平成30年度

食肉に関する
助成研究調査成果報告書

公益財団法人

伊藤記念財団

VOL. 37

「伊藤記念財団」設立趣意書
私，伊藤傳三は，昭和３年食肉加工業を創業して以来五十有余年の永きにわた
り食肉加工品の製造販売に従事して参ったところであります。
この間，昭和47年からは日本ハム・ソーセージ工業協同組合理事長，社団法人
日本食肉加工協会理事長，加えて，ハンバーグ・ハンバーガー協会理事長等の重責を担わせていただく等，業界団体の役員を勤めさせていただいてきたところであります。
こうした中で昭和55年，はからずも勲二等瑞宝章受章という身にあまる栄誉に浴したのでありますが，受章に際し私自身の過ぎ来し方を振り返り，食肉及び食
肉加工業界の行く末に思いを致し，２つの事柄を決意致しました。
第１は，食肉加工団体の指導体制の若返りであり，第２は，食肉加工業の基礎的研究の充実であります。
諸情勢が激しく変わりつつある中で食肉加工業界をさらに大きく発展させるには，新しいリーダーの登場が望ましいことは論をまちません。また，食肉加工品については，これまでも日本独自の技術開発は行われてきましたものの，いずれも企業内技術であると言っても過言でなく，大学等における基礎的研究の不足が将来の日本の食肉加工業の発展を遅らせるおそれがあり，この現状を打破する必要があると考えたところであります。
以上のような基本的考えの下に私は，食肉関係団体等の役員を辞すると共に，
食肉及び食肉加工に関する基礎的かつ広汎な研究を行い，あるいは助長するための財団の設立を発起するものであります。
昭和56年６月
設立発起人© The Ito Foundation

伊

藤

傳

三

Philosophy Behind the Establishment of
the Ito Foundation
Approximately half of a century has passed since I established a meat
packing corporation for commercial products in 1928. While involved in thisbusiness, I have had occasion to serve as chairman of the boards of trustees
of several organizations related to the meat industry, such as the HamSausage Industrial Association of Japan in 1972, the Meat Packing Industrial
Association of Japan, and the Hamburg-Hamburger Association of Japan.
In 1980, unexpectedly, I was highly honored to receive the Order of the
Sacred Treasure, Gold and Silver Star from the emperor in acknowledgement of my contributions to the meat industry and improved human nutrition
during my career. This illustrious award provided a strong impetus for me toact on my long-standing concern for the future of meat packing industries.
My commitment to the establishment of a new research foundation for thepromotion of meat science was based on two fundamental philosophies : first,
leadership of the Association of the Meat Packing Industry should be transferred to people with novel ideas and, second, an advanced system for basic
research should be established in meat industries. Clearly, fresh leadership isneeded in changing situations for intensive development in the meat packing
industry. Although some technical product developments have been achievedin certain individual corporations, the lack of basic research in meat scienceat universities and other research organizations certainly will impede future
development of Japanese meat packing industries. It is urgent to end the stagnation in the meat industry through research support.
On the basis of these philosophies, I myself will resign from any official
positions in meat-related associations and will establish a new researchfoundation to support and promote basic and applied research in meat
science.
Denzo Ito, Founder
June© The Ito Foundation

1981

事 業 の あ ら ま し（目

的）本財団は，食肉に関する研究及び調査を行い，もって畜産業及び食品産業の振興と国民食生活の安定に資することを目的とする。
（事業）

本財団は，上述の目的を達成するため，次の事業を行う。
⑴

食肉の生産，処理，加工等に関する基礎的研究及び調査⑵

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査を行う大学等の研究機関に対する助成⑶

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査に優れた業績が認められる研究者の表

彰⑷

食肉の生産，処理，加工等に関する情報の普及及び広報（事業実績）
年度
昭和57年度
58
59
60
61
62
63
平成元年度
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30

第１回
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37

研究調査助成48件 60,000千円
52
54,40060
49,80062
48,00070
53,00079
58,90095
70,50086
74,25079
60,00070
50,00086
60,00081
60,00081
60,00082
65,00081
69,10078
59,00082
60,00067
47,00057
41,00053
37,00058
40,00055
41,00055
48,00056
48,00011
10,00012
10,00015
16,90011
10,000
11
10,40012
12,00013
13,00038
37,00058
54,80069
66,00071
69,00074
75,00084
101,200© The Ito Foundation

ご

挨

拶

当伊藤記念財団は，伊藤ハム株式会社の創業者故伊藤傳三による巻頭の「設立趣意書」に掲げた趣意をもって，昭和56年７月３日に財団法人として農林水産大臣から設立を許可され、平成24年４月１日に公益財団法人伊藤記念財団に移行登記したものであり，事業の内容は，「事業のあらまし」にあるとおりであります。
おかげ様で当財団は，平成24年度からは公益財団法人として活動することとなり，その活動は本年で37年となります。この間，当財団の研究調査助成事業の存在が畜産関係の方々の間に浸透いたし，事業内容も逐次充実して参りつつあります。
これは，ひとえに関係各位のご指導ご鞭撻の賜と深く感謝申し上げるとともに，今後とも，
食肉加工等の基礎的研究の充実を希う創設者の意志にそって，益々食肉産業ひいては畜産業の振興及び国民食生活の安定のために役立つべく，更に努力を重ねて参りたいと存じております。
本書は，第37回（平成30年度）助成事業における84件の研究調査助成対象研究者の皆様からいただいた研究成果報告とともに，第４回となります伊藤記念財団賞授賞事業の受賞者とその業績概要と学会等事業助成の概要をとりまとめたものでありますが，以上の目的にしたがって，食肉産業の基礎的研究等に携わる諸氏の研究の一助ともなれば幸甚でございます。
令和元年11月

理事長

伊

藤

功

一

Dear Sir：
I am very pleased to send you and your organization a complimentary copy of theresearch reports of the Ito Foundation. This research foundation was founded by the late
Mr.Denzo Ito to advance research in meat science. The research reports are publishedannually. Unfortunately, the articles are largely in Japanease ; however, in the future wehope to contribute to the international development of meat science. Any constructive
suggestions or critiques from others involved in meat-related research would be accepted
gratefully.
You will find out philosophy behind the establishment of the Ito Foundation describedby Mr.Denzo Ito, in the research report of the Ito Foundation, Vol.37 enclosed here. We
appreciate any interest you may have in our research efforts.
It is my great pleasure to publish this report as the chief director.
Sincerely yours,
Nov. 2019
Koichi Ito
The chief director
The Ito Foundation© The Ito Foundation

i

研究助成事業目次

ミートエクストラクトのコク味とγ－グルタミルペプチドの関係について
鈴木

秀之・髙倉



有喜子・荒井進太郎（京都工芸繊維大学応用生物学系）

3

久（神戸大学大学院農学研究科）

10

明（鹿児島大学大学院医歯学総合研究科衛生学・健康増進医学分野）

15

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明（Ⅱ）


本

田

和

鹿児島黒豚における血中酸化ストレスと肉質との関連検討


川

口

博

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの活性増強と基質認識機構の改変（Ⅲ）


滝

田

禎

亮（京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻）

24

豚特有のチアミン三リン酸蓄積機構の解明
室谷


進・大江

美香

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

32

和牛肉のおいしさを「見える化」する


山

田

知

哉（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

38

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明


西

村

敏

英（女子栄養大学栄養学部）

45

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅲ）
市村

さやか・高橋吉田

真佐郎・中村

由香・猪口

幸信・
昭仁＊

由美・服部

（一般社団法人食肉科学技術研究所，＊北海道大学）

54

豚肉の筋線維タイプ組成と肉質の関連性に関する研究
水野谷

航＊・澤野

祥子＊＊・中村

真子・辰巳

隆一

＊

（九州大学大学院農学研究院， 現所属：麻布大学獣医学部，＊＊

現所属：麻布大学生命・環境科学部）

64

軽度認知症改善効果を示した豚肝臓分解物の活性本体の同定とメカニズム解明
塚原

完・羽二生

久夫＊・松田佳和＊＊（長崎大学医歯薬学総合研究科薬学系，＊信州大学先鋭領域融合研究群バイオメディカル研究所，＊＊



日本薬科大学薬学部臨床教育部門）

70

食肉タンパク質の抗肥満および脂質代謝促進効果に関する研究（Ⅱ）


若

松

純

一（北海道大学北方生物圏フィールド科学センター）© The Ito Foundation75

ii
牛心臓由来新規コレステロール代謝改善ジペプチドの作用機構解明および革新的コレステロール
代謝改善素材開発のための基礎研究長岡利（岐阜大学応用生物科学部）

80

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究（Ⅱ）
林

利哉・長澤

幸彦＊・芳賀

麻央・小川

聖一
84

（名城大学農学部，＊名城大学農学部附属農場）



肥満に伴うサルコペニア発症予防に対するカルノシン摂取の有用性（Ⅱ）
後藤


孔郎・正木

孝幸・柴田

洋孝

（大分大学医学部内分泌代謝・膠原病・腎臓内科学講座）

89

食肉摂取による，不飽和脂肪酸等の生活習慣病予防効果について（佐久コホートに於ける疫学研究）


山

田

晃

一（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所）

94

食肉を中心とする食品由来核酸の腸管保護機能の解析（Ⅱ）


河

合

慶

親（徳島大学大学院医歯薬学研究部）

101

豚赤血球由来グロビンタンパク分解物を用いた高血圧症の改善を目指した研究
糸井


亜弥・宮

菜美華・吉川豊（神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科）

107

ファージおよび食品成分等による食肉の安全確保に関する研究


宮

本

敬

久（九州大学大学院農学研究院）

112

薬剤耐性菌のガスプラズマ殺菌機構解明に向けた分子論的アプローチ
作道章一１・三沢達也２（１琉球大学医学部保健学科生体代謝学分野，


佐賀大学大学院工学系研究科電気電子工学専攻）

118

一

123

２

電気定数測定に基づく食肉の鮮度評価齊

藤幸（千葉大学フロンティア医工学センター）

可視・近赤外分光イメージングと深層学習を併用した食肉加工品のスマート品質管理

牧野義雄・チャオフイ

フォン（東京大学大学院農学生命科学研究科）

129

牛経済形質に関わる新規 DNA 多型の探索（Ⅱ）


松

本

大

和（東海大学農学部応用動物科学科）

135

吉

141

抗菌性ペプチドを指標とした豚抗病性育種法の開発
上本伸（東北大学大学院農学研究科）

肉用地鶏の増産を目指した雌系名古屋種の産卵率および卵殻強度に関する遺伝子座の効率的な探索後藤

達彦１・國重享子２・西村健志１・佐藤駿２（１帯広畜産大学，２北海道立総合研究機構）

146

牛の暑熱ストレス耐性を担う HSP70.1 遺伝子多型に関する研究森美幸（福岡県農林業総合試験場生産環境部）© The Ito Foundation

150

iii
DNA メチル化網羅解析法による種雄牛の受胎性の評価


山崎

淳平・永野

昌志（北海道大学大学院獣医学研究院）

157

霜降り豚肉の生成に関わる生体内因子の探索谷口雅章１・中島郁世１・荒川愛作１・吉岡

豪２・鈴木

香澄２

（
 １国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，２岐阜県畜産研究所）

163

組織分化制御因子の遺伝子発現プロファイルに基づく豚体外受精胚の新規培養技術の開発


澤井

健・三浦

瑠璃（岩手大学農学部）

165

体外胚生産技術を活用した純粋種豚（トウキョウＸ）の生産性向上に関する研究
幸之助１・鈴木岡田亜由美２（１日本獣医生命科学大学応用生命科学部動物科学科，
２

公益財団法人

東京都農林水産振興財団

東京都農林総合研究センター畜産技術科）

171

発情発見困難牛の特徴解明による授精率向上方策の検討


坂口

実・菊池

元宏・三浦

弘（北里大学獣医学部）

176

牛におけるクロモグラニンＡの分泌動態および繁殖障害への関与の解明と子宮内膜における生理機能の解析高橋透（岩手大学農学部）

181

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロ RNA 定量に関する基盤的研究

木崎景一郎・高橋透（岩手大学農学部共同獣医学科）

187

なつ美（東京農工大学農学研究院）

194

牛における新規腟内薬剤投与技術の確立


田中

知己・遠藤

牛体内成熟卵を用いた移植用胚生産システムの高度化に関する研究


山

中

賢

一（佐賀大学農学部）

198

洋一郎（京都大学大学院農学研究科附属牧場）

204

黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査
星野

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明（Ⅱ）
武田

久美子・西野景知＊・佐藤伸哉＊＊・今井昭＊＊（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，
 ＊茨城県畜産研究センター肉用牛研究所，＊＊広島県立総合技術研究所畜産技術センター）

212

牛の卵巣・子宮機能調節に及ぼす不飽和脂肪酸の影響とその利用
作

本

亮

介

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門家畜育種繁殖研究領域）
220

肝機能と栄養状態解析を用いた牛子宮内膜炎の新たな予後判定評価法の開発


大

滝

忠

利（日本大学生物資源科学部獣医学科獣医臨床繁殖学研究室）

226

牛の肝機能障害が炎症性子宮疾患の重篤化に及ぼす分子メカニズムの解明


真

方

文

絵（東京大学大学院農学生命科学研究科）© The Ito Foundation

232

iv
牛における卵管上皮細胞を用いた新規精子受精能獲得能評価法の開発および性選別精子の受精能獲得能機能評価（Ⅱ）
栁川

智裕＊洋二郎・菅野（北海道大学大学院獣医学院，＊社団法人ジェネティクス北海道）

238

豚における繁殖性の向上に向けたアミノ酸の効果に関する研究北原豪（宮崎大学農学部獣医学科産業動物臨床繁殖学研究室）

243

繁殖雌牛における栄養コントロールが過剰排卵処置の反応性および回収胚数に与える影響
林

武司・深水

大・上田



修二・稲田

淳

（福岡県農林業総合試験場畜産部）

250

卵巣の鉄不足に起因した豚における繁殖障害の解明（Ⅱ）―肝臓の鉄放出能低下と繁殖障害の関係―


山

下

泰

尚（県立広島大学生命環境学部）

255

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御（Ⅱ）


佐藤

繁・木崎

景一郎（岩手大学農学部共同獣医学科）

263

食肉の薬剤耐性菌による汚染菌数の測定法の開発・評価

石原

加奈子・野村静香（東京農工大学農学部）

269

弘（岐阜大学応用生物科学部）

275

筋肉中の虫体数を予測できるトキソプラズマ感染豚の検出法


高

島

康

牛趾乳頭腫症の性状解明を目指したメタゲノム解析と疫学研究


後

藤

恭

宏（九州大学大学院医学研究院）

279

簡便・迅速なマダニによって媒介される牛のアナプラズマ症とバベシア症の診断法開発
田仲

哲也１・Galay Remil Ringgatong１・山崎

渉２（１鹿児島大学共同獣医学部，２宮崎大学農学部）

286

消化管寄生性コクシジウム，Eimeria krijgsmanni における発育休止期の解析


松

尾

智

英（鹿児島大学共同獣医学部寄生虫病学分野）

289

鶏に対する高効率・低負荷な新規サルモネラ粘膜ワクチンの開発
谷


浩

行

（大阪府立大学大学院生命環境科学研究科獣医学専攻獣医内科学研究グループ）295

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査


森

本

素

子（宮城大学食産業学群）

302

ゲノム疫学的手法による豚抗酸菌症のリスク評価と実態解明
大屋（岐阜大学応用生物科学部

賢司・小松

徹也＊

現：国立医薬品食品衛生研究所，

＊

愛知県中央家畜保健衛生所）

307

鶏における家畜関連黄色ブドウ球菌の病原遺伝子および病態形成の解析（Ⅱ）
小野© The Ito Foundation

久弥（北里大学獣医学部）

313

v
ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症ヘテロ保因牛における病態解析（Ⅱ）
猪熊壽（帯広畜産大学畜産学部）

320

エゾシカ由来腸管出血性大腸菌の食品衛生リスクに関する研究
晋也１・山崎福本栄樹２（１帯広畜産大学原虫病研究センター，２帯広畜産大学動物・食品検査診断センター）324

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索（Ⅱ）―より効果的なワクチン接種部位を求めて―
市居

修・中村

鉄平・小千田

圭吾・山下



祐輔・池田

哲平

（北海道大学大学院獣医学研究院）

329

豚腸管細胞モデルを用いた豚サーコウイルス関連疾病の重症化機序解明


岡

林

環

樹（宮崎大学農学部獣医学科）334

猛（東京大学大学院農学生命科学研究科）

339

アフリカ豚コレラの侵入リスク評価に関する疫学研究


杉浦

勝明・芳賀

豚増殖性腸炎による可食部位の廃棄防止に向けた適正な抗生物質使用方法の検討


岡

田

彩

加（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）345

南九州における PRRS ウイルス変異株の地理的分布および病理学的解析


平

井

卓

哉（宮崎大学農学部）

350

北海道の肉用牛における牛ウイルス性下痢症の疫学調査
典和１・迫田磯田

義博２（１北海道大学人獣共通感染症リサーチセンター，２北海道大学大学院獣医学研究院）

356

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅱ）
黒木

香澄・吾郷

仁田

良輔・竹下

義弘・門屋

奈知子・

＊

亨介 ・関崎勉（東京大学大学院農学生命科学研究科食の安全研究センター，＊



現所属：椙山女学園大学生活科学部管理栄養学科）

362

野鳥が媒介する家畜のボツリヌス症の分子疫学的解析


阪

口

義

彦（北里大学医学部微生物学）

371

豚流行性下痢ウイルス感染による致死性を決定する遺伝子の同定
大橋

誠一・神谷

亘＊

（国立研究開発法人農業・食品産業技術研究機構動物衛生研究部門，
＊

大阪大学微生物病研究所感染症国際研究センター臨床感染症学研究グループ）376

反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索
青山


真人１・

蕪山

由己人２

（１宇都宮大学農学部生物資源科学科，２宇都宮大学農学部応用生命化学科）

380

地方病性牛白血病の簡易鑑別診断法の開発と若齢発症牛の実態調査への応用


岡

川

朋

弘（北海道大学大学院獣医学研究院）© The Ito Foundation

387

vi
ワイン搾汁残渣タンニンを利用したラム肉パストラルフレーバー低減技術の確立上田宏一郎（北海道大学大学院農学研究院）

394

骨格筋肥大を促進する植物由来成分の探索


米

倉

真

一（信州大学農学部）

400

家畜生産における抗生物質使用量の低減化を目指した「ミサイル」抗菌剤の創出

榎本賢（東北大学大学院農学研究科）

405

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響（Ⅱ）


高田

良三・田坂

祐介・立原

可南子（新潟大学農学部）

412

カリウムおよびセシウムの含量が低い国産実用牧草品種の選抜と育種に向けた植物生理学的解析
小林奈通子・二瓶直登（東京大学大学院農学生命科学研究科）

419

妊娠末期の乳用牛へのバイパスリジン給与がその産子の栄養代謝へ及ぼす影響


川島

千帆・山岸

則夫（帯広畜産大学畜産学部）

424

乳牛の周産期における肝臓由来の新規タンパク質の発現と分泌動態盧尚建（東北大学大学院農学研究科）

431

養鶏における個体管理と清掃ロボット導入による IoT 型食肉生産技術の開発
堀口

健一１・片平

光彦１・市浦茂２・高垣徹３（１山形大学農学部，２岩手大学大学院連合農学研究科，３ティーエーシー）435

成熟後の効率的な筋肥大の誘導に寄与する筋幹細胞の探索


鈴

木

貴

弘（北海道大学大学院農学研究院）

441

飼料用イネの繊維消化性を左右する要因の解明と生産現場との技術的連携近藤誠（三重大学大学院生物資源学研究科）

449

黒毛和種肥育牛の安定的ルーメン発酵に貢献する重要細菌群の特性把握小池聡（北海道大学大学院農学研究院）

455

乳用子牛への機能性飼料の給与による亜急性第一胃アシドーシスの制御と発育向上
櫛


引

史

郎

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

461

豚の未熟産子（ひね豚）の発育遅延をもたらす生理的要因の解明
中島

郁世・谷口
渡邊



雅章・芦原
源哉・本山

茜・荒川

愛作・

三知代・佐々木啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

469

亜鉛トランスポーターに着目した亜鉛栄養改善飼料の開発（Ⅱ）


神

戸

大

朋（京都大学大学院生命科学研究科）

474

半教師あり学習による飼料成分を予測する新たな近赤外分析法の開発
田中


常喜・出口

健三郎

（地方独立行政法人北海道立総合研究機構畜産試験場）© The Ito Foundation

480

vii
黒毛和種の分娩間隔短縮に資する新たな栄養管理指標の開発～牛体３Ｄモデルを用いたアプローチ～
木野

勝敏・兒嶋



朋貴・青木

直人・増田

達明

（愛知県農業総合試験場畜産研究部）

486

乳牛における高糖分イネ WCS（ホールクロップサイレージ）多給による高繁殖型飼養管理システムの確立（Ⅱ）
山口

昇一郎・柴田

果歩・柿原

孝彦・川島

千帆＊

（福岡県農林業総合試験場，＊帯広畜産大学フィールド科学センター）

493

暑熱条件下で陥る肉用鶏の免疫疲弊化を回避する機能性飼料の探索
豊水

正昭・平川

良太・野地



智法・喜久里基（東北大学大学院農学研究科）© The Ito Foundation

499

viii

CONTENTS
Relationship between kokumi andγ-glutamylpeptides in meat extracts
Hideyuki Suzuki, Yukiko Takakura and Shintaro Arai
（Division of Applied Biology, Kyoto Institute of Technology） 

3

Identification of the main factor determining the taste of Jidori meat（Ⅱ）
Kazuhisa Honda（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University） 

10

Relationships between blood oxidative stress and meat quality in swine, Kagoshima Kurobuta
Hiroaki Kawaguchi（Department of Hygiene and Health Promotion Medicine, Kagoshima University Graduate School of
Medical and Dental Sciences, Kagoshima University） 

15

Activity enhancement and substrate specificity modification of microbial transglutaminase byprotein engineering
Teisuke Takita（Kyoto University, Graduate School of Agriculture, Division of Food Science and Biotechnology） 

24Mechanism of porcine-specific thiamine triphosphate accumulation in skeletal muscle cells
Susumu Muroya and Mika Oe（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

32

Studies on the new evaluation method of Wagyu beef quality
Tomoya Yamada（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

38

Clarification of the enhancement mechanism of “koku attributes” by lipids in pork sausages
Toshihide Nishimura（Faculty of Nutrition Science, Kagawa Nutrition University） 

45

Effect of hypoxanthine on the improvement of taste during postmortem aging of meat（Ⅲ）
Sayaka Ichimura, Masao Takahashi, Yukinobu Nakamura, Yuka Yoshida, Yumi Inoguchi andAkihito Hattori＊（Japan Meat Science and Technology Institute, ＊Hokkaido University） 

54

Relationship between fiber type composition and meat quality in pork meat
Wataru Mizunoya＊ , Shoko Sawano＊＊, Mako Nakamura and Ryuichi Tatsumi（Faculty of Agriculture, Kyushu University, ＊present affiliation: School of Veterinary Medicine, Azabu
University, ＊＊present affiliation: School of Life and Environmental Science, Azabu University） © The Ito Foundation

64

ix
Identification and characterization of bioactive compounds on mild cognitive impairment in
porcine liver decomposition productTamotsu Tsukahara, Hisao Haniu＊ and Yoshikazu Matsuda＊＊（Department of Pharmacology and Therapeutic Innovation, Nagasaki University, ＊Graduate School of
Biomedical Sciences, Interdisciplinary Cluster for Cutting Edge Research, Shinshu University, ＊＊ClinicalPharmacology Educational Center, Nihon Pharmaceutical University） 

70Dietary effect of meat protein on anti-obesity and lipid metabolism（Ⅱ）
Jun-ichi Wakamatsu（Hokkaido University, Field Science Center for Northern Biosphere） 

75

Elucidation of mechanism of the novel hypocholesterolemic dipeptide drived from cattle heart
peptide and basic study of development of an innovative hypocholesterolemic food materials
Satoshi Nagaoka（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University） 

80Retort processing and cold lactic acid fermentation induce protein degradation and functional
peptides derivation in myofibrillar protein system（Ⅱ）
Toshiya Hayashi, Mao Nagasawa, Yukihiko Ogawa＊ and Seiichi Haga
（Faculty of Agriculture, Meijo University, ＊Experimental Farm, Meijo University） 

84

Efficacy of carnosine intake on the prevention of sarcopenia related with obesity（Ⅱ）
Koro Gotoh, Takayuki Masaki and Hirotaka Shibata（Department of Endocrinology, Metabolism, Rheumatology, and Nephrology, Faculty of Medicine, Oita
University） 89Prevention effects of unsaturated fatty acids on lifestyle-related diseases by the dietary intakeof meat sources（Saku cohort study）
Kouichi Yamada（National Research and Development Agency National Institutes of Biomedical Innovation, Health andNutrition） 94

Effects of nucleic acids from meat and other foods on the functions of intestinal cells（Ⅱ）
Yoshichika Kawai（Graduate School of Biomedical Sciences, Tokushima University） 

101

Improvement effect of globin protein derived from pig red cell on the blood pressure in SHR
hypertension rats
Aya Itoi, Namika Miya and Yutaka Yoshikawa（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Womenʼs University） 

107

Study on ensuring the safety of meat by phage and food components
Takahisa Miyamoto（Faculty of Agriculture, Kyushu University） © The Ito Foundation

112

x
Analysis of disinfection mechanisms of drug-resistant bacteria by gas plasma using moleculartheoretical approach
Akikazu Sakudo1 and Tatsuya Misawa2（1Laboratory of Biometabolic Chemistry, School of Health Sciences, University of the Ryukyus,
Department of Electrical and Electronic Engineering, Faculty of Science and Engineering, Saga

2

University） 

118

Evaluation of meat freshness based on measurement of its electrical properties
Kazuyuki Saito（Center for Frontier Medical Engineering, Chiba University） 

123

Smart quality management of meat processed products using visible and near-infraredmultispectral imaging combined with deep learning
Yoshio Makino and Chao-Hui Feng
（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo） 

129Novel gene polymorphisms identification related to cattle economic traits（Ⅱ）
Hirokazu Matsumoto（Department of Animal Science, School of Agriculture, Tokai University） 

135

Development of pig breeding for disease resistance with antimicrobial peptides
Yoshinobu Uemoto（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University） 141

Rapid genetic mapping for egg production and eggshell strength in Nagoya breed for productionof meat-type chicken
Tatsuhiko Goto1, Kyoko Kunishige2, Kenji Nishimura1 and Shun Sato2（1Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, 2Hokkaido Research Organization）

146

The study of polymorphism in the bovine HSP70.1 gene associated with thermotolerance
Miyuki Mori
（Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center） 

150

Genome-wide DNA methylation analysis for early evaluation of bulls
Jumpei Yamazaki and Masashi Nagano（Hokkaido University, Graduate School of Veterinary Medicine） 

157

Investigation of a bio-marker relating to pork meat marbling
Masaaki Taniguchi1, Ikuyo Nakajima1, Aisaku Arakawa1, Go Yoshioka2 and Kasumi Suzuki2（1Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, 2Gifu Prefectural Livestock ResearchInstitute） 163© The Ito Foundation

xi
Improvement of in vitro culture system of porcine IVF embryos by gene expression profiles
involved in cell differentiation
Ken Sawai and Ruri Miura（Faculty of Agriculture, Iwate University） 

165

Improvement of offspring-productivity on closed-colony pig（Tokyo-X）using in vitro
production technologies
Konosuke Okada1 and Ayumi Suzuki2（1School of Animal Science, Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary and Life Science
University, 2Tokyo Metropolitan Agriculture and Forestry Research Center） 

171

Characterization of estrus-related behaviors in subestrous cattle to improve submission rate
Minoru Sakaguchi, Motohiro Kikuchi and Hiroshi Miura（School of Veterinary Medicine, Kitasato University） 

176

Study of bovine chromogranin-A ; Plasma profiles between the normal and repeat-breeding
animals, and physiological roles in the uterine endometrium
Toru Takahashi,（Faculty of Agriculture, Iwate University） 

181

Study of circulating microRNA as biomarker for pregnancy in cattle
Keiichiro Kizaki and Toru Takahashi（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University） 

187

Establishment of novel intravaginal drug releasing device in cows
Tomomi Tanaka and Natsumi Endo
（Tokyo University of Agriculture and Technology, Institute of Agriculture） 

194

Study on improvement of in vitro embryo production system using oocytes matured in vivo forembryo transfer
Ken-ichi Yamanaka（Faculty of Agriculture, Saga University） 

198

Survey of the low durability of motile sperm in the frozen semen of Japanese Black cattle
Yoichiro Hoshino（Kyoto university livestock farm） 

204

Effect of antioxidant supplementation on quality improvement of cryopreserved bull semen（Ⅱ）
Kumiko Takeda, Kagetomo Nishino＊, Nobunari Sato＊＊ and Akira Imai＊＊（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, Beef Cattle Institute, ＊Ibaraki Prefectural
Livestock Research Center, ＊＊Hiroshima Prefectural Livestock Research Center） © The Ito Foundation

212

xii
Effects of linoleic acids and linolenic acids on ovarian and uterine function in cows
Ryosuke Sakumoto（Division of Animal Breeding and Reproduction Research, Institute of Livestock and Grassland Science,
NARO） 220

Development of a new prognostic evaluation method for bovine endometriosis using liverfunction and nutritional status analysis
Tadatoshi Ohtaki（Laboratory of Theriogenology, Department of Veterinary Medicine, College of Bioresource Sciences,
Nihon University） 

226

Effect of hepatic dysfunction on the molecular pathophysiology of uterine inflammatory diseases
in cows
Fumie Magata（Graduate School of Agricultural and Life Science, The University of Tokyo） 

232

Novel method for evaluating capacitation ability of bovine sperm using oviductal epithelial cells
and evaluation of sex sorted sperm function（Ⅱ）
Yojiro Yanagawa and Chihiro Kanno＊（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University, ＊Genetics Hokkaido Association） 238

Research on effects of amino acid for improving reproductive performance in sow
Go Kitahara（Theriogenology, Department of Veterinary Sciences, Faculty of Agriculture, University ofMiyazaki） 

243

Effect of nutrition control on superovulation response and the number of recovered embryo inheiferTakeshi Hayashi, Dai Fukamizu, Shuji Ueda and Sunao Inada（Department of Animal Production, Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center） 

250

Elucidation of reproductive disorders in swine caused by iron deficiency in ovary（Ⅱ）―Relationship between reduction of iron releasing capacity of liver and reproductive disorder―
Yasuhisa Yamashita（Department of Life and Environment Science, Prefectural University of Hiroshima） 

255

Prediction and control of subacute ruminal acidosis in periparturient dairy cows（Ⅱ）
Shigeru Sato and Kei-ichiro Kizaki（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University） 

263

Development and evaluation for determination of number of antimicrobial-resistant bacteria inmeats
Kanako Ishihara and Shizuka Nomura（Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology） © The Ito Foundation

269

xiii
Detection strategy of Toxoplasma gondii infected pigs and estimation of cysts burden in muscles
Yasuhiro Takashima（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University） 

275

Metagenomic and epidemiological studies for characterization of papillomatous digitaldermatitis
Yasuhiro Gotoh（Faculty of Medical Sciences, Kyushu University） 

279

Development of simple and rapid diagnosis of bovine anaplasmosis and babesiosis transmitted
by tick
Tetsuya Tanaka1，Galay Remil Ringgatong1 and Ayumu Yamasaki2（1Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, 2Faculty of Agriculture, Miyazaki
University） 

286

Analysis of the resting stage in the life cycle of the intestinal coccidian parasite, Eimeria
krijgsmanni
Tomohide Matsuo（Laboratory of Parasitology, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University） 

289

Development of novel salmonella mucosal vaccine with high efficiency and fewer side effects onchickens
Hiroyuki Tani
（Laboratory of Veterinary Internal Medicine, Division of Veterinary Science, Graduate School of Life andEnvironmental Sciences, Osaka Prefecture University） 295

A survey of gastrointestinal parasites infection and implementation of parasite control programin cattle
Motoko Morimoto（School of Food Industrial Sciences, Miyagi University） 

302

Population genomics and risk assessment of swine mycobacteriosis
Kenji Ohya and Tetsuya Komatsu＊（Department of Applied Biological Sciences, Gifu University, Present address : National Institute of
Health Sciences, ＊Aichi Prefectural Chuo Livestock Hygiene Service Center） 

307

Livestock-associated S. aureus in chicken : virulence, resistance and pathogenesis（Ⅱ）
Hisaya Ono（Kitasato University School of Veterinary Medicine） 313

Analysis for pathophysiology of heterozygous individual with cholesterol deficiency in Holstein
cattle（Ⅱ）
Hisashi Inokuma（Obihiro University of Agriculture & Veterinary Medicine） © The Ito Foundation

320

xiv
Research on food hygiene risk of enterohemorrhagic Escherichia coli isolated from Sika deer
Shinya Fukumoto1 and Eiki Yamasaki2（1National Research Center for Protozoan Diseases, Obihiro University of Agriculture and Veterinary
Medicine, 2Diagnostic Center for Animal Health and Food Safety, Obihiro University of Agriculture andVeterinary Medicine） 324

Study of mucosa-associated lymphoid tissues in farm animals（Ⅱ）― to identify more effective
regions for their vaccination―
Osamu Ichii, Teppei Nakamura, Keigo Kosenda, Yusuke Yamashita and Teppei Ikeda（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University） 

329

Mechanisms of progression of sever porcine circovirus associated diseases by porcine intestinal
cell model system
Tamaki Okabayashi（Department of Veterinary medicine, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki） 

334

Epidemiological research on the risk assessment of introduction of African swine fever intoJapan
Katsuaki Sugiura and Takeshi Haga
（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo） 

339

Study of appropriate usage of antibiotics for preventing the disposal of edible parts by Porcine
Proliferative Enteropathy
Ayaka Okada（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu
University） 

345

Geographical distribution and pathological analysis of PRRS virus variants in southern Kyushu
Takuya Hirai（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki） 350

Epidemiological study of bovine viral diarrhea in beef cattle in Hokkaido
Norikazu Isoda1 and Yoshihiro Sakoda2（1Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University, 2Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido
University） 

356

Comprehensive analysis of the behavior of Campylobacter and coexistent bacteria in chicken
food chain（Ⅱ）
Kasumi Kuroki, Ryosuke Ago, Nachiko Takeshita, Yoshihiro Nitta, Ryosuke Kadoya＊ andTsutomu Sekizaki（Research Center for Food Safety, Graduate School of Agricultural Life Science, The University ofTokyo, ＊present affiliation : Department of Human Nutrition, School of Life Studies, Sugiyama Jogakuen
University） 

362© The Ito Foundation

xv
Molecular epidemiological analysis of wild bird-mediated botulism in livestock
Yoshihiko Sakaguchi（Department of Microbiology, Kitasato University School of Medicine） 371

Determination of gene involved in mortality in piglets by PEDV infection
Seiichi Ohashi and Wataru Kamitani＊（National Institute of Animal Health, National Agriculture and Food Research Organization, ＊Laboratoryof Clinical Research on Infectious Diseases, Research Center for Infectious Disease Control, ResearchInstitute for Microbial Diseases, Osaka University） 

376

Investigation of the physiological markers indicating ʻnauseaʼ in domestic ruminants
Masato Aoyama1 and Yukihito Kabuyama2（1Department of Agrobiology and Bioresources, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University,
Department of Applied Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University） 

2380

Development of a simple diagnostic criteria for enzootic bovine leukemia and survey of juvenile
bovine leukemia in Japan
Tomohiro Okagawa（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University） 

387

Establishment of reducing technology for pastoral flavor of lamb meat using tannin in wine
pomaceKoichiro Ueda
（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University） 

394

Screening for phytochemicals that induce skeletal muscle hypertrophy
Shinichi Yonekura（Faculty of Agriculture, Shinshu University） 

400

Synthesis of a “missile” -antibacterial reagent that can contribute to reduction of the amount ofantibiotics contained in livestock feed
Masaru Enomoto（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University） 

405

Effects of rice feeding on growth performance and protein（amino acids）metabolism of
weaning piglets（Ⅱ）
Ryozo Takada, Yusuke Tasaka and Kanako Tachihara（Faculty of Agriculture, Niigata University） 

412

Species and cultivar selection for low potassium and low cesium in grasses
Natsuko I. Kobayashi and Naoto Nihei（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo） © The Ito Foundation

419

xvi
Effect of rumen-protected lysine supplementation during late gestation period in dairy cattle on
metabolic status in their calves
Chiho Kawashima and Norio Yamagishi（School of Agriculture and Animal Science, Obihiro University of Agriculture and Veterinary
Medicine） 424

The expression and secretion pattern of new hepatokine during the peripartum in dairy cattle
Sanggun Roh（Tohoku University, Graduate School of Agricultural Science） 

431

Development of IoT type meat production system to introduce for individual management andcleaning robot of poultry farming
Kenichi Horiguchi1, Mitsuhiko Katahira1, Shigeru Ichiura2 and Toru Takagaki3（1Faculty of Agriculture, Yamagata University, 2The United Graduate School of Agricultural Sciences,
Iwate University, 3TAC Inc.） 

435

The search study about myogenic stem cell population which can promote muscular hypertrophy
efficiently in adult animals
Takahiro Suzuki（Research Faculty of Agriculture, Graduate School of Agriculture, Hokkaido University） 

441

Studies on fiber digestibility of forage rice, and development of research-based cooperativeextension service
Makoto Kondo（Graduate School of Bioresources, Mie University） 

449

Determination of factors affecting on growth of rumen bacterial species contributing to stablerumen fermentation in Japanese Black cattle
Satoshi Koike（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University） 

455

Effects of active dry yeast supplementation on subacute ruminal acidosis and growth
performance in Holstein calves
Shiro Kushibiki（National Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

461

Factors affecting mortality and growth retardation in runt pigs
Ikuyo Nakajima, Masaaki Taniguchi, Akane Ashihara, Aisaku Arakawa, Genya Watanabe,Michiyo Motoyama and Keisuke Sasaki（National Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

469

Studies on a feed for improving zinc nutrition by the use of zinc transporters（Ⅱ）
Taiho Kambe（Graduate School of Biostudies, Kyoto University） © The Ito Foundation

474

xvii
Semi-supervised learning in near-infrared spectroscopy and chemometrics for prediction of thenutrient composition of grass silage
Tsuneki Tanaka and Kenzaburo Deguchi（Local Independent Administrative Agency, Hokkaido Research Organization Animal ResearchCenter） 

480

The development of alternative indicators of body condition score in Japanese black cows for
shortening calving interval : an approach using 3D model generation of cattle by shape-fromsilhouette method
Katsutoshi Kino, Tomoki Kojima, Naoto Aoki and Tatsuaki Masuda（Animal Husbandry Division, Aichi Agricultural Research Center） 

486

New system development of high fertility by feeding large amounts of a diet comprising sugarrich rice whole crop silage in lactating dairy cows（Ⅱ）
Shoichiro Yamaguchi, Kaho Shibata, Takahiko Kakihara and Chiho Kawashima＊（Fukuoka Agricultural Research Center, ＊Field Center of Animal Science and Agriculture, Obihiro
University of Agriculture and Veterinary Medicine） 

493

Development of feed for improvement of antigen-specific immune response in heat-stressedchickens
Masaaki Toyomizu, Ryota Hirakawa, Tomonori Nochi and Motoi Kikusato（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University） © The Ito Foundation

499

xviii

伊藤記念財団賞
目林

利哉（名城大学農学部応用生物化学科

次教授）

筋肉・食肉タンパク質の機能・加工特性に関する研究―ゲル化特性，変性・分解挙動，
生理活性― 今内513

覚（北海道大学大学院獣医学研究院病原制御学分野

准教授）

食肉の生産現場における牛白血病の新たな制御法の開発 

水野谷

航（九州大学大学院農学研究院

助教

514

現所属：麻布大学獣医学部）

筋繊維タイプの解析技術開発と食肉生産への応用に関する研究 © The Ito Foundation

515

xix

学会等事業助成目次

アジア地域の食肉衛生に関するシンポジウムに関する開催報告
公益社団法人日本獣医学会

代表理事

久和

茂（東京大学） 519

日本食肉研究会の平成 30 年度事業助成実施報告
日本食肉研究会会長

坂田亮一（麻布大学・明治大学） 521

平成 30 年度事業実施報告書
日本畜産学会第 125 回大会

公開シンポジウム「スマート畜産：IoT・人工知能およびロボット技術の利活用」
公益社団法人日本畜産学会

理事長

寺田文典（東北大学） © The Ito Foundation525研究助成事業© The Ito Foundation

3

ミートエクストラクトのコク味とγ-グルタミルペプチドの関係について
Relationship between kokumi and γ-glutamylpeptides in meat extracts

鈴木

秀之・髙倉

有喜子・荒井進太郎（京都工芸繊維大学応用生物学系）

Hideyuki Suzuki, Yukiko Takakura and Shintaro Arai
（Division of Applied Biology, Kyoto Institute of Technology）

Peptidase D from Escherichia coli which has Arg-Gly-His6-Gly-Ser insertion between thefirst and second codon was shown to have carnosinase activity. This suggests that peptidase D
may synthesize carnosine from β-alanine and histidine by its reverse reaction.
γ-Glutamyltranspeptidase of Bacillus subtilis synthesized γ-glutamylcarnosine from glutamineand carnosine. The results suggest that γ-glutamylcarnosine can be synthesized from its
constituent amino acids, glutamine, β-alanine and histidine, by two bacterial enzymes.

１．目

中での広がり，厚みといった料理の風味を増強す

的るものである」とされている６）ため，食品の製造

イミダゾールジペプチド（イミダペプチド）の段階でコク味物質を生成させることにより，料理１種であるＬ-カルノシン（β-アラニル-Ｌ-ヒスの塩味や甘味を変えることなく調理に使う塩分やチジン）が，食肉に高濃度存在することが知られ糖分を無理なく減らすことができるようになり，ている。食肉を熱水抽出して調味料としてのミー

高血圧や糖尿病といった生活習慣病の予防や治療

トエクストラクトを製造する工程で，グルタミンに繋がる低塩・低糖食が開発できると期待されとカルノシンが反応してγ-グルタミルカルノシる。我が国では少子高齢化が進行しているが，健ンが生成するとされている１）。一方，さまざまな康長寿が理想である。また，医療費の増大が社会

γ-グルタミルアミノ酸やγ-グルタミルペプチド問題となっており，高価な医薬品でなく，日常のがコク味物質だと報告されているが安価な食品によって病気を予防できれば，社会に

，γ-グ

２～５）

ルタミルカルノシンの呈味性についてはこれまで貢献できる。

報告がない。申請者はγ-グルタミルカルノシン

一方，経口摂取したγ-グルタミルカルノシン

がコク味物質であると予想しており，そのことをは，小腸絨毛突起に局在しているγ-グルタミル

確かめることが本研究の最終目的である。

トランスペプチダーゼ（GGT；EC

2.3.2.2）に

コク味物質は「それ自身は弱い香りと甘味をよって切断され，グルタミン酸とカルノシンとし持っているが，それ自体の味が分からない程度のて体内に取り込まれると予想される。カルノシン

少量添加することにより，例えば，持続性，口のには，ラジカルスカベンジャーとして細胞を酸化© The Ito Foundation

4

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ストレスから保護する効果，抗糖化作用により多列を付加してPCR増幅した。このDNAフラグメ

くの変性疾患の発症や悪化に関与する終末糖化産

ントをアガロースゲル電気泳動で分離，Wizard

物の生成速度を遅くする作用，テロメアが短くな

SV Gel and PCR Clean-up System （プ ロ メ ガ）

る速度を遅くする作用などが報告されていることを用いて精製した。精製フラグメントをBamHIから，経口摂取したγ-グルタミルカルノシとPstIで切断，同システムで精製後，BamHIとンから遊離したカルノシンの機能によっても健康

PstIで切断したpQE-80Ｌにクローニングし，得寿命の伸長に貢献できる。

られたプラスミドをpSH1836とした。得られたプ

７～10）

２．方

ラスミドはT5プロモーターの制御下にSD配列，

法

開 始 コ ド ン ，Arg-Gly-His６-Gly-Ser に 続 き ，

2 . 1 HPLCによるアミノ酸，ペプチドの定量になっていることをDNAシーケンスにより確認

法
HPLCによるアミノ酸，ペプチドの分析は既法 に従い，Amino Naカラムを用いて行った。
11）

2.2

PepDの第二コード以下がクローニングされた形した。
CM86 株 （F － pepA pepB pepN Δ（pro-lac）leu

TLCによるアミノ酸，ペプチドの分離

met thy）は，C. G. Miller12）より分与を受けた株TLC分析にはアルミニウムシート シリカゲル

である。Δ（pro-lac）の欠失はpepD域も含んでい

60 F254 （Merck）を 用 い た 。標 準 液 と し て ，るので，この株はPepD － である。SH138株（F －10mMのカルノシン，ヒスチジン，β-アラニン

thyA36 hisG::Tn10）からP1virファージを 用い水溶液を用いた。サンプルはプレートの下からて ，hisG::Tn10 を CM86 株 に 形 質 導 入 し た 株 を

1.5cmのところに線を引いて両端１cmを開けて１AS05株とした。CM86株をpSH1836とpQE-80Ｌ

cm間隔でサンプルを５μlずつスポットした。展で形質転換した株をそれぞれSH1846株，AS09株，

開溶媒は，ｎ-ブタノール：酢酸：水＝４：１：

AS05株をpSH1836とpQE-80Ｌで形質転換した株１を用いた。前線がプレートの上端から0.5cmまを そ れ ぞ れ AS06 株 ，AS08 株 と し た 。ま た ，で移動したらプレートを乾燥させた。プレートがMG1655株をpQE-80Ｌで形質転換した株をFS54

乾燥したらもう一度展開槽にプレートを入れて前株とした。

線がプレートの上端から0.5cmにくるまでサンプ

2.4ルを展開した。プレートを乾燥後，0.3％ニンヒ

SH1846株をアンピシリン100μg/mlを含むLB

ドリン溶液（アセトン：エタノール＝３：１）を培地５mlに植菌し，37℃で16時間培養した。こかけ，乾燥した後，ホットプレート上で加熱，発の前培養液を体積比で50分の１になるよう，アン色させた。

ピ シ リ ン 100 μg/ml を 含 む LB 培 地 に 植 菌 し ，

2.3

菌株の作成

至適pHの決定法

37℃，120rpmで振盪培養した。OD600が0.6となっ大腸菌MG1655株のゲノムを鋳型，オリゴヌク
レオチドBamHI_pepD_N（CCCGGATCCTCTG

た時点で終濃度１mMとなるようIPTGを添加し，37℃でさらに３時間振盪培養した。

AACTGTCTCAATTATCTCC） と PstI_pepD_

５ml分の培養液を集菌し，さまざまなpHの緩C（CCCCTGCAGTTACTTCGCCGGAATTTCT

衝液１mlで洗菌後，同じ緩衝液１mlに懸濁した。

TTCAGC）を プ ラ イ マ ー と し て pepD 遺 伝 子 の緩衝液としては，pH5.0，5.5，6.0は0.2Ｍの酢酸

コーディング領域の両端にBamHIとPstI認識配ナトリウム緩衝液，pH6.0，6.5，7.0，7.5，8.0は0.2© The Ito Foundation

ミートエクストラクトのコク味とγ-グルタミルペプチドの関係について

5

Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。菌体懸濁を持つか確認した。FS54株，SH1846株，AS09株

液を超音波処理して，無細胞抽出液を調製した。

をPro，Met，Thyを補ったM9 glucose最少寒天

無細胞抽出液と反応液を100μlずつ混ぜ合わせ培地に植え，37℃で１晩培養し生育を観察した（カ ル ノ シ ン の 終 濃 度 10mM ，CoCl ２ の 終 濃 度（Table１）。

0.1mMとなるよう），37℃で１時間反応させたのCM86株（SH1846株とAS09株の宿主）はPro，ち，５分間煮沸して反応を停止させた。遠心後のLeu，Met，Thy要求性である。大腸菌はジペプ

上清をHPLCとTLCで分析した。

チドを切断する基質特異性の広いペプチダーゼとして，アミノペプチダーゼＡ，アミノペプチダー

３．結果と考察ゼＢ，アミノペプチダーゼＮ，ペプチダーゼＤを

3 . 1 pSH1836（pQE-80L::pepD）か ら ペ プ チ

持つことが知られている。CM86株はこれらすべてを欠損しているためLeu-Glyを切断してLeuをダーゼＤが発現していることの確認
pSH1836（pQE-80L::pepD）から発現するペプ

遊離し，Leu源とすることができない。pSH1836

チダーゼＤは開始コドンと第二コドンの間に（pQE-80L::pepD）から発現するペプチダーゼＤ

Arg-Gly-His６-Gly-Serを挿入した形になっていは第一コドンと第二コドンの間にArg-Gly-His6-

る。SH1846株（pSH1836/CM86）とAS09（pQE-

Gly-Serを挿入した形になっているので，ペプチ

80L/CM86）の 菌 体 を 抗 His-tag 抗 体 を 用 い てダーゼＤの本来の活性を持つかをまず確認した。

Western-blotに供した結果，SH1846株にのみバ

Table１に示すようにpSH1836から発現するペプンドが見られ，AS09株にはバンドが見られなかっチダーゼＤは，Leu-Glyを加水分解する活性を持た（data not shown）。SH1846株に見られたバン

つことが分かった。

ドの分子量はpSH1836上のpepD遺伝子がコード

3 . 3 pSH1836（pQE-80L::pepD）か ら 発 現 すするペプチダーゼＤのサブユニットの予想分子量

るアミノペプチダーゼＤがカルノシンを分（54,182）と一致したことから，Ｎ末にHis-tagが解することの確認付加されたペプチダーゼＤタンパク質が発現したと考えられた。

大 腸 菌 の ペ プ チ ダ ー ゼ Ｄ の Salmonella
typhimuriumのホモログであるペプチダーゼＤは

3 . 2 pSH1836（pQE-80L::pepD）か ら 発 現 す

カルノシンの加水分解活性を持つことが報告さるペプチダーゼＤがLeu-Glyを分解するこれ，詳しく調べられている13）。大腸菌のペプチダーとの確認

ゼＤもカルノシン加水分解活性を持つとされてい発現したペプチダーゼＤタンパク質が酵素活性

るが14），その性質についての詳細な報告はない。

Table 1 Utilization of Leu-Gly as a leucine source to complement leucine

auxotrophy．

StrainRepresentative genotype＋0.3mM Leu-Gly

none

FS54

pQE-80L/leu＋＋＋

SH1846

pQE-80L::pepD/leu－

＋

－

AS09

pQE-80L/leu－－－

M9 glucose minimal medium supplemented with 2 mM Pro, 0.3 mM Met, and 0.32
mM Thy was used. Plates were incubated at 37℃.

© The Ito Foundation

6

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 2 Utilization of carnosine（β-Ala-His）as a histidine source to complement

histidine auxotrophy．

StrainRepresentative genotype＋0.1mM His＋0.1mM carnosine

none

FS54

pQE-80L/his＋

＋

＋

＋

AS06

pQE-80L::pepD/hisG－

＋

＋

－

AS08

pQE-80L/hisG－

＋

－

－

SH1846

pQE-80L::pepD/his＋

＋

＋

＋

M9 glucose minimal medium supplemented with 2 mM Pro, 0.3 mM Met, 0.32 mM Thy, and 0.3
mM Leu was used. Plates were incubated at 37℃.

AS05 株（AS06 株 ，AS08 株 の 宿 主）は His ，た と き と 同 様 に SH1846 株 を 培 養 し ，１ mM のPro，Leu，Met，Thy要求性である。カルノシン

IPTGを添加していたところを０，0.5，１，1.5mMはβ-Ala-Hisなので，pSH1836（pQE-80L::pepD）と振って誘導し，無細胞抽出液のカルノシン分解から発現するペプチダーゼＤがカルノシンを加水

活性を同様に求めたところ，１mMのIPTG添加

分解できればHisを供給できる。

が最適であった（Fig. 1C）。

Table２が示すように，pSH1836（pQE-80L::pepD）

3 . 6 γ-グルタミルトランスペプチダーゼのから発現する第一コドンと第二コドンの間に転移反応を用いてグルタミンとカルノシン

Arg-Gly-His６-Gly-Serを挿入したペプチダーゼからγ-グルタミルカルノシンが酵素合成

Ｄもカルノシンを加水分解してHisを供給できた。

できることの確認

つまりカルノシナーゼ活性を持つことが分かった。

γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（GGT；

3 . 4 pSH1836（pQE-80L::pepD）か ら 発 現 すEC 2.3.2.2）はグルタチオンなどのγ-グルタミル

るアミノペプチダーゼＤのカルノシン加水化合物の加水分解反応とそのγ-グルタミル基を分解活性の至適pHの検討

他のアミノ酸やペプチドに転移し，新たなγ-グ

実験方法で述べたように異なるpHの緩衝液でルタミル化合物を生成する転移反応を触媒す

セルフリーを調製し，TLCとHPLCで分析した。

る 15）。大腸菌や枯草菌のGGTは１つのオープン

TLCプレートでもHPLCでも，カルノシンとヒリーディングフレームの中にシグナルペプチド，

スチジンの分離はよくなかったが，β-アラニン

大サブユニット，小サブユニットがコードされては分離できたので，β-アラニンの生成量でペプいる構造をとっており，１本のポリペプチド鎖とチダーゼＤのカルノシン分解活性を評価した。い

して翻訳された後，細胞質外に排出される過程でずれの方法でもpH7.5の時にカルノシンが最もよ

シグナルペプチドが外され，さらに自己触媒的にく分解されていた（Fig. 1A, B）。

大小サブユニットにプロセスされることが分かっ

3 . 5 ペプチダーゼＤ発現のための最適IPTGている16，17）。著者らはこれまでにこの酵素を用いてさまざまなγ-グルタミル化合物を効率よく酵

濃度の検討
pSH1836（pQE-80L::pepD）の pepD 遺 伝 子 は素合成する方法を開発してきた18，19）。本研究では，

T5プロモーターとlacオペレーターの制御下にあ

この酵素の転移反応を利用して，グルタミンとカり，IPTGによる誘導が可能である。そこで，誘

ルノシンからγ-グルタミルカルノシンを酵素合導に最適なIPTG濃度を検討した。至適pHを求め成することを検討した。

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ミートエクストラクトのコク味とγ-グルタミルペプチドの関係について
A） SH1846

7

SH831/pQE-80L=AS10

pH 5.0 5.5 6.0 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 5.0 5.5 6.0 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0β-Ala car car
His

C）

6
5
4

2.5

β-Ala released（mM）

β-Ala released（mM）

B）

2

1.5

3
2

1

0.5

1
0
4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5
pH

0

0

0.5
1
1.5
IPTG（mM）

2

Fig. 1 The pH profile of carnosine hydrolysis activity of peptidase D from strain SH1846 obtained by TLC plate（A）

and by HPLC（B）.（C）Effect of IPTG concentration on pepD induction from pSH1836.

pQE-80Ｌの開始コドン，Arg-Gly-Ser-His６にがγ-グルタミル化合物の生成量が多くなり，グ続き枯草菌のggt遺伝子の大小サブユニットのルタミンが急速に減少し，グルタミン不足となっコーディング域（シグナル配列を除いた）をクた（data not shown）。いったん生成したγ-グル

ローニングしたプラスミドpTH3でΔggt-2変異をタミルカルノシンが分解したのはグルタミン不足

持つSH641株を形質転換してTH5株を得た。このが原因と考えられる。グルタミンの初発濃度を上株の無細胞抽出液をNi-アガロースカラム（和光げ，pHを高くし，酵素量を減らすことで，γ-グ

純薬製）で精製した酵素標品を用いた。

ルタミルカルノシンの収量を増大できると期待さグルタミン，カルノシンの混合液のpHを調整
後，GGTを添加し，各濃度が20mM，20mM，2.0
μ/mlになるように水で調節した。Fig.２はpHを

れる。
４．要

約

９にした時の反応開始前（Ａ）と開始後１時間目

第一コドンと第二コドンの間にArg-Gly-His6-（Ｂ）のHPLCのチャートである。グルタミンとGly-Serを挿入した大腸菌のペプチダーゼＤがカ

カルノシンから，γ-グルタミルカルノシン，γ-

ルノシン分解活性を持つことを示し，逆反応によグルタミルグルタミン，グルタミン酸が生成してるβ-アラニンとヒスチジンからの酵素合成の可いることが分かった。反応液のpHを振ったとこ

能性が示唆された。また，枯草菌のγ-グルタミ

ろ，pHが中性に近いほどグルタミン酸の生成速ルトランスペプチダーゼを用いてグルタミンとカ度が速く，グルタミンの加水分解反応が優先的にルノシンからγ-グルタミルカルノシンを酵素合進行したと考えられる。一方，pHを10.5以上にす成できることを示したことから，２種類の微生物

るとグルタミンの加水分解反応は緩やかになった

酵素を用いることでコク味物質と考えられるγ-© The Ito Foundation

8

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

1000 mV
900

A）

Intensity（mV）

800

carnosine

Gln

700
600
500
400
300
200
100
0
0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0 min

25.0

30.0

35.0

40.0 min1000 mVB）

Gln

γ-Glu-carnosine

900

700
600
500

γ-Glu-Gln

Intensity（mV）

800

Glu

400
300
200
100
0
0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

Retention time（min）
Fig. 2 HPLC elution patterns of the reaction mixture of 20 mM glutamine, 20 mM carnosine, and 2.0 μ g/ml GGT（pH9）before（A）and after（B）one hour of incubation.

グルタミルカルノシンを構成アミノ酸から全合成できることが示唆された。
文献１） Kuroda, M., Ohtake, R., Suzuki, E., Harada, T.：
Investigation on the formation and thedetermination of γ-glutamyl-β-alanylhistidine andrelated isopeptide in the macromolecular fraction ofbeef soup stock, J. Agric. Food Chem., 48, 6317～
6324, 2000.
２） Ueda, Y., Yonemitsu, M., Tsubuku, T., Sakaguchi,
M . , M i y a j i m a , R . ：F l a v o r c h a r a c t e r i s t i c s o fglutathione in raw and cooked foodstuffs, Biosci.

Biotech. Biochem., 61, 1977～1980, 1997.
３） Dunkel, A., Köster, J., Hofmann, T.：Molecularand sensory characterization of γ-glutamyl
peptides as key contributors to the kokumi taste ofedible beans（Phaseolus vulgaris L.）, J. Agric. Food
Chem., 55, 6712～6719, 2007.
４） Toelstede, S., Dunkel, A., Hofmann, T.：A seriesof kokumi peptides impart the long-lasting
mouthfulness of matured gouda cheesem, J. Agric.
Food Chem., 57, 1440～1448, 2009.
５） Ohsu, T., Amino, Y., Nagasaki, H., Yamanaka, T.,
Takeshita, S., Hatanaka, T., Maruyama, Y.,
Miyamura, N., Eto, Y.：Involvement of the calciumsensing receptor in human taste perception, J. Biol.
Chem., 285, 1016～1022, 2010.

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ミートエクストラクトのコク味とγ-グルタミルペプチドの関係について
６） Ueda, Y., Sakaguchi, M., Hirayama, K., Miyajima,R., Kimizuka, A.：Characteristic flavor constituentsin water extract of garlic, Agric. Biol. Chem., 54, 163～169, 1990.
７） Kohen, R., Yamamoto, Y., Cundy, K. C., Ames, B. N.：
Antioxidant activity of carnosine, homocarnosine,and anserine present in muscle and brain, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3175～3179, 1988.
８） McFarland, G. A., Holliday, R.：Retardation of
the senescence of cultured human diploid fibroblasts
by carnosine, Exp. Cell Res., 212, 167～17, 1994.
９） Shao, L., Li, Q. H., Tan, T.：L-Carnosine reduces
telomere damage and shortening rate in cultured
normal fibroblasts, Biochem. Biophys. Res. Commun.,
324, 931～936, 2004.
10） Boldyrev, A., Aldini, G., Derave, W.：Physiology
and pathophysiology of carnosine, Physiol. Rev., 93,
1803～1845, 2013.
11） Suzuki, H., Izuka, S., Minami, H., Miyakawa, N.,
I s h i h a r a , S . , K u m a g a i , H . ：U s e o f b a c t e r i a l
γ-glutamyltranspeptidase for enzymatic synthesisof γ-D-glutamyl compounds, Appl. Environ.
Microbiol., 69, 6399～6404, 2003.
12） Miller, C. G., Schwartz, G.：Peptidase-deficientmutants of Escherichia coli, J. Bacteriol., 135, 603～
611, 1978.

913） Kirsh, M., Dembinski, D. R., Hartman, P. E.,
Miller, C. G.：Salmonella typhimurium peptidase
active on carnosine, J. Bacteriol., 134, 361～374, 1978.
14） Klein, J., Henrich, B., Plapp, R.：Cloning andExpression of the pepD gene of Escherichia coli, J.
Gen. Microbiol., 132, 2337～2343, 1986.
15） Suzuki, H., Hashimoto, W., Kumagai, H.：
Glutathione metabolism in Escherichia coli, J. Mol.
Catal. B Enzym., 6, 175～184, 1999.
16） Suzuki, H., Kumagai, H.：Autocatalytic processingof γ-glutamyltranspeptidase, J. Biol. Chem., 277,
43536～43543, 2002.
17） 鈴木秀之，和田啓，福山恵一：γ-グルタミルト
ランスペプチダーゼの立体構造に基づいた成熟化と酵素反応機構，蛋白質核酸酵素，54，245～251，2009.
18） Suzuki, H., Yamada, C., Kato, K.：γ-Glutamyl
compounds and their enzymatic production using
bacterial γ-glutamyltranspeptidase, Amino Acids,
32, 333～340, 2007.
19） Suzuki, H.：Microbial production of amino acids
and their derivatives for use in foods, nutraceuticals,
and medications, In Microbial production of foodingredients, enzymes and nutraceuticals, Ed. by B
McNeil, D Archer, I Giavasis, and L Harvey, pp.385412, Woodhead Publishing, Cambridge, UK, 2013.

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10

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明（Ⅱ）
Identification of the main factor determining the taste of Jidori meat（Ⅱ）

本

田

和

久

（神戸大学大学院農学研究科）

Kazuhisa Honda（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

Jidori is one of tasty and popular meats in Japan. However, the main factor determining
the taste of Jidori meat have not been identified. It is well known that Japanese prefer female
and aged Jidori meat rather than male and young one. In the present study, the effects of age
and sex on the taste of Jidori meat and unsoluble collagen ratio in order to identify thecandidate index indicating the palatability of Jidori meat. The paired test for boiled thigh slicemeats of Jidori revealed that 76 day old female Jidori meat was significantly juicier than sameage male one. 97 day old female Jidori meat shows significantly high chewiness andfracturability when compared to same-age male one. 97 day old female Jidori meat shows
significantly high springiness when compared to the 76 day old one. 97 day old male Jidori
meat shows significantly low fattiness and high chewiness when compared to 76 day old one.
Unsoluble collagen ratio was significantly elevated by age, and female Jidori meats showedsignificantly high unsoluble collagen ratio when compared to male Jidori meats. These findings
suggest that unsoluble collagen ratio in Jidori meat may be used as a good index of the qualityof Jidori meat.

１．目

需要増加を目的として，地鶏の品種改良による増的体性の改善も進められているが，地鶏肉の美味し

地鶏肉は我国が誇る優れた食味の食材であり，さの決定要因が明らかにされないまま，増体性のその美味しさは我国鶏肉市場の約９割を占める安みによって地鶏の品種改良が進められれば，地鶏

価なブロイラーの肉とは一線を画す。しかしなが肉の価格低下は達成されても，その美味しさが損

ら，地鶏肉は鶏肉としては高価格であるにもかかなわれてしまうことが懸念される。フランスにおわらず，牛肉の肉質等級のような品質評価基準がいては，国の基準に適合した赤ラベルが貼られた

確立されていない。そのため，平成11年に地鶏肉

鶏肉（赤鶏）が，高価格にもかかわらずフランスのJAS規格が決定されて以降も，地鶏肉とブロイ

国内の鶏肉市場の３割以上を占める。この事実がラー肉との美味しさの違いが十分に消費者に認識示すように，我が国においても，地鶏肉の品質評

されず，その市場拡大が思うように進まない状況

価基準が確立され，その基準に応じて市場価格がが続いている。ここで，地鶏肉の価格低下による決定されれば，地鶏肉においても和牛や赤鶏のよ© The Ito Foundation

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明（Ⅱ）

11

うな確固たる市場が形成される可能性が高いと判肉の重量を測定した後，左右のもも肉を24時間冷断される。そのためには，地鶏肉の美味しさの要

蔵保存後，もも肉を減圧包装し，－30℃で冷凍保因を科学的に明らかにしなければならない。

存した。その後，冷凍のもも肉の中央部を内転筋

地鶏肉の美味しさは，「適度な歯ごたえ」やに対して垂直に１cm幅でスライスし，内転筋，「うま味」という言葉で表現される。このうち，

大腿二頭筋，および縫工筋他を含む４枚のスライ「うま味」を形成するとされているアミノ酸およ

ス肉を再び減圧包装後，官能検査に供するまで－

び核酸関連物質については，地鶏肉とブロイラー

30℃で冷凍保存した。

鶏肉の抽出液に含まれるアミノ酸や核酸関連物質

2.2

官能検査

の含量には大きな違いは見られないことが報告さ

官能検査当日に2.1で調製したスライス肉を解。一方，「適度な歯ごたえ」は骨格

凍後，３倍量の１％食塩水を加えた後，90℃以上

筋の筋線維組成の相違に基づくものであることがで15分間湯煎し，官能検査に供した。評価項目は，示唆されており ，日齢７）［香り（鶏肉らしい香り，獣臭，異臭，全体の強により影響されることが報告されている。実際，さ），風味（鶏肉らしい風味，獣風味，異風味，

比内地鶏においては雌のみが鶏肉生産用に供され全体の強さ），食感（咀嚼しやすさ，歯ごたえ，ており，雄の食味を改善するべく効率的な去勢方

ジューシー感，噛み切りやすさ），および味（う法が検討されている 。ここで，食肉の歯ごたえ

ま味，甘味，酸味，塩味，苦味，異味，コク，脂っは不溶性コラーゲン含有率の上昇によって増加す

こさ，まろやかさ，持続性，全体の強さ）］とし，ることが知られている 。しかしながら，これまそれぞれの項目について，標準検体を基準値０とでに，地鶏肉の食味，飼育期間，雌雄差，およびした上下３段階（＋３，とても強い；＋２，強不溶性コラーゲン含有率との関連を調べた報告はい；＋１，やや強い；－１，やや弱い；－２，弱ない。

い；－３，とても弱い）で判断させた。パネラー

れている

１～３）

４）

，あるいは飼育方法

５，６）

８）

９）

本研究では，地鶏肉の美味しさの決定要因を解には，最初に食べた鶏肉に比べ，次に食べた鶏肉明するための一環として，日齢および性別の違いの値を評価させた。なお，食べる順序が官能評価

が地鶏肉の食味と不溶性コラーゲン含有率に及ぼに与える影響をなくすため，パネラーには鶏肉のす影響について調べた。

食べる順序を伝えない条件下で，雌－雄，雄－雌，

２．方
2.1

76日齢－97日齢，97日齢－76日齢の４通りの順序

法で食して評価する官能検査を各パネラーごとに行った。

地鶏の飼育と検査用鶏肉の調製

０日齢の雌雄の地鶏（ひょうご味どり）に前期

2.3

不溶性コラーゲン含量率の測定

用トウモロコシ－大豆粕主体飼料（粗タンパク質2.1で調製したスライス肉をミンチ後，総コラー

21.8％，代謝エネルギー3,147kcal/kg）を28日齢

ゲン含有率および可溶性コラーゲン含有率をLiu

まで，後期用前期用トウモロコシ－大豆粕主体飼らの方法９）に従い測定し，総コラーゲン含有率か

料 （粗 タ ン パ ク 質 18.6 ％， 代 謝 エ ネ ル ギ ー

ら可溶性コラーゲン含有率を差し引き，不溶性コ

3,167kcal/kg）を76あるいは97日齢まで，それぞラーゲン含有率を算出した。

れ給与した後，12時間絶食し，炭酸ガス麻酔下で2.4

安楽死させた。脱羽後，右むね肉，および左もも体重，むね肉重量，もも肉重量，および不溶性© The Ito Foundation

統計解析

12

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

コラーゲン含有率は二元配置分散分析により，官肉の比較では，雄より雌がジューシーであること

能検査結果はマン・ホイットニーのＵ検定によ（＋0.50），97日齢のもも肉の比較では，雄より雌り，それぞれ解析し，危険率５％未満の差を有意が噛み切りやすく（＋0.57），咀嚼しやすいこととした。

（＋0.50），異なる日齢の雄のもも肉の比較では，
76 日 齢 よ り 97 日 齢 の 方 が 噛 み 切 り や す く

３．結果と考察（＋0.56），脂っこさが少ないこと（－0.50），およ

二元配置分散分析の結果，体重，むね肉，および異なる日齢の雌のもも肉の比較では，76日齢よ

びもも肉の重量は，雌に比べて雄が，76日齢に比り 97 日 齢 の 方 が 歯 ご た え が あ る こ と（＋0.43）

べて97日齢が，それぞれ有意に高い値を示したが，それぞれ示唆された。これらの結果から，雄（Fig.１）。また，官能検査の結果，76日齢のももよりも雌の，76日齢よりも97日齢まで飼育した地

Body weight4000

p<0.05Agep<0.05Sex
Interaction p>0.05

（g）

3000
2000
1000
0

76d
male

76d
female

97d
male

97d
femaleRight breast muscle

400

Age
p<0.05Sex
p<0.05Interaction p>0.05

（g）

300
200
100
0

76d
male

76d
female

97d
male

97d
femaleLeft thigh

500

Age
p<0.05Sex
p<0.05Interaction p>0.05

（g）

400
300
200
100
0

76d
male

76d
female

97d
male

97d
femaleFig. 1 Comparison of weights of body, right breast muscle, and left thigh of Jidori chickens© The Ito Foundation

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明（Ⅱ）

13100p<0.05Agep<0.05Sex
Interaction p>0.05

（%）

80
60
40
20
0

76d
male

76d
female

97d
male

97d
femaleFig. 2 Unsoluble collagen ratio of thigh meat slices of Jidori chickens

鶏の肉質が，それぞれ好ましいことが示唆された。
官能検査の結果，雌雄および日齢の違いは，主腿二頭筋のみを用いて比較することによって，その差がより顕著に示される可能性もある。

として食感の違いに認められたことから，食感に最近，コラーゲンに特徴的なアミノ酸であるヒ

影響するとされる不溶性コラーゲン含有率を測定

ドロキシプロリン含量を近赤外線を用いて測定でした。その結果，雄よりも雌の，76日齢よりも97きることが報告された14）。この結果と我々の結果

日齢まで飼育した地鶏の不溶性コラーゲン含有率を考え合わせれば，解体後の鶏肉を用いて機械が，それぞれ有意に高いことが明らかになった

的・自動的に鶏肉の食感を解析することにより，（Fig.２）。鶏肉の柔らかさは筋周膜の厚さと正の鶏肉の格付けが可能になることを示唆する。ま相関があることが報告されている 。また，Ⅲ型

た，日齢に伴う鶏肉の剪断力価の増加は，鶏の皮

コラーゲン含量の増加は，鶏肉の柔らかさと嗜好

膚のペントシジン含量と正の相関を示すことが報性を高めるとする報告もある 。これらの結果か告されている15）が，ペントシジンは非侵襲的に測ら，地鶏肉の性別および日齢における食感の違い

定できることから，鶏肉の食感を飼育中の生体をの原因の一つとして，筋周膜におけるコラーゲン

用いて経日的に測定できる可能性もある。今後，の重合促進や組成の変化に基づく物理学的性状の本研究の発展により地鶏肉の美味しさの決定要因

変化が示唆された。

となる不溶性コラーゲンの最適含有率を明らかに

10）

11）

地鶏肉とブロイラーの浅胸筋，深胸筋，あるいできれば，その化学分析結果と，骨格筋から近赤は大腿二頭筋をオーブンで熱処理し，その物性を外線により得られる種々のパラメーターや，皮膚比較した報告では，大腿二頭筋の弾力性が地鶏のペントシジン含量との相関を解析することに基肉で高いことが明らかにされている。また，タイ

づき，地鶏肉の美味しさの格付けと，それを高めの在来種の鶏においては，加熱した浅胸筋およびる最適な飼育管理方法を開発できる可能性が高ま大腿二頭筋の剪断力価がブロイラーに比べて高いると判断された。

12）

値を示すこと，およびその原因として不溶性コ
ラーゲン量の増加が示唆されている13）。本研究で４．要約用いたもも肉は，大腿二頭筋に加え，大内転筋や本研究では，地鶏肉の食味の指標となる候補物

長内転筋などの骨格筋を含むことから，今後，大質を同定する目的で，日齢と性別の違いが地鶏肉© The Ito Foundation

14

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）の食味と不溶性コラーゲン含有率に及ぼす影響を調べた。湯煎した地鶏ももスライス肉の比較試験の結果，76日齢のもも肉は，雄より雌がジューシーであること，97日齢のもも肉は，雄より雌が噛み切りやすく，咀嚼しやすいこと，雄のもも肉
は76日齢より97日齢の方が噛み切りやすく，脂っこさが少ないこと，および雌のもも肉は76日齢より97日齢の方が歯ごたえがあることが明らかになった。また，不溶性コラーゲン含有率は，76日
齢よりも97日齢で，雄よりも雌で，それぞれ有意に高い値を示した。これらの結果は，不溶性コ
ラーゲン含有率は，地鶏肉の肉質の指標として使用できる可能性を示している。
文献１） 山田未知，山田幸二：市販の会津地鶏肉における遊離アミノ酸と脂肪酸組成について，日本食生活学
会誌，24，177～182，2013.
２） 松石昌典，加藤綾子，石毛教子，堀剛久，石田雄祐，
金子紗千，竹之中優典，宮村陽子，岩田琢磨，沖谷明紘：名古屋コーチン，ブロイラーおよび合鴨肉の食味特性の比較，日本畜産学会報，76，423～430，
2005.
３） Fujimura, S., Koga, H., Takeda, H., Tone, N.,
Kadowaki, M., Ishibashi, T.：Chemical compositionsof pectoral meat of Japanese native chicken, Hinaijidori, and broiler of the same and marketing age,
Animal Science and Technology, 67, 541～548, 1996.
４） 尾関教生，吉田行夫，加藤貞臣，河村孝彦，伊藤
孝夫，申七郎：名古屋コーチン（名古屋種）鶏肉の食品組織学的特性（第１報）もも肉の結合組織について，調理科学，25，301～305，1992.
５） 岩本久雄：鶏骨格筋の構造と産肉生理，西日本畜産学会報，50，７～13，2007.
６） 嶋澤光一，荒木勉：飼育形態が特産肉用鶏の肉色と筋線維特性に及ぼす影響，日本家禽学会誌，36，371～376，1999.
７） 仁木隆博，佐伯祐里佳，家入誠二，米田一成，荒木朋洋，芝田猛：飼育形態が特産肉用鶏の成長，産肉性および脂肪蓄積に及ぼす影響，日本暖地畜産学
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８） Rikimaru, K., Takahashi, H., Nichols, M. A.：An
efficient method of early caponization in slowgrowing meat-type chickens, Poultry Science, 90,
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９） Liu, A., Nishimura, T., Takahashi, K.：Relationshipbetween structural properties of intramuscularconnective tissue and toughness of various chickenskeletal muscles, Meat Science, 43, 43～49, 1996.
10） An, J. Y., Zheng, J., Li, J. Y., Zeng, D., Qu, L. J., Xu,
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11） Yamauchi, K., Manabe, N., Matsumoto, Y.,
Takenoyama, S., Yamauchi, K.：Increased collagen
III in culled chicken meat after feeding dietarywood charcoal and vinegar contributes topalatability and tenderness, Animal Science Journal,
85, 468～480, 2014.
12） Sasaki, K., Motoyama, M., Tagawa, Y., Akama, K.,
Hayashi, T., Narita, T., Chikuni, K.：Qualitative andquantitative comparisons of texture characteristics
between broiler and Jidori-niku, Japanese indigenous
chicken meat, assessed by a trained panel, The
Journal of Poultry Science, 54, 87～96, 2017.
13） Wattanachant, S., Benjakul, S., Ledward, D. A.：
Composition, color, and texture of Thai indigenous
and broiler chickens muscles, Poultry Science, 83,
123～128, 2004.
14） Xiong, Z., Sun, D. W., Xie, A., Han, Z., Wang, L.：
Potential of hyperspectral imaging for rapid
prediction of hydroxyproline content in chicken
meat, Food Chemistry, 175, 417～422, 2015.
15） Iqbal, M., Kenney, P. B., Klandorf, H.：Age-relatedchanges in meat tenderness and tissue pentosidine：effect of diet restriction and aminoguanidine in broiler
breeder hens, Poultry Science, 78, 1328～1333, 1999.

© The Ito Foundation

15

鹿児島黒豚における血中酸化ストレスと肉質との関連検討
Relationships between blood oxidative stress and meat quality in swine,
Kagoshima Kurobuta

川

口

博

明

（鹿児島大学大学院医歯学総合研究科衛生学・健康増進医学分野）

Hiroaki Kawaguchi（Department of Hygiene and Health Promotion Medicine,Kagoshima University Graduate School of Medical and Dental Sciences, Kagoshima University）

It is known that the heat stress in summer affects the pork quality and flavor in domestic
swine. This study was to investigate the relationship between blood oxidation stress（oxidative
and anti-oxidative activity） and meat quality of slaughter pigs, Kagoshima Kurobuta（Berkshire pig）,in summer and winter．
Carcass results, blood exsanguinated, pork loin of each 12 pigs in summer and winterwere collected. The 24 blood biochemical concentrations, 4 blood stress marker concentrations
including cortisol and catecholamine, and blood oxidation stress including d-ROMs test
（oxidative activity）and BAP test（anti-oxidative activity, Wismerll Co., Ltd. Tokyo, Japan）
were measured. The concentrations of 28 free amino acids including glutamic acid（Glu, one offlavor components）in the blood, lean（muscle）and fat of all pigs were also measured．
In winter, carcass results showed good tendency, and the concentrations of 5 free aminoacids not including Glu in lean and the concentrations of 14 free amino acids including Glu in
fat were increased compared with those in summer．
On the other hand, in summer, increase of blood d-ROMs levels, decrease of blood sodium
and chlorine concentrations suggesting dehydration, increase tendency of blood lactate
dehydrogenase and creatine kinase concentrations suggesting muscle injury were recognizedwhile the stress marker concentrations did not increase. These findings were considered thatthe blood oxidative activity was related to the deterioration of health in Kagoshima Kurobuta．
Therefore, this study suggests that blood oxidation stress may be able to evaluate themeat quality in vivo before slaughter in domestic swine while further studies are required toreveal the concentrations of total amino acids in the lean and fat for meat quality evaluation．

１．目

良好であるという長所を有する１）。一方，出生数

的が少ない，成長も遅いため出荷までに長期間を要鹿児島県の特産品である鹿児島（六白）黒豚するという短所も有する。よって，と畜前の生体（バークシャー種）は肉質や脂肪分の食味などがで肉質を評価することは有用であり，本研究では© The Ito Foundation

16

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）と畜前の採血で評価可能な「血中酸化ストレス」に着目した。

2 . 1 材料（動物）：と畜鹿児島六白黒豚24頭（雌，去勢雄混在）

酸化ストレスはがんや動脈硬化，ひいては老化

2 . 2 群分け：夏季（Summer：８～９月），冬

や健康状態にも関連すると報告されている 。本季（Winter：11～12月）各12頭を無作為に研究で用いる酸化ストレス検査キット，d-ROMs

選抜。

２）

テスト（酸化度）およびBAPテスト（抗酸化力）

2 . 3 枝 肉 成 績（Carcass result），背 脂 肪 厚で，川口らが開発したミニ豚動脈硬化モデル３～８）（Back fat thickness），枝 肉 重 量（Carcass

を用いて検討した結果，動脈硬化発症と血中酸化weight）：日本格付協会による格付けを実ストレスに関連があることが確認でき，家畜豚に施した。

おいても酸化ストレスは健康の指標としても応用できる可能性が示唆された。また，家畜動物においては，より健康に飼育されることが肉質の向上

枝肉成績はスコア化して（上物：３点，中物：
２点，並物：１点，外物：０点），解析した。
2 . 4 内臓廃棄処分（Internal organs disposal）に寄与する。よって、と畜前の血中酸化ストレス評価により，肉質を評価できる可能性があると着想した（Fig.１）。

の発生率
2 . 5 サンプリング：放血血液およびロース（筋肉および脂身を含む可食部）

一方，養豚では夏季の暑熱ストレスがみられ，

2.6

血液処理

肉質にも影響することが知られている。本研究で血清は30分以上放置後（室温），血漿は採取後は，と畜鹿児島黒豚の夏季および冬季の血液およ

なるべく早く（４℃），3,000回転，15分で遠心分

び精肉サンプルを食肉センターよりダイレクトに離し，分注した。

入手し，健康の指標となり得る血中酸化ストレス

2.7と肉質との関連を検討することを目的とした。

2.7.1

血液検査
一般生化学値（Table２）【24項目】アスパラギン酸アミノトランスフェ

２．材料と方法

ラーゼ（AST），アラニンアミノトランスフェ

概要：鹿児島六白黒豚を対象とし，夏季および

ラ ー ゼ （ALT）， ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ

冬季に食肉センターで供試動物のと殺時放血血液（ALP），γ - グ ル タ ミ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼを採取し，同個体のロースを肉質評価部位として（γ-GTP），乳酸脱水素酵素（LDH）
，クレアチ

入手した。

ンキナーゼ（CK），総ビリルビン（T-Bil）
，直接

酸化度

―

抗酸化力

＝

酸化ストレス・活性酸素
抗酸化作用
がん，動脈硬化，老化・フリーラジカル ・抗酸化酵素：SOD・抗酸化物質：ビタミンC
・修復機構：DNA修復
健康の指標

肉質の指標？
Fig. 1 酸化ストレスと肉質指標の関連の概念© The Ito Foundation

鹿児島黒豚における血中酸化ストレスと肉質との関連検討

17

ビリルビン（D-Bil），血中尿素窒素（BUN），ク

ロイシン〔Leucine（Leu）〕，
イソロイシン〔Isoleucine

レ ア チ ニ ン（Cre），ナ ト リ ウ ム（Na），塩 素（Ile）〕，フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン 〔Phenylalanine（Cl），カリウム（Ｋ），カルシウム（Ca），無機（Phe）〕，チロシン〔Tyrosine（Tyr）〕，シスチンリン（IP），中性脂肪（TG），総タンパク（TP），〔Cystine（Cys）〕， ア ル ギ ニ ノ コ ハ ク 酸 ２アルブミン（Alb），血糖（Glu），総コレステロー〔Argininosuccinic acid 2（ASA2）〕，アルギニノル（T-Cho），高比重リポタンパクコレステロー

コハク酸１〔Argininosuccinic acid 1（ASA1）〕，ル（HDL-C），低比重リポタンパクコレステロー

セロトニン〔Serotonin（SRO）〕，アドレナリンル（LDL-C），アミラーゼ（Amy），尿酸（UA）〔Adrenaline（AND）〕，ド ー パ ミ ン〔Dopamine

2 . 7 . 2 ストレスマーカー値（４項目，Table３）
コルチゾール（EIA kit）

（DOPA）〕
2 . 8 筋肉および脂肪における遊離アミノ酸濃カテコラミン３分画（HPLC）：アドレナリン，度測定（EZ：faast, LC-MS，上記同様の28

ノルアドレナリン，ドーパミン
2.7.3

項目）

酸化ストレス（３項目，Table４）

組織を0.2ｇ採取し，３％過塩素酸を加えホモ

d-ROMs テ ス ト（酸 化 度 ，株 式 会 社 ウ イ ス

ジナイズ。４℃，10,000回転，10分間で遠心分離

マー，東京），BAPテスト（抗酸化力，株式会社

し，上清をKHCO３ で中和し，検体とした。これ

ウイスマー），BAP/d-ROMs。

らの検体の遊離アミノ酸（28項目）を2.7と同様

測定機器：FREE Carrio Duo（株式会社ウイ
スマー）
。
2.7.4

にEZ：faast, LC-MSを用いて測定した。
2.9

遊離アミノ酸濃度測定（Table５）

統計解析

測 定 値 は 平 均 値 （Mean） ± 標 準 偏 差

EZ：faast（株式会社島津ジーエルシー，東京）（standard deviation：SD）で示す。統計はIBM

LC-MS機器：Acquity ultra-performance liquid

SPSS統計ソフトを用いた。発生率（％）およびchromatography （UPLC）/Acquity TQD

枝肉成績のスコア評価についてはPearsonのカイ

tandem-quadrupole mass spectrometer：

２乗検定あるいはFisherの正確確率検定を実施しWaters, Milford, MA, USA）

た。計測値，測定値についてはMann-Whitney U【28項目】グルタミン〔Glutamine（Gln）〕，アル

testを実施し，p＜0.05で有意とした。

ギニン〔Arginine（Arg）〕，シトルリン〔Citrulline（Cit）〕， グ リ シ ン 〔Glycine（Gly）〕，ア ラ ニ ン〔Alanine（Ala）〕，β-アラニン〔β-Alanine（bAla）〕，
セリン〔Serine（Ser）〕，アスパラギン〔Asparagine

３．結果と考察3 . 1 枝 肉 成 績 と 内 臓 廃 棄 処 分 の 発 生 率（Table１）（Asn）〕，トレオニン〔Threonine（Thr）〕，プロ

夏季に比べ，冬季では格付成績が良好の傾向がリン〔Proline（Pro）〕，メチオニン〔Methionine

みられ，背脂肪厚が有意に少なかった。枝肉重量，（Met）〕，オルニチン〔Ornithine（Orn）〕，バリン

肝臓および胃腸廃棄発生率に差はなかった。本試〔Valine（Val）〕，アスパラギン酸〔Aspartic acid

験では心臓廃棄はみられなかった。以上より，冬（Asp）〕，グルタミン酸〔Glutamic acid（Glu）〕，

季の方が，枝肉成績が良いと判断された。

トリプトファン〔Tryptophan（Trp）
〕
，リシン

3.2

〔Lysine（Lys）〕，ヒスチジン〔Histidine（His）〕，

冬季に比べ，夏季では血中のナトリウムおよび© The Ito Foundation

血液一般生化学値（Table２）

18

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 Inspection of carcasses and internal organs disposal result

Group

AnimalNo.

SummerInternal organs disposal

Carcass result score＊
ResultBack fatweight（score＊） thickness（cm） （kg）

Heart

Liver

Stomach andintestines
Yes

1

1

4.4

77.4

Yes

2

1

4.0

71.6

Yes

3

1

4.1

81.9

Yes

4

2

2.7

78.4

Yes

5

1

4.0

79.9

6
7

1
1

3.5
3.5

77.6
76.4

8

1

4.2

76.0

9

1

5.2

78.4

10

1

3.5

81.3

11
12

1
1

4.0
5.5

81.3
83.9

Mean

1.1
0.3

4.1
0.8

78.7
3.3

13
14
15
16
17
18
19

1
1
3
1
3
1
2

3.3
3.8
2.2
1.2
1.6
3.1
2.4

83.9
79.0
77.8
80.9
74.0
81.7
82.5

20
21
22
23
24

2
3
2
1
1

2.5
1.5
2.6
2.3
3.0

78.2
77.4
76.4
87.5
87.7

1.8
0.9

2.5
0.8

80.6
4.3

0.065＊

0.000

0.340

Standard deviation
WinterMeanStandard deviation
p-value

Yes
Yes

Yes
Yes

The number

06

Incidence（%） （0） （50.0）

Yes
Yes

5
（41.7）

Yes

Yes
Yes
Yes

Yes
Yes

Yes
Yes
Yes
Yes
The number
06
Incidence（%） （0） （50.0）
p-value

1.00#

4（33.3）
1.00#＊Score；3：high grade, 2：middle grade, 1：low grade. Pearson's chi-square test.

#Fisher's exact test

塩素濃度が有意に低かった。これらより，夏季で3.4

は脱水が発生していることが示唆され，低張性脱冬季に比べ，夏季では血中のd-ROMs（酸化度）

水（二次性脱水）が，高張性脱水（一次性脱水）が有意に高かった。3.2より，夏季では脱水や筋かの精査が今後必要と考えられる。

肉傷害といった健康状態悪化が示唆されており，

有意ではないが，冬季に比べ，夏季では乳酸脱水素酵素（約1.5倍），クレアチンキナーゼ（約３血中酸化ストレス濃度（Table４）

血中酸化ストレスと健康状態悪化には関連があると考えられた。

倍）が高かった。これらより，夏季では筋肉傷害

3.5の発生は示唆される。

冬季に比べ，夏季ではトレオニンが有意に高3.3

血中遊離アミノ酸濃度（Table５）

血中ストレスマーカー値（Table３）

かった。トレオニンは肝臓の脂肪蓄積防止や成長

夏季と冬季の間に血中ストレスマーカー値の差促進などの効果が一般に知られている。豚においはみられなかった。

ては，夏季の背脂肪厚が多いことより，脂質代謝© The Ito Foundation

19

鹿児島黒豚における血中酸化ストレスと肉質との関連検討
Table 2 Blood biochemical concentrations
No.

Item

unit

Summer

Winterp-value

1

AST

U/l

55.1 ± 64.7

52.1 ± 53.5

0.623

2

ALT

U/l

20.1 ± 8.0

25.7 ± 6.9

0.064

3

ALP

U/l

414.5 ± 162.6

396.2 ± 100.8

0.954

4

γ-GTP

U/l

52.7 ± 26.2

45.1 ± 10.9

0.795

5

LDH

U/l

1143.6 ± 829.8

737.9 ± 207.4

0.119

6
7

CK
T-Bil

U/l
mg/dl

11149.8 ± 23757.1
0.13 ± 0.06

3778.4 ± 4034.7
0.08 ± 0.06

0.453
0.063

8

D-Bil

mg/dl

0.07 ± 0.05

0.06 ± 0.05

0.680

9

BUN

mg/dl

8.0 ± 2.0

8.0 ± 3.1

0.862

10

Cre

mg/dl

1.5 ± 0.2

1.5 ± 0.2

1.000

11

Na

mEq/l

148.5 ± 4.0

151.8 ± 4.3

12

Cl

mEq/l

98.6 ± 2.3

101.1 ± 3.4

0.032
0.048

13

K

mEq/l

7.2 ± 1.0

7.3 ± 1.1

0.665

14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24

Ca
IP
TG
TP
Alb
Glu
T-Cho
HDL-C
LDL-C
Amy
UA

mg/dl
mg/dl
mg/dl
g/dl
g/dl
mg/dl
mg/dl
mg/dl
mg/dl
U/l
mg/dl

11.3 ± 0.6
8.9 ± 0.9
45.4 ± 18.3
8.2 ± 0.5
4.5 ± 0.4
132.9 ± 35.0
111.1 ± 15.7
41.8 ± 7.9
58.8 ± 9.1
1836.0 ± 600.4
0.00 ± 0.00

11.2 ± 0.5
9.1 ± 0.5
33.0 ± 15.9
7.9 ± 0.6
4.8 ± 0.3
138.8 ± 24.3
109.5 ± 11.2
47.3 ± 9.1
55.5 ± 4.9
2095.8 ± 894.3
0.00 ± 0.00

0.862
0.435
0.060
0.052
0.163
0.402
0.885
0.149
0.369
0.525
1.000

Table 3 Blood stress marker concentrations
No.
1
2
3
4

Item
Cortisol
Adrenalin
Noradrenaline
Dopamine

unit

Summer＊

Winterp-value

μg/dl
ng/ml
ng/ml
ng/ml

4.6 ± 2.3
42.9 ± 15.7
49.3 ± 19.9
not detected

4.5 ± 2.4
46.2 ± 28.7
41.2 ± 26.5
not detected

0.902
0.268
0.599

Winterp-value
0.017
0.356
0.488

＊n=11

Table 4 Blood oxidative stress
No.

Item

unit

Summer1

d-ROMs

UCARR

1106.2 ± 136.6

970.8 ± 83.0

2
3

BAP
BAP/d-ROMsμmol/L4123.0 ± 771.7
3.8 ± 0.9

4000.2 ± 306.4
4.1 ± 0.4とトレオニンとの関連の精査が今後必要と考えら

防効果が知られており，3.2で述べた筋肉傷害とれる。

の関連の精査が今後必要と考えられる。

有意ではないが，冬季に比べ，夏季ではβ-アグルタミン酸は３大旨味成分の１つであり，さラニン（約1.3倍），グルタミン酸（約1.3倍）が高らに①脳の活性化，②整胃・整腸，③脂肪の蓄積かった。

の抑制，④血圧降下，⑤ストレス抑制（リラック

β-アラニンは筋肉中に存在し，筋肉疲労の予ス効果）といった効果が知られており，3.4で述© The Ito Foundation

20

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 5 Free amino acid concentrations in blood
Summer

Winter

No.

Name

1

Gln

11

378.7 ± 78.0

12361.2 ± 64.1

0.758

2

Arg

11

160.6 ± 37.9

12165.9 ± 24.7

0.538

3

Cit

11

67.0 ± 13.5

1260.9 ± 9.7

0.498

5

Gly

11

451.2 ± 129.8

12417.6 ± 119.5

0.712

6
7

Ala
bAla

11
11

302.9 ± 94.6
4.0 ± 1.2

1212

275.1 ± 53.6
3.0 ± 1.0

0.758
0.064

8

Ser

11

121.5 ± 23.3

12117.3 ± 30.6

0.268

9

Asn

11

24.5 ± 8.5

1224.3 ± 11.2

0.372

10

Thr

11

103.1 ± 30.1

1275.0 ± 19.3

11

Pro

11

163.8 ±48.7

12158.3 ± 31.5

0.003
0.389

12
14

Met

11

28.2 ±7.5

1227.5 ± 6.0

0.805

Orn

11

41.8 ±17.6

1247.7 ± 10.5

0.060

15
16
17
18
19
20
21
22
23
25
26
27

Val
Asp
Glu
Trp
Lys
His
Leu
Ile
Phe
Tyr
Cys
ASA2

11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
8

268.7 ±59.8
6.4 ±5.4
191.0 ±64.3
50.1 ±11.5
159.0 ±42.5
55.5 ±13.1
176.6 ±31.9132.1 ±23.2
75.7 ±15.3
63.8 ±14.838.9 ±8.7

12
11
12
12
12
12
12
12
12
12
12

259.5 ± 66.7
8.3 ± 5.6
152.3 ± 55.3
49.2 ± 11.4
144.4 ± 21.4
57.4 ± 9.0
170.0 ± 26.8
130.7 ± 19.9
68.1 ± 9.3
54.3 ± 12.7
36.6 ± 4.7

0.667
0.358
0.065
0.854
0.622
0.853
0.782
0.758
0.242
0.424
0.388

28
29
31
32

ASA1
SRO
ADN
DOPA

11
8
11
8

3.1 ± 0.2
2.7 ±0.7
6.9 ±3.0
4.0 ±0.3
4.0 ±0.1

12
12
10
8
12

3.1 ± 0.3
2.6 ± 0.7
4.9 ± 1.8
3.8 ± 1.0
3.0 ± 1.5

0.232
0.479
0.142
0.444
0.682

Numberdetected

p-value

Numberdetected

unit：nmol/ml

べた健康状態との関連の精査が今後必要と考えら

筋肉中のβ-アラニンが血中に拡散し血中濃度がれる。

上昇している，あるいは，筋肉傷害を改善するた

3.6

筋肉中遊離アミノ酸濃度（Table６）

その他では，メチオニン，ヒスチジン，イソロ

めにβ-アラニンの血中濃度が高くなっていることが推察される。

イシン，フェニルアラニン，シスチンが夏季に比

一方，ドーパミンが夏季に比べ，冬季では有意

べ，冬季では有意に高かった。このように，複数に低かった。ドーパミンが冬季に低値を示すことの遊離アミノ酸が冬季で高値を示していることかは，ストレス軽減（リラックス効果）との関連がら，冬季の方が赤肉の質が良いと考えられた。

考えられ，今後精査が必要である。

また，イソロイシンは分岐鎖アミノ酸（Branchedグルタミン酸は夏季と冬季の間に差がみられな

chain amino acids：BCAA）の１つであり，運動かった。

による筋肉中のタンパク質の分解予防効果があ

3.7

る。3.2および3.5で述べた筋肉傷害と総合的に考夏季に比べ，冬季ではグルタミン，アルギニン，

察すると，夏季では，筋肉傷害が発生しており，

アラニン，β-アラニン，セリン，プロリン，メ© The Ito Foundation

脂肪中遊離アミノ酸濃度（Table７）

21

鹿児島黒豚における血中酸化ストレスと肉質との関連検討
Table 6 Free amino acid concentrations in lean（muscle）
Summer

Winter

No.

Name

1

Gln

12

1024.2 ± 944.5

121599.6 ± 1697.1

0.525

2

Arg

12

85.2 ± 21.0

12102.9 ± 48.0

0.729

3

Cit

12

28.5 ± 28.6

11

33.4 ± 34.6

0.926

5

Gly

12

853.2 ± 332.1

12

866.6 ± 407.0

0.488

6
7

Ala
bAla

12
12

1320.0 ± 1243.9
2352.6 ± 792.1

12
121306.4 ± 469.8
2418.7 ± 1435.7

0.073
0.603

8

Ser

12

186.7 ± 82.8

12239.3 ± 89.7

0.057

9

Asn

11

80.6 ± 49.6

7

61.3 ± 43.0

0.684

10

Thr

12

113.4 ± 59.8

12108.0 ± 66.9

0.729

11
12

Pro
Met

12
12

223.3 ± 78.6
68.8 ± 25.91212256.4 ± 85.0
112.3 ± 69.5

14

Orn

9

37.2 ±43.8

1045.5 ± 36.7

15
16
17
18
19
20

Val
Asp
Glu
Trp
Lys
His

12
4
12
12
12
12

298.8 ± 94.5
18.0 ± 8.5
595.4 ± 289.9
20.9 ± 12.7
272.5 ±135.5
276.5 ±73.8

12
12
12
9
12
12

332.2 ± 125.5
17.4 ± 20.3
610.1 ± 243.9
32.5 ± 6.7
270.4 ± 65.9
352.8 ± 87.6

21
22

Leu
Ile

12
12

244.1 ±54.8
133.7 ±26.0

1212293.3 ± 83.6
173.3 ± 39.9

23
25
26
27
28
29
31
32

Phe
Tyr
Cys
ASA2
ASA1
SRO
ADN
DOPA

12
12
12
9
11
4
4
8

104.7 ±26.7
98.0 ±20.5
7.5 ± 4.6
42.5 ± 14.0
38.1 ±16.944.8 ±4.931.4 ±1.030.6 ± 0.7

12
12
12
12
12
4
1
10

144.4 ± 50.6
106.9 ± 37.3
11.5 ± 6.0
43.7 ± 17.9
42.6 ± 23.5
40.1 ± 2.3
30.0
23.7 ± 10.7

Numberdetected

p-value

Numberdetected

0.083
0.035
0.120
0.106
0.496
0.386
0.013
0.644
0.009
0.083
0.008
0.013
0.525
0.041
0.499
0.096
0.166
―
0.008

unit：nmol/g

チオニン，バリン，トリプトファン，リシン，ヒス（酸化度と抗酸化力）と肉質との関連を検討す

スチジン，フェニルアラニン，アルギニノコハク

ることを目的とした。

酸２が有意に高かった。

夏季および冬季の各12頭の豚について，と殺時

グルタミン酸は，有意ではないが，夏季に比べ，冬季で高値（1.4倍）を示した。

可食部ロースを入手した。血液検査では，24項目

多くの遊離アミノ酸は冬季で高値を示しており，冬季の方が脂身の質が良いと考えられた。
４．要

放血血液を採取し，枝肉を評価，さらに同個体のの一般生化学値，４項目のストレスマーカー値（コルチゾールおよびカテコラミン）および酸化ストレス〔d-ROMs（酸化度）およびBAP（抗酸約化力）テスト，株式会社ウイスマー）を測定し養豚では夏季の暑熱ストレスがみられ，肉質にた。旨味成分の１つであるグルタミン酸を含む28も影響することが知られている。本研究では，夏項目の遊離アミノ酸濃度の測定は，血清，赤身

季および冬季のと畜鹿児島黒豚（バークシャー（筋肉）および脂身（脂肪）について実施した。

種）を用いて，健康の指標である血中酸化ストレ

結果，冬季では，夏季と比べ，枝肉成績が良好© The Ito Foundation

22

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 7 Free amino acid concentrations in fat
SummerNo.

Name

Numberdetected

Winterp-value

Numberdetected

0.013
0.001
0.119

1

Gln

12

54.3 ± 13.2

12143.2 ± 107.1

2
3

Arg
Cit

12
12

10.5 ±1.4
4.0± 1.0

12
12

23.2 ± 9.3
7.6 ± 6.4

5

Gly

12

112.4 ±40.1

12172.3 ± 107.6

0.817

6

Ala

12

134.0 ±50.3

12361.1 ± 272.1

7

bAla

12

7.9± 10.1

12

56.4 ± 50.9

0.015
0.009

8

Ser

12

33.8 ±10.4

1282.3 ± 56.1

0.013

9

Asn

12

6.9± 5.1

12

15.0 ± 12.8

0.729

10
11

Thr
Pro

12
12

17.9 ±4.429.6 ±12.7

121235.2 ± 23.4
62.2 ± 44.2

1.000
0.018

12
14

Met
Orn

12
11

5.2 ± 3.0
2.8 ±1.9

12
11

18.1 ± 15.9
4.1 ± 2.5

0.003
0.071

15
16
17
18

Val
Asp
Glu
Trp

12
12
12
12

34.1 ±18.3
9.1 ± 4.2
183.6 ±54.1
4.9 ± 2.5

12
12
12
12

78.4 ± 61.5
19.9 ± 17.1
253.0 ± 154.3
10.5 ± 10.2

0.021
0.299
0.862

19
20
21
22
23

Lys
His
Leu
Ile
Phe

12
12
12
12
12

24.0 ±11.2
9.5 ± 4.5
20.5 ±4.3
10.0 ±3.5
8.7 ± 1.6

12
12
12
12
12

54.1 ± 41.8
31.7 ± 23.0
41.8 ± 17.8
19.4 ± 9.8
17.2 ± 7.2

25
26
27

Tyr
Cys
ASA2

12
12
12

8.3 ± 1.7
5.9 ± 1.4
0.8 ± 0.2

12
12
12

18.0 ± 8.9
5.3 ± 2.9
1.1 ± 0.5

0.033
0.106
0.273
0.021

28
29
31
32

ASA1
SRO
ADN
DOPA

12
1
4
7

0.8 ± 0.3
0.5
1.0± 0.0
1.0± 0.1121391.1 ± 0.6
0.6
0.7 ± 0.4
0.8 ± 0.5

0.119
―
0.480
0.259

0.038
0.009
0.003
0.050
0.419

unit：nmol/gな傾向で，赤肉ではグルタミン酸以外の５つの遊価するマーカーとして血中酸化ストレスが有用で離アミノ酸の濃度が高値を示し，脂身ではグルタあることが示唆された。また，本研究では旨味成

ミン酸を含む14の遊離アミノ酸の濃度が高値を示分として遊離アミノ酸（特に遊離グルタミン酸）

した。

の評価を行ったが，今後，赤肉および脂身につい一方，夏季では，暑熱ストレスによる血中スト
レスマーカー濃度の上昇はみられなかったが，血て，総アミノ酸濃度を測定し，肉質をさらに精査する必要がある。

中d-ROMs濃度の上昇，脱水を示唆する血中ナト
リウムおよび塩素濃度の減少，および筋肉傷害を示唆する乳酸脱水素酵素およびクレアチンキナー
ゼ濃度の増加傾向がみられた。これらより鹿児島
黒豚では血中酸化度と健康状態悪化には関連があると考えられた。
本研究では，家畜豚のと畜前の生体で肉質を評

引用文献１） 川口博明，秋岡幸兵，北島沢子，有村恵美，三好宣彰：六白黒豚におけるどんぐり給与が肉質特性に及ぼす影響について―井辺野黒豚の開発―，鹿児島大学農学部学術報告 第61号，p17-21，2011．
２） Yagi, H., Sumino, H., Yoshida, K., Aoki, T.,
Tsunekawa, K., Araki, O., Kimura, T., Nara, M.,
Nakajima, K., Murakami, M.：Biological Antioxidant© The Ito Foundation

鹿児島黒豚における血中酸化ストレスと肉質との関連検討
Potential Negatively Correlates With Carotid Artery
Intima-Media Thickness, Int Heart J, 57, 220～225,
2016.
３） Kawaguchi, H., Yamada, T., Miura, N., Ayaori, M.,
Uto-Kondo, H., Ikegawa, M., Noguchi, M., Wang, K.
Y., Izumi, H., Tanimoto, A.：Rapid Development ofAtherosclerosis in the World's Smallest
Microminipig fed a high-fat/high cholesterol diet：
A Useful Animal Model Because of its Size andSimilarity to Human Pathophysiology, J Atheroscler
Thromb, 21, 186～203, 2014.
４） Yamada, S., Kawaguchi, H., Yamada, T., Guo, X.,
Matsuo, K., Hamada, T., Miura, N., Tasaki, T.,
Tanimoto, A.：Cholic Acid Enhances Visceral
Adiposity, Atherosclerosis and Nonalcoholic Fatty
Liver Disease in Microminipigs, J Atheroscler
Thromb, 24, 1150～1166, 2017.
５） Kakimoto, T., Otsuka, A., Kawaguchi, H., Ogata,K., Tanimoto, A., Kanouchi, H.：Plasma Homocysteine
Concentrations in Novel Microminipigs, In Vivo, 28,
579～582, 2014.

23６） Akioka, K., Kawaguchi, H., Kitajima, S., Miura, N.,
Noguchi, M., Horiuchi, M., Miyoshi, N., Tanimoto,
A.：Investigation of necessity of sodium cholate andminimal required amount of cholesterol for dietary
induction of atherosclerosis in microminipigs, In
Vivo, 28, 81～90, 2014.
７） Kawaguchi, H., Miyoshi, N., Miura, N., Fujiki, M.,
Horiuchi, M., Izumi, Y., Miyajima, H., Nagata, R.,
Misumi, K., Takeuchi, T., Tanimoto, A., Yoshida, H.：
Microminipig, a non-rodent experimental animalo p t i m i z e d f o r l i f e s c i e n c e r e s e a r c h ：n o v e latherosclerosis model induced by high fat andcholesterol diet, J Pharmacol Sci, 115, 115～21, 2011.
８） Miyoshi, N., Horiuchi, M., Inokuchi, Y., Miyamoto,Y., Miura, N., Tokunaga, S., Fujiki, M., Izumi, Y.,
Miyajima, H., Nagata, R., Misumi, K., Takeuchi, T.,
Tanimoto, A., Yasuda, N., Yoshida, H., Kawaguchi,
H.：Novel microminipig model of atherosclerosis byhigh fat and high cholesterol diet, established inJapan, In Vivo, 24, 671～680, 2010.

© The Ito Foundation

24

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの活性増強と基質認識機構の改変（Ⅲ）
Activity enhancement and substrate specificity modification of microbial
transglutaminase by protein engineering

滝

田

禎

亮

（京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻）

Teisuke Takita（Kyoto University, Graduate School of Agriculture, Division of Food Science and Biotechnology）

I purified the product from the reaction mixture by HPLC, whose fluorescence changes
suggested fluorescence resonance energy transfer occurred as a result of the crosslinking of
two fluorescent peptides by the transglutaminase from Geobacillus stearothermophilus（GsTgl）.
LC/MS analysis revealed that the fluorescence changes were caused not by cross-linking of
peptides but by cleavage of a peptide, suggesting that GsTgl possesses amide bond-cleaving
activity. I compared the thermal stability of GsTgl with the one in which its characteristic
C-terminal short extension（EX）is eliminated and instead His-tag is added（GsTglΔEX（His）6）. The results suggested that Ex contributes favorably to the thermal activity at 50-60℃6）and
but not at 70-80℃. I purified the transglutaminase from Bacillus subtilis（BsTgl（His）
6）.
the mature form of the transglutaminase from Streptomyces mobaraensis（SmTG-M（His）

For the four enzymes, I compared the BSA cross-linking activity and the BSA modifying
6 has the very
activity with dansylcadaverine. The results indicated that SmTG-M（His）
6 showed higher activity thanhighest activity in both cases. Interestingly, GsTglΔEX（His）

GsTgl, suggesting that EX also contributes to the activity. I estimated mutational frequency inerror-prone PCR and constructed the GsTglΔEX（His）6 expression vector into which theamplified fragments were introduced. In addition, I succeeded in improvement of the screening
system for the isolation of GsTgl with desired substrate specificity.

１．目

残基は，TGにおいて利用されない。TGにより，的

さらに食肉の弾力性や食感の改善をもたらすため

トランスグルタミナーゼ（TG）によるタンパクには，本来の活性の増強や基質特異性の拡大が望質の架橋は，食肉の弾力性や食感の改善に大きなまれる。最近，Bacillus subtilis由来TG（BsTgl）

効果をもたらす。現在，Streptomyces mobaraensisの結晶構造と特性が報告された１）。

由来のTG（SmTG）が商品化されている。TGは，中等度好熱菌のGeobacillus stearothermophilus

アシル受容体（Lys残基）と異なり，アシル供与由来のTG（GsTgl）は，BsTglにないＣ末端伸長体（Gln残基）に対する認識は厳密であり，Asn

配列（EX：27残基）を有する２）。昨年度，申請© The Ito Foundation

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの活性増強と基質認識機構の改変（Ⅲ）

25

者は，以下を行った。

ル＋0.1％TFA。グラジエントは：100％Ａ（０１．Ni

カラムで精製可能な２種のGsTgl発現系

min）→100％Ａ（10 min）→30％Ａ（60 min）。蛍の構築：Ｃ末端に（AspSer）
５リンカーとHisタグ

光分析は，島津RF-5300PCを用い，反応液を水をもつGsTgl
（DS）５
（His）
６ ；EXを欠失しHisタグ

で希釈後，励起波長（Ex）＝325 nmで測定した。

をもつGsTglΔEX
（His）
６。

LC/MS 分 析 は ，以 下 の 条 件 で 行 っ た 。LC ：２．FRETペプチド対を用いた酵素活性測定法のAgilent1260。カラム：CAPCELL PAK C18 UG120。

検討（FRET法）。

MS ： QTRAP AP 3200 LC/MS/MS 。 Ionization

３．GsTglΔEX（His）６変異体の精製と，上記活性

mode ： ESI-positive ion mode 。 Scan mode ：測定法による活性比較。

Enhanced MS。

２＋

４ ．ア ン ピ シ リ ン（Amp）耐 性 を 指 標 に 目 的

2.2

GsTglをスクリーニングのためのTEM１ β-ラクB. subtilisゲノムDNAを鋳型に，BsTgl遺伝子

タマーゼ（TEM1）２断片とGsTglの共発現系のを，NdeI部位をもつプライマー（以後，NdeIプ

構築（Amp耐性スクリーニング系）。これらの結ライマーと表記）とXhoIプライマーでPCR増幅

果をもとに，本年度は以下を申請した。

し，pET-22ｂに導入した。SmTG人工遺伝子を１．FRET法の反応生成物の分析。

合成した（Invirogen）。本遺伝子を，NdeIプライ

２．FRET法により同定した活性増強変異をもつ

マーとXhoIプライマーでPCR増幅し，pET-22ｂ

多重変異体の作製。

に導入した（pET-22b_SmTG）。SmTGはPro領

３．GsTgl，BsTgl，SmTGの熱安定性と架橋活域を付加して発現し，成熟体にするにはDispase

性の比較。

Iなどで処理する必要がある。そこで，Ｎ末端に４．Error-prone PCRの検討，発現ベクターの構

PelBシグナル配列を付加したPro領域と成熟領域

築，変異体の選抜。

の タ ン デ ム 発 現 系 を 構 築 し た ３）。 pET-22b_

５．Amp耐性スクリーニング系の再現性の向上

SmTG の 成 熟 領 域 の StuI 部 位 を QuikChange 法と変異体の選抜。

（QC法）で除いた（pET-22b_SmTG_StuI（x））。

６．Ｘ線結晶構造解析。

本プラスミドのPro領域を，NcoIプライマーと

２．方
2.1

BsTglとSmTGの発現系の構築と精製

BamHIプライマーで増幅後，pET-22ｂに導入し法た（pET-22b-pelB-Pro）。本プラスミドをNdeI

FRET法の反応生成物の分析とBamHIで処理後，GSTタグ配列を除いたpET-

Lys-Ala-MCA（KA-MCA）は ペ プ チ ド 研 究

42ａに導入した（pET-42a（-GST）-pelB-Pro）。

所 か ら 購 入 し た 。 Z-Asp-Gln-Met-Asp-AFC

pET-22b_SmTG_StuI（x）の成熟領域を，NcoIプ（Z-DQMD-AFC）は，Bachemから購入した。

ライマーとXhoIプライマーで増幅後，pET-22b

両ペプチド（50μＭ）を，
GsTgl
（DS）
（
５ His）
６（2.6に 導 入 し た（pET-22b-pelB-Mat（His）６）。本 プμＭ）存在下に，37℃で反応させた（40μl）。70

ラスミドのＴ７プロモーターの上流とＴ７ターミμlの減菌蒸留水を添加し，HPLCに供した（Fig.

ネーターの下流に，QC法でStuI部位を導入した。

１）。カラムは，ナカライテスクのLaChrom C18

本プラスミドをStuIで処理後，pET-42a（-GST）（4.6 mm I.D.×150 mm L.）。流速は１ml/min。移-pelB-ProのStuI部位に導入した。

動相は，Ａ：水＋0.1％TFAとＢ：アセトニトリ© The Ito Foundation

26

平成30年度2.3

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

GsTglの精製法の改良と結晶化＝440 nmの蛍光強度から酵素活性を求めた。熱精製操作は４℃以下で行い，緩衝液は20 mM
Tris-HCl（pH 8.0）を用いた。培養液を超音波破処 理 な し の 酵 素 活 性 に 対 す る 比 で ，残 存 活 性（％）を示した。

砕し，遠心上清を硫安分画し，30-60％画分を2.6

DEAE-トヨパール（東ソー）に供し，
０-１M NaCl

2.6.1

架橋活性の比較
BSA架橋活性：１mM DTT存在下に，で溶出した。目的画分をHiPrep Phenyl HP 16/10

６μM BSAとTGを，pH 8.0，37℃で反応させた。

（GE Healthcare）に供し，１-０Ｍ硫安で溶出した。

TG濃度は以下とした：5.3μM GsTgl；0.81μM

目的画分をHiLoad Superdex 200（GE Healthcare）

GsTgl Δ EX（His）
６ ；1.6 μM BsTgl（His）
６ ；0.081に供した。結晶化には，Crystal Screen １＆２

μM SmTG-M（His）
６ 。反応液をSDS-PAGEに供とPEG Ionキット（Hampton Research）とWizardした。

１＆２キット（Rigaku）を用い，シッティングド

2.6.2

TM

ロップ法を行った。

ダンシルカダベリン（dCAD）のBSA

へ の 架 橋 活 性：１ mM DTT 存 在 下 に ，６ μM

2 . 4 Error-prone PCRの検討と発現ベクター

BSA ，200 μM dCAD ，お よ び TG を ，pH 8.0 ，37℃で反応させた（74μl）。TG濃度は以下としの構築
GsTgl配列のHindIIIとNcoI部位に挟まれた領

た：1.3μM GsTgl；0.81μM GsTglΔEX（His）６；

域 （0.7kbp） を ， 鋳 型 濃 度 （pET11a-GsTg1

1.3μM BsTgl（His）
６；0.081μM SmTG-M
（His）
６。

（DS）
５ His）（
６ ： 0.001-１ng/ul） を 変 化 さ せ ，反応液に20％ TCA（25μl）を加え，氷上に10分

GeneMorph II Random Mutagenesis kit（Agilent

放置後，４℃で遠心分離した（20000×ｇ，10分）。

Technologies）
を用い，HindIIIプライマーとNcoI

沈殿に５％ TCA（200μl）を加え，４℃で遠心分

プライマーでPCR増幅した（１st PCR）
。反応液

離 し た（３ 回）。沈 殿 に ５％ SDS 溶 液 を 加 え ，を鋳型に，ExTaq DNA polymerase HS（タカラ）

100℃で５分加熱後，水200μlを加えた。Ex＝を用い，HindIIIプライマーとNcoIプライマーで325 nmで，Em＝440 nmの蛍光強度を測定した。

PCR増幅した（2nd PCR）
。増幅断片をHindIIIと蛍光増加速度を酵素濃度で除した値を活性とし，NcoI で 処 理 後 ，新 規 作 成 の NcoI 部 位 を も つ

GsTglに対する比で表した。

pUC19（pUC19_NcoI）に導入した。各条件で３個のコロニーを配列解析し，変異導入頻度を算出

2 . 7 Amp耐性スクリーニング系の再現性の向上と改良した。HindIIIとNcoIで処理した増幅断片を導入

70μg/mlカナマイシン（Kan）を含むLB培地

するため，pET11a_GsTgl
（DS）
（His）
５
６のpET11a（５ml）に，TEM１断片遺伝子（N-195および

領 域 に あ る HindIII 部 位 を QC 法 で 除 い た

196-C）やGsTgl（DS）（His）
５
６ 遺伝子をタンデム（pET11a_GsTgl
（DS）
（His）
５
６_HindIII（x）。

に配置したpET42a（-GST）_N-195/E195Q_196-C/

2.5

L196K_GsTgl（DS）（His）
５
６等のプラスミドをもつ

熱安定性の比較

TGを５分間熱処理後，20分間氷上に静置し，大腸菌BL21（DE3）を37℃で一晩培養した。培養FRET法により酵素活性を求めた。50μM KA-

液（100μl）と Overnight ExpressTM Autoinduction

MCAと50μM Z-DQMD-AFCを，５μM TG存

Systems（Merck Millipore）の 試 薬 を 70 μg/ml

在下に，pH 8.0，37℃で反応させた。反応後，水Kanを含むLB培地（５ml）に加え，15-37℃で培で300倍希釈し，Ex＝325 nmで，発光波長（Em）

養し，100-500μg/ml Ampと１mM IPTGを含む© The Ito Foundation

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの活性増強と基質認識機構の改変（Ⅲ）

LBプレートに塗布し，20-37℃での生育を観察した。TEM１の結晶構造から，Ｅ195の近傍には，

27

た。現在，SPring-８での解析待ちである。
3 . 3 Error-prone PCRの検討と発現ベクター

Ｌ196に加えＬ199が存在することが示唆された。

の構築

そ こ で ，新 た に pET42a（-GST）_N-195/E195Q_

１st PCRの鋳型プラスミドの濃度に関係なく，

196-C/L199K等をこれまでと同様の方法で作製

２ nd PCR で 目 的 バ ン ド が 確 認 で き た（Fig.3

した。

（a））。HindIIIとNcoIで処理し，pUC19_NcoIに導入後，配列解析すると，１st PCRの鋳型プラス

３．結果と考察
3.1

ミドの濃度の減少とともに，変異導入率が上昇しFRET法の反応生成物の分析ていた：0.001 ng/μl→11.6個；0.01 ng/μl→10.9

KA-MCAとZ-DQMD-AFCを反応させると，個；0.1 ng/μl→7.2個；1.0 ng/μl→2.8個。pET-11

KA-MCAのピークのみが消失し，28 minに生成

ａ_GsTgl（DS）（His）
５
６_HindIII（x）に導入しよう物が出現した（Fig.1（a））
。KA-MCAのみを反応としたが，GsTgl（DS）（
５ His）
６はGsTglΔEX（His）
６

させても，同様の生成物が出現した。後者の反応に比べ，架橋活性が低いことが判明した（未掲で，蛍光スペクトルのピークは443 nmに移動し載）。そ こ で ，pET-22b_GsTglΔEX（His）
６に，た（Fig.1（b））。単離生成物のピークも443 nmでPCR断片を導入することにした。GsTglのNcoI部

あった。生成物をLC/MS分析すると，KA-MCA

位は，EX領域にあるため，新たにＣ末端付近に分 子 内 の ア ミ ド 結 合 が 切 断 さ れ て い た（Fig.1

BamHI部位を導入した。これにより，２残基が（b））。これらは，以下を明らかにした：（１）こ置換されたが（A224GとT225S），活性の低下はれまでFRET法で蛍光増加として観察されていた見られなかった（未掲載）。同様の方法で２ndのはペプチド架橋ではなく，分解である；（２）PCRで目的バンドが確認できた（Fig.3（b））
。

GsTglはアミド結合分解活性を有する。したがっ3.4て，昨年度にFRET法により同定した変異は，架50-60℃の熱処理では，GsTglΔEX（His）６に比橋ではなく分解活性を増強する変異であると考え

べ，GsTglが高い残存活性を示した（Fig.4（a）
）
。

られた。

70-80℃では，逆の結果となった。これらは，EX

3.2

領域は，50-60℃では有利に，70-80℃では不利に酵素発現，精製，および結晶化

BsTgl
（His）
６ とSmTG-Mat（His）
６ は，可溶性画

熱安定性の比較働くことを示唆した。

分に発現され，Ni２＋アフィニティカラムにより精3.5

製 で き た（Fig.2（a））
。保 存 中 に ，GsTgl Δ EX

BSA架橋活性では，GsTglを除く３種の酵素で（His）
６ と BsTgl（His）
６ は 部 分 分 解 し た が ，架橋物が確認できた（Fig.4（b））。酵素濃度を考

SmTG-M（His）６ は重合した。精製法の改良によ慮するとBSA架橋活性は以下の順であると考えり高純度のGsTglが得られた（Fig.2
（a）
）
。その溶

られた：SmTG-M（His）
６ ＞＞GsTglΔEX（His）
６

解度は15 mg/mlであった。７mg/ml GsTgl，5＞BsTgl（His）
６ 。高濃度にもかかわらず，GsTgl

mM DTT，50 mM l-Glnを含む溶液を，PEG Ion

で架橋物が確認できないことは，EX領域が本活G ３ 溶 液（0.2M NaAc ・ ３ H ２ O ，20 ％（w/v）

性の障害となることを示唆した。dCADのBSAへ

PEG 3,350）と混合し，４℃で保存すると結晶がの架橋活性では，SmTG-M（His）６ のみ蛍光スペ

得られ（Fig.2（b）），４Å程度の回折像が見られクトルのピークが500 nm付近に見られ，その他© The Ito Foundation

架橋活性の比較平成30年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）
Z-DQMD-AFC

KA-MCA（a）
Signal intensity（mv）

0h
Product

2 基質反応6h
KA-MCA0h

１ 基質反応Product
3h

0

10

（b）
800

20
30
40
Retention time（min）

100 mV28

50

Ex=325nm

3h

FI
（rfu）

600
0h

400

Product

200
0340
Relative intensity（%）

100

Relative intensity（%）

（c）

100

50

380

420
460
500
Wavelength（nm）

374.4 Da

H 2N

NH 2

O
O

O CH3

580

+
［M+H］
= 375.2 Da

O
H
N

540

N
H

0
100 150 200 250 300 350 400 450 500
m/z
（Da）
+
［M+H］
= 176.2 Da

O
O

50

175.2 DaH
N2

0
100 150 200 250 300 350 400 450 500
m/z
（Da）

Fig. 1
 Analysis of the product from the reaction catalyzed by GsTgl．
（a）
HPLC analysis of the reaction mixtures containing both K-MCA and Z-DQMDAFC and containing only K-MCA. Detected at 345 nm.（b）Fluorescence emission
spectra of the product purified from the mixture containing only K-MCA. Ex ＝ 325 nm.
（c）LC/MS analysis of K-MCA and the product.

は440 nm付近にピークが見られた（未掲載）。

GsTglに比べ，それぞれ，10倍，４倍，1000倍高

490 nm の 蛍 光 強 度 で 比 較 す る と ，GsTgl Δ EX

いと算出された。

（His）
６，
BsTgl
（His）
６，
SmTG-M（His）
６の活性は，© The Ito Foundation

29

M
ar
G k ersTg
G l
sT
Bs gl Δ
T E
Sm glH XH
6
TG 6
-M（
+）
H

6

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの活性増強と基質認識機構の改変（Ⅲ）

（a）

（b）

Mw x 10-3
200.0
116.3
66.2

45.0
31.0

21.5
Fig. 2 Purification of GsTgl, BsTgl, and SmTG and crystallization of GsTgl.
（a）
SDS-PAGE.（b）Crystals of GsTgl.

1st PCR プラスミド濃度（ng/μL）
0
1.

1
0.

01

r
0.

ke
ar

（b）

M

0
1.

1
0.

01

1

0.

00
0.

ar
M

（a）

ke

r

1st PCR プラスミド濃度（ng/μL）

（kbp）

（kbp）

23.1
9.4
6.6

23.1
9.4
6.6

4.4

4.4

2.3
2.0

2.3
2.0

0.6

0.6

Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of the 2nd PCR product．
（a）
PCR fragment corresponding the region between HindIII and NcoI of GsTgl（0.67 kbp）.
（b）PCR fragment corresponding the region between HindIII and introduced BamHI of the６（0.53 kbp）. In both cases, the 1st PCR and 2nd
A224G/T225S mutant of GsTglΔEX（His）
PCR was performed with GeneMorph II Random Mutagenesis kit and ExTaq DNA
polymerase HS, respectively.

3 . 6 Amp耐性スクリーニング系の再現性の向ml Ampと１mM IPTGを含むLBプレートに塗布
し20-30℃に保持すると，以下の３種で生育が観上と改良
Overnight ExpressTM Autoinduction Systems

察 さ れ た（未 掲 載）：（１）N-195_196-C；（２）を用い20-30℃で発現誘導した培養液を，100μg/

N-195_196-C_GsTgl（DS）
（His）
５
６：
（３）N-195/© The Ito Foundation

30

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

（a）
120

（b）
GsTgl
GsTglΔEXH6

100

1200

200.0

架橋物

18

900

12

600

6

300

BSA

66.2

60
40

45.0

20

相対活性

116.3
相対活性

残存活性
（%）

（c） 24

Mw x 10-3

80

0

H6
H6
EX
r
Δ H 6 -M
ke Tgl Tgl Tgl TG
As s s
M G G BSm -E BS
ar

31.0
なし

０

８0℃

50℃
６０℃
70℃
酵素熱処理温度
（℃）

GsTgl

21.5

GsTglΔEXH6

BsTglH6

SmTG-MH6

０Ka

pET42a（-GST）-N-195

n

M1

TE

5

19

N-

Ka

n

pET42a（-GST）-N-195-196-C

M1

TE

TEM1 196-C

TE

5

19

N-

TEM1 196-C

M1

Ka

n

pET42a（-GST）-N-195-196-C-GsTglΔEXH6

Gs

1
EM

5Q

19

E
5/

19

N-

T

Ka

n

pET42a（-GST）-N-195/E195Q-196-C/L199K-GsTglΔEXH6

Gs

Tg

100 μg/mL Amp, 1 mM IPTG

5

19

N-

TEM1 196-C/L199K

Fig. 4 Comparison of GsTgl, BsTgl, and SmTG．
（a）
Thermal stability. The residual activity was expressed as the percentage of the activity without heat treatment（5min）.（b）BSA cross-linking activity.（c）BSA modifying activity with dansylcadaverine. The activity（velocity/enzyme
concentration）was expressed as the ratio of the activity of GsTgl.

Tg

lΔ
EX

H

lΔ
EX

H

500 μg/mL Amp, 1 mM IPTG

Fig. 5 Construction of screening systems for GsTgl with substrate specificity altered by random mutagenesis．
（A）
Plasmids constructed. All plasmids were constructed on the basis of pET-42a（-GST）, which confers Kanamycin
resistance and in which the region of glutathione S-transferase was removed. TEM1 β-lactamase or both of the
６ were introduced into the
N-terminal domain（N-195） and C-terminal domain（196-C）domain, and GsTglΔEX（His）
plasmid.（B）Ampicillin susceptibility testing. E. coli BL21（DE3）harboring each plasmid, in which the expression ofTM
６ was induced by Overnight Express
Autoinduction Systems, was inoculated on a LB agar plate
GsTglΔEX（His）
containing 100μM Ampicillin and 1 mM IPTG or on that containing 500μM Ampicillin and 1 mM IPTG. The plates
were incubated overnight at 30℃.

© The Ito Foundation

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの活性増強と基質認識機構の改変（Ⅲ）

31

E195Q_196-C/L196K_GsTgl
（DS）
（His）
５
６ 。こ れ成熟体を発現精製した。GsTglのEX領域が熱安

は，TEM１断片複合体（Ｎ-195・196-Ｃおよび定性と架橋活性に寄与をすることを明らかにしＮ-195/E195Q・196-C/L196K）の比較的高い安た。GsTgl，BsTgl，SmTG成熟体の架橋活性を定性とGsTgl
（DS）
（His）
５
６ の低い架橋活性に起因比較した。目的GsTglを効率的にスクリーニングすると考えられた。そこで，Lys残基導入部位をする系を得た。

変更し，架橋活性の高いGsTglΔEX（His）６ を用いた。30℃で誘導し，500μg/ml Ampと１mM
IPTGを含むLBプレートに塗布し30℃に保持するとN-195_196-CとN-195_196-C_GsTglΔEX（His）
６は生育せず，N-195/E195Q_196-C/L199K_GsTgl
ΔEX（His）
６ のみが生育した（Fig.５）。これは，
GsTgl Δ EX
（His）
６ に よ り TEM １ 断 片 複 合 体 が
E195QとL199Kを介し架橋・安定化されたことを示唆し，有効なスクリーニング系が得られた可能性を示した。
４．要

約

GsTglはアミド結合分解活性を有し，蛍光基質文
献１） Fernandes, C. G., Placido, D., Lousa, D., Brito, J. A.,
Isidro, A., Soares, C. M., Pohl, J., Carrondo, M. A.,
Archer, M., Henriques, A. O.：Structural andfunctional characterization of an ancient bacterialtransglutaminase sheds light on the minimal
requirements for protein cross-linking,
Biochemistry, 54, 5723～5734, 2015.
２） Plácido, D., Fernandes, C. G., Isidro, A., Carrondo,
M. A., Henriques, A. O., Archer, M.：Auto-induction
and purification of a Bacillus subtilis transglutaminase（Tgl） and its preliminary crystallographic
characterization, Protein Expr. Purif. 59, 1～8, 2008.
３） Liu, S., Zhang, D., Wang, M., Cui, W., Chen, K., Du,
G., Chen, J., Zhou, Z.：The order of expression is a key
factor in the production of active transglutaminase
in Escherichia coli by co-expression with its propeptide, Microb Cell Fact., 10, 112～118, 2011.

を分解することを明らかにした。BsTglとSmTG© The Ito Foundation

32

豚特有のチアミン三リン酸蓄積機構の解明
Mechanism of porcine-specific thiamine triphosphate accumulation inskeletal muscle cells

室

谷

進・大

江

美

香

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Susumu Muroya and Mika Oe（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

Thiamine triphosphate（ThTP）is extraordinarily abundant in porcine skeletal muscle
compared to muscle of the other animals. It is possible that the remarkable thiamine abundancein pork is potentially due to ThTP accumulation, which could be caused by porcine specificmutation of thiamine triphosphatase（THTPA）gene. To investigate potential involvement of
porcine THTPA mutation in the thiamine accumulation, porcine THTPA was overexpressed
in HEK 293 cells（PT）, and the influence on generation of thiamine and its phosphate
derivatives was analyzed, using bovine THTPA（BT）as a positive control. First, the total
content of thiamine in the representative HEK 293 cell sample for each treatment wereanalyzed by an assay based on microbiological activity（ID-Vit kit）
. The total thiamine content
determined in the assay was 120, 160, 359, and 315 pmol/10 ６ cells in mock, PT, BT, and nontransfected（NT）cell culture, respectively, suggesting negative effect of porcine THTPA on
total thiamine content compared to bovine THTPA. Next, the content and composition of thethiamine phosphate derivatives were analyzed by capillary electrophoresis-time of flight mass
spectrometry（CE-TOFMS）. The CE-TOFMS result agreed with the ID-Vit result, showingthat thiamine content in the PT cells（43 pmol/10６ cells）was lower than those in BT（72pmol/10 ６ cells）and NT cells（159 pmol/10 ６ cells）. Thiamine diphosphate（ThDP）was
detected in BT（53 pmol/10６ cells）and NT cells（81 pmol/10６ cells）, but not in PT cells.
Unexpectedly, thiamine monophosphate（ThMP）and ThTP were not detected in all the cell
cultures in the CE-TOFMS analysis. Our results indicated that overexpression of porcine
THTPA drastically reduced not only thiamine and ThDP generation, but also a variety ofcompounds mainly related to glycolysis, amino acid, and energy metabolism in HEK293 cells.

１．目性物質で，動物細胞内で補酵素チアミン二リン酸

的（ThDP）に変換される。細胞内ではThDPのほ

チアミン（ビタミンＢ１）は動物各種組織におか ， 一 リ ン 酸 化 物 （ThMP）， 三 リ ン 酸 化 物

いて，エネルギー生産に重要なピルベートデヒド（ThTP）が生成し（Fig.１），一般に多くの哺乳ロゲナーゼ等の代謝系酵素の活性に必須な生理活類，鳥類の組織でThDPの存在割合が70％以上だ© The Ito Foundation

33

豚特有のチアミン三リン酸蓄積機構の解明
Thiamine

THTPA
ThTP
ThMP

ThDP

Fig. 1 Interconversion of thiamine and its phosphate derivatives in animal cells.

ThMP ： thiamine monoohsphate, ThDP ： thiamine diphosphate, ThTP ：thiamine triphosphate, THTPA：thiamine triphosphatase.

が，豚と鶏の骨格筋では，ThTPの存在割合が

THTPA遺伝子の特徴を明らかにすることは，豚60％以上と多く１），このことが豚肉にチアミンの肉におけるチアミン蓄積機構解明に寄与する。本

蓄積をもたらす一因である可能性が考えられる。

研究ではメタボロミクス（代謝化合物の一斉解

しかし現在までにその原因の詳細については検証析）を実施し，ThTPをはじめとするチアミン関

されていない。一方で，ThTPをThDPへと変換

連化合物の含量や存在割合を中心とした代謝がどする細胞質性酵素チアミントリフォスファターゼのような影響を受けるかという点を中心に解析を（ThTPase）遺伝子THTPAについて，豚では他行った。また，THTPAの本来の機能以外で代謝の哺乳類にみられない変異が存在することが知らに及ぼす影響についても検討した。

れ，ブタThTPaseの機能欠損が考えられる。
これまでに我々は，豚骨格筋に含まれる代謝化

２．方法

合物の網羅的解析を行う中で，188種もの検出可

2.1

能化合物リストを得て変動の全体像をとらえ ，

THTPAを過剰発現するコンストラクトを作製

チアミン関連化合物の効率的な一斉解析にも成功するために，豚および牛の骨格筋cDNAライブラ

しチアミンおよびそのリン酸化物が変動すること

リーよりTHTPAのcDNAをクローニングした。

を示した。また，その変動が２種の骨格筋の間で各cDNAをpeGFPベクターに導入し，GFPを融合

異なること，と畜直後に高いレベルで存在したチ

し た ブ タ THTPA （XP_013833657.1）， ま た は

アミン三リン酸が貯蔵過程で脱リン酸化されてチGFPを融合したウシTHTPA（NP_776895.1）をアミンが蓄積することを明らかにした３）。一連の発現するコンストラクトを作製した。対照群とし研究で我々は，THTPA遺伝子の変異が細胞内のてGFPのみを発現するベクターを用いた。

２）

THTPA導入用ベクターの構築

ThTP蓄積の一因であり，それが豚肉のチアミン

2.2細胞へのベクターの導入蓄積と関連することを仮説として考えた。そこで作製したコンストラクトをトランスフェクショ

本研究では，豚，牛のTHTPA遺伝子を培養細胞

ンしHEK293細胞に導入した。細胞内で導入したで強制発現させ，チアミンの蓄積に寄与しうるチ

GFP-THTPA が 発 現 す る こ と を イ ム ノ ブ ロ ッ

アミン化合物生成に関する機能を解析して種間でティングにて確認した（Data not shown）。

比較し，チアミン関連化合物の生成におけるブタ

2.3

THTPA遺伝子の特性を解明することを目的とし本研究では，HEK293（ヒト胎児腎臓由来）をた。THTPA遺伝子型の機能解明，およびブタ

用い，GFPのみ（Mock），GFPと豚（PT）また© The Ito Foundation

HEK293細胞の培養

34

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

はGFPと牛（BT）由来THTPA遺伝子を発現さ積値から相対面積値を算出するとともに，検出させる系で実験を実施した。具体的には，HEK293

れたピークに対してHMT代謝化合物ライブラリ

細胞を10％FBS/DMEM培地で，３日ごとに培地

およびKnown-Unknownライブラリに登録され交換しながら培養した。試験時には１×10 /cm

２た全化合物との照合，検索を行った。一部の対象の細胞密度で細胞を播種し，翌日細胞の接着を確化合物に対しては，各化合物について100μＭの認した後にトランスフェクションを行った後，48一点検量（内部標準化合物200μＭ）として濃度

時間後に細胞試料として回収した。回収後の細胞を算出した。

４

試料は液体窒素で凍結し，解析までの間－80℃で保存した。
2 . 4 THTPA導入細胞の全チアミン含量およびメタボロームの解析

３．結果と考察3 . 1 HEK293へのトランスフェクションの影
響

各種THTPA遺伝子を導入して得た細胞サンプ

HEK293 細 胞 に ブ タ THTPA ま た は ウ シ

ルを回収し，全チアミン関連化合物の含量および

THTPAを強制発現させた細胞PTおよびBTにつメタボロミクス解析用サンプルとした。全チアミ

いて，回収された細胞数をMockおよび無処理区

ン化合物含量の分析には，Immundiagnostik社の（NT）と比較すると，Mock，PT，BT，NTでそ

ID-Vit Vitamin B１キットを用い，メーカーのれぞれ，204×10４ ，220×10４ ，106×10４ ，400×プロトコルに従って分析した。メタボローム解析

10４cells/mLであった。例数が少ないため結論付

ではCE-TOFMSを用い（委託分析），チアミン，

けることは難しいものの，この結果からは細胞へ

ThMP，ThDP，およびThTPの標準試料を用いのベクターの導入により細部増殖に対する何らかた絶対定量を行うとともに，その他の代謝物につの影響があったことも考えられた。この結果についても処理区間の差異を網羅的に解析した。今回

いては，今後例数を重ねて検証する必要がある。

の分析では，１分析あたり１サンプルを用いた。

3 . 2 トランスフェクションがHEK293細胞中Ⓡ前処理として，５％マンニトール液で細胞を洗浄

チアミン含量に及ぼす影響

後，メタノールで細胞を可溶化し内部標準化合物

ID-Vit ⓇVitamin B１キットを用い，HEK293細と し て Internal Standard Solution 1 （10mM ，胞における全チアミン化合物含量を測定した。そHMT社）を細胞試料に添加，さらに限外濾過フィの数値を細胞数あたりに換算した結果，Mock，

ル タ ー ユ ニ ッ ト（ULTRAFREE MC PLHCC ，

PT ，BT ，NT で そ れ ぞ れ ，120 ，160 ，359 ，Millipore）により試料を濾過した。その後，回収

315pmol/10６ cellとなった。Mockでチアミン含量

した濾液を乾固させて純水に再溶解させたものをが低かった理由の詳細は不明だが，この結果で分 析 に 用 い た 。 測 定 は Agilent CE-TOFMS

BTを対照として比較した場合，ブタTHTPAを

systemを用いてアニオンモードとカチオンモー

発現するPTがウシTHTPAを発現するBTの44％

ドに分けて行い，CE-TOFMSで検出されたピーほどの値を示しており，PTでチアミン関連化合

ク は ，自 動 積 分 ソ フ ト ウ ェ ア の MasterHands

物の存在量が低下したことが示された。したがっver.2.17.1.11を用いてノイズを除去しピークの質てブタ型THTPAを導入したHEK293細胞におい量 電 荷 比（m/z），ピ ー ク 面 積 値 ，泳 動 時 間て，チアミン含量の低下をもたらしていることが（Migration time：MT）を得た。また，ピーク面示唆された。

© The Ito Foundation

35

豚特有のチアミン三リン酸蓄積機構の解明

今回のキットではLactobacillus fermentumの増殖活性を指標としており，測定対象となるチアに含まれるチアミン，ThMP，ThDP，ThTPの
詳細な含量比について調べた。

ミ ン 関 連 化 合 物 に は ， チ ア ミ ン ， ThMP ，

メタボローム解析の結果，HEK293細胞においThDP，ThTPが含まれる。さらに，これまでにて，MSのピークが検出され代謝化合物ライブラ

アデニンヌクレオチドに結合したThTPの誘導体

リにアノテーションされた化合物の数は合計84種も大腸菌で見出されており，その含量も測定数値であった。チアミン関連化合物のうち，チアミンに反映している可能性がある。当初，THTPAのおよびThDPのピークは検出され定量可能であっ機能としてThTPの脱リン酸化反応のみを想定したが，予想に反してThMPおよびThTPのピークていたが，本遺伝子の過剰発現がチアミン関連化

はMock，PT，BT，NTのいずれにおいても検出合物の生成反応の平衡に影響を及ぼし，今回の方されなかった。チアミンおよびThDPの含量は，法で検出された全チアミン含量が変化したと考え

MockおよびNTと比べてPTとBTで低い傾向を示られる。なぜ全チアミン含量に処理区間の差異がし，特にPTで低かった（Fig.２）。このことは，生じたかについては今後の詳細の検討が必要であID-Vit ⓇVitamin B１キットによる全チアミン含るとともに，今後例数を重ねて検証する必要があ

量の測定結果と一致するものであり，HEK293細る。

胞においてブタTHTPAがウシTHTPAに比べて3 . 3 THTPAの過剰発現がHEK293細胞のメ

チアミンおよびThDP生成に対してネガティブな影響を及ぼしたことを示唆している。

タボロームに及ぼす影響
ID-Vit Vitamin B１キットによる測定の結果，また，チアミン関連化合物以外を含むメタボ

PTでBTよりも全チアミン含量が低かったことか

ローム全体について処理区間で比べると，Mockら，PTではBTに比べチアミン関連化合物の生成

またはNTに対しPTおよびBTは異なるパターン

量が少ないことが示唆された。そこで，THTPAを示した（Fig.３）。BTでは，核酸関連化合物をの過剰発現がどの化合物生成に影響するのかにつ中心とする化合物群が高い含量を示す一方，PT

いて詳細を明らかにするため，CE-TOFMSによではMock，NT，BTに比べて検出された多くのりメタボローム解析を行い，チアミン関連化合物

化合物で低い含量を示した。

Ⓡ

Thiamine

0.045
0.04
0.035
0.03
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0

ThDP

7
6
Relative Area

Relative Area

0.05

5
4
3
2
1

Mock

PT

BT

NT

0

×10-3
Mock

PT

BT

NT

Fig. 2 Effect of THTPA overexpression on thiamine and thamine diphosphate content in HEK293 cells. Mock：vector only,

PT：porcine THTPA, BT：bovine THTPA, NT：no transfection. ThDP：thiamine diphosphate.

© The Ito Foundation

36

平成30年度Mock

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

PT

BT

Ribulose 5-phosphate
GlycerolN-Acetylneuraminic acid
S-Adenosylmethionine

NT

GTP
UDP
5'-Deoxy-5'-methylthioadenosine
N-Acetylaspar�c acid
GMP
Hypotaurine
S-AdenosylhomocysteineATP
5-Oxoproline
AMP
CDP-choline
Glutathione (GSH)
Phosphorylcholine
Crea�neUDP-N-acetylgalactosamine/UDP-N-acetylglucosamine
Carni�ne
AdenosineGDP
ADP
Glutathione (GSSG)_divalent
InosineGuanosine
UDP-glucuronic acidGly

Trp
FAD_divalent"UDP-glucoseUDP-galactose"
Glycerophosphocholine

Fig. 3 Heatmap result of hierarchical clustering of metabolome profile in HEK293 cells overexpressing THTPA.

Mock：vector only, PT：porcine THTPA, BT：bovine THTPA, NT：no transfection.

このことは，PTにおいて豚型THTPAを過剰すると考えられる。これらの結果をうけ，現在，発現したことにより，解糖，核酸代謝，アミノ酸

豚の遺伝子型とチアミン蓄積との関係や，筋細胞代謝等のあらゆるカテゴリーにおいて多くの化合におけるTHTPA過剰発現の影響等についての解物の生成量が低下したこと，それによりHEK293

析を計画している。

細胞の代謝活性が全体的に低下したことを示している。ThDPは糖代謝からエネルギーを生産する

４．要約

過程に重要なピルベートデヒドロゲナーゼ複合体

豚骨格筋において，チアミン三リン酸（ThTP）

や，ペントースリン酸経路で５単糖を産生するトは他の哺乳類骨格筋よりも極端に多く含まれていランスケトラーゼの活性に不可欠な補酵素である。豚肉のチアミン含量が他の畜肉に比べて高いる。PTでは，ブタTHTPA過剰発現による全チことについては，チアミン三リン酸脱リン酸化酵

アミン含量の低下，ThDP含量の低下が起こって素（THTPA）にみられる豚特異的な変異である

いたことから，今回のPTにおける全体的な代謝ことが一因であると考えられる。本研究では，豚化合物含量の低下は，ブタTHTPAの過剰発現に特有のチアミン蓄積におけるブタTHTPAの機能

よるThDPの低下を裏付けるものである。以上のと意義について解明するため，HEK293細胞にブことは，THTPAがチアミン関連化合物生成に関タTHTPA遺伝子を過剰発現させ（PT），その際して何らかの重要な機能を担っていることを示唆に変化するチアミン関連化合物の生成，およびメ© The Ito Foundation

豚特有のチアミン三リン酸蓄積機構の解明

37

タボロームの変動について解析した。PTについや無処理区より低い値を示し，ブタTHTPAの過て市販キットで測定した全チアミン含量，CE-

剰発現がHEK293細胞において代謝全体に大きなTOFMSメタボロミクスで解析したチアミンおよ

影響を及ぼすことが明らかになった。

びチアミン二リン酸（ThDP）の含量は，対照として作製したウシTHTPAの過剰発現系（BT）と 比 べ て 低 い 値 を 示 し た 。チ ア ミ ン 一 リ ン 酸（ThMP）お よ び ThTP は ，予 想 に 反 し て CETOFMSによる測定でいずれの細胞系においても検出されなかった。また，解糖系等の主要代謝系

文献１） Bettendorff, L., Lakaye, B., Kohn, G., Wins, P.：
Metab Brain Dis, 29, 1069～1082, 2014.
２） Muroya, S., Oe, M., Nakajima, I., Ojima, K.,
Chikuni, K.：Meat Sci, 98, 726～735, 2014.
３） Muroya, S., Oe, M., Ojima, K.：Meat Sci, 137, 228～234, 2018.

における多くの化合物の含量は，PTにおいてBT© The Ito Foundation

38

和牛肉のおいしさを「見える化」する
Studies on the new evaluation method of Wagyu beef quality

山

田

知

哉

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Tomoya Yamada（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

In this experiment, we studied the metabolomic analysis of longissimus muscle between
Japanese black（Wagyu）fattening cattle and Holstein fattening cattle to determine the key
components associated with beef quality. Total 67 compounds were detected in both groups by
GC-MS analysis. Principal component analysis（PCA）of metabolomic profiles in longissimus
muscle indicated that PC1 were clearly separated by breed differences. Holstein beef werecharacterized by the abundance of components such as amino acids, amino compounds andnucleic acid metabolites. In contrast, Wagyu beef were characterized by the abundance ofcomponents such as sugars, sugar phosphates and fatty acids. These results suggest that thedifferences of beef quality between Wagyu and Holstein might be affected by the metabolic
products identified in the present study.

１．目を有しており，癌の早期発見のための特異的な血的中バイオマーカーの同定など，これまで主に医学

食肉のおいしさは，口に入れてから知覚される分野において活用されてきた。また農業分野にお複雑な味や香りの組み合わせによって構成されていても，トマトの品質１）や，茶や果物の風味に関いる。黒毛和種はきわめて優れた肉質を有してお連するバイオマーカーの特定２，３）にメタボローム

り，これまで多くの研究によって，和牛肉特有の解析が用いられている。これに対し畜産分野で

風味やおいしさを特徴付ける成分の探索がなされは，食肉の品質評価を目的としてメタボローム解てきた。しかし牛肉の味に影響する成分に関して析を用いた事例は少なく４～６），特に牛肉品質に対は，と畜後に牛肉中で進行する種々の生化学反応

するメタボローム解析に関しては不明な点が多が大きく関与しており，これら多くの代謝反応系

い。和牛肉のおいしさには，牛肉中の複数の物質の中から和牛肉の特徴に直結する要因物質を同定が関与していると考えられている。そこで牛肉のするのはきわめて困難を有する。

メタボローム解析を実施することによって，数多メタボローム解析は，生体中の多くの代謝物質の中から，網羅的解析によって目的とするバイオマーカーを特定することが可能な点に大きな特徴

くの対象候補物質の中から，複数の目的物質を同定することが可能となると考えられる。
本研究では，肉質が大きく異なる黒毛和種とホ© The Ito Foundation

和牛肉のおいしさを「見える化」する

39

ルスタイン種牛肉のメタボローム解析結果を比較（QP2010Ultra，島津製作所）にて網羅的解析をすることにより，和牛肉のおいしさに影響を及ぼ実施した（（公財）かずさDNA研究所）。装置へす牛肉中成分を特定することを目的とした。

の試料注入量は0.5μlとした。分析条件は，GC部

２．方
2.1

はカラムDB-5（30 m 0.250mm 1.00μm，Agilent

法

Technologies）を用い，ヘリウムをキャリアガス
として流速1.1ml/min，注入口温度は280度，オー

供試牛

供試牛として，黒毛和種去勢牛（ｎ＝４）とホ

ブン昇温プログラムは100度で４分保持後，毎分

ルスタイン種去勢牛（ｎ＝４）を用いた。供試牛

４分で320度まで昇温し，８分保持とした。質量はすべて畜産研究部門で生産されたものであり，分析部はイオン源温度200℃，イオン化法はEI，両品種とも濃厚飼料は市販配合飼料，粗飼料は畜

走査速度2,500u/sec，計測質量範囲をm/z＝45-

産研究部門で生産したオーチャードグラス乾草

600で実施した。時間補正にはC7-C33アルカン混の，同一飼料を肥育期に給与した。両品種とも

合標準試料を分析し，その成分ピークの検出時間

10ヶ月齢時から肥育を開始し，黒毛和種は30ヶ月から保持指標を算出し補正を適用した。データ解齢，ホルスタイン種は22ヶ月齢時にと畜を実施し

析 で は ，GC/MSsolution（島 津 製 作 所）お よ び

た。と畜時に胸最長筋（リブロース）部位からサ

GC/MS代謝成分データベースVer.２（島津製作

ンプルを採取した。採取した胸最長筋サンプル所）を用いて化合物推定，試料間比較を行った。

は，真空パック状態で７日間４度にて冷蔵保存
後，分析時までディープフリーザーで冷凍保存し

GC-MS解析の結果，67の代謝産物が同定された。
2.2

３．結果と考察た。この結果に対し主成分分析を実施したとこ

メタボローム解析

メタボローム解析実施のため，保存した胸最長

ろ，PC１軸方向に黒毛和種とホルスタイン種の筋サンプル約１ｇを液体窒素下で乳鉢を用いパウ検体が分離してプロットされたことから，両品種

ダー状に粉砕した。粉砕した胸最長筋サンプルの牛肉は成分のプロファイルが異なっていること

100mgに80％メタノールを1,500μl添加してジルが示された（Fig.１）。本研究の結果から，検体

コニアビーズを用いたホモジナイズおよび，超音が品種ごとに分離された軸（PC１軸，41.3％）

波処理を５分実施後，遠心分離（15,000rpm，5は，同じ品種の検体が分離された軸（PC２軸，min）に て 上 清 を 回 収 し た 。上 清 は MonoSpin

21.0％）よりも寄与率が高く，品種間の差の方が，C18カラム（GL Science Cat．5010-21701）を用

品種内のバラつきよりも大きかった。したがっいて精製処理を行った。得られたカラム透過画分て，本研究で同定されたPC１軸に対する因子負のうち50μlに対し窒素ガス吹付下で濃縮乾固処

荷量の絶対値が大きい化合物は，牛肉の品種差を理を行い，メトキシアミン20mg/mlピリジン溶

特徴付ける代謝産物であると考えられた。

液50μlを添加し，30℃，90分間メトキシム化処

Table１に，PC１因子負荷量の上位30物質を示理を行った。次にこれらサンプルにトリメチルシ

した。PC１軸の相関係数Ｒが正の化合物は，ホリルトリフルオロアセトアミド50μlを添加し，ルスタイン種で高値を示す代謝産物である。PC

37℃で30分間トリメチルシリル化誘導化処理を

１因子負荷量の上位30物質には，アミノ酸および行った。これら誘導化サンプルを用い，GC-MS

その関連代謝産物と，核酸関連の代謝産物が多く© The Ito Foundation

40

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

6

PC2
（21%）

2

JB

H-3

4
B-2

B-1

0

HO

B-4
H-4

H-1

-2
-4

B-3

-6
H-2

-8
-10
-10

-5

0
PC1
（41.3%）

5

10

Fig. 1 Principal component analysis（PCA）of longissimus muscle between Japanese

black（Wagyu）and Holstein fattening cattle．

JB：Japanese black fattening steers（n＝４），
HO：Holstein fattening steers（n＝４）
Table 1 Loading values of top 30 compounds for principal component-1
compound name

PC1
R

p

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22

11
40
88
129
239
192
223
367
74
385
406
70
66
67
253
60
63
83
163
171
323
45

Alanine-2TMS
Valine-2TMS
Threonine-3TMS
5-Oxoproline-2TMS
Glutamine-3TMS
Asparagine-3TMS
Glutamine-4TMS
Ribose 5-phosphate-meto-5TMS（1）Glycine-3TMS
Tryptophan-3TMS
Inosine-4TMS
Proline-2TMS
allo-Isoleucine-2TMS
Isoleucine-2TMS
Arginine-3TMS
Leucine-2TMS
Phosphoric acid-3TMS
Serine-3TMS
Ornithine-3TMS
Phenylalanine-2TMS
Tyrosine-3TMS
4-Hydroxybutyric acid-2TMS

0.949
0.948
0.946
0.945
0.926
0.916
0.914
0.902
0.899
0.894
0.890
0.870
0.862
0.862
0.849
0.843
0.840
0.833
0.820
0.806
0.792
0.776

3.21E-04
3.41E-04
3.87E-04
3.96E-04
9.63E-04
1.39E-03
1.48E-03
2.15E-03
2.38E-03
2.74E-03
3.07E-03
4.95E-03
5.90E-03
5.90E-03
7.63E-03
8.58E-03
9.07E-03
1.02E-02
1.28E-02
1.57E-02
1.90E-02
2.36E-02

23
24
25
26

151
110
166
143

2-Hydroxyglutaric acid-3TMS
Niacinamide-TMS
Glutamic acid-3TMS
Cysteine-3TMS

0.757
0.752
0.749
0.747

2.96E-02
3.15E-02
3.26E-02

27
28
29
30

425
127
313
364

Inosine monophosphate-5TMS
Methionine-2TMS
Lysine-4TMS
Uric acid-4TMS

0.743
0.730
0.725
0.719

© The Ito Foundation

3.31E-02
3.46E-02
3.98E-02
4.19E-02
4.43E-02

41

和牛肉のおいしさを「見える化」する
Table 2 Loading values of bottom 30 compounds for principal component-1
PC1

compound name

R

p

30

347

Xanthine-3TMS

0.502

2.05E-01

29
28

134
397

4-Aminobutyric acid-3TMS
Glucose 6-phosphate-meto-6TMS（2）

0.493
0.442

2.15E-01
2.72E-01

27

365

Inositol-6TMS（2）0.415

3.07E-01

26

25

3-Hydroxybutyric acid-2TMS

0.407

3.17E-0125

392

Fructose 6-phosphate-meto-6TMS

0.395

3.33E-01

24
23

254
393

Ornithine-4TMS
Glucose 6-phosphate-meto-6TMS（1）

0.384
0.351

3.48E-01
3.94E-01

22

308

Glucose-meto-5TMS（1）0.345

4.02E-01

21

321

Glucose-meto-5TMS（2）0.339

4.11E-01

20

20

3-Hydroxypropionic acid-2TMS

0.318

4.43E-01

19
18

97
115

3-Aminopropanoic acid-3TMS
Malic acid-3TMS

0.303
0.275

4.66E-01
5.10E-01

17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5

61
44
196
293
299
1
81
77
407
202
302
236
330

Glycerol-3TMS
Urea-2TMS
Taurine-3TMS
Fructose-meto-5TMS（1）Fructose-meto-5TMS（2）Boric acid-3TMS
Nonanoic acid-TMS
Glyceric acid-3TMS
Sedoheptulose 7-phosphate-meto-7TMS
Ribose-meto-4TMS
Mannose-meto-5TMS（1）Glycerol 3-phosphate-4TMS
Sorbitol-6TMS

0.231
0.128
0.128
0.108
0.088
0.048
－0.020－0.030－0.141－0.192－0.193－0.223－0.226

5.81E-01
7.62E-01
7.63E-01
8.00E-01
8.36E-01
9.10E-01
9.63E-01
9.45E-01
7.39E-01
6.49E-01
6.48E-01
5.96E-01
5.90E-01

4
3
2
1

384
214
350
417

Stearic acid-TMS
Xylitol-5TMS
Palmitic acid-TMS
Maltose-meto-8TMS（1）－0.417－0.643－0.658－0.674

3.05E-01
8.52E-02
7.63E-02
6.66E-02

含まれていた。Table２に，PC１因子負荷量の下で構成されている。クラスター７にはアミノ酸，位30物質を示した。PC１軸の相関係数Ｒが負のアミノ化合物，核酸関連物質などが多く含まれて化合物は，黒毛和種で高値を示す代謝産物であいた。クラスター５と６はホルスタイン種で高値る。PC１因子負荷量の下位30物質には，糖と糖の代謝産物で構成されている。クラスター５と６リン酸などが含まれていた。これらの結果から，には，アミノ酸と核酸関連物質が多く含まれていホルスタイン種はアミノ酸およびその関連代謝産た。クラスター１は黒毛和種で高値の代謝産物で物と核酸関連の代謝産物が，黒毛和種は糖と糖リ構成されている。クラスター１には，脂肪酸と糖ン酸が，品種を特徴付ける牛肉中の候補代謝産物が主成分として含まれていた。それ以外のクラスであると考えられた。

ターは品種による高低の傾向が不明瞭であった。

Fig.２に，階層的クラスタリング解析（HCA）

これらの結果から，ホルスタイン種の牛肉中成分で得られたヒートマップならびに各クラスターを

はアミノ酸と核酸関連物質，黒毛和種の牛肉成分形成した代謝産物を示した。クラスター７は黒毛

は糖と脂肪酸によって特徴付けられることが示唆

和種で低値かつホルスタイン種で高値の代謝産物された。

© The Ito Foundation

42

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Fig. 2 Heatmap for the metabolites of longissimus muscle between Japanese black（Wagyu）and Holstein fattening

cattle．

JB：Japanese black fattening steers（n＝４），HO：Holstein fattening steers（n＝４）

以上の結果から，ホルスタイン種の牛肉中主成

た。旨味を呈する代表的な化合物として，L-グ

分はアミノ酸，アミノ化合物，核酸関連代謝産物

ルタミン酸，L-アスパラギン酸，コハク酸，イによって，黒毛和種の牛肉は糖，糖リン酸，脂肪ノシン一リン酸等があげられる。したがって，ホ酸によって特徴付けられることが明らかとなっルスタイン種においてグルタミン酸，コハク酸，© The Ito Foundation

和牛肉のおいしさを「見える化」する

43

イノシン一リン酸が高値傾向にあることは，ホル違に関連する物質の探索に対し，きわめて有効でスタイン種牛肉の旨味の強さを示唆すると考えらあると考えられた。

れた。またシステインやリボースを加熱すると，含硫芳香化合物の生成が促進される７）。本試験の４．要約

結果から，品種差が認められた含硫化合物として

和牛肉のおいしさに影響を及ぼす牛肉中成分をシステインとメチオニンがあげられる。これらは明らかにするため，肉質が大きく異なる黒毛和種

いずれもホルスタイン種で高値傾向であった。ホとホルスタイン種の胸最長筋を用いてGC-MS解

ルスタイン種と黒毛和種で含硫化合物の含有量が析を行った。その結果，67の代謝産物が同定され異なっていることは，牛肉加熱調理時の風味の差た。主成分分析を実施したところ，両品種の牛肉

異につながる可能性が推察された。

は成分のプロファイルが大きく異なっていること

一方，本研究から黒毛和種の牛肉成分は，糖とが示された。主要な成分として，ホルスタイン種

脂肪酸類に特徴があることが明らかとなった。和牛肉はアミノ酸，アミノ化合物，核酸関連代謝産

牛肉には独特の「甘み」があり，この風味の特徴

物が，黒毛和種牛肉は糖，糖リン酸，脂肪酸によっが和牛肉の，他の品種の牛肉との差別化につなて特徴付けられることが明らかとなった。これら

がっていると考えられる。本試験の結果から，黒成分の牛肉中含量の差が，味や風味の品種による

毛和種牛肉中のキシリトールやマルトース等の糖違いに影響していると考えられた。

類の含量がホルスタイン種より高かったことから，これら糖類の存在が，和牛肉特有の「甘み」に関与している可能性が示唆された。一般に，受容体による化合物の認識について，低濃度域にはシグナル伝達の閾値が存在し，高濃度域には刺激に対する飽和が存在する。また，同じ濃度であっても風味の強さは化合物によって異なる。さらに，化合物の組み合わせによって風味は増強した
り減弱したりすることが知られている。油脂そのものには明確な味はないが，食物中に存在する油
脂は旨味や甘みを増強する働きがあることが報告されている８）。したがって，和牛肉に多く含まれる脂肪酸類が，和牛肉中に多い糖類の風味を増強した結果，特有の甘みを強く感じる可能性が推察されるが，糖類と脂肪酸類の相互作用に関して
は，今後さらなる検討が必要であると考えられた。
本研究によって，ホルスタイン種と黒毛和種の牛肉の風味を特徴付けると考えられる，牛肉中代
謝成分が複数同定された。したがってメタボロー
ム解析は，牛品種に由来する牛肉の味や風味の相

文献１） Ikeda, H., Shibuya T., Imanishi, S., Aso H.,
Nishiyama M., Kanayama, Y.：Dynamic metabolic
regulation by a chromosome segment from a wild
relative during fruit development in a Tomoto
introgression line IL8-3, Plant Cell. Physiol, 57, 1257
～1270, 2016.
２） 及川彰：メタボロミクスの農業・食品分野への応用，化学と生物，51，615～621，2013．
３） Sumitani, H., Ootsuka, T., Sasai, M.：Metabolomic
analysis of the degradation of ascorbic acid in acommercial green tea beverage stored in PET
bottles, Journal of the Japanese Society for Food
Science and Technology, 61, 418～426, 2014.
４） Muroya, S., Oe, M., Nakajima, I., Ojima, K.,
Chikuni, K.：CE-TOF MS-based metabolomic
profiling revealed characteristic metaboloc pathways
in postmortem porcine fast and slow type muscles,
Meat Sci., 98, 726～735, 2014.
５） Watanabe, G., Kobayashi, H., Shibata, M., Kubota,
M., Kadowaki, M., Fujimura, S.：Regulation of freegulutamate content in meat by dietary lysine inbroilers, Anim. Sci. J., 86, 435～442, 2015.
６） Muroya, S., Oe, M., Ojima, K., Watanabe, A.：
Metabolomic approach to key metabolites
characterizing postmortem aged loin muscle ofJapanese black cattle, Asian-Australas. J. Anim.
Sci.,（in press）,2019.

© The Ito Foundation

44

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）７） Mottram, D. S., Nobrega, I. C.：Formation of
sulfur aroma compounds in reaction mixturescontaining cysteine and three different forms ofribose, J. Agric. Food Chem, 50, 4080～4086, 2002.

８） 山本隆：おいしさとコクの科学，日本調理科学会
誌，43，327～332，2010.

© The Ito Foundation

45

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明
Clarification of the enhancement mechanism of“koku attributes”by lipids
in pork sausages

西

村

敏

英

（女子栄養大学栄養学部）

Toshihide Nishimura（Faculty of Nutrition Science, Kagawa Nutrition University）

It is well known that pork sausage is very popular as one of delicious foods. Recently, it
has been shown that pork sausage gives us Koku attributes such as mouthfulness andlastingness in the retronasal aroma sensation. However, the clarification of factors involved in
its Koku attribute has not been carried out yet．
In the previous research, the addition of umami compounds and fats was shown toenhance the intensity and lastingness in the retronasal aroma sensation of pork sausage,
resulting that umami compounds contribute to “Koku attribute” of pork sausages. Furthermore,
the analyses of aroma compounds of smoked and non-smoked pork sausages showed that
common aroma compounds were clarified to be β-Pinene, 3-Carene, D-Limonene, Octanal,
Nonanal, Caryophyllene, Methyl eugenol. In this research, the difference in amounts andcharacteristics of aroma compounds released from the sausages containing different amounts offat was examined.
GC/MS analyses of aroma released from three kinds of pork sausages containing different
amounts of fat have shown that D-Limonene, Linaryl anthranilate, Hexanoic acid and Eugenol
were detected in these all sausages. 1-Octen3-ol was detected from the sausage without
addition of fat. Its characteristic was sweet or like green tea. On the other hands, 1-Pentanol（tea or vinegar like）, a-Terpineol（grass or sea weed like）and Methyl eugenol（flower or
irritation）were detected in only the sausages with addition of fats.
Next, the mechanisms of persistence of aroma compounds to fats were examined using
soy and egg lecithins. One percent lecithin held methyl propyl disulfides significantly and did
not hold furfural. 2, 6-dimethyl pyradine and hexanal. Furthermore, methyl propyl disulfides
were held by both lecithins at the concentration more than 0.1％. Next step is to examine themechanism for holding effect of fats in pork sausages．

１．目

れ，おいしさの代名詞のように使用されている。

的

しかし，コクには，これまでにきちんとした定義

近年，多くの食品にコクという言葉が表示さがなかったため，それぞれの製造者が独自の基準© The Ito Foundation

46

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

で評価して，表示しているのが現状である。そこ

点を当てて研究を実施している。先の研究９～11）にで，我々は，コクを客観的に評価し，「見える化」

おいて，ポークソーセージの食味性を官能評価でできないかと考えた。その結果，コクは，味，香解析し，ポークソーセージの官能的特徴として，りならびに食感のすべての刺激で形成されるもの

うま味，持続感，濃厚な味，広がりのある味，深であり，多くの刺激で形成される「複雑さ」，そみのある味，香ばしい，後をひく香り，広がりのの刺激が口腔内で膨らむ「広がり」ならびに，そある香り，スモーキー，スパイシーな香り，弾力，れが持続する「持続性」の３つの要素（基本コ

歯ごたえ，ジューシー，プリプリなど，全部で22ク）で形成される感覚であると定義した。ま

項目の用語を見出し，ポークソーセージの食味性

た，食べ物の複雑さは，熟成，発酵，加熱などのには，コクに当てはまる感覚が存在することを明処理により形成されると考えている。その複雑ならかにした。また，ソーセージに添加されている

刺激の広がりと持続性を増強する物質として，ううま味物質は，ポークソーセージの口中香を強くま味物質と脂質が重要な役割を果たしていること感じさせると同時に，風味の複雑さや味の持続性を明らかにしてきた。さらに，コクのある食を強く感じさせることから，コク増強物質である

べ物としてよく知られている食品に関して，コクことが判明した。さらに，ポークソーセージからの形成・増強因子とその形成メカニズムを研究し抽出した香気成分を臭いかぎガスクロマトグラている。

フィー（GC-O）と質量分析ガスクロマトグラ

１～３）

４～６）

ポークソーセージは，食べ物の中でもとりわけフィー（GC/MS）で解析し，ポークソーセージ

美味な食べ物の１つであり，最も消費量の多い食の特徴的な臭いに寄与する候補成分を特定した。

肉製品である。そのおいしさは，うま味，独特のスモークソーセージとノンスモークソーセージの香りならびに食感によることはよく知られてい香気成分を分析した。ノンスモークソーセージでる。これまでの食肉製品の香気に関する研究か

は16種類の香気成分が検出され，GC/O分析を用ら，塩漬肉特有のフレーバーは，亜硝酸塩の脂質

いたAEDA法により，16成分の内，β-Pinene（生酸化抑制作用による香りであるとの報告がある

シイタケ，森，豆），３-Carene（卵スープ，青７）が，完全に解明はされていない。また，Mottram臭い），D-Limonene（酸っぱい，青臭い，除光液），

やRamarathnam の報告により，硝酸アルキル，

Acetic acid（酸っぱい，酢），Copaene（カメムシ，

ベンゾニトリル，フェニルアセトニトリル，４-

きゅうり，草），Methyl eugenol（焦げ，カラメル，

メチル-２-ペンタノン，２-ブチル-２-オクテ

醤油，ハーブ）が，ノンスモークソーセージの特ナールなどの香気成分が亜硝酸塩を添加したもの

徴的な臭いに寄与する候補成分として特定ならびから多く検出されることが明らかとなっているに同定されている。これらの６成分は，スモーク

が，食肉製品の食味性との関連での研究は，ほとソーセージにおいても検出されていたことから，

んどなされていない。

すべて原料の豚肉由来，または香辛料由来である

８）

そこで，我々はポークソーセージの食味性に関と推察された。スモークソーセージでは，これらする研究を手掛けた。まず，ポークソーセージのに加えて，燻煙由来のポークソーセージを特徴付製造では，調味料としてうま味物質を添加するとける香気成分としてp-Cresol（醤油，脂，スモー

同時に，適量の脂肪を添加していることから，こク）と2,6-Dimethoxy-phenol（スモーク，煙）のれらの物質によるコク形成・増強メカニズムに焦存在が明らかとなった。このように，ポークソー© The Ito Foundation

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明

47

セージが，特徴のある香りを有する複雑さを有サンプルに添加した内部標準物質で補正して算出

し，味わいに広がりや持続性を有するコクのある

し，比較した。

食品であることを明らかとしてきた。昨年の研究

12）では，ソーセージの製造時に添加する脂肪ｃ）GC-Oによる香気成分の特性解析とAEDAによる寄与成分の特定が，ソーセージの食味性に与える影響を調べ，添ａ）で調製した試料をGC/MS（GC-2014，（株）

加する脂質含量を増やすと，うま味や塩味を増強

島津製作所）に供し，香気成分を同定すると同時するだけでなく，風味の広がりや持続性を強め，に，分離した成分の特性をGC-Oにて，解析した。

コクを増強することが明らかとなった。また，そさらに，AEDA法により，脂肪添加量の異なる

れが脂質による香気成分の保持による可能性が推

ポークソーセージの香気成分として，寄与度の大定された。

きいものを特定した。

本研究では，これまでの研究成果を基にして，2.3

脂質による香気成分の保持効果

ポークソーセージの原料として添加している脂質脂質の中で，まず，香気成分の保持効果が期待に着目し，脂質の添加量で異なる香気成分の特性できるリン脂質に関して調べた。リン脂質の中を調べると同時に，脂質の添加量が香気成分の保で，大豆あるいは卵由来のレシチンを用い，それ持量に及ぼす影響を解明することを目的とした。

ぞれを１％の濃度になるように蒸留水を加えた。

２．方
2.1

大豆由来のものは２晩放置し，卵由来のものは激法

しく撹拌して溶解した。メチルプロピルジスル

供試材料

フィド１μl，2,6-ジメチルピラジン５μl，フルフ

脂質添加量の異なる３種類のソーセージ（通常ラール５μl，ヘキサナール１μl添加した後，レ量脂肪添加製品，通常量の50％添加製品，無添加

シチン液を加え３分間超音波処理した後，製品）を調製した。冷凍保存しておいたものを，

HS-GC（下記の条件）で，放出量を測定した。

袋ごと流水をかけて解凍し，試料として用いた。

〈GC条件〉
装置：島津GC-2014，TuroboMatrix40，

2.2

ポークソーセージの香気成分分析

カラム：TC-WAX（30m×0.25mm i.d. 0.25μｍ），

ａ）モノトラップ（シリカモノリス捕臭剤）に

オーブン温度：40℃（１min）－10℃/min－180℃（５min），キャリア―ガス：He，3.5mL/min

よる香気成分の捕集
各 ソ ー セ ー ジ を 細 切 し た 後 ，５ ｇ を 取 り ，

注入口温度：200℃，検出器：FID（200℃）

40mlのバイアル瓶に入れたものを，60℃で２時〈HS条件〉加温温度：40℃，加熱時間：10min，間加熱した。この間に揮発したヘッドスペース香

加圧時間：３min，注入量：0.4ml

気成分をMono trap（シリカモノリス捕臭剤：

また，レシチンの添加濃度が，メチルプロピル

ジーエルサイエンス）で捕集した。

ジスルフィド保持効果に及ぼす影響を調べた。大ｂ）GC/MSによる香気成分の同定

豆と卵由来のレシチンを１，0.5，0.1，0.01％にａ）で調製した試料をGC/MS（GC-2014，（株）

なるように蒸留水で溶解した。バイアルビンにメ

島津製作所）に供し，香気成分を同定した。また，

チルプロピルジスルフィド１μlを添加した後，分析にはCP-wax 52 CB（30 m×0.25mm i.d．
，0.25

レシチン溶液を加え，３分間超音波処理した後，μm film thickness）（ジーエルサイエンス（株））

HS-GC（上記の条件）で，放出量を分析した。

カラムを用いた。また，各成分の量的な変化は，© The Ito Foundation

48

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

製品からだけ検出されており，脂質由来の香気成３．結果と考察

分の可能性が示唆された。

3 . 1 脂肪含量の異なるソーセージに含まれる香気成分の特徴

3 . 2 GC-O に よ る 香 気 成 分 の 特 性 解 析 とAEDAによる寄与成分の特定

脂肪含量の異なるノンスモークソーセージでGC-O装置を用いて，GCで検出された香気成分

は，食味性に違いが認められ，脂肪含量が多いほの臭いかぎを行い，脂肪添加量の異なる３種類の

ど，風味の広がりや持続性が強いことが明らかとポークソーセージの風味形成に寄与度の高い香気なった。この理由として，脂肪が香気成分を保持

成分の特定を試みた。

している可能性が示唆された。

モノトラップで捕集した試料を，ジクロロメタ

そこで，添加された脂肪含量の違いが，ソーンを用いて，４の倍数で段階的に希釈した後，セージのどの香気成分量に変動があるかを検討し

GC-OによるAEDA法を実施し，寄与度の高い香た。具体的には，細切した脂肪含量の異なるソー

気成分を特定した。それらの結果を，Table１か

セージをバイアル瓶に入れ，60℃で２時間加熱しらTable３に示した。希釈していないサンプルでた時に，バイアル瓶中に放出される香気成分を捕実施した臭いかぎでは，脂肪無添加ポークソー

集し，それらをGC/MSで分析することにより，セージで40か所，1/2量脂肪添加ポークソーセー

香気成分の特定とその量的な違いを調べた。

ジで36か所，通常量脂肪添加ポークソーセージで

脂肪無添加製品から放出される香気成分の分析は27か所で臭いが検出された。この結果から，脂結果をFig.１に示した。通常量の50％脂肪量添加

肪を加えることで臭いの放出が抑えられることが製品から放出される香気成分の分析結果をFig.２

判明し，昨年報告したように，脂肪添加により，に示した。通常量の脂肪添加製品から放出される香気成分が保持されることが判明した。

香気成分の分析結果をFig.３に示した。

次に，これらのサンプルを段階的に希釈し，64

GC/MSによる分析の結果，複数の香気成分が倍希釈サンプルまでGC-OによるAEDA法を実施

検出された。Limonene，Linalyl anthranilate，した。その結果，64倍希釈サンプルで検出された

Hexanoic acid，ならびにEugenolは，添加する脂成分として，無添加ポークソーセージは４か所，肪含量に関係なく，すべてのソーセージで共通し通常の半分量脂肪添加ポークソーセージは５かて検出された。このうち，Limonene，Hexanoic

所，通常量脂肪添加ポークソーセージは５か所でacidとEugenolは，脂肪添加量が多くなると，放あり，これらを重要成分として絞り込むことがで出される量が減少した。これは，両香気化合物が，きた。

脂肪に保持されやすい性質を有している可能性が今回の結果から，これら脂肪添加量の異なる３考えられた。1-Octen-3-olは，脂肪無添加のソー

種類のポークソーセージを比較すると，すべてのセージのみから検出されたので，脂肪に保持され試料で検出されたHexanoic acidは，あげもの・やすい香気成分であると推定された。また，スパ

ゴ ム・人 工 的・靴 の 臭 い と し て 感 じ ら れ た 。

イス，カレー粉，漢方薬の香気成分であるMethyl

Linalyl anthranilateは，ひなたの臭い・燃えていeugenolは，脂肪が添加されている製品から検出る臭い・花・箪笥の臭いと，またMethyl eugenol

されていることから，脂肪に保持されにくいと推は，花・刺激臭・不快臭と感じられた。22.42分定された。さらに，１-Pentanolは，脂肪添加の頃に検出されるeugenolは，ケチャップの臭いと© The Ito Foundation

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明

Limonene

無添加

49Internal
standard

検出強度

Linalylanthranilate Hexanoicacid
1-Octen-3-ol
Eugenol

10.0

20.0

保持時間
（分）

Fig. 1 GC-chromatogram of aroma compounds extracted from non-smoked pork sausage without addition of fat

50%量添加Limonene

Internal
standard

検出強度

Pentanal
LinalylHexanonic
anthranilate acid

10.0

保持時間
（分）

Methyleugenol Eugenol

20.0

Fig. 2 GC-chromatogram of aroma compounds extracted from non-smoked pork sausage containing 50 ％ of regular fat

content

通常量添加

Limonene

Internal
standard

検出強度

Pentanal
LinalylHexanonic
anthranilate acid
MethylEugenoleugenol

10.0

保持時間
（分）

20.0

Fig. 3 GC-chromatogram of aroma compounds extracted from non-smoked pork sausage containing regular fat content© The Ito Foundation

50

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1GC-OによるAEDA法で検出された脂肪無添加ソーセージの香気成分（Characteristic of aroma
compounds released from the sausage without addition of fat）

【脂肪無添加】サンプルの希釈倍率

保持時間
8.95
10.99
12.32
13.15
13.38
16.04
19.8
20.39
21.53
22.42

1
ガス
舞茸
コンソメ
薬品・すっきり
緑茶
人工的
不快臭
？
ケチャップ

4

16

64

ガス

すっきり

推定化合物名Limonene

刺激臭

酸化臭

甘い
人工的

靴
イカ
不快臭
？
ケチャップ

ケチャップ

人工的
不快臭

1-Octen-3-ol
Hexanoic acid
2-Butenoic acid（E）-

ケチャップ

Eugenol

４倍希釈サンプルで検出できたもの
16倍希釈サンプルで検出できたもの
64倍希釈サンプルで検出できたもの

Table 2GC-OによるAEDA法で検出された通常の半分量の脂肪添加ソーセージの香気成分（Characteristicof aroma compounds released from the sausage containing 50% of regular fat content）【通常量の半分の脂肪量添加】

サンプルの希釈倍率

保持時間
9.11
9.86
10.98
14.42
14.75
16.04
16.88
17.03
17.75
18.43
20.7
21.54
22.4

1
酸っぱい
宇治抹茶
キノコ類
刺激臭
ひなたの匂い
車のオイル
汗臭い
草
磯
夏の下駄箱
花
夏の下駄箱
ケチャップ

4

16

酸っぱい
抹茶
すっきり

64

推定化合物名Limonene
1-Pentanol

ひなたの匂い
刺激臭

汗臭い
花
夏の下駄箱

刺激臭

刺激臭・酸っぱい
ケチャップ

刺激臭

Benzaldehyde
Linalyl anthranilate
Hexanoic acid

刺激臭α-Terpineol

不快臭花

Methyleugenol

ケチャップ

Eugenol

４倍希釈サンプルで検出できたもの
16倍希釈サンプルで検出できたもの
64倍希釈サンプルで検出できたもの

Table 3   GC-OによるAEDA法で検出された通常量の脂肪添加ソーセージの香気成分（Characteristic ofaroma compounds released from the sausage containing regular fat content）【通常量の脂肪量添加】

サンプルの希釈倍率

保持時間
8.68
9.75
9.89
14.36
14.77
14.86
16.05
16.56
17.07
18.27
18.83
19.72
20.09
21.53
22.32

1
不快臭
宇治抹茶
レジン
？
花
燃えている匂い
あげもの
チーズ・ホワイトソース
ミルク
悪臭

4
不快臭

薬品
花，箪笥
刺激臭
チーズ
海苔
ミルク様

ミルク様
不快臭

16

64

Heptanal

すっきり
酢

1-Pentanol
Benzaldehyde

酢
酸っぱい

ゴム

悪臭
牛乳
落ち着く

フレッシュ

？

４倍希釈サンプルで検出できたもの
16倍希釈サンプルで検出できたもの
64倍希釈サンプルで検出できたもの© The Ito Foundation

推定化合物名

不快臭
酸っぱい
アルコール

Linalyl anthranilate
Hexanoic acid
2-Furanmethanol
α-Terpineol

Methyleugenol
Eugenolポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明

51感じられた。脂肪添加量のソーセージのみで検出

香気成分保持効果にどの成分が寄与しているかをされた１-Pentanolは抹茶・酢と，α-Terpineolは，調べる必要がある。一方，レシチンによる2,6-ジ

草・ミルク・刺激臭と感じられた。このように，メチルピラジン，フルフラール，ヘキサナールに同じ香気成分を異なる臭いと感じられるので，臭対する保持効果は，認められなかった。

いかぎでは事前に評価者同士のすり合わせが必要

ドの保持量に及ぼす影響を調べた結果，大豆ならであると思われた。
3.3

レシチンの添加量がメチルプロピルジスルフィ
びに卵のいずれのレシチンでも，１，0.5ならび脂質による香気成分の保持効果

これまでの結果から，脂質が香気成分を保持すに0.1％の添加では，メチルプロピルジスルフィることが明らかとなったので，本研究では，脂質ドの保持効果が認められたが，0.01％の添加では，の中で，まず，香気成分の保持効果が期待できる保持効果は消失することが判明した（Fig.５，
６）。

リン脂質に関して香気成分保持効果を調べた。
リン脂質の中で，大豆あるいは卵由来のレシチ

４．要

約

ンを用い，それぞれを１％の濃度になるように，

ポークソーセージは，美味な食品の１つであ蒸留水を加えて調製した。１％レシチン溶液に，り，コクのある食品である。昨年度の研究においメチルプロピルジスルフィドを添加した結果，大て，ポークソーセージの製造時に添加された脂肪豆あるいは，卵由来のレシチン添加のいずれにおが，ソーセージの特徴を示す香気成分を保持し，いても，レシチン無添加のものと比べて，放出量

味わいの広がりや持続性を強めていることが明らが有意に抑制された（Fig.４）。また，卵由来のかとなり，添加された脂肪がソーセージのコクのレシチンが，大豆由来のものより放出量が少ない増強に寄与していると推察した。

ことから，より多くの香気成分を保持できること

本研究では，添加される脂肪量が異なるソーが明らかとなった。レシチンには，主成分であるセージを作成し，GC/MSならびにGC-Oにより，ホスファチジルコリン以外に，ホスファチジルエ

それぞれのソーセージから放出される香気成分とタノールアミン，スフィンゴミエリン，リゾホス

その香気成分の臭いの特性を調べた。その結果，ファチジルコリンなどを含んでいるので，今後，Limonene（酸っぱい），Linalyl anthranilate（花，メチルプロピルジスルフィド
放出量（面積）1.8E+08
1.6E+08a1.4E+08
1.2E+08
1.0E+088.0E+07
6.0E+07b4.0E+07c

2.0E+07
0.0E+00

無添加

大豆1％

Fig.4 Effect of addition of lecitin on persistence of methylpropyldisuflide© The Ito Foundation

卵1％

52

平成30年度

メチルプロピルジスルフィド
放出量（面積）1.8E+08
1.6E+08

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）aa1.4E+08
1.2E+08
1.0E+088.0E+07
6.0E+07b4.0E+07

c

c

0.5%

0.1%

2.0E+07
0.0E+001%

無添加

0.01% （添加量）

Fig. 5 Effect of soy lecithin on persistence of methylpropyldisulfide

メチルプロピルジスルフィド
放出量（面積）1.8E+08
1.6E+08aa

1.4E+08
1.2E+08c

1.0E+088.0E+07c

6.0E+07
4.0E+07b

2.0E+07
0.0E+00

1%

無添加

0.5%

0.1%

0.01% （添加量）

Fig. 6 Effect of egg lecithin on persistence of methylpropyldisulfide
＊：Fig. 4～6

異なるアルファベットのデータ群間では有意差あり（p＜0.05）

ひなたの臭い），Hexanoic acid（揚げ物，ゴム），が明らかとなった。その効果は，いずれもレシチ

ならびにEugenol（ケチャップ）は，添加する脂ン濃度が0.1％まで低下しても持続することが判肪含量に関係なく，すべてのソーセージで共通し明した。しかし，2,6-ジメチルピラジン，フルフて検出された。１-Octen-3-ol（緑茶，甘い）は，

ラール，ヘキサナールに対する保持効果は認めら

脂肪無添加のソーセージのみから検出された。一れなかった。

方，１-Pentanol（抹茶，酢），α-Terpineol（草，海苔）ならびに，Methyl eugenol（花・刺激臭・不快臭）は，脂肪添加の製品からだけ検出されていた。
そこで，脂質の種類や添加量が香気成分の保持量に及ぼす影響を明らかにするため，リン脂質であるレシチンによる香気成分保持効果を調べた。
１％の大豆由来レシチンと卵由来レシチン溶液
は，メチルプロピルジスルフィドを保持する効果

文献１） 西村敏英：食肉のおいしさとそれを引き出すコクと は ！，JATAFF ジ ャ ー ナ ル ，３（12），29 ～ 35 ，
2015．
２） 西村敏英：食品のおいしさを改善するコク増強物
質のチョイ足し技術，月刊フードケミカル，2017-9，
23～27，2017．
３） 西村敏英：コクの要素と寄与成分を活かした食品
開発，食品と開発，53（６），20～23，2018．
４） Nishimura, T., Goto, S., Miura, K., Takakura, Y.,
Egusa, S. A., Wakabayashi, H.：“Umami compounds© The Ito Foundation

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明
enhance the intensity of retronasal sensation ofaromas from model chicken soups”, Food Chemistry,
196, 577～583, 2016.
５） Nishimura, T., Egusa, S. A., Nagao, A., Odahara,
T., Sugise, T., Mizoguchi, N., Nosho, Y.：“Phytosterols in onion contribute to a sensation of
lingering of aroma, a koku attribute”,Food
Chemistry, 192, 724～728, 2016.
６） 西村敏英：「食肉のおいしさを引き出すうま味物
質の役割」，食肉の科学，57（２），177～180，2016．
７） Mottram, D. M.：“Organic Nitrates and Nitriles
in the Volatiles of Cooked Cured Pork”, J. Agric.
Food Chem., 32, 343～345. 1984.
８） Ramarathnam, N., Rubin, L. J., Diosady, L. L.：“Studies on meat flavor. 3. A novel method fortrapping volatile components from uncured and53

cured pork”, J. Agric. Food Chem., 41（６）, 933～938,
1993,９）西村敏英，江草愛：「ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明」，平成26年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，33，101～108，2015．
10） 西村敏英，江草愛：「ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明（その２）」，平成27年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，34，72～80，
2016．
11） 西村敏英，江草愛：「ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明（その３）」，平成28年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，35，31～39，2017．
12）西村敏英：「ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂質の役割」，平成29年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，36，59～67，2018．

© The Ito Foundation

54

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅲ）
Effect of hypoxanthine on the improvement of taste during postmortem
aging of meat（Ⅲ）

市村

さやか・高橋真佐郎・中村

幸信・吉田

由香・猪口

由美・服部

昭仁＊

（一般社団法人食肉科学技術研究所，＊北海道大学）

Sayaka Ichimura, Masao Takahashi, Yukinobu Nakamura, Yuka Yoshida, Yumi Inoguchi and Akihito Hattori＊（Japan Meat Science and Technology Institute，＊Hokkaido University）

Hypoxhanthine（Hx）accumulates in aged meat because of the degradation of inosine
monophosphate（IMP）during postmortem aging. Hx has little studied as a substanceparticipating in the taste of meats. However, in preceeding study, we revealed that Hx
enhanced umami and kokumi tastes of the soup prepared from pork. Therefore, Hx might beresponsiblel for the improvement of meat taste during postmortem aging.
The purpose of this study was to estimate the degree of paratability of aged meat intermnes of Hx. Three sirlorins of beef were respectively aged by dry-aging and wet-aging at
２℃ for 70 days, and 10, 20, 30, 40, 50, 60 and 70 days postmortem samples were obtained. In
each sample, the strength of taste, aroma and texture were evaluated by sensory test, and thelevels of taste-related substances containing Hx were determined.
In the sensory test, the increase of aging aroma depended on prolongation of aging
periods, while the increase of umami and kokumi tastes and tenderness stopped in the lateaging. Especially, in dry-aged beef, the scores of sensory test were the highest values at 40 to
50 postmortem days, followed by decrease. As regards the taste-related substances, free aminoacids increased significantly by prolongation of aging periods, while free peptide increased until
40 days postmortem, Hx increased until 40 days postmortem in dry-aging and 60 days
postmortem in wet-aging. The correlation coefficients between the amounts of free peptide orHx and the scores of sensory tests were above 0.8 in both of dry-aging and wet-aging. These
results suggest that there is a each suitable period for dry-aging and wet-aging. Thus it was
concluded that the amounts of Hx might be important factor to estimate paratability of aged
meat.

