（ 1 ）263

日本食品保蔵科学会誌
３
７

VOL．

会
長
編集委員長
編集委員

６

NO．

高井 陸雄
上田 悦範
石田
裕
津久井亜紀夫

副

会

長

稲熊 隆博
東尾 久雄

上田

悦範

小宮山美弘

早坂

薫

井上 茂孝
古庄
律

今堀 義洋
松田 茂樹

竹永

章生

＜報
文＞
スクロース高資化性乳酸菌Lactobacillus paracasei NRIC０７６５株のスクロース分解酵素の生産性と諸性質 …………………………………………………………………（２６５）／本間裕人・山下秀明・徳田宏晴
佐藤 壮・上野 孝・中西載慶＜報文＞（英文）
衝撃ストレスが収穫後キャベツの生理的・化学的特性に及ぼす影響 ……………………………………（２７３）／タンマウォン マナスィカン・兼田朋子・中村宣貴
吉田 誠・曽我綾香・椎名武夫＜研究ノート＞
小麦 Ero 1 遺伝子のクローニングと発現 ……………………………………………………………………（２８３）／野口智弘・田村良太・新井智美・岡 大貴
野口治子・内野昌孝・"野克己
二次元電気泳動によるエミュー卵白タンパク質の解析 ……………………………………………………（２８９）／中村 優・松本雄太郎・入澤友啓
野口治子・内野昌孝・前橋健二
多田耕太郎・鈴木敏郎・渡部俊弘・"野克己＜技術報告＞（英文）
さなぎを用いた新規調味液の製造! …………………………………………………………………………（２９５）／谷口（山田）亜樹子・坂蒔美稔子・菊池修平・"野克己＜講座＞
身近な野菜・果物〜その起源から生産・消費まで（１５） …………………………………………………（３０１）
キウイフルーツ（Ⅰ）
／矢野昌充
＜情
報＞
食と農の資料館めぐり（５）カゴメ記念館 …………………………………………………………………………………………………（３０７）／稲熊隆博・倉田 宏＜文献抄録＞ ……………………………………………………………………………………………………（３１１）＜会
告＞ ……………………………………………………………………………………………………（３１３）

264

（ 2 ）

Food Preservation Science

CONTENTS OF VOL．
３
７ NO．
６（２
０
１
１）
＜Article＞（Japanese）
The Productivity of Sucrose-degrading Enzyme by the Sucrose-assimilating
Lactic Acid Bacterium Lactobacillus paracasei NRIC０７６５
HOMMA Hiroto, YAMASHITA Hideaki, TOKUDA Hiroharu,
SATO Sou, UENO Takashi and NAKANISHI Kotoyoshi ………………………………………………（２６５）＜Article＞（English）
Influence of Impact Stress on the Postharvest Physiologicaland Chemical Properties of Cabbage Heads
THAMMAWONG Manasikan, KANETA Tomoko, NAKAMURA Nobutaka,
YOSHIDA Makoto, SOGA Ayaka and SHIINA Takeo …………………………………………………（２７３）＜Research Note＞（Japanese）
Cloning and Expression of Wheat Ero 1
NOGUCHI Tomohiro, TAMURA Ryouta, ARAI Satomi, OKA Daiki,
NOGUCHI Haruko, UCHINO Masataka and TAKANO Katsumi ………………………………………（２８３）
Analysis of Emu Egg White Protein
by Using Two-dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis
NAKAMURA Yu, MATSUMOTO Yutaro, IRISAWA Tomohiro,
NOGUCHI Haruko, UCHINO Masataka, MAEHASHI Kenji,
TADA Kotaro, SUZUKI Toshiro, WATANABE Toshihiro and TAKANO Katsumi …………………（２８９）<Technical Report＞（English）
Silkworm Pupae in the Production of a New Liquid Seasoning"
TANIGUCHI YAMADA Akiko, SAKAMAKI Mineko, KIKUCHI Shuhei and TAKANO Katsumi………（２９５）＜Serialization Lecture＞（Japanese）
Kiwifruit（Part!）
YANO Masamichi …………………………………………………………………………………………（３０
１）＜Information＞（Japanese）
Kagome Memorial HallINAKUMA Takahiro and KURATA Hiroshi ……………………………………………………………（３０７）（ 3 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１ 〔報

文〕

265

スクロース高資化性乳酸菌Lactobacillus paracasei NRIC０７
６５株のスクロース分解酵素の生産性と諸性質
本 間 裕 人＊１§・山 下 秀 明＊１・徳 田 宏 晴＊１
佐藤
壮＊１・上 野孝＊２・中 西 載 慶＊１＊１ 東京農業大学短期大学部醸造学科＊２ 函館工業高等専門学校物質工学科

The Productivity of Sucrose-degrading Enzyme by the Sucrose-assimilating
Lactic Acid Bacterium Lactobacillus paracasei NRIC０７６５
HOMMA Hiroto＊１§，YAMASHITA Hideaki＊１，TOKUDA Hiroharu＊１，
SATO Sou＊１，UENO Takashi＊２ and NAKANISHI Kotoyoshi＊１
Department of brewing and fermentation, Junior college of Tokyo University of agriculture,
Sakuragaoka 1−1−1, Setagaya, Tokyo 156−8502
Department of material and environmental engineering, Hakodate National college of technology,14−1 Tokura, Hakodate, Hokkaido 042−8501＊１＊２

The lactic acid bacterium Lactobacillus paracasei NRIC０
７
６５can assimilate sucrose well, with no
glucose repression activity in the presence of glucose. In this study, we investigated the productivityof the sucrose-degrading enzyme by Lb. paracasei NRIC０７
６５, and analyzed the characteristics of thisenzyme. Lb. paracasei NRIC０
７
６
５ showed high sucrose degrading enzyme productivity in both thepresence and absence of sucrose. We purified this sucrose - degrading enzyme using a ４- step
chromatographic method. The purified enzyme showed high degrading activity on sucrose, p nitrophenyl-α-D-glucopyranosid, methyl-α-D-glucoside, ethyl-α-D-glucoside and isomaltose, and the K mvalues for these substrates were ３
８
９, ０．
６
７
１, １
２
８, １
２．
５ and ２５．
５ mM, respectively. The catalytic
turnover number for these substrates were １
０
２, ６
４．
１, ３
４．
９, ３
６．
７, and ５２．
８ s−１, respectively. Optimum
temperature was ４
０℃, and the activity was stable below ４
５℃. The activity was maximal at pH ５．
０,
and the activity was stable in a pH range of ４．
０ to ７．
０. The molecular mass was estimated to be ６
６
kDa, and the isoelectric point was estimated to be ５．
５
５. The N-terminal amino acid sequence of thisenzyme showed high homology to oligo-１, ６-glucosidase and exo-α-１, ４-glucosidase enzymes of some
Lactobacillus and Bacillus strains.
（Received Apr. １
８, ２０１
１；Accepted Aug. １
８, ２
０
１
１）
Key words：Lactobacillus paracasei, isomaltase, oligo-1, 6-glucosidase, sucrose-degrading enzyme,
catabolite repression
６―グルコシダーゼ，スクロース分解酵素，
Lactobacillus paracasei，イソマルターゼ，オリゴ―１，
異化代謝抑制ポリ乳酸製造のためのL―乳酸生産が盛んに研究されして生産するための研究がこれまで以上に重要視されてるようになって既に久しく，一部では実用化もなされている。その中で筆者らは食品工場などで大量に発生している。しかし，これまで行われていたとうもろこしデン

いる缶詰シロップ液に着目した。缶詰シロップ液はパイプンなどの本来食料となる原料を用いたL-乳酸生産は食

ナップルの缶詰めのシロップ液だけでも年間３４万 t 排出糧問題を悪化させる懸念があるため，廃棄物等を原料とされており，その他の果実の缶詰も含めると膨大な量が

＊１ 〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１§ Corresponding author, E-mail : h３homma@nodai.ac.jp
＊２ 〒０
４
２―８
５
０
１ 北海道函館市戸倉町１
４番１号

266

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

排出されている。この缶詰シロップ液には，果実の種類（ 4 ）３．酵素活性の測定により異なるが，スクロース，グルコースおよびフルク

スクロース分解活性は，各種炭素源で培養し粗酵素液

トースなど発酵原料として利用可能な糖類があわせての酵素活性を測定したときは，２Mスクロース溶液３!

２０％（w／v）近く含まれており，このまま廃棄してしまに酵素液０．
０２!，蒸留水１．
６８!，５
００mMリン酸緩衝液

うことは環境問題の観点からも好ましくない。そこで筆

（pH６．
０）０．
３!を加え，４０℃で６０分間酵素反応させた。

者らはこれまでこの缶詰シロップ液を原料としたL−乳酵素精製を行った際は１Mスクロース液（３０mMリン酸酸生産について研究を行ってきた１）〜４）。

緩衝液（pH６．
０））４!に酵素液１!を 加 え，４０℃で６０L―乳酸生産は乳酸菌を用いた発酵法が主流である。

分間酵素反応させた。これらの反応により，生じたグル

しかし，従来から用いられているLactococcus lactisなどコースを酵素法（グルコースC―!テストワコー：和光

で缶詰シロップ液を発酵させると，グルコース，フルク

純薬社製）で定量することによりスクロース分解活性をトースといった単糖類がスクロース加水分解酵素の発現求めた。スクロース分解活性１Uは，１分間に１#olのを抑制する異化代謝抑制が生じ，著しい発酵の遅延が生グルコースを生成しうる酵素量とした。メレチトースおじることがこれまでに明らかになっている２）〜４）。こうい

よびラフィノース分解活性は，０．
１Mメレチトース溶液

った発酵経過を示す菌では単槽による連続発酵プロセス

あるいは０．
１Mラフィノース溶液１!に酵素液１!，蒸の構築は困難であるため，筆者らは異化代謝抑制のかか

留 水２．
７!，５
０
０mMリ ン 酸 緩 衝 液（pH６．
０）０．
３!を 加

り に く いL―乳 酸 生 産 菌 の 検 索 を 行 い，こ れ ま で に

え，４
０℃で６
０分間酵素反応させ，生じたグルコースを酵

Lactobacillus paracasei NRIC０７６５株を分離同定し，当該素法で定量することにより活性を求めた。これら活性も菌は混合糖類を炭素源とする培地においても発酵遅延を

１分間に１#olのグルコースを生成しうる酵素量を１U

４）
，
５）

。さらに当該菌と定義した。p-ニトロフェニル-α-D-グルコピラノシドを用いたパイナップルシロップからの高濃度L―乳酸生（以下α-pNPG）分解活性は，１０mMα-pNPG溶液（３０mM

産法を確立し，報告している５）。

リン酸緩衝液（pH６．
０））
１!に酵素液１!を添加し，
４
０℃生じにくいことを明らかにしてきた

今回，このLb. paracasei NRIC０７６５株が，なぜグルコで１０分間酵素反応を行い，生成した遊離p-ニトロフェニース，フルクトース存在下でもスムーズにスクロースを

ル量を定量することにより求めた。p-ニトロフェニル量資化できるのかということについて知見を得るため，本は溶液の波長４００"における吸光度を，分光光度計で測菌の生産するスクロース分解活性を有するオリゴ―１，
６―

定 す る こ と に よ り 定 量 し た。α-pNPG分 解 活 性１U

グルコシダーゼについて酵素学的観点から検討を行ったは，１分間に１#olのp-ニトロフェニルを生成しうる酵ので報告する。

素量とした。p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド

実験方法
１．供試菌株および培養方法
乳酸菌Lactobacillus paracasei NRIC０７６５株を用いた。

（以下β-pNPG）分解活性も同様に測定した。
４．酵 素 精 製
ステップ１：GYP改変培地で培養した本菌の培養液
１，８００!から，前述の方法に従い粗酵素液９
５!を調製し前培養には，MRS broth培地（Oxoid社製）を用い，３０℃た。これを３０mMリン酸緩衝液（pH６．
０）にて平衡化しで２４時間静置培養した。本培養には，GYP改変培地をたTOYOPEARL-DEAE６
５
０M４
０
０!お よ び３
０mMリ ン 酸用いた。GYP改変培地はグルコース１
０&，酵母エキス

緩 衝 液（pH６．
０）１，
６０
０!に 加 え て 撹 拌 し，吸 引 濾 過

１０&，ポリペプトン５．
０&，酢酸ナトリウム・３水和物（ADVANTEC : No．
５C）した。

１．
０&，硫酸マグネシウム・７水和物０．
２０&，硫酸マンステップ２：得られた非吸着画分である濾液１，３２
０!

ガン・４水和物０．
０１&，硫酸第１鉄・７水和物０．
０１&，に，硫酸アンモニウムを２．
１Mになるように添加した。

Tween８０溶液（５０%／!）１．
０!，に蒸留水１，
０
００!を加

これを，２．
１Mの硫酸アンモニウムを含む３０mMリン酸え調製した。ここに前培養液を培地に対して１％（v／

緩衝液（pH６．
０）で平衡化したPhenyl-TOYOPEARL６５０v）添加し，３０℃で１８時間静置培養した。

Mカラム（φ２６$×１，
０００$）に供し，同緩衝液５００!で２．粗酵素液の調製培養液を遠心分離して菌体を回収し，これを元の培地と同量の３０mMリン酸緩衝液（pH６．
０）に再懸濁した後，再度遠心分離することにより洗浄菌体を得た。この洗浄

洗浄した後，同緩衝液４００!および硫酸アンモニウムを含まない３０mMリン酸緩衝液（pH６．
０）４０
０!でグラジ
エント溶出した（流速１．
０!／min）。
ステップ３：活性画分を限外濾過濃縮し，これを３０菌体を元の培養液の１／２０の液量の３０mMリン酸緩衝液

mMリン酸緩衝液（pH６．
０）で平衡化したSephacryl S-（pH６．
０）に懸濁して２０倍濃縮菌体懸濁液とした。酵素１
００HRカラム（φ１６$×１，０００$）に供し，同緩衝液で溶生産性の試験においてはこの２０倍希釈菌体懸濁液をトル出させた（流速０．
４!／min）。

エン処理し，粗酵素液を得た。酵素精製においては２０倍

ステップ４：得られた活性画分を，再度Sephacryl S-

濃縮菌体懸濁液を超音波破砕法により処理し，粗酵素液

１００HRカラムにて同様の条件でクロマトグラフィーに供を得た。

した。SDS-PAGE，等電点電気泳動は，銀染色により染（ 5 ）

文〕 Lb. paracasei NRIC０
７
６
５の蔗糖分解酵素〔報267

色を行った。タンパク質量はBradford法により定量しは多くの場合メレチトースやラフィノースなどにも分解た。

活性を示すことが知られている。また，β-D-フルクトフ

５．N!末端アミノ酸配列の決定

ラノシダーゼは一般的にスクロースの存在下で誘導されProcise４９
４cLCプロテインシーケンサー（ABI社製）て生産されることが知られている６）。本菌はスクロースを用いN―末端アミノ酸配列を決定した。精製酵素液１．
８によりスクロース分解酵素が誘導されている傾向がやや!を限外濾過濃縮しSDS―PAGEにかけ，PVDF膜にブみられるが，スクロース非存在下培養した場合でも顕著

ロッティングした後切り出し，これを分析に供した。

なスクロース分解活性を有している。よって本菌はβ-Dフルクトフラノシダーゼとは異なるスクロース分解酵素

実験結果および考察

を構成酵素として生産している可能性が考えられた。乳１． Lb. paracasei NRIC０７６５株の糖類分解酵素生産性酸菌においては，こういった構成酵素として生産される炭素源をグルコース，スクロースあるいはセロビオー

スクロース分解酵素について，これまでのところ詳しいスとしたGYP改変培地でLb. paracasei NRIC０
７
６
５株を培

報告はなされていない。

養し，スクロース，メレチトース，ラフィノース，p-ニ

２．スクロース分解酵素の精製および諸性質の検討

トロフェニル-α-D-グルコピラノシド（以下α-pNPG），p-

そこで本菌のスクロース資化特性についてさらなる検ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（以下β-pNPG）

討を加えるため，本菌のスクロース分解酵素の精製を試に対する分解酵素の生産性を調べた。その結果，いずれみた。精製方法を検討する過程でスクロース分解活性をの炭素源で培養した場合においてもスクロースおよびα-有するピークは２つ検出され，２つのアイソザイムが存

pNPGに対して顕著な分解活性が検出された（Table１）。

在していることが示唆された。本研究ではこのうちα-一方メレチトース，ラフィノースおよびβ-pNPGに対す

pNPG活性とスクロース分解活性を同時に有しているピる分解活性は，いずれの炭素源で培養した場合においてークについて精製を進めた。最終的に４段階のクロマトも低かった。微生物の生産する代表的なスクロース分解

グラフィーに供して精製度１，５００倍に精製し，０．
１２!の酵素としてはβ-D-フルクトフラノシダーゼ〔E．
C．
３．
２．
１．

精製酵素を得た（Table２）。この精製酵素をSDS-PAGE

２６〕などがあげられるが，β-D-フルクトフラノシダーゼに供したところ検出されたバンドは１本のみで，電気泳Table１ Activities of saccharide-degrading enzymes from Lb. paracasei NRIC０
７
６
５
Enzyme activity（U／"）
Substrate

Carbon source

Sucrose-degrading activity
Melezitose-degrading activity
Raffinose-degrading activity
p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside-degrading activity
p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside-degrading activity

GlucoseSucroseCellobiose

４
３
７
０．
７
８
０
０．
９
２
０
４
４
６
１
５．
９

７
１
６
１．
２
４
０．
９
６
０
４
３
３
１
６．
４

５
９
４
１．
３
２
０．
８
６
０
３
９
７
１
６．
４

The enzyme reaction mixture consisted of ３．
０! substrate solution, ０．
３ ! of ５０
０ mM phosphate buffer（pH６．
０）, and １．
７ ! ofdiluted enzyme solution in a total volume of ５．
０ !. Concentration of substrates was ２．
０ M（sucrose）,０．
１ mM（melezitose andraffinose）, and １０ µM（α-pNPG and β-pNPG）.

