令和２年度

食肉に関する
助成研究調査成果報告書

公益財団法人

伊藤記念財団

VOL. 39

「伊藤記念財団」設立趣意書
私，伊藤傳三は，昭和３年食肉加工業を創業して以来五十有余年の永きにわた
り食肉加工品の製造販売に従事して参ったところであります。
この間，昭和47年からは日本ハム・ソーセージ工業協同組合理事長，社団法人
日本食肉加工協会理事長，加えて，ハンバーグ・ハンバーガー協会理事長等の重責を担わせていただく等，業界団体の役員を勤めさせていただいてきたところであります。
こうした中で昭和55年，はからずも勲二等瑞宝章受章という身にあまる栄誉に浴したのでありますが，受章に際し私自身の過ぎ来し方を振り返り，食肉及び食
肉加工業界の行く末に思いを致し，２つの事柄を決意致しました。
第１は，食肉加工団体の指導体制の若返りであり，第２は，食肉加工業の基礎的研究の充実であります。
諸情勢が激しく変わりつつある中で食肉加工業界をさらに大きく発展させるには，新しいリーダーの登場が望ましいことは論をまちません。また，食肉加工品については，これまでも日本独自の技術開発は行われてきましたものの，いずれも企業内技術であると言っても過言でなく，大学等における基礎的研究の不足が将来の日本の食肉加工業の発展を遅らせるおそれがあり，この現状を打破する必要があると考えたところであります。
以上のような基本的考えの下に私は，食肉関係団体等の役員を辞すると共に，
食肉及び食肉加工に関する基礎的かつ広汎な研究を行い，あるいは助長するための財団の設立を発起するものであります。
昭和56年６月
設立発起人© The Ito Foundation

伊

藤

傳

三

Philosophy Behind the Establishment of
the Ito Foundation
Approximately half of a century has passed since I established a meat
packing corporation for commercial products in 1928. While involved in thisbusiness, I have had occasion to serve as chairman of the boards of trustees
of several organizations related to the meat industry, such as the HamSausage Industrial Association of Japan in 1972, the Meat Packing Industrial
Association of Japan, and the Hamburg-Hamburger Association of Japan.
In 1980, unexpectedly, I was highly honored to receive the Order of the
Sacred Treasure, Gold and Silver Star from the emperor in acknowledgement of my contributions to the meat industry and improved human nutrition
during my career. This illustrious award provided a strong impetus for me toact on my long-standing concern for the future of meat packing industries.
My commitment to the establishment of a new research foundation for thepromotion of meat science was based on two fundamental philosophies : first,
leadership of the Association of the Meat Packing Industry should be transferred to people with novel ideas and, second, an advanced system for basic
research should be established in meat industries. Clearly, fresh leadership isneeded in changing situations for intensive development in the meat packing
industry. Although some technical product developments have been achievedin certain individual corporations, the lack of basic research in meat scienceat universities and other research organizations certainly will impede future
development of Japanese meat packing industries. It is urgent to end the stagnation in the meat industry through research support.
On the basis of these philosophies, I myself will resign from any official
positions in meat-related associations and will establish a new researchfoundation to support and promote basic and applied research in meat
science.
Denzo Ito, Founder
June© The Ito Foundation

1981

事 業 の あ ら ま し（目

的）本財団は，食肉に関する研究及び調査を行い，もって畜産業及び食品産業の振興と国民食生活の安定に資することを目的とする。
（事業）

本財団は，上述の目的を達成するため，次の事業を行う。
⑴

食肉の生産，処理，加工等に関する基礎的研究及び調査⑵

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査を行う大学等の研究機関に対する助成⑶ 食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査に優れた業績が認められる研究者の表
彰⑷

食肉の生産，処理，加工等に関する情報の普及及び広報（事業実績）
年度
昭和57年度
58
59
60
61
62
63
平成元年度
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31（令和元年度）
2

第１回
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39

研究調査助成48件 60,000千円
52
54,40060
49,80062
48,00070
53,00079
58,90095
70,50086
74,25079
60,00070
50,00086
60,00081
60,00081
60,00082
65,00081
69,10078
59,00082
60,00067
47,00057
41,00053
37,00058
40,00055
41,00055
48,00056
48,00011
10,00012
10,00015
16,90011
10,000
11
10,40012
12,00013
13,00038
37,00058
54,80069
66,00071
69,00074
75,00084
101,200
74
105,000
79
105,000© The Ito Foundation

ご

挨

拶

当伊藤記念財団は，伊藤ハム株式会社の創業者故伊藤傳三による巻頭の「設立趣意書」に掲げた趣意をもって，昭和56年７月３日に財団法人として農林水産大臣から設立を許可され、平成24年４月１日に公益財団法人伊藤記念財団に移行登記したものであり，事業の内容は，「事業のあらまし」にあるとおりであります。
おかげ様で当財団は，平成24年度からは公益財団法人として活動することとなり，その活動は本年で39年となります。この間，当財団の研究調査助成事業の存在が畜産関係の方々の間に浸透いたし，事業内容も逐次充実して参りつつあります。
これは，ひとえに関係各位のご指導ご鞭撻の賜と深く感謝申し上げるとともに，今後とも，
食肉加工等の基礎的研究の充実を希う創設者の意志にそって，益々食肉産業ひいては畜産業の振興及び国民食生活の安定のために役立つべく，更に努力を重ねて参りたいと存じております。
本書は，第39回（令和２年度）助成事業における79件の研究調査助成対象研究者の皆様からいただいた研究成果報告とともに，第６回となります伊藤記念財団賞授賞事業の受賞者とその業績概要と学会等事業助成の概要をとりまとめたものでありますが，以上の目的にしたがって，食肉産業の基礎的研究等に携わる諸氏の研究の一助ともなれば幸甚でございます。
令和３年11月

理事長

伊

藤

功

一

Dear Sir：
I am very pleased to send you and your organization a complimentary copy of theresearch reports of the Ito Foundation. This research foundation was founded by the late
Mr.Denzo Ito to advance research in meat science. The research reports are publishedannually. Unfortunately, the articles are largely in Japanease ; however, in the future wehope to contribute to the international development of meat science. Any constructive
suggestions or critiques from others involved in meat-related research would be accepted
gratefully.
You will find out philosophy behind the establishment of the Ito Foundation describedby Mr.Denzo Ito, in the research report of the Ito Foundation, Vol.39 enclosed here. We
appreciate any interest you may have in our research efforts.
It is my great pleasure to publish this report as the chief director.
Sincerely yours,
Nov. 2021
Koichi Ito
The chief director
The Ito Foundation© The Ito Foundation

i

研究助成事業目次

和牛肉のおいしさを「見える化」する（Ⅲ） 和牛ブランド間の比較
山


田

知

哉

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構中央農業研究センター）

3

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅱ）


竹

中

慎

治（神戸大学大学院農学研究科）

8

牛枝肉のモモ抜けの非破壊検査用磁気共鳴スキャナーの開発
善人１・柴

中島

伸弥２

（１国立研究開発法人産業技術総合研究所地質調査総合センター，

２

国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター）

15

イミダゾール化合物が食肉の熟成に及ぼす影響について早川徹（北海道大学大学院農学研究院）

22

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅲ）


西村

敏英・山口

千里（女子栄養大学栄養学部）

25

枝肉の 3D グラフィック化システムの製作（Ⅱ）
本山

三知代・渡邊

源哉・中島

郁世・佐々木啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

34

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンⅨの形成様相と存在形態に関する研究（Ⅱ）


若

松

純

一（北海道大学北方生物圏フィールド科学センター）

40

食肉の風味を構成する呈味性化合物の分画およびメタボローム解析
水野谷

航・竹田

志郎・森川

里久＊・澤野齊藤

祥子＊・

千佳＊・良永裕子＊（麻布大学獣医学部，＊麻布大学生命・環境科学部）

46

食肉製品の香気分析に基づく品質管理手法の開発河原聡（宮崎大学農学部）

53

次世代の培養肉作製のための骨格筋タイプ変換技術の基礎的研究
久保

純１・井上

雄介２・山田昭博１・佐原近藤


玄太１・貴大１・小椋

利彦１（１東北大学加齢医学研究所，２旭川医科大学先進医工学研究センター）

58

畜産副生物から再生医療部材への高付加価値加工


神

田

英

輝（名古屋大学大学院工学研究科）© The Ito Foundation64

ii
産肉量増加を目指した間葉系前駆細胞による新規血管新生機構の解明
山

内啓太郎（東京大学大学院農学生命科学研究科）

72

三

浦

77

コリン供給源としての食肉機能の評価豊（東京農工大学大学院農学研究院）

食肉中に含まれる２- オキソ－イミダゾールジペプチドに関する研究


居原

秀・笠松

真吾（大阪府立大学大学院理学系研究科）

84

国際基準および国内と畜場の現場実態に適合した牛枝肉の生物的危害要因制御のための内部検証方法の開発


猪

島

康

雄（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

91

ハム・ソーセージに配合する食品添加物に関するリスクコミュニケーション手法の開発
ならびに効果検証
山﨑


毅・山﨑

深雪・阿紀

雅敏
96

（特定非営利活動法人食の安全と安心を科学する会）

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究（Ⅱ）


堀江

正一・渡邉

萌・堀井

千枝（大妻女子大学家政学部食物学科）

107

牛の新規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への影響（Ⅱ）
大和

修・矢吹

映・Md Shafiqul Islam・Shahnaj Pervin（鹿児島大学共同獣医学部臨床病理学分野）

118

肉用牛の枝肉形質および肉質の診断マーカーとしての血中マイクロ RNA の動態解析


横

井

伯

英（京都大学大学院農学研究科）

124

豚胎児の成長性に影響する生体内因子の探索
谷口


雅章・中島

郁世・荒川

愛作

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

129

黒毛和種における体型評価部位「肋付き」の客観的評価手法の開発


鈴

木

洋

美（北海道立総合研究機構畜産試験場）

133

遺伝子情報を用いた黒毛和種の枝肉形質と脂肪酸組成に及ぼす系統と遺伝様式の影響の解明
広岡


博之・井上

慶一＊・竹田将悠規＊・井上喜信＊＊（京都大学大学院農学研究科，＊家畜改良センター，＊＊鳥取県畜産試験場）

139

牛子宮内膜での単核球の出現が分娩後の子宮修復に及ぼす影響

三浦亮太朗・田島剛（日本獣医生命科学大学獣医学部）

148

黒毛和種における経腟採卵前のヒアルロン酸添加ブタ FSH 製剤１回筋肉内注射の効果に関する研究
及川

俊徳１・植田郁恵１・沼邊

孝２（１宮城県畜産試験場，２みやぎ農業振興公社）

154

沖縄在来豚アグーを絶滅から守るべき L- カルニチン処理による凍結精子作製技術の改良建© The Ito Foundation

本秀樹（琉球大学農学部）

159

iii
抗酸化物質を利用した牛体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した
新規 OPU-IVF-ET による子牛生産システムの開発
武裕１，２・草薙日巻


志穂２・多治見弘史３（１岐阜大学応用生物科学部，２岐阜大学自然科学技術研究科，３多治見牛ETクリニック）

167

牛体外受精胚の染色体異常予測技術の開発（Ⅱ）


杉

村

智

史（東京農工大学大学院農学研究院）

174

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロ RNA 定量に関する基盤的研究（Ⅲ）
木崎景一郎・金澤朋美・髙橋

透（岩手大学農学部共同獣医学科）

178

妊娠末期の黒毛和種における子宮動脈血流動態および胎盤の血流面積による胎盤機能および新生子牛の健全性の推定
伊

賀

浩

輔

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター畜産飼料作研究領域）

183

糞および尿を検査検体として用いる簡便かつ正確な馬の妊娠診断法の開発髙

橋透（岩手大学農学部）

189

牛におけるルーメン非分解性ナイアシン給与による子宮，卵巣への血流促進による分娩後の繁殖性向上森田

康広＊・松山秀一＊（名古屋大学大学院生命農学研究科， 名古屋大学アジアサテライトキャンパス学院）

195

発情期における牛子宮内膜機能調節因子および調節機序の解明


杉浦

智親・中田

健（酪農学園大学獣医学群動物生殖学ユニット）

202

温度センサと加速度センサを内蔵する多機能尾部センサの乳牛周産期管理への利用
檜垣彰吾１・櫻井玲奈１・松井義貴２

  （１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門，
２

地方独立行政法人北海道立総合研究機構酪農試験場）

207

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の確立
久保田


海

雄

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

215

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討小山毅（北海道立総合研究機構畜産試験場）

220

川

226

ドライ精子による牛生産に関する研究松和嗣（高知大学農林海洋科学部）

MTT（3［4,5‐dimethylthiazolyl］‐2,5‐diphenyltetrazolium bromide）を用いた豚精液の評価法の開発


内倉

健造・田島

茂行・相良

鮎美・豊島

浩一（愛知県農業総合試験場）

231

牛初期黄体における PG 抵抗性の解明－低酸素環境による抗アポトーシス機構－


西村

亮・菱沼

貢（鳥取大学農学部共同獣医学科獣医繁殖学）© The Ito Foundation

237

iv
黒毛和種牛における妊娠期の栄養状態が産子の繁殖能力に及ぼす影響北原豪（宮崎大学農学部）

243

リピートブリーダー牛の原因の多角的解析によるその対策のための基礎情報収集
羽田


真悟・真方

文絵＊

（帯広畜産大学獣医学研究部門，＊東京大学大学院農学生命科学研究科）

249

オリゴクローナルな持続性リンパ球増多症を示す牛白血病ウイルス感染牛の生産性解析猪熊壽（東京大学大学院農学生命科学研究科）

254

牛難治性伝染性蹄病であるヘアリーアタックの病態解析
喬子１・三澤谷口

尚明１，２（１宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター，２

宮崎大学農学部獣医学科獣医公衆衛生学研究室）

259

カンピロバクター・ジェジュニの「生きているが培養できない状態」を復帰させるための生物学的因子の解明


三

澤

尚

明（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）

266

豚熱（CSF）ワクチン接種繁殖母豚から初乳摂取条件の異なる子豚への CSF 抗体移行と存続に関する研究長井誠１・野口倫子１・鈴木

武人１・青木博史２（１麻布大学，２日本獣医生命科学大学）

273

尾根部の体表温度から黒毛和種育成子牛の発熱を検知する手法の開発


佐々木

羊介・上松

瑞穂＊（宮崎大学農学部，＊NOSAI宮崎）281

牛呼吸器病症候群（BRDC）発症機序の解明（Ⅱ）


帆保

誠二・石川

真悟（鹿児島大学共同獣医学部）

287

病原性因子を欠損した生後感染アカバネウイルスの作出と生ワクチンへの応用


正谷

達謄・岡島

美鈴（岐阜大学応用生物科学部）

293

熊本系褐毛和種における地方病性牛白血病抑制メカニズムの解明


稲

永

敏

明（東海大学農学部応用動物科学科）

299

豚の筋ジストロフィーの病態解明と生前検査法の開発


相原

尚之・野口

倫子（麻布大学獣医学部）

304

リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法とナノポアシークエンス技術を用いた超迅速なウイルス塩基配列解読法の開発
堀江

真行１，２，３・安藤清彦４（１京都大学白眉センター，２京都大学ウイルス・再生医科学研究所，
３

４

大阪府立大学大学院生命環境科学研究科獣医学専攻，

国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）© The Ito Foundation

310

v
牛白血病ウイルス由来の非翻訳性 RNA と結合する宿主タンパク質の同定
安


藤

清

彦

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

316

豚消化器病ウイルスの感染メカニズムを解明するための豚腸管オルガノイドを用いた画期的な
インビトロ実験感染系の開発
鈴


木

亨

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

321

アフリカ豚熱の侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅲ）


杉浦

勝明・芳賀

猛（東京大学大学院農学生命科学研究科）

325

肉用牛から分離された新規病原体 Rhodococcus equi の国内感染状況の疫学調査


鈴木

康規・角田

勤・髙井

伸二（北里大学獣医学部）

333

広（鹿児島大学学術研究院理工学域工学系）

341

畜産動物用粘膜ワクチンアジュバントの開発


若

尾

雅

UV-LED 光殺菌を用いた，鶏病原性大腸菌殺菌システムの開発
隆明１・粟飯原下畑睦美２（１徳島大学大学院医歯薬学研究部，２徳島大学大学院社会産業理工学研究部）

347

網羅的ジェノタイピングによる新規牛白血病抵抗性遺伝子の同定（Ⅱ）


目

堅

博

久（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）

354

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査（Ⅲ）


森

本

素

子（宮城大学食産業学群）

359

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究（Ⅱ）－飼養成績と腸内細菌叢に及ぼす影響－


勝俣

昌也・鈴木

武人（麻布大学獣医学部）

363

牧草サイレージの高品質化に向けたバイオガスプラント消化液施用量の評価
三谷

朋弘１・上田宏一郎２（１北海道大学北方生物圏フィールド科学センター，２北海道大学大学院農学研究院）

368

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究
保田

昌宏１，２・今泉法子２・阿部

信介１，３（１宮崎大学大学院医学獣医学総合研究科，２宮崎大学農学部，３宮崎県農業共済組合）

374

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証
西本

完１・遠野

雅徳２・山崎（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構


２

１

信３

食品研究部門，中央農業研究センター，３畜産研究部門）

380

子牛の健全な発達を目指した消化管の上皮細胞接着微生物叢の相互関係の解明


西

原

昂

来（東北大学大学院農学研究科）

386

裕（宮崎大学フロンティア科学総合研究センター）

389

ゲノム編集による高消化性暖地型イネ科牧草の開発


権

藤

崇

© The Ito Foundation

vi
牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技術の開発
則章１・上野庄司
豊２（１山形県農業総合研究センター畜産研究所，２信州大学農学部）

396

木材クラフトパルプの混合割合の異なる濃厚飼料の給与が黒毛和種去勢牛の飼料消化性および第一胃内発酵に及ぼす影響


前

田

友

香（宮崎県畜産試験場）

404

耕畜連携を目指した国産トウモロコシ子実の高品質サイレージ化に向けた調製条件の探索
神園


巴美・嶝野

英子

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター）

411

母子同品種のホルスタイン種および黒毛和種における分娩直後の母牛，分娩時の臍静脈および出生直後の子牛のアミノ酸濃度の比較
川島

千帆１・草場

信之１・山岸則夫２（１帯広畜産大学畜産フィールド科学センター，２

大阪府立大学大学院生命環境科学研究科獣医学専攻）

416

肉用鶏の成長効率に関与する腸管内 Wnt およびその受容体の探索伊藤謙（秋田県立大学生物資源科学部）

423

ルーメン内繊維消化ダイナミクスに着目した採食可能量の予測モデルの開発（Ⅱ）
谷川

珠子１・田中常喜２（１地方独立行政法人北海道立総合研究機構酪農試験場，
２

地方独立行政法人北海道立総合研究機構畜産試験場）

427

国産トウモロコシ子実の乾燥温度および貯蔵条件がトウモロコシの栄養価に及ぼす影響篠遠

善哉１・金井源太１・芦原茜２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター，
２

国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

434

黒毛和種肥育牛の部分尿による尿中窒素排泄量の推定方法の確立
近藤


誠１・股村

真也１・岡本俊英２・梅木俊樹２（１三重大学大学院生物資源学研究科，２三重県畜産研究所）

440

ビタミン A 投与が黒毛和種子牛の骨格筋成長に与える影響
二瓶直浩１・佐藤

祐介２・湯澤裕史１・川田智弘１（１栃木県畜産酪農研究センター，２宇都宮大学）

446

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響


深川

聡・松永

将伍（長崎県農林技術開発センター）© The Ito Foundation

453

vii
暑熱ストレスによる筋成長阻害のブレークスルー：筋幹細胞の活性化・増殖因子 HGF のニトロ化（不活化）の関与の検証（Ⅱ）
辰巳

隆一・増原

夏海・Mohamed Zakaria Elhussiny・

Vishwajit Sur Chowdhury・Alaa Elgaabari１・城戸
関

美弓・松吉



祐児・鈴木

貴宏・中村

潤力・今冨

奈々・

真子・古瀬

充宏

１

（九州大学大学院農学研究院， Kafrelsheikh University, Egypt）

460

家畜糞の分解効率に関わる土壌・糞中微生物の関連性～多様性と量の謎を解く～
内田義崇・龍見（岩岡） 史恵（北海道大学大学院農学研究院）

465

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可能性（Ⅱ）


松

﨑

正

敏（弘前大学農学生命科学部）

470

異なる月齢時の輸送が子牛の福祉性および生産性に与える影響戸澤あきつ（帝京科学大学生命環境学部）© The Ito Foundation

474

viii

CONTENTS
Studies on the new evaluation method of Wagyu beef quality（Ⅲ）Comparison among branded
Wagyu beef
Tomoya Yamada（Central Region Agricultural Research Center, NARO）

3

Developments in technology for meat processing by fungal aspartic protease（Ⅱ）
Shinji Takenaka（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

8

Development of a magnetic resonance scanner for the nondestructive quantification of fat
contents of the beef round in a carcass
Yoshito Nakashima １ and Nobuya Shiba ２（１National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Geological Survey of Japan,
National Agriculture and Food Research Organization（NARO）,

２

Tohoku Agricultural Research Center）

15

Effect of imidazole compounds on the aging of meat
Toru Hayakawa（Hokkaido University, Research Faculty of Agriculture）

22

Clarification of the enhancement mechanism of “koku attributes” by lipids in pork sausages（Ⅲ）
Toshihide Nishimura and Chisato Yamaguchi（Faculty of Nutrition Science, Kagawa Nutrition University）

25

Development of a system for rendering 3D computer graphics of meat carcasses（Ⅱ）
Michiyo Motoyama, Genya Watanabe, Ikuyo Nakajima and Keisuke Sasaki（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

34

Studies on the formation and the existence form of zinc protoporphyrin IX in dry-cured ham（Ⅱ）
Jun-ichi Wakamatsu（Field Science Center for Northern Biosphere, Hokkaido University）

40

Metabolomic analysis of taste components fraction to characterize meat flavor
Wataru Mizunoya, Shiro Takeda, Riku Morikawa ＊ , Shoko Sawano ＊ , Chika Saito ＊ andYuko Yoshinaga ＊（School of Veterinary Medicine, Azabu University,＊

School of Life and Environmental Science, Azabu University）

© The Ito Foundation46

ix
Development of quality control method of meat products based on flavor analysis
Satoshi Kawahara（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

53

Basic research on skeletal muscle type conversion technology for the next generation ofcultured meat
Atsushi Kubo １, Yusuke Inoue ２, Akihiro Yamada １, Genta Sahara １, Takahiro Kondo １ andToshihiko Ogura １（１Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University, ２Advanced Medical Engineering
Research Center, Asahikawa Medical University）

58

Add value preparation from livestock by-products to regenerative medicine materials
Hideki Kanda（Graduate School of Engineering, Nagoya University）

64

Elucidating a novel mechanism of angiogenesis by mesenchymal progenitor cells
Keitaro Yamanouchi（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

72

Evaluation of meats functions as a choline resource
Yutaka Miura（Institute of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

77

Studies on 2-oxo-imidazole dipeptides in meat
Hideshi Ihara and Shingo Kasamatsu（Graduate School of Science, Osaka Prefecture University）

84

Development of internal verification methods for control of biological hazard in beef carcasses
adapted to both global standard and domestic slaughterhouses
Yasuo Inoshima（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Applied Biological Sciences,
Gifu University）

91

Development and evaluation of smart risk communication method on the food additives
formulated in ham and sausage
Takeshi Yamasaki, Miyuki Yamasaki and Masatoshi Aki（NPO, Science of Food Safety and Security（SFSS））

96

Study on awareness of consumers about safety of food additives（Ⅱ）
Masakazu Horie, Moe Watanabe and Chie Horii（Department of Food Science, Faculty of Home Economics, Otsuma Women’s University）

© The Ito Foundation107

x
Molecular basis of novel genetic disorders in cattle and their adverse impact（Ⅱ）
Osamu Yamato, Akira Yabuki, Md Shafiqul Islam and Shahnaj Pervin（Laboratory of Clinical Pathology, Department of Veterinary Clinical Sciences, Joint Faculty of
Veterinary Medicine, Kagoshima University）

118

Analysis of dynamics of circulating microRNAs as biomarkers for diagnosis of carcass traits
and meat quality in beef cattle
Norihide Yokoi（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

124

Investigation of biological factors associated with growth of pig fetuses
Masaaki Taniguchi, Ikuyo Nakajima and Aisaku Arakawa（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

129

Research for objective evaluation of forerib conformation of Japanese Beef Cattle
Hiromi Suzuki（Hokkaido Research Organization, Agricultural Research Department Animal Research Center）

133

Investigation of sire lines and genetic transmission modes on carcass traits and a fatty acidtrait in Japanese Black cattle using genomic information
Hiroyuki Hirooka, Keiichi Inoue ＊ , Masayuki Takeda ＊ and Yoshinobu Inoue ＊＊（Kyoto University, ＊ National Livestock Breeding Center,＊＊

Tottori Prefectural Livestock Research Center）

139

The effect of monocyte appearance in endometrium to uterine involution in cattle
Ryotaro Miura and Tsuyoshi Tajima（Department of Veterinary Medicine, Nippon Veterinary and Life Science University）

148

Effect of intramuscular injection of porcine FSH in hyaluron acid prior to ovum pick-up in
Japanese Black cattle
Toshinori Oikawa １，Ikue Ueda １ and Takashi Numabe ２（１Miyagi Prefectural Livestock Experiment Station,
Miyagi Agricultural Development Corporation）

２

154

Improvement of the sperm freezing procedure by treatment with L-carnitine to protect
Okinawan native Agu pig from extinction
Hideki Tatemoto（Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus）

159

Improvement of bovine in vitro fertilized embryo production technology using antioxidants anddevelopment of calf production system by new OPU-IVF-ET method
Takehiro Himaki １，２, Shiho Kusanagi ２ and Hiroshi Tajimi ３（１Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University, ２Graduate School of Natural Science andTechnology, Gifu University, ３Tajimi bovine ET clinic）

© The Ito Foundation

167

xi
Development of predictive system of chromosomal abnormality on bovine in vitro fertilized
embryos（II）
Satoshi Sugimura（Tokyo University of Agriculture and Technology, Institute of Agriculture）

174

Study of circulating microRNA as biomarker for pregnancy in cattle（Ⅲ）
Keiichiro Kizaki, Tomomi Kanazawa and Toru Takahashi（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University）

178

Estimation of placental function in dums and health of newborn in Japanese Black cattle basedon uterine arterial and placental blood flow hemodynamics in late pregnancy
Kosuke Iga（Division of livestock and Forage Research, Tohoku Agricultural Research Center, NARO）

183

Development of simple and accurate procedure for pregnancy diagnosis by using fecal and urine
samples in the mareToru Takahashi（Faculty of Agriculture, Iwate University）

189

Improvement of post-partum reproductive performance by Rumen protected niacin
supplementation in cattle
Yasuhiro Morita ＊ and Shuichi Matsuyama（Graduate School of Bioagricultiral sciences,＊

Asian Satellite Campuses Institute, Nagoya University）

195

Study on bovine endometrial function regulator and regulatory mechanism during estrus
Tomochika Sugiura and Ken Nakada（Laboratory of Theriogenology, Department of Veterinary Medicine, Rakunogakuen University）

202

Peripartum management using a multimodal tail-attached devise with a thermistor and a triaxial
accelerometer in dairy cattle
Shogo Higaki １, Reina Sakurai １ and Yoshitaka Matsui ２（１National Institute of Animal Health, NARO,
Dairy Research Center, Hokkaido Research Organization）

２

207

Identification of a molecular marker for the uterine involution to affirm the female fertility
Kaiyu Kubota（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

215

Examination of new selection method of recipient cow based on ovarian reserves
Takeshi Koyama（Animal research center, Hokkaido research organization）

© The Ito Foundation

220

xii
Studies of cattle production using dried spermatozoa
Kazutsugu Matsukawa（Faculty of Agriculture and Marine Science, Kochi University）

226

The development of evaluation method of porcine sperm using MTT（3［4,5‐dimethylthiazolyl］‐2,5‐diphenyltetrazolium bromide）
Kenzo Uchikura, Shigeyuki Tajima, Ayumi Sagara and Koichi Toyoshima（Aichi Agricultural Research Center）

231

The mechanisms of PG-resistance in bovine early corpus luteum－hypoxia-induced anti-apoptotic mechanism－
Ryo Nishimura and Mitsugu Hishinuma（Laboratory of Theriogenology, Joint Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture,
Tottori University）

237

Effects of maternal nutritional condition for fertility of their offsprings in Japanese Black cattle
Go Kitahara（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

243

Gathering basic information for the solution of repeat-breeder cows by multiple analysis of its
causesShingo Haneda and Fumie Magata ＊（Department of Veterinary Medicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine,＊

Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

249

Productivity analysis of cattle infected with bovine leukemia virus which show oligoclonal
persistent lymphocytosis
Hisashi Inokuma（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

254

Pathophysiological analysis of bovine hairy attack as a refractory infectious hoof disease
Takako Taniguchi １ and Naoaki Misawa １，２（１Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki, ２Laboratory of Veterinary Public Health,
Department of Veterinary Medical Science, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

259

Clarification of biological factors to restore Campylobacter jejuni from “viable but non
culturable” status
Naoaki Misawa（Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki）

266

Investigation for classical swine fever virus specific maternal antibody levels and persistence of
piglets acquired colostrum under different condition from sow
Makoto Nagai １，Michiko Noguchi １，Takehito Suzuki １ and Hiroshi Aoki ２（１Azabu University, ２Nippon Veterinary and Life Science University）

© The Ito Foundation

273

xiii
Detection of fever of Japanese Black calves by ventral tail base surface temperature
Yosuke Sasaki and Mizuho Uematsu ＊（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki, ＊ NOSAI Miyazaki）

281

Breakthrough of pathogenic mechanism of bovine respiratory disease complex（BRDC）（Ⅱ）
Seiji Hobo and Shingo Ishikawa（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

287

Establishment of Akabane virus mutant deleted pathogenetic determinant and application forlive vaccine
Tatsunori Masatani and Misuzu Okajima（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

293

Analyses of the susceptibility for Enzootic Bovine Leukosis in Japanese Brown cattle ofKumamoto strain
Toshiaki Inenaga（Department of Animal Sciences, School of Agriculture, Tokai University）

299

Study of pathogenesis and detection method of porcine muscular dystrophy
Naoyuki Aihara and Michiko Noguchi（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

304

Development of a rapid diagnostic system for detection and sequencing of viral nucleic acidusing recombinase polymerase amplification and nanopore sequencing technology
Masayuki Horie １，２，３ and Kiyohiko Andoh ４（１Hakubi Center for Advanced Research, ２Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto
University, ３Division of Veterinary Science, Graduate School of Life and Environmental Sciences, Osaka,
４

National Institute of Animal Health, NARO）

310

Identification of host-derived proteins interacting with BLV non-coding RNA
Kiyohiko Andoh（National Institute of Animal Health, NARO）

316

Development of a new in vitro experimental system using swine intestinal organoid to clarify
infection mechanism of porcine enteric viruses
Tohru Suzuki（National Institute of Animal Health, NARO）

321

Epidemiological research on the risk assessment of introduction of African swine fever intoJapan
Katsuaki Sugiura and Takeshi Haga
（Laboratory of Global Animal Resource Science, Department of Global Agricultural Sciences, Graduate
School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

© The Ito Foundation

325

xiv
Epidemiological investigation of domestic transmission of a new pathogen, Rhodococcus equi,
isolated from beef cattle
Yasunori Suzuki, Tsutomu Kakuda and Shinji Takai（Kitasato University School of Veterinary Medicine）

333

Development of mucosal vaccine adjuvant for livestock
Masahiro Wakao（Department of Science and Engineering, Kagoshima University）

341

Development of UV-LED inactivation system for avian pathogenic Esherichia coli
Takaaki Shimohata １ and Mutsumi Aihara ２（１Department of Preventive Environment and Nutrition, Institute of Biomedical Sciences,
Tokushima University Graduate School, ２Graduate School of Technology, Industrial and Social
Sciences,Tokushima University）

347

Identification of novel bovine leukosis resistance-associated alleles by comprehensive genotyping（Ⅱ）
Hirohisa Mekata（Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki）

354

A survey of gastrointestinal parasites infection and implementation of parasite control programin cattle（Ⅲ）
Motoko Morimoto（School of Food Industrial Sciences, Miyagi University）

359

A study on requirements of lysine in weanling pigs（Ⅱ）- Effects on growth performances andmicrobiota Masaya Katsumata and Takehito Suzuki（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

363

Optimum application of biogas plant slurry for improving grass silage quality
Tomohiro Mitani １ and Koichiro Ueda ２（１Field Science Center for Northern Biosphere, Hokkaido University;
２

Reserach Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

368

Studies on the enhancement of calf immunity appraised by rumen mat score
Masahiro Yasuda １, ２, Noriko Imaizumi ２ and Shinsuke Abe １，３（１Graduate School of Medicine and Veterinary Medicine, University of Miyazaki, ２Faculty ofAgriculture, University of Miyazaki, 3Miyazaki Agricultural Mutual Aid Association）

374

Verification of the effect of feed supplemented with mass-producible oligosaccharides on the
improvement of intestinal flora in livestock
Mamoru Nishimoto １, Masanori Tohno ２ and Makoto Yamazaki ３（１Food Research Institute, ２Central Region Agricultural Research Center, ３Institute of Livestock andGrassland Science, NARO）

