日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）155，150〜154（2020）©日本薬理学会

特 集 先端的バイオ医薬品を目指した薬理学研究の新たな展開

先端的がん特異的抗体創製基盤技術開発とその臨床応用加藤 幸成 1,2
がん細胞に対する抗体医薬開発を行う場合，がん細胞に特異的な抗体でなければ正常組織への毒性が常に懸念される．過去の抗体医薬開発の戦略を振り返ると，オミックス解析を用いてがん／正常比が高い抗原を狙うことが多く，がん細胞に高発現の膜タンパク質であったとしても，正常組織にも高発現している場合は標的候補分子から外されてきた．がん／正常比が高く，かつ正常組織の発現レベルが低い新規標的分子は現在枯渇しており，新たな抗体医薬を開発するのが困難な状況が続いている．そこで製薬会社を中心として，すでに抗体医薬が存在する標的分子に対し，抗腫瘍効果のさらに高い抗体医薬開発や，抗体薬物複合体（ADC），キメラ型抗原受容体発現 T 細胞（CAR-T）療法，二重特異的抗体を用いた T 細胞誘導療法など，種々のモダリティへの応用研究が活発化している．この現状を打開するためには，標的分子ががん細胞と正常細胞に同等に発現していたとしても，がん細胞の標的分子のみに特異的に反応するモノクローナル抗体を樹立する技術が必要である．我々はこれまで，がん特異的糖鎖を発現する細胞株や独自開発のアフィニティータグシステムを駆使することにより，がん特異的抗原を大量に作製するプラットフォームを開発した．フローサイトメトリーや免疫組織染色のスクリーニング法を最適化することにより，がん特異的抗体の樹立法（CasMab 法）を確立した．また，免疫やスクリーニングに細胞株のみを使った細胞基盤免疫選択法（CBIS 法）を開発し，精製が困難なタンパク質に対する抗体を迅速に作製できるようになってきた．がん特異的抗体の開発は，がん患者に対する副作用を限りなく低減させるだけでなく，抗体医薬を開発する企業にとってもリスクが少なく，今後のバイオ医薬品の開発にとって重要な課題である．本稿
では，がん特異的抗体開発の戦略を，いくつかの実施例を使って紹介する．
キーワード：モノクローナル抗体，がん特異的抗体，CasMab1.

体で産生されるような IgG だけでなく，抗体工学技術の発はじめにタンパク質・糖鎖・脂質を，高感度かつ特異的に検出できる実験手法を考えると，必ず抗体が必要となる．抗体（IgG）は分子量が約 15 万の大きなタンパク質であるが，感度・特異度の両方において，抗体を上回るものはない ．抗1）体に種々の酵素や蛍光色素を付加することで，flow cytometry（FCM），Western blot（WB），immunohistochemistry（IHC）

展により様々な小分子化抗体（scFv や nanobody など）が開 発 さ れ て い る 3）．さ ら に，抗 体 薬 物 複 合 体（antibodydrug conjugate：ADC），二重特異性抗体（bispecific T-cellengager：BiTE），キメラ型抗原受容体発現 T 細胞（CAR-T）
療法などの新しいモダリティが開発され，国内外の製薬企業を中心に，抗体の治療への応用が活発化している．

がん特異的抗体の開発の歴史と課題などの様々な実験系に使われる．モノクローナル抗体は単2.

免疫疾患やがんなどのあらゆる病気の診断や治療に活用さに抗体を改変しても，あるいは，どんなに強力な抗がん剤糖鎖に対する抗体が使用されている 2）．2017 年度の統計な抗体でなければ常に正常組織への毒性が懸念され，臨床一のエピトープを持ち，実験的ツールとしてだけでなく，れている．古くから腫瘍マーカーと呼ばれているものは，によると，年間 1000 億円以上を売り上げる医薬品（ブロックバスター）として，46 品目の生物学的製剤があり，そのうち抗体医薬品は 23 品目となっている．最近は，生がん細胞を標的として抗体医薬を開発する場合，どんな付加や免疫細胞誘導を行ったとしても，がん細胞に特異的応用は困難である．特に，抗体医薬などのバイオ医薬に対し製薬会社が投資する開発費は膨大であり，臨床試験で患者への有害事象が起こる可能性が少しでもあれば，製薬会

