ー 新製品紹介 ー●λファージを用いたファージディスプレイ法による新規自己抗原の探索
つくば研究所丹羽幹夫

米国スクリプス研究所の丸山により開発された、λファージを用いた新規ファージディスプレイ技術を応用し、自己免疫疾患に対する自己抗原を探索した。最初にシェーグレン症候群をターゲットにして自己抗原を探索し、既知自己抗原だけでなく新規自己抗原を得ることができた。1985年に繊維状ファージを用いたファージディスプレイ
技術が提唱されて以来、この技術を用いてcDNAライブラリーから自己抗原を得た最初の例である。一般に、自己抗原を探索する他の既存技術では、単調かつ多段階のプロセスを必要とし、しかも２〜３年で１または２個の自己抗原が得られる程度の効率であるが、本方法では1年で7個以上（その内、3個は新規）の自己抗原を見出すことに成功し、既存技術に比して効率的な探索方法であることが示された。更に、患者数は多いが自己抗原が得られにくいとされる慢性関節リウマチをターゲットに自己抗原を探索し、幾つかの新規自己抗原を得ることに成功している。以上の結果より、λファージを用いたファージディスプレイ法は、新規自己抗原の探索に非常に適した方法であることが示された。

1緒

P. Smith1) によって1985年にファージディスプレイ法が提案され言た。この方法は、繊維状ファージの外套タンパク質に外来タンパ

現在までに知られている自己抗原は、自己抗体（血清等）を用

ク質を融合させて、表面にそのタンパク質を"提示"したファージ

いて、細胞や組織の溶解液から免疫沈降により特異的に結合すをパニングと呼ばれる操作により特異的に増幅していく方法であるタンパク質（自己抗原）を分離する免疫沈降法か、又は細胞やる。タンパク質・核酸・脂質に結合するタンパク質（もしくはペ組織のcDNAライブラリーから自己抗原を発現しているクローンプチド）を知る有力な方法であるが故、自己抗原の探索にも威力を免疫染色により探し出す発現スクリーニング法のどちらかの方を発揮すると期待された。しかし、現在までに数多くの研究がな法でのみ見いだされている。

されているにも拘わらず、報告の大半はランダム又はオリゴペプ

免疫沈降法は、放射性メチオニンでラベルした細胞の溶解液

チドライブラリーを用いたエピトープ解析や抗体作製がほとんどに自己抗体とプロテインAビーズを加え、抗原-抗体-ビーズの複で、自己免疫疾患に関与する自己抗原をcDNAライブラリーより合体を形成させて沈澱させる方法である。原理的に最も簡単で見いだした例はない。一つの理由として、繊維状ファージは、大はあるが、バックグラウンドが高くなり、自己抗原を特定できな腸菌の内膜と外膜との間のペリプラズム空間で会合してファージ

かったりすることが多い。自己抗原を特異的に沈降できたとしてとなるため、外套タンパク質に融合した外来タンパク質は内膜をも、そのタンパク質の精製・アミノ酸配列の決定・cDNA の選別

通過しなければならず、ゆえに分泌タンパク質以外の外来タンパ

といったハードルをクリアしていかねばならない。

ク質の提示はされにくいためと考えられる。

一方、cDNAライブラリーの発現スクリーニング法は、タンパ

近年、The Scripps Research Institute の丸山研究室で開発された

ク質発現用λファージに組み込まれたライブラリーをプレートに新しいファージディスプレイ法2), 3)は、λファージの尾部タンパク

まいてプラークを形成させ、挿入DNAがコードするタンパク質を質であるVタンパク質あるいは頭部修飾タンパク質であるDタン

誘導発現させてプラークごとメンブレンに転写し、自己抗体を用

パク質との融合タンパク質を作ることで外来タンパク質をファーいた免疫染色を行なうことで自己抗原発現ファージをスクリーニ

ジ表面上に発現することができる。λファージの表面タンパク質

ングする方法である。免疫沈降法と異なり、容易に自己抗原のに融合させると言う意味からλfoo (fusion on the outside) と名付

DNA塩基配列決定ができ、ホモロジー検索により既知・未知のけられ、Dタンパク質のC末に外来タンパク質を融合させるファ判定が可能である。しかし実際のスクリーニングでは、通常1プージベクターをλfooDcと呼ぶ。本系の特長は、ファージの会合

