平成22年度

食肉に関する
助成研究調査成果報告書

財団法人

伊藤記念財団

VOL. 29

「伊藤記念財団」設立趣意書
私，伊藤傳三は，昭和３年食肉加工業を創業して以来五十有余年の永きにわた
り食肉加工品の製造販売に従事して参ったところであります。
この間，昭和47年からは日本ハム・ソーセージ工業協同組合理事長，社団法人
日本食肉加工協会理事長，加えて，ハンバーグ・ハンバーガー協会理事長等の重責を担わせていただく等，業界団体の役員を勤めさせていただいてきたところであります。
こうした中で昭和55年，はからずも勲二等瑞宝章受章という身にあまる栄誉に浴したのでありますが，受章に際し私自身の過ぎ来し方を振り返り，食肉及び食
肉加工業界の行く末に思いを致し，２つの事柄を決意致しました。
第１は，食肉加工団体の指導体制の若返りであり，第２は，食肉加工業の基礎的研究の充実であります。
諸情勢が激しく変わりつつある中で食肉加工業界をさらに大きく発展させるには，新しいリーダーの登場が望ましいことは論をまちません。また，食肉加工品については，これまでも日本独自の技術開発は行われてきましたものの，いずれも企業内技術であると言っても過言でなく，大学等における基礎的研究の不足が将来の日本の食肉加工業の発展を遅らせるおそれがあり，この現状を打破する必要があると考えたところであります。
以上のような基本的考えの下に私は，食肉関係団体等の役員を辞すると共に，
食肉及び食肉加工に関する基礎的かつ広汎な研究を行い，あるいは助長するための財団の設立を発起するものであります。
昭和56年６月
設立発起人© The Ito Foundation

伊

藤

傳

三

Philosophy Behind the Establishment of
the Ito Foundation
Approximately half of a century has passed since I established a meat
packing corporation for commercial products in 1928. While involved in thisbusiness, I have had occasion to serve as chairman of the boards of trustees
of several organizations related to the meat industry, such as the HamSausage Industrial Association of Japan in 1972, the Meat Packing Industrial
Association of Japan, and the Hamburg-Hamburger Association of Japan.
In 1980, unexpectedly, I was highly honored to receive the Order of the
Sacred Treasure, Gold and Silver Star from the emperor in acknowledgement of my contributions to the meat industry and improved human nutrition
during my career. This illustrious award provided a strong impetus for me toact on my long-standing concern for the future of meat packing industries.
My commitment to the establishment of a new research foundation for thepromotion of meat science was based on two fundamental philosophies : first,
leadership of the Association of the Meat Packing Industry should be transferred to people with novel ideas and, second, an advanced system for basic
research should be established in meat industries. Clearly, fresh leadership isneeded in changing situations for intensive development in the meat packing
industry. Although some technical product developments have been achievedin certain individual corporations, the lack of basic research in meat scienceat universities and other research organizations certainly will impede future
development of Japanese meat packing industries. It is urgent to end the stagnation in the meat industry through research support.
On the basis of these philosophies, I myself will resign from any official
positions in meat-related associations and will establish a new researchfoundation to support and promote basic and applied research in meat
science.
Denzo Ito, Founder
June© The Ito Foundation

1981

事 業 の あ ら ま し（目

的）本財団は，食肉に関する研究及び調査を行い，もって畜産業及び食品産業の振興と国民食生活の安定に資することを目的とする。
（事業）

本財団は，上述の目的を達成するため，次の事業を行う。
⑴

食肉の生産，処理，加工等に関する基礎的研究及び調査。

⑵

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査を行う大学等の研究機関に対する助成。

⑶

食肉の生産，処理，加工等に関する情報の普及及び広報。
（事業実績）
回
第１回
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29

年度
昭和57年度
58
59
60
61
62
63
平成元年度
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22

研究調査助成48件 60,000千円
52
54,40060
49,80062
48,00070
53,00079
58,90095
70,50086
74,25079
60,00070
50,00086
60,00081
60,00081
60,00082
65,00081
69,10078
59,00082
60,00067
47,00057
41,00053
37,00058
40,00055
41,00055
48,00056
48,00011
10,00012
10,00015
16,90011
10,000
11
10,400

研究調査委託５件 18,097千円
４
12,064７
17,000９
18,100８
11,681
２
5,151
２
2,764
３
1,900
１
500
１
2,000
２
5,000
２
4,000
３
4,000
２
2,500
４
7,000
３
5,500
３
6,500
２
5,000
２
16,000
１
9,720
０
０
０
０
０
０
０
０
０

© The Ito Foundation

ご

挨

拶

当伊藤記念財団は，伊藤ハム株式会社の創業者故伊藤傳三による巻頭の「設立趣意書」に掲げた趣意をもって，昭和56年７月３日に農林水産大臣から設立を許可されました財団法人であり，事業の内容は，「事業のあらまし」にあるとおりであります。
おかげ様で当財団は去る７月３日をもちまして，創立30周年を迎えましたが，この間，次第に研究調査助成事業の存在が畜産関係の方々の間に浸透いたし，事業内容も逐次充実して参りつつあります。
これは，ひとえに関係各位のご指導ご鞭撻の賜と深く感謝申し上げるとともに，今後とも，
食肉加工等の基礎的研究の充実を希う創設者の意志にそって，益々食肉産業ひいては畜産業の振興及び国民食生活の安定のために役立つべく，更に努力を重ねて参りたいと存じております。
本書は，第29回（平成22年度）助成事業における11件の研究調査助成対象研究者の皆様からいただいた研究成果報告をとりまとめたものでありますが，以上の目的にしたがって，食肉産業の基礎的研究等に携わる諸氏の研究の一助ともなれば幸甚でございます。
平成23年11月

理事長

伊

藤

功

一

Dear Sir：
I am very pleased to send you and your organization a complimentary copy of theresearch reports of the Ito Foundation. This research foundation was founded by the late
Mr.Denzo Ito to advance research in meat science. The research reports are publishedannually. Unfortunately, the articles are largely in Japanease ; however, in the future wehope to contribute to the international development of meat science. Any constructive
suggestions or critiques from others involved in meat-related research would be accepted
gratefully.
You will find out philosophy behind the establishment of The Ito Foundation describedby Mr.Denzo Ito, in the research report of The Ito Foundation, Vol.29 enclosed here. We
appreciate any interest you may have in our research efforts.
It is my great pleasure to publish this report as the chief director.
Sincerely yours,
Nov. 2011
Koichi Ito
The chief director
The Ito Foundation© The Ito Foundation

i

目

次

抗肥満／食欲増進作用を有する新規食肉由来機能性成分に関する研究
長谷川

信・本田



和久・上曽山博（神戸大学大学院農学研究科）

1

食肉による精神機能改善に関する研究
長澤


麻央・古瀬

充宏

（九州大学大学院農学研究院）

7

食肉由来 ACE 阻害ペプチドの筋肥大作用とその機構
池内

義秀・朱

暁琳・辰巳



隆一・水野谷航（九州大学大学院農学研究院）

14

食肉由来機能性成分クレアチンによる脳機能の維持・改善に関する研究鬼澤

直樹１・豊田裕子２・豊田淳１，２，３（１茨城県畜産センター，２茨城大学農学部，３東京農工大連合農学研究科）

19

肝臓抽出物および食品成分の併用が脂質吸収に及ぼす影響
矢澤


一良・小山

智之

（東京海洋大学大学院）

23

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についてⅡ
久保田

大樹・河原



聡・六車

三治男

（宮崎大学農学部）29

秀丈（広島国際大学薬学部）

40

細菌性新規プロテアーゼの食肉加工への応用小林

低温乳酸発酵による食肉の組織構造とタンパク質化学的変化に関する研究
芳賀


聖一・林

利哉

（名城大学農学部）

46

伝統的魚肉加工手法の食肉加工への応用 ⑵
漆間

創・岩田



淑子・宇多川隆（福井県立大学生物資源学部）© The Ito Foundation

52

ii
試食パネルによる黒毛和種牛肉の肉質等級，脂肪酸組成と食味性との関連に関する研究
鈴木


啓一・横田

祥子・＊飯田文子（東北大学大学院農学研究科，＊日本女子大学）

60

放牧など粗飼料 100％で生産された赤身牛肉におけるドライエージングの効果
折目


愛・小笠原
＊

英毅・＊岡山和代（北里大学獣医学部附属フィールドサイエンスセンター八雲牧場， 北里大学保健衛生専門学院管理栄養科）© The Ito Foundation

68

iii

CONTENTS
Study on the Antiobese/Orexigenic Factor in Meat
Shin Hasegawa, Kazuhisa Honda, and Hiroshi Kamisoyama（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

1

Studies on the improvement of mental function by edible meat
Mao Nagasawa and Mitsuhiro Furuse（Faculty of Agriculture, Kyushu University）

7

Skeletal Muscle Hypertrophic Effect of Meat-derived ACE Inhibitory
Peptides and Its Mechanism
Yoshihide Ikeuchi, Xiao-Lin Zhu, Ryuichi Tatsumi, Wataru Mizunoya（Department of Bioscience and Biotechnology Graduate School of Agriculture, Kyushu University）

14

The study of maintenance and improvement for brain function with creatine
Naoki Onizawa １, Hiroko Toyoda ２ and Atsushi Toyoda １，２，３（１Ibaraki prefectural livestock research center, ２College of Agriculture, Ibaraki University,
United Graduate School of Agricultural Science, Tokyo University of Agriculture and Technology）


３

19

Effects of liver-extract with/without combined intake of other food ingredients on lipid
absorption in mice
Kazunaga Yazawa and Tomoyuki Koyama（Tokyo University of Marine Science and Technology）

23

Functional Components Sourced from Bovine, Porcine and Poultry：
Comparative Study on Bioactive Peptides. Ⅱ
Daiki Kubota, Satoshi Kawahara and Michio Muguruma（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

29

Application of a novel bacterial protease to meat processing
Hidetomo Kobayashi（Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hiroshima International University）

40

Changes in tissue structure and chemical properties of proteins in meat during fermentation
using psychrotrophic lactic acid bacteria
Seiichi Haga and Toshiya Hayashi（Faculty of Agriculture , Meijo University）

46

Application of Traditional Fish Processing Techniques to Meat Processing ⑵Hajime Uruma, Toshiko Iwata and Takashi Utagawa（Department of Biosicence, Fukui Prefectural University）
© The Ito Foundation

52

iv
Study on the relationship between meat grades, fatty acid composition and eating quality ofJapanese black beef meat by taste panel
Keiichi Suzuki, Shoko Yokota and ＊ Fumiko Iida
（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University ＊ Japan Women’s University）

60

The effect of dry-aging in the complete grass-fed beef
Ai Orime, Hideki Ogasawara，＊ Kazuyo Okayama（Yakumo Experimental Farm Field Science Center Kitasato University，＊ Department of Applied
Clinical Dietetics Kitasato Junior College of Health and Hygienic Sciences）

© The Ito Foundation68

1

抗肥満／食欲増進作用を有する新規食肉由来機能性成分に関する研究

抗肥満／食欲増進作用を有する新規食肉由来機能性成分に関する研究
Study on the Antiobese/Orexigenic Factor in Meat

長 谷 川

信・本

田

和

久・上 曽 山博

（神戸大学大学院農学研究科）

Shin Hasegawa, Kazuhisa Honda, and Hiroshi Kamisoyama（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

In the present study, we developed the in vitro assay system for measuring the effect of（ ＋ ）-fraction, beef extract-cation exchanger binding fraction, on the expression of fatty acidoxidation-related genes in order to identify the antiobese/orexigenic factor in beef extract andidentified a candidate of antiobese factor. Addition of（＋）-fraction in the medium of Fao cells
significantly increased the mRNA levels of carnitine palmitoyltransferase 1A（CPT1A）, long
chain acyl-CoA dehydrogenase（LCAD）, and their transcription factor peroxisome proliferatoractivated receptor α（PPAR α）after 6h of addition. However, the mRNA level of PPAR was
not affected after 24h of the addition of（＋）-fraction. These results suggest that the effect of（＋）-fraction on the expression of fatty acid oxidation-related genes should be measured after
6h of addition. The effects of（＋）-fraction on the mRNA levels of CPT1A and PPAR were
found at 0.8 mg/ml of（＋）-fraction whereas the effect of（＋）-fraction on LCAD mRNA wasfound at 3.2 mg/ml. A HPLC fraction of（＋）-fraction significantly increased the mRNA levels
of LCAD and PPARα. LC/MS analysis showed that the molecular weight of the main
component in the HPLC fraction is 129. These results suggest that this component might be
one of the antiobese factor in beef extract.

１．目

頼性に大きな幅がある。

的

牛肉エキスの給与は，その機構については不明

肥満，特に内臓脂肪の過剰蓄積，の解消がメタな点が多いものの，ラットの内臓脂肪蓄積を抑制

ボ対策に直結することは周知の事実である 。しすることが報告されている２）。ここで，我々は，かしながら，これ迄に肥満改善のための数多くの化学合成品に依存することなく広く天然素材から医薬品が開発されているものの，そのほとんどが抗肥満因子を検索する過程で，ラットにおいて，化学合成薬剤であり，副作用や残留の危険性が高

脱脂牛肉のエタノール抽出画分の陽イオン交換カ

い。また，肥満予防を標榜する多くの特定保健用

ラム細分画画分［（＋）-fraction］の給与が内臓脂

食品や健康食品のほとんどが，脂肪の腸管からの肪蓄積を抑制すること，および，この脂肪蓄積抑吸収阻害に基づくものであることから，同時に栄制作用は脂肪酸酸化の促進に基づくものであるこ

養上重要な種々の脂溶性物質の吸収も阻害されるとを示唆した３）。しかしながら，経口投与による可能性が高く，しかも健康食品に至ってはその信in vivo実験を基に，牛肉に含まれる抗肥満因子の１）© The Ito Foundation

2

食肉に関する助成研究調査成果報告書
Table１ Primer sequences for real-time PCR analysis

Primer sequences

Gene
CPT1A
LCAD
PPAR-αβ-actin

GenBank Accession number

sense

5'-CAT TAC AAG GAC ATG GGC AAG TT-3'

antisense

5'-CGG AAG AGC CGG GTC AT-3'

sense

5'-TTG CAA ATT ACG GCA CAA AAG A-3'

antisense

5'-TGC CCG CCG TCA TCT G-3'

sense

5'-GCA GAG GTC CGA TTC TTC CA-3'

antisense

5'-TGG GAT AGC CTT GGC AAA TT-3'

sense

5'-TCC TCC TGA GCG CAA GTA CTC-3'

antisense

5'-GTG GAC AGT GAG GCC AGG AT-3'

NM031559
J05029NM_013196
NM_031144

分離・精製を進めるにはその都度大量の各画分がHepGII細胞においてはその効果が認められない

必要となり大きな困難が伴なうことから，効率的ことが報告されている５）。それ故，本研究では，にスクリーニングするべく培養肝細胞を用いた脂脂肪酸酸化を指標とするin vitro評価系の構築に

肪酸酸化を指標とするin vitro評価系を開発する

Fao細胞を用いた。

必要があると考えられる。既に，我々は，（＋）

まず，Fao細胞を10％FBS，ペニシリン10,000-fractionのゲル濾過ピーク画分が，鶏においては単位／ml，ストレプトマイシン10,000μg/ml含有

抗肥満に加えて食欲増進能をも有することを見出

Ｆ-12培地にて37℃・５％CO２ 下で培養し，コンしている（data not shown）ことから，牛肉中にフルエントに達した後，終濃度3.2mg/mlになる

は，鶏の食欲を増進し，且つ，肥満を抑制する因よう，既報 ３）と同様に調製した（＋）-fractionを子が含まれる可能性が極めて高い。

培養液に添加し，６時間或いは24時間培養後に総そこで，本研究では，食肉中の抗肥満／食欲増

RNAを抽出した。総RNAの抽出はセパゾール

進因子を特定するための一環として，先ず，抗肥RNA Iを用いて行なった。cDNAの調製はDNase

満因子をより効率的に分離・精製するべく，培養

IおよびcDNA Reverse Transcription Kitを用い肝細胞を用いたin vitro評価系の構築を行う。次て行なった。リアルタイムPCR解析は，7300Realに，この評価系を用いて，（＋）-fractionのゲル濾

Time PCR System ，SYBR Premix Ex Taq ，お過ピーク画分に含まれる抗肥満因子を特定する。

よび Table１に示したプライマーを用いて脂肪酸

２．方
2.1

酸化の律速酵素およびその転写因子８）［カルニチ法ンパルミトイル転移酵素１Ａ（CPT1A），長鎖ア

抗肥満因子精製のための，培養肝細胞をシル- CoAデヒドロゲナーゼ（LCAD），および，

用いた脂肪酸酸化を指標とするin vitro評価系

ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α（PPARの改良α）］のmRNA量を調べた。次に，Fao細胞を同ラット肝細胞株であるFao細胞は，コレステ様の条件下でコンフルエントまで培養し，終濃度

ロール代謝調節の研究によく用いられるヒト肝細0.2，0.8或いは3.2mg/mlになるよう（＋）-fraction胞株であるHepGIIよりも，PPARαのアゴニスト

を培養液に添加した後，さらに６時間培養後のに対する感受性が高いことから，肝臓における脂CPT1A，LCADおよびPPARαのmRNA量を調。

べた。

例えば，食品由来のPPARαアゴニストである13-

2.2

ヒ ド ロ キ シ -9 ，11- オ ク タ デ カ ジ エ ン 酸 は ，（＋）-fractionのゲル濾過ピーク画分を，逆相カ

CPT1A の mRNA 量 を 有 意 に 増 加 さ せ る が ，ラムを用いたHPLCによってさらに分画し，2.1で肪酸酸化調節機構の研究に用いられている

４～７）© The Ito Foundation

抗肥満因子の分離・同定

3

抗肥満／食欲増進作用を有する新規食肉由来機能性成分に関する研究(+)-fraction

Control

1.5

1.5

CPT1A/β-actin

1.0

*

0.5

LCAD/β-actin

*

*

*

1.0

0.5

0

0
Time (h)Time (h)PPARα/β-actin

1.5

*

1.0

0.5

0

6

24
Time (h)Fig. 1 Effects of（＋）-fraction on the mRNA levels of CPT1A, LCAD，and PPARα after 6h and 24h incubationof Fao cells．＊，Ｐ＜0.05

改良されたin vitro評価系を用いた脂肪酸酸化律

時間後には有意に低下してしまうことを報告して速遺伝子mRNA量の測定を基に，抗肥満因子をいることから，PPARαのアゴニスト添加後の培含む画分を分離・精製した。そして，得られた画

養時間の延長によって，脂肪酸酸化関連遺伝子分について，LC-MSを用いて分子量を特定した。

の発現促進効果は低下することが示唆されてい2.3-fractionの添加が，Fao細胞る ９）。それ故，（＋）

統計処理得られた結果についてはStudent t-testによっにおけるCPT1A，LCADおよびPPARαのmRNA量に及ぼす影響を調べるためには，（＋）-fractionて行なった。

の添加６時間後が望ましいと考えられた。

３．結果と考察

Fao細胞の培養液への（＋）-fractionのゲル濾過

Fao細胞の培養液への（＋）-fractionのゲル濾過

ピ ー ク 画 分 の 添 加 は ，CPT1A ，LCAD お よ び

ピ ー ク 画 分 の 添 加 は ，添 加 ６ 時 間 後 に はPPAR α の mRNA 量 を 有 意 に 増 加 さ せ た が ，

CPT1A，LCADおよびPPARαのmRNA量を有

CPT1AおよびPPARαに対する効果は0.8mg/ml

意に増加させたが，添加24時間後には，CPT1A

以上の濃度で認められるのに対して，LCADに対およびLCADのmRNA量を有意に増加させたもする効果は3.2mg/mlで初めて認められることがのの，PPARαのmRNA量には影響を及ぼさな

明らかになった（Fig.２）。これらの結果から，かった（Fig.１）。Moya-Camarenaらは，強力なCPT1AおよびPPARαのmRNA量を指標とすれ

PPARアゴニストであるWY-14643は，Fao細胞のば，より低濃度で，（＋）-fractionの肝細胞にお培養液への添加６時間後にはシトクロムP450A１

ける脂肪酸酸化促進効果を評価できることが示唆のmRNA量を有意に増加させるが，その値は24された。Choiらは，ニホンカボチャ水溶性エキス© The Ito Foundation

4

食肉に関する助成研究調査成果報告書

*

100

50

(% of control)

PPARα/β-actin

*

100

50

0

0

150

150

LCAD/β-actin*(% of control)

CPT1A/β-actin(% of control)

150

*

*

100

0 mg/ml
0.2 mg/ml
0.8 mg/ml
3.2 mg/ml

500Fig. 2 Effects of（＋）-fraction on the mRNA levels of CPT1A, LCAD，and PPARα in Fao cells．＊，Ｐ＜0.05の培養肝細胞におけるβ酸化促進効果におけるさせたものの，CPT1AのmRNA量には影響を及

E.C.50値は0.23mg/mlであると報告している 。そぼさなかった。このような，PPARαの標的遺伝

れ故，（＋）-fractionのβ酸化促進効果は，ニホン子の発現変動が必ずしも連動しないという結果

カボチャ水溶性エキスのそれに相当する可能性もは，in vivoおよびin vitroの両条件下において報あると判断された。

告されている。例えば，48時間絶食させたラット（＋）-fractionのゲル濾過ピーク画分を，逆相カの肝臓において，PPARαのmRNA量は有意に増ラムクロマトグラフィーを用いて細分画した画分加するがACOのmRNA量は変化しないこと 11），の培養液への添加が，培養肝細胞のCPT1A，フェノフィブラートを給与されたラットの肝臓に

LCADおよびPPARαのmRNA量に及ぼす影響に

お い て ，ACO の mRNA 量 は 有 意 に 増 加 す る がついて調べた結果，ゲル濾過カラムクロマトグラ

CPT1AのmRNA量は変化しないこと12），および，

フィーの10分～11分溶出画分を逆相カラムクロマ

Fao細胞において，リノール酸によりPPARαのトグラフィーを用いてさらに分画して得られた標的遺伝子であるシトクロムP450A１，ACOお3.8分～4.2分溶出画分が，LCADおよびPPARαの

よびCPT1AのmRNA量は有意に増加するが，mRNA 量 を 有 意 に 増 加 さ せ る こ と が 明 ら か に

PPARαのmRNA量は変化しないこと６）が報告さなった（Fig.３）。また，LC/MSを用いて解析しれている。これらのことから，PPARαの標的遺た結果，その画分の主要な物質の分子量は129で伝子の発現は，PPARαによって上向き調節されあることが明らかになった。

るものの，その他の種々の条件によっても影響を10）

本研究において，（＋）-fractionはFao細胞にお受けると考えられた。

いてPPARαの標的遺伝子であるCPT1A，LCAD

今回，我々は牛肉に含まれる抗肥満因子の候補物

およびPPARαの総てのmRNA量を増加させた質を同定した。また，既に，我々は（＋）-fractionのが，その分画画分である分子量129の物質を含む

ゲル濾過カラムクロマトグラフィーの分画画分

画分は，LCADおよびPPARαのmRNA量を増加

が，鶏においては食欲増進能を有することを見出© The Ito Foundation

抗肥満／食欲増進作用を有する新規食肉由来機能性成分に関する研究
1.5

LCAD/β-actin

CPT1A/β-actin

1.5

1.0

0.5

1.5

PPARα/β-actin

1.0

*

*

*

0.5

0

0

*
1.0

5

*
*
0 mg/ml
0.2 mg/ml
0.8 mg/ml
3.2 mg/ml

0.5

0Fig. 3 E
 ffects of the HPLC fraction of（＋）-fraction on the mRNA levels of CPT1A, LCAD, and PPARa in Fao cells．

＊，Ｐ＜0.05

している（data not shown）。それ故，今後は，た。また，Fao細胞の培養液への（＋）-fractionの今回同定された抗肥満因子の抗肥満および食欲増

添 加 は ， CPT1A ， LCAD お よ び PPAR α の進の両作用をin vivo条件下で確認する必要があmRNA量を有意に増加させたが，CPT1Aおよび

ると考えられた。

PPARαに対する効果は0.8mg/ml以上の濃度で４．要

認 め ら れ た も の の ，LCAD に 対 す る 効 果 は ，

約0.8mg/mlでは認められず，3.2mg/mlで初めて認本研究では，牛肉中の抗肥満／食欲増進因子をめられることが明らかになった。さらに，我々は，特定する目的で，牛肉のエタノール抽出画分の陽（＋）-fractionのゲル濾過ピーク画分を，さらに逆イオン交換樹脂吸着画分［（＋）-fraction］のゲル

相カラムクロマトグラフィーを用いて細分画した

濾過ピーク画分が，脂肪酸酸化関連遺伝子の発現画分から，LCADおよびPPARαのmRNA量を有に及ぼす影響を明らかにするための，培養肝細胞

意に増加させる画分を見出し，LC/MSを用いて，を用いたin vitro評価系を構築し，抗肥満因子のその画分の主要な物質の分子量は129であること

候補物質を同定した。その結果，Fao細胞の培養を示した。これらの結果から，この成分が，牛肉液への（＋）-fractionの添加は，添加６時間後にに含まれる抗肥満因子の一つである可能性が示唆

はCPT1A，LCADおよびPPARαのmRNA量をされた。今後は，本実験において同定された因子

有 意 に 増 加 さ せ た が ，添 加 24 時 間 後 に は ，の抗肥満および食欲増進の両作用をin vivo条件下

CPT1AおよびLCADのmRNA量を有意に増加さで確認する必要があると考えられた。

せたものの，PPARαのmRNA量には影響を及ぼさなかった。それ故，（＋）-fractionの添加が，Fao細胞におけるCPT1A，LCADおよびPPARαのmRNA量に及ぼす影響を調べるためには，（＋）-fractionの添加６時間後が望ましいと考えられ

文 献１）
 Despres JP, Lemieux I : Nature，444，881～887，
2006．
２）
 Yoshihara H, Wakamatsu J, Kawabata F, Mori S,
Haruno A, Hayashi T, Sekiguchi T, Mizunoya W,© The Ito Foundation

6

食肉に関する助成研究調査成果報告書

Tatsumi R, Ito T, Ikeuchi Y : J Nutr Sci Vitaminol，
52，183～193，2006．
３） 上曽山博，本田和久，元木徹，長谷川信：平成19年度食肉に関する助成研究調査成果報告書 ，26，11～14，2008．
４） Ammerschlaeger M, Beigel J, Klein KU, Mueller
SO, Toxicol Sci：78，229～240，2004．
５） Kim JH, Yamaguchi K, Lee SH, Tithof PK, Sayler
GS, Yoon JH, Baek SJ, Toxicol Sci：85，585～593，
2005．
６） König B, Koch A, Giggel K, Dordschbal B, Eder K,
Stangl GI : Biochim Biophys Acta ， 1780 ， 899 ～
904，2008．
７） Landrier JF, Thomas C, Grober J, Duez H,
Percevault F, Souidi M, Linard C, Staels B, Besnard
P : J Biol Chem，279，45512～45518，2004．

８）
 Mandard S, Müller M, Kersten S : Cell Mol Life
Sci，61，393～416，2004．
９）
 Moya-Camarena SY, Vanden Heuvel JP,
Blanchard SG, Leesnitzer LA, Belury MA : J Lipid
Res，40，1426～1433，1999．
10）
 Choi H, Eo H, Park K, Jin M, Park EJ, Kim SH,
Park JE, Kim S : Biochem Biophys Res Commun ，359，419～425，2007．
11）
 Sterchele PF, Sun H, Peterson RE, Vanden
Heuvel JP : Arch Biochem Biophys ， 326 ， 281 ～
289，1996．
12）
 Ferreira AV, Parreira GG, Porto LC, Mario EG,
Delpuerto HL, Martins AS, Botion LM : Life Sci ，82，876～883，2008．

