2-8 生物の環境適応機構の解明●代表者

澤田博司（生命科学科・教授）●分担者

間瀬啓介（生命科学科・教授）
外川徹（生命科学科・准教授）

井上みずき（生命科学科・准教授）【研究の目的および概要】
本研究は，生物の環境適応機構を多様な生物現象から明らかにすることを目的としている。
具体的に本年度は，以下の 4 つの目的で研究を遂行した。
1．カイコの卵休眠は，環境条件の悪化の結果やむをえず発育を休止する休眠ではなく，不良環境が訪れる以前の生育にとって不都合のない環境のもとで感受し記憶され次世代の卵で実行される。この休眠の分子機構を解明するために，初期発生や胚子活性化に密接に関わる遺伝子の構造や発現などの解析，またその遺伝子産物の機能や機能発現の調節機構などを明らかにする。
2．絹糸虫類が外敵から身を守る一手段として繭の多様な緑色化によるカモフラージュがあり，複数の遺伝子が制御している。この複雑な形質の発現様式を解明するために，カイコガの緑繭系統やその染色体置換系統をはじめとした研究素材とゲノム情報を用い，それらの原因遺伝子の同定と機能解明を行う。
3．昆虫の体表面を覆うクチクラは，種・発生段階・体の部位により物理的性質が異なり，昆虫の様々な環境への適応を可能にしている。このクチクラ多様性の分子メカニズムを理解するために，クチクラの２つの主要構成成分であるクチクラタンパク質ファミリーとキチンに注目し，両者の相互作用の多様性を解明する。
4．植物の送粉成功は地域生態系の媒介昆虫の種組成や個体数によって左右される。そこで，地域の植物相を明らかにするとともに訪花昆虫の体表についている花粉の種組成を明らかにすることで，植物への忠実度を測定する。これらの技術を用いて，植物と昆虫の交互作用系を明らかにする。
【研究の結果】
1．本研究では，浸酸処理時におけるカイコのカルシニューリン調節サブユニット（BmCalR）に着目し，BmCalR 遺伝子の発現，リコンビナント BmCalR（rBmCalR）の調製と抗 rBmCal 抗体の作製，rBmCal と Ca2+ との結合実験などを行った。まず，浸酸処理した休眠卵で BmCalR 遺伝子の発現は 浸酸処理直後から認められた。一方，精製した rBmCalR を抗原として抗 rBmCalR 抗血清が得られたので，免疫組織化学的観察を行ったところ，休眠卵と浸酸処理卵では，漿膜細胞と卵黄細胞の核周辺部に BmCalR の特異的な局在が確認出来た。
2．カイコガ緑繭化原因遺伝子の同定を強力に進める手法であるゲノム編集技術の導入を行った。まず，既に証明がされている笹繭を緑繭化する P5CR1 遺伝子の破壊により実験系の構築を試みた。産卵後 2 〜 6 時間目の卵にインジェクションし，保湿性の高い容器で 95％以上の湿度を保ち 25℃で胚発生を開始させたところ，375 粒中 50 個体の孵化幼虫を得ることができた。しかしながら，目的である P5CR1 の遺伝子破壊個体を得ることはできなかった。一方，2017 年度公開のゲノム情報から新たに見いだした糖輸送関連遺伝子について，複数の系統を用いて発現様式や塩基配列と表現形質との関連性を検討したところ，有力な笹繭遺伝子 Ga の候補を見出すことができた。
3．昆虫の体表を覆うクチクラは，主にキチンとクチクラタンパク質 (CP) から構成され，その物理的性質は多様である。この多様性は CP の多様性に起因すると考えられている。そのメカニズムの一端を明らかにするためには，
CP 最大のグループである CPR タンパク質群のキチン結合能を比較することが有効だと考えられる。そこで構造的特徴の異なる６種類の CPR タンパク質を選び，大腸菌内で組換えタンパク質を合成した。これらのキチン結合性を調べたところ，タンパク質により異なるキチン結合性を示した。

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4．送粉者が訪花履歴を明らかにするために体表面についた花粉から訪花履歴を明らかにする手法を開発した。訪花昆虫を液体につけ，その液体中に含まれる花粉の種類を顕微鏡で調べた。Rarefaction curve 分析により，6 滴ほど顕鏡すれば，90％程度の送粉履歴を調べられることが明らかとなった。
【研究の考察・反省】
1．浸酸刺激により誘導される BmCalR は，浸酸処理により遊離した Ca2+ が結合することにより BmCalR がさらに触媒サブユニットに結合し，フォスファターゼとしての機能を制御することが示唆される。そして，その結果，休眠移行を阻害する因子を活性化しているのではないかと考えられる。反省点としては，今回の rBmCalRは，大腸菌内で封入体として発現してしまったので，可溶化剤存在下で精製する事になった。そのため得られた
rBmCalR は，抗体作製用や Ca2+ との結合能解析にはかろうじて使用できたが，それ以外の機能解析を行う場合，
rBmCalR を可溶化状態で発現させることが今後の課題の一つである。
2．笹繭を緑繭化する P5CR1 遺伝子の破壊系統を作出するには至らなかったが，その実験系自体を導入することは出来た。また，笹繭発現関連遺伝子 Ga の有力な候補遺伝子が見出されてきたことから，さらなる系統を用いた検証を行うと共に，導入した遺伝子破壊実験系を用いてより直接的に同定していく予定である。しかしそのためにも，材料である卵の状態やインジェクション後の処理方法を改善することで孵化個体の出現頻度を高めるな
ど，同方法のさらなる改良が必要と考えている。
3．構造的特徴の異なる６種類の CPR タンパク質のキチン結合性が大きく異なっていたことから，このことがクチクラの多様性に大きく寄与している可能性が考えられる。しかし今回の解析では大腸菌の粗抽出タンパク質を用いており，混在する他のタンパク質の影響を排除できない。また，定量的なデータ取得には至らなかった。そこ
で，今後は合成した組換えタンパク質を精製し，定量的でキチン結合性を測定することが求められる。
4．本研究は分析手法の開発であり，この手法の正当性が認められたことから今後，この分野のスタンダードになる可能性がある。
【研究発表】
令和３年度蚕糸・昆虫機能利用学術講演会
カイコ緑繭原因遺伝子 Ga の探索（続報）2021.3.19 〜 20 ／ WEB 開催【研究成果物】
Molecular characterization and tissue distribution of calcineurin regulatory B subunit during the prevention of diapause inthe silkworm, Bombyx mori. Zoological Science (in press).
Control of the ecdysteroid level plays a crucial role in density-dependent metamorphosis in the giant mealworm beetle
Zophobas atratus. Dev. Biol., 473, 71-79 (2021)
A mitochondrial phosphatase PTPMT1 is essential for the early development of silkworm, Bombyx mori. Biochem.
Biophys. Res. Commun., 530, 713-718 (2020)
Evaluation of sampling effort required to assess pollen species richness on pollinators using rarefaction. Applications inPlant Sciences 2021 9(2): e11411

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