中央味噌研究所研究報告ᆅ ሱ Ӓ ਽ ‫֖ ڨ‬
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─ 43 ─

No.39（2018）中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

研 究 報 告胃がんリスクファクターである活性酸素種とピロリ菌に対する味噌抽出成分の効果

荒木智之 1，瀬尾誠2

Effects of Miso extraction components on reactive oxygen species and H. pylori ,a strategic risk factor for gastric cancer

Tomoyuki ARAKI 1, Makoto SEO 2
1

Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Saitama Medical University,
38 Morohongo, Moroyama, Iruma-gun, Saitama, 350-0495, Japan.
2

Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Fukuyama University,
1 Sanzo, Gakuen-cho, Fukuyama, Hiroshima, 729-0292, Japan.

ロリ菌による様々な胃癌誘発機構が明らかになってき【緒言】ており，胃癌の予防にはピロリ菌の除染が極めて重要

申請者は平成27年度の本研究グラントによる助成にであるとされている2),3),4)。今年度の研究助成においてよって，味噌成分が胃癌のリスクファクターである活は，味噌成分がもつピロリ菌に対する感染予防効果

性酸素種を減少させるかについて研究を進めた。同時（除染効果），増殖抑制効果，遺伝子タンパク質作用に味噌成分が持つ胃癌細胞の増殖抑制効果についてのについて検証することによって，味噌がもつ胃癌の発検証を行った。その結果，ある種の味噌抽出液が胃癌症抑制効果について研究を行ったのでその結果を報告

細胞の増殖を抑制し，細胞死に向かわせることを示唆する。

するデータを得た。平成28年度の研究では，ピロリ菌と味噌との関係を明らかにすることにより，味噌による胃癌抑制効果について検証をおこなうことを目的と【材料と方法】

した。

１）味噌試料
これまでの癌に係る知見では，癌の発生に繋がる原実験動物に投与する味噌汁は，中央味噌研究所より

因は活性酸素種による DNA 障害であるとされている

供与いただいた，米みそ９種，豆みそ１種，麦みそ２

が，特に日本人においては胃癌の重要なリスクファク

種を各々 10 g 秤量し，90 ℃の蒸留水 100 ml で溶いたターとして，ピロリ菌（ヘリコバクター・ピロリ）にものを味噌試料液とした。微生物検定の実験では，味よる胃壁の障害（胃潰瘍）とそれに伴う胃上皮細胞

噌 10 g を下記ピロリ菌増殖培地 100 ml に懸濁し 0.45の再生の過程でおこる DNA の複製エラーが挙げられ

μm のフィルターで濾過したものを用いた。味噌の濃ている。また，ピロリ菌から胃上皮細胞内に打ち込ま

度は先行研究5)に従った。味噌試料は少量づつ小分けれる CagA タンパク質が胃細胞の増殖を引き起こすこし，-30 ℃で保存した。

1)とが明らかとなっている 。また，それら以外にもピ
埼玉医科大学医学部生化学〒 350-0495

埼玉県入間郡毛呂山町毛呂本郷 38

TEL/FAX: (049) 276-1155
E-mail: arayuki@saitama-med.ac.jp

─ 44 ─

中央味噌研究所研究報告

２）ピロリ菌No.39（2018）【結果と考察】ピロリ菌は麻布大学獣医学部微生物学第一研究室の内山淳平先生から分与いただいた Helicobacter

１）食塩と味噌による増殖期のピロリ菌への影響

pylori strain 26695 を用いた。ピロリ菌の培養は，10

多目的コホート研究の結果より，高塩分食と胃癌と％馬血清（ハイクローン社製）と 10μg / ml バンコマの関係が示唆されている6)。味噌汁は通常で約１％程

イシン（ナカライテスク社製）を含むブルセラブロス

度の食塩を含む食品であり，このコホート研究の結果（ベクトン・ディッキンソン社製）培地（ピロリ菌増を勘案すると味噌は胃癌のリスクファクターとなる。

殖培地）上でおこなった。培養にはアネロパック（スこの可能性を検証するため，ピロリ菌増殖の食塩によ

ギヤマゲン社製）を用い，酸素濃度６～12 ％，二酸

る影響を解析した。対数増殖期にあるピロリ菌を０～化炭素濃度５～８％の微好気環境，37 ℃でおこなっ

２％の NaCl を含むピロリ菌増殖培地に O.D.600＝0.06

た。

になるように懸濁し，37 ℃，微好気環境下で振盪培
養をおこなった。図１Ａに示すとおり，５時間毎の３）実験動物測定では０～1.5％の間で増殖速度に大きな差は見ら

実験動物は４週齢のオスのスナネズミ（Meriones
unguiculatus ）を用いた。通常の飼育環境で３個体れなかった。また，２％の濃度では～ 25 時間の間でづつの集団飼育をおこない，味噌汁の投与は自由飲水

ろ，最終的な濁度は他の濃度のものと変わりなかっによりおこなった。

た。この結果より，通常の味噌汁の摂取によって期待増殖が強く抑制されたが，30 時間まで培養したとこ

される塩分濃度ではピロリ菌の増殖に影響がないこと
４）タンパク質の抽出とウエスタンブロッティングが示唆された。また，短時間の高濃度塩分の暴露はむ

対数増殖期にあるピロリ菌の培養液と味噌懸濁液

しろピロリ菌の増殖を抑制する（即ちがんに対し抑制を１：１で混合し，６時間経過後の培養液をタンパ的に働く）可能性が示唆された。

ク質抽出の材料とした。ピロリ菌はプロテアーゼイ

微生物は増殖期にある時と停止期にある時で細胞活

ンヒビターカクテル（シグマ社製）を含む NP40 リシ

動を大きく変化させることが一般的であるため，味噌スバッファー【150 mM NaCl，１％ NP40，50 mMによるピロリ菌への影響も増殖期と停止期とで個別にTris - HCl（pH8.0）】で溶解した。タンパク質濃度は検証する必要がある。そのため，まずは増殖期にあBCA reagent kit（サーモフィッシャーサイエンティ

るピロリ菌の味噌による影響を調べた。【材料と方法

フィック社製）で行った。抽出したタンパク質 50μg１】で記した味噌－ブルセラ培地混合液に O.D. 600＝

分を８％のポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS -0.1 相当のピロリ菌を懸濁し～ 12 時間，37 ℃，微好気

PAGE）によって分離し，PVDF 膜（ミリポア社製）

環境下で培養した後，一部をピロリ菌選択培地に塗布に転写した。転写膜は 0.3％のスキムミルクでブロッしコロニー数をカウントすることによりピロリ菌数をキング後，抗 CagA 抗体（オーストラルバイオロジカ

比較した。結果図１Ｂに示すとおり，増殖期にあるピルズ社製），HRP を付加したヤギ抗ラビット IgG 抗体

ロリ菌は味噌の存在下で最大 25 ％程度の細胞数の低で反応させた。シグナルの検出は Chemi - doc（バイオラッド社製）でおこなった。
５）スナネズミ胃中のピロリ菌数の測定

0.8

スナネズミをエーテルによって麻酔後，胃を切除

0.7

し，胃内容物の除去をおこなった。次に滅菌済みのPBS とともにダウンスホモジナイザーで胃組織を破0.6

砕し，試料液とした。この試料液を 10 倍～ 1000 倍に0.5希釈したものをピロリ菌選択培地（日水薬品社製）に0.4

塗布し，３日後にコロニー数をカウントすることによ

0%
0.50%
1%
1.50%
2.00%

0.3

っておこなった。

0.2
0.1
0

0

10

20

30

40

図１Ａ．ピロリ菌増殖の食塩による影響

─ 45 ─

（n = 3, mean ± SD）

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

下を引き起こした（培養 12 時間後の時点において）。

が殆どないか，あるいはいくつかの味噌においては幾

しかし，短時間（１時間未満）の暴露によっては影響

分増殖率が上昇した。
２）味噌が停止期のピロリ菌の生存率に与える影響
次に，細胞周期を停止している（停止期にある）ピロリ菌に対する味噌の影響を調べるため，培養後 20

120

時間後のピロリ菌培養液を味噌試料液に懸濁し，２時
間後のピロリ菌生存率をコロニーカウント法によって

食塩

100

80

抗生物質

測定した。結果２に示すとおり，対象区（水）に対米Ａ

し，１％ NaCl（食塩水）では～５％程度の生存率の米Ｂ減少を認めた。また，味噌試料液に浸したものでは，

米Ｃ

最大で 12 ％程度の減少を認めるものがあったが，そ米Ｄの一方で４％程度上昇するものがあった。全体として

米Ｅ

60

は対象区に対して低下傾向にはあるものの，大きな差

米Ｆは認められなかった。

米Ｇ
40

米Ｈ
米Ｉ

３）味噌がピロリ菌 CagA タンパク質の発現に与える

豆Ａ

20

影響

麦Ａ

上記の結果より，長時間の味噌試料液の暴露によ

麦Ｂ
0

0

2

4

6

8

10

りピロリ菌は生存率を低下させる傾向にあることが明らかとなった。しかし，他方で NaCl はピロリ菌の12

胃癌（細胞分裂）を誘導するタンパク質 CagA の発現

図１Ｂ．増殖期にあるピロリ菌に対する味噌試料液の影響を上昇させることが知られている（図３A7)）。図３Ａ

縦軸は対照区（ブルセラ培地に他のサンプルと同量の水を添加したもの）の細胞数を 100 とした時の相対値

度依存的に上昇する（NaCl １％では０％の約 20 倍程に示すとおり，CagA タンパク質の発現量は NaCl 濃

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

─

食塩

米Ａ

米Ｂ

米Ｃ

米Ｄ

米Ｅ

米Ｆ

米Ｇ

米Ｈ

米Ｉ

図２．停止期にあるピロリ菌に対する味噌試料液の影響
縦軸は対照区（水）との相対値

─ 46 ─

豆Ａ

麦Ａ

麦Ｂ

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）度）。この結果に関連して，味噌による CagA タンパ

スナネズミを各区３匹づつに継代済みピロリ菌を摂取

ク質の発現量の変化を測定したところ，１％ NaCl にし，感染が確認された後，自由飲水による味噌試料液

晒したピロリ菌の CagA 発現量に対して多くの味噌（味噌汁）の投与を２週間続けた。その後，胃中のピ品種で CagA 量の低下を認めた（＜15 ％）。これによ

ロリ菌数をカウントしたのが図４Ｂである。結果が示って，同量の塩分（ NaCl ）を摂取する場合においてすとおり，各味噌試料液の投与による有意なピロリ菌

も，味噌汁として摂取することによって CagA の発現数の変化は認められなかった。

をある程度抑える効果が期待されることが示唆された。
４）味噌汁によるピロリ菌感染数の変化
モデル生物として頻繁に使用されるげっ歯類はピロリ菌に対して耐性があり，多くのものはピロリ菌感染試験に用いるのに適当ではない。しかし，スナネズミ
はヒトと同じくピロリ菌に感受性があり，感染試験に用いられるモデル生物である。本実験において，ピロリ菌をスナネズミに適合させるため，スナネズミの胃中で２世代に渡り継代したものを感染実験に用いた。

スナネズミ胃内でピロリ菌を２回継代

Blot:anti-CagA

130KD

→

0

0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50

味噌汁を
自由飲水により投与し２週間後にピロリ菌数を測定

NaCl(%)

図３Ａ．NaCl 添加による CagA 発現量の変化

図４Ａ．ピロリ菌の定着と実験のスキーム（n = 3, mean ± SD）（n = 3, mean ± SD）

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

米Ａ

米Ｂ

米Ｃ

米Ｄ

米Ｅ

米Ｆ

米Ｇ

米Ｈ

米Ｉ

図３Ｂ．味噌添加による CagA 発現量の変化
縦軸はピロリ菌を１％ NaCl に晒した時の CagA 量の相対値

─ 47 ─

豆Ａ

麦Ａ

麦Ｂ

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）1.4【総括と今後の展望】

1.2

今回の研究結果より，ⅰ）多くの味噌抽出液の存在下で増殖期・停止期両方のピロリ菌が生存率を低下さ1せることが明らかとなり，また，ⅱ）同等の塩分を含む液体に浸した時に比べ，味噌試料液に浸した場合に0.8はピロリ菌の毒性タンパク質である CagA 量の発現が抑えられることが明らかとなった。しかし，ⅰ）に関

0.6

Ａ

Ｂ

Ｃ

Ｄ

Ｅ

Ｆ

Ｇ

Ｈ

Ｉ

米

Ａ
豆

Ａ

Ｂ

しては，この効果は長時間の味噌試料液の暴露によって観察されることであり，（食事のような）味噌汁の麦

短時間の暴露での効果は認められなかった。また，

0.4ⅱ）の効果に関しては，同等の塩分摂取と比較した場
合には CagA 量の低下が認められた。このことから，0.2

同等の塩分を摂取する場合には味噌汁として摂取することが胃癌の抑制につながる可能性が示唆される。今

0回，スナネズミを使った in vivo 試験では有意な差は

図４Ｂ．２週間後のピロリ菌数得られなかったが，長期間・幅広い味噌サンプルで試

縦軸は味噌試料液の代わりに水を飲水させた時のピロリ菌量との相対値

験することにより，より具体的な味噌とピロリ菌，更に胃癌との関係を明らかにできると考えている。

【引用文献】
１）Science 2002;295:683-686
２）Nature Med 2007;13:470-476
３）Cancer Res 2010;70:1430-1440
４）PNAS 2011;108:14944-14949
５）瀬尾誠，荒木智之，村越隆之，慢性拘束ストレスによる脳機能低下を改善する味噌中の生理活性ペプチドの探索，中央味噌研究所研究報告，第36号
６）Am J Clin Nutr 2010;91:456-464
７）Cancer Res 2007;67:4709-4715

─ 48 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

研 究 報 告味噌による DNA 損傷抑制効果

万里 1，坂井石田

千恵美 1，田代聡 2，粟井和夫 3，石田隆史 4

The effect of Miso on radiation-induced DNA damage

Mari ISHIDA 1, Chiemi SAKAI 1, Satoshi TASHIRO 2, Kazuo AWAI 3, Takafumi ISHIDA 4
1

Department of Cardiovascular Physiology and Medicine,2
3

Research Institute for Radiation Biology and Medicine,

Department of Diagnostic Radiology, Hiroshima University,
1-2-3 Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551, Japan.

4

Departmrnt of Cardiovascular Medicine, Fukushima Medical University,
1 Hikarigaoka, Fukushima, 960-1295, Japan.

【背景と目的】【方法】

2004年の Lancet 誌に，医療先進国 15 カ国の年間の（１）味噌の抽出

エックス線検査件数は，単位人口あたりで日本が世界

味噌は中央味噌研究所より供与された米味噌３種

一多く，日本ではがんの 3.2％が医療被曝，特に画像（米味噌，米味噌（白），米味噌（麹入り）），麦味噌

診断における放射線被曝に起因すると推測される，と２種，豆味噌１種を使用した。味噌の成分の抽出方法の報告がされた1)。しかし，その一方で放射線被曝のとして，少ない国よりも平均余命は長く，各種画像診断によっ緩衝液で溶解後トリクロロ酢酸を用いた蛋白沈殿を行て疾病が早期に発見されるなどメリットがデメリット

う方法

を上回っているとも考えられる。したがって放射線検順の煩雑さ，抽出液中の塩分濃度，浸透圧等を鑑み，査をむやみに控えるよりも，検査を行う際に受ける被メタノールを用いた抽出法を選定した。これまでの報

曝の影響を低減させる新たな方法を見つけることの方

告を参考に3)，各味噌 10ｇを 20 mL のメタノールに溶が，より重要な課題と言える。

解し，濾紙で濾過後，0.20μmセルロースアセテート①リン酸緩衝液で溶解し抽出②リン酸③メタノールを用いての抽出を試みたが，手フィルター（DISMIC® - 28CP，ADVANTEC，東洋

放射線の影響とは，細胞内でラジカルが生じること

濾紙）を通して滅菌した。

によって化学結合が切断されたり分子の酸化が生じ，DNA の切断が起こることである。したがって抗酸化（２）細胞作用をもつ成分が放射線の影響を減弱させる可能性が2)ある 。本研究の目的は，放射線被曝による障害を薬

培養細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を使品などではなく，抗酸化作用をもち古来十分に安全性用した。細胞は hEGF（組換えヒト上皮細胞成長因が認められている味噌という食品によって防御できる子），ヒドロコルチゾン，ウシ胎児血清，VEGF（血か否かを明らかにすることにある。

管内皮細胞成長因子），hFGF - B（組換えヒト繊維芽細胞成長因子，塩基性），へパリン，R3 - IGF - 1（イ

広島大学大学院医歯薬保健学研究科
TEL: (082) 257-5122

心臓血管生理医学〒 734-8551

FAX: (082) 257-5124

E-mail: mari@hiroshima-u.ac.jp

─ 49 ─

広島市南区霞 1-2-3

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

ヒストン H2AX

二本鎖切断

γH2AX focus 数＝全 focus 数 / 細胞数＝18 / 4＝4.5

Figure.1 γH2AX focus のできる機序とγH2AX focus 数の算出法
縦軸は対照区（水）との相対

No radiaon

200 mGy

100 mGy

4.07 ± 0.66 focus / 細胞

Figure.2

7.29 ± 0.99 focus / 細胞

放射線照射量とγH2AX focus 数

縦軸は対照区（水）との相対

─ 50 ─

中央味噌研究所研究報告

10

9

10

9

8

9

8

7

8

6

7

5

6

4

5

3

3

4

2
1

2

3

7
6
5
4

0 min

30 min24 hNo.39（2018）

2

1
0 min

30 min

24 h

1
0 min

味噌なし

味噌なし

米味噌１
（麹入り）

米味噌2
（白）

30 min

味噌なし

12

14

10

12

8

10

7

8

6

6

24 h
米味噌３

10
9
8

5
6

4

4

4

3

2

2

2

1

0
0 min

30 min

24 h

0
0 min

味噌なし

Figure.3

麦味噌１

30 min

味噌なし

24 h

0

麦味噌2

0 min

30 min

味噌なし

24 h
豆味噌

放射線照射後のγH2AX focus 数の変化および各味噌の効果（一例）

縦軸は対照区（水）との相対

ンシュリン様成長因子），アスコルビン酸，GA - 1000

ヒドにより固定し，γH2AX 抗体を用いた蛍光免疫染（ゲンタマイシン，アンホテリシン - B）を加えた内色を行った。Zeiss 社 Metapher を用いて画像を撮影

皮細胞基本培地-2（EBM® - 2）を用いて，37 ℃，５％し，細胞核内の DNA damage focus の数をカウント（v / v）CO2 の条件下で培養した。

した。細胞 100 個分の平均値を算出し，溶媒（メタノール）のみを添加したコントロールと比較した。

（３）DNA 損傷刺激HUVEC を 22 x 24 mm カバーガラスに播種し，接着後メタノール抽出した味噌を添加し 24 時間後に，【結果と考察】Ｘ線照射装置 CP - 160 を用いてＸ線を照射した。

（１）放射線照射量の決定
最近の医療被曝とくに CT は低線量放射線により（４）DNA 損傷の程度の評価
DNA 損傷とくに二本鎖切断が生じると傷周辺のヒ画像を得る技術が進歩している。その照射量によるストン H2AX は直ちにリン酸化される（Figure.1）。

ものと同等の DNA 損傷量を得るため，100 ｍGy，

これを利用し，DNA 損傷の程度はリン酸化 H2AX

200 mGy の放射線照射を行い，DNA 損傷の程度を（γH2AX）の抗体を用いた蛍光免疫染色により評価比較した。最近の低線量肺 CT によってできる DNA

した 4)。Ｘ線照射後 30 分（最大 DNA 損傷時），24 時損傷（γH2AX focus 数）は 3.30 ± 2.4 個 / 細胞，今間（DNA 修復後）に細胞を４％パラフォルムアルデ

回の実験のＸ線照射装置による照射 100 mGy で 4.07

─ 51 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）± 0.66 個 / 細胞，200 ｍGy で 7.29 ± 0.99 個 / 細胞

き起こされる。今後，この DNA 損傷の生成抑制や（Figure.2）であることから，本実験では 100 mGy を

DNA 損傷修復の促進にいたる分子メカニズムを明ら照射量として選択した。

かにしていきたい。また，培養細胞において味噌がDNA 損傷抑制効果を有することが明らかとなったの（２）味噌による DNA 損傷抑制効果

で，動物やヒトの生体内における放射線の影響が味噌

ヒト内皮細胞に放射線 100 mGy を照射すると，味によって抑制されるか否かを検討したい。

噌の有無にかかわらずγH2AX focus 数は 30 分後に増加し，24 時間後にほぼ前値に戻った（Figure.3）。各
味噌を投与した際のγH2AX focus 数の変化の一例を【謝辞】

Figure.3 に示す。
放射線照射前（０Gy），100 mGy 照射後30 分，

本研究の遂行にあたり，味噌サンプルのご提供なら

100 mGy 照射後 24 時間において，味噌を投与していびに平成 28 年度研究助成を頂きました一般社団法人ない細胞の DNA 損傷量を 100 とした場合のみそ投与

中央味噌研究所をはじめ各関係者の方々に深謝申し上

群の DNA 損傷の程度を Figure.4 に示す。

げます。また本研究の実施に協力してくださった，広島大学医学部医学科学生の平川稔明君に感謝致しま

放射線照射後 30 分においては米味噌（麹入り）のす。

みが DNA 損傷を有意に抑制していた。照射後 24 時間
では，麦味噌１と豆味噌において DNA 損傷が有意に抑制されていた。
以上より，麹入り米味噌は放射線照射直後の DNA【文献】

損傷の生成を抑制し，麦味噌１および豆味噌は生じた

１）Berrington de Gonzalez A and Darby S. Risk

DNA 損傷の修復を促進すると考えられた。
放射線照射は酸化ストレスを生じることによりof cancer from diagnostic X-rays: estimates for

DNA 損傷を引き起こすので，麹入り米味噌は抗酸化

the UK and 14 other countries. Lancet (London,

England) . 2004;363:345-51.

