リコンビネースを体細胞でノックインする技術
所属（理化学研究所 非対称細胞分裂研究チーム）
氏名 恒川 雄二

従来技術とその問題点（背景）CRISPR/Cas9の登場により、受精卵や体細胞において簡便にゲノム編集（遺伝子のノックアウト、ノックイン）が可能となった。
• 受精卵に対するゲノム編集によりゲノム編集生物個体が簡便に作成可能になった。
• 電気穿孔法やウイルスベクターを用いることにより、発生中および発生後個体の体細胞において遺伝子のノックアウト、ノックインが行えるようになった。

従来技術とその問題点（背景）
従来の遺伝子ノックイン技術

最近の遺伝子ノックイン技術
Cas9/Talen+従来技術とその問題点（背景）
従来の遺伝子ノックイン技術

最近の遺伝子ノックイン技術
Cas9/Talen+

未分化ES細胞が必要（マウス、ラットでしか樹立されていない）

受精卵へ導入マウス、ラット以外の哺乳類（豚、牛などの家畜動物）、更にはあらゆる生物種において応用可能（鳥類、魚類、爬虫類 etc…..）

Tubb3 (βIII-tubulin) 遺伝子de novoノックイン
EGFPCas9+

Cas9-

mCherry

Tsunekawa* & Terhune* et al, Development 2016

問題点：
ノックインされないドナーベクターから遺伝子がリークする！

Actb

Cas9BFP

EGFP

merge

問題点：
ノックインされないドナーベクターから遺伝子がリークする！
ドナーベクターには遺伝子転写に必要なプロモーター配列は存在しない

BFP

Cas9EGFP

merge

問題点：
ノックインされないドナーベクターから遺伝子がリークする！
核内に入ったドナーベクターは染色体に組み込まれていないので（クロマチンコントロールカ下に無い）非特異的に遺伝子が発現してしまう！

BFP

Cas9EGFP

merge

従来技術とその問題点（背景）CRISPR/Cas9の登場により、受精卵や体細胞において自由自在にゲノム編集（特に遺伝子のノックイン）が可能となった。
しかしながら、遺伝子をノックインするために必要なドナーベクターから細胞内にタンパク質が発現してしまうことがわかった（リーク）。
• 遺伝子ノックイン技術の利点：ノックインすることにより、内在性プロモーター活性に則したタンパク質発現が実現可能
ー組織特異性な遺伝子発現（組織特異的プロモーターの限界）
ー内在性遺伝子発現量の再現（過剰発現と差別化）従来技術とその問題点（背景）CRISPR/Cas9の登場により、受精卵や体細胞において自由自在にゲノム編集（特に遺伝子のノックイン）が可能となった。
しかしながら、遺伝子をノックインするために必要なドナーベクターから細胞内にタンパク質が発現してしまっていた（リーク）。
• 遺伝子ノックイン技術の利点：
ノックインすることにより、内在性プロモーター活性に則したタンパク質発現が実現可能
ー組織特異性な遺伝子発現（組織特異的プロモーターの限界）
ー内在性遺伝子発現量の再現（過剰発現と差別化）XX我々の発明した新技術：
ノックインドナーベクターのDNA配列を最適化する技術
技術の概要：
ドナーベクターDNAからタンパク質翻訳に必要な開始コドンになりうるDNA配列を最適化した。
• ATG配列（メチオニン：真核生物で最もよく使われる開始コドン）をロイシンに変換。
• その他ATC、CTG，ATAなどマイナーなコドンもサイレント変異を入れる• 特にリークに対する感度が非常に高いCreなどのリコンビネース（組み換え酵素）をノックインする際必須になると思われる。