東北大学 未来科学技術共同研究センター，2 東北大学大学院 医学系研究科 抗体創薬研究分野（〒980-8575 宮城県仙台市青葉区星陵町 2-1）
E-mail: yukinarikato@med.tohoku.ac.jp 原稿受領日：2020 年 1 月 9 日，依頼原稿
1

先端的がん特異的抗体開発

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社が開発に乗り出すことはできない．しかし，がん細胞の8F11 のエピトープ解析や詳細な変異実験を実施し，PDPN の的分子は枯渇したと言われている．過去の抗体医薬開発のを発見した．PDPN には PLAG domain の類似配列が存在す

みに高発現している分子は限られており，理想的な新規標戦略を振り返ると，DNA マイクロアレイやプロテオミック

ス解析により，がん／正常比が高い抗原を狙うことが多く，がん細胞に高発現の膜タンパク質であったとしても，正常組織にも高発現している場合は標的候補分子から外されてきた．次に注目され始めたのが，糖鎖を対象としたグライコミクスや糖ペプチドを対象としたグライコプロテオミク

スである ．CA19-9 などの腫瘍マーカーは，糖鎖に対す2）る抗体が使われており，様々ながんの診断に役立っている．
同様に抗体医薬の標的としても糖鎖や糖ペプチドが候補にあがってきているが，糖鎖に対する抗体は，一般的にがんN 末端に EDxxVTPG の 3 回繰り返し配列（PLAG domain）ることもわかり，それを PLAG-like domain（PLD）と名付けた．PLAG domain や PLD 中のスレオニンが PDPN による血小板凝集の活性中心であり，種を超えて保存されていることがわかった 8）．PDPN はその分子量の約半分が O 型糖鎖であり，血小板凝集活性には糖鎖が重要であることが示唆されていた．我々は，糖鎖合成不全の変異 CHO 細胞株を用いることにより，PLAG domain のスレオニンに付加されている O 型糖鎖のシアル酸が血小板凝集の活性中心であることを解明した 9）．質量分析計を用いて PDPN の糖鎖構造を解析した結果，PDPN には 4 つの単糖からなる糖鎖細胞に対する特異性が乏しい．そこで，ある膜タンパク質（disialyl-core1）が付加されていた．このように，一つの分量分析計やレクチンマイクロアレイなどによって検出しよ費やしたが，この disialyl-core1 は比較的どこにでも存在すについて，がん細胞と正常細胞の糖鎖構造付加の差を，質うとする研究が様々な国家プロジェクトで実施されてきた．
しかし，膜タンパク質への糖鎖付加は不均一性があることが原因となり，がん特異的糖鎖構造が膜タンパク質に付加子の一ヵ所の糖鎖を決めるために，かなりの時間と労力をる糖鎖であり，がんの血小板凝集能に特徴的ではなかった
ため，この糖鎖を狙った医薬品開発は困難であった．