© The Ito Foundation

7

食肉による精神機能改善に関する研究

食肉による精神機能改善に関する研究

Studies on the improvement of mental function by edible meat

長

澤

麻

央・古

瀬

充

宏

（九州大学大学院農学研究院）

Mao Nagasawa and Mitsuhiro Furuse（Faculty of Agriculture, Kyushu University）

Several studies have shown a relationship between depression and animal protein intake.
To evaluate whether animal protein intake has an antidepressant-like effect and potentiates
acute antidepressant effects, three levels of dietary chicken protein were used as therepresentative animal protein with imipramine used as the antidepressant. In addition, theeffects of dietary chicken protein on brain metabolism were evaluated. After a 4-week feeding
trial, a forced swimming test (FST) was conducted. FST was not influenced by both imipramineand dietary protein levels. However, characteristic effects of imipramine treatment on brain
monoamine metabolism were observed in the cerebral cortex and hypothalamus. In addition,
dietary protein significantly increased taurine and L-ornithine levels even though these aminoacids were not contained in the diets．
In conclusion, the metabolism of several amino acids in the plasma and brain were alteredby dietary chicken protein．

１．目

定されている（2005年版日本人の食事摂取基準）。

的

肉食が敬遠される大きな理由の一つは脂肪含量の心の病の発症は現代社会において著しく、その高さにあり，肉食本来の利点であるアミノ酸バラ

増加は食生活環境と関連づけられて考察されるこンスの良さが覆い隠される結果となっている。まとがある。たとえば、自殺願望ならびに実際に自た，食による健康志向の中心は体躯にあり，脳の殺を試みた若者の割合は，ベジタリアンで高いこ

健康にはあまり関心が払われないのが実情である。

とが報告されている１）。また，我が国の自殺者数

食肉に多く含まれるクレアチンは，脳に作用すは毎年３万人を超え，中でも年齢が50代，60代にると鎮静・催眠効果を発現すること２），また，同おいてその傾向は高い。その年代は，社会的責任

じく食肉に多く含まれるジペプチドのカルノシが高まる一方，健康管理上から肉食の軽減が推奨

ンには，抗うつ様効果があることが報告されてされている。しかし，栄養所要量を見る限りタンいる３，４）。これらの有効成分はすべて窒素化合物

パク質の摂取量は高齢者においても依然と高く設であるが，食肉にまず求められるものはそのタン© The Ito Foundation

8

食肉に関する助成研究調査成果報告書
Table１ The composition（g/kg）of experimental diets with different chicken protein levels
Chicken protein level
Low
Chicken protein

Medium

High

100

200

300

Corn starch

500.486

400.486300.486

αCorn starch

132

132

132

Sucrose

100

100

100

Soybean oil

70

70

70

Cellulose powder

50

50

50

Mineral mix

35

35

35

Vitamin mix

10

10

10

Choline hydrogen tartrate

2.5

2.5

2.5

Tert-butylhydroquinone

0.014

0.014

0.014

Amino acid composition（g/kg) of chicken protein: L-aspartate 98, L-threonine 47, L-serine 42, L-glutamate 160, L-proline 36,
glycine 44, L-alanine 59, L-valine 50, L-cysteine 2.4, L-methionine 30, L-isoleucine 48, L-leucine 83, L-tyrosine 36,
L-phenylalanine 41, L-histidine 30, L-lysine 85, L-arginine 64 and L-tryptophan10.9．

パク質のアミノ酸組成の素晴らしさにある。数種とで，シナプス間隙でのモノアミン含量を増加さのアミノ酸に鎮静・催眠効果が認められていせる働きを持つ。鶏肉タンパク質摂取によってモるが，タンパク質を構成するアミノ酸の集合体とノアミンの一つであるNEの代謝が遅れることとしての効果の検証は未だになされていなかった。

抗うつ薬の働きの関係が明らかになれば，食肉摂

そこで，前年度の当助成研究において植物タンパ

取がうつ病に対して貢献できる可能性があると考ク質の代表である大豆タンパク質と畜肉タンパク

えた。本研究では，食餌鶏肉タンパク質の水準を質である鶏肉，豚肉および牛肉タンパク質の脳機低（10％），適（20％）ならびに高（30％）の３

能への影響をモノアミン代謝に着目して比較し水準とし，抗うつ薬であるイミプラミン投与の有た 。その結果，鶏肉タンパク質摂取により各脳無によって行動ならびに脳のモノアミンとアミノ部位のノルエピネフリン（NE）の代謝回転が遅く酸代謝がどのように影響を受けるかについて明らなることが判明した。また，牛肉タンパク質では，かにすることを目的とした。

５～10）

11）

海馬と大脳皮質のNEの代謝回転が高く保たれ，視床下部ではセロトニン（５-HT）代謝回転が唯

２．方

法

一高かった。畜肉タンパク質３品の加水分解によ

３週齢のオスICRマウス（Japan SLC）を，23

るアミノ酸組成に大きな違いがなかったことか±１℃，12Ｌ：12Ｄ環境下で１ケージ当たり２頭

ら，脳のモノアミン代謝は摂取するタンパク質の飼育した。自由摂取（オリエンタル酵母MF），

アミノ酸組成のみでは説明できないことが明らか

自由飲水下で１週間馴化した。
実験飼料は，AIN93Mを基準とし，タンパク質となった。
本年度は，鶏肉タンパク質でNEの代謝回転が源としてカゼインに代わり，鶏肉タンパク質を遅れることに着目した。抗うつ薬の多くはシナプ

10，20および30％配合した。鶏肉タンパク質は脱スにおけるモノアミンの再取り込みを抑制するこ

脂したものを使用した。飼料組成と鶏肉タンパク© The Ito Foundation9

食肉による精神機能改善に関する研究

Table２ Effects of dietary chicken protein levels and acute imipramine treatment on monoamine concentrations of thecerebral cortex and hypothalamus in mice
Chicken proteinlevel

Low（10％）Medium（20％）

High（30％）

Imipramine（mg/10ml/
kg）

0

30

0

30

0

5-HIAA

163±5

146±4

161±10147±6

DOPAC/DA

0.44±0.06

0.39±0.04

0.44±0.05

HVA/DA

0.34±0.03

0.31±0.03

0.35±0.03

5-HIAA／
5-HT

1.06±0.06

0.83±0.07

0.98±0.05

Ｐ

30

Food

Imipramine

Food×
Imipramine

162±7

157±7

NS

ｐ＜0.05NS

0.43±0.04

0.48±0.06

0.32±0.03

NS

ｐ＜0.05NS

0.33±0.03

0.47±0.06

0.29±0.01

NS

ｐ＜0.01NS

0.86±0.05

1.07±0.07

0.85±0.06

NS

ｐ＜0.0005

NS

Cerebral cortex

Hypothalamus
5-HIAA

675±27479±37711±65628±93687±50634±80NS

ｐ＜0.05NS

5-HT

195±17244±28215±24252±16232±26257±17NS

ｐ＜0.05NS

5-HIAA／
5-HT

3.36±0.4

2.11±0.3

3.13±0.45

2.53±0.47

2.91±0.44

2.43±0.34

NS

ｐ＜0.05NS

The number of samples used for analysis was 12. The values for5-HIAA and5-HT are expressed as mean ± S.E.M. in pg/mg wet
tissue, and the values for DOPAC/DA, HVA/DA and5-HIAA/5-HT are expressed as mean±S.E.M. NS: Not significant．

質のアミノ酸組成をTable１に示す。これらの飼離アミノ酸濃度は，Pico -Tagアミノ酸分析装置を料を用いて28日間の飼養試験を実施した。

用いて測定した。アラニン（Ala），アルギニン

Murakami and Furuse12）の方法にしたがい，（Arg），アスパラギン（Asn），アスパラギン酸

飼養試験27日目にオープンフィールド試験，28日（Asp），グルタミン（Gln），グルタミン酸（Glu），

目に強制水泳試験をすべてのマウスに対して課し

グリシン（Gly），ヒスチジン（His），イソロイシた。強制水泳試験に際して，それぞれの飼料を与ン（Ile），ロイシン（Leu），リジン（Lys），メチ

えたマウスを２群に分けた。１群には対照としてオニン（Met），フェニルアラニン（Phe），プロ

生理的食塩水を，もう１群には抗うつ薬であるイリン（Pro），セリン（Ser），タウリン（Tau），

ミプラミン（30mg/10ml/kg）を強制水泳試験のトレオニン（Thr），トリプトファン（Trp），チ

１時間前に腹腔に投与した。試験終了後，頚椎脱ロシン（Tyr），オルニチン（Orn）ならびにバ臼を行い，全脳を取り出した。その後，大脳皮質リン（Val）を測定した。

と視床下部を切り出し，液体窒素で急速冷凍後にこの実験は「九州大学大学院農学研究院，大学－80℃で保存した。切り出した部位のモノアミン

院生物資源環境科学府及び農学部における動物実（NE，ドーパミン（DA）および５-HT）ならび

験指針」，「動物の愛護及び管理に関する法律」にその代謝産物（３-メトキシ-４-ハイドロキシ（平成11年12月22日一部改正法律第105号），「実験フェニルエチレングリコール（MHPG），ジヒド

動物の飼養及び保管等に関する基準」（平成14年

ロキシフェニル酢酸（DOPAC），ホモバニリン

５月28日一部改正総理府告示第６号）の規則に基酸（HVA）および５-ヒドロキシインドール酢酸

づいて行われた。

（５-HIAA）を高速液体クロマトグラフィーによ得られた結果の解析は，統計解析ソフトであるり測定した。血漿，視床下部および大脳皮質の遊StatViewを用いて行った。二元配置分散分析の© The Ito Foundation

10

食肉に関する助成研究調査成果報告書

Table３ Effects of dietary chicken protein levels and acute imipramine treatment on plasma amino acid concentrations

in mice
Chicken proteinlevel

Low（10％）Medium（20％）

High（30％）

Imipramine(mg/10ml/kg）

0

30

0

30

0

30

Food

Imipramine

Food×
Imipramine

L-Aspartate

17.1±2.925.1±8.0

16.1±1.915.0±2.752.5±10.4

23.5±1.6＊

ｐ＜0.005NSbｐ＜0.05

L-Serine

74.6±1454.6±7.0

58.1±8.740.5±6.987.7±14.545.8±6.5

NS

ｐ＜0.005

NS

L-Asparagine

23.5±4.6

14.7±2.2

18.2±3.4

12.7±2.1

29.0±5.2

15.3±1.9

NS

ｐ＜0.005

NSＰ

Glycine

85±13

57±9

96±13

62±10

134±2081±7

ｐ＜0.05ｐ＜0.001NS

L-Glutamine

386±68375±43349±52210±36358±54235±30NS

ｐ＜0.05NS

Taurine353±76327±53412±57265±42578±139506±53ｐ＜0.05NS

NS

L-Threonine

117±2578±1099.3±1168.6±15129±2476±15NS

ｐ＜0.01NS

L-Alanine

307±53265±28257±30156±24321±55195±27NS

ｐ＜0.01

NS

L-Arginine

101±20

52±7

48±5

18±6

166±5844±12NS

ｐ＜0.05NS

L-Proline

78.1±1460±8.370.7±1042.2±8.2

105±2049.1±8.6

NS

ｐ＜0.005NS

L-Tyrosine

53.6±11.3

33.4±642.5±7.832.2±8.476.1±15.633.3±6.2

NS

ｐ＜0.005

NS

L-Valine

156±25133±16161±19120±22258±48163±23ｐ＜0.05ｐ＜0.05NS

L-Methionine

39.8±725.8±3.342.5±4.4

32.0±6.2

70.5±16.3

37.5±6.4

ｐ＜0.05ｐ＜0.01NS

L-Isoleucine

54.3±9.7

40.0±6.1

57.0±7.3

39.9±8103±2257.3±8.8

ｐ＜0.01ｐ＜0.01NS

L-Leucine

93±14

76±11

95±11

67±12

179±3492±12Ｐ＜0.005ｐ＜0.005

NS

L-Phenylalanine

47.5±830.5±3.853.3±6.5

35.5±7.2

75.6±13.5

46.5±5.7

ｐ＜0.05ｐ＜0.005

NS

L-Tryptophan

16.0±3.4

12.4±1.6

19.9±2.813.1±3.1

31.4±7.0

15.9±3.0NS

ｐ＜0.05NS

L-Ornithine

22.3±4.1

16.2±2.2

18.8±2.913.5±2.6

41.1±8.819.4±2.5

ｐ＜0.05ｐ＜0.01NS

L-Lysine

148±29100±15136±1584±18242±50111±18ｐ＜0.05ｐ＜0.005

NS

The number of samples for analysis was 12. All results are expressed mean ± S.E.M. in μ mol/l plasma ． ＊ Significantly different at
p<0.05 compared to each the saline group．

NS: Not significant．

後に，Tukey-Kramer法により多重検定を行った。

濃度の有意な低下と５-HT濃度の有意な上昇が確認され，その結果５-HIAA/５-HTの比がイミプ

３．結果と考察

ラミンにより有意に減少した。鶏肉タンパク質水

成長（体重増加量），飼料摂取量，オープン

準によるモノアミン代謝への影響は，本実験の設フィールド試験ならびに強制水泳試験に，イミプ

定において指標と考えたNEの代謝変化も含め両

ラミンと鶏肉タンパク質水準の有意な効果は認め

脳部位において観察されなかった。強制水泳試験られなかった（データ未掲載）。

におけるマウスの不動時間の短縮を抗うつ様効果

Table２に大脳皮質と視床下部において有意なの指標として取り上げた13，14）が，イミプラミンの効果が検証されたモノアミンならびに代謝回転の効果は検出できなかった。一方，脳内において，結果を示す。大脳皮質においては，５-HIAA濃度とイミプラミン投与によって５-HIAA/５-HTの比DOPAC/DA, HVA/DAならびに５-HIAA/５-HTが有意に減少したことから，イミプラミン本来のの比がイミプラミンにより有意に減少した。ま

薬理作用は確認された。また，ベジタリアンでうた，視床下部では，イミプラミンにより５-HIAA

つ病の罹患率が高いこと15，16）から，鶏肉タンパク© The Ito Foundation11

食肉による精神機能改善に関する研究

Table４ Effects of dietary chicken protein levels and acute imipramine treatment on amino acid concentrations of thecerebral cortex in mice
Chicken proteinlevel

Low（10％）Medium（20％）

High（30％）

Imipramine(mg/10ml/kg）

0

30

0

30

0

30

Food

Imipramine

Food×
Imipramine

L-Aspartate2784±182

2483±233

2576±169

2124±1072898±201

2838±116ｐ＜0.05NSb

NS

L-Glutamate

9438±689

6926±712

9143±552

6942±412

9447±659

8954±309NS

ｐ＜0.001

NS

L-Serine

933±70825±64862±58687±38945±74907±35ｐ＜0.05ｐ＜0.05NSＰ

L-Asparagine

97.9±6.2

76.4±7.2

94.2±6.3

71.7±4.9

96.7±6.2

92.9±5.3

NS

ｐ＜0.005

NS

Taurine7555±505

6714±607

7328±456

6896±462

8105±530

8471±361

ｐ＜0.05NS

NS

L-Histidine

55.7±4.143.9±4.550.8±5.8

41.6±3.751.2±3.747.8±2.9NS

ｐ＜0.05NS

L-Threonine

365±30291±17369±18307±22343±25354±14NS

ｐ＜0.05NS

L-Alanine804±62680±65789±42598±48811±64753±28NS

ｐ＜0.01

NS

L-Arginine

124±1093±8

104±11

87±5

118±8

107±9

NS

ｐ＜0.01NS

L-Proline

66.0±5.2

54.7±5.2

62.9±5.2

49.7±2.768.5±4.1

64.0±4NS

ｐ＜0.05NS

L-Tyrosine

70.4±5.6

58.1±8.3

67.7±6.556.2±7.3

62.9±5.2

65±6.4NS

ｐ＜0.05NS

L-Valine

93.1±8.074.2±9.0

94.8±6.475.3±6.1

99.4±6.590.2±6.2

NS

ｐ＜0.01NS

L-Isoleucine

32.8±529.0±1.533.7±2.3

30.2±1.940.2±439.0±2.6

ｐ＜0.05NS

NS

L-Leucine

88.7±674.4±6.7

78.3±5.970.5±4.3

96.0±5.790.1±5.8

ｐ＜0.01NS

NS

L-Phenylalanine

45.9±2.736.5±2.944.5±4.1

38±2.747.9±2.942.8±3.3

NS

ｐ＜0.01NS

L-Tryptophan

12.7±1.2

11.8±0.8

15±1.611.6±1.1

11.9±1.6

15.1±1.1

NSNS

ｐ＜0.05

L-Lysine

197±17152±14206±15153±11220±17183±9NS

ｐ＜0.0005

NS

The number of samples for analysis was 12. All results are expressed mean±S.E.M. inμmol/g wet tissue．

NS: Not significant．

質の摂取量の増加に伴い行動変化が起こることを

両アミノ酸がGlyに代謝されたことが示唆され想定したが，不動時間に有意な変化は認められなた。Proに関しても血漿濃度に変化は認められず，かった。

GluあるいはOrnへの代謝が考えられた。鶏肉タ

血漿遊離アミノ酸濃度において有意な効果が検

ンパク質によりGluに関しては濃度変化がなかっ出されたアミノ酸をTable３に示す。AspとTauをたが，Ornの増加が確認された。OrnはArgから除き，血漿遊離アミノ酸濃度はイミプラミンによも代謝されるため，Orn含量の増加は，Argならり低下した。飼料鶏肉タンパク質の増加に伴い，血びにProが代謝基質として貢献したものと推察さ漿遊離Asp，Gly，Tau，Val，Met，Ile，Leu，れた。

Phe，OrnならびにLys濃度は高まった。Aspにの視床下部の遊離アミノ酸濃度にイミプラミンなみ交互作用が確認され，高鶏肉タンパク質飼料でらびに鶏肉タンパク質水準の影響は認められな高まったAsp濃度をイミプラミンが低下させる結かった。大脳皮質の遊離アミノ酸濃度において有果となった。Ser，Gly，およびThr間には，可逆意な効果が検出されたアミノ酸をTable４に示す。

的な代謝経路が存在していることが知られていAsp，Tau，Ile，LeuならびにTrpを除いて，大る。本研究において，血漿遊離ThrおよびSer濃脳皮質の遊離アミノ酸濃度はイミプラミンにより度に鶏肉タンパク質水準の影響は認められなかっ低下した。Asp，Ser，Tau，IleおよびLeu濃度はたが，Gly濃度が有意に高くなっていることから

鶏肉タンパク質含量の増加に伴い上昇した。Trp© The Ito Foundation

12

食肉に関する助成研究調査成果報告書

濃度に交互作用が認められ，20％鶏肉タンパク質薬であるイミプラミンを腹腔内投与した。FST終水準では対照区で，30％鶏肉タンパク質水準では了後，血漿，大脳皮質および視床下部を採取し，イミプラミン投与区で高い値を示した。

モノアミン含量ならびに遊離アミノ酸含量を測定

大脳皮質における遊離Tau，IleおよびLeu濃度

した。FSTにおいて，イミプラミンと鶏肉タンパの上昇は，血漿濃度の増加を反映したものと考え

ク質抽出物の有意な効果は観察されなかった。しられた。血漿Ser濃度は鶏肉タンパク質水準の影

かし，大脳皮質ならびに視床下部のモノアミン代

響を受けなかったが，大脳皮質では水準に従って謝において，イミプラミンの特徴的な効果が確認増加した。この結果は，血漿で高まったGlyが脳され，イミプラミンが確かに中枢へと作用していに移行後にSerに代謝された結果と思われる。

ることが確認された。一方，鶏肉タンパク質抽出

Tauには抗うつ作用

10）物にタウリンならびにオルニチンは含まれていなには鎮静作用が認められているため，鶏肉タンパ

いにもかかわらず，鶏肉タンパク質抽出物摂取にク質の長期摂取は脳機能にプラスに働く可能性が

よって血漿中のこれらのアミノ酸含量が増加し考えられる。

た。本実験結果より，鶏肉タンパク質抽出物摂取12）が，また，Ser

６）とAsp

鶏肉タンパク質が，血漿ならびに大脳皮質の遊離アミノ酸濃度に及ぼした影響の中で特徴的でが血漿ならびに大脳皮質でのアミノ酸代謝に影響を与える可能性が示唆された。

あったものに，共に鶏肉タンパク質に含まれない
TauとOrnの濃度変化が挙げられる。これらの増加は，それぞれの基質となるシステインやArgの摂取量の増加によるものと考えられた。
一方，イミプラミンは血漿ならびに大脳皮質における多くの遊離アミノ酸濃度を減少させる効果を有することが明らかであった。この結果は以前の報告５）と一致するものであり，抗うつ薬が鎮静ならびに抗うつ様効果を有するアミノ酸の脳内代
謝に大きく関わることが示唆された。
４．要

約

動物性タンパク質が抗うつ様効果を有するか，また，抗うつ薬の効果を増強するか否かを評価した。１週間の馴化後，動物性タンパク質として，
鶏肉タンパク質抽出物を３水準で配合した飼料をICRマウス（４週齢，雄）に４週間給与した。給与期間中の体重と摂食量を測定し，また，給与試
験開始27日目後にオープンフィールド試験を行い，28日目に強制水泳試験（FST）を行った。
FSTの開始前に0.9％生理食塩水あるいは抗うつ

文 献
１）
 Perry CL, Mcguire MT, Neumark-Sztainer D,
Story M. : J. Adolesc. Health，29：406～416．2001．
２）
 Koga Y, Takahashi H, Oikawa D, Tachibana T,
Denbow DM, Furuse M. : Neuroscience，132：65～
71．2005．
３）
 Tomonaga S, Hayakawa T, Yamane H, Maemura
H, Sato M, Takahata Y, Morimatsu F, Furuse M. :Nutr. Neurosci.，10：181～186．2007．
４）
 Tomonaga S, Yamane H, Onitsuka E, Yamada S,
Sato M, Takahata Y, Morimatsu F, Furuse M. :Pharmacol. Biochem. Behav. ， 89 ： 627 ～ 632 ．
2008．
５）
 Murakami T, Yamane H, Tomonaga S, Furuse M.
Eur. : J. Pharmacol.，602：73～77．2009．
６）
 Asechi M, Tomonaga S, Tachibana T, Han L,
Hayamizu K, Denbow DM, Furuse M. : Behav.
Brain Res.，170：71～77．2006．
７）
 Hamasu K, Haraguchi T, Kabuki Y, Adachi N,
Tomonaga S, Sato H, Denbow DM, Furuse M. :Amino Acids，37：377～382．2009．
８）
 Suenaga R, Yamane H, Tomonaga S, Asechi M,
Adachi M, Tssuneyoshi Y, Kurauchi Y, Sato H,
Denbow M, Furuse M. : Amino Acids ， 35 ： 107 ～113．2008．
９）
 Suenaga R, Tomonaga S, Yamane H, Kurauchi I,
Tsuneyoshi Y, Sato H, Denbow DM, Furuse M. :Amino Acids，35：139～146．2008．
10）
 Yamane H, Asechi M, Tsuneyoshi Y, Kurauchi I,
Denbow DM, Furuse M. : Anim. Sci. J.，80：286～© The Ito Foundation食肉による精神機能改善に関する研究
290．2009．
11） 古瀬充宏：平成21年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，28：10～14．2010．
12） Murakami T, Furuse M. : Amino Acids，39：427～434．2010．
13） Cyran JF, Valentino RJ, Lucki I. : Neurosci.
Biobehav. Rev.，29：547～569．2005．
14） Lahmame A, Carmen del Arco, Pazos A, Yritia M,

13

Armario A. : Eur. J. Pharmacol.，337：115～123．
1997．
15）
 Baines S, Powers J, Brown W. : Pub. HealthNutr.，10：436～442．2007．
16）
 Larsson CL, Klock KS, Astrom AN, Haugejorden
O, Johanssorn G.J. : Adolescent Health 31 ， 190 ～
198．2002．

© The Ito Foundation

14

食肉に関する助成研究調査成果報告書

食肉由来ACE阻害ペプチドの筋肥大作用とその機構
Skeletal Muscle Hypertrophic Effect of Meat-derived ACE Inhibitory Peptides and
Its Mechanism

池

内

義

秀・朱

暁

琳・辰

巳

隆

一・水 野 谷航

（九州大学大学院農学研究院）

Yoshihide Ikeuchi, Xiao-Lin Zhu, Ryuichi Tatsumi, Wataru Mizunoya（Department of Bioscience and Biotechnology Graduate School of Agriculture, Kyushu University）

Main aim of this experiment is to investigate whether angiotensin-converting enzyme（ACE）inhibitory dipeptide（Ile-Tyr（IY））that is expected to be useful as antihypertensive
drug has competence to give rise to muscle hypertrophy. Mouse skeletal muscle C2C12
myoblast cells treated with 10～100μM dipeptide（IY）showed an increase in expression levelof myogenin, molecular marker of early differentiation, and a decrease with 500～1000 μ M.
Expression level of myosin heavy chain, molecular maker of late differentiation, showed aconcentration-dependent increase. Addition of IY（10～1000 μ M）to the culture media also
increased the diameter of C2C12 myotubues by up to 35％．The present results demonstrated
that IY has muscle hypertrophic effect similar to that of drug captopril（3-mercapto-2methypropanoy-L-prolin）．

１．目

費の増大という社会問題を引き起こしている１）。

的また，家畜の加齢に伴う筋萎縮による筋肉量の損

骨格筋は，力の発揮という力学的仕事を行うた

失も畜産経済的に問題である。

めに特殊化した器官であると同時に，家畜のそれ

これまで筋萎縮の抑制・改善には薬剤（ホルモはヒトにとっては重要な動物性タンパク質源でもンなど）が有効であると報告されてきたが，多くある。その筋肉は力学的仕事の負荷量や活動量のの場合，他臓器への副作用が観察される。一般に低下により容易に萎縮する。たとえば，長期間の運動を伴わず，食品のみによって筋肥大を誘導す

安静臥床や骨折によるギブス固定，無重力暴露あることは不可能と考えられてきた。しかし，我々るいはラットにおける後肢懸垂は萎縮を引き起こ

は先に食肉（特に牛肉エキス）に未知の筋肉肥大

す（廃用性筋萎縮）。また，老化や神経疾患時に因子が含まれていることを示唆する結果を得た。

も筋の萎縮は認められる（サルコペニア）。このこのことから，食肉摂取による加齢に伴う筋萎縮

ように筋萎縮は筋肉の不使用，負傷，老化あるいの軽減化が期待される２）。最近，アンジオテンシ

はある種の神経筋疾患の結果として生じる筋肉のン変換酵素（ACE）の活性変動が骨格筋の機能崩壊である。特にヒトの加齢に伴う身体能力の低に影響を及ぼすこと，とりわけ薬理的ACE阻害

下は急激な高齢化社会への進行とともに国民医療剤（captoprilなど）が筋芽細胞の分化を促進する© The Ito Foundation

食肉由来ACE阻害ペプチドの筋肥大作用とその機構15ことが報告され，注目されている３）。ACEを阻害た。その後プレートを氷上に置き，冷PBSで２回するペプチドは食肉からも多数同定されているこ洗った。さらに細胞溶解液（0.1％Nonidet P- 40，とから，これらの生理活性ペプチドがACE阻害

