本記事は , 文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム事業 秀でた利用 6 大成果について紹介するものです .

⽂部科学省ナノテクノロジープラットフォーム 秀でた利⽤ 6 ⼤成果

パルス状コヒーレント X 線溶液散乱法のための溶液試料ホルダの開発
北海道⼤学電⼦科学研究所 ⽊村 隆志，（公財）⾼輝度光科学研究センター 城地 保昌，台湾中央研究院物理研究所 別所 義隆，北海道⼤学電⼦科学研究所 ⻄野 吉則
北海道⼤学 松尾 保孝，⼤⻄ 広（左から） 北海道大学電子科学研究所 木村 隆志，（公財）高輝度光科学研究センター 城地 保昌，台湾中央研究院物理研究所 別所 義隆，北海道大学電子科学研究所 西野 吉則（左から） 北海道大学

松尾 保孝，大西 広

幅が 10fs 以下という，従来の X 線光源とは質的に異なる

１．はじめに優れた特徴を持っている．10fs 以下のパルス幅は，試料が放射線損傷による構造変化を起こす時間スケールよりX 線の持つ短波長性と高い透過性を活かせる X 線顕微も短く，この点を利用することで，放射線損傷が生じる

鏡は，生物試料などの内部構造を高分解能で観察する手前の，可能な限り自然な状態に近い生物試料の高分解能段として広く利用されている．生物試料の観察では，如観察が可能となる．XFEL を使用したタンパク質結晶構造

何に自然な状態に近い構造を維持できるかが重要な問題

解析でも，ピコ秒の時間スケールで放射線損傷が起きるである．しかし従来，X 線顕微鏡に限らず電子顕微鏡も活性部位について，無損傷の正確な構造決定がなされた

含めた高分解能観察法では，観察プローブである放射線例などが報告されている [5][6]．

による試料損傷が大きな問題となってきた [1][2]．

1999 年に J. Miao らにより世界初の実証実験 [7] が行

X 線 自 由 電 子 レ ー ザ ー（X-ray Free-Electron Laser

われたコヒーレント X 線回折イメージング（Coherent（XFEL））は新世代の X 線光源であり，現在，兵庫県の播

X-ray Diﬀraction Imaging（CXDI））は，干渉性の高いコヒー

磨科学公園都市に建設された SACLA（SPring-8 Angstrom

レントな X 線を試料に照射し計測するスペックル状の回Compact free-electron LAser）[3] と，米国の LCLS（Linac折パターンから，計算機解析により試料像を再構成する

Coherent Light Source）[4] の二箇所でのみ使用可能であ

顕微法である．XFEL の超短パルスかつ高ピーク輝度の X

る．XFEL は空間的にほぼ完全コヒーレントである点だけ線によるシングルショット計測と，CXDI によるイメージでなく，ピーク輝度が SPring-8 の 10 億倍以上，パルスングを組み合わせることにより，放射線損傷の影響のな

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い高分解能イメージングが可能になる．CXDI で計測する

液体ジェット [12] やエアロゾル [13] 入射による試料の導コヒーレント X 線回折パターンと試料像の間には，フー入が行われている．これに対し，PCXSS では二枚の窒化リエ変換の関係が成り立つが，実験で計測できるのは回ケイ素薄膜の間に溶液を封入し，制御された環境下にあ折パターンの振幅のみで位相情報が欠落しているため，る試料を静置する点を特徴としており，これは生きた細そのままでは試料像を求めることが出来ない．CXDI では，胞のイメージングにおいて重要となる．近年電子顕微鏡

回折パターンの振幅および試料サイズなどの拘束条件をの領域でも，こうした試料ホルダは気体や液体中の試料加えながら，フーリエ変換・逆変換を反復的に繰り返すを観察するために使用されている [14]．

ことにより，回折パターンの位相情報を回復し試料像のXFEL は 極 め て 高 強 度 で あ る た め，XFEL の シ ン グ ル

再構成を行う．CXDI では，ゾーンプレートなどの X 線結ショットにより，窒化ケイ素薄膜は破壊されてしまう．

像光学素子を利用しないため，光学素子の作製精度に影そのため，筆者らは 1 枚のチップ上に，多数の独立し響されない高分解能イメージングが可能である．これまた溶液槽を集積した，マイクロ液体封入アレイ（Microでの放射光を用いた CXDI で，無機試料で 2nm[8]，有機Liquid Enclosure Array（MLEA））を作製した．100 個の試料でおよそ 30nm[9][10] といった分解能の報告がなさ溶液槽を 1 枚のチップ上に集積したマイクロ液体封入アれている．

