[食品・臨床栄養 e2017_1-9]

報文
麹菌発酵大豆培養物（イムバランス）の Th2 サイトカイン抑制作用とその活性成分について
Inhibitory effects of fermented soybean culture (ImmuBalance®) and that activity component on
T-helper type 2 responses
眞岡孝至*1、安井菜穂美 2、根岸裕子 2、池田克己 2、天海智博 3（投稿日：2017.3.30、受理日：2017.5.9）

麹菌発酵大豆培養物（イムバランス）に含まれるアレルギー反応の抑制活性物質ついて検討した。ヘルパーT 細胞(Th)2 サイトカインの産生抑制を指標としてゲルろ過 HPLC でイムバランスに含まれる活性成分を分画した。その結果、分子量 10,000 程度の水溶性多糖類画分に活性が認められた。この活性成分の構造を NMR および糖の加水分解により検討した。
この多糖類は大豆細胞壁の不溶性多糖を味噌用麹菌（Aspergillus oryzae）が低分子可溶化したもの、すなわち醤油多糖（アラビノガラクタンとアラビノキシラン）類似の物質であることが明らかになった。さらにこの多糖類画分には共存する乳酸菌（Enterococus faecium および Pediococcus parvulus）由来の水溶性多糖類も含まれることが分かった。

キーワード：イムバランス、麹菌、麹多糖、Th2 サイトカイン抑制作用

藻などの食材が長寿国の“秘密”であり,特1. 緒言に味噌など麹菌による発酵大豆食品を日常疫学調査では、日本伝統な食文化である的に摂取していることが、欧米人に比べて主食の米飯に加えて、大豆、魚、野菜や海日本人の乳がん、前立腺がん及び心臓疾患などの発症率や死亡率を低減させている要＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
1

因として知られている。一方では、全人口生産開発科学研究所の 20～30％が何らかのアレルギーを持つと〒606-0805 京都市左京区下鴨森本町 15いわれている 1)。その数は年々増加してい2武庫川女子大学薬学部

る。環境要因及び食事の欧米化などがアレ〒663-8179 西宮市甲子園九番町 11-68

ルギー罹患率の増加の原因と考えられる。

3

ニチモウバイオティックス株式会社

喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、〒140-0002 東京都品川区東品川 2 丁目 2 番 20 号

花粉症などのアレルギー疾患は、生活の質*著者連絡先 E-mail: maoka@mbox.kyoto-inet.or.jpを低下させる深刻な社会問題となっている。
これらのアレルギーの治療法は対症療法が1

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ほとんどで、未だに根治療法は開発されて2. 実験いない。そこで、副作用のない安全かつ有効な天然成分由来の物質に注目が集まって2.1

いる。

装置

分取ゲルろ過クロマトグラフィーはイムバランス (ImmuBalance) は遺伝子

LC-908クロマトグラフ（日本分析工業）に組み換えしていない脱脂大豆をニチモウバ

ゲルろ過カラムJAIGEL GS320（日本分析工イオティックス（株）の開発した独自の発業、排除限界分子量40,000 Da）を2本直列に酵技術により味噌用麹菌（Aspergillus oryzae

繫ぎ、蒸留水を移動相（流速 3.8mL/min））を用いて発酵させたものである。すなわとした。成分の検出は示差屈折（RI）によち、日本の伝統的な麹菌発酵技術に基づいった。分子量の標準マーカーとしてポリエて味噌用麹菌（A. oryzae）を脱脂大豆に発チレングリコールを用いた。1H NMR (500

酵させ、麹菌が十分繁殖した時点で製麹をMHz) および13C NMR (125 MHz) はInova

終了してタンパク質と多糖類を加水分解し500 (Varian)で重水(D2O)を溶媒として測定て低分子化させる。これとともに共存するし た 。 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ は

乳 酸 菌 （ Enterococus faecium お よ びHewlett–Packard 6890:5973 GC/MS システ

Pediococcus parvulus）による乳酸発酵によムを用いた。って培養物を酸性にして雑菌の繁殖を抑えることで麹菌、乳酸菌発酵させたものであ2.2

多糖類の構成糖の検討る。その製造技術は日本（日本特許：2696057

多糖類を塩酸で加水分解して得られた糖号 , 3014145 号 ）、 米 国 （ US Patent No.:は ト リ メ チ ル シ リ ル 化 し た 後 6890:59735885632）、欧州（EP 0682877）の特許を取GC/MS シ ス テ ム得している。イムバランスのアレルギー反DB17カラムを用いて分析した。ガスクロマ