Table２ Purification of sucrose-degrading enzyme from Lb. paracasei NRIC０
７
６
５
Step
Crude
TOYO PEARL
DEAE-６５０M

Volume（!）
９５

Protein
（!）
１，
１
２
１

Total activity１） Specific activity
（mU）
（U／g）

Yield
（％）

Purification（―fold）

３
１，
２
４
１

２．
７
９×１
０

１
０
０

１

２

１，
３
２
０

２
６．
４

１
５，
５
５
３

５．
８
９×１
０

５
０

２
２

Phenyl TOYOPEARL-６
５
０M

１
１
１

２．
５
５

８，
２
０
０

３．
２
２×１
０３

２
６

１
２
１

Sephacryl
S-１
０
０HR

１
０．
５

０．
３
０

５，
０
３
１

１．
６
８×１
０４

１
６

６
３
０

Sephacryl
S-１
０
０HR

８

０．
１
２

４，
７
８
８

３．
９
９×１
０４

１
５

１，
５
０
０

１）The enzyme reaction mixture consisted of ４．
０ ! of ３０ mM phosphate buffer（pH, ６．
０）containing １ mM sucrose, and １．
０! of diluted enzyme solution in a total volume of ５．
０ !.

268

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

A

B

（ 6 ）

Table３ Substrate specificity of purified enzyme

205 kDa
116
97.4
69
55
36.5
29
20.1

Substrate
Maltose１）
Maltotriose１）
Maltopentaose１）
Trehalose１）
Isomaltose１）
Cellobiose１）
Lactose１）
Turanose１）
Sucrose１）
Melezitose１）
Raffinose１）

Fig．
１ SDS-PAGE of purified enzyme from Lb. paracasei
NRIC０
７
６
５.
Electrophoresis was carried out at a constant current of ２０
mA, in a １
２ ％ polyacrylamide gel slab containing ０．
１ ％SDS under the conditions described by Laemmli（１９７０）.
Lane A : Purified sucrose-degrading enzyme.
Lane B : Protein M. W. marker II Wide Range ３．
５―２
０５ kDa動レベルで単一タンパクであることが示された（Fig．
１）
。
精製酵素の分子量は６６kDa付近，等電点は５．
５５であった。
そこでまず本酵素の基質特異性について調べたところ，
本酵素はα-pNPGに対して高い分解活性を示し，その活
性値は１，
５
８
５U／!であった（Table３）。また，イソマル

Enzymeactivity（U／l）

Linkage type

Stachyose１）Glc（α１-４）Glc[Glc（α１-４）
Glc]３[Glc（α１-４）
Glc]５Glc（α１-１）
Glc
Glc（α１-６）Glc
Glc（β１-４）
Glc
Gal（β１-４）Glc
Glc（α１-β３）Fru
Glc（α１-β２）Fru
Glc（ α１-３）Fru（β２-α１）
GlcGal（α１-６）Glc（ α１-β２）
Fru［Gal（α１-６）］（ α１-β
２Glc
２）
Fru

１．
３
０．
６
n. d.３）
１．
６
３
３
２
n. d.
n. d.
４
９．
１
７
５．
４
０．
３

Glc
（α）
-

１，
５
８
５

p-Nitrophenyl-α-Dglucopyra-nosid２）-NO２

Methyl-α-D-glucoside１） Glc
（α１）
-CH３
１）
Ethyl-α-D-glucoside
Glc
（α１）
-C２H５

n. d.
n. d.

９
２．
７
２
９
６

１ ） The reaction mixture consisted of ４，９５０" of ３０mM
phosphate buffer（pH６．
０）containing ０．
１ M of various sugars,
and ５０ " of enzyme solution in a total volume of ５．
０ !.
２ ） The reaction mixture consisted of １９５０ µl of ３０ mM
phosphate buffer（pH６．
０）containing １
０ mM p―Nitrophenyl―α―D―glucopyranoside, and ５０ " of enzyme solution in a total
volume of ２．
０ !.
３）Not detected.

トース，エチル-α-D-グルコシド（以下α-EG），メチル―
α-D-グルコシド（以下α-MG），スクロース，およびツラ
ノースに対しても高い分解活性を示し，その活性値はそ
れぞれ３
３
２，２
９
６，９
２．
７，７
５．
４お よ び４
９．
１U／!で あ っ た。

Table４ The K m and kcat values of purified enzyme
Km
（mM）

kcat
（s−１）

kcat／K m（s−１／mM）

Sucroseα-pNPG
α-MG

３
８
９
０．
６
７
１
１
２
８

１
０
２
６
４．
１
３
４．
９

０．
２
６
２
９
５．
５
０．
２
７
２

α-EG
Isomaltose

１
２．
５
２
５．
５

３
６．
７
５
２．
８

２．
９
４
２．
０
７

Substrate

一方，マルトース，マルトトリオース，トレハロース，
およびメレチトースに対する分解活性は極めて低く，マ
ルトペンタオース，セロビオース，ラクトース，ラフィ
ノース，およびスタチオースに対する分解活性は検出されなかった。そこで本酵素の基質特異性についてさらに詳しく検討するため，高い分解活性が認められたスクロ
ース，α-pNPG，α-MG，α-EGおよびイソマルトースの５種類の基質に対するK m値およびkcat値を算出した。
その結果スクロース，α-pNPG，α-MG，α-EGおよびイソマルトースに対する本酵素のK m値はそれぞれ３
８
９，

された。

０．
６
７
１，１
２
８，１
２．
５および２
５．
５mMであり，またkcat値はそこで基質親和性が最も高く，測定が容易なα-pNPG

それぞれ１
０
２，６
４．
１，３
４．
９，３
６．
７および５
２．
８s−１であった

分解活性を用い本酵素の諸性質を調べた。その結果本酵（Table４）。よって本酵素の分子活性はスクロースにお素の至適温度は４０℃で，酵素活性は４５℃以下において安いて最も高いが，基質親和性はα-pNPG，α-EGおよびイ定であった。至適pHは５．
０で，pH４．
０〜７．
０の範囲で安ソマルトースにおいて高く，スクロースではほかの糖よ定した活性を示した。金属イオンの影響を調べたところ，りもかなり低いということが示された。このことから本本酵素はCu２＋，Zn２＋，Cd２＋，Hg２＋，Sn２＋およびFe３＋に著

酵素はオリゴ-１，６-グルコシダーゼ（別名イソマルターゼ

しい阻害を受けた（Table５）。阻害剤および糖類のお

〔E．
C．
３．
２．
１．
１
０〕
）に分類される酵素であるものと示唆

よぼす影響について調べたところ，本酵素はSDSおよび

（ 7 ）〔報文〕 Lb. paracasei NRIC０
７
６
５の蔗糖分解酵素

Table５ Effect of metal ions on purified enzyme
Metal ion
None
Na+
K+
Mg２＋
Ca２＋
Co２＋
Ni２＋
Cu２＋
Zn２＋
Cd２＋
Hg２＋
Sn２＋
Fe３＋
Al３＋

Concentration（mM）

Inhibition
（％）

０
１
０
１
０
１
０
１
０
１
０
１
０
１
０
１
０
１
０
１
０
１
０
１
０
１
０

０
０
７．
０
２
０
０．
８
４
２
０
１
２．
６
８
３．
５
８
０．
７
９
０．
１
９
９．
６
７
０．
７
３
９．
６
０

Table６ Effect of inhibitors and saccharides on purified
enzymeInhibitor

Enzyme activity was measured by α-pNPG degrading activity.

269

None
EDTA
SDS
Tris
NaN３
L-Cysteine
L-Histidine
GlucoseFructose
SucroseMaltoseLactoseConcentration（mM）

Inhibition
（％）

０
１
０
１
０
１
０
１
０
１
１
０
１
０
１
０
０
１
０
１
０
０
１
０
１
０
１
０

０
０
１
０
０
１
０
０
０
０
１
３．
２
３
０．
９
６
０．
８
５．
２
０
１
５．
９
２．
６
８
１．
６
４
０

Enzyme activity was measured by α-pNPG degrading activity.

トリスに著しく阻害されたが，EDTA，アジ化ナトリウ
ム，システインなどには阻害されなかった（Table６）。

は拮抗阻害であるものと思われた。
本酵素のN末端アミノ酸配列を調べたところ，その配

ま た，グ ル コ ー ス１
０mMで は３
０．
９％，１
０
０mMで６
０．
８％，

列は，Met-His-Lys-Ser-Trp-Trp-Gln-Glu-Alaであった活性が阻害され，生成物阻害を受けることが示された。

（Table７）。これをほかの菌の酵素のアミノ酸配列と比反応液のα-pNPG濃度は１０mMであるためグルコース濃較したところ，Lactobacillus属のオリゴ-１，６-グルコシダ度が基質よりも少ない条件では影響が少ないと思われる

ーゼ（E．
C．
３．
２．
１．
１
０）やエキソ-α-１，４-グルコシダーゼ

が，グルコース濃度が基質濃度を超える条件では顕著な

（E．
C．
３．
２．
１．
２
０）などの配列と一致した７），８）。しかしな阻害を受けるものと思われた。一方でフルクトースではがらこれらの配列はLactobacillus属の全ゲノム配列の解

１００mMにおいても残存活性は８４．
１％であり，フルクト

読に基づく報告であり，酵素学的な報告のある配列は見ースによる生成物阻害はグルコースよりも小さいことが受けられなかった。そこで酵素学的な報告のあるほかの示された。スクロースやマルトースでは阻害率は１０mM

菌の配列と比較すると，Bacillus属およびGeobacillus属において２．
６８％，１．
６４％と非常に低かった。グルコース

細菌のオリゴ-１，６-グルコシダーゼやエキソ-α-１，４-グルコの阻害様式についてさらに詳しい知見を得るため，グルシダーゼと高い相同性が認められた９）〜１３）。特にBacillus

コ ー ス 存 在 下 で のα-pNPG分 解 活 性 に つ い てK m値 とthermoamyloliquefaciens KP１
０
７１および Geobacillus

Vmax値を調べたところ，Vmax値はグルコース濃度に

thermoglucosidasius KP１
０
０
６のオリゴ-１，６-グルコシ ダ ー

よらずほぼ一定であったがK m値はグルコース濃度が高ゼと最も配列が類似していた９），１０）。これらの酵素はファいほど大きな値となった。よってグルコースの阻害様式

ミリー１３に属することが報告されており本酵素も同族のTable７ Comparison of N-terminal amino acid sequences of purified enzyme and other bacterial saccharolytic enzymes
Origin
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII

Lactobacillus paracasei NRIC０
７
６
５
Bacillus thermoamyloliquefaciens KP１
０
７１
Geobacillus thermoglucosidasius KP１
００６
Bacillus cereus ATCC７
０
６
４
Bacillus coagulans ATCC７０
５０
Bacillus thermoamyloliquefaciens KP１
０
７１
Geobacillus stearothermophilus ATCC１２０
１
６
Streptococcus mutans strain Ingbritt

Enzymeoligo-１，
６-glucosidase
oligo-１，
６-glucosidase
oligo-１，
６-glucosidase
oligo-１，
６-glucosidase
oligo-１，
６-glucosidase
exo-α-１，
４-glucosidase
exo-α-１，
４-glucosidase
glucan １，６-α-glucosidase

N-terminal amino acid sequences
M H K S WW Q E A V
M E R A WW K E A V V Y Q
M E R V WW K E A V V Y Q
M E K Q WW K E S V V Y Q
M T E ― WW K K A V V Y Q
M K K A WW K E G V V Y Q
M K K T WW K E G V A Y Q
M Q K H WW H K A T V Y Q

I
I
I
I
I
I
I

Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y

（I）This work.（II）,（VI）, and（VII）Sequence data were quoted from references no. ９.（III）Sequence data was quoted fromreferences no. １０.（IV）Sequence data was quoted from references no. １
１.（V）Sequence data was quoted from references no.
１２.（VIII）Sequence data was quoted from references no. １
３.

270

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

（ 8 ）

Table８ Properties of α-glucosidase from various microorganisms
Substrate specificity
OriginEnzymeα-pNPG

Isomaltose

SucroseMaltoseI Lactobacillus paracasei NRIC０
７
６
５
II Bacillus thermoamyloliquefaciens KP１
０
７
１
III Geobacillus thermoglucosidasius KP１００６
IV Bacillus cereus ATCC７０
６
４
V Bacillus coagulans ATCC７０
５０
VI Bacillus thermoamyloliquefaciens KP１
０
７
１
VII Geobacillus stearothermophilus ATCC１２
０
１６
VIII Streptococcus mutans strain Ingbrittoligo-１，
６-glucosidase
oligo-１，
６-glucosidase
oligo-１，
６-glucosidase
oligo-１，
６-glucosidase
oligo-１，
６-glucosidase
exo-α-１，
４-glucosidase
exo-α-１，
４-glucosidase
glucan １，６-α-glucosidase

＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
−

＋
＋
＋
＋
＋
−
−
＋

＋
−
−
−
＋
−
−
−

−
−
−
−
−
＋
＋
−

＋：Hydrolyzed well−：Not detected or Hydrolyzed weakly（I）This work.（II）Substrate specificity was quoted from references no. １
４（. III）Substrate specificity was quoted from references
no. １５.（IV）Substrate specificity was quoted from references no. １
６.（V）Substrate specificity was quoted from references no.１
７.
（VI）Substrate specificity was quoted from references no. ９.（VII）Substrate specificity was quoted from references nos. １
５ and
１８.（VIII）Substrate specificity was quoted from references no. １３

酵素である可能性が高い。また，乳酸菌の一種であるができた。精製酵素の基質特異性について調べたところ，

Streptococcus mutans Ingbritt株のデキストラングルコ

スクロース，p-ニトロフェニル-α-D-グルコピラノシド，

シダーゼ（グルカン１，
６-α-グルコシダーゼ〔E．
C．
３．
２．
１．

メチル-α-D-グルコシド，エチル-α-D-グルコシドおよび

１
３）

イソマルトースなどに対して高い分解活性を示し，K m

Table８に本酵素とこれらの酵素の基質特異性を示し

値はそれぞれ３
８
９，０．
６
７
１，１
２
８，１
２．
５お よ び２
５．
５mMで

７
０〕
）とも相同性がみられた 。
た。本酵素を含むオリゴ-１，６-グルコシダーゼは，いずれあり，またkcat値はそれぞれ１
０
２，６
４．
１，３
４．
９，３
６．
７お

もα-pNPGとイソマルトースに対する分解能は高かった。

よび５２．
８s−１であった。至適温度は４０℃で温度安定性は

一方，スクロースに対する分解能の有無は酵素により異４５℃ま で，至 適pHは５．
０でpH安 定 性 は４．
０〜７．
０の 範 囲なっており，これらの中では本酵素とBacillus coagulans

で安定であった。また分子量は６６kDa付近，等電点は５．
５
５

ATCC７
０
５
０のオリゴ-１，６-グルコシダーゼがスクロースにで あ っ た。N末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 を 調 べ た と こ ろ，

対しても分解能を有しており，類似していた９），１３）〜１８）。N

Lactobacillus属菌，Bacillus属菌等のオリゴ-１，６-グルコシ末端アミノ酸配列で本酵素と相同性のみられたBacillus

ダーゼ（E．
C．
３．
２．
１．
１
０）などと高い相同性が認められ属およびGeobacillus属細菌のエキソ-α-１，４-グルコシダーた。これらのことより本酵素はオリゴ-１，６-グルコシダー

ゼやS. mutans Ingbritt株のデキストラングルコシダー

ゼであり，本酵素をグルコースなどで培養した場合でも

ゼは，基質特異性がやや異なるようであった１３）。

生産することにより，本菌Lb. paracasei NRIC０７
６
５株は以上の結果より，本酵素はスクロース分解能を有する
オリゴ-１，
６-グルコシダーゼであり，本酵素をグルコース

混合糖類を炭素源とする培地においても発酵遅延を生じずにスクロースを資化できるものと示唆された。

などで培養した場合においても一定量生産することが，文

本菌Lb. paracasei NRIC０７６５株が混合糖類を炭素源とする培地においても発酵遅延を生じずにスクロースを資化

１）木村俊範・上野献

孝・TARIQ, M. A.：パイナップル

できる要因の一つである可能性が考えられた。乳酸菌の缶詰のシロップ果汁からの乳酸生産，日本食品科学工

オリゴ-１，
６-グルコシダーゼについてはあまり研究が進ん

学会大会講演集，４
５，２
１
３（１
９
９
８）

でおらず，今後さらに詳しい検討が望まれる。

要約

明確な異化代謝抑制を受けずにスクロースを資化でき

２）上野孝・小沢泰広・川村直子・木村俊範・中西載慶：乳酸生産における糖質原料と加水分解酵素の未利用資源からの探索，日本食品工学会大会講演集，
１，
１
４
０
（２
０
０
０）

る ス ク ロ ー ス 高 資 化 性 乳 酸 菌Lactobacillus paracasei３）UENO, T., OZAWA, Y., ISHIKAWA, M., NAKANISHI, K.

NRIC０
７
６
５株のスクロース資化特性について検討した。

and KIMURA, T. : Lactic acid production using two

本菌はスクロース非存在下で培養した場合においても高food wastes, canned pineapple syrup and grape

いスクロース分解酵素の生産性を有していた。そこで当

invertase, as substrate and enzyme, Biotechnology

該酵素の精製を試みたところ，４段階のクロマトグラフ

letters, ２
５, ５
７
３〜５
７
７（２
０
０
３）

ィーにより電気泳動レベルで単一な精製酵素を得ること

４）高坂

匠・上野

孝・手塚恭平・川崎庸・中西載（ 9 ）〔報文〕 Lb. paracasei NRIC０
７
６
５の蔗糖分解酵素271

慶：フルーツ缶詰シロップ廃液からの乳酸生産，日本

Bacillus cereus

化学会北海道支部研究発表会講演要旨集，２
０
０
６年夏

nucleotid sequence of the cloned gene, Eur. J.