50mM Tris （pH7.6），2 5 0 m M N a C l ，5 m M剤と同様に骨格筋肥大作用を有すると予想され

EDTA，2 ％ protease inhibitor cocktail，1

る４）。そこで我々は，食肉由来ACE活性阻害ペプ

phosphatase inhibitor cocktail（Nacalai Tesque））

チドの筋肥大作用とその作用機序について検討すを加え，５分間振とうした。光学顕微鏡で確認しることにした。本研究では，アンジオテンシン変ながら接着した細胞が見えなくなるまでピペット

換酵素（ACE）阻害ペプチドとしてよく知られチップでウェルの底を擦って細胞を無理やり剥が

％

をマウスサ

した。得られた細胞溶解液をチューブに回収した。

テライト細胞に由来する筋芽細胞株C2C12の培養

細胞溶解液と２×サンプルバッファー（50mM

液 に 添 加 し た 後 ，分 化 初 期 マ ー カ ー と し た

Tris（pH6.8），2％SDS，5％2-Mercaptoethanol，

myogenin の 発 現 量 ，分 化 後 期 マ ー カ ー と し た

0.02 ％ Bromophenol blue (BPB）， 40 ％ glycerol）

Myosin Heavy Chain（MyHC）の発現量およびを １：１ で 混 合 後 ，湯 浴 中 で ３ 分 間 煮 沸 し ，筋管（幼弱筋線維）直径を測定し，ACE阻害ペSDS-PAGE（12％gel）にて分離したタンパク質

プチドが筋肥大に及ぼす影響を検討した。

を，ニトロセルロース膜に転写した。転写膜をているジペプチド（IIe-Try（IY）
）

２．方
2.1

５）

anti-αtubulin（内部標準），anti-myogeninあるい法はanti-MyHC，およびビオチン化２次抗体とペル細胞培養

オキシダーゼ標識アビジンで処理した後，ECL検

マ ウ ス 骨 格 筋 由 来 筋 芽 細 胞 株 C2C12 を Cell

出試薬を用いて免疫反応像をＸ線フィルムに出力

matrixによりコラーゲンコートした24穴プレーした。

トに播種した。AA-mixとgentamicinを終濃度各

2.3

１％，0.5％添加した10％FBS -Dulbecco's Modified

分化誘導開始時に，２％HS -DMEMを基本培地

Eagle Media（DMEM ， Invitrogen）（1mL/well）（２ ％ HS ， １ ％ AA-mix ， 0.5 ％ gentamicin inを基本培地とした。培地は播種後24時間目に一DMEM, 3ml/well）と し た 24 穴 の プ レ ー ト（３度，その後は48時間毎に交換した。subconfluent

セット）にACE阻害剤captopril（（IC50 : 20nM）になった時点で２％HS -DMEM（500L/well）におよびACE阻害ジペプチド（IIe-Try，IC50 : 2.31

変え，分化を誘導した（分化誘導期）。分化誘導μM））を10～1000μＭ添加した。培養72時間後，開始から３日間でほぼ全ての細胞が筋管を形成し各ウェルで無作為に筋管40本前後を写真に撮影た時点で筋管成熟期とした。

し，Image J（NIH）にて筋管の最も太い部位を2.2

筋管直径の測定２）直径として計測し，その平均値をウェルの測定値

ウェスタンブロッティング

分化誘導開始時に，２％HS -DMEMを基本培地（２ ％ HS ， １ ％ AA-mix ， 0.5 ％ gentamicin in
DMEM, 3ml/well）と し た 24 穴 の プ レ ー ト（３とした。
３．結果と考察

セット）にACE阻害剤captopril（D-3-mercapto-

ACE阻害剤（０～1000μM captoprilまたはIY）

2-methy1propanoyl-proline, IC50 : 20nM）およびを含む分化誘導培地で筋芽細胞株C2C12の分化誘ACE阻害ジペプチド（IIe-Try，IC50 : 2.31μM））

導を開始してから72時間後に，myogenin, MyHC

を10～1000μＭ添加した。培養72時間後，筋管をの発現レベルをウエスタンブロッテイングにより形成したプレートの培養液を捨て，温PBSで２回調べた（Fig. 1A）。Fig. 1Bは，myogeninおよび

洗浄した後，1000μＭのcaptoprilまたはIYを含む

MHCの各バンドの強度をImage J（NIHイメージ

培地を添加して37℃で15分間インキュベートしソフト）で計測し，それぞれ内部標準αtubulin© The Ito Foundation

16

食肉に関する助成研究調査成果報告書
(A)

kDa

Cap(μM)

IY(μM)

Ct9 10 100 500 1000 Ct9 10 100 500 1000
MyHC(200kD)

200
116.25
97.4
66.2

α-tubulin(55kD)
45
myogenin(36kD)
31
21.5
14.4
6.5

myogenin/αtubulin ratio (%)

myogenin/αtubulin ratio (%)(B)

Myogenin (Captopril)
40
35
30
25
20
15

0

10

100

500

1000

Myogenin (IIe-Tyr dipetide)
80
75
70
65
60
55
50

0

Captopril concentration (μM)

MyHC/α-tubulin ratio (%)

MyHC/αtubulin ratio (%)
0

10

100

100

500

1000

MyHC (IIe-Tyr dipeptide)

MyHC (Captopril)
120
110
100
90
80
70
60
50

10

IY concentration (μM)

500

1000

120
115
110
105
100
95
90
85

0

10

100

500

1000

IY concentration (μM)

Captopril concentration (μM)

Fig.１ Effect of ACE inhibitors（captopril and dipeptide（IY））on the myogenic differentiation in C2C12 cells．
C2C12 cells（1x105 cells/well for captopril and 1x 106 cells/well for IY）
were cultured in either differentiation medium（DM）alone（depicted as“0”）or with various concentrations of

ACE inhibitors. Each DM was changed at day 1 after induction of differentiation, and cell lysates andconditioned medium were harvested at day 3. Western blot analysis of cell lysates was performed to determinemyogenin and MyHC expression levels．
（Ａ）
Representative blots pattern was shown．
（Ｂ）
Expression levels of myogenin and MyHC were expressed as relative values toα-tubulin expression．

© The Ito Foundation

17

食肉由来ACE阻害ペプチドの筋肥大作用とその機構

×20

(B)

×40

Myotube diameter (relative unit)（Ａ）

Control

100μM

Myotube size
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1
0.9
0.8

0

10

100

500

1000

IY concentration (μM)
1000μM

Fig.２ Effect of ACE inhibitors（captopril and dipeptide（IY））on C2C12 myotube diameter．
（Ａ） Morphological observation: morphological analyses of both non-treated（upper）and ACE
inhibitor-treated myotubes were performed at day 3 after induction of differentiation．
（Ｂ） Myotube diameter: the results were expressed as relative values to CNT（non-treated）
group. Diameters were measured with the thick of 10 large myotubes per well．

に対する比で表したものである。なお，本実験ではcaptoprilをポジティブコントロールとして用い肥大作用には明瞭な相関が認められなかった。
Fig. ２Aと２BはIYを添加した筋管細胞とその直径の計測結果をそれぞれ示している。Fig. 2Aた。
筋分化初期のマーカーであるmyogeninの発現の写真からわかるように，ジペプチドIYの添加

レベルはcaptopril，IY添加区とも100μＭまで増は明らかに筋管の肥大を誘導した。特に1000μＭ

加したが，500，1000μＭでは低下した。ACE阻の添加で，筋管の最も太い部分の直径の平均値は害剤の濃度が高いほど分化が促進され，筋管形成

無添加の場合と比べて1.35倍であった。

が早まったのでmyogeninの発現量が抑えられた

骨格筋の肥大・再生（リモデリング）には，筋ものと推測された。captopril添加区のMyHC発現

幹細胞である衛星細胞が不可欠であることが知らレベルは500μＭまでは増加したが，1000μＭではれている６）。衛星細胞の増殖や分化は筋肥大・再無添加区よりも低かった。これは，captoprilの細生の重要な過程であり，これには細胞内外の多く

胞毒性に起因するものと思われる（実際，筋管のの因子が関与することが明らかにされている。近形態に異常が観察された）。一方，IYのMyHC発

年，高齢者にACE阻害剤（captoprilなど）の長

現レベルはcaptoprilのように1000μＭで低下する期投与により，筋重量の増加および筋持久力がことはなかった。MoriらはACEを過剰発現させ回復することが多くの臨床調査で確認されていることによって，筋分化マーカーとしたMyHCのる ７）。今回drug captoprilとは異なり，ACE阻害発現低下が認められ，ACE阻害剤（captoprilな活性を持つジペプチドであるIYも筋肥大作用をど）を用いてACE活性を低下させると筋芽細胞持つことがはじめて明らかになったことから，食の分化が促進されると報告しているので，今回の品（食肉）由来のACE阻害ペプチドも同様の筋データはその結果を支持するものであった３）。

肥大効果を持つことが期待される。現在我々はcaptoprilのACE阻害活性はIYに比べ100倍ほど高食肉由来ACE阻害ペプチド（例えばIKW（IC50 :いが，今回の実験ではACE阻害活性の強さと筋0.21μM）， LKP （IC50 : 3.2μM）， MNP （IC50 :© The Ito Foundation

18

食肉に関する助成研究調査成果報告書

66.6μM）８～10）について今回同様の実験を継続中である。また，その詳しい作用機序はまだ不明であることから，今後はACE活性を人為的に変動させ，筋分化に主導的な役割を果たす調節因子（MyoD，Myf5，myogenin，MRF4）および融合に重要な細胞接着因子（α4integrin，VCAM-1）の発現，細胞内シグナル伝達因子ERK1/2および
Aktリン酸化レベルについて調べる。さらに，動物への投与による生体におけるACE阻害ペプチ
ドの筋肥大作用を検証する予定である。
４．要

約

本研究ではACE阻害活性を持つジペプチドIIeTry（IY）の筋肥大効果について，マウス由来の筋芽細胞C2C12を用いて検討した。10～100μM
IYの培地への添加は分化誘導72時間後の筋細胞のmyogeninの発現レベルを増加させたが，500～
1000μＭでは逆に低下した。一方MyHCの発現レ
ベルは濃度依存的（10～1000μＭ）に増加した。

文 献
１）
 Greenlund, L.J.S. and Nair K.S. : Mechanisms ofAgeing and Development，124，287～299，2003．
２）
 馬場研斗，水野谷航，辰巳隆一，池内義秀，関口
健：平成20年度食肉に関する助成研究成果報告書，27，17～23，2008．
３）
 Mori, S. and Tokuyama, K. : Biochem. Biophys.
Res. Commun.，353，369～375，2007．
４）
 Verrcruysse, L., Canp, J. V. and Ace, G. S. : J.
Agric. Food Chem.，53，8106～8115，2005．
５）
 Cheung, H-S, Wang, F-L, Ondetti, M.A., Sabo, E. F.
and Cushman, D. W. : J. Biol. Chem. ， 255 ， 401 ～
407，1980．
６）
 Tatsumi, R. and Allen, R. E. : Animal Science
Journal，79，279～290，2008．
７）
 Sumukadas, D., Witham, M. D., Struthers, A. D.
and Mcmurdo, M. E. T. : J. Nutri., Health &Aging，12，480～485，2008．
８） Fujita H., Yokoyama K. and Yoshikawa M. : J.
Food Sci.，65，564～569，2000．
９）
 Arihara, K., Nakashima, Y., Mukai, T., Ishikawa, S.
and Itoh, M. : Meat Sci .，57，319～324，2001．
10）
 Katayama, K., Anggraeni, H. E., Mori, T.,
Ahhmed, A. M., Kawahara, S, Sugiyama, M.,
Nakayama, Maruyama, M. and Muguruma, M. : J.
Agric. Food Chem.，56，355～360，2008．

また，1000μM IYの添加で筋管の直径は無添加
区に比べ1.35倍増加した。これらの結果から，すで に 筋 肥 大 効 果 が 確 認 さ れ て い る ACE 阻 害 剤
captoprilと同様，IYジペプチドにも筋芽細胞の分化を促進する作用と筋細胞を肥大する作用があることが明らかになった。

© The Ito Foundation

19

食肉由来機能性成分クレアチンによる脳機能の維持・改善に関する研究

食肉由来機能性成分クレアチンによる脳機能の維持・改善に関する研究
The study of maintenance and improvement for brain function with creatine

鬼

澤

直

樹１・豊

田

裕

子２・豊

田

淳１，２，３（１茨城県畜産センター，２茨城大学農学部，３東京農工大連合農学研究科）

Naoki Onizawa１, Hiroko Toyoda２ and Atsushi Toyoda１，２，３（１Ibaraki prefectural livestock research center, ２College of Agriculture, Ibaraki University,
３United Graduate School of Agricultural Science, Tokyo University of Agriculture and Technology）

Creatine is a nitrogenous organic acid that occurs naturally in vertebrates and helps to
supply energy to muscle. Creatine is synthesized from the three amino acids: glycine,L-arginine and S-adenosylmethionine, and used widely for the energy supplements for theathletes. Effects of oral administration of creatine on the peripheral tissues have been widely
investigated, while the studies of its function in the brain and the animal behaviors have been
limited. We have investigated the functions of creatine in the brain. Creatine activatesmitochondria in the spines of hippocampal neurons and changes the morphology and functionof hippocampal synaptic junctions. Recently, it was reported that chronic selective-serotonin
reuptake inhibitor（SSRI）reverses the maturation of hippocampal neurons and changes
synaptic transmission in hippocampus. Thus, we observed whether creatine rescues the SSRIinduced immature hippocampus. Chronic SSRI（fluoxetine）reduced the expression of matureneuron marker calbindin in hippocampus, and chronic creatine administration with SSRI
rescued the reduction of calbindin. However, calretinin expression was not changed withchronic fluoxetine administration．

１．目

経系におけるクレアチンの作用部位のひとつとし

的てGABA受容体があるが２），クレアチンがGABA

クレアチンは食肉に多く含まれており，グリシ受容体を活性化することにより抗ストレスや抗不ン，アルギニン，S -アデノシルメチオニンから合安作用を示す可能性が示唆されている３）。さらに，成される物質である。クレアチンは合成されたのクレアチンの経口摂取により，クレアチンの脳内

ち，細胞内でクレアチンキナーゼによりリン酸化

濃度は上昇し，脳機能の調節に関与する可能性がされクレアチンリン酸になり，ATPの再合成にある。

関与する。それゆえ，運動選手はパフォーマンス

私共は，クレアチンの摂食促進作用を発見し，向上のためにクレアチンをサプリメントとして活そのメカニズムの研究を行っている。摂食行動

用している。また，ヒトがクレアチンを摂取する

は，視床下部におけるニューロペプチドＹやオレ

ことで，精神疲労の軽減が報告されている 。神キシン，メラニン凝集ホルモンなどの摂食ペプチ

１）© The Ito Foundation

20

食肉に関する助成研究調査成果報告書

ドの発現調節と，末梢組織からのレプチンやグレ

シナプス幼若化によるシナプス伝達の異常をクレリンなどの因子の情報が視床下部で統合され，行

アチンがレスキューできるのではないかと考えた。

動が制御されている。一方で，オレキシンやグレリンにより不安様行動やうつ様行動が抑制される

２．方

法

ことが示され，摂食ペプチドと精神疾患の関連が2.1示唆されている。私共は，平成20年度，21年

８週齢C57BL/6J雄マウス（チャールズリバー）

度の貴財団助成によって，クレアチンが視床下部を１週間市販飼料MF（オリエンタル酵母工業）

摂食中枢のニューロンを活性化すること およびで予備飼育した。予備飼育の時期からマウスを個

クレアチンは摂食促進ペプチドであるオレキシン

別ケージに収容し，単飼した。水と飼料は自由摂を脳各部位で減少させる作用があること を見出取とし，室温23℃，12時間の明暗サイクル（明した。クレアチンの摂食促進作用はオレキシン系

期：07：00～19：00）の環境下で飼育した。マウとは別経路で機能している可能性が示唆された。

スは対照群（蒸留水のみ），SSRI投与群（フルオ

また，クレアチンには海馬由来の培養ニューロン

キセチンのみ），SSRI＋クレアチン投与群（フルのシナプス形成を促進する作用があり，クレアチ

オキセチンおよびクレアチン）の３群に分け，そンを投与した海馬ニューロンではシナプス数が増

れぞれ３匹ずつランダムに割り当てた。フルオキ

加する

セチンは，１日あたり22mg/kg体重となるよう

４，
５）

６）

７）

ことが知られている。

８）

実験動物

近年の日本では，急激な高齢化や社会的ストレ

蒸留水に溶解し，経口摂取させた。フルオキセチ

スの増加によって，うつ病などの中枢神経系機能

ン水溶液は，マウスの体重に基づいて個別に作製

障害疾患の患者数が増加している。これらの疾患したものを用いた。クレアチンは蒸留水に１％とでは，即効性のある薬剤がないため治療期間が長なるよう溶解した。なお，SSRIの苦味による飲期にわたることが多く，また副作用に関する報告

水量減少を避けるため，すべての処理群の水溶液（自殺企図のリスク増加，攻撃性の増加）もなさに0.2％になるようにスクロースを溶解した。フれている。特に，近年多く処方されるようになり，

ルオキセチンおよびクレアチン投与を28日間行っ

副作用の少ないとされる抗うつ薬SSRI（選択的た後に，と殺，サンプリングを行った。なお，実セロトニン再取り込み阻害薬）に関して，先に挙験はすべて茨城大学農学部実験動物委員会規則にげた副作用のリスクが注目されるようになってい沿って行った。

る。また最近，SSRIの長期間投与により，マウ

2.2

脳組織の採取ス海馬ニューロンが幼若化し，行動が変容する現給与期間終了後，ジエチルエーテルにより麻酔。この未熟ニューロンのシナし，頸椎脱臼によりと殺した後に，直ちに全脳お

プス伝達は電気生理学的にも異常になり，興奮性

よび肝臓，腎臓，副腎，脾臓を採取し湿重量を測のシナプス伝達が抑制される。それゆえ，SSRI定した。全脳は免疫組織化学的解析に供試した。

象が発見された

９，10）の副作用と関連があるのではないかと指摘されて2.3いる。先にも触れたとおり，クレアチンには海馬全脳を採取後，直ちに４％パラホルムアルデヒ

シナプス部のミトコンドリアを活性化させて，スドにて固定した。固定後，20％スクロース溶液にパインの形態を変え，シナプス伝達を増強させるて置換し，包埋した。クリオスタット（ライカ）

作用がある。そのため，SSRI慢性投与での海馬を用いて厚さ20μｍの切片を作成し，抗カルビン© The Ito Foundation

免疫組織化学的解析

21

食肉由来機能性成分クレアチンによる脳機能の維持・改善に関する研究
Table１ Effect of oral SSRI and/or creatine administration on tissue weight in mice．
Test group
Control

SSRI

SSRI＋Creatine

Body Weight (g）28.7±0.928.9±2.030.1±2.3

Whole Brain (mg）437.6±13.4448.9±5.3

437.2±3.5

Liver (g）1.45±0.08

1.47±0.08

1.51±0.13

Kidney (mg）296.2±32.5304.9±14.4

303.3±13.3

Adrenalgrand (mg）9.3±1.9

6.6±1.7

17.0±16.5

Spleen (mg）66.7±6.7

65.6±8.7

67.7±7.9

Values are means±S.E.M for 3 animals in each group．
Control

SSRI

SSRI+Cre

Calbindin

Calrenitin

DAPI

Fig.１ C hronic fluoxetine down-regulates marker calbindin for mature granule cells.（Scale bar，300μｍ．
）

ジン抗体（Sigma）および抗カルレチニン抗体れることがあると知られているが，マウスでの（Swant）を用いて免疫染色を行い，DAPIにより

SSRI慢性投与でそのような兆候は見られなかっ対比染色を行った。

た。
3.2

３．結果と考察

カルビンジンおよびカルレチニンの発現

SSRIおよびクレアチン投与によるマウス海馬

3 . 1 SSRIおよびクレアチンによる臓器重量の歯状回顆粒細胞層における神経細胞の未成熟化を
免疫組織学的手法により解析を行った。その結変化
SSRIおよびクレアチンを28日間経口投与させた

果，SSRIの慢性投与により海馬歯状回成熟神経

際に，体重および全脳，肝臓，腎臓，副腎，脾臓細胞で発現するカルビンジンの発現が低下した

重量には有意な変化は見られなかった（Table１）。

が，幼若マーカーであるカルレチニンの発現は顕ヒトではSSRIの慢性投与により体重変化が見ら著な変化が見られなかった（Fig.１）。SSRIおよ© The Ito Foundation

22

食肉に関する助成研究調査成果報告書

びクレアチンの同時慢性投与においては，カルビニンの発現は変化せず，成熟マーカータンパク質

ンジンの発現が対照区と同様になっていた。故にカルビンジンの発現は減少した。クレアチンとクレアチンで一部海馬の未成熟化がレスキューさ

SSRIの同時投与すると，カルビンジンの発現量れる可能性が示唆された。今回，海馬におけるカが対照区と同様になった。したがって，クレアチ

ルレチニンの発現量がSSRI慢性投与によって変

ンはSSRI慢性投与による海馬歯状回領域の未成化しなかった。つまり，SSRI慢性投与によって熟化に抑制をかける分子である可能性が示唆され

海馬未成熟神経細胞が増加しなかったのである

た。

が，SSRIの投与量が充分でなかったなど考えられる。SSRIの慢性投与による海馬神経細胞の状況が段階的に起こる可能性があり，今回の私共の条件では，成熟マーカーの低下という状況だけを引き起こしたのかもしれない。SSRIの投与量，投与期間などを再検討し，それぞれで得られる解剖学的および行動学的フェノタイプを追求することが必要となろう。そのような知見を得ると，SSRIによる副作用により理解が進むと考える。
４．要

約

SSRIの摂取により海馬歯状回顆粒細胞層における神経細胞の幼若化が，抗うつ薬による副作用の要因である可能性が指摘されている。一方，ク
レアチンは海馬神経細胞のミトコンドリアを活性化させることにより，シナプス形成を促進することが示唆されている。そこで，クレアチンの摂取がSSRIの副作用のリスク軽減に関与するかを検討した。SSRIの投与により，海馬歯状回顆粒細胞層における幼若化マーカータンパク質カルレチ

文 献１）
 Watanabe A, Kato N, Kato T. : Neurosci. Res ．
42．279～285，2002．
２）
 Neu A, Neuhoff H, Trube G, Fehr S, Ullrich K,
Roeper J, Isbrandt D : Neurobiol Dis ． 11 ． 298 ～
307，2002．
３）
 Koga Y, Takahashi H, Oikawa D, Tachibana T,
Denbow DM, Furuse M. : Neuroscience ．132（1），65～71，2005．
４）
 Lutter M, Sakata I, Osborne-Lawrence S,
Rovinsky SA, Anderson JG, Jung S, Birnbaum S,
Yanagisawa M, Elmquist JK, Nestler EJ, Zigman
JM. : Nat Neurosci．11．752～753，2008．
５）
 Lutter M, Krishnan V, Russo SJ, Jung S,
McClung CA, Nestler EJ. : J Neurosci ． 28 （12），3071～3075，2008．
６） 鬼澤直樹，豊田淳．平成20年度食肉に関する助成
研究調査報告書．vol.27．伊藤記念財団，2008．
７） 鬼澤直樹，豊田淳．平成21年度食肉に関する助成
研究調査報告書．vol.28．伊藤記念財団，2009．
８）
 Zheng Li, Ken-Ichi Okamoto, Yasunori Hayashi
and Morgan Sheng : Cell ． 119 （6）， 873 ～ 887 ，
2004．
９） Kobayashi K, Ikeda Y, Sakai A, Yamasaki N,
Haneda E, Miyakawa T, Suzuki H. : Proc Natl Acad
Sci U S A．107，8434～8439，2010．
10）
 Kobayashi K, Ikeda Y, Suzuki H. : Mol Brain．
2011，vol 4 : 12．

© The Ito Foundation

23

肝臓抽出物および食品成分の併用が脂質吸収に及ぼす影響

肝臓抽出物および食品成分の併用が脂質吸収に及ぼす影響
Effects of liver-extract with/without combined intake of other food ingredientson lipid absorption in mice

矢

澤

一

良・小

山

智

之

（東京海洋大学大学院）

Kazunaga Yazawa and Tomoyuki Koyama（Tokyo University of Marine Science and Technology）

In our previous study, the extract of porcine liver“Liver Hi”showed inhibitory activity
against pancreatic lipase in vitro, but did not suppress elevation of plasma triglyceride（TG）
level in TG-loaded mice. In the present study, we investigated if combination with existing foodingredients increased inhibitory effects of Liver Hi on lipid absorption in vivo. Lipase inhibitory
activity test in vitro had selected four kinds of food ingredient, i.e., hem iron, extracted taurine,
turmeric extract, and L-ornithine hydrochloride（ornithine）for combination with Liver Hi.
Among them, only ornithine with Liver Hi（2,000 mg/kg）inhibited TG absorption in vivo. Liver
Hi（2,000 mg/kg）with ornithine showed dose-dependent inhibitory effects at 0 ～ 2,000mg/kg
in TG-loaded mice. Further investigation with varying combination ratio showed that Liver Hi
at 2,000 mg/kg with ornithine at 2,000 mg/kg inhibited the absorption of TG in micesignificantly. The optimal food ingredients and the optimal ratio for combinations requires
more detailed study, but series of our experiments revealed that inhibitory effects of Liver Hi
on triglyceride absorption may be enhanced the result is obtained by combining other foods.
The future experiments to elucidate optimum conditions such as the type of materials andmixing ratio will allow that the usage of Liver Hi as a functional food.

