タンパク質同定結果検証・整理 ソフトウェア

Scaffold 5⚫ 暫定版

最終更新日 : 2021/12/08

目次
1.はじめに .................................................................................................... 1
1-1. Scaffold とは ............................................................................................................... 1
1-2. Scaffold でのデータ読み込み ........................................................................................... 1
1-3. Scaffold で採用されているアルゴリズム ............................................................................. 2

2. データの読み込み ....................................................................................... 4
2-1. 概要、データの階層構造 ................................................................................................... 4
2-2. MASCOT 結果ファイルを直接指定し読み込む方法 ............................................................... 6
2-2-1. dat ファイルの読み込み: validation は Scaffold 上で行う方法.................................................. 7
2-2-2. mzIdentML 読み込み: validation は取り込み前に行う方法 .................................................... 15
2-3. MASCOT Server からネットワークを介して dat を取得する方法 ........................................... 21
2-4. raw またはピークリストを直接読み込むところから始める方法................................................ 28
2-4-1. 実行する検索エンジンプログラムをセットする : X! Tandem の場合 ........................................ 28
2-4-2. 実行する検索エンジンプログラムをセットする : MSFragger の場合 ........................................ 29
2-4-3. MSFragger または X!Tandem での検索実施とデータ読み込み方法 ........................................ 29
2-5. 配列データベースの登録 ................................................................................................ 37
2-5-1. 概要 ................................................................................................................................... 37
2-5-2. Ediｔ FASTA Databases ダイアログ .................................................................................... 37
2-5-3. FASTA データベースの登録方法 ........................................................................................... 38
2-5-4. parse rule について（Configure Database Parser） .............................................................. 40

3. Samples View .........................................................................................40
3-1. 概要 .......................................................................................................................... 41
3-2 . Samples View 画面・表示内容 ...................................................................................... 41
3-2-1. Display pane: Samples

table で表示する数値の設定 ........................................................ 42

3-2-2. Filtering Samples: 表示たんぱく質/ペプチドの絞り込み ....................................................... 45
3-2-3. The Samples Table: 同定タンパク質に関する情報の表示...................................................... 47
3-2-4. Information Panes:タンパク質・サンプルに関する追加情報 .................................................... 49
3-3 . FDR ダッシュボード・オプションインジケーターランプ .......................................................... 50
3-4 . Probability の凡例 ..................................................................................................... 51

4. Menu の各項目について .............................................................................52
4-1. menu の内容 説明 ...................................................................................................... 52
4-2. ファイル保存方法・ファイルを開く方法 ............................................................................... 56
4-3. sf3 ファイルの統合 (File ->merge) ................................................................................. 57
4-4. sf3 ファイルのデータサイズを削減する方法 ........................................................................ 58
4-5. GO の設定 .................................................................................................................. 59
4-5-1. GOA ファイルのセット .......................................................................................................... 59

4-5-2. 表示する GO 情報の設定 ..................................................................................................... 62
4-6. Preferences の設定内容 ............................................................................................... 66
4-7. Advanced Preferences の設定内容 ............................................................................... 68
4-8. Pathway に関する設定 ................................................................................................. 69
4-8-1. Wikipathways,Reactome と使用時のタンパク質 ID について ................................................ 69
4-8-2. Pathway 情報の表示 [Scaffold 上] ...................................................................................... 69
4-8-3. Pathway 情報の表示 [外部サイト] ........................................................................................ 74
4-9. ツールバーアイコン ....................................................................................................... 76

5. Load Data View ......................................................................................77
5-1. 概要 .......................................................................................................................... 77
5-2. Experiment pane ...................................................................................................... 78
5-3. BioSample tab と Load and Analyze Queue button .................................................... 79
5-4. Information pane...................................................................................................... 80

6. Protein View ..........................................................................................81
6-1. 概要 .......................................................................................................................... 81
6-2. Proteins pane : タンパク質に関する情報を表示 ............................................................... 82
6-3. Peptide pane : ペプチドに関する情報を表示 ................................................................... 83
6-4. Spectrum pane :タンパク質/スペクトル 関連図 ............................................................... 86
6-4-1. Protein Sequence tab ......................................................................................................... 86
6-4-2. Similar Proteins tab ........................................................................................................... 87
6-4-3. Spectrum tab ..................................................................................................................... 87
6-4-4. Spectrum/Model error tab ................................................................................................. 88
6-4-5. Fragment table tab ............................................................................................................ 88

7. Grouping,Clustering と Similarity View ..................................................89
7-1. Scaffold での類似タンパク質の扱い ................................................................................ 89
7-2. 表示内容の詳細 : summary 画面................................................................................... 89
7-2-1. Protein Grouping (same-set) .............................................................................................. 91
7-2-2.Protein Pairing(sub-set) ...................................................................................................... 92
7-2-3.Protein Clustering (Family Proteins) ................................................................................... 93
7-3. Legacy Protein grouping ........................................................................................... 95
7-4. Samples View と Similarity View との関連について ...................................................... 97
7-5. Similarity View 概要 .................................................................................................. 99

8. Quantify View ......................................................................................1028-1. Quantify View : 定量指標を基にしたグラフや GO,ベン図を表示 ....................................... 102
8-2. Quantitative Value pane ......................................................................................... 103
8-3. Quantify Scatterplots pane ..................................................................................... 103
8-3-1.Scatterplot タブ ................................................................................................................. 104

8-3-2.Stdev Scatterplot タブ ....................................................................................................... 105
8-3-3.Volcano plot タブ ............................................................................................................... 106
8-4. Venn Diagrams pane ............................................................................................... 107
8-5. Annotation Charts pane ......................................................................................... 107

9. Publish View ........................................................................................1099-1. Publish View : Method の文章化 ............................................................................... 109

10. Statistics View ...................................................................................111
10-1.Statistics View 概要 : 同定確率計算に使用したスコア分布などを表示 .............................. 111
10-2. MS Sample table ................................................................................................... 112
10-3. Statistics View Upper Right Pane ......................................................................... 113
10-3-1. FDR Browser タブ ......................................................................................................... 113
10-3-2. Peptide ROC Plots.......................................................................................................... 115
10-3-3. Protein Probability Calculation タブ .............................................................................. 116
10-4. Multiple Search Engine Scatter Plot pane ............................................................. 117
10-5. Peptides Validation pane ...................................................................................... 117

11. 定量手法と検定 .....................................................................................118
11-1. 概要 ...................................................................................................................... 118
11-2. ラベルフリーの定量方法 ............................................................................................ 118
11-2-1. Spectral Counting .......................................................................................................... 119
11-2-2. Total Ion Count .............................................................................................................. 120
11-2-3. Precursor Ion Intensity quantitation .............................................................................. 120
11-3. Normalization について .......................................................................................... 121
11-4. 検定 ...................................................................................................................... 122

1.はじめに1-1. Scaffold とは
Scaffold は、DDA プロテオミクスのデータをまとめ、サンプル間での比較を主な目的としたソフトウェアです。
複数の検索エンジンの結果ファイルを取り込むことが可能なほか、いくつかのフリーな検索を使って raw
データ（またはピークリストファイル）から検索を行い、結果を表示させることも可能です。
取り込んだ同定ペプチドについて、Percolator を中心とした Validation 用のプログラムを適用する事ができます。
取り込んだ結果について、EXCEL などでまとめた状態とは異なりスペクトルとアサインされたペプチドの理論フラグメントピークとのマッチング状況を確認する事もできます。また Gene Ontology 情報の表示
や Pathway データベースへのリンク、サンプル間の同定タンパク質比較といった、タンパク質の解析を補助する機能もついています。
検索結果については Excel スプレッドシート、mzIdentML, などに出力できるほか、Scaffold 関連製品で取り扱う事ができる SFDB ファイル、BLIB ファイルを出力する事ができます。
結果についてはファイルに保存し、Scaffold ライセンスを所有していない共同研究先でもフリーのViewer を使って結果を閲覧する事が可能です。

1-2. Scaffold でのデータ読み込み
Scaffold のデータ取り込みには大きく分けて以下の 2 種類があります。
■検索エンジンの結果ファイルを読み込む■検索前の raw ファイルまたはピークリストファイルを読み込む

また、検索エンジンの結果を取り込む場合でも、改めて X!Tandem や MSFragger での検索も実行して、両者の結果を組み合わせてペプチドを評価する事も可能です。
データ取り込みについての詳細な説明は 2 章で行っています。
1

1-3. Scaffold で採用されているアルゴリズム
Scaffold では、ペプチド並びにタンパク質同定の信頼性を上げるため、以下のアルゴリズムを適用する事ができます。
■ Percolator■ LFDR-based scoring system■ Peptide Prophet■ Protein Prophet
各アルゴリズムについて、少し詳しく説明します。
■ Percolator
取り込んだデータのペプチド-スペクトルの再評価を行うと同時に、Validation も行います。スコア
だけでなく質量精度や各種情報をもとに判断します。同定スペクトルを増やす目的で、現在 幅開く利用されています。
論文：
Lukas Käll, Jesse Canterbury, Jason Weston, William Stafford Noble and Michael J. MacCoss.
Semi-supervised learning for peptide identification from shotgun proteomics datasets
Nature Methods 4:923 – 925, November 2007

■ LFDR-based scoring system
ベイズ統計の考えに基づいており、ナイーブベイズ分類器を使った判別スコアリングを使ってペプチド同定の検証が行われています。トレーニングデータセットの選別を繰り返し変更しながら判別スコアリン
グの最適化を実施しています。計算により local FDR(LFDR)を算出しその数値がそのままスコア化
されています。トレーニングデータの選別は繰り返し複数回行われ、10 ある分類器のうち 3 つずつを対象として鍛えていきます。この繰り返し操作により誤って同定されているデータの影響が薄まり判別の正確性が増します。
他の（Percolator など）スコアリング手法同様、LFDR も他の検索エンジンが提供するスコアを取り込みます。Peptide Prophet でいう LDA や Percolator でいう SVM(Support Vector Machine)の分類器にあたるものとして、LFDR ではナイーブベイズ分類器から算出した対数尤度比を使って True
Positive と False Positive ヒットの区別を判定しています。識別子の最適化にあたっては過剰適合(overfitting)による汎化不足とならないよう工夫しています。前駆体イオン（親イオン）の誤差は判別
スコア計算に考慮される要素の１つというだけでなく、別の観点からもスコアに影響を与えています。
Scaffold ではこのスコアについて離散型の（数え上げ方の）スコア分布でなく、より連続的なスコア分布の関数に置き換えて計算し、確率の積算を行う際にも積分計算を行っています。

2論文：
https://dx.doi.org/10.1021%2Facs.jproteome.5b00536■ Peptide Prophet
Peptide Prophet は検索エンジンによって算出された各ペプチドのスコアの分布を連続的な曲線の分布に変換し、同定確率を算出するために利用します。分布の変換の際には検索に利用したデータベー
スのサイズや検索データの特徴を利用します。この曲線化されたスコア分布を使って各スコアでの同定確率を再計算します。同定確率はそのままペプチド同定の基準にも適用されます。
論文：
Keller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E., and Aebersold R., Empirical statistical model to estimate the accuracyof peptide identifications made by MS/MS and database search.
Anal. Chem., 2002, 74 (20), pp 5383–5392 DOI: 10.1021/ac025747h■ Protein Prophet
Protein Prophet は Peptide Prophet で算出された各ペプチドの同定確率をもとに、アサインされているタンパク質の同定確率を算出するアルゴリズムです。Scaffold 5 ではそのアルゴリズムをさらに調整し、シェアペプチドかオリジナルペプチドかによって計算における貢献度を変更しています。
論文
Nesvizhskii, A. I., Keller, A., Kolker, E., Aebersold, R., A statistical model for identifying proteins by tandem
mass spectrometry.
Anal. Chem., 2003, 75 (17), pp 4646–4658 DOI: 10.1021/ac0341261

Scaffold では取り込んだデータに対して、上記の各手法のうちいずれかの方法が適用され評価されます。一方 Scaffold で準備されているアルゴリズムを使わず、各検索エンジンで検証の上出力された結果をそのまま取り込む方法があります。Scaffold ではこれを「Prefiltered Mode」での取り込みと呼 ん で い ま す 。 デ ー タ の 取 り 込 み 方 に 関 す る 詳 細 は 、 「 2-2-2. Prefiltered Mode で検 証 済 みの
mzIdentML ファイルを Scaffold 上の検証なしに読みこむ」をご覧ください。

3

2. データの読み込み
2-1. 概要、データの階層構造
Scaffold でデータを読み込むには大きく分けて以下の 3 つの方法があります。
結果取り込みの方法

項目

MASCOT の検索結果ファイル（dat ファイ
ル 、 又 は mzIdentML フ ァ イ ル ) をScaffold PC にコピーしてから Scaffold

・Scaffold と MASCOT がネットワークで2-2つながってない場合
・Scaffold の validation 手法を適用しない、「Prefiltered Mode」を適用したい場合

上でファイルを取り込む
Mascot Server の ロ グ フ ァ イ ル をScaffold 内で開き、該当結果を選択してお勧めのケース

・ ネットワークが つながってい て Scaffold の
2-3

validation 手法を利用する場合

ネットワーク経由で取り込む
raw またはピークリストファイルを直接読
み込み、X! Tandem または MSFragger

・X!Tandem または MSFragger での検索から2-4実行したい時で検索してその結果を取り込む
加えて、各結果ファイルにはタンパク質の ID (Accession) 情報のみ含まれ、アミノ酸配列情報が含まれていません。Scaffold で各タンパク質のアミノ酸配列情報を見るためには、検索に使用したデータベース
ファイルを Scaffold 上にも取り込む必要があります。MASCOT の検索結果を取り込む際、該当データ
ベースファイルからアミノ酸配列を取得し直し、Scaffold 内の表示に反映させています。2-5 ではデータベ
ースファイルの登録方法についてご案内します。

4[データの階層構造について]
データ取り込みの際に重要な概念として、「Category」「Sample」「dat (その他取り込み可能なテキスト/XML ファイル)」の階層構造について説明いたします。
複数の dat をまとめたものが Sample、さらに複数の Sample をまとめたものが Category です。階層構造はデータ取り込み時に定義します。

dat

Sample上層

上層

Category

dat をまとめて表示するかどうかについては、結果表示画面「Samples」の上部にある、「BIO」ボタン/「MS」ボタンで切り替えることができます。dat をすべて表示させる形式が「MS」です。

Category
sample

一方「BIO」ボタンを押すと sample 以下にある dat がすべてまとめられた表示がされます。

Category

sample5

Scaffold でデータを取り込む際、途中でどのように取り込むのか選択する画面が現れます。以下図では画面内の選択肢と、この章で説明する内容の対応付けをしています。

2-3MASCOT Serverから log を介して dat を取得する
2-2. MASCOT 結果
ファイルの取り込み

2-4 raw ファイル/ピークリストから検索を実施

2-2. MASCOT 結果ファイルを直接指定し読み込む方法
MASCOT の結果を Scaffold に取り込む 2 つの方法のうちの１つ、MASCOT の検索結果ファイルを
Scaffold で直接指定して読み込む方法についてご案内します。2-2-1 では、MASCOT の結果ファイル datの取り込みを紹介しています。取り込みたい MASCOT の結果が、どういう名称でどこにあるファイル
なのか事前に確認をした上で、該当する dat ファイルを Scaffold がインストールされている PC にコピーする必要があります。また 2-2-2 では、mzIdentML ファイルの取り込みについてご案内します。例えばMASCOT において、FDR が 1%など特定の数値となるよう定めたペプチド同定基準を Scaffold 上においても適用したい場合、結果画面から mzIdentML ファイルにて出力し、Scaffold で prefiltered mode
で出力時の状態から Validation をすることなく結果として取り込む事が可能です。

