ー 論文ー●DNA低コスト合成法の開発
つくば研究所

バイオサイエンス研究部

堀江洋慈・北村昭憲・廣瀬邦彦※

DNAオリゴマーは現在PCRプライマーなどに広く使用されているが、医薬・治療の分野でもそれを用いた応用研究が盛んに行われている。しかし、DNAオリゴマーを素材としてみた場合、あまりにも高価であり、このことが今後実用化する際に大きな阻害要因になると考えられている。そのためDNAオリゴマーの合成コストを削減する方法について、米国のベンチャー企業を中心に研究されているが、これを大幅に改善するような成果は得られていないのが現状である。
そこで筆者らはDNAオリゴマーを低コストで合成するための方法を開発する目的で、現在のDNA合成法の主なコスト要因であるDNA合成試薬、それを用いたカップリング反応、さらにその後の硫化工程についてそれぞれ再検討を行った。その結果、現行法のコストに比べ、それを大幅に削減できる新しいタイプのIn situ DNA合成法を見出した。

さくできることを見出した8）。またBonoraらも同様に、DNAオ
1 緒 言

リゴマー合成に液相系反応を用いることにより、DNA合成試薬の使用量を減ずることができることを報告している9）。

DNAの化学合成法はノーベル賞を受賞したKhoranaが1950年

そこで、我々はデオキシリボヌクレオシドとリン酸化剤との代後半にリン酸ジエステル法を見出して以来、より効率の良い反応について再検討を行い、新しいタイプのIn situ DNA合成試

1）

方法を求めて種々の改良が成されてきた 。例えば1981年に薬を見出したので、その合成と利用法について報告する。また、Caruthersによってアミダイト法2）が、また1986年Matteucciら3）

コスト的に極めて有利である、同試薬を用いたDNAオリゴマー

4）およびStawinskiら によりH−ホスホネート法が、筆者らの研の液相合成法についても検討したので、その結果を述べる。

5）

究グループにおいても1986年にチオホスファイト法 がそれぞ
2 実 験

れ開発された。反応方法はいずれも固相上にDNA合成試薬を順次反応・結合させ、ヌクレオチド鎖として伸長させていく、
いわゆる固相合成反応が用いられている。これらはDNAオリ

2.1 試薬ゴマーを迅速にかつ効率よく与えるものであり、その当時のすべての反応はアルゴン雰囲気下、脱水溶媒を用いて行っDNAオリゴマーに対するニーズを満足させるものであった。した。N−トリメチルシリルイミダゾールは東京化成社製試薬をかし、これらの方法では、固相反応をスムースに進行させるた

蒸留して使用した。その他の試薬は精製をせず、購入品をそのめに、基質であるヌクレオチド鎖に対して化学量論的に、高価まま利用した。5'−O，N−保護デオキシリボヌクレオシドは有なDNA合成試薬を大過剰に用いることが必要であり、そのた

機合成薬品（株）より購入した。DNA自動合成機上でのDNA

めに合成コストが大きくなるという難点があった。

オリゴマーの合成に必要な試薬類一式は、 パーキンエルマー社

これを解決するための方法として、Beaucageら

6）

および

（旧パーセプティブバイオシステムズ社）製試薬を使用した。ポ

Moonら はDNA合成試薬の原料であるデオキシリボヌクレオ

リエチレングリコールモノメチルエーテル（mPEG）はアルドリ

シドとリン酸化剤とを反応させた溶液をそのままDNAオリゴッチ社から購入した。その他の試薬はアルドリッチ社、東京化

マー合成に用いる、いわゆるIn situアミダイト法を開発した。

成、和光純薬、キシダ化学、純正化学から購入した。

7）

この方法はDNA合成試薬の合成コストを削減する方法として

安息香酸メチル−モノメトキシポリエチレングリコールは大注目されたが、デオキシリボヌクレオシドとリン酸化剤の反内らの報告10）およびReinhoudtらの報告11）を参考にして合成