１．目

著者らはこれまでの研究において，高脂肪食飼的育―肥満モデルマウスおよび，マウス由来の白色

我が国でも近年，運動不足，不規則な食生活に脂肪前駆細胞株３Ｔ３-Ｌ１細胞などを用いた試

より肥満者が増加している。肥満はメタボリック

験により，脂質代謝改善作用を有する新規食品素シンドローム発症の起点とされており，生活習慣材を探索し，数種類の天然素材にその活性を見出病，さらには，動脈硬化性疾患を未然に防ぐためし，学術論文にて発表してきた３～６）。また，昨年に，肥満を予防・改善することが必要とされていの本財団助成研究において，ブタ肝臓抽出物に着る。日常の食生活に機能性を付加することで目してその生理機能を調べたところ，in vitro試

余分な脂質の取り込みを調節できる機能性食品

験でリパーゼ阻害作用が確認され，マウス脂肪吸（ヘルスフード）への関心が高まっている。

収試験において有意差はないものの脂肪吸収を抑１，
２）© The Ito Foundation

24

食肉に関する助成研究調査成果報告書

制する傾向が確認された７）。これら作用は食事と2.2

ともにブタ肝臓抽出物を摂取することで食事由来

この試験はリパーゼキットS（DSファーマバイ

の脂肪の吸収を調節できる可能性を示していると考えている。

膵リパーゼ阻害活性試験

オメディカル）を用いて行った。
⑴ 酵素液はブタ由来の膵リパーゼを使用し，本研究では前年度研究成果を受けて，ブタ肝臓

１unit/mlとなるように調製した。

の抽出物「レバーHi」のリパーゼ阻害作用に着⑵ 96ウェルプレートに５μｌの酵素液，２μｌ

目して，一般的な既存の食品成分と組み合わせるのエステラーゼ阻害剤，発色液73μｌを入れことでその脂肪吸収作用を調節できるかどうかをて混合し，37℃で５分間プレインキュベート検討した。具体的には，リパーゼ阻害作用に及ぼした。

す影響（実験１），マウスにおける脂質吸収抑制⑶ その後，サンプル溶液あるいはコントロー

作用に及ぼす影響（実験２）について検討した。

ルとして10μｌの蒸留水（DW）を加えて，

２．方
2.1

さらに，10μｌの基質液を加えてよく混合し法てから，30℃，遮光下で30分間インキュベー

サンプル調製トした。ポジティブコントロール（PC）とブタ肝臓抽出物としてレバーHi（ILS株式会社）

して，ウーロン茶抽出物を用いた。

を用いた 。そのほかに一般的な既存の食品成分⑷ 200μｌの反応停止液を加え，405nmで吸光として本研究において用いた食品サンプル（ILS

度を測定した。また，反応停止液を加えた後株式会社より供給）を以下に示した。

に基質液を加えたものをブランク溶液とし

８）

①ヘム鉄

“hem iron”

た。コントロールの反応率を100％として，②タウリン（抽出物） “extracted taurine”③ア ン セ リ ン 含 有 サ ケ エ キ ス“anserine-

containing salmon extract”“l - carnitine”⑤l -オルニチン“l - ornithine hydrocholoride”“stevia extract”⑩カンゾウ抽出物Ｂ

ンプル水溶液（10ml/kg）と，５分後にコーン油（８ml/kg）を経口投与した。

“licorice extract B”

各食品サンプルは，蒸留水に溶解または懸濁させて用時調製して各試験に用いた。

予備飼育後，マウスを24時間絶食させた。
３群または４群に分けて，蒸留水あるいはサ“licorice extract A”⑨ステビア抽出物⑵⑶ マウスを平均体重がほぼ等しくなるように“turmeric extract”⑧カンゾウ抽出物Ａ

トリグリセリド（TG）負荷試験

４匹ずつ入れて，１週間予備飼育した。

“Beni-Koji powder”⑦ウコン抽出物

2.3⑴ １ケージにddYマウス（７週齢，雄性）を④l -カルニチン⑥紅麹粉末

反応率（％）を下記式のように算出した。

⑷ 投 与 後 に 経 時 的 に 尾 採 血 を し て ，
3,000rpm，20℃で10分間遠心分離を行った。
⑸ 遠心後，それぞれ血漿を２μｌ採って，96（サンプル溶液を加えた反応液の吸光度）－（サンプル溶液を加えたブランク溶液の吸光度）（コントロールの反応液の吸光度）－（コントロールのブランク溶液の吸光度）© The Ito Foundation

×100

25

肝臓抽出物および食品成分の併用が脂質吸収に及ぼす影響

(A)
120

＊＊

＊＊

Lipase activity
（％）

100
＊＊

80

＊＊＊

60
40

＊＊＊

20
0

①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

⑧

⑨

⑩

⑨

⑩

食品素材（各2,000mg/ml）

(B)
120

Lipase activity（％）

100

＊＊＊

＊＊＊

＊＊

＊＊

＊＊

＊＊＊

③

④

⑤

⑥

＊＊＊

＊＊＊

80
60
40
20
0
①

②

⑦

⑧

レバーHiと併用した食品素材（各2,000mg/ml）
Fig.１ Effects of Liver Hi alone（A）and Liver Hi with other food ingredients (B) on lipase activity in vitro hem iron，② taurine （extract）①，③ anserine-containing salmon extract，④ l - carnitine，⑤ l - ornithinehydrochloride， ⑥ Beni-Koji powder， ⑦ turmeric extract， ⑧ licorice extract A， ⑨ stevia extract， ⑩ licorice
extract B. Lipase activities of control（without samples）group are defined to be 100％． Data are expressed as
mean±S.E.（n＝３）．***：ｐ＜0.005，**：ｐ＜0.01 vs control．

ウェルプレートに移した。
⑹ 血中TG値は，トリグリセリドＥ-テストワ
コー（和光純薬工業株式会社）を用いて測定

３．結果と考察
実験１：リパーゼ阻害活性に及ぼす影響
レバーHiのin vitroにおける膵リパーゼ阻害活

した。
⑺ TGの吸収量は，投与８時間後までの血漿性の有無について検討したところ，コントロール

中のTG濃度の経時変化曲線，または総吸収（100％）と比較して有意に膵リパーゼ活性が減少量の指標とされている曲線下面積から求めた

さ せ た 。結 果 は 図 示 し て い な い が ，レ バ ー

Area under curve（AUC 値）に よ り 評 価 しHi 4,000μg/mlでは88.5±0.8％，8,000μg/mlではた。

81.3±3.2％であり，ポジティブコントロールの
ウーロン茶抽出物（100μg/ml）では61.6±0.7％© The Ito Foundation

26

食肉に関する助成研究調査成果報告書

（A）

（Ｂ）

800
600
400
200
0
0

2

4

6

8

Plasma TG level AUC value（mg/dl・h）

1000
Plasma TG concentration（mg/dl）

6,000

DW
レバー Hi 1,000mg
レバー Hi 2,000mg

1200

5,000
＊

4,000
3,000
2,000
1,000
0

DW

Time after administration（h）

レバー Hi レバー Hi
1,000mg 2,000mg

Fig.２ E
 ffects of Liver Hi on time-course change in plasma（A）and total absorbed amounts（B）of TG in triglyceride-loaded mice．
The total absorbed amounts in Panel A are expressed as area under curve（AUC value）for 8 h of Panel B. Data

are expressed as mean±S.E.（n＝８）．*：ｐ＜0.05 vs control（DW）．

であった。

変化を示し（Fig.２Ａ），コントロール（DW）に今回用いた食品素材10種類について，2,000mg

対して脂質吸収の指標となるAUC値の濃度依存/mlの濃度でリパーゼ阻害活性を調べた結果，的な抑制傾向を示した（Fig.２Ｂ）。次に，このFig.１Ａに示したとおり①ヘム鉄，⑤ l-オルニチ

マウスTG負荷試験におけるAUC値を指標として

ン，⑦ウコン抽出物が顕著な阻害活性を示した。

レバーHi単独の場合と他の食品素材を併用させまた，レバーHiとこれら食品素材を併用した結果た場合とを比較した。

（Fig.１Ｂ），レバーHiのリパーゼ阻害活性をとく

マ ウ ス TG 負 荷 試 験 に お い て レ バ ー Hiに増強した素材は見られなかったが，②タウリン（2,000mg/kg）とヘム鉄（500mg/kg，Fig.３Ａ）（抽出物），⑤l-オルニチン，⑦ウコン抽出物におタウリン（500mg/kg，Fig.３Ｂ），ウコン抽出物

いて，比較的阻害活性が保たれていた。これらの（500mg/kg，Fig.３Ｄ），のいずれかを併用した

結果を受けて，ヘム鉄，タウリン，l-オルニチン，

場合では，トリグリセリドの吸収阻害作用は確認

ウコン抽出物の４つの素材について，脂質吸収抑されなかった。一方で，l-オルニチン（500mg/

制作用を検討することとした。

kg）を併用させた場合にはリバーHiの脂質吸収実験２：マウスにおけるTGの吸収活性に及ぼす抑制作用が増強される傾向が確認された（Fig.３

影響Ｃ）。そこで，レバーHi 2,000mg/kgにl-オルニチ

トリグリセリド（TG）を負荷したマウスにおンの併用量を変化させたところ，l-オルニチン

いて，レバーHiの脂質吸収抑制作用を確認した結2,000mg/kgを併用させた場合に，有意な脂質吸果，2,000mg/kgの投与量で，血中TG経時変化の収抑制作用が確認された（Fig.４）。l-オルニチン© The Ito Foundation

27

肝臓抽出物および食品成分の併用が脂質吸収に及ぼす影響

(A)

(B)
6000
Plasma TG level
AUC value（mg/dl･h）

Plasma TG level
AUC value（mg/dl･h）

6000
5000
4000
3000
2000
1000
0

DW

ヘム鉄

5000
4000
3000
2000
1000
0

ヘム鉄
＋レバー Hi

(C)

DW

タウリン

タウリン
＋レバー Hi

DW

ウコン

ウコン
＋レバー Hi

(D)
6000

5000

Plasma TG level
AUC value（mg/dl･h）

Plasma TG level
AUC value（mg/dl･h）

6000

4000
3000
2000
1000
0

DW

5000
4000
3000
2000
1000
0

オルニチン オルニチン＋レバー Hi

Fig.３ Effects of Liver Hi with other food ingredients on total absorbed amounts of TG in triglyceride-loaded mice．
Mice were treated Liver Hi（2,000mg/kg）with heme iron（A）,extracted taurine（B）,L-ornithine hydrochloride（C）, or turmeric extract（D）per orally（500mg/kg each）. The total absorbed amounts were caluculated formtime-course data of plasma TG for 8 h. The effect of each food ingredients alone were shown for comparison
with combined effects with Liver Hi．

の濃度依存的に脂質の吸収が抑制されていることから，l-オルニチン単独でもレバーHi単独と同程

４．要

約

度の脂質の吸収抑制作用を有することも示唆され

ブタ肝臓抽出物であるレバーHiは，継続投与にた。これまでの研究においてレバーHi単独投与でよりヒトの血漿トリグリセリドレベルを低下させ確認されていた脂質吸収を抑制する傾向に加える事が知られている８）。また，昨年度の本助成研て，l-オルニチンの併用によって相加的に作用が究においてレバーHiにリパーゼ阻害作用が確認増強されたものと考えられる。より効果的な作用されたが，マウスにおける脂質吸収抑制作用は有を示すためには，併用する食品素材やその混合比

意な変化を示さないことが示された７）。この結果については，更なる検討を必要とする。

を受けて，レバーHiに既存の食品素材との組み合
わせることによってその作用が増強するかどうか，ならびに，生体での脂質吸収抑制作用を確認© The Ito Foundation

28

食肉に関する助成研究調査成果報告書

Plasma TG level
AUC value（mg/dl･h）

6000
5000
4000
3000

＊＊

2000
1000
0
0

1000

500

2000

オルニチン（mg/kg）＋ レバー Hi（2,000mg/kg）
Fig.４ Effects of Liver Hi with ornithin on total absorbed amounts of TG in trigliceride-loaded mice．
Mice were treated Liver Hi（2,000mg/kg）with L-ornithine hydrocholoride（ornithine: 0, 500, 1,000, and 2,000mg/kg）per orally. The total absorbed amounts were caluculated form time-course data of plasma TG for 8 h．
**：ｐ＜0.01 vs control (DW）．

することができるかどうかを検討した。TG負荷
マウスにおいて，レバーHi投与に加えてヘム鉄，
タウリン，ウコン抽出物，l-オルニチンと組み合わせることで，TG吸収に及ぼす影響を確認した
ところ，l-オルニチン併用群でレバーHiの作用が増強される傾向が見られた。投与量を変えて検討したところ，レバーHi（2,000mg/kg）とl-オルニチン（2,000mg/kg）の組み合わせで，マウスのトリグリセリド吸収を有意に抑制することが示された。組み合わせの素材や混合比については更なる検討が必要ではあるが，今回の一連の実験によりレバーHiのリパーゼ阻害に基づくトリグリセ
リド吸収抑制作用は，他の食品素材を組み合わせ
ることで増強する結果が得られたことから，素材の種類や混合比など条件を最適化することで用途を広げることができると考えられる。
文 献１） A WHO Consultation on Obesity : Obesitypreventing and managing the global epidemic,
World Health Organization, Geneva．

２）
 吉池信夫：Body Mass Indexに基づく肥満の程度と糖尿病，高血圧，高脂血症の危険因子との関連―
他施設共同研究による疫学的検討―．肥満研究，６，
４～17，2000．
３）
 M. Ikeuchi, K. Yamaguchi, T. Koyama, Y. Sono
and K. Yazawa : Effects of fenugreek seeds(Trigonella foenum greaecum) extract on
endurance capacity in mice. J. Nutr. Sci.
Vitaminol．52（4），287～292，2006．
４）
 M. Ikeuchi, T. Koyama, J. Takahashi and K.
Yazawa : Effects of astaxanthin in obese mice fed ahigh-fat diet. Biosci. Biotechnol. Biochem., 71 （4），893～899，2007．
５）
 M. Miyata, T. Koyama, T. Kamitani, T. Toda, andK. Yazawa : Anti-Obesity Effects of the Traditional
Japanese Food 'Tororo-Kombu', Shaved Laminaria
in Rodents. Biosci. Biotech. Biochem., 73 （10），2326～2328，2009．
６）
 M. Miyata, T. Koyama, and K. Yazawa : Water
extract of Houttuynia cordata Thunb leaves exerts
anti-obesity effects by inhibiting fatty acid andglycerol absorption. Journal of Nutritional Scienceand Vitaminology, 56（2）, 2010. (in printing）．
７）
 矢澤一良，小山智之：肝臓抽出物の継続投与がマ
ウス脂質代謝に及ぼす影響．財団法人伊藤記念財団
平成21年度助成研究調査報告書，Vol．28，55～
60，2010．
８）
 ILS株式会社製造業者用資料：「Liver-Hi（ブタ肝
臓酵素分解物）」，ILS株式会社，2009．

© The Ito Foundation

29

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についてⅡ

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についてⅡ
Functional Components Sourced from Bovine, Porcine and Poultry：
Comparative Study on Bioactive Peptides. Ⅱ

久 保 田 大 樹・河原聡・六 車 三 治 男（宮崎大学農学部）

Daiki Kubota, Satoshi Kawahara and Michio Muguruma（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

This research aimed to compare the biological and functional properties as well as
physiological effects of beef, pork and chicken protein hydrolysates. Last year, we examined
the antihypertensive effects by determining the IC50 value of the three mentioned species. This
year, we aimed to check the antioxidative properties.
In the current study, we evaluated the antioxidative activity of hydrolysates of biceps
femoris muscles from beef, pork and chicken. All the muscles separately hydrolyzed withpepsin and trypsin and then determined their antioxidative efficiency. The antioxidative
activity of the hydrolysates was determined by the DPPH radical scavenging assay and the
ORAC antioxidant assay. Meat hydrolysates showed the antioxidant activity（40μM Trolox
equivalents（TE）/mg protein）by the DPPH radical scavenging assay. Meat hydrolysates also
showed the high antioxidant activity（750μM TE/mg protein）by the ORAC antioxidant assay.
Antioxidative activitiy increased with increasing meat hydrolysates concentrations. No
significant differences in various edible meat peptides were detected by the DPPH radical
scavenging assay and the ORAC antioxidant assay. However, there are differences in the otherfactors for giving the antioxidative activity including amino acid sequence of thosehydrolysates. For instance, Cys shows strong antioxidant activity that is considered to be
specific for electron transfer reaction. On the other hand, though Trp also has also been
showing a strong activity, as it indicates only for transferring atom of hydrogen during its
reactions. Beef and pork peptides may show antioxidant activity in specific manner that are
influenced by His and Trp. Antioxidant activity of chicken peptides are small and far fromother meat peptides especially when compared to beef and pork. In ORAC evaluation, Trppattern similar to Trp in chicken one, in which we hypothesize that Trp may be very
important amino acid that determine whether peptides is effective as antioxidative or not.
We conclude that meat in the three species contain peptides that may serve several
purposes. Based on its remarkable antioxidative activity, we suggest that the functional
peptides from meat hydrolysates may have potential applications as functional food, which
could be used as sources of natural antioxidants for foods.

© The Ito Foundation

30

食肉に関する助成研究調査成果報告書

１．目

進められている５～13）。

的

抗酸化活性の測定には原理の違いにより，DPPH

畜産食品の消費量は約半世紀の間に急増した

法，ORAC法，SOD様活性法，β-カロテン法，が，これは我が国が長寿国になった一つの理由と金属キレート活性法など多様な評価方法がある。

も考えられる。一方，日本人のライフスタイルの現在主流になりつつあるのがORAC法とDPPH法

変化に伴い，生活習慣病の患者が増加しており，である。特にORAC法は食品の抗酸化活性を評価

国民の健康への関心は極めて高くなっている。そするのに最も適した方法であると考えられ，米国

こで昨年度は，我が国の死亡原因の２～３位を占を中心として世界的に統一されつつある評価方法

める心疾患，脳血管疾患の原因と深くかかわってである。ORAC法は2,2’-azobis（2-amidinopropane）

いる高血圧症の予防効果に及ぼす各種食肉ペプチ

dihydrochloride（AAPH）から誘導されるペルドに焦点を当て比較検討した１）。

オキシラジカルにより蛍光プローブが分解されて1981年以降，日本人の死因第一位になり，その蛍光を失う過程の抑制を評価することで抗酸化活増加が続いている現状を背景としてがん予防に関性を測定する方法である。つまり抗酸化活性の持する早期研究が求められている 。がんは様々な続能を評価できることがORAC法の特徴でもあ

要因が複合的に働いた結果引き起こされる。このる。さらに生体に近い条件で測定できる事，そしような危険因子の中で特に注目すべき物質は活性て親水性，親油性物質いずれの抗酸化物質も評価

酸 素 種（ROS : Reactive Oxygen Species）と 呼できる点が抗酸化活性測定法の標準として統一さばれる悪性の酸素である。ROSは酸素が紫外線やれつつある理由として考えられている。一方，

環境中の様々な要因により化学変化を起こして生DPPH法とは比較的安定な有機ラジカルであるじる。通常，酸素はO2だが特殊な環境中では一重

DPPHラジカルを用い，520nmに吸収極大を有す

項酸素O2 やペルオキシラジカルLOO のようにる紫色のDPPHラジカルが還元されて退色する性変化する。このように酸素は様々なROSへと変化質を利用して試料の抗酸化活性を評価する方法でし，細胞，DNA，タンパク質，脂質等に影響をある。操作が非常に簡単である事が長所である

与え，動脈硬化や心筋梗塞等を引き起こすと共にが，生体に無いラジカルを使用していることが欠細胞のがん化が促進されると考えられている。ま点である。ORAC法とDPPH法は原理が異なる。

た食品中の成分にもこのようなROSを消去する

ORAC 法 は 水 素 供 与 （HAT : hydrogen atom

能力（抗酸化能）があると言われている。これまtransfer）反応に基づく測定方法であり，DPPH

でにポリフェノール，ビタミンＥ，グルタチオン，法は電子供与（ET : electron transfer）反応に基

カルノシンなど様々な物質で抗酸化活性に関するづく測定方法である14，15）。

２）

－

－

報告がなされている３，４）。従って食品成分の摂取

現在，抗酸化ペプチドに関する詳細な研究はほで，日頃からROSを消去していくことは非常に効

とんど行われていない。例えば現在，ペプチドが果的であると考えられる。またタンパク質を分解

抗酸化力を示す要因としてペプチドの「アミノ酸して生じるペプチドにも抗酸化活性を有するもの

組成」および「構造」の違いが考えられているがあると言われている。

が，どちらの要因がどれだけ抗酸化活性に寄与し食肉は良質なタンパク質を豊富に含み，近年，血圧降下作用などの保健的効果についての研究がているのかなど基本的な考えさえも提唱されていない。

© The Ito Foundation

31

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についてⅡ

そこで本研究では，タンパク質を豊富に含む食料を食肉由来ペプチドとした。この溶液をペプシ

肉を題材とし，ペプシン・トリプシン・パンクレ

ン・トリプシン処理サンプル「ペプシン／トリプ

アチンによる酵素分解で生じるペプチド混合物をシン（４h）」とした。

調製する。さらにORAC法とDPPH法に焦点を絞

なお，加熱食肉タンパク質「Whole」および各

り，食肉由来ペプチドの抗酸化力を評価する。ま

反応段階で得られた酵素消化により生じたペプチ

たペプチドを構成する20種類のアミノ酸の抗酸化ド混合物を0.45μmセルロースアセテートメンブ

活性を測定し，食肉由来ペプチドが抗酸化活性をレンフィルター（アドバンティック東洋（株））

示す要因について考察していく。この研究によりにてろ過した試料を実験に供した。

抗酸化ペプチドおよび食品化学の基礎的知見を与2.3

え，新規食品素材の開発・発展に貢献していくこ

酵素未処理の食肉タンパク質「Whole」の定量とが本研究の目的である。
２．方
2.1

はBiuret法16）により行った。すなわち，タンパク質溶液に対し，４倍量のBiuret試薬を加えて常温

法

で30分間反応させた。反応液をSHIMADZU（日実験材料本）製 UV-VIS Spectrophotometer

市販の宮崎県産の各種食肉（牛肉・豚肉・鶏肉
いずれもモモ肉）を実験材料に用いた。
2.2

タンパク質の定量

1245 型 分 光光度計（吸光度：540nm）にて測定した。また分解物であるペプチドについてはUV法 17）を適用

食肉由来ペプチドの調製し，測定を行った。すなわちタンパク質溶液の食肉由来ペプチドの調製は以下のとおりである。

215nmの吸光度から225nmでの吸光度を差し引

各種食肉のミンチ肉に２倍量の蒸留水を添加してき，144倍した時の数値をタンパク質濃度とした。

フードプロセッサー（Panasonic MK-K48）を用

測定には上記と同じ分光光度計を使用した。

いて30秒間，２回ホモジナイズした。70℃で30分

2.4

間インキュベート後，このホモジェネートを酵素

DPPHラジカル消去活性の測定は，DPPH分光

未処理の加熱食肉タンパク質サンプル「Whole」

測 定 法 に 準 じ て 行 っ た 18）。す な わ ち ，400μMとした。その後，このホモジェネートをHClでDPPH，MES（2-morpholino-etanesulphonic acid）

pH1.8 に 調 整 し ，胃 粘 膜 由 来 ペ プ シ ン（１ ：buffer，20％エタノールを同量ずつ加え，混液を10000）（和光純薬工業株式会社製）をタンパク質作製した。混液を0.9ml分注し，80％エタノール量（食肉重量当たり20％のタンパク質が含まれるを240μlとサンプルを60μl加え，20分間反応させことを仮定した）に対して１/1000倍量添加し，た。その後，サンプルを加えた順に前述の分光光攪拌しながら37℃で２時間インキュベートした。

度計にて吸光度520nmで測定した。また，サンプ

NaOHを用いてpH6.8に調整し，10分間煮沸した

ルの代わりに，0.2mM Trolox（Sigma社製）を後，溶液温度を40℃まで低下させた。この溶液を使って標準として測定し，検量線からサンプルのペプシン消化サンプル「ペプシン（２h）」としTrolox相当量を算出した。MES BufferはMESをた。さらにトリプシン（和光純薬工業株式会社）

蒸留水に溶解し，NaOHでpH６に調整したもの

およびパンクレアチン（同会社）をそれぞれペプを使用した。

DPPHラジカル消去活性の測定

シンと同量添加し，再び攪拌しながら37℃で２時

2.5間インキュベートした。最後に10分間煮沸した試（独）農研機構九州沖縄農業研究センターの報© The Ito Foundation

ORAC法による抗酸化活性の測定

32

食肉に関する助成研究調査成果報告書

60
292.2

454.6
Sample50

Carnosine

DPPH (μM TE)

40

Glutathione

30

Beef

20

Pork

10

Chicken0
Carnosine

Glutathione

Beef

Pork

Concentration(mg/ml)
0.5
1.0
0.5
1.0
0.5
1.0
0.5
1.0
0.5
1.0

ChickenFig.１ Dual axis graph shows the value of DPPH radical scavending activity of beef, pork and chickenhydrolysates.
TE, Trolox Equivalent.

告 を も と に 改 良 し て 測 定 し た 19 ～ 22）。す な わ ちについては平成21年度報告書に掲載したとおりで

96wellマイクロプレートに81.6nMフルオレセイ

ある１）。すなわちSDS -PAGEによるサンプル全体

ンを200μl，サンプル20μlを添加し，マイクロプのタンパク質の分子量分布およびゲルろ過HPLC

レートリーダー（TECAN GENios Multifunction

による食肉タンパク質の経時的変化の観察と分子

FluorescenceVirginia, USA）に て 37 ℃ で 励 起 波

量分布の測定を行った。SDS -PAGEによって，酵長485nm，蛍光波長520nmにおける蛍光強度を測

素処理時間に伴い，各種食肉タンパク質の分解が定した。10分後200mM AAPH

75μlを添加し，進行したことが認められた。またHPLCの結果よ

同条件にて２分間隔で45回測定した。またORAC

り 分 子 量 20,000Da 以 上 の 食 肉 タ ン パ ク 質 は

値 は Net AUC （Area Under Curve） ＝ AUC

6,000Da以下に分解されることが明らかとなった。

sample-AUC blankを用いて算出した。検量線作

3.1

成にはTrolox（125，250，500，1000μＭ）を使食 肉由来ペプチドのDPPHラジカル消去
活性およびORAC法による測定比較検討

用した。

抗酸化活性の評価に用いるタンパク質濃度の検2.6討を行った。ゲルろ過HPLCカラムであるTSK-

遊離アミノ酸分析

分析試料１ｇに対して３倍量の３％スルホサリ

Gel G2000SWXLを用いて食肉ペプチド混合物に含チル酸を加え，冷蔵庫で１時間静置してタンパク

まれるペプチドがすべて安定的に検出されるには質を沈殿させた。その後，3000rpmで15分間遠心0.1mg/ml以上が必要であることが明らかになっ

分 離 を 行 っ た 。上 清 を フ ィ ル タ ー（Cellulose

た。従って本研究では主に0.5および1.0mg/mlのAcetate0.45μm）でろ過し分析試料とした。こ食肉ペプチドを抗酸化活性の評価に供与した。なれをアミノ酸自動分析機（JIC-500）で分析した。

お，標準物質には抗酸化ペプチドとして知られているヒスチジン含有ペプチドのカルノシンおよび

３．結果と考察

システイン含有ペプチドのグルタチオンを用いた。

各種食肉酵素分解物のタンパク質の分子量分布Fig.１に各種食肉由来ペプチドおよび標準物質© The Ito Foundation

33

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についてⅡ

1200
SampleORAC (µM TE)

1000

Carnosine
Glutathione

800

Concentration(mg/ml)
0.5
1.0
0.5
1.0
0.1

Beef

600

0.5
0.75
1.0
0.1

400

Pork

0.5
0.75
1.0

200

0.1
Chicken0
Carnosine

Glutathione

Beef

Pork

Chicken

0.5
0.75
1.0

Fig.２-ａ Dual axis graph shows the value of oxygen radical absorbance capacity（ORAC）of beef, pork

and chicken hydrolysates.

TE, Trolox Equivalent.

のDPPHラジカル消去活性を示した。TEとは既した。これはORAC法がDPPH法よりも非常に感知の抗酸化物質であるトロロックス相当量

度の高い評価系であることが理由として考えられ（Trolox Equivalent）の略である。各種食肉間でる。また各種食肉間でORAC値の有意差は認めらは1.0mg/ml濃度でおよそ40μM TEを示し，有意れなかったが，食肉ペプチドは同濃度のカルノシ差は生じなかった。またカルノシンは痕跡程度のンと近似したORAC値を示したことがわかる。ま

活性しか示さず，グルタチオンはDPPHの紫色がたDPPH法と同様にORAC法でもグルタチオンは確認できないほど強力な抗酸化活性を示した。

他のサンプルよりも高い活性を示した。

この結果は柳内らの報告と一致した 。これは次に，ORAC法を用いて1.0mg/mlにおける抗グルタチオンが電子供与反応に基づく抗酸化力を

酸化力持続能を調査した（Fig.２-ｂ）。トロロッ

有している証拠である。また食肉ペプチドがカル

クスとグルタチオンが似た性質，つまり，一定時

ノシンよりも高い活性を示した理由としては，

間フルオレセインの分解を100％阻害し，ある時

種々のペプチドによる相乗効果であると推測され点から急激に抗酸化力が失われるパターンを持つた。

ことがわかった。一方，カルノシンや食肉由来ペ

23）

Fig.２-ａに各種食肉由来ペプチドおよび標準物質のORAC法により測定した結果を示した。カプチドは徐々に活性を失っていくパターンを有していた。

ルノシン・グルタチオン共に0.5および1.0mg/ml

Fig.３にORAC値およびDPPH値の相関関係をを試験に供した。また食肉由来ペプチドは0.1，示した。食肉ペプチド間では相関係数ｒ＝0.9905，

0.5，0.75および1.0mg/mlを試験に供した。どの

ORAC値＝12.375×DPPH値＋209.69となり，非サンプルも濃度上昇に伴い有意にORAC値が上昇

常に高い相関関係を示した。一方，カルノシンと© The Ito Foundation

34

食肉に関する助成研究調査成果報告書

50000

Blank

RFU

40000

Trolox 1.0M
Carnosine 1.0mg/ml

30000

Glutathione 1.0mg/ml
20000

Beef 1.0mg/ml
Pork 1.0mg/ml

10000

Chicken 1.0mg/ml

0
0

20

40

60

80

100

Time (min)Fig.２-ｂ F luorescence decay curves of fluorescein induced by AAPH in the presence of trolox, calnosine, glutathione

and meat hydrolysates. RFU, relative fluorescence unit; AAPH, 2, 2’-Azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride.

