レーザーイオン化質量分析計（Bruker REFLEXTM MALDI-TOF MS）

薬学部

生化学研究室 三隅将吾；内線 4367

§１ はじめに生体高分子は，難揮発性であるため，気相にイオン化するイオン化法の開発が難しく，ようやく1980年代になってタンパク質や核酸等をイオン化できる，いわゆるソフトイオン化法が実用化されてきた．これらのうち高速原子衝撃（fast atom bombardment; FAB）法，エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization; ESI）法，マトリックスアシステッドレーザー励起イオン化（matrix - assisted laser desorption ionization; MALDI）法等が，現在広く用いられている．基本的には，各々のイオン化によって生成したイオンは，どの質量分析法でも分離可能であるが，相性があるため，各々のイオン化法に適した質量分析計との組み合わせによって用いられることになる．
ここでは，Bruker REFLEXTM Matrix - Assisted Laser Desorption Time - of - Flight MassSpectrometer ( MALDI - TOF MS )について述べる。
§２ 原理
MALDI-TOF MS①イオン化法--②質量分析計---MALDI法TOF MS①Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization（MALDI）法について
MALDI法では，イオン化のためにマトリックスを用います．（表１参照）
マトリックスはサンプルと同じ溶媒に溶け，かつ溶媒の蒸発とともにサンプル分子を取り込みながら結晶化します．さらに，使用するレーザーの波長に対して吸収を持ち，サンプルをイオン化させます．サンプルのイオン化には，マトリックスがまずレーザー光の照射を受けて，励起状態となり，次にその励起状態のマトリックスから得られるエネルギーによりサンプルが蒸発し，最終的にプロトン移動によってサンプルは，イオン化されます．（図１参照）-94-

Ionization
SamplePulsed Laser
337 nmMatrixLaser exposedmatrix

Probe Tip

図１

MALDI法イオン化概念図

MatrixSinapinic acid (SA)MW 224.07

Application

StructureCH=CHCOOH・Peptides
・Proteins

CH3O

OCH3OH

Alpha-cyano-4hydroxy cinnamic
acid (CCA)
MW 189.04

CH=C(CN)COOH

・Peptides
・ProteinsOH

2,5-dihydroxybenzo
ic acid (DHB)
MW 224.07

COOH

・Peptides
・Carbohydrates
・Glycolipids
・Polar synthetic polymers

OHHO
表１

代表的なマトリックス②Time-of-Flight (TOF) MSについてイオン化したサンプルは，加速電圧によって運動エネルギーを与えられ，高真空のフライトチューブ内で自由飛行を始めます．フライトチューブ内の反対側にはディ-95-

テクターが設置されています．このディテクターに分子量の低い分子が早く到達し，高い分子は後から到達することで分離が行われ，ディテクターまでの時間を測定することでその分子の分子量が決定できます．（図２参照）
N2 Laser
337 nm 5ns
Flight tube
High vacuum

P1P2
Ion Lens
グリッド

Deflectorr

Detector

Detecto

図２ TOF MSの概略§３ 理論
加速領域内に存在する質量m（amu）のz価イオンは一定加速電圧 V（volt）の電場強度により加速エネルギー（zeV）を与えられる．場の存在しない自由飛行領域に入射されたイオンのもつ運動エネルギーは加速エネルギーと等しいので式（１）が成立
し，この式（１）よりイオンの速度v（m/sec）は式（２）で表される．
mUv2/2=zeV（１）
1/2
v=(2zeV/mU)（２）
したがって，イオンが距離 L (m)（L=X1+X2）を飛行する時間 t（sec )はt=L/v（３）であるので，式（２），（３）より基本式である式（４）が導かれる．
m/z=2eV(t/L)2/U（４）
通常，TOF MSにおいて加速電圧 Vと飛行距離 Lは一定であるので，式（４）は次のようにあらわすことができる．
m/z=Kt2（５）282K=2eV/UL =1.929 x 10 V/L
e: 電子の電荷【e=1.602 x 10-19 (c)】U: 原子質量単位（atomic mass unit : amu）
【U=1.6605 x 10-27 (kg)】すなわち，イオンの質量（m/z）は飛行時間（ｔ）の２乗に比例することがわかる．
したがって，実際の測定においては式（６）における係数aとbを既知の試料を用いたキャリブレーションにより求めておき，未知試料のイオンの飛行時間を質量数に換算する．
m=at2+b（６）a, b : 定数-96-