１．目

味の改善には，酸臭や獣臭といった不快臭の消失

的や，遊離アミノ酸や低分子ペプチドの増加等の呈

食肉の熟成は，と畜後に硬直した筋肉の軟化を味への関与が報告されており１～３），近年では食品主たる目的としているが，同時に熟成によって風としての付加価値を高めるために長期間の熟成が味が改善することも知られている。熟成による風行われている。熟成方法は大きく２種類に分けら© The Ito Foundation

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅲ）

55

れ，一つは食肉流通の主流となっている真空包装

え，他の苦味物質（硫酸キニーネ・アルギニン）

した食肉を低温貯蔵するウエットエイジング法，が豚肉スープに与える影響についても官能評価にもう一つは昔ながらの無包装で温度，湿度およびより調べた。その結果，苦味物質の種類にかかわ送風を管理しながら低温貯蔵するドライエイジン

らず，ある程度の苦味は豚肉スープの苦味自体をグ法である。いずれの熟成方法においても熟成期増強せずに，うま味およびコクといった好ましい間の延長は風味の改善を促すと考えられている

味わいを増強することを明らかにした 10）。したが，熟成肉の風味は複雑な化学的・生物的反応にがって，Hxの呈する苦味は食肉に含まれるさま

よって制御されており，全容は解明されていな

ざまな物質と作用し，結果として熟成肉特有の好い。また食肉の熟成適期を判断する明確な基準もましい味を形成している可能性がある。今後，食ない。

肉の熟成に伴う味の改善におけるHxの関与機構

我々は，熟成肉の風味のうち，「味」に関与すを明らかにすれば，食肉の熟成適期およびおいしる因子を解明することを目的として，食肉中の呈さを判断する指標を提示することも可能となる。

味成分の一つである核酸関連物質に着目して研究

そこで，本課題では，長期熟成を施した食肉のを進めてきた。生筋中に含まれるATPは，と畜

熟成適期の指標としてHxを利用することを考え，直後から速やかに分解され始め，食肉のうま味物

次のような実験を実施した。交雑牛のサーロイン

質として広く認知されているイノシン酸（IMP）

をドライエイジングおよびウエットエイジングにとなって蓄積し，その後の長期熟成中にさらに分

より最長70日間熟成した。この長期熟成に伴う牛解されてヒポキサンチン（Hx）に変換する。こ肉の呈味成分および食味の変化を経時的に分析・のHxについては，これまでに鮮度指標Ｋ値に関評価し，Hx濃度と食味性との相関について調べた。

連する研究報告がいくつかなされているが

，

４～６）

味の観点からの研究報告はほとんどなく，食肉の２．方法

味に関与する物質としては否定的な見解であっ

2.1

材料

た７）。しかし我々は，これまでにハムやソーセー

供試試料には国産交雑牛（と畜月齢26ヶ月）のジといった食肉製品において，Hxが塩漬熟成と３頭を用いた。と畜から４日目に左右のサーロイ称される熟成過程で顕著に増加する呈味物質の一ンを採取し，右側にはドライエイジング（DA）

つであり，塩漬肉特有の味の増強に必須であるこを，左側にはウエットエイジング（WA）を施しとを明らかにしてきた８）。

た。DAでは，熟成庫内の温度を２℃，相対湿度

そこで，熟成中の食肉に蓄積するHxの熟成肉を75％に調節し，試料は常に送風が当たるように特有の味への関与を予測し，豚肉スープに各種濃管理しながら静置した。熟成10，20，30，40，度のHxを加え，分析型官能評価を実施した。そ50，60および70日目に試料を厚さ５cmずつカッの結果，Hxが一定の濃度までは，加えたHx量にトし，表面に付着したカビをトリミングした後，依存してスープのうま味およびコクが増強される

真空包装して成分分析および官能評価に供するまこと，さらに一定量を超えるとスープの苦味が増

で－30℃で凍結保管した。WAでは，試料を最初し，うま味およびコクが増強されないことを明らに厚さ５cmずつ７分割して非通気性の袋に入れかにした９）。Hx自体が苦味を呈する物質であるて真空包装し，次に２℃に設定した熟成庫内で最ため，その苦味が食肉の味に関与していると考長70日間静置した。熟成10日ごとに試料を熟成庫© The Ito Foundation

56

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

から取り出し，DAと同様に凍結保管した。各熟遊離アミノ酸の濃度は，試料に蒸留水および成試料を４℃に設定した冷蔵庫内に置いて一晩か10％スルホサリチル酸溶液を加えてホモジナイズ

けて解凍し，試験に供した。試験部位は胸最長筋（バイオミキサーBM-１，（株）日本精機製作所）とし，中心部を官能評価に，周辺部を成分分析に後に遠心分離し，得られた上清をヘキサンで脱脂供した。

したものを高速アミノ酸分析計（L-8900，（株）

2.2

官能評価

日立ハイテクテクノロジーズ）で測定した。

各熟成試料を５cm×５cm×0.8cmに整形し，

核酸関連物質の濃度は，北田らの方法12）で測定

230℃に設定したホットプレート（ATF-500，ア

した。試料に10％過塩素酸溶液を加えてホモジナ

サヒ理化製作所）上で片面60秒，反対面を90秒加イズ後に遠心分離し，得られた上清を５Ｎ水酸化熱調理した。調理の際にはタイムキーパー１名おカリウム溶液を用いてpH6.4に調整したものをよび調理者１名を設けた。調理後の試料をただち

HPLCシステム（Waters2695，日本ウォーターズ

に当研究所に所属する訓練された分析型パネル５（株））に供した。カラムはShimpack HRC ODS

名（36.4±4.3歳，男性２名，女性３名）により評

column（6.0mm i.d.×150mm，島津製作所）を用価した。

い，測定波長は250nmとした。

官能評価の方法は特性プロファイル法を用い遊離ペプチドの濃度は，熟成した試料に蒸留水た。同一個体の熟成０日目をコントロール（０を加えてホモジナイズ後，２％になるようにトリ点）とし，熟成した試料の食味を－３点～＋３点

クロロ酢酸を加えて遠心分離し，得られた抽出液の７段階で評価した。評価項目は，基本五味（塩をプロテインアッセイLowryキット（ナラカイ社

味，甘味，酸味，苦味，うま味），コク，熟成香製）を使用して測定した13）。

および軟らかさとした。コクは，西村ら11）が提唱

2.4

する定義の中から濃厚感（complexity：複雑さ，すべての理化学分析の結果は交雑牛３頭の平均あつみ）および持続性（lastingness：うま味の後

値および標準誤差で示し，官能評価の結果は３頭味）の強さについて評価した。なお，基本五味のに対するパネル５名の平均値および標準誤差で算評価をする時は，鼻腔を閉じた状態で香りの影響出した。また官能評価の有意差検定はＦ検定およを排除した。

びＴ検定を用いて行い，有意水準は１％とした。

2.3

統計処理

さ ら に ，食 肉 成 分 と 官 能 評 価 と の 相 関 係 数 は

成分分析

各熟成試料は，フードカッター（GRINDMIX
GM200，Retsch）を用いて均一化し，一般成分（水分，脂肪，タンパク質），pHおよび呈味成分

Microsoft Excel 2013を用いて算出した。
３．結果と考察（遊離アミノ酸，核酸関連物質，遊離ペプチド）

3.1

官能評価

の分析に供した。

DAおよびWAを施した試料の官能評価結果を

水分は加熱乾燥法，脂肪はソックスレー法（ソFig.１に示す。熟成に伴う風味の変化は，苦味，

クステストSER148/6，（株）アクタック製），タ

うま味，コク，熟成香および軟らかさについて認

ンパク質は燃焼法（スミグラフNC-220F，（株）められた。一方，データには示していないが，塩住化分析センター製），pHはガラス電極（PH-味，甘味および酸味については熟成に伴う変化がMETER F52，堀場製作所）によって測定した。

認められなかった。

© The Ito Foundation

57

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅲ）

umami
dry-aged

2.50

scores2.00

a,bx,y

1.00
0.50
0.00

b

b

1.50

3.00

wet-aged

x,y

a,b
x,y

b
x,y

by

y

b

y

a
10

1.50

70

0.00
－0.50

a

x

0

x,y a,b,c
a,b,c
x
x a,b

x,y,z

10

40

2.50

b

scores

2.00

a,b
x,y

1.00
0.50
0.00

－0.50

b
b

a,b

1.50

3.00

wet-aged

x,y

b

b

y

10

20

30

40

50

60

70

aging periods（day）

a,b
a,b

1.00

0.00
－0.50

a

x,y

0

scores2.00

wet-aged

e

b,c,d

b
a,b

1.00

10

0.50
0.00
－0.50

a x
0

x,y
10

x,y
20

y

x,y

40

x,y,z

30

a,b
y.z

40

x,y

1.50

50

aging periods（day）

60

70

a,b

1.00

0.00
－0.50

wet-aged
c
b,c

b

2.00

0.50
30

20

dry-aged

2.50

x,y
x,y

70

b
a,b
x,y,z

z

x,y,z

50

60

70

aging periods（day）

3.00

d,e

c,d c,d,e

1.50

60

x,y,z

tenderness

scores2.50

dry-agedx,yx,yaging aroma
3.00

50

b

a,b

1.50

0.50

x
0

x,y,z

wet-aged

2.00

y

x,y

dry-aged

2.50

y

x,y

a

30

z

lastingness

scoresdry-aged20daging periods（day）

complexity
3.00

c,d

a,b,c,d d

1.00
0.50

20 30 40 50 60
aging periods（day）

wet-aged

2.00

x
0

dry-aged

2.50

scores3.00

bitter

b,c
x,y

y

b,c
y

y
a,b,c

x,y
x,y

x,y
a

x

0

10

Fig. 1 Changes in the sensory scores of beef during dry-aging and wet-aging at 2℃

20

30

40

50

60

70

aging periods（day）

The strength of taste, aroma and texture of dry-aged and wet-aged beef（n＝３）are estimated by sensory evaluations（mean±standard error）.Different small letters in the same column are significantly different（p＜0.01）.

© The Ito Foundation

58

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

うま味の強さは，DA，WAいずれの熟成方法

おいても，わずかに水分が減少した。これは，熟でも熟成により増強された。熟成50日目までは成試料を分析に供するまで凍結して保管していた

DAの方がWAよりも増強の程度が大きく，熟成ため，解凍時にドリップとして水分を失った結果

方法による違いが認められた。しかし，60日目以と推定された。タンパク質含量は，熟成に伴って降はDAとWAのうま味の強さは同程度の強さに変化しなかったが，脂肪含量はDAにおいて熟成感知され，熟成方法による違いが認められなかっに伴い増加し，試料の乾燥に伴い濃縮したと考えた。コクを表す濃厚感および持続性の強さは，うられた。

ま味の推移と同様の傾向が認められた。苦味の強pHの測定結果をTable２に示す。DAにおいて，

さは，DAにおいてうま味およびコクのような顕熟成開始時には5.4だったが，熟成に伴い上昇し，著な増強は認められなかったものの，熟成により70日目には5.8となった。一方，WAでは熟成に伴やや増強された。

う変化は認められなかった。pHの値は酸味の強

熟成香の強さは，熟成方法による違いが最も顕さに影響すると考えられる。しかし，官能評価の著だった。DAにおいて熟成により顕著に増強さ結果では酸味の強さは熟成により変化しておらず

れ，最大となった60日目ではWAの２倍以上の強（データ未掲載），本結果で得られた程度のpHのさが感知された。DAを施すことにより期待され変化はヒトが感知しないと推定された。

る効果の一つに「ナッツ臭」とも呼ばれる特徴的

遊離ペプチドの測定結果をTable３に，遊離ア

な香りの付与があり ，本結果でもその効果がよ

ミノ酸の測定結果をTable４に示す。熟成に伴うく現れていた。なお，DAほどではないものの，

これらの変動についてはこれまでに多くの報告がWAでも熟成に伴い熟成香は上昇する傾向がみらあり，西村らにより熟成によって蓄積する遊離ペれた。また，軟らかさについては，DAで最も軟

プチドおよび遊離アミノ酸は食肉の風味向上に寄らかいと感知されたのが40～50日目で，それ以降与すると報告されている１，２）。本結果においても，は硬くなる傾向が示され，興味深い結果となった。

遊離ペプチドおよび遊離アミノ酸は熟成により顕以上の結果から，熟成香は熟成期間に依存して著に増加しており，官能評価で認められたうま味増強される傾向がみられたが，味および食感につおよびコクの増強に寄与すると考えられた。長尾いてはいずれの熟成方法においても期間が長いほらは，熟成中に蓄積したペプチドは内在するエンど風味が改善するわけではなく，長期間になるとドペプチダーゼの作用によりタンパク質が分解さ風味の変化は緩やかになる傾向が認められた。特れて生成すると報告している15）。本結果において，に，DAでは40日～50日目をピークとしてそれ以遊離ペプチドの熟成中の変化は熟成方法による差

降は風味が低下する傾向がみられた。

が認められなかった。したがって，熟成中のペプ

14）

3.2

成分分析

チドの生成は，同一温度で熟成した場合，熟成方

一般成分の測定結果をTable１に示す。DAにお法の影響を受けないと推定された。また，熟成40

いて，水分が熟成開始時には63.3％だったが，熟日目以降はペプチドがほとんど増加せずに横ばい成に伴い減少し，70日目に49.7％となった。特にとなった。この結果は，チルド牛肉において32日

60日から70日目にかけての減少が大きかった。こ目までペプチドが増加しその後は64日目まで横ばの結果は，試料が熟成期間中に空気に触れることいだったとする柳原らの結果 16）とも一致しておにより乾燥したことを示している。また，WAにり，熟成が長期間になるとタンパク質からペプチ© The Ito Foundation

59

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅲ）
Table 1 Changes in water, protein and fat contents（％）of beef during dry-aging and wet-aging at 2℃
dry-aging periods（day）
water
protein
fat

0

10

20

30

40

50

60

70

63.3±1.6
20.0±0.5
13.7±1.462.1±1.3
20.0±0.4
16.0±1.761.5±1.4
19.9±0.5
18.6±2.6

58.6±1.921.2±0.520.2±2.6

57.3±1.8
21.1±0.6
20.1±2.0

57.1±1.3
21.5±0.520.1±2.0

57.3±2.4
21.4±0.722.1±2.249.7±1.4
21.2±0.623.3±2.8

0

10

20

30

40

50

60

70

65.6±1.0
20.0±0.4
14.7±1.662.6±1.3
19.8±0.415.8±1.562.7±1.519.7±0.5
16.3±1.862.8±0.919.7±0.4
15.7±1.061.4±1.519.2±0.519.2±1.660.6±0.719.2±0.3
19.2±0.961.8±0.9
19.0±0.3
18.1±1.362.7±1.3
18.9±0.5
16.6±1.1

wet-aging periods（day）
water
proteinfat

Values show the mean±standard error of three samples．

Table 2 Changes in pH values of beef during dry-aging and wet-aging at 2℃
aging periods（day）
dry-aged
wet-aged

0

10

20

30

40

50

60

70

5.4±0.01
5.5±0.01

5.4±0.01
5.5±0.01

5.5±0.01
5.5±0.01

5.5±0.01
5.6±0.01

5.6±0.01
5.6±0.01

5.7±0.01
5.5±0.01

5.8±0.02
5.5±0.03

5.8±0.03
5.5±0.03

Values show the mean±standard error of three samples．

Table 3 Changes in amounts of free peptide（mg/100g）of beef during dry-aging and wet-aging at 2℃
aging periods（day）
0

10

20

dry-aged 338.4±10.1 422.1±14.5 570.0±19.5
wet-aged 378.0±19.6 467.2±25.3 498.7±13.4

30

40

50

60

70

579.5±28.5
575.6±13.4

819.1±64.2
651.5±23.4648.2±27.6
667.2±12.1

682.6±36.0
673.9±9.7

691.9±41.4645.9±13.7

Values show the mean±standard error of three samples．

ドへの分解はあまり進まないと考えられた。一

核酸関連物質の測定結果をTable５に示す。と方，遊離アミノ酸の熟成中の変化は熟成方法によ

畜後の筋肉中にはATP，ADPおよびAMPはほとる変化の違いが認められた。DAにおける遊離ア

んど含まれないため，IMP，イノシン（INO）おミノ酸の増加は，水分が減少し濃縮したと考えら

よびHxの濃度を測定した。多くの研究において，れる割合よりも顕著に大きく，うま味を呈するグ

IMPは熟成に伴い内在する５’ヌクレオチダーゼ

ル タ ミ ン 酸 （Glu） の 濃 度 は 熟 成 開 始 時 のによって分解されると報告されている15，16，18）。本

5.4mg/100ｇから70日間で64.5mg/100ｇにまで達

結果においても熟成方法にかかわらずIMPは減少した。一方，WAでのGluの濃度は熟成開始時のし，60日目にはほとんど消失した。一方，Hxは4.1mg/100ｇから37.8mg/100ｇとなり，DAより熟成に伴い増加した。DAでは10日目に，WAでも増加の程度は低かった。遊離アミノ酸は，熟成は20日目にHx含量とIMP含量が逆転し，Hx含量

期間中にペプチドが内在するアミノペプチダーゼ

はDAで40日目，WAで60日目に最高値に達した。

の作用により分解されて蓄積する 。したがって，

この熟成に伴うHxの増加は，官能評価で認めらDAにおいて，何らかの要因によりアミノペプチ

れたうま味およびコクの変動と非常に似た挙動をダーゼが活性化する可能性が考えられた。

示した。

17）

© The Ito Foundation

60

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 4 Changes in the amounts of free amino acids （mg/100g）of beef during dry-aging and wet-aging at 2℃

dry-aging periods（day）
0

10

20

30

40

50

60

70

Asp

0.0±0.0

0.6 ±0.0

1.6 ± 0.3

3.5 ± 0.3

5.9 ± 0.6

9.4 ± 0.9

11.6 ± 0.9

18.5 ± 2.5

Thr
Ser

5.2±0.0
5.9±0.1

10.3 ±0.4
14.6 ±0.6

14.1 ± 0.5
19.5 ± 0.7

17.2 ± 0.9
23.2 ± 1.0

23.0 ± 1.6
29.6 ± 2.0

32.8 ± 2.4
41.3 ± 2.6

36.0 ± 2.5
44.2 ± 2.9

40.8 ± 3.5
48.3 ± 3.5

Asn

2.7±0.0

5.5 ±0.2

7.7 ± 0.2

9.2 ± 0.4

12.8 ± 0.9

19.8 ± 1.3

21.9 ± 1.7

24.2 ± 2.0

Glu

5.4±0.3

14.2 ±0.6

19.6 ± 0.7

27.2 ± 1.3

36.8 ± 2.0

47.0 ± 3.5

54.8 ±3.764.5 ± 5.4

Gln39.8± 2.1

49.6 ± 2.7

48.0 ± 2.6

61.3 ± 3.9

62.8 ± 4.3

80.3 ± 1.2

82.6 ± 2.5

86.4 ± 2.7

Gly9.3± 0.1

13.1 ± 0.3

14.9 ± 0.4

17.5 ± 0.6

20.8 ± 1.3

29.4 ± 1.8

31.6 ± 1.2

33.7 ± 2.5

Ala
Val

33.4± 0.4
6.6± 0.1

45.7 ± 1.0
15.0 ± 0.7

50.5 ± 1.5
21.3 ± 0.8

55.7 ± 1.2
25.5 ± 1.4

63.3 ± 3.6
33.9 ± 2.1

82.3 ± 4.3
47.1 ± 3.2

84.7 ± 4.7
50.1 ± 3.3

88.5 ± 6.0
55.4 ± 4.8

Cys1.6± 0.1

1.6 ± 0.4

1.7 ± 0.4

2.7 ± 0.2

2.8 ± 0.1

2.7 ± 0.1

2.7 ± 0.1

2.8 ± 0.1Met

3.2± 0.1

11.9± 0.2

15.0 ± 0.5

16.7 ±0.7

21.0 ± 1.0

26.8 ± 1.5

28.1 ± 1.6

29.9 ± 2.1

Ile
Leu
Tyr
Phe
Trp

5.4 ±0.2
8.6 ±0.2
5.2 ±0.2
4.7 ±0.1
1.1 ±0.0

13.7 ±0.5
23.6 ±1.1
14.2 ±0.7
13.6 ±0.6
3.2 ±0.1

18.9 ± 0.5
32.0 ± 1.1
19.2 ± 0.7
19.5 ± 0.7
4.7 ± 0.2

21.6 ±1.0
37.1 ±1.822.1 ±1.122.9 ±1.2
5.3 ±0.3

27.8 ± 1.2
47.9 ± 2.3
28.2 ± 1.4
29.7 ± 1.3
7.3 ± 0.5

37.5 ± 2.3
64.1 ± 3.9
36.4 ± 2.3
39.6 ± 2.5

40.5 ± 2.2
68.6 ± 4.1
38.6 ± 2.4
41.9 ± 2.6

45.0 ± 3.3
74.2 ± 5.542.1 ± 3.3
44.9 ± 3.5

Lys
His
Arg
Pro
total

8.6± 0.1
3.4± 0.0
8.6± 0.4
3.0± 0.1
161.7± 4.8

9.0 ± 0.6
9.8 ± 0.6
11.7 ± 1.1
17.0 ± 0.6
22.9 ±0.7
27.1 ± 1.2
38.2 ± 1.9
55.0 ± 3.7
62.0 ± 3.8
72.1 ± 6.9
6.0 ± 0.2
7.8 ±0.2
9.2 ± 0.4
12.5 ± 0.6
17.6 ± 1.2
19.8 ± 1.2
23.5 ± 2.2
16.5 ± 0.4
23.3 ±1.0
25.1 ± 0.9
32.5 ± 1.5
44.1 ± 2.6
48.3 ± 2.8
52.9 ± 4.5
4.7 ± 0.0
6.2 ±0.2
7.5 ± 0.3
11.8 ± 0.3
16.2 ± 1.2
19.4 ± 0.7
23.5 ± 2.1
294.6 ± 11.4 368.5 ±14.2 437.6 ± 20.0 548.7 ± 30.6 738.4 ± 43.1 797.1 ± 45.6 882.7 ± 67.5

wet-aging periods（day）
0

10

20

30

40

50

60

70

Asp
Thr
Ser
Asn
Glu

0.0 ±0.0
4.2 ±0.1
5.0 ±0.1
2.3 ±0.1
4.1 ±0.3

0.2± 0.1
5.4± 0.2
7.1± 0.5
2.9± 0.1
5.5± 0.5

0.6 ± 0.1
8.2 ± 0.4
12.0 ± 0.6
4.2 ± 0.2
10.3 ± 0.3

2.5 ± 0.1
12.6 ± 0.7
18.0 ± 0.9
6.8 ± 0.3
17.5 ± 0.8

4.9 ± 0.2
16.9 ± 0.4
23.7 ± 0.5
9.7 ± 0.2
24.6 ± 0.5

4.5 ± 0.1
19.4 ± 0.3
27.4 ± 0.6
11.4 ± 0.2
30.9 ± 0.6

4.7 ± 0.2
20.2 ± 0.5
28.8 ± 0.6
12.1 ± 0.2
34.2 ± 0.7

5.3 ± 0.2
22.0 ± 0.6
28.8 ± 0.6
13.3 ± 0.2
37.8± 0.8

Gln
Gly
Ala
Val
Cys
Met

39.2 ±1.5
8.3 ±0.2
30.5 ±0.8
5.8 ±0.2
1.3 ±0.0
3.4 ±0.1

40.0± 1.1
8.9± 0.233.2± 0.9
7.9± 0.4
1.7± 0.0
6.6± 0.7

39.2 ± 0.9
10.6 ± 0.5
37.6 ± 1.5
13.0 ± 0.7
1.9 ± 0.0

49.5 ± 2.3
13.9 ± 0.6
46.9 ± 1.4
19.2 ± 1.1
2.0 ± 0.0

56.8 ± 3.2
16.8 ± 0.3
53.7 ± 0.8
25.6 ± 0.7
2.1 ± 0.0

58.6 ± 3.8
18.9 ± 0.4
58.5 ± 1.4
30.2 ± 0.6
2.3 ± 0.0

63.5 ± 2.8
20.2 ± 0.4
60.6 ± 1.4
31.0 ± 0.7
2.4 ± 0.0

71.9 ± 2.4
21.6 ± 0.4
63.9 ± 1.3
32.5 ± 0.8
2.5 ± 0.1

Ile
Leu
Tyr
Phe

4.3 ±0.1
7.1 ±0.2
4.3 ±0.1
4.4 ±0.2

6.8 ± 0.5
11.1 ± 0.8
6.8 ± 0.5
6.6 ± 0.4

10.7 ±0.2
11.4 ±0.4
19.1 ±0.8
12.0 ±0.5
11.2 ±0.4

13.4 ±0.7
16.0 ± 0.7
27.6 ± 1.4
16.9 ± 0.9
16.6 ± 0.8

17.1 ± 0.3
20.9 ± 0.3
36.7 ± 0.7
21.5 ± 0.5
22.1 ± 0.4

19.3 ± 0.3
24.5 ± 0.4
43.4 ± 0.7
23.9 ± 1.0
26.6 ± 0.4

19.9 ± 0.2
25.8 ± 0.4
45.2 ± 0.6
22.5 ± 0.2
28.4 ± 0.3

20.9 ± 0.3
27.2 ± 0.4
47.6 ± 0.6
21.2 ± 1.3
30.2 ± 0.6

Trp

0.9 ±0.0

1.3 ± 0.1

2.6 ±0.1

3.6 ± 0.2

4.7 ± 0.1

Lys

7.4± 0.2

9.2 ± 0.4

13.5 ± 0.6

19.9 ±0.925.8 ± 0.4

5.9 ± 0.2
30.9 ± 0.5

6.2 ± 0.3
32.0 ± 0.7

6.1 ± 0.1
34.1 ± 0.5

His
Arg
Pro
total

2.8± 0.0
7.4± 0.0
2.9± 0.2
145.5± 4.4

3.4 ± 0.2
9.0 ± 0.6
2.7 ± 0.1
176.2 ± 8.3

4.8± 0.2
13.1 ± 0.6
3.6± 0.1
239.7 ± 8.8

6.8 ±0.3
8.7 ± 0.1
10.3 ± 0.2
10.8 ± 0.2
11.4 ± 0.2
20.5 ±1.226.0 ± 0.6
30.1 ± 0.6
29.4 ± 0.3
28.9 ± 0.3
5.5 ±0.3
7.1 ± 0.1
8.6 ± 0.1
9.7 ± 0.3
10.5 ± 0.3
335.5 ±15.6 425.3 ± 10.5 485.6 ± 12.4 507.6 ± 11.2 537.5 ± 11.9

Values show the mean±standard error of three samples．

© The Ito Foundation

61

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅲ）
Table 5 Changes in the amounts of ATP-related substances（μmol/g）of beef during dry-aging and wet-aging at 2℃

dry-aging periods（day）
IMP
INO
Hx

0

10

20

30

40

50

60

70

3.1±0.2
0.9±0.0
1.4±0.0

2.0±0.2
1.1±0.0
2.3±0.0

0.9±0.2
0.9±0.1
3.0±0.0

0.4±0.1
0.8±0.1
3.1±0.1

0.3±0.1
0.8±0.2
3.8±0.3

0.1±0.0
0.6±0.1
3.7±0.1

0.0±0.0
0.5±0.1
3.8±0.3

0.0±0.0
0.3±0.0
3.7±0.2

wet-aging periods（day）
IMP
INO
Hx

0

10

20

30

40

50

60

70

4.2±0.5
1.6±0.1
1.2±0.1

3.0±0.5
1.7±0.2
2.1±0.0

1.9±0.4
1.7±0.2
2.7±0.1

1.0±0.3
1.7±0.3
3.1±0.1

0.5±0.2
1.4±0.3
3.5±0.1

0.2±0.1
1.3±0.2
4.0±0.1

0.1±0.0
0.9±0.1
4.2±0.2

0.0±0.0
0.6±0.1
4.0±0.2

Values show the mean±standard error of three samples．

Table 6 Correlation coefficient between sensory evaluation and taste substances of beef

dry-aged

wet-agedumami
complexity
lastingness
aging aroma
tenderness
umami
complexity
lastingness
aging aroma
tenderness

total offree-amino
acids

Glu

peptideIMP

Hx

0.75110.88650.89570.93370.62290.92700.95820.88940.93200.98110.73060.87740.89350.92510.59170.90880.9546
0.89490.95540.96310.88590.86620.89660.90270.8506
0.95730.94460.82520.82290.9807－0.9771－0.9927－0.9747－0.9684－0.8972－0.9464－0.9357－0.8531－0.8587－0.9825

0.94930.95750.95720.98070.89620.95170.95760.85790.87940.9860

ここで，官能評価と相関のある食肉成分を調べた試料のうま味強度を算出し，官能評価によるうるために，遊離アミノ酸の総量，グルタミン酸，

ま味の強さとの相関を調べた。その結果，うま味遊離ペプチド，IMPおよびHxの濃度と，官能評

強度とうま味との相関係数はDAでＲ＝－0.6079，

価によって得られたスコアとの相関係数を算出しWAでＲ＝－0.7171となり，いずれも負の相関をた（Table６）。その結果，熟成方法にかかわらず，示した。GluとIMPによるうま味の相乗効果につ遊離ペプチドおよびHxの濃度とすべての官能評

いてはすでに山口らにより明らかにされている19）価との間にＲが0.8以上の強い正の相関が認めらが，熟成された食肉において発現する強いうま味れた。遊離アミノ酸の総量およびグルタミン酸のはGluとIMPの濃度のみでは説明できないと考え

濃度は，DAにおいてうま味および軟らかさとのられた。

相関がやや低かった。また，IMPの濃度はすべて本研究により，WA，DAのいずれにおいてもの官能評価との間に強い負の相関が認められた。

長期間の熟成が必ずしも風味の改善には繋がらさらに，IMPおよびGluの含量から食品のうま味

ず，特にDAにおいては熟成40日～50日目をピー

強度を算出する計算式（うま味強度＝Glu（％）

クとしてそれ以降は風味が低下する傾向が示され＋1218×Glu
（％）
×IMP
（％）
） を利用し，熟成した。また，成分の変化では，遊離ペプチドは40日

19）© The Ito Foundation

62

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

目以降，HxはDAで40日目，WAで60日目以降増認められた。特に，ドライエイジングでは40日～

加せず，その挙動は官能評価と高い相関を示し

50日目をピークとしてそれ以降は風味が低下するた。以上の結果から，DAおよびWAにはともに傾向が認められた。続いて，呈味成分を分析した

熟成適期があり，その期間は遊離ペプチドあるい

結果，遊離アミノ酸は熟成により顕著に増加した

はHxの濃度を測定することによって把握できるが，遊離ペプチドは40日目以降，Hxはドライエ可能性が示された。これらの物質により食肉の熟イジングにおいて40日，ウエットエイジングにお成適期を判断することができれば，無駄な熟成時

いて60日目以降増加しなかった。これらの物質の間を省き，歩留まりを向上させることが可能とな

うち，遊離ペプチドとHxの熟成中の挙動は官能る。

評価と強い相関（Ｒ＞0.8）を示した。以上の結すでに，我々は，Hxが呈する苦味は豚肉スー果から，各種熟成方法には適期があり，この適期

プのうま味およびコクの増強に寄与することを明を知る指標としてHxは有力な候補の一つと考えらかにしているられた。

。この苦味が，実際の食肉に９，10）

おいてどのようにうま味やコクの発現を惹起しているのかについては今のところ明らかにされていないが，今回Hx濃度と官能評価の間に強い相関関係が示されたことに鑑みれば，これらの間に因謝辞・試料の提供にご協力いただいた小川畜産食品（株）に深く感謝します。

果関係が存在することを強く支持するものと考え・試 験の遂行にあたりご指導をいただいた神戸大学ている。また，中村らによって報告されている

大学院農学研究科の山之上稔准教授に深く感謝し

20）

ように，筋肉部位によって核酸関連物質の含量やます。

熟成に伴う変化は異なる。そのため，今後は，異なる畜種や筋肉部位における検討や，Hxと呈味
成分との成分間の相互作用について検討したい。
４．要約

我々は，これまでに食肉中のヒポキサンチン（Hx）は豚肉スープのうま味およびコクの増強に寄与することを明らかにしている。本研究では，長期熟成を施した食肉の熟成適期の指標としてHxが利用できるのか否かを調べる目的から，２℃
で70日間のドライエイジングおよびウエットエイ
ジングにより熟成した交雑牛の食味および呈味成分の変化について調べた。官能評価の結果，熟成
香は熟成期間に依存して増強された。一方，うま味，コクおよび軟らかさについては，いずれの熟成方法においても熟成に伴い増強したが，熟成期間が長くなると風味の変化は緩やかになる傾向が文
献１） Nishimura, T., et al.：Food Reviews International.
4, 175～194, 1988.
２） Nishimura, T., et al.：Agricultural and Biological
Chemistry, 52, 2323～2330, 1988.
３） 松石昌典：食肉の科学，36，183～198，1995.
４） Yukio, Y., et al.：Food Chemistry, 52, 4, 439 ～ 445,
1995.
５） Horiuchi, A., et al.：日本養豚学会誌，39，200～
207，2002.
６） Nicholas, P., et al.：Journal of food protection, 46,
No.７, 614～617, 1983.
７） Tikk, M., et al.：Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 54, 7769～7777, 2006.
８） Ichimura, S., et al.：Animal Science Journal, 88,
379～385, 2017.
９） Ichimura, S., et al.：平成28年度食肉に関する助成
研究調査報告書，35，52～60，2017.
10） Ichimura, S., et al.：平成29年度食肉に関する助成
研究調査報告書，36，80～88，2018.
11） 西村敏英ほか：化学と生物，54，No.２，102～108，2016.
12） Kitada, Y., et al.：日本食品工業学会誌，30，151～
154，1983.

© The Ito Foundation

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅲ）
13） 食肉の官能評価ガイドライン，（独法）家畜改良センター編，三津本充ほか，遊離ペプチド量の測定，
137～138，2005.
14） 松石昌典：日本調理科学会誌，51，３，193～196，2018.
15） 長尾真理ほか：北海道畜産草地学会報，36，29～
32，1994.
16） 柳 原 一 美 ほ か：日 本 畜 産 学 会 報 ，66 ，２ 160 ～63

166，1994.
17） Okitani, A., et al.：日本調理科学会誌，25，No.4，
314～426，1992.
18） 荒川信彦：日本調理科学会誌，12，192～202，1979.
19） Yamaguchi, S.：Journal of Food Science, 32, 473～478, 1967.
20） 中村好徳ほか：日本暖地畜産学会報，61，１，
３～
９，2018.

© The Ito Foundation

64

豚肉の筋線維タイプ組成と肉質の関連性に関する研究
Relationship between fiber type composition and meat quality in pork
meat

水野谷

航＊・澤野

祥子＊＊・中村（九州大学大学院農学研究院， 現所属：麻布大学獣医学部，
＊

真子・辰巳

隆一

現所属：麻布大学生命・環境科学部）＊＊

Wataru Mizunoya＊，Shoko Sawano＊＊，Mako Nakamura and Ryuichi Tatsumi（Faculty of Agriculture, Kyushu University，＊present affiliation：School of Veterinary Medicine, Azabu University，＊＊present affiliation：School of Life and Environmental Science, Azabu University）

Skeletal muscle fibers are largely classified into two types；slow-twitch fibers and fasttwitch fibers. To date, muscle fiber type composition is thought as an important factor todetermine meat quality and nutritional value of meat. Nonetheless, the relationship between
fiber type composition and meat quality have not been fully understood. In this study, we
aimed to clarify the relation of various meat quality parameters and muscle fiber type. Loinmeat from Large Yorkshire pigs were used as experimental samples, which were raised in aconventional pen or grazed during daytime（exercise treatment）. The muscle fiber typecomposition and the physicochemical properties were analyzed. Furthermore, sensory
evaluation test was conducted to investigate changes in taste. The pork samples were also
subjected to metabolomic analysis in order to examine the alterations of total substrate level.
In loin meat of exercised pigs（Ex-loin）, MyHC1（slow-twitch fiber marker protein）was
significantly increased and MyHC2（fast-twitch fiber marker protein）was significantly
decreased compared with control loin（Con-loin）, indicating exercise treatment can be used ashigh slow-twitch fibers meat. The shear force value, which is an index of toughness of meat,
was significantly increased in Ex-loin. The water holding capacity of the Ex-loin tended to be
increased. In the sensory evaluation test, the Ex-loin showed higher score of“the strength ofmeat taste”and“the smell in the mouth”compared with Con-loin. Metabolomic analysis
revealed marked differences between Con-loin and Ex-loin in various metabolomic substrates
contained in meat. These results suggest that higher level of slow-twitch fibers alters thevarious metabolites of pork and leads the differences of taste and texture of the pork.

１．目

タイプと食肉の食味に関わる特性についてはいく

的

つか報告があるものの，各論的な検討が主であっ骨格筋を構成する筋線維は遅筋タイプ（赤筋），た。例えば，豚肉においては速筋タイプ筋線維が速筋タイプ（白筋），中間タイプに分類でき，収多いほど肉が硬くなることが示唆されている１）。

縮特性および代謝特性が異なる。これまで筋線維

保水性とは食肉に含まれる水分を保持する力のこ© The Ito Foundation

豚肉の筋線維タイプ組成と肉質の関連性に関する研究

65とで多汁性（液汁性）とも密接に関係している。

ス（胸最長筋）を５日間チルド条件下で保存した豚肉で遅筋タイプの比率の増加が，食肉の保水性

後，解析に応じた量に切り出し，解析を実施する

および多汁性を向上させるという報告がなされてまでは－30℃で冷凍保存した。

いる 。保水性は食肉のpHが低いと著しく低下
２）することが知られているが ，それ以上の分子的３）な考察はいまだ十分とは言えない。

2 . 2 SDS-PAGE 法 に よ る ミ オ シ ン 重 鎖（MyHC）アイソフォームの測定
Mizunoyaらの方法に従い解析を行った４）。ま筋線維タイプは，筋の代謝能力と関わりが深い

ず冷凍保存していた胸最長筋を液体窒素で冷やしことから，筋細胞に存在する代謝基質レベルも異た乳鉢で粉砕後，50mg程度秤量し10％SDSを含なる。代謝基質の多くは食肉の呈味性化合物や香む細胞溶解液で処理後，サンプルバッファーで希気成分である以上，食肉の風味と筋線維タイプは釈した。次に35％グリセロールを含む８％アクリ

密接な関連があっても不思議ではない。さらにルアミドゲルを用いたSDS-PAGEに供し，ゲルは，硬さに影響する細胞外マトリックスが筋組織

上でミオシン重鎖アイソフォーム（MyHC）１とに存在する細胞に由来することから，細胞の代謝

MyHC2（2A，2X，2Bがすべて含まれる）に分特性が異なれば，発現する細胞外タンパク質のレ離し，その割合をImageJを使って解析した。

ベルや発現パターンが異なる可能性も大いに考え2.3

られる。ヒレ（大腰筋）はロース（胸最長筋）よ１×１×５cmに整形した胸最長筋片を，ナイ

り軟らかいと言われるが，姿勢維持に使われる大フカッターで筋線維方向に垂直に切断し，その際腰筋の方が遅筋タイプの組成比が高いことから，の最大荷重をレオメーターで測定し，剪断力価と硬さとの関連性は大いに示唆される。

した。サンプルは70℃のウォーターバスで１時間

理化学的特性以上より，筋線維タイプと食肉の特性は，いま加温後，流水で30分間冷却した加熱後の状態で測だ解明の余地が多く残されている。本研究の目的定した。次に肉の遠心力に対する物理的な保水性は，食肉の筋線維タイプ組成比と食肉の種々の特を測定した。胸最長筋を約0.5ｇ程度の立方体に性，特に消費者にとって重要な味に関連する特性

切り出し，サンプルをろ紙で包んだものを準備しとの関係性を豚肉を研究対象に検討し，関連性をた。作成したサンプルはガラスビーズを入れた見出すことである。

15mLチューブに入れ，2,200×g，30 min，４℃

２．方
2.1

で遠心分離し，遠心分離前後のサンプル重量の割法

合を算出した。

実験材料

2.4

官能試験

福岡県の農場にて肥育された去勢雄２頭，雌２20代から40代の男女10名を対象に官能試験を頭の豚（大ヨークシャー）の肉を解析に用いた。

行った。－30℃に冷凍保存された胸最長筋を４℃

これらの豚は出荷１か月前に安静区と放牧区に分で一晩解凍し，ミートスライサーで厚さ５mmにけて肥育された。放牧は豚の運動量を増加させる

スライスした。試験に提供する部位を約３×３

ことを確認しており（data not shown），この運cmに整形し，1.5％食塩水を入れ，10分間浸漬し動量の増加が遅筋タイプの増加を引き起こすと考た。浸漬後は試料の水分をキムタオルで除去しえた。放牧区は１か月間，出荷まで日中に放牧場た。170℃に設定したホットプレートで表面25秒，に出した。出荷体重に達した時点で，と畜し，ロー

裏面20秒加熱し室温に戻して提供した。試料の評© The Ito Foundation

66

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

価は香りと味に関わる項目を５段階の評価紙で評るため，骨格筋のMyHCアイソフォーム組成を価した。

SDS-PAGEで解析したところ，放牧区の胸最長2.5筋（ロ ー ス 部 位 の 主 要 な 筋 組 織）に お い て ，

メタボローム解析

サンプル内の代謝物量の変化を測定するため，

MyHC１（遅筋タイプ筋線維で発現する）が有意

各個体および加熱した豚肉サンプルをメタボローに増加し，MyHC２（速筋タイプ筋線維で発現すム解析に供した。メタボローム解析は，ヒューマる）が有意に減少した（Fig.１）。したがって，ン・メタボローム・テクノロジーズ（HMT）株

放牧によって運動トレーニングと同様の効果が，式会社に委託し，CE-TOFMSによるピーク検出，

豚のロース部位で引き起こされることが分かっ

主成分分析（PCA）や階層的クラスタリング解た。以降，放牧区の試料を遅筋割合が高まった筋

析（HCA）をはじめとした統計解析を行った。

組織として，安静区と比較した。

2.6

統計処理

硬さの指標である剪断力価をレオメーターで測

安静区と放牧（遅筋増加）区の有意差検定（危定したところ，放牧区の加熱ロース肉で有意に剪

険率５％）にはStudent’s t-testを用いた。値は断力価が増加した（Fig.２）。遅筋タイプ組成比

平均値±標準誤差で表した。

と食肉の硬さが正の相関を示すという報告は，筆者の知る限り，これまでなく，硬さの増加は遅筋

３．結果と考察

タイプの増加によるものではなく，恐らく放牧に

運動刺激は，骨格筋の遅筋タイプを増加するこよる運動量の増加がコラーゲンの産生を促したたとが多くの研究により確かめられている 。放牧めに生じたと予想した。実際この筋の切片をシリにより，遅筋タイプが増加したかどうかを検討す

ウスレッド染色（コラーゲンを赤色に染色する染

５）

Con

Ex

Con

Ex

MyHC2
MyHC1

（%）
100

MyHC composition
Con-loinEx-loin

80

＊

60
40

＊

20
0

MyHC1

MyHC2

Fig. 1MyHC composition of pork loin meat from control（sedentary）and grazed（exercise）pigs. Values are means±SE for 2 animals. ＊p＜0.05 vs Con-loin．

© The Ito Foundation

67

豚肉の筋線維タイプ組成と肉質の関連性に関する研究
（N）
16
14
12
10
8
6
4
2
0

Shear force value（%）centrifuge loss (water holding capacity)
25

＊＊

#

20
15
10
5

Con

0

Ex

Con

Ex

Fig. 2
Shear force value（left）and water holding capacity（right）of pork loin meat from control（sedentary）and grazed（exercise）pigs. Values are means±SE for 9-10 meat pieces. ♯p＜0.1, ＊＊p＜0.01 vs Con-loin．

2

スコア

1

#

＊

0
-1
-2

Con
Ex
Con
Ex
Con
Ex
香りの好ましさ 香りの強さ
硬さ

Con Ex
Con
Ex
Con
Ex
Con
Ex
Con
Ex
ジューシー
線維感 肉の味の強さ 口の中での香り 総合評価

Fig. 3
Sensory evaluation of cooked pork loin meat from control（sedentary）and grazed（exercise）pigs. Values are means±

SE for 10 panelists. ♯p＜0.1, ＊p＜0.05 vs Con-loin．

色法）したところ，放牧区では安静区と比較してした（Fig.３）。すなわち，遅筋タイプは，速筋

赤色で染まった筋線維間のコラーゲンが増加する

タイプより呈味性化合物（食肉では遊離アミノ酸傾向を示した（data not shown）。さらに，多汁あるいは核酸関連物質がその候補）が多く含ま性に寄与する保水性を測定した結果，放牧区のれ，その影響で「肉の味の強さ」「口の中での香ロース肉において，保水性の上昇傾向が認められり」の評価が高まったと予想した。実際に我々のた（Fig.２）。遅筋タイプと保水性は正の相関を研究から，牛肉の各種筋組織で遅筋タイプの指標示すことが複数の報告で示されていることかであるMyHC１組成と総遊離アミノ酸量は有意なら，本研究もそれらの報告と一致した結果と正の相関を示すことを明らかにしており７），本結

言える。ただし現在まで遅筋タイプの増加が保水

果を支持している。また遊離アミノ酸は，加熱調力を高める分子機序は分かっていない。

理中に食品に含まれる還元糖とメイラード反応を２，
６）

官能試験での注目すべき差として，遅筋タイプ
筋線維が多い放牧区のロースにおいて「肉の味の起こし，このとき生成する香気成分が「口の中での香り」を強める可能性も考えられた。

強 さ」の 評 価 が 増 加 す る 傾 向 が 見 ら れ（ｐ ＝メタボローム解析による代謝物の網羅的解析結

0.098），「口の中での香り」の評価が有意に増加

果では，主成分分析（PCA）の結果から，去勢© The Ito Foundation

68

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

オスにおいて安静区（Ａ１）と遅筋の多い放牧区

２）と遅筋の多い放牧区（Ｄ；加熱したＢ２）を（Ｂ１）で顕著な違いが認められた（Fig.４）。ま比較しても，代謝物分布はかなり異なっているこ

た，今回は試験的に加熱と非加熱の豚肉も比較しとが分かり，加熱調理後も筋線維タイプによる代たところ，加熱により代謝物分布が顕著に変化す

謝物の違いは維持されると考えられた（Fig.５）。

ることも分かり，さらに安静区（Ｃ；加熱したＡ検出できた各代謝物については，性差によって運

10

6
PC2
（25.9%）

A1 : sedentary（barrow）
A2 : sedentary（sow）
B1 : exercise（barrow）
B2 : exercise（sow）
C : cooked A2
B2 D : cooked B2

B1

8

4

A2

2
0

-2
C

-4
-6
-15

A1
-10

D
-5
0
PC1
（41.9%）

5

10

Fig. 4
Principal component analysis（PCA）of whole metabolites detected in pork loinmeat from six different control（sedentary）and grazed（exercise）pigs．

Fig. 5Heat map of whole metabolites detected in pork loin meat from six different control（sedentary）and grazed（exercise）

pigs．

© The Ito Foundation

豚肉の筋線維タイプ組成と肉質の関連性に関する研究

69

動の影響は異なり，去勢オスは運動によりアスパ意に増加し，速筋タイプのMyHC２が有意に減少

ラギン酸，グルタミン酸，アルギニンなどのアミしており，同一組織で異なる筋線維タイプ組成をノ酸量が減少し，一方で，メスは運動によりそれ有する試料が得られた。遅筋が増加した豚胸最長

らの代謝物量が上がることが分かった。核酸につ筋では遠心保水性が増加傾向を示した。また遅筋

いてはIMP，GMPについては去勢オスに比べメが増加した豚胸最長筋で加熱後の剪断力価が有意

スに多く存在していることが確認された。またに増加した。官能試験では遅筋が増加した胸最長

AMPやATPは加熱により存在量が多くなる傾向

筋で「肉の味の強さ」「口の中での香り」の評価が見られた。これらの結果を総合すると，呈味性が増加した。以上より，豚肉の遅筋タイプの筋線に関わる代謝物の挙動は性差や加熱により複雑に

維割合の増加は，保水性を向上させ，食味性の評

影響を受けるが，オスでは運動により呈味性代謝

価では「肉の味の強さ」「口の中での香り」を増物が下がる傾向にあること，逆にメスでは上がる

す変化が生じると考えられた。

傾向にあることが示唆された。
さらに，去勢オスとメスの豚肉をプロのシェフに調理をしてもらい，官能試験を行った結果，「メスのほうが柔らかく美味しい」とシェフが話していた。すなわち性差は肉質と呈味性に多大な影響を及ぼしていると推測される。今後，性差も念頭においてさらに検討を進めることで，筋線維タイプとそれに応じた食肉の呈味性に迫れるものと期
待される。
４．要

約

遅筋タイプを増加させる処理として，放牧をさ文献１） Hamill, R. M., McBryan, J., McGee, C., Mullen, A.
M., Sweeney, T., Talbot, A., Cairns, M. T., Davey, G.
C.：Meat Sci., 92（4）,440～450, 2012．
２） Kim, G. D., Ryu, Y. C., Jeong, J. Y., Yang, H. S.,
Joo, S. T.：J. Anim. Sci., 91（11）,5525～5534, 2013．
３） 荒川信彦：調理科学，12（4），194～202，1979．
４） Mizunoya, W., Wakamatsu, J., Tatsumi, R.,
Ikeuchi, Y.：Anal. Biochem., 377（1）,111～113, 2008．
５） Pette, D.：Acta Physiol. Scand., 162（3）,367～376,
1998.
６）Ryu, Y. C., Kim, B. C.：J. Anim. Sci., 84（4）,894 ～
901, 2006．
７） Mashima, D., Oka, Y., Gotoh, T., Tomonaga, S.,
Sawano, S., Nakamura, M., Tatsumi, R., Mizunoya,
W.：Anim. Sci. J., 2019．

せた豚の胸最長筋では遅筋タイプのMyHC１が有© The Ito Foundation

70

軽度認知症改善効果を示した豚肝臓分解物の活性本体の同定とメカニズム解明
Identification and characterization of bioactive compounds on mild
cognitive impairment in porcine liver decomposition product

塚原

完・羽二生

久夫＊・松田佳和＊＊（長崎大学医歯薬学総合研究科薬学系，＊信州大学先鋭領域融合研究群バイオメディカル研究所，＊＊

日本薬科大学薬学部臨床教育部門）

Tamotsu Tsukahara, Hisao Haniu＊ and Yoshikazu Matsuda＊＊（Department of Pharmacology and Therapeutic Innovation, Nagasaki University,＊Graduate School of Biomedical Sciences, Interdisciplinary Cluster for Cutting Edge Research, Shinshu University,＊＊Clinical Pharmacology Educational Center, Nihon Pharmaceutical University）

Phospholipids are the most important class of polar lipids in human and they areamphipathic molecules that make up the bilayer of the plasma membrane and keep themembrane fluid. Since the brain is one of the richest organs in phospholipids content, changes
in the brain phospholipid levels could lead to different pathogenic processes. In this study, ananalytical procedure for determination of major phospholipids in porcine liver decomposition
product（PLDP）by LC-MS/MS was optimized and validated. PLDP is currently attracting agreat deal of interest to help improve cognitive function in older adults. However, the exact
mechanisms of PLDP are still unclear. Here, we focus in particular identified thelysophospholipids in PLDP and effects on the proliferation and cytokine gene expression ofbrain microglial cells.

１．目

い。我々のこれまでの研究から，生理活性リン脂的質の１つであるリゾリン脂質が血管障害改善に寄廃棄処分される豚肝臓の有効利用を模索する中与することを明らかにしている。PLDPの認知障で，豚肝臓ホモジネートのプロテアーゼ分解物

害改善効果はこれらのリン脂質に由来する可能性（Porcine Liver Decomposition Product，PLDP）

が高く，その活性本体を同定し作用機序を明らかが，長谷川式簡易認知評価スケールで有意な認知にすることを本研究の目的とした。

障害改善効果を観察した１）。認知症の発症前予防には，血管障害を起こす危険因子を取り除くこと

２．方法が重要である。血管性型，アルツハイマー型，レ2.1

ビー小体型のいずれも，人格障害などの重篤な症

PLDPを解凍後，５mlを量り取り，Bligh-Dyer状が発生する以前に，軽度な認知障害が現れる

法により総脂質を抽出した。抽出物をシリカゲル

が，これは血管障害が共通の原因である場合が多カラムに添加し，クロロホルム（中性脂質画分），© The Ito Foundation

PLDPからの総リン脂質抽出と精製

軽度認知症改善効果を示した豚肝臓分解物の活性本体の同定とメカニズム解明

71

アセトン（糖脂質画分），メタノール（リン脂質で調製したPLDPを24時間暴露させた。培地除去画分）にて，順次系統分離し，リン脂質濃縮画分後，各細胞から精製したtotal RNAよりcDNAをとして回収した。リン脂質濃縮画分は15μlずつ合成し，炎症性サイトカインであるIL-6，IL-1β，マイクロチューブへ小分け後，窒素ガスエバポ

CCL-2（MCP-1）の 発 現 変 動 を リ ア ル タ イ ム

レーターで乾固し，使用するまで－80℃にて凍結

PCR で 確 認 し た 。 発 現 解 析 は SYBR Green保存した。

Realtime PCR Master Mic（toyobo）お よ び Eco

2 . 2 LC-MS/MS法によるPLDP中のリン脂質定量
タンデム型液体クロマトグラフィー質量分析器

Real-Time PCR System（illumina）にて行った。
３．結果と考察（UltiMate 3000 LC system, Thermo-Fisher

3.1

PLDPのリン脂質組成

Scientific）を使用して，PLDP中のリン脂質成分

前述したLC-MS/MS法により，PLDPに含まれを同定した。リン脂質濃縮画分をHPLC用グレー

るリン脂質を測定した結果，ホスファチジルコリ

ド の ク ロ ロ ホ ル ム 10 μl で 溶 解 後 ，C18 Waters

ン（PC）が7,100pmol/μlと最も多く，次いでフォ

X-Bridge C18カラム（3.5mm，150mm×1.0mm

ス フ ァ チ ジ ル エ タ ノ ー ル ア ミ ン （PE） がi.d.）に添加後，溶媒Ａ（イソプロパノール／メタ

2,200pmol/ μl ，ホ ス フ ァ チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル

ノール／水（5/1/4 v/v/v），５mMギ酸アンモニ（PI）が200pmo/μl，ホスファチジン酸（PA）がウム，0.05％水酸化アンモニウム）と溶媒Ｂ（イ3.9pmol/μlであった。PCにおける主なる分子種

ソプロパノール，５mMギ酸アンモニウム，0.05％

としてPC34：1，PC34：2，PC36：2，PC36：3，

水酸化アンモニウム）を利用したリニアグラジエ

PC36：4，PC38：４であった。その他の分子種

ント溶出法にて分画した。流速は20μl/min，カとしてはPC32：0，PC32：1，PC38：3，PC38：5，

ラムオーブン温度は20℃とした。

PC38：6，PC40：4，PC40：5，PC40：６が検出同定したリン脂質成分のin vitro評価

されたが，その存在量は少なかった。PEに関し

PLDPのミクログリアに対する細胞増殖試験はてはPE36：２およびPE38：４が主となる分子種

水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウム塩でで あ っ た が ，PE34：1 ，PE34：2 ，PE36：1 ，

あ る WST- ８（同 仁 科 学 研 究 所 ，Cell counting

PE36 ： 3 ， PE36 ： 4 ， PE38 ： 3 ， PE38 ： 5 ，

Kit-８）を用いた細胞増殖測定法を用いた。BV

PE38：6，PE40：5，PE40：６も検出された。PI２細胞はFBSを除いた培地で調製後，96ウェルプについてはPI38：４が主となる分子種であった

レートに細胞を播種（５×10 /well）し，培地でが ，そ の 他 に も PI34：1 ，PI34：2 ，PI36：2 ，PLDPを段階希釈（０，0.0625，0.125，0.25，0.5，

PI36：4，PI38：3，PI38：5，PI40：4も検出され１％）した供試検体溶液を添加し，24時間培養た。PSに関してはPS36：１およびPS38：４が主（37℃，５％ CO２）後，WST-８試薬を添加し２なる分子種であったが，PS34：1，PS34：2，

時間培養（37℃，５％

PS36：2，PS36：3，PS36：4，PS38：3，PS38：

2.3

３CO２）後，450nmにおけ

5，PS38：6，PS40：4，PS40：5，PS40：６も検る吸光度を測定した。
リアルタイムPCR法による変動発現解析

出 さ れ た 。 PA に 関 し て は PA36 ： １ お よ び

マウス脳マイクログリア由来の細胞株である

PA38：４が主となる分子種であり，PA32：0，

BV-２細胞（１×10 /well）に１％および0.25％

PA32 ： 1 ，PA34 ： 0 ，PA34 ： 1 ，PA34 ： 2 ，

2.4

４© The Ito Foundation

72

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

PA36 ： 0 ，PA36 ： 2 ，PA36 ： 3 ，PA36 ： 4 ，PA38 ： 3 ，PA38 ： 5 ，PA38 ： 6 ，PA40 ： 4 ，

PLDP中に多く含まれていたLPCに注目した。
3 . 2 PLDPに反応するミクログリア細胞増殖

PA40：5，PA40：６も検出された。リゾ体につ能力の測定いても同様に測定したところ，リゾホスファチジ

テトラゾリウム塩（WST-８）を用いたプロト

ル コ リ ン（LPC）が 5,000pmo/ μl で 最 も 多 く ，

コールに従い，細胞生存率を計測した。PLDP添

LPC18：０が主なる分子種であったが，LPC16：

加前日に96Well Plateに５×10３ 個/wellの細胞を0，LPC18：1，LPC18：2，LPC20：４も検出さ撒き，PLDP添加から24時間後にアッセイを行っれた。リゾホスファチジルイノシトール（LPI）

た。アッセイは各々４回行い，細胞増殖抑制曲線

は400pmo/μlで，LPI18：０が主なる分子種でを作成した。450nm波長の吸光光度計を用いて計あ っ た が ，LPI16：0 ，LPI18：1 ，LPI18：2 ，測を行い，DMSOのみ添加の細胞群の吸光度をコ

LPI20：４も検出された。リゾフォスファチジル

ントロールとして，生存率を計算した。BV２細セリン（LPS）は230pmol/μlで，LPS18：０が主胞の脱水素酵素活性はPLDP濃度依存的に増加しなる分子種であったが，LPS16：0，LPS18：1，ていたことから，PLDPはBV２細胞において細LPS18：2，LPS20：4，LPS22：６も検出された。

胞増殖活性を持つことが明らかとなった。結果をリゾホスファチヂン酸（LPA）は25pmol/μlで，Fig.１に示した。

LPA18：０が主なる分子種であったが，LPA16：

3 . 3 炎症性サイトカイン産生におけるPLDP

0，LPA18：1，LPA18：2，LPA20：４も検出さおよびLPCの抑制効果れた。我々のこれまでの研究から，生理活性リン

ミクログリアは定常状態においても非常に活発

脂質の１つであるリゾリン脂質が血管障害改善にな活動をしており，脳内環境維持のみならず，そ寄与することを明らかにしている。本研究ではの発達，学習にも重要な役割がある。リアルタイ％growth（normalized to control）

400

300

200

100

0

０ 0.0625 0.125 0.25

0.5

１
PLDP
（％）

Fig. 1 BV-2 cells were seeded in 96-well culture plates（５×10３cells/well）, and PLDP was added to cells. PLDP

was serially diluted to 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, and １％ respectively. After 24h, cell proliferation was determinedusing Cell Counting Kit-8（Dojindo, Kumamoto, Japan）. After cells were incubated for 24h, 10μL of the Cell
Counting Kit-8 solution was added to each well and the plates were incubated for 2h in an incubator at 37℃
with 5％ CO２. The amount of orange formazan dye was determined by measuring absorbance at 450nm using
a microplate reader（Awareness Technology, Westport, CT, USA）．

© The Ito Foundation

73

軽度認知症改善効果を示した豚肝臓分解物の活性本体の同定とメカニズム解明

40

＊＊

20
０
120

Control 0.05％

１％

100
80
60

＊＊

＊＊

40
20
０

Control 0.05％

１％

120
100
80

＊＊

＊＊

60
40
20
０

Control 0.05％

１％

120
IL-６
Relative RNA levels

60

＊＊

IL-1β
Relative RNA levels

80

LPC

100
80
60
40
20
０
120

Control

50（μＭ）

３

100
80

＊＊

＊＊

60
40
20
０

Control

３50（μＭ）

120
100
80
60
40
20
０

IL-1β
Relative RNA levels

100

IL-６
Relative RNA levels

120

CCL-２
Relative RNA levels

PLDP

CCL-２
Relative RNA levels

CCL-２
Relative RNA levels

IL-1β
Relative RNA levels

IL-６
Relative RNA levels

120

Control

３50（μＭ）

LPA

100
80
60
40
20
０

Control

３50（μＭ）

Control

３50（μＭ）

Control

３50（μＭ）

120
100
80
60
40
20
０
120
100
80
60
40
20
０

Fig. 2 BV-2 cells were seeded in 12-well culture plates（１×10４cells/well）, and PLDP, or LPC18：0, or LPA18：1

was added to cells. After 24 h, total RNA was extracted from cell lines using TRIzol（Invitrogen）. Total RNA
was isolated from cells using a NucleoSpinⓇ RNA II Kit（Takara, Otsu, Japan）. Then, 0.5μg of total RNA wasused for cDNA synthesis using a ReverTra Ace qPCR RT Kit（Toyobo）as per the manufacturer’s
instructions. IL-6 or IL-1β or CCL2 mRNA levels were quantified using an ECO Real-Time PCR System（Illumina, Inc., San Diego, CA, USA）. All PCRs were performed in 10-μL volumes in 48-well PCR plates（Illumina）with GeneAce SYBR qPCR MIX α No ROX（Nippon Gene, Toyama, Japan）.Relative mRNA levels
were quantified using the formula 2－ΔΔCq, where ΔCq is the difference between the threshold cycle of a target
cDNA and an endogenous reference cDNA.

ムPCRの結果をFig.２に示す。いずれの炎症性サ

炎症性サイトカインの発現変動は認められなかっイトカインもPLDP（0.05および１％）処理によた。

り発現低下が有意に認められた。一方で，PLDPの主要リゾリン脂質であるLPCおよびLPAを生

４．要

約

理的濃度（３および50μＭ）でBV-２細胞へ暴露

PLDPは豊富にリン脂質を含むことが明らかでした場合，IL-１βのみ発現の低下が観察され，あることから，PLDP中のリン脂質組成をLC-

その他の炎症性サイトカインの発現には影響を及

MS/MS法で再検討したところ，リゾホスファチ

ぼさなかった。また，炎症性リゾリン脂質の一つ

ジルコリン（LPC）が数百μＭの濃度で検出されと考えられているリゾホスファチジン酸（LPA）

た。LPCは，神経細胞に作用する「リゾホスファ

を３or 50μＭの濃度でBV-２細胞へ暴露しても，チジン酸（LPA）」や「環状リゾホスファチジン© The Ito Foundation

74

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）酸（cPA）」の前駆物質として重要なリン脂質で示した豚肝臓分解物の活性本体がLPCであることある。我々はPLDP中に含まれるLPCが体内で代が明らかとなったが，LPCは体内でさまざまな生

謝産物として，認知機能改善の活性本体であると理活性脂質へ変換される重要なリン脂質であり，考えた。また，PLDPは細胞非刺激時において，LPC代謝物による認知症改善効果を明らかにする

複数の炎症性マーカーの発現を低下させることもことも重要であり，次のテーマである。

明らかとなった。PLDPには多種多様なリン脂質を含まれることが明らかとなっているが，少なくともその構成リン脂質の一つであるLPCがIL-１βの発現を抑制する抗炎症性分子として機能して

文献１） 特願2019-7552神経機能再生促進剤：塚原完，井上俊夫，植村健，羽二生久夫，松田佳和，佐藤和三郎いる。これらの結果より，軽度認知症改善効果を© The Ito Foundation

75

食肉タンパク質の抗肥満および脂質代謝促進効果に関する研究（Ⅱ）
Dietary effect of meat protein on anti-obesity and lipid metabolism（Ⅱ）

若

松

純

一

（北海道大学北方生物圏フィールド科学センター）

Jun-ichi Wakamatsu（Hokkaido University, Field Science Center for Northern Biosphere）

In order to elucidate whether a long-term intake of chicken protein results in anti-obesity
effect and/or lifestyle disease ameliorating effect, we examined effect of chicken parts by using
a high-fat and high-sucrose diet fed animal experimental model. A long-term intake of any
parts of chicken did not decrease their body weight and white adipose tissue（WAT）weightand did not increase their brown adipose tissue（BAT）weight compared with beef- andcasein-fed groups. No significant differences were observed in blood biochemical parameters or
liver fat content among groups. Anti-obesity effect and lifestyle disease ameliorating effect ofchicken protein were not verified in this study. However, the expression of genes related tofatty acid synthesis in the liver and fatty acid uptake into the liver was significantly suppressedby chicken protein consumption. A long-term intake of chicken protein was suggested tosuppress the expression of SREBP-1c in the liver, resulting in preventing fatty acid synthesisin the liver. But, the effect of chicken parts on fatty acid synthesis in the liver was not verified
in this study.

１．目

鶏肉タンパク質や羊肉タンパク質の摂取による的体熱産生にはUCP１によって脂肪酸が使用され我々はこれまでの研究において，鶏肉や羊肉はている可能性があることから，鶏肉タンパク質や他の畜肉に比べて摂取後の体温上昇を亢進するこ

羊肉タンパク質を長期的に摂取することで，脂肪とを明らかにした 。さらに，食肉タンパク質のを減らし，抗肥満効果が得られるのではないかと摂取による体熱産生効果は食肉の摂取による体熱考えられた。そこで，ラットに各種食肉タンパク産生効果と一致することを示し，食肉の体熱産生質を配合した高脂肪・高ショ糖食を４週間投与しにはタンパク質が関与していることが明らかにたところ，鶏肉タンパク質投与群で精巣上体，腸なった 。また，鶏肉タンパク質や羊肉タンパク

間膜，腎周囲の白色脂肪組織（WAT）の減少を質の摂取による体熱産生亢進効果は，褐色脂肪組

確認し，鶏肉タンパク質の４週間の摂取は内臓型織（BAT）のUCP１による熱産生が中心的な役

肥満に対する抗肥満効果をもたらすことが示唆さ割を果たしていることが示唆された 。

れた（未発表データ）。また，ラットに鶏肉タン

１）

２）

２）

© The Ito Foundation

76

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

パク質を配合した高脂肪・高ショ糖食を22週間投
与したところ，鶏肉タンパク質の抗肥満効果は確

２．方法

認できなかったが，肝臓の脂質含量が鶏肉タンパ

2.1

動物実験

ク質投与群で有意に低いことが示され，肝臓にお供試動物には５週齢，Wistar系の雄ラットを用ける脂質代謝関連遺伝子の発現量より，脂肪酸のいた。ラットは室温23℃，12時間の明暗サイクル

合成を抑制，分解および取込を促進することが示に設定された部屋で，後述の馴化飼料と水を自由された（未発表データ）。鶏肉タンパク質の摂取に摂取させ，１週間馴化させた後に実験に供しは脂肪酸の取込を促進するが，それ以上に脂肪酸た。なお，各試験群間の平均体重に有意差がないの分解が促進されたことで，肝臓での脂質蓄積をように群分けし，個別飼育した。馴化後の試験期抑制し，脂肪肝抑制効果がある可能性が示され間は８週間とし，高脂肪・高ショ糖食（40％豚た。このように，鶏肉タンパク質の抗肥満効果や脂，20％ショ糖），水を自由に摂取させた。試験

脂肪肝抑制効果の可能性は示されたが，投与期間

期間中は７日に１回の頻度で体重測定，３日に１によって結果が異なるため，鶏肉タンパク質の作回の頻度で摂食量測定を行った。

用が明確になっていない。また，脂質異常症など

2.2

試験飼料の調製の生活習慣病の改善効果についても期待される

鶏肉には北海道大学産のロードアイランドレッ
ド種の産卵廃鶏のむね肉ともも肉を，牛肉には北が，これまで検討されていない。
ところで，鶏むね肉と鶏もも肉では構成してい海道大学静内研究牧場産の日本短角種を用いたる筋線維型が異なる 。筋線維型が異なると，ミ（部位混合）。各種ひき肉を凍結乾燥し（FD-01，

オシンなどの構成タンパク質のサブタイプも異な

東京理科機器），乳鉢で均一にすり潰した。Ezoe

る。同一タンパク質でもサブタイプが異なると，

らの方法２）に従って凍結乾燥物から精製タンパク

分子量やアミノ酸配列に差が生じる４）。畜種によ質を調製した。馴化飼料はAIN-93G標準飼料組る体熱産生の違いは，構成タンパク質のアミノ酸成に準拠して調製し，馴化期間中にラットに与え配列のわずかな違いから生じる特異的なペプチドた。試験飼料は40％豚脂（日清商会），20％ショ

によってもたらされていると考えられている 。

糖を配合した高脂肪・高ショ糖食を調製した。な

このため，鶏むね肉や鶏もも肉においても生じる

お 試 験 飼 料 は ，馴 化 飼 料 の カ ゼ イ ン 配 合 量ペプチドによって，体熱産生能や各種代謝亢進作（20％）とタンパク質含量が等しくなるようにそ用が異なるかもしれない。

れぞれの精製食肉タンパク質を配合した。

３）

２）

そこで本研究では，鶏肉タンパク質の長期摂取

2.3

血液および各種組織の採取が抗肥満効果，脂肪肝抑制作用のような生活習慣

ラットに麻酔し，体重，体長（鼻先から尾付け病改善効果をもたらすかどうかを解明するため根まで），腹囲を測定した後，ただちに血液，肝臓，に，食餌性肥満モデルである高脂肪・高ショ糖食

WAT，BAT，大腿四頭筋を採取した。血液は後を投与し，鶏肉タンパク質の効果について検討し大静脈から採取し，血漿，血清を得た。WATはた。さらに，鶏肉の部位の違いによる効果につい

精巣上体，腸間膜，腎周囲から，BATは肩甲骨ても検討した。

間から採取した。大腿四頭筋は右脚から採取した。肝臓は重量を測定後，使用時まで－80℃で保存した。

© The Ito Foundation

77

食肉タンパク質の抗肥満および脂質代謝促進効果に関する研究（Ⅱ）

2.4

2.7

血液生化学検査

統計処理

血漿中のグルコース濃度（グルコースＣⅡ-テ

測定値は平均値±標準誤差で示した。Excel

ストワコー，和光純薬工業），血清中のトリグリ（Microsoft），Excel用統計アドインソフト（エク

セリド濃度（トリグリセライドＥ-テストワコー，

セル統計2006 for Windows，社会情報サービス）

和光純薬工業），遊離脂肪酸濃度（NEFA C-テス

により，各測定値から得られたデータの一元配置

トワコー，和光純薬工業），コレステロール濃度

分散分析を行い，Tukeyの多重比較検定によって（コレステロールＥ-テストワコー，和光純薬工

有意差検定を行った。等分散性が棄却されたもの

業）を分光光度計またはマイクロプレートリーに つ い て は Kruskal-Wallis 検 定 を 用 い て Steel-

ダーを用いて定量分析した。

Dwassの多重比較により有意差検定を行った。

2.5

p＜0.05をもって統計学的に有意であるとした。

肝臓の脂肪定量

Folch法５）に基づいて行った。
2.6

３．結果と考察

半定量的PCR法

肝臓から抽出した全RNAからReverTra AceⓇ

3 . 1 鶏肉タンパク質の長期摂取が高脂肪・高qPCR RT Kit（TOYOBO）を用いて一本鎖cDNA

ショ糖食摂食ラットの体重および臓器，組を合成し，TACポリメラーゼ（promega）を用

織重量に及ぼす影響

いてPCR Thermal CyclerでPCRを行った。PCR

一日当たりの平均摂食量，解剖前のラットの体産物をアガロースゲルにアプライして電気泳動を重，腹囲，BMI，WAT重量，BAT重量，大腿四行った。画像解析ソフトを用いて，撮影されたバ

頭筋重量，肝臓重量および肝臓脂質重量をTable

ンドをβ-ACTINに対する相対量として算出する

１に示す。摂食量，体重，腹囲，BMIではすべてことで遺伝子の発現量を算出した。

の群間で有意な差は見られなかった。また，脂肪Table 1 Various parameters of animals
CBPx

CLPx

BPx

Cx

Feed intake（g/day）

15.2±0.3

15.0±0.3

15.1±0.4

15.6±0.5

Body weight（BW）（g）
Abdominal circumference（cm）
BMIy

436.2±7.6
20.4±0.3

450.0±11.0
20.8±0.4

446.3±14.9
20.4±0.4

464.1±16.9
21.2±0.5

7.59±0.22

7.62±0.10

7.60±0.127.77±0.21

Organs and tissue weights（g/BW 100g）
Epididymal WAT
2.93±0.19
Mesenteric WAT
2.15±0.11

2.84±0.16
2.27±0.11

2.59±0.27
2.03±0.20

2.88±0.14
2.27±0.10

5.35±0.25
10.4±0.4
0.172±0.006
0.75±0.04
2.56±0.05

5.25±0.21
10.4±0.4
0.167±0.008
0.72±0.02
2.71±0.08

4.91±0.27
9.5±0.7
0.167±0.012
0.73±0.02
2.56±0.03

5.81±0.27
11.0±0.5
0.169±0.007
0.72±0.05
2.95±0.27

0.166±0.012

0.191±0.014

0.159±0.010

0.173±0.006

Perirenal WAT
WAT TotalInterscapular BAT
Quadriceps femoris
Liver
Liver fat content（g/liver 1g）

Values present average±SEM（n＝７）．
x：CBP（Chicken breast protein），CLP（Chicken leg protein），BP（Beef protein），C（Casein）
y：２（BW（㎏））/（Body length（m））© The Ito Foundation

78

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

組織であるWATやBATの重量においてもすべて

リグリセリドおよび遊離脂肪酸，脂質代謝異常のの群間で有意な差は見られなかった。骨格筋であ指標となる総コレステロールを測定した（Table

る大腿四頭筋重量においてもすべての群間で有意２）。グルコース，トリグリセリド，遊離脂肪酸，な差は見られなかった。そして，肝臓重量および総コレステロールについて，すべての群間で有意

肝臓脂質含量についてもすべての群間で有意な差な差は見られなかった。

は見られなかった。

3 . 3 肝臓における脂質代謝関連遺伝子の発現先行研究では脂質に牛脂を用い，本試験では多量くの研究で用いられている豚脂を使用した。ま肝臓における脂質代謝関連遺伝子としてFAS，た，牛脂には共役リノール酸が多く含まれ，共役

CD36，CPT1α，SREBP-1cの相対的発現量をリノール酸は脂肪組織重量を減少させる 。その測定した（Table３）。脂肪酸合成に関与するFAS

ため，飼料中の脂質源を変更したため，抗肥満効について，CBP群とCLP群は，BP群やＣ群と比果や脂肪肝抑制作用が見られなかったのかもしれ

べて有意に低い値を示した。脂肪酸合成を促進すない。また，脂質の割合を増加したことで，ラッる脂質代謝関連転写因子であるSREBP-1cにつトに対する脂質の影響が大きくなったことも考えいて，CBP群とCLP群は，BP群やＣ群と比べてられる。

有意に低い値を示し，BP群はＣ群と比べて有意

６）3 . 2 鶏肉タンパク質が血中の代謝関連成分にに 高 い 値 を 示 し た 。脂 肪 酸 の 輸 送 に 関 与 す る
CD36については，CBP群とCLP群は，BP群と比及ぼす影響
試験期間終了後に採取した血液から，糖代謝のべて有意に低い値を示した。一方，脂肪分解に関指標となるグルコース，脂質代謝の指標となるト

与するCPT1αについては，すべての群間で有意

Table 2 Biochemical blood parameters

Glucose（mg/dL）
Triglyceride（mg/dL）
Free fatty acid（mEq/L）
Total choresterol（mg/mL）

CBP

CLP

BP

Ｃ

127.3±4.2144.8±18.9
0.91±0.06
83.0±11.9

160.0±13.2
153.6±1.8
0.80±0.08
65.5±3.2

156.6±28.4
150.4±17.6
0.82±0.10
82.1±6.2

132.3±16.3
120.4±13.3
0.96±0.16
83.4±7.1

Values present average±SEM（n＝７）．
Group names were shown in Table 1.

Table 3 Relative expression of lipid metabolism-related gene in liver
Gene
Fatty acid synthesis
FAS
SREBP-1cFatty acid uptake
CD36
Fatty acid degradation
CPT1α

CBP

CLP

BP

Ｃ

0.40±0.10ａ
0.53±0.14ａ

0.43±0.07ａ
0.56±0.08ａ

1.78±0.22ｂ
1.51±0.11ｃ

1.00±0.22ｂ
1.00±0.09ｂ

0.33±0.09ａ

0.32±0.05ａ

1.34±0.16ｂ

1.00±0.12ｂ

0.93±0.30

0.81±0.14

1.17±0.19

1.00±0.12

Values present average±SEM（n＝７）．
Group names were shown in Table 1.
ａ，ｂ，ｃ：Numbers within columns with different superscripts significantly differ（p＜0.05）．

© The Ito Foundation

食肉タンパク質の抗肥満および脂質代謝促進効果に関する研究（Ⅱ）

79

うかを解明するため，高脂肪・高ショ糖食をラッな差は見られなかった。
SREBPは複数の核内受容体とクロストークをトに投与し，抗肥満効果や生活習慣病改善効果，

介し，代謝制御を包括的にとり行っている ７）。

鶏肉の部位の違いによる影響について検討した。

SREBP-1の発現はLDL受容体が多く発現してい体重の減少やWAT重量の減少，BAT重量の増加

る肝臓で多い 。鶏むね肉タンパク質や鶏もも肉が確認されず，鶏肉タンパク質の長期摂取によるタ ン パ ク 質 は LDL 受 容 体 に 作 用 す る こ と で抗肥満効果は認められなかった。また，血液生化

SREBP-1cの発現を抑制し，肝臓における脂肪酸

学パラメータや肝臓脂質含量に有意な差が見られ合成を抑制したのかもしれない。鶏肉タンパク質なかったため，生活習慣病改善効果も認められなの長期摂取は肝臓における脂肪酸合成を抑制するかった。一方，鶏むね肉，鶏もも肉タンパク質のことが示唆された。一方，脂肪酸の取込に関与す

長期摂取により肝臓における脂肪酸の合成や取込る遺伝子であるCD36の発現量は，CBP，CLP群に関与する遺伝子の発現が抑制された。そのたで有意に低い値を示したCD36は細胞膜に局在し，め，鶏肉タンパク質の長期摂取では肝臓における長鎖脂肪酸に結合して細胞内への輸送を促進す

SREBP-1cの発現を抑制することで脂肪酸合成

る 。また，ヒト単球細胞における細胞性リン脂を抑制していることが示唆された。しかし，鶏肉質へのEPAやDHAの組み込みはmRNAおよびタの部位の違いによる影響は確認できなかった。

８）９）

ンパク質レベルでCD36発現を抑制し，アラキド
ン酸やリノール酸に組み込みはCD36発現を促進させる傾向がある 。そのため，脂肪酸がCD3610）発現に関与している可能性がある。先行研究では牛脂を，本研究では豚脂を用いたため，摂取した脂質の違いが影響したのかもしれない。脂肪の分解に関与する遺伝子であるCPT1αの発現量はすべての群間で有意な差は見られなかった。
CPT1αはアシルCoAとカルニチンをアシルカル
ニチンに変換する酵素であり，脂肪酸の燃焼を亢
進する 11，12）。CD36と同様に，飼料に用いた脂質の違いが影響した可能性が考えられる。以上より，鶏肉タンパク質の摂取は肝臓での脂肪酸の合成を抑制するが，脂肪の違いや投与期間の短さにより脂肪肝抑制作用が見られなかった可能性が考
えられる。
４．要

約

本研究では，鶏肉タンパク質が高いDIT亢進効
果を示すことから，鶏肉タンパク質の長期摂取が文
献１） Wakamatsu, J., Fujii, R., Yamaguchi, K., Miyoshi,S., Nishimura, T., Hattori, A.：Anim. Sci. J., 84, 416～425, 2013.
２） Ezoe, M., Wakamatsu, J., Takahata, Y., Hasegawa,T., Morimatsu, F., Nishimura, T.：J. Nutr. Sci.
Vitaminol., 62, 93～100, 2016.
３） 岩元久雄：西日本畜産学会報，50，７～13，2007.
４） Mizunoya, W., Wakamatsu, J., Tatsumi, R.,
Ikeuchi, Y.：Anal. Biochem., 377, 111～113, 2008.
５） Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H.：J. Biol.
Chem., 226, 497～509, 1957.
６） Miner, J. L., Cederberg, C. A., Nielsen, M. K.,
Chen, X., Baile, C. A.：Obesity, 9, 129～134, 2001.
７） Brown, M. S., Goldstein, J. L.：Proc. Natl Acad.
Sci. U. S. A., 96, 11041～11048, 1999.
８） Yokoyama, C., Wang, X., Briggs, M. R., Admon, A.,
Wu, J., Hua, X., Goldstein, J. L., Brown, M. S.：Cell,
75, 187～197, 1993.
９） Roy, L.：Int. J. Dev. Biol., 54, 1229～1239, 2009.
10） Pietsch, A., Weber, C., Goretzki, M., Weber, P. C.,
Lorenz, R. L.：Cell Biochem. Func., 13, 211～216, 1995.
11） Ota, N., Soga, S., Murase, T., Shimotoyodome, A.,
Hase, T.：J. Health Sci., 56, 745～751, 2010.
12） Murase, T., Misawa, K., Minegishi, Y., Aoki, M.,
Ominami, H., Suzuki, Y., Shibuya, Y., Hase, T.：Am.
J. Physiol. - Endocrinol. Metab., Doi：10.1152/
ajpendo.00441.2010.2011.

抗肥満効果や生活習慣病改善効果をもたらすかど© The Ito Foundation

80

牛心臓由来新規コレステロール代謝改善ジペプチドの作用機構解明および革新的コレステロール代謝改善
素材開発のための基礎研究
Elucidation of mechanism of the novel hypocholesterolemic dipeptide
drived from cattle heart peptide and basic study of development of an
innovative hypocholesterolemic food materials

長

岡

利

（岐阜大学応用生物科学部）

Satoshi Nagaoka（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

Only a few reports have dealt with the effects of animal protein and animal proteinhydrolysate on cholesterol metabolism. The cattle heart protein hydrolysate ultra-filtrate（HPHU, MW < ca. 1,000 Da peptides fraction） derived from HPH imparts a stronger
hypocholesterolemic activity than HPH in rats. After purification of HPHU by a reverse phase
chromatography and gel filtration chromatography, we try to identify the active
hypocholesterolic peptide derived from HPHU using in vitro assay related to micellar solubilityof cholesterol in vitro. Finally, we identified for the first time the hypocholesterolemic dipeptide,
XY derived from HPHU in rats. XY exhibited a hypocholesterolemic action in rats fed a highcholesterol diet. Oral administration of XY induced a significant increase in HDL-cholesterollevel in rats.
The mRNA level of hepatic cholesterol metabolism related genes, such as HMG-CoA
reductase, cholesterol 7α-hydroxylase, LDL receptor, ABCA1, apolipoprotein A-I, SREBP-2
was unchanged by dietary XY feeding. While, the mRNA level of intestinal ABCA1 related tocholesterol absorption was significantly decreased by XY feeding in rats. Thus, ahypocholesterolemic action of XY was induced by an inhibition of intestinal cholesterol
absorption related to the down regulation of ABCA1 in rats.

作用は動物性素材にも見られることが明らかにさ的１．目れている。実際に，私は，牛乳の乳清タンパク質

一般に，大豆タンパク質などの植物性タンパク

が，動物性タンパク質でありながら大豆タンパク

質は，カゼインなどの動物性タンパク質と比較し質よりも，強力な血清コレステロール低下作用を１）て，抗動脈硬化作用を有すると考えられている 。

発現することを発見し検討している２，３）。また，

しかし，現在活発に行われている有効成分の検討

主要な食糧資源でありながら，従来ほとんど検討によりがなされていない畜産食品素材のうち，牛肉ペプ，このような血清コレステロール低下

２～10）© The Ito Foundation

牛心臓由来新規コレステロール代謝改善ジペプチドの作用機構解明および革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究

チド，牛レバーペプチドが体内コレステロール低下作用を有することも見出した 。さらに，昨年

81

に対する影響を解析した。

６）度の研究で，動物性食餌タンパク質である牛肉に

２．方法，結果，考察

再度着目し，畜産資源の高度有効利用という観点

牛心臓由来ペプチド分画物であるHRHUgf3-から，廃棄部位を含めた各部位である牛肉，牛心RPIB2からジペプチドXY（アミノ酸配列は特許

臓，牛赤血球，牛血漿加水分解物を用いた研究をの関係で非公表）を同定したので，ジペプチド行った結果，特に牛心臓加水分解物（HPH）がXYについて，高コレステロール血症ラットにお強力なコレステロール代謝改善作用を発現するこいて，脂質代謝に対する影響を評価した。高コレとを発見した 。

ステロール食の食餌組成は既報11）に従って調製し

７）

我々の既報８，９）の研究手法を用いて，牛心臓タた。実験群は以下である。

ンパク質加水分解物（HPH）のコレステロール（１） 対照群：高脂肪高コレステロール食（HFC）

低下作用機構を明らかにした。コレステロールミ（２） XY群：ジペチドXY投与群（HFCXY）

セル溶解性はカゼインよりもHPHで有意に低下

Wistar系雄ラット４週齢を実験に使用した。ジ

した。Caco-２細胞のコレステロール吸収抑制はペプチドXYは14日間ゾンデによって経口投与しカ ゼ イ ン ミ セ ル よ り も HPH ミ セ ル で 有 意 に 高た。解剖前８時間絶食後に解剖し，血液を採取し，かった。血清コレステロールはカゼインよりも遠心分離により血漿を得て，マイナス80度で保管

HPHで有意に低かった。放射性コレステロールした。また，既報の方法に従い，肝臓や腸からで測定したコレステロール吸収はカゼインと比べRNAを回収し，肝臓や腸のコレステロール代謝てHPHで有意に減少し，HPHのコレステロール

関連遺伝子mRNAレベルを解析した12）。なお，実低下作用は空腸のコレステロール吸収阻害による

験結果の統計的分析には，Students’t-testを用いものである。HPH由来の牛心臓タンパク質加水た。

分解物の限外濾過物（HPHU，分子量約1000ダル

実験の結果（Table１）から，体重増加量，食トン以下のペプチド分画物）は，ラットにおいて

餌摂取量，肝臓重量には，群間で有意な変化は認HPHよりも強力なコレステロール低下作用を示められなかった。血清コレステロールは対照群

10）

すことを発見し報告した 。

（HFC）と比較して，XY投与群（HFCXY）で有ペプチド混合物であるHPHUのコレステロール

意に低下した。血清トリグリセリドは，対照群

代謝改善作用に寄与する活性ペプチドを特定する（HFC）と比較して，XY投与群（HFCXY）で低ために，HPHU由来ペプチドの分画精製を実施し，下傾向を示した。また，肝臓コレステロールレベ

分画物を用いてin vitroのコレステロールミセル

ル も 対 照 群（HFC）と 比 較 し て ，XY 投 与 群

溶解性試験を行った 。活性ペプチド候補の活性（HFCXY）で有意に低下した。そこで，今回はをラットによる動物実験で評価した結果，世界初

XYの血清コレステロール低下作用のさらなる機のコレステロール代謝改善ジペプチド（XY：ア

構解明のために，肝臓（Fig. 1A）や腸（Fig. 1B）

ミノ酸配列は特許の関係で非公表）を発見した。

の脂質代謝関連遺伝子mRNAについて分析した。

そこで，ジペプチドXYの血清コレステロール低

その結果，XY投与により，血清・肝臓コレステ

下作用機構を解明するために，肝臓や腸におけるロール低下時には，腸ABCA1のmRNAレベルがコレステロール代謝関連遺伝子のmRNAレベル

有意に低下したが，コレステロール輸送担体であ11）© The Ito Foundation

82

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 The effects of dietary XY on metabolic parameters in rats fed a high fat-cholesterol diet.
HFC

HFCXY

Body weight gain（g/14d）58.0±1.960.2±3.4

Food Intake（g/d）

9.6±0.1

9.9±0.4

Liver weight（g/100g body weight）

5.9±0.2

6.0±0.1

Total Cholesterol（a）

245.4±14.1

165.9±2.0＊＊＊

Triglyceride358.7±75.3

179.1±20.9

HDL-Cholesterol（b）

59.1±3.277.4±2.4＊＊

LDL＋VLDL-Cholesterol

186.2±16.0

106.8±3.9＊＊

3.2±0.4

1.4±0.1＊＊

Total Lipids
Cholesterol259.6±8.6
37.4±1.8

235.8±5.2＊
24.2±0.7＊

Triglyceride

96.9±5.599.6±5.1

Serum（mg/dl）

Atherogenic index（a）/（b）Liver（mg/g liver）

１．Values are means±SEM, n＝５．Asterisks indicate different from Control group（＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001）．
２．Values were calculated as follows：LDL＋VLDL cholesterol＝Total cholesterol-HDL cholesterol．

（Ｂ）

250

HFC

HFC

200

HFCXY

HFCXY

150

150

1

0
C
AB

1L

I
oA
Ap

A1
C

P2

AB

EB

C

R

SR

G
M
H

7A
YP

C

LD

LR

1

0

＊

50

PC

50

100

N

100

A1

％ of Control％ of Control（Ａ）

Fig. 1るNPCL1のmRNAレベルは変化しなかった。一方 ，肝 臓 の コ レ ス テ ロ ー ル 生 合 成 の 律 速 酵 素

３．要約

HMG-CoA 還 元 酵 素（HMGCR）や ，コ レ ス テ

私たちはHPH由来の牛心臓タンパク質加水分

ロール分解系の律速酵素であるコレステロール７

解物の限外濾過物（HPHU，分子量約1000ダルト

α-水酸化酵素（CYP7A1），LDL受容体（LDLR），

ン以下のペプチド分画物）は，ラットにおいて

ABCA1 ，SREBP-2 ，ア ポ リ ポ タ ン パ ク 質 A-I

HPHよりも強力なコレステロール低下作用を示（ApoAI），mRNAレベルは有意な変化は観察さすことを発見し報告した。そこで，ペプチド混合

れなかった。XYは腸ABCA1発現低下を介するコ物であるHPHUのコレステロール代謝改善作用にレステロールの腸管での吸収抑制作用により，コ寄与する活性ペプチドを特定するために，HPHU

レステロール代謝改善作用を発揮することを明ら

由来ペプチドの分画精製を逆相クロマトグラ

かにした。

フィーやゲル濾過クロマトグラフィーにより実施© The Ito Foundation

牛心臓由来新規コレステロール代謝改善ジペプチドの作用機構解明および革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究

し，分画物について，in vitroのコレステロール
ミセル溶解性試験を行った。in vitroコレステロー
ルミセル溶解性の低下作用を発揮する活性ペプチ
ド混合物を質量分析した結果，数種の候補ペプチドが含まれることを明らかにした。そのうちの活性候補ペプチドをラットによる動物実験で評価した結果，世界初のコレステロール代謝改善ジペプ
チド（XY：アミノ酸配列は特許の関係で非公表）を発見した。そこで，今回はXYの血清コレ
ステロール低下作用を解明するために，肝臓や腸のコレステロール代謝関連遺伝子mRNAについて分析した。その結果，XY投与により，血清・
肝臓コレステロール低下時には，腸ABCA1の
mRNAレベルが有意に低下し，肝臓のコレステ
ロール生合成の律速酵素HMG-CoA還元酵素，コレステロール分解系の律速酵素であるコレステ
ロール７α-水酸化酵素（CYP7A1）やLDL受容体mRNAレベルは有意な変化は観察されなかった。XYは腸ABCA1発現低下を介するコレステ

83

文献１） Carroll, K. K., Hamilton, R. M. G.：J. Food Sci., 40,
18, 1975.
２） Nagaoka, S., Kanamaru. Y., Kuzuya, Y., Kojima, T.,
Kuwata, T.：Biosci. Biotch. Biochem., 56, 1484, 1992.
３） 長岡利：日本栄養・食糧学会誌，49，303，1996.
４） Iwami, K., Sakakibara, K., Ibuki, F.：Agric. Biol.
Chem., 50, 1217, 1986.
５） Sugano, M., Goto, S., Yamada, Y., Yosida, K.,
Hashimoto, Y., Matsuo, T., Kimoto, M.：J. Nutr., 120,
977, 1990.
６） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書，336，1998.
７） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書，378，1999.
８） Nagaoka, S., Miyazaki, H., Oda, H., Aoyama, Y.,
Yoshida, A.：J. Nutr., 120, 1134, 1990.
９） Nagaoka, S., Miwa, K., Eto, M., Kuzuya, Y., Hori, G.,
Yamamoto, K.：J. Nutr., 129, 1725, 1999.
10） Nakade, K., Kaneko, H., Oka, T., Ahhmed, A. M.,
Muguruma, M., Numata, M., Nagaoka, S.：Biosci.
Biotechnol. Biochem., 73, 607, 2009.
11） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書，91，2015.
12） Kashima, Y., Kanematsu, S., Asai, S., Kusada, M.,
Watanabe, S., Kawashima, T., Nakamura, T.,
Shimada, M., Goto, T., Nagaoka, S.：PLOS ONE, 9,e105073, 2014.

ロールの腸管での吸収抑制作用により，コレステ
ロール代謝改善作用を発揮することを明らかにした。

© The Ito Foundation

84

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した
筋原線維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究（Ⅱ）
Retort processing and cold lactic acid fermentation induce protein
degradation and functional peptides derivation in myofibrillar protein
system（Ⅱ）

林

利哉・長澤

麻央・小川

幸彦＊・芳賀聖一（名城大学農学部，*名城大学農学部附属農場）

Toshiya Hayashi, Mao Nagasawa, Yukihiko Ogawa＊ and Seiichi Haga
（Faculty of Agriculture, Meijo University，＊Experimental Farm, Meijo University）

The proteolysis and expression of the inhibitory activities against angiotensin I-converting
enzyme and dipeptidyl peptidase IV by chilled lactic acid fermentation and retort-processing
were investigated using myofibrillar protein as the simple model system of meat product. The
contents of free amino acid and peptide significantly increased by retort processing（140℃）or
cold fermentation compared to that of control（70℃-heated）. Therefore, it was suggested that
retort-processing and chilled fermentation lead to decomposition of the myofibrillar proteins.
Furthermore, inhibitory activities on angiotensin I-converting enzyme and dipeptidyl peptidase
IV were significantly higher in fermented myofibrillar protein than that in control. On theother hand, although the inhibitory activities on angiotensin I-converting enzyme anddipeptidyl peptidase IV of retort-processed samples including 140℃-heated were slightly
higher than those of control（70℃-heated）, there were not significant differences in that
activity between retorted and control one. These results suggest that these food processing
treatments, in particular, lactic acid fermentation at cold temperatures can improve the foodfunctionality of cured meat products.

１．目

維の脆弱化やタンパク質の分解等も顕著にみられ的ることを明らにしている１）。また，120℃以上の著者らは，食肉製品の高付加価値化を念頭に，高温加熱であるレトルト加熱によっても著しい物

低温性乳酸菌による低温発酵やレトルト加熱処理性低下が起こるとともにタンパク質の分解もみらといった食品加工技術が食肉製品の品質に及ぼすれ，その結果として遊離アミノ酸やペプチドが派影響について種々検討してきた。その結果，

生することも併せて見出している４，５）。このよう

低温乳酸発酵をモデルソーセージの塩漬工程に導な低温乳酸発酵や高温加熱に伴う筋原線維タンパ入することにより，その物性や微細構造が，非発ク質の分解は，良好な結着を伴う食肉製品の好ま

酵の対照区と比較して大きく変化し，かつ筋原線

しい食感の発現において，負の影響をもたらすも１～３）© The Ito Foundation

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究（Ⅱ）

85のと考えられるが，その一方で生体調節機能の付試料とした。終濃度を15mg/mlに調整した筋原

与という観点においては，場合によっては機能性

線維タンパク質溶液を，レトルト殺菌釜（花木製を有する低分子ペプチドが派生するという付加価

作所，HC-VA型）を用いて，140℃で15分間加熱

値をもたらす可能性も十分考えられる。したがっしたものをハイレトルト加熱区とした。また，同て，低温乳酸発酵やレトルト加熱に伴うタンパク

じ筋原線維タンパク質溶液にグルコースが２％

質分解挙動の詳細を明らかにし，かつ機能性発現（w/v）となるように添加し，さらに乳酸菌スターの有無を評価することは，食肉・食肉製品の機能

タ ー， Lactobacillus sakei No.7 と No.9 （L. sakei改善を図るうえできわめて意義深いといえる。既No.7，No.9）を筋原線維タンパク質溶液１mlあた

報において，筋原線維タンパク質に，Lactobacillus

り10６個レベルとなるように接種し，４℃の低温

sakei No.4を用いた低温乳酸発酵や，120，130℃下で静置したものを発酵区とした。発酵期間中，のレトルト加熱処理を施すことによって，筋原線

１～２時間ごとにpHを測定し，乳酸菌を接種し維タンパク質の分解が昂進することや，そのタンた筋原線維タンパク質溶液のpHが5.3付近に達す

パク質分解に伴い，血圧上昇の鍵酵素であるアンるまで発酵処理を行った後，70℃で30分間，加熱

ジオテンシンⅠ変換酵素（ACE）の阻害活性が処理を施した。単に70℃で30分間加熱したもの

上昇する傾向にあることを報告した６）。

を，レトルト加熱と発酵試験共通の対照区としそこで本研究では，既報と同様に，食肉の主要た。いずれの試料も，加熱後速やかに氷冷した。

タンパク質である筋原線維タンパク質を単純モデ

各加熱試料を遠心分離（35,000ｇ，15分，４℃）

ル系として用いて，既報とは異なる低温性乳酸菌

し ，得 ら れ た 上 澄 み を 蒸 留 水 に 対 し て 透 析

株を用いた低温発酵やハイレトルト加熱に相当す（Spectra/por CE, M.W.：500）した後，凍結乾燥

る高温レトルト加熱（140℃）を施した筋原線維したものを最終試料とした。

タンパク質におけるペプチド・遊離アミノ酸の量2.2

的変化を調べ，かつ血圧上昇抑制作用のin vitro

上記凍結乾燥試料を蒸留水で溶解させ，等量の指標であるACE，ならびに血糖値上昇抑制剤の４％トリクロロ酢酸（TCA）を加えることによ

標的酵素でもあるジペプチジル・ペプチダーゼⅣ

り２％TCA可溶性画分を調製し，三上ら９）の方（DPPⅣ）の阻害活性を評価することで，単純モ法に準じてペプチド量を，ニンヒドリン法10）に準

デル系におけるタンパク質分解と機能性発現の有じて遊離アミノ酸量を測定した。

無について検討を行った。

2 . 3 ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）

２．実験材料と方法
2.1

上記の遠心上澄み画分のタンパク質分布を

試料調製

SDS-PAGE11）（アクリルアミド濃度：7.5～20％）

できる限り脂肪と結合組織を取り除いた新鮮な
豚ロース肉から，一部改変したPerry and Grey ，７）

Etlinger８）

ペプチド・遊離アミノ酸量の測定

らの方法に準じて筋原線維を調製し，により調べた。ゲルの染色はCoomassie Brelliant
Blue R-250により行った。
2.4

ACEならびにDPPⅣ阻害活性

最 終 的 に 0.6M-NaCl ・ 50mM リ ン 酸 緩 衝 液

ACE阻害活性は，ACE（シグマ）と合成基質（pH6.0）に対して透析，遠心分離（35,000×ｇ，

Hip-His-Leu （ペ プ チ ド 研 究 所） を 用 い ，

15分，４℃）して得られた上澄み画分を筋原線維

CushmanとCheungの方法12）に準じて測定した。

© The Ito Foundation

86

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

すなわちACEと基質が反応した結果，遊離するとにより，ペプチド（Fig. 1A），遊離アミノ酸量

馬 尿 酸 を 酢 酸 エ チ ル で 抽 出 し ，そ の 吸 光 度（Fig. 1B）のいずれも，対照区である70℃加熱区（228nm）を測定する方法である。DPPⅣ阻害活と比較して有意に高い値を示し，特にペプチド量性は，DPPⅣ（シグマアルドリッチ）と基質

においてそれが顕著であった。一方の当研究室でGly-Pro-NA・p-tosylate（ペプチド研究所）を

保 有 す る 低 温 性 乳 酸 菌 で あ る L. sakei No. ７ と用い，Ikeharaらの方法を一部改変して測定しNo.９を接種した発酵区では，ペプチド量，遊離た。すなわち，DPPⅣと基質が反応した結果，遊アミノ酸量のいずれも対照区と比較して，顕著か離するp-NA量を分光光度計（波長：385nm）でつ有意に高い値を示した（Fig. 2A，B）。SDS-

測定する方法である。いずれの活性測定において

PAGEによってタンパク質の分布を確認したとこ

も，試料タンパク質濃度が0.5～5.0mg/mLの範囲

ろ，前報６）で示した120，130℃加熱区と同様，対で阻害活性を求め，両酵素活性を50％阻害するの照区ではで明瞭にみられた分子量３万前後のバンに必要な試料タンパク質濃度（mg/mL）を算出

ドが，140℃の加熱によって減少し，分子量２万した（IC50値）。

より下の領域のバンドの染色強度が強くなる様子

13）がみられた（Data not shown）。一方の発酵区に３．結果と考察おいても，対照区でみられた明瞭なバンドはほぼ

3 . 1 低温発酵ならびにハイレトルト加熱処理

消失した（Data not shown）。これは，pH低下にが筋原線維タンパク質の分解に及ぼす影響

よる筋原線維タンパク質の酸変性・沈殿と，添加筋収縮の本体であり，筋肉・食肉の主要タンパ

乳酸菌の働きによるタンパク質の分解に起因するク質である筋原線維タンパク質をモデル系に用いものと推察される。

て，低温乳酸発酵やハイレトルト加熱がタンパク

3 . 2 低温発酵ならびにハイレトルト加熱処理

質分解に及ぼす影響について，ペプチドと遊離アを施した筋原線維タンパク質のACEとDPP

ミノ酸量を調べることにより検討した。

Ⅳ阻害活性

その結果，140℃のハイレトルト加熱を施すこ

180

（A）
b

150
120
90
60

a

30
0

control（70℃）

retorted（140℃）

Free amino acid content（mg/g protein）

Peptide content（mg/g protein）

200

ハイレトルト加熱（140℃）を施した筋原線維

0.6

（B）

0.5

b

0.4
0.3

a

0.2
0.1
0

control（70℃）

retorted（140℃）

Fig. 1 Effect of high-retort processing on the peptide（A）and free amino acid contents（B）of the myofibrillar protein．
Data represent the means ± SD of at least three independent experiments. Values with different superscript letters are

significantly different（p<0.05）．

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87

Peptide content（mg/g protein）

140
120

（A）

b

b

100
80

a

60
40
20
0

control（70℃）

fermented
fermented（L.sakei No.7）（L.sakei No.9）

Free amino acid content（mg/g protein）

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究（Ⅱ）
0.6
0.5

（B）
c
b

0.4
0.3
0.2

a

0.1
0

control（70℃）

fermented
fermented（L.sakei No.7）（L.sakei No.9）

Fig. 2 Effect of chiled lactic acid fermentation on the peptide（A）and free amino acid contents（B）of the myofibrillar

protein．

Data represent the means ± SD of at least three independent experiments. Values with different superscript letters are

significantly different（p<0.05）．
0.25
a

4

0.15
c

0.1

b

0.05
0

IC50
（mg/ml）

IC50（mg/ml）

0.2

5
a

3

a

2

b

1
control（70℃）

fermented
fermented（L.sakei No.7）（L.sakei No.9）0control（70℃）

fermented
fermented（L.sakei No.7）（L.sakei No.9）

Fig. 3 Effect of water-soluble fractions from fermented

Fig. 4 Effect of water-soluble fractions from fermented

タンパク質におけるACE阻害活性の発現の有無

接種区も対照区と比較して有意に低いIC50 を示

について検討したところ，既報

における120，

し，低温乳酸発酵によって，ACE阻害活性が上

130℃加熱区と同様，有意な活性上昇は認められ昇することが確認された（Fig.３）。また，DPPず，この傾向は，高血糖治療薬の標的酵素の一つ

Ⅳ阻害活性についても同様に検討したところ，いであるDPPⅣに対しても同様であった（Data not

ずれの菌株接種区においても有意なIC50の低下がshown）。

みられ，特にL. Sakei No.９接種区においてそれ

myofibrillar protein on the ACE-inhibitory activity.
Data represent the means ± SD of at least five independent
experiments. Values with different superscript letters are
significantly different（p<0.05）．

６）

myofibrillar protein on the DPPⅣ-inhibitory
activity．
Data represent the means±SD of at least five independent
experiments. Values with different superscript letters are
significantly different（p<0.05）．

一方，低温性乳酸菌L. Sakei No.７とNo.９を接が顕著であった（Fig.４）。先述したように，い種した発酵区のACE阻害活性は，いずれの菌株

ずれの場合もペプチド量の増加がみられたことか© The Ito Foundation

88

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ら，これらの活性因子がペプチド体であると仮定

酸発酵処理によって筋原線維タンパク質は分解した場合，系中に含まれる活性総量も大幅に増えし，その結果生じた低分子ペプチド群に機能性をているものと推察される14）。

有する因子が存在する可能性が示唆された。特今後は，活性因子の特定を急ぐとともに，他のよって，ACE，DPPⅣの両阻害活性が顕著に上

機能性指標についても検討を加えたい。
本研究の成果は，公益財団法人に，低温性乳酸菌によって低温発酵することに

伊藤記念財団昇することが確認された。

の支援によって得られたものであり，ここに深く感謝申し上げます。また，名城大学農学部食品機能学研究室の学生・院生諸氏に深謝申し上げます。
４．要

約

豚肉由来の筋原線維タンパク質を単純モデル系
として用いて，140℃のハイレトルト加熱，あるいは低温性乳酸菌を用いた低温発酵処理を施すことによる筋原線維タンパク質のタンパク質分解と機能性発現の有無について検討を行った。
筋原線維タンパク質に140℃の加熱処理を施すことによって，遊離アミノ酸ならびにペプチド量の有意な増加が確認され，超高温加熱によって，筋原線維タンパク質の分解が生じることが示唆された。また，低温発酵処理によっても同様にペプ
チド量・遊離アミノ酸量の増加がみられた。
血圧上昇および血糖値上昇抑制作用のin vitro指標であるACE阻害活性およびDPPⅣ阻害活性については，発酵区では有意かつ顕著な活性の上昇がみられたが，レトルト加熱区ではその差はわずかであった。
以上のことより，レトルト加熱ならびに低温乳文献１） 芳賀聖一，林利哉，大場正春，坂田亮一：名城大
学総合研究所 総合学術研究論文集，８，91～96，
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Int. Cong. Meat Sci. Technol., 56, E60, 2010.
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Toyoda, N., Haga, S.：Int. Cong. Meat Sci. Technol.,
57, P395, 2011.
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畜産学会報，66，630～638，1994.
10） 日本化学会編：実験化学講座23，「生物化学Ｉ」，
丸善，東京，pp.124～130，1964.
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14） 伊部さちえ，吉田恵子，熊田薫：日本食品科学工学会誌，53，189～192，2006.

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89

肥満に伴うサルコペニア発症予防に対するカルノシン
摂取の有用性（Ⅱ）
Efficacy of carnosine intake on the prevention of sarcopenia related withobesity（Ⅱ）

後藤

孔郎・正木

孝幸・柴田

洋孝

（大分大学医学部内分泌代謝・膠原病・腎臓内科学講座）

Koro Gotoh, Takayuki Masaki and Hirotaka Shibata（Department of Endocrinology, Metabolism, Rheumatology, and Nephrology, Faculty of Medicine, Oita University）

Obesity induces systemic low-grade chronic inflammation. Obesity-induced sarcopenia is
deeply related with obesity-induced insulin resistance, expression of inflammatory cytokines
and oxidative stress although the mechanism is uncertain. It is well-known that carnosine
included a lot in pork has action of anti-oxidant stress. The aim of this study is to clarify thatthe intake of carnosine improves obesity-induced sarcopenia. Male rats were divided into fourgroups and kept for 2 months as follows, standard diet（Standard；20％ fat）
-fed group, highfat diet（HF；60％ fat）-fed group, Standard-fed plus carnosine（250 mg/kg body weight）

group, and HF-fed plus carnosine group for 2 months. We evaluated 1） plasma
lipopolysaccharide（LPS）levels, 2）TNF-α expression in small intestine, 3）IL-6, irisin, andBDNF expressions as myokines in muscle. Carnosine treatment inhibited HF-induced elevationof TNF-α expression in small intestine and plasma LPS concentration. Moreover, carnosine
also reversed HF-induced decrease of BDNF and IL-6 but not irisin expression in muscle. In
addition, HF-induced atrophy of muscle fibers were ameliorated by carnosine intake. Thus, it
is suggested that carnosine intake might be effective to prevent the development of obesityinduced sarcopenia.

１．目

イオカインであるIL-15の発現が低下しているこ的とが明らかになっている。その原因の１つに骨格

加齢性筋肉減弱症（サルコペニア）は，寝たき筋内に浸潤した炎症性細胞由来のサイトカインがりや要介護状態につながる転倒の原因として，そ関与していると推測されている。肥満患者およびの成因解明や予防法の確立が注目されている。まそれに関連したサルコペニア患者の増加は世界的た，肥満・糖尿病などの代謝異常では，加齢ととな問題となっている。肥満は全身性炎症性疾患ともに転倒頻度が増加することが指摘されている。

位置付けられており，筋肉にも炎症性変化がみら

今回申請者は，骨格筋から産生されるサイトカイれるとされている。サルコペニアには，動物性タンであるマイオカインに着目する。例えば肥満モ

ンパク質の摂取が推奨されているが，どの成分がデル動物において，筋繊維の肥大化をもたらすマ

有効かについては不明な点が多い。

© The Ito Foundation

90

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

最近，豚肉や鶏肉に含まれる“カルノシン”は＋カルノシン（CNT＋Carnosine）添加群，高脂脳神経細胞を保護し，認知症発症を予防する効果

肪食＋コントロール（HF）群，高脂肪食＋カルがあることが知られている。その他，カルノシン

ノシン添加（HF＋Carnosine）群の４群を作成

は抗酸化作用や疲労回復作用を有することも明ら

し，２ヶ月飼育する。その後，採血および骨格筋

かになっている。実際ラットの実験において，カとして大腿筋，下部小腸を摘出する。以下のようルノシンは脳重量減少の抑制効果があることが明な評価項目について検討する。

らかになり，これにはカルノシンの強い抗酸化作ａ）末梢血のLPS濃度を測定する。

用が関連していることが示唆されている。これまｂ）小腸内での炎症性変化を評価するため，小腸で，カルノシン摂取とサルコぺニアとの関連につ内の炎症性サイトカインであるTNF-α発現をいての研究はあまり散見されない。申請者は，カ評価する。

ルノシン摂取は肥満に伴う骨格筋での炎症性変化ｃ）マイオカインであるIL-6，irisin，脳由来神や異所性脂肪沈着を抑制させることを明らかにし

経栄養因子（BDNF）の骨格筋内での発現を評ている。このように，肥満による全身性炎症性病

価する。

変には，腸管内での炎症性変化による腸粘膜バリｄ） 骨 格 筋 の う ち ，速 筋 に 特 異 的 に 発 現 す る

ア構造の破綻により腸管から放出される炎症惹起

SERCA１抗体を用いて，速筋繊維の萎縮度を物 質 で あ る lipopolysaccharide（LPS）が 大 き く

免疫組織学的に評価する。

関与しており，このLPSが骨格筋に作用すること
で炎症性変化をもたらすといった可能性が示唆さ

３．結果と考察

れている１）。本研究では「豚肉や鶏肉摂取が，腸3 . 1 高脂肪負荷に伴う小腸内の炎症性変化お管内炎症性変化を抑制することによって腸粘膜かよび末梢血LPS濃度に対するカルノシンのらのLPS放出を減少させ，骨格筋からのマイオカ

効果

イン発現を高め，骨格筋へのオートクライン的な

高脂肪負荷によって小腸内での炎症性サイトカ

メカニズムによって筋肉そのものを改善させ，サインであるTNF-α発現が亢進した。それらの変

ルコペニア発症予防に有用である」という作業仮化はカルノシンを経口投与により抑制された説を立証することを目的としている。これが証明（Fig.１）。また，末梢血のLPS濃度について検討されれば，カルノシンを多く含む豚肉や鶏肉の摂したところ，高脂肪負荷による末梢血LPS濃度の取が，速筋増加作用をもたらすことでサルコぺニ

増加が，カルノシン摂取によって有意に抑制されア発症予防に有用であることが示唆される。

た（Fig.２）。

２．方

3 . 2 高脂肪負荷に伴う骨格筋内マイオカイン法

発現および速筋繊維の変化に対するカルノ

雄ラットに通常食（CNT；餌中の20％が脂肪

シンの効果成分）または高脂肪食（HF；餌中の60％が脂肪

高脂肪負荷によって骨格筋でのTNF-α発現が成分）を摂取させ，通常食群と高脂肪食群に分け増加するが，その増加はカルノシンの経口投与にる。さらに，各群をカルノシン添加群（250mg/より抑制された（Fig.３）。また，BDNFについてkg体重）とコントロール群に分ける。したがっは高脂肪食によって低下したが，その変化もカルて，通常食＋コントロール（CNT）群，通常食ノシン投与により抑制された（Fig.４）。一方，© The Ito Foundation

91

肥満に伴うサルコペニア発症予防に対するカルノシン摂取の有用性（Ⅱ）

irisinについては各群間で有意な変化がみられな

チドでβアラニン・ヒスチジンであり，特に豚やかった（Fig.５）。また，骨格筋でのBDNF発現と牛の筋肉中に高濃度に存在する。これらは，ヒス

血中LPS濃度には負の相関が認められた（Fig.

チジンの構成要素であるイミダゾールからイミダ

６）。さらに速筋繊維については，高脂肪食負荷

ゾールぺプチドと呼ばれ，内因性抗酸化物質としによって速筋繊維が萎縮したが，その変化はカルての役割を果たしている２，３）。カルノシンを摂取

ノシン投与により改善した（Fig.７）。またIL-６したラットでは筋肉中のカルノシン含有量が装荷の骨格筋内発現については，高脂肪負荷によってするとともに筋肉脂質の過酸化やタンパクの酸化増加したが，カルノシン投与によって抑制されたが抑制されることが知られている。

（Fig.８）。

内臓肥満はインスリン抵抗性を基盤としたメタ200（pg/g tissue）

150

＊

100
50
0

CNT

CNT+
Carnosine

ボリック症候群の基盤となる状態である。サルコ

Plasma LPS levels

TNF-α levels in small intestine

カルノシンはβアラニンとヒスチジンのジペプ

HF

1（EU/ml）

0.8

＊

0.6
0.4
0.2
0

HF+
Carnosine

CNT

CNT+
carnosine

HF

p<0.05 vs. CNT

p<0.05 vs. CNT＊＊

Fig. 2100（pg/g tissue）

80

＊

60
40
20
0

CNT

CNT+
Carnosine

HF

HF+
Carnosine

8

Irisin levels in muscle

TNF-α levels in muscle

Fig. 1（ng/g tissue）

6
4
2
0

CNT

p<0.05 vs. CNT＊

CNT+
Carnosine

HF

HF+
CarnosineFig. 4500
400（pg/g tissue）

300
200

＊

100
0

CNT

CNT+
Carnosine

HF

HF+
Carnosine＊

BDNF levels in muscle

BDNF levels in muscle

Fig. 3Fig. 5

HF+
carnosine

600 （pg/g tissue）

R² = 0.4146

400
200
0

0

0.2

0.4

0.6

Plasma LPS levels

p<0.05 vs. CNT
Fig. 6© The Ito Foundation

0.8

1（EU/ml）

92

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

CNT

HF

CNT +
Carnosine

HF +CarnosineFig. 7

IL-6 levels in muscle

1200（pg/g tissue）

＊

1000
800
600
400
200
0

CNT

CNT+
Carnosine

HF

HF+
Carnosinep<0.05 vs. CNT＊

Fig. 8ペニアと肥満の合併を表す肥満サルコペニアは単進する４）。本研究では，抗酸化作用を有するカルなる病態の組合せではなく，代謝異常や機能障害

ノシンが肥満サルコペニアの状態を改善したことがより強く認められる 。また，肥満は全身の軽を考慮すると，カルノシンの摂取は肥満サルコペ度慢性炎症性疾患とされており，事実，脂肪組織ニアの発症予防に有効である可能性が示唆される。

ではTNF-α，IL-１βなどの炎症性サイトカイ

肥満サルコペニアは，高齢者の身体機能の低下

ンが生成され，筋萎縮やサルコペニアの進行につや代謝疾患と関連し，心血管疾患，死亡リスクをながると推測されている 。このようなインスリ

高めるため，その治療法の確立が求められていン抵抗性や炎症とサルコペニアを結びつける機序る６，７）。サルコペニアに対しては，レジスタンス

として，酸化ストレスが考えられている４）。酸化運動とタンパク質の補給の併用が除脂肪量を増加

ストレスによりミトコンドリアや核内DNAが障

させ，筋力低下を改善することがメタ解析により害され，この蓄積がアポトーシスを刺激し，筋繊報告されており，ビタミンＤやタンパク同化ホル

維の萎縮や筋細胞の喪失をきたすと考えられていモンであるテストステロン・インスリン・成長ホる。加齢も肥満も独立して酸化ストレスを惹起す

ルモンの補充も効果が期待されている８）。しかしるが，組み合わされることによりさらに障害が促ながら，肥満サルコペニアに対する有用性は不明

４）５）© The Ito Foundation

肥満に伴うサルコペニア発症予防に対するカルノシン摂取の有用性（Ⅱ）

93である。さらに，インスリン抵抗性改善薬の効果であるかは不明であった。以上より本研究では，が期待されるが，肥満サルコペニアに対するエビ「豚肉の摂取は肥満サルコペニアの進行予防効果

デンスは乏しいとされている。骨格筋は運動器とをもたらす」ことを証明することを目的とした。

しての働きだけでなく，生理活性を持つ数多くのカルノシン摂取は，肥満による小腸内での炎症変ホルモン様活性物質（マイオカイン）を分泌する化および腸管から全身へと放出するLPSを抑制さ

内分泌器官でもある。IL-６の意義については，せることで，骨格筋内での炎症性変化を抑制さIL-６はマイオカインである一方，炎症性サイト

せ，マイオカイン発現が亢進し速筋繊維の萎縮もカインでもある。今回の研究において，高脂肪負改善させた。以上より，カルノシンを多くする豚荷で萎縮した速筋繊維とともにIL-６発現が増加

肉の摂取は，肥満サルコペニアの発症もしくは進していた。肥満サルコペニアにおいては，IL-６

展予防に有効であることが示唆される。

は炎症性サイトカインとしての役割が大きいことが推測された。
本研究により，腸管から全身へと放出される
LPSが骨格筋内で炎症性変化をもたらし，そのような炎症がマイオカイン発現を低下させていることが示唆された。これに対して，カルノシンには腸内での炎症性変化といった腸内環境を改善させる作用があることが推測された。さらにカルノシンの抗酸化作用によって，腸粘膜のバリア保護作
用をもたらし，腸管からLPSを全身へと放出するのを抑制させ，骨格筋とくに速筋が維持されることが考えられた。このような結果は，運動による
サルコペニア発症予防が困難な症例に対して，カルノシンを多く含む豚や牛肉の摂取が有効である
ことが大いに期待されるものである。
４．要

約

肥満は，全身性炎症性疾患と位置付けられており，サルコペニア発症の危険因子であるとされている。肥満サルコペニアの病態生理に関しては，
インスリン抵抗性，炎症性サイトカインの過剰発
現に伴う慢性炎症，酸化ストレスなどが関与しているとされているが，メカニズムの詳細は不明である。以前より，豚肉に多く含まれる“カルノシン”は抗酸化作用があることが知られているが，

文
献１） Cari, P. D., Delzenne, N. M.：Interplay between
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population：current status and future directions forresearch, Endocrine, 45, 15～25, 2014.
５） Vincent, H. K., Raiser, S. N., Vincent, K. R.：Theaging musculoskeletal system and obesity-related
considerations with exercise, Ageing Res Rev, 11,361～373, 2012.
６） Gusmao-Sena, M. H., Curvello-Silva, K., BarretoMedeiros, J. M., Da-Cunha-Daltro, C. H.：
Assosiation between sarcopenic obesity andcardiovascular risk：where are we? Nutr Hosp, 33,
592, 2016.
７） Calvani, R., Marini, F., Cesari, M., Tosato, M.,
Picca, A., Anker, S. D., von Haehling, S., Miller, R. R.,
Bernabei, R., Landi, F., Marzetti, E.：SPRINTT
Consortium. Biomarkers for physical frailty andsarcopenia, Aging Clin Exp Res, 29, 29～34, 2017.
８） Cermak, N. M., Res, P. T., de Groot, L. C., Saris, W.
H., van Loon, L. J.：Protein supplementation
augments the adaptive response of skeletal muscle
to resistance-type exercise training： a metaanalysis, Am J Clin Nutr, 96, 1454～1464, 2012.

このような抗酸化作用が肥満サルコペニアに有用© The Ito Foundation

94

食肉摂取による，不飽和脂肪酸等の生活習慣病予防効果について（佐久コホートに於ける疫学研究）
Prevention effects of unsaturated fatty acids on lifestyle-related diseases
by the dietary intake of meat sources（Saku cohort study）

山

田

晃

一

（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所）

Kouichi Yamada（National Research and Development Agency National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition）

ω3-polyunsaturated fatty acids, such as eicosapentaenoic acid （EPA） anddocosahexaenoic acid（DHA）, are expected to have preventive effects against cardiovasculardisease（CVD）. We detected the polymorphism（SNPs）of Fatty Acids Desaturating enzymes（FADS）and examined the association with blood EPA, DHA or other polyunsaturated fatty
acids in the obese men and women of Saku Control Obesity Program（SCOP）. A significant
association was observed between FADS1 SNPs and arachidonic acid（AA）, suggesting that
FADS1 is actually implicated in the metabolism of ω 6-unsaturated fatty acids. In addition, theFADS1 SNPs are associated with blood EPA/AA ratio. The ratio was reported to be correlatedwith the risk of CVD in the other Japanese Cohort, such as Hisayama Study. These findings
lead the conclusion that FADS1 SNPs are one of the genetic background affecting CVD. On theother hand, the dietary intake of ω3- or ω6-unsaturated fatty acid, or the fish and shellfish
intake, estimated from self-administered diet history questionnaire（DHQ）, was scarcely
associated with the blood EPA or DHA level.
To study the preventive effects of meat intake against life style-related diseases, we havealso examined the correlation between meat intake and blood-biochemical parameters（redblood cells, hematocrit, serum Fe… etc.）. As a result, meat intake was correlated with plateletlevel in the obese men, and in the obese women, it was significantly correlated with whiteblood cell level, indicating that meat intake effectively contributes to the blood-forming faculty.

１．目

LDLコレステロール値を低下させて，高脂血症を的改善することが報告されている。食肉には飽和脂

EPAやDHAのようなω３系多価不飽和脂肪酸

肪酸と一価不飽和脂肪酸が多く含まれるが，ω３には，血中の中性脂肪値を下げ，不整脈や動脈硬系脂肪酸は微量である。しかし，近年は魚油等を化を予防し，脳梗塞（脳血栓）や心筋梗塞を防ぐ

飼料に配合し，ω３系脂肪酸を多く含む鶏卵や豚など，さまざまな生活習慣病予防効果が期待され肉の生産も試みられている。肉類の過剰摂取は肥ている。また，一価不飽和脂肪酸のオレイン酸は，満や高脂血症，動脈硬化を招くとされ，栄養学的© The Ito Foundation

食肉摂取による，不飽和脂肪酸等の生活習慣病予防効果について（佐久コホートに於ける疫学研究）

95にも敬遠されてきたが，本課題では食肉の生活習解析する。一元配置分散分析により，高脂血症，

慣病予防効果を疫学的に検証し，食肉摂取のポジ

動脈硬化（PWV値），心筋梗塞，肥満，糖尿病なティヴな面に焦点を当てたい。

ど生活習慣病所見との相関を解析し，罹患傾向を

２．方明らかにする。

法⑥「佐久肥満克服プログラム」の結果である，

食肉や食肉成分の生活習慣病予防効果，ω３系①～④を再検証する。特に4,502名の心筋梗塞，

不飽和脂肪酸の生活習慣病予防効果，および，脳血管疾患，脳梗塞の現在までの罹患歴を調べ，

DHA，EPAの体内合成の遺伝的背景を日本人に

不飽和脂肪酸関連遺伝子多型，およびω３系不飽

おいて明らかにするため，まず，人間ドック受診

和脂肪酸の食事による摂取量との相関を調べる。

者の中高年肥満者を対象に参加者を募った「佐久○遺伝子多型解析の方法と箇所

肥満克服プログラム（235名）１，２）」において，①

キアゲン社のキットを用いて，被験者の全血よ

血中脂肪酸組成を定量分析し，そのEPAやDHA

りDNA精製を行う。遺伝子多型の解析はPCR-

値と，肉類等の食品の食事摂取量との関係を回帰

RFLP法を用い，切断断片はMultiNA（島津製作

分析する。

所）にて検出する。この方法で，すでに生活習慣

次に，②これらの血中脂肪酸値と，体格指標等の肥満所見，血液生化学的検査値等の高脂血症所
見，糖負荷試験結果等の糖尿病所見との相関を解析し，肉類の生活習慣病予防効果について明らかにする。
③血中脂肪酸成分値は食事摂取量とともに，被験者の遺伝的背景（脂肪酸代謝酵素の遺伝子多型）に影響されることが報告されているため

病関連35遺伝子，90多型の解析を終了５～７）。
○統計解析
回 帰 分 析 ，一 元 配 置 分 散 分 析 等 の 統 計 に はSPSSを用いる。
３．結果と考察3 . 1 「佐久肥満克服プログラム（235名）」に，おける，血中不飽和脂肪酸成分値の測定

３，４）

αリノレン酸→EPA or DHAの生成に影響する「佐久肥満克服プログラム（SCOP）」の血清を遺伝子FADS1，ELOVL２などの多型を検出し，

使 用 す る 予 定 だ っ た が ，見 当 た ら な い た め ，

血中EPAやDHA値との相関を一元配置分散分析

SCOPの遺伝子精製用全血の残りから，0.25mlをする。

分取し，SRLに血中不飽和脂肪酸分画の測定を依④このコホートにおいても，ω３系不飽和脂肪

頼した。SRLの分析方法は，血液サンプルを乾固

酸の食事摂取による生活習慣病予防効果が認めらした後，塩酸メタノールでエステル化（50℃），

れるか，血中のω３系不飽和脂肪酸値と，高脂血上層をガス・クロマトグラフで分離・定量するも症，動脈硬化，心筋梗塞，肥満，糖尿病など生活のと考えられる。得られたSCOPの値は，SRLが習慣病所見との相関を解析する。

提示している「基準値」の範囲にほぼ収まっていさらに，人間ドック受診者一般を対象に参加者を募った「佐久健康長寿プログラム」（4,502名）
において，

る。
3 . 2 「佐久肥満克服プログラム」における，
FADS１多型等の検出と血中不飽和脂肪酸⑤上記③でEPA or DHAの体内生成量を有意に増減させていた不飽和脂肪酸関連遺伝子多型を成分値との相関解析
不飽和脂肪酸代謝に関与するFADS1とELOVL© The Ito Foundation

96

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）２遺伝子について，各々rs174537，rs953413をするため，より上流のrs174547と，FADS１遺伝

PCR-RFLP法で解析し，血中不飽和脂肪酸成分

子のプロモーター領域に存在するrs174556を選択

値との一元配置分散分析を行った。その結果，し，同様に解析を行った。

FADS１（rs174537）については，肥満男性で血その結果，rs174547についても，肥満男性で血中アラキドン酸値と有意な相関（ANOVA p＝中アラキドン酸値と有意な相関（p＝0.025），肥

0.021），肥満女性でも血中アラキドン酸値とより満女性でも血中アラキドン酸値とさらに強い相関

強い相関を認め（p＝0.003），血中EPA/AA比とを認め（p＝0.002）（Fig.１），血中EPA/AA比とも相関傾向があった（Fig.２）。

も有意な相関（p＝0.032）があった（Fig.２）。このrs174547の場合についてBonferroniによる多重せの位置に存在し，両遺伝子を含む一帯が連鎖不比較を行うと（Fig.１），肥満男性では，血中ア平衡領域であることが知られている。rs174537はラキドン酸値について，大多数型（T/T）と少数

FADS１遺伝子の相当下流のイントロン域に存在型（C/C）の間でのみ有意（p＝0.023）。肥満女
p＝0.032

p＝0.023200

p＝0.004
150

100

50

/C
C

C
T/

male

T

rs174547

T/

C

C
T/

T/

/C

0
T

blood Arachidonic acid (μg/mL）

FADS１遺伝子とFADS２遺伝子は向かい合わfemaleblood EPA/Arachidonic acid ratio

Fig. 1 Association between FADS1 polymorphism（rs174547）and blood arachidonic acid0.6

p＝0.028

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

T
T
T/
G/
rs174537 female

G

G/

T

T/

C
C
T/
C/
rs174547 female

Fig. 2 Association between FADS1 polymorphisms and blood EPA/arachidonic acid ratio© The Ito Foundation

97

食肉摂取による，不飽和脂肪酸等の生活習慣病予防効果について（佐久コホートに於ける疫学研究）

性の場合，血中アラキドン酸値について，大多数景であることが本課題で明らかになった。久山町型（T/T）と 少 数 型（C/C）の 間 で 有 意（p＝研究では「血清EPA/AA比が高い人ほど心血管0.032）に 加 え て ，大 多 数 型（T/T）と ヘ テ ロ

系疾患による死亡率が低い」と報告されている９）（T/C）の間でも有意（p＝0.004）であった。血が，大多数型（T/T）の血中EPA/AA比値（0.27

中EPA/AA比については，大多数型（T/T）と± 0.12），と ヘ テ ロ（T/C）の そ れ（0.34 ± 0.16）

ヘテロ（T/C）の間で有意（p＝0.028）であった。

の差は僅差であり，ただちに大多数型が心血管系

同様に，rs174556についても，肥満男性で血中疾患に罹りやすいというほどのことはない。

アラキドン酸値と有意な相関（p＝0.031），肥満

3 . 3 「佐久肥満克服プログラム」における，

女性でも血中アラキドン酸値と有意な相関を認め

DHQによる肉類等，食事摂取量と血中不飽（p＝0.037），血中EPA/AA比とも相関傾向があっ

和脂肪酸成分値との相関解析

た（データ略）。

10）
次に，食事歴法質問表（DHQ）
によって推定rs174537，rs174547，rs174556の３ヶ所の多型された食事摂取量と血中不飽和脂肪酸成分値とのについて，肥満男女性で血中アラキドン酸値と有回帰分析を行った。以下が有意なもののすべてで意な相関を示したことは，FADS１（ないしはあり，肥満男性で肉類摂取量と血中アラキドン酸

FADS２）が，少なくともω６系不飽和脂肪酸代

値の弱い正相関（Pearsonの相関係数r＝0.217；

謝に確かに関与していることを示唆する。おそら

有意確率（両側）p＝0.022）（Fig.３），魚介類摂く，FADS１の酵素発現量が違い，それがアラキ

取量とEPA/AA比の弱い正相関（r＝0.194；p＝ドン酸生成に影響を及ぼしていると考えられる。

0.041）以外に，ω３系，およびω６系不飽和脂

肥 満 女 性 で は rs174547 に つ い て ，血 中 EPA/

肪酸食事摂取量と血中不飽和脂肪酸成分値との相AA比と有意な相関があり，rs174537，rs174556

関は一切出なかった。

の２ヶ所の多型についても，相関傾向があった。

3 . 4 「佐久肥満克服プログラム」における，

EPA/AA比は，日本の他のコホート（例えば，DHQによる肉類等，食事摂取量とBMI等の久山町研究）において，心血管系疾患の死亡率と肥満所見，生活習慣病所見との相関解析の相関が報告されている所見であり，FADS

SCOPは肥満治療介入研究を実施したコホート

１多型は心血管疾患に影響する１つの遺伝的な背であるため，肥満，高脂血症や糖尿病の生活習慣

８，９）

female

120
100
80
60

y= 61.71 + 0.056 x

40
20
0

100

200
300
meat intake (g)400

blood Arachidonic acid (μg/mL)

blood Arachidonic acid (μg/mL)

male

500

Fig. 3 Association between meat intake and blood Arachidonic acid

© The Ito Foundation

120
100
80
60
40
20
0

100
200
meat intake (g)

300

98

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

malefemale4550
y = 29.06 + 0.017 x

40

40

BMI

BMI

45

35

35

30

30

25

25
0

100

200

300

400

500

0

meat intake (g)100200meat intake (g)300Fig. 4 Association between meat intake and BMI病所見が充実しており，肉類等，食事摂取量とこ

ω６系不飽和脂肪酸であるアラキドン酸は卵や豚れらの生活習慣病所見との相関解析を行った。

肉，レバーなどに多く含まれるが，どうして強い

肥満男性では，肉類摂取量と，肥満所見（BMI，

負相関になるのかは，よく分からない。

WaistAve，胴回り，全体脂肪面積，皮下脂肪面積）

それから，肥満女性が何を多く摂取して肥満しの間に強い正相関が認められたが，肥満女性では

たか，については，穀類，菓子類，炭水化物等，

相関がなかった。この場合，肉類摂取量と相関がいろいろ解析したが，有意なものは見つけられなあるのは，BMI（r＝0.307；p＝0.001）（Fig.４），

かった。

WaistAverage（r＝0.302；p＝0.001），胴回り（r

肉類摂取による生活習慣病予防効果について，＝0.269；p＝0.004），CTで測定した全体脂肪面積

肉類の摂取頻度と「貧血」との相関が日本人で報（r＝0.327；p＝0.000），皮下脂肪面積（r＝0.209；

告されている11）ので，私達もSPSSのデータビュー

p＝0.030）。肉類摂取量と，同じくCTで測定したに今まで削除してきた赤血球数，血色素量，ヘマ

腹腔内脂肪（＝内臓脂肪）面積の間には相関がな

トクリット値，血清鉄，血清アルブミン等の血液いことから，肉類摂取による脂肪は主に皮下脂肪

生化学的所見を追加して，「貧血」との相関を解に付くことが示唆される。

析した。その結果，赤血球数，血色素量，ヘマト

肥満男女性ともに，肉類摂取量と高脂血症所
見，糖尿病所見との相関はなかった。

クリット値等の貧血所見との相関は検出できなかったが，肥満男性では肉類摂取量と血小板数と肥満女性では，血中アラキドン酸値と肥満所見の間に，弱い正相関（r＝0.230；p＝0.025），肥満（BMI，WaistAve，胴回り，全体脂肪面積，皮下

女性で肉類摂取量と白血球数との間に，強い正相脂肪面積）の間に強い負相関があった（肥満男性

関が認められた（r＝0.272；p＝0.007）（Fig.５）。

では相関なし）；血中アラキドン酸値と，BMI（r回帰直線を描くと，いずれも，基準値の範囲（正＝－0.289；p＝0.002），
WaistAverage（r＝－0.382；

常範囲）に収まる（血小板数：13.0～34.9×10４/

p＝0.000），胴 回 り（r＝－0.347；p＝0.000），CTμL；白血球数：3.3～９×10３/μL）。このように，

で 測 定 し た 全 体 脂 肪 面 積（ｒ ＝－0.316 ； p＝少なくとも「佐久肥満克服プログラム」の肥満男

0.001），皮下脂肪面積（r＝－0.322；p＝0.001）。

女において，肉類は造血機能の亢進に寄与してい© The Ito Foundation

99

食肉摂取による，不飽和脂肪酸等の生活習慣病予防効果について（佐久コホートに於ける疫学研究）
male

female1230

20
y = 22.83 + 0.021 x

10
0

100

200

300

400

White blood cell(103/μＬ)

Platelet (104/μＬ)

40

10
8
6
4

y = 5.50 + 0.009 x

2
0

500

100

200

300

meat intake (g)meat intake (g)Fig. 5 Association between meat intake and platelet（male）or white blood cell（female）

ると考えられる。

が，集約が不完全ということで，データとして利3 . 5 「佐久健康長寿プログラム」（4,502名）におけるFADS１多型の検出「佐久健康長寿プログラム（SHAP）」は標準体用できなかった。
４．要

約

重者が大部分で，それに肥満者と若干名の痩身者

EPAやDHAのようなω３系多価不飽和脂肪酸を加えた構成となっており，心血管系疾患の追跡には，血中の中性脂肪値を下げ，不整脈や動脈硬調査を行うのに適したコホートである。FADS１化を予防し，脳梗塞（脳血栓）や心筋梗塞を防ぐ

多型の検出をするために，まず被験者，約2,200など，さまざまな生活習慣病予防効果が期待され

人 分 の 全 血 か ら キ ア ゲ ン 社 の QIAamp DNAて い る 。私 達 は ，脂 肪 酸 不 飽 和 化 酵 素 で あ る

blood kitを用いて，DNA精製を行った（本課題

FADS １ の 遺 伝 子 多 型 を 検 出 し ，血 中 EPA や研究開始以前に約1,600人分のDNA精製を行ってDHA値等との相関を分析した結果，FADS１多

おり，これで合計約3,800人分のDNA精製が完了

型と血中アラキドン酸値との間に有意な相関を見した）。

出した。これは，FADS１がω３系，およびω６

血中EPA/AA比と最も有意な相関が得られた

系不飽和脂肪酸代謝に確かに関与していることを

rs174547について，上記のPCR-RFLP法により示唆する。同様に，FADS１多型と，血中EPA

SHAPの3,797人の遺伝子多型を解析した（男性値／アラキドン酸値比（EPA/AA比）との間に2,211人；女性1,586人）。当初の研究計画では，平も，有意な相関を検出した。EPA/AA比は，日

成29年度にこのコホートの５年後の追跡調査が行本の他のコホート（例えば，久山町研究）におい

われ，心血管系疾患についても罹患人数等の所見て，心血管系疾患の死亡率との相関が報告されてが得られる予定だった。ところが，共同研究をいる所見であり，FADS１多型は心血管系疾患に行っている佐久総合病院の事情により，被験者の影響する１つの遺伝的な背景であるといえる。一

健診データとの連結ができないまま，現在に至っ方，食事歴法質問表（DHQ）によって推定されている。

た食事摂取による，ω３系，およびω６系不飽和

脈波伝播速度（PWV）は測定が終了している

脂肪酸量，あるいは魚介類摂取量は，血中EPA© The Ito Foundation

100

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

やDHA値等とほとんど相関がなかった。
肉類摂取による生活習慣病予防効果について，
肉類摂取量と，赤血球数，血色素量，血清鉄等の，血液生化学的所見との相関を解析した。その結果，肥満男性では肉類摂取量と血小板数との間に弱い正相関，肥満女性で肉類摂取量と白血球数との間に強い正相関が認められたことから，少なくとも「佐久肥満克服プログラム」の肥満男女性においては，肉類摂取が造血機能の亢進に寄与していると考えられる。
共同研究者饗場

直美（神奈川工科大学応用バイオ科学部）

森田明美（三重大学医学系研究科）

宮地元彦（国立研究開発法人医薬基盤・健康・
栄養研究所）

渡邊昌（公益社団法人生命科学振興会）

文
献１） Watanabe, S., Morita, A., Aiba, N., Miyachi, M.,
Sasaki, S., Morioka, M., et al.：Anti-Aging Medicine,
4, 70～73, 2007.
２） Morita, A., Ohmori, Y., Suzuki, N., Ide, N.,
Morioka, M., Aiba, N., et al.：Anti-Aging Medicine, 5,13～16, 2008.
３） Tanaka T., et al.：PLoS GENET, https://doi.
org/10.1371/journal.pgen.1000338, 2009.
４） Ameur, A., et al.：Ame. J Hum. Getet, 90, 809～
820, 2012.
５） Yamada, K., Takezawa, J., Morita, A., Matsumura,Y., Watanabe, S.：Anti-Aging Medicine, 4, 63～69,
2007.
６） Takezawa, J., Yamada, K., Morita, A., Aiba, N.,
Watanabe, S.：Obesity Research & Clinical Practice,
3, 179～191, 2009.
７） Takezawa, J., Yamada, K., Miyachi, M., Morita, A.,
Aiba, N., Sasaki S., Watanabe S.：Appetite, 63, 105～
111, 2013.
８） Ninomiya, T., et al.：Atherosclerosis, 231, 261 ～ 7,2013.
９） 九州大学大学院医学系研究科病態機能内科学・環境医学 久山町研究室，2011.
10） Sasaki, S., Yanagibori, R., Amano, K.：Journal of
Epidemiology, 8, 203～215, 1998.
11） Kunitsugu, I., et al.：Nursing & Health Sci., 14,2012.

© The Ito Foundation

101

食肉を中心とする食品由来核酸の腸管保護機能の解析（Ⅱ）
Effects of nucleic acids from meat and other foods on the functions ofintestinal cells（II）

河

合

慶

親

（徳島大学大学院医歯薬学研究部）

Yoshichika Kawai（Graduate School of Biomedical Sciences, Tokushima University）

We usually eat animals, plants, and/or microorganisms as daily foods. Therefore, ourdiet necessarily contains their biological constituents, such as proteins, lipids, carbohydrates,
and nucleic acids. However, as compared with three major nutrients（proteins, lipids,
carbohydrates）, less attention has been paid on the nutritional and biological consequences offood-derived nucleic acids. In addition,“standard tables of food composition in Japan”don’t
yet include the information of nucleic acid contents. We therefore focused on the importance of
nucleic acid contents in our foods and of the potent functions of food-derived nucleic acids inour body. Our previous studies have demonstrated that food-derived nucleic acids, especiallyfrom soybean and chicken meat, induced the mRNA expression of claudin-4 and mucin 2 indifferentiated Caco-2 cells, both of which contribute to the barrier functions of intestinal cells.
Here, we especially focused on the effects of enzymatic digestion of soybean-derived nucleic
acids on the activity in the intestinal cells. It was found that in vitro enzymatic digestion ofsoybean-derived nucleic acids with pancreatic and intestinal enzymes decreased the molecularweights of nucleic acids, and that the enzymatic digestion significantly attenuated the activityof the nucleic acids for mRNA induction in the differentiated Caco-2 cells. We also found that
DNA, rather than RNA, could contribute to the activity of soybean-derived nucleic acids. We
also tried the chemical analysis of the bioactive nucleic acids using high-performance liquid
chromatography（HPLC）. However, we could not establish suitable HPLC conditions for foodderived nucleic acids within this study. These studies demonstrated that decrease in themolecular size of during enzymatic digestion could be crucial for the potent biological activityof food-derived nucleic acids.

１．目などの栄養素が含まれている。これら栄養素の機的能性については，これまでに多くの研究がなされヒトは動物，植物，あるいは微生物由来の食品ており，すでに食品・栄養学的意義が確立されてを日常的に摂取している。これらの食品には，タいる。一方で，核酸は遺伝情報を担う生体高分子

ンパク質，脂質，糖質のほかビタミン，ミネラルとしてすべての生物に存在しており，これらを食© The Ito Foundation

102

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

品として摂取する際には，常に一定量の食品由来（－20℃）を500μl加え，沈殿を洗浄した。４℃，

核酸を摂取していることになる。しかし，食品中

12000rpmで15分遠心し，デカンテーションによの核酸量については食品成分表に記載がなく，栄り上澄みを除去し，沈殿を室温で乾固させた。核

養素あるいは機能性分子としての役割についても酸処理用のダルベッコ変法イーグル培地

不明である。昨年度の検討において，食事として（DMEM）を適量加え，４℃で溶解させた。

摂取する核酸量を明らかにするため，食品からの

2.2

核酸の定量

核酸の抽出方法について検討し，さまざまな食品

核酸の定量はQantiFlourⓇ（Promega）を用いに含まれる核酸量の測定を試みた。また，食品のて行った。RNA定量はQantiFlourⓇ RNA System,

加熱によって核酸の分子サイズが低下することも

ssDNA定量はQantiFlourⓇ ssDNA System, dsDNA

示 さ れ た 。ま た ，小 腸 上 皮 モ デ ル で あ る 分 化

定 量 は QantiFlourⓇ dsDNA System（い ず れ も

Caco-２細胞を用いた検討から，大豆と鶏ミンチ

Promega）を用いて行った。

肉由来核酸で腸管のバリア機能を高めることが示2.3された。本年度は，食品由来核酸もモデルとして

膵 液 は ， pancreatin （TOKYO CHEMICAL

大豆由来核酸を用いて，経口摂取時に予想される

INDUSTRY）50mgを１mlリン酸緩衝液に溶解，

消化分解による分子サイズの変化と，腸管細胞へ

懸 濁 し て 調 製 し た 。 ま た 腸 液 は ， intestinalの機能性への影響について検討を行うこととしacetone powders from rat （SIGMA）100mg をた。また，機能性に資する核酸分子および配列等

１mlリン酸緩衝液に溶解・懸濁後，１分×３回の情報を得るために，大豆由来核酸のHPLC分析の超音波破砕し，3000rpmで５分の遠心後の上清も試みた。

を使用した。そして消化液ごとに１，10，100，

２．方
2.1

核酸の人工消化実験

1000，10000倍希釈したものを用意した。エッペ

法

ンドルフチューブに，大豆由来核酸（核酸濃度

核酸抽出方法1.81mg/ml）を100μlと膵液を100μl入れて，37℃

50mlチューブに大豆破砕粉末を約1.5ｇ量り取り，核酸抽出用バッファーを30ml加え撹拌した。

で60分振とうさせた。その後，腸液100μl添加し，37℃で90分振とうさせた。

65℃ウォーターバスで10分ごとに転倒混和し30分

2.4

インキュベート後，12000rpmで15分遠心した。

２％アガロースゲルを作製した。パラフィルム

上清を回収し，フェノール試薬（フェノール：ク

上に６×Loadingバッファーを２μl乗せ，サンプ

ロロホルム：イソアミルアルコール＝25：24：1，

ル10μlと混合し，そのうち10μlアプライし，100

pH5.2，nacalai tesque）を15ml加えて転倒混和

Ｖの低電圧で泳動した。低分子側のマーカーがゲし，泡立てないようにゆっくりと20分振とうし，

ルの半分程度移動したところで止め，UV照射装

４℃，12000rpmで15分遠心した。上清を回収し，置で312nmの波長を照射して検出した。

アガロースゲル電気泳動

クロロホルムを等量加え，10分よく攪拌させて，

2.5

４℃，12000rpmで15分遠心した。さらに上清をヒト結腸癌由来細胞株Caco-２を10％FBS含有

回収し，イソプロパノール（－20℃）を等量加えDMEMで培養し，実験計画に応じて適宜希釈し，て－20℃で20分冷却し，４℃，12000rpmで15分

24ウェルプレートに１ウェルあたり１mlずつ撒

遠 心 し た 。上 清 を 除 去 し ，70 ％ エ タ ノ ー ル

いた。プレートに撒いた細胞はコンフルエントに© The Ito Foundation

培養細胞への核酸処理

食肉を中心とする食品由来核酸の腸管保護機能の解析（Ⅱ）

103

なった日から適宜DMEMを交換しながら21日間た。上清を捨て，70％エタノールを加えて洗浄し，培養を続け，小腸上皮様に分化させた後，実験に20000×ｇで10分遠心した。上清を捨て風乾し，用いた。食品抽出した核酸をDMEMに溶かし，DMEM培地を適量加え，４℃で溶解させた。

各核酸量を測定した。24ウェルプレートに撒いて〈DNA-rich画分の調製〉

小腸上皮細胞様に分化させた細胞を用意し，培養

エッペンドルフチューブに１mg/ml RNase A

液を除いてPBSで洗浄した。食品から抽出した核（nacalai tesque）を調製し，DNaseの失活を目的

酸 を 総 核 酸 量（dsDNA ＋ ssDNA ＋ RNA）が １

として100℃で５分加熱処理を行った。大豆由来

mg/mlとなるよう核酸処理用DMEMで希釈し，核酸溶液に１mg/ml RNase Aを添加し，37℃で１ウェルあたり300μL処理した。37℃，５％CO２

60分間反応させた後，フェノール試薬を用いて核条件下で４時間培養した。

酸抽出を行った。

2.6

定量的RT-PCR

細胞をPBSで洗浄し，Sepasol-RNA I Super G（Nacalai Tesque）を用いてRNAを抽出した。逆転写反応はReverTra Ace qPCR RT Master Mix

３．結果

3 . 1 人工消化による核酸の抽出率と組成，分子サイズの変化with gDNA Remover（TOYOBO）を用いて行っ摂取する食品は体内での消化を受けることかた 。 PCR は THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix

ら，人工消化された食品由来核酸を用いて機能性（TOYOBO）を用いてLightCycler Nanoシステムを評価することとした。今回は，核酸含有量が多（Roche）にて行った。プライマーの塩基配列をくclaudin-４遺伝子発現量の有意な増加がみられ以下に示した。

た大豆に着目し，大豆由来核酸を用いて人工消化【GAPDH】GATGAGAAGTATGACAACAGCCT

実験を行った。調製した膵液と腸液を人工消化液（forward）

として用いて，大豆由来核酸の人工消化を行った

AGTCCTTCCACGATACCAAAGT

後，フェノール・クロロホルム抽出を行った。対（reverse）

照実験として消化酵素の失活を目的に100℃で30【Claudin-4】T TGTCACCTCGCAGACCACT

2.7分加熱した人工消化液も使用した。人工消化液を（forward）

加えず，人工消化と同じ条件でインキュベートしCAGCGAGTCGTACACCTTG

た後，フェノール・クロロホルム抽出した核酸の（reverse）

量を100％として抽出率を比較したところ，消化液処理で83％，加熱した人工消化液処理で109％

各組成の画分の調製方法となった。（Fig.１）。また，核酸の組成は，グラ〈RNA-rich画分の調製〉
エッペンドルフチューブに大豆由来核酸溶液50

フには示さないが人工消化液を加えず人工消化とμlとSepasol-RNA I Super G 400μlを加えた。そ

同じ条件で抽出した大豆由来核酸は，元々の大豆

こにクロロホルムを1/5量加え，15秒間ボルテッ

由来核酸と比べてssDNAの割合が増加した。こクスを行い，よく混合した。室温で３分静置したの人工消化と同じ条件で抽出した大豆由来核酸と後，20000×ｇで15分遠心した。上清を200μl回

比べて消化後の核酸の組成に大きな変化はなく，収し，２-プロパノールを等量加えて混合した。

加熱した消化液を加えた大豆由来核酸では，室温で５分静置した後，20000×ｇで10分遠心しdsDNA，RNAの割合が増加した（Fig.２）。

© The Ito Foundation

104

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）
dsDNA

100

大豆由来核酸消化液
加熱した消化液

80
60
40

RNA

80
60
40
20

20
0

ssDNA

100
Ratio
（％）

Extraction rate
（％）

120

＋
ー
－

＋
＋
－

大豆由来核酸消化液
加熱した消化液＋－＋

Fig. 1 Effects of enzymatic digestion on the extraction

rate of nucleic acids.

0

＋
ー
－

＋
＋
－

＋
－
＋

Fig. 2 Effects of enzymatic digestion on the nucleic acidcontents.

3000 bp1000 bp
500 bp

大豆由来核酸消化液
加熱した消化液

＋

＋

ー

＋

＋
－

－

－

＋

Fig. 3 Effects of enzyme digestion on molecular weights of soybean-derived nucleic acids.

さらに，これら抽出した核酸の分子サイズを確

昨年度までの検討において，大豆由来核酸は分認した。消化後の核酸で高分子領域のバンドが消化Caco-２細胞への処理によって，claudin-４や失し，500bp以下の低分子領域のバンドが濃く

mucin-２などのバリアタンパク質のmRNA発現なっていた。一方で加熱した消化液を加えた核酸を誘導することが示されている。そこで，人工消ではDNAとみられる高分子領域のバンドは薄い化 し た 大 豆 由 来 核 酸 を 細 胞 へ 処 理 し ，今 回 はな が ら も 確 認 で き た が ，RNA と み ら れ る 500-

claudin-４のmRNA発現量について評価を行っ

1000bp付近のバンドは消失した（Fig.３）。デー

た。その結果，消化液処理により大豆由来核酸にタは省略するが，人工消化液を加えずにインキュよるclaudin-４のmRNA発現の増加は顕著に抑制ベートした後，フェノール・クロロホルム抽出しされ，消化液をあらかじめ加熱することで酵素活た核酸のバンドは，大豆由来核酸のバンドと比べ性を失活させるとその抑制作用は弱まった（Fig.

てやや低分子側のバンドが薄くなっていたがほと４）。このことから，大豆由来核酸消化液によるんど変化がなかった。よって，確かに人工消化液

低分子化によって腸管細胞に対する機能性が低下

によって核酸が消化されていることが示された。

することが示唆された。

© The Ito Foundation

105

Claudin-4
2

Relative mRNA expression（fold）

Relative mRNA expression（fold）

食肉を中心とする食品由来核酸の腸管保護機能の解析（Ⅱ）

＊

1.5
1
0.5

0
大豆由来核酸

ー

＋

＋

＋

消化液

ー

ー

＋

－

加熱した消化液－

Claudin-4
＊

2
1.5
1
0.5
0

cont

－

RNA
-rich

DNA
-rich

大豆由来核酸

－
－
＋
（ｎ＝８）
（ｎ＝２）
（ｎ＝１）
means±S.D.（＊p＜0.05）

means±S.D.（n≧3,＊p＜0.05）
Fig. 5 Activity of soybean-derived nucleic acid, and theFig. 4 Effects of enzymatic digestion on the activity for

RNA-and DNA-rich fractions to induce claudin-4mRNA in differentiated Caco-2 cells.

3 . 2 大豆由来核酸における機能性に寄与する

ず，ODSカラムを用いた逆相HPLCによってサイ

claudin-4 mRNA induction in differentiated Caco-2
cells.

ズ既知の合成オリゴヌクレオチドの分析を試み

核酸の組成の特定
大豆由来核酸を用いて，加熱や消化が核酸に与た。逆相HPLCでは，オリゴヌクレオチドは分子える影響を検討してきた。ここでは，核酸の機能

サイズが大きくなるほど溶出時間が長くなる。

性に寄与する核酸の組成を特定することを目的とデータは省略するが，合成オリゴヌクレオチドのして，核酸のRNA-rich画分とDNA-rich画分の分析においても，分子サイズの小さな順に溶出す調製を行い，それぞれの画分で腸管のバリア機能

ることが確認できた。この条件において大豆由来に関連した機能性について評価を行うこととした。

核酸の分析を試みたが，良好な分離パターンを得

機能性の検討に用いた1.0mg/ml大豆由来核酸ることができなかった。また，これまでの実験結はおよそ0.6mg/ml RNA，0.4mg/ml DNAからな

果から，ある程度の大きさを持った核酸分子によることから，RNA-rich画分中のRNAを0.6mg/

り高い機能性があると考えられたため，比較的大ml，DNA-rich画分中のDNAを0.4mg/mlとなるきな分子を分離するのに適しているゲル濾過カラ

よう濃度調節したものを細胞に処理してclaudin-

ムを用いたHPLC分析も試みた。今回の検討では，４のmRNA発現量について評価を行った。その

ゲル濾過の性質を利用して，分子サイズごとに溶結果，claudin-４のmRNA発現量がRNA-rich画

質を分離することを試みた。データは省略する

分では低下し，DNA-rich画分では増加した（Fig.

が，市販のDNA ladderのゲル濾過HPLC分析を

５）。このことから，大豆由来核酸に含まれる成試みたところ，確かに分子サイズの大きな順に溶分のうち，DNAが機能性に寄与している可能性出されたが，ピークの分離形状は良好ではなかっが示唆された。

た。本条件で，大豆由来核酸を分析したが，明瞭

3.3

なピークの分離は確認できなかった。

HPLCによる大豆由来核酸の分析

食品由来核酸のHPLC分析を行うにあたり，ま© The Ito Foundation

106
４．要

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

場合には，消化酵素によって分解され，本来有す約る機能性が低下する可能性が考えられる。今後，昨年度の研究において，食品由来核酸が腸管細動物実験やヒト試験でのさらなる検討が必要であ胞のバリア機能を増強させる活性を有することをるが，実際に食品由来核酸の機能性を発揮させる

明らかにした。また，加熱調理による核酸の低分ためには，活性を有する形で腸管細胞へ効率良く子化も確認され，低分子化による機能性への影響到達するような摂取方法の開発が必要となる。まも危惧された。本年度の検討においては，高分子

た，食品由来核酸の機能性発現メカニズムについである核酸分子を実際に食品として摂取した際にてはまったく不明のままである。今回，大豆由来予想される消化・分解による機能性への影響に焦

核酸のHPLC分析を試みたが，良好な分離条件を点を当てて検討を実施した。本研究では食品由来得ることができなかった。本研究によって，食品

核酸のモデルとして大豆由来核酸を用いて消化に由来核酸の機能性には分子サイズが重要であるこ

よる分子サイズと機能性の変化について評価をとが示されたが，核酸の塩基配列の重要性につい行った。今回，人工消化液を用いた酵素消化反応て も 今 後 の 検 討 課 題 で あ る 。HPLC な ら び にによって核酸サイズが減少するとともに，分化

LC-MSを用いた詳細な分析により，活性発現に

Caco-２細胞に対する機能性も低下することが示重要となる分子サイズや塩基配列を明らかにするされた。よって，食品として核酸を経口摂取したことが重要となるであろう。

© The Ito Foundation

107

豚赤血球由来グロビンタンパク分解物を用いた高血圧症の改善を目指した研究
Improvement effect of globin protein derived from pig red cell on the
blood pressure in SHR hypertension rats

糸井

亜弥・宮

菜美華・吉川豊（神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科）

Aya Itoi, Namika Miya and Yutaka Yoshikawa（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Women’s University）

In in vitro experiments, it was reported that globin protein products of meat-derived
natural components have strong ACE inhibitory activity. In this experiment, globin protein
products showed the blood pressure lowering effect in hypertensive model SHR rats.
Furthermore, from the measurement of catecholamine, it was revealed that the globin protein
product suppresses the secretion of two kinds of hormones, NE and Epi. But the suppressive
effects were not significant with or without globin protein product. It was suggested that theeffect of globin protein products on blood pressure lowering effect is mainly due to ACE
inhibitory action in the organ rather than action on catecholamine secretion.

１．目ができる手軽な方法を提案することは喫緊の課題

的

である。

厚生労働省が３年ごとに実施している「患者調現在の臨床現場において，医療用医薬品の数は査」の平成26年度の調査によると，生活習慣病の約16,000品目以上あり，種々の疾患を患ったヒト１つである高血圧性疾患の総患者数（継続的な治の治療薬として利用されているが，臨床で用いら療を受けていると推測される患者数）は，1,010

れている多くの有機薬剤は，開発し尽くされた感

万8,000人と報告され，前回の調査に比べて約104もあり，新規有機薬剤の開発は難しくなってきて万人増加しており，減少する気配が見られない状いる。一方，特定保健用食品の分野では，γアミ

況が続いている 。さらに，平成25年度の厚生労

ノ酪酸や酢酸，クロロゲン酸類が，血圧が高めの働省の調査では，高血圧性疾患の医療費は１兆方の食品として注目されている３）。さらに近年で8,890億円であり，国民総医療費の約５％を占め

は，アンジオテンシン変換酵素を阻害する働きをている 。さらに，日本生活習慣病予防協会の調有するペプチド類も血圧上昇を抑制することが報査では，国民の平均血圧が４mmHg下がると，告されており４），ペプチド含有の天然物は新たな脳卒中による死亡者数を約１万人，心筋梗塞によ血圧降下作用の可能性を秘めている。我々は，運る死亡者数を約5,000人減らすことができるとも

動や微量元素（特に金属元素）・天然物などのサ言われており，血圧を正常レベルで維持すること

プリメント素材に適用可能な物質に注目して研究

１）

２）© The Ito Foundation

108

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）を行い，高血圧や糖尿病など生活習慣病に関わる

内規に従い，神戸女子大学動物実験倫理委員会の数多くの研究を実施してきた承認を得たうえで実施した。

。本研究では，

５，６）

こ れ ま で の 我 々 の 研 究 分 野 の 中 か ら ，過 去 にACE阻害作用が発見されたグロビンタンパク分

2 . 2 血漿中カテコールアミンへの麻酔薬による影響

解物にターゲットを絞り ，高血圧自然発症の６週齢のWistar系雄性ラットを用い，ウレタン

SHRラットを用いて，血圧上昇抑制効果の評価を麻酔（カルバミン酸エチル0.7ｇ/kg＋α-クロラ行った。

ロース0.06ｇ/kg混合を腹腔内投与）および，イ

７）

２．方

ソフルラン麻酔下（導入濃度４-５％，維持濃度法

２-３％で吸入投与）で腹部大静脈から採血し

2 . 1 高血圧モデルラットの作成と化合物の投た８，９）。得られた血液を４℃，800ｇで10分間遠心分離を２回行うことにより得た血漿を用いてカテ

与５週齢のWistar-Kyotoラットを３匹と自然発

コールアミンの測定を行った。

症高血圧ラット（SHR）を８匹用意し，高フルク

2.3

トース食（57％フルクトース食）を与え２週間予

イソフルラン麻酔下で採血し，得られた血液を備飼育した。その後，その８匹をグロビン水溶液

４℃，800ｇで10分間遠心分離を２回行うことにを自由摂取させる群（SHR＋HF＋glo群，４匹），

より血漿を得た。血漿50μＬに，0.1 ＭのEDTA

グロビン水溶液を摂取させない群（SHR＋HF群，を100μL，内標準物質として36μＭのDHBA臭化

４ 匹）に 分 け 10 週 間 飼 育 し た 。ま た ，普 通 食

水 素 酸 塩 を ５μL ， 1.5 M ト リ ス 塩 酸 緩 衝 液（40％コンスターチ食）を与え，グロビン水溶液（pH8.6）を500μL加え，さらに活性アルミナ５を 摂 取 さ せ な い Wistar-Kyoto ラ ッ ト ３ 匹 をmg加えた。これらを10分間振盪撹拌し４℃，800

Normal群とし，10週間飼育した。与えるグロビｇで１分間遠心分離し，液相をアスピレーターでン 水 に つ い て は ，摂 取 す る グ ロ ビ ン の 量 が吸引除去した。活性アルミナを１mLの超純水で400 mg/kg BWとなるように35％グロビン抽出物

３回洗浄した後，活性アルミナをフィルター付遠をElix水で希釈したサンプルを飲料水として使用

沈 管 （MILLIPORE Ultrafree-MC Centrifugal

した。飼育開始時，飼育から２週間後（予備飼育Filter Units）に移した。４℃，1,500ｇにおける最終日），飼育から４週間後，飼育から７週間後，３分間の遠心分離による活性アルミナの脱水後，飼育から10週間後，解剖前の５回，血圧の測定を２％酢酸溶液50μＬを加えてカテコールアミンを行った。血圧は，株式会社ハクバテック・ライフ

抽出させた。数秒間ボルテックスミキサーにかけ

サ イ エ ン ス ・ ソ リ ュ ー シ ョ ン ズ の Volume撹拌し，４℃，2,000ｇで５分間遠心分離を行い，Pressure Recording（VPR）Tail-Cuff System を

上清10μＬを電気化学検出器つきの高速液体クロ使用して測定した。なお，35％グロビン抽出物は，マトグラフィー（HPLC-ECD）を用いてノルエ

ILS株式会社から提供していただいた。

ピネフリン（NE）およびエピネフリン（Epi）を群間の有意差は，Microsoft Excel 2010を用い，Excel統計2012により，Tukey-Kramer法を用い血漿中カテコールアミンの定量定量分析した。なお，HPLCの条件はTable１のとおりとする。

て検定した。
なお，本実験は，神戸女子大学動物飼育室利用© The Ito Foundation

豚赤血球由来グロビンタンパク分解物を用いた高血圧症の改善を目指した研究

109

Table 1 HPLC conditions of catecholamine measurement
分析カラム：EICOMPAK SC-50DS（Φ3.0×150mm）

プレカラム：EICOMPAK AC-ODS（Φ4.0×５mm）

流速：0.5mL / min

分析温度

：25℃

検出器

：EICOM ECD-300

設定加電圧：＋450mV vs Ag/AgCl

作用電極：Platinum electrode WE-3G

参照電極
ガスケット

：RE-100：GS-50

脱気装置：DG-300

注入量

：10μL

組織のACE阻害作用を有する結果と総合的に考３．結果と考察えると７），今回摂取したグロビン水溶液中に含ま3 . 1 グロビンタンパク分解物摂取によるラッすることで血圧低下もしくは血圧上昇抑制効果に

トへの影響
3.1.1

れる各種のペプチドが，各組織中のACEを阻害寄与したと考えられる（Fig. 1（D））
。

体重への影響

飼育終了時の体重平均は，Normal群では408ｇ，
SHR＋HF群では308ｇ，SHR＋HF＋glo群では

3 . 2 血漿中カテコールアミン測定に対する麻酔薬の影響

309ｇとなった。Normal群に比べて他の群の平均

イソフルラン麻酔時はウレタン麻酔時のカテ

体重は低い値となったが，高フルクトース食を与コールアミンレベルと類似した傾向にあった。カ

えたSHR＋HF群とSHR＋HF＋glo群はほとんど

テコールアミンの測定においてはその測定値が麻同じ体重変化をたどった（Fig. 1（A））
。

酔の影響を受けることが報告されており，特にウ

3.1.2

摂食量・摂水量への影響

レタン麻酔が最適であることが報告されていた飼育期間を通して，普通食を与えたNormal群と比べて高フルクトース食を与えたSHR＋HF群

が，イソフルランの麻酔でもその差がないことを確認することができた。

とSHR＋HF＋glo群は摂食量が少ない傾向にあっ

3 . 3 血漿中カテコールアミンの濃度変化

た 。ま た ，摂 水 量 は ，飼 育 期 間 を 通 し て ，

血漿中のNEの濃度はEpiの濃度より高かった。

Wistar-KyotoラットであるNormal群に比べて，NE・Epiともに，Normalのラットと比べ，SHR

SHR＋HF群，SHR＋HF＋glo群で多い傾向にあっにフルクトースを摂取させたラットでは，低い数た（Fig. 1（B）（C））。

値を示した。また，グロビンを摂取させるとNE

3.1.3

血圧への影響もEpiもさらに低下した（Fig. 2（A）
（B））
。

収 縮 期 血 圧（systolic blood pressure ； SBP）
はSHR＋HF群，SHR＋HF＋glo群のすべての群

４．要

約で飼育２週間後（予備飼育最終日）までに上昇し過去の研究において，in vitro実験では食肉由た。グロビン水溶液を与えたSHR＋HF＋glo群に来天然成分である，グロビンタンパク分解物には

おいては，飼育５週間後に血圧は低下した。今回

強いACE阻害活性があることが報告されていたの結果を，既報のグロビンタンパク分解物が動物

が７），本実験の結果より高血圧モデル動物の血圧© The Ito Foundation

平成30年度

（A）
450

（B）
21

400

19

350

$$

300

＊＊

250
NormalSHR+HF
SHR+HF+glo

200
150
100

0

10

20

30

40
Day

50

60

17
15
13
NormalSHR+HF
SHR+HF+glo

11
9

70

7

80

0

10

（C）
40

（D）
220

35

200

30

180

SBP
（mmHg）

water intake（g）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

food intake（g）body weight（g）

110

25
20
NormalSHR+HF
SHR+HF+glo

15
10

0

10

20

30

40

50

60

70

20

40

50

60

70

$$
$

$

＊

＊

80

Day

160

#

140
NormalSHR+HF
SHR+HF+glo

120
100

80

30

0

10

Day

20

30

40

50

60

70

80

Day

Fig. 1 Changes of body weight（A）, food intake（B）, water intake（C）, and systolic blood pressure（SBP）（D）.

Significance： ＊ p＜0.05（Normal vs SHR＋HF＋glo），$p＜0.05（Normal vs SHR＋HF），$$p＜0.01（Normal vs SHR＋HF）,and #p＜0.01（SHR＋HF vs SHR＋HF＋glo）
（A）

（B）
90
80

250
Epinephrine（pg/μg）

Norepinephrine（pg/μg）

300

200
150
100
50
0

70
60
50
40
30
20
10

NormalSHR+HF

SHR+HF+glo

0

NormalSHR+HF

SHR+HF+glo

Fig. 2 Changes of serum catecholamine, norepinephrine（A）and epinephrine（B）, concentrations after dissection© The Ito Foundation

豚赤血球由来グロビンタンパク分解物を用いた高血圧症の改善を目指した研究を低下させる作用を有することが明らかになった。さらに，カテコールアミンの測定から，NEとEpiの二種のホルモンの分泌を抑制することが明らかになった。カテコールアミンの血中レベルの上昇は血圧上昇につながることが分かっているが，高果糖食において，カテコールアミンの分泌が大きく抑制されることから，グロビンタンパク
分解物の血圧への影響は，カテコールアミンの分泌に対する作用よりも，ACE阻害作用が主たる要因であることが示唆された。
謝

辞

本実験において，グロビンタンパク分解物をご提供いただいた，ILS株式会社様には深くお礼申し上げます。また，本実験を進めるにあたり，神戸女子大学大学院健康栄養学研究科，ならびに，神戸女子大
学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科の学生諸氏に多くの協力をいただいたことを深謝いたします。

111

文
献
１） 厚生労働省 平成26年（2014）患者調査の概況，
https://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/
kanja/14/index.html，閲覧日20180428.
２） 厚生労働省，平成25年度 国民医療費の概況，
https://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/
k-iryohi/13/index.html，閲覧日20180428.
３） 松井利郎：レニン-アンジオテンシン系と血圧調節，化学と生物，53，228～235，2015.
４） Maolin, T., Cong, W., Cheng, C., et al.：Identificationof a novel ACE-inhibitory peptide from casein andevaluation of the inhibitory mechanisms, Food
Chemistry, 256, 98～104, 2018.
５） Adachi, Y., Yoshikawa, Y., Yoshida, J., et al.：Improvement of diabetes, obesity and hypertension
in type 2 diabetic KKAy mice by bis（allixinato）
oxovanadium（Ⅳ）complex, Biochem. Biophys. Res.
Commun., 345, 945～950, 2006.
６） Yoshikawa, Y., Yasui, H.：Zinc complexes
developed as metallopharmaceutics for treating
diabetes mellitus based on the bio-medicinal
inorganic chemistry, Curr Top Med Chem, 12, 210～
218, 2012.
７） 吉川豊，糸井亜弥：機能性畜産副生成物を用いた糖尿病合併症高血圧症の改善を目指した開発研究，
平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，36，123～128，2018.
８） 田嶋嘉雄編：実験動物学各論，朝倉書店，東京，
1973.
９） Sasaki-Hamada, S., Okada, S., Ito, K., et al.：Immunohistochemical determination of the site ofhypotensive effects of glucagon-like peptide-2 in the
rat brain, Neuroscience, 212, 140～148, 2012.

© The Ito Foundation

112

ファージおよび食品成分等による食肉の安全確保に関する研究
Study on ensuring the safety of meat by phage and food components

宮

本

敬

久

（九州大学大学院農学研究院）

Takahisa Miyamoto（Faculty of Agriculture, Kyushu University）

Presence of Extended Spectrum Beta-Lactamase-producing E. coli（ESBLEC）in food is
a risk to human health. From 9 meat samples, 10 lytic phages against ESBLEC isolates andenterohaemorrhagic E. coli were successfully isolated by using ESBLEC strains andenterohaemorrhagic E. coli as the hosts. The 10 purified phages were spotted onto double
layer TSA embedded with each of the ESBLEC isolates for the determination of lytic spectra.
Among the 10 phages, 2 phages showed the broadest lytic spectra against ESBLEC. Viablecounts of ESBLEC in liquid medium with the phage cocktail reduced by 2 and 1.3 log CFU/ml
at 25 and 5℃，respectively, after incubation for 6 h, compared to that of control without phage
cocktail.
To identify the genes involved in phage resistance of bacteria, the phage sensitivity ofsingle gene-deficient strain of E. coli was examined. As a result of screening using a 96-wellplate, 10 strains including Δ rpe strain showed strong phage sensitivity among the single genedeficient E. coli strains tested. The time-dependent changes of the viable counts in thepresence of the lytic phage, viable count of E. coli Δ rpe was 4.7 log lower than that of the wild
type E. coli after 12 h of cultivation. The viable count was 2.6 log lower even after 24 h ofcultivation as compared with that of the wild type strain. The same tendency was also shownin the other 9 strains, suggesting that the inhibition of the function of these genes might
suppress the growth of phage-resistant bacteria.

１．目

し て 重 症 化 し ，死 亡 す る こ と も あ る 。さ ら に的Extended Spectrum Beta-Lactamase（ESBL）- 産腸管出血性大腸菌を原因とする食中毒は，ベロ

生大腸菌など，広範な抗生物質に耐性な食中毒細毒素（VT）産生性大腸菌Ｏ157等により ，飲食菌の割合も増えてきており，感染者の治療においチェーン店の食事（サイコロステーキ）や焼きて大きな問題となっているため抗生物質に依存し肉，ユッケのような畜肉製品を原因として発生しない食中毒細菌対策も必要とされている。この対ている。特に小児や高齢者は本菌の産生するVT

策の一つの可能性としてファージがある ２，３）。

の細胞毒性により溶血性尿毒症症候群などを発症

ファージは非常に特異性が高いので，一種の食中１）© The Ito Foundation

ファージおよび食品成分等による食肉の安全確保に関する研究

113

毒細菌種についても菌株ごとにファージ感受性が100μlと前培養した宿主菌液100μlを混合して異なることが多い 。今後，加工食品のロングラ

37℃で30min培養した。これを，上記と同様にしイフ化は進むと思われ，品質が高いことから特にてプラークを形成させた。確認されたプラークをチルド流通による加熱殺菌後の食品のロングライ

滅菌済みのメスで切り抜き，前培養した宿主菌液フ化が期待されている。このため，抗生物質耐性

１mlとともに1.5mlチューブに加えた。十分にボ菌も含む主要な食中毒細菌の溶菌ファージの単離

ルテックスした後に，37℃で一晩振とう培養し，を行い，低温流通食品においても食中毒菌を制御

フ ァ ー ジ を 増 殖 さ せ た 。培 養 液 を 遠 心 分 離可能な低温作用性のファージを見出す必要があ（12,000×g，４℃，５min）後，フィルターろ過る。さらにファージに対する耐性菌は細菌集団中（0.22μm）して溶液を回収した。これを３回繰りに必ず少数存在するので，この制御のためには耐返してファージの純化を行った。純化したファー

性 化 の 機 構 解 明 が 必 要 で あ る ５）。本 研 究 で はジ保存液は４℃で保存した。

４）

ファージに対する耐性菌発生の機構解明の糸口と2.2するため，大腸菌の一遺伝子欠損株ライブラリー

１mM CaCl２ 含有LB培地4.8mlに前培養した菌についてファージ感受性試験を行い，野生株より液100μlおよびファージ保存液100μlを加え，宿も感受性の高い遺伝子欠損株の検索を行って主菌の至適生育温度，５℃および25℃で振とう培

ファージ耐性化に関与すると思われる遺伝子の同養した。各培養時間にサンプリングを行い，PBS定を試みた。

bufferで希釈した後に１mM CaCl２含有TSA培地に

２．方

ファージの抗菌試験塗布した。37℃で一晩培養し，形成したコロニー法

数をカウントして生菌数を算出した。

2 . 1 抗生物質耐性大腸菌溶菌ファージの分離

2.3

ファージ耐性化に関与する遺伝子の同定

E. coli BW25113（野生株，WT）およびE. coli

および精製
福岡市内で購入した鶏肉および牛内臓を試料とBW25113単一遺伝子欠損株3,909菌株は国立遺伝した。試料50ｇを１mM CaCl２含有LB培地200ml

学研究所から購入した。この欠損株は，大腸菌のと混合し，15secストマッカー処理した。腸管出すべての遺伝子のうち非必須遺伝子をノックアウ

血性大腸菌O157：H７およびESBL産生大腸菌をトした生育可能変異株である。１mM CaCl２含有含む宿主菌液各100μlをストマッカー袋に添加

LB培地200μlを添加した96ウェルプレートに，爪し，37℃で一晩振とう培養した。培養液10mlを楊枝を用いて野生株と欠損株を播種し，37℃で２遠心分離（12,000×g，４℃，５min）後，フィルｈ振とう培養した。ファージ10μlを添加し，37℃

ターろ過（0.22μm）してファージ溶菌液を調製

で48ｈ振とう培養して濁度を０，６，48ｈに測定した。ファージ溶菌液10μlと前培養した宿主菌した。二次スクリーニングでは，一次スクリーニ

液100μlをマイクロ遠心管内で混合し，37℃でングにおいて48ｈに野生株と比較して濁度が低30min培養した。これを，加熱溶解して50℃に保かった欠損株について，初発菌数を10８CFU/ml

温 し た Top Agar 5 ml に 全 量 混 合 し ， １ mMにそろえ，１mM CaCl２含有LB培地200μlを添加

CaCl２含有TSA培地に重層し，37℃で一晩培養後，した96ウェルプレートに菌液10μlを播種し，10

溶菌班の有無を確認した。調製したファージ溶菌倍希釈したファージ保存液10μlを添加して37℃

液20μlをSM buffer180μlで段階希釈し，希釈液で48ｈ振とう培養した（ｎ＝３）。濁度を０，６，© The Ito Foundation

20/27（74）5/27（18.5）

10/27（37）

6/27（22.2）

2/27（7.4）

10/27（37）

３．結果と考察9/27（33.3）

No. ofinfectedisolate（%）

24，48ｈに測定して菌の増殖を調べた。

21/27（77.7）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）
3/27（11.1）

平成30年度5/27（18.5）

114+（+）: Strong lysis,（±）: Weak lysis, （－）: Non-lysis

－
－

－
+

+
－

±
±

－
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±
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±

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+
PBL116-1±－
PBL33-2

±

+

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－
PBL42-2－－
PBL126-1

±

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+

±

－

PBL5-1

－

+
±
±
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±
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+
+
±
+
+
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+
+

－
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±
±

－
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+
－

－
－

－
－

－

33

+
－

129
98

－
－
－
－
－

9
65

－
+

50
45

－
+

42
40

+
－

29
108 138
88
81
66

－

126 134 145© The Ito Foundation

PBL42-2

養６ｈ後および12ｈ後において生菌数が約10 ３+化を測定した結果をFig.２に示す。rpe欠損株は培PBL66-1

rpe欠損株についてファージ添加後の生菌数の変－が抑制されていないことが示された。この中で±程度まで濁度が増加したことから，完全に耐性化±た。しかし，さらに培養を継続すると野生株と同－ら，これらはファージ耐性が低い可能性が示されPBL9-1株と比較して培養48ｈ後の濁度が低かったことか

PBL33-1

10欠損株において，ファージ添加した場合，野生PBL42-1の力価10９PFU/mlに調整して行った。この結果，

64

リーニングを，初発菌数10８CFU/ml，ファージ

100 139なる挙動を示した計211欠損株について二次スク

95

211株であった。ファージ感染により野生株と異36

して濁度が低かった欠損株は3,909欠損株のうち±ファージを添加して培養48ｈ後に野生株と比較

31

ファージ耐性化に関与する遺伝子の同定
Table １ Host range of isolated phages against ESBL-producing E. coli

3.3

5

後に1.3桁，６ｈ後に1.3桁，24ｈ後に2.2桁低下した。

－

ESBL産生大腸菌の生菌数は２ｈ後に1.0桁，４ｈ

SHV group

度 で 増 殖 し た 。こ れ に 対 し て ５ ℃ の 培 養 で はTEM group

したが，その後ファージ無添加と同程度の生育速

Phage

菌の生菌数は初発菌数に比べて２ｈ後に２桁低下

ESBL-producing E. coli isolate

をFig.１に示す。25℃の培養ではESBL産生大腸

CTX-M1 group

けるESBL産生大腸菌に対する効果を調べた結果－のファージ混合液を用いて，25℃および５℃にお－広い宿主域を示したPBL66-1およびPBL116-1－

3 . 2 分離ファージの低温下での溶菌効果－

を広く溶菌した。

－

CTX-M2
group

ちの２種は宿主特異性が広く，ESBL産生大腸菌－

10種のファージが分離された（Table１）。このう－

血性大腸菌およびESBL産生大腸菌を宿主として－福岡市内で購入した生肉を９試料から，腸管出－CTX-M9group

離・精製

110 1163 . 1 抗生物質耐性大腸菌溶菌ファージの分

115

ファージおよび食品成分等による食肉の安全確保に関する研究
10

25℃

9
8
7
6
5
4

Control
Treatment

321Viable count（CFU/ml）

Viable count（CFU/ml）

10

5℃

9
8

Control

7

Treatment

6
5
4
3
2
1

0

10
20
Incubation time（h）

0

10
20
Incubation time（h）

Fig. 1 Effects of phage cocktail on viability of ESBLEC isolate at different temperature

Viable counts（log CFU/ml）

10
9
8
7
6
5

WT

4

WT + Phage

3

∆rpe

2

∆rpe + Phage

1

0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

40

44

48

Incubation time（h）
Fig. 2 Effects of phage S127 on viability of E. coli wild type and rpe deletion mutant

CFU/mlと最も減少し，野生株のファージ処理群

リン酸回路が機能せず，その結果，大腸菌の生育と同程度まで溶菌された。その後，生菌数は増加が悪くなることが報告されている７）。したがって，し，48ｈ後には野生株と同程度まで増加した。

rpe欠損はファージ耐性菌の生育にはペントース

rpe欠損株にファージを感染させた場合，６ｈ後リン酸回路が非常に重要であると考えられる。

から12ｈ後において生菌数の増加がみられなかっ細菌におけるファージ防御機構としてはすでにたことからファージ耐性菌の生育が遅延したこと

いくつかの説が報告されているが，未知の部分がが考えられる。rpeは解糖系の側路であるペントー

多い。その一つは，菌細胞表面に存在するファー

スリン酸回路において，リブロース５リン酸をキジ受容体の欠損によりファージが細菌に吸着できシルロース５リン酸に変換するＤ-リブロース-５

なくなり，細菌がファージ耐性を獲得する防御機-リン酸３-エピメラーゼをコードする遺伝子であ構である８）。単一遺伝子の欠損によりファージ受り，この回路はNADPHのような還元物質の産生

容体の欠損を阻害できれば，細菌のファージ耐性に重要である 。rpeの欠損により，ペントース

化の一部が制御可能になると考えられる。他の防６）© The Ito Foundation

116

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

御機構として，獲得免疫機構であるCRISPR/Cas

ｈ後に3.4桁低下したが，その後増加した。これ

システムがあげられる。CRISPR/Casシステムは，に対して５℃ではESBL産生大腸菌の生菌数は２ファージゲノムのような外来性遺伝子が菌体内にｈ後に1.0桁，４ｈ後に1.3桁，６ｈ後に1.3桁，24

侵入すると，その一部を切り出して記憶し，外来

ｈ後に2.2桁低下し，低温でも感染し，ファージ性遺伝子の再侵入時に切断する機構であり，細菌の増殖可能な温度に達した場合に溶菌することがのファージ感染への抵抗性に関与していることが示された。大腸菌の単一遺伝子を欠損させた3,909

報告されている９）。このCRISPR/Casシステムに

株のうち10欠損株において，ファージ添加した場

関与する遺伝子としてcmr遺伝子がある。しかし，合，野生株と比較して培養48ｈ後の濁度が低かっcmr遺伝子の欠損株に対しファージを感染させた

たが，さらに培養後には野生株と同程度まで生育

ところ，感染後６ｈ後において濁度の減少がみらした。これらの10欠損株はファージ耐性が低い可

れたものの，感染後48ｈ後において濁度は大きく能性が示された。これらの遺伝子の機能を解明増加した。このことから，CRISPR/Casシステム

し，その機能を抑制することで細菌のファージ耐関与遺伝子の単一欠損ではファージ耐性化を阻害

性化を抑制できると期待される。

することはできないと考えられた。その他の防御機 構 と し て ，細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス を 産 生 し て
ファージと受容体との結合を物理的に阻害する機構，ファージDNAの侵入を阻害する機構，細胞内に侵入したファージゲノムを切断する機構（制限修飾系），細胞集団を守るためファージ感染菌が自殺する機構などがある５）。少なくともこれらの防御機構が十分には機能せず，ファージによる溶菌後の耐性菌の生育が抑制された欠損株が10欠損株であると考察される。今回の実験では単一遺伝子欠損株を使用したが，ファージ感受性向上に関与したこれらの遺伝子を組み合わせた複数遺伝
子欠損株を作成してファージ耐性を調べることにより，ファージ耐性の機構が明らかになると期待
される。
４．要

約

腸管出血性大腸菌およびESBL産生大腸菌を宿主として10種のファージが分離された。このうちの２種は宿主特異性が広く，ESBL産生大腸菌を広く溶菌した。広い宿主域を示した２種のファージ混合液を用いて調べた結果，25℃の培養ではESBL産生大腸菌の生菌数は初発菌数に比べて２

文献１） Paton, J. C., Paton, A. W.：Pathogenesis anddiagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli
infections, Clinical microbiology reviews, 11（3）, 450～479, 1998.
２） Brovko, L. Y., Anany, H., Griffiths, M. W.：
Chapter 6 - Bacteriophages for Detection andControl of Bacterial Pathogens in Food and FoodProcessing Environment, In Jeyakuma Henry,
Advances in Food and Nutrition Research, pp. 241288, Academic Press, 2012.
３） Hagens, S., Loessner, M. J.：Bacteriophage forbiocontrol of foodborne pathogens：calculations andconsiderations, Current Pharmaceutical Biotechnology,
11（1）,58～68, 2010.
４） Ackermann, H.：Phage Classification andCharacterization, In Clokie, M. J., & Kropinski, A.,
pp. 127-140, Humana Press, 2009.
５） Labrie, S. J., Samson, J. E., Moineau, S.：
Bacteriophage resistance mechanisms, Nature
Reviews Microbiology, 8, 317～327, 2010.
６） Zaigao, T., Jing, C., Xueli, Z.：Systematicengineering of pentose phosphate pathway improves
Escherichia coli succinate production, Biotechnology
for Biofuels, 9, 262, 2016.
７） Lyngstadaas, A., Sprenger, G. A., Boye, E.：
Impaired growth of an Escherichia coli rpe mutant
lacking ribulose-5-phosphate epimerase activity,
Biochimica et Biophysica Acta, 1381, 319～330, 1998.
８） Hashemolhosseini, S., Holmes, Z., Mutschler, B.,
Henning, U.：Alterations of receptor specificities ofcoliphages of the T2 family, Journal of Molecular
Biology, 240, 2, 105～110, 1994.

© The Ito Foundation

ファージおよび食品成分等による食肉の安全確保に関する研究９） Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards,
M., Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., Horvath,
P.：CRISPR provides acquired resistance against
viruses in prokaryotes, Science, 315, 5819, 1709～
1712, 2007.

© The Ito Foundation

117

118

薬剤耐性菌のガスプラズマ殺菌機構解明に向けた
分子論的アプローチ
Analysis of disinfection mechanisms of drug-resistant bacteria by gas
plasma using molecular theoretical approach

作

道

章

一１・三

沢

達

也２

（１琉球大学医学部保健学科生体代謝学分野，２佐賀大学大学院工学系研究科電気電子工学専攻）

Akikazu Sakudo１ and Tatsuya Misawa２（１Laboratory of Biometabolic Chemistry, School of Health Sciences, University of the Ryukyus,
２Department of Electrical and Electronic Engineering, Faculty of Science and Engineering, Saga University）

We previously demonstrated that gas plasma is effective against both drug-resistant andnon-resistant bacteria in a study using Escherichia coli transformed with a plasmid encoding
an ampicillin-resistant gene and treated with a dielectric barrier discharge（DBD）plasma
torch. In the present study, we further investigated the mechanisms by which the DBD plasma
torch disinfects drug-resistant and non-resistant bacteria. A DBD plasma torch was applied tosuspensions of E. coli transformed with a chloramphenicol acetyltransferase （CAT）-expressing plasmid and cultured in ampicillin-containing or non-drug containing medium.
The results showed that CAT was reduced under both conditions in a time-dependent
manner, suggesting that the gas plasma similarly inactivated proteins in both E. colisuspensions. Electron spin resonance spectroscopy has shown that the plasma torch generates
reactive chemical species, including hydrogen radical（H･）and hydroxyl radical（OH･）, whichmay contribute to the inactivation of proteins. Taken together, these findings suggest that theprotein inactivation, possibly due to oxidation by reactive chemical species, may at least in part
contribute to the mechanism of action of gas plasma. Consequently, the mechanism ofinactivation is unlikely to differ between drug-resistant and normal bacteria. Therefore, thisplasma method may be especially useful for eliminating not only normal bacteria but also
drug-resistant bacteria.