作用によって DNA 損傷の生成を抑制した可能性がある。DNA 損傷が生じると，ataxia - telangiectasia

２）Xiao R, Su Y, Simmen RC and Simmen FA.

mutated（ATM）などのキナーゼが活性化され，

Dietary soy protein inhibits DNA damage and

DNA 損傷修復にいたる DNA 損傷応答の活性化が引

cell survival of colon epithelial cells throughattenuated expression of fatty acid synthase.

American journal of physiology Gastrointestinal
and liver physiology . 2008;294:G868-76.
３）Teranaka T, Ezawa, M., Matsuyama, J.,

160

Ebine, H., and Kiyosawa, I. Inhibitory effects＊＜ 0.05140of extracts from rice-koji miso, barley-koji

120

miso, and soybean-koji miso on the activity

＊

100

＊

80

＊

of angiotensin I converting enzyme. Nippon

60

Nogeikagaku Kaishi (in Japanese) . 1995;69:1163-

40

1169.

20
0

４）Ishida M, Ishida T, Tashiro S, Uchida H, Sakai
０Gy

100 mGy 30 min

米味噌１（麹入り）

米味噌２（白）

米味噌３

麦味噌１

麦味噌２

豆味噌

Figure.4

C, Hironobe N, Miura K, Hashimoto Y, Arihiro

100 mGy 24 h

K, Chayama K, Kihara Y and Yoshizumi M.
Smoking cessation reverses DNA double-strand
breaks in human mononuclear cells. PloS one .
2014;9:e103993.

放射線照射後のγH2AX focus 数における味噌の効果

縦軸は対照区（水）との相対

─ 52 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

研 究 報 告味噌降圧機能性物質発現機構の解明と味噌製造への応用に関する研究

上原

誉志夫

Expression process of potent antihypertensive substance（s）in Miso andmanufacturing application to strengthen the benefits

Yoshio UEHARADivision of Clinical Nutrition, Faculty of Home Economics, Kyoritsu Women's University,
2-2-1 Hitotsubashi, Chiyoda-ku, Tokyo, 101-8437, Japan.

作用もあることをみいだしている。このように，動物はじめに実験からは味噌中に降圧物質の存在にすることが明ら

味噌には食塩感受性を抵抗性に変換する新規抗高血かであり，味噌摂取が高血圧発症に影響しないと結論

圧物質（降圧機能性物質）が存在することをみいだしされた。

てきた。味噌に含まれる降圧物質は複数存在するが，一方，ヒトでの血圧への影響については，５年間のこのうち分子量 3k ～ 5kDa 分画中にある降圧物質を横断的観察研究からは，一日１～３杯のみそ汁摂取は同定しその特性を明らかにするとともに，本分画中の正常血圧者及び正常高値血圧者の血圧に影響しないこ

降圧物質に注目し，HPLC 上で物理化学的に定量化すとを報告した5)。さらに，最近，ヒトでの二重盲検平る方策について検討した。また，全国各地で製造され

行比較介入試験を実施し，３ヶ月間の一日２杯の味噌る味噌中に存在する本降圧物質の含有量を定量測定す

汁摂取は，正常血圧者及びステージＩの高血圧症患者る可能性を検討した。さらに，製造工程と降圧物質発での血圧値に影響を与えないことを初めて報告した

現との関連性を検討した。

（図１）6)。
このように，味噌摂取による血圧への影響はないことが，動物実験に引き続きヒトでも明確に実証された。これらのことは，味噌中の降圧物質がヒトでも有１．味噌による高血圧抑制効果（表１）
長期味噌摂取が血圧に及ぼす影響については，これ効であることを強く示唆している。したがって，降圧までの動物実験での研究を通して，含有される食塩に物質の同定とそれを強化した味噌製造の重要性が示唆

よる昇圧反応性が減弱されること，それには味噌に含される。これらを背景に，複数あると考えられる味噌

まれる腎 Na 利尿促進物質と循環血液経由の血管弛緩

中降圧物質の一つに焦点を合わせ，その抽出と定量性物質が関係することを報告してきた1)-4)。

法，その意義について検討した。

昇圧反応性についてみると，味噌には摂取された食塩の30～50％の減塩効果があること，味噌の降圧作用
は食塩感受性高血圧のみならず自然発症高血圧の抑制
共立女子大学家政学部食物栄養学科臨床栄養学研究室〒 101-8437

TEL/FAX: (03) 3237-2477
E-mail: yuehara@kyoritsu-wu.ac.jp

─ 53 ─

東京都千代田区一ツ橋 2-2-1

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

表１．味噌と血圧に関する研究成果
研

究系

Dahl食塩感受性高血圧

動物実験

Dahl食塩感受性高血圧

主 な 成 績文

献

味噌汁摂取による高血圧抑制効果。

Yoshinaga M et al:Nutrition

30％減塩効果2012;28(9):924-931.

腎Na利尿による食塩感受性抑制効果

Du D et al: Clin Exp Hypertens
2014;36(5):359-366.

Dahl食塩感受性高血圧

SHRsp/Izm

文献(1)

文献(2)

腹腔内及び皮下投与による血圧抑制

Shimizu N et al: Food and Nutrition

因子

Sciences 2015;6(8):693-702.

自然発症高血圧における ACE 阻害

内川実紗等：ACE 阻害活性強化短期熟成

活性強化味噌による降圧強化

試験味噌の自然発症高血圧における有効性.

文献(3)第63回日本栄養改善学会学術総会/青森
文献(4)５年間横断的観察研究

臨床研究

味噌汁摂取回数は正常血圧〜正常高値

作山裕恵等：習慣的味噌汁摂取が血圧に

血圧に影響しない

及ぼす影響〜５年間の観察研究．日本食品機能性学会誌

短期介入試験

文献(5)味噌汁摂取回数は正常血圧に影響しない

代謝に与える影響─二重盲検ヒト比較介入

Ｂ

150
140
一般

†

開発

120

Pre

4

8

90
♯

開発

80

150
一般
開発

140

120

Pre

4

†

8

検査時期（週）12

DBP（mmHg）

SBP（mmHg）

Ｅ

130

文献(6)

Pre

4

8

80
70

開発
一般

60
50

12

Pre

検査時期（週）

160

†

一般

＊

検査時期（週）Ｄ

薬理と臨床 2016;44(11):1601-

1612.

Ｃ

100

70

12

試験─

Ｆ

110
100
一般
開発

90
80
70

Pre

4

8

4

8

12

検査時期（週）12

検査時期（週）

脈拍数（bp）

130

110

北川学等：長期味噌摂取が血圧および正常〜ステージＩ高血圧に影響しない

DBP（mmHg）

SBP（mmHg）

Ａ

通常味噌と ACE 阻害強化味噌は

脈拍数（bp）

長期介入試験

90
80
§

開発
一般

70
60

Pre

4

8

12

検査時期（週）図１．12週間のヒト介入試験の結果
上段は正常血圧者，下段は正常高値からステージＩ本態性高血圧者。Ａ，Ｄは収縮期血圧，Ｂ，Ｅは拡張期血圧，Ｃ，Ｆは§p < 0.05 開発 vs 一般
脈拍数を示す。†p < 0.05 vs pre（開発），＊p < 0.05 vs pre（一般），♯，─ 54 ─

中央味噌研究所研究報告

1200000

２．味噌中の降圧物質

No.39（2018）は味噌粗抽出物は 3k〜5kDa 分画

1000000

味噌に含有される降圧物質については，経口摂取

味噌粗抽出物

Intensityでの降圧機能性と腹腔内・皮下投与による降圧機能性物質に分けて考えられる。経口摂取下には腎 Na 利尿を伴う。一方腹腔内・皮下投与では 50 mg / 日という微量でも降圧機能性を発揮するが，Na 利尿は伴わ5000000ず，さらに分子量で分けて調べると＜3kDa と 3kDa

3k 〜 5kDa 分画＜のいずれにも降圧機能性が存在することが分かって-500000
0.0

いる3)。＜3kDa には ACE 阻害活性が存在するが，他にも多くの物質が存在することが予想され，降圧物質

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

29.0

Retention Time［min］の探査には向いていない 4),7)。したがって，予備的には 3kDa＜中の降圧活性物質に注目するのが適切と考図２．味噌抽出物の HPLC 溶出分画えた。

上段は正常血圧者，下段は正常高値からステージＩ本態性高血圧者。Ａ，Ｄはを示す。

味噌粗上清と 3k ～ 5kDa の C18 逆相 HPLC の分離パ
ターンを示す（図２）。ピーク高からも分かるように
3k ～ 5kDa には上清に比較して 0.1～１％の物質しか表２．Rt17.5 のピーク高（ｐ）とピーク面積（ａ）

含まれていない。しかし，3k ～ 5kDa の HPLC 解析
では約70種類の物質が分離され，この中に降圧活性tR ① @ 3kDa-を示すものが存在する。日本全国での地域味噌からp

ACE阻害活性の異なる７種類を選択し，これらの味

tR ② @ 3kDapaatR ③ @ 3kDAp

a

0

0

1114

113

0

0

0

0

699

67

0

0

て２時間と４時間後の血圧降下を測定した。さらに，

0

0

753

71

0

0

この分画を C 18 逆相 HPLC により分離し Rt ごとのピ

0

0

3358

279

0

0

409

37

0

0

0

0

724

70

0

0

130

15

噌 3k ～ 5kDa 上清を作成し，ラット腹腔内に投与しーク高を計測して，降圧活性とピーク高との関係性をPearson の単相関法により解析した。その結果ピーク

0

0

991

99

0

0

高と有意な逆相関関係を示す２分画が抽出され，その

0

0

765

76

0

0

うち腹腔内投与後４時間まで強い降圧活性を示す Rt

0

0

963

91

0

0

1164

113

0

0

0

0

2681

223

0

0

0

0

0

0

1119

116

0

0

0

0

977

94

0

0

1111

106

0

0

0

0

0

0

1432

110

0

0

659

67

0

0

0

0

4112

305

0

0

2243

213

17.5 min の分画に注目した。

３．日本全国の味噌における降圧物質
3k ～ 5kDa中の Rt17.5 の物質について，各種味噌での含有量を測定した。はじめに，各種30種類の味噌の

0

0

0

0

1709

161

粗分画と 3k ～ 5kDa 分画について C18 逆相 HPLC で分

0

0

0

0

2208

199

析した。Rt17.5 のピーク高（ｐ），面積（ａ）の一覧を

0

0

0

0

1927

186

0

0

0

0

1345

118

0

0

0

0

3436

282

0

0

876

82

0

0

が見られず，粗分画は 3k ～ 5kDa の量を反映しない

0

0

1092

95

0

0

と結論された。Rt17.5 近辺の多くは分子量＜3kDa に

0

0

1523

135

0

0

あり，分子量 3kDa＜でカットすることで Rt17.5 の降

0

0

1443

128

0

0

0

0

569

53

0

0

表２に示した。Rt17.5 でのピーク高または面積について粗分画と 3k ～ 5kDa 分画との間には一定の関係

圧物質を定量することが可能となる。なお，ニコチア

0

0

3716

303

0

0

ナミンの Rt は 2.67，イソフラボンであるダイジンは

0

0

914

87

0

0

14.39，グリシチンは 14.91，ゲニスチンは 15.99 であ

0

0

585

48

0

0

り，Rt17.5 の物質はこれらの機能性物質とは異なる

0

0

691

70

0

0

ものと考えられる（図３）。

─ 55 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

味噌とイソフラボンの分析チャート

30

daidzein

20

Changes in SBP（mｍHg）

Intensity［μv］

10000

genisteinglycitein
5000

Rt 17.5

0

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0 39.0

10
0
-10
-20
-30
-40

Retention Time［min］

pre2hr-pre4hr-preTime（hour）

図３．味噌の降圧成分とイソフラボン

図４．Rt17.5 分画の降圧効果
上段は正常血圧者，下段は正常高値からステージＩ本態性高血圧者。Ａ，Ｄは収縮期血圧，Ｂ，Ｅは拡張期血圧，Ｃ，Ｆは脈拍数■は０，■は 1443，■は 3358 μV の味噌
を示す。
を表す。

米 麹

甘 酒

酒 粕

味 噌

図５．米麹関連食品のクロマトグラム
上段から米麹，酒麹，甘酒，味噌のクロマトグラムを示す。

─ 56 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

3k ～ 5kDa の Rt17.5 ピーク高についてみると，０の降圧機能性は，大豆のみならず米麹菌での発酵にもから最大 37160μV まで分布していた。Rt17.5 のピー

依存するものであり，機能性物質も複数存在する。今ク高を測定することで味噌の降圧活性が評価できる

回その中で，大豆に由来すると考えられる分子量 3k

か，０，1443 及び 3358μＶ を示す３種類の味噌につ～ 5kDa にある降圧機能性物質について単離に成功し

いて 3k ～ 5kDa 分画を作成し，その降圧活性を測定た。本因子の構造決定は今後に待つ必要があるが，物した（図４）。Rt17.5 が０μＶ の味噌では２時間，４

理化学的な定量が可能となったことから，味噌の降圧

時間共に血圧は低下せず，Rt17.5 が 1443μＶ の味噌

機能性の一部について簡便に評価することができ，味では２時間値が，3358μＶ では２と４時間値が共に低噌製造への応用へ繋げることができるものと考える。

下し，降圧活性が強いことが示された。
し た が っ て ， 3 k ～ 5 k D a の 抽 出 分 画 の C 18 逆 相HPLC での Rt17.5 のピークを測定することで，味噌

文の降圧活性の一部を評価することが可能といえる。

献１）Yoshinaga M, Toda N, Tamura Y, Terakado
S, Ueno M, Otsuka K, Numabe A, Kawabata
Y, Uehara Y: Japanese Traditional Miso

４．降圧機能性物質の構造決定

Soup Attenuates Salt-induced Hypertension

味噌に含まれる降圧機能性物質の一つが同定された

and its Organ Damage in Dahl Salt-sensitive

ことから，3k ～ 5kDa での Rt17.5 ピーク高が最大のRats. Nutrition 2012;28(9):924-931.(doi:10.1016/

味噌を用いてこの分画を分取し，単離したものを用い

j.nut.2011.09.010.)て MS による構造決定を実施する予定となっている。

２）Du D, Yoshinaga M, Sonoda M, Kawakubo

分子量が 3kDa 以上であることから，ペプチドや糖鎖

K, Uehara Y: Blood Pressure Reduction byの結合体が考えられるため，慎重な解析が必要とされJapanese Traditional Miso is Associated withる。

Increased Diuresis and Natriuresis throughDopamine System in Dahl Salt-sensitive Rats.
Clinical Experimental Hypertension Clin Exp
Hypertens. 2014;36(5):359-366. http://dx.doi.

５．味噌と Na 利尿因子

10.3109/10641963.2013.827702. Epub 2013 Sep 18.

ところで，味噌水の経口投与により腎 Na 利尿作用

３）Shimizu N, Du D, Sakuyama H, Ito Y,と食塩感受性高血圧の抑制がみられるが，味噌の原料

Sonoda M, Kawakubo K, Uehara Y: Continuous

である米麹を原料とする酒粕水や甘酒においても腎Subcutaneous Administration of Miso Extracts

Na 利尿効果と自然発症高血圧の抑制効果がある8)。図Attenuates Salt-Induced Hypertension in Dahl

５には，比較のためにこれらのクロマトグラムを示

Salt-Sensitive Rats. Food and Nutrition Sciences

す。これからも明らかなように，極性が高い部位の溶2015;6(8):693-702. doi: 10.4236/fns.2015.68072.

出パターンは，味噌も酒粕，甘酒も同様のクロマトグ

４）内川実紗，佐々木玲子，山川称子，上原誉志夫，

ラムを示す。味噌にみられる溶出が遅れる部位には，

小池祥悟，北川学，山本哲郎：ACE阻害活性強化

酒粕と甘酒には溶出がみられない。

短期熟成試験味噌の自然発症高血圧における有効

このことは，味噌でみられる Rt17.5 の降圧成分は性.

第63回日本栄養改善学会学術総会.一般演題

大豆の発酵に由来する可能性が高いと考えられた。一（口頭）2016年９月９日， 15:00～16:12，B会場

方，味噌にみられる腎 Na 利尿物質は，米麹菌に由来（小会議室（4） [３階]）リンクステーションホーすることが強く示唆された。

ル青森５）作山裕恵，立崎成葉，南茂彩，山田薫，上原誉志夫：習慣的味噌汁摂取が血圧に及ぼす影響～５年間の観察研究～The influence of intake off daily

終わりにMiso soup on blood pressure in humans-The

味噌には，腎 Na 利尿活性，食塩感受性高血圧抑制

results of 5-year observational study- 日本食品機

活性，自然発症高血圧抑制活性などが存在し，これら

能性学会誌

2017;10(6):361-368.

の総合的な効果でヒトにおいても食塩感受性を抑制し

６）北川学，伊藤公美恵，山田南実，小池祥吾，山本て血圧に影響を与えないことが明らかになった。味噌

哲郎，上原誉志夫：長期味噌摂取が血圧および代─ 57 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

謝に与える影響ー二重盲検ヒト比較介入試験ー薬

Biotechnology of Japan. Toyama/Japan.

