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細菌株を駆使した新たな「染色廃水処理装置」の開発（原題：シイタケ廃菌床ラッカーゼによる染色廃水の脱色について）

愛媛県立新居浜工業高等学校 環境化学部
2 年 伊藤 夢人 古谷 秀斗●

研究のきっかけ私たちの住んでいる愛媛県には、今やタオルのブランド名にもなっていいまばり しし こくちゅうおう しる今治市、また県の東端に位置し「紙の町」として有名な四国 中 央市がある。私たちの先輩たちは、そのタオルや紙を製造する過程で出る着色廃水を、細菌を利用して無色化させようと実験を重ね、「Chryseobacterium
daecheongense KIT-56 株」という微生物を発見した。ちなみに、この
KIT-56 株は、着色する染料の中でも特にアゾ基を分子内にもち、現在もっとも多く使用されている合成染料である「アゾ染料」に有効である1）。
その結果をもとにして、先輩たちは KIT-56 株を利用した「染色廃水処理装置」を考案し、特許取得2）した。しかし、この KIT-56 株は最後までアントラキノン（anthraquinone）系などの反応染料は脱色できなかった。
そこで私たちは、先輩たちが残してくれた課題をクリアするために、安価にかつ容易に抽出する方法を確立することにした。そのためにまず、アントラキノン系反応染料を脱色してくれる物質を「シイタケ廃菌床」に求めることで本研究をスタートさせた。
図 1 に示したのは KIT-56 株の染料脱色状況である。染色工場で使われ細菌株を駆使した新たな「染色廃水処理装置」の開発

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12345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21AAB

AC

A

B

AA

A

図1AAE

A

A

DDEFAB‌ hryseobacterium daecheongense KIT-56 株による染色工場汎用染料 20 種類の脱色C状況（上段：処理前、下段：処理後、21：RBBR）ている反応染料 20 種類のうち、「A」で示すアゾ染料はよく脱色し、「B」で示すアントラキノン系反応染料は脱色できていないことがわかる。この結果から私たちは、KIT-56 株で脱色できなかった染料をシイタケ廃菌床抽出液で脱色できるか試してみることにした。
１

シイタケ廃菌床について
私たちはこれまで、シイタケ菌床製造会社にキャリア教育でお世話になっている。そこで廃棄された大量の廃菌床の再利用方法も事業所の方と考
はくしょく ふ きゅうきん

案してきた。その中で、キノコの仲間である白 色 腐 朽 菌が生産する酵素（ラッカーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ）がリグニンを分解するだけでなく、フェノール性色素を分解するという報告3）を知ることができた。さらに、これらの酵素は染料以外にもダイオキシンなどの毒物の分解にも関係することもわかった。
このことから私たちはキノコ菌床製造会社のご協力をいただき、キノコ廃菌床を使用したアントラキノン系反応染料の脱色に関する研究を開始した。
２

アントラキノン系反応染料とはアントラキノン核をもつ構造の染料で、アゾ染料と並び主要な化学染料である（図 2）。木材繊維の主成分の 1 つであるリグニンを分解する酵素を作り出す菌類の中で、特にダイオキシンを分解する菌が、レマゾールブリリアントブルー R（RBBR ＝アントラキノン系染料である）を脱色する性

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O＝ ＝

NH2

S‑ONaO

SO
図2O

＝ ＝

＝ ＝

HN

OO‑S‑ONaO

アントラキノン（左）、レマゾールブリリアントブルー R（RBBR）（右）質をもっていることはすでに報告4）されている。しかしその分解機構は、依然として不明である。

シイタケ廃菌床抽出液の諸性質
１

実験の方法と結果（1）シイタケ廃菌床抽出液の調製法
廃菌床（森産業株式会社の「しいたけ用種菌 XR-1」を使用）100 g に対し、精製水 1000 mL を加え、さまざまな条件で抽出液を調製し、もっとも脱色率の高い条件を採用することにした。その結果、どの条件でも差が見られなかったので、20 秒ミキサーにかけてろ過することにした。
（2）染料の脱色
KIT-56 株で脱色できなかった、No.3、No.5、No.7、No.19、RBBR をシ
イタケ廃菌床抽出液で脱色できるか試してみた。
方法はシイタケ廃菌床抽出液 4.5 mL、0.1% 染料水溶液 0.5 mL を 30℃で2 時間反応させた。その結果、No.3、No.7、RBBR を脱色することができた（図 3）。
これらの脱色できた染料は、すべてアントラキノン系反応染料であったので、シイタケ廃菌床抽出液でアントラキノン系反応染料を脱色することがわかった。
（3）RBBR 脱色に関する諸性質①最適 pH

細菌株を駆使した新たな「染色廃水処理装置」の開発

No.3

図3No.727RBBR（21）アントラキノン系反応染料の脱色状況（各写真左が脱色前、右が脱色後）

ここからはアントラキノン系反応染料として、入手が容易でダイオキシン類の分解判定にも活用されている RBBR を使用して実験を進めることにした。
まずシイタケ廃菌床抽出液での脱色率を高めるため、最適 pH を検証した。 そ の 方 法 と し て は、pH1.8、pH2.2、pH2.6、pH3.0、pH3.4、pH3.8、pH4.2、pH4.6、pH5 の 2M クエン酸-1M リン酸緩衝液を調製し、シイタケ廃菌床抽出液 4.0 mL、緩衝液 0.5 mL、0.1％染料水溶液 0.5 mL を混和し、2 時間反応させた。その後、RBBR の最大吸収波長である 595 nm の吸光度を吸光光度計（UV-2550

SHIMADZU 製）で測定し、脱色率を求めた。

脱色率の計算方法は、脱色率［％］＝ 100－｛（吸光度－ブランク）/（失活処理の吸光度－ブランク）× 100｝とした。
その結果、pH2.6 の緩衝液で反応させたサンプルがもっとも脱色率が高かった。しかし 24 時間の場合には pH3.0 の緩衝液がもっとも脱色率が高かった。そこで私たちは、見た目もあまり変わりはなかったので、pH2.6 で2 時間反応させる方法を採用することにした（図 4）。
②最適温度と温度安定性
最適 pH が決まったので次に最適温度を調べることにした。シイタケ廃菌床抽出液 4.0 mL、pH2.6 緩衝液 0.5 mL、0.1％染料水溶液 0.5 mL を混和し、5℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃でそれぞれ 2 時間反応させて脱色率を求めた。その結果、30℃で 2 時間反応させたものがもっとも脱色率

反応時間 2 時間
10090807060504030201001.8 2.2 2.6 3 3.4 3.8 4.2 4.6pH

脱色率〔％〕

図4脱色率〔％〕

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5反応時間 24 時間
1009080
7060
50
4030
20
100
1.8 2.2 2.6 3 3.4 3.8 4.2 4.6
pH

シイタケ廃菌床抽出液脱色酵素の各 pH による脱色率

100
90
80
7060
50403020100

図5

脱色率〔％〕

脱色率〔％〕

285℃

10℃

20℃
30℃
温度〔℃〕

40℃

50℃

シイタケ廃菌床抽出液脱色酵素の各温度による脱色率
10090
80
7060
50
40
30
20100

図65℃

10℃

20℃
30℃
温度〔℃〕

40℃

50℃

‌ イタケ廃菌床抽出液脱色酵素の各温度処理によってシ残存した脱色活性による脱色率5