380© The Ito Foundation

xv
Revealing gastrointestine development by understanding gastrointestine epithelial attached cells
in calves
Koki Nishihara（Faculty of Agriculture, Tohoku University）

386

Development of high digestibility warm-season forage grass by genome editing
Takahiro Gondo（Frontier Science Research Center, University of Miyazaki）

389

Development of fattening method that maintain the flavor of beef and shorten the feeding period
in Japanese Black cow
Noriaki Shoji １ and Yutaka Uyeno ２（１Livestock Research Institute, Yamagata Integrated Agricultural Research Center,２

Faculty of Agriculture, Shinshu University）

396

Effect of various ratio of wood kraft pulp in concentration feed on feed digestibility and rumen
fermentation in Japanese Black fattening steer
Yuka Maeda（Miyazaki Livestock Research Institute）

404

Exploration of preparation conditions for high-quality silage from domestic corn grain aiming
at integration systems between crop and animal production
Tomomi Kamizono and Eiko Touno（Tohoku Agricultural Research Center, NARO）

411

Comparison of blood amino acid levels in dams immediately after calving, in the umbilical veinsat calving, and in their calves immediately following birth between Holstein and JapaneseBlack cattle
Chiho Kawashima １, Nobuyuki Kusaba １ and Norio Yamagishi ２（１Field Center of Animal Science and Agriculture, Obihiro University of Agriculture and Veterinary
Medicine, ２Division of Veterinary Science, Graduate School of Life and Environmental Sciences, Osaka
Prefecture University）

416

Search for intestinal Wnt and its receptors involved in the growth efficiency of broiler chickens
Ken Ito（Faculty of Bioresource Science, Akita Prefectural University）

423

Prediction of feed intake capacity based on dynamic models of fiber digestion and passage inthe rumen（Ⅱ）
Tamako Tanigawa １ and Tsuneki Tanaka ２（１Local Independent Administrative Agency, Hokkaido Research Organization Dairy Research Center,２

Local Independent Administrative Agency, Hokkaido Research Organization Animal Research Center）



427© The Ito Foundation

xvi
Effects of drying temperature and storage conditions on nutritive value of domestic grain ofcorn
Yoshiya Shinoto １, Genta Kanai １ and Akane Ashihara ２（１Tohoku Agricultural Research Center, NARO,
２

Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

434

Method development to estimate total urinary nitrogen excretion in fattening Japanese black
beef cattle
Makoto Kondo １，Masaya Matamura １，Toshihide Okamoto ２ and Toshiki Umeki ２（１Graduate School of Bioresources, Mie University，２Mie prefectural Livestock Institute）

440

Effects of administration of vitamin A on skeletal muscle growth in Japanese black calves
Naohiro Nihei １, Yusuke Sato ２, Hiroshi Yuzawa １ and Tomohiro Kawada １（１ Tochigi Pref. dairy ＆ livestock experimental research center, ２ Utsunomiya University）

446

Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed fermented loquat leaf tea ondevelopment and meat quality of Tsushima-Jidori crossbred chicken for meat
Satoru Fukagawa and Shogo Matsunaga（Nagasaki Agricultural and Forestry Technical Development Center）

453

Breaking-through the heat stress-induced suppression of postnatal muscle growth：possible
implication of nitration of myogenic stem cell activation factor HGF（part Ⅱ）
Ryuichi Tatsumi, Natsumi Masuhara, Mohamed Zakaria Elhussiny, Vishwajit Sur Chowdhury,
Alaa Elgaabari １, Hirochika Kido, Nana Imatomi, Miyumi Seki, Yuji Matsuyoshi, Takahiro Suzuki,
Mako Nakamura and Mitsuhiro Furuse（Graduate School of Agriculture, Kyushu University, １Kafrelsheikh University, Egypt）

460

Relationship between microbiomes related to the decomposition efficiency of livestock dung
- the importance of diversity and the abundance Yoshitaka Uchida and Chikae Tatsumi（Iwaoka）（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

465

Colostral programming of physiological properties related to meat production（Ⅱ）
Masatoshi Matsuzaki（Faculty of Agriculture and Life Science, Hirosaki University）

470

Influence on welfare and production by transporting calves at different ages
Akitsu Tozawa（Faculty of Life & Environmental Sciences, Teikyo University of Science）

© The Ito Foundation

474

xvii

伊藤記念財団賞
目安部

亜津子（島根県畜産技術センター

次

肉用牛科長）

黒毛和種牛肥育経営の収益性向上を目指した短期肥育技術ならびに和牛肉の特性評価に関する研究 岩崎

智仁（酪農学園大学農食環境学群487
食と健康学類

教授）

食肉加工への超高圧利用，新規顕微鏡による食肉の顕微解析ならびに鶏の異常硬化胸肉に関する研究 488

© The Ito Foundation

xviii

学会等事業助成目次

令和２年度学会等事業助成実施報告書
シンポジウム『豚の感染症と私たちの暮らし―豚熱とアフリカ豚熱の現状と対策』に関する開催報告
公益社団法人日本獣医学会

代表理事

久和

茂（東京大学） 491

日本食肉研究会 令和２年度事業助成の実施報告
日本食肉科学会理事長

坂田亮一（麻布大学名誉教授） 493

令和２年度事業実施報告書
日本畜産学会第 128 回大会（オンライン開催）公開シンポジウム
市民公開シンポジウム１「地球温暖化：暑熱ストレスによる家畜・家禽の生産性低下の科学的理解と対応策の展望」
公益社団法人日本畜産学会

理事長

柏崎直巳（麻布大学） © The Ito Foundation499

研究助成事業© The Ito Foundation

3

和牛肉のおいしさを「見える化」する（Ⅲ）
和牛ブランド間の比較
Studies on the new evaluation method of Wagyu beef quality（Ⅲ）
Comparison among branded Wagyu beef

山

田

知

哉

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構中央農業研究センター）

Tomoya Yamada（Central Region Agricultural Research Center, NARO）

In this experiment, we studied the metabolomic profiling of sirloin samples among branded（A, B）and non-branded（C）Wagyu beef by GC-MS analysis. The principal component
analysis score plots showed that the metabolomic profile was divided among three Wagyu
groups. Metabolomic analysis showed that metabolites of group A were characterized by theabundance of components such as fumaric acid and malic acid. In contrast, metabolites of group
B were characterized by the abundance of components such as citric acid and uric acid. In
addition, the present study showed that the metabolites of group C were characterized by theabundance of components such as alanine, proline, maltose, and xylitol. These results indicatethat the metabolomic analysis is an optimum approach to identify characteristic chemicalcomponents of Wagyu beef.

１．目

和牛肉の販売戦略において銘柄（ブランド）は的重要な要素であり，日本三大和牛に代表される全

メタボローム解析は，癌の早期発見のための特国ブランドや，生産地名を冠した地域ブランドを異的な血中バイオマーカーの同定など，これまで含め，多数の和牛ブランドが設立されている。し主に医学分野において活用されてきた。近年畜産

かし，和牛ブランド間の特徴を明確に区別する牛分野においても，食肉の品質特性の解明を目的と肉中成分の指標はいまだ明らかではない。そこでしたメタボローム解析の適用が試みられてい日本国内においては和牛ブランド間の差別化を明るが，食肉の品質に影響を及ぼすバイオマー

確にするため，さらには和牛肉の積極的な輸出にカーに関してはいまだ不明な点が多い。申請者

よって海外における和牛ブランドを確立するたは，伊藤記念財団研究助成課題において和牛肉のめ，今後，脂肪交雑以外の和牛肉の特徴を明確に

メタボローム解析を実施した結果，和牛肉は糖類することが重要になると考えられる。

１～４）の含量が多いこと ，さらに和牛肉中の旨味成分

そこで本研究では，ブランド和牛肉と非ブランは，アメリカ産およびオーストラリア産の輸入牛

ド和牛肉のメタボローム解析結果を比較すること

肉より高いこと

により，ブランド和牛肉に特有な牛肉中成分を同５）を見出した。

６）© The Ito Foundation

4

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）の情報を解析対象として主成分分析を実施した結定することを目的とした。
２．方
2.1

果，Ａ，Ｂ，Ｃの３区がそれぞれ分かれてプロッ

法トされ，区ごとに特徴的な代謝物質が存在することが明らかとなった（Fig.１）。PC１軸では正方サンプル

黒毛和種の，和牛肉Ａブランド（Ａ区；ｎ＝向にＣ区が，負方向にＡ区がまとまってプロット４），和牛肉Ｂブランド（Ｂ区；ｎ＝４），非ブラされたことから，PC１はＡ区とＣ区の違いを表

ンド和牛肉（Ｃ区；ｎ＝４）の，サーロイン部位していると考えられた。またPC２軸方向では，サンプルを用いた。ブランド和牛肉のサンプル

正方向にＢ区が，負方向にＡ区がまとまってプ

は，食肉販売店で購入したものを用いた。非ブラロットされたことから，PC２はＡ区とＢ区の違ンド牛の和牛肉サンプルは，農研機構那須塩原事いを表していると考えられた。これらの結果か

業所で生産されたものを用いた。サンプルは分析

ら，PC１軸の因子負荷量上位の代謝物質は主に時までディープフリーザーで冷凍保存し，以下のＡ区とＣ区の違いを示す代謝物質であり，PC２

解析に用いた。

軸の因子負荷量上位の代謝物質は主にＡ区とＢ区

2.2の違いを示す代謝物質であると考えられた。Ａ区

メタボローム解析

メ タ ボ ロ ー ム 解 析 は ，既 報 に 基 づ き 実 施 しに特徴的な代謝物質は主にTCA回路関連代謝物。牛肉サンプルは，液体窒素下でパウダー状質，Ｂ区に特徴的な代謝物質は主に核酸代謝関連に粉砕し，粉砕サンプル100mgにメタノールを添物質，Ｃ区に特徴的な代謝物質は主にアミノ酸と加してジルコニアビーズを用いたホモジナイズお糖類によって構成されていた。

た

5，
6）

よび超音波処理を実施後，遠心分離を行い上清をFig.２に，階層的クラスタリング解析（HCA）

回 収 し た 。上 清 は MonoSpin C18 カ ラ ム（GLで得られたヒートマップを示した。Ａ区に特徴的

Science Cat.5010-21701）を 用 い て 精 製 処 理 をな代謝物質で構成されているクラスターには，行った。カラム透過画分は窒素ガス吹付下で濃縮

TCA 回 路 関 連 代 謝 物 質 で あ る fumaric acid と乾固処理を実施後，メトキシム化処理ならびにト

malic acidが含まれていた。Ｂ区に特徴的な代謝

リメチルシリル化誘導化処理を行った。これら誘物質で構成されているクラスターには，TCA回導化サンプルを用い，GC-MS（QP2010Ultra，路関連代謝物質であるcitric acidと核酸代謝関連

島津製作所）にて網羅的解析を実施した（（公財）物質であるuric acidが含まれていた。Ｃ区に特徴

か ず さ DNA 研 究 所）
。デ ー タ 解 析 に は ，GC/的な代謝物質で構成されているクラスターには，MSsolution （島 津 製 作 所） お よ び GC/MS

アミノ酸であるアラニンおよびプロリンと，糖類

Metabolite Database Ver. 2（島 津 製 作 所）を 用であるmaltoseおよびxylitolが含まれていた。
これら各区に特徴的であると考えられる牛肉中いた。

代謝物質を比較した結果，Ａ区ではfumaric acid

３．結果と考察とmalic acidが他区より高い結果となった。また

和牛肉Ａブランド（Ａ区），和牛肉Ｂブランド

Ｂ区ではcitric acidとuric acidが他区より高い結（Ｂ区），非ブランド和牛肉（Ｃ区）のGC-MS解果 で あ っ た 。ま た Ｃ 区 で は alanine ，proline と析を行った結果，各区においてそれぞれ約80の代

xylitolが他区より高く，maltoseも他区より高い

謝物質が検出された。検出された代謝物質すべて傾向が認められた（Fig.３）。したがって各区に© The Ito Foundation

和牛肉のおいしさを「見える化」する（Ⅲ）和牛ブランド間の比較
A

10

PC2（17.4％）

8

B

5

C

B-3

6
4

B-4
B-1

2

B-2
C-3

0
-2
-4
-6
-10

C-1
A-1
A-2
-5

C-4

C-2

A-3
A-4

0
5
PC1（46.7％）

10

15

Fig. 1 Principal component analysis（PCA）of metabolites in sirloin

sample among branded（A, B）and non-branded（C）Wagyu beef.

A1-A4：group A（n＝４），B1-B4：group B（n＝４），C1-C4：

group C（n＝４）．

Fig. 2 Heatmap of metabolites in sirloin sample among branded（A, B）and non-branded（C）Wagyu beef．
A1-A4：group A（n＝４），B1-B4：group B（n＝４），C1-C4：group C（n＝４）．

おいて特徴的な牛肉中成分は，Ａ区はTCA回路研究の結果から，メタボローム解析によってそれ関連代謝物質，Ｂ区は核酸代謝関連物質，Ｃ区はぞれの和牛肉を特徴付ける成分の同定が可能であアミノ酸と糖類であることが明らかとなった。本

ることが示された。今回，Ａ区とＢ区の和牛肉に© The Ito Foundation

6

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Fumaric acid
1.8E+06
1.6E+06a5.0E+05

1.4E+06b

1.2E+06
8.0E+05
6.0E+05
4.0E+05c

2.0E+05
0.0E+00

AB

3.0E+05
2.0E+05
1.0E+05
0.0E+00

C

Citric acid
5.0E+04

Rel. Area

Rel. Areaa2.0E+05

AB

3.0E+04
2.5E+04aa

2.0E+04
1.5E+04
1.0E+04a1.0E+05

5.0E+03
0.0E+00

C

A

Ala

b
a

Rel. Area

Rel. Area

2.0E+06a1.0E+07
5.0E+06

1.5E+06aa

1.0E+06
5.0E+05

AB

0.0E+00

C

MaltoseA

B

C

Xylitol

7.0E+05

1.0E+05b9.0E+04

6.0E+05

8.0E+04

5.0E+05

7.0E+04

4.0E+05

Rel. Area

Rel. AreaCb

2.5E+06

2.0E+073.0E+05
2.0E+05

6.0E+04
5.0E+04aa

4.0E+04
3.0E+04
2.0E+04

1.0E+05
0.0E+00

BPro

2.5E+07

0.0E+00

C

3.5E+04

4.0E+05

1.5E+07B

4.0E+04

5.0E+05

0.0E+00bb

4.5E+04

6.0E+05

3.0E+05

Ab

Uric acidb

7.0E+05a4.0E+05

1.0E+06

Rel. Area

Rel. Area

Malic acid
6.0E+05

1.0E+04
A

B

C

0.0E+00

A

B

C

Fig. 3 Relative quantity of metabolites in sirloin sample among branded（A, B）and non-branded（C）Wagyu beef. The middle line in the box plot represents the median, the dotted line
indicates the mean value, and the vertical bars indicate the range of data．
a, b, c：Values with different superscripts are significantly different（p＜0.05）．

© The Ito Foundation

和牛肉のおいしさを「見える化」する（Ⅲ）和牛ブランド間の比較

7

おいて特徴的な成分であったfumaric acid，malic

３区がそれぞれ分かれてプロットされ，区ごとにacid，citric acidは主に酸味に関連する成分であっ特徴的な代謝物質が存在することが示された。Ａた。一方，Ｃ区の和牛肉において特徴的な成分で区に特徴的な代謝物質には，TCA回路関連代謝あったalanine，proline，maltose，xylitolは甘み物質であるfumaric acidとmalic acidが含まれてに関連する成分であった。したがって，和牛肉中

いた。Ｂ区に特徴的な代謝物質には，TCA回路の呈味成分が区によって異なっていることは，そ関連代謝物質であるcitric acidと核酸代謝関連物

れぞれの和牛肉の味の違いに関連している可能性

質であるuric acidが含まれていた。Ｃ区に特徴的が推察された。

な代謝物質には，アミノ酸であるalanineおよび本研究によって，牛肉中成分のプロファイルがprolineと，糖類であるmaltoseおよびxylitolが含和牛肉の間で異なっていることが示された。これまれていた。以上の結果から，メタボローム解析

らの結果から，和牛肉ブランド間の差別化を明確を行うことによって，それぞれの和牛肉を特徴付にしていくうえで，それぞれの牛肉中に特徴的なける牛肉中成分を同定することが可能であること

成分が有効な指標となり得る可能性が示された。

が示された。

牛肉中の成分は，給与飼料条件や肉の熟成過程で変動することから，今後は牛肉中の特徴的な成分を増加させるような飼養管理技術や牛肉熟成方法の開発につなげていくことが重要であると考えら
れた。
４．要

約

和牛肉を特徴付ける牛肉中成分を明らかにするため，ブランド和牛肉（Ａ区，Ｂ区）ならびに非ブランド和牛肉（Ｃ区）を用いてGC-MSによるメタボローム解析を行った。検出された代謝物質

文献１）
 Muroya, S., Oe, M., Ojima, K., Watanabe, A.：
Asian-Australas. J. Anim. Sci, 32, 1172～1185, 2019.
 Ueda, S., Iwamoto, E., Shinohara, M., Shirai, Y.,
２）
Yamanoue, M.：Biosci. Biotechnol. Biochem, 83,
137～147, 2019.
 Muroya, S., Ueda, S., Komatsu, T., Miyakawa, T.,
３）
Ertbjerg, P.：Metabolites, 10, 188, 2020.
 Ueda, S., Yamanoue, M., Sirai, Y., Iwamoto, E.：
４）
Metabolites, 11, 56, 2021.
５）
 Yamada, T., Kamiya, M., Higuchi, M.：Metabolites,
10, 95, 2020.
 山田知哉：平成31年度食肉に関する助成研究調査６）
成果報告書，38, 78～81, 2020.

に対し主成分分析を実施した結果，Ａ，Ｂ，Ｃの© The Ito Foundation

8

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅱ）
Developments in technology for meat processing by fungal aspartic
protease（Ⅱ）

竹

中

慎

治

（神戸大学大学院農学研究科）

Shinji Takenaka（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

During postmortem aging and meat processing, endogenous proteolytic degradation ofmuscle fibers into oligopeptides and release of nucleotides and free amino acids etc. lead toincrease meat flavor. In addition, treatment by commercially obtained hydrolytic enzymes is
one of efficient methods to improve meat flavor and its texture with reducing conditioningand processing periods. In the food industry, several proteases such as papain, bromelain, andcalpain are widely used for proteolytic hydrolysis, to improve meat tenderness. Aspartic
protease from Aspergillus repens shows hydrolytic activity not only toward heme proteins andcasein but also matrix proteins, elastin and collagen. Our aim is to apply the ability of limitedlyhydrolysis of meat proteins by the aspartic protease for meat processing. Hydrolytic profiles
toward myofibrillar, myogenic, and extracellular matrix proteins using the recombinant
aspartic protease（rPepA）and plant proteases, papain and bromelain were examined. The
hydrolysates from several proteins such as commercially obtained collagen and elastin andself-prepared myofibril proteins were subjected to SDS-PAGE and tricine SDS-PAGE
analyses. The hydrolysates by plant proteases contained much more small molecular peptides
than that by rPepA. The hydrolysates by rPepA contained limitedly hydrolyzed polypeptides,
LC-MSMS mascot analysis indicated that the peptides were derived from collagen proteins. In
further study, the potential of rPepA will be revealed, based on the hydrolytic properties ofactomyosin and beef meat.

１．目

ロテアーゼによって自己消化を引き起こすことで的呈味性の遊離アミノ酸やペプチドの含量を増大さ

香味や食感に優れた食肉やハム，ソーセージ，

せることにある。一方，熟成期間を短縮化するこ

ベーコン等の食肉加工品を得るためには，低温熟とは，冷蔵・保蔵コストの削減，微生物による腐成を一定期間行うことが好ましいとされ，うま敗や品質劣化の防止につながるが，うま味を付与

味・こく味を増大させるために１週間から１か月するために別の熟成手段が必要となる。

以上も熟成させる。長期熟成の目的は，自己のプ

食肉やその加工品のおいしさを決める重要な要© The Ito Foundation

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅱ）

因として「肉の柔らかさ」，「くちどけ」，「うま味」
があげられる。肉はおいしさだけでなく，咀嚼しやすいやわらかさも消化効率や栄養摂取の面で重

9

る。
２．方

法

要である。特に，高齢化が進む先進諸国では肉質2.1の改善のためにプロテアーゼが検討されている。

分解活性試験で使用した基質は，筋原線維タン

例えば，植物由来のパパイン，ブロメライン，ア

パク質以外はSigma Aldrichから購入した。また，

クチニジンやコラーゲンを加水分解する微生物由

筋原線維タンパク質は，オーストラリア産牛もも来コラゲナーゼ等があげられる。一方，うま肉から調製した。アスパルティックプロテアーゼ

味の因子のひとつである遊離アミノ酸含量の増大は，以下に示す既報の方法に従って調製した８）。

のために，微生物由来ペプチダーゼも検討されて

パパインおよびブロメラインは富士フィルム和光いる４）。近年，肉を「塩麴」に漬け込むことで「う純薬株式会社から購入した。

１～３）

ま味やこく味を増しつつ，中までしっとりとした深い味わい」を引き出す調理法が注目されており ，食肉やその加工品の高付加価値化はこれか
５）

材料

2 . 2 組換えアスパルティックプロテアーゼの調製
A. repens MK88由来組換えアスパルティック
プ ロ テ ア ー ゼ （rPepA） は ， Pichia pastoris-

らますます重要視されると思われる。
申請者オリジナルの好乾性糸状菌由来アスパル

pPICZaA-PepA ８） を BMMY 培 地（100ml/500ml

ティックプロテアーゼは，ヘムタンパク質を限定

坂口コルベン）にて0.5％（v/v）となるようにメ分解する 。同プロテアーゼとミオグロビンの加タノールを添加しながら９日間培養し，遠心上清

水分解によって生じるペプチドの配列を解析したを回収した。つづいて，上清にアセトンを添加し，結果，同酵素がミオグロビンに含まれるヘムの近沈殿として回収して得られた酵素を20mM酢酸ナ

傍の３か所を加水分解できることから，ヘムの遊

トリウム緩衝液（pH 5.0）に対して透析すること

離によるミオグロビンの脱色が引き起こされるとで成熟rPepA（200から250Ｕ）を得た。

６）

考えられる７）。また，筋原線維・筋形成・結合組

2.3

織タンパク質に対する分解を調べ，エラスチン／

牛もも肉のミンチ（５ｇ）に対し，６倍量のカゼインに対する加水分解活性の相対値を算出す

TEK 溶 液 （0.1M KCl/１mM EDTA/10 mM

ると，同プロテアーゼはパパインやブロメライン

Tris-HCl （pH 7.0）） を 加 え ， ホ モ ジ ナ イ ズと同じく結合組織タンパク質に対する活性は低（10,000 rpm，１min）（エ ー ス ホ モ ジ ナ イ ザ ー

かった 。よって，同アスパルティックプロテアー

AM-５，日本精機製作所）した。遠心分離（600×g，

ゼは，肉由来のタンパク質を過剰に加水分解する

10 min）後，６倍量のTEK溶液で懸濁・再度ホ

ことなく，「肉の柔らかさ」と「うま味」両方をモジナイズし，遠心して沈殿物を得た。メッシュ

ほどよく改善できると期待される。そこで，本研フィルターで結合組織を除去し，遠心後の沈殿を究では，既存の食肉加工用酵素として知られていTEK 溶 液 で 穏 や か に 懸 濁 し た 。Myosin heavy

るパパインやブロメラインとともに同アスパル

chainおよびactinを主要なタンパク質として含む

ティックプロテアーゼについて筋原線維・筋形

筋原線維画分を，TEK溶液での懸濁と遠心によ成・結合組織タンパク質に対する分解特性を比較

る上清の廃棄を繰り返し，均質化した。

７）し，その潜在能力を明らかにすることを目的とす© The Ito Foundation

筋原線維タンパク質の調製

10

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

2 . 4 筋原線維・筋形成・結合組織タンパク質の加水分解と遊離ペプチドの定量

・溶離液：Solvent A：5 mM TFAおよびSolvent
B：5 mM TFA-アセトニトリル（４：６，v/

1.0％（w/v）基質タンパク質-50 mMリン酸ナ
トリウム-乳酸緩衝液（pH 5.0）3.6 mlに対して0.22％（w/v）プロテアーゼ溶液（精製rPepA，
パパインもしくはブロメライン）を添加し，30℃
で１時間反応を行った。基質は，ミオグロビン，
ヘモグロビン，コラーゲン，エラスチンおよび筋
原線維タンパク質である。遠心分離（18,000×g，
10 min，４℃）後，上清をSDS-PAGEおよびTricinev）
・溶 出 ： Sol. A-Sol. B（100 ： 0, v/v）→（75 min）
→Sol. A-Sol. B（0：100, v/v）
・流速：0.5 ml/min，
・検出：UV 280 nm
３．結果と考察3 . 1 筋原線維・筋形成・結合組織タンパク質の加水分解

SDS-PAGEに供した。また，上清を遠心濾過膜

rPepAは，ミオグロビンやヘモグロビンを限定（Amicon Ultra-30 kDa）にて通過液を回収し，分解する８）。対照酵素とともに遊離ペプチド量をペプチド量を定量するとともに，逆相クロマトグ

比較すると（Table１），ミオグロビンやヘモグロ

ラフィーに供した。ペプチド量は，GlyGlyGly換

ビンの加水分解時は，rPepAとブロメライン処理

算とした。

サンプルにおいて遊離量が同程度であったが，コ

2.5

タンパク質分解酵素を用いた牛肉の処理

ラーゲンやエラスチンといった繊維状タンパク質

牛もも肉を繊維方向に平行に切り出した肉片に対しては相違が見られた。SDS-PAGEでのバ（10（縦）×2（横）×0.5（厚さ）cm）および0.22％

ンドパターンを比較すると（Fig.１），rPepAを（w/v）プロテアーゼ溶液１mlをチャック付きポ添加した反応系では，限定・部分分解によると考

リ袋入れ，15℃で24時間放置後，溶液を回収した。

えられる高分子のバンド（Collagen，Elastin，

遊離したペプチド／タンパク質をSDS-PAGEに

Myofibrils，いずれもlane a）が多く見られた。

供した。プロテアーゼ溶液の代わりに50 mMリ

これらのバンドについてタンパク質同定を行った

ン酸ナトリウム-乳酸緩衝液（pH 5.0）を添加し（Table２）。エラスチン分解物からは構成タンパ

た反応系を対照とした。

ク質断片を検出できなかったが，Collagen加水分

2.6

遊離ペプチドの解析

解サンプルからはCollagen α-1（Ⅰ），Collagen

電気泳動は，ATTO社製の既製ゲル（P-T16.5S

α-2（Ⅰ），Collagen α-1（Ⅲ）が部分分解されおよびＥ-12.5％Ｌ）および泳動用緩衝液（AE-

た（ポリ）ペプチド断片を見出すことができた。

1415 EzRunTおよびAE-1410 EzRun）を用い，植物由来プロテアーゼ類を用いた筋原線維タンパ

同社提供のマニュアルに従って行った。メインバ

ク質画分（beef topside由来）の加水分解特性がンドについては，LC-MS/MS-Mascot解析に供調べられており９），加水分解物の電気泳動パター

し，Bos taurus由来ゲノムデータ（WSG project，ンからパパインやブロメラインはコラーゲン類やNKLS02）お よ び UniProtKB/Swiss-Prot デ ー タ

ミオシンやアクチンといった筋タンパク質類を分を参考にタンパク質同定を行った。また，逆相ク

解する９）。本研究とは基質画分の調製法や加水分

ロマトグラフィーの条件は以下である。

解反応条件が異なるが，パパインやブロメライン

・カ ラ ム ： COSMOSIL 5C18-AR-II （4.6 × 150

は筋原線維・筋形成・結合組織タンパク質に幅広

mm，ナカライテスク，京都）く作用したのに対し（Fig.１，２），rPepAはこれ© The Ito Foundation

11

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅱ）
Table 1 Hydrolysis of various natural proteins derived from beef meat.
Concentration of released peptides（mM）

Protease

Myoglobin

Hemoglobin

Collagen

Elastin

Myofibrils

rPepA

0.60±0.035

0.28±0.029

0.027±0.002

Bromelain
Papain0.60±0.078
0.34±0.047

0.31±0.022
0.21±0.006

0.068±0.004
0.036±0.002

0.049±0.004
0.23±0.012

0.20±0.007
0.63±0.030

0.084±0.003

0.35±0.021

Released peptide concentration was measured using ninhydrin method. Standard curve was created using
glycylglyclglycine.

Myoglobin Hemoglobin Collagen
M1

a

b

c a

b

c a

b

c

a

ElastinMyoﬁbrils

b

b

c a

c

M1

200
120
90
64
48

200
120
90
64
48

36

36

28

28

20

20

9

9

Fig. 1 SDS-PAGE analysis of hydrolysates from myoglobin, hemoglobin, collagen, elastin,

and myofibrils by rPepA（lane a）,papain（lane b）,and bromelain（lane c）.

Table 2 Identified released polypeptides from various natural proteins via hydrolysis by rPepA.
Substrate

Identified protein and its region

Collagen

Collagen α-1（I）（SwissProt no. CO1A1_BOVIN）
268Gly-276Lys, 352Gly-369Arg, 557Gly-630Arg, 751Gly-762Arg, 781Gly-795Arg, 984Asn-993Arg,
1062Ser-1092Arg
Collagen α-2（I）（CO1A2_BOVIN）
155Gly-163Arg, 411Ala-430Arg, 587Gly-608Arg, 692Gly-706Arg, 804Glu-829Arg, 973His-994Arg,
1066Ile-1079Arg
Collagen α-1（III）（CO3A1_BOVIN）
441Gly-454Lys

ElastinN.D.

Myofibrillar protein

Albumin（ALBU_BOVIN）
35Phe-44Lys, 66Leu-100Lys, 198Gly-204Lys, 286Tyr-298Lys, 347Asp-359Arg, 401His-412Lys,
421Leu-451Arg, 469Met-482Arg, 569Thr-598Lys

らのタンパク質に対する作用は限定的であり，食γ等のコラーゲン画分やMyosin heavy chains，

肉加工に同rPepAを用いた際，過剰な分解や肉組

actin，tropomyosin，troponin等約18種からなる

織が脆くなるといった可能性は低いことが裏付け

meat myofibril画分が得られることから，これらられた。Haらの牛由来タンパク質調製条件での画分を用いれば，rPepAにおけるmyofibrilタン

は ，Collagen tyepI α-1，chain A，chain B，

パク質の分解特性をより詳細に解析できると考え

９）© The Ito Foundation

12

令和２年度

M2

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Myoglobin Hemoglobin Collagen

Elastin

a

a

b

c

a

b

c a

b

c

b

Myoﬁbrils
c

a

b

c

M1
200
90
48

29

36
28

17

20

14.3

9

6.5
3.5
1

Fig. 2 Tricine SDS-PAGE analysis of small peptide fraction from myoglobin, hemoglobin,

collagen, elastin, and myofibrils by rPepA（lane a）, papain（lane b）, and bromelain（lane c）.

られる。

lane a）と対照（Fig.４，lane c）とは29 kDa以

3 . 2 加水分解によって生じるペプチド類の解析

上のタンパク質バンドが消失しつつあることが確認された。また，パパイン添加系では低分子領域

3 . 1 で調べたサンプルについてフィルターろ過（3.5～29 kDa）にスメア状の染色が見られ，ブロを行うことで分子質量30 kDa以下のペプチド／

メライン添加系では，高分子のタンパク質バンド

タンパク質を回収した。Tricine SDS-PAGEでのが減少し，さらに低分子領域（3.5から6.5 kDa）

バンドパターンを比較するとともに（Fig.２），に ス メ ア 上 の 染 色 が 見 ら れ た（Fig. ４ ，lanerPepAによる加水分解で生じたペプチドについてb&c）。肉の軟化処理をAspergillus由来アスパル

逆 相 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に 供 し た（Fig. ３）。

ティックプロテアーゼ（研究対象肉，牛もも肉，

SDS-PAGE （低 分 子 量 領 域） と Tricine SDS-

肩ばら肉）10）やRhizomucor miehei由来アスパル

PAGEのバンドパターンにおいて相違が見られる

ティックプロテアーゼ（豚肉）11）とパパインでのは，フィルターろ過によるものと考えられる。

行って比較し，処理肉の剪断力（Ｎ）は同程度にHPLCクロマトグラムから（Fig.３），前報で述なると報告されている。しかし，プロテアーゼがべたようにミオグロビン由来加水分解物からは，

筋原線維・筋形成・結合組織タンパク質いずれに類似したリテンションタイムにピークが多数観察

対して働くかの詳細は明らかではない。食肉の硬された。また，サンプル量と感度の関係でＮ末端さは，筋原線維タンパク質（主にアクトミオシ

アミノ酸配列決定ができなかったが，筋原線維画ン）と 結 合 組 織（コ ラ ー ゲ ン）に 起 因 す る 。

分加水分解物からは，特徴あるピークが観察され

rPepAは，コラーゲンやエラスチンといった繊維た。

状タンパク質をおおまかに部分分解（限定分解）

７）

3 . 3 牛もも肉の酵素処理によって生じるペプ

しており（Fig.１，２），今後，アクトミオシンに対する分解特性や酵素処理した肉の剪断強度等のチド／タンパク質の解析
可溶性タンパク質のバンドパターンから分解度関連性を明らかにすることで，rPepAが食肉軟化を比較すると，rPepAを添加した反応系（Fig.４，剤としての有用性を訴求できる知見が得られると© The Ito Foundation

13

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅱ）
150

150

（d）

（a）

100

mV

mV

100

50

0

0

10

-50
150

20

30

40

10

20

30

40

50

40

50

Time（min）

150

（e）

（b）

100

mV

mV

0

-50

Time（min）

50

0

10

-50
150

0

50

100

0

50

20

30

40

50

50

0

0

-50

Time（min）

10

20

30

Time（min）

（c）

mV

100

50

0

0

10

-50

20

30

40

50

Time（min）

Fig. 3 HPLC analysis of small peptide fraction from myoglobin（a）, hemoglobin（b）, collagen（c）, elastin（d）, andmyofibrils（e）by rPepA.

