39−技術資料−●ノロウイルスRNA検出試薬
TRCRtest Noro1, TRCRtest Noro2の開発
科学計測事業部 TRCプロジェクトチーム 開発・製造G 益田 昇佳
斎藤 寿一
林俊典

RNA溶液に2種類の試薬（基質とプライマーの混合試

1．はじめに薬および酵素試薬）を加え、専用装置であるTRCRリ

ノロウイルスは、主に食品や水を媒介として経口感染し、ヒトの小腸で増殖して急性胃腸炎を引き起こす病原体として知られる。ノロウイルスによる食中毒は、汚染された食品の喫食、又は、感染者を通じて付着しアルタイムモニターTRCRapid-160にセットするだけの簡便な操作が特徴である（Fig. 2）。

3．ノロウイルスRNA検出試薬の開発た食品の喫食によって引き起こされ、その患者数は食TRC法を用いたノロウイルスRNA検出試薬では、ノ中毒事件全体の38％（病因物質別の第一位）を占めてロウイルスRNAの塩基配列のうちノロウイルスに特いる。さらに、感染者の糞便や吐瀉物を介するヒト−異的な塩基配列を増幅および検出する。しかし、ノロヒト感染により、幼稚園、小・中学校、社会福祉施設

ウイルスは多様な遺伝子型（大別して2つの遺伝子群などで集団感染が多発するなど大きな社会問題となっ［GⅠ・GⅡ］、さらにGⅠ内で14の、GⅡ内で17の遺伝ている。

子型に分類）が存在する2）。そのため、本試薬の開発

現在、ノロウイルスの主要な検出法はウイルスにあたっては遺伝子データバンクに登録されている塩RNAを逆転写して得たDNAを複写増幅するRT-PCR法

基配列9種類に加え、国内のノロウイルス陽性検体かである。しかし、逆転写反応が必要であること、PCRら得た塩基配列11種類および川本らの解析した塩基配後にハイブリダイゼーションまたは塩基配列分析によ列 3）〜8）を使用し、塩基配列の相同性の解析結果をもる同定が必要なことからノロウイルスの同定までに2とにRNA増幅の起点となるプライマーやINAFプロー〜3日を必要とし、感染拡大の早期対応には迅速性をブの塩基配列を設計した。

欠くことが問題であった。さらに、RT-PCR法は国内

その結果、TRC法における増幅検出領域はノロウイで市販されるキットがなく、操作が煩雑で熟練を要すルスの各遺伝子型間で相同性の高いORF1（RNAポリことから、検査可能な施設が限定されていた。

メラーゼ領域）の3 末端側からORF2（構造蛋白領域）

科学計測事業部では、迅速・簡易な遺伝子検査法での5 末端側にかけてのjunction領域を含めるように設あるTRC技術を用いてノロウイルスRNAを直接増幅お定した。そして、GⅠの遺伝子型間で相同性の高い領よび検出する研究用試薬キット「TRCRtest Noro1」

域にanti-sense primerとpromoter primerを1セット設と「TRCRtest Noro2」を開発し、2004年12月に上市定して「TRCRtest Noro1」のRNA増幅用プライマーした。とし、さらに、promoter primerの結合領域の5 側にscissors probeを設定した。一方、GⅡの遺伝子型間で2．TRC法の原理と特長相同性の高い領域に対しても同様の設計を行ない、TRC法は43℃の一定温度でRNAを複写増幅するTRC「TRCRtest Noro2」用のanti-sense primer、promoter（Transcription-Reverse transcription-Concerted）反応

primerおよびscissors probeの塩基配列を決定した。と標的核酸に特異的に相補結合することで蛍光増感する

なお、増幅RNAの蛍光検出に使用するINAFプローブ

INAF（INtercalation Activating Fluorescence probe）

は各遺伝子群（GⅠ・GⅡ）間で相同性の高い領域にプローブを組み合わせた方法であり、標的RNAの増設定し、「TRCRtest Noro1」と「TRCRtest Noro2」で幅と検出を1本のチューブ内で10〜60分で実施するこ共通の塩基配列とした。

1)とができる （Fig. 1）。さらに、検体から抽出した（ 39 ）40

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.49（2005）

TrimmingDetection
Target RNA

53
53

Scissors probe
RNaseH activity

INAF probeAmplification
5353DNA polymerase activity
Anti−sense primer
AmplifiedRNA

Reversetranscription
RNaseH activity

Transcription
35Promoter primer
DNADNA polymerase activity

Reverse transcriptase

T7 RNA polymerase

Fig. 1 Elementary steps of the TRC reaction.

TRC reagent
20μL

RNA extract
5μL

Enzyme reagent
5μL

TRCR real−time monitor
TRCRapid−160（TOSOH）

Capacity: 16Reaction temperature: 43℃
Excitation wavelength: 470 nm
Fluorescence wavelength : 520 nm

Fig. 2 Protocol of TRC method.

