植物によるヘパリン合成のための基礎技術

国立研究開発法人産業技術総合研究所
生物プロセス研究部門
主任研究員 松尾 幸毅
2024年3月7日
1

本日の発表内容

１．植物による物質生産、特に組換えタンパク質の生産に関して
２．植物によるヘパリン合成のための基礎技術

2

様々な生産システムにより生産されるバイオ医薬品（組換えタンパク質）
タンパク質

遺伝子
組換え生産細胞

主な適応疾患t-PA（アルテプラーゼ）○

BHK （動物細胞）

急性心筋梗塞

グルコセレブロシダーゼ○

CHO （動物細胞）

ゴーシェ病

成長ホルモン○

C127 （動物細胞）

成長ホルモン分泌不全性低身長症

血液凝固第Ⅷ因子○

HEK293 （動物細胞）

血液凝固第VIII因子欠乏患者における出血傾向の抑制

ヒト抗BlyS抗体○

NS0 （動物細胞）

全身性エリテマトーデス

キメラ型抗TNFα抗体○

SP2/0 （動物細胞）

関節リウマチ、ベーチェット病、乾癬、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎

リソソーム酸性リパーゼ○

Tgニワトリライソゾーム酸性リパーゼ欠損症

尿酸オキシダーゼ○

酵母

癌化学療法に伴う高尿酸血症

グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ○

大腸菌

メトトレキサート排泄遅延時の解毒

HPV感染予防ワクチン○Hi-5（昆虫細胞）

子宮頚癌の予防

コロナウイルス（SARS-CoV-2）ワクチン○

ツマジロクサヨトウ由来細胞 （昆虫細胞）

SARS-CoV-2による感染症の予防

フェニルアラニンアンモニアリアーゼ類縁体○

Anabaena variabilis（藍藻）フェニルケトン尿症

国立医薬品食品衛生研究所 生物薬品部「承認されたバイオ医薬品」（2024年1月3日 現在）より
https://www.nihs.go.jp/dbcb/approved_biologicals.html

