リバーフロント研究所報告第18号

2007 年 9 月

DNA 多型分析技術の河川環境への適用について【中間報告】
Application of DNA polymorphism analysis technology to the river environment(interim report)

研究第一部

主任研究員

城戸和寿

研究第三部

研員

後藤勝洋

技術普及部

部

長

佐合純造

東北大学大学院工学研究科

大村達夫

東北大学大学院工学研究科

渡辺幸三

究

平成 9 年の河川法改正に伴い、従来の河川整備の柱である「治水」、「利水」に「環境」が加えられ、新たな河川行政の方針が示された。また、平成 15 年には、過去に失われた生態系その他の自然環境を取り戻すことを目的とした「自然再生推進法」が施行されており、我が国の河川、湿原、干潟、藻場、里地、里山、森林、サンゴ礁などの自然環境を保全・再生・創出することが求められている。
一方、平成4年（1992）の国連環境開発会議（地球サミット）で調印された生物多様性条約では、生物多様度を「生態系」、「種」、「遺伝子」の 3 つのレベルで捉え、それらの保全等を行うことが明記されている。
これまで、河川生物の生物多様性は、種の多様性を対象とした評価およびそれに基づく河川整備が行われてきたが、生物多様性の保全をより適切に進めていくためには、種多様性の尺度からだけでなく、種の中の個体間の遺伝的な違いである「遺伝的多様性」という尺度も必要と考える。この遺伝的多様性は、「DNA多型分析」を実施することで可能になると考える。今回は、この遺伝的多様性を評価するため、DNA（デオキシリボ核酸）多型分析に焦点をあて、その具体的な適用方法等について提案することを目的としたものである。
本報告は、適用方法の具体化に先だって基礎的な調査・分析を行ったものであり、結論を導き出すには至っていないため、途中経過を報告する。
キーワード：DNA、ヘテロ接合度、遺伝的多様性、遺伝距離、河川環境、ウルマーシマトビケラ
The amendment of the River Act in 1997 added a new objective, namely, environmental conservation, to thetwo main objectives, "flood control" and "water utilization," of river improvement, and a new policy for riveradministration was indicated. In 2003, the Nature Restoration Promotion Act was enacted with the aim ofrestoring lost ecosystems and other natural environments. The new law calls for the conservation, restorationand creation of natural environments in Japan including rivers, wetlands, seaweed beds, rural areas, forests andcoral reefs.
The Convention on Biological Diversity signed at the United Nations Conference on Environment andDevelopment (Earth Summit) in 1992 views biological diversity at three levels, namely, ecosystem, species andgenetic, and calls for conservation efforts at those levels.
The conventional practice in river improvement is to evaluate biological diversity at the species level and planand implement river improvement accordingly. For better conservation of biological diversity, however, it isnecessary to take into consideration genetic diversity, which is the genetic variety among individuals within aspecies, as an indicator of biological diversity, as well as the variety of species. Genetic diversity can be evaluatedby conducting a DNA polymorphism analysis. Focusing on this DNA (deoxyribonucleic acid) polymorphism
analysis as a means of genetic diversity evaluation, this study aims to propose a concrete method of applicationand other specifics.
Prepared as an interim report, this paper reports on the basic studies and analyses conducted before
developing a concrete method of application and, because a conclusion has not yet been drawn, on what has beenachieved thus far.
Key words : DNA, heterozygosity, genetic diversity, genetic distance, river environment, Hydropsyche orientalis－ 159 －

「自然をいかした川づくり」に関する研究報告

１．はじめに用していくかについて、その可能性を簡単に述べる。

平成 9 年の河川法改正に伴い、従来の河川整備の柱である「治水」、「利水」に「環境」が加えられ、新た① 多自然川づくりや自然再生事業の効果検証な河川行政の方針が示された。また、平成 15 年には、近年、全国各地で実施されている多自然川づくりや過去に失われた生態系その他の自然環境を取り戻すこ自然再生事業において、種数、個体数の変化に対するとを目的とした「自然再生推進法」が施行されており、 検証は行われている。しかし、種数や個体数調査は、我が国の河川、湿原、干潟、藻場、里地、里山、森林、 その方法や時期等の差異や洪水等のフラッシュによるサンゴ礁などの自然環境を保全・再生・創出すること一時的な個体量の低下により、正確な把握・検証となが求められている。