応抑制作用は基礎研究及び臨床研究においトグラフィーの昇温条件は初めに180°C で2～6)2分間保ちその後2 °C/minで260°C まで昇温

アレルギー免疫はヘルパーT（Th）細胞がした後、260°C で20分間保った。糖の同定

産生するサイトカインの種類によって Th1、は標品とのリテンションタイムの比較によ

Th2、Th17、iTreg（inducible regulatory T 細った。てすでに認められる。

(Hewlett–Packard) で胞）の少なくとも 4 種類に分類される。通常は互いの機能を抑制しあっているのでバ

2.3

サイトカインの産生抑制作用の検討

ランスを取りながら免疫反応を担っている

AKR マ ウ ス 由 来 の コ ン ア ル ブ ミ ン

が、そのバランスが崩れて Th2 細胞優位に（CA：卵白アレルゲン）特異的 Th2 細胞クなった場合に、アレルギー疾患が発症する

ロ ー ン で あ る D10.G4.1 （ D10 ） 細 胞と考えられている。今回、イムバランスに（TIB224）を米国細胞株・微生物株・遺伝含まれる Th2 サイトカインの産生抑制成分

子バンク（ATCC）より得て AKR マウス Bについて検討したので報告する。

細胞（脾臓の細胞）と 1 : 5 の量比で混合培養することにより D10 細胞を継代した。
500,000 cell/mL の D10 細胞を調製し、CA(-)

2

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培養液を変更し二日間培養した後実験に供3.17)した 。
24 ウェルプレートに 500,000 cell/mL

イムバランスの構成成分の分子量分布による分離の D10 細胞を 1mL 播き、卵白アレルゲンをまずイムバランス水溶性成分の構成を検加えないものをネガティブ対照とした討するため JAIGEL GS320 を用いるゲルろ(CA-)。ポジティブ対照には卵白アレルゲン過クロマトグラフィーを行って構成成分のを 50μg/mL 加えたものを用いた(CA+)。さプ ロ フ ィ ー ル を 見 た (Fig. 1) 。 JAIGEL

らにポジティブ対照として卵白アレルゲン

GS320 は排除限界分子量（プルラン）40,000にデキサメタゾンを(DEX)添加した群を用のゲルろ過カラムである。Fig. 1 にイムバラいた(DEX/CA+)。試験群は卵白アレルゲンンスのクロマトグラムを示した。それぞれを添加し、イムバランス水抽出物のゲルろの成分の分子量はポリエチレングリコール

過クロマトグラフィーによって得られた（Wako）を分子量マーカーとしてそのリテFr.1（Fig. 1）の凍結乾燥物を 50ng/mL を加ンションタイムから推定した。Fr. 1 は 35～えたもの（Fr. 1/CA+）、同じく Fr. 2 の凍結40 分にかけて溶出する。ポリエチレングリ乾燥物を 50ng/mL を加えたもの（Fr. 2/CA+）

コール 6,000（平均分子量 7,300～9,300）のを用いた。
各群は 5%CO2 下 37℃のインキュ溶出時間が 40～45 分であることから Fr. 1

ベーターにて培養した。72 時間培養の後、の分子量は 10,000 程度であると考えられ各群の上澄みを回収して培養液の IL-4 含量る。Fr. 2 はその溶出リテンションタイムが(ng/mg protein)を ELISA 法によって測定し60～75 分でありグルコースとの比較（溶出た。この細胞試験を 3 回繰り返し実施した。

時間 65～70 分）から分子量は 500～100 と考えられる。

3. 結果および考察

Fig. 1 イムノバランス水溶性成分のゲルろ過クロマトグラム
固定相：JAIGEL GS-230×2、移動相：水、流速：3.80 ml/min、検出：RI、なお標準物質として用いた PEG 6000 とグルコースの溶出時間を図の下に黒線で示した。

3

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3.2 イムバランスから分離したフラクションの Th2 サイトカイン抑制作用

3.3 イムバランス高分子成分のキャラクテイムバランスから分離した Fr. 1 および Fr.

