2-8 生物の環境適応機構の解明●代表者

澤田博司（生命科学科・教授）●分担者

間瀬啓介（生命科学科・教授）
外川徹（生命科学科・准教授）

井上みずき（生命科学科・准教授）【研究の目的および概要】
本研究は，生物の環境適応機構を多様な生物現象から明らかにすることを目的としている。
具体的に本年度は，以下の 4 つの目的で研究を遂行した。
1．カイコの卵休眠は，環境条件の悪化の結果やむをえず発育を休止する休眠ではなく，不良環境が訪れる以前の生育にとって不都合のない環境のもとで感受し記憶され次世代の卵で実行される。この休眠の分子機構を解明するために，初期発生や胚子活性化に密接に関わる遺伝子の構造や発現などの解析，またその遺伝子産物の機能や機能発現の調節機構などを明らかにする。
2．絹糸虫類が外敵から身を守る一手段として繭の多様な緑色化によるカモフラージュがあり，複数の遺伝子が制御している。この複雑な形質の発現様式を解明するために，カイコガの緑繭系統やその染色体置換系統をはじめとした研究素材とゲノム情報を用い，それらの原因遺伝子の同定と機能解明を行う。
3．昆虫の体表面を覆うクチクラは，種・発生段階・体の部位により物理的性質が異なり，昆虫の様々な環境への適応を可能にしている。このクチクラ多様性の分子メカニズムを理解するために，クチクラの 2 つの主要構成成分であるクチクラタンパク質ファミリーとキチンに注目し，両者の相互作用の多様性を解明する。
4. 植物の送粉成功は地域生態系の媒介昆虫の種組成や個体数によって左右される。そこで，地域の植物相を明らかにするとともに訪花昆虫の体表についている花粉の種組成を明らかにすることで，植物への忠実度を測定する。
これらの技術を用いて，植物と昆虫の交互作用系を明らかにする。
【研究の結果】
1. 浸酸処理時におけるカイコのカルシニューリン調節サブユニット（BmCalR）に着目し，BmCalR 遺伝子の発現，リコンビナント BmCalR（rBmCalR）の調製と抗 rBmCal 抗体の作製，rBmCal と Ca2+ との結合実験などを引き続き行った。浸酸処理した休眠卵で BmCalR 遺伝子の発現は 浸酸処理直後から認められた。一方，抗 rBmCalR 抗血清が得られたので，免疫組織化学的観察を行った結果，休眠卵と浸酸処理卵では，漿膜細胞と卵黄細胞の核周辺部に BmCalR の特異的な局在が確認出来た。
2. ゲノム編集技術の一つである TALEN を導入するにあたり，既に同方法による証明がなされている緑繭化遺伝子
P5CR1 の遺伝子破壊を試みた。今回は，F1 卵の利用とインジェクション後の処理方法を改善したことで，大幅に孵化率を高めることができた。さらに，成長した G0 個体を戻し交配して G1 卵を得，孵化した数個体からゲノムDNA を調整し破壊領域を調べたところ，目的の領域が欠失していると思われる結果が得られた。一方，糖輸送関連遺伝子については，多くが蛹期において致死してしまった。
3. クチクラタンパク質最大のグループである CPR は 2 つのサブグループ（RR1 と RR2）に分けられる。それぞれのグループに属するタンパク質の組換えタンパク質を大腸菌内で合成し，それらのキチン結合性を比較した。その結果，RR2 に比べ RR1 タンパク質はキチンに対して比較的高い結合性をもつことが明らかになった。一方，RR2は Ni イオンに対し親和性をもつという意外な結果が得られた。
4. 下層植生がシカにより劣化した森林では，シカの忌避植物であるトリカブトおよび柵で守られたアシウアザミ，急斜面上に残されたアキチョウジのみが秋に開花している。こうした花に送粉しているトラマルハナバチのアレ

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リックリッチネスは 8.45 であった。
【研究の考察・反省】
1. 浸酸刺激により誘導される BmCalR は，浸酸処理により遊離した Ca2+ が BmCalR に結合することにより触媒サブユニットのフォスファターゼとしての機能を制御し，最終的に休眠移行を阻害する因子を制御しているのではな
いかと考えられる。反省点としては，今回の rBmCalR は，大腸菌内で封入体となってしまったので，可溶化剤存在下で精製する事になった。そのため得られた rBmCalR は，抗体作製用や Ca2+ との結合能解析には使用できたが，それ以外の機能解析を行う場合，rBmCalR を可溶化状態で発現させることが今後の課題の一つである。
2. 今回，笹繭を緑繭化する P5CR1 遺伝子が破壊されたと思われる G0 個体をいくつか作出することができた。今後，この個体を元に系統化を進め，形質への影響を調べていく予定である。一方，糖輸送体遺伝子の破壊実験においては，蛹期特異的に致死させる作用があったとも考えられることから，その検証をするとともに，破壊する領域を変更して再度試みる予定である。
3. 構造的特徴の異なる CPR タンパク質のキチン結合性が大きく異なっていたことから，このことがクチクラの多様性に大きく寄与している可能性が考えられる。加えて，キチンには低い結合性を示した RR2 タンパク質は，Niイオンに対して親和性を示したことから RR2 は RR1 とは異なる機能をもつ可能性が考えられる。
4. 2007 年のアレリックリッチネスは 8.64 であることから，15 年以上経過してもトラマルハナバチの遺伝的多様性は保たれていることが明らかとなった。
【研究発表】
Function of a mitochondrial phosphatase, PTPMT1, that is preferentially expressed in corpora allata in Bombyx mori.
The 2021 International Insect Hormone Virtual Workshop（on line; Jun 30, 2021）
CPR クチクラタンパク質サブファミリー間のキチン結合性の比較 .
日本動物学会第 92 回米子大会，2021 年 9 月 2 日／ WEB 開催
幼若ホルモン誘導性転写因子 hairy の組織による誘導性の比較 .
日本動物学会第 92 回米子大会，2021 年 9 月 2 日／ WEB 開催
糖輸送体に着目したカイコ笹繭関連遺伝子 Ga の探索 .
第 6 回蚕糸・昆虫機能利用関東地区学術講演会，2021 年 11 月 6 日／ WEB 開催
緑繭化遺伝子 P5CR1 発現異常の原因解明 .
第 6 回蚕糸・昆虫機能利用関東地区学術講演会，2021 年 11 月 6 日／ WEB 開催
トリプトファン系生体色素オモクロームの薬理効果の探索 .
日本トリプトファン研究会第 40 回学術集会，2022 年 2 月 26 日／ WEB 開催【研究成果物】
Molecular characterization and tissue distribution of calcineurin regulatory B subunit during the prevention of diapause in35

the silkworm, Bombyx mori.
Zoological Science, Vol.38, No.4, 305-310, 2021. DOI: https://doi.org/10.2108/zs200147
The mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for the proper growth rate in the red flour beetle Triboliumcastaneum.
Zoological Science,（in press）DOI: https://doi.org/10.2108/zs210092ツヤケシオオゴミムシダマシの密度に依存した変態ではエクジステロイド量の調節が中心的な役割を担う．
比較内分泌学，47（174），e0008, 2021.

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