応が十分な選択性を持って進行しないことから、この工程のした。また安息香酸クロリド−モノメトキシポリエチレングリ

更なる改良が求められていた。

コール2は安息香酸−モノメトキシポリエチレングリコールと一方筆者らは、反応基質である固相担体に着目し、DNAオリ

塩化チオニルとの反応により調製した。

ゴマー合成に用いている固相反応系を、Merrifield樹脂を用いて新しいα−置換−β−シアノエトキシジクロロホスフィン5より液相系に近づけることにより、DNA合成試薬の過剰量を小は畑らの方法12）を参考にして、対応するα−置換−β−シア東亞合成研究年報

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ノエトキシトリメチルシランと3当量の三塩化リンとを反応さトキシポリエチレングリコール2をアルゴン雰囲気下、無水ピせた後、過剰量の三塩化リンを減圧留去し、残査を減圧蒸留

リジン（80ml）に溶解し、これを先の反応溶液に添加し、室することによりそれぞれ70〜90％の収率で得た。

温にて2時間攪拌した。0℃に冷却し、蒸留水（10ml）を添加

上記α−置換−β−シアノエトキシトリメチルシラン誘導して反応を停止し、約1／2に濃縮した後、0℃にて30％アンモ

体はHorningの方法で得られたα−置換−β−シアノエトキシ

ニア水（20ml）を加え20分間攪拌した。溶媒を留去し、飽和13）に1.2当量のトリメチルクロロシランを反応させ、炭酸水素ナトリウム水溶液（200ml）を加え、クロロホルム

生成したリチウムクロリドをアルゴン雰囲気下でろ過後、ろ（3×100ml）で抽出した。有機相は水洗（2×200ml）し、無水液を分別蒸留することにより高収率（80〜95％）で得た。

硫酸ナトリウムで乾燥した。この溶液の溶媒を留去し、シリリチウム

N−トリメチルシリル−2−メチルイミダゾールおよびN−ト

カゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノー

14）リメチルシリル−4−メチルイミダゾールは文献に従って合

ル＝100／5）で精製するとデオキシシチジンのmPEG保護体3'成した。

が得られた（18.85g，収率82％）。
同様にして2'−デオキシアデノシンのN−mPEG保護体を得

2.2 実験装置

た（収率40％）。チミジン誘導体はトリメチルシリル化の際、5核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、日本電子社製JNM-

当量のジイソプロピルエチルアミンを加え反応させ、脱シリル

31EX400核磁気共鳴測定装置を用いて測定した。 P−NMRは日

化はフッ化水素ピリジン錯体を用いて行った（収率92％）15）。

本電子社製1％トリメチルホスファイトの重アセトン溶液を外得られたN−mPEG保護体は文献に従ってジメトキシトリチ
ル化を行った（4', 60〜90％）16）。

部標準（δ＝140ppm）として測定した。HPLC分析は、Waters
社製LC Module I plusに和光純薬社製Wakopak WS-DNAカラ

2.3.2 α−置換−β−シアノエトキシビスアゾリルホスフィンム（4.6mmφ×150mm）を装着して分析した。キャピラリー

（リン酸化剤）の合成

電気泳動装置は大塚電子（株）製CAPI-3100にJ&W Scientific
社製μPAGE-5を装着して分析した。DNA自動合成機は、パーキンエルマー社製ExpediteTM 8909を使用した。
2.3 方法
2.3.1 mPEGを保護基にもつ
2 −デオキシリボヌクレオシドの合成

α−置換−β−シ
アノエトキシジクロロ
ホスフィン5の0.2Mト
ルエン溶液に2.2当量のN−トリメチルシリ
ルアゾール化合物をアルゴン雰囲気下、室温で加え、5〜10分
間攪拌した。副生したクロロトリメチルシ
ラン、トルエンおよび
過剰のN−トリメチル
シリルアゾール化合物を、まず室温で15ピリジン共沸（2×20ml）した2'−デオキシシチジンモノ塩

分間減圧留去した後、さらに35〜55℃で減圧留去して、目的酸塩（1, 13.18g，52mmol）を、アルゴン雰囲気下、無水ピリのα−置換−β−シアノエトキシビスアゾリルホスフィン6をジン（120ml）に懸濁させ0℃に冷却した。ここにトリメチル

