平成 29 年度 循環医学分野 一般研究助成 研究成果報告書

重症⼼不全に対する iPS 臨床応⽤へ向けた未分化細胞除去技術の新規開発

増田茂夫
大阪大学大学院医学系研究科 心臓血管外科【研究の背景】
Bromodomain and extraterminal（BET）タンパクファミリーは BRD2, BRD3, BRD4, BRDT からなり、RNA polymerase II による転写制御に深く関わっている。Bromodomain を介してヒストンテイルのアセチル化リジン残基を認識し（＝Epigeneticreader）、アセチル化クロマチンへ転写制御複合体をリクルートする。低分子化合物 JQ1 のような BET 阻害剤は癌や炎症における治療的役割が認められている（Nature. 2010; 468: 1067-73）（Cell. 2011; 146: 904-17）。特に、BRD4 は幾つかの癌腫で c-Myc, NK-κB, Nanog の発現を制御するといわれ、これは Super-enhancer への BRD4 結合による。Cell context により異なるが、ヒト iPS 細胞においても Super-enhancer を介した JQ1 による Nanog, Oct4 制御が想定され、未分化細胞除去への応用が考えられる。
これまでヒト iPS 細胞由来の未分化細胞（＝奇形腫形成能を有する細胞）を除去する方法は幾つか報告されてきた（筆者原図<Nature Rev Cardiol, 2014>）。しかし、臨床応用するに際して臨床グレードの薬剤であるか、有効性は充分であるか、大量の細胞を現実的に処理可能であるか、などクリアーすべき課題が山積していた。
●Table (筆者原図 <Nature Rev Cardiol, 2014>)【⽬的】

本研究では iPS 細胞由来の未分化細胞を除去することを目的として、分子標的薬剤である BET 阻害剤などを用いた除去法を検討した。

【⽅法と結果】

今回、我々のスクリーニングの結果、ヒト iPS 細胞の増殖を特異的に抑制することが判明した。すなわち、ヒト iPS 細胞（253G1細胞）を BET 阻害剤である JQ1 で処理したところ、1μM, 96hrでほぼ完全に iPS 細胞が死滅することが観察された。この傾向は他のヒト iPS 細胞株でも同様に確認された。
次に、ヒト iPS 細胞由来の心筋細胞を対象に、JQ1 処理によって in vitro で残存未分化細胞が除去可能か否かを調べた。まず未分化マーカーTRA-1-60 を FACS で解析した結果、未処理群では陽性率 0.4％に対し、JQ1 処理群では同 0.3％であった。
さらに未分化マーカーLin28 の発現を定量した結果（ヒト iPS 細206

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胞を 100％として）、未処理群では 0.62％に対し、JQ1 処理群では同 0.09％まで低下した。
JQ1 による遺伝子発現の変化を調べる目的で、iPS 細胞を対象に JQ1 処理前後の多能性関連マーカーを定量したところ、Nanog, Oct4 発現が（JQ1 濃度依存性、時間依存性に）減弱していることも確認された。すなわち、少なくともヒト iPS 細胞においては JQ1 は Nanog 阻害剤、Oct4 阻害剤として機能することが示唆された。
なお、JQ1 処理によって、iPS 細胞由来心筋細胞の拍動や心筋マーカー（cTnT）に変化を来しておらず、大きな adverseeffects をもたらすことは無かった。
以上、BET 阻害剤 JQ1 により、iPS 細胞由来の残存未分化細胞を効率的に除去できることが判明した。
これまで iPS 細胞由来の未分化細胞を除去する方法として、分子標的薬剤である BET 阻害剤や抗 CD30 抗体結合薬剤を用いた手法を各々開発してきたが、次に、これらを組み合わせることで相加・相乗効果が得られるか否かを検討した。
ヒト iPS 細胞由来心筋細胞を対象に、未処理群、1 剤処理群、2 剤処理群をそれぞれ用意し、残存未分化細胞を TRA-1-60による FACS 解析で評価した。その結果、TRA-1-60 陽性率が未処理群では 0.3％に対し、2 剤処理群では（検出限界として知られる）0.1％まで低下することが判明した。
以上より、より高い安全性を目指した未分化細胞除去法として、分子標的薬剤を用いた新規手法を組み合わせる dual
therapeutic method が奏功する可能性が示唆された。
次に、さらに未分化細胞除去効果に関し、より深い効果を目指して分子標的阻害剤のスクリーニングを行った結果、CDK阻害剤（CDK9 or CDK1 阻害剤）が BET 阻害剤（Nanog 阻害剤）と共に相乗効果を呈することを見出した。具体的には、転写 complex P-TEFb を形成する BRD4 と CDK9 を同時に阻害したところ、未分化細胞除去において相乗効果を呈した（BET阻害剤＋CDK9 阻害剤）。しかし、CDK9 阻害剤（Flavopiridol）は、ヒト iPS 細胞において多能性関連遺伝子（Nanog, Oct4,c-Myc）の発現を抑制しなかった。同様に BET 阻害剤＋CDK1阻害剤でも未分化細胞除去に関して相乗効果を確認した。

【考察】

残存未分化細胞を除去して造腫瘍性を回避する観点から、複数の分子標的阻害剤を併用する利点が示唆された。
単剤と比較し、低用量の併用で相乗効果が得られることから、side effect の軽減につながると期待される。
本研究で使用された分子標的阻害剤は種々の癌で Phase II試験施行中であり、今後、“ヒト iPS 細胞”を対象とした分子標的治療薬としての可能性が示唆された。

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平成 29 年度 循環医学分野 一般研究助成 研究成果報告書【臨床的意義・臨床への貢献度】
本研究では、iPS 細胞から心筋細胞を分化誘導する系において、未分化細胞除去を施行したが、理論的には他のあらゆる細胞種を対象とした iPS 臨床で応用可能と考えられる。すなわち iPS 心筋固有の事象に留まらず、極めて臨床的応用範囲の広い発展性・貢献度を有すると思われる。
●謝辞
下記の先生方にはこの場を借りて深謝致します。
・京都大学 CiRA：山中伸弥先生、吉田善紀先生
・東京女子医大：清水達也先生、松浦勝久先生
・国立医薬品食品衛生研究所：佐藤陽治先生
・大阪大学：紀ノ岡正博先生【参考・引⽤⽂献】
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