日本語マニュアル

MASCOT 対応 Version : 2.8
最終更新日 : 2023/01/13

目次
1.はじめに: MASCOT Server でできる事 ........................................................... 1
1-1. MASCOT Server とは ................................................................................................... 1
1-2. MASCOT Server でできる事・まとめ ................................................................................ 1
1-3. 検索手法とマニュアルで対応しているページ ......................................................................... 3

2. Mascot Server のシステム .......................................................................... 4
2-1. MASCOT Server は WEB アプリケーションである ............................................................... 4
2-2. MASCOT Server のインストール先と各フォルダ .................................................................. 5
2-3. 3 種類の MASCOT 検索 ................................................................................................. 6

3. MASCOT Server の入力データ .................................................................... 7
3-1. MASCOT Server が読み込み可能なファイルフォーマット ....................................................... 7
3-1-1. PMF で対応するファイルフォーマット ....................................................................................... 7
3-1-2. MIS で対応するファイルフォーマット:どのような情報が抜き出されているか ............................... 93-1-3. MIS で対応するファイルフォーマット:mgf ................................................................................. 9
3-1-4. MIS で対応するファイルフォーマット:mgf 以外のフォーマット ................................................... 10
3-2 . raw データ変換プログラム ............................................................................................. 11

4. MASCOT Server 検索方法 ........................................................................124-1. 「URL」と MASCOT Server[ネットワーク上で MASCOT を指定する方法] ............................ 12

4-2. 変換済みファイルを WEB ブラウザで検索 ......................................................................... 13
4-2-1. PMF : テキストデータを WEB ブラウザで検索 ....................................................................... 13
4-2-2. MIS : mgf ファイルを WEB ブラウザで検索 ........................................................................... 14
4-3. Daemon を使って raw データを直接検索 ......................................................................... 14
4-3-1. Daemon + ProteoWizard .................................................................................................... 15
4-3-2. Daemon + Distiller ............................................................................................................. 15
4-4. 質量分析装置メーカーのソフトウェアから検索 .................................................................... 17

5. 検索パラメーターとデータベース ...................................................................18
5-1. PMF : 検索パラメーター 一覧 ........................................................................................ 19
5-2. Sequence Query : 検索パラメーター 一覧 ...................................................................... 22
5-3. MIS : 検索パラメーター 一覧 ......................................................................................... 27
5-4. パラメーターの中でカスタマイズ可能な項目 ....................................................................... 33
5-5. Database................................................................................................................... 34
5-6. Search form defaults ................................................................................................ 36

6. 検索結果画面:PMF ....................................................................................37
6-1. 表示例で使用している検索について ................................................................................. 37
6-2. 表示内容の詳細 : summary 画面................................................................................... 37

6-2-1. 展開しない状態での画面概要 ............................................................................................... 37
6-2-2. ヘッダー部分....................................................................................................................... 39
6-2-3. Score Histogram ................................................................................................................ 39
6-2-4. 表示内容の変更 [Format As] .............................................................................................. 40
6-2-5. 再検索 : Research all, search unmatched ......................................................................... 41
6-2-6. 同定タンパク質の情報 ......................................................................................................... 41
6-2-7. Search parameters ............................................................................................................ 42
6-3. Protein View ............................................................................................................. 42
6-4. 結果の Export ............................................................................................................ 47

7. 検索結果画面:MIS .....................................................................................48
7-1. 表示例で使用している検索について ................................................................................. 48
7-2. 表示内容の詳細 : summary 画面................................................................................... 48
7-2-1. 展開しない状態での画面概要 ............................................................................................... 48
7-2-2. ヘッダー部分....................................................................................................................... 50
7-2-3. 再検索と結果ファイル出力: Re-search ボタン、Export ボタン ................................................ 50
7-2-4. Search parameters ............................................................................................................ 50
7-2-5. Score Distribution .............................................................................................................. 51
7-2-6. Modification statistics for all protein families .................................................................... 52
7-2-7. Legend（凡例） ..................................................................................................................... 52
7-2-8.表示内容の切り替え [スコア足切りなど] ................................................................................. 52
7-2-9. Sensitivity and FDR........................................................................................................... 53
7-2-10. 同定タンパク質とアサインペプチド ...................................................................................... 54
7-2-11. Report Builder タブ （タンパク質ベースの検索結果ファイル出力） ........................................ 57
7-2-12. Unassigned タブ ............................................................................................................. 59
7-3. Protein View ............................................................................................................. 59
7-4. Peptide View ............................................................................................................ 63
7-5. Export 機能によるペプチドベースの検索結果ファイル出力 ................................................... 68

8. PMF : タンパク質同定 ................................................................................71
8-1. PMF タンパク質同定のまとめ ......................................................................................... 71
8-2. 入力データの調整 ......................................................................................................... 71
8-3. 配列から計算される理論ピーク ....................................................................................... 72
8-4. 同定タンパク質 : マッチングとスコア、同定基準値、期待値 .................................................... 73
8-5. protein inference : ユニーク/シェア ペプチド、タンパク質のグループ化 ............................... 74

9. MIS : ペプチド同定とタンパク質同定 .............................................................76
9-1. MIS ペプチド同定とタンパク質同定のまとめ ...................................................................... 76
9-2. 入力データの調整 ......................................................................................................... 76
9-2-1. MS2 スペクトル、ピークリストの再調整 .................................................................................. 76
9-2-2. ファイル内のクエリー数 ........................................................................................................ 77

9-3. ペプチド配列から行う理論値計算、ペプチドのフィルターリング ............................................... 77
9-4. 同定ペプチド : マッチングとスコア、同定基準値、期待値、外挿的な評価 ................................... 78
9-5. 同定ペプチドから導き出される同定タンパク質 ................................................................... 79
9-5-1. 同定タンパク質=ユニークな同定ペプチドが１つ以上アサインされている ................................... 79
9-5-2. 1 Hit wonders : 同定タンパク質の Sensitivity と Specificity ................................................ 80
9-6. protein inference : ユニーク/シェア ペプチド、タンパク質のグループ化 ............................... 80

10. MASCOT 検索のオプション [MIS] ..............................................................83
10-1.Spectral Library ....................................................................................................... 83
10-1-1. Spectral Library 概要 ...................................................................................................... 83
10-1-2. Spectral Library 検索方法 ................................................................................................ 84
10-1-3. Spectral Library の検索結果 ............................................................................................ 85
10-1-4. Spectral Library をローカルの MASCOT Server にセットする方法 ...................................... 86
10-1-5. Spectral Library 補足説明資料へのリンク .......................................................................... 86
10-2. Quantitation ........................................................................................................... 87
10-2-1. Quantitation 概要 ............................................................................................................ 87
10-2-2. Quantitation 検索方法 ..................................................................................................... 87
10-2-3. Quantitation 検索結果 ..................................................................................................... 88
10-2-4. Quantitation 設定の作成 .................................................................................................. 90
10-2-5. Quantitation 補足説明へのリンク ...................................................................................... 90
10-3. Crosslink ................................................................................................................ 91
10-3-1. Crosslink 検索 概要 ......................................................................................................... 91
10-3-2. Crosslink 検索を行う方法................................................................................................. 92
10-3-3. Crosslink 検索に際し注意するべき MASCOT 設定値 .......................................................... 92
10-3-4. Crosslink 検索結果 .......................................................................................................... 93
10-3-5. Crosslinking 設定の作成 .................................................................................................. 96
10-3-6. Crosslink 補足説明へのリンク ........................................................................................... 97
10-4. Error Tolerant Search ............................................................................................. 97
10-4-1. Error Tolerant Search 概要 .............................................................................................. 97
10-4-2. Error Tolerant Search を実行する方法 ............................................................................. 98
10-4-3. Error Tolerant Search 検索結果 ....................................................................................... 98

11. FDR と Decoy データベース ....................................................................101
11-1. FDR はなぜ必要か？ ................................................................................................ 101
11-2. FDR とは、Decoy データベースとは ............................................................................ 101
11-3. MASCOT で FDR を算出させる方法 ........................................................................... 102
11-4. FDR にまつわるトピックス ......................................................................................... 103
11-4-1. Decoy データベースの利用方法、FDR 計算方法には明確な定義がありません ....................... 103
11-4-2. FDR 計算のカウント対象 .................................................................................................. 104
11-4-3. Decoy データベースでの検索結果と “1 Hit Wonders” ...................................................... 104
11-4-4. 「peptide FDR 1%」と同定タンパク質の正確さ .................................................................. 105

11-4-5. Protein FDR ................................................................................................................... 105
11-4-6. 同定ペプチド数が少ないケースにおける FDR 調整の限界 .................................................. 105

12. MASCOT Server 管理 – データベースと検索ログ.......................................106
12-1. 現在利用可能なデータベースに関する情報 : Database Status ........................................ 106
12-2. 検索ログ : Search log ............................................................................................. 111

13. MASCOT Server のカスタマイズ .............................................................113
13-1. カスタマイズは Configuration Editor で ................................................................... 113
13-2. Amino Acids ......................................................................................................... 114
13-3. Modifications ....................................................................................................... 115
13-4. Symbols................................................................................................................ 121
13-5. Linkers ................................................................................................................. 122
13-6. Enzymes ............................................................................................................... 126
13-7. Instruments ......................................................................................................... 128
13-8. Quantitation ......................................................................................................... 130
13-9. Crosslinking ......................................................................................................... 138
13-10. Configuration Options ........................................................................................ 140
13-11. Database manager .............................................................................................. 142
13-12. Security.............................................................................................................. 142

1.はじめに: MASCOT Server でできる事
1-1. MASCOT Server とはMASCOT Server は、質量分析装置のデータをもとにペプチド配列あるいはタンパク質を同定する
ソフトウェアです。
入力データ側は質量分析装置から得られたスペクトル情報ですが、すべてを利用するのでなく抜粋された情報（ピークリスト）を利用しています。一方参照するデータベースについては、配列データベース（アミノ酸配列・塩基配列）から計算された理論スペクトル、あるいは配列情報と結びついている過去の実測スペクトルどちらに対しても検索を行うことができます。
ピークリストと理論値または実測スペクトルとの照合に対してマッチング度合いを示すスコアが提示され、それが別途計算された同定基準スコアを超える時、当該ペプチド/タンパク質を「同定」したとみなします。
すなわち、入力データであるスペクトルデータが、どのようなペプチド/タンパク質由来のスペクトルであるかを同定します。MASCOT の同定基準スコアはデフォルトでは 95%信頼度を元に算出されていますが、現在論文などでは 1% FDR(詳細は 11 章をご参照ください)を満たすよう求められていて、FDR の基準を満たすように同定基準を調整する使われ方をする事が多くなっています。

1-2. MASCOT Server でできる事・まとめ[定性]・

ペプチド配列の同定

・

タンパク質の同定

・

翻訳後修飾の同定と、候補残基が複数あるケースにおける、部位別の同定確率の提示

・

設定パラメーター値以外の切断パターン、修飾、アミノ酸置換の提示

・

クロスリンクペプチドの同定（ペプチドの組み合わせとリンカーが付いている残基の位置）[定量]
・

タンパク質の相対量（比）または定量指標の提示-

フラグメントピークのピーク強度を使った定量。 [ MASCOT Server のみで実施可能 ]-Spectral Counting(emPAI)定量指標。 [ MASCOT Server のみで実施可能 ]* Extracted Ion Chromatograms (XICs)のピーク強度を使った定量については、MASCOT Distiller 定量モジュールと一緒に計算を行う必要があります。

1

MASCOT Server の検索結果。同定ペプチドや同定タンパク質、修飾の情報が表示されます。

Spectral Counting 定量指標である emPAI の表示

プロダクトイオンスペクトルのピーク強度を使った定量

2

Distiller での定量解析結果(Precursor XICs 定量は MASCOT Server に加え、Distiller 定量モジュールが必要です。)

1-3. 検索手法とマニュアルで対応しているページ
2-3 でご説明するように、MASCOT の検索は３つの方法：PMF (Peptide Mass Fingerprint),SQ(Sequence Query), MIS (Mascot Ions Search)が使用可能です。
このマニュアルで各手法に関連がある章は、それぞれ以下の通りです。

PMF : 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13
SQ: 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13

MIS : 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13

Sequence Query については使用頻度が低い事から、本マニュアルにて Query の文法や結果の解釈について詳しく説明していません。検索時に必要な入力である Sequence Query の文法については
https://www.matrixscience.com/help/sq_help.html を、
結果の解釈については MIS と概ね同じですので７章をご覧ください。

32. Mascot Server のシステム
2-1. MASCOT Server は WEB アプリケーションである
MASCOT Server は WEB アプリケーションで、クライアントーサーバーシステムです。HTTP プロトコル
を介してデータのやり取りを行います。ユーザーは、MASCOT Server プログラムがインストールされているコンピューター、あるいはネットワーク上の離れたコンピューター、どちらからでも MASCOT Server
を 利用する事が可能です。MASCOT Server をインストールするマシンには、WEB サーバープログラムを
インストール・稼働させる必要があるほか、コンピューターが置かれている ネットワーク上で HTTP
プロトコルの通信が許可されている必要があります。

4

2-2. MASCOT Server のインストール先と各フォルダ
MASCOT Server に関連するファイルやプログラムはデフォルト設定で 「C:¥inetpub¥mascot」
フ ォ ル ダ (Windows) あ る い は /usr/local/mascot デ ィ レ ク ト リ (Linux) 以 下 に 配 置 さ れ る よ う
インストールされます。インストール先のフォルダ/ディレクトリはインストール時に設定可能であるほか、一部のみ全く別の場所へ配置することも可能です。
以下、MASCOT のフォルダ/ディレクトリ の基本構成です。

5

各フォルダ/ディレクトリ に含まれる内容は以下の通 りです （概ねフォルダ名 から想定することができます）。
bin: CGI 以外の実行プログラム

cgi: CGI の実行プログラム

cluster : cluster システム使用時各計算ノードに配布するプログラム
config : 設定ファイル、ライセンスファイル
data: MASCOT 検索結果ファイル。結果ファイルは検索日の日付名フォルダ(yyyymmdd)の下に格納される。

htdig: ウェブページ検索プログラム htdig 関連のファイル

html: web ページドキュメントファイル

logs: 検索並びに各主動作のログファイル

perl64 : perl のプライベートコピー (version 5.18)
sequence : 検索対象となるデータベース-

current: 現在使用中のファイル-

incoming : 次に使用するデータベースの一時保管場所-

old: 1 つ前に使用していたデータベースの fasta ファイルを保存 (復元可能)

sessions: セキュリティに使用するセッション情報
taxonomy : 生物種情報に関するファイル
unigene: UniGene インデックスファイル
x-cgi: セキュリティ制御などと関連して使用される CGI の実行プログラム

2-3. 3 種類の MASCOT 検索
MASCOT Server では入力データのタイプ別に３つの検索方法を使用する事ができます。
■ PMF (Peptide Mass Fingerprint) 法 :MS1,ペプチドピークの組み合わせからタンパク質を同定■ Sequence Query 法 :MS1 や MS2 のピーク情報に各種絞り込み条件を追加して検索例) 1234.2 seq(n-AC[DHK]) seq(c-HI)
1314.7 tag(513.3,T[I|L]SP,911.5)■ MIS (MS/MS Ions Search) 法 :MS1 情報と MS2 情報を組み合わせてペプチドを同定。MS1 でペプチドを絞り込み、MS2 でマッチング。同定されたペプチドをもとにタンパク質を同定（推定）
主に TOF などでプレカーサーマススペクトルを測定した場合、そのデータからタンパク質を同定するためには Peptide Mass Fingerprint 法を使用します。またショットガン解析、ペプチドの MS1,MS2 情報をもとにペプチド配列やタンパク質を同定する方法としては MS/MS Ions Search 法が使用されます。
6

3. MASCOT Server の入力データ
この章では MASCOT Server で検索を行うための前処理と検索の流れを説明します。MASCOT Server
で検索を行うためには、質量分析装置で測定したデータをそのまま MASCOT Server に投げるのではなく、事前にデータ処理をする必要があります。データ処理のポイントは２つあります。
・ノイズをカットし、ペプチド又はフラグメントの質量を反映するピークのみを集めたデータにする事 (3-1)
・バイナリ形式の Raw データを判読可能なテキストファイルまたは xml フォーマットに変換する事 (3-2)
すなわち MASCOT 検索を行う前に、装置の raw データを判読可能で必要な情報のみ抽出したデータに変換する必要があります。MASCOT Server 自身では raw データを変換する事はできません。
3-1 では検索に投げる前にデータの処理が必要な理由と MASCOT Server が受け付けるファイル
フォーマットについて、3-2 では raw データから MASCOT で読み込みが可能なファイルフォーマットに変換するプログラムについてご紹介します。

3-1. MASCOT Server が読み込み可能なファイルフォーマット
MASCOT Server が読み込み可能なファイルフォーマットと変換の際に行われたピーク抽出処理の内容について説明しています。

3-1-1. PMF で対応するファイルフォーマット
PMF 検索の入力データはペプチドの質量が反映されたピークに関する情報です。PMF の入力データ作成の際にはペプチド由来のピークと考えられる箇所（下図、青色の●）を推定し、そのピークの m/z のみ、あるいは m/z と intensity 情報を利用します。ノイズに該当する個所の数値はこの段階で捨てられます。

7

ファイルについて、テキストファイルであれば拡張子が何であっても問題なく検索を実行できます。
ファイルの中身として、下左図のように 1 行につき１つの m/z が先頭に書かれていれば検索が可能です。
下右図のように後ろに intensity に該当する値が含まれている場合、intensity 情報を参考に入力
データの m/z の組み合わせを再構成したいくつかのパターンを作成し、各パターンのうちスコアが最も高いケースを真の入力データとして採用する方式となります。そのため同じ測定データでも後ろにintensity 情報を含まないケースと含むケースで検索結果を比べると、結果が異なるケースがあります。

361.21774
487.26656
494.28934
505.77755
686.36334
723.34797
836.78635
955.4842
1002.4743
1020.521
1263.679
1350.7063
1495.685
1533.6332
1675.6148

832.662903.3421186.439
1373.681
1403.722
1515.444
1727.916
1743.951
1759.966
1788.721
1804.712174.812
2190.1122256.871
2273.266
2288.489

4838.6552
5281.3009
8868.6732
16079.047
22677.156
36555.65
6731.0498
2890.8536
5553.321
2661.7174
1759.9609
3770.1817
43476.619
3063.8439
3315.1174

PMF 検索では上記のように単純なテキストファイルに加え、各装置メーカー/共通フォーマットから出力される以下のファイルの読み込みにも対応しています。
•

AB SCIEX Data Explorer (.PKM)•

Bruker Analysis AutoXecute Data Report•

Bruker (.XML)•

mzData (.XML)8

3-1-2. MIS で対応するファイルフォーマット:どのような情報が抜き出されているか
MIS 検索では入力データとしてペプチド並びにフラグメントの質量が反映されたピークの情報を集約して利用します。下図にもあるように、プレカーサーマススペクトルからはペプチドの質量を計算するために必要な m/z と電荷の情報（不明な場合は推定値）を、プロダクトイオンマススペクトルからはフラグメントを反映するピークを選び、ノイズがカットされた情報を抽出します。

3-1-3. MIS で対応するファイルフォーマット:mgf
Mascot Generic Format (mgf) は MASCOT Server の MIS 入力データとして最も使用されている
フォーマットです。以下のような構成となっています。

1query 毎 に BEGIN IONS で 始 ま り END IONS で 終 わ り ま す 。 ① の 部 分 、 赤 い 文 字 の 行 はプレカーサーマススペクトルから得られた情報に該当します。pepmass が m/z を、charge が電荷を表します。②の部分、緑の文字の行はプロダクトイオンマススペクトルから得られた情報に該当し、ノイズが9

カットされフラグメントピークに該当する m/z と intensity の情報となります。なお intensity の後に電荷情報が記されている場合、MASCOT Server 側で 1 価に換算(decharge)したフラグメントピークとして扱われます。intensity の後に電荷情報が記された形でのファイル出力すべてのソフトウェアで行われるわけでなく、現在のところ MASCOT Distiller を使用する事でのみ実現可能ですのでご注意ください。
mgf ファイルには複数の query をまとめて保存する事もできます（下図）。

mgf ファイルを得る方法として、MASCOT Distiller, ProteoWizard の msconvert,そして各社装置
メーカーの付属ソフトウェアから出力するオプションがあります。詳細は 3-2 で説明いたします。

3-1-4. MIS で対応するファイルフォーマット:mgf 以外のフォーマット
MASCOT Server の MIS 検索では mgf ファイル以外の各種フォーマット変換後ファイルの読み込みにも対応しています。対応フォーマットは以下の通りです。
•

Finnigan (.ASC)•

Micromass (.PKL)•

Sequest (.DTA)•

PerSeptive (.PKS)•

Sciex API III•

Bruker (.XML)•

mzData (.XML)•

mzML (.mzML)* 多くの装置で出力可能なフォーマットで、mgf の次によく利用されます。

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各フォーマットの詳細は以下の WEB ページをご覧ください。
https://www.matrixscience.com/help/data_file_help.html#FORMAT

3-2 . raw データ変換プログラム
バイナリ形式の Raw データを判読可能なテキストファイルまたは xml フォーマットに変換するプログラム
は、大きく分けると以下の 3 種類あります。
■ ProteoWizard msconvert
オープンソースでクロスプラットフォームのツールまたはライブラリです。
https://proteowizard.sourceforge.io/
msconvertGUI.exe というプログラムを起動してプログラム内で mgf を作成する事もできますし、
MASCOT Daemon と組み合わせて利用する事もできます（4-3 で簡単な操作の紹介をしています）。
■ MASCOT Distiller
弊社が販売しているソフトウェアです。MASCOT Server/Daemon といった弊社取り扱いソフトウェアとの連携の良さや多価フラグメントピークデータも検索に組み込む事ができるのが特徴です。
https://www.matrixscience.com/distiller.html (英語紹介ページ)
https://www.matrixscience.co.jp/distiller.html (日本語紹介ページ)■ 質量分析装置付属のソフトウェア
ほとんどの質量分析装置付属の解析ソフトウェアでは mgf ファイル（ピークリストのテキストファイル）や
mzML フォーマットに出力が可能で、それらを MASCOT 検索に利用する事ができます。mzML で使用する
場合、ピークに該当するものを選び出した状態でそれを反映したファイル出力がされている事が望ましいです。

11

4. MASCOT Server 検索方法
この章では MASCOT Server で検索を行う方法についてご説明しています。
4-1 では MASCOT Server をネットワーク上で指定する方法についてご説明します。また 4-2 では
何らかの形で準備した mgf を入力データとして、WEB ブラウザを介して MASCOT 検索を実施する方法をご説明します。
4-3 以降では raw データから mgf への変換を意識することなく検索を実施する方法についてご紹介します。4-3 は MASCOT Server に無料でバンドルされているソフトウェア MASCOT Daemon を使った検索方法、そして 4-4 では質量分析装置メーカーが提供しているソフトウェアを使って行う方法についてご案内いたします。

