2-9 生体分子の機能と発現の調節機構に関する総合的基盤研究●代表者

斎藤稔（生命科学科・教授）●分担者

岩本政明（生命科学科・教授）
安原徳子（生命科学科・准教授）【研究の目的および概要】
生命の基本単位である細胞は，膜構造により自己と外界を隔て，遺伝情報を子孫に伝達する。細胞の生存には，遺伝情報を適切に利用しながら周りの環境の変化をとらえて反応することが不可欠である。このような反応系には，遺伝子産物であるタンパク質，およびその機能に関わる機能性分子など，多くの生体分子が関与する。本研究では，生体分子について，遺伝子の発現，遺伝子産物であるタンパク質の構造・機能とその調節の仕組み，生命の活動に果たす役割に焦点を当て，動物や微生物の分子，細胞，組織，個体を用いた多段階の階層を網羅する研究の基盤を構築することを目的とした。
具体的な研究目標は以下に示す通りである。
1）哺乳類細胞の新規遺伝子発現機構の解明
2）核輸送におけるタンパク質間相互作用の構造的メカニズムの解明
3）脳の学習・記憶のメカニズムの解明
1），2）の遺伝子発現機構は様々な細胞活動に働き，3）が対象とする神経活動に関わる。この点に着目し，上記の研究を進めるに当たり，得られた研究成果を相互に活かして発展させ，基礎的研究と応用研究の統合を試みる。
【研究の結果】
1）単細胞生物である繊毛虫の細胞内には転写活性の高い大核と，転写が全く見られない小核が存在する。大核と小核の核膜孔複合体では核膜孔タンパク質が異なっており，繊毛虫は核膜孔タンパク質が担う核輸送と遺伝子発現制御の関係を研究するための好都合なモデル生物である。今回，小核を欠いた無小核種である Tetrahymena
pyriformis のゲノム中に存在する小核用核膜孔タンパク質の遺伝子が実際に発現して機能しているのかを調べた。
注目した二つの遺伝子（MicNup98A と MicNup98B）はともに RT-PCR で産物が検出され，遺伝子が転写されていることが明らかになった。しかしながら，これらの転写産物からタンパク質が合成されているかを明らかにすることはできなかった。
2）輸送因子による新規クロマチン制御の分子メカニズムを明らかにした。輸送因子に新規 DNA 結合ドメインを発見し，生化学的実験により分子モデルを構築した。さらに，輸送因子が輸送基質を DNA 上にリクルートすることを見出した。発見した新規 DNA 結合ドメインはこれまでに核輸送に必要な複数の相互作用分子との結合に必要であることが知られている。しかし，我々が発見した DNA との直接結合も含め，複数の分子との相互作用をどのように切り替えるかは明らかではない。この課題に取り組むため，多数の生物の核輸送因子の配列データを使用してホモロジーモデリングおよびアミノ酸配列の生化学的マッピングを行い，結合ドメインのどのような性質が多様な機能を引き出すのか，個々の相互作用に必要なアミノ酸はいずれかを割り出した。
3）① ラット海馬スライスに対して，男性ホルモンであるジヒドロテストステロン（DHT）を作用させると，ホルモン枯渇状態の Control スライスに対して，DG 領域における神経細胞の樹状突起スパイン（後シナプス）の密度がおよそ 1.3 倍増加するという結果が得られた。この結果は，海馬 DG 領域にも男性ホルモン受容体 AR が存在している可能性を示唆している。そこで AR のアンタゴニスト存在下で DHT を作用させる実験を行った。さらに，LIM
kinase や MAP kinase，Protein kinase A（PKA），Protein kinase C（PKC），PI3 kinase，Src kinase，JNK の阻害剤存在37