１．目

耐性菌であるとされる１）。これらのことから，薬的剤に頼らない形での食品の殺菌技術が必要とされ近年，サルモネラなどの細菌の薬剤耐性化が世ている。

界的問題となっている。例えば，米国では食肉汚

最近，申請者らは，物理的処理技術の一つであ染サルモネラの80％以上が薬剤耐性菌であり，さるガスプラズマを用いて，サルモネラを含むさま

らに50％以上が多剤耐性菌であると報告されていざまな細菌の殺菌に成功した４～６）。さらに，大気る１～３）。また，我が国のサルモネラも多くが薬剤

圧プラズマトーチを用いて薬剤耐性菌と非耐性菌© The Ito Foundation

薬剤耐性菌のガスプラズマ殺菌機構解明に向けた分子論的アプローチ

119のガスプラズマ感受性が同じであることを明らか子を持つプラスミドであるpPRO-EX-HT-CATにした 。

（Life Technologies）をトランスフォーメーショ

７）

一方，ガスプラズマによる殺菌メカニズムにはン後にアンピシリン（50mg/L）を含むLB（Luria

いまだ不明な部分が多く，ガスプラズマ発生時にBroth）寒天培地でセレクションを行い，出現し起こる種々の物理および化学過程は十分には解明たコロニーをピックアップ後にアンピシリン

されていない。そのようななか，分光技術の発展（50mg/L）を含むLB液体培地かもしくはアンピ

により，物理化学反応メカニズムの解明への分子シリンを含まないLB液体培地中で37℃，24時間

論的アプローチが活発化しつつあることに着目し培養して得られたE. coliを使用した。

た。本研究では，まず大気圧プラズマトーチにお2.3

けるガスプラズマの反応過程を電子スピン共鳴

プラスミドの導入（トランスフォーメーショ（ESR）により分子レベルで解析を行った。さらに，ガスプラズマが菌体にどのように反応するのかを理解し，ガスプラズマによる殺菌メカニズム

トランスフォーメーション

ン）は常法９）に従い行った。
2 . 4 Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）

を明らかにする目的で，ガスプラズマ処理により

CAT ELISA（CAT No. 11 363 727 001，Roche）

もたらされる菌のタンパク質成分の変化を生化学を用いて，インストラクションに従いCATの定解析した。

量を行った。

２．方

2.5

法

電子スピン共鳴（ESR）

ラジカル捕捉剤として，DMPO（5,5-Dimethyl-2 . 1 大 気 圧 プ ラ ズ マ ト ー チ と 大 腸 菌

1-pyrroline N-oxide）（京都スピンラボ）を使用した。まず，2.0mlのマイクロチューブ中に1.0ml

Escherichia coliのガスプラズマ処理
絶縁体である筒状のセラミックスの周囲を銅板の100mM DMPO溶液を調整し，そこに溶存酸素で覆い，筒内部に金属のメッシュを配置したプラを除去するためにエアーポンプを用いて５分間窒

ズマトーチを用いた８）。銅板とメッシュ間に電圧

素ガス（流量1.0L/min）でバブリングした。その10kV，周波数10kHzの高周波パルスを印加し，後，大気圧プラズマトーチの筒先端から100mM

誘 電 体 バ リ ア 放 電 （DBD ： Dielectric barrier

DMPOの液体表面との距離を10mmに保ちプラズ

discharge）によるガスプラズマを発生させた。

マ処理（窒素ガス流量1.0L/min）を行った。プラ

生成したガスプラズマは，エアーポンプ（水作：

ズマ処理後のDMPO溶液からヘマトクリット管

水心SSPP-2S）を用いて筒先端から3.5L/minの流を用いて一部を採取し，これを石英管の上に置量で放出させた。E. coliサンプルは時計皿上に20き，ESR分光計（TE-100，日本電子株式会社）でμL滴下し，筒先端までの距離を20mmに固定し測 定 し た （測 定 条 件 ： マ イ ク ロ 波 周 波 数処理を行った。

9.428GHz，掃引時間60秒，磁場335.6±5.0mT，変2.2

調幅0.10mT，変調周波数100kHz，時定数30msec，

供試細菌と培養供 試 細 菌 と し て E. coli （DH5αCompetent

検出器ゲイン125～500）。ESR信号の強度を比較

Cells, Takara bio）を用いた。プラズマ処理に供するために，Mn（Ⅱ）イオンを酸化マグネシウ

す る サ ン プ ル は ，ア ン ピ シ リ ン 耐 性 遺 伝 子 とムの結晶にドープした外部標準試料（ESRスペク

Chloramphenicol acetyltransferase（CAT）遺伝

トルの左右両側に観測される２本の信号）を使用© The Ito Foundation

120

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

し，そのESRキャビティー内への挿入位置の制御

地および非含有LB液体培地中で24時間培養した。

には日本電子株式会社製のデジタルマンガンマー

それらから回収したDH5αに対して大気圧プラカーを使用した。これらのシグナルを用いてｇ値ズマトーチを用いた処理を行った。そうして得らの推定を行った。

れたDH5αペレット中のCATの量をELISAによ

2.6

統計解析

り定量した結果，プラズマ処理によりいずれのGraphPad Prism 7（GraphPad Software）を 用

DH5αでもCATが減少し，pPRO-EX-HT-CAT

いてNon-repeated ANOVA followed by Bonferroni

をトランスフォーメーション・セレクションした

correctionにより有意差検定を行った。なお，数DH5αをアンピシリン非含有LB液体培地で培養

値 は 平 均 ± SEM（standard error of the mean）

したものはガスプラズマ処理前（０min）のCATで表示した。

量は0.3961±0.0182ng/ml（0min）であったのに
対 し ，１ min の プ ラ ズ マ 処 理 に よ り 0.0344 ±

３．結果と考察

0.0004ng/ml へ と ，２ min の プ ラ ズ マ 処 理 で はまず，ガスプラズマ処理がE. coliの構成成分に0.0339±0.0004ng/mlへと有意にCAT量が減少し与える影響を明らかにするために，CATを発現た（Fig.１）。また，pPRO-EX-HT-CATをトラするプラスミドをトランスフォーメーションしたン ス フ ォ ー メ ー シ ョ ン・セ レ ク シ ョ ン し た

DH5αに対して大気圧プラズマトーチを用いた

DH5αをアンピシリン含有LB液体培地で培養し処理を行った後，ELISAによりCATの定量を行った も の に つ い て も 3147.7302 ± 224.9762ng/ml

た。

（0min）と 0.0325 ± 0.0001ng/ml（1min）お よ び

具 体 的 に は ，ま ず DH5α に pPRO-EX-HT-

0.0335±0.0009ng/ml（2min）であり，いずれのCATをトランスフォーメーションし，アンピシ

時間においても０minと比較して有意なCATの減リン含有LB寒天培地で一晩セレクション後，コ

少が観察された（Fig.２）。

ロニーをピックアップした。そのコロニーをLB

次に，大気圧プラズマトーチにおけるガスプラ

液体培地に懸濁し，アンピシリン含有LB液体培

ズマの反応過程を調べるため，ESRを用いて解析

0.5

CAT [ng/ml］

0.4
0.3
0.2
0.1
0.0

＊＊
Amp
（－）
０min

＊＊

Amp
（－）
１min Amp（－）
２min

Fig. 1 E. coli cells transformed with pPRO-EX-HT-CAT and selected in ampicillin-containing LB agar were

proliferated in non-drug-containing LB liquid medium（Amp（-））and then subjected to plasma torch treatment.
for 0-2 min. The quantities of CAT in the cells were subsequently measured by CAT ELISA. ＊＊p＜0.01（vs 0 min）

© The Ito Foundation

薬剤耐性菌のガスプラズマ殺菌機構解明に向けた分子論的アプローチ

121

CAT [ng/ml］

4000

3000

2000

1000
＊＊

0

Amp
（＋）
０min

＊＊

Amp
（＋）
１min Amp（＋）
２min

Fig. 2 E. coli cells transformed with pPRO-EX-HT-CAT and selected in ampicillin-containing LB agar were

proliferated in ampicillin-containing LB liquid medium（Amp（＋））and then subjected to plasma torch treatment.
for 0-2 min. The quantities of CAT in the cells were subsequently measured by CAT ELISA. ＊＊p＜0.01（vs 0 min）

［ｇ］

2.03

†

332

2.02

＊

2.01

2.00

＊

＊

†

334

†

†

1.99

＊

336
338
Magnetic ﬁeld［mT］

1.98

†

340

Fig. 3 Electron spin resonance spectroscopy（ESR）detected radicals generated during DBD plasma torch operation.

ESR spectra of spin adducts in aqueous solutions irradiated using a DBD plasma torch with nitrogen at 1.0 L/min
for 10 min after bubbling with nitrogen gas. ESR spectrum of DMPO shows a 1 ： 2 ： 2 ： 1 quartet of DMPO-OH（＊）and several other small peaks due to DMPO-H（†）.

を行った。大気圧プラズマトーチによって生成さであり，後者は，DMPOの２位に水素原子が付れたフリーラジカルを検出するために，ラジカル

加したDMPO/Hラジカルと帰属された。これら

捕捉剤DMPOを用いてESRの測定を行った。得らの結果より，プラズマ照射によりOHラジカルやれたESRスペクトルを見ると，信号強度比が１：Ｈラジカルが水中で生成したものと考えられた

２：２：１の４本線の強い信号が主成分であり，（Fig.３）。

この他に弱い信号（見かけは５本，実際は９本）

本研究により，ガスプラズマ発生に伴い，OHが観測された。解析の結果，前者はDMPOの２ラジカルやＨラジカルが発生することが確認され位にOHラジカルが付加したDMPO/OHラジカルた。さらに，ガスプラズマ処理後のE.coliのCAT© The Ito Foundation

122

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）を定量した結果，経時的にCATが減少することは無関係に生じる変化であるため，ガスプラズマが明らかとなった。これらの結果より，ガスプラ

は薬剤耐性菌に対しても有効と考えられた。

ズマは活性種（ラジカル等）の効果で酸化ストレス作用をもたらしてタンパク質を不活化し，殺菌作用を示したものと考えられた。しかし，OHラ
ジカルとＨラジカルはタンパク質以外にもさまざ
まな化学物質と反応して酸化生成物を変換する可能性がある。したがって，これらのラジカルによりタンパク質以外のどのような菌体構成成分の変化も誘導されるのかについて，今後詳細に解析することで殺菌メカニズムがより明確化するものと考えられる。
４．要約

これまでに，大気圧プラズマトーチを用いた解析で，ガスプラズマ処理による薬剤耐性菌と非耐性菌の感受性に違いがないことが明らかになっている。本研究では，その殺菌メカニズムを明らかにするため，ELISAによる菌体タンパク質の定量とESRによるガスプラズマ成分の解析を行った。その結果，CATがガスプラズマ処理により減少することとガスプラズマ中にはOHラジカル
やＨラジカルが含まれていることが分かった。これらのことから，OHラジカルやＨラジカルなどの活性種がタンパク質に作用して，菌を殺菌した可能性が考えられた。一方で，活性種はタンパク質以外の成分にも作用する可能性があるため，他の菌体成分の解析も必要と考えられた。タンパク質の変化などこれまで明らかとなったガスプラズ

文献１） 伊藤均：薬剤耐性細菌の放射線殺菌効果，食品照射，41（１-２），９～13，2006.
２） Hofacre, C. L., White, D. G., Maurer, J. J., Morales,
C., Lobsinger, C., Hudson, C.：Characterization of
antibiotic-resistant bacteria in rendered animal
products, Avian Dis., 45（4）,953～961, 2001.
３） Sofos, J. N., Kochevar, S. L., Bellinger, G. R.,
Buege, D. R., Hancock, D. D., Ingham, S. C., Morgan,
J. B., Reagan, J. O., Smith, G. C.：Sources and extent
of microbiological contamination of beef carcasses inseven United States slaughtering plants, J. Food.
Prot., 62（2）,140～145, 1999.
４） Shintani, H., Sakudo, A.：Gas Plasma Sterilizationin Microbiology：Theory, Applications, Pitfalls and
New Perspectives, Caister Academic Press, Poole,UK, 2016.
５） Sakudo, A., Shintani, H.：Sterilization anddisinfection by plasma：Sterilization mechanisms,
biological and medical applications, NOVA Science
Publishers, Hauppauge, New York, 2011.
６） Maeda, K., Toyokawa, Y., Shimizu, N., Imanishi, Y.,
Sakudo, A.：Inactivation of Salmonella by nitrogengas plasma generated by a static induction thyristor
as a pulsed power supply, Food Control, 52, 54～59,
2015.
７） 作道章一，山城梨沙，三沢達也：薬剤耐性菌のガ
スプラズマ殺菌効果とメカニズム解析，平成29年度
食肉に関する助成研究調査成果報告書，公益財団法人伊藤記念財団，36，３～７，2018.
８） Sakudo, A., Miyagi, H., Horikawa, T., Yamashiro,R., Misawa, T.：Treatment of Helicobacter pylori
with dielectric barrier discharge plasma causes UV
induced damage to genomic DNA leading to cell
death, Chemosphere, 200, 366～372, 2018.
９） Green, M. R., Sambrook, J.：Molecular Cloning：
A Laboratory Manual（Fourth Edition）, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York, 2012.

マ処理による菌体成分の変化は薬剤耐性の有無と© The Ito Foundation

123

電気定数測定に基づく食肉の鮮度評価
Evaluation of meat freshness based on measurement of its electricalproperties

齊

藤

一

幸

（千葉大学フロンティア医工学センター）

Kazuyuki Saito（Center for Frontier Medical Engineering, Chiba University）

The author has been studying biological tissue characterization by the electromagnetic
field. Possibilities of characterization depends on frequency of the electromagnetic field. For
example, aspect of cells in the biological tissue can be observed by mm wave（around several
tens of GHz or higher）. However, it is not easy to realize, because it must be employed several
expensive devices and is needed high precision measurements. Therefore, in this study, theelectric current around several hundreds kHz is injected into the biological tissue and relative
permittivity and conductivity of the tissue are derived. From measured relative permittivities
and conductivities of the tissues, it has found that these values depend on their freshness.
Therefore, it is considered that the meat freshness can be estimated by many measured results
under various conditions. Moreover, in this study, simplify of the measurement have also beenstudied. At this time, the relative permittivity and the conductivity of the tissue which is filled
into an acrylic cylinder have been measured. In order to simplify the measurement,
measurement system without the acrylic cylinder has been investigated by use of numericalcomputations. In this case, using the various shapes of a pair electrodes can be considered. As
a result, possibilities of the measurement simplification could be found. As a further study,
more simplified electrodes should be investigated and the freshness of the meat should bemeasured by the simplified measurement system.

１．目があることは言うまでもなく，また，これらを判的断するには，多少なりとも経験が必要である。

本研究では，食肉の新鮮度をその電気定数に基ところで，筆者らのこれまでの経験によれば，づいて，簡便かつ高速に測定可能な装置を開発す

動物性食品の電気定数（誘電率・導電率）は，鮮るための基礎検討を行う。今日，例えば，我々が度が落ちる，すなわち，生産から日数が経つにつ個人で食肉の鮮度を判断するには，色，硬さ，にれて大きく変化することが分かった。この現象

おいといった情報を判断基準に用いる。しかしなは，数kHz～数十MHzのHigh Frequency（HF）

がら，これらの“パラメータ”は，感じ方に個人差

帯程度の周波数帯で顕著に観測されるものの，そ© The Ito Foundation

124

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

れよりも高い，例えばマイクロ波帯では観測でき

内に食品用プラスチックラップに包んで放置し，ない。これは，こういった高周波数帯では，その毎日１回，電気定数の測定を行ってその経日変化

エネルギーが電流ではなく電磁波として物質中をを記録した。通常，食肉は冷蔵庫内で保存される伝搬するため，上記のような細胞状態の変化に応ことが多い。したがって本研究での測定は，一種じた電気定数変化は現れないと考えられるためでの加速試験と考えられる。

ある。なお，類似の考えにより，過去には魚肉の測定サンプルは，測定のたびごとに直径30mm

鮮度とそのインピーダンスの関係が議論されていのアクリル円筒に隙間なく充填し，その両端に銅る。しかしながら，こういった研究は少数で板の円形電極を配置した。試料からは時間経過にあり，また，食肉に関する研究も筆者が知る限り

よってドリップが発生し，組織の体積が縮小した

ごく少数しか行われていないようである 。

ため，異なる長さのアクリル円筒を用意し，測定

１，
２）

３）

上記のように，電気定数測定により鮮度判定がごとに小型のものへ試料を移し替えることで電極できれば，色，硬さ，においといったような感じ

間が常に試料で満たされるようにした。なお，こ方に個人差が大きいパラメータに基づく必要がな

れらの試料は，同一の豚肝臓よりトリミングした

くなり，非常に有用であると考えられる。なお，４片である。

こういった測定システムでの鮮度判定を実現する

試料はLCRメータ（Waynee Kerr Electronicsには，さまざまな種類の食肉においてさまざまな社製 6530Ｂ）に接続し，２端子法により電極間状態（鮮度）での電気定数測定を行い，それらののインピーダンスを測定した（Fig.１）。測定周

データを蓄積する必要がある。しかしながら，現

波数は100kHzである。そして，その結果から試時点で，HF帯における電気定数測定は容易では料の比誘電率・導電率を算出した。また，被測定ない。筆者らが所有する測定器では，直径および対象が置かれていた部屋の室温を同時に記録した。

長さがともに数cmのサンプルホルダに，被測定以上により収集した電気定数測定結果を経日変物を隙間なく充填した後，サンプルホルダ両端に化としてまとめ，鮮度が劣化する過程で，どのよ

装荷された電極間のインピーダンスをLCRメータ

うに測定結果が変化するのかを見出す。この結果で測定し，それを誘電率・導電率に変換する。しを用いれば，鮮度が未知の食肉であっても，そのたがってこの測定の過程では，被測定物を“破壊”電気定数を測定することで，生産からの日数を割しなければならず手間も多い。そこで本研究でり出すこともできる。

は，HF帯における電気定数測定用の簡易な電極，

次に，本研究では，測定システムの簡素化を目

すなわち，食肉の簡易な鮮度測定システムの開発指す。現行の測定システムでは，被測定物を両端を目指して，その基礎的検討も行った。

に電極が装荷されたサンプルホルダ（Fig.１）に

２．方

隙間なく充填しなければならないため，侵襲的で法あり，どこでも手軽に扱えるというものではな

まず，食肉電気定数の鮮度依存に関する測定をい。そこで本研究では，被測定物に接触するだけ行う。測定対象として，新鮮な豚レバーを選択しでその電気定数測定を行うことができる電極構造

た。豚レバーは，安価かつ入手しやすく，また，を明らかにする。被測定対象の電気定数は，マイ

鮮度の低下が見た目でも分かりやすいため選択しクロ波のような高い周波数帯では，信号を電磁波た。測定サンプルは，比較的室温の高い計算機室として考えるため，同軸型プローブを被測定対象© The Ito Foundation

125

電気定数測定に基づく食肉の鮮度評価に接触させ，そこからの反射信号を解析することい。そこで本研究ではその初期段階として，肉塊で，物質の電気定数を知ることができる 。これ（被測定物）に電極を刺入しただけの簡単な構造に対して，本研究で測定を行うマイクロ波帯よりで，そのインピーダンス測定が可能かどうかを数も低い周波数帯のHF帯においては，被測定物に値電磁界解析によって検討した。

４）一対の電極を密着させ電流を注入し，電極間の電３．結果と考察

圧と電流の大きさ，およびそれらの位相差によって電気定数を決定する。したがって，サンプルホ

Fig.１に，サンプルホルダに被測定対象を充填

ルダを必要とせず，かつ，被測定対象に確実に電し，LCRメータにてその電気定数を測定している流を注入できる電極構造を見出さなければならな様子を示す。この測定では，測定時に配線の影響

1.0
0.2

SamplesA
B

Relative permittivity（normalized）

Relative permittivity（normalized）

Fig. 1 Measurement of electrical properties by LCR meter

C
D

0.1

0.0

0

1

2

3
Day

4

5

1.0

0.6

0.2
0

3.0
Samples

0.0

0

1

2

3
Day

4

A
B

C
D
5

6

Room temperature [oC]

Conductivity [S/m]（normalized）

4.0

1.0

4

8

12
Hour

16

20

24

（b）Relative permittivity（time variation）（a）Relative permittivity（daily variation）

2.0

C
F

0.4

0.0

6

Samples
A
B
D
E

0.8

30
25
20

0

（c）Conductivity（daily variation）
Fig. 2 Measured electrical properties and room temperature© The Ito Foundation

1

2

3
Day

4

（d）Room temperature

5

6

126

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）が現れないよう，サンプルホルダに装荷した円形

time domain：有 限 差 分 時 間 領 域）法 ６）を 用 い電極とLCRメータ本体は可能な限り近接させて接る。この手法は，今日，多種多様な数値電磁界解

続した。Fig.２に，測定結果を示す。Fig.2
（a）
（c）
，

析 に 用 い ら れ る 方 法 で あ る 。Fig.3（a）に示すはそれぞれ，比誘電率，導電率の経日変化である。

ギャップ部分に，同図（b）に示すガウシアンパル

これらの値は，初回の測定値を1.0として規格化

ス電圧を印加し，その時に流れる電流で除し，さした。Fig.2（d）は，測定サンプルを放置した部屋

らにこれをフーリエ変換することで，電極間のイの室温の経時変化であり，室温は約21～27℃程度

ンピーダンスを算出することができる。Fig.3（c）であった。Fig.2（a）より，比誘電率は，測定開始

は，肉塊の電気定数を“εr＝5,000，σ＝0.5 S/m”

後１日で急激に低下し，さらにその後，ゆっくりおよび“εr＝5,000，σ＝1.0 S/m”に設定した際と 低 下 傾 向 を 示 す こ と が 分 か っ た 。そ こ で ，の電極間のインピーダンス計算結果である。周波Fig.2（b）には，この測定開始後24時間の比誘電率

数が２MHz程度以下の場合に，肉塊の電気定数測定結果を示した。この測定では，被測定対象のが変化することによって，電極間のインピーダン

電気定数変化を確実に捉えるため，サンプル数をスも有意に変化することが分かる。したがって，

同図（a）
よりも増やした。一方，導電率は，測定この程度の周波数の信号を電極間に印加すること

開始から５日間ほど上昇し，その後は，大きく変によって，肉塊の電気定数変化，すなわち鮮度の化しないことが分かった。２節で述べたように，測定が可能であると考えられる。

被測定サンプルは室温中に放置しているため，一そこで，周波数を１MHzに設定し，電極間の種の加速試験と考えられる。したがって通常の冷

肉塊の電気定数をさまざまに変化させた場合の電蔵保存であれば，この急激な比誘電率変化は数日

極間インピーダンス計算結果をFig.４に示す。こ間をかけて生じる現象であると考えられる。このこで，Fig.4（a）（b）はそれぞれインピーダンスの，点については，今後，さらなる検討が必要である

実部，虚部である。この結果より，肉塊の電気定と考えている。一方，導電率は，測定開始後に徐々数が変化すると，電極間のインピーダンスも大きに値が上昇するものの，その時間上昇率はそれほく変動することが分かる。特に，この場合には，

ど大きくないため，この試料の場合は，比誘電率

インピーダンス虚部が，肉塊のε r とσの双方の変化の方が鮮度測定に適していると考えられる。

変化を反映している。したがって，Fig.１に示す

これらの変化は，被測定対象の品質劣化によっように被測定対象をサンプルホルダに充填するこて，それを構成する細胞膜が破れ，その結果としとなく，その電気定数（鮮度）を評価できる可能て細胞での静電容量が低下するためであると考え性があることが分かった。

られる 。
５）

次に，HF帯における電気定数測定用の簡易な

４．要約電極を開発するための基礎検討に関する結果を示

本研究では，食用の豚レバーの鮮度をその電気す。Fig.3（a）に，この検討に用いた数値電磁界解定数を測定することで推定できる可能性があるこ析モデルを示す。このモデルでは，一対の方形電とを見出した。すなわち，鮮度が低下するとその極を肉塊に刺入し，それらの電極に接続した導線

電気定数が変化するため，この変化の度合いに応のギャップ部分でのインピーダンスを測定する。

じて，鮮度を定量的な物理量として定義すること

数 値 電 磁 界 解 析 に は ，FDTD（finite differenceが可能である。本研究ではさらに，測定方法の簡© The Ito Foundation

127

電気定数測定に基づく食肉の鮮度評価

z

x

y

Electrode
20mm×30mm

Sample(piece of
meat)

Gap
(Observation pointof impedance)

Calculation space (x×y×z)
102×80×100(a) Calculation model
80

0.8

Resistance [Ω]Voltage [V]

1.0

0.6
0.4
0.2
0.0
0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

‐10

Reactance [Ω]

0.8
0.6

2.0

4.0
6.0
Frequency [MHz]

0.2

0.4
0.6
Frequency [GHz]

0.8

1.0

‐40
0.0

(b) Input signal

2.0

4.0

6.0

8.0

Frequency [MHz](c) Calculated input impedanceFig. 3 Calculation model and results© The Ito Foundation

10.0

εr =5,000
σ=0.5 S/m

‐30

fmax =1GHz

0.2

8.0

εr =5,000
σ=1.0 S/m

‐20

0.4

εr =5,000
σ=1.0 S/m

20

0

1.0
Voltage (normalized)

40

0
0.0

10.0

Time×10‐9 [s]

0.0
0.0

60

εr =5,000
σ=0.5 S/m

10.0

平成30年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

1.3

45

1.1
30
0.9
15

0.7
0.5
3.0

3.6

4.2

4.8

5.4

6.0

0

Conductivityσ [S/m]60

Resistance [Ω]Conductivityσ[S/m]

1.5

1.5

0

1.3

‐10

1.1

‐20

0.9

‐30

0.7

‐40

0.5
3.0

Reactance [Ω]

128

3.6

4.2

4.8

5.4

6.0

‐50

Relative permittivity εr×103

Relative permittivity εr×103(a) Calculated input impedance (real part)(b) Calculated input impedance (imaginary part)Fig. 4 Calculated input impedance under various electrical properties

易化についても検討し，従来のように被測定物をサンプルホルダに充填しなくてもその電気定数を測定できる可能性があることを見出した。
文
献１） 北村豊，藤浦建史，中尾清治，豊田浄彦：インピー
ダンス計測法の食品分野への応用―保存中の魚肉におけるインピーダンス変化―，農業機械学会第57回
大会講演要旨，pp.303-304，1998.
２） 加藤宏郎，坂口守彦，大井康之，丸尾信，豊田薫：
インピーダンス特性による魚肉の鮮度判定，農業機械学会第57回大会講演要旨，pp.305-306，1998．

３） 佐藤幸男，梅沢長一：獣肉，魚肉の電気抵抗と鮮度に関する研究，日本獣医師会雑誌，vol.18, pp.389392，1965.
４） Blackham, D. V., Pollard, R. D.：An improved
technique for permittivity measurements using a
coaxial probe, IEEE Transactions on Instrumentationand Measurement, 46, 1093～1099, 1997.
５） 電気学会 高周波電磁界の生体効果に関する計測技術調査専門委員会 編：電磁界の生体効果と計測，
コロナ社，1995.
６） Yee, K. S.：Numerical solution of initial boundary
value problems involving Maxwell's equation in
isotropic media, IEEE Transaction on Antennas andPropagation, 14, 302～307, 1966.

© The Ito Foundation

129

可視・近赤外分光イメージングと深層学習を併用した
食肉加工品のスマート品質管理
Smart quality management of meat processed products using visible andnear-infrared multispectral imaging combined with deep learning

牧

野

義

雄・チャオフイフォン（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Yoshio Makino and Chao-Hui Feng
（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

The development of Artificial Intelligence（AI）is remarkable, and it has been introduced
in all fields in society, but its application in the field of livestock is not sufficient. Therefore, inthis research, we will develop a system that targets sliced sausages, inputs two-dimensional
spectral data measured using a hyperspectral camera into AI, and nondestructively predicts
the adenosine-5’-triphosphate（ATP）concentration that is an index of freshness and decay ofsliced sausages. The samples were stored for 5 d at 35℃ and 15％ relative humidity, andspectroscopic analysis and ATP measurement were performed over time. Since the ATPconcentration tended to increase with time, it was revealed that the deterioration duringstorage was more likely to be due to rotten ATP than to the decrease in ATP concentration
due to the decrease in freshness. Furthermore, when an attempt was made to predict using AI（machine learning）, it is possible to predict the ATP concentration with an accuracy of acoefficient of determination of 0.86 or more and an average square error of 0.14 mmol・L －１ orless. The method proposed in this study was considered to be effective for nondestructive
evaluation of the quality of sliced sausage by AI.

１．目

ルで関連付ける手法である。

的

一方，人工知能（AI）は，近年進歩が著しい

申請者らは過去に，可視・近赤外分光画像と多分類・予測技術として知られる５）。なかでも，画変量解析を併用した食肉加工品の品質管理に関す

像認識の分野で威力を発揮し，医学分野におけるる研究に取り組んできた。ソーセージの抗酸化性

医療用画像診断や，気象学分野における衛生雲画

等理化学的特性１，２），表面色３），pH４）の空間分布

像診断においてAIの利用が進められ，現在は医や経時変化を可視化により非破壊評価した。その師や気象予報士の能力を上回る精度で病変を発見際，多変量解析で最も多用されている偏最小２乗

したり６），降水確率を予測する７）ことが実証され回帰分析（PLSR）は，入力変数である「分光吸ている。

収／反射スペクトルデータ」と出力変数である

そこで本研究では，AIに分光スペクトルを学「理化学特性」，「衛生状態」との関係を線形モデ

習させることにより，食肉加工品の理化学特性を© The Ito Foundation

130

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

高い精度で把握できることを実証する。AIの場

し，ランダムに３つのグループ（Group Ⅰ25枚，合，入力データが多くなるほど分類・予測精度が１ｄ貯蔵；Group Ⅱ26枚，３ｄ貯蔵；Group Ⅲ

上がることが知られていることから，分光分析

24枚，５ｄ貯蔵）に分割した。なお，貯蔵環境は

データのようなビッグデータは，AIの能力を発

35℃，相対湿度15％とした。

揮させるには適切な応用分野と考えられる。

試料をハイパースペクトルカメラ（Fig.１）で本研究では特に，スライスソーセージ中のアデ

経時的に撮影し，分光吸収スペクトルデータを得

ノシン-5’-三リン酸（ATP）濃度の経時変化を調た。ハイパースペクトルカメラのハードウエア

べることとした。新鮮なソーセージには高い濃度（JFEテクノリサーチ（株））について説明する。

のATPが含まれ，鮮度低下とともに濃度が減少

光源は150Ｗキセノンランプと150Ｗタングステ

することが知られている。一方，ATPは微生物

ン-ハロゲンランプの混合光源を使用し，可視～数評価の指標としても知られていることから，腐近赤外の広い範囲で強い光照射を可能にすること

敗とともに増えることが予想される。このため，により，測定精度を向上させる。光センサーは12ソーセージの品質低下とともにATP濃度の低下

ビット（4096諧調）の精度で光の強弱を判定できと上昇が同時進行すると考えられるが，ATP濃るCCDカメラ，分光器は透過型回折格子，レン度に基づいてソーセージの品質評価を試みた研究

ズは16mmのものを使用した。すべての光学部品例は見当たらない。そこで本研究では，AIによは光学ベンチにて固定した状態で試料をカメラ撮

りATP濃度を予測するシステムを開発し，貯蔵

影するため，試料，光源，光センサーの幾何学的中スライスソーセージの品質変化を，可視・近赤

位置関係が常に不変である。これは，再現性の高外イメージングで非破壊評価する方法について検い計測データを得るために有効である。400～討する。

1,000nmの波長範囲の分光反射／吸収データを５２．方

８）nmごとに取得した（原スペクトルの取得）。

法

ATP 濃 度（mol・L － １）は Oto et al. ９）の 方 法 に

東京都内の食品量販店から購入したスライス
ソ ー セ ー ジ （質 量 6.85 ± 0.12ｇ ； 直 径 8.86 ±0.37cm；厚み0.12±0.02cm）75枚を実験試料とて，試料を粉砕・ATP抽出の後，ルミノセンサー（アトー）にて測定した。
取得した画像データの解析は，Feng, Makino

（1）
（2）
（3）

（4）

（6）

（5）

Fig. 1 Hyperspectral imaging system applied in the present study（JFE Techno-Research Co.）（1）12-bit CCD camera,（2）Spectrometer,（3）Lends,（4）Light sauce（xenon and halogen
lamps）,（5）Sample,（6）PC Monitor© The Ito Foundation

可視・近赤外分光イメージングと深層学習を併用した食肉加工品のスマート品質管理

131

et al.３，４）の方法に従い，科学計算用プログラミン

いことを意味する。Fig.3（a）の結果によると，

グ 言 語 MATLAB 2018a （MathWorks, Inc.） とStandard normal variate（SNV）で分光分析デー

The Unscrambler X（Camo Software Inc.）で行っ

タを前処理したモデルが最もPredの値が高かった。画像のコンピューターへの取り込みと前処理

た 。 ま た ， 平 均 ２ 乗 誤 差 （root mean squareには主としてMATLAB 2018aを使用し，AI（機械error）は，値が小さいほど予測精度が高いこと学習）によるATP濃度出力にはThe Unscramblerを意味する。Fig.3（b）の結果によると，PredのデーXを使用した。

タ に 着 目 す れ ば ， Multiplicative scattercorrection（MSC）またはSNVの値が小さかった。

３．結果と考察

決定係数と併せて評価すれば，SNVでの前処理実験に使用したスライスソーセージの外観変化
をFig.２に示した。デジタルカメラ画像を観察しが，ATP濃度予測モデルの構築には最も有効であったと考えられた。

たところ，外観の違いは不明瞭であった。ただし，Fig.４には，重要な選択された10波長（385，

ATP濃度は貯蔵日数の経過とともに増える傾向

390 ，395 ，505 ，580 ，670 ，745 ，780 ，855 ，となったことから，鮮度低下による減少よりも，955nm）での分光分析データを入力変数とした，腐敗による増加の影響の方が大きかったと考えら

機械学習によるATP濃度予測精度を示す。Fig.4

れた。

（a）の結果によると，元データの１次微分（１ st

Fig.３には，全波長での分光分析データを入力der）と１ st der＋Normal（Ｎ）で分光分析デー変数とした，機械学習によるATP濃度予測精度

タを前処理したモデルでPredの決定係数の値がを示す。検量（Cal）は，モデル作成時のATP濃高く，全波長でのデータを入力した場合よりも高度算出結果，交叉検証（CV）は，検量モデル精

かった。これは，過剰なデータを入力したことに度向上過程でのATP濃度算出結果，予測（Pred）

よる過剰適合が抑制されたためと考えられる。まは，検量モデル作成時に使用しなかった未知のたFig.4（b）の結果によると，Predのデータに着目

データセットへの検量モデルの適合度を示す。こ

すれば，
MSC，
SNVまたは１st derの値が小さかっのことから，実際の予測精度はPredの値を重視た。決定係数と併せて評価すれば，１st derでのして評価することが望ましいと考えられる。

前処理が，ATP濃度予測モデルの構築には最も決定係数は，実測値と予測値の間の相関係数の２乗であることから，値が高いほど予測精度が高（a）

有効であったと考えられた。
本研究で対象とする光センシングは，非破壊検

（b）

（c）

Fig. 2 Appearance of sausages on（a）day 1（ATP：6.16 mmol・L － １），（b）day 3（ATP：6.28 mmol・L － １）and（c）day

5（ATP：6.81 mmol・L－１）stored at 35℃ and 15％ relative humidity.

© The Ito Foundation

132

平成30年度0.85

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

（a）

Cal

CV

Pred

0.8
0.75
0.7
0.65
0.6

0.03

V
1s
td
er
2n
d
de
N
r
＋
1s
td
er
1s
td
er
SN
+N
V+
1s
SN
t
V+ der
2n
d
de
r

SN

SC

N

M

ra
w

0.55

Cal

（b）

CV

Pred

0.025
0.02
0.015

r
de

d

er
SN

V+

2n

td

+N

1s

er

V+

SN

r

er
1s

td

td

de

1s

d

N

＋

er

2n

1s

td

V
SN

N

SC
M

ra

w

0.01

Fig. 3 Statistical parameters as（a）determination coefficient and as（b）root mean square error of machine learningwith 125 raw（every 5 nm in the range of 380-1000 nm）and pre-treated spectra.

Note：N, normalization ； MSC, multiplicative scatter correction ； SNV, standard normal variate ； der, derivative ； Cal,

calibration; CV, cross validation；Pred, prediction

査であることから，迅速，簡便，低ランニングコ

べき点も多い。その一方で，本研究で用いる手法

ストという特徴点があげられるが，最大の利点である光センシングは，従来法と比較して，必ずは，検体に対し非接触であるため，全数検査が可

しも測定精度は高いとは言えない。

能になることである。

そこで考えられるのは，破壊検査と非破壊検査

従来から行われている製造・出荷ラインにおけを併用した生肉の品質管理である10）。すなわち，

る品質管理の基本的手法は抜き取り検査である。

光センシングの特徴である非接触という利点を生

当該検査を高頻度で行えば安全確保の可能性は高かし，非破壊検査による全品のスクリーニングへ

まるが，検体は処分せざるを得ないため，出荷品の応用が考えられる。その結果，深刻な鮮度低下が減ってしまう欠点がある。しかも，検査には熟や腐敗が疑われる検体を製造ライン上や店頭で発練を必要とし，化学薬品を使用するなど，見直す

見・選別し，当該検体についてのみ，従来法によ© The Ito Foundation

可視・近赤外分光イメージングと深層学習を併用した食肉加工品のスマート品質管理
0.9
0.88

（a）

Cal

CV

133

Pred

0.86
0.84
0.82
0.8
0.78
0.76
0.74
0.72

0.03

V
1s
td
er
2n
d
de
N
r
＋
1s
td
er
1s
td
er
SN
+N
V+
1s
td
SN
er
V+
2n
d
de
r

SN

SC
M

N

ra
w

0.7

Cal

（b）

CV

Pred

0.025
0.02
0.015
0.01
0.005

2n

d

de

r

er
td
SN

V+

+N

1s

er

SN

td
1s

V+

td

er

r
de

1s

N

＋

d

er

2n

1s

td

V
SN

SC
M

N

ra

w

0

Fig. 4 Statistical parameters as（a）determination coefficient and as（b）root mean square error of machine learningwith 10 raw（385, 390, 395, 505, 580, 670, 745, 780, 855, 955 nm）and pre-treated spectra.

Note：N, normalization ； MSC, multiplicative scatter correction ； SNV, standard normal variate ； der, derivative ； Cal,

calibration；CV, cross validation；Pred, prediction

る検査を行い，著しい品質低下が起きた原因を追なく畜産分野にも取り込むための有効な機会作出究するという手段が考えられる。そうすれば，検に貢献できると考えられる。

査漏れの心配がなくなるうえに，時間やコストの削減にもつながる。

４．要

約

本研究での成果を普及すれば，畜産物利用分野

AIの発展は著しく，社会でのあらゆる分野でにおけるAI利用の先進的導入事例となる。医療，の導入が進められているが，畜産分野での応用は自動運転，機械翻訳，レシピ提案など，さまざま

十分とは言えない。そこで本研究では，スライスな分野で社会生活に浸透しつつあるAIを，遅滞

ソーセージを研究対象とし，ハイパースペクトル© The Ito Foundation

134

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

カメラで撮影した二次元分光分析データをAIに入力し，スライスソーセージの鮮度や腐敗の指標となるATP濃度を非破壊予測するシステムの開発を試みた。試料を35℃，相対湿度15％で５ｄ貯蔵し，経時的に分光分析とATP測定を行った。
ATP濃度は経時的に増加する傾向がみられたことから，貯蔵中における品質低下は，鮮度低下によるATP濃度減少よりも腐敗によるATP増加の方が優勢であることが明らかになった。さらに
AIで予測を試みたところ，決定係数0.86以上，平均２乗誤差0.14mmol・L－１ 以下の精度でATP濃度を予測可能であり，分光分析データを１ st derで前処理した場合に最も優良なAIモデルが作成された。以上の結果から，本研究で提案した方法は，AIによるスライスソーセージの品質の非破壊評価に有効であると考えられた。

文献１） Siripatrawan, U., Makino, Y.：Meat Science, 146,
26～33, 2018.
２） Feng, C. H., Liu, Y. W., Makino, Y., Martín, J. F. G.,
Cummins, E.：International Journal of Food Scienceand Technology, 52, 1777～1788, 2017.
３） Fengm, C. H., Makinom, Y., Yoshimuram, M.,
Rodríguez-Pulidom, F. J.：Journal of the Science ofFood and Agriculture, 98, 2564～2572, 2018.
４） Fengm, C. H., Makinom, Y., Yoshimuram, M.,
Dangm, Q. T., García-Martínm, J. F.：Journal of
Food Science, 83, 358～366, 2018.
５） 山下隆義：ディープラーニング，講談社，東京，
2016６） https://lp-tech.net/articles/TXrrN, 2016.9.15７） https://tech.nikkeibp.co.jp/it/atcl/column/14/
346926/083000618/, 2016.8.31８） Makino, Y., Isami, A., Suhara, T., Goto, K., Oshita,S., Kawagoe, Y., Kuroki, S., Purwanto, Y. A., Sutrisno,A. U.：Food Science and Technology Research, 21,
59～65, 2015.
９） Oto, N., Oshita, S., Makino, Y., Kawagoe, Y.,
Sugiyama, J., Yoshimura, M.：Meat Science, 93, 579～585, 2013.
10） 牧野義雄（監修：山本重夫）：農産物・食品検査法の新展開，53，シーエムシー出版，東京，2010.

© The Ito Foundation

135

牛経済形質に関わる新規DNA多型の探索（Ⅱ）
Novel gene polymorphisms identification related to cattle economic traits
（Ⅱ）

松

本

大

和

（東海大学農学部応用動物科学科）

Hirokazu Matsumoto（Department of Animal Science, School of Agriculture, Tokai University）

Various attempts have been made to improve carcass traits of Japanese Black cattle,
representative beef cattle in Japan. Genetic factors are known to influence on meat quality inbeef cattle. Therefore, development of additional DNA markers is useful for breeding. In thisstudy, we tried to investigate the influence of bovine SPP1 gene, coding a multifunctional
cytokine, on economic traits in beef. For this purpose, sequence comparison of the promoter
region and CDS was performed, resulting two DNA polymorphisms in the promoter region andone missense mutation in the CDS were identified. The missense mutation（g.58675C＞T）was
predicted to cause amino acid substitution from threonine to methionine, suggesting a strong
influence on the function of the SPP1 protein. Association study between genotypes andeconomic traits revealed that g.58675C＞T had a significant effect on carcass weight（p=0.0078）
and C/T type was heavier than other genotypes. These results suggest that SPP1 g.58675C＞
T is a useful genetic marker for breeding in beef cattle.

１．目（Beef Marbling Standard）であるが，このBMS

的は枝肉単価との相関が高いため，格付項目の中で日本固有の肉専用種を和牛と総称するが，これも特に重要視されている。このBMSの他，脂肪には黒毛和種・褐毛和種・日本短角種・無角和種

酸組成やアミノ酸組成，枝肉重量，歩留等も牛のの４品種が含まれる。これら和牛品種の内，黒毛

経済性に影響するため，これらの形質を向上させ

和種は国内外問わず人気の高い品種であり，現在

ようと精力的に遺伝学的研究が進められている。

国内で飼養されている肉用牛の約95％を黒毛和種

一般に枝肉形質は飼料や性などさまざまな要因が占める。黒毛和種の特徴として，俗に霜降りとによる影響を受けるが，遺伝的要因にも大きく影呼称される脂肪交雑が優れている点があげられ響されるため，枝肉形質の改良では遺伝学的アプる。脂肪交雑は口に入れた際の食感の良さに影響ローチが有効である。そこで，我々は枝肉形質にし，甘味や香りを向上させることで，肉の旨みに関与する新規遺伝子の同定を網羅的遺伝子発現解影響を与える。この脂肪交雑の評価基準がBMS

析により試みた１）。その結果，ACACAやELOVL5，© The Ito Foundation

136

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

FADS2，MMP14，SPP1等の遺伝子が枝肉形質２）を測定した。

に関与する候補遺伝子として浮上した。これらの2.2

内ACACA，ELOVL5，FADS2，MMP14の各遺

SPP1遺伝子（AC_000163.1）の各エクソンを伝子ではプロモーター領域においてDNA多型が含むDNA領域をPCR法により増幅させるプライ

同定され，これらの多型は複数の枝肉形質に効果

マーセットをOligo7（Molecular Biology Insights,を持つことが明らかにされた。したがって，

Vondelpark, CO）により作製した。SPP1遺伝子

先行研究でスクリーニングされた遺伝子群は枝肉ではプロモーター活性を持つDNA領域が明らか

形質に関連する有力な候補であると考えられる。

にされているため６），この領域も解析対象とした。

２～５）

多型探索

SPP1（secreted phosphoprotein 1）遺伝子は牛Ⓡ
PCR 酵 素 に は Go-Taq（Promega
Corporation,

第６番染色体上に位置し，８個のエクソンから構Madison, WI）を使用したが，第3，4エクソンに成される。その翻訳産物はOsteopontinとも呼ばⓇ
対 す る 反 応 に は EX-Taq（Takara
Bio, Siga,

れる多機能性のサイトカインであり，骨形成や免Japan）を用いた。PCR反応は95℃で２分熱変性

疫反応，アポトーシスなどさまざまな生命現象をさせた後，熱変性（95℃，30秒），アニーリング

制御することが知られている。経済形質に対する（任意の温度，30秒），伸長反応（72℃，30秒）を効果も検証されており，ホルスタイン種の乳房炎

35サイクル行った。ただし，－1004～－57のプロ耐性や枝肉重量に対する効果が報告されている。

モーター領域については伸長反応の時間を60秒としかしながら，黒毛和種の枝肉形質との関わりはした。プライマー配列およびPCR条件はTable１

不明である。本研究ではこのSPP1遺伝子を対象に示した。

として，DNA多型の探索およびその経済形質に対する効果を検証した。
２．方
2.1

得 ら れ た PCR 産 物 は Exo-sapIT（affimetrix,
Cleveland, OH）を 用 い て 精 製 し た 。精 製 し た
PCR 産 物 は BigDye Terminator v3.1 （Thermo

法

Fisher Scientific, Wilmington, DE） で 蛍 光 標 識

供試動物

し ， ABI 3500xl （Thermo Fisher Scientific） に

平成14年から平成26年の間全国の牧場で肥育さより塩基配列決定した。この反応にはPCR増幅にれ，現場後代検定に供せられた黒毛和種484個体

用いたものと同じプライマーを使用した（Table

をサンプルとして用いた。多型探索はこれらの内

１）。鋳型になるPCR産物を５’末端と３’末端の両から家系に偏りがないように選出した８個体を対方向から塩基配列決定することで実験の正確性を象とした。DNA抽出はこれら個体の筋肉からフェ評価した。

ノールを用いて実施した。枝肉形質（枝肉重量，

塩基配列決定により得られたデータは

ロース芯面積，ばら厚，皮下脂肪厚，推定歩留，Chromasにより可視化し，ClustalWを用いて比BMS）は社団法人日本食肉格付協会の格付によ較することで多型探索を行った。CDS領域で同定り評価された格付値を用いた。また，定法に従いしたミスセンス変異についてはClustalWにより脂肪組織より脂肪酸を抽出・メチル化し，ガスク保存性を評価した。プロモーター領域で同定した

ロマトグラフGC4000（ジーエルサイエンス，東多型については，転写因子結合配列への影響を京）によりその組成（Ｃ14：０，Ｃ14：１，Ｃ

ALGGEN-PROMOを用いて予測した。

16：０，Ｃ16：１，Ｃ18：０，Ｃ18：１，Ｃ18：© The Ito Foundation

137

牛経済形質に関わる新規DNA多型の探索（Ⅱ）
Table 1 Oligonucleotide primers used for sequencing
Target region

Primer（5’→3’）

Tm（℃）

Size（bp）

Promoter（－1863～－990）

F：TATAGCAGTTATCAGATCCAT
R：CAAGAACAGAAAACTTATACG

60

919

Promoter（－1004～－57）

F：AAGAGTATAATGGTAAACACT
R：TGGAATCTTTTCTATTTTATA

50

990

Promoter（－655～＋２）

F：ATATTTTCACCTCTGTATTTAG
R：ACGTCCTTTTTAGTAATGGTA

55

657

Exons３，
４

F：GAGATGGAAAATAGAGGTGGC
R：AGCAGGCACACAATAAATACT

60

539

Exons５，
６

F：TTATCACTTAGAGACCCCTGT
R：GCCTGGATAATCAAAAGGTGA

62

997

Exon７

F：CCCTGACACCCATTTTTCTGG
R：TGGGCTCTAATCATAACCATCTGA

60

384

Exon８

F：GGTGTGGAAGTTAGAAGGCATTA
R：TGCTTTAATGTATCCTTTTCGTTTT

54

467

F：forward primer；R：reverse primer

2.3

遺伝子型判定2.4

統計解析

遺伝子型判定にはPCR-RFLP法を採用した。

遺伝子型が枝肉形質と筋肉内脂肪における脂肪c.-1117G ＞ Ａ を 含 む DNA 領 域 は酸組成に及ぼす効果について検討するため，5’-ATCACAGGGGACTGGACTCTTCTCG-3’ お

JMP7（SAS Institute, Cary, NC）を 用 い て 分 散

よ5’-ACCTTCCCAATGAAATGAGGCA

分析を行い，各効果の最小自乗平均値に対してGCG-3’ の プ ラ イ マ ー セ ッ ト で 増 幅 さ せ た 。本

Tukey-Kramerの有意差検定を実施した。分析モ

DNA多型を含む付近の塩基配列を認識する適切

デルには遺伝子型の他，と殺月齢および性の要因

な制限酵素が存在しなかったため，ミスマッチ塩を加えた。解析集団では種雄牛の偏りが少なかっ

基 （下 線） を 導 入 し ， Fnu4HI （New England

たため，この効果は分析モデルから除外した。

び

BioLabs, lpswich, MA）で認識できるように改変
し た 。 g.58675C ＞ Ｔ を 含 む DNA 領 域 は３．結果と考察

5’-GCATGACGCACCTAAGAAGACGA-3’ お よ3.1

び

5’-TCAAGGCTATGGAATTC

黒毛和種８個体を用いた塩基配列決定の結果，

TTGGCTGA-3’のプライマーセットで増幅させプロモーター領域において２個（c.-1121C＞Ｔ：た。本DNA多型に対する制限酵素処理にはNlaⅢ

rs110329232，c.-1117G＞Ａ：rs110254070），CDS（New England BioLabs）を用いた。PCR反応は領域において１個のDNA多型（g.58675C＞Ｔ：

95℃で２分熱変性させた後，熱変性（95℃，30

rs133929040）を 同 定 し た（Fig. １）。プ ロ モ ー秒），アニーリング（任意の温度，30秒），伸長反

ター領域のDNA多型は非常に近い位置で同定さ応（72℃，30秒）を35サイクル行った。c.-1117Gれたため，連鎖していることが予想された。その＞Ａに対するPCR増幅のアニーリング温度は58℃

ため，黒毛和種30個体を対象とした塩基配列決定

で，g.58675C＞Ｔのアニーリング温度は60℃だっによりこれらの連鎖関係を調査した。いずれの個た。

体でもc.-1121C＞ＴのＣ型を持つ個体はc.-1117G© The Ito Foundation

SPP1遺伝子におけるDNA多型の同定

138

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Fig. 1 Identification of DNA polymorphisms in bovine SPP1 gene.

Sequence comparison revealed two DNA polymorphisms, c.-1121C＞T and c.-1117G＞A, in the

promoter region and one missense mutation, g.58765C＞T, in Exon 8. The missense mutation waspredicted to cause amino acid substitution from threonine to methionine.

＞ＡはＧ型であり，例外は存在しなかった（data

ノ酸の性質を大きく変更するため，このDNA多

not shown）。この二つのDNA多型は連鎖してい型はSPP１タンパク質の機能や構造に影響するこることが強く示唆されたため，以降の集団解析でとが示唆された。

はc.-1117G＞Ａのみを対象とした。次いで，c.1121C＞Ｔおよびc.-1117G＞Ａが転写因子の結合

3 . 2 SPP1遺伝子のDNA多型が枝肉形質に及ぼす効果

様式に及ぼす影響を調べた結果，C/G型とT/A型

PCR-RFLP法によるc.-1117G＞Ａの遺伝子型判

では結合が予想される転写因子が大きく異なった定の結果，黒毛和種集団484個体のうちG/G型の（data not shown）。したがって，同定されたこれ個体が220個体，G/A型が259個体，A/A型が５らのDNA多型はSPP1遺伝子の発現量に影響する個体だった。したがって，遺伝子型頻度はG/G型

こ と が 示 唆 さ れ た 。CDS 領 域 で 同 定 さ れ たが0.451，G/A型が0.532，A/A型が0.016であり，

g.58675C＞Ｔはミスセンス変異であり，第218番

対立遺伝子頻度はＧ型が0.771，Ａ型が0.229だっのアミノ酸をスレオニンからメチオニンに置換すた。一方，g.58675C＞ＴではC/C型の個体は404

ることが予想された。スレオニンは極性無電荷側

個体，C/T型は77個体，T/T型は３個体検出され鎖アミノ酸であり，メチオニンは側鎖に硫黄を含た。したがって，遺伝子型頻度はC/C型が0.829，

む疎水性アミノ酸である。また，牛SPP１タンパ

C/T型が0.164，T/T型が0.06であり，対立遺伝子

ク質における第218番目のアミノ酸に相当するア頻度はＣ型が0.91，Ｔ型が0.09だった。これら

ミノ酸は偶蹄目では高度に保存されていることがDNA多型の黒毛和種集団における枝肉形質およ確認された（Fig.２）。保存性の高い領域でアミび脂肪酸組成に対する効果を分散分析により調べ© The Ito Foundation

139

牛経済形質に関わる新規DNA多型の探索（Ⅱ）

cattle（T type）

ETNSSELSKELTPKAKDKN

Ｍ

cattle（M type）
yak
water buﬀalo

Ｒ

sheep

D

EES

goat

D

QEES

Fig. 2 Homology study of SPP1 among Artiodactyla.

g.58765C＞T was predicted to influence on the 218th amino acid（arrow）. The aminoacid sequence on this region is highly conserved among Artiodactyla, yak（ELR54943）,
water buffalo（ABC02202.1）,sheep（AAD38388.1）and goat（ABY21280.1）.Dots indicate
the same amino acids with above sequences.
Table 2 Comparison of carcass traits and fatty acid composition

between genotypes of the c.-1117G＞A and g.58675C＞T

Trait
Carcass traits
Carcass weight
Rib-eye area
Rib thickness
Subcutaneous fat thickness
Yield estimate
Beef marbling score
Fatty acid composition
Ｃ14：０
Ｃ14：１
Ｃ16：０
Ｃ16：１
Ｃ18：０
Ｃ18：１
Ｃ18：２

c,-1117G＞A

g.58675C＞T

ns
ns
ns
ns
ns
ns

＊＊
ns
ns
ns
ns
ns

ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns

ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns

＊p＜0.05；＊＊p＜0.01；＊＊＊p＜0.005；ns（non-significant）

Table 3 Effect of the g.58675C＞T on carcass weightg.58675C＞T
Trait

C/C（n＝407）

C/T（n＝83）

T/T（n＝３）

Carcass weight（㎏）459.2±2.8ｂ

473.9±6.0ａ

412.0±25.6ｂ

Values are expressed as means with standard error by least squares estimates．
a,bMeans with different superscripts differ significantly at p＜0.05（Tukey’s HSD analysis）．

た。その結果，g.58675C＞Ｔでは枝肉重量においの 最 小 自 乗 平 均 値 を 比 較 し た 。 C/C 型 はて高い有意差（p=0.0078）が認められたが，c.-459.2kg，C/T型は473.9kg，T/T型は412.0kgであ1117G＞Ａはいずれの形質に対しても有意な効果

り，C/T型を持つ個体は他の遺伝子型の個体に比を示さなかった（Table２）。g.58675C＞Ｔの効果

べ有意に重かった（Table３）。SPP1遺伝子はミを詳細に検討するため，遺伝子型ごとに枝肉重量

オスタチンの上流因子であるため７），このシグナ© The Ito Foundation

140

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ル伝達の変化により枝肉重量に差が出たと考えられた。以上の結果はg.58675C＞Ｔが重要な枝肉形質の一つである枝肉重量に対するDNAマーカーとして活用可能であることを示唆した。
４．要約

日本を代表する肉用牛である黒毛和種では枝肉形質の向上を目的とした試みが盛んに行われている。枝肉形質はさまざまな要因による影響を受けるが，その改良には遺伝学的アプローチが有効である。そこで，本研究では枝肉形質に関与する候補遺伝子の一つSPP1遺伝子に対する多型探索および同定したDNA多型の経済形質に対する効果の検証を行った。その結果，プロモーター領域において連鎖する２個のDNA多型，CDS領域において１個のミスセンス変異を同定した。これらのDNA多型が枝肉形質および脂肪酸組成に及ぼす
効 果 を 分 析 し た 結 果 ，CDS 領 域 で 同 定 さ れ た
g.58675C ＞ Ｔ は 枝 肉 重 量 に 対 す る 有 意 な 効 果（p=0.0078）を持ち，C/T型が他の遺伝子型に比べて重いことが確認された。以上より，SPP1遺伝子のg.58675C＞ＴはDNAマーカーとして活用可能であることが示唆された。

文献１） 松本大和，小栗佑介，水野雄仁，石田孝史，小林郁雄，祝前博明，齋藤邦彦，笹子奈々恵，小林栄治，
久下志朗，本多健，笹崎晋史，大山憲二，万年英之：
黒毛和種の背最長筋を用いた網羅的遺伝子発現解析，
動物遺伝育種研究，41（1），７～14，2013.
２） Matsumoto, H., Sasaki, K., Bessho, T., Kobayashi,E., Abe, T., Sasazaki, S., Oyama, K., Mannen, H.：
The SNPs in the ACACA gene are effective on fatty
acid composition in Holstein milk, Molecular Biology
Reports, 39（9）,8637～8644, 2012.
３） Matsumoto, H., Shimizu, Y., Tanaka, A., Nogi, T.,
Tabuchi, I., Oyama, K., Taniguchi, M., Mannen, H.,
Sasazaki, S.：The SNP in the promoter region of thebovine ELOVL5 gene influences economic traits
including subcutaneous fat thickness, Molecular
Biology Reports, 40（4）,3231～3237, 2013.
４） Matsumoto, H., Nogi, T., Tabuchi, I., Oyama, K.,
Mannen, H., Sasazaki, S.：The SNPs in the promoter
regions of the bovine FADS2 and FABP4 genes areassociated with beef quality traits, Livestock Science,
163, 34～40, 2014.
５） Matsumoto, H., Kawaguchi, F., Itoh, S., Yotsu, S.,
Fukuda, K., Oyama, K., Mannen, H., Sasazaki, S.：
The SNPs in bovine MMP14 promoter influence on
fat-related traits, Meta Gene,（in press）.
６） Dudemaine, P. L., Thibault, C., Alain, K.,
Bissonnette, N.：Genetic variations in the SPP1
promoter affect gene expression and the level ofosteopontin secretion into bovine milk, Animal
Genetics, 45（5）,629～640, 2014.
７） Nghiem, P. P., Kornegay, J. N., Uaesoontrachoon,
K., Bello, L., Yin, Y., Kesari, A., Mittal, P., Schatzberg,
S. J., Many, G. M., Lee, N. H,, Hoffman, E. P.：
Osteopontin is linked with AKT, FoxO1, andmyostatin in skeletal muscle cells, Muscle Nerve, 56（6）,1119～1127, 2017.

© The Ito Foundation

141

抗菌性ペプチドを指標とした豚抗病性育種法の開発
Development of pig breeding for disease resistance with antimicrobial
peptides

上

本

吉

伸

（東北大学大学院農学研究科）

Yoshinobu Uemoto（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

Mycoplasma pneumoniae of swine（MPS）caused by Mycoplasma hyopneumoniae is one of
the important factors of economic loss in the pig industry. The objective of this study was toevaluate the genetic effect of the serum β-defensing 2 concentration（DEFB2）, which is oneof the antimicrobial peptides, and the relationship of DEFB2 with MPS lesion score and theserum concentration of interleukin 17（IL17）for genetic improvement of disease resistance inpigs. The Landrace purebred pigs selected for MPS lesion score were used in this study, andthese pigs have the phenotype of MPS lesion score and IL17. A total of 298 pigs reached 105
kg body weight were measured DEFB2 by ELISA, and then the genetic parameter of DEFB2
with selection traits and IL17 were estimated. Heritability of DEFB2（0.04）was lower thanthat of MPS lesion score（0.08）. The genetic correlation between DEFB2 and MPS lesion score
were negatively moderate（－0.39）． In addition, it showed moderate positive residual
correlation between DEFB2 and IL17（0.54）in spite of low genetic correlation between them（－0.07）, suggesting that non-genetic association of DEFB2 with IL17 was shown in our study.
These results suggest that DEFB2 is not suitable as a selection indicator of disease resistancein pig, but may be indirectly related to MPS lesion score via IL17.

１．目

た個体は，生体防御機能が低下して他の細菌ある

的いはウィルスに感染しやすくなる。その結果，飼近年の養豚業では，経営の大規模化や多頭飼養料効率の低下，増体重の減少，斉一性の悪化，格化傾向が進んでおり，呼吸器性慢性疾病による経付けの低下および治療費の増大など，養豚業界に済的損失が大きな問題となっている。この呼吸器

与える経済的損失は大きい。MPSの対策として，性 慢 性 疾 病 の 一 つ と し て ， Mycoplasma

養豚現場ではワクチン接種や抗菌性資材の飼料添

hyopneumoniae に よ る マ イ コ プ ラ ズ マ 性 肺 炎

加による対策などが取られているが，ワクチン効（MPS, mycoplasma pneumonia of swine）があげ

果には限界があること，抗生物質耐性菌の出現やられる。MPSによる病変の肉眼的特徴として，

食肉への抗生物質の残留問題などから，抗菌性添

肺の両側性肝変化があげられる。MPSに感染し加物に依存しない抗病性機能の向上が求められて© The Ito Foundation

142

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

いる。そこで，家畜自身の抗病性機能を遺伝的に（DEBF2）の個体間差に遺伝的影響があるかは未高める抗病性育種が検討されてきた。宮城県畜産知である。そこで本研究ではMPS抵抗性ランド

試験場では，MPS病変をスコア化した指標（MPS

レース種集団を用いて，DEFB2について遺伝率

病変スコア）を用いてMPS病変スコアが減少すを推定するとともに，選抜形質およびIL17との間るように選抜したMPS抵抗性ランドレース種集の遺伝相関および残差相関を推定し，DEFB2を団を造成した 。しかし，MPS病変スコアの選抜指標としたMPS抵抗性育種の可能性を検討した。

１）では，豚のと畜および煩雑な病変検査が必要不可
欠であり，多検体の調査は難しく次世代の親候補

２．方法

個体から直接測定することができない。また，一

2.1

供試動物

般 的 に 病 変 形 質 は 遺 伝 率 が 低 く ，こ の 集 団 の本研究では，宮城県畜産試験場にて2003～2008

MPS病変スコア遺伝率は0.07であった１）。そのた

年に５世代選抜によって系統造成したランドレー

め，簡易に測定でき，MPSと密接に関連し，かス種集団1,395頭を用いた。この集団は，一日平つ遺伝率が比較的高い形質がMPS病変スコアに

均 増 体 重 （DG, g/day）， 背 脂 肪 厚 （BFM,

代わる新たな選抜指標として求められている。

mm），MPS病変スコア（％）および血漿中コル

MPS抵抗性ランドレース種集団では，選抜にチゾール濃度（CORT，μg/dL）の４形質を指標

伴って血清中インターロイキン17濃度（IL17）なとして，MPS病変スコアが低下する方向に選抜

ど一部のサイトカインの遺伝的趨勢が変化していしたMPS抵抗性集団である１）。このうち，MPSる２）。IL17はサイトカインの一つであり，感染防病変スコアを測定した調査豚は，疾病が発生しに御応答の働きとして抗菌性ペプチドの産生誘導にくいコンクリート床豚舎および疾病が発生しやす

よる直接的な菌体排除および好中球の活性化・遊いハウス豚舎の２つの豚舎に分けて飼育を行っ

走による間接的な菌体排除などがあげられる。

た。調査豚は，体重105kg時に血清をサンプリン

IL17の遺伝率は中程度で，MPS病変スコアと高グし，と畜後にMPS病変スコアを記録している。

い遺伝相関（－0.86）を持つことから２），IL17に

2.2

対象形質

よって産生誘導される抗菌性ペプチドがMPS病

本研究ではMP病変スコアを持つ調査豚630頭

変スコアと大きな関連性を示す可能性がある。このうち298頭について，ELISA法によってDEFB

こで，抗菌性ペプチドとは，病原体を認識して結２ を 測 定 し た 。ELISA 法 は ，市 販 の キ ッ ト

合すると同時に強力な殺菌作用を持つ分子であ（Cloud-Clone Corp.）を用いてマニュアルに従っり，代表的な抗菌性ペプチドとして，ディフェンて行った。得られた結果は，その後，自然対数変シンやカセリジシンなどがあげられる。このう

換を行った。

ち，ディフェンシンは哺乳類の自然免疫において本集団では，選抜形質であるDG，BF，MPSス

重要な働きを持つ低分子量の抗菌性ペプチドであコアおよびCORTを有していることから，これらる。豚において，腸内で産生され抗菌活性を持つの形質を用いた。MPS病変スコアは，Goodwin

βディフェンシン２が発見されており，その産生

and Whittles４）が各肺葉のMPS病変面積割合をス

部位および幅広い抗菌活性から腸の免疫にとってコア化した評価法である。これらの形質の詳細は重要な防御分子であることが報告されている３）。

Kadowaki et al.１）にて記されている。また，体重し か し ，血 清 中 β デ ィ フ ェ ン シ ン ２ 濃 度

105kg時のIL17についても当集団にてすでに得ら© The Ito Foundation

143

抗菌性ペプチドを指標とした豚抗病性育種法の開発

れていることから統計解析に用いた２）。
2.3代の個体を用いた。基本統計量の結果，各世代で統計解析

一定の個体間差が見られ，特に第１世代では最も遺伝率，遺伝相関および残差相関の推定は，選標準偏差が高い値を示していた。また４，５世代

抜形質４形質，IL17およびDEFB２からなる多形

では，１，２世代に比べ，低い標準偏差を示して

質アニマルモデルREML法によって推定した。統いた。これらのことから，DEFB2は集団内に個計解析に用いた混合モデルは以下のとおりである。

体間差が見られ，選抜に伴って何らかの変化が起

yijklm=μi+Gij+Sik+Ril+uim+eijklm

こっている可能性が示唆された。

ここで，yijklmは形質ｉの測定値，μiは形質ｉの次に，DEFB2，選抜形質４形質およびIL17に

総平均，Gijは形質ｉの世代ｊ，Sikは形質ｉの性別関する遺伝率，DEFB2と他の形質との間の遺伝

ｋ，Ril は形質ｉの飼育環境ｌ，uim は形質ｉの個相関および残差相関の推定値をTable２に示す。

体ｍの育種価，eijklmは残差である。遺伝率，遺伝

本集団では，DEFB2の遺伝率は0.04と低い値を相関および残差相関の推定は，VCE6プログラム示した。また，DG，BF，MPS，CORTおよびを用いた。

IL17の遺伝率は，それぞれ0.60，0.65，0.08，0.20

５）

お よ び 0.27 で あ っ た 。 こ れ ら の 推 定 値 は ，３．結果と考察Kadowaki et al. １）およびSato et al. ２）と非常に近本研究で得られたDEFB2の基本統計量をTable

い値を示している。DEFB2と各形質との間の遺１に示した。本集団では第３世代の血清サンプル

伝相関について，DG，BFおよびIL17とは低い遺を有していなかったため，第１，２，
４および５世伝相関を示していた（それぞれ－0.03，0.04およTable 1 Descriptive statistics of the concentration of serum β-defensin2（pg/ml）．
Generation

N

Mean

SD

Min

Max

1
2
4
5

57
84
68
89

2,879
2,642
2,868
2,090

1,209
1,099
808
837

888
515
1,734
811

6,964
6,005
5,421
5,473

Total

298

2,571

1,045

515

6,964

Table 2 Estimates of heritability, and genetic and residual correlations of β-defensin2

with other traits.

Heritability

Genetic correlation

Residual correlation

TraitsN

Estimate

SE

Estimate

SE

Estimate

SE

DEFB2
DG
BF
MPS lesion
score
CORT
IL17

298
941
929

0.04
0.60
0.65

0.09
0.05
0.05

－
－0.03
0.04

－
0.29
0.39

－
－0.10
－0.09

－
0.05
0.09

630

0.08

0.04

－0.39

1.01

0.19

0.11

1197
566

0.20
0.27

0.05
0.07

－0.88
－0.07

1.10
0.55

－0.02
0.54

0.05
0.06

DEFB2, β-defensin2；DG, daily gain；BF, backfat thickness；MPS lesion score, mycoplasmal
pneumonia of swine lesion score；CORT, cortisol concentration；IL17, interleukin 17.

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144

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

び－0.07）。MPSとは推定誤差が高かったものの菌性ペプチドの一つであり，ヒトの報告において－0.39と中程度の負の遺伝相関を示し，CORTもその関連性が報告されているが，本研究によりこ同様に推定誤差が高かったものの－0.88の高程度の関連性は特に非遺伝的なものである可能性が示の負の遺伝相関を示した。残差相関については，

唆された。本研究では，IL17がMPS病変スコア

IL17を除くすべての形質で低い残差相関を示してと高い遺伝相関を示し，遺伝率も中程度であった

いるが，IL17については中程度の正の残差相関ことから，IL17の産生誘導によって産出される抗（0.54）を示していた。

菌性ペプチドに焦点を当てた。しかし，DEFB2

抗菌性ペプチドの遺伝的寄与について調査した自体は選抜指標として適さないことが本研究から報告は，ヒトや家畜などすべての動物でこれまで示唆されたことから，今後の課題として，ナイーにない。また，抗菌性ペプチドとサイトカインおブＴ細胞に刺激を与えることで，IL17を産生する

よび病変形質との遺伝的な関連性についても同様

ヘルパーＴ細胞（Th17）への分化誘導を行うイにこれまでに報告がない。本研究は，抗菌性ペプ

ンターロイキン６（IL6）など，IL17を取り巻くチドの遺伝的関連性を示した初めての報告であサイトカインについて詳細な分析を行うことで，り，抗病性育種を行ううえでの基礎的情報であMPS抗病性育種に有用なバイオマーカーの探索る。豚βディフェンシンをコードする遺伝子はを行う必要があると考える。

Choi et al.

６）によって29遺伝子報告されており，

そのうちいくつかの遺伝子には一塩基多型

４．要

約（SNP, single nucleotide polymorphism） が 存 在

本研究ではMPS抵抗性ランドレース種集団をすることが報告されている。そのため，DEFB2

用いて，DEFB2の遺伝的な影響を調査するととにおいても個体間差に遺伝的な影響が存在するこ

もに，選抜形質およびIL17との間の遺伝的な関係とが考えられた。しかし，本集団ではDEFB2のを調査することで，DEFB2を指標としたMPS抵

遺伝率がMPS病変スコアよりも低いことから，

抗 性 育 種 の 可 能 性 を 検 討 し た 。そ の 結 果 ，その個体間差に対する遺伝的な影響は小さく，直DEFB2の遺伝率はMPS病変スコアよりも低いこ

接的な選抜指標としては適さないことが示唆されとから選抜指標としては適さないことが示唆された。一方で，MPS病変スコアとは中程度の負のた。その一方で，MPS病変スコアとは中程度の遺伝相関を示していたことから，MPS病変スコ

負の遺伝相関を示していたことから，MPS病変

アが低下する方向への選抜に伴ってDEFB2が上

スコアが低下する方向への選抜に伴ってDEFB2

昇する方向へ選抜されている可能性が示唆され，が上昇する方向へ選抜されている可能性が示唆さ

MPS病変スコアと何らかの関係が存在することれた。また，IL17とは遺伝相関が低い値であったが示唆された。

が，中程度の正の残差相関を示していたことか

ヒトにおいて，DEFB2は乾癬のバイオマーカーとして有効であることが報告され ，またIL17と７）

ら，DEFB2とIL17は非遺伝的な関連性を示すことが示唆された。

の間に高い相関が報告されている 。本研究では，
８）

DEFB2とIL17との間の遺伝相関は低い値であった が ，中 程 度 の 正 の 残 差 相 関 を 示 し て い た 。
DEFB2はIL17の産生誘導によって産出される抗文
献１） Kadowaki, H., Suzuki, E., Kojima-Shibata, C.,
Suzuki, K., Okamura, T., Onodera, W., Shibata, T.,Kano, H.：Selection for resistance to swine© The Ito Foundation

抗菌性ペプチドを指標とした豚抗病性育種法の開発
mycoplasmal pneumonia over 5 generations in
Landrace pigs, Livestock Science, 147, 20～26, 2012.
２） Sato, T., Okamura, T., Kojima-Shibata, C.,
Kadowaki, H., Suzuki, E., Uenishi, H., Suzuki, K.：
Correlated response of peripheral blood cytokines
with selection for reduced mycoplasma pneumoniaof swine lesions in Landrace pigs, Animal Science
Journal, 87, 477～483, 2016.
３） Veldhuizen, E. J., Rijnders, M., Claassen, E. A.,
van Dijk, A., Haagsman, H. P.：Porcine β-defensin
2 displays broad antimicrobial activity against
pathogenic intestinal bacteria, Molecular immunology,
45, 386～394, 2008.
４） Goodwin, R. F. W., Whittlestone, P.：Enzootic
pneumonia of pigs：immunization attempts inoculating
Mycoplasma suipneumoniae antigen by various
routes and with different adjuvants, British
Veterinary Journal, 129, 456～464, 1973.
５） Groeneveld E. VCE User's Guide and Reference
Manual Version 6.0, 2008.
６） Choi, M. K., Le, M. T., Nguyen, D. T., Choi, H.,

145

Kim, W., Kim, J. H., Chun, J., Hyeon, J., Seo, K., Park,
C.：Genome-level identification, gene expression,and comparative analysis of porcine β-defensin genes,
BMC genetics, 13, 98, 2012.
７） Jansen, P. A., Rodijk-Olthuis, D., Hollox, E. J.,
Kamsteeg, M., Tjabringa, G. S., de Jongh, G. J., vanVlijmen-Willems, I. J. J., Bergboer, J. G. M., vanRossum, M. M., de Jong, E. G. J., den Hijer, M., Evers,
A. W. M., Bergers, M., Armour, J. L., Zeeuwen, P. J.
M., Schalkwijk, J.：β-Defensin-2 protein is a serum
biomarker for disease activity in psoriasis andreaches biologically relevant concentrations inlesional skin, PloS one, 4, e4725, 2009.
８） Kolbinger, F., Loesche, C., Valentin, M. A., Jiang,
X., Cheng, Y., Jarvis, P., Peters, T., Calonder, C.,
Bruin, G., Polus, F., Aigner, B., Lee, D. M., Bodenlenz,
M., Sinner, F., Pieber, T. R., Patel, D. D.：β-Defensin
2 is a responsive biomarker of IL-17A-driven skinpathology in patients with psoriasis, Journal ofAllergy and Clinical Immunology, 139, 923～932, 2017.

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146

肉用地鶏の増産を目指した雌系名古屋種の産卵率
および卵殻強度に関する遺伝子座の効率的な探索
Rapid genetic mapping for egg production and eggshell strength in
Nagoya breed for production of meat-type chicken

後藤

達彦１・國重享子２・西村健志１・佐藤駿２（１帯広畜産大学・２北海道立総合研究機構）

Tatsuhiko Goto１, Kyoko Kunishige２, Kenji Nishimura１ and Shun Sato２（１Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, ２Hokkaido Research Organization）

Further improvement of egg production rate and eggshell quality in maternal lines ofmeat-type chickens is crucial to enhance amount of chicken meat. The aim of this study is todetect genetic loci affecting egg production rate and eggshell strength and to collectinformation for future breeding of meat-type chickens. We found that Nagoya breed has
8,563,560 SNPs by using whole genome resequencing technique. By whole genome comparison
with high（n=10）and low（n=10）egg production populations, 53 candidate regions were
found on chromosomes 1-3, 5-13, 15-19, 23-25, and 27. On chromosomes 1-7, 9-11, 19, 20, 23, 25,
27, and 28, we identified 42 candidate regions affecting eggshell strength using windowapproach for comparing genetic differentiation with high（n=9）and low（n=9）eggshellstrength populations. These candidate regions are quite high-resolution than those of previous
QTL reports. Further analyses are planned to reveal which variants of genes affect egg-related
traits and to search common regions sharing the other breeds of Japanese indigenous chickens
e.g., Hinai-dori.

１．目

くのコマーシャル鶏を生産するためには，高産卵的率の雌系が求められる。しかしながら，たとえ２鶏卵は，栄養価が高く，世界中で最も需要のあ

倍の産卵数を示しても，孵化率が低い場合には，る動物性タンパク源の一つである。卵に関連する

そのメリットを最大限に引き出せない。地鶏の種

特徴（卵形質）は，鶏卵生産用のレイヤー産業に

鶏は平飼いで自然交配の環境下のため，破卵を防おける重要性は言うまでもないが，鶏肉生産用のぐ目的で卵殻強度の高い卵が求められる。また，

ブロイラー産業においても，コマーシャル鶏を生

卵殻質が悪い卵は，その孵化率が低いため，産卵産する親世代のとりわけ雌系において非常に重要率の増加とともに，卵殻質の向上も同時に求めらなものとなる。すなわち，一定期間内に100個のれる１）。つまり，肉用地鶏の雌系において，産卵卵を生産可能な個体と，50個を生産する個体で率および卵殻質のさらなる向上は，鶏肉増産に向は，受精卵の生産効率が２倍異なるため，より多けた産業上の最重要課題の一つとなる。

© The Ito Foundation

肉用地鶏の増産を目指した雌系名古屋種の産卵率および卵殻強度に関する遺伝子座の効率的な探索

147

北海道の特産品である新得地鶏は，これまでにの表現型のヒストグラムを作成し，両極端な位置

さまざまな改良がなされ，地域の鶏肉生産を支えに存在する個体群（上位群10個体および下位群10ている。開発元である北海道立総合研究機構畜産個体）を選定した。集団全体の平均産卵率は67±

試験場では，継続した改良が行われており，雌系

16標準偏差（％）であったが，上位10個体ではには，日本の品種である名古屋種が使われてい88.8±1.9％，下位10個体では34.4±7.0％であった

る。名古屋種の卵は，新得地鶏コマーシャル世代（Table１）。300日齢の卵殻強度について分類するを生み出すために重要な働きをしている。現在，と，上位グループで4.0±0.4kg/cm２，下位グルー

名古屋種の雌は，約500個体の規模で継代維持さ

プで2.9±0.5kg/cm２ であった（Table１）。次世代

れているが，産卵ピークを含む180日から300日齢

シークエンサーによる全ゲノムリシークエンスよの産卵率は，低いもので20％程度，高いものでり検出される数百万の変異を対象に，これらの集90％程度と分布の範囲が広く，平均67％（標準偏団それぞれが保有する変異のパターンを比較する

差16）と大きなバラツキがあるため，今後の改良ことによって，産卵率および卵殻強度に関与するが強く求められている。卵殻質の一つの指標であ遺伝子座の迅速な探索を行った。

る卵殻強度は，平均3.8±0.8標準偏差とこちらも各 個 体 の 血 液 サ ン プ ル を 収 集 し ，個 体 別 に分布が広く，改良の余地がある。これらの鶏肉産

DNAを抽出し，濃度測定および品質管理を行っ

業上，重要な形質に関与する遺伝子座が同定できた。次世代シークエンサー（illumina社のHiSeq

れば，将来，新得地鶏の雌系名古屋種の改良を効

X Ten）を用いた全ゲノムリシークエンス解析

率的に行うことに貢献する。

は，受託会社において行った。DNAの断片化をそこで本研究では，産卵率および卵殻強度の表

行い，250-350bpのDNAを精製し，ライブラリを現型の多様性に関与する遺伝子座を同定し，今後作成した。この際，各個体を同定できるように，の雌系名古屋種の集団を効率良く改良するためのアダプター配列を付与した。ペアエンドのシーク

基礎的知見を得ることを目的とした。

エンスを行い，ゲノムサイズ（１Gbp）の５倍の２．方

ゲノムカバレッジ（約５Gbp）になるように調整法

して，次世代シークエンサーの生データ（fastq

北海道立総合研究機構畜産試験場で継代維持さファイル）を取得した。

れている新得地鶏の雌系名古屋種の集団の雌生データ取得後のバイオインフォマティクス（n=488）を対象に，180日から300日齢の産卵率

は，帯広畜産大学後藤研究室のLinux serverを用

Table 1 Phenotype and genome coverage of high and low groups in egg

production（EP）and eggshell strength（SS）
Group

Egg production
High_EP
Low_EP
Eggshell strength
High_SS
Low_SSN

GenomePhenotypecoverage

EP（%）

10
10

5.2 ± 0.4
5.4 ± 0.5

88.8 ± 1.9
34.4 ± 7.0995.2 ± 0.5
5.3 ± 0.5

© The Ito FoundationSS（kg/cm2）

4.0 ± 0.4
2.9 ± 0.5

148

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 2 Number, size, and chromosomes of candidate genomic regions
TargetCandidate region（Z-FST＞4）

phenotype

No.

Size

Chromosomes

Median

Min

Ave

Max

Egg production

53

30 KB

20 KB

232 KB

2.15 MB

1-3, 5-13, 15-19, 23-25, 27

Eggshell strength

42

20 KB

20 KB

123 KB

1.36 MB

1-7, 9-11, 19-20, 23, 25, 27-28

い て 行 っ た 。Lawal et al の 手 法 ２） の よ う に ，10個体（88.8±1.9％），下位10個体（34.4±7.0％）

GATK，BWA，Picard toolおよびSAMtoolsを用からなる２集団を用いた集団ゲノム解析の結果，

いて，fastqファイルを参照配列（galGal5）にマッ産卵率に関与する計53の候補領域が検出された

ピングすることにより，数百万箇所の遺伝的変異（Table ２）。こ れ ら の 候 補 領 域 は ，第 １ - ３，
５

（SNPs）を同定した。VCFtoolsを用いて，全ゲ-13，15-19，23-25および27染色体上に存在し，ノム領域を約９万の20-KBウィンドウに分けて，候補領域のサイズは，平均232KB，最小20KB，

産卵率および卵殻強度の高／低の集団における変最大2.15MBであった。候補領域サイズの中央値

異パターンの違いを，FST の指標を基にして比較が30KBであることから明らかなように，ほとん

した。FST は遺伝的分化の程度を示し，０に近け

どの候補領域は，20-30KBのサイズであり，１

れば両集団が近い関係性にあり，１に近ければ両MBを超える候補領域は４つであった。

集団が遠い関係性にあることを示す。表現型の高300日齢の卵殻強度が有意に異なる上位９個体／低の集団間の比較を行うことによって，両集団（4.0±0.4kg/cm２），下位９個体（2.9±0.5kg/cm２）

が遠い関係性にあるゲノム領域を明らかにするこからなる２集団を用いた集団ゲノム解析の結果，とができれば，当該表現型に関与する遺伝子座を計42の候補領域が検出された（Table２）。それら含む可能性が高い候補領域として検出できる。本

は，第１-７，
９-11，19，20，23，25，27および研究では，標準化したFSTであるZ-FSTの値がきわ

28染色体上に存在し，候補領域サイズは，平均

めて高い領域（Z-FST ＞４）を高低の集団間にお123KB，最小20KB，最大1.36MB，中央値20KB

いて有意に異なる候補領域として検出した。

であった。多くの候補領域は20KBであり，１MBを超える候補領域は１つであった。

３．結果と考察

これまでに多くの研究グループによって，ニワ

次世代シークエンサーを用いた全ゲノムリシー

トリの産卵率および卵殻強度に関与する遺伝子座

クエンスの結果，名古屋種の雌は，集団として（Quantitative Trait Locus；QTL）を明らかにす

8,563,560 SNPsを保有していることが明らかにる試みがなされてきた３）。従来のQTL解析は，遺なった。それらのSNPsを，20-KBウィンドウ単伝子座の信頼区間が広範囲にわたることから，そ位の染色体領域ごとに集計し，各ウィンドウにおれぞれのQTL領域に多数の候補遺伝子があげら

いて30SNPs以上が存在する81,542ウィンドウをれることが課題点とされてきた４）。本研究の結果，対象に，遺伝的分化の程度を明らかにする集団ゲ

産卵率および卵殻強度に関与する多くの候補領域

ノム解析を行った。

のサイズは20-30KBであったことから，従来の180日から300日齢の産卵率が有意に異なる上位

QTL解析の結果と比較して，きわめてマッピン© The Ito Foundation

肉用地鶏の増産を目指した雌系名古屋種の産卵率および卵殻強度に関する遺伝子座の効率的な探索

149

グの解像度が高く候補領域を検出することができの候補領域を検出した。卵殻強度の表現型に基づたことが分かる。このことは，今後計画している

いた上位９個体および下位９個体の集団を対象に大規模な集団を対象にした産卵率および卵殻強度した集団ゲノム解析により，第１-７，９-11，

に関する関連解析を効率よく進めるために有益な

19，20，23，25，27および28染色体上に計42の候

情報を与えるものと考えられる。さらなる研究に補領域が検出された。これらの候補領域は，従来よって，本研究において検出された候補領域が名のQTL解析と比較して，きわめて高解像度にマッ

古屋種に特異的なものであるのか，比内鶏などのピングされた。今後のさらなる解析によって，名他の日本鶏においても共通なものであるのかを明

古屋種の集団が保有する，どのような遺伝子におらかにしていきたいと考えている。

ける変異が産卵形質に関与しているのかを明らか

４．要にするとともに，比内鶏などの他の日本鶏品種に約おいて共通する候補領域を探索する計画である。

肉用地鶏の雌系において，産卵率および卵殻質のさらなる向上は，鶏肉増産に向けた産業上の最重要課題の一つである。本研究では，産卵率および卵殻強度の表現型の多様性に関与する遺伝子座を同定し，今後の雌系名古屋種の集団を効率良く改良するための基礎的知見を得ることを目的とした。次世代シークエンサーを用いた全ゲノムリ
シークエンスにより，名古屋種の雌は，集団として8,563,560 SNPsを保有していることが明らかになった。産卵率の表現型に基づき上位10個体および下位10個体の集団を対象に，集団間の遺伝的分化の程度をゲノムワイドで比較した結果，第１３，５-13，15-19，23-25および27染色体上に計53

文献１） Goto, T., Shiraishi, J-i,. Bungo, T., Tsudzuki, M.：
Characteristics of egg-related traits in the Onagadori（Japanese Extremely Long Tail）breed of chickens,
Journal of Poultry Science, 52, 81～87, 2015.
２） Lawal, R. A., Al-Atiyat, R. M., Aljumaah, R. S.,
Silva, P., Mwacharo, J. M., Hanotte, O.：Wholegenome resequencing of Red Junglefowl andindigenous village chicken reveal new insights on
the genome dynamics of the species, Frontiers in
Genetics, 9, 264, 2018.
３） Goto, T., Tsudzuki, M.：Genetic mapping ofquantitative trait loci for egg production and egg
quality traits in chickens： a review, Journal of
Poultry Science, 54, 1～12, 2017.
４） Andersson, L., Georges, M.：Deciphering thegenetics of complex traits, Nature Reviews Genetics,
5, 202～212, 2004.

© The Ito Foundation

150

牛の暑熱ストレス耐性を担うHSP70.1遺伝子多型に関する研究The study of polymorphism in the bovine HSP70.1 gene associated withthermotolerance

森

美

幸

（福岡県農林業総合試験場生産環境部）

Miyuki Mori
（Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center）

Summer heat stress decreases in the livestock products production and causes low
conception in cattle. Strategy of breeding method is required to selection of the individual
having heat resistance. Heat shock protein 70.1 is a molecular chaperone that is responsible forcellular protection against heat shock, potential candidate genes for stress susceptibility. In thisstudy, we identified single nucleotide polymorphisms（SNPs）located in the partial regions of 3’
and 5’ untranslated regions（UTR）of HSP70.1 in Japanese Black. One hundred three JapaneseBlack cows were genotyped；4 SNPs in 3’UTR and 17 SNPs in 5’UTR were detected withsequence method. One deletion at base position g.895 and three transversions（g.1125 A/C,
g.1128 G/T, g.1204 T/C）in 5’UTR have relation of the linkage disequilibrium by clustering
analysis. Peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）derived from Japanese black cows andHolstein cows were isolated from blood samples and incubated at 41℃ in thermal bath for 3h.
Haplotyping based on these four SNPs（g.895, g.1125, g.1128, g.1204）were significantly
influenced the cell viability after heat shock, haplotype B（CC, CC, TT, CC）in SNPs of g.895,
g.1125, g.1128, g.1204 had heat resistance. However, the survival rate of PBMCs with haplotypeA（CC, AA, GG, TT）and haplotype C（C-, AC, GT, TC）were decreased by heat shock. There
were no significant differences in HSP70.1-mRNA expressions.
In conclusion, we evaluated that the 3’ and 5’UTR of HSP70.1 gene have polymorphism inJapanese Black. The SNPs of 5’UTR region may be useful as genetic markers contribute to
selection for heat resistance in cattle.

１．目

熱環境下でも強健なストレス耐性を有する個体の的選抜法開発という新たな視点での育種戦略が望ま

暑熱によるストレスは乳牛では泌乳量や繁殖成れる。牛の育種選抜は，血統情報による育種価や

績低下，肉用牛では増体量の低下など，畜産物生

SNPs情報を用いたゲノミック評価の活用が進ん産の面で大きな損失となっている。暑熱ストレス

でいるが，これらの評価対象形質は主に増体や乳による牛の生産性低下や損耗を克服するには，暑量などの量的・質的形質であり，ストレス耐性や© The Ito Foundation

151

牛の暑熱ストレス耐性を担うHSP70.1遺伝子多型に関する研究を抽出した。HSP70.1遺伝子の非翻訳領域に相当

繁殖性についてはいまだ確立されていない。
熱ショックタンパク質HSP70.1は，細胞質に存する3’UTR（GenBank accession No AY626950.1）

在するタンパク質の一種で，暑熱ストレスに反応

および5’UTR（M98823.1）の一部配列について特して発現する分子シャペロンタンパク質として知

異的プライマー（Table１）を用いてPCR増幅しられ，生命活動を担うさまざまなタンパク質を熱た 。 増 幅 産 物 を ExoSAP-IT Express PCR

変性から保護，修復する役割を持つ。国外では，

Cleanup Reagents（サーモフィッシャーサイエ

HSP70.1 遺 伝 子 の 多 型（HSP70.1-SNPs）と 乳

ンティフィック）で精製した後，DNAシーケン

牛の供用年数や交雑種の子牛生産率，直腸温度とス（ユーロフィンジェノミクス株式会社）によりの関連について報告があるが，HSP70.1-

塩基配列情報を取得し，SNPsの検出およびアレ

SNPsのアレル頻度には品種や地域差があり ，ル頻度について調べた。3’UTRは102頭，5’UTR

多型と高温耐性との関係についてはいまだ不明なは103頭分の配列情報を取得した。

１ ～ ３）

４）

点が多い。また，国内の黒毛和種，ホルスタイン

2 . 2 HSP70.1遺伝子多型と暑熱ストレス耐性

種ではHSP70.1遺伝子多型についてはほとんどとの相関明らかにされていない。

福岡県農林業総合試験場で飼養している黒毛和そこで本研究では，耐暑性に着目した個体選抜

種雌牛11頭およびホルスタイン種雌牛23頭より血や育種改良に活用できるDNAマーカーの開発へ液を採取し，NucleoSpin Blood（タカラバイオ）

向けた基礎的知見を得ることを目的として，を用いてDNAを抽出した。2.1の黒毛和種雌牛卵

HSP70.1遺伝子のSNPs検索および末梢血単核細巣と同様に，HSP70.1遺伝子3’UTRおよび5’UTR胞を用いた高温耐性評価とHSP70.1-SNPsとのの一部配列についてPCR増幅，増幅産物を精製し相関について調べた。

た後にDNAシーケンスにより塩基配列情報を取２．方得し，SNPsの検出およびアレル頻度を調べた。

法

また，高温負荷に対する耐性評価として，末梢2 . 1 黒毛和種におけるHSP70.1遺伝子多型

血単核細胞を用いて暑熱期の牛体温と同じ条件を再現した培養試験を行った。末梢血単核細胞の採（HSP70.1-SNPs）検索
食肉処理場由来の黒毛和種雌牛の卵巣実質部分取にあたっては，BDバキュテイナCPTクエン酸

よ り 組 織 片 を 採 取 し ，－80℃ で 保 存 し た 後

Na単核球分離用採血管（日本ベクトン・ディッ

NucleoSpin Tissue（タカラバイオ）を用いてDNA

キンソン株式会社）を用いて採血を実施した。室

Table 1 Primer information
Region / GeneSequence（5’-3’）

Product length

Accession number

HSP70.1-3’UTR

F: GGATTGCTCATGTTTGTTATGG
R: CTTGGAAGTAAACAGAAACGGG

253

AY626950.1

HSP70.1-5’UTR

F: GCCAGGAAACCAGAGACAGA
R: CCTACGCAGG AGTAGGTGGT

539

M98823.1

18rRNA

F: AAACGGCTACCACATCCAAGG
R: GCGGAAGGATTTAAAGTGGACTC138

DQ066896

HSP70.1

F: GACAAGTGCCAGGAGGTGATTT
R: CAGTCTGCTGATGATGGGGTTA

117

U09861© The Ito Foundation

152

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

温，3,500rpmで30分間遠心分離して単核細胞を含む層を分離させ，ゲルバリア上に形成された細胞層を15mlチューブに回収した。末梢血単核細胞層を回収したチューブに0.1％PVP加DPBS（シ３．結果と考察3 . 1 黒毛和種におけるHSP70.1遺伝子多型（HSP70.1-SNPs）

グマアルドリッチ，サーモフィッシャーサイエン

黒 毛 和 種 雌 牛 卵 巣 か ら 抽 出 し た DNA よ り

ティフィック）10mlを加え，800rpmで15分間遠

HSP70.1遺伝子の非翻訳領域3’UTR（参照配列

心分離して上澄みを吸引除去，この操作を２回繰

AY626950.1）および5’UTR（同Ｍ98823.1）の配り返して細胞の洗浄を行った後，１×10 ～１×列について，遺伝子多型（HSP70.1-SNPs）の存

10 個 の 細 胞 ペ レ ッ ト を 10 ％ 新 生 仔 牛 血 清 加

在箇所検出およびアレル頻度を調査した。3’UTR

DPBSに懸濁した。高温負荷培養試験には小型恒には，g.101（A/G），g.176（C/T），g.210（G/A），

温槽（MD-MINI）を使用し，暑熱期における生g.215（A/G）の 計 ４ か 所 に 多 型 が 検 出 さ れ た

体体温に相当する41℃（高温区）で３時間培養を（Table２）。5’UTRには，g.895（C/DEL），g.983行った。対照として，通常の牛生体の平均体温に（C/T），g.1036（C/T），g.1045（G/A），g.1058（A/相当する38.5℃で３時間培養した区（対照区）をG），g.1076（G/A），g.1096（A/G），g.1117（G/A），設定した。培養後の末梢血単核細胞をサンプリン

g.1125（A/C），g.1128（G/T），g.1132（A/G），

グし，生存率およびHSP70.1遺伝子発現を調べ

g.1134（T/C），g.1138（C/T），g.1154（C/G），

た。生存率は，蛍光二重染色（ヘキスト33342，

g.1204 （T/C）， g.1228 （C/T）， g.1246 （A/G）

プロピディウムイオダイド）による核染色を行の計17か所に多型が検出された（Table２）。黒毛い，蛍光顕微鏡を用いて生細胞と死細胞の割合を和種において検出された5’UTRのg.1138（C/T），調査した。遺伝子発現解析については，RNeasy

g.1228（C/T）については，これまで国外の在来

mini kit（キアゲン）のプロトコールに従ってRNA

種やホルスタイン種においては報告されていない抽出を行い，QuantiTect Reverse Transcription

SNPsであり，他のSNPsについてもこれらの品種

Kit（キアゲン）を用いて逆転写反応を実施した。

とはアレル頻度が異なっていた２，４，５）。本解析で内部標準遺伝子として18ｓリボゾーマルRNA

得られた黒毛和種の5’UTRに検出された多型につ（18rRNA）を 用 い ，HSP70.1 遺 伝 子（Table １）

いてクラスター分析を実施したところ，g.895，の発現についてPower SYBR Green PCR Masterg.1125，g.1128，g.1204の４か所については類似

Mix（サーモフィッシャーサイエンティフィック）

度が高く，連鎖不平衡の関係，つまりハプロタイ

を用いてリアルタイムPCR（ABI7500，アプライ

プであると推定された（Fig.１）。

６

７

ドバイオシステムズ）により解析した。相対発現量の算出については⊿⊿CT法を用いて行った。
2.3

統計処理

3 . 2 HSP70.1遺伝子多型と暑熱ストレス耐性との相関
当 場 飼 養 の 黒 毛 和 種 雌 牛 11 頭 に お い て は ，

末梢血単核細胞の生存率およびHSP70.1遺伝

HSP70.1 遺 伝 子 の 非 翻 訳 領 域 3’UTR の g.176 ，

子発現解析については，対照区と高温区間で対応

g.210，g.215にヘテロ型の多型を有する個体が存のあるｔ検定を実施した。なお生存率について在していたがその割合は低かった。5’UTRにはは，逆正弦変換後にｔ検定を実施した。

g.895，g.1045，g.1117，g.1125，g.1128，g.1204，
g.1246に多型が検出された。ホルスタイン種雌牛© The Ito Foundation

153

牛の暑熱ストレス耐性を担うHSP70.1遺伝子多型に関する研究
Table 2 Genotype of HSP70.1-SNPs
Genotype frequency（％）
Region

3'UTR

SNPs

101

A/G

176

C/T

210
215
895

5'UTR

Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center

Japanese Black＊

G/A
A/G

AA
73.5

Japanese Black

Holstein

―

―

AG
24.5

GG
2.0

CC

CT

TT

CC

CT

TT

73.5

24.5

2.0

66.7

33.3

0

GG

GA

AA

GG

GA

AA

76.5

22.5

1.0

66.7

33.3

0

AA

AG

GG

AA

AG

GG

77.5

19.6

2.9

77.8

22.2

0

―
―
―

C/Del

CC

C/

//

CC

C-

―

CC

C-

―

15.5
TT

45.5
―

0

65.2

34.8
―

0

C/T

25.2
CT

54.5

983

59.2
CC

1036

C/T

1045

G/A

1058

A/G

90.3
CC
90.3
GG
72.8
AA
90.3

8.7
CT
7.8
GA
17.5
AG
8.7

1.0
TT
1.9
AA
9.7
GG
1.0

1076

G/A

1096

A/G

1117

G/A

1125

A/C

1128

G/T

1132

A/G

1134

T/C

1138

C/T

1154

C/G

1204

T/C

GG
89.3
AA
77.7
GG
66
AA
35.9
GG
39.8
AA
90.3
TT
72.8
CC
90.3
CC
78.6
TT

GA
9.7
AG
19.4
GA
20.4
AC
37.9
GT
35.9
AG
8.7
TC
17.5
CT
8.7
CG
18.4
TC

AA
1.0
GG
2.9
AA
13.6
CC
26.2
TT
24.3
GG
1.0
CC
9.7
TT
1.0
GG
2.9
CC

16.5
CC
90.3
AA
81.6

35.9
CT
8.7
AG
13.6

47.6
TT
1.0
GG
4.9

1228

C/T

1246

A/G

―
GG
90.9

GA
9.1
―

―
AA
0

―
―

―

―

―
GG
81.8
AA
36.4
GG
36.4

GA
18.2
AC
36.4
GT
36.4
―

AA
0
CC
27.3
TT
27.3

AA
91.3

AG
8.7
―

GG
0

AA
26.1
GG
26.1

AC
30.4
GT
30.4
―

CC
43.5
TT
43.5

―

―

―

―

―
TT

TC

CC

CC
91.3
TT

36.4

36.4
―

27.3

26.1

AA
72.7

AG
27.3

GG
0

CG
8.7
TC

GG
0
CC

30.4
―

43.5

―

＊Genotyped from Japanese Black ovaries collected from a local abattoir.

23頭では，3’UTRには多型が検出されなかった

場内の黒毛和種およびホルスタイン種雌牛につが ，5’UTR に お い て は g.895 ，g.1096 ，g.1125 ，いて，5’UTRのクラスター分析における類似度がg.1128，g.1154，g.1204に多型が検出された（Table

高い４か所のSNPs（g.895，g.1125，g.1128，g.1204）

２）。

について，g.895，g.1125，g.1128，g.1204の塩基© The Ito Foundation

154

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

600（Euclidean distance）

500
400
300
200
100
0
895 1125 1128 1204 983 1058 1132 1139 1228 1036 1076 1246 1096 1154 1045 1134 1117
（Position）
Fig. 1 Dendrogram constructed by HSP70.1-SNPs detected at the 5’UTR region.

置 換 が な い ハ プ ロ タ イ プ Ａ（CC ，AA ，GG ，置換型，g.1128置換型は子牛生産率が低く，g.1204

TT），g.895の置換がなくg.1125，g.1128，g.1204

については相関が認められなかったと報告していがホモで置換しているハプロタイプＢ（CC，る２）。一方Basiricoらは，g.895のホモ欠損型，g.1128

CC，TT，CC），g.895，g.1125，g.1128，g.1204

置換型は，いずれも高温負荷後の末梢血単核細胞のヘテロ置換が起こっているハプロタイプＣのHSP70.1-mRNA発現と生存率が高いと報告し（C-，AC，GT，TC）の３グループに分類してている７）。これらの報告はいずれも単独のSNPs

末梢血単核細胞の高温負荷試験を行い，細胞生存について検証しており，それぞれ正負の効果につ率およびHSP70.1-mRNA発現量を比較した。高

いての可能性が示唆されているが，黒毛和種にお温負荷試験後の末梢血単核細胞の生存率は，ハプ

ける本解析ではこれらの４か所のSNPsについて

ロタイプＡとＣでは高温区（41℃）の生存率が対は連鎖不平衡の関係を有するハプロタイプである

照区（38.5℃）に比べて低下したが，ハプロタイと考えられ，個体の高温耐性については複数の

プＢでは高温による生存率の低下は認められなSNPsが連鎖するハプロタイプ効果を評価する必かった（Table３）。HSP70.1-mRNA発現量は，要があることが示唆された。ストレスマーカーでハプロタイプ間に有意な差は認められなかった

あるHSP70.1は，高温感作により発現が誘導され（Fig.２）。ｇ.895のシトシン（Ｃ）欠損型と繁殖ることが知られるが，本試験の末梢血単核細胞に性，生産性については負の相関があるという報告

対する41℃３時間の高温負荷試験では，HSP70.1-

が多く，乳牛や交雑種牛の連産性や子牛生産率がmRNAの差が判然としなかった。末梢血単核細低いこと，交雑種種雄牛の精液性状や凍結融胞を用いたBasiricoらの報告では，43℃の高温下解後の生存性が劣る６）ことが報告されている。

では１時間後にHSP70.1-mRNA増加が認められ

g.1125，g.1128については，Rosenklanらはg.1125

たものの４時間後には生存率が大きく低下し，遺１，
２）© The Ito Foundation

155

牛の暑熱ストレス耐性を担うHSP70.1遺伝子多型に関する研究
Table 3 The survival rate of bovine peripheral blood mononuclear cells after heat shock.
HSP70.1-SNPs at 5’-UTR
Position

Haplotypecell viability（％）

895

1125

1128

1204

n

0h

Cultured 3h

CC

AA

GG

TT

38.5℃

41℃

ttest

A

CC

AA

GG

TT

5

95.3±2.088.9±3.380.6±3.6

＊

B

CC

CC

TT

CC

4

97.7±0.8

90.7±3.088.2±2.7

n.s

C

C-

AC

GT

TC

5

96.2±0.8

89.0±0.976.4±3.8†

n：Japanese Black（JB）and Holstein cows（H）in Fukuoka Agriculture and Research Center.
Haplotype A（n=5 ; JB 2+H 3）,Haplotype B（n=4 ; JB 1+H 3）,Haplotype C（n=5 ; JB 2+H 3）.

Relative HSP70.1mRNA expression(Haplotype A, 38.5℃=1）* p<0.05, † p<0.1

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6

38.5℃

0.4

41℃

0.2
0.0

A

B

C

HaplotypeFig. 2 HSP70.1-mRNA expression of bovine peripheral blood mononuclear cells.

Peripheral blood mononuclear cells were incubated at 38.5℃ or 41℃ for 3h. Results are means±SEM of the fold change

relative to that on Haplotype A cultured at 38.5℃ as a control.

伝子発現量の差も認められていない７）。牛胚盤胞て20％前後も低下しており，高温により浮遊細胞

では，凍結融解後41℃６時間の高温条件下で培養である末梢血単核細胞の生存性が損なわれ，熱するとHSP70.1-mRNAは有意に増加したが，48ショックに対する細胞の応答反応であるHSP70.1

時間後には差は認められていない８）。体外培養由増加という分子シャペロンが機能しなかった可能

来の単層の牛子宮内膜上皮細胞においては，41℃性もあると考えられた。

３時間でHSP70.1-mRNAの有意な増加が認めら

本研究により，国内の主要な肉用品種である黒れている 。HSP70.1の遺伝子レベルでの発現変

毛和種におけるHSP70.1-SNPsに関する遺伝子動の発動と持続時間については細胞種や培養形態

型とアレル頻度が明らかとなり，ハプロタイプににより異なる可能性があり，末梢血単核細胞のより高温感受性に差がある可能性が示唆された。

HSP70.1-mRNA発現については本試験での調査

今後は，暑熱ストレス検出マーカー選抜へ向け，

時間とは異なる時間帯に変化が起きていた可能性

これらのHSP70.1遺伝子多型が暑熱ストレス関があると考えられた。また，本試験では試験区分

連遺伝子群の発現に及ぼす影響について解明を進

によっては高温培養後の生存率が培養前と比較しめるとともに，暑熱期における個体の生産性，繁９）© The Ito Foundation

156

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

殖性に着目した能力評価を行う必要があると考え
られる。
４．要

約

本研究では，牛耐暑性に関するDNAマーカー
開発を目的としたHSP遺伝子のSNPs検索および
高温耐性との関連について解析を行った。黒毛和種における熱ショックタンパク質関連遺伝子
HSP70.1の非翻訳領域である3’UTR，5’UTRについて調べたところ，3’UTRに４か所，5’UTRに17か所にSNPsが存在することを明らかにした。そのうち5’UTRに存在する４か所のSNPsは連鎖不平衡の関係が認められ，末梢血単核細胞への高温負荷試験では，ハプロタイプにより細胞生存率への影響に違いが認められた。

文献１） Schwerin, M., Sanftleben, H., Grupe, S.：Arch
Tierz, 46, 178～185, 2003.
２） Rosenkrans Jr, C., Banksa, A., Reitera, S., Looper,
M.：Ani Rep Sci, 119, 178～182, 2010.
３） Xiong, Q., Chai, J., Xiong, H., Li, W., Huang, T.,
Liu, Y., Suo, X., Zhang, N., Li, X., Jiang, S., Chen, M.：
Cell Stress and Chaperones, 18, 711～718, 2013.
４） Oner, Y., Keskin, A., Ustuner, H., Soysal, D.,
Karakas, V.：S Afr J Anim Sci, 47, 424～439, 2017.
５） Syahruddin Said, Widya Pintaka Bayu Putra.：Biodiversitas, 19, 1622～1625, 2018.
６） Deb, R., Sajjanar, B., Singh, U., Kumar, S., Sengar,
G. S., Alex, R., Das, A. K., Tyagi, S., Raja, T. V.,
Alyethodi, R. R., Singhi, R., Bhanuprakashi, V.,
Prakash, B.：J Genet, 95, 1035～1038, 2016.
７） Basirico, L., Morera, P., Primi, V., Lacetera, N.,
Nardone, A., Bernabucc, i U.：Cell Stress Chaperones,
16, 441～448, 2011.
８） Mori, M., Hayashi, T., Isozaki, Y., Takenouchi, N.,
Sakatani, M.：Jour Reprod Dev, 61, 423～429, 2015.
９） Mori, M., Hayashi, T., Ueda, S., Shimomura, K.：
Jour Reprod Dev, 62 Suppl, P-60, 2016.

© The Ito Foundation

157

DNAメチル化網羅解析法による種雄牛の受胎性の評価
Genome-wide DNA methylation analysis for early evaluation of bulls

山

崎

淳

平・永

野

昌

志

（北海道大学大学院獣医学研究院）

Jumpei Yamazaki and Masashi Nagano（Hokkaido University, Graduate School of Veterinary Medicine）

Aberrant DNA in spermatozoa has increasingly been appreciated as an important factor
that associates with male infertility and abnormal development of fetus in human medicine.
The aim of this study is to utilize the novel genomic screening system for DNA methylation incow（Bovine DREAM）to investigate association between DNA methylation and conception
rate of bovine spermatozoa.
We studied eight spermatozoa from bulls for genome-wide quantitative DNA methylation
analysis with next-generation sequencing. We had 22,246 CpG sites that were commonly
obtained from all eight samples by Bovine DREAM. Clustering analysis with these CpG sites
identified a clearly separated two clusters. Then, we focused on CpG sites that are highlyvariable and that are located closely to genes reported to be imprinting genes in human andmouse. We performed bisulfite-pyrosequencing to analyze five CpG sites of genomic DNA fromanother set of 17 spermatozoa samples from bulls. As a result, four out of five CpG sites weresuccessfully analyzed. We found there were two CpG sites that showed higher DNA
methylation levels in a group of spermatozoa with high conception rate than those with low.
Interestingly, these two CpG sites are found to be close to“gene A”．
Bovine DREAM is found to identify candidate CpG sites that could be associated withconception rate of bovine spermatozoa. Further study should be performed to validate theseresult with a large number of spermatozoa samples. These results will help identify themechanism of change in sperm parameters and reproduction performance of bulls.

１．目

的存在がDNAメチル化であり，近年，ヒトの男的性不妊の原因となる乏精子症にこのDNAメチル

遺伝子のインプリンティング（刷り込み）現象

化の異常が関わることが示唆されつつある１）。父とは父方および母方由来対立遺伝子それぞれから方および母方の対立遺伝子それぞれで特異的にメの特異的な発現様式を可能とするために厳密に制チル化されている部位（インプリンティング遺伝

御されている機構で，胚発生，新生子の発達，胎子）がヒトゲノムでは約100箇所同定されており，盤機能などに重要である 。この機構を司る中心

これらは配偶子形成の段階で形成されるが，これ１）© The Ito Foundation

158

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

らインプリンティング遺伝子の適切なメチル化の能となる解析法（Bovine DREAM）を樹立する

喪 失 お よ び 子 へ の 伝 達 異 常 に よ り Beckwith-

ことに成功した。具体的には，牛精子DNAにおWiedemann syndrome（BWS）といった発達異いて100,000箇所にわたるDNAメチル化レベルを

常につながることが判明している 。一方，近年検討することが可能であり，組織特異性と個体特

シークエンス技術が発展し，エピジェネティクス

異性を検出することが可能であった。本年度は同分野におけるゲノムワイドな解析法がさまざまに解析法をさまざまな受胎性を示す種牡牛由来精液

樹立され用いられている。その結果，精子におけを用いることによって，特に受胎性に関連性が高るインプリンティング遺伝子だけでなくさまざま

いDNAメチル化変化領域の特定を試みた。

２）な異常なメチル化と男性不妊や胎児発達異常との強い関連が指摘されている３）。また興味深いことに，肥満などの父親の状態が精子に反映され，子に伝わっていく現象もDNAメチル化で説明可能であることが発表されている 。

２．方法

2 . 1 牛凍結精液におけるDNAメチル化のゲノ
ムワイド解析法の応用
凍結精液サンプルをPBSで洗浄し，２×10６ の４）

興味深いことに，牛にもヒトのBWSと同様の精子数に合わせゲノムDNAをDNA抽出キット

表 現 型 を 示 す Large offspring syndrome（LOS）（QIAGEN） に よ っ て 抽 出 し た 。 Nanodropが報告され，体外受精を用いた場合にその発生頻（Thermo Fisher Scientific）に よ る 濃 度 測 定 と度が高いことが判明している。さらに重要な点と100ngを１％アガロースの電気泳動にて泳動像をして，この異常を呈する子牛にはヒトと同様にイ

確認し，ゲノムDNAに大幅な切断がないことをンプリンティング遺伝子の伝達異常が起きている確認する。

ことが示されている 。この事実は，インプリン

次に，これらゲノムDNAに関しDREAM法６）

ティングを伝える大元である精子におけるDNAによる解析を行った。まず抽出したDNAより，メチル化状態の変化が，臨床的に存在する未解明

CCCGGGをともに認識配列とするDNAメチル化の問題，特に種雄牛の精液性状の変化と受胎率低

感受性／非感受性制限酵素ペアSmaI（NEB）に下を関連づける重要なメカニズムであることを示て 25 ℃，３ 時 間 ，次 に XmaI（NEB）を 用 い て唆しているのではないだろうか？

25℃，16時間の連続的処理により切断した。次に５）

ところがこれまでの報告では，ヒトの遺伝子情Klenow（NEB）を 用 い て 切 断 末 端 を 平 滑 化 後

報を外挿し限られた遺伝子部位の検討やヒトにおAmpureXP（Beckman Coulter）に よ る 精 製 をけるDNAメチル化のゲノムワイド解析デバイス行った。次に，シークエンス用アダプター（NEB）

を半ば強引に牛で用いたものであるため，網羅的を付加し，DNAを精製後，AmpureXPにより目かつ信頼性のあるデータを提供することができて的 の サ イ ズ（250-500bp）の 断 片 を 精 製 ，イ ン

いない。また少ない遺伝子座に限定して検討する

デックスプライマー（NEB）を用いたPCR反応

ことでは多数存在すると想定される未知のインプにより増幅を行い，次世代シークエンス用のライ

リンティング遺伝子を含めた網羅探索を可能とす

ブ ラ リ 作 製 を 行 っ た 。得 ら れ た ラ イ ブ ラ リ をる研究を行う必要性がある。

Qubit HS（Invitrogen）によって定量を行い，必そこで，本申請者は昨年度の同研究助成によっ要量を（株）DNAチップ研究所に外注，バイオて牛のDNAメチル化のゲノムワイドな検討が可

アナライザー（Agilent）にてクオリティチェッ© The Ito Foundation

DNAメチル化網羅解析法による種雄牛の受胎性の評価

159

ク後，Illumina HiSeq3000を用いたシークエンス

複数領域にマッピングされることが判明した。こを行った。得られたfastqシークエンスデータのれらの原因としてやはりウシゲノム特有の繰り返

Bowtie２を用いたウシゲノムへのマッピング後，し配列が原因となっていることが推測されるが，Pythonスクリプトを用いたゲノムワイドDNAメ

本法におけるこの問題の克服法は現時点では見つ

チル化データを得た。精液サンプルと並行し，血かっておらず今後の検討が必要である。

液３サンプルも同時に解析に供した。
2.2

次に，約20％ながらもウシゲノムへの単一のDNAメチル化変化領域に対する確証実験

マッピングが認められたシークエンスデータを用

ゲノムワイド解析によって得られた，受胎性といてゲノムワイドなDNAメチル化データの取得

関連すると考えられるDNAメチル化の変化領域を試みた。まず種雄牛由来精液サンプルの８サンに対して，局所のDNAメチル化解析に関して最

プルにおいて共通してDNAメチル化の比較が可も信頼性があり，ゲノムワイドな探索解析に比べ能であった22,246CpGサイトについて検討を行っ

比較的低コストで解析が可能であるバイサルファた。その結果，48％がCpGアイランドと呼ばれる

イトパイロシークエンス法を用いて検討を行っ

CpGサイトが密集している領域，また20％が遺伝た。ゲノムワイド解析に用いたサンプルとは異な子のプロモーター領域由来のCpGサイトであっる精液17サンプルを入手，DNA抽出後，バイサた。次に，それぞれのサンプルにおけるDNAメ

ルファイト変換をinnuCONVERT Bisulfite Basik

チル化の相関を検討するためにクラスタリング解Kit（Analytik jena）によって行った。対象領域析を行ったところ，今回用いた精液８サンプルがを増幅するようなプライマーを設計後，増幅させ大きく２群に分かれることが判明した（Fig.１）。

パ イ ロ シ ー ク エ ン サ ー（QIAGEN）に よ っ て

次に，これら22,246CpGサイトの定量的DNAメ

DNAメチル化レベルを検討した。

チル化データを詳細に検討し，特異的変化を伴うサイトを同定しようと試みた。受胎率の高低との３．結果と考察

関連を検討するため，DNAメチル化レベルが本はじめに精液サンプル由来のゲノムDNAより

８サンプルにおいて変動が大きい箇所（標準偏差作製したライブラリを作製したところ，前回報告の大きい箇所），および受胎率の低下に影響を及の 通 り ，す べ て の サ ン プ ル に お い て 400bp とぼすと予想されるDNAメチル化の変化はインプ

500bpに鋭いピークパターンが現れた。この現象

リンティング遺伝子のDNAメチル化の異常であは牛特異的であり，このバンドパターンの除去方ると報告されているため，ヒト，マウス，また牛法を現在もPCR条件を変更することで解決策をにおいてインプリンティング遺伝子として報告の探っている最中である。これらのライブラリサン

ある遺伝子にまず着目した。その結果，変動の大プルをシークエンスへと供したところすべてのサ

きいCpGサイト上位1000箇所のうち，20箇所のンプルで約1000万リードが得ることができ，ライCpGサイトの近傍にインプリンティング遺伝子とブラリの量に問題がないことが確認された。次にして報告されているものが含まれていた。このう

このfastqシークエンスデータをBowtie２による

ち，牛においても真にインプリンティング機構がウシゲノムにマッピングを行ったところ，得られ働いていれば血液サンプルならば50％のDNAメ

たリードの約20％がウシゲノムへの単一のマッピ

チル化の値を示すはずであるため，この条件に合ングを示したが，その他約80％はウシゲノム上の致した３箇所を優先的に，またこれ以外にも２箇© The Ito Foundation

160

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）
0
44.03
100

Fig.1 Hierarchical clustering analysis of eight samples used for Bovine DREAM in this study. DNA

methylation levels are shown in blue as low to red as high. Note that there two clusters
separated clearly.

所を対象領域として後述の確証実験へと進めるこ

プ分けを行い，各対象領域のDNAメチル化レベとにした。なお，Carvalho et al.７）によって検討

ルの違いに関して検討を行ったところ，４箇所中されたIGF2R遺伝子の近傍のDNAメチル化レベ

２箇所において受胎率の高いグループにおけるルは性選別前後だけでなく，種雄牛間においてもDNAメチル化が高い傾向を示していた（Fig.２，

まったく変わりはなかった。

CpG１，
２）
。興味深いことに，これら２箇所は同

次に，Bovine DREAMによって抽出された候じ遺伝子Ａの近傍に存在するものであり，この遺補領域に対しての確証実験を新たなサンプルセッ

伝子近傍のDNAメチル化が受胎率の違いに関し

トを用いることで試みた。前項にて同定された，て何らかの関連をもつことが強く示唆された。そウシゲノム上におけるDNAメチル化特異的変化の他２箇所に関しては本検討では違いは認められ候補領域に対して，さまざまな種牡牛，また異ななかった。

る時期に採精された精液サンプルをその既知の受今後，これら変化の見られたCpGサイトについ胎率とともに17サンプルほど入手し，バイサルて対象種雄牛数を増やし，個体間，季節変動など

ファイトパイロシークエンス法を用いて検討を

環境要因によるDNAメチル化と既存の精液評価行った。なお，Bovine DREAMの値の正確性を項目，さらには繁殖成績との関連を検討し，種雄確認するため，血液サンプルを含め７サンプルを牛の精液性状の変化に関する新規項目として樹立

同時に解析に供した。その結果，解析対象領域５を目指す。また当該遺伝子の機能に注目すること箇所のうち４箇所でDNAメチル化レベルの定量

で，受胎率低下を関連づける根本的メカニズムのが可能であった。また，パイロシークエンスに解明や，牛特有の新規インプリンティング遺伝子

よって結果の得られた値は，Bovine DREAMに候補の同定といった基礎研究への貢献を目指す。

て得られたDNAメチル化のレベルとほぼ同程度の結果を示しており，その正確性が再確認された。

４．要約

新規の精液17サンプルの受胎率によって，高昨今，ヒトの精子におけるさまざまな異常な（10サンプル）および低（７サンプル）にグルー

DNAメチル化と男性不妊や胎児発達異常との強© The Ito Foundation

Lo

H

CpG４

100
80
60
40
20
0

w
Lo

h

ｐ＝0.6430
Hig

DNA methylation（％）

w

ｐ＝0.0046

ig
h

w
w
Lo

h

ｐ＝0.6430
Hig

DNA methylation（％）

CpG３

100
80
60
40
20
0

161

CpG２

100
80
60
40
20
0

Lo

ig
h

ｐ＝0.0170

DNA methylation（％）

CpG１

100
80
60
40
20
0
H

DNA methylation（％）

DNAメチル化網羅解析法による種雄牛の受胎性の評価

Fig.2 DNA methylation levels of CpG 1, 2, 3, and 4 analyzed by bisulfite-pyrosequencing between

conception rates of High and Low groups.

い関連が指摘されている背景から，すでに樹立し子Ａの近傍に存在していた。今後対象種雄牛数をた牛のDNAメチル化のゲノムワイド解析法によ増やすことによって今回同定されたCpGサイトのり種雄牛の精液性状の変化と受胎率低下に関連すDNAメチル化と既存の精液評価項目，さらにはるDNAメチル化の関連性を検討した。本研究で繁殖成績との関連について確証を得る予定であはまず異なる種雄牛由来８サンプルからの精液をる。また，本研究を基盤として，種雄牛の精液性用いてDNAメチル化網羅的解析を行った。次世状の変化と受胎率低下を関連づける根本的メカニ

代シークエンスにより全８サンプルにおいて共通ズムの解明を目指す。

し て DNA メ チ ル 化 の 比 較 が 可 能 で あ っ た
22,246CpGサイトについてクラスタリング解析を行ったところ，大きく２群に分けられた。DNA
メチル化レベルの変動が大きく，またヒトやマウスにおいてインプリンティング遺伝子として報告されている近傍のCpGサイトについて，新規精液サンプルを用いてさらに検討を行った。本検討では，このうち４領域においてはCpGサイトの局所解析として信頼性の高いバイサルファイトパイロ
シークエンスによる解析が可能であった。その結果，このうち２箇所のCpGサイトが，受胎率の高いグループと低いグループとの比較において
DNAメチル化レベルにおける差が認められ，興味深いことにこの２箇所のCpGサイトは同一遺伝

文献１） Kobayashi, N., Miyauchi, N., Tatsuta, N.,
Kitamura, A., Okae, H., Hiura, H., Sato, A.,
Utsunomiya, T., Yaegashi, N., Nakai, K., Arima, T.：
Factors associated with aberrant imprint
methylation and oligozoospermia, Sci Rep, 7, 42336,
2017.
２） Elhamamsy, A. R.：Role of DNA methylation in
imprinting disorders： an updated review, J Assist
Reprod Genet, 34, 549～562, 2017.
３） Kobayashi, H., Sato, A., Otsu, E., Hiura, H.,
Tomatsu, C., Utsunomiya, T., Sasaki, H., Yaegashi, N.,
Arima, T.：Aberrant DNA methylation of imprinted
loci in sperm from oligospermic patients, Hum Mol
Genet, 16, 2542～51, 2007.
４） Donkin, I., Versteyhe, S., Ingerslev, L. R., Qian, K.,
Mechta, M., Nordkap, L., Mortensen, B., Appel, E. V.,
Jørgensen, N., Kristiansen, V. B., Hansen, T.,
Workman, C. T., Zierath, J. R., Barrès, R.：Obesity© The Ito Foundation

162

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of
Spermatozoa in Humans, Cell Metab, 23, 369～78, 2016.
５） Chen, Z., Hagen, D. E., Elsik, C. G., Ji, T., Morris, C.
J., Moon, L. E., Rivera, R. M.：Characterization of
global loss of imprinting in fetal overgrowth
syndrome induced by assisted reproduction, Proc
Natl Acad Sci U S A, 112, 4618～23, 2015.
６） Jelinek, J., Lee, J. T., Cesaroni, M., Madzo, J.,
Liang, S., Lu, Y., Issa, J. J.：Digital Restriction

Enzyme Analysis of Methylation（DREAM）, Methods
Mol Biol, 1708, 247～265, 2018.
７） Carvalho, J. O., Michalczechen-Lacerda, V. A.,
Sartori, R., Rodrigues, F. C., Bravim, O., Franco, M.
M., Dode, M. A.：The methylation patterns of the
IGF2 and IGF2R genes in bovine spermatozoa are
not affected by flow-cytometric sex sorting, Mol
Reprod Dev, 79, 77～84, 2012.

© The Ito Foundation

163

霜降り豚肉の生成に関わる生体内因子の探索
Investigation of a bio-marker relating to pork meat marbling谷口

雅章１・中島郁世１・荒川愛作１・吉岡豪２・鈴木香澄２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，２岐阜県畜産研究所）

Masaaki Taniguchi１, Ikuyo Nakajima１, Aisaku Arakawa１, Go Yoshioka２ and Kasumi Suzuki２（１Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, ２Gifu Prefectural Livestock Research Institute）

Previously, we identified quantitative trait loci（QTL）for intramuscular fat（IMF）content
in Duroc pigs. Introgression of those QTL by marker-assisted selection enabled to establish a
novel Duroc strain（Buono-Brown：BB）with twice as much IMF content as a basic strain of
Duroc at Gifu prefectural Livestock Research Institute. Today, the BB strain produces porkmeat with average IMF of 6％．To identify molecular markers which are associated with IMF
content in pork carcass, we aimed to elucidate a broad overview of metabolites profiles which
are potentially associated with longissimus dorsi（LD）muscle. Pork carcasses were planned to
be produced by Landrace and Large White crossbred sows mated with the BB boars. We
aimed to compare the metabolites profiles in serum between 3 groups of fattening pigs：1）
control（0.56％ Lysine level in feeding）,2）exp. 1（0.76％ Lysine）and 3）exp. 3（0.96％ Lysine）.
We planned to obtain blood samples from the fattening pigs at 120 d, 134 d, 148 d and justbefore slaughter. However, the outbreak of classical swine fever in Gifu prefecture hit directly
the pig farm at prefectural Livestock Research Institute in December 2018. Right after that, all
the pigs in the institute were ought to be sacrificed. Therefore, our planned examination wasforced to be cancelled. However, we intend to start reproducing the BB strain using the basic
genomics information in near future.

１．目

点である。欧米では赤身の多い豚肉生産に重点が的置かれているが，我が国では独特の食習慣から豚一般的な養豚では，繁殖性や保育能力に優れる

肉にも霜降りが求められ，そのような豚肉を高品

大ヨークシャー種およびランドレース種を母系と質と捉える向きもある。近年，北米では日本向け

し，産肉性（肉量・肉質）に優れるデュロック種に輸出するために霜降りのある豚肉を生産しはじを父系として掛け合わせることで肉豚を生産すめている。国産の高品質豚肉を安定的に生産するる。そのため産肉性の高いデュロック種の育種改ためには，高能力のデュロック種系統豚を開発・良が進められている。デュロック種の産肉性を向普及させることが必須である。

上させるうえで，筋組織における筋細胞および脂岐阜県は農業生物資源研究所（現農研機構：代肪細胞の発達のバランスをいかにとるかが重要な表者所属）との共同研究により，遺伝的な特性か© The Ito Foundation

164

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ら霜降り割合が６％を超える（一般的な豚肉は2.3３％）特徴的な肉質を持つデュロック種系統豚で統計解析は，t 検定，部分的最小二乗回帰分析

あるボーノブラウンを開発した。また栄養学的研（PLS）ならびに主成分分析（PCA）を用いて，究により豚の第一制限アミノ酸であるリジンが要

飼料中のリジン含量により変動した代謝物を同定

求量より低い飼料（低リジン給与）給与が霜降りする。

割合を増加させる一方，高リジン給与は増体性に優れるが霜降り割合は低くなることが経験的に知

統計解析

３．結果と考察られている。しかしながら，その生物学的メカニ

試験豚は2018年10月上旬に120日齢となった段ズムは現在のところ不明である。そこで，高霜降

階で，順次リジン含量の異なる区に群分けし，飼り割合の豚肉を安定的に生産するデュロック種系

料給与試験を開始したが，12月５日に同研究所に

統豚を供給するためには，あるいは，霜降り割合

おいて豚コレラ患畜が確認され，その後ただちにと増体性の良さのバランスをとった飼養管理を実

全頭殺処分された。そのため，飼料中のリジン含現するためには，給餌飼料中のリジン含量の違い

量による代謝物の変動ならびにIFM等の肉質へのにより飼料に含まれる栄養・エネルギーがどのよ

効果について検討するための材料が存在しないた

うに筋肉あるいは脂肪細胞へ変換するか分子生物

め，計画していた研究が続行不可能となった。

学的メカニズムを解明する必要がある。本研究では，飼料中のリジン含量が豚枝肉の霜降り割合に４．要約影響するメカニズムを解明し，霜降り割合の指標

豚の肥育期間中において飼料中のリジン含量がとなるバイオマーカー（代謝物・マイクロRNA

IMFに影響することはよく知られているがその分を含む生体内因子）を同定する。

子生物学的メカニズムは不明な点が多い。遺伝的

２．方
2.1

特性としてIMF含量が高い種豚ボーノブラウンの法

産子を用いたリジン含量の異なる飼養試験を行い，血中代謝物の変動を網羅的に解析し，IMFと供試豚および材料

岐阜県畜産研究所養豚・養鶏研究部にて生産さ関連のある代謝物の同定を検討しようと考えた

れる三元交雑豚（LWD種）について，120日齢よが，豚コレラ発生により供試豚が殺処分されたたり，リジン含量0.56％（対照区），0.76％（実験区め，計画を中止した。

１），および0.96％（実験区２）の３群に分け，２週間おきに148日齢まで３回の採血を行う。血液サンプルは遠心分離後，上清を回収して各分析に供試するまで－80℃にて保管した。
2.2

文
献１） Bligh, E. G., Dyer, W. J.：A rapid method for
total lipid extraction and purification, Can. J.
Biochem. Physiol, 37, 911～917, 1959.

血清中の代謝物分析

Bligh & Dyer法 １）により血清中の代謝物を抽※やむを得ない事情により研究は遂行できません

出し，オキシム化液およびメトキシアミン塩酸塩

でしたが，助成対象として採択しましたので掲載

により誘導体化したものをガスクロマトグラしました。（事務局）

フィー質量分析計にて代謝物の網羅的な解析を行う。

© The Ito Foundation

165

組織分化制御因子の遺伝子発現プロファイルに基づく
豚体外受精胚の新規培養技術の開発
Improvement of in vitro culture system of porcine IVF embryos by gene
expression profiles involved in cell differentiation

澤

井

健・三

浦

瑠

璃

（岩手大学農学部）

Ken Sawai and Ruri Miura（Faculty of Agriculture, Iwate University）

Although the procedure for in vitro production of porcine embryos such as in vitro
fertilization（IVF）has improved, the efficiencies of embryo development and offspringproduction after embryo transfer are not high. In order to improve the efficiency of offspringproduction, functional assessment of porcine preimplantation embryos obtained by IVF isrequired. SOX2 is one of the key factors involved in the differentiation of mouse
preimplantation embryos. However, knowledge on the roles of SOX2 in preimplantation
development during porcine embryos is currently limited. This study examined the transcript
and protein expression patterns of SOX2 and attempted to elucidate the functions of SOX2
during porcine preimplantation development using RNA interference. SOX2 mRNA was foundto be upregulated at 2-cell to 16-cell stage, and nuclear localization of the SOX2 protein was
detected at the 8-cell stage, as well as in subsequent developmental stage. SOX2
downregulation did not affect embryonic development until the blastocyst stage. Results ofgene expression analysis showed that SOX2 downregulation did not affect the expression levels
of TEAD4 and OCT-4 in 8- to 16-cell stage and blastocyst stage porcine embryos. However,at blastocyst stage, the total cell numbers and the rate of SOX2 positive cells in SOX2
downregulated embryos were lower than that in control embryos. Furthermore, localization of
SOX2 signals in the inner cell mass of blastocyst obtained from SOX2 siRNA injection weredifficult to detect. Our results indicated that SOX2 is an important factor for the
preimplantation development of porcine embryos. In addition, it is possible that SOX2
expression status is a marker for functional assessment of porcine IVF embryos．

１．目

しながら，同じく有用家畜である牛において，胚的移植を利用した子畜の生産技術が広く普及してい豚は食肉としての利用はもとより，ヒトの疾患ることと比較して，豚における胚移植技術は普及

モデル動物としての利用や移植用臓器の生産を目していない。その理由として，牛では過剰排卵技的とした利用が期待される有用家畜である。しか術を利用した移植胚の生産技術が実用化されてい© The Ito Foundation

166

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

るが，豚では同技術が実用化されておらず，移植

初期胚においてもSOX2 mRNAが発現している胚の安定的な供給が困難なことがあげられる。そこと，また，牛胚においてSOX2タンパク質が胚のため豚においては，体外受精（IVF）を利用し盤胞期のICMに局在することが明らかになっておた移植胚の体外生産技術が注目されている。しかり４），SOX2が豚初期胚の組織分化を制御する重しながら，豚のIVF胚は，体外発生の効率が低い

要因子の一つである可能性がある。しかしながこと，移植後の受胎率が低いこと，早期胚死滅がら ，豚 初 期 胚 に お け る SOX2 の 発 現 動 態 や ，

高頻度で発生することなどが問題となっており，

SOX2が豚初期胚の胚発生やICM/TE分化に及ぼこれら異常の原因解明とその克服が重要かつ緊急す影響については明らかではない。そこで本研究の課題となっている。

では，豚初期胚の組織分化を制御する因子の新た

上記のような豚IVF胚に認められる課題を克服な探索として，豚初期胚におけるSOX2の発現動するためには，IVF胚を移植可能な段階（胚盤胞態を明らかにするとともに，RNA干渉法を用い期）まで体外で効率よく発生させることはもとよ

たSOX2の人為的発現抑制が豚初期胚の胚発生おり，胚移植後の高い受胎率と産子生産率を確保す

よび組織分化に及ぼす影響について検討を行った。

ることが重要となる。そのためには，組織分化（胎子・胎盤形成）や着床などの機能が正常なIVF胚を生産できる体外培養法を開発する必要があり，組織分化や着床など豚IVF胚の機能性を客

２．方法

2 . 1 豚卵子の体外成熟，体外受精および体外発生

観的に評価する指標が必要となっている。しかし

食肉処理場由来の豚卵巣から未成熟卵子を吸引ながら，豚胚における組織分化や着床などの詳細採取し，１mM dbcAMP，10 IU/ml PMSGおよ

な機構は明らかにされておらず，豚IVF胚の機能

び10 IU/ml hCGを含む修正NCSU-37培地５）内で性を評価することは困難な状況にある。

20時間培養した。その後，dbcAMP，PMSGおよ

哺乳動物胚において，桑実期から胚盤胞期にかびhCG無添加の修正NCSU-37培地で24時間培養

けて起こる内部細胞塊（ICM；将来胎子になる細を継続し，体外成熟（IVM）卵子を得た。IVM胞群）と栄養膜細胞（TE；将来胎盤になる細胞

後の卵子をm-PigFM培地６）を用いて６時間媒精群）の分化は，胎子・胎盤形成や着床の起点となすることによりIVF胚を得た。得られたIVF胚は，る重要なプロセスである。最近，申請者らは転写

PZM- ５ 培 地 ７） を 用 い て ，体 外 培 養（IVC）を因子の一種であるOCT-４が豚胚のICMおよび行った。なお，IVM，IVFおよびIVCは，すべてTE形成に必須であることを明らかにし，OCT-

38.5℃，５％CO２ ，5％Ｏ２ ，90％Ｎ２ の気相条件

４が豚IVF胚の機能性を評価する指標となる可能下で行った。

性を示した。一方，初期胚の組織分化はさま

１，
２）

2.2

siRNAの注入

ざまな因子が相互に作用しながら制御していると

SOX2遺伝子発現抑制用siRNA（SOX2 siRNA）

され，豚胚においてもOCT-４を含む複数の因子

およびいずれの遺伝子の発現も抑制しないコント

が組織分化に関与していると考えられる。

ロールsiRNA（Control siRNA）は，IVF後の１-マウス胚においてOct-４と同様に初期胚の未分化性を維持している因子としてSRY-related

細胞期胚の細胞質内にFemtojet（Eppendolf）を用いて注入した。

HMG-box gene2（SOX2）が知られている 。豚３）© The Ito Foundation

組織分化制御因子の遺伝子発現プロファイルに基づく豚体外受精胚の新規培養技術の開発

2.3

167

OCT-4 mRNA発現量を解析した。さらに，上記

mRNA発現量解析

IVM後の卵子および各発生段階に発生した胚から３区における胚盤胞期胚の総細胞数およびSOX2抽出したmRNAをQuantitect Reverse Transcription

発 現 陽 性 細 胞 率 を 測 定 す る と と も に ，SOX2

Kit（Qiagen）を用いて逆転写しcDNAを得た。

mRNA発現量およびSOX2タンパク質発現を解析得られたcDNAを用いてQuantitect SYBR Greenした。

PCR Kit（Qiagen）によりリアルタイムPCRを行い，各遺伝子のmRNA発現量を測定した。リア
ルタイムPCRはStep One Real Time PCR system（Applied Biosystems）を用いて行った。なお，各遺伝子のmRNA発現量は，同一サンプル内の
GAPDH発現量を用いて補正した。
2.4

３．結果と考察3 . 1 豚卵子および初期胚におけるSOX2発現
動態
豚IVM卵子および各発生段階に発生した豚初期胚のSOX2 mRNA発現量をFig.１に示した。

蛍光免疫染色SOX2 mRNA発現量は，IVM卵子，１-細胞期胚，IVM後の卵子および各発生段階に発生した胚

桑実期胚，胚盤胞期胚に比べ，８-～16-細胞期胚を４％パラフォルムアルデヒドを用いて固定しで 有 意（ p ＜ 0.05）に 高 い 値 を 示 し た 。一 方 ，た。その後，0.1％Triton X-100を含むPBSで洗SOX2タンパク質は４-細胞期まで発現が認めら

浄後，0.5％BSAと１％スキムミルクを用いてブれなかったが，８-細胞期以降の胚の細胞核で発ロッキングし，SOX2の１次抗体（sc-365823；

現が認められた。また，胚盤胞期胚ではSOX2の

Santa Cruz Biotechnology）を 用 い て 処 理 し たタンパク質発現に局在性が認められ，ICMと思わ

後，Alexa488で標識された２次抗体（A11029；

れる部位にSOX2タンパク質発現が局在していInvitrogen） で 処 理 し た 。 そ の 後 ， VECTA-た。豚初期胚でのSOX2 mRNA発現においては，

SHIELD with DAPI （Vector Laboratories） で胚盤胞期と比較して，４-細胞期から８-細胞期で封入した。

高い発現量が認められるという報告８）と，４-細IVM卵子，１-細胞期胚，２-～４-細胞期胚，胞期から８-細胞期と比較して胚盤胞期で高い発

８-～16-細胞期胚，桑実期胚，胚盤胞期胚におけ現量が認められるという報告９）がある。本研究でるSOX2 mRNA発現量の比較解析を行うとともは，Zangらの報告８）と一致する結果が得られ，に，IVM卵子，１-細胞期から16-細胞期までの豚初期胚におけるSOX2 mRNA発現は８-細胞期

各発生段階の胚，桑実期胚，胚盤胞期胚におけるから16-細胞期にかけて最も高いことが明らかと

SOX2タンパク質発現を解析した。次に，１-細なった。また，マウス胚においてSOX2タンパク

胞 期 胚 に SOX2 siRNA を 注 入 す る 区 （SOX2

質はICMとTE両方に発現することが明らかとsiRNA区），Control siRNAを注入する区（Control

なっているが３），本研究において，豚胚盤胞期胚

siRNA区），siRNAを注入しない区（Uninjected

ではSOX2タンパク質発現がICMに局在する可能区）を設け，それぞれの胚において８-～16-細胞性が示された。牛の胚盤胞期胚においてSOX2タ期でのSOX2 mRNA発現量およびSOX2タンパク

ンパク質発現がICMに局在することが明らかと質発現を解析するとともに，胚盤胞期までの発生なっており４），本研究の結果から，豚胚と牛胚の率を調べた。また，上記３区に由来する８-～16-

SOX2発現の類似性が明らかとなった。

細 胞 期 胚 お よ び 胚 盤 胞 期 胚 の TEAD4 お よ び© The Ito Foundation

168

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

3aRelative abundance

2.5
ab

2
1.5
1
0.5

bc

c
c

c

0
IVM

2- to 4-cell 8- to 16-cell

1-cellMorulaBlastocyst

Fig. 1 Relative abundance（mean ± SEM）of SOX2 transcripts in porcine matured oocytes（IVM）and various stageembryos（n＝５）．
Different superscripts indicate a significant difference（ p＜0.05）．



a,b,c

Table 1 Effect of SOX2 siRNA injection on in vitro development of porcine embryos＊† of embryos developed toNo.（％）

Treatment

Number ofembryos
cultured

２-cell≤Uninjected274

ａ215（78.5）

Control siRNA271ｂ173（63.8）

SOX2 siRNA

273

195（71.4）ab

＊

Day２

Day３

Day４

Day５

４-cell≤MorulaBlastocystａ208（75.9）50（18.2）

65（23.7）ｂ152（56.1）32（11.8）45（16.6）ｂ179（65.6）36（13.2）

41（15.0）

Experiments were replicated five times．

†

Percentages of the number of embryos cultured．

a, b

Different superscripts indicate a significant difference（p＜0.05）．

3 . 2 SOX2発現抑制が豚初期胚の初期発生にいてSOX2 mRNA発現が他の区と比較して有意（ p＜0.05）に低い値を示し，さらにUninjected区

及ぼす影響
siRNA注入によりSOX2発現抑制を行った結果

およびControl siRNA区の16-細胞期胚の細胞核をTable１に示した。IVC３日目において４-細胞で は SOX2 発 現 が 認 め ら れ た も の の ，SOX2期以上に発生した胚の割合は，Uninjected区と比siRNA区ではSOX2発現が認められる細胞核が少較してControl siRNA区およびSOX2 siRNA区でなかった。これらのことから，SOX2 siRNA注入

有意（ p＜0.05）に低い値を示したが，IVC４日

によりSOX2の発現が抑制されていることが示さ目の桑実期およびIVC５日目の胚盤胞期への発生れた。以上の結果から，豚初期胚においてSOX2率では異なる処理区間で差は認められなかった。

は胚盤胞期胚への発生に影響を及ぼさない可能性

SOX2 siRNA区においては，８-～16-細胞期におが示された。

© The Ito Foundation

組織分化制御因子の遺伝子発現プロファイルに基づく豚体外受精胚の新規培養技術の開発

Number of cells per embryo

50

169

a
ab

40

b

30

20

10

0
Uninjected

Control siRNA

SOX2 siRNA

Fig. 2 Average number of total cells in porcine blastocyst stage embryos obtained from Uninjected （n＝22），ControlsiRNA（n＝26），or SOX2 siRNA（n＝19）injection．
Different superscripts indicate a significant difference（ p＜0.05）．

a,b

3 . 3 SOX2発現抑制が豚初期胚の組織分化にの相互作用は認められないことが明らかとなった。マウスの胚性幹細胞においては，SOX2は及ぼす影響
SOX2 siRNA区の８-～16-細胞期胚および胚盤

Oct-４と複合体を形成し，Oct-４を含むさまざ

胞期胚におけるTEAD4およびOCT-4 mRNA発

まな組織分化制御因子の発現を制御していること

現量は，Uninjected区およびControl siRNA注入

が 明 ら か と な っ て い る が 10），豚 胚 に お い て は区と比較して有意な差は認められなかった。一

SOX2によるOCT-４の発現制御は認められず，方，SOX2 siRNA区における胚盤胞期胚の総細胞

牛胚と同様の結果４）となった。一方，本研究にお数は，Uninjected区と比較して有意（ p＜0.05）

いて，SOX2発現抑制胚では，胚盤胞期での細胞に少ない値を示した（Fig.２）。さらに，胚盤胞数が有意に減少し，さらにSOX2発現の局在も認期におけるSOX2発現陽性細胞率はUninjected区

められなかった。これらのことは，豚胚では，およびControl siRNA区と比較してSOX2 siRNA区

SOX2が桑実期から胚盤胞期にかけて起こるICM

で有意（ p＜0.05）に減少した。また，Uninjected形成に関与し，SOX2発現抑制胚ではICMが形成

区およびControl siRNA区においては，胚盤胞期されていない可能性を示すものである。すなわのICMと思われる細胞群でSOX2タンパク質発現

ち，本研究ではSOX2発現抑制胚では胚盤胞期への局在が認められたのに対し，SOX2 siRNA区での発生は阻害されなかったが，それら胚盤胞期胚はSOX2タンパク質を発現している細胞がきわめではTE形成のみが起こっている可能性がある。

て少なく，SOX2タンパク質発現の局在も認めら

今後，ICM形成のマーカー遺伝子の発現動態を同れなかった。

時に解析することなどによりSOX2が豚初期胚のマウス胚においては，SOX2とTEAD4の相互的な発現抑制作用が明らかとなっているが３），本研究の結果から，豚胚においてはSOX2とTEAD4ICM形成を制御する機構を明らかにする必要がある。
本研究によって，SOX2が豚胚の初期発生，特© The Ito Foundation

170

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）にICM形成に重要な役割を担う可能性が示された。これらのことはSOX2が豚初期胚におけるた。これまでに豚胚の組織分化制御因子として明ICM形成に関与する可能性を示すものである。本

らかとなっているOCT-４などとともにSOX2発研究結果から，豚初期胚の発生においてSOX2が現動態を指標に，豚IVF胚におけるIVCの条件を重要な役割を担うことが示唆され，SOX2発現動検討することで，豚IVF胚の機能性の向上が期待

態が豚IVF胚の機能性を評価する指標の一つになできる。

ることが示された。

４．要

約

本研究では，豚初期胚の組織分化を制御する候
補因子としてSOX2に着目し，豚卵子および初期胚でのSOX2発現動態を解析した。また，RNA干渉法により豚初期胚におけるSOX2発現の人為的抑制を行い，SOX2発現抑制が豚胚の初期発生および組織分化に及ぼす影響について検討した。その結果，豚初期胚におけるSOX2 mRNA発現は８-～16-細胞期で高いことが明らかとなった。また，SOX2タンパク質は８-細胞期以降の割球細胞核で発現が認められ，胚盤胞期においてはICMと思われる細胞群に発現が局在することが示された。SOX2発現抑制により，胚盤胞期への発生に影響は認められず，またOCT-４やTEAD4など
他の組織分化制御因子の発現動態にも影響しなかった。しかしながら，SOX2発現抑制により，胚盤胞期での細胞数が有意に減少し，さらに胚盤胞期におけるSOX2発現の局在も認められなかっ文
献１） Sakurai, N., Fujii, T., Hashizume, T., Sawai K.：J
Reprod Dev，59，353～360，2013．
２） Emura, N., Sakurai, N., Takahashi, K., Hashizume,T., Sawai, K.：J Reprod Dev，62，401～408，2016．
３） Keramari, M., Razavi, J., Ingman, K. A,. Patsch, C.,
Edenhofer, F., Ward, C. M., Kimber, S. J.：PLoS One,5, e13952，2010．
４） Goissis, M. D., Cibelli, J. B.：Biol Reprod ，90 ，１～10，2014．
５） Petters, R. M., Wells, K. D.：J Reprod Fertil,
Suppl，48，61～73，1993．
６） Kikuchi, K., Onishi, A., Kashiwazaki, N., Iwamoto,M., Noguchi, J., Kaneko, H., Akita, T., Nagai, T.：Biol
Reprod，66，1033～1041，2002．
７） Yoshioka, K., Suzuki, C., Onishi, A.：J Reprod
Dev，54，208～213，2008．
８） Zang, L., Luo, Y. B., Bou, G., Kong, Q. R., Huan, Y.
J., Zhu, J., Wang, J. Y., Li, H., Wang, F., Shi, Y. Q.,
Wei, Y. C., Liu, Z. H.：Anat Rec，294，1809～1817，
2011．
９） Kumar, B. M., Maeng, G. H., Jeon, R. H., Lee, Y. M.,
Lee, W. J., Jeon, B. G., Ock, S. A., Rho, G. J.：J Assist
Reprod Genet，29，723～733，2012．
10） Kuroda, T., Tada, M., Kubota, H., Kimura, H.,
Hatano, S. Y., Suemori, H., Nakatsuji, N., Tada, T.：
Mol Cell Biol，25，2475～2485，2005．

© The Ito Foundation

171

体外胚生産技術を活用した純粋種豚（トウキョウＸ）の生産性向上に関する研究
Improvement of offspring-productivity on closed-colony pig（Tokyo-X）
using in vitro production technologies

岡田

幸之助１・鈴木亜由美２（１日本獣医生命科学大学応用生命科学部動物科学科，
公益財団法人 東京都農林水産振興財団 東京都農林総合研究センター畜産技術科）

２

Konosuke Okada１ and Ayumi Suzuki２（１School of Animal Science, Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary and Life Science University,
２Tokyo Metropolitan Agriculture and Forestry Research Center）

In spite of several attempts, the embryo transfer in Tokyo-X had been not successful.
Thus, not only the procedure of embryo transfer but also the increasing quality of embryotransferred should be improved. We previously indicated that a combination of FSH-LH
induced the higher rate of in vitro maturation（IVM）in pig（hybrid vs. outbred). In thisstudy, the effect of the hormonal treatments on in vitro fertilization（IVF）and in vitro culture（IVC）was examined. The follicles were excised from the ovaries and the cumulus-oocytecomplexes were collected. Then, the complexes were cultured for 44 hours with several
hormonal treatments; FSH-LH, FSH-LH/LH, and FSH/LH groups. For IVF, after thawing
Tokyo X frozen semen, the viable sperms were sorted and co-cultured with matured oocytes
at a final concentration of １× 10 ６ cells/ml for 6 hours（insemination). After insemination, theoocytes were cultured for farther 12 hours and then fixed-stained to examine the sperm
penetration rate. For IVC, the insemination was on day 0 and the first division rate and theblastocyst formation rates were observed on day 2 and 6, respectively. The blastocysts
obtained were stained with DAPI to count the cell numbers. As results, there was no
significant among the experimental groups on sperm penetration rate and normal fertilization
rate, while the FSH-LH groups tended to be higher, compared to the other groups. These
results suggest that FSH-LH is suitable for the production of IVF embryos of Tokyo X. Finally,
although non-surgical embryos transfer of Tokyo-X blastocysts alone did not yield theoffspring, co-transfer with cross hybrid（LWD）embryo could generate the offspring fromboth pigs. In order to elucidate this reason, the further study is needed．

１．目

東京都畜産試験場（現：東京都農林水産財団）は的

1997年に新規造成系統となるトウキョウＸを開発

東京都の養豚業の再編，輸入肉に負けない付加

した１）。バークシャー種，デュロック種および北価値，消費者に喜ばれる豚肉の開発を目的とし，

京黒豚を基本豚に肉質重視で開発されたトウキョ© The Ito Foundation

172

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ウＸ肉は，３品種の肉質長所を余すことなく備えており，その肉質は臭みがなく，風味や味わいに

２．方法

優れ，特に豚肉の味を左右する脂肪は良質であ

2.1

る。一方，高品位な肉質を優先して開発され食肉処理場で初回排卵前のトウキョウＸおよびたことから，その生産効率（出荷日数延長）や繁三元交雑種雌（LWD：ランドレース×大ヨーク

殖性（一腹産子数など）は一般的に流通している

シャー×デュロック）から採取した卵巣を25～

三元交雑種と比べて劣っている。これらのトウ

30℃に保管し，２時間以内に研究室へ持ち帰っ

キョウＸにおける生産性の特徴（問題点）は系統

た。0.1％ポリビニールアルコール含Dulbeccoʼsリ

特有のものであり，肉質維持のためには妥協しな

ン酸緩衝液（DPBS（－）-PVA）中で卵巣を洗浄ければならない。このような状況下，東京オリン後，ガラスシャーレ上で直径４～６㎜の卵胞を２ピック開催を機に国内外においてトウキョウＸ肉枚のメス刃を用いて切り出した。卵胞内が透き通をさらに周知させるために，生産性拡大に向けてり，浮遊物がなく，卵胞内壁から卵丘（卵母細胞）

動き出している。生産性拡大のためには，母豚数が 脱 落 し て い な い 卵 胞 を 選 出 し た 。選 出 後 ，増加による仔豚生産上昇に加えて，体外胚生産技

HEPES-Naおよび0.1％PVAを含み，pH7.4に調整術の併用も有効であると考えられる。体外胚生産

し た HEPES 緩 衝 Chatot-Ziomek-Bavister

技術は，食肉処理場由来卵巣より採取した未成熟（H-CZB）液を含むガラスシャーレへ卵胞を移動

卵母細胞を体外成熟―体外受精後に体外培養するした。次に実体顕微鏡下で２本のピンセットを用ことによって胚を作出する一連の技術であり，こいて卵胞膜をつまんで破り，壁顆粒膜細胞が一部の過程により得られた胚を子宮内移植することに付着した状態の（未成熟）卵母細胞―卵丘細胞―より，産仔生産する。しかしながら，豚における壁顆粒膜細胞複合体（OCGCs：oocyte-cumulus-

本技術の研究は多くなされてきているが，すべてgranulosa-complexes）を 採 取 し た 。OCGCs をの過程において満足できるものは少ない。また一H-CZB液中で洗浄した後，透明感のある卵丘細般的な豚の応用技術的研究においては，食肉処理胞群が周囲に半層以上緊密に付着し，卵細胞質が場にて入手しやすい交雑種由来卵巣を用いるた

均一で卵細胞膜が明瞭な卵母細胞を有する

め，交雑種で得られた結果をトウキョウＸのよう

OCGCsを選出した４）。

１，
２）

豚卵母細胞の採取および体外成熟な純粋種系統（他には黒豚や中ヨークシャーな

体外成熟培地には，高性能豚卵子成熟用基本培ど）に適用する場合，系統間の差が生じることも養液（機能性ペプチド研究所）を，ホルモンにはある。これはマウスやラットにおいて顕著な例で0.5μg/mlの豚由来FSHおよび0.5μg/mlの豚由来

あり ，近交系，クローズドコロニー，交雑種のLHを用いた。４穴滅菌ディッシュ内のHP-POM

順で繁殖性が低下し，それぞれに見合った繁殖技に洗浄したOCGCsを導入し，39.0℃，100％湿潤，術が開発されてきている。このことから，本研究

５％CO２および95％大気の環境下で合計44時間成では，本質的に繁殖性が低いトウキョウＸへの体熟培養した。ホルモン処理として，培養前半（０～

外胚生産技術の補完により，生産効率向上を見込

22 時間）にFSH およ びLH を添 加 し，培養 後 半める手法開発を試みた。また豚において，純粋種（22～44時間）にはホルモン無添加（対照区：と交雑種間における体外胚生産技術条件の相違がFSH-LH/FREE）あるいはLH添加した区（FSH-見られるか否かについて検討した。

LH/LH区）および培養前半にFSHを単独添加し，

３）© The Ito Foundation

体外胚生産技術を活用した純粋種豚（トウキョウＸ）の生産性向上に関する研究

173

培養後半にLH添加した区（FSH/LH区）をそれ

ウ キ ョ ウ Ｘ 胚 お よ び LWD × ト ウ キ ョ ウ X

ぞれ設定した。

［LWDX］胚）を子宮深部に非外科的に移植し2.2

体外受精および受精率の評価た。移植後28日目に，発情回帰のみられなかった

成熟培養後，卵丘細胞群が膨潤化したOCGCs

個体について超音波画像診断装置により妊娠判断を含む培養液中に，0.1％ヒアルロニダーゼを含し，産仔を得た場合には，系統比率，性別および

むDPBS
（－）
-PVA中でインキュベートした。イ

新生仔体重を評価した。

ンキュベート後，H-CZB液に移し，ガラスキャ
ピラリーを用いて卵母細胞に付着している卵丘細３．結果と考察

胞を一層残す程度に静かに除去した。その後，実トウキョウＸの体外受精率および胚盤胞形成率

体顕微鏡にて第一極体放出が確認できた卵母細胞について，いずれの処理区においても有意差は見を成熟卵母細胞として実験に用いた。次に成熟卵られなかったが，FSH/LH区においては正常受精

母細胞を豚媒精液（PFM；機能性ペプチド研究率（32.2％）が高く，異常受精率（22.6％）が低所）ドロップ中で洗浄後，リプロプレート内のい傾向が見られ，胚盤胞形成率（23.2％）も最も

PFMへ移動し，媒精までインキュベートした。

高い値を示した（Table１，２）。FSH/LH区が良媒精にはトウキョウＸ凍結精子を使用し，好な数値を示した理由として，LH受容体（LH-R）

Percoll密度勾配法によって生存精子を分離した。

の関与が推察された。LH-Rは採卵直後の卵丘細最終精子濃度１×10 個／mlで６時間媒精した。

胞には存在しないが，FSH刺激後卵丘細胞膜上に媒精後，卵母細胞を豚胚発生用培地（PZM-5；

LH-Rが形成される５）。また，成熟開始と同時に機能性ペプチド研究所）中に移動し，39.0℃，

添加した場合，LHの作用効果は長時間持続され100％湿潤，５％CO２および95％大気の環境下にないため，FSH誘導性LH-Rの形成までにLHの作

おいて12時間培養した。

用が持続されにくいことが考えられた６）。これら

６

受精率を調べるため，卵母細胞を酢酸―100％のことから，成熟培養前半でのLHは必須ではな

エタノールに浸漬して固定―脱脂した。次に，酢く，トウキョウＸの体外成熟時にはFSH/LH処理

酸―オルセインで染色して観察した。

が適していることが示唆された。

2.3

体外発生

三元交雑種では，FSH-LH/LH区が高い正常受

媒精６時間後にPZM-5中で洗浄―裸化し，形精率（38.2％）および胚盤胞形成率（28.8％）を態学的に正常な推測的受精卵を選別後，PZM-5

示したことから，ホルモンに対する感受性につい中で培養した。媒精日を０日目として，２日目にてトウキョウＸと異なることが推測された

第一分割率を算出し，断片化，変性および退行卵（Table１，２）。トウキョウＸは，純粋種を長期間を除去した。４日目に半量のPZM-5をピペット

にわたって繰り返し交配し，他からの遺伝子移入で吸引し，新鮮なPZM-5を添加した。６日目にのない状態で維持するクローズドコロニーであ

胚盤胞形成率を算出した。

り，系統造成―認定以来，その品質を維持してき

2.4

胚移植

ている。この系統本来の特性（肉質を優先し，繁離乳後あるいは自然発情開始６日後，子宮深部殖能を妥協）も併せて，本質的繁殖性は低下しや注入用カテーテルセット「匠」（富士平工業）をすい傾向があるのかもしれない。一方，三元交雑

用いて体外作出した20～40個の発生５日目胚（ト種は繁殖性も産肉性も優れ，系統間の交配によ© The Ito Foundation

174

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 The effect of LH-adding timing on in vitro fertilization in pigs.
No.（%）of oocytes

No.（%）of oocytes fertilized

Average no. of

Strains

Treatments（n）

examined

penetrated

normally１

abnormally２

sperm/oocyte３

Tokyo-X

FSH-LH/free（9）167089（53.3）049（29.3）40（24.0）

1.84±0.14

FSH-LH/LH（5）101057（56.4）029（28.7）

28（27.7）

1.77±0.15

HybridFSH/LH（5）115

063（54.8）037（32.2）26（22.6）

1.84±0.18

FSH-LH/free（16）346

187（54.1）

113（32.7）74（21.4）

1.61±0.95

FSH-LH/LH（12）314

194（61.8）120（38.2）

74（23.6）

1.58±0.91

FSH/LH（12）327

202（61.8）

107（32.7）

95（29.1）

1.68±1.00

１A female and male pronucleus with 2 polar bodies.
２Polyspermy and other nuclear status.
３Means±SEM.

Table 2 The effect of LH-adding timing on in vitro culture in pigs.
No.（%）of oocytes

Development to the

Average cell no.

Strains

Treatments（n）

examined

divided１

blastocyst stage（%）

of blastocyst２

Tokyo-X

FSH-LH/free（5）11062（56.4）

17（15.5）33.4±2.7

FSH-LH/LH（2）49

23（46.9）07（14.3）

28.6±2.9

FSH/LH（3）69

37（53.6）

14（20.3）

26.4±1.3

FSH-LH/free（3）65

38（58.5）

15（23.1）

39.6±4.5

FSH-LH/LH（3）66

33（50.0）15（22.7）39.1±2.2

Hybrid１The first division was observed on day 2 and they were ≥ 2 cells.
２Blastocyst rate was observed on day 6 andthey were ≥ 16 cells.

３Means±SEM.

Table 3 The production of presumptive Tokyo-X offsprings using non-sugical embryotransfer with hybrid embryos

Average no. of
No. oftests

offsprings

littersize

presumptive
Tokyo-X offsprings１

Tokyo-X alone

3

0

－

－

Tokyo-X and hybrid

2

15

7.5

13

Transfferd embryos

１The strains of offsprings were estimated by their coat color.

り，その子豚の能力が両親の平均能力を上回る雑示唆している。

種強勢効果を商業上もたせている。このような各安定した胚盤胞発生率の培養系が確立されたた系統の性質が，さまざまな細胞応答における系統

め，トウキョウＸ体外受精卵移植の受胎―分娩を間の差異を生じさせていることも考えられる。本目指した。３頭の受卵豚に移植を試みたが，いず研究における三元交雑種との比較は，試験系統にれも受胎には至らなかった（Table３）。また上述

適した体外成熟条件を用いる必要性があることをの実験において，胚盤胞の細胞数は三元交雑種由© The Ito Foundation

体外胚生産技術を活用した純粋種豚（トウキョウＸ）の生産性向上に関する研究

175ず，トウキョウＸ体外受精卵の品質を改善する必要がある。過去に体外成熟時に添加するホルモンについて検討を重ね，FSH/LHの組み合わせが適切であることが示された。本研究では，FSH/LH
処理が体外受精および体外発生に及ぼす影響を調べた。卵巣から卵胞を切り出して複合体を採取し，成熟時にいくつかのホルモン処理を実施し，合計44時間培養した。媒精のため，トウキョウＸ
凍結精液を融解後，生存精子を選別して最終濃度
１×10６個／mlで合計18時間共培養した。培養後，固定―染色して精子侵入率を調べた。体外発生では，２日目に第一分割率，６日目に胚盤胞形成率を計測した。得られた胚盤胞をDAPI染色して胚盤胞細胞数を計測した。精子侵入率および正常受Fig. 1 The piglets derived from co-transfer

with Tokyo-X and hybrid embryos
produced in vitro.

精率において，実験区間に有意差は見られなかったが，他の区と比較してFSH-LH区が高い傾向を示した。これらの結果は，トウキョウＸの体外受精卵作出には，FSH-LH区が適していることが示

来胚においてが有意に高いことが示されているこ唆している。次に，得られた胚盤胞を非外科的にとから，トウキョウＸ卵は他品種よりも発生が遅移植したところ，トウキョウＸ胚のみ移植では，く，発生能が低い可能性があるかもしれない。こ産仔を得られなかったが，三元交雑種胚との共移のため，発生能がより高いと考えられる交雑種由植によって，産仔を得られた。この理由を解明す

来胚を共移植することにより，トウキョウＸ胚のるために，今後も検討を継続していく。

着床促進を検証した。この結果，共移植した２例
は受胎―分娩に至った。トウキョウＸ胚単独の移植で受胎に至らなかった原因として，移植胚数が少なかったこと，および初期の移植では手技的問題もあったことが考えられた。分娩２例の産子は体毛色から多くがトウキョウＸと推定されるが（Fig.１），最終的には遺伝子検査により判定する
予定である。
４．要

約

トウキョウＸの生産性向上を目指して受精卵移植を試みているが，いまだ受胎には至っておら文
献１）
 東京都農林総合研究センター，トウキョウＸ：
http://www.tokyo-aff.or.jp/syutiku/01tokyox.html
２） TOKYO-X 生 産 組 合 ， TOKYO-X に つ い て：http://tokyox.net/about３） 古田祐奈，中川隆生，森田真裕，伊藤慧，永井匡，
佐東春香，安齋政幸，入谷明：Institute of Advansed
Technology，14，１～８，2009．
４）
 Okada, K., Krylov, V., Kren, R., Fulka, J. Jr.：
Journal of Reproduction and Development，52，91～
98，2006．
５）
 Shimada, M., Nishibori, M., Isobe, N., Kawano, N.,
Terada, T.：Biology of Reproduction ， 68 ， 1142 ～
1149，2003．
６） 服部眞彰：新動物生殖学，朝倉書店，生殖のホルモン，61～62，2011．

© The Ito Foundation

176

発情発見困難牛の特徴解明による授精率向上方策の検討
Characterization of estrus-related behaviors in subestrous cattle toimprove submission rate

坂口

実・菊池

元宏・三浦

弘

（北里大学獣医学部）

Minoru Sakaguchi, Motohiro Kikuchi and Hiroshi Miura（School of Veterinary Medicine, Kitasato University）

In cattle industry, detection of estrus is prerequisite for optimal timing of insemination.
Visual observation of standing estrus is often cited as industry standard；however, it is
becoming difficult to detect standing estrus. In this study we tried to evaluate the vocalization
during the preovulatory periods as estrus behavior and to characterize the subestrous
behaviors in non-restricted beef cows by continuous observation using a video system.
Although no vocalization was observed when 2 or more cows were in estrus, it was observed
when one cow in estrus. Vocalization can be used for estrus detection in dominant cows. When
2 or more cows were in estrus，10％ of the cows showed subestrus, while 58％ of cows
showed subestrus when one cow in estrus. To detect these subestrus cows, duration andintervals of visual observation should be increased. It is needed that the fluctuation of activity
and characteristics of estrus-related behavior are analyzed in subestrus cows to improvesubmission rate．

１．目という二つの条件は，発情行動の発現や持続時

的間，その後の排卵時刻との関係に大きく影響する

牛の雌同士の発情兆候の確認は，人工授精実施

ことが分かり，授精適期設定のための有用な情報の前提条件であり，その精度は牛群の繁殖性に大を得た１，２）。平成28年度までに得られた，発情ス

きく影響する。発情兆候には，スタンディング行

コアに基づくのべ39頭の結果をFig.１に示す。発動をはじめとする発情関連行動と，外陰部からの情持続時間に若干の差はあるものの，発情開始あ発情粘液漏出等，発情期に特有な生殖器官の変化

るいは終了から排卵までの時間は，発情頭数と牛がある。発情行動について，過去の本研究助成に

群内順位の影響を受けないこと，順位にかかわら

より，肉用繁殖牛における授精適期の再設定を目ず同時発情では，最大スコアで示した発情強度が的に，同時に発情する頭数や牛群内での個体の順高いことが分かった。

位が発情行動にどう影響するか調べてきた。同時

これら一連の解析は各群の平均値を比較したも発情と単独発情，および牛群内順位の上位と下位のであり，発情頭数（単独および同時発情）の違© The Ito Foundation

177

発情発見困難牛の特徴解明による授精率向上方策の検討（hr）40

One cow in estrus: Subordinate: Dominant

Two or more cows in estrus: Subordinate: Dominant

600

30
400
20

b

ab

b

a

100

10

0

Onset to ovulation

Termination to ovulation0

Duration

Maximum score

Fig. 1 Intervals from the onset and termination of estrus to ovulation and duration of estrus determined by estrous
score and maximum estrous score recorded. Vertical bar presents SD．
a, b：Significantly different（p＜0.05）．

いや牛群内順位（上位および下位）が平均的にど標となり得るか否かについて検討した。次に発情のように影響するかを示したものである。した発見困難牛については，発情強度を的確にとらえがって，各群内での発情行動の強弱や長短のばらられる発情スコアをもとに典型的なパターンを設つきについてはまったく考慮していない。生産現

定し，その発生頻度と特徴を明らかにし，適期授場では，発情行動が弱くその持続時間も短いため精に向け，個別にどのような方策があり得るか考に，発情を見つけにくい「発情発見困難牛」が一察した。

定の割合で存在しており，発情見逃しや不適期授精が増加する大きな原因となっている。前者は分２．方法

娩間隔延長に，後者は人工授精受胎率低下に直結2.1

していると考えられ，発情発見の困難度に対応し北里大学（青森県十和田市）にて飼養されていた個別の対応が必要である。また，行動が制限さた肉用繁殖牛14頭を供試し，平成27および28年度

れるつなぎ飼いでは，一般的に自由行動可能な条の本研究助成１，２）での方法と同様に，近藤の提示件と比較して，発情発見が困難であり，発情粘液した餌槽優先法３）を一部改変し，あらかじめ牛群や発情時特有の鳴き声（咆哮）を指標に授精適期内の順位付けを実施した。単独発情および同時発を判断することが多いが，発情時の咆哮について

情については過去の実験と同様の方法により，膣

はよく調べられていない。

内留置型黄体ホルモン製剤およびプロスタグラン

そこで本研究ではまず，肉用雌牛の発情時（排牛群内順位付けと発情誘起

ディンＦ２α製剤を用いて誘起した。

卵前）の咆哮について，行動制限のない状態で調2.2

査することにより，発情行動としてどのような意

上位４頭，下位５頭の計９頭を供試し，同時発義を有するかについて考察し，人工授精実施の指情７例（上位２例，下位５例）および単独発情13© The Ito Foundation

発情時の咆哮の記録

178

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 Scoring scale for estrous behavior

Table 2Behavior

PointsStanding heat100

Mounting head side of other cows

45

Mounting (or attempting) other cows

35

Resting with chin on other cows

15

Mounted by other cows but not standing

10

Sniffing vagina of other cows

10

Restlessness

5

Flehmen3

例（上位５例，下位８例）について，これまでと同様に歩数計により行動量を記録するとともに，３台のビデオカメラにより発情行動の映像を記
録，Van Eerdenburgら４）の発情スコア表（Table

Expression of vocalization behavior during estrus

CownumberDominance order

Number of vocalizations

5

Dominant

242

2

Subdominant

122

7

Dominant

81

10

Subdominant

68

7

Dominant

52

14

Subdominant

47

3

Dominant

24

9

Subdominant

4

13

Subdominant

3

12

Dominant

29

Subdominant

013

Subdominant

09Subdominant

0１）にしたがい，発情スコアを算出した１，２）。さらに，今回新たに３台のマイクを設置して音声も情時の咆哮は記録されなかった。一方で，単独発同時記録した。観察対象牛が咆哮姿勢をとり，そ情 牛 で は ，77 ％（10/13）で 咆 哮 が 記 録 さ れ たの音声が記録された場合に咆哮回数としてカウン（Table２）。これらの結果から，自由行動の可能トした。咆哮記録は，その他の行動と同様に，発なパドック飼養条件下の同時発情では，咆哮活動

情頭数および牛群内順位との関係も含めて解析しは発現しない可能性が高い。同時発情時には，行た。

動の相手に不足はないため，他に相手を求める行

2.3

発情発見困難牛の検索動と考えられる咆哮は発現しにくいものと推測さ

平成27年の研究開始からこれまでに得られた，29例の同時発情および24例の単独発情，計53例について，発情スコアを用い以下の４点に着目し解れる。しかし例数が少ないことから，より多頭数での検証が必要である。
総咆哮回数は最も多いもので242回であったが，析した。

３例では２～４回と低頻度とばらつきが大きかっ①

発情スコアが100以上にならないた。そこで，咆哮回数10回以上と10回未満に分け②

発情開始から終了までの時間が短いてみたところ，上位牛の割合は前者で計７例中４③ 発情スコアが100以上になる回数あるいは例（57％），後者で６例中１例（17％）であった。
したがって，10回以上の咆哮行動が発現する比率

頻度が低い④ 発情期間中に発情スコアが０になる時間が38％（３/８）となり咆哮行動の発現には牛群内多い

順位が影響する可能性が示された。すなわち，単３．結果と考察
3.1

は，上位牛の80％（４/５）に対し，下位牛では独発情の下位牛では，上位牛よりも咆哮による発情検出が困難であると推測されるが，これについ

発情時咆哮の特徴

複数頭が発情している同時発情では，全例で発てもより例数を重ねることによる検証が必要であ© The Ito Foundation

179

発情発見困難牛の特徴解明による授精率向上方策の検討る。

経時的な発情スコアを解析した結果，発情発見

次に，総咆哮回数10回以上（ｎ＝７）および未の容易な牛から困難な牛まで４群を設定し，Ａ～満（ｎ＝６）の２群に分けて，スタンディング行

Ｄの各条件をすべて満たしたそれぞれの群に分類

動等の他の発情行動の頻度に違いがあるかどうかした。

検討した。その結果，咆哮行動の多寡による他の

１．容易：Ａ≥５，Ｂ≥10，Ｃ≥10（Ｃ≥80％），

発情関連行動回数には，違いがないことが分かっＤ≤３た。また，発情スコアで示される発情行動の強度

２． やや容易：Ａ＜５，
８≤Ｂ＜10，８≤Ｃ≤10の時間的推移と，咆哮行動発現との関係について（60％≤Ｃ＜80％），Ｄ≤４

解析したところ，スコアが低い時に咆哮が多く発

３． や や 困 難：Ａ ＜ ５，
６ ≤ Ｂ ＜ ８，６≤Ｃ≤８

現する傾向を認めたが，それ以上の明確な関係性（50％≤Ｃ＜60％），Ｄ≤５は検出できなかった。これらの結果から，咆哮行

４．困難：Ａ＜５，Ｂ＜６，Ｃ≤６（Ｃ＜50％）

動は他の発情行動とは異なる，牛の内的要因によ

ただし，Ａは連続してスコア100以上を記録しり制御されることが示唆された。また，同一牛でた最大時間，Ｂは発情開始から終了までの時間，２回観察した２頭（牛番号７，13）と，３回観察

Ｃはスコア100以上を記録した発情期間中の回数した１頭（牛番号９）の結果（Table２）を見る

あるいは比率（％）のどちらか，Ｄは発情期間中と，同一牛では一定の傾向を示しており，咆哮行のスコア０の回数とした。

動発現については，それぞれの牛の「個性」ともいえる性質が関与するものと推測できる。

集計結果をFig.２に示すように，単独発情で，発情発見困難牛の発生率が高くなった。同時発情以上の結果から，咆哮行動については同時発情

では66％で発情発見容易と判定され，やや容易をでは観察されない可能性，単独発情では上位牛で含めると90％に達したが，単独発情では容易は優先的に観察される可能性，個々の牛が持つ特性

８％にとどまり，やや容易を加えても42％にとど（牛の好み）が影響する可能性が示された。同時

まった。発情発見困難例は同時発情ではわずかに発情している牛が存在しない条件下では，８割弱の牛で咆哮行動による発情判定が可能であるが，牛群内順位の低い牛では咆哮が観察されない

（％）
100

: Diﬃcult: Slightly diﬃcult: Slightly easy
: Easyか，その頻度が低いことに注意が必要である。今後は，今回解析しきれなかった行動量（歩数）上昇との関連など，他の発情関連パラメーターとの関係性も含め，発情検出における咆哮の意義につ50

いて，より詳しい解析を進める予定である。
3.2

発情発見困難牛

排卵前の発情スコアは，同時発情の全例で100以上を記録したが，単独発情の２例（８％）では100未満で経過し，明らかな発情発見困難牛であった。また，５時間連続して100を超えた例は同時で76％あったが，単独では29％にとどまった。

0

Two orOne cowmore cows in estrus
in estrus

Total

Fig. 2 Effects or number of cows in estrus on difficulty

for detecting estrus by visual observation.

© The Ito Foundation

180

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

３％であったのに対し，単独発情では42％と高率上昇との関係を詳しく分析し，行動量の変化を加であり，やや困難も含めると，同時の10％に対し味することによる方法を模索したいと考えていて59％と半数を越えた。

る。また，発情発見困難牛の行動の特性やパター

同時発情において，発情発見困難は１例のみでンについてより詳細に分類し，それぞれに対応しあり発生率は非常に低いと考えられた。この例でた解決策を提案することによって，授精適期判断

はスコア100を超えた回数が２回のみで，その間の精度を上げていきたいと考えている。

隔，すなわち開始から終了までの時間も４時間ときわめて短かった。こうした例に関しては，同時

４．要約に発情している牛との間の行動をよく観察するこ

自由に行動可能な肉用牛の発情に伴う咆哮行動とで，発情発見につなげる必要があるだろう。やについて，音声および映像をもとに記録し解析しや困難と判定された同時発情の１例では，スコアた。同時発情の条件下では咆哮は記録されず，単100以上の回数が６回と少なく，その発情期間中

独発情では77％で記録された。咆哮は単独発情でに占める割合も50％と低かった。もう１例では，の指標として取り入れられる可能性が示された

発情期間中にスコアゼロになる回数が５回と多が，社会的順位の低い牛では，観察されない例がかった。

多いことに留意が必要である。

単独発情の２例（８％）ではスコア100未満で発情発見困難牛はやや困難なものを含めても，推移し，100以上を連続して５時間以上記録した同時発情では10％程度であるが，単独発情ではのも７例（29％）にとどまった。また単独発情で60％近くに達し，大きな問題であることを再確認

は，同時発情（14.9時間）よりも発情開始から終した。観察のみによる対応としてはその頻度と時了までの平均時間が短かった（11.0時間）ため，間を増やす必要があることが明らかとなったが，スコアゼロになる例は50％と，同時の69％よりも行動量や行動特性等との関連をより詳しく解析し少なかった。100以上を記録した総時間数も5.8時て，授精適期の設定に役立てていく必要がある。

間と，同時の11.7時間の1/2であった。また，1/3（８例）の発情持続時間は10時間未満と短かった。
このように，単独発情で顕著に見られる発情発見困難牛では，短い発情期間に，発情行動は示す
ものの，スコアが100以上になる時間がない，あるいは少ないことから，観察のみで対応するには，観察の回数と時間を増やす必要がある。時間帯が夜間の場合はこうした対応は不可能であることから，今回は解析できていない，行動量（歩数）文献１） 坂口実，菊池元宏，三浦弘：平成27年度食肉に関する助成研究成果報告書，伊藤記念財団，34，175～
180，2016．
２）
 坂口実，菊池元宏，三浦弘：平成28年度食肉に関する助成研究成果報告書，伊藤記念財団，35，171～
179，2017．
３）
 近藤誠司：北海道大学農学部紀要，15，192～233，
1987．
４）
 Van Eerdenburg, F. J. C. M., et al.：Vet. Quart. ，18，52～54，1996．

© The Ito Foundation

181

牛におけるクロモグラニンＡの分泌動態および繁殖障害への関与の解明と子宮内膜における生理機能の解析
Study of bovine chromogranin-A；Plasma profiles between the normal andrepeat-breeding animals, and physiological roles in the uterine endometrium

高

橋

透

（岩手大学農学部）

Toru Takahashi（Faculty of Agriculture, Iwate University）

Chromogranin A（CHGA）, an acidic protein secreted by adrenal chromaffin cells, is also
expressed in uterine endometrium in the cow. Previously, the investigator of the present study
had reported that uterine CHGA expression was suppressed in repeat-breeding cows than in
the normal. The objectives in the present study were to establish the assay procedure
measuring plasma concentration of bovine（b）CHGA and to evaluate plasma bCHGA profiles
between the pregnant and non-pregnant animals. The enzymeimmunoassay for themeasurement of plasma bCHGA was established by using synthetic oligopeptides for reference
standards, biotinylated tracer and antibody generation. The minimum detectable value, andintra- and inter-assay coefficients of variation were 0.46 nM，3.0％ and 3.4％, respectively.
Recombinant bCHGA protein was generated in bacterial lysate and purified by metal affinity
chromatography. The standard curve generated by the recombinant protein was wellparalleled with that of synthetic peptides. Plasma bCHGA concentrations following insemination
were monitored in four cows. There was no consistent trend of plasma bCHGA profiles
between the pregnant and non-pregnant animals. In summary, the enzymeimmunoassay for
bCHGA was established and plasma bCHGA profiles during four weeks after insemination
were monitored．

１．目

告した中で，低受胎牛では正常牛に比べて子宮内的膜におけるクロモグラニンA（bCHGA）の発現

本研究では，「特段の異常は認められないが何が低いことを明らかにしてきた１）。本研究ではこ回授精しても受胎しない」という不受胎の背景をの成果をさらに発展させながら，上記目的を達成

解明して，正常に受胎できる牛と低受胎牛を判別するために以下の目標を設定した。［目標１］子する診断指標を確立することを目的とする。研究宮における遺伝子発現動態が末梢血中濃度に反映

代表者は，すでに正常牛と低受胎牛の子宮内膜にされるマーカータンパク質としてbCHGAを選定

差次的に発現する遺伝子の網羅的解析の成績を報して，その血中濃度測定系を開発する。［目標２］© The Ito Foundation

182

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

発情周期および妊娠期における血中bCHGA濃度

フォールディングは，0.4 Ｍアルギニンを含む緩推移を明らかにするとともに，正常牛と低受胎牛

衝液中で尿素濃度を漸減させながら透析することの濃度推移の違いを解明する。

によって行った。

２．方
2.1

2.3

法

血中bCHGA濃度の測定

人工授精されたホルスタイン種経産牛４頭から

bCHGA測定系の開発

２日おきに尾静脈血を採取し，血漿を測定まで

酵素免疫測定法（EIA）による牛血中bCHGA－30℃で保管してから本研究で開発したbCHGA

濃度測定系の開発を行った。EIAはbCHGAの合測定系を用いて濃度測定を行った。一部のサンプ成ペプチドを標識用抗原と標準品に使用し，合成

ルはあらかじめ決まった回数の凍結融解を繰り返ペプチドの抗体をウサギで作成して測定系を構築してから測定を実施した。

した。トレーサーは合成ペプチドをビオチン標識して作成した。

過去に牛の血中CHGA濃度測定を実施した研究
論文では，市販のヒトCHGA測定キット（矢内原抗ウサギIgGを固相化した96穴マイクロプレー

研究所製）を用いて測定した成績が報告されていトに抗bCHGA抗体，測定サンプルまたは標準液，る２）。本研究では，同一の牛血漿サンプルを市販

ビオチン標識トレーサーおよびアッセイバッのヒト用キット（矢内原研究所製）と本研究で開ファーを分注し，室温で振盪しながら４―24時間

発した牛用測定系の両者で測定を実施してその測インキュベートした。プレートを洗浄した後に，定値を比較した。

ストレプトアビジン―西洋ワサビペルオキシダー

2.4

ゼ溶液を添加して室温で２時間インキュベート

本研究で実施した遺伝子組換え実験と動物実験

し，プレートを再度洗浄したのちに発色基質としは，事前に岩手大学動物実験委員会および遺伝子てオルソフェニレンジアミン溶液を添加して30分

組換え実験安全委員会に実験計画書を提出し，承間発色させ，発色反応を６Ｎ硫酸で停止してから認を得たうえで実施した。

490nmの吸光度を測定した。
2.2

法令への対応３．結果と考察

組換えbCHGAの発現と精製

牛下垂体から抽出した総RNAの逆転写反応で3.1

EIAの構築得られたcDNAをテンプレートに用いたPCRを行

bCHGAの合成ペプチドを用いた競合型EIAのい，得られた増幅産物をpIVEX2.4dベクターにク測定系を開発した。標準液の濃度が１-1000 nM

ロ ー ニ ン グ し て Ｃ 末 端 に His タ グ を 付 加 し たの範囲で良好な標準曲線が得られた（Fig.１）。

bCHGA組換え発現の発現ベクターを構築した。

96穴プレートに，抗体，トレーサー，標準液／

この発現ベクターをテンプレートにして大腸菌ラサンプルを分注してインキュベートする時間を４

イセート系で無細胞系のタンパク質発現実験を行

時間から24時間まで変化させ，得られる標準曲線

い，反応液中にbCHGAを発現させた。bCHGAタを比較したところ，インキュベーション時間が長ンパク質は不溶性の沈殿を形成したので，６Ｍ尿くなるにつれて吸光度が上昇した。濃度０nMの素を含む変性バッファーで沈殿を可溶化してから標準液の吸光度を比較すると，４時間のインキュニッケルのキレートカラムに吸着させてイミダ

ベーションでは0.5程度であったが，24時間の場

ゾ ー ル で 溶 出 さ せ て 精 製 し た 。精 製 産 物 の リ

合には約2.5まで上昇した。これに対して最も濃© The Ito Foundation

牛におけるクロモグラニンＡの分泌動態および繁殖障害への関与の解明と子宮内膜における生理機能の解析
1000

3

Absorbance（490 nm）

2
1.5

Measured concentration（nM）

4h
8h
12h
16h
20h
24h

2.5

1
0.5
0

183

0

1

3.16

10 31.6 100 316 1000bCgA（nM）

Fig. 1 The standard curves of bCHGA assay；effects of

the incubation period.

100

10

1

0

3.16
10
31.6 100 316
Added bCgA peptide（nM）

Fig. 2 The recovery test of bCHGA assay.

度の高い1000 nMの標準液の吸光度は，インキュた（Fig. ２）。後 述 す る 牛 の 血 中 bCHGA 濃 度 は

ベ ー シ ョ ン 時 間 に 関 係 な く ほ ぼ 一 定 の 値（約10-40 nM程度の濃度であることから，本研究で0.08）であった。この結果は，インキュベーショ

開発した測定系は測定の感度や精度，およびそのン時間を延長すると標準曲線の下降が急峻とな再現性が良好で，牛の血中濃度測定に活用しうるり，測定精度が向上することを示している。

性能を有するものと思われた。

標準曲線の50％置換量（濃度０の場合の吸光度3.2

サンプルの凍結融解の影響が半分になる標準液濃度）は，インキュベーショ

ヒ ト や 実 験 動 物 の CHGA の 研 究 に よ っ て ，ン時間が４時間の場合には36.22 nMであったが，CHGAタンパク質は，翻訳後修飾を受けて多様なインキュベーション時間が長くなるにつれて減少

ペプチド断片が派生することが知られている。こし，24時間インキュベーションの場合には14.23

れらのペプチドの生成はエンドペプチダーゼによnMとなった。この結果は，インキュベーション

る切断によると考えられているが，血漿を凍結保時間を長くすると標準曲線が左にシフトして測定存したり，凍結融解を反復した際のタンパク質の感度が向上することを示している。よって，以下安定性については情報がない。そこで同一の血漿の実験では測定の精度と感度を考慮して，インサンプルにあらかじめ決まった回数の凍結融解処

キュベーション時間を24時間に設定して実験を置を施し，その後にbCHGA濃度を測定してサン行った。

プルの凍結融解が測定値に及ぼす影響を検討した。

本測定系の最小検出限界は0.46 nMであり，測血漿サンプルの凍結が１ないし２回の場合に定内および測定間の変動係数は3.0％および3.4％

は，その測定値に差が認められなかったが，凍結であった。本測定系に既知濃度のbCHGAペプチ

融解を３回以上反復すると測定値は減少の傾向をドを添加して添加回収試験を行ったところ，その示し，10回の凍結融解を経たサンプルのbCHGA

回収率は10 nM添加の場合に111％，100 nM添加

濃度は１回凍結の場合の約40％程度にまで低下しの場合に92％，316 nM添加の場合に74％であった（Fig.３）。この成績から，血中のbCHGAは不© The Ito Foundation

184

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）
2.5

Y=ｰ0.6533x+11.296
R2=0.7304

11

Absorbance（490nm）

Measured concentration（nM）

12

10
9
8
7
6
5
4

2
1.5
1

2

3
4
5
6
7
8
Numbers of freeze-thaw cycle

9

Arbitrary doses

0.5
0

1

1/16 1/4 1/2 1/1

10

0

1

10
bCgA（nM）

100

Fig. 4 Parallel displacement curves of reference

Fig. 3 The effect of freeze-thaw cycles of plasma

standards generated by synthetic peptide（solidline）and recombinant protein（dotted line）．

安定なタンパク質であり，凍結融解の反復によっ精製したbCHGA組換えタンパク質を本研究でて容易に分解・変性してしまうことが示唆され開発したEIAに供したところ，用量依存的な吸光た。本研究に供した血漿サンプルはすべて凍結保度の低下が認められ（破線），その変化は合成ペ存されているので，測定の時点ですでに１回の凍プチドを標準品として作成した標準曲線（実線）

結融解を経ていることになる。凍結融解２回の場と平行していた（Fig.４）。

samples on bCHGA assay values.

