（ 1 ）231

日本食品保蔵科学会誌
４
０

VOL．

会
長
編集委員長
編集委員

５

NO．

髙井 陸雄
太田 英明
石田
裕
津久井亜紀夫

副

会

長

稲熊 隆博
東尾 久雄

太田

英明

小宮山美弘

早坂

薫

井上 茂孝
古庄
律

今堀 義洋
松田 茂樹

竹永

章生

＜報
文＞
発芽大豆中のプロテアーゼの特徴と豆乳タンパク質への作用について …………………………………（２３３）／金内 誠・畑中咲子・下山田真
落合孝次・高橋義洋・津志田藤二郎
炊飯器での保温中に米飯を変敗させる細菌の推定 …………………………………………………………（２４１）／入澤友啓・辻井良政・岡 大貴
野口治子・内野昌孝・ 野克己

!

＜講
座＞
身近な野菜・果物〜その起源から生産・消費まで（２７） タ マ ネ ギ……………………………………（２４７）／室 崇人
１）
HACCP教育講座（７） 青果物／カット青果物に関わる衛生管理法の国際的動向 ……………………（２５／泉 秀実＜文献抄録＞ ……………………………………………………………………………………………………（２５７）＜本会記事＞ ……………………………………………………………………………………………………（２５８）＜会
告＞ ……………………………………………………………………………………………………（２５
９）

232

（ 2 ）

Food Preservation Science

CONTENTS OF VOL．
４
０ NO．
５（２
０
１
４）
＜Article＞（Japanese）
Characterization of Germinated Proteolysis Enzymes and its Reaction to Soy Milk Protein
KANAUCHI Makoto, HATANAKA Sakiko, SHIMOYAMADA Makoto,
OCHIAI Koji, TAKAHASHI Yoshihiro and TSUSHIDA Tojiro …………………………………（２３３）
Estimation of Bacteria in Spoiled Cooked Rice
IRISAWA Tomohiro, TSUJII Yosimasa, OKA Daiki,
NOGUCHI Haruko, UCHINO Masataka and TAKANO Katsumi ………………………………（２４１）＜Serialization Lecture＞（Japanese）
Onion
MURO Takato ……………………………………………………………………………………………（２４７）
International Status of Food Safety Program on Fresh and Fresh-cut Pruduce
IZUMI Hidemi ……………………………………………………………………………………………（２５１）

（ 3 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
０ NO．
５ ２
０
１
４ 〔報

文〕

233

発芽大豆中のプロテアーゼの特徴と豆乳タンパク質への作用について
金内
誠＊１§・畑 中 咲 子＊１＊２・下 山 田 真＊１
落 合 孝 次＊３・高 橋 義 洋＊４・津志田藤二郎＊１＊１ 宮城大学食産業学部＊２ 宮城県産業技術総合センター＊３ シードライフテック＊４ （株）
小倉屋柳本

Characterization of Germinated Proteolysis Enzymes
and its Reaction to Soy Milk Protein
KANAUCHI Makoto＊１§, HATANAKA Sakiko＊１＊２, SHIMOYAMADA Makoto＊１,
OCHIAI Koji＊３, TAKAHASHI Yoshihiro＊４ and TSUSHIDA Tojiro＊１＊１＊３Department of Management, Miyagi University, 2−2−1 Hatatate Taihaku-ku Sendai, Miyagi 982−0215＊２ Industrial Technology Institute, Miyagi Prefectural Government,
2−2 Akedoori Izumi-ku Sendai, Miyagi 981−3206
SEEDLIFE Tech Inc., Nagahama Bio Incubation Center-#13 1281−8 Tamura, Nagahama-city, Shiga 526−0829＊４ Ogurayayanagimoto co., Ltd., 4−9−21 Mikageduka-cho Higashinada-ku, Kobe 658−0044

Proteolytic enzymes are important to modify the processing characteristic of soybeans and havebeen utilized for the production of soybean-derived foods―e.g., miso and soy sauce. Proteolytic enzymes
produced in the cotyledons of soybean seeds during germination are used to modify the characteristics
of processed foods. The optimum conditions for protease production during germination were
determined and the characteristics of these proteases were described. The soybean variety Ohtsuru
５℃. Theproduced high levels of a semi-alkaline proteolytic enzyme under conditions of ２
０％ CO２ and ２
protease was purified using cation-exchange and size - exclusion chromatography. The monomeric
protein had a mass of ８４．
９ kDa. The optimum pH and temperature for this protein were pH８．
０ and
０．
０ and ４―３
０℃. The proteolytic enzyme was
３
０℃, respectively, and the protein was stable at pH７．
０―１
activated by magnesium, zinc, and manganese ions and was inhibited by copper and mercury ions,
EDTA, and EGTA. However, the enzyme was not inhibited by trypsin inhibitor. The enzyme cleaved
substrates by endo-type proteolysis and cleaved the α -, α’-, and β -subunits of the soy protein β conglycinin. The enzyme was able to modify the characteristics of soybean during their production.
Moreover, it digested a major allergen protein, Gly m Bd６
０K, which is an α-subunit of beta-conglycinin.
（Received Mar. １９, ２０
１４；Accepted Jun. １１, ２
０
１
４）

Key words：proteolytic enzyme, soybean, germination, soy milk, β-conglycinin
タンパク質分解酵素，大豆，発芽，豆乳，βコングリシニン

大豆はタンパク質に恵まれ，栄養機能である一次機能

豆乳，豆腐などの加工食材の原料として，古来より利用を有するだけでなく，嗜好・食感機能である二次機能にされてきた１）。近年では，大豆の健康性機能・生体調節も優れている。そのため日本では，醤油や味噌，納豆，機能である第三次機能も注目され，特に，血中内の脂質

＊１
§
＊２
＊３
＊４

〒９
８
２―０
２
１
５ 宮城県仙台市太白区旗立２―２―１
Corresponding author, E-mail : kanauchi@myu.ac.jp
〒９
８
１―３
２
０
６ 宮城県仙台市泉区明通２丁目２番地
〒５
２
６―０
８
２
９ 滋賀県長浜市１２８１―８ 長浜バイオ大学インキュベーションセンター ＃１
３
〒６
５
８―０
０
４
４ 兵庫県神戸市東灘区御影塚町４―９―２
１

234

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
０ NO．
５ ２
０
１
４

代謝を改善する機能を持つことから機能性食材として利２）〜４）用されている

（ 4 ）

社；７
０
１
１HS）で５分 間 磨 砕 抽 出 し た。そ の 後，４℃
で，２時間放置し，１０，０
００× g で，１０分間の遠心分離。

しかし，大豆は組織が硬く，食材として加工しにくい（himac CR―２
１G II；日立工機社）し，上澄み液を粗酵という問題点がある。そのため，強力な酵素を含蓄する素液とした。

麹による長期間の発酵・熟成やさまざまなタンパク分解

３．酵 素 活 性

酵素剤が利用されてきた。酵素製 剤 の 起 源 はBacillus

FTC 活性法１４）（Pierce Fluorescent Protease Assay

subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus thermoproteolyticus,

Kit, Cat.#２
３
２
６
６; Thermo scientific製）を用 い て 行 っAspergillus oryzae, Aspergillus saitoi, Aspergillus sojae,

た。す な わ ち，FTC（Fluorescein thiocarbamoyl）標!）を５０mMリン酸―クエン酸緩衝

Mucor pusillus, Streptomyces griseusなどの微生物やパパ識カゼイン（０．
５mg／

５）
イヤ（Carica papaya），パイナップル（Ananas comosus），

液（pH３．
０〜８．
０），ま た は５０mMホ ウ 酸―NaOH緩 衝 液

小麦などの植物である６）。

（pH８．
０〜１
０．
０）で，５
０
０倍 に 希 釈 し た FTC 基 質（１
０
０

$

$

ところで，大豆は浸漬し，発芽させると短期間に大豆µ ）に，プロテアーゼサンプルを，２０µ を加え，４０℃の胚のタンパク質を分解する。これは，それ自身が強力で，３０分間反応させた。励起波長４８５ ／蛍光波長５３８なタンパク質分解酵素・プロテアーゼを生産し，発芽時を 蛍 光 プ レ ー ト リ ー ダ ー（TECAN GENios, Tecanに蓄えているタンパク質を分解し，エネルギーとして使Group Ltd.）で測定した。対照としてプロテアーゼサ

うためである。このように，発芽させることで，酵素製

ンプルの代わりに，トリプシン（キット添付）溶液も同剤を使うことなく大豆加工時の分解促進や物性改良がで様に活性を測定した。

きると考えられる。しかし，大豆の発芽中のプロテアー
７）!