6

2-2-1. dat ファイルの読み込み: validation は Scaffold 上で行う方法[ MASCOT Server 上の dat ファイルの場所を確認する方法 ]URL 確認WEB ブラウザ-結果画面の場合

1. 結果ファイルを開いた際の URL をご覧ください。例ではアドレスの最後が.. %2Fdata%2F20211015%2FF001332.datとあり、これが dat ファイルの存在場所を示しています。この例の場合、MASCOT
フォルダ（通常 C:¥inetpub¥mascot）以下の、
C:¥inetpub¥mascot¥data¥20211015 というフォルダの中にある、
F001332.dat が目的の結果ファイルです。

2. エクスプローラーなどで該当フォルダを開き、dat ファイルを Scaffold
がインストールされている PC にコピーします。ファイルコピーはネット
ワーク経由でも、フラッシュメモリなどの外部記憶装置経由でもどちらでも結構です。

7

URL 確認WEB ブラウザ-Search log の場合

1 の別例 A. Search log 結果一覧から dat ファイルの場所を確認する方法もあります。表示項目の中で「In」と書かれている項目のチェックボック
スにチェックを入れ、左側の「Sort / Filter」 ボタンを押すと・・・

ファイルが置かれている相対 path とファイル名が表示されますURL 確認
Daemon の場合

1 の別例 B. Daemon でもパスの一覧を
1 の別例 A. 右のように、dat ファイルが表示させることができます。
置かれているパスが表示されます。
「Result URL」の項目を御覧ください。

8

[ dat ファイルを指定して読み込む方法 ]以下操作方法についてご案内します。定義するデータですが、Category として Control と Treatment,
それぞれに Sample を２種類属した計４つのデータの取り込みを想定しています。
Category

Sampledat

Control

Sample1F001234.dat

Sample2F001235.dat

Sample3F001236.dat

Sample4F001237.dat

Treatment[Control, Sample1 の指定]

1. New ボ タ ン を 押 し ( ま た は
Ctrl+N) 取り込みを開始します

2. 定量データを含んでいない場合、”Spectral
Conting(Standard)” を 選 択 し ま す 。
続いて”Next”ボタンを押します。

9

3. Sample Name、 Category の欄 を記 入します。複数ファイルを取り込みかつ結果を最初から結合し１つのファイルのように扱いたい場合
は、「MuDPIT Experiment」にチェックを入れます。続いて「Next」ボタンを押します。

4. 「Queue Search Engine Results For
Loading」 をクリックします。

5. 読み込む dat ファイルを選択します。
複数のファイルを選ぶことも可能です。

10

6. 同サンプルとして読み込む結果ファイルが更にないか問われます。ない場合は画面下の「Next」ボタンを押します。

7. 先程の指定とは別の sample として読み込
む結果ファイルがないか問われます。ある場合は「Add Another BioSample」ボタンをクリック
します。

11

[Control, Sample2 の指定]

8. 2～6 の操作を繰り返します。今度は Sample
名指定の際名称を変える事と、先ほどと異なる dat
ファイルを選択する事に注意してください。

12

[Treatmnt, Sample3 の指定]

9. 7 同様、先程の指定とは別のサンプルとして読み込む結果ファイルがないか問われます。ある場合は「Add Another BioSample」ボタンをクリックします。

10.これまで同様、取り込み操作を繰り返します。今度はCategory 名と Sample 名を変える事と、先ほどと異なる dat ファイルを選択する事に注意してください。

13

[Treatment, Sample4 の指定]
これまで同様取り込み操作を繰り返します。

11.すべての dat,sample,Category の取り込みが終了
したら、「Add Another BioSample」ボタンをクリック
せず「Next」ボタンを押します。

12. 検索で利用したデータベース
13. X!Tandem （ ま た はを指定します。

MSFragger ） で 検 索 を追加で行うか、指定します。
（ これら の 検 索 エン ジ ン を実行可能な場合のみ）

14. Scoring （ Validation含む）方法を指定します。

15. タ ン パ ク 質 のグループ化表示の有無を指定します。

17. Gene Ontology や
16. 結 果 画 面 表 示 前 にPathway アノテーション

FDR の計算を実施するかの有無を指定します。

指定します。
18. す べ て の パ ラ メ ー タ を 選 択 後 、 ”LoadData”ボタンを押すと取り込みが開始します。

以上で dat のデータ取り込みは終了です。
14

2-2-2. mzIdentML 読み込み: validation は取り込み前に行う方法[mzIdentML 並びに MGF ファイルの準備]
Scaffold で取り込みたい結果について、MASCOT の結果画面にて、「Export」の As 右側の選択肢を「mzIdentML」に変更し、「Export」ボタンを押します。

1. 「 Export 」 の As 右 側 を「 mzIdentML 」 に 変 更 し 、「Export」

ファイル出力時の条件設定を行う画面に移行します。「Target FDR」などの数値を 1%など適切な値に変更し、画面下部の「Export search results」ボタンを押します。

2. FDR の数値を適切な値に変更し、「Export Search results」

15

遷移した画面で「Download」ボタンを押します。出力されるファイルは、「F(search 番号).mzid 」という名称のファイルとなり、ブラウザの既定のダウンロードフォルダなどに保存されます。
この mzIdentML ファイルの作成を、Scaffold にて取り込みたい結果で繰り返し行います*1。
*1 Mascot Daemon にて、検索実行と連動して自動的に mzIdentML ファイルを作成するオプションが準備されています。

3. ダウンロードして F<search 番号>.mzidというファイルを入手します。

この mzid ファイルには各 query のピーク情報が含まれていません。mzid と同じフォルダ上にピークリスト
ファイルである MGF ファイルを出力しておいておく必要があります。MGF の出力も結果画面の Export から可能です。
結果画面の Export format で「MGF Peak List」を選択すると、画面が遷移します。

画面下の「Export search results」ボタンを押すと MGF ファイルがダウンロードされます。

16

すべての mzid ファイルを準備したら、Scaffold を起動しデータの取り込みを開始します。手順は以下の通りです。

1. New ボ タ ン を 押 し ( ま た は
Ctrl+N) 取り込みを開始します2.

定 量 デ ー タ を 含 ん で い な い 場合、”Spectral Conting(Standard)” を選択します。続いて”Next”ボタンを押します。

3. Sample Name、 Category の欄 を記 入します。複数ファイルを取り込みかつ結果を最初から結合し１つのファイルのように扱いたい
場合、「MuDPIT Experiment」にチェックを入れます。
続いて「Next」ボタンを押します。

17

4. Queue Search Engine Results For
Loading をクリックします。

5. 読み込む mzIdentML ファイルを選択します。

6. 同サンプルとして読み込む結果ファイルが更にないか問われます。ない場合は画面下の「Next」ボタンを押します。

18

7. 先程の指定とは別の Sample として読み込
む結果ファイルがないか問われます。ある場合は「Add Another BioSample」ボタンをクリックします。

8. 2～7 の操作を繰り返します。Sample 名指定の際名称を変える事と、先ほどと異なるｍｚIdentML ファイルを選択する事に注意してください。

19

９.すべての dat,sample,Category の取り込みが終了
したら、「Add Another BioSample」ボタンをクリック
せず「Next」ボタンを押します。

10. 検索で利用したデータベース
を指定します。

11. X! Tandem（または12. Scoring（Validation

MSFragger ） で 検 索 を含む）方法を指定します。検索エンジン側で調整した追加で行うか、指定します。

結 果 を そ の ま ま 取 り 込 む 場 合 、 「 Use（これらの検索エンジンを実

prefiltered mode」を選択します。

行可能な場合のみ）

13. タンパク質のグルー
プ化表示の有無を指定します。
15. すべてのパラメータを選択
14. Gene Ontology や

後、”Load Data”ボタンを押Pathway アノテーション

すと取り込みが開始します。

の有無を指定します。

以上で mzIdentML の取り込みは終了です。
20

2-3. MASCOT Server からネットワークを介して dat を取得する方法
MASCOT の結果を Scaffold に取り込む 2 つの方法のうちの１つ、MASCOT のログファイルを開き、Mascot Server からネットワークを通じて直接 dat ファイルを取り込む方法です。
[ Sample を Search log から指定しネットワーク経由でファイルを取得する方法 ]Category として Control と Treatment,それぞれに Sample を２種類属したデータを想定しています。
Category

Sampledat

Control

Sample1F001244.dat

Sample2F001245.dat

Sample3F001246.dat

Sample4F001247.dat

Treatment[Control, Sample1 の指定]

1. New ボ タ ン を 押 し ( ま た は
Ctrl+N) 取り込みを開始します2.

定 量 デ ー タ を 含 ん で い な い場合、 ”Spectral Conting(Standard)”を選択します。続いて”Next”ボタンを押します。

21

3. Sample Name、Category の欄を記入します。
複数ファイルを取り込みかつ結果を最初から結合し１ つ の フ ァ イ ル の よ う に 扱 い た い 場 合 、 「 MuDPIT
Experiment」にチェックを入れます。
続いて「Next」ボタンを押します。

4. Queue Search Engine Results For
Loading をクリックします。

22

5. 取り込む結果をログからクリックで選びます（同時に複数選択をすることも可能です）。
「Add」ボタンを押すと下の欄に取り込まれた結果が表示されます。選択を終えたら「OK」ボタンを押します。

6. 同サンプルとして読み込む結果ファイルが更にないか問われます。ない場合 は画面下の「Next」ボタンを押します。

23

7. 先程の指定とは別のサンプルとして読み込む
結果ファイルがないか問われます。ある場合は「Add Another BioSample」ボタンをクリックします。

[Control, Sample2 の指定]

24

8. 2～6 の操作を繰り返します。今度は Sample 名
指 定 の 際 名 称 を変 え る 事 と 、 先 ほ どと 異 なる dat
ファイル(Job 番号)を選択する事に注意してください。

25

[Treatmnt, Sample3 の指定]

9. 7 同様、先程の指定とは別のサンプルとして読み込む結果ファイルがないか問われます。ある場合は「Add Another BioSample」ボタンをクリックします。

10.これまで同様、取り込み操作を繰り返します。今度はCategory 名と Sample 名を変える事と、先ほどと異なる dat ファイル（Job 番号）を選択する事に注意して
ください。

26

[Treatment, Sample4 の指定]
これまで同様取り込み操作を繰り返します。

11.すべての dat,sample,Category の取り込みが終了
したら、「Add Another BioSample」ボタンをクリック
せず「Next」ボタンを押します。

12. 検索で利用したデータベース
13. X!Tandem（またはを指定しますMSFragger）で検索を追加で行うか、指定します

14. Scoring （ Validation含む）方法を指定します

15. タンパク質のグルー
プ化表示の有無を指定します

17. Gene Ontology やPathway アノテーション

16. 結 果 画 面 表 示 前 にの有無を指定します

FDR の計算を実施するか指定します。
18. す べ て の パ ラ メ ー タ を 選 択 後 、 ”LoadData”ボタンを押すと取り込みが開始します。

以上で search log からデータ取り込む操作は終了です。
27

2-4. raw またはピークリストを直接読み込むところから始める方法
Scaffold 5 からは、raw データを取り込み、検索エンジン X! Tandem または MSFragger で検索を行ってその結果を Scaffold 5 上に表示させることができるようになりました。検索機能を利用したい場合、
予め各検索エンジンの実行ファイルの場所を Scaffold 上から指定する設定を行う必要があります。
それぞれのプログラムをご利用の際にはライセンスについてよくご確認いただき、license agreement に承諾される必要がありますのでご注意ください。また検索エンジンによって読み込み可能なファイル
フォーマットが異なりますのでその点もご注意ください。
検索可能なファイルフォーマット
X! Tandem : mzXML, MGF, DTA, PKL などのピークリストファイル
MSFragger : Thermofisher raw データ、Bruker .d ディレクトリ、mzML などの raw ファイル2-4-1. 実行する検索エンジンプログラムをセットする : X! Tandem の場合以前までのバージョンと異なり、現バージョンでは X! Tandem がバンドルされていません。利用するためにはユーザーが X! Tandem をダウンロードして Scaffold と同じコンピューターにインストールする必要があります。
X! Tandem URL は以下にガイドがあります。
http://www.proteomesoftware.com/search-tools
インストールした X! Tandem を Scaffold で使用するため、以下の操作を行ってください。

1. menu の Edit -> Preference

2 「Path」タブの「Search Engines」でX! Tandem を 選 択 し 、 「 Choose 」 で検索エンジンプログラム(tandem.exe)を選択28

2-4-2. 実行する検索エンジンプログラムをセットする : MSFragger の場合
MSFragger を利用するためにはユーザーが MSFragger をダウンロードして Scaffold と同じコンピュータ
ーにインストールする必要があります。
MSFragger URL は以下にガイドがあります。
http://www.proteomesoftware.com/search-tools

インストールした MSFragger を Scaffold で使用するため、以下の操作を行ってください。

1. menu の Edit -> Preference

2 「Path」タブの「Search Engines」でMSFragger を 選 択 し 、 「 Choose 」 で検索エンジンの jar ファイルを選択

2-4-3. MSFragger または X!Tandem での検索実施とデータ読み込み方法

1. New ボ タ ン を 押 し ( ま た は
Ctrl+N) 取り込みを開始します

29

2.

