MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル

MASCOT Distiller
Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル

目次
1. はじめに：本資料でご紹介する計算内容について .................................................................................... 2
2. 定量解析を行うデータについて ............................................................................................................... 3
3. 準備 1・データ取得 ................................................................................................................................... 5
4. 準備 2・データベースの設定 ..................................................................................................................... 6
5. 準備 3・定量設定の定義 ......................................................................................................................... 15
6. 定量計算実行 1・データ読み込み............................................................................................................ 22
7. 定量計算実行 2・ピーク抽出 ................................................................................................................... 26
8. 定量計算実行 3・MASCOT 検索と定量計算前の設定変更 .................................................................... 28
9. 定量計算実行 4・定量計算実行と、結果表示内容について ..................................................................... 36
10. 定量計算実行 5・計算後の report、export............................................................................................. 46

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1. はじめに：本資料でご紹介する計算内容について
この資料では、質量分析装置のデータを使ったプロテオミクス・DDA 解析において、Distiller を使って Precursor ベースのラベルフリー計算を実行する具体的な手順について説明しています。データは４種類で３つの technical replicates を含む計 12 の raw データで構成されていて、ペプチド同定
結果をもとに溶出時間がアライメントされたプリカーサーの eXtracted Ion Chromatograms（XICs）の相対強度に基づいて定量解析を行います。raw データから直接ペプチドが同定された際にはその同定個所を、raw データに同定ペプチドが見つからない場合でも global alignment の結果をもとに Precursor のピークを検出し XICs 計算に利用します。出力内容は reference との比となります。
資料の前半（手順２～５）では データ解析を行うための準備について、後半 （手順６～１０）ではDistiller 上で実際に解析を行うとともに、結果の見方や、データを出力して他ソフトウェアで解析を行う方法について紹介しています。資料の構成内容については目次をご確認ください。
本資料でご紹介しているデータ解析は、弊社で公開しているブログ記事が元となっております。そちらも併せてご参照ください。
ブログ記事・英語：
http://www.matrixscience.com/blog/global-thinking-label-free-quantitation-inmascot-distiller-2-8.html#comments
ブログ記事・日本語訳:
http://www.matrixscience.co.jp/blogsJ/blog_202104.html[解析に必要な Distiller の構成]
MASCOT Distiller で定量解析を行うためには、以下の製品が必要です。
・MASCOT Server [インターネット試用版でなく、製品版]
・MASCOT Distiller [ 定量モジュールまで含む]
ま た こ の 資 料 で 紹 介 す る Distiller 定 量 計 算 は 、 ver.2.8.0 以 降 の 機 能 を 利 用 し て い ま す 。
Distiller 製品版をお持ちの方でも定量モジュールをお持ちでない方は実施できませんのでその点ご注意ください。Distiller をお持ちでない方、並びにお持ちになっていても定量モジュールをお持ちでない方は試用ライセンスを提供可能です。お気軽に弊社までご連絡ください。

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2. 定量解析を行うデータについて
手順 2 ではチュートリアルにおいてどのようなデータを解析するのかについて説明いたします。
本資料で実際にデータ解析を行うのは、以下論文で使用された raw データです。
Shalit T, Elinger D, Savidor A, Gabashvili A, Levin Y. J. Proteome Res. 2015, 14, 1979-1986

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/pr501045t
以下のサイトでデータが公開されているとともに、データや解析内容についての説明があります。raw
データの取得先でもあります。
https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD001385
本資料においても、チュートリアルの内容を理解するのに最低限必要なデータの構成並びにその中身について説明いたします。
使用データでは、200ng の HeLa 消化物にスパイクされた大腸菌 3 ng,7.5 ng,10 ng,15 ng を混合したサンプル(下図)を、それぞれ３回測定しています。
実験データのデザインの意図についてですが、まず大腸菌に着目した場合、同一のタンパク質について
15ng スパイクし たサ ンプルと それ以 外の サンプル と 比較 すると 、それぞ れ期 待 される比 率 が1:5(3ng), 1:2 (7.5ng), 1:1.5(10ng)となります。実際のデータがその期待された比率とどの程度ずれているかを見る事で、定量計算結果を評価する事ができます。また human(Hela)のタンパク質に着目した場合、どのサンプル間で比較しても比率が 1:1 になる事が期待され、こちらも同様にそのずれ方から定量結果を評価する事ができます。

4 種類のサンプルについての説明。Human 並びに E.coli の混入量が記されている。
論文 Shalit T, et.al(2015) Proteome Res. 2015, 14, 1979-1986 の Fig.1 より

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公開先で取得できるファイルと、サンプルの内容との関係性は以下の通りです(下表)。

File 名Sample: Ecoli spike 量

QEP1_SpikeIn_230914_1_3ng_270914.raw
QEP1_SpikeIn_230914_2_3ng_270914.raw

繰り返し番号

1
3 ng

2

QEP1_SpikeIn_230914_3_3ng_270914.raw

3

QEP1_SpikeIn_230914_4_7-5ng_270914.raw

1

QEP1_SpikeIn_230914_5_7-5ng_270914.raw

7.5 ng2

QEP1_SpikeIn_230914_6_7-5ng_270914.raw

3

QEP1_SpikeIn_230914_7_10ng_270914.raw

1

QEP1_SpikeIn_230914_8_10ng_270914.raw

10 ng

2

QEP1_SpikeIn_230914_9_10ng_270914.raw

3

QEP1_SpikeIn_230914_10_15ng_270914.raw

1

QEP1_SpikeIn_230914_11_15ng_270914.raw

15 ng

QEP1_SpikeIn_230914_12_15ng_270914.raw

2
3

公開されている raw ファイルとサンプルの種類について。繰り返し番号は解析に利用していません。

また検索対象としたデータベースも併せて公開されています。お手元にある human,ecoli 並びにcontaminants 用データベースをそのままご利用いただいても解析に問題は生じませんが、手っ取り
早く解析を行いたい場合は公開先の fasta ファイルを MASCOT にセットしてご利用ください。手順４で取得したデータベースを MASCOT で構築する方法についてご案内しています。