4-1. 「URL」と MASCOT Server[ネットワーク上で MASCOT を指定する方法]

MASCOT Server は WEB アプリケーションであり、自分自身あるいは別のコンピューターから
MASCOT Server を URL で指定します。
URL の記入例としては以下のような記述となります。
http://(computer 名)/mascot/ 例: http://mascotserver/mascot/
http:// (IP アドレス )/mascot/

例: http://192.168.100.222/mascot/

MASCOT Server のコンピューター自身から MASCOT を指定する場合、下図のように
http://localhost/mascot/という URL で指定できることがほとんどです。

一方 MASCOT Server とは別のコンピューターから MASCOT Server を URL で指定する場合、コンピューター名と IP アドレスのどちらが、あるいは両方使用可能かについてはケースバイケースです。
呼び出しレベルとしては IP アドレスの方がより原始的な仕組みになるため、MASCOT Server に固定 IP
アドレスが割り振られている場合は IP アドレスでの指定をする方がより可能性が高く接続できます。一方
ネットワークの仕組みとして DHCP など動的な IP 割り当てが行われている場合はコンピューター名による指定をする事で逐次変更される IP アドレスにも対応する事が可能です。
12

4-2. 変換済みファイルを WEB ブラウザで検索
何らかの方法でデータ変換を行った入力ファイルを手元に持っている場合、ＷＥＢブラウザを使ってMASCOT Server の検索を行う事ができます。ＰＭＦの場合と MIS の場合に分けてご案内します。

4-2-1. PMF : テキストデータを WEB ブラウザで検索① ピークリストファイル(テキスト)を準備② ブラウザを開き、MASCOT Server へアクセス③ Home -> Access MASCOT Server④ 「Peptide Mass Fingerprint」の「Perform search」⑤ 検索パラメーター並びに入力データを指定⑥ 「Start search」ボタンを押すことで検索実行

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4-2-2. MIS : mgf ファイルを WEB ブラウザで検索① mgf/mzML ファイルを準備② ブラウザを開き、MASCOT Server へアクセス③ Home -> Access MASCOT Server④ 「MS/MS Ions Search」の「Perform search」⑤ 検索パラメーター並びに入力データを指定⑥ 「Start search」ボタンを押すことで検索実行

4-3. Daemon を使って raw データを直接検索
毎回 raw ファイルから mgf ファイルを準備するのが大変な場合、MASCOT Daemon 上で変換プログラムを介して raw データから自動的に変換しつつ検索する方法があります。
詳細はhttps://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/MASCOTDaemon_ver28_manual.pdf
14

の「3.チュートリアル」(P.11～)をご覧ください。
変換プログラムとして ProteoWizard と MASCOT Distiller を使用する方法についてそれぞれご案内します。

4-3-1. Daemon + ProteoWizard
先程ご案内したhttps://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/MASCOTDaemon_ver28_manual.pdfの「 3.チュートリアル 」 (P.11～ )は、ProteoWizard を使 って変換し て検索を行 っています。詳しくはチュートリアルをご覧ください。
別資料内の内容をまとめた、簡単な手順について以下にご案内します。
① Daemon を起動② Parameter Editor タブで検索条件を指定し、条件をファイルに保存するため「Save」または「Save As」③ Task Editor タブでタスク名、検索対象のファイル、パラメータファイルを指定④ Task Editor タブの「Data import filter」で「ProteoWizard msConvert」を選択し、「Options」の「Peak list format」で「MGF」や「mzML」を選択してから「ＯＫ」ボタン⑤ Task Editor タブで「Run」ボタンを押すことで検索実行⑥ Status タブに検索の進捗が表示。検索完了すると結果画面へのＵＲＬが表示されるのでクリック①～⑥の手順について理解の一助となる図が次頁にございますのでそちらも併せてご参照ください。

4-3-2. Daemon + Distiller
Mascot Distiller と同じコンピューターにインストールされた Daemon では、変換プログラムに Mascot
Distiller を使用する事ができます。手順は 4-3-1 とほぼ同じですが、データ変換部分の指定個所である④が少し異なります。
① Daemon を起動② Parameter Editor タブで検索条件を指定し、条件をファイルに保存するため「Save」または「Save As」③ Task Editor タブでタスク名、検索対象のファイル、パラメータファイルを指定④ Task Editor タブの「Data import filter」で「Mascot Distiller」を選択し、「Options」の「Data File Format」で raw ファイルの形式を、「Mascot Distiller Processing Options」で変換の際に使用するピーク変換用のパラメータセットを選択してから「ＯＫ」ボタン⑤ Task Editor タブで「Run」ボタンを押すことで検索実行⑥ Status タブに検索の進捗が表示。検索完了すると結果画面へのＵＲＬが表示されるのでクリック①～⑥の手順について理解の一助となる図が次頁にございますのでそちらも併せてご参照ください。

15

16

4-4. 質量分析装置メーカーのソフトウェアから検索
弊社で準備している検索の方法とは別に、質量分析装置メーカー にて販売している 各種解析
ソフトウェアから MASCOT を呼び出して検索を行う方法があります。その場合、MASCOT Server と装置メーカー ソフトウェアは基本的に別のコンピューターにインストールされており、装置メーカー
ソフトウェア上で MASCOT Server を URL で指定する事になります。
接続がうまくいかない場合どのレベルで接続できていないかを確認するため、ソフトウェアで設定を行う前に同じコンピューターの WEB ブラウザで MASCOT を URL 指定して、Home 画面を開く事ができるか必ずご確認頂く事を推奨します。
検索後、結果をどのように利用するかはソフトウェアによって異なります。検索後 MASCOT Server の検索結果画面がブラウザで表示されるケースもあれば、MASCOT Server の検索結果が装置メーカー
ソフトウェアに取り込まれ、そのソフトウェアの仕様で表示される事もあります。いずれのケースにおいてもMASCOT Server で検索された内容は必ず MASCOT Server に残り、MASCOT の Search log などから確認する事が可能です。

17

5. 検索パラメーターとデータベース
この章では MASCOT 検索時に指定するパラメーターについて説明しています。
5-1～5-3 では各検索手法におけるパラメーターについて、検索手法別に１つ１つ説明をしています。
5-4 ではパラメーターの中でカスタマイズ可能な項目について、5-5 では検索対象のデータベースについて、
5-6 では WEB ブラウザで検索を行う際にブラウザの cookie 機能を使って予めいつも使うパラメーターの情報を保存する方法について説明しています。

18

5-1. PMF : 検索パラメーター 一覧

(1)

(2)

(3)
(4)

(5)
(6)

(7)
(8)

(9)

(10)

(11)
(13)

(12)
(14)

(15)
(17)

(16)

PMF 検索のパラメーターについて、以降順に説明いたします。
(1) Your name, (2) Email, (3) Search title
次頁図（赤枠）のように、検索結果画面並びに Search log において検索の内容や検索者を確認する際に使用します。任意の文字列を入力可能です。Email については Email で検索結果を通知するなどの設定をしていない場合、メモ欄の代わりとして使用する事も可能です。
19

(4) Database(s)検索対象のデータベースを選択します。データベースには以下の 2 種類から選択可能です。
-

AA : Amino Acid, アミノ酸配列-

NA : Nucleic Acid, 核酸配列

Ctrl キーを押しながらクリックする事で複数のデータベースを選択する事もできます。
(5) Enzyme
タンパク質の切断パターンを指定します。
(6) Allow up to
Enzyme 設定について、切断箇所と認定された箇所を見逃し連結したペプチドを作成する事ができます
が、何度まで見逃すことを許容するかについての設定です。例えば Trypsin 設定では K,R の C 末端が切断されますが、
EGRNRFPFLSLSQRという配列があった場合、missed cleavage 設定が 0 なら
EGR
NR
FPFLSLSQRという 3 種類のペプチドのみを考慮します。missed cleavage が 1 の場合、上記に加え
EGRNR
NRFPFLSLSQRの 2 種類のペプチドも考慮する対象として追加されます。

20

(7) Taxonomy
生物種の絞り込みに関する設定です。Taxonomy 設定がされているデータベース(SwissProt など)のみ適用可能です。設定されていないデータベースに使用した場合、エラーメッセージは出ますが検索はそのまま実行する事ができます。
リストに記載されている生物種はユーザーがカスタマイズする事も可能です。
(8) Fixed Modification, (9) Variable Modification
修飾に関する設定です。設定した項目について、対象アミノ酸の質量の変化を考慮します。 (8)の Fixed
は対象のすべてのアミノ酸について指定した内容に質量が変更します。一方 (9) の Variable は修飾がつくパターンとつかないパターンの両方を考慮します。両方を考慮する分融通が利くように見えますが、検索時間が長くなる事とスコアリングで不利になり同定しにくくなるというデメリットがあります。指定する場合は右側にあるリストから該当項目を選び、真ん中にある < を使って Fixed または Variable の内容として指定します。

またリストに初期表示される修飾は使用可能な設定のごく一部で、頻度の低い項目については初期に表示されないようになっています 。それらのその他多くの設定を表示させるには、画面中央にある「Display all modifications」にチェックを入れる事で右側のリストが変化します。
(10) Protein mass
タンパク質の質量に対する上限値です。データベースにエントリーされている配列の全長に対する質量ではなく、マッチしたペプチドのうち最も N 末端側と C 末端側でマッチした領域を対象として、その N 末端
から C 末端までの配列の質量が計算対象となります。
(11) Peptide tol.±ペプチドの質量について、実測値から計算された値とペプチド配列から計算された値との許容誤差です。
ユーザー側で装置のスペックや事前に行ったキャリブレーションの結果を基に適正値を判断します。
(12) Mass values
PMF 検索においてクエリーの各ピークが MH+か M-H-か、あるいはイオンが負荷していない質量に換算されたものなのか(Mr)を指定します。

21

(13) Monoisotopic / Average
ア ミ ノ 酸 の 質 量 計 算 を Monoisotopic で 行 う か 、 Average で 行 う か を 指 定 し ま す 。 現 在 はmonoisotopic を選択する事がほとんどです。
(14) Data file / Query_Data input
検索 query となるデータを指定します。ファイルで渡す場合は「Data file」で該当ファイルを選択します。
一方、ファイルでなく直接データを記入して渡す場合、「Query」を指定して、「Data input」欄にデータを記入(貼り付け)します（下図）。データフォーマットについては「3-1-1.PMF で対応するファイルフォーマット」
をご覧ください。

(15) Decoy
同定結果の検証に必要な 「FDR」を算出する事ができますが PMF ではあまり使われていません。詳細は「11.FDR と Decoy データベース」をご覧ください。
(16) Start Search
検索を開始します。
(17) Reset Form
パラメーター設定をデフォルト状態に戻します。

5-2. Sequence Query : 検索パラメーター 一覧
(1)
(3)
(4)

(2)
(5)
(6)
(7)

(8)
(9)

(10)
(11)

(12)

(13)
(15)

(14)
(16)
(17)
(18)

22

(19)

(20)

(1) Your name, (2) Email, (3) Search title
検索結果画面並びに Search log において検索の内容や検索者を確認する際に使用します。任意の文字列を入力可能です。Email については Email で結果を返すなどの設定をしていない場合、メモ欄の代わりに使用する事もできます。

(4) Database(s)検索対象のデータベースを選択します。データベースには以下の 2 種類があります。
-

AA: Amino Acid, アミノ酸配列-

NA: Nucleic Acid, 核酸配列

Ctrl キーを押しながらクリックする事で複数のデータベースを選択する事もできます。
(5) Enzyme
タンパク質の切断パターンを指定します。
(6)Allow up to
Enzyme 設定について、切断箇所と認定された箇所を見逃し連結したペプチドを作成する事ができます
が、何度まで見逃すことを許容するかについての設定です。例えば Trypsin 設定で K,R の C 末端が切断されますが、
EGRNRFPFLSLSQRという配列があった場合、missed cleavage 設定が 0 なら
EGR
NR
FPFLSLSQRという 3 種類のペプチドのみを考慮します。missed cleavage が 1 の場合、上記に加え
EGRNR
NRFPFLSLSQRの 2 種類のペプチドも考慮する対象として追加されます。
23

(7) Quantitation
定 量 計 算 に 関 す る 設 定 項 目 で す 。 MASCOT で はSpectral Counting の 1 種である emPAI についてはここで指定することなく結果画面に自動的に表示されます。
こ の 設 定 項 目 は何 の 準備 もな く 利 用で き るもの で はありません。選択項目のうち、後ろに[MD]がついていない
ものについては MASCOT Server 単独でも計算が可能
ですが、計算をするためにはそれに合わせた測定を予め行っておく必要があります。[MD]が後ろについている項目については計算のためにソフトウェア MASCOT Distillerの計算モジュールまで搭載されたものが必要です。また
ラベルフリーの手法を除き、計算のためにはそれに合わせた測定をあらかじめ行っておく必要があります。
計算を行うためには、様々な設定を事前に行いパッケージ化して名称を設定した項目を検索時に指定する事になります。
詳細は「10-2.Quantitation」をご覧ください。
(8) Taxonomy
生物種の絞り込みに関する設定です。Taxonomy 設定がされているデータベース(SwissProt など)のみ適用可能です。設定されていないデータベースに使用した場合、エラーメッセージは出ますが検索はそのまま実行する事ができます。
リストに記載されている生物種はユーザーがカスタマイズする事も可能です。
(9) Fixed Modification, (10) Variable Modification
修飾に関する設定です。設定した項目について、対象アミノ酸の質量の変化を考慮します。 (10)の Fixed
は対象のすべてのアミノ酸について指定した内容に質量が変更します。一方 (11) の Variable は修飾がつくパターンとつかないパターンの両方を考慮します。両方を考慮する分融通が利くように見えますが、検索時間が長くなる事と同定判定で不利になり同定しにくくなるというデメリットがあります。指定する
場合は右側にあるリストから該当項目を選び、真ん中にある < を使って Fixed または Variable の内容として指定します。

24

またリストに初期表示される修飾は使用可能な設定のごく一部で、頻度の低い項目については初期に表示されないようになっています。それらのその他多くの設定を表示させるには、画面中央にある「Display
all modifications」にチェックを入れる事で右側のリストが変化します。
(11) Peptide tol.±ペプチドの質量について、実測値から計算された値とペプチド配列から計算された値との許容誤差です。
ユーザー側で装置のスペックや事前に行ったキャリブレーションの結果を基に適正値を判断します。
(12) #13C
質量分析装置での測定時、12C のみから構成されるペプチドではなく 13C を含むペプチドを取り込んでいることがあります。その際生じる理論値とのずれを補正するためのパラメーターです。ペプチドの理論値に対して適応されます。上記(11)の Peptide to.±を TOL、実験値並びに理論値の質量をそれぞれ
exp,calc と表現する場合、通常はTOL > |exp – calc| の時のみをマッチとみなしますが、この設定値を 1 とした場合は TOL > |exp – calc – 1| もマッチとみなします。
また設定値を 2 とした場合は上記に加え TOL > |exp – calc – 2| もマッチとみなします。
(13) MS/MS tol.±ペプチドのフラグメントの質量について、実測値から計算された値とペプチド配列から計算された値との許容誤差です。装置のスペックや事前に行ったキャリブレーションの結果をもとに適正値を判断します。
(14) Peptide charge
通常は使用されないパラメーターです。クエリーデータの中に charge、すなわちペプチドの電荷に関する情報が含まれない場合、ここで指定した値が使用されます。ただしほとんどのケースにおいてペプチドの電荷に関する情報はファイルに含まれていて、その場合ここで指定した値は無視されます。
フ ァ イ ル 内 で 電 荷 状 況 を 示 す charge 行 は 、 仮 に 電 荷 が 特 定 で き な い ケ ー ス で も 推 定 値 と し て
charge=2+,3+,4+ などと記入されていることが多いため、このパラメーターが使用されることはあまりありません。
(15) Monoisotopic / Average
ア ミ ノ 酸 の 質 量 計 算 を Monoisotopic で 行 う か 、 Average で 行 う か を 指 定 し ま す 。 現 在 はmonoisotopic を選択する事がほとんどです。
(16) Query
検索 query となる入力データを指定します。アミノ酸配列の並びや組成に関する情報をフィルターとして利用する事ができます。Sequence Query の文法については
https://www.matrixscience.com/help/sq_help.html
をご覧ください。

25

(17) Instrument
フラグメントピークと理論値をマッチする際、考慮するイオンシリーズやフラグメントピークの電荷に関する情報が定義されたセット（下図）です。設定値が変わる事で理論値とのマッチング状況が変わり、MASCOT の Ion Score が変わり、ひいては同定結果も変わってくることがあります。

(18) Decoy
ペプチドの同定結果を検証するために必要な “FDR”を算出する事ができます。FDR を計算したい場合はチェックを入れてください。検索時間としては入れない場合に比べ２倍強かかります。詳細は「11. FDRと Decoy データベース」をご覧ください。
26

(19) Start Search
検索を開始します。
(20) Reset Form
パラメーター設定をデフォルト状態に戻します。

5-3. MIS : 検索パラメーター 一覧

(1)

(2)

(3)
(4)

(5)
(6)

(7)

(8)
(9)
(10)

(11)

(13)

(12)
(15)

(14)
(16)

(17)
(19)

(18)
(21)

(20)

(23)

(22)
(24)

(25)
27

(1) Your name, (2) Email, (3) Search title
検索結果画面並びに Search log において検索の内容や検索者を確認する際に使用します（下図）。任意の文字列を入力可能です。Email については Email で結果を返すなどの設定をしていない場合、メモ欄の代わりに使用する事もできます。

(4) Database(s)検索対象のデータベースを選択します。データベースには以下の 3 種類があります。
-

AA: Amino Acid,アミノ酸配列-

NA: Nucleic Acid, 核酸配列-

SL: Spectral Library,ピークリスト:過去に測定したペプチドのフラグメントピークデータ

Ctrl キーを押しながらクリックする事で複数のデータベースを選択する事もできます。
(5) Taxonomy
生物種の絞り込みに関する設定です。Taxonomy 設定がされているデータベース(SwissProt など)のみ適用可能です。設定されていないデータベースに使用した場合、エラーメッセージは出ますが検索はそのまま実行する事ができます。
リストに記載されている生物種はユーザーがカスタマイズする事も可能です。
(6) Enzyme
タンパク質の切断パターンを指定します。
(7) Allow up to
Enzyme 設定について、切断箇所と認定された箇所を見逃し連結したペプチドを作成する事ができます
が、何度まで見逃すことを許容するかについての設定です。例えば Trypsin 設定では K,R の C 末端が切断
されます。
28

EGRNRFPFLSLSQRという配列があった場合、missed cleavage 設定が 0 なら
EGR
NR
FPFLSLSQRという 3 種類のペプチドのみを考慮します。missed cleavage が 1 の場合、上記に加え
EGRNR
NRFPFLSLSQRの 2 種類のペプチドも考慮する対象として追加されます。
(8) Quantitation
定量計算に関する設定項目です。MASCOT では Spectral
Counting の 1 種である emPAI についてはここで指定することなく結果画面に自動的に表示されます。この設定項目は
何の準備もなく利用できるものではありません。選択項目のう ち 、 後 ろ に [MD] が つ い て い な い も の に つ い て はMASCOT Server 単独でも計算が可能ですが、計算をする
ためにはそれに合わせた測定をあらかじめ行っておく必要があります。[MD]が後ろについている項目については計算のためにソフトウェア MASCOT Distiller の計算モジュールまで搭載されたものが必要です。またラベルフリーの手法を除き、計算のためにはそれに合わせた測定をあらかじめ行っておく必要があります。
計算を行うためには、様々な設定を事前に行いパッケージ化して名称を設定した項目を検索時に指定する事になります。詳細は「10-2.Quantitation」をご覧ください。
(9) Crosslinkingペプチドがリンカーまたは共有結合で結合したデータを検索する事ができます。この設定についてもQuantitation 同様何の準備もなく利用できるものではありません 。計算を行うためには、それに合わせた測定（リンカーを添加したりＳＳ結合を切断する還元処理を行わないなど）を予め行っておく必要があるほか、様々な設定を事前に行いパッケージ化して名称を設定した項目を検索時に指定する事になります。詳細は「10-3.Crosslink」をご覧ください。

[次頁に続きます]29

(10) Fixed Modification, (11) Variable Modification
修飾に関する設定です。設定した項目について、対象アミノ酸の質量の変化を考慮します。 (10)の Fixed
は対象のすべてのアミノ酸について指定した内容に質量が変更します。一方 (11) の Variable は修飾がつくパターンとつかないパターンの両方を考慮します。両方を考慮する分融通が利くように見えますが、検索時間が長くなる事と同定判定で不利になり同定しにくくなるというデメリットがあります。指定する
場合は右側にあるリストから該当項目を選び、真ん中にある 「<」 を使って Fixed または Variable の内容として指定します。

リストに初期表示される修飾は使用可能な設定のごく一部で、頻度の低い項目については初期に表示されないようになっています。それらのその他多くの設定を表示させるには、画面中央にある「Display
all modifications」にチェックを入れる事で右側のリストが変化します。
(12) Peptide tol.±ペプチドの質量について、実測値から計算された値とペプチド配列から計算された値との許容誤差です。
ユーザー側で装置のスペックや事前に行ったキャリブレーションの結果を基に適正値を判断します。
(13) #13C
質量分析装置での測定時、12C のみから構成されるペプチドではなく 13C を含むペプチドを取り込んでいることがあります。その際生じる理論値とのずれを補正するためのパラメーターです。ペプチドの理論値に対して適応されます。上記(11)の Peptide to.±を TOL、実験値並びに理論値の質量をそれぞれ
exp,calc と表現する場合、通常はTOL > |exp – calc| の時のみをマッチとみなしますが、この設定値を 1 とした場合は TOL > |exp – calc – 1| もマッチとみなします。
また設定値を 2 とした場合は上記に加え TOL > |exp – calc – 2| もマッチとみなします。
(14) MS/MS tol.±ペプチドのフラグメントの質量について、実測値から計算された値とペプチド配列から計算された値との許容誤差です。ユーザー側で装置のスペックや事前に行ったキャリブレーションの結果を基に適正値を判断
します。

30

(15) Peptide charge
通常は使用されないパラメーターです。クエリーデータの中に charge、すなわちペプチドの電荷に関する情報が含まれない場合、ここで指定した値が使用されます。ただしほとんどのケースにおいてペプチドの電荷に関する情報はファイルに含まれていて、その場合ここで指定した値は無視されます。
フ ァ イ ル 内 で 電 荷 状 況 を 示 す charge 行 は 、 仮 に 電 荷 が 特 定 で き な い ケ ー ス で も 推 定 値 と し て
charge=2+,3+,4+ などと記入されていることが多いため、このパラメーターが使用されることはあまりありません。
(16) Monoisotopic / Average
ア ミ ノ 酸 の 質 量 計 算 を Monoisotopic で 行 う か 、 Average で 行 う か を 指 定 し ま す 。 現 在 はmonoisotopic を選択する事がほとんどです。
(17) Data file
検索 query となる入力データを指定します。WEB ブラウザで検索を行う場合、raw データではなく判読可能なテキストまたは XML フォーマットに変換されたデータを指定する必要があります。
(18) Data format
判読可能なテキストフォーマット並びに XML フォーマットのデータを読み込む際、そのフォーマットを選択します。
現在主に使用されるものとして、「Mascot generic」(mgf という拡張子、名称がよく使われます)と「mzML(.mzML)」があり、そのほかにも右図のような各種フォーマットに対応しています。詳細は「3-1-2.」～「3-1-4.」をご参照ください。

