日本大学文理学部自然科学研究所研究紀要
No.57（2022）pp.173 − 179

トリメチルアミン N - オキシドがミオシンの熱安定性に与える効果
茶圓茂＊・安田

実咲＊・長友万柚子＊

Effects of Trimethylamine N-oxide (TMAO) on the Thermal Stability of Myosin

Shigeru CHAEN ＊ , Misaki YASUDA ＊ and Mayuko NAGATOMO ＊（Accepted November 11, 2021）

Trimethylamine N-oxide (TMAO), one of osmolytes, has been shown to enhance protein stability. It has beenreported that TMAO protects the interaction between microtubules and kinesin from thermal degradation. We examined
here how much TMAO protects the actomyosin motility from thermal denaturation. To assay the effects of TMAO on thethermal stability of myosin, we measured the velocity of actin filament sliding along myosin which was heat-treated in thepresence of TMAO. Myosin incubated for 20 min at 40 ℃ in the absence of TMAO didn’t cause the actin filament sliding,but myosin which was heat-treated in the presence of 600 mM TMAO caused the actin filament sliding. These results
indicate that TMAO protects the actomyosin motility from thermal denaturation.
Keywords: myosin, actin filament, thermal stability, trimethylamine-N-oxide (TMAO)

1．はじめに表面にミオシンを吸着させそのあと蛍光標識アクチン

ト リ メ チ ル ア ミ ン N オ キ シ ド（Trimethylamine-N-フィラメントを ATP 存在下に相互作用させ，そのアクoxide (TMAO)）は主に海洋生物の体内で浸透圧を調節

チンフィラメントが吸着ミオシンに沿って動く様子を蛍1-3）。TMAO は浸透圧調節のほかに光顕微鏡で観察しその運動速度を解析した。ミオシンのタンパク質の折りたたまれた状態を安定化することが知

熱処理はいろいろな濃度の TMAO 存在下で 40 ℃，20 分している物質である
4-10）。この TMAO がどのようにタンパク質を行った。400 mM 以下の TMAO 存在下で熱処理されたミ安定化しているかについては直接に TMAO とタンパクオシン上でアクチンフィラメントは滑り運動を示さなられている

4-6）と，タンパク質と水かったが，600 mM 以上の TMAO 存在下で熱処理したミ7 〜 9）

オシン上ではアクチンフィラメントは滑り運動を示しがあるが，未だその詳細なメカニズムは明らかにされてた。この結果は TMAO がミオシンの熱失活を防ぐ作用いない。モータータンパク質の一つである微小管とキネがあることを示している。

質の相互作用によるという研究との相互作用に TMAO が関わっているという研究

シンに TMAO の効果を調べた研究ではキネシンを熱失活から保護しているという結果が得られている 10, 11）。

2．実験方法一方 アクチンとミオシン系において TMAO は，その相2-1 試12）薬があるが，熱失活

ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト を 蛍 光 標 識 す る Rhodamin-に関しては調べられていない。本研究では TMAO がミ

conjugated phalloidin は Invitrogen 社 の も の を 用 い た。

オシンの熱失活を低減できるのかをアクチンミオシン運Trimethylamine-N-oxide (TMAO)，ATP，bovine serum

動活性を測定することによって調べた。アクチンミオシ

albumin (BSA)，glucose oxidase，catalase は Sigma 社のもの

ン運動活性は以下のように調べた。 まずカバーガラスを用いた。その他の試薬は市販で高純度のものを用いた。

互作用を抑制しているという報告＊＊

日本大学文理学部生命科学科：〒 156-8550 東京都世田谷区桜上水 3-25-40

─ 173 ─Department of Biosciences, College of Humanities and Sciences, Nihon
University：3-25-40, Sakurajosui, Setagaya-ku, Tokyo, 156-8550, Japan

（ 1 ）

茶圓

茂・安田

実咲・長友万柚子

2-2 タンパク質の調製

Ａ

ミオシンはウサギの背筋と腸腰筋より Perry の方法 13），
アクチンは Spudich & Watt の方法 14）で抽出，調製した。
ミ オ シ ン は 0.54 cm2 mg -1，ア ク チ ン は 1.1 cm2 mg -1 の280 nm 吸光係数からそれぞれの濃度を調べた。ウサギの筋肉はウサギ肉販売業者（ハピー農場，秋田）より購入した。品種は日本白色種・秋田改良種である。この業者は実験の前日夕方に筋肉を取り出し，素早く氷で冷やし，真空パックし，翌日の実験当日お昼すぎまでに冷蔵宅配便で送ってくれる。