考えている。
４．要

といったおいしさを決める要因を向上しながら熟成期間を短縮化することが重要である。肉質改善

約法の１つとして酵素処理法があげられる。申請者

香味や食感に優れた食肉やハム，ソーセージ，

オリジナルのアスパルティックプロテアーゼ

ベーコン等の食肉加工品を効率よく製造するため（PepA）は，ミオグロビンに対して限定分解を示には，「肉の柔らかさ」，「くちどけ」，「うま味」

す。本研究では，植物系プロテアーゼと比較しな© The Ito Foundation

14

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

M1 C

a

b c M1

200
120
90
64

M2 C

a

b c M2

29

48
36

17

28

14.3

20
9

6.5
3.5
1

Fig. 4 The ability of rPep A（a）
, papain（b）, and bromelain（c）to hydrolyze meat withanalysis by SDS-PAGE. #lanes：C, control（without protease treatment）；a, rPep A
treatment; b, papain treatment；c, bromelain treatment.

がら，同PepAについて筋原線維・筋形成・結合
組織タンパク質および牛もも肉に対する分解活性を調べ，食肉加工への潜在能力を明らかにすることを目的とした。加水分解物の電気泳動パターン
から，植物系プロテアーゼが筋原線維タンパク質
や結合組織タンパク質を低分子量ペプチドまで非限定的に分解するのに対し，PepAは前報で考察したようにこれらのタンパク質を限定分解していた。遊離した限定分解物について配列同定を行った結果，確かに，コラーゲンタンパク質の分解物であることが分かった。また，牛もも肉からの分解物の解析からもPepAによる分解は予想どおり
限定的であることが分かった。今後，アクトミオ
シンや酵素処理した食肉の剪断力・テクスチャーを比較することで，食肉加工・熟成工程における熟成の短縮化，呈味性や食感の向上への寄与を明らかにできると考えられる。

文献１）
 味の素株式会社，特開平05-007476
２） 昭和産業株式会社，特開平05-252911
３） エーザイ株式会社，特開平06-169729
４）
 Flores, M., Toldrá, F.：Trends in Food Science &Technology, 22, 81～90, 2011.
５） 阿部真紀，秋田修：塩麹に含まれる麹由来酵素および食塩の食肉調理への効果，日本醸造協会誌，
114, 258～267, 2019.
６）
 Aoki, K., Matsubara, S., Umeda, M., Tachibanac, S.,
Doi, M., Takenaka, S.：J. Sci. Food Agric., 93, 1349
～1355, 2013.
 竹中慎治：微生物由来アスパルティックプロテ
７）
アーゼを利用した食肉加工技術の開発，平成31年度（令和元年度）食肉に関する助成研究報告書，38, 9～14, 2020.
 Takenaka, S., Umeda, M., Senba, H., Koyama, D.,
８）
Tanaka, K., Yoshida, K., Doi. M.：J. Sci. Food
Agric., 97, 95～101, 2016.
９）
 Ha, M., Bekhit, A. E. D. A., Carne, A., Hoplins, D.
L.：Food Chem., 134, 95～105, 2012.
 Ashie, I. N. A., Sorensen, T. L., Nielsen, P. M.：J.
10）
Food Sci., 67, 2138～2142, 2002.
11） Sun, Q., Chen, F., Geng, F., Luo, Y., Gong, S.,
Jiang, Z.：Food Chem., 245, 570～577, 2018.

© The Ito Foundation

15

牛枝肉のモモ抜けの非破壊検査用磁気共鳴スキャナーの開発
Development of a magnetic resonance scanner for the nondestructive
quantification of fat contents of the beef round in a carcass

中

島

善

人１・柴

伸

弥２

（１国立研究開発法人産業技術総合研究所地質調査総合センター，
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター）

２

Yoshito Nakashima１ and Nobuya Shiba２（１National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Geological Survey of Japan,
２National Agriculture and Food Research Organization（NARO）, Tohoku Agricultural Research Center）

The fat content of beef meat significantly affects consumers’ sense of taste and determines
price. Thus, it is desirable to nondestructively and noninvasively measure the fat content of abeef round, a large portion of a carcass, using hand-held sensors at meat processing plants toaccurately assess the value and price of the carcass. For this in-situ fat quantification of beefround in a carcass, the applicability of a single-sided nuclear magnetic resonance（NMR orMR） scanner is examined. The MR scanner enables us to measure fat contents
nondestructively and noninvasively by analyzing the time-series proton relaxation data
derived from the fat molecules. An original planar radio-frequency coil（1.3 kg）was developed,
and combined with a single-sided Nd-Fe-B permanent magnet（3.7 kg）to be used as a sensor
unit of 5 kg. The specification of the MR scanner is as follows. The sensed region is located at
4 to 15 mm（width, 15－４＝11 mm）distant from the surface of the scanner, which is sufficient
to probe the meat section beneath the underlying subcutaneous fat layer of 4 mm in thickness.
The three-dimensional size of the sensed region is 14 x 15 x 11 mm3. The MR scanner was
successfully applied in a laboratory to 26 packed beef meat samples to measure the fat content.
The required measurement time was 36 s for each sample. The results of MR scanning werecompared with those of conventional destructive food analysis（i.e. Soxhlet extraction method）.
Reasonable agreement with an error（root-mean-square residual）of as small as 4.8 wt％ was
obtained for fat quantification. This reasonable agreement demonstrates that the portable MR
scanner with a hand-held sensor unit developed is a promising tool for the in-situ
nondestructive and noninvasive fat quantification of beef round in a carcass.

１．目

脂肪交雑判定は，枝肉の第６-７肋骨間の切開面

的のみで実施されている。このため，産肉量の多い

牛肉の脂肪交雑すなわち脂肪含有量は，食味ひモモなど他の部位の脂肪交雑度が正しく評価されいては価格を左右する重要な特性である。現行のていないという問題がある。枝肉のモモ抜け（モ© The Ito Foundation

16

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

モ肉に脂肪交雑が伸びているかどうか）を定量的

測所要時間は40秒以内とする（手で持てる小型セに評価できる非破壊・非侵襲計測技術があれば，ンサーユニットの開発に関する直近の論文４）では枝肉全体の脂肪交雑をより高い信頼度で評価でき100秒なので，それを上回るスペックに設定した）。

ることになり，枝肉評価の進展に大きく貢献でき
る。

２．方

法

脂肪分子中のプロトンを計測対象にした核磁気高周波コイルは当該研究予算で購入した備品で共 鳴 計 測 法 （Nuclear Magnetic Resonance,

あるが，その設計・製作・評価は，以下の手順でNMR. あるいは略してMagnetic Resonance, MR）

実施した。希土類永久磁石が周囲の空間に作り出は，静磁場のもとで歳差運動をする軽水素の原子

している３次元磁場分布データをもとに，コイル

核（プロトン）の挙動を共鳴周波数に該当するラの感度領域（静磁場と高周波磁場ができるだけ均

ジオ波で検出する手法であり，脂肪定量計測の国

一な領域）が上記の目標（ⅰ）をクリアできるよ

際純正・応用化学連合（IUPAC）公定法としてうにコイルの形状や大きさを設計した。コイルの有用性が広く確認されている。この計測法をさら

基本デザインは，先行研究４）の「Ｄ型」の平面コに改良して，片側開放型１～５）とよばれる特殊な構

イルを向かい合わせた「ダブルＤ型」といわれる造の磁気回路と高周波コイルをセンサーユニット

平面型（Fig.１）にした。完成したコイルの感度として採用すれば，計測対象をカットしてサンプ

領域のサイズや探査深度を確認するために，厚さル管に挿入する必要はない。枝肉のような大きな

１～２mmの薄いシリコンゴムをコイル上に順次

物体表面に磁気共鳴センサーを聴診器のように当積み重ねていき，MR信号強度の増加挙動を計測てるだけで，物体表面から数mm～数cm深部のする実験３～５）を行った（この手法では，規格化し部位の脂肪含有量を非破壊・非侵襲で定量できる。

たシリコンゴム層の信号強度が10％～90％に対応

そこで，本研究では高周波コイルを新規に製作するゾーンを感度領域と定義している）。

したうえで，牛肉サンプルの脂肪含有量を片側開完成したコイルを永久磁石に取り付けて，

放型磁気共鳴スキャナー（MRスキャナー）で実

BNCケーブル経由でMRコンソール（MR分光計

測し，モモ抜け評価への適用可能性を評価する研本体）に接続して計測システムとなした。牛肉サ究を行った。スキャナー開発の具体的な数値目標

ンプルについては，農研機構の研究分担者が提供は以下のとおり。（ⅰ）センサーの感度領域の大したモモ肉サンプル（真空パック状態）13個のプ

きさは信号・ノイズ比を改善するためにできるだ

ロトンMR緩和波形データを取得した（Fig.２）。

け大きく，具体的には12 x 12 x 4 mm 以上の直ほかにもつくば市内の小売店で購入した国内外の方体であること。そして，感度領域の位置はコイ

牛肉サンプル13個，合計26個を計測した。計測時

ル表面から４mm以遠であること。つまり，モモのサンプル温度は約30℃であった。

３

具体的なMR計測・データ解析作業は先行文の部位にセンサーを当てた状態で，厚さ最大４mmの皮下脂肪より奥の部位の筋肉組織中の脂肪献を定量できること。（ⅱ）センサーユニット（永り。パルスシーケンスはCarr-Purcell-Meiboom-

久磁石と高周波コイル）は，手で持てる重さ（５Gill（CPMG）法を採用し，そのエコー間隔は0.5kg程度）であること。（ⅲ）計測所要時間は短い

ms，高周波パルス幅は0.06 ms，ラーモア周波数

ほど実用的であるが，目安として肉の１部位の計は4.5 MHz，シーケンス繰り返し間隔は２秒，積２～４）© The Ito Foundationに準じて実施したが，概略は以下のとお

17

牛枝肉のモモ抜けの非破壊検査用磁気共鳴スキャナーの開発
a

b

y

t

gne

ma

z

x

coil

BNC cable
Fig.１ Photo of the sensor unit（permanent magnet and radio-frequency coil）used in thisstudy.（a）Hand-held shot.（b）Front view. While the z axis is normal to the coil, the x
and y axes are parallel to the plane coil.

absamplesamplesensor unit

C
BN

le

cab

MR

BNC
co

cable

ns

ole

sensor unit

Fig.２ Photo of an experiment using the single-sided MR scanner system. A packed meat sample is being

measured on the sensor unit.（a）Long shot.（b）Magnification of（a）.

算回数は18回とした（したがって，１部位の計測

間）。

所要時間は２ｘ18＝36秒となり，40秒以内という目標をクリアしている）。MR計測が終われば，（t）
f =Afat exp（－t/94）＋Alean exp（－t/43） （１）感度領域をカバーする肉の部位を切り取り（切り取ったサイズは約４x４x２cm３），ソックスレー
抽出法による通常の食品分析を行った。

ただし，式（１）においてAfatとAleanは，それぞれ脂肪分子と赤身中の水分子のプロトンの得られた牛肉のプロトンMR緩和波形データf

CPMG信号への寄与度であり，最小自乗法で決定（ t ）には脂肪分子由来のMR緩和信号（時定数94する。そののちに，上記のソックスレー抽出法にmsで減衰）と筋肉中の水分子由来のMR緩和信号

よる脂肪含有量の分析結果とAfat との関係を式（時定数43 msで減衰）が混在しているので分離（２）でモデル化して検量線となした４）。

する必要がある。その分離作業は，先行文献４）に準じて以下のように実施した（ t はms単位の時© The Ito Foundation

18

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Fig.２の計測システムで計測した肉サンプル内（1.06Bfat wfat）
Afat＝（92＋0.14wfat）（２）部構造の例をＸ線CT画像としてFig.３に示す。
そのサンプルは皮下脂肪が厚さ４mm程度ある

ただし，式（２）において，wfatはソックスレー

が，センサーの感度領域は皮下脂肪を外している抽出法による脂肪含有量のwt％値，Bfatは最小自ので，MR計測で得られた脂肪含有量は筋肉内の乗法で決定されるパラメタである。最後のステッ

脂肪含有量（脂肪交雑としての脂肪含有量）といプとして，決定したBfat値をもちいて式（２）にえる。この例のように，皮下脂肪の厚みが４mm

基づいてAfat をMR法による脂肪含有量の推定値より薄い箇所については，当該装置は枝肉の脂肪に換算し，ソックスレー抽出法による結果と比較

含有量の評価用途として使えそうといえる。
得られたCPMG時系列生データの例をFig.４にした。

示す。ノイズがあるのでデータ点はばらついてい３．結果と考察るが，式（１）による２つの指数関数的減衰モデ製作した高周波コイルを搭載したセンサーユ

ルで最小自乗解析することでAfatを得ることがでニットをFig.１に示す。図中のBNCケーブルを除きた。合計26個のサンプルを計測して得たAfatをいた高周波コイルの重量は1.3 kgであった。希土

ソックスレー抽出法の結果と対応させたグラフを

類永久磁石重量が3.7 kgなので，センサーユニッ

Fig. 5aに示す。Fig. 5aには，式（２）による検量

ト全体では1.3＋3.7＝5.0 kgとなり目標（５kg程

線も描いてある。この検量線をもちいて，MRス度）を達成している。また，シリコンゴムを用いキャナーによる脂肪含有量を推定した。その値とた感度分布計測実験結果によれば，感度領域はコ

ソックスレー抽出法の結果をクロスプロットした

イル表面から４～15 mm離れた空間にあり（しものがFig. 5bである。計測誤差の目安としての根たがって，その幅は15－４＝11 mm），３次元的

平均自乗残差を26個のデータについて算出するな感度領域のサイズはFig. 1bの座標系でいえばと，4.8 wt％であった。いっぽう27個のクロマグ

x ，y ，z 軸方向にそれぞれ14 x 15 x 11 mm３であっロサンプルの脂肪含有量の片側開放型MRスキャた。これらの数値も目標（12 x 12 x 4 mm 以上）

ナ ー に よ る 計 測 で は ，根 平 均 自 乗 残 差 は 約 ２をクリアしている。

wt％であった４）。4.8 wt％は２wt％よりは若干悪３subcutaneous fat

sensor unit

meat

2cm

sensed region

Fig.３ Two-dimensional X-ray CT image of a meat sample with asubcutaneous fat layer. The sensed region（11 mm x 15 mm）
is indicated by a rectangle. The supposed position of thesensor unit based on Fig. 2b is superimposed.

© The Ito Foundation

19

牛枝肉のモモ抜けの非破壊検査用磁気共鳴スキャナーの開発
12000
10000

MR signal, f（t）

8000
6000
4000
2000
0
－2000

0

100

200
300
time, t（ms）

400

500

Fig.４ Example for the time-series CPMG data of a meat sample measured by thesystem of Fig. 2. Equation（1）was fitted to the data by a solid line.

い結果であるが，電波シールド布で囲うなどの電モニタリングをすることもできるであろう。特に磁波ノイズ対策を実施すれば ，Fig.４のノイズ

皮下脂肪が薄い家畜については，生体でも脂肪含も低下することが期待される。ノイズレベルを低

有量を非侵襲計測できる可能性もある。さらに，下させることができれば，計測所要時間（本研究

ヒトの臨床応用で汎用されているように，Fig.４

では１部位36秒）の短縮も可能と思われる。こののプロトン緩和波形は，組織の病変を検出できる

電磁波ノイズ対策は今後の課題ではあるものの，可能性もあるので，家畜の健康診断にも使えるで今回開発したMRスキャナーは，１部位の計測所あろう。このように，今回開発したMR装置は畜

要時間36秒でコイル表面から４～15 mm離れた産業への広大な適用ポテンシャルを持っている。

２）

位置の肉の脂肪含有量を誤差4.8 wt％で計測することができた。つまり，本研究によって枝肉のモ
モ抜けの評価用としての適用可能性を示すことが４．要

約

枝肉のモモ抜けを定量的に非破壊評価するための，片側開放型磁気共鳴スキャナーを開発した。

できた。
今回の研究の将来展開として，以下を提案した

今回新たに設計・製作した高周波コイルをセンい。開発したシステム（Fig.２）は，キャスター

サーユニットに搭載したスキャナーシステムのスがついており（ポータブル）しかも通常の100Ｖペックとしては，センサーユニットの総重量は５商用電源で駆動できる。よって，全国の食肉処理

kg，センサーの感度領域の３次元サイズは14 x

施設・保管倉庫等に搬入して枝肉のモモ抜けなど

15 x 11 mm３，特に深度方向の感度としてはコイの原位置・非破壊・非侵襲評価を行うことができ

ル表面から４～15 mm離れた位置（幅11 mmのるであろう。また，ハムやソーセージなどの畜肉ゾーン）の肉の脂肪含有量を計測できる。１部位製品の加工ラインに常設して脂肪含有量の非破壊の計測所要時間36秒で合計26個の牛肉サンプルを© The Ito Foundation

20

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Afat（NARO）
Afat（local store）
ﬁtted by Eq.（2）

ａ
10000
8000

Afat

6000
4000
2000
0
-2000

0

20
40
60
fat by the Soxhlet extraction method（wt%）
fat by MR scanning（wt%）NARO
fat by MR scanning（wt%）local storeｂ
60

fat by MR scanning (wt%)

50
40
30
20
10
0
-10

0

10
20
30
40
50
60
fat by the Soxhlet exraction method（wt%）

Fig.５ Summary of the fat quantification by the single-sided MR scanner. “NARO” and “local store” refer to samples

provided by the National Agriculture and Food Research Organization, and samples purchased at local stores in
Tsukuba city, respectively.（a）Calibration curve. The quantity Afat determined by Eq.（1）was plotted against thefat content（wfat）by the conventional Soxhlet extraction method. The calibration curve, Eq.（2）, was fitted to thedata by a solid line.（b）Cross-plot of the fat content measured by the MR method against the Soxhlet extraction
method. The solid and dotted lines refer to the discrepancy of 0 and ±5 wt％, respectively.

計測した結果，誤差4.8 wt％で脂肪含有量を定量の評価用としての適用可能性を示すことができた。

することができた。このように，本研究によって片側開放型磁気共鳴スキャナーの枝肉のモモ抜け© The Ito Foundation

牛枝肉のモモ抜けの非破壊検査用磁気共鳴スキャナーの開発
文
献１） 中島善人：産業技術総合研究所地圏資源環境研究
部門十大ニュース2020, p5, 2021.
２） Nakashima, Y.：Journal of Aquatic Food Product
Technology, 28, 241～252, 2019.
３） Nakashima, Y., Sawatsubashi, T., Fujii S.：

21

International Journal of Coal Preparation andUtilization（in press）,2021.
４）
 Nakashima, Y.：Journal of Food Measurement
and Characterization, 14, 2947～2955, 2020.
５）
 Nakashima, Y.：Applied Magnetic Resonance, 46,
593～606, 2015.

© The Ito Foundation

22

イミダゾール化合物が食肉の熟成に及ぼす影響について
Effect of imidazole compounds on the aging of meat

早

川

徹

（北海道大学大学院農学研究院）

Toru Hayakawa（Hokkaido University, Research Faculty of Agriculture）

Carnosine is a dipeptide, consisted of β-alanine and L-histidine, and is abundant inskeletal muscle. In order to elucidate the role of carnosine in the transition from skeletal muscle
to meat, this study focused on calpain, a Ca2＋ ion concentration-dependent proteolytic enzyme,
to investigate whether it is involved in the tenderization process after rigor mortis. Proteaseactivity of calpain was evaluated by measuring the absorbance of the reaction solution with 10
mM carnosine and 0-1.0 mM CaCl2. In the absence of carnosine, the absorbance increasedslightly. In the presence of carnosine, the absorbance after 7 days reaction increased comparedwith that in the absence of carnosine. SDS-PAGE also showed protein degradation of
myofibrillar proteins by calpain, but the degraded proteins could not be identified. These
results suggested that the addition of carnosine accelerated the degradation of myofibrillar
proteins by calpain under low Ca2＋ ion concentration conditions. In this study, it could beclarified that carnosine activated the proteolysis of calpain．

１．目

であるミオシンのカルシウム感受性を向上させて的いるためであると考えられている１）。このようにイミダゾール化合物はイミダゾール環と呼ばれカルノシンの機能には不明な部分が多く，新たなる五員環構造を含む化合物を指し，骨格筋および機能を明らかにすることで，骨格筋に豊富に存在

食肉においては，βアラニンとヒスチジンからなする理由も解明されるだろう。

るジペプチドであるカルノシンが豊富に存在する

一方，骨格筋には種々のタンパク質分解酵素がことが知られている。イミダゾール化合物の生理存在する。これらの酵素は代謝に寄与するだけで的な役割については，緩衝作用や抗酸化作用を有なく，死後の硬直状態にあった骨格筋を軟化し，するために細胞内の恒常性維持に寄与していると食肉として適した硬さにするとされている。なか考えられている。また，近年，筋線維モデルを用でも，カルパインはカルシウムイオン濃度に応じいた検討で，カルノシンが骨格筋の収縮運動を活て分解活性が変化し，死後にカルシウムイオン濃性化させるという報告がなされ，これはカルノシ

度が上昇することで活性化され，骨格筋の軟化，ンの存在により筋収縮に関与しているタンパク質

つまり食肉の熟成に関与しているとされてい© The Ito Foundation

イミダゾール化合物が食肉の熟成に及ぼす影響について

23る２）。しかしながら，死後のカルシウムイオン濃で分解反応を開始させた。反応溶液の組成は，い度では活性化されないカルパインも存在するた

ずれも終濃度で，0.5 M NaCl，０～1.0 mM CaCl2，

め，カルパインの熟成への関与については明らか

100 mM Tris-HCl pH 6.5とし，カルノシン（終になっていない部分も多い。

濃度10 mM）の添加したものをCAR群，無添加

そこで，カルノシンが死後骨格筋におけるカルのものを対照群とした。カルパイン添加の前にパインの活性を制御していることを明らかにし，30℃に設定したインキュベーター内で10分間プレ

カルノシンの食肉の熟成への関与について検討すインキュベートし，反応開始後も同インキュベーる。

ター内で保持した。反応時間は０，１，３，および

２．方
2.1

７日間とした。反応の停止は同量の10％トリクロ法

ロ酢酸を加えることで行った。反応停止後，４℃

試料調製

で15分間静置し，上清の280 nmにおける吸光度

カルパインはColleとDoumitの方法にならい調を測定した。

製した 。ひき肉にした鶏浅胸筋に対し，３倍量2.3の 抽 出 液 （100 mM Tris ， 10 mM EDTA ， 10

上記の分解反応において，反応停止前に一部をmM DTT，pH 8.3）を加え，ホモジナイズした

サンプリングし，SDS-PAGE用の試料処理を行っ

のち，8,800Ｇで30分遠心分離した。上清を回収し，た。電気泳動には，４％ポリアクリルアミドの濃牛乳ろ紙でろ過したろ液をカルパイン溶液とし縮ゲルと12％の分離ゲル，およびLaemmliの泳動た。カルパイン溶液に30％グリセリンとなるよう

用 緩 衝 液 を 用 い た 。 泳 動 後 の ゲ ル は 0.1 ％

十分冷却したグリセリンを加え，十分に混和し，Coomassie Brilliant Blue R-250溶液で染色し，現分注したものを液体窒素中で急速凍結し，使用時れたバンドを目視で確認した。

３）まで－80℃で保存した。
筋原線維タンパク質は，新鮮な鶏浅胸筋から

SDS-PAGEによるタンパク質分解の確認

３．結果と考察

Hasselbach-Schneider溶液により抽出し，調製しタンパク質の分解の指標とした吸光度は，カルた。鶏浅胸筋をひき肉にし，10倍量の蒸留水を加ノシンおよびCaCl2 無添加の条件においても反応

えホモジナイズ（10,000 rpm，30 sec）した。遠日数を経るごとに緩やかに上昇した。これは反応

心分離後（19,000Ｇ，20 min）
，上清を捨て，得液に混入するカルシウムイオンの影響と考えられられた沈殿に15倍量のHasselbach-Schneider溶

る 。ま た ，カ ル ノ シ ン を 含 ま な い 条 件 で は ，液（0.6 M KCl，１mM MgCl2，10 mM Na4P2O7，

CaCl2の添加によっても吸光度の変化に差はなく，0.1 M K-phosphate，pH 6.4）を加え，同様にホ1.0 mM程度のカルシウムイオン存在下では，カモジナイズした。懸濁液を冷蔵室にて12時間振とルパインによるタンパク質分解反応は促進されなうした後，遠心分離（19,000Ｇ，20 min）によっいことが分かった。一方，カルノシン存在下では，て得た上清を筋原線維タンパク質とした。

1.0 mMのCaCl2添加でも，無添加区およびカルノ

2 . 2 カルパインによる筋原線維タンパク質のシン不在下との吸光度の差は反応３日目まで見られなかったが，反応７日目においては，0.2 mM

分解
筋原線維タンパク質を含む反応溶液（タンパクのCaCl2添加でも吸光度は上昇し，1.0 mMのCaCl2

質濃度1.0 mg/ml）にカルパインを添加すること

添加ではさらに吸光度の上昇が見られた。つま© The Ito Foundation

24

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

り，カルノシン存在下では，CaCl2 濃度依存的にが考えられる。つまり，今回得られた結果は，カ吸光度の上昇が見られ，カルノシンによってカル

ルパイン-１によるタンパク質分解が主な要因でパインのタンパク質分解酵素活性が活性化されたあるだろう。上述のようにカルパイン-１の活性と考えられる。

化にはmMオーダーのCa2＋イオンが必要であるにカルパインが筋原線維のどのタンパク質を分解も関わらず，カルノシン存在下では1.0 mMだけしているのかを調べるために，分解反応後のタンでなく0.2 mMのCaCl2を添加した場合でもタンパ

パク質溶液をSDS-PAGEに供した。カルノシン

ク質分解の上昇が見られた。このことは，カルノを含まない条件では，CaCl2 濃度にかかわらず得シンがカルパイン-１のカルシウム感受性を高め，られたバンドパターンに差異は見られなかった。

低濃度のCa2＋イオン存在下でも活性化されたためカルノシン存在下ではCaCl2 濃度依存的にタンパであると考えられる。

ク質が分解されている様子が見られた。しかし，反応液中の筋原線維タンパク質濃度が，粗抽出し４．要約

たカルパイン溶液中の夾雑タンパク質の濃度に比本研究は，骨格筋中に豊富に含まれるカルノシ

べて低く，分解されたタンパク質の同定には至らンが骨格筋から食肉への転換期においてどのようなかった。

な役割を担っているのかを解明するために，死後骨格筋に含まれるカルパインには，mMオー

硬直からの軟化（熟成）に関わっているのかどう

ダーのCa イオン存在下で活性化されるカルパイ

かについて，Ca2＋イオン濃度依存性のタンパク質

ン-１と，μＭオーダーのCa2＋ イオン存在下で活分解酵素であるカルパインに着目し検討した。カ

性化されるカルパイン-２などがある。しかし，ルノシンの添加により，カルパインによる筋原線

骨格筋中のCa イオン濃度を考慮するとタンパク

維タンパク質の分解が促進され，また低Ca2＋イオ

質分解に寄与しているのはカルパイン-２であるン濃度条件においてもタンパク質分解が確認されとされてきた。本研究では，鶏浅胸筋より粗抽出た。つまり，カルノシンがカルパインのタンパクしたカルパインを用いたため，これら２種類のカ質分解を活性化させたことが示された。

2＋2＋ルパインが含まれていると考えられる。しかしながら，カルノシン不在下で１mM CaCl2を添加した場合でもカルパインによるタンパク質分解が見られなかったことから，今回の実験系ではカルパ
イン-２による影響はないと考えられる。この原因としては，カルパイン溶液にカルパイン阻害物質であるカルパスタチンも同時に抽出されたこと

文献１）
 Dutka, Travis L., Graham, D. Lamb：Journal of
Muscle Research and Cell Motility, 25, 203～13,
2004.
２）
 Pomponio, Luigi, René Lametsch, Anders, H.
Karlsson, Leonardo Nanni Costa, Alberto Grossi,
Per Ertbjerg：Meat Science, 80, 761～64. 2008.
３）
 Colle, M. J., M. E. Doumit：Meat Science, 131, 142～45. 2017.

© The Ito Foundation

25

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅲ）
Clarification of the enhancement mechanism of “koku attributes” by lipids
in pork sausages（Ⅲ）

西

村

敏

英・山

口

千

里

（女子栄養大学栄養学部）

Toshihide Nishimura and Chisato Yamaguchi（Faculty of Nutrition Science, Kagawa Nutrition University）

It is well known that pork sausage is very popular as one of delicious foods. Recently, it
has been shown that lipids in pork sausage give us Koku attributes such as mouthfulness andlastingness in the flavor sensation.
In the previous research, the analyses of aroma compounds of smoked and non-smokedpork sausages showed that common aroma compounds were clarified to be β-Pinene, 3-Carene,
D-Limonene, Octanal, Nonanal, Caryophyllene, Methyl eugenol, Hexanoic Acid, 2-Hydroxy-3methyl-2-cyclopentenone, Guaiacol, 4-ethyl-2-Methoxyphenol, 1, 2, 4-Trimethoxybenzene,
m-Cresol, Eugenol, and 2, 6-Dimethoxyphenol. In this research, we tried to clarify which lipid
in sausages hold these aroma compounds.
The holding capacity of lipids was evaluated by the measurement of amounts of aroma
compounds released from the mixture containing each lipid after heating it. Triolein, one oftriacylglycerols in pork sausages did not hold aroma compounds, while cholesterol and lecithin
held them. Among 13 aroma compounds identified in pork sausages, β-Pinene, 3-Carene,
D-Limonene, Octanal, Nonanal, Caryophyllene, and Methyl eugenol were held with cholesterol
and lecithin. Furthermore, lecithin held these aroma compounds much larger than cholesterol.
However, Hexanoic Acid, Guaiacol, 4-ethyl-2-Methoxyphenol, 1, 2, 4-Trimethoxybenzene,
m-Cresol, and Eugenol were not held with cholesterol and lecithin. The difference in thebinding property of aroma compounds with these lipids seems to be caused by the differencesin log P（octanol/water partition coefficient）that each aroma compound possess. Seven
compounds that held with lipids possessed log P with value more than 3.

