中央味噌研究所研究報告ᆅ ሱ Ӓ ਽ ‫֖ ڨ‬
ࢲ਽ ³± ࢳ࣊ᆅሱӒ਽Ⱦɛɞᆅሱ‫֖ڨ‬

─ 33 ─

No.42（2022）

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

研 究 報 告味噌汁の摂取が酸化ストレスの低下・
自律神経活動に与える効果

胡愛玲 1，奈良岡

佑南 2，山口琢児 1，小林

弘幸 1,2The effect of the miso soup gives for a decrease of the oxidative stressand autonomic nerve activity
HU Ailing 1, NARAOKA Yuna 2, YAMAGUCHI Takuji 1, KOBAYASHI Hiroyuki 1,2
1.

Department of Personalized Kampo Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine
2.

Department of Hospital Administration, Juntendo University Graduate School of Medicine
2-1-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8421, Japan.

【緒言】

【方法】

味噌は日本を代表とする発酵食品である。原料の大１．対象者

豆は栄養が豊富な食材であるが，発酵することでさら本研究は30代から70代の健常正常女性17名（コンに栄養価が増すことが知られている。例えば，ビタミ

トロール群６名：51.2±4.7歳，味噌摂取群11名：

ンB1は5.5倍，ビタミンB6は2.5倍，鉄は３倍，葉酸は55.8 ±3.5歳）を対象とした。対象者には本研究の３倍，カルシウムは３倍，カリウムは1.2倍に増加す

目的と方法について十分な説明を文書にて行い，書る。これに加えて，発酵の過程で抗酸化物質であるメ面による同意を得た。本試験は，2019年10月～2020

ラノイジンや，興奮抑制性物質であるGABAが産生

年１月に実施した。

されるため，身体に様々な効果をもたらす可能性が高２．試料

い。
自律神経を乱すひとつの要因はストレスである

市販の赤味噌と白味噌を１：１で合わせ１回約が 1)， 味 噌 に は ス ト レ ス を 緩 和 す る γ ア ミ ノ 酪 酸

18 gの味噌玉を作製した。１日２回，味噌汁として（GABA）が多く含まれているため，継続的に味噌２週間摂取した。対照群は２週間味噌の摂取を中止

を摂取することで，自律神経を整える可能性がある。

した。

本研究において，味噌の摂取による自律神経バラン
スの調整，酸化ストレスに対する作用について検討

３．自律神経活機能の測定法

し，疲労回復効果や，ストレスの緩和の改善効果を明

対象者は実験室にて30分順化したのち，測定をらかにし，健康食品としての味噌の有用性を検証す行った。自律神経機能はパルスアナライザープラる。

スビュー（TAS9VIEW：株式会社YKC）を用い，

順天堂大学大学院医学研究科
TEL: (03)3813-3111〒 113-8421

東京都文京区本郷 2-1-1

FAX: (03) 3814-8040

E-mail: koba@juntendo.ac.jp

─ 34 ─

中央味噌研究所研究報告

安静座位にて測定した。総自律神経活動（TP），交No.42（2022）【考察】

感神経活動（LF/HF），副交感神経活動（HF）を味噌摂取による自律神経機能，酸化ストレス値・抗解析した。

酸化力値に対する作用を検討した。
４．酸化ストレス値・抗酸化力値の測定法

コントロール群と比較して２週間の味噌摂取による抗酸化能は手指より採血し，フリーラジカル解

自律神経機能に対する顕著な作用はみられなかった。

析装置FREE Carrio DUO（株式会社ウィスマー）年齢による影響について解析したところ，60歳以上でを用いて酸化ストレス値（dROMs），抗酸化力値

有意でないが総自律神経活動（TP）の低下と副交感（BAP）を測定した。さらに，酸化ストレス度

神経活動（HF）の増加がみられた，加齢により自律（OSI:酸化マーカー÷抗酸化マーカー×8.85）を解神経のバランスに変化はみられないが，交感神経析した。
いずれの測定も摂取前，摂取２週間後に実施した。
（Ａ）

５．統計処理統計解析は，Student T-testを用い，0.05以下を有意差ありとした。

【結果】（week）

１．自律神経機能に対する作用
味噌の２週間摂取後の自律神経機能に対する作（Ｂ）

用を図１に示した。味噌の摂取による総自律神経
活動（TP）に有意な変化はみられなかった（図１- A）。味噌の摂取による交感神経活動（LF/HF），
副交感神経活動（HF）の変化はみられなかったが，コントロール群に副交感神経活動（HF）の低下がみられた。
味噌対象群について年齢における解析を行ったと
ころ，60歳以上で有意でないがTPの低下とHFの増（week）

加がみられた（図２）。
（Ｃ）

２．酸化ストレス・抗酸化力値に対する作用
味噌の２週間摂取後の酸化ストレス・抗酸化力値
に対する作用を図３に示した。味噌の摂取による酸化ストレス値（dROMs）の減少がみられたが有意な変化ではなかった。コントロール群はわずかに増加した（図３- A）。抗酸化力値（BAP）は味噌の摂取により有意な低下がみられたが，コントロール
群に変化はみられなかった（図３- B）。いずれの群（week）

も酸化ストレス度（OSI）の変化はみられなかった（図３- C）。

図１．味噌摂取による自律神経機能に対する作用

味噌対象群について年齢における解析を行った
ところ，60歳以下がdROM，BAPの低下が顕著

Ａ：総自律神経活動（TP），Ｂ：交感神経活動（LF/HF），Ｃ：副交感神経活動（HF）（平均値±標準誤差，コントロール群：ｎ＝６，味噌
摂取群：ｎ＝11）であった。OSIの年齢による影響はみられなかった（図４）。

