ニュースリリース
令和４年７⽉１⽇
国⽴⼤学法⼈千葉⼤学

ES 細胞よりもヒトの受精卵に近い段階の初期胚様細胞を効率よく作製―ヒトの初期発⽣のメカニズムのさらなる理解へ前進―

千葉⼤学国際⾼等研究基幹・⼤学院医学研究院の吉原正仁 准教授、カロリンスカ研究所（スウェーデン）、ヘルシンキ⼤学（フィンランド）からなる共同研究グループは、ヒト ES 細胞注１）よりもさらに受精卵に近い段階の細胞モデルの作製に取り組みました。その結果、ヒト ES 細胞に DUX4 という遺伝⼦を⼀時的に発現させることで、8 細胞期胚に似た細胞集団を誘導し、さらに、SLC34A2 (NaPi2b)注２）という細胞表⾯蛋⽩に対する抗体を⽤いて、これらの細胞を効率良く回収することに成功しました。
これらの細胞は誘導割球様 (induced blastomere-like: iBM) 細胞と名付けられました。iBM 細胞は、新たに受精卵を作ることなく、胚性ゲノム活性化(embryonic genome activation: EGA)注３）の研究に役⽴つ細胞モデルとして⽤いることができるため、ヒトの初期発⽣の分⼦メカニズムの理解が加速することが期待されます（図１）。
本研究成果は、2022 年 6 ⽉ 30 ⽇（⽶国時間）に、学術誌「Stem Cell Reports」でオンライン公開されました。

図１︓ヒトの初期発⽣段階。ES 細胞は胚盤胞の内細胞塊から取り出し、培養することで作製される。

■研究の背景⽣命は１つの受精卵から始まり、細胞分裂に伴い、細胞ごとに適切な遺伝⼦が適切な段階で活性化されて細胞が分化し、様々な組織や臓器が形成されます。受精直後の最初の遺伝⼦発現である EGA は、あらゆる細胞に分化する能⼒の獲得・維持に⾮常に重要な段階です。EGA が適切に起こらないと、正常な発⽣が停⽌してしまうと考えられているため、EGA の詳細を明らかにすることで、不妊の原因究明や体外受精の成功率の向上に繋がることが期待されます。研究グループは以前、ヒト初期胚を⽤いて、⼀細胞レベルで網羅的に遺伝⼦の発現量を定量するシングルセルトランスクリプトーム解析により、数々のEGA 遺伝⼦を同定しました。これらの遺伝⼦は分化能の獲得・維持に関与することが⽰唆され、再⽣医療研究への応⽤も期待されていますが、その多くは詳細な機能が分かっていません。
ヒトでは受精後 2–3 ⽇で、4 細胞期から 8 細胞期にかけて EGA が起こりますが、 EGA は動物種によって起こる時期が異なるため、動物モデルをヒト EGA の研究に使⽤するのは困難でした。また、多能性-1-幹細胞である ES 細胞・iPS 細胞注４）は発⽣モデルとして広く⽤いられていますが、これらは受精後 5 ⽇⽬以降の発⽣段階に相当し、EGA の研究モデルには適していません。従って、EGA 遺伝⼦の機能を解明するには、ヒト初期胚そのものを使う必要があり、研究のために新たな受精卵を作り破壊することになるため、倫理的な問題を伴いました。
近年、研究グループは DUX4 という転写因⼦注５)が EGA 遺伝⼦の発現を促進することを報告しました。そこで、研究グループは、DUX4 を⽤いてヒト ES 細胞の EGA 遺伝⼦を活性化し、より受精卵に近い段階の細胞モデルを作製することを⽬指しました。
■研究の成果DUX4 は EGA に重要な役割を担う⼀⽅で、細胞毒性を持つことが知られています。顔⾯肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)注６)患者では、筋細胞に異所性に発現することで細胞死を引き起こします。実際、
DUX4 をヒト ES 細胞に⻑時間発現させると、数時間後には多くの細胞が死んでしまいました。これでは細胞モデルとして研究に使⽤することは出来ません。そこで、研究グループはヒト初期胚における DUX4の発現が⼀過性であることに着⽬し、15 分間のみ DUX4 を ES 細胞に発現させることで、多くの細胞が⽣存し、増殖することを確認しました。短時間の DUX4 発現では、DUX4 が活性化するべき EGA 遺伝⼦が⼗分に活性化されないことも懸念されましたが、⻑時間発現させた時と同等に活性化されていることが確認されました。
受精卵を含め、全ての細胞は同じ遺伝⼦情報を持っていますが、細胞種ごとに異なる遺伝⼦のセットが発現しています。特に初期発⽣段階では短期間で劇的に遺伝⼦の発現パターンが変化するため、発現パターンを調べることで、その細胞の発⽣段階を推測することができます。そこで、研究グループは、ヒト初期胚に発現している遺伝⼦を網羅的に解析したシングルセルトランスクリプトームのデータと、15分間のみ DUX4 を発現させた ES 細胞のシングルセルトランスクリプトームのデータを⽐較し、それらの類似性を確認しました。すると、DUX4 を発現させた ES 細胞の⼀部の細胞集団が、受精後 3 ⽇⽬の 8細胞期胚に特異的に発現する遺伝⼦を多く発現し、8 細胞期胚と類似した遺伝⼦発現パターンを⽰していました（図 2）。これはつまり、ES 細胞に特徴的な遺伝⼦の発現が減少し、8 細胞期胚に特徴的な遺伝⼦の発現が増加したことで、元の ES 細胞の性質が失われ、8 細胞期胚様の性質を獲得したと考えられます。研究グループは、これらの細胞を iBM 細胞と名付けました。iBM 細胞は DUX4 を強制発現させてから 12 時間後の細胞に多く認められました。