目として，コクがよく使われている。これまでコク的の定義がなかったことから，我々は，コクを「味，ポークソーセージは，食品の中でもとりわけ美香りならびに食感のすべての刺激で形成される総味なものの１つであり，そのおいしさは，うま味，

合感覚であり，多くの刺激で形成される「複雑独特の香りならびに食感によることはよく知られさ」，その刺激が口腔内で膨らむ「広がり」ならている。また，最近，食品のおいしさを示す言葉

びに，それが持続する「持続性」の３要素（基本© The Ito Foundation

26

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）コク）で形成されるものである」と定義した１～５）。

香辛料由来であると推察された。スモークドソー

３要素のうち，複雑さは，熟成，発酵，加熱など

セージではこれらに加えて，燻煙由来のポークソーの処理により形成される。その複雑な刺激の広がセージを特徴付ける香気成分としてp-Cresolとりと持続性を増強する物質として，うま味物質と2, 6-Dimethoxy-phenolの存在が明らかになった。

脂質が重要な役割を果たしていることを明らかに

ポークソーセージの製造では，調味料としてうしてきた。さらに，コクのある食品に関して，

ま味物質を添加すると同時に，適量の脂肪を添加

コクの形成・増強因子とその形成メカニズムを研していることから，これらの物質によるコク形究している。ポークソーセージの製造工程では，成・増強メカニズムに焦点を当てて研究を実施しうま味物質や脂肪を添加していることから，ポーている。先の研究12～15）において，ポークソーセー

クソーセージはコクのある食品といえる。

ジの食味性を官能評価で解析し，ポークソーセー

６～９）

筆者らは，ポークソーセージの食味性に関する

ジの官能的特徴として，うま味，持続感，濃厚な研究をスタートさせた。食品のおいしさを決める

味，広がりのある味，深みのある味，香ばしい，要因の中で，香りは特に重要である。食肉製品の後をひく香り，広がりのある香り，スモーキー，

香 気 に 関 す る 研 究 で は ， Mottramやスパイシーな香り，弾力，歯ごたえ，ジューシー，Ramarathnam11）の報告により，硝酸アルキル，

プリプリなど，全部で22項目の用語を見出し，ベンゾニトリル，フェニルアセトニトリル，４-

ポークソーセージの食味性には，コクに当てはま

メチル-２-ペンタノン，２-ブチル-２-オクテる感覚が存在することを明らかにした13）。また，

ナールなどの香気成分が亜硝酸塩を添加したもの

ソーセージに添加されているうま味物質は，ポーから多く検出されることが明らかになっている。

クソーセージの口中香を強く感じさせると同時

また，塩漬肉特有のフレーバーは，亜硝酸塩の脂に，風味の複雑さや味の持続性を強く感じさせる

質酸化抑制作用による香りであるとの報告がある

ことから，コク増強物質であることが判明した。

が，完全に解明はされていない。このような背景

このように，ポークソーセージが，特徴的な香りから，まず，スモークドポークソーセージとノンを有する複雑さを示し，味わいに広がりや持続性

スモークドポークソーセージから抽出した香気成を有するコクのある食品であることを明らかにし分を臭いかぎガスクロマトグラフィー（GC-O）

た。さらに，ソーセージの製造時に添加する脂肪と質量分析ガスクロマトグラフィー（GC/MS）

が，ソーセージの食味性に与える影響を調べ，添で解析し，ポークソーセージの特徴的な臭いに寄加する脂質含量を増やすと，うま味や塩味を増強

与する候補成分を特定した 。ノンスモークドするだけでなく，風味の広がりや持続性を強め，

ソーセージでは16種類の香気成分が検出され，コクを増強することが明らかになり，脂質がソー

GC/O分析を用いたAEDA法により，16成分のうセージの香気成分を保持していることが推察され

ち ，β-Pinene ，3-Carene，D-Limonene，Acetic

た９，15）。そこで，ヒトがソーセージを咀嚼した時

acid，Copaene，Methyl eugenol が ，ノ ン ス モ ーの香気成分の放出を模倣し，十分にすりつぶした

クドソーセージの特徴的な臭いに寄与する候補成ソーセージに生理食塩水を添加した時の香気成分分として特定ならびに同定された。これらの６成の放出量が，脂質の添加によって変化するか否か

分は，スモークドソーセージにおいても検出されを調べた結果，脂肪無添加および脂肪添加スモーていたことから，すべて原料の豚肉由来，またはクドポークソーセージからは，主な香気成分とし

10）

12）

© The Ito Foundation

27

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅲ）て， β-pinene， 3-Carene， D-Limonene，

実験方法

Caryophylleneが検出された。これらの４つの成（１） 試薬分は，いずれも脂肪添加製品からの放出量が，脂トリオレインとコレステロール（純度99％以

肪無添加製品からのものより約２～４倍多いこと

上）はSigma社から，メチルプロピルジスルフィが判明した。ソーセージ製品では，添加されていドは富士フィルム・和光純薬（株）から購入した。

る脂肪がこれらの香気成分を保持しているが，生（２） 脂質による香気成分の保持特性

理食塩水の添加により放出されることが明らかに試験管に0.05ｇの脂質を精秤した後，氷水中でなった 。

５μｌのメチルプロピルジスルフィドを添加し，

16）

そこで，本研究では，ポークソーセージを喫食撹拌した。この混合物を氷中で10 分間静置した

した時に，放出される香気成分が脂質の種類に後，10 mlの冷やした蒸留水を加えた。次に，こよって異なる可能性を考え，中性脂質，リン脂質，

れを90 ℃の温浴中で4.5 時間加熱した。これは混コレステロールを用いて，これらに対する香気成合溶液が90 ℃に達してから，加熱時間を計測した。
4.5 時間加熱した混合溶液を氷中で冷やした分の保持効果を検討した。

後，10 mlにメスアップした。メスアップ後の混１．脂質によるメチルプロピルジスルフィドの保持特性合溶液をモノトラップ捕集ビンに移し，混合溶液から放出される香気成分をモノトラップ（シリカ

最初に，脂質による香気成分の保持特性を調べ

モノリス捕集剤：GL Sciences（株））で捕集した。

た。すでに，植物ステロールに結合することが明（３）
 モノトラップ（シリカモノリス捕集剤）

らかになっている香気成分のメチルプロピルジス

による香気成分の捕集

ルフィドの脂質への結合性を調べた。八訂食品成

脂質と香気成分の混合溶液が入ったモノトラッ

分表2021には，ウインナーソーセージに含まれる

プ捕集ビンにモノトラップ１枚を取り付けた後，脂質含量は30.6％で，そのほとんどは中性脂肪

40 ℃の温浴で20 分間加熱した。なお，加熱時間（ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル）と 記 載 さ れ て いは，溶液が40 ℃に達してから20 分間加熱した。

る 。コレステロールは，100ｇのソーセージ当

モノトラップを抽出ビンに移した後，抽出溶媒とたり60 mg含まれている。リン脂質も含まれていしてジクロロメタン１mlと内部標準物質（原液るがわずかである。中性脂肪を構成する脂肪酸のの1000倍希釈）を加えて５分間超音波処理をし中では，オレイン酸が最も多く，続いてパルミチて，香気物質を抽出した。これをGC/MSの分析

ン 酸 ，ス テ ア リ ン 酸 ，リ ノ ー ル 酸 の 順 で あ る試料とした。

（Table１）。そこで，本項では中性脂肪として，（４）GC/MSによる香気成分の比較ならびに同

17）

トリオレインを使用することとした。また，コレ
ステロールとの結合性を調べた。

定Mono Trapから得られた試料を以下の条件で分析した。

Table１ Amount of each fatty acids in 100 g pork sausages（ポークソーセージの可食部100グラム当たりの各脂肪酸量）
脂肪酸

ミリスチン酸

パルミチン酸

パルミト
レイン酸

オレイン酸

イコセン酸

リノール酸

α-リノレン酸

含有量（mg）

390

6800

660

12000

250

3100

200

© The Ito Foundation

28

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

GC/MS の 昇 温 条 件 は ， 40 ℃（10 min）→

トステロールやスティグマステロールは，メチル（５℃/min）→ 240 ℃（20 min）で，合計70 分間

プロピルジスルフィドを保持することが分かってのプログラムを用いた。検出器には，MS（250 ℃）いる。また，前者は，後者よりメチルプロピルジを使用した。GC/MSは，GCMS-QP2010（島津

スルフィドの保持力が高いことも明らかになって製作所（株））で，カラムはTC-wax（長さ60ｍいる。植物ステロールならびに動物コレステロー

×内径0.25 mm i.d.，膜厚0.25μｍ，使用温度上限

ルのステロール骨格は同じであることから，骨格

260 ℃）（GL Sciences（株））を使用した。注入以外の部分の構造がメチルプロピルジスルフィド

量は，２μｌ（スプリットレス）で，内部標準物との結合性に重要である可能性が示唆された。

質としてDimethyl phthalateを用いた。また，各成分の量的な変化は，サンプルに添加した内部標

２．スモークドポークソーセージに含まれる香気成分の各脂質との結合性準物質で補正した後，比較した。
結果および考察

我々の先行研究で，スモークドポークソーセー

脂質は，香気成分を保持できることが分かって

ジおよびノンスモークドソーセージの香気成分をいる。また，香気成分の種類によって，脂質との解析し14），スモークドポークソーセージの特徴的結合の強さが異なることも明らかにしてきた１）。

な香りに寄与する香気成分として，β-Pinene，

そこで予備実験として，これまでに植物ステロー

3-Carene，D-Limonene，Acetic acid，Copaene，

ルに結合することが知られているメチルプロピル

Methyl eugenol，p-Cresol，2, 6-Dimethoxy-phenol

ジスルフィドを，中性脂肪であるトリオレイン，

を候補成分として特定ならびに同定した。このうあるいはコレステロールに添加し，それぞれに結ち，p-Cresolと2, 6-Dimethoxy-phenolは，燻煙合するか否かを調べた。各脂質にメチルプロピル

由来の香気成分であると推定された。

ジスルフィドを添加した後，90 ℃で4.5 時間加熱した。その後，40 ℃で加熱した時に放出される

そこで，ポークソーセージに含まれる香気成分
が，各種脂質に保持されるか否かを調べた。

香気成分をモノトラップによる捕集方法で調べた。

実験方法

脂質無添加ならびにトリオレインでは，メチル（１） 試薬プロピルジスルフィドの放出はまったく認められスモークドポークソーセージをジエチルエーテなかった（Fig.１，
２）。このことから，中性脂肪

ルでダイレクト抽出した場合に検出されたの中で，トリオレインには香気成分の保持効果は

β-Pinene，3-Carene，D-Limonene，Octanal，

弱い可能性が示唆された。今回，トリオレインを

Nonanal ，Caryophyllen ，Methyl eugenol（A グ

使用したのは，動物性脂肪を構成している脂肪酸

ル ー プ），ま た ，ダ イ レ ク ト 抽 出 物 を さ ら にで最も高いのはオレイン酸であることが分かって

SAFE 蒸 留 し て 得 ら れ た 試 料 か ら 検 出 さ れ た

いたからである。しかし，メチルプロピルジスル

Hexanoic acid， Guaiacol， 4-Ethyl-2-

フィドは，中性脂肪の１つであるトリオレインに

methoxyphenol，Trimethoxybenzene，m-Cresol，は保持されないことが明らかになった。

Eugenol（Bグループ）を用いて，脂質との保持

一方，コレステロールは，メチルプロピルジス
ルフィドを保持することが明らかとなった。
我々の研究から，植物ステロールであるβ-シ特性を調べた。これらの香気成分は，いずれも東京化成工業（株）から購入した。また，トリオレ
インとコレステロール（純度99％以上）はSigma© The Ito Foundation

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅲ）

29

内部標準物質メチルプロピルジスルフィド
ピーク強度

コレステロール
トリオレイン
脂質無添加

20

30

40
保持時間（分）50

60

Fig.1  Chromatogram of methylpropyl disulfide released from the mixture containing

each lipid after heating（x 105）

Area of peak

30

20

10

0

Non-lipid

Triolein

Cholesterol

Fig. 2 Amounts of methylpropyl disulfide released from the mixture containing

each lipid after heating

社 か ら ，レ シ チ ン（卵 由 来）は 東 京 化 成 工 業却した後，10 mlにメスアップした。メスアップ（株）から購入した。

後の混合溶液をモノトラップ捕集ビンに移し，混（２） 脂質による香気成分の保持特性合溶液から放出される香気成分をモノトラップ

試験管に0.05ｇの各脂質（トリオレイン，コレ（シリカモノリス捕集剤：GL Sciences（株））でステロール，卵レシチン）を精秤した後，氷水中で，ジクロロメタンで希釈した７種類（Ａグルー

捕集した。
Ｂグループの香気成分に関しても，同条件で結プ）の香気成分を添加し，撹拌した。この混合物

合性を調べた。

を氷中で10分間静置した後，10 mlの冷却した蒸（３）
 モノトラップ（シリカモノリス捕集剤）

留水を加えた。次に，これを90 ℃の温浴中で4.5による香気成分の捕集時間加熱した。混合溶液が90 ℃に達してから，4.5

１-（３）と同様の方法で実験を行った。

時間を計測した。

（４） GC/MSによる香気成分の比較ならびに

4.5 時間加熱した混合溶液を氷中で室温まで冷© The Ito Foundation

同定

30

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Mono Trapから得られた試料を，１-（４）とた。また，①～⑥の香気成分は，コレステロール

同じ条件で分析した。

よりもレシチンに保持されやすいことも分かっ結果および考察

た。一方，⑧～⑬の香気成分は，加熱後の放出量

各種脂質（トリオレイン，コレステロール，卵が脂質無添加のものと変わらなかったことから，

レシチン）に，７種類の香気成分（Ａグループのいずれの脂質にも保持されないことが明らかに①～⑦）を添加し，90 ℃で，4.5 時間加熱した後なった。本研究で用いた13の香気成分に関して，に，各種脂質混合液から放出される香気成分量を脂質に対する保持のされ方の違いは，化合物が有測定し，加熱後に残存している香気成分量を測定するlog P値（オクタノール／水分配係数）の違した。

いに起因すると推察された。コレステロールやレ

Fig. ３ と ４ に 示 す よ う に ， 脂 質 無 添 加

シチンに保持されたＡグループの香気成分のlog（BLANK）では，⑦Methyl eugenolだけがわず

Pは，いずれも３よりも大きい値を有していた。

かに検出されたが，それ以外の香気成分は検出さ一方，それ以外の化合物は，３よりも小さい値でれず，ほとんどすべてが加熱により放出されたとあった。Log Pの違いは，構造の違いによる疎水推察された。また，トリオレインからは脂質無添性度の違いを反映していることから，脂質への香加（BLANK）の場合と同様に，香気成分はあま

気成分の保持への応用を考える場合，log Pを考り 検 出 さ れ ず ，少 量 の ⑦ Methyl eugenol ，⑥

慮する必要があると考えられる。

Caryophyllene ，⑤ Nonanal ，③ Ｄ -Limonene が次に，コレステロールやレシチンに保持された

検出された。一方，コレステロールとリン脂質で香気成分のうち，Ｄ-LimoneneとOctanalが，4.5ある卵レシチンでは，すべての成分が加熱後に検時間の加熱中に放出量がどのように変化するかを出され，香気成分がこれらの脂質に保持されてい調べた（Fig.７）。その結果，Ｄ-Limoneneおよることが明らかになった。以上の結果から，Ａグ

びOctanalは，ともに０時間では脂質無添加のループの７成分は，トリオレインとの結合性が弱Blankで放出量が最も多く，脂質がないと放出量

いが，コレステロールと卵レシチンに保持されるが多いことが明らかになった。２時間および４時ことが判明した。

間加熱すると，脂質無添加ではほとんど香気成分

次に，各種脂質に６種類の香気成分（Ｂグルーが放出されなくなり，保持されている香気成分がプの⑧～⑬）を添加し，同条件で加熱し，加熱後ないと推察された。一方，コレステロールやレシに残存している香気成分を測定した。Fig.５に示チンが存在すると，２時間以上加熱されても，香すように，脂質無添加（BLANK）で，加熱後に気成分が保持されていることが判明した。

すべての香気成分が検出された。また，各脂質でも，脂質無添加と同量の６成分が検出されたことから，これら６つの香気成分に対する脂質の保持効果は低いと推察された。

要約

ポークソーセージは，美味な食品の１つであり，コクのある食品である。ポークソーセージに

これらの結果をFig.６にまとめた。①～⑦の香添加される脂肪が，ソーセージの特徴を示す香気

気成分は，脂質により保持される量が異なり，ト成分を保持し，味わいの広がりや持続性を強め

リオレインには保持されないが，コレステロールて，ソーセージのコクを増強することが知られてと卵レシチンに保持されることが明らかになっいる。

© The Ito Foundation

31

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅲ）

卵レシチン

①

③

④

⑤

⑥

②

⑦

内部標準物質ピーク強度

コレステロール

トリオレイン

脂質無添加

20

30

40

50

保持時間（分）Fig. 3 Chromatogram of aroma compounds（A-group）released from the mixture containing eachlipid after heating（①β-pinene，②3-Carene，③D-Limonene，④Octanal，⑤Nonanal，⑥Caryophyllene，⑦Methyl eugenol）（x 106）
140
120

ピーク面積

100
80
60
40
20
0

①β-Pinene ②3-Carene ③D-Limonene ④Octanal
BLANK

トリオレイン⑤Nonanal ⑥Caryophyllene ⑦Methyl eugenol

コレステロール

卵レシチン

Fig. 4 Amounts of aroma compounds（A-group）released from the mixture containing

each lipid after heating

本研究では，ソーセージに含まれている香気成検出されたβ-Pinene，3-Carene，D-Limonene，分が，どのような脂質に保持されるかについて検Octanal，Nonanal，Caryophyllen，Methyl eugenol

討した。その結果，脂質の中でポークソーセージ

は，コレステロールやレシチンに保持されやすいこに最も多く含まれている中性脂肪（トリアシルグとが判明した。一方，SAFE蒸留法で抽出された時リセロール）のトリオレインには，香気成分が保に検出されたHexanoic Acid，Guaiacol，4-Ethyl-

持されにくく，コレステロールやリン脂質である

2-methoxyphenol， 2, 4-Trimethoxybenzene，

レシチンに香気成分が保持されやすい可能性が明

m-Cresol，Eugenolは，脂質に保持されない香気

らかになった。

成分であることが分かった。香気成分の保持特性

また，ポークソーセージからダイレクト抽出での違いは，化合物が有するlog P値（オクタノー© The Ito Foundation

32

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

内部標準物質

卵レシチン
⑧

⑨

⑩

⑪

⑫

⑬

ピーク強度

コレステロール

トリオレイン

脂質無添加

35

40

45
保持時間（分）50

Fig. 5 Chromatogram of aroma compounds（B-group）released from the mixture containing eachlipid after heating（⑧Hexanoic
acid，⑨Guaiacol，⑩4-Ethyl-2-methoxyphenol，⑪1, 2, 4-trimethoxybenzene，⑫m-Cresol，⑬Eugenol）

ピーク面積（x 106）140

脂質無添加（BLANK）

120

トリオレイン100

コレステロール

80

卵レシチン

60
40
20
0
①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

⑨

⑧

⑩

⑫

⑬

⑪

Fig. 6 Amounts of aroma compounds（A and B-groups）released from the mixture containing eachlipid after heating（x 107）
（A）

脂質無添加

（B）

ピーク面積

０時間

２時間

４時間

脂質無添加
コレステロール
卵レシチン

コレステロール
卵レシチン

０時間

２時間

４時間

Fig. 7 Changes in amounts of D-limonene （A）and Octanal （B）released from the mixture

containing each lipid in heating© The Ito Foundation

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅲ）

ル／水分配係数）の違いに起因すると推察された。コレステロールやレシチンに保持されたＡグ
ループの香気成分のlog Pは，３よりも大きい値を有していた。
文献１） Nishimura, T.：Definition of “Koku” Involved inFood Palatability （Koku in Food Science andPhysiology, Eds. Nishimura, T. & Kuroda, M.）,
Springer Nature, Singapore, １-16, 2019.
２） 西村敏英：食肉のおいしさとそれを引き出すコクとは！，JATAFFジャーナル, 3（12）, 29～35, 2015.
３） 西村敏英：食品のおいしさを改善するコク増強物
質のチョイ足し技術，月刊フードケミカル, 2017-9,
23～27, 2017.
４） 西村敏英：コクの要素と寄与成分を活かした食品
開発，食品と開発, 53（6）, 20～23, 2018.
５） 西村敏英：食品のコクとおいしさへの活用，醤油の研究と技術, 45（3）, 161～168, 2019.
６） Nishimura, T., Goto, S., Miura, K., Takakura, Y.,
Egusa, S. A., Wakabayashi, H.：“Umami compounds
enhance the intensity of retronasal sensation ofaromas from model chicken soups”, Food
Chemistry, 196, 577～583, 2016.
７） Nishimura, T., Egusa, S. A., Nagao, A., Odahara, T.,
Sugise, T., Mizoguchi, N., Nosho, Y.：“Phytosterols
in onion contribute to a sensation of lingering ofaroma, a koku attribute”, Food Chemistry, 192, 724～728, 2016.
８） 西村敏英：「食肉のおいしさを引き出すうま味物
質の役割」，食肉の科学, 57（2）, 177～180, 2016.

33

９）
 Nishimura, T., Saiga, A.：Umami Compounds
and Fats Involved in Koku Attribute of Pork
Sausages（Koku in Food Science and Physiology,
Eds. Nishimura, T. & Kuroda, M.）,Springer Nature,
Singapore, 47-58, 2019.
10）
 Mottram, D. M.：“Organic Nitrates and Nitriles
in the Volatiles of Cooked Cured Pork”, J. Agric.
Food Chem., 32, 343～345, 1984.
11）
 Ramarathnam, N., Rubin, L. J., Diosady, L. L.：“Studies on meat flavor. 3. A novel method fortrapping volatile components from uncured andcured pork”, J. Agric. Food Chem., 41（6）, 933～938,
1993.
12）
 西村敏英，江草愛：「ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明（その３）」，平成28年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書, Vol. 35, 31～39,201713）
 西村敏英，江草愛：「ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明」，平成26年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書, Vol. 33, 101～108, 2015.
14） 西村敏英，江草愛：「ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明（その２）」，平成27年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書, Vol. 34, 72～80,
2016.
15）
 西村敏英：「ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂質の役割」，平成29年度 食肉に関 す る 助 成 研 究 調 査 成 果 報 告 書 , Vol. 36, 59～67,
2018.
16）
 西村敏英，力石麗奈：「ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂質の役割（Ⅱ）」，平成
31年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書, Vol.
38, 33～41, 2020.
17）
 「八訂 食品成分表 2021」女子栄養大学出版部, 2021.

© The Ito Foundation

34

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作（Ⅱ）
Development of a system for rendering 3D computer graphics of meat
carcasses（Ⅱ）

本山

三知代・渡邊

源哉・中島

郁世・佐々木啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Michiyo Motoyama, Genya Watanabe, Ikuyo Nakajima and Keisuke Sasaki（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

With the recent improvement of computer performance, three-dimensional（3D）graphicthat visually expresses objects with a three-dimensional feeling on a two-dimensional monitor
has become our familiar technology. If it becomes possible to create 3D graphics for meat
carcasses, it will be possible to digitize information on the carcass shape and appearance thatare not currently evaluated. 3D graphics also enable us to easily check more realistic carcasses
from 360° around anywhere on portable devices such as smartphones with combining ICT
technology, which will lead to the creation of new value in meat production and distribution.
In the previous year we had developed a basic technology for rendering 3D graphics ofmeat carcasses and its prototype photogrammetric system. In the present study, the prototype
was expanded to a practical system with 40 cameras that enables the measurement of entire
carcass 3D shape instantly. Both hardware and software of the prototype were ameliorated tosolve the expected problems in the practical use.
The improved system was tested, and we confirmed that the strength of frame structure
and the speed of data transfer were adequately ameliorated and also that the newly introduced
devices（automatic release mechanism and flashlight）operated without problems. In addition,by checking the quality of the rendered 3D model, we found some further countermeasures tomake the system more compatible with various situations in the actual meat carcass production．
We also investigated the countermeasures for applying ICT technology to the system to
distribute the carcass 3D graphics. It would be effective to connect the system to a existing or
newly constructed computer network that can automatically operate to generate and distribute
3D graphics from the acquired image data from the system.

１．目

技術は，さまざまなゲームやデジタル映像など

的

我々の身近なものとなり，その作製と表示のため

近年のコンピュータの性能向上により，物体やの技術進歩と低価格化が目覚ましい。枝肉につい空間を二次元のモニタ上に奥行き感（立体感）をても３Ｄグラフィックが作製可能になれば，現在持って視覚表現する三次元（３Ｄ）グラフィック

は枝肉の価格形成に活用されていない立体形態や© The Ito Foundation

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作（Ⅱ）

35

外観の情報を新たに数値化できるようになるだけ

２件，2019年および2020年）１，２），本基盤技術に基でなく，ICT技術と組み合わせることでスマートづいたプロトタイプシステムを本研究助成金等をフォン等でよりリアルな枝肉を確認することが簡活用して2019年度に製作した。本プロトタイプの単に可能になり，新しい価値の創造に結び付くと現場での試用により，実用システムへ拡張するた考えられる。

めに必要な改良点が明らかになっていたことか

申請者らはこれまでに，枝肉の３Ｄグラフィッ

ら，これらの点に留意してプロトタイプのハードクを作製するための基盤技術を開発し，本基盤技およびソフトウェア構成の改良・拡張を以下のよ術を実用化につなげるためのプロトタイプシステ

うに進めた。

ムを2019年度に設計・製作した。本プロトタイプ

2.1

装置は20台のデジタルカメラを具備した枝肉同時

2.1.1

撮影システムであり，生産ラインを動く枝肉を静これまでの研究から，枝肉全体について３Ｄグ

止させることなく計測可能で，得られた３Ｄグラ

ラフィックを作製する場合，カメラは約40台必要

フィックから，これまで数値化の難しかった枝肉なことが分かっていたことから，プロトタイプシ

断面形状等の評価が可能となった。

ステムに採用したものと同機種の産業用カメラ

ハードウェアおよびソフトウェア
カメラしかし，本プロトタイプシステムはカメラ台数（Omron-Sentec社STC-MCS312POE，３Ｍ画素，の制約から枝肉の一部分の計測しかできず，実用カラー）およびレンズ（東京パーツセンター社

システムとするためにはカメラを増設して枝肉全

TPC-GO6F18-３Ｍ）を必要な台数（40台）まで

体の３Ｄグラフィック製作を可能にする必要があ

自己研究資金（農研機構）により増設した。

り，そのためのソフトウェアおよびハードウェア

2.1.2の改良が必要なことが，プロトタイプを用いた検カメラからコンピュータへの画像データの転送

証から明らかになっていた。

コンピュータに問題が出ることが予想されていた：すなわち，また，枝肉３Ｄグラフィックから今後広く価値

昨年度製作したプロトタイプ（カメラ20台）は一を生み出すためには，インターネットを活用して般的な１Gbpsの帯域幅を持つ転送速度125 MB/s

３Ｄグラフィックを表示・配布可能にすることがのシステムであり，このままカメラ台数を40台に有効と考えられる。家畜伝染病の観点から出荷者増やした場合には画像が転送できない重度のフや買参人でも枝肉を直接見ることが難しくなってレーム落ち（カメラからパソコンに転送されるリ

きており，枝肉３Ｄグラフィックの早い実用化がアルタイム画像が抜け落ちる現象）が想定された。

必要である。

そこで，10倍の転送速度を持つ次世代高速ネッ

そこで本年度は，枝肉３Ｄグラフィックの活用

ト ワ ー ク 10GigE の 通 信 規 格 を 採 用 し た ネ ッ トを見据え，昨年度作製したプロトタイプシステム

ワークボードをインターフェースとしたコンをICT技術と親和性の高い実用システムに改良・ピュータ（Iiyama社Solution TO39-i9K-XYVI，発展させることを目的とした。

Windows10 64bit，Intel Core i7，16GB RAM）を

２．方

導入した。

法

2.1.3

PoEハブ

申請者らはこれまでに，枝肉の３Ｄグラフィッ

コンピュータと同様にフレーム落ちへの対応とクを製作するための基盤技術を開発し（特許出願

し て ，ア ッ プ リ ン ク 10GigE 規 格 の も の と し た© The Ito Foundation

36

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）（Netgear社GC752XP）。
2.1.4

ノシシにおいて断続的に続き家畜防疫上の懸念が自動撮像トリガあったため，システムの動作確認は実際の枝肉生

プロトタイプでは，枝肉が計測に適切な生産ラ産ラインではなく，勤務する事業場内の試験用枝

インの位置に来たことを人が確認してコンピュー

肉生産ラインにおいて，豚枝肉の半丸の立体模型

タのキーボードから撮像トリガを入力する仕様でを用いて行った。

あったが，トリガ入力失敗の回避と省力化のたまた，当システムを用いて撮影した豚枝肉模型

め，枝肉の位置を自動検知してパソコンに信号をの写真から，ソフトウェアZephyr Aerial（3Dflow

送り，ソフトウェア経由でカメラに撮像トリガを社）を用いてStructure from Motion法により三入力するトリガ機構を導入した。位置の検知には次元モデル（テクスチャ付メッシュデータ）を作

レーザセンサ（MiSUMi社MZL-D）を利用した。

製し完成度を確認することで，システムから得ら

2.1.5

照明の設置

れる画像データの品質を検証した。

ブレのない画像取得に必要な十分に短い撮影露2.3

ICT技術の活用法の検討

光時間を達成するために照明を設置した。照明と枝肉３Ｄグラフィックから今後広く価値を生みして，ストロボフラッシュ（ライトグラフィカ社

出すためには，インターネットを活用して３Ｄグ

GB-150 Studio Flash）およびLED照明（エコリ

ラフィックを表示・配布可能にすることが有効と

カ社 ECL-LD2EGD-L3A）の２種類を準備した。

考えられる。そこで，当システムをICT技術と親ストロボフラッシュの発光信号はコンピュータ

和性の高いシステムに発展させるための方策につ（ソフトウェア）からLANケーブルおよびシンク

いて情報収集を行った。

ロコードを介して送る仕様とした。
2.1.6

３．結果と考察支持フレームの改良

増設したカメラや照明の設置のために，フレームの素材を塩ビ管からより堅牢なアルミ製とし，構造も改良した。
2.1.7

3.1

ハードウェアおよびソフトウェアの改良改良したシステムの概要および外観をFig.１とPhoto１に示す。枝肉の全体について３Ｄグラ

ソフトウェアフィックを作成するのに必要な台数のカメラ（40

前述のとおり，カメラを増設した場合にフレー台）を備えたシステムとなった。カメラと，今年ム落ちが予想され，撮影データの転送に加え，各度新たに追加した自動撮像トリガ機構およびストカメラの位置やピント等の調整も難しいことが想ロボフラッシュとは，ソフトウェアを介して連動定された。そこで，接続された全カメラのリアルする。

タイム画像を常時転送する現在採用している一般

フレームはアルミ管製で軽量，かつパイプラッ

仕様から，ソフトウェア上で選択したカメラにつクシステムに用いられる強度の高い管とインナー

いてのみ，リアルタイム画像を転送する仕様に改

ジョイントを採用し堅牢で，組み立て分解も六角良した。

レンチのみで可能で可搬性にも優れる。また，柱2.2梁を増設し，40台のカメラおよび照明器具等の重改良したシステムの動作確認

システムの改良が適切であったか確かめるため量に十分耐える強度を有していた。

に，動作の検証を行った。新型コロナウイルス流改良したソフトウェアのGUI画面をPhoto２に行による出張の自粛と，豚熱の陽性報告が野生イ示す。カメラの露光時間およびゲインの入力や，© The Ito Foundation

37

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作（Ⅱ）（１）カメラ増設（２）コンピュータ通信速度改善（７）ソフトウェア改善（４）自動撮像トリガ機構

選択中のカメラのみ
リアルタイム画像転送（３）PoEハブ通信速度改善
10GigE
LANケーブル（５）照明増設
蛍光灯
ストロボフラッシュ

ソフトウェアで選択中のカメラ（モニタリング＋撮像）
選択していないカメラ（撮像のみ）（６）支持フレーム改良

Fig. 1 Schematic diagram of the improved system

Photo 1 Appearance of the improved system with fourty cameras.

Photo 2 A ppearance of the improved software（GUI）and camera windows.

From the GUI, settings of camera and flash light can be easily changed.

© The Ito Foundation

38

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

レーザセンサによる自動トリガ／手動トリガの切ている。しかし，枝肉を移動させた場合は，７

り替え，フラッシュ使用の有無などが，一括してmsではモデル化が失敗する枝肉部位があったこ

GUI画面から簡単に行えるようになった。

とから，７msという短時間であっても画像にブ

また，ソフトウェアで選択した任意のカメラのレが生じ問題となることが分かった。

みリアルタイム画像を転送・表示する仕様であり露光時間をより短くするためにストロボ照明も（Photo ２ 中 の 大 き い 画 像 ウ イ ン ド ウ）
，コ ン

検討したが，７ms未満の非常に短い時間にタイ

ピュータおよびハブの転送速度の改善の効果とあミングを合わせて発光させることは困難であっ

わせて，リアルタイム画像も目立ったフレーム落た。システムを実際の生産ラインに導入する際にちなく滑らかに表示され，カメラのピント調整もは，ラインの速度や周囲の明るさ，ライン位置容易になった。

（上流か下流か）による枝肉表面の光学特性（光

3.2

動作確認

沢）の違いなどにより，状況に応じた照明の調整

カメラ40台の同時撮影により取得した画像40枚が必要であるが，LED照明のような定常光をON/は，数秒以内にパソコンに転送され指定したフォOFF制御可能にして，さらに増設しておくことルダに格納された。枝肉生産ラインの速度は，例が最善策と考えられた。

えば枝肉計量は枝肉あたり５秒程度以上かかり，

3.3

これに比べてシステムの処理スピードは速いため

本システムを用いて得られる三次元モデルの活

枝肉生産ラインの流れには干渉しにくいと考えら用法として，枝肉の品質評価指標や家畜の育種指れる。

標の開発などが考えられるが，得られる３Ｄグラ

レーザセンサによる枝肉の検出と撮像トリガの出力は正常に稼働し，自動撮像することができ

ICT技術の活用法の検討

フィックはそれ自体がリアルな品質情報であり，そのまますぐに活用できる。

た。一方，今回動作確認に用いたラインは枝肉を今回改良したソフトウェアでは，撮影した画像

一定の速度で自動搬送できるものではなかったたの保存場所にネットワーク上のストレージも指定

め，枝肉模型を手で押す速度の遅速によってタイすることができる。本システムを，既存あるいはミングがずれ，撮影範囲から外れる問題が生じ新たに準備するネットワークに接続することによた。自動撮像機能を利用する場合は，システムをり，ノード間の接続の通信速度に留意する必要が自動搬送のライン箇所に導入するか，システムのあるが，ネットワーク上のさまざまな計算資源を撮影可能範囲を広くする工夫が必要と考えられた。

活用可能になるため，多数の枝肉３Ｄグラフィッ

改良したシステムを用いて，静止あるいは移動クを自動で生成・配布する仕組みを構築できると（約0.5 m/s）する枝肉模型を露光時間を変えて撮影し，三次元モデルを作成した結果をTable１に示す。

考えられた。
作製した３ＤグラフィックはPDFファイルとしてメールやインターネットで誰でも簡単に扱

静止した枝肉模型を撮像した結果，７msの露え，コロナ下における世界的なオンライン化に対

光時間で枝肉全体の三次元モデルが問題なく作成応した新しい食肉品質管理技術として活用できる。

できることが確認でき（Table１写真），今回の光条件（模型表面において500～1200 lx）では，露光７msで画像の明るさは十分だったことを示し

４．要約

過年度に製作した枝肉の３Ｄグラフィック化シ© The Ito Foundation

39

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作（Ⅱ）
Table 1 Number of image that could not been used for the 3D-model

calculation. Images were obtained under different condition of
exposure time. Rendered 3D model with the condition of 7-ms
exposure time are shown．

露光時間

三次元モデル化計算に利用できなかった画像の枚数（40枚中）
撮影対象

静止

撮影対象

５ms

11枚

11枚

６ms

13枚

12枚

７ms

０枚

９枚

移動

露光時間7msの写真から計算された
3Dモデル

ステムのプロトタイプを，枝肉全体の計測が瞬時対応可能とするための，システムのさらなる改善にできるカメラ40台を具備した実用システムに拡策を明らかにした。

張するとともに，拡張後に予想された問題点の解

３Ｄグラフィックの活用のためのICT技術の利消のためにハードウェアおよびソフトウェアを改用についても検討し，取得画像データから３Ｄグ良した。

ラフィックの生成・配布までを自動で行えるネッ

拡張したシステムの動作検証を行い，新たに導入した自動撮像トリガおよびストロボフラッシュ

トワーク構築が有効であると考えられたことか
ら，その環境整備を今後進めたい。

はすべて問題なく稼働し，支持フレーム強度とデータ転送速度も十分であった。また，得られた画像から作成した三次元モデルの品質検証により，実際の生産ラインにおけるさまざまな状況に

文献１） 本山ら，特願（2019年２月28日）
２） 本山ら，特願（2020年２月28日）© The Ito Foundation

40

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンIXの形成様相と存在形態に関する研究（Ⅱ）
Studies on the formation and the existence form of zinc protoporphyrin IX
in dry-cured ham（Ⅱ）

若

松

純

一

（北海道大学北方生物圏フィールド科学センター）

Jun-ichi Wakamatsu（Field Science Center for Northern Biosphere, Hokkaido University）

In order to elucidate the mechanism by which zinc protoporphyrin IX（ZnPP）in nitrite/
nitrate free dry-cured meat products, we tried to clarify ZnPP-binding proteins which are notwater-extractable from Parma ham and to establish a new ZnPP-forming experimental modelwith high yield of ZnPP. The ZnPP content varied among hams or muscles but the waterextraction ratio of ZnPP positively correlated to pH values of muscles and maximized at pH 9.0.
The weak alkali extract from the residue after water extraction was evaluated with the sizeexclusion chromatography, western-blotting, and immunoprecipitation and the water-insoluble
ZnPP was suggested to exist as complex with hemoglobin and myoglobin. In the experimental
model established in this study, water-extractable ZnPP was formed 10-fold higher than thatin the previous experimental model. Moreover, since the formed ZnPP complexes existed ascomplexes similar to those in Parma ham, it was suggested that this new experimental modelis useful to elucidate the ZnPP formation mechanisms in nitrite/nitrate free dry-cured meatproducts.

