Scaffold DIA マニュアル
1.

はじめに .............................................................................................................. 4

1-1. Scaffold DIA とは ............................................................................................................................. 4
1-2. インストール・ライセンシングについて ....................................................................................................... 5
1-3. 本資料の構成について ........................................................................................................................... 5

2. データの準備 ............................................................................................................ 6
2-1. 取り込むデータの種類 ............................................................................................................................ 6
2-2. DIA と DDA の比較 .............................................................................................................................. 6
2-3. Scaffold DIA ワークフロー ................................................................................................................ 7
2-4. Scaffold DIA データ処理の流れ ......................................................................................................... 9

3. データの取り込み .................................................................................................... 13
3-1. 取り込み可能な raw ファイルのフォーマット ........................................................................................... 13
3-2. コマンドラインでの利用 ........................................................................................................................ 13
3-3. ライブラリマネージャー ........................................................................................................................ 14
3-4. 解析の開始とワークフローダイアログ ..................................................................................................... 16
3-4-1. ワークフローダイアログの Search タブ......................................................................................... 17
3-4-2. ワークフローダイアログの Analysis タブ ..................................................................................... 24
3-4-3. ワークフローダイアログの Advanced タブ .................................................................................. 25

4.

Main 画面 .......................................................................................................... 26

4-1. Scaffod DIA メイン画面について ..................................................................................................... 26
4-3. ツールバー（アイコン）.......................................................................................................................... 30
4-4. 表示タンパク質のフィルターリング......................................................................................................... 31
4-5. 各画面への切り替え ........................................................................................................................... 32
4-6. FDR 計算値表示 ............................................................................................................................... 32
4-7. Summarization .............................................................................................................................. 33

5.

Organize 画面 ................................................................................................... 34

5-1. Organize パネルについて ................................................................................................................. 34
5-2. Organize パネルの画面と設定箇所 .................................................................................................... 34
5-3. Category, Attribute の定義設定 ................................................................................................... 35
5-4. Sample ファイルと Attribute の関係性を設定・確認する表 ................................................................ 38
5-5. Import Attributes File / Export Attributes File ....................................................................... 41
5-6. 選択可能な 3 種類の Experimental Design について ........................................................................ 41
5-7. Experimental Design の設定 ........................................................................................................ 43
5-7-1. Sample Hierarchy タブ........................................................................................................... 44
5-7-2. Statistical Analysis タブ........................................................................................................ 48©2023 Scaffold DIA マニュアル

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1

6.

Samples 画面 .................................................................................................... 50

6-1. Samples 画面について ...................................................................................................................... 50
6-2. Samples Table （Fig6-1 の[1]） .................................................................................................... 50
6-3. Display Type バー （Fig6-1 の②） .................................................................................................. 52
6-4. 「Summarization」と定量値 ............................................................................................................. 54
6-5. 定量値データのまとめられ方 ............................................................................................................... 56

7. Proteins 画面 ...................................................................................................... 58
7-1. Proteins 画面について...................................................................................................................... 58
7-2. ペプチドフィルターリング (Fig.7-1 [1]) ............................................................................................ 59
7-3. ペプチド情報 (Fig.7-1 [2]) ............................................................................................................. 59
7-4. ペプチド – Query マッチ情報 (Fig.7-1 [3]) .................................................................................... 61
7-5. Visualization 情報 (Fig.7-1 [4]).................................................................................................. 61
7-5-1. Protein Sequence タブ .......................................................................................................... 62
7-5-2. Protein Level Chart タブ ....................................................................................................... 63
7-5-3. Statistics タブ ........................................................................................................................ 64
7-5-4. Protein Intensities タブ ........................................................................................................ 64
7-5-5. Fragment Intensities タブ .................................................................................................... 65
7-5-6. Chromatograms タブ ............................................................................................................. 65
7-5-7. Fragmentation table タブ ..................................................................................................... 66
7-6. Similar Proteins タブ .................................................................................................................... 67

8. Visualize 画面 .................................................................................................... 68
8-1. Visualize 画面について .................................................................................................................... 68
8-2. Quantitation タブ .......................................................................................................................... 69
8-2-1. Protein Sequence ................................................................................................................. 70
8-2-2. Quantitative Scatterplot ...................................................................................................... 71
8-2-3. Quantitative Trend Chart & CVs ........................................................................................ 72
8-2-4. GO Term Pie Chart, GO Connections Graph ..................................................................... 73
8-3. Principal Component Analysis タブ ........................................................................................... 74
8-3-1. Overview ................................................................................................................................. 75
8-3-2. Scree Plot .............................................................................................................................. 75
8-3-3. Scores Plot ............................................................................................................................ 76
8-3-4. Loading Plot........................................................................................................................... 76
8-4. Heatmap タブ................................................................................................................................. 77
8-4-1. Heatmap Landscape pane ................................................................................................... 77
8-4-2. Heatmap Details pane.......................................................................................................... 78

9. Analysis 画面...................................................................................................... 79
9-1. Analysis 画面のグラフについて.......................................................................................................... 79©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved210. Publish 画面 ..................................................................................................... 80
10-1. Publish 画面について .................................................................................................................... 80
10-2. Experiment Methods タブ .......................................................................................................... 81
10-3. SQL Report タブ .......................................................................................................................... 83

11.定量の手法と検定機能 ............................................................................................ 84
11-1. 定量の手法について .......................................................................................................................... 84
11-1-1. Peptide Counting ................................................................................................................. 84
11-1-2. ラベルフリー定量 ....................................................................................................................... 84
11-2. 検定 ................................................................................................................................................ 86
11-2-1. Basic Design で実施可能な検定 .............................................................................................. 86
11-2-2. Repeated Measures で実施可能な検定.................................................................................. 87
11-2-3. Two-way で実施可能な検定 ..................................................................................................... 87
11-3. 多重検定補正 ................................................................................................................................... 88

12. タンパク質のグループ化、クラスター化 ..................................................................... 89
12-1. 同定タンパク質のグループ化、クラスター化 .......................................................................................... 89

13. Report ............................................................................................................... 91
13-1. Scaffold DIA で出力可能なファイルについて.................................................................................... 91

14. Prosit との連携によるライブラリフリーサーチ .......................................................... 93
14-1. Proteome Software 社が公開している DLIB ファイルを利用する .................................................... 93
14-2. FASTA ファイルを元に Prosit を利用して DLIB ファイルを作成 .......................................................... 95
14-2-1. FASTA ファイルを取得する(例:Uniprot サイト) .......................................................................... 95
14-2-2. Scaffold DIA で Prosit 用のインプットファイルを作成する ...................................................... 100
14-2-3. Prosit 公開サイトにてペプチド配列情報から計算を行う ............................................................... 101
14-2-4. Scaffold DIA で Prosit 出力ファイルと FASTA ファイルから DLIB ファイルを作成する ............. 105
14-3. DLIB 並びに FASTA ファイルを Scaffold DIA にセットする方法 ..................................................... 106

15. Gene Ontology .............................................................................................. 108
15-1. Gene Ontology ファイルを Scaffold DIA にセットする方法 ......................................................... 108
15-2. Scaffold DIA の各タンパク質に Gene Ontology 情報を表示させる方法 ........................................ 110
15-2-1. 表示する GO 項目を選択する .................................................................................................... 110
15-2-2. タンパク質と GO 情報との紐づけを行う ..................................................................................... 112

16. デモデータと追加情報のご案内 .............................................................................. 114
16-1. デモデータについて ......................................................................................................................... 114
16-2. Appendix について ....................................................................................................................... 114
16-3. EncyclopeDIA について .............................................................................................................. 115©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved31. はじめに1-1. Scaffold DIA とは
Scaffold DIA は、DIA 定性/定量プロテオミクス解析において、RAW データ読み込みから解析、結果表示までの一連作業がワンパッケージで行えるソフトウェアです。Scaffold DIA の機能に ついて、以下の4 つ(5 つ)のキーワードで説明いたします。
・Identify
・Organize,Summarize
・Quantify
・Visualize■Identify
事前に作成した DDA ピークリストデータのライブラリと比較して DIA データからタンパク質を同定する事ができます。また FASTA 配列から作成された仮想ピークパターンに対して検索を行う事もできます。
同定ペプチド・タンパク質は FDR を基に再評価されるほか、同定タンパク質はシェアペプチドの状況によりグループ化やクラスタリングが行われます。
■Organize と Summarize
取り込んだデータに対して属性グループを定め、属性値を付与する事ができます。定められた属性を基に定量値や検定結果をまとめる事ができます。
■Quantify
各ペプチドの代表的なイオンフラグメントに基づいて行われます。サンプル間の正規化が行われ、各ペプチドの定量値が合計されてタンパク質の定量値が算出されます。定量値に基づいて様々な検定・統計解析を実施する事ができます。
■Visualize
表示するタンパク質はフィルター機能などで調整可能です。タンパク質のリストには、Gene Ontology の情報を併記することができます。検定・統計解析を行った結果を表示する各種方法に対応しています。
定められた属性ごとに計算される定量値は、選択肢を変更する事でインタラクティブに表示内容を変更する事ができます。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved41-2. インストール・ライセンシングについて
イ ン ス ト ー ル 並 び に ラ イ セ ン シ ン グ に つ い て は 、 別 資 料 「 ScaffoldDIA イ ン ス ト ー ル 手 順 .pdf 」 をご覧ください。インストール DVD 内にも含まれています。
https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/scaffold/ScaffoldDIA_install.pdf

1-3. 本資料の構成について
本資料では Scaffold DIA の基本的な使い方について説明しています。
2,3 章では 解析対象のデータとその取り込みについて、4 章では ソフトウェア画面のメニューや全体像の説明、
5 章～10 章では画面左側にあるパネルの切り替えで表示させる各画面の説明、11 章では使用可能な検定と Significant Level の設定、12 章ではタンパク質のグループ化に関する設定、13 章では出力可能な report、14 章ではライブラリフリーサーチ作成の手順、15 章では Gene Ontology について、16 章ではデモデータや参考資料などその他の情報について、それぞれご紹介しています。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved52. データの準備
この章では Scaffold DIA に取り込む測定データの特徴について説明しています。

2-1. 取り込むデータの種類
これから DIA 測定を始める方に対して解析のヒントを記した資料が「Designing a DIA Method」
https://www.proteomesoftware.com/documentation/scaffold_dia_ms_methods/です。ご興味がございましたらご参照ください。

2-2. DIA と DDA の比較
DDA ワークフローの場合、再現性とカバレージを両立させようとすると測定しなければならない
データ数が膨大となります（Fig.2-1）。DIA は測定の数を減らしながらカバレージを落とさず網羅的に解析ができる、バランスの良い測定手法と言えます(次頁 Fig.2-2)。

Fig.2-1 DDA 解析におけるデータ収集©2023 Scaffold DIA マニュアル

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6Fig.2-2 DIA 解析におけるデータ収集

2-3. Scaffold DIA ワークフロー
Scaffold DIA は DIA データ内とライブラリにおけるフラグメントパターンを比較する事で、ペプチド/タンパク質の同定と定量を同時に行います。

Fig.2-3 Scaffold DIA のワークフロー©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved7検索時に参照する「ライブラリ」については、主に以下の 4 つの方法に対応しています。
-

FASTA ファイルを使う方法
FASTA フォーマットのタンパク質配列ファイルを使って解析できます。ピーク強度情報は予測
しません。

-

Prosit ライブラリを使う方法（DLIB を使う方法）
FASTA フォー マ ット のタ ン パ ク 質配 列 情 報 から 、 プログラ ム ”Prosit”を 介し て作成 され た
スペクトルライブラリに対して検索が可能です。ファイル拡張子は .dlib です。ライブラリは、Proteome Software 社サイト
https://support.proteomesoftware.com/hc/en-us/articles/360035151172-PrositDerived-Spectral-Libraries-for-Scaffold-DIA-Searchesから取得できるほか、ご自身で FASTA ファイル元に Prosit のサイト
https://www.proteomicsdb.org/prosit/で作成し得られたファイル（拡張子が .csv または .spectronaut）を使用する事もできます。
ライブラリ作成について詳しい手順を 14 章(P.94～)にまとめたので、作成の際はそちらをご参照
ください。

-

BLIB を使う方法 (Skyline または Scaffold 5 経由)
DDA 解析時に得られたピークリストライブラリです。ソフトウェア Skyline や Scaffold 5 上で作成できます。Skyline などの他ソフトウェアから得た iRTDB ファイルも併せて取り込む事ができ、RT のアライメントに利用する事ができます。blib 以外に、dlib, traML,MSP,SPTXT といった
フォーマットにも対応しています。

-

ELIB を使う方法
Scaffold DIA が作成したクロマトグラムのライブラリで、BLIB,DLIB や FASTA を使った解析の結果得られた 、ピークと RT な ども含むクロマトグラム情報 が組み合わさったエントリーのライブラリです（Fig.2-4）。

⚫ ELIB と DLIB は同じフォーマットで実質中身が同じであり、相互互換があります。Scaffold の
ELIB 用/DLIB 用オプションはどちらも利用可能です

Fig.2-4 ELIB 作成例
一方 Scaffold DIA では pool のサンプルと個別のサンプルを組み合わせた解析法にも対応しています。
例えば pool されたサンプルを FASTA や BLIB(DDA 由来のピークライブラリ)に対して検索を行い その結果から ELIB を作成し、個々の DIA データをその ELIB に対して検索させることができます(Fig.2-5、次頁図)。
Scaffold DIA では様々な解析方法に対応しています。データ取り込みについては「3 章データ取り込み」
にて詳しく説明しています。
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8Fig.2-5 個別の DIA データと pooled データを組み合わせた解析

2-4. Scaffold DIA データ処理の流れ
データ処理の流れを図示したのが、次頁図「Fig.2-6 Scaffold DIA データ処理の流れ」です。Scaffold
DIA では raw データの変換に、外部プログラムの 「ProteoWizard」 を利用しています。その後、 読み
込 ん だ デ ー タ を 解 析 に 中 心 的 な 役 割 を 果 た す の が 「 EncyclopeDIA 」 と い う プ ロ グ ラ ム で す 。
https://bitbucket.org/searleb/encyclopedia/wiki/Homeペプチドの特定とスコアリング、保持時間のアライメント、Percolator によるスコアリング結果の再評価、ペプチド同定の決定とタンパク質同定、各種計算結果のサンプル横断的な補正、定量、といった処理がEncyclopeDIA 上で行われます。EncyclopeDIA はワシントン大学の MacCoss 教授の研究室（旧所属）でProteome Software 社の製品開発担当者 Brian Searle が作成・公開しているプログラムです。
次々項以降に、以下の処理・計算について詳しく説明しています。
-

RAW ファイルの変換-

ペプチドの同定-

Decoy データの作成方法-

ペプチドのスコアリング-

保持時間のアライメント-

ペプチドの定量©2023 Scaffold DIA マニュアル

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9FASTADIA Data

DIA Data

DIA Data

file1

file2

・・・

fileN

MSConvert

MSConvert

・・・

MSConvert

ペプチドの

ペプチドの

スコアリング

スコアリング

RT

RT

BLIB

ProteoWizard

ELIB
DLIB

Library

アライメントアライメントペプチドの・・・

スコアリングRT・・・

アライメントPercolator

ペプチド同定ELIB

FASTA

タンパク質同定

アライメントのサンプル横断化
Transition の自動修正
ペプチド定量EncyclopeDIA

タンパク質同定の調整

Scaffold DIA

視覚化

SDIA
file
Fig.2-6 Scaffold DIA データ処理の流れ©2023 Scaffold DIA マニュアル

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10■ RAW ファイルの変換
Scaffold DIA では raw データの変換に、 ProteoWizard で提供されている「MSConvert」を利用しています。Scaffold DIA で対応する RAW データは、MSConvert の対応に依存します。
MSConvert では raw データを共通 XML フォーマットである「mzML」フォーマットに変換します。
変換時の一時ファイルはソフトウェア内で「Processing directory」として定義されたフォルダに保存されます。使用後は基本的にファイルを削除しますが、もしデータを残すよう指定していた
場合、データは削除されず残ります。
■ ペプチドの同定
ペプチドの同定などにはプログラム「EncyclopeDIA」 が使われています。同定に際し測定
データとライブラリーデータとの比較が行われます。ライブラリ ーデータには前述のように幾つかのバリエーションがあります。
・BLIB: DDA 測定データのピークリストライブラリ : Skyline や Scaffold から出力・FASTA : タンパク質のアミノ酸配列情報から単純なピークパターンを計算
・Prosit Library:アミノ酸配列情報から計算された理論ピークリスト。RT や強度情報を含む
・ELIB: Scaffold DIA で検索された過去の解析データ。RT や強度情報を含む■ Decoy データの作成方法
EncyclopeDIA の中で Percolator の計算を行う際、decoy データベースを使用します。decoyの配列は末端を固定して target エントリーのペプチドを逆向きにする事で作成します。ピークについては逆向きにした配列が来るべきフラグメントピークの位置に合うように m/z をシフトし、強度についてはそのまま利用します。
■ ペプチドのスコアリング
EncyclopeDIA に よ っ て 計 算 さ れ る 主 要 な ス コ ア 、 [primary peptide score] は 、 純 粋 に
プレカーサー分離ウィンドウ内の実測ピークとライブラリ内のピークとのマッチングから評価します。DIA では共溶出ペプチドの存在が当たり前である事を踏まえ、マッチしなかったイオンに関してペナルティを与えていません。１つのウィンドウ内で複数のペプチドフラグメントピークとのマッチを評価します。[primary peptide score] は X!Tandem の HyperScore と概念が似ていて、測定したスペクトルとライブラリのスペクトルにおけるフラグメントの強度の加重ドット 積に、
マ ッ チ し た イ オ ン の 数 の 階 乗 を か け た も の で す 。 そ の ほ か 関 連 ス コ ア と し て デ ル タ CN や
フラグメントイオンの精度、プレカーサーマスの精度、保持時間精度などを評価したスコアも計算されます。