Pork 1.0800

Carnosine
1.0mg/ml

700

ORAC (µM TE)

600

Beef 1.0

Carnosine
0.5mg/ml

500

Chicken
1.0

Beef 0.5400

Chicken 0.5

300

Pork 0.5

200
r = 0.9905
Meat ORAC activity (μM TE) = 12.375 DPPH activity + 209.69

+

100
0
0

10

20

30

40

50

DPPH (µM TE)
Fig.３ Relationship between ORAC activity and DPPH activity. TE, Trolox Equivalent.

食肉ペプチドの間には相関関係は見られなかっこのようにペプチドが抗酸化活性を示す要因はた。一般にORAC値はDPPH値よりも高い値を示

何か。その要因の一つにはペプチドを構成するア

す傾向があることが知られている

ミノ酸の種類が考えられる。そこで，次にアミノ。本研究の14，15）

結果もこの報告と一致した。ORAC値がDPPH値

酸の抗酸化活性について詳細に調査した。

よりも高い値を示す理由は解明されていないが，3.2

アミノ酸の抗酸化活性

本研究を進める過程でORAC法は食肉ペプチドがまず個々のアミノ酸単独の抗酸化活性をDPPH

mg/ml以下でも測定可能なほど高感度

法により調査した。現在，抗酸化アミノ酸としてであった事を確認した。従ってORAC値＞DPPH

はヒスチジン（His），システイン（Cys），チロ

値となる可能性が非常に高いと考えられた。

シン（Tyr）などが知られているが，どのアミノ

1.0×10－３© The Ito Foundation

35

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についてⅡ

50

876.27

DPPH (µM TE)

40
30
20
10
0
His

Cys

Met

Tyr

Trp

Antioxidant amino acids (1.0mg/ml)
Fig.４-ａ Effects of antioxidant amino acids on DPPH radical scavending activity.

1

TE, Trolox Equivalent.

0.797

mg/ml (500µM TE)

0.8
0.6
0.4
0.206

0.2

0.129

0.129
0.0250

0
His

Cys

Met

Tyr

Trp

Antioxidant amino acids
Fig.４-ｂ Effects of antioxidant amino acids on ORAC activity. Vertical value showed the concentration that indicates

500μM TE.

TE, Trolox Equivalent.

酸がどのような性質の抗酸化活性を示すかは明られた。

かにされていない。Fig.４-ａに供与濃度1.0mg/

Fig.４-ｂにORAC法にて評価したアミノ酸の抗mlでDPPHラジカル消去活性を発現したアミノ酸

酸化活性の結果を示した。また評価方法としてを示した。His，メチオニン（Met），Tyr，トリ

500μＭ

プ ト フ ァ ン（Trp）は ORAC 値 を 示 し た た めノ酸濃度（mg/ml）を用いた。アミノ酸の抗酸

Fig.４-ａにも掲載したが，それらのDPPH活性は

化力はTrp＞Tyr≒Cys＞Hisの順に高い値を示し痕跡程度であった。従って明瞭な電子供与反応にた。特にTrpは他のアミノ酸よりも非常に強い活よる抗酸化能を示したアミノ酸はCysだけであっ性を示した。従ってTrpは微量でも抗酸化活性にた。すなわち食肉由来ペプチドの電子供与反応活大きな役割を果たすことが示唆された。

性はCys含有量に大きく左右されることが示唆さ

トロロックス相当量を示すときのアミ

Fig.４-ｃはアミノ酸の抗酸化持続能をORAC法© The Ito Foundation

36

食肉に関する助成研究調査成果報告書

50000
Blank

40000

His
RFU

30000

Cys
Met

20000

Tyr
10000

Trp

0
0

20

40

60

80

100

Time (min)Fig.４-ｃ Fluorescence decay curves of fluorescein induced by AAPH in the presence of antioxidant amino acids.

RFU, relative fluorescence unit; AAPH, 2, 2’-Azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride.

にて解析した結果である。また各アミノ酸濃度はり２段階のなだらかなカーブを持ち，フルオレセ

一律でなく，同実験系に収まる濃度に設定した。

インが経時的に分解されるパターンを示した。まこの結果から抗酸化力には２つのパターンが存在

た鶏肉はTrpの描くカーブと非常に近似していすることが示唆された。それらを１．電子供与た。Trpは微量でも大きな抗酸化活性を示すアミ（ET）型，２．水素供与（HAT）型と名付けた。

ノ酸である。従って牛・豚肉ペプチドはTrpやET型とはここではCys，グルタチオン，トロロッHisなどの影響が大きく，鶏肉はTrpの影響をそ

クスのようにDPPHラジカル消去活性が高く，一のまま反映した抗酸化力であることが示唆され定時間フルオレセインの分解を100％阻害し，あた。従って次にHisやTrpなど抗酸化アミノ酸のる時点から急激に活性が低下するパターンを持つ

定量が必要であると考えられた。そこで各種食肉物質のことをいう。HAT型とはHis，Met，Tyr，にどのようなアミノ酸が含まれているのか，特にカルノシンなどを指し，経時的にフルオレセイン

抗酸化アミノ酸に注目して定量した結果をTable１が分解されていくパターンを持つ物質のことであに示した。すでに報告はあるが，牛肉および豚肉る。このように個々のアミノ酸やペプチドには特は非常に類似したアミノ酸組成を持つ。しかし鶏有の抗酸化活性を持つことが明らかになった。そ肉は牛肉や豚肉と比較してカルノシンやアンセリ

こでアミノ酸やペプチドの持つこのような性質はンの含有量が異なる点が特徴である24）。データに

食肉ペプチドの抗酸化活性にどのような影響を及は示してはいないがアンセリンはカルノシンと同ぼしているのか調査した。

等のDPPH値およびORAC値を示すHis含有抗酸3.3

各種食肉由来ペプチドとアミノ酸の抗酸化ペプチドである。このように鶏肉は他の２種と化活性の関係比較してHis含有量が少なく，わずかであるが各種食肉由来ペプチドとアミノ酸の抗酸化活性

Trpを多く含む。しかし既述の通り，わずかなの関係を示した（Fig.５）。ここで注目すべき点

Trp量が抗酸化活性に影響を与えたと考えられは，牛肉・豚肉ペプチドと鶏肉ペプチドの違いでる。従ってTrp含有量はペプチドの抗酸化力を大ある。牛・豚肉はHisに近い曲線を描いた。つまきく左右するアミノ酸であるといえる。

© The Ito Foundation

37

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についてⅡ

60000
Blank

50000

Beef

RFU

40000

Pork
Chicken

30000

Carnosine

20000

Histidine
10000

Tryptophan

0
0

20

40

60

80

100

Time (min)Fig.５ F luorescence decay curves of fluorescein induced by AAPH in the presence of meat peptides, carnosine, histidine

and tryptophan. RFU, relative fluorescence unit ; AAPH, 2, 2’-Azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride.
Table 1 T he amounts of antioxidant amino acids,

carnosine and anserine in beef, pork and chicken.
Unit（mg/100g）性を発現しており，その活用においては個々のペプチドに適した使用条件の設定が必要である。そのため単一のペプチドよりは，タンパク質分解物

Antioxidant aminoacids and peptides

Beef

Pork

Chicken

His

2.15

1.48

4.74

Cys

0.19

0.21

N.D

Met

3.57

2.47

4.23

活性評価を行うことは重要な研究となってくるだ

Tyr

10.79

10.15

12.49

ろう。

Trp

8.39

7.34

9.17

そこで我々は今後もタンパク質酵素分解ペプチ

Carnosine

208.31243.8044.26

Anserine

49.85

32.14

123.37

ド混合物の抗酸化活性評価や抗酸化ペプチドの基の方がより多様な活性酸素種に対応できると考えられる25）。従ってタンパク質酵素分解物の抗酸化礎的研究を行っていく。例えば，ペプチドが抗酸化活性を発現する要因である「アミノ酸組成」お以上の結果から，食肉酵素分解物の抗酸化活性

よび「立体構造」のどちらが重要であるのか，調を評価した結果，単純に活性値を比較しただけで査していく必要がある。またそれら要因の抗酸化は各種食肉間に有意差は認められなかった。しか活性への寄与度を具体的に数値化し，食肉由来ペ

し，構成アミノ酸に注目して研究を進めた場合，プチド等の抗酸化活性発現作用を明確にしていく

牛肉・豚肉と鶏肉では抗酸化活性の性質が異なる必要がある。

ことが示された。また特にペプチドの抗酸化活性を左右する重要なアミノ酸は高い電子供与（ET）
活性を示すCys，および高い水素供与（HAT）活性を示すTrpであることが示唆された。

４．要

約

本研究では，ORAC法とDPPH法に焦点を絞り，
食肉由来ペプチドの抗酸化力を評価した。またペ一般にペプチドは多様な機構によって抗酸化活

プチドを構成する20種類のアミノ酸の抗酸化活性© The Ito Foundation

38

食肉に関する助成研究調査成果報告書を測定し，食肉由来ペプチドが抗酸化活性を示す
要因についても考察した。
DPPH法にて調査した結果，各種食肉間ではタンパク質濃度1.0mg/mlでおよそ40μＭ

トロロッ

クス相当量の抗酸化活性を示したが，畜種間の活性に有意差は認められなかった。なお，食肉酵素
分解物の添加濃度依存的に抗酸化活性は増加した。カルノシンは痕跡程度の活性しか示さず，グルタチオンはDPPHの紫色が確認できなくなるほど強力な抗酸化活性を示した。これはグルタチオ
ンが電子供与反応に基づく抗酸化力を有している証拠であると考えられた。また食肉ペプチドがカ
ルノシンよりも高い活性を示した理由としては，食肉が有する様々なペプチドによる相乗効果であると推測された。ORAC法にて測定した結果，各種食肉共に非常に高い抗酸化化活性を有することが確認された。各種食肉間でそれらの値に有意差は認められなかったが，同濃度のカルノシンと近似した値が得られた。このように単純に活性値を比較しただけでは各種食肉間に有意差は認められなかったが，食肉を構成するアミノ酸に注目し，ORAC法による抗酸化活性の経時変化を見ると，
牛肉および豚肉と鶏肉では抗酸化活性を左右するアミノ酸が異なることが明らかになった。特に重要なアミノ酸は高い電子供与活性を示すCys，高い水素供与活性を示すTrpであることが示唆された。
我々は今後も，抗酸化ペプチドの基礎的研究を行っていく。次なるステップとしてペプチドの「アミノ酸組成」および「構造」どちらが重要であるのか調査することにより，食肉由来ペプチドの抗酸化活性発現作用を明確にする必要がある。
文 献１） 久保田 大樹，アブドラティフ アーメド，河原聡，六車 三治男：平成21年度食肉に関する助成研
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© The Ito Foundation

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についてⅡ
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© The Ito Foundation

40

食肉に関する助成研究調査成果報告書

細菌性新規プロテアーゼの食肉加工への応用
Application of a novel bacterial protease to meat processing

小

林

秀

丈

（広島国際大学薬学部）

Hidetomo Kobayashi（Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hiroshima International University）

Several enzymes are widely applied to meat processing. Among them, proteases such as
papain are utilized as a meat tenderizer. Tenderization of meat is an important process thatmakes meat easier for the elderly and others to eat. However, the process should be safe andreliable．
Aeromonas sobria is ubiquitously found in aquatic environments. This organism produces
a variety of biologically active substances. Among them, serine protease（ASP）directly acts on
various kinds of proteinaceous components. We have already cloned the ASP gene andestablished a method for purification of ASP. Since bacteria can be easily cultivated, bacterial
proteases are though to be useful and powerful tools in food applications. In this study, we
carried out basic research on the application of ASP to meat processing．
As a result, the following findings were obtained: After treatment of the meat with apreparation containing ASP, we analyzed the proteins by SDS-PAGE. The SDS-PAGE profiles
revealed that the muscle fiber proteins such as myosin and actin were markedly hydrolyzed
by the action of ASP. In contrast, degradation of the muscle fiber proteins was not observed
when the meat was treated with 0.1 or 1.0 μ M subtilisin, which is another bacterial serine
protease produced by Bacillus subtilis. This result suggests that ASP may hydrolyze themuscle fiber proteins more efficiently than subtilisin. We therefore propose that ASP can beapplied to the meat processing as a novel tenderizer at small dosages. However, the results are
not yet sufficient because the sample containing ASP used in this study was a crude
preparation. We must evaluate the proteolytic action using a purified ASP sample. Moreover,
we also need to assess whether ASP actually contributes to tenderization of meat using aproper measuring instrument. Further research is in progress in our laboratory．

１．目

する。そのため食肉軟化にはそれらタンパク質を的

物理的，化学的に切断する処理が行われている１）。

食肉の嗜好的品質は様々な要因により決定され現在，化学的処理の一つとして微生物由来のプロる。その中で食肉の硬さは重要な要因の一つであテアーゼがしばしば用いられ，その有用性についる。食肉の硬さは筋肉組織や結合組織の量に依存て様々な方面から検証されている２）。食肉の軟化© The Ito Foundation

細菌性新規プロテアーゼの食肉加工への応用に用いる場合，プロテアーゼは筋肉組織や結合組

41

大腸菌で複製されるpSA19CPを用いた。

織を構成するタンパク質を切断することでその効

2.3

菌体抽出物の調製果が出ると考えられている。

プロテアーゼ遺伝子を導入した大腸菌をプロテ

近年，高齢者でも美味しく，食べやすい食事へ

アーゼ産生菌として使用した。一方，プロテアーの関心が高まっている。その中で栄養価が高い肉

ゼ遺伝子非導入大腸菌をプロテアーゼ非産生菌と製品の利用価値は高く，高齢者向けに軟らかい食して使用した。LB寒天培地にコロニーを形成し肉の調理加工技術の開発が検討されている３，４）。

た菌をエーゼで少量かき取り２mlのLB液体培地

また，食肉の軟化技術はその嗜好的品質の向上が中に懸濁させ37℃で一晩振盪培養した。培養菌液期待され，高齢者のみならず食肉を食べる多くのを100ml LB液体培地に植菌し，さらに37℃で16人がその恩恵をこうむる有用な技術であると考え時間振盪培養した。遠心分離（8,000×ｇ，15分）

られる。

にて培養液を除去後，菌体を20mMリン酸緩衝液

我々は淡水中に生息している細菌である（pH7.5）に懸濁して超音波処理により菌体を破Aeromonasの培養上清中より高いプロテアーゼ

砕した。遠心分離（18,000×ｇ，30分）にて不溶活性を見出し，それがsubtilisin様セリンプロテ性画分（菌体膜成分などが含まれる）を除去後，アーゼであることを同定した５）。また，本プロテ

上清をプロテアーゼが含まれる菌体抽出物としてアーゼは20～70℃，pH４～11の広い範囲で活性使用した。一方，枯草菌のプロテアーゼとして市販を有すること，さらにsubtilisinとは異なるアミのsubtilisin（Sigma, St Louis, MO, USA）を1μＭ

ノ酸配列を認識して切断することを明らかにしもしくは0.1μＭの濃度に調製し，比較のために使た６）。Subtlisinはこれまで食肉の軟化に一般的に用した。

使用されているプロテアーゼであるが，本プロテ

2.4

アーゼはいくつかの性状でsubtilisinよりも優れ菌の産生するプロテアーゼの活性はアゾカゼイ

たプロテアーゼであることが期待できる。そこ

ンを基質とした方法により測定した。菌体抽出物で，本研究ではAeromonasが産生する新規プロテに20μｌの0.2Ｍリン酸緩衝液（pH7.5），20μｌのアーゼを食肉の軟化へ応用することを目的に，基20％アゾカゼインを加え37℃で１時間インキュ

礎的な知見を収集することにした。

ベーションした。反応後，10％トリクロロ酢酸溶

２．方

法

2.1

料

試

プロテアーゼ活性の測定液を加え反応を停止させた。
遠心分離（18,000×ｇ，30分）後，上清に等量の10Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加え，450nmにて吸光度を測定した。

鶏もも肉は食料品店で購入し，皮および脂身を取り除き約0.5ｇに整形したものを試料として使

2.5

菌体抽出物の添加

菌体抽出物およびsubtilisin溶液は食肉重量１ｇ

用した。

あたり約４mlとなるようにそれぞれ添加した。

2.2

菌体抽出物添加後，４℃で16時間，室温で２時間，大腸菌株およびプラスミド

プラスミド遺伝子の精製ならびにプロテアーゼ

37℃で２時間それぞれ反応させた。

の 産 生 に は 大 腸 菌 HB101 株（Takara Bio Inc.,

2.6

Shiga, Japan）を使用した。プロテアーゼ遺伝子

菌体抽出物処理後の鶏肉，またはsubtilisin処理のクローニングに用いるプラスミドベクターは，後の鶏肉に約500μｌの水溶性タンパク質抽出溶© The Ito Foundation

水溶性タンパク質の抽出42

食肉に関する助成研究調査成果報告書
1.6
1.4

absorbance at 450nm

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
ASP-

ASP+

1μMSub

0.1μMSub

Fig.１ Proteolytic activity of Aeromonas protease and subtilisin. E. coli HB101 was transformed with the plasmid

including the A. sobria serine protease（ASP）gene or the vector plasmid alone. The crude preparation containing
ASP（ASP＋） or not（ASP－） was obtained as described in the method. The proteolytic activities of these
preparations were measured using azocasein．

液 〔0.25M Tris （hydroxymethyl）

および非産生菌より抽出した菌体抽出物のプロテ

aminomethane，0.25Ｍスクロース，１mMエチ

アーゼ活性を測定した。プロテアーゼ産生菌およレンジアミン四酢酸，１mMふっ化フェニルメチ

び非産生菌を，アゾカゼインを基質としたプロテ

ルスルホニルpH7.6〕を加えホモジナイザーで食アーゼ活性を測定した。その結果，プロテアーゼ

肉片を均質化した。遠心分離（18,000×ｇ，20分）

産生菌は非産生菌と比較して高いプロテアーゼ活

後の上清を水溶性タンパク質抽出画分とした。同性が観察された（Fig.１）。枯草菌産生プロテアー

様の抽出操作をSDS-PAGEでバンドが確認できなゼであるsubtilisinについても同様にプロテアー

くなるまで繰り返した（６回）。抽出した水溶性

ゼ活性を測定した結果，使用した基質に対するプタンパク質溶液のタンパク質量は，BSAを検量

ロテアーゼ活性が認められた。次いで，それらの線に用いたBradford法により決定した。

菌体抽出物およびsubtilisin溶液を食肉に添加し2.7

筋線維タンパク質の抽出解析を行った。

水溶性タンパク質抽出後の沈殿を蒸留水で洗浄

3.2

水溶性タンパク質への影響

後 ，約 500μｌ の 筋 線 維 タ ン パ ク 質 抽 出 溶 液

種々の処理条件でプロテアーゼ産生性菌体抽出〔0.25M Tris（hydroxymethyl）aminomethane ，物，非産生性菌体抽出物，subtilisinおよび未処理

2 ％ SDS ，10mM Imidazole ，mM Dithiothreitolを行った食肉試料より水溶性タンパク質の抽出を

pH7.0〕を加え混和した。遠心分離（18,000×ｇ，行った。試料より抽出したタンパク質濃度を定量20分）後の上清を筋線維タンパク質抽出画分としし，各試料10μｇとなるように10％SDS -PAGEにた。

より分離しタンパク質のバンドを確認した。その結果，プロテアーゼ処理サンプルは未処理サンプ

３．結果と考察
3.1

ルと比較して同様なバンドパターンを示すことがプロテアーゼ活性観察された（Fig.２）。また，今回試験した処理

Aeromonas由来のプロテアーゼを産生する菌

条件の違いによる変化も観察されなかった。従っ© The Ito Foundation

43

細菌性新規プロテアーゼの食肉加工への応用

Control

0.1μM Sub

１μM Sub

ASP－

0.1μM Sub

１μM Sub

ASP＋

ASP＋

37℃, 2h

RT, 2hASP－

0.1μM Sub

１μM Sub

ASP＋

(kDa)

ASP－

4℃, 16h

250
150
100
80
60
50
40

30
Fig.２ SDS-PAGE profile of the water-soluble proteins extracted from meat treated with ASP or subtilisin. The water-soluble proteins were extracted from the meat treated with the crude preparations（ASP＋，ASP－）as describedin the method, or subtilisin（Sub）. The water-soluble proteins were also extracted from the meat without suchtreatment（Control）.The proteins（10μg）were separated by10 ％ SDS-PAGE. Numbers along the left side refer tothe molecular masses of standard proteins（in kilodaltons）.RT means“room temperature”．

て，今回試験を行った食肉処理条件において，り，Aeromonas由来のプロテアーゼは食肉中のア

Aeromonas由来のプロテアーゼは食肉水溶性タ

クチンおよびミオシンの分解を行うことが明らか

ンパク質に影響を及ぼさないことが推察される。

になった。アクチンおよびミオシンは筋線維の主3.3

筋線維タンパク質への影響

要な構成タンパク質であり食肉の硬さと密接に関

水溶性タンパク質の抽出の項目と同様の処理条係する。今回，Aeromonas由来のプロテアーゼが件下で処理した食肉試料より筋線維タンパク質のこれらのタンパク質を分解することで，食肉中の抽出を行った。試料より抽出したタンパク質濃度

筋線維を分解することで食肉の軟化を導くと推察を定量し，各試料10μｇとなるように7.5％SDS -される。また，今回試験したすべての処理条件に

PAGEによりタンパク質のバンドを確認した。そおいて，Aeromonas由来のプロテアーゼは筋線維の結果，未処理およびプロテアーゼ非産生性菌体

タンパク質を分解することから，本プロテアーゼ

抽出物を処理した食肉試料より抽出したサンプル

が様々な処理条件に対応できる有用なプロテアー

は200kDaのミオシンおよび45kDaのアクチンのゼである可能性が示唆される。さらに，産業的にバンドが観察された（Fig.３）。一方，Aeromonas

広く使用されているsubtilisinと比較して筋線維由来のプロテアーゼを処理した食肉試料より抽出

タンパク質を分解する効果が高いことから，食肉したサンプルはアクチンおよびミオシンのバンド分野において本プロテアーゼがsubtilisinに代わが消失していることが観察された。この結果よる有用なプロテアーゼとなることが期待できる。

© The Ito Foundation

44

食肉に関する助成研究調査成果報告書

RT, 2h37℃, 2h

ASP－
ASP＋
１μM Sub
0.1μM SubASP－
ASP＋
１μM Sub
0.1μM SubASP－
ASP＋
１μM Sub
0.1μM Sub
Control

4℃, 16h(kDa)
250

myosin

150
100
80
60
50

actin

40

Fig.３ SDS-PAGE profile of the muscle fiber proteins extracted from meat treated with ASP or subtilisin. The muscle

fiber proteins were extracted from the meat treated with the crude preparations（ASP ＋ ， ASP －）as describedin the method, or subtilisin（Sub）. The water-soluble proteins were also extracted from the meat without suchtreatment（Control）.The proteins（10μg）were separated by 8％SDS-PAGE. Numbers along the left side refer tothe molecular masses of standard proteins（in kilodaltons）. Arrows along the right side indicate myosin（200kDa）
and actin（45kDa）bands, respectively. RT means“room temperature”．

今後，本プロテアーゼの精製プロテアーゼ標品を～70℃，pH４～11で活性を有するsubtilisin様セ調製し，食肉への処理濃度および条件を検討する

リンプロテアーゼであることを明らかにした。さとともに，剪断強度などを測定し軟化を引き起こ

らに，塩基性側鎖のアミノ酸配列を特異的に認識

すかについて評価する予定である。

して切断することなど，本プロテアーゼの性状は

４．要

い く つ か の 点 で subtilisin よ り も 優 れ た プ ロ テ

約

アーゼであることが期待された。そこで，食肉軟

食肉加工の分野において様々な目的のために酵素が広く利用されている。特に，プロテアーゼは化を目的にAeromonasの産生するセリンプロテ
アーゼの有用性について検討を行った。

食肉中の筋肉組織や結合組織を構成するタンパク

Aeromonasの産生するセリンプロテアーゼ遺質を切断することで軟化させる効果が期待され伝子を導入した大腸菌抽出液を鶏もも肉へ作用さる。本研究では細菌由来プロテアーゼの食肉軟化

せ，水溶性タンパク質および筋線維タンパク質をへの応用について検討を行ったものである。

抽出しそれぞれのタンパク質の分解をSDS -PAGE

Aeromonasは淡水中に生息している細菌であり，で解析した。その結果，プロテアーゼ産生菌抽出その培養上清中に高いプロテアーゼ活性を有する液処理サンプルではそれぞれのタンパク質の未処のが特徴である。我々はこれまで本菌の産生する理のサンプルと比較した。セリンプロテアーゼ非

セリンプロテアーゼについて性状解析を行い，20

導入大腸菌と比較した結果，水溶性タンパク質に© The Ito Foundation

細菌性新規プロテアーゼの食肉加工への応用

対してはそれほど大きな影響は与えなかったが，筋線維タンパク質のアクチンおよびミオシンを分解することを明らかにした。アクチンおよびミオシンは筋線維の主要な構成タンパク質であり，加熱調理後の筋線維タンパク質の変性が食肉の硬さと密接に関係している。今回，Aeromonasのセリ
ンプロテアーゼを食肉へ作用させた際にアクチン
およびミオシンを分解することから，本プロテアーゼは食肉を軟化させる効果を有する可能性が示唆された。さらに，今回試験した低温でも効果が観察されたことから，と畜後の低温熟成過程で

45

文 献
１）
 池内義秀，他：高圧力の科学と技術，16，17～
25，2006．
２）
 井上國世：フードプロテオミクス食品酵素の応用
利用技術，１～12，シーエムシー出版，東京都，
2004．
３）
 Sugiyama, S., et al. : J Nutr Sci Vitaminol（Tokyo），51，27～33，2005．
４）
 Asakura, T., et al. : Application of plant
proteinases to production of multi-functional foodfor elderly persons, Urakami Foundation
Memories，2009．
５）
 Okamoto, K., et al. : Microbiol. Immunol., 44，787～798，2000．
６）
 Kobayashi, H., et al. : FEMS. Microbiol. Lett.,
256，165～170，2006．

の処理にも適応できる可能性があり，本プロテアーゼの優位性が示唆された。

© The Ito Foundation

46

食肉に関する助成研究調査成果報告書

低温乳酸発酵による食肉の組織構造とタンパク質
化学的変化に関する研究
Changes in tissue structure and chemical properties of proteins in meat during
fermentation using psychrotrophic lactic acid bacteria

