DIA 定量プロテオーム解析ソフトウェア

Scaffold DIA
Volcano plot

図の補足説明→ P.34

日本語マニュアルの該当ページ
×対応するスライド番号
スライド番号→1

1

Scaffold DIA 何ができるか•DIAデータのタンパク質の同定、定量•検索対象: 4種の検索に対応- FASTA- BLIB(DDA-ライブラリ),- DLIB(prositライブラリ、配列から理論DDAライブラリ作成)- ELIB (DIA解析結果ライブラリ)•定量解析/検定とグラフ表示•Viewerによる結果ファイルのシェア
2

→ P.13対応フォーマット：ProteoWizard Msconvert を使っている各社メーカーのファイルフォーマット [読み込みなどがよく確認されているもの]
装置メーカー
ファイルフォーマット
*.wiff (.wiff.scanも同じフォルダSCIEXに置く事)
Agilent*.d (ディレクトリ)
Thermo*.raw
オープンフォーマット (原理的には mzML フォーマットになっていればデータの読み込みが可能)
HUPO Proteomics Standards Initiative mzML *.mzML* mzMLはほぼすべてのメーカーで変換可能なフォーマット
3→ P.50

Samples 画面同定されたタンパク質の一覧並びに定量値をはじめとするタンパク質の関連情報が表示

GO情報

定量値

タンパク質解析結果の概要を確認する上で主体となる画面

4

データ取り込み時の画面

5→ P.16

データ取り込み開始
・以下のいずれかの操作を実施- メニューのFile -> New- Ctrl + N- メニューバー下にあるアイコン

をクリック

6

① workflow : elib作成と連動した2段階検索かそれ以外か
Search a reference library : 直接ライブラリー検索を実施①→ P.14→ スライド13Create a chromatogram library and search against it :2段階検索

② ライブラリ、タンパク質配列の指定
直接検索対象とするファイル(elib, dlib, blib, fasta)と、それに対応する配列データベース(fasta)を選択②→ スライド11③③ parameter
Fragmentation :CID/HCD/ETDから選択。考慮するイオンシリーズ
Precursor / Fragment / Library Fragment Tolerance :
理論値と実測スペクトルデータとの許容誤差範囲
Digestion Enzyme : ペプチド切断方法
Peptide Length: 検索対象とするペプチドの長さ

Peptide Charge: 検索対象とするペプチドの電荷

Max Missed Cleavages :理論ペプチド作成の際、切断対象のアミノ酸を何回無視したペプチドを作成するかの設定
Modifications: 考慮する修飾
7→ P.17④ Peptide FDR Threshold :ペプチドの同定基準値、FDRの値⑤ Data Acquisition Type
DIAの測定でのPrecursor Isolation Window タイプについて[次、次々スライドに補足説明図]⑦- Non-overlapping Windows :両端のオーバーラップ領域がない- Overlapping Margins :両端のオーバーラップ領域がある (値も指定)- Staggered Windows :window領域が半分ずつずれた測定を実施⑥ Precursor Window Size
DIAの測定Window に対する設定。通常はrawファイルに書かれた情報をそのまま利用④⑤⑦ Experimental Data File
検索対象となるrawファイルを選択→ スライド 9,10

⑥8

補足説明 : 対応するDIA解析 -- marginあり

測定順m/z9

補足説明 : 対応するDIA解析-- Marginなし、staggered10補足説明 : 検索対象 FASTA、BLIB、ELIB (+DLIB)

FASTA
・配列ファイル＊配列から測定条件などを考慮して計算されたスペクトルデータ（DLIB）も使用できる。

BLIB

ELIB・（DDA）・(DIA) RT ＋

マススペクトル

m/zのピーク位置

ピークリスト＊DLIBフォーマットはELIBとほぼ同じ

11

補足説明 : Prositで作成されたライブラリ、DLIB
https://support.proteomesoftware.com/hc/enus/articles/360035151172-Prosit-Derived-Spectral-Libraries-forScaffold-DIA-Searches