合には１回の場合と差が見られなかったことか

3.4

ら，本測定系を用いて牛血中bCHGA濃度を測定

人工授精された４頭の血中bCHGA濃度の経時する場合には，凍結融解の回数を２回以内にとど変化を調べた（Fig.５）。４頭のうち受胎した牛めることが必要と思われた。

は個体Ｂの１頭で，他の３頭は不受胎であった。

3.3

血中bCHGAの濃度推移

組換えbCHGAの発現精製と特性評価

グラフの実線は本研究で開発した測定系による測大腸菌ライセートの無細胞発現系でbCHGAを定値を示し，破線は市販のヒト用EIAキットで測組換え発現させたところ，bCHGAは58 kDaのタ定した値を示している。本研究で開発した測定系

ンパク質として発現した。発現反応液を試料としによる血中bCHGA濃度の推移は個体ごとにさまたウェスタンブロット解析を行い，EIAに使用しざまで，血中濃度推移と受胎性との間に関連性はた抗体と抗Hisタグ抗体を用いて検出したところ，認められなかった。個体Ａ（不受胎），Ｂ（受胎）両者で58 kDaのバンドが検出された。反応液をおよびＣ（不受胎）の３頭では，個体ごとに差は

上清と沈殿に分けてウェスタンブロット解析をあるものの黄体期に血中bCHGA濃度の上昇が認行ったところ，上清にはほとんど認められず，発められた。しかし，個体Ｄ（不受胎）ではそのよ

現した組換えタンパク質は不溶性の沈殿を形成しうな変化は認められなかった。不受胎であった個ていることが分かった。沈殿を可溶化した後に体Ｃにおいては，授精後約２週間で一過性の高い

ニッケルカラムで精製し，アルギニン存在下で尿ピークを形成したが，このピークをもたらした素濃度を漸減させながら透析することによって精bCHGA分泌の起源がどこであるかは不明である。

製タンパク質を得た。

一方，ヒト用キットを用いた測定値は変化に乏© The Ito Foundation

牛におけるクロモグラニンＡの分泌動態および繁殖障害への関与の解明と子宮内膜における生理機能の解析

Plasma bCgA（nM）

40

P
（-）

30

20

20

10

10

40
Plasma bCgA（nM）

（B）
40
P
（+）

（A）

30

0

0

10

20

30

0

P
（-）

30

20

20

10

10

0

0

10

20

30

10

20

30

（D）
40
P
（-）

（C）

30

0

185

10

20

30

0

0

Days after AI

Days after AI

Fig. 5 Plasma bCHGA profiles during four weeks after insemination. In each panels, P（＋）and P（－）represent as

pregnant and non-pregnant, respectively. Solid lines represent the values measured by bCHGA assay establishedin the present study, whereas dotted lines represent the values measured by commercial human CHGA assay kit.

しく，すべての牛で採血全期間を通じてほぼ一定

的としてEIAによる濃度測定系を開発した。開発

の数値を示した。Oginoらは牛に輸送ストレスをした測定系は血中濃度を測定するのに十分な感度負荷した実験を行い，血中bCHGA濃度を本研究を有し，測定の精度や再現性も良好であった。牛で使用したヒト用EIAキットで測定しているが，の血中bCHGAを測定した研究はヒト用キットの輸送後の血中bCHGA濃度は上昇したものの有意流用で実施されており，牛用の測定系の樹立に関な差ではなかったと報告している 。しかし，こする報告がないことから，本研究がそのさきがけの実験サンプルを本研究で開発した測定系で測定となると思われる。

２）

した場合には，輸送前後における血中bCHGA濃度の有意な上昇を検出できるかもしれない。
４．要

人工授精から４週間の血中濃度推移を受胎牛と不受胎牛で比較したところ，受胎に特異的な濃度
変動パターンは認められなかったが，受胎牛１頭

約と不受胎牛２頭では黄体期の濃度ピークが観察さ牛の子宮内膜で発現して，低受胎牛で発現量が低下するbCHGAを末梢血中で検出することを目れた一方で，不受胎牛の１頭では，そのようなピークが認められなかった。

© The Ito Foundation

186

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

本研究では，大腸菌の無細胞発現系を用いて組換えbCHGAタンパク質を発現・精製した。本研
究で得られた組換えタンパク質は，いまだ不明な点が多いbCHGAの生理機能の解明に活用できる文献１）
 H a y a s h i , e t a l . ：R e p r o d u c t i v e B i o l o g y &Endocrinology，15（１），20，2017．
２）
 Ogino, et al.：Animal Behaviour and Management，
47（１），12～20，2011．

ものと期待される。

© The Ito Foundation

187

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基盤的研究
Study of circulating microRNA as biomarker for pregnancy in cattle

木

崎

景一郎・高

橋

透

（岩手大学農学部共同獣医学科）

Keiichiro Kizaki and Toru Takahashi（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University）

Early pregnancy diagnosis in cattle is very important in considering its productivity.
However, methods for reliable early diagnosis have not been established. In this study,
therefore, we focused on circulating miRNAs and verified the possibility as a novel biomarker
for pregnancy diagnosis. In order to determine whether plasma or serum sample is suitable forquantifying blood miRNA, the amount of miRNA recovered from both samples, the quantity offree hemoglobin and miR-2455, used as a reference miRNA（endogenous control）, werecompared in both samples. The results indicated that 1）plasma is suitable as a sample forblood miRNA quantification than serum, and 2）it is necessary to separate immediately after
blood collection. Seven specific miRNAs in plasma were highly detected in the pregnant cow
on day 21 gestation than the non-pregnant cow. However, none of miRNA that showed asignificant difference between the pregnant and the non-pregnant cow on day 18 of gestation.
To examine the hemolysis on miRNA contents in plasma, hemolyzed plasma（0-20％）were
prepared by sonication treatment of whole blood. Free hemoglobin concentration anderythrocyte-derived miRNA amounts were increased in a hemolysis-dependent manner, andshowed significantly high values at 0.8 ％ and ４ ％ . When eight miRNAs were quantified inthese samples, two miRNAs were not affected at all even by high hemolyticity. The other
miRNAs were affected only 4％. The present study identified that several miRNAs as novel
biomarkers of pregnancy diagnosis on 21 days of gestation, which they are less susceptible tohemolysis. Further studies to identify miRNA species that can verify the accuracy of
pregnancy diagnosis are required to making the more earlier diagnosis and lead to theconstruction of new pregnancy diagnosis technology．

１．目

よる診断が用いられている。しかし，これらの方的法は診断手技の熟練度や牛の正常な発情周期21日

家畜における早期の妊娠診断は生産効率の向上

を過ぎてしまう問題点もあるため，不受胎牛へのにとって重要である。特に牛では，発情周期回帰

次回授精の時期が遅れ，繁殖効率の低下につなの有無，直腸検査，ホルモン測定および超音波にがっている。家畜生産性の向上を考えるうえで© The Ito Foundation

188

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

は，より早期の妊娠の成否判断が望まれるが，現在のところ早期に，確実に診断する方法は確立さ（ｎ＝４）から採血した血液を用いた。
2 . 2 miRNA抽出と定量的リアルタイムRT-れていない。一方，分子生物学的手法を用いた診断法，特に末梢血白血球における遺伝子発現を指標とした早期妊娠診断が提唱されているがPCR
血漿および血清試料からのmiRNA抽出には，

miRNeasy Serum/Plasma Kit （QIAGEN） を 使

操作手技等の問題点もあり，必ずしも簡便な手法

用し，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kitとは言えない。このようなことから，新たな早期（TAKARA） を 用 い て 逆 転 写 反 応 を 行 い ，

妊娠診断バイオマーカーが求められている。

miRNAからcDNAを合成した。定量的リアルタイ

１～３）

マイクロRNA（miRNA；miR）は，短鎖の１

ムPCRには，KOD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）

本鎖RNAであり，臓器特異的な発現様式を示し，を使用し，7300リアルタイムPCRシステム（Applied

エクソソームに内包され血中に分泌されることがBiosystems）により増幅反応および検出を行っ知られている。ヒトでは血中エクソソーム由来のた。本研究では，研究代表者の先行研究（科学研miRNAを測定することにより，各種のがんを早究費補助金・挑戦的萌芽研究2015―2017年度）に期発見するプロジェクトが開始されているが，おいて抽出したmiR-AからＪを検証した（現在miRNA発現動態情報を妊娠診断に応用し，確定

論文執筆中であることから，ここでは具体名の記できる手法はいまだ開発されていない 。

載はせず，ＡからＪとした）。なお，リファレン

４）

本研究では，牛の血中エクソソームに内包され

スmiRNA（内在性コントロール）には，同様にるmiRNAに焦点をあて，妊娠診断の新規バイオ

先行研究で明らかにしたmiR-2455を使用した。

マーカーとしての可能性を検証することを目的と

2.3

するとともに，候補miRNAの同定，ならびに測採血後の全血液を超音波処理後に遠心分離した血漿を100％溶血検体とした。超音波処理をして定基盤確立のための検討を行った。
２．方
2.1

溶血検体の調製いない同個体の血漿を溶血度０％とし，これを用法

いて５倍段階希釈系列（0.00128-20％）の検体を作成した。遊離ヘモグロビン濃度は，414nmの吸供試材料

ホルスタイン種牛（ｎ＝４）からEDTA・２

光度を測定することにより調べた５）。また，溶血Na採血管およびプレーン採血管を用いて採血後，度０％，0.00128％，0.0064％，0.032％，0.16％，

遠心分離して血漿および血清を得た。全血液から0.8 ％，４ ％ の 血 漿 か ら 上 記 と 同 様 の 方 法 で血漿分離までの日数を検討する実験では，採血後miRNA抽出およびcDNAの合成を行い，溶血評のEDTA・２Na採血管を４℃で１日および２日価の指標とされるmiR-23aおよびmiR-451を対象

保存後に遠心分離した。当日分については，採血として定量的リアルタイムPCRを実施した５）。

後おおむね２時間以内に分離した。妊娠および非妊娠牛血漿については，発情同期化した黒毛和種

３．結果と考察

牛に人工授精後18日および21日に採血した。授精

3.1

後約30日および60日後に超音波検査により妊娠鑑

血中miRNAを定量するうえで血漿，あるいは定を実施し，妊娠群（ｎ＝７）と非妊娠群（ｎ＝

血清試料のどちらが適しているかを調べるため４）とした。溶血検体の調製では，黒毛和種牛に，両試料からのmiRNA回収量，両試料中の遊© The Ito Foundation

血中miRNA解析に供する試料種別の検討

189

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基盤的研究

離ヘモグロビン量およびリファレンスmiRNA（内miRNA回収量は，血清試料において高値を示

在性コントロール）として使用するmiR-2455量

す傾向であったが，統計学的には有意差は認めれを比較した（Fig.１）。

なかった（Fig. 1A）。一方，溶血指標となる遊離

A

D

400

miRNA amounts（ng）

miRNA amounts（ng）

500

300
200
100
0

Plasma

300

200

100

0

Serum

0

1

2

Days of plasma separationfrom blood collection
B

E

0.2

＊

Hemoglobin（A414）

Hemoglobin（A414）

0.3

0.2

0.1

0

Plasma

＊

0.1

0

Serum

0

1

2

Days of plasma separationfrom blood collection
C

F

50

0

150
miR-2455（copy/ng miRNA）

miR-2455（copy/ng miRNA）

100

Plasma

100

Serum

50

0

0

1

2

Days of plasma separationfrom blood collection

Fig. 1 Comparison of recovered miRNA, free hemoglobin and miR-2455 quantities inplasma and serum.
 The recovered miRNA（A and D）, free hemoglobin（B and E）and miR-2455（Cand E）quantities were measured in plasma and serum（A, B and C）or plasma
separated from whole blood at days 0, 1 and 2 after collection（D, E and F）. Data areshown as mean±SEM．＊p＜0.05.

© The Ito Foundation

190

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ヘモグロビン量は，血清において有意に高値を示（Ｄ21）の妊娠および非妊娠牛の血中miRNA量をしたが（Fig. 1B），リファレンスmiRNA量は両者定量した（Fig.２）。miR-A，C，D，F，G，Hおで差は認められなかった（Fig. 1C）。回収量およよびＩの各miRNAについては，Ｄ21の妊娠群でびリファレンスmiRNA量の検体間のバラつきは，有意に高値を示し，miR-A，C，F，GおよびＨ

血清試料において大きかった。

はＤ18と比較しても高い値であった。しかし，Ｄ採血から血漿分離までの日数の関係について調
べたところ，miRNA回収量は血漿分離までの日

18の妊娠群と非妊娠群間で有意差を示すmiRNAはなかった。

数の経過に伴い増加する傾向にあったが，有意な以上の結果から，miR-A，C，D，F，G，Hお差ではなかった（Fig. 1D）。しかし，採血後１日

よびＩは，妊娠21日齢における妊娠判定のバイオ

および２日後の分離血漿では，検体間のバラつき

マーカーとしての可能性が示唆されたが，それ以が大きくなっていた。血漿中の遊離ヘモグロビン

前での判定は難しいことも示された。不受胎牛へ

量は２日後の分離で有意に増加していた（Fig.

の次回授精の時期を考慮すると，妊娠21日での診1E）。リファレンスmiRNA量については統計学的断では遅く，より早期に判定が可能なmiRNA分

な差は認められなかったが，miRNA回収量の結子 種 を 探 索 す る こ と が 必 要 で あ る 。さ ら に ，果と同様に検体間の変動が大きかった（Fig. 1F）。

miR-A，C，F，GおよびＨは，Ｄ18と比較して一般生化学検査においては，血漿あるいは血清も高値であったことから，卵巣由来ステロイドホ

試 料 の 溶 血 は 問 題 と な る こ と が 多 い 。血 中

ルモンによる制御を受けている可能性も考えら

miRNA定量においても赤血球に多量に含まれる

れ，その制御機構の詳細を今後検討する必要があ

miRNA分子種が知られており，その定量においる。

て問題が生じる可能性がある。血清試料では遊離

3.3

ヘモグロビン量が高値を示していることから，血前述の3.2において，miR-A，C，D，F，G，H

漿と比べ溶血度合いが高く，これが血清試料でのおよびＩが妊娠21日齢における妊娠判定のバイオ回収量やリファレンスmiRNA量の検体間のバラマーカーとして有用である可能性が示された。3.1

つきの要因になっていることが考えられた。さらでは，可能な限り溶血後が低い血漿を使用するこに，血漿試料においても採血から血漿分離までのとが血中miRNA定量に必須であることを示した

時間が経過することにより溶血が生じ，回収量やが，これらのmiRNAが溶血によって影響を受け

リファレンスmiRNA量に影響が生じている可能

るか否かについては明らかではない。そこで，溶性がある。すなわち，より溶血度が低い試料を使

血 検 体（血 漿）を 調 製 し ，溶 血 が 血 漿 中 の 各用する必要があると考えられる。これらの結果

miRNA量に及ぼす影響について調べた。

溶血による血中miRNA量の変動

は，牛血中miRNA定量の試料としては血漿が適０-４％の溶血検体を調製し，遊離ヘモグロビ

していること，さらに採血後速やかに分離する必ン濃度および赤血球由来miRNA量を測定した

要があることを示している。

（Fig.３）。各指標ともに溶血度依存的に増加し，

3 . 2 定量的RT-PCRによる妊娠および非妊娠

0.8％，４％で有意に高値を示した。これらの検体を用い，miR-A，C，D，F，G，HおよびＩを牛の血中miRNA量の検証
前述の3.1で示された条件下で分離した血漿試定量したところ，miR-CおよびＤは高い溶血度で料を用いて，人工授精後18日（Ｄ18）と21日後も 測 定 値 に は ま っ た く 影 響 を 受 け ず ，他 の

© The Ito Foundation

191

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基盤的研究

6

++

A

＊＊

4

0

Circulating miRNA（miR/miR-2455）

B

4
2

0

0
C

++

＊＊

3

++

H

＊

0
D
+

0.4

0.4

0.2

0

0
E

1

I

+

J

0.5

5
0

＊

1

0

10

++

G

2

2

0.8

+

＊＊

0

0.04

4

F

4

2

0.08

8

18

21

0

18

21

Days after insemination
Fig. 2 Circulating miRNA quantities in pregnant and non-pregnant cow on days 18 and 21 gestation.
 Closed circle and solid line represents pregnant cows. Closed triangle and dotted line
represents non-pregnant cows. A to J indicate miR-A to J. Data are shown as mean±SEM．＊p＜0.05 and ＊＊p＜0.01：D18 pregnant vs D21 pregnant．＋p＜0.05 and ＋＋p＜0.01：D21 pregnant
vs D21 non-pregnant.

miRNAについても溶血度が最も高い４％で測定

3.4

値が高値を示すのみだった。

今 後 は ，確 立 し た 試 料 条 件 下 お よ び 標 的

今後の展開

以上の結果から，今回検証したmiR-A，C，D，miRNAを用いて，より例数を増やした解析を実F，G，HおよびＩは溶血の影響をほぼ受けるこ

施し，妊娠診断時の精度（陽性適中率，陰性適中とがないことが明らかになった。

率などの解析）を検証する。また，候補とした各© The Ito Foundation

平成30年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

0.
00
12
8

0.
00
64

192

4

0.
8

0.
16

0.
03
2

Hemolysis（%）
C

100
50

4

8
0.

16

2

0.

03

0.

8

00
0.

Hemolysis（%）

64

0
12

4

8
0.

16
0.

2

8

03

0.

00

0.

12
00
0.

64

0

＊＊

0.

＊＊

1

150

0

＊＊

2

＊＊

200

00

B
miR-451/miR-23a ratio

30

Hemoglobin（A414）

0

A

Hemolysis（%）

Fig. 3 Visual inspection, free hemoglobin and erythrocyte-derived miRNA in hemolyzed plasma.
 Hemolyzed plasma were prepared by sonication treatment of whole blood, and evaluated by visual inspection (A),free hemoglobin concentration（B）and erythrocyte-derived miRNA amounts（C）. Data are shown as mean±SEM．
＊＊
p＜0.01.

miRNAは妊娠21日齢における妊娠診断バイオが適していること，２）採血後速やかに分離する

マーカーとしては有用である可能性はあるが，よ必要があることが示された。さらに妊娠21日におり早期の判定は難しいという結果であった。繁殖

ける妊娠診断の新規バイオマーカーとしていくつ

効率を高めるためには，妊娠18日以前で判定可能

かのmiRNAを同定するとともに，これらが溶血なバイオマーカーが必要であることから，網羅的の影響を受け難いことも示された。今後は，妊娠解析により新たなmiRNA分子種を特定する。

診断の精度の検証やさらに早い時期での判定が可

４．要能なmiRNA分子種を特定し，新規妊娠診断技術

約の構築につなげたい。

牛の早期妊娠診断は，その生産性を考えるうえで非常に重要である。しかし，早期，かつ確実に診断する方法は確立されていない。そこで，本研
究では血中miRNAに着目し，妊娠診断の新規バ
イオマーカーとして可能性を検証した。本研究の結果，１）血中miRNA定量の試料としては血漿文
献１） Gifford, C. A., Racicot, K., Clark, D. S., Austin, K. J.,
Hansen, T. R., Lucy, M. C., Davies, C. J., Ott, T. L.：
Journal of Dairy Science，90（1），274～80，2007．
２）
 Green, J. C., Okamura, C. S., Poock, S. E., Lucy, M.
C.：Animal Reproduction Science，121（1-2），24～
33，2010．

© The Ito Foundation

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基盤的研究
３） Kizaki, K., Shichijo-Kizaki, A., Furusawa, T.,
Takahashi, T., Hosoe, M., Hashizume, K.：
Reproductive Biology and Endocrinology，11，６，
2013．

193

４）
 Wang, J., Chen, J., Sen, S.：Journal of Cellular
Physiology，231（1），25～30，2016．
５） Shah, J. S., Soon, P. S., Marsh D. J.：PLoS One, 11（4），e0153200，2016．

© The Ito Foundation

194

牛における新規腟内薬剤投与技術の確立
Establishment of novel intravaginal drug releasing device in cows

田

中

知

己・遠

藤

なつ美

（東京農工大学農学研究院）

Tomomi Tanaka and Natsumi Endo
（Tokyo University of Agriculture and Technology, Institute of Agriculture）

We improved and evaluated the novel intravaginal drug releasing devices, and revealed
the structural characteristics that suppresses their dropout from the vagina and reduces thephysical damage to the vagina in cows. In order to clarify the efficacy of the device,progesterone-containing mixtures with the different type of basement compounds wereencapsulated and attached to the intravaginal devices. The present study demonstrated the
profiles of plasma progesterone concentrations after the insertion of each intravaginal device inovariectomized and cycling cows. We were able to obtain fundamental data for theestablishment of a new intravaginal drug releasing device for the administration of
reproductive hormone and/or medical drugs via vagina in cows.

１．目

多くの薬剤では注射法による投与が一般的となっ的ている。腟内留置型投与具を用いた経腟薬剤持続酪農および肉用牛経営では牛群の大規模化が進

投与法は家畜での利用においていくつかの利点がみ，効率的な乳肉生産を目指した新たな飼養管理ある。一つ目は投薬のコントロールが非常に容易技術の開発が大きな課題となっている。特に農家になる。投与具を腟内に挿入して抜去するのみでの経営を左右する繁殖管理においては繁殖用薬を投薬期間をコントロールでき，獣医師や農家に効果的に使用し，繁殖効率を向上させたい強い

とって大きな負担軽減となる。投与具の抜去後，ニーズがある。本研究課題は獣医療における新た腟内に残留した薬剤は腟の収縮運動により速やか

な投薬技術の開発を目的とするものである。

に腟内から消失する特徴も残留薬物の観点から有獣医療において長期間薬剤を投与する方法とし利となる。二つ目は投与具による腟内投与法は製て経口投与法があるが，反芻動物（牛，ヒツジ，

造コスト面でメリットがある。投与具に装着したヤギ等）での経口投与は胃内の特殊な生理機構の腟内吸収薬は外用薬として投与できるため，注射影響を受けるため，多くの薬剤において薬剤の吸薬に比べて製造コストを大きく抑えることができ

収効率がきわめて悪い。また，人医療に比べて獣る。この他にも，腟と卵巣や子宮は特殊な血管系医療では対象が動物であるという特殊性があるたで結ばれており，腟で吸収された薬物は全身循環

め投薬技術の開発が遅れており，繁殖用薬を含めを巡ることなく直接卵巣や子宮に到達することか© The Ito Foundation

195

牛における新規腟内薬剤投与技術の確立

ら，卵巣や子宮に作用するホルモン剤などの使用

Vaginaでは，少ない薬用量で強い薬理効果が見込める。
腟内留置型投与具はこれらの利点を有するにもかかわらず，腟内に投与具を確実に滞留させることの困難さや腟内で薬剤を効率的に吸収させること等の技術的な問題が開発の隘路となっていた。
我々は腟内留置型投与具として前進駆動部の形状を特殊化したデバイスの開発を進め，牛での使用を想定した改善を加えることで，従来の投与具を上回る操作性に優れた腟内薬剤投与具の開発を目

UterusIntravaginal
deviceFig. 1 Schematic illustration of insertion of theintravaginal device in cows（lateral view）

指している。また，この投与具では溶出性と粘膜吸収性に優れた特殊な基材を組み合わせた丸剤を投与具の先端に取り付けることが可能であり，さ物の混入が疑われる場合には，分泌物を回収してまざまな薬剤投与に応用できるメリットがある。

塗抹標本を作成し，細胞学的検査を実施した。

本課題では黄体ホルモンであるプロジェステロン

2 . 2 プロジェステロン含有カプセルを装着しをリファレンス剤として用い，投与具および基材

た投与具挿入後の血中プロジェステロン濃の応用性について解析を行った。

度の変化

２．方
2.1

投与具の先端に黄体ホルモンを含有するカプセ法

ルを装着して実験牛に挿入（投与）し，プロジェ

投与具の腟内滞留性能の評価

ステロンの体内移行性の評価を行った。適切な候我々が開発を進める投与具に改良を加え，改良補基材を選定することを目的に，５種類の粘度の型投与具の性能評価を行った。ホルスタイン種経異なる水溶性基材とプロジェステロンを混合した

産牛延21頭を実験に供試し，改良型投与具を腟内

プロジェステロン含有混合物をカプセルに封入に挿入し，脱落などの不具合の発生や腟内分泌物

し，投与具の先端に装着した。黒毛和種牛延べ11の状態を観察した。投入具は基本的に薬剤装着部

頭およびホルスタイン種経産牛延べ４頭を実験に

位と前進駆動部からなり，投与具の先端に十分な供試した。黒毛和種牛については，卵巣からのホ薬剤（丸剤）が装着できる構造である。投与具はルモン分泌の影響を除外するため，外科的な卵巣

陰門より腟浅部に挿入し，挿入後は腟の脈動と投摘出処置を施し，任意の時期にプロジェステロン

与具の構造により投与具が自ら前方に進み腟深部

含有カプセル装着投与具を挿入した。ホルスタイに滞留する仕組みとなっている（Fig.１）。投与

ン種牛については，卵巣機能の影響も考慮し，発具の改良は基本的に前進駆動部について行い，前情周期の黄体期よりホルモン処置を行い，投与具

進駆動部の角度，長さ，開張強度を調整した。投の挿入を行った。すなわち直腸検査により排卵を与具の挿入期間は獣医臨床領域における使用を考確認し，黄体期にプロスタグランジンF2α類似体

慮して３日から10日間の範囲とした。投与具の抜

1.5mg（ｄ-クロプロステノール，ダルマジン，

去の際に腟内分泌物の分泌量および性状（分泌物

共立製薬株式会社）を筋肉内投与して黄体退行をへの絮状物の混入など）を目視にて検査し，膿様

誘起し，プロスタグランジンF2α類似体投与後２© The Ito Foundation

196

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

日に投与具を挿入した。投与具の挿入期間は臨床方，開張強度の強さは腟壁に対して物理的な障害領域における利用を考慮して14日間とした。投与を与え，腟内における炎症の発生につながる恐れ

具挿入後２-３，
６，
９，12-13日に尾静脈あるいはがある。臨床現場における活用を考慮して，これ

頸静脈より採血を行い，血漿中プロジェステロン

ら条件の最適化を図ることが重要であり，今回の濃度をEnzymo immuno-assay法

実験により完成度の高い投与具に改良することが１）により測定しできた。一方，課題として，今回は大型品種であた。

るホルスタイン種において検証を行ったが，黒毛３．結果と考察3.1

和種などホルスタイン種に比べて小型の品種においても最適な条件について検討を加える必要があ

投与具の腟内滞留性能の評価ると考えられる。

投与具を挿入した21例のうち４例において投与具の脱落が認められ，４例いずれも挿入後３日以

3 . 2 プロジェステロン含有カプセルを装着し内に脱落した。脱落は前進駆動部の角度が小さくた投与具挿入後の血中プロジェステロン濃開張強度が弱いものについて発生が認められた。

度の変化

一方，分泌物における絮状物の混入の程度は，前プロジェステロン装着投与具挿入後の血中プロ進駆動部の角度が大きく開張強度が強い投与具にジェステロン濃度をTable１にまとめた。投与挿おいて認められた。これらの条件を分析して改善入直前の血中プロジェステロン濃度はほとんどのを加え，本研究課題実施期間の最終段階におい

例で低い値を示しており，黒毛和種牛においてはて，脱落を抑え，かつ，抜去時において腟分泌量

卵巣摘出が適切に行われていること，およびホルの少ない投与具の形状を特定することができた。

スタイン牛については，プロスタグランジンF2α脱落の発生は，前進駆動部による前進力の強さお投与により黄体の退行が誘起されていることが示

よび開張強度の強さによる腟からの排出力に対すされた。投与具挿入後のプロジェステロン濃度のる投与具の抵抗性によるものと考えられる。一

推移は基材のタイプにより異なっていた。タイプ

Table 1 Changes in the plasma concentration of progesterone after the insertion of intravaginal

device attached progesterone-contaning capsules

Cow No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Breed

Type ofcapsule

JB
JB
H
JB
H
H
JB
JB
JB
JB
JB
JB

Type 1
Type 1
Type 1
Type 2Type 2Type 2Type 3
Type 3
Type 4
Type 4
Type 5
Type 5

JB：Japanese Black

H：Holstein

Plasma progesterone concentration (ng/ml)
0

2-3

Days after insertion
6

9

12-13

0.1
0.7
0.8
0.6
0.7
0.2
0.1
0.1
0.1
2.5
0.3
0.4

2.1
2.5
264
1.5
2.9
1.3
1.7
0.3
0.6
0.1
0.3
0.3

1.4
1.4
1.9
2.8
0.7
1.6
1.6
1.1
0.7
0.6
0.1
1.1

0.2
0.2
0.3
3.7
0.1
0.7
1
0.3
0.5
0.1
0.1
0.1

0.4
0.4
ND
0.1
ND
ND
0.5
0.1
0.6
0.3
0.2
4.6

ND：No Data

© The Ito Foundation

牛における新規腟内薬剤投与技術の確立

197

１およびタイプ２の基材を用いて作成されたプロ作用されることを目的とした投与の場合，タイプ

ジェステロン含有カプセルを装着した投与具を挿２あるいはタイプ３の特性を持つ基材が有効であ入した際には，すべての例で挿入後２～３日におると考えられる。

いて血中プロジェステロン濃度の上昇が起こり，多くの例で挿入後６日まで，１例では挿入後９日

４．要

約まで血中プロジェステロン濃度が高いレベルで維我々が開発を進めている新たな腟内留置型投与

持されていた。一方，タイプ４およびタイプ５の具に対して改良を加えその評価を行ったところ，カプセルを挿入された例では血中プロジェステロ

脱落を抑え，かつ，腟内に与える物理的障害を軽

ンの上昇は認められず，挿入期間中は低い濃度で減する投与具の特徴を明らかにすることができ推移した。タイプ３については，血中プロジェス

た。また，性質の異なる５つの基材それぞれにつ

テロン濃度が上昇した例と上昇しなかった例が認いて，プロジェステロン含有混合物を作成してカめられた。牛の発情周期において黄体が最も活発

プセルに封入し，それらを投与具に装着して腟内に機能する黄体開花期における血中プロジェステに挿入した場合のプロジェステロンの体内移行のロン濃度は５ng/ml前後であることが示されてい特徴を検証することができた。我々はヤギにおいる２）。今回タイプ１およびタイプ２のカプセルにてプロジェステロンと化学的性状の異なるペプチ

よる腟内投与は腟内で溶出したプロジェステロン

ドホルモンの腟内投与効果を明らかにしていが腟壁から吸収され，全身循環に移行させることる３）。今回のプロジェステロン剤において得られができるものの，黄体開花期のレベルまで血中プ

た投与具および基材の特性を応用して，プロジェ

ロジェステロン濃度を上昇させることはできな

ステロン以外の薬剤を用いた新規腟内薬剤投与技

かったと考えられる。このことは獣医領域におけ術の確立に向けて基盤的な成果を得ることができる既存の腟内徐放剤によるプロジェステロン投与た。

後の血中プロジェステロン濃度の推移と類似しており，同様の効果が発現したものと考えられる。
一方，異なる基材による血中へのプロジェステロ
ンの移行性の違いは基材の有する粘度と溶出性が関与していると思われる。粘度の低い基材の場合
は，短い時間内における腟壁への溶出性は高いが，腟内から排出される速度も早い傾向がある。

文献１） Suganuma, C., Kuroiwa, T., Tanaka, T., Kamomae,
H.：Anim. Reprod. Sci., 101, 285～294, 2007.
２） Endo, N., Nagai, K., Tanaka, T., Kamomae, H.：
Anim. Reprod. Sci., 134, 112～118, 2012.
３） Rahayu, L. P.：Studies on the clinical applicationof kisspeptin analog and neurokinin B receptor
agonist to improve Reproductive Performance inGoats, PhD thesis, 37～61, Gifu University, Gifu, 2018.

今回の成績から比較的長期間（７日以上）薬剤投与を行う場合はタイプ１が，短期間（７日未満）© The Ito Foundation

198

牛体内成熟卵を用いた移植用胚生産システムの高度化に関する研究Study on improvement of in vitro embryo production system using
oocytes matured in vivo for embryo transfer

山

中

賢

一

（佐賀大学農学部）

Ken-ichi Yamanaka（Faculty of Agriculture, Saga University）

In this study, we examined whether the use of in vivo-matured oocytes, collected byovum pick-up（OPU）from superstimulated Japanese Black cows, can improve the productivity
and quality of in vitro produced embryos. The cows were superstimulated by treatment withprogesterone, GnRH, FSH and prostaglandin F2α according to a standardized protocol. The
resulting in vivo-matured oocytes were collected by OPU and used subsequently for the otherexperiments. The immature oocytes from cows in the non-stimulated group were collected by
OPU and then subjected to maturation in vitro. We found that the rate of normally distributed
cortical granules of the matured oocyte cytoplasm in the superstimulated group was
significantly higher than that in the non-stimulated group. The normal cleavage rate（i.e.,
production of embryos with two equal blastomeres without fragmentation）and freezable
blastocyst rate were significantly higher in the superstimulated group than in the
nonstimulated group. Among the transferable blastocysts, the ratio of embryos from normal
cleavage was also significantly higher in the superstimulated group than in the non-stimulatedgroup. For in vivo-matured oocytes, it was observed that the pregnancy rates weresignificantly higher when normally cleaved embryos were used for transfer. Taken together,
these results suggest that high-quality embryos with respect to developmental kinetics can be
efficiently produced with the use of in vivo matured oocytes collected by OPU fromsuperstimulated Japanese Black cows.

１．目

良形質を受け継いだ子牛をより効率的に生産する的ことができるため，優良雌牛の遺伝資源の有効活

超音波画像診断装置を用いて生体内卵巣から卵用の観点から，OPU法の現場レベルでの普及が母細胞を採取するOvum Pick-Up（OPU）法が開

現在推進されている。さらに，OPU法を利用し発され，雌牛から繰り返し卵母細胞を採取するこて体外で胚を生産することは，現在，現場レベルとが可能となっている。OPUと体外受精技術とでの活用が広まりつつある黒毛和種牛のゲノム育組み合わせることによって任意の雌雄個体から優種価の利用促進にも大いに貢献することから，今© The Ito Foundation

牛体内成熟卵を用いた移植用胚生産システムの高度化に関する研究

199

後ますますその需要が高まると考えられる。しか2.2

しながら，体外胚生産システムに関して過去数十

事前の処理は行わずに発情周期の任意の時期に年にわたって研究がなされてきたにもかかわら未成熟卵をOPUにより採取する群を対照区とし，ず，体外生産胚の移植後の受胎率および凍結保存

過剰排卵処理後に体内成熟卵をOPUにより採取後の生存性は体内生産胚のそれと比較していまだする群を試験区とした。供試牛を枠場に保定し，に低く ，これらは体外生産胚を利用した子牛生

キシラジン塩酸塩（セラクタール２％注射液，バ産における最大の問題と言える。体外生産胚の発イエル薬品株式会社）10mgの頸部筋肉内投与に生能に影響を与える最も重要な要因として卵母細よる鎮静処理を行った後，塩酸リドカイン（リド

胞の品質があげられ，体外成熟卵では細胞小器官

カイン注２％，ファイザー株式会社）100mgの尾や分子の再分布，タンパク質やmRNAの合成と椎硬膜麻酔を行った。OPUは7.5MHzのコンベッ

いった細胞質成熟が損なわれていることが示され

クス型プローブを接続した超音波診断装置ている 。これらのことを考慮すると，体外成熟（ECHOPALⅡ，日立メディコ）と吸引装置（FV

技術の改良が必要であると考えられる一方で，４，富士平工業）に接続した17ゲージ×540mm

OPU-IVPにおいて効率的に高品質な体外生産胚の採卵針（COVA Needle，ミサワ医科工業）をを作製するためには，現時点では体内成熟卵を利用いて一定の陰圧（120mmHg，20-25 ml／分）

用することが合理的であると考えられる。

で行った。超音波ガイド下にて採卵針を卵巣に誘

１）

２）

OPUによるCOCsの採取

そこで，本研究では現時点で生産現場への普及

導し，直径２mm以上のすべての卵胞を穿刺してが可能で，かつ高い受胎率が望める移植胚生産シ

卵胞液とともに卵胞内卵母細胞を吸引した。まステムの確立を目的として，体内成熟卵の有用性

た，吸引した卵胞の数および大きさを記録した。

について検討を行った。

回収液には10 IU/mlヘパリンナトリウム（ヘパ

２．方
2.1

リンNa注５千単位，持田製薬），0.5％（v/v）子法

牛血清および抗菌薬（GIBCO）を添加した乳酸
加リンゲル液（ハルゼンＶ注射液，日本全薬工

過剰排卵処理発情周期の任意の時期に腟内留置型黄体ホルモ業）を用いた。

ン 製 剤（CIDR；フ ァ イ ザ ー ）を 挿 入 し（０ 日

2.3目），5.5日目に性腺刺激ホルモン放出ホルモン

対照区では，未成熟卵母細胞を５％（v/v）牛（GnRH）類縁体（酢酸フェルチレリン，スポル

胎児血清（FBS；Thermo Fisher Scientific），0.02

ネン，共立製薬）100μgを筋肉内投与した。８日

IU/ml FSH（共立製薬）および50μg/mlゲンタ

目に水酸化アルミニウムゲルと混合した卵胞刺激

マイシン（ナカライテスク）を添加したTCM-

ホルモン（FSH）製剤（アントリンAl；共立製

199（Thermo Fisher Scientific）培養液を用いて薬）30AUを頸部皮下に単回投与し，10日目にプ

38.5℃，５％CO２気相にて22時間の体外成熟後にロスタグランジンＦ2α類縁体（エストラメイ

体外受精を行った。一方，試験区では，卵丘細胞

ト；インターベット）500μgを筋肉内投与した。

が膨化した成熟卵母細胞を５％FBSおよび50μg/

10.5日目にCIDRを抜去し，11.5日目にGnRH100

mlゲンタマイシンを添加したTCM-199培養液をμgを筋肉内投与した。この二回目のGnRH投与

用いて38.5℃，５％CO２気相にて約３時間培養し，後25～26時間にOPUを行った。

供試牛のGnRH投与から30時間後に体外受精を© The Ito Foundation

体外生産胚の作出

200

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

行った。牛凍結精液を融解し，90％
（v/v）
パーコー

Society（IETS）マニュアルで定められている基ル溶液（GE Healthcare）を用いて2100rpm，10

準に従ってcode１と評価した培養から７-８日後分間の遠心処理を行った。上清を除去した後，の胚盤胞期胚を用いた。受胚牛にはホルスタイン

IVF100（機 能 性 ペ プ チ ド 研 究 所）で 希 釈 し ，種を用いて，シダーシンク法による排卵同期化処

1500rpm，５分間の遠心処理により洗浄した。さ理を行い，発情から７-８日後に黄体側の子宮角

らに精子の最終濃度が3.0×10 個/mlになるように新鮮胚を１個移植した。発情から35-40日後ににIVF100にて希釈し，38.5℃，５％CO２気相にて超音波画像診断装置（iMAGO；ECM）を用いて６時間媒精した。体外発生培養は個々の胚を識別

妊娠診断を行った。

６

す る た め に 個 別 管 理 培 養 デ ィ ッ シ ュ（LinKID

2.6

micro25；大日本印刷株式会社）を用いて，５％CGs分布および胚盤胞発生率はカイ二乗検定を

FBS添加CR1aa内で38.5℃，５％Ｏ２ ，5％CO２ 気用いて試験区間の差の解析を行った。受胎率は相にて８日間行った。

フィッシャーの直接確率検定を用いて試験区間の

2 . 4 表層顆粒（cortical granules：CGs）の染統計解析

差の解析を行った。また，他のデータについてはStudentのｔ検定により試験区間の差の解析を色対照区で得られた未成熟卵を体外成熟した後の行った。％データは解析の前にアークサイン変換

体外成熟卵と試験区から得られた体内成熟卵間でを行った。p＜0.05の場合を統計的に有意な差がCGs分布の比較を行った。１mg/mlのアクチナー認められると判断した。

ゼＥ（ナカライテスク）を添加したTCM-199溶
液中でCOCsの膨化した卵丘細胞および透明帯を３．結果と考察

ピペッティングにより機械的に除去した。次に，

OPUで採取された卵母細胞に対する過剰排卵４％（w/v）パラホルムアルデヒド（pH7.4）に処理の影響を調査した研究では，体内成熟卵は体て60分間固定し，0.05％（v/v）TritonX-100を添

外成熟卵よりも体外発生能が高いことが示されて加したPVP-PBSで５分間の透過処理を行った。

いるが３），それらの間で細胞質成熟の状態を比較

PVP-PBS で ３ 回 洗 浄 し た 後 ，卵 母 細 胞 を １ ％した研究はほとんどない。したがって，本研究で（w/v）牛血清アルブミン加PBSにて15分間のブは，細胞質成熟の状態をCGsの分布を指標として

ロ ッ キ ン グ を 行 い ， 10μg/ml fluorescein

調査を行った。CGsの各分布パターンの典型的なisothiocyanate（FITC）-labeled Lens culinaris

画像をFig.１に示した。CGsが正常な分布を示す

agglutinin（LCA）（Vector Labs Inc.）にて遮光

卵母細胞の割合は，対照区に比べて試験区で有意下で30分間インキュベーションした。卵母細胞をに高かった（p＜0.05；Table１）。CGsは卵母細胞

PVP-PBSで３回洗浄した後，スライドグラスにの成熟における最終段階では細胞膜付近に分布し蛍光褪色防止液とともにマウントし，共焦点レーており，CGsが細胞質膜直下に存在する場合にのザー顕微鏡（Ｃ１；ニコン）を用いて励起・蛍光

みCGsは卵細胞膜と融合し，その内容物を囲卵腔

波長それぞれ488nm，515nmの条件下でCGs分布に放出させることができる４，５）。このCGsのエキを観察した。

ソサイトーシスは多精子受精を防止するために最2.5

胚移植および妊娠診断も重要な事象であると考えられており６），細胞質胚移植にはInternational Embryo Technology

成熟の指標の一つとして用いられている。最近の© The Ito Foundation

201

牛体内成熟卵を用いた移植用胚生産システムの高度化に関する研究
Bright ﬁeld

研究によると，OPU前に過剰排卵処理した牛かCortical granules（A）

ら採取された卵母細胞は，無処理の牛のそれと比較して多精子受精の割合が低かったことが報告されている７）。体内成熟卵の多精子受精率に関しては今後検討する必要があるが，体内成熟卵では，体外成熟卵と比較して細胞質成熟がより適切に起（B）

こっていることが示された。
対照区の体外成熟卵および試験区の体内成熟卵を用いた体外発生成績をTable２に示した。また，
本研究で用いた第１卵割のパターンをFig.２に示した。分割率および胚盤胞発生率に有意な差は認（C）められなかったが，正常卵割胚および凍結可能胚（code１）の割合は対照区と比べて試験区で有意に高かった（p＜0.05）。また，移植可能胚（code
１および２）のうち第１卵割が正常な胚の割合は対照区と比べて試験区で有意に高かった（p＜（D）0.01）。これらの結果は，体内成熟卵を用いることで高品質胚の産生は可能であるが，体外発生率は改善されなかったという過去の報告と一致していた３，８）。一方で，本研究で用いたプロトコルはFig. 1 Representative images of the distribution ofcortical granules （CGs） in bovine matured
oocytes ； The distribution pattern of CGs in bovine
ooplasm were classified according to the four
patterns described by Hosoe and Shioya ４）：Pattern
I - CGs distributed in clusters or large aggregates（A）；Pattern Ⅱ - CGs individually dispersed
beneath the plasma membrane and partiallyclustered or aggregated（B）；Pattern Ⅲ - CGs
completely dispersed beneath the plasma membrane（C）；and Pattern Ⅳ - no CGs（D）

ホルスタイン種の過剰排卵処理のために設計されたものを参考にしており，今後は黒毛和種に最適なプロトコルを設計し，得られた卵母細胞およびそれらを用いて生産された胚について再度精査することで，体外発生率の向上につながるかもしれない。
最後に，本研究の体内成熟卵を用いた体外胚生

Table 1 D istribution patterns of cortical granules （CGs） in in vitro-（non-stimulated, control） and in vivo-（superstimulated）matured oocytes in Japanese Black cows.

Group

No. of oocytes
examined

Non-stimulated
Superstimulated

26
31

No. of oocytes showing each distribution pattern of CGs
Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

No. of oocytes
showing normal CG
distribution（%）

11
5

10
11

4
14

1
1

14（53.8）＊25（80.6）＊

The distribution patterns of CGs in ooplasm were detected after in vitro maturation （non-stimulated group） or OPU（superstimulated group）, and classified according to the four patterns shown in Fig. 1. Oocytes with CGs distributing corticalcytoplasm（patterns Ⅱ and Ⅲ）were classified as normal distribution. Asterisks indicate that values within the same column are
significantly different（p＜0.05）.

© The Ito Foundation

202

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 2In vitro development of embryos produced using in vitro-（non-stimulated,
control）and in vivo-（superstimulated）matured oocytes.
Non-stimulated

No. of putative zygotes cultured

Superstimulated

200

204

166（83.0）160（78.4）

No. of normally cleaved embryos（%）b＊86（51.8）＊
105（65.6）

No. of embryos developed to blastocystbstage on Day 8（%）

100（60.2）

96（60.0）81（48.8）＊42（25.3）

92（57.5）＊
59（36.9）＊＊49（29.5）＊＊73（45.6）aNo. of embryos cleaved（%）

b
No. of IETS code 1 and 2 blastocysts（%）
b
No. of IETS code 1 blastocysts（%）
No. of IETS code 1 and 2 blastocysts fromb
normal cleaved embryos（%）

Oocytes collected from non-stimulated and superstimulated Japanese Black cows were subjected
to in vitro and in vivo maturation in the non-stimulated and superstimulated groups, respectively,
and used for in vitro fertilization. Data for the non-stimulated and superstimulated groups wereobtained from 7 and 6 replicates, respectively. a The percentages of cleaved embryos at 50 hpi tocultured zygotes was denoted. b The percentages of embryos corresponding to each criterion incleaved embryos was denoted. Asterisks indicate that values within the same row are
significantly different（＊, p＜0.05；＊＊, p＜0.01）.

（A）

（B）

（D）

（E）

（C）

Fig. 2 Morphological classification of cleavage pattern of bovine embryos at the first cell cleavage；The cleavage

patterns of embryos at the first cell division were classified as described by Sugimura et al.９）；Embryos withblastomeres of the same size without fragmentation（A）were classified as having undergone normal cleavage, andembryos with two blastomeres of different sizes（B）, two blastomeres with a protrusion（C）or several small
fragments（D）, direct cleavage from the one-cell stage to three or four blastomeres（E）were classified as having
undergone abnormal cleavage

産システムが高品質な移植胚の生産に寄与するか

来の胚盤胞期胚で有意に高くなった（p＜0.05）。

について評価するため，移植後の受胎率について

最近の研究によると，第１卵割後に均等な割球を検討を行った。試験区において，第１卵割が正常有する正常卵割胚は，異常な卵割を経た胚より受卵割または異常卵割由来の胚盤胞期胚を移植した胎率が高いことが報告されており，第１卵割パ

結果，受胎率はそれぞれ61.9％（13/21），12.5％

ターンを解析することは胚移植後の妊娠損失の危（1/8）であり，異常卵割由来と比べて正常卵割由

険性を減らすことができる可能性を示してい© The Ito Foundation

牛体内成熟卵を用いた移植用胚生産システムの高度化に関する研究203る９）。本研究の結果はこの報告と一致しており，

このような胚の発生能に対する体内成熟卵の有効

形態学的に同等の品質の胚であっても，異常卵割

性は，正常なCGs分布から示されるように，適切胚と比べて正常卵割胚で受胎率が有意に高くなるな卵母細胞の成熟によるものと考えられた。これ

結果が得られた。一方，対照区において，第１卵らの結果から，OPUにより採取された体内成熟

割が正常卵割由来の胚盤胞期胚を移植した結果，卵を用いることで，形態学的および発生動態的に受胎率は50.0％（5/10）であった。この結果は，高品質な胚の生産性を向上させることができ，体高い受胎率を得るためには必ずしも体内で成熟さ外生産胚による効率的な子牛生産に寄与することれた卵母細胞から胚を生産する必要はなく，単純が示唆された。

に正常卵割胚を選択して移植することが重要であることを示唆している。しかしながら，本研究において，体内成熟卵を用いた場合，体外成熟卵を用いた場合と比較して，より多くの正常卵割を経た移植可能胚が得られた。この結果と第１卵割が正常な胚の受胎率が高いという移植試験の結果を考慮すると，体外胚生産に体内成熟卵を用いることで形態学的だけではなく，発生動態の観点からも品質が高い胚を高率で生産することが可能であり，結果として移植可能胚の生産効率，しいては受胎率の向上に寄与することが期待される。
４．要

約

本研究では，体外胚生産に体内成熟卵を用いる
ことで，第１卵割が正常な胚および凍結可能胚の生産性が向上することを示した。さらに，正常卵

文献１） Galli, C., Duchi, R., Colleoni, S., Lagutina, I.,
Lazzari, G.：Theriogenology, 81, 138～51, 2014.
２） Merton, J. S., de Roos, A. P., Mullaart, E., deRuigh, L., Kaal, L., Vos, P. L., et al.：Theriogenology,
59, 651～74, 2003.
３） Matoba, S., Yoshioka, H., Matsuda, H., Sugimura,S., Aikawa, Y., Ohtake, M., et al.：J Dairy Sci, 97, 743～53, 2014.
４） Hosoe, M., Shioya, Y.：Zygote, 5, 371～６, 1997.
５） Hyttel, P., Fair, T., Callesen, H., Greve, T.：
Theriogenology, 47, 23～32, 1997.
６） Wang, W., Hosoe, M., Li, R., Shioya, Y.：Dev
Growth Differ, 39, 607～15, 1997.
７） Ribas, B. N., Missio, D., Junior Roman, I., Neto, N.
A., Claro, I. J., Dos Santos Brum, D., et al.：Anim
Reprod Sci, 195, 284～90, 2018.
８） Dieleman, S. J., Hendriksen, P. J., Viuff, D.,Thomsen, P. D., Hyttel, P., Knijn, H. M., et al.：Theriogenology, 57, ５～20, 2002.
９） Sugimura, S., Akai, T., Somfai, T., Hirayama, M.,
Aikawa, Y., Ohtake, M., et al.：Biol Reprod, 83, 970～８, 2010.

割胚を移植することで，高い受胎率が得られた。

© The Ito Foundation

204

黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査
Survey of the low durability of motile sperm in the frozen semen of
Japanese Black cattle

星

野

洋一郎

（京都大学大学院農学研究科附属牧場）

Yoichiro Hoshino（Kyoto university livestock farm）

Sperm motility of frozen semen affects the conception rate in the artificial insemination in
cattle production. The durability of sperm motility differs greatly depending on bulls. In thisstudy, we defined the sperm motility durability score that indicates the degree of keep ofsperm motility, and analyzed the motility of frozen semen in 56 Japanese black bulls. Frozen
semen of 19 bulls that were produced by the old method or from the bull that was over 8
years old at the time of production were excluded from the analysis due to low sperm motility.
There is no correlation between the birth date of 37 bulls and the sperm motility at 0 h or
sperm motility durability score. This result indicates that there was no change in sperm
motility during the process of breed improvement of Japanese black cattle. On the other hand,the durability of velocity curvilinear（VCL）tends to be lower and the durability of linearity（LIN）tends to be higher in the recent bulls. This result suggests that the onset of the sperm
spontaneous hyperactivation of recent bulls getting later. The SNP association analysis withthe sperm motility durability score showed that there is a possibility that a SNP which was
included in the uncharacterized gene LOC101907140 on the chromosome No. 10 correlate withhigh sperm motility durability score.

交雑種生産の場合の受胎率も含まれているため，

的

１．目

肉用牛間の受胎率は乳用牛ほど低下していないと家畜牛の人工授精受胎率は低下傾向である。家も言われている。明らかな低受胎率を呈する種雄

畜改良事業団による凍結精液の受胎率調査では，牛の精液は，精子の形態等に異常があることが報

平成元年の初回授精受胎率は乳用牛精液62.4％，

告されているが３），通常，このような精液は人工

肉 用 牛 精 液 67.5 ％ で あ っ た が ，平 成 26 年 に は授精に用いられない。しかし，一定以上の受胎率

44.4％，55.0％に低下したことが報告されていがあり，人工授精に幅広く利用されている凍結精る 。受胎率低下の原因としては，乳用牛におい液であっても，種雄牛によって受胎率が異なる４）。

ては，雌牛の高泌乳化に伴う繁殖能力低下の影響

本研究では，精子の運動性がどの程度長く維持が大きい 。一方，肉用牛精液の受胎率調査には，されるかに着目し，これを精子の運動持続性と呼１）

２）© The Ito Foundation

黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査

ぶ。凍結融解精液中の運動精子の割合は，時間経205（1920×1080，秒間60フレーム）を撮影した。

過とともに低下するが，種雄牛によって低下の程自作の精子運動性解析プログラムを用い，動画度は異なる。運動持続性の低い種雄牛の精液は，中１秒間（60フレーム）の精子運動軌跡を解析し雌牛子宮内での生存時間が短いと考えられ，潜在た。精子の軌跡の最も遠い二点の距離が20μｍ以的な受胎率低下要因の一つである可能性がある。

上であった精子を，運動精子と判定した。動画中

もし低運動持続性が遺伝的要因であるなら，育種で解析した全精子に占める運動精子の割合を運動改良の過程で低運動持続性の増加を防ぐ必要があ

精子率とした。特に０時間における運動精子率る。そこで本研究では，一地域でこれまでに造成

を，融解時運動精子率とした。各運動精子についされた多数の黒毛和種種雄牛の凍結精液の精子運て，WHOラボマニュアル５版５）に記載された定動持続性を調査し，種雄牛の生年月日との相関を

義 に 従 い ， 運 動 性 解 析 項 目 （VCL ， VAP ，調べることにより，精子運動持続性に変化傾向が

VSL，LIN，WOB，STR，BCF，ALH）を算出

あるかどうかを明らかにした。さらに精子運動持した。運動性解析項目は正規分布しないため，中続性と関連する可能性のあるゲノム領域につい央値を代表値とした。

て，種雄牛のSNP型との相関を調べることにより
調査した。
２．方
2.1

2 . 3 精子運動持続性の指標（持続性スコア）の定義
精子運動の持続性スコアは，各種雄牛の融解時法

運動精子率の1/2を基準として，運動精子率が基

凍結精液の体外培養

準以上である時間を小数点以下まで求めた。

凍結精液は岐阜県畜産研究所（岐阜県高山市）

運動性解析項目の持続性スコアは，培養０時間

がこれまでに製造・保管していた黒毛和種凍結精から４時間後までの全解析精子の中央値を基準と液の提供を受けた。種雄牛56頭（1966年～2011年

して，時間区別の中央値が基準以上である時間を生，凍結精液は1982年～2015年製造の74ロット）

小数点以下まで求めた。

の凍結精液を３本ずつ解析に用いた。解析結果は３本の結果を集計した。

2 . 4 精子運動性に精液製造時の季節および種雄牛年齢が及ぼす影響の検討

凍結精液の運動性解析は以下のように実施し予備実験として，精子運動性に種雄牛の個体差た。凍結精液ストローを37℃の温水に浸漬して融以外に季節，および種雄牛の年齢の影響があるか

解し，ストロー１本につき200μlを48wellプレーを検討した。季節の影響は，１年を３ヶ月ずつのトの１wellに入れ，38℃の培養器（高湿度，空気期間（春（３～５月），夏（６～８月），秋（９～の気相）内で培養した。融解直後（０時間）から11月），冬（12～２月））に分け，１年以内に各期

１時間ごとに４時間後まで，以下のとおり動画をで凍結精液が製造された種雄牛３頭の運動精子率

撮影し，精子運動性解析を行った。

を比較した。年齢の影響は，５歳，７歳，９歳，

2.2

精子運動性の動画解析

11歳時に凍結精液が製造された種雄牛３頭の運動

精液２μlを精子検査用チャンバー（Leja，８検
体用）に注入し，倒立顕微鏡に設置した37℃のマ
イクロウォームプレート上に置き，顕微鏡に接続したデジタルカメラを用いて約３秒間の動画

精子率を比較した。
2 . 5 黒毛和種種雄牛集団における精子運動持続性の大規模調査
種雄牛56頭の凍結精液について，融解時運動精© The Ito Foundation

206

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

子率と精子運動持続性スコアを解析し，種雄牛生

精子率および精子運動持続性スコアについて，上年月日との相関を調べた。ただし，凍結精液製造

位１σ以上または下位１σ以下を陽性とみなし，方法および種雄牛年齢が精子運動性に影響していゲノム相関解析ソフトPLINKを用いてSNP型とる可能性がある19頭は，調査から除外した。

の相関を調べた。

2.6

精子運動に関わる遺伝的要因の探求

３．結果と考察

各種雄牛について34481個のSNPがタイピング
されている。このうちハーディー・ワインベルグ

3 . 1 運動精子率の時間変化と精子運動持続性

平衡検定のｐ値が0.001以下，およびマイナーア

スコア

リル頻度５％以下のSNPを除外した。融解時運動

Fig.１に運動精子率の時間変化と，精子運動持（A）

B47（Durability score = 3.14）
Sperm motility

50%

1/2 motility at 0 h

40%

Sperm motility
durability score

30%
20%
10%
0%

0

1
2
3
Time after thawing（h）

Sperm motility

50%

Sperm motility

Sperm motility

B42（Durability score = 1.31）

Sperm motility
durability score

30%
20%
10%
0%

4

1/2 motility at 0 h

40%

0

1
2
3
Time after thawing（h）

4（B）
B29（Durability score = 1.91）

70%

Sperm motility

60%

1/2 motility at 0 h

50%

Sperm motility
durability score

40%

Sperm motility

30%

30%
20%

1/2 motility at 0 h
Sperm motility

Sperm motility

B39（Durability score = 1.96）

Sperm motility
durability score

20%

10%

10%
0%

0

1
2
3
Time after thawing（h）

4

0%

0

1
2
3
Time after thawing（h）

4

Fig. 1 Illustration of the definition of the sperm motility durability score. The sperm motility durability score is thevalue of time that the sperm motility becomes the half of sperm motility at 0 h.（A）Sperm motility of frozen
thawed semen from two bulls（B47, B42）. Although both semen has almost same motility at 0 h（B47：40.4％, Ｂ
42：42.8％）,semen of B47（score=3.14）has higher durability than semen of B42（score=1.31）.（B）Sperm motilityof frozen thawed semen from two bulls（B39, B28）. Semen of B39（64.8％）has higher sperm motility at 0 h thansemen of B28（15.6％）. But sperm motility durability scores of semen from these bulls were almost same（B39：
1.96, B29：1.91）.

© The Ito Foundation

207

黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査

続性スコアの算出方法の例を示した。Fig. 1Aに

3.3

示すように，融解時運動精子率が同等であって凍結精液製造時の種雄牛の年齢が精子運動性にも，持続性スコアが高い種雄牛は運動精子率の低

及ぼす影響を，３頭の種雄牛の凍結精液を用いて下が緩やかであり，持続性スコアが低い種雄牛は調べた結果をFig.２に示す。３頭の種雄牛に共通

運動精子率の低下が速い。また，Fig. 1Bに示す

して，加齢に伴い運動精子率が低下する傾向が見ように，融解時運動精子率が大きく異なるが，持られ，５歳時および７歳時の運動精子率は９歳時

続性スコアは同等である事例もあった。このようより高かった。11歳時の運動精子率は，９歳時にに，持続性スコアは精子の運動性の低下の緩急を比べると向上していたが，この原因は不明である。

表す指標になると考えられる。
3.2

精子運動性と年齢の関係

3 . 4 種雄牛生年月日と融解後精子運動率の関

精子運動性と季節の関係

係

凍結精液を製造した季節が精子運動性に及ぼす

融解直後の運動精子率と凍結精液製造年月日と影響を，３頭の種雄牛の凍結精液を用いて調べたの相関をFig. 3Aに示す。1998年以前に製造されところ，季節ごとに精子運動性の変化は見られたた凍結精液において，運動精子率が低いことが分が，３頭の種雄牛に共通した変化は見られなかっかった。これは，2000年以前に生産された凍結精

た。

液は製造方法が異なるためであると考えられた。

精巣の造精機能は，体温より低い温度で正常に

具体的には，希釈精液のストローへの充填と封印働く。牛において，夏に採取された精液は冬よりを，現在は機械を用いて自動で行っているが。

形態異常率が高いという報告がある 。しかし本2000年以前は手作業でストローに精液を充填し，研究では，黒毛和種精液の運動性に季節環境が及パウダー（PVA）を用いて封印を行っていた。

ぼす影響は，種雄牛によって異なる可能性が考え

2000年以前の精液は，製造方法の違いによって生られた。

じ る 作 業 時 間 の 違 い や ，希 釈 液 に 溶 け 込 ん だ

６）

PVA等が原因となり，凍結融解後の生存率が低

Age 7
Age 11

40%
30%
20%

Age 7
Age 11

40%
30%
20%

0

1
2
3
4
Time after thawing（h）

0%

Age 5
Age 7

50%

Age 9

Age 9
Age 11

40%
30%
20%
10%

10%

10%

60%

Age 5

50%

Age 9
Sperm motility

Sperm motility

50%

0%

60%

Age 5

Sperm motility

60%

B22

B15

B12

0

1
2
3
4
Time after thawing（h）

0%

0

1
2
3
4
Time after thawing（h）

Fig. 2 Effects of the age on sperm motility in three sires（B12, B15, B22）
. Sperm motility decreased with ageing. In bull

B12, Sperm motility at age 9 and 11 were lower than age 5 and 7. In bull B15 and B22, Sperm motility at age 7, 9
and 11 were lower than age 5.

© The Ito Foundation

208

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）（A）

Sperm motility

70%
60%

80%

Straws made by old method

Straws made by old method
Straws made by present method

70%

Straws made by present method

Sperm motility

80%

（B）

50%
40%
30%
20%

60%
50%
40%
30%
20%

10%

10%

0%
1982 1986 1990 1994 1998 2002 2006 2010 2014

0%0

Production date of semen straws

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17

Age of bulls

Fig. 3 Correlations between the sperm motility and（A）semen production date or（B）age of bulls at production ofsemen. Semen straws that were made by the old method（filled with hands and sealed by PVA powder）indicatedby blank dots, and present method（filled and sealed by machine）indicated with black dots.

いのではないかと考えられた。

がある。受精能獲得に伴い，精子の運動性が超活

また，融解直後の運動精子率と凍結精液製造時性化と呼ばれる変化を起こす。精子が超活性化すの種雄牛年齢の相関をFig. 3Bに示す。先の実験

ると，VCLが高まり，ALHが大きくなるが，精でも，９歳以降で運動精子率が低下することが示

子尾部の振幅は非対称となり，旋回運動になるた

されているが，この結果では８歳以上で運動精子

めLINは低下する７）。今回の調査の結果は，近年率が低い傾向が見られた。

の種雄牛の精液ほど，VCLが全期間中央値より

これらの結果から，以降の解析には，凍結精液

高い時間が短く，LINが高い時間が長くなっていが2000年以降製造であり，製造時に種雄牛が８歳ることを表しており，培養中に超活性化が起こる以下だった凍結精液（種雄牛37頭）のみを対象と時間が遅くなっていることを表しているのではな

した。

いかと考えられる。

種雄牛の生年月日と融解後運動精子率および精子 運 動 持 続 性 ス コ ア の 相 関 を ，そ れ ぞ れ Fig.

3 . 5 精子運動持続性に関連するゲノム領域の推定

4A，Bに示す。融解後運動精子率と精子運動持続

37頭の種雄牛について，SNP型と融解時運動精性スコアは個体差が大きいが，種雄牛生年月日と子率および精子運動持続性スコアとの相関を解析の相関は見られなかった。このことから，運動精した。その結果，融解時運動精子率とSNP型との子率および運動持続性に育種改良に伴う変化はな

有意な相関は見られなかった。一方，精子運動持いと考えられた。

続性スコアの上位１σ以上（７頭）を陽性とした

種雄牛の生年月日と精子の曲線速度（VCL），

場合，解析対象となった27559個のSNPのうち，

頭部振幅幅（ALH），直線性（LIN）の持続性ス

10番染色体上のSNP：ARS-BFGL-BAC-16113とコアの相関を，それぞれFig. 5A，B，Cに示す。

の 相 関 が ，ボ ン フ ェ ロ ー ニ 補 正 さ れ た ｐ 値 で

近年の種雄牛の精子ほど，VCLの持続性は低下

0.0314であり，５％水準で有意であった。このし，LINの持続性は増加する傾向が見られた。

SNPは，機能未知の遺伝子LOC101907140上に存ALHの持続性に変化傾向は見られなかった。

在することが分かった。

精子が受精するためには受精能を獲得する必要© The Ito Foundation

209

黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査（A）80%

y =-8E-06x + 0.7217
R² = 0.0082

Sperm motility

70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1993

Sperm motity durability score

（B）

1997

2001
2005
Birth date of bulls

2009

2013

4
3.5
3
y = -3E-05x + 3.2084
R² = 0.006

2.5
2
1.5
1
0.5
0
1993

1997

2001
2005
Birth date of bulls

2009

2013

Fig. 4 Correlations between the birth date of bulls and（A）sperm motility or（B）sperm motility durability score.

There were large differences in sperm motility and sperm motility durability score between individual bulls. There
was no upward trend or downward trend of sperm motility and sperm motility durability score with the birthdate of bulls.

3.6

総

括

ある。

凍結精液の精子運動持続性は種雄牛の個体差が大きいが，育種改良に伴う変化は見られなかっ４．要約

た。一方，近年の種雄牛の精液ほど，自発的超活

牛凍結精液の精子の運動持続時間は人工授精受性化が起こる時間が遅くなっている可能性が見出胎率に影響するが，種雄牛によって持続性は大きされた。このことが受胎率の低下と関連するかどく異なる。本研究では精子の運動性が維持される

うかは，今後の研究で調査する必要がある。また，時間を表す精子運動持続性スコアを定義し，56頭

精子運動持続性と関連する可能性のあるSNPが見の黒毛和種種雄牛の凍結精液の運動持続性を解析出されたが，本研究ではまだサンプル数（一地域

したが，古い製造方法で作られた凍結精液と，製の種雄牛37頭）が少ないため，今後，他の地域で造時の種雄牛の年齢が８歳以上だった凍結精液育種された種雄牛の凍結精液を用いて同様の解析

は，運動精子率が低いため解析から除外した。種を行うなど，サンプル数を増やす取り組みを実施

雄牛37頭の生年月日と融解後運動精子率および精し，候補SNPとの関連をより詳細に調べる必要が子運動持続性を調べたところ，相関は見られな© The Ito Foundation

210

平成30年度VCL durability score（A）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

32.5

y = -7E-05x + 4.1971
R² = 0.0486

2
1.5
1
0.5
0
1993

1997

2001

2005

2009

2013

Birth date of bulls

ALH durability score（B） 3.5

y = -1E-05x + 2.3582
R² = 0.0008

3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1993

1997

2001

2005

2009

2013

Birth date of bulls（C） 3.5
LIN durability score

3
2.5
2
1.5

y = 0.0002x-4.6154
R² = 0.24

1
0.5
0
1993

1997

2001

2005

2009

2013

Birth date of bulls
Fig. 5 Correlations between the birth date of bulls and（A）VCL durability score,（B）ALH durability score, or（C）

LIN durability score. There were slightly downward trend of the VCL durability score, and slightly upward trendof LIN durability score.

かった。このことから，運動精子率および運動持なっている可能性が示された。精子運動持続性と続性に育種改良過程での変化はないと考えられ

種雄牛のSNP情報との相関を調べたところ，１つた。一方，近年の種雄牛の精子ほどVCLの持続のSNPについて精子運動持続性の高さとの相関が性が小さく，LINの持続性が高い傾向があること見られた。当該SNPを内部に含む遺伝子の機能はから，精子の自発的超活性化が遅く起こるように未知であった。

© The Ito Foundation

黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査
文献１） http://liaj.or.jp/giken/hanshoku/jyutai.html
２） Lucy, M. C.：Journal of dairy science, 84, 1277～93,
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andrology, 11（3）,195～203, 1990.

© The Ito Foundation

212

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明（Ⅱ）
Effect of antioxidant supplementation on quality improvement ofcryopreserved bull semen（Ⅱ）

武田

久美子・西野景知＊・佐藤伸哉＊＊・今井昭＊＊（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，
茨城県畜産研究センター肉用牛研究所，＊＊広島県立総合技術研究所畜産技術センター）＊

Kumiko Takeda, Kagetomo Nishino＊, Nobunari Sato＊＊ and Akira Imai＊＊（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, Beef Cattle Institute,＊Ibaraki Prefectural Livestock Research Center, ＊＊Hiroshima Prefectural Livestock Research Center）

It is known that spermatozoa suffer various damages by freezing. It is thought thatseminal plasma containing excessive reactive oxygen species（ROS）induces oxidative stressand increases DNA damage in sperm during the manufacturing process of frozen semen. The
aim of this study was to clarify the efficiency of supplementation of bull spermatozoa withantioxidants, such as reduced glutathione（GSH）and astaxanthin before freezing to improve
fertilization ability. The influence of GSH addition on the quality of bovine cryopreserved
semen was assessed by sperm motility, DNA fragmentation index（DFI）, antioxidant capacity,and the developmental ability of embryos after in vitro fertilization（IVF）. Addition of GSH tosperm lots characterized with low developmental rates after IVF improved the results in asimilar manner using both abattoir and OPU-derived oocytes. GSH addition, before or after
cryopreservation, had a similar positive effect on developmental rates after IVF. However,since GSH addition may increase DFI in some semen lots, it is necessary to examine its
influence on embryo quality. When astaxanthin powder was dissolved in tetrahydrofuran andthen added to cryopreservation extender, its effect on sperm motility was limited. Then weused astaxanthin-rich egg yolks for cryopreservation extender and examined its effects onsperm motility and the developmental rate after IVF. The effect of astaxanthin-rich egg yolk
was bull and ejaculate dependent. Using the astaxanthin-rich egg yolks for the extendercaused no damage on sperm DNA. Astaxanthin-rich egg yolk is suitable for use as a semen
cryopreservation extender.

１．目の向上に向けた取り組みは急務である。種雄牛候

的補の一部には，精液性状が正常でも凍結ダメージ

わが国における牛の人工授精による受胎率はこを受けやすいもの，また人工授精に使用してみる

こ20年間で低下し続けている。黒毛和種においてと受胎性の低いものが存在している。凍結によりも子牛不足の常態化が問題となっており，受胎率

精子はさまざまなダメージを受け，凍結融解後の© The Ito Foundation

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明（Ⅱ）

精子は活力が凍結前の25-75％に低下し，機能が低下する。凍結精液の製造過程もしくは利用時に過剰な活性酸素種（Reactive Oxygen Species，ROS）を含む精漿が酸化ストレスを惹起し，精子の成熟，先体反応，運動性などに影響を及ぼすとともにDNAダメージを与える

２．方

213

法

2 . 1 牛精液の抗酸化力およびGSH濃度の測定の試み採取した精液の評価項目として一射精（ロッ。ヒトの男性不ト）ごとの抗酸化力およびGSH濃度を計測する

妊の多くはROSによる精子核DNAダメージによ手法の検討を行った。農研機構畜産研究部門で飼るものであると考えられており，妊娠率の低下，養している２頭の雄牛（Ｎ１，Ｎ２）より採取し胚発達の障害，流産に関係すると指摘されていた３ロットずつの精液の酸化ストレス（d-ROMs

るテスト）および抗酸化力（BAPテスト）につい

１，２）。近年，DNAダメージを軽減する手法のひ３，
４）

とつとして抗酸化物質の添加によって精子の受精て（株）ウィスマーへ分析依頼を行った。

能を改善しようとする試みが行われており，還元

精液のGSH濃度の測定は，蛍光法によるGSH定型 グ ル タ チ オ ン（GSH）や コ エ ン ザ イ ム Q10

量 キ ッ ト（Total GSH Assay Kit ，Fluorimetric,（COQ10）等の添加が有効との報告がある。

SensoLyteTM ，Anaspec社）を用いた。Ｎ１およ

そこで申請者らは，牛凍結精液製造時にあらかじびＮ２から採取した６ロットずつの精液をそのまめ抗酸化物質を希釈液へ添加することにより凍結

ま（精子＋精奨），もしくは5000rpm，５分で遠融解時に発生する酸化障害を低減すれば，結果的心した上清（精奨）を－80℃で凍結保存した。こに牛凍結保存精液の人工授精や体外受精の効率

れらサンプルは測定前に凍結融解を３回行い，アップに繋がるのではないかと考えた。しかし，キットに付属の希釈液で10倍希釈を行った後，抗酸化物質の利用にあたりその添加方法および効12000rpm，10分，４℃で遠心した上清を測定に果やマイナス面について詳細な検討はされていな用いた。蛍光強度は蛍光マイクロプレートリー

い。平成29年度本研究助成の成果として，６頭のダー（GENiOUS，励起492nm/蛍光535nm）にて

種雄牛についてGSH添加効果を検討したところ

計測した。

５，６）

体外受精胚発生率の低い雄牛もしくは採取ロット
でGSH添加効果の程度が高くなることを明らか

2 . 2 GSH添加凍結精液のDNAダメージ率および抗酸化力測定にした。また，細胞膜保護効果の期待できる脂溶

精子核DNAダメージの検出には，DNA断片化

性抗酸化物質であるアスタキサンチンの希釈液へを標識する方法（TUNEL法，In Situ Cell Deathの添加方法について検討したところ，有機溶媒やDetection Kit, Fluorescein, Roche 社） を 用 い

水溶化製品の利用には精子生存性への悪影響がみた４，７）。凍結精液を融解後，既報に従って染色をられたため，凍結希釈液にアスタキサンチン高含

行い８，９），TUNEL陽性精子（＝DNA断片化あり）

有卵黄を用いた方法が有効である可能性を示しを蛍光顕微鏡下（Ｂ励起蛍光フィルター）におい

た。本年度も引き続き，希釈液へのGSH添加によて検出し，DNA断片化指数（DFI）値を求めた。

る凍結精液受胎性向上効果の解明とアスタキサン

次にＮ１およびＮ２より採取した精液にGSH

チン等脂溶性抗酸化物質の添加による凍結精液品

を１mM，５mM，10 mMを添加し凍結した精液質向上効果について詳細な検討を行った。

を融解後，2.1の方法で抗酸化力分析を行った。

© The Ito Foundation

214

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

2 . 3 凍結前後でGSHを添加した精液を用いた体外受精試験～種雄牛や採取ロットの違い～

2 . 5 アスタキサンチン高含有鶏卵を用いた凍結精液の運動性評価
茨城県畜産センター肉用牛研究所にて本年度も広島県立総合技術研究所畜産技術センターに引き続き市販のアスタキサンチン高含有鶏卵の卵て，種雄牛（Ｈ１，Ｈ２）や採取ロットの違いが黄（Ax/E）を用いた凍結精液を製造し，種雄牛

体外受精胚発生率へ与える影響について精査をや採取ロットごとに運動性への効果の違いを検討行った。昨年度，凍結融解後の精液にGSH添加処

し た 。凍 結 融 解 後 ，牛 精 子 画 像 解 析 装 置理を行ったところ，と場由来卵子への体外受精に（C-IMAGING，コンピックス社製）により生存おいて５mM添加区に共通して効果がみられた。

性（運動精子数率）および運動性（移動速度）をそこで本年度は受精卵生産現場への実用化を図る

計測した。昨年度からのデータも合わせ，６頭のため，生体卵子吸引法（OPU）によって採取し種雄牛（Ｉ１～Ｉ６）について採取日の異なる３た卵子を用いた体外受精胚発生へのGSH添加効～７ロットの精液について調査を行った。

果を検討した。また，１頭の種雄牛（Ｈ２）につ

次にAx/Eを用いて凍結した精液を融解し，2.1

いて採取日の異なる３ロットに対しGSHをあらの手法と同様に抗酸化力の測定，および2.2の手かじめ添加した（５mM，10 mM）凍結精液を製法と同様にDNAダメージ率を計測した。

造し，と場由来卵巣より採取した卵子を用いて体外受精試験を行った。

2 . 6 アスタキサンチン高含有鶏卵を用いた凍結精液の体外受精試験

2 . 4 アスタキサンチン添加による凍結精液のAx/Eを用いて農研機構畜産研究部門にて製造したＮ１およびＮ２の凍結精液，および茨城県畜

運動性への効果の検討
昨年度は，Ax粉末（WAKO）を細胞毒性が低産センター肉用牛研究所にて製造したＩ１およびい有機溶媒であるテトラヒドロフラン （THF）

Ｉ５の凍結精液を用いて既報に従い体外受精試験に溶解させた（Ax/T）後に希釈液へ添加したとを行った11）。

10）

ころ0.1μL/mLの添加による運動性改善への効果がみられた。本年度は，以下について２頭の雄牛（Ｎ１，Ｎ２）より採取した新鮮精液の運動性への影響を調査した。まずTHFの精子運動性への３．結果と考察3 . 1 牛精液のGSH濃度および抗酸化力の測定の試み影響を調査するため，THFのみ２μL/mL，20

依頼分析の結果，d-ROMsテストでは検出限界

μL/mLを卵黄不含希釈液へ添加し次に１％（w/

以下となり，BAPテストのみ検出が可能であっv）Ax/T 溶 解 液 を 卵 黄 不 含 希 釈 液 へ 最 終 濃 度

た。数値は採取ロットにより変動していた。Ｎ１（w/v）を0.0001～0.002％となるように添加した。

とＮ２の数値に有意差はみられなかったが，精液

また，１％（w/v）もしくは４％（w/v）
Ax/T溶解（精子を含む）ではＮ１で抗酸化力の数値が低く

液を卵黄含有希釈液へ最終濃度が0.001～0.1％となる場合があった。Ｎ１の精液の品質との関連性

なるよう添加した。それぞれの区を37℃で30分イを明らかにするためには今後例数を重ねることがンキュベートした後，精子運動性に及ぼす影響を必要である。

牛用精子運動解析装置（SMAS牛用，富士平工業）で測定した。

新鮮精液の全GSH測定を試みた結果，前処理としてタンパク質を沈殿させるスルホサリチル酸処© The Ito Foundation

215

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明（Ⅱ）

理を行うと計測不能となったため，本行程を省い

後，５mM GSH処理を行った後にOPU卵子の体て計測を行うこととした。全GSH量は精液から遠外受精に用いたところ，１ロットで発生率の向上

心分離により精子画分を除いた精奨のみとするとがみられた（Fig.１）。

低くなった（p＜0.01）。しかしＮ１とＮ２の間で次に胚盤胞発生率の比較的低かった種雄牛（Ｈ

有意差はなかった。本手法についても精液の品質

２）について凍結前の精液にあらかじめGSHをとの関連性を明らかにするためには今後検討が必

添加し（５mM, 10 mM），凍結精液の製造を行っ要である。

た。体外受精試験の結果，胚盤胞発生率の比較的

3 . 2 GSH添加凍結精液のDNAダメージ率およ

低いロットでGSH添加の発生率改善への効果が認められた（Fig.２）。

び抗酸化力測定
本年度は2.3で製造したＨ２種雄牛由来のGSH

3.2の結果よりGSH添加によりDNAダメージが添加凍結精液について融解後のDFIを調査したと増大しても体外受精の結果が向上することが明ら

ころ５mM以上のGSH添加によってDFI値の著しかとなった。GSHは精子のS-S結合の還元を促進

い増加がみられた。TUNELでの評価においては

し，既報によればS-S結合の少ない場合ほど胚発

GSHの添加が精子凍結融解の際のDNAダメージ

生が良好である一方，精子DNA断片化の程度はを増大していることが示唆される結果となった。

胚発生異常と相関することが知られている 12）。

一方，GSHを添加した２頭の種雄牛（Ｎ１，Ｎ

GSH添加により精子生存率は下がらないことか

２）の凍結精液を融解後，抗酸化力分析を行った

ら，GSH添加により精子に起きる変化の解明およ

ところ有意差はなく，GSH添加による抗酸化力へ

び体外受精胚の正常性について今後検討する必要の効果はみられなかった。

がある。

3 . 3 GSHの添加が体外受精胚発生率へ与える

3 . 4 アスタキサンチン添加による凍結精液の影響～種雄牛や採取ロットの違い～

運動性への効果の検討

２頭の種雄牛（Ｈ１，Ｈ２）の凍結精液を融解

A）

B）
100

100
80

b

60

80
60

a

40

b

40

20
0

THFのみ卵黄不含希釈液へ添加した場合，２20
H1H2（lot.1） H2（lot.2）
0 mM

0

5 mM

a
H1

H2（lot.1） H2（lot.2）
0 mM

5 mM

Fig. 1 Comparison of IVF results among bull spermatozoa obtained from two bulls（H1, H2）supplemented with orwithout GSH（0, 5 mM）just before IVF using oocytes collected by OPU. A）Percentage of embryo cleavage（％ of
total incubated embryos）, B）Percentage of blastocyst development（％ of total incubated embryos）. ab；Bars
within each bull with different letters differ（p＜0.05）.

© The Ito Foundation

216

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

A）

B）

100
80

100
b

b

ab

a

60

b

80
60

a

40

40

20

20

0

Lot.1
0 mM

Lot.2

Lot.3

5 mM

10 mM

b
a

0

b b
a

a

Lot.1
0 mM

Lot.2

Lot.3

5 mM

10 mM

Fig. 2 Comparison of IVF results among bull spermatozoa obtained from one bull（H2）supplemented with or without

GSH（0, 5, 10 mM）before freezing steps. A）Percentage of embryo cleavage（％ of total incubated embryos）, B）
Percentage of blastocyst development（％ of total incubated embryos）. ab；Bars within each bull with different
letters differ（p＜0.05）.
N1

N2

100

100

80

80

60

60

40

40

20

20

0

0

Ax/T
Ax/T
0.004% 0.02%

Ax/T
0.1%

0

0

Ax/T
0.004%

Ax/T
0.02%

Ax/T
0.1%

Fig. 3 Motility of fresh ejaculated spermatozoa（N1 and N2）supplemented with astaxanthin dissolved in THF（Ax/T）

measured by SMAS.

μL/mL添加では運動性に変化はみられなかったが，20μL/mL添加では著しく運動性が低下した。
THFの添加量により精子運動性へ影響のあるこれたことは，今後の課題である。
3 . 5 アスタキサンチン高含有鶏卵を用いた凍結精液の運動性評価とが明らかとなった。次に４％（w/v）のAx/Tを

Ax/E利用が精子生存率および移動速度へ与え

卵黄含有希釈液に１，
４，20μL/mL添加したとこる効果を調査した結果，Ax/Eの使用により生存ろ（0.004％，0.02％，0.1％），Ｎ２の精液では運率が有意に高くなる雄牛が１頭みられた（Ｉ５）。

動性への変化はあまりみられなかったが，Ｎ１のその他５頭については採取ロットにより精子の生

精液で１～４μL/mL添加において運動性が向上

存率および移動速度は異なっており，平均値に対する傾向がみられた（Fig.３）。しかし，卵黄含

照区との有意差はみられなかった。

有もしくは不含にかかわらず，Ax/Tを希釈液に

次に，Ax/E使用にて製造した凍結精液（N１，添加すると同時にアスタキサンチンの析出がみら

N２，I４）のDFIを計測した結果，対照区との有© The Ito Foundation

217

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明（Ⅱ）

DFI （%）

20

10

N1-1

N1-2

N2

Ax/E

Control

Ax/E

Control

Ax/E

Control

Ax/E

Control

0

I5

Fig. 4 The DNA fragmentation index（DFI）analyzed by TUNEL in frozen-

thawed semen using Ax/E, obtained from three bulls（N1, N2, I5）.

（%）
100.0
80.0

a

a

40.0

b
a

20.0

a

N1

N2
Control

I5

Blastocyst

CleavedBlastocyst

CleavedBlastocyst

BlastocystbCleaved0.0bCleaved

60.0

b

I1

Ax/E

Fig. 5 Comparison of IVF results among bull spermatozoa obtained from four bulls（N1, N2, I5, I1）using control egg

yolk or astaxanthin-rich egg yolk（Ax/E）for freezing.

意な差は検出されず，Ax/Eの利用によるDNAダ
メージ低減効果および悪影響はなかった（Fig.

3 . 6 アスタキサンチン高含有鶏卵を用いた凍結精液の体外受精試験

４）。また，BAPテストによる抗酸化力測定の結Ax/Eを用いた凍結精液について体外受精を果，Ｎ１およびＮ２で対照区とAx/Eの使用間で行った結果，雄牛Ｎ１で胚発生率は高くなった

数値は同程度であり，差は検出されなかった。

が，N２，Ｉ１では効果はみられず，Ｉ５では胚発生率は低くなる結果となった（Fig.５）。市販のAx/Eは卵黄における含有量が0.002％（w/w）© The Ito Foundation

218

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

であり，凍結希釈液では0.0004％となる。至適濃

生率を調査したところ種雄牛ごとに効果が異なっ度を調査するためには，アスタキサンチン濃度のていた。一方でアスタキサンチン高含有卵黄の利

異なる卵黄を得る必要がある。また今後，Ax/E

用によるDFIへの影響はみられなかった。精液希利用で効果のみられる場合とみられない場合の検釈液へのアスタキサンチン添加手法としてアスタ証を行い，利用効果の得られる条件を検討していキサンチン高含有卵黄は利用可能と考えられた。

く必要がある。
3.5および3.6の成果については日本畜産学会第125回大会において「牛精液希釈液への脂溶性抗酸化物質アスタキサンチン添加手法の検討」との演題にて発表を行った。
４．要

約

本研究は，牛凍結精液の製造過程で抗酸化物質
をあらかじめ添加することで，凍結融解時に精子が受ける酸化ダメージを低減させ，受精能を改善することが目的である。我々は，牛凍結精液希釈
液への水溶性抗酸化物質である還元型グルタチオン（GSH）の添加と脂溶性抗酸化物質であるア
スタキサンチンの添加による凍結精液の運動性，
DNAダメージ（DFI），抗酸化力，体外受精による胚発生率等，凍結精液の品質や受胎性向上効果について検討を行った。希釈液へのGSH添加による品質向上効果について検討した結果，生体吸引
卵子を用いた体外受精においても低発生率を示す
精液ロットについてGSH添加効果が高いことが示唆された。しかし凍結前添加の場合，精子のDFI値が高くなる場合がみられた。また，GSHの添加時期としては，凍結前添加の場合でも凍結融解後のGSH添加処理と同様の体外受精胚発生率の向上効果がみられた。
アスタキサンチン粉末を有機溶媒であるテトラヒドロフランに溶解後卵黄含有希釈液へ添加した
ところ，２頭のうち１頭の雄牛で運動性に対し添加効果がみられた。また，６頭の雄牛を用いたアスタキサンチン高含有卵黄利用試験では１頭で精子運動性への効果がみられた。体外受精後の胚発

文献１） Chen, S. J., Allam, J. P., Duan, Y. G., Haidl, G.：
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therapeutical approaches, Arch Gynecol Obstet, 288,
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deoxyribonucleic acid damage on fertilization andpregnancy, Fertil Steril, 81, 965～972, 2004.
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A s s a y （ S C S A（（ R ））） a n d o t h e r s p e r m D N A
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Sci, 169, 56～75, 2016.
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Sudhakaran, S., Longobardi, S., Gualtieri, R.：
Supplementation of sperm media with zinc,
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sperm against exogenous oxidative stress andimproves their ability to support embryo
development, Zygote, 25, 168～175, 2017.
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Supplementation of the dilution medium afterthawing with reduced glutathione improves function
and the in vitro fertilizing ability of frozen-thawedbull spermatozoa, Int J Androl, 31, 40～49, 2008.
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sperm DNA damage in the evaluation of maleinfertility, Urology, 76, 1380～1386, 2010.
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DNA damage in bulls by TUNEL assay as aparameter of semen quality, J Reprod Dev, 2015.
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71～74，2016.
10） Boesch-Saadatmandi, C., Rimbach, G., Jungblut,© The Ito Foundation

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明（Ⅱ）
A., Frank, J.：Comparison of tetrahydrofuran, fetal
calf serum, and Tween 40 for the delivery ofastaxanthin and canthaxanthin to HepG2 cells,
Cytotechnology, 63, 89～97, 2011.
11） 武田久美子，西野景知，今井昭：抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明，平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，36，190～
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Hayashi, S., Yanagida, K., Sato, A.：Relationshipbetween assessment of sperm nuclear qualities andembryo deelopment in vitro, Journal of Mammalian
Ova Research, 24, 153～160, 2007.

© The Ito Foundation

220

牛の卵巣・子宮機能調節に及ぼす不飽和脂肪酸の影響とその利用
Effects of linoleic acids and linolenic acids on ovarian and uterine function
in cows

作

本

亮

介

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門家畜育種繁殖研究領域）

Ryosuke Sakumoto（Division of Animal Breeding and Reproduction Research, Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

The aim of the present study was to evaluate effects of linoleic acids and linolenic acids onbovine luteal and uterine function using a tissue culture experiment. Effects of continuous
administration of linoleic and linolenic acids into intra-uterine horn with ipsilateral to the
corpus luteum on the duration of the estrous cycle and plasma progesterone （P4）concentration were also studied. Both linoleic（500μg/ml）and linolenic（500μg/ml）acids
stimulated prostaglandin（PG）E2 but inhibited PGF2α production by cultured endometrial
tissue（p＜0.01）. In contrast, both linoleic and linolenic acids did not influence P4 secretion by
cultured bovine luteal tissues. Intra-uterine administration of linoleic and linolenic acids（5㎎/10ml each per day）in the cows between on days 12 and 21 resulted in prolong the estrous
cycle in compared with control cows （saline administration）（p＜0.05）. Moreover, P4
concentration of the cows treated with linoleic and linolenic acids was higher between days 19
and 21 than that of control cows（p＜0.05）. Based on these findings, both linoleic acids andlinolenic acids affect endometrial PG production and the duration of estrous cycle, suggestingthat these unsaturated fatty acids may be useful substances to control reproductive
performance in cows．

１．目の早期回復にはプロジェステロン（Ｐ４）濃度の的増強が必要であるとともに，子宮機能の回復には

家畜の生産性を向上し，収益性の高い畜産経営

炎症反応の鎮静化とステロイドホルモンへの反応を構築することは喫緊の課題であるが，人工授精

性の回復，プロスタグランジン（PG）合成能のにおける受精不成立や早期胚死滅等による牛の受亢進が必要不可欠である。我々はこれまでの研究

胎率の低下はいまだ高い障壁となっている。繁殖において，牛の黄体や子宮内膜における妊娠に伴雌牛を効率的に生産するためには，分娩後に早期う遺伝子発現変化を網羅的に解析し，妊娠成立のかつ正常に卵巣と子宮を回復させ，遅滞なく人工カギとなり得る黄体もしくは子宮由来のケモカイ授精を行う必要がある。また，卵巣（黄体）機能

ン等の生理活性物質を提唱してきた１，２）。これら© The Ito Foundation

牛の卵巣・子宮機能調節に及ぼす不飽和脂肪酸の影響とその利用

221

複数の生理活性物質のうち，不飽和脂肪酸がその１日１回同様の処置を施し，発情周期への影響を発現調節に密接に関わることが示唆されている調べるとともに超音波画像診断装置を用いて，処が，不飽和脂肪酸が牛の黄体や子宮機能に及ぼす置による卵巣と子宮の状態変化の有無を確認し影響には不明な点が多く残されている。本研究でた。また，処置開始日（発情周期12日目）から次は，不飽和脂肪酸のうちリノール酸とリノレン酸

回発情周期の12日目まで連日頸静脈より採血し，に注目し，これらが培養牛黄体ならびに子宮内膜

血中Ｐ４濃度をELISAにより測定した。なお，組織の内分泌機能に及ぼす影響を解明するとともリノール酸とリノレン酸の子宮内投与濃度は過去に，発情周期12～21日の牛にリノール酸とリノレの報告３）を参考にして決定した。

ン酸を連日子宮内投与した場合の発情周期への影
響と血中Ｐ４濃度の変化を明らかにすることにより，リノール酸やリノレン酸を用いた牛の繁殖制

３．結果と考察3.1

培養牛子宮内膜組織のPGE2産生は，リ御技術の開発に資する新知見を提唱することを目

ノール酸とリノレン酸（ともに500μg/ml）添加的とした。

によって対照と比較して有意に増加し（Fig.1；p２．方＜0.01)，PGF2α産生はリノール酸とリノレン酸

法（ともに500μg/ml）添加によって対照と比較して

2 . 1 牛の卵巣・子宮機能に及ぼすリノール

有意に減少した（Fig.２；p＜0.01）。一方，培養牛黄体組織のＰ４産生に及ぼすリノール酸，リノ酸，リノレン酸の影響
黄体期（排卵後10－14日）にある牛をと殺し

レン酸の影響を調べた結果，いずれの濃度におい（ｎ＝４），卵巣（黄体）ならびに子宮を採取したても対照区と比較して有意な変化は認められな後，定法に従い組織片を作成・培養した。４時間

かった。なお，TNF添加区では，PGE2，PGF2の馴致後，濃度の異なるリノール酸（５，50，

α濃度ともに著しく増加したことから，本実験で500μg/ml）とリノレン酸（５，50，500μg/ml）

用いた子宮内膜組織ならびに黄体組織の生存性やを添加し，18時間後に培養上清を採取した。また，反応性に問題はないものと考えられた。

細胞の生存性と反応性を示すポジティブコント

3.2

予備実験として，深部注入用移植器を用ロールとして，腫瘍壊死因子（TNF：50 ng/ml）

いて，0.5％エタノールを含む生理食塩水10mlを添加区を設けた。培養上清中のＰ４（黄体）なら

黄体側子宮角中央部～深部へ注入し，注入直後，

びにPGE2（子宮），PGF2α（子宮）濃度を酵素

１時間後ならびに２時間後に超音波画像診断装置

免疫測定法（ELISA）により測定した。

を用いてその動態を確認した結果，投与２時間で

2 . 2 牛の繁殖機能に及ぼすリノール酸，リノ

ほぼ子宮角深部に生理食塩水が拡散吸収されたことを確認した。リノール酸（５㎎/10ml）を投与

レン酸の子宮内投与の影響
正常な発情周期を営む黒毛和種経産牛を実験にした牛において，生理食塩水（10ml）を投与し供した（のべ11頭）。発情周期12日目に深部注入た対照牛と比較して有意な発情周期の延長が認め用移植器を用いて，0.5％エタノールを含む生理られ（p＜0.05），リノレン酸（５㎎/10ml）を投

食塩水10ml（対照区），リノール酸（５㎎/10ml）

与した牛では，対照牛と比較して発情周期の延長

あるいはリノレン酸（５㎎/10ml）を黄体側子宮する傾向が認められた（Fig.３）。一方，リノー

角中央部から深部に注入した。発情周期21日まで

ル酸を投与した牛の血中Ｐ４濃度は発情周期19～© The Ito Foundation

222

平成30年度350

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

a-b : p＜0.01bRatio of PGE2 production（% of Control）

300

b

250

b

200
150
100

a

a

a

a

50
0
Control

5

50

500

Linoleic acid（μg/ml）

5

50

500

Linolenic acid（μg/ml）

Fig. 1 Effects of linoleic acid and linolenic acid on prostaglandin E2（PGE2）secretion by

cultured bovine endometrial tissue. Data are the means±SEM for four cows per stage,
and are expressed as relative ratios to control（100％）. a-b Bars without common lettersdiffer（p＜0.01）．
aRatio of PGF2α production（% of Control）

100aa-c : p＜0.01

a
b

80

b

b

60
40

c

20
0
Control

5

50

500

Linoleic acid（μg/ml）

5

50

500

Linolenic acid（μg/ml）

Fig. 2 Effects of linoleic acid and linolenic acid on prostaglandin F2α（PGF2α）secretionby cultured bovine endometrial tissue. Data are the means ± SEM for four cows per
stage, and are expressed as relative ratios to control（100％）. a-c Bars without
common letters differ（p＜0.01）．

21日において，対照牛の血中Ｐ４濃度と比較して酸，リノレン酸投与牛の間で有意な差は認められ高くなり（p＜0.05），リノレン酸を投与した牛のなかった。

血中Ｐ４濃度は同時期の対照牛と比較して高い傾

本実験の結果は，不飽和脂肪酸であるリノール

向は認められたが有意な差は見られなかった

酸とリノレン酸が直接牛子宮内膜のPG産生を制（Fig.４）。さらに，次回排卵後から12日目までの御することを示すものであり，両者の子宮内投与

血中Ｐ４濃度を調べたところ，対照牛とリノールによって発情周期の長さにも影響を与えることを© The Ito Foundation

牛の卵巣・子宮機能調節に及ぼす不飽和脂肪酸の影響とその利用

The length of the estrous cycle（days）

30
25*

Before experimentDuring administration: p＜0.01（vs before experiment）

223

*

20
15
10
5
0

Control

Linoleic acid

Linolenic acid

Fig. 3 Effects of continuous administration of linoleic acid and linolenicacid on the length of estrous cycle of Japanese black cows. Linoleicacid（5㎎/10ml per day）and linolenic acid（5㎎/10ml per day）were
administrated intra-uterine horn with ipsilateral to the corpus
luteum from day 12 after estrus to the next estrus. The length of
estrous cycles of the cows treated with a continuous administrationof linoleic acid was significantly extended（p＜0.01）．

示すものである。In vitroの実験から，リノール

与で乳用牛の妊娠率が変化したという報告があ酸とリノレン酸は培養子宮内膜組織のPGE２合成る３）。しかし，どのようなメカニズムで不飽和脂を促進し，PGF2α合成を抑制することが示唆さ

肪酸が卵巣・子宮機能を制御するのか，または子

れたが，PGE２は黄体のＰ４合成を促進する黄体

宮内投与が繁殖機能にどのような影響を及ぼすか機能亢進作用が知られ，PGF2αは逆に黄体退行はまったく明らかにされていなかった。本研究

作用が広く知られている 。In vivoの実験から，は，これらの疑問に一定の解答を提示するものでリノール酸とリノレン酸の子宮内投与において，あり，抗炎症作用を持つことが知られる不飽和脂

発情周期が延長することが示唆されたが，これは肪酸を繁殖牛に投与することによって，卵巣や子子宮内膜のPGE２合成が促進され，PGF2α合成

宮機能を亢進できることを示唆するものである。

が抑制されたことから，黄体が維持されたものと今後，さらにリノール酸やリノレン酸の効果的な考えられる。さらに，リノール酸とリノレン酸は投与手法を確立し，新たな技術開発への展開を進

直接黄体のＰ４合成に有意な影響を与えなかった

めることで，分娩後の牛の繁殖機能を効率的に制ことから，in vivoの実験で見られた血中Ｐ４濃度

御することが期待できる。

４）が維持されたのは，リノール酸とリノレン酸が黄体に直接作用したのではなく，子宮由来のPGを

４．要約

介して黄体が維持されたことにより，発情周期が本研究では，不飽和脂肪酸のうちリノール酸と延長したものと推察される。実際，過去の報告でリノレン酸に注目し，これらが培養牛黄体ならびは，肉用牛にリノレン酸をサプリメントとして経に子宮内膜組織の内分泌機能に及ぼす影響を解明

口投与した場合，子宮内のインスリン様成長因子

するとともに，発情周期中期の牛にリノール酸と２の発現が増加し ，リノール酸とリノレン酸給

リノレン酸を子宮内投与した場合（１日１回）の

５）© The Ito Foundation

224

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

発情周期への影響と血中Ｐ４濃度の変化を明らか

酸（５㎎/10ml）を発情周期12日目から連日子宮にすることにより，リノール酸やリノレン酸を用内投与した牛では対照牛と比較して有意な発情周いた牛の繁殖制御技術を開発することを目的とし期の延長が認められ，同様にリノレン酸（５㎎た。培養牛子宮内膜組織のPGE2α産生は，リノー/10ml）を投与した牛では対照牛と比較して発情

ル酸 と リ ノ レ ン 酸（ともに500μg/ml）添加に周期の延長する傾向が認められた。一方，リノー

よって対照と比較して有意に増加することが示さ

ル酸を投与した牛の血中Ｐ４濃度は発情周期19～れた。一方，PGF2α産生はリノール酸とリノレ

21日において，対照牛の血中Ｐ４濃度と比較してン酸（ともに500μg/ml）添加によって対照と比高くなり，リノレン酸を投与した牛の血中Ｐ４濃較して有意に減少することが示された。リノール

度は同時期の対照牛と比較して高い傾向が認めら

Progesterone concentration（ng/ml）

10

a）

8

*

**
**

6
4
2
0

7

* : p＜0.01（Control vs Linoleic acid）** : p＜0.05（Control vs Linoleic acid）
12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

5

6

7

12

b）

Progesterone concentration（ng/ml）

6

Control
Linoleic acid
Linolenic acidControl
Linoleic acid
Linolenic acid

5
4
3
2
1
0

0

1

2

3

4

Days after estrus
Fig. 4 Effects of continuous administration of linoleic acid and linolenic acidon a）progesterone production from day 12 to 21, and b）day 0 to 12 of
the estrous cycle in Japanese black cows. Linoleic acid（5㎎/10ml per day）
and linolenic acid（5㎎/10ml per day）were administrated intra-uterine
horn with ipsilateral to the corpus luteum from day 12 after estrus to
the next estrus. Progesterone concentration of the cows treated withlinoleic and linolenic acids was higher between days 19 and 21 thanthat of control cows. In contrast, there was no significantly difference
among experiment groups at day 0 to 12 of the next estrous cycle．

© The Ito Foundation

牛の卵巣・子宮機能調節に及ぼす不飽和脂肪酸の影響とその利用れた。本実験の結果は，不飽和脂肪酸であるリ
ノール酸とリノレン酸が直接牛子宮内膜のPG産生を制御することを示し，両者の子宮内投与によって発情周期の長さにも影響を与えることを示すものである。今後，さらにリノール酸やリノレン酸の効果的な投与手法を確立し，新たな技術開発への展開を進めることで，分娩後の牛の繁殖機能を効率的に制御することが期待できる。

225

文
献
１）
 Sakumoto, R., Hayashi, K. G., Fujii, S., Kanahara,
H., Hosoe, M., Furusawa, T., Kizaki, K.：Int J Mol
Sci，18，742，2017．
２）
 Sakumoto, R., Hayashi, K. G., Takahashi, T.：
Reprod Biol，14，115～121，2014．
３）
 Silvestre, F. T., Carvalho, T. S. M., Francisco, N.,
Santos, J. E. P., Staples, C. R., Jenkins, T. C.,
Thatcher, W. W.：J Dairy Sci，94，189～204，2011．
４）
 Kumar, R., Ramteke, P. W., Nath, A., Kumar
Pramod, R., Singh, S. P., Kumar Sharma, S., Kumar,
S.：ISRN Physiol, ID854572，2013．
５）
 Coyne, G. S., Kenny, D. A., Waters, S. M.：
Theriogenology, 75，500～512，2011．

© The Ito Foundation

226

肝機能と栄養状態解析を用いた牛子宮内膜炎の新たな予後判定評価法の開発
Development of a new prognostic evaluation method for bovine
endometriosis using liver function and nutritional status analysis

大

滝

忠

利

（日本大学生物資源科学部獣医学科獣医臨床繁殖学研究室）

Tadatoshi Ohtaki（Laboratory of Theriogenology, Department of Veterinary Medicine, College of Bioresource Sciences, Nihon University）

The relationship between endometriosis development, liver function and nutritional status
was analyzed, and it was examined whether blood biochemistry is useful as a prior judgmentof endometritis. In Experiment 1, endometrial and blood samples were collected by cytobrushfrom 11 cows at 2, 3, 4 and 8 weeks postpartum for profiles of PMN％，and blood biochemical
properties, Hp and LPS concentration were measured. In Experiment 2, the relationshipbetween the healing status of endometritis at the next examination, blood biochemicalparameters, Hp, and LPS concentration was investigated for 16 cows who were diagnosed withendometritis at the time of fresh check. As a result, significant negative correlation was foundbetween albumin, FFA and PMN％, and significant positive correlation between blood LPS
concentration and PMN％ at 3 weeks after parturition. Albumin and FFA had a significant
negative correlation with PMN％，blood LPS concentration had a significant positive
correlation with PMN％ at 3 weeks after parturition. Also, Albumin had a significant negative
correlation with PMN％ at 4 weeks, BCS had a significant negative correlation with PMN％ at
8 weeks after parturition, γ-GTP had a significant positive correlation with PMN％ at 8 weeks
after parturition. Hp concentration of endometritis continuation group is significantly higher
than the recovery group where the endometritis was cured at the next examination. And
γ-GTP and peripheral blood LPS in endometritis group concentrations tended to be high. It is
concluded that albumin and Hp concentration may be candidates for markers of
pathophysiology and prognosis endometritis.

１．目

る。しかし，国内の臨床現場では子宮内膜炎を簡的易的に診断する実用的な方法がなかったため，検高泌乳牛の半数で子宮炎・子宮内膜炎などの炎出されない子宮疾患牛の存在により牛群の繁殖成症性子宮疾患を発症しており ，子宮内膜炎牛の績は十分に向上されていない３）。また，子宮内膜

40％で卵胞の発育遅延や黄体遺残が見られ２），こ炎のリスク要因として，分娩前の血中遊離脂肪酸のような牛の受胎率は20％低下すると言われてい（FFA）の高値や分娩後のエネルギー不足があげ

１）© The Ito Foundation

肝機能と栄養状態解析を用いた牛子宮内膜炎の新たな予後判定評価法の開発

227

られ，子宮修復に関係するPGF２α分泌には，ルー

後90分まで30分間隔で行った。また，分娩後１，

メン内の分解性タンパクの利用率や肝機能など栄

２，
３，
４，
８週に正中尾静脈より血液20mlを採取

養代謝状態が影響を与えるとの報告があるが詳細

し，遠心分離して血清および血漿サンプルを得たは不明である。一方，多くの乳牛は妊娠末期に糖後，測定まで－20℃にて保存した。さらに，分娩を胎子や乳腺へ優先的に分配させるようインスリ

後２，
３，
４，
８週にメトリチェックによる子宮腟

ン抵抗性（IR）を持つようになる

が，IRが強部における粘液性状の記録とサイトブラシによるい場合には分娩後の生産性を低下することが指摘

子宮内膜上皮細胞を採取し，スメア標本をスライされている。このIRは肝臓の脂肪化や肝機能のドガラスに作製した。

４，５）

2.1.3

指標と相関が高いことも報告されている。

測定項目

そこで，本研究では，まず，客観的な子宮内膜

インスリン感受性試験については，インスリン炎の診断手法である子宮内膜細胞診（サイトブラ

投与後における血糖濃度の低下割合を求めた。血シ）による子宮内膜炎の診断を実施する。次に，

液サンプルについては，血液生化学性状として，ここで検出された子宮内膜炎発症と乾乳期の肝機

アルブミン，総タンパク（TP），血中尿素窒素能，特にIRならびに分娩前後の栄養状態との関（BUN），FFA，Glu，BHBA，総コレステロール連を解析し，さらには子宮内膜炎発症時の血液生（T-Cho），アスパラギン酸トランスフェラーゼ

化学性状，特にCow Side Testとして利用可能な（AST），γ-グルタミントランスペプチダーゼ

血糖およびβヒドロキシ酪酸（BHBA）値とサイ（γ-GTP）を測定した。ハプトグロビン（Hp）

トブラシによる診断結果の推移により予後判定が濃度は，中村ら７）のヘモクグロビン結合アッセイ

可能であるかを検討した。

により測定した。末梢血中LPS濃度の測定は，Petschら８）の方法に従ってProteinase K消化によ法

２．方る前処理を行った後に，エンドスペシーⓇ ES-50M

2 . 1 子宮内膜炎発症と肝機能ならびに栄養状

ELISA法（IGF-1 Human ELISA kit Quantikine，

態との関係
2.1.1

（生 化 学 工 業）を用いて 行った。IGF-１濃 度はR&D Systems Inc.，U.S.A.）により測定した。

供試動物

日本大学付属農場にて飼養されている乳牛11頭

メトリチェックスコアは，McDougallら９）の報を供試した。

告に基づき測定した。サイトブラシによって採取

2.1.2

された子宮内膜上皮細胞と多形核白血球数

サンプリング

まず，それぞれの供試牛について，分娩前３週にOhtsukaら

６）の報告を一部変更した方法でインスリン感受性試験を実施した。すなわち，インス
リン投与前に血糖濃度を簡易血糖測定器（プレシ（PMN）からPMNのパーセント（PMN％）を求めた。また，試験期間中に週１回，ボディコンディ
ションスコア（BCS）の測定を実施した。
2 . 2. 子宮内膜炎予後判定評価のための項目選

ジョンエクシード，アボットジャパン，千葉）で択

測定し，その後，体重100㎏当たり５単位の即効

2.2.1

性ヒトインスリン注射液（ヒューマリン

Ｒ注

藤沢市内２牧場で実施した定期繁殖検診のフ

Ｕ-100，日本イーライリリー，東京）を静脈内投レッシュチェック時に子宮内膜炎牛と判定された与した。採血は，正中尾静脈よりインスリン投与16頭を供試した。

Ⓡ© The Ito Foundation

供試動物

228

平成30年度2.2.2

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

サンプリングおよび測定項目

いては，明らかな差は認められなかった。また，

フレッシュチェック時および４週間後の再診時

分娩前３週におけるインスリン感受性試験においにサイトブラシによる子宮内膜上皮細胞を採取て，インスリン投与後30分の血糖減少率は，正常し，スメア標本をスライドガラスに作製した。ま群が47.2±5.4％，子宮内膜炎群は27.4±5.0％と子た，初診時に正中尾静脈より血液20mlを採取し，宮内膜炎牛で有意に低かった（p＜0.05）。健康牛

遠心分離して血清および血漿サンプルを得た後，の指標である45％を下回っていた頭数は，正常牛測定まで－20℃にて保存した。血液サンプルにつで16.7％（1/6）であったのに対し，子宮内膜炎

いては，前述の血液生化学性状，Hp，LPS濃度

牛では100％（5/5）であった。分娩前３週から分を測定した。

娩後８週にかけてのBCSの減少スコアは，正常牛

2.2.3の0.63±0.14に比べ，子宮内膜炎牛では1.05±0.15

子宮内膜炎の予後判定

定期繁殖検診のフレッシュチェック時にメトリと大きい傾向が見られた。

チェックならびにサイトブラシを実施し，メトリ

今回，供試頭数が少なかったこともあり，子宮チェックスコアが２以上またはPMN％が８％以内膜炎発症と肝機能ならびに栄養状態との明確な上を子宮内膜炎と判定した。子宮内膜炎牛につい関連性を示すことができなかった。乳牛は乳量がては，治療は実施せずに無処置で経過観察し，４多いため，他の哺乳動物に比べ，IRをさらに悪週後の次回検診時に再度，サイトブラシを実施し化させ，負のエネルギーバランスの状態を長引かた。再診時にPMN％が５％未満の場合に子宮内せることが指摘されている10，11）。また，子宮内膜膜炎が治癒したものと判定した。その結果，子宮炎群でBCSの減少が大きかったことから，負のエ内膜炎が治癒していた個体を回復群（ｎ＝９），

ネルギーバランスの程度が大きく，このことが子治癒しなかった個体を子宮内膜炎継続群（ｎ＝宮内膜での感染を容易にさせている12）ことが推察

７）として区分した。

された。
3.1.2

３．結果と考察

PMN％と血中パラメーターとの関係

上記で，子宮内膜炎牛と正常牛に明らかな差が3 . 1 子宮内膜炎発症と肝機能ならびに栄養状認められなかったため，PMN％とBCS，血液生
化学性状，Hp，LPS，IGF-１濃度との相関につ態との関係
子宮内膜炎牛と正常牛の比較

いて検討した。分娩後３週のアルブミンならびに分娩後４週におけるメトリチェックスコア２以FFAとPMN％との間に有意な負の相関（それぞ上またはPMN％が８％以上の個体を子宮内膜炎

れ，ρ＝－0.85，p＜0.05およびρ＝－0.93，p＜と判定し，子宮内膜炎群（ｎ＝５）と正常群（ｎ0.01），血中LPS濃度とPMN％との間に有意な正＝６）に区分し，各群の血液生化学性状，Hp，の相関（ρ＝0.86，p＜0.05）が認められた（Table

LPS，IGF-１濃度の推移について比較した。そ１）。また，分娩後４週におけるアルブミンとの結果，アルブミン濃度が，正常群に比べ子宮内PMN％との間に有意な負の相関（ρ＝－0.62，p

膜炎群では分娩後１～２週で低い傾向が認められ＜0.05），分娩後８週のBCSとPMN％との間に有た。Hp濃度は，有意な差は認められないものの，

意な負の相関（ρ＝－0.82，p＜0.05），γ-GTPと分娩後１週において子宮内膜炎群で高値を示す個

PMN％との間に正の相関（ρ＝0.76，ｐ＜0.05）

体が散見された（Fig.１）。それ以外の項目につが認められた。今回の試験では，安価な簡易測定

3.1.1© The Ito Foundation

肝機能と栄養状態解析を用いた牛子宮内膜炎の新たな予後判定評価法の開発
4229

Endometritis

Albumin conc.（g/dl）

Normal
3.5

c

a

3

b

d

2.5

2

1

2

3

4

Hp conc.（μg/ml）

1200
1100

Endometritis

1000

Normal

8

900
800
700
600
500
400
300
200
100
0

1

2

3

4

8

Week（W）
Fig. 1 Comparison of albumin and haptogrobin concentration between

normal and endometritis groups in dairy cows. Values are mean ± SEM.
a/b：p＝0.054．c/d：p＝0.093

器によるGluおよびBHBA濃度測定では子宮内膜を示しており，低アルブミンレベルは子宮内膜炎炎の病態を把握することはできなかった。

発症のマーカーとして利用できることが示唆されアルブミン濃度は分娩後の疾患と関連し，クており，本研究の結果と一致した。今後は，さらローズアップ牛や産褥牛の病気の危険性の予測にに子宮内膜炎の重症度とアルブミンレベルについ用いることができると報告され，低アルブミン濃ても精査する必要がある。

度の産褥牛は病気に適切に対応できず，子宮炎，乳房炎その他の疾病に罹患している可能性があ3 . 2 子宮内膜炎予後判定評価のための項目選
択る 。アルブミンは陰性反応性タンパクであり，子宮内膜炎継続群と治癒群の血液生化学性状な

その濃度は炎症により減少することが知られていらびにHp，LPS濃度をTable２に示した。初診時

る14，15），Nazhatら16）の報告によれば，アルブミンのHp濃度は回復群に比べ，子宮内膜炎継続群で濃度が2.5g/dl未満の牛７頭中５頭が高いPMN％

有意に高く（p＜0.05），γ-GTPおよび末梢血中

13）© The Ito Foundation

230

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 Spearman correlation coefficients （ρ） of the relationship between PMN%,

concentrations of biochemical parameters, LPS and Hp in postpartum dairy cows（n=11）.

Biochemical indices
BCS

Week2

Week3

Week4

Week8

ρ

p

ρ

p

ρ

p

ρ

0.47

N.S.

0.58

N.S.

-0.21

N.S.

-0.82

p
p<0.05Albumin

-0.05

N.S.

-0.85

p<0.05-0.62

p<0.05

-0.45

N.S.

TP

-0.68

N.S.

-0.36

N.S.

0.13

N.S.

-0.14

N.S.

BUN

0.41

N.S.

0.07

N.S.

0.33

N.S.

-0.05

N.S.

FFA
Glu

-0.52
0.21

N.S.
N.S.

-0.93
0.05

p<0.01
N.S.

-0.59
0.64

N.S.
N.S.

-0.10
-0.22

N.S.
N.S.

BHBA

0.05

N.S.

-0.23

N.S.

0.06

N.S.

-0.05

N.S.

T-Cho

0.14

N.S.

-0.61

N.S.

-0.50

N.S.

-0.31

N.S.

AST

0.11

N.S.

0.29

N.S.

0.12

N.S.

-0.05

N.S.

γ-GTP
IGF-1

-0.46
-0.46

N.S.
N.S.

-0.14
-0.54

N.S.
N.S.

-0.32
-0.30

N.S.
N.S.

0.76
-0.37

p<0.05
N.S.

Hp
LPS

0.25
0.14

N.S.
N.S.

0.07
0.86

N.S.
p<0.05

-0.12
0.03

N.S.
N.S.

0.00
-0.29

N.S.
N.S.

BCS: body condition scores. TP: total protein. BUN: blood urea nitrogen.
FFA: free fatty acid. Glu: glucose. BHBA: β-hydroxybutyric acid. T-cho: Total cholesterol. AST: Aspartate
aminotransferase. γ-GTP: Gamma glutamyl transpeptidase. IGF-1: insulin-like growth factor-1. Hp: haptoglobin.
LPS: lipopolysaccharide. N.S.: non significant

Table 2 Comparison of blood biochemical parameters, haptoglobin and lipopolysaccharide

according to prognosis of endometriotic cows（n=16）.

Biochemical indicesAlbumin（g/dl）
TP（g/dl）
BUN（mg/dl）
FFA（μEq/l）
T-Cho（mg/dl）
AST（U/l）γ-GTP（U/l）
Hp（μg/ml）
LPS（EU/ml）

Recovery（n=9）
3.24
6.84
10.1
372.2
164.0
73.3
21.0
173.2
0.544

±
±
±
±
±
±
±
±
±

0.10
0.14
1.3
58.4
17.2
4.8
1.7
12.9
0.054

Endometritis（n=7）
3.14
6.86
10.4
398.6
155.3
74.0
24.7
309.3
0.686

±
±
±
±
±
±
±
±
±

0.02
0.13
1.3
93.2
13.3
2.2
1.8
71.5
0.077

p
N.S.
N.S.
N.S.
N.S.
N.S.
N.S.
p=0.11p<0.05p=0.08Recovery: endometritis at fresh check, it recovered. Values are mean ± SEM. N.S.: non significant

LPS濃度は高い傾向にあった。

遊離されたLPSは子宮から静脈に移行し，門脈をHpは急性相タンパクの一つで，微生物の感染

経て肝臓に達してクッパー細胞により貪食されな ど の 刺 激 に よ り 肝 臓 で 産 生 ，血 中 に 放 出 さる。また，脂肪肝牛へLPSを静脈内投与すると血れ ，子宮炎で濃度上昇することが知られてい中LPSの消失がまったく起こらないことが報告さる18）。今回，乳房炎など子宮内膜炎以外の炎症のれており19），末梢血LPSの消失には肝機能が大き有無を確認していないが，子宮内膜炎における炎く影響していることが示唆される。今回，供試頭症の程度が高い個体ほど治癒に時間を有すること数が少なく，子宮内膜炎牛で血液生化学性状におが推察され，子宮内膜炎の病態把握のマーカーといて明確な肝機能低下を示す個体がいなかったこ

して有用であることが示唆された。

とから，子宮内膜炎と肝機能との関係については

17）

子宮内に細菌感染が生じた場合には，細菌から明らかにすることができなかった。今後，子宮内© The Ito Foundation

肝機能と栄養状態解析を用いた牛子宮内膜炎の新たな予後判定評価法の開発

膜炎の程度，肝機能を含めた個体の健康状態なども考慮にいれ，子宮内膜炎の予後判定指標としてのアルブミン，Hpの判定基準を明らかにする必
要がある。
４．要

約

子宮内膜炎発症と肝機能，栄養状態との関連を解析し，子宮内膜炎の予後判定として血液生化学
性状が有用であるかを検討した。試験１では，経産牛11頭を供試し，分娩後２，
３，
４，
８週にサイ
トブラシにてPMN％を評価するとともに，血液生化学性状，Hp，LPS濃度の検査を実施した。
試験２では，フレッシュチェック時に子宮内膜炎と診断された経産牛16頭について，次回検診時の子宮内膜炎治癒状況と血液生化学性状，Hp，LPS濃度との関係を調査した。その結果，分娩後３週のアルブミンならびにFFAとPMN％との間に有意な負の相関，血中LPS濃度とPMN％との間に有意な正の相関が認められた。また，分娩後４週におけるアルブミンとPMN％との間に有意な負の相関，分娩後８週のBCSとPMN％との間に有意な負の相関，γ-GTPとPMN％との間に正の相関が認められた。また，フレッシュチェック
時に子宮内膜炎と診断された経産牛のうち，次回検診時に子宮内膜炎が治癒していた回復群に比べ，治癒していなかった子宮内膜炎継続群のHp濃度は有意に高く，γ-GTPおよび末梢血中LPS
濃度は高い傾向にあった。以上の結果より，子宮内膜炎の病態，予後判定のマーカーとしてアルブ
ミンおよびHpが候補となることが明らかになっ
た。

231

２）
 Opsomer, G., Groehn, Y. T., Hertl, J., Coryn, M.,
Deluyker, H., Kruif, A.：Theriogenology，53，841～
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© The Ito Foundation

232

牛の肝機能障害が炎症性子宮疾患の重篤化に及ぼす分子メカニズムの解明
Effect of hepatic dysfunction on the molecular pathophysiology of uterine
inflammatory diseases in cows

真

方

文

絵

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Fumie Magata（Graduate School of Agricultural and Life Science, The University of Tokyo）

The present study aimed to investigate the effect of liver dysfunction on thepathophysiology of uterine inflammatory diseases and the accumulation of bacterial endotoxin
lipopolysaccharide（LPS）in dairy cows. In Experiment Ⅰ, cows with high concentration of
aspartate aminotransferase（AST）and γ-glutamyl transferase（GGT）in serum were defined
as liver dysfunction. And the effect of liver dysfunction on the changes of plasma LPS
concentration was determined in the peripartum dairy cows. In experiment Ⅱ, uterine
inflammation was diagnosed by the examination of the appearance of the endometrium, andthe concentration of LPS, nonesterified fatty acid（NEFA）, and β-hydroxybutyric acid
（BHBA）in each follicular fluid sample were measured. In experiment Ⅲ, the effect of
combination treatment of BHBA and LPS on the oocyte maturation was determined in vitro.
Cumulus-oocyte complexes were aspirated from ovaries of healthy Holstein cows, and BHBA
and/or LPS were supplemented to the maturation medium. In experiment Ⅰ, plasma LPS
concentration was higher（p＜0.05）in cows with liver dysfunction than that of healthy cows.
In experiment Ⅱ, follicular concentration of BHBA and NEFA were higher（p＜0.05）in cows
with uterine inflammation than that of cows without uterine inflammation. Also, follicular LPS
concentration was higher in cows with high concentration of BHBA and NEFA in follicular
fluid（p＜0.05）. In experiment Ⅲ, supplementation of BHBA or/and LPS reduced the nuclear
maturation rate of oocyte and the blastocyst formation rate after in vitro fertilization（p ＜ 0.05）.
However, there was no synergistic effect of the combination treatment of BHBA and LPS.
Results indicate that liver dysfunction is commonly accompanied by uterine inflammation andpossibly associated with LPS accumulation. BHBA（ketone body）increased in follicular fluid ofcows with uterine inflammation and might impair the developmental competence of oocytes
without interaction with LPS．

１．目

菌感染によって引き起こされる子宮炎や子宮内膜的炎といった炎症性子宮疾患が存在する。炎症性子乳牛における繁殖障害の主要因に，子宮への細宮疾患に罹患した牛では，臨床的に子宮が治癒し© The Ito Foundation

牛の肝機能障害が炎症性子宮疾患の重篤化に及ぼす分子メカニズムの解明

233ても長期にわたり受胎性が低下するが，分娩後早響を検証した。分娩後21日以内に外陰部から悪臭期に発生する子宮の炎症が繁殖機能に影響を及ぼを伴う赤褐色水様の排出液が認められ，さらにし続けるメカニズムは不明であった。我々はこれ

39.5℃以上の発熱がみられた場合を子宮炎としまで，子宮に感染した細菌が放出するエンドトキ

た。肝機能障害の診断のため，分娩前１週から分シンであるリポポリサッカライド（LPS）が牛卵

娩後６週の乳牛より週１回の採血を行い，肝機能

巣内の卵胞に移行し，卵胞の性ステロイドホルモ障害に関連する血液生化学因子として遊離脂肪酸

ン産生や卵母細胞の成熟機構を阻害することを明（NEFA），β-ヒドロキシ酪酸（BHBA），アスパ

らかにしてきた。本研究では，LPS代謝の主

ラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST），おたる器官である肝臓に着目し，炎症性子宮疾患とよびγ-グルタミントランスフェラーゼ（GGT）

高い頻度で併発する肝機能障害がLPSの代謝と作の血清中濃度を測定した。また，血漿中のLPS濃用に及ぼす影響を明らかにする。現代の高泌乳牛

度を測定し，LPSの濃度推移を肝機能と合わせてでは分娩後の泌乳開始によって急激に負のエネル

評価した。

１，
２）

ギーバランスに陥り，肝機能の低下が避けられない状態である。実際，炎症性子宮疾患に罹患した

2 . 2 試験Ⅱ：乳牛の卵胞液中LPS濃度と肝機能との関連性の解析

乳牛では脂肪肝やケトーシスといった肝機能障害

肝機能障害による卵胞へのLPS蓄積の可能性にが頻発しており，予備調査によってその併発率はついて検証した。食肉処理場においてホルスタイ

６割にのぼることが明らかとなった。これらのこン種経産牛の子宮および卵巣を採取し，子宮内膜とから，肝機能障害によってLPS代謝能力が低下の充血や腫脹，および膿の貯留が認められた個体

するとともに，肝機能障害により産生された物質を子宮の炎症ありと診断した。また，卵胞液中のがLPSと相互作用を示すことで子宮の炎症が重篤

肝機能障害関連因子（NEFAおよびBHBA）濃度化する可能性が考えられる。

とLPS濃度を測定した。

以上の背景を踏まえ，本研究では肝機能障害が炎症性子宮疾患の長期化と重篤化に及ぼす分子メ

2 . 3 試 験 Ⅲ ： 卵 母 細 胞 の 発 生 能 に 及 ぼ す
BHBAとLPSとの相互作用の解明

カニズムを明らかにすることを目的とした。炎症試験Ⅱにおいて子宮の炎症を呈した乳牛の卵胞性子宮疾患の病態指標としてLPSを取り上げ，液において濃度増加が認められたBHBAがLPSと① 肝機能障害によってLPSが代謝されずに蓄積相互作用を示す可能性についてin vitroで検証しする，もしくは，② 肝機能障害により産生された。食肉処理場において採取した健康な乳牛の卵た物質がLPSと相互的に作用する，といった２つ巣を用いて，直径２－８㎜程度の小卵胞より卵丘の要因について精査した。

細胞―卵母細胞複合体を吸引採取して体外成熟培

２．方養に供した。LPS（１ng/ml，E. coli O111：B4，

法

Sigma-Aldrich Japan Inc., Tokyo, Japan）とBHBA

2 . 1 試験Ⅰ：分娩後の乳牛の血中LPS濃度と（100μg/ml, DL-β-ヒドロキシ酪酸ナトリウム塩，Sigma-Aldrich Japan Inc., Tokyo, Japan）と肝機能との関連性の解析
肝機能障害および炎症性子宮疾患の自然症例をを複合的に作用させた培地を使用し，38.5℃，５％用いて，二つの疾病の併発率を調査するとともCO２湿度飽和気相下で23時間体外成熟培養を行っに，血中LPS濃度の推移に及ぼす肝機能障害の影た。培地に添加したLPSおよびBHBAの濃度は，© The Ito Foundation

234

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

試験Ⅱにおいて得られた卵胞液中濃度を参考に決の発生頻度を増加させる可能性が示された。

定した。培養後は卵母細胞の核染色を行い，第二ASTとGGTは肝細胞の傷害により産生される逸

減数分裂中期（ＭⅡ期）に達したものを成熟卵子脱酵素であり，その高値は肝機能障害を直接反映

として核の成熟率を算出した。また，成熟卵子はしている。肝機能障害に関連するこれらの血中因

体外受精および体外発生培養に供し，媒精後２日子において，乳牛における泌乳初期の基準値よりに卵割率を，８日に胚盤胞期胚への発生率を算出

も高値（AST＞110 U/l，GGT＞25 U/l）を示しした。

た牛を肝機能障害群（ｎ＝３），低値であった牛を健常群（ｎ＝７）として，血中LPS濃度の推移

３．結果と考察を検証した（Fig.１）。本研究に供試した肝機能障害群の牛はいずれもNEFAおよびBHBAが高値

3 . 1 試験Ⅰ：分娩後の乳牛の血中LPS濃度と（それぞれ1000μEq/Lおよび1400μＭ以上）を示

肝機能と関連性の解析子宮炎に罹患した乳牛において，血中のNEFAしており，肝機能障害によるケトーシスの発生がおよびBHBA濃度は健康牛と比較して分娩前１週示唆された。肝機能障害群では血中LPS濃度が分から分娩後４週まで高値で推移した（ p＜0.05，

娩後１週より上昇し，健常群よりも高値で推移しデータ掲載なし）。NEFAの高値はエネルギー不た（ p＜0.05）。血中からのLPSの消失は，個体の足による体脂肪動員を反映しており，肝臓への過健康状態に大きく影響される。LPSを静脈内投与

剰なNEFAの動員により脂肪肝を引き起こす。さした場合，健康な乳牛では投与後30分以内に血中らに，NEFAの過剰動員により肝機能が低下する

からLPSが消失したが，脂肪肝を起こしている乳と，ケトン体であるBHBAが生成されることでケ牛ではLPSの消失がまったく起こらず，死亡する

トーシスの原因となる。つまり，子宮炎はケトー個体がいることが報告されている３）。本研究におシスや脂肪肝といった肝機能障害に関連する疾病

いても，分娩後の乳牛において子宮炎と肝機能障

1.4
Healthy

LPS conc.（EU/ml）

1.2

Liver dysfunction

1.0
0.8
0.6
0.4

Group : p<0.01
Week : p<0.05
Group×Week : p<0.1

0.2
0.0

-1

0

1

2

3

4

5

6

Weeks after calving
Fig. 1 Changes in plasma lipopolysaccharide（LPS）concentrations in healthy

cows（open circles, n＝７）and cows with liver dysfunction（solid squares,n＝３）．All values are shown as the mean±SEM．

© The Ito Foundation

235

牛の肝機能障害が炎症性子宮疾患の重篤化に及ぼす分子メカニズムの解明

害とが併発した場合，子宮への細菌感染により産症なしの牛（ｎ＝27）と比較して有意に増加して生されたLPSが肝臓で代謝されずに血中に蓄積すいた（ p＜0.05, Fig.２）。このことから，子宮の炎る可能性が推察された。

症によって肝機能障害の発生頻度が増加し，

3 . 2 試験Ⅱ：乳牛の卵胞液中LPS濃度と肝機

BHBAおよびNEFAが卵胞に移行する可能性が示唆された。さらに，卵胞液中のBHBA濃度および能との関連性の解析

NEFA濃度が高値であった牛（それぞれｎ＝４お卵胞液中のBHBAおよびNEFA濃度は，子宮の炎

よびｎ＝18）では，低値であった牛（それぞれｎ

（a）

（b）

600

600

400

NEFA (μEq/l)

BHBA (μmol/l)

子宮の炎症が認められた牛（ｎ＝12）における

b
a

200

0

Healthy

b
400

a

200

0

Uterineinﬂammation

Healthy

Uterineinﬂammation

Fig. 2 The concentration of（a）BHBA and（b）NEFA in follicular fluid of ovarian large follicles

in cows without uterine inflammation（healthy, n＝27）and with uterine inflammation（uterine
inflammation, n＝12）．All values are shown as mean±SEM. Values with different letters（a,b）are different between groups（p＜0.05）．

（a）

（b）

25

b

15

20
LPS (EU/ml)

LPS (EU/ml)

20
a

10
5
0

25

15

b
a

10
5

low BHBA

high BHBA

0

low NEFA

high NEFA

Fig. 3 The concentration of LPS in follicular fluid of ovarian large follicles in cows with（a）Cows

with a follicular fluid BHBA concentration of less than 500μmol/l were categorized as ‘low
BHBAʼ（n＝42）and those with a concentration greater than 500μmol/l were categorized as‘high BHBAʼ（n＝４）.（b）Cows with a follicular fluid NEFA concentration of less than 350μEq/l were categorized as ‘low NEFAʼ（n＝28）and those with a concentration greater than
350μEq/l were categorized as ‘high NEFAʼ（n＝18）. All values are shown as mean±SEM.
Values with different letters（a, b）are different between groups（p＜0.05）．

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236

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）＝42およびｎ＝28）と比較して卵胞液中のLPS濃性が考えられた。

度が高値を示した（それぞれ p＜0.05および p＜

3 . 3 試験Ⅲ：卵母細胞の機能に及ぼすBHBA

0.01, Fig.３）。このことは，肝機能障害に関連しとLPSとの相互作用の解明て産生されたBHBAおよびNEFAが卵胞液中に移LPSとBHBAを単独および複合的に作用させた

行した個体では，LPS産生が増加，もしくは卵胞培地にて体外成熟培養を行った卵母細胞の核成熟へのLPS蓄積が生じる可能性を示している。食肉率をTable１に，体外受精後の卵割率と胚盤胞期処理場由来の卵巣を用いた研究において，肝機能胚への発生率をTable２に示した。コントロール

障害を呈した個体では卵胞液中のBHBA濃度が増群と比較して，LPS単独処理群とBHBA単独処理

加するとともに，内包される卵母細胞の体外受精

群のいずれにおいてもMII期に達した成熟卵子の後の胚盤胞期胚への発生率が低下することが報告

割合が低下した（ p＜0.05）。さらに，体外受精後されている４）。また我々は，LPSが卵母細胞の成の卵割率と胚盤胞期胚への発生率においても，コ

熟能および卵胞におけるステロイドホルモン産生

ン ト ロ ー ル 群 と 比 較 し て ，LPS 単 独 処 理 群 とを阻害することを報告してきた。本研究におBHBA単独処理群では低下した（ p＜0.05）。しかいても同様に，子宮の炎症と併発した肝機能障害

しながら，LPS＋BHBA複合処理群の核成熟率，により産生されたBHBAおよびNEFAが卵胞に到

卵割率，および胚盤胞期胚への発生率のいずれに達し，LPSと相互的に，もしくは独立して卵母細

おいてもLPSとBHBAの単独処理群と同レベルで胞および卵胞構成細胞の機能に影響を及ぼす可能あった。以上の結果から，LPSとBHBAはどちら

１，２）

Table 1 Effect of lipopolysaccharide （LPS） or/and β-Hydroxybutyric acid （BHBA）

treatment on nuclear maturation of bovine oocytes
Treatment

LPS（１ng/ml）

BHBA（100μg/ml）

No. of oocytes

Replicates

MII oocytes（％）

－

－

90

3

ａ
64（71.1）

＋

－

92

3

ｂ
46（50.0）

－

＋

82

3

ｂ
40（48.8）

＋

＋

73

3

ｂ
35（47.9）

Values with different superscripts within the same column are significantly different（a，b：p＜0.01）．

Table 2 Effect of lipopolysaccharide（LPS）or/and β-Hydroxybutyric acid（BHBA）treatment

on embryo development
Treatment

LPS（１ng/ml）

BHBA（100μg/ml）

No. of oocytes

Replicates

－

－

211

3

ａ
146（69.2）

61（28.9）ｘ

＋

－

208

3

ｂ
113（54.3）

38（18.3）ｙ

－

＋

197

3

ｂ
112（56.9）39（19.8）ｙ3

ｂ117（56.8）

37（18.0）ｙ

＋

＋

206

Cleaved（％） Blastocyst（％）

Values with different superscripts within the same column are significantly different（a，b：p＜0.01,
x，y：p＜0.05）．

© The Ito Foundation

牛の肝機能障害が炎症性子宮疾患の重篤化に及ぼす分子メカニズムの解明

237

も単独で卵母細胞の成熟および胚発生を阻害する

し の 個 体 と 比 較 し て 卵 胞 液 中 の BHBA お よ びが，相互作用は示さないことが明らかとなった。

NEFA濃度が有意に増加していた。また，卵胞液

つまり，LPSとBHBAはそれぞれ異なる機序に中のBHBA濃度およびNEFA濃度が高値であった

よって卵母細胞に作用し，その核成熟を阻害する

牛では，低値であった牛と比較して卵胞液中のことでその後の胚発生能を低下させる可能性が示

LPS濃度が高値を示していた。このことから，子された。LPSは，細胞膜上に存在するToll様受容宮の炎症と併発した肝機能障害により産生された体（TLR）４もしくはTLR2により認識されるこ

BHBAおよびNEFAが卵胞に到達するとともに，とで卵母細胞に作用することが推察されてい卵胞へのLPS蓄積に影響を及ぼす可能性が考えらる 。一方で，BHBAが卵母細胞の成熟と胚発生れた。さらに，試験Ⅲでは，BHBAがLPSと相互に影響を及ぼすメカニズムは明らかになっていな作用を示す可能性についてin vitroで検証するたい。BHBAはTLR4の発現には影響を及ぼさない

め，LPSとBHBAを単独および複合的に作用させ５）ことが報告されており ，LPSによる炎症反応のた培地を用いて牛未成熟卵母細胞の体外成熟培養

惹起とは別の経路によって細胞に作用する可能性を行った。その結果，LPS単独処理群，BHBA単が推察される。BHBAによる卵母細胞の成熟阻害

独処理群，およびLPS＋BHBA複合処理群のいずの発生メカニズムについては今後さらなる検証がれにおいても核成熟率および体外受精後の胚盤胞必要である。

期胚到達率が低下したが，LPSとBHBAの複合処

２）

４．要

理による相互作用は認められなかった。以上の結約

果から，乳牛の炎症性子宮疾患においては肝機能本研究では，肝機能障害が炎症性子宮疾患の長障害が高頻度で併発し，血中および卵胞液中への期化と重篤化に及ぼすメカニズムを明らかにする

LPS蓄積に関与する可能性が推察された。さらに，ことを目的とした。試験Ⅰでは，乳牛における肝子宮の炎症と併発した肝機能障害により産生され機能障害および炎症性子宮疾患の自然症例を用いたBHBAおよびNEFAは卵胞液に到達し，LPSとて，血中LPS濃度の推移に及ぼす肝機能障害の影の相互作用は示さないものの，卵母細胞の性状に響を検証した。その結果，ASTとGGTが高値を影響を及ぼすことが考えられた。

示した肝機能障害群では血中LPS濃度が健常群よりも有意に高値で推移したことから，子宮炎と肝機能障害とが併発した場合，子宮への細菌感染により産生されたLPSが肝臓で代謝されずに血中に蓄積する可能性が推察された。試験Ⅱでは，食肉処理場で採取した乳牛の子宮および卵巣を用い，子宮の炎症と卵胞液中のBHBAとNEFA濃度，およびLPS濃度との関連性を検証した。その結果，子宮の炎症が認められた個体では，子宮の炎症な文
献１） Magata, F., Horiuchi, M., Echizenya, R., Miura, R.,
Chiba, S., Matsui, M., Miyamoto, A., Kobayashi, Y.,
Shimizu, T.：Anim Reprod Sci，144，６～13，2014.
２）
 Magata, F., Shimizu, T.：Reprod Toxicol．71，１～
７，2017．
３）
 Andersen, P. H., Jarløv, N., Hesselholt, M., Baek,
L.：J Vet Med Ser A，43，93～101，1996．
４）
 Sarentonglaga, B., Ogata, K., Taguchi, Y., Kato, Y.,
Nagao, Y.：J Reprod Dev，59，168～173，2013．
５）
 Hillreiner, M., Flinspach, C., Pfaffl, M. W., Kliem,
H.：PLos ONE, 11, e0157774，2016．

© The Ito Foundation

238

牛における卵管上皮細胞を用いた新規精子受精能
獲得能評価法の開発および性選別精子の受精能
獲得能機能評価（Ⅱ）
Novel method for evaluating capacitation ability of bovine sperm using
oviductal epithelial cells and evaluation of sex sorted sperm function（Ⅱ）

栁

川

洋二郎・菅

野

智

裕＊

（北海道大学大学院獣医学院，＊社団法人ジェネティクス北海道）

Yojiro Yanagawa and Chihiro Kanno＊（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University, ＊Genetics Hokkaido Association）

Recently sex-sorted sperm have widely used in the dairy and beef industry. However, theconception rate of them is usually low compare to those of conventional sperm. It is said that
one of the reasons for low fertility is due to short longevity inside the oviduct, but there are no
methods to prove the hypothesis. Requirement for fertile sperm is binding ability to oviductal
epithelial cells, capacitation ability and longevity to keep those abilities. The purpose of present
study is to establish novel method for evaluating ability of sperm binding to oviductal epithelial
cell from molecular aspects and for evaluating hyper-activated motility expressed after
capacitation, moreover, evaluating sex-sorted sperm by established methods．
After labelling sperm with FITC labelled Lewis-a, the factor binding to sperm thoseexhibits on oviductal epithelial cell, it was possible to evaluate objectively by flow-cytometry.
However, it is not possible to evaluate binding ability of sex-sorted sperm, may be due tofluorescent, Hoechst, used during sorting. On the other hand, it was able to know the ratio of
sperm in hyper-activation by cluster analysis using motility data examined by computerassisted sperm analyzer. In sex-sorted sperms, there were high rate of hyper-activated spermcompared to conventional sperm, and this seems one of the reason causing low fertility in sexsorted sperm．

１．目

る現在において性選別精液の受胎率（38－44％）

的は通常の凍結精液（55－60％）に比べさらに低我が国の乳牛および肉牛はそのほとんどが凍結

く１），性選別精液による人工授精受胎率の向上が精液を用いた人工授精により生産されており，近強く望まれている。販売されている性選別精液の年ではおよそ90％の確率で望む性別の産子を得る

機能評価としては，通常精液の評価と同様な精子ことができる性選別精液の利用が拡大している。

生存性および運動性が検査されており，性選別精

しかし，人工授精受胎率の低下が問題視されてい液についてもこれらの項目に問題がないとされて© The Ito Foundation

牛における卵管上皮細胞を用いた新規精子受精能獲得能評価法の開発および性選別精子の受精能獲得能機能評価（Ⅱ）

239いる。しかし，実際は性選別精液を使用した人工管上皮線毛から離脱するには精子表面タンパクの授精については世界的に受胎率の低下が認めら変質と受精能獲得時にみられるハイパーアクチ

れ，これは卵管内での生存時間が短いためである

ベーションという活発な運動が必要とされていと推察されているが，既存の検査では精子の生存る５）。これまでに精子とLewis-aに対する結合能時間を評価する方法は確立されていない。

について卵管上皮を介して評価した報告はある

精子は精液の凍結融解の過程で傷害を受け，生が，直接的また客観的に評価した報告はなく，評存率および運動性の低下の他にも細胞膜および細価法も確立していない。また精子のハイパーアク

胞小器官の形態的・機能的変化を起こす 。さらチベーションについても客観的かつ定量的な評価に性選別精子については，精子を蛍光染色したの方法は報告されていない。

２）

ち性染色体サイズの違いによるDNA量の差異をそこで本研究では精子の雌生殖道内における卵フローサイトメーターにより選別する過程におい管上皮結合能およびハイパーアクチベーション運ても傷害を受けていると考えられる。性選別精液動に関わる評価方法の開発と性選別精子への応用

を凍結せず，人工授精に用いる場合，精液作製後を目的とした。

１日までの人工授精では受胎率が通常精液の場合とほぼ同程度であることが報告されている３）。そ

２．方法のため，性選別精液が凍結過程において受ける傷

2.1

精子の卵管上皮細胞結合能評価

害は通常精液とは異なると考えられる。子宮内に精子の卵管上皮結合能としてはLewis-a-PAA-

注入された精子は，卵管峡部に到達し，卵管上皮

FITCに対する結合能として評価した。精子に対細胞の線毛に付着して卵子が排卵・輸送されるまするLewis-a-PAA-FITCの標識はSuarez et al.４）

で待機している。この間，卵子侵入に関わる機能に従った。凍結精液を37℃の温湯中で融解させ，（受精能）を獲得し，卵子が卵管峡部に到達する

５mlのTyrode albumin lactate pyruvate（TALP）

まで生存性を保持していれば受精することができ液で希釈し，400×ｇで５分間遠心した。上清をる。そのため，良質精子の条件として，卵管峡部吸引したのち，精子濃度をTALP液で12×10６/ml

における上皮細胞への結合能および受精能獲得能に調整した。95μlの精子浮遊液に５μlのLewis-が求められる。これまでに卵管峡部の上皮細胞を

a-PAA-FITC（1.0㎎/ml in PBS）を加え，遮光，培養し，精子と上皮細胞との結合を評価しようと室温下で30分間染色した。５mlのTALP液を加試みたところ，卵管峡部上皮細胞の培養が困難か

え，200×ｇ，５分で遠心し，上清を500μl残し

つ検査実施に十分量の上皮細胞を採取するには国て除去した。PIを４μl入れ，５分間遮光，室温内のと畜場において採取される卵管の数では不十

下で静置した。蛍光顕微鏡を用いて精子の染色性分であることが分かった。そこで上皮細胞と精子を確認した後，37℃に加温した400μlのPBSおよの結合やその後の受精能獲得に関わる分子に着目

び100μlの染色後精子を混和し，フローサイトメ

した評価法の開発への転換が適切であると考えらトリーによる精子染色性の評価を実施した。判定れた。

に は FITC （Lewis-a-PAA-FITC） お よ び

卵管峡部上皮細胞上の線毛側の結合に関わる因PerCP-Cy 5.5（PI）の２次元プロットを作成し，子としてはLewis-aという三糖類が精子との結合

10,000個の精子について評価を実施した。PI陰性

能が高いことが分かっている 。さらに精子が卵を生存精子，PI陽性を死滅精子と判定した。

４）© The Ito Foundation

240
2.2

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ハイパーアクチベーション運動評価

用いて精子運動性を評価した。測定は１サンプル

３頭の種雄牛由来の凍結精液を実験に用いた。

あたり６視野以上，かつ100精子以上とした。精凍結精液を37℃の温湯中で融解させ，精子浮遊液

子運動性の評価は，培養前，培養２時間および４200μlに対し１μＭのカルシウムイオノフォア

時間後に実施した。測定により得られた性選別精（Ａ23187）を添加した。精子浮遊液精子運動性解液および通常精液中の，個々の運動精子データを析用チャンバーに入れ，精子運動能自動解析装置

クラスターに分類した。判別分析は2.2で得られ（CASA）により精子運動性を測定した。測定項

たクラスター解析の結果（各クラスターにおける

目 は 精 子 運 動 率 ，直 線 速 度（VSL），曲 線 速 度

VSL，VCL，VAP，ALHおよびBCFの平均値お（VCL），平均速度（VAP），頭部振幅（ALH），

よび標準偏差）をリファレンスデータとして用

頭部振動数（BCF）および直進性（LIN；VSL/い，Igor Pro（Wavemetrics社）を用いて作製しVCL）とした。測定は１サンプルあたり３視野たプログラムにより実施した。

以上かつ，200精子以上とした。CASAにより測定した精子個々の運動性データを，クラスター解

３．結果

析によるグループ（クラスター）分類に供した。

3.1

44,570個の運動精子データを，Ward法による樹

蛍 光 顕 微 鏡 に よ る 観 察 に お い て は Lewis-a-

形図作成に供した。作成された樹形図の形状から

PAA-FITCによってまったく標識されない精子，

クラスター数を決定した後，k-means法により，

尾部のみ標識されている精子，全体を標識されて個々の精子データを決定したクラスター数に分類

いる精子などさまざまな状態の精子が観察されたした。クラスター解析のパラメータには，運動性（Fig.１）。フローサイトメトリーによる評価では項目のうち独立項目であるVSL，VCL，VAP，精子全体の21.9％，生存精子中では3.7％の精子がALHおよびBCFの５項目を用いた。

Lewis-a-PAA-FITCに結合していた。

2 . 3 性選別精液における卵管上皮結合能およ

ハイパーアクチベーション運動評価

クラスター解析の結果，すべての精子は６つのびハイパーアクチベーション運動
2.3.1

3.2

精子の卵管上皮細胞結合能評価

クラスターに分類することができた。このうち

卵管上皮細胞結合能

１頭のホルスタイン種由来の性選別精液を実験

ALHが大きく，LINが小さい軌道を示すクラスに供した。方法は2.1に従ったが，ストロー１本

ター３がハイパーアクチベーション運動を呈する

あたりの精子数が少ないことから，精子のロスを精子であると考えられた。これらの精子の軌跡は防ぐためLewis-aとの反応後の洗浄は行わず，PI

円形であり，前進性がなかった（Fig.２）。一方，による染色を行った。

VSLおよびLINが高いクラスター１精子は活発な

2.3.2

ハイパーアクチベーション運動の比較

全身運動を示す精子であると考えられた。

３頭の種雄牛由来の性選別精液および通常凍結

3 . 3 性選別精子における卵管上皮細胞結合能

精液を実験に供した。凍結精液を融解後，精子濃およびハイパーアクチベーション運動

度を10×10 /mlに調整した。精子浮遊液を用い性 選 別 精 子 に お い て 全 精 子 の う ち Lewis-a-て体外受精用の50μlのドロップを作製し，パラ

PAA-FITCと結合していると判定された精子数

フィンオイルをかぶせて５％CO２，5％Ｏ２，90％は86.1％であり，生存精子中（全体の87.9％）に

Ｎ２ ，39℃の条件化で培養を行った後，CASAをあっては78.5％であった。

６© The Ito Foundation

牛における卵管上皮細胞を用いた新規精子受精能獲得能評価法の開発および性選別精子の受精能獲得能機能評価（Ⅱ）

241

Fig. 1 Bright field（A）and FITC fluorescene（B）images of sperm observed after labelling with Lewis-a-PAA-FITC.

Arrow indicates spermatozoa not bound to Lewis-a and arrow head indicates that bound to Lewis-a．

ション運動を評価する方法の開発を行った。卵管上皮細胞への結合能は精子のLewis-aへの結合として評価した。通常精液にLewis-aを標識した結果，さまざまな程度で結合する精子が観察されたため，一定の評価が可能であると考えられた。通常精液は生存かつLewis-aに結合する精子の割合
が3.7％であり，１本のストロー中において受精に関わると考えられる精子の割合は実はとても少数であることが推察された。一方，性選別精子における生存かつLewis-aに結合する精子の割合は78.5％と高い値を示した。しかし，性選別精子に
Fig. 2 Typical motility pattern of hyper-activated sperm.

おいて生存精子は全体の87.9％であり，一般的な凍結融解による障害および性選別精液の運動性を精子の運動性については，ハイパーアクチベー

考慮すると異常値であると考えられた。性選別精ション運動を示すクラスター３の割合は融解直後

液は生産過程においてDNAと結合するHoechstににおいては性選別精液（18.8％）の方が，通常精より染色されるが，Hoechstの濃度が高く，また液（8.6％）と比較して高かった。しかしクラス

一度染色されたらHoechstを排除することはでき

ター３精子の割合は培養により減少し，培養２おないため，Hoechstが結合したまま評価を実施しよび４時間後では精液による差はなかった。一方ていることとなる。Hoechstの濃度が高い場合，クラスター１の精子割合はどちらの群においてもフ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー で は FITC 判 定 時 に融解直後から培養２時間目まで変化がなかった。

Hoechst 発 色 が 漏 れ 込 む こ と が あ る 。今 後 は

４．考Hoechstの影響を考慮して染色法の検討が必要で察ある。

本研究では精子の受精能を評価するため，卵管一方，ハイパーアクチベーション運動の評価に上皮細胞への結合能およびハイパーアクチベー

ついてもハイパーアクチベーション運動の特徴で© The Ito Foundation

242

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ある頭部振幅が大きく円運動を示す精子のクラス

究では精子の卵管上皮結合能を分子学的な側面かターの存在が明らかとなった。また，判別分析にら評価する方法および受精能獲得時に呈するハイより各精子の運動性に基づいて各クラスターへのパーアクチベーション運動に関わる評価方法の新分類が可能であることから，ハイパーアクチベー

規開発と性選別精子への応用を目的とした。卵管ション運動を呈する精子の定量的な評価が可能と上皮に存在する精子と結合する因子であるなったと考えられた。ハイパーアクチベーション

Lewis-aと精子との結合について調べた結果，フ運動を示す精子は時間経過により減少することか

ローサイトメトリー法により評価が可能であるとら，直進運動を示す精子と比較して寿命が短いこ考えられたが，性選別精子の場合は生産過程に使とが推察された。さらに性選別精液ではハイパー用されているHoechstの影響により評価が困難でアクチベーション運動を示す精子の割合が通常精あった。一方，ハイパーアクチベーション運動の液中のよりも高かったことから，性選別の過程で評価についてはCASAによる精子運動性解析後の本来であれば卵管内で受精能獲得後に示すべきハクラスター解析によりその割合を算出することがイパーアクチベーション運動を示すような障害を可能となった。性選別精液においては融解後のハ受けていること，またこれらの精子の寿命が短い

イパーアクチベーション運動を示す精子の割合がことから性選別精液の受胎率が低い要因の一つで通常精液と比べ高いことが受胎率が低い要因の一あることが推察された。

つであると考えられた。

５．要

約

性選別精液の使用が拡大しているが通常精液と比較して受胎率が低いことが問題となっており，
これは卵管内での生存時間が短いためであると推察されているが，既存の検査では精子の生存時間を評価する方法は確立されていない。良質精子の条件として，卵管狭部における上皮細胞への結合能および受精能獲得能が求められる。そこで本研

文
献１）
 DeJarnette, J. M., Leach, M. A., Nebel, R. L.,
Marshall, C. E., McCleary, C. R., Moreno, J. F.：J
Dairy Sci，94，3477～3483，2011．
２）
 Watson, P. F.：Anim Reprod Sci，60，481～492，
2000．
３） Xu, Z. Z.：J Dairy Sci，97，7298～7304，2014．
４）
 Suarez, S. S., Revah, I., Lo, M., Kölle, S.：Biol
Reprod，59，39～44，1998．
５）
 Suarez, S. S.：Cell Tissue Res，363，185～194，
2016．

© The Ito Foundation

243

豚における繁殖性の向上に向けたアミノ酸の効果に関する研究
Research on effects of amino acid for improving reproductive performancein sow

北原

豪（宮崎大学農学部獣医学科産業動物臨床繁殖学研究室）

Go Kitahara（Theriogenology, Department of Veterinary Sciences, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

In improvement of swine production, the increase of litter size is needed. There aredivisions of opinion on the effects of L-arginine（Arg）for reproductive performance in sows.
Moreover there is no evidence in the effects of uterine blood flow by Arg until now. In thisstudy, we investigated the effects of Arg in the changes of uterine blood flow and reproductive
performances in pregnancy sow.
76 sows were investigated from the first artificial insemination（AI）after parturition（defined as D1）, and divided Control group（not given Arg, n=41）and D0-28 group（given
Arg, n=35）. Plasma Arg, Nitric Oxide（NO）, and progesterone（P ４）before and after given
Arg or concentrated diet（D56）at D0, 14, 28, 35, 42 and 56 were measured. And also thenumbers of corpus luteum（CL）at D14, and the uterine blood flow before given Arg, wereindividually measured. Finally the litter size was recorded, and then the efficiency of newborn（litter size/the numbers of CL）was calculated. In the result, plasma Arg concentrations in D028 group were higher than in Control group throughout the study（p＜0.05）, whereas there
were no significant differences in the numbers of CL, plasma P ４ and NO levels. The volumesof uterine blood flow at D28, 35 and 56 in D0-28 group were lager compared with Control
group（p＜0.05）. The number of normal neonatal piglets and the efficiency of new born（Litter
size/the numbers of CL×100）in D0-28 group were higher than Control group（p＜0.05）.
In conclusion, the present study has demonstrated that the L-arginine given sow frombefore AI to 29 days after AI improved uterine blood flow and reproductive performances.

１．目

豚の産子数を決める要因には，胚死滅率および的胎子死率があり，妊娠30日頃までに発生する早期

国際競争力の求められる近年の日本の養豚業に胚死滅が特に大きな割合を占めている２）。また，

おいて，生産性の向上は重要な課題であり，特に産子数が15頭を超える多産系豚３）において，妊娠

離乳頭数に直接影響する種雌豚の繁殖成績の向上

早期の胚死滅に加え，妊娠中期以降には子宮の物が生産性向上に向けた最重要課題である 。

理的な体積，胎盤の表面積，栄養供給およびガス

１）© The Ito Foundation

244

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

交換能力が不足し，胎子死を引き起こす４，５）。こて20ｇのArg（L-アルギニン「あすか」，あすかのため，胎子数の増加に対応した適切な栄養など

アニマルヘルス，東京）を与えるＤ０-28群（ｎの供給が必要である６）。

＝35，産次＝3.8±0.9）の２群に分けた（Fig.１）。

豚において準必須アミノ酸であるL-アルギニ

血液は，供試豚から無作為に抽出した一部の豚ン（Arg）は，一酸化窒素（NO），ポリアミン，において，Ｄ０のArg給与前，Arg給与２時間後，成長ホルモン，インスリンの合成促進や，哺乳類

Ｄ14のArg給与２時間後，Ｄ28のArg給与前，における尿素回路の中間体としてのアンモニア

Arg給与１時間後，Arg給与２時間後，Ｄ56の（NH３）代謝促進といった多様な作用を有してい

14：30の配合飼料給与前に，鼻保定下で頸静脈よる。豚への人工授精（AI）前後から妊娠早期りヘパリン加血として採取した。Arg（配合飼料）

におけるArgの経口給与が繁殖成績に与える影響

給与前の採血は，Arg給与（14：30）前５から６

は議論が分かれており，また同時期におけるArg

時間に行った。採取した血液は氷上にて輸送し，の経口給与が子宮血流動態に与える影響は報告さ遠心分離機にて４℃，1,400ｇ，15分間にて遠心し，れていない。

血漿サンプルを測定まで－30℃にて保存した。

７，８）以上より，AI前後から妊娠早期の豚へのArg給

血漿中Arg濃度は高速液体クロマトグラフィー

与が，豚の妊娠期間中における子宮動脈血流動態法，血漿中NO，プロジェステロン（P４），エス

および繁殖成績や産子に与える影響を明らかにすトラジオール-17β（E２），インスリン様成長因ることを目的に研究を行った。

子 - １（IGF-1）濃 度 は ELISA ，血 漿 中 NH ３ ，

２．方
2.1

BUNおよびグルコース（Glu）濃度はエンドポイ法

ント法で測定した。なお，各物質の測定日および供試動物

頭数は，Fig.１に示す。

宮崎県内の一養豚場にて飼養されているランド

黄体数と子宮動脈血流動態の測定は，10MHz

レース種×大ヨークシャー種の一代交雑種76頭をのリニア型探触子（Ｉ739-RS，GEヘルスケア・用いた。産次は3.8±0.8産（平均±SD）で，23.4

ジ ャ パ ン ，東 京）を 装 着 し た 超 音 波 診 断 装 置±2.9日の授乳期間を経て正常に発情回帰した。

（LOGIQ Book，GEヘルスケア・ジャパン，東京）

供試豚はストールにて単頭飼育した。また，自由を用いて経直腸にて検査した。黄体数は，Ｄ14±

飲水とし，配合飼料を７：30と14：30の１日２回２に測定し（対照群：ｎ＝19，Ｄ０-28群：ｎ＝

給与し，１回あたりの給与量は，離乳からAIま17），Ｂモードで左右卵巣の動画を録画し，そのでは1.5kg，AI後は1.0kgであった。離乳後，発情後再生した画像より黄体数を数えた。左右の子宮観察は８：30と16：30の１日２回実施し，初めて動脈血流動態の測定は，対照群（ｎ＝17），Ｄ０-28

発情徴候（不動反応）がみられた12時間後に初回群（ｎ＝15）について，Ｄ０，Ｄ14，Ｄ28，Ｄ35，のAIを行い，発情徴候が消失するまで12時間おＤ42およびＤ56のArg（配合飼料）給与（14：

きにAIを行った。

30）前３時間と５時間，Ｄ28のArg給与後30分に2.2

試験デザイン

検査した。測定した子宮動脈の位置はFig.２に示

離乳後初回AI実施日をＤ１とし，配合飼料のす。子宮動脈の拡張期における血管径（cm）をみを給与する対照群（ｎ＝41，産次＝3.6±0.7），

計測し，子宮動脈の縦断面を描出し，パルスドプ

14：30の配合飼料給与時に，Ｄ０からＤ28においラ法（４MHz）にて拍動係数（PI），血管抵抗指© The Ito Foundation

245

豚における繁殖性の向上に向けたアミノ酸の効果に関する研究
Control（n=41）
D0-28group（n=35）
AI

Pregnancy diagnose

Parturition
～
～

0 D1

25

14±2

28

35

42

56

→Days of pregnancy:Only concentrated diet
Timing of Bleed；
Mesureditems: Concentrated diet + Arg: before Arg or CD＊（56）：1hr after Arg：2hr after Arg

Control D0-28 before Arg 2 hr after Arg 2 hr after Arg before Arg 1 hr after Arg 2 hr after Arg before CD＊
at D56
(n)
(n)
at D0
at D0
at D14at D28at D28at D28

Arg

10

10

NO

16

14

P4

10

14

E2

10

9

〇

IGF-1

9

9

〇

〇

NH3, BUN,
Glu

19

19

〇

〇

〇

〇

〇

〇
〇

〇

〇

〇

〇

〇
〇

〇

〇

〇

〇

〇

〇

〇

〇

〇

〇

＊

CD：Concentrated dietFig. 1 T
 he experimental schedule and the timing for measuring blood chemicals

るArg給与前）を算出した。
Internal iliac artery
Internal pudendal artery

External iliac artery
Uterineovary

AI後25日の妊娠診断ではすべての供試豚で妊娠を確認したが，その後流産した対照群の１頭をRectal除く豚について，産子状況を記録した。娩出したProbe

すべての産子を総産子数とし，生存，死亡に分けた。さらに生存産子は，正常，虚弱（＜１kg），

Uterine artery

奇形に分け，産子率（％）は，（産子率）＝（総産子数）÷（黄体数）×100の式で算出した。
対照群（ｎ=８）とＤ０-28群（ｎ=７）の産子は，分娩時（対照群：ｎ=116，Ｄ０-28群：ｎ＝104）および離乳前日（対照群：ｎ=47，Ｄ０-28
群：ｎ=62）に体重を測定した。分娩時および離Fig. 2 T he position for measuring uterine blood flow bytransrectal ultrasonography

乳前日の両日に体重が測定できた子豚（対照群：
ｎ＝47，Ｄ０-28群：ｎ＝62）は２回の測定値の差から体重増加量を算出した。

数（RI），子宮動脈血流量（ml/分）を算出した。

2.3

また，各項目においてＤ28におけるArg給与前後

統計処理には統計解析ソフトR studio（Versionの変化率（Ｄ28におけるArg給与後/Ｄ28におけ

1.1.447，http://cran.us.r-project.org）を用いた。

© The Ito Foundation

統計解析

246

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

正規性の検定にはシャピロ・ウィルク検定，分散がみられなかった。妊娠１日目から30日目，妊娠の検定にはＦ検定を用いた。血漿中Arg，NO，P４，

14日目から25日目もしくは28日目までのArg給与

E２，IGF-1，NH３，BUN，Glu濃度および血流動が繁殖成績を向上させた報告６，９～11）がある一方，態について，２群間の比較にはウィルコクソンの妊娠０日目から25日目の基礎飼料に対して0.8％

順位和検定を用いた。また，総産子数，生存産子のArg経口給与によって黄体数，胎子の総数，母数，正常産子数について，クラスカル・ウォリス

体血漿中P４ 濃度が低下した報告 12）がある。この検定とウィルコクソンの順位和検定を用い，ホル

報告ではArgの給与回数を１日２回としていた

ムの方法を用いて補正を加えた。死亡産子数，虚が，本試験では１日１回としており，卵胞発育や弱子数，奇形子数にはチューキー・クレイマー検

排卵を阻害するとされる血中NO濃度が，過去の定を用いた。子豚の体重はＴ検定を用いた。有意報告と比べ，高濃度に維持される時間が異なって水準はｐ＜0.05とし，すべての数値は平均値±標いたため，結果が違ったかもしれない。よって，準偏差（SD）で記載した。

妊娠早期の豚へArgをAI前後から給与する場合，NOによる副作用を考慮し，十分な給与間隔を設３．結果と考察けることが重要である。

血漿中Arg濃度は，Ｄ０のArg給与後にＤ０-28

血漿中Ｅ２ 濃度について，Ｄ０のArg給与前で群が対照群より高い傾向にあった（ｐ＜0.1）。ＤはＤ０-28群が対照群より高い傾向にあった（ｐ14とＤ28のArg給与後にＤ０-28群が対照群より＜0.1）。血漿中IGF-1，NH ３ ，Glu，BUN濃度は高かった（ｐ＜0.05）（Fig.３）。

有意な差がみられなかった。

血漿中NO濃度は，Ｄ28のArg給与前後での変子宮動脈血管径について，Ｄ28ではＤ０-28群

化率は，Ｄ０-28群が対照群より大きい傾向にが対照群より大きかった（ｐ＝0.07）。Ｄ35ではあった（ｐ＜0.1）が，血漿中P４ 濃度は有意な差

Ｄ０-28群が対照群より大きかった（ｐ＜0.05）。

（μM）

Plasma Arginine concentration

600

＊＊

Control

＊

500

：SD

D0-28

400
300
200
100
0
beforeD0

2hr after

beforeD28

2hr after

D56
before＊：p＜0.05, ＊＊: p＜0.01
Fig. 3 The changes in plasma Arginine concentrations before and after given arginine or concentrated diet（D56）© The Ito Foundation

247

豚における繁殖性の向上に向けたアミノ酸の効果に関する研究

The volume of uterine blood ﬂow（ml/min）
1600
1400

＊

：SD

＊

Control

1200

D0-28

1000

＊

800
600
400
200
0

D0

D28

D35

D42

D56
＊: p＜0.05

Fig. 4 The volume of uterine blood flow during experimental period

子宮動脈血流量について，Ｄ28，Ｄ35，Ｄ56ではから胎盤の成長や血管新生に必要不可欠であＤ ０ -28 群 が 対 照 群 よ り 多 か っ た（ｐ＜0.05）

る13，15）。Arg給与終了後も子宮動脈血流量が増加（Fig.４）。Ｄ28におけるArg給与前後の変化率にしていたことは，Arg給与期間中のポリアミンがついて，子宮動脈PI，RIではＤ０-28群が対照群増加することで胎盤における血管新生が促進さ

よ り も 低 く（ｐ ＜ 0.01），子 宮 動 脈 血 流 量 で はれ，妊娠子宮全体の血流量が増加したことが考え

Ｄ０-28群が対照群よりも高かった（ｐ＜0.01）。

られる。

正常な子宮内膜において，非妊娠子宮より妊娠子

正常産子数および産子率について，Ｄ０-28群宮では，著しく小動脈および毛細血管網が増加すが対照群より増加した（ｐ＜0.05）（Table１）。分る 13）。妊娠子宮のNOはこの小動脈および毛細血娩した子豚の体重について，有意な差はみられな管網を拡張させる

ことで母体と受胎産物間の物かった。産子率の増加について，妊娠早期におけ

質交換を促進させている。Ｄ28において，Arg給るArgの給与により胚や胎子の生存率が増加した

与によりNOが増加し，子宮内膜の豊富な小動脈

報告６，９～11）と一致していた。豚において産子数がおよび毛細血管網が拡張した結果，子宮の血液要増加すると，子宮容量が不足９，10）し，子豚１頭あ求量が増加し，Arg給与前より後で子宮動脈血流たりの出生時体重との間に負の相関関係を生じた量が増加したことが示唆された。さらにArg給与報告16，17）がある。しかし，本試験では，Ｄ０から

期間終了後のＤ35における子宮動脈血管径および29日間にわたりArgを給与した結果，産子率およ

血流量，Ｄ56における子宮動脈血流量は，Ｄ０-28

び正常産子数は増加したものの，虚弱産子数およ群が対照群よりも高く，Arg給与が子宮動脈に及び出生時体重に負の影響がみられなかった。これ

ぼす影響が，一過性のものではなく，少なくともは，血管拡張および血管新生作用によって，妊娠

本研究で調査を行った妊娠中期まで及ぶことが明期間中に子宮容量が不足せず，胎子体重が著しくらかとなった。Argによってポリアミンの産生が増加する妊娠後期18）で，胎子への栄養供給等が十促進され，ポリアミンは血管新生作用を有すこと分に行われたからかもしれない。また，授乳期間

14）© The Ito Foundation

248

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 Reproductive performances

Numbers of CL

Control（n=40）

D0-28（n=35）

27.4±4.7（n=20）

26.0±5.0（n=17）

Litter size

16.3±3.4

17.6±2.4

The efficiency of newborn（%）（Litter size / the number of CLs×100）

60.0±14.0＊（n=20）

69.3±11.4＊（n=17）

Living piglets（heads / a parturition）

14.7±3.3†

16.1±2.1†

Normal neonatal piglets（heads / a parturition）

12.9±3.0＊＊

14.8±2.4＊＊

1.7±1.8

1.3±1.7

1.7±2.7

1.4±1.7

Weak neonatal piglets（heads / a parturition）
Died neonatal piglets（heads / a parturition）†：p＜0.1；＊：p＜0.05；＊＊：p＜0.01

中の増体量および離乳前体重について差がみられ

０～Ｄ28にArgを給与するＤ０-28群（ｎ＝35）

なかったことも，Ｄ０から29日間のArg給与によに分けた。血漿中Arg，一酸化窒素（NO），プロ

る正常産子数の増加は，養豚場経営における利益

ジェステロン（P４）濃度測定のため，Ｄ０とＤに直接影響する離乳頭数の増加につながるかもし

28のArg給与前後，Ｄ14のArg給与後，Ｄ56のれない。

Arg給与前に採血した。Ｄ14に黄体数を，Ｄ28の結論として，繁殖成績の向上を目的とした妊娠

Arg給与前後，Ｄ０，Ｄ14，Ｄ35，Ｄ42，Ｄ56の早期の豚へのArg給与について，Ｄ０からＤ28にArg給与前に子宮動脈血流量を測定した。また，かけての１日１回の給与とすれば，Arg給与期間

産子数を記録し，黄体数と総産子数から産子率

中および給与期間終了後のＤ56にかけて子宮動脈（％）を算出した。血漿中Arg濃度はArg給与期

血流量を増加させ，産子率および正常産子数を向間内の給与後の測定において，Ｄ０-28群が対照上させることが明らかとなった。

群より高かった（ｐ＜0.05）。黄体数と血漿中P４４．要

濃度は群間に差がなかった。Arg給与前後の血漿

約中NO濃度変化率は，Ｄ０-28群が対照群よりも大養豚場の生産性向上には年間離乳頭数増加を目きかった（ｐ＝0.1）。Arg給与前の子宮動脈血流的とした産子数増加が必要である。L-アルギニ

量は，Ｄ35，Ｄ56においてもＤ０-28群は対照群

ン（Arg）について，排卵前後の豚へのArg給与よりも多かった。Ｄ28のArg給与前後の子宮動脈が繁殖成績に与える影響は議論が分かれており，

血流量変化率は，Ｄ０-28群が対照群よりも大き子宮動脈血流動態に与える影響も明らかになってかった。正常産子数と産子率はＤ０-28群が対照いない。本研究では，Arg給与が妊娠豚の子宮動群よりも多かった（ｐ＜0.05）。

脈血流動態と繁殖成績に与える影響を明らかにすることを目的とした。

以上より，本研究では，AI開始前日から29日間のArg給与は黄体数や血中P４ 濃度を低下させ

種雌豚76頭を供し，離乳後初回AI実施日をＤず，給与期間終了後も長期にわたって子宮動脈血

１とし，Argを給与しない対照群（ｎ＝41），Ｄ

流動態を向上させ，分娩成績を向上させることが© The Ito Foundation

豚における繁殖性の向上に向けたアミノ酸の効果に関する研究

明らかとなった。
文献１） Yamane, I., Ishizeki, S., Yamazaki, H.：J. Jpn.
Vet. Med. Assoc., 67, 177～182, 2014.
２） Pope, W. F.：Biol. Reprod., 39, 999～1003, 1988.
３） Dallanora, D., Marconb, J., Walter, M. P., Biondo,N., Bernardi, M. L., Wentz, I., Bortolozzo, F. P.：
Livestock Sci., 197, 30～35, 2017.
４） Vallet, J. L., Leymaster, K. A., Christenson, R. K.：
J. Anim. Sci., 80, E115-E125, 2002.
５） Webel, S. K., Dziuk. P. J.：J. Anim. Sci., 38, 960～963, 1974.
６） Li, J., Xia, H., Yao, W., Wang, T., Li, J., Piao, X.,
Thacker, P., Wu, G., Wang, F.：J. Anim. Sci., 93, 5291
～5303, 2015.
７） Stechmiller, J. K., Childress, B., Porter, T.：Am. J.
Crit. Care., 13, 17～23, 2004.
８） Wu, G., Morris, S. M.：Biochem. J., 336, 1～17, 1988.
９） Li, X., Bazer, F. W., Johnson, G. A., Burghardt, R.
C., Frank, J. W., Dai, Z. L., Wang, J. J., Wu, Z. L.,

249

Shinzato, I., Wu, G.：Amino Acids., 46, 375～384, 2014.
10） Berard, J., Bee, G.：Animal, 4, 1680～1687, 2010.
11） Madsen, J. G., Pardo, C., Kreuzer, M., Bee, G.：J.
Anim. Sci. Biotechnol., 8, 58～69, 2017.
12） Li, X., Bazer, F. W., Johnson, G. A., Burghardt, R.
C., Erikson, D. W., Frank, J. W., Spencer, T. E.,
Shinzato, I., Wu, G.：J. Nutr., 140, 1111～1116, 2014.
13） Reynolds, L. P., Redmer, D. A.：Biol. Reprod., 64,
1033～1040, 2001.
14） Reynolds, L. P., Redmer, D. A.：Biol. Reprod., 48,
698～708, 1992.
15） Wu, G., Bazer, F. W., Datta, S., Johnson, G. A., Li, P.,
Satterfield, M. C., Spencer, T. E.：Amino Acids, 35,
691～702, 2008.
16） Maruyama, J.：Jpn. J. Swine Sci., 27, 135～139, 1990.
17） Bergstrom, J. R., Potter, M. L., Tokach, M. D.,
Henry, S. C., Dritz, S. S., Nelssen, J. L., Goodband, R.
D., DeRouchey, J. M.：Report of Progress. Kansas
State Univercity, 1020, 1～7, 2009.
18） Reynolds, L. P., Borowicz, P. P., Vonnahme, K. A.,
Johnson, M. L., Grazul-Bilska, A. T., Wallace, J. M.,
Caton, J. S., Redmer, D. A.：Placenta, 26, 689～708, 2005.

© The Ito Foundation

250

繁殖雌牛における栄養コントロールが過剰排卵処置の反応性および回収胚数に与える影響
Effect of nutrition control on superovulation response and the number ofrecovered embryo in heifer

林

武司・深水

大・上田

修二・稲田

淳

（福岡県農林業総合試験場畜産部）

Takeshi Hayashi, Dai Fukamizu, Shuji Ueda and Sunao Inada（Department of Animal production, Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center）

This study investigated the effect of increasing or decreasing the feed on superovulated
cattle. Changes in the number of small follicles in the ovaries of cattle, reactivity ofsuperovulation treatment, and normal fertilized embryo rates were examined. After feeding a
low-nutritional diet for 2 weeks to Japanese Black cows for which normal estrus cycle wasconfirmed, they were switched to a high-nutritional diet simultaneously with CIDR insertionand maintained on a high-nutritional diet until uterus flushing（LH group）. The control group
was fed a standard nutrition diet for the same period as the LH group.
In the LH group, body weight did not decrease with low nutrition feeding, but increased
at 1 week after switching to high-nutrition feed. The total cholesterol and BUN decreased
during low nutrition and increased during high nutrition, but no significant difference wasfound for IGF-1. The number of follicles did not change while on a low-nutritional diet, but the
number of small and medium follicles tended to increase after a high-nutritional diet. In
contrast, there was no difference in the number of large follicles between the LH group andcontrol group. In addition, there was no difference between the total number of embryos andthe number of normal fertilized embryos.
In conclusion, short-term changes in feeding content resulted in altered blood components,and suggested an effect on increasing the small and middle follicles. However, there was noeffect on the increase in the number of large follicles in response to superovulation treatment
and the increase in normal fertilized embryos.

１．目

伝子を効率よく活用でき，牛舎内の牛群改良速度

的を飛躍的に高めることができる。しかしながら過畜産農家における牛群能力改良は人工授精によ剰排卵処置は少なくない経費がかかるうえ，対象る雄側からのものと，過剰排卵処置による体内受牛によって採取される胚数の安定性を欠くために精胚の採取と移植による雌側からのものがある。

品質の高い移植可能胚が少数しか取れない場合

なかでも，雌牛の過剰排卵処置は農家内の優良遺は，農家の負担が大きくなる。このことは過剰排© The Ito Foundation

繁殖雌牛における栄養コントロールが過剰排卵処置の反応性および回収胚数に与える影響

251

卵技術の幅広い普及を妨げる要因になっている。

（TDN：120％，CP：170％）を算出した。栄養過剰排卵処置における採胚成績の不安定要因と量を切り替える区を増減区（LH区）とし，試験して，投与されるホルモン製剤に対する卵巣内に開始の１週間前から，基準栄養量の飼料を給与おける卵胞の反応性の差があげられる。このこと

し，試験牛を適応させる期間を設けた。試験開始について過剰排卵処置牛の卵巣を調査したとこ

とともに増減区は２週間（０～14日）低栄養量をろ，過剰排卵処置前の小卵胞数と処置後に反応し給与して試験開始２週間目からCIDRを挿入する

た大卵胞数には正の相関があることが報告されてとともに採胚による試験終了まで高栄養量の飼料

いる 。また，乳用種育成牛において低栄養状態を給与した（15～31日）。また，対照区は増減区から高栄養に切り替えることで，小中卵胞の増加と同期間，基準栄養量の飼料を給与した（Fig.１）。

１）が確認されている 。これらの報告は牛の栄養状

2.2

態をコントロールすることで，過剰排卵処置に反

供試牛は福岡県農林業総合試験場において飼養

応可能な小卵胞数を増加させ，採胚成績を改善さする黒毛和種雌牛（経産牛）の８頭を用い，増減せる可能性を示唆している。

区と対照区を反復して試験を行った。過剰排卵処

２）

供試牛の頭数および体重測定・血液採取

本試験では黒毛和種繁殖雌牛を用い栄養量を増

置後の卵巣回復のため，反復試験間は２か月以上減することで，低栄養状態にした後，高栄養状態の休止期間を設けて実施した。体重測定および血に切り替えると同時に過剰排卵処置を行うことで液分析用の採血は飼料給与から２時間後とし，試採胚成績が改善可能か調査を行った。

験開始から１週間ごとと採胚日に測定した（Ｄ２．方０，Ｄ７，Ｄ14，Ｄ21，Ｄ28，Ｄ31）
。体重につ

法

いては個体差が大きいため，試験開始時を起点と

2 . 1 栄養コントロールと試験開始のタイミン

して体重の増減について調べた。
2.3

グ

過剰排卵処置および採胚，採取胚の処理

栄養コントロールと試験開始のタイミングにつ

過剰排卵処置方法についてFig.１に示した。過いて，Fig.１に示した。試験開始前に試験牛の体剰排卵処置は試験開始２週間目（Ｄ14）にCIDR重を測定し，必要養分量を計算したうえで，試験（Zoetis）を挿入し，CIDR挿入後６日目（Ｄ20）

牛の基準栄養量（TDN：106％，CP：140％），

からFSH（18AU）（共立製薬株式会社）を漸減

低栄養量（TDN：92％，CP：105％），高栄養量

投 与 し た 。CIDR 挿 入 後 ８ 日 目（Ｄ 22）の 朝 に

D-7
LH

Adptioncontrol

Adption

US

US

EB
+
CIDRin
+
US

D0

D7

D14

AM：PG
PM：CIDRout
AM：GnRH
PM：AI+US

US
FSH

US

D20D21D22 D24D25

Low diets

D28

High diets
Standard dietsFig. 1 Schematic illustration of the superovulation protocol and diets stage in embryo donors© The Ito Foundation

Flushing
+
US
D31

252

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

PGF2α（共立製薬株式会社）を３ml筋肉注射

えたうえで観察を開始した。試験開始からCIDRし，同日の夕方にCIDRを引き抜いた。CIDR挿入

挿入までの３週間は１週間ごとに観察し（Ｄ０，

後10日目（Ｄ24）の朝にGnRH（インターベット）

Ｄ ７ ，Ｄ 14），CIDR 挿 入 後 は FSH 投 与 前（Ｄ４mlを投与し，同日の夕方に人工授精（AI）を20）， AI 時 （Ｄ 24）， 排 卵 確 認 （AI 翌 日）（Ｄ行った。AIから７日目（Ｄ31）の朝，バルーン

25），採 胚 時（Ｄ 31）に 卵 巣 の 卵 胞 を 観 察 し た

カテーテルを用い，非外科的に子宮を灌流し，胚（Fig.１）。卵胞は小卵胞（２～４mm），中卵胞を回収した（Fig.１）。

（５～７mm），大卵胞（８mm以上）に分類し，

回 収 し た 胚 は ， 顕 微 鏡 下 で International

記録した。

Embryo Technology Society（IETS）の マ ニ ュ

３．結果および考察

アルに従って分類し，採胚成績とした。凍結保存
後移植可能胚をCode１胚としてプログラムフ

3 . 1 体 重 お よ び 血 中 総 コ レ ス テ ロ ー ル ・リーザーを用いて緩慢凍結した後，胚移植に供し

BUN・IGF-1の変化

受胎率を求めた。
2.4

試験開始時を起点とし体重の変動を調べたとこ

卵胞数の観察ろ，低栄養量飼料給与時の２週間（Ｄ０～Ｄ14）

卵胞の観察した時期についてFig.１に示した。

では体重は変化せず，高栄養量飼料給与を開始し卵巣の観察は超音波画像診断装置（HS-101Ｖ，

た１週間以降（Ｄ21～）に体重増加がみられ，増藤平工業株式会社，東京）を用い，卵胞の発育を減区は対照区に比べ28日目で増加傾向があり，31

調 査 し た 。 試 験 開 始 の ２ 週 間 前 に PGF2α

日目では有意に体重の増加が確認された（Fig. 2（Zoetis）を４ml投与し，試験牛の発情周期を整（A））
。

control

LH

20

（B）11
†

＊

15
10
5
0
0
-5

7

14

21

28

control

LH

31
Day

（C）

BUN（mg/dl）

10.5
10
9.5
9
8.5
8
7.5
7
6.5
6

control

85

†

80
75
70
65
7

14

21

28

31
Day

LH

†

†

0

7

（D）

90

60
0

T-cho（mg/dl）

25

14

21

control

250
IGF-1（ng/ml）

Body weight change（kg）

（A）

28

31
Day

LH

200

150

0

7

14

21

28

31
Day

Fig. 2 Relationship between change in feed content and（A）Body weight change,（B）T-cho,（C）BUN,（D）IGF-1（mean±SEM）© The Ito Foundation

繁殖雌牛における栄養コントロールが過剰排卵処置の反応性および回収胚数に与える影響

The number of follicles

50

Control small and middle follicles

LH small and middle follicles

Control Large follicles

LH Large follicles

253

40
30
20
10
0
US1

US2

CIDRinbefor FSH

AI

D0

D7

D14

D20

D24

LH

High diets

Low diets

Control

the next day of Flushing
AI
D31
D25

Standard dietsFig. 3 Relationship between change in feed content and number of follicles（mean±SEM）

増減区において，総コレステロール（T-cho）

な差は見受けられなかった。これらのことについは低栄養期間に低下し，高栄養期間に移るとともて，短期間の低栄養後は小中卵胞数の増加と生産に増加が確認され，試験開始後から31日目（採胚される胚の品質を高めることや５），低栄養から高時）で は 対 照 区 と 比 較 し て 高 い 傾 向 に あ っ た

栄養への移行により卵巣が賦活化し，小中卵胞の（Fig. 2（B））。BUNもT-choと同様に，低栄養量増加につながった報告があり２），本試験と結果が期間に減少し，14日以降の高栄養期間への切り替一致する。また過剰排卵処置前の小卵胞数と過剰えとともに増加した（Fig. 2（C））
。IGF-1は個体排卵処置に反応する大卵胞数に正の相関関係があ差が大きいため，区間に有意差は得られなかった

るとする報告もあるが１），今回の試験では低栄養が，数値的には増減区が対照区に比べて高く推移から高栄養状態に切り替えることに伴う小卵胞数した（Fig. 2（D））。これらのことについて，血中の増加は過剰排卵処置後の大卵胞数の増加につな

BUNでは，飼料給与量変更による短期間での血がらなかった。Molloらは過度な乾物飼料給与は

中BUNのコントロールの可能性が報告されてい血中インスリンの増加を招き過剰排卵処置に対する３）。さらに飼料給与量と血中IGF-1は正の相関

る反応性を低下させる可能性があることを報告しがあることが報告されており，本試験と同様の結ている４）。本試験ではCIDR挿入からFSH投与ま果となった４）。

で６日間であり，TDN，CPの増加が急激であっ3.2

たため，過剰排卵処置に対する卵胞の反応性が低

卵巣内の卵胞数の推移

卵巣内卵胞数の推移についてFig.３に示した。

下したと考えられる。

試験開始後，低栄養量期間では卵胞数に大きな変3.3

動はみられなかった。その後高栄養量期間開始１

採胚成績および胚移植後の受胎成績について

週間目（Ｄ20）に，統計的有意差はないものの増Table１にまとめた。過剰排卵処置に対して反応

減区では小中卵胞の増加が起こった。一方で，した大卵胞数に差がなく，子宮灌流により得られAI時の大卵胞については増減区と対照区に大きた採取胚数，Code１胚数，正常受精胚数に差が© The Ito Foundation

採胚成績および受胎成績

254

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 Embryo production of bovine that was fed LH or control diets and conception rate of collected embryos
Total embryos

The number of
The number of normal
code1 embryos（%）
embryos（%）

The number ofunfertilized oocytes（%）

Conception
rate（n）

LH

12.5±4.0

6.4±4.0（51.0）

7.3±3.0（58.0）

3.4±2.0（27.2）

75%（3/4）

Control19.4±5.7

6.0±5.7（31.0）

6.8±2.4（34.8）

11.0±4.0（56.8）

66.7%（2/3）

P value

0.345

0.897

0.113

0.714

0.916

認められなかった。一方で，有意差はないものの

飼料給与を維持した（増減区）。一方，対照区は未受精胚数は対照区が高く（ｐ＝0.11），これは標準的栄養（TDN：106％，CP：140％）の飼料

AI後の排卵率が高かったためと考えられる。栄

給与を増減区と同様の期間給与した。増減区にお養状態と排卵の関係について，乳牛では低栄養状

いて低栄養給与時において体重は低下せず，高栄

態から高栄養状態に切り替わることで，血中の養飼料給与に切り替えたのち，１週間後に増加しIGF-1が増加し，排卵が促進されると言う報告がた。血中成分について総コレステロールやBUN

ある 。本試験では排卵時のIGF-1測定を行わなは，低栄養時には低下し，高栄養時に増加したがかったが，排卵期に最も近い試験28日目では，有IGF-1について有意な差はみられなかった。卵胞

意差はないものの増減区のIGF-1が増加してお数の推移について，減量時には変化はなかった

り，高栄養状態が排卵を促進した可能性がある。

が，増量後に小中卵胞数が増加傾向にあった。一採取した胚の受胎率については，例数が少なく，方で大卵胞数には増減区と対照区で差は認められ有意差は認められなかった。今後は移植数を増やなかった。また採胚によって得られた採胚総数とし，受胎率について調査する必要がある。これら

正常受精胚数に差はみられなかった。これらの結の結果から，短期間の飼料給与で血中成分の変化

果から，短期間の飼料給与で血中成分の変化が認が認められ，小中卵胞増加への影響が示唆された

められ，小中卵胞増加への影響が示唆されたが，が，過剰排卵処置への反応性，採胚によって得ら過剰排卵処置への反応性，採胚によって得られるれる正常受精胚の増加には伴わなかった。今後は正常受精胚の増加には伴わなかった。

６）

飼料の給与期間の変更等，増加した小卵胞の過剰排卵処置による反応向上につながる方法を探索する必要性があると考えられる。
４．要

約

本研究課題は過剰排卵処置対象牛に対する栄養状態の切替え（低栄養→高栄養）を行い，卵巣内の小卵胞数，過剰排卵処置の反応卵胞数や正常受精胚数への影響を調べたものである。正常な発情周期が確認された黒毛和種繁殖牛に２週間低栄養（TDN：92％，CP：105％）の飼料を給与した後，
CIDR挿入と同時に高栄養（TDN：120％，CP：170％）の飼料給与に切り替え，採胚まで高栄養

文献１） 福田卓己，大澤健司，打座美智子，鳶岡奈々恵，
遠藤保，大井隆弘，荒屋幸一，下村紀夫，広沢悠子，
居在家義昭：家畜臨床誌，31，137～142，2008．
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３） 福島成紀，木曽田繁，滝本英二：岡山農総セ畜研
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５） Nolan, R., O'Callaghan, D., Duby, R. T., Lonergan,
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Sasamoto, Y., Takahashi, Y., Matsui, M., Miyamoto,
A.：J Reprod Dev, 53, 113～20, 2007.