季，６
９（２
０
０
６）

Biochem., １
９
２, ６
０
９〜６
２
０（１
９
９
０）

５）NAKANISI, K., UENO, T., SATO, S. and YOSHI, S. : LLactic

acid

production

fromcannedpineapple

ATCC ７０
６
４ deduced fromthe１２） WATANABE, K. , KITAMURA, K. and SUZUKI, Y. :Analysisofthecritical

sites

for

proteinsyrup by rapid sucrose catabolizing Lactbacillus

thermostabilization by proline substitution in oligo-

paracasei NRIC０７
６５, Food Sci. Technol. Res., １
６
（３）,

１，
６-glucosidase from Bacillus coagulans ATCC ７
０
５
０

２
３
９〜２
４
６（２
０
１
０）

and

６）ODA, Y. and ITO, M. : Characterization of Mutant
from

Lactobacillus

amylovorus

JCM １
１
２
６T

with

improved utilization of sucrose, Cur. Microbiol ., ４
１,
３
９
２〜３
９
５（２
０
０
０）

the

evolutionary

considerationofprolineresidues, Appl. Environ. Microbial . , ６
２（６）, ２
０
６
６〜
２
０
７
３（１
９
９
６）
１
３）RUSSELL, R., R., B. and FERRETTI, J., J. : Nucleotide
sequence of the dextran glucosidase（dexB）gene

７）MORITA, H., TOH, H., OSHIMA, K., MURAKAMI, M.,
TAYLOR, T. D., IGIMI, S. and HATTORI, M. : Complete
genome sequence of the probiotic Lactobacillusof Streptococcus mutans, J. gen. microbial ., １
３
６, ８
０
３
〜８
１
０（１
９
９
０）
１
４）SUZUKI, Y. and OISHI, K. : A relationship between

rhamnosus ATCC５３１０３., J. Bacteriol ., １
９
１
（２
４）, ７
６
３
０

efficiency

〜７
６
３
１（２
０
０
９）

thermostability of six Bacillus oligo-１，
６-glucosidases,

８）MAZÉ, A., BOËL, G., ZÚÑIGA, M., BOURAND, A., LOUX,
V. , YEBRA, M. J. , MONEDERO, V. , CORREIA, K. ,ofisomaltosaccharidehydrolysis

andAppl. Microbiol. Biotechnol ., ３
１, ３
２〜３
７（１
９
８
９）
１
５） TSUJIMOTO, Y. , TANAKA,

H. ,TAKEMURA,

R. ,MATSUI,

H. ,JACQUES, N. , BEAUFILS, S. , PONCET, S. , JOYET, P. ,YOKOGAWA,T. ,SHIMONAKA,

MILOHANIC, E., CASARÉGOLA, S., AUFFRAY, Y., PÉREZ -WATANABE,

K.

andMARTÍNEZ, G., GIBRAT, J., ZAGOREC, M., FRANCKE, C.,determinants

HARTKE, A. and Deutscher, J. : Complete genome

thermostableα-glucosidases belonging to glycoside

of

A. ,

SUZUKI,

substrate

Y. : Molcular
recognitioninsequence of the probiotic Lactobacillus caseistrainhydrolase family １
３, J. biochem. , １
４
２, ８
７〜９
３

BL２
３, J. Bacteriol ., １
９
２
（１
０）
,２
６
４
７〜２
６
４
８（２
０
１
０）

（２
０
０
７）

９）SUZUKI, Y., YONEZAWA, K., HATTORI, M. and TAKII,

１６）SUZUKI, Y., AOKI, R. and HAYASHI, H. : Assignment

Y. : Assignment of Bacillus thermoamyloliquefaciensof a p - nitrophenyl-α-D-glucopyranoside-hydrolyzing

KP１０７
１α-glucosidase I to an exo-α-１，４-glucosidase,

α-glucosidase of Bacillus cereus ATCC７０
６
４to anand its striking similarity to bacillary oligo-１，
６-

exo-oligo-１，
６-glucosidase, Biochim. biophys. acta., ７
０４,

glucosidasesinN - terminal

sequence

andinstructural parameters calculated from the amino

４
７
６〜４
８
３（１
９
８
２）
１
７） SUZUKI, Y. and TOMURA Y. : Purification andacid composition, Eur. J. Biochem. , ２
０
５, ２
４
９〜２
５
６

characterization of Bacillus coagulans

（１
９
９
２）

glucosidase, Eur. J. Biochem., １
５
８, ７
７〜８
３（１
９
８
６）

１
０）WATANABE, K., CHISHIRO, K., KITAMURA, K. andoligo-１，６-１８）SUZUKI, Y., SHINJI, M. and ETO, N. : Assignment offora p - nitrophenyl-α-D-glucopyranosidase of Bacillus

thermostability occur with high frequency in thestearothermophilus ATCC １
２０
１
６ to a novel exo-α-

SUZUKI,

Y. : Proline

residues

responsible

loop regions of an extremely thermostable oligo-

１，
４-glucosidase

１，６-glucosidase from Bacillus thermoglucosidasius KP

and α-glucans, Biochim. biophys. acta, ７
８
７, ２
８
１〜２
８
９

１
０
０
６, J. Biol. Chem., ２
６
６
（３
６）
,２
４
２
８
７〜２
４
２
９
４（１
９
９
１）

（１
９
８
４）

１
１）WATANABE, K., KITAMURA, K., IHA H. and SUZUKI,
Y. : Primary structure of oligo-１，
６-glucosidase ofactiveforoligomaltosaccharides

（平成２
３年４月１
８日受付，平成２
３年８月１
８日受理）

（ 11 ）

Food Preservation Science VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１ 〔Article〕

273

Influence of Impact Stress on the Postharvest Physiologicaland Chemical Properties of Cabbage Heads
THAMMAWONG Manasikan＊１†，KANETA Tomoko＊１†，NAKAMURA Nobutaka＊１，
YOSHIDA Makoto＊２，SOGA Ayaka＊２ and SHIINA Takeo＊１§＊１ National Food Research Institute, National Agriculture and Food Research Organization,2−1−12, Kannondai, Tsukuba, Ibaraki 305−8642＊２ Kanagawa Agricultural Technology Center, 1617, Kamikitsusawa, Hiratsuka, Kanagawa 259−1204

Because the mechanical damage caused by postharvest handling （ including bulk storage andtransport）plays an important role in the yield and the postharvest quality of fresh produce, the effectof postharvest impact stress on the physiological and chemical properties of cabbage（Brassica oleracea
var. Capitata L.）was investigated in this study. To simulate the impact stress occurrence during thebulk handling practice, cabbage picked at commercial harvest stage was dropped from different
heights（１０, ２０, ４０, and ８０cm）onto a flat, rigid concrete floor. The effects of the dropping treatment
on the respiration rate and on the content of various sugars（sucrose, glucose, and fructose）were
evaluated during storage at ２
０℃ for ６ days. Shortly after the dropping treatment, an increased rateof respiration correlated with a higher dropping height. However, a decreased respiration rate wasobserved after one day of storage. The sugar content of all samples changed slightly at days １ and
３. At day ６, cabbages dropped from ８
０ and ４０cm showed the lowest content of fructose and total
sugar（the sum of sucrose, glucose, and fructose）. The major effects of impact stress on cabbage heads
include increases in the respiration rate and a loss of sugar content. In addition, tests of controlled
atmosphere（CA）treatment on dropped cabbages showed that CA likely inhibited the severe damage
caused by impact stress on cabbages because it reduced the rise in respiration rate and slowed theloss of sugar content in dropped cabbages during storage at ２
０℃. Overall, impact stress obviously
affects the postharvest physicochemical properties of cabbage just after impact occurrence（respirationrate）and during storage（sugar content）. These changes are also influenced by the strength of thestress level（height of dropping treatment）and the time period after the application of the stresstreatment. Rapid and appropriate postharvest handling and storage management, therefore, will delay
the onset of deterioration of cabbage quality and extend its shelf life.
（Received Apr. ２
７, ２０
１
１; Accepted Sep. １, ２
０
１
１）
Key words：cabbage, controlled atmosphere（CA）, dropping treatment, HPLC analysis, impact stress,
respiration rate, sugar content
キャベツ，修正空気，落下処理，高速液体クロマトグラフ分析，衝撃ストレス，
呼吸速度，糖含量

andmechanical ／ dynamic stress, which is a transitory

cracking）is considered a type of stress that occurs

change, occurring through a sudden acceleration or

duringisdeceleration causing a high dissipation of energy

Mechanicaldamage （bruising,postharvest

accompaniedbyhandling.

physiological,

wounding,This

stressandand subsequent damage to the produce. It occurs atmorphological changes that affect the postharvest

biochemical,

varying intensities during packing, transport, andyield and quality of fruits and vegetables and cause

storage handling５）〜８）. Moreover, there is a high１）
〜４）

rejection by wholesale and retail markets. The

probability of impact stress when a large amount of

postharvest damage of fresh produce is usually

produce is pooled and transported together in one

caused by one or more types of stress :large

compression,

andvibration.

Impactimpact,stressis† These authors contributed equally to this work.
§ Corresponding author, E-mail address : shiina@affrc.go.jp

bulk

container ;thisstresswill

increasequality deterioration and consumer rejection of fresh

274

Food Preservation Science

VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

（ 12 ）

the effect of impact stress on the physicochemical

produce.
Bulk containers are generally used for storing andproperties

ofcabbage

heads

under

controlled-transporting goods from one location to another. In

atmosphere （ CA ） storage, the respiration rate ofJapan,

dropped

the

newly

developed

large

size

bulk

cabbagesamples

under

air

or

CA

container （ cardboard body with plastic base andconditions were continuously monitored in this work,

cover, outside dimensions approx. L １
１
３!×D １１
５!

and after ６ days of storage, the sugar contents of

×H １
００!〜L １
１
３!×D １
４
７!×H １
１０!）has been

cabbage samples were analyzed.

proposed for fresh fruits and vegetables distribution.
This

returnable

andreusable

large

size

Materials and Methods

bulk

container offers not only reduced cost, but also
９）

１．Plant materials

abated emission of greenhouse gases . However,

One hundred and twelve heads of ‘Hamamisaki’with using this large bulk container in the field or

cabbage （ Brassica oleracea var. Capitata L. ） wereat the packing house, cabbage heads are subject tostress ／ damage

impactcontainer,

resulting

Additionally,

the

when

in

woundedphysicaldamageobtained from a commercial farm in Miura Citythe

（Kanagawa prefecture, Japan）on １
５ Nov. ２０１
０. Theyouterleaves.

were harvested and transported by car with air

andqualityconditioning（２０℃, approx. ２h）to the laboratory at

droppedinto

deterioration of fruits and vegetables transported bythebulk container including cabbages has not been well

Ibaraki, Japan. After arrival, cabbages were selected

National

Food

Research

Institute,

Tsukuba,-clarified.

for experimentation based on uniformity of shape

Cabbage（Brassica oleracea var. Capitata L.）is anand size. The average height（from cut end to headeconomically important crop grown and consumedtop）and equatorial diameter of the cabbage headworldwide. Cabbages are generally harvested bysamples were １４
０.３±７.１㎜ and １７
４.３±８.０㎜ ,hand to avoid mechanical damage from machinerespectively. The selected cabbages（８１ heads）were

harvesting. After harvesting, they are packed andtransferredtransported to marketplaces or are placed into bulk

temperature of ２
０℃ overnight to equilibrate theircontainers and stored in cold storage for futuretemperature. After this prestorage,

packing and distribution１０）〜１２）. During handling andsamples were then used for the following dropping

distribution, loss of quality and yield caused byand storage experiments.

impact stress is likely due to improper postharvest

２．Dropping treatment and storage conditions

handling and management of

bulk

storage

and

The

to

a

harvestedstorageroom

cabbages

were

at

a
the

constant
cabbagetreatedwithdifferent degrees of impact by letting the cabbage

transportation.
A study of the effect of mechanical stress inhead fall from the heights of ８
０!, ４
０!, ２
０!, andcabbage on the cracking of leaf layers has been

１
０!. Each individual cabbage head was dropped ３

conducted１３）. The effect of wounding ／ cutting ontimes from the same height onto a flat, rigid

１
４）
，
１
５）

.

concrete floor, with the cut end（core）of the cabbage

However, little is known about the stress response

facing up （ Fig. １）. Three replicates （１ head ＝１

mechanism in cabbage, and there are few reports

replicate ） were analyzed in this study, with ainvestigatingcompletely randomized design. The highest height ofvolatile compounds has also been investigatedtheeffectofmechanicalstressesthethe dropping treatment（８０!）was designed based

physiological and biochemical changes in cabbage

on the height of bulk container（１００!）and the size

（impact,
heads,

compression,
eitherdirectly

and
after

vibration） on
receivingstressorof cabbage（approx. ２０!）. Additionally, the leaf packside of cabbage was dropped onto a rigid floor

during long-term storage.
This study, therefore, aimed to understand the

because it is likely to be the most sensitive part ofeffects of dropping treatment （ the impact stressthe head to the impact stress. The injury symptoms

simulation during the bulk handling practice）on theof cabbage leaves caused by the dropping treatment

postharvest quality of cabbage heads during storage

are shown in Fig. ２. Slight browning symptom of

at ２
０℃ .

we

wounded part was observed during the storage;

investigated changes in the respiration rate and the

however it seemed not to affect the rest of the leaf

individual sugar content at days ０, １, ３, and ６. Inarea（data not shown）
.

After

the

dropping

treatment,

addition, because there are few studies addressingTo

investigate

thechangesofchemical（ 13 ）

〔Article〕 Influence of Impact Stress on Cabbage（A）

Cut end275

Cork borer（ø2 cm）

Cabbage head
Cut line

80 cm

Core

40 cm

（B）
Sampling area by a cork borer（6 spots/head）

20 cm
10 cm
Concrete ﬂoor
Fig．
１ Schematic illustration of the dropping treatmentof cabbage heads at ８０，４０，２０ and １０"

Fig．
３ Schematic illustration of the sampling method forcabbage heads : equatorial cut line（A）and leaf packsampling area by a cork borer（B）

the first leaf layer but also in other layers of headleaf pack（Fig. ２）. The leaf pack on the opposite
side of the core was sampled using a cork borer（φ２"）. The cabbage leaf disks were randomly mixed,
weighed, and immediately frozen in liquid nitrogen.

（A）

The frozen samples were then kept at −４
０℃ untilthe analysis of the sugar content was performed.
３．Respiration measurement
The fifteen heads of cabbage（four sets of dropped
cabbages and one control set, each set containing ３
heads）were used for respiration analysis at days ０,
１, ３, and ６. Each cabbage head was weighed andsealedinheadspacea １
２.１# plastic
gas

was

container,

injected

chromatograph （ GC ６― AM ;and １! of

into

Shimadzu,agas
Kyoto,

Japan）equipped with a ZY ―１ column （ Shimadzu,（B）

Japan ） held at ７
０℃ and a thermal conductivity
detector held at ８０℃ . Helium was used as thecarrier gas.
４．CA treatment
Six chambers（１０! thick acrylic plate, ２
８
０!×２
８
０
!×３
８
５!）were used in this study : three chambers

Fig．
２ Injuries caused by dropping treatment from theheight of ８０"：the first layer（A）and the fourth layer（B）of the head leaf pack of cabbage

for air storage and three chambers for CA storage.
After the dropping treatment, two groups of threetreatments（control cabbage, ８０-" dropped, and ２０" dropped, each treatment containing ３ heads ）components during storage at ２
０℃ and to allow gas

wereexchange and prevent water loss, the cabbages

chambers and another group was stored in CA

droppedchambers.

from

the

four

levelsandthecontrolselected.
The

One

group

respiration

wasstoredmeasurement

in
of

air
all

cabbages（total ４
５ heads）were kept in closed andsamples was conducted with a flow-through system.

unsealed polyethylene（PE）bags at ２
０℃ for analysis

The inlet gas composition with a constant massat days １, ３ and ６.

flow control of the air chamber was ２１％ O２＋７
９％

For sample collection, each cabbage head was

N２＋０％ CO２ and that of the CA chamber was ２.

individually cut at the equatorial line （ Fig. ３）,

５％ O２＋４５. ％ CO２, balanced with N２. Six chambers

because the impact injury was observed not only inwere individually linked with a gas chromatograph276

Food Preservation Science（ GC ― ８ A ;

VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

Shimadzu ） equipped with a thermal

Results

conductivity detector.
５．Analysis of sugar content（ 14 ）

１．Effect of dropping treatment on the respiration

Briefly, ５% of the frozen sample was directly
immersed and homogenized with １
５! of ８０％（v／rate of cabbages
The largest change in respiration rate（mg CO２・v）ethanol at １２０,００rpm for ２min and at １
００
,０
０ rpm

& ・h−１ ） wasforhomogenizer,

immediately after the dropping treatment ）. The

１min （ NS ― ５
１ ;Physcotron−１

observed

atday ０（ measured

Microtech Nition, Chiba, Japan ）. The homogenate

highest respiration rate was found in the ８０-#

was centrifuged at ２５,２５gn for １０min（Biofuge primo,

dropped sample（ca. ７
０$・&−１・h−１）, and lower rates

SORVALL!, Osaka, Japan）to yield an ethanol-soluble

were observed in the ４０-# dropped, ２
０-# dropped,

fraction. The supernatant was collected and the１
０-# dropped, and control samples, respectively（Fig.

pellets were rehomogenized twice with １
０! of ８０％

４）
. In addition, a gradual decrease in the respiration（ v ／ v ） ethanolrate of all cabbages （ treated and control ） was

at １
０,０
０
０rpm

for １min.