Cre-loxp システム
バクテリオファージP1に由来するCre リコンビネースはType I トポイソメラーゼで、34bpからなるloxP配列間でのDNAの部位特異的組換えを行う。
任意の遺伝子座にCreをノックインしたマウスをもちいることにより、• loxP配列でターゲットする遺伝子を挟んだノックインマウス（floxマウス）と掛け合わせることにより、Creが発現した細胞でのみ遺伝子を欠失させる（コンディショナルノックアウト）。
• CAG-floxSTOP-GFPトランスジェニックマウス（CAGプロモーターとGFPの間にloxp配列で挟んだ転写STOP配列が挿入されている）と掛け合わせることにより、Creが発現した事のある細胞系譜が全てGFPでラベルされる（リニエージトレーシング）。
• CAG-floxSTOP-geneX(任意の遺伝子)トランスジェニックマウスと掛け合わせることで、Creが発現した細胞のみで任意の遺伝子を過剰発現させる（細胞特異的遺伝子発現）などの技術に必須。
非常に高感度で、ごく少量のCreで組み換えが起こる

Cre ノックインドナーはリークする
Cas9+

Cas9Cas9+
pCAX-hCas9
pCAG-mChery-gRNA
pCAG-flox-STOP-GFP
Cre Donor
Cas9pCAG-mChery-gRNA
pCAG-flox-STOP-GFP
Cre Donor
E14.5: electroporation
Fixation:2 days laterノックインドナー用コドン最適化：CreをLsCreにノックインドナー用コドン最適化：CreをLsCreに90%80%%of GFP+cells/total

70%60%Cre
LsCre
optiCre50%

40%30%20%

10%

0%

x1

x10

x100

x1000

x10000LsCre ノックインドナーはリークしない（マウスTubb3遺伝子座へのノックイン）
Cas9+

Cas9Cas9+
pCAX-hCas9
pCAG-mChery-gRNA
pCAG-flox-STOP-GFP
optiCre Donor
Cas9pCAG-mChery-gRNA
pCAG-flox-STOP-GFP
optiCre Donor
E14.5: electroporation
Fixation:2 days laterLsCre ノックインドナーはリークしない（フェレットPax6遺伝子座へのノックイン）
EGFP+Cas9-Cas9

mCherrypCAX-hCas9
Pax6 gRNApLR5 CAG-mCherypLR5 CAG-flox-STOP-GFP
pCAG hyper piggybase
optiCre２ Pax6 HDR Donor

EP@E30-34

想定される用途：超細胞種特異的遺伝子発現システム

想定される用途：超細胞種特異的遺伝子発現システム
現在開発中

想定される用途：ワンステップコンディショナルノックインマウス

Genomeに挿入されるCas9/Talen+
LsCreflox mouse
受精卵へ導入↓遺伝子特異的にCreを発現するマウスラインと更に掛け合わせが必要

想定される用途：遺伝子治療用ベクター
GCL

INL
OPL

ONLRCS

Cas9+HITIONL l thickness (um)

IPL

Normal

OKN recording2.pptx
Rod-Cone Response

10 Hz Flicker

10 Hz Flicker

Cas9+HITI

RCS rat
RCS rat**100b-wave value (μV)

RCS ratb-wave value (μV)

120

80

60

Cas9+HITI
Cas9+rMertk

40

**

20

NormalRCS Cas9+HITI Normal
NormalNormal0RCS
Cas9+rMertk
Cas9+HDR
RCS
Cas9+HITI
Normal Normal

Suzuki* Tsunekawa* et al, Nature 2016

実用化に向けた課題• 現段階では、プラスミドベースのノックインではリークの制御が可能なところまで開発済み。現在、AAVなどのウイルスベクターでのリークレス化を開発中。
• ウイルスベクターのリークレス化を開発後、遺伝子治療用ドナーベクターに適用するため研究を行っていく。

本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：ポリヌクレオチドおよびその利用• 出願番号 ：PCT/JP2020/040738• 出願人：理化学研究所• 発明者：恒川 雄二、松崎 文雄

お問い合わせ先
株式会社理研鼎業（りけんていぎょう）

戦略企画部 （理研新技術説明会事務局）
E-mail: senryaku@innovation-riken.jp※ 連携に関する窓口は、理化学研究所より委託を受けて実施しております。