Acceleration
Voltage

Length (X1)
Flight Time (t1)Length (X2)
Flight Time (t2)Acceleration
RegionFree-FlightRegion

DetecterTarget

図３ TOF MSの概念図
キャリブレーション: Matrix - Assisted Laser Desorption Ionization Time - of - Flight Mass
Spectrometer （Model Reflex）では，Calibrantを用いることで未知試料の真のMassを測定します．実際には，CalibrantをTA buffer（0.1%TFA/acetonitril (2:1)）で1〜10 pmol/µlに調製後，未知試料と1:1で混合し，更にその混合溶液とMatrixを1:1で混合したものを測定することで真のMassを得ます．以下に推定される分子量と選択すべきCalibrantを示します．
分子量選択す べ き Calibrant

Mw<5000

Angiotensin II human, Substance P , ACTH(18-39), Insulin Bovine

5000<Mw<10000

Insulin Bovine, Ubiquitin, Cytochrome C horse

10000<Mw<60000 Cytochrome C horse, Myoglobin horse, Trypsin bovine, BSA
60000<Mw

BSA, BSA-dimer
表２

代表的なCalibrant

平均分子量[M+H]+[M+2H]++

Angiotensin II human1046.192

1047.200-

Substance P

1347.728

1348.736-ACTH(18-39)

2465.720

2466.728-Insulin Bovine

5733.549

5734.557

2867.728

Ubiquitin

8564.835

8565.843

4283.425

Cytochrome C horse

12360.080

12361.088

6181.048

Myoglobin horse16951.457

16952.465

8476.736

Trypsin bovine

23311.53

23312.5411656.77

BSA

66430

66431

33216

BSA-dimer

13285813285966430

Calibrants

表３

代表的なCalibrantの[M+H]+および[M+2H]++-97-§４ 方法サンプル調整法: サンプル（ 蛋白質）は，Pharmasia BiotechのResourceTMRPC等のHPLCカラムで脱塩されることをお奨めいたします．以下にサンプルの調製時に可能な限り除去すべきものを示します．
不揮発性物質Salts （e.g. NaCl, CaCl2, KH2PO4）
Detergent （e.g. Tween, Triton, SDS）
Chaotropic agent （e.g. Urea, Guanidinium salts）
solvent （e.g. DMSO, Glycerol）
これらの物質が測定サンプル中に混合していた場合には，正確な分子量が得られない，もしくはシグナルを得られないこともあります．たとえば，①サンプル中に多量の塩が混入していた場合（溶媒がNaCl溶液），その塩とサンプルがクラスターを形成してMass peakが非常にブロードになり良い結果が得られない，またはシグナルが得られなくなる（イオン化が妨げられる）可能性があります．
②不揮発性の溶媒（DMSO）を使用した場合，測定用の結晶を形成することができません．
サンプル量:分子量 a)

測定試料の濃度 b)

Matrix c )Mw<5000

1~2 pmol/µl

CCA

5000<Mw<10000

2~3 pmol/µl

CCA, DHB

10000<Mw<60000

3~5 pmol/µl

SA, DHB60000<Mw<5 pmol/µl

SA, DHB

表４

測定試料の分子量と選択すべきMatrix<注意事項>
a) 測定試料の分子量b) 測定試料の濃度とは，最終的にMatrixと混合する直前のサンプル溶液の濃度をいいます．
①凍結乾燥品の場合
TA bufferで表４の濃度に調製する．
②溶液の場合
表４の濃度にTA bufferで希釈する。