レート（φ10〜15cm）当たり５万個のファージプラークを形成が大腸菌内で起こるため、融合タンパク質が内膜を通過する必要させ、このプレートを20枚以上作製してそこからスクリーニングがなく、分泌／細胞内タンパク質に拘わらずファージ表面に発現を行なうこととなり非常に労力がかかり、多数の血清サンプルをできることで、まさに繊維状ファージ系の欠点を克服している。

用いて行うことは不可能である。しかも、特異的な抗原を得られシェーグレン症候群（以下SS）は慢性・全身性の自己免疫疾る確率は低く、その成否はcDNAライブラリーの "でき具合" によ患で、特に唾液腺・耳下腺の破壊による分泌機能の低下・消失

るところが大きい。

を特徴とする疾患である。現在までに幾つかの自己抗原／抗体

この様な発現スクリーニングをより効率よく行なうために、G.

東亞合成研究年報が同定されており、その中でもSS-B/Laに対する抗体はSSの疾患

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TREND 2002 第5号

マーカーとして使用されている。SS-B/La抗体は、SSに特異的で素 (SuperScript II, Life Technologies) により1st strand cDNAを合成あるが、患者で検出される割合（陽性率）は20〜30％と低いた

し た 。こ れ を 鋳 型 と し て 、2nd strand cDNAを 合 成 キ ッ ト

め、診断に苦慮するケースもある。

（Promega）を用いて作製した。T 4 DNA ligase（New England

2実

Biolabs）を用いて、下記の２本鎖DNA（Sfi-I adapter）を合成

験cDNAの末端に結合させた。

2.1 実験の大まかな流れ

adapter 1,5'-

CGGCCAGGATCTGGTGGT

3'-GGAGCCGGTCCTAGACCACCA

adapter 2,5'-CTGACTGACTGAGGCCATAG
3'-GACTGACTGACTCCGGT
未反応のadapterはゲルろ過スピンカラム（Sephacryl S-400,
Amersham Pharmacia）を通すことで除去した。このようにして得られた合成cDNAを1μgのλfooDc2SfiIファージDNAと結合させ、packaging mixture（MaxPlax, Epicentre Technologies）を用いてファージ粒子とし、宿主大腸菌Q447株に感染させて増幅した。

2.4 ファージタイターの測定法
E.coli JM105のシングルコロニーを0.2% maltose-CY（1%カザ
ミノ酸/0.5% yeast extract/51 mM NaCl/27 mM KCl）培地に植菌し、37℃で1晩培養した。このJM105培養液100μlに1/100 vol.の1
M MgCl2を加えた後、SM溶液（0.1 M NaCl/0.01% gelatin/5 mM
MgCl2/50 mM Tris-HCl (pH 7.5)）で希釈したcDNA ライブラリーやファージ溶出液を 1〜10μl程度添加して、37℃で15分間振盪
させながら、ファージをE.coliに感染させた。このファージ感染
2.2 大腸菌株、細胞株、ファージおよび血清

E.coli液に8μlの25 mg/ml IPTGを添加した後、8μlの25 mg/ml X-

ファージ宿主大腸菌として、JM105、TG１、Q447を用いた。

galを添加したTop agar 1.5 mlを加え、良く撹拌した後、直径6 cm

Mikawa等 が作製したファージ表面発現ベクターのλfooDcのマのλagar plate上に重層し、37℃で８時間以上インキュベートしルチクローニングサイトに、以下のようなオリゴDNAを組み込んてファージプラークを形成させた。プラークは、親ファージ（λでSfiI制限酵素サイトを２つ持つベクターを構築し、λfooDc2SfiI