らない可能性もある。DNA多型分析を併用すること

一方、平成 4 年（1992）の国連環境開発会議（地球サによって、外的要因に左右されない遺伝子レベルの把ミット）で調印された生物多様性条約では、生物多様握が可能となり、より精度の高い事業効果の検証を行度を「生態系」、「種」、「遺伝子」の 3 つのレベルで捉え、 うことが可能である。
それらの保全等を行うことが明記されている。
これまで、河川生物の生物多様性は、種数（分類群自然再生事業等の実施数）や多様性指数などの種多様性を対象に評価され、それらを保全・再生するための河川環境整備が実施さ【従来のﾓﾆﾀﾘﾝｸﾞ調査】○ 種数○ 個体数 などれてきた。しかし、生物多様性の保全をより適切に進めていくためには、種多様性の尺度からだけでなく、種の中の個体間の遺伝的な違いである「遺伝的多ただし、調査精度が違えば正確な把握ができない場合がある！

様性」という尺度も必要と考える。この遺伝堤多様性は、「DNA多型分析」を実施することで可能になると考える。今回は、この遺伝的多様性を評価するため、DNA（deoxyribo nucleic acid：デオキシリボ核酸）多型分析に焦点をあて、その具体的な適用方法等について提案することを目的としたものである。

DNA 多型分析技術の実施

本報告は、適用方法の具体化に先だって基礎的調査・分析を行ったものであり、結論を導き出すには至っていないため途中経過を報告する。

事業の効果検証

２．河川における DNA 多型技術の適用

図－ 1

DNA 多型分析技術の適用イメージ

河川における生物多様性の保全は、その重要性が以前にも増して認識されつつある。河川管理上において② ダ ム・堰等の横断工作物による河川分断化に伴うも生物多様性を保全するための適切な対応が求められ遺伝的多様性の評価ている。

ダムや堰等の横断工作物により、平常時の河川流下

現在、遺伝的多様性として同種内に蓄積されている方向の生物移動が阻害される場合、分断された集団間個体間の遺伝的差異は、将来起こる新種の発生（種分に起こる遺伝的変化を把握する。また、遺伝子レベル化）のために欠くことのできない原動力となっている。 での差異を把握しておくことで、人為的な種の移入に遺伝的多様性が極端に低い種は、近交弱勢により生存よって生じる遺伝的汚染を防止することも可能であ率や繁殖力が低下して絶滅しやすい。このため、遺伝る。

的多様性が低下他した地域集団は、長い目で見ると、 ③ 代替生息地等における遺伝的多様性の評価
将来に河川環境が大きく変わった時に、変化後の環境河川改修等により、やむを得ず代替生息地の生物を移入・定着させる場合が考えられる。このとき、単純下で遺伝子を存続させる可能性が低くなる。
PCR法などの分子生物学的手法の発達によりDNAな定量把握・評価だけでなく、遺伝的多様性を把握す多型分析が従前より格段に身近なものになった今、河ることで、遺伝子レベルで保全されているかについて川分野でのDNA多型分析技術の積極的な導入が期待の検証が可能となる。