リゼーション

2 の Th2 サイトカイン抑制効果を Fig. 2 に示

続いて顕著な Th-2 サイトカイン抑制作用した。Th2 サイトカイン抑制作用は Fr. 1 にが認められた高分子画分の構成成分につい顕著に見られた。すなわち Fr. 1 添加群は卵て検討した。すなわちゲルろ過クロマトグ

白アレルゲン添加群（CA+群：ポジティブラフィーによって高分子画分である Fr. 1 を対照）に対して約 50%のサイトカインの産分取したのち凍結乾燥して得られた残渣を生抑制を示した。この群の IL-4 含量は卵白重水に溶解して 1H NMR および 13C NMRアレルゲンを加えていないネガティブ群によりその構造を検討した。Fig. 3 にイムバ(CA-)とほぼ同じであった。一方 Fr. 2 添加群

ランスの高分子画分の NMR を示す。 1Hはポジティブ対照に対して 10%ほどの抑制

NMR では 3.6 ppm から 4.3 ppm にかけての効果しか示さなかった。この結果からイムブロードなシグナルと 5.0 ppm から 5.2 ppm

バランスの Th2 サイトカイン抑制作用は Fr.

にかけてのブロードなシグナルが見られた。

1 に含まれる成分に存在する事が明らかにこのシグナルパターンは多糖類に特徴的ななった。

シグナルパターンである。すなわち 3.6 ppmから 4.3 ppm にかけてのシグナルは糖の H-2から H-6 位の 5.0 ppm から 5.2 ppm にかけてのシグナルは糖の H-1 位のシグナルと帰属される。13C NMR では 60 ppm から 85 ppmにかけてのブロードなシグナルと 107 ppm付近のシグナルが見られた。同様に 60 ppmから 85 ppm にかけてのシグナルは糖の C-2位から C-6 位のシグナル、107 ppm 付近のシグナルは糖の C-1 位のシグナルと帰属できる。したがってイムバランスの高分子画分は主に多糖類から構成されることが分かった。
この多糖類の構成糖を検討するため塩酸

Fig. 2. イムバランスから分離したフラクシ
ョンの Th2 サイトカイン抑制作用
CA- : 卵白アレルゲン無添加群（ネガティブ対照）、CA+ : 卵白アレルゲン添加群（ポジティブ対照）、DEX/CA+ : 卵白アレルゲンにデキサメタゾン(DEX)添加をした群、
Fr. 1/CA+ : 卵白アレルゲンに Fr. 1 の凍結乾燥物 50ng/mL を添加した群、Fr. 2/CA+ : 卵白アレルゲンに Fr. 2 の凍結乾燥物 50ng/mLを添加した群。
（n=3, * p<0.05 vs CA+群）

で加水分解して得られた単糖混合物の 1H
NMR および 13C NMR の測定(Fig. 4)とそれらをトリメチルシリル化して個々の構成単糖をガスクロマトグラフィーにより分析した。加水分解して得られた単糖混合物のNMR(Fig. 4)からは通常の六単糖のシグナ
ルに加え 1.07 ppm と 1.03 ppm にダブレッツ
ト(J=6.5 Hz)のメチル基（13C NMR では 15.14

[食品・臨床栄養 e2017_1-9]ppm）のシグナルが見られる事からデオキース、キシロースが検出された。これらのシ糖の存在が示唆される。トリメチルシリ単糖の構成比を Table１に示す。

ル化物のガスクロマトグラフィーを標品の麹菌は大豆細胞壁の多糖類を低分子可溶糖のトリメチルシリル化物とのリテンショ化する。今回イムバランスの多糖類を加水ンタイムの比較によりマンノース、グルコ分解してアラビノースとガラクトースおよース、ガラクトースに加えデオキシ糖であびキシロースが主成分で得られた。これはるラムノースさらに五単糖であるアラビノ

Fig. 3.

イムバランス多糖類 (Fr, 1) の 1H NMR および 13C NMR (重水中)。

5[食品・臨床栄養 e2017_1-9]

Fig. 4

イムバランスの多糖を加水分解して得られる単糖類混合物の重水中の1H-NMR （上段）と 13C-NMR（下段）。

大豆細胞壁を構成する主多糖類であるアラている。従ってイムバランスに含まれる多ビノガラクタンとアラビノキシランに由来糖類には乳酸菌由来の成分も含まれると考すると考えられる 8)。リボースとマンノーえられる。

スについても菊池らは濃縮大豆を原料としなお菊池らは大豆の蒸煮によって抽出さた水溶性多糖の構成成分にその存在を報告れる酸性多糖類の構成成分としてデオキシ。これらの事からイムバランス糖であるラムノースを報告している 8)。今の多糖類はダイズ細胞壁の不溶性多糖を麹回われわれも Fr. 1 の多糖類の加水分解物に菌が低分子化して可溶化したもの、すなわ

