ライフイノベーション新技術説明会
オンライン開催（2022年10月25日）

がん幹細胞を標的とした抗がん剤創製
Development of anti-cancer drug targeting cancer stem cells
特願2022-45538号「抗がん剤」

檜井 栄一
岐阜薬科大学・薬学部・薬理学研究室

産学連携の経歴
血液のがん＝白血病
がん幹細胞が残ることにより再発・転移がおこる
がん幹細胞が残ることにより再発・転移がおこる＜産学連携による特許取得状況＞➢ 特許第4430374号：檜井栄一「骨芽細胞の細胞死阻害剤」➢ 特許第4773102号：檜井栄一「破骨細胞分化抑制剤、及びこれを含んでなる骨粗鬆症用薬剤」➢ 特許第4923236号：檜井栄一「骨密度向上剤、抗骨粗鬆症薬および抗骨粗鬆症食品」➢ 特許第5822189号：檜井栄一「幹細胞から褐色脂肪細胞への分化誘導促進剤」➢ 特許第5866138号：檜井栄一「骨粗鬆症の予防及び/又は治療剤、骨吸収抑制剤、骨形成促進剤
及びそれらのスクリーニング法」➢ 特許第5979658号：檜井栄一「破骨細胞が関与する疾患の予防剤及び/又は治療剤」＜最近の産学連携＞➢ 課題名：CDK8阻害剤の開発と抗がん剤治療（Oncogene 2021）：毎日新聞、日経バイオテクなどで紹介➢ 課題名：間葉系幹細胞を標的とした骨粗鬆症治療（Stem Cell Reports 2022）：NHKニュース、朝日新聞、毎日新聞などで紹介＜進行中の産学連携＞➢ 課題名：骨疾患領域における漢方製剤のエビデンス構築➢ 課題名：ポリアミン含有食品素材の骨粗鬆症予防効果➢ 課題名：キナーゼ阻害剤による骨系統疾患治療

がん幹細胞が生き残り、再発や転移が起こる
血液のがん＝白血病
がん幹細胞が残ることにより再発・転移がおこる
がん幹細胞が残ることにより再発・転移がおこる
がん幹細胞
がん細胞

既存の抗がん剤や放射線療法など

がん幹細胞を標的とした革新的創薬（従来技術とその問題点・新技術の特徴・従来技術との比較）
がん幹細胞（がんの親玉）

①

②
働きバチ
＝がん細胞

女王バチ
＝がん幹細胞

がん細胞
（次代の）
女王バチ

がん幹細胞に対する薬を開発し、③④
既存の抗がん剤と併用することで、がんの根治を目指す！
既存の抗がん剤

効かない

標的標的スイッチON（活性化）

放射線治療（再発・転移）革新的ながん根治へ！
抗がん剤の創製！

SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 2（Smurf2）について• タンパク質分解系のE3 ubiquitin ligase• TGF-bシグナルを抑制する因子（Kavsak P et al., Mol Cell. 2000）（Ikushima H et al., Cell Stem Cell. 2009）• 腫瘍の発生を抑制する因子（Blank M et al., Nat Med. 2012）

TGF-β

Smurf2欠損マウス

TGF-βreceptor
Ub
Ub

PUb

腫瘍の自然発生率が上昇

Smad7
Smurf2

Smurf2欠損マウス由来
胚線維芽細胞（MEF）

Smurf2

発がん性が上昇

Smad7

Smad7

Smad7
NuclesSmurf2（E3ユビキチンリガーゼ）の249番目のスレオニンのリン酸化は、幹細胞の幹細胞性維持に重要である
これまでの研究成果

間葉系幹細胞
P

本研究に関連する研究成果

TGF-βThr249

がん幹細胞
P

Smurf2

TGF-βThr249
Smurf2P

分解

分解

Smad2/3

PP

Smad2/3

P

Smad2/3

Smad2/3

幹細胞性の維持

幹細胞性の維持

骨格の恒常性維持

がんの悪性進展度

Iezaki, et al., Development 2018
➢ Smurf2Thr249のリン酸化状態が高い ⇒ Smurf2活性が亢進グリオーマについて
脳神経細胞
神経線維腫瘍化