(19) Precursor
通常は使用されないパラメーターです。クエリーデータの中に pepmass、すなわちペプチドの m/z に関する情報が含まれない場合、ここで指定した値が m/z として使用されます。ただしほとんどのケースにおいてペプチドの m/z に関する情報が含まれていて、その場合ここで指定した値は無視されます。
(20) Instrument
フラグメントピークと理論値をマッチする際、考慮するイオンシリーズやフラグメントピークの電荷に関する情報が定義されたセットです（次頁図参照）。設定値が変わる事で理論値とのマッチング状況が変わり、MASCOT の Ion Score が変わり、ひいては同定結果も変わってくることがあります。

31

32

(21) Error tolerant
1)想定外の修飾、2)非特異的切断を伴うペプチド、3)アミノ酸残基置換 の３つを検出する事ができる
2 段階検索です。詳細は「10-4. Error Tolerant Search」の項目をご覧ください。
(22) Decoy
ペプチドの同定結果を検証するために必要な「FDR」を算出する事ができます。FDR を計算したい場合はチェックを入れてください。検索時間としては入れない場合に比べ２倍強かかります。詳細は「11. FDR とDecoy データベース」をご覧ください。
(23) Target PSM FDR
FDR を同定基準として利用する際に設定します。カウントの対象は PSM(Peptide-Spectrum Matches)、
即ち query ベースの数え上げとなります。
(24) Start Search
検索を開始します。
(25) Reset Form
パラメーター設定をデフォルト状態に戻します。

5-4. パラメーターの中でカスタマイズ可能な項目
検索パラメーターの中にはカスタマイズをして利用する事ができる項目があります。
Databases
Taxonomy
EnzymeQuantitation
Crosslinking
Modification
Instrument
ほとんどの設定は Configuration Editor (Home -> Configuration Editor)で行います。各設定画面については「13. MASCOT Server のカスタマイズ」をご覧ください。
なお設定変更が可能なのは製品版（ローカル版）MASCOT Server のみです。インターネット上で公開されている試用サーバーでは変更ができません。MASCOT Server をカスタマイズしてご利用頂きたい
場合は製品版の購入をご検討ください。

33

5-5. Database
MASCOT では検索対象として最適なデータベースを自動的に選択するような仕組みはありません。
ユーザーが目的に応じて適切なデータベースを自身で選択する必要があります。
MASCOT で検索可能なデータベースは大きく分けて３種類あります。

AA : Amino Acid
: アミノ酸配列
NA : Nucleic Acid
: 核酸配列SL : Spectral Library : ピークリスト/過去に測定したペプチドのフラグメントピークデータ
データベースは「Database Manager」で既存データベースについて最新版への更新を行ったり、新規
データベースの追加を行ったりする事ができます。新規データベースの追加については、MASCOT 側で
予めファイル取得先やデータベース諸設定を定義されたものから選択する方法と、自身で準備した FASTA
ファイルをセットする方法があります。Database manager については別紙の設定資料を準備しておりますのでそちらをご覧ください。
https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/MASCOTServer_ver26_sequencedbmanage.pdf
8-3 や 9-3 で後述するように、MASCOT ではデータベースにないエントリーを同定する事はできません
が、必要以上にエントリー数の多いデータベースを選択してしまうと同定基準値が高くなってしまい
結果的にペプチド配列やタンパク質の同定がより難しくなってしまいます。必要十分な検索範囲のデータベースを選択する必要があります。
使用するべきデータベースが良くわからない場合、最初の選択として「SwissProt」を選択して頂く事をお勧めします。より網羅的な解析を希望する場合、データベース名が UP で始まり生物種名が名称内に含まれる、Uniprot 系のデータベースの使用をセットして利用する事もお勧めします。
以下、MASCOT が Predefined として準備しているデータベースのうち代表的なものについて説明をいたします。

■ SwissProt
https://www.expasy.org/sprot/
Uniprot デー タベ ースの 中 の １つで、 EBI(European Bioinformatics Institute) と SIB (Swiss
Institute of Bioinformatics)により共同運用されたタンパク質配列のデータベース。各エントリーに対して、
機能・ドメイン構造・修飾・バリアント・論文情報・他データベースへのリンクなど、精査されたアノテーション
情報が手動で付与されています。配列の冗長性はできるだけ無いように調整されていて、２０２１年３月版
で 565,254 件のデータが登録されています。このエントリー数は長期に渡りあまり変動がありません。
■

Uniprot → MASCOT データベースでは UPN_B と表記 (N は番号、B は生物種)
https://www.uniprot.org/
手動アノテーションされた上記 SwissProt に加え、自動かつ精査無しのデータベース TrEMBL を併せたデータベースです。TrEMBL は SwissProt に比べ圧倒的にエントリー数が多く２０２１年３月版で34

219,174,961 件のデータが登録されています。SwissProt のみのデータベースに比べ配列のカバー範囲
が広く、SwissProt でマッチしなかった場合の次の選択肢に最適です。ただし Uniprot すべてのエントリー
では件数が多すぎるので、生物種を限定したデータベースを準備してそれに対して検索をかける事を推奨しています。
詳細な説明並びにデータベースをセットする具体的な方法については以下日本語資料「検索対象の生物種を予め絞り込んだ UniprotKB データベースの作成手順」をご覧ください。
https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/Uniprotdb_20200915.pdf■ NCBIprot (旧名称 NCBInr)
NCBI(National Center for Biotechnology Information)で公開されているタンパク質データベース「nr」です。「nr」とは「non-redundant」の略ですが、実際にはほぼ同じ配列のデータが数多く登録されており、それが膨大なエントリー数の要因となっています。かつて網羅的な探索用のデータベースとしてSwissProt の次の選択肢として弊社にて使用を推奨していました。しかし現在は冗長性膨大なエントリー数
により MASCOT Server での更新やセットアップが困難になってしまった事から、使用を推奨しておりません。代わりに上述の Uniprot の使用をお勧めしています。

■ IPIInternational Protein Index にてかつて公開され、一時期多くのユーザーによって利用されていたタンパク質配列のデータベースです。2011 年 9 月に最後のリリースが行われその後更新されていないため、現在は非推奨です。

■ XXXXX_EST (Human_EST など)
EST とは Expressed Sequence Tag の事で、cDNA ライブラリの部分配列にあたります。mRNAレベルでの塩基配列情報が含まれているデータベースで、タンパク質データベースでは見つからないようなペプチド配列などが検出される事が期待されます。一方でマッチング後に次のステップに進みにくいため、目的をもって利用される事をお勧めします（機能が不明な状態でも得られた配列情報を使って別の解析を進める、など）。

■ NIST_XXXX_YYYY (NIST_Human_HCD など)
ピークリスト（過去に測定したペプチドのフラグメントピークの情報）データベースで、NIST（National
Institute of Standards and Technology）にて公開しているものです。

■ PRIDE_XXXXX (PRIDE_Human など)
ピークリスト（過去に測定したペプチドのフラグメントピークの情報）データベースで、data repositorysite の PRIDE（Proteomics IDEntification database）にて公開しているものです。

その他のデータベースについての説明は以下のページをご参照ください。
https://www.matrixscience.com/help/database_help.html

35

5-6. Search form defaults「Access Mascot Server」ページの一番下に「Search form defaults」という項目があります（下図）。
「preferred default settings」リンクをクリックし開いた画面でパラメータをセットし保存すると、各検索方法の search form 画面を開いた際に保存内容がデフォルトの選択設定として選ばれた状態になっています。

36

6. 検索結果画面:PMF
この章では MASCOT PMF 検索における結果画面について説明します。

6-1. 表示例で使用している検索について
PMF の検索例として MASCOT Server 内に存在する以下の検索結果を利用します。
[公開サーバー] https://www.matrixscience.com/cgi/master_results.pl?file=../data/F981122.dat[ローカルサーバー] http://localhost/mascot/cgi/master_results.pl?file=../data/F981122.dat

18 のピークを含んだ query（左下）で、以下のようなパラメーター設定（右下）を行った検索です。
同定されるタンパク質は「PML_HUMAN」となります。

814.430
958.350
1000.330
1165.390
1182.440
1191.500
1300.470
1320.400
1348.410
1355.530
1423.520

設定項目

設定値

Database

SwissProt

EnzymeTrypsin/P

Allow up to

2

Taxonomyall

Peptide tol,±

0.2 DaMass Values

MH+

Monoisotopic/Average

Monoisotopic

1426.570
1624.740
2265.1102544.410
2550.300
2653.390
2882.500000

6-2. 表示内容の詳細 : summary 画面
6-2-1. 展開しない状態での画面概要
URL を WEB ブラウザで指定し結果画面を開くと次頁のような画面が現れます。画面内の赤線で囲われた各パーツで記載されている内容について、以降順に説明します。
37

6-2-2 ヘッダー部分

6-2-３ Score Histogram

6-2-4 表示内容の変更[Format As]

6-2-5 再検索
6-2-６ 同定タンパク質の情報================中略===================

6-2-７ Search parameters386-2-2. ヘッダー部分「5-3 PMF 検索パラメーター 一覧」も併せてご覧ください。
User: パラメーター「your name」で指定した内容

Email: パラメーター「Email」で指定した内容

Search title : パラメーター「Search title」で指定した内容
Database: 検索対象としたデータベースとバージョン、登録件数と総残基数

Taxonomy: パラメーター「Taxonomy」で指定した生物種（指定しているときのみ）。
生物種限定時の登録エントリー数も表示

Timestamp: 検索開始時間

Top Score: 最も高いスコアとなったタンパク質のスコア、Accession, Description

6-2-3. Score Histogram

横軸が MASCOT Score,縦軸はそのスコアを持つエントリーの数です。
上記図内の赤枠で囲われた箇所(70)が同定基準値で、同定基準値より高いスコアを持つタンパク質がMASCOT で判定された「同定タンパク質」となります。
同定基準値は、グラフの緑の網掛けゾーン一番右側に対応します。グラフの緑の網掛けより右側にタンパク質が存在するとき同定タンパク質が見つかったことを意味し、逆に最もスコアが高いタンパク質も緑の網掛けの領域を脱する事が出来なかった場合は同定タンパク質が見つからなかったことを意味します（次頁図）。同定タンパク質が見つかった場合は検索成功で、同定内容について検証する作業に入ります。
一方同定タンパク質が見つからなかった時は入力データや指定パラメーターを見直して同定できなかった理由を検証するか、新たな測定を実施して再度同定を試みる事をお勧めします。

39

6-2-4. 表示内容の変更 [Format As]

表示 Summary 形式: 結果画面のフォーマットを変更したり、結果ファイルの export を行います。
Protein Summary / Concise Protein Summary / Export Search Results

Significance threshold : 同定基準の p value（このケースでは Expect と同じとお考え下さい）を指定します。小さいほど同定基準が厳しい事になります。
Max. number of hits

: 表示するタンパク質数、推奨は”AUTO”。

Preferred taxonomy: 優先表示させる生物種。タンパク質の 1 つのエントリーに数種のエントリーが統合されていることがあります。検索パラメーター「taxonomy」の絞り込みはエントリーに登録されている複数生物種すべてに対応する事ができる一方、表示される生物種はエントリー時にデフォルトで定められた１種類のみです。結果、パラメーターで指定した生物種と明らかに異なる生物
種由来と見受けられるエントリーが結果に表示されることがあります。
Preferred taxonomy の設定を行う事で、優先して表示させる生物種名を指定したものに切り替える事ができます。

各種項目を変更後、”Format As”ボタンを押すことで設定内容に基づいて結果画面表示が切り替わります。
40

6-2-5. 再検索 : Research all, search unmatched

再検索を実施するボタンです。「Re-Search All」は入力データ全てを使った、「Search Unmatched」は同定基準を超えたタンパク質にマッチしたものを除いた全てのピークを使って再検索を行います。

6-2-6. 同定タンパク質の情報検索した結果、スコアが高かったタンパク質について表示されます。表示内容は以下の通りです。
Accession: データベースの ID が表示されます。ハイパーリンクになっていてクリックするとより詳しい情報が記載されている「Protein View」の画面が開きます。Protein View の
詳細は 6-3 をご覧ください。

Mass: タンパク質の質量で、データベースに登録されている配列情報から計算。

Score: MASCOT Score。赤字の表示は同定基準を超えている事を表します。高いほど理論値と実測値がよりよくマッチしていることを示します。

Expect: Score と同定基準値をもとに算出された値。ランダムマッチだった場合に検索したデータベースからどれくらいのエントリーが見つかってくるかを表す「期待値」です。
同定基準を超えている時、値が 0.05（デフォルト設定の場合）より小さくなります。なお
同定基準値は「Significance threshold p<」の値と連動します。期待値についての詳細は「8-4.同定タンパク質:マッチングとスコア、同定基準値、期待値」をご覧下さい。

Matches: マッチしたピーク数。

Description: データベース各エントリーのヘッダー行に記載されている、タンパク質の機能に関する情報。

41

6-2-7. Search parameters

検索時に指定したパラメーター。詳細は「5-1.PMF:検索パラメーター 一覧」をご参照ください。
Type of search: MASCOT 3 つの検索手法のうち、どれか。

Enzyme: 切断パターン。

Fixed modification: 必ず質量置換する修飾設定 (設定時のみ。上記例図には含まれていない)。

Variable modification : 質量置換する/しないケースを想定する修飾設定(設定時のみ。上記例図には含まれない)。
Mass values: 各種質量計算に使うアミノ酸の質量が「Monoisotopic」か「Average」か。

Protein Mass

: タンパク質質量の上限値

Peptide Mass Tolerance:ペプチドの質量マッチングにおける誤差範囲
Peptide Charge State: ピークの電荷が MH+か Mr か M-H- かMax Missed Cleavages : Enzyme 設定について、切断箇所と認定された箇所を見逃し連結したペプチドを作成する事ができるが、何度まで見逃すことを許容するかについての設定Number of queries: 入力データのピーク数

6-3. Protein View
Summary 画面の中でタンパク質名の箇所がハイパーリンクになっています。このハイパーリンクをクリックすると、マッチしたタンパク質についてより詳しい情報が記されている「Protein View」の画面となります（次頁図）。

42

次頁以降、青色で囲われた各表示領域についてより詳しく説明します。

43

ページの最初にタンパク質の Acession と Description が最初に表示されます。続いて以下の情報が表示されます。
Database: 使用したデータベース名。

Score: MASCOT Score。

Expect: Score と同定基準値をもとに算出された値。同定基準を超えている時、Expect = 0.05 となる。Expect が 0.05 より小さい時同定。

Monoisotopic mass (Mr): データベースの配列から計算されたタンパク質の質量。
Calculated pI: データベースの配列から計算された予測等電点。

Taxonomy: 生物種。

また該当タンパク質の配列を、NCBI の BLAST（配列相同性検索プログラム）実行するためのリンクが表示されます。

Enzyme: 切断パターン。

Mass values searched: クエリーのピーク数。クエリーに強度情報が含まれている場合、クエリーセットを様々なパターンに組み合わせてマッチングスコアを検証
しますが、クエリーが少ない組み合わせが採用された場合はその時のピーク数が表示されます。

Mass values matched : 理論値とマッチしたピーク数。

44

続いてタンパク質全長に対してマッチしたペプチドがどの部位にあたるのか、またその割合についての情報が表示されます。Coverage とは、全長に対するマッチペプチド残基数の割合です。マッチしたペプチド部分が赤の太字で表現されています。

さらにその下には、マッチしたペプチドがアミノ酸残基順（デフォルト設定の場合）に並んでリスト表示
されています。
Unformatted sequence string : 残基数と共に配列をコピーしやすくなるページが開きます。他のアプリケーションで配列を使用したい場合に便利です。
45

Sort by: リストの並び順を指定。残基番号、質量の昇順/降順 が選択可。

Show: 理論値と実測値がマッチしたペプチドのみをリストに表示させるか、マッチしなかった理論ピークも表示させるかを選択します。

Start-End: タンパク質全長におけるアミノ酸残基番号。

Observed: ピークリストファイルの m/z。

Mr(expt): ピークリストの値から計算されたペプチドの質量。

Mr(calc): 配列から計算されたペプチドの質量。

Delta: Mr(expt) － Mr(calc)。

M: Missed cleavage。

Peptide: ペプチド配列。修飾も含まれる場合は併せて表示されます。

ページ下部で表示されているグラフはともにピークのマッチングの誤差を表すグラフで、左が Da、右がppm で表現されています。ともに横軸は実験データ側のペプチド質量で、縦軸が誤差です。含まれている
事が確実なタンパク質でこのグラフを確認する事で、パラメーターで指定した誤差範囲(peptide tol.)の設定値が適切であったかどうかを確認する事もできます。

画面の最下部にはタンパク質の詳細情報が表示されます。ただしデータベース側で情報表示に関する
適切な設定がある時のみ表示されます。

46

6-4. 結果の Export
同定結果をファイル出力する事ができます。Format As の選択肢で「Export Search Results」を選択してから「Format As」ボタンを押します。

出力のファイルフォーマットや条件、出力項目
な ど を 選 択 し 、 画 面 下 部 の 「 Export Search
Results 」 ボタン を押 す と ファ イ ル出 力 が 実 行
されます。

47

7. 検索結果画面:MIS
この章では MASCOT MIS 検索における結果画面において説明します。

7-1. 表示例で使用している検索について
MIS の検索例として MASCOT Server 内に存在する以下の検索結果を利用します。
[公開サーバー] https://www.matrixscience.com/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F981139.dat[ローカルサーバー] http://localhost/mascot/master_results_2.pl?file=../data/F981139.dat

設定項目

設定内容

EnzymeTrypsin/P

Fixed Modification

iTRAQ4plex(K),iTRAQ 4plex(N-term), Methylthio(C)Variable Modification

Acetyl(Protein N-term), Gln->pyro-Glu(N-term Q),
Oxidation(M)Peptide tol.±

0.9 DaFragment mass tolerance ±0.6 DaMissed cleavage

1

Instrument

ESI-TRAP

query 数

: 33,191

検索の結果、以下のスペクトルとタンパク質が同定されています。
同定スペクトル数: 2,812

同定タンパク質数: 480 (448 グループ)

7-2. 表示内容の詳細 : summary 画面
7-2-1. 展開しない状態での画面概要
URL を WEB ブラウザで指定し結果画面を開くと、次頁のような画面が現れます。画面内の赤線で囲われた各パーツで記載されている内容について、以降順に説明します。
（次頁図は表示領域の関係で２つの画像を１つに組み合わせています。）

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7-2-2 ヘッダー部分

７-2-3 再検索と結果ファイル出力
７-2-４ search parameters

７-2-5 スコア分布, ７-2-６ modification 一覧,
７-2-7 凡例
７-2-8 表示内容の切り替え[スコア足切りなど]

７-2-9 Sensitivity and FDR

７-2-10 同定タンパク質とアサインペプチド（ペプチド情報は展開時に表示）

49

7-2-2. ヘッダー部分「5-3 MIS 検索パラメーター 一覧」も併せてご覧ください。
User: パラメーター「your name」で指定した内容。

Email: パラメーター「Email」で指定した内容。

Search title : パラメーター「Search title」で指定した内容。
MS data file : 検索で使用した実験データのファイル名。
Database(s): 検索対象としたデータベースとバージョン、登録件数と総残基数。

Taxonomy: パラメーター「Taxonomy」で指定した生物種（使用した時のみ）。その生物種として登録されているエントリー数も表示されます。

Timestamp: 検索開始時間

7-2-3. 再検索と結果ファイル出力: Re-search ボタン、Export ボタン「Re-search」は再検索を実施するためのボタンです。再検索を行う query の種類によって、All(すべての query)、「Non-significant」(同定基準に満たなかった query)、「Unassigned」(同定タンパク質に帰属しない query)の３種類を選択する事ができます。
「Export」は検索結果をペプチド単位でファイル出力するためのオプションです。様々なフォーマット 、同定ペプチド/タンパク質の条件、出力項目を設定してファイル出力する事ができます。詳細は「7-5.Export 機能によるペプチドベースの検索結果ファイル出力」でまとめましたのでそちらをご覧ください。

7-2-4. Search parameters50パラメーター内容の詳細は、「5-3:MIS 検索パラメーター 一覧」をご覧ください。
Type of search: MASCOT 3 つの検索手法のうち、どれか。

Enzyme: 切断パターン。

Fixed modification: 修飾、すべての対象アミノ酸の質量を指定内容に入れ替える。

Variable modification : 修飾、対象アミノ酸の質量を指定内容と入れ替えるケースと入れ替えない
ケースの両方を計算する。
Mass values: 各種質量計算に使うアミノ酸の質量が、「Monoisotopic」か「Average」か。

Protein Mass

: タンパク質質量の上限値。

Peptide Mass Tolerance: ペプチドの質量マッチングにおける誤差範囲。
Fragment Mass Tolerance : フラグメントの質量マッチングにおける誤差範囲。
Peptide Charge State: ペプチドの価数 (precursor イオンレベル)。

#13C: ペプチドに含まれる 13C を考慮した回数。

Max Missed Cleavages : Enzyme 設定について、切断箇所と認定された箇所を見逃し連結したペプチドを作成する事ができるが、何度まで見逃すことを許容するかについての設定。
Instrument type

: 考慮するイオンシリーズやフラグメントピークの電荷に関する情報が定義されたセット。

Number of queries: 入力データの測定データ数。

7-2-5. Score Distribution「 Score distribution 」 の 箇 所 を ク リ ッ ク
すると、２つのスコアのヒストグラムが表示されます。上は query、下は同定タンパク質です。
上の query のグラフは、横軸がマッチング
度合いを表す Mascot Ions スコア、縦軸が個数です 。各 query により同定基準値が異なりますが、その同定基準の平均値が緑の網掛けラインの一番右側となります。
下は同定タンパク質のスコア（ペプチドのスコアをタンパク質毎に集計したスコア）分布です。タンパク質には同定基準スコアはなく、グラフには緑の網掛けは現れません。

51

7-2-6. Modification statistics for all protein families「Modification statistics for all protein families」の箇所をクリックすると、同定 query のうち修飾を含んでいた内容について、種類別の個数がカウントされリスト表示されます。