上述した通り，血小板凝集に重要な糖鎖（disialyl-core1）

されているという明確な結論はほとんど出ていない．O 型はあらゆるタンパク質に付加されているため，この糖鎖をれることがわかっているが，ムチン型タンパク質の複数のこで，がん細胞に高発現した PDPN による血小板凝集を特糖鎖の場合は，セリンあるいはスレオニンに糖鎖が付加さセリンやスレオニンのどこにどの程度，がん特異的な糖鎖が付加されているかを決定することは，今でも非常に難しい作業である．仮にがん特異的糖鎖構造やその付加位置が決定されたとしても，免疫原として糖ペプチドの合成を高純度に大量に行うことは，通常のアカデミアの研究室では不可能であり，ペプチド合成のように受託企業で合成をしてもらうことも予算的に困難である．以上のことから，がん細胞と正常細胞から精製した各膜タンパク質に付加した糖鎖などの翻訳後修飾の違いを発見し，その違いに対して狙った中和抗体は，特異的な転移阻害薬にはならない．そ異的に抑制する抗体を作製することで PDPN によるがん転移を抑制でき，さらには抗腫瘍効果も高い抗体を樹立するという治療戦略を考案した．筆者らは 2006 年に，ヒト
PDPN の PLAG domain に対し感度・特異度・親和性の高いモノクローナル抗体（NZ-1）を開発し，PDPN による血小板凝集やがん転移を有意に抑制できることを証明した 10）．
カニクイザルを用いた安全性試験によって，NZ-1 のヒト化抗体には毒性が全くないことも確認した．

これまでの多くの研究において，PDPN はリンパ管内皮がん細胞に特異的な抗体を作製するストラテジーは理解し細胞，Ⅰ型肺胞上皮細胞，腎ポドサイト，皮膚基底層など，難である．

また，PDPN による血小板凝集は，リンパ管の発生などの正やすいが，上述の通り，実際の作業として実施するのは困

3.

ポドプラニンの発見と高機能抗体の開発

過去の多くの研究において，がん細胞による血小板凝集と血行性転移に相関があることは報告された．がん細胞による血小板凝集を阻害することによりがんの転移を抑制しようという治療戦略も世界中で考案されてきたが，臨床応用はされていない．gp44 という血小板凝集因子は，マウス大腸がん細胞に高発現しており，がんの転移と相関がある分子として注目された 4）．gp44 はムチン型タンパク質であり，多くの O 型糖鎖が付加され血小板凝集に重要な役割を果たしていることがわかった 5）．gp44 に対する特異的抗体（8F11）が作製され，過剰発現した gp44 によって引き起こされるがん転移が 8F11 によって有意に抑制された ．2003 年になり，我々は gp44 の遺伝子がポドプラニ6）ン（podoplanin/PDPN）であることを発見した 7）．PDPN はC 末端に膜貫通部位を有したⅠ型膜貫通タンパク質であり，リンパ管マーカーとして病理診断に活用されている．また，複数の正常細胞に高発現していることがわかっている 11）．
常の機能にも重要であることが報告され 12），PLAG domain

や PLD を狙うことも，がん特異性がないことがわかってきた．既述の通り，NZ-1 のように正常細胞に反応し，少しでも副作用が懸念されるモノクローナル抗体は，製薬企業は開発しようとしない．これはすべての標的分子についても該当することであり，医薬品開発を目標とした場合には，分子の機能解析や構造解析をもとにしたモノクローナル抗体の開発には限界があった．一方，NZ-1 抗体の開発をきっかけとして，PDPN の機能解明や糖鎖構造解析が飛躍的に進んだことは特筆すべきことであり，基礎研究においてモノクローナル抗体を樹立することの重要性に変わりはない．

我々は，NZ-1 抗体を他の分子の高精度精製にも応用するため，NZ-1 の認識ペプチドをペプチドタグとし，PDPN/Aggrus（PA）タグというペプチドタグシステムを確立した（Aggrusとは，血小板をアグらせる（aggregate させる）ということ
13）から命名した造語）．PA タグシステムを用いて，これまで多くのタンパク質の高難度精製に成功している 14）．

加藤 幸成152

図14.