される。この技術を今後、河川のどのような場面で適－ 160 －リバーフロント研究所報告第18号

2007 年 9 月

３．DNA 多型分析技術活用のための現地調査 （２）対象種
３－１

DNA多型の分析方法

今回、調査対象としたウルマーシマ
トビケラは、日本列島の渓流等によく（１）調査地点
サンプリング調査は、2006 年 9 月 19 日から 10 月 24見られる水生昆虫である。宮城県中南日にかけて、宮城県中南部地域の位置する名取川水系、 部において最も分布範囲が大きく、ま七北田川水系等の 6 水系 73 地点にて実施した。このうた生態系ピラミッドにおいて魚類よりち、今回対象としたウルマーシマトビケラの生息が確も下層に位置することから、対象種と認されたのは、名取川水系 40 地点、七北田川水系 12して選定した。

地点、砂押川水系、増田川水系、川内沢川水系、五間ウルマーシマトビケラの幼虫は、石の下や礫間に分堀川水系各 1 地点の計 58 地点であり（図－ 2）、非生息

泌絹糸で作った荒い目の巣網を張って営巣し、巣網に地（n=15）は各水系の下流域に存在した。したがって、 かかる河川水中の粒状性有機物を摂食する造網型トビDNA多型分析は生息が確認された 58 地点を対象としケラに分類される。網は石の上面、特にコケ類の付着て行った。

した場所に多く、流れの速い場所に作られることが多6水系の中で最も流域面積が大きい名取川水系

い。1） 成虫の大きさは 8 ～ 15mmで、メスは産卵期に（=939km ）は、奥羽山脈を源として、丘陵地、仙台2）600 ～ 700 個程度の卵を産む。
羽化は春から秋にか平野を貫流して太平洋へ注ぐ水系である。流域面積がけて水面で行われる。１日あたりの羽化量が少なく、2 番目に大きい七北田川水系（=229km ）、も奥羽山脈羽化後も舞い上がらずに水面上を滑ってそのまま岸際22を源として太平洋へ注ぐ水系である。他の 4 水系は、 の茂み等に入り込むことが多い。1）ただし、成虫の飛標高が比較的低い丘陵を源としており、名取川水系や行距離に関する知見はないため、ウルマーシマトビケ

七北田水系に比べると規模が小さい。調査地域には 5ラの正確な行動範囲は明確でない。

つのダム（釜房、大倉、七北田、樽水、忽の関ダム）と一つの自然沼（サイカチ沼）がある。調査地点は、上流から下流にわたり、幅広い河川環境を有している。

生息地（n=58）
非生息地（n=15）
2

宮城県

318171633153436383942726432221

砂押川水系

2724472823374145

名取川水系
55544657

宮城県中南部 6 水系の調査地点－ 161 －

七北田川水系

51534958

図－ 22952505610km

111248441092032182514354061930315413

増田川水系
川内沢川水系
五間堀川水系

「自然をいかした川づくり」に関する研究報告析で調べた。

（３）サンプリング
サンプリングは平水時に行い、DNA多型分析の検出に十分な個体数（20 個体程度）を確保するために、 ３－２

分析結果同一地点において、キックネット法（メッシュサイズ： （１）遺伝的多様性250m）による定性的なサンプリングを繰り返し行っ全 1129 サンプルから計 135 遺伝子座が検出された。

た。採取したウルマーシマトビケラは 99.5％エタノー

このうち 65 が多型遺伝子座だった。平均ヘテロ接合

ルで保存し、実体顕微鏡（150x）を用いて同定を行っ度（He）の範囲は 0.111 － 0.287 で、全地点のHeの平均た。生物採取の他に、各地点の川幅、水深、流速、石値は 0.193（標準偏差＝ 0.049）だった。

礫等の環境変数についても調査を行った。

58 地点のHeの出現頻度分布を図－３に示した。Heの頻度分布は一様分布との適合性はなく（P＜ 0.01）、（４）AFLP分析

正規分布との適合性はあった（P＞ 0.05）。Heの頻度DNA分析はAFLP法にて実施した。AFLP分析は分布には 0.15 と 0.24 付近に２つのピークが見られた。