-98-

③Internal calibrationをする場合
上記の2倍程度の濃度の測定試料にinternal calibration溶液を等量加え調製する．
･ TA buffer: 0.1 % trifluoroacetic acid in water/acetonitrile (2:1)．
･ Internal calibration溶液: 測定するサンプルの推定分子量に近いCalibrantを表２より選択し、そのCalibrantをTA bufferで1~10 pmol/µlに調製したもの．
c) サンプルの推定される分子量に応じてMatrixを選択する．
<略号説明>
CCA: Alpha-cyano-4-hydroxy cinnamic acid
SA: Sinapic acid
DHB: 2,5-dihydroxybenzoic acid
測定概要:
●MatrixとしてSA, CCAを用いる場合
1) サンプルをTA bufferで適切な濃度の測定試料として調製する．（表４参照）
2) TA bufferに飽和させておいたMatrix溶液と測定溶液とを1:1で混合する．
3) Matrix溶液と測定溶液の混合溶液1~2µlをprobe tip上にのせ真空乾燥させる（SAのみ）．
4) Microscopeでサンプルの状態を観察する．
5) Probe tipをセットし、測定する．
Matrix溶液と測定試料の混合溶液の乾燥操作法
Matrix乾燥操作
CCA
測定溶液をMatrix溶液と混合後、常圧室温で乾燥する．
SA
測定溶液をMatrix溶液と混合後、真空乾燥させる．
●MatrixとしてDHBを用いる場合
1) サンプルをTA bufferで適切な濃度の測定溶液として調製する．（表４参照）
2) DHBを10mg/mlになるように20 % ethanolに溶解する．
3) 1µlのDHB溶液と3µlの測定溶液を混合する。
4) DHB溶液と測定溶液の混合溶液1µlをprobe tip上にのせる。
5) Hair dryerですばやく乾燥させる。
6) Microscopeでサンプルの状態を観察する。
7) Probe tipをセットし、測定する。
Matrix溶液と測定試料の混合溶液の乾燥操作法
Matrix
乾燥操作
DHB
SampleをMatrixと混合後、Hair dryerですばやく乾燥させる．

-99-

600

[M+Na]

500

1506.021490.50

a.i.

+

AEAMSQVTNTATIM[M+K] +4003002001000500

1000

1500

2000

2500

3000

3500m/z

図４ MALDI-TOF MSによる測定例
HIV-1 内因性プロテアーゼインヒビターp2gag peptideの検出（マトリックスとしてCCAを使用）
Shoji, S., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1997) in press.
§５ 仕様
Bruker REFLEXTM Matrix-Assisted Laser Desorption Time-of-Flight Mass Spectrometer(MALDI-TOF MS)の仕様を以下に示す．
機種: Bruker REFLEXTM Matrix-Assisted Laser Desorption
Time-of-Flight Mass Spectrometer
反射型MALDI-TOF: 総飛行距離 165 cm，グリッドレスイオンリフレクター，正/負イオン測定，最大加速電圧 30kV
サンプル導入: SCOUT 26サンプルターゲット，コンピュータコント
ロールX-Yステージ，CCDカメラによるターゲットモニ
ター
データ処理システム: SUN，17インチカラーモニター，XMASSソフトウェアー，
UNIXソフトウェアー
データアクイジション : 1GHz デジタイザ§６．利用上の注意事項①タンパク質試料溶液は，一般に無機塩を含んでいるが，質量分析計による測定では脱塩した試料を用いた方が，良いスペクトルを得ることができる．
②レーザーのパワーは，スペクトルの質を決定する重要なパラメーターである．パワーを上げれば上げるほど初期運動エネルギーのバラツキが大きくなり，精度が低下する．逆にあまりパワーを下げてしまうと，検出に十分なイオンを得ることができな
い．良いスペクトルを得るためには，目的のタンパク質がイオン化する最低強度の-100-