１．目

かになっていない。

的

我々はこれまでに，パルマハムにおけるZnPP

パルマハムは発色剤が使用されていない乾塩漬の形成機構解明の一環として，ZnPPの存在形態

生 ハ ム で あ る が ，鮮 や か な 赤 色 を 呈 す る 。

に関する研究を行ってきた。パルマハム中には，Wakamatsuらは，この赤色色素が亜鉛プロト

水抽出できるZnPPと水抽出できないZnPPが存在

ポルフィリンIX（ZnPP）であることを明らかにすることを明らかにし（データ示さず），水抽出した。ZnPPはプロトポルフィリンIX（PPIX）にできるZnPPについては，ほとんどがヘモグロビ

亜鉛が配位したものであるが，生体にはほとんど

ンとミオグロビンと結合していることを明らかに含まれていないことから，パルマハムの熟成中した３）。一方，水抽出できないZnPPは，単体あに生成されるものと考えられる。ZnPPは発色剤

るいは何らかの物質との複合体としてパルマハム

無添加の食肉製品の色調改善への応用が期待され中に存在していると考えられるため，その結合タるが，パルマハム中での形成機構は完全には明らンパク質を調べるには可溶化する必要がある。し１）

２）© The Ito Foundation

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンIXの形成様相と存在形態に関する研究（Ⅱ）

かし，一般的に可溶化に用いられる界面活性剤では，ZnPPとタンパク質との結合が外れる（データ示さず）ため，その詳しい存在形態は明らかに

２．方

41

法

2 . 1 パルマハムからのZnPPの分画・抽出とさ れ て い な い 。ま た ，パ ル マ ハ ム 中 の 不 溶 性

ZnPPの水抽出率の測定

ZnPPの割合は相当量存在するため，不溶性ZnPP

市販のパルマハム原木（ｎ＝３）から主要な４の存在形態を明らかにすることは，パルマハムにつの筋肉（大腿四頭筋（QF），大腿二頭筋（BF），

おけるZnPP形成機構解明の一助になる。

半膜腰筋（SM），半腱様筋（ST））を切り出して

一方，パルマハムにおけるZnPP形成機構につ細切したものに，10倍量の純水を加えて，ホモジ

いて，複数の説が提唱されている。細菌由来の酵ナイズした。懸濁液のpHを測定した後，遠心分素による説

は，ZnPPは離して抽出液と残渣に分画した。それぞれを元のミオグロビンのヘム由来である説を唱えた。ヘム

体積になるように純水を加えて懸濁した後，３倍からの脱鉄および亜鉛の挿入については，嫌気的量の冷アセトンを加えてZnPPを抽出し，抽出液条件下での非酵素的反応と，酵素的反応の両者がの蛍光強度（Ex/Em：420/590nm）を相当量と存在する 。酵素的反応には，ヘム生合成に関わした。水抽出液中に存在するZnPPを水抽出でき

り，ヘムからの脱鉄と亜鉛の挿入を触媒すると考るZnPP，水抽出残渣に存在するZnPPを水抽出でえられているフェロケラターゼの関与が提唱されきないZnPPとした。両者のZnPP量に対する水抽ている 。一方，我々はin vitroのZnPP形成モデ

出できるZnPP量をZnPPの水抽出率とした。まル実験系を構築して，ZnPPの形成機構を検討した，NaOHによりpHを調整したパルマハム懸濁たところ，豚肉では至適pHの異なる２つの機構

液を遠心分離して分画し，同様にアセトンで抽出が存在することを明らかにし，筋線維型との関係

して蛍光強度を測定した。

４）に加え，Adamsenら

５）

６）

７）

性を示唆した。しかし，至適pH 4.75の形成機

１,８）

構ではミトコンドリアの多い遅筋型筋線維の割合

2 . 2 サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SEC-HPLC）と正に相関して，多くのZnPPが形成したが，そパルマハム水抽出残渣を，NaOHを用いてpHの大部分は水抽出できず，パルマハムにおける存

7.5に調整した後，遠心分離を行って上清を得た。

在様相とは異なっていた。一方，至適pH 5.5の形

これをシリンジフィルターで濾過して，成機構では線維型によらず，水抽出できるZnPP

G3000SWカラム（東ソー）を用いてSEC-HPLCを形成するものの，その形成量は少なく，パルマに供した。ZnPPの検出は蛍光強度（Ex/Em：

ハムと同様の形態で存在しているか検証ができな

420/590nm），タンパク質とヘムの検出はそれぞい。このため，より大量かつ安定にZnPPを形成れ波長280nm，415nmで検出した。

させるモデル実験系の構築が必要となる。

2.3

ZnPP結合タンパク質の免疫学的同定

そこで本研究では，パルマハムにおけるZnPP

パルマハム水抽出残渣を，NaOHを用いてpH

形 成 機 構 解 明 を 目 的 と し て ，水 抽 出 で き な い

6.0，7.5および9.0に調整した後，遠心分離を行っ

ZnPPの存在形態を明らかにすることと，形成量て上清を得た。上清をSDS-PAGEに供した後，のより多いin vitroのZnPP形成モデル実験系を再抗ヘモグロビン抗体ならびに抗ミオグロビン抗体

構築することとした。

を用いたウェスタンブロッティング法に供した。
また，pH 7.5および9.0で抽出したものを抗ヘモグ© The Ito Foundation

42

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

ロビン抗体ならびに抗ミオグロビン抗体を用いて室内で，ガラス板から外さないで，420nm付近の免疫沈降に供し，得られた免疫沈降物をアセトン

光を透過するバンドバスフィルターを通して紫色で抽出して，ZnPPの結合を検証した。

LED（中心波長400nm）を照射して，600nm付近の光を透過するバンドパスフィルターを装着した

2 . 4 ZnPP形成モデル実験系とZnPP形成量のデジタルカメラでZnPPの蛍光を撮影した。その測定が構築したモデル実験系を元

後，ただちにゲルからPVDF膜に分離タンパク質に，ZnPP形成に及ぼす豚肉含量，インキュベー

を転写して，抗ヘモグロビン抗体ならびに抗ミオ

ト温度，pH，およびインキュベート日数の影響

グロビン抗体を用いたウェスタンブロッティングを検討した。豚最長筋を純水でホモジナイズし法に供した。

Wakamatsuら

９）て，HClまたはNaOHを用いてpHを調整し，抗生３．結果と考察

物質を添加したものを嫌気的に暗所でインキュベートした。インキュベート後に懸濁液を遠心分

3 . 1 パルマハム中のZnPPの存在様相とpHと離して上清と沈殿に分画した。それぞれを元の体の関係積になるように純水を加えて懸濁した後，３倍量

パ ル マ ハ ム の 各 筋 肉 中 か ら ，水 抽 出 で き るの冷アセトンを加えてZnPPを抽出し，抽出液のZnPPと水抽出できないZnPPの量を測定したとこ

蛍光強度（Ex/Em：420/590nm）をZnPP相当量

ろ，ばらつきが大きく，筋肉の種類や個体の影響とした。同様に，上清中に存在するZnPPを水抽は見られなかった（Fig. 1A）。しかし，ZnPPの出できるZnPP，沈殿物中に存在するZnPPを水抽

水抽出率と各筋肉部位のpHとの関係を調べたと出できないZnPPとした。

ころ，両者間に強い正の相関が認められた（Fig.

ZnPP結合タンパク質の分離と同定

1B）。そこで，水抽出時のpHを調整してZnPPの上清中のZnPP結合タンパク質は，Laemmliの水抽出率を検討したところ，pHの上昇に伴い，緩衝液系から0.1％SDSの代わりに４Ｍ尿素を加水抽出できるZnPPの量は増加して水抽出できな

えた尿素ゲル電気泳動で分離した。なお，泳動緩

いZnPPの量は減少し，pH ９付近においてZnPP

衝液中のSDSも除いた。電気泳動後，ただちに暗の水抽出率が最大となり，水抽出できないZnPP

B）

300

water-soluble
water-insoluble

200

100

0

QF

BF
SM
muscle100

Water-extraction ratioof ZnPP（％）A）
Fluorescence intensity（Ex/Em：420/590 nm）

2.5

ST

80

r = 0.86

60
40
20
0
5.9

6

6.1

pH

6.2

6.3

6.4

Fig. 1 Water-soluble and water-insoluble ZnPP contents in each muscle（A）and correlation

between water-extraction ratio of ZnPP and muscle pH in muscles（B）

Bars represent standard deviation（n＝３）.

© The Ito Foundation

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンIXの形成様相と存在形態に関する研究（Ⅱ）

43

は大幅に減少した。以上のことから，パルマハム

抽出できないZnPPが存在すること３）から，本研中の水抽出できないZnPPの多くはpHを上げるこ究で検討したモデル実験系ではインキュベート後とによって抽出できることが示された。

に遠心分離を行い，上清と残渣に含まれるZnPP

3 . 2 パルマハム水抽出残渣から弱アルカリでの形成量から評価することにした。
初めに，豚肉の含有量について検討したとこ抽出されるZnPP複合体の解明
パルマハム水抽出残渣の懸濁液をNaOHでpH

ろ，豚肉の含有量の増加に伴い，水抽出できる

7.5に調整した後，遠心分離して得られた上清をZnPPと水抽出できないZnPPはいずれも増加し

SEC-HPLCで分離したところ，ZnPP由来と思わた。含有量が50％を超えると，粘性が高く定容でれる自家蛍光のピークが複数観察された。これら

きないことから，豚肉含有量を50％とした（Fig.

のピークはヘムタンパク質のピークと一致したこ2A）。次に，インキュベート温度を変えてインキュとから，ZnPPが複数の異なるヘムタンパク質とベートしたところ，水抽出できるZnPPならびに複合体を形成している可能性が示された。

水抽出できないZnPPのいずれも35℃で形成量は次に，食肉に含まれる主要なヘムタンパク質で最大になり，それ以上の温度では形成量はやや低あり，パルマハム水抽出液中でZnPPとの結合が下した（Fig. 2B）。次に，豚肉懸濁液のpHを変え報告されているヘモグロビンとミオグロビンに注たものをインキュベートしたところ，水抽出でき

目して，パルマハム水抽出残渣の懸濁液をNaOH

るZnPPはpH 5.5で最大になったが，水抽出できでpH 7.5または9.0に調整して得られた抽出物をないZnPPはpH 4.75および5.0で著しく形成したウェスタンブロッティング法に供した。pH 7.5ま（Fig. 2C）。上述のパルマハムにおけるZnPPの水

たは9.0で抽出したものには，いずれも抗ヘモグ抽出率（40～80％）とパルマハムのpH（6.0～6.4）

ロビン抗体と抗ミオグロビン抗体に対する陽性バを考慮して，水抽出できるZnPPが最大になった

ンドが観察された。このため，抗ヘモグロビン抗pH 5.5を選択した。最後に，インキュベート日数体および抗ミオグロビン抗体を用いて得られた免について，１～19日まで検討したところ，イン

疫沈降物からアセトンで抽出したところ，ZnPP

キ ュ ベ ー ト 日 数 の 増 加 に 伴 い ，水 抽 出 で き る

特有の蛍光スペクトルが観察された。このことか

ZnPPと水抽出できないZnPPのいずれも増加した

ら，弱アルカリで抽出されるZnPPは，パルマハ（Fig. 2D）。微生物の混入はZnPP形成を促進する

ムのpHでは不溶化して存在するヘモグロビンおことから，モデル実験系には抗生物質を添加してよびミオグロビンとの複合体として存在している

いるが，殺菌作用はないため長期間では微生物のことが示唆された。

増殖する可能性がある。このため，１日間と比べ3.3て有意な増加が見られた10日間をインキュベート

新規ZnPP形成モデル実験系の構築

我々が以前に構築した至適pH 5.5のモデル実験日数とした。

系の基本プロトコールは，20％の豚最長筋懸濁液

本研究で構築したモデル実験系でのZnPP形成を塩酸でpH 5.5に調整し，微生物の生育を抑える

量を，従来のモデル実験系でのZnPP形成量と比ように抗生物質を添加したものを，嫌気的条件下

べたところ，水抽出できるZnPPの形成量は約10

で25℃，７日間インキュベートしたものからアセ倍に増加し，水抽出できないZnPPも約５倍に増トンで抽出して全ZnPPを抽出して評価した９）。

加した（Fig.３）。ZnPPの水抽出率も40％程度と，

しかし，パルマハムでは水抽出可能なZnPPと水

上述のパルマハムのものと同程度であった。さら© The Ito Foundation

44

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

A）

B）
A

200
B

150
BC

100
50

C

a

b

c
20%

C）

30%
40%
Meat content

800
600
400

B
a

0

c
4.75

AB

BC

250
C

200
150
100

ab

ab

bc

D

c

a

50
0

50%

Water-soluble ZnPP
Water-insoluble ZnPP

A

200

Water-soluble ZnPP
A
Water-insoluble ZnPP

300

30
35
40
Incubation temperature（℃）

25

45

D）

A

1000

a

Fluorescence intensity（Ex/Em：420/590 nm）

250

0Fluorescence intensity（Ex/Em：420/590 nm）

350

Water-soluble ZnPP
Water-insoluble ZnPP

ab

bc
5.6

5.5
pH

B

6.0

ab

B

Water-soluble ZnPP
Water-insoluble ZnPP

350
Fluorescence intensity（Ex/Em：420/590 nm）

Fluorescence intensity（Ex/Em：420/590 nm）

300

300

A

250
200
150

bc

AB
AB abc

A
A

a A

a

13

16

19

a

ab

100
50

6.5

c B

0

1

4

7

10
Days

Fig. 2 Effects of meat content（A）, incubation temperature（B）,pH（C）and incubation days（D）on ZnPP formation in

new experimental modelBars represent standard errors（n＝３）. abc：Significant differences among water-soluble ZnPP groups, ABCD：

Significant differences among water-insoluble ZnPP groups（p＜0.05）.

Fluorescence intensity（Ex/Em：420/590 nm）

250

Water-soluble Znpp
Water-insoluble Znpp
＊＊

200
150
100
50
0

Previous model 1

New model

Fig. 3 Fluorescence intensities of water-soluble and water-

insoluble ZnPP in previous and new models

Bars represent standard errors（n＝３）. ＊＊：ｐ＜0.01© The Ito Foundation

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンIXの形成様相と存在形態に関する研究（Ⅱ）

45に，新しいモデル実験系で形成した水抽出できるび 免 疫 沈 降 法 か ら ，弱 ア ル カ リ で 抽 出 さ れ る

ZnPPを尿素ゲル電気泳動に供したところ，パル

ZnPPは，パルマハムのpHでは不溶化して存在す

マハム水抽出物とほぼ同じところに，ZnPP由来

るヘモグロビンおよびミオグロビンとの複合体との自家蛍光バンドが観察され，これらはウェスタ

して存在していることが示唆された。新しく確立

ンブロッティング法によりWangら

が報告したしたモデル実験系は，従来法よりもZnPP形成量

ヘモグロビンのバンドと一致した。従来のモデル

はおよそ10倍高く，形成されたZnPPはパルマハ

実 験 系 で は ，形 成 量 が 少 な く 尿 素 電 気 泳 動 でムと同様の複合体を形成しており，パルマハムに

ZnPPのバンドが観察されなかったが，本研究でおけるZnPP形成機構解明に有用であることが示構築した新しいモデルでは，パルマハムで観察さ

された。

３）

れるZnPP結合タンパク質と同一のバンドを短期間でZnPPを形成させることができることから，
ZnPP形成機構の解明に有用なツールとなり得る
ことが示唆された。
４．要

約

本研究では，パルマハムにおけるZnPP形成機
構解明を目的として，不溶性ZnPPの存在形態を明らかにすることと，形成量のより多いin vitroのZnPP形成モデル実験系を再構築することとした。ZnPPの含有量については筋肉や個体の違い
によるばらつきが大きかったが，水抽出率と筋肉部位のpHとの間に強い正の相関があり，ZnPPの水抽出率はpH ９で最大となった。パルマハム水
抽出残渣の弱アルカリ抽出液をサイズ排除クロマ
トグラフィー，ウェスタンブロッティング法およ文献１） Wakamatsu, J., Nishimura, T., Hattori, A.：Meat
Sci, 67, 95～100, 2004.
２）
 Labbé, R. F., Vreman, H. J., Stevenson, D. K.,
Labbe, R. F.：Clin. Chem, 45, 2060～2072, 1999.
３）
 Wang, H. C., Hayakawa, T., Kumura, H.,
Wakamatsu, J. I.：Food Bioscience. 40, 100870, 2021.
４）
 Morita, H., Niu, J., Sakata, R., Nagata, Y.：J. Food
Sci, 61, 1021～1023, 1996.
５） Adamsen, C. E., Møller, J. K. S., Hismani, R.,
Skibsted, L. H.：Eur. Food Res. Technol., 218, 403～409, 2004.
６）
 Becker, E. M., Westermann, S., Hansson, M.,
Skibsted, L. H.：Food Chem, 130, 832～840, 2012.
７）
 Taketani, S., Ishigaki, M., Mizutani, A., Uebayashi,M., Numata, M., Ohgari, Y., Kitajima, S.：
Biochemistry, 46, 15054～15061, 2007.
８）
 Wakamatsu, J., Akter, M., Honma, F., Kumura, H.,
Nishimura, T.：LWT - Food Science and Technology,
101, 599～606, 2019.
９）
 Wakamatsu, J., Okui, J., Ikeda, Y., Nishimura, T.,
Hattori, A.：Meat Sci, 68, 313～317, 2004.

© The Ito Foundation

46

食肉の風味を構成する呈味性化合物の分画およびメタボローム解析
Metabolomic analysis of taste components fraction to characterize meatflavor

水野谷

航・竹田

志郎・森川

里久＊・澤野祥子＊・齊藤千佳＊・良永裕子＊（麻布大学獣医学部，＊麻布大学生命・環境科学部）

Wataru Mizunoya, Shiro Takeda, Riku Morikawa＊, Shoko Sawano＊, Chika Saito＊ and Yuko Yoshinaga＊（School of Veterinary Medicine, Azabu University, ＊School of Life and Environmental Science, Azabu University）

The meaty taste is considered to be a complex group of taste compounds rather thanlimited known components such as free amino acids and nucleic acid related substances. We
fractionated the hot water extracts of beef by medium pressure chromatography, andsubjected each fraction to TLC to confirm the separation of the compounds. Beef extract was
separated by ODS column and two major broad peaks were observed in UV absorption, thefirst peak was assigned to Fr. 3 and 4, and the second half peak was assigned to Fr. 5 and 6 in
the first sample. Silica gel TLC showed a continuous spots consisting of ninhydrin positive
multicomponent at Rf（Relative to front）0-2 in Fr. 3 and 4. In Fr. 5 and 6, there was a spotnear Rf 0.4 that was detected by UV and another spot that showed weak reaction withninhydrin. By the sensory test comments of the first sample, it was found that Fr. 3 had a salty
and meaty taste, but Fr. 5 and 6, which were thought to have less free amino acids, also had ameaty taste. In addition to the free amino acids in Fr.5, other components may also affect themeat taste. We also performed the metabolomic analysis with these fractions. The principal
component analysis（PCA）and hierarchical clustering analysis（HCA）showed that there werelarge differences in the groups of compounds among fractions, suggesting that the compounds
were separated sufficiently. As a result, there was a remarkable difference in the substances
contained in the fractions with different sensory evaluations. In particular, the fraction
evaluated as “meat-like” contained about 60 compounds, including many substances in addition
to free amino acids.

１．目を示すものが多い。このアミノ酸は食肉の最も重的要な呈味性化合物と考えられている。アミノ酸に食肉を食味評価する際の化学的因子として味と加えて，核酸関連物質のイノシン酸も食肉の味の香りがある。食肉の味に関する成分として，アミ重要な成分である。イノシン酸は単独でもうま味

ノ酸，ペプチドと核酸関連物質（イノシン酸等）

を示すが，アミノ酸と同時添加することでアミノがよく知られている。アミノ酸は水に溶けると味酸の味覚応答がかなり強化される。このような物© The Ito Foundation

食肉の風味を構成する呈味性化合物の分画およびメタボローム解析

47

質は味覚調節物質と呼ばれ，イノシン酸だけでなされた７）。解析対象物質には遊離アミノ酸や核酸

く，いくつかの食肉由来ペプチドにはうま味増強

関連物質以外の物質も多数含まれていたが，それ作用や酸味抑制作用があることが知られていらの物質が食肉の風味にどの程度影響を与えている 。アミノ酸は食肉の加熱調理においてメイ

るかは，いまだよく分かっていない。

１）

ラード反応の基質となることから，フレーバーのそこで，本研究は肉の熱水抽出物のカラムクロ

生成にも重要な役割を果たす。食肉ではアミノ酸マトグラフィ分画物の官能評価とメタボローム解は熟成中にタンパク質が分解することで増加する

析を組み合わせることで，食肉の風味を特徴付けと考えられているが，と畜直後あるいは生体でもる化合物（群）を新規に見出すことを目的とす

筋組織には遊離アミノ酸が常に一定量存在している。本研究の実施から食肉の風味を構成する化合る。また含硫アミノ酸代謝物のタウリンも，牛肉物の全体像を描き出すことができると期待される。

のうま味の強さと正の相関を示し２），コク味との関連性も報告されていることから，食肉の呈味性法

２．方

化合物の一種と考えられる。以上より，食肉の風

2.1

味を構成する化合物について，ある程度分かって国産ホルスタイン去勢オスの市販の牛モモ肉

いるが，まだ未解明の要素が多く残っている。

実験材料（試料１）の脂身を包丁で取り除いた後，フード食品科学分野において，品質管理の最適化や食プロセッサーでミンチ状にし，100ｇに対し沸騰

品の鮮度や加工の評価，食材品種の判別，嗜好性

水600mLを入れ20分間加熱した。このようにしてや機能性の因子解明という点で，“フードメタボ

得られた肉熱水抽出液を濾過後，エバポレーター

ロミクス”として網羅的成分分析に基づくメタボで濃縮乾固を行い，再度蒸留水に溶解させて0.45

ローム解析を活用した報告が増えている。食μｍフィルターで濾過を行い，それを肉抽出液と肉でもメタボローム解析の応用は増えている。

して使用した。次に，交雑種去勢オスの牛ヒレ肉

Jiangらはいくつかの牛挽き肉のメタボローム解の市販品を購入し，同様に調製した（試料２）。

析と官能評価の結果を比較し，牛挽き肉の官能評

ただし，試料２は脂肪分が多かったため，熱水抽

価の違いを生む33の物質（化合物の同定には至っ

出液を氷水で冷却し固化した脂肪分を取り除く作ていない）をあげている 。また，Muroyaらは業を加えた。

３，４）

５）

牛肉の熟成中に増加する物質の解析にメタボロー
ム解析を応用している６）。したがって，メタボロー
ム解析は食肉の風味の解析に非常に有用な手法で

2 . 2 中圧クロマトグラフィーによる肉抽出物の分画
試料１の抽出液1.5mL（牛肉0.4ｇ相当）をス
モ ー ル ス ケ ー ル の 逆 相 系 ODS カ ラ ム（ODS-あることが示唆される。
食肉の呈味性化合物の多くは筋細胞に存在する

SM-50Ａ，山善）に流速1.0mL/minで，10％エタ代謝基質（あるいはこれらの物質が加熱により変

ノールでイソクラティックに展開して８フラク化した化合物）である。我々は性別や飼育条件，

ション（Frs. 1-8）を分取した。試料２の抽出液

加熱条件が異なる豚肉をメタボローム解析に供し2.0mL（牛肉12ｇ相当）は，ラージスケールの水て調べた結果，約130の物質についてピークが同系逆相ODSカラム（ODS-Ａ-40Ｂ，山善）に流定され，これらの組成比は飼育条件や加熱調理で

速4.0mL/minで，蒸留水で10分，１％エタノール

異なることが示され，食肉の風味との関連が推測

で６分（Frs. 1-4），２％エタノールで４分（Frs.

© The Ito Foundation

48

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）5-8），３％エタノールで８分（Frs. 9-13），５％エタノールで６分（Frs. 14-16）のステップワイ

３．結果と考察

ズ法で分画した。最後は100％エタノールで溶出

肉熱水抽出液（試料１）をODSカラム（ODS-を行った。検出はUV検出器（254nm）を用いてSM-50Ａ）で分離したところ，UVの吸収におい行った。

て２つのピークを確認することができ，前半の2.3

薄層クロマトグラフィー（TLC）

ピークをFr. 3，4，後半のピークをFr. 5，6に割

中圧カラムクロマトグラフィーで分画した各フり当てた（Fig.１）。シリカゲルTLCでは，Fr. 3，

ラクションはODSプレート（RP-18 W

F254s，

4においてRf（Relative to front）０-２にニンヒ

Merck）とSiO2（シリカゲル）プレート（TLC

ドリン陽性の多成分からなる連続スポットが見らSilica Gel 60 F254，Merck）で，ODSプレートはれた。したがって，Fr. 3，4ではアミノ基をもちエタノール：酢酸：水＝１：１：18，SiO2プレー

極性の高い成分，すなわちアミノ酸が多く含まれトは，ブタノール：酢酸：水＝４：２：１の展開

る画分と考えられた（Fig. ２）。Fr. 5，6におい

溶媒で展開し，254nmのUV吸収，ニンヒドリンてはRf 0.4付近にUVで検出されたスポットとニおよび10％硫酸との加熱による呈色反応で検出しンヒドリンで弱い反応を示すスポットが見られた。

た。一方，Table１に示した試料１の官能検査の2.4

コメントを見ると，Fr. 3では塩味や肉様の呈味

官能試験

各フラクションは蒸発乾固の後，少量の蒸留水性があることが分かったが，遊離アミノ酸が少なで溶解した。男女７名を被験者とした。各被験者

いと思われるFr. 5，6でも肉様の呈味性が見られは蒸留水で溶解したフラクション溶液約50μＬをたことから，単独の物質が肉の風味を決めている

口に含んだ後，各フラクションについて感じたコ

わけではない点と，Fr. 5の遊離アミノ酸以外のメントを自由に記載してもらった。試料２につい成分も風味に影響を与える可能性を示している。

ては，評価項目として「肉らしさ」を０～３の４

肉熱水抽出液（試料２）をラージスケールのODSカラム（ODS-A-40Ｂ）で，ステップワイズ

段階で評価した。
2.5

法で分離したところ，顕著なUVの吸収は見られメタボローム解析

官能試験の結果，風味を感じたフラクションをなかったが，シリカゲルTLCでは，Fr. 9-12にお中心にメタボローム解析に供した。解析したサン

いてRf 0.4付近にニンヒドリン陽性の複数のス

プルは試料１からFr. 3とFr. 5，試料２からFr.

ポットが見られた（Fig. ３）。したがって，UVの4-6の混合溶液，Fr. 7-9の混合溶液，Fr. 11溶液，

吸収は見られなかったが，肉熱水抽出液に含まれ

Fr. 13溶液，Fr. 14-16の混合溶液，100％エタノー

る化合物の分離はできていることが示唆された。

ル溶出画分および試料１と試料２のクロマトグラ

また，Fr. 15，16はUVとニンヒドリンで検出はフィー抽出液の合計10検体とした。メタボローム

なかったが濃縮すると白色沈殿が観察された。

解析は，ヒューマン・メタボローム・テクノロ

Fr. 3，4ではアミノ基をもち極性の高い成分，すジーズ（HMT）株式会社に委託し，CE-TOFMS

なわちアミノ酸が多く含まれる画分と考えられによるピーク検出，主成分分析（PCA）や階層

た。Fr. 5，6においてはRf 0.4付近にUVで検出さ的クラスタリング解析（HCA）をはじめとした

れたスポットとニンヒドリンで弱い反応を示すス

統計解析を行った。

ポットが見られた。Table２に示した試料２の官© The Ito Foundation

49

食肉の風味を構成する呈味性化合物の分画およびメタボローム解析

UV detector signal

Fr. 5

Fr. 3

Fr. 1

Fr. 6

Fr. 4

Fr. 2

0

Fr. 7

15

30

Fr. 8

45

Elution time (min)Fig. 1 Chromatogram of medium pressure column chromatography. The hot water

extract of beef sample（sample No.1）was separated by ODS column. The 10％
ethanol at the flow rate of 1.0 mL/min was used for isocratic elution. Totaleight fractions were obtained.

ODSプレート

UV（254 nm）

solvent
front

Origin

Fr. 1

2

3

4

5

6

ニンヒドリン

7

8 Fr. 1

2

3

4

SiO2プレート

UV（254 nm）

solvent
front

5

10%濃硫酸6

7

8

ニンヒドリン

Fr. 1 2 3 4

5

6 7

8

10%濃硫酸OriginFr. 1 2

3

4

5

6

7

Fr. 1 2

8

3

4

5

6

7

8

Fr. 1 2 3 4 5

6

7

8

Fig. 2 Thin layer chromatography（TLC）analysis of the fractionated substances derived from beef sample（sample

No.1）by the medium pressure chromatography. TLC was done on a regular ODS and silica plate. The plate was
eluted with ethanol：acetic acid：water 1：1：18（by volume）for ODS plate and butanol：acetic acid：water 4：
2：1（by volume）mixture followed by exposure to UV light（254 nm）, ninhydrin stain and 10％ sulfuric acidspray with heating. The circles drew in the plates indicate spots detected by UV light.
Table 1 官能検査のコメント（試料１）
フラクションNo.

評価コメント1

何も感じない（７名）

2

何も感じない（７名）

3

塩味（４名），はっきりとした味（刺激）（１名），だしの素（１名），肉の味（１名）

4

Fr.3より薄い（１名），Fr.3と似ている（１名），肉の味（３名），弱くなったが肉（１名）

5におい（強い）が肉（１名），味はマイルド（１名），Fr.4より肉（４名），肉の味（４名）
後味がしつこい（１名）

6

何も感じない（７名）

7

あと味のある味（１名），表現できない味（うま味，甘味）（１名）

8

香り？喉に何かあるかなという感じ（肉ではない）（２名）© The Ito Foundation

50

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

ODSプレート（ニンヒドリン）
solvent
front

Origin

Fr. 0

1 2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

9

10

11

12 13 14

15

16

SiO2プレート（ニンヒドリン）
solvent
front

OriginFr. 0 1 2

3

4

5

6

7

8

12 13 14

15

16

Fig. 3 Thin layer chromatography（TLC）analysis of the fractionated substances derived from beef sample（sample No.2）by the medium pressure chromatography. TLC was done on a regular ODS and silica
plate. The plate was eluted with ethanol：acetic acid：water 1：1：18（by volume）for ODS plate andbutanol：acetic acid：water 4：2：1（by volume）mixture followed by ninhydrin stain.