7-2-7. Legend（凡例）「Legend」の箇所をクリックすると、
結 果 画 面 の 見 方 に関 す る 説 明 が 表 示されます。

7-2-8.表示内容の切り替え [スコア足切りなど]表示するタンパク質やペプチドに関する条件を指定し、表示内容を変更します。
Significance threshold p < :有意性の閾値 p の設定で、デフォルトは 0.05。現バージョンでは実質、「ペプチドの期待値の閾値」と同義。”Target FDR”の値を設定するとそちらが優先され、FDR の設定を満たすような値が自動的に調整・設定されます。
Max.number of families :結果として表示するタンパク質（ファミリー）数の上限値。デフォルトは Auto、すなわち同定基準を超える
タンパク質をすべて表示する設定です。
Target FDR (overrides sig.threshold) :FDR の設定値。詳細は「11. FDR と Decoy データベース」を参照。
52

FDR type :FDR のカウント対象。PSM は query を数え上げるのに対し、Sequence は同じペプチド配列にマッチする
query を１つにまとめてカウントします。
Display non-sig. matches :同定基準を超えるペプチドのみ表示されるのがデフォルト設定ですが、タンパク質にアサインされているペプチドすべてを結果に表示させたり、スコアで閾値を設けて表示させたりする事が可能です。
Min. number of sig. unique sequences :同定タンパク質の基準として、アサインされるユニークなペプチドをいくつとするかという設定です。
MASCOT のデフォルトは 1 です。9-5 で後述するように、設定値を 2 以上にする事で同定タンパク質のリストの信頼性を引き上げる事ができる反面、同定タンパク質数は大幅に減ってしまいます。
Show Percolator scores :Percolator の計算を実行している場合のみ。Percolator のスコアと期待値が結果に表示されます。
Dendrograms cut at :ファミリータンパク質の類似度を表しているデンドログラムについて、スコアのカットオフを指定します。
デフォルトではカットオフを実行しない 0 です。カットオフの結果によって類似するタンパク質が１つにまとめられることがあります。
Unigene index :（例図になし、Unigene の設定を行っている塩基配列データベースで検索した時のみ。）タンパク質を遺伝子ベースのファミリーにクラスタリングするために使用する UniGene インデックスを選択し結果画面で表示します。
Error tolerant matches :Error tolerant 検 索 を 行 っ た 時 の み 。 検 索
内容に対する信頼度に基づき検索結果の表示
内容を切り替える事ができます（右図）。
Preferred taxonomy :優先表示させる生物種。タンパク質の 1 つのエントリーには複数生物種エントリーが統合されている事があります。検索パラメーター「taxonomy」の絞り込みはエントリーに登録されている複数生物種すべてに対応できる一方、表示される生物種はデフォルトで定められた１種類のみです。結果、パラメーターで指定した生物種と明らかに異なる生物種由来と見受けられるエントリーが結果に表示されることがあります。
Preferred taxonomy の設定を行う事で、優先して表示させる生物種名を指定した生物種に切り替える事ができます。

7-2-9. Sensitivity and FDR「Sensitivity and FDR」の箇所をクリックすると、protein FDR の値と peptide または PSM の FDRの値が表示されます（次頁図）。

53

FDR の値を同定基準として利用したい場合は その上に表示されている「Format」欄の「Target FDR」
で数値を設定して、「Format」ボタンを押してください。
FDR に関する詳細は、「11.FDR と Decoy データベース」をご覧ください。

7-2-10. 同定タンパク質とアサインペプチド
同定タンパク質に関する情報がまとめられた箇所です。

上図のうち上側の部分を拡大して表示したのが以下の図です。

赤で囲われた部分のうち、数字 480 の箇所はリストアップされた同定タンパク質の種類、数字 448 の部分は同定タンパク質ファミリーの数です。ファミリーとはシェアペプチドを持つタンパク質をまとめたグループです。詳細は「9-6.Protein inference」をご覧ください。
上記情報以外に、1 ページに表示するタンパク質ファミリーの数、現在表示されているページとそれ以外のページへの移動、表示内容の全展開/全収縮、そして項目の検索欄が準備されています。
54

続いて各ファミリーの情報が記された箇所について説明します。
など、各タンパク質ファミリーの先頭には三角マークと rank の数字が表示されています。三角部分をクリックすると、タンパク質のマッチングに関するより詳しい情報、タンパク質にアサインされているペプチドのマッチング情報などが表示されます（下図）。

展開された時に表示される内容について、上図の青で囲われた各パーツ単位でより詳しい説明を行います。
デンドログラムの箇所には、共通ペプチドを持つタンパク質の類似度が表現されています。
より右側で結合しているタンパク質がより類似している事を表します。類似度を表すスコア（横軸）が可動バーになっていて、変更した場合の結果がインタラクティブに表示されます。
（スコアを直接数字入力し Cut ボタンを押す事でも切り替わります。）
55

ファミリーに属する各タンパク質の情報が表示されています。図例は rank 2 ですが、rank2 の中でスコア順にサブの番号がつけられ、それぞれ 2.1, 2.2 などと表現されています。そのほかの項目は以下の
通りです。
Score

:

タンパク質のスコア。タンパク質にアサインされているペプチドの Ions Score をもとに算出され、大きいほど信頼度の高いペプチドが多いことを示しますが、現在の MASCOT では Protein Score をもとに同定
タンパク質を判定する事はしていません。詳細は 9-5 をご覧ください。
Mass :
タンパク質の質量。データベースに登録されている配列情報から計算。
Matches :タンパク質にアサインされた query 数。（）内の数字はその中で同定基準を超えているもの。現在のデフォルト設定では同定基準を超えている query のみ結果画面に表示されているため（）内外の数字が同じです。
Sequences :query のうち同じペプチド配列にマッチしている内容を 1 つにまとめてカウントしたもの。（）についてはMatches と同じく同定基準を超えているもののみをカウント。
emPAI :
Spectral Counting の１つである emPAI。値が大きいほど量が多いという判断の基準となります。
タンパク質にアサインされたペプチド配列数をもとに算出し、かつタンパク質の大きさをもとに標準化されているため結果内の異なる大きさのタンパク質間でも比較が可能。詳細は以下 URL をご覧ください。
https://www.matrixscience.com/help/quant_empai_help.html
続いて、アサインペプチドに関して表示しています。

Query: Query 番号。MASCOT では入力データについて、ペプチドの質量に換算した際小さい順に番号が割り振られます。Query 番号が小さいデータはペプチドの質量が小さい事を示します。
56

Dupes: 同じペプチド配列でかつ修飾や電荷も同じ結果にマッチした query は、スコアが最も高いもののみ表示されそれ以外は Dupes 欄に格納されます。Dups で表示される
数字は query がいくつまとめられているかを表し、三角印をクリックするとその query が表示されます。

Observed: 実験値側のペプチドの m/z

Mr(expt): m/z と電荷から計算された、実験値側のペプチドの質量Mr(calc): 配列から計算された、理論値側のペプチドの質量Delta: Mr(expt) – Mr(calc)

M: Missed cleavage が実際に適用された数

Score: Mascot Ions score で実験値の MS2 ピークと理論値とのマッチング度合いを表します

Expect: 同定基準値と Score から計算された期待値。

Rank: データベース中の候補ペプチドとマッチングを行った際、表示されているペプチド配列とのマッチングが全体の中での何位であったかを示します。「Rank」の箇所をクリック
して展開すると、下図のようにマッチングとスコアリングを行った他のペプチドとそのスコアについて rank 順に表示されます。また上部にはその query で定められた
２つの同定基準値も併せて表示されます（詳細は「9-4.同定ペプチド」をご覧下さい）。

U: U マークがついている場合、他のエントリーと共有されていない Unique ペプチドである事を意味します。

数字: 数字はファミリーに属するタンパク質と連動しています。■印があるタンパク質に該当ペプチドがアサインされていることを示します。同じファミリー内で■が１つのみ表示されているペプチドがユニークペプチドという事になります。

Peptide: ヒットしたペプチド配列。修飾や前後のアミノ酸残基なども併せて表示されます。

7-2-11. Report Builder タブ （タンパク質ベースの検索結果ファイル出力）
7-2-10 でご案内した同定タンパク質の表示個所について、表示領域全体がタブ構成になっています。
7-2-10 でご案内したのは「Proteins」タブでしたが、それ以外に 2 つのタブがあります。
「Report Builder」（下図）は、同定タンパク質ベースのリストを作成するのに便利なページです。

57

Report Builder タブをクリックすると、表示が下図のように切り替わります。

上図のようなリストが作成され、表示内容を CSV ファイルで出力する事ができます。さらに、表示する項目を調整する「Columns」、表示するタンパク質に対してスコアやアサインペプチド数などで絞り込み条件を与える「Filters」などといった機能を使用する事も出来ます（下図）。

58

7-2-12. Unassigned タブ「Unassigned」タブでは、同定タンパク質にアサインされていないペプチドの一覧が表示されます。
表示項目については、7-2-10 で示したタンパク質にアサインされているペプチドとほとんど同じですので、不明な項目がありましたらそちらをご参照ください。

7-3. Protein View
結果画面では様々なハイパーリンクがあります。タンパク質名(Accession)のハイパーリンクをクリック
すると、マッチしたタンパク質についてより詳しい情報が記されている「Protein View」の画面となります（次頁図）。
次々頁以降、次頁図の青で囲われた各表示領域についてより詳しく説明します。

59

================中略===================

60

ページの最初にタンパク質の Acession と Description が表示されます（上図）。続いて以下のような情報が表示されます。
Database: 使用したデータベース名Score: タンパク質のスコア

Monoisotopic mass (Mr) : データベースの配列から計算されたタンパク質の質量
Calculated pI: データベースの配列から計算された予測等電点

Taxonomy: 生物種

また該当タンパク質の配列を NCBI の BLAST（配列相同性検索プログラム）実行するためのリンクが表示されます。

MS data file

: 入力データファイルの名称

Enzyme: 切断パターン

その他、検索で使用したパラメーターに関する情報が表示されます。

61

続いてタンパク質全長に対してマッチしたペプチドがどの部位にあたるのか、その割合についての情報が表示されます。Coverage とは、全長に対するマッチペプチド残基数の割合です。マッチしたペプチド部分が赤の太字で表現されています。

タンパク質全長の下にはマッチしたペプチドが、アミノ酸残基順（デフォルト設定の場合）に並んでリスト表示されています（上図）。表示されている情報は以下の通りです。
Unformatted sequence string :残基数と共に配列をコピーしやすくなるページが開きます。他のアプリケーションで配列を使用したい場合に便利です。
Sort by: リストの並び順を指定します。残基番号、質量の昇順/降順 が選択できます。

Show: 理論値と実測値がマッチしたペプチドのみをリストに表示させるか、マッチしなかった理論ピークも表示させるかを選択します。

Query: Query 番号。入力データについてペプチド質量の小さい順に付けられた番号。

Start-End: タンパク質全長におけるアミノ酸残基番号。

Observed: ピークリストファイルの m/z。

Mr(expt): ピークリストの値から計算されたペプチドの質量。

Mr(calc): 配列から計算されたペプチドの質量。

Delta: Mr(expt) － Mr(calc)。

M: Missed cleavage。

Score: Mascot Ions score、実験値の MS2 ピークと理論値とのマッチング度合いを表します。

Expect: query 毎に計算される期待値、スコアと同定基準値から算出。

Rank: データベース中の候補ペプチドとマッチングを行った際、ペプチド配列とのマッチング
が全体の中での何位であったかを示します。

U: U マークがついている場合、他のエントリーと共有されていない Unique ペプチドである事を意味します。

Peptide: ヒットしたペプチド配列。修飾や前後のアミノ酸残基なども併せて表示されます。
62

ページ下部で表示されているグラフはともにピークのマッチングの誤差を表すグラフで、左が Da、右がppm で表現されています（上図）。ともに横軸は実験データ側のペプチド質量で、縦軸が誤差です。
含まれている事が確実なタンパク質でこのグラフを確認する事で、パラメーターで指定した誤差範囲(peptide tol.)の設定値が適切であったかどうかを確認する事もできます。

画面の最下部にはタンパク質の詳細情報が表示されます（上図）。ただしデータベース側で情報表示に関する適切な設定がある時のみ表示されます。

7-4. Peptide View
Summary 画面、あるいは Protein view 画面で Query 番号のハイパーリンクをクリックすると、MS/MS データと理論フラグメントピークとのマッチング度合いなどを確認できる Peptide View の画面が現れます（次頁図）。

63

64

以降、前頁の青色で囲われた各表示領域について詳しく説明します。

ペプチド配列並びにこのペプチドがアサインされたタンパク質の情報が表示されます（上図）。
また入力データ側の情報として、query 番号や title 行の情報、そして元のファイルのパスや名称に関する情報も表示されます。
以降の箇所を説明する前に、重要なポイントである入力データの再調整と表示ピークについて説明をします。

[Label matches used for scoring]
スコアリングに使用されたピークだけを表示してマッチング有無の表示対象とするか[Label all possible matches]
スコアリングに使われなかったピークも表示対象とするか「9-2 入力データの調整」でも説明していますが、MASCOT では入力データについてピーク強度等を基に再構成を行います。入力データ（mgf などピークリストファイル）にあるすべてのピークがスコアリングに使われるわけではありません。元のピークリストファイルを見ると存在するピークが、peptide view のマッチング表・図で理論値とマッチングしてない場合、 そのピークが何らかの理由でスコアリングに使われるピークの選別から漏れたためと考えられます。マッチングしていない事に疑問を感じた場合はまず「Label all possible matches」を選択して、該当ピークが表示されるか、改めてご確認ください。

65

選択項目の上に表示されているのが、入力データのスペクトルベースで見たマッチングの確認画面（前頁図）です。理論値とマッチした場所が赤で表示されます。また表示領域の設定や、マッチング図のファイル出力に関するアイコンも併せて表示されています。（＊ここで使用されている(Xi Spectrum Viewer は、
エジンバラ大学の Rappsilber 研究室によって開発され、Artistic License 2.0 で公開されています。また関連するいくつかのアイコンは、Farm-fresh web icons, released under the Creative Commons Attribution 3.0 License.から引用されています。） 色の設定なども変更可能です。

このグラフでは、peptide molecular ion 周辺のピークがスペクトルから除去されています。MASCOTの検索ではこのピークを使わないのでその事を反映させるためですが、別の場所で表示させた元のスペクトルと見た目が変わる事があるのでご注意ください。

続いて理論値の一覧表をベースとしたマッチングの確認画面が現れます（上図）。表の上にはペプチドの質量や修飾、スコアと期待値の情報が表示されます。「Matches」の行については少し補足説明をします。

104 は表の中の数字すべて、その中で理論値と実測値がマッチしたのが 17（表の中の赤い文字の数すべて）であった事を意味します。24 most intense peaks は、入力データのうち 24 のピークが入力
データ側の代表ピークとして使われていることを示しています。
表の中で使用されている文字の色・形態についても補足説明をします。４種類あります。

赤・太字斜体: イオンシリーズ単位で有意と判定され、スコアリングに利用

赤・太字: イオンシリーズ単位ではぎりぎり有意と判定も、スコアリングには不使用

赤・太字でない: マッチはしたがイオンシリーズ単位ではランダムマッチの域を超えないという判断で、
スコアリングには不使用

黒: マッチしていない
上記の赤色の中で区別されるポイントは、イオンシリーズごとに見てランダムマッチを超えていると言え66るほどの数がマッチしているかどうかがです。イオンシリーズ単位である程度の数が見つからないと、そのイオンシリーズはスコアリングにおいて使用されない事を意味します。

マッチング表の下に表示されるグラフはともにピークのマッチングの誤差を表すグラフで、左が Da、
右が ppm で表現されています（上図）。ともに横軸は実験データ側のフラグメントの質量で、縦軸が誤差です。含まれている事が確実なペプチドでこのグラフを確認する事で、誤差範囲(MS/MS tol.)の設定値が適切であったかどうかを確認する事もできます。

続いて、ヒットしたペプチド配列を NCBI の BLAST で検索するためのリンク、並びに BLAST を稼働しているその他の外部サイトへのリンクが表示されています（上図）。

最後に、データベース検索でマッチングとスコアリングを行ったほかの結果について、ページ内で表示されているペプチドも含めた形で rank 順に表示します（上図）。また 1 つの修飾がペプチド内で複数の箇所につく可能性がある場合、上記表の Sequence 列の右側にアミノ酸残基位置特定の確率が表示されます。
例えば一方が 99%でもう一方が 1%、といったような数字が表示されます。
67

7-5. Export 機能によるペプチドベースの検索結果ファイル出力
同定結果をファイル出力する事ができます。7-2-11 で紹介した Report builder では同定タンパク質に着目したファイル出力でしたが、同定ペプチド情報をベースとしてまとめたファイルや、その他解析結果に関連するファイルの出力をするには、7-2-3 で紹介した Export 機能を利用します。
Export の選択肢で希望するファイルフォーマットを選択し「Export」ボタンを押します。

対応しているファイルフォーマットは右図の通りです。
同定ペプチド情報を EXCEL で読み込んで表示可能な形式である「CSV」、
結 果 フ ァ イ ル の 共 通 フ ォ ー マ ッ ト と し て 認 識 さ れ て い る 「 mzIdentML 」 や
MASCOT の結果ファイルである「Mascot DAT File」、MASCOT の入力データ
フォー マ ット である 「MGF Peak List 」などが比較 的 使用 される 事 の多い選択肢です。

Export ボタンを押すと画面が遷移します（右図）。
出力を希望するパラメーターを選択したうえで、画面最下部にある「Export search results」ボタンを押 し 、続 い て現 れる 画面で「 Download」 ボ タン を押す事で、サーバー側でのファイル作成とそのファイ
ルのクライアントへのダウンロードが始まります。

出力されるファイルの項目のうち、XML ファイル
出力に関する詳細については以下２つの URL を
ご参照 ください。
https://www.matrixscience.com/xmlns/schema/mas
cot_search_results_2/mascot_search_results_2.xsd

https://www.matrixscience.com/xmlns/schema/mas
cot_search_results_2/index.html

export で CSV として出力されたファイルの表示列について、次頁以降で説明します。

68=========中略=========

prot_hit_num

同定タンパク質ファミリーの順位

prot_family_member

同定タンパク質がファミリーの中で割り振られたサブの番号

prot_acc

タンパク質の Accession

prot_desc

タンパク質の Description

prot_score

タンパク質のスコア(アサインペプチドのスコアをもとに算出)

prot_thresh

同定基準値(タンパク質、PMF の時のみ)

prot_expect

期待値（タンパク質、PMF のみ）

prot_mass

タンパク質の配列から計算された質量

prot_matches

タンパク質にアサインされた query 数

prot_matches_sig

タンパク質にアサインされた、有意基準を超える query 数

prot_sequences

タンパク質にアサインされたペプチド数

prot_sequences_sig

タンパク質にアサインされた、有意基準を超えるペプチド数

prot_cover

シーケンスカバレージ

prot_len

タンパク質の残基長

prot_piタンパク質の配列から計算された予測等電点

prot_tax_str

生物種情報

prot_tax_id

NCBI の Taxonomy ID

prot_seq

タンパク質の配列

prot_empai

emPAI

prot_acc_alpha

クロスリンクペプチドの結果における、１つめのタンパク質の Accession

prot_acc_beta

クロスリンクペプチドの結果における、2 つめのタンパク質の Accession

pep_query

ペプチドの query 番号

pep_rankペプチドの rank(マッチング順位)

pep_isbold

1…有意基準を超えている、0…有意基準を超えていない

pep_isunique

ユニークぺプチド（タンパク間でシェアされていない）かどうか。1…ユニーク 0…
ユニークでない

pep_exp_mz

ペプチド・実験値側の の m/z

pep_exp_mr

ペプチド・実験値側の質量

pep_exp_z

ペプチド・実験値側の 電荷

pep_calc_mr

ペプチド・理論値側の質量

pep_delta

ペプチドの質量誤差、実験値 - 理論値

pep_start

タンパク質におけるペプチド残基の位置、開始点

pep_endタンパク質におけるペプチド残基の位置、終了点

pep_miss

該当ペプチドにおける misssed clavage の数

pep_score

Mascot Ions Score（query のマッチングスコア）

pep_homol

query の homology treshold(homology 同定基準値)

pep_ident

query の identity threshold(identity 同定基準値)

69

pep_expect

query の期待値

pep_res_before

タンパク質において該当ペプチドの１つ前に存在するアミノ酸残基

pep_seqペプチドの配列

pep_res_after

タンパク質において該当ペプチドの１つ後ろに存在するアミノ酸残基

pep_frame

翻訳のフレーム番号(塩基配列の検索時のみ)

pep_var_mod

Variable の修飾
Variable の修飾がペプチド内で存在する位置を数字の文字列で表しています。

pep_var_mod_pos「.」で挟まれたのがペプチドで数はペプチド残基長と同じ、最初の「.」の前が N 末端、最後の「.」の前が C 末端です。0 は修飾がないことを、数字は各修飾に割り当てられた修飾の番号（ファイル上部に表示）を意味します。

pep_summed_mod_pos「pep_var_mod」の補足で、同時に１つのアミノ酸残基に修飾がついているケースに対応するための項目です。

pep_local_mod_pos

Query レベルでの「pep_var_mod_pos」と同様の情報

pep_var_mod_conf

複数の修飾候補領域が同一ペプチド内にある場合、各位置における同定確率

pep_num_match

スコアに使用されたフラグメントマッチの数

pep_scan_title

ピークリストの「title」行に記された情報

pep_source

データベースの種類 (AA, NA, XA, SL)
クロスリンクの状況を表す、3 数字 x 2 で構成された文字列。
例: 1:0:6,2:5:7.

pep_linked_sites

アルファペプチド (= 1) のペプチド上の位置 0 (N-term)でリンカーの選択肢が6 (リンカーと番号の結びつきは「Linkers table」にあります) 。一方ベータペプチ
ド (= 2)のペプチド上の位置は 5 残基目、リンカーの選択肢は 7。

pep_res_before_beta

クロスリンクペプチド、ベータペプチドの pep_res_before

pep_seq_beta

クロスリンクペプチド、ベータペプチドの pep_seq

pep_res_after_beta

クロスリンクペプチド、ベータペプチドの pep_res_after

pep_frame_beta

クロスリンクペプチド、ベータペプチドの pep_frame

pep_var_mod_beta

クロスリンクペプチド、ベータペプチドの pep_var_mod

pep_var_mod_pos_beta

クロスリンクペプチド、ベータペプチドの pep_var_mod_pos

pep_summed_mod_pos_beta

クロスリンクペプチド、ベータペプチドの pep_summed_mod_pos

pep_local_mod_pos_beta

クロスリンクペプチド、ベータペプチドの pep_local_mod_pos

pep_monolink_mod_pos
pep_monolink_mod_pos_beta
pep_looplink_pos
pep_looplink_pos_beta

クロスリンクペプチドのうちモノリンクペプチドだったケースでの修飾が付いた
アミノ酸残基の位置
クロスリンクペプチド、ベータペプチドにおける「pep_monolink_mod_pos」
クロスリンクペプチド、ループリンクペプチドだったケースでの、ループ残基の位置
クロスリンクペプチド、ベータペプチドにおける「pep_looplink_pos」