定 量 デ ー タ を 含 ん で い な い 場合、”Spectral Conting(Standard)” を選択します。続いて”Next”ボタンを押します。

3. Sample Name、Category の欄を記入します。複数ファイルを取り込みかつ結果を最初から 結 合 さ せ た い 場 合 、 「 MuDPIT
Experiment」にチェックを入れます。
続いて「Next」ボタンを押します。

30

4. Queue Raw Data For Loading をクリックします。

5. 検索を行う raw ファイルまたはピーク
リストファイルを選択します。

6. 同サンプルとして読み込む結果ファイルが更にないか問われます。ない場合 は画面下の「Next」ボタンを押します。

31

7. 先程の指定とは別のサンプルとして読み込む
結果ファイルがないか問われます。ある場合は「Add Another BioSample」ボタンをクリックします。

8. 2～6 の操作を繰り返します。今度は Sample 名
指 定 の 際 名称 を変 える事 と 、 先ほどと 異なる raw
ファイル (ピークリストファイル)を選択する事に注意してください。

32

33

9.すべての dat,sample,Category の取り込みが終了
したら、「Add Another BioSample」ボタンをクリック
せず「Next」ボタンを押します。

10. 検索で利用したデータベース
11. X!Tandem （ ま た はを指定します。

MSFragger ） で 検 索 を追加で行うか、指定します。

12. Scoring （ Validation含む）方法を指定します。

13. タンパク質のグルー
プ化表示の有無を指定します。

15. Gene Ontology やPathway アノテーション

14. 結 果 画 面 表 示 前 にの有無を指定します。

FDR の計算を実施するか指定します。
16. す べ て の パ ラ メ ー タ を 選 択 後 、 ”LoadData”ボタンを押すと、検索パラメータ入力画面に遷移します。

34[X! Tandem の場合]
以下のように検索を実行する際に与えるパラメータ入力画面が現れます。

すべてのパラメータを選択後、”LoadData”ボタンを押すと、 データ取り込
み並びに検索が実行されます。

X! Tandem Database Options
Include only identified proteins : 拡張検索実施のオプションだが、この画面では使用しません。
Generate decoy proteins: FDR 計算を行うための Decoy データベース作成を行います。

Accession Filter: 文字列の条件検索で、taxonomy や特定遺伝子のみを対象とする時に利用します （”_HUMAN”などと利用します）。

Precursor Tolerarnce: Precursor の測定値と理論値の誤差

Fragment Tolerance: Fragment の測定値と理論値の誤差

Digestion Enzyme: タンパク質配列から理論ペプチドを生成する際の切断パターン。

Modification: 修飾。Fixed(全アミノ酸置換)と Variable（置換する/しない を両方考慮）

35

[MSFragger の場合]
以下のように検索を実行する際に与えるパラメータ入力画面が現れます。

すべてのパラメータを選択後、”LoadData”ボタンを押すと、 データ取り込
み並びに検索が実行されます。

MSFragger Database Options
Include only identified proteins : 拡張検索実施のオプションだが、この画面では使用しません。
Generate decoy proteins: FDR 計算を行うための Decoy データベース作成を行います。

Accession Filter: 文字列の条件検索で、taxonomy や特定遺伝子のみを対象とする時に利用します （”_HUMAN”などと利用します）。

Precursor Tolerarnce: Precursor の測定値と理論値の誤差

Fragment Tolerance: Fragment の測定値と理論値の誤差

Digestion Enzyme: タンパク質配列から理論ペプチドを生成する際の切断パターン。

Modification: 修飾。Fixed(全アミノ酸置換)と Variable（置換する/しない を両方考慮）

36

2-5. 配列データベースの登録
2-5-1. 概要
Scaffold に取り込む結果ファイルには、タンパク質の配列が含まれていません。同定タンパク質のID(Accession)情報を基に配列情報を取得し紐づけるため、Scaffold 上で検索に利用したものと同じ配列
データベースを取り込む必要があります。また FASTA データベースのセットは Scaffold で検索結果を読み込んだり検索を実行する前に行ったりする必要があります。Scaffold で取り込んだ FASTA ファイルは“Edit FASTA Databases”ダイアログで管理する事ができます。
FASTA を取り込む際、FASTA 先頭行の中でどの部位が Accession(ユニークな ID)となり、またどの部位が Description(タンパク質の内容についての説明)にあたるのかを指定する必要がありますが、それを自動的に行う設定も Scaffold には準備されています。ここでは配列データベースを Scaffold に取り込ませる方法やその関連事項について説明しています。

2-5-2. Ediｔ FASTA Databases ダイアログ
・Menu の Edit -> Edit FASTA Databases
・データ取り込みなど各所必要な時に現れる「Edit Databases」ボタン
これら操作によりダイアログが現れます。

37

「Edit Databases」ダイアログでは登録されているデータベースの一覧、データベースの追加・変更・削除を行う事ができます。

2-5-3. FASTA データベースの登録方法
1. 2-5-2 で案内している方法で、「Edit Databases」ダイアログを開きます。

2. 「Add Database」ボタンを押します。

38

3. データベースファイルを選択し、「開く」を押します。

4. データベースの ID,Descriptionに関する抜出ルールを設定します。
特 に こ だ わ り が な い か ぎ り 、 「 Auto
Parse」を選んでください。

5 データベースの取り込みが開始します。収容後、取り込まれたデータベースが一覧に表示されます。確認後「OK」を押してください。

39

2-5-4. parse rule について（Configure Database Parser）
2-5-3 の parse rule に関する補足説明をいたします。
FASTA の先頭行の情報から、Accession (データベースのユニークな ID)と Description (説明部分の記述)の箇所を認識し、各エントリーデータの特性とします。この時、Accession や Description の部位を認識するためのルール、文法のようなものが「parse rule」です。「正規表現」と呼ばれるようなルールを使って定義します。Accession については、結果ファイルに含まれている内容と Scaffold 上で指定した内容が一致している必要があります。
Parse rule は 2-5-3 でも説明したように、通常は”Auto Parse”を選択すれば問題ありません。しかし
検索エンジン側で使用していた parse rule と、Scaffold auto parse で指定した parse rule が一致していない場合は調整する必要があります。一致しないと Scaffold で取り込んだのち各タンパク質の配列の紐づけがうまくいかず、配列や分子量などの表示が正しく行われません。
ご自身で最適な parse rule を指定したい場合、FASTA ファイル設定時の途中、「Parsing Method」
選択時に、「Use Regular Expressions」ボタンを押します（下図）。

予め準備されている parse rule から最適なものを選び、「Apply」ボタンを押してください。

40

3. Samples View

3-1. 概要
Scaffold では各種機能を持つ View（画面）があり、左側にそれらの View を切り替えるためのスイッチがあります。
データを取り込み後、最初に表示されるのが「Samples」View です。
各サ ンプル別 の同定 タン パク質 やアサインされたペ プチド の数 、同定 されたタンパク質の Gene
Ontology 情報を一覧で表示する画面です。Scaffold のデータ検証は主にこの Samples View で行います。

3 章では Samples View について、その見方・使い方を説明いたします。
英文マニュアルの「Chapter.6 Sample View」に該当する内容です。

3-2 . Samples View 画面・表示内容
Samples view ではサンプル毎に、同定タンパク質／アサインされたペプチドの数／Gene Ontology などの情報を表示しています。以降、表示内容について説明いたします。

41

[全体図]
下図内の番号（①など）が、以降の説明の小項目 (「3-2-1」など)と連動しています。

② Filtering Samples
表示タンパク質/ペプチドの絞り込み条件① The Display pane :samples table で表示する数値の設定③The Samples Table④ Information Panes

同定タンパク質に関する情報を表示

類似タンパク質情報、GO 情報など

以降、各項目について説明をしていきます。

3-2-1. Display pane: Samples table で表示する数値の設定
各サンプルの列で表示される数字について、表示内容を切り替えます。主に、同定の確からしさや定量に関連する数値を評価できる数値を選択する事ができます。
Display Options の選択項目は次頁表の通りです。

42

項目

説明

Protein Identification Probability

タンパク質の同定確率。タンパク質にアサインされたペプチドの同定確率(Peptide prophet) を基に Protein Prophet で計算 されます。

Percent Coverage

タンパク質全長（残基数）に対し、アサインされたペプチドの残基数の割合。

Percentage of Total Spectra

サンプル内全スペクトルに対して、タンパク質にアサインされたスペ
クトルの数の割合。

Exclusive Unique Peptide Count
Total Unique Peptide Count
Exclusive

UniqueSpectrum

Count
Total Unique Spectrum Count
Exclusive Spectrum Count
Total Spectrum Count
Quantitative Value

下記説明文参照。用語の構成として、
最初 : Exclusive か Total
その後ろに
Unique peptide / Unique spectrum / Spectrum
Count という形式となっています。

Total Spectrum Count を、各サンプルの全同定スペクトル数を元に Normalize した指標値。表示内容を別の定量指標に変更可能（Experiment -> Quantitative Analysis の「Use

Normalization」->「Quantitative Method」）
説明補足:■ Exclusive と Total
・Exclusive は、該当タンパク質（グループ）のみに存在するペプチド／スペクトル。それに対し Total は、
Exclusive に加え他のグループ【類似タンパク質群】でもアサインされているペプチド／スペクトルを加えた数となります。従って、数はTotal ≧ Exclusive となります。
■ Unique peptides / Unique spectra / Spectrum
Scaffold の用語において「Unique」は、他の同定タンパク質と共通してアサインされているペプチドであるかどうかは一切関係ありません。同じ配列にマッチしている複数のスペクトルについて、１つにまとめて１つと数え上げるか、それともばらばらのままで数え上げるかの違いです。３つの項目は次頁のような違いがあります。
・Unique Peptides
タンパク質にアサインされたペプチド数。修飾のあるなしに関わらず、また電荷の相違に関わらず、同一配列のペプチドは１つとして数えます。
43

・Unique Spectra
Unique peptides と似ていますが、修飾が異なる場合や電荷が異なる場合は別のものとして数えます。
・Spectrum
同一ペプチド配列として同定されたスペクトルすべてを１つにまとめずバラバラに数えます。
従って数はSpectrum ≧Unique Spectra ≧Unique Peptides となります。

「 Req Mods 」：
特定の修飾基がついているペプチドのみを表示するためのフィルター「 Search 」：
すべてのタンパク質 / ペプチド データを対象としたキーワード検索で検索条件に該当するタンパク質／
ペプチド のみを表示するためのフィルター。入力欄にキーワードを入れて検索する単純検索のほか、虫眼鏡アイコンをクリックすると現れる詳細検索画面があります（下図）。

44

3-2-2. Filtering Samples: 表示たんぱく質/ペプチドの絞り込み[Protein Threshold]
タンパク質の同定確率（Protein Identification Probability）、または Protein FDR による表示
タンパク質の絞込みができます。同定確率は アルゴリズムProtein Prophetにより計算される数値です。
Protein FDR は%の後ろに「FDR」とついている項目（下図）で、decoyデータベースに対する検索を行った時のみ現れます。（Protein FDRの計算方法は少し特殊です。英文マニュアルをご参照ください）[Min # Peptides]
タンパク質にアサインされた同定ペプチド数の最低数値を指定できます。1～5 までの数値を設定できます。
[Peptide threshold]ペプチドの同定確率 (Peptide Identification Probability）または FDRのパーセントによる表示
ペプチドの絞込みができます。数値はアルゴリズム LFDR(local False Discovery Rate)またはPeptide
Prophet により計算されます。ここで定義した閾値の基準を上回るペプチドのみが、タンパク質の同定やDisplay options などで表示されるペプチドの数、Coverage の数値計算に使われます。
同定基準は、予め提示されている選択肢の他、「Custom」を選択する事でユーザーが独自に設定をすることができます。Custom を選択した場合、Protein Threshold の基準は使用できなくなります。

45

“Custom”では様々な条件を指定する事ができます。
-

Peptide Probability (最初から入っていますがゴミ箱アイコンをクリックして消す事ができます)

-

電荷

-

Precursor の誤差-

ペプチドの長さ

-

修飾の種類

-

Missed Cleavage数-

各検索エンジンから得られるパラメータ [スコアなど]

複数の条件を組み合わせて作成する事も可能です。

46

3-2-3. The Samples Table: 同定タンパク質に関する情報の表示
Samples Tableでは各サンプルで同定されたタンパク質の情報が表示されます。

Gene Ontology
タンパク質名,Accession,Taxonomy

ペプチド数など

A

Bio View

又はAccession

分子量

生物種

MS/MS View
タンパク質総数
タンパク質名Gene Ontology

Gene Ontology

Gene Ontology

Biological Process

Cellular Compartment

Molecular Function
各サンプルの同定

検 索 し 該 当 し た GO

ペプチド数などを表示

情報には●を表示

47

Samples View での表示は、アイコンの BioSample View / MS Sample View ボタンの切り替えによって内容を変更することができます（下図）。

BioSample View では、予め定義された BioSample 単位にデータがまとめられます。一方 MS
Sample View を選ぶと、まとめられていた MS Sample が展開して表示されるようになります（下図）48また、表内の各列をクリックすると、その項目での降順／昇順／並び替え解除 にて各列を並び替えることができます。

3-2-4. Information Panes:タンパク質・サンプルに関する追加情報
画面下部には Samples table とは異なる情報を表示する Information Panes があります（下図）。
左から順に、「Protein Information pane」「Annotation pane」「Sample Information pane」から構成されています。

Protein Information pane
左下の「Protein Information pane」では、選択しているタンパク質について、ファミリー（Scaffold では、
MASCOT でいう subset と sameset に該当する）タンパク質の ID が並んで表示されます（下図）。また「Lookup Accession Number In」で接続先のサイトを選択してからボタンを押すと、該当サイトにおけるエントリー情報をブラウザで表示させることができます。

49

Annotation pane
真ん中下の「Gene Ontology pane」では、選択しているタンパク質の Gene Ontology 階層構造の情報が表示されます（下図）。気になる GO に関して選択しダブルクリックすると、Gene Ontology の用語説明のページが WEB ブラウザで開きます。

Sample Information pane
画面右下は、Sample に関する情報を表示する「Sample Information pane」です。sample table 内で、
各 sample(Biosample または MS Sample)の列の何かの項目を選択すると、その sample に関する情報が表示されます（下図）。

3-3 . FDR ダッシュボード・オプションインジケーターランプ
画面一番左側の下に、FDR の計算内容に関する表示と、表示に関するオプション
で何が選択されているかを一目で判別するインジケーターがついています（右図）。

FDR ダッシュボードには、同定基準を超えるタンパク質数、スペクトル数並びに
50

それぞれのフィルターリング条件が表示されます。
解析対象の検索が Decoy データベースに対しての検索も行い FDR の計算ができる時、ダッシュボードの色が赤（下図左）になります。decoy の計算をしていない場合、青色（下図右）となります。

FDR ダッシュボードの下にある６つの〇は、表示のオプション選択状況のオン/オフを緑丸/黒丸で表しています（下図）。各丸の内容は左から順に以下の内容です。丸にカーソルを合わせると説明が

表示され

ます。
-

Show less <5% probability-

Show lower Scoring Matches-

Show entire protein Clusters-

Use Protein Cluster Analysis-

Use Independent Sample Grouping strategy-

Scoring Scheme(LFDR:緑, Peptide Prophet Advanced : オレンジ、

Peptide Prophet:黒)インジケーターの上にカーソルを合わせる事で、選択内容を文字で確認する事ができます。なお上記
リストの上の３項目は、 Menu の View にて設定内容を切り替える事が可能です。

3-4 . Probability の凡例
MS Sample 並びに BioSample の各セルについている色は、Sample 画面の表左上にあるタンパク質の同定確率(Probability)に基づいています（下図）。タンパク質の同定確率は、Protein Prophet によって計算された数値です。

51

4. Menu の各項目について
この章では、Scaffold のメニュー選択内容と各項目で設定できる内容について説明しています。最初に一通り説明し、それ以降の項目で各選択項目の中でより詳しい解説が必要な情報についてピックアップ
しています。

4-1. menu の内容 説明
メニュー
File

コマンド
・New - ファイル作成ウィザードを起動します。詳細は 2 章「MASCOT
結果取り込み」をご覧ください。
・Open - Scaffold のファイル（.sf3）を開きます。
・ Merge – Scaffold 上 で .sf3 フ ァ イ ル を 統 合 し ま す 。 詳 細 は「4-3.sf3 ファイルの統合(merge)」をご覧ください。
・Close - 今開いている sf3 ファイルを閉じます・Save - 今開いている sf3 ファイルを保存します
・Save As - 今開いている sf3 ファイルを別名で保存します。
・Save Condensed Data - 今開いている sf3 ファイルを、保存
象を変更しながら別名保存します。詳細は「4-4.データサイズ

対間引き方法」をご覧ください。
・Print – 現在開いている view 画面を印刷します。
・Print Preview – 印刷の preview を表示します。
・Exit – Scaffold を終了します。
Edit

・Copy – 選択時に開いている view のデータをそのままクリップボ
ードにコピーします。タブ区切りのデータとなります。
・Find – 検索用のダイアログを開き view から該当項目を探します。
・Edit FASTA Database - FASTA データベースを追加します。詳細は「2-4. 配列データベースの登録」をご覧ください。
・Edit Peptide Threshold - ペプチドの閾値を設定します。詳細は「3-2-2. Filtering Samples」内の Peptide Threshold 項目をご覧ください。
・Edit Annotation Options–GO に関する設定画面を開きます。詳細は「4-5.GO の設定」をご覧ください。
・Bulk Operation – [Samples view のみ] 選択項目をまとめて設定変更します。
・Preferences – Scaffold の設定変更。詳細は「4-6.Preferences 設定」をご覧ください。
・ Advanced Preferences – Scaffold の 設 定 変 更 。 詳 細 は「4-7.Advanced Preferences」をご覧ください。
52

