2-9 生体分子の機能と発現の調節機構に関する統合的基盤研究●代表者

中里勝芳（生命科学科・教授）●分担者

茶圓茂（生命科学科・教授）

斎藤稔（生命科学科・教授）

安原徳子（生命科学科・准教授）【研究の目的および概要】
本研究は，生体分子の機能と発現の調節機構に関する研究であり，以下の４つの目的で研究を行った。
1．実験動物としてマウスを用い，学習・記憶の中枢である脳海馬における時空間神経活動状態をレーザー共焦点
カルシウムイメージング法，および多点電位記録法によって測定し，そこに出現する多様な神経活動パターンを数理解析することによって学習・記憶のメカニズムに関する知見を得る。
2．胚性幹細胞，がん細胞をモデル系とし，細胞分化，がん化の際の輸送因子の量的変化に伴う遺伝子発現を調べ，核機能調節による遺伝子発現機構を明らかにする。これまでに輸送因子による新規クロマチン制御の分子メカニズムを明らかにしつつある。この分子モデルを基盤に，様々な細胞現象における輸送因子の作用を明らかにしていく。
3．オスモライト（浸透圧調節物質）は浸透圧を調整するほかにタンパク質の構造を安定にする。本研究はオスモラ
イトの一つである trimethylamine-N-oxide(TMAO) がミオシンの熱失活に及ぼす影響を調べる。
4．FoF1ATP 合成酵素による ATP 合成に不可欠な膜を介した DpH を発生させる方法として，二酸化炭素を用いる方法について検討する。本研究では，リポソーム内部の緩衝剤濃度を極めて低くし，リポソーム外部の緩衝剤濃度が比較的高くした条件下での，CO2 ガス供給による DpH 形成について調べる。
【研究の結果】
1．多電極記録法によってマウス海馬スライスの自発的な電気的活動を測定した。その結果，多くの海馬スライスに周期的なバースト波形が観察された。このバースト波形について詳細に調べたところ，同一スライスにおいても様々な活動パターンが存在することが明らかとなった。また，バースト波形発生時のカルシウム信号をレーザー共焦点カルシウムイメージング法で測定したところ，カルシウム信号を発生する神経細胞が時間的に不規則に変化し，様々な時空間活動パターンが発生していることが分かった。
2．胚性幹細胞のゲノム DNA を用い，核輸送因子がいかにしてクロマチンに結合するか調べた。In vitro 実験系を使用して，核輸送因子の一つが直接 DNA に結合することを見出し，結合ドメインを明らかにした。また，乳がん細胞での核輸送関連因子の遺伝子変異，発現変化を解析した。
3．ミオシンの 40℃ 20min 熱処理を TMAO200mM 存在下行った時，そのアクチンフィラメントを滑らす活性は40℃ 20min 熱処理 TMAO 無しの時より 40％に低下したが，800mM 存在下では 80％の活性があった。
4．リポソーム内部溶液に緩衝剤が含まれず，リポソーム外部溶液に適度な濃度の緩衝剤が含まれる場合に，適度な濃度の CO2 ガスを適度な速度でリポソーム溶液に供給するとリポソーム内部の pH（ピラニン蛍光測定）は大きく低下し，2.5 以上の DpH が発生した。この結果から CO2 ガスを用いるリポソーム系での DpH 形成方法はFoF1ATP 合成酵素再構成リポソームにおける DpH 形成にも有効であると考えられる。
【研究の考察・反省】
1．マウス海馬スライスの電気的活動には様々な活動パターンが存在することが明らかになった。今後は，多点電40