無色、透明の油状物として定量的に得た。1H−NMRの測定結

クロロシラン（19.0ml，150mmol）を添加し15分間攪拌した。

果をTable 1に纏めた。このようにして得られたリン酸化剤6

安息香酸−モノメトキシポリエチレングリコール（Mn＝350，

は、精製することなくIn situでヌクレオシドのリン酸化反応に17.60g，34.9mmol）から調製した安息香酸クロリド−モノメ用いた。

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Table 2 Preparation of In situ DNA Synthesis Reagents [7]Table 1 α-Diorgano-β-cyanoethoxy-bis(azolyl)-phosphines12[6] (NCCH2CR R OPX2)エステル]／（[メチルエステル]＋[3'−3'二量体]）×100。
2.3.4

リン酸

化剤の置換基の体積和の算出
α−モノ（もしくはジ）置換−β−シ
アノエトキシビス（4−メチルイミダゾ
リル）ホスフィン、
ROPX2（6，X＝4−メチルイミダゾリル）
において、まずSPARTANTM Version4.1.1（Wavefunction，Inc.）により三次元分子構造を組み立て、MM力場を使って立体エ
ネルギーの最適化を行った。更に半経験的分子軌道法（AM1）により構造の最適化を行い分子構造を確定した。こうして得られた立体構造に基づいて、TSARTM 3.0（Oxford Molecular Group）の分子体積
2.3.3 リン酸化剤と保護デオキシリボヌクレオシドとの反応計算プログラムにより置換基Rのvan der Waals体積和を計算した。
その結果（R1＋R2）をTable 3 に示した。

（In situ DNA合成試薬の合成）

Table 3 Evaluation of In situ DNA Synthesis Reagents [7]2.3.2に従って合成して得たリン酸化剤6を、系内をアルゴン置換した後、適量の重クロロホルムを加えて溶解し、反応溶液の濃度が仕込みのジクロロホスフィン5に対して0.5Mとなるよう調製した。別に5'−O−ジメトキシトリチル−N−保護
デオキシリボヌクレオシド4を仕込みのジクロロホスフィンに対して1当量を秤取し、室温で2時間減圧乾燥した。これに先の重クロロホルム溶液をアルゴン雰囲気下で加え、均一になるまで攪拌した後、一晩静置し反応を完結させ、目的とする

In situ DNA合成試薬7を得た。種々のIn situ DNA合成試薬の2.3.5 In situ DNA合成試薬を用いた2量化反応

物性値はTable 2 、Table 3 に纏めた。

（ジデオキシリボヌクレオチドの合成）

目的とする一置換体と副生した二置換体（3'−3'二量体）との成分比は、この反応溶液の約1／2容をNMRサンプルチューブに移し、ここに脱水メタノール約2当量を加えて室温で攪拌し一置換体をメチルエステ
ルに誘導し、この反応溶液の31P−NMRスペクトルを測定して、各成分の積分値からモル組成率を算出した（Table 3）。一置換選択性（％）＝[メチル東亞合成研究年報

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2.3.3に従い合成した In

situ DNA合成試薬7を、濃度[方法A]が0.25Mとなるように適当な反応溶媒で溶解した1.0〜
2.0当量のN−保護デオキシ
リボヌクレオシド3に氷冷下加えた。反応混合物を4℃で一晩放置した後、その一部をアルゴン雰囲気下で採取し、トリエステル9の 31 P−
NMRを測定した。そのスペクトルから上記合成試薬の[方法B]

N−保護デオキシリボヌク
レオシドの5'水酸基への反応 性 選 択 率 を 求 め た（ Table 4）。 そ の 後 31 P−
NMR測定に用いたサンプルと反応混合物を合わせ、こ
2.3.6

れに1.5当量の単体イオウを加え30分間室温で反応させた。反In situ 法を用いた3量化反応

応混合物を5％炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水で洗浄し（トリデオキシリボヌクレオチドの合成）

た後、溶媒を留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグ[方法A] 2.3.5で合成したチミジンダイマー10と2.3.2で得たラフィーに供し、目的のジデオキシリボヌクレオチド（ダイマ