増幅産物の塩基配列の相同性結果、または増幅産物に4．感度・特異性

対するプローブハイブリダイゼーションの結果より決［1］評価方法「TRCRtest Noro1」と「TRCRtest Noro2」の感度評価には、それぞれChiba type（GⅠ／4）およびKashiwa 47 type（GⅡ／14）を含む検体のRT-PCR産物（cDNA）よりin vitro転写にて調製したRNA（以下、それぞれをGⅠ RNAおよびGⅡ RNAと表記）の水溶液5 μLを用いた。さらに特異性評価には、RT-PCR法
によりノロウイルス陽性と判定されている糞便検体32検体（ノロウイルスの遺伝子群はRT-PCRで得られた定）、Ａ型ロタウイルスを含有する糞便検体5検体、ノロウイルス以外の腸管感染症病原菌4検体から得られた核酸抽出物を用いた。なお、糞便検体は10%[w/v]乳濁液からEXTRAGEN Ⅱ（東ソー）にて、腸管感染症 病 原 菌 は 一 昼 夜 培 養 液 か ら RNeasy Mini kit（QIAGEN）にてそれぞれ核酸抽出した。いずれの測定も専用装置であるTRCRリアルタイムモニター
TRCRapid-160を使用した。

（ 40 ）

東ソー研究・技術報告 第49巻（2005）［2］評価結果

41

ロウイルスGⅡ陽性検体全てと一部のノロウイルス

GⅠ RNA溶液を「TRCRtest Noro1」で測定した結GⅠ 陽 性 検 体 を 検 出 し た 。「 TRCRtest Noro1」 と果をFig. 3 (a)に、GⅡ RNA溶液を「TRCRtest Noro2」「TRCRtest Noro2」を組み合わせることで全てのノロで測定した結果をFig. 3 (b)に示す。なお、Fig. 3におウイルスを検出できた。一方、ノロウイルス以外の検いて横軸は酵素試薬を添加してからの反応時間を示

体については両試薬とも陰性判定であった。

し、縦軸は蛍光強度比（蛍光強度／初期蛍光強度）を5．実検体を用いた評価9), 10)示している。そして、蛍光強度比が1.2を超えた時間を検出時間とした場合、「TRCRtest Noro1」は300コ［1］評価方法
食中毒患者の糞便検体252検体を使用し、Fig. 4にピー／5 μLのGⅠ RNAを20分以内に、「TRCRtest
4Noro2」は10 コピー／5 μLのＧⅡ RNAを15分以内に示すフローにて評価した。糞便検体（10%[w/v]乳濁それぞれ検出した。

液）100 μLより、グアジニン・塩化セシウム超遠心「TRCRtest Noro1」と「TRCRtest Noro2」の特異法 、 QIAamp Viral RNA Mini Kit（ QIAGEN）、性試験の結果をTable 1に示す。なお、判定は反応開EXTRAGEN Ⅱ（東ソー）のうちのいずれかの方法に始後60分以内に蛍光強度比が1.2以上になったときにてRNA（EXTRAGEN Ⅱでは全核酸）を抽出した。

陽性、1.2未満のときを陰性とした。結果、「TRCRtest

TRC法では核酸抽出物原液あるいは10倍希釈液5 μNoro1」はノロウイルスGⅠ陽性検体全てと一部のノLを試料とし「TRCRtest Noro1」と「TRCRtest Noro2」

ロウイルスGⅡ陽性検体を、「TRCRtest Noro2」はノでTRCRapid-160を用いて60分間測定した。一方、RT-(b)

3.0

4.5

［copies］
Negative
2.5300
10＾33000
2.0
10＾4
10＾5
10＾6
1.5
10＾7

Fluorescence intensity ratio

Fluorescence intensity ratio(a)1.0［copies］
Negative
10＾4
3.5
30000
3.0
10＾5
10＾6
2.5
10＾7
2.0
4.0

1.5
1.0
0.5

0.505

10 15 20 25 30
Reaction time［min］

35400510 15 20 25 30
Reaction time［min］

Fig. 3 Fluorescence monitoring of the TRC reactionof the GⅠ RNA(a), and the GⅡ RNA(b).
Horizontal line indicates the cut−off value 1.2.

Table 1 Specificity of TRCRtest Noro1 and TRCRtest Noro2 .

SampleStool sample
Norovirus(GⅠ)(GⅡ)(GⅠ＋GⅡ)
Rotavirus A
Bacterial cells
Vibrio parahaemolyticus
Salmonella Enteritidis
Escherichia coli O157 : H7

TRCRtest
Noro1

TRCRtest
Noro2＋＋−−TRCRtest
Noro1＋Noro2＋20
1225
732（8） （0） （1） （7） （8）（11） （12） （23） （0） （23）（1） （0） （1） （0） （1）05050000211（ 41 ）

000211000−0（0）（0）（0）
52113540

42TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.49（2005）

PCR法の結果は、核酸抽出物1〜10 μLを試料として、のプライマーセットを用いたリアルタイムRT-PCRにORF1のRNAポリメラーゼ領域にあるプライマーセッ

よって得られた。

ト 2系 列 （ SR46, 48, 50, 52/SR33系11）、 NV82,12)［2］評価結果

SM82/NV81＋Yuri22F/22R 系）を用いたRT-PCRおTRC法とRT-PCR法との成績比較をTable 2に示す。

よびORF2領域にあるプライマーセット1系列
13）（G1SKF/R＋G2SKF/R系 ）を用いたRT-PCR、ORF1

Table 2の結果のうち(a)はRT-PCRをSR46, 48, 50,とORF2のjunction領域にあるG1COF/RとG2COF/R14)