DNAを制限酵素で断片化し、その中から特定の断片をHeの出現頻度に基づいて、累積出現確率 20％、40％、選択的にPCR増幅して多型を検出する手法である。3） 60％、80％を境界として各地点のHeを、図－４に示
本調査では、合計 1129 個体の幼虫サンプルのAFLP分すように５段階の相対評価を行った。この評価基準で析を行った。地点当たりの平均サンプル数は19.5であっは次のように評価される。

た。既報の方法 に従って、各幼虫個体からDNAをフェ4）ノール抽出し、AFLP分析を行った。

○ 非常に低い：He＜ 0.136【0 － 20％】○ 低い

：0.136 ＜He＜ 0.171【20 － 40％】（５）データ解析○ 中程度：0.171 ＜He＜ 0.213【40 － 60％】

○ 高い

：0.213 ＜He＜ 0.244【60 － 80％】得られたフラグメント波形データを、各遺伝子座においてピークが検出された場合を１、されなかっ○ 非常に高い：0.244 ＜He【80 － 100％】た場合を 0 とした 0 － 1 データに変換した。全地点のまた、各地点の５段階評価の結果を地図上にプロッ個体をプールした集団の劣性遺伝子頻度が 0.05 － 0.95となる遺伝子座を多型遺伝子座としてデータ解析にトすると、図－５に示すようになる。

用いた。I番目の遺伝子座の劣性遺伝子頻度（qi）は、LynchとMilligan5）の方法により算出した。優性遺伝
子頻度（pi）は、pi＝１－qiより算出した。各地点の遺10

伝的多様性を評価するために平均ヘテロ接合度（He）9を、He＝（1/r）Σ 2piqiより算出した。ここで、r は8遺伝子座の総数を表す。Heは0より大きくなるにつれ、遺伝的多様性が増すことを示す。
また、地点間の遺伝的分化の大きさをθ 6）で評価7654した。θは地点間の遺伝的分化がまったく同じであ3る場合に 0 を示し、0 よりも大きいほど遺伝的分化が2大きいことを示す。θを連関測度とするUPGMAによるクラスター分析をPHYLIP3.6 ｂのneighborおよび100.10drawgramで行い、58 地点の遺伝系統樹を作成した。

0.12

図－ 3

作成された遺伝系統樹に基づいて、遺伝構造が類似す

0.140.160.180.200.220.240.260.280.300.32

各地点の平均へテロ接合度 He の頻度分布る地点をグループあるいは各グループ内のサブグループに分類した。
58 地点のHeの出現頻度分布について、一様分布おHe

よび正規分布との適合性をコルモゴロフ・スミルノフ

非常に低い検定でそれぞれ調べた。各地点のHeと 20 つの環境変数（標高、河口からの距離、緯度、経度、川幅、水深、流速等、石礫の平均粒径等）との相関関係を単相関分

0.136

図－ 4－ 162 －

0.171
低い

0.213
中程度

0.244
高い

非常に高い

平均へテロ接合度 He の頻度分布に基づく相対区分

リバーフロント研究所報告23181761916920252233343635262115321871430272428295250374149484544

非常に高い5147421123384310123940

2007 年 9 月

541331第18号

高い

53

中程度

554654

低い

5657

非常に低い

58

非生息地
図－ 5

平均へテロ接合度 He の地理的分布（２）遺伝的多様性と環境変数との相関
遺伝的多様性と環境変数との相関について、前に示した平均ヘテロ接合度（He）を用いて検証を行った結表－ 1

果を表－１及び図－６（一例としてpHとの相関）に示

環境変数

単位相関係数す。これらを見ると、Heと相関が見られるのは、「緯平均ヘテロ接合度 He と環境変数との相関

平均川幅m-0.028度」、「経度」、「標高」、「河口からの距離」、「付着藻類平均水深cm0.006量」、
「pH」、
「SS」、
「微細粒状性有機物」、「クロロフィ

