疾患に関連するエクソソームの選択的分解・除去技術
鳥取大学 農学部 生命環境農学科准教授 岩崎 崇
2024年3月5日

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従来技術とその問題点①
がん治療に使用される従来の抗体医薬としては、抗HER2抗体医薬ハーセプチンなどがあるが、がん細胞が分泌するHER2陽性エクソソームが抗体医薬の薬効を阻害するため、抗体医薬の薬効低下や、抗体医薬の使用量増加に伴う医療費の高額化が問題とされている。
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従来技術とその問題点②
従来のエクソソーム除去技術としては、Aethlon Medical Introduces 社 の 人 工 透 析（血液透析）装置「HER2osome」があるが、長時間の透析に起因する患者QOL低下などの問題があり、広く利用されるまでには至っていない。
Marleau AM. et al., 2012, J. Transl. Med., 103

新技術の特徴・従来技術との比較• 従来技術の問題点①であった、エクソソームによる抗体医薬の薬効阻害を改善することに成功した。
• 従 来 技術 の 問題 点 ② で あ った 、 人工 透 析（血液透析）装置を使わない技術の開発に成功した。
• 本技術の適用により、①抗体医薬の使用量の 軽 減 （ 医 療コ ス トの 削 減 ） や 、 ② 患 者
QOLの改善が期待される。

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想定される用途① 本技術は、抗体医薬の投与前に使用することで、抗体医薬の促進剤・補助剤として使用できると考えられる。
② 疾患に関連するエクソソームを除去することで、疾患の治療・予防効果が得られることも期待される。
③ エクソソームに限定せず、細胞外の標的タンパク質などの選択的分解・除去技術に展開することも可能である。
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疾患に関連するエクソソームの選択的分解・除去技術の詳細について【背景と課題】

ヒト血中のエクソソームは疾患の原因物質であると同時に、抗体医薬の阻害物質でもある。しかし、エクソソームは細胞間の重要なコミュニケーションツールでもある。
【ニーズ】
血中から疾患に関連する特定のエクソソームだけを選択的に除去する技術があれば、新たな治療戦略を創出できる。
【手法】
独自素材である細胞膜透過性・リソソーム移行性ペプチドをエクソソームに選択的に修飾し、細胞外のエクソソームを細胞内リソソームへ輸送・分解する技術を開発する。
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エクソソームと疾患
エクソソーム細胞間の情報伝達を担う直径50～100 nmほどの細胞外小胞
mRNAやmiRNAを含有し、様々なタンパク質を表出している
細胞

核

核細胞

エクソソームと疾患の関係性例）HER2陽性エクソソーム
抗体医薬を中和したり、周囲の乳がん細胞の浸潤・転移を活性化したりすることで、乳がんの難治性・悪化に関与している重要な原因物質
HER2

抗体医薬
（抗HER2抗体）
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核
HER2陽性エクソソーム

乳がん細胞
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エクソソーム除去技術の概要
乳がん細胞
リソソーム

リソソーム分解を誘導

核

HER2

分泌

ポリヒスチジン (H16)
膜小胞を細胞内リソソームに輸送することができる
新しい細胞膜透過ペプチド

HER2陽性エクソソーム
抗体医薬を中和したり、周囲の乳がん細胞の浸潤・転移を活性化したりすることで、乳がんの難治性・悪化に関与している重要な原因物質
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8細胞膜透過ペプチド：ポリヒスチジン (H16)特徴

従来の細胞膜透過ペプチド

ポリヒスチジン (H16)アミノ酸配列アルギニン／リジンを豊富に含む塩基性アミノ酸配列
TAT (GRKKRRQRRRPPQ)
R8 (RRRRRRRR)

ヒスチジンのみで構成される
アミノ酸配列H16 (HHHHHHHHHHHHHHHH)

細胞膜透過能

高い

非常に高い

分子輸送能

タンパク質
膜小胞
核酸

血清安定性

低い
血清タンパク質により細胞膜透過が抑制される高い
血清タンパク質により細胞膜透過が全く抑制されない

細胞内局在

細胞質

リソソーム

タンパク質

膜小胞

特許第6202707号 新規細胞膜透過ペプチド
T. Iwasaki, et al. (2015) J. Control. Release, 210, 210-224
T. Hayashi, et al. (2018) BBRC, 501, 648-653

9細胞膜透過ペプチド：ポリヒスチジン (H16)
細胞膜透過(細胞内蛍光強度)

ポリヒスチジン (H16) の特徴
細胞株に対するポリヒスチジン(H16) の細胞膜透過細胞株

ポリヒスチジン (H16) の生体内挙動
矢印は腫瘍組織に集積したポリヒスチジン(H16)を示す。

腫瘍1h
ポリヒスチジン

24 h

132 h

Iwasaki, T., et al. (2015) J. Control. Release, 210, 115-124.