─ 35 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

（Ａ）

（Ａ）

（week）（week）（Ｂ）（Ｂ）（week）（week）（Ｃ）（Ｃ）（week）（week）

図２．味噌摂取による自律神経機能に対する年齢の影響

図３．味噌摂取による酸化ストレス、
抗酸化力値に対する作用

Ａ：総自律神経活動（TP），Ｂ：交感神経活動（LF/HF），Ｃ：副交感神経活動（HF）
平均値±標準誤差，60歳以下（45.6±4.0歳，ｎ＝５），
60歳以上（64.3±1.3歳，ｎ＝６）

活動，副交感神経活動が低下することが知られていＡ：酸化ストレス値（dROM），Ｂ：抗酸化力値（BAP），
Ｃ：酸化ストレス度（OSI）（平均値±標準誤差，コントロール群：ｎ＝６，味噌
摂取群：ｎ＝11） *：p < 0.05 vs. 0

酸化ストレスは，活性酸素種の増加，抗酸化能力の2)る 。現在，味噌の需要は減少し，昭和35年と比較す低下により生体が酸化した状態である。酸化ストレス

ると平成26年では60％減少したとも言われている。今の亢進は細胞，組織を障害することで老化促進，生活回，60歳以上で副交感神経活動の増加がみられたこと

習慣病，ガンなどの疾患形成に関与している。また，

で，味噌の摂取量を増やすことで自律神経活動の低下

精神的，肉体的疲労状態を評価できる可能性が示唆さを抑制することが期待できる。また，ストレスによりれている3,4)。

1)

自律神経の変調をきたすことが知られている 。味噌

酸化ストレスに対して２週間の味噌の摂取によりコの摂取により自律神経バランスを整えることで，ストントロール群と比較して酸化ストレス値（dROMs）

レスに対する予防としての効果も期待できる。

および抗酸化力値（BAP）の低下がみられた。年齢による影響については，60歳以下でdROMsが著しく─ 36 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

今回の結果から，味噌の摂取は自律神経活動のバラ（Ａ）

ンスを整え，酸化ストレスを軽減することが示唆された。

【謝辞】
本研究を助成していただいた一般社団法人味噌中央（week）

研究所に感謝します。

（Ｂ）【引用文献】
１）雪下岳彦，大谷悟，小林弘幸．メンタルストレ

スと自律神経 ～心拍変動解析を用いた客観的なス
トレス評価～，アンチ・エイジング医学 Vol. 11，
42-47（2015）２）倉恒弘彦．ストレス・疲労の科学と健康イノベー（week）

ション，産業ストレス研究，22，307-313（2015）３）野島順三．種々の疲労状態における酸化ストレス（Ｃ）

値／抗酸化力値の評価，厚生労働科学研究費補助金（障害者対策総合研究事業)(精神の障害／神経・筋疾患分野）（分担）研究年度終了報告書（2010）４）野島 順三．疲労病態における酸化ストレス，抗酸化力の評価，厚生労働科学研究費補助金（障害者対策総合研究事業）（精神の障害／神経・筋疾患分野）（分担）研究年度終了報告書（2009）（week）

図４．味噌摂取による酸化ストレス、
抗酸化力値に年齢の影響
Ａ：酸化ストレス値（dROM），Ｂ：抗酸化力値（BAP），
Ｃ：酸化ストレス度（OSI）
平均値±標準誤差，60歳以下（45.6±4.0歳，ｎ＝５），
60歳以上（64.3±1.3歳，ｎ＝６）低下した。若年齢では普段味噌の摂取が少ないために２週間であるが味噌を摂取したことによる結果であると考える。BAPは酸化ストレスの制御に関与しているが，今回の結果からdROMsの低下とともにBAPも低下した。この結果は味噌の摂取がBAPに作用することでdROMsを低下したと考えられるが，味噌の作用機序に関してさらなる研究が必要である。酸化スト
レス度（OSI）は疲労状態と相関することが示唆されているが，味噌摂取によるOSIに対する影響はみられなかった。

─ 37 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

研 究 報 告子宮内膜症に対する味噌の有効性の検討

垂水

洋輔，髙岡

宰，森

泰輔，北脇

京都府立医科大学大学院医学研究科

城

女性生涯医科学

Effect of Miso on stromal cells derived from ovarian endometrioma

Yosuke TARUMI, Osamu TAKAOKA, Taisuke MORI, Jo KITAWAKI
Department of Obstetrics and Gynecology, Kyoto Prefectural University of Medicine,
Graduate School of Medical Science
Kajii-cho, Kawaramachi-Hirokoji, Kamigyo-ku, Kyoto 602-8566, Japan.

トロゲンであるイソフラボンが多く含まれている。イ

【背景と目的】ソフラボンには弱いエストロゲン作用あるいは抗エス

子宮内膜症は子宮内膜様の組織が卵巣や腹膜などでトロゲン作用があることが知られているが，子宮内膜

異所性に増殖することによって疼痛や不妊を生じる疾症に対するイソフラボンの作用は不明であった。近年患である。罹患率は性成熟期女性の10％であり，近われわれはイソフラボンの一種であるダイゼインを豊