位記録法で測定した電気的な活動に対してより詳細な波形解析を行い，レーザー共焦点カルシウムイメージング法によって測定されるカルシウム信号の時空間活動パターンとの関係を調べる必要がある。
2．本研究では in vitro 実験系で核輸送因子のクロマチン結合を明らかにしたが，細胞内での機能を明らかにするには in vivo 実験系での検証が必要となる。今後，様々な変異体を作成し，in vivo 系での研究を進める必要がある。
3．酵素に熱を加えたとき , 細胞内にある時のほうが，抽出されて単独の時よりも失活しにくいことがわかっている（molecular crowding 効果 )。本実験結果は TMAO が molecular crowding 効果を表すことを示唆した。反省点は，ミオシンだけでなくアクチンフィラメントの熱失活に対する TMAO の影響を調べるべきであると思った。
4．二酸化炭素を用いてリポソームに 2.5 程度の DpH を形成させることが可能であることが明らかになったが，FoF1ATP 合成酵素再構成リポソームにおいて同様な結果が得られるかどうかは不明であり，今後同様の実験を行う必要がある。
【研究発表】
・The effects of thermal stress on long-term memory formation in the land slug, Yoshimasa Komatsuzaki, Minoru Saito,
FENS (Federation of European Neuroscience Society) 2020 Forum, 2020 年 7 月 11 日（オンライン）．
・ヨーロッパモノアラガイの咀嚼神経系の蛍光 NO イメージング −味覚嫌悪学習前後の NO 放出の比較，伊藤綾香，小松崎良将，斎藤稔，第 58 回日本生物物理学会年会，2020 年 9 月 16 日（オンライン）．
・海馬で合成される男性・女性ホルモンやストレスホルモンによる記憶シナプスの早い non-genomic な制御，川戸佳，相馬ミカ，池田真理，斎藤稔，第 58 回日本生物物理学会年会，2020 年 9 月 16 日（オンライン）．

・確率論的・カオス的レヴナー発展におけるエントロピー生成と流れ，柴崎雄介，斎藤稔，日本物理学会第 76回年次大会，2021 年 3 月 14 日（オンライン）．
・核輸送因子 importin a のクロマチン結合解析，地引和也，野本心，川瀬陽太，斉藤典子，末永敦，児玉高志，安原徳子 , 第 72 回日本細胞生物学会大会 , 2020 年 6 月 9 〜 11 日 / オンライン．
・新規ドメインを介した核輸送因子 importin a の DNA 結合様式解析，地引和也，児玉高志 , 末永敦，川瀬陽太，柴崎典子，斉藤典子，安原徳子，第 93 回日本生化学会大会，2020 年 9 月 14 日 / オンライン .
・Importin a proteins differentially localize in cytoplasm, 柴崎典子，地引和也，岡安美奈，安原徳子，第 43 回分子生物学会年会，オンライン /2020 年 12 月 2 日 .
・A nuclear transport receptor importin a2 associates with chromatin via novel DNA binding domain, NAAT, 安原徳子，第 43 回分子生物学会年会，2020 年 12 月 2 日 / オンライン，招待講演．
【研究成果物】
・Loewner Evolution Driven by One-dimensional Chaotic Maps, Yusuke Shibasaki, Minoru Saito, Journal of the PhysicalSociety of Japan 89 (2020) 054801 (10 pages).
・Entropy Flux in Stochastic and Chaotic Loewner Evolutions, Yusuke Shibasaki, Minoru Saito, Journal of the PhysicalSociety of Japan 89 (2020) 113801 (4 pages).
・Loewner driving force of the interface in the 2-dimensional Ising system as a chaotic dynamical system, Yusuke
Shibasaki, Minoru Saito, Chaos: An Interdisciplinary Journal of Nonlinear Science 30 (2020) 113130 (10 pages).
・Epicatechin increases the persistence of long-term memory formed by conditioned taste aversion in Lymnaea, AyakaItoh, Yoshimasa Komatsuzaki, Ken Lukowiak, Minoru Saito, Journal of Experimental Biology 224 (2021) jeb238055 (10pages).

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・Molecular profiling of nucleocytoplasmic transport factor genes in breast cancer, Mehmood R, Jibiki K, Shibazaki
N, Yasuhara N.Heliyon. 2021 Jan 30;7(1):e06039. doi: 10.1016/j.heliyon.2021.e06039. eCollection 2021 Jan.PMID:33553736.
・Importin a2 association with chromatin: Direct DNA binding via a novel DNA binding domain, Kazuya Jibiki, Takashi
S. Kodama, Atsushi Suenaga, Yota Kawase, Noriko Shibazaki, Shin Nomoto, Seiya Nagasawa, Misaki Nagashima, Shieri
Shimodan, Renan Kikuchi, Mina Okayasu, Ruka Takashita, Rashid Mehmood, Noriko Saitoh, Yoshihiro Yoneda, Ken-ichi
Akagi, Noriko Yasuhara,BioXiv doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.04.075580 (preprint).

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