[次頁に続きます]©2023 Scaffold DIA マニュアル

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11

■ 保持時間のアライメント
EncyclopeDIA では同定されたペプチドすべてについて、x 軸がライブラリ内にある保持時間、y 軸が測定値の保持時間のプロットを取ります(Fig.2-7)。続いてカーネル密度推定(ヒストグラムから計算された曲線)により 1000x1000 グリッドデータに補正され線が引かれます。サンプル間にわたりアライメントの調整が行われる段階では、構成要素のペプチド数が最も多いサンプルをリファレンスサンプルと定め、そのリファレンス内のペプチドを基準に他のサンプルのペプチドの保持時間を調整します。保持時間のずれが大きく異常値と判定された各サンプルのペプチドについてはマッチの再評価が試みられます。

Fig.2-7 RT Alignment■ ペプチド定量
ペプチドの定量はフラグメントのピーク強度のみを定量値として利用しており、プリカーサーピークの強度の値は使っていません。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved123. データの取り込み
この章では Scaffold DIA でのデータ取り込みについて説明いたします。

3-1. 取り込み可能な raw ファイルのフォーマット
Scaffold DIA では データ取り込みの際、ProteoWizard で提供されているプログラム「msconvert.exe」を利用しており、取り込み可能な raw ファイルのフォーマットもそのプログラムの対応に準じます。読み込み可能なファイルをまとめたのが以下の表です（Tab.3-1 Scaffold DIA で取り込み可能なファイルフォーマット）。例として挙げたメーカーのファイル読み込みについてはよく確認していますが、それ以外のメーカーでも raw データの読み込みが可能である他、 mzML に変換されたデータについても基本的に読み込みが可能です。

各社メーカーのファイルフォーマット [読み込みなどがよく確認されているもの]
装置メーカー

ファイルフォーマット

AB/SCIEX*.wiff (.wiff.scan も同じフォルダに置く事)

Agilent*.d (ディレクトリ)

Thermofisher scientific*.raw

オープンフォーマット (原理的には mzML フォーマットになっていればデータの読み込みが可能)
HUPO Proteomics Standards Initiative mzML*.mzMLTab.3-1 Scaffold DIA で取り込み可能なファイルフォーマット

3-2. コマンドラインでの利用
Scaffold DIA では、サーバーでの利用や自動化処理を目的として、コマンドラインでも利用できます。
実行時にワークフローの定義を行っているファイルと raw ファイルを読み込みます。コマンドラインのインターフェースを利用する場合、「ScaffoldDIABatch.exe」プログラムを利用します。「-help」で使い方に関する説明文が現れます。また以下の HELP サイトを利用すると実行したい内容を引数として指定するにはどうするか、より簡単に理解できます。
https://www.proteomesoftware.com/annotated-scafml
ご不明な点はサポートへお問い合わせください。

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133-3. ライブラリマネージャー
検索を行う際に使用するライブラリについて、ダウンロード・ライブラリ作成と管理・選択を行うのがライブラリマネージャーです。ライブラリマネージャーを通じて検索時に複数のライブラリを選択したり、
FASTA ファイルとの紐づけを予め指定したりすることも可能です。

Fig.3-1 ライブラリマネージャー

ダイアログ

ライブラリマネージャーは以下の 3 つの操作のいずれかで起動できます。
- 「File」メニューから「Open Library manager」を選択- ツールバーの「ライブラリマネージャー」アイコン

をクリック- 「Workflow」ダイアログの「reference file」選択ボックスで「Choose...」をクリックすると表示されるドロップダウンから「Library manager」を選択
画面下の各ボタンについて、以降より詳しく説明します。
“Add Library”
新たにライブラリを追加します。ボタンを押すとファイル選択ダイアログが現れます。ライブラリファイル(FASTA 以外)を選択して Scaffold DIA に取り込みますが、この段階では対応する FASTA ファイルとの紐づけが行われていません。紐づけを行うには、ライブラリを選択して右クリックし、「Associate with
FASTA」を選択して、対応する FASTA ファイルを選んでください(次頁 Fig3-2)。紐づけを行う事で、ライブラリ検索におけるペプチドとタンパク質の連結が行われ、タンパク質全長の配列や分子量の情報を取得できるようになります。

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Fig.3-2 ライブラリマネージャー

ライブラリと FASTA の紐づけ操作“Remove Library”
作成したライブラリを Library Manager から削除します。
“Create Library”
検索を行いその結果を DIA の検索結果ライブラリ(ELIB)として保存する事ができます。検索後作成されたライブラリは自動的に Library Manager に、対応する FASTA ファイル情報と共に登録されます。
“Download”
Proteome Software 社が作成した、Prosit 由来のピークリストファイルをダウンロードしセットする事ができます。ボタンを押すと Fig3-3 のようなダイアログが現れます。①で生物種を選ぶと、データベースの詳細情報と共に URL が③に自動的に入力されます(次頁 Fig.3-4)。④でファイルダウンロード先並びにダウンロード後のファイル名を選択すると”Download”ボタンを押すことができるようになります。この時、ライブラリに対応する FASTA ファイルも同時に取得します。

Fig.3-3 ライブラリマネージャー©2023 Scaffold DIA マニュアル“Download”ダイアログ

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Fig.3-4 ライブラリマネージャー “Download”ダイアログ

ライブラリの詳細情報

3-4. 解析の開始とワークフローダイアログ
新しく解析を始めるには、ソフトウェアを起動後以下のどちらかの操作を行います。
-

メニューの File -> New-

Ctrl + N-

メニューバー下にあるアイコンをクリック

新しいファイルが作成されると最初に現れるのが「ワークフローダイアログ」です(Fig.3-5)。ダイアログのタイトル欄には「Load Data」と表示されています。

Fig.3-5 ワークフローダイアログ©2023 Scaffold DIA マニュアル

初期表示画面

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ワークフローダイアログでは検索実行に必要な各種パラメータを設定します。パラメータの多くはデフォルト値が定められていますが一部パラメータはユーザーが指定する必要があります。ユーザーが指定しなければならないパラメータが残っている項目については、▲で警告が表示されています。
ワークフローダイアログは以下３つのタブから構成されています。
1. Search タブ(3-4-1,P.17 ～)検索のタイプ、検索対象のライブラリや配列ファイル、許容可能な誤差範囲などを指定します。
2. Analysis タブ (3-4-2,P.24 ～)検索後、どのような条件のタンパク質を結果に表示するかに関するパラメータを指定します。
3. Advanced タブ (3-4-3,P.25 ～)
定量計算の条件や一時ファイルの置き場所などを指定します。
使用初期でよくわからない場合、とりあえずは Search タブで▲が表示され入力を促されている項目のみ記入してください。また各タブのフッター部分に共通して表示される「Load Workflow From File …」と「Save Workflow As …」は、このワークフローダイアログで定義する内容について、 予めファイルとして保存した内容を呼び出したり、逆に定義した内容をファイルとして保存したりする際に利用します。
以降、ワークフローダイアログの各タブの内容について、詳細を説明します。

3-4-1. ワークフローダイアログの Search タブ
Search タブでは検索対象のライブラリ（FASTA,BLIB,DLIB,ELIB など）、配列ファイル、許容可能な
誤差範囲などを指定します（Fig.3-3）。
ダイアログ上部には２つの選択肢があります。
-

Search a reference library-

Create a chromatogram library and search against it「Search a reference library」は、FASTA あるいは BLIB、DLIB,ELIB（この中のいずれか 1 種類）に対する検索を行います。開発元が特に推奨している手軽さと同定力を兼ね備えたライブラリが Prosit によって作成されたライブラリ（DLIB）です。Prosit は Wilhelm と Kuster のグループによって開発された、ペプチドのフラグメントと保持時間を予測する深層学習アルゴリズムです。Proteome Software 社では多くの生物の Prosit ライブラリを提供しており、Library Manager からファイルをダウンロードできます
し、以下 WEB サイトからダウンロードする事も可能です。作成に関する詳しい内容は、以下 URL または本資料の 14 章(P.93～)をご参照ください。
https://support.proteomesoftware.com/hc/en-us/ articles/360035151172-Prosit-Derived-SpectralLibraries-for-Scaffold-DIA-Searches©2023 Scaffold DIA マニュアル

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もう 1 つの選択肢、「Create a chromatogram library and search against it」は最初に FASTA
あるいは BLIB,DLIB に対する検索を行い、そこで得られた情報を元に作成された DIA の解析結果をライブラリ化した ELIB に対して別のデータを検索する、2 段階検索です（P.8 の Fig2-5 の検索方法に対応しています）。1 回目と 2 回目の検索させるデータとの間で、保持時間に関する関連性がある事が求められます。
2 種類の検索のどちらかを選ぶかに伴って指定が必要なパラメータが連動してユーザーに提示されます。前出の Fig3-5 は「Search a reference library」を選んだ場合、以下 Fig.3-6 が「Create a chromatogram library and search against it」を選んだ場合です。
以降、２つの選択肢を選んだ場合それぞれにおけるパラメータ入力画面について説明いたします。

Fig.3-6 ワークフローダイアログ

Search タブ初期表示画面■ Search a reference library を選択した場合
ダイアログ内に「Experimental Data Search Parameters」という領域が現れます。その行をクリックするとパラメータ入力画面が現れます(次頁 Fig.3-7)。各パラメータを入力後、画面下の「Load Data」ボタンを押すことで解析が開始されます。
この領域について、画面を３つのパーツに分けて説明いたします。

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3

1

2

Fig.3-7 ワークフローダイアログ©2023 Scaffold DIA マニュアル

Search タブ

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1

Fig.3-8 ワークフローダイアログ

Search タブの 1 部分

・ Reference Library と Protein Sequence Database「Reference」検索対象となる Library を選択します。ライブラリマネージャーから選ぶ方法と、
DLIB や BLIB などのファイルを直接選択する方法があり、後者の場合はピークリストリファレンスに対応する FASTA ファイルを下の「Protein Sequence Database」で選択する必要があります。
・iRT Database File

[必須ではない]

BLIB を検索対象とし、かつ Skyline から該当ファイルを出力している場合、Scaffold DIA の計算にそのファイルを保持時間情報として利用できます。” Choose” でファイルを選択します。
・Fragmentation
CID / HCD / ETD から選択します。ペプチドの同定並びに定量の際に対象とするイオンシリーズが変わります。CID,HCD は b,y イオン、ETD は c と z イオンを同定や定量時に利用します（CID は特定のケースにおいて同定時 y イオンしか考慮しない事がありますが、その時も定量には b イオンを使用します）。
・ Precursor / Fragment / Library Fragment : Tolerance
測定値と、理論値またはライブラリ値 との許容誤差範囲です。 単位として Da と ppm どちらでも選択可能です。
・Digestion Enzyme
実験で用いたペプチド切断方法（酵素）です。None Specific の場合任意の場所での切断パターンを考慮しますが、その場合は missed cleavage の設定を、(考慮したい最大ペプチド残基長-1) の数値を設定する
ようにしてください。

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・Peptide Length
検索対象とするペプチドの長さです。
・Peptide Charge
検索対象とするペプチドの電荷です。
・Max Missed Cleavages
理論ペプチド作成の際、切断対象のアミノ酸を何回無視したペプチドを作成するかの設定です。 数が多いと理論ペプチド数が増えます。

2
Fig.3-9 ワークフローダイアログ

Search タブ の 2 部分

・Modifications
考慮する修飾です。FASTA を対象とする検索の場合、このリストで指定した修飾を考慮した理論値を作成して検索します。一方 BLIB や ELIB など、ピークリストへの検索の際は、ライブラリに含まれる修飾に関する情報を極力拾い上げてこの欄に修飾情報を表示します。
・Peptide FDR Threshold
Percolator 適用によって計算されるペプチド FDR の閾値です。

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・Data Acquisition TypeDIA の測定での Precursor Isolation Window の幅に関する設定です(Fig.3-9)。
-Non-overlapping Windows:両端のオーバーラップ領域がない-

Overlapping Margins : オーバーラップ領域がある場合、ウィンドウ幅と合わせてマージン幅を指定-

Staggered Windows : 一度 MS/MS の測定をした後、ウィンドウ幅を半分ずらして再度MS/MS の測定を行う手法。

Non-overlapping Windows

Overlapping Windows
・

Staggered Windows

Fig.3-9 ワークフローダイアログ

Search タブ の ② 部分

Precursor Window Size
ウィンドウ幅を、ファイル情報から取得し設定するかユーザーが特定するか選びます。通常は ”Determine from raw file”を選択してください。

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3
・

Fig.3-11 ワークフローダイアログ

Search タブ の 3 部分

Experimental Data Files
検索対象となる raw ファイルを選択します。

■ Create a reference library and search against it を選択した場合
ダイアログ内に「Chromatogram Library Creation Parameters」と「Experimental Data
Search Parameters」の２つのセクションが現れます。最初の検索で ELIB を作成し、その ELIB に対して本命のサンプルデータを検索します。「Chromatogram Library Creation Parameters」については前述の通常検索とパラメータの内容が同じです。後段にあたる、「Experimental Data SearchParameters」の「Experimental Data Files」で、検索対象とする本命のサンプルデータを指定してください（Fig.3-12）。

Fig.3-12 Search タブ Experimental Data Search Parameters 画面©2023 Scaffold DIA マニュアル

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3-4-2. ワークフローダイアログの Analysis タブ
Analysis タブでは、ペプチドに関する検索後、その結果から同定タンパク質に選定しグループ化する際に利用されるパラメータです。

Fig.3-13 ワークフローダイアログ Analysis タブ
・Shared Evidence Clustering
シェアペプチドを持つ類似タンパク質のグループ化についての設定です。以下 3 段階があります。
-

Perfect shared evidence protein groups-

Moderate shared evidence clusters-

Any shared evidence clusters

上に行くほどクラスター化させるためにペプチドセットの組み合わせ条件が厳しくなり、逆に下は緩くなります。一番上の「Perfect～」なら、完全にペプチドセットが同じタンパク質でないとグループ化されません。逆に一番下の「any～」では１つでもシェアペプチドがあればグループ化されます。
詳細は本資料 12 章「タンパク質のグループ化、クラスター化」(P.89～)をご覧ください。
・Target Protein FDR表示させるタンパク質について FDR の閾値を設定します。ペプチドの FDR 設定とは異なる、タンパク質の FDR であることにご注意ください。
・Minimum Number of Peptides
表示させるタンパク質の条件として、アサインされているユニークペプチドの最低数を設定します。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved243-4-3. ワークフローダイアログの Advanced タブ
Advanced タブでは、データ処理に関する基本的な部分に関する設定を行います(Fig.3-14)。

Fig.3-14 ワークフローダイアログ Advanced タブ・Processing Directory
Scaffold DIA がデータ処理を行う際に利用する一時的なファイルの保管場所です。フォルダの選択と、ラジオボタンで計算に利用した一時ファイルの扱いを決定します。デフォルトでは計算の度にサブフォルダを作成してその下に一時的なファイルを作成し、計算後にそのファイルを消すように設定しています。
ファイルを消さないようにしたり、サブフォルダでなく作成フォルダに直接ファイルを書き込むように設定したりする事ができます。
・Minimum/Maximum Number Of Quant Ions
DIA の定量計算に使うフラグメントイオンの数について上限と下限を設定しています。Scaffold DIA の定量計算はフラグメントピークのみを対象とします。共溶出の影響による精度の低下を避ける目的で、すべてのフラグメントを使うわけでなく設定した上限個数までしか使用しません。Scaffold DIA では
デフォルトで使用するフラグメントピーク数を 3 以上 5 以下として設定しています。
・Percolator Training Set Size, Percolator Training Set Threshold
Percolator 計算に関するパラメータです。通常はデフォルト値を使用してください。
・Filter RT
RT のフィルターです。明示的に解析に不要な領域がある場合に指定してください。なお、データ取り込みの最初の段階で raw ファイルから .dia ファイルを作成する際にのみ機能するため、input データが.dia
ファイル(raw や mzML から Scaffold DIA 用に変換したファイル)の場合は機能しません。

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4.