3

植物で生産した組換えタンパク質（試薬）の実用例
植物で生産したタンパク質（試薬）は20年ほど前から販売されている。

Sigma-Aldrich
製品名

カタログナンバー

植物種

ラクトフェリン ヒト

L1294

ラクトフェリン ヒト

ORF Genetics
製品名

カタログナンバー

植物種

イネ

ヒトEGF

IK0100オオムギ

L4040

イネ

ヒトFGF2

IK0200

オオムギ

トランスフェリン ヒト

T3705

イネ

ヒトVEGF 165

IK0500オオムギ

アルブミン ヒト

A9731

イネ

ヒトKGF

IK0600

オオムギ

アビジン from egg whiteA8706

トウモロコシヒトLIF

IK0700

オオムギ

Aprotinin, Bovine, Recombinant,Nicotiana sp., Animal-Free616371タバコ

ヒトGDNF

IK0900

オオムギ

Activin A active human

A4362

タバコ

ヒトFlt3 Ligand

IK1700

オオムギ

BAFF active human

B0939

タバコ

ヒトG-CSF

IK1800

オオムギ

ヒトIFNγIK2000オオムギ

ヒトIL-2

IK2100オオムギ

ヒトIL-3

IK2200オオムギ

ヒトIL-4

IK2300オオムギ

ヒトM-CSF

IK2400

オオムギ

ヒトSCF

IK2500

オオムギ

ヒトTNFαIK2600オオムギ

Lifeasible社
製品名

カタログナンバー

植物種

ヒト血清アルブミン

PP-Osr-001

イネ

ヒトフィブロネクチン

PP-Osr-004

イネ

ヒトフィブロネクチン

PP-Osr-005

イネ

ヒトトランスフェリン

PP-Osr-006

イネ

ヒトFGF2

PP-Osr-007

イネ

ヒトVEGF

PP-Osr-008

イネ

ヒトKGF

PP-Osr-009

イネ

ヒトラクトフェリン

PP-Osr-012

イネ

ヒトリゾチーム

PP-Osr-014

イネ

ヒトα-1 Antitrypsin

PP-Osr-016

イネ4

植物で生産した組換えタンパク質の実用例

 ニンジン培養細胞で生産したゴーシェ病治療薬（glucocerebrosidase）が販売（開発：Protalix社、販売：ファイザー）（2012年）。
 タバコ植物体で生産した抗エボラウイルスモノクローナル抗体（3種混合）がエボラウイルス感染者に使用され、良好な結果が得られた（2014年）。
 タバコ植物体で生産したCOVID-19ワクチン「COVIFENZ」がカナダで承認（Medicago社）（2022年）。
 イヌインターフェロンを発現したイチゴ果実を使用したイヌ歯周病軽減薬「インターベーリーα」が販売開始（ホクサン、北里研究所、産総研）（2013年）。

5植物生産医薬品の臨床試験
生産物発現に使用した植物疾患／病原体

臨床試験

大学、会社等臨床試験番号

P2G12 antibody

Nicotiana tabacum

ヒト免疫不全ウイルス (HIV)Phase I 終了 (2011)

University of Surrey,
Guildford, UK

NCT01403792

HAI-05 vaccine

Nicotiana benthamiana

インフルエンザウイルス (H5N1)

Phase I 終了 (2011)

Fraunhofer, Center for
Molecular Biotechnology,
USA

NCT01250795

Plant cell-expressed
recombinant
glucocerebrosidase (prGCD)

ニンジン培養細胞

ゴーシェ病

Phase III 終了、FDA 認可 (2012)

Protalix, Karmiel, Israel

NCT00376168

H5-VLP + GLA-AF vaccine

Nicotiana benthamiana

インフルエンザウイルス (H5N1)

Phase I 終了 (2014)

Infectious Disease
Research Institute,Seattle, WA, USA

NCT01657929

Autologous FL vaccine

Nicotiana benthamiana

濾胞性リンパ腫

Phase I 終了 (2015)

Icon Genetics, Munchen,
Germany

NCT01022255

Pfs25 VLP-FhCMB

Nicotiana benthamiana

マラリア

Phase I 終了 (2015)

Center for Molecular
Biotechnology, Plymouth,
MI, USA

NCT02013687

PA83-FhCMB

Nicotiana benthamiana

炭疽Phase I 終了 (2015)

Center for Molecular
Biotechnology, Plymouth,MI, USA

NCT02239172

PRX-102

タバコ培養細胞 (BY2 Cell)

ファブリー病

Phase II 終了 (2016)

Protalix, Karmiel, Israel

NCT01769001

NCT02363322

ZMApp

Nicotiana benthamiana

エボラウイルス

Phase II 終了 (2017)

National Institute ofAllergy and Infectious
Disease (NIAID),
Bethesda, MD, USA

CP-PRO-CoVLP-024

Nicotiana benthamiana

COVID-19

認可 (Canada, 2022)

Medicago, Quebec, QC,Canada

NCT05040789

KBP-201

Nicotiana benthamiana

COVID-19

Phase II (2021)

Kentucky BioProcessing,Owensboro, KY, USA

NCT04473690

植物による組換えタンパク質生
産には、主にタバコ（Nicotianabenthamiana）が使用される。

Plant Biotechnol Rep. 2023; 17(1): 53–65. より6一般的な遺伝子組換え植物の作出法
Rhizobium radiobacter(Agrobacterium tumefaciens、アグロバクテリウム)への導入

アグロバクテリウム DNA

アグロバクテリウムは有用物質遺伝子を植物のゲノムに組み込む

植物細胞再分化の誘導

遺伝子発現用ベクターの作製

再分化個体

有用物質遺伝子を持つアグロバクテリウムを植物（リーフディスク等）に感染させる。

形質転換処理後のリーフディスク

カルスの形成再分化個体の形成

再分化個体

馴化7

植物で組換えタンパク質を生産する方法（恒常的生産と一過性生産）

恒常的有用物質遺伝子

再分化(3 ヶ月)