年，晩婚，少子，少産化の影響もあり日本での患者数

富に含む成分が子宮内膜症に対して細胞増殖を抑制

は増加傾向にある 1,2)。子宮内膜症による慢性骨盤痛

し，抗炎症作用を持つことを報告している3)。

や不妊症は女性の quality of life を著しく低下させる

そこで，本研究では味噌が子宮内膜症細胞に及ぼす効果を in vitro で検討した。

ため，多大な社会的損失をもたらす。子宮内膜症はエストロゲン依存性に増殖，退縮をする疾患であり，手術療法とならんで内分泌療法が効果的である。しか【方法】

し，内分泌製剤は高い治療効果を発揮する反面，排卵１．味噌の抽出を抑制することから妊娠を希望する女性に対しては同

味噌は中央味噌研究所から供与された味噌９種類を時には使用できない欠点がある。妊娠希望者でも使用使用した（米味噌７種，麦味噌１種，豆味噌１種）。

可能な緩徐な作用を持つ治療薬が望まれている。
子宮内膜症と食習慣の関連を調査した疫学研究が行

各味噌の特徴を表１に示す。これまでの報告をもとにわれているが，一致した結論は得られていない。味噌

メタノール抽出法を選択した4)。各味噌 10 gを 20 mL

は大豆由来の発酵製品であり，その健康増進効果につのメタノールに溶解・撹拌し，濾過後にセルロースア

いてはしばしば指摘されているが，具体的な疾患とのセテートフィルターに通して滅菌した（図１）。

関連については未だ不明である。大豆には植物性エス
京都府立医科大学大学院医学研究科
TEL: (075)251-5560〒 602-8566

京都市上京区河原町通広小路上る梶井町 465

FAX: (075) 251-1265

E-mail: takaoka@koto.kpu-m.ac.jp

─ 38 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

表１．各味噌の特徴:
番号

麴による分類

生産地

特

徴

1

米味噌

宮城県

・発酵が進んでおり，色が濃い

2

米味噌

宮城県

・発酵が進んでおり，色が濃い・低麴（大豆：米 = 10ʁ5.5）

3

米味噌

山形県

・発酵が進んでおり，色が濃い
・天然醸造

4

豆味噌

愛知県

・発酵が進んでおり，色が濃い

5

米味噌

長野県

・米味噌の一般流通品

6

米味噌

富山県

・米味噌の一般流通品

7

麦味噌

大分県

・麦味噌の一般流通品

8

米味噌

東京都

・熟成期間が短く，色が濃い

9

米味噌

京都府

・研究者地元の味噌

(B)

(A)

(C)

(C)

(D)

(E)

図１．メタノールを用いた味噌成分の抽出供与された各味噌をメタノールに溶解・撹拌し（Ａ-Ｂ），濾紙で濾過後（Ｃ），セルロースアセテートフィルターに通して滅菌した（Ｄ，Ｅ）。

対象患者は20～45歳で，周期的な月経があり，手術前

２．子宮内膜症間質細胞，正常子宮内膜間質細胞の分３か月以内にホルモン療法を施行されていない患者と離培養
腹腔鏡手術施行時に子宮内膜症患者の卵巣子宮した。摘出組織を細切し，0.25％ type I collagenase

内膜症病巣から子宮内膜症間質細胞（stromal cellsと15 IU / mL deoxyribonuclease 含有DMEMによりderived from ovarian endometrioma, OESC）を，消化し，メッシュで濾過することにより単離した細胞

また非子宮内膜症患者の正常子宮内膜から正常子宮を得た。遠心により赤血球を除去した後，10％ウシ胎

内膜間質細胞（stromal cells derived from normal

仔血清含有DMEMで培養した。

5)

endometrium, NESC）をそれぞれ分離培養した 。

─ 39 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

３．味噌の投与方法【結果】

味噌抽出液を10％ウシ胎仔血清含有DMEMで希１．味噌２番はOESCの細胞増殖を抑制する

釈し，各濃度の味噌抽出液を含むDMEMでOESCと各味噌によるOESCの細胞増殖の変化を評価した。

NESCの培養液を交換した。

味噌２，３，５，７，８番は投与後96時間において，４．細胞増殖測定およびRT-PCR解析

0.01，0.1，１％のいずれの濃度でも細胞増殖を抑制

OESCを96-well plateに播種し，24時間後に味噌する傾向を示した（図２）。その中で，味噌２番は投抽出液を含む培地に交換，24～96時間後にWST-8

与後24，48，72，96時間のいずれの時間でも細胞増殖

assayを用いて評価した。

を抑制する傾向を示したため，味噌２番の作用をさら

培養細胞から抽出したmRNAからcDNAを作成に検討した。

し，real-time PCRを行った3)。
２．味噌２番は濃度依存的にOESCの細胞増殖を抑制
５．統計解析

するが，NESCの細胞増殖は抑制しない

one-way repeated measures ANOVAで解析後，子宮内膜症病巣のみならず，正所性子宮内膜に対

post-hoc testにはDunnett法を用いた。統計学的有意する味噌の効果を検討するため，OESCとNESCの細水準は5％とした。

胞増殖の変化を評価した。味噌２番は投与後72時間

Miso 1

Miso 2

Miso 3

Miso 4

Miso 5

Miso 6

Miso 7

Miso 8

Miso 9

図２．各味噌によるOESCの細胞増殖の変化
味噌２，３，５，７，８番は投与後96時間において細胞増殖を抑制する傾向であった。味噌２，３，５，７，８番の内，味噌２番は24〜96時間，0.01〜１％の濃度のいずれにおいても細胞増殖を抑制する傾向であった（ｎ＝３）。

─ 40 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

において濃度依存的にOESCの細胞増殖を抑制したため，子宮内膜症の増悪因子として報告されるVEGFが，NESCの細胞増殖は抑制しなかった（図３Ａ）。

の発現を測定した。投与後72時間において味噌２番は0.1％の濃度の味噌２番は投与後24～96時間において0.01，0.1，１％の濃度のいずれの濃度でもOESCにおはOESCの細胞増殖を抑制する傾向であったが，統計