Main 画面4-1. Scaffod DIA メイン画面について
Scaffold DIA は、以下 6 つのパネル（画面左側）から構成されています。
-

Organize(5 章)-

Samples(6 章)-

Proteins(7 章)-

Visualize (8 章)-

Analysis(9 章)-

Publish(10 章)

以降に続く 5 章～10 章ではそれぞれのパネルについて説明しています。
この章では、どのパネルを選択していても表示される、画面の周辺にあるタイトルバーやメニューバーなどについて詳しく説明しています(Fig.4-1)。

Summarization
メニューバー
データのまとめ単位

表示タンパク質のフィルターリング

各画面への切り替えFDR 計算値表示

Fig.4-1 Scaffold DIA メイン画面©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved264-2. メニューバー
メニューバーの各項目(Fig.4-2) について説明します。

Fig.4-2 Scaffold DIA メニューの内容

メニュー

各項目の内容・

FileNew – 新たな解析ファイルを作成します。詳細は 3 章「データの取り込み」をご覧ください。

・Open – Scaffold のファイル「*.sdia」を開きます。

・Close – 現在開いているファイルを閉じます。

・

Save – 現在開いているファイルを上書き保存します。

・Save As - 現在開いているファイルを別名で保存します。

・New Chromatogram Library – 検索時に使用する新たな Chromatogram
ライブラリ(ELIB ファイル)を作成するダイアログを開きます。

・Open Library Manager – Library Manager ダイアログを開き、現在登録されているライブラリの調整ができます。

・Convert Raw Files to DIA Files – raw ファイルを dia ファイルに変換する処理を行うためのダイアログを開きます。

・Print – 現在開いている画面を印刷します。

・Print Preview - 現在開いている画面を印刷する前に、印刷後のイメージを表示します。

Edit

・

Exit - ソフトウェアを終了します。

・Copy - 現在開いている画面の主な情報をまとめてクリップボードにコピーします。データはタブ区切りです。他ソフトウェアにテキスト情報として貼り付けることができます。

・

Find - 現在開いている画面内でキーワード検索をするダイアログを表示
します。

・

Edit Go Terms Options – GO 情報について表示項目を選択したり、参照のファイルを設定したりします。

・Preferences – Scaffold DIA を使用する際に必要な各種基本設定（メモリ、プロセッサー数、proxy、msconvert プログラムの指定など）を確認・変更します。

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View

・

Color Options – 定量値の表示数字の大小を表す色について、設定を変更するダイアログを表示します。

・Advanced Filter -メイン画面にあるフィルター画面では指定しきれない
細かい条件を指定したフィルターリングを実行します。

・Show/Hide Columns - 各画面で表示されている列の内容を調整します・

Navigate – 表示されているパネル画面内のタブを切り替えます（タブを直接クリックしても切り替わります）

・

Summarization – メイン画面内の「Summarization」と同じく、 データをまとめる単位（階層構造）を切り替えます。

・

Display Type – メイン画面内の「Display type」と同じく、表示する数字の内容を切り替えます。

・Cluster Value Suppression – 類似タンパク質をまとめるクラスター化をした際、一覧表にクラスター並びに各構成タンパク質の定量値をどのように表示するか設定します。

・Log Intensities – 定量値表示を底が 10 の Log 表示に切り替えたり元に戻したりします。

・

Organize View ～ Publish View – メイン画面の左側のパネルと同じく、各パネルへ切り替え・移動できます。

Experiment・Apply Thresholding –各ペプチドについて同定の信頼度を求めるパラメー
タです。設定値の Percolator q-value 閾値を上回らないペプチドは定量計算に使用されません。デフォルトは No bound で閾値設定はありません。

・Protein Clustering - 類似タンパク質をグループ化してまとめる「Clustering」について、まとめる基準の設定をします(→12 章、P.89～)。

・

Apply GO Terms – (Samples 画面) 予め設定した GO データベース
ファイルに照合しタンパク質に GO 情報を付与します（→15 章、P.108～）。

・

Import Attributes Files - 各サンプルデータ間の階層・属性を定義した「Attribute file」を読み込みます。

・Quantitative Analysis –定量値を使って検定を行ったり、検定の有意基準についての設定を行ったりします。

・Clear User Peptide Validation - 定量計算を行う際に行った各種設定をリセットして、デフォルト値に戻します。

Export・

Export Attributes Files -各サンプルデータ間の階層・属性を定義した「Attribute file」を設定ファイルとして出力します。

・Export Samples Report to Excel ～ Export Workflow – 解析データ
を様々な観点でまとめたレポートを Excel で読み込み可能な CSV フォーマッ
トで出力します。詳細は P.91～.「13.Report」をご覧ください。

・Run SQL Query for Export - SQL コマンドを入力実行するダイアログが現れます。

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・

Tools

Windowing Scheme Wizard – Windowing Scheme Wizard(EncyclopeDIA の機能)を起動します。質量分析装置の DIA 測定に際して装置の設定に必要なウィンドウ幅の設定数値を計算します。

・

DIA Structure Viewer (mzML only) – DIA Structure Viewer(EncyclopeDIA の機能)を起動します。mzML を開いて windowing
scheme に関する設定を確認する事ができます。Data Acquisition
type の確認などに利用できます。Scaffold DIA 上では mzML への変換ツールを利用できないので、手元の raw ファイルを見たい時には
別途 msconvert を起動し変換を実施した上でツールに読み込ませる必要があります。

・

Launch Peptide Browser – Peptide/DIA Detection Viewer(EncyclopeDIA の機能)を起動します。mzML または dia ファイルから、特定ペプチドを検索します。実行後、ダイアログ内の上のパネルにはフラグメントイオンのピーク強度が、下のパネルにはスコアの情報が表示されます（どちらも横軸は RT）。

・

Convert BLIB to ELIB– BLIB ファイルを ELIB ファイルに変換します。

＊ ELIB と DLIB は同じ

・

します。

フォーマットで、通常の解析においては実質中身が同じものと考えて問題・である CSV ファイルを DLIB に変換します。出力ファイルは入力ファイオプションはルと同じ場所に作成されます。

どちらのフォーマットも利用可能です。（例:DLIB の結合に「combine
ELIB libraries」を使用する、など）

・Convert TraML to ELIB – TraML ファイルを ELIB に変換します。

・Convert ELIB to BLIB – ELIB ファイルを BLIB に変換します。

・Convert ELIB to OpenSWATH TSV – ELIB ファイルを
OPENSWATH TSV フォーマットに変換します。出力ファイルは

ELIB と DLIB について

入力ファイルと同じ場所に作成されます。

https://bitbucket.org/searleb/encyclopedia/wiki/
EncyclopeDIA%20File%20Formats

Convert Prosit/Spectronaut CSV to DLIB – Prosit のライブラ
リ(Prosit から出力されたファイル)、または Spectronaut のライブラリありません。Scaffold DIA 上では
ELIB 用/DLIB 用

Convert MSP/SPTXT to ELIB – MSP や SPTXT を ELIB に変換

・Convert FASTA to Prosit CSV – FASTA ファイルから、Prosit
検索の入力データ(CSV 形式)を作成します。作成されたファイルは
Prosit サイトにて入力データとして使用でき、ライブラリを作成する事ができます。この機能を利用した場合は 以下論文への Citation をつけてください。
https://www.nature.com/articles/s41467-020-15346-1

・Combine ELIB libraries – 複数の ELIB ファイルを結合します。

・Subset ELIB library – ELIB を開き、特定条件に合う結果のみを抜き出した新たな ELIB ファイルに出力します。

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・

Help

Help on Current View -現在開いている画面/ダイアログの内容に該当するヘルプ画面を開きます。

・Help Contents – ソフトウェアのヘルプを開きます。

・

Scaffold DIA User’s Guide – Scaffold DIA ユーザーガイド英語版(PDF ファイル)を開きます。

・

Scaffold DIA FAQs/Resource Center – Proteome Software 社が提供する各種ドキュメントが配置された WEB ページへアクセスします（WEB ブラウザ経由）。

・Open Demo Files – Scaffold DIA で予め準備している
デモファイルを開くダイアログが現れます。

・Show Log Files – ソフトウェアの実行ログファイルを開きます。
トラブルシューティングなどで使用します。

・Show License Agreement – ライセンス契約内容を表示します。

・

Referencing Scaffold DIA – Scaffold DIA について論文などに記載するための記述例を表示します。

・Update License Key - ライセンス情報を入力するダイアログが現れます。試用ライセンスから製品ライセンスに切り替える場合や、期間限定のライセンスを継続する場合などに利用します。

・About Scaffold DIA – ライセンス情報や保守期間などが表示されます。

4-3. ツールバー（アイコン）
画面上部に、頻繁に使うコマンドに対応するアイコンが準備されています（下図）。

Fig.4-3 Scaffold DIA ツールバーにあるアイコン

アイコンが表すコマンドは以下の通りです。
アイコン

機能
New – 新たなファイルを作成します。詳細は 3 章「データの取り込み」をご覧ください。
Open – Scaffold DIA のファイル「*.sdia」を開きます。
Save – 現在開いているファイルを上書き保存します。
Open Library Manager – Library Manager を開きます。
Print – 現在開いている画面を印刷します。
Print preview - 現在開いている画面を印刷する前に、印刷後のイメージを表示します。

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Copy - 現在開いている画面の主な情報をまとめてクリップボードにコピーします。他ソフトウェアに
テキスト情報として貼り付けることができます。
Find - 現在開いている画面内で、キーワード検索をするダイアログを表示します。
Quantitative Analysis – 表示されている定量値を元に検定を行ったり、タンパク質の有意基準についての設定を行ったりします（詳しくは「5-7 Experimental Design の設定」(P.43～)をご覧ください）。
Excel - 現在開いている画面に適したレポートを EXCEL で読める CSV 形式で出力します。
Help - オンラインヘルプを開きます

4-4. 表示タンパク質のフィルターリング

表示タンパク質について、各種条件によるフィルターリングを行うことができます。

Fig.4-4 Scaffold DIA 表示タンパク質のフィルターリング設定項目

アイコン

機能
Show Hidden – 各種絞り込み条件に合わないタンパク質を表示する / しない を切り替えます。
Star Filter – Samples 画面内にて設定された項目「Star」の内容でフィルターリングを行います。Star には、/星なし/黄色/青色/黄＋青色/ の 4 種類があります。
Name/Accession – キーワード検索により Accession やタンパク質の名称に対して
絞り込みを行うことができます。
P-value filter - P value が、検定の p 値、またはさらに別途定められた Family-Wise
Error Rate（または FDR）の閾値を超えているかどうかでフィルターリングを行います。
検定を実施した後のみで選択できます。
GO term – アサインされた GO 情報によるフィルターリングを行います。
Advanced filter - メイン画面にあるフィルター画面では指定しきれないような細かい
条件を指定したフィルターリングを実行します。
Protein FDR – Protein FDR の値によるフィルターリングを行います。
Min # Peptides - アサインされたペプチド数によるフィルターリングを行います。

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4-5. 各画面への切り替え

画面左の「Navigation pane」(Fig.4-5) にて、Scaffold DIA の解析画面を切り替えることができます。

-

Organize(5 章)-

Samples(6 章)-

Proteins(7 章)-

Visualize

(8 章)

-

Analysis(9 章)-

Publish(10 章)

以降に続く 5 章～10 章ではそれぞれのパネルについて説明しています。

Fig.4-5 Scaffold DIA Navigation pane

4-6. FDR 計算値表示
Navigation pane の下に、FDR の情報がまとめられた表示欄があります(Fig.4-6)。ペプチド、タンパク質
それぞれの FDR 設定値並びに閾値を超える Target / Decoy エントリーの数が表示されます。
このダッシュボード内の情報は、エディター操作のようにドラッグ＆ドラッグを行ってコピーする事ができます。

Fig.4-6 Scaffold DIA FDR Info ボックス©2023 Scaffold DIA マニュアル

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4-7. Summarization
Summarization バー(Fig.4-7)では、着目するサンプルの階層構造を切り替えることができます。 結果
画面に表示されるサンプル、並びにその定量値も連動して変更されます。

Fig.4-7 Scaffold DIA Summarization バー

項目の一番下、「Edit」を選ぶと、「Configure Sample Organization and Statistical Analysis」ダイア
ログの「Sample Hierarchy」が表示されます。このダイアログについては「5-6.選択可能な 3 種類のExperimental Design について(P.41～)」にて詳しく説明しています。

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5.

Organize 画面

5-1. Organize パネルについて
Scaffold DIA ではデータの階層につける名称を"Category"と呼び、Category 内の各変数（属性）の名称を"Attribute"と呼びます。Organize パネルではデータの Category(階層)や Attribute(属性)の定義や、各 Sample データに対して Attribute との紐づけを行う事ができます。
例えば、"Treatment Group "という Category を定義し、そこに "Control "と "Treated "というAttribute を配置する事ができます。あるいはタイムコース、薬物の投与に対する反応を測定する研究では、"Time "と呼ばれる Category を作成して、そこに属する Attribuite として「0min」「20min」「40min」「60min」などを設定する事もできます。臨床サンプルには多くの場合、年齢、性別、病歴などの多くの属性が付与されていますが、Scaffold DIA 上においても１つのデータに複数の Category のAttribute を割り当てる事が可能です。Category と Attribute は、Organize パネルのグラフィカル
ユーザーインターフェースで定義する事ができるほか、予め設定が完了した情報を内包するファイルを読み込んで利用する事ができます。
最初に Scaffold DIA にロードされたばかりの段階ではこれらの定義が全くされておらず、取り込んだデータ(raw 又は mzML)の単純なリストが存在するのみです。Fig.5-1 は、サンプルがロードされた直後のOrganize パネル 画面です。

属性情報なしFig.5-1 データと階層構造の例
以降、Organize パネルの画面内で Category や Attribute の定義を作成し各データと紐づけをする
作業についてご案内します。

5-2. Organize パネルの画面と設定箇所
Organize パネルの概要です（次頁図）。以下の 4 つのポイントに分けてご説明します。
① Category, Attribute の定義設定[5-3]② Sample ファイルと Attribute の関係性を設定・確認する表③ Import Attribute File / Export Attribute File

[5-4]

[5-5]

④ Experimental Design の定義 [5-6,5-7]©2023 Scaffold DIA マニュアル

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③ Import Attribute File / Export Attribute File

① Category, Attribute の定義設定② Sample ファイルと Attribute の④ Experimental Design の定義

関係性を確認する表

Fig.5-2 Organize 画面内の各機能に関する説明

5-3. Category, Attribute の定義設定
画面左側、「Define Categories」では category と、それに属する Attribute の設定を行う事ができます(Fig.5-3)。例として、①のエリアで「Treatment」というカテゴリーを作成し、そこに「Control」と「Insulin」という２つの Attribute を作成する操作をご案内します。

Fig.5-3 Organize 画面 View Table 拡大©2023 Scaffold DIA マニュアル

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35最初に、”Add Category”ボタンを押します（Fig.5-4）。

Fig.5-4 Organize 画面 Add Category ボタンの位置

Category 名として「Treatment」と入力します。続いて、右側にある「Add Attribute」をクリックします（Fig.5-5）。

Fig.5-5 Organize 画面 Add Attribute ボタンの位置

Attribute 名として「Insulin」と入力します（Fig.5-6）。

Fig.5-6 Organize 画面 Attribute 設定©2023 Scaffold DIA マニュアル

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36必要に応じて色のアイコンをクリックし、色の設定を変更します（Fig.5-7）。

Fig.5-7 Organize 画面 Attribute の色設定

続いて、作成した Attribute の下に新たに現れる「＋Add Attribute」をクリックします（Fig.5-8）。

Fig.5-8 Organize 画面 Attribute 追加

同様の操作で、もう１つの Attribute である「Control」を作成します（Fig.5-9）。

Fig.5-9 Organize 画面 Attribute 追加完了

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved37以上で作成の操作は終了です。
もし作成後の Category を削除する時は、画面内のボタン「Delete (カテゴリー名)」をクリックします。
作成後の Attribute を削除する時は、Attribute を選択してから右クリックして「delete」を選択します。