リン酸化剤6とから2.3.3に記載した方法に従って合成したInー）10を得た（Table 4）。

situ チミジンダイマー合成試薬11の重クロロホルム溶液を、
1.0〜1.5当量のN−保護デオキシリボヌクレオシド3の0.25Mピ

Table 4 Preparation of Di- and Tri-deoxyribonucleotides

リジン溶液に氷冷下加え、4℃で一晩反応させた。ダイマー合
成試薬のN−保護デオキシリボヌクレオシドの5'水酸基への反応選択率はチミジントリマー（TPTPT）の場合は31P−NMRス
ペクトルから求めた（Table 4）。またチミジン−デオキシアデ
ノシンを含むトリデオキシリボヌクレオチド（TPTPA）については、上記反応混合物を単体イオウを用いて2.3.5に示した方法でチオリン酸トリエステル12に変換した後、30％アンモ
ニア水で脱保護したサンプルをキャピラリー電気泳動で分析し、その測定結果から求めた（Table 4）。
[方法B] 2.3.3で合成したIn situ チミジン合成試薬7の重クロ
ロホルム溶液を1.2当量のチミジンダイマー（TPT）13の0.25M
ピリジン溶液に氷冷下加え、4℃で一晩放置した。チミジン合
成試薬のチミジンダイマーの5'水酸基への反応選択率は31P−
NMRスペクトルから求めた（Table 4）。またチミジントリマー（TPTPT）12は2.3.5に示した方法により精製、単離した。
2.3.7 In situ 法を用いたヘキサマーの液相合成
2.3.2に記載した方法で合成したリン酸化剤（6，R1＝H，
R2＝t−ブチル，X＝イミダゾリル，0.33mmol）のクロロホルム溶液（0.7ml）を、2.3.5で合成した5'−O−保護チミジン
ダイマー（10，0.29g，0.3mmol）に加え室温で1時間反応させた。この溶液をチミジンダイマー（13，0.22g，0.33mmol）とベンゾトリアゾール（0.07g，0.56mmol）のピリジン溶液

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保護−デオキシリボヌクレオシド3'の高純度品が得られた。こうして得られたN−mPEG保護−デオキシリボヌクレオシドは常法に従って5'−O−ジメトキシトリチル化することができた。
この方法によりmPEG残基をデオキシリボヌクレオシドの核酸塩基に導入できたことは、ポリマーであるmPEGを含むアシル化剤が、通常のアシル化のための試薬、例えばアニソイル
クロリドと同様に、均一系反応に用いられ得ることを意味している。
また今回得られたN−mPEG保護−デオキシリボヌクレオシ
ド3'の高分解能NMRの測定・解析の結果、mPEGポリマー1分
子とヌクレオシド1分子から成る化合物が一連の反応で得られたことが支持された。これはN−mPEG保護−デオキシリボヌ（1.5ml）に氷冷下加えた。室温で1時間反応させた後、単体イ

クレオシド3'が、基本的には完全な1分子として今後取り扱う

オウ（0.02g，0.6mmol）を加え、反応混合物を室温で1時間攪ことができることを意味している。この点は従来法の固相担拌した。反応生成物を5％炭酸水素ナトリウムおよび飽和食体とは大いに異なる。従ってこのヌクレオシドはmPEGという塩水で洗浄した後、溶媒を減圧留去した。残査をシリカゲル

固相部分を有していながら、例えばN−ベンゾイル−2'−デオ

カラムクロマトグラフィーに供し、目的のテトラマー14を得キシシチジンなどの保護ヌクレオシド3と等価体とて取り扱う

た（0.48g，収率87％，Rf＝0.38（クロロホルム／メタノー

ことができ、mPEGが可溶性ポリマーであるため、化学量論的

ル＝10／1））。

反応の設計が比較的容易に成るものと考えられる。
1

2

同様にしてリン酸化剤（6，R ＝H，R ＝t−ブチル，X＝イ
3.2 α−置換−β−シアノエトキシビスアゾリルホスフィン

ミダゾリル，0.28mmol）、5'−O−保護チミジンテトラマー（新規リン酸化剤）の合成とその性質（14，0.46g，0.25mmol）、チミジンダイマー（13，0.19g，0.28mmol）とベンゾトリアゾール（0.07g，0.56mmol）とから一般にリン−アゾリド化合物はアルコール性水酸基と反応