Aftercentrifugation, the three ethanol soluble fractions

observed during storage at ２
０℃ for ６ days.

were pooled together, and the volume was adjusted

２． Effect of dropping treatment on the sugar

to ４
５! with ８０％（v／v）ethanol. Nine milliliters ofcontent of cabbages

each sample was evaporated to dryness under N２ at

The changes in total sugar, sucrose, glucose, and

７
０℃ and then redissolved in １! of Milli-Q water

fructose during storage are shown in Fig. ５. The（ Nihon Millipore, Ltd. , Japan ）. The concentration

total sugar content slightly decreased during the ６

factor of the final sample solution in this study wasdays of storage. The differences in the total sugar

therefore １-fold（５g／４
５![at extraction]x ９!／１![atlevels were small at day １ and day ３. However, a

wassignificant loss of sugar was observed in the ４０-#

recentrifuged at １,００
０ gn for ５min（Biofuge primo,

dropped cabbages at day ６（P !００. ５, Fig. ５A）. The

SORVALL! ）to produce a clear solution and thensucrose content of the cabbage heads in this groupfiltered through a ０.４
５" polytetrafluoroethylene

was ０８. 〜１１. $・%−１ fresh weight（FW）, the lowest（PTFE）filter（Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.,sugar content in this research. A small change inJapan）.

sucrose content was observed during the ６ days ofpurification ] ＝１.０）.

Standard

The

solutionsofsolublesucrose,fractionandstorage, but a significant difference was not found

fructose were purchased from Wako Pure Chemical

glucose,among the various treatments（Fig. ５B）. The glucose

Industries, Ltd. （ Osaka, Japan ）. A stock standard

content also changed slightly during storage. At day

solution of the three sugars mixed （３０.０$ ・ !−１

６, there was a difference in the glucose contenteach）was prepared, and the standard mixture wasamong the dropping treatments, with the lowest

for standard curve calibration（０, ０５. , １０. , ２.５, ５.０,
１０.０, １
５.０, and ３
０.０$・!−１）. A high-performanceliquid chromatography（HPLC）system（LC―１
０ AVP ;
Shimadzu ） was

used

for

sugar

determination.

Degassed Milli-Q water at ０.５! ・ min−１ and ６
０℃
was used as the mobile phase. A refractive index
detector（RID―１
０A ; Shimadzu）was used to quantify
the sugar content following separation with a Shimpack SCR―１
０
１N column（Shimadzu）.
６．Data analysis
Ananalysisofvariancewithacompletely

randomized design using dropping levels or days ofstorage as factors was performed using SPSS（SPSS,
Chicago, IL）. Tukey’s multiple-range test was used
to test for a significant difference at the ９５％confidence level of each variable.

Respiration rate（mg CO2・kg-1・h-1）

diluted in Milli-Q water to the desired concentration
100

Control
20 cm

80

80 cm
10 cm

40 cm

d
c
b
b
a

60
40
20
0
0

1

2

3

4

5

6

7

Day（s）after dropping treatment
Fig．
４ Respiration rate of control and dropped cabbages
during storage at ２
０℃ for ６ days
Each value is the mean of three replicates. Different letters（ a, b, c, and d ） indicate a significant difference among
treatments at the ５％ level, as determined by Tukey’s
multiple-range test

〔Article〕 Influence of Impact Stress on Cabbage

30.0

a
a
a
ab

25.0

b

A

Control
20 cm

2.0

80 cm
10 cm

40 cm

1.0
B

20.0

0.0
0

1

2

3

4

5

6

17.5

Glucose (mg・g-1FW)

277

3.0
Sucrose (mg・g-1FW)

35.0

7
a
a
ab

15.0

b

12.5
C
10.0

0
Fructose (mg・g-1FW)

Total sugar (mg・g-1FW)（ 15 ）

1

2

3

4

5

6

7

17.5
15.0
a
ab
abc
bc
c

12.5
D
10.0

0
1
2
3
4
5
6
7
Day (s) after dropping treatment

0
1
2
3
4
5
6
7
Day (s) after dropping treatment

Fig．
５ Changes in the individual sugar content in control and dropped cabbage
during ６ days of storage at ２
０℃：total sugar（A），sucrose（B），glucose（C），andfructose（D）
Each value is the mean of three replicates. Different letters （ a, b, and c ） indicate asignificant difference among treatments at the ５％ level, as determined by Tukey's
multiple-range test.

content in the ４０-! dropped sample（Fig. ５C）. For

８
０-! dropped sample. However, in contrast to air

the fructose content, the highest content of １５"・

conditions, the respiration rate of the ８０-! dropped#−１ FW was observed at day ０, and it gradually

samplestoredunderCAconditions

wasdecreased during storage. The most obvious change

approximately ５０％ lower than that of samples

in fructose content among the different treatments

stored under air conditions（Fig. ６）. Moreover, thewas observed at day ６（Fig. ５D）, with a significant

respiration rate of all cabbage samples graduallyloss in the ８０-! and ４
０-! dropped samples. In

decreased, reaching below ２０" CO２・kg−１・h−１ after

addition, there was a small change in the fructose

５０h.

content in the １０-! dropped samples that was notcabbage stored under CA were shorter（１１２h）thansignificantly

that of air storage because of the instability of thedifferent

from

the

content

inthe

Unfortunately,therespiration

data

of

the

control cabbages.

gas regulating system（Fig. ６B）. The concentration

３．Changes in respiration rate and sugar content

of

the

inlet

carbondioxidealso

revealed

theof dropped cabbages stored under CA conditions

instability of the gas conditions at １
１
２〜１
３
０h of

The respiration rate（" CO２・$−１・h−１）of cabbage

investigation （ Fig. ６C ）, resulting in difficulties insamples under air and CA conditions was monitoredfor １
５０h （ Fig. ６）.

Under

air

conditions,thecalculating the respiration rate for this period.
Table １ shows the content of the different types

respiration rate of all of the samples increasedof sugars in cabbage heads stored at ２
０℃ for ６

during the first １
０h of measurement, with thedays under air or CA conditions. No significant

highest value observed in the ８０-! dropped sample

difference was found in the glucose content of any（ca. ７０" CO２・kg−１・h−１）. The respiration rate of theof the samples. However, although there was nocontrol and ２０-! dropped cabbages was observed

significant

ca. ３
０〜４
０"

CO２・kg−１・h−１ anddifference

between

the

air

and

CA

gradually

conditions, a loss of fructose and total sugar content

decreased to ２
０" CO２・kg−１・h−１ at the end of thewas observed at day ６ of storage, with the lowest

measurement. The respiration rate of CA - storedcontent in the ８０-! dropped samples stored undercabbagesof

air conditions. Sucrose was the least abundant sugar

measurement, with the highest rate observed in theamong the three individual sugars monitored in thisatincreased

during

the

first

１
０h

278

Food Preservation Science

Respiration rate
（mg CO2 kg-1・h-1）

80

Discussion
A

Mechanical damage causes cellular changes in40

fresh produce, affecting qualities such as flavor,
appearance, and physiological properties１６）〜２３）. Plant

20

organs subjected to mechanical stress also inducechanges

0
0

25

50

75

100

125

150

Respiration rate
（mg CO2 kg-1・h-1）

respiration

rate

and

ethyleneof the most important factors leading to quality

CA-Cont.
CA-80 cm
CA-20 cm60

inproduction２４），２５）. Mechanical stress, therefore, is one

80

deterioration and reducing the shelf life of fresh
produce.

BForlengthystorageoffruitsandvegetables, controlled and ／ or modified atmosphere40

storage has been reported as a useful tool for shelf
20

life extension, especially for those that deteriorate
rapidly. Our present work shows the effect of00
Inlet CO2 concentration（%）（ 16 ）

in all samples receiving the CA treatment.

Air-Cont.
Air-80 cm
Air-20 cm

60

VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

25

50

75

100

125

impact stress on the physiological and biochemical

150

changes in cabbage stored at ２
０℃（in air and CA

10

conditions）
.
Under

7.5

C

air

storageofcabbage,therespiration rate of cabbage dropped from a height5of ８
０! was higher than other dropping treatments,
with the lowest respiration rate observed in control

2.5
0ambient

cabbages（Fig. ４）. For respiration analysis duringstorage at ２
０℃ for ６ days, the results showed a025
50
75 100 125
Time after storage（h）

150

gradual decrease of respiration rates in all samples.
From the results, it can be hypothesized that theFig ．６ Respiration rates of control and dropped
cabbages stored at ２
０℃ under air conditions（A）and
CA conditions （ B ） and the inlet CO２ concentration（C）during the １
５０ h of the investigation

sudden impact stress resulting from the dropping
treatment immediately induces a higher respiration
rate in the cabbage head after it receives a stresssignal. Although the mechanism of the dropping
effectonthephysiologicalandbiochemical

study. At day ６ after dropping, the sucrose content

properties is still not clear, this study indicated thatwas not changed under air storage conditions, but

anan increase in sucrose content（ca. ２-fold）was foundsensitive internal responses of cabbage to impact

increaseinrespiration

rate

is

one

of

the

Table １ Changes in the individual sugar content（"・#−１ FW）of control and dropped cabbages during storage under
air or CA conditions at ２
０℃ for ６ days
Air
SugarsDay
Control

SucroseGlucoseFructose

CA

８
０!

２
０!

Control

８
０!

２
０!

０．
６
０±０．
０
６a

０．
７
７±０．
０
６ ab

１．
５
４±０．
３
８c

１．
３
２±０．
０
８ bc

１．
７
０±０．
０
９c

＊

０

０．
７
７±０．
２
８ ab

６

０．
８
７±０．
２
１ ab

０ １
６．
０
４±０．
５
１a
６ １
５．
４
５±０．
７
８a

１
４．
１
９±０．
３
３a １
５．
４
３±０．
２
８a

１
６．
１
６±１．
５
０a １
６．
０
９±０．
８
３a

１
６．
０
６±１．
１
２a

０ １
４．
９
１±０．
３
５a
６ １
２．
１
８±０．
６
４b

１
０．
３
７±０．
９
６b １
１．
７
５±０．
０
７b

１
２．
２
３±１．
８
６b １
２．
９
４±０．
５
９ ab

１
２．
５
２±０．
９
０ ab

=Different letters（a, b, and c）indicate a significant difference among treatments compared with Day ０ at P !０．
０５, asdetermined by Tukey’s multiple-range tests.
Each value is the mean of three replicates±SD.

＊（ 17 ）

〔Article〕 Influence of Impact Stress on Cabbage

279

stress. Cabbage may require a large amount of

respiration rate ofenergy to respond to a sudden impact stress. A

treatment might relate to the inhibitory activities

high respiration rate can supply energy for cellulardescribed above. Moreover, CA conditions of ２.５％

metabolism. Additionally, large increases in carbon

O２ and ４.５％ CO２ appear to effectively inhibit

dioxide and ethylene production have been reported

physiological changes and to extend the shelf life ofas a responsetomechanicalstresses,such

droppedcabbage

under

CA

as

cabbage under room temperature storage. However,wounding in fruits and vegetables２６）〜３０）. Moreover,

it is important to consider that the degree ofincreased respiration has been correlated to theimpactenhanced synthesis of enzymes involved in theefficiency of CA storage.

respiratory pathway and to a transient increase in
２
３）

With respect to the biochemical properties of
produce,manydescribed changes

inprevious

will

likelyinfluencethe

In general, fruits and vegetables stored understudieshavevalues of soluble sugars and organic acids. Increases
in sugar content were also observed in previous

solidsinducedbystudies of various fresh produce３６）〜４０）. Although there

Our

study

solubledamage１８），３１），３２） .

mechanicallevelsmodified or controlled atmospheres maintain highaerobic respiration in fresh-cut carrots .
freshstressalso

was no significant difference between air and CA

demonstrates the effect of impact stress on changes

conditions in this study, CA treatment seemed toin sugar content. The results revealed that themaintain glucose content during storage and to slow

dropping treatment induced the loss of fructose andthe loss of fructose content. Moreover, at day ６ of

the total sugar content of cabbage heads during

the investigation, an increase of sucrose（ca. ２-fold）

storagethewas found in all samples receiving CA treatment

investigation（Fig. ５）. This indicates a change in the（Table １）. The small change in sugar content might

chemical

at ２
０℃ ,

especiallyatday ６ ofinalso be due to the low respiration of cabbage underresponse to impact stress and is likely caused by a

CA storage conditions（Fig. ６）. Additionally, because

metaboliccomponents

indroppedcabbagethethe most pronounced increase in respiration rate in

respiration rate. Additionally, according to the close

cabbage occurs immediately after the impact stressrelationshipresponse

following

the

rise

of

cellularand decreases gradually thereafter, the management

respiratory metabolism, a decrease in soluble solidsof postharvest handling, including both the storage

might be associated with the use of sugars asandrespiration substrates. Nevertheless, the dropping

attention and maintenance in a controlled and ／ ortreatment from a height of １
０! did not cause

modified atmosphere should immediately follow fieldchanges in individual sugar content during the ６

harvesting to reduce injury to the cabbage bydays of the investigation. For future applications inmechanical stress.

agricultural

betweensugar

research

content

stages,shouldreceivemore

In conclusion, the application of impact stress byfurther study of various types of mechanical stressdropping treatment to cabbages caused an increase

and acceptable levelsofmechanicaldamageinin respiration rate and a loss of sugar content. The

cabbage

fresh

produceshouldbestrength of the stress level and the time period

otherpostharvest

transportation

handling,

and

and

and

considered.

after the application of stress also play a role inCabbage is perhaps the most common vegetable
storedunderCAconditions,

undercellular changes in the cabbage. In addition, CA

thetreatment

seemedrecommended storage levels of ２％ to ３％ O２ andchemicalchanges

４％ to ５％ CO２１１）. In this study, CA treatment

technique may reduce the severe damage caused by

reduced the rise in the respiration rate of dropped

impact stress in cabbages.

cabbages during storage at ２
０℃（Fig. ６）. For mostvegetable

products,

when

the

external

oxygenPostharvest
deterioration

toimpactofinhibitduring １
５０h

stresscabbages.

physiological

and

of

This

storage.

induces

However,quality

quick

and

pressure is low, the respiration activity is decreased,

appropriate manipulation of postharvest handling cana changeoxidasemaintain quality and reduce losses of cabbage yield.

activities. Low O２ levels can also suppress the genes

Moreover, as the general storage and transport ofand enzymes that are associated with maturation

cabbage is conducted in bulk, further studies of theand senescence, such as acid invertase, cellulase andeffectofmechanicalstressonqualityofcabbageduringbulk

attributed

３
３）
〜３
５）

polygalacturonase

to

.

a

The

reduction

decrease

of

in

the

the

postharvest

handling

and

280

Food Preservation Science

VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

（ 18 ）

the Institute of Life Cycle Assessment, Japan, ２
０〜２
１

distribution should be considered.

（２
０
０
９）
AcknowledgementThe

authors

thank

the

１
０）OMAF FOOD INSPECTION BRANCH : Cabbage“Research and development projects for application

risk assessment introduction and summary, Foodin promoting new policy of Agriculture, Forestry

Safety Risk Assessment, Food of Plant Origin, ２００１.

and Fisheries ” No. ２
２
０
１
４（ funded by MAFF ） for（Consult web page〈http : ／／www.omafra.gov.on.ca／

financial support.

english／food／inspection／fruitveg／risk̲assessment̲
pdf／cabbage／３
０ ra.pdf〉for further information）.
１
１）RAMSEY, H. and PHILLIPS, D. : Exporting vegetables

Referencesin bulk :Reducing supply chain costs without

A. ,compromising quality, Bulletin ４７
６６, Department of

GUARNIERI, A. and RAGNI, L. : Damage to pears

Agriculture and Food, Western Australia, ２００９（Consult.

caused by simulated transport, J. Food Eng. , ６
６,

web page〈http : ／／www.agric.wa.gov.au／objtwr／

２
１
９〜２
２
６（２
０
０
５）

imported̲assets／content／hort／veg／ bn ̲ exporting ̲１ ） BERARDINELLI,A. ,DONATI,

V. ,GIUNCHI,２ ） JARIMOPAS, B. , SINGH, S. P. and SAENGNIL, W. :Measurement
vibrationandlevelsandtruck

transport

１２）PRANGE, R. K. : Cabbage. The commercial storage

damagetopackagedof fruits, vegetables, and florists and nursery

tangerines during transit, Packag. Technol. Sci., １
８,
１
７
９〜１
８
８（２
０
０
５）
parameters

and

fruit

responsetomechanical damage in sweet cherry, J. Amer. Soc.
Hort. Sci., １
０
４, ８
０
８〜８
１
１（１
９
７
９）

Agriculture

Handbook

Number ６
６,

USDAtransport vibration levels on mechanical damage
and physiological responses of Huanghua pears（Pyrus pyrifolia Nakai, cv. Huanghua）, Postharvest
Biol. Technol ., ４
６, ２
０〜２
８（２
０
０
７）
to

dissipation in cabbages, J. Text. Stud ., １
４, ９
９〜１
１
１
（１
９
８
３）
compounds

postharvest

bruisingofapples, Trans. of the ASAE ., ３
２, ９
５
３〜９
５
７（１
９
８
９）

formedindisrupted

tissuesofdifferent cabbage cultivars, J. Food Sci., ５
８, ８
３
５〜
８
４
１（１
９
９
３）
１
５）HEREDIA, J. B. and CISNEROS - ZEVALLOS, L. : The
effects

５ ） BRUSEWITZ, G. H. and BARTSCH, J. A. : Impact
related１３）HOLT, J. E. and SCHOORL, D. : Cracking and energy

１４）CHIN, H.-W. and LINDSAY, R. C. : Volatile sulfur４）ZHOU, R., SU, S., YAN, L. and LI, Y. : Effect ofparameters

stock,（２００４）３）LIDSTER, P. D. and TUNG, M. A. : Identification of
deformationveg̲bulk̲bins.pdf〉for further information）.

ofanalysisofjasmonate

exogenousonthe

ethyleneandmethylaccumulationofphenolic

antioxidants in selected whole and wounded fresh
produce, Food Chem., １
１
５, １
５
０
０〜１
５
０
８（２
０
０
９）

６）BRUSEWITZ, G. H., MCCOLLUM, T. G. and ZHANG,

１６）DeMARTINO, G., MASSANTINI, R., BOTONDI, R. and

X. : Impact bruise resistance of peaches, Trans. Am.

MENCARELLI, F. : Temperature affects impact injury

Soc. Agric. Eng, ３
４, ９
６
２〜９
６
５（１
９
９
１）

on apricot fruit, Postharvest Biol. Technol ., ２
５, １
４
５〜

７）MONTERO, C. R. S., SCHWARZ, L. L., SANTOS, L. C.