下で DHT を作用させる実験を行い DHT がスパインを増加させるメカニズムを検証した。これらの結果は現在，解析中であり，新しい知見が期待される。 ② 健常者およびアルツハイマー型認知症患者（AD）から作製した iPS 細胞由来の神経細胞の神経突起形態に対して数理解析を行った。ディッシュ上に培養した iPS 細胞由来の神経前駆細胞に対して，播種後 3 日目から 14 日目に顕微鏡撮影を行い，駆動関数を計算した。それぞれの神経突起に対応する駆動力に対して，トレンド除去揺らぎ解析（Detrended Fluctuation Analysis; DFA）を行うことで，スケーリング指数や自己相関性の変化を求めた。その結果，駆動力の自己相関性は，AD 由来の神経突起では健常者由来のものより有意に小さく，駆動力はよりランダムに近いことが分かった。また，神経突起の伸長過程において，神経突起変性に関わっているタウやアミロイドβといったタンパク質の異常凝集体の発現を免疫蛍光染色によって調べた。
その結果，これらの凝集体による発現が健常者由来と AD 由来の神経突起で異なることが分かり，またこのような違いが見られる前に，既に上記のような駆動力の自己相関性の違いが見られることを見出した。
【研究の考察・反省】
1）小核を失った無小核種においても小核用核膜孔タンパク質の遺伝子が偽遺伝子化することなく機能している可能性が示された。これらの遺伝子から合成されるタンパク質が，小核が無い細胞内のどこに局在するのかを明らかにするため遺伝子に GFP タグを付加したが，GFP 融合タンパク質の細胞内局在を観察することはできなかった。
原因として，発現量が小さすぎて検出限界に達していない，あるいは特異的な局在場所が存在しないために速やかに分解・除去されているなどが考えられた。従って，当該遺伝子を過剰発現させ，ウェスタンブロットならびに蛍光顕微鏡観察で GFP 融合タンパク質が確実に合成されていることを確認する必要がある。
2）核輸送因子が DNA に直接結合することを見出し，その分子メカニズムを明らかにすることができた。今後はこの結合が細胞内でどのような生理機能を果たすのかを明らかにする必要がある。しかし，この DNA 結合にはたらく単一ドメインが複数の相互作用に関与することから，細胞を用いた実験系で輸送因子の機能を区別して解析することが難しく，実験の実施に至っていない。そのため，ホモロジーモデリングおよび生化学的マッピングにより得られた結果をもとに特定機能を欠く変異体を作成し，細胞生物学的解析を行う必要がある。
3）① 海馬 DG 領域では，女性ホルモン受容体 ER は発現が確認されているが，男性ホルモン受容体 AR は抗体染色法では確認されず，発現していないとされている。しかし，本研究により DG 領域においても男性ホルモン DHTによりスパインの増加が起こることが明らかとなり，DG 領域における男性ホルモン受容体 AR の発現の可能性が示された。現在，DG 領域における DHT によるスパイン増加のメカニズムを AR のアンタゴニストと kinase の阻害剤を用いて検証しているが，実験の進行に対して解析が追い付いていないので，解析も平行して進めていきたい。
② 神経突起の伸長過程において，健常者由来と AD 由来の神経突起に対する駆動力のスケーリング指数や自己相関性に違いが現れることを見出した。また，このような違いが，タウやアミロイド β といったタンパク質の異常凝集体の発現の違いが見られる前に現れることを見出した。このことから，神経突起に対する駆動力の違いから，迅速に神経突起の変性状態を評価できることが期待される。今後は，神経突起の伸長過程をタイムラプスでリアルタイムに撮影し，伸長過程の駆動力及びそれに対するスケーリング指数や自己相関性をリアルタイムに評価することを試みる。
【研究発表】
Hippocampal-derived androgen and estrogen non-genomically modulate synaptic plasticity, Mika Soma, Mari Ikeda,