レーザーパワーを見つけることが重要である．
③スペクトルの質は，マトリックス分子の結晶構造がうまくできているかどうかに大きく依存する．一般的に，無機塩やグリセロールを含む試料や，界面活性剤や高濃度の尿素，TFAなど，タンパク質の変性剤や可溶化剤に溶解した試料では，マトリックスの結晶がうまくできず，良いスペクトルを得ることは難しい．
④MALDI法では次の場合にイオン化されやすい．
1) 分子量小>大2) 疎水性大>小（分子量が同程度なら）3) 正電荷の数
大>小（プラスイオンを検出するポジティブモードの場合）
MALDI法でのイオン化を規定している因子や機構は十分に明らかになっていないので，ここにあげたパラメータ以外にも未知のパラメータが関係していると考えられる．
§７

応用例①アミノ酸配列分析法
MALDI-TOF MSは，磁場型のMSに比べると分解能の点で劣っていたため，高分解能を保つためにそれなりの測定技術を要していたが，近年この問題を大幅に改善する
Delayed Extractionが開発され，MALDI-TOF MSをもちいたアミノ酸配列分析法は飛躍的に進歩した．このDelayed Extractionとリフレクターを用いることにより，フラグメントイオンを分離する『MS/MS』としての機能を重視されるようになった．タンパク質のアミノ酸配列分析法としては，PSD法，CID法，酵素を用いたアミノ酸配列決定法等がある．
●Post source decay(PSD)-Low energy collision法
分子がイオン化されることによりもつ過剰エネルギーを使いPost-source decay（PSD）を起こします．これは分子が飛行中にメタステーブルディケイを起こしフラグメントイオンが生成するものです．ここで生成したフラグメントイオンをリフレクターのポテンシャルを変化させること（Vrefを30 kVから徐々に下げていく）によりMassをセレクトし，異なる分子量のイオンを選択的に測定します．その後，Massをキャリブレーションし一つのスペクトルとして表し（図６参照），そのフラグメントパターンからシーケンスを解析する方法です．はじめに余分な分子（マトリックスや２価イオン）をディフレクターのパルス電場によりカットして測定分子だけをフライトチューブ側に導いて測定を開始します．リフレクターのポテンシャルを数段階ステップさせ測定を開始します．最後にキャリブレーションを行い一つのスペクトルにして結果となります．

-101-

▲
▲

Reflector
Reduced(Vref=13.5kV)m/z▲
Reflector
Reduced(Vref=27.5kV)▲▲
Reflector
ON (Vref=30kV)

m/z

▲

図５m/z

PSDの概念図

リフレクターのポテンシャルを数段階ステップさせ得られたスペクトルの合成m/z

PSDによって得られたスペクトルの合成
A sn

Ly s

N - Myr - Gly

Se r

4 69 .39

261.2 32 6 8 .3 5211 .30

147 .26

1 74.1 5A sn

8 7.19101 .08

60.5 530 .04

7000

Ly s

Ser

6 15 .95

N- M yr - Gly
a . i.

32 7.3 1
3 48.0 2
3 56.3 6

図６6000

5000

y "2

N - M yr -4000

I33000I2

b1y "3a2y "12000

b2
X "31000

I1b3I4010 0

図７200

3 00

40 0

500

600 m/ z

PSD法によって得られたN-Myr-GSNK peptideのアミノ酸配列-102-●Collision induced dissociation(CID)-High energy collision法
衝突活性化により起こるイオンの分解によって生じるフラグメントイオンを，リフレクターで分離してスペクトルを測定する方法．High energy collisionであるためPSDでは生じないフラグメントイオンも積極的に検出できる．具体的にはLeuとIleの違いを質量分析的に決定できるばかりか，翻訳時/後修飾タンパク質の修飾部位周辺構造をより明確にできる．基本的にはフラグメントイオンの分離方法は，PSD法と同じであるが，サンプルプレート上でイオン化された分子イオンにアルゴンなどの不活性ガスを吹き付けることにより，分子イオンを不活性ガスに衝突させ，分子イオンのフラグメントイオンを積極的に生じさせる点がPSD法と異なる．
M+