fooDc2SfiI）による青色プラークとcDNA などの外来遺伝子が挿と名づけた。

入されたファージによる白色プラークとなるので、各々を計数し3)た後、ファージタイター（pfu : plaque forming unit）と白色プラ

5'-GATCCCCGGGTACCGAGGCCGCCTCGGCCGAG

ーク比を求めた。

3'-GGGCCCATGGCTCCGGCGGAGCCGGCTC

5'-CTCGAATTCGGCCGGCCATAGCGGCCGC

2.5 cDNAライブラリーのアフィニティセレクション

3'-GAGCTTAAGCCGGCCGGTATCGCCGGCGTTAA

E.coli TG1（suppressor positive）のシングルコロニーを 1 mlのSS患者血清は、Scripps Reference Laboratoryより供与された。

CY 培地に植菌し、37℃で1晩培養した。このE.coli TG1培養液

その他の自己免疫疾患患者血清（SLE, PBC, SSc）および健常人

1/100 vol.を3 mM MgCl2-CY培地に添加し、37℃で1時間培養した血清は奈良医大より供与された。ヒトcell lineのHeLaおよび後、cDNAライブラリーを加えて完全に溶菌するまで37℃で培養

HepG2はATCCより購入し、10％FBS含有DMEM培地で、5％CO2

した（およそ1 mlのE.coli培養液に対して、4 x 107pfu のファージ存在下で培養した。

を添加すると４〜５時間で完全に溶菌する）。溶菌した後、溶菌
液1 ml当たり1μlのCHCl3 を添加し更に15分間培養を続けた。こ2.3 cDNAライブラリーの作製の溶菌液を遠心して溶菌細胞片を除いた上清（phage lysate）に、

およそ3×10 個のHeLa 細胞またはHepG2 細胞よりグアニジン

1 ml当たり2μlの10 mg/ml RNaseA水溶液と1μlの10 mg/ml

チオシアネート法と塩化セシウム密度勾配遠心法にて全RNAを

DNaseI水溶液を加えて37℃で10分間インキュベートした後、抽出した。得られた全RNA 1 mgより、定法に従い、オリゴ (dT)polyethylene glycol (MW6000 - 8000)、NaCl、MgCl2 を各々、終濃

カラムを用いてpoly (A)+ RNA約25μgを精製した。このRNA約5

度7%、3.5%、2 mMになるように加え、氷上で1時間静置してフμgと2.5μgのランダムヘキサマー (Sigma) を用いて、逆転写酵

ァージを沈澱させた（PEG沈澱）。遠心してファージを集め、

8

東亞合成研究年報

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phage lysateの1/50-1/100 vol.のblocking buffer (5% dry milk/0.1%

上記の線状プラークから2 mm程掻き取ったものを加え、37℃でTween20/0.25% BSA /0.05% NaN3/PBS) で懸濁した物をファージ

完全に溶菌するまで培養した（およそ、３〜４時間）。この溶菌

懸濁液（又は"Input"）として以下の操作に使用した。

液を遠心して溶菌細胞片を除いた上清（phage lysate）から0.8 ml

0.05% NaN 3-PBSで血清を適宜希釈し、Immulon 4 microtiterplate（Dynatecを分注して、CHCl3を終濃度0.3%になるように加え、これをクロLab.）に50μl/wellずつ添加した。４℃で１晩置ーン化したphage lysateとして４℃で保存した。残りの1.2 mlは2.7