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3. 準備 1・データ取得
以降 手順 3～5 では、定量解析前の準備について説明しています。
手順 3 では、手順 ２で説明したデータの取得についてご案内いたします。
まず、WEB ブラウザなどでデータの公開元である以下サイトにアクセスしてください(下図)。
http://ftp.pride.ebi.ac.uk/pride/data/archive/2015/03/PXD001385/

データ公開先をウェブブラウザで開いた際の画面。各データについて raw と dat (MASCOT 検索結果ファイル)があるが、raw のみを取得する。必要に応じて fasta ファイルもダウンロードする。

ここで公開されている 全 raw ファイル (12 個)と、MASCOT の検索対象データベース FASTA である、 “SPhum_canon_2014_06_ecoliK12-201408_contm.fasta”をダウンロードしてください。
[ダウンロードに関係する参考情報 ]・ Raw ファイルサイズ平均 1.45 GB。 12 のデータ、 合計 約 18 GB・ fasta ファイル: 15MB。
ダウンロードに時間がかかるため、その間に手順 4 または 5 を進めておくことをお勧めします（手順 4 を行
うには上記 fasta ファイルが必要です）。
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4. 準備 2・データベースの設定
手順 4 では、MASCOT Server 上に解析用のデータベースをセットする方法についてご案内
いたします。作業前にいくつかご注意・ご確認いただきたい事項があります。
・ご自身で準備したデータベースを利用する場合は必ずしもこの手順４でご紹介する設定を行う必要はありません。
・手順３でダウンロードをご案内している fasta ファイルを取得しておく必要があります。
・今回取得するデータベースについて、名称を “PXD001385”、FASTA 先頭行の抜き出しルールは
スペース前後の区切りを利用するとします。実際には任意の名称、任意の設定でも問題ありません。
区切り例
先頭行 >sp|05100|3MG_ECOLI DNA-3-methyl ladenine glycosylase
Accession : sp|05100|3MG_ECOLIDescription : DNA-3-methyl ladenine glycosylase
まず、MASCOT Server の Home 画面にアクセスし、Configuration Editor -> Database
Manager を開きます。

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左フレームの”Fasta”にある、”Create new”リンクをクリックします。
続いて現れる画面で、“Database name” に”PXD001385” (データベースの名称)と記入し、作成の種類として“New custom definition”のラジオボタンを選択し、”Next”ボタンを押します。

FASTA に含まれる配列の種類を選択します。ここでは “Amino acid(protein database)”を選択します。選択後、”Next”ボタンを押します。

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FASTA ファイルの設置方法を選択します。普段慣れている方法があればこの資料の指示通りでなくても問題ありません。ここではブラウザを介してファイルをアップロードする方法でご案内します。
“upload or copy file manually”を選択し、”Create”ボタンを押します。

データベース設定の枠組みが構築されます。引き続きファイルを WEB ブラウザ経由で設置するため“Upload file using web browser”を選択し、”Next”ボタンを押します。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル“FASTA file to upload”の下にある”ファイルを選択”ボタンを押し、公開サイトからダウンロード
した fasta ファイルを選んで開きます。選択後元の画面に戻って”Upload”ボタンを押します。

ファイルがアップロードされ認識されると画面が切り替わり、”Edit configuration”ボタンが現れる
のでボタンを押します。

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データベースの抜出ルールを設定します。
まずは Accession (データベースの中で唯一となるような文字列・識別子)の設定を行います。
“Accession parse rule “の下にある”Choose”ボタンを押します。スペースあるいはカンマより前の識別文字をすべて選択するルール、”>\([ ,]*\) ”の行を選択します。

抜出ルールの候補が１０現れます。候補の中にある”>\([ ,]*\) ”を選びます。

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選択後、画面下部の”Choose”ボタンを押してください。

元 の 設 定 画 面 に 戻 り ま す 。 続 い て 同 様 の 操 作 で ”Description” の 抜 出 ル ー ル を 設 定 し ます。”Description parse rule”の下にある”Choose”ボタンを押してください。

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抜 出 ルー ルの候 補が 10 現 れま す 。ス ペース 以降 す べ ての 文字 を Description とし て認 識する、”>[ ]* \(.*\)” を選択して、画面下部の”Choose”ボタンを押してください。

選択後元の画面に戻ります。抜出ルールが意図しているものであることを再度確認した上で、画面下部にある”Next”ボタンをクリックします。

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続いて現れる画面は taxonomy 設定やタンパク質情報を取得する際に使用する設定の画面ですが、今回は特に設定しないとします。画面下部にある”Save and finish”ボタンを押してください。