m1 +M+

m1' + + m2' + + m3' ++m2 ++m3 +PSDにより生じるフラグメントイオン

CIDにより生じるフラグメントイオン

PSDでは生じないフラグメントイオンも積極的に検出できる。

メタステーブル分解では生じない分解を起こすことができる．

N 2 Laser
337 nm 5nsDeflector

F1' +P+N F 2' +CID

Detector

FastFilter
P1P2グリッド

Ion Lens
Detector

図８

CIDの概念図●酵素を用いたアミノ酸配列決定法
目的のペプチドのN末端またはC末端のアミノ酸が１つずつ欠損したラダー状の反応混合物を調製し，これをMALDI-TOF MSで測定して，各ピークの質量差から相当するアミノ酸を同定する．このラダー状の混合物を調製するには，カルボキシペプチター
ゼやアミノペプチターゼで目的のペプチドを消化する方法などがある．

-103-

V

T

N

T

A

T

I

V

T

N

T

A

T

I

V

T

N

T

A

T

V

T

N

T

A

V

T

N

T

V

T

N

V

T

M

Vシグナル
強度

800

1489.181505.631246.26a.i.

m/z
酵素を用いたアミノ酸配列決定法の概念図（カルボキシペプチターゼの場合）1359.37

図９IleMet600

AEAMSQVTNTATIM
4000 min200020 min-2001200

図１０1300

1400

1500

1600m/zHIV-1 p2gag peptide（AEAMSQVTNTATIM）のカルボキシペプチターゼYを用いたC末端アミノ酸配列分析（カルボキシペプチターゼYを用いて20分間酵素反応後，MALDI-TOF MSを用いてC末端のアミノ酸配列を決定した例）-104-

②MALDI-TOF M Sを用いた翻訳時・後修飾の解析
多くのタンパク質は，その分子自体の細胞内での発現量や合成，分解速度だけでなく，脂肪酸やリン酸，糖鎖の付加や脱離等の翻訳時・後修飾によってもその活性や機能が調節されている．したがって，一般にタンパク質の構造と機能，相互作用を知るためには，の翻訳時・後修飾の解析が必要である．その一例として，ここに翻訳時修飾であるタンパク質のミリストイル化の解析法を示す．

StrategyProtein

Direct Analyses

N-Myristoylation[M+H] +

Co-translational modification
NH 2- Gly- Protein[M+2H] 2+

CH 3 -(CH 2 ) 12 -CONH-Gly-Proteinm/z

N -Myristoyl transferase

Digested Analyses

Peptide N-Fattyacylase等
N -Myristoylated ProteinscAMP-dependent protein kinase catalytic subunit
RSV src -gene product: pp60 v- src
c- src -oncogene

product: pp60 c- src

Sequence Analyses
AnBn

CnCHCONH

CH

HIV-1 p17 gag protein
RnHIV-1 p27 nef protein

図１１Xn

Yn

Rn+Zn
1MALDI-TOF MSを用いたタンパク質ミリストイル化解析法のStrategy●アミノ末端ミリストイル化タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列の化学的同定法1982年，仔牛心筋由来cAMP-dependent protein kinase触媒サブユニットの全一次構造決定の際，タンパク質のアミノ末端に炭素数14の長鎖飽和脂肪酸であるミリスチン酸が酸アミド結合を介して共有結合していることが庄司により見いだされて以来，今日までに種々のアミノ末端ミリストイル化タンパク質が報告されている（図１１参照）．
タ ンパ ク 質 の アミ ノ 末 端ミ リ ス ト イル 化 は ， 細胞 内 に 存在 す る N-myristoyltransferaseによって触媒され，ミリストイル基供与体であるmyristoyl-CoAから，ミリストイル基がタンパク質のアミノ末端Gly残基へ酸アミド結合を介して翻訳時に転移されると考えられている．
これまで，種々のアミノ末端ミリストイル化タンパク質のアミノ末端配列がcDNAから推定されているが，これらアミノ末端ミリストイル化タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列を直接化学的に同定する方法は確立されていなかった．そこでここに免疫学的手法およびペパーテクノロジーを駆使し，MALDI-TOF MSを用いたアミノ末端ミリストイル化タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列の化学的同定法をここに述べる．