いて、血清をプレートに結合させた後、100μlのblocking bufferのDNA抽出に用いた。

でwellを２回洗浄し、更に100μlの同bufferを加えて、室温下１時間静置した。バッファーを除いた後、前述のファージ懸濁液50

2.7 ファージからのDNA抽出およびDNA塩基配列決定

μlを添加して、４℃で１晩緩やかに振盪しながら抗原発現ファ

2.6 で得られたphage lysate 1.2 mlを用いて2.5と同様の手技によージを結合させた。未結合のファージ懸濁液を除いて、0.3 mlのりファージをPEG沈澱させた。遠心により集めたファージを130

washing solution (5% dry milk/0.1% Tween20/PBS/0.05% NaN3)を添

μlの10 mM Tris-HCl /10 mM EDTA (pH 8.0)で懸濁し、５分間氷

加し、軽く振り混ぜるなどした後、washing solutionを捨てた。こ上に静置した後、緩やかに撹拌した。1.2μlの10% SDSを加え、のwash操作を3回行った後、SM溶液を用いて同様に3回洗浄し室温で5分間静置した後、TE飽和phenolによる抽出を２回、た 。10 mM CaCl 2 -SM溶 液 50μ lを 添 加 し 、10 units/μ lのphenol : CHCl3 = 1 : 1溶液による抽出を1回行った。EtOH沈澱を

collagenase溶液2μlを加えた後、37℃で２時間、microplate mixer

行った後、これをTEで溶解させたものをファージDNA 溶液とし（M-36、TAITEC）で激しく振盪しながらcollagenaseを作用させ、てDNA塩基配列決定等に用いた。DNA塩基配列決定は、ダイデ

plateに結合していたファージを上清中に溶出させた。これをファオキシ法にて行った。

ージ溶出液（又は "Output" ）とした。
2.8 ファージELISA
2.6 ファージプラーク免疫染色（Immunostaining）及びE.coli TG1の１晩培養液1/100 vol.を3 mM MgCl2-CY 培地に添

クローン化

加し、37℃で1時間培養した後、各抗原発現ファージ（2.6で得らOutputなどのファージ溶液を用いて、径10 cmのλagar plateに、れるphage lysate）を加えて完全に溶菌するまで37℃で培養した。

タイター測定操作（2.4参照）と同様にしてファージプラークを溶菌した後、溶菌液1 ml当たり1μlのCHCl3 を添加し更に15分間形成させた。その上に、径82 mmのnitrocellulose membrane

培養を続け、遠心して溶菌細胞片を除いた上清（phage lysate）（PROTRAN, pore size 0.2μm、Schleicher & Schnell）をかぶせ、を以下の操作に使用した。

37℃で1晩静置してファージ粒子をメンブレン上に転写させた。

抗λfooDc2SfiI抗体（ウサギ、ポリクローナル抗体）を0.05%

メンブレンをImmunostaining buffer（5% dry milk/0.1% TritonX-

NaN3/PBSで2μg/mlになるように希釈し、Immulon 4 microtiter

100/PBS）を用いて30分間振盪しながら洗浄し、これを2回行う

plateに100μl/wellずつ添加した。４℃で１晩静置した後、溶液をことで同時にブロッキングした。血清をλfooDc2SfiIファージ溶

除去し、100μlの1% BSA/PBS/0.05% NaN3を加えて室温下1時間

菌液で適度に希釈（500〜5000倍）した後、４℃で１晩振盪しな静置した。溶液を除いた後、前述のphage lysateの10倍希釈液

がら血清中のλfooDc2SfiI及びE.coli溶菌液に対する抗体を吸収（blocking bufferで希釈）100μlを添加して、４℃で１晩静置してさせ（この操作によりback groundが下がる）、Immunostaining

ファージを結合させた。溶液を除去し、0.3 mlのImmunoscreening

bufferで２倍に希釈したものをブロッキングされたメンブレン上

bufferを添加し、軽く振り混ぜた後、bufferを除去した。このwashに注いだ。室温で１時間ほどゆっくりと振盪した後、操作を3回行った後、0.05% NaN3/PBSで1000倍希釈した各血清をImmunostaining bufferを加え、10分間激しく振盪してメンブレン

100μl添加し、室温で1時間静置した。0.3 mlの Immunoscreeningを洗浄した。この洗浄を３回行った後、Immunostaining bufferでbufferで6回の洗浄を行った後、0.05% NaN3/PBSで10000倍に希釈