図 1A

2-3 実験セットアップ

アクチンフィラメント滑り運動の観察装置

図の右にある Lamp（高圧水銀灯）の白色光が Ex.F（励起フィルター）を通過し緑色の光になり DM（ダイクロイックミラー）で反射され Obj（対物レンズ）に入り Flow chamber 内のアクチンフィラメントのローダミン色素を励起する。そして生じた赤色の蛍光が DM（ダイクロイックミラー），Em.F.
（蛍光フィルター）を通り，M（ミラー）で反射し camera で撮影される。録画はカメラ内の SD カードに保存され，のちにパソコンで読み出し解析される。

図 1A にミオシン上を運動するアクチンフィラメントを観察する実験（ In Vitro motility assay system）の装置を示す。図には用いた倒立型蛍光顕微鏡（IX71，オリンパス）の対物レンズ（x100，N.A. 1.35 oil），試料ステージ，励起用光源，励起フィルター，ダイクロイックミラー，蛍光フィルター，および撮像用カメラ（ソニーミラーレ
スカメラ Į7s）を示す。対物レンズの上の試料ステージにはフローチャンバーと呼ばれる試料プレパラートを置く。このフローチャンバーは24 x 32mmのカバーガラス，Ｂスペーサーとなる0.5mm厚のシリコンゴムシートと18 x18mmカバーガラスからなっている（図1B）。スペーサーと な る 0.5mm 厚 の シ リ コ ン ゴ ム シ ー ト は 大 き さ 18 x7mm の 2 枚からなり，したがって 2 つのカバーガラスの間には 18 x 4 x 0.5 mm の通路溝ができる（図 1B）。この通路溝に 1. ミオシン溶液，2. BSA 溶液，3. 蛍光標識ア
クチンフィラメント &ATP 溶液を順次流して実験を進め

図 1B Flow chamber のガラス構成

る。対物レンズと試料ステージは温度を一定（約 5 ℃か

24 x 32 mm カバーガラスに 7 x 18 mm シリコンゴムシート 2枚を貼り付けた 18 x 18 mm カバーガラスを貼り付け，できた隙間 4 x 18 mm に溶液を流せる構造になっている。このᅗ1
Flow chamber は実験のたびに新しいものを用意する。

ら約 35 ℃まで）に保つようにした。実験時の試料の温度は通路溝に極細の熱電対型サーモメーター（安立，ST11E-008）を差し込んで測った。そして実際の Motility
Assay は 25 ℃ ± 0.2 ℃の温度であった。図 1C はミオシンを熱処理するブロックインキュベーター（写真）（BI-Ｃ516，ASTEC）を示す。このアルミブロックの上にミオシンを吸着させたフローチャンバーを乗せ，指定した温度で指定した時間インキュベートした。

12-4 実験の手順とデータ解析
液体窒素中に保存していた 10 mg/ml ミオシンを 100

ᅗ1μg/ml になるように 0.6 M KCl，50 mM リン酸カリウムバッファー（pH6.8）で希釈し，フローチャンバーに流

図 1C

Flow chamber 内カバーガラス表面に吸着させたミオシンを熱処理するブロックインキュベーター

し入れた。この後，このフローチャンバーをブロックインキュベーター（図 1C）のアルミブロックの上に乗せ，指定した温度で指定した時間インキュベートした。その

ᅗ1 1（ 2 ）

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00 ⛊10䃛m01 ⛊02 ⛊図2

アクチンフィラメント滑り運動の記録動画

カメラに記録した動画像から 1 秒おきの静止画像を 3 枚並べた。白矢印の方向にアクチンフィラメントが動いている。スケールバーは 10 μm 。

図4ᅗ4アクチンフィラメント滑り速度のヒストグラム

何も処理していない Normal ミオシン上を滑るアクチンフィラメントの速度の分布。温度は 25 ℃。50 個のアクチンフィラメントをトラッキングした。このヒストグラムより平均値は 1.36 μm/sec，標準偏差は 0.32 μm/sec と計算された。

ジにのせ，観察した。図 2 は典型的な蛍光標識アクチン
図3フィラメントが滑り運動をする様子を表した。1 秒おき

ᅗ2

アクチンフィラメントの滑り運動解析の画像をビデオ画像から切り出した像で，画面上の白矢アクチンフィラメント滑り運動解析のためのトラッキングコンピュータープログラム（Mark 2）画面。4 つの画面より成る。右半分の画面はアクチンフィラメント動画像，動いているアクチンフィラメントの先端にマウスカーソルをおきマウ
2スをクリックすると設定秒後の画面になり，また新しい画面で動いていくアクチンフィラメントの先端をクリックしていく。左上から 2 番目の画面は右図アクチンフィラメント先端においたカーソル付近の拡大画面。動きに合わせてクリックを繰り返していくと，そのクリック位置と時間の関係が左上から 3 番目の図の赤線のように直線として表示される。この直線の傾きは速度を表す。左の一番下の画面はアクチンフィラメントごとに計算された速度が表におさめられる。