Prosit・配列からdeep Neural Networkアルゴリズムで計算された理論スペクトルで、保持時間やintensityも予測
・Proteome Software社側で準備したDLIBを公開している
・多くのケースでBLIBの代わりになる、手軽に使える検索対象として利用してください・Scaffold DIA上にFASTAからprositのインプットファイルを作成するツールあり
・修飾が苦手12

→ P.8

補足説明 : ELIBと「2段階」検索「pool」データへの検索でELIBを作成し、そのELIBに対して元のデータを検索するプロトコル例①sampleから少量集めプール②100Daなど大きさで分ける③fasta,blibを使って解析④解析結果を「ELIB」登録⑤元のサンプルの解析開始（N回繰り返し実験）⑥ ④で作ったELIBを使って同定・定量力アップ

⑤①⑥③④

②13

Analysisタブ、Advanced タブ、取り込み開始
Analysis→ P.18Advanced→ P.20
すべての項目を埋めてから「LoadData」ボタンを押す14ペプチド・タンパク質の定性（同定）• ペプチド- encyclopeDIA スコア評価- peptide FDR 設定値 (percolator も使用)を満たす• タンパク質- 同定ペプチド N(デフォルト2) 以上アサインされている- protein FDR 設定値を満たす- clustering ルールでグループ化
15→ P.53

表示される「定量値」 [Display Type]

Exclusive : ユニークペプチドのみ
Total: シェアペプチド含む

・Exclusive/total Intensity
ペプチド定量値(フラグメントXICのピーク強度から算出) の和・ Exclusive/total Intensity (Log2 Fold Change)
ペプチド定量値について、Referenceとの比を取りその数字に対して2を底にするLogに変換
・ Exclusive/total Quantified Peptide Count
タンパク質あるいは表示グループにアサインされたペプチドで、かつ定量に使われたフラグメントを持つペプチドに限定し数え上げた数(標準化処理も実施)。

16

→ P.85

Normalization

サンプル強度分布によるNormalization
・全データ vs 各sample 、それぞれ強度分布を作成
・各サンプルにおいて、25%,50%,75%にあたる定量値を、全データ平均にそろえる・各四分位数の間は点間を結ぶ直線に従って変換する
17

タンパク質を選択した状態でダブルクリック、またはProteins パネルをクリックすると…
→次頁

18

→ P.58

Proteins 画面→ ①/②スライド 19
ペプチド/タンパク質の定性/定量 結果をより詳細に検証①
同定ペプチド②
同定スペクトル→ ③ スライド 20③
関連グラフ

19→ P.59①
同定ペプチドQuantified
定量計算に使用される条件（一定数以上のフラグメントの検出など）を満たしタンパク質の定量計算に使用されているかどうか。
手動でチェックを外すと定量計算から外される。
Quantified Matches
全サンプルに対して定量計算に使用されたサンプルがいくつあるのか②
同定スペクトル

Quant. Intensity
定量計算に利用したフラグメントピーク強度の和# of Quant. fragment
定量計算に利用したフラグメントピーク数
RT Start, RT Center, RT Stop
該当ペプチドを検出し定量計算に利用したRTの開始から終了までの時間