けるVEGFの発現を抑制した（図４）。

学的有意差を認めなかった。NESCでは24～96時間のいずれにおいても細胞増殖を抑制しなかった（図３
Ｂ）。

【考察】
本研究では供与された味噌９種類のうち，味噌２番

３．味噌2番はOESCのVEGFの発現を抑制する

は卵巣の子宮内膜症病巣から分離したOESCの細胞増

次に，OESCに対する味噌２番の作用機序を調べる

150
100

OESC

(B)

NESC

**

50

0

0 0.01 0.1 1

0 0.01 0.1 1

Cell proliferaƟon (% of control)

Cell proliferation (% of control)

(A)

OESC

NESC

Cont 24 48 72 96

Cont 24 48 72 96

150
100
50

0

concentraƟon (%)Ɵme (h)

図３．味噌２番によるOESCとNESCの細胞増殖の変化
味噌２番は投与後72時間において0.1％，１％の濃度でOESCの細胞増殖を抑制したが，NESCの細胞増殖は抑制しなかった（Ａ）。 0.1％の濃度の味噌２番はOESCの細胞増殖を抑制する傾向であったが，NESCの細胞増殖は抑制しなかった（Ｂ）。
mean ± SEM（n=4），* P < 0.05 vs controlRelaƟve mRNA
expression (/GAPDH)

VEGF

1.0
0.8
0.6

*
* *

0.4
0.2
0

0
0.01 0.1
1
concentraƟŽn (%)

図４．味噌２番によるOESCの遺伝子発現の変化
0.01，0.1，１％の濃度の味噌2番はOESCにおけるVEGFの発現を抑制した。
mean ± SEM（ｎ＝４），* P < 0.05 vs control

─ 41 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

殖を濃度依存的に抑制したが，非子宮内膜症患者の子【文献】

宮内膜から分離したNESCの細胞増殖は抑制しなかった。このことは，味噌２番が子宮内膜に影響を及ぼさ

１）Zondervan KT, Becker CM, Koga K, Missmer

ずに子宮内膜症病巣に対してのみ増殖抑制効果を持SA, Taylor RN, Vigano P. Endometriosis. Nat

つことを示唆している。味噌の特異的な増殖抑制作用

Rev Dis Primers. 2018;4(1):9.
２）厚生労働省．「平成29年 患者調査（疾病分類

は，著者らが知る限り最初の報告である。
さらに，味噌２番はOESCにおいてVEGFの発現を編）」．https://wwwmhlwgojp/toukei/saikin/

抑制することがわかった。VEGFは質量30～46 kDa

hw/kanja/10syoubyo/dl/h29syobyopdf (2020年4の血管新生に関与する糖タンパクであり，さまざまな月10日）． 2017.

悪性腫瘍の増殖を担う増殖因子である。McLaren et３）Takaoka O, Mori T, Ito F, Kitawaki J, et al.

al. は子宮内膜症患者の腹水では正常患者と比較してDaidzein-rich isoflavone aglycones inhibit cell

VEGFの濃度が上昇しており，子宮内膜症病巣が腹腔

growth and inflammation in endometriosis. J

内で生存するためには血管新生が重要であることを報Steroid Biochem Mol Biol. 2018;181:125-32.

6,7)

告している

。

４）石田万里，坂井千恵美，田代聡，粟井和夫，吉子宮内膜症と大豆摂取の関連を調査した疫学研究は

栖正生，石田隆史．味噌によるDNA損傷抑制効果

ごく限られている。Tsuchiya et al. は，尿中のイソⅡ．中央味噌研究所研究報告．2019;No.40:50-3.

フラボン濃度が高いことが重症子宮内膜症のリスクを５）Mori T, Kitawaki J, et al. Estrogen-related

減少させるとしているが，逆にUpson et al. は幼児期

receptor alpha expression and function areに大豆成分を常時与えられた女性は子宮内膜症リスク

associated with vascular endothelial growth

8,9)が２倍以上になるとしている。

factor in human cervical cancer. Int J Gynecol

味噌は麴の種類，生産地，麴比率，味 (辛口・甘口)

Cancer. 2011;21(4):609-15.

などによって分類される。味噌２番の麴は米麴，生産

６）McLaren J. Vascular endothelial growth factor

地は東北で，醗酵期間が長く，麹比率が低いことが特and endometriotic angiogenesis. Hum Reprod

徴である。詳細な味噌の成分は不明であるが，長い醗Update. 2000;6(1):45-55.

酵期間と低い麴比率によって，子宮内膜症増殖抑制効

７）McLaren J, Prentice A, Charnock-Jones DS,果を示す特徴的なイソフラボン類の含有比率となった

Smith SK. Vascular endothelial growth factor

可能性が考えられる。味噌の成分分析とともに，逆に(VEGF) concentrations are elevated in peritoneal

子宮内膜症増殖抑制効果を示す製品の開発が期待され

fluid of women with endometriosis. Hum Reprod.

る。

1996;11(1):220-3.

本検討により子宮内膜症に対する味噌の増殖抑制効

８）Tsuchiya M, Miura T, Hanaoka T, Iwasaki

果がin vitro で示された。今後，味噌の子宮内膜症へ

M, Sasaki H, et al. Effect of soy isoflavonesの作用機序を解明するための基礎的検討，およびマウ

on endometriosis: interaction with estrogenスを用いたin vivo の実験を予定している。

receptor 2 gene polymorphism. Epidemiology.
2007;18(3):402-8.
９）Upson K, Sathyanarayana S, Scholes D, Holt
VL. Early-life factors and endometriosis risk.
Fertil Steril. 2015;104(4):964-71 e5.