理と臨床 2016;44(11):1601-1612.

８）上原誉志夫，山川称子，樋口千恵，植松玲名，平７）Kitagawa M, Tada K, Yamada M, Haruno

山あい，横田真歩 : 日本の伝統的発酵食品である

R, Higashi T, Koike S: Purification and酒粕による自然発症高血圧への抑止効果とその機

characterization of angiotensin I converting序 . 一般口演，発表形式 : 一般口演，2016 年 10 月

enzyme inhibitor from short-term fermented

1 日（土）17:10 ～ 18:10 会場 : 第 7 会場（仙台国際Miso. The 68th Annual Meeting of the Society ofセンター 会議室 4）

─ 58 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

研 究 報 告ヒト大腸フローラモデルを用いた味噌と腸内フローラに関する基盤研究稲垣瑞穂 1，水谷

綾乃 1，大澤朗2

The effect of miso on gut microbiota using a human colonic microbiota
simulation system

Mizuho INAGAKI 1, Ayano MIZUTANI 1, Ro OSAWA 2
1

Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University,
1-1 Yanagido, Gifu, Gifu, 501-1193, Japan.

2

Department of Bioresource Science, Graduate School of Agricultural Science, Kobe University,
1-1 Rokkodai-cho, Nada-ku, Kobe, Hyogo, 657-8501, Japan.

【緒言】
ヒトの体内では，小腸での消化吸収を免れて大腸にたどり着いた食事成分は，ヒト腸内細菌叢（フローラ）の餌となり菌叢構成に大きな影響を与えている。しかしながら現在の食品機能性評価では，細胞やモデル動物を用いた試験に基づいた食事成分とヒトの健康の関わりの議論が主流となっており，ヒト腸内フローラに対する議論に及んでいない。腸内フローラが人々の健康に大きく関与していることが明らかになりつつある
今，食事成分が腸内フローラに与える影響を評価する
試験系の確立が強く望まれている。
我々はこれまでに腸内細菌叢環境の培養槽レベルで

図１．ヒト大腸フローラモデル培養槽の再現（ヒト大腸フローラモデル，Kobe University（エイブル株式会社／BME - 25NC）
100 mL 培地中にヒト糞便を加えてフローラ構成を再現する

Human Intestinal Microbiota Model；KUHIMM，
図１）に取り組み，このモデルを用いて機能性食品
素材が腸内フローラに与える影響を評価する試験系の構築に関わってきた 1) 。本研究では，味噌の主原料である大豆に含まれる特異的なオリゴ糖・スタキオース

いるが 2)，スタキオースがヒト腸内細菌叢構成に与え(stachyose) に着目した。スタキオースとは，天然にる影響については報告がない。本研究では本モデルを存在する非還元性の四糖のオリゴ糖である。これまで

用いてスタキオースのヒト腸内細菌叢構成に与える影にスタキオースのビフィズス菌増殖作用は報告されて響を検証した。

神戸大学大学院農学研究科〒 657-8501

神戸市灘区六甲台１- １

Tel/Fax: (078) 803-5804
E-mail: tamie@opal.kobe-u.ac.jp

─ 59 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）の承認を得て実施した。

【方法】
１）ヒト大腸フローラモデル培養

２）味噌中のスタキオースの定量

ヒト糞便（検体）から綿棒を用いて腸内フローラを

味噌を熱水に溶かした溶液に含まれるスタキオース

回収し，実験使用時まで嫌気的に保管し，５時間以内の量について，アセトニトリルにより抽出し，以下のに試験を開始した。検体を生理食塩水に溶かしこんだ

条件で HPLC 解析を行った。スタキオース標品を用ものをスターターとして，このスターターを培地に播いて検量線を作成し，味噌１g に含まれるスタキオー

種した。24時間，嫌気条件下で攪拌しながら培養を

スの定量を試みた。

行った（ヒト大腸フローラモデル試験，図１）。培養

HPLC：DIONEX Ultimate 3000（Thermo

開始時に，スタキオースを加えて培養を開始した群Scientific），Column：AsahiPak NH2P - 50 4E，（スタキオース群）と未添加群（コントロール群）をFlow rate：1.0 mL / min，Injection volume：20

用意し，スタキオース添加以外は同一条件で実験を

μL，Gradient program：0.5 ％ C H 3 C O O H：行った。培養開始時から経時的に pH のモニタリング

Acetonitrile ＝ 25 ％：75 ％（13 min）→ 7 minを実施した。また培養24時間後にサンプリングした

gradient → 40％：60％（ 5 min）．

培養液から DNA を抽出し，定量 PCR 法に供した。
全菌数を基準に正規化しΔΔ CT 法により解析した。
Student's t-test により有意差検定を行った。本試験はヒト糞便を使用するため，岐阜大学医学部倫理審査【結果および考察】
１）味噌汁 1 杯の大豆原料に含まれるスタキオース量がヒト腸内フローラに与える影響
味噌汁１杯に相当する大豆タンパク量から算出した
ローラモデルに供した。一例として２名の被験者デー

control
stachyose 37Fタを示す。培養液内の pH の経時変化では，培養 10

6.0

5.0

0

3

6

9

12

15

18

21

24

27

relative expression to control

pH

スタキオース 73 mg （和光純薬工業）をヒト大腸フ

Ａ

7.0

30

経過時間（ｈ）

Ｂ

7.0

control
stachyose 37F

2.5■ stachyose 73 mg 37F■ stachyose 73 mg 43F

2.0
1.5
1.0
0.5

e

s

ce
a
ria

En

te
ro
ba

ct
e

ro

co
cc
u

s
te
En

ob
a

ci
llu

iu
m
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Bi

fid

ob

ac
t

st
ri
lo
C

La
ct

um
di

id
es
ro
Ba

ct
e

pH

0.0
6.0

5.0

0

3

6

9

12

15

18

21

24

27

図３．スタキオース73 mg 添加がヒト腸内細菌叢に
与える影響

30

ヒト大腸フローラルモデルにてスタキオース 73 mg 添加・未添加を同一条件で培養した。24時間後に回収した培養液から細菌 DNA を抽出し，定量 PCR 解析を行った。スタキ
オース未添加のコントロールを 1.0 としたときのスタキオー
ス 73 mg 添加時の菌叢変化を示す。
ｎ＝ 3 ，* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01

経過時間（ｈ）
図２．スタキオース 73 mg 添加時の培養液 pH の
経時変化
（Ａ）37歳女性，（Ｂ）43歳女性（n = 3, mean ± SD）

─ 60 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

表１．各味噌に含まれていたスタキオースの量

時間ごろまではコントロールとスタキオース群では類似した挙動を示した。10 時間後から培養終了時まで

ʃʉɷɴ˂ʃ༟࣊ᴥíg ¯ ֞‫ أ‬± g ᴦ

は，コントロールと比較して，スタキオース添加群で

°®¸
°®¶
²®¸
²®°
°®¶
±®°

ំ֞‫أ‬
ዢ֞‫أ‬ᴾዢ֞‫أ‬ᴿዢ֞‫أ‬ᵀణᕹ֞‫أ‬
Ჶ֞‫أ‬は pH が低く維持された（図２）。コントロールを比較してみてもわかるように，培養液の pH 変動は個人のフローラに依存した個人差がある。43 歳女性の被験者についてはスタキオース添加により腸内の pH が低く保たれていた（図２Ｂ）。

値は，平均値 ± 標準偏差 で示した。
N.D. 検出限界（0.1 μg / ml ）以下

24 時間後の培養液に含まれる菌叢について定量
PCR 解析を行った。コントロール培養液に含まれる

Ａ

7.0

各属の菌量を 1.0 とした時の変化を示している（図３）。２名の被験者いずれも善玉菌として知られるビ

control 24F

フィドバクテリウム属を増加させ，一方で，バクテロ

stachyose 8 mg 24F

イデス属は減少する傾向が共通して見られた。その他
pHにも 43 歳女性被験者については，クロストリジウム
属，エンテロコッカス属，エンテロバクター科の増加6.0が観察された。
大豆オリゴ糖であるスタキオースは，腸内のビフィドバクテリウム属を有意に増加させる効果が見られた。ビフィドバクテリウム属の増加に伴い，代謝産物5.0である乳酸，酢酸などの有機酸の産生量が増加し，結

0

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 22 24

経過時間（ｈ）

果として培養液 pH が低下したと推測される。味噌汁
１杯の大豆原料中に含まれるスタキオースには，腸内Ｂ

7.0

フローラ改善作用が期待できると考えられた。

control 43F
stachyose 8 mg 43F

２）味噌に含まれるスタキオース量の定量
量で十分な腸内環境改善効果が期待されたことから，

pH

味噌汁１杯の大豆原料に含まれるスタキオースの6.0

味噌６種に含まれるスタキオース量の定量を試みた。
HPLC 分析より，味噌１g 中に 0.6 mg ～ 2.8 mg のスタキオースが含まれていた（表１）。大豆原料に含まれているスタキオース量と比較すると，加工・成熟

5.0

により約 60 - 90％のスタキオースが減少していた。過

0

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 22 24

経過時間（ｈ）

去に，味噌の熟成期間において遊離するオリゴ糖の組成が異なることが報告されている 3)。今回の試験に用

図４．スタキオース8 mg 添加時の培養液 pH の
経時変化

いた味噌は熟成期間が統一されていなかったため，各味噌に含まれるスタキオース量を一概に比較すること（Ａ）24歳女性，（Ｂ）43歳女性（n = 3, mean ± SD）

はできないが，加工・成熟によりスタキオースが減少することが明らかとなった。
３）味噌汁１杯スタキオース量がヒト腸内フローラには 1011 に到達した。しかしながら，24 歳女性（24 F）

与える影響
HPLC の結果から，実際の味噌汁１杯（味噌 10 g）/ スタキオース 8 mg 群では，バクテロイデス属の急に含まれるスタキオース量を想定し，大腸フローラモ

激な増加が見られ，一方でビフィズドバクテリウム属

デル 100 mL 培養液中に 8 mg を添加して試験を行っの減少が観察された。43 歳女性（43 F）/ スタキオー

た。未添加の場合と比較して，スタキオース 8 mg 添

ス 8 mg 群では様々な属において全体的に菌数の減少

加により pH は上昇傾向にあった（図４）。菌叢解析傾向が見られた。今回の検証だけでは結論にはできなを行ったところ，いずれの試験群においても全菌数いけれども，少量のスタキオースの単回投与では腸内─ 61 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）することで，腸内細菌叢を改善する食品・プロバイオ■ stachyose 8 mg 24F■ stachyose 8 mg 43F

3.0

ティクスとしての利用性が考えられる。
スタキオースは大豆特有のオリゴ糖であることか

2.5

ら，被験者の日常的な大豆摂取量が本試験結果に大き2.0く関与している可能性が考えられる。例えば一般的な

1.5

見解として，日常的を大豆摂取している被験者はスタ
キオース資化性の高い腸内細菌が定着している可能性1.0が高い。また加齢による腸内フローラの変遷も生じる

0.0

検証するためには，被験者を区分して試験を行う必要
ae
te
ria

ce

がある。また今回の 8 mg 試験は味噌汁 1 杯による影響を検証しているが，今後は味噌汁を継続して摂取し

te
ro
b

ac

te
ro
c

oc

cu

illu
s

た場合の影響なども検証していく必要がある。

En

En

ac
ct
ob

ac
ob
fid

Bi

La

iu
m
st
rid
lo

C

ct
er
oi
de
Ba

s

ことから，スタキオース・味噌摂取の有効性をさらに
te
riu
m

0.5

s

relative expression to control

3.5

図５．スタキオース 8 mg 添加が腸内細菌叢に
与える影響

【謝辞】

ヒト大腸フローラルモデルにてスタキオース 8 mg 添加・未添加を同一条件で培養した。24時間後に回収した培養液か
ら細菌 DNA を抽出し，定量 PCR 解析を行った。スタキオ
ース未添加のコントロールを 1.0 としたときのスタキオース
8 mg 添加時の菌叢変化を示す。
ｎ＝ 3 ，* p ＜0.05，** p ＜ 0.01

本研究の遂行にあたり，味噌サンプルのご提供なら
びに本研究のご支援・ご協力いただきました一般社団
法人中央味噌研究所をはじめ各関係者の方々に深謝いたします。またスタキオースの定量では，岐阜大学大学院連合農学研究科 中野浩平先生にご協力いただきました。感謝申し上げます。

細菌叢に対して良い効果を得るのは難しいと考えられた。

【参考文献】
１）Takagi et al., A single-batch fermentation
system to simulate human colonic microbiota for【総括】high-throughput evaluateion of prebiotics, PLoS

味噌汁１杯相当の大豆（原料）に含まれるスタキオー

ONE (2016)

ス量に対してビフィズス菌増殖効果が認められた。ま２）Inoguchi et al., Effects of non-fermented

た味噌に含まれるスタキオースの定量結果より，加工・and fermented soybean milk intake on fecal

熟成の工程により 60 から 90 ％ほど減少すると推測さ

microbiota and fecal metabolites in humans,

れた。加工・熟成の工程において，味噌に含まれる微International Journal of Food Sciences and生物がスタキオースを資化するため，実際の味噌汁

Nutrition (2012)（１杯の摂取量）には腸内細菌叢に好影響を与えるほ

３）本藤智・望月務

どのスタキオースが残っていないと推測された。味噌

みその遊離糖について

品工業学会誌（1979）

加工・成熟においてスタキオース含量を高める工夫を─ 62 ─

日本食

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

研 究 報 告高 HEMF 産生味噌酵母の育種と味噌酵母接合育種の可能性の検討

尾形智夫

Consideration of a possibility of breeding miso yeast that produce high HEMF by mating

Tomoo OGATA
Department of Biotechnology, Maebashi Institute of Technology,
460-1 Kamisadori, Maebashi, Gunma 371-0816, Japan.

᥋ྜᆺ䠍ಸయa㓝ẕᰴ䜘䛔㤶Ẽ䜢⏘⏕䛩䜛

１．序論᥋ྜᆺ䠍ಸయα㓝ẕᰴⓎ㓝ᛶ䛜䜘䛔
᥋ྜ

接合は，酵母の自然現象である。酵母の接合性 aを示す細胞と接合性αを示す細胞間で接合し，接合性を示さない２倍体 a /α細胞となる現象である。接合

MAT

MAT

a

α

育種とは，この現象を利用した育種法である（図１）。
育種された酵母菌株は，遺伝子組み換え体には該当し᥋ྜ䛧䛯ᰴ㻌 䠎ಸయ᥋ྜᆺ a /α㓝ẕᰴ䜘䛔㤶Ẽ䜢⏘⏕䛧䠈Ⓨ㓝ᛶ䛜䜘䛔ないので，有望な酵母育種法であるといえよう。酵母の接合性は，接合遺伝子座 MAT に Y a 配列が挿入さMATれていると，その細胞の接合性は a になり，Yα配列aが挿入されていると，その細胞の接合性はαとなる。

MAT

昨年度，我々は，接合性が a であると報告されてα

い る 味 噌 酵 母 Zygosaccharomyces sp. NBRC1876と，接合性αであると報告されている味噌酵母 Z.

図１．酵母の接合

rouxii NBRC0740 と の 間 に， 接 合 株 を 得 た こ と を
報 告 し て い る 1)。 し か し，Zygosaccharomyces sp.
NBRC1876 の接合性を決定する遺伝子座 MAT の構造，この領域の DNA 塩基配列の詳細が不明で，接合が生じたかを正確に証明することができていなかっ-furanone）は，味噌の品質を高める香気物質であるた。そこで，本年は，次世代シークエンサーを用いて，とともに，強い抗酸化性より，抗ガン性等の生理活性

Zygosaccharomyces 属酵母株のゲノム配列を決定し，も注目されている物質である。昨年度の我々の研究で接合が生じたことをゲノムデータから証明することをは，味噌酵母による HEMF の産生には，五炭糖であ試みた。

るリボースが必須であることを見出した 1)。本年は，菌体内リボース含量を増加させる変異株を用いること

ま た， 味 噌 酵 母 が 産 生 す る 香 気 物 質 HEMF（2（or 5 -）- ethyl - 5（or 2）- methyl - 4 - hydroxy - 3（2H ）前橋工科大学工学部生物工学科
Tel: (027) 265-7385〒 371-0816

で，HEMF 産生量に変化があるかを検討した。

前橋市上佐鳥町 460-1

Fax: (027) 265-3837

E-mail: tomoo.ogata@maebashi-it.ac.jp

─ 63 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

Z. rouxii NBRC0740，Zygosaccharomyces sp.

２．実験材料と実験方法

NBRC1876 のゲノム配列解読は，次世代シークエン（１）実験材料と培地

サー HiSeq2500 を用いておこなった。アセンブリソ味 噌 酵 母 Zygosaccharomyces rouxii は， 独 立 行

フトウエア Platanus を用いて配列アセンブリをおこない，scaffold を作成した 3)。

政法人製品評価技術基盤機構（NITE）のバイオテク
ノロジーセンター（NBRC）より入手した。タイプス（４）各 Zygosaccharomyces 酵母株の MTL （Mating

トレインである NBRC1130，NBRC の菌株リストにtype like）loci の PCR による増幅

接合性αと記載されている NBRC0740，1877 と，接各 Zygosaccharomyces 酵母株の MTL（Mating type

合性 a と記載されている NBRC1876 を使用した。培
地は，YPD 培地（１％ yeast extract，２％ peptone，like）loci の PCR による増幅は，Zygosaccharomyces

２％ glucose）使用した。HEMF の産生培地としては，

ゲノムデータあるいは，次世代シークエンスデータを

Sugawara ら の 報 告 2) に あ っ た 培 地（2.5 ％ ribose，

基に作成したプライマーを用いておこなった。各プラ

１ ％ glycine，7.5 ％ glucose， １ ％ KH2PO4，0.5 ％イマーの配列は，表１に示す。

MgSO4，0.5％ yeast extract）を使用した。
（５）プリン塩基生合成変異株の HEMF 産生への影響（２）味噌酵母 Z. rouxii の接合実験

プリン塩基生合成に関わる遺伝子 ADE1 が遺伝子破壊された Sacchromyces cerevisiae BY4741 Δade1

NBRC の菌株リストに，接合性αと記載されてい株を用いて，HEMF 産生量を測定した。

る NBRC0740 に，シクロへキシミド耐性の選択マーカーを付与した。シクロへキシミド耐性の付与は，
NBRC0740 を，EMS（エチルメタンスルホン酸）で変異処理し，YPD 寒天培地に，シクロへキシミド５

３．実験結果および考察

μg / ml でコロニーを形成する菌株を分離することで（１）次世代シークエンサーを用いたゲノム解読とそおこなった。分離されたシクロへキシミド耐性酵母のゲノムデータを用いた接合の確認

株を，NBRC0740 - CYR1 と命名した。接合は，このNBRC0740 - CYR1 と，NBRC の菌株リストに，接合

味噌酵母 Z. rouxii NBRC1130（type strain），

性 a と記載されている NBRC1876 を，１細胞ずつ，Z. rouxii NBRC0740，Zygosaccharomyces sp.