作成したデータベース画面に戻ります。画面下部にある “Activate”ボタンをクリックしてデータベースを使用可能な状態にしてください。

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デ ー タ ベ ー ス 構 築 の 確 認 は “Database Status” 画 面 に て 行 い ま す 。 Home 画 面 にある”Database status”をクリックします。作成したデータベース PXD001385 が使用中のデータベースの一覧画面に表れているかどうか、現れている場合、”Status”項目が”In use”となっているか、の２点についてご確認ください。

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5. 準備 3・定量設定の定義
手順 5 では、MASCOT Server 上に、今回の解析に特化した Label Free (Replicate)設定を作成します。サンプルの種類（今回の場合は 3ng,7.5ng,10ng,15ng の４種類、それぞれ３つずつの繰り返しで x3 となり計 12 個）の Components 定義作成と、結果画面に表示する ratio の定義を行います。Distiller で計算を行う際、ここで定義した定量の設定を選択して検索を実行します。
MASCOT ではあらかじめ 検索パラメータ”Quantitation”の中に、”Label Free [MD]”という設定があり、検索時にこれを選択すれば replicate ラベルフリーの定量計算を行う事ができます。しかし特に詳しい定義をせずにこの設定を利用した場合、結果として表示される各 raw ファイルの名称や表示される ratio については MASCOT Server 側で自動的に割り振られた記号・ratio となってしまいます。項目名をわかりやすくしたり、ratio を標準以外のものにしたい場合は、この手順 5 で紹介するような設定の作成をあらかじめ行ったうえで検索時に作成した項目を Quantitation から選択して検索を実行する必要があります。
Home -> Configuration Editor -> Quantitation と辿り、Quantitation 設定画面を開きます。

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定量設定画面が現れます。既に MASCOT で使用可能な定量設定が準備されています。今回はReplicate 手法の基本である”Label-free[MD]”項目をカスタマイズして使用する事を目的としているため、”Label-free[MD]” 行にある “Copy”をクリックします。

Label-free[MD]設定の複製が現れます。まず、name と description を書き換えます。今回の例
で は name を ”Label-free Customized01[MD]”, description は 既 存 の も の の 後 ろに”customized”という文字を追加しました。
続いて、”Component”タブをクリックします。

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デフォルトでは C1,C2,Ref とい３つの設定が作成されています。
MASCOT Server + Distiller を使った Replicates の定量計算では、計算したファイル数(サンプル 数 ) と 、 こ の ”Component” タ ブ で 定 義 さ れ た Component 設 定 数 が 一 致 し て い る 時 のみ、”Component”と”Report Ratio” タブで設定した内容が結果に反映されます。設定数が一致していない場合は、”Ref”, “C1”,”C2”・・・（データ数に準じた数の Cn-1） などの記号が自動的に割り振られ、すべての Cn-1 の Ref に対する Ratio が結果に表示されます。
ここでは、12 の raw ファイルに対応する component 名を以下のように設定する事とします。
File 名File index

名称

1

3ngR1

2

3ngR2

QEP1_SpikeIn_230914_3_3ng_270914.raw

3

3ngR3

QEP1_SpikeIn_230914_4_7-5ng_270914.raw

4

7p5ngR15

7p5ngR2

QEP1_SpikeIn_230914_6_7-5ng_270914.raw

6

7p5ngR3

QEP1_SpikeIn_230914_7_10ng_270914.raw

7

10ngR1810ngR2

QEP1_SpikeIn_230914_9_10ng_270914.raw

910ngR3

QEP1_SpikeIn_230914_10_15ng_270914.raw

1015ngR1

11

15ngR21215ngR3Sample:Ecoli spike 量

QEP1_SpikeIn_230914_1_3ng_270914.raw
QEP1_SpikeIn_230914_2_3ng_270914.raw

QEP1_SpikeIn_230914_5_7-5ng_270914.raw

QEP1_SpikeIn_230914_8_10ng_270914.raw

QEP1_SpikeIn_230914_11_15ng_270914.raw
QEP1_SpikeIn_230914_12_15ng_270914.raw

3 ng

7.5 ng

10 ng

15 ng

各 Component について、”Component”で名称を作成し、”File index”で取り込まれた raw ファ
イルの順番と Component との紐づけを行います。この”File index”は重複しないようにしてください。

１つずつ作成し、新たな設定を作成するために”New”(あるいは Copy)ボタンを押して、作成を繰り返します。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
すべて作成すると、Component が以下のように１２個作成されます。作成後、”Report Ratio”タブをクリックします。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
続いて、Distiller で表示される Ratio の内容を定義します。
表示される ratio の設定については、各 Component 名を変数とした単純な四則演算の結果のみ表示可能です。また必ず分子・分母にくる Component を指定する必要があります。
MASCOT Server の protein ratio 計算方法にもいくつかのオプションがあるものの、ご自身で細かい式を指定しつつ ratio を計算する事は Distiller 内で行う事ができません。そのような計算をご希望の方は、本資料の手順 10 で紹介するようなデータの export 機能を使用すると、タンパク質単位でなくペプチド単位で定量値（ratio でなく intensity から計算された単一の数値）が出力されますので、その数値を使ってご自身で別のソフトウェアを使って protein ratio や各種検定の計算を行ってください。
ここでは各サンプルについて、３つの繰り返し実験の単純な平均値を使った ratio を計算する、というイメージで、(15ngR1+15ngR2+15ngR3)/(3ngR1+3ngR2+3ngR3) といったような項目を作成
します。
設定する ratio は以下の３つです。
-