Table 2 官能検査のコメント（試料２）
フラクションNo

評価
平均値

1

0

水ではない（３名）

2

0

ぺちょっとする味（１名）

評価コメント30

何かある（１名），刺激？（１名）

4

1

肉ではないが味はある（３名），肉っぽいなにか（１名）

5

1

肉ではないが味はある（３名）

6

1

弱いが肉に近い（１名）

7

1

何かある（１名），肉！？（１名）

8

1

Fr.6, 7よりは強い肉（２名）

92

うま味（２名），塩味（１名），ねちょ肉（１名），何かある（１名）

10

2.5

Fr.9より強いうま味（１名），塩味（２名），ダシっぽい（１名），肉らしさがある（１名）

11

3

濃厚（１名），味が強い（１名），Fr.8.9よりうま味，塩味が強い（１名）

12

2

11よりは薄い（２名），肉っぽい（１名），塩味が弱くなった（１名）

13

1.5

酸味？（３名）141

弱い酸味（２名）

15

0

何もない（４名）

16

0

何もない（４名）

EtOH

3

何か足りない肉の味（培地っぽい）（４名）

能検査のコメントを見ると，全体的に試料１と比出した溶出液の評価は，培養細胞の培地のよう，

べ呈味性は弱かったが，Fr. 11で最も強い味刺激という食肉の風味との関連は推測されるが，好まが得られた。ただ100％エタノールでカラムを溶しい評価ではない意見が見られた。

© The Ito Foundation

51

食肉の風味を構成する呈味性化合物の分画およびメタボローム解析

HCA

PCA
15

Fr11(S2)

PC 2（11%）

2.5
2

10

1.5
1
0.5

5

0
-0.5

Fr5(S1)
Fr7-9(S2)0undiluted(S2)Fr13(S2)Fr4-6(S2)
Fr3(S1)Fr14-16(S2)－5-1undiluted(S1)

-1.5
-2

FrEtOH(S2)

-2.5

－10
－10

0

10

20

30

40

50

PC 1（77.4%）

Sample 2

Sample 1

Fig. 4 Principal component analysis（PCA）and hierarchical clustering analysis（HCA）of whole metabolites detectedin fractions and/or undiluted beef samples（sample No.1 and No.2）.

メタボローム解析による代謝物の網羅的解析結ら，これらの物質は食肉の呈味性については，直果では，主成分分析（PCA）と階層的クラスタ

接的な影響はないことが示唆された（他の味を修リング解析（HCA）の結果から，フラクション

飾する可能性はある）。官能検査で食肉の風味をに含まれる化合物群で大きな違いがあることが分感じた試料２のFr. 11には約60の化合物が含まれかり，化合物の分離はできていることが示唆されていた。今後は，この物質がどれほど呈味性に影た（Fig.４）。一方，肉抽出液の原液では試料１響するかを検証していきたい。

と試料２で化合物の濃度に大きな違いがあった。
この理由は今のところ不明であるが，材料の違

４．要約い，脂肪分除去操作の影響が考えられた。検出で食肉の呈味成分，いわゆる食肉らしさを特徴づ

きた各代謝物については，フラクションによってける味は，単独の呈味成分ではなく複合的に含ま大きく異なっていた。ニンヒドリンの反応から予れている呈味性化合物群であると考えられる。

測されたように試料１のFr. 3とFr. 5にはそれぞ

我々は食肉熱水抽出物をクロマトグラフィで分画れ含まれる化合物群は異なっていた。また，含まし，各分画物をTLCに供し化合物の分離が達成れる化合物には複数の種類のアミノ酸が含まれてできたことを確認するとともに，分画物の官能評いた。さらに，アミノ酸以外にも多くのジペプチ

価から食肉らしい風味を有する画分を見出し，メ

ドや有機酸も含まれていた。特にアミノ基を有す

タボローム解析を行った。その結果，官能評価がるペプチド類はニンヒドリンとも反応することか異なる画分では含有物質には大きな違いがあっら，ニンヒドリンと反応した物質はジペプチドもた。特に食肉らしいと評価された画分では約60の含まれていた可能性が高い。試料２についてもフ化合物が見出され，その中には食肉の呈味性に最ラクションによって含まれる化合物は大きく異なも重要と思われる遊離アミノ酸以外の物質も多数ることが分かった。特に呈味性を示さなかったフ含まれていた。

ラクションにも化合物が多く含まれていたことか© The Ito Foundation

52

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

文献１） 岸恭一，西村敏英編：タンパク質・アミノ酸の科
学，工業調査会, 2007.
２） Suzuki, K., Shioura, H., Yokota, S., Katoh, K., Roh,
S. G., Iida, F., Komatsu, T., Syoji, N., Sakuma, H.,
Yamada, S.：Anim. Sci. J., 88（3）, 421～432, 2017.
３） Wishart, D. S.：Trends Food Sci. Technol., 19（9）,482～493, 2008.
４） Cevallos-Cevallos, J. M., Reyes-De-Corcuera, J. I.,
Etxeberria, E., Danyluk, M. D., Rodrick, G. E.：
Trends Food Sci. Technol., 20（11-12）, 557～566,
2009.
５） Jiang, T., Bratcher, C. L.：Food Res. Int., 90, 298～306, 2016.
６） Muroya, S., Oe, M., Ojima, K., Watanabe, A.：
Metabolomic approach to key metabolites
characterizing postmortem aged loin muscle ofJapanese Black（Wagyu）cattle, Asian Australas. J.
Anim. Sci., 32（8）, 1172, 2019.
７） Sawano, S., Oza, K., Murakami, T., Nakamura, M.,
Tatsumi, R., Mizunoya, W.：Metabolites, 10（1）, 10,
2020.

© The Ito Foundation

53

食肉製品の香気分析に基づく品質管理手法の開発
Development of quality control method of meat products based on flavor
analysis

河原聡（宮崎大学農学部）

Satoshi Kawahara（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

The taste of meat products is one of the essential qualities, as is the hygienic quality. This
study investigated the relationship between quality evaluation results by typical methods suchas sensory tests and aroma component composition.
Among the sausages manufactured by a domestic meat processor, the same lot of
sausages whose off-flavor was detected during the quality inspection process within thecompany was used as samples. As typical quality evaluation items, lipid content and fatty acidcomposition, TBARS value, product color, and aroma components were analyzed. At the sametime, a sensory evaluation of flavor was also carried out.
For the off-flavor samples tested this time, increases in TBARS value and decreases in b＊
value（yellowness）on the product surface were observed. In addition, the analysis results ofthe flavor components showed an increase in the compounds related to lipid oxidation and adecrease in the smoke component. These results were in agreement with the results of thesensory evaluation. Therefore, the above results suggested that it is possible to evaluate thechange in taste or quality of meat products by analyzing the flavor component.

１．目

は生活環境や食習慣など，経験則に基づく学習に的より形成されると考えられているが，異臭につい食肉製品の食味性は，衛生品質とならび，最もては生体防御に近い本能的な感覚であるとされて重要な品質の一つである。食品の食味性は味，香いる。それゆえ，人の知覚においても比較的感度

り，食感などで形成されることが知られており，が高く，検知した際の嫌悪感が強いため，製品に

食肉製品においては，原材料や調味料，添加物，対する苦情の原因となりやすい。

製造工程や製造条件など，さまざまな要因により製品の呈味の評価は一般に官能評価により行われるが，官能評価員の主観に依存した手法のた変化する。
食品から生じる香気成分は鼻先香や口中香を形め，その精度や再現性に問題が生じやすい。また，成する要因であり，消費者にも鋭敏に知覚される

機器分析などから得られる数値データと比較し食味の構成要素である。香気に対する人の嗜好性て，官能評価の結果は可視化が難しく，管理手法© The Ito Foundation

54

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

として利用しにくい。

GC-2010を用いて，以下の条件で行った。

そこで本研究では，食品の呈味に直接的な影響

キャリアガス：He，流速：25cm/秒，気化室温を及ぼす食肉製品の香気成分を分析し，その結果

度：250℃，検出器温度：250℃，カラム温度：

により製品の品質を管理することの可能性に着目

160℃，３分保持→240℃（４℃/分）

した。香気成分分析は，その成分の回収操作が煩雑であり，かつ再現性に乏しいことに起因して，

３）
TBARS値の測定は，Yamauchiらの方法（1980）に準じて行った。

食肉製品の品質管理に利用されることは少なかっ

製品色の色調測定は，製品表面および接断面にた。しかし，上述のような特性を鑑みて，香気成

つ い て 色 彩 計（MINOLTA CM-23d）を 用 い て

分に基づく品質管理と品質改善は食肉産業におい行った。

て非常に重要な検討課題である。

官能検査は，本学学生10名をパネルとして，市

本申請課題では上記の観点に基づき，官能検査

販製品および異常製品の２点比較法により口中香をはじめとする伝統的な手法による品質評価結果の質の差異，口中香の強さ，口中香の好ましさをと香気成分組成との関連を検討する。これにより評価した。また，各製品に感じた特徴について自得られる知見に基づき，最終製品の官能的な品質

由記述を求めた。官能評価にあたっては，あらかを可視的に，より精度高く推測する手段を考案す

じめ樹脂包材に真空包装した製品をウォーターバ

ることを最終的な目的として実施するものである。

ス（70℃）で20分間湯煎したのち，包材から製品２．方を取り出し，厚さ約３mmの輪切りにして，ただ法

ちにパネルによる評価を実施した。パネルに提供

供試材料は，国内の食肉加工業者において製造された食肉製品（ソーセージ）のうち，同社内のする製品の組み合わせは乱塊法により決定し，順序効果は本試験では誤差要因とした。

品質検査の過程で風味異常（オフフレーバー）が香気成分の分析試料は，官能評価と同様に，検知されたものと同ロットの製品を提供していた

70℃，20分間加温した後，流水中で10分間放冷し

だいた。また，比較対照には同社同銘柄の市販製た。その後，包丁で細切し，ブレード型のホモゲ品を用いた。分析までの間，製品は包装状態のまナイザー（AM-７，日本精機製）を用いて氷冷

ま，－70℃で保存した。

下にジクロロメタンで香気成分を抽出した。その製品の品質評価項目として，脂質含量，脂肪酸後，抽出液をsolvent-assisted flavor evaporation

組成，チオバルビツール酸反応物質値（TBARS（SAFE，桐山製作所製）にて揮発性成分の減圧値），製品の色調，官能評価および香気成分分析

蒸留を行った。蒸留物をジクロロメタンに再溶解を実施した。脂質含量は重量法で行った。脂肪酸

し，クデルナ・ダニッシュ濃縮器で濃縮した後，組成分析のための脂肪酸メチルエステルの調製

GC-MS分析を行った。

は，Folchらの方法（1957）１）に準じて総脂質を抽GC-MS 分 析 は ，Rtx-WAX Ⓡ （0.25mmID × 30

出した後，Takenoyamaらの方法（1999）２）に準ｍ，膜厚0.25μm，Restek社）を装着したGCMS-

じて，けん化とメチルエステル化を行った。脂肪

QP5050（島津製作所製）により行った。分析条

酸メチルエステルの分析は，Rtx-WAX （0.25

件は，キャリアガス，He；気化室温度，200℃；

mmID×30ｍ，膜厚0.25μm，Restek社）および

カラム温度，40℃～220℃（40～100℃まで５℃/

水素炎イオン化検出器を装着した島津製作所社製

分，100～220℃まで10℃/分）；イオン化電圧，Ⓡ© The Ito Foundation

55

食肉製品の香気分析に基づく品質管理手法の開発

70eV；スキャンレンジ，33-400m/zとした。各は，すべての項目で製品間の差異は認められな成分の同定は，標準物質（標品）に対する相対保

かった。このことは，すべての製品で適切に塩漬

４）
持時間（Kováts，1958）
およびNISTデータベーが行われていたことを暗示するものと考えられた。
塩漬やくん煙の状態を推測する指標として，製スにより行った。

品の表面および断面の色調を測定した。製品表面

３．結果と考察の 色 調（Table １ の 表 面 色）に つ い て は ，明 度

市販されている正常製品と製造業者内での官能（L＊値）および赤色度（a＊値）には顕著な差異は評価でオフフレーバーが検知されたロットの製品認められなかった。それに対して，黄色度（b＊値）（オフ製品）の品質評価結果をTable１に示す。原はオフ製品でやや低い値を示した。食肉製品表面

料品質の指標として測定した脂質含量に明確な差の色調は主にくん煙により付与され，煙中の成分異は認められなかったが，脂質酸化の指標であるに由来する褐色に特徴付けられる。オフ製品の表

TBARS値についてはオフ製品が若干高い値を示

面色におけるb＊ 値の低下は，製造工程においてした。なお，本研究で試料としたソーセージは加くん煙成分が製品表面に十分付着していなかった

熱食肉製品であることを考慮すると，オフ製品でことを示唆すると考えられた。

得られたTBARS値は製品不良とするほどの高値ではなかった。

食肉製品の香りや風味には，脂肪の品質，すな
わち脂肪酸組成が大きな影響を及ぼすことが知ら

加熱食肉製品においては塩漬やくん煙の作用にれている。本研究で用いた試料については，それより，一般に脂質酸化が抑制されると考えられてぞれの平均的な脂肪酸組成に明確な差異は認めらいる。塩漬剤に含まれる亜硝酸塩から生成する一れなかった（Table２）。これらの結果および脂質酸化窒素（NO）がミオグロビンのヘム鉄と結合含量の結果から，品質検査時における風味異常あすることで，食肉製品に特徴的な塩漬肉色を付与

るいは脂質酸化の進行は原材料の品質が主な原因する。また，ヘム鉄へのNOの結合は，ヘム鉄のではないと推測された。

酸化還元電位を安定化し，鉄の酸化に起因する脂SAFE装置によりソーセージから抽出した香気

質酸化を抑制することが知られている。本研究で成分のGC分析結果をTable３に示す。本研究におは，鉄の安定化について直接的な評価を行わな

いては，正常製品あるいはオフ製品を明確に区別かったが，製品内部の色調（Table１の断面色）

できるような，特徴的な成分の変化は観察できな

Table 1 食
 肉製品の品質評価結果
正常製品

オフ製品

p

脂質含量（g/100 g）

29.3 ± 1.69

29.2 ± 0.91

0.948

TBARS値（mg MDA/kg）

0.034 ± 0.014

0.163 ± 0.080

0.022

表面色

L＊

59.66 ± 1.43

60.65 ± 2.53

0.542

a＊

13.30 ± 1.16
28.52 ± 0.84

12.99 ± 0.74
25.23 ± 2.61

0.714
0.081

68.20 ± 3.99
11.00 ± 1.84

67.54 ± 1.97
10.48 ± 0.80

0.809
0.678

8.68 ± 0.59

8.79 ± 0.61

0.806

b＊
断面色

L＊
a＊
b＊

ｐはWelch検定による有意確率を示す© The Ito Foundation

56

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 2 総脂質の脂肪酸組成（g/100g総脂肪酸）
化合物名

正常製品

Table 3 ソーセージに認められた主な香気成分（ppm）

オフ製品

オフ製品

72.7

80.5

14：0

1.11 ± 0.02

1.15 ± 0.03

16：0

22.1 ± 0.2

22.6 ± 0.4

Hydrocarbones

16：1 n-7
18：0

1.98 ± 0.02
12.0 ± 0.5

1.98 ± 0.08
12.5 ± 0.7

Heptane2.4

2.9

Octane0.7

0.6

18：1 n-941.8 ± 0.1

40.8 ± 0.9

18：1 n-7

2.72 ± 0.09

2.73 ± 0.08

18：2 n-6

14.6 ± 0.8
0.80 ± 0.12

Propanal

3.7

4.2

18：3 n-3

14.5 ± 0.5
0.78 ± 0.09

Butanal

1.7

2.5

20：4 n-60.34 ± 0.02

0.34 ± 0.01

Hexanal

17.0

22.4

others

2.59 ± 0.04

2.52 ± 0.08

SFA

35.9 ± 0.7

36.9 ± 1.1

MUFA
PUFA

47.7 ± 0.2
16.4 ± 0.7

46.6 ± 1.1
16.5 ± 0.9

か っ た 。し か し ，主 に 脂 質 酸 化 に 起 因 す る
hexanalなどのアルデヒド類や一部のケトン類はオフ製品で増加する傾向が認められた。これは，オフ製品においてTBARS値が比較的高値を与えた事実を裏付けるものであった。また，個々の成分量に明確な差異はないものの，くん煙に起因す
るフェノール化合物や環状ケトン類は，オフ製品
で低値を与える傾向が認められた。
学生をパネルとする官能評価において，「正常製品」と「オフ製品」の口中香は，２点比較（食べ比べ）をすれば確実に検出されるほど，明確な違いがあることが示された（Table４）。また，口中香の「強度」はパネルあるいは被験試料の組み合わせにより揺らぎを生じるものの，「正常製品」
がより「好ましい」と評価される傾向にあることが示された（Table５）。また，官能評価にあわせ

Lipid oxidation

正常製品

Aldehyde

Ketones
2-butanone

8.9

7.6

2-heptanone

10.8

10.1

2,3-octanedione

8.0

9.4

3-methylbutanone

4.3

4.4

Alcohols
1-pentanol
1-penten-3-ol

8.6
2.2

8.2
3.3

Furans2-methylfuran
2-ethylfuran

1.3
3.1

1.4
3.5

Amino acid degradation
2-methyl-1-propanol
2-methylbutanal
3-methylbutanal

27.0
4.9
6.4

27.3
6.9
5.9

15.7

14.5

Smoke
Phenolic compounds
Phenol2-methylphenol
2-methoxyphenol

37.1

26.6

2.3
3.6

2.5
2.6

13.8

10.4

1.2

1.1

9.8

3.1

4.2

4.5

2.2

2.4

7.4

7.9

Cycloketones
Cyclopentanone
Cyclohexanone
3-methylpyridine
2-furanmethanol
SpicesEugenolて実施したアンケートでは，オフ製品について「酸敗臭」や「生臭さ」を感じた，あるいは「ス臭が十分に付与されていない可能性が示唆されモーク感が弱い」というコメントが寄せられた。

た。くん煙は，その前後に乾燥および加熱調理の対照的に，正常製品については，「食肉製品の風工程を含み，複雑な加工工程である。また，スモー味」や「スモーク感」を強く感じたというコメン

クチャンバーの仕様や性能などの要因によって，トがあった。

同じロットの製品でも品質のムラが生じやすいも以上の結果より，製造工程でオフフレーバーがのと推測される。くん煙の不良は製品表面の色調検出された製品では，くん煙が不均一で，くん煙や香気成分，特にフェノール化合物の含量低下に© The Ito Foundation

食肉製品の香気分析に基づく品質管理手法の開発

57

Table 4 官能評価における「口中香の質の違い」の回答を行った。その結果，品質評価指標についてはあるない

TBARS値の増加，製品表面の黄色度の低下が認400められた。また，香気成分の分析結果では，脂質パネルの回答数
総回答数＝40

酸化に関連する成分の増加，およびくん煙成分の減少が観察された。これらのことから，本研究でTable 5 ソ ーセージの官能評価結果
正常製品

オフ製品

p

「強い」という回答数

24

14

0.268

「好ましい」という回答数

26

13

0.081

総回答数＝40

用いた試料では脂質酸化の進行およびくん煙の不良が予測された。これらの結果は，官能評価の結果と一致するものであった。以上の結果から，香気成分を分析することにより，製品の呈味の変化

p：正常製品を選択する場合の二項確率を示す

あるいは品質の評価が可能であることが示唆された。

より検出することが可能であると推測された。また，脂質酸化の進行についても，脂質酸化により生成するアルデヒド類の増加により検出できるものと予測された。
オフフレーバーの発生原因は多様であるため，
今後，同様の性状を示すさまざまな製品の検査点数を増やし，製品の加工不良や脂質酸化などの品
質劣化と相関する臭気成分を精査することで，香気成分に基づく品質管理が可能であると考えられ
た。
４．要

約

風味異常（オフフレーバー）を呈する食肉製品の品質変動を，その香気成分の変化により評価す
る方法について検討した。正常な製品およびオフ
フレーバーが認められた製品について，従来から

文
献１）
 Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H.：A
simple method for the isolation and purification of
total lipids from animal tissues, Journal of
Biological Chemistry, 226, 497～509, 1957.
２）
 Takenoyama, S-I., Kawahara, S., Murata, H.,
Yamauchi, K.：Investigation of some preparation
procedures of fatty acid methyl esters for capillarygas-liquid chromatographic analysis of conjugatedlinoleic acid in meat, Animal Science Journal, 70（50）,336～342, 1999.
３）
 Yamauchi, K., Nagai, Y., Ohashi, T.：Quantitative
relationship between alpha-tocopherol andpolyunsaturated fatty acids and its connection todevelopment of oxidative rancidity in porcine
skeletal muscle, Agricultural Biological Chemistry,
44, 1061～1067, 1980.
４）
 K o v á t s , E . ：G a s - c h r o m a t o g r a p h i s c h e
Charakterisierung organischer Verbindungen. Teil
1：Retentionsindices aliphatischer Halogenide,
Alkohole, Aldehyde und Ketone, Helvetica Chimica
Acta, 41（7）,1915～1932, 1958.

用いられている品質評価指標および香気成分分析© The Ito Foundation

58

次世代の培養肉作製のための骨格筋タイプ変換技術の基礎的研究
Basic research on skeletal muscle type conversion technology for the next
generation of cultured meat

久保

純１・井上

雄介２・山田昭博１・佐原玄太１・近藤貴大１・小椋

利彦１（１東北大学加齢医学研究所，２旭川医科大学先進医工学研究センター）

Atsushi Kubo1, Yusuke Inoue2, Akihiro Yamada1, Genta Sahara1, Takahiro Kondo1 and Toshihiko Ogura1（１Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University,
２Advanced Medical Engineering Research Center, Asahikawa Medical University）

Controlling the skeletal muscle type of cultured muscle is essential for the production ofhigh-quality cultured meat. In this study, we developed an electrical pulse stimulator that can
mimic the activity patterns of various motor nerves from slow to fast muscles, with the aim ofestablishing a skeletal muscle type conversion technology that does not require genetic
manipulation such as viral transduction or genome editing. We were able to reduce the sizeand cost of the system by designing and manufacturing our own electronic circuit board, which
is a significant improvement over our initial system that combines commercial devices. In
addition, we recognized that the constant voltage stimulation method that we initially used
may have reproducibility problems, so we changed it to a more reproducible constant current
stimulation method.
When we performed stimulation experiments using cultured fast-twitch muscle derived
from mouse myoblasts on a culture dish, we were able to increase the expression of slowtwitch myosin heavy chain gene, Myh7. At the same time, we were able to confirm theactivation of transcription factors such as Nfatc1. In addition, we identified candidate
transcription factors that may be involved in skeletal muscle type conversion. In knockout
mice of one gene, the expression of Myh4, a fast-twitch myosin heavy chain, was drasticallyreduced. This gene may be involved in the determination of skeletal muscle type.
In this study, we also investigated a method to efficiently isolate myoblasts from various
skeletal muscles. Under the myoblast culture conditions we identified, myoblast proliferation
was greatly enhanced. We plan to apply these findings to cultured bovine and porcine muscle
to control skeletal muscle type for high-quality cultured meat production.

１．目

脂肪組織の比率の違いのほかに，筋繊維ごとの違的いにも起因していると考えられる。骨格筋は遅筋

我々が食している肉はさまざまな部位からなから速筋のバリエーションがあるが，代謝の違い

り，味や食感が異なる。この部位の違いは筋肉とから，脂質を主なエネルギー源とする遅筋，糖を© The Ito Foundation

次世代の培養肉作製のための骨格筋タイプ変換技術の基礎的研究

59

主なエネルギー源とする速筋に分類される（速筋2.2はさらに，２Ａ型，２Ｘ型，２Ｂ型の３種類に分

当初の電気刺激装置は直流安定化電源，ファン

類が可能）１）。このように骨格筋は，筋繊維レベ

クションジェネレーター，オシロスコープを自作

ルで特性が異なっており，これらの特性の違いがの電子回路を用いて接続し，Bipolarの電気パル

食感や味の違いにも寄与していると考えられる。

スを発生できるようにした。装置改良では，上記

一方で，次世代の食品加工技術として，動物の市販装置が担っていた機能を持つ電子基板を設個体からではなく，筋肉細胞を培養皿上で培養計・製造し，マイコンにより制御する構成に変更

し，成形した培養肉が近年登場してきた。高品質した。上記システムから生成される電気パルスをな培養肉を作製するためには，これらの筋肉のタ

炭素電極を通じて培養皿上の培養筋肉に負荷しイプを自在にコントロールする技術が必須といえた。初期型の刺激方式では定電圧制御であったる。

が，より再現性が高いと考えられる定電流方式に

これまでの研究から，骨格筋タイプは転写因子

電気刺激装置改良した。

とよばれるいくつかの遺伝子を操作することで，2.3

筋タイプの変換を誘導することが可能であること

RNAの抽出はTrizol Reagentを用いた。組織サが分かってきた。しかし，食品という用途のため

ンプルのホモジナイズが必要な場合には，組織に，分子生物学で汎用されるウイルスやゲノム編

50-100mgに対して，１mlのTrizol Reagentを用集等による遺伝子操作は安全性への配慮，消費者

い，ビーズ破砕装置Microsmash MS100R（トミーのイメージのために積極的な選択肢とはなりえな

精工）を用いて，破砕を行った。クロロホルム添

い。遺伝子操作を用いずに，骨格筋のタイプをコ加により得られた水溶性成分に対し，イソプロパ

ントロールする方法論を確立することが必要であ

ノール沈殿を行い，RNAを回収した。RNAはる。そこで我々は骨格筋の可塑性に注目した。

ReverTraAce qPCR Master Mix with gDNA

骨格筋は神経の発火パターンに適応して，別の骨

Remover（TOYOBO）を用いて，逆転写した。

格筋タイプへと変化しうることが知られてい合成したcDNAを鋳型として，各遺伝子の発現量る 。この骨格筋の可塑性を利用し，遺伝子操作を定量PCR装置CFX connect（Bio-Rad）によりによらない骨格筋のタイプ変換技術を確立するこ

解析した。

２,３）

４）

2.4

とが本研究の目的である。
２．方
2.1

遺伝子発現解析

遺伝子導入

培養筋肉への遺伝子導入はプラスミドを用いた法

トランスフェクション，またはアデノウイルスを用いた感染により実施した。プラスミドを用いた細胞培養

C2C12 細 胞 は 牛 胎 児 血 清 （FBS ， Gibco ：トランスフェクションの場合，C57BL/6Nマウス

10270-106）を10％含む培養液DMEM（nacalai）

由来のRNAから合成した遺伝子全長のcDNAをを用い，37℃，５％ CO２環境下で培養を行った。

鋳型として，目的とする遺伝子のタンパク質コー

筋肉への分化誘導は，細胞をコンフルエントにしド領域をPCRにより増幅し，精製した。これを蛍た後，ウマ血清（gibco）を２％含むDMEMに交光タンパク質であるGFP遺伝子がすでに組み込ま換し行った。

れているプラスミドなどにIn-Fusion HD Cloning
Kit（TaKaRa）を用いて組み込んだ。組み込ま© The Ito Foundation

60

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

れたプラスミドは大腸菌に形質転換後，アンピシ

組み合わせて，培養骨格筋への電気刺激装置としリンで選択した。得られたコロニーは，液体培地

た。しかし，この方法では１システムあたりのコ中で振盪培養し，ZymoPURE Plasmid Miniprep

ストが高く（30-50万円），またシステム全体も比Kit（ZYMO RESEARCH）を用いてプラスミド

較的大きく，他の解析装置との連携の面でも柔軟の抽出を行った。プラスミドのトランスフェク

性が低いという欠点があった。またこの装置を用

シ ョ ン に は ， ViaFect Transfection Reagent

いて行った一連の実験の結果，当初システムで採（Promega）を用いた。アデノウイルスを用いた用していた刺激方式（定電圧刺激）では，同一電感染の場合，上記のクローニング手法と同様に目

圧値で刺激した場合でも，培養条件や細胞の状態

的遺伝子をコードするDNAを，アデノウイルスに影響され，誘起できる収縮強度にばらつきがあ

ゲノムをコードするコスミドベクターに組み込ん

り，再現性に問題があることが分かった。これらだ。制限酵素処理によりアデノウイルスゲノムをの問題点を解決すべく，我々は自ら電子基板を設

コスミドから切り出した後，Adeno-Ｘ 293細胞計・製造し，当初システムで使用していた市販装

株にトランスフェクションし，アデノウイルスを置の機能を代替できる新しい電気刺激装置を作製作製した。抽出したアデノウイルスを細胞培養培した（Fig.１）。この電気刺激装置はサイズが非地に添加することで，感染を行った。

常に小さく，また直流安定化電源も必要としない

2.5

ゲノム編集

ことから，簡便に使用することができる。また，

CRISPR/Cas9システムを用いて，遺伝子の破さまざまな運動神経の活動を模倣する任意の刺激壊を行った。目的遺伝子のエキソンを標的とするパターンを生成することができる。定電流方式をガイドRNAを設計した。同時にガイドRNAが標実装したことにより，多サンプルへの刺激でも常的とする配列周辺のコドンを終止コドンに変更し

時正確に電流値をコントロールすることで，再現た 一 本 鎖 オ リ ゴ DNA（ssODN）を 設 計 し た 。

性が大幅に向上した。

crRNA，tracrRNA，Cas９タンパク質，ssODN

3.2を導入し，目的遺伝子内のコドンを終止コドンに

電気刺激のパターンの違いによって骨格筋タイ

電気刺激による骨格筋タイプ変換の検討

変更し，タンパク質が発現しないようにした。
2.6

握力測定

マウス・ラット用握力測定装置GPM-101B/V（メルクエスト）を用いて，水平式での測定を行った。マウスに前肢でバーをつかませ，尾を引っ張ることで最大張力を記録した。測定間のイ
ンターバルを１分とし，６回の測定を行った。
３．結果と考察3.1

電気刺激装置の開発

研究開始当初に行ったパイロット実験では，直流安定化電源，ファンクションジェネレータ，オシロスコープなどの市販装置を自作の電子回路とFig. 1 The electrical pulse stimulator developed in thisstudy. By implementing a constant current
stimulation method, reproducibility was greatly
improved.

© The Ito Foundation

次世代の培養肉作製のための骨格筋タイプ変換技術の基礎的研究

61

4.5
4
3.5
3
2.5
2

N.A.

1.5
1
0.5
0

Myh7

Myh2
Control

Myh1

Myh4

EPS

Fig. 2 Cultured skeletal muscle differentiated from C2C12 cells was subjected

to slow-muscle-type electrical pulse stimulation and gene expression was
examined. Myh7 gene expression was upregulated.

析 し た と こ ろ ，遅 筋 型 の ミ オ シ ン 重 鎖 で あ る
Myh7遺伝子の発現が上昇した（Fig.２）。また遅Nfatc1-GFP

筋型の電気刺激によって，培養筋肉内で起きている現象を調べるために，蛍光タンパク質GFPを付加した転写因子を培養筋肉に発現させ，その局在
変 化 を 観 察 し た 。そ の 一 例 と し て ，転 写 因 子
Nfatc1の例を示す（Fig.３）。Nfatc1はC2C12細胞

EPS－

由来の培養筋肉では，細胞質に局在しているが，＋Fig. 3 The transcription factor Nfatc1 moved to the

nucleus of the myotube and was activated in
response to electrical pulse stimulation.

遅筋型の刺激パターンに応答して，細胞核に移行した。また複数の転写因子について調べた結果，
Nfatc１以外にも局在を変化させる転写因子を複数見出すことができた。
3 . 3 さまざまな筋肉から安定的に筋芽細胞をプ変換を効率的に誘導できるかどうか検証した。

単離する方法の確立

検証にはマウス由来の筋芽細胞であるC2C12細胞

これまでの実験では，速筋型のマウス筋芽細胞株を培養皿上で筋分化させたものを用いた。

株C2C12を用いて解析を行ってきたが，骨格筋タC2C12細胞株由来の培養筋肉は遅筋型のミオシン

イプ変換メカニズムを明らかにし，さらには食肉重鎖であるMyh7遺伝子やⅡａ型のミオシン重鎖への応用を模索するためには，牛や豚などさまざであるMyh2遺伝子はまったく発現しておらず，

まな生物種の，さまざまな部位の筋肉を用いて検速筋型と考えられる。電気刺激装置を用いて遅筋証を行わなくてはならない。そのため，生体のど型の刺激パターンで刺激を行い，遺伝子発現を解のような筋肉からでも，安定的に筋芽細胞を単離© The Ito Foundation

62

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

1.4

1.2
1

0.8
0.6

0.4
0.2
0

Myh7

Myh2

Myh1
WT

Myh4

KO

Fig. 4 To examine the effects of the candidate gene on skeletal muscle types

determination, expression levels of myosin heavy chain genes in wild-type
and knockout mice was compared. In soleus muscle, the expression of the
Myh4 gene in KO mice was significantly decreased.