１Uに相当する活性は，１ゼに関しての報告は少なく，MORITAら が，「毛振」とに分解されるFTP量とした。

いう品種中の種子中に存在する潜在的セリンプロテアー

４．ペプチダーゼ活性ゼの報告とQI によるProtease C１が β―コングリシニン
８）のα-，α’-サブユニットを分解する報告のみである。
さらに，非加熱大豆に含まれる消化酵素阻害物質トリ
９）

１
０）

!

"のTrypsinによって１分

ペ プ チ ダ ー ゼ 活 性 は，benzyloxycarbonyl-glutamyltyrosine（Cat.# C０２
５
７; Sigma-Aldrich）を５０mMホ ウ酸―NaOH緩衝液（pH８．
０）に０．
５mMとなるように溶解!）に０．５!のサ

プシンインヒビター やレクチン の一部は発芽中に阻させ，基質溶液とした。基質溶液（１

害活性が弱くなることが報告されている１１）。しかし，発ンプル溶液を加え，３０℃で，３０分間反応させた１５）。１Uは，芽時に生産されたタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）

pH８．
０で基質から分解されたチロシンのmM数をもってに対しての阻害の有無に関する検討はない。

示した。

本研究では，大豆発芽時に生産されるプロテアーゼに着目し，その発芽プロテアーゼ生成にかかわる諸条件と５．酵素タンパク質の測定
酵素タンパク質の測定はBradford法１６）に従った。すなにより発芽は促進される１２）。そこで，CO２濃度と発芽プ! の サ ン プ ル 溶 液 に，０．５! の Coomassie# Coomassie Brilliant Blue G（Cat.# B０
７
７０; Sigma-Aldrich）を５０!，９５％エ タ ノ ー
ルと１
０
０! phosphoric acidに溶解させ，２００!に定容）

ロテアーゼの関係と温度条件について検討する。

を加え，撹拌後に分光光度計（V―６３０；日本分光）によ

プロテアーゼの特徴を明らかにした。これにより，大豆
タンパク質の加工特性を改善することを目的とする。
特に発芽中には，雰囲気中の二酸化炭素（CO２）増加

!

り，５
９
５ を測定した。検量線は牛血清アルブミン（Cat.

実験方法

!の範囲

#０
５
４
８
２; Sigma-Aldrich）を用い，１
０〜１
０
０µg／

１．発芽処理方法
大豆（オオツル

わ ち，１．
０

Brilliant Blue 溶液（０．
１#滋賀県産 ２０１
１年度収穫）１００ を，で測定した。
６．硫酸アンモニウム沈殿

１％次亜塩酸カルシウム溶液３０分に浸漬し，洗浄・殺菌

粗酵素液に微粉末に砕いた硫酸アンモニアを，３０〜した。滅菌水で洗浄後，８時間滅菌水に浸漬させ，排水４０％飽和となるよう添加し，塩析させた。これを１
０，
０
０
０

後，１
６時間放置し，再び，２４時間滅菌水に浸漬させた。

× g，３０分遠心分離した。沈殿したタンパク質は，５０mM

さらに，排水し，７２時間放置した。これらの操作はすべ

ホウ酸―NaOH酸緩衝液（pH８．
０）に溶解させた。これて無菌で行い，容器は滅菌した５００ 容三角フラスコにを透析チューブ（１２〜１
４kDa，Cat.#２―３
１
６―０
３；アズワ

綿栓したものを用い，温度は各々１
５，２
５，３
０℃で行っ

ン社）に入れ，外液を２ の５０mMホウ酸―NaOH緩衝液

!

１
３）

$

た 。また，CO２条件の調整は，５〜２０％および無調整（pH８．
０）として４℃で，１晩透析した。

とし，CO２インキュベータ（IT―３００；ヤマト科学）を用

７．イオン交換クロマトグラフィー

いて行った。
２．酵素液の抽出

粗酵素液のイオン交換クロマトグラフィーは，CM gel（Macro-Prep support, Bio-Rad Laboratories, Inc., Ca.

発芽させた大豆種子に，５０mMホウ酸―NaOH緩衝液USA）をカラム（２５㎜×３００㎜）に充填し，行った。ま（pH８．
０）を加え，ラボレタリー・ブレンダー（WARING

た，溶出は０〜１．
０M NaClを含む５０mMリン酸―クエン（ 5 ）〔報文〕 発芽大豆中のプロテアーゼ

酸緩衝液（pH６．
５）によるリニアグラジエントによって!

行った。溶出液の流速は１．
５ ／minとし，各フラクショ!

ンは４．
０ とした。

235

１
３．ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量測定
酵素タンパク質の分子量の測定は定法によった１８）。す
な わ ち，Blue dextran（Cat.# D４７７２; Sigma-Aldrich）
および分子量スタンダード（Sigma-Aldrich, α-Chymo-

８．ゲル濾過クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィーで得られた活性画分

trypsinogen A from bovine pancreas, Cat. # C４
８
７
９,

は，８
０％飽 和 の 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム に よ っ て 塩 析

２
５．
６kDa ; albumin from egg, Cat.# A７
６
４
１, ４
５．
０kDa ;

後，１０，０
００×gで，３０分遠心分離した。この沈殿を１．
０!の５０mMホウ酸―NaOH緩衝液（pH８．０）に再溶解後，Bovine Serum Albumin, Cat. # A２
１
５
３, ６
６．
０kDa ;

ゲルろ過クロマトグラフィー（１０㎜×３５０㎜，P―１００gel,

を単独で，あるいはこれらの混合物を前述したゲル濾過

Bio-Rad Laboratories, Inc., Ca. USA）に供試 し た。溶クロマトグラフィー法により分画し，溶出量と分子量かLactoferrin bovine milk, Cat. # L９
５
０
７, ８
７．
０kDa ）

出溶媒は５０mMホウ酸―NaOH緩衝液（pH８．
０）を用い，

ら，サンプルの分子量を算出した。

流速は０．
１５ ／min，各フラクションは２．
０ とした。

１
４．発芽プロテアーゼのトリプシンインヒビターによる!

!

９．金属イオンおよび阻害剤に対する影響
各種金属イオンとしてKCl，NaCl，MgSO４，ZnSO４，
CuSO４，CoSO４，FeCl２，Iodoacetamide（Cat.# I１
１
４
９;

阻害
ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー（Cat.# T９１
２
８; SigmaAldrich）は，５mUのトリプシンが５０％阻害（最終濃度

してEGTA（Cat.#３
４
６―０
１
３
１
２；和光純薬），EDTA（Cat.

!）す る よ うFTC（Fluorescein thiocarbamoyl,
０．
５mg／!）― 緩 衝 液（５０mMホ ウ 酸―NaOH緩 衝 液，pH

#３
４
５―０
１
８
６
５；和光純薬），Azide, sodium azide（Cat.

８．
０）溶液に添加した。酵素液として，トリプシン（Cat.

Sigma-Aldrich），CaCl２，HgCl２を用い，また，阻害剤と

４
０
０µg／

#１
９
５―１
１
０
９
２；和光純薬）を用いた。これらを最終濃度

#２
０
２
３
３; Thermo Scientific, TPCK Trypsin）と 精 製

１．
０mMとなるよう，反応液に添加し，酵素活性を測定した酵素液を５（mU／

した。

し，活性を測定した。対照はトリプシン無添加とした。

１
０．プロテアーゼの至適pHおよび至適温度
０．
１Mリン酸―クエン酸緩衝液（pH３．
０〜８．
０）
，または

!）となるようにこの溶液に添加

活性は，トリプシンインヒビター無添加のトリプシンの活性を１００％とした相対活性で示した。

０．
１Mホウ酸―NaOH緩衝液（pH８．
０〜１０．
０）を用いて，

実験結果および考察

酵素液のpHを調製し，至適pHを測定した。また，恒温水槽を用い，反応系を１５℃から７０℃として至適温度を測

大豆種子の発芽中のプロテアーゼ活性をFig．
１に示し定した。なお，酵素液は反応前に１０分間予熱した。

た。一般的にタンパク質は特有の等電点をもち，特にプ

１
１．プロテアーゼのpH安定性および温度安定性

ロテアーゼに関しては，酵素タンパク質と基質タンパク!