15ng と３ng の ratio: (15ngR1+15ngR2+15ngR3)/(3ngR1+3ngR2+3ngR3)-15ng と 7.5ng の ratio : (15ngR1+15ngR2+15ngR3)/(7p5ngR1+7p5ngR2+7p5ngR3)-15ng と 10ng の ratio: (15ngR1+15ngR2+15ngR3)/(10ngR1+10ngR2+10ngR3)

Report Ratio で計算式を記入します。”Report Ratio”項目は単なる名称ではなく計算式となりますの
で、変数となる Component 名も含めて正確に記述してください。
例: (15ngR1+15ngR2+15ngR3)/(3ngR1+3ngR2+3ngR3)
Report ratio で 指 定 し た 変 数 名 と 、 Component を 紐 づ け す る 設 定 を 行 う 必 要 も あ り ま す 。 ”Add

Numerator” , ”Add Denominator” ボタンを駆使して Component 数に合わせて項目を呼び出すとともに、選択肢から Component を呼び出して、 はっきりと定義する必要があります。
＊Coefficient は係数です。設定数値が Components の定量値に掛けられます。
詳しい設定内容は以下図をご覧ください。

(15ngR1+15ngR2+15ngR3)/(3ngR1+3ngR2+3ngR3)19

MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
作成予定の３つの ratio について設定を作成します。各 Report Ratio はすべて表示できなかったため、
以下画像内の黄色い枠の中に設定内容を記しました。

(15ngR1+15ngR2+15ngR3)/(3ngR1+3ngR2+3ngR3)(15ngR1+15ngR2+15ngR3)/(7p5ngR1+7p5ngR2+7p5ngR3)(15ngR1+15ngR2+15ngR3)/(10ngR1+10ngR2+10ngR3)

設定後 Save changes ボタンを押すと今回設定した全体の定義が保存されます。
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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル[参考・タンパク質を使った Normalization について]
以下設定内容は normalization を希望される方のみご利用ください。
参照論文では 変動のない human のタンパク質、特に値が真ん中程度にあるタンパク質 20 個を全体
データの補正・Normalization に利用しています。この資料では使用例として、参照論文にリストアップ
されたタンパク質 20 を使って normalization する設定をご案内いたします。
参照論文が利用したタンパク質 20 については、
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/pr501045t
supporting info にある 3 つめの補足資料(excel ファイル)にある定量結果表をご参照ください。
表の中に” House keeping protein? (1=yes, 0=no)”というタイトルの列があり、行の並びの真ん中あたりに この設定項目が 1 になっているタンパク質が normalization に使用されたタンパク質です。
今 回 の 計 算 で同 様 に タン パ ク 質 によ る normalization を 希 望 さ れ る 場 合 、 下 図 の よ う に し て「Normalization」タブ内で、使用するタンパク質の accession を指定してください。
なお、この normalization はここで必ずしも設定しなくとも結構です。例えば一度計算を実行後、その結果を見た上で改めて normalization に使用するタンパク質を設定して計算させることも可能です。

すべての設定が終わったら、画面下部にある”Save changes”ボタンを押して設定を終了してください。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル

6. 定量計算実行 1・データ読み込み
手順 2～5 で準備が整ったところで実際に定量計算を行います。手順 6 では Distiller 上で raw
データを読み込む操作を行います。
まず MASCOT Distiller を起動します。続いて、Menu の File から”New Multi File Project”
を選択します。

ダイアログ右側の Add Files をクリックします。ここで、raw データに合わせたメーカー名並びにソフトウェア名を選択します。今回の PXD001385 のデータは、Thermofisher Scientific 社の装置で測定されたデータです。 Add Files -> Thermo -> Xcalibur を選択します。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
12 の raw ファイルを選択します。定量設定時に定めた File index はファイルの読み込み順と対応しています。後で再調整する必要が無いよう、Components の index 番号と raw ファイルの読み込み順が同じになるよう、raw ファイルを選択して取り込むのが望ましいです。しかしながら対応付けに失敗しても後で変更可能ですので、よくわからない場合は順番を気にせず選んでいただければ OK です。
ファイルを選択して”Open”ボタンを押します。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
元のダイアログに戻ります。さらに２か所の変更を行います。
１か所目は Distiller Project File, 全体ファイル名です。Distiller project file（拡張子が .rovのファイル） ですが、デフォルトでは読み込んだ最初の raw ファイルに基づいて名づけられており、混同してしまう事も多いので変更されることをお勧めします。今回は raw ファイル名の後半部分にあたる
個所を削除し各データに共通する個所を残した上で、”12dataMod2”という文字を加えています。
２か所目は”Processing Options”です。Distiller では各装置・各手法に合わせてデータ処理に適したデフォルト設定値を準備していますが、それを適用するためにデータ読み込み時に opt ファイルを選択します。装置・測定手法に近い名称の opt ファイルを選択してください。今回の例では多少名称と実行内容が合いませんが、reporter.prof_prof.ThermoXcalibur.opt を選択しています。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
項目選択後、”OK”ボタンを押すとファイルを開き始めます。

ファイル読み込みが終了すると TIC 画面が表示されます。

各ステップにおいて、次のステップに進む前にデータを Save しておくことをお勧めいたします。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル

7. 定量計算実行 2・ピーク抽出
読み込んだ各 raw データに対してピーク抽出処理を行います。MASCOT Server 側では raw
データをそのまま受け付ける事はできません。検索前にスペクトルからノイズを除去し、ペプチド/フラグ
メントのピークに該当する個所を抜き出してまとめた入力データを作成する必要があります。その処理の事をこの資料では「ピーク抽出」と呼んでいます。
Menu の Processing から”Process All Scans”を選択すると、すべての raw データに対してピーク抽出を行います。

[_関連項目 : Peak Processing option について]
以下は希望される方のみの操作です。ピーク抽出はあらかじめ定められた設定をもとに計算されます。
設定は、データ取り込み時の opt ファイル内に定められていますが、データ読み出しの後に変更する事ができます。設定内容並びに設定を変更する方法をご紹介します。必要に応じて実行してください。
Menu の Processing から”Edit Processing Options”を選択してください。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
Processing options は５つのタブから構成されています。
タブ

設定内容

MS Processing

MS スペクトルデータの特性・データの質について

MS/MS Processing

MS/MS スペクトルデータの特性・データの質についてTime Domain

溶出時間と関連した、同一ペプチドに対する認識と処理

MS Peak Picking

MS のピークの認識と選別（抽出）条件

MS/MS Peak Picking

MS/MS のピークの認識と選別（抽出）条件

各タブに設定項目の詳細については、ダイアログ右下の”Help”をご覧ください。
ここでは抽出ピークの調整に特にわかりやすく影響するパラメータ 2 つについてのみピックアップしてご紹介します。抽出ピークの内容が変わると検索結果も変わることがあります。
MS/MS Peak Picking タブをご覧ください。

Correlation Threshold: 理論同位体スペクトルと実測データの類似度、相関係数。1 に近いと理論値の形状に似ていることが求められ、0 に近ければ似ていなくてもよくなります
Minimum signal to nose (S/N) : S/N。値が低いほど選定条件が緩く対象が広がります。
条件を定めたら”Save”をして、Process Peak Scan を実行してください。
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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル

8. 定量計算実行 3・MASCOT 検索と定量計算前の設定変更
ピーク抽出が終わりましたら、引き続き MASCOT Server での検索を行います。
Distiller の menu Analysis -> Mascot Search -> All Peaklists を選択してください。

検索パラメータ入力画面が現れます。今回は以下画像のように各種パラメータを設定しました。
特にご注意いただきたいのが”Quantitation”項目です。手順 4 にてあらかじめデータに合った
Quantitation 設定を作成した場合はその作成項目を、そうでない場合は”Label Free[MD]”を選択
してください。設定値は以下の通りです。設定内容は次頁図をご覧ください。

設定項目

設定値

備考

Database

PXD001385

手元のデータベースを使用してもよい

Allow up to1

独自に判断した数値。元の論文データ投稿
サイトには指定がない。「2」でも良い

Quantitation

Label free Customized[MD]Fixed Modification

Carbamidemethyl(C)Variable Modification

Oxidation(M)Peptide tol.

10 ppm論文やサイトで使用されている数字

MS/MS tol.

0.02 Da

論文やサイトで使用されている数字

#13C

1

独自に判断した数値。「2」でも良い

Instrument

Default

独自に判断した設定値。装置に合わせたも

上述の通りのに変更してもよい

Decoy

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チェックを入れる

FDR 計算のため必須

MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル

画面下部の” Start Search”ボタンを押すと検索を実行します。

[次頁に続きます]29

MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
検索が終わると、Distiller の左フレームに同定タンパク質一覧が表示されます。

続いて、同定タンパク質の選定条件について変更したり、定量計算の基準を変更したりします。Menuの Tools から”Format Options”を選択します。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
Format Options は３つのタブから構成されています。
-

Mascot Search Import Options-

Quantitation Options-

Replicates (定量手法 Replicates の時のみ現れます)

以降、各タブ内の設定について補足説明をします。
MASCOT Search Import Options
ファミリータンパク質や subset/sameset タンパク質の表示などシェアペプチドに関連した内容、並びに同定タンパク質/同定ペプチドの基準を設定する事ができます。
参照論文では ペプチドの同定基準として FDR 1%の設定を行っていました。この資料でも同様の設定をいたします。”Peptide Scoring”の選択肢で “Target FDR”を、PSMs の 1% と設定しました。“PSMs” の選択肢には他に”Sequences”もあります。同一ペプチドにマッチした query に対するカウントが異なり、Sequence の場合同一ペプチドにマッチしている query を１つにまとめてカウントします。お好みの方をご利用ください。（ご利用の際、選択内容を明記すればどちらも使用が認められて
います）。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
Quantitation Options
MASCOT Server で行った Quantitation の設定内容を引き継いでおり、ご希望により変更が可能です。以下、計算に関連が深い項目に関してのみ簡単な説明を記します。各項目の詳細は”Help”ボタンを押してご確認ください。