70

8. PMF : タンパク質同定8-1. PMF タンパク質同定のまとめ
この章では PMF でのタンパク質同定において説明いたします。重要な点を列挙すると以下の通りです。

・PMF では１度の検索で基本的に１種類のタンパク質が同定される [8-4]・入力データはピーク作成時とマッチング時の２段階で選別・組み換えされる [8-2]・スコアとは理論値と実測値のマッチング度合いを評価した数値で、高いほどよくマッチしている [8-4]・検索規模をもとに同定基準値が計算される。スコアが同定基準値を超えた時タンパク質を同定とみなす（デフォルト値の場合、信頼度は 95%）[8-4]・ タ ン パ ク 質 間 で シェ ア さ れ て い る ペ プチ ド 情 報 に 十 分 注 意し て 結 果 を 解 釈しなければならない [8-5]・「検索対象のデータベースの選択」も結果に大きく影響する [8-3]以降、順に説明いたします。

8-2. 入力データの調整
入力データは 2 段階で調整されます。3-1-1 で説明したように、MASCOT Server ではスペクトルデータをそのまま受け付けておらず検索の前段階でペプチドのピークを抽出しノイズをカットしたものを入力
データとして受け付けていて、これが 1 段階目の調整にあたります。入力データに m/z に加え強度情報も含まれている場合、MASCOT Server の検索プログラムは入力データから強度情報に基づいて 10 種類のサブセット入力データを作成し、それぞれのサブセットに対して理論ピークとのマッチングを行って最もスコアが高くなった結果を採用します。このように MASCOT Server 側で強度を使ってデータの再構成を行うのが 2 段階目の調整です。
MASCOT Server プログラムは 2 段階目の処理を行う事ができますが、あくまでも 1 段階目の前処理としてピーク抽出が行われていることを前提としています。また、上記のようにサブセットの選別に強度情報を使っていますが、マッチングの評価そのものに関してはピーク強度の情報を利用していません。強度の高いピークに対してマッチした場合、よりスコアが高くなる、というような判断はありません。
71

8-3. 配列から計算される理論ピーク
入力データとマッチングを行う参照側は、配列から計算されたタンパク質の理論的なピークリストです。
検索時に指定したデータベースに登録されているタンパク質１つ１つに対して、パラメーターをもとに理論
ペプチドを作成しその質量を計算します。タンパク質毎の理論ペプチドセットを作成して、入力データとのマッチングを行います。この検索方法では「答が含まれているデータベース」で検索をしなければ同定できません。データベースに含まれないタンパク質を答えとしてレポートする事はなく、同定タンパク質の検出も行われません。しかし 8-4 で説明するように、登録エントリー数が多いデータベースで検索をすると同定基準値が高くなり同定には不利です。データベースの選択は検索対象が小さすぎず大きすぎない、
必要十分なエントリーが含まれるデータベースである必要があります。

入力データ

マッチング

72

8-4. 同定タンパク質 : マッチングとスコア、同定基準値、期待値
アルゴリズムは非公開ですが、基本的な考え方についてご説明いたします。
同定基準値
スコア

期待値

スコア (S)
実測スペクトルと理論スペクトルとのマッチング度合いを表します。スコアが高いほど両スペクトルが良くマッチしています。MASCOT では Probability based scoring、確率論ベースのスコアリングです。実測
スペクトルと理論スペクトルのマッチングがランダムな事象である確率を Pro とした場合、スコアは-10Log10(Pro)と表すことができます。

同定基準値(St)
検索毎に計算される同定基準。同定基準は検索エンジンが算出した信頼度 95%を満たすスコアがデフォルト設定では提示され、主に検索対象となったデータベースのエントリー数を基に算出されます（データベースのエントリー数が少ない場合など一部例外のケースもあります）。スコア１位の結果でも同定基準値を超えない限りそのタンパク質が同定されたとはみなしません。

期待値 (Expect)
検索対象のデータベース中に、同様のランダムマッチをする事が期待されるタンパク質の数。デフォルト
設定では、期待値が 0.05 より小さい時同定としています。

スコアと同定基準値、期待値の関係

Expect = 0.05・10-(S-St)/10

MASCOT の 検 索 ア ル ゴ リ ズ ム の 基 と な っ て い る の は Mowse で す 。 詳 細 は 以 下 の ペ ー ジ か らご覧下さい。
https://www.matrixscience.com/help/history.html
https://www.matrixscience.com/help/scoring_help.html
73

8-5. protein inference : ユニーク/シェア ペプチド、タンパク質のグループ化
データベースに登録されているタンパク質は互いに類似の配列を持っていることがあり、切断ペプチド単位でみても同じペプチド配列、同じ質量になる事があります 。検索結果はペプチド質量ピークの組み合わせから同定の判定を行いますが、質量分析装置のデータだけではこれら類似配列のタンパク質を見分ける事が難しかったり、不可能であったりするケースがあります。
結果解釈の際 MASCOT Server がこれらのデータをどのように扱っているのか、ユーザー側が注意するべき点はどこか、についてご紹介します。
ある PMF 検索の結果について、13 のピーク（入力データ側）がデータベースに登録されている複数のタンパク質を候補として列挙しましたが、そのうち４つのタンパク質にフォーカスを当て、どのようにマッチしているかを表したのが以下の表です。「■」がマッチしていることを表し、「■」はピックアップした４つのタンパク質のうち１種類のタンパク質でしかマッチしていない事を表します。このようなペプチドはよく「ユニークペプチド」とこの分野では表現します。一方複数のタンパク質にマッチしている場合、それを「シェアペプチド」と表現します。

ピーク

OPSD_HUMAN

OPSD_PHOVIOPSD_MACFA

OPSD_CRIGR

832.662

■

■

■

■

903.342

■

■

■

■

1186.439■■■

1403.722■■

1617.857■■

1727.916■■■

1743.951■

1759.966■

1788.721
1818.963■■

2159.143■■

2174.812
2256.871

■

■
■

■

この４つのタンパク質を含む検索結果画面が次頁図です。

74■

〇である OPSD_HUMAN と 〇の OPSD_PHOVI は 1 位のグループとしてまとめられています。一方〇の OPSD_MACFA と OPSD_CRISR は２位、３位として別に報告されています。
前頁の表と上図の結果を見比べると、まとめられ方の理由がわかります。ポイントはユニークペプチドの有無です。OPSD_PHOVI は OPSD_HUMAN が持っていないペプチドが存在しません。OPSD_PHOVI がはっきりと存在する理由がないため、OPSD_HUMAN のグループに属して表示されます。MASCOT では、マッチしたペプチドの組み合わせが全く同じものを same-set, 包含関係にあるものを sub-set と呼びます。same-set や sub-set のタンパク質はグループとしてまとめられ、基本的にはグループの中で最もスコアが高い、あるいはデータベースに含まれている順番の関係で選ばれた代表タンパク質のみが考慮の対象となります。OPSD_PHOVI は OPSD_HUMAN の subset と認定されています。
一方〇である OPSD_MACFA と OPSD_CRISR は、表の「■」が示すように、〇である OPSD_HUMAN にはマッチしていなかったピークとマッチしています。PMF 検索ではこのような場合、異なるタンパク質がそれぞれ含まれている可能性を考慮し、異なるグループとして認識され、順位も別に表示されます。実際に、
OPSD_HUMAN の他に OPSD_MACFA や OPSD_CRIGR が本当に別に含まれていたかについては
ケースバイケースで、確率はあまり高くないと言えます。「■」のピークの部分がランダムマッチである
可能性は低くなく、否定できないためです。ユニークなペプチドマッチの扱いについて、MIS 検索の場合は意味合いがより重くなります。１つ１つのペプチドについてプロダクトイオンマススペクトルとのマッチングを行い確からしさを評価しているため、同定基準をクリアしているユニークなペプチドが存在は重要性が増し、それぞれのタンパク質が同定できたと考える事ができます。
このように、PMF では類似タンパク質の同定について難しい点を含んでおり、それを回避するためには
MALDI の測定でポイントとなるペプチドを取り出して MS2 データを測定して MIS を行ったり、最初からショットガンなど MIS 検索を実施する必要があると言えます。
75

9. MIS : ペプチド同定とタンパク質同定9-1. MIS ペプチド同定とタンパク質同定のまとめ
この章では MIS でのペプチド同定とタンパク質同定について説明いたします。重要な点を列挙すると以下の通りです。

・query 毎にペプチドに対する検索が行われる [9-3]・入力データはピーク作成時とマッチング時の２段階で選別・組み換えされる[9-2]
・スコアとは理論値と実測値のマッチング度合いを評価した数値で、高いほどよくマッチしている [9-4]・スコアが同定基準値を超えた時ペプチド配列の同定とみなす（デフォルト設定値の信頼度は 95%） [9-4]・FDR を適用して信頼度にあたる数字を 99%まで引き上げる事が多い[9-4, 11 章]
・同定ペプチドが見つかったタンパク質の情報から同定タンパク質をリストアップ
する [9-5]・タンパク質間でシェアされているペプチド情報に十分注意して結果を解釈する[9-6]
・検索対象のデータベースの選択も結果に大きく影響する [9-3]以降、順に説明します。

9-2. 入力データの調整
9-2-1. MS2 スペクトル、ピークリストの再調整
入力データは 2 段階で調整されます。3-1-2, 3-1-3 でご案内したように、MIS のデータではスペクトル
データをそのまま受け付けておらず検索の前段階でフラグメントの質量を反映したピークを抽出しノイズをカットしたものを入力データとして受け付けており、これが 1 段階目の調整です。MASCOT Server 側では受け取ったデータに対してさらに強度情報に基づいて入力データからサブセットデータを作成し、76それぞれのサブセットに対して理論値とのマッチングを行って最もスコアが高くなった結果を採用しており、これが 2 段階目の調整に当たります。このように MASCOT Server プログラム側でも 2 段階目の処理を行う事ができますが、あくまでも 1 段階目の前処理としてピーク抽出が行われていることを前提としています。また、上記のようにサブセットの選別に強度情報を使っていますが、マッチングの評価そのものに関してはピーク強度の情報を利用していません。強度の高いピークに対してマッチされた場合、よりスコアが高くなる、というような判断はありません。

9-2-2. ファイル内のクエリー数
PMF では入力データとして１つのスペクトルデータを受け付けていました。一方 MIS では 3-1-3 でご紹介しているように、BEGIN IONS からはじまり END IONS で終わる領域を１つの query としますが、
１ファイルの中に複数の query を含めてそれらを同時に検索する事ができます。各 query のマッチングや
スコアリングは他の query の影響を受ける事はなく、１つずつばらばらに query を検索してもまとめて検索しても同定ペプチドの評価（スコア、同定基準値）は変わりません。一方 9-5 で説明しますが同定
タンパク質は同定ペプチドの情報を組み合わせてレポートされるので、入力データの状況によって同定
タンパク質の内容は変わってきます。
基本的には１サンプルから由来する query はすべてまとめて検索をする事をお勧めしています。
そうする事で、レポートされる同定タンパク質が「サンプルに含まれるタンパク質のリスト」となります。

9-3. ペプチド配列から行う理論値計算、ペプチドのフィルターリング

77

フィルターリングと理論値生成、入力データとのマッチングまでの流れを示したのが前頁図です。入力
データとマッチングを行う参照側はペプチド配列から計算されたフラグメントの理論的なピークリストです(データベースが AA,NA の場合)。検索時に指定したデータベースに登録されているタンパク質１つ１つに対して、パラメーターをもとに理論ペプチドを作成しその質量を計算します。生成したペプチドについて質量を計算し、query と指定誤差範囲内でマッチしたペプチドのみを残す作業を最初に行います（フィルターリング）。残ったペプチドのみ、理論フラグメントのピークを生成し、入力データ MS2 のピーク
リスト部分とマッチングを行ってその結果をスコアリングします。
この検索方法では測定データのペプチドがデータベース中に含まれている事が前提となっています。
データベースに含まれないタンパク質 ・ペプチドからは当然理論値も作成されず、マッチング・同定
タンパク質の検出も行われません。しかし 9-4 で説明するように、登録エントリー数が多いデータベースで検索をすると同定基準値が高くなり同定には不利です。データベースの選択はエントリー数が多すぎず
少なすぎない、必要十分なエントリーが含まれるデータベースである必要があります。

9-4. 同定ペプチド : マッチングとスコア、同定基準値、期待値、外挿的な評価
以下のスコア・同定基準値・期待値・外挿的な評価、についてはペプチドに対してのものです。タンパク質の評価については 9-5 をご覧ください。

同定基準値

スコア

期待値

スコア (S)
実測スペクトルと理論スペクトルとのマッチング度合いを表します。スコアが高いほど両スペクトルが良くマッチしています。MASCOT のスコアリングは確率論に基づいています。実測スペクトルと理論
スペクトルのマッチングがランダムな事象である確率を Pro とした場合、スコアは-10Log10(Pro)と表す事ができます。

同定基準値(St)query 毎 に 計 算 さ れ る 同 定 基 準 で す 。 ２ 種 類 あ り 、 そ れ ぞ れ Identity threshold と
Homology threshold という名称ですが、配列の同一性や類似性などは名称と関係がありません。
両者は常に Identity threshold スコア ≧ Homology threshold スコア という関係性があり、また
Homology threshold は 存 在 し な い 事 が あ り ま す 。 現 在 の MASCOT の 結 果 画 面 で は 基 本 的 に
Homology threshold を同定基準値とし、以下に説明する期待値の計算などにも利用しています。
78

Homology threshold がない場合は Identity threshold が同定基準値となります。スコアが１位の結果でも、同定基準値を超えない限りそのペプチド配列が同定されたとはみなしません。

期待値 (Expect)
検索対象のデータベース中に、同様のマッチングがランダムで起こった場合に見つかってくるであろう
ペプチド数。検索エンジンのデフォルト設定では期待値が 0.05 より小さい時同定とします(FDR を同定基準として適用した場合を除く)。スコアと同定基準値、期待値には以下の関係が成り立ちます。

Expect = 0.05・10-(S-St)/10

外挿的な評価 : FDR
当初 MASCOT をはじめとする各種検索エンジンは各々の同定基準、MASCOT でいえば有意基準を超える信頼度 95%に該当する同定基準値のみをレポートに提示していました。しかし論文に提出される検索結果について疑念を持たれるケースなどが発生する中で、各検索エンジンの同定基準について別の観点から評価をする事が好ましいと考えられるようになりました。また後述する同定ペプチドと同定
タンパク質の関係性から、信頼度に該当する数値は 95%でなく 99%の方が好ましいと考えられるようになりました。これらの事を踏まえ外挿的に評価する FDR という数字を各検索結果で算出し、それが 1%となるように同定基準を調整するようになり、現在はその方法が主流になっています(但し MASCOT で提示される同定基準はデフォルト設定の場合信頼度 95%のまま)。各 query の同定基準値は、FDR が 1%となるような期待値になるよう調整され使用されます。検索時、パラメーター「Decoy」にチェックを入れ、「Target PSM FDR」の数字を 1%とする事で実現可能です。FDR については 11 章で詳しく説明します。

9-5. 同定ペプチドから導き出される同定タンパク質
9-5-1. 同定タンパク質=ユニークな同定ペプチドが１つ以上アサインされているスペクトルデータと理論値のマッチングを行う際、理論値の生成元はあくまでもペプチド配列です。
スコアや期待値は測定データの基となるペプチドが、マッチング対象としているペプチド配列であることを示す確からしさを表していることになります。
一方 MASCOT ではタンパク質のスコアも表示されます。タンパク質のスコアは、そのタンパク質にアサインされたペプチドのスコアをもとに算出されます。タンパク質のスコアが高い事は、信頼度が高くスコアも高いペプチドが多く存在する事を意味します。しかし現在ではタンパク質のスコアをもとに同定タンパク質であるかどうかを判定する事はしていません。
現在 MASCOT で採用されている同定タンパク質を判定する基準は、同定基準を超え、他のタンパク質にはアサインされていないユニー クなペプチドが１つ以上アサインされているかどうかとなります(sub-set,same-set を除く)。この基準は現在広く採用されていますが、同定タンパク質の内容に厳密性を持たせようとすると問題があります(9-5-2 で説明します)。

79

9-5-2. 1 Hit wonders : 同定タンパク質の Sensitivity と Specificity
ペプチド FDR 1%を同定基準とした場合、ユニークな同定ペプチドが１つのみアサインされているタンパク質を 100 集めると、False Positive、すなわち本来不正解の配列であるにも関わらず同定基準を超えて同定ペプチドと判定されているペプチドが１つ見つかります。そのペプチドがアサインされているタンパク質も False Positive という事になります。MASCOT がレポートする同定タンパク質の信頼度のレベルもこれに準じている事になります。このようなタンパク質の存在を指して「1 Hit wonders」問題という事がありますが、 より厳しい基準を求めるケースでは、同定タンパク質を判定する際に最低限アサイ
ンされているペプチド数を 2 に引き上げる事で問題を回避できます。False Positive がランダムマッチであると考えると、２つの False Positive ペプチドが数多くあるデータベース内のタンパク質に対して同時にアサインされることはほとんどない、というのが根拠です（ランダムマッチによるアサインペプチド数を
ポワソン分布で考慮）。
こういった基準については定まった厳密なルールが準備されておらず、状況に応じてユーザーが使い分ける事になります。

9-6. protein inference : ユニーク/シェア ペプチド、タンパク質のグループ化
データベースに登録されているタンパク質は互いに類似の配列を持っていることがあり、測定結果において複数エントリーで完全に同一である配列部分の切断ペプチドが同定される事もしばしばあります。
質量分析装置のデータだけではこれら類似配列のタンパク質を見分ける事が難しかったり、不可能であったりするケースがあります。結果解釈の際 MASCOT Server がこれらのデータをどのように扱っているのか、ユーザー側が注意するべき点はどこか、についてご説明します。
同定ペプチドが複数タンパク質にシェアされている場合を「シェアペプチド」、唯一のタンパク質にて見つかった場合を「ユニークペプチド」と呼びます。MASCOT においてシェアペプチドとユニークペプチドの状況により同定タンパク質がどのように扱われるかを説明するために、７つのタンパク質 A～G、５つのペプチド p1～p5 を使って同定タンパク質のグループ分けをします。5 つのペプチドが各タンパク質にアサインされている状況を「■」（または「■」）で表したのが以下の表示です。
ペプチド

タンパク質

ペプチド配列

A

B

C

p5

LVQDVANNTNEEAGDGTTTATVLAR

■

■

■

p4

ALMLQGVDLLADAVAVTMGPK

■

■

■

p3

ISSIQSIVPALEIANAHR

■

■

p2

VGGTSDVEVNEK

p1

NAGVEGSLIVEK

D

E

F

G

■
■
■

■
■
■
■

またこれを、タンパク質 A を中心に、シェアされているペプチドの状況によって A 以外のタンパク質をどのようにみなすのかを記したのが次頁の図です。

80

proteinB のように、proteinA と全く同じ組み合わせのペプチドが同定されているケースを same-set
protein、proteinC,D,E のように proteinA の一部のペプチドが同定されていて包含関係的に proteinAの方が上位、かつ proteinA に含まれないペプチドがないケースについて、sub-set protein とそれぞれ呼んでいます。same-set や sub-set については代表タンパク質が１つのみが表示され、それ以外のタンパク質は最初の結果表示では現れません。
一方、proteinF や proteinG のように、proteinA にアサインされているペプチドと共有するペプチド（シェアペプチド）があるものの、proteinA にはアサインされていないユニークペプチドもある場合、proteinA とは異なる同定タンパク質としてリストに表示されますが、同時にシェアペプチドを含む分だけ配列が似ているという事で「Family Protein」として、まとめられて表示されます。またペプチドがシェアされている状況をもとに類似度を表す樹形図のようなクラスター表示も併せて表示されます。
下図は検索結果です。protein A～G まですべて含むデータベースで、ペプチド p1～p5 が同定されるようなデータで検索しましたが、結果の初期表示には proteinA,F,G の 3 種類のみが表示されます。

81

クラスター表示は本来であれば各タンパク質の配列相同性を専用アルゴリズムで計算した結果を使用するのが好ましいですが、計算の簡易化のため MASCOT では互いのユニークペプチドのスコアをもとに類似度を算出しています。そのため本来ファミリータンパク質に属するような配列の類似度をもつタンパク質がグループ化
されなかったり、逆にシェアされた数少ないペプチドの存在の影響により、類似度が高くないタンパク質がファミリータンパク質としてまとめられる事があります。また配列の相同性とは異なる状況で類似度表示されている事もあります。
same-set や sub-set のタンパク質はデフォルト表示では確認できませんが、結果画面内から展開表示
させるとその内容を確認する事ができます。前頁のオレンジで囲った部分の三角の部分、展開ボタンをクリックすると、下図のように該当タンパク質を表示させることができます。ProteinA と same set である
ProteinB, subset である proteinC, proteinD, proteinE も表示されます。

CSV などでファイル出力させる場合は、same-set のタンパク質も出力させるか選択する事ができます。
また sub-set についても出力のオプションがあり、共有されるペプチドの度合いの情報を使って出力タンパク質の調整が可能です。

82

10. MASCOT 検索のオプション [MIS]
9 章までは汎用的に使用されるペプチド同定・タンパク質同定を中心とした説明でした。一方でMASCOT では通常の検索とは少し異なる、いくつかの検索オプションが存在します。この章では MIS で使用可能な 4 つの検索オプションについて説明いたします。なおこれらのオプションは PMF ではすべて適用できません。
10-1. Spectral Library: ピークリストライブラリに対する検索

10-2. Quantitation: 定量解析

10-3. crosslink: クロスリンクペプチド検索

10-4. Error Tolerant Search: 拡張２段階検索

10-1.Spectral Library
10-1-1. Spectral Library 概要
従来プロテオミクス・DDA の解析では入力データの参照先データとして、配列から計算された理論値が使 用されてきまし た。 一方 解析デー タの 蓄積 によ り、検 索に使 用した ピー クリスト データと 正解とみなされるペプチド配列の組み合わせに関する情報が蓄積し、それを検索に利用する試みが行われるようになりました。
MASCOT でも Spectral Library（ピークリスト情報と正解のペプチド配列情報を含むデータベース）に対する検索を行う事ができます。Spectral Library 単独または FASTA データベースと組み合わせて検索が可能です。検索エンジンには NIST Mass Spectrometry Data center の MS PepSearch（https://chemdata.nist.gov/dokuwiki/doku.php?id=peptidew:mspepsearch）を利用しています。
また検索対象の Spectral Library には、インターネット上で公開されているデータベースと、ご自身の検索結果から作成したものの２種類を利用する事ができます。MS PepSearch 検索時には以下のような引数で実行しています。
* 下記は本来一行で実行するコマンドです。
MSPepSearch.exe m a P /ZPPM 100 /M 0.509902 /LIB [ライブラリへのパス] /INP [MGF ファイルへのパス] /OUTTAB [出力ファイ
ルへのパス] /HITS 10 /MinMF 0 /NumCompared /OutPrecursorMz /OutDeltaPrecursorMz /OutSpecNum

検索結果例として、以下の WEB ページをご覧ください。
https://www.matrixscience.com/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F981140.dat