する方法を整備する必要がある。これまでに我々

3 . 4 骨格筋タイプに関与する新規転写因子のが用いていた生体筋肉からの筋芽細胞の単離方法

探索では，筋芽細胞の増殖が遅く，マウス腓腹筋のよ

これまでの研究から，骨格筋タイプ変換に関与

うな比較的大きな筋肉からはなんとか得ることがする可能性のある転写因子の候補をいくつか見出

できても，マウス長趾伸筋のような小さな筋肉かした。これらの転写因子の中から，遅筋線維に優らの単離では，短期間のうちに大量に筋芽細胞を位に発現している転写因子のノックアウトマウス

調整するのは困難であった。そこで筋芽細胞の培を，ゲノム編集により作製した。まだ純系化が不養方法の検討を行った。過去の文献では，培養液十分な面があるものの，ノックアウトマウスではの成分として，ニワトリ胚抽出液を添加すること

ヒラメ筋においてMyh4遺伝子の発現が顕著に減で筋芽細胞の増殖を活性化できるという報告が少しており（Fig.４），また握力も低下していた。

あったため，これを検討した。実際に，有精卵を3.5入手し，各発生段階のニワトリ胚からニワトリ胚本研究において，電気刺激装置を独自に開発

抽出液を作製した。また筋芽細胞の培養においてし，それを用いて効率的な骨格筋のタイプ変換をは，Engelbreth-Holm-Swarmマウスの肉腫由来誘導できるか検討した。また，骨格筋のタイプ変の基底膜成分を用いて培養器のコーティングを換に関与する可能性のある新規転写因子を見出行った。以上の検討の結果，筋芽細胞の増殖が大し，ノックアウトマウスの作製を通じて，骨格筋幅に向上し，生体の骨格筋から１週間程度で，腓タイプに与える影響を解析することができた。一腹筋であれば，１×10 個，長趾伸筋であっても，方で，本研究期間では，実際の牛や豚の筋肉を用

1.5×10 個程度の筋芽細胞の調整が可能となった。

いて，筋芽細胞を単離し，培養皿上で培養筋肉を

８

７

考察

形成させ，タイプ変換が可能であるかどうかを検討することはできなかった。食肉卸売業者にコン© The Ito Foundation

次世代の培養肉作製のための骨格筋タイプ変換技術の基礎的研究

63

タクトし，牛や豚のと殺後短期間での筋肉の入手がある転写因子の候補を同定した。実際，ある遺を試みたが，入手することができなかったためで伝子を欠損させると，特定の骨格筋タイプのミオある。

シン重鎖の発現が減少することを確認できてい４．要る。本研究で得られた知見を牛や豚の培養筋肉に約適応することで，骨格筋タイプ変換をコントロー

高品質な培養肉の作製において，培養筋肉の骨ルできるかどうか，今後検討を進める予定である。

格筋タイプを制御することは必要不可欠である。
本研究では遺伝子操作によらない骨格筋のタイプ変換技術を確立することを目的として，遅筋から速筋にいたるさまざまな運動神経の活動パターンを模倣できる電気刺激装置を開発し，それを用いて検討を行った。結果，速筋型筋肉において遅筋型ミオシン重鎖の発現を亢進させることができ，
Nfatc1などの転写因子の活性化を確認することができた。さらに骨格筋タイプ変換に関わる可能性

文
献１）
 Stefano Schiaffino, Carlo Reggiani：Physiol Rev,
91（4）,1447～531, 2011.
 Melissa L Ehlers, Barbara Celona, Brian L
２）Black：Cell Rep, 25, 8（6）,1639～1648, 2014.
３）
 Katja S C Röckl, Michael F Hirshman, Josef
Brandauer, Nobuharu Fujii, Lee A Witters, Laurie
J Goodyear：Diabetes, 56（8）,2062～9, 2007.
 N Nikolić, S W Görgens, G H Thoresen, V Aas, J
４）Eckel, K Eckardt：Acta Physiol（Oxf）, 220（3）, 310～331, 2017.

© The Ito Foundation

64

畜産副生物から再生医療部材への高付加価値加工
Add value preparation from livestock by-products to regenerative
medicine materials

神

田

英

輝

（名古屋大学大学院工学研究科）

Hideki Kanda（Graduate School of Engineering, Nagoya University）

Porcine aortic tissue was decellularized by subcritical dimethyl ether（DME）used as analternative to the surfactant sodium dodecyl sulphate. The process included three steps. For
the first step, lipids were extracted from the porcine aorta using subcritical DME at 23℃ witha DME pressure of 0.56 MPa. Next, the aorta was collected from the extraction column, andDME was evaporated from the aorta under atmospheric pressure and temperature. Residual
DME in the aorta was not detected by a headspace GC/MS. The second step involved DNA
fragmentation by DNase, which was primarily identical to the common method. For the third
step, similar to the common method, DNA fragments were removed by washing with waterand ethanol. After 3 days of DNase treatment, the DNA was completely fragmented, and theamount of DNA remaining in the porcine aorta was 40 ng/dry-mg, which was lower than thestandard value of 50 ng/mg-dry. Haematoxylin and eosin staining showed that most cell nuclei
were removed from the aorta. DNase treatment for 7 days after DME extraction resulted in amore complete removal of DNA. These results demonstrate that introducing subcritical DME
into the conventional method of decellularization of porcine aortas eliminates the need to utilize
surfactants.

１．目ド）が有用であり，その材料として主に豚組織が的注目されている。脱細胞化は，酸，アルカリによ臓器移植は重度の臓器不全患者に対する治療法

る処理，界面活性剤，酵素消化などの化学的方法となっているが，臓器移植は倫理面，移植可能なに分類される１～５）。最も広く使用されている界面臓器の欠如，免疫による拒絶反応等の課題があ

活性剤による処理は簡便である。典型的な手法でる。特に脳は記憶や人格を司ることから移植が倫は，ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）による脂質理的に不可能である。これらの課題を克服するたの抽出，DNaseによるDNA断片化，および水とめには患者自身の細胞を三次元的に培養した臓器

エタノールでの洗浄によるDNA断片の除去の３の作成が望まれる。三次元培養には他の生物組織

つのステップが含まれる。SDSには組織に対してから細胞を除去した三次元足場（スキャホール

非常に強力な脱脂作用があるが，SDSがスキャ© The Ito Foundation

畜産副生物から再生医療部材への高付加価値加工

ホールドに残留するとスキャホールド内の細胞培養が炎症反応で阻害されたり，引っ張り強度など

２．方

65

法

の力学特性が損なわれる懸念があるので，SDSを脱細胞化プロトコルは，１）亜臨界DMEによ使用しない新たな手法が望まれるが，代替物質がる脂質抽出，２）DNase処理，および３）洗浄の見つからない状況にある

６～15）

３つのステップで構成される。従来の方法との違

ここで我々は亜臨界ジメチルエーテル（DME）

いは，SDSの代わりに亜臨界のDMEを使用するを使用して，種々の湿った微細藻類や植物の細胞

最初のステップである。ステップ２と３は従来のから脂質や機能性物質の抽出に成功してき方法と同じである。

。

。微細藻類の場合，DMEによって脂質の１cmに切断した新鮮な豚の大動脈から表面のほとんどを抽出できる。特に動物のように細胞壁

脂質をナイフでトリミングした。DME抽出操作を持たないミドリムシの場合，亜臨界DMEで抽は過去の微細藻類からの脂質抽出の研究と同様の出された脂質の分子量分布は有機溶媒を使用してプロトコルである 22）。亜臨界DMEで満たされた得られたものと同じであり16），すべての脂質が抽貯蔵容器から，亜臨界DMEを抽出カラムに流通出される。さらにDMEには抽出残留物に残らなさせた。操作条件は抽出カラムの入口で23℃およい利点がある。

び0.56MPaである。抽出カラムの出口に取り付けた

16～26）

これらの結果は，DME特有の化学的および物

られた手動流量制御バルブを使用して，DME流

理的特性によるものである。DMEは最もシンプ

量を10㎖/minに調整した。5.48ｇの湿った大動脈

ルな形状のエーテルだが，その特性は一般に知ら組織をガラス製耐圧容器（96cm3）に充填した。

れるエチルエーテルとは著しく異なる。DMEの亜臨界DMEを流通させることで脂質と水分が抽

標準沸点は－24.8℃と非常に低い 。つまり，低出された。抽出カラムの出口は，接続SUSチュー

沸点のため大気圧下では常温で蒸発する。また，

ブを介して空の96cm3 圧力容器に接続されていDMEは弱い極性溶媒であり部分的に水と混合する。抽出後のカラムに溜まった抽出液の圧力を減る28, 29）。さらに，欧州食品安全機関はDMEを安全

圧弁を開いて下げた。減圧によりDMEを蒸発さな食品加工溶媒として残留許容値を示していせた後，抽出した脂質と水を容器内に残した。

る 。米国ではDMEはお菓子の表面をチョコレー

107℃で容器内の水分を蒸発させて脂質から分離

トでコーティングするための噴射剤として使用さ

し，水と脂質の重量を測定した。最後にDMEをれる 31）。また，DMEは他のエーテルとは異なり60分間流した後，抽出カラムを開放し抽出カラム

過酸化物をほとんど生成しない 。

に残っているDMEを蒸発させた。

27）

30）

32）

こ れ ら の 特 性 に 基 づ く と ，SDS の 代 わ り にDME流通後の豚大動脈1.0ｇを30㎖のDNase生

DMEを使用して高含水の豚組織から脂質を抽出

理食塩水を使用して，DNAを断片化した。生理でき，最終的にはDMEは組織に残らないと考え

食塩水は，0.9％のNaClと１％のペニシリンおよられる。そこで本研究では，DMEを使用した油びストレプトマイシンを含む脱イオン水で調製し脂抽出の後にDNase処理と洗浄を施すことで，豚た 。酵 素 溶 液 は 0.2 ％ DNase お よ び 0.05mol/l の組織（大動脈，脳），ダチョウ組織（頸動脈）の

MgCl2 6H2Oを生理食塩水に添加して調製した。

脱細胞化を試みた。本報告書では紙面数の都合調製したDNase溶液は，周囲の空気との接触を避上，豚大動脈を例に報告する。

けながら，クリーンベンチ内で使用した。DME© The Ito Foundation

66

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

抽出後，豚大動脈をDNase-生理食塩水で４℃でTEバッファー水溶液を260nmでUV分光光度法で１～７日間振とうした。

測定した。フェノールに対応する265nmにピーク

DNase処理後，サンプルを80/20（v/v）エタは観察されないこと，260nmと280nmの強度比はノール／生理食塩水で１時間洗浄した。次に，サ

約２：１であり，タンパク質がほぼ完全に除去さンプルを抗生物質を含む80/20（v/v）エタノーれたことを確認しつつ実施した。

ル／生理食塩水に浸し，４℃で保存した。洗浄と前節で得られたDNA溶液の断片分布は，ポリ保管を３日間毎日繰り返した。次にサンプルを抗アクリルアミドゲル電気泳動によって決定した。

生物質を含む生理食塩水に４℃で１日間浸漬した。

12.5％ゲルのポリアクリルアミド/トリス-HCl

豚大動脈への残留DME量は，既往研究のプロ

バッファーのゲル/バッファー組成を使用した。

トコルに従ってガスクロマトグラフィー／質量分

DNA溶液をDNAローディングバッファーと５：析（GC/MS）ヘッドスペースシステムで検出し１（v/v）の比率で混合した。調整したDNA溶液

たと塩基鎖長マーカーを泳動槽に滴下し，蛍光染色。DME抽出の１日後0.50ｇの豚の大動脈を

21, 33）

10㎖のヘッドスペースバイアルに入れ，GC/MS
分 析 は Agilent 5977A 質 量 分 析 計 に 接 続 さ れ た
Agilent 7890B-GCシステムを使用して実施した。

試薬で染色した。
３．結果と考察Agilent7697Aヘッドスペースサンプラーを接続

Fig.１はDMEを使用した豚大動脈からの脂質

し，ヘッドスペースの加熱温度は50℃，バイアル抽出挙動である。1.65wt％の脂質が大動脈の乾燥の平衡化時間は10分に設定した。オーブン温度は重量の150倍の亜臨界DMEで抽出された。その最初に40℃で５分間設定され，その後５℃min－１

際，大動脈に含まれていた初期水分の90.1％も抽の速度で260℃まで上昇した。測定質量範囲は29出されて除去された。Fig.２は，亜臨界DMEによ～450 m/zである。

るDME処理前後の豚大動脈の外観を示している。

脱細胞化された豚大動脈の核は，１％ヘマトキ

DME処理後の大動脈は乾燥して白色に変化し，

シリン-エオシン（HE）で染色した。パラフィン

ヘッドスペースGC/MSにより残留DMEは検出さブロックを作成後に中心部でスライスし光学顕微れなかった。以前の研究で藻類から脂質を抽出し鏡で観察した。

た 場 合 も 抽 出 残 渣 に DME は 検 出 さ れ て お ら

DNase処理後の豚大動脈からDNAを抽出した

ず21, 34），今回の結果はこれと一致している。

後に精製した。まず５mgのDME抽出後の豚大動

DNaseでさまざまな日数でDNA分解処理を施

脈組織をマイクロチューブに入れ，200㎕のプロして洗浄した後，豚の大動脈組織をHE染色した。

テ イ ナ ー ゼ Ｋ 溶 液（１MTris-HCl 水 溶 液［pHFig. 3aに示す未処理の豚大動脈組織と同様に，

7.8］， 0.5M エ チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸 水 溶 液

DME抽出のみのサンプルでは細胞核が見られた［EDTA，pH 8.0］
，蒸留水，SDS＝１：２：２：（Fig. 3b）
。DNase処理１日後（Fig. 3c），ほとん

95：0.5 v/v/v/v/w）と混合し，55℃で１日転倒

どの細胞核が除去された。Fig. 3d，3e，3fに示す混和した。DNAはフェノール/クロロホルム抽出

ように，DME抽出後３～７日間のDNase処理後によって組織から除去され，エタノール沈殿に

では細胞核は観察されなかった。これらの結果はよって精製した33）。

亜臨界DMEだけでは細胞核を除去できないが，DNAの定量化は，溶解したDNAを含む１㎕のDNase処理や洗浄と組み合わせると，SDSを使用© The Ito Foundation

67

畜産副生物から再生医療部材への高付加価値加工

Extracts / sample (g/g-dry)

0.018
0.016
0.014
0.012
0.010
0.008
0.006
0.004
0.002
0.000
0.0

50
100
150
200
DME / sample (g/g-dry)

250

Fig. 1 Amount of lipids extracted by subcritical DME extraction

from porcine aortas.

abFig. 2 Porcine aorta before（a）and after（b）subcritical DME treatment.

せずに細胞核を除去できることを示している。

を下回るものである。ただし，Fig.４に示すよう各条件における残留DNA量をFig.４に示す。

にDNA残存量を測定すると誤差があるので，確DME 抽 出 の み の 場 合 ，残 留 DNA 量 は 1704ng/

実に目標値を下回るには５日間のDNase処理が望mg-dryであり，未処理の豚大動脈のDNA量であましい。７日間のDNase処理後，残留DNA量はる2295ng/mg-dryと比較してわずかに減少し，８ng/mg-dryであり，DNAのほぼ完全な除去が亜臨界DMEは低い効力ではあるがDNAを抽出お達成された。

よび除去する能力を持っている可能性がある。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出された

DNase処理の１日後の残留DNAの量は，未処理

残留DNA断片長の分布をFig.５に示す。左端のの大動脈の32％にあたる量にまで減少しており，

レーンはDNA断片の長さの標準値を示す。（ａ）

DNAが容易に除去され急速に分解されることを

元の豚大動脈（ｂ）DME処理のみ（ｃ）DME処示している。DNase処理の３日後に残留DNAの理と１日間のDNase処理（ｄ-ｆ）DME処理と量は40ng/mg-dryだった。これは，脱細胞化後

DNase処理を３，５，７日間施したサンプルを示す。

のDNA残存量の目標値である50ng/mg-dry

35～38）

Fig. 5aおよび5bに示すように，元の大動脈と© The Ito Foundation

68

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

a

b

c

20µm

d

20µm

e

20µm

f

20µm

20µm

20µm

Fig. 3 Haematoxylin-eosin staining：（a）Untreated.（b）DME extraction only.（c-f）

DNase treatment for 1（c）,3（d）,5（e）,and 7（f）days following DME extraction.

Residal DNA amount (ng/mg-dry)

104
1704
731

103

102

40

20
8

101

100

0

2

4

6

DNase treatment after DME extraction (day)Fig. 4 Residual DNA amounts in the porcine aortas.

DME処理だけのサンプルでは，1000bpを超えるされ，亜臨界DMEはDNAを断片化できないこと

ものから200bp未満までの広い範囲でDNAが検出がわかる。（ｃ）に示すように，DME抽出後１日© The Ito Foundation

畜産副生物から再生医療部材への高付加価値加工Standard

(a)

(b)

69

(c) (d) (e) (f)1000 bp
900 bp800 bp700 bp600 bp500 bp400 bp300 bp200 bp100 bpFig. 5 Fragments of residual DNA in the samples detected by agarose gel electrophoresis：（a）Untreated.（b）DME extraction only.（c-f）DNase treatment for 1（c）, 3（d）, 5（e）, and 7（f）days following DME
extraction.

間DNase処理した場合DNAは検出されず，100bp未満への完全な分解が明らかになった。同様に，

４．要約

DNaseにより長期間処理した場合，（ｄ-ｆ）に示

亜臨界DMEによって豚大動脈から脂質を抽出すようにDNAは検出されなかった。つまり，

し，DNase処理と組み合わせることで，細胞核を

DNAを200bp未満に断片化するには１日のDNase

豚の大動脈から除去し，界面活性剤を用いずにス処理で十分だったが，Fig.４に示す残留した断片

キャホールドを作成できた。また，紙面数の都合

化DNA量の結果とあわせると，断片化したDNAで本報告書での記載を省略したが，同じ手法で豚を洗浄によって除去するには，長時間のDNase処

脳組織やダチョウ頸動脈組織でも成功した。脳は理による断片化が必要であると示唆している。

従来，スキャホールド化がきわめて困難であった

このように，亜臨界DMEによる脂質抽出と組織であり，ダチョウ組織は豚が宗教上の禁忌でDNaseによるDNA断片化の組み合わせにより，ある患者に適用できる。今後は，これらのスキャ

SDSを使用せずに豚大動脈を脱細胞化してスキャ

ホールドの引っ張り強度やタンパク質の変性の有ホールドを作成できた。

無についても研究を進めたいと考えている。

© The Ito Foundation

70

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

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22）
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 Subratti, A., Lalgee, L. J., Jalsa, N. K.：Efficient
24）
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oil containing thymol, using liquefied dimethyl
ether（DME）, J. Food Process. Preserv., 43, No.
e13913, 2019.
25）
 Catchpole, O. J., Grey, J. B., Perry, N. B., Burgess,© The Ito Foundation

畜産副生物から再生医療部材への高付加価値加工
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© The Ito Foundation

72

産肉量増加を目指した間葉系前駆細胞による新規血管新生機構の解明
Elucidating a novel mechanism of angiogenesis by mesenchymal
progenitor cells

山

内

啓太郎

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Keitaro Yamanouchi（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

Mesenchymal progenitor cells（MPC）are present in a variety of organs including skeletal
muscle. We previously identified chondroitin sulfate proteoglycan 4（CSPG4）as a molecule
specifically expressed in MPC in skeletal muscle, and its distribution during muscle
regeneration suggested a role in microvascular development. In the present study, we aimed to
examine whether MPC-derived CSPG4 affects behavior of vascular endothelial cells（VEC）.
Lack of CSPG4 in MPC resulted in lower migration of VEC in co-culture system, andangiogenesis from microvascular fragments from CSPG4 knockout rats was less than thosefrom wild-type rats. In addition, skeletal muscle growth was retarded in CSPG4 knockout rats
compared to wild-type rats. The results obtained suggest that meat production could be
improved by controlling the function of MPC-derived CSPG4．

１．目

また，コラーゲンをはじめとする細胞外基質の主的要な供給源である線維芽細胞への分化能をもあわ

食肉を構成する筋肉は筋線維が集合したもの

せもつ１）。さらに，我々は未分化なMPCは筋線維で，その発達や成長を促すことは結果として肉量の形成過程（筋分化）を促進することを見出しての増加へとつながる。そのための方策としては，

いる２）。我々はMPCの細胞膜上に発現するCSPG4ステロイドや成長ホルモンのように筋線維への直（Chondroitin Sulfate Proteoglycan 4） が ， 脂 肪接の同化作用をもつホルモン（いわゆる肥育ホル細胞や線維芽細胞への分化を制御することを明らモン）の利用が古くから考えられてきたが，人体かにしてきた３）。その過程で，ラット筋肉においへの影響等，考慮すべき課題が多いため，我が国て人為的な損傷とそれに続く筋再生を誘導したやEU諸国では使用されていない。

際，CSPG4が再生直後の筋線維周囲に一過的に筋肉内には筋線維に加えて間葉系前駆細胞

集積し，その近傍にCD31陽性の血管内皮細胞（MPC）とよばれる細胞群が存在する。MPCは脂（VEC）が遊走していることを観察した。さらに

肪細胞への分化能をもち，いわゆる脂肪交雑にみ我々が新たに作出したCSPG4欠損ラットでは，られる脂肪細胞の主たる起源とされる 。MPCは遊走するCD31陽性VECの数が減少していること

１）© The Ito Foundation

産肉量増加を目指した間葉系前駆細胞による新規血管新生機構の解明73を見出した。筋線維自身はCSPG4を発現しない胞をtranswellの上層に，５ｘ10４個の２Ｇ11細胞

こ と ，さ ら に MPC の 細 胞 膜 表 面 に 発 現 す る

もしくはB2G9細胞を下層に，それぞれ播種し，CSPG4の一部は切断されて遊離型としても作用24時間培養した。メンブレンをギムザ染色したのすることを考え合わせると，これらの知見は，ち，その両面に接着しているMSS31細胞数およ

MPCから遊離したCSPG4が再生直後の筋線維周びメンブレンの下側へと遊走したMSS31細胞数

囲に集積し，それを目標としてVECが遊走してを計測した。

いる可能性を示すものである。実際，ある種のが2.3

ん細胞ではCSPG4がVECの遊走を引き起こし，野 生 型 お よ び CSPG4 欠 損 ラ ッ ト の ２ ヶ 月 と自身の増殖に有利な血管新生を誘導することが知５ヶ月齢における体重を測定した。さらに，イソられている。筋線維の発達や成長には，筋肉内にフルラン麻酔の過剰吸入により動物を安楽死させ構築される毛細血管網を介した栄養素の供給が大たのち，骨格筋および心筋を採取した。筋重量

きく影響する。したがって，筋線維の成熟過程で（前脛骨筋，ヒラメ筋および心筋）を測定し，採形成される毛細血管網を増加させることができれ取した骨格筋は液体窒素で冷却したイソペンタン

ば，効率的に筋線維の発達や成長を促すことが期中で急速凍結し，使用時まで－80℃で保存した。

待される。

骨格筋サンプルから凍結切片を作製し，抗ジスト

そこで本研究では，MPCから遊離したCSPG4
が再生直後の筋線維周囲に集積し，それを目印と骨格筋の組織学的解析

ロフィン抗体により免疫染色した切片を用いて２ヶ月齢における筋線維径を計測した。

してVECが遊走することで，効率的な血管新生

2.4が生じ，その後の筋線維の発達に寄与するという野生型およびCSPG4欠損ラットの脂肪組織か仮説の構築・立証を通じて，筋量を効率的に増加

ら，酵素処理により毛細血管の組織片（血管フラさせる新たな方法論の開発に資することを目的にグメント）を採取した。これをコラーゲンゲル中した。

に包埋し，６日間培養した。顕微鏡下で，血管フ

２．方
2.1

ラグメントに由来する血管内皮細胞により形成さ法

れる新生血管の長さと分枝数を測定した。

使用動物

CSPG4欠損ラットは，当研究室にてCRISPR/
Cas法を用いて作製した。温度23℃，湿度60％に維持された動物室にて飼育し，固形飼料，水は自由に摂取させた。すべての動物実験は東京大学農学部動物実験委員会の承認を受けて行った。
2.2

血管フラグメントの成長測定

間葉系前駆細胞と血管内皮細胞の共培養

ラット間葉系前駆細胞2G11細胞

３．結果と考察3 . 1 間葉系前駆細胞に発現するCSPG4が血管内皮細胞の遊走に与える影響
本項目では間葉系前駆細胞におけるCSPG4発
現の有無が血管内皮細胞の遊走に影響を与えるかどうかについて検証することを目的とした。血管とそこから内皮細胞（MSS31細胞）と間葉系前駆細胞（野作製したCSPG4欠損細胞（B2G9細胞）および血生 型 お よ び CSPG4 欠 損 2G11 細 胞（B2G9 細 胞））

管内皮細胞のモデルとされるMSS31細胞（JCRB

をメンブレンにより上下に区切られたtranswell

細胞バンクより購入）は，10％牛胎子血清を含むを利用して共培養した。24時間後にメンブレンのDMEM中で培養維持した。３ｘ10 個のMSS31細上 下 に 付 着 し て い た MSS31 細 胞 数 は ，下 層 に

４）

４© The Ito Foundation

74

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

2G11細胞もしくはB2G9細胞を播種した群および3 . 3 CSPG4がラットの体重や筋組織に与える細胞を播種していない群の間で違いがみられな影響かった（Fig.１）。このことから間葉系前駆細胞

本項目ではCSPG4の有無が実際に生体の筋組の有無や，それにおけるCSPG4発現の有無は血織の発達に影響を与えるかどうかについて検証す管内皮細胞の増殖には影響を与えないことが分ることを目的とした。以上のin vitroの実験で示かった。この時，メンブレンの下側に付着していされた，血管内皮細胞の遊走や血管新生に対するたMSS31細胞数，すなわちメンブレン上側から

CSPG4の作用は，当初予想していたとおりのも下側に遊走した細胞数は，下層に野生型の2G11のであった。そこで，このような作用の有無によ細胞を播種した場合に比較してCSPG4欠損2G11り実際に筋発達に違いが生じるかどうかについ細胞（B2G9細胞）を播種した場合に有意に減少て，CSPG4欠損ラットを用いて検討した。２ヶしていた（Fig.１）。このことから間葉系前駆細月齢および５ヶ月齢におけるCSPG4ラットの体胞に発現するCSPG4は血管内皮細胞を誘引する

重や骨格筋重量，心筋重量はいずれも野生型ラッ作用があることが判明した。

トに比べて低値を示していたことから，筋組織の3.2

CSPG4が血管新生に与える影響

発達が低下していることが考えられた（Fig.３）。
そこで２ヶ月齢における骨格筋発達について知与えるかどうかについて検証することを目的としる目的で，速筋線維優位である前脛骨筋と遅筋線

た。CSPG4欠損ラットから採取した血管組織片維優位であるヒラメ筋をそれぞれ構成する筋線維（血管フラグメント）のコラーゲンゲル内培養系の径を定量的に比較・解析した。その結果，前脛における血管新生について，野生型ラット由来の骨筋，ヒラメ筋ともにCSPG4欠損ラットでは野ものと比較した。その結果，培養６日後における生型ラットに比べて有意に筋線維径が減少してい新生血管の伸長や分岐数はCSPG4ラット由来のた（筋線維径の中央値，前脛骨筋：野生型88.4

血管フラグメントで野生型に比べて有意に低値をμm vs CSPG4欠損85.0μｍ，ヒラメ筋：野生型

示した（Fig.２）。このことからCSPG4が血管新104.3μm vs CSPG4欠損98.9μm）（Fig.４）。この生に対する促進作用をもつことが明らかとなった。

ことからCSPG4欠損が筋の発達を低下させる可

2500

600

2000

500

Cell number（/area）

Cell number（/area）

本項目ではCSPG4の有無が血管新生に影響を

1500
1000
500
0

2G11

B2G9

Control

＊＊＊
＊＊

400
300
200
100
0

2G11

B2G9

Control

Fig. 1 Effect of mesenchymal progenitor cells with（2G11）or without（B2G9）CSPG4 on proliferation（left）

and migration（right）of vascular endothelial cells. Graphed data are means ± SEM（n＝8）.＊＊ and, p < 0.01 and p < 0.005 vs 2G11, respectively.

＊＊＊© The Ito Foundation

75

産肉量増加を目指した間葉系前駆細胞による新規血管新生機構の解明
KO

＊＊

400
300
200
100
0

WT
Sprout number/fragment

Sprout length（μm）

WT

6
Day

2.0

KO

＊

1.5
1.0
0.5
0.0

6
Day

Fig. 2 Effect of CSPG4 on in vitro angiogenesis from microvascular fragments

in collagen gel. Angiogenesis was evaluated by measuring sprout length（left）and sprout number（right）. WT, wild-type；KO, CSPG4 knockout.
Graphed data are means ± SEM（WT, n＝4 and KO, n＝3）.＊ and ＊＊, p <0.05 and 0.01 vs WT rats, respectively.

体重（WT=18,6 KO=19,7）
WT
＊
＊

300
200
100
0

WT

Heart weight（g）

Body weight（g）

KO

2

Age（months）

1.5

0.5
0.0

5

WT

Age（months）

KO

5

WT

KO

＊＊

Soleus weight（g）

TA weight（g）

2

ヒラメ筋重量（WT=15,6 KO=18,7）

0.8
＊＊

0.4
0.2
0.0

＊

1.0

前脛骨筋重量（WT=12,6 KO=12,7）

0.6

KO

＊

500
400

心臓重量
（WT=18,6 KO=18,7）2

Age（months）

5

0.15

＊＊＊

0.10
0.05
0.00

2

Age（months）

5

Fig. 3 Body, skeletal muscle and cardiac muscle weight of wild-type（WT）and CSPG4 KO rats. Graphed data aremeans ± SEM（number of rats used are indicated in parentheses）. ＊, ＊＊ and ＊＊＊, p < 0.05, < 0.01 and p < 0.005
vs WT, respectively.

© The Ito Foundation

76

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

WT

ヒラメ筋の筋線維径（WT=5，KO=5）

KO

0.020

0.020

0.015

0.015

Frequency

Frequency

前脛骨筋の筋線維径（WT=5，KO=5）

0.010
0.005
0.000

20

40 60 80 100 120 140 160 180
Muscle ﬁber diameter（μm）

WT

KO

0.010
0.005
0.000

20

40 60 80 100 120 140 160 180
Muscle ﬁber diameter（μm）

Fig. 4 Distribution of fiber diameters of tibialis anterior and soleus muscles of WT and CSPG4 KO rats. WT,

wild-type；KO, CSPG4 knockout.

能性が示された。
４．要

約

本課題の仮説は「筋線維の成熟過程で形成される毛細血管網を増加させることができれば，効率的に筋線維の発達や成長を促すことが期待される」というものである。以上で得られた知見は，間葉系前駆細胞による血管新生機構が存在することを示すもので，本課題の仮説にも合致するものであった。今後はin vivoにおける血管発達の詳細な解析や間葉系前駆細胞からCSPG4が切断されて遊離する機序についての解明を進めること
で，産肉量の増加に向けた新規のアプローチが可能になることが期待される。

文
献１）
 Takeuchi, S., Yamanouchi, K., Sugihara, H.,
Matsuwaki, T., Nishihara, M.：Differentiation ofskeletal muscle mesenchymal progenitor cells tomyofibroblasts is reversible, Anim Sci J, 91, e13368,
2020.
２）
 Takegahara, Y., Yamanouchi, K., Nakamura, K.,
Nakano, S. I., Nishihara, M.：Myotube formation isaffected by adipogenic lineage cells in a cell-to-cell
contact-independent manner, Exp Cell Res, 324,
105～114, 2014.
３）
 Takeuchi, S., Nakano, S., Nakamura, K., Ozoe, A.,
Chien, P., Yoshihara, H., Hakuno, F., Matsuwaki, T.,
Saeki, Y., Takahashi, S., Yamanouchi, K., Nishihara,
M.：Roles of chondroitin sulfate proteoglycan 4 infibrogenic/adipogenic differentiation in skeletal
muscle tissues, Exp Cell Res, 347, 367～377, 2016.
４）
 Murakami, Y., Yada, E., Nakano, S. I., MiyagoeSuzuki, Y., Hosoyama, T., Matsuwaki, T.,
Yamanouchi, K., Nishihara, M.：Establishment of
bipotent progenitor cell clone from rat skeletal
muscle, Anim Sci J, 82, 764～772, 2011.

© The Ito Foundation

77

コリン供給源としての食肉機能の評価
Evaluation of meats functions as a choline resource

三

浦

豊

（東京農工大学大学院農学研究院）

Yutaka Miura（Institute of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

The nutritional properties of meats as the dietary choline resources were evaluated. The
contents of choline-related compounds, that is, betaine, free choline, phosphocholine（P-choline）, glycerophosphocholine（GPC）and phosphatidylcholine（PC）& sphingomyelin（SPM）in several kinds of beef, pork and chicken meats were determined by LC-MS/MS
analyses. Water-insoluble choline（PC and SPM）was the most abundant in beef roast meats,
while pork roast meats were rich in water-soluble choline, especially GPC. Chicken breast
meats contained much amount of betaine as compared with other meats.
Rats were fed for 16 days with the diets that contained freeze-dried meats powders as all
dietary choline source. There was no statistically significant difference in body weights, foodintakes and liver weights among all groups, and the serum biochemical parameters were
almost equal, although slight hypercholesterolemia and hypertriglyceridemia were observed inchicken-diet group. The serum concentration of PC and SPM was 10 times higher than that ofwater-soluble choline. Although there was no statistically significant difference, beef-diet group
showed the highest serum total choline concentration among all meat-diet groups, suggestingthat dietary PC and SPM might be important for the homeostasis of serum choline
concentration. However total choline concentration in the control group was almost equal with
beef-diet group. This result suggests that free choline is also important as dietary choline
source in water-soluble choline compounds.
In conclusion, beef roast meat was proved to be a good resource for a dietary choline
resource and dietary free choline and water-insoluble choline might be important for the
homeostasis of serum choline metabolism.