目的のヘキサマー15を得た（0.57g，収率85％，Rf＝0.35（クし、リン−アルコキシド結合を形成することが知られている。

ロロホルム／メタノール＝10／1））。

そこでα−置換−β−シアノエトキシジクロロホスフィン5を対応するビスアゾリド化合物に誘導する反応について検討し3 結果と考察た。その結果、化合物5をトルエン中で2.2当量のN−トリメチ

3.1 mPEGを有するデオキシリボヌクレオシド誘導体のルシリルアゾール類を反応させた後、溶媒と過剰量のN−トリ合成とその性質

メチルシリルアゾール類を減圧留去すると、残査として対応

液相系反応に適用可能なヌクレオシドとして、核酸塩基のするビスアゾリド化合物6が定量的に得られることが判った。

保護基に可溶性ポリマーであるポリエチレングリコールメチル

これらの化合物6は水に対して不安定であるが、窒素雰囲気

17）

エーテル（mPEG） を導入した新規ヌクレオシドを合成した。

下、−20℃で保存すれば1週間程度は使用可能である。

mPEGの活性カルボン酸誘導体をデオキシリボヌクレオシド
3.3 新規DNA合成試薬の合成とその反応の塩基に導入する方法としては、反応操作が容易である
Transient Protection法を利用した16）。その結果、活性カルボン酸誘導体としてmPEGの安息香酸クロリド誘導体2を用いる

N−保護デオキシリボヌクレオシド−3'−O−3.3.1 5'−O，と、N−アシル化反応が進行し、3'，5'−O−ビス（トリメチル（α−置換−β−シアノエトキシアゾリルホスフィン）シリル）―2'―デオキシシチジンおよびデオキシアデノシンの（In situ DNA合成試薬）の合成

アミノ基にmPEG残基を導入することができた。チミジンにつ3.2に示したビスアゾリルホスフィン6（リン酸化剤）は5'−いても基本的には同様であるが、イミノ基のアシル化反応に

O，N−保護デオキシリボヌクレオシド化合物4の3'−水酸基とおいてはプロトンスカベンジャーであるジイソプロピルエチル

反応し、モノアゾリルホスフィン7、即ちDNA合成試薬を与え15）る（Table 2）。

アミンが存在しないと全く反応は進行しなかった 。2'−デオ
キシグアノシンの場合は、mPEGの末端オキシアセチル誘導体

In situ DNA合成試薬として利用するためには、リン酸化剤とピバロイルクロリドから生ずる混合酸無水物をアシル化剤

6と保護デオキシリボヌクレオシド4が過も不足もなく反応すとして用いると、反応が速やかに進行し、目的物を得ることる必要があり、そうした反応を可能にするリン酸化剤を選択ができた。アシル化反応の後、水酸基の脱シリル化を行い、カすることが肝心である（一置換選択性）。そこで、種々のα−ラムクロマトグラフィーで精製すると、目的とするN−mPEG

置換−β−シアノエトキシビスアゾリルホスフィン6と5'−O−東亞合成研究年報

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TREND 2000 第3号

ジメトキシトリチルチミジンとの反応を検討した結果、アゾ

クル当たりの収率が98.5％に向上した。この結果得られたプラ

リル基として（置換）イミダゾイル基が有効であり、またα位

イマーサイズ（15〜30量体）のDNAオリゴマーは従来法（アミの置換基が嵩高い方が目的とするDNA合成試薬を効率よく発ダイト法）で得られたものと純度的に遜色なく、またPCRプラ

生させられることが判った（Table 3）。特にα位に1，1−ジエ

イマーとしても利用可能であることが判った。

チル−3−ブテニル基などの立体的に嵩高な置換基をもつリン酸化剤は、一置換選択性が4種類のデオキシリボヌクレオシドのいずれの場合にも98％以上であり、この値は従来のIn situ 法で得られていた95〜98％のそれを凌ぐものである。また上記
選択性はリン酸化剤に対して小過剰量（1.03当量）の5'−O，N−保護デオキシリボヌクレオシド化合物4を用いると99％以上に向上することが明らかとなっている。
Fig.1 Preparation of In situ Reagents for solid phase
3.3.2 In situ DNA合成試薬を用いたDNAオリゴマー

oligonucleotide synthesisの固相合成
3.3.1に示した種々のIn situ DNA合成試薬7の純度、即ち3.4 DNAオリゴマーの液相合成