酵素液（０．
１ ）に０．
１Mリン酸―クエン酸緩衝液（pH質の双方に等電点をもつことなどから，pH条件によっ

３．
０〜８．
０）
，ま た は０．
１Mホ ウ 酸―NaOH緩 衝 液（pH８．
０て活性が異なると考えられる。そこで，異なる発芽温度!
酵 素 液（０．
１!）に０．
１!の０．
１Mホ ウ 酸―NaOH緩 衝 液

〜１
０．
０）０．
１ を加え，４℃，６０分間放置した。また，
100

い，１
５℃から７
０℃，６
０分間放置した。活性測定は，これ!

!

ら酵素液（０．
０２ ）を０．
１ のFTC溶液（０．
１Mホウ酸―NaOH緩衝液，pH８．
０に溶解）に添加し，３０℃，３０分間反応させ，活性測定を行った。
１
２．SDS-ポリアクリルアミド電気泳動
１７）
酵素タンパク 質 はLAEMMLI（１９７０）に 従 い，１２．
５％均一ゲル（e-pagel, Cat.#２
３
３
１
８
２
０；アトー製）を用い，２０mAの定電流で泳動させた。分子量測定のため，SDSPAGEスタンダード（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いた。泳動後，Coomassie Brilliant Blue染色液（AE−１３４０ Ez Stain Aqua，アトー製）にてゲルを染色した。
分子量マー カ ーSDS-PAGEス タ ン ダ ー ド（Cat.#１
６
１―
０
３
１
７ ; Bio - Rad,

myosin, ２００kDa ; β ― glucosidase,

１
１
６．
２
５kDa ; phosphorylase
albumin,B, ９
７．
４ kDa ; serum

６
６．
２kDa ; ovalbumin, ４
５．
０kDa ; carbonic

anhydrase ３
１．
０kDa ; trypsin inhibitor, ２
１．
５kDa ;
lysozyme, １
４．
４kDa ; aprotinin, ６．
５kDa）を用いた。

Relative activity (%)（pH８．
０）加え，酵素 液 のpHを 調 製 し，恒 温 水 槽 を 用

80
60
40
20
0
pH
3.0
Acid
(Acidic)

pH 8.0pH
9.0
pH 7.0 Mildly-Alkaline
NeutralA
lkaline(Neutral) (Weakly-alkaline) (Alkaline)
Kinds of Protease

Fig．
１ Protease activity in soybean seedlings germinatedat various temperatures, under acidic, neutral, weakly
alkaline, and alkaline conditions
Protease activity was assessed under acidic（pH ３０. ）, neutral（pH ７.０）, weakly alkaline （pH ８.０）, and alkaline （pH ９.０）
conditions. Soybeans were germinated at １
５℃, ２
５℃, and ３０℃.
□１■５℃, □２５℃, ■３０℃

236

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
０ NO．
５ ２
０
１
４

条件での酸性（pH３．
０），中性（pH７．
０），弱アルカリ性（ 6 ）根などは増殖を促進されるとしている２１）。本実験におい

（pH８．
０）
，アルカリ性（pH９．
０）プロテアーゼを検討しても，観察したところ，CO２濃度２０％の条件下で発芽さた。発芽温度を１
５〜３
０℃にて検討したところ，各プロテせた幼根が長く伸びていた。増殖が活発になりプロテア

アーゼの活性は発芽温度２５℃が高く，特に弱アルカリ性ーゼの活性も高くなったと考えられた。よって，２
０％

（pH８．
０）プロテアーゼが高かった。１
５℃でも，弱アルCO２，２５℃の条件下で，pH８．
０のアルカリプロテアーゼ

カリ性（pH８．
０）プロテアーゼが高かったが，２５℃に比が最も生産されていると考えられた。

べ，８０％程度であった。３
０℃では，２５℃と同等の活性で，さらに，本プロテアーゼ酵素の酵素化学的性質を明ら

それは約９０％以上であった。しかし，pH９．
０のアルカリかにするために，精製を行った。まず，硫安沈殿画分後，性プロテアーゼは１５℃より３０℃で発芽させたほうが低い

イオン交換クロマトグラフィーによって生成の検討を行活性であった。ASANOら１９）は，発芽大豆よりセリンプロ

った。陽イオン交換樹脂（CM樹脂）にてNaCl濃度は約テアーゼを単離精製し，至適温度は４０℃で，酸性域に至０．
３Mにて，溶出した（Fig．
３）
。また，活性画分をゲル

適pHをもつと報告した。さらにMORITAら７）やGUO２０）らは，

ろ過クロマトグラフィーに供した結果，フラクションナ

大豆のタンパク質分解酵素は中性・アルカリで働くセリ

ンバー４および５に活性の大きなタンパク質のピークがンプロテアーゼであると報告しており，本結果でのpH得られた（Fig．
４）。この画分を生成タンパクとした。こ８．
０の弱アルカリ性が高いことと一致した。よって，今の精製酵素タンパク質の分子量はSDS-PAGEで８４．
９KDa

後は，発芽によるプロテアーゼ高生産条件として，２５℃であり（Fig．
５a），ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出で発芽させた弱アルカリ性（pH８．
０）プロテアーゼを検時間からのタンパク質量を算出した。その結果をFig．
５

討することとした。

bに示した。その結果，本酵素ゲルろ過クロマトグラフ

次に雰囲気中のCO２濃度を変え，酸性，中性，弱アル

ィーの溶出時間と緩衝液の溶出量から算出したところ分

カリ性，アルカリ性の各プロテアーゼ活性を検討した。

子量７６〜９０kDaのタンパク質であった。さらに，SDS-

結果はFig．
２に示した。

PAGEによる分子量の推定とゲルろ過クロマトグラフィ

その結果，CO２濃度２０％の条件で発芽させた弱アルカーによる分子量の推定との値が近似であることより，モ

リ性（pH８．
０）プロテアーゼが高かった。これはFig．
１

ノマーのタンパク質であることが推察された。GUO２０）はに示した結果と同様であった。この活性を１００％とする

大豆遊離細胞の培養物からserine proteaseを生産させ，相対活性で示すと，CO２濃度２０％の条件で発芽させたも精製・単離した結果，分子量９０．
０kDaのプロテアーゼでののpH９．
０のアルカリ性プロテアーゼは５７％であった。

あることを報告している。本報では８４．
９kDaと非常に近一番低いものはCO２濃度５％の条件で発芽させたもののいものであった。

pH３．
０の酸性プロテアーゼであった。つまり，CO２濃度

次に本酵素の至適pHと至適温度について検討した。

が低い条件はプロテアーゼ活性が低く，CO２濃度が高い

結果をFig．
６aおよび６bに示した。その結果，本酵素の条件では活性が高かった。一般的に高CO２条件下で，幼至適pHは８．
０あった。分子量が近いGUO２０）の報告のプロテアーゼでは，至適pH範囲が５．
５〜８．
５と広いことも報

40
20

pH3.0
(Acidic)

pH7.0
pH8.0
pH9.0
(Neutral) (Weakly-alkaline) (Alkaline)
Kinds of Protease

1.4

7,000

1.0

1.2

6,000

1.0

5,000

0.8

4,000

0.6

3,000

0.4

2,000

0.2

1,000

0.0

0
10

30

50
70
Fraction No

90

0.8
0.6
0.4

----- NaCl (M)600Enzyme Fraction

8,000○ Protein A280

80
● Activiy fluorescence（Ex.485/Em.535）

Relative activity (%)

100

0.2
0

Fig．
２ Protease activity in soybean seedlings germinatedat various carbon dioxide concentrations, under acidic,
neutral, weakly alkaline, and alkaline conditions

Fig．
３ Cation-exchange chromatography of the soybean
seedling protease

Acidic, neutral, weakly alkaline, and alkaline conditions wereas described in Fig.１ Soybeans were germinated in a CO２
incubator adjusted to ５〜２０％ CO２.
５％ CO２, □１０％ CO２, ■□１
５％ CO２, ■２０％ CO２

Gel, CM Gel（Macro-prep, Bio-Rad, CA, USA）; flow rate, １５.
/ min ; fraction volume, ４．
０ ; elution buffer, ５０mM
phosphate-cittic acid buffer （pH ６.５）; NaCl ０―１．
０ M linear
gradient.

!

!

