ISSN 2186-9138
食品の抗酸化力評価法について 1/4

JFRL ニュース

Vol.6

No.2

Oct．2017

食品の抗酸化力評価法について
はじめに
近年，酸化ストレスが様々な疾患を引き起こす原因 となると言われています。酸化ストレスとは，生体内で活性酸素が産生されて障害作用を発現する作用と ，生体システムが直接活性酸素を解毒したり ，生じた障害を修復する作用との間で均衡が崩れた状態のこと を言います 。酸化ストレスの原因は様々で，煙草の煙に含まれる有害物質を取り除くために白血球によって大量の活性酸素が生成されたり，紫外線が皮膚を通過して体内の酸素を刺激することにより過剰の活性酸素が生成されること が例としてあげられます。近年，過剰になった活性酸素を除去するために食品中の抗酸化物質で体内の抗酸化能を補うことが注目され，食品の抗酸化力を評価することが重要 視されています。
そこで，今回は食品の抗酸化力評価法についてご紹介いたします。

活性酸素と抗酸化能について金属が酸素に触れて放置されると錆びるように，酸素はもともと酸化力を持っています。これは酸素が不対電子を二つ持 つと安定するという特殊な性質を持っている ためです。この酸素がなんらかの影響で不安定な状態になり，酸化力が非常に強くなったもの を活性酸素およびフリーラジカルと呼びます。活性酸素は化学反応を起こしやすい酸素種 のことで一重項酸素，過酸化水素などが含まれます。フリーラジカル は不対電子を持ち，不安定で反応性の 高い物質のことでスーパーオキシドラジカル，ヒドロキシラジカル，一酸化窒素や遷移金属が含まれます。
スーパーオキシドラジカルとヒドロキシラジカルは ，フリーラジカルでもあり活性酸素でもあります（図－1）。このため活性酸素は広い意味で 反応性の高い物質，酸化力の強い物質全てを指すこともあり ，活性酸素とフリーラジカルを同義として扱うことも多々あります 1) 。
活性酸素は病気の元凶のように言われることが多いですが，体内に入り込んできた微生物，細菌及び毒物などを排除，分解する作用があり，生命にとって必要不可欠なものです。生体内で生成される活性酸素の例として，スーパーオキシドラジカル，過酸化水素及びヒドロキシラジカルがあります。これらはミトコンドリア内部で電子伝達系と TCA サイクルの過程で生成され，そのほとんどはミトコンドリア内部で水となりますが，少量の活性酸素がミ図－1

活性酸素とフリーラジカル

トコンドリア外に放出されます。このCopyright © 1987-2017 Japan Food Research Laboratories. All Rights Reserved.
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放出された活性酸素が体内の防御機構として使用され，さらに余った活性酸素は抗酸化能により無害化されます。その活性酸素を無害化する物質を抗酸化物質と呼びます。生体内での代表的な抗酸化物質にはスーパーオキシドディスムターゼ（SOD），カタラーゼなどの酵素があります。SOD はスーパーオキシドラジカルを酸素と過酸化水素に変え，カタラーゼはその過酸化水素を酸素と水に変えます。このように生体内の抗酸化能と活性酸素のバランスが取れている状態であれば活性酸素は 生体内で適切に処理され ，体は酸化されにくくなります 。しかし，余剰の活性酸素が生体内の抗酸化能によって消去 しきれない場合があり，この状態 が前述の酸化ストレスとなります。

抗酸化力の評価法について
ある抗酸化物質があらゆる活性酸素を消去することができ 訳ではなく ，抗酸化物質 毎に消去可能な活性酸素種が異なります。さらに抗酸化物質 は種類が非常に多く，それぞれの 活性酸素種に対する消去能の強さが異なる ため，抗酸化物質の含量で抗酸化 力を評価することはできません。このため，食品そのものがどの程度 の抗酸化力を持つか評価する必要があります。今回
は 弊 財 団 が 受 託 し て お り ま す 抗 酸 化 評 価 試 験 の 中 で 理 化 学 的 手 法 を 用 い た ス ー パ ー オ キ シド
消去活性，DPPH ラジカル消去活性 および ORAC を紹介します。

① スーパーオキシド消去活性 （SOSA）
生体内にも存在するラジカルであるスーパーオキシドラジカルに対する消去能を電子スピン共鳴装置（ESR）で測 定する方法です。 スーパ ーオキシドラジカルは活 性酸素の中では反応性は低いですが発生する量は多く，その他の活性酸素 の発生源でもある ので，SOSA を評価することは非常に重要です。ヒポキサンチンとキサンチンオキシダーゼを 混合すると酵素反応によりスーパーオキシドラジカルが発生します が，スーパーオキシドラジカルは非常に不安定な物質ですので DMPO のようなスピントラップ剤と反応させ て安定化し，ESR で測定します。これをスピントラップ法といいます。この測定系に食品の抽出液を添加したときに，抗酸化物質が存在すればスーパーオキシドラジカルは消去 され酵素反応により生じたラジカルの シグナルが小さくなります。このシグナル がどの程度小さくなるかで抗酸化力を評 価します（図－2）。
よく SOSA=SOD 活 性 と考 えら れ る ことがありますが， ビタミン C のような SOD
ではない 抗酸化 物質もス ーパーオ キシドを消去しますので， SOD のみではなく ，SOD 様の 物質 も含め た 測 定をして いる 点について は注意 が必要で す。また この方法は水系 での試 験となる ため，脂 溶性の抗酸化物質の評価には適しておりません。