メニュー
View

コマンド
・Navigation Pane – View 切り替えパネル(画面左側) 表示/非表示
・Switch Sample View – BioSample / MS Sample 表示切替
・Switch Display Options – Display Options を切替。詳細は「3-2-1.Display options」をご覧ください。
・Show Entire Protein Clusters – タンパク質のクラスターに 含
まれる、Protein probability が設定基準値以下のメンバー

タ

ンパク質について表示/非表示 するかの切替・Show Lower Scoring Matches -Protein probability が設定
基準値以下の場合に display option で定められた数値を各サンプルのセルに表示/非表示 するかの切替・Show < 5% Probabilities – Peptide Probability のとても低いペプチドについて 表示/非表示 するかの切替・Show Sample Notes – Samples 画面下段の「Information pane」
について 表示/非表示 するかの切替・Show Hidden Annotations – Hidden と定義したタンパク質の表
示/非表示 するかの切替・Navigate – 画面内にタブがある view 内の pane について、選択タ
ブを切替
Experiment

・Edit Experiment – 選択中の MS Sample(experiment)について、名称などを設定するダイアログが現れます
・Edit BioSample – 選択中の BioSample の編集。「Load Data」
view→sample タブ選択右クリック→「Edit BioSample」と同じ

操

作（ダイアログ出現）
・Add BioSample – BioSample を追加。「Load Data」view→ 「Add
BioSample」と同じ操作（ダイアログ出現）
・Delete BioSample – BioSample を削除。「Load Data」view→
BioSample のタブ選択右クリック→「Delete BioSample」と同じ操作（ダイアログ出現）
・Queue Files For Loading – Experiment を追加。「Load Data」
view→「Queue Files For Loading」と同じ操作（ダイアログ出現）
・Queue Files From Mascot Server For Loading – １つ上の「Queue Files for Loading」コマンドと似ていますが、dat ファイルを
MASCOT Server のログから選択しネットワーク経由で取得。
・ Queue Structured Directories For Loading – 2 つ 上 の「Queue Files for Loading」と似ていますが、取得対象がファイルでな
くフォルダ内のファイル群である場合に使用。「Load Data」 view→「Queue Structured Directories」と同じ操作（ダイアログ出現）

53

メニュー
Experiment 続き

コマンド・Apply New Database – データベースの追加。詳しくは「2-4.

配列データベースの登録」を参照してください。
・Extract Alternate IDs – 検索時の「Accession」とは別に定められた ID に関する設定。Pathway など外部データベースとの連携の際に使用する ID の抜き出しルールを選択します。
・Apply Protein Annotation Preferences - 類似タンパク質

グ

ループの中で、どのタンパク質を代表として選択し表示するかに関する設定。正規表現で設定します。
・Load and Analyze Queue - 「Load Data」View にて Experimentと BioSample の紐づけが完了しているものの、Experiment の取り込みが未完了な状態の場合、取り込みを開始します。
・Reset Peptide Validation – 主に Proteins View で、手動で変更した peptide valid チェック（同定ペプチドとして認識する/ しな
い の切り替え）をリセットします。
・Add or Edit Annotations – GO または Pathway 情報の付与に関する設定を行います。詳しくは「4-5. GO の設定」、並びに 「4-8.
Pathway の設定」をご覧ください。
・Quantitative Analysis – 定量解析（検定）を行います。詳細は 11
章の「定量手法と検定」をご覧ください。
Export・Subset Database – 結果に出てきたタンパク質のうち特定の条件を満たすタンパク質のみを fasta フォーマットで出力します。
・Spectra – 特定の条件を満たす ピークリストを出力します。
・BLIB – blib フォーマットで同定結果の中かピークリストを出力します。skyline や Scaffold DIA などでで使用可能です。
・ProtXML – protXML フォーマットで解析結果を出力します・mzIdentML – mzIdentML フォーマットで解析結果を出力します
・SFDB – Scaffold PerSPECtives（別売） フォーマットでファイルを保存します。
・Scaffold Batch /・Scaffold Batch Archive
ともに Scaffold Batch(別売)で使用するフォーマットファイルを保存します。
[次頁に続く]54

メニュー
Export 続き

コマンド
以降は Excel で開く事ができる CSV フォーマットでの出力です
・Publication Report – Publish view で表示される内容と同じ情報・Samples Reports – Samples view で表示される内容と同じ情報で出力します。出力時に、表示する数字を Display option から選択できるほか、sameset/subset のタンパク質も併せて出力するかを選ぶことができます。
・Spectrum Reports – 検索結果をスペクトル単位で出力します。
Spectrum の数字をそのまま出力するか、定量指標を出力するか選ぶことができます。
・ Peptide Reports – 検 索 結 果 を ペ プ チ ド 単 位 で 出 力 し ま す 。
Protein View の Peptide pane のデータ一覧に該当します。
・Protein Reports – 検索結果をタンパク質単位で出力。Protein
View の Protein pane のデータ一覧 に該当します。
・PSEA-Quant Report – PSEA-Quant 解析(同定タンパク質について機能別のグループ化を行う解析)のレポートを出力します。
・Current View – 現在みている View の情報を出力（＊View によっては選択できません）
・Complete - 様々な解析データをまとめてフォルダに出力します。

Quant

-

sample 画面の display option を変えたパターンで出力-タンパク質毎に Peptide Report と同内容の情報が出力（「Q+」または「Q+S」モジュール購入時で該当データを読み込み時のみ選択可能）
・Launch Q+ Quantitation Browser – Q+モジュールを起動
・Edit Quantitative Method / Purity Correction – 定量解析に関連する値の補正に関する設定

Window・Emphasize – 選択中の view が複数の panel から構成される時、大きく表示したい箇所を emphasize で選択してください。
・view 名 - view 名と同じ項目を選択する事で View 画面の切り替えができます。画面左側「Navigation pane」で各 View のパネルをクリックするのと同じです。（表示されているショートカットキーでも画面を切り替える事ができます。）

55

メニュー
Help

コマンド
・Help on Current View – 現在開いている view に関して online
help 画面が開きます。
・ Help Contents – online help が開きます。
・ Scaffold User’s Guide – PDF の Scaffold マニュアルが開きます。
・Scaffold Q+ User’s Guide – PDF の Scaffold Q+マニュアルが開きます。
・Open Demo Files- 予め準備されている demo ファイルを開く事ができます。
・Scaffold FAQs/Resource Center – Proteome Software 社のサイトにある FAQ や tutorial 用の Resource にアクセスできます。
・Show Log Files – errorlog, output log が格納されているフォル
ダを開きます。
・Referencing Scaffold – Scaffold 関連の reference (論文)に関する情報にアクセスできます。
・Upgrade License Key – license を再入力できます。
・About Scaffold – Scaffold のバージョンや、コピーライトに関する情報などにアクセスできます。

IdentityE・Quantitation Options – identityE に関するオプションを指定
・Export IdentityE report – IdentityE のレポート同様、解析対象
ペプチド情報のタブ区切りデータを出力します。

4-2. ファイル保存方法・ファイルを開く方法
File -> Save （又は Ctrl キー + S）でファイルを保存できます。Scaffold ファイルの拡張子は「sf3」です。

56

OS が日本語環境の場合ファイルできるだけデスクトップ上でなく別の場所に置くようにしてください。
保存したファイルを開くには、File -> Open (Ctrl + O)とします。旧バージョンのファイル（拡張子 sfd）を開く場合、フォーマット変換の過程が入るので多少時間がかかります。ご注意ください。

4-3. sf3 ファイルの統合 (File ->merge)
別 々 に 作 成 さ れ た sf3 フ ァ イ ル を 、 Scaffold
上で統合する事ができます。
統合する時はまず一方の sf3 ファイルを Scaffold
上で開きます。File -> merge とするとファイル 選
択画面になるので、もう一方の sf3

ファイルを選択します。すると右図のような Merge 操作のダイ
アログが現れます。ダイアログの「Merge」ボタンを押すとファイルの統合が行われます。

なお、Merge の逆、すなわちデータから一部のデータを削除するのは「Load Data」view から行います。
詳細は「5-3.BioSample tab と Load and Analyze Queue button」をご覧ください。

57

4-4. sf3 ファイルのデータサイズを削減する方法
Scaffold で読み込む dat ファイルのサイズが大きく処理が遅くなったりできなくなる場合、sf3 ファイルが内部に持っている MS/MS のスペクトルデータを捨て、sf3 ファイル全体のサイズを小さくする事で対処できます。
＊ ここで指定する操作でファイルを保存すると、データが完全に捨てられてしまい元の状態に戻す事ができません。試す場合などは必ずファイルのバックアップを取ってから行ってください。
File -> Save condensed data と選択すると、選択肢のダイアログが現れます（下図）。

選択肢の内容は以下の通りです。なお、「Frozen」とついているものは、ついていないものに加えてファイル情報を内部で圧縮しており、ファイルサイズはより小さくなりますが処理は遅くなります。
・Save Only Identified Spectra
・Save Frozen Identified Spectra
同定基準を超えるスコアを持つデータのみスペクトルデータを保存し残りのデータは破棄します。
・Save Without Any Spectra
・Save Frozen Without Any Spectra
同定基準を超えるものも含め、すべてのスペクトルデータを破棄します。各ペプチドの配列やスコアに関する情報は残ります。
・Save MCP Required Spectra
・Save Frozen MCP Required Spectra
MCP で提出が求められる基準に基づいたもので、基本的には Only Identified Spectra と同じです。

58

処理によりファイルサイズが減少します。目安として、「Only Identified Spectra」が元データの 50%、
「Without Any Spectra」が元データの 90%を削除します。また Frozen の圧縮では 1/2～ 1/3 となります。
ある解析例では以下のようにファイルサイズが縮小されます。
項目

ファイルサイズ

元のデータ

1,337,646 KB

Only Identified Spectra

457,167 KB

Without any spectra

79,657 KB

Save MCP Required Spectra

457,134 KB

Frozen Save only Identified

212,247 KB

SpectraFrozen Without Any Spectra

36,271 KB

4-5. GO の設定
Scaffold の Samples ウ ィ ン ドウ で Gene Ontology の 情報 を 表示 させる 事が で きます 。 Gene
Ontology の情報は NCBI から取得することができるほか、EBI にて公開されている Gene Ontology
Annotation Database ファイルを Scaffold がインストールされている PC にダウンロードし、その ファイルから取得する方法もあります。ローカルのファイルをいったんセットすると、インターネットを介した取得より短時間で情報を取得できるほか、インターネット接続がない／回線速度が遅い 環境でも問題なく利用できます。以降、「GOA ファイルのセット」「表示する GO の設定」「GO 情報を付与、表示する方法」についてご案内します。

4-5-1. GOA ファイルのセット
Gene Ontology Annotation Database を Scaffold にセットする方法について記します。操作は GOのファイルが自動で取得できる場合と、自動取得を試みた結果何らかの理由で操作が完了しない場合にファイルを別途取得してセットする場合の 2 種類をご案内いたします。

[次頁に続きます]59[ファイル取得を自動で行う場合]
Edit -> 「Edit Annotation Options」 -> 「GO Annotation Database」にて「Add」ボタンを押します。現
れるダイアログの「Source」項目で使用予定の生物種を選択し、「Add」ボタンを押します。（下図）1.Edit -> Edit Annotation Options

2「GO Annotation Databases」タブ内の、を選びます。

「Add」をクリックします。

3. Source で GO 情報を表示させたい生物種を選択し、「Add」ボタンを押します。以降、ファイルのダウン
ロード、解凍、Scafold 用ファイルフォーマットへの変換、が自動的に行われます。
＊「All Proteomes」の場合、すべての生物種に対応しますがファイルサイズが大きく表示にも時間がかかりますのでご注意ください。

60

[ファイルを別途準備してセットする場合]
前述の [ファイル取得を自動で行う場合] にて、ファイル取得が一定時間内に終わらなかったなど何らかの理由で実行完了しなかった場合、ファイル取得を別途行ってそのファイルを読み込むことで問題を回避できることがあります。
Edit -> 「Edit GO Term Options」 -> 「GO Annotation Database」にて使用予定の生物種を選択し、「Add」ボタンを押します（下図）。

1.Edit -> Edit Annotation Options

2「GO Annotation Databases」タブ内の、を選びます。

「Add」をクリックします。

3. Source で「Other File」を選択します。ファイル選
択ダイアログが現れるので該当ファイルを選択し、「開く」を押すと GOA ファイルが追加されます。

61

4-5-2. 表示する GO 情報の設定
GO は「Biological process」「Cellular component」「Molecular function」の３つについて、それぞれ階層構造で構成されています。Scaffold では GO 情報を表示させることができますが、どの階層のどの項目について表示するかは以下 2 つの選択肢があります。
-

PSEA-Quant を適用し得られた Gene Ontology を適用

-

自身で選択

ここでは表示内容に関する設定方法をご案内します。
[設定画面の表示]

1.Experiment -> Add or Edit
Annotations を選びます。

2.Annotation Source で GO Terms
を選択します。続けて、GO の表示
項目を選択します (以下続きます)62[a.Automatically select with a PSEA-Quant analysis を選択する場合]

3a.「Automatically select with a
PSEA-Quant analysis」を選択し、「OK」ボタンを押します

4a. 自動的に、表示に最適な GO グループを選択する「 PSEA-Quantanalysis」実行に関するパラメータを選択します。設定後、「Apply」ボタンを押すと設定が適用され、設定に合わせた GO 情報が表示されます。
＊このプログラムは本来定量解析との結びつける目的で開発されたものです。今回の選択肢でも Quantitative
Value と結び付けた Report 出力に関するオプションを選択する事が
出来ます。

63

[b.Manual Select を選択する場合:表示項目を増やす操作]

3b.「Manually select」を選択し、「OK」ボタンを押します

4b. 上段の GO 情報で加えたい項目を階層構造を展開しながら探し出し、選択した状態で「Add」ボタンを押します。

64

5b. 下段の表示リストに該当項目が加わります。

[Manual Select を選択する場合:表示項目を減らす操作]

6b.下段の GO 情報で削除したい項目を選択し「Remove」ボタンを押します。

7b. 下段の表示リストから該当項目が削除されます。

65

4-6. Preferences の設定内容
Scaffold 動作に関する設定が集まっている「Preferences」ダイアログは、メニューの「Edit」→「Preferences」と選択する事で開く事ができます。Preferences ダイアログには、以下の計９つのタブから構成されています。
「Internet」「Memory」「Procesors」「Web Link」「Mascot Server」「Display Settings」「Password」「Paths Settings」「MZID」

以下、各タブで設定できることについて説明しています。

□ Internet
Internet 接続する/しない、Proxy サーバーの設定を行う事ができます（右図）。

□ Memory
Scaffold で使用する事ができる Memory の最大値を設定する事ができます。Scaffold の動作が遅い時、設定値を上げる事で改善される事があります。設定変更の内容を反映させるためには、Scaffold

ソフ

トウェアの再起動を行う必要があります。
□ Processors
Scaffold で使用するコア数を指定する事ができます。ただし Scaffold 自体は使用可能なスレッド上限は２で、それ以上の設定は X!Tandem の検索時にのみ有効です。
□ Web Link
Samples View の画面下部、Protein Information（下図、右図）で表示されるタンパク質データベース
へのリンクに関する設定ができます。

66

□ Mascot Server
log ファイルを参照する MASCOT Server に関する設定を行う事ができます。
□ Display Settings
利用できる View を選択する事ができます（右図）。
チェックを外すと画面左の Navigation pane から消え、さらに menu の Window でも選択する事ができなくなります。
またデータ取り込みやファイルオープン時に最初に開く View に関する設定も行う事ができます。