─ 42 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

研 究 報 告麹菌ゲノム情報と質量分析装置を活用した
味噌の糖類に関する基盤研究

徳岡

昌文，柏木

豊，矢野 碧子，崔 淋鈞，本田
金本 湧太，小島 祐輔

千尋，小林

泉美

Studies on the saccharides in Miso based on genome information ofAspergillus oryzae and mass spectrometry
Masafumi TOKUOKA, Yutaka KASHIWAGI, Aoko YANO, Linkin SAI, Chihiro HONDA,
Izumi KOBAYASHI, Yuta KANEMOTO, Yusuke KOJIMA
Department of Fermentation Science and Technology Graduate School of Agriculture,
Tokyo University of Agriculture
1-1-1 Sakuragaoka, Setagaya-ku, Tokyo, 156-8502, Japan.

菌のゲノム情報から推定されたα-グルコシダーゼに【背景】

ついて，遺伝子破壊株と高発現株を作製し，その麹菌

味噌の糖類は，麹由来のデンプン分解物，原料大豆を用いて醸造した味噌のオリゴ糖を分析することで，由来の糖類，細胞壁分解物など複雑多岐な成分を含ん

α-グルコシダーゼと味噌中のオリゴ糖の関連を調べでいるが，分析の難しさから研究例が少ないため，そた。さらに，味噌麹から，活性に基づき，α-グルコの構造や熟成中の推移，生成メカニズムについての報

シダーゼを精製することで，味噌中のオリゴ糖生成に告は限られている1)。我々はこれまでに，多数の市販関与する新規酵素の酵素化学的性質，タンパク質科学

味噌の網羅的分析から，味噌中のオリゴ糖が味噌のタ的性質を解明することを目指した。

イプにより異なることを明らかにし，未知糖を含む多様な非発酵性糖が味噌中に含まれることを見出した
2)。麹菌の糖転移酵素はマルトースから非発酵性糖を【実験１】誘導化試薬による微量試料からのオリゴ糖の構造推定法の検討

生成することは昔から知られていることから3)，麹菌のα-グルコシダーゼが味噌中のオリゴ糖生成に重要であることは間違いなく，すでに高α-グルコシダー（方法）

ゼ活性の麹を用いた味噌製造が報告されている4)。

１．試薬

本研究では，大量精製が困難な味噌中のオリゴ糖に

標準品に用いたオリゴ糖は富士フィルム和光純薬株

ついて，未知糖の構造解析に資する，誘導化を介した式会社，又は Carbosynth Product 社のものを用い微量試料からの構造推定法の検討を行なったほか，麹た。

東京農業大学応用生物科学部醸造科学科〒 156-8502

東京都世田谷区桜丘 1-1-1

TEL/FAX: (03) 5477-2302
E-mail: m3tokuok@nodai.ac.jp

─ 43 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

２．誘導化方法

acid ethyl ester）は蛍光及びUV検出が可能であるこ

重合度２，３の標準品（maltose，kojibiose，とから5)，検出感度が優れていた。さらに，誘導化さsakebiose，isomaltose，maltotriose, panose，れたオリゴ糖を加水分解した際に，誘導化部位は分解

isopanose，isomaltotriose）各0.01mg及びABEE

されない特徴を生かし，誘導化後に加水分解し，誘導16.5mg，borane-2-methylpyridine 21.2mgを化糖のHPLC分析を行うことで，還元末端の糖残基をmethanol 360μLに溶解し，酢酸 40μLを添加後，60決めることができると考えた。特に，試料のオリゴ糖℃で2時間インキュベートすることで誘導体化した。

の重合度が小さい場合は，加水分解により生じた，還その後，吹き付け濃縮によって乾固し，Milli-Q水及元末端以外の糖について，再度誘導化をすることで，びchloroform 200μLを添加，攪拌後，遠心分離し，還元末端以外の部分についても構造推定が可能な場合

水層をHPLC試料とした。

があり，分析結果を統合することで，元試料のオリゴ糖の構造を決定できると考えた。

３．HPLC分析

標準品として，種々のマルトース，マルトトリオー

カラムにはPoroshell 120 EC-C18 （4.6 x 100スの異性体を誘導化して分析したところ，異なる溶mm，2.7μm；アジレント・テクノロジー株式会

出時間で明瞭なピークを検出することができた（図社）を用い，試料導入量５μL，流速 0.5mL / minと１）。さらに重合度６の標準品について加水分解を行した。移動相の液はMilli-Q水，B液はアセトニトリったところ，１N塩酸で80℃の条件で１時間反応させルを用い，グラジエント溶出はA / B = 100 :０（０ることで，重合度２，３のオリゴ糖が最も多く生成すmin），40 : 60（20 min），０: 100（21-25 min）でることが分かった。

行った。検出器はSPD-20A（株式会社島津製作所）

今後は，味噌試料から精製した微量なオリゴ糖に対を用い，検出波長は254 nmとした。

して，本法による分析を行い，構造の解明を目指す。

（結果・考察）前報告2)において，味噌中より新たにみいだされた【実験2】α-glucosidase遺伝子破壊株及び高発現株を用いた味噌製造

未知糖の構造に興味が持たれたものの，多様な糖を含む試料から微量に含まれる特定のオリゴ糖を精製し構造決定することは困難であった。そこで，オリゴ糖が（方法）

加水分解によりグリコシド結合で切断される特徴を生

１．味噌の仕込み及びサンプリング
市販味噌仕込みキット（株式会社伊勢惣）を使用しかし，誘導化と加水分解を組み合わせることで，構造た。説明書に従い，キット付属蒸煮加塩大豆110 g，の推定を行う方法を検討した。
様々な糖修飾試薬の中で，糖鎖分析に用いられる，

