分野：医療・福祉

ラジカル物質ＴＥＭＰＯの揮発使用により脳組織を保護する
群⾺⼤学
⾷健康科学教育研究センター
教授 ⿃居 征司2022年 9 ⽉ 15 ⽇
1

ラジカル物質ＴＥＭＰＯの揮発使用により脳組織を保護する
概要

低分子化合物の2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシル（通称 TEMPO）が常温で揮発し、遠隔地の生細胞に作用して酸化ストレス性細胞死を阻害することを初めて示した。またマウスを用いた脳梗塞モデル実験で、気化したTEMPOを自然吸入したことで脳組織の保護が可能となることを示した。

2

発明の背景

酸化ストレスを伴う細胞死が様々な虚血障害に関与することから、抗酸化機能を持つ薬剤が細胞や組織の保護を果たす可能性がある。



例えば、ラジカル捕捉剤のエダラボン（ＭＣＩ－１８６）は、日本で開発され世界に先駆けて承認された脳梗塞急性期の脳保護薬である。しかし、エダラボン以外に臨床的エビデンスが確立された細胞保護薬は存在しない。

フェロトーシスは鉄に依存するプログラムされた細胞死の一種であり、過酸化脂質の蓄積を特徴とする。脳虚血障害をはじめとする酸化ストレスを伴う細胞死がフェロトーシスである可能性が報告されている。



フェロトーシス阻害剤のＦｅｒｒｏｓｔａｔｉｎ－１などの神経細胞死への応用が検討されているが、細胞・組織レベルの結果にとどまり、個体（生体）の効果は明らかでない。脳神経疾患の急性期治療などに有用な、酸化ストレスに対して速やかに組織保護を図ることのできる薬剤が求められている。
3

発明の背景

従来の薬剤のスクリーニングと生体への適用実験は、ほとんどが水系におけるものであった。

動物細胞



培養液

細胞や動物実験で有効な化合物が臨床試験を突破するのは容易ではなく、多くは溶解性や組織浸透性、毒性の問題が表出する。
4

発明の背景

ＴＥＭＰＯは有機合成における酸化反応の触媒として使用される。
2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ, ラジカル

TEMPO



ＴＥＭＰＯは細胞実験などではラジカル捕捉剤として使用され、フェロトーシスを阻害することも既に報告されている。

5① 揮発TEMPO によるフェロトーシス抑制
平均値±標準誤差で示した（n = 3 ）

Cell+
RSL3

TEMPO

ＴＥＭＰＯは濃度依存的にＲＳＬ３で誘導されるヒト浸潤性線維肉腫HT1080細胞のフェロトーシスを阻害した。ＲＳＬ３の代わりに別のフェロトーシス誘導試薬であるＥｒａｓｔｉｎ（10 M）を使用した場合や、異なる癌細胞種の ＣａｌｕＩ，ＰａｎｃＩ を用いても、同様の結果が得られた。
⇒ 本実験では、水に添加したＴＥＭＰＯが細胞培養液に直接混じ入ることはないため、揮発した後に、気体状態を介して細胞に作用したと考えられる。
6

② 気体状態のTEMPO によるフェロトーシス抑制

Ga s

アルミニウムガスバッグに空気と１μＬのＴＥＭＰＯ（100mM）を投⼊して、37℃インキュベータ内で３時間放置したのち、ガスタイトシリンジでガスバッグ内の気体（10mL）を採取した。

ＴＥＭＰＯ（ガス）を含む空気を培養皿に加えると細胞死率が減少し、ＲＳＬ３誘導性フェロトーシスは阻害された。
⇒ 本実験では、加温により放出されたＴＥＭＰＯの気体成分（ガス）の存在により、フェロトーシスが阻害されたと考えられる。
7③ TEMPO の揮発および再溶解
H2O

50 mM
TEMPO

３７℃ インキュベータ内密封

１ 時間incubate

ＴＥＭＰＯ水溶液（50 mM, 1 mL）を含む小皿と H2O（水）を入れた小皿を並べてディッシュに入れ、３７℃で１時間 加温した。それぞれの皿のＴＥＭＰＯ濃度を LC-MS および吸光度により測定した。
⇒ ＴＥＭＰＯは１時間の加温で約２３％が揮発し、約１４％が移動した。
8④ 揮発TEMPO による神経細胞死の抑制