種々のリン酸化剤の5'−O，N−保護デオキシリボヌクレオシ

デオキシリボヌクレオシドと新規リン酸化剤との反応で得ド化合物4に対する一置換選択性が、DNAオリゴマー合成のられるIn situ DNA合成試薬7およびそのアミド誘導体8は、固収率にどのような影響を及ぼすかについて検討した。DNA自相法によるDNAオリゴマーの合成の原料に成り得ることを示

動合成機上で通常のアミダイト法のプロトコールに従って、したが、更にその有用性を確かめるために、これらを用いた

DNA合成試薬7を用い、固相法によりDNAオリゴマー（チミDNAオリゴマーの液相合成について検討した。

ジン20量体またはデオキシシチジン20量体）を合成した。そ3.4.1 In situ DNA合成試薬を用いたジおよびの結果、従来のリン酸保護基であるβ−シアノエトキシ基でトリデオキシリボヌクレオチドの合成

は平均縮合収率は高々93.0％であり有用性は認められなかったが、α位に嵩高いアルキル置換基を有する場合はいずれもTable 4 に示した通り、In situ DNA合成試薬7と3'，5'の水

96.8％以上であり、明らかに平均収率が向上した（Table 3）。

酸基が無保護のデオキシリボヌクレオシド3との反応では、5'Table 3 より、 In situ DNA合成試薬7を用いたDNAオリゴの水酸基への反応性が大きく、3'水酸基と反応した生成物が5マーの固相合成の平均縮合収率は、各DNA合成試薬を製造す〜15％であるのに対して、目的とする5'へのそれは85〜95％でる際の一置換選択性が高くなるに従って高くなる傾向があり、あった。またこの反応に影響を及ぼす要因、例えば反応溶媒、また、置換基のvan der Waals体積の和ともかなり良い相関がIn situ DNA合成試薬7と3'，5'−O−無保護−N−保護−デオあることが見出せた。即ち、リン酸化剤のうち、置換基のvan

キシリボヌクレオシド3の量比および反応温度等については次

der Waals体積の和が49A3以上であるものは、In situ DNA合成のことが判った。

試薬として有用であることが明らかとなった。

1）反応溶媒としてピリジンを用いると5'の水酸基への反応選択性が上がった。

3.3.3 モノアルキルアミノ型アミダイト試薬を用いた

2）In situ DNA合成試薬7と3'，5'−O−無保護−N−保護−デオ

DNAオリゴマーの固相合成

キシリボヌクレオシド3の量比と5'−選択性は相関が無かった。

3.3.1に示したIn situ DNA合成試薬7は固相法によるDNAオ3）反応温度を0℃から−40℃に下げても5'−選択性は向上しリゴマーの合成に用いられ得ることを前節で示した。しかしそなかった。

の平均縮合収率は実用レベルに到っておらず、比較的長鎖の

4）3'，5'−O−無保護−N−保護−デオキシリボヌクレオシド

オリゴマーを合成する場合には、目的物の収率が低くなるとい3としてプリン塩基誘導体を用いた場合、ピリミジン塩基誘導

う不利な面がある。そこで平均縮合収率を更に向上させるため

体のときよりも5'−選択性は向上した。

の方法について探索した。その結果、化合物7は1級アミンと反5）3'，5'−O−無保護−N−保護−デオキシリボヌクレオシド

応し、新しいタイプの亜リン酸アミド8を与え、これをDNA合として、塩基に通常の保護基を有するヌクレオシド3とmPEG

成試薬として用いると、DNAオリゴマーが効率よく合成できを有するもの3'とは、5'−選択性に差は認められなかった。

ることが判った（Fig.1）。特に化合物7において塩基がピリミ

一方、In situ DNA合成試薬7と塩基をmPEGで保護したヌクジンの場合にはR1として2−メチルブチル基、1級アミンとして

レオシド3'との反応で得られたジデオキシリボヌクレオチド

i−プロピルを用い、また塩基がプリンの場合はR1およびアミは、ジエチルエーテル等のmPEGが不溶の溶媒を用いることよ

ンがそれぞれn−プロピル基、t−ブチルアミンであると、1サイり、それを効率よく回収できることが判った。例えば、In situ

東亞合成研究年報

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法により合成したmPEG分子を2個有するデオキシシチジンダ

