59●順相液体クロマトグラフィーによるペプチド分離法の開発
東ソー分析センター

2.3

1．はじめに

吉田 達成
笠原 泉司

分離方法（クロマトグラフ測定）

分離条件を種々検討の結果、以下に示す条件に決定

ペプチドの液体クロマトグラフィー（HPLC）は、した。

生体の抽出液からペプチド類を分離・精製する手段とNPLC：A液（初期溶液）には水−ACN（3：97，して、大変有用である。中でも逆相液体クロマトグラv／v）、B液（展開溶液）には水−ACN（45：55，v／

フィー（RPLC）は、ペプチド分離に要求される（1）v）で、0.1％TFAを添加したものを用いた。ペプチド

高分解能である（2）操作が容易である（3）分離後ペはA液100％からB液100％への70分グラジエント

プチドの単離が容易の3つの条件を満たしているため、（0.6％water／min）で溶出させた。

最も多用されている。しかし、親水性の高いペプチド

RPLC：A液（初期溶液）には水−ACN（95：5，を保持することができないため、これらを取り扱うこv／v）、B液（展開溶液）には水−ACN（45：55，v／とができない。このようなペプチドに対してはイオンv）で、0.1％TFAを添加したものを用いた。ペプチド交換クロマトグラフィーが使用されるが、これは上記はA液100％からB液100％への83.3分グラジエントの要求項目（3）の要件を欠いているため問題がある。

（0.6％water／min）で溶出させた。
移動相の流量は1.0ml／min、検出は215nm、カラム

上記要求3項目を満足するクロマトグラフ法の開発がオーブン温度40℃で測定を行った。

求められている。
そこで、逆相法では取り扱うことができないような親水性の高いペプチドの分離が可能であり、且つペプ

3．結果・考察

チド分離に要求される上記3つの項目を満足するペプ

このNPLCは、極性固定相を用い、また、移動相のチドの順相液体クロマトグラフィー（NPLC）を開発

極性（水の比率）を増加させることでペプチドを溶出したので報告する。

させることから、順相法に属すると考えられる［1−5］。

2．操作

2.1

薬試

市販標準ペプチドを用いて、RPLCとNPLCとの選択性の違いを観察した。図１（上）はRPLCで分離したクロマトグラムであり、親水性の高いペプチド1，5，アセトニトリル（ACN ）はHPLCグレード品（半井8はほとんど保持がない。図１（下）はNPLCで分離化学製）を用い、トリフルオロ酢酸（TFA）は和光純
薬製をそのまま用いた。水はMilli-Qシステムで精製し5たものを用いた。ペプチドは、Sigma、プチド研究所（大阪）の市販標準品を用いた。ペプチド消化物試料

4008
1はConcanavalinAをトリプシンで酵素消化したものを46用いた。
2.2装置

327（逆相法）
TSKgel ODS−80Ts

200

HPLCシステムは、東ソー製8020シリーズ、送液ポ

12

ンプCCPM-Ⅱ、UV-8020検出器、AS-8020オートサン
プラー、CO-8020カラムオーブン、SC-8020データ処理装置を用いた。カラムは東ソー製、TSKgel Amide80、TSKgel ODS-80Ts（25cm×0.46cm i.d.）を用いた。

7 8（順相法）
TSKgel Amide−8040
溶出時間（分）60

530020Peak identification：1＝PG；2＝LG；3＝FG；4＝EHP−NH2；
5＝VGSQ；6＝GGYR；7＝WAGGDASGE；8＝DSDFD.

図１（ 59 ）64

NPLCとRPLCとの比較クロマトグラム

60

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.46（2002）

したクロマトグラムであるが、これら親水性のペプチの各フラクションを順次 NPLCに供した。このクロマ

ド1，5，8は良く保持され、完全に分離されている。

トグラムを図2−2に示す。RPLC分離ではほとんど保このようにNPLCは、RPLCで分離が困難或いは不可持のなかったRP1、RP2は、NPLCによって、RP1から能なペプチド混合物を分離することができる。また、

はTAK、DQK、SKの3つのペプチドに、RP2からはこの選択性の違いは、ただ単純に逆の関係にないこと

LK、SVRの2つのペプチドに分解することができた。

も興味深い［6−7］。

また、RP8はRPLCではシングルピークであったが、次に実試料へ応用とした。タンパク質消化物を試料NPLCでは2つのペプチドと不純物とに分離することに用い、RPLCとNPLCとを組み合わせた2次元HPLCができた［1］。このように、2次元HPLCを用いるこによるペプチドマッピングを検討した 。試料にはとで、17種類のペプチド全てを分離することができた。

Concanavalin Aの酵素消化物（ペプチド数17）を用いこのNPLCは、RPLCでは保持のない画分や分離不可た。まずRPLCを用いて分離を行い、13のフラクショ能であったペプチドを、分離することが可能である。

ンを得た。このクロマトグラムを図2−1に示す。そ4．ま と めTSKgel Amide-80カラムと水−ACN−TFA系移動相を用いるペプチドの順相液体クロマトグラフィーを開RP12発した。この方法は、逆相液体クロマトグラフィーでRP13RP9RP11RP7RP5RP6RP3RP2RP4（mV）

RP1RP8RP10210

は保持できない親水性のペプチドをよく保持し、分離することができる。また、この方法でのペプチドの溶出順序と逆相法によるそれとは、ただ単純に逆の関係ではなく、選択性に大きな違いが観察された。
この選択性の違いを利用して、逆相法と組み会わせ00

図2−1204060Time（min）

80た2次元液体クロマトグラフィーを行うことにより、逆相法だけでは分離できなかったペプチド混合物を完全に分離することができた。今回開発した順相液体ク2次元HPLC（1st, RPLC）

ロマトグラフィーは、逆相法と組み合わせることにより更に有用なペプチドの分離法となることを明らかにした。
171615225（mV）

1413RP1012111098765412325626

RP13RP12RP11RP9RP8RP7RP6RP5RP4RP3RP2RP146Time（min.）ADTIVAVELDTYPNTDIGDPSYPHIGIDIKI｜SVR｜SK｜K｜TAK｜WDMQDGK｜VGTAHIIYNSVDK｜R
145 3178LSAVVSYPNADATSVSYDVDLNDVLPEWVR｜VGLSASTGLYK｜ETNTILSWSFTSK｜LK
169114SNSTHQTDALHFMFNQFSK｜DQK DLILQGDATTGTDGNLELTR｜VSSNGSPEGSSVGR
12106ALFYAPVHIWESSATVSAFEATFAFLIK｜SPDSHPADGIAFFISNIDSSIPSGSTGR｜LLGLFPDAN
171513

図2−25．文献

１．T.Yoshida，Anal.Chem., 69, 3038−3043（1997）
２．T.Yoshida and T.Okada, J.Chromatogr. A, 841,19−32（1999）
３．J.C.Linden, and C.L.Lowhead, J.Chromatogr.,
105,125−133（1975）

４．A.J.Alpert, J.Chromatogr., 499, 177−196（1990）
５．J.YuandZ.E.Rassi,J.High

Resolution

Chromatogr., 17, 773−778（1994）
６．T.Yoshida, J.Chromatogr., A, 808, 105−112（1998）
７．T.Yoshida, T.Okada, T.Hobo and R.Chiba,

Chromatographia, 52, 418−424（2000）

2次元HPLC（2nd, NPLC）（ 60 ）