神経膠細胞（グリア細胞）

グリオーマ（神経膠腫）

悪性度

Grade Ⅰ 毛様状星細胞腫
Grade Ⅱ びまん性星細胞腫
Grade Ⅲ 退形成性星細胞腫
Grade Ⅳ 膠芽腫(Glioblastoma=GBM)

低5年生存率・あらゆるがんの中で、最も予後不良の中枢神経系腫瘍
・「手術・放射線治療・化学療法」＝集学的治療

10080→ 根本的な治療法開発が望まれている60

グリオーマ幹細胞%→ 約半世紀もの間、著明な予後の改善は認められていない

・「グリオーマ幹細胞（glioma-initiating cell = GIC）」

40
20

薬剤療法
放射線療法

グリオーマ細胞0再発

自己複製・分化

高10%程度GICにおけるSmurf2Thr249のリン酸化修飾が与える影響の検討について
pCS2-Smurf2T249A（リン酸化不活性化） Transfection
pCS2-Smurf2T249E（リン酸化活性化）
ヒトグリオーマ幹細胞

TGS-01

HEK293T

Infection
Lentivirus

2×105 cells/mL

4 days4 days

TGS-01

1×103 cells/well

DMEM/F12 Glutamax
B27(RA-)
20 ng/mL FGF
20 ng/mL EGF

7 days

DMEM/F12 Glutamax
B27(RA-)
20 ng/mL FGF
20 ng/mL EGF
1% Methylcellulose

スフィア形成能評価（幹細胞性の評価）
生存期間の観察（グリオーマ悪性進展度の評価）

TGS-015×104 cells/5 μL

GICにおけるSmurf2Thr249のリン酸化修飾は幹細胞性・悪性進展度に関与
スフィア形成能（グリオーマ幹細胞性）評価
E.V.

Smurf2変異体導入GIC移植マウス
生存期間の観察（グリオーマの悪性進展度評価）

Smurf2T249E
Smurf2T249A
リン酸化不活性化体 リン酸化活性化体

累積生存率

1100

活性化体

0.880
%0.6600.440
Scale bar, 1 mm

Sphere formation assay

不活性化体

**

0.220
00

00E.V.
E.V.
Smurf2T249A
Smurf2T249A
リン酸化不活性化体**

Smurf2T249E

Smurf2T249E
リン酸化活性化体**
001010204030203040
Sphere number

50506060**

608040406080
n=10-14生存日数**p < 0.01 , Log-rank test., Bonferroni test.
2020E.V.

活性化体

グリオーマ患者の腫瘍組織を用いた解析
Glioma悪性度

GradeⅡ

GradeⅢ

GradeⅣ

Glioma組織分類

Normal Brain

OD(乏突起神経腫)

DAAA(びまん性星細胞腫)(退形成性星細胞腫)

GBM( 膠芽腫)

検体数836912300

250

250

200

200

150

% of NB% of NB

300

Smurf2/b-actin

p-Smurf2/b-actin
ヒトグリオーマの悪性度（グレード）に依存
してSmurf2のリン酸化レベルが低下する

150100100505000低下

Smurf2の249番目のスレオニンのリン酸化修飾はがんの悪性進展度に関与
Smurf2Thr249のリン酸化修飾 ＝① グリオーマ幹細胞の幹細胞性維持に関与② グリオーマの悪性進展度に関与③ ヒトグリオーマの悪性進展度と関連性
Smurf2リン酸化活性化状態

グリオーマ幹細胞

TGF-βリン酸化
Thr249P

創薬標的？

Smurf2➢ Hiraiwa et al., Commun. Biol. 2021
➢ NHKニュース、朝日新聞、中日新聞、岐阜新聞などのメディアで紹介

PP

分解?

Smad2/3
Smad2/3
幹細胞性の低下グリオーマ悪性進展度の抑制

PP5はグリオーマの治療標的となり得る？
PP5ノックダウンGIC

Sphere formation assay

PP5導入GIC

PP5E.V.

shContshCtrl

E.V.
E.V.