１
４
９（２
０
０
２）

dos, ANDREAZZA, C. S., KECHINSKI, C. P. and BENDER,

１７）GARCIA, J. L., RUIZ -ALTISENT, M. and BARREIRO,

R. J. : Postharvest mechanical damage affects fruit

P. : Factors influencing mechanical properties andquality of ‘Montenegrina’ and ‘Rainha’ tangerines,

bruise susceptibility of apples and pears, J. Agric.

Pesq. agropec. bras., ４
４, １
６
３
６〜１
６
４
０（２
０
０
９）

Eng.Res., ６
１, １
１〜１
８（１
９
９
５）

８）ZWIGGELAAR, R., YANG, Q., GARCIA-PRADOT, E. and
BULL, C. R. : Use of

１８）MORETTI, C. L., SARGENT, S. A. and HUBER, D. J. :andChemical composition and physical properties ofmachine vision for bruise detection on peaches

pericarp, locule, and placental tissues of tomatoes

spectral

information

and apricots, J. Agric. Eng. Res. , ６
３, ３
２
３〜３
３
２

with internal bruising, J. Amer. Soc. Hort. Sci., １
２
３,

（１
９
９
６）

６
５
６〜６
６
０（１
９
９
８）

９）ORIKASA, T., ROY, P., YOSHIDA, M., SOGA, A., OHNO,

１９） PEREZ - VICENTE,

A. ,MARTINEZ - ROMERO,

D. ,S., NIIMI, T., YOKOYAMA, K., HAGA, H., NAKAMURA,CARBONELL, A., SERRANO, M., RIQUELME, F., GUILLEN,

N. and SHIINA, T. : Possibility of greenhouse gases

F.

and

VALERO,

abatement

by

using

newly

developed

extendingshelfcontainer

for

fresh

fruitsandbulk

D. : Roleofpolyamines

in

life

the

reductionofandvegetables

mechanical damage during plum （ Prunus salicina

distribution, Proceedings of the 5 th annual meeting ofLindl.）storage, Postharvest Biol. Technol ., ２
５, ２
５〜３
２

（ 19 ）

〔Article〕 Influence of Impact Stress on Cabbage

Study of impact and compression damage on

（２
０
０
２）
２
０）QUINTANA, M. E. G. and PAULL, R. E. : Mechanicalinjury281

duringpostharvest

handling‘Solo’

ofpapaya fruit, J. Amer. Soc. Hort. Sci., １
１
８, ６
１
８〜６
２
２
（１
９
９
３）

Asian pears, Trans. of the ASAE ., ３
０, １
１
９
３〜１
１
９
７
（１
９
８
７）
３
２）MENCARELLI, F., MASSANTINI, R. and BOTONDI, R. :Influence of impact surface and temperature on

２
１） ROLLE, R. S. and CHISM, G. W. : Physiologicalconsequences of minimally processed fruits andthe ripening response of kiwifruit, Postharvest Biol.
Technol ., ８, １
６
５〜１
７
７（１
９
９
６）

vegetables, J. Food Quality, １
０, １
５
７〜１
７
７（１
９
８
７）

３
３）COUPE, S. A., SINCLAIR, B. K., GREER, L. A., GAPPER,

２２）SARGENT, S. A., BRECHT, J. K. and ZOELLNER, J.

N. E., WATSON, L. M. and HURST, P. L. : Analysis of

J. : Sensitivity of tomatoes at mature - green andacidbreaker ripeness stage to internal bruising, J.

senescenceAmer. Soc. Hort. Sci., １
１
７, １
１
９〜１
２
３（１
９
９
２）

Technol ., ２
８, ２
７〜３
７（２
０
０
３）

２
３）SURJADINATA, B. B. and CISNEROS - ZEVALLOS, L. :Modeling wound - induced respiration of fresh - cut

invertaseofgene

expression

duringthebroccoli

florets,

Postharvest

Biol.

３
４）HURST, P. L., CHEER, V., SINCLAIR, B. K. and IRVING,
D. E. : Biochemical

responsesofasparagus

tocarrots（Daucus carota L.）, J. Food Sci., ６
８, ２
７
３
５〜

controlled atmosphere storage at ２
０℃ , J. Food

２
７
４
０（２
０
０
３）

Biochem., ２
０, ４
６
３〜４
７
２（１
９
９
７）

２
４） NAKAMURA, R. and ITO, T. : The effects of３５） KANELLIS, A. K, SOLOMOS, T. and ROUBELAKIS -vibration on the respiration of fruit. １. Changes in

ANGELAKIS, K. A. : Suppression of cellulose andthe respiration rate of tomato fruit during andpolygalacturonaseandinduction

after vibration, J. Jpn. Soc. Hort. Sci., ４
５, ３
１
３〜３
１
９

dehydrogenase

isozymes

in

（１
９
７
６）

mesocarp subjected to low oxygen stress, Plant

２５）MACLEOD, R. F., KADER, A. A. and MORRIS, L. L. :Stimulation of ethylene and CO２ product ion of
mature - green

tomatoesbyimpactbruising,

HortScience, １
１, ６
０
４〜６
０
６（１
９
７
６）

of

alcohol

avocadofruit

Physiol ., ９
６, ２
６
９〜２
７
４（１
９
９
１）
３
６）JONES, R. B., FARAGHER, J. D. and WINKLER, S. : A
review of the influence of postharvest treatmentson quality and glucosinolate content in broccoli

２６） ESCALONA, V. H. , AGUAYO, E. and ARTÉS, F. :Quality and physiological changes of fresh - cut
kohlrabi, HortScience, ３
８, １
１
４
８〜１
１
５
２（２
０
０
３）

（Brassica oleracea var. italica）heads, Postharvest Biol.
Technol ., ４
１, １〜８（２００６）３７）ONTAI, S. L., PAULL, R. E. and SALTVEIT Jr., M.

２７） HERNER, R. C. and SINK Jr, K. C. : Ethylene
production and respiratory behavior of the rin
tomato mutant, Plant Physiol ., ５
２, ３
８〜４
２（１
９
７
３）
２
８）HODGES, D. M. and TOIVONEN, P. M. A. : Quality of

E. : Controlled atmosphere storage of sugar peas,
HortScience, ２
７, ３
９〜４
１（１
９
９
２）
３
８） PARIASCA, J. A. T. , MIYAZAKI, T. , HISAKA, H. ,NAKAGAWA, H. and SATO, T. : Effect of modified

fresh - cut fruits and vegetables as affected byatmospherepackaging （ MAP ） andcontrolled

exposure to abiotic stress, Postharvest Biol. Technol .,atmosphere（CA）storage on the quality of snow

４
８, １
５
５〜１
６
２（２
０
０
８）

pea pods （ Pisum sativum L. var. saccharatum ）,２９） MAO, L. , YING, T. , XI, Y. and ZHEN, Y. :Postharvest. Biol. Technol ., ２
１, ２
１
３〜２
２
３（２
０
０
０）

Respiration rate, ethylene production, and cellular３９）PARKIN, K. L. and SCHWOBE, M. A. : Effect of lowleakageof

fruit

following

vibrational

stress,

HortScience, ３
０, １
４
５〜１
４
９（１
９
９
５）

temperature and modified atmosphere on sugar
accumulation and chip color of potatoes（Solanum

３０）SALTVEIT, M. E., CHOI, Y.-J. and TOMÁS-BARBERÁN,tuberosum）, J. Food Sci., ５
５, １
３
４
１〜１
３
４
４（１
９
９
０）

the

４
０） SÁNCHEZ - MATA, M. C. , CÁMARA, M. and DÍEZ -phosopholipid-signalling pathway in wound-induced

MARQUÉS, C. : Extending shelf - life and nutritiveF.

A. : Involvementofcomponentsofphenylpropanoid metabolism in lettuce （ Lactuca

value of green beans（Phaseolus vulgaris L.）, by

sativa ） leaf tissue, Physiol. Plant. , １
２
５, ３
４
５〜３
５
５

controlled atmosphere storage :

（２
０
０
５）

Food Chem., ８
０, ３
０
９〜３
１
５（２
０
０
３）

３
１）CHEN, P., RUIZ, M., LU, F. and KADER, A. A. :macronutrients,

282

Food Preservation Science＊１

タンマウォン マナスィカン ・兼田朋子 ・中村宣貴
吉田は，落下高さが大きいほど顕著であった。その後，呼吸速度は低下し，落下処理１日後には，対照区（落下処理＊１

誠＊２・曽我綾香＊２・椎名武夫＊１＊１

農研機構食品総合研究所

（〒３
０
５―８
６
４
２ 茨城県つくば市観音台２―１―１
２）＊２（ 20 ）

ャベツの呼吸速度は，落下処理直後に上昇し，その程度

衝撃ストレスが収穫後キャベツの生理的・化学的特性に及ぼす影響
＊１

VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

神奈川県農業技術センター

（〒２
５
９―１
２
０
４ 神奈川県平塚市上吉沢１６１７）無し）のそれとの間に，有意な差はみられなくなった。
フ ラ ク ト ー ス と 全 糖 は，保 存１，３日 後 に や や 低 下
し，６日後には顕著な低下がみられ，８
０cm，４
０cmから
落下処理したキャベツで最も低い値を示した。すなわち，落下処理による生理的，化学的な影響として，呼吸速度の上昇と，糖含量の低下があることが示された。一方，落下処理後に，２０℃，CA環境下に保存したキャベツに

青果物の収穫後の取扱における物理的損傷は，ロスやおいては，呼吸速度の上昇と糖含量の減少が抑制された

品質低下に大きな影響を及ぼす。そこで，本研究では，ことから，CA環境条件によって落下ストレスによる生

バルクでの荷扱いを想定し，物理的ストレスのうちの落

理的な損傷が低減されるものと考えられた。以上の結果

下衝撃が，キャベツの生理的，化学的特性に及ぼす影響

から，収穫後のキャベツにおいて，落下処理は，処理直について検討した。適期収穫したキャベツを，１０，２０，

後の呼吸速度の上昇と，保存中の糖含量の減少を引き起

４０，８０cmの高さから水平コンクリート床に自由落下さ

こすこと，その影響が落下高さに依存すること，さらに，

せ，その後，２
０℃に６日間保存し，保存中の呼吸速度，

CA環境を含めた適切な環境の維持によりストレスの軽糖含量（スクロース，グルコース，フラクトース，およ

減と品質劣化の抑制が可能であることが示された。

びそれらの合計としての全糖）を経時的に測定した。キ

（平成２
３年４月２
７日受付，平成２３年９月１日受理）

（ 21 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１ 〔研究ノート〕

283

小麦 Ero1遺伝子のクローニングと発現
野 口 智 弘＊１§・田 村 良 太＊２・新 井 智 美＊２・岡大 貴＊１
野 口 治 子＊２・内 野 昌 孝＊２・! 野 克 己＊２＊１ 東京農業大学応用生物科学部食品加工技術センター＊２ 東京農業大学応用生物科学部生物応用化学科

Cloning and Expression of Wheat Ero1
NOGUCHI Tomohiro＊１§，TAMURA Ryouta＊２，ARAI Satomi＊２，OKA Daiki＊１，
NOGUCHI Haruko＊２，UCHINO Masataka＊２ and TAKANO Katsumi＊２
Food Processing Center, Faculty of Applied Bioscience, Tokyo University of Agriculture,1−1−1 Sakuragaoka, Setagaya−ku, Tokyo 156−8502
Department of Applied Biology and Chemistry, Faculty of Applied Bioscience, Tokyo University of Agriculture,1−1−1 Sakuragaoka, Setagaya−ku, Tokyo 156−0−8502＊１＊２

Ero１ encodes a flavoprotein oxidase that promotes oxidative protein folding through protein disulfide
isomerase and generates reactive oxygen species（hydrogen peroxide）as byproducts. Ero１ was cloned
and sequenced from wheat（Triticum aestivum cv. Haruyutaka）. Three homologous Ero１ genes wereobtained, which showed high sequence conservation. These Ero１genes were ４５５ amino acids in lengthwith a conserved catalytic Cys-X-X-Cys-X-X-Cys motif（Cys３７
０, Cys３７３, Cys３７６）and a transmembrane
signal in the N-terminal domain. Wheat Ero１ without the signal sequence was expressed in Escherichia
coli as a His-tagged fusion protein. Recombinant Ero１was purified by affinity chromatography using a
TALON resin column. The activity of purified recombinant Ero１ was measured by both the catalytic
reduction of FAD and an oxygen consumption assay. FAD was reduced in an Ero１ concentrationdependent manner. Oxygen consumption at ０１. µM wheat Ero１ was slow ; however, the rate increased
with increased Ero１ concentration. These results indicated that recombinant Ero１ from wheat has
FAD-reducing ability, and utilizes oxygen as a terminal electron accepter in the PDI-Ero１ system.
（Received Apr. ７, ２０１１；Accepted Aug. ２
９, ２
０
１
１）
Key words：Ero1, wheat, dough, disulfide bondEro1，小麦，生地，ジスルフィド結合

生体内で合成さるタンパク質がその機能を発揮するににより形成される２）。PDIは小胞体内膜に存在し，活性は，いくつかの修飾を受けることが重要であり，フォー

中心に２つのシステイン残基を有し，活性中心が酸化状

ルディングもそのひとつである。タンパク質のフォール態にあるとき，タンパク質の２つのシステイン残基に対ディングとは翻訳されたタンパク質の折りたたみのことして作用しジスルフィド結合の形成を触媒する。反応後，であり，それに関与するタンパク質としては分子シャペ

活性中心は還元状態となるため，PDIを酸化型へと再生

ロンが知られている。分子シャペロンによるフォールデする必要がある。この還元型PDIを酸化型へと変換する

ィングは，主に分子間の非共有結合が中心である。しかのがEro１である。PDI-Ero１システムによるジスルフ

し，フォールディングにおいては，ジスルフィド結合の

ィド形成機構は，酵母，ヒトやイネなどにおいてその存ような共有結合も必要とされる。生体内のジスルフィド在が報告され，イネではPDI 遺伝子が１９，Ero1遺伝子が結合は，原核生物ではDsbAとDsbBの働きにより１），真

１つ見い出されている３）。Ero1遺伝子の発現を抑制させ核生物ではPDI（Protein disulfide isomerase, EC５．
３．
４．

たイネ変異株においては，コメ貯蔵タンパク質内のジス１）とEro１（Endoplasmic reticulum oxidoreductase）

ルフィド結合が正常に形成されず，同タンパク質のフォ

＊１ 〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１§ Corresponding author, E-mail : tomo@nodai.ac.jp
＊２ 〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１

284

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

（ 22 ）

Biosystem社製）を用いてシークエンス解析を行った。

ールディングが不十分であった。
一方，同じイネ科植物であるコムギでは９種類のPDI

シークエンス分析は，３１００-Avant／８
０# Capillary array

ファミリーの存在が報告されている４）。小麦粉の水を加

（９
１ #×５
０", Applied Biosystem社 製）の カ ラ ム と，え混捏するとグルテンを形成するという特性は，製パン

３
１
０
０
３
１
０
０-POP-７（Applied Biosystem社 製）を ポ リ マをはじめ様々な加工食品で利用されている。このグルテー と し た ジ ェ ネ テ ィ ッ ク ア ナ ラ イ ザ ー（ABIPRISM

ン形成には，タンパク質間のジスルフィド結合が重要と

３
１
００-Avant, Applied Biosystem社製）にて行った。３ -され，筆者らのグループはコムギ内在性の要因として

RACEにより明らかにした塩基配列をもとに５ -RACE

PDIの関与を検討している。しかし，これまでにコムギ用プライマーを作製し，PCRにより増幅したcDNAのシにおいてPDIを酸化するEro１についての報告はない。

ーケンス解析を行った。

そこで本研究ではコムギEro１について解明することを

３．コムギEro１の発現目的として，Ero１遺伝子を取得し，リコンビナント

コ ム ギEro１の 発 現 用 ベ ク タ ー に はpET-２
１a（＋）（Novagen社製）を用いた。全長コムギEro1の両末端にEro１の発現を試みた。

制限酵素サイトを付加したプライマーと，N末端側に存試料および実験方法

在する小胞体膜貫通領域を除く領域を増幅できるような

１．試料およびcDNAの調製

プライマーを構築し（Table １），２種類の発現用プラ試料には，北海道産ハルユタカ（Triticum aestivum cv

スミドを作成した。発現用ベクターで宿主大腸菌である

Haruyutaka）を用いた。乾燥小麦を水に浸漬し，ろ紙

BL２
１ codon Plus
（DE３）
-RIL（STRATEGENE社 製）を

に播種後２
８℃で４
８時間発芽，発根させた。小麦根を採取

形質転換した後，アンピシリンとクロラムフェニコール

し，液 体 窒 素 で 凍 結 後，RNeasy Plant Mini Kit

を含むLB培地にて２０℃で培養した。培養液のA６６０が約（QIAGEN社製）を用いて総RNAを抽 出 し た。総RNA

０．
６のときIPTG（終濃度０．
２ M）を添加し，一晩培養しの 逆 転 写 はFirst choice RLM-RACE kit（Ambion社てタンパク質の発現を誘導した。