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255

卵巣の鉄不足に起因した豚における繁殖障害の解明（Ⅱ）―肝臓の鉄放出能低下と繁殖障害の関係―
Elucidation of reproductive disorders in swine caused by iron deficiency
in ovary（Ⅱ） ― Relationship between reduction of iron releasing
capacity of liver and reproductive disorder ―

山

下

泰

尚

（県立広島大学生命環境学部）

Yasuhisa Yamashita（Department of Life and Environment Science, Prefectural University of Hiroshima）

We investigated that transferrin（TF）-Fe3＋ specifically accumulates in follicular fluid
during follicular development and promotes oocyte maturation in pigs. Since TF-Fe 3＋ is aliver-derived factor, we hypothesized that follicular development-specific tissue-to-tissuecommunication between liver and ovary existed. Firstly, we investigated the time dependentchanges of iron-releasing factor（TF, FPN, HPD）in the liver before or after administration of
PMSG and hCG in mice. The results showed that the expression of FPN and TF that acts oniron release and transport, respectively, were increased by PMSG stimulation, and the HPD
that inhibits iron release decreased after PMSG stimulation. Tf and Fpn mRNA expression also
increased during follicular development in pigs. Tf and Fpn mRNA expression also increasedby E2-dependent manner in liver in mice and pigs. Furthermore, Tf mRNA expression in liverwith hepatitis is lower than that in normal liver. Competence of oocyte maturation derived
from hepatitis is significantly lower than that derived from normal. Thus, the results suggested
that hepatitis induces a decrease of Tf mRNA expression in the liver, which is one of thecauses of low quality of oocyte condition in pigs.

１．目

殖障害について研究を行い，以下の成果を得た。

的

家畜の生産性向上のために繁殖形質の改善が必・８mm以上の卵胞において，鉄（Fe3＋）の担体須であり，これまで後代検定やDNA育種によりタンパク質であるトランスフェリン（TF）が改良がすすめられてきた。しかし，遺伝的には繁蓄積する。

殖能力が高い種畜においても育種環境により繁殖

・TF-Fe3＋は卵胞発育期特異的に卵成熟を著しく成績が異なるのが現状である。したがって，後天促進するが，排卵期に存在すると卵成熟が阻害的（特に栄養状態や加齢など）な繁殖障害の原因される。

を解明する技術の開発が求められている。申請者
はＨ29年度の伊藤記念財団研究助成により豚の繁・繁殖能力低下は卵胞発育期における卵巣の鉄不足が原因の一つである。

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256

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

以上から，メス豚の繁殖には卵胞発育（発情）Fpn，Hpd mRNA発現に及ぼす影響を調べた。

期に卵巣に鉄がTF依存的に十分量存在すること

実験３では，肝臓疾患と繁殖性を調べるために，が重要であることが明らかになった。さらに，申正常個体および肝炎を罹患した豚の卵巣を採取

請者はマウスを用いて卵巣のTf mRNA発現と血し，卵巣内の卵丘細胞卵複合体（COC）を体外中のTF量を測定し比較解析した結果，卵巣にお培養し，退行率，卵成熟率により卵巣機能に及ぼいてTf mRNAの発現はまったく増加していない

す影響を調べた。また肝炎を罹患した豚と正常個が，血中のTF量は著しく増加すること，この増体の肝臓における鉄の放出に関わるTf，Fpn，

加は卵胞発育刺激（FSH/PMSG）を投与した場

HpdのmRNA発現を調べた。

合に限定され，その後排卵刺激（LH/hCG）により急激に低下することを明らかにした。体内においてTFの産生は肝臓に依存することから，卵巣のFSH刺激により応じて肝臓がTF-Fe の供給を
3＋

２．方

法

2 . 1 実験１：卵胞発育期，排卵期における肝臓の鉄放出因子の経時的発現変化促すというこれまでまったく報告されていない組

実験１では，まず性周期が人為的に調節可能な

織間コミュニケーションの存在が示唆された。

マ ウ ス を 用 い て ま ず 研 究 を 行 っ た 。３ 週 齢 の本研究では，Ｈ29年度の助成成果をヒントにし

C57BL6メスマウスに卵胞発育を誘導するFSHとて考えられた繁殖障害の原因が卵巣と肝臓との組同作用のPMSGを投与し，その後排卵を誘導する

織間コミュニケーションの破綻にあると仮説を立LHと同作用のhCGを投与した。各処理時間におて研究を進めた。なぜ卵胞発育期特異的にTF-

いてマウスをと殺し，肝臓を採取した。肝臓からFe3＋が卵巣に運搬されるのかを，肝臓の鉄供給シ

Total RNA お よ び タ ン パ ク 質 を 抽 出 し ，qRT-

ステムに注目し，これらの因子が卵巣により時期

PCRによりTf，FpnおよびHpd mRNAの経時的特異的な調節を受けることを個体レベルおよび細発現変化を，Western blottingによりTF，FPN

胞レベルで詳細に解析を行った。肝臓からの鉄供およびHPDのタンパク質発現変化を調べた。ま給は鉄の運搬に働くTF１），肝細胞からの鉄の輸た，一部の肝臓はパラフィン包埋後，免疫組織化

送路となるFerropotin（FPN）により促進され学染色によりTF，FPNおよびHPDの局在変化をる調べた。さらに，食肉市場由来の豚から肝臓，卵２）

こと，鉄の供給遮断はFPNに特異的に結合こと巣を採取し，１-３mm，４-７mm，８mm以上が明らかになっている。そこで実験１では，卵胞の卵胞を有する，あるいは黄体を有する卵巣に分発育を誘導するFSHと同作用のPMSGを投与し，類し，この時期における肝臓のTf，Fpnおよびその後48時間後に排卵を誘導するLHと同作用のHpd mRNA発現を調べた。

するHepcidin（HPD）により促進される

３）

hCGを投与し，肝臓におけるTF，FPN，HPDの経時的発現変化を調べた。また発育期と排卵期の2 . 2 実験２：肝臓の鉄放出因子の発現制御機
構

卵胞を有する豚の肝臓を採取し，Tf，Fpn，Hpd

３ 週 齢 の C57BL6 メ ス マ ウ ス に Ｅ ２ 非 投 与mRNAの発現変化を調べた。実験２では，肝臓（Non-stimulated；NS区），Ｅ２投与（Ｅ２区），のTf，Fpn，Hpd mRNA発現が卵胞発育に応じＥ２とＥ２受容体阻害剤（ICI）（Ｅ２＋ICI区）て変化していたことから，卵胞発育期に卵巣で合を投与し，肝臓におけるTf，FpnおよびHpdの成 さ れ る エ ス ト ロ ゲ ン（Ｅ ２）が 肝 臓 の Tf ，mRNA発現をqRT-PCR法により調べた。また肝© The Ito Foundation

卵巣の鉄不足に起因した豚における繁殖障害の解明（Ⅱ）―肝臓の鉄放出能低下と繁殖障害の関係―

257

臓のTF濃度をELISA法で調べた。さらに，食肉

ク質発現は，PMSG投与前においても発現が認め

市場由来の肝臓をDMEMを用いてＥ２無添加

られるが，PMSGの投与により強いバンドが出現（NS）区およびＥ２添加区で24時間培養し，鉄放し，hCGの投与により減少した。FPNタンパク質出因子のTf，FpnおよびHpdのmRNA発現を調べ

は，PMSG投与前およびPMSG投与後６時間までた。

はバンドはほとんど認められなかったが，12時間

2 . 3 実験３：肝臓疾患が肝臓の鉄放出因子のにおいて発現が認められ，24時間で強いバンドが発現と卵巣の鉄受容因子の発現および卵成認められ，その後バンド強度は低下し，hCGの投熟に及ぼす影響

与により完全にバンドは消失した。HPDタンパ

肝臓疾患が卵巣機能に及ぼす影響を調べる目的
で，食肉市場において正常，肝炎と診断された肝Tf mRNAＡから顆粒膜細胞を採取し，顆粒膜細胞におけるエ0.12

ストロゲン合成遺伝子（Cyp19a1）のmRNA発現を調べた。また，正常および肝炎の卵巣から卵Expression

臓および卵巣を採取した。正常および肝炎の卵巣

0.16

丘細胞卵複合体（COC）を採取し，FSH（１μg/

＊

0.08
0.04
0

ml）およびAmphiregulin（100ng/ml）を添加し

＊

NS 1h

3h

6h 12h 24h 36h 48h 5h 10h
PMSG

たNCSU37培地で48時間成熟培養し，卵成熟率（第二減数分裂中期率：MII率）を調べ，肝疾患

Ｂ

らの個体から採取した肝臓における鉄の放出因子（Tf，FpnおよびHpd）のmRNA発現を調べた。

Expression

が卵巣機能に及ぼす影響を調べた。さらに，これ３．結果と考察Fpn mRNA

0.1
0.08
0.06

＊
＊

0.04
0.02
0

3 . 1 実験１：卵胞発育期，排卵期における肝

NS 1h

3h

6h 12h 24h 36h 48h 5h 10h
PMSG

臓の鉄放出因子の経時的発現変化
スの卵巣におけるTf mRNA発現は低い値を示したが，PMSG投与直後に有意に増加した後に低下
し ，hCG 投 与 後 に 再 び 高 い 値 を 示 し た（Fig.
1A）。Fpn mRNA発現は，PMSG投与前まで低い値を示し，PMSG投与後に発現が増加したが，そＣ

Expression

PMSG 投 与 前（Non-stimulated；NS）の マ ウ

14
12
10
8
6
4
2
0

の後hCGを投与するとPMSG投与前と同程度まで発現量が低下した（Fig. 1B）。一方，肝臓におけるHpd mRNA発現は，PMSG投与前で高い値を示し，PMSGを投与することで低下したが，hCGの投与により増加した（Fig. 1C）。TFのタンパ

hCG

hCG

Hpd mRNA

＊

＊

＊

＊

NS 1h

3h

6h 12h 24h 36h 48h 5h 10h
PMSG

＊

＊

＊

＊

hCG

Fig. 1 PMSG投与前，PMSG投与後およびそれに続くhCG

投与後のマウス肝臓におけるTf（A），Fpn（B），およびHpd（C）mRNAの経時的発現変化
NS；刺激あり＊ ；NSに対して有意差あり（ｐ＜0.05）© The Ito Foundation

258

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ク質は，PMSG投与前において強いバンドが出現

しかし黄体においては１-３mmのレベルにまでしたが，PMSGの投与により減少し，hCG投与５

発 現 量 が 低 下 し た（Fig. 3A）。Fpn mRNA 発 現

時間後に再びこの強いバンドが検出された（Fig.

は，１-３mmに比べ，４-７mmで増加し，８2A）。TFの局在はPMSG投与後の肝臓の細胞質にmm以上で１-３mmと比較し有意に高い値を示し認められた。FPNは，PMSG投与後に細胞膜に局た。この高い値は黄体においても維持していた在が認められ，その後hCG投与後まで細胞膜に認（Fig. 3B）。またHpd mRNA発現は，１-３mm，められた。HPDの局在は，PMSG投与前および４-７mm，８mm以上では低い値を示したが，黄hCG投与後の細胞質に認められたが，PMSG投与

体において有意に高い値を示した（Fig. 3C）。

後 に お い て は ，染 色 像 は 低 下 し て い た（Fig.

以上のマウスおよび豚を用いた結果から，肝臓

2B）。

における鉄放出は，性周期に同調し，卵胞発育期

豚の肝臓におけるTf mRNA発現は，１-３mmに活性化されることが明らかになった。一方，排の卵胞直径では低い値を示したが，４-７mm，卵期および黄体期においては，卵巣は鉄を必要と有意に増加し，８mm以上まで高い値を示した。

しないため肝臓におけるHPDの発現を増加させ

Ａ
TF
FPN
HPD

PMSG
Ｂ

NS

10h

5h

48h

36h

24h

12h

6h

3h

1h

NS

β-actinhCG

PMSG 24h

hCG 5h

TF

FPN

HPD

20μm

Fig. 2 PMSG投与前，PMSG投与後およびそれに続くhCG投与後のマウス肝臓におけるTF，FPN，HPDのタンパク質発現（Ａ）と局在変化（Ｂ）

NS；刺激なし© The Ito Foundation

卵巣の鉄不足に起因した豚における繁殖障害の解明（Ⅱ）―肝臓の鉄放出能低下と繁殖障害の関係―

Ａ

0.6

Tf mRNA

現に及ぼす影響を調べた。その結果，Ｅ２非投与

bのマウス肝臓におけるTf mRNA発現は低い値をExpression

0.5

値はＥ２とともにICIを投与すると有意に減少した（Fig. 4A）。またFpnの発現もＥ２非投与に比

0.2
a
1-3mm

Expression

4-7mm

8mm<

Fpn mRNA
b

0.05
0.04
0.03

べＥ２投与区で増加し，Ｅ２＋ICI区で低下した

CL（Fig. 4B）
。Hpd mRNA 発 現 は Ｅ ２ ＋ ICI 区 で ，
NS区およびＥ２区よりも高い傾向を示した（Fig.
4C）
。肝臓のTF濃度は，NS区に比べＥ２投与でab有意に増加し，Ｅ２＋ICI区でＥ２区に比べ低い

ab

0.01

傾向を示した（Fig. 4D）。
豚の肝臓においてもTf mRNAは培養前の０ｈ

a
1-3mm

およびＥ２無添加区で低い値を示したが，これら
4-7mm

8mm<

Hpd mRNA

1.2
1

Expression

a

0.02

0

Ｃ

示したが，Ｅ２の投与により有意に増加し，この

0.3

0

Ｂ

ab

0.4

0.1

CL

による影響は認められず，すべての処理区で同程b

度の値を示した（Fig. 5B, C）。
以上の結果から，マウスおよび豚において卵胞

0.6

発育期に卵巣で合成されるＥ２が肝臓を刺激し，0.40に対してＥ２添加区で有意に高い値を示した（Fig. 5A）
。FpnおよびHpd mRNA発現にはＥ２

0.8

0.2

259

a

a

a

1-3mm

4-7mm

8mm<

鉄放出に関わるTFの発現を亢進するという新たCL

Fig. 3 １-３mm，４-７mm，８mm以上の卵胞，および黄体を有する卵巣を持つ豚における肝臓のTf（A），
Fpn（B），およびHpd（C）mRNAの発現
CL；黄体
a-b；異符号間に有意差あり（ｐ＜0.05）

な組織間コミュニケーションが存在することが明らかになった。
3 . 3 実験３：肝臓疾患が肝臓の鉄放出因子の発現と卵巣の鉄受容因子の発現および卵成熟に及ぼす影響
顆粒膜細胞におけるエストロゲン合成遺伝子ることで肝臓からの鉄放出を阻害していると考え（Cyp19a1）のmRNA発現は，正常個体に比べ肝られた。

臓 疾 患 個 体 で 有 意 に 低 い 発 現 を 示 し た（Fig.

3 . 2 実験２：肝臓の鉄放出因子の発現制御機6A）。肝炎を罹患した個体の卵成熟率（MII率）
は，正常個体よりも有意に低い値を示した（Fig.

構
実験１において，卵胞発育期において，肝臓の6B）。一方卵子が正常に減数分裂を誘導していな鉄放出に関わる因子であるTF，FPNが発現上昇

いGV期の割合は，肝臓疾患個体の方が正常個体したことから，この時期の卵巣で合成されるＥ２に比べ有意に高い値を示した（Fig. 6C）。これらが肝臓に作用し，これらの因子の発現を増加させの結果から，肝臓疾患個体では低エストロゲンにると考えられた。このことから，実験２ではマウより卵胞発育が抑制されその結果，卵子の質が低スおよび豚を用いてＥ２が肝臓の鉄放出因子の発下しているものと考えられた。

© The Ito Foundation

260

平成30年度Tf mRNA
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

＊

Ｃ
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

＊

NS

Ｂ

E2

E2＋ICI

0.003
TF amount（mg/liver 1mg）

Expression

0.00250.002

0.00150.001

0.0005
NS

E2

NS

D

Fpn mRNA0

Hpd mRNA

Expression

Expression

Ａ

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

E2＋ICI

0.016
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0

E2

E2＋ICI

TF量

NS

E2

E2＋ICI

Fig. 4 Ｅ２非投与，Ｅ２投与，Ｅ２とICIの同時投与時のマウス肝臓のTf（A），Fpn（B），Hpd（C）mRNA発現および肝臓のTF量NS；E２非投与
＊；処理区間に有意差あり（ｐ＜0.05）

Ｂ

0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0

Hpd mRNA
Ｃ 0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0

Expression

Expression

Ａ

Tf mRNA
＊
＊

0h

Free

E2

0h

Free

E2

Fpn mRNA

0.12

Expression

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0

0h

Free

E2

Fig. 5 豚肝臓をＥ２添加培地で培養したときのTf，Fpn，Hpd mRNAの発現
０h；培養前Free；Ｅ２無添加培地で24時間培養
E２；E２添加培地で24時間培養

 ；処理区間に有意差あり（ｐ＜0.05）＊© The Ito Foundation

卵巣の鉄不足に起因した豚における繁殖障害の解明（Ⅱ）―肝臓の鉄放出能低下と繁殖障害の関係―
Ａ

Cyp19a1 mRNA
＊

0.4
0.3
0.2
0.1
0

正常

Ｂ

70
60
50
40
30
20
10
0

肝炎

GV 率
＊

正常

肝炎

MII 率
＊

50
oocyte（％）

Ｃoocyte（％）

Expression

0.5

261

40
30
20
10
0

正常

肝炎

Fig. 6 正常肝臓および肝炎を罹患した豚卵巣の顆粒膜細胞におけるCyp19a1

mRNA発現（Ａ），卵子のMII率（Ｂ），GV率（Ｃ）

＊；処理区間に有意差あり（ｐ＜0.05）

Ａ

0.1
0.05

Expression

Ｂ
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0

0.25

＊

0.15

0

Ｃ

Tf mRNA

Expression

Expression

0.2

正常

0.2
0.15
0.1
0.05
0

肝炎

Hpd mRNA

正常

肝炎

Fpn mRNA

正常

肝炎

Fig. 7 正常肝臓および肝炎を罹患した豚肝臓のTf（A），Fpn（B），Hpd（C）

mRNA発現 ；処理区間に有意差あり（ｐ＜0.05）＊

肝臓疾患個体における低卵巣コンディションの7A）。FpnおよびHpd mRNA発現も有意差は認め

原因を追求するために，正常個体と肝炎個体におられないが，肝臓疾患個体で低い傾向を示した

ける肝臓の鉄放出因子との関係を調べた。肝炎を（Fig. 7B, C）。

罹患した個体では肝臓におけるTf mRNAの発現

以上の結果から，肝臓疾患個体では鉄の輸送には正常個体に比べ有意に低い値を示した（Fig.

働くTFの発現量が低下することが明らかになっ© The Ito Foundation

262

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

た。さらに，肝臓疾患個体におけるTF発現量低mRNA発現が増加したことから，卵胞発育期に下が一因となり卵胞環境のコンディションが低下

卵胞内で合成されるＥ２が肝臓の鉄放出を促進す

し，低Ｅ２分泌能に伴って卵胞発育が抑制され，る新たな組織間コミュニケーションが存在するこ

卵子の質が低下すると考えられた。

とが明らかになった。さらに豚で頻発する肝炎を４．要

罹患した肝臓におけるTf mRNA発現は正常個体約よりも低く，このとき肝炎を罹患した個体の卵巣

我々は，Ｈ29年度伊藤記念財団研究助成によの卵成熟率が著しく低かったことから，肝臓疾患

り，トランスフェリン（TF）-Fe が卵胞発育期

個体では鉄の輸送に働くTFの発現低下が卵巣のの卵胞液に特異的に蓄積し，豚の卵成熟を促進す

卵子のコンディション不良の一員である可能性がることを明らかにした。この卵成熟を誘導する示唆された。

3＋

TF-Fe3＋は肝臓由来因子であることから，卵胞発育期特異的な肝臓と卵巣の組織間コミュニケー
ションが存在すると仮説を立て，以下の研究を行った。まず，人為的に性周期を調節できるマウスを用いて卵胞発育刺激（PMSG）投与後，その後の排卵刺激（hCG）投与後の肝臓における鉄放出因子（TF，FPN，HPD）の経時的発現を調べた結果，鉄の放出運搬に働くTF，FPNの発現は
PMSG刺激により増加し，鉄の放出を阻害する
HPDはPMSG刺激前に高く，PMSG刺激後には低下した。また豚においても卵胞発育期にTf，Fpn
mRNA発現が高い値を示した。さらに，マウス
および豚において，Ｅ２依存的に肝臓のTf，Fpn

文献１） Lawrence, C. M.：Crystal Structure of the
Ectodomain of Human Transferrin Receptor, Science,
286（5440）,779～782, 1999.
２） McKie, A. T., Marciani, P., Rolfs, A., Brennan, K.,
Wehr, K., Barrow, D., Miret, S., Bomford, A., Peters,
T. J., Farzaneh, F., Hediger, M. A., Hentze, M. W.,
Simpson, R. J.：A novel duodenal iron-regulatedtransporter, IREG1, implicated in the basolateraltransfer of iron to the circulation, Moll Cell, （
5 2）
, 299
～309, 2000.
３） Nicolas, G., Bennoun, M., Devaux, I., Beaumont, C.,
Grandchamp, B., Kahn, A., Vaulont, S.：Lack ofhepcidin gene expression and severe tissue ironoverload in upstream stimulatory factor 2（USF2）
knockout mice, Proc Natl Acad Sci U S A, 98（15）,8780～5, 2001.

© The Ito Foundation

263

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御（Ⅱ）
Prediction and control of subacute ruminal acidosis in periparturient dairy
cows（Ⅱ）

佐

藤

繁・木

崎

景一郎

（岩手大学農学部共同獣医学科）

Shigeru Sato and Kei-ichiro Kizaki（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University）

The objectives of this project are to clarify the pathogenesis of subacute ruminal acidosis（SARA）in dairy cows using radio transmission pH measurement system, and further, toassess the prediction and control of post-partum SARA at the pre-partum stage. Twenty dry
period and multiparous Holstein cows（A herd, n=10；B herd, n=6；C herd, n=4）were usedin this experiment, and the amount and composition of diets were thoroughly managed. The
nutritional management during the transition period, milk yield and breeding performance atthe post-partum were monitored. Rumen fluids were collected at 3 weeks pre-partum and 2, 4,
and 6 weeks post-partum for analysis of VFA, ammonia, and lactic acid, LPS activity.
Furthermore, liver tissues were biopsied at 3 weeks pre-partum, 2 and 6 weeks post-partum,and transcriptomic dynamics were evaluated using microarray method.
As a result, the ruminal pH depressed dramatically at the post-partum, and tended to belower until 6 weeks post-partum in the SARA cows（diagnosed when pH remained under 5.6
for hr/day）compared with the healthy cows. In addition, the greater differences between the
maximum and minimum values within diurnal changes（diurnal deviation）in the ruminal pH
were identified in the SARA cows compared with the healthy cows. In the microarray data
analysis, PCA plots showed that mRNA expression profiles of the liver tissue had changed
during the pre- and post-partum, whereas they were entirely separated between the twogroups regardless of parturition stage.
From these findings, an analysis of liver tissue transcriptomic alterations with use ofwireless pH sensor revealed the relationship between the occurrence and pathophysiology of
SARA during peripartum periods, and it can be possible to predict the post-partum occurrenceof SARA at the pre-partum stage in dairy cows.

１．目

持・向上させるために濃厚飼料が多給され，その的結果，潜在性第一胃アシドーシス（SARA）が増

乳牛の泌乳量は栄養管理や育種改良の進展に加している。SARAは粗飼料の不足と濃厚飼料なよって飛躍的に増加してきた。一方で泌乳量を維ど 易 発 酵 性 飼 料 の 多 給 に よ り ，揮 発 性 脂 肪 酸© The Ito Foundation

264

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）（VFA）の産生量と吸収量のバランスが崩れて第１）を用い，周産期乳牛を対象として栄養管理状

一胃液pHが低下し，グラム陰性菌が死滅して細態などSARAの発症リスクと病態生理を解析し，胞壁からのリポポリサッカライド（LPS）遊離がさらに，分娩前における分娩後SARAの発症予知

亢進する病態である 。分娩後の濃厚飼料多給にと制御の可能性を検討した。そのため，平成29年伴って発生するSARAは，代謝病（生産病）や繁度に実施した10頭に加え，今年度さらに７頭を追殖障害の発生と密接な関連のあることが示唆され加し，計17頭を対象として「周産期乳牛におけるており，農家経営に多大な影響を及ぼす代謝障害

SARA発症のリスク解明」と「SARA発症牛におリスクである。

ける第一胃LPSカスケードと病態の解明および分１）

本研究の目的は，申請者らが開発した無線伝送

娩前における分娩後SARAの発症予知」に取り組を用いて，乳牛の分娩後に多発んだ。

するSARAの発症リスクと病態を明らかにし，さ2.1

らには分娩前の段階で分娩後SARAの発症予知と野外実態と病態解明に関する調査は，前年度と制御を目指すことである。これによって，乳牛の同様，移行期の給与飼料内容や飼養管理状況が明周産期に発生する種々の生産病を予防し，乳牛のらかな３牛群において，乾乳期の経産牛17頭（Ａ

健康を維持して食品としての牛乳と食肉の安全確

牛群・７頭，Ｂ牛群・６頭，Ｃ牛群・４頭）を対保に貢献することが最終的な目標である。

象として行った。移行期における給与飼料などの式pHセンサ

２～５）

供試牛群および供試牛

具体的には，乳牛の周産期における栄養管理状

飼養管理状況と分娩後の泌乳量を調査した。な況が第一胃液pHの変動や第一胃内発酵（VFA，お，供試したすべての牛において分娩前後に臨床乳酸）に及ぼす影響，SARAによるLPSの産生と的異常は認められなかった。

体内移行が生体反応に及ぼす影響を解析する。さ2.2

らに，SARAの病態生理解明を基盤として第一胃

第一胃液はカテーテルを用いて経口的に，血液内細菌叢の不安定化を予防し，正常な第一胃発酵

は頸静脈から真空採血管を用いて，いずれも分娩機能を維持するため，栄養管理の改善や生菌・酵

前３週，分娩後２週，４週および６週の計４回採母製剤の投与による分娩後SARAの制御効果を明取した。また，肝組織は生検（自動生検針エース

らかにする。

カ ッ ト 14 Ｇ × 115mm

２．方

採材

22mm タ イ プ ，タ ス ク（株），栃木）により分娩前３週と分娩後２週と６法週の計３回採取した。

申請者らが開発した無線伝送式pHセンサ（Fig.

Fig. 1 Appearance of the pH sensor of a radio transmission pH measurement system. The pH sensor（A）, which is 184

g in weight, 30 mm in diameter, and 145 mm in length, was composed of a small-grass electrode（B）and antenna.

© The Ito Foundation

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御（Ⅱ）

2.3

検査項目および方法

2 . 3 . 1 第一胃液pH，VFA，アンモニア態窒
素および乳酸濃度

265３．結果と考察3 . 1 周産期乳牛におけるSARA発症のリスク

第一胃液pHは，無線伝送式pHセンサを用いて解明

分娩前３-２週から分娩後６-８週までの間，10分

３牛群の17頭において，分娩前３-２週から分間隔で連続測定した。VFA濃度の測定は，ガス

娩後６-８週までの間，第一胃液pHを連続測定しクロマトグラフィー（HITACHI-163型，日立，た結果，第一胃液pHは分娩日以降に著しく低下

東京）を用いて行った。アンモニア態窒素濃度のして分娩前に比べて低値，かつ１日の最大値と最測定は，窒素自動蒸留装置（ケルティックオート

小値との差異（日内較差）が増大する傾向が認め

1035型，アクタック，東京）を用いた水蒸気蒸留られた。なお，３牛群間で第一胃液pHに差異は法で，乳酸濃度の測定は，市販の乳酸測定キット

みられなかった。分娩後２週までの間にSARAを（Ｆキット，Ｄ-/Ｌ-乳酸，R-Biopharm，ドイツ）発症したSARA群（１日あたり３時間以上にわを用いて行った。

たって第一胃液pHが5.6以下，ｎ＝９）の第一胃

2.3.2

第一胃液LPS活性値

液pHは，SARAを発症しなかった非SARA群（ｎ一部のサンプルにおいて，LPS活性値はLAL＝８）に比べて，分娩日から分娩後６週までの（Limulus amebocyte lysate）試 薬（パ イ ロ ク ロ

間，低値で推移し（Fig.２），１日あたりpH＜5.6

ム，生化学工業，東京）を用いたカイネティックの時間はSARA群で非SARA群に比べて有意な高比色法により測定した。

値 を 示 し た（Fig. ３）。ま た ，SARA 群 で は 非2.3.3

肝臓の遺伝子解析

SARA群に比べて，分娩前および分娩後における肝臓の遺伝子解析は，組織から総RNAを抽出した後，マイクロアレイ法およびリアルタイム

第一胃液pHの日内較差が大きい傾向が認められた。

PCR法により行った。マイクロアレイ法は，約

これまでに，乳牛の周産期における第一胃液15,000 の ウ シ 遺 伝 子 を 搭 載 し た ウ シ ・ オ リ ゴ

pHの変化を観察した報告２，６），あるいはSARA予DNA マ イ ク ロ ア レ イ （Agilent Technologies,

防を目的として種々の菌体製剤や酵母製剤の効果

USA）を使用した。RNAサンプルからのcDNAを検討した申請者らの報告６～９）はあるが，分娩前合 成 ，cDNA か ら の Cyanine3（Cy3）-CTP 標 識の第一胃液pHおよび第一胃発酵産物の変動によ

cDNAの合成，標識cRNAの精製，ハイブリダイ

り，分娩後SARAの摘発を目指した研究はみられゼーション，洗浄，スキャンおよびデータ解析のない。また，周産期の飼養管理状況と生産病の発一連の操作を行った。

生との間に関連があるとされているが，本課題の

2.4

統計解析

ように飼養管理状況と第一胃液pHの連続的変化

マイクロアレイ法のデータは，Gene Springとの関係を検討した研究はみられない。今回，

GX12.0（Agilent Technologies, USA）を 用 い てSARA群の第一胃液pHは，分娩前に非SARA群

統計解析した。

と差異がみられなかったが，分娩後には６週目まで長期間にわたって低値を示した。このことから，今後詳細な解析が必要であるが，分娩前後の乳牛における第一胃液pHの変動は，給与飼料な© The Ito Foundation

266

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

7.0

Non-SARA
SARA

pH

6.5
6.0
5.5
5.0

-2

-1

分娩

1

2
分娩後週

3

4

5

6

Fig. 2 Changes in the 24-h mean ruminal pH in the Non-SARA group（n=8）

and SARA group（n=9）during the peripartum periods.

800

Non-SARA
SARA

700
600
500
min

＊

＊

400

＊

＊

300

＊

200

＊

＊

＊

＊

100
0

分娩

1

2

3

4

5

6
7
8
分娩後日数

9

10

11

12

13

14

Fig. 3 Changes in the duration of time where pH＜5.6 in the Non-SARA group（n=8）andSARA group（n=9）during the peripartum periods.

どの飼養管理状況とこれに対応した第一胃発酵ば

3 . 2 SARA 発 症 牛 に お け る 第 一 胃 LPS カ ス

かりでなく，濃厚飼料に対する各牛に特有な第一

ケードと病態の解明および分娩前における胃発酵の順応性（適応性）とも関連のあることが分娩後SARAの発症予知示唆された。なお，本課題において，第一胃液と肝組織は生検により分娩前３週，分娩後２週と血液は分娩前２週，分娩後２週，４週および６週

６週の３回サンプリングを終了し，マイクロアレの計４回サンプリングし，いずれもVFA，アンイ法による網羅的遺伝子解析も終了してデータのモニア態窒素および乳酸の解析を終了した。LPS

解析中である。これまでのPCA解析の結果によ

活性値のデータを追加し，すべてのデータが出ると，SARA群（ｎ＝６）と非SARA群（ｎ＝５）

揃った段階で栄養管理上のSARA発症リスクを評

とも分娩前３週，分娩後２週と６週の遺伝子発現価する予定である。

は，きわめて類似した変動を示す傾向が認められた。しかし，SARA群と非SARA群では分娩前か© The Ito Foundation

267

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御（Ⅱ）
PCA 2D（PC1 vs. PC2）
15000

Component 2（19.61%）

10000
5000
0
-5000
-10000Control-2Wk
Control+2Wk
Control+6Wk-150000

20000

SARA-2Wk
SARA+2Wk
SARA+6Wk

40000

60000

Component 1（26.3%）
Fig. 4 Principal component analysis plots generated from the microarray data in the Non-SARA group（n=5）andSARA group（n=6）during the peripartum periods. Open and closed represent the Non-SARA and SARA cows,
respectively. Circle （circled by solid line）, triangle（circled by dashed line）, and rectangle（circled by dotted line）
represent 3 weeks pre-partum and 2 and 6 weeks post-partum, respectively.

ら遺伝子発現がまったく異なることが明らかと酸化ストレスと関連のある遺伝子の発現状況が明なった（Fig.４）。今後，リアルタイムPCR法にらかになると考えている。一方，すでに申請者らよる特定遺伝子の発現解析を行い，これらデータ

は，SARA牛では健康牛に比べて，第一胃の細菌が出揃った段階で，肝組織における遺伝子発現状叢構成が大きく異なることを明らかにしてい況に関して分娩前後におけるSARA群と対照群のる13，14）。したがって，今回検索したSARA群にお比較を行い，肝組織における遺伝子発現の面かける第一胃細菌叢構成についても，追加検討する

ら，SARAの病態解明にアプローチするとともに，必要がある。

分娩前の発症予知に応用可能な候補遺伝子について検討する予定である。
SARA牛の肝組織における遺伝子発現，特にSARAに起因したLPSの影響に関する報告

４．要約

乳牛の分娩後に多発するSARAの発症リスクをや明らかにし，分娩前の段階で分娩後SARAの発症

SARA牛の第一胃粘膜における遺伝子発現に関す

予知と制御を目指す目的で試験を行った。移行期

る報告11，12）はあるが，いずれも実験的に誘発したの給与飼料内容や飼養管理状況が明らかな３牛群

SARA牛を対象として観察したもので，本課題のにおいて，乾乳期の経産牛17頭（Ａ牛群・７頭，ように野外の周産期乳牛を対象とした実証的研究

Ｂ牛群・６頭，Ｃ牛群・４頭）を対象とし，移行はみられない。今後の解析によって，分娩前後の期の飼養管理状況，分娩後の泌乳量を調査した。

乳牛における肝組織中のエネルギー関連遺伝子の分娩前３週，分娩後２週，４週および６週に第一ほか，分娩後SARA牛においてLPSカスケードや胃液を採取し，VFA，アンモニア態窒素および

10）© The Ito Foundation

268

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

乳酸濃度のほかLPS活性値を測定した。また，分娩前３週，分娩後２週と６週に生検により肝組織を採取し，マイクロアレイ法によって網羅的遺伝
子解析を行った。
その結果，SARA群の第一胃液pHは分娩後に著しく低下し，分娩後６週までの間，非SARA群に比べて低値で推移する傾向が認められた。また，SARA群の分娩前後における第一胃液pHの
日内較差は，非SARA群に比べて大きい傾向が認められた。さらに，マイクロアレイ法のデータのPCA解析により，SARA群と非SARA群では分娩前から肝組織中の遺伝子発現がまったく異なることが明らかとなった。
以上のように，周産期乳牛の肝組織における遺伝子発現解析によって，SARAの発症や病態と関連のある遺伝子群が明らかになるとともに，分娩前において分娩後SARAの発症予知ができる可能性のあることが示唆された。
文献１） Sato, S.：Anim Sci J, doi：10.1111/asj.12415, 2015.
２） Sato, S., Mizuguchi, H., Ito, K., Ikuta, K., Kimura,A., Okada, K.：Prev Vet Med, 103, 274～279, 2012.
３） Sato, S., Kimura, A., Anan, T., Yamagishi, N.,
Okada, K., Mizuguchi, H., Ito, K.：Vet Med Commun,
36, 85～89, 2012.

４） Sato, S., Ikeda, A., Tsuchiya, Y., Ikuta, K.,
Murayama, I., Kanehira, M., Okada, K., Mizuguchi,
H.：Vet Med Commun, 36, 85～89, 2012.
５） Nagata, R., Yo-Han, K. I. M., Ohkubo, A.,
Kushibiki, S., Ichijo, T., Sato, S.：J Dairy Sci, 101, 1～
13, 2018.
６） Hasunuma, T., Uyeno, Y., Akiyama, K., Hashimura,S., Yamamoto, H., Yokokawa, H., Yamaguchi, T., Itoh,M., Mizuguchi, H., Sato, S., Hirako, M., Kushibiki, S.：
Anim Feed Sci Technol, 221, 215～225, 2016.
７） Maeda, Y., Nishimura, K., Kurosu, K., Mizuguchi,
H., Sato, S., Terada, F., Kushibiki, S.：Anim Sci J（Inpress）,2018.
８） Nishimura1, K., Kurosu, K., Terada, F., Mizuguchi,
H., Sato, S., Kushibiki, S.：Anim Sci J, doi：10.1111/
asj.13131, 2018.
９） Watanabe, Y., Yo-Han, Kim, Kushibiki, S., Ikuta,
K., Ichijo, T., Sato, S.：J Dairy Sci,（in Press）,2019.
10） Chang, G., Zhuang, S., Seyfert, H-M., Zhang, K.,
Xu, T., Jin, D., Guo, J., Shen, X.：Oncotarget, 6, 38578～38590, 2017.
11） Yo-Han, Kim, Nagata, R., Ohtani, N., Ichijo, T.,
Ikuta, K., Sato S.：Front Microbiol, doi：10.3389/
fmicb.2016.01575, 2016.
12） Yo-Han, Kim, Touji, N., Kizaki, K., Kushibiki, S.,
Ichijo, T., Sato, S.：Physiol Genomics, doi：10.1152/
physiolgenomics.00086.2016, 201613） Nakamura S-I., Yo-Han Kim, Takashima K.,
Kimura A., Nagai, K., Ichijo, T., Sato, S.：J Amin Sci,
doi：10.2527/jas2017-1431, 2017.
14） Yo-Han, Kim, Nagata, R., Ohkubo, A., Ohtani, N.,
Kushibiki, S., Ichijo, T., Sato, S.：BMC Vet Res, 14：
310, doi.org/10.1186/s12917-018-1637-３, 2018.

© The Ito Foundation

269

食肉の薬剤耐性菌による汚染菌数の測定法の開発・評価
Development and evaluation for determination of number of antimicrobialresistant bacteria in meats

石

原

加奈子・野

村

静

香

（東京農工大学農学部）

Kanako Ishihara and Shizuka Nomura（Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

In order to estimate the number of coliform bacteria harbored antimicrobial resistancegenes in chicken meats, combined method of most probable number method（MPN）and PCR（MPN-PCR）were applied. Coliform bacteria were also isolated from the same chicken meats
and were tested by antimicrobial susceptibilities test. The results of MPN-PCR andantimicrobial susceptibilities of isolates were compared．
The number of bacteria harbored following antimicrobial resistance genes could be,
estimated for 120 chicken meat samples；tetA（average of positive samples, 103.07 MPN/100 g）. For samples from that ampicillintetB（103.59）, blaTEM（103.07）, blaCTX-M（102.80）and blaCMY-2（102.87）（65/120, 54.2%）and tetracycline-resistant coliform bacteria（18/120, 15%）were isolated, thepercentage of detected antimicrobial resistance genes were high［blaTEM, blaCTX-M and/or
blaCMY-2, 81.5％（53/65）；tetA and/or tetB, 100%（18/18）］. These results demonstrated that
MPN-PCR is useful to estimate the number of ampicillin- and tetracycline-resistant coliform
bacteria. On the other hand, for the samples from that cefazolin-，cefpodoxime, amoxicillin/
clavulanic acid- and cefpodoxime/clavulanic acid-resistant coliform bacteria were isolated, thepercentages of detection for blaTEM, blaCTX-M and/or blaCMY-2 were low. Tested major coliform
bacteria isolates inherently produced β-lactamase and these isolates would harbor different
resistance genes from tested genes in this study．
DNA sequence of tetA（27 DNA samples）and tetB（26 DNA samples）were confirmed tobe each tetracycline resistance gene. DNA sequence of blaCTX-M were confirmed to be blaCTX-M-2（2 DNA samples）and blaCTX-M-36（3 DNA samples）. However, 26 out of 31 gene segments

group

amplified by primers for blaCTX-M were identified to blaOXY, blaSED and blahugA. In order to estimate
the number of bacteria harboring blaCTX-M, further investigation was needed using improved
primer pair.

１．目

薬剤耐性菌が食肉等を汚染し，食肉とともに消費的者に摂取され，その薬剤耐性菌がヒトに感染症を食用動物への抗生物質の使用により選択された引き起こした場合，抗菌剤の治療効果が得られな© The Ito Foundation

270

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

いことが危惧される１）。食用動物や食肉を中心にな ら び に blaTEM ４），blaCTX-M ５） お よ び blaCMY-2 ４） を薬剤耐性菌の保菌・汚染割合やその遺伝子型が調PCR法により検出した。各耐性遺伝子が検出され査・報告されているが２），薬剤耐性菌の菌数を測たDNA検体の数の組み合わせから，最確数表を定した報告はない。食肉中の薬剤耐性菌の菌数が用いて，各鶏肉検体の耐性遺伝子保有細菌数を推多いほど，加熱調理を経ても，薬剤耐性菌が食肉定した。

に生残しやすく，調理過程で他の食品を汚染しや

2.3

すい。また，ヒトの腸管内に定着しやすく，他の各鶏肉検体の最も希釈倍率の高い希釈液から分細菌に耐性遺伝子を伝達するリスクも高い。そこ離した大腸菌群１株について，フローズンプレーで本研究では，最確数法（Most Probable Number

ト（栄研化学株式会社，東京）を用い，最小発育

Method，MPN法）に，耐性遺伝子を検出する

阻止濃度を決定した６）。

薬剤感受性試験

PCR法を組み合わせる“MPN-PCR法”により，

2.4

鶏肉を汚染する耐性遺伝子保有細菌の数を推定し

MPN-PCR法で陽性となったtetA ７），tetB ７）おた。また，同じ検体から，大腸菌群を分離・同定

よびblaCTX-M５）について，それぞれのプライマー

し，薬剤感受性を調べ，MPN-PCR法の結果と比ペアで増幅しなおし，塩基配列を決定した。

較した。
２．方
2.1

薬剤耐性遺伝子の塩基配列の決定

３．結果と考察法

3.1

大腸菌群の分離・同定

PCRによる耐性遺伝子の検出

大腸菌群陽性と推定されたBGLB発酵管806本

市販鶏ひき肉120検体を検査材料とし，検体25から，DNA検体を得た。これらから耐性遺伝子

ｇに緩衝ペプトン水225 ml（日水製薬株式会社，を 検 出 し た 結 果 ，tetB が 最 も 多 く 検 出 さ れ東京）を加え，ストマッカー処理し，試料原液と（490/806，60.8％），次にtetA（208/806，25.8％）

した。これを10倍階段希釈して，1000倍希釈液まが多く検出された（Table１）。耐性遺伝子が検出で作成し，各濃度１mlを３本のBGLB発酵管（日された鶏肉検体の割合も，tetB（114/120，95％）

水製薬株式会社）に接種した。35℃で24時間培養およびtetA（82/120，68.3％）が多かった（Table

し，ガスの発生が認められた培養液をEMB培地１）。日本の食用動物の糞便由来大腸菌では，テ（日水製薬株式会社）に接種し，大腸菌群を分離

トラサイクリン耐性株の割合が高く２），その結果した。乳糖ブイヨン発酵管（日水製薬株式会社）と一致した。

で，ガス産生および酸産生を確認後，16S rRNA

耐性遺伝子が検出されたDNA検体の数から，遺伝子の塩基配列を決定し，菌種を同定した 。

各鶏肉検体の汚染耐性遺伝子保有細菌数を推定し

2 . 2 MPN-PCR法による耐性遺伝子保有細菌

た。耐性遺伝子が検出された鶏肉検体の，耐性遺３）

伝子保有細菌数の10を底とする対数の平均および数の推定
上述のガスの発生が認められ，大腸菌群陽性と最 大 値 を Table １ に 示 し た 。 tetB の 平 均 値推定されたBGLB発酵管の培養液500μlを遠心分（103.59MPN/100ｇ）および最大値（105.66MPN/100

離し，沈査を滅菌生理食塩水で洗浄後，滅菌TEｇ）が検査した耐性遺伝子の中で最も高かった

緩衝液に再浮遊させ，加熱抽出によりDNA検体（Table １）。 blaCMY-2 が 検 出 さ れ た DNA 検 体を得た。これらを鋳型として，tetA およびtetB（26/806，3.2％）および鶏肉検体の数（15/120，

４）

４）© The Ito Foundation

271

食肉の薬剤耐性菌による汚染菌数の測定法の開発・評価
Table 1 The antimicrobial resistance genes detected by PCR.
Antimicrobial
resistance genes

Number of positive
DNA sample（%）

Number of positive
chicken sample（%）

Log MPN/100 g
Mean＊

Max

tetA

208

（25.8%）

82（68.3%）

3.07

4.97

tetB

490

（60.8%）

114（95.0%）

3.59

5.66

bla TEM176（21.8%）

71（59.2%）

3.07

4.97

bla CTX-M

51（6.3%）

29（24.2%）

2.80

3.97

bla CMY-2

26（3.2%）

15（12.5%）

2.87

4.97

MPN, most probable number＊mean of positive samples

12.5％）は，最も少なかったが，blaCMY-2保有細菌

びCitrobacter freundiiが続いた（Table２）。

数の最大値（10 MPN/100ｇ）は，tetBの次に高

3.3

かった。

上述の117株の薬剤感受性をTable３にまとめ

4.97

分離株の薬剤感受性

MPN法のBGLB発酵管では，複数の細菌が混在た。アンピシリン耐性株が65株（55.6％）と最もし，増殖するため，耐性遺伝子非保有細菌の遺伝多く，テトラサイクリン耐性株は18株（15.4％）

子により，耐性遺伝子の検出が阻害されることもと少なかった。

想定された。実際に試料原液の培養液からは耐性遺伝子が検出されず，希釈液からは検出された検体も認められた（各遺伝子２～８検体，平均5.8検体）。陽性管数の組み合わせによっては，最確数表により，菌数を推定できないが，本調査では全検体の耐性遺伝子保有細菌数を決定でき，
MPN-PCR法が耐性遺伝子保有細菌数を推定するのに有用であると考えられた。
3.2

分離株の同定鶏肉120検体中117検体から大腸菌群が分離でき，１検体１株を選び，同定した。Escherichia
coliが最も多く，それにButtiauxella agrestisおよTable 2 Identification of isolated coliform

bacteria from chicken meats

Bacterial species

No. of isolates

Escherichia coli
Buttiauxella agrestis
Citrobacter freundii
Klebsiella variicola
Shimwellia blattae
Enterobacter bugandensis
Hafnia paralvei
Enterobacter aerogenes
Lelliottia aquatilis
Unidentified

40
21
20
16
7
2
2
1
1
7

Total

117

Table 3 Antimicrobial susceptibilities of coliform bacteria isolated from chicken meats.
Antimicrobials

MIC range＊

Breakpoint＊

No. of resistantisolates（%）

Ampicillin
Cefazolin
Cefpodoxime
Amoxicillin/clavulanic acid
Cefpodoxime/clavulanic acid

≤1
≤0.5
≤0.5
≤8/4
≤2/4

32
8
8
32/16

65
56
12
50

Tetracycline≤0.5 - >64

-

>128
>64
>64
>64/32
>16/4

＊＊

16

（55.6%）（47.9%）（10.3%）（42.7%）

5 （4.3%）18 （15.4%）

MIC, minimal inhibitory concentration＊μg/ml＊＊ >3 two-fold concentration decrease in an MIC for cefpodoxime/clavulanic acid vs cefpodoxime alone© The Ito Foundation

272

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 4 Comparison of percentage between antimicrobial resistance identified by isolation and MIC tests

and PCR

Antimicrobials

Antimicrobial
Antimicrobial
resistanceresistance genes
bacteria isolated detected sample
sample No.
No.
（A）
（B）

Concordance rate
C / A

（%）

C / B

（%）

Ampicillin

65 （54.2%）

83 （69.2%）1）

Cefazolin
Cefpodoxime

56 （46.7%）
12 （10.0%）41 （34.2%）2）
41 （34.2%）2）

6 / 12 （50.0%）

6 /

41 （14.6%）

Amoxicillin/clavulanic acid

50 （41.7%）

15 （12.5%）3）

10 / 50 （20.0%）

10 /

15 （66.7%）

1 / 5 （20.0%）
18 / 18 （100%）

1 / 15 （6.7%）
18 / 114 （15.8%）

Cefpodoxime/clavulanic acid5

（4.2%）

15 （12.5%）3）

Tetracycline

18 （15.0%）

114 （95.0%）4）

53 / 65 （81.5%）
23 / 56 （41.1%）

53 /
23 /

83 （63.9%）
41 （56.1%）１）The sample number was counted that one or more bla genes of blaTEM, blaCTX-M or blaCMY-2 was detected in.
２）The sample number was counted that blaCTX-M or/and blaCMY-2 was detected in.
３）The sample number was counted that blaCMY-2 was detected in.
４）The sample number was counted that tetA or/and tetB was detected in.
Ｃ）No. of sample from that both antimicrobial resistant bacteira and antimicrobial resistance genes were identified byisolation, antimicrobial susceptibility test and PCR.

3 . 4 MPN-PCR法と分離株の薬剤感受性の比

中，テトラサイクリン耐性株が分離されたのは18
検体（15.8％）と少なかった（Table４）。

較
MPN-PCR法を評価するため，各検体から検出

従来の分離株の薬剤感受性を調べる方法では，された遺伝子の組み合わせおよび分離株の薬剤感１検体１株または数株を選んで薬剤感受性を調べ受性の比較を行った（Table４）。blaTEM, blaCTX-Mおるのが一般的である２）。MPN-PCR法では，鶏肉よびblaCMY-2 のうちいずれか１遺伝子を保有するの希釈液中に存在する複数の大腸菌群を混合培養と，アンピシリン耐性になるため，この３遺伝子し，その中に耐性遺伝子保有細菌が一定数以上存のいずれかが検出された検体数およびアンピシリ

在すれば，耐性遺伝子が増幅されるため，従来法

ン耐性株が分離された検体数を比較した。アンピより高感度に，耐性菌を検出できたと考えられた。

シリン耐性株が分離された65検体のうち，３遺伝

一方，セファゾリン等の抗生物質に対する耐性

子 の う ち い ず れ か が 検 出 さ れ た の が ，53 検 体とそれらに耐性となる遺伝子の検出の一致率は，（81.5％）であったのに対し，３遺伝子のうちい6.7％から66.7％と低かった（Table４）。

ずれかが検出された83検体中，アンピシリン耐性

Citrobacter spp.およびEnterobacter spp.は，先株が分離されたのは53検体で，その割合（63.9％）

天的にβ-ラクタマーゼを産生する細菌として知は低かった。

られている。また，Buttiauxella agrestisも全ゲノ

同様に，tetAまたはtetBのいずれかを保有する

ムの塩基配列決定により，β-ラクタム系抗生物とテトラサイクリン耐性になるため，この２遺伝

質への耐性が報告されている ８）。今回，MPN-

子のいずれかが検出された検体数およびテトラサ

PCR法で検出した耐性遺伝子は，主にE. coliで多イクリン耐性株が分離された検体数を比較した。

く保有される耐性遺伝子から選出した。E. coliは，

テトラサイクリン耐性株が分離された18検体のす分離した大腸菌群の中で，最も優勢な菌種だった

べてから，２遺伝子のいずれかが検出されたのにが，その割合は，34.2％（40/117）であり，上述

対し，２遺伝子のいずれかが検出された114検体の先天的にβ-ラクタム系抗生物質に耐性を示す© The Ito Foundation

273

食肉の薬剤耐性菌による汚染菌数の測定法の開発・評価
Table 5 Antimcirobial resistance genes by identified by DNA sequencing
Antimicrobial resistancegene detected by PCR

Antimicrobial resistance gene
identified by DNA sequencing

blaCTX-M

No. of chicken samples

No. of DNA samples

blaCTX-M-36１）

3

3

blaCTX-M-2 group2

2

blaOXY-6

9

9

blaOXY-2

1

3

blaSED２）

1

1blahugA３）

12

13

tetA

tetA

21

27

tetB

tetB

9

26

Concordance rate of DNA sequence, １）83-84%；２）92%, ３）around 70%

菌種の割合が高かった。これらが産生するβ-ラDNAを鋳型とし増幅した遺伝子のシークエンス

クタマーゼは，E. coliが産生するものとは異なり，解析を行ったため，波形に重複が生じたと考えら

MPN-PCR法と分離株の薬剤感受性の結果の一致れた。tetBは，陽性検体が多いため，遺伝子のク率が低くなったと考えられた。

ローニング後の配列決定や，異なるプライマーで

3 . 5 MPN-PCR法により検出した耐性遺伝子の塩基配列の決定
鶏肉28検体由来のDNA31検体から増幅したの増幅など，精査が必要と考えられた。
４．要

約

blaCTX-M ，鶏肉21検体由来のDNA27検体から増幅

最 確 数 法（Most Probable Number Method ，したtetAおよび鶏肉９検体由来のDNA26検体か

MPN法）に，耐性遺伝子を検出するPCR法を組ら増幅したtetBの塩基配列を決定した。BLAST

み合わせた“MPN-PCR法”により，鶏肉中の耐検索により配列の一致率の高い遺伝子と同定し性遺伝子保有細菌数を推定し，同検体より分離した 。そ の 結 果 を Table ５ に ま と め た 。既 報 のた大腸菌群の薬剤感受性を調べた。鶏肉120検体

blaCTX-M を 増 幅 す る プ ラ イ マ ー を 用 い た が ５），中のtetA（陽性検体の平均，103.07MPN/100ｇ），

blaCTX-M-36およびblaCTX-M-2 groupに加えて，同じクラス

tetB（103.59），blaTEM（103.07），blaCTX-M（102.80）およＡではあるが，blaCTX-Mとは異なるblaOXY，blaSEDおびblaCMY-2（102.87）の保有細菌数が推定できた。ア

よびblahugAが増幅され，blaCTX-M保有細菌数を決定

ンピシリン耐性株またはテトラサイクリン耐性株

するには，プライマーの配列を検討する必要がが分離された35検体または18検体からは，高率にあった。

耐性遺伝子が検出され［81.5％（53/65）またはtetAまたはtetBが検出された鶏肉114検体のう100％（18/18）］，MPN-PCR法は有用であった。

ち，テトラサイクリン耐性株が分離された検体は一方，アモキシシリン／クラブラン酸およびセ18検体（15.8％）と少なかったため，当初の研究

ファゾリン等の耐性株が分離された検体からの計画にはなかったが，tetAおよびtetBの塩基配列

blaTEM，blaCTX-MまたはblaCMY-2の検出率は低かった。

を決定した。いずれの配列も既知のそれらの遺伝

これは，分離株に先天的にβ-ラクタム系抗生物子と高い一致率を示し，同遺伝子と同定できた。

質に耐性を示す菌種が多く含まれ，今回検査した

ただし，一部は波形の重複等により，配列が決定

耐性遺伝子とは異なる耐性遺伝子を保有していたで き な い も の も あ っ た 。混 合 培 養 液 か ら 得 たためと推察された。blaCTX-M の塩基配列を決定し© The Ito Foundation

274

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

たところ，blaCTX-M-36およびblaCTX-M-2 groupに加えて，
同 じ ク ラ ス Ａ で は あ る が ，blaCTX-M と は 異 な る
blaOXY等と同定された。blaCTX-M保有細菌数の推定には，プライマー等の検討が必要である。
文献１） WHO, Antibiotic resistance, https://www.who.int/
news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistances,
2018２） 動物医薬品検査所 http://www.maff.go.jp/nval/
yakuzai/pdf/h27cyousakekkagaiyou.pdf
３） Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane,
D. J.：J. Bacteriol., 173, 697～703, 1991.

４） Kozak, G. K., Boerlin, P., Janecko, N., Reid-Smith,
R. J., Jardine, C.：Appl. Environ. Microbiol., 75, 559～566, 2009.
５） Edelstein, M., Pimkin, M., Palagin, I., Edelstein, I.,
Stratchounski, L.：Antimicrob. Agents Chemother.,47, 3724～3732, 2003.
６） Clinical and Laboratory Standards Institute.
Performance standards for antimicrobial disk anddilution susceptibility tests for bacteria isolated fromanimals, M31-A3, 2008.
７） Sengeløv, G., Halling-Sørensen, B., Aarestrup, F.
M.：Vet. Microbiol., 95, 91～101, 2003.
８） Jothikumar, N., Kahler, A., Strockbine, N.,
Gladney, L., Hill, V. R.：Genome Announc. 2, e0106014, 2014.

© The Ito Foundation

275

筋肉中の虫体数を予測できるトキソプラズマ感染豚の検出法
Detection strategy of Toxoplasma gondii infected pigs and estimation ofcysts burden in muscles

高

島

康

弘

（岐阜大学応用生物科学部）

Yasuhiro Takashima（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

Toxolasma gondii is an important zoonotic parasite that infects many warm-blooded
animals including livestock and poultry. Although approximately 5 ％ of Japanese pigs showed
seropositive for T. gondii, it has not yet been known whether these seropositive pigs harbor
infectious cysts in the muscle. In this study, to evaluate the relation between antibody
production and parasite burden, the number of latent cysts in the tissue, in T. gondii infected
pigs, a gene modified T. gondii（TgCatJpGi1/TaJ/GRA red）,which expresses a red fluorescentprotein, was used. The cysts of this strain in the host tissue can be easily detected by theobservation using fluorescent stereoscopic microscope. Although the infected pig produced
anti-T. gondii antibodies, which reacted with tachyzoites crude antigens, and the antibodies
were maintained during entire period of the observation, more than 100 days, any cyst was not
isolated from the tissue of the infected pig. In the preliminary experiments, the sera of infected
pig did not reacted with a potentially immunogenic bradyzoites/cyst-specific protein. These
results showed that seropositive pig does not always harbor infectious cyst in the tissue. It
might be possible to establish the serodiagnosis system to distinguish cysts harboring pigs andpigs temporally exposed to T. gondii.

１．目には抗体陽性と虫体保有はほぼ同義と考えられて的いる。また潜伏感染個体は病変を一切形成しない

トキソプラズマは豚に肺炎を起こすほか，食肉ため食肉検査で摘発されることもない。すなわ

を介して人にも感染する人獣共通感染性原虫であち，年間と畜数（約1600万頭）の５％にあたる80る。家畜衛生状態の改善とともに，わが国におけ万頭のトキソプラズマ虫体保有個体が食肉としてる豚での発例は近年激減し「養豚業を経済的に脅

毎年市場に出ているものと危惧される２）。一方で

かす豚の病気」としては過去のものになった感が抗体陽性個体の筋肉に含まれる虫体の数や位置にある。一方で，今なお５％程度の豚が無症状ながついてはほとんどデータがない。もし全身の筋肉

ら抗体陽性を示す１）。本原虫はいったん感染する

中に一様に虫体が分布するのであれば，抗体陽性と一生にわたって筋肉中に潜伏するため，一般的個体から切り分けられた「一人前」の精肉にはほ© The Ito Foundation

276

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ぼ確実に虫体が存在することになる（消費者に届

トは感染マウスの脳から採材した。C57BL/6Jマ

けられる精肉の５％は感染源となる）一方，特定ウスに100虫体のタキゾイトを腹腔摂取し，30日

箇所に虫体が集中して感染しているのであれば当以上たってから脳を採取し脳内に形成されたシス

該箇所以外から切り出された精肉にはリスクがほトを得た。

とんどない（食肉が感染減となるリスクは５％よ

2.3

感染

りずっと低い）。このように，豚の体内における

実験１：

潜伏虫体の分布状況を知ることは，食の安全の観

１歳齢のマイクロミニピッグ１頭に10５虫体の点から豚肉の安全性を評価する際に非常に重要な

TgCatJpGi1/TaJ GRA red株タキゾイトを皮下接データである。ところが現行の血清学的検査では種し経時的に採血した。５か月後に安楽殺し，脳，

家畜におけるトキソプラズマ感染歴を確かめるこ

心臓，肝臓，肺，腎臓，舌，胃，筋肉（バラ，肩，とはできるが，可食部における潜伏虫体の有無・

腿，ロース，ヒレ）を採材した。

数や感染部位を推測することはできない。そこで

実験２：

本研究では実際に豚にトキソプラズマを実験感染

１歳３か月齢のマイクロミニピッグ１頭に1000

し，潜伏感染した虫の数・位置と抗体価の相関を個のTgCatJpGi1/TaJ GRA red株シストを経口摂定量的に評価するとともに，その時の抗体の産生取させ経時的に採血した。８か月後に安楽殺し，

状況を合わせて調査する。２つのデータを比べる

脳，心臓，肝臓，肺，舌，胃，膵臓，筋肉（バラ，ことで，虫体数の多い個体と少ない個体の間で抗

肩，腿，ロース，ヒレ）を採材した。

体産生にどのような違いがあるのか明らかにでき

実験３：れば，抗体の状況から豚体内におけるトキソプラ

５か月齢のマイクロミニピッグ５頭に10７虫体

ズマ潜伏虫体の状況を間接的に把握できる可能性のＸ株タキゾイトを皮下接種した。死亡時に脳，がある。

肝臓，肺，腎臓を採材した。

２．方
2.1

2.4

法

実験１および２：

実験動物

臓器を厚さ５mm程度に薄切し，２枚のスライ

５か月から１年３か月齢マイクロミニピッグ（富士マイクラ）を用いた。
2.2

虫体の検出

ドガラスに挟んで圧平したうえで蛍光顕微鏡で観察した。臓器，あるいは筋肉の部位ごとに５cm

寄生虫×５cm程度の薄切を10-22作成して観察した。

豚に対して病原性のないTgCatJpGi1/TaJを親実験３：

株 に 作 成 し た ， 赤 色 蛍 光 タ ン パ ク （DsRed

パラフィン包埋のうえ薄切し，ヘマトキシリン

Express）を 発 現 す る 組 換 え 虫 体 TgCatJpGi1/

エオジン染色を施して監査付いた。肺については

TaJ GRA red株３），豚に対して強い病原性を示す

抗トキソプラズマSAG１抗体を用いて免疫染色

Ｘ株，および世界中で研究用に使用されることのを行った。

多いPLK株を用いた。これらの株は7.5％FCSを2.5

含むRPMI培地で培養したVero細胞にタキゾイト

抗体の検出は過去に報告された手法に従ってとして感染させて維持した。またTgCatJpGi1/

Western Blotting法にて実施した３）。この方法で

TaJ株およびTgCatJpGi1/TaJ GRA red株のシスはVero細胞に感染させて培養したPLK株の粗抗© The Ito Foundation

抗体の検出

277

筋肉中の虫体数を予測できるトキソプラズマ感染豚の検出法

原をSDSゲルで泳動した後メンブレンに転写し，は見られなかった。さらにタキゾイトを接種した

ここに検体となる豚血清を反応させる。

豚は５か月後に，シストを経口摂取させた豚は８か月後に安楽殺し各臓器に潜伏感染しているシス３．結果と考察

トがあるかどうか観察した。本実験で用いた組換

TgCatJpGi1/TaJ GRA red株のシストを感染さ

え原虫（TgCatJpGi1/TaJ GRAred株）のシスト

せたマイクロミニピッグの各臓器からは虫体が検は強い赤色蛍光を示すので，存在していれば蛍光出されず，また抗トキソプラズマ抗体の産生も見

実態顕微鏡下で簡単に視認することができるられなかった。これは当該個体に感染が成立しな（Fig.２）。ところがいずれの豚についても，観察かったものと思われる。同様の感染条件で本組換したすべての臓器において虫体の存在は確認でき

え株の親株（TgCatJpGi1/TaJ株）はマイクロミなかった。これらの豚の体内には潜伏感染していニピッグに感染していることから２），本組換え株

るシストは存在しないか，きわめて少ない数であの豚への感染性は親株に比べて若干低下しているることが推測される。以上のことから抗体陽性豚

可能性がある。一方TgCatJpGi1/TaJ GRA red株

が必ずしも一定数以上のシストを可食部に有してのタキゾイトを感染させたマイクロミニピッグでいるとは限らないことが明らかになった。わが国は，感染35日目から血中に抗トキソプラズマ抗体

では年間約80万頭の抗トキソプラズマ抗体陽性豚の存在が認められ，感染119日たっても消失するが市場へ出ていると試算されるが１，２），これらをことはなかった（Fig.１）。抗体の存在はタキゾ

ただちに「筋肉中にシストを含む個体」「ヒトへイト粗抗原を抗原としたWestern Blotting法にての感染源」と考えることはリスクを過大に評価す検出したが，経時的に採取した血清（感染後35，ることになると思われる。

56，70，84，98，119日）が反応する抗原のバン

次に豚に対して強い病原性を示すことが分かっ

ドパターンは観察期間中を通じてほぼ一定であっているＸ株（国内分離・未発表株）をマイクロミ

た（Fig.１）。実験期間中，感染豚が何らかの症

ニピッグ５頭に感染させたところ，３頭が２週間状を示すことはなく，活動性や食欲にも特に変化以内に死亡した。死亡した３個体ではいずれも感

80kDa
58kDa
46kDa
32kDa
25kDa

0

14

35

56

70

84

98

119

Fig. 1 Production of anti T. gondii Antibodies. Western blot analysis using tachyzoite lysate as

antigen. Serum samples were collected over time from a TgCatJpGi1/TaJ/GRA red tacyzoite
infected micromini pig. The number under each lane indicates days post infection.

© The Ito Foundation

278

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

心臓

肝臓Fig. 2 Red fluorescent parasite in the edible portion of chicken.

TgCatJpGi1/TaJ/GRA red parasites in the hart and liver of a chicken.

染後10日程度で抗トキソプラズマ抗体の産生が確あまり知られていない。そこで本研究では，マイ認されており，急性症状を示す場合は抗体価の上クロミニピッグにトキソプラズマTgCatJpGi1/

昇が速いものと推測される。タキゾイト粗抗原を

TaJ GRA red株およびＸ株を感染させたところ，抗原としたWestern Blotting法にこれら個体の血いずれの株に感染した個体においても抗トキソプ

清を供したところ，反応する抗原のバンドパター

ラズマ抗体の産生が確認された。しかしながらそンはFig.１に示したTgCatJpGi1/TaJ GRA red株の組織内から潜伏感染中のシストは検出されな感染個体のものと類似していた。さらに死亡後にかった。本研究により，抗体陽性豚が必ずしも一各臓器を精査したところ，肺を中心に多数のタキ

定数以上のシストを可食部に有しているとは限らゾイトが見られたがシストの形成は認められなないことが明らかとなり，抗体陽性個体と「筋肉かった。

中にシストを含む個体」「ヒトへの感染源となる

TgCatJpGi1/TaJ GRA red株およびＸ株を感染個体」とを区別する必要性が示された。予備的実させた個体の血清を潜伏期虫体（ブラディゾイ

験では，これらの個体から得られた血清は潜伏期

ト）特異的抗原に反応させたところ，抗原抗体反虫体（ブラディゾイト）特異的抗原に反応してい応は見られなかった。なお精査が必要であるが，ない。このような抗原を用いた血清学的検査法を

潜伏期虫体（ブラディゾイト）特異的抗原と活性確立すれば，体内にシストを有した個体とそうで期虫体（タキゾイト）特異的抗原を戦略的に使いない個体を区別できる可能性がある。

分けることで，体内にシストを有する個体と一過性の感染を経ただけの個体を区別できる可能性が
示された。
４．要

約

トキソプラズマは多くの種類のほ乳類，鳥類に感染する重要な人獣共通感染症の病原体である。
わが国の豚の約５％が抗体陽性であるが，抗体陽

文献１） Matsuo, K., Kamai, R., Uetsu, H., Goto, H.,
Takashima, Y., Nagamune, K.：Parasitol. Int., 63,
638～639, 2014.
２） 高島康弘：Alll about SWINE 50, 16～19, 2017.
３） Appiah-Kwarteng, C., Saito, T., Toda, N., Kitoh, K.,
Nishikawa, Y., Adenyo, C., Kayang, B., Owusu, E. O.,
Ohya, K., Inoue-Murayama, M., Kawahara, F.,
Nagamune, K., Takashima, Y.：Parasitol Int., 69, 114～120, 2019.

性豚が筋肉中にどの程度虫体を保育しているかは© The Ito Foundation

279

牛趾乳頭腫症の性状解明を目指したメタゲノム解析と疫学研究
Metagenomic and epidemiological studies for characterization ofpapillomatous digital dermatitis

後

藤

恭

宏

（九州大学大学院医学研究院）

Yasuhiro Gotoh（Faculty of Medical Sciences, Kyushu University）

Papillomatous digital dermatitis（PDD）is a severe infectious disease that causing
lameness in dairy cattle worldwide. It is an important animal health and welfare concern,
resulting in reduced milk yield and reproductive performance, with substantial costs oftreatment and control. Epidemiological evidence, such as geographic spread and healing after
antibiotic treatment, shows PDD as bacterial infection. Various bacterial species have been
identified, including spirochaetes, Bacteroides spp., Fusobacterium spp. and Peptococcus spp.
Now, PDD is considered as causing by multiple bacteria including non-cultivate species, andone of the polymicrobial diseases, new category of infectious diseases.
For metagenomic approach to characterization of PDD, we collected a large PDD legion
and purified total DNA that enriched bacterial DNA from the lesion. Six types of libraries wereprepared and sequenced with Illumina MiSeq platform. After removing reads from bovine
genome, the remained reads were assembled using metaplatanus and obtained draft sequenceswith binning. Draft genomes of several bins were performed PCR based gap-filling to obtainhigh-quality draft genomes. To identify true causative agents, we purified total DNA fromanother four lesions and sequenced with Illumina HiSeq platform. The reads were performed
mapping-based analysis to high-quality draft genomes. As a result, 18 bins were commonly
detected with highly redundancy among these lesions. On the 13 out of 18 bins, the complete
genomes were succeeded to reconstitute. This is the first step to elucidate the polymicrobialinteractions involved in the etiology of PDD. To examine role of each bacterial species orinteraction between species（at the presence/absence）on the clinical stage of PDD, thelocalization of each causative agent clarifies. Specific probes that able to detect causative
agents for in situ hybridization analysis are in development.
These metagenomic-based approach for polymicrobial disease caused mainly by
uncultivated bacteria is a new research strategy and research field. Besides contributing to
PDD research and disease control, the results of this study can be applied to otherpolymicrobial disease research.

© The Ito Foundation

280

平成30年度

１．目

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

基盤として，PDD起因菌群の同定と各起因菌の的細菌学的特徴を明らかにしpolymicrobial disease

牛 趾 乳 頭 腫 症 （Papillomatous digitalとしての本症の実態を解明する。また，各菌のゲ

dermatitis；PDD）は，乳牛に見られる趾皮膚表

ノム情報等を利用して，本症の早期診断やサーベ層の伝染性炎症性疾患である。罹患牛は激しい疼

イランス手法を開発し，本症のリスク評価を検討

痛を伴い，跛行，体重減少，乳量や繁殖成績の低する。

下が見られる。一度発生した牛舎では発生が繰り返され，根絶が困難であることから，治療と管理

２．方法に多大なコストがかかり，経済的損失および動物

2.1

福祉の点で重要な問題である。1974年に世界で初

慢性期の比較的大きなPDD病変を採集し，１めてイタリアから報告され，その後ほぼすべての

mm３ 程度の大きさに断片化した。細菌を遊離さ国で報告されている。日本国内では，北海道全域せるために，断片化したPDD病変に輸送培地をに加え，北海道からの導入牛により各地の酪農地

加え，室温で１時間振とうした。その後，細胞ろ帯へ発症が拡大している。抗生物質を用いた治療

過フィルター（メッシュサイズ40μｍ）を用いてが有効なことから，細菌感染症と考えられておPDD病変や遊離した牛細胞を除去し，ろ液を遠り ，病変部からスピロヘータ様のらせん菌が高心分離し，集菌した。集菌した菌体は，次の３つ頻度に検出されている。しかしながら，菌の分離の酵素を用いて処理（リゾチーム，アクロモペプに成功した例は限られており，これまでに再現試

チナーゼ，プロテイナーゼＫ）し，さらに10％験の成功例の報告もない。このことから真の起因

SDSを加え，完全に溶菌させた。この溶液はフェ菌は決定されていない。これまでの細菌学的およノール抽出およびエタノール沈殿により，total

び分子生物学的解析により，PDDは難培養性のDNAを調製した。また，ビーズ破砕法によるスピロヘータ様細菌を含む未培養細菌群を主体とPowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio）を用いた

した複数の細菌による感染症であると考えられて

total DNAの調製も行った。

１）

いる。優勢に存在するトレポネーマだけでも

１，
２）

2.2

メタゲノム解析用total DNA調製

PDD病変部の菌種組成解析

３-５以上であると報告されている（Treponema

メタゲノム解析用total DNAが標準的なPDD病

medium/Treponema vincentii-like, Treponema

変であることを確認するために菌種組成解析を

phagedenis-like, Treponema putidum/Treponema

行った。すでに日本各地から収集済みの５病変

denticola-like spirochaetesなど）。これらのこ（IZ，MJ，CH1，CH8，HD）を参照として含めた。

と か ら ，新 た な 疾 患 概 念 で あ る polymicrobial

16S rRNA full-length clone library（1500 bp程度）

diseaseの１つにあげられている 。いずれにおいは，バクテリア共通プライマー27Ｆと1492Ｒを用ても，発症に関与する各菌の役割や発症のメカニ

いてPCR増幅し，pUC118にクローニング後，大ズムなどの詳細は不明である。多くの菌種の分離

腸菌に形質転換し，クローンライブラリを作成し培養が望めない，および，公開されたウシゲノム

た。192程度ずつキャピラリーシーケンスし，配列がある，という点でPDD病変のメタゲノム

sequencher を 用 い て ア セ ン ブ リ す る こ と で ク

解析は非常に有効な解析法である。本研究では，

ローンの配列を決定した。得られたクローン配列

PDD病変のメタゲノム解析から得られた情報をは，相同性99％でクラスタリングし，operational

３，４）

５）

© The Ito Foundation牛趾乳頭腫症の性状解明を目指したメタゲノム解析と疫学研究

taxonomic unit（OTU）解析した。
2 . 3 シーケンス解析と高精度ドラフト配列の３．結果と考察
3.1

構築

281

total DNAの調製および菌種組成

高精度なドラフト配列の構築を目指すために，

メタゲノム解析用total DNA調製により，次世

６種類のイルミナライブラリ（ペアエンドライブ

代シーケンス解析をするための十分なtotal DNA

ラリ２種類，メイトペアライブラリ４種類；４，が得られた。この調製法による菌種組成の偏りが８，10，12kb）を調製し，MiSeq（イルミナ）をな い こ と を 確 認 す る た め に ，PowerSoil DNA

用いてシーケンスデータを取得した。牛由来のIsolation Kit（MoBio）を用いて同じ病変から調リードは，ウシゲノム配列（GCA_002263795.2）

製したtotal DNAもあわせて菌種組成の比較をに対してbowtie2

によるマッピング解析（相同行った。また，メタゲノム解析用のPDD病変が性≥90％）で除去した。得られた非牛由来リード

標準的なPDD病変であることを確認するために，は metaplatanus を 用 い て ア セ ン ブ リ し た 。

す で に 日 本 各 地 か ら 収 集 済 み の ５ 病 変（IZ ，scaffoldは予測された遺伝子のdi-codon usageに

MJ，CH1，CH8，HD）を参照として加えた。最よりクラスタリングし，系統推定は，16S rRNA

近は網羅的な菌種組成解析には次世代シーケンサ

配列の検索およびuniversal single copy geneを用を使用して行われることが多いが，解析に用いる

いて行った。

配列長が400bp程度と短く，解像度が低い。PDD

2.4

６）

病変のように複数存在する同属菌種間を識別する

真のPDD起因菌群の決定

異なる農場および異なる時期に採取した４つのためには，16S rRNA full-length clone library解病 変 は ，PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio）

析により解像度を高める必要がある。６つの病変を用いてtotal DNAを精製した。HiSeq2500（イから計1547のクローン配列を取得し，相同性99％

ルミナ）を用いてシーケンス解析（ペアエンド，の閾値でOTU形成したところ391となった。それ

150 x2, 1 Flow cell）した。得られたリードデー

ぞれのOTUについて，菌種同定を行った（Table

タは，高精度ドラフトゲノム配列を参照配列にし１）。メタゲノム解析に用いた病変は，これまでたマッピングし，各病変中の起因菌群の存在量はに報告されている菌種組成と同様であり，そのFPKM （fragments per kilobase per million

total DNAは菌種を網羅的に含むことが確認されreads mapped）として算出した。

た。

2.5

病変部における各起因菌の局在の特定

3.2

高精度ドラフトゲノム配列の構築

異なる農場および異なる時期に採取した４つのMiSeqシーケンサにより計150Gbのデータ量を病変は，病期の決定をするために，肉眼的観察に取得した。牛由来リードを除去するために，ウシよる病変部の形態学的診断を行った後，ただちにゲノム配列を用いてマッピング解析したところ，

ホルマリン固定し，パラフィン包埋切片を作成

12Gbの非牛由来リードが得られた。このリード（FFPE切片）した。FFPE切片にはヘマトキシリ

をmetaplatanus（http://platanus.bio.titech.ac.jp/

ン・エオジン染色を実施し，病理的診断を行い，

metaplatanus）を用いてアセンブリ，クラスタリ

２つの診断法による知見を照らしあわせ，PDD

ングした（Fig.１）。さらにクラスタごとのドラ

病変の病期（急性期，慢性期）を決定した。

フト配列は，PCRによるギャップフィリングを行い，高精度ドラフトゲノム配列の構築に成功した。

© The Ito Foundation

282

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 Microbial population analysis（OTU abundance, %）using 16S rRNA full-length clone library.
OTUs

Enrich
482

Whole
226

IZ
163

MJ
172

CH1
182

CH8
171

HD
151

PDD
1547

OTU01

0.0%

1.8%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.3%

Luteococcus japonicus-like bacterium

98

OTU02

0.8%

0.4%

2.5%

5.2%

0.0%

0.0%

1.3%

1.3%

Porphyromonas levii-like bacterium

97

OTU03

0.4%

0.9%

0.0%

1.7%

0.0%

0.0%

0.0%

0.5%

Porphyromonas levii

99

OTU04
OTU05

0.0%
1.2%

0.0%
2.2%

0.0%
0.6%

0.0%
0.6%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

8.6%
0.0%

0.8%
0.8%

uncultured bacterium
uncultured bacterium

89
92

OTU09

2.1%

0.0%

1.8%

0.0%

0.0%

1.8%

0.0%

1.0%

Lachnospiraceae bacterium canine oral taxon 024

96

OTU10
OTU11

1.2%
0.4%

0.4%
0.0%

0.0%
2.5%

1.2%
1.2%

0.5%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
1.3%

0.6%
0.6%

Peptostreptococcaceae bacterium canine oral taxon 003
Peptostreptococcaceae bacterium canine oral taxon 030

99
99

OTU12

2.7%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.8%

Peptostreptococcaceae bacterium canine oral taxon 065

99

OTU13

4.8%

0.9%

1.2%

0.0%

1.6%

0.0%

0.0%

1.9%

Peptostreptococcaceae-like bacterium

95

OTU14

2.5%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.8%

Peptostreptococcaceae bacterium canine oral taxon 071

99

OTU15
OTU16

0.6%
1.5%

0.0%
0.4%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
2.7%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.2%
0.8%

Peptostreptococcaceae bacterium canine oral taxon 135
Peptostreptococcus sp. oral clone EX153-like bacterium99
95

Classification

Ident
%

OTU17

5.2%

1.3%

1.8%

1.2%

0.5%

0.0%

0.0%

2.2%

Selenomonas dianae-like bacterium

92

OTU18
OTU19

0.6%
0.4%

0.0%
0.9%

0.6%
0.6%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.3%
0.3%

Selenomonas-like sp. oral clone DM071-like bacterium
Tissierella sp. canine oral taxon 029-like bacterium

91
89

OTU20
OTU21

0.6%
0.8%

0.4%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.3%
0.3%

uncultured bacterium
uncultured bacterium

93
92

OTU22
OTU23
OTU24

0.6%
2.1%
0.2%

0.0%
1.3%
0.0%

1.2%
1.8%
5.5%

4.1%
0.0%
8.7%

0.0%
1.6%
0.5%

0.0%
1.2%
0.0%

0.0%
13.9%
1.3%

0.8%
2.7%
1.8%

uncultured Catonella sp.
uncultured Firmicutes bacterium
uncultured Firmicutes bacterium

94
100
99

OTU25
OTU26
OTU27

2.3%
0.6%
0.6%

0.9%
0.0%
0.0%

1.2%
2.5%
0.6%

0.0%
0.0%
0.0%

2.7%
0.0%
0.0%

7.6%
0.0%
0.6%

0.0%
0.0%
0.0%

2.1%
0.5%
0.3%

uncultured Firmicutes bacterium
uncultured Firmicutes bacterium
uncultured Firmicutes bacterium

100
93
96

OTU28
OTU29

0.6%
3.1%

0.0%
0.9%

0.0%
9.8%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.2%
2.1%

uncultured Firmicutes bacterium
uncultured Firmicutes bacterium

89
100

OTU30
OTU31

0.2%
0.2%

0.9%
0.9%

0.6%
0.0%

2.9%
0.0%

1.6%
0.0%

0.0%
0.0%

1.3%
0.0%

0.9%
0.2%

uncultured rumen bacterium
uncultured bacterium

91
99

OTU32
OTU33

0.2%
0.6%

0.9%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.0%
0.0%

0.2%
0.2%

Aerococcus sp. 4101
Aerosphaera taetra

99
99

OTU34
OTU35
OTU36

2.5%
0.0%
1.7%

0.0%
0.0%
4.9%

0.6%
0.0%
0.0%

0.6%
4.1%
0.0%

0.0%
0.0%
0.0%

0.0%
0.0%
0.0%

0.0%
0.0%
0.0%

0.9%
0.5%
1.2%

Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme 1_1_36S
uncultured bacterium
Spirochaeta sp. canine oral taxon 314

99
99
99

OTU37
OTU38
OTU39

0.0%
0.0%
3.7%

0.0%
1.3%
4.4%

0.6%
0.0%
1.8%

0.6%
0.0%
6.4%

0.0%
0.0%
0.0%

3.5%
0.0%
0.0%

0.7%
0.0%
1.3%

0.6%
0.2%
2.8%

Treponema refringens
Treponema sp. canine oral taxon 199
Treponema sp. canine oral taxon 233

99
99
99

OTU40
OTU41

0.0%
0.8%

0.0%
7.5%

0.0%
0.6%

0.0%
8.7%

4.9%
23.1%

1.8%
1.8%

0.0%
0.0%

0.8%
5.3%

Treponema sp. canine oral taxon 233
Treponema sp. canine oral taxon 249

99
99

OTU42
OTU43

2.7%
9.1%

2.7%
19.9%

2.5%
3.7%

0.0%
0.0%

0.5%
0.0%

0.6%
0.0%

0.0%
22.5%

1.6%
8.3%

Treponema sp. canine oral taxon 356
Treponema sp. G179

99
99

OTU44
OTU45
OTU46

3.3%
0.4%
0.0%

7.5%
4.0%
1.8%

0.0%
8.0%
0.0%

0.0%
0.6%
0.0%

0.0%
0.0%
0.0%

0.0%
0.0%
0.0%

2.0%
0.0%
0.0%

2.3%
1.6%
0.3%

Treponema sp. G179
Treponema sp. G179-like bacterium
Treponema sp. G179

99
97
99

OTU47

4.4%

0.0%

0.6%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

1.4%

Treponema sp. PT2

100

OTU48
OTU49
OTU50
OTU51

2.9%
0.0%
0.2%
1.9%

8.4%
0.0%
1.3%
0.9%

6.1%
0.0%
0.0%
0.6%

9.3%
5.8%
0.0%
0.0%

17.6%
15.9%
0.0%
0.0%

33.3%
7.0%
2.9%
0.0%

18.5%
0.0%
3.3%
0.0%

11.4%
3.3%
0.9%
0.8%

Treponema sp. PT6（※T. phagedenis）
uncultured Treponema sp.
uncultured Treponema sp.
uncultured Treponema sp.

99
100
99
97

uncultured Treponema sp.
uncultured Treponema sp.
uncultured Treponema sp.
uncultured bacterium
uncultured Bacteroidetes bacterium
uncultured Bacteroidetes bacterium
uncultured Deferribacteraceae bacterium
uncultured Tenericutes bacterium
Mycoplasma fermentans M64
Mycoplasma hyopharyngis

99
99
97
99
100
100
95
100
100
99

OTU52

1.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.3%

OTU53
OTU54
OTU06
OTU07
OTU08
OTU55
OTU56
OTU57
OTU58

0.6%
0.6%
0.0%
2.7%
2.7%
0.8%
0.8%
0.0%
0.2%

0.0%
0.0%
0.0%
7.5%
1.8%
0.4%
0.9%
0.4%
0.9%

0.0%
0.0%
0.0%
14.1%
0.6%
1.2%
2.5%
0.0%
0.6%

0.0%
0.0%
0.0%
18.6%
0.0%
2.3%
0.0%
0.0%
0.0%

0.5%
0.0%
0.0%
14.8%
1.1%
0.5%
2.2%
1.6%
0.0%

0.0%
0.0%
0.0%
12.9%
0.0%
0.0%
17.0%
1.8%
0.0%

0.0%
0.0%
6.0%
4.6%
0.0%
0.0%
0.0%
2.6%
0.0%

0.3%
0.2%
0.6%
9.1%
1.3%
0.8%
2.8%
0.7%
0.3%

3.3

真の起因菌群の決定して見られる菌種を明らかにするために，他の１つの病変による菌種の有無や優勢だけでは，

PDD病変の採取を行った。メタゲノム解析に用

真の起因菌群は決定できない。PDD病変に共通いた病変を採取した牛舎とは異なる地域および異© The Ito Foundation

283

牛趾乳頭腫症の性状解明を目指したメタゲノム解析と疫学研究

1000

Coverage（X）>500kb>250kb>100kb
>50kb
>25kb
>10kb

100

10

25

30

35

40

45

50
55
GC content（％）

60

65

70

75

Fig. 1 Coverage-GC plots with binning for PDD metagenome（plot symbols are scaled by scaffold length）.

なる時期のPDD病変を４つ採取した。メタゲノ

入率が高くなることが予想された。そこで，まずム解析が可能な大型のPDD病変を収集できる機

小さいスケールでシーケンスデータを取得し会は限られており，多くは小さな病変しか採取で（MiSeqシーケンサ），サンプル中の非牛由来リー

きない。そのため，PowerSoil DNA Isolation Kit

ドの割合を算出したところ，５-10％程度である（MoBio）を用いて，PDD病変を丸ごとからtotal

ことが分かった。その割合をもとにデータ量を計

DNAを調整した。本手法では，ウシゲノムの混算し大型のシーケンサHiSeq2500によりデータ© The Ito Foundation

284

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）（150bp x2, 1FC）を取得した。取得したデータは，

関与していると考えられた。このうち13クラスタ

牛由来リードを取り除いたのち，高精度ドラフト

は，完全長ゲノムの再構築に成功していた。

ゲノム配列にマッピング解析した。各病変中の起3.4

因菌群の存在量は，クラスタごとにマッピングさ異なる農場および異なる時期に採取した４つのれたリード数とそのクラスタのゲノム配列長か病変について，パラフィン包埋切片を作成した。

ら，FPKMとして算出した（Table２）。その結果，

今後，FFPE切片にはヘマトキシリン・エオジン

比較的共通して検出されたクラスタは18個にな染色を実施し，病理的診断を行う。２つの診断法

り，これらは真の起因菌群としてPDDの発症にによる知見を照らしあわせ，PDD病変の病期（急病変部における各起因菌の局在の特定

GC content（%）

CheckM completeness（%）

FPKM
メタゲノム解析用サンプル

FPKM
HiSeq#1

FPKM
HiSeq#2

FPKM
HiSeq#3

FPKM
HiSeq#4

14

2,969,581

663,380

1,462,589

1.2

36.8

99.7

36.7

0.4

15.2

60.8

40.0

1

1

2,907,490

2,907,490

2,907,490

1.0

37.1

91.1

31.3

8.7

32.7

1.4

0.9

63

3 1097.6

1

12,177,299

2,177,299

2,177,299

12.3

54.4

92.3

35.1

62.7

20.2

28.0

5.0

51

4

611.4

1

1

2,265,591

2,265,591

2,265,591

1.4

33.3

99.1

15.2

10.6

32.0

0.1

6.4

126

5

571.6

1

1

1,144,466

1,144,466

1,144,466

24.9

29.4

68.9

16.5

20.5

22.6

1.9

49.7

18

6

560.3

1

1

2,543,537

2,543,537

2,543,537

1.1

39.5

100.0

30.1

108.1

21.8

99.2

70.4

94

7

504.2

23

192

3,366,857

1,210,189

1,538,286

15.4

44.3

87.3

14.0

20.1

9.3

14.3

7.9

10

8

487.3

1

1

2,435,611

1,369,076

1,369,076

16.2

45.2

78.3

18.7

9.1

5.9

12.7

16.5

93

9

470.6

39

322

1,376,306

41,430144,821

17.1

40.7

0.0

3.1

1.8

4.1

3.7

2.9

73

10

429.3

6

7

2,857,831

1,602,072

1,602,072

23.5

40.1

77.1

11.6

15.4

17.7

24.0

18.4

Total size（bp）# scaffolds（≥1kb）

Ranking

N ratea（%）

Max length（bp）

7

2 1217.4# scaffolds（≥10kb）

1 1401.8

67

Coverage66

Cluster ID

N50 length（bp）

Table 2 Status of metagenomic assembly and identification of dominant clusters.

46

11

384.4

24

129

2,574,261

260,021567,530

10.1

35.9

85.8

10.2

12.2

10.8

3.0

6.9

29

12

357.9

1

1

3,271,756

3,271,756

3,271,756

2.8

43.5

100.0

10.1

21.3

14.9

2.0

11.8

1

13

347.5

32

123

2,209,266

155,574

454,470

14.6

39.6

89.6

8.5

2.4

3.0

4.1

2.9

99

14

334.5

1

1

2,049,234

2,049,234

2,049,234

3.8

36.7

93.7

8.5

2.5

2.4

1.3

0.7

41

15

294.0

1

1

870,629

870,629

870,629

0.1

26.0

99.3

8.6

0.0

3.0

38.1

26.5

2

16

247.6

1

1

1,824,108

1,824,108

1,824,108

0.3

40.3

99.6

6.5

3.2

6.8

0.0

11.2

109

17

237.0

1

1

2,584,979

2,584,979

2,584,979

1.6

37.2

93.3

5.6

0.6

2.3

0.4

46.4

74

18

227.6

1

1

1,239,348

1,239,348

1,239,348

0.0

33.5

75.7

5.6

12.2

11.8

0.0

21.7

62

19

220.8

1

1

2,573,932

2,573,932

2,573,932

2.6

36.1

95.4

5.6

4.0

0.5

2.9

0.2

44

20

181.3

6

60

1,920,608

576,347

666,637

9.4

36.1

86.1

3.4

2.0

1.2

0.5

0.7

143

21

175.9

7

65

1,127,658

165,965

250,720

5.3

29.7

1.6

4.0

0.5

1.7

0.1

0.7

58

22

165.9

22

226

2,884,632

462,780

606,570

19.0

46.6

79.1

4.4

0.3

2.1

1.0

4.2

12

23

161.0

25

126

917,441

43,02093,188

11.4

34.0

0.0

3.4

2.2

1.8

1.1

0.6

124

24

145.2

66

409

2,711,684

77,199288,314

9.9

33.3

15.5

4.1

2.9

3.0

1.5

1.9

49-115

25

130.2

1

1

2,084,690

2,084,690

2,084,690

1.9

48.0

98.6

3.7

0.6

0.6

0.2

0.9

7

26

129.8

1

1

2,095,785

2,095,785

2,095,785

1.4

50.9

98.7

3.7

9.5

7.8

1.4

1.2

80

27

119.1

1

1

1,697,864

1,697,864

1,697,864

1.3

31.9

96.6

3.0

1.5

2.2

0.0

1.1

20

29

112.8

1

1

2,466,406

2,466,406

2,466,406

9.9

50.7

96.7

3.4

1.2

1.5

0.6

0.5

83

30

108.5

47

250

1,560,689

46,406

162,363

5.7

40.9

0.0

2.0

0.7

1.2

1.1

1.1

144

31

107.6

20

218

944,074

53,334

223,463

10.8

44.5

12.6

3.4

4.1

4.7

2.4

2.3

© The Ito Foundation牛趾乳頭腫症の性状解明を目指したメタゲノム解析と疫学研究

285

性 期 ， 慢 性 期） を 決 定 す る 。 今 後 ， in situ

疫学調査から，PDD起因菌群の牛環境での常在hybridization解析を行い，各起因菌群の局在部位

部位も明らかにできる。これはPDD発生のリスを明らかにする。各起因菌における病期による局ク評価にも有用であると考えられる。

在部位の変化（の有無）と病変部での起因菌同士の 位 置 関 係（共 局 在 の 有 無）を 明 ら か に し ，謝

辞PDD発症と進行過程における各菌種の役割や菌本研究の実施にあたり，病変の採取にご協力い種間相互作用の有無などを検討する。現在，in

ただきましたNOSAIみやざきの上松瑞穂様，橋situ hybridization解析のための各起因菌に特異的

本岳樹様に深謝いたします。

なプローブセットの設計を進めている。
４．要約

慢性期の比較的大きなPDD病変１つを用いて，細菌叢がエンリッチされたtotal DNAの調製に成功した。６つのシーケンスライブラリを調製し，シーケンス，アセンブリすることで，高精度ドラ
フトゲノム配列の決定に成功した。18個のクラス
タは完全長ゲノム配列の再構築に成功した。さらに，大型シーケンサHiSeqを用いて，他の４つの病変由来丸ごとのシーケンス情報を大量に取得
し，マッピング解析により真の起因菌群を決定した。どの病変でも比較的共通して検出されたクラスタは18個であった。うち13個のクラスタは完全長ゲノムが再構築されていた。これら情報基盤の整備によって，PDDおよび各菌種の性状解明が可能であり，未培養の起因菌群の分離培養につながると考えられ，PDDの発症に関わる複雑な菌
種間相互作用を解明するための第一歩となる。ま文献１） Read, D. H., Walker, R. L.：Papillomatous digitaldermatitis（footwarts）in California dairy cattle：
clinical and gross pathologic findings, J Vet Diagn
Invest, 10, 67～76, 1998.
２） Yano, T., Moe, K. K., Yamazaki, K., Ooka, T.,
Hayashi, T., Misawa, N.：Identification of candidate
pathogens of papillomatous digital dermatitis indairy cattle from quantitative 16S rRNA clonal
analysis, Vet Microbiol, 143, 352～62, 2010.
３） Klitgaard, K., Boye, M., Capion, N., Jensen, T. K.：
Evidence of multiple Treponema phylotypes
involved in bovine digital dermatitis as shown by
16S rRNA gene analysis and fluorescence in situ
hybridization, J Clin Microbiol, 46, 3012～20, 2008.
４） Evans, N. J., Brown, J. M., Demirkan, I., Singh, P.,
Getty, B., Timofte, D., Vink, W. D., Murray, R. D.,
Blowey, R. W., Birtles, R. J., Hart, C. A., Carter, S.
D.：Association of unique, isolated treponemes withbovine digital dermatitis lesions, J Clin Microbiol, 47,
689～96, 2009.
５） Evans, N. J., Murray, R. D., Carter, S. D.：Bovine
digital dermatitis： Current concepts fromlaboratory to farm, Vet J, 211, 3～13, 2016.
６） Langmead, B., Salzberg, S. L.：Fast gapped-readalignment with Bowtie 2, Nature Methods, 9, 357～9,
2012.

た，起因菌群の迅速検出系の構築とそれを用いた© The Ito Foundation

286

簡便・迅速なマダニによって媒介される牛のアナプラズマ症とバベシア症の診断法開発
Development of simple and rapid diagnosis of bovine anaplasmosis andbabesiosis transmitted by tick

田仲

哲也１・Galay Remil Ringgatong１・山崎

渉２（１鹿児島大学共同獣医学部，２宮崎大学農学部）

Tetsuya Tanaka１，Galay Remil Ringgatong１ and Ayumu Yamasaki２（１Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, ２Faculty of Agriculture, Miyazaki University）

Anaplasmosis and babesiosis causes great economic losses to animal industry worldwide
and designated as an exotic infectious disease. Objective of the present study was to develop
new gene diagnostic test against anaplasmosis and babesiosis to do molecular epidemiologicalsurvey on anaplasmosis and babesiosis in Philippines, and to contribute for strength of thequarantine system in Japan. As a result, new gene diagnostics was developed against bovine
anaplasmosis and babesiosis. The epidemiological surveillance at the surround area of Manila inPhilippines demonstrated high prevalence of anaplasmosis and babesiosis in these regions.

１．目

療薬開発に繋がる高度な研究にきわめて重要な情的報をもたらすものとして，マダニやマダニ媒介性

唯一の栄養源が血液という偏性吸血性節足動物であるマダニは，魚類以外のすべての脊椎動物に疾病を公衆衛生学的に再評価する疫学的研究が必要とされている。

寄生可能であり，長期間・大量の血液摂取を行う

特に，Anaplasma marginaleによるアナプラズ

とともに，世界各地で家畜に甚大な被害を与えてマ症やBabesia bigeminaによるバベシア症は牛にいるアナプラズマ症やバベシア症などの多種多様

重度の貧血・黄疸を主微とする致死的感染症を引な病原体の伝播に関与し得る，他に類を見ない優き起こし，日本では家畜（法定）伝染病として指れた疾病媒介能を有している。このため，マダニ

定されている。これらの疾病は，2007年から2008とマダニ媒介性感染症が世界経済に与える脅威は

年に沖縄県で散発的な発生があったが，現在，国甚大であり，その防除費用は世界全体で毎年約内では根絶されている。しかし，A. marginaleや３兆円にも及ぶと報告されている 。したがって，

B. bigeminaは東南アジアを含む熱帯，亜熱帯をマダニおよびマダニ媒介性疾病対策は人を含めた流行地域としているので，近年のグローバル化に

動物の健康と畜産業においては不可欠であり，よ伴う国内再侵入が危惧されている。日本にはこれり有効な対策法の開発は今や世界的な急務であらのリケッチアや原虫を媒介しうるマダニの存在る。そのため，マダニ防除のためのワクチン・治が確認されているために，一度国内に侵入すれば１）© The Ito Foundation

簡便・迅速なマダニによって媒介される牛のアナプラズマ症とバベシア症の診断法開発

広く蔓延・浸潤する可能性が大きく，その清浄化は非常に困難と想定される。これらのPCR法による鑑別手法がすでに確立されているが，LoopMediated Isothermal Amplification （LAMP） 法

287

３．結果と考察3 . 1 PCR法によるアナプラズマ・バベシアの検出を開発すれば，さらに簡易・迅速かつ正確な同定

フィリピンマニラ周辺地域（カラバルソン地が 可 能 と な る 。LAMP 法 は Polymerase Chain方）における農場から250頭の乳・肉牛の血液をReaction（PCR）法よりも10倍から100倍高感度

採取し，DNAを抽出後，マダニ媒介性感染症のである。従来は病原体数の少ないサンプル（例え流行実態をnested PCR法で調べた。その結果，ば初期感染個体）においては，診断に苦慮するこ

アナプラズマ種が90％，バベシア種が20％，タイとがあったが（偽陰性），LAMP法の開発によっレリア種が９％の感染率であった。それら陽性検て，より正確な摘発・病原体鑑別が可能となる。

体についてPCR産物のDNA配列を決定したとこ

そこで，本研究では，PCR装置のような現場でろ，A. marginal，B. bigemina，B. bovis，Theileriaの特殊な整備などを必要としない遺伝子増幅法－

orientalis，T. buffeliの遺伝子と高い相同性が認

LAMP法を開発することを最終目的とした。

められた。

２．方

これらの結果から，フィリピンの乳・肉牛はマ法

ダニ媒介性病原体を高い確率で保持していること

本研究は国内外におけるマダニ媒介性動物感染症の流行実態を明らかにし，診断・予防対策の向上と普及に資することを最終目標とし，以下のよが分かった。
3 . 2 LAMP法によるアナプラズマ・バベシアの検出うに実施した。まず，GenBankから，アナプラ

フィリピンマニラ周辺地域における農場から採

ズマ・バベシアに特異的な塩基配列情報を入手取した乳・肉牛の血液のうち，PCR陽性DNAス

し，それぞれを同定できるPCR・LAMPプライ

トックを用いて，LAMP法によるアナプラズマなマーを設計した。すなわち，研究代表者が保有すらびにバベシアの検出方法を検討した。その結るアナプラズマ・バベシア陽陰性DNAストック

果，Anaplasma marginalについては写真にようを使用して，設計したプライマーの特異性や検出にPCR陽性DNAストックを検出することに成功

感度を精査し，PCR・LAMP法による検出系を確した（Fig.１ No.1～3）。

立した。アナプラズマについてはA. marginaleを，

現在，Babesia bigemina，Babesia bovisについバベシアについてはB. bigeminaならびにB. bovisては，LAMP法の確立に向けて条件検討を行ってを適切に検出できるPCR・LAMPプライマーをいるところである（LAMP用のプライマーは構設計した。そのうえで，既存のPCR法による検出築済み）。

系と判定所要時間・検出感度・特異性の比較によ

本研究において，牛のアナプラズマ症ならびにり，有用性を評価した。このように，現地調査にバベシア症に対するPCR法やLAMP法などの遺よってフィリピン側から提供されたDNAストッ

伝子診断法が開発された。また，これらの診断法

クについて，LAMP法に向けた基礎診断法を構築を用いたフィリピンマニラ周辺地域の牛のアナプした。

ラズマ症ならびにバベシア症の疫学調査により，これらの地域で高い感染率が認められた。今後，© The Ito Foundation

288

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

3
1

4

2

5

Fig. 1 The detection of Anaplasma marginal by LAMP method. No.1～3：Positive

DNA samples by PCR, No.4：Negative DNA sample by PCR, No.5：Negative
control（Water）

PCR法やLAMP法などの診断技術や得られた情検疫体制強化に貢献することを目的として行われ報が動物検疫体制の強化に貢献することが期待さた。その結果，牛のアナプラズマ症ならびにバベれる。

シア症に対する新規の遺伝子診断法が開発され４．要た。これらの診断法を用いたフィリピンマニラ周約

辺地域における牛のアナプラズマ症ならびにバベ

牛のアナプラズマ症やバベシア症は，世界規模で甚大な被害を与えており，海外悪性伝染病に指シア症の疫学調査により，高い感染率が認められた。

定されている。本研究は，新たな診断法を開発するとともに，フィリピンにおける牛のアナプラズ
マ症ならびにバベシア症の感染状況を明らかにし，日本のアナプラズマ症とバベシア病に対する文
献１） Walker, A. R.：Eradication and control of
livestock ticks：biological, economic and social
perspectives, Parasitology, 138, 945～959, 2011.

© The Ito Foundation

289

消化管寄生性コクシジウム，Eimeria krijgsmanni
における発育休止期の解析
Analysis of the resting stage in the life cycle of the intestinal coccidianparasite, Eimeria krijgsmanni

松

尾

智

英

（鹿児島大学共同獣医学部寄生虫病学分野）

Tomohide Matsuo（Laboratory of Parasitology, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

Eimeria spp. cause serious damages especially in cattle and poultry worldwide and theirinfection is known to be self-limited. However, we clarified that only 2nd generation meronts
were remained in the epithelial cells of the caeca after end of oocyst shedding in a mouseintestinal coccidium, Eimeria krijgsmanni, which had not been known in the other eimerianparasites. In the present study, in order to investigate reactivation of their development fromremained 2nd generation meronts under suppression of host immunity, we administrated thedexamethasone for artificial immunosuppression with experimental infection and estimated thenumber of oocyst shedding. As the results, reactivation of oocyst shedding was confirmed once
even in the non-administrated immunocompetent mice group. On the other hand, in thedexamethasone treatment groups, two or three oocyst shedding periods were observed andthe number of shed oocysts was larger than that of immunocompetent mice although relatively
differences correlated with the schedule of dexamethasone administration were confirmed. The
number and period of oocyst shedding was more increased and extended in innate
immunodeficient（nude and SCID）mice. Additionally, during the end of 1st patent period andthe beginning of 2nd oocyst shedding period, it was observed histologically that their life cycle
restarted from remained 2nd generation meronts. These results suggested that restart ofdevelopment of zoites was induced by suppression of host immunity and 2nd generation meronts
surviving in the epithelium of the caeca were source of the resumption of oocyst shedding.

１．目す１，２）。これらに対しては一定の効果のある治療的薬や一部の種に対するワクチンはすでに存在

世界中に分布し，特に牛および鶏において大きし３，４），重篤な場合は死に至るケースがあるもの

な被害をもたらしているEimeria属原虫は宿主のの，軽症ならば一定期間で自然治癒する一過性の消化管上皮に寄生し，激しい下痢症を引き起こし感染と考えられてきた。そのため新たな研究が停て宿主を衰弱させることで生産性を低下させ，ま滞しているのが現状である。しかしながら，治療た時に致死的となるコクシジウム症を引き起こ薬・ワクチンの安全性やコストはもちろん，薬剤© The Ito Foundation

290

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

耐性株の出現など新たな問題も知られるようにた。供試されたEimeria krijgsmanniは鹿児島大なってきた。そして何よりEimeria属原虫は学共同獣医学部寄生虫病学研究室にてマウスを用

いまだ各地で蔓延しており，これらによるコクシ

いて継代維持されている。オーシストは感染マウ

ジウム症を制圧したとは言い難い現状である。

スの糞便から集められ，25℃，２％重クロム酸カ５，６）一方，Eimeria属原虫はin vitro培養によって生リウム水溶液中でスポロゾイトを形成させた後，活環を完全に再現できず，また牛のような大型動使用まで４℃で保管した。本動物実験は鹿児島大物を用いた感染実験は現実的に困難であるため，学における所定の認可の下で行われた。

申 請 者 は マ ウ ス 寄 生 性 Eimeria krijgsmanni

７，８）

2.2

免疫抑制実験

。

残留虫体の発育再活性化を調べるため，宿主免

その結果，これまでEimeria属原虫感染は「オー

疫抑制状態での感染実験を行った。免疫抑制剤とシストの経口摂取→無性生殖ステージ→有性生殖

してデキサメタゾンを使用し，これを滅菌水に１ステージ→オーシスト排泄」という生活環を経

mg/mlとなるよう懸濁し，100μl/匹/日で皮下投て，オーシスト排泄終息後には虫体は宿主体内か与を行った。デキサメタゾン投与日程により次のら排除される一過性のものであると信じられてきように実験群（各５匹）を設定した：感染２日前た常識を覆す新知見を得た。すなわち，無性生殖から第２代メロントの宿主盲腸上皮内における存期の１ステージ，第２代メロントの虫体のみが在が確認されている最長の期間である感染後56日

オーシスト排泄終息後も長期間，寄生部位に留目まで（-2-56DXM群），感染２日前から感染後まっていることを確認した 。このステージの虫

一 度 オ ー シ ス ト 排 泄 が 終 了 す る 15 日 目 ま で体は宿主が感染を耐過して抵抗性を獲得した後だ（-2-15DXM群），感染後15日目から感染後56日目

けでなく，オーシスト排泄を完全に抑制することまで（15-56DXM群），および再感染を行ってものできる治療薬の投薬下でも残留していることがほとんどオーシスト排泄に至らないことが明らか確認されている。このことは，これまで「治癒」

な 初 感 染 後 21 日 目 か ら 感 染 後 56 日 目 ま でしたと考えられていた宿主において感染が継続し（21-56DXM群），さらに，免疫不全モデルであるていることを意味し，宿主の健康状態悪化によっ

SCID マ ウ ス の 群（SCID 群）と nude マ ウ ス 群て症状が再発する可能性を示唆する。そこで，こ（nude群），コントロールとして感染前２日からの潜在的な感染の意義と特定のステージの虫体が感染後56日目まで100μl滅菌水を皮下投与した群残留を可能にするメカニズムを解明する第一歩と（DW群）も設定した。

を感染モデルとして基礎研究を続けてきた

９～11）

10）

して，本研究においては，この残留虫体の役割を2.3

明らかにするため，宿主免疫抑制または不全状態

すべてのマウスに2.0×10２ 個/匹でオーシスト

における虫体の発育の変化をオーシスト排泄状態

を経口的に接種した。感染状態は，体重の推移おの評価によって詳細に調べた。

よびオーシスト排泄数（OPG：oocysts per gram

２．方
2.1

感染の評価

of feces）を毎日計測して評価した。

法

３．結果と考察

実験動物と寄生虫

５週齢，雌のBALB/cマウス，免疫不全モデル

Eimeria属原虫は，宿主体内において無性生殖であるSCIDマウスおよびnudeマウスが供試されステージと有性生殖ステージを経てオーシストを© The Ito Foundation

消化管寄生性コクシジウム，Eimeria krijgsmanniにおける発育休止期の解析

291

形成する単一宿主性の発育環をもつ。無性生殖ス

オーシスト排泄の再開が確認された。第２オーシ

テージでは，経口摂取されたオーシストに内包さ

スト排泄期のOPG値のピークは5.7×10６に達し，れるスポロゾイトが寄生部位である腸管上皮細胞

排泄期間は８日間，第３オーシスト排泄期のOPGに侵入し，メロゾイトの増殖過程であるメロント

値のピークも1.3×10５と高値であり，デキサメタを形成，それが崩壊し放出されたメロゾイトが他

ゾン投与群では最もオーシスト排泄数が多かっの宿主細胞に再び侵入するというサイクルを，種た。同様に３度のオーシスト排泄期が確認されたによって規定の回数繰り返す。E. krijgsmanniは15-56DXM群においては，２回目のオーシスト排

盲腸上皮細胞に寄生し，第４代メロントまで形成

泄期のOPG値のピークはコントロール群と同様していた。この無性生殖ステージ後の有性生であったが期間が長く，しかしながら３回目の殖ステージを経てオーシスト排泄に至る生活環にオーシスト排泄期においてはごくわずかな排泄がより，Eimeria属原虫の感染はこれまで「一過性２日間観察されたのみであった。この差異には明の自己治癒する感染」と信じられてきた。また，

らかにデキサメタゾン投与期間による宿主免疫状

初感染耐過後は獲得免疫を得て再感染に対して抵態の違いが影響していると考えられた。

７，10）

，E.

一方，先天性免疫不全モデルであるnude群とkrijgsmanniにおいても再感染への抵抗性は確認

およびSCID群はcontrol群とほぼ同様に２回目のされている 。

オーシスト排泄期間が終了したが，その後，観察

抗性を示すことはよく知られており

12 ，13）５）

各実験群の体重の推移がFig.１に，オーシスト

期間の感染後56日までの長期にわたる３回目の排泄数の推移がFig.２に，それぞれ示されている。

オーシスト排泄期間が認められた。この予想を大マウスの体重はデキサメタゾン投与期間に相関しきく上回る排泄数および期間は，先天的に無胸腺て増加が停止しているが，実験期間を通して著し

でＴ細胞が欠損したnudeマウス 14），およびDNA

い 衰 弱 な ど は 認 め ら れ な か っ た 。DW 群 ，

修復異常によりＢ細胞とＴ細胞の遺伝子再構成が-2-15DXM群および21-56DXM群では２回のオー行えないために成熟したＢ細胞とＴ細胞を欠損しシスト排泄期，すなわち１度のオーシスト排泄のたSCIDマウス 15，16）における実験的免疫抑制より再開が確認された。また，このオーシスト排泄の高度な免疫不全状態によるものであることは明ら

陰性期間における組織学的観察により，感染部位

かである。一方，免疫正常マウス群においては

において第２代メロントしか観察できないわずか

オーシスト排泄が認められない感染25日以降のこな期間の後，第３代メロント以降の発育ステージの長期にわたるオーシスト排泄期において，周期が 再 出 現 す る と い う 現 象 が 観 察 さ れ た（Table

的にOPG値が増減する現象も確認された。これ

１）。このことから，残留第２代メロントが起点もまた第２代メロントにおける発育の休止と再開となって発育の休止と再開を繰り返していることに基づいていることが強く示唆された９，10）。

が強く示唆された。さらに，同じ２回のオーシス

以上のことから，すべての感染マウスで認めら

ト排泄期を示したこれら３群を比較しても，DW

れた１回目と２回目のオーシスト排泄期の分割は群および21-56DXM群はほぼ同様だったのに対宿主の免疫状態によらず起こる現象であることがし，-2-15DXM群では２回目のオーシスト排泄数示された。それに対し，その後の長期のオーシスは明らかに多かった。また，-2-56DXM群においト排泄は免疫抑制または不全状態で認められた。

ては３度のオーシスト排泄期，すなわち２度のすなわち，免疫正常マウスでは再感染に抵抗性を© The Ito Foundation

292

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

160
140

Body weight（%）

120
100
80

-2-56 d.p.i. D.W.
-2-56 d.p.i. DXM-2-15 d.p.i. DXM
15-56 d.p.i. DXM
21-56 d.p.i. DXM
SCID

60
40
20
0
-2

0

10

20

d. p. i.

40

30

50

56

Fig. 1
Change of the average body weight of mice of each experimental group administrated Dexamethasone（DXM）. The

body weight on 2 days before the infection was shown as 100％. Body weight of DW groups tended to increase until
end of experiment. Body weight gain of DXM groups was suppressed only during administration. DXM treatment
clearly affected changes of body weight. d.p.i., days post infection.

OPG

A

108
107
106
105
104
103

control
SCID
nude

＋
0

OPG

B

10

20

30

40

108
107
106
105
104
103

50

56

-2-56 d.p.i. DXM-2-15 d.p.i. DXM
15-56 d.p.i. DXM
21-56 d.p.i. DXM

＋
0

10

20

30

40

50

56
d. p. i.

Fig. 2
Oocyst shedding of DW group and immunodeficient mouse（SCID and nude）groups（A）, and four groups treated by

DXM（B）.（A）Twice oocyst shedding periods were confirmed in control（DW）group. On the other hands, three timesof oocyst shedding periods were confirmed and 3rd oocyst shedding were remarkably prolonged in SCID and nudegroups.（B）Third oocyst shedding period were also confirmed in -2-56 and 15-56 DXM groups but only 2 oocyst
shedding periods in -2-15 and 21-56 DXM groups. The number of shed oocysts was clearly different with host immune
status. ＋：Oocyst positive by sugar flotation method. OPG：oocysts per gram of feces；d.p.i., days post infection.

© The Ito Foundation

293

消化管寄生性コクシジウム，Eimeria krijgsmanniにおける発育休止期の解析

Table 1 Developmental stages of Eimeria krijgsmanni in the caeca of host mice at 14-17 days after primary

infection

14 d.p.i.

14.5 d.p.i.

15 d.p.i.

15.5 d.p.i.

16 d.p.i.

16.5 d.p.i.

17 d.p.i.

1st generation meront

-

-

-

-

-

-

-

2nd generation meront

++

++

++

++

+

+

+

3rd generation meront

-

++

+

++

++

++

+

4th generation meront

-

+

++

+++

+++

+++

++

Microgametocyte

-

-

-

-

+

+++

+

Macrogametocyte
Zygote

-

-

-

-

+
-

+++
+

+
+

+, − Meronts or their clusters were found or not；+++, ＞10；++, 5–10；+, ＜5 meronts or their cluster by light microscopy（×200）. d.p.i., days post infection

獲得した時期に，免疫抑制または不全状態によるの発育再開を調べるために，実験的免疫抑制のた

虫体の発育の活性化が引き起こしているのであろめのデキサメタゾンを投与した感染実験を行い，う。それに対して，免疫不全モデルマウスで認め

オーシスト排泄状況を精査した。その結果，デキられた長期のオーシスト排泄期において，一定間

サメタゾン非投与の免疫正常マウスにおいても１隔で発育の休止と再開を繰り返す現象は，宿主免回の発育休止，再開が起こることが確認された。

疫の影響ではなく，虫体の独自の発育周期による一方，デキサメタゾン投与群では２回または３回ものではないかと予想される。そしてこれらすべの発育休止と再開がみられ，オーシスト排泄数はての現象は，宿主免疫や薬剤に抵抗性であると推明らかに免疫正常マウスよりも多かった。また，察される第２代メロントの残留によって可能とな

この発育休止と再開の回数およびオーシスト排泄

る潜在的感染継続の戦略だと考えられる。この第数の増加は，デキサメタゾンの投与スケジュール

２代メロントの特殊な性状および感染に伴う宿主によって変動した。さらに，先天性免疫不全モデ

免疫の変化をより詳細に調べることは，Eimeria

ルマウス（SCIDおよびnudeマウス）において，属原虫感染の確実な予防・治療法開発に貢献できオーシスト排泄期間および排泄数は，それぞれさるであろう。

らに延長と増加が認められた。さらに，第１オー

４．要

シスト排泄期と第２オーシスト排泄期の間におけ

約る組織学的観察によって，このオーシスト排泄のEimeria属原虫は世界各地において，特に牛や休止と再開は，第２代メロントを起点にした発育鶏における深刻な被害を引き起こしているが，そ環の休止と再開に基づいていることが確認されの感染は一過性の自己治癒するものであることがた。これらの結果は，虫体の発育再開が宿主免疫知られてきた。しかしながら，我々はマウス寄生の抑制によって引き起こされ，それによるオーシ

性コクシジウムEimeria krijgsmanniにおいて，スト排泄再開は寄生部位で生存している第２代メオーシスト排泄終息後も第２代メロントだけが寄

ロントが起点となっていることが強く示唆された。

生部位である盲腸上皮内に残留していることを明らかにした。これは他のEimeria属原虫では知られていなかった現象であった。そこで，本研究において，宿主免疫抑制下での残留第２代メロント

文献１） Daugschies, A., Najdrowski, M.：Eimeriosis incattle： current understanding, Journal of
Veterinary Medicine, 52, 417～427, 2005.

© The Ito Foundation

294

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）２） Williams, R. B.：A compartmentalized model forthe estimation of the cost of coccidiosis to theworld's chicken production industry, International
Journal for Parasitology, 29, 1209～1229, 1999.
３） Philippe, P., Alzieu, J. P., Taylor, M. A., Dorchies,
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© The Ito Foundation

295

鶏に対する高効率・低負荷な新規サルモネラ粘膜ワクチンの開発
Development of novel salmonella mucosal vaccine with high efficiency andfewer side effects on chickens

谷

浩

行

（大阪府立大学大学院生命環境科学研究科獣医学専攻獣医内科学研究グループ）

Hiroyuki Tani
（Laboratory of Veterinary Internal Medicine, Division of Veterinary Science,
Graduate School of Life and Environmental Sciences, Osaka Prefecture University）

Outer membrane vesicle（OMV）is released spontaneously during growth by many
Gram-positive and -negative bacteria and has great potential as a mucosal delivery vehicle foruse as a vaccine carrier. The purpose of this research is to provide basic information for
applying the OMV in the development of a novel salmonella mucosal vaccine with highefficiency and few side effects on chickens．
OMV designed to express a candidate vaccine antigen in the lumen is useful for vaccine
carrier because a recombinant protein in the lumen of OMV is reported to be very stable withrespect to temperature changes and chemical substances. In this study, we could newly
constructed expression plasmid vector designed to express a fusion protein consisting of E.
coli lipoprotein signal sequence and partial major outer membrane protein A for ancohring a
recombinant protein inside outer membrane of non-pathogenic E. coli．
Most of reports for separation of OMV are using ultracentrifugation. However,ultracentrifugation is expensive, labor-intensive, and not easily performed outside of researchfacilities. Therefore, we studied applying the aqueous two-phase extraction method for thedevelopment of efficient separation method of OMV. Aqueous two-phase extraction method
has already been used for exosome separation and purification. High amount of OMV could be
separated without affecting the antigenicity from non-pathogenic E. coli displaying Salmonella
candidate vaccine antigen on the surface by the modified aqueous two-phase extraction
method.

１．目

しかし，飼料自給率を考慮するとそれぞれ９％お的

よび13％と低値を示しており，なお一層の生産効

我が国の食料自給率は低下の一途を辿り，先進率の向上が必要である。サルモネラ属菌を原因と国の中で最も低い水準を示している。特に畜産物する食中毒は，日本国内においていまだ年間1,000で著しい中，鶏肉，鶏卵はいまだそれぞれ65％お人以上もの患者数が報告されている（平成29年度

よび97％を維持する（平成28年度 農林水産省）。

厚生労働省）。Salmonella Enteritidis（SE）やS.

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296

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Typhimurium（ST）は主に鶏肉，鶏卵，およびは，非病原性大腸菌OMVの内側にSE抗原を固その加工品を介して感染することから，衛生環境定・発現する技術の開発，および鶏への粘膜免疫の向上が重要とされるが，その伝搬経路はきわめ賦活効果について検討することを目的とした。

て多様であり完全な防除が難しいため，ワクチン接種の併用による汚染防御が推奨されている。現
在，日本で認可されている不活化ワクチンは，弱毒化生ワクチンに比べ，効果が弱く１），さらに，

２．方法

2 . 1 アンカータンパク質発現プラスミドベク
ターの構築

細菌の感染防御に重要な粘膜免疫の誘導には効果

組換えタンパク質を大腸菌外膜内側（ペリプラが低い。鶏は生後２～３週間以上経過すると無症ズム腔側）に固定・発現するアンカータンパク質

候性キャリアとなる可能性があり，汚染卵を長期と し て ，既 報 の 大 腸 菌 の ゲ ノ ム 情 報 を も と にに産出するため，早期に，SEの定着自体を阻止（Genbank accession No. NC_000913, CP028306），

し得る粘膜ワクチンの開発が強く望まれている。

大腸菌リポタンパク質のシグナルシークエンス

また，不活化ワクチンに含まれるLPSやアジュバ（Lpp），およびOMVの産生量を増加させる外膜

ントは，強い副作用を示すことが知られており，の不安定化を目的として，Lppにそれぞれ大腸菌

世界的な畜産動物の福祉に対する意識の向上か

主 要 外 膜 タ ン パ ク 質（OmpA）の 46-88 ，46-

ら，動物に対する低負荷のワクチンの開発が急務

132，あるいは46-174アミノ酸残基，およびＣ末である。

端にヒスチジンタグタンパク質をコードする遺伝

細菌外膜小胞（OMV）は，生菌が放出する外子配列を連結し，pBAD30プラスミドベクターに膜で包まれた袋であり，化学的処理あるいは遺伝挿入した４種の発現プラスミドベクターを構築し子組換え技術を用いることにより，内腔に薬剤やた（Fig. 1A）。

組換えタンパク質を内封し得る。さらに，それ自体がアジュバント効果を示すことから，近年，そ2 . 2 大腸菌外膜内側（ペリプラズム腔側）への組換えタンパク質の発現の確認

れらの送達手段として注目されている２）。培養液

組換えタンパク質の発現にはE.coli UT5600株

中に放出されるため，比較的簡便な物理的手法を（F－ ara-14 leuB6 secA6 lacY1 proC14 tsx-67 Δ

用いて単離精製が可能であることから，大量に，（ompT-fepC） 266 entA403 trpE38 rfbD1

低コストで作製することが可能であり 。特に大rpsL109 xyl-5 mtl-1 thi-1）を用い，すべての培量の抗原を必要とする家畜のワクチンとして適し

養 は ア ン ピ シ リ ン（100μg/mL）を 添 加 し たていると考えられる。OMVのワクチン応用に関

Luria-Bertani（LB）培養液およびLB寒天培地をする研究は，主にヒトを対象として盛んに行われ用いて，37℃，150rpmで行った。2.1で構築したて い る 。現 在 ，ヒ ト 用 の 髄 膜 炎 菌 血 清 群 Ｂ の発 現 プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー を そ れ ぞ れ E.coli

OMVを使用したワクチンが開発され，すでに米UT5600株に形質転換し，Ｌ-アラビノースを最終

国 ，欧 州 を 中 心 に 認 可 ・ 利 用 さ れ て い る

濃度0.2％となるように加え，発現誘導した。組（Bexsero ，ノバルティス）。一方，家畜を対象

換えタンパク質の局在を明らかにするため，発現としたOMVワクチンの開発はヒトと比較すると

誘 導 後 の 大 腸 菌 菌 体 か ら ，Lobos ら ５） お よ び

遅れており，特に家禽を対象としたOMVワクチ

Santiviagoら６）の方法を参考に外膜を分離した。

ンに関する報告はいまだ数少ない３，４）。本研究で３時間発現誘導後の菌液を遠心分離し，10mM

２）Ⓡ© The Ito Foundation

297

鶏に対する高効率・低負荷な新規サルモネラ粘膜ワクチンの開発
A

B

lpp-ompA 46-174

araBAD

Lpp+9aalpp-ompA 46-132

araBAD

Lpp+9aalpp-ompA 46-88

araBAD

Lpp+9aa

OmpA 46-88

lpp

araBAD

Lpp+9aaMCS

pBAD-MisL（NC）

araBADLTB

His tagpBAD-ﬂiC-MisL

araBADLTB

His tag

OmpA 46-174
OmpA 46-132
MCS

MCS
MCS

His tag

His tag

His tag

His tag

MCS

MisLβ
ﬂiC

MisLβ

Fig. 1 Gene maps of recombinant protein expression vectors used in this study. Abbreviations；araBAD, araBAD

promoter；lpp+9aa, gene encoding the leader peptide and the first nine amino acids of the major E.coli
lipoprotein；LTB, gene encoding the heat-labile enterotoxin chain B（LTB）signal sequence；MCS, multicloning
site.

Tris-HCl（pH8.0）で洗浄，再懸濁後，超音波破計画を変更し，組換えタンパク質の大腸菌表層砕機を用いて菌体を破砕した。破砕した菌液をディスプレイ系を用いてOMVの分離・精製条件

４℃，8,000×ｇで５分間遠心し，上清の一部をの検討を行った。本発現系は著者らの研究グルー

大腸菌の粗抽出物（crude extract；CE），残りのプで構築され，大腸菌の外膜外側（外膜表層）に上清をさらに４℃，13,000×ｇで30分間遠心し，任意の組換えタンパク質を発現し得ることをすで上清を可溶性画分（soluble fraction；SF）としに報告しており７），発現した組換えタンパク質は，て－80℃で保存した。ペレットに外膜溶出溶液

特殊な処理を必要とせず，一般的な免疫学的手法（10mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，２％トリトンを用いて容易に検出することができる。この発現Ｘ-100）を添加し，37℃で30分間インキュベート

プラスミドベクターは，pBAD30プラスミドベク

後，４℃，13,000×ｇで45分間遠心した。ペレッ

ターをベースに，アンカータンパク質としてST

トを10mM Tris-HClで洗浄後，得られた沈殿物のautotransporter MisLのβ領域，そのMisLのシに50μlの２％SDS/Tris-HClを添加して，４℃，

グ ナ ル ペ プ チ ド と し て 既 報 の heat-labile

一晩静置することにより完全に溶解させ，大腸菌

enterotoxin chain Bのシグナルペプチドが組み込

外膜（outer membrane；OM）として－80℃でまれている（Fig. 1B）。本研究では，大腸菌表層

保 存 し た 。抽 出 し た 各 画 分 に つ い て ，SDS-にSEのワクチン候補抗原であるfliCを発現する発PAGE お よ び 抗 His tag 抗 体 を 用 い た western

現プラスミドベクターを用いた。また，OMVのblottingにより解析した。

分離・精製には，動物細胞から放出されるエクソ

2.3

大腸菌OMVの分離・精製条件の検討

2.2で作製した発現プラスミドベクターの組換

ソームやウイルスの分離に用いられる水性二層分配法を応用した。

えタンパク質の発現効率が予想以上に低く，OMVの産生条件はSchroederら ８）の報告を参OMVの精製条件を検討するには，感度および精考に以下のように設定した。大腸菌表層にSEの度が十分ではない可能性が予想されたため，研究

ワクチン候補抗原であるfliCを発現する発現プラ© The Ito Foundation

298

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ス ミ ド ベ ク タ ー （pBAD-filC-MisL） を E.coli
UT5600に形質転換し，Ｌ-アラビノースを最終濃度0.2％となるように加え，発現誘導した。OMV

３．結果と考察3 . 1 大腸菌外膜内側（ペリプラズム腔側）への産生に最適な発現誘導時間を検討するために，の組換えタンパク質の発現の確認

発現誘導後，３，６，および10時間培養した。培構築した４種の発現プラスミドベクターの形質養後，ゲンタマイシン（最終濃度50μg/mL）を転換体について，発現誘導３時間後の全菌体を用添加し，37℃で30分間振盪培養した。培養液を回いたSDS-PAGE，および抗His tag抗体を用いた

収し，４℃，4,500×ｇで30分間遠心した後，上清

western blotting を 行 っ た 結 果 を Fig. 2A に 示 しを回収し，0.20μmシリンジフィルターを用いてた。lpp-ompA 46-174，lpp-ompA 46-132，およ濾過滅菌した。浦島らの報告を参考に ，0.2容量

びlppプラスミドベクターの形質転換体において，のポリエチレングリコール溶液（30％ PEG6000,

いずれも予想される分子量のバンドが検出され3M NaCl）を添加し，４℃で16時間静置した。静た。一方lpp-ompA 46-88プラスミドベクターの置後のサンプルを４℃，9,360×ｇで60分間遠心

形質転換体では，バンドは検出されなかった。バ

し て OMV を 沈 殿 さ せ ，PEG 洗 浄 溶 液（５ ％ンドが検出された３種の形質転換体の，それぞれPEG6000, 0.5 M NaCl）に再懸濁した後，同条件

CE，SF，OMについてSDS-PAGE，および抗His

で遠心した。沈殿を20mM Tris-HCl（pH8.0）でtag抗体を用いたwestern blottingを行った結果を懸濁し，限外濾過（MWCO 100,000）を２度行う

Fig. 2Bに示した。lpp-ompA 46-174およびlpp-

こ と で 低 分 子 量 タ ン パ ク 質 と PEG を 除 去 し ，ompA 46-132の形質転換体において，外膜画分

OMVを精製した。各発現誘導時間におけるOMVにバンドが検出された。以上の結果から，lpp-

産生量は，沈殿のタンパク質濃度を測定すること

ompA 46-174 お よ び lpp-ompA 46-132 発 現 プ ラで比較した。精製したOMVについて，形態学的スミドベクターは，大腸菌の外膜の内側に組換え

変化を透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて観察

タンパク質を固定・発現し得る可能性が示唆されするとともに，Protease accessibility assayを用た。

いて組換えタンパク質の発現および局在について

3.2

10）

検証した。Protease accessibility assayはKimら

各誘導時間の培養液から得られたOMVのタンの報告を参考に行った。発現誘導後10時間の形質

パク質量は３時間と比較して６および10時間で増転換体から精製したOMV9μgを20mM Tris-HCl

加し，６時間では有意な増加が見られた（Tukey（pH8.0）に懸濁し，それぞれバッファーのみ，

Kramer p<0.05）（Fig. 3A）。発現誘導後10時間のSDS（終濃度１％），proteinase K（PK：終濃度

培養液から得られた精製物の総タンパク質量は，0.1mg/mL），あるいは同一濃度のPKとSDSを混超遠心法を用いた既報と比較してもほぼ同等の回合して加え，37℃で30分間インキュベートした。

収効率であった８）。TEMを用いてOMVの形態観

プロテアーゼ阻害剤を添加し，PKを完全に不活察を行ったところ，すべての誘導時間において化 し た 後 ，SDS-PAGE ，抗 SE 抗 体 を 用 い た

OMVを示唆する球状で二重膜構造を示す小胞がwestern blottingにより解析した。

確認され，大きさはおおよそ10～100nmであった

９）

大腸菌OMVの分離・精製条件の検討（Fig. 3B）
。最も多くのOMVが確認されたのは発現誘導後，10時間であった。精製したOMVにつ© The Ito Foundation

鶏に対する高効率・低負荷な新規サルモネラ粘膜ワクチンの開発

A

B

174

132

174

132

M

0

3

0

3

M

0

3

0

M

0

3

lpp
0 3

M

0

3

lpp
0 3

88

174
132
lpp
pBAD
M C S O C S O C S O C S O

88

299

3

174
132
lpp
pBAD
M C S O C S O C S O C S O

Fig. 2 SDS-PAGE（left panel, stained by CBB）and western blot analysis（right panel）of total cell proteins（A）andouter membrane fractions（B）from transformant of lpp-ompA 46-174, lpp-ompA 46-132, lpp-ompA 46-88, or lpp
expression vector. The presence of recombinant proteins was confirmed by western blot using anti-His antibody.
Abbreviations：174, transformant of lpp-ompA 46-174 expression vector；132, transformant of lpp-ompA 46-132
expression vector；88, transformant of lpp-ompA 46-88 expression vector；lpp, transformant of lpp expression
vector；pBAD, transformant of pBAD30 plasmid vector ； 0, 3, hours after induction；C, crude extract；S, soluble
fraction；O, outer membrane fraction.

いて，fliCタンパク質の局在を確認する目的で，

blottingの結果，バッファーのみを反応させた

Protease accessibility assayを行った（Fig.４）。

OMVにおいて，75～100kDa付近にfliCのバンド

銀染色の結果から，PK，およびPKとSDSを反応が確認された。Proteinase Kは大腸菌の外膜を通させたOMVにおいて，それぞれ30kDa付近にPK

過して作用することはないため，透過処理を行っと思われるバンドが確認された。PKのみを反応ていない外膜では外側に存在するタンパク質のみさせたOMVでは，37kDa付近にOmpAのバンドを分解する。PKのみを反応させたOMVにおいてが 認 め ら れ た 。 抗 SE 抗 体 を 用 い た western

認められたOmpAは，外膜が分解を受けていない© The Ito Foundation

300
A

Total amount of protein（µg）

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）
＊

500
400
300
200
100
0

3

B

6
10
Hours after induction

3h

6h

10h

Fig. 3 The total amount of protein（A）and TEM image（B）of OMV separated from pBAD-fliC-MisL transformant of 3,6, or 10 hours after induction.（A）All data represents means（±SD）of triplicate experiments. ＊indicate p＜0.05.
Tukey-Kramer test.（B）Scale bar represents 100 nm.
（kDa）

（kDa）

100
75

100
75
50

50

37

37

25

25

20

20

PK ： ＋SDS ： ＋＋－－－

PK ： ＋SDS ： ＋＋－－－

Fig. 4 Analysis of recombinant protein localization in OMV separated from pBAD-fliC-MisL transformant of 10 hours

after induction. Puriﬁed OMV expressing fliC protein were incubated with and without proteinase K in thepresence or absence of 1％ SDS. Samples were then subjected to SDS-PAGE（left panel, stained by silver staining）
and western blot analysis using anti-SE antibody（right panel）.

ことを示しており，同条件のサンプルのwestern

層分配法の条件は大腸菌のOMVの分離・精製に

blottingでfliCのバンドが確認されないことから，

有効であり，得られたOMVに発現する組換えタ

fliCが外膜の外側に発現していることが明らかとンパク質の抗原性にも影響を与えないことが明らなった。以上の結果から，本研究で用いた水性二かになった。

© The Ito Foundation

鶏に対する高効率・低負荷な新規サルモネラ粘膜ワクチンの開発

４．要

約

細菌から放出される外膜由来の小胞である外膜
小 胞（outer membrane vesicle；OMV）の ワ ク
チン利用を目的に，大腸菌リポタンパク質のシグ
ナルシークエンス（Lpp），および大腸菌主要外膜タンパク質（OmpA）をアンカータンパク質として，非病原性大腸菌の外膜内側に組換えタン
パク質を固定・発現し得る発現プラスミドベク
ターを構築した。また，水性二層分配法を応用することにより，組換えタンパク質の抗原性を変化させることなく大腸菌OMVを分離・精製することが可能であった。

301

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© The Ito Foundation

302

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査A survey of gastrointestinal parasites infection and implementation ofparasite control program in cattle

森

本

素

子

（宮城大学食産業学群）

Motoko Morimoto（School of Food Industrial Sciences, Miyagi University）

Lean meat from pasture grazing cattle has become popular for Japanese consumers as
healthy and tasty. However, it is a challenging task to control internal parasites in grazing
livestock. When the gastrointestinal nematode infects with the host, intestinal epithelium andinnate lymph cells are activated and induce Th2 immune responses. However, it is rare thatcattle show extremely severe clinical disease during parasite infection so that many owners failto recognize the loss of productivity. Ivermectin is a highly effective medication against ticks
or nematodes； however, the incidents of anti-parasitic drug resistance increase these days.
The field study to investigate an infestation of gastrointestinal parasites has been conductednation-wide in Japan in the 1990s, but not recently. In this study, the field study was
performed to investigate an infestation of gastrointestinal parasites and deworming practice inpublic pastures in Miyagi. Feces were collected from 10-21 cattle from four pastures andinvestigated with the modified Wisconsin technique. Parasites eggs were detected from all
pasturelands. Infection rates of nematodes were from 29％ to 70％ each. 85％ of the total were
infected with coccidia. Next, we reinvestigated one of the pastures which several cattle infectedwith Moniezia benedeni. Deworming practice with ivermectin was performed every month in
this pasture, but 30 out of 145 cattle were positive with Moniezia benedeni and they wereadministrated with fulmoxal after the fecal test, then 24 out of 28 cattle（85.7％）were
dewormed. It is essential to carry out an appropriate deworming program, especially to start
before installing the cattle in pasture.

１．目

費者にも人気が高まっている。しかし，放牧は感的染のリスクを高め，その結果甚大な経済的損失を

近年，生産コストの削減や省力化だけでなく，もたらす場合がある。線虫感染により，腸管粘膜

家畜のアニマルウェルフェアや畜産物の付加価値

下の免疫細胞が活性化し，上皮に作用して粘液産生産を目的とした放牧が注目を浴びている。放牧生を増し，平滑筋の運動が活発になって蠕動運動

牛の赤身肉は健康的で食べ応えがあるとして，消が増す１，２）。その結果，腸内細菌叢も変化し，他© The Ito Foundation

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査の病原体に対する免疫応答にも変化をもたらす。

303⑤ 消化管寄生虫の感染による家畜への影響に

しかし一方で臨床に目を移すと，消化管内寄生虫

ついての認識感染では死に至る重篤な病態はまれであり，外観⑥

からは家畜のダメージを見極めるのが難しいこと

調査２：調査結果をとりまとめた結果，Ａ農場も多い。そのため，寄生虫感染が宿主消化管の生から全頭調査の依頼があり，146頭の牛から再度理機能の変化をもたらし，潜在的な損耗を与えて採材した。そのうち条虫に感染していることが確いることを見逃しがちである。その結果，生産性

認された牛30頭に，家畜保健衛生所が投薬（フルを上げることを目的に給与される免疫賦活飼料やモキサール）を実施した。その後，投薬の効果を生菌剤も，期待される効果を発揮することが困難

確認するためにもう一度糞便検査を行った。

になる。駆虫薬として，イベルメクチン系の製剤が開発され，効果をあげるようになったが３～５），
開発から時間が経ち，近年では適切な駆虫プログ

駆虫プログラム実施による診療回数の変化

３．結果と考察調査１：宮城県内の４か所の公営牧場の消化管

ラムが行われず，効果が十分得られなかったり，

内寄生虫の浸潤度耐性をもつ虫が出現して感染をコントロールでき【Ａ牧場】和牛10頭とホルスタイン11頭の21頭かていない例が報告されるようになってきた６）。わら採材した。

が国では，1990年代に消化管内寄生虫感染につい

消化管内線虫の感染が29％，コクシジウム感染ての全国的な疫学調査が行われた が，その後はが100％，条虫感染が19％であった（Fig. 1A）。

地域限定的に調べられている程度で，まとまった

一般線虫，ネマトジュルス，ベネデン条虫が検出

データはない。そこで本研究では，まず宮城県をされた。駆虫薬はイベルメクチン系のアイボメッ

中心に，東北圏内の牧場において駆虫プログラム

クを使用しており，毎月投薬していた。

のヒアリングを行うとともに，採糞して虫卵検査【Ｂ牧場】和牛10頭から採材した。

７）を実施し，消化管内寄生虫の浸潤度を調査するこが20％，条虫感染が20％であった（Fig. 1B）
。駆

ととした。
２．方

消化管内線虫の感染が50％，コクシジウム感染
虫薬は定期的には使用しておらず，寄生虫の感染法症状が出たときにイベルメクチン製剤を使用して調査１：宮城県内の４か所（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）

いるとのことであった。一般線虫，ベネデン条虫の公営放牧場に調査協力を依頼し，各農場でホルが検出された。また，全体的な感染率は低いもの

スタイン種または和牛10～20頭から直腸便を採取の，乳頭糞線虫に濃厚感染している若齢牛が確認した。ウィスコンシン変法を用いて虫卵検査を実された。乳頭糞線虫は毎年感染牛の死亡が報告さ施し，虫卵数の計測，虫の種類の同定を行った。

れており，陽性牛が数頭であっても注意を要する

同時に，以下の項目についてヒアリング調査を実施した。

線虫である。
【Ｃ牧場】和牛９頭と，ホルスタイン10頭から採材した。

①

使用している駆虫剤の種類②

投薬時期および回数

③

放牧の時期

が95％，条虫感染が５％であった（Fig. 1C）。一④

駆虫プログラムの継続年数

般線虫，乳頭糞線虫，牛鞭虫，ベネデン条虫が検消化管内線虫の感染が58％，コクシジウム感染© The Ito Foundation

304

平成30年度Ａ

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Nematodes

Coccidia

Moniezia benedeni

19%

29%
71%

Ｂ

Nematodes

100
%

81%

Coccidia

Moniezia benedeni

20%

20%
50%

Ｃ

50%

Nematodes

80%

80%

Coccidia

Moniezia benedeni

5%

5%

42%
58%

Ｄ

Nematodes

95%

95%

Coccidia

Moniezia benedeni
10%

30%
70%

100
%

90%

Fig. 1 The ratio of gastrointestinal parasite-infected cattle.（■：positive■：negative）

F arm A：The positive ratio of nematodes infection was less than other farm.

Ivermectin was administered every month.（n=21）, Farm B：Deworming was
unexecuted.（n=10）, Farm C：Flumethrin was poured on every month.（n=19）,
Farm D：Flumethrin was poured on sometimes.（n=10）出された。駆虫薬はバイチコールを使用してお消化管内線虫の感染が70％，コクシジウム感染

り，放牧期間中に１回から２回の投与を行っていが100％，条虫感染が10％であった（Fig. 1D）。

た。

一般線虫，牛捻転胃虫，毛細線虫，ベネデン条虫【Ｄ牧場】Ｄ牧場は和牛10頭からサンプリングをが検出された。駆虫薬はバイチコールを使用して行った。

おり，放牧期間中に１回から３回の投与が行われ© The Ito Foundation

305

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査

CoccidiaFig. 2

Nematodes

Trichuris

Moniezia benedeni

Microscopy images of eggs or oocysts．

ていた。

化を調べたところ，条虫陽性牛は陰性牛に比較し検出されたオーシストおよび虫卵の一例を写真

低値を示した（Fig.３）。そこで，陽性牛に駆虫に示した（Fig.２）。一般線虫については，糞便目的でフルモキサールを投与した。その結果，５ｇあたりの虫卵数が100個を超えた個体につい85％以上の牛で虫卵不検出となったことから，フて 培 養 を 行 い ，子 虫 に て 同 定 を 行 っ た が ，ルモキサールに一定の効果があることが確認でき

OesphagostomumやHaemonchusが同定された。

た。また，調査１および２を比較したところ，寄ピロプラズマ感染予防のため，ダニの駆除を行う

生虫陽性割合について結果はほぼ同様であった目的でバイチコールがよく利用されているが，消（Table１）ことから，今後の調査では，まず10～

化管寄生虫には効果が低い。イベルメクチン製剤

20頭を抽出して検査を行えば，群全体の駆虫の方を適切に使用することが必要であるが，経済的な向性を決めるには十分であることが示唆された。

理由から両剤を使用している牧場はなかった。ま本研究の結果は，全国的な疫学調査を呼びかけた，イベルメクチン製剤を使用していたＡ牧場でる基礎調査になることが期待され，家畜の生産性

は，使用頻度が高すぎ，耐性虫が出現している可能性もあり，適切なプログラムに従って使用する
よう指導が必要と考えられた。

Body weight450

調査２：Ａ牧場の追跡調査
400

146頭（和牛42頭・ホルスタイン104頭）の牛か

ベネデン条虫に感染しており，フルモキサールを経口投与された。約３週間後に28頭について再度虫卵検査を行ったところ，24頭において虫卵不検

kg

48か月・ホルスタイン26頭：月齢11～23か月）が

350
300
250

出となり（85.7％），改善が見られた。
通常，条虫感染は大きな問題にはならないが，
今回陽性牛の中に，育成に課題をかかえた個体が多いことが家畜保健衛生所から指摘され，体重変

positive
negative＊ら採材した。このうち30頭（和牛４頭：月齢20～

4

5

6

7

8 9 10
month

11 12

Fig. 3 Changes of body weight from ten（May）to 17

month old（December）in Farm A. The body weightof Holstein infected with Moniezia benedeni was
kept less than uninfected cattle. n=8，＊p＜0.05© The Ito Foundation

306

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 Positive ratio（％）of worm infection in Farm A

グを行うとともに，採糞してウィスコンシン変法

Exp1（n＝21）

Exp2（n＝146）

により虫卵検査を実施し，消化管内寄生虫の浸潤

Nematodes

29％

43％

Coccidia

100％

86％

Moniezia benedeni

19％

21％

度を調査した。
調査１：４か所の牧場からそれぞれ10～21頭のThe ratio of gastrointestinal worm-infected cattle in Farm A
didn’t show big differences between experiment 1（n＝21）and2（n＝146）．

サンプルを採取した。消化管内寄生虫の感染は４か所すべての牧場において確認され，特にコクシジウム感染は蔓延している。蠕虫としては，一般
線虫，ネマトジュルス，乳頭糞線虫，牛鞭虫，ベの向上に貢献しうる。今後は，放牧前および投薬

ネデン条虫などが検出された。

後の虫卵調査を実施することにより，経済的かつ調査２：今回の調査結果でベネデン条虫の感染

効果的な駆虫プログラムが提案できるものと考えが見られた牧場で，引き続き全頭調査を行ったとる。また，本研究によって示されたとおり，寄生

ころ，146頭のうち30頭に条虫の感染が確認され虫は広く浸潤しており，増体への影響も示唆された。条虫陽性牛の体重変化を調べたところ，陽性たので，今後さらに広い地域の調査を行うことが牛は陰性牛に比較し，調査期間を通じて低値を示重要である。

した。続いて，その30頭に対してフルモキサール

４．要を投与した後，再調査を行ったところ，28頭中24

約頭（85.7％）の牛で改善が見られた。すなわち，近年，生産コストの削減や省力化だけでなく，家畜のアニマルウェルフェアや畜産物の付加価値

フルモキサールは条虫感染に対し一定の駆虫効果が認められた。

生産を目的とした放牧が注目を浴びているが，放今後は，入牧前および投薬後の検査を行うこと

牧は感染のリスクを高め，その結果甚大な経済的と，イベルメクチン製剤の適切な投与プログラム

損失をもたらす場合がある。駆虫薬として，イベの実施を助言したいと考えている。

ルメクチン系の製剤が開発され，効果をあげるよ
うになったが，近年では適切な駆虫プログラムが行われず，効果が十分得られなかったり，耐性をもつ虫が出現して感染をコントロールできていない例が報告されるようになってきた。わが国では，1990年代に消化管内寄生虫感染についての全
国的な疫学調査が行われたが，その後は地域限定
的に調べられている程度で，まとまったデータはない。そこで本研究では，まず宮城県内の４か所の公営牧場において，駆虫プログラムのヒアリン

文献１） 森本素子：家畜感染症学会誌，5，63～68，2016.
２） Zhao, A., McDermott, J., Urban, J. F. Jr., et al.：J.
Immunol., 171, 948～54, 2003.
３） 及川伸，川匂文男，平賀健二，本川正人，千葉由見，
小川徹三，福本真一郎：日獣会誌，51，237～240，
1998．
４） 髙橋俊彦：家畜診療，50，339～347，2003.
５） Nagata, T., Roncalli, R. A., Mishiba, T., Yamada, K.,
Ura, S.：Jpn. Bull. Animal Hyg., 42, 3～7, 1995.
６） Geurden, T., Chartier, C., Fanke, J., et al.：Int J
Parasitol Drugs Drug Resist, 5, 163～71, 2015.
７） 髙橋史昭：臨床獣医，36，14～20，2018.

© The Ito Foundation

307

ゲノム疫学的手法による豚抗酸菌症のリスク評価と実態解明
Population genomics and risk assessment of swine mycobacteriosis

大（岐阜大学応用生物科学部

屋

賢

司・小

松

徹

也＊

現：国立医薬品食品衛生研究所，＊愛知県中央家畜保健衛生所）

Kenji Ohya and Tetsuya Komatsu＊（Department of Applied Biological Sciences, Gifu University, Present address：National Institute of Health Sciences，＊Aichi Prefectural Chuo Livestock Hygiene Service Center）

Swine mycobacteriosis, mainly caused by Mycobacterium avium subsp. hominissuis（MAH）, represents chronic proliferative intestinal and systemic lymphadenitis in pigs. In thisstudy, we performed genotyping and genome analysis of MAH isolates derived from different
geographical locations and clinical conditions. Instead of typical MAH genotypes and lineages,
we found atypical MAH genotypes and lineages in pigs in Japan. In addition, we attempted torisk assessment of swine diseases by analyzing questionnaires to farmers concerning pigrearing conditions. Furthermore, by in silico DNA-DNA hybridization analyses ofMycolicibacterium peregrinum isolates, we revealed that M. peregrinum should be one of thecausative agents for swine mycobacteriosis, which may infect to a pig from surrounding
environment. In the way described above, genome epidemiological study towards to elucidate
swine mycobacteriosis has been on-going.

１．目

ワーヘッドから遺伝子型が同じ菌が分離され，こ的

れら環境中のMAHがヒトへ感染することが明ら

豚抗酸菌症は，非結核性抗酸菌（nontuberculous

かになっている２）。豚抗酸菌症においても，MAH

mycobacteria：NTM）の う ち ，Mycobacterium

は，感染母豚から排出された後，オガ粉や土壌でavium subsp. hominissuis（MAH）が主要な原因

増殖し次の豚（主に新生豚）への感染源となるこ菌となる，内臓や全身の慢性増殖性リンパ節炎でとが知られている１）。そのため，本症の発生と豚ある。本症による病変部廃棄（部分・全廃棄）率の飼育形態の関連も重要であることが分かる。本は全出荷豚数の１％前後であり，経済的損出は年

研究では，日本国内において異なる地域で飼育さ間1.5～２億円であると試算され，蔓延する農場れる豚から分離されたMAHのゲノムおよび遺伝や地域における損害は大きい 。MAHをはじめ

子型解析を行い，ヒトMAH症分離株との比較をとしたNTMは，動物やヒトの体内以外に，土壌した。また，養豚生産者に豚飼育形態のアンケー

や 水 中 な ど の 環 境 中 に も 存 在 す る 。ヒ ト の 肺

ト調査を行い，抗酸菌症をはじめとした廃棄要因

NTM症では，患者の使用するバスタブやシャとのリスク解析を試みた。さらに，豚抗酸菌症は，

１）© The Ito Foundation

308

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

MAH以外のNTMも原因となることが知られているした５）。

が，その詳細は不明である。本研究では，豚リンパ節

2 . 2 MAH の 縦 列 反 復 配 列 多 型 （variable

炎からMAH以外のNTMであるMycolicibacterium

numbers of tandem repeats：VNTR）解析

peregrinumを分離した。そこで，豚のリンパ節炎

MAH の VNTR 解 析 は ，反 復 配 列 領 域 と し て病変から分離したM. peregrinum株と周辺の土壌か

Mycobacterial interspersed repetitive units

ら分離した株のゲノム解析を行い，M. peregrinum（MIRU）-VNTRとMycobacterium avium Tandem

が周辺環境から豚に感染しリンパ節炎（抗酸菌

Repeats（MATR）-VNTRの計19領域の反復配列症）の原因となる可能性について検討した。以上

領域を対象として行った ６，７）。M. avium subsp.

のようなゲノム疫学的アプローチを行い，豚抗酸

hominissuis MAH104株を基準株として，供試株菌症の実態解明を目指した。

の各領域の反復数を算出した。得られた反復数

２．方
2.1

は ，Bionumerics ver. ７ を 用 い て ，最 小 全 域 木

法（minimum spanning tree：MST）を作成し供試

供試菌株

株と他地域，他宿主から分離されたMAHの疫学

MAHに関しては，研究室にて保有していた東的関連性を評価した。

海地方のＡ県の豚のリンパ節から分離された282.3

株，北陸地方Ｂ県の豚リンパ節から分離された20

M. peregrinum株およびMAH株のゲノムは，株を用いた。M. peregrinumに関しては，Ａ県でPureLink genomic DNA extraction kit

飼育される豚リンパ節炎および同一農場の土から（Invitorgen）を用いて調製した。各種株３μｇの分離された株合計２株を用いた。M. peregrinum

ゲノムDNAを用い，平均長350bpのペアエンドラの分離は，以前の報告のとおり，以下のように行っ

イ ブ ラ リ ー を 調 製 し た 。 Beijing Genomic

た。小豆大の不透明な白色結節や乾酪様壊死

Institute に て ，HiSeq X10 シ ス テ ム（Illumina）

部およびその周辺１cm を切り出し，１mlのダルを用いてリード長２x 150 bpでデータを取得しベッコリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS（-））中でた。得られたリードの品質チェック，トリミング，

５mmステンレス球（アズワン），400μlの２％アセンブル，ドラフトゲノムの取得は以前の報告

NaOHとともに，卓上破砕機μT-12（TAITEC）
をのとおり行った ３，４）。アノテーションは，NCBI

用いて3,200rpm，30秒間処理し乳剤を調製した。

Prokaryotic genome Annotation pipeline（PGAP）

400 μl の 0.5 ％ N-Acetyl-L cysteine（NALC）-2 ％により行った８）。ゲノム配列を利用したin silico

NaOHを加え14時間静置し，D-PBS（－）
で洗浄後

DNA-DNA Hybridization（DDH）として，ANI

最終的に１mlの接種用乳剤とした。これら接種（average nucleotide identity）解 析 を JSpeciesWS

用乳剤100μlを２％小川PS培地（日水製薬），400μl（Richter）上で行った９）。

３，
４）

３

をoleic acid-albumin-dextrose-catalase（OADC；BD Diagnostics）とPANTA（BD Diagnostics）を

MAHおよびその他のNTMのゲノム解析

2 . 4 豚飼育状況のアンケート作成と聞き取り調査の実施

加 え た Mycobacteria Growth Indicator Tube

豚飼育状況のアンケートは，家畜衛生の専門（MGIT）（BD Diagnostics）に そ れ ぞ れ 接 種 し家，微生物リスク評価の経験者，東海地方Ｃ県の37℃で３週間から４週間培養した。得られた抗酸

家畜保健衛生所・養豚担当者ら共同研究者と協議

菌は，rpoB遺伝子の配列解析により菌種を決定し作成した。アンケート内容は，回答者が先入観© The Ito Foundation

ゲノム疫学的手法による豚抗酸菌症のリスク評価と実態解明

309をもって回答することのないよう注意して作成しに国内で，NTM症患者，患者周辺の環境，豚かた。担当家畜保健衛生所（６ヶ所）が各生産者をら分離されたMAH株と比較を行い，さらにゲノ

訪問し，解析結果を還元する旨を説明しアンケー

ムデータを取得した。本研究では，VNTR19領域

トを実施した。

を解析したが，結果がほぼ同等であったVNTR15
領域の解析結果をFig.１に示す。これまでの報告

３．結果と考察どおり，日本国内で分離されるMAHのVNTRパ

3 . 1 国 内 で 飼 育 さ れ る 豚 か ら 分 離 さ れ た

ターンは，患者，バスタブなどの周辺由来株と豚由来株の２グループに分かれる７）。Ａ県の豚抗酸

MAHの遺伝学的特性
MAHはヒト，豚を含むさまざまな動物に感染菌症アウトブレイク株と，Ｂ県の豚抗酸菌症由来

し環境中にも広く存在する。そのため本菌の感染株は，過去の報告で豚から分離された株（沖縄，源，感染経路や疾病の予後，薬剤耐性の有無など

大阪などに由来）と同じグループであった。Ａ県を明らかにすることは医学，獣医学上重要であのアウトブレイク株はノードの位置から典型的なる。MAHを遺伝学的に型別する方法として，ゲ

日本の豚由来株の特性を示した。Ｂ県由来株は腸ノム上に複数存在する10bpから100bpの繰り返し

間膜リンパ節炎だけでなく，全身のリンパ節炎を配列のコピー数を指標とした，VNTR解析が用い呈した17株を含んでおり，これらは，典型的な豚られている。VNTRのパターンはMAHの細菌学由来株と同じグループに属したものの，ノードの的特徴を直接的に表現しているものではない 。

位置は少し離れたところに配置された（Fig.１，

しかしこのパターンを株間で比較することによPig isolates in B prefecture）。また，Ａ県由来株り，さまざまな地域，宿主，環境を由来とする

では，MAHのマーカーとして使用される挿入配

MAHの遺伝学的関連や性質が明らかとなる。こ列IS1245を持たない８株を含んだが，これら８株

れ ま で に ，MAH の VNTR 型 別 に よ り ，日 本 のは豚由来株のグループではなく，患者および患者

NTM症患者より分離されたMAHは，欧米（米周 辺 環 境 の グ ル ー プ に 配 置 さ れ た（Fig. １ ，国，フランス，フィンランド）のNTM症患者，

Particular pig isolates in A prefecture）。

10）

欧州で飼育される豚から分離されるMAHと遺伝

近年，MAHの集団ゲノム解析の結果，MAHは学的に異なることが報告されている。また日本の宿主・地域の異なる５つの系統（lineage）に分

豚より分離されたMAHは日本のNTM症患者を由けられることが報告された12）。この報告によると，来とするMAHよりもフランスやフィンランドの日本の患者および周辺環境由来株は，NTM症患者，豚より分離されたMAHと遺伝学的MahEastAsia１およびMahEastAsia２に属し，に近いという報告がある

日 本 の 典 型 的 な 豚 由 来 株 は ，SC2 に 属 す る 。

。

７，11）

本研究では，東海地方Ａ県において食肉検査場

VNTR解析で明らかとなった，非典型的な豚由来で廃棄処分となったリンパ節より分離された株がどの系統に属するかについて現在詳細な集団

MAH，同Ａ県のある養豚場で発生した豚抗酸菌

ゲノム解析が進行中である。非典型的なVNTRプ症アウトブレイクの際に分離されたMAH，北陸

ロファイルを示す豚由来MAH株，例えば患者由

地方Ｂ県において食肉検査場で廃棄処分となった

来株と同じグループに属する株がただちにヒト－リンパ節より分離されたMAHの遺伝学的特性を

豚間の感染を示唆するものではない。しかし，さ検討した。これらの株のVNTRパターンを，過去

まざまな地域，宿主，病態から分離されたMAH© The Ito Foundation

310

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Fig. 1 A minimum spanning tree based on 15 MATR-VNTR genotyping of M. avium subsp. hominissuis isolates（93isolates from patients in Japan, 70 isolates from pigs in Japan from past studies, 37 isolates from patients’bathrooms in Japan, 15 isolates from pigs in a case of outbreak in A prefecture, particular 13 isolates from pigs in
A prefecture and 20 isolates form pigs.

ゲノムの情報を蓄積することにより，環境に生存が，豚抗酸菌症以外の感染症が発生したため，さし幅広い宿主域，病態を示すMAHの自然界におらなるアンケートの実施，食肉処理施設での廃棄ける生存戦略を明らかにできると考えられる。

記録の集計を行うことができなくなった。2019年

3.2

豚飼育形態のアンケート調査

３月時点で45件の生産者からアンケートを回収で本研究では，豚飼育形態のアンケート調査を行きた。生産規模としては45件中32件（71.1％）がい，豚抗酸菌症をはじめとした各種疾病の発生状

飼育母豚200頭以下であり，全国平均の21.3％ 13）

況との相関を解析しリスク評価を行うことを計画に比べるとかなり高い割合を示したが，前述の理した。調査地域とした東海地方のＣ県では，６ケ

由のため大規模な養豚場を訪問することができな所の家畜保健衛生所の担当地区に約180件の養豚かったためであると思われる。敷き材としてオガ場が存在する。アンケート調査は順調に進んだ粉を使用している生産者は５件（11.1％）であっ© The Ito Foundation

ゲノム疫学的手法による豚抗酸菌症のリスク評価と実態解明た。生産者へのインタビューでは，オガ粉の使用生産者の中で豚抗酸菌症の発生に苦労している話

４．要

311

約

をうかがうことはできなかった。引き続き，未実

豚抗酸菌症は ，非結核性抗酸菌（nontuberculous

施の生産者へのアンケート実施と食肉処理施設でmycobacteria：NTM）の う ち ，Mycobacteriumの廃棄要因の集計を行う予定である。いくつかの

avium subsp. hominissuis（MAH）が主要な原因

養豚場では，MAHの分離もできており，MAHの菌となる，内臓や全身の慢性増殖性リンパ節炎で遺伝子型，飼育形態と廃棄要因の相関を検討するある。本研究では，病態，地域の異なる豚由来

ことにより，豚の飼育形態と抗酸菌症をはじめとMAHの遺伝子型別，ゲノム解析を行った。典型

した各種疾病のリスク評価を実施予定である。

的な豚のグループ，系統に属する株以外に，非典

3 . 3 豚抗酸菌症から分離したM. peregrinum

型的なグループ，系統に属する株も存在することが示された。また，豚の飼育形態と抗酸菌症をはのゲノム解析
豚抗酸菌症は，MAH以外のNTMも原因菌となじめとする疾病の発生状況のアンケート調査によることがあると言われているが，その詳細は不明

るリスク評価を試みた。さらに，MAH以外に，な点が多い。実際，食肉処理の現場では，抗酸菌

Mycolicibacterium peregrinumが抗酸菌症の原因症が疑われる病変部は廃棄され，原因菌の分離，となる可能性があり，豚由来M. peregrinum株は，種の同定作業は行われていないのが現状である。

環境由来株とゲノムの一致率が非常に高く，環境本研究を進める過程で，豚のリンパ節炎病変部より，中のM. peregrinumが動物に感染する可能性を示

迅速発育菌であるMycolicibacterium peregrinum

唆するデータを得た。ゲノム疫学的アプローチにを分離した。M. peregrinumは，迅速発育型の抗より，豚抗酸菌症の実態解明にむけた研究が進行

酸菌であり，HIV陽性患者の結核様病変や野鳥へ中である。

の感染など比較的ヒトや動物への症例報告が多い
NTMである 14）。M. peregrinumも他のNTMと同様に土壌や水などの環境中に生息しているが，ヒトや動物の疾病との因果関係は不明である。リン
パ節からM. peregrinumが分離された同一農場において，土壌からM. peregrinumが分離されたため，ゲノム配列を取得し両者の比較を行った。豚
由来株，土壌由来株のゲノムサイズはそれぞれ
6,451,733bpおよび6,479,047bpであり，GC含量は
両株とも66.4％であった。in silico DDHの結果，両株のidentityは100％，ヒト結核様病変からの分離
株とのidentityはそれぞれ98.28％および98.27％であった。本研究は，迅速発育菌のM. peregrinuminが豚抗酸菌症の原因となる可能性を示し，環境中のM. peregrinumが動物への感染に関与することを示唆する貴重な研究となった15）。

文
献＊の文献は，謝辞に本研究費の成果として記載。
１） 大屋賢司，澤井宏太郎：豚の抗酸菌症の原因菌とその生態について，All about Swine，51，33～37，2017.
２） Nishiuchi, Y., Iwamoto, T., Maruyama, F.：
Infection sources of a common non-tuberculous
mycobacterial pathogen, Mycobacterium avium
complex, Front Med（Lausanne）,4, 27, 2017.
３） Ito, T., Maruyama, F., Sawai, K., Nozaki, K., Otsu,
K . , O h y a , K . ：D r a f t g e n o m e s e q u e n c e o f
Mycobacterium virginiense strain GF75, isolated fromthe mud of a swine farm in Japan, Genome Announc,
6. pii：e00362-18, 2018.
＊４） Ito, T., Sawai, K., Kawai, M., Nozaki, K., Otsu, K.,
Fukushi, H., Ohya, K., Maruyama, F.：Draft genome
sequences of Mycolicibacter senuensis isolate GF74
and Mycobacterium colombiense isolates GF28 and
GF76 from a swine farm in Japan, Microbiol Resour
Announc, 7. pii：e00936-18, 2018.
５） Kim, B. J., Lee, S. H., Lyu, M. A., Kim, S. J., Bai, G.
H., Chae, G. T., Kim, E. C., Cha, C. Y., Kook, Y. H.：© The Ito Foundation

312

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Identification of mycobacterial species by comparative
sequence analysis of the RNA polymerase gene
（rpoB）,J Clin Microbiol, 37, 1714～1720, 1999.
６） Inagaki, T., Nishimori, K., Yagi, T., Ichikawa, K.,
Moriyama, M., Nakagawa, T., Shibayama, T., Uchiya,K., Nikai, T., Ogawa, K.：Comparison of a variablenumber tandem-repeat（VNTR）method for typing
Mycobacterium avium with mycobacterial interspersed
repetitive-unit-VNTR and IS1245 restriction
fragment length polymorphism typing, J Clin
Microbiol, 47, 2156～64, 2009.
７） Iwamoto, T., Nakajima, C., Nishiuchi, Y., Kato, T.,
Yoshida, S., Nakanishi, N., Tamaru, A., Tamura, Y.,
S u z u k i , Y . , N a s u , M . ：G e n e t i c d i v e r s i t y o f
Mycobacterium avium subsp. hominissuis strains
isolated from humans, pigs, and human living
environment, Infect Genet Evol, 12, 846～52, 2012.
８） Tatusova, T., DiCuccio, M., Badretdin, A.,
Chetvernin, V., Nawrocki, E. P., Zaslavsky, L.,
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９） Richter, M., Rosselló-Móra, R., Glöckner, F. O.,
Peplies, J.：JSpeciesWS：a Web server for prokaryotic
species circumscription based on pairwise genome
comparison. Bioinformatics, 32, 929～31, 2016.
10） Iwamoto, T.：Outcome and challenge brought
about by molecular epidemiology of tuberculousorganisms, Kekkaku, 86, 917～21, 2011.
11） Ichikawa, K., van Ingen, J., Koh, W. J., Wagner, D.,
Salfinger, M., Inagaki, T., Uchiya, K. I., Nakagawa, T.,
Ogawa, K., Yamada, K., Yagi, T.：Genetic diversityof clinical Mycobacterium avium subsp. hominissuis
and Mycobacterium intracellulare isolates causing
pulmonary diseases recovered from different
geographical regions, Infect Genet Evol, 36, 250～255,2015.
12） Yano, H., Iwamoto, T., Nishiuchi, Y., Nakajima, C.,
Starkova, D. A., Mokrousov, I., Narvskaya, O.,
Yoshida, S., Arikawa, K., Nakanishi, N., Osaki, K.,
Nakagawa, I., Ato, M., Suzuki, Y., Maruyama, F.：
Population Structure and Local Adaptation of MAC
Lung Disease Agent Mycobacterium avium subsp.
hominissuis, Genome Biol Evol, 9, 2403～2417, 2017.
13） 日本養豚協会：2016年養豚農業実態調査.
14） Omar, S. V., Allam, M., Joseph, L., Mtshali, S.,
Ismail, N. A., Ismail, A.：Draft genome sequence ofMycobacterium peregrinum isolated from an HIVpositive patient in South Africa, Genome Announc, 5,e00759-17, 2017.
15） Komatsu, T., Ohya, K., Sawai, K., Odoi, J. O., Otsu,
K., Ito, T., Kawai, M., Maruyama, F.：Draft genome
sequences of Mycolicibacterium peregrinum isolated
from a pig with lymphadenitis and from soil on thesame Japanese pig farm, BMC Res Notes, 12, 341～
344, 2019.

© The Ito Foundation

313

鶏における家畜関連黄色ブドウ球菌の病原遺伝子
および病態形成の解析（Ⅱ）
Livestock-associated S. aureus in chicken：virulence, resistance andpathogenesis（Ⅱ）

小

野

久

弥

（北里大学獣医学部）

Hisaya Ono（Kitasato University School of Veterinary Medicine）

Staphylococcus aureus is one of the most common causes of zoonotic agents in the world,which are attributable to the infectious diseases and the contamination of food withenterotoxins in human and animals. In this study, to investigate the prevalence and pathogenic
factors of S. aureus in chickens in Japan, S. aureus isolates were cultured from chickens inslaughterhouses during the period from 2017 to 2018. The results showed that positive rates ofS. aureus detected in chicken was 81.1 percent. The isolates cultured from head and wing
showed high frequency of staphylococcal enterotoxin（SE）genes but a few of leg isolates
harbored SE genes. In addition, novel sequence types of S. aureus were found, suggesting theexistence of chicken-specific S. aureus strains. Although MRSA was not detected, manymethicillin-resistant coagulase negative staphylococci were detected and some of them wereidentified. We also clarified that SE causes mast cell degranulation in chickens. Furthermore, in
vitro studies showed staphylococcal enterotoxin A（SEA）bind with pyruvate kinase（PK）and
SEA induced PK translocation to nucleus, indicating that SEA-PK interaction evoke cellproliferation. These results would reveal the spread of S. aureus in chickens and highfrequency of virulence genes in the isolates and would lead to the insight into severe symptoms
in S. aureus infections.

１．目

けるS. aureus保菌状況の調査を行ったところ，的

これまで知られているよりも高頻度にS. aureus

黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は，が検出された。さらにMRSAは検出されなかった

近年，家畜関連メチシリン耐性黄色ブドウ球菌

もののメチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球（LA-MRSA）によるヒトおよび家畜の疾病が問菌が多数見つかった。また，我々は黄色ブドウ球

題視されており，実際に家畜・家禽と高頻度に接菌食中毒の原因毒素であるブドウ球菌エンテロト

触する農場関係者や獣医師でLA-MRSAが検出さキシン（SE）が鶏へ炎症を惹起すること，およ

れている１，２）。

び鶏マクロファージ由来培養細胞HD11細胞に細昨年度の本研究助成により，我々は食用鶏にお胞増殖を引き起こすことを見出した。本研究で© The Ito Foundation

314

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

は，鶏におけるブドウ球菌感染症の病態解析を目API Staph（ビオメリュー）により解析した。ま的とし，引き続き鶏における黄色ブドウ球菌およた，一部の株において次世代シークエンサーによびメチシリン耐性菌の保有状況および病原遺伝子

る全ゲノム解析に供し，同定を行った。

の解析を行う。さらにSEの解析をin vitroおよび

2 . 4 ELISAによるブドウ球菌エンテロトキシ

in vivoで行いブドウ球菌感染の成立および増悪ンA（SEA）とピルビン酸キナーゼ（PK）に重要な因子を明らかにする。

の結合の検討２．方
2.1

前年度の研究より，HD11細胞においてSEAと法

PKが結合することが示唆されたため，Sandwich

ブドウ球菌の分離

ELISA法の変法を用いてSEAとPKの結合を確認

2018年４月から８月まで食鳥処理場において一した。PKを96ウェルプレートに固着させ，試料

月当たり60羽，計300羽の廃鶏から菌を採取した。

としてSEAを0.0625から32μg/mlの濃度で加え同一の鶏の体表３カ所（頭部，翼下および脚部）

た。SEAの検出は標識抗SEA抗体および基質でを滅菌した綿棒で拭い卵黄加マンニット食塩培地

あるO-phenylendiamine（和光純薬工業）を用い，（栄研化学）に塗抹した。一部の試料はセフォキ

マイクロプレートリーダーで吸光度（490nm）を

シチンを加えた卵黄加マンニット食塩培地に塗抹測定した。

した。37℃で48時間培養し，培地の黄変および卵2.5

黄反応が認められたコロニーをS. aureusと推定

HD11細胞を用いて免疫蛍光染色を行い細胞内

した。
2.2

鶏培養細胞内におけるPKの動態の解析を行った。HD11細胞にSEAを30μg/ml添ブドウ球菌種の同定と病原遺伝子の検出

加し，９時間培養後，免疫蛍光染色に使用した。

S. aureusと推定された分離株をコアグラーゼ

１次抗体としてウサギ抗SEA抗体，ヤギ抗PKM試験に供した。ウサギプラズマ（栄研化学）を用

２抗体（abcam）を用い，２次抗体としてAlexa

い，定法に従って各株のコアグラーゼ陽性またはFluorTM488 標 識 ロ バ 抗 ウ サ ギ IgG 抗 体 ，Alexa

陰性を確認した。コアグラーゼ試験陽性株およびFluorTM594標識ロバ抗ヤギIgG抗体（Invitrogen）

セフォキシチン耐性コアグラーゼ陰性株についを用いた。核染色にはDAPI（同仁化学研究所）て，Chrobakらの方法によりmultiplex PCRを実を用いた。

施し，ブドウ球菌種の同定とメチシリン耐性遺伝

2.6

子 で あ る mecA の 検 出 を 行 っ た ３）。分 離 し た S.

HD11細胞を２×10５cells/mlで播種後，SEAを

aureusのSE遺伝子（sea-sey），表皮剥奪毒素（eta

添加し６および24時間でRNAiso（タカラバイオ）

およびetb），溶血毒素（hla，hlb，hlg，hlg2およによりRNAの抽出を行い，総RNAを回収した。

びhld）およびロイコシジン（lukE/lukD，lukS/

こ の RNA を ReverTra Ace（TOYOBO）を 用 い

lukF-PVおよびLukM）の各病原遺伝子の検出をて 逆 転 写 し ， THUNDERBIRD SYBR qPCR

mutiplex PCRにより行った（TOYOBO）により増幅反応を行った。

。さらに一部の株

４，５）

2.7

でMLST解析を行い系統を確認した。

HD11細胞における定量的PCR

鶏へのSEの接種と肥満細胞の解析

コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の菌種同定

８週齢のレイヤーにおいて，背部の羽毛を除去

前年度分離されたメチシリン耐性コアグラーゼ

後，皮内にSEA，BSAまたはコントロールとし

陰性ブドウ球菌を同定するために，生化学性状をてPBSを接種した。24時間後に皮膚を切除し形態

2.3© The Ito Foundation

鶏における家畜関連黄色ブドウ球菌の病原遺伝子および病態形成の解析（Ⅱ）

315

学的解析に供した。採取した皮膚を分割しメタ

り，多くはSE遺伝子非保有株である（Table２）。

ノールカルノア液に浸漬して固定後，定法に従いなお昨年度の報告でSE遺伝子非保有株とした菌

パラフィン包埋を行った。組織を薄切後，トルイ

株の一部において，再解析の結果SE遺伝子が検ジ ン ブ ル ー 染 色 に よ り 異 染 色 性（メ タ ク ロ マ

出されたため，SE遺伝子非保有株の数が減少しジー）陽性細胞数を計測した。

ている。また，分離株において他の病原遺伝子の2.8

鶏における黄色ブドウ球菌感染実験

検索を行った。溶血毒素およびロイコシジンは部

養鶏場より６週齢のレイヤーを購入し，胸部の位にかかわらず高頻度で検出された。特にhla,

皮下に１×10 または１×10 CFUのS. aureusを

hlg2，hldおよびlukE/lukDは高い保有率を示し接種した。陰性対照群にはPBSを接種した。投与た（Table３）。さらに，分離株のMLST解析を行っ後５日間観察し，死亡鶏を解剖し，皮下の病態をたところ，４種類の新規Sequence type（ST）が観察した。その後皮膚，脾臓および肝臓を回収し見出された。また，頭部および翼下分離株は同様

菌数測定に供した。各組織は重量を測定し９倍量のST傾向を示したが，脚部から分離されたSE遺のPBSを加え懸濁した。懸濁液を10倍階段希釈伝子非保有株はその多くが異なる系統の株であっし，希釈液を平板培地に塗抹した。培養後，菌数た（Table４）。以上の結果より部位ごとに異なるを計測し組織１グラム当たりの菌数（CFU）を系統のS. aureusが存在し，他の病原遺伝子と比算出した。

べてSEはその保有状況が部位により異なる可能

７９性が示唆された。今後，全分離株の病原遺伝子保３．結果と考察有状況を明らかにし，多変量解析により鶏におけ3 . 1 鶏におけるLA-MRSAの調査とその病原るS. aureusの定着・感染に重要な因子の解明が必要である。

遺伝子の探索300羽の鶏から分離した菌を解析し，前年度の研究結果（500羽）と合わせて12カ月800羽分の解3 . 2 メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の同定

析結果を示す。S. aureusの陽性率はそれぞれ頭11 株 の 生 化 学 性 状 を 確 認 し た と こ ろ ，部18.8％，翼下30.8％，脚部69.3％，計81.1％であっ

Staphylococcus sciuriおよびStaphylococcus xylosus

た（Table１）。つづいてSE遺伝子の保有状況をが１株ずつ同定された。残る株はStaphylococcus

Table２に示す。頭部および翼下分離株は90％以

sciuriに類似の性状であるが同定不能であった。

上がSE遺伝子を保有していた（Table２）。一方，

このうち２株において次世代シークエンサーで全脚部からは高頻度でS. aureusが分離されたがSE

ゲ ノ ム 解 析 を 行 っ た と こ ろ ，Staphylococcus

遺伝子保有株は頭部由来株と同程度の頻度であ

fleurettiiと同定された。また耐性遺伝子について

Table 1 Prevalence of Staphylococcus aureus in Japanese chicken

Head
Wing
Leg
Total

Number of S. aureus-harboringchickens（n=800）（％）

mecA-positive S. aureus

150
246
554
649

18.8
30.8
69.3
81.1

0
0
0
0

© The Ito Foundation

316

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 2 S. aureus superantigenic toxin genotypes and its prevalence in this study
S. aureus superantigenic toxin genotypes

Head（n=150）Wing（n=246）Leg（n=554）Total（n=950）S. aureus harboring superantigenic toxin genes

144（96.0）232（94.3）

130（23.5）506（53.3）

seb

2（1.3）

2（0.8）

6（1.1）

10（1.1）

sec, ser

0（0）

0（0）

1（0.2）

1（0.1）

sec, seh, ser

0（0）

0（0）

1（0.2）

1（0.1）

sed
sed, seg, sei, sem, sen, seo, ser, sey

6（4.0）
1（0.7）0（0）0（0）

1（0.2）0（0）7（0.8）
1（0.1）
3（0.3）

sed, seh2（1.3）0（0）1（0.2）

sed, seh, selj, ser

0（0）

0（0）

3（0.5）

3（0.3）

sed, seh, ser40（26.7）

56（22.8）50（9.0）146（15.4）

sed, seh, ser, seysed, seh, sey2（1.3）0（0）1（0.4）0（0）0（0）
1（0.2）

3（0.3）
1（0.1）

sed, sersed, ser, sey0（0）4（2.7）

1（0.4）
3（1.2）0（0）3（0.5）

1（0.1）
10（1.1）

seg, sei, sem, sen, seoseg, sei, sem, seoseg, sei, seosehseh, sersensey

37（24.7）0（0）1（0.7）
49（32.7）
0（0）
0（0）
0（0）

44（17.9）0（0）0（0）
122（49.6）2（0.8）0（0）1（0.4）

12（2.2）1（0.2）
1（0.2）
47（8.5）0（0）1（0.2）
1（0.2）

93（9.8）1（0.1）
2（0.2）
218（22.9）2（0.2）
1（0.1）
2（0.2）

S. aureus harboring no superantigenic toxin gene6（4.0）

14（5.7）424（76.5）444（46.7）

Table 3 S. aureus virulence toxin gene prevalence in this study
S. aureus virulence toxin genes

Head（n=29）

Wing（n=38）

Leg（n=146）Total（n=213）

S. aureus harboring one or more virulence toxin genes

29（100）38（100）142（97.3）

209（98.1）

hla
hlb
hlg
hlg2
hld

29（100）6（20.7）
11（37.9）29（100）29（100）34（89.5）8（21.1）12（31.6）31（81.6）34（89.5）

118（80.8）83（56.8）
18（12.3）
102（69.9）135（92.5）

181（85.0）97（45.5）41（19.2）
162（76.1）
198（93.0）

lukE/lukD
lukS/lukF-PV
lukM

21（72.4）0（0）0（0）

28（73.7）0（0）0（0）

131（89.7）
0（0）
0（0）

180（84.5）
0（0）
0（0）

eta
etb

0（0）
0（0）

0（0）
0（0）

26（17.8）0（0）26（12.2）0（0）S. aureus harboring no above virulence toxin gene

0（0）

0（0）

4（2.7）

4（1.9）解 析 し た と こ ろ mecA 遺 伝 子 の 他 に 複 数 の行ったところ，SEA濃度依存的に吸光度が増加

SCCmec構成遺伝子が保存されていたため，本耐したため，in vitroにおけるPKとSEAの結合が確性菌群のさらなる解析が必要である。

認された（Fig. 1A）。つづいて，HD11細胞にお3.3けるSEA添加後のPKの細胞内動態を観察した。

SEA投与によるPKへの影響

PKとSEAの結合を確認するためにELISAを

コントロール群ではPKは細胞質にシグナルが観© The Ito Foundation

鶏における家畜関連黄色ブドウ球菌の病原遺伝子および病態形成の解析（Ⅱ）
Table 4 MLST analysis in S. aureus isolates in this study
S. aureus superantigenic genotypes

Number ofisolatesSequence type
（ST）

Head

Wing

seb

1

12

sed, seh, ser2A

sed, seh, ser, sely

1A

sed, ser, sely
seg, sei, sem, sen, seo

3
3

B
5

no SE gene

1

12
B

sed, ser, sely1seg, sei, sem, sen, seo

6

5

seh

2

A

no SE gene2

A

sed, seh, selj, serseg, sei, sem, sen, seo

1
2

A
5

sely

2
8
1

C
D
5

Leg

no SE gene
ST A-D：Novel STs identified in this study

0.8

A
Absorbance（490 nm）

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

0

0.0625 0.125 0.25

0.5

1

2

4

8

16

32

Concentration of SEA（μg/ml）
B

DAPI

PK

SEA

Merge

RPMI

SEA

Fig. 1 Interaction of SEA and PK.

A ：PK binds with SEA dose-dependently in vitro. B：Immunostaining exhibits

colocalization of nuclei and PK under condition with SEA.

© The Ito Foundation

317

318

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）
SEA

Relative expression

Mock
MEK5

3

STAT3

＊
3

2

＊

2

1

1

0

6h

0

24h

6h

24h

Fig. 2 SEA induces upregulation of MEK5 and STAT3 in HD11 cells.
＊p＜0.05

A

PBS

BSA

0

μm

50

0

B
Number of metachromatic
cells per mm²

SEA

＊

12

μm

50

0

μm

50

＊

10
8
6
4
2
0

PBS

BSA

SEA

Fig. 3 SEA induces degranulation of subcutaneous mast cell in chicken. A：Toluidine

blue staining in chicken skin injected PBS, BSA or SEA. Arrow heads show
metachromatic cells in each group. B：Number of metachromatic cells in SEAinjected group significantly decreased in comparison with other groups. ＊p＜0.05

察されるが，SEA投与後９時間ではPKは核においてもシグナルが検出される（Fig. 1B）。さらに，
HD11細胞において定量的PCRを行ったところ，

響するか明らかにする必要がある。
3 . 4 黄色ブドウ球菌由来物質による鶏への病
原性

SEA添加群において細胞増殖に関わるMEK５お

前年度の研究において，SEA投与により鶏皮

よびSTAT３遺伝子の発現上昇が見られた（Fig．

膚組織にアレルギー関連細胞の遊走が確認された

２）。がん細胞においてはPKが核内に移行し，ため，SEA投与による肥満細胞への影響を検討

MEK５遺伝子の発現を上昇させることで細胞のした。皮膚組織のトルイジンブルー染色像によ増殖が起こる６）。本研究結果からSEAによる細胞り，SEA投与皮膚における異染色性陽性細胞数

増殖は，SEAがPKに直接作用し，PKの核内移行の有意な減少が確認され，SEA投与による肥満を惹起することで起こると推測される。今後，細胞脱顆粒の惹起が示唆された（Fig.３）。肥満SEA誘導性細胞増殖がS. aureusの感染にどう影細胞は脱顆粒によりヒスタミンやプロテアーゼと© The Ito Foundation

鶏における家畜関連黄色ブドウ球菌の病原遺伝子および病態形成の解析（Ⅱ）

いった分子を放出するため，本毒素による肥満細胞脱顆粒の惹起が組織破壊や浮腫形成といった病態に関わる可能性が考えられる。また，感染実験
では１×10９CFU投与個体において12羽中２羽が死亡し，皮下の黄色の滲出液および全身感染が確認された。今後感染モデルのさらなる条件検討が必要である。
４．要

約

本研究では我が国の家禽におけるブドウ球菌感
染の実態を調査し，鶏における黄色ブドウ球菌感染症の解明を目的とした。食鳥処理場で鶏800羽
からS. aureusの分離を試みたところ，81.1％から
S. aureusが分離され，鶏特有のS. aureus系統の存在が示唆された。in vitroおよびin vivoにおける研究により，SEAがPKと結合し細胞増殖を誘導することおよび肥満細胞の脱顆粒を惹起し，組織障害に関わる可能性が見出された。本研究により鶏におけるS. aureusの蔓延が明らかになり，S.
aureus感染症における重篤な症状の端緒が見出さ
れた。

319

文
献
１） Lekkerkerk, W. S., van Wamel, W. J., Snijders, S.
V., Willems, R. J., van Duijkeren, E., Broens, E. M.,
Wagenaar, J. A., Lindsay, J. A., Vos, M. C.：What Is
the Origin of Livestock-Associated MethicillinResistant Staphylococcus aureus Clonal Complex 398
Isolates from Humans without Livestock Contact?
An Epidemiological and Genetic Analysis, J. Clin.
Microbiol., 53, 1836～1841, 2015.
２） Tang, Y., Larsen, J., Kjeldgaard, J., Andersen, P. S.,
Skov, R., Ingmer, H.：Methicillin-resistant andsusceptible Staphylococcus aureus from retail meatin Denmark, Int. J Food Microbiol., 249, 72～79, 2017.
３） Chrobak, D., Kizerwetter-Świda, M., Rzewuska,
M., Moodley, A., Guardabassi, L., Binek, M.：Molecularcharacterization of Staphylococcus pseudintermedius
strains isolated from clinical samples of animal
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４） Omoe, K., Hu, D-L., Takahashi-Omoe, H., Nakane,A., Shinagawa, K.：Comprehensive analysis ofclassical and newly described staphylococcal
superantigenic toxin genes in Staphylococcus aureus
isolates, FEMS Microbiol. Lett., 246, 191～198, 2005.
５） Jarraud, S., Mougel, C., Thioulouse, J., Lina, G.,
Meugnier, H., Forey, F., Nesme, X., Etienne, J.,
Vandenesch, F.：Relationship between staphylococcus
aureus genetic background, virulence factor, agrgroups（alleles）, and human disease, Infect. Immun.,70, 631～641, 2002.
６） Gao, X., Wang, H., Yang, J. J., Liu, X., Liu, Z. R.：
Pyruvate Kinase M2 Regulates Gene Transcription
by Acting as a Protein Kinase, Mol. Cell, 45, 598 ～ 609,
2012.

© The Ito Foundation

320

ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症ヘテロ
保因牛における病態解析（Ⅱ）
Analysis for pathophysiology of heterozygous individual with cholesterol
deficiency in Holstein cattle（Ⅱ）

猪

熊

壽

（帯広畜産大学畜産学部）

Hisashi Inokuma（Obihiro University of Agriculture & Veterinary Medicine）

The cholesterol deficiency disorder in Holstein Friesian is considered to be autosomal
recessive inheritance, but heterozygous individuals may exhibit hypocholesterolemia, thus in
the present study productivity of cattle with heterozygote was evaluated. A total of 718 cows
from 5 farms were examined, and 93（14.9％）were found to be heterozygous. The median TCof heterozygous and wild group were 116 mg/dl and 129 mg/dl, respectively, and TC ofheterozygous group was significantly lower. In one of the farms where milking data wereanalyzed, the median 305-day corrected milk yield of 12,269 kg in the heterozygous group was
significantly lower than that in the wild group-12,700 kg（p<0.05）. Because lower milk yieldassociated with lower TC value was found in the heterozygous group, it is suggested thatheterozygous had a negative impact on milk production. However, there was no significant
difference in reproductive performance compared with wild group.

