1-2 遺伝子組換えカイコを用いた機能性シルクの開発●代表者 外川徹（生命科学科准教授）●分担者 間瀬啓介（生命科学科・教授）
安原徳子（生命科学科・准教授）
藤森裕基（化学科・教授）
中尾有利子（地球科学科・准教授）【研究の目的および概要】
シルクはカイコの生産する服飾の素材として人類が古くから利用してきた生物材料であるが，その主要なタンパク質であるフィブロインは生体適合性が高く，拒絶反応も低いことから再生医療用素材としても注目を集めている。また近年，カイコにおける遺伝子組換え技術の確立により，シルクタンパク質に他の有用タンパク質を組み込むことで新規の「機能性シルク」を作出することが，服飾のみならず医療など様々な分野に活用されることが期待されている。
植物由来の生理活性物質であるフラボノイドには抗酸化作用や抗動脈硬化作用，抗腫瘍作用が報告されおり，その利用が期待されている。カイコの食草であるクワの葉にも，ケルセチンをはじめとする多くのフラボノイドが含まれており，カイコの腸で吸収され，繭糸タンパク質を作る絹糸腺に輸送されて繭糸に含まれる。しかしながら，繭糸を構成する 2 つのタンパク質の層のうち，フラボノイドが含まれるのは精練の過程で洗い流されてしまうセリシン層であり，シルクを構成するフィブロイン層には含まれない。これは，フラボノイドを絹糸腺の細胞内に輸送する輸送タンパク質が，セリシンを合成する中部絹糸腺でのみ発現し，フィブロインを合成する後部絹糸腺では発現しないためだと考えられている。現在，中部絹糸腺におけるフラボノイド輸送タンパク質を同定しつつあり，遺伝子組換えの技術を用いて，このタンパク質を後部絹糸腺に発現させることで，フラボノイドを多く含む「フラボノイド - シルク」を合成することが期待される。
昆虫をはじめとする節足動物の体表面を覆うクチクラは様々で，例えばカブトムシの角は固いクチクラで覆われるが，幼虫であるイモムシの体の表面のクチクラは柔らかい。またバッタの脚の付け根には弾性に富んだクチクラが存在し，優れた跳躍に寄与している。この弾性に富んだクチクラはレジリン（resilin）と呼ばれるタンパク質で構成されており，天然ゴム以上の弾性を持つことから工業的な利用も期待されている。この弾性タンパク質レジリンの遺伝子をカイコのフィブロインタンパク質遺伝子に組み込むことで，新規素材としての「レジリン - シルク」を生産するカイコの作出を目指した。
本研究では，様々な生理活性を持つフラボノイドと弾性タンパク質であるレジリンに注目して，カイコの遺伝子組換え技術を用いて「フラボノイド - シルク」「レジリン - シルク」を作出し，その素材としての機能性を検証することを目指して，まずはフラボノイドを絹糸腺に輸送するタンパク質の同定と，複数種の昆虫からのレジリン cDNAのクローニング，およびそれらの遺伝子組換えカイコを作出するための実験系の構築を行った。
【研究の結果】
フラボノイドを絹糸腺に輸送するタンパク質を同定では，これまでに第 27 番染色体端部にその役割を担うタンパク質をコードする遺伝子の候補がクラスターとなっていることを見つけている。そこで，これら候補遺伝子の中部絹糸腺における発現様式と，塩基配列から予測されるアミノ酸配列について，正常個体と変異体との比較解析から責任遺伝子の絞り込みを行った。その結果，絞り込まれた糖輸送体クラスターの中の一つの予測遺伝子について，複数の系統を用いて塩基配列解析をしたところ，いくつかの塩基置換が確認された。さらに，この塩基配列をアミノ酸配列に変換して比較した結果，絹糸腺におけるフラボノイド透過の可否に対応したアミノ酸の置換が 2 箇所で4確認された。また，タンパク質の二次構造予測を行ったところ，アミノ酸置換により二次構造が大きく変化していた。これらのことから，この予測遺伝子がフラボノイド輸送に関わっている可能性が示唆された。
レジリン，あるいはレジリン様タンパク質は多くの昆虫から知られている。それらのアミノ酸配列を比較すると多様性に富んでおり，弾性タンパク質としての性質も大きく異なると考えられる。そこで，様々な性質をもつ「レジリン - シルク」の作出を意識し，いくつかの昆虫種（キイロショウジョウバエ，カイコガ，ステフェンスハマダラカ）のレジリン cDNA のクローニングを行なった。キイロショウジョウバエのレジリンタンパク質は，典型的なレジリン様構造を有しており，実際に先行研究において組換えタンパク質が高い弾性をもつことが示されている。
カイコガレジリンは，いくつかのレジリンに特徴的な構造を有しているものの，キイロショウジョウバエのレジリンに多く見られる繰り返し構造の数が少なく，異なる物理的性質をもつと考えられる。ステフェンスハマダラカのレジリンは，他の昆虫のレジリンとはかなり異なる構造を持つことが明らかになり，特有の性質をもつことが示唆された。