コストが嵩むという難点があった。

イマー9'は、その反応溶液を10倍容量のジエチルエーテル中に

今回我々が開発した方法によれば、これらの工程を省くこ投入し一晩4℃で放置し再沈殿させると、90％でmPEGに由来とができる。またDNAオリゴマーを合成する方法として、従する生成物が回収された。このことは、従来この種のジデオ

来は3'→5'方向にヌクレオチド鎖を伸長していたが、当法を用

キシリボヌクレオチドは反応終了後、生成物を炭酸水素ナト

いれば5'→3'方向に合成できる可能性がある。

リウム水溶液等で洗浄し、適当な方法で精製した後に得るの3.4.2 In situ 法を用いたDNAオリゴマーの液相合成が一般的であるが、これらの手段を経ずに目的とするジデオ
キシリボヌクレオチドを効率よく回収できることを意味してお今回開発したIn situ 法が従来のものとは異なり、5'→3'方向へヌク

り、本法はそれの低コスト合成法として有効であることを示

レオチド鎖を伸ばす方法として有用であるか否かについて検討した。
本検討ではDNAオリゴマーを効率よく合成するために、まずしている。
このようにして得られたジデオキシリボヌクレオチド誘導体

In situ DNA合成試薬7と3'，5'−O−無保護−N−保護デオキシ9は、単体イオウとの反応で容易にチオリン酸トリエステル体

リボヌクレオシド3（あるいはデオキシリボヌクレオチド13）と10へ変換することができた。現在硫化反応を行うための試剤のカップリング反応を促進させる方法について探索した。

としてはBeaucage試薬18）等が用いられているが、これらは単その結果、上記カップリング反応を行う際にベンゾトリアゾ

体イオウに比べ非常に高価であり、DNAオリゴマーの合成コ

ール誘導体を存在させておくと、同試薬の5'−水酸基への反応

ストを大きくしている一因となっている。硫化剤の選択が広選択性を損なうこと無く、同反応をスムースに進行させ得るこ範になり、高価な硫化剤を必要としない本法は、DNAオリゴとが判った。例えばチミジン合成試薬（7，R1＝H，R2＝t−ブチマーの合成コスト削減において極めて有用であると思われる。

ル，X＝イミダゾリル）とチミジンとの反応では、それが完結す

またIn situ DNA合成試薬7と3'，5'−O−無保護−N−保護−るのに約6時間要するが、ベンゾトリアゾールを2倍当量存在さ

2'−デオキシリボヌクレオシド3との反応で、その5'−選択性はせると、その反応は約1時間で終了した。また5'−水酸基への反モノマー同士を反応させてジデオキシリボヌクレオチドを合成

応選択性は前者が88％であるのに対し、後者は89％であった。

した場合よりも、一方にジデオキシリボヌクレオチドを用いてまた3.4.1で示したように、In situ DNA合成試薬7と3'，5'−

トリデオキシリボヌクレオチド12を合成したときの方が良いこ

無保護，N−保護デオキシリボヌクレオシド3（あるいはデオキとが示唆された。このことからこの反応にはヌクレオシ（チ）シリボヌクレオチド13）との反応では、その5'−反応選択性は、

ドの立体的な嵩高さも関与しているのではないかと思われる。

モノマー同士を反応させた場合よりも、一方にジデオキシリボ

従来、デオキシリボヌクレオチドを得るためには下記に示

ヌクレオチドを用いてトリデオキシリボヌクレオチドを合成した
ときの方が良い。従って本検討では、同合成試薬に反応させる

したようなルートを経るのが一般的であった（Fig.2）。

3'成分として、ジデオキシリボヌクレオチド13を用いる方法、いわゆるブロック合成法を採用した。
その結果、Fig.3 に示したサイクルに従ってチミジ
ンヘキサマーを70％程度の全収率で合成することができた。このことは、従来法とは逆の方向で、ヌク
レオチド鎖を伸長させ得ること、また従来法に比べて工程数が少なく、コスト的にも有利な合成法であることを示している。このように当法を用いた場合
Fig.2 General procedure for the preparation of dimeric building block forのDNAオリゴマーの合成コストは、概算ではあるが、oligonucleotide synthesis

