関東森林研究 67-1(2016)

論 文

東北産マツノザイセンチュウ抵抗性クロマツ種子からの不定胚形成とクローン増殖
Somatic embryogenesis and propagation in Japanese black pine from seeds of nematode-resistant clonesof the Tohoku-region
丸山 E. 毅＊１＊＊・大西昇＊２＊＊・細井佳久＊１・安野紀子＊２・今野幸則＊３・山野邉太郎＊４・織部雄一朗＊５
Tsuyoshi E. MARUYAMA＊１＊＊, Noboru ONISHI＊２＊＊, Yoshihisa HOSOI＊１, Noriko YASUNO＊２,Yukinori KONNO＊３, Taro YAMANOBE＊４ and Yuichiro ORIBE＊５＊１ 森林総合研究所
Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), Matsunosato 1, Tsukuba, 305-8687 Japan＊２ キリン株式会社
Kirin Company Limited, Fukuura 1-13-5, Kanazawa-ku, Yokohama, 236-0004 Japan＊３ 宮城県林業技術総合センター
Miyagi Prefectural Forestry Technology Institute, Hanuki 14, Ohira-mura, Kurokawa-gun, Miyagi, 981-3602 Japan＊４ 森林総合研究所林木育種センター
FFPRI, Forest Tree Breeding Center, Ishi 3809-1, Juo, Hitachi, Ibaraki, 319-1301 Japan＊５ 森林総合研究所林木育種センター東北育種場
FFPRI, Forest Tree Breeding Center, Tohoku Regional Breeding Office, Osaki 95, Takizawa, Iwate, 020-0621 Japan＊＊ Co-first authors contributed equally to this work
要旨：2014 年 7 月中旬～8 月中旬にかけて，宮城県林業技術総合センターのマツノザイセンチュウ抵抗性系統採種園から球果を採取した。これらの球果から摘出した種子を滅菌し，種皮を取り除いた後に雌性配偶体（megagametophyte）を不定胚形成細胞の誘導用培地に置床した。得られた培養細胞は維持・増殖させた後，不定胚誘導用培地上で培養した。誘導した不定胚は発芽用培地上で個体再生させた。さらに，増殖率を向上させるため，液体培養条件（エチレン作用阻害剤や細胞密度の影響）について検討を行った。
キーワード：マツノザイセンチュウ抵抗性系統，不定胚形成，Pinus thunbergii，液体培養，クローン増殖
Abstract: Cones of pine wood nematode-resistant trees were collected from seed orchard of Miyagi Prefectural Forestry Technology
Center in July-August 2014. Excised seeds from the cones were surface-sterilized and after removing their seed coat, themegagametophytes containing zygotic embryos were cultured onto somatic embryogenesis initiation medium. Initiated embryogeniccells were propagated and then transferred to somatic embryo induction medium. Induced somatic embryos were regenerated intoplantlets after transfer to germination medium. Furthermore, liquid culture conditions (effect of ethylene biosynthesis suppressor andcell density in culture) were examined in order to improve the propagation rate.
Keywords: nematode-resistant clones, somatic embryogenesis, Pinus thunbergii, liquid culture, clonal propagation
Ⅰ はじめにに農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業「東北2011 年の東日本大震災によって，東北地方太平洋地方海岸林再生に向けたマツノザイセンチュウ抵抗性側のクロマツ海岸防災林は壊滅的な被害を受けた。さクロマツ種苗生産の飛躍的向上」が立ち上げられ，各らに，マツ材線虫病が東北地方にも蔓延していること種の苗木生産技術の開発が行われている。その中，不から，クロマツ海岸防災林の再生には膨大な数のマツ定胚形成技術も対象となっており，今回は実用に向けノザイセンチュウ抵抗性系統苗木が必要となる。現在

たその開発状況を紹介する。

は，その供給量はごく限られているため，東北地方の海岸防災林の再生には長期間を要する。そこで 2013 年

Ⅱ 実験方法－ 73 －(2016 年 3 月 15 日受理)