マイクロマニピュレーターで釣菌し，YPD 寒天培地

NBRC1876 の ゲ ノ ム 配 列 は， 次 世 代 シ ー ク エ ン

上に接触させ，コロニーを形成させ，接合株 Y130 を

サ ー HiSeq2500 を 用 い て 決 定 し， ア セ ン ブ リ ソ フ

得た。

トウエア Platanus を用いて配列アセンブリをおこない，scaffold を作成した。各接合遺伝子座に相当
す る 推 定 の 染 色 体 構 造 と scaffold は， 図 ２ － ４ に（３）次世代シークエンサーによるゲノム配列解読
味噌酵母 Z. rouxii NBRC1130（type strain），

示 し た。 こ の 推 定 さ れ た 染 色 体 構 造 に 基 づ き， 各

表１．PCR プライマーの配列
ʡʳɮʨ˂ջ
Ê× ²í
Ê× Áí
Ê× ±í
Ê× Âí
Ê× ³í
Ê× Ãí
α òåö
値は，平均値 ±Ù標準偏差で示した。
Ùáòåö/ ml ）以下
N.D. 検出限界（0.1 μg
ÙαÙáÓãáæ±¹µ·ß±¸·¶ß±²¸ÒᥓҚᴥµż­ ­ ³żᴦÔÇÃÇÃÇÃÁÇÃÇÃÁÔÇÁÔÁÔÇÁÁÁÃÇÁÁÇÁÔÇÃÁÁÃ
ÃÔÁÔÁÁÃÃÁÁÃÃÁÇÔÔÁÇÔÇÔÇÔÔÁÔÃÇÁÔÁÁÇÔÃ
ÁÁÇÁÃÇÁÁÁÔÇÃÔÁÃÔÃÃÃÔÃÁÔÔÁÇÁÁÃÁÔÇÁÁÁ
ÃÃÔÁÃÁÁÔÁÃÔÃÔÁÔÔÔÃÇÔÃÃÇÔÔÔÁÔÃÇÔÔÇÇÔÔ Ô Ã ÔÁ Ô Á Ã Ô Ô Á Ã Ô Ç Ç Á Ô Ç Á Á Ô Ã Ô Ô Ã Ô Ç Ô Ç ÁÔÃÁÇÔÁÃÃÁÇÁÁÇÔÇÇÔÃÔÔÔÇÁÁÁÃÇÁÔÔÇÃÃÇÃ
ÁÁÁÔÃÔÇÔÇÁÔÁÃÁÁÔÔÃÃÔÇÇÁÁÔÁÃÔÇÃÁÔÃÃÔÇ Á Ç Á Ô Á Ô Ç Ô Ô Ô Ô Ç Ç Ç Ç Ã Ô Ô Ã Ô Á Ô Ç Á Ô Ç Ô Á Ô Ô Á Ã ÃÔÁÔÁÔÁÇÇÁÔÇÃÁÇÔÁÔÔÃÃÁÇÇÁÁÔÔÇÔÁÔÃÁÃÁÇ
ÁÔÔÇÃÁÁÇÁÁÁÁÇÇÔÁÁÔÁÃÁÔÃÁÔÁÇÁÁÇÃÃÃÃÁ
ÁÔÃÁÁÃÃÇÇÔÁÁÇÔÇÔÔÃÔÔÔÃÁÁÔÁÁÇÔÃ

─ 64 ─

中央味噌研究所研究報告(a) Chromosome F (accession no: CU928178) in CBS732
CHA1
ZYRO0F15774g

Yα
ZYRO0F15818g
ZYRO0F15840g

CHA1
ZYRO0F18524g

SLA2
ZYRO0F15862g

1,303kbNo.39（2018）

Yα
ZYRO0F18568g
ZYRO0F18590g

ZYRO0F18634g
20kb

133kb

(b) Chromosome F on which Watanabe et al. insist (2013) in NBRC1130
CHA1
ZYRO0F15774g

Scafflod48 NBRC1180

Ya

PCR Primer set JW 1m(c) Chromosome C (accession no: CU928175) in CBS732

ZYRO0C18392g

JW Bm

ZYRO0C18458g
Scafflod505 NBRC1180

DIC1
Ya
ZYRO0C183049g ZYRO0C1834g

ZYRO0C18392g 118kb ZYRO0C18458g

1,436kb(d) Chromosome C on which Watanabe et al. insist (2013) in NBRC1130
DIC1
ZYRO0C183049g

putave
MAT locusSLA2
ZYRO0F18634g
CHA1
Ya/Yα
ZYRO0F15862g ZYRO0F18524g Yα

PCR Primer set JW 2m

Scafflod16 NBRC1180

JW Cm
JW Am PCR Primer set JW 3m
Scafflod505
Scafflod1118 NBRC1180
NBRC1180

図２．Zygosaccharomyces rouxii CBS732 or NBRC1130 の染色体 Ｃ および Ｂ の推定構造(a) Chromosome F on which Watanabe et al. insist (2013) in NBRC0740
CHA1
MTL
ZYRO0F15774g Yα ZYRO0F18634g

PCR Primer set JW 1m

Scafflod28 NBRC0740

JW Cm

Scafflod2210 NBRC0740(b) Chromosome C on which Watanabe et al. insist (2013) in NBRC0740
DIC1
ZYRO0C183049g

MTL
Yα

CHA1
MTL
ZYRO0F18524g Yα

SLA2
ZYRO0F15862g
PCR Primer set JW 2m

Scafflod9 NBRC0740

JW Am

ZYRO0F18634g
JW 3m
JW Cm
PCR Primer set

Scafflod2209 NBRC0740
Scafflod2210㻌
NBRC1180

図３．Zygosaccharomyces rouxii NBRC0740 の染色体 Ｃ および Ｂ の推定構造─ 65 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）(a) Chromosome F on which is deduced from this sequencing in NBRC1876
CHA1
ZYRO0F15774g

MTL
Ya ZYRO0C18370r

ZYRO0C18458g
JW 1m
JW Bm
PCR Primer set
Scaffold1060_NBRC1876(b) Chromosome C which is deduced from this sequencing in NBRC1876
DIC1
ZYRO0C183049g

CHA1
ZYRO0F18524g

MTL

SLA2 ZYRO0F15862g
JW 2m

MTL
Yα

ZYRO0F18612g
JW 3m JW Cm
PCR Primer set

JW Am

JW 2W Scaf1957_1876_128R
PCR Primer set
Scaffold31_NBRC1876 Scaffold1957 Scaffold412 Scaffold63 Scaffold652_NBRC1876 _NBRC1876 _NBRC1876_NBRC1876

図４．Zygosaccharomyces sp. NBRC1876 の染色体 Ｃ および Ｂ の推定構造(a) Chromosome C(b) Chromosome C right arm end

putave
MAT SLA2
DIC1
ZYRO0C183049g Ya/Yα ZYRO0F15862g

1
2
3
4

JW 2m

Yα
Ya

JW Am

Yα revYa rev

M 1 2 3 4

CHA1
MTL
ZYRO0F15774g Ya ZYRO0C18392g

1
2
3
4

JW 1m

JW Bm

Yα revYa rev

Yα
Ya
M 1 2

(c) Chromosome F
CHA1
MTL
ZYRO0F18524g Yα

JW 3m

1
2
3 Yα
4 Ya

3 4

ZYRO0F18634g

JW Cm

Yα revYa rev

M 1 2 3 4

図５．Zygosaccharomyces rouxii NBRC1130 の MTL 遺伝子座

MTL（Mating Type Like）locus を PCR に よ っ て
増 幅 さ せ た（ 図 ５ － ７）。Z. rouxii NBRC1130 お
よ び Z. rouxii NBRC0740 で は， 各 MTL loci でWatanabe らが報告していたように，各 MTL locusに，Y a あるいは Yα配列が挿入されていることが確認された（図５，６）4)。一方，接合実験で用いた─ 66 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）(a) Chromosome C(b) Chromosome C right arm end(c) Chromosome F

DIC1
MTL
ZYRO0C183049g Yα

CHA1
MTL
ZYRO0F15774g Yα ZYRO0C18634g

CHA1
MTL
ZYRO0F18524g Yα

JW 2m

1
2
3
4

SLA2
ZYRO0F15862g

JW Am

JW 1m

Yα revYa rev

Yα
Ya

1
2
3
4

JW Cm

Yα revYa rev

YαYa

M1 2 3 4

ZYRO0F18634g

JW 3m

JW Cm

1
2
3 Yα
4 Ya

Yα revYa rev

M 1 2 3 4M 1 2 3 4

図６．Zygosaccharomyces rouxii NBRC0740 の MTL 遺伝子座(a) Chromosome C(b) Chromosome C right arm end(c) Chromosome F

DIC1
ZYRO0C183049g MTL

CHA1
MTL
ZYRO0F15774g Ya ZYRO0C18730r

CHA1
MTL
ZYRO0F18524g Yα

JW 2m

1
2
3
4
5

Yα
Ya
JW 2W

M

SLA2

JW Am

Yαrev
Ya rev

JW 1m

1
2
3
4

JW Bm

Yα revYa rev

Yα
Ya

JW 3m

1
2
3 Yα
4 Ya

ZYRO0F18612g

JW Cm

Yα revYa rev

Scaf1957_1876_128R

1 2 3 4 5M 1 2 3 4M 1 2 3 4

図７．Zygosaccharomyces sp. NBRC1876 の MTL 遺伝子座

酵 母 菌 株 Zygosaccharomyces sp. NBRC1876 で は，列が，データベースのものと異なっていることが予

Chromosome C に あ る MTL locus が，PCR で 増 幅

想 さ れ た。Zygosaccharomyces sp. NBRC1876 の 次されず（図７(a) lanes 1-4），この領域の DNA 塩基配

世代シークエンサーのゲノム解析後の Scaffold1957_

─ 67 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

1. Chromosome C

DIC1
ZYRO0C183049g MTL

JW 2W

3. Chromosome F

CHA1
ZYRO0F15774g MTL

SLA2

JW 1m

Scaf1957_1876_128R

2. Chromosome C

DIC1
ZYRO0C183049g MTL

JW 2m

4. Chromosome F
CHA1
ZYRO0F15774g MTL

SLA2

JW 1m

JW Am

M

NBRC1876⏤᮶ᰁⰍయ
ZYRO0C18730r

JW Bm

NBRC0740⏤᮶ᰁⰍయ
ZYRO0C18634g

JW Cm

1 2 3 4

図８．接合株 Y130 の MTL 遺伝子座

結 果 よ り， 接 合 実 験 で 用 い た Z. rouxii NBRC0740

䝸䝪䞊䝇と，Zygosaccharomyces sp. NBRC1876 と で は，࿡ჯ㓝ẕChromosome C の MTL locus と，Chromosome F
右腕末端の MTL locus で，染色体構造及び DNA 塩䝸䝪䞊䝇

基配列に差異があることがわかった。この差異を利用䝥䝸䞁ሷᇶ⏕ྜᡂ䛻㛵䜟䜛㑇ఏᏊADE1➼䛻ኚ␗䛜䛒䜛䛸䠈HEMF䛾⏘⏕㔞䛜ቑຍ䛩䜛䛣䛸䛜ᮇᚅ䛥䜜䜛䚹䝥䝸䞁ሷᇶして，接合が生じていた場合，Z. rouxii NBRC0740
由 来 の MTL locus と，Zygosaccharomyces sp.

HEMF

NBRC1876 由来の MTL locus が，接合株に共に存在することを，PCR によって証明可能となることが予想された。そこで，PCR をおこなったところ，接合
株 Y130 から，増幅産物を得た（図８）。従って，次HEMF

世代シークエンサーを用いたゲノムデータを利用し

図９．HEMF 産生量増加のために考えられる酵母育種て，味噌酵母 Zygosaccharomyces 酵母で接合株を分離できたことを証明することができた。
（２）高 HEMF 産生味噌酵母の育種の可能性の検討

NBRC1876 の DNA 塩基配列は，このゲノム領域に昨年度の我々の研究では，味噌酵母による HEMF

あ る 遺 伝 子 SLA2 （ZYRO0F15862g） と，81 ％ の 一の産生には，五炭糖であるリボースが必須であること

致 率 で あ っ た が， プ ラ イ マ ー JW_Am の 相 当 領 域を見出した（図９）1)。そこで，本年，菌体内リボーで は 一 致 し て い な か っ た。 そ こ で，Scaffold1957_

ス含量を増加させることが予想されるΔade1 変異株

NBRC1876 の DNA 塩基配列を基に新たにプライマーを用いることで，HEMF 産生量に変化があるかを検Scaf1957_1876_128R を 作 成 し，PCR を お こ な っ た

討した。HEMF 産生実験の結果は，表２に示す。Δ

ところ，増幅産物を得た（図７ (a) lane 5）。以 上 のade1 変異によって，HEMF 産生量が増加したことが─ 68 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

表２．HEMF 産生への Δade1 変異の影響ÈÅÍÆ ༟࣊ᴥμç ¯ íì ᴦ

S. cerevisiae ÂÙ´·´±
S. cerevisiae ÂÙ´·´± Δade1
値は，平均値 ± 標準偏差ᴮ᣸ᩖ‫ڗ‬᭴ᴯ᣸ᩖ‫ڗ‬᭴±´®² Ă ±®¶³°®³ Ă ²®·ª±·®± Ă ³®²³±®· Ă ³®±ªで示した。

* 危険率１％で有意差あり確認された。この結果は，Uehara らの結果と一致す

参考文献るものであった 5)。

１）尾形智夫：高 HEMF 産生味噌酵母の接合による育種

中央味噌研究所研究報告第 38 号，p101-

107 (2017).

４．総括２）E. Sugawara, M. Ohata, T. Kanazawa, K.

（１） 次世代シークエンサーを用いて得た味噌酵母のKubota, Y. Sakurai: Effects of the amino-

ゲノムデータを利用して，接合実験に用いた味

carbonyl reaction of ribose and glycine on the

噌酵母菌株間の染色体構造及び MTL loci 周辺のformation of the 2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-

DNA 塩基配列の差異を見い出し，これを利用し4-hydroxy-3(2H)-furanone aroma componentて，接合株であることを PCR 実験によって証明

specific to miso by halo-tolerant yeast. Biosci

することができた。

Biotechnol Biochem Vol.71, p1761-1763 (2007).

（２） 味噌の品質を高める香気物質である HEMF は，

３）Kajitani, R., Toshimoto, K., Noguchi, et al.:

前駆物質であるリボース量に産生量が影響される

Efficient de novo assembly of highly heterogousと予想され，酵母菌体内リボース量を増加させる

genomes from whole-genome shotgun short

Δade1 変異によって，HEMF 産生量が増加した

reads. Genome Research Vol.24, p1384-1395 (2014).

ことが確認された。

４）J. Watanabe, K. Uehara, Y. Mogi: Diversity ofmating-type chromosome structures in the yeast謝Zygosaccharomyces rouxii caused by ectopic
exchanges between MAT -like loci. PLoS ONE

辞Vol.8, e62121 (2013).

本研究は，一般財団法人中央味噌研究所の平成２８５）K. Uehara, J. Watanabe, T. Akao, D.

年度研究助成を受けて実施したものです。関係各位にWatanabe, Y. Mogi, H. Shimoi: Screening

深く感謝します。本研究の実施にあたっては，前橋工

of high-level 4-hydroxy-2 (or 5)-ethyl-5 (or科大学工学部生物工学科卒業研究生，伊藤功起さん，

2)-methyl-3(2H)-furanone-producing strains

黒木克明さんと共同でおこないました。次世代シークfrom a collection of gene deletion mutants

エンサーを用いた味噌酵母のゲノム解読は，前橋工科

of Saccharomyces cerevisiae . Appl Environ

大学工学部生命情報学科教授

Microbiol Vol.81, p453-460 (2015).

中村建介先生との共同研究です。

─ 69 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

研 究 報 告各種味噌が食中毒菌に汚染された際の微生物学的安全性に関する網羅的解析

島村

裕子，増田

修一

Analysis on microbiological safety of various Miso contaminatedwith food poisoning bacteria

Yuko SHIMAMURA, Shuichi MASUDA
School of Food and Nutritional Sciences, University of Shizuoka,
52-1 Yada, Suruga-ku, Shizuoka 422-8526, Japan.

乳酸菌をはじめとする様々な微生物が存在しているこ

はじめにとが知られており，味噌製造に関する微生物は，身近

味噌は，食品の品質や保存性を高めることが以前かに存在する微生物であるにも関わらず，味噌中に含まら知られており，食塩だけでなく，水分活性およびれる微生物の挙動に関する知見は少ない。一方，新たpH の低下，また含有するアルコール 1)，メラノイジン 2)

な機能を有する微生物の分離源として味噌等の発酵食

3)および乳酸菌由来のバクテリオシン などの作用によ品が注目されていることから，現在，発酵食品中にどり食中毒菌の生育を抑制できることが知られている。

のような微生物が存在するのか，その菌叢構造を明ら

このように，味噌は微生物に関する安全性が高いことかにする研究が世界中で活発に行われている 5)。従来が報告されているが，最近の市販されている味噌におの分子生物学的な菌叢解析では，発酵食品中の細菌叢

ける微生物の挙動および病原性因子の発現に関する情の解析は困難であったが，近年，次世代シーケンサー

報・知見は少ない。

を用いた細菌叢を正確かつ網羅的に把握する手段（メ

味噌は，加熱変性処理した米または麦に，麹菌を生タゲノム解析）が報告されており，韓国の味噌である

育させた「麹」と加熱変性処理した大豆と食塩を混合

テンジャン 6) や meju 7) において，その細菌叢が報告して仕込まれる。仕込みの過程で，切返しという天地されている。しかし，近年，日本で市販されている味

返し工程を含む醸造発酵中において，麹菌の生産する噌に食中毒菌を接種した際の味噌中の細菌叢のメタゲ

加水分解酵素群により大豆のタンパク質や米，麦のノム解析や食中毒菌の病原性因子の発現について網羅

デンプンが分解され，分解物を Zygosaccharomyces

的に解析した報告はない。

rouxii 等の酵母や Tetragenococcus halophilus 等の

そこで，本研究では，各種味噌が食中毒菌に汚染さ乳酸菌が資化する。半年間程度，酵母発酵と乳酸発酵れた際の細菌の挙動に影響を及ぼす因子について調べが行われた後，漉し味噌は，漉し機を通してすり味噌た。まず，近年市販されている味噌における微生物学に整えられ，粒味噌はそのまま製品化される。また，的安全性について検討し，次に，次世代シーケンサー

再発酵を防ぐために，必要に応じて酒精（アルコーを用いた細菌叢のメタゲノム解析により，食中毒菌をル）を添加，または加熱殺菌してから包装された後，接種した際の細菌叢の変動や挙動について，明らかに4)製品として販売される 。味噌中には，麹菌，酵母，
静岡県立大学食品栄養科学部〒 422-8526

静岡市駿河区谷田 52-1

Tel/Fax: (054) 264-5526
E-mail: shimamura@u-shizuoka-ken.ac.jp

─ 70 ─

することを目的とした。

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

Table. 1：試験に供した味噌試料

材料および方法

ዢႂɒȰᴾǽ
ዢႂɒȰᴿǽ
ዢᢵՠɒȰᴾዢᢵՠɒȰᴿዢᢵՠɒȰᵀዢᢵՠɒȰᵁዢᢵՠɒȰᵂ

１．試料
各種味噌は，一般社団法人 中央味噌研究所が選定した味噌を用いた。保存温度４℃における味噌中の食中毒菌数の変動については，市販味噌 20 検体（米味噌 15 検体，麦味噌２検体，豆味噌１検体および調合
味噌２検体）を実験に用いた（Table. 1）。保存温度ዢᢵՠɒȰᵃዢᢵՠɒȰᵄ
ዢᢵՠɒȰᵅ
ዢᢵՠɒȰᵆ
ዢᢵՠɒȰᵇዢᢵՠɒȰᵈዢᢵՠɒȰᵉዢᢵՠɒȰᵊ
ំɒȰᴾǽǽ
ᲶɒȰᴾǽǽ
ᲶɒȰᴿǽǽ
ᝩնɒȰᴾǽ
ᝩնɒȰᴿǽ