5-4. Sample ファイルと Attribute の関係性を設定・確認する表
Fig.5-2 画面、右側の②の領域では、取り込んだ データ の各 Sample と定義した Attribute との紐づけの定義をしたりその内容を確認したりする事ができます（Fig.5-10）。

Fig.5-10 Organize 画面 Sample-Attribute 対応表

以下、データと属性の紐づけ操作に関するご案内です。
[sample と attribute を紐づけする操作について]
Sample を選択した状態で右クリックすると、表示リストの中に Category 名が現れます。Category 名にカーソルを合わせると、さらに Attribute が表示されます。Attribute を選択する事で、該当 Sample に選択した Attribute 情報が紐づけされます。
なお Sample をドラッグ＆ドロップや Ctrl キーを使って複数選択し、同時に Attribute 紐づけ設定する事もできます(Fig.5-11)。

Fig.5-11 Organize 画面 Sample に対して Attribute 情報を付与している操作©2023 Scaffold DIA マニュアル

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Attribute 情報を付与後、その情報が表内に表示されます(Fig.5-12)。

Fig.5-12 Organize 画面 Sample に Attribute 情報が付与された画面[Group Samples By]の選択肢について
３つの選択肢、「Sample Name」「Selected Category」「Experimental Design」があります。

Fig.5-13 Organize 画面 「Group Samples By」項目

表内のデータの並びについてどの項目に着目するかを選びます。
Sample Name: Sample 名のアルファベット順に並んだリストになります。
Selected Category: Category、Attribute 名の順に並んだリストになります。
Experimental Design: Experimental Design(詳細は 5-6.をご参照ください)の階層構造とCategory, Attribute 情報に基づきデータがまとめられ表示されます。

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[Bulk Edit Sample Names] と選択肢について取り込んだ Sample 名が長すぎる場合、Scaffold DIA の中でデータを扱いやすくするために、表示される Sample 名を短く変更すると便利です。一つ一つを選択して表示される Sample 名を編集する事もできますが、データ数が多い時はその操作の実施も非常に煩雑です。そういった場合に一括してファイル名を変更できるのが、「Bulk Edit Sample Names」ダイアログです (Fig.5-14)。
ファイル名について、全ファイル名に共通する特定文字を一括して削除したり（Remove prefix, Remove
suffix*）、ファイル名の前/後ろからの特定文字数を強制的に削除する事ができます(Remove charactersat beginning, Remove characters at end)。また単純に文字を削除するだけでなく、 選択した
Attribute 情報に基づいてファイル名を変更するオプションもあります（Rename based on Attributes）。
＊prefix -> 接頭語、suffix -> 接尾語

Fig.5-14 Organize 画面 「Bulk Edit Sample Names」ボタンとダイアログ©2023 Scaffold DIA マニュアル

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5-5. Import Attributes File / Export Attributes File
同じデータを取り込むもののパラメータを変えて再検索したい場合、現バージョンの Scaffold DIA ではデータの読み込みから再度実施する必要があります。その際、Sample と Attribute の紐づけを再度設定するのは少々面倒です。
そのような時には Sample ファイルと Attribute 情報の紐づけ状況をファイルとして保存しておき、後で再び読み込んで利用する事ができます。ファイルはカンマで区切られた CSV ファイルです(Fig.5-15)。

Fig.5-15 Attributes text file

設定した内容を CSV ファイルとして出力するには”Export Attributes File”を、いったん保存した
CSV ファイルを読み込むには ”Import Attributes File”ボタンを押します (Fig.5-16)。

Fig.5-16 Import Attribute Files / Export Attributes File

5-6. 選択可能な 3 種類の Experimental Design について
Scaffold DIA では実験計画法に基づいた定量解析を行う事ができます。データの構造について以下３つのオプションが選択可能です。
-

Basic Design-

Repeated Measures-

Two-way Design

以降それぞれのオプションについて詳しく説明します。

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41

■Basic Design

Fig.5-17 experimental design 構成例
残り 2 つの選択肢が特殊な状況を想定しているのに対し、「Basic Design」はより一般的なデータ構造を想定しており、Experimental Design の選択肢がよくわからない場合はこの「Basic Design」を選択して下さい。
まず比較を行いたい一番大きな分類として、2 つ以上の「Biological class」を設定します。「Biologicalclass」は実験条件の違いを反映したグループから構成されます（例:Control と Treatment など）。
それぞれの「Biological class」に「Biological Replicates」を属させる事が可能です。これは同一実験でありながらも生物的な差異があるケースなどが当てはまります。さらにそれぞれの「Biological
Replicates」に対して、繰り返し実験である「Technical Replicates」を対応付ける事ができます。データ
構造の最下層として、各「Technical Replicates」が複数の画分から構成されている場合それを「Fraction」として紐づけする事ができます。
Fig.5-17 の状態を Scaffold DIA の Category 情報を使って以下のように定義するとします。
Group -> { Treatment, Control }Subject -> { Subject 1,Subject 2, Subject 3, Subject 4 }すると Scaffold DIA の summarization 選択では以下のように階層構造が表示されます。
Group
Subject(MS Sample)
結果画面の Summarization で Group を選んだ場合は Treatment と Control にまとめた結果が、Subject を選んだ場合は Subject の単位でまとめられた結果が表示されます。(MS Sample)を選択した
場合はデータがまとめられず、各 MS データ単位(測定データの単位)で結果が表示されます。
■ Repeated Measures
同一の生物種個体からデータを取得していることを前提としており、各個人のレベルがどのように変化するかを分析する際に選ぶ選択肢です。例として、経時的変化を追った実験やクロスオーバー法が挙げられます。前述の項目「Basic Design」のように、Biological Replicates や technical replicates、fractionなどの分類を定義する事もできます。

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■ Two-way Design
２つの独立変数の効果を比較し、2 つの変数の間に交互作用があるかどうかを判断する際に選ぶ選択肢です。例えばある薬剤を投与した時の男性と女性の反応の違いについての比較です。Two-way
ANOVA を実施すると、３つの尺度で評価する事ができます。３つの尺度とは、2 つの要素が交互作用する程度(Interaction)並びに Primary として指定した要素の影響度、並びに Secondary として指定した要素の影響度です。前述の項目「Basic Design」のように、Biological Replicates や technical replicates、
fraction などの分類を定義する事もできます。
なお、特殊な状況での Two-way Design である Randomized Block Design (乱塊法)にも対応しています（乱塊法 : Randomized Blocks in Analysis of Variance (ANOVA) - StatsDirect）。サンプルをブロックと呼ばれるグループに分割（ブロック化）し、処理グループの状態以外の既知の要因（年齢・性別等）と、測定データ側の各要素とが与える影響の度合いを確認します。Randomized Block ANOVA はブロック化したカテゴリーの効果を最小化しながら治療効果 (treatment effect)を見るための解析方法です。Two-way ANOVA と異なり、ブロッキング・カテゴリーの効果の評価は行いません。

5-7. Experimental Design の設定
以降、Scaffold DIA 上でデータから実験計画の内容を定義する操作方法についてご紹介します。
設定は「Configure Sample Organization and Statistical Analysis」ダイアログ(Fig.5-18)から行います。
ダイアログを表示させる方法は以下の 4 通りあります。
-「Organize」View の画面左下にある「Configure Experimental Design and Statistical
Analysis」ボタンをクリック-

menu の「Experiment」-> 「Quantitative analysis」を選択-

ツールバーにある「Quantitative analysis」アイコンをクリック-

ツールバーの「Summarization」選択肢内にある「Edit」をクリック

Fig.5-18 Configure Sample Organization and Statical Analysis ダイアログ©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved43このダイアログは 2 つのタブから構成されています（前頁図赤枠）。
・「Sample Hierarchy」タブ : 実験の種類の選択や各カテゴリーの位置づけの定義 [5-7-1]
・「Statistical Analysis」タブ : 検定手法や多重検定の補正についての設定 [5-7-2]
以降、各タブでの設定内容について詳しく説明します。

5-7-1. Sample Hierarchy タブ
４つのパーツから構成されています(Fig.5-19)。
-

Sample Acquisition-

Experimental Design-

Summarization Hierarchy-

Design Matrix

Fig.5-19「Simple Hierarchy タブ」の画面上部拡大

Sample Acquisition
Samples were fractionated
測定データに分画データが含まれている時にチェックを入れます。定性・定量において分画されたデータ
は解析時に結合して１つのファイルであるかのように取り扱います。チェックを入れると、カテゴリーのどの分類の属性情報が分画前の属性であるかを指定する設定欄が「Summarization Hierarchy」に現れます。
Technical replicates were acquired
測定データについて、繰り返し実験（同一サンプル・同一条件のサンプルについて測定した）データを含む
時にチェックを入れます。定量において繰り返し実験の単位で標準化を行います。チェックを入れるとカテゴリーのどの分類の属性情報を使って Technical Replicates データを認識するか指定する設定欄が「Summarization Hierarchy」に現れます。
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44Experimental Design
Basic Design / Repeated Measures / Two-way Design の 3 択です。選択肢の詳細は以下の通りです。詳細については「5-6.選択可能な 3 種類の Experimental Design について」(P.41～)をご覧ください。
■ Basic Design
下記 2 手法以外の場合に選択。データを階層構造化し様々な分類でデータを見る事ができます。
■ Repeated Measures
経時的な変化やクロスオーバー測定など、同一個体種からとったデータの比較をする■ Two-way Design
２つの独立変数の効果を比較し、変数の間に交互作用があるかどうかを判断する
Summarization Hierarchy :カテゴリーに対して分類・階層構造化を行う設定欄です。画面上部の「Sample Acquisition」並びに「Experimental Design」で何を選んだかによって選択肢が変わります。基本的には、画面左側の「Available Categories」に表示されるカテゴリーを画面右側の分類や階層構造を定める箇所に移動（ドラッグ＆ドロップまたは矢印を使用）させて設定します。

Fig.5-20 Summarization Hierarchy 設定 / Basic Design

Available Categories [すべての状況で現れる]
Organize 画面で設定したカテゴリーの一覧です。カテゴリーの設定やデータとの紐づけ方法については
5-3,5-4 をご覧ください。左側にあるカテゴリーを右側の適切な分類に当てはめていきます。

Categories to be studied [Experimental Design で Basic Design を選択した時]統計解析を行う対象となるカテゴリーで、統計解析を行う場合は必ず何かしらのカテゴリーをこの分類にアサインする必要があります。ここで指定されるカテゴリーが 1 つである場合、そのカテゴリーの属性値毎にデータがまとめられます。2 つ以上指定された場合(Fig.5-20)、各カテゴリーの属性についてすべての©2023 Scaffold DIA マニュアル

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45

組み合わせがデータまとめの対象となります。例えば「Condition」カテゴリーに属性値{Control,Treated} が、「sex」カテゴリーに{male,female} が存在し Fig5-20 のように Condition と sex どちらも「Categories to bestudied」に指定していた場合、データまとめの 対象は「Control,male」、「Control,female」、「Treated,male」、「Treated,female」の 4 種類となります。

Biological Samples [すべての状況で現れる]「Biological Replicates」にあたる項目を選択する事ができます。 当てはまるものがない場合は特に気にせず「MS Sample」が選ばれている状態であれば OK です。

Technical Replicates [Sample Acquisition で Technical replicates were acquired を選択した時]
Fig.5-17 データの説明における「Technical Replicates」にあたる項目を選択する事ができます。該当する
ものがなければ「Technical replicates were acquired」のチェックを外してください。該当するものがある
ものの特に当てはまるカテゴリーがない場合、「MS Sample」が選ばれている状態であれば OK です。

Fractions [Sample Acquisition で Samples were fractionated を選択した時]
Fig.5-17 データの説明における「Fractions」にあたる項目を選択する事ができます。該当するものがなければ「Samples were fractionated」のチェックを外してください。該当するものがあるものの当てはまる
カテゴリーが特にない場合、「MS Sample」が選ばれている状態であれば OK です。
[Experimental Design で Repeated Measures Design を選択した時]

The Time Category
Repeated Measures Design では同じ解析対象の経時変化や条件を変えたデータ測定を行う実験を想定しており、そのようなカテゴリーを選択します。例えば 「TimePoint」カテゴリー{属性値(0hr,1hr,2hr,3hr)}や、「Treatment」カテゴリーなどです(Fig.5-21)。

Fig.5-21 Summarization Hierarchy 設定 / Repeated Measures Design©2023 Scaffold DIA マニュアル

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[Experimental Design で Two-Way Design を選択した時]Primary Analysis Category ,Secondary Analysis Category

Fig.5-22 Summarization Hierarchy 設定 / Two-way Design

Two-way Design は２つの独立変数の効果を比較し、2 つの変数の間に交互作用があるかどうかを判断する際に選ぶ選択肢で、例えばある薬剤を投与した時の男性と女性の反応の違いについての比較などが例に挙げられます。この時実験の主な焦点となるカテゴリーを Primary Analysis Category として、結果に影響を及ぼす可能性があるカテゴリーを Secondary Analysis Category で指定します。例ではPrimary Analysis カテゴリーに「Treatment」{control,treated}を、Secondary Analysis カテゴリーに「sex」{male,female}を指定しています。

Design Matrix
設定した Experimental Design の内容に従って、カテゴリーの属性の分類とその属性を持つサンプル
データを確認する事が表形式でまとめられます。

Fig.5-24 Design Matrix©2023 Scaffold DIA マニュアル

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5-7-2. Statistical Analysis タブ
検定手法や多重検定の補正についての設定を行います(Fig.5-24)。
各統計手法や補正に関する詳細は、「11-2.検定(P.85～)」をご覧ください。ここでは設定項目について簡単に説明します。

Fig.5-24 Statistical Analysis タブ

Statistical Test
選択された実験計画の種類や数に基づき、実施/結果表示 可能な検定の選択肢が現れます (Fig.525) 。

Fig.5-25 Statistical Test

Test Hypothesis
選択された検定に合わせて帰無仮説(H0)と対立仮設(Ha)の内容が表示されます。

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Multiple Test Correction
多重検定の補正、すなわち多重検定に伴う擬陽性の上昇を抑えるために新たに設ける基準についての設定です。補正方法を選び基準値を指定します。詳細は「11-2.検定」をご覧ください。
Reference Samples
表示する Intensity 情報を Fold Change とした場合、Reference とするサンプルをどれにするか指定します。さらに対象とする Reference を、マッチしたデータに対応するサンプルに限定か、カテゴリー内
全てのサンプルを対象としたものにするかを選ぶことができます。
Design Matrix
Sample Hierarchy タブでも表示されているのと同様、設定した Experimental Design の内容に従って、カテゴリーの属性の分類とその属性を持つサンプルデータを確認する事が表形式でまとめられます。こちらのタブではさらに、解析対象とする属性などをチェックボックスで ON/OFF し、検定の対象を変更する事も可能です。

Fig.5-26 Design Matrix (Statistical Analysis タブ)©2023 Scaffold DIA マニュアル

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49

6.