１．球果の採取 球果の採取には，宮城県林業技術総全ての系統において不定胚形成細胞を誘導できた。得ら合センターのマツノザイセンチュウ抵抗性系統採種園内

れた不定胚形成細胞は，約２週間ごとに継代培養するこに生育するクロマツを用い，７月中旬～８月中旬に採取とで維持・増殖が可能であった（図－２）。

した球果から取り出した種子を使用した。

２．不定胚の誘導と不定胚の成熟化 増殖させた細胞

２．不定胚形成細胞の誘導と継代培養 種子表面の殺を不定胚誘導用の培地に移すと，培養開始６週間後に不菌は，70％エタノールに 30 秒，0.5％次亜塩素酸ナトリウ定胚の形成・成熟が見られた（図－３）。成熟不定胚の誘ム溶液に５分浸漬・撹拌し，滅菌水で洗浄して行った。そ導率は，系統によって著しく異なったが，山元 90 # 1 をの後，種皮を剥ぎ取り，種子胚を含む雌性配偶体除けば，シャーレあたり 180 個以上の不定胚が形成され，（megagametophyte）を不定胚形成細胞誘導用の培地に置

山元 84 # 3 の場合は 350 以上の最も高い値を示した（図床した。容器として，90 × 20 mm のシャーレを用い，培－４）。

地には LP 培地（１）に，ミオイノシトール 20 g/l,マルト

３．不定胚の発芽と個体再生 成熟した不定胚を１～ース 15 g/l，グルタミン 0.45g/l，カゼイン 0.5 g/l，ビオチ２週間程度脱水させた後に発芽用培地で培養すると，約ン 0.05 mg/l， 葉酸 0.5 mg/l，寒天８ g/l，1-ナフタレン酢

１～２週間後に発芽を開始し，４週間目に不定胚全体の酸 ２ mg/l，６-ベンジルアミノプリン 0.63 mg/l，カイネ68～93％程度の発芽率がみられた（図－５，６）。発芽しチン 0.61 mg/l を添加した固形培地を用いた。培養は暗黒

た不定胚は植物体を形成し（図－７），53～88％程度の個下，25℃で行った。誘導後の不定胚成細胞は，維持・増殖体再生率を示した（図－８）。

用 EM 培地（３）と同一の培養環境で維持し，増殖させた。

４．液体培養による不定胚誘導 固形培地で検討した培養条件に加え，液体培地を用いて，エチレン作用阻害

３．不定胚の誘導 不定胚の誘導は，固形培地で２～剤（クリザール・ジャパン）の添加，及び細胞の培養密度

３週間ごとに継代培養して増殖させた不定胚形成細胞をが不定胚誘導に与える効果について調べた。その結果，用いた。容器として 90 × 20 mm のシャーレを，培地としクリザールを添加することにより不定胚の誘導率が著して不定胚成熟用 EM-PEG 培地（２）を用いた。培地上にく向上することがわかった。クリザールを 3000 倍希釈では，約 500 mg FW の不定胚形成細胞を置床して培養した。

添加した培地を用いると，無添加培地に比べて３倍量の培養は暗黒下，25℃で行った。

不定胚が得られた（図－９）。また，細胞の培養密度を変４．不定胚の発芽と個体再生 形成した成熟不定胚は，えると，不定胚の誘導率や成熟化に多大な影響を及ぼす植物生長調節物質を含まない発芽用 EM 培地（２）に移ことが明らかとなった（図－10）。得られた不定胚は，脱し，16 時間蛍光灯照明（約 4,000 lx），25℃の環境下で培水させた後に発芽用培地で培養すると，固形培地で誘導養を行った。発芽した不定胚を，同一組成の培地に移植した不定胚と同様な発芽を示した（図－11）。成長した植し，培養した。

物体を温室で順化したところ（図－12）， 80～90％程度

５．液体培養条件の検討 不定胚形成による増殖率をの順化率を示した。

向上させるため，液体培養条件について検討を行った。
固形培地で検討した培養条件をもとに，培養フラスコ

IV おわりに（300 ml）を用いて，山元 84 # 3 の細胞系統を液体培地

液体培養条件の検討はまだ途中段階であるが，現在宮（100 ml）で不定胚の誘導における，エチレン作用阻害剤

城県にて，液体培養によって得られた約 4500 本の試作苗や細胞の培養密度の影響を調べた。得られた不定胚を発を使用して生育試験を行っている。苗化の達成度，生育芽培地に移し，培養した。