30℃における味噌中の食中毒菌数の変動，各種味噌中の細菌叢の変動および各種味噌の理化学検査について
は，保存温度４℃における結果をもとに選抜した６種（米味噌３種；米甘みそＡ，米甘みそＢ，米辛口みそＨ，
方法 1；サンプル 200 mg を採取し，ガラスビーズを

豆味噌１種 ; 豆みそＡ，麦味噌１種 ; 麦みそＢ，およ

用いて均質化し，NucleoSpin Food（タカラバ

び調合味噌１種 ; 調合みそＢ）を試料とした。

イオ株式会社）を用いて味噌中に存在する微生物の DNA を抽出・精製した。

２．供試菌株

Staphylococcus aureus C - 29（黄色ブドウ球菌），
Salmonella Enteritidis NBRC3313（サルモネラ）および Escherichia coli JCM2449（大腸菌）を試験に供した。

方法２；サンプル 200 mg に DNA すいすい -F または DNA すいすい-E（株式会社リーゾ）のバッ
ファー溶液を混合し，乳鉢を用いて均質化した。
65℃で１時間インキュベートした後，フェノー
ル・クロロホルム処理にてタンパク質を除去

３．保存温度４℃および 30 ℃における味噌中の食中し，上清をイソプロパノール沈殿で回収した。

毒菌数の変動NucleoSpin Food を用いて味噌中に存在する

各 味 噌 ５g を 50 mL 遠 沈 管 に 入 れ，2,000 × g で微生物の DNA を精製した。

20 秒間遠心し，味噌の表面を平らにしたものを味噌試料とした。これを味噌１種につき３菌株 × 試験日

５．各種味噌中の理化学検査数（４℃；０，１，４，７，14，28 日，30 ℃；０，２，５，

５-１．pH の変化

７日）分の試料を作製した。一晩培養した各供試菌

各味噌試料を 30 ℃で７日間保存し，継時的株の培養液 30 µL を Brain Heart Infusion（BHI）に pH を測定した。各味噌試料５g を 50 mL 遠液体培地（３mL）に接種し，37 ℃で 24 時間振盪培

沈管に入れ，MilliQ 水を最終容量が 50 mL と養（本培養）した。マイクロチューブに各菌体の培養なるように分注し，ボルテックスミキサーで撹

液 1 mL を分注し，4000 × g で 5 分間遠心分離した拌し， 懸濁液を作製した。 pH メーター F - 21

後，phosphate buffered saline（PBS）1 mL を加え，（株式会社 堀場製作所）を用いて，pH を測定

菌懸濁液とした。 菌懸濁液 50 μ L を味噌表面に接種した。

（107 ～ 108 CFU / g ）し，４℃（28 日間）または 30℃（７日間）で保存した。各試験日に，味噌試料の入っ５-２．酸度の変化

た遠沈管に最終容量が 50 mL となるように PBS を加各味噌試料を 30 ℃で 7 日間保存し，継時的

え，ボルテックスミキサーで撹拌した後，PBS で適に酸度（酸の質量パーセント濃度）を測定し宜希釈し，希釈液 100µL を選択培地に塗布した。黄た。各味噌試料５g に MilliQ 水を最終容量が色ブドウ球菌選択培地としてマンニット食塩寒天培地

70 mL となるように分注し，ボルテックスミ

を，サルモネラ選択培地として XLD 寒天培地を，大キサーで撹拌し，懸濁液を作製した。縣濁液

腸菌選択培地として XM - G 寒天培地を用いた。

を 100 ℃で 20 分加熱した後，ろ過した。ろ液
は，MilliQ 水を加えて最終容量を 100 mL とし，

４．各種味噌中の細菌叢の変動

そのうち 10 mL を試験に供した。指示薬とし次世代シーケンサーによるメタゲノム解析を実施て１％フェノールフタレイン溶液を２，３滴加するにあたり，各種味噌からの DNA 抽出法の検討をえ，0.1 N 水酸化カリウム（KOH） 溶液で滴行った。

定し，次式を用いて酸度を算出した。

─ 71 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

酸度（％）＝ 0.009 × a × F × 100 / w

た遠沈管に最終容量が 50 mL となるように PBS を加え，ボルテックスミキサーで撹拌した後，PBS で適宜希釈し，希釈液 100µL を選択培地に塗布した。黄

ａ：滴定に要した KOH 溶液（mL）

色ブドウ球菌選択培地としてマンニット食塩寒天培地

Ｆ：0.1 M KOH 溶液のファクター

を，サルモネラ選択培地として XLD 寒天培地を，大ｗ：サンプルの採取量

腸菌選択培地として XM-G 寒天培地を用いた。
７．評価方法５-３．遊離アミノ酸組成の変化

データは，平均値および標準偏差を算出し，Tukey-

各味噌試料を 30 ℃で７日間保存し，遊離ア

Kramer の多重比較検定法を用いて有意差の検定を実

ミノ酸含有量を測定した。遊離アミノ酸組成分施した。試料 100 g あたりの成分の比較については，

析は，北海道大学創成研究機構 共用機器管理

各試料群の平均値および標準偏差を算出し，両群間でセンター委託分析部門に委託した。各味噌試

等分散性の検定（Ｆ検定）を行い，Student のｔ 検定

料５g に２％スルホサリチル酸 20 mL を加え，により統計学的有意差検定を行った。なお，いずれのボルテックスミキサーで１分間撹拌し，縣濁液場合も有意水準は５％とし，両側検定で実施した。

を調製した。この縣濁液を 3000 × g で 10 分
間遠心分離し，変性タンパク質や脂肪を含まない中間層をさらに 10,000 × g で遠心分離した

結果および考察後，得られた透明層を Amino Acid Analyzer
L - 8900（日立ハイテクノロジーズ）を用いて測１．保存温度 4℃における味噌中の食中毒菌数の変動定した。分析は，カラム（＃ 2622SC - PF（高保存温度４℃における味噌中の食中毒菌数の変動を分離用）（Φ4.6 mm x 80 mm；日立ハイテク

Fig. S1 に示した。全試料中 19 検体で，４℃，28 日

ノロジーズ），フィルターカラム（＃ 2650L（高間の保存期間中における減少は，他の食中毒菌に比べ分離用）（Φ4.6 mm x 80 mm；日立ハイテクて，サルモネラが最も速かった。特に，28 日目にサノロジーズ），溶離液（生体液分析法用緩衝液

ルモネラが検出限界以下（≦ 102 CFU/g）となった

PF セット（関東化学））および反応液（日立

試料は，米味噌２検体（米甘みそＢおよび米辛口み用ニンヒドリン発色溶液キット（和光純薬工そＪ），豆味噌１検体（豆みそＡ）および麦味噌１業））を用い，検出波長 570，440 nm で検出した。

検体（麦みそＡ）であった。これらのうち３検体は，味噌 100 g あたりの食塩含有量が約 10 g であったが，１検体（米甘みそＢ）は 5.5 g であった（Fig. 1）。ま６．加熱処理後の味噌における食中毒菌数の変動
我々は，これまでに，80 ℃で 30 分加熱した塩麹溶

た，28 日目に黄色ブドウ球菌が検出限界以下となっ液においても，食中毒菌の増殖抑制効果が認められるた試料は，豆味噌（豆みそＡ，食塩含有量 9.7 g/100

ことを明らかにしている（データ未発表）。そこで，

g）であった（Fig. 1）。しかし，いずれの試料におい加熱処理した味噌においても食中毒菌の増殖抑制効果ても，大腸菌は検出限界以下にならなかった。一方，が認められるか検討した。各味噌は，オートクレーブ

米味噌３検体（米甘みそＡ，米辛口みそＩおよび米辛を用いて，121 ℃で 15 分間加熱して試験に供した。オー口みそＧ）および調合味噌（調合みそＡ）１検体におトクレーブで加熱した各味噌試料５g を 50 mL 遠沈

いて，28 日目においても 104 CFU/g 以上の菌が生存管に入れ，2,000 × g で 20 秒間遠心し，味噌の表面していた。これらのうち３検体では，味噌 100 g あたを平らにしたものをオートクレーブ加熱処理味噌試

りの食塩含有量が 10 g 以上であったが，１検体（米料とした。これを味噌１種につき３菌株 × 試験日数

甘みそＡ）は 4.9 g（Fig. 2）であった。これらの結果（０，２，５，７日 ) 分作製した。一晩培養した各供試菌より，食中毒菌の死滅速度には，味噌の主原料や食塩

株の培養液 30µL を Brain Heart Infusion（BHI）液

含有量以外の因子が関与していることが推察された。

体培地（３mL）に接種し，37 ℃で 24 時間振盪培養

食中毒菌の死滅速度が速かった４試料（Fig. 1）お（本培養）した。マイクロチューブに各菌体の培養液よび遅かった４試料（Fig. 2）について，試料 100 g

１mL を分注し，4000 × g で５分間遠心分離した後，あたりのタンパク質，脂質，炭水化物および食塩含有

PBS １mL を加え，菌懸濁液とした。菌懸濁液 50 μ量（g）の平均値を Fig. 3 に示した。試料 100 g あた

L を味噌表面に接種 （107 ～ 108 CFU / g ）し，30 ℃

りのタンパク質，炭水化物および食塩含有量において，（７日間）で保存した。各試験日に，味噌試料の入っ食中毒菌の死滅速度が速かった試料と遅かった試料の─ 72 ─

1.E+08⡿⏑ࡳࡑB (⡿, ሷศ: 5.5 g/100 g)

a

b

a
a b
1.E+06 b

c

c

c

c

b

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

中央味噌研究所研究報告

c
c

c

b

1.E+04cb

1.E+02b

1.E+00㇋ࡳࡑA (㇋, ሷศ: 9.7 g/100 g)
1.E+08 a baab

1.E+06

10

20

c

c

c

c

c
c
c

1.E+020b

1.E+06

b

c
bc

c

c

bc

c

c

c

1.E+04cc

1.E+02
c

0

10

c

Day

10

20

30

Day

⡿㎞ཱྀࡳࡑJ (⡿, ሷศ: 12.5 g/100 g)
1.E+08 aa ab
a

c

c

30

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)c1.E+04Day

1.E+00b bc

1.E+000No.39（2018）20

Staphylococcus aureus C-2930

1.E+08 a㯏ࡳࡑA (㯏, ሷศ: 10.9 g/100 g)

a ab ab aba bbbc
1.E+06 b
c

ab
bc

b

c

1.E+04cd

1.E+02c

1.E+00

0

10

Salmonella Enteritidis NBRC3313

Day

20

30

Escherichia coli JCM2449

1.E+06⡿⏑ࡳࡑA (⡿, ሷศ: 4.9 g/100 g)

b ab ab
b
a a
b
a b b
c

c
c
d

Bacterial number (CFU/g)

1.E+08 accd

1.E+04
1.E+02
1.E+00

0

10

Day

20

30

⡿㎞ཱྀࡳࡑG (⡿, ሷศ: 11.7 g/100 g)
1.E+08 a b
1.E+06

a a
a
b

c
a

c

bc
a

a

c
d

a
c

d

e

1.E+04
1.E+02
1.E+000

10DayStaphylococcus aureus C-29

20

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

Fig. 1：味噌中の食中毒菌の死滅速度が速かった試料（保存温度４℃）
Tukey - Kramer test，p < 0.05

30⡿㎞ཱྀࡳࡑI (⡿, ሷศ: 12.2 g/100 g)
1.E+08 a a abab

1.E+06

b

bc

bc

c

c

c

c

c

d

d

c

c

1.E+04c

1.E+02
1.E+00

0

10

Day

20

ㄪྜࡳࡑA (ㄪྜ, ሷศ: 10.4 g/100 g)
1.E+08 aaa

1.E+06

b

b
b

bc
c
c

bc
c
cd

cd
cd

d

cd

d

1.E+04d

1.E+02
1.E+000

Salmonella Enteritidis NBRC3313

10

Day

20

Escherichia coli JCM2449

Fig. 2：味噌中の食中毒菌の死滅速度が遅かった試料（保存温度４℃）
Tukey - Kramer test，p < 0.05

─ 73 ─

30

30

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

間に有意差は認められなかった。一方，脂質含有量

食中毒菌の死滅速度には，味噌の脂質含有量が関与しは，食中毒菌の死滅速度が速かった試料の方が遅かっている可能性が推察された。しかし，今回は，比較した試料に比べて有意に少なかった。これらの結果より，た試料数が少ない（４試料 vs. ４試料）ことから，今後試料数を増やして検討する必要がある。
２．保存温度 30 ℃における味噌中の食中毒菌数の変Death rate

40

Fast

Slow

動
保存温度４℃における味噌中の食中毒菌数の変動のContents per 100 g (g)35

結果より，食中毒菌の菌数減少が速い（米甘みそＢお30

よび豆みそＡ），または遅い味噌（米甘みそＡ）およ25

び試料を米（米辛口みそＨ），麦（麦みそＡ），調合味

20

噌（調合みそＢ）から各１種類の６種を選抜し，保存15＊

温度 30 ℃における食中毒菌の生菌数の変動を調べた

10（Fig. 4）。その結果，サルモネラおよび大腸菌を接種5した全ての試料において７日目までに検出限界以下と0

Protein

Lipid

Carbohydrate

なった（Fig. 4（Ａ）
（Ｂ））。黄色ブドウ球菌を接種しSalt

た米甘みそＡのみが７日目までに検出限界以下に至ら
Fig. 3：食中毒菌の死滅速度と味噌中成分の関係なかった（Fig. 4（Ｃ））が，４℃で保存した際の生菌

Fast；味噌中の食中毒菌の死滅速度が速かった４試料の平均値，Slow；味噌中の食中毒菌の死滅速度が遅かった４試料の平均値．＊p < 0.05

味噌に接種した食中毒菌は，低温条件下（４℃）よりも高温条件下（30 ℃）で生育が抑制されたことから，(B)

1.E+06
1.E+04
1.E+02

1.E+00

1.E+08Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

1.E+08

0

⡿⏑ࡳࡑA
㇋ࡳࡑA

2

4
Day

⡿⏑ࡳࡑB
㯏ࡳࡑB

6

1.E+06
1.E+04
1.E+02
1.E+00

8

0

2

4
Day

6

8

⡿㎞ཱྀࡳࡑH

⡿⏑ࡳࡑA

⡿⏑ࡳࡑB

⡿㎞ཱྀࡳࡑH

ㄪྜࡳࡑB

㇋ࡳࡑA

㯏ࡳࡑB

ㄪྜࡳࡑB

Fig. 4：保存温度30℃における味噌中の食中毒菌数の変化(A) Salmonella Enteritidis NBRC3313，(B) Escherichia coli JCM2449，(C) Staphylococcus aureus C-29．

(C)

1.E+08Bacterial number (CFU/g)(A)

数の推移と比較するとその減少速度が大きくなった。

1.E+06
1.E+04
1.E+02
1.E+00─ 74 ─

0

2

4
Day

6

8

⡿⏑ࡳࡑA

⡿⏑ࡳࡑB

⡿㎞ཱྀࡳࡑH

㇋ࡳࡑA

㯏ࡳࡑB

ㄪྜࡳࡑB

中央味噌研究所研究報告(A)

味噌中に，30 ℃で保存した際に，新たに生成もしく

No.39（2018）

6.0は活性化する成分が存在する可能性が示唆された。過去の報告によると，味噌中に混入した大腸菌の生菌数5.5は，特定の保存条件下では寒天平板法の検出限界以下
pHまで減少することが報告されており 8)，本研究の結果も既報の結果を支持する結果となった。

5.0

３．各種味噌中の細菌叢の変動
4.5

味噌中の DNA を抽出する方法について検討した

02が， い ず れ の 方 法 に お い て も 味 噌 中 微 生 物 由来の4
Dayるまでに至らなかった。今後は，ジルコニアビーズによる破砕方法を使用し，DNA の抽出効率の向上を図(B)る予定である。

0.6

Acidity (%)

４．各種味噌中の理化学検査
選抜した６種（米味噌３種，豆味噌１種，麦味噌
１種および調合味噌１種）を検体として pH の測定を行った（Fig. 5（A））
。その結果，最も高い試料で平均

8

⡿⏑ࡳࡑB
㇋ࡳࡑA
ㄪྜࡳࡑB

⡿⏑ࡳࡑA
⡿㎞ཱྀࡳࡑH㯏ࡳࡑB

DNA は，次世代シーケンシング解析に必要な量を得

6

0.4

0.2

pH5.6（米甘みそＡ），最も低い試料で平均 pH4.9（豆みそＡ）となり，味噌試料間での pH の差が確認され0た。しかし，30 ℃で７日の保存した味噌試料におい0て１日目と７日目で pH の増減は確認されなかったこ2⡿⏑ࡳࡑA⡿㎞ཱྀࡳࡑH㯏ࡳࡑBとから，味噌中における食中毒菌の抑制因子は，pHによるものではないことが示唆された。
酸度については，最も高い試料で平均 0.44％（豆み

4
Day

6

8

⡿⏑ࡳࡑB
㇋ࡳࡑA
ㄪྜࡳࡑB

Fig. 5：保存温度30 ℃における味噌中の（Ａ）pH および（Ｂ）酸度の推移

そＡ），最も低い試料で平均 0.1％（米甘みそＡ）となり，味噌試料間での酸度の差が確認された（Fig. 5（Ｂ））。しかし，30 ℃で７日の保存した味噌試料において１日目と７日目で酸度の増減は確認されなかったことから，味噌中における食中毒菌の抑制因子は，酸化については，Lys，Glu，Phe および Asp の含有量によるものではないことが示唆された。

が約５％上昇したが，Arg の含有量に変化は認めら

アミノ酸含有量については，４℃および 30 ℃で７れなかった（Fig. 6（Ｂ））。上記以外のアミノ酸含有日の保存した試料におけるアスパラギン酸（Asp），

量についても，４℃および 30 ℃で７日保存した試料

トレオニン（Thr），セリン（Ser），グルタミン酸（Glu），

間で差は認められなかった。これらの結果より，味噌

グリシン（Gly），アラニン（Ala），システイン（Cys），

中における食中毒菌の抑制因子は，アミノ酸によるもバリン（Val），メチオニン（Met），イソロイシン（Ile），のではないことが示唆された。

ロイシン（Leu），チロシン（Tyr），フェニルアラニ
５．加熱処理後の味噌における食中毒菌数の変動

ン（Phe），リシン（Lys），ヒスチジン（His），アルギニンおよび NH3 の含有量の変化を調べた。30 ℃でオートクレーブで加熱した味噌試料に各種食中毒菌

７日の保存した試料における抗菌作用を示す Gly おを接種して 30 ℃で７日保存し，継時的に食中毒菌数

よび Ala の含有量の変化については，米甘みそＡのの変動を調べた。その結果，オートクレーブ加熱後のGly，豆みそＡ，麦みそＢおよび調合みそＢの Ala の味噌においても，オートクレーブ加熱していない味噌