レイの写真を図 2a に示す．マイクロ液体封入アレイの作

筆 者 ら は，XFEL を 利 用 し た 溶 液 中 の 試 料 に 対 す る

製には，文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム

CXDI であるパルス状コヒーレント X 線溶液散乱法（Pulsedの支援を受け，北海道大学が運用を行っているレーザー

Coherent X-ray Solution Scattering（PCXSS）） を 独 自 にビーム描画やドライ・ウェットエッチングといった半導開発している．PCXSS の概念図を図 1 に示す．本稿では，体プロセスの装置群を利用した．溶液中の試料粒子を奥XFEL を用いた PCXSS によって，溶液中の生きた細菌の行き方向の重なりなく観察するため，SiO2 製のビーズを高分解能イメージングを行った結果 [11] について紹介すスペーサーとして利用し，試料と同程度の溶液層の厚みる．分解能およそ 37nm の試料像が得られ，試料像内にになるように調整している．

核様体と推察される高電子密度領域を観察することに成今回の実験で我々は，Microbacterium lacticum という功した．将来的には，結晶化していない状態の生体超分乳製品中に存在する微小な細菌を観察した．図 2b に M.
lacticum の走査型電子顕微鏡像を示す．サブマイクロメー
トルという小さなサイズのため，光学顕微鏡ではほとんど点のようにしか見えず，内部構造の観察は困難であり，細胞生物学的な知見はほとんど得られていない．
図 2c は，マイクロ液体封入アレイ中の M. lacticum を蛍光顕微鏡で観察した像である．生細胞が緑，死細胞が赤に蛍光するよう染色した後に，マイクロ液体封入アレ子複合体の構造解析の実現を目指している．

２．マイクロ液体封入アレイによる溶液試料の保持
XFEL を利用した回折実験では，米国の LCLS において

図 1 パルス状コヒーレント X 線溶液散乱法（PCXSS）の模式図．
XFEL のシングルショットごとにマイクロ液体封入アレイの位置を変え，放射線損傷のない試料を計測する．

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イ中に閉じ込めた．マイクロ液体封入アレイを真空中にM. lacticum に XFEL パ ル ス を 一 回 照 射 し．Multi-Port

放置し，1 時間後に再び観察を行ったところ，99% 以上

Charged-Coupled Device（MPCCD）[17] で 計 測 し た コの細菌が生存し続けていることを確認した．これにより，ヒーレント X 線回折パターンを図 3 に示す．コヒーレン

マイクロ液体封入アレイを使用することで，生きた細菌

ト X 線回折パターン中の，斜めの一方向に強く伸びた干を観察可能であることを示した．実際に XFEL で実験を行

渉縞は，杆菌である M. lacticum が一定の幅を持つことう際には，より自然に近い状態の試料の観察を行うため，に起因する．干渉縞の縞間隔から，M. lacticum がおよそこうした染色作業は行っていない．

194nm の幅を持つことが導かれる．この結果は，図 2bに示す M. lacticum の走査型電子顕微鏡像と矛盾しない．
位相回復計算を行い，コヒーレント X 線回折パターン

３．生きた細胞の XFEL シングルショッ
トイメージングから再構成した試料像を図 4a に示す．位相回復アルゴリ
ズムには，
relaxed averaged alternating reﬂections（RAAR）[18]，noise-tolerant hybrid input-output（HIO）[19] 及

生きた M. lacticum に対する PCXSS 実験を，SACLA のび shrink-wrap[20] アルゴリズムを使用した．位相回復計

BL3 において実施した．光子エネルギー 5.5keV の X 線を算には初期値依存性があるため，複数の初期値から再構使用し，全反射ミラーを利用した X 線集光システム [15]成した試料像の平均を解析結果としている．解析結果のにより 1.5m × 2.0m に集光した後，マイクロ液体封入アレイ内の M. lacticum に照射した．

分解能の評価には，位相回復伝達関数 [21] を利用した．
位相回復伝達関数では，平均後の再構成試料像をフーリPCXSS 実験において精度の高い試料像を得るためには，エ変換して得られる回折パターンと，計測した回折パター

試料からの回折 X 線に対してノイズとなる，試料以外かンを比較し，どの空間周波数まで一致しているかを判定

らの寄生散乱を可能な限り低減することが重要である．こし分解能を評価する．その結果，図 4a の再構成試料像ののため，大気からの散乱を防ぎ真空中で試料を保持する分解能は，およそ 37nm と見積もられた．

MAXIC（Multiple Application X-ray Imaging Chamber）[16]図 4a の再構成試料像の下部には，白〜赤で色付けされを使用した．また，全反射ミラーなど光学系からの寄生散ているおよそ 300nm × 100nm サイズのイメージ強度の乱を低減するために，MAXIC 中に二組の四象限スリット高い領域が存在する．この高イメージ強度領域は，再構を設置した．マイクロ液体封入アレイの X 線照射領域は，成試料像上部の低イメージ強度領域の間と比べ，およそ 2

