５－２	 

助成番号 180448
研	 究	 成	 果	 報	 告	 書	 

研究テーマ	 
（和文） ＡＢ	 

病原性大腸菌等の V 型分泌装置による毒性発現機構の解析	 

研究テーマ	 
（欧文） ＡＺ	 

Analysis	 of	 the	 molecular	 mechanism	 of	 the	 type-V	 secretion	 system	 of	 EHEC.	 

研	 
ｶﾀｶﾅ	 ＣＣ	  姓） シオタ	 
究氏	 
代	 
塩田	 
漢字	 ＣＢ
表名	 
Shiota	 ﾛｰﾏ字	 ＣＺ	 者	 名） タクヤ	 

研究期間	 Ｂ

２０１８年～	 ２０１９年	 

拓也	 

報告年度	 ＹR	 

２０１９年	 

Takuya	 

研究機関名	 

宮崎大学	 

研究代表者	 ＣＤ	 
宮崎大学テニュアトラック推進機室・准教授	 
所属機関・職名	 
概要 ＥＡ (600 字～800 字程度にまとめてください。)	 
病原性大腸菌等のグラム陰性菌は、感染に必要な毒素の分泌を種々の分泌装置によって行う。V 型分泌装置に分類される毒素群は通常、タンパク質の N 末端側が毒素ドメイン、C 末端側がβバレル膜タンパク質ドメインから構成される。V 型分泌装置による分泌は、βバレルドメインが、外膜に存在する BAM 複合体と呼ばれる分子装置を介して外膜に組込まれ、その後、毒素ドメインが自身のβバレルの内孔を利用して外膜透過を行い、細胞外へと輸送される。V 型分泌装置の効果的な阻害剤をデザインするためには、これら各ステップの詳細な分子機構の理解が欠かせない。	 
本研究では、腸管出血性大腸菌（EHEC）の V 型分泌装置、EspP をモデル基質として、分泌に関わる分子機構の解析を行った。まず、EspP の膜組込みを高い時間分解能で解析できる in	 vitro 再構築実験系を開発した。BAM 複合体には、機能に必須な BamA と BamD のふたつのサブユニットと、BamB、C、E の補助因子が存在する。我々の解析から EspPの外膜組込みには、必須因子のみが必要である事が明らかになった。また、ペプチドライブラリーを用いた阻害実験から、EspP の外膜組込みを阻害できる 17 アミノ酸残基のペプチドを４種類単離する事に成功した。阻害効果があった
ペプチド配列と、EspP のアミノ酸配列を比較する事により、EspP には BAM 複合体に認識される配列が２ヶ所に存在する事が示唆された。	 
βバレル型膜タンパク質は、グラム陰性菌だけでなく、ミトコンドリア外膜にも存在する。ミトコンドリアでは、βバレル型膜タンパク質は、TOM 複合体、small	 Tim タンパク質そして、SAM 複合体を介して外膜に組込まれる。今回、京都産業大学の遠藤斗志也教授らとの共同研究により、クライオ電子顕微鏡を用いて TOM 複合体の立体構造を 3.8Åの分解能で決定した。さらに、相互作用解析から TOM 複合体が small	 Tim タンパク質が直接相互作用しており、βバレル型膜タンパク質が効率的に輸送できうることを明らかにした。	 

キーワード	 ＦＡ	 

V 型分泌装置	 

βバレル	 BAM 複合体	 

（以下は記入しないでください。）	 
助成財団ｺｰﾄﾞ	 ＴＡ	 

研究課題番号	 ＡＡ	 

研究機関番号	 ＡＣ	 

シート番号	 -	 1	 -	 TOM 複合体	 	  発表文献（この研究を発表した雑誌・図書について記入してください。）	 
論文標題ＧＢ	  Structure	 of	 mitochondrial	 import	 gate	 reveals	 distinct	 preprotein	 paths.	 
雑	 誌	 