〔報

8,000

文〕 発芽大豆中のプロテアーゼ

Enzyme Fraction

至適pHではなかった。至適pHを１００％とした相対活性

7,000

1.0

6,000
0.8

5,000
4,000

0.6

3,000

0.4

2,000

で，pH７．
５では６８％，pH７．
０では４０％であった。また，
至適温度は３
０℃で，１
５℃，５
０℃では４
０％ほどしか活性がなく，低温・高温では活性が低いことも明らかとなった。
また，pH安定性および温度安定性について検討した。
結果をFig．
７aおよび７bに示した。pH安定性はpH７−１０で，９０％以上の残存活性を有していた。しかし，pH

0.2

1,000

６．
０では５
０％，pH５．
０では２０％の残存率まで低下した。

0
0

10

20
30
Fraction No.

0.0
50

40

一方，温度安定性に関し，４〜３０℃までは非常に安定
し，９０％以上の残存活性を有していた。しかし，５０℃では，約５０％以下まで低下した。６
０℃では３
８％，７
０℃では

Fig ．
４ Size - exclusion chromatography of the soybean
seedling protease

完全に失活した。一般的な植物プロテアーゼのフィチンやパパインは，常圧５０〜８０℃では非常に安定性が高いとGel, P-１０
０ Gel（Bio-Gel, Bio-Rad ; exclusion limit １００ kDa）;
gel bed, ６７５.
; flow rate, ０１. ５ /min ; fraction volume, ２０.
; elution buffer, ５０ mM borate-NaOH buffer（pH ８０
. ）
.

!

!

a

SampleStandardされている２２）。本酵素と他の植物酵素との耐熱性の違いや耐熱を保つためのアミノ酸配列の違いなどを明らかに

b
kDa
200

10 5

84.9
(kDa)

M.W. (kDa)

116.3
97.4
66.2
45

10 4

M. W.
77-87 kDa

10 3
10 2

31

0

0.5

1
Ve/V0

1.5

2

21.5
14.4
6.5
Fig．
５ The molecular weight of the soybean seedling protease determined by using
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）（a） andsize-exclusion chromatography（b）

100

100

a

b

80

Relative activity (%)

Relative activity (%)!

237

告している。本酵素はこの既知のものとは異なり，広い

1.2○ Protein as A280

● Activity Fluorecense (Ex.485/Em.535)

（ 7 ）

60
40
20
0

80
60
40
20
0

3

4

5

6 7
pH

8

9 10

0

20
40
60
Temperature (℃)

Fig ．
６ Optimum pH and temperature of the soybean seedlingprotease
The pH was adjusted using ０１. M phosphate-citric acid buffer（pH ３０. 〜
８０. , ○）and ０１. M borate-NaOH buffer（pH ８０. ―１
００. , ●）（a）. The enzyme
was assayed in ０１. M borate-NaOH buffer（pH ８０. ）at １５〜７
０℃（b）.

238

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
０ NO．
５ ２
０
１
４

Relative activity as residual
activity (%)

Relative activity as residual
activity (%)

a
100

（ 8 ）

b

100

80
60
40
20

80
60
40
20
0

0
3

4

5

6 7
pH

8

0

9 10

20
40
60
80
Temperature (℃)

Fig．
７ Stability of the soybean seedling protease at various pH
and temperature conditions!

!

The enzyme（０１.
）was added to ０１.
of ０１. M phosphate-citric acidbuffer（pH ３０. 〜８０. ）and ０１. M borate-NaOH buffer（pH ８０. 〜１００. ）for ６０
min at ４℃（a）. The protease activity of the enzyme（０４.
）assayed at
pH ８０. . The enzyme（０１.
）, with the pH adjusted to ８０. , was kept at
１
５〜７
０℃ for ６
０ min（b）.

!

!

するために，プロテインシークエンサーなどの検討が必較したところ，endo型の活性が１０倍以上高かった（デ要と思われた。

ータ未提示）。また，本発芽プロテアーゼによる大豆タ

金属イオンを添加し，金属イオンの影響を検討した結

ンパク質の分解の状態をSDS-PAGEで確認した。その結果 はTable１に 示 し た。本 酵 素 はMg２＋，Zn２＋，Mn２＋に果，endo型にみられるような急激な分子量の低下がみ

２＋２＋

よって活 性 が 賦 活 さ れ，Cu ，Hg ，EDTA，EGTAられた。特にβコングリシニンのサブユニットα，α’サによって阻害された。これより金属プロテアーゼである

ブユニットが作用を受け，２時間後で分解が確認された。

ことが推察された。

βサブユニットは，緩やかに分解していた。一方，グリ本酵素のexo型（ペプチダーゼ），endo型の活性を比

シニンの酸性サブユニットが消失していた（Fig．
８）
。KIM
ら２３）は大豆発芽中のタンパク質の消化について検討した。
その結果，β―コングリシニンのαとα’サブユニットは分

Table１ The inhibition of seedling soy bean protease bymetals and inhibitors
metals and inhibitors（１mM＊）

Relative Activity
（％）

Non
NaCl
KCl
MgSO４

１
０
０．
０
１
０
３．
９
９
８．
１

ZnSO４
CuSO４
CoSO４
FeCl２
HgCl２
CaCl２
MnSO４
Iodoacetamide
Azid
EDTA
EGTA

１
３
３．
７
１
２
０．
４
９．
９
５
９．
９
６
６．
９
０．
０
９
０．
２
１
１
１．
５
８
８．
３
５
８．
４
１
９．
９
２
８．
１

Azide, sodium azide EDTA, ethylenediaminetetraacetic acid
EGTA, O,O-bis（２-aminoethyl）ethylene-glycol-N, N, N’, N’tetra-acetic acid.
＊
Final concentration

解されていると報告されている。また，βサブユニット

k DaStandard

Reacting time(min)
0 30 120

200
116.3
97.4
66.2
45

αʼ & αβacidic

31

basic
21.5
14.4
6.5
Fig ．
８ SDS - PAGE of soy milk protein digested withthe soy germination protease
Soy milk protein was extracted using ０.１ M borate-NaOH
buffer and digested by the protease for ０―２h at ３
０℃.

（ 9 ）〔報文〕 発芽大豆中のプロテアーゼ

239の分解は緩やかに行われているとされ，本結果とも一致

けでなく，効率的に大豆のアレルゲンの消失の可能もあした。また，グリシニンの酸性サブユニットでも同様に，ると考えられた。今後はこれらタンパク質のタンパク分

分解されていた。このように，発芽中の分解酵素として解による消去について，酵素結合免疫吸着法（ELISA

７）

本酵素が関与することが推察された。一方，MORITAら法）を利用した分析法にて測定を行い，本酵素の食品利は，同じ至適pHをもつプロテアーゼでも，β―コングリ用を検討する予定である。

７）

シニンは消化しないことを報告している。MORITAら が要

用いたのは７Sグロブリンのα’-サブユニットを欠失した

約「毛振」，本実験では，タンパク質が多い品種である「エ① 大豆「オオツル」品種の発芽プロテアーゼは，CO２ンレイ」を親品種とし，育種された「オオツル」を用い

濃度が２
０％で，２
５℃条件下で発芽させたときに，弱た。そこで，今後はこれら系統や品種間でのプロテアー

アルカリ性（pH８．
０）プロテアーゼを生産した。

ゼ活性の違いや，タンパク質量とプロテアーゼ活性に相② 本プロテアーゼを陽イオン交換クロマトグラフィ

関があるかも検討が必要であると推察された。

ー，ゲルろ過クロ マ ト グ ラ フ ィ ー で の 精 製 の 結さらに，トリプシンインヒビター（TI）によるプロ

果，８
４．
９KDaのモノマー酵素タンパクが得られた。

テアーゼ活性の阻害について検討した（Fig．
９）
。基質で③ 本酵素の至適pHは８．
０，至適温度は３０℃であった。

!）のトリプシン活性に対しあるFTC溶液に，５（mU／

pH安定性はpH７〜１０で，９０％以上の残存活性を有て５０％阻害するようにトリプシンインヒビターを加え，!となるよしていた。温度安定性に関し，４〜３０℃まで安定うに調製し，活性を検討した。トリプシンインヒビター④ 本酵素はMg２＋，Zn２＋，Mn２＋によって活性が賦活さ

トリプシンと精製酵素の活性が共に５mU／

無添加を対照とし，相対活性１００％で示した。

し，９０％以上の残存活性を有していた。
れ，Cu２＋，Hg２＋，EDTA，EGTAに よ っ て 阻 害 さ

その結果，トリプシンインヒビターは，トリプシン活れた。これより金属プロテアーゼであることが推察性に対して約５０％の阻害を示したのに対して，本酵素はされた。さらにトリプシンインヒビターによる阻害

ほとんど活性阻害がみられなかった。Fig．
８の豆乳のは認められなかった。

SDS-PAGEの結果では，２０kDa付近のトリプシンインヒ⑤ 本発芽プロテアーゼの分解様式は，endo型で，特ビターと考えられるバンドの消失までは，確認できなかに，βコングリシニンのサブユニットα，α’サブユ

った。今後は，本酵素によるTI活性とトリプシンイン

ニット，βサブユニットに作用した。発芽工程によヒビタータンパク分解について詳細に検討予定である。

り，大豆タンパク質の限定的な作用・分解により加一般的な大豆アレルゲンのGly m Bd３
０K, Gly m Bd

工特性の改良やアレルゲンの低減が可能であると考２
８K, Gly m Bd６０Kが存在し，これらの多くは，７Sグえられた。

ロブリンに存在する。特に，Gly m Bd６
０Kは αサブユ
ニットである。これまで，WUら２４）は，発芽によって，
これらアレルゲンタンパク質が消失することを報告している。

文
１）ENDRES,J.