□ Password
ファイル単位で各種操作にパスワードを設定し、パスワードを入力しないと幾つかの操作ができない
ようにします（右図）。設定に関する各項目に ついての説明は以下の通りです。
-

Use Password
パスワード使用の ON/OFF 、並びにパスワードを設定します。

-

Protect Exporting Spectra
スペクトルを出力する際パスワードを要求します。

-

Protect Resetting Thresholds
Threshold を変更する際パスワードを要求します。

-

Protect Changing Display Settings
表示 View 画面の変更をする際にパスワードを要求します。

-

Protect Hidden Proteins
Hidden protein の設定を変更する際にパスワードを要求します。

□ Path
修飾設定で利用しているファイル unimod に関する設定を行います。
-

Do not use UNIMOD
結果ファイルに入っている修飾に関する情報をそのまま利用します。

-

Use Scaffold default UNIMOD
Scaffold が自身で持っている UNIMOD ファイルを利用します。

-

Use a custom UNIMOD file
ユーザーが準備した UNIMOD ファイルを利用します。
67

□ MZID
MZID にタンパク質の配列情報が含まれている場合、MZID に含まれている方のタンパク質配列を優

先して使用するように設定する事ができます。

4-7. Advanced Preferences の設定内容
Scaffold が結果検証のアルゴリズムで使う検索エンジンのスコアについて定義する事ができます。

設

定内容により同定基準に変動があり、結果も変わってきます。Sequest と MASCOT 用の設定がありますが、Sequest(Proteome Discoverer) 用の設定はバージョンが 1.2 より古い場合のみ適用を検討するもので、多くの人は当てはまりません。
[Sequest]
バージョンが 1.2 より古い場合、以下の資料をご参照の上設定値を検討してください。ver.1.3 以上の場
合、設定画面にあるように最適な設定を「Auto-Detect」します。
・PDF(英文) マニュアル
Chapter.4 Scaffold’s Main Window -> Advanced Preferences -> Sequest tab
・Online help
Main menu component ->Advanced Preferences -> Sequest tab[MASCOT]「Ion – Identity Scoring も利用」するか「Ion Score のみ使用」するかを選択することができます。
設定は、MASCOT から来た結果か、Proteome Discoverer から来た結果かでさらに分かれています。

68

4-8. Pathway に関する設定
Scaffold の Samples ウィンドウで Pathway の情報を表示させる事ができます。Pathway の情報は「Wikipathways」または「Reactome」サイト から取得する事ができます。以降、「データベースの使用条件（タンパク質 ID）」、「適用の実施方法」「お勧めの Pathway 情報表示」についてご案内します。

4-8-1. Wikipathways,Reactome と使用時のタンパク質 ID について
WikiPathways, Reactome はそれぞれ反応パスウェイについてまとめられたデータベース[サイト]です。
詳細は以下情報をご参照ください。
Wikipathways
Kelder T, Pico AR, Hanspers K, van Iersel MP, Evelo C, Conklin BR. (2009) Mining Biological
Pathways Using WikiPathways Web Services. PLoS ONE 4(7)Reactome
Fabregat et al. 2017 PMID: 28249561
Wikipathways を利用するためには、「gene name」情報が必要です。Scaffold にて gene name は
FASTA ファイル内の情報、または NCBI のサイトから取得します。gene name 情報の取得並びに表示させるには、「Experiment」->「 Extract Alternate IDs」を実施する必要があります。
一 方 、 Reactome デ ー タ ベ ー ス を 利 用 す る 際 も Uniprot の Accession ( 例 :P02769 など。’ALBU_BOVIN などの表記ではない)情報が必要となります。そのため、Reactome 使用を前提とする
場合、検索時から Accession (P02769 など)が ID となっているデータベースに対する検索結果をScaffold に取り込むように注意してください。

4-8-2. Pathway 情報の表示 [Scaffold 上]
Pathway に関する情報を Scaffold の Samples 画面で表示させる事ができます。ただし Scaffold 上では該当タンパク質が含まれる Pathway の種類が表示されるのみです。タンパク質が含まれる Pathway 一覧
や、特定 Pathway の全体図とその中で該当タンパク質が占める位置の確認については、外部サイトの情報を確認する必要があります。外部サイトの参照については、「4-8-3. Pathway 情報の表示 [外部サイト]」をご参照ください。
次頁以降、Scaffold 上で Pathway 情報を表示させる操作方法についてご案内しています。

69

[設定画面の表示]

1.Experiment -> Add or Edit
Annotations を選びます。

2.Annotation Source で「Pathways」
を選択します。

70[a.Automatically select with a PSEA-Quant analysis を選択する場合]

3a.「Automatically select with a
PSEA-Quant analysis」を選択し、「OK」ボタンを押します

4a. 自動的に、表示に最適な Pathway
グループを選択する 「PSEA-Quantanalysis」実行に関するパラメータを選択します。設定後、「Apply」ボタンを押します。

5a. 続けて PSEA_Qiamt Report の出力場所とファイル名が問われ、入力・決定します。
Pathway 情報が表示されます。

71

6a. Pathway 情報が表示されます。

[b.Manual Select を選択する場合:表示項目を増やす操作]

3b.「Manually select」を選択し、「OK」ボタンを押します724b. 表示させたい Pathway 項目を手動で選択し、チェックを入れます。
必要に応じてダイアログ下部にある
検索ウィンドウなどを使用します。
すべて選択後、「OK」ボタンを押します。

5b. Pathway 情報が表示されます。

73

4-8-3. Pathway 情報の表示 [外部サイト]
Scaffold 上では各タンパク質が含まれる Pathway 情報が表示されるのみにとどまります。Pathway の
詳細情報については、公開元の WikiPathways または Reactome サイト上で確認することになります。
両サイトへのリンクは Scaffold の Samples 画面下部、「Protein Information」pane と「Annotation」
pane にあります。

左側の「Protein Information」にある gene name (または Accession)ボタンをクリックすると、該当タンパ
ク質でサイト上にて検索した Pathway 一覧が表示されます（下図）。

74

また真ん中の「Annotaion」pane には、検索項目でマッチした Pathway の項目リストがあり、それぞれのハイパーリンクをクリックすると該当 Pathway が表示されます。
Pathway の中で該当タンパク質がどの位置に存在するかについては、表示された WEB ページ内の検索で該当タンパク質名を探してください。

ページ内で該当タンパク質を検索

タ ン パ ク 質 が強調表示される「Protein Information」または「Annotation」 pane についての詳細は、「3-2-4. Information Panes:
タンパク質・サンプルに関する追加情報」も併せてご確認ください。

[次頁に続く]75

4-9. ツールバーアイコン
使用頻度が高い項目については、画面左上にアイコンが準備されています。ほとんどのアイコンはメニューに同じ項目があります。
アイコン

説明・New - ファイル作成ウィザードを起動します。詳細は 2 章「MASCOT 結果取り込み」をご覧ください。
・Bach Job Queue Dialog – Scaffold Batch の実行ダイアログを表示。このアイコンはScaffold Batch のライセンス購入時のみ表示されます。
・Open - Scaffold のファイル（.sf3）を開きます。
・Save - 今開いている sf3 ファイルを保存します
・Print – 現在開いている view 画面を印刷します。
・Print Preview – 印刷の preview を表示します。
・Copy – 選択時に開いている view のデータをそのままクリップボードにコピーします。タ
ブ区切りのデータとなります。
・Find – 検索用のダイアログを開き view から該当項目を探します。
・Excel - 現在の View 画面情報について、CSV フォーマットで出力。Export- current viewと同じ。
・BioSample Summarization level – データを BioSample 単位にまとめた表示に切り替えます。
・MS/MS Sample Summarization level – データを Experiment (MS/MS Sample)
単位にまとめた表示に切り替えます。
・Add BioSample – BioSample を追加。「Load Data」view→「Add BioSample」と同じ操作（ダイアログ出現）
・Queue Files For Loading – Experiment を追加。「Load Data」view→「Queue Files
For Loading」と同じ操作（ダイアログ出現）
・Load and Analyze Queue - 「Load Data」View にて Experiment と BioSample の紐づけが完了しているものの、Experiment の取り込みが未完了な状態の場合、取り込みを開始します・Quantitative Analysis – 定量解析（検定）を行います。詳細は「」
・Scaffold Q+/Q+S – Q+/Q+S モジュールを起動します。
・Help – Online help を起動します。

76

5. Load Data View
5-1. 概要
Scaffold では各種機能を持つ View があり、画面左側にそれらの View を切り替えるためのスイッチがあります。5 章では「Load Data」View について説明しています。
「Load Data」View では現在取り込んでいるデータの BioSample に関して MS Sample データを追加/削除 したり、BioSample 自体を追加/削除 する事ができます。

Experiment pane

BioSample tab
Load and Analyse
Queue button

Informationpane

以降 Load Data View 画面について、上図で示す４つのパーツ、- Experiment pane
- BioSample tabs と、Load and Analyze Queue button- Information paneに分けて説明していきます。

77

5-2. Experiment pane
View 画面上部、「Experiment pane」（下図）では Scaffold で取り込んでいるデータに関する概要を確認する事ができるほか、BioSample*や MS Sample の追加を行う事ができます。
* BioSample … (MS) sample データをまとめた、1 つ上の階層単位。詳細は「2-1. 概要、結果ファイルの階層構造」をご確認ください。

Experiment pane 左側は Experiment の名称 (sf3 ファイルの名称)や取り込んだスペクトルの総数、タンパク質のグループ化の設定が表示されています。
右側には３つのボタンがあります。
・Queue Files For Loading
現在選択されている BioSample に、新たに MS Sample を加えます。加える MS Sample が1 ファイルの時に使用します。
・Queue Structured Directories
現在選択されている BioSample に、新たに MS Sample を加えます。加える MS Sample がフォルダ構造になっている時に使用します。
・Add BioSample
BioSample を追加する時に利用します。

以下内容の関連項目として、2 章の「MASCOT 結果取り込み」も併せてご参照ください。
-

MS Sample, BioSample, Category (2-1. 概要、結果ファイルの階層構造)-

データの取り込み操作 (2-2, 2-3,2-4)78

5-3. BioSample tab と Load and Analyze Queue button
Load Data View の主体部分では、BioSample 別にタブで構成された画面が表示されています（下図）。
タブには BioSample 名が、そのすぐ下にはスペクトル数と（BioSample より上位に位置する）Category 名が表示されています。その下の行には以下２つのオプションの現状について表示されています。
-

データのまとめ方（標準か MUDPIT 設定か）-スペクトルデータの扱い (condense 設定)

BioSample のタブ

BioSample に

BioSample に取り込み予定の結果取り込み済の結果

その下に続いている左右二つの表ですが、画面の右側の表「Files Currently Loaded」が現在 BioSampleに取り込み済みの MS Sample を表しています。一方左側の表「Files in Loading Queue」は、追加はされていないが追加されるように設定されている MS Sample を表しています。左側に項目がある状態で、真ん中のボタン「Load and Analyze Queue」を押すと、データの取り込みを開始します。
左右どちらの表に含まれる MS Sample も、右クリック→Remove とすることで取り除く事ができます。
特に右側の「Files Currently Loaded」のデータを取り除くと、各種再計算が自動的に実行されます。
79

5-4. Information pane
Load Data View の下部にある表示が「Information pane」です。
左から順に「Analysis Information」「Fixed Modifications」「Variable Modifications」のsubpane から構成されています。
検索条件

修飾 (fixed)

修飾 (variable)

Analysis Information では、検索に関する条件が表示されています。
Fixed Modifications 並びに Variable Modifications では、検索時に指定した修飾に関する情報が記されています。
各種表示は、BioSample tab 内の Files Currently Loaded で MS Sample が指定されている場合、
選択 Sample での情報が表示されます。何も選択されていない場合はすべての sample について該当項目が列挙される形で表示されます（ただし通常は検索条件がすべて同じデータを取り込むケースがほとんであると考えます）。

80

6. Protein View
6-1. 概要
Scaffold では各種機能を持つ View があり、画面左側にそれらの View を切り替えるためのスイッチがあります。
6 章では「Proteins」View について説明いたします。
各タンパク質に関する詳細な情報、例えばタンパク質全長に対してアサインされた同定ペプチドの分布状況であったり、マッチしたペプチドの MS/MS マススペクトルとのマッチング状況を確認したりといった事は、「Proteins」View で行います。
Proteins View は、主に３つのパーツで構成されています。
左上の「Proteins Pane」では同定タンパク質に関する様々な情報を表示しています。
右上の「Peptides Pane」では、同定タンパク質にアサインされているペプチドに関する様々な情報を表示して、Proteins Pane の選択項目と連動しています。
画面下部の「Spectrum Pane」では、Proteins/Peptides pane で選択している内容に関連する
各種図/グラフ が表示されます。以降各 pane についてより詳しく説明しています。

Peptides Pane

Proteins Pane

Spectrum Pane81

6-2. Proteins pane : タンパク質に関する情報を表示
Proteins View の左上、Proteins pane では、同定タンパク質に関する情報が表示されます。画面上部に左右２つのプルダウンメニューがあります。
左はタンパク質一覧、右は BioSample/MS Sample 一覧です（下図）。

BioSample / MS Sample 一覧

タンパク質一覧

右の一覧が BioSample か MS Sample かは、選択している表示モードによります。すべての項目について選択・表示するか、個別のタンパク質、個別の BioSample/MS Sample に対して表示を行うかを選択する事ができます。
BioSample / MS Sample 一覧

タンパク質一覧

プルダウンの下には同定タンパク質に関する各種情報が表としてまとめられています。
表の各項目についてはそれぞれ以下の通りです。
・Sequence Coverage
タンパク質の全長に対して、マッチしたペプチドの箇所を一瞥して確認できる表示です。枠内域がタンパ
ク質全長を、黄色の領域がマッチしたペプチドの箇所を、緑の領域が修飾部位を表しています。タンパク質が各 BioSample / MS Sample でどのようにマッチしているかを比較する際に利用します。
・Protein
タンパク質の description (短めの機能説明文)
・Accession
タンパク質の Accession number
・Category
属している Category 名・BioSample
属している BioSample 名82

・MS/MS Sample
データの MS sample 名・m.w.
タンパク質の質量・Prob.
protein probability の数値。prefiltered mode で取り込んだ場合は表示されません。
・%Spec.
Sample View の Display option にもある、「Percentage of all Spectra」
・#Pep.
Sample View の Display option にもある、「Exclusive unique peptide count」
・#UniqueSample View の Display option にもある、「Exclusive unique spectrum count」
・#Specタンパク質のグループ化（クラスタリング）設定をしている場合、Display option の「Total spectrum
Count」を表します。グループ化設定をしていない場合、Display option の「Exclusive Spectrum
Count」を表します。列の項目名にカーソルを合わせるとどちらが表示されているか、確認する事ができます。
・%Cov.
Sequence Coverage (の%)6-3. Peptide pane : ペプチドに関する情報を表示
Protein View の右上、Peptides pane では、左上で選択された protein にアサインされたスペクトルデー
タに関する情報が表示されています（下図）。