ポリヒスチジン (H16) による細胞内分子輸送技術
110100500 nm

ポリヒスチジン(H16)

Human cell
Kimura, S., et al. (2017) Biosci. Biotechnol. Biochem., 81, 112-118; Hayashi, T., et al. (2018) Biochem. Biophys. Res. Commun., 501, 648-653;
Hayashi, T., et al. (2019) Molecules, 24, 2995; Iwasaki, T., et al. (2020) Biochem. Biophys. Res. Commun., 533, 905-912; Tanaka, Y., et al. (2021)
Biosci. Biotechnol. Biochem., 85, 1405-1414; Hori, K., et al. (2022) J. Biotechnol., 354, 34-44; JP6202707; JP6961202; PCT/JP2021/046845
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10エクソソーム除去技術の概要
HER2陽性エクソソーム

抗HER2抗体-H16➀抗HER2抗体-H16とエクソソームの結合

抗体医薬

分泌

HER2

②細胞膜透過リソソーム➄抗体医薬の薬効改善
増殖阻害活性細胞死誘導③リソソーム輸送④リソソーム内分解

HER2陽性乳がん細胞

HER2陽性エクソソームにポリヒスチジン (H16) を選択的に修飾し、HER2陽性エクソソームを細胞内リソソームに輸送・分解することで、標的エクソソームを選択的に除去し、抗体医薬の薬効を改善する
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抗HER2小型抗体Nb-H16/FLAGの調製
Nb-H16/FLAG大腸菌発現プラスミド

kDa
46

ウェスタンブロッティング

CBB染色kDa
46

3131262618186.3

Nb-H16/FLAG 6.3

Nb-H16

Nb-FLAG

安価な大腸菌発現系にてNb-H16/FLAGの調製を確認
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エクソソームとNb-H16/FLAGの結合

Nb-H16
回収

結合
Ni固定ビーズ

Ni2+

Nb-FLAG
結合

回収

抗FLAG抗体ビーズ

Agarose
bead

Mag
bead

Nbに結合したエクソソーム量 (蛍光強度)

赤色蛍光mCherryで標識した
HER2陽性／陰性エクソソーム

20,00015,000エクソソーム-Nb結合アッセイ
Protein conc. : 0.3 mg/mL
HER2陰性エクソソーム *HER2陽性エクソソーム
Student‘s t-test * p<0.05n.t.: Not treated*10,000

5,0000n.t.

Nb-FLAGNb-H16

HER2陽性エクソソームとNb-H16/FLAGの特異的な結合を確認
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Nb-H16のエクソソーム除去効果
SKBR3培養細胞 (HER2陽性ヒト乳がん細胞) を使用

2500

培養上清からのエクソソーム除去

HER2陰性エクソソーム
HER2陽性エクソソーム
Student‘s t-test * p<0.05n.t.: Not treated

HER2陰性エクソソーム
HER2陽性エクソソーム

*

2000
1500

1000
5000n.t.

Nb-FLAGNb-H16

培養上清のエクソソーム量 (%)

エクソソームの細胞膜透過量(細胞内蛍光強度)

エクソソームの細胞膜透過140120

Student‘s t-test * p<0.05n.t.: Not treated*100806040200n.t.