含有量が約５％上昇したが，その他の試料では，ア

試料と同様に食中毒菌数が有意に減少した。これらのミノ酸含有量の変化は±５％以内に留まった（Fig. 6

結果より，味噌中に生存している微生物により，食中（Ａ））。また，30 ℃で７日の保存した試料における味毒菌の増殖抑制効果が得られている可能性は低いこと

噌の熟成度を示す指標となる成分として報告されていが推察された。また，食中毒菌の増殖抑制効果を有す

る Lys，Glu，Phe，Arg および Asp9)の含有量の変る物質は，耐熱性であることが示唆された。今後は，

─ 75 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）■ ４℃■ 30 ℃

米辛口みそＨ

麦みそＢ

(A)
2,000

䜰䝭䝜㓟ྵ᭷㔞 (μM)

1,500

1,000

500

調合みそＢ

Glycine

豆みそＡ

米甘みそＢ

米甘みそＡ

調合みそＢ

麦みそＢ

豆みそＡ

米辛口みそＨ

米甘みそＢ

米甘みそＡ

0

Alanine

(B)

■ ４℃

2,500

■ 30℃

䜰䝭䝜㓟ྵ᭷㔞 (μM)

2,000

1,500

1,000

500

Fig. 6：保存温度の違いが味噌中のアミノ酸含有量に及ぼす影響（n=2）(A) 抗菌作用のあるアミノ酸， (B) 味噌の熟成度を反映するアミノ酸．

─ 76 ─

調合みそＢ
麦みそＢ
豆みそＡ
米辛口みそＨ
米甘みそＢ

Lysine

米甘みそＡ

調合みそＢ
麦みそＢ
豆みそＡ
米辛口みそＨ
米甘みそＢ

Phenylalanine

米甘みそＡ

調合みそＢ
麦みそＢ
豆みそＡ
米辛口みそＨ
米甘みそＢ

Glutamic acid

米甘みそＡ

調合みそＢ
麦みそＢ
豆みそＡ
米辛口みそＨ
米甘みそＢ

Aspartic acid

米甘みそＡ

調合みそＢ
麦みそＢ
豆みそＡ
米辛口みそＨ
米甘みそＢ

米甘みそＡ

0

Arginine

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

食中毒菌の増殖抑制効果を有する物質が 30 ℃の保存

ブで加熱後の味噌においても食中毒菌数が有意に減少

期間中に生成するものか，もしくは 30 ℃で活性化すしたことから，食中毒菌の増殖抑制効果を有する物質

る物質であるかについて明らかにする予定である。現は耐熱性であり，味噌中に生存している微生物により在，30 ℃で 10 日間保存した味噌に食中毒菌を接種し食中毒菌の増殖抑制効果が得られている可能性は低い

た後，４℃で保存した場合の食中毒菌数の変動についことが推察された。本研究の成果および今後の更なるて検討している。

研究により，味噌の微生物学的な安全性や品質向上に寄与する新たな成分や因子を見出し，病原性因子の発総現抑制メカニズムを明らかにしていきたいと考えてい括る。

本研究では，近年市販されている各種味噌が食中毒
菌に汚染された際の細菌の挙動に影響を及ぼす因子について検討し，以下のことを明らかにした。

謝辞（１）各種市販味噌に食中毒菌を接種し，４℃で保存

本研究は，一般社団法人中央味噌研究所の研究助成したところ，食中毒菌の死滅速度が速い味噌と遅と試験試料の提供により実施したものです。本研究のい味噌が存在した。その因子については，味噌の遂行に，多大なるご支援を賜りました一般社団法人中主原料や食塩含有量以外の因子が関与しているこ央味噌研究所 常任理事 中野京子氏をはじめ，関係者とが示唆された。

の方々に心より感謝申し上げます。

（２）４℃で保存した際に食中毒菌の死滅速度が速い，
または遅い味噌を 6 試料選抜し，食中毒菌を接種した後，30 ℃で保存したところ，サルモネラお参考文献

よび大腸菌を接種した全ての試料において７日目までに検出限界以下となった。これらの結果より，

１）窪田譲，伊藤公雄，望月務．
：味噌と病原細菌．

日本釀造協會雜誌 ，76(12): 821-826 (1981)．

味噌中に，30 ℃で保存した際に新たに生成もし

２）Hiramoto, S., Itoh, K., Shizuuchi, S., Kawachi, Y.,

くは活性化する成分が存在する可能性が示唆されMorishita, Y., Nagase, M., Kagaya, I.: Melanoidin,

た。
（３）保存温度が味噌の成分に及ぼす影響について明a food protein-derived advanced Maillard reaction

らかにするために，30 ℃における味噌の pH およproduct, Suppresses Helicobacter pylori in vitro

び酸度の変化と，４℃および 30 ℃で保存した味

and in vivo. Helicobacter , 9(5): 429-435 (2004).

噌のアミノ酸含有量の比較を行った。その結果，

３）Onda, T., Yanagida, F., Uchimura, T., Tsuji,

30 ℃，７日間の保存期間中において，味噌の pH

M., Ogino, S., Shinohara, T., Yokotsuka, K.:

および酸度に変化は認められず，４℃で保存した

Widespread distribution of the bacteriocin-

味噌と 30 ℃で保存した味噌のアミノ酸含有量にproducing lactic acid cocci in Miso-paste
products. Journal of applied microbiology , 92(4):ついても大きな差は認められなかった。

695-705 (2002).

（４）オートクレーブ加熱した味噌試料に各種食中毒

４）みその製造法，みそ技術ハンドブック，全国味噌菌を接種して 30 ℃で７日間保存し，継時的に食技術会編集発行，14-32 (1995)．

中毒菌数の変動を調べた。その結果，オートクレー
ブで加熱後の味噌においても，加熱していない味

５）Nam, Y. D., Yi, S. H., Lim, S. I.: Bacterial

噌試料と同様に食中毒菌数が有意に減少した。こdiversity of cheonggukjang, a traditional

れらの結果より，味噌中に生存している微生物に

Korean fermented food, analyzed by barcoded

より，食中毒菌の増殖抑制効果が得られている可

pyrosequencing. Food Control , 28(1): 135-142 (2012).

能性は低いことが推察された。また，食中毒菌の６）Nam, Y. D., Lee, S. Y., Lim, S. I.: Microbial

増殖抑制効果を有する物質は，耐熱性であること

community analysis of Korean soybean pastes byが示唆された。

next-generation sequencing. International Journalof Food Microbiology , 155(1): 36-42 (2012).

本研究の結果より，30 ℃で新たに生成もしくは活７）Kim, Y. S., Kim, M. C., Kwon, S. W., Kim, S.

性化する味噌中の物質により，食中毒菌の増殖が抑制

J., Park, I. C., Ka, J. O., Weon, H. Y.: Analyses of

されていることを明らかにした。また，オートクレー

bacterial communities in meju, a Korean traditional─ 77 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

fermented soybean bricks, by cultivation-based９）Yoshida, H., Yamazaki, J., Ozawa, S.,

and pyrosequencing methods. The Journal of
Microbiology , 49(3): 340-348 (2011).

Mizukoshi, T., & Miyano, H.: Advantage of８）伊藤公雄，今井

学，石神

実，武田

LC-MS metabolomics methodology targeting茂，安平hydrophilic compounds in the studies of

仁美．：味噌熟成過程における添加大腸菌の消長，

fermented food samples. Journal of Agricultural

味噌の科学と技術 ，349: 102-106 (1983)．

and Food Chemistry , 57(4): 1119-1126 (2009).

1.E+06

b ab
a a
b
a b b

c
c
d

b
c

Bacterial number (CFU/g)⡿⏑ࡳࡑA (ሷศ: 4.9 g/100 g)
1.E+08 aabccd

1.E+04
1.E+02
1.E+00

0

10

Day

20

⡿⏑ࡳࡑB (ሷศ: 5.5 g/100 g)
1.E+08 a baa b
1.E+06 b

c

c

c

c

b

c

c

c

b

1.E+04cb

1.E+02
1.E+00

b c

0

10

Day

Staphylococcus aureus C-29

20

1.E+08 a

30⡿㎞ཱྀࡳࡑC (ሷศ: 12.7 g/100 g)

a b
a b
1.E+06 b

1.E+04

bc

c

c

c

c

cd

c

c

d
d

1.E+000

1.E+08 a

10

Day

20

a a
ab
a
1.E+06 bb b

b

c

c

1.E+04

b

b

b

b

b

c

c

1.E+02

1.E+0030⡿㎞ཱྀࡳࡑD (ሷศ: 12.7 g/100 g)

0

Salmonella Enteritidis NBRC3313

10

Day

20

Escherichia coli JCM2449

Fig. S1：保存温度４℃における味噌中の食中毒菌数の変化
Tukey - Kramer test，p < 0.05

─ 78 ─

cc

1.E+0230

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

補足資料

30

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

a

a a
b

1.E+06

b

c

b
c

ab

d

b

c

1.E+04bcc

1.E+020

1.E+08 aaa

1.E+06

10

Day

20

30

⡿㎞ཱྀࡳࡑB (ሷศ: 11.9g/100 g)
b

a b
b ab
c

ab

Bacterial number (CFU/g)

1.E+00Bacterial number (CFU/g)⡿㎞ཱྀࡳࡑA (ሷศ: 11.5 g/100 g)
1.E+08 a b
c

c

b
c

b

b

c

c

1.E+04c

1.E+02

1.E+081.E+06

0

10

Day

20

30

⡿㎞ཱྀࡳࡑG (ሷศ: 11.7 g/100 g)

a
b
a a
a
b

c
a
c

bc
a

a
c
d

Bacterial number (CFU/g)

1.E+00acde

1.E+04
1.E+02
1.E+00

0

10

Day

20

30

⡿㎞ཱྀࡳࡑH (ሷศ: 12.2 g/100 g)
1.E+08 a ab a
1.E+06a aab

1.E+04

bc

bc

bc

c

c

bc

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

森戸知沙希

c

bc

b

c

c

1.E+02
1.E+000

10DayStaphylococcus aureus C-2920

30⡿㎞ཱྀࡳࡑF (ሷศ: 13.2 g/100 g)
1.E+08 a a
a

ab
a
bcd
a ab
1.E+06 b bd cb

1.E+04

bcd

d

b

d
b

1.E+02b

1.E+00

0

10

20

Day

⡿㎞ཱྀࡳࡑE (ሷศ: 11.7 g/100 g)
1.E+08 a baaa ab
1.E+06 bbcbcb

1.E+04

c

c

c

c

c
b

b

1.E+02b

1.E+00

0

10

20

Day

30

⡿㎞ཱྀࡳࡑK (ሷศ: 11.7 g/100 g)
1.E+08 a b
d
a
a

b

1.E+06

b

cd

c

c
c

1.E+04

c

c

d
d

c
c

c

1.E+02
1.E+00

0

10

Day

20

30

㇋ࡳࡑA (ሷศ: 9.7 g/100 g)
1.E+08 a baa

1.E+06

b

b bc

c

c

c

c

c

1.E+04ccc

1.E+02

1.E+00ccc

0Salmonella Enteritidis NBRC3313

10

Day

20

Escherichia coli JCM2449

Fig. S1（続き）：保存温度４℃における味噌中の食中毒菌数の変化
Tukey - Kramer test，p < 0.05

─ 79 ─

30

30

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）ab

1.E+06

b

bc

bc

c

c

c

c

c

d

d

c

c

1.E+04Bacterial number (CFU/g)⡿㎞ཱྀࡳࡑI (ሷศ: 12.2 g/100 g)
1.E+08a a abc

1.E+02
1.E+00

0

10

Day

20

b

1.E+06

b

c

c

bc

bc

c

c

c

c

1.E+04Bacterial number (CFU/g)⡿㎞ཱྀࡳࡑJ (ሷศ: 12.5 g/100 g)
1.E+08 aa abacc

1.E+02c

1.E+00

0

10

Day

c

20

30

1.E+06

b
a b
b bc
bc

1.E+04

c

c

c

c

c

c

Bacterial number (CFU/g)㯏ࡳࡑB (ሷศ: 10.4 g/100 g)
1.E+08 a a
a

c

c
c

1.E+02
1.E+00

0

10

Day

20

a

1.E+06a bab

1.E+04

b

b

bc

c

c

b

b

bc

c

c

c

1.E+02
1.E+000

10DayStaphylococcus aureus C-29

20

30

ㄪྜࡳࡑA (ሷศ: 10.4 g/100 g)aa

1.E+06

b

b
b

bc
c
c

bc
c
cd

cd
cd

d
d

1.E+02
1.E+00

0

10

Day

20

30

㯏ࡳࡑA (ሷศ: 10.9 g/100 g)
1.E+08 aa ab ab ab
a b
b
bc
b
1.E+06
c

ab
bc

b

c

1.E+04cdc1.E+02
1.E+00

0

10

Day

20

30

ㄪྜࡳࡑB (ሷศ: 11.9 g/100 g)
1.E+08 a b
ac
a
ab
a ab
b
ac ab
b b

1.E+06acb

1.E+04acbb

1.E+02b

1.E+00

0

10

Day

20

30

⡿㎞ཱྀࡳࡑM (ሷศ: 12.2 g/100 g)
1.E+08 a a a aba1.E+06b

1.E+04

b

b

c
b

b

c

b

b
c

b

b
c

1.E+02
1.E+000

Salmonella Enteritidis NBRC3313

10

Day

20

Escherichia coli JCM2449

Fig. S1（続き）：保存温度４℃における味噌中の食中毒菌数の変化
Tukey - Kramer test，p < 0.05

─ 80 ─

dcd

1.E+0430⡿㎞ཱྀࡳࡑL (ሷศ: 12.0 g/100 g)
1.E+08 a aab

1.E+08 a30

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

Bacterial number (CFU/g)

森戸知沙希

30

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

森戸知沙希
Table. S1 - 1：４℃で保存した試料と30 ℃で７日のTable. S1-2：４℃ で保存した試料と30 ℃で７日の保存した試料におけるアミノ酸含有

保存した試料におけるアミノ酸含有量の比較（米甘みそＡ）

量の比較（米甘みそＢ）

Áóð
Ôèò
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´³²®·
´±®±
±···®µ³°³®·（単位：μＭ）（単位：μＭ）

Table. S1 - 3：４℃で保存した試料と30 ℃で７日のTable. S1-4：４℃ で保存した試料と30 ℃で７日の保存した試料におけるアミノ酸含有

保存した試料におけるアミノ酸含有量の比較（米辛口みそＨ）

量の比較（豆みそＡ）

Áóð
Ôèò
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（単位：μＭ）ᴱƇ

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─ 81 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

森戸知沙希
Table. S1 - 5：４℃で保存した試料と30 ℃で７日のTable. S1-6：４℃ で保存した試料と30 ℃で７日の保存した試料におけるアミノ酸含有

保存した試料におけるアミノ酸含有量の比較（麦みそＢ）

量の比較（調合みそＢ）

Áóð
Ôèò
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Íåô
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（単位：μＭ）

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±±³®¹
²±´³®·¶¹µ®³（単位：μＭ）

─ 82 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

研 究 報 告味噌による免疫系の活性化を介したがん予防

永尾雅哉

Cancer prevention through activation of innate immunity
by compounds in Miso

Masaya NAGAO
Division of Integrated Life Science,
Graduate School of Biostudies, Kyoto University,
Kitashirakawa-Oiwake-cho, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8502, Japan.

【要旨】

【目的】

味噌の原料の大豆に含まれるイソフラボン類が，樹大豆イソフラボンが，樹状細胞からの NK 細胞活状細胞からのナチュラルキラー（ N K ）細胞活性化因

性化因子である IL-12 の産生を促進することで，間子であるインターロイキン- 12（IL - 12）産生を促進

接的に NK 細胞が活性化され，がん予防につながるすることで，間接的に自然免疫系を活性化する可能性

可能性について検討することを目的とした。

を考えて，その確認を試みた。単球系の細胞株である
THP - 1 細胞をホルボール 12 -ミリステート 13-アセテート（ P M A ）とインターロイキン- 4（ I L - 4）で【方法】

樹状細胞様の細胞に分化させた細胞系を用いて，イソ
フラボン類の IL - 12 産生誘導能を観察した。その結IL-12 測 定：96 穴 プ レ ー ト に 20 ng/ml PMA，果，ゲニステインには IL - 12 産生誘導能はなかったが，20 ng/ml ヒト組換え型 IL-4，10 ％ ウシ胎児血清

ダイゼインは IL - 12 の産生を用量依存的に促進するを含む RPMI1640 培地に 1.1 x 105 cells/ml で分散

ことが明らかになった。その他のイソフラボン類にさ せ た THP-1 細 胞 を 100 μl 播 種 し， ５ ％ CO2 存

ついても検討したところ，バイオカニンA には IL-12

在下，37 ℃で 96 時間培養して樹状細胞様に分化誘産生誘導能はなかったが，フォルモノネチンには観察導させ，リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で３回洗浄された。IL - 12 は N K 細胞活性化因子であり，大豆後，1 mg/ml のオボアルブミンと被験サンプルを含イソフラボンのダイゼインをはじめ，ある種のイソフ

み，PMA，IL-4 を含まない上記培地を 100μl 加えラボン類は，IL - 12 の産生誘導を介して，自然免疫系て，72 時間培養した。培養後，プレートを 1,000 rpm，を活性化して，がん予防につながる可能性が示唆され４℃で，５分間遠心し，上清 70μl を回収した。培養た。

上清中の IL-12 量は，ヒト IL-12 測定キット（Cisbio）
を用いて測定した。なお，ポジティブコントロールとしては，リンゴプロシアニジン（アサヒビールより入手）を用いた。

京都大学大学院生命科学研究科生体情報応答学分野〒 606-8502

京都市左京区北白川追分町

Tel: (075) 753-6271
E-mail: mnagao@kais.kyoto-u.ac.jp

─ 83 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

N K 活 性 測 定：2.5 x 105 cells / well（1.25 ml / 12

【結果】

well plate）の N K 細胞株 KHYG - 1 を 100 IU /ml のIL - 2（WAKO）と 10％ウシ胎児血清を含む RPMI

PMA と IL-4 により樹状細胞様に分化した THP-1

1640 培地で，被験物質を添加して 24 時間前処理を細胞に，大豆に含まれるイソフラボンであるダイゼイ

行った。ポジティブコントロールとしては，フラボノ

ン，ゲニステイン，グリシテインと，ひよこ豆などにイドの一種であるノビレチン（東京化成工業）を 30μ多く含まれるイソフラボンのフォルモノネチン，バイ

M になるように添加した。一方，標的となる白血病細オカニンＡを添加して培養したところ，ダイゼインと胞 株 K562 は PBS で 洗 浄 後，10μg / ml の calcein-

フォルモノネチンでは用量依存的な IL-12 の産生促

AM を含む血清を含まない RPMI 1640 培地で，30 分

進が見られるのに対して，ゲニステイン，グリシテイ

間遮光して室温で緩やかに混和し，PBS で洗浄後，ン，バイオカニンＡでは産生促進効果は見られなかっ

１％のウシ血清アルブミンを含み，フェノールレッド

た（図１）。

を含まない R P M I 1640 培地（アッセイ培地）を加え

なお，前年度にゲニステインは直接 NK 細胞を活て，96 well plate に 100 μl ずつ，1 x 104 cells / well性化しないことを，NK 細胞株の KHYG-1 の白血病になるように播種した。前述の被験物質で処理した細胞株 K562 への細胞傷害性を見る系で示したが，ダKHYG - 1 細 胞 を 96 well plate に 100μl ず つ，1 x

イゼイン，グリシテイン，フォルモノネチンも同様に

4

10 cells / well になるように，先ほど播種した K562

NK 細胞を活性化しないことを，同じ系で確認した

細 胞 の 上 に 添 加 し た（K 562 : KHYG - 1 ＝ 1：1）。

（図２）。

37 ℃，５％ CO2 条件下で４h 培養後，上清の calceinの量をプレートリーダー PowerScan 4（ DS Pharma
Biomedical） で 測 定 し た（excitation / emission ＝
485 nm / 538 nm）。