神経細胞株
HT22

ＴＥＭＰＯは濃度依存的にグルタミン酸で誘導されるマウス神経細胞
HT22の酸化ストレス性細胞死を阻害した。
⇒ ＴＥＭＰＯ（ガス）はフェロトーシスと同様に神経細胞死を阻害する

9

⑤ 揮発TEMPO による虚⾎マウスにおける脳組織障害の抑制

TEMPO
マウスの脳（⽇本クレアHPより）

マウス中⼤脳動脈永久閉塞（MCAO）による脳梗塞モデルの作製は、⽂献 (J. Cereb. Blood
Flow Metab 1:53,1981) の⽅法 (Tamuraモデル)に⼩さな変更を加えて施⾏した。

ＴＥＭＰＯ吸⼊投与群については、3.5ｃｍ培養⽫に0.1gの綿を敷き、６０℃に加温した5mLの100mM Ｔ
ＥＭＰＯ⽔溶液を染み込ませたものをケージ内中央に留置した。エダラ
ボン投与群は静注投与した。

10

⑤ 揮発TEMPO による虚⾎マウスにおける脳組織障害の抑制

梗塞作成後 ３、５、７時間点でＭＲＩ Ｔ２強調画像を取得した。

８時間点で脳組織片を２，３，５－トリフェニルテトラオリウムクロライド（ＴＴＣ）染色し、梗塞病変を検出した。

ＴＥＭＰＯを自然吸入投与したマウスでは脳組織障害が強く抑制された。
また ＴＥＭＰＯの濃度の検討を行ったところ、２５ｍＭでも全く同等の保護効果を示した。
11

発明技術の補⾜

1

化合物名培地添加における阻害効果

揮発作用による阻害効果

1

TEMPO++2HydroxyTEMPO

2OHN+-

3Amino-TEMPO+-

4Edaravon+-

5Trolox+-6Ferrostatin-1+-O

3エダラボン

4

ＴＥＭＰＯ誘導体を含む様々な抗酸化化合物はフェロトーシスを阻害できるが、ＴＥＭＰＯだけは揮発して作用できる。
12

競合技術との⽐較
本発明

競合技術１

競合技術２構成

TEMPO

ニトロキシド類（TEMPOL）

PEG化TEMPO

得られる特性

気化使⽤するTEMPO
は、速やかに標的組織へ到達及び浸透できる

経⼝剤︓TEMPOLを含む錠剤、カプセル、顆粒等
⾮経⼝剤︓溶液、懸濁液、エマルション等 による幅広い使⽤⾼分⼦ミセルを形成する
PEG化TEMPOにより、還元性環境下において⻑期安定性を⽰す

適用分野

脳梗塞及び筋萎縮性側索硬化症の治療および予防薬

⼼臓⾎管系疾患及び脳虚⾎再灌流障害の予防及び治療薬脳梗塞、⼼筋梗塞、脳浮腫、神経脱落症状、炎症等の治療投与方法

吸⼊投与

静脈内投与

静脈内投与

13

想定される⽤途（１） 虚⾎性疾患、とくに脳梗塞における超急性期の治療薬
 筋委縮性側索硬化症（ALS）における神経保護薬
 その他の脳神経疾患, ⽼化などの保護薬・予防薬

実⽤化に向けた課題
TEMPOは揮発させて使⽤するため、下記課題を解決する必要がある。
１．投与形態、投与量、吸⼊量（溶液濃度、時間等を決定する）
２．投与デバイスの開発

14想定される⽤途（２） ⽝・猫など 愛玩動物（伴侶動物）の脳梗塞治療薬
 愛玩動物のアンチ・エイジング, ⽼化予防法の提供

企業様への期待① 動物実験に関する産学共同研究 もしくは資⾦サポート② 揮発性物質の溶媒、樹脂等に関する産学共同研究③ 投与デバイスに関する産学共同研究

15

本技術に関する知的財産権• 発明の名称：2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニル
オキシルの揮発使用による細胞死抑制と組織保護• 出願番号：PCT/JP2021/036440• 出願人：国立大学法人群馬大学• 発明者：鳥居征司、久保田知里、輿石一郎、瀧川雄太、水野寛之、神徳亮介

16

お問い合わせ先

群馬大学
産学連携・知的財産活用センター
ＴＥＬ 0277-30-1171～1175
ＦＡＸ 0277-30-1178
e-mail tlo＠ml.gunma-u.ac.jp

17