOUT 21いる乳酸菌同士の分離はなかなか困に保有するリボソームタンパク質が高い精度で微生物を同定することが難であり，これらを分離するために着目されている。これらのタンパクできる。

は細胞表層の電荷だけでなく他の特質は細胞を破砕すれば細胞外に取り

MALDI-TOFMS で 得 ら れ る ス ペ徴を利用した分離技術の導入が必要

出 す こ と が で き る 4 〜 20kDa のクトルのピークパターンは，既知微となる。

塩基性タンパク質である。株間でも生物から予め取得して蓄積したスペ保存性の高いタンパク質と変異があクトルライブラリーのスペクトル群

る タ ン パ ク 質 の 混 合 物 と し て， サと比較して，類似度の高いパターン

このように何らかの形で分離できブユニットを形成しタンパク質工を探すことにより同定する方法がた微生物細胞が，どんな微生物なの場として機能している。これらのタ

主 流 で あ る。 現 在 市 販 さ れ て い るかをできる限り簡便に知ることはでンパク質をマトリックス支援レー

MALDI-TOFMS を 用 い た 微 生 物 同きないだろうか。顕微鏡での形態学

ザー脱離／イオン化飛行時間型質量定システムもこの方法が採用されて的観察からは，その微生物を完全特分 析 法（MALDI-TOFMS：Matrixいる。既知微生物の解析においては，定することはまず不可能である。そAssisted Laser Desorption

迅速かつ簡便な技術である（図４）。の 微 生 物 を 特 徴 づ け る も の と し て，Ionization-Time Of Flight-Mass

我々はこの技術の簡便性を継承しあらゆる微生物がその細胞内に大量Spectrometry）で分析することで，つつ，より高い同定精度と未知微生

３ 微生物細胞の同定技術

マトリックス溶液
イオン化助剤コロニー

微生物の培養菌体破砕

混合試料プレート

1ml 滴下乾燥X 105

L293.005000

10000

L18m/z15000

図４ 培養微生物のMALDI-TOFMS同定の測定手順と大腸菌のスペクトル

5SCAS NEWS 2011-Ⅰ- S7- L6- S5L10- L13

MALDI-MS 測定

S13L19- L14- S11S8- L17- S9- L15- S14- S10- L22- L31- S21
L27- L28
S16- S20- S22- L34

1.0

L32- L35

L33- L30- L36

Intensity

2.0- L25- L23- S19X420000

環境微生物の新たな解析技術の開発を目指して物への適用性を獲得するために，上述のリボキャピラリーソームタンパク質の解検出部

析手法にゲノム情報から得られる翻訳タンパク質情報を有効利用す細胞る方法を導入した。こマトリックス溶液

れにより，破砕した微生物細胞から得られるピークのほとんどがリボソームタンパク質でサンプル導入口あることを証明した ４）。
こ の こ と は， 図 ４ の大腸菌の質量ピーク

質量分析用プレートに マ ー ク し た L36 や
S22 な ど の リ ボ ソ ー

図５ 迅速微生物解析用に構築したキャピラリー電気泳動とMALDI-TOFMS

ムタンパク質の割り当てからも確認できるが，観察されるわせる方法論としてはさほど難しくは現時点ではまだ夢の話かも知れなほとんどのピークを特定できる。こはない。図５に示すように，キャピい。こうした環境微生物の次世代解れらのスペクトルパターンから微生

ラ リ ー の 出 口 を ア ー ス し た MALDI

析技術は，医療や衛生，産業技術な物の分類も可能であり，この方法での基板に置き換え，さらに泳動してどの幅広い分野における夢のプラッ

分類した系統樹はこれまで汎用されくる細胞はマトリックス試薬と混和トフォーム技術でもある。まだまだている特定領域の DNA 配列や特定されるように準備する。マトリック

克 服 す べ き 課 題 は 山 積 み で あ る が，酵素活性の有無などから得られる結ス試薬の溶媒に泳動してきた細胞が少しでも少ない細胞数で，少しでも接すると，細胞が崩壊して内部のリ短い時間で解析できる技術へ発展さ

こうしたポテンシャルは，未知の微ボソームタンパク質が細胞外に漏出せていきたい。

生物への適用性を示しており，ゲノムし，同時にプレート上で塗布乾燥さ解読されていない微生物の解析だけでれる ６）。

５）果と高い相関性を示した 。

なく，培養不可能な微生物を分類する

しかし，問題は上記溶剤と混和すための簡便な方法と期待される。解析るだけで細胞を崩壊できるのは，微に必要な細胞数が現状よりも飛躍的に生物の中でも比較的細胞壁がやわら少なくなることが，この技術の発展にかいグラム陰性菌などに限られ，グ

文 献おいて大変重要である。

ラム陽性菌や酵母などの硬い細胞に

１） M. Torimura, S. Ito, K. Kano, T. Ikeda, Y.

は適用が難しいことである。硬い微Esaka, T. Ueda, J. Chromatogr . B , 712,
31-37 (1999).

生物にも適用可能な，簡便かつより

２） T. Shintani, K. Yamada, M. Torimura, FEMS

微生物の CE 分離技術と MALDI-

汎用性の高いインターフェースを構

３） T. Shintani, M. Torimura, H. Sato, H. Tao, T.

TOFMS 同 定 分 類 技 術 は， 組 み 合築することが次の課題になっている。

４） K. Teramoto, H. Sato, L. Sun, M. Torimura,

４ 分離同定技術へ

Manabe, Anal. Sci., 21, 57-60 (2005).
H. Tao, J. Proteome Res ., 6, 3899-3907

わせることで両技術の可能性を大き く 高 め る こ と が で き る。 例 え ば，Microbiol. Lett ., 210, 245-249 (2002).

(2007).

５ おわりに分 離 が 不 十 分 な 微 生 物 も MALDI-

土の中の微生物を一個つり上げてTOFMS により解析できるようにな

き て，10 分 後 に は そ の 微 生 物 が 何ると期待できる。両技術をつなぎ合であるかを知ることができる。これ

５） K. Teramoto, H, Sato, L. Sun, M. Torimura,
H. Tao, H. Toshikawa, Y. Hotta, A. Hosoda,
H. Tamura, Anal. Chem ., 79, 8712-8719(2007).
６） 特開2006-126039「細胞の分離、同定装置及び方法」

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