**

PP5PP500

20204060
4060
Sphere number00%%

0.4
400.2
2000

0010102020**
30403040
生存日数40604060
Sphere number

0.8
80

0.880
E.V
E.V.
.
PPPP5
520208080

1100

11000.660

***

shPP5
shPP58080

累積生存率

生存期間の観察

shPP5

shCtrl

5050

0.6
60
0.4
400.2
2000

60607070*

shCtrl
shNeg
a
shPP5
shPP500

101020
2030
4030
40
生存日数

5050

60
607070PP5はグリオーマの治療標的となり得る？
PP5ノックダウンGIC

shControl

shPP5
①

shPP5
②

p-Smurf2

shPP5

shCtrlPP5阻害により
shCtrlSmurf2Thr249のリン酸化（活性化）維持
shPP5
***
shContPpp5c

shPP5b-actin

↓00

2020

**p < 0.01,
Ppp5c: ***p < 0.001 Student’s t-test.
Protein phosphatase 5, catalytic subunit

40604060
Sphere number

GICの幹細胞性
累積生存率
100 が低下する
グリオーマの悪性進展度
PP5ノックダウンGICでは
80

80
80

n=4

1

p-Smurf2Thr249低下%

0.80.660

shCtrlshNeg
ashPP5
shPP50.4400.2
2000001010*p < 0.05, **p < 0.01 , Log-rank test.

202030
4030
40
生存日数

*50
5060
60

70
70

n=12-14

Smurf2活性化剤の探索
Smurf2Thr249
リン酸化活性化状態

PP5Thr249

P

Smurf2Thr249
リン酸化不活性化状態

P阻害?

Smurf2

Smurf2

グリオーマ治療薬「Smurf2Thr249の脱リン酸化を阻害する化合物（＝Smurf2活性化剤）」の探索

スクリーニングについて大規模スクリーニング
1次フォスファターゼ法による評価
Hit compound

Smurf2Thr249のリン酸化への影響
2次(-)

グリオーマ幹細胞での評価
スフィア形成能への影響

3次

(+)

グリオーマ幹細胞での評価

Hit compound
(+)

(-)

「Smurf2Thr249の脱リン酸化を阻害する化合物の（＝Smurf2活性化剤）」の探索

in vitroフォスファターゼアッセイ• 基質としてp-Smurf2(Thr249) 周辺ペプチドを用いるので、特異性が高い（＋独自性）• 特別な試薬や抗体を必要としない（安価な系）• 特別な機器も必要なし（吸光光度計があればOK）• 組換えPP5タンパク質の大量精製系を確立済み• シンプルなアッセイ系• 多検体を短時間（1時間以内）にスクリーニング
可能50 mM Tris-HCl (pH 7.4)
2 mM MgCl250 mg/ml p-Smurf2(Thr249 ) ペプチド
(RTHLH{pTHR}PPDLPEGYC)
100~500 ng 組換えPP530分
5% Na2MoO42mM Malachite green
2 M H2SO40.1 M L-Ascorbic acid15分
吸光度測定（O.D.600）

45分

Validated Compound Library（3,300個）
1次スクリーニング結果
PP5 assay 活性値

350
350

活性値 (% of Control)

300
300

250
250

200
200

150
150

100
100

50
50000500

活性値：10 μMでの残存活性

1000

1500

2000

2500

3000

2次スクリーニング（Smurf2Thr249リン酸化に対する効果）
TGS-01

ヒット化合物
10 μM

2×105 cells/mL

12 h

Western blotting→ Smurf2p-Smurf2

DMEM/F12 Glutamax
B27(RA-)
20 ng/mL FGF
20 ng/mL EGF

Controlp-Smurf2

Smurf2b-actin①②③④⑤⑥⑦

3次スクリーニング（スフィア形成能に対する効果）
Sphere formation assay
140120①100% of Control

Control②8060③40n=410 µM 暴露

200***

Control

Control⑤⑤③④②①②③⑤***p < 0.001, Student’s t-test., Bonferroni test.