83

ピ ー ク リ ス ト ラ イ ブ ラ リ は 右 図 の よ う な msp と い う
フォーマットで MASCOT Server 上に格納されています。
ライブラリには、インターネット上で公開されているものを利用する方法と、ご自身の MASCOT Server で行った検索結果をライブラリ化してセットして利用する方法があります。

10-1-2. Spectral Library 検索方法
MASCOT Server で Spectral Library に対して検索を行うためには、データベースの選択時にSpectral Library を選んで検索するだけです（下図）。Spectral Library はデータベース一覧の中で「Spectral Library(SL)」と記された箇所の下にまとめて存在します。

Spectral Library 検索では Modification, enzyme, missed cleavages, taxonomy, instrument,
charge などのパラメーターは指定しても無視されます。この検索では単純に入力データとライブラリとのマッチングを行うため、通常検索で理論値のバリエーションを変更させたり、検索対象を調整するようなパラメーターが使用する事ができないためです。
また現段階では Decoy データベースへの検索並びに FDR 計算を行う事ができません（将来的に対応予定です）。Error Tolerant 検索も行う事ができません。

8410-1-3. Spectral Library の検索結果
https://www.matrixscience.com/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F981140.datの結果をもとに説明いたします。必要に応じて上記 WEB ページも併せてご参照ください。
■ 結果画面の表示内容
FASTA で検索を行った時と概ね同じです。表示内容を調整する「Format」欄で、使用できない一部の項目が表示されません。タンパク質 Accession をクリックした際に表示される protein view、
ペプチドの query 番号をクリックした際に表示される peptide view の表示内容も通常の検索と同じです。タンパク質の配列については Spectral Library 内にはありませんがタンパク質の ID 情報が含まれており、かつ Spectral Library 作成時に同じ Accession 系列の配列データベースを設定しているためそちらから配列情報を取得し結果画面などで表示されます。
■ Score と同定基準
検索エンジンとして使用している NIST MSPepSearch のスコアは 0(一致しない)から 999(完全一致)の範囲で表されます。ライブラリ検索のみを行った場合は特にこのスコアの補正などは行われません。
同定基準スコアは 300 となっています。期待値については、スコア s の時の期待値 E(s)が以下の式から計算しています。

E(s) = 0.05・10(300-s)/100■ FASTA データベースと Spectral Library を一緒に検索した時検索例として以下の WEB ページも併せてご覧ください。
https://www.matrixscience.com/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F981141.dat
この例のように Spectral Library 検索と FASTA 検索が統合された結果の場合、同定基準を使った期待値の調整が行われます。ライブラリと FASTA のマッチの期待値について、両者でマッチしているデータを使ってその平均と分散が同じになるように調整をします。例として query1451 の調整の様子を以下の図で表示します。ライブラリだけの検索では同定基準スコアが 300 で期待値が 0.00012 でしたが、
FASTA と共に行った検索では同定基準が 493 に、期待値が 0.0044 になっています（両者のスコアは共に 561 です）。
ライブラリ単独での検索結果

ライブラリ＋FASTA での検索結果

85

10-1-4. Spectral Library をローカルの MASCOT Server にセットする方法
詳細は、データベース管理マニュアル（日本語版）
https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/MASCOTServer_ver26_sequencedbmanage.pdfの P.52～ をご覧ください。
インターネット上で公開されているライブラリをセットする方法は P.53～、ご自身の MASCOT Server で行った検索結果をライブラリ化してセットする方法は P.83～ をご覧ください。

10-1-5. Spectral Library 補足説明資料へのリンク■ 弊社インターネットサイトでのヘルプページ
https://www.matrixscience.com/help/spectral_library.html■ MSPepSearch について•

Stein, S. and Scott, D. R. (1994). Optimization and testing of mass spectral library search algorithms
for compound identification, J. Am. Soc.Spectrom., 5, 859-66
https://dx.doi.org/10.1016/1044-0305(94)87009-8■ PRIDE の Spectral Library について•

Griss, J., Foster, J. M., Hermjakob, H., and Vizcaíno, J. A., PRIDE Cluster: building a consensus ofproteomics data, Nature Methods 10, 95–96 (2013)https://dx.doi.org/10.1038/nmeth.2343•

Griss, J., et al., Recognizing millions of consistently unidentified spectra across hundreds of shotgun
proteomics datasets, Nature Methods 13, 651–656 (2016)

https://dx.doi.org/10.1038/nmeth.3902■ Spectral Library の公開元サイト•

PeptideAtlas / ISB
http://www.peptideatlas.org/speclib/•

NIST
http://chemdata.nist.gov/dokuwiki/doku.php?id=peptidew:cdownload•

PRIDE / EBI
https://www.ebi.ac.uk/pride/cluster/#/libraries8610-2. Quantitation
10-2-1. Quantitation 概要
質量分析データを用いたタンパク質の定量解析には様々なアプローチがあります。その中でピークリスト
内の情報、または検索結果の情報だけを使う手法については MASCOT Server 単独で定量計算が可能です。 具体的には以下の手法です (手法名は MASCOT 内で使用している呼称)。
・reporter: MS2 スペクトル内のある領域のフラグメントピークの相対的な強度に基づいた定量

・multiplex: MS2 スペクトル内のイオンシリーズのフラグメントピークの相対的な強度に基づいた
定量

・emPAI: タンパク質にアサインされたペプチドの情報に基づく定量指標。
Spectral Counting の１種。

このうち emPAI については、MS/MS スペクトル数
が 100 以上の時自動的に結果画面に表示されます。
上 記 ３ 手 法 以 外 に つ い て は raw デ ー タ か ら
プレカーサーペプチドに関する追加の情報を得る必要があり、MASCOT Server 単独では定量計算ができません。弊社ソフトウェアで言えば MASCOTDistiller 定量モジュールがあると計算が可能です（右図）。
検索結果例としては以下の WEB ページをご参照ください。
https://www.matrixscience.com/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F981131.dat

10-2-2. Quantitation 検索方法
検 索 パ ラ メ ー タ ー 「 Quantitation 」 で 、 予 め 設 定 し ておいた定量手法の組み合わせを選択して検索を行うだけです（右図）。定量に使用する修飾なども Quantitation の
各項目に紐づけられているため、それらをあえてModification から指定する必要はありません。
デフォルト設定の名称については、名称の後ろに「MD」が付いている項目が MASCOT Distiller が必要な手法で、ついていないものが Server 単独で計算可能な手法です。
定 量 手 法 の 組 み合 わ せを 自 身 で カ ス タマイ ズしたり新たに作成したりするのは専用の設定画面で行います。
10-2-4,13-8 で詳しく説明いたします。
87

10-2-3. Quantitation 検索結果
後ろに[MD]が付いていない Quantitation の項目を選択した状態で検索を行った際、結果画面では各ペプチドの定量値とそのペプチドがアサインされているタンパク質の定量値が表示されます（下図）。

下に拡大図①下に拡大図②拡大図①

拡大図②

アサインされている各ペプチドの定量値からタンパク質の定量値がどのように計算されるかについては、「Quantitation」パラメーターで選択された項目にデフォルト設定が定義されているほか、検索結果画面から再調整する事が可能です（下図、赤線で囲われた黄色の領域）。

88パラメーターで設定できる事項については以下の通りです。
Protein ration type

: ペプチドの ratio からタンパク質の ratio をどのように計算するか指定-

Average: ペプチド ratio の幾何平均-

Median: ペプチド ratio のメジアン-

Summed intensities : （reporter プロトコルのみ）ピーク強度の和Min. precursor charge : ペプチド定量値の計算対象とするペプチド電荷の最小値
Min. # peptides: タンパク質定量値の計算対象とする、最低限必要なアサインペプチド数

Unique peptides only : ユニークペプチドのみを計算に利用するかどうか
Outlier removal: 外れ値を除く方法の指定、以下から選択

-

None

: 外れ値を除く処置を行わない-

Automatic: データ数によって Dixon 法または Rosner 法のどちらかを選択-

Dixon’s method: Dixon 法-

Grubbs’ method : Grubbs 法-

Rosner’s method : Rosner 法

Peptide threshold: 定量計算対象とするペプチドについて、スコアや期待値、同定基準値を使ったフィルターリング

Normalise to: データの Normalisation 実施。サンプル間比較で、サンプルに属するペプチドの ratio を使って調整

-

None

: normalisation を実施しない-

Average ratio: ペプチドの ratio について幾何平均が同じになるようにする-

Median ratio: ペプチドの ratio についてメジアンが同じになるようにする-

Summed intensities : (reporter プロトコルのみ) MS/MS スペクトルのレポーターイオンの強度の和が同じになるようにする

さらに上記 Normalisation について計算の対象を特定する事が可能です。各サンプルで等量含まれている事が確定している内容を選択可能です。選択肢はすべてのペプチド、配列が特定 されたペプチド（複数指定可）、Accession で特定されたタンパク質（複数指定可）にアサインされているすべてのペプチド、です。
タンパク質の定 量値をまとめ た情報 をファイル出力したい場合、Report Builder
をご利用ください。
結 果 画 面 の Report Builder タ ブ で「Columns」を展開し、出力内容で定量値を選 択 の 上 「 Apply 」 ボ タ ン を 押 し ま す
（右図）。

89

Apply ボタンを押すと Report Builder の表示内容が変わります。ファイル出力は表示内容と同じ順番、データが出力されるのでこの段階で好みの様式に調整してください。調整後「Export CSV」ボタンを押すとファイル出力が行われます。

10-2-4. Quantitation 設定の作成
Quantitation で選択する設定項目は、予め MASCOT で作成済みである設定を使う場合でも、ピーク
シフトなどの設定や修飾と定量計算に使用するかなどの内容についてより正確なデータ解析を行うため
微調整をした方が好ましいケースがあります。また事前に準備された設定内容とは大きく異なる方法で定量を行う場合、新たに設定を作成する事もできます。
設 定 画 面 は 13-8 で ご 紹 介 し て い る 「 Quantitation 」 (Home -> Configuration Editor ->Quantitation」で行いますのでそちらをご参照ください。

10-2-5. Quantitation 補足説明へのリンク■ MASCOT の Quantitation 全般に関する HELP ページ
https://www.matrixscience.com/help/quant_overview_help.html
90

■ MASCOT の Quantitation 結果画面表示内容に関する HELP ページ
https://www.matrixscience.com/help/quant_format_help.html■ ラベルフリー定量解析のチュートリアル [日本語]https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/MascotDistiller_replicatesQuantTutorial.pdf■ SILAC 解析のチュートリアル [日本語]https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/MascotDistiller_Quantitative_quick_start.pdf■ Reporter プロトコルの解析結果例(iTRAQ)
https://www.matrixscience.com/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F981131.dat■ Multiplex プロトコルの解析結果例 (SILAC K+6, R+6 multiplex)
https://www.matrixscience.com/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F981133.dat

10-3. Crosslink
10-3-1. Crosslink 検索 概要
MASCOT では質量分析のデータからタンパク質の立体構造解析やタンパク質間の相互作用解析に応用される手法、ペプチドの crosslink 解析にも対応しています。
MASCOT で単一のペプチド同定を行うのとは異なり、候補ペプチドが N 個存在する crosslink 解析は
N2 のデータ数が解析対象となり莫大な数が対象となってしまう事から、検索対象を慎重に選定せざるを得ません。検索前に crosslink 解析のターゲットとするタンパク質をかなり限定するとともに、リンカーの種類や結合パターンを考慮する範囲を特定した設定を予め作成しておきパッケージ化しておいて、検索時にその設定項目を選択します。これは「Quantitation」検索と同じ方式です。
予め設定しておくべき主な内容とは以下の通りです。
・

リンカーの組成、リンカーが付くアミノ酸残基

・

crosslink で使用するリンカー

・

リンカーの結合パターン （下記４種類）

・リンカーが結合するタンパク質、またはデータベース

リンカーの結合パターンには以下の４種類があります。
・ intralinks: 同一タンパク質内の別ペプチド間の結合

・ interlinks: 異なる 2 種類のタンパク質のペプチド間の結合

・ looplinks: 同一ペプチド内での結合・ monolinks: リンカーの一方にのみ結合した状態（単純な修飾）
91

10-3-2. Crosslink 検索を行う方法
MASCOT で Crosslink 検索を行いたい場合、予め設定をしておいた Crosslinking 項目を選んで検索を実行してください（下図）。

Crosslinking 設定には、対象とするタンパク質（または非常に小規模のデータベース）も予め指定しておく必要があり、実質解析の度に何かしらの項目を変更したものを使用しなければならないと言えます。
設 定 変 更 に つ い て は 、 10-3-5 で 全 体 像 に 対 す る 説 明 を し て い る ほ か 、 「 13-5. Linkers 」 ,「13-9. crosslinking」 の項目で設定画面についてもう少し詳しく説明しています。必要な場合はそちらも併せてご参照ください。

10-3-3. Crosslink 検索に際し注意するべき MASCOT 設定値
Crosslink 検索において、いくつかの MASCOT Server 設定値は２つのペプチドを合わせた数字が制限対象となります。そのため通常の検索で問題にならないような設定値が、Crosslink 検索では不足し検索結果に悪影響を及ぼす事があります。
関連する設定値は以下のようにまとめられます。
■ 両ペプチド合わせた数字が適用されるもの-

MaxPepModArrangements (Variable modification の組み合わせパターンについて考慮する
組み合わせ数の最大値)■ 両ペプチドのうち長い方の数字が適用されるもの-

MinPepLenInSearch (検索対象とするペプチド長さの下限)-

MinPepLenInPepSummary (結果画面表示対象とするペプチド長さの下限)■ それぞれのペプチドに対して適用されるもの-

missed cleavages （検索パラメーター）-

MaxPepNumVarMods (1 ペプチドにおいて考慮する Variable modification（種類）数の最大値)-

MaxPepNumModifiedSites (1 ペプチドにおいて考慮する、Variable modification を考慮する
アミノ酸残基数の最大値)92設定不可な内容として、MASCOT Server には Peptide mass の上限 16kDa という制限がありますが、
これは２つのペプチドの合計値に対して適用されます。また検索パラメーターの中で、Error tolerant,
Decoy, Quantitation, そして検索後のオプション Percolator については Crosslink 検索と同時に行う事ができません。また設定値とは関係がありませんが、Crosslink 検索では各々の電荷が合算される事が多く、MS2 フラグメントピークの電荷も多価になる事が多くなる一方、MASCOT Server では 2 価のフラグメントまでしか考慮できません。多価のフラグメントを 1 価に換算してピークリストに書き込む（弊社ではこれを decharge と呼んでいます）事が可能であれば、そのようなオプションをご利用ください。
弊社ソフトウェア MASCOT Distiller では decharge が可能ですので、ご興味がございましたら弊社までご連絡ください。

10-3-4. Crosslink 検索結果
以下の結果を使って説明いたします。より分かりやすい理解のためには、結果画面を開いてご参照ください。ジスルフィド結合で、同一タンパク質内の結合を考慮した検索です。
https://www.matrixscience.com/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F002553.dat
結果の表示は通常の検索とほぼ同じです。Crosslink ペプチドのスコアや同定基準、期待値の算出については通常検索と同様に行われます。

結果のペプチド表示において、2 つのペプチドとそのペプチドがどの位置で結合しているかが示されています。例えば query 1496 の結果（上図の緑で囲われた部分、下図は緑で囲われた部分の拡大図）を見ると、最初に表示されたペプチド[αペプチド]の 7 番目の C と、後に表示されたペプチド（βペプチド）の
3 番目の C がリンカー「Xlink:Disulfide」（ジスルフィド結合の定義）で結合している事を示しています。

Query 番号をクリックするとマッチング内容を確認する peptide view ページを見る事ができます。
次頁図は query1496 の peptide view です。

93

上図について、緑で囲われた領域について次頁に拡大図を準備しています。
94画面上部（下図）はスペクトルベースで理論値がどのようにマッチングしているのかを確認する事ができる画面で、クロスリンクされたペプチドそれぞれにα、βという記号を割り振り、マッチングがどちらのペプチド由来のフラグメントなのかも示されています。

その下には理論値ベースのマッチング確認画面があり、これも両ペプチドそれぞれの理論値表が準備されています。

95Summary の結果画面に話を戻します。crosslink 検索を行った場合、ファイル出力オプションで「xiVIEW-CSV」というファイルが出力可能となります。

このファイルは、サイト xiVIEW
https://xiview.org/xiNET_website/index.php
において、結合状況を図示可能な入力データとして利用する事ができます。

10-3-5. Crosslinking 設定の作成
Crosslink の検索を行う際パラメーターとして設定項目を選択する必要がありますが、この項目については検索内容に応じて予め設定を作成しておく必要があります。設定変更は、リンカーや結合対象といった基本的な内容に加え、検索対象とするタンパク質またはデータベース名についても指定する必要があ るなど、若 干複雑 な構造 となってい ます 。 リンカー の設 定については 「13-5. Linkers」 を、 またCrosslinking の項目自体の設定については、「13-9. crosslinking」の設定をご覧ください。
なお、crosslink 検索、特に interlink(タンパク質間の結合)は本来探索的な用途で利用したいケースも多く、対象タンパク質が 1 つや２つで済まない事もしばしばです。しかし検索対象とするタンパク質は多すぎると検索が終わらず、同定基準も高くなりあまり機能しません。目安として、ターゲットのタンパク質組み合わせは 100 まで、という提案をしています。これは intralink であれば 100 エントリー程度、interlink であれば 10 エントリー(10x10=100)程度となり、デフォルト設定もそのようになっています。

96

10-3-6. Crosslink 補足説明へのリンク■ Crosslink 検索 MASCOT HELP ページ
https://www.matrixscience.com/help/crosslink.html■ S-S 結合検索結果例
https://www.matrixscience.com/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F002553.dat＊同じ結果をお手元の MASCOT Server で開けば、この結果を再検索したり少し条件を変えた検索を試すことができます。
http://localhost/mascot/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F002553.dat■ DSS 結合検索結果例
https://www.matrixscience.com/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F002555.dat;_ignoreionsscorebelow=0.05＊同じ結果をお手元の MASCOT Server で開けば、この結果を再検索したり少し条件を変えた検索を試すことができます。
http://localhost/mascot/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F002555.dat;_ignoreionsscorebelow=0.05

10-4. Error Tolerant Search
10-4-1. Error Tolerant Search 概要
MASCOT の MIS 検索で数多くの query を同時に検索した際、どのような配列ともマッチしない queryが必ずと言っていいほど多数存在します。マッチしない理由として以下のような事が考えられます。
1. データベースにないペプチド配列だった
2. 指定した誤差範囲を超えていた
3. Precursor の電荷が適切でなかった
4. 切断パターンが想定していたものと異なるペプチドだった
5. 想定外の修飾
これらの原因を検証するためにはパラメーターを変えながらの再検索が必要となりますが、そのための便利なアプローチが「Error Tolerant Search」です。Error Tolerant Search は最初、通常の条件で検索を行います。この時同定基準を超えた query をそのまま結果として採用しつつ、同定基準を超えなかった
query については以下の 3 点を考慮して 2 段階目の検索を行います。
A. 選択した酵素の切断パターンを「半特異的」に変更します。すなわち片方が切断ルールに則った切断でもう片方が任意の切断、となります。
B. 修飾の追加。修飾リストに含まれるすべての項目が対象で、追加で１つだけ修飾が付くケースを網羅的に探索します。
C. アミノ酸置換の確認。DNA の 1 塩基置換によってもたらされるアミノ酸の置換パターンを網羅的に探索します。さらにデータベースが塩基配列であった場合は挿入や欠失も考慮します。
97

A は前頁で挙げた５つのマッチしない理由のうちケース 4、B はケース 5, C はケース 1 に対してある程度フォローする事ができる検索方法となります。2 段階目の検索では 1 回目と 2 回目の試行で検索対象となったペプチド数をもとに同定基準値が算定され、1 回だけ行われた検索の結果に比べ 2 段階目の検索では同定基準値が厳しくなります。

10-4-2. Error Tolerant Search を実行する方法
検索パラメーターで「Error tolerant」にチェックを入れてから検索(Start Search)を行います。この時「Decoy」へのチェックと「Target PSM FDR」での数値の指定を行っていると、2 段階目への query 選別における FDR 閾値の適用、並びに検索後の同定基準算出に Target PSM FDR の設定値が使用されます（下図）。Error Tolerant 検索の信頼度を高めるためにもご利用をお勧めします。

10-4-3. Error Tolerant Search 検索結果
以下のページをもとに結果画面を使った説明をいたします。可能であれば実際に WEB ページで開いてご参照ください。
https://www.matrixscience.com/cgi/master_results_2.pl?file=../data/F981130.dat;_sigthres
hold=0.06427;_target_fdr=1
rank2 のタンパク質ファミリー、2 の隣の三角をクリックし展開してファミリータンパク質へのペプチドマッチング状況を確認する画面を開いてください。その中の、PPB1_HUMAN へのアサインペプチドをご確認ください（次頁図）。

[次頁に続きます]98結果には Expect の値も表示されています。2 段階目の検索結果は 1 段階目で同定済みの結果に比べ、同定基準が高めになっています。
以下、Error Tolerant 検索で見つかった結果にフォーカスしていきます。上図の赤線で囲われた部分を拡大したのが下図です。
query 133 は N 末端側がトリプシンのルールに従わないペプチドを検出しています。

99

Query 260 では N 末端側に+57.0215 修飾の可能性が指摘されており、[+57.0215 at N-term]の部分にカーソルを合わせると、その質量変動を引き起こす修飾やアミノ酸の置換が一覧で表示されます（下図）。
質量分析装置のデータでは単に質量の変動のみがわかるので、この中のどれであるかについては特定する事はできません。状況から考えてありえないような選択肢も含まれることがありますが、MASCOT では
単に質量の変化から候補を提供しているためその内容について判別する事ができません。

Error Tolerant Search は便利な検索ではあり、同定基準値に基づいた期待値も表示されてはいますが、結果の採用については慎重な判断が必要です。このページの結果に対する議論については以下 HELP
ページをご覧ください。現段階ではまだ「有力な正解候補となるペプチドを探すためのツール」程度に考えておくのがよいかもしれません。
https://www.matrixscience.com/help/error_tolerant_help.html#RESULTS

100

11. FDR と Decoy データベース
11-1. FDR はなぜ必要か？
プロテオームの解析において、検索エンジンは確率論を基にしたアルゴリズムで同定ペプチドを検出しますが、MASCOT では同定基準を統計的有意性を元に判断しており、信頼度としては 95%が解析当初から採用されていました。
解析が広まるにつれ、同定ペプチド並びに同定タンパク質が、想定した有意水準とかけ離れているのではないかと思われるケースが散見されるようになり、検索エンジンが提唱する同定基準とは別の観点から同定結果を検証する事が求められるようになりました。また、好ましい信頼度の数字についても議論されるようになりました。その流れの中で広く広まった評価方法が Decoy データベースを使った FDR による方法であり、FDR の基準値として 1%が採用される事が非常に多くなりました。