10000倍に希釈した２次抗体（抗human IgG-Alkaline phosphatase

した2次抗体（抗 human IgG-Alkaline phosphatase標識mouse

標識mouse monoclonal抗体：SIGMA）を加え、室温で1時間ほど

monoclonal抗体：SIGMA）を加え、室温で1時間静置した後、0.3

ゆっくりと振盪した。上記と同様にしてImmunostaining bufferで3mlのImmunoscreening bufferで4回とAP bufferで2回の洗浄を行っ

回洗浄を行い、PBS及びAP buffer（100 mM Tris-HCl (pH 9.5)/100

た。 AP bufferで2 mg/mlに調整したSIGMA 104（AlkalinemM NaCl/5 mM MgCl 2 ）で各1回ずつ洗浄した後、Alkaline

phosphatase基質：SIGMA）100μlを添加し、室温で1時間静置しphosphatase基質溶液（0.33 mg/ml NBT/ 0.165 mg/ml BCIP in APて発色させ、405 nmにおける吸光度を測定した。コントロールと

buffer）を添加して、室温で発色させた。

して、λfooDc2SfiIのphage lysateを用い、以下のように判定を行った。

免疫染色されたファージプラークを爪楊枝で突いて、E.coli「抗原ファージでのA405 nmの平均値＞λfooDc2SfiIでのA405

JM105 菌叢上に線を書くよう塗り、37℃で１晩インキュベート

nm の平均値＋３SDの場合、陽性とする」

して線状プラークを形成させた。E.coli Q447の1晩培養液20μlを2 mlの3 mM MgCl2-CY 培地に加え、37℃で１時間培養した後、東亞合成研究年報

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mixtureの内、５つから免疫染色で血清と反応するファージプラ

3 結果および考察ークを多数見出した。このセレクションの１例をFig.１に示す。

3.1 cDNAライブラリーの作製

セレクションのサイクルが進むにつれ、全溶出ファージ中に占め

λfooベクターはβガラクトシダーゼのαサブユニットをコードる白色ファージの割合が増加し、免疫染色されるプラーク数も増加することがわかる。

している為、ωサブユニットを持つ宿主大腸菌（たとえばJM105やTG1など）の菌叢上で、βガラクトシダーゼ基質のXgalを含んだ寒天培地を用いてプラークを形成させると、青色のプラークとなる。このベクターのクローニングサイトはαサブユニット内にある為、cDNAが挿入されると、βガラクトシダーゼ生成が阻害され、白色のプラーク（厳密には透明）が形成される。このシステムにより、作製したライブラリー中にcDNAが挿入されたファージがどれくらい存在しているのか計算することができる。
HeLa細胞またはHepG2細胞から作製したcDNAライブラリーはそれぞれ、2.7×107 pfuおよび2.5×107 pfuのファージから成り、
白色プラークの比率はそれぞれ15.3%と3.0%であった。故に、cDNAが挿入されたファージ数はそれぞれ、4.1×106 pfuと7.5×Fig. 1. Affinity selection of cDNA libraries with sera frompatients with SS.
Phages from the HepG2 cDNA library were applied to a
microtiter well coated with serum from a patient with SS, andselected four cycles by affinity selection as described in 2.5. In
this figure, an example of such affinity selection is shown, andthe increased fraction of white plaques in total phage plaques is
illustrated by a line graph and the increased fraction of reactive
clones with a patient serum in the library population by ahistogram.

105 pfuと算出された。しかしながら、cDNA挿入ファージ中、理論上、半分は本来のタンパク質翻訳方向とは逆向きに挿入され、また、３分の２はリーディングフレームではない為、スクリーニングに有効なライブラリーのプールは、6.9×105 pfuおよび1.3×
105 pfuと算出された。
今回用いたベクターは挿入されたcDNA由来のタンパク質を外套タンパク質のDタンパク質に融合させた形で発現するが、そのつなぎ目にはamber停止コドンを持つようにデザインされている。
それゆえ、amber suppressor変異大腸菌株（TG1など）でファージ５つの血清mixtureで選別された血清反応クローンを血清を増殖させると外来タンパク質はファージ表面にDタンパク質とmixture １つにつき、10クローンずつランダムに拾い上げ、PCRの融合タンパク質として "ディスプレイ" され、amber suppressor