G. : Soy

献
Protein

Products :Characteristics, Nutritional Aspects, and Utilization,

発芽により生成された本酵素は，限定的な作用・分解（AOCS press, Champaign）Illinois, p．
１
２（２
０
０
１）

を起こすことより大豆の加工特性の改良に利用されるだ

２ ） POTTER, S. M. : Soy protein and serum lipids,
Curr. Opin. Lipidol ., ７, ２
６
０〜２
６
４（１
９
９
６）
３）CARROLL, K. K. : Review of clinical studies on

Relative activity (%)

120cholesterol-lowering response to soy protein, J. Am.
100

Diet Assoc., ９
１, ８
２
０〜８
２
７（１
９
９
１）
４）ANDERSON, J. W. , JOHNSTONE, B. M. and COOK -80

NEWELL, M. E. : Meta-analysis of the effects of soy

60

protein intake on serum lipids, N. Engl. J. Med .,

40

３
３
３, ２
７
６〜２
８
２（１
９
９
５）
５）日本化学会編：化学便覧第５版（応用編，丸善東

20

京）
，p．
２
６
５（１
９
９
５）
0
Germination Protease

TrypsinFig．
９ Effect of trypsin inhibitor on protease activity
Two proteases were adjusted to approximately ５mU andcombined with diluted trypsin inhibitor at a concentrationthat inhibited trypsin activity by approximately ５０％. □, withtrypsin inhibitor ; ■, without trypsin inhibitor.

６）都甲潔・内田亨弘監修：食品・医薬品の味覚修飾技術（シーエムシー出版，東京）
，p．
１
２
６（２
０
０
７）
７）MORITA, S., FUKASE, M., HOSHINO, K. FUKUDA, Y.,
YAMAGUCHI, M. and MORITA, Y. : A Serine Proteasein Soybean Seeds That Acts Specifically on the
Native α Subunit of β―Conglycinin, Plant and cell

240

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
０ NO．
５ ２
０
１
４

physiology, ３
５, １
０
４
９〜１
０
５
６（１
９
９
４）

１
７）LAEMMLI, U. K. : Cleavage of structural proteins８）QI, X., WILSON, K. A. and TAN-WILSON, A. L. :Characterization of the major protease involved inthesoybean ０ ― conglycinin（ 10 ）

storageproteinmobilization, Plant Physiol ., ９
９, ７
２
５〜７
３
３（１
９
９
２）

during the assembly of the head of bacteriophage
T４. Nature, ２
２
７, ６
８
０〜６
８
５（１
９
７
０）
１
８） WHITAKER, J. R. : DeterminationofMolecular

Weights of Proteins by Gel Filtration of Sephadex,

９）WESTFALL, E. J. and HAGUE, S. M. : The nutritive
quality and trypsin inhibitor content of soybean
flour heated at various temperatures, J. Nutr., ３
５,
３
７
４〜３
８
０（１
９
４
８）

Anal. Chem., ３
５, １
９
５
０〜１
９
５（１
９
６
３）
１
９）ASANO, M., SUZUKI, S., KAWAI, M., MIWA, T. and
SHIBAI,

H : Characterization

of

novel

cysteine

proteases from germinating cotyledons of soybean

１０）VRIES, J. D. : in Food Safety and Toxicity（CRC［Glycine max（L.）Merrill］, J. Biochem., １
２
６, ２
９
６〜
３
０
１（１
９
９
９）

Press Boca Raton, Florida）
, p．
４
０（１
９
９
６）
１
１）MC GRAIN, A. K., CHEN, J. C., KARL, A., WILSON, K.

２０）GUO, Z. J., LAMB, C. and DIXON, R. A. : A serine

A. and WILSON, A. L. : Degradation of trypsin

protease from suspension - cultured soybean cells,

inhibitors

Phytochemistry, ４
７, ５
４
７〜５
５
３（１
９
９
８）

duringsoybeangermination,

Phytochemistry, ２
８, １
０
１
３〜１
０
１
７（１
９
８
９）

２
１）GRABLE, A. R. and DANIELSON, R. E. : Influence of

１２）GRABLE, A. R. and DANIELSON, R. E. : Influence of
CO２ on Growth of Corn and Soybean Seedlings,
Soil Sci. Soc. Ame J ., ２
９, ２
３
３〜２
３
８（１
９
６
５）
of

plant

and

microbial

originingerminating barley, J. Inst. Brew. , ８
７, ７
７〜７
８
０

assay

for

proteolytic

enzymes. ,Anal.

Biochem., １
４
３, ３
０〜３
４（１
９
８
４）
new

of the plant proteases ficin and papain, J. FoodEngineer., ９
１, ４
２〜４
８（２
０
０
９）

type

of

acid

KWON, O. S. : Mobilization of storage proteins insoybean seed（Glycine max L.）during germinationand seedling growth, Biochem Biophys Acta., １
８
１
４,

１
５）ICHISHIMA, E. : Purification and characterization ofaS. : High hydrostatic pressure inactivation kinetics

２３）KIM, H. T., CHOI, U. K., RYU, H. S., LEE, S. J., and

（１
９
８
１）
１
４）TWININGA, S. S. : Fluorescein isothiocyanate-labeledcaseinSoil Sc. Soc. Ame. J ., ２
９, ２
３
３〜２
３
８（１
９
６
５）
２
２）KATSAROS, G. I., KATAPODIS, P. and TAOUKIS, P.

１３）HOY, J. L., MACAULEY, B. J. and FINCHER, G. B. :Cellulases

CO２on Growth of Corn and Soybean Seedlings,

carboxypeptidase

from

１
１
７
８〜１
１
８
７（２
０
１
１）
２
４）WU, Y. M., GUAN, R. X., LIU, Z. X., LI, R. Z.,

Aspergillus, Biochimica et Biophysica Acta, ２
５
８, ２
７
４〜

CHANG,

２
８
８（１
９
７
２）

Degradation of the Major Allergens in Developing

１６）BRADFORD, M. M. : Rapid and sensitive method
for the quantitation of microgram quantities ofproteinutilizingtheprincipleofprotein - dyebinding, Anal. Biochem., ７
２, ２
４
８〜２
５
４（１
９
７
６）

R.

Z.

and

QIU,

L.