製）を用いて行い，cDNAを取得した。

４．コムギEro１の精製

２．コムギ Ero1 の塩基配列の決定

発現誘導した菌体を回収し，平衡化緩衝液（２０ mM

逆転写反応により得られた一本鎖cDNAを鋳型としTris-HCl（pH７４. ），１
００mM NaCl） に 懸 濁 後，超 音 波て，３ -RACEお よ び５ -RACEに よ るPCRを 行 い，小ホモジナイザー（US１５０，日本精機製作所社製）にて菌麦Ero1の塩基配列を決定した。すなわち，既知である体を破砕した。菌体破砕後，遠心分離（７，０００rpm，４℃，

ヒトおよび酵母Ero1の塩基配列情報を基に，３ -RACE

２０min）した上澄液を超遠心分離（４２，０００g，４℃，６０に用いるプライマーを構築し（Table １），Nested PCRmin）し，得られた上澄液を粗酵素とした。同緩衝液にを行った。PCRには，PrimeSTAR HS DNA Polymeraseて 平 衡 化 し たTALON superflow metal affinity resin（TAKARA社製）を使用した。PCRにより増幅したcDNA（Clontech社製）カラムに粗酵素液を供し，同緩衝液での精製は，Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system

未吸着画分を洗浄した後，１０mMおよび５０mMイミダゾ（Promaga社製）を用いて行った。精製したDNA断片をールを含む同緩衝液にてタンパク質を溶出した。溶出液

pUC１
１８（TAKARA社製）へライゲーションし，大腸の２
８０!における吸光度を測定し，得られたピーク画分菌DH５α（TAKARA社製）を形質転換後，培養した。

を回収し，精製度の確認をLAEMMLIの方法５）に従いSDS-

培 養 し た 菌 体 よ り プ ラ ス ミ ド を 抽 出 し，BigDye

PAGE（T＝１
２５. ％）にて行った。

Terminater v３.１ Cycle Sequencing Kit （ Applied

Table １ Primers used in this study
Designation
For ３ -RACE
Ero1 １st
Ero1 ２nd
For ５ -RACE
Ero1-AS １st
Ero1-AS２nd
For expression of Ero１ protein
Ero1- NheI-Fw
Ero1-NdeI-signal IP-Fw―２
Ero1-XhoI-Chis-Rv―２

Sequence（５ -３ ）ACTSTGGCAAGGTGAAAATGGCCTGAGAAGTGTCGATTATGGGGAAAGC
CAATTTGAATCAACAGTTCCAGCTGC
CAAGTTCTTGGGCTTGGAACAGC
ATGCGCTAGCATGTCAGAGGGCCCCCCTCATGCCATATGTCCCGCGGCTTCCCCTCGCATCTCGAGGGAAGCCCCCTTTTGCAAAGTAGAThe underlined sequences are restriction site.

（ 23 ）

〔研究ノート〕 小麦Ero1の発現285

５．酸化還元活性測定６）

列はいずれも１，
３
６８bpであり，アミノ酸配列は４５５残基（１）FAD退 色 法

各 濃 度 に 調 製 し た コ ム ギEro１であった。コムギEro１間における配列の相違は，塩基８００"（終 濃 度１，３，５µM） に，１２０µM FAD １００

配列ではEro１-１とEro１-２間で３塩基，Ero１-１とEro"を加え，予備加温（３０℃，５min）したのち，１２５mM

１-３間 で５塩 基，Ero１-２とEro１-３間 で８塩 基 で あDTT １００"を添加，撹拌し，４
５
２!における吸光度の減り，アミノ酸配列においても最大で３残基の違いであっ少を経時的に測定した。

た（Fig．
２）。コムギは６倍体であること，取得されたEro（２）溶存酸素量の測定

酸素飽和状態となるよう調1の相同性が非常に高いことから，コムギには少なくと製 し た１００mM NaClを 含 む２
０mM Tris HCl（pH７４. ）もEro1が１つコードされていることを明らかにした。

を予備加温（３０℃，５分）し，各濃度のEro１（終濃度

アミノ酸配列について解析したところ，Ero１のN末端

０．
１，０．
２
５，０．
５，０．
７
５，１．
０，２．
０mM）
および２
５mM FAD側（１-３７残基）には小胞体膜結合域が存在し，３
７
０番目

１４ "を添加した。撹拌後，１．
２
５ M DTT ３
５!を 添 加

と３
７
３番目，３
７
６番目のシステイン残基にEro１の活性中し反応を開始した。反応液量は３５. !となるよう調整し心であるCxxCxxCモチーフが保存されていた。コメEro１た。反応液中の酸素濃度の変化は，クラーク型酸素電極の配列と比較したところ，８５％と高い相同性を示した。

（YSI社製，MODEL５３００）を用いて測定した。

２．総Ero１の発現実験結果および考察
１．コムギEro1のアミノ酸配列

コムギより取得した３種のEro1遺伝子のうち，もっとも多くクローンを取得したEro1-1遺伝子を用いて発現を行った。全長Ero１は主に不溶性画分で５
３ kDaとして，

コムギ根より総RNAを抽出後，RT-PCRにより一本鎖小胞 体 膜 結 合 領 域 を 除 去 し たEro1は，可 溶 性 画 分 に

cDNAを合成した。これを鋳型としてコムギEro１の全

４
８．
５ kDaのタンパク質として発現を確認した（Fig．
３）
。

領域をPCRしたところ，約１３. kbpの増幅産物を取得した。

可溶性画分に発現した小胞体膜結合領域を含まない

増幅産物についてサブクローニングし，シークエンスに

Ero１について，アフィニティークロマトグラフィーに供したところ，３種類のEro１（Ero１-１, -２, -３）のクて精製を行った。その結果，５０mMイミダゾール溶出画

ローンが得られた（Fig．
１）
。取得したのEro 1の塩基配分にてタンパク質のピークが得られ，SDS-PAGEに供し

E r o 1−1
E r o 1−2
E r o 1−3
E r o 1−1
E r o 1−2
E r o 1−3
E r o 1−1
E r o 1−2
E r o 1−3
E r o 1−1
E r o 1−2
E r o 1−3
E r o 1−1
E r o 1−2
E r o 1−3

Fig．
１ Amino-acid sequences of the Ero１ from wheat
The transmembrane region is underlined. Active-site cysteines are shown in bold.

RiceE r o 1−1

Rice
E r o 1−1

Rice
E r o 1−1

Rice
E r o 1−1

Rice
E r o 1−1

Rice
E r o 1−1Fig．
２ Sequence alignment of wheat Ero１ and rice Ero1 using ClustalW
Asterisks and dots indicate identical and similar amino acid residues, respectively.

286

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

2

3

4

5

6
Absorbance at 452 nm

1（ 24 ）

0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0

1.0 μ M
3.0 μ M
5.0 μ M

0

120

240
360
Time (sec)

480

600

Fig．
４ Reduction of FAD in the absence of oxygen
Fig．
３ SDS-PAGE analysis of samples from each step of
the purification

たところ４
８．
５ kDaに単一バンドを確認した。
３．コムギEro１の活性
アフィニティークロマトグラフにて精製したEro１の100

Oxygen level（%）

Lane １: molecular mass makers ; lane ２: cell extract, soluble
fraction ; lane ３ : cell extract, insoluble fraction : lane ４ :affinity column fraction eluted without imidazole ; lane ５ :fraction eluted in １
０ mM imidazole ; lane ６: fraction eluted
in ５
０ mM imidazole. The arrowhead indicates the purified
Ero1.

80

0.25 μM

1.0 μM

0.5 μM

2.0 μM

40
20
0
0

120

240
360
Time（sec）

ころ，Ero１濃度が０．
１µMでは４５
２!における吸光度のな減少が確認された（Fig．
４）
。これは，補酵素であるFAD

0.75 μM60

還元活性について，FADの退色法を用いて測定したと減少が緩やかであったがEro１濃度の増加に伴い速やか

Ero 1
0.1 μM

480

600

Fig．
５ Oxygen consumption by wheat Ero１ oxidation in
１
２５. mM DTTがEro１により還元され，FADH２へと変換されるためと考えられた。FADH２は酸素により酸化されFADとなることから，反応液中の酸素濃度を測定したところ，Ero文

１濃度依存的に酸素濃度の減少速度の増加を確認した（Fig．
５）
。コムギ根より取得したEro１が活性を示した

献１ ） GUILHOT, C. , JANDER G. , MARTIN, N. L. andことから，小胞体膜結合部位を除去してもその機能を保BECKWITH, J. :持していることを確認した。また，コムギのPDI-Ero１

bondシステムにおいても酸素が最終電子受容体となることがinteractions between the cysteines of DsbB and

Evidence that pathway disulfide

formation

inEscherichia

coli

involves

DsbA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ９
２, ９
８
５
９〜９
８
９
９

示唆された。

要約

コムギよりEro1遺伝子をクローニングし，コムギEro1の全塩基配列を決定した。コムギEro１のN末端には小胞体膜貫通領域が存在し，Cys３
７０，Cys３
７
３，Cys ３７
６

（１
９
９
５）
２）FRAND, A. R., CUOZZO, J. W. and KAISER, C. A. :Pathway

forproteindisulfidebondformation,

Trends Cell Biol ., １
０, ２
０
３〜２
１
０（２
０
０
０）
３）HOUSTON, N. L., FAN, C., XIANG, Q-Y., SCHULZE, J-にEro１の活性中心であるCxxCxxCモチーフが保存されM. , JUNG, R. and BOSTON, R. S. :ていた。大腸菌を用いた発現系にてリコンビナントタン

analyses identify １
０ classes of the protein disulfide

パク質としてコムギEro１を大量に取得し，その活性をisomerase family in plants, including single-domain

測定したところ，FADの退色とFAD存在下での酸素濃

protein disulfide isomerase - related proteins, Plant

度の減少を確認した。これらのことより，コムギより取

physiol., １
３
７, ７
６
２〜７
７
８（２
０
０
５）

Phylogenetic

得したEro１が還元能していることを確認し，ジスルフ

４） D’ALOISIO, E., PAOLACCI, A. R., DHANAPAL, A. P.,

ィド結合を形成するPDI-Ero１システムにおいて酸素をTANZARELLA, O. A., PORCEDDU, E. and CIAFFI, M. :最終電子受容体とすることが示唆された。

The protein disulfide isomerase gene family in（ 25 ）

〔研究ノート〕 小麦Ero1の発現

bread wheat（T. aestivum L.）, BMC Plant Biol ., １
０287６）GROSS, E., KASTNER １ , D. B., KAISER, C. A. and

（２
０
１
０）

FASS,

５）LAEMMLI, U.K. : Cleavage of Structural Proteins

Disulfide Bonds for Oxidative Protein Folding induringthe

Assembly

of

the

Head

Bacteriophage T４, Nature, ２
２
７, ６
８
０〜６
８
５（１
９
７
０）

of

D.

:

Structureof

Ero １ p,Sourceofthe Cell, CELL, １
１
７, ６
０
１〜６
１
０（２
０
０
４）
（平成２
３年４月７日受付，平成２
３年８月２
９日受理）

（ 27 ）

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１ 〔研究ノート〕

289

二次元電気泳動によるエミュー卵白タンパク質の解析中村優＊１§・松本雄太郎＊２・入 澤 友 啓＊２
野 口 治 子＊２・内 野 昌 孝＊２・前 橋 健 二＊３
多田耕太郎＊１・鈴 木 敏 郎＊１・渡 部 俊 弘＊４・! 野 克 己＊２＊１ 東京農業大学畜産学科＊２ 東京農業大学生物応用化学科＊３ 東京農業大学醸造科学科＊４ 東京農業大学食品香粧学科

Analysis of Emu Egg White Protein
by Using Two-dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis
NAKAMURA Yu＊１§，MATSUMOTO Yutaro＊２，IRISAWA Tomohiro＊２，
NOGUCHI Haruko＊２，UCHINO Masataka＊２，MAEHASHI Kenji＊３，
TADA Kotaro＊１，SUZUKI Toshiro＊１，WATANABE Toshihiro＊４ and TAKANO Katsumi＊２＊１

Department of Animal Science, Tokyo University of Agriculture, 1737 Funako, Atsugi, Kanagawa＊２ Department of Applied Biology and Chemistry, Tokyo University of Agriculture,1−1−1 Sakuragaoka, Setagaya, Tokyo 156−8502＊３ Department of Fermentation Science, Tokyo University of Agriculture,1−1−1 Sakuragaoka, Setagaya, Tokyo 156−8502＊４ Department of Food and Cosmetic Science, Tokyo University of Agriculture,
196 Yasaka, Abashiri, Hokkaido 099−2493

243−0405

Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis was used for analyzing emu and hen egg white
proteins. The ７
８ kDa protein spots of emu and hen egg whites had varied isoelectric points, ９．
０ and
６．
０, respectively. The protein spot of emu egg white showed ７
５％ homology with the N―terminal
region of ovotransferrin from Gallus gallus domesticus （ hen ）. The differential scanning calorimetry（DSC）pattern of emu egg white was different from that of hen egg white. In addition, on DSC
analysis using purified ovotransferrin from emu egg white, the ２ endothermic peaks were observed at
６０℃ and ８
０℃. This might suggest that emu and hen egg whites contain distinct heat shock（HS）
proteins. Moreover, these results suggest the effect of HS proteins on the thermal properties of emu
egg white.
（Received Apr. ２
７, ２０１
１；Accepted Oct. １
３, ２
０
１
１）
Key words：emu, egg white, ovotransferrin, two−dimensional gel electrophoresis
エミュー，卵白，オボトランスフェリン，二次元電気泳動

エ ミ ュ ー（Dromaius novaehollandiae）は，オ ー ス トの理化学特性を解明することは，その特徴を活かした加ラリア原産の走鳥類で環境適応性が高く，粗放飼育にも工品の開発および経済的価値の向上に繋がり，エミュー

適しているため新たな家畜として注目されている。しか飼育の産業化および畜産産業の発展に大きく貢献するこし，エミュー卵に関する研究は鶏卵に比べて少ないため，とが期待される。

その加工特性は不明な点が多く，かつ流通量も少ないこ

エミュー卵白の主要タンパク質とその一次構造についとから日本ではほとんど利用されていない。エミュー卵て前橋ら１）は，エミュー卵白の主要タンパク質はオボト

＊１
§
＊２
＊３
＊４

〒２
４
３―０
０
３
４ 神奈川県厚木市船子１７３７Corresponding author, E-mail : y４nakamu@nodai.ac.jp
〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１
〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１
〒０
９
９―２
４
９
３ 北海道網走市八坂１
９
６

290

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

（ 28 ）

ランスフェリンであり，そのアミノ酸配列はニワトリよ用いた。平衡化した一次元目のゲルを二次元目のゲルにりもダチョウ，アヒルとの相同性が高いことを報告して密着させ，加熱溶解した１％アガロース溶液にて接着しいる。また，エミュー卵白の調理特性は鶏卵白と大きくた。なお分子量マーカーには，Precision Plus ProteinTM

２）異なり ，これは卵白の構成タンパク質およびその構造Standards Unstained（Bio―Rad社 製）を 用 い，定 電 圧の違いと加熱時における挙動の違いが加工特性に大きく

３００V，変 電 流２
０mA／枚 で 泳 動 後，Sypro! R Ruby

影響しているものと思われる。

（Invitrogen社製）にて染色およびMolecular Imager FX

従来，電気泳動法を利用したエミュー卵白の解析には
１），３）一次元SDS―PAGEが利用されてきたPro（Bio―Rad社製）にて画像化した。

。しかし，分子さらに，２D―PAGEにより差異のみられたタンパク質量の差を利用した分離だけではすべてのタンパク質を分スポットについて，N末端アミノ酸配列の解析および日

離することは困難であることから，エミュー卵白の構成

本DNAデータバンク（DDBJ）のBLASTによる相同性タンパク質の特徴と加熱特性に対する影響を調べるための検索を行った７）。

には，さらに網羅的な解析が必要である。

４．熱凝固性に対するオボトランスフェリンの影響

そこで本研究では，異なる調理特性を示すエミュー卵

エミュー卵白の主要タンパク質であるオボトランスフ

白および鶏卵白の構成タンパク質の相違と，その相違がェリンの熱凝固性を調べるために，オボトランスフェリ

エミュー卵白の加熱特性に及ぼす影響について調べるた

ンをCM Sepharose Fast Flowにより精製し，DSCによめ，二次元電気泳動法による解析を試みた。

る解析を行った８），９）。
すなわち，卵白に３倍容の０．
１M塩化ナトリウム溶液

実験方法を加え，０．
１N塩酸にてpH６．
０に調整し等電点沈殿させ１．試料の調製方法

た。次 に，遠 心 分 離（１０，０００r.p.m，２
０分，４℃）に よ

エミュー卵はエミュー飼養施設（株）
東京農大バイオイ

り得られた上澄液を脱塩し，アルブミン画分として回収

ンダストリー（北海道網走市）から入手した。割卵後，した。アルブミン画分は１０mM酢酸ナトリウム緩衝液

卵白と卵黄を分離し，得られた卵白を以下の実験に供し（pH４．
５）にて平衡化したCM Sepharose Fast Flow（φた。なお対象とした鶏卵は白色レグホーン種鶏卵を用い