900
800

*

*

**

**

***

700

IL-12（ng /ml）

600
500
400
300
200
100
0

2

10

50

2

10

50

2

10

50

2

10

50

2

10

50 （μM）

50-

AP（μg/ml）
ゲニステイングリシテイン

ダイゼイン

フォルモノネチン

バイオカニンＡ

図１．各種イソフラボン類による樹状細胞様に分化させた THP-1 細胞からの IL-12 産生（ｎ＝３，mean ± SD，*ｐ＜0.05，**ｐ＜0.01，***ｐ＜0.001）

─ 84 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

5

5

70

Cytotoxicity（％）

60
50
40
30
20
10
0

30
ノビレチン

-

0.5

5

0.5

ゲニステイン

ダイゼイン

0.5

（μM）

フォルモノネチン

図２．NK活性に対するイソフラボン類の効果
ノビレチンはポジティブコントロール。イソフラボン類（ゲニステイン，ダイゼイン，フォルモノネチン）には NK 活性促進能はない。（ｎ＝３）

ゴプロシアニジンを用いた 3)。その結果，ダイゼイン【考察】によって，樹状細胞様に分化した THP-1 細胞からの信州大学の大谷元教授（現・名誉教授）らのグルー

IL-12 産生が促進されたが，ゲニステインにはその活プにより，無塩味噌粉末（正確には塩を含まないも性がなかった（図１）。そこで，その他の大豆イソフのは味噌と呼ばない）を C3H / HeN マウスに投与す

ラボンであるグリシテイン，ならびに，ひよこ豆に多ると，脾臓中の免疫関連細胞である IL - 12+CD11b+

く含まれるイソフラボンであるフォルモノネチン，バ+

1)細胞，CD49b 細胞が増えることが示されていた 。

イオカニンＡについても IL-12 産生誘導能を観察しCD49+ 細胞は主に自然免疫系の N K 細胞と考えられ，たところ，フォルモノネチンにのみ活性が認められた大豆に含まれる成分が直接 N K 細胞の活性化に関わっ（図１）。イソフラボン類の構造と樹状細胞様の細胞かている可能性が考えられた。そこで，前年度に味噌らの IL-12 産生能との構造活性相関から，Ａ環の５の原料である大豆に含まれる成分として，イソフラ位に水酸基がないダイゼインやフォルモノネチンには

ボン類の一種のゲニステインに着目し，N K 細胞株

IL-12 産生促進能があるが，この位置に水酸基がある

K H Y G - 1 の白血病細胞株 K 562 に対する傷害性で評

ゲニステイン，バイオカニンＡでは活性がなくなるこ

価する系 2) で検討したが，残念ながら N K 細胞の直とが分かった。また，ダイゼインのＡ環の６位にメト接的な活性化は見られなかった。また本年は，大豆のキシ基が加わったグリシテインでは，ダイゼインで見主要なもう一つのイソフラボンであるダイゼインにつられた活性が消失することが明らかになった（表１）。

いても同様の実験を行ったが，ゲニステインと同様にダイゼインやフォルモノネチンは何に作用して IL-12

活性化は見られなかった（図２）。そこで，無塩味噌の産生を促進するかについては今後の検討課題であ++粉末で IL - 12 CD11b 細胞が増加することに着目し，る。Ａ環の５位に水酸基があるゲニステインも，このCD11b+ 細胞に分類されるマクロファージや樹状細胞

位置に水酸基がないダイゼイン（表１）も，例えばエからの，N K 活性化因子である IL - 12 の分泌を促進

ストロゲン受容体（ER）（特に ERβ）を介して，エすることで，大豆イソフラボンが間接的に N K 細胞

ストロゲン様の活性を示すことが知られており 4)，こを活性化する可能性について検討することにした。今の樹状細胞様の細胞からの IL-12 産生誘導では，ダ

回は，信州大学の中村宗一郎教授らが開発した，単球

イゼインは IL-12 産生誘導活性があるものの，ゲニ系の細胞株である T H P - 1 細胞を P M A と IL - 4 で樹

ステインには活性が見られないのとは全く対照的であ状細胞様に分化させた細胞系で，オボアルブミン刺り，IL-12 産生誘導に関わるダイゼインの標的はエス

激下での IL - 12 産生に及ぼすイソフラボン類の効果

トロゲン受容体とは異なるのではないかと予想されを検討した。なお，ポジティブコントロールとしてる。

は，この論文で IL-12 産生誘導能が示されていたリン─ 85 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

表１．イソフラボン類と IL- 12 産生誘導能
㻵㻸㻙㻝㻞⏘⏕
ㄏᑟάᛶ【参考文献】

໬䚷ྜ䚷≀
㻴㻻

１）
Karasawa K, Sugiura Y, Kojima M, Uzuhashi Y,

㻴㻻

㻻

㻻

and Otani H. (2013): Fermented soybean powder
with rice mold in the absence of salt stimulates

㻻㻴 㻻

㻻㻴

㻻㻴

䝀䝙䝇䝔䜲䞁䞊㻴㻻㻻

the cellular immune system and suppresses the㻻㻯㻴㻟䝞䜲䜸䜹䝙䞁䠝

humoral immune response in mice. J Nutr Sci

㻻Vitaminol 59, 564-569.
㻴㻟㻯㻻㻻２）Nagahama K, Eto N, Shimojo T, Kondoh㻻㻴䜾䝸䝅䝔䜲䞁㻴㻻䠇T, Nakahara K, Sakakibara Y, Fukui K, and㻻㻴㻻

Suiko M. (2015): Effect of kumquat (Fortunella㻻crassifolia) pericarp on natural killer cell activity
㻻

䝎䜲䝊䜲䞁

㻻㻴

㻻

䝣䜷䝹䝰䝜䝛䝏䞁

in vitro and in vivo. Biosci Biotechnol Biochem㻻㻯㻴㻟

79, 1327-1336.
３）Katayama S, Kukita T, Ishikawa E,
Nakashima S, Masuda S, Kanda T, Akiyama
H, Teshima R, and Nakamura S. (2013): AppleIL - 12 は N K 細胞活性化因子として知られている

polyphenols suppress antigen presentation ofため 5)，本研究では大豆イソフラボンのダイゼインが，ovalbumin by THP-1-derived dendritic cells. Food

樹状細胞などからの IL - 12 の産生を誘導することで，Chem 138, 757-761.

自然免疫系の N K 細胞を活性化して，がん予防につ

４）An J, Tzagarakis-Foster C, Scharscmidt TC,

ながる可能性が示唆された。IL - 12 は Th1 細胞を増Lomri N. and Leitman DC. (2001): Estrogen

やす形で，腸管の Th1 / Th2 バランスを制御すること

receptor β -selective transcriptional activity andで，アレルギーの制御に関わっている可能性が示唆さ

recruitment of coregulators by phytoestrogen. J

れており 6)，ダイゼインによる，IL - 12 の産生制御は，Biol Chem 276, 17808-17814.

腸管免疫系の制御にも重要なのかも知れない。

５）Trinchieri G. Immunobiology of Interleukin-12.
(1998): Immunol Res 17, 269-278.
６）Sergio R.(2004): Immunologic influences onallergy and the TH1/TH2 balance. J Allergy Clin

【謝辞】

Immunol 1113, 395-400.

本研究は，平成28年度一般社団法人中央味噌研究所
研究助成のご支援を頂きました。厚く御礼申し上げます。

─ 86 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

研 究 報 告味噌のフィターゼ特性を活用した
フィチン酸低減化技術の開発

中川良二

Technical development for reduction of the phytic acid by phytase from Miso

Ryoji NAKAGAWA
Hokkaido Research Organization, Food Processing Research Center,589-4 Bunkyodai Midori-Machi, Ebetsu, Hokkaido, 069-0836, Japan.

Ⅰ較的多く，特に大豆は乾燥重量 100 g あたり 3.2 mg

緒言

含まれ，牛や鶏のレバーに匹敵することから，亜鉛供

亜鉛はヒトの健康や栄養バランスの維持に重要な必給素材として期待される。

須微量元素であり，欠乏すると味覚異常，免疫機能低

しかし，植物性食品である大豆には，亜鉛をはじ

下および創傷治癒力低下等を招くなど人体に重篤な影め，カルシウム，鉄，銅などの必須ミネラルの吸収を響を与える 1)。最近の試算では，世界人口の実に 25％阻害するフィチン酸が多く含まれていること 6) が知ら

2), 3)があり，亜鉛欠乏れており，吸収率を高めるためには，フィチン酸を十を予防することは，健康社会の実現のため重要な要素

分に取り除くことが不可欠である。実際に，塩酸抽出のーつとなっている。このことから，平成14年に厚生等によりフィチン酸が除去された分離大豆タンパク質

労働省が栄養機能食品成分として亜鉛を追加し，また，では，亜鉛の吸収効率が改善されることが報告されて平成16年には文部科学省により給食中亜鉛含量の目標

いる 7)。

が亜鉛欠乏傾向にあるとの報告

値を設定するなど，国による対策も講じられている。

大豆発酵食品では，フィチン酸は発酵過程中に微生

我が国の食事摂取基準においては，一日あたり成人物が持つフィチン酸分解酵素（フィターゼ）により分

男性は 10 mg，女性は 8 mg（妊婦や授乳婦は数 mg

解されることが報告 8) されており，優れた亜鉛供給食

4)の付加）の亜鉛を摂取することが推奨されている が，品として期待される。味噌では，主に麹由来のフィター

現状では充足されていない。また，通常の食事に含まゼが大豆中のフィチン酸に作用し，これを分解するこれる亜鉛の消化管での吸収効率は 30％前後と低い 5)。

とが示唆されている 9) が，フィチン酸の分解に関与すしたがって，必要量の亜鉛を充足させるには食事中のるフィターゼの種類が特定されていない。そこで，本亜鉛量を高めることや，消化管での亜鉛吸収効率を高研究では味噌および原料中のフィターゼを精製し，幾めることが要求される。

つかの化学的性質を明らかにするとともに，味噌の試亜鉛を多量に含む代表的な食材は，牡蠣，ホヤなど

作をとおして効果的なフィチン酸低減化技術に繋がる魚介類や豚レバーなどの動物性食品があげられるが，基礎データの取得を目指した。

これらは日本人の食生活習慣から日常的に摂取することが難しい。また，植物性食品では豆類や種実類に比地方独立行政法人北海道立総合研究機構
Tel: (011) 387-4122

食品加工研究センター〒 069-0836

Fax: (011)387-4664

E-mail: nakagawa-ryoji@hro.or.jp

─ 87 ─

北海道江別市文京台緑町 589-4

中央味噌研究所研究報告

ⅡNo.39（2018）られた上清は 50mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）

味噌および味噌原料のフィターゼ活性で透析し，これを粗酵素液とした。

１．目的
味噌のフィチン酸含有量が他の大豆製品と比較して

２）タンパク質量の測定少ないことは幾つかの報告 9), 10) があり，フィターゼの粗酵素液のタンパク質は Bradford 試薬（TaKaRa

関与が示唆されている。麹のフィターゼについては

Bradford Protein Assay Kit，タカラバイオ）を用い，

Fujita らの報告があり，麹の液体培養物からフィター

試薬に添付された説明書に準じて測定した。BSA 標

11)

ゼを見出し，特性を調べている 。一方，味噌は麹の準溶液の検量線から濃度を求めた。

ほか，大豆も原料としており，大豆からもフィターゼが分離されている12)。また，麹の原料である米由来フィ３）フィターゼ活性の測定

ターゼに関する報告も出されている 13)。味噌の原料で2 mM フィチン酸を含む 20 mM 酢酸緩衝液（pHある大豆や米は蒸煮処理を行うことから，酵素はほぼ5.2）に同量の粗酵素液を加え，40℃，60分間インキュ

失活していると考えられるが，味噌におけるフィター

ベーションした。生成した無機リン酸をホスファ C-

ゼの由来は明らかにされていない。

テストワコー（和光純薬工業）にて，試薬に添付されそこで，本実験では味噌とその原料である大豆，米，た説明書に準じて定量した。フィターゼ活性は１分間

麹のフィターゼ活性を調べるとともに，味噌の原料でに 1μM のリン酸の生成する酵素量を 1 U と定義した。

ある米および大豆については蒸煮前後のフィターゼ活性についても調べた。

３．結果および考察
米，大豆，麹および味噌（３点）は全てフィターゼ活

２．実験方法性を有していた（図１）。しかし，米は蒸煮すること

１）粗酵素液の調製で活性が減少し，大豆はほぼ活性を失った。麹は高い大豆（道産大豆「ユキホマレ」）および米（市販の活性を有していた。３点の味噌については，活性に約食用米）は一晩，2.5 倍量の水に浸漬した。蒸煮は３倍の差が見られた。

オートクレーブで 95 ℃，30 分間で行った。余分な水

これらの結果から，味噌のフィターゼ活性は主に麹分を除き，氷冷した抽出バッファー（20 mM CaCl2,由来であろうと推察されるが，米由来フィターゼが残1 mM DTT，1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride

存している可能性も考えられる。

を含む 100 mM 酢酸緩衝液，pH 5.5）を加え，ホモ
ジナイザーで破砕した。米麹（市販の味噌用）および味噌（試験試作したもの）は同抽出バッファーを

Ⅲ 味噌および味噌原料のフィターゼ精製

加え，同様に破砕した。全てのサンプルは遠心分離

１．目的（10,000 rpm，20 分，4 ℃）し，上清を回収した。得

味噌のフィターゼ活性は，主に麹由来であろうと推察されたが，米由来フィターゼが残存している可能性
ゼの由来を明らかにするには，味噌のフィターゼを精製するとともに，大豆や麹等の原料由来フィターゼを5,000

精製し，その性質を比較する必要がある。そこで，本
4,000

実験では味噌および大豆，米，麹からフィターゼの精3,000製を試みた。

2,000

２．実験方法１）サンプル

1,000

大豆（道産大豆「ユキホマレ」），米はタンパク質の
-3

-2

iso

味噌株式会社）を用いた。味噌は蒸煮後の大豆に米麹

m

iso

-1
m

i

iso

ko
j

m

e
y

多い玄米（道産米「ゆきぴりか」），麹は生麹（北海道（10割）と食塩（終濃度 12％）を加え，８日間，30 ℃

st

ea

m

ed

so

so

y

ric

ric

e

e
ric
ra

w

ed
m

ea

ra

w

ric

e

0

st

Phytase activity（U/ mg protein）

も考えられた。したがって，味噌の含まれるフィターで発酵させた発酵初期段階のものを用いた。これは，図１．味噌原材料および味噌のフィターゼ活性

味噌では発酵経過とともにタンパク質が分解され，低─ 88 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

分子化することが示されている 14) ことから，当初の（東ソー），Toyoperl HW55S ゲル濾過クロマトグラ

フィターゼに近い構造を維持しているものを調べるた

フィー（東ソー），ConA アフィニティークロマトグ

め比較的短期間発酵した味噌を用いることとした。

ラフィー（アガロース固定化ゲル，J-オイルミルズ）の手順で精製した。各フラクションについて，280

２）フィターゼの精製

nm の吸光度およびフィターゼ活性を測定した。

Ⅱ２．１）に記した手順で粗酵素液を調製し，これクロマトグラフィー後のフィターゼ活性画分は必要に硫酸アンモニウムを 80％飽和として加え，沈殿をに応じてアミコンウルトラ（10 K，Merck Millipore）

20 mM 酢酸緩衝液（pH5.2）に溶解し , 同緩衝液にを用いて濃縮した。

対して24時間透析した。透析後，Toyoperl DEAE650 M イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー（ 東 ソ ー），３）タンパク質量およびフィターゼ活性の測定

500
0

0

0

10

3

1,500

2

1,000

1

500
2

3

4

5

6

0

OD 280 nm

2,000

Phytase activity（U/mL）

OD 280 nm

4

1

100
50

0

1

2

3

4

5

6

0

1,500

2

1,000

1

500
0

10

200
100

0.0

1

2

3

4

5

6

20

30

40

50

60

0

250

3

200
2

150
100

1

50
0

0

10

20

30

40

50

60

0

0.6

OD 280 nm

300

Phytase activity（U/mL）

OD 280 nm

400

0.2

0.2

0.6
0.4
0.2

0

0.6
0.4
0.2

Fraction No.
500

0.4

0

3

Fraction No.
0.6

60

2,000

0

OD 280 nm

150

Phytase activity（U/mL）

OD 280 nm

200

1

50

Fraction No.
250

2

40

4

Fraction No.
330

Fraction No.

Fraction No.

020

NaCl conc.（M）7

0.4

NaCl conc.（M）

5 6

0.6

500
400

0.4

300
200

0.2
0.0

100
0

10

20

30

40

50

60

0

0.6
0.4
0.2

NaCl conc.（M）1 2 3 4Phytase activity（U/mL）

0

500

1

Phytase activity（U/mL）

1

1,000

2

NaCl conc.（M）23Phytase activity（U/mL）

1,000

1,500

Phytase activity（U/mL）

OD 280 nm

3Ⅱ２．２）および３）を参照のこと。

4

OD 280 nm

1,500

4

Phytase activity（U/mL）

Toyoperl SP - 650 M イオン交換クロマトグラフィー

Fraction No.

Fraction No.

図２．DEAE - 650M イオン交換クロマトグラフィーによるフィターゼの精製
上から大豆，玄米，麹および味噌由来フィターゼのクロマトグラム，●；280 nm 吸光度，ǫ；フィターゼ活性

─ 89 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

４）SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動

３．結果および考察

電気泳動はコンパクト PAGE・ツイン- R（アトー）

１）DEAE-650M イオン交換クロマトグラフィー

を使い，泳動ゲルは c -パジェル（ゲル濃度：5 -20％，

DEAE-650 M イオン交換クロマトグラフィー（5.0アトー），タンパク質染色はクマシーブリリアントブ

× 12.5 cm，250 mL）は 20 mM Tris - HCl 緩衝液（pH

ルー（イージーステインアクア，アトー）を用いて行っ8.0）で平衡化し，非吸着画分は同緩衝液で溶出（50た。分子量マーカーは SDS - PAGE 用イージースタン

mL/ 画分）した。吸着画分は 0.2 ～ 0.6 M NaCl の直ダード（アトー）を用いた。

線濃度勾配（500 mL）で溶出（１分 / 画分）した（図２）。玄米のフィターゼ活性は吸着画分のフラクショ
ン No.25-26 にピークがあった。大豆，麹および味噌

400

0.2

200

6

0

0.0

0

10

20

150
100

0.05

50
0.00

1

2

3

4

5

6

0

200
0.10

150
100

0.05
0.00

50
0

10

20

30

20
10

0.0

1

2

3

4

5

6

0

20

0.01
0.00

10
1

2

3

4

5

6

0

40
0.2

30
20

0.1
0.0

0

OD 280 nm

30

Phytase activity（U/mL）

OD 280 nm

40

0.02

60

0.6
0.3
0

10
0

10

20

30

40

50

60

0

0.6
0.3
0

Fraction No.
50

0.03

50

50

Fraction No.
0.04

40

0.3

OD 280 nm

30

Phytase activity（U/mL）

OD 280 nm

40

0.1

0

Fraction No.
50

0.2

0

250

Fraction No.
0.3

60

0.15

OD 280 nm

200

Phytase activity（U/mL）

OD 280 nm

250

0.10

50

Fraction No.