Samples 画面

6-1. Samples 画面について
Samples 画面では、同定されたタンパク質の一覧並びに定量値をはじめとするタンパク質の関連情報が表示されます（Fig.6-1）。解析結果を確認する上で主体となる画面です。

[2] Display type バー[1] Sample Table

Fig6-2. table 左側

Fig6-3. table 右側

Fig.6-1 Scaffold DIA Samples 画面

この章では Samples 画面の表の見方（図[1] Samples Table）と、表示する定量値の内容（図[2]DisplayType バー）について詳しく説明します。

6-2. Samples Table （Fig6-1 の[1]）Samples Table では、同定タンパク質の一覧並びにそのタンパク質の関連情報、定量値が表示されます。
Samples Table で表示されるタンパク質は、各種フィルターリング機能で表示対象を変更する事ができます。詳しくは 4 章「メイン画面」の「4-4.表示タンパク質のフィルターリング」(P.31～)をご覧ください。また各列をクリックする事で降順・昇順に並び替えることができます。
次頁以降で、table に表示されている各列の内容について説明いたします。

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50

11

7

2

10

8

6
1

9

3
5

4

Fig.6-2 Samples table 左側

番号

項目

説明

1

#

上位から順に割り当てた番号

2

Visible「Hidden」フィルターにより該当タンパク質をリストに表示するかしないかを定めます

3

Star

タンパク質に付与できるマーク。無色/黄色/青/黄色＋青 の 4 種類を設定可能

4Protein Name

タンパク質の名称

5

Accession Number

タンパク質の ID

6

Molecular Weight

タンパク質の質量7Protein Group

Clustering グループに属するタンパク質にアサインされた全ペプチド

Scoreの中で最も高いペプチドの同定確率の値。1、すなわち 100%、が最大値で数値が大きいほど信頼度の高いペプチドがアサインされている事を示しています。

8

Identified Peptide

同定ペプチド数Count
9

Exclusivity

各タンパク質の全アサインペプチドにおける、Exclusive ペプチドの割合。数値が高いほどリスト上の他タンパク質とシェアされているペプチドが少ない事を示し、Exclusivity が 100%のタンパク質はすべて他タンパク質とはシェアされていないペプチドだけがアサインされた状態である事を示しています。

10

検定に関する値検定（Experiment -> Quantitative Analysis）で実施した検定に関連する数値。p 値、q 値や変動係数など

11Color Legend

項目 14(次頁)の定量値表示の際の凡例。Display type の切り替えにより凡例表示も切り替わります。

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51

13
3

14

12

Fig.6-3 Samples table 右側

番号

項目

説明

12

Taxonomy

生物種

13

GO info

Gene Ontology 情報

14

Quantitation

定量値。表示する数値は Display type バーの設定内容に基づきます。また「Summarization」の選択項目により、データをまとめる単位が変更され、定量値を表示する列数が変化します。

6-3. Display Type バー （Fig6-1 の②）
1

3

2

4

Fig.6-4 Display Type バー
上記 14 の定量値について、表示内容を切り替えることができるのが「Display Type」 バーです
(Fig.6-4)。以降、各項目について説明します。

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1. Display Type
表示する数字を以降の 8 種類から選択する事ができます。
-

Exclusive Intensity
share ペプチドを除く Exclusive(ユニーク)なペプチドを計算対象としてタンパク質の定量値を算出-

Total Intensity
share ペプチドも含む全ペプチドを計算対象としてタンパク質の定量値を算出-

Log2 Fold Change (Exclusive Intensity )share ペプチドを除く Exclusive な(ユニークな)アサインペプチドを対象としてタンパク質の定量値を算出し、Reference との比を取りその数字に対して 2 を底にする Log をとった値。Scaffold
シリーズでは 比を取り 2 を底にする Log を「Fold Change」 として呼んでいます。
Fold Change を選択した場合、Reference を指定する欄が新たに表れます（下図 Fig.6-5）

Fig.6-5 Fold Change を選択した時は reference を選択する項目が現れる-

Log2 Fold Change (Total Intensity)
share ペプチドを含む全アサインペプチドを対象としてタンパク質の定量値を算出し、Reference との比を取りその数字に対して 2 を底にする Log をとった値。Fig.6-5 Reference を指定する欄が
現れます。

-

CV (Exclusive Intensity)
share ペプチドを除く Exclusive な(ユニークな)ペプチドを対象とした定量値の変動係数-

CV (Total Intensity)
share ペプチド含むすべてのペプチドを対象とした定量値の変動係数-

Exclusive Quantified Peptide Countshare ペプチドを除く Exclusive な(ユニークな)ペプチドでかつ定量に使われたフラグメントを持つペプチドに限定して数え上げた数に対して、標準化処理を行った数字 (11-1-1, P.84～)。

-

Total Quantified Peptide Countshare ペプチドを含むペプチドでかつ定量に使われたフラグメントを持つペプチドに限定して数え上げた数に対して、標準化処理を行った数字(11-1-1, P.84～)

2. Normalized
Normalization を実施する/しない を切り替えることができます。サンプルの階層構造定義時にTR(Technical Replicate) として定義されたグループの単位毎に Normalization の処理が行われ、平均の 4 分位数と各データの 4 分位数の値を揃えるように調整されます。詳細は「11-12. ラベルフリー定量」の「normalization」（P.85～）をご覧ください。

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3. Log Intensities
タンパク質の定量値を、底を 10 としたログに変換して表示
4. Color Options
凡例の色分けについて、その境値と色を定義します。ユーザーにより自由に設定変更ができます。

Fig.6-6 色分けに関する設定画面

6-4. 「Summarization」と定量値データを取り込んだ当初の Samples 画面では、各データの定量値がそのまま表示されている状態です(Fig.6-7)。

Fig.6-7 データ取り込み直後の Samples 画面©2023 Scaffold DIA マニュアル

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「Organize」画面で各データの階層構造と属性を定義すると、その定義内容が Samples 画面にも反映されます(Fig.6-8)。表右側の定量値表示で、データ名の上部に階層の属性値が表示されます。

Fig.6-8 Organize で階層構造と属性定義後の Samples 画面

Summarization の選択を切り替えて別の階層を選択すると、その階層における属性別にデータがまとめ直されます（Fig.6-9）。

Fig.6-9 Summarization 切り替えを行うと、定量値のデータまとめ方も変わる

表示の切り替えは Summarization 選択と連動して行われます。同じ属性の複数データがどのようにまとまるかについては、次の項目「6-5.定量値データのまとめられ方」をご覧ください。

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6-5. 定量値データのまとめられ方【Rolling up, 代表値はメジアンです】
Summarization のレベルを変更し階層構造が上のレベルを選択すると、その階層に属する各定量値からメジアンが計算され代表値として表示されます。

【不足値と表記】

Fig.6-10 不足値がもたらす特別表記：Missing Value, No Values, Missing Ref

Log2 Fold Change あるいは Summarization 上位階層選択時の Intensity (または Log10)をまとめる(複数サンプルから代表値を計算する)際、値の不足する状況に応じて以下のような表記がされます(Fig.6-10)。
Missing Value--- ratio において参照先（分数の分子）の値がない

Missing Ref(又は Reference Missing)--- ratio において参照元（分数の分母）の値がない

No Values--- ratio において参照先も参照元も値がない

Summarization により Rolling up する時、50%以上のデータが不足している時には別途計算式によって代表値が計算されます(Fig.6-11,緑線)。またすべて Missing Value であった場合は、まとめた時にも Missing Value として表示されます（次頁 Fig.6-11,黒線）。

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Fig.6-11 Rolled up と missing value©2023 Scaffold DIA マニュアル

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7. Proteins 画面
7-1. Proteins 画面についてProteins 画面ではペプチド/タンパク質の同定並びに定量計算結果をより詳しく検証する事ができます。
タンパク質にアサインされているペプチドの情報、ペプチドが定量計算に使用されているかどうか、グループに属するタンパク質のペプチドシェアの状況、等を確認する事ができます。Proteins 画面へ移行するには、Samples 画面で気になるタンパク質が選択されている状態でダブルクリックするか、画面左の「Proteins」pane(Fig.7-1,緑枠)をクリックします。
Proteins 画面は、２つのタブから構成されています。「Protein」タブと「Similar Proteins」タブです（Fig.7-1、青枠）。
Protein タブではペプチド/タンパク質の同定内容やペプチドの定量計算結果を詳しく検証する事ができます。それに対して「Similar Proteins」タブでは、配列が類似するタンパク質を集めたクラスターグループに属する、各タンパク質のペプチドシェアの状況を確認する事ができます。

[1] ペプチドフィルターリング[2] ペプチド情報[3] ペプチド – query
マッチング情報[4] Visualization

Fig.7-1 Proteins 画面「Protein」タブProtein タブは主に４つのパーツから構成されています（Fig.7-1 [1]～[4]）。以降、各パーツで表示される内容について説明します。

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7-2. ペプチドフィルターリング (Fig.7-1 [1])Protein タブの上部にあるのが「ペプチドフィルターリング」です(Fig.7-2)。

B

A

Fig.7-2

C「Protein」タブ ペプチドフィルターリング

ペプチド情報（Fig.7-1 [2]）で表示されるペプチドを絞り込む際に利用します。
A でグループ内のタンパク質を特定しており、B でアミノ酸配列あるいは修飾などのキーワードをもとにさらにペプチドを絞り込むことができます。絞り込みをリセットする場合は C「Showing All Peptides」
ボタンをクリックします。この「Showing All peptides」 は Proteins 画面内での各種操作により表示
ペプチドが絞り込み表示になってしまった状態を元に戻す、フィルターリセットをしたい場合に利用します。
なおペプチドの絞り込みは、[4] Visualization でタンパク質のカバレージ情報を表示させている際、黄色のハイライト箇所である同定ペプチド部分をクリックする事でも行われます。

7-3. ペプチド情報 (Fig.7-1 [2])[2]の「ペプチド情報」欄では、選択したタンパク質あるいはクラスターグループにアサインされ、かつフィルターリング条件を満たしたすべての同定ペプチドが一覧表示されます(Fig.7-3)。

Fig.7-3「Protein」タブ ペプチド情報

配列や修飾、ペプチドのタンパク質上の位置、同定確率や質量といった情報が表示されます。必要に応じて各列の項目名称で降順や昇順の並び替えを行うことができます。またドラッグ＆ドロップ操作などで列の順番を入れ替えたり不要な項目を非表示にすることもできます。
「Quantified」のチェックの有無は、定量計算に使用される条件（一定数以上のフラグメントの検出など）を満たしタンパク質の定量計算に当該ペプチドが使用されているかどうかを表しています。
「Quantified Matches」は、全サンプルに対して定量計算に使用されたサンプルがいくつあるのかを表しています。
行の後半に表示される情報はデータの確からしさを評価する指標です（次頁 Fig7-4）。

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Fig.7-4「Protein」タブ ペプチド情報

ペプチド情報の欄で表示されている指標は、サンプル全体にまたがって評価した内容です。
「Probability」 : ペプチドの同定確率です。
「Fragment Consistency Score」: 強度値の算出に使用したフラグメントパターンの、サンプル間での一貫性を表す指標です。同定結果が間違えている、あるいは定量計算への使用に適さない可能性があるペプチドを評価する指標の一つです。「フラグメントのパターンの一貫性」とは Proteins 画面右下の”Chromatograms”→”Fragments”のグラフで表現されている各 Intensity 曲線についての、 サンプル間の一致度とも言えます。この指標の計算方法は以下の通りです。
n 個の DIA サンプルからなる実験で検出された各ペプチドについて、そのペプチドに割り当てられた
各フラグメントの強度を、各サンプルの強度の合計が 1 になるよう和で割ります。続いてサンプルと使用したフラグメント、値が相対強度の行列を構成します。各セル（M_ij)には、i 番目のサンプルにおける
j 番目のフラグメントの調整後の相対強度が含まれます。行列の各列は、サンプル間の単一のフラグメントの強度を表す「feature ベクトル」とみなす事ができ、各 feature ベクトルについて、その平均ベクトルからのユークリッド距離を算出します。ユークリッド距離の強度加重平均(以下式の avg)を使い、以下の式でFragment Consistency Score が計算されます。
(𝑓𝑐𝑠 = (1 − 𝑎𝑣𝑔/√2)

2

値が 1 に近いほどサンプル間の誤差が小さく、サンプル間の相関性がなく独立していると値が 0 に近くなります。サンプルが 2 つしかない場合は値の解釈に注意が必要です。
「Peptide Profile Correlation」:各ペプチドのペプチドプロファイルと平均ペプチドプロファイルとのピアソン相関の係数です。Technical replicate 単位でピーク強度の和を取りその値を元に標準化処理をした後、すべてのペプチドから平均値をとった「average profile」を作成してピアソン相関の相関係数を求めます。負の値の場合は逆相関があり、また 0 に近いと相関性がなく、他のタンパク質とペプチドが共有されているなどといった要因が影響している可能性が考えられます。
この表内で選択しているペプチドについて、各サンプルにおける検出状況をまとめたのがすぐ下に表示される「ペプチド-Query マッチ情報」（Fig.7-1 [3]）です。またペプチドを選択しダブルクリックするとSamples 画面に戻り、該当ペプチドを含むデータ（タンパク質）のみがリストに表示されます。

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7-4. ペプチド – Query マッチ情報 (Fig.7-1 [3])Fig.7-5「Protein」タブ ペプチド-Query マッチ情報 左側（上図）と右側（下図）すぐ上のペプチド情報テーブルで選択しているペプチドについて、各サンプルにおける検出状況をまとめたのが「ペプチド – Query マッチ情報 [3]」です (Fig.7-5)。主な項目について、以下に説明をします。
「Global Probability」「Global q-value」「Sample Probability」「Sample q-value」
項目名の最初に「Global」がついている項目は、該当ペプチドがどこかのサンプル 1 つ以上に存在する
確率や Percolator で計算した時の q-value を表します。ペプチド-Query マッチ情報の表の中で最も確率が高いサンプル 1 行にしか表示されません。一方「Sample」で始まる項目は、該当行のサンプルのみを対象として求めた Probability や q-value が表示されます。
「Quant. Intensity」
ペプチドの定量値です。フラグメントピークの XIC のピーク面積（定量値）を基に算出されています。
「# Quant. fragment」
定量計算に使用したフラグメントの数です。
「RT Start(min)」「RT Center(min)」「RT Stop(min)」該当ペプチドを検出し定量計算に利用した RT の開始・中央・終了の時間を示しています。

7-5. Visualization 情報 (Fig.7-1 [4])画面の一番下、Visualization は 7 つのタブから構成されています(Fig.7-6)。
-

Protein Sequence-

Protein Level Charts-

Statistics-

Peptide Intensities-

Fragment Intensities-

Chromatogram-

Fragmentation Table

Fig.7-6©2023 Scaffold DIA マニュアル「Protein」タブ Visualization 情報

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7-5-1. Protein Sequence タブ
画面(Fig.7-7)上部にはタンパク質の全配列とマッチしたペプチド領域が、画面下部ではタンパク質全長を1 行で表した状態で、ペプチドのマッチング状況を確認できます。

Fig.7-7「Protein」タブ Visualization 情報 Protein Sequence タブ

画面上部ではタンパク質のアミノ酸配列が表示されます。マッチしたペプチド部分が黄色のハイライトで表記、修飾がある部分は色のついた〇で囲まれています。黄色のペプチドをダブルクリックすると画面上のペプチド情報欄[2] でフィルターリングがかけられ、該当ペプチドのみが表示されます（この状況を解除するためには「Show all peptides」をクリックします）。
画面下部のカバレージについては、表示の棒状の枠全体がタンパク質全長を表しており、左が N 末端側、右が C 末端側です。枠の上には全長に対するペプチド残基長の割合（カバレージ）と、検出された修飾の総数が表示されています。枠内で黄色のラインで塗られている箇所がペプチドマッチを、黒い線が引かれた部分が修飾を表しています。
右クリックにより、表示されている情報を出力し各種フォーマットのファイルとして保存するメニューが現れるほか、配列をコピーしたり BLAST 検索にかけたりする事もできます。

[次頁に続きます]©2023 Scaffold DIA マニュアル

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7-5-2. Protein Level Chart タブ
選択しているペプチドが属するタンパク質について、定量値をグラフ表示します。定量値の表示項目はSummarization で選択しているレベルと連動しています。表示形式には箱ひげ図と棒グラフ、
ヴァイオリン図の 3 種類があります(Fig.7-8)

Fig.7-8「Protein」タブ Visualization 情報 Protein Level Chart タブ

棒グラフでは、メジアン値並びに誤差範囲が表示されます。
箱ひげ図では、四分位数並びに最大値と最小値が表示されます。
ヴァイオリン図は箱ひげ図と似ていますがデータの確率密度の情報も併せて表示されています。
それぞれグラフにカーソルを合わせると、ポップアップされたダイアログにグラフの主要な数字が表示されます。
[次頁に続きます]©2023 Scaffold DIA マニュアル

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7-5-3. Statistics タブ
検定に関する図表です。
Statistics table :検定に関連する数字をまとめた表で、実施した検定により表示される数字が異なります。例えば
ANOVA/t-検定の場合、「平方和」「自由度」「平均の平方」「F-統計量」「F-統計量の有意性」です。
Interaction Chart :ユーザーが一次変数と二次変数の間の交互作用効果の解釈を検討するための図です。
一次変数と二次変数の間に相互作用がない場合、線はほぼ平行になり、線の傾きは一次変数の効果を示します。線が平行ではないが交差しない場合、交互作用効果がないとは言えないため、二次変数がある
程度影響を及ぼしている事を理解した上で、一次変数の効果を検討することになります。線が交差する
場合 2 つの変数が有意な相互作用を示すことを意味し，一次変数の効果について一般的な結論を出すことは不可能と言えます。