従来の抗体作製法と CasMab 法の比較がん特異的抗体作製法（CasMab 法）の開発

がん細胞と正常細胞に発現している PDPN のアミノ酸配列は全く同じであるため，がん特異的抗体を樹立するためには，糖鎖付加などの翻訳語修飾を狙う必要がある．既述の通り，質量分析計などの最新機器を駆使しても，PDPNの糖鎖についてがんと正常の差を発見することができなかったため，逆の戦略を立てることにした．すなわち，がん型 PDPN が存在するという仮説を立て，まず抗体を先に作ってから，がん特異的糖鎖付加を証明しようと考えた．

LN229 という脳腫瘍細胞株に PDPN を発現すると，正常細胞の PDPN には付加されない糖鎖が付加されていることがわかったが，どこにどれだけ付加されているかは証明できなかった．そこで，PDPN の高発現株である LN229/hPDPNをマウスに複数回免疫し，FCM や IHC により，がん特異的抗体をスクリーニングした．このように，免疫原の作製に，がん細胞株を使用する方法を，cancer-specific mAb（CasMab）法と命名した（図 1）．この方法論により，PDPN に対するがん特異的抗体（LpMab-2）の樹立に成功した．がん特異トープが，PDPN のがん型糖ペプチドとなる．常法に従い，PDPN の deletion mutant や point mutant を複数作製しエピトープ解析を行なった結果，LpMab-2 は Thr55/Ser56 を含む糖ペプチドを認識することがわかった 15）．すなわち，Thr55/Ser56 に付加する O 型糖鎖が，PDPN のがん特異的糖鎖であることが示された．その後，PDPN の Thr55/Ser56をエピトープに含む別のがん特異的抗体（LpMab-23）を樹立し，CasMab 法に再現性があることを示した 16）．また，
Thr55/Ser56 以外にも，Thr52 や Thr85 にがん特異的糖鎖が付加しており，それぞれのがん特異的抗体の開発に成功している．このように，ひとつの分子にも複数のがん型糖鎖が付加していることから，CasMab 法により網羅的にがん特異的抗体を作製することの意義を示すことができた．
がん細胞への糖鎖付加には不均一性があり，糖鎖や糖ペプチドを標的としても十分な効果が得られないのではないかという意見も聞かれるが，PDPN の複数のがん特異的糖鎖を標的として抗体医薬開発を行うことにより，糖鎖付加の不均一性の問題を解決できると考えている．

15）

細胞基盤免疫選択法（CBIS 法）の開発

的抗体は，糖鎖をエピトープに含むことがわかった．ヒト

5.

クイザルを用いた毒性試験も行った結果，全く毒性がないが，必ずしも容易にタンパク質が精製できるわけではない．

は，免疫原として LN229/hPDPN を用いており，精製したGPCR の場合には，我々が開発した PA タグや MAP タグ 17）

キメラ型抗体による抗腫瘍効果が高いことを証明し，カニことが判明し，ついに製薬企業への導出に成功した．今回
タンパク質を免疫原として用いていないことも，がん特異的抗体樹立に成功した理由だと考えている．

最初に掲げたストラテジーの通り，樹立した LpMab-2の エ ピ ト ー プ 解 析 を 行 っ た．LpMab-2 が 認 識 す る エ ピ

通常の抗体作製には，精製したタンパク質が必要である

上述の通り，精製の難易度の高い膜タンパク質，例えばを使用することにより解決する場合もあるが，それでも精製が困難なタンパク質は多く存在する．そこで我々は，免疫原として強制発現株を使用し，ハイスループットスクリーニングにも細胞株のみを使用するという細胞基盤免疫先端的がん特異的抗体開発

図2153

CBIS 法の流れ

選 択 法（cell-based immunization and screening：CBIS 法）ことが重要である．こうして作製したがん特異的抗体は，CHO-K1 や HEK-293T などのタンパク質発現用の細胞や，QOL を重視した真の先端的抗体医薬へつながると我々はの開発を行った（図 2）．強制発現株に使用する細胞株は，各種がん細胞を用いる．またハイスループットスクリーニ
ングには，5〜10 枚の 96 well plate を半日で処理する必要があるため，高速フローサイトメーターが必要となる．
我々はラボ内に 4 台の高速フローサイトメーター（Sony製）を完備し，これを実現した．この CBIS 法により，どのような複雑な構造を持つタンパク質に対しても，迅速に高効率に抗体を樹立することが可能となった．具体例として，5 回膜貫通タンパク質の CD13318）に対し，FCM，WB，IHC に有用な抗体を短期間に樹立することができた．このCBIS 法と CasMab 法を組み合わせることにより，効率よくがん特異的抗体が樹立できることもわかってきており，さらに複数の新規標的に対するがん特異的抗体を樹立していく予定である．

6.