ラムノースが 7.6％含まれていることを確

ち醤油多糖(sps: Shoyu polysaccharides) 類似認した。

している9,10)の物質であると考えられる。
また乳酸菌（Enterococus faecium およびPediococcus parvulus）は菌体外に水溶性多糖類を分泌する事が知られている 11)。これ
ら乳酸菌の分泌する多糖類はグルコースを構成糖とすることが知られている 12) 。Table
1 に示したように Fr. 1 の多糖類の加水分解物にはグルコースも少量（1.5％）含まれ

6

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Table 1 イムバランスの多糖を加水分解しから直接多量に摂取することは含まれる塩て得られる単糖とその量比(%)。

分の関係で難しい。醤油多糖類は醤油にエタノールを混合することにより沈殿物や醤単糖

含量 %油を透析処理したあとの非透析物として得

ラムノース

7.6

ることができるが調整する事が大変である。

リボース

3.6

従ってイムバランスは醤油多糖類似物質お

フコース

7.4

よび乳酸菌由来の多糖が含まれることから

アラビノース

41.4

有効な機能性素材である。

キシロース

10.4

フルクトース

±

マンノース

4.0

グルコース

1.5

ガラクトース

23.7

日本の伝統的な麹菌発酵技術に基づいて作られた機能性麹菌発酵食品は、乳酸菌のプロバイオティクスより顕著な効果が確認され 3)、日本特有の麹プロバイオティクスである。

4. 結論
麹菌発酵大豆培養物（イムバランス）のアレルギー反応の抑制活性物質を Th2 サイトカイン産生の抑制作用を指標として検討した。その結果、分子量 10,000 程度の水溶性多糖類画分に強い活性が認められた。この画分の構造を NMR および糖の加水分解などで検討した結果、この多糖類は大豆細胞壁の不溶性多糖を麹菌が低分子可溶化したもの、すなわち醤油多糖（アラビノガラクタンとアラビノキシラン）と類似の物質であると考えられる。また乳酸菌（
Enterococus faecium および Pediococcusparvulus）の水溶性多糖類も含まれていると考えられる。この多糖類は醤油多糖と異なり、我々の独自の特許製法（日本特許：2696057 号、3014145 号、US Patent No.:5885632、EP 0682877）で製造したものであり、麹多糖 (koji polysaccharides) と命名した。
醤油多糖は免疫賦活作用やアレルギー抑制などの効果が知られている 13~15) が醤油7

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unique to individual cloned helper T cell8

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ArticleInhibitory effects of fermented soybean culture (ImmuBalance®) and that activity component
on T-helper type 2 responses
Takashi Maoka*1, Naomi Yasui2, Hiroko Negishi2, Katsumi Ikeda2 , Tomohiro Amami3
1) Research Institute for Production Development, 15 Shimogamo-morimoto-cho Sakyo-ku, Kyoto,606-0805, Japan
2) School of Pharmacy and Pharmaceutical Science, Mukogawa Women's University, 11-68,
Koshien-9-bancho, Nishinomiya 663-8179, Japan
3) Nichimo Biotics Co.Ltd., 2-2-20, Higashishinagawa, Shinagawa-ku, Tokyo 140-0002, Japan

Received March 30, 2017; Accepted May 9, 2017

ImmuBalance® is a fermentation product of a defatted soybean with koji fungus (Aspergillusoryzae) and lactic acid bacterium (Enterococus faecium and Pediococcus parvulus). The active
compound of ImmuBalance® was screened with down-regulation of Th2 responses assay. As theresult, macromolecule fraction having molecular weight about 10,000 showed strong activity. The
structure of this compound was determined as polysaccharides by NMR. Hydrolysis experimentshowed that this polysaccharide was mainly consisted with arabinose (41.4 %), galactose (23.7 %),and xylose (10.4 %). The results indicated that this polysaccharide was resembled to soy sauce
polysaccharides (arabinogalactan and arabino xylan). Furthermore, rhamnose, ribose, fucose,mannose and glucose were identified as minor components. These sugars might be derived frompolysaccharides produced by lactic acid bacterium (Enterococus faecium and Pediococcus parvulus).
Therefore, the activity compound of ImmuBalance® was called as koji polysaccharides. Koji
polysaccharides protect against allergic reaction that protection was associated with down-regulationof Th2 responses

Key Words
ImmuBalance®, koji fungus, koji polysaccharides, Th2 response down-regulation（責任編集委員：石嶌純男）9