選択中のタンパク質について・・・

ペプチドの情報を表示

83

表の各項目は以下の通りです。

・Validチェックが入っているデータは protein probability の計算に使用されます。取り込み時のデフォルトでは
peptide probability の threshold を満たすすべてのデータにチェックが入っています。
・Weight/Assigned
単純なグループ化が適用されている場合は該当ペプチドがユニークだと緑のチェック、共有ペプチドだと赤の十字で表示されます。Clustering （類似タンパク質のグループ化）が適用されている時には該当デー
タの weight の数値を表します。ユニークなら 1,シェアならシェア状況に応じて数値が小さくなります。
・Sequence
ペプチド配列を表します。前と後ろの（）に囲われた部分はペプチド直前あるいは直後のアミノ酸を表します。
・Prob.
peptide probability. Prefiltered mode で取り込まれた場合は表示されません。
・Search engine scores
検索エンジンごとに表示内容が異なります。
-

SEQUEST : Xcorr と DeltaCn-

Mascot : Ion score、Identity score、Delta Ion Score-

X! Tandem : Expect 値(log)・NTTmissed cleavage あるいは Number of Tryptic Termini (同じ意味ですが検索エンジンなどで用語が異なります)。
・Modifications
修飾情報

84

・Observed
スペクトルデータ側のペプチドの m/z・Actual Mass
ペプチドの質量・Chargeペプチドの電荷・Delta Da
ペプチド質量の差の Da、実測値 – 理論値
・Delta ppm
ペプチド質量の差の Da、(実測値 – 理論値) / (実測値)
・Retention TimeLC の保持時間 (秒)。データによっては表示されない
・Intensityペプチドの Precursor スペクトルでの intensity (面積)。データによっては表示されない。
・TIC
MS/MS 各ピークの intensity の和。
・Startペプチド先頭部の、タンパク質全長における位置 (残基番号)。
・Stop
ペプチド末端部の、タンパク質全長における位置 (残基番号)。
・# Other Proteins
シェアペプチドの場合、シェアされているタンパク質の数。
・Other Proteins
シェアされているタンパク質の Accession。
・Spectrum ID
スペクトルの名称。

85

6-4. Spectrum pane :タンパク質/スペクトル 関連図
Spectrum pane (英文マニュアルでは Protein Sequence pane)では、proteins pane や peptides
pane で選択しているタンパク質やスペクトルに関連する図を表示させることができます。以下５つのタブから構成されています。
-

Protein Sequence tab-

Similar Proteins tab-

Spectrum tab-

Spectrum/Model Error tab-

Fragmentation Table tab

以下、各タブの画面について説明しています。

6-4-1. Protein Sequence tab

Protein Sequence tab では、選択しているタンパク質の全長に対して、アサインされたペプチドがどこに位置するのかを表しています。黄色い部分はペプチドがマッチしている箇所、緑のアミノ酸は修飾を受けていることを表します。また配列の上部にはタンパク質の Accession や Description、質量、アサイン
されたペプチド/スペクトル 数、coverage (%)なども表示されます。
またタブ内で右クリックを選択する事で、画像として保存したり関連情報をクリップボードにコピーしたりする事もできます。

[次頁に続きます]86

6-4-2. Similar Proteins tab
Similar Proteins tab では、選択しているタンパク質と同様のペプチドマッチをしているタンパク質（グループ）について、その類似度を確認する事ができます（下図）。グループ内のタンパク質すべてについて、左上の Proteins pane と基本的に同じ情報が表示されます。グループ内のタンパク質において、ペプチドの重なり度合などを確認する事ができます。

6-4-3. Spectrum tab
Spectrum tab では、画面右上の Peptides pane で選択中のスペクトルデータについて、スペクトル
ベースで理論値とのマッチング状況を確認する事ができます（下図）。

スペクトルのグラフはインタラクティブに操作/表示 できます。ドラッグ＆ドロップで特定領域を拡大
したり、拡大後にシングルクリックする事で元の表示に戻したりする事ができます。またタブ内で右クリックを選択する事で、画像として保存したりピークリスト情報をクリップボードにコピーしたり、配列を BLAST
検索したりする事もできます。

[次頁に続きます]87

6-4-4. Spectrum/Model error tab
Spectrum/Model Error tab では、右上の Peptides pane で選択しているスペクトルデータについて、理論値と実測値との誤差を確認する事ができます（下図）。縦軸が誤差、横軸はフラグメントの質量（Da）です。

またタブ内で右クリックを選択する事で、画像として保存したりピークリスト情報をクリップボードにコピーしたり、配列を BLAST 検索したりする事もできます。

6-4-5. Fragment table tab
Fragment table tab では、右上の Peptides pane で選択しているスペクトルデータについて、理論値
ベースで理論値とのマッチング状況を確認する事ができます（下図）。色が塗られているところがマッチした箇所です。「＋2H」は 2 価、「-NH3」「-H2O」は脱アミノ/脱水を表します。またタブ内で右クリックを選択する事で、画像として保存したりデータをクリップボードにコピーしたり、CSV ファイルに出力する事が
できます。

88

7. Grouping,Clustering と Similarity View
Scaffold では各種機能を持つ View があり、画面左側にそれらの View を切り替えるためのスイッチがあります。7 章では「Similarity」View について説明しています。また Similarity と関連がある内容として、
Scaffold にて Group 化、Clustering 化する際のルールについても併せて説明しています。

7-1. Scaffold での類似タンパク質の扱い
質量分析データベースのプロテオミクスの解析ではスペクトルデータを元にペプチド配列を同定します。
そしてそのペプチドがどのタンパク質に含まれる配列と同じかという情報を元に同定タンパク質をリストアップします。検索対象のデータベース中に、同定ペプチドをシェアするタンパク質が複数存在する事は頻繁に起こります。
ヒットしたペプチドの組み合わせが全く同じ、mascot で「same-set」と呼んでいる組み合わせを、
Scaffold では「protein group」と呼んでいます。Samples リストの中で Accession の表示の後ろに（）がありその中に＋数字、と表示されているものがこれに該当します（下図）。

same-set より下位、ヒットしたペプチドにオリジナルのペプチドがなく、他により多くのペプチドがマッチしているタンパク質が存在するケースを MASCOT では「sub-set」と呼んでいます。Scaffold では
sub-set のデータは Samples View の同定タンパク質リストに現れず、後述するように Similarity Viewの「No group」に一緒くたにされてしまいます。
一方シェアするペプチドを持ちながら、他のタンパク質にはアサインされていないユニークなペプチドをもつタンパク質もあります。MASCOT ではこれらタンパク質はすべて「Family Protein」としてまとめられます。取り込み時のグループ化アルゴリズムの選択にもよりますが、Scaffold ではユニークペプチドのみ
ならずシェアペプチドの確からしさに基づいて、クラスター(Cluster)としてまとめられるケースと、リスト中の他のタンパク質にシェアペプチドが存在する事を示すにとどまるケースがあります。
以降 7 章では、グループ化や Clustering の手法について説明しています。

7-2. 表示内容の詳細 : summary 画面
Scaffold 4 以降では「Share peptide Grouping」というグループ化・クラスター化のアルゴリズムを適用する事ができます。Scaffold 3 以前で扱われていた内容については「Legacy Protein Grouping」と呼んでいます。
「Share peptide Grouping」の方法は、従来の方法で求められていた、「高い同定確率であるペプチドが89『ユニーク』に存在する」という条件適用にこだわると同定タンパク質リストから抜け落ちてしまうようなタンパク質を救済する事を第一の目的としたアルゴリズムです。
データ取り込み時に「Protein Grouping」というオプションで「Use protein cluster analysis」という選択
肢を選ぶことでこのアルゴリズムが適用可能です（下図）。

他の選択肢を選んだ場合でも、データを取り込んだ後に変更することができます。
メニューの Experiment -> Edit Experiment にて現れるダイアログにて、ラジオボタン上の 選択肢にて「use protein cluster analysis」の項目を選び、「Apply」ボタンを押す事で変更可能です（右図）。
以降、このグループ化並びにクラスター化のアルゴリズムの説明のため、内容をさらに以下３つのパートにわけて説明します。
90

・7-2-1. Protein Grouping (same-set)
・7-2-2. Protein Paring (sub-set)
・7-2-3. Protein Clustering (Family protein)

7-2-1. Protein Grouping (same-set)
ヒットしたペプチドの組み合わせが全く同じ、mascot で「same-set」と呼んでいる組み合わせを、
Scaffold では「protein group」と呼んでいます。前述のように、group に複数のタンパク質を含む場合、Samples view にて Accession の後ろに（）と＋数字、と表示されます（下図）。

Accession Number のところをクリックすると、group に含まれるタンパク質が表示され、その中から選択する事でリストに表示される Accession を変更することができます（下左図）。また Samples View 下部の「Protein Information pane」でもグループに属するタンパク質を確認する事ができます（下右図）

グループに属するタンパク質と、そのタンパク質に帰属するペプチドについて着目すると、ペプチドは以下の 2 種類に大別する事ができます。
-

シェアペプチド … 複数タンパク質にアサインされるペプチド-

ユニークなペプチド … 単一のタンパク質にアサインされているペプチド

シェアペプチドについてはタンパク質によって配分比率が計算され、確率の計算などにはその配分比率が適用されます。配分比率自体はタンパク質の存在が確からしいほど高くなるような計算式になっていて、
主にユニークなペプチドを使って計算します。

91

タンパク質 A における ペプチド p の配分比率 Weight W (p,A) は、以下の式から算出します。

分子(numerator)である PEexcl(A) とは、A にアサインされているすべてのユニークペプチド X の同定確率
Px を足し合わせたものです（下式）。

分母(denominator)が意味するところは標準化です。PEexcl(A)と同様ユニークペプチドの probability 和を、ペプチド p がアサインされているすべてのタンパク質でさらに足し合わせ、その数字で割ると準化を行っています。すなわち、他のタンパク質に比べユニークペプチドの数が多くいう標
その

probability が高いと配分比率も高くなるようになっています。
計算された配分比率は Similarity View の画面内で表示されます（下図）。

7-2-2.Protein Pairing(sub-set)same-set のデータは group としてまとめらますが、ペプチドのアサイン状況が sub-set,包含関係的に下位に位置する状況、の場合、group にはまとめられず Similarity View でのみ確認する事ができます。
Similarity View の画面右側、「No Group」にまとめられています（次頁図）。

92

7-2-3.Protein Clustering (Family Proteins)
MASCOT では、同定基準を超えるシェアペプチドが１つでも存在すれば Family Protein としてまとめられます（下記条件 1）。一方 Scaffold の Protein Clustering のアルゴリズムではそれよりも厳しい条件（下記条件 2）があり、シェアペプチドが一定の基準を超えていなければなりません。
クラスター化のルールは以下の通りです＊ 英文マニュアルと記述の構成が少し異なりますのでご注意ください
1. シェアペプチドの probability 値の和が 95% 以上である
2. シェアペプチドの probability 値の和が、シェア並びにユニークペプチドの probability 値の和に対して50% 以上である。
3. 1,2 の条件をすべて満たすタンパク質同士で Family が構成される
なお、Cluster 形成を検討する段階では Samples Filter の各種条件は検討されません。Cluster 形成後、
filter が適用され、Samples 画面に表示されるかどうかが決まります。下記資料に、計算例も含めた説明がございます。
https://proteomesoftware.zendesk.com/hc/en-us/articles/115001221723-Protein-Grouping-and-Clustering-in-Scaffold
Cluster は、Samples 画面にて Row number の横に十字アイコンが表示され、名称も「Cluster of ～」と表示されています（下図）。Accession の後ろには、Cluster に属するタンパク質の数も[N]の形で表示されています。

93

Cluster の Accession number のところをクリックすると、Cluster で表示する代表タンパク質のAccession に関して選択する事ができます。
十字ボタンをクリックするとその下に展開し、Cluster に属するタンパク質が一覧で表示されます（下図）。

メニューの View -> Show Entire Protein Clusters を選択すると、Samples 画面の各種 Filtering 条件を満たさないタンパク質がグレーアウトの形で表示されます（下図）。ここからも、Family の形成にはSamples の Filtering 条件は関係ないことがわかります。

Samples View などで表示される数字について、Cluster では個々のタンパク質とは内容が異なります。
例えば下図をご覧ください。丸と A,B,C がタンパク質、丸の中の小さい四角の表示がスペクトルを表し、タンパク質 B と C がクラスターを構成しているとします。B の Total Spectra は 4、C も 4 ですが B と Cのクラスターでは和の 8 ではなく 6 であることに注意してください。シェアされているペプチドはまとめて１つとカウントされます。

94

7-3. Legacy Protein grouping
ここでは Scaffold 3 以前で利用されていた グループ化のルール（現バージョンでも Legacy Proteingrouping と呼ばれているルール）について説明しています。
Legacy Protein grouping ルールが適用されている場合でも、Similarity View の表示はほとんど変わりませんが、各セルの数値が Weight でなく 同定確率 probability である点が異なります（下図）。

Legacy protein grouping における、ペプチドのタンパク質への帰属方法は以下の通りです。
大まかにいうと、ペプチド帰属はタンパク質の同定の確からしさの大きい方にペプチドを帰属させる、というルールとなっています。
そこでまずタンパク質毎に、アサインされたペプチドの probability の和を算出します（下図）。

95ペプチド単位でデータを眺めた際、シェアされているタンパク質の中で最も probability の和が大きい
タンパク質に帰属させます。値が同じタンパク質が 2 つ以上ある場合はそのすべてに帰属させます。下図では緑に塗られた箇所が帰属する位置です。

続いて、緑に塗られたペプチドがないタンパク質をリストから除きます（下図）。

最後に、緑に塗られたペプチドの中で probability が 95%未満のものしかないタンパク質をリストから除きます（下図）。

最終的に残ったものが Legacy proteins group でまとめられる「group」となります。
96

7-4. Samples View と Similarity View との関連について類似(Group,Cluster)タンパク質の類似状況と、Samples View 並びに Similarity View でそれらがどのように表示されるかについて、改めて説明します。

group [same-set] のタンパク質は、Samples view で代表タンパク質１つにまとめられて表示されます（下図）。Accession Number の後ろに（＋数字）の形で表示され、カーソルを合わせると画面下部のProtein Information pane に group に属する他のタンパク質の情報を確認する事ができます。

MASCOT でいう sub-set のタンパク質は、samples view には全く表示されません。Similarity Viewの「No group」欄にまとめて表示されます（下図）。

97

Family protein に属するような、シェアペプチドを持ちつつユニークなペプチドを持つ場合で、シェアペプチドの確からしさもある程度保証されている場合、Samples View には「Cluster」としてまとめられて表示されます（下図）。

一方 シェアペプチドの確度が基準を満たさない場合や、古いバージョンの Grouping アルゴリズムを使った場合、Samples View において特にタンパク質をまとめた表示は行いませんが、Similarity View
にてその重複度合いをチェックする事ができます。
Cluster も 含 め 、 シェ ア ペ プチ ド をも つ タ ン パク 質 は Samples View に て 「 Protein Grouping
Ambiguity」列の星印がついています（下図）。

星印をダブルクリックすると 該当タンパク質に関する Similarity view に切り替わります（下図）。

98

Similarity view で内容をチェックしたことのあるタンパク質は Samples View で星の色が緑に代わります（下図）。切り替わる前の星の色は赤色です。

7-5. Similarity View 概要「Similarity」View では、特定タンパク質とマッチング内容が類似する別タンパク質について、ペプチドの重なり具合などをチェックすることができます（下図）。

Protein
Pulldown list
Similarity table

Identification pane99

「Similarity」View 画面は主に３つのパーツに分かれています。
画面上部にある「Protein Pulldown list」は、現在選択中のタンパク質を表します。
「Similarity table」 は類似タンパク質とのペプチドの重複度合いを確認する事ができます。
「Identification pane」では、「Similarity table」にて選択しているペプチドに関して関連情報を表示する欄で、「Proteins View」画面の右上「peptides pane」や、下部「Spectrum pane」と同じ内容です。
項目の詳細については、Protein View 内画面の各説明「6-3 peptide pane」「6-4.Spectrum pane」をご参照ください。
本資料では、メインとなる表示「Similarity table」についてのみ説明しています。
Similarity view の画面上段から中段にかけて表示されている画面が「Similarity table」です（下図）。
類似タンパク質について、どのペプチドがシェアされているのかを確認する際に利用します。