２
０×８
０"，GE Healthcare社製）カラムに供し精製オボた。

トランスフェリンを得た。なお溶出は，流速１．
０!／min２．示差走査熱量分析計（DSC）による熱凝固性の解析

にて塩化ナトリウム濃度０．
２，０．
４，０．
６，０．
８および１．
０

エミュー卵白の熱凝固性（加熱特性）を調べるためにMのステップワイズ溶出を行い，得られた精製オボトラ

DSCによる分析を行った。すなわち，あらかじめ酸化処
理 を 施 し た 分 析 用 の ア ル ミ ニ ウ ム 容 器（AL７０―CAPSULE；４０PCS／SET）に割卵後の 卵 白 を１０$加 えて密封後，DSC（DSC６１００；SII社製）を用いて３０℃か
ら１
３０℃まで５℃／minの速度にて昇温させ吸熱量を測定

ンスフェリンの熱凝固性はDSCにて解析した。

結果および考察
１．エミュー卵白の熱凝固性
エミュー卵白および鶏卵白をDSCに供したところ，エした。なお，卵白の凝固性はpHに影響を受けることか

ミュー卵白では４
１．
７（A）
，６
１．
６（B）
，７
６．
９（C）
，８
３．
０

ら４），エミュー卵白および鶏卵白のpHがほかの報告５）と

（D）
，９
７．
０（E）および１
０６．
９℃（F）に吸熱ピークを得一致することを確認し，実験に供した（エミュー卵白；

た。一方，鶏卵白は６
５．
３
（B′
）
，７
９．
４
（C′
）および８
４．
８℃

pH７．
５，鶏卵白；pH８．
３）
。

（D′
）に吸熱ピークを示し，エミュー卵白は鶏卵白とは

３．二次元電気泳動法（２D-PAGE）によるエミュー卵異なるDSCパターンを示した（Fig．
１）
。鶏卵白のオボタンパク質の解析

トランスフェリンおよびオボアルブミンの凝固温度は，一次元目の等電点電気泳動にはagar―GEL（φ２×７
５

それぞれ６
１および８
０℃との報告があることから１０），１１），B"，pH３〜１
０，ATTO社製）を用いた。すなわち，卵およびB′はオボトランスフェリン，CおよびC′
はオボ白溶液（タンパク質量４０#）をサンプル溶解液｛６０mM

アルブミンである可能性が示唆された。また，Eおよびトリス塩酸緩衝液，８M尿素，２Mチオ尿素，２％（w

Fの吸熱ピークはエミュー卵白のみに確認されたことか／v）CHAPS，２％（v／v）TritonX―１
００，０．
５％（v／v）

ら，これらタンパク質がエミュー卵白の熱凝固性に影響

Apholyte pH３―１
０お よ び５０mM DTTを 含 む｝に て 処している可能性が考えられた。

理後，ディスクラン（AE―６
５
４
１B，ATTO社製）等電点

エミュー卵白の主要タンパク質であるオボトランスフ

電気泳動装置にて定電圧３
０
０Vにて２
１
０分間泳動を行った。

ェリン，オボアルブミンおよびオボムコイドの一次構造

泳動終了後，０．
６
２
５Mトリス塩酸緩衝液（pH６．
８）
，１
０％

は，鶏卵白よりもダチョウ卵白との相同性が高く１），エ

グリセリン，２．
５％SDSおよび５％２―メルカプトエタノ

ミュー卵白およびダチョウ卵白は鶏卵白よりも高い温度

ールを 含 む 緩 衝 液 に てSDS処 理 後，二 次 元 目 のSDS―

で熱凝固することが知られている５），１２）。また，エミュー

６）

PAGEを行った。SDS―PAGEはLAEMMLIの方法 に従い，

卵白のDSCパターンは鶏卵白と異なっていたことから，既製ゲルであるe―PAGEL（T―１
２．
５％，ATTO社製）をエミュー卵白には熱凝固性が鶏卵白と異なるタンパク質（ 29 ）

〔研究ノート〕 エミュー卵白の加工特性が存在し，その相違がエミュー卵白の加熱特性に影響を

291

２．２D-PAGE

与えていると推察された。

エミュー卵白および鶏卵白の熱凝固性の相違は，構成タンパク質の相違が大きく影響していると考えられた。

DSC（mW）

Emu
41.7℃
（A）

そこで，エミュー卵白および鶏卵白の２D―PAGEを行っ

76.9℃
（C）

61.6℃
（B）

たところ，７８kDaのタンパク質の等電点に違いがみられ，

97.0℃
83.0℃ （E） 106.9℃（F）（D）

鶏卵白がpI６．
０であったのに対して，エミュー卵白ではpI９．
０であった（Fig．
２）
。そこで，７８kDaのタンパク質ス
ポットについてN末端アミノ酸配列を解析したところ，
鶏卵白のオボトランスフェリンと７５％の相同性を示した

30

40

50

60

（Fig．
３）
。オボトランスフェリンはエミュー卵白タンパ

70 80 90 100 110 120
Temp.（℃）

ク質の３３％を占める最も含量の多いタンパク質であり１），
２D―PAGE解析によりエミュー卵白オボトランスフェリ

Hen

ンの等電点は，鶏卵白オボトランスフェリンと大きく異

79.4℃
（C´）

DSC（mW）

65.3℃
（B´）

なることが明らかになった。
３．エミュー卵白中のオボトランスフェリンの加熱挙動

84.8℃
（D´）

エミュー卵白オボトランスフェリンの等電点が鶏卵白
オボトランスフェリンと異なったことから，その性状に違いがあることが推察された。そこで，陽イオン交換ク

30

40

50

60

ロマトグラフィーを用いてエミュー卵白からオボトラン

70 80 90 100 110 120
Temp.（℃）

スフェリンを精製し，DSCによる解析を試みた。CMFig ．
１ Comparison of differential scanning calorimetry（DSC）thermograms of egg whites from emu and hen

Sepharose Fast Flowカラムによる精製にて得られた各画 分（A１〜A６）をSDS―PAGEに 供 し た と こ ろ，A―

1D/IEF

1D/IEF

2D/SDS−PAGE

（kDa）

3.0

I

3.0

10.0

I

10.0

250
150
100
75
50
37
25
20

pI 9.0/78 kDa

pI 6.0/78 kDa

15
10
【Hen】

【Emu】

Fig．
２ Two―dimensional polyacrylamide gel electrophoresis（２D―PAGE）nalysis of
egg whites from emu and hen

10
78 kDa/ I 9.0

20

A A PKATV RWCT I S S P E Q KK …
:

Ovotransferrin… A P PK SVI RWCT I S S P E E KK CN…
20
30
40

８ kDa／pI９．
０
Fig．
３ N―terminal amino acid sequence of ７
protein in emu egg white
Black and grey boxes denote identical and similar amino acidresidues, respectively, present in both sequences.

292

日本食品保蔵科学会誌 VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

（ 30 ）

６画分においてオボトランスフェリンの分子量である７８もしくはその中間体である可能性が示唆された。また，

kDaにタンパク質バンドを確認し，高度に精製されてい

EおよびFの吸熱ピークはエミュー卵白のみに確認されることを確認した（Fig．
４）
。そこで，精製オボトランス

たことから，エミュー卵白には鶏卵白とは異なる熱安定

フェリン（A―６）を用いてDSCによる解析を行ったと型タンパク質が存在し，その相違が鶏卵白よりも凝固温

ころ，鶏卵白オボトランスフェリンの凝固温度である

度が高い一要因である可能性が考えられた。

６０℃に 加 え て，８０℃に お い て も 吸 熱 ピ ー ク を 得 た

以上のことから，これまで一次元SDS―PAGEによる

（Fig．
５）
。鶏卵オボアルブミンには熱安定型（HS―オボ

評価だけであったエミュー卵白および鶏卵白の構成タン

アルブミン）
が存在し，DSC解析により８
３．
５および８
６．
２℃

パク質について２D―PAGE法による解析を試みた結果，に２つのピークを示し，前者はHS―オボアルブミンの中エミュー卵白オボトランスフェリンの等電点は鶏卵白オ

１３）間体だと考えられている 。このことから，エミュー卵

ボトランスフェリンと大きく異なることを明らかにした。

白オボトランスフェリンにおいても熱安定型が存在し，また，エミュー卵白タンパク質には鶏卵白タンパク質とFig．
１において確認された吸熱ピークD，E，FおよびD′異なる熱安定型タンパク質が存在し，この熱安定型タンがエミュー卵白および鶏卵白構成タンパク質の熱安定型

パク質がエミュー卵白の加熱特性に影響している可能性

1.4

（kDa）

A−3

1.4

1.2

A−4

1.2

1.0

1.0
0.8

0.6
0.4

A−5

0

25

0.4

A−2

0.2
0.0

37

0.6

A−6

1

50

0.8
A−1

M

250
150
100
75

NaCl
（M）

Protein（O.D.280nm）

1.6

0.2

20
40
60
Fraction No.
（6.0 mℓ/tube）

0.0

Fig ．
４ Purification of ovotransferrin from emu egg white, and SDS
polyacrylamide gel electrophoresis （ SDS ― PAGE ） pattern of purified
ovotransferrin（A―６）
Abbreviations : １, Purified ovotransferrin ; M, Molecular weight marker

80.0℃

DSC（mW）

60.0℃

30

40

50

60

70

80

90

100 110 120

Temp.（℃）
Fig．
５ Differential scanning calorimetry（DSC）analysisof ovotransferrin from emu egg white（ 31 ）

〔研究ノート〕 エミュー卵白の加工特性

293

during the assembly of the head of bacteriophageが示唆された。
今後，エミュー卵の構成タンパク質の理化学的特性および加熱による挙動について更に詳細に解明することに

T４, Nature, ２
２
７, ６
８
０〜６
８
５（１
９
７
０）
７）HIRANO, H. : Microsequence analysis of winged

より，エミュー卵を利用した新規性のある加工品の開発

beanに繋がることが期待される。

dimensional gel, J. Protein Chem. , ８, １
１
５〜１
３
０

seed

proteins

electroblotted

from

two -

（１
９
８
９）
文

献

８）KATO, A., NAKAMURA, R. and SATO, Y. : Studies

１）MAEHASHI, K., MATANO, M., IRISAWA, T., UCHINO,

on changes in stored shell eggs. Part VI. Changes

M., TAKANO, K., KASHIWAGI, Y., ITAGAKI, Y., ITAGAKI,

in the chemical composition of ovomucin during

Y. and WATANABE, T. :storage, Agricultural and Biological Chemistry, ３
４,Primary Structure ofPotential Allergenic Proteins in Emu （ Dromaius
novaehollandiae ）Egg White, J. Agric. Food Chem.,
５
８, １
２
５
３
０〜１
２
５
３
６（２
０
１
０）

of Separating Ovomucin from Egg White, J. Agric.

２）TAKEUCHI, J. and NAGASHIMA, T. : Chemical andPhysicalCharacterizationofDromaius

novaehollandiae（Emu）Eggs, Food Sci. Technol. Res.,
１
６, １
４
９〜１
５
６（２
０
１
０）
３）横濱道成・佐山勇輔・小川

１
０
０
９〜１
０
１
３（１
９
７
０）
９）DILEEP, A. O. and JIANPING, W. : A New Method
Food Chem., ５
７, ３
５
９
６〜３
６
０
３（２
０
０
９）
１
０）WILLIAM, J. S. and OWEN, J. C. : Egg science andtechnology, p.１
２
７（１
９
９
５）
１
１）PHOTCHANACHAI, S., MEHTA, A. and KITABATAKE,

博：エミューと他鳥種

N. : Heating of an Ovalbumin Solution at Neutral

間の卵白成分の電気泳動像の比較，生物物理化学，

pH

５
３，４
１〜４
２（２
０
０
９）

Biochem., ６
６, １
６
３
５〜１
６
４
０（２
０
０
２）

４）JOHN, W. D., CAROL, J. M., JOHN, G. D. and JOHN,

and

ンの品質

of the stability of egg white to heat denaturation,

１
８（２
０
０
６）

J. A. J. Sci. Food Agric., ２
６, ７
３〜８
３（１
９
７
５）
古屋女子大学紀要，５
５，１
９〜３
０（２
０
０
９）
６）LAEMMLI, U. K. : Cleavage of structural proteins

Temperature,

Biosci.

Biotechnol.

１２）峯木真知子・棚橋伸子：ダチョウの卵で作ったプリ

A. G. : A differential scanning calorimetric study５）小出あつみ・山内知子：エミュー卵の調理特性，名High

熱凝固性，東京医療保健大学紀要，１，９〜

１３）杉元康志：鶏卵の機能性タンパク質への期待，New
Food Ind ., ４
３, １
２〜１
６（２
０
０
１）
（平成２
３年４月２
７日受付，平成２
３年１
０月１
３日受理）

（ 33 ）

Food Preservation Science

VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１ 〔Technical Report〕

295

Silkworm Pupae in the Productionof a New Liquid Seasoning !
TANIGUCHI YAMADA Akiko＊１§，SAKAMAKI Mineko＊２，
KIKUCHI Shuhei＊３ and TAKANO Katsumi＊３＊１ Department of Nutrition and Dietetics, Kamakura Women’s University,
6−1−3, Ofuna, Kamakura−shi, Kanagawa 247−8512＊２ Tokyo Kenbikyoin Foundation, 4−8−32, Kudanminami, Chiyoda−ku, Tokyo 102−0074＊３ Department of Applied Biology and Chemistry, Tokyo University of Agriculture,1−1−1, Sakuragaoka, Setagaya−ku, Tokyo １
５
６−８
５
０
２

The aim of this study was to develop a new seasoning solution using koji andchitinase preparations
as a way to effectively utilize silkworm pupae. Seasoning solutions aged for ９
０ days contained００ g in asufficient amounts of total nitrogen for seasoning purposes ; total nitrogen was １.６
９ g／１
０
０ g in a seasoning solution to which koji andseasoning solution to which koji was added and １７. ０ g／１
chitinase were added. Chitinase addition was inferred to increase the amounts of amino acids andpeptides ; formol nitrogen content was ０８. ２％ in the seasoning solution to which koji alone was added
and ０８. ７％ in the seasoning solution to which koji and Chitinase were added. The seasoning solutions
from silkworm pupae contained about ２ times more free amino acids than soy sauce, including taurine
and ８５. 〜８９. times more alanine than soy sauce. The radical scavenging capacity of １,１-diphenyl-２picrylhydrazyl（DPPH）in the seasoning solutions made from silkworm pupae ranged from １
７
２〜１
８
６
０
０ !, which was ２７. times higher than the radical scavenging capacity of soy sauce.
µmol Trolox eq.／１
０
０ ! GABA, which was ４６ times more than soy
The seasoning solutions contained about ２３ !／１
sauce, and were higher in functionality than soy sauce. The seasoning solutions from silkworm pupae
were clear, light brown in color, and suitable for use in processed food.
（Received Apr. ４, ２０
１
１；Accepted Jul. ２５, ２
０
１
１）
Key words：Key word : silkworm pupae, new liquid seasoning, production, soy sauce, functionality food
さなぎ，新規調味料，製造，醤油，機能性食品

In a previous study１）, protease and chitinase

appliedtosilkworm

pupae

to

developanew

preparations were applied to silkworm pupae toseasoning. We also focused on the functionality ofdevelop a new seasoning. A previous test, thatsilkworm

involved

antioxidant action and GABA content.

chitin,indicatedthatchitin

could

be

pupae

as

decomposed by chitinase and then converted, using

contained

peptidesand １.２〜１.８ times

more

food

material,

includingMethods

proteases, to a seasoning that tasted good and hadhigh functionality. The resulting seasoning solutiona１．Materials
Pupae

from

the

silkworm

Bombyxmori

L.

functional amino acids, such as taurine and γ -（ produced in Gifu Prefecture ） were air - dried ataminobutyric acid （ GABA ）, than soy sauces. In

１
０
０℃ for ６ h and then ground up, as previously

addition, the antioxidant activity was １.４ times

described.

higher in the seasoning solution than in soy sauces,pupae were ９.１％ moisture, ５６.０％ protein, ３
２.１％

confirming the functionality of the seasoning solution.

lipid, and ２８. ％ ash.

The

component

values１） ofsilkworm

The clear and light yellow color of the silkworm

Koji spores, Aspergillus sojae, were used for thepupae seasoning solution increased its potential for

preparation of seasoning. Soy sauce koji２），３） consisted

use in processed food.

of a １ : １ mixture of wheat malt and soybean

In this study, koji and chitinase preparations were
§ Corresponding author, E-mail : akiko@kamakura-u.ac.jp

meal.

296

Caseinwasdetermination

used
of

koji

as

Food Preservation Science

VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

substrateacid was used as a reference standard, and theaprotease

KUNITZ method４）. One unit

for

the

by

the

total polyphenol concentration of gallic acid wasasandetermined using a standard curve.

activitywas（ 34 ）

definedenzyme titer that increased the absorbance at ２
８０

６． Measurement of １,１-diphenyl-２-picrylhydrazyl! of a decomposition liquid, when treated with an（DPPH）radical scavenging capacity

equivalent of １ "ol of tyrosine at ３
７℃ in １ min.

The

antioxidant

activityofsilkworm

pupae

Chitinase from Streptomyces griseus （Sigma-Aldrichseasoning solutions was measured by the DPPH

Japan K.K.） was used at the optimum pH of ６.０

method１０）, in which the radical scavenging capacityand optimum temperature of ２
５℃ . Colloidal chitinof Trolox is used as

was used as a substrate toactivity was expressed in Trolox equivalents （"olmeasurechitinaseactivity by determining if there was decreased
absorbance

at ６
１
０ !.

An

enzyme

titer

that

decreased the absorbance of a reaction liquid by
１％ in １ min at ３
７℃ was defined as １ unit.

an

Trolox ／１
００ ! ） calculated

indicator.
bytheAntioxidant
decreaseinabsorbance of a DPPH solution at ５２
０ !.
７．Measurement of γ-aminobutyric acid（GABA）
Samples were prepared following the procedure

２．Preparation of new seasoning

for

free

amino

acid

measurement.