著者名	 ＧＡ	 	 Araiso,	 Y.,	 Shiota,	 T	 ,	 

雑誌名	 ＧＣ	 

Nature	 発行年	 ＧＥ	 

2	 

雑誌名	 ＧＣ	 	 

発行年	 ＧＥ	 	 

雑誌名	 ＧＣ	 	 ～	 

発行年	 ＧＥ	 	 	 Endo,	 T.	  他	 ページ	 ＧＦ	 

395～401	 

0	 

1	 

9	 

巻号	 ＧＤ	 

575	 	 	 	 

巻号	 ＧＤ	 	 	 	 	 	 

巻号	 ＧＤ	 	 発行年	 ＨＤ	 	 	 	 	 総ﾍﾟｰｼﾞ	 ＨＥ	  	 発行年	 ＨＤ	 	 	 	 	 総ﾍﾟｰｼﾞ	 ＨＥ	  	 論文標題ＧＢ	  	 雑	 誌	 

著者名	 ＧＡ	 	 

ページ	 ＧＦ	 

～	 

論文標題ＧＢ	  	 雑	 誌	 

著者名	 ＧＡ	 	 

ページ	 ＧＦ	 
著者名	 ＨＡ	 	 

書名	 ＨＣ	 	 図	 書	 

出版者	 ＨＢ	 
著者名	 ＨＡ	 	 

書名	 ＨＣ	 	 図	 書	 

出版者	 ＨＢ	 	 

欧文概要 ＥＺ	 	 
Gram-negative	 bacteria	 secrete	 toxin	 proteins	 using	 molecular	 machines	 termed	 secretion	 systems.	 
Proteins	 belonging	 in	 the	 Type-V	 secretion	 system	 are	 composed	 of	 a	 N-terminus	 passenger	 domain,	 the	 "toxin	 domain",	 and	 a	 C-terminus	 beta-barrel	 domain.	 The	 type-V	 secretion	 system	 secretes	 the	 passenger	 domain	 through	 a	 multi-step	 process.	 First,	 the	 beta-barrel	 domain	 is	 assembled	 into	 the	 outer	 membrane	 by	 the	 BAM	 complex.	 Second,	 the	 passenger	 domain	 traverses	 the	 outer	 membrane	 via	 the	 interior	 of	 the	 beta-barrel	 domain	 and	 is	 then	 secreted.	 Understanding	 the	 molecular	 mechanism	 of	 each	 step	 of	 the	 type-V	 
secretion	 systems	 is	 necessary	 to	 design	 a	 drug	 targeting	 type-V	 secretion	 systems.	 	 We	 optimized	 conditions	 to	 employ	 EspP,	 the	 type-V	 secretion	 system	 of	 EHEC,	 as	 a	 substrate	 protein	 for	 our	 in	 vitro	 assembly	 assay.	 The	 BAM	 complex	 is	 composed	 of	 two	 essential	 subunits,	 BamA	 and	 BamD	 
and	 accessory	 proteins,	 BamB,	 C,	 E.	 Our	 in	 vitro	 assembly	 assay	 revealed	 that	 the	 accessory	 proteins	 
of	 the	 BAM	 complex	 are	 not	 necessary	 for	 EspP	 assembly.	 We	 identified	 four	 different	 inhibitor	 peptides	 of	 EspP	 assembly	 from	 our	 systematically	 designed	 peptide	 library.	 A	 sequence	 comparison	 between	 
inhibitor	 peptides	 and	 EspP	 implies	 that	 EspP	 has	 several	 signals	 recognized	 by	 the	 BAM	 complex.	 	 	 Beta-barrel	 membrane	 proteins	 exist	 not	 only	 bacterial	 outer	 membrane	 but	 the	 mitochondrial	 outer	 membrane.	 At	 the	 mitochondria,	 beta-barrel	 membrane	 proteins	 are	 assembled	 by	 the	 TOM	 complex,	 small	 Tim	 proteins,	 and	 SAM	 complex.	 We	 reported	 the	 structure	 of	 the	 yeast	 TOM	 complex	 at	 3.8A	 resolution	 with	 Toshi	 Endo’s	 lab.	 Our	 crosslinking	 study	 revealed	 that	 the	 TOM	 complex	 interacts	 with	 small	 Tim	 
proteins	 directly,	 enabling	 the	 transfer	 of	 the	 substrate	 protein	 efficiently	 	 -	 2	 -