J. : Synthesis

andand Germinating Soybean Seed, J. Integrative Plant
Biol ., ５
４：４〜１
４（２
０
１
２）
（平成２
６年３月１
９日受付，平成２
６年６月１
１日受理）

（ 11 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
０ NO．
５ ２
０
１
４ 〔報

文〕

241

炊飯器での保温中に米飯を変敗させる細菌の推定
入 澤 友 啓＊§・辻 井 良 政＊・岡大 貴＊
野 口 治 子＊・内 野 昌 孝＊・髙 野 克 己＊
＊ 東京農業大学応用生物科学部

Estimation of Bacteria in Spoiled Cooked Rice
IRISAWA Tomohiro＊§, TSUJII Yosimasa＊, OKA Daiki＊,
NOGUCHI Haruko＊, UCHINO Masataka＊ and TAKANO Katsumi＊＊

Department of Applied Biology and Chemistry, Faculty of Applied Bio-Science, Tokyo University of Agriculture,1−1−1 Sakuragaoka, Setagaya-ku, Tokyo 156−8502

Spoilage of cooked rice occurred as a result of heat insulation. The cooked rice had an off-flavorthat was caused by spoilage. This phenomenon is thought to be caused by microorganisms. Therefore,
in this study, we attempted to isolate the contaminating microorganisms from cooked rice and identify
them by using polymerase chain reaction （ PCR ） and PCR - denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）. No microorganisms were detected in normal cooked rice ; however, microorganisms were
２h of heat insulation. The isolates were able to grow at
detected at ４６. ×１
０６ cfu/g in rice spoiled by ７
６
０〜６
５℃ on the cooked rice, and they produced an off-flavor. Based on phylogenetic analysis, theisolates were identified as members of the genus Geobacillus, and were closely related to Geobacillus
thermoleovorans. Contaminating microorganisms in the cooked rice were identified by PCR using
bacterial universal primers and G. thermoleovorans was only detected using PCR-DGGE. These results
suggest that G. thermoleovorans was the contaminating microorganism in the spoiled cooked rice andproduced the off-flavor.
（Received Feb. １
７, ２
０
１４；Accepted Jul. １６, ２
０
１
４）
Key words：cooked rice, thermal insulation, spoilage, thermophilic, Geobacillus
米飯，保温，変敗，好熱性細菌，Geobacillus

炊飯は，現在では電気炊飯器が主流となっている。電これまでに米飯保温時に生じる変敗について松下ら７）気炊飯器は１９
５
０年代に登場し，その後１
９
６
０年には保温機が報告してい る。ガ ス 炊 飯 器 を 用 い て 炊 飯 し，そ の能が開発され，米飯を移し替える手間を省き，炊飯から後，６０℃にて保温をすると５時間後から細菌の繁殖が確

保温の一台二役の電気炊飯器となった。この保温機能に認 さ れ た。さ ら に，変 敗 を 引 き 起 こ す 原 因 細 菌 がより，米飯は温かく，おいしい状態を維持できるように

B. stearothermophilus（現 在 は 再 分 類 さ れ Geobacillus

なった。

stearothemophilus）であると結論づけている。

しかし，保温機能の向上により長時間の保温が可能と以上の背景からも電気炊飯器での保温中に生じる変敗なった反面，それに伴う異臭や変敗が問題視されるようについても細菌によるものであると推測された。そこで，になってきた。米飯およびその加工食品の汚染の主たる本研究では炊飯器での保温中に変敗した米飯を材料に培原因として，Bacillus属細菌やClostridium属細菌に関す養法と分子生物学的手法を用いて，細菌の関与を明らかる報告が多く，中でもB. cereusなど食中毒に関与する細にすることを目的として研究を行った。

１）〜６）菌についての報告が特に多い。これまでは弁当のよ

うな容器包装米飯などの加工製品に関する変敗だけが問題視されてきた。そこで炊飯器での保温中においてもこのような変敗が生じる原因を考えた場合，微生物的要因による可能性が高いと考えられた。
＊ 〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１§ Corresponding author, E-mail : sawa３
７＠hotmail.com

試料および実験方法
１．供試炊飯器・試料米および炊飯・保温条件
同じ機種の炊飯器を複数機体用いて保温試験を行い，常に保温中に変敗が生じる炊飯器（Spoilage rice cooker,

242

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
０ NO．
５ ２
０
１
４

（ 12 ）SR）と 変 敗 が 生 じ な い 炊 飯 器（Normal rice cooker,

ライマーと増幅条件，シークエンス解析および系統解析

NR）の二種を選抜した。炊飯および保温は炊飯器に搭はIRISAWAらの方法９）に従った。

載されている通常炊飯および保温機能を使用した。試料

６．PCR-DGGE法による変敗原因細菌の検出

米として富山県産コシヒカリを使用した。なお，炊き上変敗原因菌について培養法による検出に加えてDNA

がり直後の米飯に関しては，官能試験を行い喫食に問題レベルでの検出を行った。まず，上記２．
と同様に供試がないことを確認した（データ未掲載）。

炊飯器（SRおよびNR）と試料米を用いて通常炊飯を行

２．保温時間による菌数変化

った。炊飯終了直後を０時間目とし，２４時間毎に米飯を供試炊飯器（SRおよびNR）と試料米を用いて通常炊採取した。米飯は保温７２時間まで採取をした。採取した飯し，炊飯直後を０時間目とし，以降２４時間毎に米飯を試料１．
０ に対して１．
０ の純水を加え，よく撹拌し，４℃採取して保温７
２時間までの米飯中の菌数変化を測定した。

にて１時間静置した。この上澄液を分取し，０．
１ の乾

!

!

!

!

!

採取した米飯０．
５ に生理食塩水４．
５ を加え，十分に撹

熱 滅 菌 し た ガ ラ ス ビ ー ズ と と も に BugCrasher

拌した。撹拌後，生理食塩水にて段階希釈を行った。こ（TAITEC）にて菌体を破砕した。以後は，フェノールの希釈液を培地に接種し，６０℃で３日間培養した。分離・クロロホルム法にてDNA抽出を行った。一般細菌を培地として，０．
６％ gellan gum含有GS培地（１．
０ につ対象としてTable１に示したプライマーセットを用いて

き１．
０ MgSO４，２．
０ yeast extract，１０ polypeptone

PCR法 に て 検 出 を 行 っ た１０）。反 応 液２
５µ （５．
０µ ５×を 溶 解 後，NaOHに てpH７．
０に 調 整。１２
１℃１
５分 間，オPrimeSTAR

!

!

!

"

"

"

"
"

buffer, ２．
０µ dNTP Mixture，
０．
５µ each""" dH O）を 用 い て，PCR反 応（９４℃ for ５

ートクレーブ滅菌）を用いた。培養後，出現したコロニ

primer, ０．
２５µ TaKaRa PrimeSTAR , １．
０µ 鋳型DNA,ー数を数えた。また，保温２
４時間目の試料について炊飯

１
５．
７
５µ

器釜内の米飯を上層，中層，下層に３分画し，それぞれmin，９４℃ for １min＊ , ６
３℃ for １min, ７
２℃ for １min,の画分の菌数分布を調べた。

go to ＊３
５times, ７
２℃ for ５min, ４℃ forever）を 行 っ

３．変敗原因細菌の残存場所の推定た。アガロース電気泳動により増幅が確認されたPCR産２

保温２
４時間後と炊飯釜および内蓋を洗浄・乾燥後の２物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient

つの時点で変敗原因細菌の残存性確認実験を行った。な

Gel Electrophoresis : DGGE）法 に 供 し た。DCodeお，拭き取り地点は炊飯器内部のうち，炊飯釜，内蓋universal mutation detection system（Bio-Rad）を 用（表面・裏面），パッキンとその隙間，水蒸気口など計１
６い，アクリルアミド濃度８．
０％，変性剤濃度勾配は３５％か所を選択した。まず，滅菌綿棒にて各試験個所を拭きから５０％となるように調製した（１００％変性剤は７M尿取った。それをGS液体培地に懸濁し，５０℃にて３日間素と４０％formamideを含む）。電気泳動は４
０V，
３
０分，
６
０℃

培養した。培養後に培地に濁りがみられ，生育が確認さの予備泳動後に６
０V，１
２．
５時間，６
０℃の条件で本泳動をれたものを陽性と判断した。

行った。電気泳動後，アクリルアミドゲルはSYBR

４．変敗原因細菌の分離Green I nucleic acid gel stain（Lonza）溶 液 中 で３０分

変敗を起こす炊飯器SRより，細菌の分離を直接分離

間の染色を行った。染色後，Molecular Imager FX Pro法にて試みた。SRを用いて炊飯後に 保 温 し，継 時 的（Bio-Rad）により検出した。検出されたバンドを切り出

（０，２
４，４
８，７
２時間）に米飯を採取した。培地や培養

し，PCRによる再増幅を行った。さらに，PCR産物を用

条件は上記２．
に準じて行った。培地上に出現したコロ

いて，１−５と同様の方法でシークエンス解析を行った。

ニーを釣菌し，０．
６％ gellan gum含有GS培地（GSG培

７．モデル試験による米飯変敗の再現実験地）を用いて純粋分離を行った。分離した菌株について!

スクリューキャップ付き試薬ビンに未汚染米飯２０ を
３グラム染色し顕微鏡にて形態観察を行った。分離菌株は分取し，１０spore／g になるように分離菌株の芽胞を接種

１０％グリセロール溶液に懸濁後，−８０℃にて保存した。

した。これを６０，７０，７５，８０℃にて保温し，接種直後か

５．１
６S rRNA遺伝子塩基配列に基づく系統解析!