Nb-FLAGNb-H16

Nb-H16はHER2陽性エクソソームを細胞内へ輸送することで、培養上清のHER2陽性エクソソームを除去する
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Nb-H16によるエクソソームのリソソーム輸送

HER2陽性エクソソーム
＋Nb-H16

HER2陰性エクソソーム+ Nb-H16

SKBR3培養細胞 (HER2陽性ヒト乳がん細胞) を使用

核リソソームHER2陰性エクソソーム融合

核リソソームHER2陽性エクソソーム融合

青蛍光：核 緑蛍光：リソソーム 赤蛍光：HER2陽性エクソソーム

Nb-H16はHER2陽性エクソソームを細胞内リソソームに輸送する
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Nb-H16によるエクソソームのリソソーム分解
HER2陽性エクソソーム
＋Nb-H16

SKBR3培養細胞 (HER2陽性ヒト乳がん細胞) を使用
Day1

Day2Day3Day5細胞内のエクソソーム量 (蛍光強度)

青蛍光：核 緑蛍光：リソソーム 赤蛍光：HER2陽性エクソソーム
*6000
5000

**

Tukey test * p<0.05n.t.: Not treated

4000

*3000

**Day 1
Day 2
Day 3
Day 5*

2000

*

1000

0n.t.

Nb-H16

Nb-FLAGHER2陰性エクソソーム
HER2(−) exosomen.t.

Nb-H16

Nb-FLAGHER2陽性エクソソーム
HER2(+) exosome

Nb-H16はHER2陽性エクソソームのリソソーム分解を誘導する 16

Nb-H16による抗体医薬の薬効改善
SKBR3培養細胞 (HER2陽性ヒト乳がん細胞) を使用
抗体医薬品
ハーセプチン添加

Nb-H16添加

HER2陽性乳がん細胞培養(エクソソーム分泌)抗体医薬なし+ 抗体医薬 10 ng/mL

細胞生存率 (％)

100

ハーセプチンによる細胞増殖阻害

Nb-H16による培地中のエクソソーム除去

100*+ 抗体医薬 100 ng/mL+ 抗体医薬 1,000 ng/mL100100*****8080808060606060

H164020H1640FLAG

Student‘s t-test * p<0.05
n.s. Not significant

02040FLAG
Student‘s t-test * p<0.05
n.s. Not significant

00110100

Nb添加量 (μg/mL)

20H1640FLAG
Student‘s t-test * p<0.05
n.s. Not significant

20110100

Nb添加量 (μg/mL)

薬効改善
H16FLAG
Student‘s t-test ** p<0.001
n.s. Not significant

000**

0110100

Nb添加量 (μg/mL)

0110100

Nb添加量 (μg/mL)

製造コストの低いNb-H16は、製造コストの高い抗体医薬の薬効を改善（補助）するCreated with BioRender.com

17新技術の特徴・従来技術との比較• 従来技術の問題点①であった、エクソソームによる抗体医薬の薬効阻害を改善することに成功した。
• 従 来 技術 の 問題 点 ② で あ った 、 人工 透 析（血液透析）装置を使わない技術の開発に成功した。
• 本技術の適用により、①抗体医薬の使用量の 軽 減 （ 医 療コ ス トの 削 減 ） や 、 ② 患 者QOLの改善が期待される。

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想定される用途① 本技術は、抗体医薬の投与前に使用することで、抗体医薬の促進剤・補助剤として使用できると考えられる。
② 疾患に関連するエクソソームを除去することで、疾患の治療・予防効果が得られることも期待される。
③ エクソソームに限定せず、細胞外の標的タンパク質などの選択的分解・除去技術に展開することも可能である。
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自力解決

実用化に向けた課題① 今後は適用範囲を拡大するために、
HER2陽性エクソソーム・抗体医薬ハーセ
プチン以外の他の標的エクソソーム・抗体医薬についても有効性を実証する必要がある。
② 現在、in vitro試験についてエクソソーム除去を実証済み。今後はin vivo試験においても有効性を実証する必要がある。
企業共同研究にて解決
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企業への期待① in vivo試験における有効性を実証するために、マウス試験などのin vivo試験技術を持
つ企業との共同研究を希望。
② 組換えタンパク質の製剤化の技術を持つ企業との共同研究を希望。
③ がん治療分野やタンパク質分解誘導試薬の開発への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：新規細胞膜透過ペプチド• 登録番号 ：特許第6202707号• 出願人：国立大学法人鳥取大学• 発明者：岩崎 崇、徳田佳久、小竹彩香、河野 強

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お問い合わせ先
国立大学法人鳥取大学
研究推進機構 研究戦略本部
ＴＥＬ 0857‐31‐5546
ＦＡＸ 0857‐31‐5571e-mail sangakucd＠ml.cjrd.tottori-u.ac.jp
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