各列の項目はそれぞれ以下の通りです。
・Index - ペプチドの通し番号
・Peptide – ペプチド配列
・Prob. - ペプチドの同定確率。prefiltered mode で取り込んだ場合、すべて「99%」と表示
・Exclusive to - ユニークペプチドかどうか。ユニークな場合、タンパク質名が表示
・Valid – ペプチドを解析に利用しているかどうか。ユーザーが自らクリックし、使用するかどうかを経能する事もできます。
その次の列からはタンパク質になります。タンパク質はユニークなタンパク質毎に、あるいはクラスター
ごとに色分けで表示されています。”Exclusive to” 列にタンパク質名の表示と着色があり、最上列のタンパク質の色と連動しています。
ペプチドとタンパク質が交わる各セルに表示される数字は、新しいグルーピングアルゴリズムが採用されている時は Weight の数値が表示されます。Legacy protein grouping の時は Probability が表示され100ます（右下図）。ペプチドがアサインされているタンパク質のセルのみ数字が表示されます。
タンパク質の Accession の下に＊がある
場合、ペプチドの同定基準を満たしユニークなペプチドが存在するものの、タンパク質の同定基準を満たせず現段階の Samples のリストには表示されていない タンパク質であることを示しています（＊右図の

ALBU_PIG など）

101

8. Quantify View
8-1. Quantify View : 定量指標を基にしたグラフや GO,ベン図を表示
Scaffold では各種機能を持つ View（画面）があり、左側にそれらの View を切り替えるためのスイッチがあります。定量値に関するグラフを表示したり、同定結果のベン図や Gene Ontology に関する図・グラフを表示したりする事ができるのが「Quantify」View です（下図）。
Quantify View は大きく分けると４つのパートから構成されています。

8-2. Quantitative Value pane

8-3. Quantitative Scatterplot pane

8-4. Venn Diagrams pane

8-5. Annotation charts pane

・Quantitative Value pane （左上）
選択中のタンパク質について、サンプル 別の定量に関連する値(Quantitative value)の比較ができる
棒グラフが表示されます。
・Quantitative Scatterplots pane （右上）
サンプル間で各タンパク質の定量値に関する散布図や volcano plot が表示されます。
・Venn Diagrams pane （左下）
同定タンパク質/ペプチドに関してサンプル別に比較ができるベン図が表示されます。またベン図の各エリアに属するタンパク質/ペプチド を確認する事ができます。
・Annotation charts pane (右下)Samples に表示されているタンパク質の Gene Ontology の項目情報や Pathway の項目情報について102まとめた円グラフなどが表示されます。
Quantify 内の表示内容は連動しており、例えば Quantitative Value pane のプルダウンでタンパク質を選択すると Quantitative Scatterplot pane や Venn Diagrams pane で該当タンパク質が強調表示されます。
以降、各 pane について説明しています。

8-2. Quantitative Value pane
画面左上が Quantitative Value pane です。縦軸が Quantitative value で各サンプル別の棒グラフが表示されます。縦軸の値は Experiment -> Quantitative Analysis で選択している「Quantitative
Method」の選択肢に連動しています。選択肢内容については、「11-2.ラベルフリーの定量方法」をご参照ください。

グラフ内で右クリックをすると、各種画像ファイルへのエクスポートや印刷、データのテキストコピーなどの選択肢が現れます。

8-3. Quantify Scatterplots pane
画面右上が Quantitative Scatterplots pane です。定量値について、サンプル間で比較して確認したい際に利用します。以下の３つのタブから構成されています。
・ 8-3-1. Scatterplot タブ
・ 8-3-2. Stdev Scatterplot タブ
・ 8-3-3. Volcano Plot タブ
以降、Quantify Scatterplots pane 内の各タブについて説明します。
103

8-3-1.Scatterplot タブ
X 軸と Y 軸に、チェックしたいサンプルをプルダウンから選択します。それぞれの軸の値は Quantitativevalue を 表 し 、 各 点 は タ ン パ ク 質 に 該 当 し ま す （ 下 図 ） 。 Quantitative Value pane と 同 じ く 、Quantitative value が具体的に何を示しているかは Experiment -> Quantitative Analysis で選択している「Quantitative Method」の選択肢に連動しています（同ダイアログ内の「Use Normalization」や「Minimum Value」選択とも連動しています）。

③

②

①

グラフ内の各点について、カーソルを合わせると縦軸と横軸の値、並びに Accession の情報が表示されます（上図内①）。またクリックするとタンパク質を選択したことになり（上図内②）、そのタンパク質の情報について左上の Quantitative Value pane での図表示や、左下の Venn Diagrams でのハイライト表示と連動します。
また、図内には y=x の直線が引かれる（上図内③の実線）ほか、±σ、±2σ、±3σに該当す線も引かれます。
さらに検定を実施している場合、有意基準に達しているかどうかで各点の色が変化します。検定でなくCoeeficient of Variance (変動係数)が選択されていた場合は 1 以上の時、Fold Change が選択されていた場合は 2 以上、または 0.5 以下の時に「有意」としています。

104

8-3-2.Stdev Scatterplot タブ
Stdev Scatterplot タブでは、Coefficient of variance (または variation、変動係数:CV)の評価に利用するグラフです。Quantitative Value のばらつき具合を見ています。各点はタンパク質を表し、横軸がQuantitative Value の（カテゴリー内）全サンプルにおける Mean について Log10 とったもの、縦軸が 同様の数値の SD です（次頁図）。もし検定が行われている場合は検定の対象として選択している sample のみ、表示対象とされます。

グラフ内の点線は各プロットから計算された回帰直線です。データのばらつきが大きなタンパク質を識別し、定量の検証に使うかどうかを判断する事もできます。

105

8-3-3.Volcano plot タブ
Volcano plot はタンパク質のサンプル間での変動を見るのに便利なグラフです。前提として、対象サンプルを選択した上での検定を実施する必要があります。
X 軸は Scatter plot タブで選択中の２カテゴリーにおける fold change の Log です。fold change とは
この場合単純に比（割り算）の事をさし、その値に対して Log2 をとっています*。
＊各所で用いられる用語のばらつきによっては、本グラフの横軸である、比の Log2 の事を Foldchange と呼称する場合もあります。
Y 軸は検定の結果計算された各タンパク質の p-value について Log10 をとりマイナスをかけたものです。
従って、X 軸については左右の方向にいけばいくほど、Y 軸については上に行けば行くほど該当タンパク質が選択サンプル間で大きく変動していることを意味します（次頁図）。

他のグラフ同様、各点はタンパク質を表し、点にカーソルを合わせると accession 並びに X/Y 軸の値が表示されます。またクリックするとそのタンパク質の情報について左上の Quantitative Value pane での図表示や、左下の Venn Diagrams でのハイライト表示と連動します。
X 軸の 0 の値、すなわち変動がないラインついてはグラフ表示のオプションで変更することができます。
また同様に Y 軸の Significant のラインについても変更可能です。

106

8-4. Venn Diagrams pane
Quantify 画面の左下、「Venn Diagrams pane」では最大３つのカテゴリーを対象にベン図を書かせることができます。「Proteins」「Total Unique Peptides」「Total Unique Spectra」３つのタブから構成され、それぞれタンパク質/ペプチド/スペクトル数 についてベン図を描く事ができます（下図）。

①②

ベン図内の各領域を選択しクリックすると黄色のハイライト表示がされ（上図①）、選択領域に属するタンパク質/ペプチド/スペクトル の一覧がその右側に表示されます。表内にて青色でハイライト（上図②）を受けているのは現在選択されているタンパク質で、表内の行をダブルクリックする事でタンパク質を切り替える事もできます。
また表内のエリアをダブルクリックすると Samples View に切り替わり、その時に選択エリアに 属する
タンパク質だけがフィルターリングで残された状態となっています。元の状態に戻すには Samples 画面上部の「Search」のところにある文字列を削除し空欄にします。
グラフの上の「Counting Unit」では、数え上げる対象をクラスター単位とするか個々のタンパク質とするか変更することができます。データ取り込み時のグループ化オプションによっては表示されません。
また「Evaluate based on」は対象とするタンパク質についてのオプションで、「Presence/Absence」はSamples 表での有無で判断するのに対し、「Quantitative profile」は検定に使用されたかどうかで判断されます。従って「Quantitative profile」は検定を行った時にしか選択する事ができません。

8-5. Annotation Charts pane
Quantify View の右下、「Annotation Charts pane」では、各タンパク質にアサインされた Gene
107

Ontology または Pathway 情報に関してまとめた図を表示します。それぞれ、２つのタブ「Pie Charts」「Bar Charts」から構成されます。
例えば Gene Ontology では「Biological Process」「Cellular Component」「Molecular Function」から構成されていますが、画面上部のプルダウンから該当項目を選ぶことで表示内容を切り替える事ができます。
「 Pie Charts 」 タ ブ で は Samples で 表 示 さ れ て い る す べ て の タ ン パ ク 質 に つ い て Gene
Ontology/Pathway 情報の項目を数え上げ、それを円グラフにて表示しています（下図）。

一方同様の情報を棒グラフにて表示しているのが「Bar Charts」です（下図）。

108

9. Publish View
9-1. Publish View : Method の文章化
Scaffold では各種機能を持つ View（画面）があり、左側にそれらの View を切り替えるためのスイッチがあります。
9 章では「Publish」View について説明しています。各種論文投稿時、データ解析に関する説明文を記載する必要がありますが、その目的に役立つのが Publish View 画面です。

109画面左側が、解析内容について項目別にまとめられた表です。取り込んだデータの内容に合わせて項目が自動入力されます。項目前に鍵マークがついている欄はユーザーによる書き換えができません。
赤い強調表示されている項目はユーザーの手入力による穴埋めが促されています。そのうち入力欄に「∨」となっている箇所については、クリックする事で選択肢が現れユーザーが選択をする形になっています。
左側の表に入力された内容に合わせて、右側の説明文が自動的に編集されます。右側の説明文についてはドラッグ＆ドロップで文章を選択できるほか、ショートカットキーなどでテキストをコピーする事ができます。ユーザーはこの文章を出発点とし書き換えたものを 論文投稿などでの method に利用する事ができます *1。
右側下部には情報を EXCEL で読むことができる形式で出力できるボタンがついています。各ボタンによって出力される内容は、メニューの「Export」にて選択できる内容と同じです。詳細は「4-1.メニューの内容 説明一覧」の「Export」欄をご覧ください。

＊1
Scaffold を利用した解析においては、論文投稿時に以下論文を参照してください。
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pmic.200900437

11010. Statistics View
10-1.Statistics View 概要 : 同定確率計算に使用したスコア分布などを表示
Scaffold では各種機能を持つ View（画面）があり、左側にそれらの View を切り替えるためのスイッチがあります。
「Statistics」View では、主にペプチド同定やタンパク質同定のアルゴリズムに関連するデータ・グラフを表示する事ができます。従って、データを Prefiltered mode で取り込んだ場合は何も表示されません。

10-2. MS Sample table

10-4.

Multiple

10-3. Statistcs View Upper Right pane

10-5. Peptide Validation

Searchpane

Engine Scatter Plot pane

Statistics View は主に４つの画面から構成されています。
左上、MS Sample table は、Experiment 内の MS Sample に関する情報をまとめた表です。
右上、Statistics View Upper Right pane は、「FDR Browser tab」「Peptide RPC Plots tab」「Protein
Probability Calculation tab」３つのタブから構成されていて、ペプチドやタンパク質の probability 計算に直結する数値を確認できるグラフです。
左下、Multiple Search Engine Scatter Plot pane は、複数の検索エンジンでのスコアを比較する散布図です。
右下、Peptides Validation pane は、検索エンジンでのスコア分布と適用アルゴリズムでの分布を同時に確認できるグラフです。
左上の MS Sample table で選択されている項目について、他の pane のグラフ・図が表示されます。
選択の変更によってグラフもインタラクティブに表示が切り替わります。また画面上部の各種フィルターの選択内容にもインタラクティブに対応します。

111

10-2. MS Sample table
Statistics View の左上、MS Sample table は、MS Sample に関する情報がまとめられています （下図）。表示される情報は以下の通りです。

・Category -属する Category 名・BioSample - 属する BioSample 名・MS/MS sample – MS Sample 名・#Prot - 同定タンパク質数
・#IDs – ユニークな同定スペクトル数。 MS/MS Sample View モードでの、Exclusive Spectrum
Counts の和（下図、黄色の枠で囲まれた箇所を参照）。またクラスターモードの時にも個々のタンパク質についてカウントされます。
・#Spec （ユニークでないものも含む）同定スペクトル数。
・%IDs 同定スペクトル中に占めるユニークスペクトルの割合。 #IDs / #Spec。

112

10-3. Statistics View Upper Right Pane
Statistics View の右上の pane には公式に名称を付けておりませんが、主にペプチドやタンパク質の同定の検証に関連する情報を提供しています。 以下３つのタブから構成されています。
-

10-3-1. FDR Browser タブ-

10-3.2 Peptide ROC Plots タブ-

10-3-3. Protein Probability Calculation タブ

以降、１つ１つのタブについて説明しています。

10-3-1. FDR Browser タブ
通常データベースに加え decoy データベースへの検索も実施している時のみ現れるタブです。Peptide
Probability と Protein Probability の組み合わせにより、基準を超えるタンパク質がいくつになるかをヒートマップで表しています（下図）。赤がタンパク質の数が少なく緑が多くなっていますが、基本的に赤の領域ほど確度の高いタンパク質の領域です。ヒートマップの描写はグラフ下の設定 数値と連動しています。
設定値には「Max.Protein FDR」「Max Peptide FDR」「Min # Peptides」の３種類があります。

このグラフの一番の目的は、Peptide Probability と Protein Probability の組み合わせが同定タンパク質数にどのように影響を及ぼすのかを確認する事です。解析の目的に応じて Peptide, Protein のProbability の Threshold を変更し状況に合わせた同定タンパク質リストを作成する事ができます。
表示されているヒートマップ上にカーソルを合わせると、その位置における Peptide Probability,
Protein Probability、基準を超えるタンパク質数とともに、Peptide や Protein の FDR の値も表示され113

ます（下図、青枠）。また、グラフの中には条件によりプロットが現れる事があります。青い〇は現在の条件の中で最も拾い上げるタンパク質が多くなり、かつ各基準値の値が高くなる位置を表します。ピンクの〇は
現在 Filter として設定しているアサインペプチド数とグラフ内の Min # Peptides が 同じ時のみ表示され、filter の設定箇所を表します。

114

10-3-2. Peptide ROC Plots
Peptide ROC Plot タブでは、ROC カーブの図が表示されます。ペプチド同定において、同定基準と、
Sensitivity / Specificity のバランスを確認するために利用します。
横軸に偽陽性率（1-特異度 ( 陰性を陰性と判断する率]）、縦軸にはここでは 同定ペプチド数をとったグラフです。 * 通常は Sensitivity (陽性を要請と判断する率)とする事が多いです。各判定方法 （ペプチド同定アルゴリズム）の、各同定基準値において、False Positive Rate と 同定ペプチド数がそれぞれいくつなのかを表す線が描かれています（次頁図）。Statistics View の左上、MS Sample pane にて選択されている MS Sample についてのグラフが表示されます。
グラフの中の Sensitivity や Specificity の数値については、右下のタブ「Peptide Validation pane」の表示内容から計算されています。具体的には、Correct を Positive、Incorrect を Negative と認定してそれぞれのスコア分布から、各スコアにおける Sensitivity や Specificity が計算されます。