形質転換

育成(3 ヶ月)

再分化植物体 (T0)

発現ベクターの構築

アグロバクテリウムの組換え

アグロバクテリウム
培養液

採種

育成(3～7 日)

減圧

バキューム
インフィルトレーション

針無しシリンジ育成(3～7 日)
シリンジ
インフィルトレーション

一過性（アグロインフィルトレーション）8

アグロインフィルトレーション（バキュームインフィルトレーション）の概要

気体が気孔から抜ける気体が気孔から抜ける

菌体懸濁液

菌体懸濁液

（１）植物をアグロバクテリウムの液に浸漬し、チャンバー内で減圧する。

（２）減圧状態を解除した際に、菌体液が葉の細胞間隙へと浸潤する。

シリンジインフィルトレーションの場合は、菌懸濁液を気孔から針無しシリンジによって強制的に注入する。

9

アグロインフィルトレーションの実際

10

GFPの植物発現

恒常的発現

形質転換後3か月

一過性発現（アグロインフィルトレーション）

処理後4日目

野生型

GFP発現
青色 LED 光下で撮影

11アグロインフィルトレーションによる組換えタンパク質生産（ウエスタンブロット解析）

kDa
80 60 -

上：クマジー染色下：ウエスタン

74 kDa50 -kDa40 -15–

30 25 20 -20–15 -

10 -

M

12

1

野生型
M

12

IGF1

12

TNF-α

12IL2

12タンパ
ク質A

12タンパ
ク質B

122

FGF1

GFP MP

タンパ
ク質C

植物では初（未発表）

千代田化工建設株式会社との共同研究成果
12

組換えタンパク質を植物で作るメリット・デメリット
メリット 複数のタンパク質の複合体の形成が可能（抗体など）。
 タンパク質のフォールディングが正確。
 翻訳後修飾（糖鎖修飾など）が可能。
 生産コストが低い（動物培養細胞等に比べ1/10以下）。
 動物やヒト由来病原体の混入が無い (ウイルス、プリオンなど)。
 拡大生産が容易。
 可食植物を用いた場合、「食べるワクチン」や「食べる薬」が作成可能。
デメリット
 タンパク質が発現可能かはやってみなければわからない（どの発現システムも同じ？）。
 組換えタンパク質の精製方法が発展途上。
 植物特有の翻訳後修飾。

13

本日の発表の内容

１．植物による物質生産、特に組換えタンパク質の生産に関して
２．植物によるヘパリン合成のための基礎技術

14プロテオグリカン、グリコサミノグリカンについて
プロテオグリカン
糖鎖（グリコサミノグリカン）とタンパク質（コアタンパク質）の複合体の総称。

アミノ糖

ウロン酸

アミノ糖グルク
ロン酸

n

ガラク
トース

ガラク
トース

キシロース

セリン

共通コアオリゴ糖

コアタンパク質

ウロン酸

グリコサミノグリカン
アミノ糖とウロン酸から成る２糖の繰り返し構造により構成される多糖。
アミノ糖とウロン酸の組み合わせや硫酸化パターン等によりコンドロイチン硫酸、へパラン硫酸、ヘパリン等に分類される。
↓
血液凝固を阻害する物質として幅広く利用されている。

15

従来技術とその問題点
ヘパリン等の動物由来糖鎖は、現在動物組織より抽出・精製することにより得られているが、不純物の混入等が問題となっている。
本技術によりヘパリン等の植物生産が可能となれば、アニマルフリーでヘパリン等を生産することが可能となる。