“Quality”
XIC 計算の際、該当ペプチドの Precursor ピークを探索したり前後の時間に探索範囲を拡張したりする際に利用するパラメータです。「手順 9. 定量計算実行４・定量計算実行と、結果表示内容について」 ( P.
36～) も併せてご参照ください。
Correlation Threshold
理論スペクトルと実測スペクトルの同位体クラスター形状に関してマッチングを行った際の相関係数です。
１に近いほど実測スペクトルが理論スペクトルの形状に近い必要があり、逆に 0 に近いほど形状が離れていても問題ありません。１に近いほど厳しく、０に近いほど緩い基準となります。
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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
Std Err.Threshold
各時間の ratio について、最小二乗法フィッティングの直線との差（標準誤差）です。前頁図の設定値のように”999”などであれば実質このパラメータは利用しないことを意味しています。
Fraction Threshold
ペプチドの同位体クラスターピークが存在する m/z 領域に、それ以外のピークが存在するかどうかを表す指標です。チェックの有無でパラメータとして使用するかどうかが変わります。
Fraction とは (同位体クラスターピークの面積) / (領域全体のピークの面積) の事を意味します。
値が 1 に近いほどペプチドの同位体クラスターピーク以外の存在を許さず、逆に 0 に近いほど他のピークを許容します。
ここで表示されている項目以外にもパラメータは存在します。詳細は”All Options”ボタンを押して内容をご確認ください。また MASCOT の HELP ページ、Quantitation の”Configuration”の項
目も併せてご覧ください。
http://www.matrixscience.com/help/quant_config_help.html“Protein Ratio Type”
タンパク質にアサインされたペプチドの ratio から、タンパク質の ratio をどのように計算するかについて定義します。average, median, weighted(peptide の intensity をもとにした重みづけを加味した average)の３種類があります。
“Normalisation”
ペプチドの ratio を定めた基準を使って正規化します。
“Outlier removal”
ratio について外れ値を検出し処理をする方法について選択します。

Normalization や Outlier removal に関する設定については、以下 URL も併せてご参照ください。
http://www.matrixscience.com/help/quant_statistics_help.html

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
Replicate
raw ファイルと component の紐づけを確認できるほか、表示する ratio についても定義を確認したり変更したりする事ができます。
Files で表示されている raw ファイル名と、Components の名称が正しく対応付けられているか確認してください。紐づけに意図と異なる個所がある場合、右側の”Move up” “Move down”を押して Components の並び順を変え、対応内容を変更してください。
また Custom ボタンの隣、”Ratios”ボタンを押すと、表示される Ratio を変更する事ができます。
設定方法は MASCOT Server の Quantitation で行った”Report Ratio”と同じです。詳しくは
手順 4 をご覧ください。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
すべての設定を変更して”OK”ボタンを押すと、結果内容の再度取り込みを実行する旨警告文が現れます。特に問題ありませんのでそのまま”OK”ボタンを押してください。引き続き、同定結果を取得し直す処理が行われます。

こ の 後 実 行 す る 定 量 計 算 に は と ても 時 間 が かか り ま す 。 ま た場 合 によ っ て は 途 中 で 失 敗 し て
ソフトウェアが落ちてしまう事もあります。定量計算を行う前に、必ず project ファイル(.rov ファイル)を保存するようにしてください。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル

9. 定量計算実行 4・定量計算実行と、結果表示内容について
同定ペプチドの情報をもとに各 raw データで XIC 計算を行い、さらにアサインされているペプチドの情報から各タンパク質の定量数値を計算します。
menu の Analysis で、”Quantitate”を選択します。

Quantitate ダイアログが現れます。計算対象となるタンパク質を選択します。ここではすべてのタンパク質で計算を行うという事で、”All Families”を選択し、”OK”ボタンを押します。

定量の計算が実施され、画面中央～右側に定量結果が表示されます。
[計算時間とコンピュータのスペックに関連する補足]
replicates 定量計算には非常に時間がかかります。今回のサンプルデータ (4x3=12 の raw
ファイル)において、弊社推奨のスペックを持つコンピュータでも 24～48 時間程度かかります。ただしver.2.8 へのアップグレードにより従来よりも計算に必要なメモリ量は大幅に減っています。このデータについては 30GB 程度のメモリを搭載したコンピュータであれば 問題なく計算が実行可能です。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
以降、定量計算結果の検証に関連する事項について説明いたします。
表示された結果の一番上、“Quantitation Table”は、タンパク質の定量について、ユーザーが独自に定めた、あるいは自動的に定められた比が一覧に表示されます。
Qunatitation table で タ ン パ ク 質 を 選 択 す る と 、 そ の 下 に “Matches Table” が 現 れます。”Mataches Table”には、Quantitation table で選択したタンパク質にアサインされているペプチドについて、ratio やそれに関連する数字と共に表示されます。
さらに”Matches Table ”でペプチドを選択すると、Distiller にて” ＴＩＣ Window”と呼んでいる、
TIC 並びに該当のペプチド部分の XICs が全サンプルを対象に表示されます。

Quantiation Table

Matches Table

TIC Window（XICs 情報含む））

３つの表並びにグラフについて、さらに詳しく説明します。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル[Quantitation table]ratio

SD(geo)#

選択中のタンパク質

各タンパク質について、あらかじめ定めた定量の計算結果 (ratio)を表示します。この資料では手順にて表示する ratio を以下の３通りに定めたため、その内容が表示されています。
-(15ngR1+15ngR2+15ngR3)/(3ngR1+3ngR2+3ngR3)-(15ngR1+15ngR2+15ngR3)/(7p5ngR1+7p5ngR2+7p5ngR3)-(15ngR1+15ngR2+15ngR3)/(10ngR1+10ngR2+10ngR3)

事前に定義していない場合、各 Component について Ref(erence)との単純な比が表示されます。
SD(geo)は幾何標準偏差です。（アサインされたペプチドの定量値から求められる）タンパク質の定量計算方法によっては表示されないことがあります。
#は定量計算に用いられたペプチドデータの数です。
SD(geo)と#は設定した ratio 毎に数値が表示されます。
現在選択しているタンパク質については行の先頭にペンマークが表示されます。選択されているタンパク質について、Quantitation table のすぐ下に”Matches table”が表示されます。
[Matches table]