図 2c にも示すように 20m 幅のシリコン窓枠で囲われているが，この構造自体が上流光学系からの寄生散乱を低減〜 3 倍の強度を持つ．高イメージ強度領域が主に DNA でする上で効果的な役割を果たすことを確認した．

されていると仮定すると，この強度比をほぼ定量的に説構成され，低イメージ強度領域が主にタンパク質で構成

図 2 PCXSS 計測に使用したマイクロ液体封入アレイと M. lacticum ．
（a）マイクロ流体封入アレイ （b）M. lacticum の走査型電子顕微鏡像．
（c）マイクロ液体封入アレイ中の M. lacticum の蛍光顕微鏡像．緑が生細胞，赤が死細胞を示す．

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図 3 M. lacticum から計測されたシングルショットコヒーレント X 線回折パターン．

．
図 4 M. lacticum の再構成試料像（a）と透過型電子顕微鏡像（b）（a）は生きた細菌の電子密度分布を表している．

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本研究は，文部科学省 X 線自由電子レーザー重点戦略

明することが可能である [22]．
図 4b は M. lacticum の透過型電子顕微鏡による断面観研究課題，JST CREST，科研費，物質・デバイス領域共同察像であるが，同様の核様体構造が内部に観察される．

研究拠点，ナノテクノロジープラットフォーム等の支援

このことからも，PCXSS により得られた試料像が高い信を受けて実施した．

頼性を有していることが確認できる．ここで強調すべきことは，透過型電子顕微鏡像は試料を重金属で染色し薄切片にしたものであるが，PCXSS では非染色の生きた細参考文献

胞を観察している点である．自然な状態の生きた細胞を[1] Henderson, R., et al. , Q. Rev. Biophys. 28, 171 (1995).

高分解能で観察可能な PCXSS は，細胞内での生命現象を[2] Kirz, J., et al. , Q. Rev. Biophys. 28, 33 (1995).

深く理解する上で大きな利点を有している．

[3] Ishikawa, T., et al. , Nat. Photon. 6, 540 (2012).
[4] Emma, P., et al. , Nat. Photon. 4, 641 (2010).
[5] Hirata, K., et al. , Nat. Methods. 2962 (2014).

４．まとめと今後の展望[6] Boutet, S., et al. , Science . 337, 362 (2012).
[7] Miao, J., et al. , Nature . 400, 342-344 (1999).

本稿では，XFEL を用いた PCXSS が，染色していない生きた細胞を，ナノメートルの分解能で定量的に観察で[8] Takahashi, Y., et al. , Phys. Rev. B 82, 214102 (2010).

きる優れた手法であることを示した．今後，生きた細胞[9] Nishino, Y., et al. , Phys. Rev. Lett. 102, 018101 (2009).

を系統的に測定することで，未だ解明されていない原核[10] Nam, D., et al. , Phys. Rev. Lett. 110, 098103 (2013).

微生物のゲノム複製やそれに続く細胞分裂などの，重要[11] Kimura, T., et al. , Nat. Commu. , 5, 3052 (2014).

な細胞内現象の解明に繋がることが期待される．

[12] Chapman, H. N., et al. , Nature 470, 73 (2011).
[13] Seibert, M. M., et al. , Nature 470, 78 (2011).

また，XFEL や集光光学素子の性能が向上すれば，より[14] Jonge, N. et al. , Nature nanotech. 6, 695 (2011).

微小な試料の観察や，さらなる分解能の向上が可能になる．その際，PCXSS は細胞試料のみならず，溶液中での[15] Yumoto, H. et al. , Nat. Photon. 7, 43 (2013).

生体超分子複合体の構造解析にも道を開くと期待する．

[16] Song, C. et al. , J. Appl. Cryst. 47, 188 (2013).
[17] Kameshima, T. et al. , Rev. Sci. Instrum. 85, 033110(2014).
[18] Russell L., D., Inverse Problem , 21, 37 (2005).

謝辞[19] Martin, A. V., et al. , Opt. Express , 20, 16650 (2012).
本研究は，理化学研究所の石川哲也センター長，矢橋[20] Marchesini, S., et al. , Phys. Rev. B, 68, 140101 (2003).

牧名グループディレクター，Changyong Song チームリー[21] Chapman, H. N., et al. , J. Opt. Soc. Am. A , 23, 1179

ダー，Sangsoo Kim 博士，高輝度光科学研究センターの(2006).
[22] Svergun, D. I., et al. , Rep. Prog. Phys. 66, 1735 (2003).

登野健介チームリーダー，共和化工株式会社環境微生物学研究所の大島泰郎所長，森屋利幸博士，東京薬科大学の玉腰雅忠准教授との共同研究である．

（北海道大学電子科学研究所木村 隆志）【お問い合わせ】
微細加工プラットフォーム
北海道大学☎ 011-706-9340
E-mail nanoplat@cris.hokudai.ac.jp

ホームページ
http://www.cris.hokudai.ac.jp/cris/nanoplat/

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