１．目ている６，７）。さらに，健康な種雄牛群の中で，ヘ的テロ群の血清コレステロール濃度（TC）はワイ

ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症はルド群より低値を示すと報告されており８），臨床

2015年に見出された遺伝性疾患で，罹患牛は著し的に健常な成牛であってもTCが低く，生産性にい低コレステロール血症から下痢、栄養不良，削何らかの影響が及んでいる可能性がある。血清痩を呈して６ヵ月以内に死亡する 。欧州で初発

TCは乳量と相関することが知られ，泌乳中期の例が報告され ，2016年には日本でも発症牛が報血清TCレベルと乳脂率は相関する９）。また，TC

告された３，４）。本症ではリポタンパク質Apo B遺と授精回数に負の相関があるとの報告もあり10），

伝子（APOB）のエクソン５への塩基挿入が認め

低TCが農場の生産性に負の影響をもたらしていられ，遺伝様式は常染色体劣性遺伝とされておる可能性が考えられる。しかし，ヘテロの生産性

りについてはこれまで検討されたことがない。

１）２），ホモ個体のみが発症する。しかし近年，

４，５）

ヘテロ保因牛（ヘテロ）においてもコレステロー

日本ではコレステロール代謝異常症は2017年３

ル代謝異常症様の症状を発現する症例が報告され月に「指定遺伝的不良形質」に指定され，ヘテロ© The Ito Foundation

321

ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症ヘテロ保因牛における病態解析（Ⅱ）

であることが判明している種雄牛の精液販売は中減少傾向という試算―を上回ってヘテロが存在し止されている。このため，今後ホモは生産されず，ていることが明らかとなった。ヘテロの割合は，ヘテロ個体数は減少することが予想されるが，ヘＡ農場411頭中71頭（17.3％），Ｂ農場76頭中10頭

テロの根絶には至らない。そこで本研究では，牛（13.1％），Ｃ農場63頭中３頭（4.7％），Ｄ農場51

群検定成績を用いて農場におけるヘテロ牛の生産頭中９頭（17.6％），Ｅ農場117頭中14頭（11.9％）性について検討した。

と，農場ごとにばらつきがみられた。コレステ

２．方

ロール代謝異常症の起源牛モーリン・ストームと法

その後継牛は好体格・高泌乳・高乳質から世界中

2017年11月から2018年６月にＡ農場411頭，Ｂ

で多くの精液が販売され，日本でも数多くの娘牛農場76頭，Ｃ農場63頭，Ｄ農場51頭，Ｅ農場117頭，が存在する。ヘテロの割合が高かったＡ農場およ

計５農場718頭（哺乳牛２頭，育成牛330頭，搾乳

びＤ農場は，乳牛の改良に熱心に取り組んでいる

牛386頭）の臨床的に健康なホルスタイン種乳牛

ことがコレステロール代謝異常症保因率の上昇にから採血した。すべての供試牛について，Menzi

つながった可能性が考えられた。

らの方法によるPCR検査 によりコレステロール

供試牛のTCをFig.１に示す。ヘテロ群および代謝異常症の診断を行い，ホモ，ヘテロ，ワイル

ワイルド群のTC中央値はそれぞれ，116mg/dlと11）ドの３群に分類した。
718頭のうち346頭（Ａ農場156頭，Ｂ農場76頭，400

Ｃ農場63頭，Ｄ農場51頭）において血清TCを測＊＊定し，ヘテロ群とワイルド群の値を比較した。なお，血清TCは酵素法（第一岸本臨床検査センター）により測定した。
よびＢ農場の牛について，乳量，乳脂率，乳タンパク質率，無脂固形分率，空胎日数および授精回数を，各農場内のヘテロ群とワイルド群で比較した。なお，乳量，乳脂率，乳タンパク質率，無脂固形分率については305日補正値を用いた。
すべての統計解析には，Excel統計を使用し，

300
Total cholesterol（mg/dL）

供試牛のうち，牛群検定成績を確認できたＡお

200

129

116
100

２群間比較については，有意水準をｐ＜0.05とし，
マン＝ホイットニーのＵ検定で比較検討した。測定値は中央値で示した。

0３．結果と考察
供試牛718頭のうち93頭（14.9％）がヘテロであった。今回調査した農場では，ホルスタイン登録協会の試算―保因率は2013年の８％をピークに

HeteroWild

Fig. 1 Comparison of serum total cholesterol （TC）

between wild cattle and heterozygotes with
autosomal recessive cholesterol deficiency disorder.
The median TC value of hetero group was
significantly lower than that of wild cattle．

© The Ito Foundation

322

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 Comparison of serum total cholesterol, and performance of milk production and reproduction

between wild cattle and heterozygotes with autosomal recessive cholesterol deficiency disorder infarm A and B.
Milk production（305 days correction）

Farm

Group

Reproduction

Totalcholesterol

Yield

Fat

Protein

Solid-not FatOpen period（mg/dl）

（kg）

（%）

（%）

（%）

（days）

Insemination
frequency

134

12269

3.96

3.31

8.83

75

2

（n=71）（n=42）（n=42）（n=44）（n=42）（n=37）（n=44）

Wild

146（n=85）

12770（n=43）

3.88（n=43）

3.25（n=41）

8.81（n=43）

87.5（n=42）

2（n=52）

p-value

0.033

0.017*

0.25

0.075

0.61

0.42

0.98

Hetero85（n=10）

10700
（n=6）

4.87
（n=5）

3.64
（n=5）

9.07
（n=5）

93
（n=4）

2
（n=4）

Wild

104.5
（n=66）

11570（n=34）

4.00（n=29）

3.24（n=29）

8.80（n=29）

94（n=29）

1（n=30）

p-value

0.075

0.067

0.026*

0.054

0.098

0.86

0.39

HeteroA

B＊：significant difference

129mg/dlであり，ヘテロ群のTCが有意（ｐ＜動態についての検索が必要と考えられた。

0.01）に低値であった。健常なヘテロ群とワイル

ＡおよびＢ農場の生産性データをTable１に示ド群のTCに有意な差が認められたことから，ヘす。Ａ農場においては，ヘテロ群の305日補正乳

テロ個体では，臨床症状の発現はなく淘汰には至量中央値12,269kgがワイルド群12,700kgに比べ有らないものの，何らかのコレステロール運搬機能

意に低値であった（ｐ＜0.05）。また305日補正タが低下している可能性が示された。ヒトの家族性

ンパク質率については，ヘテロ群で高い傾向（ｐ低 β リ ポ タ ン パ ク 血 症 （familial hypobeta-＝0.08）がみられた。その他305日補正乳脂率，lipoproteinemia；FHBL）もAPOB変異が原因で305日無脂固形分率，空胎日数，授精回数についあるが，ホモ患者が低TC血症に続発する重篤なては２群間に有意差が認められなかった。なお，症状を呈すだけでなく，ヘテロ個体でもTC低下

Ａ農場内でのヘテロ群のTC中央値134mg/dlはワが知られており，常染色体優性遺伝性疾患と考え

イルド146mg/dlより有意に低値であった（ｐ＜られている。牛のコレステロール代謝異常症0.05）。一方，Ｂ農場のヘテロ群の305日補正乳脂においても，多くのヘテロ個体では臨床症状は示率中央値4.87％はワイルド群4.00％に比較して有さないものの低TC血症を呈する点でFHBLと同意に高値を示した（ｐ＜0.05）。また，305日補正

様の結果が得られ，コレステロール代謝異常症の

乳量についてはヘテロ群で低い傾向（ｐ＝0.07），

遺伝様式についても再検討が必要と考えられた。

305日補正乳タンパク質率はヘテロ群で高い傾向

FHBL で は 患 者 に よ っ て 種 々 の 大 き さ の 短 縮（ｐ＝0.05），305日補正無脂固形分率はヘテロ群

ApoBが生成され，低コレステロール血症の程度で高い傾向（ｐ＝0.09）がみられた。空胎日数とも発現するApoBの大きさによって異なる 。コ

授精回数については，２群間で有意な差はみられレステロール代謝異常症のAPOB変異では97％のなかった。なお，Ｂ農場のTCに有意差は認めら

アミノ酸が翻訳されないが，その詳細は明らかとれないものの，ヘテロ群で低い傾向がみられたなっておらず，翻訳後の短縮ApoBの働きや血中（ｐ＝0.08）。

12，13）

12）© The Ito Foundation

ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症ヘテロ保因牛における病態解析（Ⅱ）

323

これらの結果から，Ａ農場ではTCの低下が，は，ヘテロ群の305日補正乳量中央値12,269kgが乳量減少に影響を与えたことが示唆された。ま

ワイルド群12,700kgに比べ有意に低値であった

た，乳脂率はヘテロ群で低下することが予想され（ｐ＜0.05）。ヘテロ群ではTC低下と関連した乳

たが，Ｂ農場ではヘテロ群で高値を示した。乳脂量減少がみられたことから，ヘテロが乳生産に負肪の大部分は乳腺内で，第一胃発酵産物として吸の影響を与えることが示唆された。しかし，ヘテ

収された酢酸や酪酸から合成される。一般に，泌

ロ群の繁殖成績はワイルド群と比べて有意差がみ

乳初期や食欲減衰によって負のエネルギーバラン

られなかった。

スとなった乳牛では，体脂肪動員された遊離脂肪酸から乳脂肪が生成されるため高乳脂率となる。
ヘテロ群でエネルギー充足率が低いために体脂肪動員が起こり，乳脂率が上昇した可能性が考えられた。また，ヘテロ群では子牛時にコレステロー
ル代謝異常症様症状を呈して淘汰され，生産に至るまで生存していない個体が存在した可能性がある。つまり，生産性への影響が発現するような個
体は，搾乳に至るまでの成長過程で，すでに淘汰されている可能性も考えられた。さらに，今回調査したTC，乳量，乳成分は，産次数や乳期，分娩時期などの要因で変動するため，今後より詳細な解析が必要と考えられた。
４．要約

ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症は常染色体劣性遺伝とされているが、ヘテロ個体でも低コレステロール血症を示すことがあることから、本研究ではヘテロ群の生産性を検討した。計
５ 農 場 718 頭 の 乳 牛 を 調 べ た と こ ろ ， 93 頭
（14.9％）がヘテロであった。ヘテロ群およびワイルド群のTC中央値は，それぞれ116mg/dlと129mg/dlであり，ヘテロ群のTCが有意に低値で文献１） Kipp, S., Segelke, D., Schierenbeck, S.：Interbull,49, 49～53, 2015.
２） Mock, T., Mehinagic, K., Menzi, F., Studer, E.,
Oevermann, A., Stoffel, M. H., Drogemuller, F.,
Meylan, M., Regenscheit, N.：J Vet Intern Med, 30,
1369～1375, 2016.
３） 鴇田直子，大脇茂雄，荻野敦，黒木一仁，堀内雅之，
猪熊壽：家畜診療，64，515～523，2017.
４） Kipp, S., Segelke, D., Schierenbeck, S., Reinhardt,
F., Reents, R., Wurmser, C., Pausch, H., Fries, R.,
Thaller, G., Tetens, J., Pott, J., Haas, D., Raddatz, B.
B., Hewicker-Trautwein, M., Proios, I., Schmicke, M.,
Grünberg, W.：J Dairy Sci, 99, 8915～8931, 2016.
５） Schütz, E., Wehrhahn, C., Wanjek, M., Bortfeld, R.,
Wemheuer, W. E., Beck, J., Brenig, B.：PLoS One,11, e0154602, 2016.
６） 工藤彩佳，大久保宏平，互野佑香，渡邉謙一，堀内雅之，古林与志安，猪熊壽：獣畜新報，71，513～
516，2018.
７） 工藤彩佳，田中佑典，山木博巳，渡邉謙一，堀内雅 之 ，古 林 与 志 安 ，猪 熊 壽：北 獣 会 誌 ，63 ，65 ～
68，2019.
８） Gross, J. J., Schwinn, A. C., Schmitz-Hsu, F.：J
Anim Sci, 94, 1761～1766, 2016.
９） 佐藤博：Anim Sci Technol, 62, 996～999, 1991.
10） 権五鏡，小野斉，山科秀也，金川弘司：乳牛の分娩前後の血液成分および疾病発生と繁殖成績との関係，家畜繁殖学雑誌，31（2），63～67，1985.
11） Menzi, F., Besuchet-Schmutz, N., Fragnière, M.：
Anim Genet, 47, 253～257, 2016.
12） Schonfeld, G.：J Lipid Res, 44, 878～883, 2003.
13） Welty, F. K.：Curr Opin Lipidol, 25, 161～168, 2014.

あった。乳検データを解析できた１農場において© The Ito Foundation

324

エゾシカ由来腸管出血性大腸菌の食品衛生リスクに関する研究Research on food hygiene risk of enterohemorrhagic Escherichia coli
isolated from Sika deer

福

本

晋

也１・山

崎

栄

樹２

（１帯広畜産大学原虫病研究センター，２帯広畜産大学動物・食品検査診断センター）

Shinya Fukumoto１ and Eiki Yamasaki２（１National Research Center for Protozoan Diseases, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine,
２Diagnostic Center for Animal Health and Food Safety, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

In recent years, damage to agriculture and forestry by the increasing of sika deer
population in Hokkaido has become serious problem. Therefore, the need for the sika deer
population control has been increasing. Effective use of captured deer resources is being soughtby providing them for meat use. In this study, we focused on enterohaemorrhagic Escherichia
coli（EHEC）possessed by Sika deer, and aimed at contributing to the improvement of safety
for the use of meat by clarifying the risk to its food utilization. As a result of conducting asurvey in Hokkaido Tokachi district where high density habitat of sika deer, about 15％ of sika
deer are EHEC positive, their O-genotypes are rich in variety, and further O26：VT1/2（＋）
and eae（＋）was detected. These results indicate that EHEC is a risk factor to be noted in
the use of Sika deer for meat．

１．目

資することを目的として実施した。

的

野生動物による農林水産業被害の爆発的増大が近年の野生鳥獣被害と捕獲必要性の増加を受懸念されているが，狩猟者減少による捕獲圧の低け，野生鳥獣肉の食利用への期待が高まってい下，生息密度上昇による感染症の伝播係数上昇なる。しかしながら，その安全性の担保については

ど，さまざまな問題が浮上してきている。そこで理想的状態とは言えず，公衆衛生上のリスク要因

近年，野生鳥獣を食肉として有効利用し，付加価であると懸念される。研究代表者の福本は獣医学

値によりその需要を高めることで，結果的に野生教育・研究に携わるかたわら，ハンターとしても動物の生態管理を目指そうとする動向がある。そ活動を行っている。研究者かつハンターの立場か

こで問題となるのが，野生動物という特殊性に起ら実際の狩猟の場で散見される実態を踏まえ，本因する食品衛生リスクである。衣食住が管理され研究は，エゾシカの微生物学的リスク要因をよりた家畜とは異なり，野生動物はそのすべてが野放明確にすることで，ジビエの食品衛生管理向上にしであることから，一般的な自然で安全とのイ© The Ito Foundation

エゾシカ由来腸管出血性大腸菌の食品衛生リスクに関する研究

325

メージとはまったく異なり，むしろ危険を大きくはなく，狩猟不可地域および時間での活動が増加

はらむ可能性を有している。行政による野生鳥獣している。すなわち，エゾシカの出没は捕獲困難

肉衛生管理ガイドラインの策定や，その周知・徹な地域へと移っている。したがって，捕獲圧がよ底などの安全性確保への努力が払われている。そり少ない地域，つまりより辺鄙な地域での狩猟をの結果として，条例等に基づき適切な処理を経た行う必要がある。すなわち，山奥の猟場でエゾシ

野生鳥獣肉の流通が拡大してきてはいるが，依然カを銃器で捕獲，100㎏を超えることも稀ではなとして捕獲鳥獣の一割程度を占めるにすぎず，大いエゾシカを車まで運搬，過酷な山道を移動しエ部分は廃棄され，その利用は限定的である。そのゾシカの受け入れを行っている処理施設への移遠因として，捕獲法や捕獲後の処理の問題がある。

動，以上のプロセスを２時間以内に行うことは容一般的に本研究の対象とするエゾシカの場合，易ではない。

捕獲は銃器によって行われる。正規に流通し食利

このようにハンターの立場から見ると捕獲した用に用いる場合，肉質への影響・衛生的問題か

エゾシカを正しい流通経路に載せることは，一般ら，射撃部位は一般的に頭部もしくは頸部に限定

市民の想像以上に困難なことである。結果としされる。すなわち心臓・肺等の大型バイタル臓器て，正規の処理経路を経ない野生鳥獣肉が，レスが位置し，体サイズに対して大きな割合を占める

トラン等で商業利用されている実態が散見され胸部は食利用の観点からは狙撃部位として不適でる。このような安易な取り扱いは喫食リスクに対ある。一般にエゾシカの捕獲に用いられる銃器はする知識浸透が不十分なことが原因の一つと考えライフル銃と散弾銃（ハーフライフル銃）に大別られる。ガイドライン等の「どのような病原体をされる。散弾銃を継続して10年間所持後ライフル保有しているか不明であること等から生食はする

銃の所持が許可される。散弾銃はライフル銃と比べきでなく」の文言から理解されるように，具体較すると命中精度，有効射程ともに劣る。した的なリスク要因が不明なため明確な注意喚起がでがって，一定以上の技能を有するかつ熟練のライきないことが，一般消費者・飲食業者・狩猟者のフル所持者以外のハンターにとっては，食利用にリスク意識向上への妨げとなっていると考えられ供するためのエゾシカの捕獲は容易とは言えないる。

のが現状である。

そこで本研究では，日本で最も増加が問題と次に捕獲後の搬送の問題がある。野生鳥獣を食なっている野生鳥獣であるシカを対象に，その主利用に供する場合，肉質の維持のため捕獲後，一

要生息地域である北海道東部地方を調査モデル地

定時間以内に剥皮等の一時処理を公的に認可され域として設定し，エゾシカ食品衛生リスクの一端た施設で行う必要がある。一般の食肉処理施設のの具体化を試みることとした。現在までの我々の場合，捕獲後２時間以内の搬入が受け入れ基準と研究により，食中毒起因性病原微生物として最重なっている。実際の捕獲現場の状況を鑑みるとこ要の一つである腸管出血性大腸菌（EHEC）をエの時間基準は容易なものではない。昨今，有害鳥

ゾシカが約15％と高率で保菌していることを明ら

獣捕獲への補助金が増額されたことから，駆除捕かにしてきた。本研究ではエゾシカが保有する獲圧が高まっている。その結果，エゾシカの狩猟

EHECに着目し，より詳細に解析を行うことで，可能地域・時間への出没は減少の一途である。しジビエ利用におけるEHECの微生物学的リスクをかしながら生息数が減少したのかというとそうで明確化することを目的として研究を展開した。

© The Ito Foundation

326

平成30年度２．方
2.1

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

らによるE. coli O-genotyping PCR法１）によって

法

Ｏ抗原型の特定を分子生物学的に行った。また，

エゾシカ糞便サンプルの収集

病原性遺伝子として知られるeae遺伝子２）（SK1：

十勝地方を中心とした北海道東部地域において

CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC ，SK2 ：狩猟または有害鳥獣駆除による許可捕獲によっ

CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG），aggR遺て，銃猟によって射獲後，食肉処理施設等に運び

伝 子 ３）（aggRKs1 ： GTATACACAAAAGAAGG

込まれた個体より，エゾシカ個体トレーサブルな

AAGC，aggRKas2：ACAGAATCGTCAGCATC

形で直腸便を採取した。採集エゾシカ糞便は20％AGC），LT 遺 伝 子 ４）（TW20：GGCGACAGATT

グリセロール溶液に懸濁，解析まで４℃またはATACCGTGC，JW11：CGGTCTCTATATTCC－20℃にて保存した。本研究報告においては主とCTGTT）についてもPCR法による検出を試みる

して2016年から2018年にかけて採材した糞便約ことで，エゾシカ糞便由来EHECの性状解析を分350サンプルを解析に供した。

子生物学的に行った。

2 . 2 エゾシカ糞便由来DNAのベロ毒素（VT）
遺伝子スクリーニング

３．結果と考察

採 取 し た エ ゾ シ カ 糞 便 よ り PureLink

糞便由来DNAのリアルタイムPCR法による解Microbiome DNA Purification Kit

析の結果，赤痢菌，サルモネラ菌については全個（ThermoFisher Scientific）を用いて，DNAを精体において陰性を示した。腸管出血性大腸菌につ製した。精製DNAについて腸管系病原細菌遺伝

いては約350検体中54検体が明確な陽性のピーク

子検出キット（TAKARA）を用いたリアルタイを示した。陽性検体については，VT遺伝子のサムPCR（StepOne, ThermoFischer Scientific）法

ブタイピングをPCR法により実施した結果，VTにより，腸管出血性大腸菌（EHEC）陽性糞便サ

１およびVT２遺伝子の双方が確認された。また，

ンプルのスクリーニングを行った。

陽性個体について，関東科学クロモアガーSTEC

エゾシカ糞便由来EHECの分離培養を用いて，糞便よりEHECの分離培養を試みた結上記リアルタイムPCR法の陽性検体について，

果，一部のPCR陽性サンプルよりVT遺伝子陽性

EHEC選択培地であるクロモアガーSTEC（関東

コロニーを分離することに成功した（Table１）。

科学）を用いたEHECの分離培養を試みた。得ら

分離株についてPCR法によりＯ抗原型の同定を試れたコロニーについて，Ｏ-157（ベロ毒素１型，み た 。ク ロ モ ア ガ ー STEC で は 分 離 不 可 能 な

２ 型 遺 伝 子）PCR Typing Set（TAKARA）を

EHECも存在するため，さらにBHI培地を用いた

用いてEHECコロニーの同定を行った。クロモア

単離培養を試みた結果，クロモアガーSTECによガーSTECによってEHECコロニーを分離できなり単離したものも含め，15種のＯ抗原型がエゾシ

かったEHEC陽性糞便サンプルについてはBHI培

カ由来EHECより検出された（Table１）。EHEC

地を用いた培養を行い，Ｏ-157（ベロ毒素１型，分離培養成功株について病原性遺伝子の検出を２型遺伝子）PCR Typing Setを用いてEHECコ行った結果，aggR遺伝子とLT遺伝子については

ロニーの同定を行った。

明確な陽性バンドを呈する検体は得られなかっ2.3

エゾシカ糞便由来EHECの性状解析た。一方eae遺伝子については13株が陽性を示し同定に成功したEHECコロニーについて，井口た。Ｏ26はＯ157についで公衆衛生上の問題とな

2.4© The Ito Foundation

327

エゾシカ由来腸管出血性大腸菌の食品衛生リスクに関する研究
Table 1 The properties of EHEC clones isolated from stool samples of Yeso Sika deer.
Sample ID

SEX

AGE

12

♀

1

19

♀

30

♀

51

♀

54

♂

54
55

VT subtype

O genotype

eae

1

O156

＋

2

1

O98

＋

3

2

O83

－

3

2

O76

＋

2

1/2

O26

＋

♂

2

2

O10

－

♂

2

2

O83

＋

68

♀

3

2

O159

－

17-1

♂

3

2

O22

－

17-8

♀

3

2

O22

－

17-11

♀

3

2

O83

＋

17-23

♀

3

2

O83

＋

17-39

♀

3

2

O21

－

17-40

♂

2

2

O83

＋

17-46

♂

5

2

O10

－

17-52

♂

2

2

O83

＋

17-68

♂

3

2

O83

＋

17-72

♂

1

2

O22

－

17-87

♀

3

2

O22

－

17-119

♀

3

1

ND

－

17-120

♀

3

2

ND

－

17-136

♀

3

2

O83

－

17-144

♀

3

2

O83

＋

17-155

ND

ND

2

O10

－

17-157

♀

2

2

O117

－

17-160

♀

3

1

O7

－

17-163

♂

2

2

O79

＋

17-164-1

♀

3

2

O181

－

17-169

♂

2

2

ND

－

17-183

♂

3

2

O10

－

17-192

♂

2

1

O149

＋

17-195

♂

2

2

O75

－

17-205

♀

2

2

O22

－

17-207

ND

ND

2

O83

＋

17-219

♀

3

2

O28ac

－

17-228

♀

3

2

O83

＋

18-2

♀

3

2

O83

＋

18-12

ND

ND

2

O10

－

ND : not determined© The Ito Foundation

328

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

る抗原型である。本研究でエゾシカから分離されたＯ26はeae，VT1/2陽性であり，公衆衛生上も４．要約

重大な被害を起こし得る可能性が示唆され，この近年，エゾシカの個体数増加による農林業被害

ようなEHECが検出されたことはエゾシカジビエが深刻化し捕獲必要性が増加している。ジビエ利利用において重要な知見であると言える。

用に供することで有効な資源利用が模索されてい宮崎大学・井口准教授らの2016年食品衛生動物る。本研究ではエゾシカが保有する腸管出血性大学会大会等での報告によると，本州ニホンジカで腸菌に注目しその食利用へのリスクを明確化する

分離されるＯ抗原型は限定的であるとされていことでジビエ利用への安全性向上に資することをる。北海道十勝地方において多様なＯ抗原型が検目的とした。エゾシカの高密度生息地域である北

出されることは特徴的な現象であり，今後日本の海道十勝地方で調査を行った結果，約15％のエゾ

各地方との比較調査の実施が望まれる。エゾシカ

シカがEHEC陽性，そのＯ抗原型はバラエティーにおいて比較的高率にEHECが陽性となったことに富む，さらにはＯ157についで問題となるＯ

は，食利用以外にも農作物の汚染等についても考26：VT1/2（＋），eae（＋）が存在することなどが慮する必要がある。家畜は一般的に管理された特明らかとなった。これらの結果はエゾシカのジビ

定箇所で飼育されているため，家畜の糞便由来のエ利用においてEHECは留意すべきリスク要因で病原体は家畜飼育場所以外に拡散しないよう，一あることを示すものであった。

定のコントロールがなされている。しかし，エゾ
シカにはそのような制限はないため，糞便をさまざまな場所にまき散らす。事実，十勝地方においては農作物を荒らすことからエゾシカは有害鳥獣とされており，その姿は繁茂に畑で確認される。
したがって，エゾシカの糞便による農作物への汚染は容易に起こるため，生食の対象となる野菜等の衛生管理は重要と考えられる。
以上のことから，エゾシカの保有する腸管出血性大腸菌の疫学については，十勝地方だけでなくより広範囲に，その詳細を明らかにすることが重要であると考えられる。

文献１）
 Iguchi, A., Iyoda, S., Seto, K., Morita-Ishihara, T.,S c h e u t z , F . , O h n i s h i , M . ：E s c h e r i c h i a c o l i
O-Genotyping PCR： a Comprehensive andPractical Platform for Molecular O Serogrouping, J
Clin Microbiol，53，2427～32，2015．
２）
 Beutin, L., Krause, G., Zi㎜ermann, S., Kaulfuss, S.,
Gleier, K.：Characterization of Shiga toxinproducing Escherichia coli strains isolated fromhuman patients in Germany over a 3-year period, J
Clin Microbiol，42，1099～108，2004．
３）
 小林一寛，勢戸和子，八柳潤，斉藤志保子，寺尾通徳，金子通治，芹川俊彦，倉本早苗，藤沢倫彦，
鈴木理恵子，山崎貢，林賢一，松根渉，安岡富久，
堀川和美，村上光一，河野喜美子，山田亨，伊藤健
一郎：下痢原性大腸菌における付着性因子保有状況とそれに基づく大腸菌検査法の一考察，感染症誌，
76，911～920，2002．
４）
 Stacy-Phipps, S., Mecca, J. J., Weiss, J. B.：
Multiplex PCR assay and simple preparation
method for stool specimens detect enterotoxigenic
Escherichia coli DNA during course of infection, J
Clin Microbiol，33，1054～9，1995．

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329

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索（Ⅱ）―より効果的なワクチン接種部位を求めて―Study of mucosa-associated lymphoid tissues in farm animals（Ⅱ）― to identify more effective regions for their vaccination ―

市居

修・中村

鉄平・小千田

圭吾・山下

祐輔・池田

哲平

（北海道大学大学院獣医学研究院）

Osamu Ichii, Teppei Nakamura, Keigo Kosenda, Yusuke Yamashita and Teppei Ikeda（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University）

In recent years, the development of a mucosal vaccine is progressing rapidly and has been
put to practical use in respiratory diseases of chickens such as highly pathogenic avian
influenza. These methods target to mucosa-associated lymphoid tissues, in particular the roleof “eye-associated lymphoid tissue” would be important for the achievement of effective
ophthalmic vaccination. In addition, it is a possibility that the mucosa of genital organs would
be a target cite to induce the mucosal immunity, but its morpho-functional information is still
scarce. Therefore, in the present study, we focused on the mucosa-associated lymphoid tissuesof “eye” as well as “genital organs” in cattle and pigs and investigated their morphology. Our
histological analysis revealed that the mucosa-associated lymphoid tissues were developed in
the conjunctiva and third eyelid in the cattle and miniature pigs. Further, we also clarified the
localization of T-cells, B-cells, and Cytokeratin 18-positive cells（M cell-like cells）in eyeassociated lymphoid tissue of cows. In genital organs, the mucosa associated lymphoid tissues
were observed in vaginal vestibule of both species. Thus, these the mucosa associatedlymphoid tissues have the possibility of future development of local mucosal vaccination to
induce a host mucosal immunity in these animal species. In further study, we would continue
to focus on the possibility of mucosa-associated lymphoid tissue to realize the efficient
immunity induction in farm animals．

１．目染症予防においては，全身免疫を誘導する注射型

的ワクチンが主体だった。全身免疫誘導は病原体侵

産業動物獣医療では乳牛の乳房炎，牛ウイルス

入後の防御・回復に有効であるが，上述のように性下痢・粘膜病等および豚の各種呼吸器感染症

多くの産業動物感染症では，消化器，呼吸器およ等，難治性の粘膜感染症が問題となる。近年，粘び生殖器等の粘膜が病原体の侵入門戸となるた

膜免疫を誘導して粘膜への病原体侵入を未然に防め，我々はIgAを主役とする局所粘膜免疫誘導にぐことができる“粘膜型ワクチン”の開発に大きよる感染防御がより効果的であると考え，研究をな関心が寄せられている。これまで産業動物の感進めている。

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330

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

粘膜免疫では，MALTが機能的な主役となり，Ｍ細胞の存在は明らかではないが，これまで両動抗原提示細胞，Ｔ細胞やＢ細胞等の細胞集団を上物種のEALTでは粘膜上皮下に濾胞性あるいは散皮細胞周辺に配置し，リンパ球を機能的に成熟さ在性にリンパ球が集簇することを明らかにしてきせる。これまで，代表的な粘膜関連リンパ組織

た。

（MALT）としてワルダイエルの咽頭輪に存在す

本年度では，牛のEALTに着目してその形態やる扁桃や鼻咽頭関連リンパ組織（NALT），腸管

構成細胞を調べるとともに，牛とミニ豚を用いて関連リンパ組織（GALT，パイエル板）が注目さまだ明らかではなかった生殖器関連リンパ組織のれてきた。鶏では，特にNALTを標的とした経鼻探索を実施した。特に，昨年度までの検索では生ワクチンが開発され，ヒトでも経鼻インフルエン

殖器関連リンパ組織を発見できなかったが，今回ザ生ワクチン“フルミスト”が有名である。2015

腟前庭にMALTを発見した。

年に牛ではTSV２（牛伝染性鼻気管炎と牛パラ
インフルエンザ３型）経鼻ワクチンが実用化さ

２．方法

れ，豚では回虫抗原を応用した粘膜免疫が検討さ2.1れてきた。さらに近年，点眼ワクチンの開発も日

本研究のすべての過程において，北海道大学な進月歩であり，高病原性鳥インフルエンザ等，鶏らびに同学獣医学研究院における動物実験ガイドの呼吸器疾患で実用化されている。粘膜型ワクチ

ラインに従って実験を行った（承認番号16-0074・

ン接種には高価な医療基材や高度な技術を必要と16-0077，本研究院の動物実験プログラムはThe

せず，開発途上国への応用という点からも新たなAssociation for the Assessment and技術として期待されている。

Accreditation of Laboratory Animal Care

動物実験倫理および供試動物

我々は，牛と豚における将来の粘膜型ワクチン

Internationalによる認証を受けている）。ニチロの発展と普及を想定している。昨年度までの研究

畜産名寄工場のと体，本学部の実習で安楽死されにおいて，ワクチンを接種しやすい粘膜免疫誘導た雌のホルスタイン種成牛，および雌の交雑系成部位として“眼と腟”に注目し，特に両動物種のミニ豚を用いた。動物はいずれも微生物学的にコ

眼球結膜部分にMALTが存在することを明らか

ンベンショナルな環境で飼育された。動物から眼にした（結膜関連リンパ組織（CALT）や涙道関瞼，眼球結膜，第三眼瞼，腟前庭および腟を採取

連リンパ組織（LTALT）を併せて眼関連リンパした。

組織（EALT）と呼ぶ）。口や直腸もワクチン接2.2

種候補部位となるが，前者は食渣に，後者は糞便

上記のように採取した臓器を10％中性緩衝ホルに邪魔されるだろう。また，眼と腟の所属リンパマリンあるいは４％パラホルムアルデヒドで固定節を考慮に入れると，眼は上部気道疾患に，腟はした。生殖器に関してはホールマウントヘマトキ

付近の尿生殖器や乳房等への免疫誘導に有用であ

シリン染色を施し，塩酸アルコールで脱色しながると考えられる。MALTには特徴的なろ胞被蓋ら観察した。肉眼観察後，すべての組織を階段希上皮が存在し，特に抗原取り込み能を有する“Ｍ

釈アルコール系列で脱水後，定法に従いパラフィ細胞”が重要である。Ｍ細胞は基底膜側に樹状細ン包埋組織を作成した。パラフィンブロックから胞等を集簇させ，外来抗原に対する粘膜免疫誘導

３μｍ厚の組織切片を作成後，ヘマトキシリン・に重要な役割を果たす。牛と豚のEALTにおけるエオジン（HE）染色を施した。

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組織解析産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索（Ⅱ）―より効果的なワクチン接種部位を求めて―牛の結膜組織を用いて免疫組織化学を実施した 。脱 パ ラ フ ィ ン 後 の 切 片 を Tris-HCl 緩 衝 液（pH9.0）で110℃，15分間加熱し，抗原を賦活化した。0.3％H２O２／メタノールに切片を浸漬し，331

でバーチャルスライド化することで組織画像を得た。
３．結果と考察

内因性ペルオキシダーゼを除去した。10％正常ヤ

3.1

ギ血清でブロッキング後（ニチレイ，東京，日本），

昨年度の検索と同様，牛の眼瞼結膜および眼球Ｔ細胞マーカーCD３（ニチレイ，東京，日本），

結膜には散在性リンパ組織や集合リンパ小節が存

Ｂ細胞マーカーＢ220（Cedarlane，Ontario，カ

在した（Fig.１）。第三眼瞼結膜においては散在

ナ ダ） お よ び Ｍ 細 胞 マ ー カ ー Cytokeratin 18性リンパ組織を認めたが，いずれの標本も明瞭な（Progen ，Heidelberg ，ド イ ツ）の 一 次 抗 体 と濾胞構造や胚中心は認められなかった。結膜につ４℃，一晩インキュベートした。切片を0.01Ｍリ

いては，上眼瞼と下眼瞼のリンパ組織を比較した

ン酸緩衝液で洗浄後，ビオチン標識抗ウサギIgG

が，いずれの所見についても上下の眼瞼で明瞭な二次抗体およびHRP標識ストレプトアビジンビ

差異は認められなかった。

オチン（ニチレイ，東京，日本）と反応させ，3,3ʼ-

結膜の散在性リンパ組織においてはＢ細胞とＴ細胞が混在し，リンパ小節においては中心部にＢ

ジアミノベンジジン四塩酸塩で発色した。
2.3

牛のEALTの形態と構成細胞について

細胞領域，その周辺にＴ細胞領域が形成されてい画像解析

組織スライドグラスについて，BZ-Ｘ710（キーた（Fig. 1a, b）。リ ン パ 組 織 上 の 粘 膜 上 皮 に はエ ン ス ，大 阪 ，日 本）で 撮 影 ，あ る い は Nano

Cytokeratin18陽性細胞が局在しており，Ｍ細胞

Zoomer 2.0-RS（浜松ホトニクス，静岡，日本）様細胞の存在が示唆された（Fig. 1c）。特に集合

Fig. 1 Comosing cells of eye-associated lymphoid tissue（EALT）in cow.

Panels a-d show the bulbar conjunctiva-associated lymphoid tissues（BCALT）.

CD3-positive T cells and B220-positive B cells are localized to BCALT.
Cytokeratin 18（K18）-positive epithelial cells are detected in mucus epitheliumof bulbar conjunctiva（panel c）, and these cells are partially accumulated to
crypt-like structures（panel d, arrows）.Immunohistochemistry．

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332

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Fig. 2 Morphology of genital organ-associated lymphoid tissue（GOALT）in cow

and miniature pig．

P anel a shows the hematoxylin-stained wholemount specimen of vaginal

vestibules. Several crater-like structures are observed. For histological sections,crater-like structures in gross anatomy indicated lymphoid follicles（panel band c, arrowheads）.HE staining（panels b and c）．

リンパ小節上の粘膜上皮には陰窩様の陥凹部が存する。

在し，Cytokeratin18強陽性上皮細胞が集簇して3.3いた（Fig. 1d）。

これまでの予備実験ならびに昨年度の解析か

3.2

考察

牛と豚の生殖器関連リンパ組織について

ら，牛，馬，猫，豚（ミニ豚）およびマウス１）の両動物種の腟前庭部のホールマウント標本を観結膜関連リンパ組織を発見しているが，今回は畜察した。腟前庭の粘膜部に小円のクレーター状構

産分野において重要な牛のEALTについて検索を造が散在性に認められた（Fig. 2a）。本部位のパ

行い，その組織構成細胞，特にＴ細胞とＢ細胞のラフィン包埋組織を作成し，その組織切片を観察

局 在 を 明 ら か に し た 。ま た ，興 味 深 い こ と にしたところ，上皮下に散在性および濾胞性のリン

Cytokeratin18陽性細胞が結膜上皮に存在し，当パ組織が見られた（Fig. 2b）。濾胞性のリンパ組

該部位にＭ細胞様細胞の存在が示唆された。過去

織の直上では，粘膜上皮が欠損し，リンパ組織がの報告より，動物のＭ細胞マーカーとして，マウ

一部粘膜面に露出していた（Fig. 2c）。以降，こスではGlycoprotein２２）が汎用されるが，豚ではのMALTを生殖器関連リンパ組織（GOALT）とCytokeratin18 や Toll-like receptor（TLR）２ お© The Ito Foundation

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索（Ⅱ）―より効果的なワクチン接種部位を求めて―

333

よび９が用いられ３），牛のＭ細胞はCytokeratin18

膜関連リンパ組織（MALT）を標的としており，やCyclophilin Aに陽性を示す 。Cytokeratin18

特 に 点 眼 ワ ク チ ン で は“眼 関 連 リ ン パ 組 織に加え，他のＭ細胞マーカーの発現，さらには（EALT）”の役割が重要である。加えて，ワクチ

EALTへの抗原取り込み能を評価し，牛と豚のンを接種しやすい粘膜免疫誘導部位として生殖器

EALTにおけるＭ細胞の存在とその機能的意義をも考えられるが，そのMALTに関する報告は皆明らかにしたい。

無である。本研究では，産業動物，特に牛と豚（ミ４）

本研究において，牛とミニ豚の腟周囲，特に腟ニ豚）の眼と生殖器のMALTに着目し，形態学

前庭部分にGOALTを発見した。これまで動物の的研究を進めた。本解析より，両動物種ともに結腟におけるMALTに関して明確な報告がなく，膜および第三眼瞼にEALTを具備すること，まその機能的意義は非常に興味深い。腟前庭部にはた ， 牛 の EALT に お け る Ｔ 細 胞 ， Ｂ 細 胞 ，

大きな種差が存在し，げっ歯目では本部位の発達

Cytokeratin18陽性細胞（Ｍ細胞マーカー）の局が悪く，実験げっ歯目のGOALT研究への応用は在を明らかにした。また，両動物種の腟前庭に散難しいのかもしれない。

在性および濾胞性のリンパ組織を発見した。眼と眼瞼および腟前庭は薬剤の留置に適しており，

腟前庭のMALTは牛と豚における将来の粘膜型

人医療では過去に下眼瞼留置型のピロカルピン徐ワクチンの発展と普及への可能性を有しており，放剤が使用され，また，産業動物では牛用の腟内

今後もこれらを利用して効率的な免疫誘導を実現

留置型プロジェステロン徐放剤が汎用されていする可能性に着目したい。

る。単に，GOALTへの抗原塗布も有用かもしれない。本研究で免疫誘導部位として着目する眼および腟前庭は留置および徐放暴露によって長期間の抗原刺激が可能な部位であり，今後も既存のワクチン接種部位よりも効率的な免疫誘導を実現す
る可能性に着目したい。
４．要約

近年，粘膜型ワクチンの開発は日進月歩であり，高病原性鳥インフルエンザ等，鶏の呼吸器疾患で点眼ワクチン実用化されている。これらは粘文
献１）
 Kosenda, K., Ichii, O., Otsuka, S., Hashimoto, Y.,
Kon, Y.：Clin Exp Ophthalmol ， 41 ， 788 ～ 797 ，2013．
２）
 Terahara, K., Yoshida, M., Igarashi, O., Nochi, T.,
Pontes, G. S., Hase, K., Ohno, H., Kurokawa, S.,
Mejima, M., Takayama, N., Yuki, Y., Lowe, A. W.,
Kiyono, H.：J Immunol，180，7840～7846，2008．
３）
 Tohno, M., Shimosato, T., Moue, M., Aso, H.,
Watanabe, K., Kawai, Y., Yamaguchi, T., Saito, T.,
Kitazawa, H.：Vet Res，37，791～812，2006．
４）
 Hondo, T., Someya, S., Nagasawa, Y., Terada, S.,
Watanabe, H., Chen, X., Watanabe, K., Ohwada, S.,
Kitazawa, H., Rose, M. T., Nochi, T., Aso, H.：Cell
Tissue Res，364，585～597，2016．

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334

豚腸管細胞モデルを用いた豚サーコウイルス関連疾病の重症化機序解明
Mechanisms of progression of sever porcine circovirus associated diseases
by porcine intestinal cell model system

岡

林

環

樹

（宮崎大学農学部獣医学科）

Tamaki Okabayashi（Department of Veterinary medicine, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）causes a highly contagious enteric infection inswine. PEDV damages pig intestinal epithelial tissues, causing intestinal hyperemia andatrophy of intestinal villi, with formation of intestinal epithelial cell cytoplasmic vacuoles.
Porcine circovirus type 2 has been associated with a number of different syndromes anddiseases such as postweaning multisystemic wasting syndrome （PMWS） and porcine
dermatitis and nephropathy syndromes（PDNS）. Recently, dual infection with PEDV and PCV2
has been reported in neonatal piglets. Moreover, the clinical course of PEDV diseases wasmarkedly affected in PCV2-transplacentea infected pigs. However, direct interaction of PEDV
and PCV2 infections has not been demonstrated yet. The objective of present study was toinvestigate the effect of PEDV-PCV2-co-infection on porcine intestinal epithelial cells（PIEcells lines）established by Moue et al., 2008．
PCV2 isolation and cells persistently infected PCV2, derived from pig serum with PCV2,
has been attempted with PIE cells. Using these PCV2-infected PIE cells, PEDV-coinfection
model was established and evaluated the viral propagation by TCID50 and mRNA activation oftype I/III Interferons（IFN）by qRT-PCR．
PCV2 was successfully isolated by PIE cells. The persistent infection of PCV2 were
established with 3rd PCV2 infected-cell-passage and confirmed the 30％ infectivity by indirect
immunofluorescence assay. Any cytopathic effects were observed on neither PCV2 nor PEDV
infected PIE cells. However, significantly CPE appeared at 2 days post PEDV infection in PIE
cells coinfected with PCV2 and PEDV. Viral copy numbers of PEDV and activation of type I/
III IFNs mRNA in coinfection cells were significantly higher than those in single infection
cells．
It is concluded that the cell damages and PEDV propagation were markedly enhanced
PCV2 infected cells. Our results suggested that PCV2 infection potentiates PEDV-propagationin pig intestine epithelial cells.

© The Ito Foundation

豚腸管細胞モデルを用いた豚サーコウイルス関連疾病の重症化機序解明

さ れ た PIE 細 胞 を 用 い て ，PCV2 の 分 離 お よ び

的

１．目

335

PCV2感染細胞の樹立を試みた。また，このPCV2

豚流行性下痢ウイルス（PEDV）は小腸上皮細感染細胞を用いて，PEDVの重複感染豚腸管上皮胞を標的とし，日齢に関係なくすべての豚に感染細胞モデルの作製を行った。これらのPCV2とする。特に哺乳豚では，致死的な水様性下痢を引

PEDVの重複感染豚腸管上皮細胞モデルを用い

き起こし，壊滅的な被害を及ぼすために，その経て，ウイルス増殖性，細胞障害性および免疫応答

済的影響が大きな問題となっている。豚サーコウ

への影響を明らかにすることを目的とした。

イルス２型（PCV2）は，単独感染では多くが不顕性に経過する。PCV2は他病原体との重複感染

２．材料と方法に よ り ，離 乳 後 多 臓 器 性 発 育 不 良 症 候 群

PIE細胞は東北大学の麻生久先生から分与を受（PMWS）の他に豚皮膚炎腎症症候群（PDNS），

けた。これらのPIE細胞をMoueらの方法を改変

豚離乳後多臓器性発育不良症候群（PMWS）をし４），DEME/F-12に添加物を加えることにより，はじめとするさまざまな病型との関連性が指摘さ

さらに栄養リッチな細胞培養液を用いた培養をれている。しかしながら，PCV2と他病原体との行った。宮崎県で採集されたPCV2感染豚血清を直接的な関連性は明らかにされていないのが現状

PIE細胞に接種し，接種された細胞を1/3継代－である。

７日間培養にて３代繰り返すことでPCV2の分離

近 年 Hirai ら に よ っ て ，新 生 哺 乳 豚 に お け るを試みた。またPIE細胞およびPCV2感染PIE細胞

PCV2とPEDVの重複感染が報告された 。彼らにPEDV（Fukuoka-1/Japan/2014株：福岡中央の報告では，腸管上皮細胞にPEDVの抗原，マク

家畜保健所より分与）をMOI１にて感染させて，ロファージなどの免疫細胞にPCV2の抗原を検出

ウイルス増殖性，細胞障害性，免疫誘導性への影しているが，同一細胞における重複感染は確認し響を比較した。ウイルス増殖性を定量RT-PCR法ていない。JungらはPEDVに自然感染した新生哺（qRT-PCR），間接蛍光抗体法（IFA)，TCID50に

乳豚の腸管上皮細胞にPCV2遺伝子を検出し，より解析した。またⅠ型／Ⅲ型インターフェロン

PCV2がPEDV発症豚から多く検出されることを（IFN）mRNAの誘導性をqRT-PCRにより測定し報告した 。また，PCV2を胎盤経由にて感染さ

た。

１）

２）

せた新生哺乳豚においては，PEDVの症状が長期化し，重症化することを確認している３）。しかし，生体内におけるそれぞれのウイルスの動態や腸管３．結果と考察PCV2感染豚血清を接種したPIE細胞の培養上清中にPCV2遺伝子を検出したことから，PCV2上皮細胞に与える影響などは不明である。
Moueら（Moue et al., 2008）は豚小腸の上皮細の分離を確認した。PCV2の分離は一般的には豚胞における免疫反応を解明するために，豚の小腸

腎臓上皮細胞であるPK-15が用いられている。しよ り 腸 管 上 皮 細 胞 Porcine intestinal epithelial

かしながらATCCなどの細胞バンク由来のPK－

cells（PIE細胞）を樹立した。このPIE細胞を豚15細胞にはすでにサーコウイルスが感染している

腸管上皮細胞モデルとして，LPS刺激に対することが明らかになっており，PCV2の分離には

TLR４経由の細胞情報伝達系が活性することを

PK-15細胞集団の中から非感染細胞をクローニン

報告した 。そこで本課題においては，この樹立

グして分離用細胞としてしなければならず，困難４）© The Ito Foundation

336

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）をきたす ５）。本実験結果において，PIE細胞が

PCV2やPEDV単独感染では観察できなかった顕PCV2分離のための新しい有用な細胞であること

著な細胞変性効果（CPE）の出現が確認できた。

を提言することができた。

またその培養上清中における感染性ウイルスの存在をVero KY５細胞を用いたTCID50 法によって子コピー数が細胞の継代を重ねるごとに増加した測定すると，PCV2やPEDV単独感染細胞よりもことから，PCV2のPIE細胞への持続感染が起こっ

PCV2とPEDVの重複感染細胞において有意に高ていると考えられた（Fig.１）。細胞内におけるい感染性ウイルスの増殖が確認できた（Fig.３）。

PCV2抗原をIFAにて観察すると，30％の細胞が

これらの条件下における細胞上清中，細胞中のウPCV2に感染していた（継代３代目

Fig.２）。こイ ル ス 核 酸 量 を qRT-PCR に て 測 定 す る と ，の継代３代目PCV2持続感染PIE細胞にPEDVを

TCID50 のデータに相関して，PCV2とPEDVの重重複感染することにより，重複感染しているPIE

複感染細胞においては細胞上清中，細胞中ともに細胞（PCV2＋PEDV）において，感染２日目にPEDVのコピー数が有意に高い値を示した（Fig.

PCV2
Log 10 copies /μl in supernatant

PCV2感染PIE細胞では，上清中ウイルス遺伝

9
8
7
6
5
4
3
2
1
Serum

P1

P2

P3

P5

P6

P8

No. of PIE cell passage
Fig. 1 Isolation of PCV2 and establishment of persistent PCV2 infection

with PIE cells.

anti-PCV2 capsid

hoechstoverlay

Uninfected
PIE cells

PCV2 infected
PIE cells(3 rd Passage )40 xFig. 2 Indirect immunofluorescence assay images for PCV2 infected

PIE cells.

© The Ito Foundation

Live cell images

豚腸管細胞モデルを用いた豚サーコウイルス関連疾病の重症化機序解明

PCV2

PEDV

PCV2+PEDV

PEDV

PCV2+PEDV

337

Log10 TCID50/50 μlwith Vero KY5 cells

5
4
3
2
1

PCV2

infection in PIE cells, 2dpi
Fig. 3 Live cell images and TCID50 of PCV2 and/or PED

PEDV copy number
Log10 Copies/μl

6
4
2

6

Log10 Copies/μl

Log10 Copies/μl
Log10 Copies/μl

CellularSupernatant

infected PIE cells.

42

PCV2 PEDV PCV2
PEDV6

PCV2 copy number

4
2

6
4
2

PCV2 PEDV PCV2PEDVFig. 4 Viral copies number of PCV2 and PED of PCV2 and/or PEDV infected PIE

cells.

４）。PCV2 と PEDV の 重 複 感 染 細 胞 に お け る

ないが，PCV2の放出を抑制する作用があること

PCV2の細胞内コピー数には変化はなかったが，が示唆された。またPCV2とPEDVの重複感染細しかし上清中のPCV2コピー数は減少していた。

胞では，Ⅰ型／Ⅲ型IFN mRNAの発現が増強さこれらの結果より，PCV2とPEDVの重複感染細れたために，Ⅰ型／Ⅲ型IFNがPEDVとPCV2に胞においては，PEDVの複製および放出が増幅さそれぞれ異なる抗ウイルス効果を与えている可能れていることを示した。また重複感染することに性が考えられた。

よりPCV2の細胞内における複製には影響を与え© The Ito Foundation

338
４．要

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

約

本研究において，PCV2感染豚血清からPIE細胞を用いてPCV2の分離に成功した。これらのことよりPCV2の新しい分離用細胞としてPIE細胞の有用性を確認することができた。またPCV2が感染した豚腸管上皮細胞にPEDVが重複感染すると，PEDVの増殖性が亢進され，細胞障害性が強く誘導されることが明らかになった。本研究で確立したPIE細胞を用いたPCV2感染モデルが，病原性が明瞭でないPCV2とPEDVやその他の病原体との相互関係により重症化を示唆するような細胞障害，炎症反応を起こすのかを調べるための有用なツールになると考えられた。

文献１） Hirai, T., Nunoya, T., Ihara, T., Kusanagi, K.,
Shibuya, K.：Dual infection with PCV2 and porcine
epidemic diarrhea virus in neonatal piglets,
Veterinary records，148，482～484，2001．
２）
 Jung, K., Ha, Y,, Ham, S. K., Kim, J., Choi, C., Park,
H. K., Kim, S. H., Chae, C.：Identification fo porcine
circovirus type 2 in retrospective cases of pigs
naturally infected with porcine endemic diarrhea
virus, The Veterinary Journal ， 171 ， 166 ～ 168 ，
2007．
３）
 Jung, K., Kim, J., Ha, Y., Choi, C., Chae, C.：The
effect of transplacental porcine circovirus type 2
infection on porcine epidemic diarrhea virusinduced enteritis in preweaninng piglets, The
Veterinary Journal，171., 445～450，2007．
４）
 Moue, M., Tohno, M., Shimizu, T., Kido, T., Aso, H.,
Saito, T., Kitazawa, H.：Toll-like receptor 4 andcytokine expression involved in functional immune
response in an originaly established porcine
intestinal epithelial cells, Biochim. Biophys. Acta.,
1780（2），134～144，2008．
５）
 Zhu, Y., Lau, A., Lau, J., Jia, Q., Karuppannan, A.,
Kwang, J.：Enhanced replication of porcine
circovirus type 2 （PCV2） in a homogeneous
subpopulation of PK15 cell line, Virology，369，423～430，2007．

© The Ito Foundation

339

アフリカ豚コレラの侵入リスク評価に関する疫学研究
Epidemiological research on the risk assessment of introduction of Africanswine fever into Japan

杉

浦

勝

明・芳

賀

猛

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Katsuaki Sugiura and Takeshi Haga
（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

To identify and rank the potential risk factors associated with the introduction and spreadof ASF in Japan, we conducted a rapid risk assessment using a questionnaire composed of 10questions asking experts in African swine fever（ASF）. The 12 experts who participated inthis risk assessment considered illegal import of food as the most relevant pathways of ASF
introduction into Japan followed by transport routes and foreign workers. Kanto and Kyushu
were the regions where ASF is most likely to be introduced. All experts agreed that China is
the most likely source of ASF introduction into Japan. Most Japanese experts were of the viewthat the risk of spread of ASF once introduced in Japan is low, while foreign experts answeredthat the risk of spread is moderate or high. Most experts answered that the presence of wildboars will play an important role in the persistence of ASF, once the disease spread in Japan.
Based on the risk factors identified by this rapid risk assessment, we conducted a questionnaire
survey targeting the pig farms in Japan to collect data at farm level on the employment offoreign workers, practice of swill feeding and implementation of biosecurity measures. Thissurvey based on response from 578 farmers of 42 prefectures revealed that the proportion of
pig farms with foreign employees is relatively high in Kanto region than in other regions while
the proportion of pig farms practicing swill feeding is high in Kansai region. In most
prefectures throughout Japan, shower-in-and-out was conducted in less than half of pig farms.
These results will provide policy makers, veterinarians and pig farmers with useful informationin developing quarantine programs to protect Japanese pig herds from the introduction andspread of ASF.

１．目

シシ間の直接または間接的接触により広がり，高的い死亡率を示す。ASFVは，環境中およびさまざ

アフリカ豚コレラ（ASF）は，アフリカ豚コ

まな豚肉製品中で長期間生存することから，畜産

レラウイルス（ASFV）により起こるきわめて伝物を介して遠隔地に持ち込まれることがある。常播力の強い豚の感染症である 。ASFは豚やイノ

在国や流行国では，野生のイノシシやヒメダニ

１）© The Ito Foundation

340

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）（Ornithodoros）で感染サイクルが形成され，防10の質問からなる質問票を作成し，日本および世疫を困難にする 。

界のASFの専門家を対象に配布し，その結果を２）

ASFは1921年にケニアで最初に報告されて以もとに迅速なリスク評価を実施した。質問票は降，サハラ以南のアフリカ諸国でのみ流行してい2018年８月31日に電子メールで計15人の専門家にた。1957年および60年に初めてアフリカ以外の国送付し，９月14日までに12人から回答を得た。なポルトガルで発生し，その後一部のヨーロッパ諸

お，回答を依頼した専門家には質問票とともにリ国，カリブ海諸国，ブラジルに広がったが，2000

スク評価に必要な背景情報として，日本の養豚産

年初頭までにはアフリカとイタリアのサルジニア

業，日本に到着する国際航空機，国際船舶などの島を除く地域から撲滅された。2007年にコー

便数および到着地，生きた豚，豚肉および加熱処

カサス地方のジョージアに侵入し，その後，ロシ

理豚肉製品，飼料，飼料原料などの日本への輸入

ア連邦，アルメニア，アゼルバイジャンなど近隣

量・輸入先国のデータ，日本への畜産物の違法輸諸国に広がり，さらに，ウクライナ（2012），ベ

入に関するデータ，日本への海外旅行者および労ラルーシ（2013），エストニア（2014），ラトビア

働者数，日本でのイノシシ生息に関するデータ，（2014），リトアニア（2014），ポーランド（2014），

日本におけるヒメダニの生息地および日本の養豚モルドバ（2016），チェコ（2017），ルーマニア場のバイオセキュリティ対策に関する情報を提供（2017）と発生が続き，流行地域は拡大してい

した。

る

３～５）

。2017年３月，ASFはロシア連邦のイルクー

５～７）

2.2

農場レベルの評価

ツ ク（中 国 と の 国 境 か ら 1000 ㎞ ）で 報 告 さ れ

養豚農場のバイオセキュリティ措置の実施状況た８）。2018年８月，ASFは中国の遼寧省瀋陽市近などに関する10の質問からなる質問票を作成し，くの農場で最初の発生が報告され，その後全国に

９月10日に公益社団法人日本養豚協会を通じ同協

広がり，2019年３月15日までに131件の発生が報会の会員養豚農家1600戸に郵送配布した。11月10

告されている 。このような地理的拡大により，日までに588戸から回答を得た。質問票には2.1の日本への侵入リスクは増大しているが，ASFの迅速リスク評価においてリスク要因として指摘さ侵入に関連するリスク要因や一旦侵入した場合にれ，情報ギャップの存在が判明した外国人従業員

日本でのまん延を助長する要因を特定するためのの有無，残飯養豚の実施状況に関する質問を含め体系的なリスク評価は行われていない。そこで，た。

９）

我々は日本におけるASFの導入とまん延の潜在的なリスク要因を特定しランク付けするために迅

３．結果と考察速リスク評価を行うとともに，リスク評価に必要

3.1

な情報を入手するための農場レベルの評価を実施

ASFの日本への侵入経路―ASFの日本への侵入経路として最も可能性の高い経路は，畜産物のした。

違法輸入であり，続いて外国人労働者であった

２．材料と方法
2.1

迅速リスク評価（Fig. 1A）
。これらの経路による侵入リスクは中程度，他の経路によるリスクは無視できるか，き迅速リスク評価

日本におけるASFの侵入，拡大，定着に関連

わめて低いか低いとランク付けされた。ある専門する潜在的なリスク要因のランク付けを依頼する

家は，加熱処理肉については，たとえ熱処理条件© The Ito Foundation

341

アフリカ豚コレラの侵入リスク評価に関する疫学研究
6

5

0

0

West Europe

RussianEast Europe

East Asia (China)
Slaughterhouse

1

Fattening

1
Farrow to wean

2

Farrow to ﬁnish

2

Commercial

3

Semi-intensive

3

Family-run

Ｄ

4

Presence of vector

4

Movement related tohuntingＣ

Caucasus

Foreign workers

Illegal import of food1
Legal import of food0

Illegal import of feed2

Legal import of feed1
Wild boar

3

Illegal import of pigs

2

Legal import of pigs

4

Transport routes

3

5

Ｂ

5

Africa4

Production system

Ａ

Presense of wild boars

5

Fig. 1 Most likely way of ASF introduction into Japan（A）；most likely source of ASF introduction into Japan（B）；

production system mostly affected（C）；and risk factors associated with the persistence of ASF in Japan（D）.The
scale on the vertical axis indicates the risk：0（negligible risk）；1（very low risk）；2（low risk）；3（moderaterisk）；4（high risk）and 5（very high risk）. Open circles indicate the average and error bars indicate the range ofexpert opinions．

が適用されたとしても，その輸入量を考えると侵していた。

入経路となるリスクは高いとの見解を示した。ほ日本でのASFの侵入地域―ほとんどの専門家

とんどの専門家は，海に囲まれていて国境を共有

は，関東と九州がASF侵入リスクが高い地域でしていないという日本の地理的な利点のために，

あ り ，次 に 近 畿 地 方 で あ る と ラ ン ク 付 け し た

豚やイノシシの輸入による侵入リスクは無視でき（Fig. 2A）
。侵入地域をランク付けする際のリス

るか非常に低いとの見解であった。さまざまな輸ク要因として，大規模な国際空港の存在，外国人送機関のうち国際船舶や航空機からの廃棄物の方

観光客の数，イノシシの生息地および豚の飼養密が外国から到着する車両よりも高い確率でASF度が考慮された。

侵入に寄与すると考えられたが，仮にASFが韓日本へのASFの侵入源国―すべての専門家は，国に侵入すれば，汚染された車両を通じて日本に東アジア（中国）がASFの日本への導入元であ持ち込まれる危険性が劇的に高まるという見方をる可能性が最も高いとの見解で一致していた© The Ito Foundation

Okinawa

KyushuShikoku

Chugoku

Okinawa

Kyushu1

Shikoku

2

1

Chugoku

3

2
Kinki

4

3

Chubu

5

4

Kanto

6

5

Tohoku7

6

Hokkaido

7

Ｂ

Kinki

8

Chubu

9

Ａ

Kanto

8

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Tohoku9

平成30年度Hokkaido

342

Fig. 2 Regions where ASF is most likely to be introduced（A）；and regions where ASF is most likely to spread（B）.

The scale on the vertical axis indicates the rank of regions in terms of the likelihood of introduction, from 1（least
likely to be introduced/spread）to 9（most likely to be introduced/spread）. Open circles indicate the average anderror bars indicate the range of expert opinions.

（Fig. 1B）。ほとんどの専門家は，日本とアフリまん延した場合に影響を受ける農家の経営形態

カとの経済関係を考えると，アフリカから日本へ―ほとんどの専門家は，日本でまん延した場合にの侵入リスクは中国に比べ低いとした。

は，企業養豚ではなく家族経営または半集約的養一旦侵入した場合のまん延リスク―ほとんどの豚場が最も影響を受けると回答した（Fig. 1C）。

日本の専門家は，日本でのASFのまん延リスク

ASF 定 着 の リ ス ク ― ほ と ん ど の 専 門 家 は ，は非常に低いとの見解であったが（１～10％），

ASF定着のリスクは低い～非常に低い（10％未

外 国 人 専 門 家 は そ う で は な い と 答 え た（30 ～満）との見解であった。

60％）。一部の外国の専門家は，イノシシの生息

ASF定着に関係するリスク要因―ほとんどのにより，養豚農家のバイオセキュリティレベルに専門家は，一旦日本で広まったら，イノシシの存

よっては，ASFが早期に発見されずに広がる可在が定着において最も重要な役割を果たすと回答

能性があるとの見解であった。

した（Fig. 1D）。

ASFのまん延におけるダニの関与―ほとんど

このリスク評価を実施する過程で，以下の情報の専門家は，日本のASFまん延におけるダニのギャップが確認された。

関与はきわめて低い（１％未満）との見解。ある・中国その他の国から違法に輸入される豚肉製品

日本の専門家は，日本のヒメダニ（Ornithodorosの量。違法に輸入される豚肉製品は，適切に熱処

spp）がASFの媒介になる可能性は低いとの見解

理されていない可能性があり，合法的に輸入されであった。

た製品よりも感染源になる可能性が高い。動物検

ASFが広がる可能性の高い地域―ほとんどの疫所が実際に押収した畜産物（2017年は83トン）

専門家は，九州と関東がASFが最もまん延するが氷山の一角であると仮定すると，個人消費また可能性が高い地域であり，四国が最もまん延しには商業目的で，はるかに多くの量が中国や他の国くい地域であるとの見解であった（Fig. 2B）。感から違法に輸入される可能性がある。

染が家畜の豚に現局している限り，流行は起こら

・養豚場における残飯給与の頻度。残飯養豚は日ないだろうという見方をした。

本の養豚場では一般的ではないが，禁止されてい© The Ito Foundationアフリカ豚コレラの侵入リスク評価に関する疫学研究
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
沖縄
鹿児島
宮崎
大分
熊本
長崎
佐賀
福岡
高知
愛媛
香川
徳島
山口
広島
岡山
島根
鳥取
和歌山
奈良
兵庫
大阪
京都
滋賀
三重
愛知
静岡
岐阜
長野
山梨
福井
石川
富山
新潟
神奈川
東京
千葉
埼玉
群馬
栃木
茨城
福島
山形
秋田
宮城
岩手
青森
北海道

0.0

Fig. 3 Probability of a pig farm employing a foreign worker by prefecture. Open circles

indicate the average and error bars indicate the 95％ confidence interval. There was nodata provided from Shiga, Wakayama, Shimane, Fukuoka and Saga prefectures. The
probabilities for these prefectures reflect the uninformed prior distribution of Uniform
（0,1）
．

1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
沖縄
鹿児島
宮崎
大分
熊本
長崎
佐賀
福岡
高知
愛媛
香川
徳島
山口
広島
岡山
島根
鳥取
和歌山
奈良
兵庫
大阪
京都
滋賀
三重
愛知
静岡
岐阜
長野
山梨
福井
石川
富山
新潟
神奈川
東京
千葉
埼玉
群馬
栃木
茨城
福島
山形
秋田
宮城
岩手
青森
北海道

0.0

Fig. 4 Probability of a pig farm practicing swill feeding by prefecture. Open circles indicate theaverage and error bars indicate the 95％ confidence interval. There was no data provided
from Shiga, Wakayama, Shimane, Fukuoka and Saga prefectures. The probabilities forthese prefectures reflect the uninformed prior distribution of Uniform（0,1）．

1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
沖縄
鹿児島
宮崎
大分
熊本
長崎
佐賀
福岡
高知
愛媛
香川
徳島
山口
広島
岡山
島根
鳥取
和歌山
奈良
兵庫
大阪
京都
滋賀
三重
愛知
静岡
岐阜
長野
山梨
福井
石川
富山
新潟
神奈川
東京
千葉
埼玉
群馬
栃木
茨城
福島
山形
秋田
宮城
岩手
青森
北海道

0.0

Fig. 5 Probability of a pig farm not practicing shower-in-and-out policy as biosecurity

measure by prefecture. Open circles indicate the average and error bars indicate the
95％ confidence interval. There was no data provided from Shiga, Wakayama, Shimane,
Fukuoka and Saga prefectures. The probabilities for these prefectures reflect theuninformed prior distribution of Uniform（0,1）．

© The Ito Foundation

343

344

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

るわけでもない。より正確なリスク評価のために施状況などに関するデータを入手した。日本へのは，残飯の給与頻度と適用される処理に関する

ASFの侵入リスクが増大している状況下で，こデータが必要。

れらの結果は行政機関および養豚農家によるリス・養豚場におけるバイオセキュリティ対策のレベ

ク管理に有用な情報を提供する。これらの結果をル。多くの専門家は，ASFの導入と拡大を防止踏まえ，今後さらに精緻なリスク評価を進めていするうえで養豚場におけるバイオセキュリティのきたい。

重要性を強調した。家畜伝染病予防法に従い，すべての養豚農家はASFを含む伝染病の発生から豚群を保護するためのバイオセキュリティ対策を遵守することになっているが，その遵守状況については不明な部分が多い。
3.2

農家レベルのリスク評価

上述の迅速リスク評価の結果を踏まえて実施した養豚農家を対象とするアンケート調査において回収した588戸分のデータのうち，回答項目に欠損がない578戸分のデータを用いて都道府県別の外国人労働者の雇用状況，残飯給与その他のバイ
オセキュリティ措置の実施状況を分析したとこ
ろ，関東地方の養豚農家では外国人労働者の雇用割合が高く，関西地方の養豚農家で残飯給与を実施している農家の割合が高いことが分かった（Fig.３および４）。また，バイオセキュリティ対策の１つとしてとるべき従業員のシャワーイン・
シャワーアウトについては実施していない農家がほとんどの都道府県において半分以上を占めることが判明した（Fig.５）
。
４．要

約

本研究では，世界のASF専門家の意見をもとに日本への侵入経路として可能性の高い経路，侵入源として可能性の高い国などを特定した。また，同リスク評価の結果を踏まえて実施した養豚農家を対象とするアンケート調査の結果，養豚場

文
献１） Alonso, C., Borca, M., Dixon, L., Revilla, Y.,
Rodriguez, F., Escribano, J. M.：ICTV Report
Consortium：ICTV Virus Taxonomy Profile：
Asfarviridae, Journal of General Virology，99，613～614，2018．
２）
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African swine fever. In：Coetzer, J. A. W.,
Thomson, G. R., Tutsin, R. C., eds.：Infectious
diseases of livestock, with special reference tosouthern Africa, vol 1, pp.567-599 ，1st edn, Oxford
University Press, Cape Town, South Africa，1994．
３）
 Costard, S., Jones, B. A., Martinez-Lopez, B., Mur,
L., de la Torre, A., Martinez, M., Sanchez-Vizcaino,F., Sanchez-Vizcaino, J. M., Pfeiffer, D. U., Wieland,
B.：Introduction of African Swine Fever into theEuropean Union through Illegal Importation of
Pork and Pork Products, PLoS ONE, 8, e61104，2013.
４）
 Montgomery, R. E.：On a form of swine fever
occurring in British East Africa（Kenya Colony）,J.
Comp. Pathol．34，159～191，1921．
５）
 Sánchez-Vizcaíno, J. M., Mur, L., Martínez-López,B.：African Swine Fever：An EpidemiologicalUpdate, Transboundary and Emerging Diseases，59，
27～35，2012．
６）
 European Food Safety Authority（EFSA）：
Scientific opinion on African swine fever, EFSA
Journal，8，1556，2010．
７）
 Sánchez-Vizcaíno, J. M., Mur, L., Martínez-López,B.：African swine fever（ASF）：Five years around
Europe, Vet Microbiol，165，45～50，2013．
８）
 Kolbasov, D., Titov, I., Tsybanov, S., Gogin, A.,
Malogolovkin, A.：African Swine Fever Virus,
Siberia, Russia, Emerging Infectious Diseases，24，
796～798，2017．https://dx.doi.org/10.3201/eid240
4.171238，2018．
９）
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March 2019. http://www.maff.go.jp/j/syouan/
douei/attach/pdf/asf-467.pdf

における外国人労働者の雇用状況，残飯給与の実© The Ito Foundation

345

豚増殖性腸炎による可食部位の廃棄防止に向けた
適正な抗生物質使用方法の検討
Study of appropriate usage of antibiotics for preventing the disposal of
edible parts by Porcine Proliferative Enteropathy

岡

田

彩

加

（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

Ayaka Okada（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

Proliferative enteropathy（PE）was caused by the obligate intracellular bacterium,
Lawsonia intracellularis（Li）. Porcine PE is a disease with large economic damage in pig
industry, such as the disposal of the intestinal tract and the decreased weight gain of pigs. In
this study, to control PE, the Li culture method using McCoy cells and the appropriate
antibiotics against Li in vitro were examined. The Li strain isolated from a Japanese pig hadpoor growth efficiency by the previously reported culture method, thus, the detailed
examinations could not be investigated. However, the different effect against some antibiotic
was observed among the Japanese strain and overseas strains. Japanese strains may havedifferent characters from overseas strains. This result suggests that in vitro culture method
could be useful for investigating the effective antibiotics against Li.

１．目

齢の豚だけでなく，今回のケースのように肥育豚

的で発症することも多い。死亡してしまう重症例だ2017年，養豚農家より原因不明の豚の腸炎の調けでなく，軽症であっても豚の増体率が低下する

査 依 頼 を 受 け ， 肉 眼 所 見 か ら Lawsonia

ことや，と畜場での解体時に可食部である腸管がintracellularis（Li）による増殖性腸炎を疑い，病変部として廃棄されてしまうため，経済的被害

病変部を材料としたPCRによる遺伝子診断を実施が大きい。

した。遺伝子診断の結果，13検体中７検体でLiの

近年，Liによる増殖性腸炎が増加している要因

遺伝子が検出された。臨床症状と遺伝子診断の結の一つとして，抗生剤の使用低減が考えられてい果から，Liによる増殖性腸炎が強く疑われ，農場る。抗生剤は，薬剤耐性菌の発生リスクの面から，内で広く蔓延していることが示唆された。本と畜農林水産省より慎重な使用が提言されている１）。

場だけでなく，近年，日本の豚においてLiを原因

そのため，飼料への抗生剤の添加などは行われなとする増殖性腸炎の疑似症例が増加している。Li

くなってきており，これが今まで潜在的に存在しは感染していても症状が出ないこともあるが，若ていたLiが顕在化，被害が拡大してきた要因の一© The Ito Foundation

346

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

離培養の際にはDMEM High Glucoseに10％牛胎つだと考えられている。
日本の農場におけるLi汚染率は100％近いとさ児血清を加えるとともに，腸管内のその他の真れており，Liを農場から清浄化することは難しい。

菌，細菌の増殖を抑制するために，2.5μg/mlのLiによる被害を防ぐためには，抗生剤との関連性

アムホテリシンＢおよび50μg/mlのゲンタマイシを明確にし，適正な抗生剤使用方法を確立する必ンを加えた培地を使用した。24穴プレートに播種要がある。そのため，本研究ではLiによる増殖性

したMcCoy細胞をDMEM High Glucoseを用いて腸炎に対する適正な抗生剤使用方法を検証，Liに洗浄後，作製した乳剤を１穴あたり250μｌ接種

よる腸炎の発生をコントロールする方法を検討す

し，700 x g，10分間常温で吸着遠心を行った。

ることを目的とした。Liは偏性細胞内寄生細菌でその後，６時間，37℃微好気条件で培養し，細菌あり，人工培地での培養ができないため，まず培の細胞内への侵入を促した。その後，接種材料を養細胞を用いた培養方法の検討を行い，その後，除去し，新しい培地で培養した。感染直後（０培養細胞を用いた抗生剤の検証を行った。

dpi）および，感染４日後（４dpi）の細胞および

２．方
2.1

上清を回収し，それぞれ細胞内Liゲノムおよび細法

胞外Liゲノムの定量に供した。すなわち，回収した サ ン プ ル を DNeasy Blood & Tissue Kits

定量系の調整Liは人工培地で生育できないため，培養細胞で（QIAGEN, Hilden, Germany）によってDNA抽出の増殖効率をリアルタイムPCRによって定量するを行い，2.1で検討したリアルタイムPCRによる必要がある。定量法はGoTaq qPCR Master Mix

ゲノムDNAの定量を行った。また感染細胞に関（Promega, Madison, WI, USA）を使用し，既報２）

しては４％パラホルムアルデヒドで固定し，間接に従った。すなわち，フォワードプライマーとし蛍光抗体法に供した。

て 5ʼ-GTT CCC GGG CCT TGT ACA C-3ʼ ， リ

2.3

バースプライマーとして5ʼ-CCG GCT TTG GGT

McCoy細胞にLi陽性腸管サンプルの乳剤を2.2

AAA ACC A-3ʼ，プローブとして5ʼ-FAM-CCGで検討した方法に従い感染させた。６時間感作

CCC GTC ACA CCA CGA AA-TAMRA-3ʼを使後，新鮮な培地と交換した。各種抗生物質（カル

用した。検量線作製用のコントロールとして，

バドックス，タイロシン，チアムリン，クロルテ

PCR産物をpTAC２ベクターにクローニングした

トラサイクリン，バルネムリン，リンコマイシン）

プラスミドを用いた。
PCRミックスチャーの組成，を128μg/mlの濃度で添加し，37℃，微好気条件

プログラムはqPCR酵素のマニュアルに従った。

で４日間培養した。感染後０日（０dpi），４日

2.2（４dpi）の細胞を回収し，DNAを抽出後，2.1でLi分離培養方法の検討

Li分離培養は既報

３，４）

効果の高い抗生剤の検討に従い，McCoy細胞を用いて行い，一部改変した。McCoy細胞の培養には Dulbeccoʼs modified Eagleʼs minimal essential
medium High Glucose（Wako, Osaka, Japan）に検討した方法によりLiゲノムDNAの定量を行った。
３．結果と考察

10％牛胎児血清を加えた培地を使用した。Li陽性

リアルタイムPCRによるLiゲノムDNAの定量

腸管サンプルの乳剤を作製し，McCoy細胞を用系を確立することができた。検量線を解析した結いて乳剤中に存在するLiの分離培養を試みた。分

果，コントロールプラスミドにおいて，10２コピー© The Ito Foundation

347

豚増殖性腸炎による可食部位の廃棄防止に向けた適正な抗生物質使用方法の検討

が 検 出 限 界 で あ っ た 。以 後 使 用 す る Li ゲ ノ ム

海外の株とは性質が異なる可能性がある。

DNAの定量では10 コピー未満の検出は検出限界

Liの増殖効率は悪いものの，感染は成立してい２たため，抗生剤の効果を上記の感染系を用いてin以下とすることとした。

vitroで検証した。最終的には最終発育阻止濃度は，間接蛍光抗体法によりLiの感染を確認するこを求める必要があるが，今回は海外の報告５）を参とができた（Fig.１）。一方，LiゲノムDNAの定考に，効果の有無を判定する最大の濃度として使量において，非感染細胞（mock）では検出限界

用されていた128μg/mlの濃度での検証を行った。

以下であったのと比較して，０dpiではゲノム

また，使用した抗生剤も前述の文献と同様のもの

DNAが検出され，感染が成立していることが確を使用した。抗生剤を添加していないLi感染細胞認された。しかしながら，０hpiと４dpiではほとをコントロールとし，コントロールのLiの増殖効

んど差が認められず，今回の培養条件ではLiの増率を１とした時のLiゲノムDNA相対値をグラフ

殖効率が悪いことが示唆された（Fig.２）。また，にした（Fig.３）。カルバドックスとリンコマイ

上清中からはほとんどLiゲノムDNAが検出されシンにおいては増殖効率がコントロール群よりもず，Liは細胞外に放出されていないことが示され高く，効果がないことが示唆された。その他のタた。すなわち，間接蛍光抗体法の結果および，リ

イロシン，チアムリン，クロルテトラサイクリン，

アルタイムPCRによるゲノムDNA定量の結果よ

バルネムリンに関しては増殖効率が抗生剤非添加

り，Li感染腸管サンプルからのMcCoy細胞によ群よりも低く，効果のある可能性が示唆された。

るLi分離には成功したが，培養にはさらなる条件

海外の報告と比較すると，リンコマイシンの効検討が必要であることが示唆された。海外のLi株

果がないことは一致したものの，カルバドックス

に関しては同様の分離培養法でLiの増殖が確認さについては海外の株は比較的低濃度でも効果が認れているものの，日本における分離株での増幅効

められていたため，株間で抗生物質に対する感受率の良い培養方法の報告はないため，日本の株は性の差がある可能性が示唆された。抗生剤に対す

Copy numbers of Li genome / µL

2.2の方法によるMcCoy細胞へのLi感染実験で

3000
2500
2000
1500
1000
500
0

Fig. 1 McCoy cells were infected with 10％

suspension of Li-infected intestine. After 6hours post infection, cells were fixed by
4％ paraformaldehyde and indirect
fluorescent assay using anti-Li antibody
was performed. Arrowheads（green
fluorescence）indicate Li．

mock

0d

intracellular

4d

mock

0d

4d

extracellularFig. 2 McCoy cells were infected with 10％ suspension of

Li-infected intestine. After 0 and 4 days post infection,
cells and supernatants were collected separately.
Quantitative real-time PCR assay was performed tomeasure the Li genome DNA．

© The Ito Foundation

Relative copy numbers of Li genome348

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

1.4

４．要

1.2

約

1

近年増加傾向にある豚増殖性腸炎は偏性細胞内0.8

寄生細菌であるLawsonia intracellularis（Li）に0.6

よって引き起こされる。可食部位である腸管の廃0.4

棄や増体率の現象など，潜在的な経済被害の大き0.2
0contral carvadox tylosin tiamulin

chlor valnemulin lincomycin
tetracycline

Fig. 3 McCoy cells were infected with 10％ suspensionof Li-infected intestine. After adsorption, eachantibiotic was added to the medium at theconcentration of 128μl/ml. After 4 days post
infection, quantitative real-time PCR assay was
performed to measure the Li genome DNA. The
relative Li genome copy numbers of 4 dpi werenormalized to the copy numbers of 0 dpi andcontrol．

い疾病である。本研究では，Liによる増殖性腸炎を制御するために効果的な抗生剤をin vitroで検証することを目的とし，in vitroでのLi培養方法の検討および，適正な抗生剤の検証を行った。日本の豚から分離したLi株は既報での培養方法では増殖効率が悪く，詳細な検討は難しかった。しかしながら，抗生剤の効果の検証では，海外の株では効果の認められた抗生剤の効果が日本の株では認められないなど，株間での差異を認めることがる感受性を検討するという本研究の必要性が実証できた。今後，培養方法を検討し，より詳細な検された。また，馬から分離されたLiを用いた抗生討を行っていくことで，in vitroでの適正な抗生剤の感受性試験のデータも報告されている が，剤評価が可能になると考えられる。

６）

本研究で使用した抗生剤とは異なっていたため，同様の抗生剤の効果を検証することで，豚から分離されたLiと馬から分離されたLiの性状を比較することができる可能性がある。
日本でLiによる増殖性腸炎の治療を行う場合
は，チアムリンやタイロシンが使用されることが多いが，それらに対する効果はin vitroでも認めることができた（Fig.３）。今回の実験では高濃度での検証しか行わなかったが，カルバドック
ス，チアムリン，バルネムリンでは細胞毒性も観察されていたため，正確な評価はできていなかった可能性もある。今後，LiのMcCoy細胞での増殖効率を上げることや，より低濃度の抗生剤の効果を検証し最小発育阻止濃度などを算出していく必要がある。また，より効果的な抗生剤を検証していくとともに，別の農場で分離されたLiに関しても検証をしていくことも必要である。

文
献１）
 農林水産省：家畜に使用される抗菌性物質に対する農林水産省のリスク管理措置，平成29年３月27日．
http://www.maff.go.jp/j/syouan/tikusui/yakuzi/
attach/pdf/koukinzai-9.pdf
２）
 Draskovica, V., Bosnjak-Neumullerb, J.,
Vasiljevicb, M., Petrujkicc, B., Aleksicd, N., Kukolje,
V., Stanimirovica, Z.：Influence of phytogenic feed
additive on Lawsonia intracellularis infection inpigs, Preventive Veterinary Medicine，151，46～51，
2018．
３）
 Guedes, R. M. C., Gebhart, C. J.：Preparation andcharacterization of polyclonal and monoclonal
antibodies against Lawsonia intracellularis, Journalof Veterinary Diagnostic Investigation ， 15 ， 438 ～
446，2003．
４）
 Watarai, M., Yoshiya, M., Sato, A., Furuoka, H.：
Cultivation and Characterization of Lawsonia
intracellularis Isolated from Rabbit and Pig, Journalof Veterinary Medical Science ， 70 ， 731 ～ 733 ，
2008．
５）
 Wattanaphansak, S., Singer, R. S., Gebhart, C. J.：in vitro antimicrobial activity against 10 North
American and European Lawsonia intracellularis
isolates, Veterinary Microbiology，134，305～310，© The Ito Foundation

豚増殖性腸炎による可食部位の廃棄防止に向けた適正な抗生物質使用方法の検討2009．
６） Pereira, C. E. R., Resende, T. P., Vasquez, E.,
Marshall-lund, L., Guedes, R. M. C., Gebhart, C. J.：
In vitro antimicrobial activity against equine
Lawsonia intracellularis strains, Equine Veterinary
Journal, doi：10.1111，2019．

© The Ito Foundation

349

350

南九州におけるPRRSウイルス変異株の地理的分布
および病理学的解析
Geographical distribution and pathological analysis of PRRS virus variants
in southern Kyushu

平

井

卓

哉

（宮崎大学農学部）

Takuya Hirai（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Geographical distribution of different strains of PRRS virus was investigated in thesouthern Kyushu, Japan. In addition, comparative pathological analysis of lung lesions due todifferent strains was examined in this area. Totally 253 samples were collected from 46 farms
in Miyazaki, Kagoshima and Kumamoto prefectures. To detect the ORF5, extracted RNA wasused for nested RT-PCR and samples of 23 farms were provided for sequence analysis. Thelung samples were examined by histopathology and immunohistochemistry（IHC）using Iba-1
antibody. PRRS virus strains which belonged to the cluster IV were detected in 17/23（74％）
farms. In contrast, cluster II strains were confirmed in 10/23（43％）farms. Most of them wererelated vaccine strain. In addition, cluster I strain was also identified in the Kagoshima
prefecture. Histopathologically, lung lesions consisted of infiltration of macrophages into
alveolar septa and alveolar sacs and type II pneumocyte hyperplasia. Macrophages in thecluster IV samples were mainly accumulated in the alveolar septa, whereas macrophages in
the cluster II samples were wildly distributed in the alveolar sacs. This study revealed that
PRRS virus strains which belonged to the cluster IV are wildly distributed in southern Kyushu.
The same virus strains of cluster IV were detected in the several farms. From these data,swine movement, transport vehicles and people movement are risk factors of PRRS entry tofarm. In addition, the distribution of the macrophages may indicate different pathogenesis of
PRRS virus strains, which need more investigation．

１．目

されている。このため，養豚業界における呼吸器的病対策は最も重要な課題になっている。本症は

豚呼吸器複合感染症は，豚繁殖・呼吸障害症候

PRRSウイルスが主となり，上記の複数の病原体群（PRRS）ウイルスを基本に，豚インフルエン

が複雑に関与し，子豚に間質性肺炎を引き起こ

ザウイルス，豚呼吸器コロナウイルス，豚サーコ

す。本ウイルスの遺伝子変異は高頻度に起こり，ウイルスなどのウイルスの他，各種細菌の重感染

異なる型のウイルスに暴露された場合，再び感染により起こり，推定損失額は年間280億円と報告する。遺伝子変異が起こりやすい領域はウイルス© The Ito Foundation

南九州におけるPRRSウイルス変異株の地理的分布および病理学的解析

351

表 面 糖 タ ン パ ク 質 GP ５ を コ ー ド す る Openた。

Reading Frame 5（ORF5）で，この領域がウイ

2.2

ルス株の解析に用いられている。多数の変異株が豚呼吸器複合感染症で発育不良を示した豚もし存在し，日本で検出される株は５つのクラスター

くは死亡した豚の肺を採材後，前記2.1でPRRSウに分類されている。クラスターⅣには北米強毒株

イルスの感染を調べた。その後，ダイレクトシー

が属し，他のクラスターが属する株と比較して，クエンス法にてウイルス遺伝子型の分類されるク

病原性が高いとの報告もある。

ラスターを明らかにした。クラスターⅣに分類さ

病理組織学的検査

PRRSウイルスの拡散経路として，車両（家畜れる遺伝子型の肺炎の病理学的特徴を調べ，クラ運搬車，飼料運搬車および糞尿運搬車），PRRS

スターⅡに属するウイルス株の肺炎像と比較・検ウイルス陽性豚および陽性豚の精液の導入などが討した。また，ウイルスの標的細胞であるマクロ

あげられている。南九州のウイルス株およびそれファージを検出するIba-１抗体を用いて，免疫組

らの地理的分布は報告されておらず，バイオセ

織化学的検査を実施した。

キュリティに対する意識が低く，車両消毒体制の整備されていない農場が散見される。このため，他地区から異なる型のウイルスが侵入し，経済的被害を大きくしている。本研究の目的は，南九州

３．結果と考察3 . 1 PRRSウイルス遺伝子型の解析，クラス
ター分類およびそれらの地理的分布におけるPRRSウイルス遺伝子型の地理的分布を宮崎県県西地区の24農場128検体の内，シーク明らかにすることである。また，遺伝子型によるエンス解析できた検体は15農場64検体であった。

肺病変の相違についても検討する。

また，宮崎県県央，県西および県南地区の６農場

２．方62検体の内，シークエンス解析できたのは４農場法

33検体であった。鹿児島県の５農場20検体の内，

2 . 1 PRRSウイルス遺伝子型の解析，クラス

シークエンス解析できたのは２農場４検体であった。熊本県６農場43検体の内，シークエンス解析

ター分類およびそれらの地理的分布
宮崎県県西地区の26農場から128検体，県央，できたのは２農場２検体であった。本研究に供し

県西および県南地区の６農場から62検体を採取した41農場253検体中，シークエンス解析できたサ

た。サンプルは，子豚の血液や鼻腔スワブ，死亡

ンプルは23農場103検体であった。

子豚の肺，流産胎子とした。鹿児島県については

宮崎県で検出されたクラスターⅣのウイルス株

５農場20検体，熊本県については６農場43検体をは19農場の内16農場（約84％）であった（Fig.

同様に採取した。上記の３県で合計43農場253検１，２）。県西地区のＡ農場，Ｂ農場およびＫ農場

体を採材した。市販のキットを用いてRNAを抽のウイルス株では塩基配列の相同性が98％以上

出し，PRRSウイルスのORF5を増幅するプライで，同一のウイルス株と考えられた。また，Ｃ農マーを用いたRT-PCRを行い，増幅された遺伝子場およびＫ農場のウイルス株，Ｈ農場，Ｉ農場お断片についてダイレクトシークエンス法により得

よびＯ農場のウイルス株においても塩基配列の相られた塩基配列情報を既知のデータと比較した

１，

同性が98％以上で，同一のウイルス株と判断し

２）。さらに，各農場の代表的な株を用いて分子系た。さらに県西地区のＤ農場と県央地区のＱ農場

統樹を作成し，各株をクラスターⅠ～Ⅴに分類しおよびＲ農場のウイルス株も同一のウイルス株で© The Ito Foundation

352

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）
P (IV)Q (II & IV)

A (II & IV)
B (IV)R (IV)C (IV)
D (IV)E (II & IV)
F (II)G (II)I (IV)H (IV)J (IV)K (II & IV)

L (II)O (IV)M (II & IV)
N (II & IV)
S (IV)

Fig. 1 Geographical distribution of PRRS virus in Miyazaki prefectureduring 2018 and 2019. The parenthesis indicates PRRSV cluster．

あった。県央地区のＱ農場と県北地区のＰ農場ので検出されたウイルス株を除いた７農場のウイル

ウイルス株も同一であった。これらのことから，

ス株はワクチン近似株であった。Ｑ農場で検出さ陽性豚の導入，車両の往来，人の移動などによりれた２種類のウイルス株は，ワクチン株との塩基他農場から侵入した可能性が推察された。

配列の相同性が低く，野外株と推測された。

Ｋ農場では，４月に検出されたＫ Ｐ18-602，

熊本県で検出されたウイルス株は２種類で，そ10月に検出されたＫ Ｐ18-420，12月に検出されれぞれクラスターⅡ（野外株）とクラスターⅣにたＫ Ｐ18-655のウイルス株は塩基配列の相同性分類された。一方，鹿児島県で検出されたウイルが低く，異なるウイルス株と考えられた（Fig.

ス株は２種類で，それぞれクラスターⅠとクラス

２）。すなわち，Ｋ農場では１年間に異なるウイ

ターⅡ（ワクチン近似株）に分類された。クラス

ルス株が３株農場内に侵入したことになる。農場

タ―Ⅳに分類されたウイルス株は，宮崎県で検出侵入防止のため，防疫体制を徹底する必要がある。

された株との相同性が低かった。

宮崎県で検出されたクラスターⅡのウイルス株

以前は，クラスターⅠは中国・九州地方で多いは19農場の内８農場（約42％）であった。Ｑ農場と報告されてきた３）。しかし，今回の調査では，© The Ito Foundation

南九州におけるPRRSウイルス変異株の地理的分布および病理学的解析
Jfs1
Jst1
Jib1
EDRD-1
Chiba 14
Kitasato 93-1
Jyt1
Jyt3
EDRD-8
Jsz2
Aomori 93
Jeh1
Gu922M
Jiw1
Jiw2
Shizuoka08-1
Jsa1
Jsz3
Ibaraki 3
Jtg1
Jnt1
Aomori08-1
Ibaraki08-3
Saga08-1
Ibaraki08-1
Ibaraki08-2
Yamagata08-1
Miyagi08-2
Miyagi08-3
Ibaraki08-6
Ibaraki08-4
Ibaraki08-5
Jyn1
Jos1
LMY
Jam2
Q P18-19
T P18-719
Jyt2
CNA18
YL8
Osaka08-1
Osaka08-2
Q P18-398
MLV RespPRRS/Repr
BJ-4
ML2
Miyagi08-1
VR2332Kochi08-1
V P18-712
V P18-714
JXA1
Prime Pac
Aichi N20
Kyoto 93
Jis1
Jsi1
Jis2
Jyc1
Nagasaki 93
Kagoshima N14
J P18-515
K P18-655
K P18-657
C P19-81
A P18-182
K P18-420
K P18-608
B P19-46
K P18-602
L 2018-2232-3
M S1880
S P18-675
O P19-30
O P19-31
I P19-65
H P19-69
E P18-503
PRRSV0000008558
Jpn5-37
MN184A
Quebec 807/94
IAF-EXP91
U P18-690
N S1884
Q P18-393
P P18-745
R P18-440
Q P18-400
Q P18-619
R P18-665
D P19-78

353

Cluster III

Cluster V

87.5%

96.92%

Cluster II

99%

Cluster I

83.85%
99.5%
98-99 %

83.91 %
93.25 %
90.84 %
98-100 %77.46 %

Cluster IV

92.11 %
99.31 %
98-100 %Fig. 2 Phylogenic tree of NA-type PRRS virus ORF5 nucleotide sequence．

クラスターⅠに分類されるウイルス株は鹿児島県であり，今後の課題と思われる。

の１農場でしか検出されず，宮崎県ではクラス

3.2

ターⅣに分類されるウイルス株が多勢を占めた。

今回，クラスターⅣに分類されるウイルス株とウイルス株の調査に関して，個人情報の絡みがあクラスターⅡに属するワクチン近似株との肺病変

り，検体の収集が難しかった。どの地区にどのよを比較した。クラスターⅣに属するウイルス株でうなウイルス株が存在するかが分かれば，どこかは，剖検時にも明らかな肺炎が認められたが，ワら侵入したかを検証でき，今後の農場防疫に役立

クチン近似株の肉眼的な肺病変は軽度であった。

てることができる。すなわち，他地区からの侵入

両方のウイルス株において病理組織学的に間質性を予測し，未然に防ぐことができる。検体の収集

肺炎を認めた。クラスターⅣに分類されたウイルに関しては，養豚関係者や獣医師の協力が不可欠

ス株の病変では，主に肺胞壁にマクロファージが© The Ito Foundation

病理学的検査354

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Fig. 3 Interstitial pneumoniae．

a Lung of cluster IV PRRS virus strain. Note infiltration of macrophages in thealveolar septa. HE．

b L ung of cluster IV PRRS virus strain. Note infiltration of Iba-1 positive

macrophages in the alveolar septa. IHC．

c Lung of cluster II PRRS virus strain. Note infiltration of macrophages in thealveolar sacs. HE．

d L ung of cluster II PRRS virus strain. Note infiltration of Iba-1 positive

macrophages in the alveolar sacs. IHC．

多数検出され，マクロファージのマーカーである

肺については10％中性緩衝ホルマリン固定後，定Iba-１に陽性を示した（Fig.３）。一方，クラス法に従ってパラフィン包埋し，HE染色標本を作

ターⅡに分類されるウイルス株の病変では，主に製した。また，Iba-１抗体を用いた免疫組織学的

肺胞腔内にマクロファージが多数認められ，Iba-

検査でマクロファージの局在を調べた。46農場の１に陽性を示した。今後，症例数を増やし，ウイ

内，シークエンス解析できた農場は23農場であっルス遺伝子陽性細胞を両者で比較・検討する予定た。これらの農場の内，クラスターⅣに分類されである。

たウイルス株は17農場（74％）であった。また，

４．要

同一のウイルス株が複数の農場で検出された。一約方，クラスターⅡに属するウイルス株は10農場

本研究の目的は，南九州におけるPRRSウイル（43％）であり，そのほとんどがワクチン近似株

ス遺伝子型の地理的分布を明らかにすることであであった。クラスターⅠのウイルス株は１農場でり，ウイルス株による肺病変の相違も病理学的にあった。肺の病理組織学的検査にて，肺胞壁や肺検討した。2018年１月～2019年２月にかけて宮崎

胞腔内へのマクロファージ浸潤およびⅡ型肺胞上県，鹿児島県および熊本県における46農場の豚の皮細胞の増生が認められた。免疫組織化学的検査

血液・肺などを採取した。これらのサンプルからにて，肺胞腔および肺胞壁のマクロファージはRNAを抽出後，RT-PCR法によるPRRSウイルス

Iba-１で陽性を示した。クラスターⅣに属するウの検出およびORF5遺伝子の増幅を行った。また，

イルス株は肺胞壁に，クラスターⅡのウイルス株© The Ito Foundation

南九州におけるPRRSウイルス変異株の地理的分布および病理学的解析

は肺胞腔内に分布する傾向がみられた。本研究から，南九州においてクラスターⅣに属するウイルス株が多いことが明らかになった。また，同一のウイルス株が複数の農場に存在していたことより，豚の導入，車両の往来，ヒトの移動などが農場防疫に重要と考えられた。ウイルス株により，

355

文
献
１）
 Takagi, M.：Proc.Jpn.Pig Vet. Soc., 63 ， 1 ～ 5 ，2014．
２）
 Iseki, H., Takagi, M., Miyazaki, A., Katsuda, K.,
Mikami, O., Tsunemitsu, H.：Microbiol Immunol，
55（3），211～６，2011．
３）
 Yoshii, M., Kaku, Y., Murakami, Y., Shimizu, M.,
Kato, K., Ikeda, H.：Arch Virol，150（11），2313～
24，2005．

肺病変部のマクロファージの分布に相違がみられ，今後さらなる研究が必要である。

© The Ito Foundation

356

北海道の肉用牛における牛ウイルス性下痢症の疫学調査
Epidemiological study of bovine viral diarrhea in beef cattle in Hokkaido

磯

田

典

和１・迫

田

義

博２

（１北海道大学人獣共通感染症リサーチセンター，２北海道大学大学院獣医学研究院）

Norikazu Isoda１ and Yoshihiro Sakoda２（１Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University, ２Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University）

Bovine Viral Diarrhea （BVD） is a chronic disease of cattle prevalent worldwide.
Transmission of BVD virus（BVDV）to the fetus of pregnant cattle would cause abortion, or
induce fetal immune tolerance to BVDV and resulting in the delivery of persistently infected
calves（PI）. This vertical transmission results in huge economic losses to the livestock industry.
In the present study, In order to reveal the epidemiology of BVD among beef cattle, a total of
829 serum samples were collected from 22 beef cattle farms in Hokkaido Prefecture and were
investigated for presence of antibodies against BVDV. It is revealed that 20.0％ of the animals
investigated possessed antibodies against neither BVDV type-1 or type-2（95％CI：
18.6％-21.4％）. There are no significant differences between the negative rate for antibodies
against BVDVs among non-vaccinated farms（24.4％，95％CI：22.7％-26.1％）and that among
animals fed at farms with unknown-vaccination history（19.2％，95％CI：16.5％-22.0％）.
Furthermore, significant association is found between the presence or absence of antibodies
against BVDV, and ages of animals investigated, however, both of these are also associatedwith the status of vaccination（non-vaccination or unknown）, independently. In the present
study, it is concluded that approximately 80％ of the beef cattle are positive for antibodies
against BVDV, which is independently from the vaccination status, but significantly andindependently associated with age of animals. These results would indicate that, in Hokkaido,
the BVDV are prevalent among the beef cattle population as well. We need to promote thebasic control measures, including delivery of adequate knowledge of BVD for beef cattle
farmers, development of vaccination program, and effective test scheme to transferred animals,for BVD even for beef cattle population in which there are few numbers of BVD cases
reported.

疫学的特徴として，妊娠時に母牛がBVDVに感染

１．背景と目的

すると，ウイルスが経胎盤感染し胎子の死流産お牛ウイルス性下痢症（BVD）は主に牛で発生よび発育遅延を引き起こすことから，本疾病は畜す る 慢 性 消 耗 性 疾 患 で あ り ，BVD ウ イ ル ス

産分野では生産性に密接に関与する重大な疾病で（BVDV）感染によって引き起こされる。BVDのある１～３）。BVDVに感染した胎子は胎齢により，© The Ito Foundation

北海道の肉用牛における牛ウイルス性下痢症の疫学調査

BVDVに対して免疫寛容となり，ウイルスに感染したまま持続感染牛（PI）として分娩されることがある。PIの多くは発育障害を引き起こし生産性357

有率を算出すべく，疫学調査を実施した。
２．方法に影響を与えるが，それ以上にPIの全身から終生

2.1

調査対象集団の選定

BVDVを分泌することよって牛群の汚染源とな

北海道庁を通して道内各家畜保健衛生所にお願り ，新 た な PI を 産 み 出 す こ と が よ り 深 刻 で あいし，全道で合計22の肉用牛飼育農場から血清材

る３，４）。このように牛の生産性を著しく減退させ料を集め，それらを本調査に用いた。材料提供をる本疾病への対策では欧州の一部ではすでに進め受けた22農場のうち，６農場はワクチン接種未実

ら れ て お り ，2000 年 代 初 頭 で は 北 欧 諸 国 で は施の農場であり，その他16農場でのワクチン接種

BVD感染抗体陽性牛の摘発淘汰により，本疾病に関する情報は不明であった。

の根絶に成功している。その一方で，アメリカや

2.2

材料収集

他の欧州諸国では依然として本疾病の対策に追わ

材料由来農場について精査を行った結果，最終れている。日本でも平成29年度は222件406頭の発的に９振興局22農場から得られた829頭の血清材生が報告されており，流行が終息する兆しは見え

料を本試験に供した。

ていない。日本におけるBVDの制御方策はPIの2.3

血清材料からの抗BVD抗体の検出

早期摘発および淘汰であるが，感染牛を減少する

採取した血清サンプルを56℃で30分加熱し，血清中に含まれる補体成分を非働化させた。細胞培ためのワクチン接種も推奨されている。
申請者らは現在まで，確率論的疾病モデルによ養用96穴プレート上で，非働化済み血清をウマ血るリスク評価により，ワクチン接種率および公共

清添加MEM培地を用いて10倍階段希釈し，その牧場の使用がPI数の推移に多大に影響することを血清250μlと50％培養細胞感染濃度の200倍濃度報告した 。また，決定木解析を用い，ワクチンの指示ウイルス液とを等量混合させた。混合液を接種およびバルク乳を用いた集団モニタリングの37℃にて１時間で反応させた後，牛胎子筋肉初代

有効性，およびこれら疾病対策の有効性はウイル

培養細胞のトリプシン消化浮遊液を各穴に50μl

ス浸潤率にも影響されることを報告した 。しか添加し，37℃にて３日間培養した。指示ウイルス

し，これらの報告は既存の乳用牛に関するBVDの細胞変性効果を指標とし，中和を示した血清のの疫学データを基づいて構築した疾病モデルによ最大希釈の逆数を中和抗体価とした。本試験にてるものであり，日本の肉用牛におけるBVD浸潤

用 い た 指 示 ウ イ ル ス に は ，抗 原 性 の 異 な る

状況について信頼のおけるデータが存在しないこ

BVDV- １ 型 の 標 準 株 で あ る BVDV/Nose-CPとから，現時点では肉用牛におけるBVD制御対（Nose 株）お よ び BVDV- ２ 型 の BVDV/KZ-91-

策の評価を実施することが非常に困難である。

CP（KZ株）を用いた。

５）

６）

そこで，本研究では，日本における肉用牛群中

2.4

統計検定

のBVDVの浸潤状況を明らかにするために，肉用試験に供した全893検体のNose株およびKZ株

牛の抗BVD抗体陽性率を算出するための疫学調に対する抗体価，血清採取時の被検動物の月齢，査を実施することを目的とした。代表研究者は現およびワクチン接種履歴の項目について統計検定

在まで北海道庁と共同研究を実施していた経緯か（カイ２乗検定，フィッシャーの正確検定およびら，北海道の肉用牛群における抗BVD抗体の保ウィルコクソンの順位和検定）を行った。統計解© The Ito Foundation

358

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

析ソフトとしてEZR（バージョン1.27）を用いた。

採取した22の農家では，材料採取当時合計3,197
頭の肉用牛が飼育されていたことから，これら22

３．結果と考察

農家での動物当たり抗体陰性率の（95％信頼区間試験に供した829検体のうち，Nose株に対するは18.6％-21.4％となった。

抗体を有していないのは187検体，KZ株に対する試験に供した829検体について，ワクチン接種

抗体を有していないのは352検体であった（Table

履歴について区分すると，ワクチン接種未実施が１）。Nose株およびKZ株どちらに対する抗体も

６農場127検体（飼育頭数合計：781頭）およびワ

有していないのは166株であった。我々の今まで

クチン接種履歴不明が16農場702検体（飼育頭数の研究結果より，BVDV１型と２型では抗体反応

合計：2,416頭）であった。それぞれのタイプの抗では若干の交差性が確認されていることから，こ

体陰性率は，ワクチン接種未実施で24.4％（95％の166検体を抗体陰性材料とした７）。血清材料を

信頼区間：22.7％-26.1％）およびワクチン接種履

Table 1 Number of animals categorized by antibody presence against each of two bovine viral diarrhea virus strain in

the 22 beef cattle farms.

A total of 829 serum samples of beef cattle in 22 farms were investigated for presence of antibody against BVDV/

Nose-CP and BVDV-KZ-91-CP strain. The numbers of animals in each farm were counted according to thecategorization of the antibody titer combinations.
No. of animals antibody positive to two strains（%）

Farm
ID

Vaccineinjection

No. ofanimals
investigated

No. of animals
fed at sample
correction

A

Unknown

17

25

9（52.9）2（11.8）3（17.6）3（17.6）17

B

Unknown31

80

2（6.5）

0（0.0）

5（16.1）24（77.4）

31

C

Unknown

1850

1（5.6）

2（11.1）0（0.0）

15（83.3）

18

E

Unknown

37

45

15（40.5）0（0.0）

0（0.0）

22（59.5）

37

F

Unknown

63

600

15（23.8）5（7.9）

15（23.8）28（44.4）

63

G

Unknown

39

193

21（53.8）0（0.0）

3（7.7）

15（38.5）

39

H

Unknown24

93

3（12.5）0（0.0）

16（66.7）

5（20.8）24

I

Unknown48

170

2（4.2）

0（0.0）

11（22.9）35（72.9）

48

J

Unknown25

84

1（4.0）

0（0.0）

10（40.0）14（56.0）

25

K

Unknown

13

67

11（84.6）0（0.0）

0（0.0）

2（15.4）

13

L

Unknown

18

83

2（11.1）0（0.0）

10（55.6）

6（33.3）

18

M

Unknown

12

57

12（100.0）0（0.0）

0（0.0）

0（0.0）

12

N

Unknown

11

52

5（45.5）0（0.0）

3（27.3）3（27.3）

11

O

Unknown

30

297

22（73.3）0（0.0）

0（0.0）

8（26.7）30

T

Unknown

222

400

8（3.6）

2（0.9）

50（22.5）

162（73.0）

222

U

Unknown
Subtotalα-Nose
α-KZ

-

+

+
-

+
+

Total

94

120

6（6.4）

9（9.6）

17（18.1）

62（66.0）

94

702

2,416

135（19.2）20（2.8）143（20.4）404（57.5）

702

D

No

99

127

25（25.3）1（1.0）

38（38.4）

35（35.4）

99

P

No

5

240

2（40.0）0（0.0）

2（40.0）1（20.0）

5

Q

No

5

36

0（0.0）

0（0.0）

0（0.0）

5（100.0）

5

R

No

5

190

0（0.0）

0（0.0）

3（60.0）2（40.0）

5

S

No

10

180

2（20.0）0（0.0）

0（0.0）

8（80.0）

10

V

No

3

8

2（66.7）0（0.0）

0（0.0）

1（33.3）

3

Subtotal

127781

31（24.4）

1（0.8）

43（33.9）52（40.9）

127

Total

829

3,197

166（20.0）21（2.5）186（22.4）456（55.0）

829© The Ito Foundation

359

北海道の肉用牛における牛ウイルス性下痢症の疫学調査

歴不明で19.2％（95％信頼区間：16.5％-22.0％）（ウィルコクソンの順位和検定：ｐ値＜0.001）。

となった。これら２つのタイプの農場における抗このことから，BVDVに対する抗体の陽性および体陰性率を比較したところ，有意差は認められな

陰性は，その検査動物の月齢に関連しており，若かった（カイ２乗検定：ｐ値＝0.135）。よって，齢の動物ほどBVDVに対する抗体が陰性である傾ワクチン接種履歴によらず，試験に供した肉用牛向があることが示唆された。次に，ワクチン未接のBVDVに対する抗体陰性率は20.0％前後である種動物とワクチン接種履歴不明動物それぞれにつと結論づけられた。

いて，BVDVに対する抗体陽性および陰性動物の次にBVDVに対する抗体陽性もしくは陰性率お月齢分布を比較したところ，ワクチン接種未実施

よびワクチン接種未実施もしくは接種履歴不明に動物においても（ウィルコクソンの順位和検定：

ついて，被検動物の血清採取時の月齢で比較しｐ値＜0.001），ワクチン接種履歴不明動物においた。６月齢ごとの抗体陽性もしくは陰性の分布，て も（ウ ィ ル コ ク ソ ン の 順 位 和 検 定：ｐ 値 ＜およびワクチン接種未実施もしくは接種履歴不明

0.001），抗体陰性動物の月齢平均は抗体陽性動物の分布はFig.１のとおりである。BVDVに対するの月齢平均よりも有意に若かった。また，ワクチ

抗体陽性もしくは陰性に区分し，月齢分布につい

ン接種状況で区分しても，被検動物の月齢分布にて比較したところ，抗体陰性動物の月齢平均は抗ついては２群に有意な差が確認され（ワクチン接体陽性動物の月齢平均よりも有意に若かった

種未実施vsワクチン接種履歴不明：ウィルコク

70
60

No. of animals

50
40
30
20
10
0

1-6

13-1 825-3 037-4 249-5 461-6 6

73-7 885-9 0 97-1 02

109 114121 126

Monthly age of animals
Negative (unknown vac. history)

Negative (No vac.)

133 138

145 150

157 162

Negative (unknown vac. history)

169 174

181 186

193 198

Positive (No vac.)

Fig. 1 Age distribution of animals according to presence of antibody against BVDV.

Each of animals was sorted according to the age at sample collection and categorized every six-month-old. In eachcategory, animals were further distinguished by presence or absence of antibody against BVDV and by thevaccination history. Light blue bar；negative of antibody against BVD with unknown vaccination history, deep
blue bar；negative of antibody against BVD with no vaccination history, light red bar；positive of antibody against
BVD with unknown vaccination history, deep red bar；positive of antibody against BVD with no vaccination
history.

© The Ito Foundation

360

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ソ ン の 順 位 和 検 定 ： ｐ 値 ＜ 0.001），そ れ ら がしている牛の慢性弛緩である。妊娠牛の胎子へのBVDVに対する抗体陽性群および陰性群で区分しBVDウイルス感染は流産や，胎子にBVDウイルても，両群で有意差は確認された（ウィルコクソ

スに対する免疫寛容を引き起こし，持続感染牛をンの順位和検定：ｐ値＝0.004およびｐ値＜0.001）

分娩させる。この垂直感染は畜産業界に多大な経ことから，BVDVに対する抗体の有無およびワク

済的被害をもたらす。本研究では，肉用牛群におチン接種履歴は被検動物の月齢に関連はあるが，けるBVDVの疫学を明らかにするために，北海道

それらは交絡することなく，互いに独立な要因と内の22の肉用牛飼育農家から829頭の血清材料をなっていることが予想される。

採取し，BVDVに対する抗体価の有無を調べた。

上記統計解析結果より，ワクチン接種履歴が不調査した20.0％（95％信頼区間：18.6%-21.4％）

明な動物集団ではワクチン接種未実施動物集団との動物は１型および２型に対する抗体を有してい比較して有意にBVDVに対する抗体が高いことがないことが明らかとなった。ワクチン非接種農場

棄却されていることから，ワクチン接種が実施さの牛におけるBVDウイルスに対する抗体の陰性れていない集団（未実施および不明集団）では，率（24.4％，95％信頼区間：22.7％-26.1％）とワ

BVDVに対する抗体を有していない動物はわずか

クチン接種履歴不明の農場の牛におけるBVDウ

20％程度にとどまることが示唆された。これは，イルスに対する抗体の陰性率（19.2％，95％信頼2004年から2006年にかけて，226頭の黒毛和種の区間：16.5％-22.0％）の間で有意な差は認められ

抗BVDV抗体価を測定したところ，80.7％が抗体なかった。さらに，BVDVに対する抗体の有無と，陽性であった結果とほぼ一致していると言えよ

被検動物の月齢にも有意な相関は確認されたが，

う８）。さらに，Nose株とKZ株の両株に対して高これら両者はワクチン接種状況とは独立した要因

い抗体価（100以上）を示す動物は14.9％となっであることも示唆された。本研究では約80％の肉た。これらのことから，肉用牛群からのPI摘発数

用牛BVDウイルスに対する抗体が陽性であり，は多くはないが，これら群内でもBVDVが循環しこれはワクチン接種状況とは独立であり，かつ，ている証拠であり，乳用牛同様に肉用牛に対して被検動物の月齢には独立であるが相関があると結もBVD対策の積極的推進が望まれる。

論づけられた。これらの結果から，北海道におけ本研究で調査に供した検体数は829頭であり，る肉用牛群においてもBVDVが流行していること

決して少なくはないと思われる。しかしながら，が 示 唆 さ れ た 。我 々 は ，肉 用 牛 農 家 に 対 す る

ワクチン接種未実施が確認できたのはわずか６農

BVDの正しい知識の普及，ワクチンプログラム

場にとどまり，検定結果からワクチン接種状況にの樹立，および移動牛に対する有効な検査計画な

よるBVDVに対する抗体保有率に有意差が認めら

ど，少数のBVD陽性牛のみが報告されている集

れないことは確認はされたが，ワクチン接種を確団にもそのような基礎的な対策を進める必要があ

実に実施していない農場の選定およびその農場内る。

でのBVDVに対する抗体価の測定を継続し，より正確なデータを集める必要がある。
４．要

約

牛ウイルス性下痢症（BVD）は世界中で流行

文献１） illespie, J. H., Baker, J. A., Mc, E. K.：Cornell Vet.
50, 73～79, 1960.
２） Hessman, B. E., Fulton, R. W., Sjeklocha, D. B.,
Murphy, T. A., Ridpath, J. F., Payton, M. E.：Am. J.

© The Ito Foundation

北海道の肉用牛における牛ウイルス性下痢症の疫学調査
Vet. Res., 70, 73～85, 2009.
３） Houe, H.：Vet. Microbiol., 64, 89～107, 1999.
４） Niskanen, R., Lindberg, A., Traven, M.：Vet. J.,
163, 251～259, 2002.
５） Sekiguchi, S., Presi, P., Omori, R., Staerk, K.,
Schuppers, M., Isoda, N., Yoshikawa, Y., Umemura,T., Nakayama, H., Fujii, Y., Sakoda, Y.：Transbound.
Emerg. Dis., 65, e135-e144, 2018.
６） Isoda, N., Asano, A., Ichijo, M., Wakamori, S.,
Ohno, H., Sato, K., Okamoto, H., Nakao, S., Kato, H.,
Saito, K., Ito, N., Usui, A., Takayama, H., Sakoda, Y.：

361

J. Vet. Med. Sci., 79, 1172～1181, 2017.
７） Abe, Y., Tamura, T., Torii, S., Wakamori, S.,
Nagai, M., Mitsuhashi, K., Mine, J., Fujimoto, Y.,
Nagashima, N., Yoshino, F., Sugita, Y., Nomura, T.,
Okamatsu, M., Kida, H., Sakoda, Y. J.：Vet. Med. Sci.,
78, 61～70, 2016.
８） Minami, F., Nagai, M., Ito, M., Matsuda, T., Takai,
H., Jinkawa, Y., Shimano, T., Hayashi, M., Seki, Y.,
Sakoda, Y., Sugiura, K., Akashi, H.：Comp. Immunol.
Microbiol. Infect. Dis., 34, 35～39, 2011.

© The Ito Foundation

362

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅱ）
Comprehensive analysis of the behavior of Campylobacter and coexistentbacteria in chicken food chain（Ⅱ）

黒木

香澄・吾郷

良輔・竹下

奈知子・仁田義弘・門屋亨介＊・関崎勉（東京大学大学院農学生命科学研究科食の安全研究センター， 現所属：椙山女学園大学生活科学部管理栄養学科）＊

Kasumi Kuroki, Ryosuke Ago, Nachiko Takeshita, Yoshihiro Nitta, Ryosuke Kadoya＊ and Tsutomu Sekizaki（Research Center for Food Safety, Graduate School of Agricultural Life Science, The University of Tokyo，＊present affiliation：Department of Human Nutrition, School of Life Studies, Sugiyama Jogakuen University）

Campylobacteriosis is a serious bacterial food-borne disease mainly caused byCampylobacter jejuni and C. coli which are microaerophilic bacteria. The colonization ofCampylobacter in the chicken intestine occurring on broiler farms induces the bacterial
contamination to chicken meat throughout the food chain from farm to fork. In the previous
study, we showed that the bacterial composition of chicken meat was different at each store,
and the contamination of Campylobacter in processing factories or stores was suggested. We
also found that the abundance ratio of Pseudomonas was more than 30％ and dominant in the
microbiota of chicken meat. Since other studies suggested that Pseudomonas would help
Campylobacter to survive for long periods outside the host, chicken meat would be suitable forthe survival of Campylobacter under the atmospheric oxygen tension. In this study, we
compared the bacterial population structure on chicken meat for each store in detail, andestimated the contamination routes of Campylobacter from the comparison of bacterial types
existing on chicken meat and liver. First, a total of 69 packed chicken products were tested bynested PCR combined with an enrichment culture, with 72％ of the products found to be
Campylobacter-positive. As a result of 16S rRNA gene-based metagenomic analysis, thebacterial composition of chicken meat was different at each store regardless of the purchasedate and poultry producing area, and Pseudomonas and Staphylococcus was found in each store
B and C as a characteristic bacterial genus. Also, the bacterial composition was different
between liver and meat as our previous study has shown. Furthermore, some bacteria existingin chicken intestines such as Clostridium cluster XI and Lachnospiraceae were detected fromall liver samples and a part of Campylobacter-positive meat, and those samples were clustered
the same group by a cluster analysis based on unweighted Unifrac distances. From the results,
Campylobacter was suggested to contaminate liver and chicken meat via contents of chicken
intestine. Finally, linear discriminant analysis（LDA）effect size revealed that Carnobacterium
was the most characteristic in Campylobacter-positive meat. Since this bacterial genus is
known to cause putrefaction of foods and not to be detected from chicken intestine, itsuggested to have contaminated chicken meat via some tools or hands of workers. These© The Ito Foundation

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅱ）

363

results strongly suggest that cross-contamination occurred in not only slaughterhouses but
also retail stores and processing factories.

１．目類を追加し，小売店内での本菌汚染の実態とその的経路を明らかにすることを目的とした。また，大カンピロバクターは細菌性食中毒の主要な原因

気中で長期生存が困難な微好気性細菌である本菌菌であり，下痢や嘔吐などを引き起こす。さらに，が消費者に喫食されるまでの期間を鶏肉表面で生本菌に感染した場合には一定の割合で致死的な症存し続ける機序はいまだ不明である。昨年度の研状を呈するギラン・バレー症候群を発症すること

究助成課題で我々は鶏肉上には本菌の大気中でのからも，食卓の安全を確保するうえで本菌の汚染生存を助けるPseudomonas属細菌が多く存在す

防止は喫緊の課題である。本菌はヒトにおいて前ること，鶏肉表面は多種類の細菌によって細菌叢述の症状を呈する一方で，鶏の腸管内には無症候が構成されていること，Helicobacter属などが鶏的に定着し，養鶏場での飼育段階で感染すること

腸管内からカンピロバクターと挙動を共にしていが多くの調査により明らかにされている。申請者

る可能性を明らかにした。本研究では引き続き，らの先行研究では養鶏場ごとに本菌の汚染状態が鶏肉表面の細菌叢の構成細菌を網羅的に調べるこ

異なることや，同一養鶏場においても時期によっとによって，小売店における本菌の動態を調べるて汚染状況が異なることが示されており，本菌のとともに，本菌の挙動に関連していると考えられ汚染源や汚染経路を同定することで養鶏場での鶏るPseudomonas属やHelicobacter属など他の細菌への汚染防止策を提示できると考えている。しか群との相互関係を明らかにし，将来的には小売店しながら，もし仮に養鶏場の段階で本菌の汚染をでの鶏肉への本菌汚染防止法の提案や鶏肉上の本完全に排除できたとしても，現状では，養鶏場で菌排除方法の開発を目指す。

本菌に汚染された鶏が多数出荷されているため，
食鳥処理場や加工場での鶏肉への汚染を完全に防２．方法

ぐことは難しい。さらに，平成29年度研究助成課

2.1

実験材料

題「鶏肉フードチェーンにおけるカンビロバク

東京都の小売店３店舗（A，B，C）で鶏肉をターと共存する細菌の網羅的な挙動解析」で申請購入した。部位はムネ（ｎ＝30），モモ（ｎ＝30），

者らは，小売店で販売されていた鶏肉の75％が本

レバー（ｎ＝９）の３種類とした。

菌に汚染されており，加工場や店舗でも本菌の汚2.2

染が拡大する可能性を明らかにした。したがっ購入した鶏肉を125ｇ量り取り，ストマッカーて，小売店での鶏肉加工などの作業中の汚染を防袋に移した。ただし，125ｇに満たない鶏肉は全除できれば，より安全な鶏肉を消費者に提供する量を用いた。ストマッカー袋に滅菌生理食塩水をことができ，商品価値を高めることにも繋がると100ml入れ，袋越しに手で鶏肉を30秒揉んだ後の考えられる。しかしながら昨年度の調査は対象店

生理食塩水を試料として収集した。ストマッカー

舗数や検体数が十分とは言えず，小売店内での汚を使用せず，手で鶏肉を揉んだ理由としては，機染の実態を詳細に把握することまではできなかっ械操作による本菌の死滅があげられる。収集したた。そこで本研究では店舗数と検体数，検体の種

試料は5000×ｇで５分間遠心した後，上清を捨© The Ito Foundation

試料調整

364

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）て，沈渣を含む５mlの試料を以降の実験（2.3増ウ ェ ア Quantitative Insights Into Microbial

菌培養と2.4 16S rRNAメタゲノム解析）に使用

３）
Ecology（QIIME）
およびＲ言語 ４）を用いて精した。

査した。統計学的処理として，データの正規性を

2 . 3 増菌培養とnested PCR法によるカンピロ

Ｒ言語を用いてShapiro-Wilk検定で判断した。
データが正規分布に従っていた場合は，等分散性バクター遺伝子の検出
Bolton培地（Oxoid）が10ml入った３本の試験管に2.2で調製した試料を１mlずつ分注し，アネ
ロパック・微好気（三菱ガス化学）と角型ジャーをＦ検定あるいはBartlett検定で判断した。
３．結果と考察（三菱ガス化学）による微好気条件の下42℃で483.1

時間培養した。培地を遠心後に得られた沈殿物を

鶏肉中のカンピロバクターを増菌培養とnested

滅菌生理食塩水で洗浄後，フェノール・クロロホ

PCRを組み合わせた方法で検出したところ，72％

ルム抽出法を用いてDNAを抽出し，C. jejuniまからカンピロバクターの遺伝子が検出された

たはC. coliの遺伝子が存在するかをnested PCR（Table１，２）。昨年度の成績では75％の汚染率

法 で確認した。プライマー配列とPCR条件は以だったことから，店舗A，B，Cで販売される鶏前の報告に従った４）。Nested PCRの結果，３本肉は恒常的にカンピロバクターに汚染されているの試験管中１本でも陽性であれば，元の鶏肉はカことが示唆された。またC. coliよりもC. jejuniのンピロバクターに汚染されていると判定した。

検出率が高く，これまでの報告と一致していた。

１）

2.4

市販鶏肉からのカンピロバクター検出率

さらにC. jejuniの検出率はレバーで100％であり，16S rRNAメタゲノム解析

2.2で調整した試料のうち200μlをDNAの分解

ムネ肉よりモモ肉から高頻度に検出された。カン抑 制 作 用 の あ る 溶 液 RNAlater Stabilizing

ピロバクターの鶏肉への汚染は食鳥処理の際の腸Solution（Thermo Fisher Scientific）1 ml 中 に 入

管内容物の汚染が主な原因と考えられており，モれ，DNA抽出を行うまで－20℃の冷凍庫に保管

モ肉の方が汚染されやすいことが示唆された。

し た 。試 料 を 滅 菌 生 理 食 塩 水 で 洗 浄 後 ，PowerBiofilm DNA Isolation Kit（QIAGEN）をⓇ

3 . 2 16S rRNAメタゲノム解析による鶏肉中の構成細菌の同定

用いてDNAを抽出した。ただし，細胞破砕に利

3.2.1

主要な構成細菌用するビーズをより破砕力の強いジルコニアビー

前年度の研究成果と同様に精肉とレバーでは構ズ （Toray） に 換 え ， 破 砕 力 の 強 い Beads

成細菌が大きく異なっており，Pseudomonas属

Crusher μT-12（TAITEC）を用いて作業を行うはモモ肉とムネ肉で約50％の存在率を占める主要

ことで，DNAの抽出効率を高めた。

な構成細菌だったのに対してレバーでの存在率は抽 出 し た DNA に お け る 16S rRNA 遺 伝 子 の約10％だった。またレバーではモモ肉やムネ肉のV3-V4領域を，PCR法で増幅し，高速シーケン

ように特定の細菌が細菌叢を占有することはな

サーMiSeq（Illumina）を用いて塩基配列を決定

く，Lactococcus属，Lactobacillus属，Aeromonas

した。決定した塩基配列は16S rRNAメタゲノム

属，Lachnospiraceae科など多数の細菌が10％程度

解析用のパイプラインIM-TORNADOを用いずつ存在していた。モモ肉とムネ肉での存在率がた処理に供した。また，各試料に存在する構成細１％以下で，レバーでの存在率が１％以上だった菌やその比率，試料間の関連性などを，ソフト

Lactobacillus属，Corynebacterium属，Enterococcus

２）© The Ito Foundation

365

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅱ）
Table 1 Percentages of Campylobacter-positive chicken products in retail stores.
C. jejuni
NumbertestedNumberpositive% positive

Numberpositive

A

10

8

80

B
C

10
10

6
10

60
100

Part

Store

Thigh

BreastLiver

Campylobacterspp.

C. coli% positive% positive

0

0

80

3
0

30
0

60
100

Total

30

24

80

3

10

80

A

10

8

80

0

0

80

B

10

2

20

4

60

50

C

10

4

40

0

0

40

Total

30

14

47

4

13

57

A
C

5
4

5
4

100
100

4
0

4
0

100
100

Total

9

9

100

4

44

100

69

47

68

11

16

72

Total

Table 2 Details of chicken samples used in this study.
Store Date

Area of productionPart

Sample ID Campylobacter spp.

Store Date

Area of productionPart

Sample ID Campylobacter spp.

A

Japan

Breast

A1-1
A1-2

＋
＋

Ｂ

Japan

Thigh

B6-1

－

A1-3

＋

B6-2

－

A2-1

＋

A2-2
A2-3
A2-4

＋
＋
＋

B7-1
B7-2
B7-3

－
＋
＋

A3

＋

B8-1
B8-2

－
－

A4
A5

－
－

B9-1

＋

B9-2

＋

B10

＋

A6-1
A6-2

－
＋

C1-1

＋

A6-3
A6-4

＋
＋

C1-2

＋

C2-1

＋

A6-5
A6-6
A7

＋
＋
－

C2-2

＋

C3-1

＋

C3-2

＋

A8-1
A8-2
A8-3

＋
＋
＋

C4-1

－

C4-2

＋

C4-3

－

A9-1

＋

C4-4

＋

A9-2

＋

C5-1

＋

A9-3

＋

C5-2

－

A9-4

＋

C5-3

－

C5-4

－

C5-5

＋

C5-6

－

C6-1

＋

C6-2

＋

C7-1

＋

C7-2

＋

C8-1

＋

C8-2

＋

C8-3

＋

C9

＋

18/12/2017

Thigh

Aomori Prefecture
19/6/2018

Japan

Thigh
BreastThigh

24/8/2018

B

Japan

Liver

28/9/2018

Japan

Liver

A10

＋

19/12/2017

Japan

Thigh

B1-1
B1-2
B1-3
B2
B3

＋
＋
－
－
＋

B4-1
B4-2
B4-3
B4-4
B5

－
－
＋
＋
＋

Breast29/8/2018

Breast28/9/2018C

24/12/2017

Japan

Japan
Iwate Prefecture

Thigh

Thigh
Thigh

Breast20/8/2018

Japan

BreastThigh

24/8/2018

28/9/2018© The Ito Foundation

Japan

Japan

Liver

Liver

366

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

属は鶏腸管の細菌叢で主要な細菌として知られて較すると，特にＢ店でPseudomonas属の存在率いる 。食鳥処理場では内臓と，と体に分けて処が高かった（Fig.１）。Ｂ店は店舗の規模が小さ理が行われるため６），内臓に分類されるレバーはいことや商品ラベルの加工者欄に外部の工場名がモモ肉やムネ肉よりも腸管からの汚染を受けやす記載されていたことから，切り分けやパッケージ

く，腸管内の主要な細菌がレバーにも多く存在しング等の加工を店舗のバックヤードではなく工場ていたと考えられた。また，モモ肉とムネ肉の構で行っていると思われる。Pseudomonas属の細成細菌の存在率を店舗ごとに平均化したものを比菌は腐敗菌として広く食肉に存在していることが

５）

100

17

17
90

80

1413
12
11
10
9
8
7

Relative abundance（%）

16

10

3
2

6
70

17

16
15
10
9
4

5

9

4
60

8

3

7
50

5
4

2

3
40

2

1

30
1
1

20

10

0

Shop A

Shop B

2 Acinetobacter
1 Pseudomonas
6 Photobacterium
5 Psychorobacter
9 Enterobacteriaceae＊ 10 Staphylococcus
14 Chryseobacterium
13 Micrococcaceae＊
17 others

3 Janthinobacterium
7 Brochothrix
11 Shewanella
15 Aeromonas

Fig. 1 The bacterial composition in chicken meat（thigh and breast）at the genus level.

Shop C
4 Carnobacterium
8 Kocua
12 Dermacoccus
16 Buttiauxella

Sixteen bacterial genera are shown as the predominant taxa（＞１％）, ＊These taxa were unclassifiable at thegenus level.

© The Ito Foundation

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅱ）

367

知られており７），Ｂ店の鶏肉では加工後，店舗で叢に存在することが知られていることから９，10），販売されるまでに時間を要したことからクラスター８に属する検体，つまりすべてのレPseudomonas属が増加したと示唆された。また，

バーと一部のムネ肉やモモ肉が腸管からの汚染をＣ店の鶏肉にはStaphylococcus属が高率で存在し受けたことが示唆された。加えて，クラスター８ており（Fig.１），Staphylococcus属と推定されたの検体はすべてカンピロバクターに汚染されていOTUの中で最も存在率が高かったOTUの配列をた こ と か ら ，カ ン ピ ロ バ ク タ ー が Clostridium

Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）

cluster XI，Lachnospiraceae等の鶏腸管に存在すによる相同性解析に供したところStaphylococcus

る細菌とともに鶏肉に移行したことが推測され

saprophyticus と 高 い 一 致 率 を 示 し た（Identity

た。食鳥処理場にて冷却や内臓摘出による微生物

99％）。本菌は尿路感染症の原因菌の一つで，食汚染の制御を行っているにもかかわらず，腸内容品や環境中からも分離されることが知られてい物の流出等によるカンピロバクター汚染が生じてる 。Ｃ店では８ヶ月の期間を隔てて２回鶏肉をいることは以前より指摘されてきた６）。上述の成購入したが，購入日や肉の産地に関わらず，いず績から，食鳥処理場で生じた汚染が小売店まで持れの肉もS. saprophyticusに汚染されていたこと続している可能性が示された。また，クラスター

から，店舗のバックヤードに本菌が常在して鶏肉８やその近縁のクラスターに分類された検体以外を汚染していると示唆された。ただし，OTUはにもカンピロバクター汚染は生じていた。つま97％の相同性を持つ配列をまとめたものであり，り，鶏腸管から受けた汚染の程度が比較的低いとOTUの代表配列を用いたBLAST解析では菌種の推測される検体でも鶏肉にカンピロバクター汚染

推定にとどまる。菌種の同定のためには，菌分離が生じていたことが示唆される。これらの検体はをして性状を確認するなど他の手法が必要である

食鳥処理や加工場，小売店のバックヤードの器具点を留意しなければならない。

や肉を扱う人の手，すでに汚染された肉製品など

８）

3.2.2

階層クラスター解析から間接的にカンピロバクターの汚染を受けたと各構成細菌の類似性を調べるためUnweighted
Unifrac距離に基づくクラスター解析を行った結考えられた。
3 . 2 . 3 Linear discriminant analysis（LDA）

果，69個の全検体は13のクラスターに分類された

effect size（LEfSe）解析（Fig.２）。すべてのレバーはクラスター８に分類

Unweighted Unifrac距離に基づく解析はOTU

され，クラスター８の全検体がカンピロバクターの種類のみを考慮しており，細菌叢内での存在率陽性だった（Fig.２）。Unweighted UniFrac距離までは考慮できない。一方で，Linear discriminant

はOTUの種類にもとづいたものでOTUの存在率

analysis（LDA）effect size（LEfSe）解析はOTU

は考慮されない。レバーとクラスター８に分類さの存在率も考慮して群間の有意差を比較することれた精肉には，類似した種類の細菌が存在していが可能であり，本解析でカンピロバクター陽性検

た こ と が 示 さ れ た 。ク ラ ス タ ー ８ に 特 徴 的 な体に有意に多いとされた細菌はカンピロバクター

OTU，つまりクラスター８の検体に普遍的に存の生存に影響を与えている可能性がある。モモ肉

在し他の検体では存在することが少ないOTUにとムネ肉の検体を用いてLEfSe解析を行ったとこ

は Clostridium cluster XI ，Lachnospiraceae 等 とろ，陽性検体に有意に多く存在する細菌として推定されるものがあった。これらは鶏の腸内細菌

Lactobacillus属，Corynebacterium属が検出され© The Ito Foundation

368

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）
B8-1
B10
B3
A5
B8-2
B7-1
B6-1
B9-1
B6-2
B9-2
B7-2
B7-3
B4-1
B4-2
B4-3
B4-4
C4-1
C4-2
C4-3
C4-4
C2-1
C3-1
C6-1
C6-2
C5-1
C5-2
C5-3
C5-4
A6-1
A6-2
A6-3
A6-4
C7-1
C7-2
A9-4
A8-1
A8-2
A8-3
C8-1
C8-2
C8-3
C9
B5
A10
A9-1
A9-2
A9-3
C3-2
A3
C2-2
C1-1
C1-2
A1-1
A1-2
A1-3
A2-1
A4
A2-2
A2-3
A2-4
B1-1
B1-2
B1-3
B2
C5-5
C5-6
A7
A6-5
A6-6

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

1
2
3
4

5

6

7

8

9

10

11
12
13

0.0

Fig. 2 All samples were clustered into 13 groups based on unweighted UniFrac distances.
O pen and filled circle means each Campylobacter-negative and Campylobacter-

positive.

た（Fig.３）。これらは鶏腸管の細菌叢で主要なロバクター陰性検体の多くからは検出されなかっ細菌属として知られていることから ，カンピロ

た こ と か ら も ， Lactobacillus 属 ，バクター陽性検体は鶏腸内容物の汚染の影響を大Corynebacterium 属 は 鶏 腸 管 か ら カ ン ピ ロ バ ク

きく受けていたことが考えられた。また，カンピ

ターとともに移行したことが示唆された。一方で５）© The Ito Foundation

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅱ）

369

Carnobacterium
Staphylococcus
Lactobacillus
Lactococcus
Brachybacterium
Dermacoccus
Brevibacterium
Acinetobacter
Brevibacterium
Corynebacterium
Arthrobacter
Corynebacterium
Microbacteriaceae*
Sphingobacterium
Dermacoccus
Enterobacteriaceae*
0

1

2
LDA score（log 10）

3

4

Fig. 3 Linear discriminant analysis（LDA）effect size（LEfSe）identified the most differentially abundant bacteria at

the genus level between Campylobacter-positive and -negative chicken（LDA score＞2, p＜0.05）.

Campylobacter-positive chicken-enriched bacteria are indicated with black bars. ＊ These taxa were unclassifiable at

the genus level.

最もLDA scoreが大きかったCarnobacterium属

することが認められている13）。食肉に添加する微は肉や魚などの食品に存在し，食品を腐敗させる

生物製剤として安全に利用するためにも，同じ食ことで知られる11）。また，鳥類や哺乳類の腸管か肉上に存在する病原微生物であるカンピロバクらの分離報告がないことから，本菌は鶏腸内容物

ターとの関連性は詳細に評価すべきだろう。まを介さない経路で鶏肉上に移行したと考えられた，前年度の研究ではカンピロバクター陽性の鶏た。これはLactobacillus属，Corynebacterium属

肉 に 特 徴 的 な 細 菌 と し て Helicobacter 属 やがカンピロバクター陽性検体のみ存在しているのKocuria属が検出されたが，今回の解析では検出に対し，Carnobacterium属は陰性検体も含めたされなかった。肉の細菌叢は環境や扱われ方に鶏肉に共通して存在していたことからも考えられよって変化するものであり，解析に供した検体にた。またCarnobacterium属は食品上で低温下でよって異なる特徴的な細菌が検出されるのは当然

も代謝産物を生産することから，鶏肉が低温で保のことと考えられる。反対に，前年度と今年度の持されている状態でも代謝産物を介してカンピロ

解析で共通してカンピロバクター陽性の鶏肉に特バクターと何らかの関連を生じる可能性もある。

徴的な細菌として検出されたLactobacillus属やCarnobacterium属はListeria monocytogenesの発Arthrobacter属は鶏肉に普遍的に存在し，カンピ育を阻害することでも知られており12），実際にカロバクターの生存に影響している可能性が考えら

ナダでは一部の株が保存料として食肉製品に使用れた。

© The Ito Foundation

370
４．要

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

約増菌培養とnested PCR法を組み合わせて鶏肉のカンピロバクター汚染率を調査した結果，72％の鶏肉に汚染が認められた。また16S rRNAメタ
ゲ ノ ム 解 析 に よ り ，モ モ 肉 と ム ネ 肉 で は
Pseudomonas属が構成細菌の約半数を占めていた の に 対 し ， レ バ ー で は Lactococcus 属 とLactobacillus属をはじめとする多様な細菌が存在することが分かった。また，Ｂ店ではPseudomonas
属，Ｃ店ではStaphylococcus属の存在率が高いな
ど，店舗ごとに構成細菌の特徴に違いがみられた。さらに，その特徴は購入時期や産地に左右されないことから，店舗や加工場に常在する細菌が鶏肉に継続的に交差汚染していることが示唆された。またUnweighted UniFrac距離に基づいたクラスター解析により，カンピロバクター汚染肉の中にはレバーと類似した細菌叢をもつものがあることが分かった。それらはレバーと同様に鶏の腸管に存在するClostridium cluster XIやLachnospiraceaeに汚染されていた。またLEfSe解析の結果，カン
ピロバクターに汚染されている肉に特徴的な細菌としてCarnobacterium属が検出された。本菌が鶏腸管から分離されたという報告はないことから，腸内容物からの汚染とは違う経路で鶏肉を汚染しカンピロバクターの生存に関与している可能性が示唆された。
文
献１） Inglis, G. D., Kalischuk, L. D.：Use of PCR for
direct detection of Campylobacter species in bovine
feces, Applied and environmental microbiology, 69,
3435～3447, 2003.
２） Jeraldo, P., Kalari, K., Chen, X., Bhavsar, J.,
Mangalam, A., White, B., Nelson, H., Kocher, J., Chia,
N.：IM-TORNADO：a tool for comparison of 16S
reads from paired-end libraries, PLoS One, 9,e114804, 2014.
３） Caporaso, J. G., Kuczynski, J., Stombaugh, J.,

Bittinger, K., Bushman, F. D., Costello, E. K., Fierer,N., Pena, A, G., Goodrich, J, K., Gordon, J, I., Huttley,
G, A., Kelley, S, T., Knights, D., Koenig, J, E., Ley, R,
E., Lozupone, C, A., Donald, D, M., Muegge, B, D.,
Pirrung, M., Reeder, J., Sevinsky, J, R., Turnbaugh, P,
J., Walters, W, A., Widmann, J., Yatsunenko, T.,
Zaneveld, J., Knight, R.：QIIME allows analysis ofhigh-throughput community sequencing data,
Nature methods, 7, 335～336, 2010.
４） Ihaka, R., Gentleman, R.：R：a language for data
analysis and graphics, Journal of computational andgraphical statistics, 5, 299～314, 1996.
５） Xiao, Y., Xiang, Y., Zhou, W., Chen, J., Li, K., Yang,
H.：Microbial community mapping in intestinal tractof broiler chicken, Poultry Science, 96, 1387～93, 2017.
６） 三澤尚明：食鳥処理場におけるカンピロバクター
制御法の現状と課題，日本獣医師会雑誌，65，617～
23，2012.
７） Ayres, J. C.：The Relationship of Organisms of
the Genus Pseudomonas To the Spoilage of Meat,
Poultry and Eggs, Journal of Applied Bacteriology,
23, 471～86, 1960.
８） Raz, R., Colodner, R., Kunin, C. M.：Who are you Staphylococcus saprophyticus? Clinical Infectious
Diseases, 40, 896～８, 2005.
９） Mohd Shaufi, M. A., Sieo, C. C., Chong, C. W.,
Gan, H. M., Ho, Y. W.：Deciphering chicken gut
microbial dynamics based on high-throughput 16SrRNA metagenomics analyses, Gut Pathogens, 7, 4,
2015.
10） Apajalahti, J., Vienola, K.：Interaction between
chicken intestinal microbiota and protein digestion,
Animal Feed Science and Technology, 221, 323 ～ 30,2016.
11） Leisner, J. J., Laursen, B. G., Prévost, H., Drider, D.,
Dalgaard, P.：Carnobacterium：positive andnegative effects in the environment and in foods,
FEMS Microbiology Reviews, 31, 592～613, 2007.
12） Duffes, F., Leroi, F., Boyaval, P., Xavier, D.：
Inhibition of Listeria strains in a simulated cold
smoked fish system stored at 4℃, International
Journal of Food Microbiology, 47, 33～42, 1999.
13） Health Canada [Internet]. Notice of Modification
to the List of Permitted Preservatives to Enable theUse of Carnobacterium maltaromaticum CB1 as an
Antimicrobial Preservative in Certain Meat andPoultry Meat Products Reference Number：NOM/
ADM-0097.［cited 2018 Nov 27］. Available from：：
https://www.canada.ca/en/health-canada/services/
food-nutrition/public-involvement-partnerships/
notice-modification-list-permitted-preservativesenable-use-carnobacterium-maltaromaticum-cb1antimicrobial-preservative-certain-meat-poultrymeat.html© The Ito Foundation

371

野鳥が媒介する家畜のボツリヌス症の分子疫学的解析
Molecular epidemiological analysis of wild bird-mediated botulism inlivestock

阪

口

義

彦

（北里大学医学部微生物学）

Yoshihiko Sakaguchi（Department of Microbiology, Kitasato University School of Medicine）

Clostridium botulinum produces the botulinum neurotoxin（BoNT）that causes botulism, aneuroparalytic disease. The potentially lethal toxin causes a range of pathology in humans andanimals. C. botulinum is conventionally classified into seven serotypes A to G based on theantigenicity of BoNT. Among these serotypes, C. botulinum types C and D cause animal
botulism. This study aimed to evaluate the possibility that wild birds such as crows may
mediate C. botulinum transmission to domesticated cattle. Samples were collected from
diseased wild birds and from cattle and their rearing environment in eight Japanese
prefectures to try to isolate C. botulinum. From this sampling, 19 strains could be isolated ofwhich 19 were confirmed to be C. botulinum by detection of the BoNT/C and BoNT/D genes（bont/C and bont/D）using polymerase chain reaction（PCR）, determination of the nucleotide
sequence of the bont/C and bont/D, and examination of the lethality of these strains in mice.
Next, typing analysis of the genomic DNA of these 19 strains of C. botulinum type D using
pulse-field gel electrophoresis（PFGE）was performed which produced seven band patterns. C.
botulinum strains isolated from crows and cattle in the same prefecture showed the same
PFGE pattern, suggesting that crows may mediate C. botulinum type D strain transmission to
cattle. For a full risk assessment in future, it will be necessary to analyze a larger sample.

１．目ス毒素）を産生し，ヒト，家畜に重篤な感染症

的（ボツリヌス症）を引き起こす。家畜のボツリヌ

当研究課題は，国内で飼育される牛等の家畜のス症は，ボツリヌス菌またはボツリヌス毒素が混ボツリヌス症において，カラス等の野鳥がボツリ入した飼料や水を摂取することに起因し，世界中ヌス菌を媒介するリスクを分子疫学の観点から評で発症が確認されている。農場で飼料，水等を介価を行うことを目的としている。ボツリヌス菌

してボツリヌス症の集団発生が起きると，生産者

は，グラム陽性の偏性嫌気性菌で芽胞を形成し，への経済的な損失や消費者の食の安全に対する不土壌や河川，湖沼など自然界に広く分布してい安感を助長させる。したがって，農場におけるボる。本菌は，きわめて強力な神経毒素（ボツリヌ

ツリヌス菌の感染制御は重要な課題である。ボツ© The Ito Foundation

372

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

リヌス菌は，産生するボツリヌス毒素の抗原性のミート培地に接種し，30℃で，４日間，嫌気培養

違いにより，Ａ～Ｇ型菌に分類されている。そのを 行 っ た 。培 養 し た 菌 に つ い て ，Polymerase

中で，牛には主にＤ型菌がボツリヌス症を引き起chain reaction（PCR）法によりＣ型およびＤ型

こすことが知られる。興味深いことに，野鳥，特ボツリヌス毒素遺伝子の有無を調べた。コントにカラスの糞便からボツリヌス菌が分離される

ロール菌株として，４菌株（CTL01，CTL02，

が，カラス自身には発症しない。このことから，

CTL03，CTL04）を使用した。また，菌の培養生産現場である農場において，カラスが媒介動物

上清を用いて，マウスによるバイオアッセイ（毒となって，ボツリヌス菌を地理的に離れた農場間性試験）を行った。

に伝播する可能性が考えられるが，これまでのと

2.2

ころ科学的根拠は報告されていない。牛のボツリ

分離した種々のボツリヌス菌をクックドミート

ヌス症の原因となるＤ型ボツリヌス毒素遺伝子培地で培養し，DNA精製キットを用いて菌体かは，バクテリオファージ（ファージ）により，近らDNAを精製した。精製したDNAを鋳型として，縁菌間において伝達されている。本研究課題Ｃ型またはＤ型ボツリヌス毒素遺伝子に特異的なでは，家畜と野鳥のボツリヌス症由来菌株の分子プライマー対１）を作製しPCRを行った（94℃，１分

疫学的解析を行った。具体的には，ボツリヌス症

間，55℃，１分間，72℃，１分間，25サイクル）。ポの罹患牛およびカラスを含む野鳥の糞便から分離

ジティブコントロールとして，Ｃ型およびＤ型ボツ

されたボツリヌス菌株のゲノムに対しファージ領リヌス菌の16S rRNA遺伝子に特異的なプライマー

域を含めて遺伝学的解析を行い，その比較解析に

対（bot16S-F：GAGAGTTTGATCCTGGCTCAGG，

より野鳥から家畜へのボツリヌス菌の伝播の可能

bot16S-R：AAGGAGGTGATCCAACCGCAGG）

性について検討した。本研究成果は，野鳥の防除を作製し，本プライマー対を用いて16S rRNA遺が家畜のボツリヌス症の感染制御に有用である伝子を増幅させた。PCR後の反応液について，

か，科学的な証明を試みるものである。

２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い，泳

２．方
2.1

１～３）

ボツリヌス毒素遺伝子の検出

動後のアガロースゲルを臭化エチジウムで染色法

し，目的のサイズにDNAバンドが検出されるこ

ボツリヌス菌の分離とを確認した。得られたPCR産物を精製し，シー

本研究では，2004～2016年に日本の８県で，ボツリヌス症の疑いのあるカラス等の野鳥や牛等のケンス解析によりボツリヌス毒素遺伝子の毒素型を判定した。

罹患動物または飼育環境から得た57試料を用い

2.3て，ボツリヌス症の原因菌であるボツリヌス菌の分離した種々のボツリヌス菌をクックドミート

分離を試みた。カラスまたは牛の消化管内容物や培地で培養し，４℃，8,000rpm，20分間遠心した。

糞便を加熱処理（60℃，15分間または80℃，30分

その上清を0.2％ゼラチン-PBS（phosphate buffered間）し，クックドミート培地，血液寒天培地また

saline）（－）で ２ 倍 あ る い は 10 倍 段 階 希 釈 し たは卵黄寒天培地に接種し，30℃で４～７日間，嫌後，マウスの腹腔内に投与し，24時間後マウスの気培養を行った。血液寒天培地では厚みが薄く，生死を判定した。

毒性試験

rough型溶血環を示すコロニー，卵黄寒天培地で2.4は真珠層を形成するコロニーをそれぞれクックド

分離した種々のボツリヌス菌をブレインハート© The Ito Foundation

ボツリヌス菌のPFGE解析

野鳥が媒介する家畜のボツリヌス症の分子疫学的解析

373

インフュージョン（BHI）培地に接種し，37℃で管内容物から１菌株，野鳥の糞便から１菌株，牛一晩嫌気培養した。培養液を４℃，8,000rpm，から13菌株を分離することができた。

20分間遠心し，上清を除去した。沈渣をPBS
（－）

3.2

で懸濁し，その懸濁液を低融点アガロースと混和

通常，ボツリヌス毒素は，軽鎖（Lc）と重鎖

し，プラグを調整した 。プラグは２mg/mlリゾ（Hc）から構成されており，Ｃ型ボツリヌス毒素

チームで，37℃，16時間処理し溶菌させた。そのはＣ型のLc（C-Lc）とＣ型のHc（C-Hc），D型ボ

後，１mg/mlプロテナーゼＫで50℃，18時間処理

ツリヌス 毒素はＤ型 のLc（D-Lc）とＤ型 のHc

し，タンパク質を分解した。さらに，プラグを１mM（D-Hc）からなる。Lcは酵素活性に，Hcはボツ

phenylmethylsulfonyl fluoride（PMSF）で50℃，

リヌス毒素の細胞内への移行およびレセプターへ

１時 間 処 理 し ，制 限 酵素Nru Ⅰ，SacⅡまたはの結合に関わっている。まずは，C-Lc遺伝子にXhoⅠで37℃，一晩反応させDNAを切断した。

特異的なプライマー対を作製し１），分離した19ボ

CHEF MAPPER（Bio Rad）を用いて，種々の制ツリヌス菌株のDNAについてPolymerase chain

限酵素で処理したプラグについてパルスフィール

reaction（PCR）を行ったところ，すべての菌株

ドゲル電気泳動（pulsed-field gel electrophoresis：

においてPCR産物が得られなかった（Table１）。

PFGE）を行った。泳動条件は，６Ｖ/cm，パル

そこで，D-Lc遺伝子に特異的なプライマー対をス角度120度，５～20秒間，20.18時間で行った 。

作製し１），同じ菌株について調べたところ，いずDNAサイズマーカーは，ラムダラダーを使用しれ の 菌 株 に お い て も PCR 産 物 が 認 め ら れ た

た。PFGE後のアガロースゲルを臭化エチジウム（Table１）。牛および鶏などのボツリヌス症からで染色し，DNAバンドパターンを確認した。得分離されるＣ型およびＤ型ボツリヌス菌においてられたPFGEパターンを菌株ごとに比較することは ，C-Lc と D-Hc（C/D），D-Lc と C-Hc（D/C）

によって，被験菌株のゲノムDNAの型別を行った。

のボツリヌス毒素（モザイク毒素またはキメラ毒

本研究は，北里大学，大阪府立大学，宮崎大学，

素）遺伝子を有することが報告されている４）。そ国立感染症研究所，麻布大学および岡山大学の他

こで，モザイク毒素遺伝子を検出する目的で，19

施設共同研究により行った。本研究での二種病原菌株のC-HcとD-Hcの遺伝子に特異的なプライ体の取り扱いについては，二種病原体等取扱施設

マー対を作製しPCRを行ったところ，すべての菌として厚生労働省の承認を得た大阪府立大学で実株においてDNAバンドが検出された（Table１）。

験を行った。

これらの結果から，分離した19菌株はD/C型毒素

１）４）

遺伝子を有している可能性が考えられた。

３．結果と考察
3.1

ボツリヌス毒素遺伝子の検出

3.3

ボツリヌス菌の分離

ボツリヌス毒素遺伝子の塩基配列の決定

PCRによりD-Lc遺伝子が陽性を示した19菌株

日本の８県で，ボツリヌス症の疑いのある，１）カに お い て ，得 ら れ た PCR 産 物 の 塩 基 配 列 が ，ラス等の野鳥や牛等の罹患動物の消化管内容物，

D-Lc遺伝子のものであるかを確認するため，

２）飼育環境から採取した餌，わら，水，土，植PCR産物の塩基配列の決定を行った。その結果，物を含む57試料から，ボツリヌス症の原因菌であすべての菌株においてD-Lc遺伝子の塩基配列でるボツリヌス菌の分離を試みたところ，19菌株をあった。また，モザイク毒素（D/C型）の保有が分離することができた。この中で，カラスの消化疑われた７菌株についてもシーケンス解析を行っ© The Ito Foundation

374

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 Detection of botulinum neurotoxin genes in C. botulinum types C and D.
PCRStrainLocation

Origin

C-Lc

D-Lc

C-Hc

D-Hc

Type

CTL01

Unknown

Unknown

＋

－

＋

－

C/C

CTL02
CTL03

Unknown
Unknown

Unknown
Unknown

－
＋

＋
－

－
－

＋
＋

D/D
C/D

CTL04

Unknown

Unknown

－

＋

＋

－

D/C

CB04

A

Unknown

－

＋

＋

－

D/C

CB05

B

Unknown

－

＋

＋

－

D/C

CB11

C

Crow, gut content

－

＋

＋

－

D/C

CB13

C

Bovine, gut content

－

＋

＋

－

D/C

CB16
CB18

D
E

Bovine, gut content
Bovine, feces

－
－

＋
＋

＋
＋

－
－

D/C
D/C

CB22

E

Bovine, feces

－

＋

＋

－

D/C

CB24

F

Bovine, gut content

－

＋

＋

－

ND

CB31

D

Bovine, feces

－

＋

＋

－

ND

CB32
CB36
CB37

C
A
G

Bovine, feces
feed
Bovine, feces

－
－
－

＋
＋
＋

＋
＋

－
－

ND
ND

CB38
CB39
CB41
CB43
CB45
CB47
CB48

G
A
H
D
D
G
G

Wild animal, feces
Bovine, feces
Bovine, gut content
Bovine, feces
Bovine, gut content
Bovine, gut content
Bird, feces

－
－
－
－
－
－
－

＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋

＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋

－
－
－
－
－
－
－
－

ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND

CTL：control strain, CB：isolated strain, ＋：positive, －：negative, ND：no data

たところ，D/C型ボツリヌス毒素遺伝子の配列を3.5示すことが明らかとなった。すなわち，PCR陽性

分離した19菌株について，パルスフィールドゲ

を示した19菌株のうち７菌株については，毒素遺ル電気泳動（PFGE）を行い，ボツリヌス菌ゲノ

伝子型を決定することができた。未解析の12菌株

ムDNAの型別解析したところ，７つのバンドパについては，現在，シーケンス解析を行っている

ターンに分かれた。Fig.１には，分離した一部のところである。

菌株DNAのSac Ⅱ消化によるPFGEパターンを示

3.4

ボツリヌス菌のPFGE解析

した。PFGE解析では，同じ県内の牛および環境

毒性試験

PCRおよびシーケンス解析により，D-Lc遺伝から分離したボツリヌス菌株は，同じPFGEパ子を有する19菌株をそれぞれ嫌気培養し，その培ターンを示した。また，離れた県同士では，Ｄと養上清をマウスに投与したところ，すべての菌株

Ｇで分離されたボツリヌス菌株が，同じPFGEパ

において数時間でボツリヌス症の典型的な症状でターンを示した。カラスの消化管内容物から分離死亡した。このことから，PCRおよびシーケンス

したボツリヌス菌株と同じ県で分離した牛の消化解析の結果から得た遺伝子解析結果は表現型と合管内容物から分離したボツリヌス菌株では，同じ致しており，これらの菌株はボツリヌス菌である

PFGEパターンが認められた。この結果から，カことが確定した。

ラスがボツリヌス菌の媒介動物となり，牛に伝播した可能性が考えられた。今回の研究成果では，© The Ito Foundation

野鳥が媒介する家畜のボツリヌス症の分子疫学的解析
M

1

2

3

375

おいて，カラス等の野鳥がボツリヌス菌を媒介す

4る可能性について，分子疫学の観点から評価した。日本の８県で，ボツリヌス症の疑いのある野
鳥や牛の罹患動物，飼育環境から57試料を採取し，ボツリヌス症の原因菌であるボツリヌス菌の
436.5
388.0
339.5
291.0

分離を試みた。その結果，19菌株を分離すること

242.5

配列の決定，Ｃ型とＤ型ボツリヌス毒素のマウスができた。これらの菌株について，PCRによるＣ型とＤ型ボツリヌス毒素遺伝子の検出および塩基194.0

致死活性により，19菌株がボツリヌス菌であるこ

145.5とが明らかとなった。次に，19菌株について，パ97.0

ルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を用いた
ボツリヌス菌ゲノムDNAの型別解析を行ったと

48.5

ころ，７つのPFGEパターンに分かれた。この中で，同じ県のカラスおよび牛から分離されたボツリヌス菌株は，同じPFGEパターンを示したことから，カラスがボツリヌス菌を媒介している可能kb

性が示唆された。リスク評価を行うためには，今後，さらに試料を追加し，ボツリヌス症の分子疫

M：DNA size maker
1：CB43
2：CB45
3：CB47
4：CB48

学的解析を行っていく必要がある。

Fig. 1 PFGE genotyping.

まだ事例が少ないため，今後，さらなるカラス由
来のボツリヌス菌を分離し，そのゲノムDNA型
別解析などの分子疫学的調査が必要である。
４．要

約

ボツリヌス菌は，きわめて強力なボツリヌス毒素を産生し，ヒトや家畜（鶏，牛）に重篤な感染症（ボツリヌス症）を引き起こす。本菌は，産生するボツリヌス毒素の抗原性の違いにより，A～G型菌に分類されている。その中で，C型菌は鶏に，D型菌は牛にボツリヌス症を引き起こす。本研究文献１） Sakaguchi, Y., Hayashi, T., Kurokawa, K.,
Nakayama, K., Oshima, K., Fujinaga, Y., Ohnishi, M.,
Ohtsubo, E., Hattori, M., Ogma, K.：The genome
sequence of Clostridium botulinum type C neurotoxinconverting phage and the molecular mechanisms of
unstable lysogeny, Proc Natl Acad Sci USA, 102,
17472～17477, 2005.
２） Oliva, M. A., Martin-Galiano, A. J., Sakaguchi, Y.,
Andreu, J. M.：Tubulin homolog TubZ in a phageencoded partition system, Proc Natl Acad Sci USA,109, 7711～7716, 2012.
３） Sakaguchi, Y., Suzuki, T., Yamamoto, Y.,
Nishikawa, A., Oguma, K.：Genomics of Clostridium
botulinum group Ⅲ strains, Res. Microbiol., 166, 318～325, 2015.
４） Nakamura, K., Kohda, T., Umeda, K., Yamamoto,H., Mukamoto, M., Kozaki, S.：Characterization of
the D/C mosaic neurotoxin produced by Clostridium
botulinum associated with bovine botulism in Japan,
Vet Microbiol, 140, 147～154, 2010.

課題では，国内で飼育される牛のボツリヌス症に© The Ito Foundation

376

豚流行性下痢ウイルス感染による致死性を決定する
遺伝子の同定Determination of gene involved in mortality in piglets by PEDV infection

大

橋

誠

一・神

谷

亘＊

（国立研究開発法人農業・食品産業技術研究機構動物衛生研究部門，
大阪大学微生物病研究所感染症国際研究センター臨床感染症学研究グループ）＊

Seiichi Ohashi and Wataru Kamitani＊（National Institute of Animal Health, National Agriculture and Food Research Organization,＊Laboratory of Clinical Research on Infectious Diseases, Research Center for Infectious Disease Control, Research Institute forMicrobial Diseases, Osaka University）

We generated recombinant porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）derived from theprototype CV777 strain, as well as chimeric PEDVs in which the original S gene are replacedwith two different types of S-mutants by reverse genetics. Eighteen five-day-old piglets wererandomly divided into three groups, with six piglets/group. Piglets inoculated with the rPEDVCV777-NA type-S developed acute severe watery diarrhea within 1 dpi and subsequently
developed anorexia, severe dehydration and lethargy at 2-4 dpi. Eventually, all piglets died by
7 dpi. Viral RNA in feces was detected as early as 2 dpi. The highest viral RNA shedding titerin feces was 10８-10９ genome equivalents/ml at 3-5 dpi. On the other hand, all the piglets
inoculated with rPEDV-CV777 or rPEDV-CV777-INDELS type-S showed less severe diarrhea
than piglets inoculated with the rPEDV-CV777-NA type-S and survived to the end of theexperiment. Viral RNAs in feces were significantly increased at 2-4 dpi. The highest viral RNA
shedding titers in feces were 10 ７-10８ genome equivalents/ml at 4-7 dpi. The viral RNA
shedding in feces delayed compared with the piglets inoculated with rPEDV-CV777-NA
type-S.
The results indicate that the S gene is an important determinant of PEDV virulence inpiglets. We will, thus, attempt to further map the sequences in the S gene that are critical tovirulence.

１．目

一つとして，近年の流行ウイルス株は過去の流行

的ウイルス株と比べ，外被タンパク質をコードする

2013年，わが国では７年ぶりに豚流行性下痢

Ｓ遺伝子に変異をもつ株が複数種存在すること，（PED）が発生し，その後流行はほぼ全国に拡大

また自然宿主である子豚を用いた感染実験においし，養豚産業に甚大な被害を与えた。以後，PEDて，それら変異株間において病原性が大きく異なの発生件数は年々減少しているが，今もなお発生ることを示してきた１～３）。しかしながら，これまは続いている。その流行拡大をもたらした要因のでの感染実験で用いた株はいずれも野外症例由来© The Ito Foundation

豚流行性下痢ウイルス感染による致死性を決定する遺伝子の同定377

株であることから，病原性の相違にＳ遺伝子以外

製した（それらのウイルスをそれぞれrPEDV-の他の遺伝子の影響が関与している可能性は否定

CV777-NA type-S，rPEDV-CV777-INDELS

できない。そこで，PEDウイルスにおいてリバー

type-Sと命名）（Fig.１）。接種のためのウイルス

スジェネティクス技術を確立し，遺伝子の基本骨はトリプシン添加Vero細胞で培養した。

格はPEDウイルスの古典株であるCV777株であ2.2

るが，外被タンパク質をコードするＳ遺伝子のみ

元株および２種類の組換えPEDキメラウイル

が異なる組換えPEDキメラウイルスを作製し，スを病原体に対して感受性が高い子宮切除摘出・子豚への感染試験を通じて，Ｓ遺伝子が病原性を

初乳未摂取子豚（５日齢，６頭／群）に対してそ検定する因子であるか否かを検証する。

れぞれ経口的に接種（10６TCID50／頭）し，接種

２．方
2.1

豚への感染実験

後28日目まで子豚の感染動態，特に死亡率につい法て観察・比較した。ウイルス接種後から７日間，組換えウイルス

糞便は毎日，血液は２日おきに各個体から採取し

元 株 と な る 組 換 え PED ウ イ ル ス（rPEDVCV777）の感染性cDNAは古典株であるCV777株の全長ゲノムをBacterial Artificial Chromosome

た。７日目以降は，糞便，血液ともに３-４日間
隔で経時的に採取した。
2 . 3 リ ア ル タ イ ム RT-PCR に よ る ウ イ ル ス（BAC）を用いて作製した。さらに，組換えPED

RNAの定量解析

キメラウイルスは，元株のＳ遺伝子を近年の流行

採取した糞便はリン酸緩衝液で希釈して20％乳株の代表株であり，子豚に対して致死性が高いと剤を作製し，遠心分離（3000×ｇ，10分）により考えられている北米型（NA type）由来，または

夾雑物を取り除いたうえで，上清をRNA抽出に供

Ｓ遺伝子に特異的な欠損と挿入を複数箇所有し，した。また，採取した血液は遠心分離（3000×ｇ，子豚に対して致死性が低いと考えられている10分）を行い，血清のみを使用した。ウイルス

INDELS型由来のＳ遺伝子に置換した２種類を作

RNA は 市 販 の キ ッ ト（QIAmp viral RNA mini

PEDV
（CV777-niah）
:

5°UTR

ORF1a

ORF1b

S（CV777-niah）

rPEDV-CV777:
pCMV
rPEDVCV777-NA type-S:

ORF3 M 3°UTR
S
E N

S（NA type）

pCMV
S（INDELS type）

rPEDVCV777-INDELS type-S:
pCMV
Fig. 1 Structure of recombinant PED viruses

Recombinant PED virus（rPEDV-CV777）carrying full-length genome of the CV777-niah strain, maintained in

National Institute of Animal Health was generated using a BAC（bacterial artificial chromosome）system. Thisvirus was modified to generate chimeric viruses（rPEDV-CV777-NA type-S and i rPEDV-CV777-INDELS type-S）
in which the S gene is fully replaced with those of NA and INDELS types, respectively.

© The Ito Foundation

378

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）kit）を用いて，手順書に従って抽出した。抽出３．結果と考察したウイルスRNAはPEDウイルスのＮ遺伝子をターゲットとしたプライマー・プローブセットな

rPEDV-CV777-NA type-Sはすべての個体がらびにスタンダードを用いてリアルタイムRT-

接種後１日目から重度の下痢を示し，２日目以降

PCRで定量・解析した。

食欲不振，元気消失，脱水，体重減少，起立不能を呈し１週間以内に死亡した（Table１）。一方，

Table1 Summary of mortality and clinical signs in rPEDV-inoculated groups＊ Half of numbers in each group necropsied at 2 or 5 days post-inoculation．

GroupsClinical signs

Ｎ＊

Mortality［％］

Diarrhea

Anorexia

Lethargy

Dehydration

AstasiarPEDV-CV777

6

0
（0/3）

Mild

＋

＋

－

－

rPEDV-CV777-NA type-S

6

100
（3/3）

Severe＋＋＋＋rPEDV-CV777-INDELS type-S

6

0
（0/3）

Mild orModerate

＋

＋

－

－

1.0E+09

rPEDV-CV777

1.0E+09

1.0E+08

1.0E+08

1.0E+07

1.0E+07

1.0E+06

1.0E+06

1.0E+05

1.0E+05

1.0E+04

1.0E+04

1.0E+03

1.0E+09

0dpi 1dpi 2dpi 3dpi 4dpi 5dpi 7dpi 10dpi 14dpi 17dpi 21dpi 24dpi 28dpi

1.0E+03

rPEDV-CV777-NA type-S

0dpi 1dpi 2dpi 3dpi 4dpi 5dpi 7dpi 8dpi 11dpi 15dpi 17dpi 21dpi 28dpi

rPEDV-CV777-INDELS type-S

1.0E+08
1.0E+07
1.0E+06
1.0E+05
1.0E+04
1.0E+03

0dpi 1dpi 2dpi 3dpi 4dpi 5dpi 7dpi 10dpi 14dpi 17dpi 21dpi 24dpi 28dpi

Fig. 2 Virus shedding in feces from piglets inoculated with the recombinant PEDV strain, rPEDV-CV777 and theS-chimeric PEDV strains, rPEDV-CV777-NA type-S and rPEDV-CV777-INDELS type-S. Data are genome
equivalents/ml in individuals indicated in different colors as quantified at each time point by a real-time reversetranscription quantitative PCR for the N gene. Three piglets from each group were necropsied at two days postinoculation.

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豚流行性下痢ウイルス感染による致死性を決定する遺伝子の同定

379

rPEDV-CV777 お よ び rPEDV-CV777-INDELS

イルスのリバースジェネティスクを確立すること

type-Sはすべての個体が接種後２日目から食欲は困難であるとされていたが，ヒトコロナウイル

不振，元気消失とともに軽度あるいは中等度の下スであるSARSコロナウイルス，MERSコロナウ

痢を示したが，接種後７日目から徐々に元気が回

イルスでリバースジェネティスクを確立した実績

復し，観察期間を通じてすべての個体が生存した。

がある大阪大学微生物病研究所神谷准教授の協力

糞便におけるウイルスの排泄に関して，を経て，本ウイルスのリバースジェネティスクを

rPEDV-CV777-NA type-Sは接種後２日目から確立することに成功した。この技術を用いて，遺排泄量が急激に上昇して，その後３-５日目に伝子骨格は共通で，Ｓ遺伝子のみ近年の流行株由ピーク値に達し，死亡するまで高いウイルス排泄来に組み換えたPEDキメラウイルスを作製し，量を示した（Fig.２）。一方，rPEDV-CV777およ

子豚への感染試験を通じて，Ｓ遺伝子が本ウイル

びrPEDV-CV777-INDELS type-Sは接種後２-４スの病原性を決める重要な因子であることを証明

日目から排泄量が急激に上昇して，その後４-７した。

日目にピーク値に達したが，10日目には急激に減少し，観察終了日まで低いウイルス排泄量を示した。
これらの結果は従来の野外分離株を用いた子豚の感染実験結果とほぼ一致していた。すなわち，近年の流行株に対するＳ遺伝子の解析を通じて見つかった北米型およびINDELS型はそれぞれ子豚に対して高い致死性および低い致死性を示すことが明らかとなった。このことから，PEDウイルスのＳ遺伝子は病原性を決める重要な因子である
ことが強く示唆された４）。
４．要

約

PEDウイルスは元来RNAウイルスの中で大きいゲノムサイズ（約30Kbp）を有するため，本ウ

文献１） Suzuki, T., Murakami, S., Takahashi, O., Kodera,A., Masuda, T., Itou, S., Miyazaki, A., Ohashi, S.,
Tsutsui, T.：Molecular characterization of pig
epidemic diarrhoea viruses isolated in Japan from2013 to 2014, Infect. Genet. Evol., 36, 363～368, 2015.
２） Masuda, T., Murakami, S., Takahashi, O.,
Miyazaki, A., Ohashi, S., Yamasato, H., Suzuki, T.：
Discovery of a new PEDV variant with a large
deletion in the spike gene identified in domestic
pigs, Arch. Virol., 160, 2565～2568, 2015.
３） Suzuki, T., Shibahara, T., Yamaguchi, R., Nakade,K., Yamamoto, T., Miyazaki, A., Ohashi, S.：Pig
epidemic diarrhoea virus S gene variant with alarge deletion non-lethal to colostrum-deprived
newborn piglet, J. Gen. Virol., 97, 1823～1826, 2016.
４） Suzuki, T., Terada, Y., Enjuanes, L., Ohashi, S.,
Kamitani, W.：S1 subunit of spike protein from acurrent highly virulent porcine epidemic diarrhea
virus is an important determinant of virulence inpiglets, Viruses., 30, 10, 467, 2018.

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380反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索
Investigation of the physiological markers indicating ‘nausea’ in domestic
ruminants

青

山

真

人１・蕪

山

由己人２

（１宇都宮大学農学部生物資源科学科，２宇都宮大学農学部応用生命化学科）

Masato Aoyama１ and Yukihito Kabuyama２（１Department of Agrobiology and Bioresources, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University,
２Department of Applied Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University）

As well as pain or uncomfortable temperature, nausea is one of the most typicalunpleasant experience. The clearest behavioral response to nausea is emesis（vomiting）. While,some species, including ruminants, such as cattle, sheep and goats, don’t possess the emetic
reflex, thus there have been no reports investigating the nausea in domestic ruminants. Authorof this report have been investigated the stress responses to road transportation in goats, andbuilt the hypothesis that goats might experience nausea because some of them seemed to be
sick during road transportation. The aim of this study is to find the physiological marker（s）fornausea in goats. Six Shiba goats were loaded onto a truck and transported for 60 min. Before
15 min the transportation start, each goats was given diphenhydramine（DH：one of the antimotion sickness medication）administration, or saline（control for DH）. Behavioral observationand the analysis of blood components were conducted. The data of the usual housed goats onother days were also corrected as the control for transportation. Road transportation induced
1）the decrease in the period spent in rumination, 2）the increase in the period spent in lying,and 3）the increase in the blood cortisol level. While, road transportation did not induced anychanges in blood concentration of the thyroid hormones（triiodothyronine and thyroxin）, nor
oxytocin. DH administration reduced the time spent in rumination of usual housed goats, but
did not induced any other behavioral and physiological changes both in housed nor transportedgoats. The comprehensive analysis of goats’ plasma were conducted with the two-dimensional
electrophoresis, but we still could not find any specific spots to transported goats. Further
works are necessary to find specific components in the bloods of the transported animals, andother stimuli can induce nausea.

１．目である。人を含めたいくつかの動物種において，的悪心によって起こる最も明確な反応は「嘔吐」で「悪心」（吐き気，気分が悪いこと）は，「痛み」ある。一方，嘔吐反射を持たず，嘔吐をしない動や「暑さ・寒さ」と同じく代表的な不快感の一つ

物種も少なくない（これらを「非嘔吐動物」とす© The Ito Foundation反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索

381る）。非嘔吐動物には，齧歯目，兎，馬などが含

2.2

まれる 。これら非嘔吐動物についての悪心の研

９：00～10：00の60分間，山羊を軽トラックの究はほとんど行われていないが，齧歯目である荷台に積載し，輸送した。各山羊に，以下の４種

ラットやマウスは例外的に悪心の研究に供試され類の処置を行った：生理食塩水を投与して通常飼ている。これら齧歯目では，異食症（カオリンと育（CS区），DHを投与して通常飼育（CD区），

いう瀬戸物の原料を摂食する異常行動）が嘔吐に

生理食塩水を投与して輸送（TS区），DHを投与代わる悪心の行動学的指標となると考えられていして輸送（TD区）。DHの投与は，ジフェンヒド

る。一方，悪心経験時に特異的に起こる生理

ラミン塩酸塩（シグマ-アルドリッチ社，Ｄ3630）

学的反応，特に血液中に現れる成分については，を生理食塩水で60mg/mlとなるよう溶解し，こいまだ明確な知見が得られていない。

れを山羊の体重１kgあたりDH2.0mgとなる量を

１）

２，
３）

輸送およびジフェンヒドラミンの投与

牛や羊，山羊などの反芻動物も非嘔吐動物であ

筋肉内注射した。生理食塩水を投与する実験区にる。そのため，反芻動物における悪心の研究はこ

おいては，同量の生理食塩水を投与した。DHまれまで皆無に近い。一方，著者は山羊を反芻家畜

たは生理食塩水の投与は輸送開始15分前（８：のモデルとして家畜の輸送ストレスのメカニズム

45）とした。

やその軽減法を研究してきた４，５）過程から，山羊

2.3

行動

は嘔吐をしないが，輸送中の様子から動揺病を発

９：00～10：00の間に反芻に費やしていた時間症している，つまり，輸送中に悪心を感じているおよび伏臥位姿勢であった時間を計測し，実験区のではないかと考えてきた。家畜が悪心を経験す間で比較した。得られた結果に１を加えた数値をる可能性のある要因は，輸送だけでなく，感染症

常用対数変換し，二元配置分散分析（輸送×DHやカビ毒など多く存在する。そのため，反芻家畜投与）により，実験区間の比較を行った。

が悪心を経験する可能性は確かめておく必要があ

2.4

る。本研究の目的は，反芻動物において悪心の生

８：30（輸 送 30 分 前）
，９：00（輸 送 開 始 直

理学的指標を見つけ出すことである。特に今回前），輸送開始から15分ごと（９：15，9：30，9：は，トラック輸送を山羊に与え，行動と血中成分

45，10：00），輸送終了後30分後（10：30）と60への影響について検討した。また，動揺病を軽減

分後（11：00）の計８回，頚静脈より血液を採取する作用が認められているジフェンヒドラミン

し，遠心分離で得た血漿を－30℃で保存した。
ストレスの生理的マーカーとして一般に用いら（以下DH）の効果についても検討した。
２．方
2.1

血中成分の分析れている血中のコルチゾル（Cor），甲状腺ホル法

モン（トリヨードチロニン：T3，チロキシン：
T4），オキシトシン（Oxt）の各濃度を測定した。

実験動物

実験にはシバ山羊（Capra hircus）６頭（オス

さらに，血漿からアルブミンを除去した後，等４頭，メス２頭，２～７歳）を使用した。実験は，

電点と分子量に従った二次元電気泳動を行い，輸宇 都 宮 大 学 動 物 実 験 委 員 会 の 承 認（承 認 No.

送による血中成分の変化を網羅的に解析すること

A18-0008）を得て，同大学動物実験等管理規程を試みた。

に従って行った。

血中のCor濃度については４頭の山羊で測定し，反復測定二元配置分散分析（時間×処置）に© The Ito Foundation

382

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

より比較した。血中のT3，T4，Oxtの各濃度お0.07）。通常，伏臥位姿勢は休息中によく観察さよび二次元電気泳動の結果については，今回は２れるため，通常飼育であったCS区およびCD区に例ずつしか検討しなかったため，統計解析は行わおいて観察された伏臥位姿勢については，休息行なかった。

動の一環と考えられた。一方，輸送時に観察された伏臥位姿勢については，通常飼育時とは異なる

３．結果と考察
3.1

機能を持つものと考えられた。山羊に繰り返し輸送を経験させると，輸送開始から伏臥位姿勢を取行動

行動の結果をTable１に示す。輸送中はTS区，るまでの時間が短くなり，個体によってはエンジ

TD区いずれにおいても反芻はまったく観察されンをかけるとトラックが動き出す前に伏臥位姿勢なかった。統計解析の結果，輸送中に反芻に費やを取ろうとすることが観察されている５）。輸送中した時間は，通常飼育時（CS区およびCD区）のの山羊の伏臥位姿勢は休息ではなく，不規則な加

それと比較し，有意に短かった。反芻は，動物が速度の影響を緩和する機能があるものと推察できストレスを受けている状況下では起こり難いことる。一方，CS区，CD区の間に伏臥位姿勢を取っが報告されており ，輸送によるストレスによっていた時間に違いはなく，DHは伏臥位を取る行て反芻が抑制されたものと考えられた。一方，通動には影響が薄いと考えられた。

６）

常飼育条件下で比較すると，CD区においてはCS

3.2

血中コルチゾル濃度

区よりも有意に反芻時間が少なく，DHは反芻を血中Cor濃度は，TC区，TD区のいずれにおいても輸送によって顕著に増加した（Fig. 1A）。血抑制する効果があることが示された。
伏臥位姿勢を取っていた時間について，統計的

中Cor濃度の増加は，あらゆるストレスの生理的に有意な差ではなかったが，輸送中は通常飼育時

マーカーとして使われており，輸送により血中よりも伏臥位姿勢が増加する傾向にあった（p＝Cor濃度が顕著に増加することは牛 ７），馬８），山Table 1 The effects of road transportation and diphenhydramine

administration in goats

Treatment

Total periods ofRumination（sec）

Total periods of Lying
position（sec）

CS

1195±372（351-2403）

411.3±411.3（0-2468）CD

424.7±265†（0-1543）59.0±59.0（0-354）TS

0.0±0.0＊（0-0）

811.3±597.9♯（0-3741）TD

0.0±0.0＊（0-0）

507.7±283.1♯（0-1705）

Each data represents the averaged±SE and（minimum value-maximum value）
of six goats. CS：control（usual housing）and saline administration, CD：usual
housing and diphenhydramine administration, TS：transportation and saline
administration, TD：transportation and diphenhydramine administration．
＊ or ♯：Significant or tendency of difference from non-transported treatment（CS or CD）（＊：p＜0.05， ♯：p＝0.07）. †：Significant difference from saline
administrated treatment（CS）（p＜0.05）,Two way ANOVA．

© The Ito Foundation

383

反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索

羊４，５）など，あらゆる家畜で報告されている。一

T3，T4ともに明確な変化はなかった。家畜の輸方，TD区とTC区の間の血中Cor濃度に統計的な送による甲状腺ホルモンの変化については，過去有意差はなかった。今回，輸送によって山羊が動にも報告があるが，その結果は一定していない。

揺病を発症したか否かは定かではないが，仮に動Ferlazzoらによる総説では，馬においては輸送に揺病が幾分か軽減されたとしても，輸送によるス

よって血中のT3，T4濃度がいずれも増加したが，トレス刺激はそれだけとは考え難く，他の要因に牛においてはＴ３のみが増加したことを報告して起因するストレスによりTD区においても血中いる９）。一方，Tajikiらはカシミア山羊において，Cor濃度が顕著に増加したのかも知れない。CD

輸送によりT3，T４いずれも増減がなかったと報区とCS区の血中Cor濃度は，投与前と比べ顕著な告している10）。今回，我々はシバ山羊で初めて輸変化はなく，また，両区の間に有意な差はなかっ

送による血中甲状腺ホルモン濃度の影響を検討した。DHの投与は反芻の抑制という行動に変化をたが，同じ山羊を用いているTajikiらの報告に類もたらしたが，DH投与自体はストレスとならな似したものとなった。甲状腺ホルモンは，年齢やいことが考えられた。

季節によって分泌様式が異なることが知られてお3.3

血中甲状腺ホルモン濃度

り，今回の結果だけで結論を下すことは早計かも知れないが，山羊においては輸送によって甲状腺よび1Ｃに示す。いずれの実験区においても，ホルモンは影響を受けないことが示唆された。

CS
CD
TS
TD
A
120
n=4
100
y
y
y
80
b
60
xz
b
xz
b
yz
b
40
a
a,x a,xa
200－30 0 15 30 45 60 90 120
Blood T4 level（ng/ml）

C
100
80

B

Blood T3 level（ng/ml）

Blood cortisol level（ng/ml）

血中の甲状腺ホルモン濃度の結果をFig. 1Bお

4

n=2

3
2
1
0

－30

0

15

60

90 12030

4560

90 120

n=2

60
40
20
0

－30

0

15

30

45

Time from the transportation start（min）
Fig. 1 The effects of road transportation and diphenhydramine（DH）administration on blood levels of cortisol（A）,

triiodothyronine（T3）（B）or thyroxin（T4）（C）. Road transportation was conducted between 0 and 60 min. Eachdata represents the averaged±SE of four or two goats. CS：control（usual housing）and saline administration,
CD：usual housing and diphenhydramine administration, TS：transportation and saline administration, TD：
transportation and diphenhydramine administration.
‘a, b’ or ‘x, y, z’：Having no same letter represents the significant difference among each time period within TS or
TD treatments, respectively（p＜0.05, repeated measures two way ANOVA and Tukey’s test）.

© The Ito Foundation

384
3.4

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

血中オキシトシン濃度3.5

二次元電気泳動

血中Oxt濃度については，今回は輸送45分後

山羊の血液をアルブミン除去し，分子量に従っ（９：45）のみを測定し，実験区間の比較を行って電気泳動を行った例をFig.３に示す。17.2以下た。２頭のみの結果ではあるが，CS区とTS区の～229.3kDaの間に複数のバンドが確認でき，血漿比較から，輸送によって血中Oxt濃度に顕著な変量100μlにおいてのみ確認できたバンドも見られ化は観察できなかった（Fig.２）。また，CS区とた。この結果を受けて，血漿100μlについて，二CD区，またはTS区とTD区の比較より，DH投与

次元電気泳動を行った。Fig.４に，例として１個による変化も，見られなかった。これまで，著者

体（２歳のオス）の各実験区の泳動結果を示す。

が知る限りでは，輸送に伴う血中Oxt濃度の動態

複数のスポットが確認できたが，その数は少なを検討した報告はない。人や犬など嘔吐動物におく，実験区間の間で明確な違いも確認できなかっいては，血中のアルギニンバソプレシン（AVP）

た。現在，感度を上げて，さらに研究を進めてい濃度が嘔吐に伴って増加することから，これが悪る。

心の生理的マーカーになる可能性が指摘されてい3.6

る 。しかし，非嘔吐動物であるラットにおいて今回の実験からは，Cor以外に，輸送に伴っては，悪心を引き起こす刺激を与えても血中AVP変化する血中成分を発見するところまで至らな

濃度は増加せず，代わりにOxt濃度が増加するこかった。今後，検討する成分を増やすとともに，とが報告されており ，ラットでは血中のOxt濃輸送以外の，悪心を引き起こす可能性のある刺激

度が悪心の生理的マーカーになる可能性が示唆さの影響や，悪心を起こさないストレス（例えば心れている。しかし，少なくともトラック輸送に

理ストレスなど）の影響を比較し，悪心に特異的

よっては山羊のOxtは影響を受けないことが示唆な血中成分の探索を継続する。

１）

11）

まとめ

された。

Blood oxytocin level（pg/ml）

60
Sample amountStd.
kDa Marker 10μL 50μL 100μL

n=2

50
40

229.3

30

71.3

94.6

20

45.1

10
0

32.2
CS

CD

TS

26.8

TD

Experimental treatment

17.2

Fig. 2 T h e e f f e c t s o f r o a d t r a n s p o r t a t i o n a n ddiphenhydramine administration on blood levels ofoxytocin. Blood samples at 45 minutes after the roadtransportation starts were analyzed. Each data
represents the averaged of two goats. See legend of
Fig. 1 for the explanation of each treatment.

Fig. 3 A result of the electrophoresis of goat’s plasma.

This analysis was conducted to determine theoptimal condition.

© The Ito Foundation反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索
CS

CD

TS

TD

385

Fig. 4 The results of the two-dimensional electrophoresis of one male goat’s

plasma. Each treatment was represented on the upper corner of eachpanel. See legend of Fig. 1 for the explanation of each treatment.

４．要を抑制したが，それ以外は輸送時，通常飼育時の約いずれにおいても明確な変化をもたらさなかった。

牛や山羊などの反芻動物は嘔吐をしないため，「悪心」（気分が悪いこと）を経験するとは考えられてこなかった。しかし，著者は山羊を用いて家畜の輸送ストレスを研究してきた経験から，輸送により山羊が「動揺病」（乗り物酔い）を発症している，すなわち，悪心を感じているものと考えるに至った。本研究では，反芻家畜における悪心に特異的な生理的マーカーを探索することを最終目的として，山羊にトラック輸送を与え，血中に現れる成分の変化を検討した。また，動揺病軽減効果のあるジフェンヒドラミン（DH）の効果についても検討した。輸送によって山羊に起こった変化は，１）反芻が抑制された，２）伏臥位姿勢でいる時間が長くなる傾向にあった，３）ストレスマーカーとなる血中のコルチゾル濃度が増加した，であった。一方，輸送により，血中の甲状腺ホルモン濃度およびオキシトシン濃度は変化しなかった。二次元電気泳動を試みたが，現時点では輸送に特異的な物質の変化は見つかっていない。
今回の実験では，DHの投与は通常飼育時の反芻文献１） Andrews, P. L. R., Horn, C. C.：Signals for nausea
and emesis：implications for models of uppergastrointestinal diseases, Auton Neurosci, 125, 100～
115, 2006.
２） Takeda, N., Hasegawa, S., et al.：Pica in rats is
analogous to emesis：an animal model in emesis
research, Pharmacol Biochem Behav, 45, 817～821,
1993.
３） De Jonghe, B. C., Lawler, M. P., et al.：Pica as an
adaptive response：Kaolin consumption helps rats
recover from chemotherapy-induced illness, Physiol
Behav, 97, 87～90, 2009.
４） Aoyama, M., Negishi, A., et al.：Short-termtransportation in a small vehicle affects thephysiological state and subsequent water
consumption in goats, Anim Sci J, 79, 526～533, 2008.
５） 佐怒賀琴美，青山真人他：トラック輸送の経験がヤギの輸送に対する反応に及ぼす影響，Anim Behav
Manage，52，123～133，2016.
６） Herskin, M. S., Munksgaard, L., et al.：Effects ofacute stressors on nociception, adrenocorticalresponses and behaviour of dairy cows, Physiol
Behav, 83, 411～420, 2004.
７） Ishiwata, T., Uetake, K., et al.：Steer stress levels
during long distance transport throughout the year
in Japan, Anim Sci J, 79, 510～517, 2008.
８） Friend, T., Martin, M. T., et al.：Householder, D.

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386

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

D., Bushong, D. M.：Stress responses of horses
during a long period of transport in a commercial
truck, J Am Vet Med Assoc, 212, 838～844, 1998.
９） Fazio, E., Medica, P., et al.：Effect of longdistance road transport on thyroid and adrenal
function and haematocrit values in Limousin cattle：
influence of body weight decrease, Vet Res Commun,
29, 713～719, 2005.

10） Tajiki, J., Nazifi, S., et al.：The influence oftransportation stress on serum cortisol, thyroid
hormones, and some serum biochemical parametersin Iranian cashmere（Raini）goat, Veterinarski Arhiv,
86, 795～804, 2016.
11） Verbalis, J. G., McHale, C. M., et al.：Oxytocin
and vasopressin secretion in response to stimuli
producing learned taste aversions in rats, Behav
Neurosci, 100, 466～475, 1986.