平均流速cm/s

0.172

cm0.194

有意な相関は見られなかった。

rad0.291

平均ヘテロ接合度 Heルa濃度」の 9 変数であった。その他の変数について、 礫平均粒径
緯度

有意確率

*経度

rad-0.313*

標高m0.358**

Stream order--0.1040.35

河口からの距離
付着藻類量km
Chla mg/cm2

0.390-0.3010.30

FBOM

g AFDM/cm2-0.232

電気伝導度μs/m-0.144

0.25

pH

0.20
0.15

無相関の検定0.10* :5% **:1%
0.05
0.00
6.50

7.00

y = -0.0721x + 0.7211
R2 = 0.1742

7.50

8.00

**

BODmg/L-0.211

SSmg/L-0.265*

FPOMmg AFDM/L-0.261*

クロロフィルamg/L-0.301*

TINmg/L-0.204

PO4-Pmg/L-0.203

堆積土砂平均粒径 mm8.50

pH

図－ 6-0.419***

平均ヘテロ接合度 He と pH との相関（一例）－ 163 －

◆凡例（相関の検定）*: 5%有意水準** : 1%有意水準0.216

「自然をいかした川づくり」に関する研究報告

図－８に各グループおよびサブグループの地理的（３）遺伝的分化
地点間のθは、0.004 ～ 0.405（平均＝ 0.105）の範囲分布を示した。グループＡの生息地の標高は 270 ～で測定された。θに基づいて作成した遺伝的系統樹を590mであり、グループＢは 2 ～ 350mであり、グルー

図－７に示す。θ＞ 0.25 を境界として各地点を遺伝的プＡとＢの分布は、標高 270 ～ 350mを境界として地に区分すると、宮城県中部のウルマーシマトビケラ地理的に明瞭に分かれていた（図－９）。サブグループB域集団は3つの遺伝的グループ（図－７のＡ～Ｃグルー－ 1 はグループbの中の上流側に、サブグループB－ 2プ）に分かれる。

は下流側に分かれた。グループＣは、自然湖（サイカ

グループ内を細かく見ると、グループＡとＢの中にチ沼）に流入する短い小河川の源流端（St.61）と河川は遺伝構造が特に類似したサブグループ（A－1，B－1， の大部分が灌漑水路化された影響で生息域が源流のみ
B－ 2）が存在し、階層的な遺伝構造が形成されていた。 に残された小河川の源流端（St.6）の 2 地点であった。
グループＡ（n=14）は、11 地点のサブグループA－

図－ 10 にサブグループごとに各地点の平均ヘテロ1 とそれ以外の 3 地点で構成されていた。また、グルー接合度（He）を示した。サブグループA－ 1 およびサプＢ（n=42）は、11 地点のサブグループB－ 1 と 30 地

ブグループB－ 1 のHeの各平均値は、グループＡその点のサブグループB－ 2 とそれ以外の 1 地点（St.44）で他（サブグループA－ 1 以外の 3 地点）、サブグループ構成されていた。グループＣはSt.1 とSt.58 の 2 地点でB－ 2、グループＣのそれよりも有意に高かった。

構成される小グループであった。
0.3



0.2

0.1

52
2647
729328
83446
54
555
48
49
56
2737571136
222353504538951
102543412021
611233141544
42
35
30
32
13240
16
4
171939
31
1858
24

0

サブグループA-1
グループC

サブグループB-1グループA

図－ 7

サブグループB-2
グループB

地点間のθに基づいた遺伝系統樹（数字は図－ 1 に示した地点番号）

グループＡ
グループＡ

グループＢ
グループＢ10km
ダム湖

自然湖

グループA
サブグループA-1 (n=11)
グループAその他(n=3)

グループB
サブグループB-1 (n=11)
サブグループB-2 (n=30)

グループＣ
グループＣ

グループBその他 (n=1)

グループC (n=2)
図－ 8

宮城県中南部 6 水系における遺伝的グループの地理的分布－ 164 －

リバーフロント研究所報告第18号

2007 年 9 月

0.3

600

4000.2350m
He

標高(m)