図－2ESR のシグナル

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3/4② DPPH ラジカル消去活性DPPH（ 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）ラ ジ カ ルと いう 人工 的 に作 られ たラ ジカ ルに 対する消去能を分光光度計で測定する方法です。DPPH ラジカル溶液は紫色に呈色しており，抗酸化物質によりラジカルが 消去されるとその色が薄くなります。この色の濃淡を分光光度計で測定することにより 抗酸化力を評価します。標準物質に Trolox を用い，Trolox 相当量（μmol TE）として抗酸化力を評価します。この方法は試薬を混合して吸光度を測定する簡単な手法であるため，古くから利用されており抗酸化力を評価したデータが豊富にあります。また図－3 のように布のような固体の抗酸化力も測定できます。試料そのものに抗酸化力があれば DPPH 溶液に浸し ておけば色は退色するので抗酸化力の有無を確認することができます。
しかし，この評価法は生体内には存在しないDPPH ラジカルを使用しているため， 生体内で実際に抗酸化力があるかはわからないという

図－3布の DPPH ラジカル消去活性欠点があります。

③ ORACORAC は Oxygen Radical Absorbance Capacity の略で，1992 年米国農務省 （USDA）と国立老化研究所の研究グループが血漿の抗酸化能を測定するために開発した方法です。ラジカル発生剤 と し て AAPH[2,2'-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride]を 使 用 し ま す 。 AAPH
溶液を 37℃にすること で発生したラジカル が酸 素と反応してペルオキシ ドラジカルになると言われており，そのラジカル は蛍光物質であるフルオレセインを 分解します。その結果，フルオレセインの蛍光強度は 弱くなります。しかし，抗酸化物質が存在するとラジカルは消去されるのでフルオレセインの 蛍光強度は持続します 。この蛍光強度の衰退時間をマイクロプレートリーダーで経時的に測定し て，得られた測定時間と蛍光強度のグラフの 曲線下面積（Area underCurve：AUC）から抗酸化力を測定します （図－4）。抗酸化力は DPPH ラジカル消去活性と同様に Trolox 相当量（μmol TE）として評価されます。

図－4

測定時間と蛍光強度

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4/4

弊財団では，USDA 法と弊財団で開発した 50%エタノール抽出法を受託しています。USDA 法では水溶性の ORAC（H-ORAC）と脂溶性の ORAC（L-ORAC）を別々に測定し，両者の和を Total-ORACとします。この方法は 水溶性と脂溶性抗酸化物質のそれぞれの値が測定できる利点 がある一方で，操作が煩雑なために 時間がかかるという欠点もあります。そのため，簡易法として弊財団
は 50%エタノールで抽出 することで水溶性から脂溶性抗酸化物質まで幅広く抽出し測定する方法も使用しています 2) 。この方法は，50%エタノールでは十分に抽出されない脂溶性の抗酸化物質はあるものの，抽出操作が簡単かつ Total-ORAC の値に高い相関性があ ることが確認できました（図－5）。
4500
4000

y = 1.0514x - 33.069
R2 = 0.9879

3500

USDA法

3000
2500
2000
1500
1000
50000

図－51000

2000
3000
50%エタノール抽出法

4000

5000

USDA 法と 50%エタノール抽出法の比較(単位:μmol TE/g)

おわりに現在の評価法ではどの手法を用いても 全ての種類の活性酸素に対する抗酸化力を評価することはできません。例えば ，野菜などのカロテノイドは一重項酸素と呼ばれる活性酸素を消去しますが，ORAC では評価することができず，別のラジカルを用いた 方法で評価する必要があります。より正確に食品の抗酸化力を評価するためには ，複数の方法を用い て食品の抗酸化力を総合的に評価することが必要です。さらに食品中の抗酸化物質は多様であるため，同じ方法でも選択した抽出方法により抗酸化 力の値が変化することもあります。この問題点を解決するた
めに国内では統一された方法の確立が AOU 研究会により進められています。
また，近年では試験管の中ではなく生体内での抗酸化力を評価できるような評価法の開発 も進められています。弊財団でもご紹介した方法以外に細胞を用いた評価方法での試験も受託しており，お客様の目的に応じたご提案を行い，お役に立てるよう努めてまいります。

参考文献
1) 中野稔，浅田浩二，大柳喜彦

編: 活性酸素，共立出版（1988）

2) 吉田泉ら, 健康・栄養食品研究，12（3），11-17，2009

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