HPLC

was

To ５
０
０ g of ground silkworm pupae, １$ of aperformed using a ６ # ID × １
０
０ ! ShimPack

２０％（w／w）salt solution was added. One hundred g

AMINO-Na column（Shimadzu Co., Ltd.） and an RFof koji alone or a combination of １００ g of koji and-１０

２
５ units of chitinase were added to the mash, which（ Shimadzu Co. , Ltd. ）. The mobile phase was a

was then aged at ３
５℃ for ９
０ days. Samples were

gradient solution made of a sodium citrate buffertaken for analysis during the aging period.

solution（pH ５９. ）and a mixture of a NaClO reagent

３．Analysis of common components

AXL

spectrofluorophotometricdetector

and an OPA reagent （５０:５０, Shimadzu Co., Ltd.）.

Common components of silkworm pupae wereDetection of the GABA content was performedof ０.４ ! ／ min,measured as described previously５）. The Kjeldahlusing

method６） was used for determining protein content

temperature of ４
０℃ , an excitation wavelength ofand total soluble nitrogen content. A pH meter was

４７
０ !, and a fluorescence wavelength of ５
３
０ !.

used for pH measurement. Formol nitrogen content,
acidity,

and

salt

content

weredeterminedinaccordance with soy sauce analysis methods７）.

a

flow

rate

a

columnResults and Discussion
１．Units of the protease of koji

４．Measurement of free amino acids

The protease activity of １
０
０ g koji was ３
０〜５０

Samples were processed as previously described１）

units, and koji was prepared according to theand NBD-labeled. HPLC was performed using a ３.２

amount of protease A activity, in a previously#

described manner１）.

ID

×１
５
０ #

Corporation ）

and

ODS-８
０ TS
an

column （ Tosoh

F-１
０
５０ spectrophotometer

２．Time-dependent changes in acidity and pH（Hitachi Ltd.） as detector. The mobile phase was a

The time-dependent changes in titratable acidity

gradient solution made of ２ solutions : ０.１ M

and pH during aging of silkworm pupae seasoning

sodium citrate buffer（pH ６２. ） and ５
０％ acetonitrile

solutions is shown in Fig.１. Addition of koji alone（in water, ５０:５０）. Detection was performed using a

and both koji and chitinase increased the acidity

flow rate of １.０ !／min, a column temperature ofduring aging to ０.８ and ０.９, respectively ; ３０ days４３℃ , an excitation wavelength of ４７
０ ! , and alater, the acidities were increased to １.６ and １.７,

fluorescence wavelength of ５３０ !.

respectively, and ９
０ days later, the values were５．Measurement of polyphenol

twice as high as the values after ６
０ days.
pupae

The data indicate that acidity and pH change

seasoning solutions was measured by the Folin -during aging. When chitinase was included in the

Denis method８），９）. Samples were diluted １
０ times,

aging process, the acidity of the seasoning solution

and １ ! of the sample solution was mixed andincreased. During the initial ３
０ days of aging, thestirred with １ ! of Folin-Denis reagent prior to

pH of the seasoning solution decreased markedlyThe

polyphenol

contentofsilkworm

addition of １ ! of a １
０％ sodium bicarbonate

from ６.０ to ５.３ when koji alone was added and（Na２CO３） solution. After ３
０ min of incubation, thefrom ６０. to ５.２ when both koji and chitinase were

sample's absorbance at ７
０
０ ! was measured. Gallic

added ; the pH of both seasoning solutions was ４７.５

（ 35 ）

〔Technical Report〕 New Liquid Seasoning of Silkworm Pupae II

6.5

1.6

6

1.2

5.5

koji and Chitinase were added.
koji
koji andchitinase

４．Free amino acids
The analytical data on free amino acids after ９
０days of aging are summarized in Table １. The
amounts of free amino acids were １
５７
. g／１
０
０ ! inpH

Acidity

2

5

0.8
koji
koji andchitinase

0.4
0

0

30
60
Days

297

the seasoning solution to which koji alone wasadded and １
６.５ g／１
００ ! in the seasoning solution

4.5
4

90

to which koji and
0

30
60
Days

90

Fig ．
１ Changes in acidity and pH in thefractions of silkworm pupae seasoning solution

solublechitinasewereadded.

Bothseasoning solutions were rich in alanine, glutamic
acid, aspartic acid, and leucine. In contrast, theseasoning solutions from silkworm pupae contained
９ timesmorealaninethanseasoning

solutionsfromcontainedtaurine.

Althoughsoysilkwormthesauces.

The

pupae

also

２

seasoning

solutions from silkworm pupae had similar amino〜４.８
０ after ９
０ days. This was believed to be dueacid compositions, the seasoning solution containing

to

and

chitinase had a larger amount of amino acids. This

peptides. The seasoning solutions had nearly thewas believed to be due to chitin decomposition insame pH as that of commercially available soy

the outer layer of silkworm pupae by chitinase thatsauce２），３）and were more acidic than fish sauces１１）.

made

３． Total nitrogen content and formol nitrogenprotease.

thebuffering

capacity

of

amino

acids

silkworm

pupae

Chitinasemore

addition

accessible
was

to

koji

confirmed

tocontent

increase the amino acid content, resulting in the

Changes in total nitrogen content and formol

production of a seasoning solution rich with umami.

nitrogen content in the soluble fractions of silkworm

Addition of Koji increased the levels of amino acids

pupae seasoning solutions during aging are shown

more than addition of protease A１）.

in

Fig. ２.

Total

nitrogencontent

andformolnitrogen content were somewhat higher inthesoluble fraction of the seasoning solution to which
both koji and chitinase were added than in thesoluble fractions of the seasoning solution to which

Table １
Free amino acids
generated from silkworm pupae

koji alone was added, with values of １.７
０ g／１
０
０ g
and １.６
９ g ／１００ g, respectively, after ９
０ days ofaging. The fo rmol nitrogen contents were ０８. ２％ inthe seasoning solution to which koji alone wasadded and ０８. ９％ in the seasoning solution to which

2kojikoji andchitinase

0.8

1.6
1.2

0.6

0.8

0.4

0.4

0.2
0

koji
koji andchitinaseTotal nitrogen（g/100g）

Formol nitrogen（g/100g）

1

0

30
60
Days

90

0

0

30
60
Days

90

Fig ．
２ Changes in total nitrogen content and formol
nitrogen content in the soluble fractions of seasoning
solutions generated from silkworm pupae

seasoning

solutionsFree aminoacid

Koji added＊

Koji andchitinase added＊

Soy sauce＊

Ala
Glu
Asp
Leu
Ser
Val
I-Leu
Arg
Gly
Phe
Lys
Tyr
Thr
Pro
Met
His
Cys
Tau

４
１
７
５．
０
３
５
３
７．
９
１
８
５
６．
４
１
１
０
９．
２
９
２
０．
１
７
２
２．
１
５
４
７．
８
４
７
３．
６
４
０
４．
１
３
６
１．
８
３
５
４．
５
３
４
１．
５
３
３
１．
７
１
８
０．
０
２
０
３．
３
１
６
６．
２
２
０．
０
１．
６

４
３
５
８．
８
３
７
７
２．
８
１
９
５
２．
２
１
１
４
０．
４
９
８
３．
１
７
４
８．
０
５
６
３．
２
４
７
４．
７
４
２
４．
０
３
７
３．
５
３
５
８．
０
３
５
４．
０
３
５
０．
４
２
２
１．
０
２
１
４．
１
１
６
９．
９
１
７．
０
１．
７

４
９
０．
１
２
１
３
７．
２
８
９
７．
２
８
１
１．
０
５
９
０．
３
５
１
３．
０
４
１
０．
２
５
２
５．
６
１
１
７．
８
４
１
１．
５
４
３
２．
０
１
４
４．
０
３
１
５．
４
１
０
１．
０
１
８
１．
５
１
５
１．
１
１
０．
０
０

!／１
００ g solution

＊

in

298

Food Preservation Science

VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

（ 36 ）

Table ２ Analytical results of seasoning solutions generated from silkworm pupae
Analysis

Koji added

Koji andchitinase added

Soy sauce

Acidity１
pH
Salt %
Total nitrogen（g／１００ g）
Formol nitrogen（g／１００ g）
Amino ratio２ ％

１．
６
４．
８
０
１
９．
７
１．
６
９
０．
８
２
４
８．
５

１．
７
４．
７
５
１
９．
９
１．
７
０
０．
８
９
５
２．
３

１．
０
４．
７
０
１
８．
０
１．
４
０
０．
８
０
５
７．
１

１

Volume（!）of １ N NaOH solution necessary to titrate the sample to pH ８．
５
Amino ratio : Formol nitrogen／Total nitrogen×１００２

５． Properties

ofseasoning

solutionsfromsilkworm pupae

transparent and clear. Soy sauce has an opaquecolor. The clear and light brown color of thepupaeseasoning solutions should make them applicable toseasoning solutions that were aged for ９
０ days andprocessed food and thus, increase their commercial

filtered are shown in Table ２. The acidity and pH

value.

values were similar in both the seasoning solution

７．Functional components

The

resultsofanalysisofsilkworm

to which koji and chitinase were added and the one

The polyphenol content in the seasoning solutions

to which koji alone was added. The data showedfrom silkworm pupae to which koji alone was addedthat the chitinase preparation was effective for theand to which both koji and chitinase were added

production of seasoning solutions from silkworm

were １７
１ #／１
０
０ ! and １
７
３ #／１
０
０ !, respectively

pupae. The amination ratio was about ５
２３. ％ in the（Table ４）. This result was １.５ times higher thanseasoning solution to which chitinase was added andwhat was previously reported for seasoning andwas about ３％ higher than that in the seasoning

was considered to be caused by the inclusion of koji.

solution to which koji alone was added （ about
４
８．
５％）
.
６． Color

toneofseasoning

solutionsfromsilkworm pupae

antioxidant

activityofsilkworm

pupae

value

method, in which the radical scavenging capacity of
Trolox is used as an indicator. The antioxidant

The color tone is also an important factor in thecommercial

The

seasoning solutions was analyzed using the DPPH

ofaseasoning

solution.

The

activity determined by DPPH radical scavenging
capacity （Table ５） was １８
６ "ol Trolox eq. ／１
００seasoning solution to which koji alone was added
and the seasoning solution to which both koji andchitinase were added were much lighter in color
than soy sauce（Table ３）. The absorbances at ４
２０

Table ４ Polyphenol content of silkworm pupae seasoning
solutions! of １０-fold diluted seasoning solutions to whichkoji alone and both koji and chitinase were added
were ０．
１
４ and ０．
２
８ lowerthansoysauce,

respectively. Seasoning solutions to which koji wasadded were darker in color ; however, they wereTable ３ Color tone of silkworm pupae seasoning solutions

１

Seasoning solution

Polyphenol content
０
０!）
（#／１

Koji added
Koji and chitinase added
Soy sauce

１
７
１
１
７
３
１
８
０

Table ５ Antioxidant activity of silkworm pupae seasoning
solutions, as determined by the DPPH method＊

Color tone

Koji added

Koji andchitinase added

Soy sauce

Seasoning solution

Antioxidant activity
００!）（µmol／１

L
a
b
４
２
０ nm１

１
９．
３
２
８．
１
１
１．
５
２．
０
８

１
８．
５
２
７．
２
１
１．
２
２．
２
２

１
０．
８
３
１．
５
１
６．
７
２．
３
６

Koji added
Koji and Chitinase added
Soy sauce

１
７
２
１
８
６
７
０

The seasoning solutions were diluted １
０ times.

＊

The DPPH method, in which the radical scavenging capacityof Trolox is used as an indicator.

（ 37 ）

〔Technical Report〕 New Liquid Seasoning of Silkworm Pupae II

Table ６
γ - aminobutyric acid （ GABA ） content
seasoning solutions generated from silkworm pupaeofKoji added
Koji and chitinase added
Soy sauceseasoning solution. The clear and light brown colorof the seasoning solution generated from silkworm

GABA content（#／１００!）

Seasoning solution299

pupae increases its value for use in processed food.
We conclude that koji and chitinase preparations
can be effectively used to produce a seasoning

２
３．
２
２
３．
１
０．
５

solution from silkworm pupae and confirmed thatthe obtained seasoning solution has a high level offunctionality.

! in the seasoning solution to which koji andReferenceschitinase were added, which was about １.１ times
that of the seasoning solution to which koji alone

１）TANIGUCHI YAMADA, A., SAKAMAKI, M.,KIKUCHI,S.

was added（１７
２ "ol Trolox eq. ／１
００ !） and ２.７

and

times

Production of a New Liquid Seasoning ! , Foodthat

antioxidant

of

soy

activitysauce.

wasFurthermore,theapproximately ２ times

TAKANO,K. :Silkworm

Pupae

for

the

Preservation Scientists, ３
５, ２
８
５〜２
８
９（２
０
０
９）

higher than that of protease A, as shown previously.

２）KIKUCHI, S. and TANIGICHI YAMADA, A. : Brewing

The data confirmed that the seasoning solution toof Soy Sauce from Soybeans Different in Place of

which

koji

and

chitinase

were

added

was

a

functional seasoning solution. Functional components
are currently

receivingmuchattention

in

Production-I ， Journal of Soy Sauce Research andTechnology, ３
２, ３
７
９〜３
８
２（２
０
０
６）

food

３）TANIGICHI YAMADA, A. and KIKUCHI, S. : Brewing

research. In this study, we found that seasoningof Soy Sauce from Soybeans Different in Place ofsolutions from silkworm pupae have a high level of

Production-II ， Journal of Soy Sauce Research andfunctionality. Decomposition products fromTechnology, ３
３, ３
１〜３
４（２
０
０
７）

chitin,which are considered antioxidants, will be further
studied in the future.

４）KUNITZ, M. : Protein method, J. Gen. Physiol , ２
９,
１
４
９〜１
５
６（１
９
６
９）
.

The GABA content in silkworm pupae seasoning
solutions was ２
３.２ # ／１
００ !

５）TSUTSUMI, C. : Food Analysis Handbook（audited

solutionby OBARA, T. ）, １. Quantitaive dertermination ofcontaining only koji and ２
３.１ # ／１
００ ! in the

moisture, Food component analyses, Kenpakusha,

solution containing both koji and chitinase, which

Tokyo. p.１
７（１
９
７
２）

in

the

was ４
６ times more than that in soy sauce （Table６）. In addition,thesilkwormpupaeseasoning

solutions possessed higher levels of functionality
than soy sauce.

６ ） YANAGIDA,F.

: BrewingFood

Analytical

Experiment, ３.３.２ Protein. Shokuhin Kenkyusha,
Tokyo. p.２
２
６（１
９
８
５）
７ ） Japan Soy Sauce Research Institute Edition :Methods for soy sauce tests. I. Analytical methods

Summary

for soy sauce. Japan Soy Sauce Research Institute,

The aim of this study was to determine whether

Tokyo. p.１（１９８５）

silkworm pupae could be effectively used for food.

８）FOLIN, O. and DENIS, W. : On phosphotungstic-

Koji and chitinase preparations were applied tophosphomolybdic compounds as color reagents, J.

silkworm pupae to develop a high - quality

andfunctional seasoning solution.

Blot. Ghem., １
２, ２
３
９（１
９
１
２）
９ ） TUSHIDA,

The results confirmed that the seasoning solution
was highly aminated with large amounts of amino

F. :Methodsfor

Food

Function

Research. ４―４―１ Analysis of polyphenols. Korin,
Tokyo, p.３
１
８（２
０
０
０）

acids and peptides and had functional amino acids,１０）SUDA, I. : Methods for Food Function Research.

such as taurine and GABA, that are not present in

３―３―９ Antioxidant functions. I. Spectrophotometricsoy sauce. In addition, the antioxidant activity wasevaluation of antioxidant functions, Korin, Tokyo,

２.７ times higher in the seasoning solution than in

p.２
１
８（２
０
０
０）

soy

sauce,

confirming

thefunctionality

of

the

１
１）TANIGICHI YAMADA, A., SATO, H., MITSUMORI, H.,

300

Food Preservation Science

KIKUCHI, S. and TAKANO, K.

:

VOL．
３
７ NO．
６ ２
０
１
１

Effect of various

さなぎを用いた新規調味液の製造!

kinds of protease on fish sauce with salmon
Oncorhynchus

keta

of

the

maturation,（ 38 ）

谷口（山田）亜樹子＊１・坂蒔美稔子＊２

Food

菊池修平＊３・!野克己＊３

Preservation Scientists, ２
９, １
７〜２
３（２
０
０
３）
＊１

鎌倉女子大学家政学部管理栄養学科

（〒２
４
７―８
５
１
２ 神奈川県鎌倉市大船６―１―３）＊２ （財）
東京顕微鏡院
（〒１
０
２―０
０
７
４ 東京都千代田区九段南４―８―３
２）＊３

東京農業大学応用生物科学部生物応用化学科

（〒１
５
６―８
５
０
２ 東京都世田谷区桜丘１―１―１）
本研究ではさなぎの食品への有効利用として，カイコのさなぎに醤油麹およびキチナーゼ製剤を用い，良質で機能性のあるさなぎ調味液の開発を行った。
その結果，醤油麹およびキチナーゼ製剤を作用させた調味液は一般の醤油に比べ，アミノ化率が高く，アミノ酸，ペプチドが多く生成されていることが確認された。
また，醤油に含有されていないタウリンが含まれており，
さらにGABA含量が醤油の４６倍多く，機能性のあるアミノ酸が多く含有されていることが確認された。醤油麹およびキチナーゼ製剤を作用させた調味液のポリフェノー
ル量は１
７
３!／１
０
０!であり，抗酸化作用は醤油に比べ２．
７倍高かった。さなぎ調味液の色調は澄んだ茶褐色で，加工食品の利用にも充分利用価値の高いものであった。
本研究の結果から，さなぎ調味液の製造に麹およびキチナーゼ製剤の利用効果が認められ，さなぎの機能性に富んだ調味液の利用が確認された。
（平成２３年４月４日受付，平成２３年７月２５日受理）