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Minoru Saito, Suguru Kawato, 第 44 回日本神経科学大会 / 第 1 回 CJK 国際会議 , 2021 年 7 月 30 日 , 神戸 .
脳神経系における非線形現象の数理解析とその医工学への応用の試み，斎藤稔，2021 年電子情報通信学会ソサイエ
ティ大会・大会委員会企画「先端バイオテクノロジーの医工展開」，2021 年 9 月 14 日，依頼講演，オンライン .
一般化SLEの非平衡統計力学的定式化について，柴崎雄介，斎藤稔，日本物理学会2021年秋季大会，2021年9月23日，
オンライン .
ヒト iPS 細胞由来ニューロンの神経突起伸長過程における駆動力のゆらぎ解析，前田成海，柴崎雄介，白川由佳，
斎藤稔，第 59 回日本生物物理学会年会，2021 年 11 月 26 日，オンライン．
海馬で合成される男性・女性ホルモンやストレスホルモンによる記憶シナプスの早い non-genomic な制御，川戸佳，相馬ミカ，池田真理，斎藤稔，第 59 回日本生物物理学会年会，2021 年 11 月 26 日，オンライン．
ヨーロッパモノアラガイの咀嚼調節ニューロンのカルシウムイメージング−味覚嫌悪学習前後のカルシウムシグナ
ルの比較−，伊藤綾香，小松崎良将，斎藤稔，第 59 回日本生物物理学会年会，2021 年 11 月 26 日，オンライン．
モノアラガイの味覚嫌悪学習に対する緑茶由来カテキン混合物の影響，松岡英樹，伊藤綾香，斎藤稔，小松崎良将，
第 59 回日本生物物理学会年会，2021 年 11 月 26 日，オンライン．
数理物理学に基づいた神経突起変性の評価方法の提案，斎藤稔，第 4 回ファーマラボ EXPO アカデミックフォーラ
ム，2021 年 12 月 9 日，幕張．
数理物理学に基づいた神経突起変性の評価方法の提案，斎藤稔，JST 新技術説明会，2021 年 12 月 23 日，オンライン．
Basal bodies in the anterior region of the Tetrahymena cell are binding sites for nucleoporin MicNup98A, Takaharu
Yamamoto, Noriko Fukuta, Masaaki Iwamoto, Atsushi Matsuda, 2021 Ciliate Molecular Biology Meeting, July 19, 2021,
online.
細胞の前端部に局在する繊毛虫テトラヒメナのヌクレオポリン MicNup98A，山本孝治 , 福田紀子 , 近重裕次 , 岩本政明 , 松田厚志，日本原生生物学会，2021 年 11 月 22 日，オンライン .
【研究成果物】
Quantifying scaling exponents for neurite morphology of in vitro-cultured human iPSC-derived neurons using discrete
Loewner evolution: A statistical − physical approach to the neuropathology in Alzheimer’s disease, Yusuke Shibasaki,Narumi Maeda, Chihiro Oshimi, Yuka Shirakawa, Minoru Saito, Chaos: An Interdisciplinary Journal of Nonlinear
Science 31（2021）073140.
Non-Equilibrium Entropy and Irreversibility in Generalized Stochastic Loewner Evolution from an Information-Theoretic
Perspective, Yusuke Shibasaki, Minoru Saito, Entropy 23（2021）1098.
脳神経系における非線形現象の数理解析とその医工学への応用の試み，斎藤稔，2021 年電子情報通信学会ソサイエ
ティ大会論文集，CI-4-7，2021.
Perinatal Exposure of Bisphenol A Differently Affects Dendritic Spines of Male and Female Grown-Up Adult Hippocampal
Neurons, Suguru Kawato, Mari Ogiue-Ikeda, Mika Soma, Hinako Yoshino, Toshihiro Kominami, Minoru Saito, ShujiAou, Yasushi Hojo, Frontiers in Neuroscience 15（2021）712261.
Phosphorylation of endogenousα-synuclein induced by extracellular seeds initiates at the pre-synaptic region andspreads to the cell body, Shiori Awa, Genjiro Suzuki, Masami Masuda-Suzukake, Takashi Nonaka, Minoru Saito, Masato
Hasegawa, Scientific Reports 12（2021）1163.
Green Tea-Derived Catechins Have Beneficial Effects on Cognition in the Pond Snail, Yoshimasa Komatsuzaki, Ayaka
Itoh, Minoru Saito, Update on Malacology, Chapter 2, IntechOpen.

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Biochemical propensity mapping for structural and functional anatomy of importin α IBB domain, Kazuya Jibiki, Mo-yanLiu, Chao-sen Lei,Takashi S. Kodama, Chojiro Kojima, Toshimichi Fujiwara, Noriko Yasuhara, Genes to Cells 27（2021）
173-191.
Importin α 2 association with chromatin: Direct DNA binding via a novel DNA-binding domain, Kazuya Jibiki, Takashi S.
Kodama, Atsushi Suenaga, Yota Kawase, Noriko Shibazaki, Shin Nomoto, Seiya Nagasawa, Misaki Nagashima, Shieri
Shimodan, Renan Kikuchi, Noriko Saitoh, Yoshihiro Yoneda, Ken-ich Akagi, Noriko Yasuhara, Genes to Cells 26（2021）
945-966.
Systems genomics of nucleoporins provides prognostic insights into breast cancer, Rashid Mehmood, Kazuya Jibiki,Zakeya J. Alsafwani, Muhammad Naseem, Noriko Yasuhara. Advancements in Life Sciences, accepted.

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