500

300280m

2000.11000

グループ A

図－ 9グループ B

グループ C0

遺伝グループごとの標高との関係

A-1

図－ 10４．まとめ

B-1

B-2

サブグループごとの平均ヘテロ接合度

今回は、ウルマーシマトビケラを対象として、名取① DNA多型分析技術の適用事例の広報と有効性の周知

川水系等の 6 水系において大規模なDNA分析を行っ

河川分野におけるDNA多型分析技術の適用事例をた。これにより得られた成果は以下のとおりである。

目的や手法、効果等の観点から整理し、その有効性を● 名 取川水系を中心とする 6 水系において、多数河川実務者へ広く周知していくことが重要と考える。のヘテロ接合度（He）を測定し、標本数が大き【DNA多型分析適用事例整理の観点】

いHeの統計分布に基づいて、各地点の遺伝的多● DNA適用目的様性を相対的に 5 段階で評価するHeの基準を提● 対象生物種案した。

● 分析手法● 平 均ヘテロ接合度（He）は標高、緯度と有意な● 対象フィールド

正の相関があり、経度と負の相関があった。

● 得られた知見● 宮 城県中南部のウルマーシマトビケラの地域集② 河川水辺の国勢調査等と連携させた環境評価の検討

団は、3 つの遺伝的グループに分けられた。各グ

既往の河川水辺の国勢調査結果（生物標本）を用い

ループは水系ごとに分かれるのではなく、複数た生物の遺伝的多様性の変化を把握するとともに、遺の水系に跨って分布しており、本分析による遺伝的多様性を評価するための指標とすべき対象種の選伝構造の近似性を考慮すると、河川に沿って移定方法や、生息環境に応じた適切な評価方法（定量的動するだけでなく、他の河川間も飛行して移動評価及び遺伝的多様性）を検討していく。さらに、生している可能性が高いと推測される。

息場の類型化を行い、遺伝的多様性との相関について検証し、河川管理の実務上の目安となるような定量的５．課題と今後の展開判断基準を検討していく必要があると考える。

今後、河川環境へDNA多型分析技術を適用してい③ 遺伝的多様性を表す指標（He）の精度向上

くに当たり、今回の成果をもとに更なる検討が必要で一般に個体数や生息域が限られて絶滅に瀕した野生あると考える。また、地先での生息環境の評価におい集団の遺伝的多様性は小さい。7） 絶滅に瀕した野生生て、既往の定量調査とDNA多型を組み合わせること物のHeをAFLPマーカーで調査した過去の研究におによる多角的な評価も有効的であると考える。

いて、オヤマノエンドウの一種のHeは 0.145 ～ 0.189 8）

DNA多型分析技術を河川環境へ適用するに当たっての課題と今後の展開について、以下に述べる。

であり、貝類ミズシタダミ科の一種のHeは 0.166 ～0.242 9）と報告されている。
本研究で測定したウルマーシマトビケラのHeの範囲 0.111 ～ 0.287 は、これらの絶滅危惧種のHeの下限値（0.145，0.166）よりもさらに低い範囲を含んでおり、－ 165 －

「自然をいかした川づくり」に関する研究報告

今回のHeが特に低かった地点は、絶滅危惧種よりもValvatidae）at amall and large spatial scales.

Heのレベルが低かったことになる。ただし、DNA塩

Freshwater Biology，51，pp.2362 － 2375，2006.

基配列が異なる種間での値を一概に比較できないた
め、今回の調査で特にHeが低かった地点でのウルマーシマトビケラが局地的絶滅に瀕していると単純に考えることはできない。今後は、シマトビケラ属あるいはシマトビケラ科の近縁種に対しても同様の調査を行い、その的確性を検証していく必要があると考える。
【謝辞】本研究は、東北大学大学院工学研究科大村達夫教授、渡辺幸三氏の研究成果に基づいて作成したものである。ここに記して謝意を表します。
＜参考文献＞
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