芳

賀

聖

一・林

利

哉

（名城大学農学部）

Seiichi Haga and Toshiya Hayashi（Faculty of Agriculture, Meijo University）

The authors have previously reported that product quality and safety in sausage
production using commercially available pork can be improved by inoculation of psychrotrophic
lactic acid bacteria at the time of the routine curing process．
In the present study, we inoculated two kinds of psychrotrophic lactic acid bacterial
starter culture strains and examined the tissue structure of cured pork during fermentation.
The results showed a constant presence of a large number of lactic acid bacteria on the orderof 108 in the cured pork during 10 days of fermentation. The Lactobacillus sakei No. ４ strain,part of our laboratory collection, was more effective for decreasing pH compared to thecommercially available Lactobacillus sakei D-1001. There were also clear differences in muscle
fiber and connective tissue structures, which determine the texture of meat products, between
fermented and non-fermented samples and between strains. Specifically, in addition to
exhibiting the largest decrease in pH, the sample inoculated with the lactic acid bacterial strain
No. ４ showed a three-dimensional network of finer granular denatured proteins between andwithin muscle fibers, as well as a loose endomysium structure of collagen fibers due to thefermentation process. The above results are expected to lead to new a production process formeat products and may strongly influence preferences, such as texture．

１．目

いての多くの報告１，２）がみられ，著者ら３，４）も乳的製品によく使用される乳酸菌によって派生したペ欧米では伝統的な発酵食肉製品の製造が古くか

プチドの有用性について報告した。著者らは，我ら製造されているが，我が国では食肉に関してのが国で多く製造されているクックドソーセージの発酵技術の使用は様々な理由であまり普及してい製造過程の塩漬工程にバイオプリザーバティブとない。しかし，発酵食品の健康への寄与についてしての低温増殖性乳酸発酵を取り入れ，安全性のは多くの報告があり，食肉製品製造においてもそ向上に加え，食感の改善による嗜好特性の改善，の技術を活かすことは有用と考えられる。我が国

さらには機能性の付与による製品の付加価値の向ではこの十数年の間に発酵食肉製品の有用性につ上を意図して研究を重ねてきた。特に，著者らが© The Ito Foundation

低温乳酸発酵による食肉の組織構造とタンパク質 化学的変化に関する研究47保有する低温下（４℃以下）でも増殖能を有する

用いた低温増殖性乳酸菌はリボソームタンパク質

乳酸菌は食品衛生上極めて有効な微生物といえの質量解析結果によって95％の相同性をもつが，る。これまで保有乳酸菌のスクリーニングを行異なるグループに分類された菌株である５）。

い，既に塩漬食肉中で旺盛に増殖する菌株の選2.2

定・分類に至っている 。それらの乳酸菌を用い

新鮮な市販豚モモ肉から脂肪と結合組織をできて，食肉を低温発酵させた場合のタンパク質分解

るだけ取り除いたおよそ１cm角の大きさの赤肉の程度やそれに伴う機能性発現の有無についてに ， 塩 漬 剤 （NaCl ： 2.0 ％， NaNO2 ： 0.02 ％，

種々検討した。その結果，低温乳酸発酵によって，KNO3 ：0.05％，トリポリリン酸Na：0.30％）お筋原線維タンパク質が分解し，派生する分解物のよびグルコース２％を加えた。その際，発酵食肉

中に，種々の生理機能をもったペプチドが存在すの場合，乳酸菌スターターを10６CFU/gレベルでる可能性を見出しており，低温乳酸発酵が食肉の接種した。その後，低温下（４℃）にて10日間静機能性改善に有効であることを示した 。しかし置して発酵させた。

５）

６）

試料の調製

ながら一方で，食肉製品に求められる品質には，

2.3

嗜好性が極めて重要であることはいうまでもな

低温下（４℃）で発酵させた塩漬豚肉を滅菌生く，特に，結着性や保水性は製品の品質決定要素

理食塩水で10倍～108 倍の範囲で段階希釈し，として重要視されている。従って，高品質な発酵

MRS寒天培地中に希釈液１mlを混和させ，30℃

食肉製品を開発するためには，これらの品質に及で48時間培養し，試料１g中の乳酸菌数を算出しぼす影響を考慮した研究が必要となる。

た。

そこで本研究は，本研究室でスクリーニングし2.4

乳酸菌数の測定

pH測定

た乳酸菌を用いて，塩漬豚肉を低温発酵させた場

各試料10ｇに対して25mlの蒸留水を加え，ホ合の，筋原線維および結合組織の組織構造に着目

モ ジ ナ イ ザ ー（IKA-WERKE GMBH & CO.KG,

して検討した。このことは塩漬・発酵工程後の製IKA T25 Basic）で均質化（11,000／min，２分）

造過程において食肉製品の保水性・結着性発現のした後，pHメーター（堀場製作所，Ｆ-12）で測

鍵因子となる可能性が高く，筋原線維タンパク質定した。

の変性・分解過程を経た後，食肉製品製造におけ

2.5

る製品品質の改善をはかるための重要な基礎デー
タとなる。
２．方
2.1

走 査 型 電 子 顕 微 鏡（Scanning Electron
Microscope）による筋線維構造の観察

各試料を３mm角にトリミングした後，2.5％グ
ルタルアルデヒドを含む0.1M Na-リン酸緩衝液

法（pH7.0）を用いて24時間の前固定を行い，１％四スターター調製

酸 化 オ ス ミ ウ ム を 含 む 0.1M Na- リ ン 酸 緩 衝 液

市販のLactobacillus sakei D-1001および当研究（pH7.0）を用いて５時間の後固定を行った。その室 保 有 の 低 温 増 殖 性 乳 酸 菌 Lactobacillus sakei

後，脱水，置換，臨界点乾燥（日立工機株式会社，

No.４（以後，Ｄ-1001，No.４と略す）をMRS液

HCP-２型），金・パラジウムを蒸着（日立株式会体培地中にて30℃で18～24時間培養し，遠心分離社，Ｅ-101）し，観察用試料とした。観察は走査（8,000×g，10分）して得られた沈殿を，滅菌生型電子顕微鏡（日立計測器サービス株式会社，

理食塩水で懸濁してスターターとした。本実験でＳ-3000Ｈ）（以下，SEMと略す）を用い，加速電© The Ito Foundation

48

食肉に関する助成研究調査成果報告書
6.5
6.3

8

6.1

7

5.9

6

5.7

5

5.5

pH

(log CFU/g meat)

Lactic acid bacterial counts

9

A

4

5.3

3

5.1

2

4.9

1

4.7

0

B

4.5
0

1

5

0

10

days
control

D-1001

1

5

10

days
No.4

control

D-1001

No.4

Fig.１ Changes in psychrotropic lactic acid bacterial counts（A）and pH（B）of cured pork meat at 4℃ during
fermentation

圧25kVで1000倍ならびに10,000倍で観察し，装備されたカメラで撮影した。
2.6

る乳酸菌数とpHの変化を示した。
その結果，control区では102 レベルの乳酸菌数

細胞消化法による結合組織構造の観察

が日数経過に伴い104 レベルへとわずかな増加に

各試料を６mm×６mm×10mmにトリミング

止まったのに対し，乳酸菌を接種した発酵試料でした後，試料の前固定を10日間行い，Ohtaniらのは本実験の発酵期間を通し，107～108レベルと高方法７）に従って７日間細胞消化，蒸留水で５日間

い乳酸菌数を維持することが確認された。次に，洗浄，１％タンニン酸に３時間浸漬，蒸留水で５pHに関しては，control区ではpH6.0前後で安定し時間洗浄を行った。その後，１％四酸化オスミウ

た値を示したが，発酵区では発酵期間の延長に伴ムによる５時間の後固定を行い，臨界点乾燥，イ

い漸次低下し，Ｄ-1001では5.03，No.４では4.64

オンスパッタリングを行ったものを結合組織観察まで低下した。本報告では示さないが，当研究室用試料とした。

で保有する16の低温増殖性乳酸菌株についてpH
低下能に基づく分類を行っており，No.４のpH低３．結果と考察
3.1

下能が最大であることが判っている。

低温増殖性乳酸菌を接種した塩漬豚肉に3.2おける乳酸菌数とpHの経時的変化

低温発酵を施した塩漬豚肉の筋線維構造変化

発酵食肉製品に用いるスターターを選択する上食肉製品においてその物理学的特性は，組織構で重要な点は，発酵過程において食肉中で安定し造の変化と密接な関係があり，それは製品の嗜好

た生育によるpHの低下にある。pHの変化は食肉性にも反映されることから微細構造の変化を調べの組織構造，塩漬時のタンパク質抽出量そして加ることは意義深いといえる。特に，筋線維および熱時の加熱損失率など，食肉製品の嗜好性に関わその主体となる筋原線維タンパク質の状態は前述

る重要因子となる。Fig.１に低温発酵過程におけしたように食肉の物性を決定づける要因であり，© The Ito Foundation

低温乳酸発酵による食肉の組織構造とタンパク質 化学的変化に関する研究

A

49

C

B
E

D

Fig.２ Scanning Electoron Micrographs of muscle fiber after ten days
A, non-fermented pork meat ; B.C, Fermented pork meat（Lactbacillus sakei D-1001）; D.E, Fermented porkmeat（Lactbacillus sakei No.4）.A scale bar : A, B and D（50μm）,C and E（5μｍ）

発酵過程における筋線維構造の変化が食肉製品のネットワークの形状についてはpH低下度の異な品質に与える影響は少なくないと考えられる。

る２つの乳酸菌株間で大きな差異が認められた。

そこで，低温発酵過程における筋線維の変化を

すなわち，Ｄ-1001による発酵試料のネットワー

SEMにより観察し，10日目の像をFig.２に示した。

クはミオシンやアクトミオシンからなる球状の変

その結果，control区では10日間経過しても形状，性タンパク質で構成されるのに対し（Ｃ），No.４

筋線維のサイズおよび筋線維間隙の形態的な変化のそれはより細かい粒状のタンパク質からなるは認められなかったが（Ａ），乳酸菌接種区では（Ｅ）ことが明らかとなった。このような結果は，発酵10日目で筋線維の収縮，筋線維間の間隙拡

ミオシン溶液の緩慢なpH低下は加熱処理を施さ張，筋線維内および筋線維間における三次元ネッ

なくても保水性に富んだ弾性的なゲルを形成する

トワーク形成が観察された（Ｂ～Ｅ）
。さらに，という報告８）を裏付けるものであり，さらには塩© The Ito Foundation

50

食肉に関する助成研究調査成果報告書

A

B

C

D

Fig.３ Scanning Electoron Micrographs of endomysium in muscle after ten days
A and B, non-fermented pork meat; C and D, Fermented pork meat（Lactbacillus sakei No.4）.A scale bar : A
and C（50μm）,B and D（5μｍ）

漬工程の後に行う加熱処理によって得られるゲル構成されている（Ｂ）のに対し，発酵処理を施し構造の差異に反映し，物性値ひいては嗜好性にもた２試料は粗野な線維構造になっている（Ｄ）こ

大きな影響を与えることがこれまでの研究から推とで裏付けることができた。Nishimuraら10）は豚察される。

生肉を使用した際に，熟成14日間の結合組織構造

3.3

低温発酵を施した塩漬豚肉の結合組織構

変化について観察しており，蜂の巣状構造は維持

造変化

されつつもコラーゲン線維の配列や緻密性が熟成

食肉は死後硬直後の硬直解除によって熟成が進期間に伴い失われていくことを報告している。本んでいくが，食肉の軟化現象の一因として結合組

実験での結果は発酵により結合組織構造の崩壊が織内のプロテオグリカンの分解による筋内膜や筋促進されたことを意味し，このことも食肉製品の周膜の崩壊がNishimuraらの一連の報告

物性，および嗜好性に強く反映されるものと考え

９）

により

明らかにされている。そこで発酵処理が食肉の結合組織構造に及ぼす影響について組織構造的に検討し，筋内膜像をFig.３に示した。その結果，未

られる。
４．要

約

発酵試料と発酵試料に差異が認められ（Ａ，Ｃ），

本研究で使用した低温増殖性乳酸菌スターター

筋内膜のシート状壁面が発酵により薄くなっていは，発酵10日間で108レベルの高い乳酸菌数を維持る様子が観察された。すなわち，それはcontrol

しており，そのpH低下能は市販されるLactobacillus

区とした未発酵試料では緻密なコラーゲン線維で

sakei D-1001よりも当研究室保有のLactobacillus© The Ito Foundation

低温乳酸発酵による食肉の組織構造とタンパク質 化学的変化に関する研究

sakei No.４の方が強いことが確認された。また，
食肉製品のテクスチャーを決定づける要因となる
筋線維構造，結合組織構造は発酵の有無，乳酸菌
株の違いによる明らかな差異が認められた。すな
わち，pH低下の大きかった乳酸菌株No.４接種試
料では筋線維間や筋線維内に，より微細な粒状変性タンパク質からなる三次元ネットワークが観察され，また，筋内膜を構成するコラーゲン線維は発酵処理により膜組織がルーズな構造となっていることが観察された。以上の結果は，食肉製品製
造工程において通常の製品とは異なる製品製造につながり，食感をはじめとする嗜好性に強く反映されることが考えられる。

51

文 献１）有原圭三：食肉の科学，48（1）,4～19, 2007.
２） 有原圭三，大畑素子：食肉の科学，50（2）,202～
211, 2009.
３）加藤久美子，林利哉，芳賀聖一：名城大学総合学
術研究論文集，4, 87～95, 2005.
４）林利哉，加藤久美子，芳賀聖一：名城大学総合学
術研究論文集，7, 71～80, 2008.
５）寺本華奈江，佐藤浩昭，孫麗偉，鳥村政基，田尾博明，和栗伸伍，林利哉，芳賀聖一：分析化学，56（12）,1063～1070, 2007.
６）林利哉，和栗伸吾，小川幸彦，芳賀聖一：平成19年度食肉に関する助成研究調査報告書，26, 44～49,
2008.
７）Ohtani,O.,Ushiki,T.,Taguchi,T. and Kikuta,A. :Arch.Histol.Cytol., 51, 249～261, 1988.
８）K. Fretheim, B. Egelansdal, O. Harbitz and K.
Samejima：肉の科学，27（2）,155, 1986.
９）T. Nishimura, A. Hattori and K. Takahashi : Meat
Science, 42（3）,251～260, 1996.
10）T. Nishimura, S. Fang, T. Ito, J. Wakamatu and K.
Takahashi : Animal Science Journal, 79, 716～721,
2008.

© The Ito Foundation

52

食肉に関する助成研究調査成果報告書

伝統的魚肉加工手法の食肉加工への応用 ⑵Application of Traditional Fish Processing Techniques to Meat Processing ⑵

漆

間

創・岩

田

淑

子・宇 多 川隆

（福井県立大学生物資源学部）

Hajime Uruma, Toshiko Iwata and Takashi Utagawa（Department of Biosicence, Fukui Prefectural University）“Heshiko”is a traditional Japanese fermented fish product made from mackerel. It is madeby gutting mackerel, pickling it in salt from one to two weeks and then letting it ferment in abarrel packed with rice bran for six to twelve months at room temperature. During thisfermentation period, amino acids and peptides are produced from the mackerel by the reactionof protein hydrolyzing enzymes. The motivation behind Heshiko production is to preserve themackerel and to improve its taste．
In our last study, we took up the challenge of applying the Heshiko production process topork and beef to produce new prototypes of ham-like foods, which we named“Heshiko-ham”．
We were able to confirm that pork could be preserved for more than six months without any
rotting and that its amino acids were increased. However, evaluation of the finished products
suggested that their taste was too salty．
In this study, we investigated the salting conditions at the initial stage to reduce thissaltiness, and found that salting for two days is suitable for two kilograms of meat to produce
mildly salty Heshiko-ham. After two days salting, the meat was pickled in rice bran for six toeight months to complete fermentation．
The fermented meat was evaluated by special chefs, who also gave us suggestions on how
to use the Heshiko-ham. They prepared dishes with the Heshiko-ham for evaluation．
Along with the formation of amino acids, peptides were detected in extracts of thefermented meat. We examined the effect of the extracts on the angiotensin Ⅰ converting
enzyme inhibitory activity, which is an index for the blood pressure lowering effect, but thiseffect was weak compared with fish extracts．
We also applied the Heshiko production process to wild boar meat to obtain anotherprototype ham. We found that the wild boar ham contains a high amount of free amino acids inthe extracts of its fermented meat．

１．目

時代から続く魚介類の保存技術であり，大量のサ的バが越前海岸にて捕獲された時の保存方法として

福井県の伝統的発酵食品の「へしこ」は，江戸開発されてきたものである。内臓を除去した後に© The Ito Foundation

伝統的魚肉加工手法の食肉加工への応用 ⑵53

約１週間の塩蔵後，糠に漬けて室温にて長期間保は市販の海水塩（並塩，鳴門塩業（株）製）を存 す る も の で ，そ の 間 に ，好 塩 性 の 乳 酸 菌

50kg単位で購入し使用した。米糠は福井県内の（Tetragenococcus halophilus）が生育し乳酸を生市販品を購入し使用した。

成することにより，糠の環境を酸性側にシフトさ

食肉を塩漬けおよび糠漬け発酵させる樽は，漬せる。この乳酸の効果と塩の効果で，雑菌の繁殖

物用に市販されている15lから30lのプラスティッ

が抑えられ，「へしこ」の品質が保たれている。

ク製の容器で中蓋と対になっているものを購入しこの糠漬け期間中に，サバの自己消化酵素が作用使用した。重石は市販されている，２～５kgのし，遊離アミノ酸及びぺプチド類が生成し，「へものを組み合わせて使用した。

しこ」独特の旨味が出てくる 。即ち，「へしこ」

2.2

塩漬け及び糠漬け方法

生産技術は保存と旨味を付ける優れた技術と考え⑴

塩漬けられる。さらに，最近の研究で，生成するペプチ

前報３）と同じように，各肉のブロック（約２ドに血圧を低下させる効果があることが報告されkg）に食塩をすり込み，プラスティック容器にている 。

肉を重ねるように漬け込む。塩の量は，肉の重量

１）

２）

我々は「へしこ」生産方法は，魚肉の保存だけ
でなく，他のタンパク食材の保存に応用できるのの約30％とした。中蓋を乗せ，上から肉重量とほぼ同じ重量の重石を乗せて室温に置いた。

ではないかと考え，豚肉と牛肉に応用しハム様の⑵

加工食品が生産される事を報告した 。

塩漬け後，肉を取り出し，肉に付着している塩

３）

糠漬け

しかしながら，「へしこ」と同じ条件で食肉をを充分に落とす。プラスティック容器にポリエチ漬けると，アミノ酸の遊離は認められたものの，レンの袋を入れ，底に米糠を敷き，その上に米糠

塩味が強すぎるという評価結果が得られ，塩味のを刷り込むようにしてまぶした肉を乗せ，肉と肉改善が課題であった。一方，食肉においても，サの間に糠の層を作るようにして重ねる。最後に，

バと同じように糠漬け中にペプチドの遊離が予想

糠を上部に重ね，空気を追い出すようにして抑され，その生理活性も期待された。

え，ポリエチレン袋の上部を縛った。その上に落今回，豚肉を原料としてつくる「へしこハム」の味の改善と，遊離ペプチドの生理活性についてとし蓋を乗せ，肉とほぼ同重量の重石を乗せて室温にて６～８ヶ月間発酵させた。

検討することを目的とした。さらに，最近，福井2.3

県で獣害として問題になっているイノシシの肉を各々肉片0.5ｇを粉砕後，２％スルホサリチル

豚肉と同じように糠漬けにすることにより発酵さ酸を添加し50mlとした後，10分間振とう混合しせ，ハム様の加工肉の生産についても検討した。

た後，混合液を遠心分離する。その上清を精密ろ過した後，遊離したアミノ酸をアミノ酸アナライ

２．材料と方法
2.1

材

遊離アミノ酸分析

ザーにて分析した。
2.4

料

pH測定

豚肉（モモ肉）は福井県の食肉加工専門店であ糠を等重量の水に懸濁し，肉のpHは肉片を粉る（株）カワグチより入手した。イノシシの肉は砕後等量の水に懸濁してpH計（堀場製作所）に地域の方から提供されたものを使用した。重量はて計測した。

約２kgの塊とし，必要に応じて加減した。食塩© The Ito Foundation

54

食肉に関する助成研究調査成果報告書

2.5

ペプチドの定量た馬尿酸を抽出する。

豚肉エキスの調製：豚肉20ｇに対して蒸留水

５）6000rpm，10分間遠心分離し，酢酸エチル

100mlを加え，ホモジナイズした後，100℃で５層を150μｌ回収，別のエッペンチューブに分間加熱した。室温まで冷却した後，遠心分離機

入れる。

により２℃で30分間遠心分離（10000ｇ）して上６） 酢 酸 エ チ ル 層 150μｌ 入 れ た エ ッ ペ ン

清ａを得た。沈殿に蒸留水を50ml加えて撹拌しチューブをデシケーター中に入れ，水流アスた後，同条件で遠心分離し上清ｂを得た。上清ａ

ピレーターにて酢酸エチルを乾燥する。

およびｂを合わせた後，ポアサイズ３μｍのセル７）蒸留水を900μｌ加えて撹拌し，228nmの吸

ロースアセテートメンブレンを用いてろ過し，蒸留水で250mlに定容して熱水抽出エキスとした。
ペプチドは，得られた抽出エキスを，Lowry法

光度を測定する。
2.7

味覚評価

発酵した肉を取り出し，糠を落とした後，薄い４）切片を作成して評価した。満足できたへしこハム

2 . 6 アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害

は，近隣のレストランの専門シェフによって評価により定量した。

を行い，へしこハムを用いた14種類の創作料理を活性の測定
ACE阻害活性は山本らの方法５）に準じて測定

シェフ等の料理専門家を招待して行った。

した。
⑴

調理して頂いた。味覚評価は，福井県のホテルの試

薬

ホウ酸buffer：1MNaClと0.05MNa ２ B ４ O ４ の溶３．結果と考察

液と，１MNaClと0.2MH３BO３の溶液とを混合し，

3.1

塩味の調整

pH8.3に調整。

前報で調製した「へしこハム」は塩味が強すぎ

ヒプリル-Ｌ-ヒスチジル-Ｌ-ロイシン（HHL）

ると言う評価であったため，塩味の加減が必要で

溶液：HHLacetate saltはSIGMA社より購入し，あった。その調整を，初期の塩漬け時間によって

硫酸bufferを加えて，12.5mMに調整した。

行うこととし，約２kgブロックの肉を２日，３日，

アンジオテンシンⅠ変換酵素（ACE）溶液：

４日塩漬けした後に糠漬けに移行した。糠漬け

ACE は Lung acetone powder from rabbit を

５ヶ月後に取り出し，アミノ酸分析を行った。

SIGMAより購入し，これに蒸留水を加え撹拌後，遠心分離し，上清を酵素液として使用した。
⑵

Fig.１に示すように，２kgの肉に対して２日間の塩漬けした肉のアミノ酸含量が最も高く，塩漬
け時間が長くなると遊離アミノ酸量が低下する傾

測定手順１）氷上でエッペンチューブに各試料を15μｌ向にあった。

と，HHL溶液（試薬２）を30μｌ添加し，このことは，肉に含まれるプロテアーゼが肉中37℃で，５分間プレインキュベートを行う。

に塩が浸透することによって塩濃度が高まり，活２）ACE溶液（試薬３）を30μｌ添加し，撹拌

性が抑えられる事を示唆している。

した後，37℃で60分間インキュベートを行う。

肉の塩味も，２日間塩漬けしたものが最もマイ３）0.5Ｍ塩酸を75μｌ加え撹拌し反応を停止さルドであり，旨く感じられた。塩漬け期間が長くなると塩味が強くなった。そこで，２kgの肉塊せる。
４）酢酸エチル450μｌを加え撹拌し，遊離しに対し，２日の塩漬けすることを基準とし，糠漬

© The Ito Foundation

55

伝統的魚肉加工手法の食肉加工への応用 ⑵140Amino acids mg/100g

120
100
80
60
40

e
H
is
Ly
s
Tr
p
Ar
g

Ph

Le

As
p
Th
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S
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As
n
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lu
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Pr
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G
ly
Al
a
Va
l
M
et
Ile

0

u
Ty
r

20

Fig.１ Water soluble amino acids content in fermented pork
After pork was pickled in salt for 2, 3 and 4 days, salted pork was fermented in rice branfor 6 months． Salting period :2days :
3days :
4days

け期間の評価を行うこととした。糠漬け期間の評

ミノ酸と同時にペプチドを生成していることを示

価は，経時的に肉切片を切り出し，食しながら評すものである。

価した。その結果，糠漬けは６～８ヶ月間の糠漬
けが良いと判断した。長期間の糠漬けは，味が薄くなるように感じられた。

3 . 3 アンジオテンシン変換酵素阻害効果の検討
ぺプチドを含むエキスを25倍に希釈し，アンジ６ヶ月後にできた製品が写真のもので，昨年のオテンシン変換酵素阻害活性を求めた。発酵３ヶ一週間塩漬けしたものに比べ色も鮮やかであり，

月後のエキスの阻害率は11％，10ヶ月後のエキス

口当たりの良いハムに仕上がっていた（Fig.２）。

は24％の阻害効果を認めた。この活性の増加は，以上の検討結果に基づき，「へしこハム」の生エキス中のペプチド量にほぼ比例している。ほぼ産方法として，肉塊２kgを30％の塩でまぶし，

同じペプチド濃度に調製したサバの自己消化エキ

等量の重石を乗せて２日間放置した後に取り出スの場合，阻害活性は66％であり，サバのエキス

し，塩を充分に落とした後米糠にまぶし，６～に比較すると活性が弱いことが分かった。遊離す

８ヶ月間，等量の重石を乗せて放置する，とまとるペプチドの構造に違いがあるものと考えられる。

められる。
3.2

サバの「へしこ」発酵中に生成するペプチドをぺプチドの生成量

含むエキスには，アンジオテンシン変換酵素を

へしこハム発酵中に遊離してくるペプチド量

阻害し，ラットの血圧を下げる効果が知られては，発酵３ヶ月目でエキス１ml中に28mg，10ヶいる２）。今回得られた「へしこハム」のエキスに月で48mgであった。このように，経時的にペプは，アンジオテンシン変換酵素阻害活性が弱かっ

チド量の増加が認められた。これは，肉タンパクたため，ラットへの投与試験に至らなかった。

質が自身の持つプロテアーゼで徐々に分解されア© The Ito Foundation

56

食肉に関する助成研究調査成果報告書

Fig.２ Heshiko-ham

3.4

After two days salting, pork was pickled in rice bran for six months．

味覚評価

Table１ Evaluation of dishes

上記基準で調製した「へしこハム」を，福井県

創作料理名

投票数

永平寺町にあるレストラン“サニーサイド”の

1

へしこハムの木綿豆腐とトマトのサラダ

11

シェフに評価を頂き，「へしこハム」を使った創

2

タラの芽，こごみとへしこハムの白和え

133

へしこハムと野菜の田楽串

144

ごま豆腐とへしこハム味噌風味

20

作料理を作って頂いて，地域の専門家を招いて試食会を行った。その時の様子は地域のテレビ，新5

へしこハムの古代米入り手毬寿司

21

聞に取り上げられ，メディアの新加工肉への関心

6

へしこハムと菜の花卯の花和え

8は高かった。シェフによってへしこハムを使った

7

へしこハムと若布のあべかわ

915種類の創作料理が作られ，29名からのアンケー

8

へしこハムの内豆なます

9

ト回答を得た。へしこハムを使った料理の一部をFig.３の写真で紹介する。美味しいと感じた料理

9

へしこハムの冷や奴

410

へしこハムとメロン

10

11

へしこハムとチコリのフィンガーサラダ

14に投票してもらった結果はTable１に示した通り

12

へしこハムとキノコのブルスケッタ

18である。料理の中で，番号５の「へしこハムの手

13

へしこハムと春野菜のパスタ

6

毬寿司」は高い評価を得ており，ハムと寿司米の

14

へしこハムとポークカツレツ

15

15

へしこハムのサブレ

15

16

店で買いたい

26

17

レストランで食べたい28

組み合わせが好ましいと出た。この組み合わせは，へしこハムの味を直接感じる事ができ，良い組み合わせであると思われる。次いで，「ごま豆腐とへしこハム味噌風味」，「へしこハムとキノコ