米麹40 g，水11.2 mlを混合し，容器は270 ml容の4-アミノ安息香酸エチルエステル（4 - aminobenzoic

タッパーを使用し，仕込み後は30℃でインキュベート䝁䞊䝆䝡䜸䞊䝇

䜲䝋䝬䝹䝖䞊䝇

䝃䜿䝡䜸䞊䝇

䝬䝹䝖䞊䝇䜲䝋䝟䝜䞊䝇

䝟䝜䞊䝇

䜲䝋䝬䝹䝖
䝖䝸䜸䞊䝇

䝬䝹䝖䝖䝸䜸䞊䝇

図１．ABEE誘導化したオリゴ糖のHPLC分析
─ 44 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

表１．味噌試料からのサンプリング法Ａ，Ｂにおける糖グルコース及び全糖の相対標準偏差した。サンプリングは，条件Aでは，試料を離れた3
カ所から0.2 gをサンプリングし，条件Bでは，試料を離れた４カ所から1.0 gをサンプリングした。サンプ
リング後，Milli-Q水で希釈し，濾紙（アドバンテッ
ク東洋No. 2）でろ過をした後，分析まで-80℃で保存した。
２．麹菌遺伝子破壊株及び高発現株の作製

Aspergillus oryzae のゲノムデータベース（CAoGD（https://nribf21.nrib.go.jp/CAoGD/））
より抽出したα-グルコシダーゼ遺伝子について2)，遺べた。10日目以降，約10日ごとに70日目までサンプリ

伝子破壊と遺伝子高発現株を作製した。遺伝子破壊及ングを行なったところ，対照株２株と比較し，重合度び高発現株作製は既報6)に従った。

（DP）２のオリゴ糖量が10日目の時点から遺伝子破壊株で多く，遺伝子高発現株で少ない傾向が観察され３．糖の分析

た。変動があったオリゴ糖の分子種の解明は今後の課重合度（DP）２～５のオリゴ糖定量には，親水性題であるが，AgdA遺伝子破壊株でオリゴ糖が増加す

相互作用クロマトグラフィー・飛行時間型質量分析計

ることは，同株を用いた清酒醸造でも確認されている

7)

ことから6)，高発現の影響と併せ，AgdAは味噌醸造（HILIC－TOF/MS）を既報と同様に用いた 。全糖
8)はフェノール硫酸法 で，グルコースはグルコースア

においても重合度２のオリゴ糖の分解に寄与している

ナライザーGLU-12（東亜ディーケーケー株式会社）

ことが分かった。また，若干の増加傾向が見られるもを用いて測定した。

のの，各株の重合度２，３のオリゴ糖は10日目と70日目で大きな差は無いことから，味噌中のこれらオリゴ（結果・考察）糖は米麹に由来する，もしくは仕込み後10日目までの

１．味噌からの糖分析試料のサンプリング法の検討間に生成すると考えられる。重合度４，５については

味噌醸造を実施する上で，本研究では遺伝子組換え漸減する傾向から仕込みの期間に分解が進んでいると体を用いた検討を行うため，設備上，小さいスケール考えられる。

での仕込みが必須となる。そこで初めに，安定した分析値を得るためのサンプリング方法を検討した。試３．新規α-グルコシダーゼの遺伝子破壊株及び料３カ所から0.2ｇ（Ａ法）及び４カ所から1.0 g（Ｂ高発現株を用いた味噌の製造及びオリゴ糖分析法）のサンプリングを行い，サンプルについて，グル麹菌のゲノム情報からは，α-グルコシダーゼをコースと全糖の測定値のバラツキを，相対標準偏差コードすると考えられる14遺伝子が見出されている（RSD）から比較した（表１）。サンプリング法Aはものの 2) ，機能が確認されているものは，AgdAと試料が少ないものの，RSDが大きく，Ｂ法はサンプ

Bのみである 10,11) 。しかし，データベースからは，リングによるバラツキを抑えることができていたこと

その他のα-グルコシダーゼ遺伝子の中にも米麹でから，Ｂ法を本実験における分析試料のサンプリング

発現しているものもあることから，これら遺伝子に方法とした。

ついて破壊株と高発現株の作製を進めた。取得できた，AgdE（AO090102000559）の遺伝子破壊株と高発現株，AgdB（AO090038000471）及びAgdG

２．α-glucosidase A遺伝子破壊株及び高発現株を用いた味噌の製造及びオリゴ分析（AO090020000176）の高発現株について米麹を作製

α-glucosidase A（AgdＡ）は麹菌 A. oryzae におし，味噌醸造を行い，20，30，40日目におけるオリ

いて，最も遺伝子発現が強く，またデンプン分解に関

ゴ糖（DP２～５）を定量した（図３）。興味深いこと

わる重要な転写因子AmyRとα-アミラーゼを含む遺に，データベース上ではAgdEの遺伝子発現が比較的伝子クラスターである amyR-agdA-amyA 遺伝子ク

高いにもかかわらず，破壊株と高発現株に差がほとん

9)

ラスターを構成することからも ，主要なα-グルコシ

ど無かった。一方，データベース上で発現が比較的弱

ダーゼと考えられている。これまでにAgdAの遺伝子

いAgdGの高発現により重合度２～５すべてのオリゴ破壊株及び高発現株を遺伝子組換えにより作製してい糖が増加する傾向が観察された。agdG は A. nidulans

ることから6)，これらの麹菌株を用いて味噌醸造を行

において agdG とされている遺伝子（AN4843.3）のうことにより，AgdAのオリゴ糖生成への関わりを調ホモログであるが12)，米麹（仲仕事）での遺伝子発現