7-5-4. Protein Intensities タブ

Fig.7-9「Protein」タブ Visualization 情報 Peptide Intensities タブ

Peptide Intensities タブには、Fig.7-9 のようにタンパク質にアサインされた各ペプチドの定量値を積み重ねた棒グラフが表示されます。タンパク質の定量値計算に使用された各ペプチドの全強度に対する割合を表しており、各ペプチドの影響度（寄与の度合い）がわかります。
データをまとめる単位は選択中のカテゴリーに連動します。またサンプル横断的にデータを見ながら組成の変わっている箇所に注目する事で、各ペプチドの定量評価における信頼度を検討する事もできます。例えばカテゴリー間で大きく割合が変動しているようであれば、該当ペプチドを信頼度の低いものとして除外する事を検討する必要があります。なお検証の結果もし除外を行いたい場合、ペプチド
情報欄の Quantified チェックボックスをオフにしてください。
図のバンドにマウスを合わせると、ペプチドの強度値も含むペプチドの情報が表示されます。さらにクリックするとペプチドのフィルターリングが行われます。（フィルターリングを解除するには、タブ上部のShow All Peptides をクリックしてください）。
ペプチドを識別するための凡例表示切替オプションも準備されており、表示数が多い扱いにくい場合は表示をオフにしてください。
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7-5-5. Fragment Intensities タブ「Fragment Intensities」タブでは、選択ペプチドについて定量計算に利用したフラグメントピークの定量値の割合が表示されます(Fig.7-10)。ペプチドの定量データの信頼度を評価する際等に利用できます。検証の結果もし除外を行いたい場合、ペプチド

情報欄の Quantified チェックボックスをオフにしてください。

Fig.7-10「Protein」タブ Visualization 情報 Fragment Intensities タブ

7-5-6. Chromatograms タブ
Precursor, Fragment それぞれにおける XIC、保持時間別の強度値です（Fig7-11）。

Fig.7-11「Protein」タブ Visualization 情報 Chromatgram タブ

左が Precursor、右が Fragment の図で、共に横軸は保持時間、縦軸が Intensity です。グラフ内で青くなっている領域が定量計算に使用された時間帯です。左の Precursor 図では、+1,+2 のアイソトピックについても併せて表示されています。右の Fragments の図では定量計算に使用されたフラグメントについて表示されています。検出されているものの定量計算には利用されていない©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved65フラグメントについては色のない点線で表示されています。Precursor, Fragments どちらの図においても、グラフ内の線にカーソルを合わせるとその線と凡例が強調表示されどの項目かわかります。
またドラッグ＆ドロップの操作でグラフを拡大表示する事が可能であるほか、右クリックで表示を微調整したり、画像やデータを保存したりする事も出来ます(次頁 Fig.7-12)。

Fig.7-12

Chromatgram タブ グラフ拡大

7-5-7. Fragmentation table タブペプチドの配列から計算されるフラグメントの m/z 理論値一覧の表です。さらに検出されたフラグメントを色分け表示しています (Fig.7-13)。

Fig.7-13「Protein」タブ Visualization 情報 Fragment table タブ©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved667-6. Similar Proteins タブ
Similar Proteins タブでは、マッチしたペプチドの重なり具合を見てリスト内の同定タンパク質間の類似度を確認する事ができます。類似タンパク質の候補として、protein inference にて良く使用される概念の話で使用される用語でいえば same protein, sub-set protein,並びに family protein に該当するタンパク質が表内に現れます。ユニークなペプチド(「Exclusive to」の列に色をつけて表示)やシェアされたペプチドがどれなのかをわかりやすく図示しています(Fig.7-14)。シェアペプチドは、そのシェアされているタンパク質の数により円マークの色塗り部分が 1/2, 1/3, 1/4 … と変わります。

Fig.7-14©2023 Scaffold DIA マニュアル「Similar Proteins」タブ

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8. Visualize 画面
8-1. Visualize 画面について

Fig.8-1

Visualize 画面

Visualize 画面では、主に定量的なデータの傾向をつかむのに役立つグラフを提供しています。
Visualize 画面には、「Quantitation」タブと「Principal Component Analysis」タブ、そして「Heatmap」タブの 3 つが存在します(Fig.8-1 赤丸部分)。
以降、それぞれのタブ内にある図について説明します。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved688-2. Quantitation タブ
Quantitation タブは４つのパーツから構成されます (Fig.8-2)。

② Quantitative
Scatterplot① Volcano plot

④ GO info③ Quantitative
Trend Chart & CVs

Fig.8-2

Visualize 画面 Quantitation タブ① Volcano plot (8-2-1, P.70)② Quantitative Scatterplot (8-2-2, P.71)③ Quantitative Trend Chart, Quantitative CVs (8-2-3, P.72)④ GO Term Pie Chart, GO Connections Graph (8-2-4, P.73)
以降、それぞれのグラフについて説明します。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved698-2-1. Protein Sequence
Volcano plot は 2 つのグループを比較する検定を行った時のみ表示されます（Fig.8-3）。x 軸はFold Change（ratio,かつ Log2 変換）、 y 軸は検定時に計算された p-value の Log10 にマイナスを掛けた値です。プロット １つ１つはタンパク質の定量データに対応しています。

Fig.8-3

Visualize 画面 Quantitation タブ Volcano plot

縦軸の値が上に行けば行くほど p-value が低く統計的に有意な差がある事を表し、また横軸については
0 から離れるほどサンプル間で発現量に差がある事になります。
プロットの色にも意味があります。Scaffold DIA 内で定めた「Significant Level」、例えば FDR や
FWER の閾値を超える条件を持つデータは緑、その基準未満で p ≦ 0.05 のデータは黄色で表示されます。この色分けは、Samples 画面の統計数値（p-value）表示列にも同じ条件が適用されています。
グラフの左側にはいくつかのオプションがあります。縦軸では補正後の有意なラインをグラフ内に表示
したり、横軸では比較サンプルの定量値が同じ（値が 0 になるライン）を表示したりする事ができます。
また「Multiselect Action」の項目には星を付けるオプションがあり、グラフ内で左クリックによる四角形
ドラッグ描写を行うと、その四角形に含まれるタンパク質に星印がつきます（Samples 画面で確認できます）。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved708-2-2. Quantitative Scatterplot「Quantitative Scatterplot」では選択した２つの要素の定量値をプロットした散布図が表示されます(Fig.8-4)。

Fig.8-4

Visualize 画面 Quantitation タブ Scatterplot

グラフ左の設定で、x,y 両軸に置くサンプル/選択項目を変更したり、 y=x の直線や回帰直線も表示させることができます。また「Multiselect Action」の項目には星を付けるオプションがあり、グラフ内で左クリックによる四角形ドラッグ描写を行うと、その四角形に含まれるタンパク質に星印がつきます（Samples 画面で確認できます）。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved718-2-3. Quantitative Trend Chart & CVs
Visualize 画面の左下には 3 つのタブ「Quantitative Trend Chart」、「Pre/Post Normalization」、そして「Quantitative CVs」の図が存在します。
「Quantitative Trend Chart」では、フィルター適用後のタンパク質すべてを対象に、定量値の分布に関する情報を様々なグラフ（箱ひげ図・棒グラフ・Trend Line・ヴァイオリン図）で表示しています。
「Pre/Post Normalization」タブでは、Normalization 前後の定量値について、箱ひげ図またはヴァイオリン図で比較する事ができます(Fig.8-5)。

Fig.8-５

Visualize 画面 Quantitation タブ Quantitative Trend Chart「Quantitative CVs」には定量値の信頼性を評価する２つのグラフが同時に表示されています(Fig.8-6)。グラフは Samples で選択されている Summary 単位による区分が適用されます。2 種類の表示のうち１つは CV50%の信頼区間ならびにその中央値の線です。以下図の場合、線と色分け区間で表現されているグラフの方になります。もう１つはカーネル密度推定値を使った分布となります。

Fig.8-6

Visualize 画面 Quantitation タブ Quantitative CVs©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved728-2-4. GO Term Pie Chart, GO Connections Graph
GO 情報に関しては２つのタブから構成されています。「GO Term Pie Chart」と「GO Connections
Graph」です。利用するためにはデータ取り込み後に「GO 情報の付与」（メニューの experiment -> Apply
GO Terms）を実行する必要があります。GO 情報について詳細は本資料の 15 章（P.108～）をご覧ください。
GO Term Pie Chart は、付与された Gene Ontology 情報を数え上げ円グラフにしたもの(Fig.8-7)
で、Biological Process, Cellular Component, Molecular Function それぞれの分類で描写させることができます。グラフの右上にグラフ描写に関するいくつかのオプションがあります。

Fig.8-7

Visualize 画面 Quantitation タブ GO Term Pie Chart「GO Connections Graph」は、 GO の項目とタンパク質を線で繋いだもので、GO で共通項の多い
タンパク質を可視化する図です(Fig.8-8)。色のついた項目が GO の項目で、白い項目がタンパク質です。

Fig.8-8

Visualize 画面 Quantitation タブ GO Connections Graph©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved738-3. Principal Component Analysis タブ
PCA 解析[主成分分析]とは、データのばらつきに影響を及ぼす「主成分」を見つけ、データの特徴を抽出する解析手法です。PCA 解析の詳細については、英文マニュアルの「Appendix I. How PCA is
Performed in Scaffold DIA(P.195～)」 をご覧ください。
Principal Component Analysis タブは４つのパネルから構成されています（Fig.8-9）。

Overview

Scores Plot
Fig.8-9

Scree Plot

Loadings Plot
Visualize 画面 Principal Component Analysis タブ-

Overview (左上,8-3-1)-

Scree Plot (右上,8-3-2)-

Scores Plot (左下,8-3-3)-

Loadings Plot (右下,8-3-4)です。次頁以降、各グラフについて詳しく説明します。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved748-3-1. Overview
主成分間における値のプロットです(Fig.8-10)。グラフ内の点はサンプルを表しています。グラフを選択した状態でプロットにカーソルを合わせると、主成分の組み合わせについて確認する事ができます。また
選択中のグラフに対応して左下の Scores Plot や右下の「Loadings Plot」が連動して表示変更されます。右下の「Fewer Principal Components」「More Principal Components」ボタンを押す事で、解析対象の主成分数を増減する事ができます。

PC1 が y 軸

寄与率

PC1 が
x軸

Fig.8-10

Visualize 画面 Principal Component Analysis タブ

Overview

8-3-2. Scree Plot
赤い線が各主成分の寄与率、青い線が寄与率の累積を表します（Fig.8-11）。

Fig.8-11

Visualize 画面 Principal Component Analysis タブ©2023 Scaffold DIA マニュアル

Scree Plot

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved758-3-3. Scores Plot
Overview で選択したグラフを拡大した、主成分間のスコア分布図です(Fig.8-12)。色のついた楕円は該当エリア内に同じ属性値を持ったデータが入るとみなした時の N%信頼区間で、N の数字はグラフ左のオプション(Confidence)で変更することができます。

Fig.8-12 Visualize 画面 Principal Component Analysis タブ

Scores Plot

8-3-4. Loading Plot
各タンパク質の主成分への寄与を表す分布図(Fig.8-13)で、絶対値が大きいほどその主成分への影響が大きいことを示しています。原点から離れているタンパク質に注目してください。「Multiselect Action」で気になるタンパク質に星印をつけ、Samples 画面で確認する事もできます。

Fig.8-13 Visualize 画面 Principal Component Analysis タブ©2023 Scaffold DIA マニュアル

Loadings Plot

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved768-4. Heatmap タブ
ヒートマップは 2 次元の表や行列で構成された複雑なデータセットを可視化する有力な方法のひとつです。類似性の高いデータを近さの基準に従って空間的にまとめつつ行と列を並び替えると同時に、各セルにあたる定量値について量の大小を表す色分けをして傾向をわかりやすくしています。
ヒートマップはデータ数が多すぎると意味が薄れるため、Scaffold DIA ではタンパク質数の上限を1000 に定めています。そのため 1000 を超えているケースでヒートマップを適用したい場合、ユーザーが事前に Samples 画面でデータ数を制限して 1000 未満にする必要があります。制限をする際にはキーワード検索や GO 並び替えで項目をピックアップするとともに、それらに対して星印を付して絞り込み表示に活用してください。（→P.51）
ヒートマップタブは 2 つの画面から構成されます。
-

Heatmap Landscape: ヒートマップの全体図 (8-4-1)-

Heatmap Details pane : ヒートマップのうち全体図で選択した内容についてのみ、より詳しい情報を表示した図 (8-4-2)

２つの画面のうちそれぞれ一方のみ、あるいは両方を表示するかどうかで３つの選択肢（ラジオボタン）があります(Fig.8-14)。

Fig.8-14

Visualize 画面 Heatmap タブ

8-4-1. Heatmap Landscape pane
行がタンパク質、列がサンプルに該当します。行・列ともに Samples 画面で選択した内容が反映されています。行列どちらもクラスタリングの結果を表すデンドログラムが記載され、その結果を基にデータが並び直されています。デンドログラム内のブロックをクリックするとその塊が選択されます。選択状態にある領域は灰色で表示されます。ブロックの内容について詳しい情報は、「Heatmap Details pane」にて確認できるほか、ブロックの内部における相同性が表示されます(Fig.8-14)。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved77ヒートマップのデータの内容を数字の CSV 出力したい時、あるいはグラフを図として出力したい時、
画面内で右クリックしてそれぞれの操作を実行できます(Fig.8-15)。

Fig.8-15 Visualize 画面 Heatmap タブ、コンテキスト

8-4-2. Heatmap Details pane
Landscape で選択されたブロックについて、タンパク質の名称や Description なども含めたより詳しい情報を確認する事ができます(Fig.8-16)。

Fig.8-16 Visualize 画面 Heatmap タブ、details info.

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved789. Analysis 画面
9-1. Analysis 画面のグラフについて
Analysis 画面では TIC と補正前後の LC 保持時間の誤差を確認する事ができます（Fig.9-1）。２つのグラフを上下並べて表示しています。横軸は共に(Reference) Retention Time (min) です。

Fig.9-1 Analysis 画面

上のグラフは、縦軸が TIC(Total Ion Current)です。TIC は MS1/ペプチドレベルのデータから計算
しています。x 軸である保持時間についてはアライメントの前と後、どちらでも表示可能です。グラフ上にあるチェックボックスにより表示の切り替えができます。
下のグラフは元データの RT とアライメント後の値との誤差（元データとリファレンスの差）を表しています。
どちらも凡例ならびに実線の上にカーソルを合わせると強調表示され、凡例との連動によりどのデータがどの曲線か、わかりやすくなります。

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7910. Publish 画面
10-1. Publish 画面について
Publish 画面は、検索パラメータ一覧を確認したり、論文や Repository site で記載する Method の
文章にまとめた内容を表示したりする「Experiment Methods」タブと、SQL コマンドを実施してテーブル（ファイル）を出力する「SQL Report」タブから構成されています(Fig.10-1)。

Fig.10-1 Publish 画面

以降、Experiment Method タブ (10-2)、SQL Report タブ (10-3) についてご紹介します。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved8010-2. Experiment Methods タブ
Experiment Methods タブでは表示内容が大きく右側と左側に分かれています。
左側は Scaffold DIA で指定したパラメータが、ツリー上にまとめられて表示されています（Fig.10-2）。

Fig.10-2©2023 Scaffold DIA マニュアル

Experimental Method 左側

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81

一方右側には、論文やレポートの Method 部分を意識した、解析手法についてまとめられた文章が表示されます (Fig.10-3)。

Fig.10-3

Experimental Method 右側

これらの文章は、クリップボードにテキストとして保存させたり、CSV 形式でデータを出力させたりすることができます。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved8210-3. SQL Report タブ
Scaffold DIA から、オープンソースのリレーショナルデータベース管理システム：SQLite のファイルを出力する事ができます。SQL Report タブでは SQLite の GUI が使用可能です。ユーザーは SQLite のコマンドを実行する事で、データを好きなように集め、出力する事ができます。

Fig.10-4

SQL Report タブ

出力される実験ファイル、sdia(sfdb)のスキーマについては、英文マニュアルの「Appendix A.
Structure of Scaffold DIA files」（P.172～）をご覧ください。

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8311.定量の手法と検定機能
Scaffold DIA ではフラグメントピークの強度情報を基にしたラベルフリーの定量解析をサポートしています。値はサンプル間で Normalization する事ができ、因子レベルや治療法の組み合わせによる発現の違いを確認するため、様々な検定を適用する事ができます。なお基本的に Normalization は実験間の比較レベルにおいてタンパク質総量が同じである前提の下で行われており、総量が異なるケースにおいてNormalization を行う事は適切ではありません。