Fraction No.
0.15

40

30

NaCl conc.（M）5

0.3

NaCl conc.（M）

4

200

0.6

0.05

50

0.04

40

0.03

30

0.02

20

0.01

10

0.00

0

10

20

30

40

50

60

0

0.6
0.3
0

NaCl conc.（M）3

0.2

Phytase activity（U/mL）

2400

Phytase activity（U/mL）

1

0.4

Phytase activity（U/mL）

0.0

600

NaCl conc.（M）

0.4

0.6

Phytase activity（U/mL）

600

OD 280 nm

0.6

Phytase activity（U/mL）

OD 280 nmの各フィターゼ活性はほぼ同様に吸着画分のフラク

Fraction No.

Fraction No.

図３．SP - 650M イオン交換クロマトグラフィーによるフィターゼの精製
上から大豆，玄米，麹および味噌由来フィターゼのクロマトグラム，●；280 nm 吸光度，ǫ；フィターゼ活性

─ 90 ─

中央味噌研究所研究報告

ション No.28 - 30 にピークがあった。それぞれの最大

No.39（2018）

３）HW55S ゲル濾過クロマトグラフィー

活性フラクションを集め，次のクロマトグラフィーに

HW55S ゲル濾過クロマトグラフィー（2.5 × 102

供した。

cm，500 mL）は 0.5 M NaCl を含む 20 mM 酢酸緩衝液（pH5.2）で平衡化し，供試試料は同緩衝液で溶出（20２）SP-650M イオン交換クロマトグラフィー

分 / 画分）した（図４）。玄米 - 1 ，大豆，麹およびSP - 650 M イオン交換クロマトグラフィー（5.0 × 12.5

味噌由来フィターゼ活性はフラクション No.50 付近

cm，250 mL） は 20 mM 酢 酸 緩 衝 液（pH 5.2） で 平にピークがあった。玄米 - 2 のフィターゼ活性はフラ衡化し，非吸着画分は同緩衝液で溶出（50 mL / 画分）

クション No.53-54 にピークがあった。それぞれの最した。吸着画分は０～ 0.6 M NaCl の直線濃度勾配

大活性フラクションを集め，次のクロマトグラフィー（500 mL）で溶出（１分 / 画分）した（図３）。玄米に供した。

由来フィターゼは吸着画分の No.28 - 29 と No.62-63にピークがあった（それぞれ玄米 - 1 ，玄米 - 2 とする）。

４）ConA アフィニティークロマトグラフィー

着画分にピークがあった。それぞれの最大活性フラク量；1 mL）は TBS（トリス緩衝生理食塩水，pH7.4）

ションを集め，次のクロマトグラフィーに供した。

で 平 衡 化 し， 非 吸 着 画 分 は 同 溶 液 で 溶 出（5 mL，

0.3

300

0.2

200

0.1

100

0

10

20

30

40

50

60

70

200
150

0.008

100

0.004

0

0.000

50

0

10

20

Fraction No.

OD 280 nm

100

0.004

50

10

20

30

40

50

60

70

OD 280 nm

150

0.008

Phytase activity（U/mL）

200

0

0

0.06

100

0.04
50

0.02

20

30

40

0
70

50

25

0.8

20

06

15

0.4

10

0.2

5
0

10

20

30

40

50

60

0
70

60

Phytase activity（U/mL）

OD 280 nm

150

10

60

Fraction No.

0.08

0

50

1.0

0.0

Fraction No.

0.00

40

Fraction No.

0.012

0.000

30

Phytase activity（U/mL）

0.0

0.012

OD 280 nm

400

Phytase activity（U/mL）

0.4

Phytase activity（U/mL）

ConA アフィニティークロマトグラフィー（充填OD 280 nm

一方，大豆，麹および味噌の各フィターゼ活性は非吸070Fraction No.

図４．HW55S ゲル濾過クロマトグラフィーによるフィターゼの精製
上左から大豆，玄米 - 1 ，玄米 - 2 ，麹および味噌由来フィターゼのクロマトグラム，●；280 nm 吸光度，ǫ；フィターゼ活性

─ 91 ─

No.39（2018）

0.08

10
0.04

0.00

5

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

20

0.04

OD 280 nm

15

0.05

15

0.03
10
0.02
5

0.01

0

0.00

1

2

3

Fraction No.

0.04
10

0.02

3

4

5

6

7

7

8

9 10

0

8

9 10

60
50

0.03

OD 280 nm

20

Phytase activity（U/mL）

OD 280 nm

0.06

2

6

0.04

30

1

5

Fraction No.

0.08

0.00

4

Phytase activity（U/mL）

20

Phytase activity（U/mL）

OD 280 nm

0.12

40

0.02

30
20

0.01

0

0.00

10
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Phytase activity（U/mL）

中央味噌研究所研究報告

0

Fraction No.

Fraction No.

図５．ConA アフィニティークロマトグラフィーによるフィターゼの精製
上左から大豆，玄米 - 1 ，麹および味噌由来フィターゼのクロマトグラム，●；280 nm 吸光度，ǫ；フィターゼ活性

1 mL/ 画分）した。吸着画分は TBS に溶解した 0.2 M
Methyl-α-D-glucoside で溶出（5 mL，1 mL/ 画分）

97200

した。大豆および玄米（本実験では玄米 - 1 を用いた）
由来フィターゼ活性は非吸着画分にあったが，麹およ66400

び味噌由来フィターゼ活性は吸着画分にあった（図５）。
味噌由来フィターゼの活性画分を集め，精製度を調45000

べるために SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。アフィニティークロマトグラフィー後の精製
酵素は，ほぼ単一のバンドであり，分子量は約 53,000と推定された（図６）。

29000（１） （２）Ⅳ（３）

味噌および味噌原料由来フィターゼの性質

１．目的

図６．味噌由来フィターゼの SDS - PAGE

精製された味噌および味噌原料由来フィターゼの性（１）アフィニティークロマトグラフィー後，（２）DEAE イオン交換クロマトグラフィー後，（３）標準タンパク質質として，分子量，pH 及び温度特異性を調べた。また，
味噌発酵過程での活性を想定して，味噌由来フィター
ゼの食塩およびアルコール耐性を調べた。

─ 92 ─

中央味噌研究所研究報告

２．実験方法

３．結果および考察

１）ゲル濾過による分子量測定

１）ゲル濾過による分子量測定

No.39（2018）

Ⅲ３．
３）のゲル濾過クロマトグラフィーで得られた

ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出時間から玄米

フィターゼ活性画分の溶出時間および標準タンパ-1，大豆，麹および味噌由来フィターゼの分子量はほク 質 の 溶 出 時 間 か ら 算 出 し た。 標 準 タ ン パ ク 質 はぼ同じであり，標準タンパク質の溶出時間との比較

Ovalbumin（44,000），Conalbumin（75,000），から約55,000 と推定された。また，同様に米 - 2 は約A l d o l a s e （ 1 5 8 , 0 0 0 ）， F e r r i t i n （ 4 4 0 , 0 0 0 ），25,000 と推定された（図７）。

Thyroglobulin（669,000）とした。
２）pH 特異性
10000000

フィターゼ活性の測定方法（Ⅱ２．３）を参照）にム（pH 3.19 - 5.78），トリス - 塩酸（pH 7.49）を用いた。
３）温度特異性フィターゼ活性の測定方法に従い行ったが，イン

Molecular weight

従い行ったが，緩衝液はクエン酸 - クエン酸ナトリウ
1000000

440,000
669,000

158,000

10000044,00075,000キュベーション温度は 30 ～ 60 ℃の 10 ℃刻みとした。
10000

４）食塩およびアルコール耐性

35

40

45

図７．ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量の測定

応液に食塩（終濃度０，２，５，10，15 ％）またはエタノール（終濃度０，２，５，10，15 ％）を添加した。

（soy bean）

60
40
20

3

4

5

6

7

（brown rice）

100

Relative activity（％）

Relative activity（％）ǲ；玄米 - 1 ，大豆，麹および味噌由来フィターゼ，ǫ；玄米 - 2

80

0

80
60
40
20
0

8

3

4

5

6

pH

（koji）

60
40
20

3

4

5

8

6

7

80
60
40
20
0

8

pH

（miso）

100

Relative activity（％）

Relative activity（％）

80

0

7

pH

100

55

Fraction No.

フィターゼ活性の測定方法に従い行ったが，酵素反

100

50

3

4

5

6

7

pH

図８．味噌原料および味噌由来フィターゼの pH 特異性
DEAE イオン交換クロマトグラフィー後の部分精製フィターゼを用い，活性は相対活性値で示した。

─ 93 ─

8

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）とから，麹由来フィターゼは効果的に作用すると考え

２）pH および温度特異性られる。

DEAE イオン交換クロマトグラフィー後の部分精製フィターゼを用いて pH および温度特異性を調べ同様に各フィターゼの温度特異性を調べた。至適温

た。大豆および玄米由来フィターゼの至適 pH は約

度は全由来フィターゼで 50 ℃前後であった（図９）。

4.5，麹および味噌由来フィターゼの至適 pH は約5.5

味噌は一般的に 30 ℃前後で発酵させる 16) ので，このであった（図８）。味噌の pH は 5.5 前後である 15) こ

温度で麹由来フィターゼは高い活性を維持しており，100 （brown rice）

Relative activity（％）

Relative activity（％）

100 （soy bean）
80
60
40
20
0

30

40

50

80
60
40
20
0

60

30

40

Temperature（℃）

80
60
40
20

30

60

100 （miso）

Relative activity（％）

Relative activity（％）

100 （koji）

050

Temperature（℃）

40

50

80
60
40
20
0

60

30

Temperature（℃）

40

50

60

Temperature（℃）

図９．味噌原料および味噌由来フィターゼの温度特異性
DEAE イオン交換クロマトグラフィー後の部分精製フィターゼを用い，活性は相対活性値で示した。

100

Relative activity（％）

Relative activity（％）

100
80
60
40
20
0

0

5

10

90
80
70
60
50

15

NaCl concentration（％）

0

5

10

Ethanol concentration（％）

図10．味噌由来フィターゼ活性に及ぼす食塩およびエタノールの影響
アフィニティークロマトグラフィー後の精製フィターゼを用い，活性は相対活性値で示した。

─ 94 ─

15

中央味噌研究所研究報告

十分に作用すると考えられる。

No.39（2018）

２．実験方法以上のクロマトグラフィー精製，分子量，pH およ１）味噌の試作び温度特異性などの結果は，先行文献 11) - 13) で報告さ

蒸煮後の大豆（道産大豆「ユキホマレ」）に米麹（10れた各フィターゼとほぼ同様の特性を示した。味噌由割）と食塩（終濃度12％），さらに味噌由来フィター

来フィターゼは麹由来フィターゼと特性が類似したこゼ（約10 U/g）または市販の小麦由来フィターゼ試とから，麹に由来することが示された。

薬（約120 U/g ，Sigma）を加え 30 ℃，28 日間の発酵により試作した。コントロールはフィターゼ無添加

３）味噌由来フィターゼの食塩およびアルコール耐性区とした。

味噌由来フィターゼは食塩およびアルコールの含有量の増加とともに活性が低下したが，食塩濃度15％２）フィチン酸

で約60％，アルコール濃度 15％で約80％の活性を有フィチン酸量は試料を３％トリクロロ酢酸で抽出し，Wade 試薬を用いる比色法にて測定した 17)。

した（図10）。したがって，味噌の発酵過程において十分に活性を保持し，フィチン酸の分解に効果のある

３）麹由来酵素液による小麦由来フィターゼの分解反ことが示唆された。

応
麹由来酵素液は，Ⅲ２．２）に記した手順で硫安塩

Ⅴ析し，20 mM 酢酸緩衝液（pH5.2）に溶解し，同緩味噌試作とフィチン酸の低減化

衝液に対して透析したものを用いた。この麹由来酵素

１．目的液（たんぱく質量：1.5 mg/mL）に同量の 20 mM 酢

味噌製造において，フィターゼ活性に基づいたフィ酸緩衝液（pH5.2）に溶解した小麦由来フィターゼ試

チン酸の低減には発酵過程での pH，温度，食塩濃度薬（ 1 mg/mL）を混和し，30℃で24時間インキュベーなどフィターゼ活性の至適条件で発酵させるのが効果ションした。

的であろうと考えられる。しかしながら，味噌は伝統的に地域や各メーカーで製法が決められており，これ

４）SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動

らの条件を変更するのは非常に難しいのが現状であⅢ２．４）を参照のこと。

る。
そこで，本実験ではフィターゼ添加による米味噌の

３．実験結果および考察

試作をとおして，味噌発酵過程におけるフィチン酸量

フィチン酸量は，フィターゼ無添加のコントロールの変化を調べ，フィターゼ添加の有効性を検討した。

区を含めて発酵７日までに有意に減少した（図11）。
また，発酵７日では，小麦由来フィターゼ添加区がコ
ントロール区よりも減少傾向にあった。味噌由来フィターゼ添加区では，フィターゼの添加量が少なかった

Phytic acid（mM）

10
8
6
4
2
0

0

7

14

Control

21

28

0

7

14

21

28

0

Phytase from miso

7

14

21

28

Phytase from wheat

図11．味噌試作におけるフィターゼ添加の影響
蒸煮大豆，麹（麹歩合10割），食塩（塩分濃度12％）に味噌由来フィターゼ（約10 U / g ）または小麦由来フィター
ゼ試薬（約120 U / g ）を加え混和後，30 ℃で28日間の発酵を行った。コントロールはフィターゼ未添加のもの。

─ 95 ─

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）（手持ちが無かったため）ことから，コントロール区

において迅速なフィチン酸の低減にはフィターゼ添加との有意差はなかった。コントロール区および味噌由が有効であろうと考えられる。しかし，発酵７日以降

来フィターゼ添加区では，21日間までフィチン酸量のでは小麦由来フィターゼの効果が認められなかった。

緩やかな減少傾向が見られ，小麦由来フィターゼ添加

コントロール区と小麦由来フィターゼ添加区につ区とほぼ同量となった。このことから，味噌発酵過程

いて，図12 に発酵過程における可溶性タンパク質の

97200
66400
45000
29000
20100
14300

Fermented days： 0

7

14

21

28

Control

0

7

14

21

28

Ｗ Ｓ

Phytase from wheat

図12．味噌発酵過程における粗抽出液の SDS ゲル電気泳動パターン
Ｗ：小麦由来フィターゼ試薬，Ｓ：標準タンパク質

97200
66400
45000
29000
20100
14300

Incubation time（ｈ）
： 0

1

3

7

24

Ammonium sulfate
fractionation from koji

0

1

3

7

24

Ｗ

Plus phytase
from wheat

図13．麹粗酵素液による小麦由来フィターゼの分解反応
Ｗ：小麦由来フィターゼ試薬薬（ 1 mg / mL），Ｓ：標準タンパク質─ 96 ─

Ｓ

中央味噌研究所研究報告

No.39（2018）

SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示し

いたことから，麹由来であることが示された。また，

た。発酵前には約15,000および約55,000にバンドが見味噌製造におけるフィチン酸の低減化にはフィターゼられた。発酵７日で，約15,000のバンドはほぼ消失し活性を高めることが有効であり，特に，麹由来フィター

たが，約55,000のバンドは発酵28日まで検出された。

ゼが効果的であると推察された。

小麦由来フィターゼ試薬の複数バンドは，発酵７日までに全て検出限界以下に分解された。
図13 に麹由来酵素液による小麦由来フィターゼ試

Ⅶ

薬の分解反応の結果を示した。インキュベーション直

参考文献

後（０時間の位置）には，薄いながらも小麦由来フィ

１）Hambidge, M., J. Nutr ., 130，1344S-1349S (2000).

ターゼ試薬の複数バンドが見られたが，数時間のイン

２）Wuehler, SE., Peerson, JM. and Brown, KH.,

Public Health Nutr ., 8, 812-819 (2005).

キュベーション後には全てのバンドが検出限界以下ま３）Maret, W., and Sandstead, H H., J. Traceで分解された。一方，麹由来の約55,000付近に見られ

Elem. Med. Biol ., 20, 3-18 (2006).

る主バンドは，時間経過とともに分解されたが，幾つ

４）厚生労働省，日本人の食事摂取基準（2015年版）．

かのバンドは24時間経過後も検出された。

５）Gallaher, DD., Johnson, PE., Hunt, JR.,

麹は高いプロテアーゼ活性を有し，60日間の味噌発酵過程でも大きく活性が低下しないことが示されて

Lykken, GI. and Marchello, MJ., Am. J. Clin.

いる 18)。したがって，小麦由来フィターゼは麹のプロ

Nutr ., 48, 350-354 (1988).
６）Anderson, RL. and Wolf, WJ., J. Nutr . 125,

テアーゼにより迅速に分解され，活性を消失したもの

581S-588S (1995).

と考えられる。一方，麹由来フィターゼは ConA アフィ
ニティークロマトグラフィーに親和性を示したことか

７）Lonnerdal, B., Bell, JG., Hendrickx, AG.,ら糖タンパク質であることが示唆された。一般的に，

Burns, RA. and Keen, CL., Am. J. Clin. Nutr .,48, 1301-1306 (1988).

糖タンパク質は安定性に優れ，分解されにくいことが８）大槻耕三，佐藤健司，中村考志，大豆たん白研究，

知られている。本研究において，小麦由来フィターゼ

4, 33-38（2001）．

試薬は糖鎖染色法であるシッフ染色に反応しなかった

９）海老根英雄，味噌の科学と技術，31，248-253（データは示していない）ことから，糖鎖をもたない
タンパク質であろうと考えられる。これらのことから，（1983）．

麹由来フィターゼは小麦由来フィターゼよりも長期間

10）加藤熙，鬼頭幸男，清水裕幸，愛知県食品工業技術センター年報，35，6-13（1995）．

にわたって活性を維持したと考えられるが，仮説の域をでない。今後，麹由来フィターゼのプロテアーゼ抵11）Fujita J., Shigeta S., Yamane Y., Fukuda H.,

抗性や味噌発酵過程での挙動などに関する研究を進め

Kizaki Y., Wakabayashi A. and Ono K., J Biosci.
Bioeng ., 95, 460-465 (2003).
12）Sutardi, BK., J. Food Biochem ., 10, 197-216

る必要がある。
以上から，味噌製造において市販の小麦由来フィ(1986)

ターゼ試薬の添加は発酵初期では有効であるが，ある13）Hayakawa, T., Toma, Y. and Igaue, I., Agric.

程度の発酵期間で作用させるには麹由来フィターゼのBiol. Chem ., 53, 1475-1483 (1989).

優位性が示唆され，今後の研究の進展に期待するところである。特に，味噌発酵過程でのフィチン酸低減化14）Nikkuni, S., Itoh, H., Tanaka, M. and Ohta, T.,には，高フィターゼ活性を有する新たな種麹菌株の開Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi , 8, 502-510(1984).

発が望まれる。

15）全国味噌技術会，味噌の科学と技術，53，145161（2004）．

Ⅵ16）全国味噌技術会，味噌の科学と技術，52，255-

まとめ

268（2004）．

味噌およびその原料である大豆，米，麹のフィター

17）American Association of Cereal Chemists，

ゼを各種クロマトグラフィーにより精製し，幾つかのApproved Methods of the AACC 10th edition，

性質を調べた。味噌から精製されたフィターゼは，分76-13(2000).

子量55,000，至適 pH 5.5，至適温度 50 ℃であり，同18）和久豊，醸協，88，433-438（1993）．

様に精製した麹のフィターゼと類似した特性を有して─ 97 ─