─ 45 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

図３．麹菌α-グルコシダーゼ遺伝子破壊株及び高発株を用いて製造した味噌のオリゴ糖（DP2-5）の推移

図２．AgdA破壊株及び高発現株を用いて製造した味噌のオリゴ糖（DP2-5）の推移

はagdA の17分の１程であり，さらに細胞内タンパク

沈殿，TSKgel DEAE-5PW陰イオン交換カラム及び2)質と予想されている 。実際の味噌醸造での役割につTSKgel UP-SW3000GPCカラムによるクロマトグラ

いては破壊株の結果が得られるまでは結論付けられな

フィーによって，α-グルコシダーゼ活性画分を精製

いものの，強制発現をさせることでオリゴ糖が増える

した。

ことは興味深く，育種のターゲットとしても期待できる。なお，AgdGの遺伝子高発現の影響についても，

２．α-グルコシダーゼ活性画分の酵素化学的性質

AgdAでの結果（図２）と同様に，10日目の時点で差活性画分の酵素活性は，各pH及び温度において基が生じているため，観察された生成オリゴ糖量の差

質p -nitrophenyl-α-glucopyranoside（p NP-Gluc）

は，米麹中もしくは10日目までに生じた差であると考から遊離するp -nitrophenol（p NP）をOD 400の測定えられる。

により定量し，酵素活性を算出した。酵素活性の1Uは１分間に１μmolのp NPを遊離する酵素量とした。
SDS-PAGEによって酵素標品の均一性と分子量を推【実験３】味噌用米麹からのα-グルコシダーゼの精製と性質定した。酵素によるマルトースからの反応生成物をシ
リカゲル薄層クロマトグラフィーにより分析した。

（方法）

展開溶媒 2-propanol / 1-butanol / DW（12 : 3 : 4）

１．実用麹菌株の味噌麹からの酵素画分の精製により上昇法にて展開し，20％ H2SO4 / methanol ス

実用種麹を用いて製麹した味噌麹から0.5 ％ NaCl

プレー加熱法によって糖のスポットを検出した。LC/溶液により抽出を行い粗酵素液を取得した後，硫安

MS 2)によって，酵素反応生成物の構造を解析した。

─ 46 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）Ѝʘήϩαεξʖκ‫׈‬੓

ʤ

ʥ

P3

༻ड़࣎ؔʤ

ʥ

図４．TSKgel-UP-SW3000ゲル濾過クロマトグ
ラフィーにおける溶出パターン

図５．活性ピークのSDS-PAGE
M，分子量マーカー；P3，ゲル濾過クロマト活性ピーク
画分（←）（結果・考察）
１．味噌麹からのα-グルコシダーゼ活性画分の精製

味噌醸造は食塩存在下で発酵熟成が進行することか

市販精米（飯米用）を用いて常温にて一夜吸水し水ら，高濃度食塩の酵素活性への影響が注目される事項

切後，100 ℃，60分蒸煮し，放冷した後，市販粉末種である。そこで０- 10％ NaClを添加した際の酵素活麹（味噌用，醤油用，いずれもA. oryzae ）を散布し性を検討した。本酵素は10％ NaCl存在下において，てよく混合し，ガラスシャーレに盛り込み，恒温恒湿

NaCl無添加に比べて約56％の活性を保持した（図器にて30℃，相対湿度90％にて72時間培養した。出麹７）。

重量の10倍量の0.5 ％NaClを加え，室温にて２時間振

食塩添加による活性低下は緩やかであり，赤色辛口

とうして抽出液を得た。抽出液のα-グルコシダーゼ

味噌等の発酵熟成が長期間にわたることを考えると，活性は，味噌用及び醤油用種麹においてそれぞれ7.1

本酵素は食塩存在下でも活性を保持し，穏やかに酵素

mU / mL及び11.2 mU / mLであった。このため以後反応を進行していることが予想された。

の精製操作には醤油用種麹由来の米麹を用いた。麹本酵素を100mg / mLマルトースに作用させた場合

抽出液に対して90％飽和硫安沈殿，TSKgel DEAE-の反応生成物をTLCによって解析した。図８に示し

5PWカラム，TSKgel UP-SW3000カラムによるクロたように，反応初期から分解産物であるグルコースはマトグラフィーによりα-グルコシダーゼ画分を精製

ほとんど検出されずマルトースより重合度の高い糖がし，SDS-PAGEにより単一の活性画分を取得した。

検出され，マルトースの加水分解と同時に糖転移反応

図４に示したように，ゲル濾過クロマトグラフィーが起こっていることがわかった。さらに22時間の長時によって鋭いタンパク質ピークP3が得られ，活性ピ間反応においては，重合度４～６と考えられるオリゴークが一致した。本ピーク画分をSDS-PAGEによっ糖が生成することがわかった。従って，本酵素はマルて分析したところ，単一のタンパク染色バンドが得ら

トースに対して分解反応と同時に糖転移反応を行う典れた（図５）。

型的なα-グルコシダーゼであった。
さらに22時間反応における反応生成物をLC/MSに

２．精製活性画分の酵素化学的性質

よって構造解析したところ，糖転移による生成糖としSDS-PAGEによって，本酵素の分子量は約99 kDて，パノース，イソマルトース，イソマルトトリオーと推定された。本酵素は，至適pH 6.0，至適温度50

ス，コージビオース，マルトトリオース及びイソマル℃であり，pH 4 - 8，40 ℃以下で安定であった（図トテトラオースが検出された。さらに，４糖と考えら

６）。合成基質に対しては p NP-α-Gluc のみを分解れる未同定のオリゴ糖も検出された（図９）。また，し，p NP-β-Gluc，p NP-α-L-Fuc，p NP-α-Man 及

