学位論文内容の要旨

博士の専攻分野の名称

博士（医 学）氏 名

山口 秀

学 位 論 文 題 名Novel Photodynamic and Sonodynamic Therapy using Water-dispersed
TiO2-polyethylene Glycol Compound:
Evaluation of Anti-tumor Effect on Glioma Cells（グリオーマ細胞に対する水散性二酸化チタンを用いた光線力学・超音波力学療法の検討）【背景と目的】光線力学療法(Photodynamic therapy; PDT)は悪性新生物に対する治療の補助療法の一つの候補として認知されつつある。悪性脳腫瘍、なかでも特に予後不良である悪性神経膠腫に対しても応用が模索されている。さらに、PDT から由来した治療法である音響力学療法(Sonodynamic therapy; SDT)は PDT の弱点を克服する新たな治療法として大いに期待されている。SDT は触媒物質の励起に超音波(US)を用いることで、光励起で問題となる励起エネルギーの組織深達度を大幅に改善できる可能性があり、かつ、理論的には US エネルギー焦点の集中も可能なため、これまで PDT では困難であった脳腫瘍などの腫瘍で、かつ切除困難な深部腫瘍を標的にできる可能性がある。
二酸化チタン(TiO2)は光触媒物質の一つであり、紫外線(UV)で励起させることのより水溶液中で非常に強力な酸化ラジカルを発生することが知られている。この物質を PDT に用いる試みは以前から研究されていた。この TiO2 が US によっても同様に酸化ラジカルを発生させることが最近報告された。さらに、TiO2 は元来水溶液中で凝集してしまう不溶性の物質であり生体内への投与に不向きであったが、TiO2 粒子にポリエチレングリコール(PEG)を修飾することで、水溶液中で約 50nm の大きさで安定した非凝集性ナノ粒子の作成に成功した。本研究の目的は、この新規製剤を用いた PDT や SDT に関して glioma 細胞を用いて in vitro で検証することである。
【材料と方法】PEG で修飾された TiO2 ナノ粒子(TiO2/PEG)の基本的な特性と神経膠腫細胞に対する細胞障害性を確認するため、
C6 rat glioma 細胞とその Spheroid モデルを用い、UV を励起方法として PDT に関する実験を行った。TiO2/PEG との共培養時間は治療前 3時間とし、単層培養における生存率測定には MTT assay を使用、Spheroid モデルではその直径を測定することによる成長曲線にて抗腫瘍細胞効果を評価した。細胞障害機序はAnnexin V-FITC と Propidium iodide(PI)を用いた蛍光免疫染色によって評価した。
SDT に関しては、ヒト膠芽腫細胞である U251 を使用して、PDT との比較検討にて行った。US 照射装置は民生機である SONICMASTER® (OG Giken, 1.0 MHz, 1.0W/cm2)を使用した。単層培養における細胞障害の評価は、TiO2/PEG 溶液を 100μg/ml、共培養を治療前 3 時間とし、生存率測定は治療後 24 時間で MTT assay を用いて行った。さらに、細胞障害機序解明のため様々な蛍光免疫染色を行い、PDT との比較検討を行った。また、細胞障害における酸化ラジカルの関与を検討する目的で、酸化ラジカル阻害剤であるglutathione を用いて PDT・SDT における細胞障害抑制効果を検討した。
【結果】1000μg/ml までの TiO2/PEG 溶液と C6 細胞は 24 時間の共培養で毒性は確認されなかった。TiO2/PEG を蛍光色素 Rhodamine で標識して C6 細胞と共培養させ、細胞への取り込みを蛍光顕微鏡にて確認したところ、TiO2/PEG は細胞膜上もしくは細胞質内に存在することが示唆された。細胞障害効果は、単層培養では TiO2/PEG の濃度、UV の照射強度、両者に依存して増強することが確認され、500μg/ml の TiO2/PEG において13.5J/cm2 の UV 照射により 90%以上の細胞が死滅した。Spheroid モデルにおいては、control 群と比較し、PDT 群において成長抑制効果を得ることができたが、成長を完全に止めることはできなかった。蛍光免疫染色では、PDT 群において 6 時間後から Annexin
V-FITC で染色される細胞が出現、引き続いて PI で染色される細胞が増加することが確認された。
SDT においては、US 照射単独でも軽度の細胞障害が出現したが、TiO2/PEG 共培養による US 照射の場合は殺細胞効果が著明に増強された。また、PDT と SDT の単層培養細胞に対する細胞障害の比較検討においては、両群で細胞障害機序の相違が認められた。蛍光免疫染色を用いた細胞障害の観察では、SDT 群において、治療直後から細胞膜のviability が消失している細胞が出現することが確認され、これは PDT 群では認められない現象だった。さらに酸化ラジカル阻害剤である glutathione を添加して UV・US 照射を行ったところ、PDT では細胞障害が完全に抑制されたのに対し、SDT では細胞障害抑制効果は十分ではなかった。
【考察】TiO2/PEG には、非励起状態では細胞障害がないこと、神経膠腫細胞に水溶液中で細胞内へ取り込まれる可能性があることが判明した。水溶液中で約 50nm で安定した拡散性を有している同製剤は、生体内で EPR 効果（Enhanced permeability and retentioneffect）により脳腫瘍内への移行が期待される。一方で、正常脳組織には BBB（Blood brainbarrier）が存在し、理論的には同製剤は脳組織内への移行はないことになる。腫瘍細胞選択性という観点からも TiO2/PEG の可能性が示唆された。
TiO2/PEG は UV 励起によって神経膠腫細胞に対する細胞障害効果があることが確認で
き、US 照射でも細胞障害を著明に増強し、同剤を用いた SDT の可能性を示すことができた。また、SDT の細胞障害機序は PDT によるものとは異なるものであることが推測された。これまでにも光感受性物質である porphyrin 関連製剤を用いた SDT の基礎実験において、PDT と SDT の細胞障害機序の相違点は指摘されていた。本研究では、この相違点を明確に検出するために免疫染色を使用した。その結果、PDT における細胞障害は酸化ラジカルを介した反応によるアポトーシスが主であると考えられ、これは治療から一定の時間が経過してから細胞障害を惹起した。一方、SDT における細胞障害は、酸化ラジカルを介した反応だけではなく、治療直後から細胞膜に対して強い障害を与える反応が関与していることが推測された。治療直後からの細胞膜障害は US 照射単独ではほとんど起こらないため、TiO2/PEG の関与は確かである。SDT における細胞障害は励起された触媒物質による細胞膜の物理的損傷が強く関与していることが報告されており、これは触媒物質と細胞の距離が近いことが重要であると言われている。TiO2/PEG は腫瘍細胞膜上に存在、または細胞質内に取り込まれることが予想され、この物理的細胞損傷が SDT における重要な作用機序と推測された。
【結論】新規製剤である水散性 TiO2/PEG を用いて神経膠腫細胞に対する PDT や SDTの可能性を in vitro で示した。両治療法による細胞障害機序が異なっていることが示唆された。