による挿入断片サイズの比較およびDNAシークエンスを行った。

を持たない大腸菌（Q447など）では外来タンパク質は発現されその結果、４つの異なったcDNA断片を持ったクローンであるこない。一般に外来タンパク質は大腸菌やファージの生育に阻害的とが判明した。これらを、Sg1p3、Sg3p11、Sg4p1およびSg9p22に働くため、上記性質を利用して、作製したcDNAライブラリーと名づけた（Table１）。これら単離したファージクローンを用いはその多様性をできるだけ失わないようにQ447で増殖させ、アて、それぞれスクリーニングに用いた血清mixtureのどの患者血清

フィニティセレクションの直前にTG1で再増殖させた。

と反応したかを同定した。
更に、HeLa cDNAライブラリーを用いて、51人中17人の患者血3.2 cDNAライブラリーのスクリーニング

清を個々に、および残りの34人分については上記と同様に４〜５

HepG2 cDNAライブラリーのスクリーニングの為に、５〜６人人の患者血清からなる８つのmixtureによるアフィニティセレクシ

分のSS患者血清をプールして１つのmixtureとし、51人の患者血ョンを行った。17患者血清を個々に用いた場合では、最終的に２

清から９つの血清mixtureを作製した。この血清mixtureをコート個の血清反応クローンが得られ、S7-1およびS12-11と名づけた。８したmicro titer plateに、TG1で増殖させたライブラリーから約つのmixtureによるセレクションにおいては、３個の血清反応クロ２×10 pfuのファージを添加して、アフィニティセレクションをーンが得られ、Sg2-1、Sg4-1およびSg7-2と名づけた（Table １）。

10開始した。未結合のファージを除去した後、結合したファージを
collagenaseによる切断で溶出させた。ファージタイターを測定した後、約500個のファージプラークを寒天培地で形成させ、ニト
ロセルロース膜にこれらのプラークを転写して、スクリーニングに用いた血清mixtureで免疫染色を行い、血清と反応するプラークを探索した。残りの溶出液は再度TG1に感染・増殖させ、血清
コートプレートに添加してアフィニティセレクションを繰り返した。４回のアフィニティセレクションを行った結果、９つの東亞合成研究年報

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Table 1

端領域をコードしていた。このKi-67 antigenに対する抗体は"proliferation marker" として使用されている10)。

3.3 DNA塩基配列解析
選別したクローンの挿入cDNA断片の5'および3'末端の塩基配列（およそ400塩基）を読み、インターネット上のDNAデータベ

Fig. 2. cDNA sequences encoded by phage clones isolated.
Rectangles indicate coding sequences of autoantigen cDNA
based on published sequences. Lines protruded from therectangles indicate the 5' and 3' untranslated regions on theleft and right, respectively. DNA sequences encoded by all thecDNA clones isolated in this study are indicated by lines under
the rectangles. The numbers of amino acid residues encoded by
the autoantigen cDNA are shown inside the rectangles. The
names of autoantigens and isolated clones are shown on theleft.

ース（GenBank、EMBL、DDBJ、PDB）と比較した（BLAST検索）。その結果、９つのクローンで７つの既知タンパク質の一部をコードしていることが判明した (Fig.２)。この７つのタンパク質の内、３つのクローン（Sg7-2、Sg3p11、Sg4-1）がコードする
タンパク質はこれまでにどの自己免疫疾患でも、自己抗原として報告されたことは無く、一方残りの４つのタンパク質（Sg1p3、Sg2-1、Sg9p22、S7-1）はSS患者血清により認識される自己抗原として報告のあるものであった。新規な自己抗原タンパク質の内、Sg7-2はSMN（survival motor neuron gene product）と呼ばれ3.4 単離したクローンと反応する患者血清の頻度るタンパク質の中心部位をコードしていた。SMNは脊髄筋萎縮