11-2. FDR とは、Decoy データベースとは
FDR(False Discovery Rate)という用語を単独でインターネット検索するとその多くが多重検定に関する事項として結果が出ますが、MASCOT で使用されている(、並びにプロテオミクスの定性で使われる)FDR は具体的な計算方法という面で大きく異なります。
検査・検定における Sensitivity, Specificity についてその各種性能を論じる際よく以下のような表が使われますが、MASCOT で使われている FDR は検査(判定)の Positive 全体における False Positiveの割合を示します。以下の表における文字を使うなら、 FDR とは B / (A+B) です。
正解配列と予測配列の一致

検索エンジンの
判定

+
-

+

-

True Positive

False Positive

A

B

False Negative

True NegativeC

D

MASCOT(、並びにプロテオミクスの定性で使われる)における FDR のポイントは False Positive,すなわ
ち B の見積り方にあります。FDR の計算において分母にあたる A+B は MASCOT が同定とみなしたペプ
チドすべての数にあたります。検索結果の同定数そのものであり容易に使用できます。しかし B について
は通常の検索結果からはその数がいくつであるかを判断する事ができません。もし何かしらの判断によりFalse Positive の結果とわかるようならそれらは誤った同定結果として取り除かれるべきですが、、当然そのようにする事ができません。
101

B の算出に一役買っているのが「Decoy」データベースです。正解が一つも含まれていないはずのデータ
ベース、「Decoy」（撒き餌、疑似餌）データベースを準備して、そのデータベースに対して同じ検索条件・
同じ入力データを検索した際同定基準スコアを超えてきたデータ数を、最初の検索の False Positive Bと概ね同じくらいの数字であろうと仮定して、FDR 計算における分子 B の代わりに利用しています。

Decoy データベースへの検索で同定基準を超えたデータ数
すなわち

FDR ＝

通常データベースへの検索で同定基準を超えたデータ数と計算しています。
ペプチドでカウントした際の FDR 1%とは、「同定基準スコアを超えたペプチドの中で、正解とは異なる配列が含まれている割合が 1%」とみなす事ができます。
なお Decoy データベースは「正解の配列を含まないデータベース」という事になりますが、通常の検索とデータベースの性質（残基長分布、エントリー数、アミノ酸出現頻度）を揃えるため、通常の検索で使用した
データベースの各エントリーの配列を逆向きまたはランダム配列に変更したものを利用します。

11-3. MASCOT で FDR を算出させる方法
検索パラメーターにある「Decoy」のチェックを入れて検索を実行する事で FDR が計算可能となります（下図）。また「Target PSM FDR」の数値を設定する事で、FDR の設定値を目安として同定基準値が調整された状態で検索結果が表示されます。現在 FDR の設定値として 1%が採用されることがほとんどです。

Decoy のオプションを使用すると、使用しない時に比べ２倍強の時間がかかります。

102

FDR の数値については、上図にあるように結果画面の Format 欄、「Target FDR」「FDR type」で調整する事ができます(FDR type については「11-4-1.Decoy データベースの利用方法、FDR 計算方法には
明確な定義がありません」もご覧ください)。また「Sensitivity and FDR」の箇所をクリックすると、Target (通常のデータベースの事)と Decoy それぞれでどれだけの数が同定基準を超えていたのかについて確認する事ができます。

11-4. FDR にまつわるトピックス
11-4-1. Decoy データベースの利用方法、FDR 計算方法には明確な定義がありません
Decoy データベースを準備する方法や Decoy のカウント対象、並びに FDR を計算する際にどのようなデータを数え上げるのかについての厳密な定義はなされていません。そもそも数え上げでなく別の方法で類似の概念を持つ計算式により算出されている事もあるなど、研究者により多少異なるのが現状です。
従ってその内容には注意が必要であると共に、ご自身でデータを示す際にも説明の記述に注意する必要があります。論文や論文投稿の際データをアップロードするのに利用されている repository site などでデータ処理の項目を見てどのように処理されたかを確認する必要があります。
主要な論文やコンソーシアムでは一定の枠組みでのガイドラインがありますのでご紹介します。
● HUPOhttps://www.hupo.org/HPP-Data-Interpretation-Guidelines● MCP Guidelines
https://www.mcponline.org/guidelines
FDR の適用についてどのようパターンがあるか調べる意味で、あるいはご自身で記載する際の参考のため、PRIDE, jPOST などの repository site の投稿データを実際に眺めてその記述内容をご確認頂く
事をお勧めいたします。次頁図は PRIDE というサイトで FDR に関する表記の例です。peptide FDR
103

だけでなく protein FDR も適用している事、FDR の設定値が 1%である事、Decoy データベースにはランダムでなく逆向き(reverse)配列を適用している事などがわかります。

11-4-2. FDR 計算のカウント対象
MASCOT のデフォルト設定では、PSM、即ち query 数をベースとして数え上げた FDR を使用していますが、これについては Format の「FDR type」というパラメーターで「Sequence」に変更する事ができます。
「Sequence」にすると、同じペプチドにマッチしている query は１つにまとめて数え上げます。

11-4-3. Decoy データベースでの検索結果と “1 Hit Wonders”
結果画面にある「Sensitivity and FDR」を展開した際一番下に表示される「the decoy report」
ハイパーリンクをクリックすると、Decoy データベースに対して行った検索結果画面を確認する事ができます。9-5-2 でランダムマッチなペプチドが１つのタンパク質に２つ以上アサインされることはほとんど
104

ないという説明をしましたが、Decoy の結果を見ると実際に同定基準を超えるペプチドが２つ以上アサイン
されるタンパク質はほとんどない事がわかります。

11-4-4. 「peptide FDR 1%」と同定タンパク質の正確さ
peptide FDR 1%というのは、同定ペプチドを 100 集めた際、１つのペプチドが不正解である可能性がある事を意味しています。同定ペプチドのリストの正確さについても同様の評価が可能です。
同定タンパク質については、前述のようにアサインペプチドが２つ以上である場合、その２つとも False
Positive ペプチドであることはほとんどありません。一方アサインペプチドが１つしかない場合、そのタンパク質同定の確からしさはペプチドと同じです。すなわち peptide FDR1%なら、「アサインペプチドが１つである同定タンパク質を 100 集めた場合、１つ間違えている同定タンパク質である可能性がある」と言えます。
現状では同定タンパク質数を確保する目的もあり、このような正確性での解析レベルがほとんどの研究者に受け入れられています。すなわち 9-5-1 で説明したように「同定タンパク質とは、ユニークな１つの同定ペプチドがアサインされているタンパク質」という基準となっています。

11-4-5. Protein FDR
結果画面の「Sensitivity and FDR」を展開した時に表示されている「Protein Family members」の行で表示されている FDR は、通常良く言われるところの「protein FDR」になります。MASCOT では
peptide（PSM または Sequence）と異なり、protein FDR で足切りをする事ができません。近年 protein
FDR も条件として求められる事がありますが、MASCOT で protein FDR の数字も何かの条件を満たすようにするには、PSM または sequence FDR を上げたり下げたりしながらこちらの表示をご自身で確認して頂く必要があります。ほとんどのケースでは protein FDR と peptide FDR に同じ設定値（1%）を適用した場合、protein FDR の方が条件が厳しく実質 protein FDR を適用する事で両条件を達成します。
Protein FDR を調整する際、タンパク質にアサインされるペプチド数の最低限必要な数を 1 から 2 に変更する事で対応する事もできます。この場合 protein FDR の値は 0 になる事がほとんどです。

11-4-6. 同定ペプチド数が少ないケースにおける FDR 調整の限界
FDR が 1%という数字は、100 の同定ペプチドがあると 1 つ False Positive ペプチドがあるレベルである事を示します。FDR 計算という観点から見ると、Decoy データベースでの検索で 1 つが同定基準を超えた場合、通常データベースでの検索結果で最低 100 のペプチドが同定基準を超えないと FDR1%以上となってしまう事になります。すなわち最低 100 のペプチドを同定できないようなデータでは FDR 1%以下にするのはとても難しく、このようなケースにおいてもどうにか FDR を無理やり適用させたい場合、Decoy での検索において同定基準を超えるペプチドが 0 になるよう、Decoy ペプチドの最高スコアより少し上に基準値を置くしかありません。Decoy の結果のランダム性に大きく引っ張られ、FDR そのものの信用度が揺らぐケースです。

105

12. MASCOT Server 管理 – データベースと検索ログ
この章では MASCOT Server の管理に利用するプログラムについてご紹介します。
12-1 では MASCOT Server で使用しているデータベースや各種ログを確認する事ができる Database
Status について、12-2 では検索のログである Search log についてご紹介しています。

12-1. 現在利用可能なデータベースに関する情報 : Database Status
Database status では各種動作のログに関する情報へのリンクや、MASCOT Server 上で現在使用可能なデータベースに関する情報について表示されます（下図）。

①
②
③

④

図内の表記について説明いたします。$MASCOT は MASCOT のインストールフォルダでを意味します。
① : 使用している MASCOT のバージョンと MASCOT のライセンス② : MASCOT Server が搭載されているコンピューターの CPU の中で、MASCOT Server がどのコアを動かしているか、並びに現在稼働中の検索件数106

③ : 各種ログへの移動
Search log: 検索ログ (Home にある「Search log」と同じ)

monitor log: MASCOT Server の動作ログ。$MASCOT¥logs¥monitor.log の内容

error log

: MASCOT Server のエラーログ。$MASCOT¥logs¥errorlog.txt の内容

Error message descriptions: MASCOT のエラー番号に関する情報

Do not auto refresh this page : database status 画面を自動・定期的に更新するかしないかの切り替え④ : 各データベースの状況。例として以下に SwissProt の情報を表示した部分の拡大図を示します。

各項目が示す内容は以下の通りです。
Name: MASCOT Server で登録されているデータベースの名称

Family: データベース側で登録されている、ファイルの path 並びにファイル名称ルールの情報

Filename: 現在認識されている fasta ファイルの名称

Pathname: 現在認識されている fasta とファイルが置かれている path

Status:データベースの現在の状況を表しています。データベースは fasta ファイルが更新された場合、その fasta ファイルから MASCOT で使用する複数のファイルが作成され、すべてのファイルが作成された後に最初の検索テストが実施されます。また設定内容によってはデータベースファイルがメモリ上にマッピングされ、最後に使用可能となります。
データベース構築から使用可能になるまでの一連の状況を知らせるため、Status 項目
で以下のように表示されます。
Creating compressed files
Running 1st test
First test just run OK
Trying to memory map files
Just enabled memory mapping
In Use

またどこかの段階でエラーになった場合などは「Halted:」などのように問題を含む状況であることを表すメッセージを表示します。
State Time: 現在示されている Status を認識した日時

Mem mapped: データベースがメモリ上にマップされた状態であるか

Request to mem map : MASCOT Server の設定でデータベースをメモリにマッピングする事を試みる設定であるか
107

Request unmap: MASCOT のプログラムがメモリ上へのマッピングを解除する命令を下した状態であるかMem locked: データベースのメモリ上へのマッピングを固定(lock)する状態になっているかどうか

Number of thresholds : 検索に使用可能なコア数の設定。通常は、最適設定を自動適用する設定である事を表す「-1」と表示
Current: 現在データベース関連のファイルが正しく認識されているかType: データベースの種類が Amino Acid か Nucleic Acid か、あるいはSpectral Library か

表示のいくつかの箇所はハイパーリンクになっていて、クリックする事でさらに詳しい情報を確認する事ができます。以下、各ハイパーリンク先の画面について説明します。

・データベースの名称(Name の項目) : 該当データベースで行われている検索の進捗状況、または過去に行った検索の内容。実行中の検索がある場合、”Current jobs”にその内容が表示されます。”Job”の検索
番号がハイパーリンクになっており、クリックするとさらに詳細の情報を確認できます（次頁）。

検索が完了すると、”Completed jobs”に移行します。

108

・[job 番号] :“Percent

complete” で検索の進捗状況を確認する事ができます。

Database Status のハイパーリンクに話を戻します。

・Unidentified taxonomy :データベースのエントリーの中で taxonomy 情報との紐づけできなかったものをピックアップして表示します。データベースファイル自身の不具合で生じるケースもあります。
・Statistics :データベースの登録情報に関する各種数値。画面上部（左下図）ではデータベースの登録件数や残基数、生物種エントリー毎の登録件数などが表示されます。画面下部には各アミノ酸残基数やエントリーの残基長分布が表示されます（右下図）。

109

・Recompress file :現在構築済みのデータベースについて、再度データベースの構築を開始します。Taxonomy の設定などを変更しそれを反映させる時などに利用します。
・retry :Status が Halted になった際表示される retry をクリックすると、データベースの再構築または
1st テスト検索の再実施を行います。エラーが生じた際、エラーへの対処を行ったのち再度データベース
構築や検索を試みる際などに利用します。
Database Status で同じデータベースが２つ表示されることがあります。データベース入れ替え中、または入れ替え済みであることを示しています。
入れ替え途中の過程では、現在使用可能な(status = in use)データベースと、構築中である新たなデータベースの進捗状況が２つとも表示されます（下図）。

また入れ替え済みとなった後、現在使用可能な 「status = in use」の データベースと、かつて使用していて現在「status = not in use」となったデータベースについても引き続き表示されます（下図）。

もし２つ表示されている状況が気になるようであれば、MASCOT Service またはコンピューター自身を再起動する事で、最新の１つのみが表示されるようになります。

110

12-2. 検索ログ : Search log
MASCOT Server で 行 っ た 検 索 は
すべて検索結果を格納したファイルが保存され、検索のログも残ります。
Home → 「 Search log 」 を ク リ ッ ク
するか、Database Status で「Searchlog 」 の ハ イ パー リ ン ク をク リ ッ ク す る
事 で 、 Server で行 っ た検 索 の ロ グを開く事ができます。

下図のような Search log 画面が表示されます。
①③②

以下、①～③各パートに記載されている情報や利用可能な機能について、詳しく説明します。
①

バージョンとライセンスの情報が先頭行に記載されています。
Sort/filter: この行で指定した情報に基づいて検索ログが表示されます。条件を変更して新たに表示させる場合、このボタンを押します。

Log File: MASCOT の検索ログのファイルの path

Start at: 検索ログを、検索番号の降順(-1)で表示するか昇順(1)で表示するか

how many: 表示するログ件数

Data dir: デフォルト設定以外の data フォルダへのパスを使用するときに指定

Gets?

: getseq 情報を表示するか

111

②

Job#

: 検索番号。デフォルトでは 1234 番から実行順に割り振られています

PID: MASCOT Server で使用しているプロセス ID

dbase: 使用したデータベース

User Name: 検索ユーザー(検索時に指定)

Email: メールアドレス。ただし local 版ではメールアドレスでなく短いテキスト情報でもよい

Title(Ti とデフォルト表示) : 検索のタイトル (検索時に指定)Intermediate File (In とデフォルト表示) : 結果ファイルの置かれている場所③

start time

: 検索開始時間

Duration: 検索時間Status: 検索結果の状態

Priority: 検索時に指定した、検索の優先順位

Type: PMF / SQ / MIS

Enzyme: 特異性を持つ設定で行ったか(Yes)、特異性を持たない設定 None で実行したか (No)IP address: 検索をかけたコンピューターの IP アドレス

User ID: MASCOT のセキュリティ設定で指定しているユーザーID

Peak list data file : 入力データファイルのパス並びに名称
各項目の一番上にある入力欄はフィルターとして利用できます。例えば SwissProt で検索した結果のみ
を 表 示 さ せ た い 場 合 、 ”dbase” 項 目 に ”SwissProt” と 入 力 し て ”sort/filter” ボ タ ン を 押 す こ と でフィルターリングが実現します。
またその上にあるチェックボックスは項目の表示を広げてすべて読めるようにするかどうか、さらにその上にあるラジオボタン（１項目のみ選択可能）は選択項目で並び替えを行う事を意味します。並び替えについては通常”Job#”が選択されていて、検索を行った順番で並べられています。
112

13. MASCOT Server のカスタマイズ
13-1. カスタマイズは Configuration Editor でMASCOT Server の各種設定変更を行うのが「Configuration Editor」です。Home 画面にある「Configuration Editor」をクリックすると、設定内容一覧が現れます。
各設定画面について、以降より詳しく説明いたします11313-2. Amino Acids
アミノ酸の質量に関する設定を行う画面です。Home -> Configuration Editor -> Amino Acids で開く事ができます。
最初に定義一覧が現れます（下図）。基本的には定義されている内容をそのままご利用頂く事になります。

U,J,O の 3 文字についてはユーザーがカスタマイズする事ができます。カスタマイズを希望する場合、カスタマイズを希望する文字の行にある「Edit」ボタンをクリックします。

このカスタマイズは、20 種類のアミノ酸以外のアミノ酸をターゲットとしたい時や、あるアミノ酸の特定修飾について配列に組み込んでおきたい場合などに、配列データベースのカスタマイズと一緒に使用するなどといった使い方があります。
114

13-3. Modifications
修 飾 、 アミノ 酸 の 質 量 の 変 化 に関 す る 設 定 を行う画 面 です 。 Home -> Configuration Editor ->Modifications で開く事ができます。
最初に、設定済みの定義一覧が現れます（下図）。既にある設定をそのまま微調整する場合は項目名のリンクを、現存設定を残しコピーしてそちらで書き換える場合は「Copy」のリンクをクリックします。新規の設定を作成するには画面下部の「Add new modification」ボタンを押します。

■ 最初の一覧表で表示されている項目（列）は以下の通りです。
Title: 修飾の名称。詳しくは https://www.unimod.org/names.html

Monoisotopic : Monoisotopic 質量
Average: Average 質量

Composition: 化学式、修飾が付く残基における質量の増減

Source: unimod 由来の項目か、unimod 内容を一部変更したか、自身で作成した項目かVisibility: modification リストのデフォルト表示(short)か、”show all mod”オプションを使用した時に初めて表示される項目(long)か、修飾が付くアミノ酸残基によってそれらの設定が異なり混ざっている状態 (mixed)か

Err Tol: Error Tolerant 検索 (10-4)の時に考慮される修飾かどうか

115

表示されている項目のうち青い太字で表されている Title, Monoisotopic, Average については、項目
名をクリックする事で降順/昇順 に並べ替える事ができます。目的とする項目を探す際に、Title(名称)のアルファベット順にするか、Monoisotopic 質量の順に並べて計算値から探すことで見つけやすいです。

■ 前頁図一覧下に表示されているボタンは以下の通りです。
Page N/M Go to page , page size N: 表示しているページの変更や 1 ページで表示される項目数の変更
Add new modification : 新しい修飾を作成
Main menu: Configuration Editor の一覧表示に戻ります

Check Unimod: 修飾設定は Unimod というサイトでまとめられています。「check Unimod」
ボタンは Unimod にある修飾設定ファイルの内容を確認し、手元のファイル
よ り 新 し か っ た 場 合 に そ れ を 取 得 し て 設 定 を ア ッ プ デ ー ト し ま す 。 なお
Unimod ファイルをアップデートしても自身で作成した修飾はなくなりません。

■ 前頁図左フレームは、表示内容をフィルターリングしたり、項目を複数選んで設定をまとめて変更する
際に利用する欄です。
以下は表示内容をフィルターリングする項目です。
Visibility: modification リストのデフォルト表示(short)か、”show all mod”オプションを使用した時に初めて表示される項目(long)か、修飾が付く残基によってそれらの設定が異なり混ざっている(mixed)か、あるいはリストには記入されておらず修飾以外の特定の設定内のみ有効な内容か（Not listed）。

Error tolerant : Error tolerant 検索で考慮される修飾かどうか 。「Yes」:使用される設定、「No」:
使用されない設定、「Mixed」:残基により使用される/されない 設定が混ざっている
Classifications : 修飾の分類。検索などで使用するタグのようなものですが、検索そのものには「AA substitution」以外どれを選んでいても影響を与えません。
Source: Unimod 登録内容か、Unimod 登録内容をユーザーが一部変更したか、完全にユーザーが作成したものか

また以下は設定をまとめて変更するためのオプションです。
Apply to selected : 設定をまとめて変更します。以下の選択肢があります。
-

Include in short list :右側の表で選択（行先頭のチェック欄）された内容を、すべて修飾の short list (パラメーター選択時にデフォルトで表示される修飾リスト)に含める
116

-Include in long list :右側の表で選択（行先頭のチェック欄）された内容を、すべて修飾の long

list (パラメーター選択

時、”show all mod”オプションを指定する事で初めて表示される項目)に含める-

Include in error tolerant / Exclude from error tolerant:
右側の表で選択（行先頭のチェック欄）された内容を、Error tolerant 検索で考慮する修飾に含む、あるいは考慮対象から外す-

Delete : 選択した修飾をリストから除く

以降、さらに修飾の各設定項目について、その設定画面の説明をいたします。例として項目「Phospho」（リン酸化）の設定を利用いたします。

「Phospho」リンクをクリックするとまず Title , Fullname 欄に名称並びに詳細情報が記された画面が現れます（上図）。この段階では閲覧のみ可能で編集ができません。画面右下にある「Make editable」をクリックすると編集が可能となります（下図）。

「Delta」タブでは、修飾が付いた場合の質量の増減分を”Composition”に記載します。設定の際すぐ下にある「Symbols」で対象の元素記号（または化合物を表す記号）とその数を指定して「Add」を押す
事で「Composition」に反映されます。減少分はマイナスの数字がありそれを指定する事で対応可能です。
また入力ミスなどの場合、Compositon 部分の数字を直接書き換えたり、同じ記号で数字を変えて再びAdd 操作を行う事でも対応可能です。
117

「Specificity」タブでは修飾が付くアミノ酸残基、あるいは N 末端/C 末端の位置 について設定します（上図）。設定項目がある場合、「Show Details」ボタンを押すことでより詳しい設定内容が確認できます（下図）。

表示項目は以下の通りです。
Site: 修飾が付くアミノ酸またはペプチドの位置(N 末端/C 末端)。

Position: Site のアミノ酸についての位置の絞り込み。

Classification : 修飾の分類。但しフィルターリングの際使用するタグのような意味合いがあるものの、検索そのものには「AA substitution」以外影響を与えません。
118

Group: 異なる specificity で同じ group 番号が割り振られている場合、phospho(ST)などのようにアミノ酸が１つにまとめられます。一方 phospho の場合 ST と Y は異なる group
番号が割り振られており、修飾リストでもそれらが分けられて表示されます。

Visibility: modification リストでの表示のされ方。

-

short list : modification の選択項目として最初から表示。

-

long list

Notes: ”show all modifications”のオプションをオンにしないと表示されない。
: 修飾についてのメモ。

また Neutral loss、すなわち precursor の段階では損失しておらずプロダクトイオンマススペクトル測定の段階で損失する官能基などの塊やそれに対応する質量減少に関する設定もあります。
Neutral loss : 基本的に「Scoring」を指定します。Neutral Loss に派生して生じるピークについて、その存在を特に重視したり、逆に影響を抑える場合などに別のオプションを利用します。
-