おわりにPDPN に対するがん特異的抗体の作製をきっかけとして，我々は複数のプロジェクトにおいてがん特異的抗体の作製に取り組んでいる．既述の通り，低分子化抗体や二重特異性抗体などの新しいタイプの抗体が国内外の研究機関や製薬企業で開発され，さらに ADC や CAR-T のようなモダリティとの組み合わせも多数存在する．しかし，がん細胞を狙う際に忘れてはいけないのが，がんに対する特異性である．これまで紹介してきたように，がん特異的抗体の作製には新規の技術は必要なく，古典的な技術を工夫していく

様々な新規モダリティと結びつくことにより，がん患者の考えている．

著者の利益相反：加藤 幸成（小野薬品工業株式会社，ゼノアックリソース株式会社，日本全薬工業株式会社，扶桑薬品工業株式会社）．

文

献1）谷口 克. 実験医学増刊. 1998;6:1-174.
2）植田幸嗣. 実験医学. 2017;35:1-141.
3）津本浩平. 実験医学. 2018;36:1818-1874.
4）Watanabe M, et al. Cancer Res. 1988;48:6411-6416.
5）Toyoshima M, et al. Cancer Res. 1995;55:767-773.
6）Sugimoto Y, et al. Cancer Res. 1991;51:921-925.
7）Kato Y, et al. J Biol Chem. 2003;278:51599-51605.
8）Kaneko MK, et al. Gene. 2006;378:52-57.
9）Kaneko MK, et al. FEBS Lett. 2007;581:331-336.
10）Kato Y, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2006;349:1301-1307.
11）Breiteneder-Geleff S, et al. Am J Pathol. 1999;154:385-394.
12）Bertozzi CC, et al. Blood. 2010;116:661-670.
13）Fujii Y, et al. Protein Expr Purif. 2014;95:240-247.
14）Inoue M, et al. Cell Rep. 2019;27:1221-1230 e1223.
15）Kato Y, et al. Sci Rep. 2014;4:5924.
16）Yamada S, et al. Monoclon Antib Immunodiagn Immunother.
2017;36:72-76.
17）Fujii Y, et al. Monoclon Antib Immunodiagn Immunother.
2016;35:293-299.
18）Itai S, et al. Monoclon Antib Immunodiagn Immunother.
2017;36:231-235.

加藤 幸成154

Development of cancer-specific monoclonal antibodies against glycoproteins
Yukinari Kato1,212

New Industry Creation Hatchery Center, Tohoku University
Department of Antibody Drug Development, Tohoku University Graduate School of Medicine

Abstract. Many strategies have been tried to produce monoclonal antibodies (mAbs); however, there have been
several problems about focusing on molecular targets and screening methods. For instance, the high tumor/normal
ratio of antigen expression using DNA microarray has been thought to be important when we determine themolecular targets for antibody-drug. Although many antigens are expressed highly in tumors, those antigens havebeen removed from the candidates of antibody-drug targets because they were also expressed in normal tissues. We
recently established a novel technology to produce a cancer-specific monoclonal antibody (CasMab). The posttranslational difference such as glycans can be utilized to produce the CasMab, although the protein possesses thesame amino acid sequence in both cancer and normal cells. We have already produced CasMabs against several
glycoproteins such as podoplanin, which is expressed in both cancer and normal cells. Those CasMabs possess
antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC) in vitro and antitumor effect in xenograft models in vivo. In conclusion, the CasMab technology is the platform to develop cancerspecific mAbs, which could attack only cancer cells without side effects.