ᅗ3

印の方向に蛍光標識アクチンフィラメントが動いている。蛍光標識アクチンフィラメントの滑り運動速度は情4報通信研究所の古田健也氏が開発した Mark 2 と呼ばれる Windows10 アプリケーションを用いて解析した。図3 にその Mark 2 アプリケーションの画面を示す。図 3
右はビデオ画像で，滑り運動をするアクチンフィラメン
トの先頭に十字カーソルを置いてクリックすると設定秒後の画面になり，動いた先端に又十字カーソルを置いてクリックを置いていく。クリックしていく都度，このアプリケーションは十字カーソルの位置を測定し，速度を計算する。左中図は 3 秒間の動いていくアクチンフィラ

後そのフローチャンバーは氷上に 1 分間おき，室温に置メント先頭の位置変化で，横軸時間，縦軸変位で，そのいた。次に 1mg/ml BSA in 0.6 M KCl，50 mM リン酸カ傾き（赤い線）の傾きが速度を表す。図 4 は熱処理をしリウムバッファー（pH6.8）を流し入れ，3 分置いた。最ていない TMAO 非存在下のミオシン上を滑り運動した

後に motility 溶液（10nM rhodamine-phalloidin 標識アクチ

50 本のアクチンフィラメントに関して解析した速度のン フ ィ ラ メ ン ト，25mM KCl，25 mM HEPES（pH7.5），

ヒストグラムである。速度の平均値は 1.36μm/sec で標4mM MgCl2，1mM ATP，1mM EGTA,1 mM DTT，1% ȕ

準偏差は 0.32 μm/sec（標本数 = 50）であった。

3メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル，4.5 mg/ml glucose，0.2 mg/ml
glucose oxidase，0.035mg/ml catalase，0.2%[w/v]
methylcellulose）を流し入れ，蛍光顕微鏡の試料ステー
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茂・安田

実咲・長友万柚子

3．実験結果および考察

管はキネシン上を滑っている結果を得ている。Chase ら

3-1

ミオシンの熱処理温度とアクチンフィラメント滑は我々の実験とは違い，あらかじめキネシンを高温に処り運動速度との関係理するのではなく，motility assay 時の温度は高温にして図 5 はミオシンを TMAO 非存在下で熱処理した際，アいるが，我々の結果と同じように TMAO がキネシン微

クチンフィラメントの滑り運動速度がミオシンの熱処理小管系を熱失活から抑えていることを報告している。

温度とともに減少していく様子である。熱処理の時間は

Munmun ら 11）は同じくキネシン微小管の再構成運動系

20 min 一 定 と し て， 熱 処 理 の 温 度 を 25，30，35，38，への TMAO の効果を調べている。熱失活でキネシンか40 ℃ と 変 化 さ せ た。25 ℃ 処 理 時 は 1.4 ± 0.5 μm/sec，

ら微小管は遊離しやすくなるが，TMAO はその遊離を抑30 ℃処理時は 1.3 ± 0.39 μm/sec，35 ℃処理時は 0.55 ±えている。アクチンミオシン系の場合，アクチンフィラ

0.29 μm/sec と減少していき，38 ℃と 40 ℃処理時は動きメントからのミオシンの解離が速いほどミオシン上のアがみられなかった。図 6 にミオシン熱処理時，溶液にクチンフィラメントの滑り運動の速度も速くなる。図 8

100 mM，200 mM，400 mM，600 mM，800 mM，1000

は TMAO 存在下の motility assay 実験結果を示した。温

mM の TMAO を含ませた時のアクチンフィラメント滑度は 25 ℃である。TMAO 濃度が高くなるにしたがってり速度と熱処理温度関係を表した。TMAO 濃度が高くな

アクチンフィラメントの滑り速度が遅くなることからるにしたがって，高温熱処理による熱失活の程度が小さ

TMAO はアクチンからミオシンの解離を抑制しているくなっている。図 7 は滑り速度と TMAO 濃度の関係を，ことがわかった。このアクチンフィラメントからのミオ