Scoring: NeutrallLoss により生じるフラグメント側のピークが、マッチング・スコアリングの対象となります（通常はこちらを選択します）。

-

Satellite : Neutral loss で生じたピークをピークリストから外します。マッチング対象の理論値はNeutral loss をしていないものとなります。Neutral loss のピークがノイズと認識されない分、マッチングスコアが上昇する事が期待される時に選択します。

-

Peptide: プレカーサーから Neutral loss 分が消失して生じたピークをピークリストから除きます。マッチングしない無駄なデータが減る分、マッチングスコアが上昇する事が期待される時に選択します。

-

Required Peptide :上記「Peptide」の性質を持ち、かつプレカーサーから Neutral loss 分が消失して生じたピークが存在しない場合、Neutral loss に関連する考慮を全くしなくなります。 ：参考 : https://www.matrixscience.com/pdf/2005WKSHP2.pdf

Composition : 「Delta」で指定した修飾がついている状態を基本としてそこからの増減を指定します。
隣にある「Symbols」と数字、「Add」ボタンと連動していますまた直接の記入にも対応
しています。
Neutral loss するパターンとしないパターンの両方を考慮したい場合、例の図のように片側は空欄（しない場合）の設定を作成しておく必要があります。

以降タブがありますが、記入が必須ではなく重要度はあまり高くない設定項目です。

119

「Ignore Masses」タブ（下図）は解析に付随して現れる特定のピークについて、そのピークを入力データから取り除きマッチングの対象から外す際に利用します。

「Misc」タブ（下図）は登録エントリーに関してこれまでの設定項目以外のメモ、「その他」となります。

「Reference」タブは、この Modification 情報を設定するにあたり参考にした情報について記入します。

120

13-4. Symbols
元素や分子の部分構造の質量に割り当てた記号(Symbol)とその質量を確認する事ができる画面です（下図）。Home -> Configuration Editor -> Symbols で開く事ができます。設定変更はできず確認のみとなります。この画面内で定義されいている Symbol は、modification,linker などのページ内で利用する事が可能です。また各記号に対して実際に割り当てられた質量や部分構造を確認する際にも利用します。

[次頁に続きます]121

13-5. Linkers
クロスリンクの設定に関連する Linkers に関する設定を行う画面です。Home -> Configuration Editor-> Linkers で開く事ができます。
最初に、設定済みの定義一覧が現れます（下図）。既にある設定をそのまま微調整する場合は項目名のリンクを、現存する設定を残しコピーしてそちらで書き換える場合は「Copy」のリンクをクリックします。
新規の設定を作成するには画面下部の「Add new linker」ボタンを押します。
「Linkers」の設定内容は、13-3 の modification と概ね同じで、modification と一部連動しています。
この画面の表示内容で不明な点がある場合は 13-3 前半をご覧ください。

以降、各項目の設定画面について、「Xlink:DSS」の設定画面を使って説明します。
Xlink:DSS のリンクをクリックするとまず Title ,Fullname 欄に名称並びに詳細情報が記された画面が現れます。この段階では閲覧のみ可能で編集ができません。画面右下にある「Make editable」をクリック
すると編集が可能となります。

122

「Delta」タブ（上図）では、リンカーが付く際の質量の増減分を”Composition”に記載します。増減につい ては結 合対象となる 2 つの アミノ酸配列を併 せた数 字で考えます。設定の際、すぐ下 にある「Symbols」で対象の元素記号（または化合物を表す記号）とその数を指定して「Add」ボタンを押す
事で”Composition”に反映されます。減少分は数字にマイナスのものがありますのでそれを指定する事で対応可能です。また入力ミスなどの場合は Compositon 部分の数字を書き換えたり、同じ記号で数字を変えながら再び Add 操作を行う事でも対応可能です。

「Specificity」タブ（上図）ではリンカーが付くアミノ酸残基、あるいは N 末端/C 末端の位置 について設定します。設定項目がある場合、「Show Details」ボタンを押すことでより詳しい設定内容が確認できます。（次頁図）[次頁に続く]

123

Site

: 修飾が付くアミノ酸またはペプチドの位置(N 末端/C 末端)。

Position: Site のアミノ酸についての位置特定。

Classification : リンカーの分類ですが、表示の絞り込みなどで使用するタグのようなもので検索そのものには影響を与えません。
Group: 異なる specificity で同じ group 番号が割り振られている場合、Link(ST)などのようにアミノ酸が１つにまとめられます。

Visibility: modification リストでの表示のされ方-

short list : modification の選択項目として最初から表示-

long list: ”show all modifications”のオプションをオンにしないと表示されない

また Neutral loss に関する設定もあります。必ずしも Loss だけでなく、質量が増加する場合もこちらで設定をします。この部分は crosslinking の monolink 設定と連動しており、modification にはない独自の設定項目があるので注意が必要です。
Code: Crosslinking の Monolink 設定で、NeutralLoss のパターンを指定する際に選択する記号として表示されます。記号は任意で、MASCOT Server 側で特に準備されたものはありません。ユーザーが連想しやすいものをご利用ください。Linker がペア
124

ペプチドを構成せず構造の一部が変化するパターンは１つでない事も多いですが、その複数のパターンを予め作成しておくことができます。
Pairs With

: monolink パターンの中で特に対になっている組み合わせがあれば、相手側のCode を記入します。

Composition: 「Delta」で指定した修飾がついている状態を基本としてそこからの増減を指定します。隣にある「Symbols」と数字、「Add」ボタンによる入力に対応しています。

Description: Code で指定したパターンの内容について後で確認するときに使うメモ欄です。

以下、重要度があまり高くない設定欄です。不明な場合は空欄でも問題ないことがほとんどです。
「Ignore Masses」タブ（下図）は解析に付随して現れる特定のピークについて、そのピークを入力データから取り除きマッチングの対象から外す際に利用します。

「Misc」タブは登録エントリーに関してこれまでの設定項目以外のメモ、「その他」となります。

125

「Reference」タブは、この linkers 情報を設定するにあたり参考にした情報について記入します。

13-6. Enzymes
タンパク質からペプチドに切断するパターンに関する設定を行う画面です。Home -> Configuration
Editor -> Enzymes で開く事ができます。
最初に設定済みの定義一覧が現れます（下図）。既にある設定をそのまま微調整する場合は「Edit」のリンクをクリックします。既存のものとは異なる新規の設定を作成するには画面下部の「Add new
enzyme」ボタンを押します。

126

以降、Trypsin を例に画面について説明いたします。

Title

: 設定名

Independent: 2 つ以上の Components が設定に含まれている時、2 つの設定をばらばらに実施してその後混入されたケースを仮定して切断されたパターンを考慮する（チェック）か、それとも同時に切断パターンが有効になるケースを考慮する（チェック無し）かSemispecific: N または C 末端の片側が Components で定義した内容、もう片側が任意の場所で切断する切断方法を考慮するかどうか

Components: 切断パターンに関する設定。以下項目を設定します。

-

Sense

: 切断箇所が N 末端か C 末端か-Cleave At : どのアミノ酸残基を認識して切断するか-

Restrict: 切断残基の前後(N-term 切断なら前、C-term 切断なら後ろ)に指定残基がある場合
切断しない

Test Enzyme ボタン : 設定内容によってタンパク質配列が実際にどのように切断されるかのテスト。

127

切断パターンの Componetns は２つ設定する事もできます。下図は「CNBr+Trypsin」設定の例です。

13-7. Instruments
プロダクトイオンスペクトルのフラグメントピーク理論値作成を考慮するイオンシリーズに関する設定を行う画面です。Home -> Configuration Editor -> Instruments で開く事ができます。
最初に、設定済みの定義一覧が現れます。既にある設定をそのまま微調整する場合は項目名の下にある「Edit」リンクをクリックします。既存のものとは異なる新規の設定を作成するには画面下部の「NewInstrument」ボタンを押します。

128

MS2 データとのマッチングを考慮するイオンシリーズや電荷についてチェックを入れ、設定作成後に「Save changes」ボタンを押すことで設定が保存されます。

129

13-8. Quantitation
タ ン パ ク 質 の 定 量 解 析 に 関 す る 設 定 を 行 う 画 面 で す 。 Home -> Configuration Editor ->Quantitation で開く事ができます。
最初に設定済みの定義一覧が現れます（下図）。既にある設定をそのまま微調整する場合は項目名のリンクを、現存設定を残しコピーしてそちらで書き換える場合は「Copy」のリンクをクリックします。既存のものとは異なる新規の設定を作成するには画面下部の「New quantitation method」ボタンを押します。
以降、「TMT 6 plex」の設定を使って各画面の説明をいたします。

130画面上部には「Name」と「Description」があり、設定項目の識別情報として利用します。
「Method」タブではタンパク質の定量値を計算する条件やペプチド定量値からタンパク質の定量値を計算する方法に関連する設定項目が集められています。

Constrain Search: 「Quality」タブの「Exclusion」項目で設定された修飾について、検索結果から除いてレポートするかどうかを指定します。

Protein Ratio Type: アサインペプチドの定量情報からタンパク質の定量値を計算する方法。
median, average, weighted(intensity による重みづけをした average)
から選びます。結果画面で変更可能。

Protein score Type: タンパク質のスコア算出方法でデフォルト設定からの変更を希望する時に指定。standard または mudpit から選択します。

Report Detail: ペプチドレベルでの定量値を結果画面に表示するかどうか。

Show subsets: subset のタンパク質を結果画面に表示するかの設定でデフォルトから変更希
望の際に指定。0（全く表示させない）から 1（すべて表示させる）の間の数値。

Require bold red: 定量計算対象のペプチドを bold red (同定基準を超えランクが１位) に限定するかどうか

Minimum Peptides: タンパク質にアサインされるペプチド数の最低値。結果画面で変更可能。

Significance Threshold: ペプチドの同定基準をデフォルト設定から変更したい場合に指定。
131

comp qualifier: ペプチドに含まれるアミノ酸残基数による限定。文法は Sequqnce Query 法の記述と同じです。 例) *[C]→C を必ず１つ含む、など

seq qualifier: ペプチドに含まれるアミノ酸配列による限定。文法は Sequence Query 法の記述と同じです。
例) *-TSL →N 末端または C 末端から TSL という並びの配列、など

Modification groups: 定量計算を行う際必ず指定する修飾の組を設定します。図例では「TMT fixed」というグループがあり、グループ内で TMT6plex (N-term) とTMT6plex (K) が定義されています。グループの設定画面は以下の通りです。

Name: 修飾グループの名称。

Mode: fixed または variable。

Required: 定量計算を行う上で、この修飾が必ず付いていることが求められるかどうか

Modification: 修飾設定。

Unmodified: 検索対象から除外するアミノ酸残基や N/C 末端。

Local definitions: Quantitation 内部だけで使用する修飾を指定可。

「Protocol」タブでは、実施する定量解析が MASCOT で定義するどのパターンの定量解析方法かを指定するとともに、その手法独自の関連設定項目が表示されます（下図）。表示例は reporter の設定項目
ですが、その他の設定値は選択されたプロトコルによって大きく異なります（実際に変更してみると関連する設定項目が切り替わります）。項目名にカーソルを合わせると、下の欄に説明文が現れるので詳しくはそちらをご参照ください。

132

Protocol: MASCOT で定義される定量解析プロトコルの選択、以下の項目があります。

-

reporter: MS2、特定領域に表れる各ピークの強度を定量計算に利用。

-

precursor : タグなどの影響で質量が異なる同一ペプチドのペアを 1 データ内から探し、
同定ペプチドの MS1(XICs)情報を利用して定量計算に利用。Mascot Distiller が必要-

multiplex : MS2,同定ペプチドのフラグメントピークの強度を定量計算に利用。

-

replicate : ラベルフリー定量、複数のデータにまたがった解析。同定ペプチドの MS1(XICs)
情報を利用して定量計算に利用。Mascot Distiller が必要。

-

average: ラベルフリー定量、複数のデータにまたがった解析。各タンパク質の定量値について強度が強い top N(N は整数)のペプチドデータを使い計算するとともにreference との比較で定量値を算出

右図例は Average プロトコルの場合です。上記と表示項目が異なります。

「Component」タブでは、定量計算を行うために定義した各データシリーズ(Component)について、名称や質量などの設定を行います（下図）。こちらも Protocol により設定項目が変化します。以下 reporterの例については各項目について簡単に説明しますが、各プロトコル、各項目の詳細は実際の画面でカーソルを各項目にあわせた際、画面下部の説明欄に表示される内容をご覧ください。

Components: 定義済みの「Component」一覧（右図）

Component: 選択している Component の名称

M/Z: reporter のピークの位置

Corrections: 各 component で生じるピークシフトについて、シフトする数値をその割合の設定。

133

「 Report Ratio 」 タ ブ で は 結 果 で 表 示 す る 比 に つ い て 定 義 し ま す 。 分 母 や 分 子 に 使 用 さ れ る
Components を指定しますが、単純な設定だけでなく、要素同士を足したりする設定も可能です。

■ 複雑な設定については以下 URL をご覧ください。
https://www.matrixscience.com/help/quant_overview_help.html#CONCEPTS■ ラベルフリー定量、replicate プロトコルでの Component や Report Ratio の設定例については
以下資料の P.16～ をご覧ください。
https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/MascotDistiller_replicatesQuantTutorial.pdf「Integration」タブは Precursor の intensity について、
同定ペプチドのピーク強度を足し合わせていく際のルールについての設定で、MS1 関連の定量手法で設定が必要な項目です。ペプチドが検出されたポイントを中心に Retention
time を前後し ながら ターゲットとなるペプチドピークの
intensity を定量値として足し合わせていく際のルールです。
reporter プロトコルではデフォルト設定のように、 基本的に「none」設定でご利用頂く事になります（右図）。

134

よってここでは TMT でなく 「Label-free[MD]」の設定を使って Integration の各項目を説明します（下図）。

Integration Method: データの統合（積分）方法。

-

none

: 結合しない。

-

simpsons : シンプソンズ則に基づいた積分。

-

trapezium: 台形公式に基づいた積分。

Integration Source: 何のデータを積分するかについての設定。

-

survey: survey scan の Precursor ピーク面積。

-

zoom

: zoom scan の Precursor ピーク面積。

-

header: ヘッダー情報に記載されている XIC の値。

-

fragments: MS/MS のフラグメントピーク面積の合計。

-

mrm: MRM, multiple reaction monitoring

Simple ratio: チェックが入っている時は合計値がそのまま計算に利用されます。
チェックされていない場合、近似曲線の勾配を比率とします。

Allow Elution Shift: 溶出時間のタイムシフトを容認するか（データ間の RT アライメントを実施するかどうか）。

Elution Time Delta: アライメントの許容時間。

Elution Profile Correlation Threshold :XIC ピークの各スキャンの成分強度から近似直線を書かせた際、直線と各スキャンとの標準誤差をスキャン選定の閾値として利用。
All Charge States: 他の電荷で同定されたペプチドのピークを定量計算で合算するかどうか

All Charge States Threshold :上記「All Charge States」にチェックが入っている場合、最も強度が強い
電荷に対してここで設定した割合以上の強度ももつ電荷のピークを合算対象として定量計算に利用。
135

Matched Rho: 同位体クラスターピークの実測値と理論値の相関係数がこの設定値以上の時定量計算に利用。

XIC Threshold: XIC 領域最大値に対しての割合。XIC の強度について、計算対象領域は
XIC 強度がこの設定値以上の割合の値であることが求められます。

XIC Max Width: XIC 計算対象領域の拡張を考慮するスキャン数の上限。

XIC Smoothing: スムージングのパラメーターで、設定値を n とした時 2n+1 個のSavitzky-Golay コンボリューション整数のセットによってスムージングを実施（数字が大きいほど細かくなるが計算時間がかかる）。

Matched Rho については以下資料も補足資料としてご参照ください。
https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/MascotDistiller_replicatesQuantTutorial.pdf
Matched Rho は P.42～の「Correlation coefficient」に該当します。

「Quality」タブは定量計算の対象とするペプチドに関する選定条件です（下図）。

Minimum precursor charge :計算対象とするペプチドの電荷の下限。
Isolated precursor :precursor ピーク付近の全ピーク面積に対して、precursor のクラスターピークの面積が占める割合を XIC 計算対象とするペプチドの選定の判断に利用するかどうか。Distiller 上の結果画面で「Fraction」として表示される値と同じです。
https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/MascotDistiller_replicatesQuantTutorial.pdf

P.40～ に、図と共に Fraction に関する説明がございます。
Isolated Precursor Threshold :上記「Isolated precursor」で使用する閾値。
Minimum a(1) :最大ピーク強度に対して a(1)ピークの強度として求める割合。
136

Peptide Threshold Type :定量計算対象とするペプチドについて、スコアや期待値、同定基準値を使ったフィルターリング。
Peptide Threshold Value :上記「Peptide Threshold Type」でスコアや期待値を選択した際、閾値に使われる数字
Unique Pepseq : ユニークペプチドのみを結果に表示。
Exclusion: ここで指定した修飾（グループ）がついているペプチドを定量計算から外します。

「Outliers」タブはペプチドの定量値からタンパク質の定量値を計算する際、「外れ値」の扱いをどうするかについての設定です（下図）。
Outlier method : 外れ値を除く方法-

none:外れ値を除く処置を行わない-

dixons: Dixon 法-

auto: データ数によって Dixon 法またはRosner 法のどちらかを選択-

grubbs: Grubbs 法-

rosners: Rosner 法「Normalisation」タブは数値の normalisation に関する設定です（下図）。最初から異なる事を前提としたデータの解析の場合”none”に、normalisation に使用可能なデータがある場合は以下ご案内に基づきご利用ください。

Normalisation method :-none: normalisation を実施しない。

-

sum: (reporter プロトコルのみ) MS/MS スペクトルのレポーターイオンの強度の和がサンプル間で同じになる前提とする。

-

average: ペプチドの ratio についてサンプル間で幾何平均が同じになる前提とする。

-

median: ペプチドの ratio についてサンプル間で中央値が同じになる前提とする。
137

Normalisation Peptides : Normalisation に使用するペプチド（配列）を指定。
Normalisation Proteins : Normalisation に使用するタンパク質(Accesion)を指定。

「XML」タブは設定ファイル内で設定内容が記述されている、XML フォーマットを実際に表示して確認するとともに、場合によっては直接編集するための設定欄です。記述変更後「Update method」ボタンを押す
ことで記述内容が適用されます

13-9. Crosslinking
ク ロ ス リ ン ク ペ プ チ ド 検 索 に 関 す る 設 定 を 行 う 画 面 で す 。 Home -> Configuration Editor ->Crosslinking で開く事ができます。
最初に設定済みの定義一覧が現れます。既にある設定をそのまま微調整する場合は項目名のリンクを、現存設定を残しコピーしてそちらで書き換える場合は「Copy」のリンクをクリックします。既存のものとは異なる新規の設定を作成するには画面下部の「New quantitation method」ボタンを押します。

以降、各項目の設定画面について、「HSA Xlink:DSS」の設定を使って説明をいたします。

138

画面上部には「Name」と「Description」があり、設定の識別に利用します。
「Method」タブで GUI での設定を行う事ができます(下図)。

Strategy: クロスリンクのペアペプチドを探す方法。Ver.2.8 では実施の選択肢が「Brute-force」(総当たり)の 1 択です。

InterLink: 異なるタンパク質のペプチド間の結合を考慮するか。

IntraLink: 同一種類のタンパク質の異なるペプチド間の結合を考慮するか。

LoopLink: 同一種類のタンパク質・同一ペプチド内での結合を考慮するか。

Linker: リンカーの種類。リンカー設定より選択。

Monolink: 一方のペプチドのみにリンカーが付き実質修飾のようになるケース。リンカーとして設定していた状態と構造が異なるため、予め「linkers(13-5)」内で定めておいた質量変化パターンを Neutral Loss として定義した Code を選択します。Code が何を示しているかは、Linkers の設定を確認する必要があります。

DoesNotPairWith : 同時に考慮しない Linker の組み合わせ。
Accessions
Database name : クロスリンク検索を考慮するタンパク質について、対象のデータベースを特定したい
場合にデータベース名を記入して使用します。Accession の記載がない場合はデータベースエントリーを網羅的に探索しますが基本的に非推奨です。どうしても利用したい場合はエントリー数が非常に少ない(interlink なら 10 以下、
intralink なら 100 以下)、ペプチド組み合わせを考慮するタンパク質の対象が100 以下となるような選び方ができるデータベースを準備してください。
139

Accession: クロスリンク検索を考慮するタンパク質の Accession を指定

Filters: crosslink 検索対象とする候補ペプチドの条件-

MinPrecursorMr : 候補ペプチドの質量の最低値-

MinLen: 候補ペプチドの残基長の最低値-

MinCharge: 候補ペプチドの電荷の最低値

Settings-: そのほかの設定。現在は以下一つのみ

MaxProteins : 考慮するタンパク質数の最大数。サーバーへの負荷を制御したい場合などに利用「XML」タブは設定ファイル内で設定項目の内容が記述されている、XML フォーマットを実際に表示して確認し、場合によっては直接編集するための設定欄です（下図）。編集後「Update method」ボタンを押す
ことで編集内容が適用されます。

13-10. Configuration Options
MASCOT Server のオプション に関する設定を行 う画面 です 。 Home -> Configuration Editor->Configuration Options で開く事ができます（次頁図）。
パラメーターには空欄の場合 MASCOT Server が予め定めているデフォルト値を適用する場合と、設定値がない場合の 2 パターンがあります。また Configuration Options にデフォルトで表示されていない
オプションも存在し、その場合は MASCOT Server が定めるデフォルト値が適用されていますが、その項目
名と設定値をこの画面で明示する事で設定値を変更する事もできます。
設定画面の一番下にある「Add New Options」を押すと、一覧表示にはなかったオプションについて
設定項目名と設定値を入力する欄が現れます。
すべての設定変更が完了した時点で「Apply」ボタンを押すことで変更内容が適用されます。

140

==================中略=================

Configuration Options で初期表示されている/いない に関係なく、MASCOT Server で使用可能なオプションがあります。詳細は別紙の日本語資料資料
URL : (資料未完成、完成後公開いたします)
または、MASCOT の Setup & Installation manual (Home 画面にあるリンクで開く事ができる PDF
ファイル、英語)の 6 章、「Options」の項目をご覧ください。

14113-11. Database manager
MASCOT で使用しているデータベースに関する設定を行う画面です。Home -> Configuration Editor-> Database Manager で開く事ができます。

Database manager については別紙の設定資料を準備しておりますのでそちらをご覧ください。
https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/MASCOTServer_ver26_sequencedbmanage.pdf

13-12. Security
セキュリティ機能に関する設定を行う画面です。MASCOT Server で Security 機能を ON にしている時のみ、Home -> Configuration Editor -> Security で開く事ができます。

セキュリティ機能については別紙の設定資料を準備しておりますのでそちらをご覧ください。
https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/Security.pdf

142

技術サポート
ご質問等ありましたら弊社技術サポートにご連絡ください。
電子メール：support-jp@matrixscience.com

電：03-5807-7897

話