各種自己免疫疾患および健常人の血清中に存在する、単離し症原因遺伝子としても知られている 。Sg3p11はpM5と呼ばれるた抗原クローンに対する自己抗体の頻度を測定する為に、ファータンパク質のカルボキシ末端部と3'-UTR部分をコードしており、ジクローンを固相に結合させたELISA法を用いて、72人のSS患

pM5はヒトコラゲナーゼの金属結合領域とホモロジーを持つ者、22人のSS以外の自己免疫疾患患者（SLE８人、PBC８人、cDNAとしてA2058メラノーマcDNAライブラリーから単離された

SSc６人）および72人の健常人より得られた血清を測定した。

ものである 。Sg4-1とSg4p1はTRK-fused gene (TFG)と呼ばれる

Table ２に示すように、Sg1p3 (SS-B/La)は21/72（29％）のSS患

タンパク質のアミノ末端をコードしていた 。

者血清と反応した。22個のSS以外の自己免疫疾患患者血清では、

4)

5)

6)

Sg1p3とS12-11はSS-B/Laのアミノ末端側のペプチドをコードし１人のPBC患者血清と反応した（1/22: 4.5%）。市販のELISAキッていた。SS-B/LaはRNA polymerase-III転写産物の結合するリボヌトを用いた試験では、Sg1p3と反応した上記21人のSS患者血清でクレオプロテインでSS-B/Laに対する自己抗体はSSやSLEで見つは20人の患者血清がSS-B/La抗体陽性と判定され、ファージ

けられている 。

ELISAの有効性が示唆された。SS-B/LaはSS患者血清で認識され7)

Sg2-1はhuman replication protein-A 70 kDa subunit (hRPA-70)のる主要な抗原の1つであり、陽性率は20〜30%と低いものの疾患

アミノ末端側約1/3部位をコードしていた。hRPAは１本鎖DNA結

特異性が高い為にSS診断の柱とされる診断マーカーとなってい合能をもち、種を超えてよく保存されているタンパク質混合体でる。今回の陽性率および特異性に関する結果は既存の知見と非あり、DNAの複製開始と伸長反応に関与するタンパク質である8)。

常によく一致していた。抗体が結合する抗原の領域をエピトープ

Sg9p22はnucleolus organizer region-90/human upstream bindingと呼ぶが、SS-B自己抗原のエピトープに関してはよく研究されてfactor (NOR-90/hUBF)の一部をコードしており、NOR-90/hUBFはおり11)、アミノ末端側に存在するエピトープ領域と今回得られた

RNA polymerase-Iが関与するリボソーマルRNAの転写を活性化す

クローンの挿入cDNA断片は一致しており、このことからも本研る機能をもつ9)。

究の採用した方法が正しかったことを裏付けている。

S7-1はcell cycleに関与したリボヌクレオプロテインの一つであ

Sg2-1/hRPA-70クローンは72人中２人の患者血清と反応したがるcell proliferation-associated protein Ki-67 antigenのカルボキシ末（2.8%）、SLE患者の2/8（25％）とも反応した。近年、immunoblot

東亞合成研究年報

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解析によりhRPAの３つのサブユニットの内２つ（70 kDaと32における頻度もSS-B/Laに比較して低いが、コードしている領域。

がC末端の短い領域であることおよび、自己抗体の多くは複数のGarcia-Lozanoらによれば、SS患者血清中に存在するhRPAサブユ

エピトープを持っている事からこれ以外の主要エピトープが存在

ニットに対する自己抗体の頻度は２〜３%とされ、今回の結果としている可能性がある。

kDa）がSSとSLE患者の血清と反応することが示されている

12),13)