拡大左側

説明する領域が広いため、表の左側、右側に分けて説明いたします。

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拡大右側

MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル

拡大左側
ratio

Std.Err

X

タンパク質にアサインされた各ペプチドについて、定量値の比(ratio)が表示されます。表示される
ratio はユーザーの定義に基づき、上記のような 1 組の表示だけでなく設定した ratio 分の情報が表示されます。Quantitation の選択項目で事前に定義していない場合や、Quantitation の選択項目とraw ファイル数が合わない場合、各 Component について Ref(erence)との単純な比が表示されます。すべての表示比に対してそれぞれ、”Std.Err”、 ”X”という名称の項目も併せて表示されます。
Std.Err は、標準誤差(Standard error)の略です。
Ratio を計算する際にばらつきが大きいデータは計算に利用しないよう閾値を定める事ができます。
MASCOT Distiller の定量計算では、XIC の計算をするか、あるいはペプチドの ratio をタンパク質の ratio 計算に利用するかについて、３つの観点から検証しています。そのうちの１つが StdErr.です。
Std.Err は計算されたペプチドの比率に対する各比の標準誤差です。ペプチドの比率は XIC ピーク
における各プリカーサイオンの強度に対して最小ニ乗法フィッティングにより求めています。フィッティン
グして得られた直線の傾きが ratio となりますが、この時この直線に対する標準誤差が設定値よりも大きいペプチドの比率はタンパク質の比率計算から除外されます。(下図例は ラベルフリー定量でなくSILAC のもので、2 サンプルの名称がそれぞれ Light, Heavy となっていますのでご注意ください。)

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル“X”は、タンパク質の定量計算に該当ペプチドが使用されているかを表しており、チェックが入っている
場合計算に利用されていることを示しています。

拡大右側Fraction

Correlation

Intensity

各 ペ プ チ ド に 対 し て 定 量 に 関 連 す る 評 価 値 が ２ つ 、 結 果 に 表 示 さ れ て い ま す 。 ”Fraction”と”Correlation”です。これらはペプチド自体が定量計算に用いられるかの判定をするだけでなく、前駆体が検出され前後の保持時間に対しての探索を継続する際の基準にもなっています。

Fraction : ピーク領域の面積比(Fraction of peak area)
Precursor のピーク付近（Scan Window,次頁以降の図も参照の事）の全ピークの面積に対して、計算された理論クラスターピークの面積が占める割合です。理論クラスターピークは実測データの中でモノアイソトピックピークに位置するピークの情報から計算されます。Scan Window に対して、
precursor の同位体クラスター以外のピークが多く混ざっているデータ、もともと全然関係のなかったピークを誤って同位体クラスターと認識しているようなデータを排除するための目安となります。値が大きい（1 に近い）ほど理論値と合致するピークだけが指定領域内に現れている事が求められ、逆に小さいほど理論値以外のピークの存在を許容します。
理論スペクトルと実測スペクトルについては、Distiller 上でペプチドを選択した際に次頁のような図が表示されますのでそちらをご参照ください。さらに、右クリック→ ”SPP/DPP Quantitation info”のオン／オフ により理論値の表示形式が変わります。

次頁図例では、赤線が実際のスペクトルデータ、黒線が計算された理論クラスターピークです。
Fraction の数値が低いほど、黒線と重なっている箇所以外の赤線のスペクトルが描く面積が増える事がわかります。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
Fraction の数値 0.99 の例

Fraction の数値 0.50 の例

Fraction の数値 0.26 の例

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
Correlation coefficient（相関係数)
実験データのピークと理論データのピークを重ね合わせた際の相関係数です。1 に近いほど一致度が高い必要があり、逆に 0 に近くなると一致度が低くても許容します。
Correlation 0.999 (Fraction 0.991)の例

Correlation 0.9８４ (Fraction 0.461)の例

Correlation ０.778 (Fraction 0.500)の例、定量計算には使われていない

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル[TIC Window]
Matches でペプチドを選択した際表示される TIC Window で、各データに対する XICs も併せて表示されています（下図）。各 raw データに対して、桃色の領域が XICs 計算されている箇所を意味しま
す。横軸の保持時間データは alignment されています。

各 raw データに対して XICs 計算対象となった領域を見比べる事ができます。デフォルトで表示される状態は保持時間全体が表示対象となっているため詳細が確認できませんが、領域をドラッグ＆ドロップ操作で拡大して表示させることもできます（下図）。

表示内容は以下の通りです。

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赤い■

Precursor Scan

青い×

MS/MS Scan

桃色の領域

XICs を計算している範囲

紫の領域

同定ペプチドの MS/MS スペクトルが検出された領域

MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
Quantitation table の 各 項 目 は 並 び 替 え て 表 示 さ せ る こ と が で き ま す 。 ま た ratio やnormalization, peptide ratio から protein ratio を計算させる方法などについては、menu のTools -> Format Options -> Quantitation Options にある各項目を変更する事で調整可能です。設定値を変更しながら、結果がどうなるのかを確認していくことができます。
また、TIC ウィンドウと Scan ウィンドウはどちらも表示に広い領域が必要で、場合によってはデフォ
ル ト 表 示 に 適 さ な い こ と が あ り ま す 。 特 に 両 ウ ィ ン ド ウ を 同 時 に 見 た い 場 合 、 Windows ->Tile Vertically を選択する事で両ウィンドウが横並びになり見やすくなることがありますのでお試し
ください。