16

キシロース転移酵素によりグリコサミノグリカン合成が開始される
キシロース転移酵素

アミノ糖

ウロン酸

アミノ糖

グルク
ロン酸

n

グリコサミノグリカン

ガラク
トース

ガラク
トース

共通コアオリゴ糖

キシロース

セリン

コアタンパク質

ウロン酸

キシロース転移酵素 (XYLT, EC:2.4.2.26)がグリコサミノグリカンの合成には必要● プロテオグリカンの糖鎖部分合成の第一段階は、タンパク質のセリン残基にキシロースを転移する酵素（UDPD-xylose:protein beta-D-xylosyltransferase）が担う。

キシロース

セリン

UDP-キシロース

セリン

植物においてセリン-O-キシロース化されたタンパク質は未だ見出されていない。

キシロース転移酵素
17

植物細胞でのセリン-O-キシロース修飾の確立●ヒトキシロース転移酵素（XYLT）をタバコ（Nicotiana benthamiana）において一過性発現させることにより、タンパク質に対するセリン-O-キシロース修飾が可能にならないか？

ヒトキシロース転移酵素
遺伝子

アグロバクテリウム

キシロース転移酵素の一過性発現

キシロース

UDP

UDP-キシロース

Nicotiana benthamiana

セリン

キシロース
転移酵素

キシロース

セリン

18

キシロース転移酵素とセルグリシンの植物における一過性発現
セルグリシン：
主要なプロテオグリ
カンコアタンパク質

キシロース転移酵素（XYLT）発現用アグロバクテリウム

混合

セルグリシン（SRGN）発現用
アグロバクテリウム

セルグリシンに対してキシロース修飾がなされるか？
植物体を鉢ごと逆さにし、アグロバクテリウム懸濁液に浸漬。

アグロバクテリウム
懸濁液減圧し、アグロバクテリウムを葉に浸潤させる。

（バキュームインフィルトレーション法）

４日間育成
各タンパク質の発現

Nicotiana benthamiana

各種解析

19

植物生産セルグリシンのウエスタンブロット解析

遠心分離
葉試料

精製

磨砕

kDa

精製
組換えセルグリシン

遠心上清

キシロース
転移酵素
単独

セルグリシン
単独

キシロース
転移酵素＋
セルグリシン

XYLT

○ー○

SRGNー

○

○

25–

ウエスタンブロット
解析

セルグリシンの分子量に変化が認められた↓
セルグリシンに何らかの修飾がされた可能性

15–M

W

123

キシロース
転移酵素
単独

123

セルグリシン
単独

123

キシロース
転移酵素＋
セルグリシンJ Biosci Bioeng. 2018 Sep;126(3):371-378.より

20

植物生産セルグリシンに対する糖鎖修飾解析
糖特異的検出

クマジー染色kDakDaSDS-PAGE

50–50–

37–37–セルグリシンが糖修飾を受けた

25–
20–

20–

15–

15–

PVDF膜へのブロッティング

M

糖特異的検出SRGN XYLT＋単独
SRGN

P

M

SRGN XYLT＋単独
SRGN

P

P: ペルオキシダーゼ（糖鎖修飾あり、ポジティブコントロール）
J Biosci Bioeng. 2018 Sep;126(3):371-378.より

21

植物生産セルグリシン糖鎖修飾解析（トリプシン消化～質量分析）

切り出し

トリプシン処理

ペプチドの精製MALDI-TOF MS

85

134

：トリプシン切断個所

ヒトセルグリシン

IFPLSEDYSGSGFGSGSGSGSGSGSGFLTEMEQDYQLVDESDAFHDNLR
S：キシロース転移酵素によりキシロース修飾を受けると推定されるセリン残基22トリプシン消化物の質量分析結果
IFPLSEDYSGSGFGSGSGSGSGSGSGFLTEMEQDYQLVDESDAFHDNLR=5138.29
Intens. [a.u.]