52/SR3311)のプライマーで実施したときの、(b)はRT-Table 2 Result of evaluation by stock samples.
(a)RT−PCR
SR46, 48, 50,
83 feces

TRCRtest
Noro1＋Noro2

52/SR33＋−TotalPositive ratio＋−5763176023

RT−PCR 72％

Positive

Totalratio

63TRC

2076％

83
Concordance 89％(b)
RT−PCR
169 feces

TRCRtest
Noro1＋Noro2＋−Total①②NV82, SM82/NV81

Yuri22F/22R＋

−＋−＋

−

882059471008061

88

81

Positive ratio

RT−PCR 52％

82 feces

G1SKF/R, G2SKF/R

457

457

63104

10465RT−PCR 38％(c)RT−PCR＋−

Total

Positive
ratio

TRCRtest＋

46551TRC

Noro1＋Noro2−

1303162％473582

Total
Positive ratio

RT−PCR 57％

Concordance 93％(d)Real-time RT−PCR
G1COF/R, G2COF/R

85 feces＋

Total

Positive
ratio−

TRCRtest＋

48

553

TRC

Noro1＋Noro2−

1313262％493685

Total
Positive ratio

Total

①＋②

RT−PCR 58％

Concordance 93％（ 42 ）

RT−PCR 62％

Positive
ratio

108

TRC

6164％

169
Concordance 93％

東ソー研究・技術報告 第49巻（2005）

Stock Patient s Samples
252 fecesfrom gastroenteritis
patients43

Extraction reagents

10% Stool emulsion

・Super centrifugal method withGuanidine−Cesium chloride
・QIAamp Viral RNA Mini kit(QIAGEN)
・EXTRAGENⅡ (TOSOH)

100μL

RNA extract

Extract volume
1 〜 10 μL

Sample dilution(optional) ×10

RT reaction

1 h

PCR reaction

2〜4 hElectrophoresis

1 hExtract volume
5 μL
1 h

TRC reaction

RT−PCR method

Fig. ４

TRC method

Protocol of evaluation by stock samples.

PCRをNV82, SM82/NV81とYuri22F/22R12)のプライマ

RT-PCR法と同等以上の成績を示した。

ーで実施したときの、(c)はRT-PCRをG1SKF/Rと一方、糞便検体252検体のうち集団発生事例20件につ13)

G2SKF/R で実施した時の、(d)はリアルタイムRT14)

いてその事件毎にRT-PCR法との成績を比較した。そPCR（G1COF/RとG2COF/R） を実施したときの成の結果、どの集団発生事例においても検出率はほぼ一績比較である。いずれの場合においてもノロウイルス致しており、本試薬がノロウイルス急性胃腸炎の集団検出率はTRC法とRT-PCR法とでほぼ一致し、陽性と発生における病原体の迅速検査に適した性能を持って陰性の一致率も約90%と高く、今回開発した試薬はいることがわかった（Table 3）。

6．まとめ
Table 3 Result of evaluation by outbreak samples.

今回開発した「TRCRtest Noro1」と「TRCRtest
Outbreak No.

Number of positive/tested

Noro2」はノロウイルスRNAを直接増幅するため逆転RT−PCR

TRC

写反応が不要であり、反応開始から判定までに要する

I−1
I−2
I−3I−4
I−5
I−64/ 610/1410/1411/116/ 65/ 94/ 610/1410/1411/116/ 65/ 9

時間も最長60分と短時間である。また、増幅反応後の

N−1
N−2
N−3
N−4
N−5
N−6
N−7
N−86/ 64/ 61/ 33/123/ 64/ 55/ 63/ 36/ 64/ 61/ 3
3/123/ 63/ 56/ 63/ 3の利用が期待される。

O−1
O−2
O−3
O−4
O−5
O−64/ 59/ 95/ 77/ 95/ 65/ 74/ 59/ 95/ 77/ 95/ 65/ 7

電気泳動による判定やDNAハイブリダイゼーションによる同定も不要であるため、迅速かつ簡便な試薬である。ノロウイルスによる感染性胃腸炎の集団発生時、感染拡大防止の早期対応を可能とする迅速試験として7．謝辞
本研究は下記施設との共同研究として実施されました。貴重な検体の供給および測定の実施に対し、各先生に厚く御礼申し上げます。
岐阜県保健環境研究所：川本 尋義 先生
岐阜県生物産業技術研究所：葛口 剛 先生
岩手県環境保健研究センター：齋藤 幸一 先生
新潟県保健環境科学研究所：西川 眞 先生、田村務 先生（ 43 ）44

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.49（2005）

岡山県環境保健センター：藤井 理津志 先生、濱野雅子 先生

参考文献
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