TIC

ウ ィ ン ド ウ

(XICs 情報含む)

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Scan ウィンドウ

MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル[結果でチェックしていく内容について]「手順 2.定量解析を行うデータについて」でご紹介しているように、解析対象のデータはタンパク質の量比は human の protein ですべて 1:1 に、Ecoli の protein で 1:5, 1:2, 1:1.5 になる事が期待されたデータです。
まずは Distiller にて表示設定をした 3 種類の ratio が、human 並びに Ecoli で上記のような期待される値にどれくらい近いのかご確認ください。データは各種項目で並び替えが可能です。
Distiller 上でいくつかの解析とグラフ表示が可能です。詳細は手順 10 に示す report 機能についてご覧ください。PCA でのサンプル分散状況の確認をしたり、クラスター解析、volcano plot などでの変動タンパク質に関する解析を行ったりすることが可能です。
ただし Distiller 上で行う事ができる操作・検証は限られています。必要に応じて、手順 10 の export
機能、あるいは report 機能の一部でデータを出力して外部のプログラムで読み込ませたうえで、期待値からのずれている度合いを表す数値をご自身で計算して頂く事も推奨いたします。
また本解析は同じサンプルについて replicate の 3 回繰り返しという構成です。その構成の特性を活かして MASCOT 側が提供している方法以外の protein ratio 計算方法を適用したい、繰り返し内容を活用した検定を行いたい、などの希望もあるかと思います。Distiller で表示される定量結果はratio ですが、report 機能にある出力項目「table-peptides-int」で各ペプチドの intensity を出力させることもできます。ご希望の方はその出力内容を使ってそれ以降の計算を実行してください。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル

10. 定量計算実行 5・計算後の report、export
Distiller の標準機能では raw データを取り込み、定量データの算出に関する計算個所の確認や簡単な結果出力までを行う事ができます。
より複雑な解析を行う場合、Distiller にはプログラム言語 Python と連動する機能があり、各種
統計解析やグラフ表示をさせる事ができます。これらを report 機能と呼んでいます。
またデータを XML やテキストファイル、クリップボードに出力させることもできます。これを export 機能と呼んでいます。
手順 10 では report 機能と export 機能についてご紹介します。

結果の report : 各種グラフ表示・結果画面を別形態で出力・表示
ＭＡＳＣＯＴ Distiller では算出された定量値からさらにレポートを作成する機能を有しています。
ｖer.2.8 以降の Distiller ではプログラム言語 Python との連携によってレポート機能を実現しています。レポート機能は、レポートする内容を定義している Python プログラムと、プログラムに与えるデータの入力に使用する XML ファイルから構成されています。report 関連のファイルは、Distiller
インストールフォルダの”reports”フォルダ内に格納されています。またデータの定義方法については、
distiller_report_definition_1.xsd (Distiller インストールフォルダの”schema”フォルダにあります)に記述されています。
定義した内容は menu の Analysis -> Reports に一覧表示されます。Distiller ではあらかじめ作成済の reports 機能がいくつかあり、最初からこれらの機能を使用する事ができます（次頁図）。また
内容について python プログラムや XML ファイルを書き換えて調整する事も可能です。
さらに、必要に応じてユーザーが report 機能を追加したり、カスタマイズしたりする事が可能です[次頁に続きます]46

MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル[統計解析・グラフ表示]
-

ANOVA

-

ANOVA plus clustering-

Hierarchical clustering-

K-mean clustering

-

PCA

-

Volcano plot

[定量数値を HTML や CSV ファイルとして出力]-

Peptides-Proteins-

Quality-table-matches-

table-peptides-

table-peptides-int-

table-proteins＊ 特に、table-peptides-int は、ご自身でペプチドの intensity 情報から protein の定量情報を算出する事を希望される際よく使われるフォーマットです。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル

結果の export : テキストデータ出力
解析した数値を出力して利用する場合、前述の report で出力させる方法の他にさらにあと２種類の方法でファイル出力をさせる事ができます。
A. “Export quantitation results” と、 B. “Ｃｏｐｙ quantitation table”です。

A. “Export quantitation results”
Menu の analysis -> Export quantitation results にて、３種類の形式でファイルを出力する事ができます。
“Save Abbreviated/Complete XML は、定量データをＸＭＬ形式でまとめている出力ファイルで、
主に他アプリケーションと XML 形式でのデータやり取りをする際に利用します。
実例として、Scaffold Q+S とのデータやり取りなどが挙げられます。
一方、”Save Stats Package export”では、query(matches)、peptide, protein, proteingroup レベルでの定量値をタブ区切りファイルで出力し、それらを圧縮したファイルが得られます。タブ
区切りファイルを読み込めるソフトウェアにご利用ください。

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MASCOT Distiller Replicate ラベルフリー定量解析チュートリアル
B. Copy Quantitation table
手っ取り早く Distiller の Quantitation table 情報を他のアプリケーションで利用するために、
クリップボードに Quantitation table 情報をコピーさせることができます。
Menu の Edit -> Copy Quantitation table を選択する事で、クリップボードにデータがコピーされます。

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お問い合わせ先
マトリックスサイエンス株式会社
support-jp@matrixscience.com
03-5807-7895〒110-0015 東京都台東区東上野 1-6-10 ART ビル 1 階49