いないのかもしれない。

のブルスケッタ」と続いた。へしこハムの冷や

アンケート番号16，17で購入意欲についての問奴，へしこハムと春野菜のパスタ等は高い評価はいに対して，殆どの方が購入又はレストランで注得られなかった。へしこハム以外の食材の影響が文したいとしており，料理専門家の見方もかなり出過ぎて，へしこハムの味を楽しむのには適して好意的であった。

© The Ito Foundation

57

伝統的魚肉加工手法の食肉加工への応用 ⑵Fig.３ Dishes with Heshiko-ham

500

Amino acids mg/100g

450
400
350
300
250
200
150
100
50
Ar
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S

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As
p

0

Fig.４ Water soluble amino acids content in fermented pork and wild boar meet

After 2 days salting, meets were pickled in rice bran for 6 months．
：wild boar
：pork

自由意見欄では，お酒やご飯とよく合うというがある。

好意的な意見が多くみられたが，まだ塩味が強い

3.5というコメントもあり，今後さらに改善する必要

地域の方から入手したイノシシ肉は1.5kgで© The Ito Foundation

いのしし肉への展開

58

食肉に関する助成研究調査成果報告書

Fig.５ Fermented wild boar meatAfter 2 days salting, wild boar meet was pickled in rice bran for 6 months．

あったので，塩漬けは１日半とした。後工程は豚準的であるが，同じ条件で生産すると，塩味が強

肉同様に糠漬けを行い，６ヶ月間糠漬けしたもの

くなる傾向にあった。塩漬け期間を検討の結果，を取り出し，味覚評価と遊離アミノ酸分析を行っ２kgの豚肉を２日塩漬けした後に糠漬けを行った。

た場合が最もよくアミノ酸が遊離してくることがFig.４に示すように，イノシシ肉から遊離する

分かり（Fig.１），味覚評価においても，糠漬け

アミノ酸のプロファイルは豚肉に類似していた

期間が６～８ヶ月経過すると旨味が増加し，塩味が，遊離アミノ酸量は豚肉よりも多く認められもマイルドになって，ほぼ満足できると判断した。味覚評価において豚肉よりもコクがあると評た。しかしながら，呈味性の向上については，今価されたのは，遊離アミノ酸が多い為と考えられ後も更に継続検討する必要があると思われる。上る。尚，イノシシは野性であるため，食材として記条件で生産された「へしこハム」を用いた創作

利用する場合は，衛生面での配慮が必要かと判断

料理を専門のシェフにお願いし，料理専門家によされる。

る評価会を開催した。この模様は福井県のメディFig.５にイノシシ肉の糠漬けの写真を示した。
豚肉のへしこハムよりもやや色が濃いのが特徴的
であった。
４．要

アが取り上げるに至り，サバの「へしこ」の姉妹品としての開発が期待されている。
糠漬け期間中に，アミノ酸の遊離と共にペプチドが生成する事を認めた。サバの「へしこ」の場

約合，このペプチドにアンジオテンシン変換酵素を

サバ等の魚類の保存方法として伝統的に伝えら阻害し，血圧低下作用のあることが報告されていれている糠漬け「へしこ」の技術を豚肉に展開

るが２），「へしこハム」由来のペプチド含有エキ

し，「へしこハム」ともいうべき加工食品の生産

スにはその効果は弱いことが分かった。

方法をほぼ確立することができた。伝統的な「へ全国的に獣害をもたらしているイノシシについしこ」は，塩漬け１週間，糠漬け８～10ヶ月が標ても，「へしこハム」同様の操作で糠漬けを試み，© The Ito Foundation

伝統的魚肉加工手法の食肉加工への応用 ⑵59ほぼ，同じようなハム様の加工食品ができあがっ法を確立することができた。ここに至るまでの，財た。味は，豚の「へしこハム」比較してコクが団法人伊藤記念財団のご支援に深謝申し上げます。

あった。アミノ酸分析の結果（Fig.４），イノシ
シの糠漬けによって遊離してくるアミノ酸は，豚肉のそれよりも濃度が高く，味も濃厚であった。
謝辞終始，適切なアドバイスを頂いた福井県立大学生
物資源学部講師，高橋正和先生にお礼申し上げます。
過去２年間にわたり，伝統的な糠漬け手法を食肉に展開する試みを行い，豚肉を用いて，ほぼ満足できる味を呈する「へしこハム」のプロトタイプの製文
献１）
 伊藤光史，赤羽義章：日本水産学会誌，65，878～885，1999．
２）
 Itou K. and Akahane Y. : Fisheries Science，70，
121～129，2004．
３）
 岩田淑子，宇多川隆：平成21年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，28，40～45，2010．
４）
 Lowry O., Rosebrough N., Farr A. and Randall R.
: J.Biol Chem．，193，265～275，1951．
５） 山本節子，戸井田一郎，岩井和郎：日胸疾会誌，
18，297～303，1980．

© The Ito Foundation

60

食肉に関する助成研究調査成果報告書

試食パネルによる黒毛和種牛肉の肉質等級，
脂肪酸組成と食味性との関連に関する研究
Study on the relationship between meat grades, fatty acid composition and eating
quality of Japanese black beef meat by taste panel

鈴

木

啓

一・横

田

祥

子・＊飯

田

文

子

（東北大学大学院農学研究科， 日本女子大学）＊

Keiichi Suzuki, Shoko Yokota and ＊Fumiko Iida
（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University ＊Japan Women's University）

The effect of BMSNo.（4, 7and9）sex（Heifer and Steer）and mono-unsaturated fatty acidpercentage（MUFA，high：60.09 ％，moderate：56.74 ％ and low : 53.41 ％）on the eating
quality of Japanese black cattle was examined. The trained panel of ten people evaluated theten items by eight stage evaluation standard about 45 sirloins of beef cattle. The difference of
MUFA was not found between 4, 7 and 9 of BMSNo, and the heifer was higher than that of thesteer in MUFA and C18 : 1. The panel test results revealed that BMSNo. influenced all items
except “desirable taste”，and high BMSNo. was excellent in all items. The effect of sex
influenced the “strength of the flavor” and heifer was superior to the steer. Further, the effectof MUFA was significant in “fibrous feeling” and “total texture” and high MUFA was evaluatedlower than moderate and low MUFA. However, high MUFA was significantly superior to low
MUFA in “strength of flavor”．Medium MUFA was found excellent in “strength of flavor” byregression analysis. In addition, medium MUFA was higher than high and low MUFA in“overall judgment”.

１．目

りが課題となってきている。

的

肉の食味性に関しては，国産黒毛和牛に特異な

近年，国内で生産されている黒毛和牛の肉質は香り成分（和牛香）や，最近ではオレイン酸など育種改良と飼養管理技術の改善により劇的に向上のモノ不飽和脂肪酸割合が関連しているとの報告

してきている 。特に，肉質等級４以上の割合ががある。しかし，肉の美味しさは，アミノ酸，脂この十年間に去勢で47.6％から57.3％に，雌でも肪酸組成などの他にも未解明の複合的な要素が加32.0％から41.2％と約10％それぞれ増加し，枝肉わったものと考えられる。国内では，全国和牛登重量やロース断面積などもそれぞれ40kgと５cm

2録協会が今後の和牛改良の重要な選抜形質の一つ

増加あるいは太くなってきている。このような変として脂肪酸組成を取り上げ，全国和牛共進会の化の一方で，新たな肉質評価基準が模索されてお枝肉評価の項目としても採用されている。我々はり，より付加価値の高い美味しい牛肉の指標づく

これまでモノ不飽和脂肪酸組成を育種改良の選抜

1）© The Ito Foundation

試食パネルによる黒毛和種牛肉の肉質等級，脂肪酸組成と食味性との関連に関する研究

61

指標として有効か否かの研究を進めてきているて別の共詮試験管に分け取った。ブロックヒー

が，融点よりもモノ不飽和脂肪酸割合が食味性にターで50℃に加温し窒素を噴きつけながらn - ヘキ

影響する知見を得ている 2）。また，いくつかの研

サンを揮発させて濃縮し，その後一定量のn - ヘキ

究機関でも食味性と脂肪酸組成との関連研究が行サンで希釈してガスクロマトグラフィーにより脂われている情報もあるが，学術的な報告は皆無で

肪 酸 組 成 を 分 析 し た 。分 析 結 果 に 基 づ き ，ある。我々の調査も訓練パネルではなく，一般消

BMSNo．の各性別にモノ不飽和脂肪酸の高，中，費者パネルテストの結果であり，脂肪酸組成と食低の３グループに分け，BMSNo.４の去勢牛９頭，

味性との関連を詳細に研究する必要がある。脂肪雌９頭，No.７の去勢牛９頭，雌９頭，No.９去勢

酸組成と食味性との関連を明らかにすることは，

牛９頭の合計45頭の牛肉を選び以下の官能評価に今後の我が国の黒毛和牛の育種改良を進める上で供した。

最も緊急で肝腎な研究課題の一つである。本研究2.3の目的は，黒毛和種牛肉の肉質等級と脂肪酸組成

BMSNo.の４，７，
９の去勢または雌牛肉についが既知の牛肉を用い，BMSNo.，脂肪酸組成と訓てモノ不飽和脂肪酸量MUFAの高中低３点を同練パネルによる食味性との関連を検討することで時に官能評価した。すなわち，BMSNo.，性およある。

びMUFAごとに３回のパネル試験を行ったこと

２．方
2.1

官能評価

になる。試料は，あらかじめ１cmの厚さに切り法

そろえ，200℃のホットプレートで２分15秒（内部温度60℃・medium rare）焼き，筋線維に直角

サンプルの入手

食肉市場に出荷された枝肉を購買した食肉流通に３×４cmに切り出した。評価は，訓練パネル

業者からBMSNo.４，７および９に評価された牛10名により，「やわらかさ（はじめの一噛み）」肉の去勢と雌の牛肉サーロイン部分１kgを10頭「やわらかさ（咀嚼時）」「線維感」「多汁性」「総ず つ 合 計 60 頭 分 の 購 入 を 予 定 し た 。し か し ，合的食感」「良い牛くささ」「悪い牛くささ」「風BMSNo.９の雌についてはサンプルは３頭分しか味の強さ」「好ましいうま味」「総合評価」の10項

入手できず，実際に購入したのは53頭分だけだっ目について，８段階評価尺度（好ましい→８，好たためBMSNo.９雌は分析対象から除外した。

ましくない→１）で評価を行った。パネルテスト

2.2の結果は，45頭の牛肉についてそれぞれ10名のパ脂肪酸組成の分析

真空パック冷凍保存された牛肉サーロイン部分

ネルの平均値とした。

から脂肪を採材し，採材した脂肪にn - ヘキサン

2.4

定速圧縮破断測定（和光純薬）を１mL加え激しく振とうした後，10

山電製Reoner-RE2-33005Ｂを用い，応力200Ｎ，分以上室温に放置後，2N - NaOHメタノールを200

くさび型プランジャーを用い，１cm/minで圧縮μＬ添加し，約１分間振とうした。さらに，ウォーしたときの破断応力と破断エネルギーを測定した。

ターバスにより50℃で20秒間加温し，約１分振と2.5

うした後室温に放置して冷却させ，塩酸メタノー

BMSNo.（４，７，９），性（雌と去勢），モノ不ル 試 薬 10（2N-HCL メ タ ノ ー ル；東 京 化 成）を飽和脂肪酸割合（低，中，高）を要因とした分散600μL添加し，約１分間振とうした後，２層に分分析を行い，さらに全ての形質の相関を算出し離した上層をキャピラリーガラスピペットを使った。計算は全てSASプログラムパッケージを使い© The Ito Foundation

統計処理

62

食肉に関する助成研究調査成果報告書

Table １ Mean and standard deviation of fatty acids and physical measurement traits.
TraitsBMS No．
4

Sex
9

18

18

2.53

2.66

0.54

0.37

26.29
2.73

Interaction
BMS No.＊Sex＊
FFA Grade

Heifer

Steer

Low

Medium

High

9

18

27

18

18

9

2.55

2.56

2.60

2.88a

2.47b

2.40b

0.48

0.49

0.45

0.52

0.36

0.35

26.46

26.79

25.74b

26.94a28.37a26.20b24.80c

1.99

1.60

2.03

2.24

2.00

1.08

1.82

3.99

4.06

3.85

4.40a

3.72b

3.57b

3.86ab

4.55a

1.07

0.90

0.79

1.10

0.71

0.69

0.77

1.08

C18：0

12.25

11.60

11.84

11.28

12.32

13.11a12.15a10.45b

ns

C18：1

2.24
52.67

1.94
52.92

1.89
52.61

2.22
53.89a1.82
52.00b

1.5
49.85c1.78
52.89b

1.92
55.54a

＊＊

3.68

2.47

2.19

2.74

2.82

1.96

1.57

1.71

2.27
0.61
41.07
4.13
56.66

2.31
0.73
40.72
3.12
56.98

2.37
0.51
41.18
2.73
56.46

2.13
0.64
39.58b
3.05
58.29a2.42
0.61
41.86a2.22
0.50
44.37a2.43
0.73
40.83b

2.26
0.67
37.65c

3.41

2.00

2.11

2.06

4.22
30.98a
8.80
85.33
28.16

2.92
27.06ab
5.46
74.27
16.41

2.72
24.59b
4.13
80.98
16.21

3.17
33.65a7.16
94.06a23.70

55.72b
3.20
24.45b
4.18
70.68b
14.97

53.41c
1.96
27.26
6.74
81.18
17.19

56.74b
1.95
27.73
6.51
78.31
20.27

60.09a
2.18
29.41
8.34
80.60
28.42

Number of beef

7

FFA Grade

C14：0
C16：0
C16：1

C18：2
SFA
MUFA
Rupture stress
N/m2×105
Rupture energy
J/m3×10４

ns
ns
ns

ns
＊＊

＊＊

ns
ns

Upper row is mean and lower row is standard deviationa, b, c: Significant difference between different character of same row at 5％level. ns : not significant, ＊p＜0.05，＊＊p＜0.01: Significant difference at 5 and 1％level

行った。ただし，BMSNo.９の雌のセルが完全にについて有意であり，雌は去勢よりモノ不飽和脂

欠測しているためTypeⅡの平方和を利用し有意肪酸であるC16：１とC18：１が多かった。また，性を評価し，Tukeyの方法により多重検定を行っモノ不飽和脂肪酸の低，中，高では明らかに差がた。

認められ，低，中，高の間にはモノ不飽和脂肪酸が3.3％ずつ，高低間には6.68％の差が認められた。

３．結果と考察

また，C18：１とSFAおよびMUFAについてはTable１にはサーロインから採材した脂肪の各

BMSNo.，性と脂肪酸組成の交互作用が有意と脂肪酸組成，肉の物理的測定値である破断応力となったが，これは，BMSNo４では雌と去勢の間

破断エネルギーについて，BMSNo.（４，７，
９）

でC18：１，SFAおよびMUFAの差が大きいが，と性（去勢と雌）およびモノ不飽和脂肪酸（低，BMSNo.７では雌と去勢と間に大きな差が認めら中，高）を要因とした分散分析結果を示した。各れなかったためである。物理的特性値である破断

脂肪酸組成に及ぼすBMSNo.の効果はいずれも有応力についてBMSNo.が有意であり，No.９の方意ではなく，BMSNo.とロース脂肪の脂肪酸組成がNo４と比べ応力が低くやわらかい肉であるこは関連がないことが示された。脂肪酸組成に及ぼとが示された。また，去勢が雌より有意に破断応す性の効果は，C16：０，C16：１，C18：１，

力，破断エネルギーが小さくやわらかいことが示

SFA（飽和脂肪酸），MUFA（モノ不飽和脂肪酸）

された。さらに，脂肪酸組成はこれらの物理的特© The Ito Foundation

63

試食パネルによる黒毛和種牛肉の肉質等級，脂肪酸組成と食味性との関連に関する研究
Table ２ Mean and standard deviation of panel test results．
BMS No．

Panel test item
4
Number of beef

Sex

7

9

FFA Grade

Interaction

Heifer

Steer

Low

MediumHigh
9

BMS No.＊Sex＊
FFA Grade

18

18

9

18

27

18

18

Tenderness（Before）

5.14c

5.67b

6.32a

5.49

5.65

5.75

5.74

5.27

0.71

0.56

0.23

0.62

0.79

0.52

0.68

0.86

Tenderness（After）

5.10b

5.65ab

6.16a

5.49

5.56

5.72

5.64

5.24

0.66

0.54

0.29

0.61

0.73

0.46

0.60

0.85

Fibrous feeling

4.77b

5.09ab

5.37a

5.09

4.97

5.18a

5.15ab

4.72b

0.59

0.52

0.22

0.54

0.56

0.53

0.46

0.56

5.15b

5.53ab

5.52a

5.44

5.33

5.43

5.40

5.29

ns

0.41
5.16b
0.53
4.99b

0.38
5.49ab

0.20
5.67a

0.32
5.41

0.45
5.38

0.36
5.53a

0.31
5.50a

0.52
5.15b

ns

0.33

0.17

0.45

0.45

0.38

0.30

0.55

5.44ab

5.58a

5.28

5.29

5.3

5.35

5.21

0.53

0.22

0.08

0.33

0.51

0.34

0.32

0.61

4.81b

5.23ab

5.53a

5.18

5.09

5.14

5.18

5.05

0.52
5.28b

0.28

0.28

0.31

0.56

0.43

0.37

0.62

5.36ab
0.36
5.49
0.48

5.58a
0.16
5.55
0.15

5.47a
0.25
5.56
0.32

5.30b
0.35
5.42
0.42

5.23b
0.40
5.34
0.35

5.43ab
0.31
5.55
0.40

5.46a
0.17
5.54
0.40

5.26ab
0.53

5.45a
0.20

5.25
0.44

5.17
0.47

5.12
0.45

5.28
0.46

5.20
0.47

Juiciness
Total texture
Good cattlearoma
Bad cattle
aroma
Strength offlavorFavorable taste
Overall
judgment

0.30
5.42
0.37
5.02b
0.41

ns
ns
ns

ns
ns
ns
＊＊

＊

Upper row is mean and lower row is standard deviationa, b, c: Significant difference between different character of same row at 5％level. ns:not significant, ＊p＜0.05, ＊＊p＜0.01 :Significant difference at 5 and 1％level

性値には影響しないことが明らかとなった。

勢牛では「好ましいうま味」の評価はMUFA中

Table２にはパネルテストに及ぼすBMSNo.，

で高いが，雌では差が認められなく，BMSNo.７

性，モノ不飽和脂肪酸組成割合の影響の結果を示の去勢牛では，MUFA高は「好ましいうま味」

した。BMSNo.の効果は，「好ましいうま味」をについて評価が高かった。しかし，BMSNo.７の除く全ての項目に影響しており，BMSNo.の高い

雌では，MUFA高，中，低間の差はなく，同様

方が全ての項目で優れることが示された。性の効にBMSNo.９の去勢牛は，MUFA低，中，高間で果は，「風味の強さ」で有意であり，雌が去勢よ

有意差は見られなかったことが原因である。さらり優れる結果となった。さらに，モノ不飽和脂肪に「総合評価」についてもBMSNo.４の去勢牛で酸の効果は，「線維感」で有意であり，モノ不飽

は ，MUFA 中 で 高 く ，BMSNo. ４ の 雌 で は ，和脂肪酸の低が高より優れる結果となった。まMUFA高は「総合評価」が有意に低かったこと

た，「総合的食感」でもモノ不飽和脂肪酸高が中による。

や低よりも評価が低い結果となった。しかし，「風

Table３にはBMSNo.，性とモノ不飽和脂肪酸割

味の強さ」ではモノ不飽和脂肪酸高が低よりも優合をすべて込みにして求めた脂肪酸組成とパネルれた。さらに，「好ましいうま味」と「総合評価」

テストの評価項目との相関を示した。C14：０がについて３つの要因の交互作用が有意となった。

「多汁性」，「総合的食感」とそれぞれ有意（p＜これは，Fig.１に示したように，BMSNo.４の去

0.05）な正の相関を示し，割合が高いと「多汁© The Ito Foundation

64

食肉に関する助成研究調査成果報告書

Favorable taste
6.00

5.00

4.00
FFA

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

SEX

2

2

2

3

3

3

2

2

2

3

3

3

3

3

3

BMSNo

4

4

4

4

4

4

7

7

7

7

7

7

9

9

9

Overall judgment
6.00

5.00

4.00
FFA

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

SEX

2

2

2

3

3

3

2

2

2

3

3

3

3

3

3

BMSNo

4

4

4

4

4

4

7

7

7

7

7

7

9

9

9

Fig.１ Panel test results of favorable taste and overall judgment by BMSNo., sex（2: Heifer, 3 : steer）and fatty acid clasification.（1 : Low, 2 : Medium, 3 : High）

Table 3

Coefficient of correlation between fatty acids percentage and panel test．
C16：0

C16：1

C18：0

C18：1

C18：2

SFA

MUFA

RupturestressRuptureenergyTenderness（Before）
Tenderness（After）
Fibrous feeling
Juiciness

0.254

0.370＊

0.050－0.129－0.260

0.056

0.197

－0.209－0.437＊＊ －0.103

0.273

0.370＊

0.104－0.151－0.254

0.008

0.186

－0.189－0.411＊＊ －0.090

0.268

0.001

－0.027－0.220

0.037

0.180

－0.188－0.2590.037

Total texture
Good cattle aroma
Bad cattle aroma
Strength of flavor

0.305＊
0.115－0.002－0.1690.130
0.393＊＊
0.128－0.008－0.363＊0.225－0.0030.086
0.058－0.196－0.009－0.100－0.099－0.098－0.325＊－0.0310.085

0.048－0.069－0.196－0.131

0.012
0.289
0.039
－0.064－0.021－0.279－0.0030.089－0.218－0.383＊＊－0.356＊－0.271－0.071－0.147－0.248－0.107

Favorable taste
Overall judgment
Rupture stress

0.003
0.085
－0.161－0.0960.029－0.381＊＊

0.258
0.151
0.108
0.267

－0.192－0.064－0.019－0.1930.370＊
0.128－0.0110.397＊＊－0.070－0.274－0.211－0.147－0.373＊－0.1000.019－0.383＊＊0.389＊＊
0.036
0.152
0.044
0.020
－0.296＊
0.413＊＊
1.000

Rupture energy－0.191－0.156

0.195－0.1900.270－0.236－0.2390.285

p＜0.05，

＊

C14：0

＊＊

0.170
0.332＊

p＜0.01，＊＊＊p＜0.001© The Ito Foundation

0.816＊＊＊

0.058－0.011－0.2430.816＊＊＊
1.000

65

試食パネルによる黒毛和種牛肉の肉質等級，脂肪酸組成と食味性との関連に関する研究

Total texture

6.50

Strength of ﬂavor

y＝－0.0032x2＋0.3298x－2.9204
R2＝0.0886

y＝0.0002x3－0.0517x2＋3.4896x－71.644
R2＝0.3213

6.00

6.50

5.50

6.00

5.00

5.50

4.50

5.00

4.00

4.50

3.50
3.00
45.00

4.00
50.00

60.00

55.00

65.00

45.00

MUFA

50.00

55.00

60.00

65.00

MUFA

Total Judgment
6.50

y＝－0.0074x2＋0.8489x－18.954
R2＝0.0555

6.00
5.50
5.00
4.50
4.00
3.50
45.00

50.00

55.00

60.00

65.00

MUFA

Fig.２ Relation between MUFA and panel test (Total texture, Strength of flavor and total judgment）

性」，「総合的食感」の値が高まることが示唆されがやわらかいことが示唆された。最後に，器械でた。さらに，C16：０については「やわらかさ」

測定した破断応力とパネルテストの肉の「やわらと好ましい正の相関（p＜0.05）を示し，破断応

かさ」とは中程度の負の有意な相関を示し，破断力との負の相関からもC16：０の割合の高い方応力の高い肉ほど硬いことが確認された。

が ，肉 が や わ ら か く な る こ と が 示 唆 さ れ た 。

Fig.２には，MUFA割合とパネルテストの「総C18：１は「総合的食感」とは負の有意な相関

合的食感」，「風味の強さ」および「総合評価」の（p＜0.05）を示し，また，破断応力とも正の相関関連をそれぞれプロットした。MUFAと「総合（p＜0.01）を示したことから，C18：１の割合が的食感」との関係は右下がりの負の関連を示して高いほど肉が硬いことが示唆された。ただし，

おり，MUFAが高くなると「総合的食感」は低C18：１は「風味の強さ」とは正の相関を示し，くなることが示唆された。さらに，「風味の強さ」

牛肉の香りと関連することが示唆された。

のグラフを見ると，MUFAが中程度だと「風味MUFAはC18：１とほほ同様な相関が認められ，の強さ」が高いことが示された。さらに，「総合「風味の強さ」には好ましい影響を及ぼすが，破判定」についてもMUFA高低よりも中程度の割断応力との正の相関から，割合が高いほど硬い肉合の方が評価の高い結果が得られた。なお，「総であることが示唆された。逆にSFAは「風味の合判定」と最も相関の高かったパネルテスト項目

強さ」とは負の，破断応力とは負の相関を示し肉は，「好ましい味」（0.750：p＜0.001）であり，モ© The Ito Foundation

66

食肉に関する助成研究調査成果報告書

ノ不飽和脂肪酸と関連の高い「風味の強さ」と総

MUFAの高低が食味性に及ぼす効果は「風味の合判定の相関は0.542（p＜0.001）だった。

強さ」を除いて差が認められず，MUFAの割合

近年，美味しい牛肉に関する関心が高まってきが牛肉の評価に及ぼす効果は必ずしも高いとは限ており，特に脂肪の質を左右する脂肪酸組成や脂らないことが明らかとなった。特に，「やわらかさ」

肪融点の重要性が指摘 されている。特にモノ不や「線維感」の項目でMUFAの多い牛肉ほど評

飽和脂肪酸割合であるオレイン酸割合が高いと風価が低い結果となったがこの原因は不明である。

味が良くなり，融点が低くなると言われており，

MUFAの多い牛は月齢が進んでいる可能性はあ

これを前提に，全国和牛登録協会を中心に道府県る。その結果，肉が硬く，また「線維感」が認め

では枝肉共進会で脂肪の質を評価するため光ファられる可能性がある。今回サンプルとして購入しイバー分光測光法によるモノ不飽和脂肪酸割合をた牛肉の月齢その他の情報を入手することはでき

予測し，肉質を評価する試みが開始されている。

なかったが，再調査してこのことを確認する必要

一方，脂肪の融点や脂肪酸組成が香り，風味と関があると思われる。しかし，これまで約1,500頭

連すると言われているが，黒毛和牛について公表の牛肉を分析した結果では，MUFAの割合と月された学術的な報告はない。そこで我々は，食肉齢との間には0.150程度の関連しかないことが分

市場に出荷された牛肉の脂肪酸組成について遺伝

かっており（未発表），他の要因が関連している的パラメータの推定 と同時に，牛肉100頭から可能性があり，今後の検討課題である。さらに，

モノ不飽和脂肪酸と融点の異なる牛肉７頭分ずつ

黒毛和種牛肉の風味，味について科学的分析も含の 試 食 試 験（一 般 学 生 ，院 生）の 結 果 ，融 点

めて評価を行うことが黒毛和種牛肉の質的向上を（40.3℃と22.7℃）では差が認められないが，モノ

目指す上で重要と思われる。

3）4）不飽和脂肪酸（65.05％と50.54％）ではやわらか
さと風味で差がある結果を得た2）。

４．要

約

モノ不飽和脂肪酸の割合だけではなく脂肪酸の黒毛和種牛肉のBMSNo.（４，７，９）と脂肪酸組

絶対量も食味に影響することが考えられる。その成（高，中，低）が既知の牛肉を用い，BMSNo.，

た め ，本 研 究 で は 脂 肪 量 を 一 定 と す る た め ，性（去勢，雌）および脂肪酸組成が食味性に及ぼ

BMSNo.を４，７，９と去勢と雌のそれぞれについす影響を検討した。10名の訓練パネルを使い，て，モノ不飽和脂肪酸割合の高中低の３区分に分BMSNoと性，モノ不飽和脂肪酸（MUFA）ごと

けてパネルテストを実施した。国内外共に，脂肪に，それぞれ３頭分の牛肉，合計45頭分のサーロの量，性を統一した上で，MUFAの違いだけでインを用い（BMSNo.９の雌は除く），10項目のテストを行った報告はこれまでなく，本研究が初パネルテスト項目について，８段階評価尺度で評めての報告となる。その結果，BMSNo．のラン価を行った。BMSNo.の４，７，９の間にはMUFA

クはパネルテストに明らかな影響を及ぼし，の差は認められず，雌が去勢よりMUFA，C18：

BMSNo．の高い牛肉ほどいずれの評価も高いこ１の割合が有意に高かった。MUFAの高中低のとが明らかとなった。一方，性については，雌の平均はそれぞれ，53.41％，56.74％，60.09％だった。

方が去勢雄の肉より「風味の強さ」が強かった。

パネルテストの結果，BMSNo.は，「好ましいうまこれはC18：１やMUFAについて，雌が去勢より味」を除く全ての項目に影響しており，BMSNo.

