Identification of metallopeptidases from germ cell conditioned
medium using pH gradient 2-D electrophoresis and ECL
immunodetection
二 次 元 電 気 泳 動 お よ び ECL Western Blotting を 用 い た 培 養 生 殖 細 胞 上 清 か ら の
metallopeptidaseの同定
本報では、精細胞由来のタンパク質をサンプルとして二次元電気泳動を行い、その後ECLによるウェスタンブロッティングによって特定のタンパク質スポットを同定した二次元ウェスタンブロッティングをご紹介します。二次元電気泳動後、実験方法
培養生殖細胞からの培養上清の調製
PineauSD

5

メンブレンにタンパク質を転写し、metallopeptidaseに対するGCCM抗体を用いてウェスタンブロッティングを行いました。これ
らの解析によって、 N-arginine dibasic convertase、 amino-一次元目電気泳動：等電点電気泳動

peptidase B、thimet oligopeptidaseを含む既知の生殖細胞由来

GCCM

metallopeptidaseを同定することができました。

50 µg

8M

400 µl

0.5 % Triton X-100 0.2 % DTT

0.5 %(v/v) Pharmalyte 3-10 Orange G

はじめに

Immobiline DryStrip 3-10 NL 18 cm)

101 4

MultiTemp III

EPS 3500XL

Multiphor II

1

二次元目電気泳動：SDS-PAGE

ECL
GCCM

N-arginine dibasic (NRD) convertase (narlysin, EC 3.4.24.61)
aminopeptidase B (ApB, EC 3.4.11.6) thimet oligopeptidase(TOP, EC 3.4.24.15)

Immobiline DryStrip 6M

2 % SDS 10 %0.5 % DTT 50 mM Tris-HC（pH 6.8）
102% SDS

DryStrip
10%6M

4.5%50 mM Tris-HCl(pH 6.8)

10SDS-PAGE
XL 12-14

ExcelGel SDS Gradient
ECL Western Blotting
1Molecular Weight Marker

使用した製品

表7-1．電気泳動条件

Step
IEF
123SDS-PAGE
123― 54 ―

Voltage(V)

Current
(mA)

Power
(W)

500
500
3,500

11
155
55h
5h
9.5 h

1,000
1,000
1,000

20
40
40

40
40
4045 min
5 min
2 h 40 min

Timem(kDa)
90 –
80 –
70 –
60 –
50 –
40 –
30 –

20 –
15 –

3.6

4.4

5.2
5.6
6.0
pH (non-linear)

6.4 7.0 8.0

図7-1．銀染色を行ったGCCMの二次元電気泳動

GCCMから回収したタンパク質 50 µgをIPG DryStrip 3-10NL（一次元目電気泳動）およびExcelGel SDS gradient 12-14%（二次元目電気泳動）により二次元電気泳動を行いました。GC特異的に発現している

metallopeptidaseのウェスタンブロッティング検出にはECLを用いました。

銀染色と金コロイド染色

図7-2．ECLウェスタンブロッティング（A）ならびに金コロイド染色（B）を用いて検出したGCCM中のthimet oligopeptidaseのスポット

6PVDF

実験は図7-1と同様の方法で行い、ウェスタンブロッティングによって検AuroDye Forte Kit

出されたタンパク質のスポットを長方形の枠で囲っています。Standard
Spot Number 7210のタンパク質スポットは以前にN末端アミノ酸シークエンシングによってtesticular phoshatidylethanolamine binding proteinと同定されたタンパク質のフラグメントです。右側のレーンには ECL
Western Blotting Molecular Weight Markerを泳動しています。サイズは上から、97,400、68,000、46,000、31,000、20,100、14,400 Daになタンパク質のメンブレンへの転写
PVDFNovablot

1 cm2ります。

0.8 mA 1

ECLを用いたWestern blotting

0.1%(v/v) Tween 20 /TBSECL

deglycosylated
SDS-PAGE

1% BSA
0.1%(v/v) Tween 20 / TBS1

1D
1/8,000
3% BSA2

deglycosylated

TBS 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) 150 mM NaCl

HRP

1/3,000

1ECL

Hyperfilm4

表7-2．ECLウェスタンブロッティングにより検出されたmetallopeptidaseの特性

タンパク質

Standard Spot Numberm（kDa）

pI

thimet oligopeptidase

4907-4913-5915-5916-591774.4-75.2

5.46-5.59

NRD convertase3402-3405-3417-3418-3422-3423-4402

23.5-25.4

5.05-5.31

aminopeptidase B

1004-1008-1010-1109

11.3-11.9

4.60-4.62― 55 ―

121

thimet oligopeptidase
ECLECL23

ECL Western Blotting Molecular Weight Marker
図7-3．ストリッピングによるウェスタンブロッティングのシグナルの影響

NRD convertaseをウェスタンブロッティングにより検出しました。一次抗体には抗NRD convertase抗体、二次抗体にはHRP標識抗ウサギ抗体を用いました（A）。メンブレンを本文中の方法によってストリッピングし、thimet oligopeptidaseのウェスタンブロッティング検出を行った後に再度。
メンブレンをストリッピングし、NRD convertaseの検出を行いました（B）

結論ECL
metallopeptidase

リプロービング

100 mM/2%(w/v) SDS / 62.5 mM Tris-HCl(pH 6.7)50300.1 %(v/v) Tween 20 / TBSdeglycosylated
mM NaCl

1023% BSA

TBS 50mM Tris-HCl (pH 7.6) 150

参考文献
1. Boitani, C. et al., Cell Differentiation 9, 41-49 (1980).
2. Kramer, J. M. and Erickson, R. P., J. Reprod. Fert. 64, 139-144(1982).

1

3. Jutte, N. H. P. M. et al., J. Exp. Zool. 233, 285-290 (1985).
4. O' Brien, D. A., Biol. Reprod. 37, 147-157 (1987).

結果と考察
GCCM

metallopeptidase

ECL

5. Pineau, C. et al., J. Androl. 14, 87-98 (1993).
6. Heukeshoven, J. and Dernick, R., Electrophoresis 9, 28-32 (1988).

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