ら１２時間おきに７
２時間後まで米飯を０．
５ 分取した。分

分離菌株２０株について１
６S rRNA遺伝子塩基配列に基取した米飯を用いて上記２．
と同様の方法にて培養を行づく系統解析を行った。分離菌株からのDNA抽出はZHU

い，出現したコロニー数を測定した。なお，米飯に接種

らの方法８）に従って行った。各遺伝子の増幅に用いたプ

した芽胞はスポア実験マニュアル１１）に従って調製した。

Table１ PCR primers used in this study
Primer
U９
６
８GC
R-１
４
０
１

Sequence（５ to ３ ）CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG
CCAACGCGAAGAACCTTAC
CGGTGTGTACAAGACCC

Target microorganisms

Reference

Bacteria

８

Bacteria８

（ 13 ）

〔報文〕 米飯を変敗させる細菌の推定

243

３．変敗原因細菌の分離

実験結果および考察

変敗が確認された米飯から細菌の分離を試みると培地

１．保温時間による菌数変化

上 に コ ロ ニ ー が 確 認 さ れ た。こ の 中 か ら 保 温 時 間

保温時間による菌数の経時的変化をFig．
１に示した。

（０，２
４，４
８，７
２時間）ごとに５株釣菌し，計２０菌株にNRでは，保温を７２時間継続しても菌数は検出限界以下

ついて純粋分離し，保存を行った。全分離菌株を顕微鏡

１

（＜１．
０×１
０）であった。一方，SRでは０時間後で菌数にて観察をしたところ，全菌株はグラム陰性桿菌で芽胞は３．
６×１０２colony form unite（cfu）／gであり，２
４時間後を形成していた。このことから変敗の原因菌は好熱性の４!と保温開始時の約１００倍に達してい

には１．
６×１
０cfu／

た。さらに保温を継続することにより菌数は増加し，７２!にまで増加した。また，細菌

芽胞形成細菌であることが示唆された。
４．１
６S rRNA遺伝子塩基配列に基づく系統解析

時間後には４．
６×１
０６cfu／

分離菌株の１
６S rRNA 遺伝子のシークエンス解析よの分布を検討したところ，上層部，中層部および低層部り得られた塩基配列を用いて，近隣結合法により系統の菌数はそれぞれ３．
３×１
０５cfu／g，１．
３×１
０４cfu／g および樹を作成した（Fig．
２）
。すべての分離菌株は系統的に

３

３．
３×１
０cfu／g であった。最も生菌数が多かったのが上

Geobacillus属に属することが明らかになった。また，各層部であったことから，変敗の原因となる細菌は好気性配列について EMBL/GenBank/DDBKのデータベースである可能性が示唆された。変敗が繰り返し起るSRかに て 相 同 性 検 索 を し た と こ ろ，Geobacillus

らのみ，細菌の存在が確認されたことから，変敗に関与

thermoleovorans１２），１３）と９
９％以 上 の 相 同 性 を 示 し た。

している可能が高いと考えられた。

Geobacillus属細菌はBacillus属から再分類された一属で２．変敗原因細菌の残存場所の推定あり，一般的にはグラム陽性を示す。しかし，菌種によ

保温時の変敗は繰り返し生じることから，炊飯器内のってはグラム陰性と同じ色に染色されることがある。G.

いずれかの箇所で変敗原因細菌が残存している可能性がthermoleovoransもグラム陰性に染色されることがあるこ予想された。そこで，炊飯器の内部の拭き取り試験を行とから，前述のように分離菌株がグラム陰性と判定されった。保温時には１６か所中１１か所から細菌が検出された。

た結果と一致した。Geobacillus属細菌は耐熱性芽胞を形

また，洗浄後にも１６か所中１０か所から細菌が検出された。

成する，好熱性細菌であり，食品製造においてフラット

特に内蓋のパッキンやその隙間などから高頻度に検出さサワー菌と呼ばれている１４），１５）。この細菌は芽胞の耐熱性れた。これらの部位は保温時に水蒸気が凝縮した水分がが高いことから，レトルト殺菌で完全に殺菌ができない。

特に溜まりやすい部分であった。通常の洗浄ではこれら

そのため，容器詰食品や飲料を加熱販売する際に特別なの細菌を除去することは難しいと考えられた。米飯は注意が必要とされている。

１
００℃以上で炊き上げることからほぼすべての細菌は死５．PCR-DGGE法による変敗原因細菌の検出

滅してしまうことからも，耐熱性芽胞細菌が関与してい一般細菌を検出するプライマーセットにてPCRを行っることが考えられた。耐熱性芽胞であれば，洗浄や炊飯たところ，増幅が確認された（Fig．
３）
。このPCR産物を時の熱では死滅せず，休眠することが可能である。つまDGGEに供し，菌叢をモニタリングした。その結果，保り，炊飯後の保温中に芽胞が発芽し，栄養細胞へと変化

温０時間目には細菌は検出されなかった。しかし，保温するため，変敗が繰り返し生じると考えられた。

２
４時間目になるとバンドが複数確認され，これらのシー

7

7
NR

SR

5
4
3
2

5
4
3
2
1

1
N.D. *
00(b)

6
Log CFU/ g

Log CFU/ g

6

(a)

N.D.

N.D.

24
48
Time (hour)

N.D.
72

0

upper part

middle part lower partFig．
１ Comparison of the number of cells during heat insulating（a）and distributionof contaminated bacteria in the cooked rice（b）
NR ; normal rice cooker, SR ; spoilage rice cooker.
＊
N.D. : Not Determined

244

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
０ NO．
５ ２
０
１
４
77

Geobacillus thermantarccus DSM 9572T (FR749957)
Geobacillus thermoglucosidasius DSM 2542T (FN428685)
Geobacillus caldoxylolycus DSM 12041T (AF067651)
Geobacillus toebii DSM 14590T (FN428690)
Geobacillus galactosidasius DSM 18751T (AM408559)
97
Geobacillus thermolevorans DSM 5366T (Z26932)

93

0.01

（ 14 ）

Isolated strain No 1 - 20

96

Geobacillus uzenensis DSM13551T (AF276304)
84 Geobacillus jurassicus DSM 15726T (FN428697)
Geobacillus lituanicus DSM 15325T (AY044055)
Geobacillus kaustophilus DSM 7263T (X60618)
Geobacillus vulcani DSM 13174T (AJ293805)
Geobacillus thermocatenulatus DSM 730T (AY608935)
96
Geobacillus stearothermophilus DSM 22T (FN428694)
Geobacillus subterraneus subsp. aromacivorans DSM 23066T (HE613733)
Geobacillus thermodenitriﬁcans subsp. thermodenitriﬁcans DSM 465T (FN538993)
98
72
Geobacillus thermodenitriﬁcans subsp. calidus DSM 22629T (EU477773)
73
Geobacillus subterraneus subsp. subterraneus DSM 13552T (AF276306)
Geobacillus debilis DSM 16016T (FN428699)
Anoxybacillus tepidamans DSM 16325T (FN428691)
Aeribacillus pallidus DSM 3670T (Z26930)
Brevibacillus brevis NBRC 12622T (AB271756)

Fig．
２ Phylogenetic relationship of the isolates and closely related species based on １
６S
rRNA gene
The tree was constructed by neighbour-joining method. Brevibacillus brevis NBRC １２
６２
２T was used
as an outgroup. Bootstrap percentages above ７
０％ are given at branching points. Bar indicates １.
０％ sequence divergence.

(a)
Bacteria
M 1

8

(b)

7

2

3

1

4

2

3

4
6
Log CFU/ g

(bp)

1,000
500
a

b
c
d

60℃

5

70℃

4

75℃
80℃

3
2
1
0
0

12

24

36

48

60

72

Time (hour)Fig．
３ Detection of contaminated microorganisms
PCR（a） and PCR-DDGE（b） method

by

Fig．
４ Reproducibility of cooked rice deterioration by
the model test

Lane M, １００bp ladder ; １, ０h heating insulating ; ２, ２４h
heating insulating ; ３, ４８h heating insulating ; ４, ７２h heating
insulating. DGGE profile of PCR products of the cooked rice
samples obtain with the bacterial universal primer set（U９６８GC and R-１
４０１）. Labelled bands with letters a to d wereidentified to the following species : a, Oryza sativa ; b, c, d,Geobacillus thermoleovorans

The spore of the used strain were inoculated to cooked rice
and incubated at ６０, ７０, ７
５ and ８０℃.