Core Library（9,600個）
1次スクリーニング結果
PP5 assay 活性値

300300

活性値 (% of Control)

250
250

200
200

150
150

100100505000

01000

2000

活性値：10 μMでの残存活性3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

100002次スクリーニング（Smurf2Thr249リン酸化に対する効果）
ヒット化合物
10 μM

TGS-012×105 cells/mL

12 h

Western blotting→ Smurf2
p-Smurf2⑩⑪DMEM/F12 Glutamax
B27(RA-)
20 ng/mL FGF
20 ng/mL EGF

Controlp-Smurf2

Smurf2b-actin⑧⑨⑫

3次スクリーニング（スフィア形成能に対する効果）
Sphere formation assay
140120Control% of Control

100⑧8060
40*20⑩⑫n=410 µM 暴露0Control
Control⑪⑧⑧⑩⑫⑫*p < 0.05, Student’s t-test., Bonferroni test.

現時点でのまとめ
Validated Compound Library総数

1st screening（酵素評価）

2nd screening（リン酸化評価）

3rd screening（細胞評価）＞50%阻害@10 mM

3,300 ＞

7＞＞

4

1Core Library総数

1st screening（酵素評価）

2nd screening（リン酸化評価）

3rd screening（細胞評価）＞50%阻害@10 mM

9,600 ＞

5＞

3＞

1

特願2022-45538号「抗がん剤」

新技術の科学的・技術的優位性
創薬標的及び作用機序の新規性、独創性
創 薬 標 的 は 我 々 が 世 界 に 先 駆 け て 見 出 し た Smurf2 の 新 規 リ ン 酸 化 修 飾（Smurf2Thr249）であり、新規性および独自性は極めて高い。
スクリーニングで見出されたヒット化合物群の新規性
複数のケモタイプがヒット化合物として見出されたが、これまでにPP5阻害およびSmurf2脱リン酸化阻害としても知られていない。
アンメットニーズの充足度や既存薬に対する優位性
Smurf2Thr249のリン酸化状態を高く維持することにより、著明なグリオーマ進展抑制が観察されたことから、GICのSmurf2の翻訳後修飾を標的とした薬剤はアンメットニーズの解消に貢献可能である。
化合物等の医薬品シーズとなる新物質
現在得られているヒット化合物群のSmurf2リン酸化維持作用、GIC阻害作用を把握することで合成展開可能なシード・リード化合物を決定する。

実用化に向けた検討項目・企業への期待
コンセプト「Smurf2Thr249 のリン酸化修飾（研究標的）」がGBMの発症機序において中心的な役割を担い、そのリン酸化亢進がアンメットニーズを充足しうる治療効果をもたらすこと

研究内容①ヒット化合物群のGICに対する効果がPP5阻害およびSmurf2活性化の効果と一致するかを検討する（＝ヒット化合物群が真の阻害化合物であることを検証）②ヒット化合物群が合成展開（最適化、高活性化）できる骨格（ケモタイプ）であるかを検証する（＝構造活性相関の検証）③ヒット化合物群に懸念点となる非特異的作用がないか（少ないか）を検証する（＝PP5特異性の検証）④ヒット化合物群がin vivoモデル系で評価できる化合物であるかを検証する（＝ファーマコキネティックス解析）

がん幹細胞を標的とした難治性がんに対する創薬（想定される用途）
①

がん幹細胞
②
難治性がん（膠芽腫、白血病、骨肉腫など）
女王バチ（がんの親玉）働きバチ＝がん幹細胞
対象：ヒト・伴侶動物
＝がん細胞

がん細胞
（次代の）
女王バチ

③
既存の抗がん剤

④
効かない

放射線治療

標的

標的

Smurf2活性化（再発・転移）革新的ながん根治へ！
抗がん剤の創製！

問合せ先：
発表者：
岐阜薬科大学・薬学部・薬理学研究室 檜井栄一
TEL: 058-230-8123
E-mail: hinoi-e@gifu-pu.ac.jp

担当コーディネーター：
岐阜薬科大学・事務局庶務会計課 中尾真一郎
TEL: 058-230-8100
E-mail: syomuk@gifu-pu.ac.jp