図 6 のデータから 35 ℃，38 ℃，40 ℃の熱処理温度ごとシンの解離はミオシンのヌクレオチド結合ポケットからにプロットし直した。この図で 40 ℃の場合 TMAO 濃度の ADP の遊離過程が律速している 15）。また，そのミオが高いほど，滑り速度は大きいこと，熱失活の程度が小シンのヌクレオチド結合ポケットの X 線構造解析からヌさいことがわかる。Chase らはガラス基板に固定したキクレオチドはその結合ポケットと水素結合していること

ネシン上を滑り運動する微小管を TMAO 存在下で調べがわかっている 16）。このことから TMAO は結合ポケッている 10）。彼らは TMAO なしでは〜 30 ℃ぐらいが実験

トからヌクレオチドが遊離するのを抑制しているものとの限界温度であったが，46 ℃まで温度を上げても，微小考えられる。ではTMAOはどのようなメカニズムによって結合ポケットからヌクレオチドの遊離を抑制しているのか？図 9 に TMAO の構造式を示した。TMAO はその O原子に į −（部分電荷は− 0.65），N 原子に į ＋（部分電荷は0.44）の電荷の偏りのある極性を持っており 4），ポリペプチド側鎖，あるいは水分子と水素結合を形成する 4 〜 6）。
さらに親水基（NO 基）と疎水基（CH3 基）を持つことから両親媒性の性質もある。こうした構造がタンパク質の水和構造を安定化し 4-10），ミオシンの場合，熱変性やヌクレオチドの結合ポケットからの遊離を抑制しているものと思われる。

4．まとめ
今回の実験結果から TMAO はミオシンの熱変性を抑えることや，ミオシンのヌクレオチド結合ポケットからのヌクレオチド遊離を抑えることがわかった。その詳細な分子メカニズムはこれまでの TMAO のジペプチド，
ᅗ5TMAO 非存在下でミオシンを加熱処理した際のその加熱温度とアクチンフィラメントの滑り運動速度との関係

短いポリペプチドに対する分光学研究や分子動力学シ

Flow chamber 内カバーガラスのミオシンを 20 分，それぞれ25 ℃，30 ℃，35 ℃，38 ℃，40 ℃加熱処理しアクチンフィラメントの滑り運動速度を調べた。
5 38 ℃，40℃では滑り運動は見られなかった。エラーバーは標準偏差。図中の回帰曲線は解析ソフト Kaleidagraph のスムースを使った。

化しているという報告から類推するしかないが，将来，図5（ 4 ）

ミュレーション研究からのタンパク質の水和構造を安定
アクチン，ミオシン，ATP 化学反応サイクル内の個々の素反応に対する TMAO の効果を調べることによって明らかになると思われる。

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トリメチルアミン N - オキシドがミオシンの熱安定性に与える効果

図6

加熱温度とアクチンフィラメントの滑り運動速度との関係

TMAO 100 mM，200 mM，400 mM，600 mM，800 mM，1000 mM 存在下でミオシンを加熱処理した際，その加熱温度とアクチンフィラメントの滑り運動速度との関係を示した。エラーバーは標準偏差。図中の回帰曲線は解析ソフト Kaleidagraph のスムース（100 mM，200 mM，400 mM）および多項式（600 mM，800 mM，1000 mM）を使った。

ᅗ6
ᅗ66─ 177 ─6（ 5 ）茶圓茂・安田実咲・長友

図8万柚子

アクチンフィラメント滑り運動速度の TMAO 濃度依存性
ᅗ8エ ラ ー バ ー は 標 準 偏 差。 図 中 の 回 帰 曲 線 は 解 析 ソ フ ト
Kaleidagraph の線形を用いた。

8

図 9 トリメチルアミン N オキシドの化学構造

ᅗ9

図7

35℃，38℃，40℃の加熱温度ごとのアクチンフィラメ
ントの滑り速度と TMAO 濃度との関係

謝辞
本研究において，ミオシン上を滑り運動するアクチンフィラメントの速度測定は，国立研究開発法人 情報通信研究機
構，未来 ICT 研究所（神戸）フロンティア創造総合研究室，生体物性プロジェクトの古田健也博士が開発した windows
OS 上 で 動 く「 微 粒 子 ト ラ ッ キ ン グ プ ロ グ ラ ム（ 通 称：Mark 2）」を使った。プログラムを送っていただき，その使用をご許可いただいた古田博士に深く感謝いたします。

図 5 と図 6 のデータを 35 ℃，38 ℃，40 ℃の加熱温度ごとに滑り速度と TMAO 濃度との関係に表し直した。エラーバーは標準偏差。図中の回帰曲線は解析ソフト Kaleidagraph の双曲線カスタム定義（35 ℃），多項式（38 ℃），スムース（40 ℃）を使った。

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7─

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