図 2︓ヒト着床前初期胚（受精後 3 ⽇〜7 ⽇）と、DUX4 を⼀過性に強制発現させたヒト ES細胞のシングルセルトランスクリプトームデー
タの統合解析。⼀つ⼀つの点は各細胞を⽰す。
受精後 3 ⽇の 8 細胞期胚と iBM 細胞が⾚点線で囲まれた部分に⼀塊となって存在しており、⾮常に近い発現パターンを⽰している。
Late 1 は iBM 細胞から派⽣したと考えられる細胞。

-2-

DUX4 を強制発現した ES 細胞の⼀部のみが 8 細胞期胚に類似していたため、細胞モデルとして使⽤するには、これらの細胞を⽣きたままの状態で、効率良く回収する必要があります。FACS 注７)は細胞表⾯に存在するタンパク質に対する抗体を⽤いて、様々な細胞から構成される集団から、特定の集団の細胞のみを⽣きたまま単離する技術です。研究グループは FACS による iBM 細胞の単離を⽬指し、DUX4を強制発現した ES 細胞の中で、iBM 細胞に特異的に発現する細胞表⾯蛋⽩として、SLC34A2 (NaPi2b)を同定しました。DUX4 強制発現後 12 時間で iBM 細胞が多く認められたことから、強制発現後 6 時間後の細胞を抗 NaPi2b 抗体を⽤いた FACS により分離し、さらに 6 時間培養しました。すると、NaPi2b陽性細胞は、NaPi2b 陰性細胞や FACS による分離前の細胞と⽐較し、8 細胞期胚に近い遺伝⼦発現パターンを⽰していました。このことから、 抗 NaPi2b 抗体を⽤いて、効率良く iBM 細胞を回収できることが分かりました（図３）。

図３︓本研究の概略図。ヒト ES 細胞に DUX4 を⼀過性に強制発現させた後、抗 SLC34A2 (NaPi2b)抗体を⽤いた FACS により細胞を分離し、8 細胞期胚様の iBM 細胞（NaPi2b 陽性細胞）を効率良く回収することが出来る。