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387

地方病性牛白血病の簡易鑑別診断法の開発と若齢発症牛の実態調査への応用
Development of a simple diagnostic criteria for enzootic bovine leukemia
and survey of juvenile bovine leukemia in Japan

岡

川

朋

弘

（北海道大学大学院獣医学研究院）

Tomohiro Okagawa（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University）

Bovine leukemia is a malignant lymphoma in cattle and is classified into enzootic bovine
leukemia（EBL）and sporadic bovine leukemia（SBL）. EBL is a cancer of bovine B cells
infected with bovine leukemia virus（BLV）. On the other hand, SBL is B-cell or T-cell type
lymphoma, which is not associated with BLV infection. Recently, BLV infection is widely
spread in most farms throughout Japan. Accordingly, EBL cases have been increased
dramatically in Japan. Previously, it is believed that EBL is occurred in animal more than three
years old because more than three years are required to develop tumors in cattle after getting
infected the virus. However, recent several studies reported juvenile cases of EBL onset inanimal less than three years old. These atypical cases add confusion to differential diagnosis ofbovine leukemia. Thus, this study is designed to establish a simple guideline for diagnosis ofbovine leukemia and survey occurrence of enzootic bovine leukemia in juvenile cattle around
Japan．
In this study, 104 cases of bovine leukemia occurred in Japan during 2013-2019 werediagnosed by expression analysis of lymphocyte markers, quantification of BLV proviral load,and clonality analysis of BLV-infected cells. Out of tested samples, 80 samples（76.9％）werediagnosed as EBL. Among 54 cases of juvenile animals less than three years old, 39 cases（72.2％）were confirmed as EBL, including 23 cases of Japanese black breed, which is expected
to be susceptible to EBL onset. Additionally, juvenile EBL cases were found in all of thesurveyed areas in this study. Taken together, this study proposes a simple guideline fordiagnosis of bovine leukemia and shows that EBL onset in juvenile cattle commonly occurs inseveral areas around Japan.

１．目

bovine leukemia；EBL）と，BLV感染以外の原的因に起因する散発性牛白血病（Sporadic bovine

牛白血病は牛に発生する悪性リンパ腫で，牛白leukemia；SBL）に大別される。EBLはBLVが牛

血 病 ウ イ ル ス （bovine leukemia virus ； BLV）のＢ細胞に持続感染することによって引き起こさの感染に起因する地方病性牛白血病（Enzootic

れる，Ｂ細胞性白血病である。一方，SBLは臨床© The Ito Foundation

388

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

学的に子牛型，胸腺型，皮膚型に分類されるＢ細胞性またはＴ細胞性の白血病であり，BLVは発症には関わらない。SBLは３歳以下の子牛や育成

EBLの発生状況を調査した。
２．方法

牛から成牛に至るまで幅広い年齢で発症が認めら2.1れる。近年，日本国内の農場ではBLV感染が蔓

2013～2019年に国内の農場においてリンパ腫の延しており，2009～2011年の血清調査によると全症状を呈した牛104例について，末梢血から末梢国の肉牛の28.7％，乳牛の40.9％がBLV陽性であ血単核球を，各種臓器の腫瘍部から組織由来細胞

る 。BLVの蔓延に伴い，国内でのEBLの発生はを分離した。分離した細胞からWizard Genomic

急増しており，2017年の牛白血病発生数は20年前

DNA Purification Kit（Promega）を用いてDNAの約35倍に達している 。

を抽出した。

１）

２）

BLV感染からEBL発症までには通常３年以上

2.2

材料

リンパ球マーカー解析を要するため，EBLは３歳以上の成牛に発生する腫瘍検体の主な構成細胞を判定するために，Ｂと言われており，実際の疫学調査によるとEBLの細胞およびＴ細胞の特異的マーカーをフローサイ

好発年齢は５～７歳である 。しかし近年，２歳

トメトリーで検出した。まず，細胞と10％ヤギ血

以下の子牛や肥育牛におけるEBLの発症例が日本

清（Thermo Fisher Scientific）加 PBS と 室 温 で国内で報告されている。ただしこれらは，

15分間反応させ，検出抗体の非特異的反応を阻害

EBLの若齢発症例について個別に報告したものでし た 。 次 に ， Fixable Viability Dye eFluor780

あり，特定の地域で継続的に調査がなされたこと（Thermo Fisher Scientific）を用いて死細胞を染はなく，その発生状況の実態は明らかにされてい色し，FOXP3 Fix/Perm Buffer Set（BioLegend）

ない。

を用いて細胞の固定ならびに細胞膜透過処理を

３）

４～７）

現在，牛白血病の鑑別診断はさまざまな機関で行った。さらに，細胞をAlexa Fluor647標識抗実施されているが，診断手法や診断基準が統一さ

CD79a マ ウ ス 抗 体（Bio-Rad ； HM57）お よ び

れていないため，曖昧もしくは不適切な診断基準

Alexa Fluor488 標 識 抗 CD3 ラ ッ ト 抗 体 （Bio-が用いられ，正しい鑑別診断がなされない場合がRad；CD3-12）と４℃で20分間反応させた。そある。特に，若齢牛において発生したEBLや，して，フローサイトメーターFACS Verse（BD）

BLV感染牛に偶発的に発生したＢ細胞性SBLなどで染色した細胞を解析した。

は，典型的なEBL症例とはかけ離れており，必要

2.3

BLVプロウイルス量測定

な検査項目を正しく把握して鑑別診断を進めてい抽出したDNA中のBLVプロウイルス量を測定するため，Cycleave PCR Reaction Mix SPおよび

かなければならない。
このような状況を改善するため，我々は以前，

牛白血病ウイルス検出用Probe/Primer/Positive

国内の牛白血病検体について18項目を解析し，control（Takara Bio）を用いて，LightCycler480

EBLとSBLを明確に鑑別診断する基準を報告しSystem Ⅱ（Roche）でリアルタイムPCRを行った 。この知見を基に本研究では，牛白血病の鑑

た 。 DNA 濃 度 は 分 光 光 度 計 Nanodrop 8000

別診断に必要な最小限の項目のみを解析し，簡易（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。

６）

的な鑑別診断基準を確立した。さらに本研究で2.4

は，日本国内の複数地域において，若齢牛での腫瘍検体に含まれるBLV感染細胞のクローナ© The Ito Foundation

BLV感染細胞クローナリティ解析

地方病性牛白血病の簡易鑑別診断法の開発と若齢発症牛の実態調査への応用

リティを解析するため，既存のインバースPCR（iPCR）法８）に改変を加えて実施した。抽出した

389

３．結果と考察DNAをBclI（New England Biolabs）で切断し，本研究では，牛白血病の鑑別診断に必要な最小

エタノール沈殿により精製した。次に，DNA限の検査項目として，リンパ球マーカー解析，

Ligation Kit <Mighty Mix>（Takara Bio）を用い

BLVプロウイルス量測定，BLV感染細胞クローて遺伝子断片をセルフライゲーションさせ，環状ナリティ解析を設定し，簡易的な鑑別診断基準を

DNAを得た。その後，各検体を96℃で１分間処確立した（Fig.１）。

理した後，BLVプロウイルスのLTRを標的としまず，リンパ球マーカー解析では，Ｂ細胞あるたプライマーBMM-F（5’-CAGAAGCGTTCTTC

いはＴ細胞のマーカーとしてCD79aおよびCD3を

TCCTGAGA-3’）およびBMM-R（5’-TTA TCA

選抜し，腫瘍細胞におけるマーカー発現を解析し

GCA GGT GAG GTC AGC A-3’）およびTaKaRa

た。解析した104検体のうち，Ｂ細胞性（CD79a＋）

Ex Taq（Takara Bio）を用いてPCRを行った。

の腫瘍は90例，Ｔ細胞性（CD3＋）の腫瘍は６例，

PCR反応は，初回の熱変性を95℃，１分間行い，

その他表現型（CD79a－CD3－）の腫瘍（骨髄性白熱変性95℃，30秒間，アニーリング61℃，30秒間，血病など）は８例であった（Table１）。ここで，および伸長反応72℃，３分間を50サイクル繰り返

Ｔ細胞性の腫瘍はＴ細胞性SBL（T-SBL）と診断し，最終伸長反応を72℃，７分間行った。その後，した。

増幅された遺伝子断片を２％アガロース-TBEゲルを用いた電気泳動で確認した。

次に，Ｂ細胞性の腫瘍について，BLVプロウ
イルス量を測定した。調べたＢ細胞性腫瘍90検体のうち85検体でプロウイルスが検出された。BLV

Expression analysis oflymphocyte markers

CD3＋（T cell type）

CD79a+（B cell type）

T-SBL

CD79a－CD3－
OthersQuantiﬁcation of BLV
proviral load
> 5,000 copy

BLV negative< 5,000 copy

EBL

Clonality analysis of
BLV-infected cells
Positive

Negative

EBL

B-SBL

B-SBL

Fig. 1 Flowchart of differential diagnosis of bovine leukemia.

Clinical samples of bovine leukemia were diagnosed by expression analysis of lymphocyte

markers, quantification of BLV proviral load, and clonality analysis of BLV-infected cells.

© The Ito Foundation

390

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 Diagnostic result of bovine leukemia cases in this study.
EBL

B－SBL

T－SBL

OthersTotal

BLV+（> 5,000 copy）

73

－

－

－

73

BLV+（< 5,000 copy）

7

5

－

－

12

BLV−

－

5

－

－

5

Not tested

－

－

6

8

14

Total

80

10

6

8

104

陰性の５検体は，Ｂ細胞性SBL（B-SBL）と診断

その他は８例（7.7％）であった（Table１）。

した（Table１）。過去の研究によると，EBLの腫次に，簡易的な鑑別診断基準に基づく臨床検体

瘍 化 し た リ ン パ 節 で は ，プ ロ ウ イ ル ス 量 がの診断結果を用いて，地域Ａ～Ｈにおいて2013～

5,000copy/50 ng DNAを超えていると報告されて2019年に発生した症例104例について，牛白血病いる 。そこで本研究でも，プロウイルス量がならびに若齢EBLの発生状況を精査した。若齢発5,000copy/50 ng DNA以上の73検体は，EBLと診症例を中心に検体を収集したため，若齢牛（２歳断した（Table１）。

以下）と成牛（３歳以上）で発症数や割合を直接

９）

さ ら に ，プ ロ ウ イ ル ス 量 が 5,000copy/50 ng

比較することはできないが，若齢牛における牛白

DNA未満の12検体については，BLV感染細胞ク血病54例のうち，EBLは39例（72.2％），B-SBL

ローナリティ解析を行った。EBLでは，プロウイ

は５例（9.3％），T-SBLは５例（9.3％），その他

ルスが宿主DNAに挿入された単一あるいは少数

は５例（9.3％）であった（Fig. 3A）。一方，成牛のBLV感染細胞が腫瘍化する。この特徴を利用

における発生した牛白血病49例のうち，EBLは40

して，iPCR法を用いて腫瘍検体におけるプロウ
感染細胞のクローナリティを調べることで，EBLとBLV感染牛において偶発的に発生したB-SBLを鑑別した。その結果，12検体中７検体がiPCR
陽性であり，EBLと診断された（Table１）。一方で，残りの４検体については，プロウイルスは陽性だがiPCRが陰性で，B-SBLと診断した（Table１）。これらの検体におけるプロウイルス量は，
iPCR 陽 性 の ７ 検 体 で は 1,543 ～ 4,962copy/50 ng

1,000,000
Proviral load（copy/50 ng DNA）

イルス挿入部位のクローナリティ，すなわちBLV

100,000
10,000
1,000
100
10

DNA，iPCR陰性の４検体では25～3,368copy/50
ng DNAであった（Fig.２）。このように，プロウ
イルス量5,000copy/50 ng DNA未満の検体については，iPCR法を診断に取り入れることにより
EBLとB-SBLの鑑別が可能であった。最終的に，診断した104例のうち，EBLは80例（76.9％），
B-SBLは10例（9.6％），T-SBLは６例（5.8％）
，

EBL

B-SBL
（BLV+）

Fig. 2 BLV proviral load in EBL and B-SBL occurred in

BLV-infected cattle.

B LV proviral loads were quantificated in tumor

samples of B-cell leukemia, including EBL（n＝80）
and B-SBL（n＝10）. Five of B-SBL samples werepositive for BLV infection. Dot line represents 5,000
copy/50 ng DNA of proviral load.

© The Ito Foundation

391

地方病性牛白血病の簡易鑑別診断法の開発と若齢発症牛の実態調査への応用
（A）

（B）

All areas

100%

EBL
B-SBL

80%
60%

T-SBL
Others

39

40

50%
40%
30%
20%
10%
0%

5
5

5
1
3

5

40%
30%
20%
0%

EBL

80%

T-SBL

80%

70%

Others
15

50%
40%
30%
20%
10%
0%

1
3
3

3

60%
50%

2
2

0-2
>3
Age
（years old）

EBL
B-SBL
T-SBL
Others
7

40%
30%
20%
0%

0-2
>3
Age
（years old）

2

70%

10%

1
1

2

Areas C/D/E/F/H
90%

20

3

100%

B-SBL

60%

Others
25

50%

（D）

90%

T-SBL
12

60%

10%

Area B

100%

Rate of each leukemia type

70%

0-2
>3
Age
（years old）

（C）

B-SBL

80%

Rate of each leukemia type

70%

EBL

90%

Rate of each leukemia type

Rate of each leukemia type90%

Area A

100%

1
0-2
>3
Age
（years old）

Fig. 3 Rate of each leukemia type in juvenile and adult cattle.

Rates of each leukemia type were compared between juvenile（0-2 years old）and adult cattle（＞ 3 years old）in（A）all areas,（B）area A,（C）area C, and（D）areas C-H. Percentages of each leukemia type were shown invertical axis. Numbers in the bars represent case number of each leukemia type.

例（81.6％），B-SBLは５例（10.2％），T-SBLはEBLのうち，ホルスタイン種が８例（20.5％），

１例（2.0％），その他は３例（6.1％）であった

黒毛和種が23例（59.0％），交雑種が８例（20.5％）（Fig. 3A）
。さらに，地理的に離れた地域Ａおよだった（Fig.４）。一方，成牛のEBLの内訳は，

びＢのいずれにおいても，若齢牛におけるEBL発

ホルスタイン種が21例（52.5％），黒毛和種が16症例が多く認められた（Fig. 3B, C）。加えて，症例（40.0％），交雑種が１例（2.5％）だった（Fig.

例数は少ないが地域Ｃ～Ｈにおいても１～２例ず４）。この結果から，特に黒毛和種において若齢

つ若齢牛におけるEBLが認められた（Fig. 3D）。

EBLが発生しやすい傾向にあると推測される。た最後に，EBL発症牛の品種を比較した。若齢

だし，肉用牛である黒毛和種と乳用牛であるホル© The Ito Foundation

392

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

EBL cases
100%
90%

8

Rate of each breed population

80%
21

70%

HolsteinJapanese blackMix breed
Unknown

血病ウイルス（BLV）の感染に起因するＢ細胞

発性牛白血病（SBL）に大別される。近年，日本

23

国内の農場ではBLV感染が蔓延しており，それに伴い国内でのEBLの発生は急増している。これ30%までは，EBLは３歳以上の成牛に発生すると言わ16れてきた。しかし，２歳以下の若齢牛における

20%

0%

牛白血病は牛に発生する悪性リンパ腫で，牛白外の原因に起因するＢ細胞性またはＴ細胞性の散

40%

10%

約

性の地方病性牛白血病（EBL）と，BLV感染以

60%
50%

４．要

8

EBL発症が日本国内で近年報告されている４～７）。
12

このように非典型的な症例が散見されるようにな

0-2>3Age (years old)り，牛白血病の鑑別診断は一層複雑になりつつあ

Fig. 4 Rate of each breed population in EBL cases.

Rates of each breed population in EBL cases werecompared between juvenile（0-2 years old）andadult cattle（＞ 3 years old）. Percentages of each
breed population were shown in vertical axis.
Numbers in the bars represent case number of each
breed population.

る。そこで本研究では，牛白血病の簡易的な鑑別
診断基準を確立し，さらに日本国内の複数地域において若齢牛でのEBLの発生状況を調査した。
本研究では，リンパ球マーカー解析，BLVプ
ロウイルス量測定，BLV感染細胞クローナリティ
解析を検査項目として設定し，2013～2019年に発生した104例の牛白血病症例について鑑別診断を

スタイン種（雌）では飼養期間や飼養形態が大き

行 っ た 。 診 断 し た 104 例 の う ち EBL は 80 例

く異なるため，この結果が品種間の遺伝的背景の（76.9％）であった。特に，２歳以下の若齢牛では，違いに起因しているか，飼養方法の違いによる影54例のうち39例（72.2％）がEBLであった。この

響を受けているのかについては，さらなる検証がうち，黒毛和種は23例（59.0％）と半数以上を占必要である。

めており，黒毛和種において若齢EBLが発生しや本研究では，牛白血病の簡易的な鑑別診断基準

すい傾向にあることが示唆された。加えて，今回を確立し，その有用性を示した。さらに，日本国調査したすべての地域で若齢EBL症例が確認され内における牛白血病の発生状況を調査し，若齢た。このように本研究では，牛白血病の簡易的な

EBLが日本国内の広い地域で発生していることが鑑別診断基準を確立し，その有用性を示した。さ示唆された。今後はEBL若齢発症検体に関して，らに，日本国内における牛白血病の発生状況を調腫瘍細胞における網羅的遺伝子発現解析やBLV

査し，日本国内のさまざまな地域において若齢のウイルス株の違いなどを解析し，若齢牛におけEBLが発生していることを明らかにした。

るEBL発症メカニズムを探っていきたい。

© The Ito Foundation

地方病性牛白血病の簡易鑑別診断法の開発と若齢発症牛の実態調査への応用
文献１） Tsutsui, T., et al.：Prevent. Vet. Med., 124, 96～
101, 2016.
２） 前澤誠希ら：産業動物臨床医誌，6，161～164，
2016.
３） Oguma, K., et al.：Virus Res., 233, 120～124, 2017.
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５） Maezawa, M., et al.：Jpn. J. Vet. Res., 66, 209～213,
2018.

393

６） Murakami, K., et al.：J. Vet. Med. Sci., 75, 1123～
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７） 農林水産省ホームページ：監視伝染病発生状況の累 年 比 較（届 出 伝 染 病），http://www.maff.go.jp/j/syouan/douei/kansi_densen/attach/pdf/kansi_
densen-95.pdf８） Murakami, H., et al.：Virus Res., 156, 107 ～ 112,2011.
９） Somura, Y., et al.：Arch. Virol., 159, 2693～2697,
2014.

© The Ito Foundation

394

ワイン搾汁残渣タンニンを利用したラム肉パストラル
フレーバー低減技術の確立
Establishment of reducing technology for pastoral flavor of lamb meatusing tannin in wine pomace

上

田

宏一郎

（北海道大学大学院農学研究院）

Koichiro Ueda
（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

This study evaluated effects of supplementation with red wine pomace for fattening sheep
under grazing system on body weight gain and pastoral flavor source chemicals of meat. In
experiment 1, effect on digestibility and rumen fermentation were assessed for red wine
pomace when sheep were supplemented at 200 g/day indoor feeding. Digestibility decreased
for crude protein but increased for crude fat. However, the supplementation did not affectrumen fermentation parameters. In experiment 2, twelve lamb were assigned to twotreatments；control（CTLG）and red grape wine pomace supplementation（RGPG）of 100 g/
day under grazing system. Body weight gain increased for RGPG. Concentration of branchedchain fatty acid, neophthadiene, and indole in muscle tissue which all were source of pastoral
flavor decreased for RGPG, but in fat tissue such decrease was not observed. Thus, the results
clearly showed that 100 g/day red wine pomace supplementation for fattening lambs undergrazing system was appropriate to increase body weight gain as well as to reduce pastoral
flavor in lamb meat.

１．目

は，畜舎内で穀類を多給する飼育方式によるもの

的とは異なった味や香りを持つことが明らかとなっ草食家畜の放牧飼育は，生産者と消費者の双方ている。

にとって利益となる生産方式である。放牧飼養で肉用仔羊を放牧飼育により生牧草を多給して肥は，家畜と草地の間の物質循環機能を生かし自給

育すると，ラム肉のパストラルフレーバーが高ま

牧草を最大限利用するため，穀物の国際価格の変ることが知られている。パストラルフレーバーと動に左右されることなく低コストで畜産物を生産

は食肉から発生する糞臭，樟脳臭，動物臭，農場できる。また，家畜に適度な運動と自由な行動を臭などの総体であり，とくに日本人が嫌悪する香発現させることから，家畜の健全性と福祉性を高りであることが既往の研究により報告されていめ，生産物の消費者に対する印象と安心感を向上

る１，２）。パストラルフレーバーの原因成分は，飼させる。しかし，放牧飼育により生産した乳や肉料アミノ酸のルーメン内および動物体内の代謝物© The Ito Foundation

ワイン搾汁残渣タンニンを利用したラム肉パストラルフレーバー低減技術の確立

395にあると報告されている３）。具体的には，インドー

21日間および本期８日間とした。両処理区においル，スカトール（糞臭，樟脳臭，農場臭），フェノーて基礎飼料として大麦300ｇおよび乾草600ｇ給与

ル（農場臭，樟脳臭），側鎖中鎖脂肪酸（ヒツジ

した。RGP区では追加で乾燥赤ワイン粕を原物臭），硫化物，メルカプタン，チオール（動物臭）

200g/d補給した。

などがあげられる。放牧肥育では摂取する生草の糞のサンプルは本期の１から７日目にかけて，

タンパク質含量が非常に高いため，タンパク質の排糞量を測定した。糞および飼料サンプルの各種

摂取量が増加し，その結果アミノ酸の代謝物も多成分を分析し，成分ごとの消化率を算出した。

く生成される。これにより，仔羊を放牧肥育する

ルーメン液サンプルは本期の８日目に，飼料給とラム肉のパストラルフレーバーが高まると考え与の４時間後に採取した。採取したサンプルを遠られている。

心分離（４℃，3000rpm，20分）し，上清１mlを

反芻動物へのタンニンの補給はルーメン内でのマイクロチューブに移し，－20℃で冷凍保存しタンパク質分解を抑制することが知られている。

た。ルーメン液の上清の揮発性脂肪酸（VFA）

したがって，放牧肥育仔羊へタンニンを補給する

およびNH3-N濃度を分析した。

ことにより，ルーメン内での遊離アミノ酸生成を処理および期間を固定効果とし，個体を変量効低減し，肉中のパストラルフレーバー原因成分の果とした。p＜0.05で有意，p＜0.10で傾向がある

生成を抑制できる可能性があるとした。

。申請者は，

４，５）

タンニンを多く含有する補助飼料としてワイン搾汁残渣に着目した。近年，国産ワインの生産量が2 . 2 実験２：放牧肥育期の仔羊への赤ワイン
粕補給が肉の臭気成分に及ぼす影響増えているが，搾汁残渣（ブドウの果皮，種子）仔羊12頭（テクセル種およびテクセル種雑種）はほとんどが廃棄されている現状にあり，その有を用いた。試験開始時の供試仔羊の月齢は平均4.6

効利用が求められている。

カ月齢であった。本試験期間終了時に，平均6.8

本研究では，ワイン搾汁残渣タンニンを利用し

カ月齢でと畜した。１週間に１回，体重計で体重たラム肉パストラルフレーバー低減技術を確立す測定を行った。飲水およびミネラルブロックの摂るため，放牧肥育仔羊生産におけるワイン搾汁残取は自由とした。

渣の適正な給与量を明確にすることを目的とした。
２．方仔羊を体重，増体，雌雄および品種に基づいて，
赤ワイン粕補給放牧肥育区（RGPG）および対照法

放牧肥育区（CTLG）２処理の肥育処理に，無作

2 . 1 実験１：羊への赤ワイン粕補給が養分利為に割り当てた。試験期間の途中で，体重に合わ用およびルーメン内発酵に及ぼす影響

せて，濃厚飼料給与量を増やした。最終の給与量

テクセル種２頭，コリデール種１頭およびサはRGPG区では大麦400g/sheep/d，乾燥赤ワイン

フォーク種×コリデール種１頭の計４頭の去勢成粕100g/sheep/d，CTLG区では大麦400g/sheep/

羊を用いた（平均体重：71.8±8.6kg）。供試羊はdであった。本試験期間中，濃厚飼料は１日１回，代謝ケージの中で管理した。

0900ｈに，各処理区に頭数分，まとめて給与した。

赤 ワ イ ン 粕 補 給 区 （RGP） お よ び 対 照 区（CTL）の２処理を，２×２のクロスオーバー法
に従い，４頭に処理を配置した。試験期は予備期

試験終了後，RGPG区４頭，CTLG区４頭をと畜した。
と畜した全13頭のロース芯肉を後の分析のため© The Ito Foundation

396

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）に，真空包装し，－80℃で冷凍保存した。筋組織

機物（OM）および総エネルギー（GE）消化率

10ｇ，または脂肪組織１ｇを切り分け，ホモジナ

はRGP区で低い傾向が見られた。しかし，粗脂肪

イザーを用いて粉砕した。バイアル瓶にサンプル（EE）消化率はRGP区で有意に高かった。NDFを入れ，シリカモノリス捕集剤MonoTrap（RGC（中性デタージェント繊維）消化率は処理間で差およびRGPS（ジーエルサイエンス株式会社，東はなかった。

京））をヘッドスペースに差し込み，60℃のホッルーメン内発酵産物濃度をTable２に示した。

トバスで60分間静置し，臭気成分を捕集した後，すべての項目において，処理間で差は見られな

室温まで冷やした。臭気成分の分析には，ガスク

かった。

ロマトグラフ質量分析計（GC-MS 2010 Ultra，

本実験と同様に，ワイン粕補給によりDM，

島津製作所，京都）を用いた。MonoTrapをGC

OM，CP，NDF，GE消化率が低下し，EE消化率に挿入し，スプリットレスモードでGCに捕集しが高まる結果が他の研究６～８）によっても報告された臭気成分を注入した。GCの保持時間および質ている。本実験では，CTL区に比べRGP区では

量分析スペクトルを比較することで臭気成分を特

DM消化率は７％，OM消化率は７％，CP消化率

定し，内部標準比として濃度を測定した。

は13％，NDF消化率は９％，GE消化率は７％低

増体は処理を固定効果とし，試験開始時の体重下し，EE消化率は17％増加した。Abarghueiら６），を共変量とした。臭気成分は，処理，と体重およBaumgartelら７）およびZalikarenabら８）の結果とび雌雄を固定効果とした。ｐ＜0.05で有意，ｐ＜比較して，本研究における消化率の低下の程度は0.10で傾向があるとした。

低かった。Zalikarenabら８）の実験では350ｇおよび49％，Baumgartelら７）の実験では800ｇおよび３．結果と考察
3.1

55 ％，Abarghuei ら ６） の 実 験 で は 762 ｇ お よ び

実験１76％であったが，本研究における，赤ワイン粕の飼料成分およびエネルギーの消化率をTable１

給与量は200ｇ，全給与飼料中に対する赤ワインに示した。粗タンパク質（CP）消化率はCTL区

粕給与量の割合は18％と低かったことから，全体に比べてRGP区で有意に低く，乾物（DM），有の消化率に対する赤ワイン粕の消化率の影響は小Table 1 Digestibility of sheep when supplemented with

Table 2 Rumen fermentation parameters of sheep when

red wine pomace（RGP：supplemented with red
wine pomace, CTL：control）.

DM（%）
OM（%）
CP（%）
NDF（%）
EE（%）
GE（%）

RGP

CTL

p value

60.8
62.0
56.0
48.9
78.5
59.5

67.5
69.3
68.5
58.2
61.9
66.9

†
†
＊
NS
＊
†

†p＜0.1, ＊p＜0.05, NS：Non-significancesupplemented with red wine pomace （RGP：
supplemented with red wine pomace, CTL：control）
.
RGP

CTL

p value

NH3-N（mg N/dl）

13.6

19.0

NS

Total VFA（mmol/dl）
Individual VFAs（mmol/100mmol）
AcetatePropionate
iso-Butyrate
n-Butyrate
iso-Valerate
Valerate

7.4

7.8

NS

64.25
19.19
0.91
13.53
0.89
1.24

68.72
18.10
0.91
11.15
0.45
0.67

NS
NS
NS
NS
NS
NS

NS：Non-significance© The Ito Foundation

ワイン搾汁残渣タンニンを利用したラム肉パストラルフレーバー低減技術の確立

397

さかった。タンニンの摂取量が増加すると，自由比べて0.04kg/ｄ高かった。そのため，日量100ｇ

摂取量および消化率が低下するので ，赤ワイン

程度の乾燥赤ワイン粕の給与は増体に負の影響を

粕の給与割合が増加するにつれて，消化率は大き及ぼさないことが示唆された。

９）

ロース芯肉の筋組織の分析では，赤ワイン粕補く低下する可能性がある。
ルーメン内に流入したタンニンは植物タンパク

給により，BCFA（4-メチルオクタン酸メチル，質と結合し，微生物の活性を抑制するので，ルーオクタン酸メチル，ノナン酸メチルおよびデカン

メ ン 内 NH3-N 濃 度 が 低 下 す る と 報 告 さ れ て い酸メチル）が有意に減少した。また，インドール

る。しかし，本実験の結果では，RGP区におで低い傾向が見られた。これらはパストラルフ

いて赤ワイン粕補給によるルーメン内NH3-N濃レーバーの臭気成分であり，放牧草由来のタンパ

度の有意な低下は見られなかった。また，タンニ

ク質がルーメン内の微生物の作用を受けて変化しンを給与すると，微生物の活性が抑制され，繊維たものとされている３）。赤ワイン粕補給により，消化率が低下するので，ルーメン内VFAが減少

微生物の活性が抑制された結果，ラム肉中のパスする可能性があるが，ルーメン内のVFAに赤ワ

トラルフレーバーの蓄積が軽減された可能性があイン粕給与による影響は見られなかった。

る。また，RGPG区において筋組織においてネオ５，６）以上から，日量200ｇ以下の補給量であれば乾フィタジエンが有意に低かった。フィタンおよび

燥赤ワイン粕の補給のルーメン内発酵に及ぼす影

ネオフィタジエンなどのジテルペノイドはクロロ

響は小さく，放牧肥育に問題なく用いることがでフィルの分解産物として11），あるいは放牧草からきる可能性が示唆された。

直接摂取することで10），体内に吸収される。その

3.2

実験２

ため，放牧肥育のラム肉では，特徴的な臭気成分

体重および増体をTable３に示した。RGPG区の増体はCTLG区に比べて，有意に高かった。
ロース芯肉の筋組織の脂肪酸類および脂肪酸エである12）。赤ワイン粕補給の結果，分解および吸収が抑制されたことにより，ネオフィタジエンが低くなったと考えられる。

ステル類をTable４に示した。CTLG区に比べて以上の結果から，放牧飼養の仔羊に日量100ｇ

RGPG区の4-メチルオクタン酸メチル，オクタンの乾燥赤ワイン粕を補給することで，増体を高め

酸メチル，ノナン酸メチル，デカン酸メチルが有ると同時に，ラム肉中のパストラルフレーバーを意に低かった。CTLG区に比べて，RGPG区のナ軽減できることが示唆された。

フタレンおよびネオフィタジエンが有意に低く，
インドールが低い傾向が見られた（Table４）
。

４．要

約

脂肪組織の臭気成分については，RGPG区およ本研究では，放牧肥育期の子羊への赤ワイン粕

びCTLG区の比較で有意差が見られたものは少なの補給が増体およびパストラルフレーバ原因成分

く，RGPG区およびCTLG区の比較において，分に及ぼす影響を評価した。実験１において，去勢

岐鎖脂肪酸，インドールおよびスカトールに差は雄羊４頭を用い，代謝試験を行い，赤ワイン粕が見られなかった。

消化率およびルーメン内代謝に及ぼす影響を確認

Minら

は，タンニンを給与すると，自由摂取した。その結果，赤ワイン粕の給与により，CP量および消化率が低下し，増体が低くなると述べ消化率が低下し，EE消化率は増加した。また，

たが，本研究では，RGPG区の増体がCTLG区に

ルーメン発酵産物には赤ワイン粕補給の影響は認

９）© The Ito Foundation

398

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 3 Body weight and daily body weight gain of lambs under grazing system

when supplemented with red wine pomace（RGPG：supplemented with red
wine pomace, CTLG：control）.
RGPG

CTLG

p value

Initial body weight（kg）

33.1

32.8

NS

Body weight at slaughtering（kg）

42.7

39.6

NS

Carcass weight（kg）

22.5

21.3

NS

Daily body weight gain（kg/d）

0.15

0.11

＊

＊p＜0.05, NS：Non-significance
Table 4 Pastoral flavor sources of muscle tissue in meat of lambs fattened undergrazing system when supplemented with red wine pomace（RGPG：
supplemented with red wine pomace, CTLG：control）.

Butanoic acid, methyl ester
Methyl valerate
Hexanoic acid, methyl ester
Heptanoic acid, methyl ester
Octanoic acid, 4-methyl-, methyl ester
Octanoic acid, methyl ester
Nonanoic acid, methyl ester
4-Decenoic acid, methyl ester
Decanoic acid, methyl ester
Dodecanoic acid, methyl ester
Tetradecanoic acid, methyl ester
Hexadecanoic acid, methyl ester
Stearic acid, methyl ester
Oleic acid, methyl ester
PhenolTolueneo-XyleneIndoleSkatoleD-Limonene
Naphthalene
Dihydrophytol
Neophytadiene
Phyt-1-ene
PhytanePhyt-2-ene
Dimethyl sulfone

RGPG

CTLG

1.15
0.21
3.53
1.78
0.08
7.64
7.50
0.19
35.46
22.79
36.64
72.35
24.68
7.87
0.19
0.75
1.16
0.77
0.71
0.40
10.50
2.28
2.85
1.42
0.15
1.13
12.77

1.02
0.29
4.59
2.64
0.19
13.71
10.84
0.26
56.84
27.51
58.76
128.10
19.31
14.46
0.22
0.75
1.57
1.64
0.88
0.68
23.33
5.34
5.61
1.16
0.15
1.29
13.68

p value

＊
＊
＊＊
＊

†
†

†

＊
＊

†p＜0.1, ＊p＜0.05, ＊＊p＜0.01

められなかった。試験２において，仔羊12頭を赤た。以上から，放牧肥育仔羊への乾燥赤ワイン粕

ワイン粕補給放牧肥育区（RGPG）に配置した。

の日量100ｇ程度の補給は，増体を改善すると同日増体量はCTLG区に比べて，RGPG区で高かっ

時にラム肉のパストラルフレーバーを軽減するこた。筋組織では分岐鎖脂肪酸，ネオフィタジェン

とが明らかになった。

およびインドールに赤ワイン粕補給による低減効
果が見られたが，脂肪組織では差が見られなかっ© The Ito Foundation

ワイン搾汁残渣タンニンを利用したラム肉パストラルフレーバー低減技術の確立
文献１） Prescott, J., Young, O., O' Neill, L.：The impact ofvariations in flavor compounds on meat
acceptability：a comparison of Japanese and New
Zealand consumers, Food Quality and Preference, 12,257～264, 2001.
２） Young, O. A., Lane, G. A., Priolo, A., Fraser, K.：
Pastoral and species flavor in lambs raised on
pasture, lucerne or maize, Journal of the Science ofFood and Agriculture, 83, 93～104, 2003.
３） Schreurs, N. M., Lane, G. A., Tavendale, M. H.,
Barry, T. N., McNabb, W. C.：Pastoral flavour inmeat products from ruminants fed fresh forages andits amelioration by forage condensed tannins,
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４） Tiemann, T. T., Avila, P., Ramirez, G., Lascano, C.
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fermentation of tanniniferous tropical plants：Plantspecific tannin effects and counteracting efficiencyof PEG, Animal Feed Science and Technology, 146,
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５） Waghorn, G.：Beneficial and detrimental effects
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and goat production-Progress and challenges,
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399

６） Abarghuei, M. J., Rouzbehan, Y., Alipour, D.：
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parameters of sheep, Livestock Science, 132, 73～79,
2010.
７） Baumgartel, T., Kluth, H., Epperlein, K.,
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value for sheep of different grape pomace, Small
Ruminant Research, 67, 302～306, 2007.
８） Zalikarenab, L., Pirmohammadi, R., Teimuriyansari,A.：Chemical composition and Digestibility of dried
white and red grape pomace for ruminants, Journalof Animal and Veterinary Advances, 6, 1107～1111,
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９） Min, B. R., Barry, T. N., Attwood, G. T., McNabb,
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temperate forages：a review, Animal Feed Scienceand Technology, 106, ３～19, 2003.
10） Suzuki, J., Bailey, M. E.：Direct sampling capillary
GLC analysis of flavor volatiles from ovine fat,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 33, 343～
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11） Body, D. R.：The lipid composition of adipose
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12） Young, O. A., Berdadue, J. L., Viallon, C., RoussetAkrim, S., Theriez, M.：Fat-borne volatiles andsheepmeat odour, Meat Science, 45, 183～200, 1977.

© The Ito Foundation

400

骨格筋肥大を促進する植物由来成分の探索
Screening for phytochemicals that induce skeletal muscle hypertrophy

米

倉

真

一

（信州大学農学部）

Shinichi Yonekura（Faculty of Agriculture, Shinshu University）

So far, we have shown from studies using cultured cells that thermal stimulation promotes
muscle hypertrophy, and thermal stimulation-induced muscle hypertrophy is throughtemperature-sensitive transient receptor potential（TRP）channels present on membranes.
Interestingly, not only temperature but also phytochemicals are known as ligands as TRP
channels. Therefore, in this study we investigated to clarify phytochemicals that promoteskeletal muscle hypertrophy. It has been revealed that capsaicin, which is an agonist of TRPV1,
enhanced myogenesis by facilitating the fusion of myoblasts. Our study shows that capsaicinincreases the expression of Cdh15 gene which plays a significant role in the fusion of myoblasts
and is uniquely expressed during skeletal muscle differentiation. Furthermore, also in theevaluation experiment of muscle regeneration ability using a mouse, it became clear that
capsaicin has an effect of enhancing muscle regeneration ability. Together, these results
demonstrate that capsaicin, which is an agonist of TRPV1, promotes skeletal muscle
differentiation, which was caused by up-regulation of myofusion marker.

１．目

芽細胞が成熟した筋管に分化するまでには，大き的く分けて“融合”と“伸長”という２段階の形態

世界規模の人口増加や気候変動によって食料危的な変化を辿る１）。まず１つ目のステップである機が叫ばれるなか，良質な動物性タンパク質の安融合ステージでは，MRFs（MyoD，Myf５など）

定供給は我が国のみならず，人類の生存にきわめと呼ばれる筋分化の主要な転写因子群の発現増加て重要である。食肉は家畜骨格筋が由来であるこを経たのち，互いに融合して多核の筋管細胞となとから，家畜１個体当たりの骨格筋量を増加さる。そして２つ目のステップである伸長ステージ

せ，食肉の生産性を飛躍的に向上させる技術開発に移行すると，筋管が縦に伸長し，筋タンパクをが強く望まれている。

盛んに合成するようになり，大きく肥大した成熟

食肉を構成する大部分を占める骨格筋は，筋管筋管へと成長していく２，３）。このように段階的にの集合体である筋繊維と，それを包む筋膜および進んでいく骨格筋分化に関与する分子はいくつか結合組織から構成されている。前駆細胞である筋

報告されているものの，筋形成を促進する鍵とな© The Ito Foundation

骨格筋肥大を促進する植物由来成分の探索

401

児由来血清（FBS）を10％，抗生物質（ペニシリる作用点はまったく不明である。
これまで我々は培養細胞を用いた研究から，温ン-ストレプトマイシン）を１％の濃度になるよ

度刺激によって筋肥大が促進することを明らかにうに添加した増殖用培地を用いて培養した。２％している 。具体的には，骨格筋の分化や再生をHS（Horse serum）含有DMEM（分化培地）に研究するためのin vitroモデルとして広く利用さ

置換し，分化誘導刺激を行った。カプサイシンがれているマウス筋芽細胞株C2C12を用いて検討し筋管形成能に及ぼす影響の検討には，１μＭのカた結果，通常温度（37℃）で培養したC2C12細胞

プサイシンを含む分化培地（コントロールとしてと比べて，マイルドヒート条件下（39℃）で培養

溶媒を添加）で分化誘導刺激を行った。

４）した細胞は分化が促進することを明らかにした。

2.2

免疫蛍光染色と画像解析

39℃の温度刺激は筋芽細胞同士の融合促進およびAnti-Myosin Heavy Chain抗体（１次抗体）と筋管の伸長を促す効果を有していた。さらに，こGoat anti-mouse IgG Alexa Flour 488抗体（２次の温度刺激による筋肥大は，骨格筋細胞の膜上に抗体）を用いた免疫染色を行った後，１μg/mL

存在する温度感受性Transient Receptor PotentialのDAPIを細胞に５分間処理し，核染色を行った。

（TRP）受容体を介して生じることも見出してい洗 浄 後 の 細 胞 は 蛍 光 顕 微 鏡 EVOS Ⓡ FL Cell

る（成果未発表）。すなわち温度刺激はTRP受容

Imaging System を 用 い て 観 察 し た 。 Anti-

体を活性化させ，そのことがトリガーとなって筋

Myosin Heavy ChainおよびDAPI蛍光免疫染色の肥大が促進されることを明らかにしている。

観 察 画 像 を 定 量 解 析 に 供 し た 。Myosin Heavy

TRP受容体は，細胞膜上に存在し温度刺激のChain陽性の細胞体（核を２個以上含む）を筋管感知を行っており，これまで９つの受容体が同定とみなし，Fusion indexをImage J softwareを用されている 。興味深いことに，このTRP受容体

いて測定した。統計解析には t 検討を用い，ｐ＜は温度のみならず植物由来成分を特異的リガンド

0.05を有意差ありと判定した。

５）とする受容体であることが知られている 。よっ2.3て温度刺激だけでなく，TRP受容体を活性化す

TRPV3 siRNAの導入はリポフェクション法をる植物由来成分もまた筋肥大化を促進することが用 い て 行 っ た 。 手 法 は Lipofectamine 2000

予想される。筋肥大を促進する植物由来成分は，（invitrogen社）のプロトコルに準拠した。トラ

筋肉量を増やす飼養技術に活用することが可能でンスフェクションした翌日，分化誘導刺激を行あると考える。

い，刺激後５日目の細胞をAnti-Myosin Heavy

６）

よって本研究では，肉牛の筋肉量を増加させる
飼養技術開発を目指すうえで，骨格筋の肥大化を

siRNAを用いたノックダウン実験

Chain抗体を用いた免疫染色によって分化能の評価を行った。

促進する植物由来成分を明らかにすることを目的

2.4に検討した。

ト ー タ ル RNA 抽 出 に は TRIzol を 使 用 し た 。

２．方
2.1

リアルタイムPCR

TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with gDNA

法

Eraserの手順に従い，cDNAを作成した。PCR反応 試 薬 に は TaKaRa SYBR Premix ExTaq を 用細胞培養

マウス筋芽細胞株C2C12は，ダルベッコ変性い，リアルタイムPCRを行った。GAPDHを内部

イーグル培地（DMEM, high glucose）に，牛胎標準として相対定量解析を行った。統計解析には© The Ito Foundation

402

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

t 検討を用い，ｐ＜0.05を有意差ありと判定した。
2.5

等が知られている。本研究では，まずTRPV1の代表的なアゴニストと広く知られているカプサイ

マウスを用いた筋再生能の評価障害に伴う筋再生を誘導するためマウス前脛骨シンがC2C12筋芽細胞の形成能に及ぼす影響を検筋にヘビの毒素であるカルディオトキシン（CTX）

討した。分化誘導刺激と同時に１μＭのカプサイを10μＭ注入した。CTX注入の３日前より毎日１シンを培地に添加し，37℃（通常条件）で培養をμＭのカプサイシンを注入し，カプサイシン注入

行 っ た 。処 理 後 ５ 日 目 の 細 胞 を Anti-Myosin

後８日目の筋組織を摘出した。筋線維径当たりの

Heavy Chain抗体を用いた免疫染色により分化能

核個数をImage J softwareを用いて測定した。統を評価した。その結果，カプサイシンを処理した

計解析には t 検討を用い，ｐ＜0.05を有意差あり

細胞では，コントロール（カプサイシン未処理）と判定した。

と比べてより肥大した筋管が観察された（Fig.
1A）
。fusion indexを測定した結果，カプサイシ

３．結果と考察

ン処理群において，未処理群に比べ有意な増加が

3 . 1 温度刺激による筋形成促進とTRPV3との認められた（Fig. 1B）。またカプサイシン処理により分化48時間後のcdh15の遺伝子発現が，未処関与について
これまで９つの温度感受性TRP受容体が同定

理群に比べ，有意に上昇していることも明らかとされており，それぞれ活性化する温度域が異ななった（Fig. 1C）。cdh15はカドヘリンスーパー

る。この中で，39℃以上で活性化し植物由来成分

ファミリーの一つであり，骨格筋分化過程で特異によって活性化することが知られているのは，的に発現し，筋芽細胞の細胞融合に先立つ細胞接TRPV1とTRPV3と呼ばれている受容体である。

着において，カルシウム依存的なcell-cell間の接これまで温度刺激による筋管形成の促進は少なく着を仲介するという働きを持つ７）。これまで我々

ともTRPV1を介することを明らかにしているこは39℃の温度刺激によって，cdh15遺伝子発現がとから，TRPV3も関与しているのか否か検討を上昇し，細胞同士の融合が促進することを明らか行った。siRNAによってTRPV3発現をノックダに し て い る ４）。よ っ て ，カ プ サ イ シ ン も ま た

ウンさせたC2C12細胞を分化誘導刺激した後，

cdh15遺伝子発現を誘導し，筋芽細胞同士の融合

39℃の条件で培養し，Anti-Myosin Heavy Chainを促進させることで筋形成能を高めていることが抗体を用いた免疫染色により分化能を評価した結予想される。

果，通常細胞と変わりがないことが明らかとなった。すなわち，温度刺激による筋管形成の促進に

3 . 3 カプサイシンがマウスの筋再生能に及ぼす影響

TRPV3は関与しないことが考えられた。よって，培養細胞を用いた実験より，カプサイシンは筋以後の検討はTRPV1のみに着目して検討するこ

形成能を高める作用を有することが明らかとなっととした。

た。続いて，マウスモデルを用いた検証を行った。

3 . 2 カプサイシンがC2C12筋芽細胞の筋形成

マウス前脛骨筋にCTXを10μＭ注入し，障害に伴う筋再生を誘導した。CTX注入の３日前より毎能に及ぼす影響
これまでTRPV1の植物由来の活性化物質とし

日１μＭのカプサイシンを注入し，カプサイシンてカプサイシン（トウガラシ由来），ギンゲロー

注入後８日目の筋組織を摘出し，筋線維径当たりル（ショウガ由来），アリシン（ニンニク由来）の核個数を測定した。その結果，カプサイシンを© The Ito Foundation

403

骨格筋肥大を促進する植物由来成分の探索

B

Capsaicin

ControlA

C

40

Relative Cdh15 mRNA levels

Fusion index (%)

35
＊

30
25
20
15
10
5
0

Control

2

＊

1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

Capsaicin

Control

Capsaicin

Fig. 1 Capsaicin facilitates differentiation of C2C12 cells. （A） Five days after differentiation, the cells were

immunostained using an anti-muscle heavy-chain antibody（green）. Nuclei were stained with DAPI（blue）. Scalebar=400μm.（B）Fusion index analysis representing the number of nuclei in multinucleated myotubes divided by
the total number of nuclei in the field of vision. ＊p＜0.05 compared with the control.（C）Relative expression level of
cdh15 mRNA. ＊p＜0.05 compared with the control.

注入することで，核個数が有意に増加しているこを特異的リガンドとする受容体であることが知らとが明らかとなった（Fig.２）。すなわちカプサ

れていることから，TRP受容体を活性化する植イシンは，in vivoにおいても筋再生能を高める

物由来成分もまた筋肥大化を促進することが予想効果を有することが明らかとなった。筋形成能と損傷に伴う筋再生能はまったく同じに考えること
る。
４．要

約

これまで我々は，培養細胞を用いた研究から温度刺激によって筋肥大が促進することを明らかにCentral nuclei per myoﬁberができない。現在，筋形成能について検討中であ

2.5細胞の膜上に存在する温度感受性TRP受容体を介して生じることを見出した。興味深いことに，
このTRP受容体は温度のみならず植物由来成分

2
1.5
1
0.5
0

しており，また温度刺激による筋肥大は，骨格筋＊

Control

Capsaicin

Fig. 2 Capsaicin facilitates muscle repair in mouse TA

muscles. Quantification of the number of central nuclei
per myofiber in TA muscle at 5 d after injury. ＊p＜0.05
compared with the control.

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404

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

される。よって本研究では，肉牛の筋肉量を増加させる飼養技術開発を目指すうえで，骨格筋の肥大化を促進する植物由来成分を明らかにすることを目的に検討した。本研究により，TRPV1のアゴニストであるカプサイシンは，筋芽細胞同士の融合を促進させることで筋形成能を高める作用を有することが明らかとなった。またカプサイシン
は骨格筋分化過程で特異的に発現し，筋芽細胞の細胞融合に先立つ細胞接着分子であるcdh15遺伝
子発現を誘導することで，筋芽細胞同士の融合を促進させていることが示唆された。さらに，マウスを用いた筋再生能の評価実験においても，カプ
サイシンは，筋再生能を高める効果を有することが明らかとなった。今後，動物個体レベルでカプ
サイシンは筋再生能のみならず筋形成能も促進す
る作用を有するのか検討する必要がある。またカ
プサイシン以外のTRPV1の植物由来アゴニスト

文献１） Roman, W., Gomes, E. R.：Nuclear positioning inskeletal muscle, Seminars in Cell and Developmental
Biology, 82, 51～56, 2018.
２） Smith, C. K., Janney, M. J., Allen, R. E.：Temporal
expression of myogenic regulatory genes during
activation, proliferation, and differentiation of rat
skeletal muscle satellite cells, Journal of Cellular
Physiology, 159（2）,379～385, 1994.
３） Cooper, R. N., Tajbakhsh, S., Mouly, V., Cossu, G.,
Buckingham, M., Butler-Browne, G. S.：In vivo
satellite cell activation via Myf5 and MyoD inregenerating mouse skeletal muscle, Journal of Cell
Science, 112（Pt17）,2895～2901, 1999.
４） Hayashi, S., Yonekura, S.：Thermal stimulation
at 39℃ facilitates the fusion and elongation of C2C12
myoblasts, Animal Science Journal, in press.
５） Tominaga, M., Caterina, M. J.：Thermosensationand pain, Jounal of Neurobiology, 61（1）,３～12, 2004.
６） Premkumar, L. S.：Transient receptor potential
channels as targets for phytochemicals, ACS
Chemical Neuroscience, 5（11）,1117～1130, 2014.
７） Wrobel, E., Brzoska, E., Moraczewski, J.：
M-cadherin and beta-catenin participate indifferentiation of rat satellite cells, European Journalof Cell Biology, 86（2）,99～109, 2007.

であるギンゲロールやアリシンも筋形成能を促進する効果があるのか検討することも，将来，家畜の飼料化を考えるうえで重要であると考える。

© The Ito Foundation

405

家畜生産における抗生物質使用量の低減化を目指した「ミサイル」抗菌剤の創出
Synthesis of a “missile” -antibacterial reagent that can contribute to
reduction of the amount of antibiotics contained in livestock feed

榎

本

賢

（東北大学大学院農学研究科）

Masaru Enomoto（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

As the emergence of drug-resistant bacteria is increasing worldwide, the requirement for
novel therapeutic compounds is increasing. Although excessive use of antibiotics is generally
considered as the main cause for the emergence of drug-resistant bacteria, it is not wellknown that the amount of antibiotics used in livestock is greater than that used in humanbeings. In fact, veterinary medicines are casually added to feedstock even when the livestock
are healthy. Thus, the main origin of drug-resistant bacteria could be ascribable to livestock
production rather than to medical sites. It is believed that several kinds of drug-resistantbacteria such as MRSA and VRE have emerged due to improper or excessive use of veterinary
medicines, which are also used as human medicines. Therefore, this author reasons that efforts
to decrease the use of veterinary medicines could contribute to reduce the emergence of new
drug-resistant bacteria. Among the veterinary medicines used as feedstock additives,
ionophore antibiotics are very common. Therefore, we aimed to develop a novel ionophore
antibacterial agent that is superior to conventional analogs.
Our strategies for reducing ionophore antibiotic use are as follows：1）enhancement of
antimicrobial activity by increasing the affinity for cations；and 2）improvement of their
specificity for the target microbe.
Among ionophore antibiotics, monensin, a naturally occurring sodium ion-selective
ionophore produced by Streptomyces sp., is the most commonly used. To investigate its
modification site, we chemically synthesized some monesin analogs including a monensin dimer,
which is expected to show increased affinity for sodium ions, and also evaluated their biologicalactivity. Cytotoxic assays indicated that the C1-carboxylic acid function of monensin is
important for its biological activity.
Regarding improvement in the specificity of ionophore antibiotics for S. aureus, which
commonly causes livestock infection, we planned to utilize small peptides that specifically bindto S. aureus. Through a phage display analysis, a heptapeptide was found to be a candidate S.
aureus-specific binding agent.

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406
１．目

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

抗生物質は，このコンセプトの適用が可能と考察的できるので，標的を特異的に認識するペプチドを薬剤（多剤）耐性菌への対処は人類にとって喫緊の課題となっている。日本における抗生物質

ポリエーテル系抗生物質に連結して化合物を「ミサイル化」する。

使用の現状として，全抗生物質量の50％以上が家次に作用機構に着目すると，イオノフォア分子

畜生産の現場において使用されている。その目的は金属イオンを取り込むことで抗菌活性を示すのの過半は治療目的であるものの，飼料添加物としで，金属イオンとの親和性を高めれば活性の向上ても利用されている。これらの多くはポリエーテが期待できる。そこで，金属イオンの取り込みがル系抗生物質で，製造量全体の59％を占める 。

有利になるようにイオノフォアを二量化する。実

この種の抗生物質の中で最も使用量の多いモネン

際，Liuらはイオノフォア活性のポリエーテル系

シンは人の医療で使用されたことはなく，飼料添

抗生物質であるサリノマイシンの二量体が単量体

加物として家畜に給与された場合に選択される薬よりも２-５倍強い細胞毒性を示したと報告して剤耐性菌に関する食品健康影響評価においてもリいる３）。従来の官能基（構造）変換による生物活

スクは無視できる程度とされている。しかし，薬性向上戦略と比較して，二量化法はきわめて簡便剤耐性菌に関する詳細な情報は十分とは言えななアプローチである。

１）い 。そこで申請者は，ポリエーテル系抗生物質

本研究では，ポリエーテル系抗生物質の中で家を題材にして薬剤耐性菌出現リスクの低減と抗菌

畜に対する使用量が最も多いモネンシン（Mon）

活性の向上を目的として本研究に着手した。

を題材に，家畜感染症起因菌の中で最も一般的な

２）

ほとんどのポリエーテル系抗生物質は，細胞膜

黄色ブドウ球菌を標的として，従来の抗菌物質開においてイオノフォアとして作用することで抗菌発戦略とは一線を画す「ミサイル化」と「二量活性を示す。まず，標的部位が菌体表面（細胞膜）化」戦略により，特異性と抗菌活性が向上した抗であることに着目すると，ミサイル療法が効果的菌剤創出を目指した。

に適用できると予想した。ミサイル療法は，標的に選択的に薬剤を到達させる手法として注目され

２．方法ている。例えば，癌治療においては，癌細胞に特2.1

異的に結合する認識部位（抗体等）と抗癌剤を連

標的細菌（黄色ブドウ球菌）に特異的に結合す

結し，正常細胞と区別して選択性を高めることる ペ プ チ ド の 探 索 は ，研 究 分 担 者 米 山 に よ り

で，抗癌剤使用量と副作用の低減化を実現していファージディスプレイ法を利用して行った。具体る。このミサイル療法のコンセプトを利用すれ的には（Fig. 1A），NEB社 Ph.D.-7 Phage Display

ば，抗生物質を標的の菌体に選択的に輸送して，Library Kit（M13 ファージビリオン上にヘプタ

その付近に濃縮できる。効果的な方法であるが，ペプチドを提示したランダムペプチドライブラ

認識部位が結合する場所が菌（細胞）表面である

リー）を用いて，①表面にペプチドがランダムにため，菌体内で作用する抗生物質の場合，取り込呈示されたファージライブラリーと標的菌（S.

みが効果発現の障害になり得る。これを考慮する

aureus SA5）を反応させて，特異的に結合すると，薬剤の作用部位は菌体内よりも表面である方

ペ プ チ ド を 選 別 ，② 洗 浄 ，③ 標 的 菌 か ら 目 的が有利である。細胞膜に作用するポリエーテル系

ファージを溶出，④大腸菌（E. coli ER2738）に© The Ito Foundation

候補ペプチドの探索と化学合成

407

家畜生産における抗生物質使用量の低減化を目指した「ミサイル」抗菌剤の創出

よりファージを増幅，⑤得られたファージを再度化してMonを調製した後に，ノルマルブチルアミ

標的と反応させる，というサイクルを繰り返してンと縮合して目的物２を得た。

候補配列を得た。

一 方 ， ７ 位 修 飾 体 Monensin Methylester

さらに，シークエンス解析の結果から最も有望（MME）-7-アミド（６）は次のように合成した。

と考えられたペプチド配列の化学合成を試み，目

まず，Monに対して３工程の変換で１，25および的ペプチドの保護体１を合成した（Fig. 1B）。

26位を保護した化合物３を得た。このものの７位
ヒドロキシ基を直接修飾することも試みたが困難

2 . 2 モネンシン（Mon）修飾部位決定のためを極めた。この原因は７位ヒドロキシ基周辺が立の構造活性相関Monの抗菌活性を可能な限り保持してペプチ

体的に混み合っているためと考えられた。そこ

ドを連結するために（実際は間にリンカーを挟で，既知の方法を参考に１炭素増炭したカルボン

む），最適な修飾位置を決定するべく，誘導体の酸誘導体へと変換することにした６）。まず，化合調製と細胞毒性試験を実施した。Monには修飾可

物３のヒドロキシ基をケトンに変換した４を得

能部位が３ヶ所存在する。このうち，26位ヒドロた。さらにHorner-Wadsworth-Emmons反応にキシ基修飾体に関する研究は盛んに行われているより増炭，続く二重結合への水素添加により所望

ので４，５），１位カルボキシ基と７位ヒドロキシ基のカルボン酸５を得た。このものに対して，26位修飾体について細胞毒性の調査を行った。

ベンゾイル基および25位メチル基の除去，ノルマ
ルブチルアミンとの縮合により６の合成を完了し１位ヒドロキシ基修飾体Mon-1-アミド（２）た。

はFig. 2Aに示した方法で合成した。まず市販の細胞毒性試験は研究協力者此木の指導の下，以モネンシンナトリウム塩（MonNa）をプロトン

A

O

B
FmocHN

O
H
Ot-Bu

⑤再度
反応
標的菌
①反応

1）20% piperidine/DMF
2）Fmoc-Arg（Pbf）
3）20% piperidine/DMF
4）Fmoc-Lys（Boc）
5）20% piperidine/DMF
Peptide solid6）Fmoc-Arg（Pbf）
phase synthesis
7）20% piperidine/DMF
8）Fmoc-Leu
9）20% piperidine/DMF
10）Fmoc-Ile11）20% piperidine/DMF
12）Fmoc-Leu
H
H
HN
N Pbf HN
N Pbf
HN
HN

ランダムペプチド
ファージライブラリー

④ファージ
の増幅
大腸菌
③溶出

②洗浄
H2N

O

H
N
H

H
N
O

O
N
H

H
N
O

結合しなかったファージ

O
N
H

H
N
O

NHBoc
1

Fig. 1A Phage display method；Fig. 1B

Synthetic study of a candidate S. aureus-specific binding peptide.

© The Ito Foundation

O
O
H
OH

408

平成30年度
H

A

O

O H
H
O
H
O

O

25

26
OH
OH

O

CHCl3, rt
quant.

CO2Na
1

H

H

O

OH

H

O

26
25 OH
OH

HO 7

EDC·HCl, HOBt
n-BuNH2, DIPEAO

CH2Cl2, 0℃ to rt
75%

26
OH
O 25
O
H
OH
CONHn-Bu

MeO

Mon

Mon-1-amide（2）EDC·HCl, MeOH
CH2Cl2, 0℃ to rt, 79%

MonNa

O
CO2Me

O
CO2H

MeO

O

HO

MeO

HO 7
1 M HClO4

7
OHO

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

O

HOOH 1) PPTS, MeOH
0℃ to rt, 80%O2) BzCl, pyridine
0℃, 72%

O
CO2Me

MeO

MME

O
O
CO2Me

2）H2, 10% Pd/C, MeOH, rt, 58%

OMe

OBz

DMP, NaHCO3

O

CH2Cl2, rt
quant.

O
CO2Me

MeO

3

O

H

OMe

OBz

4

CONHn-Bu

CO2H
1）NaH,（MeO）
P（O）
CH2CO2Bn
2THF, 0℃ to rt, 68%

H

O

MeO

H

O

OMe

OBz

1）28% NaOMe, THF, 0℃, 43%2）0.01 M FeCl3, iPrOH/H2O
（1:1）
, 57%

O

3）n-BuNH2, HBTU, DIPEACH2Cl2, 0℃ to rt, 16%

MeO

5

O
CO2Me

H

O

OH

OH

MME-7-amide（6）

B
HO
O

O

H

O

OH

OMe
H
N
O

OH

H 2N

7
CH2Cl2/CHCN
rt to 40℃, 34%

HO 7

HBTU

HBTU
H2 N
Mon

O
9

O

NH2

O

O

H

OMe
H
N

CH2Cl2/CHCN
rt to 40℃, 15%

O

26
25 OH
OH

O

O

O

8
HO

OH H
O

O
N
H
MeO
O

O
OH

10

Fig. 2A Preparation of Mon-1-amide（2）and MME-7-amide（6）；Fig. 2B

Preparation of amide 8 and monesin dimer 10.

下の要領で行った。まず，市販のMonNa（Sigma-

30 mMメタノール溶液を２μＬずつ96穴マイクロ

Aldrich，純度95％），MME，Mon-1-アミド（２）プレート内のＰ388細胞液（5,000 cells/200μL）

およびMME-７-アミド（６）の10μＭ，100μに添加した。37℃で24時間インキュベート後にand 1 mMメタノール溶液を２μLずつ96穴マイ

WST-８を添加し，さらに３時間後450 nmの吸光

クロプレート内のＰ388細胞液（5,000 cells/200

度を測定した。

μL）に添加した。37℃で24時間インキュベート

2.3

後にWST-８を添加し，さらに３時間後450 nmのMon二量体の合成に関して，３ヶ所の修飾可能

吸光度を測定した。

モネンシン（Mon）二量体の調製部位のうちどの部位で二量化することが最適か検

２および６に関するより詳細な細胞毒性試験は討する必要があったが，当面の標的として，最も以下の要領で行った。まず，MME，２および６修飾が容易な１位カルボキシ基で二量化した化合の 0.3 mM ， 1.0 mM ， 3.0 mM ， 10 mM お よ び

物の調製を試みた（Fig. 2B）。当初は，Monをア© The Ito Foundation

家畜生産における抗生物質使用量の低減化を目指した「ミサイル」抗菌剤の創出

409

ミド８へと導き，このものをクロスメタセシス反あった。このうち，頻度１位の配列であるLeu-

応により二量化することを目指した。しかし，二Ile-Leu-Arg-Lys-Arg-Thrをペプチド固相合成

量化には成功したものの，生じた化合物の二重結法により化学合成を試みた。現在までに目的ペプ合の還元が進行しなかった。そのため種々検討しチドの保護体１を得ているので，今後は選択的にた結果，Monをトリエチレンジアミン誘導体９と主鎖アミノ基，もしくはLys側鎖アミノ基にリン縮合することで，低収率ながらもMon二量体10をカーを導入してMonと連結する予定である。

合成することができた。

3 . 2 モネンシン（Mon）アナログの細胞毒性

細胞毒性試験は，以下の要領で行った。まず，

試験

市 販 の MonNa（Sigma-Aldrich ，純 度 95 ％ ），天然物であるMonNaと調製したMME，Mon-

Mon二量体10およびアミド８の10μＭ，100μM

1-アミド（２）およびMME-7-アミド（６）にand 1 mMメタノール溶液を２μLを96穴マイクロ

対して，WST-８を発色試薬とし，Ｐ388細胞をプ レ ー ト 内 の Neuro 2A 細 胞 液（41,000 cells/200

用いた細胞毒性試験を行った。その結果，MME

μL）に添加した。37℃で48時間インキュベート

を含む誘導体の細胞毒性は天然物より大幅に低後にWST-８を添加し，さらに３時間後450 nmの

く，0.10-10μＭ間の濃度においては誘導体間の活吸光度を測定した。

性強度にあまり差がない結果となった（Fig.３）。
さ ら に MME ，Mon-1- ア ミ ド（２）お よ び

３．結果と考察
3.1

MME-7-アミド（６）間での活性強度の差を比候補ペプチドの探索と化学合成較するべく，詳細な細胞毒性試験を行った（Fig.

バイオパニングで獲得した43種類のファージラ

４）。そ の 結 果 ，多 少 の 差 異 は あ る も の の ，

イブラリーの塩基配列を解析し，21種類の配列を0.30 mM-3.0μＭ間の濃度に関しても各誘導体間得た。そのうち，複数回現れた配列は６種類ででの活性強度に大きな差はないことが示唆される

1.200

cell viability

1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000

1.00E-07
Mon

1.00E-06
concentration [M]MME

Mon-1-amide

1.00E-05
MME-7-amide

Fig. 3 Growth inhibition of P388 cells in the presence of monensin sodium salt（Mon）, monensin methyl ester（MME）,

monensin-1-amide（1-amide）or MME-7-amide（7-amide）. After an aliquot of the cell suspension（5,000 cells/200μL）was incubated with monensin sodium salt（monensin）, momensin methyl ester（MME）, monensin-1-amide（1-amide）or MME-7-amide（7-amide）at the designated concentration for 24h at 37℃ and 5％ CO ２/air
atmosphere. The relative cell viability was measured using WST-8 and plotted against the concentration of thecompound.

© The Ito Foundation

410

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

1.200cell viability

1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000

3.00E-06 1.00E-05 3.00E-05 1.00E-04 3.00E-04
concentration [M]MME

Mon-1-amide

MME 7-amide

Fig. 4 Growth inhibition of P388 cells in the presence of monensin methyl ester（MME）, monensin-1-amide（1-amide）

or MME-7-amide（7-amide）. After an aliquot of the cell suspension（5,000 cells/200μL）was incubated withmonensin methyl ester（MME）, monensin-1-amide（Mon-1-amide）or MME-7-amide（MME 7-amide）at thedesignated concentration for 24 h at 37℃ and 5％ CO２/air atmosphere. The relative cell viability was measured
using WST-8.

結果となった。

1
0.9

れているという点であることから，１位のカルボ

Monensin
Analog0.8

Dimer

キシ基がMon一量体のイオノフォアとしての活0.7

性強度に大きく関係していることが示唆された。

0.6

3 . 3 モネンシン（Mon）二量体の細胞毒性試験得られたMon二量体10を，MonNa（monensin）

cell viability

誘導体の共通点が１位のカルボキシ基が修飾さ

0.5
0.4

およびアミド８とともに細胞毒性試験に供したと

0.3

ころ，８と10は細胞毒性が共にMonの約1/100で0.2あるという結果が示された（Fig.５）
。またアミ

0.1

ド８と二量体10の活性に大きな差がなかった。イ0
1.00E-07

オン輸送試験ではなく細胞毒性試験の結果ではあるものの，１位のカルボキシ基で二量体した化合物は二量化の恩恵を受けておらず，ナトリウムイ
オンの取り込み能が向上していないことが示唆された。今後は二量化の修飾位置を中心に，リンカーの種類・長さも含めて，さらなる検討を行う
予定である。
４．要

1.00E-06
Concentration（M）

1.00E-05

Fig. 5 Growth inhibition of Neuro 2A cells in thepresence of monensin sodium salt （Monensin）,
amide 8（Analog）or dimer 10（Dimer）. After analiquot of the cell suspension（41,000 cells/200μL）
was incubated with monensin sodium salt
（Monensin）,amide 8（Analog）or dimer 10（Dimer）
at the designated concentration for 24 h at 37℃ and
５％ CO ２ /air atmosphere. The relative cell viability
was measured using WST-8 and plotted against theconcentration of the compound.

約

本研究では，家畜飼料添加物として使用されるを目指して研究を行った。

抗生物質Monの使用量削減に向けて，「ミサイル「ミサイル化」に関しては，研究分担者米山が化」と「二量化」による選択性と抗菌活性の向上

黄色ブドウ球菌特異的な結合を示す候補配列とし© The Ito Foundation

家畜生産における抗生物質使用量の低減化を目指した「ミサイル」抗菌剤の創出て同定したペプチド配列Leu-Ile-Leu-Arg-LysArg-Thrの化学合成を実施した。これまでに保護体１の合成に成功しているので今後，Monの連結を実施する。Mon側の修飾に関しては，１位カルボキシ基が活性発現に重要な役割を果たしていることが確認されたので，今後は７位もしくは26位での修飾を目指す。
「二量化」についても，１位カルボキシ基の重要性が再確認されたので，今後はイオン対の形成が促進されるようにカルボキシ基を残した二量体の合成を目指す。
文献１） 小嶋二三夫：飼料検査，478，１～８，2003.
２） 食品安全委員会 評価書：https://www.fsc.go.jp/
fsciis/evaluationDocument/print/kya20070419050

411３） Huang, M., Deng, Z., Tian, J., Liu, T.：Synthesis
and biological evaluation of salinomycin triazole
analogues as anticancer agents, E. J. Med. Chem.,
127, 900～908, 2017.
４） Westley, J. P., Evans, Jr., R. H., Sello, L. H.,
Troupe, N., Liu, C.-M., Miller, P. A.：Isolation ofnovel antibiotics X-14667A and X-14667B from
Streptomyces cinnamonensis subsp. urethanofaciens
and their characterization as 2-phenethylurethanesof monensins B and A, J. Antibiot., 34, 1248～1252,
1981.
５） Westley, J. P., Liu, C.-M., Evans, Jr. R. H., Sello, L.
H., Troupe, N., Hermann, T.：Preparation, properties
and biological activety of natural nd semisynthetic
urethanes of monensin, J. Antibiot., 36, 1195～1200,
1983.
６） Nagatsu, A., Tabunoki, Y., Nagai, S., Ueda, T.,
Sakakibara, J., Hikada, H.：Studies on Chemical
Modification of Monensin. VI. Preparation of C-7
Modified Monensins via Protected 7-Oxomonensin
and Evaluation of Their Ion Transport Activity,
Chem. Pharm. Bull., 45, 966～970, 1997.

© The Ito Foundation

412

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響（Ⅱ）
Effects of rice feeding on growth performance and protein（amino acids）
metabolism of weaning piglets（Ⅱ）

高田

良三・田坂

祐介・立原

可南子

（新潟大学農学部）

Ryozo Takada, Yusuke Tasaka and Kanako Tachihara（Faculty of Agriculture, Niigata University）

In this study, we investigated the effects of feeding rice on growth performance andprotein（amino acids）metabolism of weaning piglets using slightly high protein diet. Twenty
weaning piglets with an average initial weight of 8.1kg were divided into two groups. One
group was fed a corn-soybean meal diet, and the other was fed a rice-soybean meal diet,containing about 45％ of corn or rice, respectively. CP contents in the corn diet（23.5％）and
rice diet（24.2％）were about ３％ higher than its recommendation. A two weeks growth trial
was conducted and growth performance, liver lysine-ketoglutarate reductase（LKR）and
threonine dehydrogenase（TDH）activities, plasma urea nitrogen, glucose, insulin and freeamino acids concentrations were measured. Liver LKR mRNA and loin muscle branched chainketo acids dehydrogenase（BCKDH）mRNA expressions were also measured. The feed
efficiency（gain/feed）in the rice group were significantly higher than that in the corn group.
Liver LKR activity was significantly lower（p＝0.013）in the rice group than that in the corngroup. Plasma urea nitrogen concentration in the rice group tended to be lower（p＝0.079）
than that in the corn group. There were no significant differences in plasma insulin and glucose
concentrations under the condition of ad libitum feeding. LKR mRNA expression in the ricegroup tended to be lower （p＝0.091）than that in the corn group. Plasma free valine
concentration was significantly higher in the rice group than that in the corn group. Plasma
free isoleucine concentration tended to be higher（p＝0.071）in the rice group than that in thecorn group. In general, these results show that the rice feeding affect the protein and aminoacids metabolism as well as improvement of growth performance in weaning piglets.

１．目がかかり，しばしば発育の停滞や下痢の発生が起的きる。一方，食料自給率の向上および休耕田の有離乳子豚は，母豚からの急激な隔離・消化管の効利用を目的として飼料用米の利活用が活発に

未成熟・母乳から穀物主体の飼料への急変・複数なってきた。そこで消化性が優れる特徴を有するの腹兄弟の同一豚房での飼育等，多くのストレス

飼料用米を離乳子豚に給与することを試みた。海© The Ito Foundation

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響（Ⅱ）

413

外ではこれまでにスペインのMateosらのグルー

期間を５日間とした。飼料用米を約45％含む飼料

プと オ ー ス ト ラ リ ア の Pluske ら の グ ル ーを２週間給与する飼養試験を行い，日増体量，飼プ５，６）が離乳子豚に対する飼料用米の研究を行っ

料摂取量および飼料効率を求めた。飼養試験終了ており，飼養成績の改善や下痢発生の軽減効果が後，子豚をと畜し，血液，肝臓，ロースを採取し報告されている。当研究室においてもYagamiて各種成分や酵素活性，mRNA発現量を測定した。

１ ～ ４）and Takada

７）によって離乳子豚への飼料用米給

2.1

飼養試験

与によって使用成績の改善や，小腸膜酵素活性の2.1.1上昇を報告している。このような背景下，昨年度

飼料の配合割合をTable１に示した。

の当報告 では離乳子豚に飼料用米を給与し，以８）

離乳子豚を用いる実験

試験区：

下のような結果が得られた。飼料用米給与によっ

対照区………トウモロコシを約45％配合して，①日増体量の改善のみならず，初めて飼料効た対照飼料率の有意な向上を確認，②血漿中尿素態窒素の有

飼料用米区…トウモロコシを飼料用米（玄意な低下，③血漿中グルコースおよびインスリン米）で完全代替した飼料用米の有意な上昇，④血漿中分岐鎖アミノ酸（バリン飼料

お よ び イ ソ ロ イ シ ン）の 有 意 な 上 昇 ，⑤ 肝 臓 なお，両試験区のアミノ酸含量がほぼ等

Lysine-ketogltarate reductase（LKR，リジン分

しくなるように，リジン，メチオニン，ト解酵素）活性の低下傾向，以上のような興味ある

レオニン，およびトリプトファンを添加し結果が得られた。そこで，今年度は飼料効率の改て調整した。

善およびアミノ酸分解代謝に焦点を当てて検討を

供試動物：約28日齢の離乳子豚20頭を２試験行った。飼料中のタンパク質含量をやや高めにし区に10頭ずつ振り分けたて確実にすべてのアミノ酸が十分量飼料中に存在

試験期間：２週間。その間不断給餌，自由飲するようにして飼料効率の改善が確認できるか否かを試みた。また，採血を不断給餌条件下で行い，

水
分析項目：

より実際の飼養条件下での血中成分の変動を検討

血中尿素態窒素濃度，遊離アミノ酸濃度，

し た 。 肝 臓 LKR 活 性 に 加 え て Threonine

およびインスリン・グルコース濃度。な

dehydrogenase（TDH ，ト レ オ ニ ン 分 解 酵 素）お，採血は不断給餌条件下および絶食再給活性も測定した。さらにLKR mRNAおよび分岐餌条件下で行い，血中尿素態窒素濃度，遊鎖 ア ミ ノ 酸 分 解 の 律 速 と さ れ て い る Branched

離アミノ酸濃度は不断給餌条件下のサンプ

chain keto acids dehydrogenase （BCKDH）

ルのみ分析した。

mRNA発現量も測定した。ここで得られる結果

肝 臓 中 の リ ジ ン 分 解 酵 素 （Lysineを基に，飼料用米給与による離乳子豚の飼料効率

ketoglutarate reductase, LKR）活 性 お よ改善およびタンパク質（アミノ酸）代謝変動のメ

び ト レ オ ニ ン 分 解 酵 素 （Threonine

カニズムを明らかにすることを目的とした。

dehydrogenase, TDH）活性２．方肝 臓 LKR mRNA 発 現 量 お よ び ロ ー ス

法

BCKDH mRNA発現量

約23日離乳の子豚を実験動物として用い，馴致© The Ito Foundation

414

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 Composition of experimental diets（g/kg）
Item

Corn

Rice

Ingredients
Corn

448.6

－

Brown rice

－

444.7

Soybean meal

125

125

Soybean meal（extruder）

125

125

Dried skim milk
Concentrated soyprotein

150
50

150
60

Soybean oil

60

55

Dicalcium phosphate

15

15

Calcium carbonate

6

6

Sodium chloride
L-lysine・HCl

5
3.3

5
3

DL-methionine
L-threonine

2
1.4

1.4
1.4

L-tryptophan
Vitamin mixture１）

0.2

0

4.5

4.5

Mineral mixture２）

22Antibiotics３）

2

2

Calculated chemical composition
ME（MJ/kg）
CP（g/kg）
Calcuium（g/kg）
Phosphorus（g/kg）
４）
L-lysine（g/kg）

15.3
235
90
70

15.3
242
90
73

17.3
9.5
10.6
3

17.7
9.7
10.8
2.9

DL-methionine + cystine（g/kg）
L-threonine（g/kg）4）
L-tryptophan（g/kg）１）Provided the following（per kg of diet）：retinol, 6 mg; cholecalciferol, 100 μg；
αtochopherol acetate, 200 mg；thiamine mononitrate, 2.5 mg；riboflavin, 17.5 mg；
pyridoxine HCl, 1.25 mg；D-Ca pantothenate, 272.5 mg；nicotinamido, 15 mg；
choline chloride, 1440 mg.
２）Provided the following（per kg of diet）； Mn, 100 mg ； Fe, 100mg ； Cu, 20mg ；ZnCO3, 120 mg；CaI2, 2 mg.
３）Provided the following（per kg of diet）； avilamycin, 20 mg titre ； colistin sulfate,
20mg titre；morantel citrate, 30 mg titre４）Analysed data

プ１～４）では飼料用米給与による増体量の改善は報３．結果と考察

告しているものの飼料効率の上昇は確認されてい飼養成績の結果をTable２に示した。日増体量ない。今回の実験において，昨年度と同様な飼料（g/d）は飼料用米区がトウモロコシ区に対して効率が上昇した原因について以下のことが推察さ高くなる傾向（p＝0.053）を示した。飼料摂取量れる。近年の豚はその成長能力が著しく改善されは両試験区間に差は認められず（p＝0.295），結ており，その結果として栄養素要求量，特にアミ果 と し て 飼 料 効 率 は 飼 料 用 米 区 で 有 意（p ＝ノ酸要求量が高まっている。それを考慮して今回

0.021）に高くなる値を示した。このような飼料は飼料中のアミノ酸が十分量存在するように，や効率の有意な上昇は，昨年度の当報告とよく一致

や高めのタンパク質含量とした。また，リジン含した。海外の報告においてはMateosらのグルー量は17.3ｇ（トウモロコシ区），17.7ｇ（飼料用米© The Ito Foundation

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響（Ⅱ）

415

Table 2 Growth performance of piglets fed a diet with corn or rice.
Corn

Rice

p-value

8.0±0.2

8.2±0.3

0.498

0 to 1 week

308±36395±370.046

1 to 2 week

620±45687±400.112

0 to 2 week

464±38541±360.053

0 to 1 week

356±27410±320.084

1 to 2 week

774±46793±52

0.692

0 to 2 week

561±36601±41

0.295

0 to 1 week
1 to 2 week

0.866±0.05
0.795±0.02

0.956±0.04
0.873±0.03

0.098
0.045

0 to 2 week

0.819±0.03

0.903±0.02

0.021

Initial body weight（kg）
Average daily gain（g/d）

Average feed intake（g/d）

Feed efficiency（gain/feed）

Values are means ± SE （n=10）

Table 3 Plasma glucose, insulin and urea nitrogen concentrations in piglets fed a diet withcorn or rice.

Glucose（mg/dL）
ad libitum feeding
fasting
Insulin（μg/L）
ad libitum feeding
fasting
Plasma urea nitrogen（mg/dL）
ad libitum feeding

Corn

Rice

p-value145±12
120±4

144±6
129±6

0.938
0.183

0.134±0.040
0.029±0.009

0.077±0.022
0.046±0.013

0.217
0.190

15.0±0.9

13.0±0.7

0.079

Values are means ± SE（n=10）区）であり，NRC９）のリジン要求量（1.53％）を血漿中の尿素態窒素，グルコースおよびインス

大きく上回っている。飼料効率が改善されなかっリン濃度の結果をTable３に示した。血漿中尿素た 我 々 の 以 前 の 報 告 ７）に お け る リ ジ ン 含 量 は態窒素濃度は飼料用米区でトウモロコシ区よりも1.3％であり，成長の優れる子豚に対してはやや低くなる傾向が見られた（p＝0.079）。この結果不足であった可能性が高い。飼料用米給与によっは昨年度の結果と比べてp値は大きくなったが，てさらに増体量が高くなり，やや不足気味のアミ

これは今年度の飼料中タンパク質含量を高めた結ノ酸を満たすために飼料摂取量が高くなっていた

果，尿素態窒素濃度の値が高くなり，その結果，のかもしれない。今回および昨年度の結果はいず差が現れにくくなったものと思われる。しかし両れも飼料摂取量に差はなく，結果として飼料効率試験区間で傾向は認められるため，昨年度とほぼの有意な改善が認められたことから，離乳子豚の同様な結果が得られたものと解釈できる。昨年度

アミノ酸要求量はかなり高くなっているものと推は血漿中インスリン，グルコース濃度いずれも有測される。

意に飼料用米区で高くなったが，今年度は同じサ© The Ito Foundation

416

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 4 Liver lysine-ketoglutarate reductase（LKR）and threonine dehydrogenase（TDH）

activities in piglets fed a diet with corn or rice.
Corn

Rice

p-value1.34±0.09

1.01±0.08

0.013

1.56±0.23

1.24±0.22

0.323

LKR
μmole/min/g liver
TDH
μmole/min/g liver
Values are means ± SE（n=10）

Table 5 Relative mRNA expressions of liver lysine-ketoglutarate reductase（LKR）and loinmuscle branched chain keto acids dehydrogenase（BCKDH）of piglets fed a diet withcorn or rice.

LKR
BCKDH

Corn

Rice

p-value

1.000±0.153
1.000±0.355

0.684±0.082
0.719±0.162

0.091
0.484

The normalized expression ratio in the corn group is set to 1.000
Values are mean ±SE（n=10）

ンプリング条件下（絶食再給餌）の値においてもれ，リジンの再利用が高まっていることを示唆し

飼料用米区で数値自体は高くなったが有意差は見ている。ロース筋肉中のBCKDH mRNA発現量られなかった。これもおそらく今年度の高タンパ

は両試験区間で差は認められなかった。分岐鎖アク質飼料が影響しているかもしれない。一方，不ミノ酸の分解系は筋肉におけるBCKDHのリン酸

断給餌条件下のサンプルでは，インスリン濃度は化によって制御されているとされている。した

有意ではないが飼料用米区で逆に低い値を示しがってBCKDHリン酸化酵素活性やBCKDHのタた。飼養成績や血漿中尿素態窒素濃度，肝臓LKR

ンパク質量，さらに筋肉ではなく肝臓におけるこ活性の変動を考慮すると，体内でのインスリン作

れらの変化も必ずしも明確にはされておらず，詳

用は飼料用米区で強く働いているように思われ細な検討が今後必要である。

る。それにもかかわらず飼料用米区でインスリン

血漿中の遊離アミノ酸濃度について，バリンの濃度が低かったことは，インスリン感受性が飼料

み飼料用米区で有意に上昇し，イソロイシンは高用米区で高まっていたのかもしれない。

くなる傾向（p＝0.071）が見られた（Table６）。

肝臓のLKR活性およびTDH活性をTable４に示

この結果は昨年度の結果よりも変動が緩やかであした。LKR活性は飼料用米区で有意（p＝0.013）

り，尿素態窒素濃度と同様な違いであった。このに低くなり，TDH活性は有意ではなかったが，違いも飼料中の高タンパク質含量が影響し，両試低い数値を示した。また，肝臓のLKR mRNA発

験区間の差が現れにくくなったものと考えられる。

現量およびロース筋肉中のBCKDH mRNA発現
量をTable５に示した。LKR mRNA発現量は飼料

４．要

約用米区で低くなる傾向（p＝0.091）が認められ高タンパク質飼料を用いて離乳子豚への飼料用た。この結果は肝臓でのリジンの分解が抑制さ

米給与を飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）© The Ito Foundation

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響（Ⅱ）

417

Table 6 Plasma free amino acids concentrations in piglets fed a diet with corn or rice.
Corn

Rice

p-value

Threonine355±18408±490.255

Valine292±27390±52

0.009

Methionine

157±23135±180.23

Isoleucine

175±16229±330.071

LeucinePhenylalanine

223±13113±8219±27115±16

0.844
0.849

Histidine

102±10100±17

0.839

Lysine217±10207±43

0.849

Arginine

262±28226±46

0.518

Tryptpphan
Nonessential amino acids, μmol/L

112±18

99±18

0.073

Aspartic acid
Serine26±7212±1721±3
214±26

0.320
0.929

glutamic acid
Glycine
AlanineTyrocine

174±22

171±161097±53148±27157±71187±105428±44171±17

0.820
0.463
0.809
0.506

Essential amino acids, μmol/L

Values are means±SE（n=10）

代謝に及ぼす影響について検討を行った。高タン

ると，飼料中のアミノ酸が十分量存在している時

パク質飼料を用いた理由はすべてのアミノ酸が確

は増体のみならず飼料効率も改善され，タンパク実に十分量満たされるようにしたためである。日質（アミノ酸）代謝は影響を受けてタンパク質蓄

増体量および飼料効率は飼料用米区がトウモロコ

積量が高まる方向に変動することを示している。

シ区よりも優れる結果を示した。血漿中の尿素態
窒素濃度は飼料用米区で低くなる傾向が見られ，また，グルコースおよびインスリン濃度は不断給
餌条件下のサンプルでは有意差は認められなかった。肝臓におけるリジン分解酵素（LKR）活性は飼料用米区でトウモロコシ区よりも有意（p＝0.013）に低くなった。同様にLKR mRNA発現量も低くなる傾向（p＝0.091）が認められた。このことはおそらく飼料用米給与によって体内でのリジン分解は抑制されているものと示唆される。豚にとってもっとも重要な必須アミノ酸であるリジン（要求量が高く，かつもっとも欠乏しやすい）の分解が抑制され，再利用が高まっていることは豚の栄養状態にとってきわめて好ましいことである。
これらの結果は，離乳子豚に飼料用米を給与す

文献１） Mateos, G. G., Martin, F., Latorre, M. A., Vicente,
B., Lazaro, R.：Inclusion of oat hulls in diets foryoung pigs based on cooked maize or cooked rice,
Animal Science, 82, 57～63, 2006.
２） Mateos, G. G., Lopez, E., Latorre, M. A., Vicent, B.,
Lazaro, R. P.：The effect of inclusion of oat hulls inpiglet diets based on raw or cooked rice and maize,
Animal Feed Science and Technology, 135, 100～112,
2007.
３） Vicente, B., Valencia, D. G., Serrano, M. P., Lazaro,R., Mateos, G. G.：Effects of feeding rice and thedegree of starch gelatinization of rice on nutrient
digestibility and ileal morphology of young pigs,
British Journal of Nutrition, 101, 1278～1281, 2009.
４） Parra, N., Lazaro, R. P., Serrano, M. P., Valencia, D.
G., Mateos, G. G.：Influence of the inclusion of
cooked cereals and pea starch in diets based on soy
or pea protein concentrate on nutrient digestibility
and performance of young pigs, Journal of Animal
science, 88, 671～679, 2010.
５） Pluske, J. R., Siva, P. M., Pethick, D. W., Durmic, Z.,© The Ito Foundation

418

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Mullan, B. P., Hampson, D. J.：The incidence ofswine dysentery in pigs can be reduced by feeding
diets that limit the amount of fermentable substrateentering the large intestine, Journal of Nutrition,
126, 2920～2933, 1996.
６） Pluske, J. R., Black, B., Pethick, D. W., Mullan, B. P.,
Hampson, D. J.：Effects of different sources andlevels of dietary fibre in diets on performance,
digesta characteristics and antibiotic treatment ofpigs after weaningm Animal Feed Science andTechnology, 107, 129～142, 2003.

７） Yagami, K., Takada, R.：Dietary rice improves
growth performance, mucosal enzyme activities andplasma urea nitrogen in weaning piglets, Animal
Science journal, 88, 2010～2015, 2017.
８） 高田良三，香川龍太郎，立原可南子：離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響，平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書VOL.36. 356～361，2018.
９） National Research Council, Nutrient Requirementof Swine, 211, National Academic Press, Washington,
D.C., 2012.

© The Ito Foundation

419

カリウムおよびセシウムの含量が低い国産実用牧草品種の選抜と育種に向けた植物生理学的解析
Species and cultivar selection for low potassium and low cesium in grasses

小

林

奈通子・二

瓶

直

登

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Natsuko I. Kobayashi and Naoto Nihei（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

Identifying the low-Cs grass cultivars among the cultivars commercially grown in Japanis an important issue to achieve the recycle-based cattle farming in the radiocaesium
contaminated area. For the health of cows, low-K is also the important property of grass. In
this study, mineral contents and Cs uptake characteristics in five domestic cultivars were
investigated to identify the cultivars having low-Cs and low-K property, which can be goodmaterials for breeding. Plants were grown in pots filled with forest soil contaminated by Cs137（9000 Bq/kg）in a plant-growth chamber, and the contents of K, Ca, Mg, Na, and also Cs137 in shoot parts were determined. The result showed that Potomac（orchard grass）
accumulated Cs-137 two times as high as ryegrass cultivars. The K concentration in Regro（meadow fescue）was higher than other cultivars. Regro also showed the lowest Cs/K ratio,suggesting this cultivar can be useful for producing a cultivar having good K selectivity overCs. Then, three ryegrass cultivars, Hitachihikari（Italian ryegrass）, Akiaoba Ⅲ（Italianryegrass）, Yatsuyutaka（perennial ryegrass）, were cultivated in the field in Iitate village,
Fukushima, for further evaluation. The concentration of K in the three cultivars was notdifferent among them, while the Cs-137 and Ca concentration was higher in Hitachihikari
comparing with Yatsuyutaka. Additionally, the experiment using Cs-137 as a radiotracer
indicated that root Cs＋ uptake rate（pmol/mm root length/20 min）was high in Hitachihikari.
Considering that the concentrations of available K in forest soil and the field soil were
5.3mg/100g（low-K）and 17.2mg/100g（intermediate-K）, respectively, Yatsuyutaka can be a
candidate as a cultivar having low-K and low-Cs concentration under various environment.
Further experiment is needed to determine the K and Cs uptake properties in this cultivar.

１．目発を目指すものである。飼料作物の安定的かつ低的コストでの生産のためには，有用品種を作出する

本研究は，国産でまかなうべき牧草において，ことが重要な要素となっている。有用品種に求め牛のために低カリウムで，かつ食の安全に資するられる形質には，減肥条件での高い生産性など複ために低セシウムである品種を選抜する技術の開数あるが，チェルノブイリでの事故以降，放射性© The Ito Foundation

420

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

物質を吸収しにくいことも重要な形質と考えられニウムで抽出される乾土100ｇあたりの可給態イるようになった。

オン濃度は，Ｋ5.3mg，Ca5.0mg，Mg0.76mg，

牧草以外の農作物の生産においては，カリウム

水抽出画分のpHは4.0であった。

（Ｋ）を増肥することでCs吸収を十分に抑制でき牧草はポトマック（オーチャードグラス），ア

ることが学術的な知見とともに認知されている

キアオバⅢ（イタリアンライグラス），ヤツユタ

が，草地へのＫ増肥は栽培コストの上昇につカ（ペ レ ニ ア ル ラ イ グ ラ ス），リ グ ロ（メ ド ー

ながるうえ，牧草中のＫ濃度の上昇は牛にグラスフェスク），ヒタチヒカリ（イタリアンライグラ

テタニーを引き起こすことから ，持続的な対処

ス）の５種類であり，それぞれを３ポットずつ植法としては不十分である。このような中，国内で物育成器（25℃，L/D＝12h/12 h）で栽培した。

も，福島第一原子力発電所の事故のあと2012年度

播種から１ヵ月後に地上部を刈り取り，乾熱器でには食品の放射性セシウム（Cs）濃度に100Bq/

乾燥させ，プラスチックバイアルに充填し，ガンkg と い う 基 準 値 が 定 め ら れ た こ と も あ り

マ カ ウ ン タ ー（Wizard2 ，PerkinElmer）で Cs-（https://www.mhlw.go.jp/shinsai_jouhou/

137を定量した。測定後のサンプルに，硝酸を添

shokuhin.html），いかなる環境においても常にＫ

加し90℃に加温して完全に分解し，分解液を超純とCsの含量が低い品種へのニーズが高まってい水 で 適 宜 希 釈 し た 後 に ICP 発 光 分 光 分 析 装 置る。そして，有用品種の作出のためには，国内の（Optima 7300，PerkinElmer）で無機元素濃度を既存の草種・品種について，ＫとCsの濃度に関

測定した。

１，
２）

３）

する情報の集積が欠かせない。特に，除染後の農2.2地を使い，飼料生産と合わせた畜産業を再開する

福島県飯舘村小宮地区の畑地でアキアオバⅢ

動きも広がっていることから，低Cs品種の特定（イタリアンライグラス），ヤツユタカ（ペレニアは喫緊の課題と言える。そこで本研究では，国内

ルライグラス），ヒタチヒカリ（イタリアンライの実用品種の中でのＫとCs濃度の草種・品種間グラス）を栽培し，地上部に含まれるCs-137，K，差を明らかにし，さらに，牧草の持つCsの吸収

Ca，Mg，Na濃度を調べた。畑地土壌のCs-137

特性を実験的に明示することを通して，変動する濃度は10000Bq/kg，交換性Ｋ濃度は17.2mg/100

栽培環境下においても低Ｋ濃度と低Cs濃度とい乾土，pH6.2であった。2018年６月に播種し，９う表現型を安定して示す品種を特定し，有用品種

月に収穫した。無機元素および放射線の測定方法作出に向けた材料として提示することを目的としは2.1に記述したとおりである。
2.3

た。
２．方
2.1

畑地での栽培試験

Cs-137を用いたトレーサー試験

寒天培地でヤツユタカ（ペレニアルライグラ

法ス），ヒタチヒカリ（イタリアンライグラス）を10日間栽培し，Cs-137を添加した寒天培地（吸植物育成器でのポット栽培試験

福島県飯舘村小宮地区の山林土壌を用いて牧草収培地）に移植し，20分後の植物のCs-137含量をポット栽培し，地上部に含まれるCs-137，K，と根長を測定することで，根の単位長当たりのカルシウム（Ca），マグネシウム（Mg），ナトリ

Cs＋吸収速度を算出した。寒天培地の基本組成は

ウム（Na）の含量を調べた。使用した土壌のCs-

1/2木村氏Ｂ液４）（0.27mM K）に塩化セシウムを137濃度は約9000Bq/kgであり，１Ｍ酢酸アンモ

0.1μＭ添加したものとした。吸収培地のＫ濃度は© The Ito Foundation

カリウムおよびセシウムの含量が低い国産実用牧草品種の選抜と育種に向けた植物生理学的解析

0.03mM，0.27 mM，および３mMに調整した。

Ca

Cs-137を吸収させた牧草の根を純粋で洗浄した
あと，地上部と根に切り分け，両面テープを貼りK

Cs-137

付けた台紙に貼り，ラップで覆い，イメージング

421

PotomacAkiaoba Ⅲ
Yatsuyutaka
Regro
Hitachihikari

プ レ ー ト（BAS-IP-MS ，GE Healthcare）に 密着させた。イメージングプレートはFLA5000イ
メージリーダー（FujiFilm）を用いて読み取った。Cs-137のシグナル（PSL）強度に基づいて20分間に吸収されたCs 量を算出した 。
＋

５）

３．結果と考察
ポット栽培した牧草５品種の無機元素濃度の平

Na

Mg

Fig.１
Relative concentrations of elements in the shoot of 5

grass cultivars. Grasses were grown in the pots placed in
the plant growth chamber. Contents of Ca, K, Mg, andNa were measured using ICP-OES, and Cs-137 wasdetermined using Ge semiconductor radiation detector.
The concentration values relative to the mean
concentration in 5 cultivars were plotted.

均値は，Ｋは3.58mg/g，Caは1.21mg/g，Mgは0.83mg/g，Naは1.37mg/ｇであった。また，Cs137濃度の平均は4.2Bq/gであり，移行係数の平均

リ，およびペレニアルライグラスであるヤツユタ

値は0.47となった。ポット栽培に利用した山林土

カはCs-137とＫ濃度がともに低いことから，低壌はＫ濃度が5.3mg/100ｇ乾土であり，作物栽培

Ｋ濃度と低Cs濃度という表現型を示す品種とし用の農地土壌のＫ濃度に比べると非常に低い。して有望と思われた。そこでこれら３品種を畑地でたがって，本実験の結果は無施肥で貧栄養条件での栽培試験に供することにした。

の牧草の無機元素濃度と捉えることができる。５

2018年の夏季に畑地で栽培した牧草地上部の無品 種 の 無 機 元 素 含 量 を 比 較 し た と こ ろ ，オ ー

機元素濃度とCs-137濃度をTable１に示す。Ｋ濃

チャードグラスであるポトマックのCs-137がき

度は３品種間で有意差はなく，いずれもポット栽

わめて高く，５品種での平均値の２倍に達した

培での結果の約10倍の濃度であった。これは，畑（Fig.１）。オーチャードグラスの放射性セシウム

地土壌のＫ濃度はポット栽培で使用した山林土壌

含量がイタリアンライグラスよりも高いことは福の約３倍であり，また，pHも6.2と高く，根がＫ＋

島県農業センターによる試験結果（www4.pref.

を吸収しやすい土壌環境であったことが原因と考

fukushima.jp/nougyou-centre/kenkyuseika/

えられた。Cs-137とCa濃度は，ヒタチヒカリが

h27_radiologic/h27_radiologic_33_og-ir.pdf） と最も高いという結果となった（Table１）。ヒタチも一致するものであった。一方，メドーフェスク

ヒカリの移行係数は0.014，アキアオバⅢとヤツであるリグロは，K，Ca，Mg濃度が高い傾向を

ユタカの移行係数はおおよそ0.0085であった。

示した（Fig.１）。また，Cs吸収機構の重要な指ポット栽培時よりも移行係数が大きく低下してお標であるCs/K濃度比についてはリグロが0.34でり，この原因としても土壌中の可給態Ｋ濃度が高あり，他の品種が１以上であったことから，高いかったことが考えられた。ただし，今回の栽培試

Ｋ選択性を持つＫ吸収機構を備えた品種としてリ

験は，播種適期を過ぎてから開始したため，牧草

グロは有望であると思われた。さらに，イタリアの草勢がやや悪くなってしまった。本試験結果をンライグラスであるアキアオバⅢとヒタチヒカ

確認するためにも，今後も数年にわたって繰り返© The Ito Foundation

422

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1
Concentration of elements in the shoot of 3 grass cultivars grown in the grass field. Means andstandard deviations（within brackets）were presented（N=3）.
Ca（mg/g）

K（mg/g）

Mg（mg/g）

Na（mg/g）Cs-137（Bq/kg）

5.80（1.44）

32.5（7.29）

2.32（0.256）

0.65（0.037）

Akiaoba Ⅲ

2.81（0.85）

28.8（1.65）

1.69（0.440）

0.49（0.017）

85.1（16.7）

Yatsuyutaka

3.07（0.20）

25.3（6.17）

2.01（0.260）

0.59（0.105）

86.0（65.0）

し栽培試験を行う必要があると考える。
ヒタチヒカリとヤツユタカのCs-137含量の違いが（Table１），根によるCs＋ 吸収速度の違いによるものである可能性を検証するため，寒天培地で栽培した幼植物を用いたトレーサー試験を行った。Ｋを0.27mMとCsを0.1μＭ含む完全栄養培地上で生育したヤツユタカのCs＋ 吸収速度は0.0037～0.0052pmol/mm/20minであり，共存するＫの

Cs+ uptake rate (pmol/mm/20 min)

Hitachihikari

0.014
0.012

と，ヤツユタカよりも高い傾向を示した（Fig.
２）
。また，ヒタチヒカリについては，共存するＫの濃度が0.03mMの場合，何本かの根のCs＋ 吸
収速度が大きく高まる様子が観察された（datanot shown）。

Yatsuyutaka
Hitachihikari

0.01
0.008
0.006
0.004
0.002

濃度によらなかった（Fig.２）。一方，ヒタチヒカリのCs＋ 吸収速度は0.0056～0.0073pmol/mm/20min

136.7（31.5）

00.03mM
0.27mM
3mM
K concentration in the absorption gel

Fig.２
U ptake kinetics of Cs ＋ in the 2 selected cultivars.

Grasses were grown on the nutrient agar-gel plates, andwere put on the gel containing Cs-137 for 20 min forabsorption. The concentration of K in the absorption gel
were varied（0.03, 0.27, 3 mM）, while the concentrationof Cs was kept to 0.1μM. Means and standard deviations
were presented（N＝４～６）.

植物の根によるCs＋の吸収に対して，Ｋ施肥は抑制的に作用することが知られている。そのメカ
ニズムは完全には解明されてはいないが，大まかている６）。したがって，Ｋ施肥による牧草のCs含に，①両元素間での競合と，②Cs＋透過性Ｋ輸送量の低下は，②の作用によるところが大きい可能体の発現抑制，に分けることができる６）。イネを性が考えられた。この作用は，Ｋ輸送体のCs＋透用いて行ったCs-137トレーサー実験によると，過能やＫ環境に応じた発現量など，ゲノム構造に

Cs-137吸収時の溶液中のＫ濃度が0.02mMの場合

よってその大小が定まると考えられる。ヒタチヒのCs 吸収速度は，Ｋ濃度が0.25mMの場合の約カリとヤツユタカが低Ｋ土壌でＫ濃度とCs-137

７倍に高まることが分かっている５）。つまり，イ濃度がともに低く，さらに，土壌中のＫ濃度がや

ネにおいてはCs とＫ の競合関係は明白である。

や高くなるとヤツユタカのCs含量がヒタチヒカ

ところが今回の研究の結果，ライグラス種では両リよりもさらに低くなったことから，環境条件に元素間の競合はイネに比べると緩やかであること

よらず低Ｋ濃度と低Cs濃度という表現型を示すが示唆された（Fig.２）。同様の傾向はコムギで品種としてヤツユタカは有望であり，今後さらにもＫ欠乏ではない場合に見られることが報告され条件を変えて試験を続ける必要性を示したものと

＋

＋

＋

© The Ito Foundation

カリウムおよびセシウムの含量が低い国産実用牧草品種の選抜と育種に向けた植物生理学的解析

結論付けられた。
４．要

423

タリアンライグラス）のCs-137濃度はヤツユタ
カ（ペレニアルライグラス）よりも高く，また，

約

トレーサー実験においてもヒタチヒカリのCs＋吸除染後の農地を使い，飼料生産と合わせた畜産

収速度がヤツユタカよりもやや高い傾向を示し業を再開する動きも広がっている現在においてた。これら一連の結果は，Csを吸収しにくい実は，低Cs品種の特定は喫緊の課題と言える。そ

用品種としてヤツユタカは有望な品種であり，今こで本研究では，変動する栽培環境下においても後，より詳細な実験を行っていく必要があること

牛のために低カリウムで，かつ食の安全に資するを示すものと考えられた。

ために低セシウムという表現型を安定して示す品種を特定し，有用品種作出に向けた材料として提示することを目的とした。そのため，本研究においてはCs-137を含む土壌を用いたポット試験と，
福島県飯舘村の畑地での栽培試験，およびCs137を用いたトレーサー実験を実施し，国内の実用品種の中でのＫとCs濃度の草種・品種間差を調べた。ポット試験の結果，ポトマック（オーチャードグラス）のCs-137濃度がライグラス種の約２倍であること，リグロ（メドーフェスク）のＫ濃度が高いことが分かった。ライグラス種３
品種を畑地で栽培したところ，ヒタチヒカリ（イ文献１） Kato, N., Kihou, N., Fujimura, S., Ikeba, M.,
Miyazaki, N., Saito, Y., Eguchi, T., Itoh, S.：Soil
Science and Plant Nutrition, 61, 179～190, 2015.
２） Zhu, Y-G., Smolders, E.：Journal of Experimental
Botany, 51, 1635～1645, 2000.
３） Kemp, A., t’Hart, M. L.：Netherlands Journal of
Agricultural Science, 5, ４～17, 1957.
４） Kobayashi, N. I., Saito, T., Iwata, N., Ohmae, Y.,
Iwata, R., Tanoi, K., Nakanishi, T. M.：Physiologia
Plantarum, 148, 490～501, 2013.
５） Kobayashi, N. I., Sugita, R., Nobori, T., Tanoi, K.,
Nakanishi, T. M.：Functional Plant Biology, 43, 151～160, 2016.
６） Zhu, Y-G., Shaw, G., Nisbet, A. F., Wilkins, B. T.：
Plant and Soil, 220, 27～34, 2000.

© The Ito Foundation

424

妊娠末期の乳用牛へのバイパスリジン給与がその産子の栄養代謝へ及ぼす影響
Effect of rumen-protected lysine supplementation during late gestation
period in dairy cattle on metabolic status in their calves

川

島

千

帆・山

岸

則

夫

（帯広畜産大学畜産学部）

Chiho Kawashima and Norio Yamagishi（School of Agriculture and Animal Science, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

Holstein heifers are received embryo transfer or artificial insemination of Japanese Black
cattle in order to avoid dystocia. However, there is little information on nutritional
requirements in the case of difference of breeds between dams and fetuses. The aim of thepresent study was to compare nutritional parameters in blood of Holstein late-pregnant heifers
with same or different breed fetus, umbilical cords and their calves immediately after birth. In
addition, we investigated the effect of supplementation of lysine, which is one of the essential
amino acid of dairy cattle, on nutritional parameters in blood. We used 25 Holstein latepregnant heifers. Number of Holstein and beef（Japanese Black cattle and F1）fetuses were 11（Lysine；n＝6, Control；n＝5）and 14（Lysine；n＝4 and 3, Control；n＝4 and 3）,respectively.
Blood samples were obtained from dams at 2 and 1 weeks before expected calving and after
calving, umbilical cords at calving and their calves immediately after birth for measurement of
metabolites, metabolic hormones and amino acids. Statistical analyses were carried out between
lysine supplementation and control group in Holstein or beef fetuses for evaluation of the effectof lysine supplementation, and between Holstein and beef fetuses without lysine
supplementation for evaluation of the effect of breed. The dams with Holstein fetus were lower
energy status compared with the others with beef fetus. On the other hand, mother cattle withbeef fetus supplied lysine showed higher blood lysine and total amino acid concentrations atcalving. However, blood amino acid concentrations in umbilical cord and calves were lower inbeef than Holstein. Overall, our results indicated that energy status of dams and supply of
amino acid from mothers to fetuses were differ depending on the breeds of fetuses in Holsteinlate-pregnant heifers.

１．目る。牛の多くは群で飼育され一元的な管理を受け的るが，同一の飼育管理下でも生まれながらに病気

近年，離農数増加による肉用素牛の確保が難しになりにくい牛や繁殖性が良好な牛がいる。ヒト

く価格の高騰は続いており，乳牛に肉用種の受精やラットでは妊娠期の低栄養がその産子の疾病罹

卵や精液を用いて素牛を確保している現状があ

患率や生殖能力，栄養代謝に悪影響を及ぼすこと© The Ito Foundation

妊娠末期の乳用牛へのバイパスリジン給与がその産子の栄養代謝へ及ぼす影響425が知られており１～５），牛においても胎子環境が影に基づき実施した（承認番号#18-127）。2018年

響している可能性が考えられる。日本飼養標準で５-12月に分娩予定のホルスタイン種未経産妊娠

は乳牛に肉用種を妊娠させた場合の栄養要求量

牛25頭とその産子を用いた。胎子の品種はホルス

は，肉用種に同品種を妊娠させた場合に比べてやタイン種11頭，黒毛和種８頭，黒毛和種とのＦ１や高く，一方，乳牛に同品種と肉用種を妊娠させが６頭であった。実験対象牛にグラスサイレージた場合を比較すると，後者では出生時体重が小さとコーンサイレージに乾乳用配合飼料を加えた完く養分要求量も少ないことが示されている６）。し

全混合飼料を給与し，乾草や鉱塩，水は自由摂取

かし，生産現場では未経産牛に肉用種の精液や受とした。分娩予定季節と胎子品種，母牛の体格や精卵を用いて妊娠させた場合でも，ホルスタイン

月齢に偏りがないようにルーメンバイパスリジン

種を妊娠させた場合と同じ飼育管理が行われてい給与群（ホルスタイン種；６頭，黒毛和種；４る。

頭，Ｆ１；３頭）と対照群（ホルスタイン種；５牛の胎子における主要な栄養源はグルコースと頭，黒毛和種；４頭，Ｆ１；３頭）を設定した。

アミノ酸である 。グルコースは母牛と胎子の血給与群には，味の素ヘルシーサプライ株式会社の中濃度差に応じて供給されるため，妊娠末期の母

Ajipro-L100g/日/頭を米ぬか30ｇと混合して分

牛のインスリン抵抗性が強く関与する８）。一方，

娩予定14日前から分娩まで毎日給与した（有効リ

アミノ酸は母牛と胎子の血中濃度差に関係なく，

ジン含量，25ｇ/製品100ｇ）。対照群には米ぬか能動輸送で胎子に取り込まれるため，あまり重要

30ｇを同期間に給与した。血液は，母牛では分娩視されてこなかったが，牛と同様の胎盤構造を持予定２週前（給与前）と１週前，分娩直後の計３

つ羊では，母体が低栄養の場合，胎子へのアミノ回，尾静脈から採取し，分娩時の臍帯静脈血は娩

酸供給が減少する 。未経産牛は生物学的には育出直後の臍帯が切れる前に鉗子でクランプし，子成期であり，アミノ酸は胎子への供給だけでなく牛側の臍帯を鈍性に切断した後，母牛側の臍静脈

自身の成長にも必要とされる。そのため，胎子がから採取した。出生直後の子牛は初乳摂取前に頸急成長する妊娠末期の未経産牛は低栄養の可能性

静脈から採血した。また，分娩状況や出生直後のがある。

子牛の体重を記録した。採取した血液から糖代

７）９）

そこで本研究では，乳用種（ホルスタイン種）

謝，脂質代謝，タンパク代謝および肝機能に関連の母牛に胎子が同品種である場合と肉用種（黒毛する代謝物と代謝ホルモン濃度，27種類のアミノ

和種・Ｆ１）である場合の妊娠末期の母牛や分娩酸濃度を測定した。

時の母牛，臍帯および出生直後の子牛の血液性状

リジン給与群のホルスタイン種妊娠牛２頭は予の比較に加え，乳牛の必須アミノ酸であり，制限

定日より１週間以上早く分娩したため解析から除アミノ酸にもなりやすいリジンの給与による血液外した。加えて，リジン給与群のホルスタイン種

性状の変化を確認することで，同種または異種妊

妊娠牛の産子１頭と黒毛和種妊娠の産子１頭，対娠の未経産牛やその胎子におけるアミノ酸の重要

照群の黒毛和種妊娠の産子２頭が死産のため臍帯性を検討することとした。

と子牛の血液採取ができず，リジン給与群の黒毛２．方

和種妊娠１頭と対照群のホルスタイン種妊娠１

法

頭，Ｆ１妊娠２頭の臍帯静脈血を採取できなかっ

本試験は帯広畜産大学動物実験等に関する規定

たため，黒毛和種とＦ１を合わせて肉用種として© The Ito Foundation

426

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

統計解析を行った。さらにシステインは測定限界

合が高かった（Fig.２，p＜0.05）。乳牛にリジン値以下のサンプルが多く解析から除外した。リジを給与した既報では，血中リジン濃度が増加する

ン給与効果をホルスタイン種妊娠のリジン給与群

場合や変化しない場合があり，また，リジンを給（Hol-Lys）と対照群（Hol-Cnt）間，肉用種妊娠

与することでその他のアミノ酸が利用され，血中の リ ジ ン 給 与 群（Beef-Lys）と 対 照 群（Beef-の総アミノ酸濃度が減少するなど，対象牛のアミ

Cnt）間，胎子品種間の比較を対照群のホルスタノ酸吸収や組織での利用等のさまざまな要因に影

イ ン 種 妊 娠（Hol-Cnt）と 肉 用 種 妊 娠（Beef-

響を受けると考えられている11～13）。本試験のホルCnt）間で確認するため，データの正規性を検定

スタイン種妊娠のリジン給与群では，有意差はな

した後，スチューデントのｔ検定またはマンホ

いものの分娩に向けた採食量低下に伴う血中リジ

イットニーのＵ検定を行った。ｐ＜0.05を有意差

ン濃度低下やリジン給与による他のアミノ酸利用ありとし，データは平均±標準誤差で示した。

率増加による血中総アミノ酸濃度低下が起こり，
総アミノ酸中のリジン割合が高くなったと推察さ３．結果と考察れた。一方，肉用種妊娠ではこのような変化が認

3 . 1 分娩予定２週および１週前の母牛の血液

められなかった。その理由は本試験では明らかにできないが，胎子品種の違いにより妊娠期間中の性状
Fig.１に分娩予定２週前と１週前の母牛の血中代謝物およびインスリン濃度を，Fig.２に血中リジン，総必須アミノ酸，総非必須アミノ酸，総ア
ミノ酸濃度および総アミノ酸中のリジン割合を示した。

母体のアミノ酸充足率が異なる等の差異があるのかもしれない。
3 . 2 分娩直後の母牛，臍帯および出生直後の子牛の血液性状Fig.３に分娩直後の母牛，臍帯および出生直後

分娩予定２週前の血中インスリン濃度は，両品の子牛の血中代謝物およびインスリン濃度，Fig.

種ともにリジン給与群に比べて対照群で低かった４に血中リジン，総必須アミノ酸，総非必須アミが（Fig.１，p＜0.05），１週前に差はなくなり，ノ酸，総アミノ酸濃度および総アミノ酸中のリジ

他の血中代謝物やアミノ酸濃度は両群間に差はな

ン割合を示した。

かったため，試験処理設定に問題はないと考えら

ホルスタイン種妊娠において，分娩直後の母牛れた。分娩予定１週前の血中AST活性値はホルはリジン給与群の方が対照群に比べて，血中インスタイン種妊娠のリジン給与群に比べて対照群でスリン濃度が高く（Fig.３，p＜0.05），NEFAお高くなったが（Fig.１，p＜0.05），適正範囲内でよびBHBA濃度が低かったが（Fig.３，p＜0.05），

あり ，肉用種妊娠の母牛では両群間に差はない

臍帯静脈血のNEFA濃度はリジン給与群の方が高こと，その他の肝機能指標（アルブミン，ビリル

かった（Fig.３，p＜0.05）。肉用種妊娠のリジン

ビンおよびGGT）に差はないことから，リジン

給与群では，分娩直後の母牛の血中リジン濃度と給与と肝機能との関連性はないと考えられた。ま

総アミノ酸濃度が高かった（Fig.４，p＜0.05）。

た，両品種ともに分娩予定１週前の各アミノ酸濃他の項目において，両品種ともに群間による差は度の群間の差はなく，リジン給与の影響は認めらなかった。インスリンはエネルギー状態，NEFAれなかったが，ホルスタイン種妊娠牛のリジン給はエネルギー不足時の体脂肪動員，BHBAは脂質

与群は対照群に比べて，総アミノ酸中のリジン割

代謝異常の指標であることから14～16），ホルスタイ

10）© The Ito Foundation

427

Before1.5

0.5
01 weeka
Beforeb

Before

4
2
0

100

0.15

80

AST（IU/l）

Bilirubin（mg/dl）

0.20

0.10
0.05
BeforeBeforeab

100
0Before1 weekBefore1 weekBefore1 week

4
3
2
1
0

20
＊

40
20
0

200

1 week60

1 week300

1 week6

1 week400Albumin（g/dl）

a

200

0.00

b

8

600

0

＊

1

800

400

＊

NEFA（μEq/l）a2

Hol-Lys（n=4） Hol-Cnt（n=5）
Beef-Lys（n=7） Beef-Cnt
（n=7）
500

BeforeGGT（IU/l）b

Insulin（ng/ml）

120
100
80
60
40
20
0

TP（g/dl）

BHBA（μmol/l）

Glucose（mg/dl）

妊娠末期の乳用牛へのバイパスリジン給与がその産子の栄養代謝へ及ぼす影響

15
10
5
0

1 week

Fig. 1 Blood metabolites and metabolic hormone concentrations before and 1week after supplementation in dams.
Data are presented as the mean ± SEM.

 ；p＜0.05（Hol-Lys vs. Hol-Cnt, or Beef-Lys vs. Beef-Cnt）
＊

300
250
200
150
100
50
0

BeforeBefore1 week

1 week

140
120
100
80
60
40
20
0
6
5
4
3
2
1
0

Before1 weekNonessential AA（μmol/l）

14
12
10
8
6
4
2
0

Lysine / /Total AA（%） Essential AA（μmol/l）

Total AA（μmol/l）

Lysine（μmol/l）

a, b；p＜0.05（Hol-Cnt vs. Beef-Cnt）

160
140
120
100
80
60
40
20
0

Hol-Lys（n=4） Hol-Cnt（n=5）
Beef-Lys（n=7） Beef-Cnt（n=7）

Before1 week＊Before1 week

Fig. 2 Blood amino acid（AA）concentrations and the rario of lysin in total AA before and 1week after supplementationin dams.

Data are presented as the mean±SEM.

 ；p＜0.05（Hol-Lys vs. Hol-Cnt, or Beef-Lys vs. Beef-Cnt）＊© The Ito Foundation

250
a

150
100

b

50

800

Dam

Umbilical
cord

Calf

600
400
200
0

Dam

Umbilical
cord

a

b

Dam

Umbilical
cord

Calf

6
4
2
0

Calf

1200
1000
800
600
400
200
0

＊

8

＊

TP（g/dl）

BHBA（μmol/l）

0

3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

Albumin（g/dl）

200

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

NEFA（μEq/l）

平成30年度Insulin（ng/ml）

Glucose（mg/dl）

428

Dam

Umbilical
cord

Hol-Cnt
Beef-Cnt
b

＊

a

Dam

Umbilical
cord

Calf

Dam

Umbilical
cord

Calf

5
4
3
2
1
0

Calf

Hol-LysBeef-Lys＊

Fig. 3 Blood metabolites and metabolic hormone concentrations immediately after calving in dams, umbilical cords andcalves.

Number of dam, umbilical cord and calf were 4, 3, and 3 in Hol-Lys, 5, 4, and 5 in Hol-Cnt, 7, 5, and 6 in Beef-Lys
and 7, 3, and 5 in Beef-Cnt, respectively. Data are presented as the mean±SEM.
 ；p＜0.05（Hol-Lys vs. Hol-Cnt, or Beef-Lys vs. Beef-Cnt）
＊

200

a

＊

b

Dam

Umbilical
cord
a

600
＊

Calf

a
b

Dam

Umbilical
cord

b

Calf

b

100

b

200
0

a

150

a

800

400

a

b

50
0

Dam

Umbilical
cord

Calf

Dam

Umbilical
cord

Calf

5

Nonessential AA（μmol/l）

30
25
20
15
10
5
0

Lysine / /Total AA（%） Essential AA（μmol/l）

Total AA（μmol/l）

Lysine（μmol/l）

a, b；p＜0.05（Hol-Cnt vs. Beef-Cnt）

600
500
400
300
200
100
0

Hol-LysBeef-Lys

Hol-Cnt
Beef-Cnt

a

a
b

Dam

Umbilical
cord

b

Calf

4
3
2
1
0

Fig. 4 Blood AA concentrations and the rario of lysin in total AA immediately after calving in dams, umbilical cords

and calves.

Number of dam, umbilical cord and calf were 4, 3, and 3 in Hol-Lys, 5, 4, and 5 in Hol-Cnt, 7, 5, and 6 in Beef-Lys
and 7, 3, and 5 in Beef-Cnt, respectively. Data are presented as the mean±SEM.
 ；p＜0.05（Hol-Lys vs. Hol-Cnt, or Beef-Lys vs. Beef-Cnt）＊

a, b；p＜0.05（Hol-Cnt vs. Beef-Cnt）© The Ito Foundation

妊娠末期の乳用牛へのバイパスリジン給与がその産子の栄養代謝へ及ぼす影響

429

ン種妊娠において，給与されたリジンはエネル

和種；４頭・Ｆ１；３頭）のホルスタイン種未経

ギーとして利用された可能性がある。一方，肉用産牛25頭に対し分娩予定２週前・１週前および分種妊娠では約２週間にわたり給与されたリジンが娩直後，加えて分娩時の臍帯静脈血，出生直後の余剰となり血中濃度に反映されたことが考えられ産子の血液を採取し，代謝物や代謝ホルモン，アる。また，胎子品種による差異を両品種の対照群

ミノ酸濃度を各品種のリジン給与群と対照群間，間で比較したところ，ホルスタイン種妊娠の方がならびに各品種の対照群間で比較した。その結母牛の血中インスリン濃度は低く（Fig.３，p＜

果，ホルスタイン種妊娠の母牛は肉用種妊娠の母

0.05），一方で子牛の血中グルコース濃度は高く牛よりもエネルギー不足であり，給与したリジン（Fig.３，p＜0.05），また，Fig.４で示したすべてがエネルギーとして利用された可能性が示されの臍帯静脈血と子牛の血中アミノ酸濃度はホルスた。一方，肉用種妊娠では約２週間にわたり給与

タイン種の方が高かった（Fig.４，p＜0.05）。以されたリジンが母牛の血中濃度に反映されたが，上より，本試験における胎子品種間やリジン給与

ホルスタイン種妊娠に比べて肉用種妊娠の臍帯静時の血液性状の変化の違いがもたらされた要因と脈血ならびに子牛の血中アミノ酸濃度が非常に低して，①ホルスタイン種胎子の体重が重く，よりかった。本試験ではこの理由は不明であるが，肉多くのグルコースやアミノ酸を必要とする（ホル用種の胎子は体重が軽くホルスタイン種に比べてスタイン種42kg，肉用種35kg，ｐ＜0.05），②母アミノ酸をあまり必要としない，もしくは母牛と牛と胎子の品種の違いが母から胎子への栄養供給の品種の違いが胎子への栄養供給を妨げている可を妨げるという２つの可能性があげられ，その特能性が示された。しかし，胎子品種の違いにより定には臍帯の機能の違いも含めたさらなる検証が母牛のエネルギー状態や胎子のアミノ酸要求量が必要であると思われる。しかし，本試験の結果だ

異なることは明らかであり，胎子品種に合わせた

けでも胎子品種の違いにより母牛のエネルギー状

飼養管理の構築が必要であることが示された。

態や胎子のアミノ酸要求量が異なることは明白であり，胎子品種に合わせた飼養管理の構築が必要であることが明らかとなった。
４．要約

肥育素牛確保や難産回避のため，ホルスタイン
種に黒毛和種の精液授精や受精卵移植が行われているが，その場合の母牛や胎子の栄養要求に関する情報は少ない。そこで胎子品種が異なる乳用未経産牛の妊娠末期と分娩直後，分娩時の臍帯やその産子の血中代謝物・代謝ホルモン・アミノ酸濃度を牛の必須アミノ酸の一つであるリジン給与の影響も含めて比較した。胎子がホルスタイン種（リジン給与；６頭，対照；５頭）と肉用種（リジン給与黒毛和種；４頭・Ｆ１；３頭，対照黒毛

文献１） Rasby, R. J., Wettemann, R. P., Geisert, R. D., Rice,
L. E., Wallace, C. R.：J. Anim. Sci., 68, 4267～4276,
1990.
２） Holt, R. I.：Trends Endocrinol. Metab., 13, 392～
397, 2002.
３） Gluckman, P. D., Hanson, M. A.：Trends
Endocrinol. Metab., 15, 183～187, 2004.
４） Kc, K., Shakya, S., Zhang, H.：Ann. Nutr. Metab.,
66 Suppl ２, 14～20, 2015.
５） Helle, E. I. T., Biegley, P., Knowles, J. W., Leader, J.
B., Pendergrass, S., Yang, W., Reaven, G. R., Shaw, G.
M., Ritchie, M., Priest, J. R.：J. Pediatr., 195, 275～
278, 2018.
６） 国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構：日本飼養標準乳牛（2017年版），76～77，中央
畜産会，東京，2017.
７） 西田武弘：子牛の科学, 31～33, チクサン出版社,
東京, 2009.
８） Hayirli, A.：Vet. Res. Commun., 30, 749～774. 2006
９） Kwon, H., Ford, S. P., Bazer, F. W., Spencer, T. E.,© The Ito Foundation

430

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Nathanielsz, P. W., Nijland, M. J., Hess, B. W., Wu,
G.：Biol. Reprod., 71, 901～908, 2004.
10） Kida, K.：J. Vet. Med. Sci., 64, 1003～1010, 2002.
11） Pereira, A. B. D., Whitehouse, N. L., Aragona, K.
M., Schwab, C. S., Reis, S. F., Brito, A. F.：J Dairy
Sci., 100, 6239～6255, 2017.
12） Patton, R. A., Hristov, A. N., Parys, C., Lapierre,
H.：J Dairy Sci., 98, 4707～4734, 2015.

13） Berthiaume, R., Dubreuil, P., Stevenson, M.,
McBride, B. W., Lapierre, H.：J Dairy Sci., 84, 194～203,2001.
14） Armstrong, D. G., Gong, J. G., Webb, R.：Reprod.
Suppl., 61, 403～414, 2003.
15） Grummer, R. R.：J Dairy Sci., 76, 3882～3896, 1993.
16） Grummer, R. R.：J Anim. Sci., 73, 2820～2833, 1995.

© The Ito Foundation

431

乳牛の周産期における肝臓由来の新規タンパク質の発現と分泌動態
The expression and secretion pattern of new hepatokine during theperipartum in dairy cattle

盧

尚

建

（東北大学大学院農学研究科）

Sanggun Roh（Tohoku University, Graduate School of Agricultural Science）

Acute physiological adaptation of lipid metabolism during the postpartum transition periodof cows facilitates peripheral metabolic regulation. Hepatokines, which are hormones secreted
from hepatocytes, are presumed to play a critical role in systemic metabolic regulation.
Angiopoietin-like protein 8（ANGPTL8）has been identified as a novel hepatokine associatedwith circulating triglyceride concentrations in mice and humans. However, regulation of
ANGPTL8 and its physiological effects are still unknown in cattle. The present study aimed toreveal changes in ANGPTL8 expression and secretion during the periparturient period, and toinvestigate its regulatory effect on hepatocytes. In the peripartum period, liver ANGPTL8mRNA expression was lesser on the day of parturition and 1 week postpartum than it was 1
week before parturition（p＜0.05）. Moreover, plasma ANGPTL8 concentrations decreased on
the day of parturition as compared with that 1 week before parturition（p＜0.05）. In addition,
ANGPTL8 expression in cultured bovine hepatocytes was downregulated after oleate andpalmitate treatment but upregulated after insulin treatment（p＜0.05）. These data suggest that
hepatic ANGPTL8 production was downregulated postpartum when the cows experienced anegative energy balance during the peripartum period.

１．目

は，非反芻動物において糖代謝，脂質代謝やイン的スリンシグナルを調節する作用を持つことから，

反芻家畜における糖代謝と脂質代謝の特性は，ヘパトカインが移行期の代謝調節に関与する新規

離乳や泌乳などの代謝移行期に大きく変化する因子であることが示唆されるが，反芻家畜におけが，その調節メカニズムは代謝産物，内分泌因子，

る具体的な検討は行われていない１，２）。本研究で遺伝子発現調節などが関わる複雑なシステムであは ， ヘ パ ト カ イ ン で あ る Angiopoietin-like

り，完全な解明はなされていない。肝臓はこれら

protein 8（ANGPTL8）について，各組織の発現の代謝の中心として機能するが，近年の研究から分布および乳牛の泌乳期における遺伝子発現変

内分泌機能を持つことが明らかになりつつある。

化，分泌調節を検討し，代謝移行期における生理ヘパトカインと総称される肝臓由来の内分泌因子的機能を解明することを目的とした。

© The Ito Foundation

432

平成30年度２．方

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

法

３．結果と考察

2.1

Fig.１は各組織でのANGPTL8の遺伝子とタン

ホルスタイン種仔牛（２～３ヶ月齢，雄）の肝パク質量を示している。ANGPTL8遺伝子発現量

臓，皮下脂肪組織，内臓脂肪組織，腎周囲脂肪組

は肝臓と脂肪組織において高発現しており，その織，生殖器周囲脂肪組織，筋肉，第１胃を採材し，他 の 組 織 に お い て は 検 出 さ れ な か っ た（Fig.

Total RNAとタンパク質を抽出し，ANGPTL８1A）。また，ANGPTL8のタンパク質は肝臓におの遺伝子とタンパク質発現量を解析した。

いてのみ検出された（Fig. 1B）。Fig.２は分娩前

2.2後の肝臓組織におけるANGPTL8の遺伝子発現量

畜草研那須研究拠点において飼養されたホルスを示している。血中NEFA濃度は分娩前に比べ，タイン種乳牛６頭から分娩前４週，１週，分娩日，分娩日から４週間後まで上昇していた。また，血分娩後１週と４週に肝臓を生検し，Total RNAを中インスリン濃度は分娩４と１週間前より低下抽出し，ANGPTL８の遺伝子発現量を解析した。

し，分娩にて低値を示した後，４週間後まで低下2.3していた。周産期の肝臓においてANGPTL8発現牛（５ヶ月齢）の肝臓組織から単離した肝臓細量は分娩前と比べ分娩日と１週間後に有意に減少胞を培養・増殖させた後，オレイン酸とパルミチした（Fig.２）。培養肝細胞においてオレイン酸

ン酸を含む培地で24時間培養し，細胞からTotalとパルミチン酸の刺激によってANGPTL8の遺伝

RNAを抽出し，ANGPTL8の遺伝子発現量を解析

子発現量は減少した（Fig.３）。インスリン刺激

した。

によってANGPTL8の遺伝子発現量は上昇した。
肝臓のANGPTL8発現量はインスリン受容体ア
ンタゴニスト（Ｓ961）を投与し，耐糖能の低下

A. Gene expression

B. Protein expression

ANGPTL8

10

Ep
iA
T

Pe
riA
T

M
es
AT

Sc
AT

Li
ve
r

me
n
Ru

le
sc
Mu

AT
Pe
ri

ND

0

Liv
er

β-actin

5

M
us
cl
e

Relative mRNA levels

15

Fig 1 mRNA expression and protein expression of ANGPTL8 in various tissues of Japanese Black cattle.（A）ANGPTL8 expression was quantified in liver, adipose, and muscle tissues of five cattle by qRT-PCR. Data areshown as fold changes relative to expression in the liver tissue. N.D., not detected.（B）ANGPTL8 protein
expression was evaluated in the liver, perirenal adipose tissue（PeriAT）, skeletal muscle, and rumen of cattle byimmunoblotting. β-actin was used as an internal standard.１）© The Ito Foundation

433

乳牛の周産期における肝臓由来の新規タンパク質の発現と分泌動態

b

b
-4

-1

a

ab

1.2
1
0.8
0.6
0.4

b
0

bc

bc

1

4

0.2
0

0.5
0.4

Insulin

GH

10

a

8

ab

0.3

C

6

0.2

4

0.1

2

0

-4

-1

bc

c

0

1

bc
4

0

ANGPTL8

Relative mRNA levelsabInsulin and GH in bloodB

GH（ng/mL）

a

NEFA
a

Insulin（ng/mL）

16
14
12
10
8
6
4
2
0

TG

Plasma NEFA（mEq/L）

NEFA and TG in blood

Plasma TG（mg/dL）

A

2

1.5

a

a

ab

1

0.5
0

-4

-1

b

b

0

1

4

Fig 2 Production of hepatic ANGPTL8 at parturition in dairy cows.（A and B）Plasma was sampled from multiparous

Holstein dairy cows around parturition（－4，－1，0，1，and 4 weeks from parturition；n＝6 each time）, andmetabolite plasma concentrations［non-esterified fatty acid（NEFA）and triglyceride（TG）］and hormones［insulin
and growth hormone（GH）］were measured.（C）Biopsied liver tissues from the same cows were subjected toqRT-PCR analysis to determine ANGPTL8 expression. Data are shown as fold change relative to ANGPTL8
expression at －4 weeks. Different letters indicate significant differences between groups（p＜0.05）.１）
B

1.5

1.5

Relative mRNA levels

A

1

a

a

C

1

5

a

a

b

0.5

0

25

250

Palmitate（µM）

0

10

100

3
2
1

0

a

4

b
0.5

ab

0

25

250

0

Oleate（µM）

b

0

b

1

Insulin（nM）

Fig 3 Fatty acid and insulin regulation of ANGPTL8 expression in bovine hepatocytes. Hepatocytes prepared fromcattle were cultured and proliferated to approximately 80 ％ confluence. Cultured primary bovine hepatocytes weretreated with palmitate（A）, oleate（B）, and insulin（C）at the concentrations indicated for 24 h. After treatment,
total RNA was extracted from the cells and ANGPTL8 expression was analyzed using qRT-PCR. Data are shownas fold changes in expression relative to untreated control cells. Different letters indicate significant differences
between groups（p＜0.05）.１）

したマウスにおいて大きく上昇することが報告さ謝に切り替わるメカニズムであると考えられていれている。また，ob/obマウスや高脂肪食給餌肥る。以上のように，ANGPTL8はインスリンシグ

満マウスにおいても肝臓におけるANGPTL8の発ナルと脂質代謝を結び付ける因子であると考えら現が上昇している。したがって，インスリンシグ

れる１，２）。

ナルが肝臓におけるANGPTL8の遺伝子発現の調節因子の１つであると考えられている。子牛の肝４．要約

臓におけるインスリン感受性は離乳後に低下す

牛の分娩後移行期における脂質代謝の急激な変る。これは，グルコース利用の低下やプロピオン化により肝臓などの末梢組織における代謝調節は酸からの糖新生の亢進といった反芻動物特有の代促進させる。肝細胞から分泌されるホルモンであ© The Ito Foundation

434

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

るヘパトカインは，全身の代謝調節において重要

ANGPTL8発現は，オレイン酸およびパルミチンな役割を果たすと推定されている。Angiopoietin-

酸処理後に下方制御されたが，インスリン処理後

like protein 8（ANGPTL8）は，マウスおよびヒに上方制御された（ｐ＜0.05）。以上の結果は，トにおける血中トリグリセリド濃度に関連する新分娩後に負のエネルギーになると，脂肪組織から規のヘパトカインとして同定されている。しか由来する遊離脂肪酸により肝臓のANGPTL8産生

し，反芻動物におけるANGPTL８の調節とそのが分娩後に下方制御されることを示唆している。

生理学的効果はまだ不明なところがある。本研究は周産期におけるANGPTL8の発現と分泌動態を明らかにし，培養肝細胞においてその調節効果を
調 べ る こ と を 目 的 と し た 。周 産 期 で は ，肝 臓
ANGPTL8 mRNA発現は，分娩前１週間よりも分娩日と分娩後１週間で低下した（ｐ＜0.05）。
さらに，血漿ANGPTL8濃度は，分娩の１週間前と比較して，分娩直後と分娩後１週に減少した（ｐ ＜ 0.05）。さ ら に ，培 養 牛 肝 細 胞 に お け る

文献１） Nakano, M., Suzuki, Y., Haga, S., Yamauchi, E.,
Kim, D., Nishihara, K., Nakajima, K., Gotoh, T., Park,
S., Baik, M., Katoh, K., Roh, S.：Downregulated
Angiopoietin-like Peptide 8 Production at Calving
Related to Changes in Lipid Metabolism in Dairy
Cows, Journal of Animal Science, 96, 2646～2658, 2018.
２） 鈴木裕，中野美智，芳賀聡，中島恵一，加藤和雄，
盧尚建：反芻動物におけるヘパトカインとしてのChemerinとANGPTL８の発現調節，家畜栄養生理研
究会会報，59（2），59～68，2015.

© The Ito Foundation

435

養鶏における個体管理と清掃ロボット導入による
IoT型食肉生産技術の開発
Development of IoT type meat production system to introduce forindividual management and cleaning robot of poultry farming

堀口

健一１・片平

光彦１・市浦茂２・高垣徹３（１山形大学農学部，２岩手大学大学院連合農学研究科，３ティーエーシー）

Kenichi Horiguchi１, Mitsuhiko Katahira１, Shigeru Ichiura２ and Toru Takagaki３（１Faculty of Agriculture, Yamagata University,
２The United Graduate School of Agricultural Sciences, Iwate University, ３TAC Inc．
）

Consumers prefer to provide reliable, safe and healthy food to meet their food needs.
Management techniques for reliable and efficient livestock production is demanded feedingwith consideration for the comfort of livestock, maintenance of the hygienic feeding
environment and reduction of the burden of its management work. Generally in the meat,
broiler’s chicken is a food of lower calorie and high protein. Broilerʼs chicken production systemdoes not have the less effort technology to manage the individual because of the low profits per
broiler. So, we need to develop the less effort technology for broiler management. And it is also
required to check the health of broilers. From these backgrounds, we conducted several
experiments and obtained the following results. It is confirmed that artificial intelligencelearned using broilerʼs behavior image can distinguish among eating, drinking and rest
behaviors. The system of body weight measurement using RFID tag and strain gauge, andbehavior imaging with camera can be used for feeding management and shipment forecast
based on body weight data of broilers. Although RFID is effective for behavioral analysis, it isnecessary to consider how to attach a tag and the cost. It is suggested that broiler image
obtained from this system can develop inference module of body weight in deep learning
framework. By establishing a monitoring function based on deep learning in this system, it isconsidered possible to realize reduction of monitoring labor and optimization of feeding
conditions in broiler farming. As future tasks, it is necessary to study the quantification of theamount of learning work required to create a robust inference module for body weight, andthe individual identification technology that does not use RFID. It is confirmed that moving
cart of assisting robot for chemical spray can travel following an operator with the control
system, and can be stably towed to a hose of about 20kg.

１．目

飼養時の快適性について配慮が求められているこ

的とから，個体管理の重要性が増加している。飼養

近年ではアニマルウェルフェアの観点から家畜時の個体管理では飲水や飼料摂取，休息などの家© The Ito Foundation

436

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

畜の行動，温度や湿度などの環境情報を総合的に望が高い。

解析して評価することが求められる。これらの情

このような背景から，消費者志向に合致した安報はこれまで観察や個別でのデータ収集に止まっ

全・安心な畜産物生産，家畜の快適性に配慮したていたが，もののインターネット（Internet of

飼養，衛生的な飼育環境の整備とその作業の負担

Things「IoT」）の促進により大容量の画像デー軽減などの点を意識した管理技術の必要性が増す

タとそれに連動した各種センサによる環境データと思われる。本研究では大規模飼養が進んでいるの収集といったビッグデータを活用し，高精度な養鶏において，飼養管理時の鶏の快適性に考慮

GPUによる深層学習（Deep Learning）を用いた

し，安全で安心な鶏肉生産を実現することを目的

人 工 知 能（Artificial Intelligence「AI」）に よ るに，畜産業における家畜の個体管理手法と清掃ロ解析が可能になっている。しかし，AIの適用にボット開発によるIoT型の食肉生産技術を確立す

ついては工業面での実装が進んでいるが，畜産業る。

の現場での実装例は少ない現状にある。
国内の肉用若鶏（ブロイラー）の生産におい

２．方法て，飼養戸数は小規模の飼養者層を中心に減少傾

2.1

供試動物と飼養管理

向にあるものの，飼養羽数は平成20年の102,987

供試動物にはブロイラー（鶏種チャンキー）

千羽から平成30年の138,776千羽へ増加し，出荷を用い，その飼育実験は山形大学動物実験委員会

羽 数 50 万 羽 以 上 の 大 規 模 の 飼 養 者 層 が 全 体 の（学長）の承認を受けた農学部内の動物実験飼養12.0％（平成30年）を占めており，大規模化が進施設で行った。ブロイラーの雛（雄）を導入し，んでいる１）。ブロイラーの飼養管理は，開放型や３週齢まで同一条件下で管理した。飼育実験のた

ウンドウレス型などの鶏舎にて，その大半が平飼めの飼養管理は市販の仕切り板（メッシュ型）でいの群れ（群飼）で行われており，群飼管理下で飼育用の囲いを設置し，給餌器と給水器を配置しの生産効率や衛生面などに関する技術開発が不可て不断給餌，自由飲水とし，敷料として籾殻を用欠であり，大規模化に合わせた適正な飼育環境下いて行った。

で最適な飼養管理を行うことが重要となる。

2.2

鶏の行動識別のための教師データとAI

ブロイラーの生産現場では各種疾病に対応する

カメラを用いてブロイラーの行動を撮像して記ため，作業施設への立ち入り制限や消毒の徹底な録用サーバーに保存した。撮像した画像は摂食行

どの対策が取り組まれている。鶏の出荷後には防動，飲水行動，休息行動の特徴的な行動ごとに分疫の観点から徹底した清掃と消毒を行い，生産施

類して教師データを作成し，それを基にDeep

設の衛生管理を厳密に実施している。鶏舎の清掃

Learningのフレームワーク２）を用いて学習作業と消毒には乗用のホイールローダによる敷料の除による特徴抽出を行った。各行動の画像（500枚，去，牽引式の散布機による薬剤散布などが行われ1,000枚，2,000枚，4,000枚）を用いて学習させたている。これらの衛生管理は基本的にヒトの立ちAIにより，それぞれの行動を識別する精度を評

入りを制限した条件下において限定された管理作価した。精度の評価は，各行動のテスト用画像

業者により実施されている。このような状況下で（各20枚）を用いて識別検証を行い，それぞれのは管理作業者の負担が増す課題を抱えており，清識別判定の割合（識別割合）から判断した。

掃や消毒などの管理作業のロボット化に対する要© The Ito Foundation

養鶏における個体管理と清掃ロボット導入によるIoT型食肉生産技術の開発

2.3

鶏の体重計測・行動撮像システム

2.5

437

薬剤散布補助ロボット

各ブロイラーを識別しながら体重を計測できる

薬剤散布補助ロボットとしての走行台車は，自システム開発のため，RFID受信機能内蔵の体重作したフレーム台車にインホイールモータ（後輪計を試作した。この試作体重計はロードセル，

２輪のみ）と制御用コントローラ（試作機）を組A/Dコンバータ，マイコンで構成し，SDカード

み込んだものを利用した。薬剤散布補助ロボット

への記録とWi-Fiへの接続も可能である。得られの走行特性としては主に牽引力，走行速度，重心たデータはテキストデータ（csv形式）で体重計位置を調査した。

測システムに保存し，動物実験飼養施設内にある
Wi-Fiルータを経由してクラウドサーバへ転送し３．結果と考察た。また同時に，ブロイラーの行動をカメラで撮3.1像した。この行動の動画データはネットワーク内

ブロイラーの各行動の画像を500枚，1,000枚，のネットワークアタッチドストレージ（NAS）

2,000枚，4,000枚用いて学習させたAIにおいて，に保存した。

摂 食 行 動 の 識 別 割 合 は 0.0 ％，99.9 ％，99.9 ％，2.4

AIによる鶏の行動識別

鶏の体重判別のための教師データとAI100％であり，飲水行動の識別割合はすべて100％

行動撮像時にはブロイラーのIDと体重をリア

で あ り ，休 息 行 動 に お け る 識 別 割 合 は ０％，

ルタイムで表示でき，実際の行動映像と同時に録100％，０％，100％であった（Table１）。画像500

画することが可能なシステムにより，画像再生時枚で学習されたAIでは，摂食や休息の行動を識に各個体のIDと体重，画像を関連付けたデータ

別する精度がきわめて低かった。画像を1,000枚を取得し，それをDeep Learningの教師データとおよび4,000枚として学習させたAIでは，各行動した。教師データは体重が1,700ｇ，1,800ｇ，1,900

とも識別の精度が高く，また，2,000枚で学習さ

ｇ，2,000ｇ程度のブロイラーの画像を各500枚ずせたAIでは，摂食行動と飲水行動の識別の精度

つ切り出し，学習用画像（400枚）と検証用画像が高かった。2,000枚での学習AIは休息行動の識（100枚）を準備した。学習用画像を用いてDeep

別割合が低い結果であった。これは，AIが各行

Learningのフレームワーク

で学習させた。こ動を識別するときに使用する基準値（閾値）が変の学習の重みデータであるAIを用いて体重ごと化したことが要因として考えられる。この点は学に検証用画像を読み込ませて学習精度を確認し習用の画像枚数をさらに増やした条件でのAIにた。その後，作成したAIを別の画像（10枚）をよる行動の識別精度を確認する必要がある。

３）

用いて評価した。

Table 1 Recognition percentage of various behavior by artificial intelligence using different

numbers of image data.

Numbers of image data
500
1000
2000
4000

Recognition percentage（%）
Eating behavior

Drinking behavior

Rest behavior

0.04
99.94
99.98
100

100
100
100
100

0
100
0
100

© The Ito Foundation

438
3.2

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

RFIDタグの鶏用足環への適用性評価に接着したRFIDタグは，時間の経過とともに糞RFIDの活用はさまざまな分野で増えており，

尿で接着剤が劣化することに加え，鶏の成長とと125～135KHz帯，13.56MHz帯，2.45GHz帯などがもに行動が活発となり，鶏の足と足環との摩擦が市販されている。本実験では無線指向性が広く，起こって脱落したと考えられる。その対策とし金属や水の影響を受けにくい125KHz帯を利用して，RFIDタグを熱収縮チューブで足環に固定すた。RFIDタグは，電磁誘導方式を利用して心棒る方式を考案した。この方式はコストが安く，取状に巻いたコイルアンテナとして電源を内蔵しなり付けが簡単であり，飼育実験でRFIDの脱落がいパッシブタイプの超小型タグ（直径2.12mm，

確認されなかった。

長さ12mm）を使用し，市販の鶏用足環にホット

3.3

メルト接着剤（エチレン酢酸ビニル）で取り付け試作したRFID受信機能内蔵の体重計は各ブロた。足環に取り付けたRFIDタグは飼育実験中にイラーの体重データを記録できた（Fig.１）。体

脱落し，接着部分の耐久性に問題を有した。足環重データは日別にヒストグラムから算出した。カ

鶏の体重計測・行動撮像システムの評価

BW
（g）
3500
3000
2500
2000
1500
ID number

1000

1

500
0

Day 1

3

5

7

2

9

3

4

5

6

7

8

11

13

15

17

19

21

Fig. 1 Changes of individual body weight（BW）of broiler.

Fig. 2 Individual ID number and body weight of broiler.

© The Ito Foundation

439

養鶏における個体管理と清掃ロボット導入によるIoT型食肉生産技術の開発

メラと試作体重計で得られたデータはFig.２に示

3.4

すとおり，行動と体重の表示データを同時に録画作成したAIによるブロイラーの体重の判別結することが可能であり，各ブロイラーのIDの判果をTable２に示した。体重の判別は，飼育実験

別と行動や体重を容易に確認できた。試作体重計

時にカメラで撮像した画像データと試作したで得られたブロイラーの体重は変動を伴い増加しRFID受信機能内蔵の体重計が示した体重データ

ながら推移していた。これはブロイラーが静止しにより，鶏の画像と体重を関連づけて作成した教て体重計にのることがなく，常に動作状態である師データをDeep Learningで学習させた重みデー

ことから振動が歪ゲージに受信され，数百グラム

タを用いて行った。その結果，1,700ｇと1,800ｇ単位で測定誤差が発生したことが要因として考えの体重区分の認識率は不十分であったが，1,900られる。また，体重データは大きく変動する日やｇと2,000ｇの体重付近の個体では60～90％の精欠測日があった。体重が大きく変動したのは，体度で判別できた。判別精度が低くなった要因とし重計を通過するブロイラーの動作が激しかった場ては，学習用画像の背景や切り出し位置の違いに合にロードセルの測定値の変動が大きくなり，こよって認識物を別物と認識してしまうAIになっれによる影響と思われる。体重データの欠測はブていたことが考えられる。

AIによる鶏の体重判別

ロイラーの活動量が低下した際や２羽が同時に体3.5

重計にのった際に，ブロイラーのIDと体重が反薬剤散布補助ロボットとして試作した走行台車

応しなくなりデータが取得できなかったことが原はFig.３に示した。走行台車は，高さと質量が因として考えられる。これらは行動の観察記録や139cm，40.4kgであり，牽引力が214Ｎ，走行速

前後日の体重の推移から補正することが可能であ度の範囲が0.21～0.47m/sであった。また，走行る。よって，本試作システムは，改善すべき点が台車の重心は，Gxが217mm，Gyが403mm，Gz

あるものの，ブロイラーの行動と体重の推移をリが339mmであった。試作機の薬剤散布補助ロボッ

アルタイムで取得することが可能であり，それをトは制御システムで作業者に対して追従した走行

基にブロイラーの標準体重を参考にしながら目標が可能であり，速度を無段変速で制御することが体重への到達予測に利用できると考えられる。

できる。牽引力は214Ｎと約20kgのホースまで安薬剤散布補助ロボットの走行性評価

Table 2 Recognition percentage of broiler body weight classification by artificial intelligence.
Times of test
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Average

Recognition percentage（%）
1700g

1800g

1900g

2000g

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

81
86
86
93
96
66
91
0
0
0
60

99
99
99
97
95
96
96
90
83
85
94

© The Ito Foundation

440

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）が確認できた。RFIDタグと歪ゲージを用いた体重計測とカメラによる行動撮像のシステムは，ブロイラーの体重データを基にした飼育管理や出荷予測に活用できる。RFIDは行動解析にも有効であるが，タグの取り付け方法やコストを考慮する必要がある。本システムから得られたブロイラーの画像は，Deep Learningのフレームワークで体重の推論モジュールを開発できることが示唆された。本システムにDeep Learningによる監視機能を確立することで，養鶏における監視労力の軽減
や飼育状態の最適化を実現できると考えられる。
今後の課題として，環境に依存しないロバストな
体重推論モジュールを作り上げるのに必要な学習

Fig. 3 Moving cart for chemical spray.

作業量の定量化，RFIDを用いない個体認証技術方法について検討が必要である。薬剤散布補助ロ

定して牽引可能であったが，車体フレームが軽ボットの走行台車は制御システムで作業者に対しく，前後のホイールベースが短かったため214Ｎて追従する走行が可能であり，約20kgのホースを超えると転倒のリスクが高まった。実用に際しまで安定して牽引できることが確認できた。

ては，機体フレームとホイールベースを見直し，重心の位置を下げることが必要であることが確認
できた。
４．要

約

ブロイラーの行動画像を用いて学習させたAI
は，摂食，飲水，休息の各行動を識別できること

文献１） 農林水産省生産局畜産部食肉鶏卵課：食肉鶏卵をめ ぐ る 情 勢 ， http://www.maff.go.jp/j/chikusan/
shokuniku/ lin/ index.html，2019.
２） Chainer Documentation Release 1.23.0 Preferred
Networks and Preferred Infrastructure. 2017.
３） YOLOv3：An Incremental Improvement. Joseph
Redmon, Ali Farhadi. University of Washington.
2018.

© The Ito Foundation

441

成熟後の効率的な筋肥大の誘導に寄与する筋幹細胞の探索
The search study about myogenic stem cell population which can promotemuscular hypertrophy efficiently in adult animals

鈴

木

貴

弘

（北海道大学大学院農学研究院）

Takahiro Suzuki（Research Faculty of Agriculture, Graduate School of Agriculture, Hokkaido University）

After the maturation, skeletal muscle regeneration and hypertrohy are greatly dependent
on myogenic stem cells（satellite cells）contribution since myofibers cannot proliferate andsupply myonuclei. Recently, authors revealed that myogenic capability of satellite cells may bedifferent depending on localized environments, such as myofiber-type or muscle sites. In thepresent study, we aimed to search the satellite cell-group with high myogenic capability withbroad perspective. So, we focused on the myogenic capability difference of satellite cells in micestrains. In comparative experiments between C57BL/6（B6）and ICR mouse strain, satellite
cells isolated from B6 would form more myotubes and also express the myotube markers andmyogenic regulatory factors（MRFs）in higher levels. The expression patterns of myogenin amember of MRFs during differentiation stage were doramatically up-regulated in B6 satellite
cells, suggesting that myogenin might be a key factor for detection about satellite cell-groupwith high myogenic capability. Next, we examined the effect of myogenin knockdown
treatment on myogenic differentiation in C2C12 mouse myoblasts. The expression level ofmyosin heavy chain-embryonic an immature myotube-formation marker was down-regulated,but other markers of myotube were not affected by myogenin knockdown. These results
showed that the satellite cell-group with high myogenic capability localize in B6, futhermore
myognin may not be a key factor. Therefore, we will continue this search study focusing onother myogenic factors. These basic scientific knowledges would be beneficial to not only meat
science field but also medical and sports sciences.

１．目

れる。しかし，成熟個体内における骨格筋細胞

的（細長い構造のために“筋線維”と呼称される）家畜の骨格筋は主に食肉の原料となるが，採取は，最終分化しており自身で増殖することができできる可食肉量は個体体重の約35％程度にしか至ないため，その数や容積を容易に増加させること

らないことが分かっている。そのため，家畜１個は困難だと考えられている１）。

体あたりの骨格筋量が一生を通じて増加し続ける

一方で，骨格筋には筋再生に重要な役割を担う

ことは，効率的な食肉生産へ寄与できると期待さ筋幹細胞（衛星細胞）も局在している。衛星細胞© The Ito Foundation

442

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

は，筋線維の基底膜と細胞膜の間隙に位置し２），に，改良した衛星細胞の単離培養方法を採用し普段は休止状態にあるが激しい運動などに伴う物

た８～11）。ICRおよびC57BL/６マウス骨格筋（脊柱理刺激によって活性化状態に入ると３～５），増殖し起立筋群，大殿筋，ヒラメ筋，足底筋，腓腹筋，て筋芽細胞へと分化し，細胞同士で互いに融合し長趾伸筋，前脛骨筋および大腿直筋を含む）を摘て新生筋線維（筋管）を形成し，または既存の筋

出 し ，37 ℃ に 温 め た リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水

線維に融合することで損傷部を修復する 。この（PBS）により洗浄しながら結合組織や脂肪を取ように衛星細胞には，成熟個体内であっても筋線

り除いた後に，細切した。1.0mg/mlとなるようPBS

維の数や容積を増加させる能力が備わっている。

に希釈したプロテアーゼ（Streptomyces griseus ;また最近，著者らの研究グループでは，衛星細胞

ストレプトマイシスグリゼウス由来）と細切したの筋管形成能が単離した骨格筋部位によって異な骨格筋を37℃の恒温槽内で60分間反応させ，遠心る“筋部位特異性”を報告した７）。つまり，衛星分離（1,700x g，25℃，４分間）した後に上清を細 胞 は 局 在 し て い た 環 境 に よ っ て myogenic

捨てた。反応後の筋組織に37℃に温めたPBSを加capabilityに差が生じる細胞集団であることが示

えて懸濁し，遠心分離（190x g，25℃，10分間）

唆された。

を行った後に上清を回収した。本作業は，遠心分６）

そこで本研究では，成熟後においても効率的に離時間を８分間，５分間に変更して繰り返した。

筋肥大を誘導できる優れたmyogenic capabilityを集めた上清を遠心分離（1,700x g，25℃，４分間）

有する衛星細胞集団を探索することを目的としして，細胞ペレットを回収した。そこに，４℃にた。具体的な探索方法として，成熟したマウスの冷ました２％FBS-PBS（Wash Buffer）を加えて異系統間における衛星細胞の筋管形成能および筋

攪拌した後，100μｍセルストレーナーを通して分化能の比較試験を行うとともに，差が生じた際不純物を除去し，遠心分離（1,700x g，４℃，４の要因として筋分化転写制御因子の関与について分間）を行った。上清を捨て，４℃に冷ました溶検証した。

血バッファーを３分間反応させた後に，Wash

２．方
2.1

Bufferでメスアップしてから遠心分離（1,700x g，法

４℃，４分間）を行った。上清を捨て，37℃に温めた増殖誘導培養液（20％FBS-F10）を加えて実験材料

本 研 究 で は ，８ -10 週 齢 の Jcl ： ICR マ ウ ス

攪拌した後，40μｍセルストレーナーを通し不純（ICR；日本クレア株式会社）およびC57BL/6NJcl

物を除去し，遠心分離（430x g，25℃，10分間）

マウス（B6；日本クレア株式会社）の骨格筋かを行った。再度20％FBS-F10を加えてよく攪拌

ら単離した衛星細胞の初代培養系を，およびノッ

し た 後 ，fibronectin コ ー テ ィ ン グ し た 24well

クダウン実験にはマウス骨格筋由来筋芽細胞株

poly-L-lysine coated multiplate に 骨 格 筋 量 0.5-

C2C12を使用した。本研究における動物実験（動1.0g/ mlの濃度となるように調製した細胞懸濁液

物実験承認番号：15-0173）は，国立大学法人北を500μl/wellで播種し，５％CO ２ ，95％大気，海道大学動物実験に関する規定に基づく北海道大37℃の条件下で細胞密度が50％コンフルエントに学動物実験実施マニュアルに従った。

な る ま で 培 養 し た 。そ の 後 ，分 化 誘 導 培 養 液

2.2

衛星細胞の初代培養系（５％HS-DMEM）に切り換えて，筋管形成が認本研究では，Allenら（1997年）の方法を参考められた分化72時間目まで培養した。

© The Ito Foundation

成熟後の効率的な筋肥大の誘導に寄与する筋幹細胞の探索443

2 . 3 RNA干渉法を用いたmyogenin knockdown

トリス緩衝液により30分間ブロッキングし，免疫20％FBS-F10を用いて1.0x 10 cells/mlに濃度

反応促進試薬（Can Get Signal, TOYOBO）で希を調製したC2C12の細胞懸濁液を，Type Iコラー

釈した１次抗体溶液中で一晩４℃においてインゲン（Cellmatrix Type I-A，新田ゼラチン）でキュベーションした。メンブレンを洗浄後，同様

コーティングした24well multiplateに500μl/wellに希釈したHRP標識２次抗体溶液で１時間25℃で播種し，５％CO２，95％大気，37℃の条件下でにおいてインキュベーションした。その後，ECL

24時間増殖させた。その後，５％HS-DMEMに

Western Blotting Reagents （GE Helth care） と切り換えて分化誘導を行い，筋管形成が認められメンブレンを反応させ，ChemiDocTM XRS＋シス

た分化72時間目まで培養した。分化誘導と同時

テム（Bio-Rad）を用いて化学発光検出を行った。

４に ，濃 度 40nM に 調 製 し た myogenin 特 異 的 な

2.6

siRNA （stealth siRNA， Invitrogen） を siRNA

測定値は平均値±標準誤差で示した。

transfection reagent （Screen Fect , WAKO）

Microsoft Office Excel 2016（Microsoft）を 用 いを用いてトランスフェクションした。なお，対照て，各測定値から得られたデータをStudentのｔ

群 と し て 濃 度 40nM の Control siRNA（AllStars

検定によって有意差検定を行い，ｐ＜0.05をもっNegative Control siRNA, QIAGEN）を同様にトて統計学的に有意であるとした。

TM

ランスフェクションした。
2.4

RNA抽出およびreal-time RT-qPCR各 培 養 細 胞 を PBS で 洗 浄 後 ，RNA 抽 出 試 薬（ISOGENⅡ，ニッポンジーン）により溶解し，

統計解析

３．結果と考察3 . 1 マウスの系統間における衛星細胞の筋管形成能の違いメーカー推奨のプロトコルに従ってtotal RNAをこれまでに，マウスにおいて筋損傷誘導や筋移抽出した。衛星細胞の初代培養系においてはtotal

植などの処置を行うと，系統間で筋再生能に差異

RNAの濃度を15ng/μlに，C2C12は50ng/μlにそが生じることが報告されている12～14）。すなわち，

れ ぞ れ 希 釈 し て か ら ，逆 転 写 に 供 試 し て

マウス系統間では衛星細胞のmyogenic capability（ReverTra Ace qPCR RT Kit, TOYOBO），cDNAに差が生じる可能性が考えられた。そこで，本項を作成した。作製したcDNAを含む逆転写反応液

では，ICRとB6のそれぞれから単離した衛星細胞を 鋳 型 と し ， TaqMan Probe Assay を 用 い たの初代培養系を用いて，系統の違いによる筋管形

real-time RT-qPCR（Light Cycler 480 systemⅡ,

成能について比較した。まず，位相差顕微鏡像よRoche）によって定量的解析を行った。データのり両系統の衛星細胞において経過時間とともに分分析は，添付のソフトウェアを用いて行った。

化して互いに融合する様子が観察され，分化誘導

2 . 5 タンパク質の抽出およびWestern Blotting

72時間目では筋管の形成が認められた（Fig.１）。

各培養細胞をPBSで洗浄後，Laemmli sample

しかし，48時間目においてB6では筋管の形成が

bufferでタンパク質を抽出した。サンプルは10％観察され始めたのに対して，ICRでは認められなポリアクリルアミドゲルによるSDS-PAGEに供かった。そこで，筋収縮タンパク質ミオシン重鎖

試し，泳動後のゲルよりPVDFメンブレンにタン（myosin heavy chain；MyHC）のアイソフォー

パク質を転写した。転写後のメンブレンは，５％ムのうち，筋管形成のマーカーとなるMyHC-（w/v）のスキムミルクを添加したtween20含有

embryonicおよびneonatalのmRNA発現量を比較© The Ito Foundation

444

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）
Phase Contrast Microscopy

0

24

48

72

（h）

ICR

B6

Fig. 1 Satellite cells isolated from each mouse strain formed myotubes during myogenic differentiation. Satellite cells

were proliferated about 50％ confluence until the beginning of differentiation. During differentiation stage, phasecontrast microscopy was taken for observation of aspects about myotube-formation on every 24 h. Upper panels
show satellite cells isolated from ICR, lower panels are from C57BL/6（B6）.White arrows indicate myotubes. Scalebar；100μm.

した（Fig. 2A, B）。MyHC-embryonicにおいて，（MRFs）の MyoD, myogenin, Myf5 お よ び MRF

ICRでは分化誘導０時間目では発現が認められな４に着目し，各系統の衛星細胞における分化誘導

かった。B6は０時間目から発現しており，48時

後のmRNA発現量を比較した（Fig.３）。MyoD

間目以降に発現量が増加し，ICRよりも有意に高は，ICRおよびB6両系統で分化誘導０時間目からい値を示した。MyHC-neonatalにおいては，ICR発現が認められ，その発現量はいずれの時間におでは24時間目まで，B6では０時間目で発現が認い て も B6 が ICR よ り も 有 意 に 高 か っ た（Fig.

められなかった。なお，MyHC-embryonicと同

3A）。myogeninは，ICRでは０時間目に発現が認様にB6の発現量が48時間目以降で増加し，ICRよ

められなかったが，B6では０時間目から発現しりも有意に高い発現量が認められた。次に，筋管ており，24-72時間目にかけてICRよりも有意にマーカーであるtotal MyHCのタンパク質発現量

高い発現量であった（Fig. 3B）。Myf5は，ICRでを比較した（Fig. 2C）。その結果，ICRではバン

は24時間目まで発現が認められなかったが，B6ドの検出が認められなかったのに対し，B6ではでは０時間目から発現しており，72時間目におい明確なバンドが検出された。よって，位相差顕微てはICRよりも有意に高い発現量が認められた鏡像で観察されたB6がICRに比べて筋管形成が優（Fig. 3C）。また，MRF4はいずれの時間において勢であった結果とも一致し，B6から単離した衛も有意な差はなく，ICRでは48時間目まで発現が星細胞はICRと比べて筋管形成能が高いことが明認められなかった。72時間目において，ICRではらかとなった。

B6よりも高発現の傾向が認められたが有意な差

3 . 2 衛星細胞における筋分化転写制御因子のはなかった（Fig. 3D）。よって，B6から単離した
衛 星 細 胞 は ICR よ り も MyoD, myogenin お よ び

発現パターンの比較
本項では，B6において筋管形成能が高い要因

Myf５の発現量が相対的に高いことから，筋分化を追求するために，衛星細胞の筋分化制御に深くが盛んに起こることで筋管形成能が高いことが推

関 わ る 転 写 因 子 myogenic regulatory factors

測 さ れ た 。つ ま り ，B6 に は 優 れ た myogenic© The Ito Foundation

445

成熟後の効率的な筋肥大の誘導に寄与する筋幹細胞の探索
real-time RT-qPCR
B
MyHC-neonatal/HPRT（relative unit）

MyHC-embryonic/HPRT（relative unit）

A

15
＊

＊

10

5

0

N.D.
0

24

48

72

150

ICR
C57BL/6

＊＊

＊＊

100

50

0

N.D. N.D. N.D.

0

24

48

72

Western BlottingC
MyHC（220 kDa）
β-actin（42 kDa）

ICR

B6

Fig. 2 Comparative analysis about the expression levels of myotube-formation markers between ICR and B6. Eachsatellite cells prepared from ICR or B6 were differentiated until 72 h as shown in Fig. 1. Cell lysates were collected
at indicated time points and evaluated for（panel A）MyHC-embryonic and（panel B）MyHC-neonatal mRNA
expression levels by real-time RT-qPCR normalized to HPRT. Bars relative to the means in（panel A）24-h or（panel B）48-h differentiated-culture from ICR. The values are expressed as mean±SEM from three independentcultures. Significant differeces（p ＜ 0.05 and p ＜ 0.01）between ICR and B6 satellite cells are indicated by single or
double asterisks, respectively. N.D. indicates non-detectable mRNA expression level in each culture.（panel C）
Protein expression levels of total MyHC were analyzed by Western Blotting of cell lysates collected at each 72-hdifferentiation culture normalized to β-actin.

capabilityを有する衛星細胞集団が局在すること

行 い ，仮 説 の 妥 当 性 の 検 証 を 行 っ た 。ま ず ，が示唆された。

myogenin knockdownによる筋分化誘導過程を観3 . 3 myogenin knockdownによる筋管形成能察したが，対照群と比較して細胞の形態に大きな違いは認められず，分化誘導72時間後においてもへの影響
前項において，B6の衛星細胞ではICRよりも同程度の筋管が形成されていた（Fig.４）。続い

myogeninの発現量が有意に高く，かつ劇的な発て，72時間目において回収したサンプルを用い現変動を示すことが明らかとなった。そこで，て ，myogenin ，筋 管 形 成 の マ ー カ ー で あ る

myogeninがB6の衛星細胞における高い筋管形成

MyHC-embryonic お よ び neonatal の mRNA 発 現

能および筋分化能を誘導するkey factorなのでは量を比較した（Fig. 5A）。myogeninの発現量は，ないかと仮説を立てた。本項では，マウス由来筋

対照群よりも有意に低くなっており効率的な芽細胞株C2C12において，RNA干渉法を用いた

knockdown を 確 認 し た 。 な お ， MyHC-

myogenin特異的なsiRNAのトランスフェクショ

embryonicにおいて有意な発現減少が認められたン処理により発現を抑制したknockdown実験をが，MyHC neonatalについては対照群と同程度© The Ito Foundation

446

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）
real-time RT-qPCR

＊＊

＊＊

＊＊
25

0

＊＊

0

24

48

72

D

100
80
60

＊＊

40
20
0

N.D.

N.D.

0

24

48

72

MRF4/HPRT（relative unit）

MyoD/HPRT（relative unit）
Myf5/HPRT（relative unit）

C

50

myogenin/HPRT（relative unit）

B

A

250
＊

200
150

ICR
C57BL/6

＊

100

＊＊

50
0

N.D.
0

24

48

N.D.

N.D.

N.D.

0

24

48

72

2
1.5
1
0.5
0

72

Fig. 3 Comparative experiments about the expression patterns of myogenic regulatory factors（MRFs）in satellite cells

isolated from ICR or B6. Each satellite cells prepared from ICR or B6 were differentiated until 72 h as shown in
Fig. 1. Cell lysates were collected at indicated time points and evaluated for（panel A）MyoD,（panel B）myogenin,（panel C）Myf5 and（panel D）MRF4 mRNA expression levels by real-time RT-qPCR normalized to HPRT. Bars
relative to the means in（panel A）0-h,（panel B）24-h,（panel C）48-h or（panel D）72-h differentiated-culture
from ICR. The values are expressed as mean±SEM from three independent cultures. Significant differeces（p＜0.05 and p＜0.01）between ICR and B6 satellite cells are indicated by single or double asterisks, respectively. N.D.
indicates non-detectable mRNA expression level in each culture.

の発現量を示した。さらに，筋管マーカーtotal

有する衛星細胞集団のkey factorとして作用する

MyHCのタンパク質発現量を比較したところ，対可能性は低く，他の因子に着目した同定作業を進照群とmyogenin knockdown群で同程度のバンドめる必要があることが明らかとなった。

検出レベルであった（Fig. 5B）。よって，myogenin
knockdownによって筋管形成の初期段階に何ら

４．要約かの作用があった可能性が推測されたが，筋管形

成熟個体の骨格筋細胞は，最終分化しており，成能には大きく影響しないことが示唆され，骨格かつ自身で増殖することができないため，細胞容

筋特異的にmyogeninをconditional knockoutした

積や数を増加させることが難しい。しかし，骨格マウスを用いた過去の知見と合致していた15）。ゆ筋に局在する筋幹細胞（衛星細胞）は増殖およびえに，myogeninは優れたmyogenic capabilityを

筋分化能を有しているため，筋再生時に重要な役© The Ito Foundation

447

成熟後の効率的な筋肥大の誘導に寄与する筋幹細胞の探索
Phase Contrast Microscopy
24

48

72

（h）

ControlsiRNA

myogeninsiRNA

Fig. 4 Normal myotube-formation in myogenin knockdown cultures. C2C12 mouse myoblasts were transfected withmyogenin-specific siRNA in differentiation medium. Phase-contrast microscopy was taken for observation of
aspects about myotube-formation during 24-72 h differentiation stage. Upper panels show control siRNAtransfected cultures, lower panels are myogenin knockdown cultures. White arrows indicate myotubes. Scale bar；
100μm.

Target Genes / HPRT（relative unit）

A

real-time RT-qPCR
1.5

Control siRNA＊＊＊

myogeninsiRNA

B

Western Blotting

MyHC（220 kDa）

1
α-tubulin（55 kDa）
0.5

0ControlsiRNA

myogenin

MyHCembryonic

myogenin
siRNA

MyHCneonatal

Fig. 5 myogenin knockdown may not inihibit myotube-formation. C2C12 myoblasts were transfected with myogenin

siRNA in differentiation medium until 72 h as shown in Fig. 4.（panel A）Cell lysates were collected and evaluatedfor myogenin, MyHC-embryonic and MyHC-neonatal mRNA expression levels by real-time RT-qPCR normalized
to HPRT. Data represent arbitrary units relative to the mean in control siRNA transfected cultures. The values are
expressed as mean±SEM from four independent cultures. Significant differeces（p＜0.05 and p＜0.01）between
control siRNA and myogenin siRNA transfected cells are indicated by single or double asterisks, respectively.
（panel B）Protein expression levels of total MyHC were analyzed by Western Blotting of cell lysates collected eachsiRNA-transfected culture normalized to α-tubulin.

割を担うとともに，超再生を通して筋肥大にも寄が 示 さ れ て い る た め ，よ り 優 れ た myogenic

与すると考えられている。最近，衛星細胞は局在

capabilityを発揮する細胞集団が存在することがする環境に応じて筋分化能に差異が生じる可能性期待される。そこで，本研究ではマウスの系統間© The Ito Foundation

448

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

における衛星細胞の筋管形成能ならび筋分化能を比較するとともに，要因探索を行った。その結果，
ICRと比較してB6系統において衛星細胞の筋管形
成能が高く，また筋分化制御転写因子MRFsのうちMyoD，myogeninおよびMyf5の発現量が相対的に高いことが明らかとなった。特に，B6では分化誘導後のmyogeninの劇的な発現変動も認められたため，筋管形成を促進するkey factorであると予想された。そこで，myogenin knockdown
実験を行ったところ，筋管形成マーカーMyHCembryonicの発現減少は認められたものの，筋管の形成自体には影響がなかった。よって，優れた
myogenic capabilityを有する衛星細胞が局在する
マウスの系統は同定されたが，その要因となる
key factorは明らかとならなかった。今後は，
MyoD，Myf5ならびにMRFsと協働的に作用する
他の転写因子，さらには細胞膜タンパク質などの関与についてもフォーカスをあて，網羅的な探索を行う予定である。
文献１） 水野谷航：食肉の科学，57，７～17，2016.
２） Mauro, A.：J. Biophys. Biochem. Cytol., 9, 493～
495, 1961.
３） Tatsumi, R., Allen R. E.：Anim. Sci. J., 79, 279～
290, 2008.

４） Tatsumi, R.：Anim. Sci. J., 81, 11～20, 2010.
５） Hara, M., Tabata, K., Suzuki, T., Do, M.-K. Q.,
Mizunoya, W., Nakamura, M., Nishimura, S., Tabata,S., Ikeuchi, Y., Sunagawa, K., Anderson, J. E., Allen,
R. E., Tatsumi, R.：Am. J. Physiol. Cell Physiol., 302,
C1741-C1750, 2012.
６） Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A.：Physiol. Rev.,93, 23～67, 2013.
７） 鈴木貴弘：食肉の科学，59，33～38，2018.
８） Allen, R. E., Temm-Grove, C. J., Sheehan, S. M.,
Rice, G.：Methods in Cell Biol., 52, 155～176, 1997.
９） Tatsumi, R., Sankoda, Y., Anderson, J.E., Sato, Y.,
Mizunoya, W., Shimizu, N., Suzuki, T., Yamada, M.,
Rhoads, R. P. Jr., Ikeuchi, Y., Allen, R. E.：Am. J.
Physiol. Cell. Physiol., 297, C238-C252, 2009.
10） Suzuki, T., Takaishi, H., Sakata, T., Do, M.-K. Q.,
Hara, M., Sato, A., Mizunoya, W., Nishimura, T.,
Hattori, A., Ikeuchi, Y., Tatsumi, R.：Anim. Sci. J.,
81, 245～251, 2010.
11） Tatsumi, R., Suzuki, T., Do, M.-K. Q., Ohya, Y.,
Anderson, J. E., Shibata, A., Kawaguchi, M., Ohya, S.,
Ohtsubo, H., Mizunoya, W., Sawano, S., Komiya, Y.,
Ichitsubo, R., Ojima, K., Nishimatsu, S-I., Nohno, T.,
Ohsawa, Y., Sunada, Y., Nakamura, M., Furuse, M.,
Ikeuchi, Y., Nishimura, T., Yagi, T., Allen, R. E.：
STEM CELLS, 35, 1815～1834, 2017.
12） Grounds, M., McGeachie, J.：Cell Tissue Res.,
255, 385～391, 1989.
13） Grounds, M., McGeachie, J.：Muscle Nerve, 13,
305～313, 1990.
14） Mitchell, C., MeGeachie, J., Grounds, M.：Cell
Tissue Res., 269, 159～166, 1992.
15） Meadows, E., Cho J. H., Flynn, J., Klein, W.：Dev.
Biol., 322, 406～414, 2008.

© The Ito Foundation

449

飼料用イネの繊維消化性を左右する要因の解明と生産現場との技術的連携
Studies on fiber digestibility of forage rice, and development of researchbased cooperative extension service

近

藤

誠

（三重大学大学院生物資源学研究科）

Makoto Kondo（Graduate School of Bioresources, Mie University）

Whole crop rice silage has been used as feed for dairy cattle in Japan. Indigestibility ofunhulled grains in the digestive system of cattle causes an energy loss through excretion.
Thus, rice cultivars that produce large shoot biomass with extremely small panicles（smallpanicle cultivars）have been developed to reduce the energy loss as well as to supply a large
quantity of fibers. Small-panicle cultivars Tachiayaka（TA）and Tachisuzuka（TS）are
reported to accumulate a high concentration of sugars and starch in stems during the grainfilling period. While sugars enhance the lactic acid fermentation during ensiling, starch is
expected to supply energy to dairy cattle. The large accumulation of non-structuralcarbohydrates（NSC）in stems during grain-filling is hypothesized to be induced by the small
sink capacity in panicles. The present study is aimed at investigating whether panicle size
affects the accumulation of NSC in stems during grain-filling and ruminal fermentation
afterwards. Large-panicle cultivars Hoshiaoba（HA）and Kusanohoshi（KH）which produce
large shoot biomass with large panicles were grown along with TA and TS. A portion of eachpanicle in HA and KH were artificially cut at the full-heading to mimic small-panicle cultivars（HAc and KHc, respectively）. Then, stems were sampled at 4 and 8 weeks after full-heading
stage. Both sugar and starch concentrations were significantly higher in small-panicle cultivars（TA and TS）than in large-panicle cultivars（HA and KH）. The reduction of panicle size inlarge-panicle cultivars（HAc and KHc）significantly increased sugar and starch concentrations
in stems. NDF contents in TS, TA, HAc and KHc were lower than those in HA and KH. In
vitro ruminal total SCFA concentrations were significantly higher in TA, TS, HAc and KHc
than in HA and KH. NDF digestibilities of TA, TS, HAc and KHc were also significantly higher
than those of HA and KH. These results suggest that rice plants with genetically or artificiallysmall-sized panicles accumulate a large amount of NSC in stems and their fiber digestion inrumen increases.

© The Ito Foundation

450

平成30年度

１．目

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

2.2

的

ルーメン内消化性と含有成分の分析

イネ茎部のルーメン内消化性を評価するため水田を活用した国産の飼料生産の必要性が高まに ，め ん 羊 か ら ル ー メ ン 微 生 物 を 採 取 し ，inる中，乳牛や肉牛に対しては，飼料用イネをサイ

vitroのルーメン培養を行った。基質として各品

レージ発酵させたイネホールクロップサイレージ

種のイネ茎部を加え，48時間後に未消化の培養残（WCS）が普及している。イネWCS用の品種とし渣を回収し繊維消化率を測定した。また，ルーメては，従来はデンプンを蓄える穂部が大きい品種

ン内での発酵可能な炭水化物量の指標として，培（穂重型）が選ばれていたが，籾が牛の消化管内

養上清から短鎖脂肪酸（SCFA, short-chain fatty

で消化しづらく，未消化のまま排泄されることがacid）の濃度をHPLCにより測定した２）。イネ茎判明した。そこで穂が小さく（極短穂型），繊維部に含まれる含有成分として単少糖類，デンプ

質に富む茎葉が多いタイプの品種が開発され，たン，総繊維（NDF, neutral detergent fiber），ヘちすずかやたちあやかなどの極短穂型の品種が普ミセルロース，セルロース，リグニンを測定した。

及している。たちすずかの栄養的な特徴として，

単少糖類はフェノール硫酸法３），デンプンはtotal

繊維の消化性が従来の穂が大きい穂重型品種のク

starch assay kit（Megazyme 社）に よ り 測 定 しサノホシと比べて消化性が高いことが報告されてた。総繊維および繊維構成成分はデタージェント

いる 。繊維の消化性は，牛による採食性や乳生

法４）により測定した。

１）産性と関連があるため，その性質が近年たちすず

2 . 3 イネWCSを生産する農業法人における栽

かの利用が急拡大した理由の一つと言える。しか

培概要の調査し，たちすずかの繊維消化性が高い原因は不明瞭

中部地域にてイネWCSを生産する農業法人にな点が残っている。そこで，本研究では，極短穂て，栽培品種と収穫時期を聞き取りにより調査し型と穂重型の品種を用いて，イネの穂部割合が茎た。

部の繊維消化性に与える影響とその要因を解析することを目的とした。
２．方
2.1

３．結果と考察
Table１に飼料用イネの茎部の総繊維消化率を法示した。極短穂型品種のたちあやか，たちすずか

飼料用イネの栽培

はともに穂重型品種のホシアオバ，クサノホシと試験にはイネWCSとして利用される品種のう

比べて，有意に高い消化率を示した。河野ら１）でち，穂重型のホシアオバ，クサノホシ，極短穂型

はたちすずかの繊維消化率がクサノホシと比べてのたちあやか，たちすずかを用いた。播種後３週有意に高いことを示しており，今回の結果を支持

目の苗を５月下旬に三重県津市の水田に移植ししている。また本研究では，たちあやかについてた。なお，出穂直後のホシアオバ，クサノホシのもたちすずかと同様に繊維消化性が高い特徴を有一部の個体で穂を部分的に切除した。各品種，出することが明らかになった。特に穂重型では，出穂後４週目および８週目に地上部の植物体を収穫

穂後の週数が４週から８週に進むにつれて繊維消し，全重量を測定した。その後，穂，茎（稈＋葉化率が低下したのに対して，極短穂型ではその期

鞘），葉を分けて各部位の重量を測定し，60℃で間での変化はわずかであった。極短穂型品種で48時間乾燥させた。

は，茎部は地上部重量の約７割を占めており，飼© The Ito Foundation

451

飼料用イネの繊維消化性を左右する要因の解明と生産現場との技術的連携
Table 1 in vitro ruminal NDF digestibility, SCFA profiles of stem from rice forage harvested at

4 and 8 weeks after heading.
NDFD
%

SCFA
mM

AcetatemM

Propionote
mM

ButyratemM

Hoshiaoba（intact）

44.2

42.6

27.2

12.0

3.3

Hoshiaoba（cut）
Kusanohoshi（intact）

45.0
44.1

50.6
38.2

31.5
24.6

14.1
11.0

5.0
2.5

Kusanohoshi（cut）

44.8

49.0

30.7

13.4

4.9

Tachiayaka

47.9

54.7

33.9

15.1

5.6

Tachisuzuka

49.5

56.4

34.5

17.0

4.9

8 weeks after heading
Hoshiaoba（intact）

38.4

39.7

25.2

11.2

3.2

Hoshiaoba（cut）

43.2

49.7

30.7

13.3

5.7

Kusanohoshi（intact）

38.9

41.4

26.0

11.8

3.6

Kusanohoshi（cut）

44.4

52.0

31.8

14.6

5.6

Tachiayaka
Tachisuzuka
p-value
Cultivar
HarvestCultivar x Harvest

46.2
46.7

51.6
55.0

31.6
33.2

13.7
15.7

6.4
6.1

＜0.001＜0.001＜0.001＜0.0010.408＜0.001＜0.001
0.015＜0.001＜0.0010.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001Treatments
4 weeks after heading

NDFD, NDF digestibility；SCFA, short-chain fatty acid

料価値に影響する主要な部位である。粗飼料の繊

茎部に非繊維性の炭水化物が蓄積するため，相対維消化率は乳牛にとって飼料摂取量と正の相関が的に繊維含量が少なくなったためと考えられる。

認められており ，極短穂型の２品種で茎部の繊繊維構成成分として，ヘミセルロース，セルロー

維消化率が高いことは粗飼料として重要な特徴とス，リグニンの繊維中の割合を比べると，たちあ言える。続いて，穂重型品種のホシアオバとクサ

やかとたちすずかはともにホシアオバとクサノホノホシに対して穂部の一部を切除することで，人シと比べて，ヘミセルロース割合が高く，セル

為的に穂部割合が小さい草型のイネを作り，そのロース割合が低かった。また，ホシアオバとクサ

繊維消化率を無処理の場合と比較した。その結ノホシの穂部を一部切除することでも，極短穂型

果，出穂後４週目では切除した効果は認められな品種と同様に，ヘミセルロース割合が増加し，セかったが，出穂８週目では無処理に対して，切除

ルロース割合が低下した。一方，リグニンの割合

により繊維消化率は有意に高い値を示した。以上には，穂部割合の違いによる影響は認められず，の結果から，極短穂型品種が有する高消化性の特ホシアオバとたちあやかが，クサノホシとたちす

徴は，繊維の質に関係する遺伝的な性質よりも穂ずかよりも高い傾向を示した。さらに，穂部の一部の大きさの変化による二次的な要因が関与して部切除によってリグニンの割合は変化しなかっいることが推察された。

た。リグニンは繊維と強固に結合することで，繊５）Table２にイネ茎部に含まれる総繊維含量と繊

維消化率を低下させる成分であるが６），本研究か

維構成成分の割合を示した。総繊維含量は，穂重らは，極短穂型品種の繊維消化率とリグニン割合型の２品種が極短穂型の２品種と比べて高い値をとの関係は見出されなかった。イネ科牧草を対象示した。これは後述するように，極短穂型では，に繊維構成成分の消化率を比較した研究例では，© The Ito Foundation

452

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 2 Chemical composition of stem from rice forage harvested at 4 and 8 weeks after heading.
NDF%DM

Hemicellulose%NDF

Cellulose%NDF

Lignin
%NDF

Sugar
%DM

Starch%DM

Hoshiaoba（intact）
Hoshiaoba（cut）

62.0
51.2

35.9
38.3

57.2
55.8

6.9
5.9

11.0
15.7

3.9
11.3

Kusanohoshi（intact）

68.5

36.4

55.9

7.7

7.7

2.4

Kusanohoshi（cut）

57.8

42.1

50.4

7.5

15.3

10.0

Tachiayaka

50.3

40.6

52.3

7.1

16.7

15.4

Tachisuzuka

47.6

39.1

54.4

6.6

21.9

9.5

Hoshiaoba（intact）
Hoshiaoba（cut）

63.8
51.5

36.4
43.1

53.3
46.9

10.3
10.0

12.8
17.6

4.3
16.2

Kusanohoshi（intact）

60.8

37.6

55.2

7.2

12.7

5.2

Kusanohoshi（cut）

50.8

44.7

49.2

6.1

18.7

14.9

Tachiayaka
Tachisuzuka
p-value
Cultivar
HarvestCultivar x Harvest

51.9
47.2

45.9
44.1

43.9
50.3

10.1
5.6

16.4
20.9

20.0
16.0

＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001
0.004＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001
0.004＜0.001＜0.001＜0.001
0.002＜0.001＜0.001
0.019

Treatments
4 weeks after heading

8 weeks after heading

ヘミセルロースの消化率はセルロースの消化率よ性が高く飼料用イネとしても重要な要素と判断でり高いことが報告されており ，ヘミセルロース

きるが，その機構を明らかにするためには，今後

は繊維の中でもルーメン内で消化されやすい成分の追究が必要である。

７）である。そのため，極短穂型品種の繊維消化率がルーメン微生物の培養系にて飼料用イネの茎部高い原因として，ヘミセルロースの割合が高いこから産生された短鎖脂肪酸の濃度をTable１に示とが影響していると考えられた。ここで，穂部割した。牛の生体内では，ルーメン内で生じた短鎖合が小さい極短穂型品種でヘミセルロースの割合

脂肪酸を牛が吸収して体内でのエネルギー産生にが高まった原因としては不明であるが，同様の現利用するため，本研究の培養系で示す短鎖脂肪酸

象 は 他 の 先 行 研 究 で も 示 さ れ て い る 。Arai-

濃度は，牛が代謝可能なエネルギー量の間接的なSanoh et al では，地上部に占める子実割合が25

指標として判断できる。飼料用イネの出穂後４週～53％のイネを対象に，ヘミセルロースの一部で目，８週目ともに極短穂型品種から産生した短鎖あるβ-1,3：1,4-グルカンの変化量を出穂前後で脂肪酸が穂重型品種よりも高かった。さらに，穂調べている。同論文では子実割合が多い品種で重型品種において人為的に穂部の一部を切除したは，出穂後に茎部に残存するβ-1,3：1,4-グルカ

ことでも短鎖脂肪酸が増加した。これらの結果はンが少ないのに対して，子実割合が少ない品種で穂部割合が小さい品種ほど，茎部から得られる代は，β-1,3：1,4-グルカンの残存量が多いことを謝エネルギー量が多いことを意味しており，品種示している。つまり，イネWCSとして収穫するとしても飼料価値としても高いことが推察され出穂後の時期には，穂部の大きさにより茎部のヘる。短鎖脂肪酸はルーメン内で発酵可能な炭水化

ミセルロース割合が影響を受けることを示唆して物量を示しており，主に単少糖類，デンプン，繊いる。ヘミセルロース割合は茎部の消化性と関連維から得られる。そこで飼料用イネの茎部に含ま８）© The Ito Foundation

飼料用イネの繊維消化性を左右する要因の解明と生産現場との技術的連携

453

れる単少糖類，デンプンを比較したところ，単少では天候不順などにより収穫期間の延長も起こり

糖類は，いずれの収穫時期においても，ホシアオ

うるため，繊維消化率が低下しづらい極短穂型品

バおよびクサノホシの穂重型と比べて，たちあや

種を利用することは，牛へより飼料価値の高いイ

かおよびたちすずかの極短穂型で有意に多く含ま

ネWCSを供給するうえでの利点であることが示

れ て い た（Table ２）。Matsushita et al.