よく一致している。hRPA-70自己抗体が結合する部位（エピトー

4 結語プ）に関する知見については報告が無く、本研究で見出された1186番目のアミノ酸からなる領域がエピトープとしての初の報告

自己免疫疾患の自己抗原探索における、λfooファージベクタとなった。

ーで作製したcDNA発現ライブラリーを用いたファージディスプ

Fujii14)らによれば、NOR-90/hUBF自己抗体の出現頻度はSS患

レイスクリーニングの有用性を検討した結果、有効なツールであ者で7.7%、SSc患者で2.2%とされているが、今回得られたクローることが確認できた。この技術は必要とする患者血清が非常に少ン（Sg9p22）では、SS患者で1.4％（1/72）と非常に低いもので量（10μl程度）で良いこと、また多数の検体をマイクロプレー

あった。この抗原の主要エピトープは89−310番目と310−633番

トなどを使って同時にスクリーニングできることなどから、非常目の２つの領域であることが既に報告されており、Sg9p22クローに効率的であることがわかった。このようなファージを用いた発ンの持つ433-510番目のアミノ酸からなる領域は２番目のエピト

現では糖付加やリン酸化といった翻訳後修飾が抗原性に関与しープと重なるだけである為、陽性率が低かったものと思われた。

ている場合には適していない為、万能とは言えない。しかし今回

Ki-67 antigenはBlochらによって、HepG2 cDNAライブラリーかのような抗体や、リガンド、レセプターなどのタンパク質、DNA、らSS患者血清を用いた免疫染色で反応したクローンがKi-67

RNAなどの核酸、多糖類など固相化できるものと相互作用する

antigenの一部をコードしていたことから自己抗原であることが確

タンパク質を見出すことには有用である。この方法は、タンパク認された15)。BlochらのクローンはKi-67 antigenの1159−1526番目

質の機能解析に研究の主流が移行しつつあるポストゲノム時代の（中心付近）のアミノ酸配列領域をコードしていたが、筆者が取有用なツールの一つとして期待が持たれるものである。

得したクローンはカルボキシ末端の2757-2850番目の領域をコー引用文献ドしていた。SS患者血清中の自己抗体出現頻度は1/72（1.4%）と1) G. P. Smith, Science, 228, 1315-1317 (1985).

非常に低いが、新しいエピトープ領域と考えられた。

2) I. N. Maruyama, H. I. Maruyama, S. Brenner, Proc. Natl. Acad. Sci.

これまでに自己抗原としての報告の無い３つのタンパク質でUSA, 91, 8273-8277 (1994).

は、SMN（Sg7-2）に対する自己抗体の頻度が4/72（5.5%）と最3) Y. G. Mikawa, I. N. Maruyama, S. Brenner, J. Mol. Biol., 262, 21-

も高く、次いでpM5（Sg3p11）で3/72（4.2%）であり、TFG（Sg4-1）では1/72と非常に低かった。今回得られた抗原クローン

30 (1996).

では健常人血清72サンプルと反応するものはTFG以外に無く、

4) S. Lefebvre, L. Bürglen, S. Reboullet, O. Clermont, P. Burlet, L.

TFGはSS特異的な自己抗原ではない可能性が考えられた。このViollet, B. Benichou, C. Cruaud, P. Millasseau, M. Zeviani, D. L.

３つの中では、pM5（Sg3p11）が他の自己免疫疾患患者血清とPaslier, J. Frézal, D. Cohen, J. Weissenbach, A. Munnich, J. Melki,は全く反応していないことから、特異性が非常に高い。SS患者

Cell, 80, 155-165 (1995).

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略語一覧
PBC, primary biliary cirrhosis（原発性胆汁性肝硬変）
SLE, systemic lupus erythematosus（全身性エリテマトーデス）
SS, Sjögren's syndrome（シェーグレン症候群）
SSc, systemic sclerosis（強皮症）
RA, rheumatoid arthritis（慢性関節リウマチ）
謝辞
本研究はスクリプス研究所丸山一郎主任研究員、奈良県立医大藤本隆講師のご指導とご協力を頂いておこなわれたものであり、深く謝意を示します。
本論文は、Geneに発表した論文16)をもとに加筆・修正したものであり、図表はElsevier Science社より転載許可を頂きましたことをここに明記します。

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