11-1. 定量の手法について
11-1-1. Peptide Counting
Scaffold DIA では定量解析の一環として、以下の２つのペプチド数を Samples 画面で表示可能です。
Display type を通じて表示内容を選択する事ができます。
・Total Quantified Peptide Count
EncyclopeDIA によって同定され定量に使われているペプチドについて、シェアペプチドかどうかに関わらずタンパク質毎にカウントした数字です。
・Exclusive Quantified Peptide Count
EncyclopeDIA によって同定され定量に使われているペプチドについて、シェアペプチドを除きユニークペプチドのみをカウントした数字です。
もう１つ重要な点として、これらの表示におけるペプチドカウント数は正規化されているのでご注意ください。Samples テーブルに表示される値を調整し、各列のユニークペプチドの合計数が同じになる
ようにします。選択したまとめのレベルに応じ、Samples テーブルで表示される列の数は変動し、カウント
も変動します。

11-1-2. ラベルフリー定量■ ペプチドの定量、タンパク質の定量
Scaffold DIA では XIC におけるフラグメントイオンのピーク強度をベースとしたラベルフリー定量を採用しています。プリカーサーイオンのピーク強度は定量計算そのものには利用されていません。
Scaffold DIA では定量の対象とするフラグメントの選定において、他のフラグメントイオンの干渉の影響ができるだけないきれいなピークを選ぶため、干渉度合いを表すスコアによって評価しています。
選ばれたフラグメントピークについて、バックグラウンドの影響も加味して差し引いた面積強度を算出し、その和がペプチドの定量値となります。場合によっては、検索したスペクトルライブラリのピークとしては含
まれていないフラグメントが定量されることがあります。これは、EncyclopeDIA がペプチドの理論的なフラグメンテーションパターンも考慮しており、理論的なスペクトルから追加のフラグメントイオンが同定された場合、それらを選択して定量計算に加える事が可能である、という事です。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved84選択されたペプチドについては、全サンプルで見た干渉の程度や、ユーザーが指定したパラメータに合致するかを判定したスコアを元に取捨選択され、タンパク質の定量値計算に利用されます。
■ Normalization
Normalization はユーザーが Experimental Design ダイアログで指定した Technical Replicates
レベルで行われます（設定前は全データを１つのグループとして見ています）。
まず intensity の和が Log10 に変換され、Experimental Design で TR [Technical Replicate] のグループと認定されたデータ間で、各サンプルの四分位数における数字が全体平均の四分位数における数字と一致するように調整され、四分位数間は直線で近似します。調整後、Log10 から通常の数字に戻し、TR レベルで和を計算して結果画面に表示されます。
Normalization は画面にあるチェックボタンで実施する/しない を切り替える事ができます。
■ 欠損値
欠損値は Scaffold DIA の様々な計算に影響を与えるため、適切な処理をする必要があります。値をより高いレベルで要約したり、統計的なテストや主成分分析を行ったりするため、測定値が得られなかった
場合に適切な値を入力する必要があります。
DIA 分析における欠損値はサンプル中にペプチドが存在しないか、または非常に低い強度で存在するかのいずれかの結果であると仮定し、Scaffold DIA では「Quantile Regression for Imputation of LeftCensored data 法*」（QRILC）を使用した値の代入を行っています。
* Cosmin Lazar (2015): imputeLCMD v2.0". R package version 2.0
QRILC は，観測値（非欠損値）と欠損値および観測値の数をもとに想定した正規分布から，欠損値がどの観測値よりも小さいと仮定して値を推定します。
また欠損率が 50％を超えるケースでデータをまとめる場合、QRILC で推定した平均値を使用します。
なおその場合部分的に欠損しているものとして扱い、値を括弧で囲んで表示します。
欠損値の割合が全体データ数に対して X%の場合、推定値は推定分布の X パーセンタイル以下になる
ようにします。
QRILC の参照実装を提供する R パッケージ "imputeLCMD v2.0 "もありますので、そちらの文章も併せてご参照ください。
（https://www.rdocumentation.org/packages/imputeLCMD/versions/2.0/topics/impute.QRILC）．
また英文マニュアルの「 Appendix.D Missing Value」(P.178～)にも説明がございます。

[次頁に続きます]©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved8511-2. 検定
Scaffold DIA ではいくつかの検定機能を有しています。検定機能を実行するためには、Experimental
Design の設定が必要となります。検定ならびに Experimental Design の設定は、「Configure Sample Organization and Statistical Analysis」ダイアログにて行います。このダイアログを表示させるには以下 4 通りの操作があります。
-「Organize」View の画面左下にある「Configure Experimental Design and Statistical
Analysis」ボタンをクリック-

menu の「Experiment」-> 「Quantitative analysis」を選択-

ツールバーにある「Quantitative analysis」アイコンをクリック-

ツールバーの「Summarization」選択肢内にある「Edit」をクリック
選択時に開くダイアログは、「Sample Hierarchy」と「Statistical Analysis」２つのタブで構成されています。
Experimental Design で選択可能な項目の内容については「5-6. 選択可能な 3 種類のExperimental Design について(P.41～)」を、選択内容の設定については「5-7. Experimental
Design の設定(P.44～)」をご覧ください。
検定を実行すると、Samples 欄に検定に関する数字を表示する列が現れます。選択した検定によって表示される数字は異なります（p-value や q-value など）。セルは、有意で設定した Error rate を超えている場合は緑色で、また有意だが Error rate の設定を超えていない場合は黄色に色塗りされ、一方有意でない場合は無色となります。
以下に、各データ構成タイプで選択可能な検定についてその内容を説明します。主な観点は「サンプル数」と「パラメトリック/ノンパラメトリック」となります。

11-2-1. Basic Design で実施可能な検定
・ t-test / ANOVA
取り扱うグループまたはカテゴリー間の平均値の等質性を評価する検定で、カテゴリー間に差があるかどうかを示します。両側検定を行います。3 群以上が ANOVA で、解析対象が 2 群しかない場合 t 検定となります。
・ Permutation Test
2 群あるいは 3 群以上のグループ比較で有意な差があるかを検定できる手法です。ベースは F 検定
ですが、群間のランダムなデータを入れ替えて F 値を計算し続けます。Scaffold DIA では 10000 回の計算を行い、入れ替えた際に入れ替える前の F 値を超えた回数を 10000（試行回数）で割った値をp-value とします。

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マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved86

・ Mann-Whitney U Test
独立した観測値の２つの標本のうち、一方の値が他方の値よりも大きい傾向にあるかどうかを評価する
ノンパラメトリック検定です。２つの中央値が等しいかどうかに依存せず、２つの標本データの順位を使用します。比較サンプル数がきっちり２つでないと使用できません。

・ Kruskal-Wallis Test
順位別一元配置分散分析とも言え、標本が同じ分布に由来するかどうかを検定するノンパラメトリックな手法です。しかし同じ分布の形とスケールである事を前提としています（中央値が同じである事を求めていません）。独立した 3 つ以上のサンプルに適用可能です。帰無仮説は「サンプルが由来する集団が同じ
中央値を持つ」であり、検定が有意な時、少なくとも 1 つのサンプルが他のサンプルとは異なる事を意味します。この検定は差がどこで発生したのか、どれだけの差が発生したのかを特定する事はできません。

11-2-2. Repeated Measures で実施可能な検定
・ Repeated Measures ANOVA/Paired t-test
反復測定分散分析(rANOVA)はパラメトリックな手法です。3 つ以上の条件の違い（経時変化など）を考慮した繰り返し測定が行われている場合、それらの測定の母平均が異なるかどうかを評価しています。
Paired- t 検定も同様ですがこちらはサンプルが２つの時にとられる手法です。正規分布でカテゴリー間の分散が等しい場合に適用可能です。

・ Wilcoxon Signed-rank test
ノンパラメトリックな手法でサンプル数は 2 つの時に限定されます。繰り返し測定の母平均の順位が異なるかどうかを評価しており、２つのサンプルが独立で同一の分布であることを前提としています。
パラメトリックな手法である Paired t-test が適用できない際にご利用を検討してください。

・ Friedman test
ノンパラメトリックな手法で 3 つ以上のサンプルがある時に適用する手法で、母平均順位が異なるかどうかを評価しています。サンプルが独立で同一の分布であることを前提としています。パラメトリックな手法である rANOVA の代替方法であり、分析データが正規分布でない場合に適用してください。

11-2-3. Two-way で実施可能な検定
・ Two-way ANOVA
二元配置分散分析では２つの独立変数がタンパク質の量に与える影響を評価します。それぞれの独立
変数の主効果を測定し、さらに変数間に有意な相互作用があるかどうかも判定します。

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・ Randomized Block ANOVA
Secondary 分析カテゴリー（この場合はブロック因子）の効果をコントロールしながら、Primary 分析
カテゴリーの効果を評価します。Secondary 分析カテゴリーそのものの効果を評価するものではありませんが、ブロッキング効果を評価するオプションとして、Primary 分析カテゴリーと Secondary
分析カテゴリーとの間に有意な相互作用があるかどうかを評価する事ができます。

・ Friedman test
ノンパラメトリックな手法で 3 つ以上の条件で測定が行われた時、母平均順位が異なるかどうかを評価しています。サンプルが独立で同一の分布であることを前提としています。分析データが正規分布でない場合に適用してください。

11-3. 多重検定補正
多重検定において第一種の過誤（帰無仮説が真であるにもかかわらず偽として棄却してしまう誤り）を防ぐため、p 値と調整し直す処理を施す事があります。シンプルな方法としては Bonferroni 補正という手法があります。これは p を検定数 N で割った p/N を新たな基準として使う方法ですが、この基準では厳しすぎて False Negative が増えすぎてしまうのが問題です。Scaffold DIA ではその点を考慮した２つの補正方法を採用しています。
-

ホッホベルクのステップアップ手順＆ホルムのステップダウン (FWER)-

BH 法 (FDR)■ FWER とホッホベルクのステップアップ＆ホルムのステップダウン
Bonferroni の不等式をベースとした、単純な Bonferroni 補正より積極的に同定タンパク質を拾える補正を行って Family-wise error rate (FWER)をコントロールする手法です。「ホッホベルクのステップア
ップ」と「ホルムのステップダウン」の２つをサポートしています。
詳細については 英文マニュアルの 「Appendix G. Controlling the Family-wise Error Rate」（P.184～）をご覧ください。
■ FDR と BH 法
Scaffold DIA では FDR (False Discovery Rate)の計算を、Benjamini-Hochberg 法で計算しています。FDR ペプチドやタンパク質で使用している FDR とは基本コンセプトが同じあるものの中身は大きく異なりますのでご注意ください。

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8812. タンパク質のグループ化、クラスター化
12-1. 同定タンパク質のグループ化、クラスター化
Scaffold DIA で表示される同定タンパク質は、シェアペプチドの情報を基に類似タンパク質がグループ化、クラスター化されます。クラスター化における基準について、menu の experiment -> Protein
Clustering-> Shared Evidence clustering を選択する事によって現れるダイアログで変更可能です(Fig.12-1)。

Fig.12-1

Cluster Proteins with Shared Evience ダイアログ

類似度合いの評価については、二つのタンパク質 A,B のペプチドシェア度合いを表す L(A,B)と、閾値のλによって定義されています。詳細は英語マニュアル Apendix .Shared Evidence Clustering Algorithm(P.180～)をご覧ください。パラメーターL (A,B)は、以下のように計算されています。

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L(A,B) をλと比較して基準を満たす時、タンパク質がクラスター化されます。
ダイアログ内各項目の選択肢とλはそれぞれ次頁の通りです。
Perfect shared evidence protein groups
λ= 1 、すなわち L(A,B)=1 で A と B が same-set でないとグループ化されません。最低限の設定レベルとして常にオンになっているため、グレイアウトして設定が変更できないようになっています。
Moderate shared evidence clusters
λ= 1/3 を基準として L(A,B)が 1/3 以上の時グループ化されます。「Perfect shared evidence proteingroups」と「Any shared evidence clusters」の項目の間に定められた設定です。
Any shared evidence clusters
λ= 0 を基準値としており、L(A,B)が 0 より大きい時、すなわち１つでもシェアペプチドがあればクラスター化されます。MASCOT などで採用されている基準と同等です。
なお、「Moderate shared evidence clusters」と「Any shared evidence clusters」の両方にチェックが入った状態の場合、サブクラスターが表示されます。大きなクラスターは Moderate shared evidence
clusters の基準が、その中のサブクラスターは Any shared evidence clusters の基準が適用されます。

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Scaffold DIA では様々な内容のファイル出力が可能です。メニューバーの「Export」にまとめられています。
・ Export Attributes File
サンプルデータの属性設定値である Attribute 設定、並びに raw データと attribute との関連を記した Scaffold DIA 用のフォーマットのテキストファイルを出力します。Organize 画面の「Export
Attributes File…」ボタンと同じです。出力したファイルは Organize 画面で再び取り込む事ができます。同じデータで異なる条件を適用する

再検索などに利用します。

・ Export Samples Report to Excel
Samples 画面で表示される内容、タンパク質の定量値のレポートを CSV 形式（コンマ区切りのテキストファイル）で出力できます。出力前には Fig.13-1 のような Export する定量値を選択する
ダイアログが現れます。Samples 画面では一つしか表示されない定量値ですが、出力時には複数選択する事も可能です。Normalization の設定も個別に行う事ができます。

Fig.13-1

Export samples ダイアログ

・ Export Peptide Report to Excel
Proteins 画面の上、Peptide Pane の内容に対する情報が、1 タンパク質でなく Samples 画面で表示されているすべてのタンパク質について CSV 形式で出力されます。

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・ Export Peptide Match Report to Excel
Proteins 画面の中段、Peptide Match Pane の内容に対する情報が、1 タンパク質でなく Samples
画面で表示されているすべてのタンパク質について CSV 形式（コンマ区切りのテキストファイル）で出力されます。「Export Peptide Report to Excel」と異なりファイル情報などは出力されません。
・ Export Publish Report to Excel
Publish 画面、「Experiment Methods」タブの左側に表示されているパラメータの一覧情報がCSV 形式（コンマ区切りのテキストファイル）で出力されます。
・ Export Workflow
検索時のパラメータファイルをまとめた「Workflow」ファイルを出力できます。New ボタンを押してデータ取り込みを行う際に現れるダイアログ内にある「Save Workflow as …」ボタンと同じです。
保存したファイルは別の解析で import する事もできます。別の解析で同じ検索条件を複数回適用
したい場合に利用します。
・ Run SQL Query for Export
Publish 画面の「SQL Report」 タブ画面を開きます。

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9214. Prosit との連携によるライブラリフリーサーチ
Scaffold DIA では検索の対象とするライブラリとして、Prosit により計算されたピークリスト並びに保持時間情報を含むデータ(各関連資料にて”DLIB”と記載しています)の使用をお勧めしています。
Prosit は Wilhelm と Kuster のグループによって開発されたディープラーニングアルゴリズムです。
Scaffold 上で配列データベース(FASTA)を指定する検索と比較すると保持時間やピーク強度といった予測値を持つことにメリットがあり、また DDA ライブラリ検索と比較すると事前の DDA 検索を必要とせず、DDA 結果にとらわれない（DDA で同定できなかったペプチドもターゲットとできる）点でメリットがあります。ただし DLIB 検索では修飾パターンとして現段階ではシステインのカルバミドメチ
ル化(固定)しか考慮していない事にご注意ください。
この章では、Scaffold DIA で使用する DLIB の取得方法について以下２つをご案内いたします。
14-1. Proteome Software 社が公開している DLIB ファイルを利用する
14-2. 準備した FASTA ファイルを元に Prosit を利用して DLIB ファイルを作成する
また取得した DLIB ファイルについて、
14-3. DLIB 並びに FASTA ファイルを Scaffold DIA にセットする方法もご紹介します。

14-1. Proteome Software 社が公開している DLIB ファイルを利用する
Proteome Software 社にて、いくつかの生物種については事前に計算を行った DLIB ファイルと対応する FASTA ファイルを公開しています。作成パラメータは Tab.14-1 の通りです。
https://support.proteomesoftware.com/hc/en-us/articles/360035151172-Prosit-DerivedSpectral-Libraries-for-Scaffold-DIA-Searches

Parameter

Setting

Charge Range

2-3

Maximum Missed Cleavages

1

m/z Range

396.4 - 1002.7

Default NCE

33

Default Charge

3

Tab.14-1 Proteome Software 社で公開している DLIB ファイルの Library 作成パラメータ©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved932022 年 12 月末現在、以下の生物種について準備しています (表記は公開サイトの内容に準ずる,
Fig.14-1)
Coronavirus （または plus Human）, Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, Daniorerio, Drosophila melanogaster, Escherichia coli(strain K-12), Homo sapiens, Mus musculus,
Rattus norvegicus, Saccharomyces cerevisiae
利用したい生物種について、”DLIB”と”FASTA” を両方ともダウンロードしてください。
取得したファイルを Scaffold DIA で利用する方法については、「14-3.DLIB 並びに FASTA を
Scaffold DIA にセットする方法 (P.106)」をご覧ください。