■今後の展望これまで適切なモデルが存在しなかったため、ヒトの EGA 遺伝⼦の詳細な機能は⻑らく不明でしたが、本研究で作製された iBM 細胞にゲノム編集技術などを応⽤することで、これらの遺伝⼦の機能解明が可能となると考えられます。EGA は正常な胚発⽣が起こるための重要な鍵であり、EGA が適切に起こらないことで初期胚が死に⾄るとも考えられています。EGA 遺伝⼦の機能解明により、ヒトの正常な初期発⽣過程のメカニズムを理解することで、不妊の原因究明や体外受精の成功率の向上などの⽣殖医療の発展だけでなく、分化能の獲得・維持機構の解明により再⽣医療研究の発展にも繋がることが期待されます。
■研究プロジェクトについて
本研究は、⽇本学術振興会 海外特別研究員制度、公益財団法⼈ アステラス病態代謝研究会、公益財団
法⼈ ⽇本アイバンク協会、スカンジナビア・ニッポン ササカワ財団からの⽀援を受けて実施されました。
■⽤語解説
注１）ES 細胞︓胚性幹細胞（embryonic stem cell）の略。受精後 5-6 ⽇⽬の胚盤胞の内細胞塊から細胞を取り出し、それを培養することによって作製される。ほぼ無限に増殖させることができる。
注２）SLC34A2 (NaPi2b)︓IIb 型ナトリウム依存性リン運搬蛋⽩ (NaPi2b)をコードする遺伝⼦。
SLC34A2 は II 型肺胞上⽪細胞に特異的に発現するとされているが、8 細胞期胚にも⾼発現している。
注３）胚性ゲノム活性化 (EGA)︓ Zygotic genome activation (ZGA)とも呼ばれる。受精時は⺟性因-3-⼦に依存した遺伝⼦発現が⾒られるが、やがて⺟性因⼦は減少して胚⾃⾝からのゲノムの活性化へと切り替わる。これを EGA と呼ぶ。研究グループは以前、ヒト初期胚において 32 の遺伝⼦が 4 細胞期胚で、129 の遺伝⼦が 8 細胞期胚で活性化されることを報告した。
注４）iPS 細胞︓⼈⼯多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）の略。体細胞に初期化因⼦を導⼊することにより樹⽴される多能性幹細胞。ES 細胞に類似した性質を持つ。
注５）転写因⼦︓DNA 上の転写制御領域に結合することで、遺伝⼦の転写調節に関与するタンパク質。
京都⼤学の⼭中伸弥教授らにより発⾒された初期化因⼦も転写因⼦であり、ES 細胞に多く発現する転写因⼦から絞り込まれた。
注６）顔⾯肩甲上腕型筋ジストロフィー︓Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD)。顔⾯や肩、上腕などの筋⾁の変性を起こす遺伝性疾患。本来発現していない DUX4 が⾻格筋細胞で発現し、細胞傷害を起こすと考えられている。
注７）FACS︓Fluorescence-activated cell sorting の略。蛍光抗体で染⾊した細胞が発する蛍光を測定することで、特定の細胞を⽣きたままの状態で単離することができる。
■論⽂情報
タイトル︓Transient DUX4 expression in human embryonic stem cells induces blastomere-like
expression program that is marked by SLC34A2
著者︓Masahito Yoshihara*,#, Ida Kirjanov*, Sonja Nykänen, Joonas Sokka, Jere Weltner, KarolinaLundin, Lisa Gawriyski, Eeva-Mari Jouhilahti, Markku Varjosalo, Mari H. Tervaniemi, TimoOtonkoski, Ras Trokovic, Shintaro Katayama, Sanna Vuoristo#, Juha Kere#(*共同筆頭著者、#共同責任著者)
雑誌名︓Stem Cell Reports
DOI︓https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2022.06.002＜本研究に関するお問い合わせ＞千葉⼤学国際⾼等研究基幹
千葉⼤学⼤学院医学研究院⼈⼯知能（AI）医学 准教授
吉原正仁

TEL: 043-226-2977 メール︓masahito.yoshihara@chiba-u.jp＜広報に関するお問い合わせ＞千葉⼤学亥⿐地区事務部総務課企画係
TEL: 043-226-2841 メール︓inohana-koho＠chiba-u.jpac.jp-4-