一方，遺伝子組換え実験を行う前に，同様な操作手順を行うゲノム編集技術を用いた遺伝子破壊実験を試みた。その第一歩として，笹繭の緑繭化への責任遺伝子であるピロリン 5 カルボン酸還元酵素遺伝子（P5CR1）のTALEN による破壊を行った。すでにこの方法によって生じた第 2 エキソンにおける欠失が，P5CR1 タンパク質の機能欠損を引き起こすことが明らかにされていることから，同様の領域で TALEN を設計し Platinum Gate 法によってそのプラスミドを構築した。続いて in vitro 転写によって TALEN mRNA を作成し，超微量インジェクション装置（FemtoJet-4i）を用いてカイコ産卵後 2 〜 6 時間目の卵にインジェクションした。使用した卵は，低温全暗条件下で胚発生させることにより非休眠卵を産卵する系統である大造メスに，P5CR1 正常系統である Kp 過剰肢蚕を交配して得た受精卵である。これにより 99％の確率で P5CR1 正常遺伝子を持つ非休眠卵を得ることができた。TALENmRNA をインジェクションした卵は，瞬間接着剤で注射跡を塞いだ後に保湿ケースに入れて 25℃環境下で胚発生を開始させたところ，353 卵中わずか 14 個体（4％）しか孵化幼虫（G0 世代）を得ることができなかった。そこでより保湿性の高い容器を用いて 95％以上の湿度を保ったところ，375 卵中 50 個体（13.3％）の孵化幼虫を得ることができた。
得られた G0 世代の繭からフラボノイド色素を抽出し分光光度計（420nm）によって調べたところ，幾つかの見かけ上濃い色調になっていた繭の色素ではその値が高くなっており，P5CR1 の機能欠損によるプロリナルフラボノールの蓄積を示唆していた。さらに，これら G0 の成虫個体に Kp 過剰肢蚕を戻し交配して G1 世代の卵を得，その一部からゲノム DNA を調製して DNA Duplex formation によるスクリーニングと Fragment 解析によるジェノタイピングを行った。しかしながら，これら 2 種類の方法いずれにおいても，目的である P5CR1 遺伝子の第 2 エキソン欠失に特有なバンドやピークを検出することはできず，結果としてノックアウト個体を得るまでには至っていないと判断された。
【研究の考察・反省】
今回，遺伝子組換えと類似の操作であるゲノム編集技術（TALEN）を用いた遺伝子破壊実験系の構築を進めることはできた。また，G0 世代に見られた繭の色調の変化は，当代のみではあるが中部絹糸腺細胞の P5CR1 遺伝子領域の破壊の可能性を示唆していた。しかし，残念ながらP5CR1遺伝子のノックアウト個体を得るには至っておらず，より適正なインジェクションのタイミングや十分量の TALEN mRNA の注入，インジェクション個体の孵化率の向上を検討することが必要であると考えている。
一方，中部絹糸腺におけるフラボノイド透過に関与している輸送体遺伝子として，可能性の高い候補遺伝子を見出すことができたことから，この候補遺伝子のノックアウトを行うことでフラボノイド輸送体遺伝子であることを5同定できると考えている。また，カイコガ卵への超微量インジェクション技術を改良することで遺伝子組換えカイコガ作出法を確立し，「フラボノイド - シルク」「レジリン - シルク」の作出を目指していく予定である。
【研究発表】
小山里実・間瀬啓介・山本公子，カイコ緑繭原因遺伝子 Ga の探索（続報），令和 3 年度蚕糸・昆虫機能利用学術講
演会（オンライン開催 2021 年 3 月）
菅野彩佳・長谷川遼・保久村俊朗・外川徹，CPR クチクラタンパク質のサブファミリー間でのキチン結合性の比較，
日本蚕糸学会第 90 回大会（長野県上田市，2020 年 3 月）
佐仲壮規・間瀬啓介・小山里実・平山 力，カイコ緑繭抑圧遺伝子 Ign-1 とピロリン 5 カルボン酸還元酵素遺伝子
P5CR1 との関係解明，第 5 回蚕糸・昆虫機能利用関東地区学術講演会（東京都府中市，2019 年 11 月）【研究成果物】
Mehmood R, Jibiki K, Shibazaki N, Yasuhara N., Molecular profiling of nucleocytoplasmic transport factor genes in breastcancer., Heliyon, 7, e06039（2021）
Homma, Y., Toga, K., Daimon, T., Shinoda, T. and Togawa, T., A mitochondrial phosphatase PTPMT1 is essential for the
early development of silkworm, Bombyx mori., Biochem. Biophys. Res. Commun., 530, 713-718（2020）
Yoshimi, T., Shima, A., Hagiwara-Norifusa, S., Sugimoto, T., Nagoe, A. and Fujimori, H., Phase Transitions of N（4-methoxybenzylidene）-4-butylaniline（MBBA）Confined within Mesoporous Silica., Crystal, 10, 792（2020）
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