Fig.14-1

Proteome Software 社が公開している DLIB と FASTA©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved9414-2. FASTA ファイルを元に Prosit を利用して DLIB ファイルを作成
Proteome Software 社で予め準備されている DLIB は対象の生物種が限られています。また FASTA
エントリーの対象を Uniprot 内の reviewed (=Swissprot に相当)に限定しています。必要に応じて公開されているもの以外の生物種を利用したり unreviewed (=TrEMBL に相当)を加えたいなどといった調整が必要な時、さらにはそれらとは全く別の FASTA ファイルを利用したい時は、ご自身で DLIB を作成することができます。作成の例として、Uniprot-reveiewed にて生物種 「Oryza sativa」に絞り込んだ
データベースの作成についてご説明いたします。
DLIB 作成のステップは以下の通りです。
14-2-1. FASTA ファイルを取得する (例:Uniprot サイト)
14-2-2. Scaffold DIA で Prosit 用 のインプットファイルを作成する
14-2-3. Prosit 公開サイトにてペプチド配列情報から計算を行う
14-2-4. Scaffold DIA で Prosit 出力ファイルと FASTA ファイルから DLIB ファイルを作成する
以降、順にご説明します。

14-2-1. FASTA ファイルを取得する(例:Uniprot サイト)
FASTA ファイルを準備します。FASTA はどこから取得したファイルでも使用可能ですが、Gene
Ontology 情報に紐づけができるデータベースとして、Uniprot データベースの使用をお勧めしており、ここでは Uniprot サイトからファイルを取得する例をご紹介します。
Uniprot に登録されているタンパク質が表示されます。
Uniprot サイト（https://www.uniprot.org/）にアクセスし、Proteins をクリックします(Fig.14-2,赤丸)。

Fig.14-2©2023 Scaffold DIA マニュアル

Uniprot サイト

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved95検索対象を reviewed,しっかりしたアノテーションがついているデータのみにしたい場合は「SwissProt」
あたりをクリックします(Fig.14-2,黄色枠)。Unreviewed、幅広いデータのみを対象としたい場合は「Unreviewed」のあたり((Fig.14-2,赤色枠))をクリックします。選択しない場合は両方のデータベースが選ばれている状態(Uniprot データベース)です。

Fig.14-2

UniprotKB protein table

また、左フレームにある「Popular organisms」で表記されている生物種に選択したい内容をクリックすると、該当生物種に限定されたタンパク質のみが表示されます。目的の生物種がリストにない場合、Filter by taxonomy をクリックします（Fig.14-3 緑色枠）。

Fig.14-3©2023 Scaffold DIA マニュアル

UniProtKB 左フレーム拡大

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved96生物種名を入力すると、候補が現れます。適切な内容を選択して Search ボタンを押すことで生物種の絞り込みが行われます(Fig.14-4)。

Fig.14-4

taxonomy filter で適切な生物種を選択

生物種別のタンパク質リストに変わります。変更後のエントリー数は生物種別のタンパク質リストに変わります。変更後のエントリー数は左側の”Status”で（）内に表示されている数字や一覧の上の数字で確認ができます(Fig.14-5 赤色枠)。使用に適切かどうかは、想定される生物種の遺伝子数と比較しながらご検討ください。

Fig.14-5©2023 Scaffold DIA マニュアル

Filter 適用後の UniProtKB

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved97

内容を確認後、ファイル取得を行います。画面上部の「Download」(Fig.14-6)をクリックし、Format
として “FASTA(canonical)”を選択します。Compressed / Uncompressed はどちらでも結構ですが、圧縮されている形式が Windows 標準では解凍できない”gz”ですので、それを解凍できる

アプリケーションを持っていない方は”Uncompressed”を選択して下さい。
全ての項目を選択後、「Download」ボタンを押すとファイル取得(ダウンロード)が実行されます。

Fig.14-6

UniProtKB の”Download”

Fig.14-7 UniProtKB の”Download”オプション[ 参考 ] 生物種情報を特定するために NCBI の Taxonomy サイトが利用できます。
上記操作で「Popular organisms」で生物種を指定する際、名称の類似性などからターゲットとする対象を限定するのが難しいケースがあります。Popular organisms の候補選択肢として現れる文字列の後ろに表示されている数字は NCBI の TaxID です。この数字について、NCBI の Taxonomy サイトにて事前に調べておくと候補の中から自らのターゲットとなる生物種を選びやすくなります。以下その操作についてご紹介します。
NCBI の Taxonomy サイト
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
へアクセスします。

©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved98画面上部の検索枠で、生物種名による検索を行います。キーワードを入れて「Search」ボタンを押します(Fig.14-8)。

Fig.14-8 NCBI Taxonomy 検索欄

検索結果が表示されます。目的の生物種名のハイパーリンクをクリックします(Fig.14-9)。

Fig.14-9 NCBI Taxonomy 検索結果

遷移画面にて、該当生物種の Lineage(系統)が表示されます。選択項目が正しい階層・属・種・株であるかを確認しながら、ターゲットとする項目のハイパーリンクをクリックします(Fig.14-10)。

Fig.14-10

NCBI Taxonomy 検索結果 Lineage 表示©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved99遷移画面にて、NCBI の Taxonomy ID をチェックします。以下図(Fig.14-11)であれば「4530」です。
この数字を記録しておき、Uniprot で生物種を特定する際の識別情報として利用してください。

Fig.14-11

NCBI Taxonomy 検索結果 各生物種の情報表示画面

14-2-2. Scaffold DIA で Prosit 用のインプットファイルを作成する
FASTA を取得したら Scaffold DIA を起動し、menu の Tools -> Convert FASTA to Prosit CSV
を選択します(Fig.14-12)。

Fig.14-12

Tools -> Convert FASTA to Prosit CSV©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved100FASTA を選択し(Fig.14-13)、パラメータはこだわりがない限り基本的にはデフォルト設定で「OK」
ボタンを押してください。FASTA ファイルと同じ場所に CSV ファイルが作成されます。

Fig.14-13

Convert FASTA to Prosit CSV ダイアログ＊ダイアログ内にも記載がありますように、この機能を利用され論文公開・学会発表をされた場合、リンクが貼られている論文(Searle et.al 2020)の引用をお願いしています。

14-2-3. Prosit 公開サイトにてペプチド配列情報から計算を行う
Prosit のサイトへアクセスし、「SPECTRAL LIBRARY」をクリックします（Fig.14-14 赤枠）。
https://www.proteomicsdb.org/prosit/

Fig.14-14©2023 Scaffold DIA マニュアル

Prosit サイト

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Scaffold DIA で作成した Prosit 用の CSV を指定するため「Next」ボタンを押します(Fig.14-15)。

Fig.14-15「Settings」選択内容

遷移画面にて画面左側のボタンをクリックし、Scaffold DIA で作成した CSV ファイルを指定してから「Next」ボタンを押してください(Fig.14-16)。

Fig.14-16©2023 Scaffold DIA マニュアル

Upload Files 選択項目

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved102

続いてピーク強度並びに保持時間の予測モデルの選択を行います。適切な内容を選び「Next」ボタンを押します。各モデルについての詳細は、論文 https://www.nature.com/articles/s41467-021-23713-9などをご参照ください（概ね名前から内容をご判断いただいて問題ないと思います）。

Fig.14-17

Model 選択項目

出 力 の フ ォ ー マ ッ ト を 選 び ま す 。 こ こ で は ”Generic text” を 選 択 し て 下 さ い (Fig.14-18) 。
選択後”submit”ボタンを押すことで計算が実行されます。
*フォーマットを.MSP にして、scaffold の変換で .MSP→ELIB を選択した場合も、作成後のファイルは目的のDLIB と同じものができます。何らかのエラーなどにより以下ご案内する方法で DLIB が作成されない場合がありましたらそちらの迂回策をお試しください。

Fig.14-18©2023 Scaffold DIA マニュアル

Model 選択項目

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved103計算には時間がかかります。Task の ID が表示されますが、この TaskID の情報をどこかに残しておくと、万が一ブラウザを閉じてしまった場合でも後でアクセスすることが可能です。
例えば以下のように Task ID が示されている場合、

Fig.14-19

Prosit サイト Task ID 表示

URL は以下の通りとなります（後ろの部分がタスクの ID です）。
https://www.proteomicsdb.org/prosit/task/D907DA69FAC698CA2D23D4BDFBBC5144

計算が終わると以下のようにファイル取得が可能となります。「Download」ボタンを押してください。
ファイルは zip 形式で圧縮されていますので、(windows なら)右クリック→すべて展開、で解凍できます。

Fig.14-20©2023 Scaffold DIA マニュアル

Prosit サイト Task ID 表示

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved10414-2-4. Scaffold DIA で Prosit 出力ファイルと FASTA ファイルから DLIB ファイルを作成する＊以降 14 章では図の番号を省略します。
Scaffold DIA を起動し、menu の Tools -> “Convert Prosit/Spectronaut CSV to DLIB”を選択します。

時間がかかる可能性がある旨警告するダイアログが現れます。「OK」ボタンを押してください。

Prosit から得た CSV ファイルと、Uniprot サイトから取得した FASTA ファイルを選択して OK ボタンを押します。

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ファイル作成が開始します。以下ダイアログが消えるとファイル作成が完了しており、Prosit から出力された CSV ファイルと同じ場所に DLIB ファイルが作成されています(拡張子 :.dlib)。

14-3. DLIB 並びに FASTA ファイルを Scaffold DIA にセットする方法

Menu の File -> Open Library manager
ま た は ア イ コ ン な ど で Library manager を起動します。

“ Add Library” ボタンを押します。

準備した DLIB ファイルを選択します。続いて、新たに表示された DLIB ファイルの行を選択した状態で右クリック→“Associate with FASTA”を選択します。

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DLIB と対になっている FASTA (あるいは Prosit で DLIB 作成時、最初に取得した FASTA)を選びます。

Library Manager に追加 DLIB がセットされました。

検索時に Library manager をご利用頂く事で、DLIB と FASTA の選択がスムーズになります。

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10715. Gene Ontology
Scaffold DIA では、各タンパク質の Gene Ontology の情報を結果画面に表示させる事が出来ます。
また同定タンパク質リストの各タンパク質にアノテーションされた Gene Ontology 情報をまとめてグラフ表示させる事ができます。Gene Ontology 情報を適用させるためには、事前に関連ファイルを
ダウンロードし Scaffold DIA に登録させる必要があります。

15-1. Gene Ontology ファイルを Scaffold DIA にセットする方法
Edit -> Edit GO term options で「GO Term Configuration」ダイアログを開きます。
「GO Annotations」タブをクリックして画面を開きます(Fig15-1)。

Fig.15-1

GO Annotations ダイアログ、GO Annotations タブ

GO Annotations タブでは、現在 Scaffold DIA でセットされている GO ファイルが表示されます。
新たな項目を加えるため、画面下部の「Import Annotations」ボタンをクリックすると、新たなダイアログ[「Add GO Annotation Database」が現れます(Fig.15-2)。

Fig.15-2

Add GO Annotation Database ダイアログ©2023 Scaffold DIA マニュアル

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108Source の項目をクリックすると、一覧に取得可能な各種生物種/種類 の GO ファイルが現れます。適切な項目を選び「Add」ボタンを押すことで、ファイルのダウンロードならびに Scaffold DIA へのセットが自動的に行われます。
同一生物種で複数の種類がありますが、どれを選べばよいか判断がつかない時はとりあえず後ろに何もついていない項目を選んでください。例えば Fig.15-3 で Chicken であれば「goa_chicken」です。

Fig.15-3

Add GO Annotation Database ダイアログ 「Source」項目

上記オプションは Scaffold DIA がオンラインの時でかつセキュリティ的にこの操作が問題ない時のみ使用可能です。上記オプションが適用できない場合でも、必要なファイルを別の場所で取得し、Scaffold DIA にセットする事も出来ます。取得したファイルをセットする時には「Choose file…」ボタンを押します。
取得するべきファイルの場所については、Source で取得したい項目を選んだ際にその下に表示される
URL を参照してください(Fig.15-4、赤で囲われた部分)。

Fig.15-4

Add GO Annotation Database ダイアログ 「Source」項目©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved10915-2. Scaffold DIA の各タンパク質に Gene Ontology 情報を表示させる方法
15-1 でセットした Gene Ontology ファイルの情報と同定タンパク質との紐づけと表示を行う事が出来ます。Gene Ontology については非常に多数の項目がある中で、ユーザーが事前にどの項目を表示させるのかを選択しておく必要があります。

15-2-1. 表示する GO 項目を選択する
Edit -> Edit GO term options で「GO Term Configuration」ダイアログを開き、「Displayed GO
Terms」タブをクリックします。
画面上部が Gene Ontology の分類すべて、画面下部がその中でピックアップして Scaffold DIA で表示する項目となります(Fig.15-5)。

Fig.15-5

GO Term Configuration ダイアログ 「Displayed GO Terms」タブ©2023 Scaffold DIA マニュアル

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110ツリー構造となっている GO 情報から目的の項目を探し、その項目を選択した上で画面中央の”Add”
ボタン(Fig.15-6,赤で囲われた部分)を押すと、下の”Selected GO Terms”項目へ移り、結果画面に該当項目が表示されるようになります。

Fig.15-6

GO 項目の選択と Add ボタン

逆に現在設定されている表示項目を外したい場合、その項目を選び”Remove”ボタンを押すことで実施できます(Fig.15-7)。

Fig.15-7©2023 Scaffold DIA マニュアル

GO 項目の選択と Remove ボタン

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved11115-2-2. タンパク質と GO 情報との紐づけを行う
Edit -> Edit GO term options で「GO Term Configuration」ダイアログを開き「GO Annotations」
タブをクリックして、適用したい GO ファイルを選択して「OK」を押してください(Fig.15-8)。

Fig.15-８

GO ファイルの選択

続いて、Experiment -> Apply GO Terms ->Apply All annotations を選択すると、Gene Ontology の情報が表示されます(Fig.15-9)。

Fig.15-9

GO 情報の表示[Samples 画面]

GO 情報の表示では、円のマークが全塗りと中が空いているものがありますが、これは情報の信頼度を表します。全塗りのものは信頼度が高い、人間の実験者やキュレーターの確認を経ている情報で、中が空いているのはコンピューターのアルゴリズムによるアノテーションです。GO ファイル内にある Evidence©2023 Scaffold DIA マニュアル

マトリックスサイエンス株式会社 All Rights Reserved112code 情報に基づいています。Code とそれらを Scaffold DIA でどのように表示するかについては
Tab.15-1 をご覧ください。

Tab.15-1

GO 情報の Evidence のコードと Scaffold DIA での表示(Type of Circle)

GO 情報については、Samples 画面で並べ直しを実施できるほか、Visualize で項目をカウントした
円グラフ、ならびにタンパク質と項目の関係性を表示した Connection graph を表示させる事も可能です（8-2-4,P.73～）。

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11316. デモデータと追加情報のご案内
16-1. デモデータについて
Scaffold DIA にはデモデータが準備されています。デモデータは
Help -> Open Demo Files
で開くことができます。

16-2. Appendix について
本ソフトウェアを使用するにあたり、特に計算方法について付録として英文マニュアルに説明がございます。ご不明な点がございましたらそちらの資料もご参照ください。
Appendix A. Structure of Scaffold DIA files (*.sdia)
Appendix B. Computation of FDR in Scaffold DIA
Appendix C. Summarization : Rolling up Values
Appendix D. Missing Values
Appendix E. Shared Evidence Clustering Algorithm
Appendix F. Heat map clustering
Appendix G. Techniques to Control the Family-wise Error Rate
Appendix H. Using Principal Component Analysis
Appendix I. How PCA is Performed in Scaffold DIA
Appendix J. Description of Mouse Right Click Context Menu Commands©2023 Scaffold DIA マニュアル

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16-3. EncyclopeDIA について
Scaffold DIA における、ペプチド同定や定量の中心的なプログラムは、「EncyclopeDIA」というフリーのプログラムが担っています。EncyclopeDIA については以下 URL をご参照ください。
https://www.biorxiv.org/content/early/2018/03/07/277822
https://bitbucket.org/searleb/encyclopedia/wiki/Home

ご不明な点がございましたら、ご遠慮なくお問い合わせください。

技術サポート

担当：高江洲（たかえす）

電子メール ：support-jp@matrixscience.com
電話 ：03-5807-7897

ファックス：03-5807-7896©2023 Scaffold DIA マニュアル

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