かをモデル試験にて確認した。変敗の原因となる細菌が生菌体として炊飯器内で生育していることは考えにくく，分離菌株が芽胞を形成することから本実験では培養菌体よりも芽胞を添加したほうが，より炊飯器での変敗に近クエンス解析およびデータベース上のデータとの相同性い状況での再現ができると判断し，芽胞を接種後，経過検索を行った結果，すべてG. thermoleovoransと９９％以を観察した。その結果，保温温度６０℃と７０℃で生菌数の上の相同性を示した。この菌叢は保温７２時間目において増加が認められた（Fig．
４）
。さらに米飯からの離水や異も菌叢に変化はなく安定したものであった。この結果は臭が確認され，炊飯器での変敗と同様の現象が確認され分離の結果を支持するものであった。なお，カビや酵母た。Bacillus属細菌はデンプンを含有する食品で増殖すについてはPCR法にて検出されなかった（データ未掲

ることにより離水現象を引き起こすことがある１６）。今回

載）。この結果より，G. thermoleovorans以外の微生物がの離水現象も同様に細菌が影響していると推察される。

変敗に関与した可能性は非常に低いと考えられた。

一方，７
５℃と８
０℃では生菌数の増加や米飯からの離水は６．モデル試験による米飯変敗の再現実験

認められなかった。つまり，分離菌株が有する芽胞は保分離菌株が炊飯器内と同じ状況下で米飯を変敗させる

温時に発芽し，増殖することが示された。

（ 15 ）

〔報文〕 米飯を変敗させる細菌の推定

本研究により，耐熱性芽胞を形成する好熱性細菌であ245４）KASAI, Y., KIMURA, B., KAWASAKI, S., FUKAYA, T.,

るG. thermoleovoransが米飯の変敗に関与していたこと

SAKUMA, K. and FUJII, T. :を明らかにした。これまで米飯をはじめとするデンプン

production by Clostridium botulinum

を含む加工食品の汚染は，中温域（３０〜３７℃付近）で良rice aseptically packed under modified atmosphere,

好な生育を示す，Bacillus属細菌によるものが多く報告

J . Food Prot., ６
８, １
０
０
５〜１
０
１
１（２
０
０
５）

されている。米飯保温中の変敗に関与する細菌としてこれ ま で にB. stearothermophilusが 報 告 さ れ て い る がG.

Growth and toxin
in steamed

５）小 田 隆 弘：ブ ド ウ 球 菌 食 中 毒 と 原 因 物 質，月 刊
HACCP，２（３）
，６
７〜７
３（１
９
９
６）
６）柳川義勢：セレウス菌食中毒，月刊 HACCP，２（７），thermoleovoransの報告例はこれが初めてとなる。
炊飯器への混入経路を明らかにするために，これまで
Geobacillus属細菌の分離報告例のある糠をはじめとして，

５
４〜５
７（１
９
９
６）
７）松下

功・尾山祥子・城野久美子：ガス加熱の特性

精米後の白米などから分離を試みたが，分離には至らなを活かしたガス炊飯中の米飯の保存性，防菌防黴誌,

かった（データ未掲載）。本研究により，Geobacillus属

２
７，４
９
５〜５
０
３（１
９
９
９）

細菌による米飯の変敗事例に関する知見を得ることができた。これらの知見が今後，食品業界における細菌汚染

Isolation of

genomic DNAs from plants, fungi, and bacteriausing benzyl chloride, Nucleic Acids Res., ２
１, ５
２
７
９〜

事故の対策に役立てられることを期待したい。

要８）ZHU, H. , QU, F. and ZHU, L. H. :

５
２
８
０（１
９
９
３）

約

９）IRISAWA, T. and OKADA, S. : Lactobacillus sucicola

家庭用の炊飯器にて米飯を保温するとその過程で米飯

sp. nov. , a motile lactic acid bacterium isolated

から異臭がする事例が生じた。この原因が細菌によるもfrom oak tree（Quercus sp.）sap, Int. J. Syst. Evol.

のと考え，変敗原因細菌の特定を試みた。培養法にて原Microbiol ．
５
９, ２
６
６
２〜２
６
６
５（２
０
０
９）

因細菌を分離したところ，炊飯器の保温温度である６０℃

１０）HUWS, S. A. , EDWARDS, J. E. , KIM, E. J. andで旺盛に生育する好熱性の細菌を分離した。これらは１６SCOLLAN, N. D. :S rRNA遺伝子に 基 づ く 系 統 解 析 とEMBL/GenBank/

eubacterial primers utilized for molecular profiling

DDBJのデータベースを用いた相同性検索からからG.

of bacteria within complex microbial ecosystems. J

thermoleovoransであると考えられた。さらにPCR-DGGE

Microbiol Methods., ７
０, ５
６
５〜５
６
９（２
０
０
７）

Specificity and sensitivity of

法を用いて変敗した米飯から遺伝子レベルでの細菌の検１１）近藤雅臣・渡部一仁：スポア実験マニュアル−微生

出を行った。その結果，培養法と同様にGeobacillus属細物の芽胞・胞子の基礎研究から応用まで−，技報堂出菌が検出された。以上の結果より，炊飯器の保温環境と
い う 特 殊 な 環 境 に 好 熱 性 芽 胞 形 成 細 菌 で あ るG.

版，p．
２
２（１
９
９
５）
１
２）ZARILLA,

K.

and

PERRY,J.

J. :Bacillus

thermoleovoransが混入し，変敗を引き起こすとともにG.

thermoleovorans sp. nov. , a species of obligately

thermoleovoransが形成する芽胞が炊飯器内に残存するこ

thermophilichydrocarbon

utilizingendospore -forming bacteria, Syst. Appl. Microbiol ., ９, ２
５
８〜２
６
４

とにより繰り返し，変敗が起ること考えられた。

（１
９
８
７）
謝

辞

本研究を遂行するにあたりご協力頂いた，川１３）NAZINA, T. N., TOUROVA, T. P., POLTARAUS, A. B.,

口祐来氏，島田麻央氏（東京農業大学応用生物科学部生

NOVIKOVA, E. V., GRIGORYAN, A. A., IVANOVA, A. E.,

物応用化学科）をはじめ，関係の方々に感謝申し上げま

LYSENKO, A. M., PETRUNYAKA, V. V. OSIPOV, G. A.,

す。

BELYAEV１ , S. S. and IVANOV１ , M. V. : Taxonomic
study of aerobic thermophilic bacilli : descriptions
文

献of Geobacillus subterraneusgen. nov. , sp. nov. and１）好井久雄・金子安之・山口和夫：食品微生物学ハンドブック，技報堂出版，p．
３
２
２（１
９
９
５）

Geobacillus

uzenensis

sp.

nov.

from

petroleumreservoirs and transfer of Bacillus stearothermophilus,

２）石田和夫：生米におけるBacillus cereusの汚染実態

Bacillus thermocatenulatus, Bacillus thermoleovorans,と米飯での増殖，名古屋文理短期大学紀要，１３，２５〜Bacillus kaustophilus, Bacillus thermoglucosidasius and

３
１（１
９
８
８）

Bacillus thermodenitrificans

to Geobacillus

newstearothermophilus,

３）OKAHISA, N. , INATSU, Y. , JUNEJA, V. K. andcombinations

G.

as theG.

KAWAMOTO, S. : Evaluation and control of the risk

thermocatenulatus, G. thermoleovorans, G. kaustophilus,ofG. thermoglucosidasius and G. thermodenitrificans, Int.

foodbornepresentinpathogensandspoilage

Awa - Uirou,astickybacteria

rice

cake

containing sweet red bean paste, Foodborne Pathog
Dis. ５, ３
５
１〜３
５
９（２
０
０
８）

J. Syst. Evol. Microbiol ., ５
１, ４
３
３〜４
４
６（２
０
０
１）
１
４）CAMERON, E. J. and ESTY, J. R. : The examinationof spoiled canned foods．
２．Classification of flat-sour

246

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
４
０ NO．
５ ２
０
１
４

spoilage organisms from non-acid foods, J. Infect.
Dis., ３
９, ８
９〜１
０
５（１
９
２
６）
１
５）FIELDS, M. L. : The flat sour bacteria, Adv. FoodRes., １
８, １
６
３〜２
１
７（１
９
７
０）

（ 16 ）

１６）内藤茂三：Bacillus属細菌による食品の変敗と防止技術，SUNATEC e-Magagine，３
９, １〜９（２
０
０
９）
（平成２
６年２月１
７日受付，平成２６年７月１６日受理）