10％ NaCl存在下でも，反応生成物は変化しなかっび p NP-α-Gal には全く作用しない。

た。

─ 47 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

120

Relative Activity㸦%㸧

Relative Activity㸦%㸧

100

100

80
60
40
20
0

0

1

2

3

4

5

ઃ

6

7

8

79.17

80

72.92

60

56.25

40
20
0

9 10 11

0%
1%
5%
10%
Concentration of NaCl (㸣㸧120

Relative Activity㸦%㸧

100.00

図７．食塩存在下の加水分解反応の比較

100
80
60
40
20
0

10

20

30

40

50

㼀㼑㼙㼜㻚㻌䠄䉝䠅

60

70

80

G1
G2
G3
G4
G5
G6

Residual Activity㸦%㸧

100
80
60
40
20
0

0

1

2

3

4

ᐊ

䠗㻞㼔㼞

5

pH

6

7

8

9

10 11

㻳㼘㼏
㻹㼍㼘

㻠䉝䠗୍ᬌ

Residual Activity㸦%㸧

120཯ᛂ᫬㛫 䠄㼔㼞䠅

図８．精製酵素によるマルトースからの反応生成物のTLC分析

100
80
60
40
20
0

従って，味噌醸造に用いられる米麹に含まれるα0

10

20

10min

30

40

50

60

70

㼀㼑㼙㼜㻚䠄䉝䠅
ಖ

1hr

ಖ

80

グルコシダーゼは，α-アミラーゼ等によってデンプンから生成するオリゴ糖を加水分解すると同時に糖転移反応によってα-1，2- ，α-1，3- ，α-1，6-グリコシド結合を含むオリゴ糖を生成し，味噌熟成中において

図６．精製酵素の至適pH，至適温度，pH安定性及び温度安定性

分岐オリゴ糖の一部を生成する役割を持つことが強く示唆された。

【総括と展望】
本実験では，麹菌のゲノム情報から推定されたαグルコシダーゼと，味噌麹から精製したα -グルコシ

─ 48 ─

中央味噌研究所研究報告

No.42（2022）

もに，未知糖の構造解析法を構築し，味噌中のオリゴ࣐ࣝࢺ࣮ࢫ࢖ࢯ࣐ࣝࢺ࣮ࢫ
ࢥ࣮ࢪࣅ࣮࢜ࢫ

࣐ࣝࢺ
ࢺ࣮ࣜ࢜ࢫ

ᶆ
‽

unknown

きたいと考えている。

【謝辞】

㸱
⢾
㢮

ࣃࣀ࣮ࢫRU࢖ࢯࣃࣀ࣮ࢫ
࢖ࢯ࣐ࣝࢺࢺ࣮ࣜ࢜ࢫ

糖の詳細及び生成メカニズムについて明らかにしてい㸰⢾㢮

本研究は一般社団法人中央味噌研究所の研究助成と試料提供により実施したものです。研究遂行に多大なᶆ‽

ご支援を賜りました一般社団法人中央味噌研究所をは

unknown

じめ，関係者の方々に心より感謝申し上げます。

㸲⢾㢮࣐ࣝࢺࢸࢺ࣮ࣛ࢜ࢫ
࢖ࢯ࣐ࣝࢺࢸࢺ࣮ࣛ࢜ࢫ ᶆ

【文献】

‽

１）本藤

図９．マルトースからの反応生成物の LC / MS による解析

智・他；日本食品工業学会誌，26，469-

474（1979）
２）徳岡昌文・他；中央味噌研究所研究報告，41，
36-42（2020）３）PazurH., et al. ；Journal of Biological

Chemistry，196，265-272(1952)
ダーゼについて，それぞれ遺伝学的手法及び酵素化学４）渡辺隆幸・他；日本醸造協会誌，107，191-196

的手法で，味噌醸造におけるオリゴ糖生成の観点か（2012）
５）Kwon H.，et al. ; Journal of Liquid Chromatography,

ら，それぞれ特徴付けを行った。ゲノム情報からは，

18，1437-1449（1995）

主要なα-グルコシダーゼであるAgdAが味噌中のオ６）Kojima Y., et al. ; Journal of Agricultural and

リゴ糖を減少させる方向に寄与することが明らかにな

Food Chemistry，68，1419-1426 （2020）

った一方で，味噌麹から見出された酵素は活発な糖転７）Tokuoka M., et al. ;Journal of Bioscience and移作用を示したことから，味噌中のオリゴ糖の生成へ

Bioengineering, 124, 171-177（2017）の寄与が強く示唆された。また，ゲノム情報では発現が相対的に弱いAgdGを強制発現することで，味噌中８）Dubois M., et al. ; Nature 168, 167 （1951）のオリゴ糖が増加することが分かった。これらは，味９）Gomi K.; Bioscience, Biotechnology, andBiochemistry, 83, 1385-1401（2019）

噌中のオリゴ糖量と酵素との関連性を具体的に示す興10）Minetoki T., et al. ；Bioscience, Biotechnology,

味深い結果である。味噌中のオリゴ糖は，味噌の味や

and Biochemistry, 59, 1516-1521（1995）

物性，テリなどに影響すると考えられているが，その11）Nagayoshi E., et al. ；Journal of Biological

詳細は明らかではない。将来的に，本結果を踏まえてMacromolecule, 15, 13-27（2015）

育種された麹菌を用いることにより，味噌中のオリゴ

12）Nakamura T., et al. ；Bioscience, Biotechnology,

糖量をコントロールした醸造が可能になると期待でき

and Biochemistry, 70, 2363-2370（2006）

る。今後は，造成できていないα-グルコシダーゼ遺伝子の破壊株や高発現株を用いた解析を継続するとと

─ 49 ─