でもたされた。今後の課題として，本研究では１年分のちすずかは親品種のクサノホシと比べ，スクロー

栽培試験に限定されたため，今後は複数年にわたスをはじめ単少糖類が多く含まれていることを報り調査を継続することが必要である。また，本研

告しており，本研究の結果を支持している。また

究ではサイレージではなく収穫直後のイネを試験

本研究では，単少糖類に加えて，デンプンも穂重に用いたため，実際に畜産農家が牛に給与する際型と比べて，極短穂型で有意に多く含まれていのサイレージとは状況が異なる可能性も想定された。単少糖類やデンプンはルーメン内で速やかにる。今後，サイレージを用いた試験により繊維消微生物により発酵され，短鎖脂肪酸を産生する栄化性やサイレージ内での単少糖類，デンプンの残養素である。このように極短穂型品種の茎部に単存性，ルーメン内での短鎖脂肪酸産生について明

少糖類に加えてデンプンも多く蓄積していたこと

らかにすることが必要である。

９）が，先に述べた極短穂型品種からの短鎖脂肪酸の産生量が多かった要因として考えられた。また，

４．要

約

穂重型品種の穂を一部切除した場合，極短穂型品

本研究では，飼料用イネの茎部の繊維消化性が種と類似して単少糖類およびデンプンを多く含ん

イネの穂部割合により影響を受けることを明らかでいた。これらのことは，穂部割合が小さい飼料にした。特に近年利用が拡大している極短穂型の用イネでは，穂部のシンクサイズが小さく限定さ

品種は茎部の繊維消化性が高く、その要因としてれるため，光合成産物が茎部に単少糖類およびデは，繊維中のヘミセルロースとセルロースの存在

ンプンとして蓄積し，その結果，ルーメン内で産比率が関与していることが示唆された。また，極生する短鎖脂肪酸量を増加させることを示した。

短穂型品種では，茎部に単少糖類とデンプンが蓄

イネWCSを生産する農業法人における栽培概

積することで，ルーメン内で発酵可能な炭水化物

要の聞き取り調査を行った結果，複数の法人で量が多く，牛へ供給可能なエネルギー量が多い可20ha以上のWCS用イネを栽培しており，品種は能性が示された。特にこれらの特徴は出穂後４週

極短穂型品種が過半数を占めていた。特にたちす目から８週目まで維持されており，従来の穂重型

ずかの利用量が最も多かった。また，収穫時期は品種と比べて優位な点として判断できた。イネ

主に９月中下旬から10月下旬にかけて行われていWCSを生産する農業法人では，栽培面積が広い

るが，年によっては天候の不順が続くこともあ

ことや天候により収穫期間が長引くこともあるたり，その場合は11月に差しかかることもあった。

め，繊維消化率が低下しづらい極短穂型品種を利先述の栽培試験の結果では，穂重型品種では生育用 す る こ と は ，牛 へ よ り 飼 料 価 値 の 高 い イ ネ

期間が出穂後４週目から８週目まで４週間延長す

WCSを供給するうえでの利点であることが示さることで繊維消化率が低下したが，極短穂型品種

れた。

ではその期間の消化率低下はわずかであった。したがって，広大な面積でイネを栽培する生産現場© The Ito Foundation

454

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

文献１） 河野幸雄，新出昭吾，神田則昭，城田圭子，福馬敬 紘 ，塚 崎 由 子：日 本 草 地 学 会 誌 ，60 ，91 ～ 96 ，
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３） Hall, M. B.：Anim Feed Sci Techonol, 185, 94 ～ 100,
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４） Van Soest, P. J., Robertson, J. B., Lewis, B. A.：J
Dairy Sci, 74, 3583～3597, 1999.
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６） Thorstensson, E. M. G., Buxton, D. R., Cherney, J.
H.：J Sci Food Sci, 59, 183～188, 1992.
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８） Arai-Sanoh, Y., Ida, M., Zhao, R., Nishitani, K.,
Yoshinaga, S., Takai, T., Nakano, H., Iwasawa, N.,
Kondo, M.：Plant Prod Sci, 16, 335～341, 2013.
９） Matsushita, K., Iida, S., Ideta, O., Sunohara, Y.,
Maeda, H., Tamura, Y., Kouno, S., Takakuwa, M.：
Breeding Sci, 61, 86～92, 2011.

© The Ito Foundation

455

黒毛和種肥育牛の安定的ルーメン発酵に貢献する
重要細菌群の特性把握
Determination of factors affecting on growth of rumen bacterial species
contributing to stable rumen fermentation in Japanese Black cattle

小

池

聡

（北海道大学大学院農学研究院）

Satoshi Koike（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

Japanese Black（JB）is the most popular beef breed and accounts for 60％ of beef cattle inJapan. In order to produce marbling meat, JB cattle are fed concentrate-based diet for over
one year. Therefore, starch degrading bacteria play an important role in stable rumen
fermentation in JB cattle. In this study, we aimed to characterize starch degrading bacteria
belonging to core phylotypes of rumen microbiota in JB cattle. Ruminal content was collectedfrom fattening JB cattle using the stomach tube and used for isolation of starch degrading
bacteria （roll tube method）. In the previous study, Lachnospiraceae, Prevotellaceae,
Ruminococcaceae, unclassified Bacteroidales and unclassified Clostridiales were identified ascore members of the microbiota, and we attempted to isolate starch degrading bacteria
belonging to these phylotypes. Among 178 newly isolated strains, 12 strains were classified intoeither of target phylotypes；5 strains for Lachnospiraceae, 5 strains for Ruminococcaceae and 2
strains for Prevotellaceae. Based on the phylogenetic positions, representative strains wereselected and used for characterization. Under different pH conditions, Lachnospiraceae straingrew at pH 5.5；meanwhile, strains of Prevotellaceae and Ruminococcaceae did not. Strains of
Lachnospiraceae and Ruminococcaceae adhere to feed particles within 30 minutes of incubation,and the extent of adhesion was higher in concentrate particles than in hay particles. Although
Prevotellaceae strain did not adhere to feed particles within 30 minutes of incubation, amountof particle-adherent cells seemed to gradually increase during 24 h of incubation. Therefore,
the strains belonging to core phylotypes of rumen microbiota in JB cattle might be involved in
feed digestion in different manners.

１．目

健全なルーメン発酵を維持することがきわめて重的要である。私たちの研究室では，これまでに分子

黒毛和種は日本の肉用牛飼養頭数の約65％を占生態的アプローチにより黒毛和種肥育牛のルーメ

める重要な肉用品種である 。本品種は良好な脂ン発酵において重要な役割を担う細菌群の特定を

肪交雑を得るために１年以上にわたって濃厚飼料

進 め て き た。 そ の 結 果， Lachnospiraceae,

多給による肥育を行うため，安定生産においては

Ruminococcaceae，Prevotellaceae，Unclassified

１）© The Ito Foundation

456

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Clostridiales お よ び Unclassified Bacteroidales が

餌後４時間のルーメン液を経口採取し，分離源と肥育ステージによらず主要な構成メンバーである

して用いた。ルーメン液を段階希釈した後，マルことが明らかとなった。特に前三者には既知の澱

トースとスターチを基質とする培地に接種して粉分解性細菌が含まれ，濃厚飼料多給条件下で重ロールチューブを作製した。培養１日から18日に要な存在と考えている。Lachnospiraceae科には出現したコロニーを釣菌し，マルトース・スター

非常に多様性の高いButyrivibrio属が含まれチ培地へ植菌した。グラム染色により純菌であるており，澱粉分解性のB. fibrisolvensを含め，生

こ と を 確 認 し た 菌 液 よ り DNA を 抽 出 し ，16S

理機能の異なる多くの菌種が含まれる。

rDNAをPCR増幅後，ダイレクトシーケンシング

Ruminococcaceae科にはヒト腸管内の澱粉分解菌

により塩基配列を決定した。新規分離株の16Sとして知られるRuminococcus bromii

が属し

rDNA塩基配列をBLAST検索によりGenBankにており，ルーメン内においても本菌種の近縁菌群登録されているデータベースと照合した。遺伝子の分布量が濃厚飼料多給時に増加することが知ら解析ソフトウェアCLUSTAL Xを用いて多重比較れている 。Prevotellaceae科に属するPrevotellaを行い，近隣結合法により系統樹を作成し，近縁属細菌は，さまざまな飼料条件において優勢な菌の既知菌情報から新規分離株を同定するとともに群であり７～９），全ルーメン細菌の60％を占めるこ

分子系統位置を特定した。

２，３）

４，５）

６）

ともある 。さらにPrevotella属細菌の中でも最10）も多くの割合を占めるP. ruminicolaは，セルロー

2 . 2 新規菌株の基質利用性，基質への初期付着能および低pH耐性の査定

スを分解できないものの，澱粉やヘミセルロース

コア澱粉分解菌群に属することが確認された菌を分解できる11，12）ことから広食性の糖類利用菌と株の中から，分子系統位置から代表菌株を選抜いえる。以上の既知情報より，黒毛和種牛ルーメ

し，異なる炭素源を含む培地を用いて増殖モニタ

ン内においてLachnospiraceae, Ruminococcaceae

リングを行い，基質利用性を調べた。基質への初およびPrevotellaceaeに属する細菌が主導的に澱期付着能は，各菌株を対数増殖中期まで培養後，粉分解を担う細菌群（コア澱粉分解菌群）と考え菌体を遠心分離により沈殿させ，嫌気性希釈液でられる。

１度洗浄してから再懸濁したものを粗飼料および一方，分子生態的アプローチでは標的細菌群の濃厚飼料片へ30分間接触させた。接触後，基質に生理的特徴を正確に把握することは難しく，コア付着した細菌のみを回収し，Protein Assay Kit

澱粉分解菌群の役割を解明するためには実際に分（BIO-RAD）により菌体タンパク量を測定した。

離株を取得し，その生理機能を明らかにする必要

低pH耐性はpHを6.8，6.0または5.5に調整したルーがある。本研究では，黒毛和種肥育牛ルーメン内

メン液培地（可溶性スターチが唯一の炭素源）をのコア澱粉分解菌群に属する新規菌株を分離・培用い，各菌株の増殖を嫌気チャンバー内のプレー

養し，それらの生理機能を把握することを目的とトリーダーにより継時的にモニタリングした。な

した。

お，pH5.5の培地にはpH6.0の培地で一代馴致させ

２．方た菌液を接種した。

法

2 . 3 ルーメン液に含まれるコア澱粉分解菌群

2 . 1 コア澱粉分解菌群の分離および系統解析
肥育中期（20ヶ月齢）の黒毛和種牛８頭から給に対する増殖因子の探索
可溶性デンプンを基質とする合成培地に黒毛和© The Ito Foundation

457

黒毛和種肥育牛の安定的ルーメン発酵に貢献する重要細菌群の特性把握

種肥育牛，黒毛和種育成牛またはホルスタイン種

YAB-26株はスターチおよびマルトースのみを利肥育牛由来の精製ルーメン液を異なる濃度で添加用し，幅広い基質を利用したB. fibrisolvensとはし，供試菌株の増殖を測定した。

利用性が異なることが明らかとなった（Fig.１）。
R. bromii基準株はグルコース，マルトースおよ３．結果と考察びスターチ培地で増殖したが，R. bromii近縁分

本研究では178菌株を釣菌し，純菌であった84

離株２株はマルトースを利用せず，また増殖の程菌株について16S rDNAシーケンシングによる同度も既知菌株よりも低かった（Fig.１）。したがっ定 を 行 っ た 。そ の う ち Lachnospiraceae ま た はて ，黒 毛 和 種 牛 ル ー メ ン 由 来 Lachnospiraceae

Ruminococcaceaeに属する菌株をそれぞれ５菌株

YAB-26株およびR. bromii近縁菌株（YAB-117取得した。LachnospiraceaeのYAB-26株は黒毛株およびYAB-127）はいずれもスターチもしく

和種牛ルーメン由来未培養クローンとの塩基配列はマルトースの利用性が他の糖類に比べて高く，相同性が100％であった。Ruminococcaceaeに属

澱粉分解に特化した特性を有する可能性が示され

す る 菌 株 の う ち ，既 知 R. bromii 分 離 株 と 92 ～

た。飼料片への初期付着能において，いずれの菌96％の塩基配列相同性を示したYAB-117株およ株も粗飼料に比べて濃厚飼料への付着能が高いこびYAB-127株は，黒毛和種牛ルーメン由来未培とが明らかとなった（Fig.２）。この結果から，

養クローンと分子系統樹上でほかの分離株よりもこれらの菌株がルーメン内においても濃厚飼料片近傍に位置していた。以上より，これら３菌株をに速やかに付着することが示唆された。

コア澱粉分解菌群の代表菌株として選定した。基異なるpH条件における各菌株の増殖モニタリ

質 利 用 性 を 調 べ た と こ ろ ， Lachnospiraceae

ン グ の 結 果 を Fig. ３ に 示 す 。Lachnospiraceae

B. ﬁbrisolvens ATCC19171

Lachnospiraceae YAB-26

（OD）
1.5

1.5

Starch

1.2

1.2

Maltose

0.9

0.9

0.6

0.6

0.3

0.3

0.0
0

（OD）
1.0

6

12

18

24
（h）

Cellobiose
Glucose0.0
0

R. bromii ATCC27255

6

12

18

Ruminococcus sp.
YAB-117

1.0

24

1.0

0.8

0.8

0.8

0.6

0.6

0.6

0.4

0.4

0.4

0.2

0.2

0.2

0.0

0.0

0

24

48

72
（h）

0

24

48

72

0.0

Fig. 1 Growth monitoring of starch degrading bacteria under different carbon sources© The Ito Foundation

Ruminococcus sp.
YAB-127

0

24

48

72

458

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

mg bacterial cell protein / mg feed particle＊
forage＊：p＜0.05

conc.

0.4
＊

＊

0.2

0.0
Lachnospiraceae
YAB-26

Ruminococcus sp.
YAB-117

Ruminococcus sp.
YAB-127

Fig. 2 Attachment of starch degrading strains to feed particle

Lachnospiraceae YAB-26
（OD）
2.0

pH6.8

pH6.0

pH5.5

0.8

1.5

0.6

1.0

0.4

0.5

0.2

0.0

0

6

12

18

Ruminococcus sp. YAB-127

Ruminococcus sp. YAB-117

24
（h）

0

0.3
0.2
0.1

0

12

24

36

48

60

72

0.0

0

12

24

36

48

60

72

Fig. 3 Growth monitoring of starch degrading bacteria under different pH conditions

YAB-26株はいずれの培地でも増殖し，pH5.5の品種もしくは生育ステージが異なる３種類の培地においては最大OD値が1.0に達した。このこ

ルーメン液を添加した培地において，R. bromiiとからLachnospiraceae YAB-26株は低pHに耐性

基準株の増殖はいずれのルーメン液および添加濃があり，給餌直後の黒毛和種牛ルーメン内におい

度 で も 顕 著 な 差 は 見 ら れ な か っ た（Fig. ４）。

ても増殖を阻害されることはないと考えられる。

YAB-117株では特に黒毛和種肥育牛由来ルーメ

一方でR. bromii近縁菌株はpH6.0までは増殖したン液で増殖改善が見られ，YAB-127株ではいず

ものの，pH5.5では72時間後も増殖を示さなかっれのルーメン液でも添加濃度依存的な増殖改善がた。この結果から，R. bromii近縁菌株はpHへの見られた（Fig.４）。このことから，黒毛和種肥感受性が高く，pHが低下する給餌直後のルーメ

育牛ルーメン液に新規デンプン分解菌の増殖因子

ン内での活性が限定されることが推察される。一が含まれる可能性が高いと考えられる。

方，両菌株が属するRuminococcaceaeは肥育期間を通じてルーメン内で分布量を維持していることから，本科の細菌は低pHへ段階的に適応していく可能性が示唆された。

４．要

約

本研究では，黒毛和種牛ルーメン内におけるコア細菌群３科の特徴を把握することを目的とし© The Ito Foundation

459

黒毛和種肥育牛の安定的ルーメン発酵に貢献する重要細菌群の特性把握
R. bromii ATCC27255

OD660

JB fattening

0%

1.2

1.2

0.8

0.8

0.8

0.4

0.4

0.4

0

20

40（h）

0

0

20

20%

30%

Holstein fattening

JB growing

1.2

0

10%

40

0

0

20

40

0

20

40

0

20

40

Ruminococcus sp. YAB-117
0.4

0.4

0.4

0.3

0.3

0.3

0.2

0.2

0.2

0.1

0.1

0.1

0

0

20

40

0

0

20

40

0

Ruminococcus sp. YAB-127
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

0

20

40

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

0

20

40

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

Fig. 4 Effect of rumen fluid addition on growth of starch degrading bacteriaて，黒 毛 和 種 牛 ル ー メ ン か ら 分 離 培 養 し た

YAB-117株およびRuminococcus sp. YAB-127株

Lachnospiraceae YAB-26 株 ， Ruminococcaceae

はルーメン液添加により増殖が改善し，その程度

YAB-117株，Ruminococcaceae YAB-127株およは特に黒毛和種肥育牛ルーメン液で顕著だった。

びPrevotellaceae YAB-131株を各科の代表菌株として供試し，生理機能解析を行った。異なる
pH に お け る 増 殖 モ ニ タ リ ン グ の 結 果，
Lachnospiraceae YAB-26 株 は 低 pH に 耐 性 が あり，濃厚飼料増給によりルーメン内のpHが低下する条件下においても澱粉分解に貢献すると考えられる。初期付着能試験では，Lachnospiraceae
科およびRuminococcaceae科の代表菌株が粗飼料片と比較して濃厚飼料片に対して高い付着能を示したことから，ルーメン内においても濃厚飼料片へ優先的に付着するものと考えられる。R. bromii
基準株ではルーメン液添加による顕著な増殖促進は認められなかった。一方，Ruminococcus sp.

引用文献１） 農林水産省：平成25年度畜産統計調査，東京，
2014.
２） Forster, R. J., Teather, R. M., Gong, J., Deng, S. J.：
Lett. Appl. Microbiol., 23, 218～222, 1996.
３） Kopecny, J., Zorec, M., Mrazek, J., Kobayashi, Y.,
Marinsek-Logar, R.：Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 53,
201～209, 2003.
４） Ze, X., Duncan, S. H., Louis, P., Flint, H. J.：ISME
J., 6, 1535～1543, 2012.
５） Ze, X., Mougen, F. L., Duncan, S. H., Louis, P.,
Flint, H. J.：Gut microbes, 4, 236～240, 2013.
６） Klieve, A. V., O’Leary, M. N., McMillen, L.,
Ouwerkerk, D.：Appl, Environ. Microbiol, 103, 2065
～2073, 2007.
７） Pitta, D. W., Pinchak, W. E., Dowd, S. E.,
Osterstock, J., Gontcharova, V., Youn, E., Dorton, K.,
Yoon, I., Min, B. R., Fulford, J. D., Wickersham, T. A.,© The Ito Foundation

460

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Malinowski, D. P.：Microb. Ecol., 59, 511～522, 2010.
８） Stevenson, D. M., Weimer, P. J.：Appl. Microbiol.
Biothechnol., 75, 165～174, 2007.
９） Tajima, K., Aminov, R. I., Nagamine, T., Matsui, H.,
Nakamura, M., Benno, Y.：Appl. Environ. Microbiol.,67, 2766～2774, 2001.

10） Van Glyswyk, N. O.：FEMS Microbiol. Ecol., 73,
243～254, 1990.
11） Cotta, M. A.：Appl. Environ. Microbiol., 54, 772～
776, 1988.
12） Cotta, M. A.：Appl. Environ. Microbiol., 59, 3557
～3563, 1993.

© The Ito Foundation

461

乳用子牛への機能性飼料の給与による亜急性
第一胃アシドーシスの制御と発育向上
Effects of active dry yeast supplementation on subacute ruminal acidosis
and growth performance in Holstein calves

櫛

引

史

郎

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Shiro Kushibiki（National Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

We conducted two experiments to clarify the effects of active dried Saccharomyces
cerevisiae（ADSC）strain CNCM I-1077（Levucell Ⓡ SC；Lallemand, France）on Holstein calves.
In the first experiment, we investigated the impact of ADSC on ruminal pH, fermentation, andplasma metabolites during the short-term high-grain（HG）diet feeding. Four rumen-fistulated
Holstein calves（3.6 ± 0.2 months of age）supplemented with（2×10９ CFU/d；SC group, n=4）
or without（Control group, n=4）ADSC were fed the HG diet for 2 days. The 1 h mean ruminal
pH was significantly depressed during the HG diet feeding in both groups, although thechanges were more severe in the SC group compared with the Control group, consistent witha higher proportion of total VFA（p＜0.1）and butyric acid（p＜0.05）. The results suggest thatADSC supplementation induced the intense decreases in ruminal pH by increased total VFA
and butyric acids production through a HG diet. In the second experiment, we evaluated theinfluence of administered ADSC on ruminal fermentation, plasma hormones and metabolites,
and growth performance for seven weeks（from 3 to 10 weeks of age）during pre- andpostweaning periods. Ruminal propionate ratio and NH ３ concentration after weaning, andplasma GH and IGF-I concentrations around the time of weaning in the SC group（treatedwith 2×10９ CFU/d of ADSC, n=13）were higher than the control group（without ADSC
treated, n=13）. These changes may have resulted in greater ADG observed in the SC group,compared with the Control group.

１．目

期におけるスターターの多給が行われてきた２）。

的

しかし，易発酵性飼料の多給とそれに伴う粗飼料

離乳という過程は，液状飼料から固形飼料への摂取量の低下は第一胃液pHの低下につながる可移行だけではなく，単胃動物から反芻動物への移能性がある３）。成牛では，第一胃液pHの低値が行，つまり代謝・内分泌機能における顕著な変化

一定時間以上持続する状態は亜急性第一胃アシをもたらす。それゆえ，離乳が発育停滞の誘因とドーシス（SARA）と診断され，乾物摂取量や乳なる場合も少なくない 。その予防策として離乳量の低下４）などさまざまな病態との関連が指摘さ

１）© The Ito Foundation

462

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

れている。子牛における第一胃液pHの変化が第平均±標準誤差）を用い，対照区，または活性酵

一胃内発酵や生体機能へ及ぼす影響について，多母（LevucellⓇ SC；２×10９CFU/日）を飼料へ添

くは明らかになっていない。しかし，離乳前後に加給与する活性酵母区に配置した。試験期間は21おける粗飼料の無給与は，第一胃液pHの低値だ日間とした。試験開始から15日間は粗濃比57：43

けでなく，第一胃発酵の変化や第一胃液エンドトの飼料を給与した（CP15.2％，TDN68.4％）。そキシン（LPS）活性の増加，そして血中成長ホルの後２日間は配合飼料および大豆粕を等量混合しモン濃度の低下を引き起こすことが分かっていた飼料のみ給与した（CP15.7％，TDN80.5％；濃

５）

る 。

厚飼料多給期間（Day ０および１））。濃厚飼料多Saccharomyces cerevisiae（SC）は牛で広く利給期間の後，試験終了までの４日間は再び粗濃比用 さ れ る 代 表 的 な 酵 母 で あ る 。中 で も CNCM

57：43の飼料とした。試験期間終了より２週間，

I-1077株（LevucellⓇ SC；Lallemand，France）は

乾草を飽食させてから区を入れ替えて同じ処理を

反芻動物の第一胃機能を向上させる効果の高さか行った。試験飼料は乾草（CP13％，NDF68％），

ら選抜された株で，成牛で認められる効果のひと

配合飼料，および大豆粕で構成し，食べ切れる量

つに第一胃液pH低下の軽減作用がある 。そこを給与した。飼料給与は８：00と17：00の１日２で，子牛におけるこの効果を検証するために，本回，飲水は自由とした。

６）

株を給与した子牛への濃厚飼料多給試験を行った

第一胃液pHは，研究用に開発された子牛用無線伝送式pHセンサー（YCOW-S；山形東亜DKK（濃厚飼料多給試験）。
一般に，SC製剤の給与は第一胃内の嫌気状態

株式会社）を用いて10分間隔で連続測定した。集を維持し，総細菌数，真菌数，プロトゾア数を増めたデータから１時間ごとの平均pHおよび１日

加させ ，第一胃環境を安定化させる。これによあたりのpH5.6未満の時間数を算出した。また，り，線維消化率の向上 ，乾物摂取量の増加およ

濃厚飼料多給の前後においてフィステルから第一び発育の向上胃液を，頚静脈から血液を採取した。

７）８）等の効果が認められる。しかし，

９）

子牛へのSC製剤給与時における第一胃発酵およ2.2

び発育と，血中の代謝成分やホルモン濃度変化と2 . 2 . 1 供試牛，給与方法，体重測定，およびの関連は明らかとなっていない。そこで，離乳前長期給与試験
胃液と血液の採材後の７週間における活性酵母SC CNCM I-1077株

ホルスタイン種子牛26頭（雌12頭，雄14頭）をの給与が，第一胃発酵，代謝・内分泌機能，およ用いた。試験期間は３週齢から10週齢までの７週

び発育に及ぼす影響を明らかにした（長期給与試間とした。供試牛（体重57.8±1.0kg）は試験開始

験）。

時に対照区，または活性酵母区（各区，雌６頭，

２．方
2.1

雄７頭）へ無作為に配置した。活性酵母区には，

法朝給与する全乳またはスターターに活性酵母

濃厚飼料多給試験（LevucellⓇ SC；２×10９cfu/日）を添加して給与

2 . 1 . 1 供試牛，給与方法，第一胃液pH測定，した。飼料給与は９：00と16：00の１日２回とした。全乳は，給与上限を９Ｌ/日として１日あたおよび胃液と血液の採材
第一胃にフィステルを装着したホルスタイン種

り体重の11％量（朝５％，夕６％）を給与した。

雄子牛４頭（体重147±5.8kg，3.6±0.2か月齢；６週齢で哺乳量を２Ｌ/日に減らし，７週齢で離© The Ito Foundation

乳用子牛への機能性飼料の給与による亜急性第一胃アシドーシスの制御と発育向上

463

乳した。スターター（CP 21％，TDN 84％）お長ホルモン（GH），インスリン様成長因子-Ⅰ

よ び カ ッ ト チ モ シ ー（CP 8.1 ％，NDF 63.5 ％ ）（IGF-I），インスリンおよびグルカゴン濃度はは，週齢にあわせて食べ切れる量を給与した。体RIA，血漿中急性期タンパク質およびサイトカイ

重は週１回計測し，平均日増体重（ADG）を算

ン濃度はELISAにより測定した。

出した。第一胃液は10週齢の11：00に経口採取し2.4た。血液は３，４，
６，
７，
８，および10週齢時の飼

統 計 ソ フ ト （SAS University Edition ； SAS

料給与前に頚静脈から採取した。
2.3

統計処理

Institute，USA）を用いて，各測定項目における第一胃液および血液の測定

処理効果の判定を行った。最小二乗平均および標第一胃液のVFA濃度は，Thermon-3000 ３％ガ

準誤差を算出し，交互作用が有意であった時にラスカラム（進和化学工業株式会社）を用い，ガTukeyの検定により同時間または同採材週におけスクロマトグラフィー（Model135，日立）にてる処理区の差を判定した。p＜0.05を有意差あり，定量した。第一胃液のLPS活性は，平林ら

p＜0.1を有意傾向ありとした。

10）

の方

法に準じて測定した。第一胃液のアンモニア濃度
は ， 窒 素 自 動 蒸 留 装 置 （kjeltec Auto 1035 ，

３．結果と考察Actac）にて測定した。血漿中の代謝成分は自動3.1

濃厚飼料多給試験

分析装置（7070，日立）にて測定した。血漿中成

試験期間中，両区とも給与飼料を完食し，飼料

7.0

6.5

pH

6.0

5.5
＊
5.0

＊

＊

＊＊
4.5

8

16 24
Day -1

8

＊

8
16 24
16 24
Day 0
Day 1
Days after treatment, Day

8

16

24

Day 2

Fig. 1 Diurnal changes in the 1 h mean ruminal pH in Holstein calves supplemented 0（Control group, ●, n=4）or 2×10９

CFU/day（SC group, ○, n=4） of active dried Saccharomyces cerevisiae. Dotted lines indicate feeding only
concentrate and soybean flakes（0800h and 1700h）.Values represent mean±SE. ＊p＜0.05.

© The Ito Foundation

464

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

摂取量に区間の差はなかった。

から３時間程かけて低下し，その後次の採食まで試験期間を通して両区の第一胃液pHは，採食

23

13

Trt：p = 0.541
Time：p = 0.001
Trt×Time：p = 0.067

21
19
17
15
13
11

11

-24

0

24

72

7

5
4
3

-24

0

24

5

48

72

120

Trt：p = 0.240
Time：p = 0.001
Trt×Time：p = 0.001

4
＊

＊

3
2

＊

1

2
-24

0

24

48

72

0

120

Trt：p = 0.687
Time：p = 0.001
Trt×Time：p = 0.906

300,000

200,000
150,000
100,000
50,000

-24

0

24

48

72

120

Trt：p = 0.987
Time：p = 0.019
Trt×Time：p = 0.631

10
9
Rumen NH3, mg/dL

250,000
Rumen LPS, EU/mL

8

4

120

Butyrate, mmol/dL

Propionate, mmol/dL

48

Trt：p = 0.728
Time：p = 0.001
Trt×Time：p = 0.761

6

0

9

5

7

1

10

6

9
7

Trt：p = 0.234
Time：p = 0.001
Trt×Time：p = 0.197

12
Acetate, mmol/dL

Total VFA, mmol/dLに採食前と同じレベルまで回復する日内変動を示

8
7
6
5
4
3

-24

0

24

48

72

120

2

-24

0

24

48

72

120

Time after treatment, time
Fig. 2 Changes in ruminal fermentation characteristics of Holstein calves supplemented 0（Control group, ●, n=4）or 2

×10９ CFU/day（SC group, ○, n=4） of active dried Saccharomyces cerevisiae. Dotted lines indicate feeding only
concentrate and soybean flakes（0800h and 1700h）.Values represent mean±SE. ＊p＜0.05.

© The Ito Foundation

乳用子牛への機能性飼料の給与による亜急性第一胃アシドーシスの制御と発育向上465した（Fig.１）。濃厚飼料多給期間には，両区とらに，活性酵母区では，対照区より採食後のpHも採食に伴うpH低下の程度が大きくなった。さが顕著に低下した（p＜0.05）。しかし，次の採食

2.0

70

Trt：p = 0.527
Time：p = 0.008
Trt×Time：p = 0.857

1.850Hp, μg/mL

LBP, μg/mL

1.6
1.4
1.2

0.8

10
-24

0

24

48

72

90

0

120

Trt：p = 0.001
Time：p = 0.111
Trt×Time：p = 0.450

95

85
80
75

24

48

72

120

Trt：p = 0.397
Time：p = 0.001
Trt×Time：p = 0.016

＊

700
500
300

65
-24

0

24

130

48

72

100

120

105

72

120

Trt：p = 0.767
Time：p = 0.001
Trt×Time：p = 0.134

1.5
0.5

48

120

2.0
1.0

24

72

2.5

95
0

48

3.0

100

-24

24

3.5
Insulin, ng/mL

110

0

4.0

120
115

-24

4.5

Trt：p = 0.336
Time：p = 0.001
Trt×Time：p = 0.165

125

90

0

900

70

60

-24

1,100

BHB,μmol/L

AST, IU/L

30
20

100

Glucose, mg/dL

40

1.0

0.6

Trt：p = 0.473
Time：p = 0.418
Trt×Time：p = 0.453

60

0.0

-24

0

24

48

72

120

Time after treatment, time
Fig. 3 Changes in plasma metabolites and hormones profiles in Holstein calves supplemented 0（Control group, ●, n=4）

or 2×10９ CFU/day（SC group, ○, n=4）of active dried Saccharomyces cerevisiae. Dotted lines indicate feeding
only concentrate and soybean flakes（0800h and 1700h）.Values represent mean±SE. ＊p＜0.05.

© The Ito Foundation

466

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

までには採食前と同程度のpHに回復し，対照区考に，１日に３時間を超えて第一胃液pHが5.6をとの差も認められなくなった。成牛の基準下回る状態をSARAと診断すると，対照区では濃

130

を参

0.6

Trt：p = 0.009
Wk：p = 0.001
Trt×Wk：p = 0.917

0.5

110

Insulin, ng/mL

Glucose, mg/dL

120

11）

100
90

30

3

4

6

7

8

0.4

140
120

15
10

4

6

7

8

10

Trt：p = 0.069
Wk：p = 0.001
Trt×Wk：p = 0.316

80
60
40
20

3

4

6

7

8

0

10

0.20

Trt：p = 0.191
Wk：p < 0.528
Trt×Wk：p = 0.011
＊

130
120
110

0.15
Ghrelin, ng/mL

Glucagon, ng/mL

140

3

100

5

150

†

†

0.2

160

Trt：p = 0.070
Wk：p = 0.046
Trt×Wk：p = 0.118

20

0

＊

0.3

0.0

10

IGF-Ⅰ, μg/mL

GH, ng/mL

25

†

0.1

80
70

Trt：p = 0.243
Wk：p = 0.157
Trt×Wk：p = 0.006

3

4

7

10

Trt：p = 0.895
Wk：p = 0.001
Trt×Wk：p = 0.822

0.10

0.05

100
90

3

7

10

0.00

3

4

7

10

Weeks of age, Wk
Fig. 4 Temporal changes in plasma metabolites and hormones profiles of Holstein calves treated with（SC group）or

without（Control group）active dried Saccharomyces cerevisiae supplementation.（●）and（■）represent theControl group, and（○）and（□）represent the SC group. Values represent mean±SE（n=13）.＊ p＜0.05 and † p＜
0.1. Gray background shows the weeks of after weaning.

© The Ito Foundation

乳用子牛への機能性飼料の給与による亜急性第一胃アシドーシスの制御と発育向上

467

厚飼料多給２日目に，活性酵母区では多給した両４）。活性酵母区のインスリン濃度は離乳前後に日ともにSARAが誘発された（データ示さず）。

対照区よりも有意に高まった。活性酵母区のGH

濃厚飼料多給期間の翌日以降は，両区とも第一胃濃度とIGF-I濃度は離乳の前後に増加し，対照区

液pHが上昇しSARAから回復した。

よりも高い傾向が認められた（各p＝0.07）。活性

濃厚飼料の多給により，第一胃液中の総VFA

酵母区のグルカゴン濃度は週齢に伴い増加し，対量および各VFA濃度は両区とも有意に高まった

照区は逆に週齢とともに低下した。そのため，10（Fig.２）。活性酵母区の総VFA量は対照区よりも週齢時における活性酵母区のグルカゴン濃度は対高い傾向（p＜0.1）を示し，酪酸濃度は対照区よ

照区と比較して有意に高まった。両区における他りも有意に高まった。なお，両区の第一胃液LPSの代謝およびミネラル成分に有意な差はなかった。

活性に差は認められなかった。

両区の飼料摂取量に有意な差は認められず，活血漿中急性期タンパク質濃度およびAST濃度

性酵母区のADGは，離乳前後とも対照区より有は，濃厚飼料多給の影響を受けず，両区の差も認意に高まった（Table１）。この結果は，上述の第められなかった（Fig.３）。血漿中BHB濃度は，

一胃液プロピオン酸割合とアンモニア濃度の増

両区とも濃厚飼料多給により有意に増加した。濃加，ならびに血漿中GHおよびIGF-I濃度の増加

厚飼料多給２日目には，活性酵母区のBHB濃度が関与していると考えられた。

は対照区よりも高値を示した（p＜0.05）。血漿中

濃厚飼料多給試験での知見を考慮すると，活性サイトカイン濃度や，その他の代謝およびミネラ

酵母の子牛への給与は，第一胃発酵の亢進とエネ

ル成分に差は認められなかった。

ルギー利用または吸収の向上14），そして栄養状態

本試験で第一胃液pH低下の軽減効果が認めら向上による代謝・内分泌機能の活性化15）を介してれなかった理由は明らかでないが，我々の先行研発育向上につながると推察される。しかしその反

究

など，子

応機序や，代用乳と全乳給与における効果発現の牛への給与では同様に第一胃発酵の亢進効果を確違い，子牛における飼料消化率への影響などにつ認した報告もある。以上から，活性酵母を給与しいては今後検討を重ねる必要がある。

12）やSC培養物を長期給与した試験13）た子牛へ濃厚飼料を多給すると，成牛における報告とは逆に第一胃液中のVFA濃度を高めてpHの約

子牛における，活性酵母の第一胃液pH低下軽低下を増強させることが明らかとなった。
3.2

４．要

減効果を検証することを目的として，活性酵母を

長期給与試験

10週齢時における両区の総VFA量に区間の差給与した子牛へ濃厚飼料を多給した。その結果，は認められず，活性酵母区のプロピオン酸割合お

活性酵母給与子牛では非給与子牛よりも第一胃液よびアンモニア濃度は対照区より有意に高まった

中の総VFA量および酪酸濃度が増加し，第一胃（データ示さず）。両区の第一胃液LPS活性，血漿発酵が亢進した。そして飼料摂取後の第一胃液

中急性期タンパク質濃度に有意な差は認められなpHの低下は，非給与子牛よりも増強され，成牛かった。

における報告とは逆の結果が示された。

両区におけるグルコース濃度は週齢とともに緩また，離乳前後の７週間における活性酵母の給やかに低下したが，活性酵母区の濃度は試験期間

与が，第一胃発酵，代謝・内分泌機能，および発を通して対照区よりも有意に高く推移した（Fig.

育に及ぼす影響を検討した。その結果，活性酵母© The Ito Foundation

468

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 1 Performances of Holstein calves fed with（SC group）or without（Control

group）active dried Saccharomyces cerevisiae supplimentation.
Treatment

SEMp-value

58.60

0.99

ND３

94.20

103.502.03

ND

Total４

0.75

0.92

0.04

0.003

Pre-weaning５

0.73

0.92

0.05

0.002

Post-weaning６

0.77

0.92

0.05

0.002

Control1

Item

SC２

Intial

57.00

Final

BW, kg

ADG, kg/d

１no active dry yeast supplementation. n=13.
２Saccharomyces cereviciae（LevucellⓇ SC, Lallemand, Toulouse, France）at 2×109 CFU/din the milk or starter. n=13.
３not determined.
４whole experimental period（21-70d of age）.
５21-48d of age.
６49-70d of age.

給与子牛では第一胃液中プロピオン酸割合，アン
モニア濃度，そして血漿中GHおよびIGF-I濃度
が非給与子牛よりも増加した。これらの変化が総合して，活性酵母給与子牛のADG向上につながったと推察された。
文献１） Lambertz, C., Farke-Röver, A., Gauly, M.：Anim.
Sci. J., 86, 345～350, 2015.
２） Castells, L., Bach, A., Aris, A., Terré, M.：J. Dairy
Sci., 96, 5226～5236, 2013.
３） Laarman, A. H., Oba, M.：J. Dairy Sci., 94, 5661～
5664, 2011.
４） Enemark, J. M. D.：Vet. J., 176, 32～43, 2008.
５） Takemura, K., Shingu, H., Mizuguchi, H., Kim,
Y-H., Sato, S., Kushibiki, S.：J. Anim. Sci., in press,
2019.
６） Bach, A., Igelesias, C., Devant, M.：Anim. Feed
Sci. Technol., 136, 146～153, 2007.
７） Ding, G., Chang, Y., Zhao, L., Ren, L., Meng, O.：J.
Anim. Sci. Biotechnol., 5, 24, 2014.

８） Guedes, C. M., Gonçalves, D., Rodrigues, M. A. M.,
Dias-da-Silva, A.：Anim. Feed Sci. Technol., 14527～40, 2008.
９） Lesmeister K. E., Heinrichs, A. J., Gable, M. T.：J.
Dairy Sci., 87, 1832～1839, 2004.
10） Hirabayashi, H., Kawashima, K., Okimura, T.,
Tateno, A., Suzuki, A., Asakuma, S., Isobe, N., Obitsu,
T., Kushibiki, S., Sugino, T.：Anim. Sci. J., 88, 1162～
1170, 2017.
11） Gozho, G. N., Plaizier, J. C., Krause, D. O.,
Kennedy, A. D., Wittenberg, K. M.：J. Dairy Sci., 88,
1399～1403, 2005.
12） Watanabe, Y., Kim, Y-H., Kushibiki, S., Ikuta, K.,
Ichijo, T., Sato, S.：J. Dairy Sci., in press, 2019.
13） Mutsvangwa, T., Edwards, I. E., Topps, J. H.,
Paterson, G. F. M.：Anim. Prod., 55, 35～40, 1992.
14） Zwaorski, E. M., Shriver-munsch, C. M., Fadden,
N. A., Sanchez, W. K., Yoon, I., Bobe, G.：J. Dairy
Sci., 97, 3081～3098, 2014.
15） Smith, J. M., Van Amburgh, M. E., Diaz, M. C.,
Lucy, M. C., Bauman, D. E.：J. Anim. Sci., 80, 1528～
1537, 2002.

© The Ito Foundation

469

豚の未熟産子（ひね豚）の発育遅延をもたらす
生理的要因の解明
Factors affecting mortality and growth retardation in runt pigs

中島

郁世・谷口

雅章・芦原

茜・荒川

愛作・渡邊

源哉・本山

三知代・佐々木啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Ikuyo Nakajima, Masaaki Taniguchi, Akane Ashihara, Aisaku Arakawa,
Genya Watanabe, Michiyo Motoyama and Keisuke Sasaki（National Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

It is widely accepted that low birth weight in piglets（≤ 1.0 kg）correlates with decreased
survival and lower postnatal growth rates than those born with normal body weights. The
objective of this study was to figure out whether these problems might come from some kindof disordered physiological condition in runt pigs, such as stress, inflammation or malnutrition.
Three-way crossbred female pigs originated from 8～10 litters were categorized in two groups
by their birth weights； birth weight of 1.0 kg and under as “runt pig”, and the heaviest weightin the same litter as “normal pig”. At 10 wk-old of age（approximately 30 kg）, blood and saliva
samples were collected from both fed and fasted conditions. Circulating levels of amino acids inrunt and normal pigs responded similarly when they were fasted, but there was no significant
difference in levels of essential nor limiting amino acids between these two groups. Our results
also showed that concentrations of stress hormone and inflammatory cytokines in serum andsaliva of runt pigs did not differ from those of normal pigs. Interestingly, the effect of birthweight was observed in levels of serum immunoglobulins, which amount was lowered in runt
pigs. This finding suggests that the one of the possibilities for greater preweaning mortality
associated with runt pigs might be the reduction of antibodies in circulating systems.

１．目

指標とする改良は，死産子数や未熟産子の割合を的増すリスクを伴う。肉質形質に比べて繁殖形質そ

養豚業界において，離乳まで十分生存しうる生のものの遺伝率が低い中，未熟産子や生時体重の時体重の子豚をバラツキなく生産することは積年

バラツキに関する遺伝率はさらに低いことから育の課題である。近年の大規模養豚農場の種豚は，種改良を望むのは非常に困難な形質となっている。

欧米から導入される驚異的な繁殖成績を示す多産

生時体重１kg以下で生まれる未熟産子（以下系ハイブリッド種が主流を占め，また農林水産省「ひね豚」と呼ぶ）は，離乳までの死亡率が40～の家畜改良増殖目標（平成27年３月）において一60％にもなる１）。したがって，死亡率の高いひね

腹当たりの生産頭数向上を掲げているように，今豚の存在は，一腹当たりの生存産子数および離乳後も多産化傾向が続く。他方で総産子数の増加を

子豚数を低下させるため養豚農場の繁殖成績に直© The Ito Foundation

470

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

結する。また生存したひね豚は発育が遅いため，

でと畜した。採材は，と畜予定の約一週間前に21出荷までの日数が長期化することからやはり養豚

時間の絶食処理を行い唾液採取および頸静脈より

農場の収益に悪影響を及ぼす。さらにひね豚は，採血を行った（絶食時）。また，と畜前に唾液お平均的な体重の子豚に比べてPRRS（豚繁殖・呼よびと畜時の放血血液を採取した（飽食時）。い

吸障害症候群）に罹患しやすく ，ひね豚の感染ずれも遠心分離後，上清を回収して各分析に供試をきっかけに養豚農場でPRRSが発生すれば甚大するまで－80℃にて保管した。

２）

な経済被害をもたらすことになる。

2 . 2 血清および唾液中ストレス・炎症マー

日本養豚開業獣医師協会の生産性評価システム

カーの測定

PigINFO（2017/4/7現在）によると，平均的な農ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）

場では一腹当たりの総産子数と生存産子数の間に法により，ストレスおよび炎症の主要マーカーで1.1頭，さらに生存産子数と離乳子豚数の間に1.3ある血清および唾液中のＣ反応性タンパク（CRP，頭の差があり，分娩してから離乳までに一腹当た

R&D Systems）， イ ン タ ー ロ イ キ ン（IL）-1β

り2.4頭損失するとされる。いかに一腹当たりの（R&D Systems）， IL-6 （R&D Systems）， 腫 瘍

離乳子豚数を総産子数に近づけられるかが，生産

壊 死 因 子（TNF）-α（R&D Systems），免 疫 グ性向上のための技術開発において重要な要素とな

ロ ブ リ ン（Ig）G（Bethyl Laboratories）と IgAる。我々は，まずは一定の割合で娩出されるひね（Bethyl Laboratories）の濃度について測定した。

豚を強健化し，平均的な離乳体重に仕上げること

コルチゾール濃度については，Beckman Coulterが問題解決上有効であると考えた。しかしながAccess 2 PROイムノアッセイシステムを用いてら，ひね豚の死亡率を高めている虚弱性あるいは測定を行った。

増体の低さが何に起因するのか不明である。

2 . 3 血清中尿素窒素（BUN）および遊離アミ

そこで本研究では，ひね豚強健化の第一段階とノ酸濃度の測定してひね豚の虚弱性および発育遅延をもたらして飽食時および絶食時の血清中BUN濃度は，オいる生理的要因を明らかにすることを目的としリエンタル酵母工業株式会社にて依頼分析を行った。具体的には，同腹のひね豚と正常豚の絶食時た。また遊離アミノ酸濃度については，血清と同と飽食時の血液および唾液中の成分を比較するこ

量の６％スルホサリチル酸水溶液を加えて除タンとで，ひね豚の虚弱あるいは発育不良要因がストパクし，上清を限外濾過膜（倉敷紡績）でろ過しレス・炎症および栄養障害のいずれにあるかを特た後，高速アミノ酸分析計（日立Ｌ-8900）を用定する。

いて41種類のアミノ酸を解析した。

２．方
2.1

2.4

法

統計解析

統計解析は，統計パッケージSAS（ver9.12）

供試豚および材料

プログラムのMIXEDプロシジャを用い，生時体農研機構畜産研究部門にて生産された三元交雑

重と摂食の有無を主効果とした一般線型混合モデ

豚（LWD種）10腹から，同腹の雌子豚のうち生ルで解析した。最小二乗平均値間の多重比較は

時体重が１kg以下の最小の産子（ひね豚）と最Tuckey-Kramerの方法で行い，ｐ＜0.05の場合

大の産子（正常豚）のペアを選出して飽食給餌にに差が有意であると判定した。

て飼養し，10週齢（正常豚の目安体重約30kg）© The Ito Foundation

471

豚の未熟産子（ひね豚）の発育遅延をもたらす生理的要因の解明不明である。

３．結果と考察

アミノ酸分析計により検出されたのは計31種類

正常豚の生時体重が1.6kgであったのに対しての物質であったが，生時体重の違いによる効果が

ひね豚の生時体重は0.9kgであった。離乳時（４観察されたのは血清中NH３ とPSerのみであり，

週齢）には正常豚の体重が9.8kgに到達したのに飽食時および絶食時ともに必須アミノ酸や制限ア

対し，ひね豚の体重は5.9kgであった。最終的にミノ酸において有意な差が認められなかったことと畜時（10週齢）における正常豚の体重は38.6kg

から，ひね豚が極端な栄養障害下にあるわけではと な る 一 方 で ひ ね 豚 の 体 重 は 30kg に 満 た ずないことが示唆された（Table２）。また，アミノ（28.9kg），生時から10週齢に至るまで両者におけ酸利用率の指標に用いられるBUN４）においてもる体重の大小が逆転することはなかった（Fig.

両者で差は見られなかった（Table２）
。さらに，

１）
。

炎症性サイトカインであるCRPとIL-6およびスト血液および唾液中成分を分析するにあたって，

レスマーカーであるコルチゾールにおいても血豚の絶食時と飽食時の両方から採材を行った。飽清・唾液ともに生時体重による影響は認められな食時に比べ，絶食時の血清中遊離脂肪酸濃度が６倍高値を示したことから採材試料が絶食状態であることを確認している。本研究では摂食の有無による影響は血清中CRP，唾液中IgAとコルチゾー
ル（Table１）および多種の血清中遊離アミノ酸
濃度において観察された（Table２）。当然ながら，絶食により大半の遊離アミノ酸濃度は低下した。
また早朝空腹時に最もコルチゾール濃度が上昇すると言われているように３），絶食時の唾液中コル
チゾールは飽食時よりも高値を示した。絶食時に低下した血清中CRPおよび唾液中IgAについて
は，これまでに報告のない知見でありその意義はFig. 1 Body size difference of runt pig comparing withthe same littermate at 10 wk-old.

Table 1 Effects of feeding and birth weight difference on inflammatory and stress markers

in blood and saliva１）

Feeding２）

Birth weight３）
Serum

Measurements

SalivaSerum

Salivafed

fastedfed

fasted

CRP

＊

n.s.

n.s.

IL-6

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s

n.s.

n.s.

n.s.

IgA

n.s.

＊

＊

n.s.

＊

n.s.

n.s.

IgG

n.s.

n.s.

＊

n.s.

n.s.

n.s.

Cortisol

n.s.

＊＊

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

１）＊p＜0.05, ＊＊p<0.01, n.s., not significant.
２）Asterisks indicate difference between fed and fasted condition.
３）Asterisks indicate low birth weight piglets different from normal birth weight piglets.

© The Ito Foundation

472

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

Table 2 Effects of feeding and birth weight difference on serum aminoacid concentrations１）

Feeding２）

Birth weight３）
fed

fasteda-AAA

Measurements
n.s.

n.s.

n.s.

a-ABA

＊＊＊＊

n.s.

n.s.

Ala

n.s.

n.s.

n.s.

Arg

n.s.

n.s.

n.s.

Asp
b-Ala

n.s.
＊＊＊

n.s.
n.s.

n.s.
n.s.

Cysthi

n.s.

n.s.

n.s.

Glu

＊

n.s.

n.s.

GluNH2

＊＊＊＊

Gly
His
Hylys
Hypro
Ile
Leu

＊＊＊＊
＊＊

n.s.
n.s.
n.s.

n.s.
n.s.
n.s.

n.s.
n.s.
n.s.

n.s.
n.s.
n.s.

n.s.
n.s.
n.s.

＊＊

n.s.
n.s.

n.s.
n.s.

n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.

n.s.

Lys
Met

n.s.

NH3
Orn
Phe
Pro

＊

＊＊

＊＊＊＊

n.s.
＊＊＊＊

＊＊

n.s.
n.s.
n.s.

P-Ser

n.s.

＊

n.s.

Ser

＊＊＊＊

n.s.
n.s.
n.s.
n.s.

n.s.
n.s.
n.s.
n.s.

n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.

n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.

Tau
Thr
Trp
Tyr
Urea
Val
1Mehis3Mehis
BUN

＊
＊＊＊＊
＊
＊＊＊＊

n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.

１）＊p＜0.05, ＊＊p＜0.01, ＊＊＊p＜0.001, ＊＊＊＊p＜0.0001, n.s., not significant.
２）Asterisks indicate difference between fed and fasted condition.
３）Asterisks indicate low birth weight piglets different from normal birthweight piglets.

か っ た 。よ り 重 度 な 炎 症 促 進 マ ー カ ー で あ るのではなく，免疫関連機能に問題を抱えている可IL-1βおよびTNFαについては両者ともにほぼ能性が示唆された。

検出レベル以下であった。ひね豚と正常豚の間で有意差が認められたのは血清中のIgAとIgGであ４．要約

生時体重１kg以下で生まれる未熟産子（ひねり，いずれもひね豚の方で低値を示した。
以上の結果から生時体重の小さいひね豚は，慢豚）は，死亡率が高くまた生存したとしても発育性炎症や慢性ストレスに暴露されていたり，顕著が遅いことから養豚農家の繁殖成績や肥育成績になアミノ酸代謝不全状態下に置かれていたりする

直結する。本研究では，ひね豚の死亡率を高めて© The Ito Foundation

豚の未熟産子（ひね豚）の発育遅延をもたらす生理的要因の解明

473

いる虚弱性あるいは増体の低さが何に起因するから，本研究の結果，ひね豚の虚弱性に抗体量の少を明らかにすることを目的として，ひね豚と同腹なさが関与している可能性が示唆された。

の正常豚（いずれも雌）を用いて10週齢時（約30kg）の血清および唾液中の成分を比較し，ひね豚がストレス・炎症および栄養障害の状態にあるか否かを検討した。血清中の遊離アミノ酸とその関連物質について31種類を検出したが，ひね豚において極端に欠乏している必須アミノ酸や制限
アミノ酸はなかった。また，血清および唾液中のコルチゾールや炎症性サイトカインについてもひね豚で増加している現象は見られなかった。両者で差が認められたのは血清中の免疫グロブリン濃文献１） 武田浩輝：生時体重の小さい豚，淘汰か？隔離飼
養か？，Pig Journal，11，14～17，2008.
２） 伊藤貢：ヒネ豚が生じないための飼養管理，Pig
Journal，9，84～86，2006.
３） Hucklebridge, F. H., Clow, A., Huezo-Diaz, P.,
Evans, P.：The awakening cortisol response andblood glucose levels, Life Sciences, 64, 931～937, 1999.
４） Klindt, J., Thallman, R. M., Wisc, T.：Effects ofsire line, sire, and sex on plasma nitrogen, bodyweight, and backfat thickness in offspring of Duroc
and Landrace boars, Journal of Animal Science, 84，1323～1330, 2006.

度であり，ひね豚で有意に低値を示したことか© The Ito Foundation

474

亜鉛トランスポーターに着目した亜鉛栄養改善飼料の開発（Ⅱ）
Studies on a feed for improving zinc nutrition by the use of zinctransporters（Ⅱ）

神

戸

大

朋

（京都大学大学院生命科学研究科）

Taiho Kambe（Graduate School of Biostudies, Kyoto University）

Zinc is an essential trace element as a second most abundant transition metal in biologicalsystems. As zinc plays pivotal roles as a structural, catalytic, and signaling component of many
proteins, its deficiency causes diverse pathophysiological symptoms in life. Thus, preventing
zinc deficiency is critically important for growth promotion for livestock. Two zinc transporters,
ZIP4 and ZNT1, are known to be important for efficient zinc absorption. ZIP4 is essential fortake of dietary zinc from the intestinal lumen, which is localized to the apical membrane in theenterocytes, while ZNT1, which is located to the basolateral membrane of the enterocytes, isthought to play a role by effluxing zinc into the portal blood. Thus, Up-regulation of bothproteins is thought to increase zinc absorption. In this study, we screened various food extracts
possessing such activity by the use of our screening systems, and found novel extracts
possessing the activity to increase the processed ZIP4 expression. Moreover, we tried to findenzyme（s）, whose activities nicely correlates with zinc levels in body zinc status, because wefound it difficult to evaluate whether or not food extracts have positive effects on zincabsorption in rats. We found several enzymes would be useful as a marker for evaluation ofzinc absorption rates. Our approaches would provide new information to achieve a feed forlivestock by improving zinc nutrition through targeting zinc transporter expression, because
the content of zinc is significantly affects the good health and growth of child livestock.

１．目

痢の抑制，免疫力亢進効果などを示すという報告

的が多数ある１，２）。そのため，一般的な家畜用配合

亜鉛は生命活動に不可欠となる微量栄養素であ

飼料には十分量の亜鉛が添加されている。しかしる。タンパク質の構造維持や酵素の補因子，またながら，ほ乳類における亜鉛吸収効率は30％程度

細胞内外のシグナル因子としても機能しており，と低いうえ，亜鉛摂取量の増加に反比例して低下

その欠乏は生体に大きな影響を与える。家畜の成する。そのため，添加亜鉛の大部分は家畜の体内長にとっても，亜鉛はきわめて重要であり，例えに吸収されず，糞尿とともに排出される。家畜にば仔豚においては，亜鉛の添加が，成長促進，下おける亜鉛栄養の効果を十分に発揮させるには，© The Ito Foundation

亜鉛トランスポーターに着目した亜鉛栄養改善飼料の開発（Ⅱ）

亜鉛摂取量の増加と同時に，亜鉛吸収効率を改善

475

一方，乳児期の家畜の成長に必須となるのは，
母乳中の亜鉛である。これまでに，母乳中に亜鉛させることが肝要となる。
消化管からの亜鉛吸収には，消化管上皮細胞のを運搬する分子が亜鉛トランスポーターZNT2で管腔側膜に発現するZIP4と側底膜側に発現するあることを明らかにしていることから，今回は，ZNT1の両亜鉛トランスポーターが重要であると母乳中に輸送される亜鉛量を増加させることを目考えられている。ZIP4が消化管内腔に存在する

指し，ZNT2の解析を進めた。さらに，食品因子

亜鉛を上皮細胞内に取り込み，ZNT1が細胞からによる軽度の亜鉛吸収量の変化を評価することが門脈への放出を担う。ZIP4はヒトの先天性亜鉛

難しいため，亜鉛の有用性を評価できる系の確立

欠乏症・腸性肢端皮膚炎の原因遺伝子として同定に取り組み，本スクリーニングで得られた食品因されたタンパク質である。牛においてもlethal

子を評価することを試みた。

trait A46と呼ばれる先天性の亜鉛欠乏症が存在

本研究で見出される種々の亜鉛トランスポー

し，その原因は同じくZIP4の変異である 。また，

ターの発現増強因子は，家畜の健康な成長促進に

消化管特異的にZIP4を欠損させたマウスは，亜繋がることが予想されるため，亜鉛栄養改善飼料

鉛補充なしには成育することができない 。この開発の基盤確立を目的として本研究を遂行した。

３）

４）

ように，ZIP4はすべてのほ乳類の亜鉛吸収に必須のタンパク質となる。研究代表者は，これまでに，ZIP4の発現が亜鉛欠乏依存的に増加し，亜２．方法

2 . 1 ZIP4およびZNT1発現を増強させる活性

鉛十分時には速やかに消失すること，さらに重度を有する因子の探索の亜鉛欠乏では，ZIP4の細胞外アミノ末端が切植物や食品サンプルを，滅菌水に100mg/mlに断される（プロセシングされる）ことを分子レベなるように調整し，マルチビーズショッカー（安ルで証明している。一方，上皮細胞に取り込

井器械株式会社）を使用して粉砕したものを一晩まれた亜鉛を血流に放出する役割を果たすZNT1

混和後，上清をサンプルとした。ZIP4-targetingに関しては，多くの知見は得られていないもの

およびZNT1-targeting用の培養細胞を単層培養の，効率的な亜鉛吸収には，ZIP4とZNT1の発現し，その培養液に調整したサンプルを終濃度0.1％

をともに高める必要があることが明らかになってとなるように添加して24時間培養した。細胞を回いる。我々のグループでは，これまでの知見を基収して細胞膜画分を調製し，ウェスタンブロットに，「ZIP4・ZNT1発現促進活性を持つ食品の摂にてZIP4の発現量を定量した。ZIP4の検出には，取→腸管でのZIP4・ZNT1発現の増大→亜鉛の吸抗ZIP4モノクローナル抗体を使用した６）。

５，６）

収効率上昇→亜鉛欠乏を予防」というストラテ

2.2

ジーを考案し，これらの発現を増加させる因子を

腸管上皮モデル細胞CaCo2や他の培養細胞を，ス ク リ ー ニ ン グ で き る ZIP4-targeting お よ び

亜鉛十分および欠乏培養液で培養し，ZNT1の発

ZNT1-targeting因子探索系を構築した。また，

現変化について，2.1と同様の解析を実施した。

ZNT1に関しては，その亜鉛吸収における重要性

ZNT1の検出には，抗ZNT1モノクローナル抗体が十分に解析されていないため，発現増強因子のを使用した７）。

探索と同時に，亜鉛依存的な発現制御に関しても検討を行った。

© The Ito Foundation

ZNT1の亜鉛依存的な発現変化

476

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

2 . 3 ZNT2の亜鉛輸送活性に重要な領域の同今回，初めてプロセシング型のZIP4の発現を増強する因子を含むサンプルを見出すことに成功し

定
ZNT2の特徴的な配列を，ZNT3（ZNT2に高いた（Fig.１）。プロセシングできない変異を持つ

相同性を示し，神経細胞特異的に発現する）の相

ZIP4が，先天性亜鉛欠乏症である腸性肢端皮膚

同部分と入れ換えたキメラタンパク質を作成し，炎の原因となることからも，プロセシングは亜鉛

各キメラタンパク質の亜鉛輸送活性を評価した。

吸収に重要な役割を果たす制御であると考えられ評価には，ZNT2の亜鉛輸送活性を反映することている。したがって，本解析で見出した食品因子ができる変異体細胞を使用し，基準値に対する生は，これまでとは違う新たなアプローチによる亜存率で各変異体の亜鉛輸送活性を算出した。

鉛吸収を増強させる因子であることが期待され

2 . 4 体内亜鉛量を反映するマーカー酵素の解る。現在，本因子の活性化合物の単離を試みてい

８，９）

る。

析
ラットを亜鉛欠乏食（４mg zinc/kg），軽度亜一方，ZNT1に関しては，ポジティブコントロー

鉛 欠 乏 食（10mg zinc/kg）お よ び 亜 鉛 十 分 食ルに使用した亜鉛添加条件に匹敵するような有意（33.7mg zinc/kg）で一定期間給餌し，十二指腸な活性を有する抽出物を見出すことができなかっを回収した。回収した十二指腸をマルチビーズ

た。これは，ZNT1の発現変化のリスポンスがショッカーにて破砕後，膜画分を調整した。調整

ZIP4に比べて遅いため，大きな影響を与える因

した膜画分に含有される各亜鉛要求性酵素の活性子を検出できなかったことが理由であると考えらを常法にしたがって測定した。アルカリフォス

れる。本年度の解析では，食品因子の探索とともフ ァ タ ー ゼ （ALP） 活 性 は ， p-nitrophenyl-にZNT1の亜鉛依存的な発現調節についても解析

phosphateを基質に使用し，反応により遊離するした。その結果，ZNT1の発現は，これまでに知p-nitrophenolを405nmの吸光度で測定して定量られていた亜鉛依存的な発現上昇のみならず，亜した。CD73活性については，酵素反応により遊鉛欠乏下では積極的に分解されることを見出した

離 さ れ た リ ン 酸 を Biomol Green （Enzo Life

（Fig.２）。この応答は，亜鉛欠乏で発現が上昇し，Science）により発色させ，595nmでの吸光度を亜鉛十分時に分解されるという性質を持つZIP4

測定することで定量した。

とはまったく逆の応答である。すなわち，本解析
結果をふまえると，ZIP4により消化管管腔側か３．結果と考察

らの亜鉛吸収量が増加すれば，側底膜側に発現す

昨 年 度 に 引 き 続 き ，ZIP4-targeting お よ び

るZNT1の発現も増加すると考えられる。ZNT1

ZNT1-targeting探索系を用いて，種々の食品抽に関しては，これまで発現を変化させる食品因子

出物におけるZIP4およびZNT1の発現を増強させに関する情報がほとんどないが，ZIP4の発現増る因子を探索した。本スクリーニングでは，対象

加と連動させることが重要と考えられている。本として，すでにZIP4の発現増強因子として同定

結果は，この考えを支持する結果となっており，している大豆含有因子ソヤサポニンBbを使用し消 化 管 か ら の 効 率 的 な 亜 鉛 吸 収 に は ，ZIP4 とた 。これまで我々のグループで見出したZIP4発

ZNT1が連動することが重要と考えられる。よっ

現増強因子は，ソヤサポニンBbを含めすべて，て，本研究のようにZNT1の発現制御を明らかに

全長のZIP4の発現を増強させる因子であったが，する意義は大きい。

10）© The Ito Foundation

477

亜鉛トランスポーターに着目した亜鉛栄養改善飼料の開発（Ⅱ）A）

ZnA ZnD Soy Soy 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ZIP4

75kDa

CBB
A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

L

M

N

O

P

75kDa

ZIP4
CBB

B）

C）

Extracts A

Extracts B

ZnD Soy 0.01 0.05 0.1

N

ZnA ZnD 0.01 0.05 0.1
75 kDaC

Full-length ZIP4

ZIP4
48 kDaC

Processed ZIP4

CBB
Fig. 1 Screening of component（s）to increase ZIP4 and ZNT1 expression.

A）. Screening of food extracts possessing the ability to increase ZIP4 expression. Hepa cells were cultured in thepresence or absence of various food extracts for 24 h. B）. Two food extracts increased both full-length andprocessed ZIP4 expression. Hepa cells were cultured in the presence or absence of food extracts of the indicatedconcentrations for 24 h. In A）and B）, Membrane proteins（20μg）prepared from the cells were subjected towestern blot analysis, and ZIP4 protein was detected by anti-ZIP4 antibody. Soy；soybean extracts as a positive
control. The representative results are shown. C）. Cartoon of full length ZIP4（upper）and the processed ZIP4,
whose amino-terminal portion is proteolytically released.

Ａ）
ZnSO４ ０102040 （μＭ）

ZnSO４（20μＭ） ０ 12

ZNT1

ZNT1

tubulintubulin

B）
ZnSO４

Ｎ
－

０

10

CX
20

CX

40（μＭ）

ZNT1

ZNT1

tubulintubulinFig. 2 Zinc-dependent expression regulation of ZNT1 protein.

０

12

24

24

48

48

72 （ｈ）

72 （ｈ）A）. Human HepG2 cells were culture in the presence of indicated concentrations of ZnSO４ for 48 h（left）,or in thepresence of 20μM ZnSO４ for the indicated period of time prior to preparation of total cellular lysates（right）. B）.
Human HepG2 cells were culture in normal, zinc-deficient medium（CX）or CX medium supplemented with ZnSO４
for 48 h（left）, or zinc-deficient medium（CX）for the indicated period of time. N：normal medium, CX：zinc
deficient medium. In A）and B）, 20μg total cellular lysates were subjected to immunoblotting. The representative
results are shown. Tubulin is shown as a loading control.

© The Ito Foundation

478

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

20

1.4

16

1.2

absorbance at 550nm

ALP activity (mU/μg protein）

平成30年度

12
8
4
0

0

1

2

days

3

1.0
0.8

Zn-Suf0.6

Zn-Low

0.4

Zn-Def

0.2
0

4

0

1

2

3
days

4

5

Fig. 3 Regulation of ALP and CD73 activities by zinc deficiency in rat duodenum.

ALP and CD73 activities were measured using the membrane protein prepared form the duodenum obtained fromthe rats that were fed zinc deficient diet（Zn-Def）, low zinc diet（Zn-Low）, or zinc sufficient diet（Zn-Suf）for up
to 4 days. Left；ALP activity, Right；CD73 activity.

また，母乳中に輸送される亜鉛量を増強するこる。今後は，上述の解析で見出した抽出物を含むとを目指し，亜鉛を輸送する亜鉛トランスポー

飼料で飼育した動物を用いてその効果を検証する

ターZNT2の解析を進めた結果，これまで着目し計画を立てている。また，乳児期の亜鉛栄養に関ていたZNT2のＮ末端はそれほど重要ではなく，しては，家畜の成長に重要であるため，特に授乳Ｎ末端と細胞質ループの相互作用を促進する因子

中のラットに対しての効果の検証を進めたいと考が重要であることを示す結果を得た 11）。ZNT2のえている。

当該領域を大腸菌で発現させることに成功したた

なお，本解析では，酵素活性の感度をあげるた

め，現在，この領域に相互作用する因子の探索をめに体内亜鉛レベルを反映する亜鉛要求性酵素を開始するところである。

過剰発現するトランスジェニックラットの作出を昨年度に同定した亜鉛吸収増強効果を有する食試みていたが，本年度の解析中に作出することが品因子の効果を個体レベルで評価するためには，できなかった。乳児期に影響を与える食品因子の効率的なマーカーを見出すことが重要と考えられ評価には，本ラットが必要と考えられるため，現た。そこで，本解析では，亜鉛要求性酵素に着目

在引き続き作出を試みており，作出でき次第，亜し，このような亜鉛依存的なマーカーの探索も合鉛要求性酵素の活性を指標にして，同定抽出物のわせて実施した。異なる亜鉛欠乏食で飼育した効果を検証する予定である。

ラットの十二指腸を調整して，膜結合型および分泌型の亜鉛要求性酵素について解析した結果，同

４．要約

じ亜鉛要求性酵素であっても，亜鉛欠乏に対する

亜鉛栄養改善飼料の開発に繋がる基盤の確立を応答性が異なることを見出した。応答性が鋭敏な目的として，消化管からの亜鉛吸収に機能する

ALPやCD73活性は，亜鉛吸収を促進する食品因ZIP4およびZNT1の発現を増加させる食品因子の子の効果をモニターする際に有用であることが予探索を実施した。結果，プロセシング型のZIP4想されたため（Fig.３），現在，本酵素活性を指の発現を増強させる活性を有する食品因子を複数標とした食品因子の効果に関する解析を進めてい見出した。母乳中の亜鉛量を増強させる解析で© The Ito Foundation

亜鉛トランスポーターに着目した亜鉛栄養改善飼料の開発（Ⅱ）

は，鍵となるZNT2の亜鉛輸送活性に重要な制御を見出し，現在，活性因子の探索を進めている。
また，食品因子の効果を鋭敏に検証するために，亜鉛欠乏を鋭敏に評価できるマーカー酵素の探索を実施し，ALPやCD73活性がマーカーとして有効であることを確認した。本研究での成果を基にして，亜鉛強化飼料の使用時に問題となる糞尿中に排出される余剰量亜鉛の重金属毒性問題を回避した亜鉛栄養改善飼料を開発し，環境の改善や家畜の健やかな成長に繋げることを目指したい。
謝

辞本研究を実施するにあたり，ご援助賜りました
公益財団法人伊藤記念財団に厚く御礼申し上げます。
文献１） Wang, Y., Tang, J. W., Ma, W. Q., Feng, J.：
Dietary zinc glycine chelate on growth performance,
tissue mineral concentrations, and serum enzyme
activity in weanling piglets, Biol Trace Elem Res,
133, 325～334, 2010２） Cho, J. H., Upadhaya, S. D., Kim, I. H.：Effects of
dietary supplementation of modified zinc oxide on
growth performance, nutrient digestibility, blood
profiles, fecal microbial shedding and fecal score in
weanling pigs, Anim Sci J, 86, 617～623, 2015３） Yuzbasiyan-Gurkan, V., Bartlett, E.：Identificationof a unique splice site variant in SLC39A4 in bovine
hereditary zinc deficiency, lethal trait A46：An
animal model of acrodermatitis enteropathica,
Genomics, 88, 521～526, 2006
４） Geiser, J., Venken, K. J., De Lisle, R. C., Andrews,
G . K . ：A M o u s e M o d e l o f A c r o d e r m a t i t i sEnteropathica：Loss of Intestine Zinc Transporter
ZIP4（Slc39a4）Disrupts the Stem Cell Niche andIntestine Integrity, PLoS Genet, 8, e1002766, 2012479５） Kambe, T., Andrews, G. K.：Novel proteolyticprocessing of the ectodomain of the zinc transporter
ZIP4（SLC39A4）during zinc deficiency is inhibitedby acrodermatitis enteropathica mutations, Mol
Cell Biol, 29, 129～139, 2009６） Hashimoto, A., Nakagawa, M., Tsujimura, N.,
Miyazaki, S., Kizu, K., Goto, T., Komatsu, Y.,
Matsunaga, A., Shirakawa, H., Narita, H., Kambe, T.,
Komai, M.：Properties of Zip4 accumulation during
zinc deficiency and its usefulness to evaluate zincstatus：A study of the effects of zinc deficiency
during lactation, Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol, 310, R459-468, 2016７） Nishito, Y., Tsuji, N., Fujishiro, H., Takeda, T.,
Yamazaki, T., Teranishi, F., Okazaki, F., Matsunaga,A., Tuschl, K., Rao, R., Kono, S., Miyajima, H., Narita,
H., Himeno, S., Kambe, T.：Direct Comparison ofManganese Detoxification/Efflux Proteins andMolecular Characterization of ZnT10 as a
Manganese Transporter, J Biol Chem, 291, 14773～
14787, 2016８） Fujimoto, S., Itsumura, N., Tsuji, T., Anan, Y.,
Tsuji, N., Ogra, Y., Kimura, T., Miyamae, Y., Masuda,S., Nagao, M., Kambe, T.：Cooperative functions of
ZnT1, metallothionein and ZnT4 in the cytoplasm
are required for full activation of TNAP in the earlysecretory pathway, PLoS One, 8, e77445, 2013９） Itsumura, N., Inamo, Y., Okazaki, F., Teranishi, F.,
Narita, H., Kambe, T., Kodama, H.：Compound
heterozygous mutations in SLC30A2/ZnT2 resultsin low milk zinc concentrations：a novel mechanism
for zinc deficiency in a breast-fed infant, PLoS One,8, e64045, 201310） Hashimoto, A., Ohkura, K., Takahashi, M., Kizu, K.,
Narita, H., Enomoto, S., Miyamae, Y., Masuda, S.,
Nagao, M., Irie, K., Ohigashi, H., Andrews, G. K.,
Kambe, T.：Soybean extracts increase cell surface
ZIP4 abundance and cellular zinc levels：a potential
novel strategy to enhance zinc absorption by ZIP4
targeting, Biochem J, 472, 183-193, 201511） Fukue, K., Itsumura, N., Tsuji, N., Nishino, K.,
Nagao, M., Narita, H., Kambe, T.：Evaluation of theroles of the cytosolic N-terminus and His-rich loop
of ZNT proteins using ZNT2 and ZNT3 chimericmutants, Sci. Rep., 8, 14084, 2018

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480

半教師あり学習による飼料成分を予測する
新たな近赤外分析法の開発
Semi-supervised learning in near-infrared spectroscopy and chemometrics
for prediction of the nutrient composition of grass silage

田

中

常

喜・出

口

健三郎

（地方独立行政法人北海道立総合研究機構畜産試験場）

Tsuneki Tanaka and Kenzaburo Deguchi（Local Independent Administrative Agency, Hokkaido Research Organization Animal Research Center）

Semi-supervised learning would result in accuracy improvement of prediction and/or
expanded scope of application in near-infrared（NIR）spectroscopy and chemometrics. This
study demonstrated applications of（i）NIR spectra reconstructed by principle component
analysis（PCA）combined with big data of spectra and（ii）imputation of missing value toprediction of the nutrient composition of grass silage. PCA combined with 9,872 data of NIR
spectra showed that the cumulative contribution rate of first 33 principle components（PCs）
reached at approximately 100％ . Partial least squares regression（PLSR）on reconstructed NIR
spectra by PCA with first 72 PCs was better than PLSR on the raw NIR spectra orconventional PLSR for undigestible neutral detergent fiber after in vitro fermentation for 48
hours, especially in samples that are far from predictable. These results showed that PLSR on
reconstructed NIR spectra have advantage of robust prediction of unknown samples ofdifferent derivation from the training data. Some of predictions by imputation of missing valueof digestible neutral detergent fiber after in situ fermentation for 48 hours as a target trait
showed practical level of accuracy（higher than 2.3 of PRD）
, although scores of slope in thepredictions were smaller than 1. These results suggested that imputation of missing value oftarget traits could be used in predictions for traits with a small number of data, although there
is room of consideration about selection of training data, and/or adjustments of calibration
curve in application of imputation of missing values.

１．目

き，飼料設計・給与診断など現場レベルでの対応的を可能としている。飼養研究の発展に伴って，分近赤外分析（NIRS）は，家畜の給与飼料の品

析する草種や成分項目が多様化し，NIRSに求め質を迅速かつ簡便に測定できるため，フォレージられる分析精度も高まっている。しかしながら，テストの中心的な手法として，全国の飼料分析セ適用範囲が広く，高精度な検量線の早期開発におンターで活用されている。その結果，個別農家単

いて，基礎となるサンプル収集とその成分値の取位での粗飼料の飼料成分と栄養価が迅速に把握で得が大きなボトルネックとなっている。

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481

半教師あり学習による飼料成分を予測する新たな近赤外分析法の開発

半教師あり学習とは，教師ありデータ（目的値て，中性デタージェント繊維含量｛％DM，NDFと説明変数がそろったデータ）による予測・判別（耐熱性α-アミラーゼあり，亜硫酸ナトリウムなに，教師なしデータ（説明変数のみのデータ）をし，灰分補正あり）｝とホルスタイン種乾乳牛の加えた統計手法であり，精度・安定性向上，適用

ルーメン液を用いたin vitro 48時間培養未消化中

範囲の拡大に利点がある。飼料成分のNIRS（近性 デ タ ー ジ ェ ン ト 繊 維 含 量（％ DM, in vitro

赤外分光法の定量分析）においては，目的とする

uNDF48h）およびその差分により算出するin vitro

成分の化学分析値と近赤外スペクトルデータがそ

48時間培養可消化中性デタージェント繊維含量

ろっているものが教師ありデータ，近赤外スペク（％DM, in vitro dNDF48h）の分析値が得られていトルデータのみのものが教師なしデータに該当する（Table１）。その他の繊維に関連する形質としるが，どのような利点が具体的にあるかは必ずして，ルーメンフィステル装着牛を用いたナイロンも明らかになっていない。

バック法によるin situ dNDF48h（％DM）が77点，本研究は，牧草サイレージの繊維の消化率の予

めん羊によるin vivo dNDF（％DM）が89点，総測を例にとりあげ，（ⅰ）膨大な教師なしデータ

繊維含量（％DM，OCW）が539点，低消化性繊と合わせた主成分分析により再構築した近赤外ス

維含量（％DM，Ob）が537点について分析値がペクトルからの予測，（ⅱ）関連形質による補完得られている（Table１）。各種解析は，統計ソフ

データセットを教師データとした予測の２つのアトＲ（GUN）を用いた。

プローチでの近赤外分光法の定量分析における教2 . 1 主成分分析による情報の要約と近赤外ス

師なしデータの活用を試み，近赤外分光法の定量

ペクトルの再構築

分析での半教師あり学習の有効性を検討した。
２．方

目的形質をin vitro uNDF48h とした。分析値が得られている759点を，検量線作成用候補318点，

法

検量線検証用441点の収集年などの来歴が異なる

試料は北海道内各地より収集した牧草サイレー

２群に分割した。従来の検量線作成の手順に従ジ759点を用いた。試料の乾燥粉砕処理および一い，検量線作成用候補318点のうち189点を検量線

般化学分析は常法作成用として、あらかじめ選抜した。飼料分析セにより行った。全試料につい

１）

Table 1 The number of data（n）, mean, minimum value, maximum value, and standard

deviation（SD）for traits of grass silage samples used in this study
Traits

Unit

n

Mean

Min

Max

SD

NDF＊

%DM
''
''
''

759
759
759
77

65.4
25.4
40.1
43.2

43.8
8.2
19.0
26.9

83.0
45.7
53.2
53.8

5.89
6.03
5.85
6.11

''
''
''

89
539
537

42.4
68.9
60.1

30.2
48.6
33.8

53.0
88.9
81.0

5.62
5.95
6.69

in vitro uNDF48h＊＊in vitro dNDF48h＊＊in situ dNDF48h＊＊＊in vivo dNDF＊＊＊＊
Organic cell wall（OCW）
Low digestible fiber（Ob）＊ Neutral detergent fiber with heat-stable alpha-amylase, ash correction and without sodium sulfite.
＊＊ undigestible/digestible NDF after in vitro fermentation for 48 hours in rumen fluid of dry cow.
＊＊＊ digestible NDF after in situ fermentation for 48 hours in rumen of dry cow.
＊＊＊＊ in vivo digestible NDF in sheep.

© The Ito Foundation

482

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

ンターで2016～2018年に分析した北海道内産の牧

2.2

草サイレージの近赤外スペクトルデータ9,872点

目 的 形 質 を in situ dNDF48h と し ， NDF ， inを収集し，教師なしデータとした。検量線作成用

vitro dNDF48h，in vivo dNDF，OCW，Obを関連

候補318点と9,872点の近赤外スペクトルデータ形質とした。欠測値に対応した主成分分析によ（1100.0～2499.5nm，0.5nmピッチ，2800データポ

り，データの補完を行った。欠測値補完のアルゴ

イント）について主成分分析を行い，第１主成分

リ ズ ム と し て ， ベ イ ズ 推 定 に よ る Bayesian～第Ｘ主成分までの主成分得点からスペクトル

PCA３），EM ア ル ゴ リ ズ ム に よ る Probabilistic

データに戻した2,791通り（Ｘ：10～2,800）の再PCA, PCA軸を推定しながら，その結果から線形構築スペクトルを作成した。検量線作成用189点補正するSVD impute４）の３通りについて検討しの再構築スペクトルは，２次微分（window size

た（Table２）。前項で検量線作成用に選抜した＝11dpt, non-smoothing）処理を行い，部分最小189点の補完データ（目的形質は，すべて補完し二乗（PLS）回帰（kernel法，最大ファクター数た値）を基に，単形質PLS（PLS1）および複形

16，Leave-one-outクロスバリデーション）によ質PLS（PLS2）回帰（Factor＝12）により，検り検量線を作成し，検量線作成用189点によるク

量 線 を 作 成 し た 。近 赤 外 ス ペ ク ト ル は ，ロスバリデーションによる予測誤差（RMSECV）

Savitzky-Golay ２ 次 微 分（２ 次 曲 線 ，window

お よ び 検 証 用 441 点 に よ る 予 測 誤 差（RMSEP）

size＝21dpt）処理を行った。目的形質が得られを求めた。従来法として，検量線作成用189点のている77点を検量線の予測精度検証用の試料とし

原スペクトルに，前処理（Savitzky-Golay２次微て用い，R２, Bias, Slope, RMSEPおよびRPDを求分，２次曲線，window size＝11dpt）を行い，めた。

PLS回帰（kernel法，ファクター数12）により検成分値の欠測値の補完

３．結果と考察量線を作成し，誤差が最小であった再構築スペク
トルによる検量線の寄与率（Ｒ２）および予測誤3 . 1 再構築スペクトルにより作成した検量線差（RMSEP），RPD２）を比較した。

の予測精度
教師ありデータと教師なしデータを合わせた主Table 2 Predictions of in situ dNDF48h of 77 grass silage samples by PLS1 and PLS2 regression on imputation

data by principal compornent analysis with NDF, in vitro dNDF48h, in vivo dNDF, OCW, and Ob
content as related traits

No. of
Impute algorihm comps.
＊

PLS1

PLS2

R2

Bias

Slope

RMSEP

RPD

R2

Bias

Slope

RMSEP

RPD

Bayesian PCA

4
3
2

0.85
0.85
0.81

0.7
0.7
0.0

0.7
0.7
0.7

2.8
2.7
2.7

2.5
2.5
2.3

0.77
0.78
0.75

0.4
0.5
0.2

0.6
0.6
0.6

3.2
3.1
3.2

2.1
2.1
2.0

Probabilistic PCA

2

0.79

－0.2

0.5

3.3

2.1

0.73

0.0

0.5

3.7

1.9

SVD impute

4
3
2

0.59
0.82
0.82

－0.2
0.1
0.0

0.3
0.8
0.8

4.5
2.6
2.6

1.5
2.3
2.3

0.67
0.72
0.75

0.1
－0.5
0.4

0.3
0.7
0.7

4.5
3.3
3.2

1.7
1.9
2.0

＊Number of compornents to use estimation or re-estimation.

© The Ito Foundation

483

半教師あり学習による飼料成分を予測する新たな近赤外分析法の開発

成分分析を行った結果，累積寄与率は第33主成分

ズが再構築スペクトルから除去されていることがでほぼ100％に達した。再構築スペクトルによる示唆された。加えて，その再構築スペクトルは，

PLS回帰の予測誤差（RMSECV）は，再構築ス

累積寄与率がほぼ100％の主成分得点から算出さペ ク ト ル の 主 成 分 数 が 76 の 時 に 最 小 と な っ た

れるため，原スペクトルデータの情報の損失がき（Fig.１）。検証用441点による予測誤差（RMSEP）

わめて小さいものであった。

は，主成分数72の時に最小となり（Fig.２），ク

予測誤差（RMSEP）が最小であった再構築ス

ロスバリデーションにより最適であった再構築ス

ペクトルによるPLS回帰での分析値と予測値の関ペクトルの主成分数とおおむね一致した。今回の係を従来法によるPLS回帰と比較した（Fig.３）。

結果では，第72主成分より情報量の小さい主成分

再構築スペクトルによるPLS回帰は，予測を大きに，PLS回帰で変数として選択された場合に誤差

く外す試料が少ないことが確認でき，再構築スペ

が大きくなる情報（ノイズ）が含まれ，そのノイクトルによるPLS回帰は，従来法に比べて，頑健

4.0
3.5
3.0
2.5
2.0

ctor

LS
in P

12
16

of fa

8

No.

1010

910

IR spectrum

960

810

tructing N

860

s in recons

710

No. of PC

760

4

10
60
110
160
210
260
310
360
410
460
510
560
610
660

RMSECV

4.5

Fig. 1 Root-mean-square of error of leave-out-one cross validation（RMSECV）in kernel partial least squares（PLS）

regression for in vitro uNDF48h based on near-infrared（NIR）spectra of 189 samples of training data reconstructedby principal component analysis on 10,190 samples. Kernel PLS regression was performed after preprocessing ofSavitzky-Golay second deviation with 11 data points of window size and non-smoothing for reconstructed NIR
spectrum. Number of the principal components（PCs）in reconstructing NIR spectra were used from first 10 PCs
to first 1010 PCs with a 10-interval.

3.0

IR spectrum1010

tructing N

910

s in recons

960

No. of PC

12
860

10
60
110
160
210
260
310
360
410
460
510
560
610
660
710
760
810

2.0

f fact
or in

4
8

PLS

4.0

16

No. o

RMSEP

5.0

Fig. 2 Root-mean-square of error of prediction（RMSEP）in kernel partial least square（PLS）regression for in vitro

uNDF48h based on reconstructed near-infrared（NIR）spectra. Four hundred forty-one samples of test data wereused for prediction.

© The Ito Foundation

平成30年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

50

50

40

40

30

30

Observed

Observed

484

20

20

n = 441n = 441

R2 = 0.78

10RMSE = 2.7
RPD = 2.15

0
0

10

20

30

40

R2 = 0.74

10RMSE = 3.0
RPD = 1.98

0
50

0

Predicted by PLS
on the reconstructed NIR spectrum

10

20

30

40

50

Predicted by PLS
on the raw NIR spectrum

Fig. 3 Observed versus predicted in vitro uNDF48h（％DM）for 441 samples of test data by kernel partial least square（PLS）regression with the reconstructed（Left）and raw（Right）NIR spectra. Preprocessing for the reconstructed
NIR spectrum with first 72 PCs was performed by Savitzky-Golay second deviation with 11 data points（dpt）ofwindow size and non-smoothing. For the raw NIR spectrum, Savitzky-Golay smoothing and second deviation with
11 dpt of window size were performed before PLSR. R２, RMSE, and RPD showed coefficient of determination,root-mean-square of error of prediction, and ratio of standard deviation of reference data in prediction sample tostandard error of prediction, respectively.

な予測ができることが示された。

作成したにもかかわらず，ある程度の精度が確認

本研究では，再構築スペクトルの主成分数の最できたことは，データ数の少ない形質の予測に，適化の方法として，Leave-one-outクロスバリ

本手法が有用である可能性が示唆された。しかし

デーションを採用した。一般に，PLS回帰の潜在ながら，データ数に限りがあったため，検証に用

変数の数（ファクター数）を決定する場合に過剰いた試料は欠測値補完の情報としても利用した。

適合しやすいとされるため，PLS回帰のファク

今後，未知の試料での再検証が必要である。また，

ター数を決定する場合にはk-foldクロスバリデー

検討したいずれの方法においても，スロープが１ションで再計算が必要である。

より小さいことが確認された。実測値のある試料

3 . 2 検量線作成用データの欠測値補完によりを検量線作成群に加える，あるいは，検量線を補正して利用するなどの工夫も必要になると考えら作成した検量線の予測精度
検量線の検証結果をTable２に示した。検討しれる。

た方法の一部では，RPDが2.3以上と実用可能な欠測値補完によるPLS回帰での予測精度は，検量線が作成できた。欠測値の補完方法は，検討（ⅰ）関連形質の有無と相関程度，（ⅱ）欠測が生し た 中 で は Bayesian PCA の 精 度 が 高 い 傾 向 でじた理由に依存し，欠測値補完による検量線作成あった。単形質PLSと複形質PLS回帰では，単形の際に留意する必要がある。本研究で扱った目的

質PLS回帰の精度が明らかに高かった。目的形質

形質は，相関の高い関連形質が複数あり，それにとしたin situ dNDF48hの値のない試料で検量線をより実用可能な検量線作成に至ったと考えられ© The Ito Foundation

485

半教師あり学習による飼料成分を予測する新たな近赤外分析法の開発

た。本研究では，完全に無作為に欠測が生じたもた。また，関連する分析項目によりデータを補完のとして解析をしたが，実際は家畜に給与するたすることで，目的の分析項目がないサンプル群にめに入手可能な飼料のみのデータが得られているより実用可能な精度の検量線が作成できた。ス

はずで，欠測以外の値に依存して欠測が生じていロープが１より小さくなるなど，データを補完しる可能性もある。このことが，スロープが生じたて検量線を作成する際の問題点も確認できた。得一因の可能性が考えられるが，データ数が限られられた知見は，試料の由来により予測精度が異なたため検証できなかった。

る場合や，データ数が少ない分析項目の検量線開3 . 3 近赤外分光法での半教師あり学習の有効性
本研究は，再構築スペクトルおよび欠測値補完

発での活用が期待される。
謝

辞による検量線作成の有効性を示すことができた。

本実験の実施にあたり，飼料分析センターに収それぞれは，従来の検量線作成の近赤外スペクト

集される粗飼料の近赤外スペクトルデータを提供

ルの前処理工程と目的形質のデータ処理工程に該いただきました十勝農業協同組合連合会

当し，両者を組み合わせた利用も可能である。し学研究所

かしながら，欠測値補完の検証では収集した試料

道研究農場の偏りに由来する予測精度が劣る試料の確保がで

興野若菜氏，in situ消化試験データおよび給与粗きなかったため，２つの手法を組み合わせた検証

飼料サンプルを提供いただきました北海道立総合は実施しなかった。近赤外分光法に関する研究は研究機構

飛躍的な発展を遂げており，ニューラルネット

謝申し上げます。

ワークやMoving Window PLS

５）北海

川越大樹氏，日本甜菜製糖株式会社

酪農試験場

谷川珠子博士に心より感など定量分析に利用できるさまざまな手法が提案されている。今後は，本手法による検量線開発と飼料分析機関での利用に向けて，各機関で導入しているソフト
ウェアでの適用・検証をする予定であるが，併せてさまざまな手法と組み合わせた検量線開発を試みたいと考えている。
４．要

岡崎智哉氏，雪印種苗株式会社

農産化

約

予測精度の向上，適用範囲の拡大が期待される
半教師あり学習の粗飼料の飼料成分近赤外分析への適用を試みた。再構築スペクトルを基に作成し文
献１） 自給粗飼料品質評価研究会偏：改訂粗飼料の品質評価ガイドブック，社団法人日本草地畜産種子協会，
東京，2001.
２） Williams, P. C., Norris, K.：In Near infrared
technology in the agricultural and food industries,
2nd edition, American Association of Cereal
Chemists, Minnesota, p145-169. 2001.
３） Oba, S., Sato, M., Takemasa, I., Monden, M.,
Matsubara, K., Ishii, S.：Bioinformatics. 19（16）. 2088
～2096. 2003.
４） Troyanskaya, O., Cantor, M., Sherlock, G., Brown,P., Hastie, T., Tibshirani, R., Botstein, D., Altman, R.
B.：Bioinformatics. 17（６）.520～525. 2001.
５） Jiang, J.-H., Berry, R. J., Siesler, H. W., Ozaki., Y.：
Anal. Chem., 74（14）.3555～3565. 2002.

た検量線は，従来法よりも予測精度がやや高かっ© The Ito Foundation

486

黒毛和種の分娩間隔短縮に資する新たな栄養管理指標の開発～牛体３Ｄモデルを用いたアプローチ～
The development of alternative indicators of body condition score in
Japanese black cows for shortening calving interval： an approach using
3D model generation of cattle by shape-from-silhouette method

木野

勝敏・兒嶋

朋貴・青木

直人・増田

達明

（愛知県農業総合試験場畜産研究部）

Katsutoshi Kino, Tomoki Kojima, Naoto Aoki and Tatsuaki Masuda（Animal Husbandry Division, Aichi Agricultural Research Center）

The objectives of this study were to derive regression equations to estimate the Body
Condition Score（BCS）of Japanese Black cows in accordance with Wagyu Registry Associationfrom heart girth and the information extracted from 3-dimensional models of cows, and toinvestigate relationships between the BCS and metabolic profile tests. Single regression
analysis was performed to estimate the equations using data of difference between heart girthand tightened heart girth（n=118）and the ratio of 3-dimensional rump surfaces areas to
2-dimensional rump areas（n=43）. Following are the derived equations：Y=0.598G＋1.928（R２=0.80）and Y=－6.17X＋12.00（R２=0.31）,where Y is the BCS, G is the difference between heart
girth and tightened heart girth, X is the ratio of 3-dimensional rump surfaces areas to
2-dimensional rump areas. Cows that experienced excessive body condition gain or loss were
not observed during pre and postpartum periods, which concurred with the results ofmetabolic profile tests.

１．目

黒毛和種繁殖雌牛の全国平均分娩間隔は405日で的あり３），１年１産から大きな隔たりがあることか

分娩間隔を長期化させないためには，分娩前後ら，簡便な栄養度判定法の開発が急務である。

の牛体を適正な栄養状態に維持することが重要で一方，乳牛ではボディーコンディションスコア

ある 。黒毛和種の栄養度判定には，公益社団法

評価法（UVシステム法）４）が広く用いられてお人全国和牛登録協会（全和）によって定められたり，これは後躯のみで牛の栄養状態を判定する方

６部位（き甲・背骨・肋骨・腰角・臀部・尾根法である。黒毛和種は血統により体型が多様化し部）を視診・触診する方法 があるが，実施者にているため，UVシステム法は，牛体全体の栄養

豊富な経験が必要とされるため，一般的な農家が度判定法として適していないと考えられる。他

自身で実施することは困難である。平成27年３月

方，乳牛で開発された簡便な栄養度推定法の１つに農林水産省が公表した家畜改良増殖目標では，に，胸囲差を用いる方法５）がある。これは脂肪が

１）

２）© The Ito Foundation

黒毛和種の分娩間隔短縮に資する新たな栄養管理指標の開発～牛体３Ｄモデルを用いたアプローチ～

多い場合に強く締めた際の胸囲が小さくなることを利用した方法であり，黒毛和種繁殖雌牛にも応

２．方
2.1

用可能であると考えられる。

487

法

胸囲差による栄養度推定式の作成

また，近年のICT関連技術の進歩により，３Ｄ

供試牛は，当試験場を含む愛知県内５農場，延スキャンおよび３Ｄモデル化を簡易に実施できる

べ118頭の黒毛和種成雌牛とした。調査項目は胸機器やソフトウェアが開発され，普及してきてい囲差および栄養度とした。胸囲差は通常測定するる。そこで，３Ｄモデル化技術を用いた黒毛和種

胸囲ときつく締めた際の胸囲の差（Fig. 1 A, B）

繁殖雌牛の牛体３Ｄモデルについても栄養度判定とし，栄養度は全和が定める栄養度判定法に従っができる可能性がある。

た。その他，供試牛の情報として生年月日，産次，代謝プロファイルテストは，主として乳牛で実施されている血液生化学検査を中心とした牛群検

最終授精日および分娩（予定）日の聞き取りを行った。

診であるが，近年，繁殖性向上や子牛の損耗防止

栄養度推定式は，説明変数を胸囲差，目的変数の観点から黒毛和種繁殖牛にも利用されてきておを栄養度とし，単回帰分析を行った。胸囲差は，り ，黒毛和種繁殖牛の外貌だけではなく，牛体畜産現場での汎用性を考慮して１cm単位とした。

内での実際の栄養状態を確認できるため，有用な

栄養度は小数点１位を四捨五入することとされて手法である。

いるが，本分析では，数値の連続性を重視し，四６）

そこで，本研究では，胸囲差から全和が定める

捨五入を行わなかった。単回帰分析は，SAS（SAS

栄養度を推定する簡便な方法の開発，牛体３ＤモInst. Inc., Cary, NC）のREGプロシジャを用いてデルにおいても栄養度を推定する方法の検討およ行った。

び代謝プロファイルテストの結果と栄養度との関連性を調査することを目的とした。

2 . 2 牛体３Ｄ抽出データと栄養度との相関分
析
供試牛は，３Ｄデータ取得に適した条件下にあった当試験場を含む愛知県内４農場，延べ43頭

（A）

（B）

Fig. 1 Examples of measuring heart girth（A）and tightened heart girth（B）.

© The Ito Foundation

488

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）の黒毛和種成雌牛とした。調査項目は，栄養度お目的に３Ｄ表面積と２Ｄの面積の差（面積差）および牛体の３Ｄデータとし，３Ｄデータは３Ｄス

よび比（面積比）を算出した。ここでの面積差あキャナ（Hapimo：3D，株式会社ノア）を用いてるいは面積比の値が大きくなると，３Ｄ表面の凹取得した。栄養度および供試牛の情報は2.1と同凸が激しいことを示し，すなわち，やせているこ様に取得した。高橋ら（2016） は，牛の腰角，とを示している。栄養度と３Ｄ表面積，２Ｄの面寛骨および坐骨の３部位を結んだ３角形の３Ｄ表

積，面積差および面積比それぞれとの相関関係

面積により，牛のボディーコンディションスコア

を，SAS（SAS Inst. Inc., Cary, NC）のCORRプの評価の可能性を示唆している。高橋ら（2016）

ロシジャを用いて行った。

７）

７）の方法に従い，本研究においてもこの３部位に

2 . 3 栄養度と代謝プロファイルテストとの関テープを貼り，３Ｄデータを取得した（Fig. 2 A）。

係性調査

取得した３Ｄデータの解析には，３Ｄ点群データ

供試牛はおおむね分娩前１か月，分娩後２か月

処理オープンソフトウェアのCloudCompare（v.

および３か月の３ステージを調査対象とし，当場

2.10.1（Zephyrus），http://www.cloudcompare.org/）を含む５農場，延べ75頭の黒毛和種成雌牛としを用い，３部位を頂点とする三角形に切り出した。栄養度および供試牛の情報は2.1と同様に取（Fig. 2 B）
，３Ｄ表面積を解析した（Fig. 2 C-1）。

得した。採血は尾静脈からテルモ株式会社製のベ

供試牛の大きさは個体によって異なるため，３部

ノジェクトⅡ真空採血管プレインを用いて行い，位の３Ｄ表面積のみでは，個体間差の影響が大き

採血後すみやかに遠心分離し，血清を分離した

く，栄養度との相関が低くなると予想された。そ後，分析まで－30℃で凍結保存した。分析は外部こで，３部位の頂点を結ぶ２Ｄの面積を解析し委託により実施した。代謝プロファイルテストの（Fig. 2 C-2），個体間差の影響を相殺することを

８）
検 査 項 目 は 渡 邉 ら（2014）
を 参 考 に ，血 糖

（A）

（B）
Hooks

Hooks

Thurl

Pins

Pins

（C-2）
Hooks

（C-1）
Hooks

Thurl

Pins

Pins

Thurl

Thurl

Fig. 2 Localization of the 3 anatomical landmarks Hooks, Pins, and Thurl（A）, a triangle cut out from 3-dimensional

image（B）used to extract the 3-dimensional surfaces area（C-1）and 2-dimensional area（C-2）.

© The Ito Foundation

黒毛和種の分娩間隔短縮に資する新たな栄養管理指標の開発～牛体３Ｄモデルを用いたアプローチ～

489

（Glu）
，遊離脂肪酸（NEFA），尿素窒素（BUN），

まるように栄養管理をすることが適当と考えられアルブミン（Alb），総コレステロール（T-cho），

た。本研究で作成した栄養度推定式は，巻尺で畜アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ

産農家が容易に実施でき，客観的な数字で栄養度（AST），γ-グルタミルトランスペプチダーゼを推定できることから，畜産現場への応用は十分（GGT），カルシウム（Ca）の８項目とした。

可能であると考えられた。また，畜産現場へ普及するために，胸囲測定部の適切な場所や締める際

３．結果と考察
3.1の力の強さといった点について，今後基準を定め

胸囲差による栄養度推定式ていく予定である。

胸囲差と栄養度の単回帰分析の結果をFig.３に示す。この単回帰分析によって得られた栄養度推
定式は，

3.2

牛体３Ｄ抽出データと栄養度との相関

栄養度と３Ｄ表面積および２Ｄの面積それぞれとの間には，有意な相関関係は認められなかった

Y＝0.598G＋1.928

が，栄養度と面積差および面積比との間には，そとなり，決定係数Ｒ は0.80と高い値であった。

れぞれ相関係数Ｒが－0.42および－0.55と有意な

ここで，Yは栄養度，Gは胸囲差であり，傾きと相関係数が得られた（Fig.４）。この結果から，

切片は有意であった（p＜0.001）。全和が定める

相関係数の高かった面積比による栄養度推定の可

栄養度判定要領では，栄養度４から６が普通の体能性が示唆されたが，栄養度を目的変数，面積比型で，その中でも４がやせ気味，５が普通，６がを説明変数とした単回帰分析を行ったところ，傾太り気味とされている。本研究で得られた推定式

きと切片の値は有意（p＜0.001）であったもののにおいて，胸囲差が４cmと７cmでは，それぞれ

決定係数Ｒ２ が0.31と低く，面積比での栄養度推

推定栄養度が4.3と6.1となることから，実際の畜定は精度が低いと考えられた。３Ｄスキャナは非産現場で適用される際には，適正な胸囲差の下限

接触でデータを取得でき，ICTによりシステム化

値を４cm，上限値を７cmとし，この範囲内に収されることにより，日常の栄養管理に応用される

２

8.0

Y= 0.598G＋1.928
R2= 0.80

Body Condition Score

7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0

0

2

4

6

8

10

Diﬀerence in heart girth and tightening heart girth（cm）
Fig. 3 Relationship between Body Condition Score and the difference between heart girth and tightened heart girth inJapanese Black cows.

© The Ito Foundation

490

平成30年度

6
5.5
5
4.5
4
3.5
3

7 （B）

R = -0.42
Body Condition Score

Body Condition Score

7 （A）
6.5

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

0
5000
10000
15000
Diﬀerence in 3-dimensional surfaces area and2-dimensional area (cm2)

6.5
6

R = -0.55
Y = -6.17X＋12.00
R2 = 0.31

5.5
5
4.5
4
3.5
3

1
1.05
1.1
1.15
1.2
1.25
1.3
Ratio of 3-dimensional surfaces area to 2-dimensionalarea.

Fig. 4 Relationships between Body Condition Score and the difference between 3-dimensional surfaces area and2-dimensional area（cm２）（A）, and Body Condition Score and the ratio of 3-dimensional surfaces area to
2-dimensional area（B）in Japanese Black cows.

ことが期待される。ホルスタイン種ではすでに実れた。Ｃ農場は分娩前にGluが低く，BUNが高い用化されており，飼養管理に役立てられている９）。

ことから，エネルギー不足あるいは摂取飼料の粗本研究では，栄養度と面積比の間には有意な相関タンパク質含量が高いことによって飼料中のタンが認められたものの，面積比による栄養度推定式

パク質が有効利用できていないことが推察されは精度が低かったため，今後，他部位の３Ｄデー

た。また，ASTも上限値を上回っており，タンタを用いた栄養度推定報について検討する必要がパク質を有効利用できていない，あるいは余剰のあると考えられた。

タンパク質由来のアンモニアにより肝障害を起こ

3 . 3 栄養度と代謝プロファイルテストとの関している可能性が考えられた。さらに，分娩後においてNEFAが上限値を超える個体が多かった。

係性本研究の代謝プロファイルテストの結果をFig.

この農場は昼間放牧を行い，また自然哺乳を行っ７）５に示す。各項目の上下限値は渡邉ら（2014）ていることから，慢性的なエネルギー不足が推察の報告に従った。Ａ農場で特徴的なのは，分娩前された。以上のことから，配合飼料の再検討や放においてGluは適正値内であるものの，NEFAが牧地の草種の確認が必要と考えられた。Ｄ農場

上限を超える個体が散見された。この時期は胎児

は，Ｂ農場と同様の傾向で適切に栄養管理されてが成長してくる時期であることから，摂取飼料かいるように見受けられた。Ｅ農場については，分らのエネルギーだけでは不足している可能性が推娩前において，Gluは適正範囲内であるものの察された。Ｂ農場はGlu，T-ChoおよびNEFAにNEFAが上限値を上回っていたため，分娩前後については標準範囲内に収まっており，飼料によるややエネルギーが足りていないことが推察されエネルギー摂取量は適切に管理されていることがた。栄養度については，どの農場においても分娩うかがえた。BUNおよびALBにおいて下限値を前後で大きな増減は認められず，栄養度に反映す下回る個体が多く見られたことが特徴的であり，るほどのエネルギーの過不足はなかったと考えら

これが異常値となり得るかは繁殖成績に影響を及れた。代謝プロファイルテストの結果では，個々ぼしているかを追跡調査する必要があると考えらの農場の特徴が認められ，一部の農場で改善の必© The Ito Foundation

491

ALB（g/dl）

4.5

T-Cho（mg/dl）

3.5
3.0
2.5

A

120
100

B

C

D

-50
0
50
100
Days from calving（days）

E

GGT（U/l）

60
40
20
0
-100

A

B

C D E

-50
0
50
100
Days from calving（days）
Body Condition Score

8
7

150

D

E

50

20

-50
0
50
100
Days from calving（days）

（D）

A

B

150

C D E

15
10
5
-50
0
50
100
Days from calving（days）

（F）

A

11

B

C

150

D

E

10
9

33

80

C

100

38

（G）

B

150

8
-100

150

A

200

12

4.0

（B）

0
-100

（E）

2.0
-100

250

0
-100

150

0.9 （C）
0.8
A B C D E
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
-100
-50
0
50
100
150
Days from calving（days）
5.0

AST（U/l）

300

BUN（mg/dl）

85 （A）80
A B C D E
75
70
65
60
55
50
45
40
-100
-50
0
50
100
Days from calving（days）

Ca（g/dl）

NEFA（mEq/l）Glu（mg/dl）

黒毛和種の分娩間隔短縮に資する新たな栄養管理指標の開発～牛体３Ｄモデルを用いたアプローチ～

-50
0
50
100
Days from calving（days）

（H）

150

A B C D E

28
23
18
13
8
3
-100

-50
0
50
100
Days from calving（days）

150

（I）

6
5
4
3
2
-100

A B C D E
-50
0
50
100
Days from calving（days）

150

Fig. 5 Concentration of serum glucose（Glu,（A））,total cholesterol（T-Cho,（B））,NEFA（C）,BUN（D）,Albumin（ALB,（E））, Ca（F）, AST（G）, GGT（H）, and Body Condition Score（I）in Japanese Black cows. Dotted lines：upper andlower limits reported by Watanabe et al.（2014）.

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492

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

要性が示唆されたものの，適正な栄養度の個体は農場においても分娩前後で大きな増減は認められ代謝プロファイルテストもおおむね標準範囲内とず，栄養度に反映するほどのエネルギーの過不足なっていた。本研究では，供試牛の調査後の繁殖はなかったと考えられた。代謝プロファイルテス

成績を把握していないため，今後，追跡調査を実トの結果では，個々の農場の特徴が認められたも施する必要があるが，調査対象農場の農場全体でのの，適正な栄養度の個体は代謝プロファイルテの繁殖成績は良好であったことから，適切な栄養ストの結果もおおむね標準範囲内であったことか

度管理により良好な繁殖成績が期待されると考え

ら，適正な栄養度の管理により，良好な繁殖成績られた。

が期待された。

４．要

約

本研究では，黒毛和種繁殖雌牛の簡易な栄養度推定法の開発と代謝プロファイルテストによる各
栄養度との関係性の調査を実施した。Yを栄養度，Gを胸囲差（通常の胸囲と強く締めた際の胸囲の差）としたとき，得られた栄養度推定式は，Y＝0.598G＋1.928で決定係数Ｒ２ は0.80と高く，畜産現場での実用性が高いと考えられた。また，牛体の３Ｄモデルを用いて，牛の腰角，寛骨および坐骨の３部位を結んだ３角形の３Ｄ表面積と３部位の頂点を結ぶ２Ｄの面積の比（面積比＝３Ｄ表面
積／２Ｄ面積）を算出し，関係性を調査したところ，この面積比と栄養度には有意な相関（p＜0.001）が認められた。栄養度については，どの

文献１） Gillund, P., Reksen, O., Gröhn, Y. T., Karlberg, K.：
Journal of Dairy Science, 84, 1390～1396, 2001.
２） 公益社団法人全国和牛登録協会編：和牛登録事務
必携（平成29年度改訂版），241，公益社団法人全国
和牛登録協会，京都，2018.
３） 農林水産省：家畜改良増殖目標（平成27年３月），
13，農林水産省，東京，2015.
４） Ferguson, J. D., Galligan, D. T., Thomson, N.：
Journal of Dairy Science, 77, 2695～2703, 1994.
５） 渡辺高俊：二本立給与法虎之巻 理論編，明治乳業株式会社，東京，1988.
６） 渡邉貴之，田中佑ー，野口浩正，小西一之：肉用
牛研究会報，85，９～15，2008.
７） 髙橋茂，河原孝吉，栗生要，今井敬，堂地修：酪農学園大学紀要 自然科学編（Web），40，79～86，2016.
８） 渡邉貴之，小西一之，熊谷周一郎，野口浩正，武井直樹：日本畜産学会報，85，295～300，2014.
９） Delaval. Delaval Body Condition Scoring BCS
www.delaval.com. 2014.

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493

乳牛における高糖分イネWCS（ホールクロップサイレージ）
多給による高繁殖型飼養管理システムの確立（Ⅱ）
New system development of high fertility by feeding large amounts of a dietcomprising sugar-rich rice whole crop silage in lactating dairy cows（Ⅱ）

山口

昇一郎・柴田

果歩・柿原

孝彦・川島

千帆＊

（福岡県農林業総合試験場，＊帯広畜産大学フィールド科学センター）

Shoichiro Yamaguchi, Kaho Shibata, Takahiko Kakihara and Chiho Kawashima＊（Fukuoka Agricultural Research Center，＊Field Center of Animal Science and Agriculture, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）‘Tachisuzuka’, a rice cultivar for whole-crop silage（WCS）, is characterized by a small
panicle and high sugar content in the stem. The aim of this study was to investigate metabolic
parameters and reproductive performance in dairy cows by feeding large amounts of a dietcomprising sugar-rich rice whole crop silage（WCS）and adding a dietary supplement such as
betaine to serve as an agent for amelioration of hepatic steatosis during the dry andpostpartum periods. The experimental diets consisted of two total mixed rations（TMR）
consisting of grass silage and/or cured hay（control）or sugar-rich rice WCS（rice WCS，28％
of DM）. Rice WCS cows（n=4）were supplied with 50g of betaine by oral administration daily
from 3 weeks pre-partum to 3 weeks postpartum. Control cows（n=5）did not receive betaine
supplementation. Blood samples from multiparous Holstein cows were collected once a weekfrom 3 weeks pre-partum to 12 weeks postpartum. The first postpartum luteal formation was
confirmed using ultrasonography. The dry matter intake, milk yield, GOT and NEFA did not
differ between control and rice WCS cows. The plasma GGT in rice WCS cows tended to behigher than in control cows（p<0.01）. However, the TDN sufficiency ratio, plasma glucose andtotal cholesterol in rice WCS cows remained higher than in control cows. Days of the first
postpartum luteal formation in rice WCS cows were slightly earlier than in control cows.
In conclusion, the present study suggested that the resumption of postpartum ovarianfunction was earlier by feeding large amounts of a diet comprising sugar-rich rice WCS andadding a dietary betaine, suggesting that the negative energy balance early post-partum was
improved early.

１．目

である約460日であるが，当県におけるトップ５

的

農家の平均値である400日に短縮すると50頭規模

国内における乳牛の受胎率は低下傾向にあり，の農家換算では子牛生産頭数は，年間で７頭増加

その対策は重要な課題である。福岡県における乳する計算となる。生産頭数に加え乳量増加も考慮

牛の平均分娩間隔は，都道府県の平均値と同程度すると繁殖成績の向上が経営に与える影響は，多© The Ito Foundation

494

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

復させ，さらに脂肪肝対策を行うことによって泌大なものである。
近年，イネホールクロップサイレージ（WCS）
用でモミが少なく茎葉に糖を多く含む「たちすずか」が開発された１）。従来品種では乳牛に給与し乳牛の繁殖性が改善できるかについて検討した。
２．方法

た場合において，モミが消化されず糞として排泄

供試牛は福岡県農林業総合試験場で飼養するホ

されてしまうという問題を，モミが少なく茎葉をルスタイン種経産牛９頭（対照区：２産４頭およ

長くすることで解決した画期的な品種とされていび３産１頭，イネWCS区：４産１頭，３産１頭る。「たちすずか」を乳牛に給与する事例は増え

および２産２頭）を用いた。試験牛はフリースているものの酪農現場では，従来品種同様に少量

トール牛舎で飼養し，ドアフィーダによって個体（乾物で３～５kg程度）給与している事例がまだごとに飼料摂取量を計測した。搾乳はミルキング

多く，高糖分高消化性という飼料特性を十分に活パーラーで８：45と17：15の１日２回行った。体用しているとは言い難い。また依然としてモミの重は毎日測定し，乳成分は分娩後２週間に１回乳不消化による食滞が心配されており，多給に懸念

サ ン プ ル を 用 い て ，MILKO-SCAN FT＋（Fossを示す農家がいるのが現状である。

Electric, Hillererod, Denmark）で分析した。TDN

一方，分娩後の乳牛は泌乳初期の摂取エネル

充足率は日本飼養標準（乳牛）から算出した５）。

ギーの不足により，体脂肪が遊離脂肪酸として肝

試験期間は，分娩予定の３週間前から分娩後12週

臓に過剰動員されることによって脂肪肝になりや目までとした。採血および超音波画像診断装置にすいことが知られている。肝臓では，卵巣からのよる分娩後の卵巣診断は，１週間に１回行った。

発情ホルモン分泌に関与するインスリン様成長因

血漿中の血糖，総タンパク，総コレステロール，

子-１が産生されることから，脂肪肝による肝機

GOT（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミ

能低下は，卵巣不活化の要因となる。Kawakami

ナーゼ），およびGGT（γ-グルタミルトランス

らはマウスにおいてアミノ酸の一種であるベタフェラーゼ）は血液化学自動分析機（スポットケ

インを給与すると肝臓への脂肪蓄積が抑制される

ムSP-4410）によって測定した。またNEFA（遊こと，中井らはベタインがルーメンで完全に分離脂肪酸）はキット（WAKO）によって分析し解されずに小腸に流入することを報告している。

た。すべての試験用飼料は，カッターで細断した

これまで脂肪肝対策として乳牛に給与した事例は粗飼料と濃厚飼料を合わせ混合飼料（TMR）にないため，分娩後の体脂肪動員への対策として活よって調製した。対照区のTMRの養分含量は，

用すれば繁殖性改善につなげられるかもしれない。

おおむねTDN71％，CP15％，NDF35％となるよ

我々は，高糖分イネWCS「たちすずか」を泌

うに場内産自給飼料（イタリアンライグラスまた

乳中後期牛に多給したところ開花期のイタリアンはヒエサイレージ）を給与した。なお，ヒエサイ

ライグラスサイレージに比べ，乾物摂取量が増加

レージを給与する際には，流通乾草（オーツヘ

したことを報告している 。そこで，本研究ではイ）を併用した。WCS用イネは，場内で生産し前年度に引き続き，高糖分イネWCSを泌乳初期た高糖分イネ「たちすずか」を完熟期で刈り，乳牛に多給して飼料摂取量を向上させるとともに，酸菌（畜草２号，雪印種苗）を添加後，ラッピン

ベタインを分娩前後３週間給与することによってグしたものを用いた。イネWCS区のTMRは，お分娩後の負のエネルギーバランスをすみやかに回

おむねTDN71％，CP15，NDF32％となるように

２）

３）

４）

© The Ito Foundation

乳牛における高糖分イネWCS（ホールクロップサイレージ）多給による高繁殖型飼養管理システムの確立（Ⅱ）

495

調整し，イネの配合割合は，28％（乾物）とした。

滞が発生することが報告６）されているが，モミのなお，イネWCS区のTMRは，分娩予定前１週目

少ない「たちすずか」は泌乳初期牛に多給してもから給与を開始した。イネWCS区には，分娩前問題ないことが明らかになった。またTDN充足３週間から分娩後３週間まで食品添加物の無水ベ率は，イネWCS区が分娩後７週および８週に高タイン（日本甜菜製糖株式会社）を50ｇ/日トッ

くなる傾向を示した（ｐ＜0.1）。短期的な栄養状

プドレスで給与した。また分娩から分娩後１週間

態を示す血中グルコースは，７，10および12週目まで飼料用グリセリン（85-S，日油株式会社）にイネWCS区が有意に高くなった（ｐ＜0.01またを500ml/日経口投与した。統計処理は，ｔ検定

はｐ＜0.05，Fig.２）。また長期的な栄養状態を示で実施した。

す総コレステロールは，４週目にイネWCS区が高くなる傾向を示した（ｐ＜0.1）。GOTおよび３．結果と考察NEFAは，差が認められなかったが，GGTは０，

乾物摂取量および乳量には差が認められず，懸６および７週目にイネWCS区が有意に高くなっ念されたモミによる食滞は認められなかった

た（ｐ＜0.01またはｐ＜0.05）。分娩後，超音波画（Fig.１）。従来品種ではモミの量が多いため泌乳

像検査によって初めて黄体が確認された日数は，牛に多給した場合には，未消化モミに起因する食対照区43±14日，イネWCS区26±７日であり，

50.0

Control

45.0

20.0

40.0

15.0
10.0
5.0
0.0

120%
100%

TDN suﬃciency ratio (%)

Rice WCS

Milk yield (kg/day)

Dry matter intake (kg)

25.0

35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112
Postpartum weeks

0.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9101112
Postpartum weeks

††

80%
60%
40%
20%
0%

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112
Postpartum weeks

Fig. 1 Dry matter intake, milk yields and TDN sufficiency ratio in control and rice WCS cows from0 to 12 weeks postpartum. †p＜0.1© The Ito Foundation

496

平成30年度
70.0

††

60.0

＊＊

†

＊

250.0

＊

200.0

50.0
40.0

Rice WCS

30.0

Control

20.0

T-cho (mg/dl)

Glucose (mg/dl)

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

100.0
50.0

10.0

0.0

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

7.0

70.0

6.0

60.0

5.0

50.0
GOT (IU/l)

T-pro (g/dl)

0.0

4.0
3.0
2.0
1.0
0.0

20.0

0.0

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

0.50
†＊

50.0
†

＊

†

＊＊

†

20.0

NEFA (mEq/l)

GGT (IU/l)

30.0

0.60

60.0

0.40
0.30
0.20
0.10

10.0
0.0

40.0

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

70.0

30.0

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

10.0

80.0

40.0

†

150.0

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

0.00

Postpartum weeks

-2

-1

0

1

2

3

4

Postpartum weeks

5

Fig. 2 Metabolic parameters in control and rice WCS cows from 2 weeks prepartum to 5 or 12

weeks postpartum. ＊＊ｐ＜0.01，＊ｐ＜0.05，†ｐ＜0.1

有意差はないもののイネWCS区が短くなった

給与した場合には，乾物摂取量がイタリアンライ（Fig.３）。

グラスサイレージの半量代替（乾物割合で1.5割）

我 々 は ，泌 乳 中 後 期 牛 に 対 し て 高 糖 分 イ ネ

で６％，全量代替（乾物割合で３割）で11％有意WCSに関する給与試験を実施したところ，本県に向上し，高糖分イネWCSを多給することによっで一般的な自給粗飼料であるイタリアンライグラて乾物摂取量がより向上することを明らかにしスサイレージ（開花期刈り）を乾物割合で３割配た４）。また，収穫時期が異なる高糖分イネWCSを合したTMRよりも高糖分イネWCS配合TMRを

泌乳中後期牛に給与した場合において，完熟期刈© The Ito Foundation

乳牛における高糖分イネWCS（ホールクロップサイレージ）多給による高繁殖型飼養管理システムの確立（Ⅱ）
60

由は不明であるが，イネWCS区が試験開始前か

50

ら数値が高かった影響が大きかったと考える。なお，イネWCS区には分娩後１週間のグリセリン

40
Days

497

の給与も行ったが分娩後１週間目の血糖には差が30認められなかった。しかし，分娩１週目の乳量に20は統計上差が認められないものの，3.4kg/日の増加が認められた。栄養状態や繁殖への影響につい

10
0ては今後さらに検討する必要があるものと考える。
Control

以上のことから，泌乳初期牛に「たちすずか」

Rice WCS

Fig. 3 Days of the first postpartum luteal formation incontrol and rice WCS cows. Values are mean±SEM.

WCSをTMRに乾物割合で３割程度給与しても乾物摂取量および乳量には影響なく，懸念された食滞も認められなかった。分娩前後３週間にベタイりで調製した給与飼料の方が，適期刈りと考えらンを給与すると分娩後の負エネルギー状態が改善れていた糊熟期刈りの場合よりも泌乳牛の乾物摂され，卵巣機能回復が早まる傾向にあることが明

取量が若干多い傾向にあり，発情ホルモン合成にらかとなった。

深く関与する血糖値が有意に高く推移することも明らかにしている４）。本研究では，泌乳初期牛に

４．要約

完熟期刈りの高糖分イネWCSを３割程度TMRに

本研究では，高糖分イネホールクロップサイ

配合して給与したところ，乾物摂取量や乳量は差

レージ（WCS）を泌乳牛に多給し，かつ脂肪肝が 認 め ら れ な か っ た 。一 方 ，栄 養 状 態 を 示 すに効果があるとされるベタインを給与することでTDN充足率，血糖値および総コレステロールは，栄養状態や繁殖性が改善できるかどうかについて

イネWCS区の方が高く推移した。この理由は，検討した。試験飼料は，グラスサイレージ単体まベタインの効果により肝機能が向上した結果と思

たは乾草と併用したTMR（対照区）および高糖

われる。我々は，乾草主体の酪農家において給与分イネWCSで構成したTMR（イネWCS区，乾物飼料を同一条件とし，ベタインのみを本試験と同割合で28％配合）とした。イネWCS区の試験牛様に給与したところ，分娩後の総コレステロール（ｎ＝４）には，分娩前後３週間にわたりベタイが有意に高くなり，初回発情が早くなる傾向があンを50ｇ/日経口投与した。対照区（ｎ＝５）にることを明らかにしている （データ省略）。このは無処理とした。本試験は経産牛のみ用い，分娩ことから本研究においてもベタイン給与による肝前３週間から分娩後12週まで週１回採血した。分機能が向上したため，栄養状態がすみやかに回復

娩後の初回黄体形成は，超音波検査によって確認したと考える。この分娩後の負のエネルギー状態した。乾物摂取量，乳量，GOTおよびNEFAとの改善は，卵巣機能の回復を高め，初回排卵をイも試験区間で有意差は認められなかった。GGTネWCS区において早めたものと考えられた。一は，イネWCS区が有意に高くなった（ｐ＜0.01）。

般的に分娩後の初回排卵が早い方がその後の正常TDN充足率，血糖および総コレステロールは，な卵巣機能回復が早く，早期受胎につながること

イネWCS区が高く推移した（ｐ＜0.01，ｐ＜0.05が報告されている 。一方，GGTが高くなった理

またはｐ＜0.1）。分娩後の初回黄体形成日数は，

７）８）© The Ito Foundation

498

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

有意差は認められないもののイネWCS区が早くなる傾向にあった。
以上のことから，高糖分イネWCSを泌乳牛に多給し，ベタインを給与することによって，分娩後の負のエネルギーバランスが改善し，分娩後の卵巣機能の回復が早くなることが明らかとなった。
文献１） 松下景，飯田修一，出田収，春原嘉弘，前田英郎，
田村泰章：近畿中国四国農業研究センター研究報告，第11号，１～14，2012.
２） Kawakami, S., Han, K., Nakamura, Y., Shimada, K.,
Kitano, T., Aritsuka, T., Nagura, T., Ohba, K., Nakamura,K., Fukushima, M.：J Nutr Sci Vitaminol, 58, 371～5,
2012.

３） 中井朋一，菊地裕人，佐藤忠，佐渡谷裕朗，大谷昌之，花田正明，岡本明治：日獣会誌，60，131～
133，2007.
４） 山口昇一郎，太田剛，手島信貴，浅岡壮平，馬場武志：福岡県農林業総合試験場研究報告，５，41～
46，2019.
５） 農業・食品産業技術総合研究機構編：日本飼養標準・乳牛（2006年版），37～93，中央畜産会，東京，
2007.
６） 村田美里，石崎重信：千葉県畜産センター研究報
告，14，１～13，2014.
７） 山口昇一郎，増田善巳，柴田果歩，柿原孝彦，中村瑞希，大谷昌之，川島千帆：日本畜産学会第125回
大会講演要旨，141，2019.
８） Kawashima, C., Sakaguchi, M., Suzuki, T.,
Sasamoto, Y., Takahashi, Y., Matsui, M., Miyamoto,
A.：J Reprod Dev, 53, 113～20, 2006.

© The Ito Foundation

499

暑熱条件下で陥る肉用鶏の免疫疲弊化を回避する
機能性飼料の探索
Development of feed for improvement of antigen-specific immune response
in heat-stressed chickens

豊水

正昭・平川

良太・野地

智法・喜久里基（東北大学大学院農学研究科）

Masaaki Toyomizu, Ryota Hirakawa, Tomonori Nochi and Motoi Kikusato（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

Heat stress（HS）is of major concern for poultry industry, especially in the hot regions of
the world because of the resulting poor growth performance, immunosuppression, and highmortality：due to feathers and lack of sweat glands on skin, chickens are particularly
susceptible to high environmental temperatures. In fact, alterations of immune functions havebeen observed under the HS conditions：the titer of antibodies that react to Infectious
Bronchitis（IB）, Newcastle Disease（ND）or Avian Influenza（AI）virus did not increase as
expected by such vaccinations. In the present study, in order to clarify a possible mechanism
underlying the immunological disorder of broiler under the HS conditions and provide a new
idea for dietary manipulation to improve it, a series of experiments were conducted todetermine quantitatively the effect of HS on not only the number of lymphocytes and plasma
titer of IgY, IgM and IgA induced by BSA immunizations, but also metabolic status on thebasis of energy-yielding substrates in lymphoid tissues.
The exposure of 3-week-old chickens to 34.5±0.5℃ for 6-7 days resulted in significantly
decreased number of lymphocytes in spleen and bursa of fabricius, but not in thymus. HS
decreased the relative amount of metabolites in glycolysis and TCA cycles（e.g., lactate, citrate,
succinate and glyconeogenic amino acids）in those lymphoid tissues, and increased levels of thegene expression related to fatty acid oxidation（e.g., CPT-1, 3HADH, LCAD, CD36）in thymus
and spleen, but not in bursa of fabricius. It was also observed that plasma titer of IgY, IgM and
IgA induced by BSA immunizations of chickens exposed to heat for 14 days were weaker thanthat of the thermoneutral chickens. These results suggest that metabolic alterations inlymphoid tissues might be involved in immunological disorder in heat-stressed chickens.
Then, given these results and previous findings, experimental diets containing L-carnitine（Car）or vitamin B１ plus amino acid（VB１/AA）were fed HS chickens. Feeding of VB１/AA
significantly alleviated the decrease in body weight of HS chickens, while weaken plasma titerof IgY and IgM induced by BSA immunizations in HS chickens were not significantly but
definitely improved by（Car）or vitamin B１ plus amino acid（VB１/AA）respectively, though
weaken plasma titer of IgA were not changed at all.
It thus appears that optimization of dietary treatment can play a role, to some extent, inthe control of immune functions for heat-stressed birds via metabolic changes.

© The Ito Foundation

500

平成30年度

１．目

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

供給強化を考え合わせた，免疫システム改善のた的めの飼料開発を試みた。

近年の地球温暖化の進行に伴う気温上昇は畜産業の生産性や繁殖性に世界的に大きな被害を与え

２．方法ている。肉用鶏は分厚い羽毛に覆われ汗腺がない

2 . 1 暑熱下の各免疫担当組織における免疫細ため，暑熱ストレス下ではパンティング（浅呼胞の動態とエネルギー基質代謝動態の調査

吸）により熱拡散を確保するため，バクテリアや実験には22日齢雄肉用鶏（Ross308系統）を供

ウイルスが鼻腔でろ過されることなく呼吸するの試し，試験区として対照区（TN/24±0.5℃）とで二次的な細菌感染やウイルス病への感染リスク

暑熱区（HS/34.5±0.5℃）を設定し，試験期間をが高い。このため，近年暑熱下の鶏の免疫機能に６日間とした。

関する研究成果が多く報告されている。例えば，

2.1.1

暑熱下の肉用鶏において，消化管における病原性

放血と殺後，各区より一次リンパ組織（胸腺，細菌の増加や腸管透過性の上昇すること ，骨格

ファブリキウス嚢）ならびに二次リンパ組織（脾筋や肝臓のサルモネラ感染も認められること ，臓）を回収し，各組織断片をPBSとともにナイロ

さらにニューカッスル病や鳥インフルエンザウイ

ンメッシュを透しながら，50mlチューブに移し，ルスなどのワクチン抗原を点眼で投与した際に，遠心・上澄み除去後，PBSで単核細胞数１×10６

各抗原に特異的に反応する抗体の産生量が低下す/100μLになるように調整した。その後，各種蛍ること

光標識抗CD45，CD3，CD4，CD8，Bu1抗体をそ

１）

２）

３，
４）

が明らかにされている。

免疫細胞の動態解析

すでに，当研究グループでは，暑熱下の肉用鶏

れぞれ添加し，４℃で30分間反応させた。反応後，では骨格筋の酸化ストレスの上昇が活性酸素種のPBS で 細 胞 を 洗 浄 し ，フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー

過剰産生によることを明らかにしているが，（Accuri C6, BD Bioscience）で 組 織 当 た り の 各

免疫担当器官である一次リンパ組織（胸腺，ファ種細胞数ならびに細胞割合をそれぞれ算出した。

ブリキウス嚢）や二次リンパ組織である脾臓の重2 . 1 . 2 リンパ組織における代謝関連物質の半５～７）量が著しく低下し，脾臓におけるＴ細胞・ヘル定量解析

パーＴ細胞・キラーＴ細胞・Ｂ細胞の数が低下－80℃で凍結された組織サンプルより抽出したし，また予備実験により抗原暴露時の血中の抗原

水溶性代謝物質をメトキシアミン塩酸塩ならびに特異的抗体価が低下することを観察している。さMSTFAを添加することで誘導体化（メトキシム

らに，脾臓における解糖系やTCA回路の中間代

シリル化）させ，ガスクロマトグラフィー質量分

謝物や糖原性アミノ酸量が欠乏状態にあり，免疫析 装 置（GCMS-QP2010 SE/SHIMADZU）で 各

担当細胞のエネルギー基質が枯渇していることが代謝物質の内部標準（２-イソプロピルリンゴ酸）

予想された。したがって，獲得免疫応答能が低下に対する濃度比を調べた。

している暑熱下の肉用鶏は，細菌などの感染リス

2 . 1 . 3 リンパ組織におけるβ酸化関連遺伝子

クは一層高い状態にある。

の発現量の測定

そこで本研究では，まず暑熱下の肉用鶏の免疫－80℃で凍結された組織サンプルよりRNAを疲弊化の機序，ならびにこれに関連する栄養学的

抽 出 し ，CPT-1 ，CPT-2 ，3HADH ，LCAD ，要因を明らかにし，免疫細胞へのエネルギー基質

CD36の遺伝子発現量をリアルタイムRT-PCRで© The Ito Foundation

501

暑熱条件下で陥る肉用鶏の免疫疲弊化を回避する機能性飼料の探索定量した。

ドリアへの脂肪酸の移行速度と酸化的リン酸化の2 . 2 暑熱下の抗原特異的な液性免疫応答の評促進を施し，好気的代謝の強化が期待されるＬカルニチン0.01％添加飼料を給与する暑熱カルニ

価
実験には22日齢雄肉用鶏（Ross308系統）を供

チ ン 区（HS-Car/34.5 ± 0.5 ℃ ），な ら び に ，２）

試し，試験区として対照区（TN/24±0.5℃）と解糖系の律速段階にあるピルビン酸脱水素酵素

暑熱区（HS/34.5±0.5℃）を設定し，試験期間を（PDH）の賦活化ならびにグルコースと糖源生ア

14 日 間 と し た 。こ の ２ 区 に 牛 血 清 ア ル ブ ミ ン

ミノ酸による糖質源の補給による嫌気的代謝の改（BSA）を暑熱感作３日後（初回免疫）と10日後

善が期待されるビタミンＢ１ 0.01％，グルコース（追加免疫）に筋肉内注射を行った（対照BSA

５％，クエン酸0.5％ならびに各種アミノ酸（グ区：TN-BSA/24±0.5℃ならびに暑熱BSA区：

ルタミン酸１％，グルタミン１％，ロイシン0.8％，

HS-BSA/34.5±0.5℃）。なお，この２区に加えバリン0.4％，イソロイシン0.4％，アスパラギン

BSA投与をしない２区も設定した。

酸0.4％）を添加した飼料を給与するビタミン2.2.1

血中のBSAに特異的な抗体価の定量

Ｂ１・アミノ酸強化飼料区（HS-VB１・AA／34.5

追加免疫４日後に翼下静脈より採血し，ただち±0.5℃）の２区を設定した。なお，対照区と暑に血漿を分離し，－20℃で保存した。その後，

熱区ならびに強化飼料区の４区には，BSAを暑ELISA法を用いて血漿中のBSAに特異的なIgY，

熱感作３日後（初回免疫），10日後（追加免疫）

IgMおよびIgA抗体価を定量した。

に筋肉内注射を行った（Fig.１）。

2 . 3 機能性飼料の暑熱下の免疫疲弊化への有

2.3.1

飼養成績

暑熱試験開始前と試験終了後の体重を計測し，効性の検証
実験には22日齢雄肉用鶏（Ross308系統）を供

暑熱試験期間中の累積資料摂取量も測定した。ま試し，試験期間を14日間とした。試験区として先た，試験終了後に，各区より一次リンパ組織（胸の2.2の４区に加え，暑熱試験開始の１週間前か腺，ファブリキウス嚢）ならびに二次リンパ組織

ら，１）脂肪酸のβ酸化律速段階にあるミトコン（脾臓）を回収し，それぞれの重量を測定した。

Days 3Days 10

BSA Immunization
Thermoneutral conditions 24 ±0.5 ℃
Heat stress conditions 34.5 ±0.5℃
TN-BSA group

14 Days

HS-BSA group

14 Days

HS-Car group

14 Days

HS-VB 1・AA group

14 Days

Days 14
Sampling

Fig. 1 Experimental design. Broiler chickens were fed either a control diet, an L-carnitine-supplemented diet, or an

vitamin B１ plus amino acids-supplemented diet for 7 days and then exposed either to heat stress（HS：/34.5±
0.5℃, 14 days）or kept at a thermoneutral temperature（TN：24±0.5℃）. All chickens were intramuscularly
administered BSA on days 3 and 10 of heat exposures.

© The Ito Foundation

502

平成30年度2.3.2

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

血中のBSAに特異的な抗体価の定量

3 . 1 . 2 リンパ組織における代謝関連物質の半牛血清アルブミン（BSA）を暑熱感作３日後

定量解析（初回免疫），10日後（追加免疫）に筋肉内注射を

暑熱下のリンパ組織におけるエネルギー基質の施す対照BSA区ならびに暑熱BSA区を設定した。

存在量を明らかにするため，各組織における水溶追加免疫の４日後に翼下静脈より採血し，ただち

性代謝物質をGC-MSによって網羅的に解析をに血漿を分離し，－20℃で保存した。その後，行った。胸腺では，クエン酸回路のリンゴ酸なら

ELISA法を用いて血漿中のBSAに特異的なIgY，びにアミノ酸であるPhe，Tyrの各量は暑熱区でIgMならびにIgAの抗体価を定量した。

有意に低下していた。ファブリキウス嚢ではGlyが暑熱区で有意な低下が認められた。脾臓では解

３．結果・考察

糖系やクエン酸回路の中間代謝物質である乳酸，

3 . 1 暑熱下の各免疫担当組織における免疫細コハク酸，クエン酸に加え，糖原性アミノ酸でも胞の動態とエネルギー基質代謝動態の調査

あるTyr，Asn，Pro，Glu，Gly量が暑熱区で有3.1.1

意に低下していた。このように６日間暑熱感作し免疫細胞の動態解析

暑熱感作によって萎縮したリンパ組織の免疫機

たリンパ組織ではエネルギー基質代謝が変化して能を評価するため，６日暑熱感作後の胸腺，ファいることは明らかで，暑熱感作時に血中８）や肝ブリキウス嚢，脾臓における免疫細胞の数・割合

臓９）で中間代謝物が変化しているとのこれまでのをFACS解析で調べた。その結果，Ｔ細胞の成熟

知見がリンパ組織においても同様にあてはまるこ

分化領域である胸腺では，細胞構成ならびに組織とが検証された。

当たりの各CD4－CD8－Ｔ細胞，CD4＋CD8＋Ｔ細胞，

3 . 1 . 3 リンパ組織における脂肪酸酸化関連遺CD4 ヘルパーＴ細胞，CD8 キラーＴ細胞の数に＋伝子の発現量＋対照区と暑熱区との間に有意な差は認められな

暑熱下のリンパ組織における脂肪酸酸化能を，かった。一方，Ｂ細胞の成熟分化領域である，鳥各β酸化関連遺伝子の発現量によって評価した。

類固有の一次リンパ組織ファブリキウス嚢におけ胸腺では，脂肪酸酸化の律速段階である３HADH

るCD45 白血球のうちのBu1 Ｂ細胞の割合は，ならびにLCAD，脂肪酸トランスポーターである

両区とも約98％と違いは認められなかったが，組CD36の発現量が暑熱区で有意に増加していた。

織当たりのBu1 Ｂ細胞の数は暑熱区で有意な低脾臓では，CPT-1ならびに3HADH，さらにCD36下が認められた。なお，二次リンパ組織の脾臓にの発現量は暑熱区で有意に増加していた。一方，

おけるCD45 白血球の細胞構成を調べた結果，Ｔ

ファブリキウス嚢では，CPT-2ならびに3HADH細胞ならびにＢ細胞の割合に違いは認められなの発現量は暑熱区で有意に低下していた。した

かったが，組織当たりのBu1 Ｂ細胞，CD3 Ｔ細がって，６日間暑熱感作した胸腺ならびに脾臓で胞，CD4＋ヘルパーＴ細胞，CD8＋キラーＴ細胞のは脂肪酸酸化が促進される一方で，ファブリキウ

数は暑熱区で有意に低下していた。したがって，ス嚢では抑制されていることが明らかとなった。

暑熱感作により萎縮したファブリキウス嚢ならび

このように，Ｔ細胞の数が維持されていた胸腺でに脾臓では，免疫細胞の構成には変化が認められ脂肪酸酸化が上方制御されており，逆にＢ細胞のないが，組織当たりの数が暑熱で著しく低下する

数が低下していたファブリキウス嚢では，脂肪酸

ことが明らかとなった。

酸化能が低下していた。このことから，成熟段階

＋

＋

＋

＋

＋

＋

© The Ito Foundation

暑熱条件下で陥る肉用鶏の免疫疲弊化を回避する機能性飼料の探索

503の免疫細胞において脂肪酸酸化は重要なエネル

価の低下に対して，HS-VB１・AA飼料やHS-Car

ギー供給経路である可能性が示唆された。

飼料給与による回復効果はまったく認められな

3 . 2 暑熱下の抗原特異的な液性免疫応答の評かったが，BSAに特異的なIgMとIgYの各低下は
HS-VB１・AA飼料給与とHS-Car飼料給与でそれ価
本試験では，暑熱下の液性免疫機能を評価する

ぞれ軽微な上昇が認められた。このように，通常た め ，追 加 免 疫 後 の 血 漿 中 の BSA に 特 異 的 な環境下のブロイラーにカルニチン添加飼料を給与

IgY，IgMならびにIgAの抗体価をELISA法で調すると一次リンパ組織の重量や抗体価が上昇する

べた。その結果，血漿中のBSA特異的IgYならびとの知見10～12）を考え合わせると，各添加物質の給にIgM抗体価は両区とも，免疫前と比較して上昇

与方法ならびに至適添加濃度を今後検討することしていたが，HS-BSA区の両アイソタイプの抗体で，暑熱下の免疫疲弊化を改善できる可能性が期

価はTN-BSA区と比較して，有意な低下が認め待される。

られた。血漿中のBSA特異的IgA抗体価は，TNBSA区でのみ上昇が認められ，HS-BSA区ではそ

約

４．要の上昇は認められなかった。これらの結果より，

本研究は，暑熱ストレス下の肉用鶏における鶏

暑熱下の肉用鶏では液性免疫機能が低下している病感染リスクを低減するため，暑熱下の免疫疲弊ことが示された。このことは，脾臓での免疫細胞化の機序に関連する栄養学的要因を明らかにし，数が低下している暑熱下において，筋肉内注射に免疫システム改善のための飼料開発基盤の構築をよるワクチン接種法では十分な細菌・ウイルス耐目的とした。

性を獲得させることができないことを示唆している。

暑熱下では，ファブリキウス嚢でのＢ細胞の数，脾臓でのＢ細胞，ヘルパーＴ細胞，キラーＴ

3 . 3 機能性飼料の暑熱下の免疫疲弊化への有により投与した抗原に対して十分な特異的抗体産

効性の検証
3.3.1

細胞の数が著しく低下しており，また筋肉内注射
生が行われないことが明らかとなった。そこでリ

飼養成績

HS-VB１ ・AA区の終体重は，HS-BSA区と比ンパ組織におけるエネルギー基質動態を解析し較して有意な増加が認められたが，飼料摂取量なた。その結果，暑熱感作により各リンパ組織で解らびに飼料効率には変化は認められなかった。

糖系やクエン酸回路の中間代謝物質，糖原アミノ

HS-VB１・AA区の骨格筋，胸腺，ファブリキウ

酸の各量が低下していることが明らかになった。

ス嚢の各重量はHS-BSA区と比較して有意な増加

さらに，胸腺ならびに脾臓では，暑熱感作によりあるいは増加傾向を示した。一方，HS-Car区の

脂肪酸酸化の律速段階の酵素３HADHを含む複終体重は，HS-BSA区と比較して増加傾向を示し数の関連遺伝子の活性が上昇していることから，

たが，飼料摂取量ならびに飼料効率には変化は認

脂肪酸酸化経路におけるエネルギー産生が促進さめられなかった。HS-Car区の骨格筋，胸腺，ファれていることが示唆された。逆に，ファブリキウ

ブリキウス嚢の各重量はHS-BSA区と比較して有ス嚢では，暑熱感作により3HADHの活性が低下

意な増加あるいは増加傾向を示した。

しており，脂肪酸酸化経路によるエネルギー供給3.3.2が制限されていることが考えられた。

血中のBSAに特異的な抗体価

暑熱に伴う血液中のBSAに特異的なIgAの抗体

これらの結果を踏まえ，解糖系・ATP供給系© The Ito Foundation

504

平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.37）

アミノ酸代謝の改善が期待されるビタミンＢ１・アミノ酸強化飼料ならびにβ酸化によりATP供給の強化が期待されるL－カルニチン添加飼料を
暑熱下の肉用鶏に給与し，飼養成績，臓器重量ならびに液性免疫機能に及ぼす影響を検証した。その結果，暑熱下で各種試験飼料を給与した区では，終体重や一次リンパ組織の重量に改善が認められたが，BSAに特異的なIgMとIgYの各低下は
HS-VB１・AA飼料給与とHS-Car飼料給与でそれぞれ軽微な回復が認められた。したがって，今後添加物質の給与法や添加濃度の最適化をはかれ
ば，暑熱下の免疫疲弊化をある程度改善しうるよ
うに考えられた。
文
献１） Zhang, C., Zhao, X. H., Yang, L., Chen, X. Y., Jiang
R. S., Jin, S. H., Geng, Z. Y.：Resveratrol alleviates
heat stress-induced impairment of intestinal
morphology, microflora, and barrier integrity inbroilers, Poultry Science, 96, 4325～4332, 2017.
２） Alhenaky, A., Abdelqader, A., Abuajamieh, M.,
Al-Fataftah, A. R.：The effect of heat stress on
intestinal integrity and Salmonella invasion in
broiler birds, Journal of Thermal Biology, 70, 9 ～ 14,2017.
３） Jahanian, R., Rasouli, E.：Dietary chromium
methionine supplementation could alleviate
immunosuppressive effects of heat stress in broiler
chicks, Journal of Animal Science, 93, 3355～3363, 2015.
４） Hajializadeh, F., Ghahri, H., Talebi, A.：Effects ofsupplemental chromium picolinate and chromium
nanoparticles on performance and antibody titers of
infectious bronchitis and avian influenza of broiler
chickens under heat stress condition, Veterinary
Research Forum, 8, 259～264, 2015.

５） Mujahid, A., Akiba, Y., Warden, C. H., Toyomizu,
M.：Sequential changes in superoxide production,
anion carriers and substrate oxidation in skeletal
muscle mitochondria of heat-stressed chickens,
FEBS Letter, 581, 3461～3467, 2007.
６） Kikusato, M., Toyomizu, M.：Crucial role ofmembrane potential in heat stress-induced
overproduction of reactive oxygen species in avian
skeletal muscle mitochondria, PLoS One, 8, e64412,
2013.
７） Azad, M. A., Kikusato, M., Sudo, S., Amo, T.,
Toyomizu, M.：Time course of ROS production inskeletal muscle mitochondria from chronic heatexposed broiler chicken, Comparative Biochemistry
and Physiology Part A： Molecular & Integrative
Physiology, 157, 266～271, 2010.
８） Tomonaga, S., Okuyama, H., Tachibana, T.,
Makino, R.：Effects of high ambient temperature on
plasma metabolomic profiles in chicks, Animal
Science Journal, 89, 448～455, 2018.
９） Jastrebski, S. F., Lamont, S. J., Schmidt, C. J.：
Chicken hepatic response to chronic heat stressusing integrated transcriptome and metabolome
analysis, PLoS One, 12, e0181900, 2017.
10） Geng, A., Li, B., Guo, Y.：Effects of dietary
L-carnitine and coenzyme Q10 at different
supplemental ages on growth performance and someimmune response in ascites-susceptible broilers,Archives of Animal Nutrition, 61, 50～60, 2007.
11） Takahashi, K., Kitano, A., Akiba, Y.：Effect of
L-carnitine on proliferative response and mRNA
expression of some of its associated factors in
splenic mononuclear cells of male broiler chicks,
Animal Science Journal, 81（2）,215～22, 2010.
12） Mast, J., Buyse, J., Goddeeris, B. M.：Dietary
L-carnitine supplementation increases antigenspecific immunoglobulin G production in broiler
chickens, British Journal of Nutrition, 83, 161～6, 2000.

© The Ito Foundation

平成30年度助成研究調査一覧

本年度の対象とする研究または調査：
食肉に関する研究または調査（製造加工，食品的価値，食品安全，家畜生産，飼料，疾病，食肉・食
肉製品の流通など）
単位：千円
研
Ⅰ

究

課

継続
年数

題

代

表

代表者名

研

究

者

所属機関

助成金額

食肉の品質加工，食品的価値，食品安全

ミートエクストラクトのコク味とγ‐グルタミルペプ
チドの関係について鈴木秀之

京都工芸繊維大学
応 用 生 物 学 系

1,000

本田

和久

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,200

川口

博明

鹿児島大学大学院
医歯学総合研究科
衛生学・健康増進
医 学 分 野

1,000

滝田

禎亮

京都大学大学院
農 学 研 究 科
食品生物科学専攻

1,200

豚特有のチアミン三リン酸蓄積機構の解明

室谷進

国立研究開発法人
農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,000

和牛肉のおいしさを「見える化」する

山田知哉

国立研究開発法人
農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,500

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明

西村敏英

女 子 栄 養 大 学
栄 養 学 部

1,300

市村さやか

一般社団法人食肉
科学技術研究所

1,300

豚肉の筋線維タイプ組成と肉質の関連性に関する研究

水野谷

航

九州大学大学院
農 学 研 究 院

1,300

軽度認知症改善効果を示した豚肝臓分解物の活性本体の同定とメカニズム解明

塚原完

長 崎 大 学医 歯 薬 学 総 合
研 究 科 薬 学 系

1,200

若松

純一

北海道大学北方生
物圏フィールド科
学 セ ン タ ー

1,300

長岡

利

岐 阜 大 学
応用生物科学部

1,300

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明（Ⅱ）

H29～

鹿児島黒豚における血中酸化ストレスと肉質との関連検討
タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの活性増強と基質認識機構の改変（Ⅲ）

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅲ）

食肉タンパク質の抗肥満および脂質代謝促進効果に関する研究（Ⅱ）

H28～

H28～

H29～

牛心臓由来新規コレステロール代謝改善ジペプチドの作用機構解明および革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究© The Ito Foundation

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線
維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究（Ⅱ）

H29～

林

利哉

名城大学農学部

1,000

肥満に伴うサルコペニア発症予防に対するカルノシン
摂取の有用性（Ⅱ）

H29～

後藤

孔郎

大分大学医学部

1,000

山田

晃一

国立研究開発法人
医薬基盤・健康・
栄 養 研 究 所

1,000

河合

慶親

徳島大学大学院
医歯薬学研究部

1,200

豚赤血球由来グロビンタンパク分解物を用いた高血圧症の改善を目指した研究

糸井亜弥

神 戸 女 子 大 学
健 康 福 祉 学 部
健 康 ス ポ ー ツ
栄 養 学 科

1,200

ファージおよび食品成分等による食肉の安全確保に関
する研究

宮本

敬久

九州大学大学院
農 学 研 究 院

1,000

薬剤耐性菌のガスプラズマ殺菌機構解明に向けた分子論的アプローチ

作道章一

琉球大学医学部
保 健 学 科生 体 代 謝 分 野

1,200

電気定数測定に基づく食肉の鮮度評価齊藤一幸

千 葉 大 学フ ロ ン テ ィ ア
医工学センター1,200

可視・近赤外分光イメージングと深層学習を併用した
食肉加工品のスマート品質管理牧野義雄

東京大学大学院農学生命科学研究科

1,500

松本

大和

東海大学農学部
応用動物科学科

900

抗菌性ペプチドを指標とした豚抗病性育種法の開発

上本吉伸

東北大学大学院
農 学 研 究 科

1,500

肉用地鶏の増産を目指した雌系名古屋種の産卵率および卵殻強度に関する遺伝子座の効率的な探索後藤達彦

帯 広 畜 産 大 学

1,500

牛の暑熱ストレス耐性を担うHSP70.1遺伝子多型に関
する研究

森

美幸

福岡県農林業総合試験場生産環境部

700

DNAメチル化網羅解析法により種雄牛の受胎性の評
価

山崎

淳平

北海道大学大学院
獣 医 学 研 究 院

1,500

谷口

雅章

国立研究開発法人
農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,300

組織分化制御因子の遺伝子発現プロファイルに基づく
豚体外受精胚の新規培養技術の開発

澤井健

岩手大学農学部

1,300

体外胚生産技術を活用した純粋種豚（トウキョウX）の生産性向上に関する研究

岡田幸之助

日 本 獣 医 生 命科 学 大 学
応用生命科学部
動 物 科 学 科

1,300

発情発見困難牛の特徴解明による授精率向上方策の検
討

坂口

実

北里大学獣医学部

1,000

牛におけるクロモグラニンAの分泌動態および繁殖障
害への関与の解明と子宮内膜における生理機能の解析高橋透

岩手大学農学部

950

食肉摂取による，不飽和脂肪酸等の生活習慣病予防効果について（佐久コホートに於ける疫学研究）
食肉を中心とする食品由来核酸の腸管保護機能の解析
（Ⅱ）

Ⅱ

H29～

遺伝育種

牛経済形質に関わる新規DNA多型の探索（Ⅱ）

H29～

霜降り豚肉の生成に関わる生体内因子の探索
Ⅲ

繁殖© The Ito Foundation

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基盤的研究

木崎景一郎

岩手大学農学部
共 同 獣 医 学 科

1,500

牛における新規膣内薬剤投与技術の確立

田中知己

東 京 農 工 大 学
農 学 研 究 院

1,300

牛体内成熟卵を用いた移植用胚生産ｼｽﾃﾑの高度化に関
する研究

山中

賢一

佐賀大学農学部

1,300

黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査

星野洋一郎

京都大学大学院
農 学 研 究 科附 属 牧 場

1,350

武田久美子

国立研究開発法人
農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,500

牛の卵巣・子宮機能調節に及ぼす不飽和脂肪酸の影響
とその利用

作本

亮介

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門
家 畜 育 種 繁 殖
研 究 領 域1,200

肝機能と栄養状態解析を用いた牛子宮内膜炎の新たな予後判定評価法の開発

大滝忠利

日 本 大 学
生物資源科学部
獣医学科獣医臨床繁 殖 学 研 究 室

1,000

牛の肝機能障害が炎症性子宮疾患の重篤化に及ぼす分子メカニズムの解明

真方

文絵

東京大学大学院
農 学 生 命 科 学
研
究
科

1,300

栁川洋二郎

北海道大学大学院
獣 医 学 院1,300

豚における繁殖性の向上に向けたアミノ酸の効果に関
する研究

北原

豪

宮崎大学農学部
獣医学科産業動物
臨床繁殖学研究室

1,300

繁殖雌牛における栄養コントロールが過剰排卵処置の反応性および回収胚数に与える影響林武司

福 岡 県 農 林 業
総合試験場畜産部

1,200

H29～

山下

泰尚

県 立 広 島 大 学
生 命 環 境 学 部

1,300

H29～

佐藤

繁

岩手大学農学部
共 同 獣 医 学 科

1,500

食肉の薬剤耐性菌による汚染菌数の測定法の開発・評
価

石原加奈子

東 京 農 工 大 学
農
学
部

1,000

筋肉中の虫体数を予測できるトキソプラズマ感染豚の
検出法

高島

康弘

岐 阜 大 学
応用生物科学部

1,500

牛趾乳頭腫症の性状解明を目指したメタゲノム解析と
疫学研究

後藤

恭宏

九州大学大学院
医 学 研 究 院

1,500

簡便・迅速なマダニによって媒介される牛のアナプラ
ズマ症とバベシア症の診断法開発

田仲哲也

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,100

消化管寄生性コクシジウム，Eimeria krijgsmanni における発育休止期の解析

松尾智英

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部寄生虫病学分野

900

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明（Ⅱ）

牛における卵管上皮細胞を用いた新規精子受精能獲得
能評価法の開発および性選別精子の受精能獲得能機能評価（Ⅱ）

卵巣の鉄不足に起因した豚における繁殖障害の解明（Ⅱ）―肝臓の鉄放出能低下と繁殖障害の関係―
Ⅳ

H29～

H29～

動物衛生

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症
予知と制御（Ⅱ）© The Ito Foundation

鶏に対する高率的・低負荷な新規サルモネラ粘膜ワク
チンの開発

谷

浩行

大 阪 府 立 大 学
大学院生命環境科
学 研 究 科獣 医 学 専 攻獣 医 内 科 学 研 究
グ ル ー プ

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施
状況調査

森本

素子

宮 城 大 学
食 産 業 学 群

800

ゲノム疫学的手法による豚抗酸菌症のリスク評価と実
態解明

大屋

賢司

岐 阜 大 学
応用生物科学部

1,300

1,500

鶏における家畜関連黄色ブドウ球菌の病原遺伝子および病態形成の解析（Ⅱ）

H29～

小野

久弥

北里大学獣医学部

1,300

ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症ヘテロ保因牛における病態解析（Ⅱ）

H29～

猪熊

壽

帯 広 畜 産 大 学
畜 産 学 部

600

福本

晋也

帯 広 畜 産 大 学
原 虫 病 研 究
セ ン タ ー

800

市居

修

北海道大学大学院
獣 医 学 研 究 院

700

豚腸管細胞モデルを用いた豚サーコウイルス関連疾病の重症化機序解明

岡林

環樹

宮崎大学農学部
獣 医 学 科1,300

アフリカ豚コレラの侵入リスク評価に関する疫学研究杉浦勝明

東京大学大学院
農 学 生 命 科 学
研
究
科

1,200

豚増殖性腸炎による可食部位の廃棄防止に向けた適正な抗生物質使用方法の検討岡田彩加

岐 阜 大 学応 用 生 物 科 学 部共 同 獣 医 学 科

1,500

南九州におけるPRRSウイルス変異株の地理的分布および病理学的解析

平井卓哉

宮崎大学農学部700

北海道の肉用牛における牛ウイルス性下痢症の疫学調
査

磯田

典和

北海道大学人獣共通感染症リサーチ
セ ン タ ー

800

黒木

香澄

東京大学大学院
農 学 生 命 科 学
研究科食の安全研 究 セ ン タ ー

1,300

野鳥が媒介する家畜のボツリヌス症の分子疫学的解析

阪口義彦

北里大学医学部
微 生 物 学1,300

豚流行性下痢ウイルス感染による致死性を決定する遺
伝子の同定

大橋

誠一

国立研究開発法人
農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
動物衛生研究部門

1,300

反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索

青山真人

宇都宮大学農学部
生物資源科学科

1,200

地方病性牛白血病の簡易鑑別診断法の開発と若齢発症
牛の実態調査への応用岡川朋弘

北海道大学大学院
獣 医 学 研 究 院

1,300

ワイン搾汁残渣タンニンを利用したラム肉パストラル
フレーバー低減技術の確立

上田宏一郎

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,100

骨格筋肥大を促進する植物由来成分の探索

米倉

信州大学農学部

1,500

エゾシカ由来腸管出血性大腸菌の食品衛生リスクに関する研究
産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索（Ⅱ）―より効果的なワクチン接種部位を求めて―

H29～

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅱ）

Ⅴ

H29～

家畜飼養，飼料© The Ito Foundation

真一

家畜生産における抗生物質使用量の低減化を目指した「ミサイル」抗菌剤の創出

榎本賢

東北大学大学院
農 学 研 究 科

1,100

高田

良三

新潟大学農学部

900

カリウムおよびセシウムの含量が低い国産実用牧草品
種の選抜と育種に向けた植物生理学的解析

小林奈通子

東京大学大学院
農 学 生 命 科 学
研
究
科

1,300

妊娠末期の乳用牛へのバイパスリジン給与がその産子の栄養代謝へ及ぼす影響川島千帆

帯 広 畜 産 大 学
畜 産 学 部

1,400

乳牛の周産期における肝臓由来の新規タンパク質の発現と分泌動態蘆尚建

東北大学大学院
農 学 研 究 科

1,400

養鶏における個体管理と清掃ロボット導入による異IoT型食肉生産技術の開発

堀口健一

山形大学農学部

1,100

成熟後の効率的な筋肥大の誘導に寄与する筋幹細胞の
探索

鈴木

貴弘

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,200

飼料用イネの繊維消化性を左右する要因の解明と生産現場との技術的連携近藤誠

三重大学大学院
生物資源学研究科

1,100

黒毛和種肥育牛の安定的ルーメン発酵に貢献する重要細菌群の特性把握小池聡

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,500

乳用子牛への機能性飼料の給与による亜急性ルーメン
アシドーシス制御と発育向上

櫛引史郎

国立研究開発法人
農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,100

豚の未熟産子（ひね豚）の発育遅延をもたらす生理的
要因の解明

中島

郁世

国立研究開発法人
農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,100

神戸

大朋

京都大学大学院
生命科学研究科

1,600

半教師あり学習による飼料成分を予測する新たな近赤外分析法の開発田中常喜（地 独）北 海 道 立
総 合 研 究 機 構
畜 産 試 験 場

1,200

黒毛和種の分娩間隔短縮に資する新たな栄養管理指標の開発～牛体３Dモデルを用いたアプローチ～

木野勝敏

愛知県農業総合試験場畜産研究部

1,200

乳牛における高糖分イネWCS（ホールクロップサイ
レージ）多給により高繁殖型飼養管理システムの確立 H29～
（Ⅱ）

山口昇一郎

福 岡 県 農 林 業
総 合 試 験 場

1,200

暑熱条件下で陥る肉用鶏の免疫疲弊化を回避する機能性飼料の探索豊水

東北大学大学院
農 学 研 究 科

1,400

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響（Ⅱ）

亜鉛トランスポーターに着目した亜鉛栄養改善飼料の
開発（Ⅱ）

合

計

H29～

H29～

84件

正昭

101,200© The Ito Foundation

伊藤記念財団賞© The Ito Foundation

513

林

利

哉

名城大学農学部応用生物化学科

教授〔業績の課題名〕

筋肉・食肉タンパク質の機能・加工特性に関する研究―ゲル化特性，変性・分解挙動，生理活性―〔業績の概要（受賞理由）〕
良質なタンパク質を多く含む食肉は，嗜好面と栄養面の両方を兼ね備えるポテンシャルに満ちた食材であるが，現在のところ十分な知見が取得・活用されているとはいい難く，食肉・筋肉の未知・既知機能の発掘とさらなる改善が待たれるところである。受賞者の研究内容は大きく以下の三つに分類される。一つ目の領域は， 未利用・低利用資源の食肉製品への有効利用を念頭においた大豆タンパク質と筋肉タンパク質の相互作用に関する研究である。連続的に加熱挙動を追跡できる動的粘弾性測定とタン
パク質化学的手法を併用して，異種タンパク質同士が共存することによって生ずる相乗的な分子間反応の帰結として発現される粘弾性特性と理化学的特性の変化から，これらのタンパク質間で生ずる相互作
用を論じ，加熱に伴う異種タンパク質間相互作用の発現機構の一部を明らかにした。
二つ目は，食肉の“素”である筋肉の成長・肥大と運動との関連に関する研究である。筋肉の肥大は
栄養・運動・成長因子の相乗作用で助長されると考えられており，同氏は，運動とタンパク質栄養が動物の成長に如何に作用するかを動物実験によって検討し，運動と食肉タンパク質摂取の組合せにより，ラットの成長と筋肉の成長因子として知られるインスリン様成長因子-I（IGF-Ｉ）の血液中濃度の上昇が促されることを明らかにした。さらに，運動神経支配と，筋肉の成長との関係を，外科的に運動神経を切除したウサギの筋肉の量的および質的変化を調べることによって検討したところ，神経切除による筋萎縮に伴って，分子量12kDaの糖タンパク質因子の量が減少することを見出すとともに，そのアミノ酸配列が新規なものであったことから，本因子をs-myotrophinと命名した。この運動神経依存型の筋肉細胞成長因子は，既知の有力な筋肉細胞成長因子であるIGF-Ｉに匹敵する培養骨格筋細胞の肥大化活性ならびに骨格筋特異的タンパク質の発現賦活活性を有することも明らかにした。
三つ目は，現在推進している食肉・食肉製品の機能改善に関する研究である。特に，高温殺菌や発酵といった食品加工技術によって，より安全で，おいしく，かつ機能性が強化された高付加価値な製品の開発を志向した研究である。その成果として，発酵やレトルト処理により，食肉タンパク質は，ミオシ
ン等の主要タンパク質の一部分解を伴う極めて特徴的なゲル形成挙動を示すことや，血圧上昇抑制効果
や筋骨格系細胞の成長といった種々の機能性を発現する可能性を見出している。
これらの成果は，食肉・食肉製品の付加価値向上に寄与し得る基礎的知見であり，学術面のみならず，
産業面においてもその発展に資することが期待される。

© The Ito Foundation

514

今

内

覚

北海道大学大学院獣医学研究院病原制御学分野

准教授〔業績の課題名〕

食肉の生産現場における牛白血病の新たな制御法の開発〔業績の概要（受賞理由）〕
牛白血病は，白血球増加や全身性の悪性リンパ腫を症状とする疾病で，発症すると死に至る。牛白血病の発生原因は，ウイルス性と非ウイルス性に大きく二つに分かれ，このうち牛白血病ウイルスを原因とする牛白血病が，本病のほとんどを占める。牛白血病は平成10年に届出伝染病に指定された当初，全国での発生数は100頭にも満たなかったが，平成29年の発生数は3,383頭（うち607頭は北海道での発生）にも至り，当時の34倍以上も急増している状況である。現在，牛白血病に対する有効なワクチンや治療法はいまだなく，的確な診断法および制御法の開発が求められている。ウイルスが原因となる牛白血病
は地方病型と呼ばれ，主に３歳以上の牛に発生するとされていた。しかし，若齢牛での発症が示唆され始めたことから食肉衛生検査所と共同研究を実施し，これまで否定されていた若齢牛での地方病型白血病が発生していることを報告した。一方，長年の研究にもかかわらずワクチンの実用化に至っていない
牛の難治性疾患，特に免疫抑制状態に陥っていると想定される慢性感染症の宿主免疫機構を明らかにした。すなわち，牛白血病では，ワクチン非働化の機序が免疫抑制因子によるリンパ球の疲弊化であると解明した。この知見により，免疫抑制因子を阻害することでウイルス量を低下させる治療薬の解発にも成功し，今後の牛白血病をはじめとする牛の難治性疾病の新制御法としてなりうることを報告した。本
開発技術の応用がなされれば，休眠状態だった抗原特異的リンパ球の機能回復がなされ，ウイルス感染
細胞の排除が可能となり，牛白血病発症の抑制のみならず，病態進行に伴う乳量の低下や脂肪沈着量などに及ぼす経済的損失の抑制効果にも寄与する。さらに，免疫低下に付随する他の疾患への易感受性状
態からの脱却も図られる。また，本開発技術は，いまだワクチンが成功に至っていない牛の慢性感染症（ヨーネ病，マイコプラズマ症・乳房炎等の経済損失が大きい疾患）にも同様の効果をもたらすと考えられ，北海道をはじめとした日本の生物系特定産業や社会，経済への間接的貢献も期待が大きいと考えられる。

© The Ito Foundation

515

水野谷
九州大学大学院農学研究院

航助教（現所属：麻布大学獣医学部）〔業績の課題名〕

筋繊維タイプの解析技術開発と食肉生産への応用に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
骨格筋は動物体のさまざまな運動に関わる組織である。骨格筋を構成する筋線維には遅筋タイプと速筋タイプが存在し，このタイプ組成により動物の運動能力と代謝能力が左右されることがよく知られている。一方と畜後に肉用家畜の骨格筋は死後変化を経て食肉に変わるが，筋線維タイプ組成は保水性や肉色等に代表される食肉の質にも強い影響を与えることが分かっている。水野谷氏は筋線維タイプ組成を効率的に解析できる手法の開発に努め，筋線維タイプの指標分子であるミオシン重鎖アイソフォーム
を明瞭に分離する電気泳動プロトコルを開発し（Mizunoya et al. Anal Biochem, 2008），次いでミオシ
ン重鎖アイソフォームに特異的に結合する４種の異なるモノクローナル抗体を新規作成し，抗体に直接蛍光標識することで，単一試料で筋線維タイプを可視化できる免疫染色プロトコルの開発にも成功した（Sawano et al. PLOS ONE，2016）。
さらに，上記解析技術を駆使し，食品栄養学的な処理によって筋線維タイプ組成を制御できるか検討してきた。まず，脂肪代謝を促進する寒冷環境下での飼育がラット骨格筋の遅筋タイプを増加することを明らかにした（Mizunoya et al. Anim Sci J, 2008）。さらに，魚油あるいはリンゴポリフェノールを搾取したラットの骨格筋では，それぞれの対照区と比較して，有意に遅筋タイプ側へ筋線維タイプ組成が変化することを明らかにした（Mizunoya et al. PLOS ONE, 2013, 2015）。これらの発見は，筋線維タ
イプ組成は運動によってのみ変化すると考えられていた従来の定説を覆すものである。さらに近年では，遅筋タイプが多い筋組織で脂肪合成系の遺伝子発現が高いこと，蓄積脂肪が多い筋線維は実際は遅筋タイプではなく中間タイプの筋線維であることを見出している（Komiya et al, J Muscle Res Cell M,
2017）。

© The Ito Foundation

学会等事業助成© The Ito Foundation

519

アジア地域の食肉衛生に関するシンポジウムに関する開催報告
公益社団法人日本獣医学会

代表理事

久和

茂（東京大学）〔日時〕平成30年11月22日（木）16：00－18：40〔場所〕国立大学法人東京大学

伊藤国際学術研究センター

本シンポジウムは，公益社団法人日本獣医学会が主催する国際会議「獣医師資格と教育」にアジア諸国，米国，スペインおよび国内の獣医学関係者が参加することに合わせて，そのサテライトシンポジウ
ムとして，一般市民も自由に参加できる公開シンポジウムとして開催した。上記国際会議参加者および一般市民を含めて100名以上が聴講した。以下に，本シンポジウムのプログラムと各講演の概要を報告する。
〔プログラム〕
座長：関崎勉（東京大学・食の安全研究センター）

１．「Beta－agonist Control Project：A Case Study in Thailand（β－アゴニスト制御計画：タイにおけるケーススタディ）」：Prawat Rattanaphumma（Department of Livestock Development, Thailand（タイ政府畜産局）
２．「Helminthic food－borne infection in Japan（日本における食品由来蠕虫症）」：吉田彩子（宮崎大学）
３．
「The outbreak of Trichinella papuae infection in BanRai District, Thailand：Experience of
successful control of the disease（タイ国バンライ地域でのトリヒナ症の集団発生：本病制圧の成功
経験」：Teera Kusolsuk（マヒドル大学（タイ））４．「African swine fever；a great threat to the Asian food security（アフリカ豚コレラ；アジアの食料安全保障に対する重大な脅威）」：津田知幸（KMバイオロジクス）〔講演内容〕
１．「Beta－agonist Control Project：A Case Study in Thailand」
タイ国においては，牛や豚の体重増加を目的としてβ－アゴニスト薬を飼料添加物として給飼することは2001年から禁止されていた。しかし，相変わらずこれを使用する農家が後を絶たず，食肉に残留したβ－アゴニストがヒトの健康に害を及ぼすことが問題となっていた。そこで，2015年から違反した事
例に対しては，３年以下の懲役または60,000タイバーツの罰金を科して，その根絶を目指した。計画は３期に分けて，特定の地域から始め，豚の尿検査を実施してβ－アゴニストが検出された場合には出荷停止措置をとり，懲役または罰金の処分を下した。この作業を次第に他の地域にまで広げ，2017年には，調べた6,207頭のうちわずか68頭（1.09％）が摘発されるにとどまり，撲滅が着実に進んで消費者に安全な食肉を提供できるようになった。
２．「Helminthic food－borne infection in Japan」
幼虫移行症候群は，ヒトを終宿主とせず成虫になれない線虫の幼虫によって起こる典型的な人獣共通© The Ito Foundation

520
感染症である。本症を起こす線虫は多く知られているが，中でもイヌ回虫，ネコ回虫，ブタ回虫によるものが最もよく見られる。ヒトはこれらの寄生虫卵に汚染された土壌がついた食品，野菜，あるいは生または加熱不足の食肉を介して感染する。欧州や北米では，泥遊びを好む子供での症例がよく見られる。
一方，日本では成人男性が生または加熱不足の獣肉やレバーを食べることで発症する。したがって，食用家畜におけるこれら寄生虫による汚染度調査が喫緊の課題となっている。同時に，寄生虫の専門家は
食肉の生食は寄生虫感染のリスクが高いということを市民に伝えなければならない。
３．
「The outbreak of Trichinella papuae infection in BanRai District, Thailand：Experience of
successful control of the disease」
トリヒナ症は，世界中，特に欧州での新興再興感染症である。特に北部タイでは，1962年以来
Trichinella spiralisによる本症が毎年発生している。T. Pseudospiralisによる症例はチュンホン県での１例のみであったが，2006年と2007年にケンマクロッド村などで２件の集団発生があった。患者の生検
組織と血清をマヒドル大学熱帯医学部寄生虫講座で検査し，特異抗体の検出と，生検組織では寄生虫も観察され，遺伝子配列から，T. papuaeと同定された。ケンマクロッド村では，村民に対して保健教育が行われ，小学校では漫画本を使った教育が，大人によりも高い効果を見せた。そこで，保健担当者やマヒドル大学移動クリニックチームが協力して，村長，子供達の保護者，家族などに対してグループミー
ティングを行った。その後，10年後の節目にフォローアップ調査を実施したところ，血液検査陽性者は一人も出なかった。村人へのインタビューやアンケート調査で，野生イノシシ肉の生食と本症との関連への関心が続いていることを確認した。今後も野生動物でのトリヒナ汚染の有無を調査するべきである。
４．「African swine fever；a great threat to the Asian food security」
アフリカ豚コレラは養豚業にとって最も恐ろしい感染症で，直接および間接の強い伝染力，高い致死率を示すだけでなく，ウイルスは豚肉加工品中で長期間活性を保つ。1921年ケニアで報告され，その後，1957年に欧州から東欧やカリブ海諸国，ブラジルに広まったが，イタリア・サルジニア島を除き制圧は成功した。次の発生は，2007年ジョージアから豚と野生イノシシを介して何千キロも離れたロシアに広がった。2018年夏中国での最初の発生報告があってから瞬く間に９つの県に広がった。中国には，世界中の豚の約半数が飼育され消費量も多いことから，本病の発生は食料の安全と確保への影響が大きいだ
けでなく，東南アジア諸国，朝鮮半島，日本への伝播を引き起こしかねない。本病は有効なワクチンがなく，越境性感染症の中でも制圧が難しい疾病である。したがって，清浄地域であり続けることが重要で，豚および野生イノシシ間への侵入防止と発見後は迅速な制圧が求められる。

© The Ito Foundation

521

日本食肉研究会の平成 30 年度事業助成実施報告
日本食肉研究会会長

坂田亮一（麻布大学・明治大学）

１．はじめに
標記の事業の項目として，（公財）伊藤記念財団から今回助成を受けたのは（１）海外派遣事業の補助（国際食肉科学技術会議派遣），および（２）国内における研究会でのセミナーの補助，の２項目である。
（１）の助成は昨年８月に実施され，今年３月に行った（２）の項目まで，実施内容の概要を順次報告するが，初めにこの助成を受けた団体である「日本食肉研究会」の概要について以下に記す。
２．日本食肉研究会等の概要
本会は昭和34年（1959年）４月に発足し，食肉に関する分野について広く学界，業界，団体関係者がお互いの研鑽の場として，学術と産業の発展を目指し，活動を行ってきた。
本会では毎年，研究会大会（学術講演会）の開催，ならびに会誌として「食肉の科学」を発行している（平成３年に「肉の科学」を改称）。研究会は通常，日本畜産学会大会の開催に合わせて春に実施され，食肉および食肉加工に関連する分野のエキスパートによる特別講演，ならびに会員による研究発表を行い，活発な意見交換がなされている。「食肉の科学」の主な内容として，総説，解説，海外事情，
最近の文献紹介，研究会大会の発表要旨などが満載されている。
設立40周年の1999年に横浜で第45回国際食肉科学技術会議（International Congress of Meat Scienceand Technology，通称ICoMST）を開催し，会員相互一体となって運営を行った経緯がある。この国
際会議は毎夏に欧州と他の国々で交互に開催されている。その各国代表者会議での話し合いで，2022年（第68回）にわが国で再び開催する運びとなり（開催地は神戸），このICoMSTの成功に向けて国内受入組織である本研究会は重要な役割を担っている。
今年，研究会創設60周年を迎え，３月30日の大会で記念式典が開催された。ヨーロッパからも招待講演者を迎え，会場となった麻布大学に多くの参加者が詰めかけ，盛大なセレモニーとなった。これらの行事に関しても，日本食肉研究会ホームページで紹介している（http://jmeatsci.org/）。
なお本年３月の研究会総会時点で，正会員174名（うち学生会員４名），特別会員30社，名誉会員９名，賛助会員６社を擁している。
３．今回の助成結果（１）海外派遣事業の補助
国際食肉科学技術会議派遣助成として，第64回会議（2018年オーストラリア開催）に本会から会員３名が参加した。このICoMSTは毎年８月中旬に開催され，本会からは，会長，副会長あるいは常任幹事の中から１名を派遣している。その際，代表者会議に出席し，会議報告を研究会機関誌の「食肉の科学」に掲載し内容を会員に周知することが研究会の中で義務づけられている。2018年は８月12日（日）～17© The Ito Foundation

522
日（金）にメルボルンで開催され，本助成により，有原圭三会員（北里大学獣医学部），若松純一会員（北海道大学農学部）ならびに竹田志郎会員（麻布大学獣医学部）の３名が派遣された。
会場はメルボルンの中心地区にあり，ヤラ川河口に近いGrand Hyatt Hotel（写真１）で行われた。参加者は489名あり（表１），日本からは上記３名以外に松石昌典
副会長（日本獣医生命科学大学），西海理之会員（新潟大学），山之上稔会員（神戸大学），宮口右二（茨城大学），渡邊源哉会員（農研機構）らが参加した（写真写真１ Grand Hyatt Hotel内の会場（64th ICoMST）
表１ 国別参加者数（64th ICoMST）

２）。この会議の詳細は，食肉の科学（2018年２号）中の【海外事情】に報告されている１）。

国・参加者数＊

国・参加者数＊Argentina

１

Netherlands

１

前回の開催地コーク（アイルランド）は遠かったせい

Australia

165

New Zealand31

か，日本からの参加者が例年より少なく，３名だけでBelgium

２

Norway２

あったが，それでもデスクを会場に設置し，2022年日本

Brazil11

Philippines

３

開催のPRに務めた。今回は日本からの参加者が15名あCanada８

Poland４

り，ICoMST2022 in神戸の宣伝を大いに行うことができ

Chile

２

Portugal

１

China

40

Russia２

Costa Rica

１

Serbia１Denmark

９

Singapore

４

Estonia１

South Korea

42

Finland

４

Spain

11

France６

Sweden４

た（写真２）。
会期中は終日，ミートサイエンスに関する多くのセッションで，食肉の産地・飼養条件などの由来，食品の安全 性 と 微 生 物 学 に つ い て の 最 近 の 進 歩 ，生 体 認 証（Biometrics）と官能科学（Sensory science），食肉や副産物の付加価値を増すための技術，食肉の品質を向上さ

Germany

13

Switzerland

１

せるための新技術，肉質に及ぼす糖代謝とタンパク質代

India

１

Taiwan１

謝の影響に関するトピックス，保存性や品質維持のため

Ireland８

Thailand12の包装技術，食肉の栄養的機能と食肉製品における天然

Italy

３

United Kingdom５由来添加物による有用性，オーストラリアにおける豚肉

Japan

15

United States

67の品質保証と安全への取り組み，などをテーマに基調講

Lithuania

１

Uruguay

４

演とディスカッションが展開された。

Mexico２

日本食肉研究会では，2022年の第68回ICoMST開催準備のための情報収集，ならびに情宣活動を行うために，＊同伴者，学生も

含む。

Total

489

昨年にICoMST2022準備委員会から組織員会に移行している。2019年のICoMSTはドイツが担当し，ベ
ルリン・ポツダムで８月に開催される。次回も伊藤記念財団からの派遣事業助成によって参加者は積極的に海外の研究者との学術交流を行い，日本での会議参加のアピールを大いに実施すると期待される。

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523（２）国内における研究会でのセミナーの補助「国際的な食肉研究のトップランナーを海外から招聘し，討論重視型の食肉ワークショップを開催するために，平成28年度から外国人研究者を日本食肉研究会大会に招き，伊藤記念財団から助成を受けこの事業を行っている。その第１回目は，２年前の2017年３月30日に神戸大学国際文化学部で開催された第58回日本食肉研究会大写真２ 日本人参加者集合写真（64th ICoMST）

会 の 中 で 特 別 講 演 と し て ド イ ツ か ら Prof. Schwägele
（Max－Rubner Institute, Kulmbach副所長）を招き，食肉中の微量残留物質の基準と分析法の話題を中心にセミナーを実施した２）。
2018年は東京大学農学部本郷キャンパスで第59回日本
食肉研究会大会にて，トルコ共和国からDr. Abdulatef
Ahhmed（Yıldız Technical University 講 師）を 招 き ，「Accreditation of Halal meat products and thediversity of their protein properties」の 演 題 で ，ハ ラ

写真３ Dr. Hinrichsen（Denmark）の講演

ルと畜の科学的検証，ならびに食肉としての機能性について特別講演が行われた。続いて，韓国のDr. Seon－
Tea Joo（Gyeongsang National University 教 授） に よ
り ，「Health implication of consuming highly marbled
Hanwoo beef」の演題で，韓牛の肉質について講演があり，その脂肪酸組成から機能性に富む肉であることが示され，会場からも和牛との比較についてなど，活発な討論が行われた３）。
2019年は，デンマークからDr. Lars Hinrichsen（Danish
Technological Institute副所長），ならびにスペインから
Dr. Mónica Flores （Instituto de Agroquímica y

写真４ Dr. Flores（Spain）の講演

Tecnología de Alimentos, Valencia）を本助成事業の一環として招聘し，第60回日本食肉研究会記念大会で特別講演を行った（写真３と４，於麻布大学）。Dr.
Hinrichsen は 「The Industrial Meat Revolution － Advanced technology will change operations as weknow it」の演題で，デンマークにおける豚肉解体作業の自動化について動画も交え，最新技術が紹介された。中でもデジタル化とロボット導入での解体，CTスキャンによる肉質判定など，ハイテクによる豚枝肉処理のスピードアップ化に，会場で驚きの声が聞かれた。Dr. Floresは「Aroma of Wet and
Dry Cured Meat Products：Implications of current health trends and natural strategies forenhancement」の演題で，塩漬肉製品，特に乾塩漬ハムなどスペインの伝統的加工品の芳香物質に関して，その成分を詳細に丁寧に調べた結果を公表した。両者の講演要旨は，「食肉の科学」本年第１号に© The Ito Foundation

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も掲載されている。
４．おわりに
伊藤記念財団からの学会・研究会など学術集団への活動助成は今年で３回目となった。私ども招く側も前回の経験で順調に招聘を実施することができた。
日本食肉研究会大会の席上，英語の講演であったが，あえて通訳を入れる必要はなく，演者と参加者でのコ
ミュニケーションは図られた。年々，日本人会員の英語力も向上しており，この助成による成果であると判断する。招聘の人選は今回も国際食肉科学技術会議で各国からの研究者が集うことを利用している。その結果，メルボルンでの第64回会議中に２名の研究者に直接本年３月の日本食肉研究会大会での講演を打診でき，以後の正式依頼に快諾が得られ，招聘がスムースに進んだ。
国際会議参加，食肉研究会への招聘，2022年神戸での図１ 第68回国際食肉科学技術会議神戸開催ポス

ター（英語版）

国際会議開催（図１）を見据えて諸外国のキーパーソンとの交流など，この海外派遣とセミナーの事業助成効果は確実に上がっている。
ここに，助成をいただいた（公財）伊藤記念財団の皆様に心から謝意を表し，引き続き本助成が継続することを日本食肉研究会として願ってやまない。
参考資料１） 松石昌典・有原圭三・若松純一・竹田志郎．2018．海外事情「第64回国際食肉科学技術会議に出席して」食肉の科学．VOL.59 No.２，149～157．
２） 根岸晴夫．2017．日本食肉研究会への平成28年度事業助成実施報告．平成28年度食肉に関する助成研究調査成果
報告書．VOL.35，438～439．
３） 根岸晴夫．2018．日本食肉研究会への平成28年度事業助成実施報告．平成29年度食肉に関する助成研究調査成果
報告書．VOL.36，455～457．

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525

平成 30 年度事業実施報告書
日本畜産学会第 125 回大会 公開シンポジウム「スマート畜産：IoT・人工知能およびロボット技術の利活用」
公益社団法人日本畜産学会

理事長

寺田文典（東北大学）〔日時〕2019年３月28日（木）13：00～16：30〔会場〕麻布大学

百周年記念ホール〔主催〕公益社団法人日本畜産学会〔共催〕日本学術会議

食料科学委員会畜産学分科会・日本畜産学アカデミー〔プログラム〕
司会進行：柏崎直巳（日本学術会議連携会員・麻布大学教授）
開会挨拶：寺田文典（日本畜産学会理事長・東北大学教授）
基調講演

座長：小深壯行（日本学術会議連携会員・日本獣医生命科学大学教授）

講演Ⅰ：「畜産ビッグデータの処理・活用による新しい畜産生産管理システムの展望」
大和田勇人（東京理科大学教授）
講演Ⅱ：「放牧型畜産への利活用：IT技術を活用した高度放牧管理システム」
後藤貴文（鹿児島大学教授）
講演Ⅲ：「ロボット搾乳・ハードナビゲータシステム導入による生産性の向上」
松下寛（株式会社松下牧場代表取締役）
講演Ⅳ：「日本型豚舎洗浄ロボットの開発」
松野更和（農研機構農業技術革新工学研究センター）
講演Ⅴ：「MIJ－カメラを活用した牛肉質自動解析システムの開発」
口田圭吾（帯広畜産大教授）
総合討論

座長：眞鍋昇（日本学術会議第二部会員・大阪国際大学学長補佐

教授）

閉会挨拶：渡邉誠喜（日本畜産学アカデミー会長）〔開催趣旨〕
本シンポジウムは，「スマート畜産：IoT・人工知能およびロボット技術の利活用」をテーマとして，研究者および生産者からの事例報告を中心に，現在，大いに注目を浴びている新たな畜産物生産システ
ムについての議論を行った。とりわけAI・IoT技術の援用による畜産管理システムの現状を踏まえたう
えで，これを有効利用している畜産経営主から生産現場の声をくみ上げることにより，畜産の指導者や生産者への各種関連技術の改善に寄与することが期待された。一方，本シンポジウムが企図している「スマート畜産」による生産システムは，畜産物価格のコスト上昇につながることが懸念されており，
当該増加コスト分は販売価格に上乗せ転嫁されることも考えられるため，消費者の理解醸成を有すると© The Ito Foundation

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ころである。そこで日本畜産学会および日本学術会議が有する公益性を踏まえ，消費者である一般市民の皆様にもご参加いただき，本邦畜産の広報活動を促進することにより，畜産に対する関心とご理解を深めていただくために一般の皆様も参加できる公開シンポジウムとした。
〔講演概略〕
Ｉ：軽労化と生産性向上を目指してロボットやAIを導入することが注目されている中，さまざまなセンサーを導入して畜種の活動や環境を把握することは，スマート畜産におけるデジタル化の第一歩である。これにロボットを組み合わせるとアクティブなセンシングが可能となり，データ収集が加速され，ビッグデータが構築される。さらに，それをAIで解析して効率的な繁殖管理や早期疾病予測が実現できれば，畜産経営に役立つことが期待される。
Ⅱ：現在の畜産が抱えるさまざまな問題～牛舎内での加工型畜産における過度な輸入飼料への依存，高騰する輸入飼料相場や子牛の価格高騰に翻弄される経営困難，循環不可の過剰糞尿処理，BSE等の食の安全，脂肪過多牛肉志向で硬直したマーケット，さらに集約的飼養による動物福祉等～を，放牧IoT技術を開発・導入することで，未利用な山地，中山間地域等の植物資源を省力的・効率的に活用し，低コ
ストで持続的，そして環境保全型の肉用牛生産が構築される。
Ⅲ：非常に注目を集めている搾乳ロボットだが，どんな牛でも完璧に搾乳できるわけでもない。しかし
搾乳ロボットのことを酪農家が理解し，ロボットが高いパフオーマンスを発揮できる環境を作ることにより，乳量の増加や乳房炎の減少をさせることができ，労働力削減やさまざまなデータを集めることも可能である。
Ⅳ：豚舎内の洗浄・消毒は，養豚農家において防疫上不可欠な作業である。その作業時間は農場の管理作業の約1/3にもなるにもかかわらず，洗浄作業そのものは豚の生産工程には含まれず，その重要性は認識しつつも極力手をかけたくない，というところが養豚農家の本音ではないかと思われる。そこで日本型豚舎洗浄ロボットの開発が行われることとなった。
Ⅴ：肉牛の育種改良を効率的に行うためには，牛枝肉の高精度な品質評価が非常に重要である。客観的な肉質評価手法が求められている中，狭い切開面に対応した新しい牛枝肉撮影装置を開発し，撮影と同時の自動解析を実現したので，その概要ならびに利用の可能性を紹介する。
〔参加者数〕468名
学会員の畜産学関連研究者，畜産農家の他，IoT・人工知能およびロボット関連の民間企業の技術者・研究者や畜産関連団体・行政関係からも多数（非学会員：156名）ご参加いただいた。このように，畜産分野へもIoT・人工知能およびロボットを利活用しようとすることへの関心の高さから，本シンポジ
ウムの内容が幅広く受け入れられたと考えられる。

© The Ito Foundation食肉に関する助成研究調査成果報告書
Final Reports for Research Grants for Meat and Meat Products

平成30年度（Vol. 37）
2019年11月

発行

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