-105-

①ミリストイル化タンパク質の同定及び分離

60.0 kDa

pI 6.0
1st antibody: Sheep anti c-src polyclonal antibody
2nd antibody: AP Rabbit anti Sheep FC SP HRP

106.0 kDa
80.0 kDa

60.0 kDa
49.5 kDa

acidicbasic
pI 6.0
Staining: Coomassie brilliant blue G-250
図１２ Immunoblotting Analysis after Two-Dimensional E l e c t r o p h o r e s i s（ 上 : Sheep anti c-src polyclonal antibody を 用 い た N-Myr-pp60c- src の 同 定 ， 下 :Coomassie brilliant blue G-250を用いたN-Myr-pp60c-srcの検出）-106-ヒト結腸腺癌細胞COLO320DMのcell lysateを二次元電気泳動後，ブロッティングを行い，一次抗体としてSheep anti c-src polyclonal antibodyを用いてwestern immunoblottinganalysisを行ったところ等電点6.0に分子量60kDaの N-Myr-pp60c-srcを同定することができた（図１２上）．次に，N-Myr-pp60c-srcのアミノ末端アミノ酸配列を決定するために先程と同様 に二次元電気泳動 後，ブロッティン グを行い，Coomassie brilliant blue
G-250で染色し，N-Myr-pp60c- src に相当する部分を切り取り，そのPVDF膜をtrypsin消化後，90 % EtOHを用いて12時間振とうし，得られた膜を0.1 % TFAを含む30 % アセ
トニトリルを加え，10分間超音波処理した溶液をHPLC（column: PICO・TAG column，A buffer: 30 % CH3CN containing 0.1 % TFA，B buffer: 80 % CH3CN containing 0.1 % TFA，
Gradient: 0→100 % B, 30 min）で分離しMALDI-TOF MSで分析する．
②アミノ末端ミリストイル化ペプチドの同定
a.i.
1800

N-Myr-GSNK[M+H] +

1600
1400

615.81

1200
1000
800
600

1047.20400
200
0100200

300

400

500

600

700

8009001000 1100 1200m/z

図１３ N-Myr-pp60c-src由来N-Myr-GSNK peptideの同定

Shoji, S., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2 1 7:632-639 (1995)①で得られたHPLCのフラクション（retention time 18 min）をMALDI-TOF MSで分析したところ，N-Myr-pp60c-src のアミノ末端tetrapeptideであるN-Myr-GSNK peptideを同定することができた．また確認のために，このHPLCフラクションを凍結乾燥後，ミリス トイ ル基 切断 活性 を有 する Peptide N-Fattyacylase を 用い て酵 素反 応後 ，HPLC（column: PICO・TAG column，A buffer: 30 % CH3CN containing 0.1 % TFA，B buffer: 80% CH3CN containing 0.1 % TFA，Gradient: 0→100 % B, 30 min）で分離後，得られたフラクション（retention time 2 min）を気相プロテインシーケンサーで分析を行った結果，-107-

GSNK peptideであり，N-Myr-pp60c-srcのcDNAから推定されたアミノ末端アミノ酸配列と一致し，アミノ末端ミリストイル化タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列の化学的同定法を確立することができた．
●ミリストイル化ペプチドの化学的同定法
アミノ末端が本当にミリストイル化でブロックされているかどうかは，先程と同様にミリストイル化を受けていると思われるタンパク質のアミノ末端ペプチドを分離した後，Peptide N-Fattyacylaseを用いて酵素反応後，Peptide N-Fattyacylaseによってミリス
トイル基が切断されたために生じる質量の差を確認すればよい．
a.i.

N -Myr-GNAAAARR[M+H] +

2000

1047.201000
997.58

Myr基0100200300400500

6007008009001000m/z

a.i.
GNAAAARR[M+H] +

2000

786.551000

1047.200100200300400500

6007008009001000m/z

図１４ アミノ末端ミリストイル基の同定
Peptide N-FattyacylaseによってN-Myr-GNAAAARR peptideのミリストイル基を切断した例-108-