従来のそれの50％程度であると見積もられる。 このIn situ 法を一般化するための方法、例えばmPEG

この方法によれば、収率良く保護されたジデオキシリボヌの物理化学的性質を利用して、Fig.3 に示した各工程を自動的

クレオチドIV を得ることができるが、そのためには3'水酸基へに行わせる方法について検討し、いくつかの成果が得られての保護基の導入および同脱保護とその工程が多く、それだけいるが、本報告では割愛させていただいた。

東亞合成研究年報

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TREND 2000 第3号

4) P. J. Garegg, I. Lindh, T. Regberg, J. Stawinski,
R. Stronberg, C. Henrichson, Tetrahedron Lett.,
27, 4051 (1986).
5) 吉田祇生，木村馨，日本特許第2508006号．
6) M. F. Moore, S. L. Beaucage, J. Org. Chem.,
50, 2019 (1985).
7) H.-J. Lee, S.-H. Moon, Chem. Lett., 1984, 1229.
8) 堀江洋慈，吉田祇生，未発表.
9) G. M. Bonora, Appl. Biochem. Biotechnol., 54, 3 (1995).
10) M. Ouchi, Y. Inoue, Y. Liu, S. Nagamune, S.
Nakamura, Bull. Chem. Soc. Jpn., 63, 1260
(1990).
11）C. J. van Staveren, J. van Eerden, F. C. J. van
Veggel, S. Harkema, D. N. Reinhoudt, J. Am.

Chem. Soc., 110, 4994 (1988).
12) H. Nagai, T. Fujiwara, M. Fujii, M. Sekine, T.
Hata, Nucleic Acids Res., 17, 8581 (1989).
13) E. C. Horning, A. F. Finell, "Organic
Syntheses", Coll. Vol. IV, p.461 (1963).
Fig.3 Reaction cycle for the synthesis of oligonucleotides based on In situ
Reagents and dimeric building block

14) L. Birkofer, P. Richter, A. Ritter, Chem. Ber.,93, 2804 (1960).
15) M. Sekine, M. Fujii, H. Nagai, T. Hata,

4 結 言

Synthesis, 1987, 1119.
16) G. S. Ti, B. L. Gaffney, R. A. Jones, J. Amer. Chem. Soc.,

これまでの研究によって以下の点を明らかにした。

104, 1316 (1982).

1）α位が嵩高いα−アルキル−β−シアノエトキシビスアゾ
リルホスフィンと保護デオキシリボヌクレオシドとの反応によ

17) D. J. Gravert, K. D. Janda, Chem. Rev., 97, 489 (1997).

って新たなIn situ DNA合成試薬を合成した。この新たな方法

18) R. P. Iyer, L. R. Phillips, W. Egan, S. L. Beaucage, J. Org.

Chem., 55, 4693 (1990).

は、DNA合成試薬の合成コストを大きく削減でき、極めて有用であることが判った。また、このIn situ DNA合成試薬を用※ 現在坂出工場技術開発グループ勤務．

いると、高収率でジあるいはトリデオキシリボヌクレオチドが得られることが判った。
2）上記In situ DNA合成試薬はDNAオリゴマーの液相合成に適用でき、その結果チミジンヘキサマーが高収率で得られた。
この方法は工程が短く、また特殊な硫化剤を全く必要としな
いため、コスト的にも従来法より有利となることが判った。
3）一連の研究成果を活かしてDNAオリゴマーを液相法で合成した場合のコストは、従来法のそれの50％程度であると概算
された。
引用文献
1) S. Agrawal (Ed.),

Protocols for Oligonucleotides and Analogs(Methods in Molecular Biology Vol.20) , Humana Press,
Totowa, NJ (1995).
2) S. L. Beaucage, M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett., 22, 1859
(1981).
3) B. C. Froehler, P. G. Ng, M. D. Matteucci, Nucleic Acids Res.,14, 5399 (1986).

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