20

全長とcoverage、修飾残基→ P.61

③
関連グラフ

ペプチド/フラグメントのクロマトグラム

定量にはPrecursorのピーク強度情報を使っていない

タンパク質の定量値

21→ P.68

Visualize 画面
有意な変動をしている
タンパク質の解析＆データのバラつきをはじめとした確からしさを検証するグラフを
提供

Volcanoplot

Scatter
plot

GO情報

22

Volcano plot
縦軸 -Log10 (p)横軸 Log2 (Fold Change)
赤点線 多重検定検証の p(q,α)→ P.70→ P.71

変動タンパク質をratio, p-value両面から探す→ P.72

サンプル毎の定量値に関するグラフ
箱ひげ図（左）、棒グラフ（中）、Trend line(右)サンプル毎の定量値ばらつきをチェックする

Scatterplot
y=x や回帰直線から大きく外れるタンパク質を探す

23→ P.73GO情報
円グラフ（上） ネットワーク図（下）24→ P.74

Visualize 画面 PCAタブ
主成分の寄与率と累積

PCA Score
Scatterplot

Score
plot

Loadings
plot
25→ P.75

各主成分の寄与率と累積
PCA score scatterplot
主成分別
プロットはsampleに該当

26

→ P.76

Loadings Plot
各タンパク質の主成分への寄与を表すプロット
左上で選択した主成分組み合わせと連動

Score plot
左上で選択した主成分組み合わせのスコア分布図
拡大版

27→ P.79

Analysis 画面

TICとLC保持時間のサンプル間誤差を確認できる

上各サンプルのRTとTIC

下各サンプルのRTとReferenceとの誤差

28

→ P.80

Publish 画面
検索パラメータの確認、論文のMethodのような文章の作成

パラメータ一覧

Method文章

29→ P.42

定量 : 階層構造化と属性付与の例

30

データをまとめる
単位を変更可能31→ P.85

検定
Permutation Test- ノンパラメトリック- 2群 〇 3群以上 〇- ベースはF検定、群間のランダムなデータを入れ替えF値を計算し続ける- 10000回の 入れ替え計算を行い、入れ替え前のF値より有意差以上に差があった回数を10000（データ入れ替えの試行回数）で割った値をp-value とする。
t-test / ANOVA- パラメトリック- 2群 〇 3群以上 〇- ANOVA両側検定を行う。(2群しかない場合 t検定と同じ。)
Mann Whiteney U test / Kruskal-Wallis test
- ノンパラメトリック- 2群→Mann Whiteney U, 3群以上→Kruskal-Wallis- 同じ分布の形、スケールである事を前提とする

32

→ P.88

多重比較補正多重検定時の第一種過誤に対応する補正
FDR: (False Discovery Rate)
BH法
FWER: Family Wise Error Rate
ホッホベルクのステップアップ手順＆ホルムのステップダウン
33

解析操作の流れ• ソフトウェア起動• 新規作成、Ctrl + N(menuの「File」-> New やアイコンクリック)• 検索パラメータ指定、検索開始• データ取り込み完了• 属性付与、階層構造化• データ解析（定性解析、定量解析、検定）• レポート34

→ P.10

内部プログラム• MSConvert- データ変換• EncyclopeDIA- ペプチドピックアップ- RTアライメント- ペプチド同定- タンパク質同定- ペプチド定量
35

その他のトピックス（＋日本語マニュアル対応ページ）
・タンパク質のグループ化、クラスター化 (→P.89)
シェアペプチドの存在とタンパク質のグループ化ルール
・Report (→P.91)
Scaffold DIAで出力可能なファイル
・Prositとの連携によるライブラリフリーサーチ (→P.93)
Prositでライブラリーを作成しScaffold で使用可能にするための操作方法
・Gene Ontology
Scaffold DIAでGene Ontology情報を付与させるために必要な前処理操作
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英語マニュアルのAppendix• Appendix A.Structure of Scaffold DIA files (*.sdia)• Appendix B.Computation of FDR in Scaffold DIA• Appendix C. Summarization:Rolling up Values• Appendix D. Missing Values• Appendix E. Shared Evidence Clustering Algorithm• Appendix F.Heat map clustering• Appendix G.Techniques to Control the Family-wise Error Rate
• Appendix H. Using Principal Component Analysis• Appendix I. How PCA is Performed in Scaffold DIA• Appendix J. Description of Mouse Right Click Context Menu
Commands

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インストール環境、その他■インストール環境
・対応OS
Windows 10,11 (64bit)。MacやLinux利用の場合、mzMLを自身で準備・メモリ
最低 4GB以上
しかし64GB以上を強く推奨(大規模解析なら128GB以上)
・ストレージ
最低 数百 MB 以上。高速SSD の使用を推奨
・CPU
使用可能なコア数の上限が 64コア

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