多 い こ と と 関 連 す る と 思 わ れ る 。し か し ，の高い方が全ての項目で優れた。性の効果は，「風© The Ito Foundation

試食パネルによる黒毛和種牛肉の肉質等級，脂肪酸組成と食味性との関連に関する研究

味の強さ」で有意であり雌が去勢雄より優れた。
さらに，モノ不飽和脂肪酸の効果は，「線維感」と「総合的食感」で有意だが，モノ不飽和脂肪酸
高が中や低よりも評価が低い結果となった。しかし，「風味の強さ」ではモノ不飽和脂肪酸高が低よりも優れる結果となった。MUFAは「風味の強さ」に対しては良い影響を及ぼすが，破断応力と有意な正の相関を示し，割合が高いほど硬い肉であることが示唆された。逆にSFAは「風味の強さ」とは負の，破断応力とは負の相関を示し，

67

文 献１）家畜改良センター：全国域での種雄牛および繁殖
雌牛の遺伝的能力の推移について，平成23年３月28日，http://www.nlbc.go.jp/pdf/data/trend22s.pdf２）大友良彦・小室純也・須田義人・鈴木啓一：黒毛和種肥育牛の胸最長筋脂肪酸組成と枝肉，肉質形質及び食味性との関連，肉用牛研究会報，90 : 15～21,2011.
３）井上慶一・庄司則章・小林正人：黒毛和種肥育牛の脂肪融点，脂肪酸組成および格付形質間の遺伝的関係，日本畜産学会報，79 : 1～8, 2008.
４）横田祥子・杉田春奈・大友良彦・須田義人・鈴木
啓一：黒毛和種牛肉における脂肪酸組成と枝肉形質
および肉質形質との遺伝的関係，東北畜産学会報，
63 : 80～85, 2011.

肉がやわらかいことが示唆された。MUFAが中程度の場合，「風味の強さ」が良いことが示された。さらに，「総合判定」についてもMUFAが高低よりも中程度で評価の高い結果が得られた。

© The Ito Foundation

68

食肉に関する助成研究調査成果報告書

放牧など粗飼料100％で生産された赤身牛肉におけるドライエージングの効果
The effect of dry-aging in the complete grass-fed beef折目

愛・小 笠 原 英 毅・＊岡

山

和

代

（北里大学獣医学部附属フィールドサイエンスセンター八雲牧場，＊北里大学保健衛生専門学院管理栄養科）

Ai Orime, Hideki Ogasawara，＊Kazuyo Okayama（Yakumo Experimental Farm Field Science Center Kitasato University，＊Department
of Applied Clinical Dietetics Kitasato Junior College of Health and Hygienic Sciences）

Wet-aging（WA）of beef is a widely used and growing method of aging that utilizes
refrigeration and vacuum-sealed packaging. The older alternative to WA is Dry-Aging（DA）,
which is performed by hanging meat in a temperature and humidity controlled environment
just above freezing. We produced complete grass-fed beef in the Yakumo Experimental Farmof Kitasato University. The aging method of grass-fed beef has not been established. The
purpose of this study is to examine the effect of DA in the complete grass-fed beef．
We investigated the pH, moisture, free amino acid content, tissue anatomy using histology,
and sensory evaluation of WA and DA grass-fed beef（dry-aged and wet-aged grass-fed beef）（M. longissiumus）. WA and DA showed similar pH, however, the moisture level in DA wassignificantly lower. In histochemical analysis, the DA grass-fed beef showed morphologicalchange in connective tissue and the diameter of myofibers were smaller than WA grass-fed
beef. The DA grass-fed beef was found to have significantly larger amounts of Tyr, His, Ala,
Val, Gly, Pro and Ser. Relating to this, DA grass-fed beef showed significantly higher levels ofsweetness and MSG-like flavor indicative of higher amounts of free amino acids. Moreover,Japanese consumers preferred DA grass-fed beef by evaluating tenderness, aroma and flavor.
These results suggest that dry aging is a valid aging method of complete grass-fed beef．

１．目

級霜降り牛肉を嗜好してきたが，最近では健康志

的向から赤身牛肉への関心が高まっている。放牧や我が国における牛肉の熟成法の多くは真空包装

粗飼料主体で生産された赤身牛肉は，濃厚飼料多に よ る ウ ェ ッ ト エ ー ジ ン グ（Wet-aging : WA）

給で生産された牛肉と比較して，共役リノール酸が主流である。近年，米国で注目を集めているド（Conjugated Linoleic Acid : CLA）などの機能性

ライエージング（Dry-aging : DA）は表面を露出成分が多く含まれることが知られている２）。北里

した肉に送風し，低温の熟成庫で長期間かけて熟大学獣医学部附属フィールドサイエンスセンター成させる。DA処理した牛肉は柔らかさおよび多八雲牧場（八雲牧場）では，放牧など自給粗飼料

汁性が増すことが報告されている 。日本人は高100％給与による肉牛生産を実践しており，この１）© The Ito Foundation

69

放牧など粗飼料100％で生産された赤身牛肉におけるドライエージングの効果

ような飼養方法で生産された牛肉（赤身牛肉）でTable１ Live body weight and slaughter age of complete

grass-fed Japanese Shorthorn

はCLA含量が穀物多給の慣行肥育牛と比較して著しく高いことが明らかとされているが３），現行

Individual number

Months of Age

Live body weight(kg）の脂肪交雑重視の格付けによる牛肉評価では適正

1

110.2

614

な評価がされにくい。一方，消費者における品質

2

113.0

625

3

104.5

571

4

67.5

675

評価の指標は「味や食感」，「食品原料の安全性」
であり，個々の評価基準では統一された見解が得られない。八雲牧場において学生および一般消費６）（社団法人畜産技術協会）に準じてサンプルを作者に行った赤身牛肉（肥育牛）の官能試験では，製 し た 。 pH は 突 き 刺 し 型 pH 計 （東 亜 DKK「外観・食味」に関しては高い評価が得られたが，HM-11Ｐ），水分含量は電子式水分計（島津製作「柔らかさ」に関しては評価が分かれた４）。さら所

MOC-120Ｈ）を用いて測定した。

に，経産牛の牛肉は若齢肥育牛の牛肉と比較して2.3

組織学的解析

「風味」に違いは認められないが，「柔らかさ」にWAおよびDA区のロース芯から１cm角のサン５）有意な差があり ，消費者が感じる赤身牛肉のプルを切り出し，ドライアイス・アセトンにより「硬さ」の改善が課題となっている。

急速凍結後，凍結切片を作製した。作製した凍結

そこで，本研究ではWAおよびDA処理した赤

切 片 は ア ザ ン 染 色 を 行 い ，光 学 顕 微 鏡

身牛肉（経産牛）の理化学的および組織学的解（OLYMPUS）で観察した。また，１切片３カ所

析，遊離アミノ酸含量，官能試験を行い，放牧なを無作為に選択し，筋線維の直径を画像解析ソフ

ど粗飼料100％で生産した赤身牛肉に適した熟成

ト「Image J」で測定した。
2.4

方法を明らかにすることを目的とした。
２．方

法

2.1

料

材

遊離アミノ酸分析

遊離アミノ酸分析にはロース芯部分のみを用いた。代表的な遊離アミノ酸であるイソロイシン（Ile），ロイシン（Leu），リジン（Lsy），メチオ

供試牛は放牧など粗飼料100％で生産された日ニン（Met），フェニールアラニン（Phe），チロ

本短角種の経産牛，４頭を用いた。供試牛の月齢

シン（Tyr），スレオニン（Thr），トリプトファおよび生体重をTable１に示す。各個体の２本のン（Trp），バリン（Val），ヒスチジン（His），

最長筋（ロース肉）のうち，一方は株式会社さのアルギニン（Arg），アラニン（Ala），アスパラ

萬の協力を得て，送風のできる熟成庫（室温：ギン酸（Asp），グルタミン酸（Glu），グリシン

２℃，湿度：70％）で熟成させた（DA区）。他（Gly），プロリン（Pro），セリン（Ser）の17種

方は真空包装後，熟成庫（室温：２℃，湿度：

について日本食品機能分析研究所に委託し，高速80％）で熟成させた（WA区）。熟成期間は両区

液体クロマトグラフ法により測定された。

ともに，と畜から30日間とし，５cm厚ブロック

2.5

官能試験

に加工後，試験に使用するまで－30℃で保存した。

⑴

対象者と調査時期

2.2

対象者となった学生および教員，一般消費者にpHおよび水分含量

熟成終了後のロース芯部分を切り抜き，牛肉品は事前に調査項目の説明を行い，調査参加の同意

質評価のための理化学分析マニュアルVer．２の得られた被験者のみを対象とした。パネリスト© The Ito Foundation

70

食肉に関する助成研究調査成果報告書

は北里大学保健衛生専門学院の学生31名（男性２行った。危険率が１または５％未満で有意な差が名，女性29名），教員26名（男性14名，女性12名），

あると判断した。

新潟県南魚沼市の主婦39名，計96名とした。調査は2010年７月16日，10月15日，11月19日に実施し

3.1

た。
⑵

３．結果と考察
理化学的分析

WAおよびDA処理された最長筋の理化学的特

調理方法

調理は北里大学保健衛生専門学院管理栄養科調性をTable２に示した。WAおよびDA区のpHは両理室にて実施した。WAおよびDA区のブロック

区 で 有 意 な 差 が 認 め ら れ な か っ た 。こ れ は

肉は試験前日に２℃で24時間かけて自然解凍した

AhnstromらおよびOreskovichらの報告と一致しものを使用した。解凍した牛肉は調理20分前に常ており９，10），DAが適正に処理されたことを示し

温に置き，脂身を弱火（70℃）で10分間焼いたている。一方，水分含量ではDA区はWA区より，後，表面を強火（250℃）で２分間焼いた。60℃

有意に低かった（ｐ＜0.01）。AhnstromらのDAに設定したオーブンで供試牛肉の中心温度が52℃

処理は除骨処理を行っておらず，WAおよびDAになるまで加熱した。その後，強火で表面を３分処理した牛肉の水分含量に有意な差は認められて間焼き，常温で５分間静置した。静置後，1.5cm

いない９）。本試験では熟成前に除骨をしたことか

厚にスライスし，保温した皿で速やかに対象者にら，肉表面の乾燥がロース芯部分に影響した可能配布した。

性が考えられた。また，除骨前にDA処理された

⑶

アンケート

牛肉は除骨後にDA処理された牛肉より可食部の

食肉の官能評価ガイドライン７）に準じて官能試

歩留まりが高くなることが報告されている１）。し験を行った。外観では赤身肉の色の明るさ（１：

たがって，本試験よりDA処理過程での除骨の有暗い→５：明るい），食感では柔らかさ（１：硬無が牛肉の歩留まりに影響することが再確認され

い→５：柔らかい）および多汁性（１：パサパサ

た。

→５：ジューシー），食味では食べる前の香り

Table２ The pH and moisture of complete grass-fed beef
Aging treatment（１：弱い→５：強い），口腔を通して感知される
香りと味を総称して風味（１：弱い→５：強い）
およ び 旨 み（１：薄 い→５：濃い），総合評価（１：苦手→５：好ましい）を含めた７項目を調pH
Moisture（％）

WA（n＝４）DA（n＝４）5.67±1.8

5.68±1.770.4±0.1

66.1±0.2＊

Data are expressed as mean±SD（＊ｐ＜0.01 versus WA）

査した。評価環境は蛍光灯下でクローズドパネル法，試料コードはＡ，Ｂとし，１から５の評価点

3.2

で評価させた 。

食肉の構造変化にはアザン染色が用いられ，筋

８）

2.6

組織学的解析

線維は赤く強染され，結合組織を構成する膠原線

統計処理

pHおよび水分含量，遊離アミノ酸含量，組織維と弾性線維は青く染色される11）。アザン染色で学的解析で測定された値はStudent's t-testによりは熟成により筋線維が軟化すると青色で染色され有意差検定を行った。官能試験の統計解析は，るようになるが，本試験では筋線維におけるWA

SASソフトウェア（version8.0.2，SAS社）を用（Fig.1 A a）お よ び DA 区（Fig.1 A b）で 染 色 性

いて，Mann-Whitney U-testにより有意差検定をの違いは観察されなかった。これはロース芯から© The Ito Foundation

放牧など粗飼料100％で生産された赤身牛肉におけるドライエージングの効果

71

A

a

b

B
Diameter (μm)

Proportion of myofiber (>50μm) (%)

WA

65.6±1.787.7±2.4DA57.3±2.6 *66.0±5.6 *Fig.１ Histochemical analysis of WA and DA grass-fed beef．
A : Azanstained sections of WA（a）and DA（b）grass-fed beef. Scale bars＝100μｍ．
B : Histomorphometric analysis of WA and DA myofibers. The diameter of myofibers and proportion of

myofiber（＞50μm) were smaller in DA grass-fed beef than those of WA grass-fed beef. Data are expressed as
mean±SD（＊ｐ＜0.05 versus WA）．

のサンプルの採取が中心部であったことから，

Ser＋Gly＋Ala＋Pro）および旨味（Ser＋Glu＋DA区でアザン染色での検出可能な範囲に筋線維

Ala＋Met＋Asp）においても，DA区で有意に増の熟成が進んでいない可能性が考えられた。一加した（ｐ＜0.05）。牛肉の熟成における遊離ア

方，筋束間の結合組織においてはDA区で大型のミノ酸の組成については同期間で異なる熟成法を結合組織が観察されなかった。また，筋線維の径比較検討した報告は少ない。本研究における遊離および径が50μｍ以上の筋線維の割合においてもアミノ酸含量の増加は，DA区での水分含量の減DA区で有意に低かった（Fig.1 B）。食肉の硬さは少および筋線維の萎縮が影響したと考えられた。

結合組織の存在の有無によって影響を受ける11）。

また，DA区では結合組織の脆弱化が観察された

したがって，DA処理した牛肉では結合組織の脆ことから，結合組織の分解により遊離アミノ酸含弱化および筋線維間の空隙が認められ，牛肉の柔量が増加した可能性が示唆された。遊離アミノ酸

らかさを増加させる可能性が示唆された。

の生成にはアミノペプチターゼ類が関与し，牛肉

3.3のアミノペプチターゼＨは失活しやすく，牛肉の遊離アミノ酸含量

DA処理した牛肉の遊離アミノ酸含量をTable３

熟成過程では総アミノ酸およびグルタミン酸の生に示した。DA区においてThr，HisおよびAlaは成が少ないと推定されている12）。本研究において，WA 区 と 比 較 し て 顕 著 に 増 加 し（ｐ ＜ 0.01），

旨みへの寄与の大きいグルタミン酸量は各供試牛

Val，Gly，ProおよびSerにおいても有意に増加による変動が大きく，WAおよびDA区で有意差し た（ｐ ＜ 0.05）。さ ら に ，甘 味（Lsy ＋ Thr ＋は認められなかった。しかしながら，DA区にお© The Ito Foundation

72

食肉に関する助成研究調査成果報告書

D

A

B

3.5

3.5

3.0

3.0

3.0

3.0

2.5

2.5

2.5

2.5

WA

DA

E

*

WA

*

WA

3.5

3.0

3.0

3.0

2.5

2.5

2.5

DA

3.5

DA

WA

DA

G

3.5

WA

*

3.5

DA

F

3.5

C

WA

WA

DA

DA

Fig.２ Sensory evaluation for WA and DA grass-fed beef. Sensory evaluation was performed（n＝96）． There is not

significant difference in lean meat color（A）,umami（D）,juiciness（F）and overall acceptability（G）.However, DA
grass-fed beef was preferred by evaluating aroma（B）, flavor（C）and tenderness（E）. Data are expressed as
mean±SD（＊ｐ＜0.05 versus WA）．
Table３ Effect of DA in free amino acid contents ofcomplete grass-fed beef (mg/100g）
WA (n＝４）

DA (n＝４）Ile

13.6±3.725.8±10.3

Leu

24.7±6.4

44.8±17.2

Lsy

17.0±3.1

19.0±23.2

Met

11.0±2.517.7± 5.6Phe

15.7±4.1

27.9±10.6

Tyr

6.0±5.95.2± 4.0

Thr

12.8±1.726.4± 6.1**

Trp

4.2±1.3

7.0± 2.1Val

16.8±3.1

32.6±10.1*

His

8.2±0.714.5± 3.2**Arg

14.4±3.918.8± 14.5Ala45.3±0.972.8±9.0**

Asp

6.6±2.1

14.0± 7.3

Glu

14.7±6.956.3± 40.2

Gly

15.6±3.925.4± 5.1*Pro

4.6±0.2

13.7± 1.4*Ser

18.4±3.1

32.6± 8.8*

Total

249.6±36.8454.3±140.1*

Sweet１）111.4±8.2

183.0± 43.7*

MSG-like２）

96.0±12.6

193.3± 56.5*

Data are expressed as mean ± SD （* Ｐ ＜ 0.05 and ** Ｐ ＜ 0.01
versus DA）．
１）Lsy ＋ Thr ＋ Ser ＋ Gly ＋ Ala ＋ Pro and ２）Ser ＋ Glu ＋ Ala ＋
Met＋Asp

いて総遊離アミノ酸含量は有意に増加したことから，DA処理は牛肉の食味を向上させる熟成法であることが明らかとなった。
3.4

官能試験

WAおよびDA区の牛肉の外観（Fig.２A），旨み（Fig.２D），多汁性（Fig.２F），総合評価（Fig２G）に有意な差はなく，香り（Fig.２B），風味（Fig.２C），
柔らかさ（Fig.２E）においてDA区で有意に高い評価であった（ｐ＜0.05）。遊離アミノ酸分析の結果から，旨みについてはDA区で高い評価を期待したが，本研究では有意な差が認められなかった。これは牛肉の香りが味と同時に知覚されたため，旨みの濃度の差をパネリストが判断できなかった可能性13），また，パネリストの30％が女子大生であり，旨みの感受性が低い傾向があることが影響したと考えられた14）。和牛肉の芳香では生
牛肉熟成香，煮牛肉熟成香，焼牛肉熟成香および熟成牛肉発酵臭が報告されており 12），DA処理した牛肉は焼肉熟成香など嗜好性の高い香りが強© The Ito Foundation

放牧など粗飼料100％で生産された赤身牛肉におけるドライエージングの効果

73

く，WA処理した牛肉は酸臭や血液臭などの生鮮目において高い評価が得られた。以上の結果は，香気が強いとの報告がある 。したがって，パネ

放牧など粗飼料100％で生産した経産牛の牛肉でリストが感じた香りが焼牛肉熟成香である可能性

はドライエージングが消費者の嗜好に適した熟成が考えられた。一方，WAおよびDA処理の牛肉法である可能性を示唆している。

15）

で風味に有意な差が認められないとの報告もあり，パネリストの旨みと風味の感受性に関して

16，17）

は統一した見解が得られていない。
本試験ではDA区の柔らかさにおいて有意に評価が高く，組織学的解析の結果と一致した。また，総合評価ではDA区を好ましいと感じたパネリス
トが多い傾向にあり，食肉の嗜好には柔らかさも重要な要素となることから11），我が国でもドライ
エージング技術が普及可能であることが示唆された。
本研究より，DA処理は放牧など粗飼料100％で生産した赤身牛肉の遊離アミノ酸含量を増加させ，「風味」および「柔らかさ」を向上させることが明らかとなり，ドライエージングが消費者の嗜好に適した熟成法である可能性が示唆された。
５．要

約

近年，健康志向および環境負荷の問題から赤身牛肉への関心が高まっている。本研究では，放牧など粗飼料100％で生産された牛肉の熟成法の開発として，DA処理された牛肉の特性を明らかにすることを目的とした。
WAおよびDA処理後の牛肉は理化学的および組織学的に解析し，消費者（96名）による官能試
験を行った。理化学的および組織学的解析では，
DA区はWA区と比較して，pHに変化はないが，水分含量では有意に少なく（ｐ＜0.01），筋束間の結合組織の脆弱化および筋線維の空隙が観察された。また，DA区のアミノ酸含量は甘みと旨みに 関 与 す る Thr ，His ，Ala（ｐ ＜ 0.01），Val ，
Gly，Pro，Ser（ｐ＜0.05）で有意に増加した。
官能試験より，DA区では香り，風味，食感の項

文 献１）
 Jeff W. Savell : Dry-aging of beef Exective
Summary, center for research and knowledge
management national cattleman's beef association,
U.S.A., １～９，2008．
２）
 萬田富治，畔柳正，中井淳二，東善行：日本における放牧畜産の技術的展望．栄養生理学会報，49（2），27～29，2005．
３）
 佐藤洋子，坂本千恵，野島正博，田中弘康，畔柳正，
中井淳二，東善行，萬田富治：100％自給飼料で飼育した北里八雲牛と慣行肥育牛の牛肉中CLA等について，東北畜産学会報，54（2），32，2004．
４）
 折目愛，久保田博昭，米澤智洋，小笠原英毅，畔柳正，萬田富治：放牧など自給粗飼料100％で生産した牛肉に対する消費者の階層別官能特性と嗜好
性 ，日 本 畜 産 学 会 第 110 回 大 会 講 演 要 旨 ，139 ，
2009．
５） 谷本保幸，千田雅之，小山信明：遊休農林地に放牧した黒毛和種経産老廃牛の肉質及び飼養方法の評
価，近畿中国四国農業研究センター研究報告，３，
１～14，2004．
６） 社団法人畜産技術協会：牛肉評価のための理化学
分析マニュアルVer.2，５～８，2003．
７）
 財団法人日本食肉センター：食肉の官能評価ガイ
ドライン，独立行政法人家畜改良センター編，東京，
2005．
８）
 古川秀子：おいしさを測る，初版，（112～113），
幸書房，東京，2007．
９）
 Ahnstrom, M. L., Seyfert, M., Hunt, M.C.,&
Johnson, D.E. : Dry aging of beef in a bag highly
permeable to water vapour. Meat Science，73，674～679，2006．
10）
 Oreskovich, D.C., McKeith, F. K., Carr, T. R.,
Novakofski, J., & Bechtel, P. J. : Effects of different
aging procedures on the palatability of beef,
Journal of Food Quality，11，151～158，1988．
11） 渡邊康一，山口高弘：食肉とその肉製品の食品組
織 学 ，前 編「食 肉 の 科 学」，45（2），151 ～ 158 ，
2004．
12）
 沖谷明紘：肉の科学，初版，（80～84），朝倉書店，
東京，2007．
13）
 松石昌典：牛肉のおいしさに貢献する香り，栄養生理研究会報，53（2），39～42，2009．
14）
 川上育代，我如古菜月，池上由美，湯之上祐子，
松添直隆，北野直子：女子大生における味覚感度の現状とだしの嗜好性，栄養学雑誌，69（1），10～
19，2011．

© The Ito Foundation

74

食肉に関する助成研究調査成果報告書15） Warren, K. E., & Kastner, C. L : A comparison ofdry-aged and vacuum-aged beef striploins. Journalof Muscle Foods，３，151～157，1992．
16） Parrish, F. C., Jr., Boles, J. A., Rust, R. E.,& Olson,
D.G. : Dry and wet aging effect on palatability
attributes of beef loin and rib steaks from three
quality grades. Journal of Food Science，56，601～
603，1991．

17）
 Sitz, B. M., Calkins, C.R., Feuz, D. M.,
Umberger,W.J., & Eskridge, K. M. : Consumer
sensory acceptance and value of wet-aged and dryaged beef steaks, Journal of Animal Science ， 84 ，1221～1226，2006．

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平成22年度助成研究調査一覧

本年度の対象とする研究または調査：食肉および食肉製品の食品的価値（機能性，栄養性，好味性，安全性など）および加工技術の向上
などに関する研究または調査
単位：千円
整理
番号

研

究

調

査

の

テ

ー

マ

継続
年度

代 表 研 究 者
属

機

関

助成金額

代表研究者名所長谷川信

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

800

古瀬

充宏

九州大学大学院
農 学 研 究 院

1,000

池内

義秀

九州大学大学院
農 学 研 究 院

1,000

研９

抗肥満／食欲増進作用を有する新規食肉由来
機能性成分に関する研究

研11

食肉による精神機能改善に関する研究

研18

食肉由来ACE阻害ペプチドの筋肥大作用と
その機構

研24

食肉由来機能性成分クレアチンによる脳機能の維持・改善に関する研究

H.20～

豊田

淳

茨 城 県 畜 産
セ ン タ ー
茨城大学農学部

800

研29

肝臓抽出物および食品成分の併用が脂質吸収に及ぼす影響

H.21～

矢澤

一良

東 京 海 洋大 学 大 学 院

800

研４

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討
についてⅡ

H.21～

六車三治男

宮崎大学農学部

1,200

研19

細菌性新規プロテアーゼの食肉加工への応用小林秀丈

広島国際大学
薬
学
部

800

研25

低温乳酸発酵による食肉の組織構造とタンパ
ク質化学的変化に関する研究

H.19～

芳賀

聖一

名城大学農学部

800

研34

伝統的魚肉加工手法の食肉加工への応用 ⑵

H.21～

宇多川

隆

福井県立大学
生物資源学部

1,000

研14

試食パネルによる黒毛和種牛肉の肉質等級，
脂肪酸組成と食味性との関連に関する研究鈴木啓一

東北大学大学院
農 学 研 究 科

1,200

研15

放牧など粗飼料100％で生産された赤身牛肉
におけるドライエージングの効果

折目愛

北里大学獣医学部附属フィール
ドサイエンスセンター八雲牧場

1,000

合

H.21～

計

© The Ito Foundation

11件

食肉に関する助成研究調査成果報告書「Final Reports for Research Grants for Meat and Meat Products」

平成22年度（Vol. 29）
2011年11月

発行

編集・発行 ― 財団法人伊藤記念財団
THE ITO FOUNDATION
東京都目黒区三田 1 丁目 6 番21号

アルト伊藤ビル〒 153-8587
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153-8587 JAPANTEL：03（5720）8611
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