本来の ROC カーブは縦軸が Sensitivity で、y=x の直線を引いてその直線と各プロットがどれくらい離れているかが有効な判定方法かを評価する目安とりますが、本ソフトウェアのグラフでは縦軸の値が異なるためそのような見方をすることができません。よりグラフの左上方向に曲線が向かっている判定方法が優秀である、といった見方だけが可能です。
115

10-3-3. Protein Probability Calculation タブ
Protein Probability Calculation タブは、アサインされたペプチド数別に Peptide probability とProtein Probability の関係性を表したグラフです。検索を行った query 数が少ない場合は表示されません。Statistics View の左上、MS Sample pane にて選択されている MS Sample についてのグラフが表示されます。
Scaffold で採用されている、タンパク質同定確率を表す「Protein Probability」は、そのタンパク質にアサインされているペプチドの「Peptide Probability」から計算されています。計算式には検索のパラメータや
FASTA のデータベースサイズが関係しています。

グラフを見ると、1 アサインペプチドの場合には peptide probability が 95%でも protein probability
が十分な値ではない（上図例では 70%）である事がわかります。逆に 2 つ以上のペプチドがアサインされているタンパク質では、peptide probability が十分な値でなくても protein probability が高い値になる事がわかります。

[次頁に続きます]116

10-4. Multiple Search Engine Scatter Plot pane
Statistics View の左下、「Multiple Search Engine Scatter Plot pane」では、同じ query に対して複数の 検 索 エンジ ン を適 用した場 合の 、ス コア の違 いをプロッ ト化 したグラ フが 表 示されま す（ 下図 ） 。
Statistics View の左上、MS Sample pane にて選択している MS Sample についてのグラフが表示されます。
二軸それぞれに検索エンジンのスコアが配置され、それぞれの（同定）基準値が横軸/縦軸に点線で表示されます。また各プロットは
correct に 属 す る デ ー タ とincorrect に属するデータで色分けされます。さらに、Scaffold のpeptide 同定確率を判定するプロ
グラム peptide prophet のラインが ”combined 95%” と表記されている実線としてグラフに表示されています。

10-5. Peptides Validation pane
Statistics View 画面の右下、Peptides Validation pane では、各検索エンジンのスコア分布から
peptide probability 算出に利用するスコア分布をどのように変換しているか確認できるグラフが表示されます。
評価アルゴリズムとして Peptide Prophet が選択されていた場合、各検索エンジンにおいて、電荷別のスコア分布が表示されます。横軸にはマッチング内容を評価するス
コアが、縦軸には個数が 表された
棒グラフが表示されます（下図）。
棒グラフは incorrect と correct
別に色分けがされており、あるス
コア位置での両社の割合がそのま
ま peptide probability として評価されます。

117

11. 定量手法と検定
11-1. 概要
Scaffold では、いくつかの Label Free の定量手法 (Spectrum Counting と MS1 イオン強度ベースの定量)に対応しています。また定量の数値を元にした検定も実施する事ができます。この章では以下の内容
で、Scaffold で対応している定量手法と検定について説明しています。
11-2. ラベルフリーの定量手法
11-3. Normalization について
11-4. 検定11-2. ラベルフリーの定量方法
Scaffold で対応しているラベルフリーの定量手法は大きく分けると以下の３つの手法に対応しています。
-

Spectral Counting [11-2-1]
各タンパク質にアサインされている、同定スペクトル数(または同定ペプチド数)を元にした定量指標です。

-

Total Ion Count [11-2-2]
MS2 のスペクトルの intensity 情報を定量情報として利用します。

-

Precursor Ion Intensity quantitation [11-2-3](利用できる場合のみ) MS1 のペプチドの Intensity 情報を定量情報として利用します。

Scaffold では、各手法に分類される選択肢がそれぞれ複数存在します。以降で各選択肢について説明
しています。

118

11-2-1. Spectral Counting
Spectral Counting は各タンパク質にアサインされている、同定スペクトル数(または同定ペプチド数)を元にした定量指標です。Scaffold では以下の 4 項目が選択可能です。
-

total Spectra-

Weighted Spectra

-

emPAI

-

NSAF

以下、各手法について説明します。
■ total Spectra
タンパク質にアサインされた同定スペクトルの数です。Normalization （11-3 をご参照ください）も実施されています。
■ Weighted Spectra
タンパク質にアサインされた同定スペクトルのうち、他のタンパク質にもアサインされているシェアされた
スペクトルについては、そのシェアされている度合いにより小さな数字としてカウントした数です。詳細は英文マニュアルの「7-2-1. Protein Grouping (sameset)」内に記述されている weight の計算式などをご参照ください。Normalization（11-3 をご参照ください）も実施されています。
■ emPAIタンパク質にアサインされた同定ペプチド数を、タンパク質の大きさで有利/不利 が生じないよう標準化処理をされた定量指標です。
emPAI は Exponentially Modified Protein Abundance Index の略です。
PAI 自体は以下の式のように、タンパク質にアサインされたペプチド数(N_observed)を、そのタンパク質から得られる理論ペプチド数（N_observable）で割った数値です。

＊元の論文では保持時間や各種条件によりペプチドを数え上げる際にフィルターリング条件も含んでいます。
emPAI は、PAI を使って以下のようにあらわす事ができます。

Scaffold では、計算の簡易化を目的に論文で適用されているルールとは異なるルールで N_observed やN_observable をカウントしています。Matrix Science 社で使用している以下ルールと基本的に同じです。
http://www.matrixscience.com/help/quant_empai_help.html
レアケースにおいて Scaffold でしか採用していない独自ルールがありますが詳細は英文マニュアルをご参照ください119

■ NSAF
NSAF もタンパク質の大きさで有利/不利 が生じないように標準化処理をし、さらに同定スペクトル数
全数との比を考慮した定量指標です。NSAF は Normalized Spectral Abundance Factor の略です。
論文で提示されている NSAF の計算方法ですが、まず Number of spectra (論文では SpC と表記)をタ
ンパク質の全長（L）で割った、SpC/L が「SAF」です。解析別に SAF の値をすべて足した値で各 SAF を割って標準化（Normalized）したのが NSAF です。
Scaffold では SpC のところで「number of exclusive spectra」を適用しています。また normalization
は「11-3. Normalization について」で説明する方法が採用されています。

11-2-2. Total Ion Count
Total Ion CountMS2 のスペクトルの intensity 情報を定量情報として利用します。以下の3 項目が選択可能です。
-

Average TIC-

Total TIC-Top Three TIC

以下、各手法について説明します。
■ Average TIC
query の MS/MS スペクトル内のすべてのピークについて、その強度の平均値を定量情報として利用します。
■ Total TIC
query の MS/MS スペクトル内のすべてのピークについて、その強度の和を定量情報として利用します。
■ Top Three TIC
query の MS/MS スペクトル内のすべてのピークの中で強度の強い top3 について、その強度の和を定量情報として利用します。

11-2-3. Precursor Ion Intensity quantitation
Precursor Ion Intensity quantitation は MS1 のペプチドの Intensity 情報を定量情報として利用します。以下の 4 項目が選択可能です。
-

Average Precursor Intensity-

Total Precursor Intensity-

Total Three Precursor Intensity

-

iBAQ

この定量手法を利用するためには、Scaffold の取り込み前に別のソフトウェアで手法に合わせた析を実施する必要がある他、その時の解析ファイルを別途取り込ませる必要があります。詳細はの資料あるいは英文マニュアルの 14 章をご参照ください。
http://www.proteomesoftware.com/pdf/loading_search_engine_results_into_scaffold.pdf
120

解
以下

以降、各手法について説明します。
■ Average Precursor Intensity
タンパク質にアサインされているペプチドの定量値について、幾何平均を定量情報として利用

します。
■ Total Precursor Intensity
タンパク質にアサインされているペプチドの定量値について、すべての和を定量情報として利用

します。
■ Total Three Precursor Intensity
タンパク質にアサインされているペプチドの定量値について、上位３つの和を定量情報として利用します。データ数が 3 つ以下の場合、すべての和を利用します。
■ iBAQMS1 intensity ベースの定量に、emPAI の概念を組み合わせたような計算です。ペプチドの定量値の和を、該当タンパク質の理論ペプチド数で割ります。

11-3. Normalization について
Scaffold の定量計算では、サンプル間の誤差を吸収するための標準化処理が行われます。その前提となる考えが、「各サンプル (MS Sample) で同定されるタンパク質の全量は変わらない」というものです。
Spectrum Counting なら同定スペクトル数の和が、MS1 や MS2 の Intensity ならその総和の全サンプルで同じであるという前提の元、平均より多い（大きい）場合は少なく（小さく）なる
少ない（小さい）場合は多く（大きく）なるように調整されます。従って、サンプル間の

値が

ように、

タンパク質全量が等しくないと思われるケースでは Scaffold の Normalization を適用しない方が良いことになります。
同様に、ダイナミックレンジの中で全量が少ないタンパク質は Normalization の影響を大きく受けて差が出やすくなり、本来の値からずれる事も大きくなる点に注意してください。（Scaffold の場合、intensityの値が小さいタンパク質やアサインされたスペクトル数が少ないタンパク質の事をさします。）
Normalization を 実 行 する/しない、については、
menu の Experiment ->Quantitative analysis で開くダイアログの右下、「 Other Setting 」 の 中 に「Use Normalization」という項目があります（右図）。

121

なお、欠損値(Missing values)については、予め定めた最小値 (Minimum value)に置き換えて標準化計算の処理をします。Minimum value はデフォルトで 0 に設定されています。また設定した 最小値より小さな値も最小値に置き換えられてから計算されます。

11-4. 検定
Scaffold では算出された定量値について各種検定を実施できます。検定の計算時に利用される数値は、ペプチド・タンパク質などの各種フィルターリング条件を満たすものだけが対象となります。

検定とは別に、Fold Change (比)の値を表示させることができます。
利用可能な検定は選択しているカテゴリー数やカテゴリー内のデータ数などで変更され、合わない手法
についてはグレイアウトされる事があります。
・Coefficient of Variance or Coefficient of Variation
・T-test・ANOVA・Fisher’s Exact Test

122

検定を実施すると、Scaffold 上でいくつかの変化があります。
■Samples View : 検定の結果、有意性を示す数値(p-value など)と、変動の様子を表す列が表示されるようになります。
■Quantify View :Quantitative Value pane にて、検定の有意性と関連した値がグラフに表示されるよ
うになります。
Fold Change 並びに各検定項目について、以降で説明いたします。

■ Coefficient of Variance or Coefficient of Variation
CV、変動係数は標準偏差を平均で割ったもので、データのばらつき度合を表します。値が大きい
ばらつきが大きい事を意味します。Scaffold では %表示となっています。値が大きな場合、

ほど

サンプル

のうち最低 1 つの値が大きくずれていることを表し、値を（グラフなどで）見比べる事で変動のあったサン
プルを特定していく事ができます。
■ T-Test
T 検定では 2 つのカテゴリー間の平均に有意差があるかを検証しています。Scaffold では両側検定を行っています。T 検定を実施すると、p-value が Samples 画面にレポートされます。T 検定を実施

するにはカテゴリーが 2 つ以上選択されている必要があります。
■ ANOVAANOVA (ANalysis Of VAriance、分散分析)では、3 つ以上のカテゴリー間の平均に有意差があるかを検証しています。ANOVA は様々な手法がありますが、Scaffold で採用されているのはシンプルな手法のみです。ANOVA を実施すると p-value が Samples 画面にレポートされます。p-value が小さいによる評価同様少なくともカテゴリーの中のどれか１つが他と異なる事を示しますが、場合、CV

具体的な内容はわかりません。値をグラフなどで見比べる事により変動のあったサンプルを特定して いくことができます。
■ Fisher’s Exact Test
Fishers Exact Test (フィッシャーの正確確率検定、フィッシャーの直接確率検定)は、T 検定同様

2サンプル間の比較により両サンプル間に差異があるかを判定する手法です。T 検定との選択における大まかな目安として、カテゴリー内の繰り返しが少ない場合（2 回など）に F 検定を適用する事をお勧めします。

フィッシャーの正確確率検定を実施すると p value が Samples 画面にレポートされ、その小ささで差異があるかを判断します。
p-value の算出に関しては、以下論文で議論され構築されたモデルに基づいています。
[論文]
Zhang, B., VerBerkmoes, N.C., Langston, M. A., Uberbacher, E., Hettich, R. L., Samatova, N. F.
Detecting differential and correlated protein expression in label-free shotgun proteomics
J. Proteome Res., 2006, 5 (11), pp 2909–2918. DOI: 10.1021/pr0600273

123■ Multiple Test Correction と Significance Level
検定の選択画面の下に、多重検定補正の実施に関する選択肢と、実施する場合の閾値を設定する画面があります。

多重検定の際に擬陽性が増加してしまう事を考慮し、別途評価基準を設けて当初の目的に合わせた新たな基準の線引きをする、というのがこの手法の目的です。Scaffold では以下の手法が準備されています。
-

Benjamini-Hochberg-

Borferroni-

Holm Step-down-

Hochberg Step-up

Significance Level は、多重検定補正においてはよく「ファミリーワイズエラー率（FWER と表記される事が多い）」と呼ばれます。それぞれの手法について、以下簡単に補足説明を加えます（説明の都合により項目の順番を変更して説明しています）。
◇ Borferroni
この手の手法で最も単純で初期の頃に提唱された手法です。設定したい p-value に対し、検定の数で割り算をします。しかしこの数値の場合基準が厳しくなりすぎる（有意基準に満たないものが多くなってしまう）という事で、現在ではこの手法は選択されず別の手法が使われる事が多くなっています。
◇ Hochberg のステップアップと Holm のステップダウン
Bonferroni の不等式をベースとしていますが、様々な点を考慮し基準が厳しくなりすぎないような補正が追加されています。同定タンパク質数が少ない場合はこの手法が向いています。
詳細は英文マニュアル Appendix E の「Holm’s and Hochberg’s Techniques
to Control the Familywise Error Rate」をご覧ください。
◇ Benjamini-Hochberg
タンパク質の数が少なすぎない場合は基本的にこちらを選択してご利用ください。Hochberg のステップアップや Holm のステップダウン同様、厳しすぎない程度に補正されます。Scaffold に算では以下の論文で提唱されたモデルを利用しています。

124

おける計

[論文]
Benjamini Y. and Hochberg Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical andPowerful,Approach to Multiple Testing Journal of the Royal Statistical Society, Series B(Methodological),1995, Vol.57, No. 1: 289-300■ Fold Change
複数のサンプル間での比較を行うための検定をご紹介してきましたが、もっと単純な、何かの値を ベース(Reference)に比をとって表示する「Fold Change」を表示させることもできます。
Biosample が２つしかない場合のみ「Fold Change by Sample」が選択できます。また、Quantitative
Analysis にてカテゴリーを 2 つだけ選択している時に「Fold Change by Category」が選択できます（下図）。

「Fold Change」を設定した場合、分母となるカテゴリーを選択し、もう一方との比が「Fold Change」列に表示されます。Samples 画面では分母に選ばれた方がベージュに、分子の方が薄紫色に色が塗られて表示されます（右図）。
Missing value を 0 に置き換えた場合などで分母が 0 であった場合、Fold
Change の値は「INF」と表示されます。

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