特性や実生苗との違いなどの結果を踏まえて，一刻も早く実用に向けた技術開発に貢献したいと考えている。

Ⅲ 結果と考察１．不定胚形成細胞の誘導と維持・増殖 培養開始か

引用文献

ら 1 週間ごとに，実体顕微鏡下で培養物の観察を行った。

(1) AITKEN-CHRISTIE J, THORPE TA. (1984) Clonal

培養開始１～２週間後に初期細胞誘導がみられ，約 18％

Propagation: Gymnosperms. In Cell culture and somatic cell

～36％の外植体が反応を示した。そして，不定胚形成細genetics of plants, Vol. 1. Vasil IK (ed.), 480 pp, Academic胞の誘導（図－１）については，培養開始８週間後に用いPress Inc., San Diego, 82-95

た種子のうち，約１～15％の頻度で不定胚形成細胞の増(2) 丸山Ｅ．毅・細井佳久 (2015) ポリエチレングリコー殖が認められた（表－１）。著しい系統間差がみられたが，ル又は高濃度ゲランガムを添加した培地上で成熟したク－ 74 －関東森林研究 67-1(2016)

ロマツ不定胚からの植物再生. 関東森林研究 66: 69-72(3) 丸山Ｅ．毅・細井佳久・二村典宏・斉藤真己 (2014) 無森林研究 65: 107-110

花粉スギ未成熟種子からの不定胚形成細胞の誘導. 関東

図－５．不定胚の発芽
Fig. 5 Germination of somatic embryos

図－１．不定胚形成細胞の誘導

発芽率（％）

Fig. 1 Induction of embryogenic cells

500

培養細胞系統図－２．不定胚形成細胞の増殖

図－６．細胞系統による不定胚の発芽率
Fig. 6 Somatic embryo germination from different cell lines
平均値±標準偏差（n=4）

Fig. 2 Proliferation of embryogenic cells

図－３．成熟した不定胚Fig. 3 Maturation of somatic embryos

図－７．フラスコ内で生長する植物体
Fig.7 In vitro growing of somatic plants

500400300
2001000

個体再生率（％）

不定胚数／シャーレ

100

100500培養細胞系統培養細胞系統図－４．細胞系統による不定胚の誘導率
Fig. 4 Somatic embryo induction from different cell lines
平均値±標準偏差（n=5）

図－８．細胞系統による不定胚の個体再生率
Fig. 8 Somatic embryo conversion from different cell lines
平均値±標準偏差（n=4）－ 75 －不定胚数／フラスコ

400
300
200
1000
無添加

2000倍

3000倍

4000倍

クリザール添加濃度（希釈倍）図－９．エチレン作用阻害剤（クリザール）が

図－11．液体培地で誘導した不定胚の発芽液体培地での不定胚誘導に及ぼす影響

Fig. 11 Germination of somatic embryos induced

Fig. 9 Effect of Chrysal on somatic embryo induction

in liquid medium

in liquid medium

不定胚数／フラスコ細胞の培養密度（6.5 ml），平均値±標準偏差（n=3）

4000
3000
2000
1000
0
1.5ml

2.5ml
細胞培養密度

図－12．液体培地で誘導した不定胚由来の順化苗
Fig. 12 Acclimatized somatic plants derived from embryos

図－10．細胞の培養密度が液体培地での不定胚誘導

cultured in liquid mediumに及ぼす影響
Fig. 10 Effect of cell culture density on somatic embryo
induction in liquid medium
平均値±標準偏差（n=3）

表－１．系統による不定胚形成細胞の誘導率
Table 1

Embryogenic cell induction from different seed families

系統

未熟種子

初期細胞誘導不定胚形成細胞誘導

継代可能不定胚形成細胞

培養数 (a)数 (b)％ (b/a)数 (c)％ (c/a)数 (d)％ (d/a)

亘理５６

403

72

17.9%

4

1.0%

4

1.0%

鳴瀬６

293

102

34.8%

3

1.0%

2

0.7%

鳴瀬７２

495

156

31.5%

69

13.9%

62

12.5%

山元８２

228

51

22.4%

8

3.5%

7

3.1%

山元８４

384

128

33.3%

22

5.7%

22

5.7%

山元９０

426

152

35.7%

80

18.8%

63

14.8%

－ 76 －