Intens.
[a.u.]
8000x104

セルグリシンのみ発現

M5M-63\M5M-63 Ser (CHCA) 4\1SLin

5155.580
5155.580

0.8

6000

0.6

4000

0.4

2000
Intens. [a.u.]

0.200

Xyl0

3000

3000

Δm/z

Xyl1

130.6

Xyl2132.7

2000

132.7

Xyl4

Xyl5

132.1 132.2
5687.395
5687.395

5555.269
5555.269

2000

1000

5000
5000

5200
5200

5400
5400

Xyl6132.2

Xyl7

130.5

M5M-63\M5M-63 XT-Ser (CHCA) 5\1SLin

Xyl8133.7
セルグリシンとキシロース転移酵素を共発現

5819.580
5819.580

5951.801
6215.921
6215.921
5951.801
6082.258
6082.258

5422.582
5422.582
5289.898
5159.345
5289.898
5159.345

1000

0Xyl3

5600
5600

5800
5800

6000
6000

J Biosci Bioeng. 2018 Sep;126(3):371-378.より

6200
6200

m/z
6400 m/z
6400

23

まとめ
● キシロース転移酵素とセルグリシンをN. benthamianaにおいて一過性共発現させた結果、セルグリシンに対するキシロース修飾が認められた。
● セルグリシンのみをN. benthamianaで発現させても、キシロース修飾されない。
→タバコにはキシロース転移酵素と同様の働きをする酵素は発現していない。
● キ シ ロ ー ス へ の ガ ラ ク ト ー ス 付 加 が 認 め ら れ な い た め 、 N. benthamiana に は
xylosylprotein β-1,4-galactosyltransferase (B4GALT7)も発現していないと推定。

ウロン酸

アミノ糖

ウロン酸

アミノ糖

グリコサミノグリカン

グルク
ロン酸

nガラク
トース

ガラク
トース

キシロース

セリン

共通コアオリゴ糖

コアタンパク質

B4GALT7

Matsuo K. and Atsumi G.
Xylosylation of proteins by expression of human xylosyltransferase 2 in plants.
J. Biosci. Bioeng. (2018) 126 (3): 371－378.

24

本技術に関する知的財産権• 発明の名称：植物細胞においてキシロース修飾タンパク質を製造する方法、コアオリゴ糖修飾タンパク質を製造する方法、及びプロテオグリカンを製造する方法• 出願番号 ：特願2018-006334, PCT/JP2019/001544• 登録番号 ：特許6934666• 出願人：国立研究開発法人 産業技術総合研究所• 発明者：松尾 幸毅25

実用化に向けた課題• 現在、更なる糖鎖の伸長に成功している（未発表）。ただし、単純にヒト由来糖転移酵素をそのまま植物に導入してもヘパリン等の合成は達成されないと推定される。
• 今後、各酵素遺伝子を改変等して植物に導入する必要がある。

26

新技術の特徴・従来技術との比較• アニマルフリーでヘパリン等の生産が可能となり、動物由来の不純物の混入を防ぐことが可能。
• ヘパリン標品やヘパリン類似品に対して、価格面で対抗することは困難？

27

想定される用途• 医療分野• 美容分野• 宗教上の理由等で動物由来製品が利用できない人への提供。

28

企業への期待• 糖鎖解析の技術を持つ企業との共同研究を希望。
• 今回紹介した特許に関してだけでなく、植物による有用物質生産に関心を持つ企業との共同研究を希望。

29

産学連携の経歴• 2012年-2013年 O社と共同研究実施• 2014年-2015年 A社と共同研究実施• 2017年-2018年 M社と共同研究実施• 2022年- NEDO助成「カーボンリサイクル実現を加速するバイオ由来製品生産技術の開発」実施中• 2023年- 千代田化工建設株式会社と共同研究実施中

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お問い合わせ先株式会社 AIST Solutions（産業技術総合研究所 新技術説明会事務局)
URL：https://www.aistsolutions.co.jp/contact/form.html

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