１．目

記載もなく，また食事摂取基準も定められていな

的いが，米国や欧州では食事摂取基準が定められてコリンは４級アンモニウムイオンのトリメチル

おり，また成分表示も行われている。さらに，米アミノメタノールであり，乳，卵，食肉類に豊富

国農務省の食品成分データベースには食肉，肉製に含まれている。現在，我が国ではコリンは必須

品のコリン含量が記載されているが，我が国の食の栄養素として扱われておらず，食品成分表への品中のコリン化合物の含量は個別に調査されたも© The Ito Foundation

78

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）の以外に知られておらず，データベースも存在し合物であるベタインを，脂溶性コリンとしてPCていない。しかし，コリンは神経伝達物質であるとSPMを測定し，サンプルごとに食肉１ｇあた

アセチルコリン，細胞膜リン脂質であるフォス

りのコリン含有量を求めた。

ファチジルコリンの原料であるだけでなく，タンLC-MS/MSは青木らの手法１）を改変して行っ

パク質・核酸のメチル化に関与する一炭素代謝経た。水溶性コリンの分析条件は以下のとおりであ路を構成する重要な化合物であり，その栄養学的る。HPLC（日立LC2000）にカラム（XBridge Ⓡ

な重要性は明らかである。

HILIC3.5μm，2.1 x 100mm（Waters））を装着し，

本研究は，食事由来コリンの重要な供給源であ

流速0.2ml/min・カラム温度30℃・サンプル温度

る食肉，特に我が国において主要な食肉である牛

10℃，サンプル注入量５μLの条件で分離した。

肉，豚肉，鶏肉を対象として，コリン含有化合物

遊離液はＡ；5 mM酢酸アンモニウムpH4.0，Ｂ；

を部位ごとの違いも含めて測定し，既存のデータ

100％アセトニトリルとし，０分から3.2分：A.

ベースと比較すること，さらに各食肉の中で比較

18.5％，B. 81.5％，3.2分から５分：A. 80％，B.

的コリン含量が多い部位の肉を主たるコリン源と20％，５分から14分：A. 80％，B. 20％，14分かして実験動物に摂取させた際の血中コリン含有化

ら14.1分：A. 18.5％，B. 81.5％，14.1分から20分：

合物濃度の変化を測定することにより，コリン供A. 18.5％，B. 81.5％のグラジエント条件で分離し給源として優れた食肉を見出し，食肉の食品的・た。質量分析にはBruker daltonics社MicrOTOF-

栄養学的価値を高めることを目的とする。

QIIを用いた。分析時に毎回内部標準物質として

２．方
2.1

ギ酸ナトリウム（Bruker社）を最初に質量分析

法に供し，ピークの分子量を補正して精密分子量測

食肉中のコリン含量の測定定を行った。イオン化モードはESI/positiveモー

コリン含有化合物としては水溶性のものとして

ドとして，各成分のm/z（Free Choline 104.1070，

遊 離 コ リ ン （Free Choline），ホ ス ホ コ リ ン

P-Choline 184.0733， GPC258.1101， ベ タ イ ン（P-Choline），グリセロホスホコリン（GPC）の117.1463）を有する物質のピーク面積をもとに，３種が，脂溶性のものとしてフォスファチジルコ

複数の濃度の各標準品の分析から作成した検量線

リン（PC），スフィンゴミエリン（SPM）があにより濃度を求めた。

り，これらの分別定量にはLC-MS/MSを用いた。

一方，脂溶性コリンは以下の条件で分析した。

測定に用いた食肉は，牛肉（ロース，モモ），豚

用いた機器は上記と同じである。使用カラムは肉（ロース，ヒレ），鶏肉（もも，むね）の６種

CAPCELL PAK C8 （OSAKA SODA ， Type ：であり，いずれも地元のスーパーマーケットで購

UG120，5μm，SIZE：1.5mm I.D.×150mm）とし，入した。食肉からのコリン測定用サンプルの調製

流速：0.2ml/min，カラム温度：30℃，サンプルは以下のように行った。各食肉は脂身を入れない

温度：10℃，サンプル注入量：５μＬの条件で分ように約５ｇを精秤し，４倍量のメタノールを添離した。バッファーは，Ａ；5mM酢酸アンモニ

加し，ホモジェナイズした。遠心した上清をそのウムpH4.0，Ｂ；100％アセトニトリルとして，０ままコリン測定用のサンプルとしてLC-MS/MS

分から１分：A. 95％，B. ５％，１分から５分：A.

測 定 に 供 し た 。水 溶 性 コ リ ン と し て ，Free-

40％，B. 60％，５分から10分：A. 15％，B. 85％，

Choline，P-Choline，GPCに加えてコリン関連化

10分から17分：A. ５％，B. 95％，17分から27分：© The Ito Foundation

79

コリン供給源としての食肉機能の評価

A. ５％，B. 95％，27分から27.2分：A. 95％，B.

取り除き，ロース芯に相当する部分のみを取り出

５％，27.2分から30分：A. 95％，B. ５％のグラした。食品用チョッパーを用いて，肉をミンチにジエント条件で分離した。標準品（PC, Avanti社

し，そのまま凍結乾燥後，フードプロセッサーで製，PC（12：0／12：0））とサンプルを１：９の細粉化した。食餌組成はTable１に示した。基本

比率で混合し，内部標準のピーク面積との比較に組成はAIN93Gに準拠したが，通常添加されていより，検出されたピークの濃度を算出した。PC

る遊離コリン量を食肉のみで添加することは食肉およびSPMのピークの検出は，MS/MS分析によ中のコリン含有量から困難であったため，コリン

りホスホコリンに相当するm/zである184.0733が含量を３分の１に減らし，同量のコリンを含む食検出された親イオンの分子量を確認し，その分子

肉乾燥粉末を計算し，それらに含まれるタンパク量を有する物質のクロマトグラムを作成すること

質，脂質含量を日本食品標準成分表（七訂）の該で行った。検出された複数のピークをまとめて測当する項目から抽出し，それらの値を用いて，添定することでPCおよびSPMの濃度とした。した

加する脂質，糖質を調整した。したがって，今回がって，今回の分析では各分子量ごとのPC &用いた食餌ではタンパク質含量は群ごとに異なる

SPMの合計として示した。

（Table１に計算による含量比を記載）。

2 . 2 食肉をコリン源とした食餌の作製と動物

Wistar系雄ラット（５週齢，日本SLC）24頭を予備飼育の後，一群６頭として平均体重が等しく飼育実験
食肉の分析結果から脂溶性コリンが最も多く含なるように４群に分け，AIN93G（低コリン，有される牛肉（ロース），水溶性コリンが最も多Con），Beef食，Pork食，Chicken食の４群で16く含まれる豚肉（ロース），ベタインが多く含ま

日間飼育した。食餌，水は自由摂取とし，食餌摂れる鶏肉（むね）を選び，各食肉をコリン源とす

取量は毎日，体重は２日ごとに測定した。飼育終る食餌を作製して，ラットを飼育した。食肉は食了時に麻酔下，下向大静脈より全採血し，血清を肉メーカーより直接購入した。脂身をできるだけ調製した。血清中のコリン関連化合物の測定は，Table 1 The composition of experimental diets（g/100 g diet）

Control diet（20C）

Beef diet

Pork diet

Chicken dietβ-cornstarch
CaseinBeef powder
Pork powder
Chicken powder
α-cornstarch
SucroseCorn oil
Cellulose powder
Mineral mixture（AIN93G）
Vitamin mixture（AIN93G）
Choline bitartrate

39.227
20.0
0
0
0
13.2
10
8
5
3.5
1
0.073

41.7
0
25.6
0
0
13.2
10
0
5
3.5
1
0

42.2
0
0
25.1
0
13.2
10
0
5
3.5
1
0

34.3
0
0
0
28.0
13.2
10
5
5
3.5
1
0

100

100

100

100

The values are calculated based on the choline contents in meats（Table 2）and other nutrients contents in Standard
Tables of Food Composition in Japan（7th ed.）.The protein contents are 16.7%, 15.5% and 25.7% for beef diet, pork dietand chicken diet respectively. Fat content is 8% in all diets. The choline contents in all diets are equal.

© The Ito Foundation

80

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

血清10μℓにメタノール90μℓを添加し，10分間

り，調理肉の数値が記載されていたりと直接比較

超音波処理後に遠心した上清をサンプルとしてすることは難しい。我が国の食材の分析を進め，行った。分析条件は上記と同じである。また，血独自のコリンデータベースを構築する必要がある

清中の各種生化学指標を外部に委託して測定したと考えられる。なお，今回の分析では脂溶性コリ（血糖値，血中総タンパク質，アルブミン，総コンとして100種前後の分子種が検出されているが，レステロール，HDL-コレステロール，トリグリ

詳細については割愛する。しかし，三浦らの報告３）

セリド，遊離脂肪酸，リン脂質）。

では食肉中に奇数脂肪酸を有するPCが存在する
ことも明らかにされており，今回の測定でも奇数

３．結果と考察
3.1

脂肪酸が結合したPCの存在を示唆するデータが食肉中のコリン含量について得られている。

Table２に分析結果を示した。数値はコリン関

次に，Table２の結果をもとにしてコリン供給

連化合物ごとのコリンの量として算出したもので源として食肉凍結乾燥粉末のみを用いた食餌を作ある。牛肉は水溶性コリン化合物に比べて，脂溶

製し，ラットに摂取させ，食肉のコリン供給源と性コリンを多く含むこと，豚肉は両者の量がほぼしての評価を実施した。

同じであるが，比較的水溶性コリン，特にGPCが3.2多いこと，鶏肉は牛肉と同様脂溶性コリンの方が16日間の飼育に関する基礎データをTable３に多いが，その量は牛肉よりも少ないということが示した。体重増加量に関してはChicken群がBeef

明らかになった。Table２にUSDAのデータベー

群よりも有意に高い値を示したが，他の群間では

ス ２） か ら 抜 粋 し た 食 肉 の 値 も 示 し た が ，有意な差は認められなかった。コリン量を合わせP-Cholineを除いてほぼ同じ傾向になっている。

るためにChicken群ではタンパク質レベルが高く

今回の測定でP-Cholineが高めになった原因は不なっていることがその理由の一つであると考えら明であるが，測定法の違い，標準品の純度などがれた。食餌摂取量，肝臓重量に差は見られなかっ関係している可能性が考えられた。また，USDA

た。

のデータベース記載の値は食肉の部位が異なった

食肉由来コリン含有食による飼育実験

Fig.１に血清生化学指標の測定結果をまとめ

Table 2 Choline contents in beef, pork and chicken meats
BetaineFree choline

Meat
Beef

Pork

Chicken

GPC

P-choline

PtdCho & SPM

Total Choline（mg choline moiety/100 g wet weight）
Roast

5.45

2.60

4.53

13.80

42.33

63.72

Tight

5.02

0.80

3.52

13.34

28.14

46.13

Roast

7.06

4.04

14.48

14.21

40.82

73.72

Fillet

2.78

2.40

15.25

13.77

31.85

63.42

Breast

12.04

2.77

2.68

8.33

34.89

48.97

Tight

3.61

3.64

2.20

5.62

38.38

50.13

ShoulderShoulderBroilers

12.0
4.1
8.5

1.0
5.4
5.8

6.1
11.0
1.1

1.5
1.0
3.5

66.2
61.0
56.0

75.0
79.5
66.0

USDA database2
Beef
Pork
Chicken© The Ito Foundation

81

コリン供給源としての食肉機能の評価
Table 3 Initial body weight, body weight gain, food intake and liver weight
Con

Beef

Pork

Chicken

Initial body weight（g）

151.8±1.5152.3±2.0152.5±1.7152.7±3.0

Body weight gain（g）

74.8±2.0ab

72.0±3.0a

74.0±2.9ab

83.7±2.4b

Food intake（g/16 days）

237.5±2.6
8.90±0.26

226.6±5.4
8.36±0.25

233.7±5.4
8.68±0.32

239.3±2.7
9.51±0.36

Liver weight（g）

Values are means±SEM for 6 rats. Values not sharing a common letter are statistically significant at p<0.05 by

1

hi
c

60
40
20

200
150
100
50

n
ke

k

hi
c

ef

Po
r

C

hi
c

Be

on

0

C

C

n
ke

k
C

hi
c

Po
r

Be

ef

Phospholipids

on

180
160
140
120
100
80
60
40
20
0

C

Serum Phospholipids
Concentration (mg/dL)

n
hi
c

ke

k
C

Po
r

ef
Be

on

n

Triglyceride

250nSerum Triglyceride
Concentration (mg/dL)

300

ke

k
Po
r

ef
Be

on
NEFA

C

ke

k
C

hi
c

Po
r

C

Be

n

ef

0

C
HDL-Cholesterol

C
Serum HEFA Concentration(μEq/L)

1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0

n

C
80

ke

k

Total Cholesterolon

Serum Total Cholesterol
Concentration (mg/dL)

100

hi
c

ef

Po
r

C

Be

Serum HDL-Cholesterol
Concentration (mg/dL)

40
35
30
25
20
15
10
5
0

Albuminon

Serum Albumin
Concentration (g/dL)

4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

ke

C

ke

k

n

0

C

Po
r

Be

C

ef

0

2

k

20

3

hi
c

40

4

Po
r

60

5

ef

80

Total Protein

on

100

6

Be

GlucoseSerum Total Protein
Concentration (g/dL)

120

on

Serum Glucose
Concentration (mg/dL)

one-way ANOVA followed by Tukey-Kramer’s multiplecomparison test.

Fig. 1 Serum concentration of biochemical parameters in rats. Values are means±SEM for 6 rats.

© The Ito Foundation食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

100

Free Choline

80
60
40
20

rk

hi
C
hi
C
en

rk

hi

ck

ef

Po

Be

C

on

Serum PC & SPM
Concentration (μM)

en
ck

C

C

Total choline

3500
Serum Total Choline
Concentration (μM)

en

on
C

hi
C
rk

PC & SPM

3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0

hi

Po

Be

C

ef

Soluble choline

350
300
250
200
150
100
50
0

on

Serum Soluble Choline
Concentration (μM)

B

ck
en

ef

Po

0

en

rk

50

ck

Po

Be

C

ef

0

100

rk

5

150

ck

10

GPC

200

ef

15

250

Po

20

Be

Serum GPC
Concentration (μM)

P-choline

25

onSerum P-Choline
Concentration (μM)

C

hi

Be

on

0

C

rk

ef
Be

C

ab

b

b

Serum Free Choline
Concentration (μM)

Betaine

a

ck
en

35
30
25
20
15
10
5
0

on

A

Serum Betaine
Concentration（μM）

令和２年度

Po

82

3000
2500
2000
1500
1000
500
0
Con

Beef

Pork

ChickenFig. 2 Serum concentration of choline-related compounds in rats.
A：Betaine and soluble choline-related compounds
B：Total soluble and insoluble choline

Values are means ± SEM for 6 rats. Values not sharing a common letter are statistically significant at p ＜ 0.05 by

one-way ANOVA followed by Tukey-Kramer’s multiple comparison test.

た。どの指標においても有意差は見られなかった

血中のコリン関連化合物濃度の測定結果をFig.

が，総コレステロール濃度，トリグリセリド濃度，２に示した。血中水溶性コリン濃度は脂溶性コリ

遊離脂肪酸濃度，リン脂質濃度においてChicken

ン濃度の約10分の１程度であり，これまで我々が群が高めの値を示した。

測定しているラットおよびヒトの血中の存在比と© The Ito Foundation

コリン供給源としての食肉機能の評価

同様の傾向が見られた（未発表データ）。統計学的に有意な差が見られたのはベタイン濃度のみであり，対照群と比較して食肉群すべてにおいて有83であり，今後の課題である。
４．要

約

意に低い値を示していた。対照群には外因性のベ

食肉のコリン供給源としての栄養学的特性を評

タインは添加されておらず，一方の食肉群には食価するため，６種類の食肉中のコリン関連化合物

肉由来のベタインが添加されているにも関わら含量を定量し，さらに３種類の食肉についてコリず，このような結果になった正確な理由は不明でン供給源として食肉のみを用いた食餌を作製し，あるが，コリンの存在様式が異なる形で食事を摂ラット飼育実験を行った。その結果，牛肉（ロー取することがベタインを含めたコリン代謝経路にス）には脂溶性コリンが，豚肉（ロース）には水影響していることが明らかとなった。

溶性コリン（特にGPC）が豊富に含まれているこ

コリン濃度に関しては４群間で有意な差は見らと，鶏肉（胸肉）にはベタインが比較的多く含まれなかったが，Beef群のみが対照群と同程度の値れていることが明らかとなった。これらの食肉をを示し，他のPork群，Chicken群は低めの値を示用いた食餌をラットに摂取させた結果，牛肉食がした。食肉群は脂溶性コリンが最も多く含まれてコリン供給源として他の食肉よりも優れている可おり，そのため血中脂溶性コリン濃度も他の２群能性が示唆された。

に比べて高くなったと推測される。一方，Beef群

コリンは生体恒常性維持のために重要な栄養素

は水溶性コリン化合物の含有量が少なく，実際にであるが，未解明な点が多く残されている。食肉

摂取したラットの血中においても水溶性コリン化は食生活上重要なコリン供給源であるため，今後合物の濃度がすべての化合物において低めの値をさらに検討を進める必要がある。

示している。一方，対照群はコリン源として遊離
コリンである重酒石酸コリンのみを含有した食事

最後に，本研究の実施にあたりご支援いただいた伊藤記念財団に深く感謝いたします。

であるが，水溶性コリン，脂溶性コリンともに高い値を示している。これらの結果から，コリンを食事から摂取する際には遊離コリンか脂溶性コリ
ンの形で摂取することが望ましく，そうすることで体内のコリン代謝経路が適切に働くのではないかと推測される。さらに，食肉間では脂溶性コリ
ンが豊富な牛肉がコリン供給源として適していると考えられた。今後，食品中で最も多量の脂溶性
コリンを含有する卵，特に卵黄を材料として同様の実験を行い，牛肉と比較することが必要である。すでに我々はコリン関連化合物の細胞への吸収や利用効率が化合物ごとに異なることを培養細胞で明らかにしている（未発表データ）。コリン
関連化合物ごとの生体利用率を明らかにすること文
献１） Okudaira, M., Inoue, A., Shuto, A., Nakanaga, K.,
Kano, K., Makide, K., Saigusa, D., Tomioka, Y., Aoki,
J.：Separation and quantification of 2-acyl-1lysophospholipids and 1-acyl-2-lysophospholipids
in biological samples by LC-MS/MS, Journal of
lipid research, 55, 2178～2192, 2014.
２）
 Kristine Y. Patterson, Seema A. Bhagwat, Juhi R.
Williams, Juliette C. Howe, Joanne M. Holden：
USDA database for the choline contents in common
foods. Release 2, January 2008, https://www.ars.
usda.gov/ARSUserFiles/80400525/data/choline/
choln02.pdf
３） Yamamoto, S., Kato, S., Senoo, N., Miyoshi, N.,
M o r i t a , A . , M i u r a , S . ：D i f f e r e n c e s i n
phosphatidylcholine profiles and identification ofcharacteristic phosphatidylcholine molecules inmeat animal species and meat cut locations, Biosci.
Biotech, Biochem, 85, 1205～1214, 2021.

は適切なコリン摂取の基準を定めるためにも重要© The Ito Foundation

84

食肉中に含まれる２-オキソ-イミダゾールジペプチドに関する研究Studies on 2-oxo-imidazole dipeptides in meat

居

原

秀・笠

松

真

吾

（大阪府立大学大学院理学系研究科）

Hideshi Ihara and Shingo Kasamatsu（Graduate School of Science, Osaka Prefecture University）

Imidazole dipeptides（IDPs）, such as carnosine and anserine, are present in meat at highconcentrations. They can act as antioxidants and metal chelators, and are involved in various
physiological processes, such as anti-aging and anti-advanced glycoxidation end-productactivities. Recently, in mouse tissue samples, we demonstrated the endogenous production of
2-oxo-IDPs, such as 2-oxo-carnosine and 2-oxo-anserine, which exhibited significantly higher
antioxidant activities than IDPs. The functional oxidation products of IDPs, 2-oxo-IDPs, aremost abundantly found in muscle. However, information has been scarce about 2-oxo-IDPs inmeat. In this study, we aimed at quantifying 2-oxo-IDPs in various meats and increasing
2-oxo-IDP content in meat hot water extracts.
We quantified IDPs（carnosine and anserine）and 2-oxo-IDPs（2-oxo-carnosine and2-oxo-anserine）in meats from various animals and chicken using high performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometry coupled with a stable isotope dilution method.
The analysis of 36 samples showed that IDPs were present in meats at the concentration rangeof 72.8-397.2 nmol/mg protein, consistent with previously reported results. Furthermore, we
identified and quantified the 2-oxo-IDPs in meats, and determined that 2-oxo-IDPs are present
in meat at the concentration range of 0.026-0.90 nmol/mg protein. The 2-oxo-carnosine
contents in foreign bovine sirloin and 2-oxo-anserine contents in chicken meat were higher
than those in other meats.
In addition, we prepared a chicken breast hot water extract as a model of meat processing
residue. The hot water extract contained carnosine and anserine in millimolar concentrations.
The incubation of the hot water extract with copper ion and ascorbate under oxygen
ventilation enhanced 2-oxo-IDPs levels in a copper ion and ascorbate concentration-dependent
manner. Under optimum conditions, the 2-oxo-IDPs levels in the extracts increased by 359fold. When air was ventilated instead of oxygen, the 2-oxo-IDPs levels increased by 140-fold.
These results suggest the possibility of effective meat residue application by increasing thefunctional 2-oxo-IDPs molecules present in the meat processing residue.

© The Ito Foundation

食肉中に含まれる２-オキソ-イミダゾールジペプチドに関する研究

１．目

的

２．方

カルノシンやアンセリンなどのイミダゾールジ

2.1

85

法

食肉サンプルペプチド（IDPs）は，食肉中に高濃度存在する

本実験で解析した食肉をTable１に示す。牛６ことが知られていて，抗酸化能，抗糖化能，抗炎

品種14サンプル，ヒツジ２品種２サンプル，シカ症活性，細胞保護活性などの多様な生理活性を持

２品種２サンプル，豚３品種７サンプル，イノシ

ち，機能性食品成分として利用されている１）。し

シ２品種２サンプル，ウマ２品種２サンプル，カ

かしながら，IDPsの生理活性の発現メカニズム

ンガルー２品種２サンプル，鶏３品種５サンプル

は不明な点が多く残っている。最近，申請者らは，の合計36サンプルを解析した。各サンプルはイン

IDPsの機能性酸化生成物である２-オキソ-カル

ターネット経由で購入し，冷凍で配送されたもの

ノミンや２-オキソ-アンセリンなどの２-オキソを解析するまで－80℃で保存した。

-IDPsの生体内産生を世界で初めて明らかにし，

2.2

筋肉に最も多く含まれることを示した 。さらに，安定同位体標識標準物質は，以前に報告した方２-オキソ-IDPsがIDPsよりもはるかに高い抗酸法で調製した２）。安定同位体標識カルノシンは，化活性，細胞保護活性を持つことを示した２～４）。

［13C3, 15N1］β-アラニンとp-トルエンスルホン酸

これらの結果は，これまで知られていたIDPsの（pTsOH）を混合し，さらに塩化チオニルを添加

生理活性の本体が，２-オキソ-IDPsであること

して［13C3, 15N1］β-アラニンCl・pTsOHを得，を示唆している。したがって，IDPsを機能性食また，ヒスチジンとp-TsOHを反応させたヒスチ品成分として利用する場合，食品中の２-オキソ

ジン・2pTsOHと反応させて合成した。高速液体-IDPsの存在様式に関する知見が重要となる。

クロマトグラフィー（HPLC）を用いて分取，精２）

食肉および加工残渣にはIDPsが多く含まれているが，２-オキソ-IDPsに関する知見は皆無である。２-オキソ-IDPsは，強力な生理活性因子としての可能性を秘めた新たな機能性食品成分な

安定同位体標識標準物質の調製

製し，濃度既知のカルノシンを用いて濃度を決定した。
安定同位体標識アンセリンは３-メチルヒスチ
ジンを用い，同様の方法で調製した。

ので，食肉および加工残渣中の２-オキソ-IDPs

安定同位体標識２-オキソ-IDPsは，上記で調の存在様式を明らかにし，さらに含量を高めるこ製した安定同位体標識IDPsを原料にし，硫酸銅，とができれば，食肉，加工残渣の付加価値を高め，アスコルビン酸存在下で酸素を通気して調製した

さらに健康増進，疾患予防に適用できることが期（銅・アスコルビン酸法）。

待される。本研究では，申請者が開発した高感度

2.3

定量解析法でさまざまな食肉中の２-オキソ

食肉100mgに10倍量の安定同位体標識２-オキ-IDPsを定量することと，申請者が開発した２-

ソ-IDPsを含む80％アセトニトリルを添加し，氷

オキソ-IDPsの合成法を利用して，食肉加工残渣

上でホモジナイズした。懸濁液の一部をIDPs解中の２-オキソ-IDPs量を高める方法を開発する

析用およびタンパク定量用に別のチューブに回収ことを目的とした。

した（後述）。残りの懸濁液を遠心し，上清を別IDPs，２-オキソ-IDPsの抽出チューブに移した。減圧濃縮後，100mM塩酸をホモジナイズ時の体積になるように加え，等量の© The Ito Foundation

86

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 1 List of meat samples
サンプル番号部位

ブランド・品種

産地

1

動物

サーロイン

あか牛

熊本県阿蘇

2

ロース

但馬牛

兵庫県

豊西牛

北海道

3

ウデ

4

リブロース

5

バラ

6

サーロイン

7
8

ウシ

モモ
ロース

9

ウデ

10

リブロース

11

サーロイン

12

サーロイン

アメリカ牛

アメリカ

13

サーロイン

オーストラリア牛

オーストラリア14

サーロイン

ニュージーランド牛

ニュージーランドラム

オーストラリアマトン

オーストラリア

モモシカ

高知県 梼原

モモ

エゾシカ

北海道

桜島美湯豚

鹿児島県

大和美豚

奈良県

TOKYO X

東京都

15
16
17
18

ヒツジ
シカ

19

ロース

20

バラ

21

モモ

22

ブタ

ロース

23

モモ

24

ロース

25

モモ

26

モモ

長州ジビエ イノシシ

山口県下関

モモ

イノシシ

高知県 梼原

モモ

ウマ

熊本県

モモ

ウマ

メキシコ

モモ

カンガルー

オーストラリア

モモ

カンガルー

オーストラリア

32

ムネ

ふもと赤鶏

佐賀県

33

ムネ

茶美鶏

徳島県

錦爽鶏

愛知県

27
28
29
30
31

34

イノシシ
ウマ
カンガルー

ニワトリ

モモ

35

ウデ

36

ムネ

酢酸エチル/ヘキサン（80％/20％）を添加，混合希釈法により定量解析を行った。

した。静置した後，回収した水層を強カチオン交

分注しておいた懸濁液は遠心し，上清を安定同

換樹脂カラムに供し，水，１Ｍ塩酸で洗浄後，１位体標識IDPsを含む0.1％ギ酸で希釈し，同様に

Ｍアンモニアで溶出した。溶出液を濃縮乾固後，定量解析を行った。また，沈殿を１％ ドデシル

0.1％ギ酸に溶解し，HPLC-タンデム質量分析で硫酸ナトリウム 200μlに溶解し，BCAタンパク

多重反応モニタリング（MRM）法，安定同位体

質定量キットを用いて，牛血清グロブリンを標準© The Ito Foundation

食肉中に含まれる２-オキソ-イミダゾールジペプチドに関する研究

87

Table 2 MRM parameters
AnalytePrecursor ion（m/z）

Product ion（m/z）

Collision energy
（V）

カルノシン

227.0

110.1

20

カルノシン-SI
アンセリン

231.0
241.0

110.1
109.1

20
25

アンセリン-SI

245.0

109.1

25

2-オキソ-カルノシン

243.1

196.1

10

2-オキソ-カルノシン-SI

247.1

198.0

10

2-オキソ-アンセリン

257.2

169.1

15

2-オキソ-アンセリン-SI

261.1

169.1

15

タンパク質として，タンパク質量を定量した。
2 . 4 高速液体クロマトグラフィー-タンデム

３．結果と考察3.1

質量分析（HPLC-MS/MS）

食肉中のIDPs，２-オキソ-IDPsの定量

HPLC-MS/MSは，HPLC Alliance e2695（Waters），

HPLC-MS/MSを用いたMRM法，安定同位体

三連四重極型質量分析装置Xevo TQD（Waters）

希釈法によるIDPsの定量結果をFig.１に示す。

を 用 い た ２）。IDPs は ，Scherzo SS-C18 カ ラ ム

IDPsの総量は，72.8～397.2nmol/mg protein（3.3（Imtakt）を用い，0.1％ギ酸と50mMギ酸アンモ～18.8g/kg 筋肉：筋肉中20％がタンパク質としニウム/50％アセトニトリルの濃度勾配で溶出して）であり，大筋で既報の結果と一致していた１）。

た。２-オキソ-IDPsは，Intrada Amino Acidカ

種間，系統間，部位間で，IDPs総量に大きな違ラム（Imtakt）を用い，0.1％ギ酸/アセトニトリ

いは認められなかった。牛，豚，ウマではカルノ

ルと100mMギ酸アンモニウムの濃度勾配で溶出シンが主要なIDPsであり，ヒツジ，シカ，イノ

した。質量分析のMRMパラメーターをTable２にシシ，カンガルー，鶏ではアンセリンの含量が多示す。

く，既報の結果と一致していた１）。牛とヒツジは

2 . 5 ２-オキソ-IDPsを多く含む食肉熱水抽出哺乳綱鯨偶蹄目ウシ科に，豚とイノシシは哺乳綱
鯨偶蹄目イノシシ科に属し，系統的に近縁にある液の調製
鶏ムネ肉10ｇを包丁で２～３mm角になるようにも関わらず，カルノシン・アンセリンの組成比に刻み，300ml三角フラスコに入れた。水100ml

は異なっていた。これは，餌や生育環境がカルノを加え懸濁し，三角フラスコごと沸騰湯浴中で１

シン・アンセリンの組成に影響を与えているため

時間静置した。懸濁液を遠心し，上清を熱水抽出であると考えられる。

液とした。熱水抽出液にリン酸水素二ナトリウム

２-オキソ-IDPsの定量結果をFig.２に示す。本

（終濃度100mM），硫酸銅，アスコルビン酸を添

結果は，マウス以外の筋肉中における２-オキ

加し，室温で酸素または空気を１時間通気した

ソ-IDPsの存在を示す世界で初めての結果であ後，上記の方法で，カルノシン，アンセリン，２

る 。２ - オ キ ソ -IDPs の 総 量 は 0.026～0.90nmol/-オキソ-カルノシンおよび２-オキソ-アンセリン

mg proteinであり，IDPsの0.02～0.41％に相当すを定量した。

る。申請者は，マウス骨格筋におけるIDPs，２オ キ ソ -IDPs は ，そ れ ぞ れ 34.9 ，0.035nmol/mg
proteinであり，IDPsの0.10％に相当することを© The Ito Foundation

88

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）
Carnosine
Anserine

350

300

IDPs (nmol/mg protein)

250

200

150

100

50

0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
食肉サンプルFig. 1 Quantitative analysis of carnosine and anserine in meats. Carnosine and anserine in meats were quantified using

HPLC-MS/MS coupled with a stable isotope dilution method.

2-oxo-carnosine
2-oxo-anserine

1.0
0.9

2-oxo-IDPs (nmol/mg protein)

0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
食肉サンプルFig. 2 Quantitative analysis of 2-oxo-carnosine and 2-oxo-anserine in meats. 2-oxo-carnosine and 2-oxo-anserine inmeats were quantified using HPLC-MS/MS coupled with a stable isotope dilution method.

© The Ito Foundation

89

食肉中に含まれる２-オキソ-イミダゾールジペプチドに関する研究
2-oxo-carnosine
2-oxo-anserine

350
300

2-oxo-IDPs (µM)

250
200
150
100
50
0

AsA (mM)

-

0.1

1

10

0.1

1

10

10

Cu (mM)

-

0.1

0.1

0.1

1

1

1

0.1

Gas

-

OxygenAir

Fig. 3 Production of 2-oxo-carnosine and 2-oxo-anserine in hot water extract of a chicken breast. The hot water

extract was incubated with copper ion and ascorbate under oxygen or air ventilation. 2-oxo-carnosine and 2-oxoanserine in the extract were quantified using HPLC-MS/MS coupled with a stable isotope dilution method. ASA,
ascorbic acid ; Cu, copper.

報告している２）。本実験の結果と合わせると，哺2.27mM，0.22μＭ，0.76μＭ含まれていた。熱水

乳類，鳥類の筋肉中には，IDPsの数百分の１～

抽出液に硫酸銅，アスコルビン酸を加え，酸素を数千分の１の２-オキソ-IDPsが含まれていると通気したところ，硫酸銅，アスコルビン酸の濃度推察される。なかでも，外国産牛サーロインのに依存して２-オキソ-IDPsが増加した。硫酸銅

２-オキソ-カルノシン，鶏の２-オキソ-アンセリ

１mM，アスコルビン酸10mMの場合，未処理のンの含量が高かった。この結果から，種，系統，359倍に増加した。

部位，餌，飼育環境，食肉加工方法，保存状態な

また，酸素の代わりに水槽用エアーポンプを用どが２-オキソ-IDPs含量に影響を与えている可いて空気を通気したところ，酸素通気の場合と同能性が考えられる。

様に，２-オキソ-IDPsが140倍に増加した。この3 . 2 ２-オキソ-IDPsを多く含む食肉熱水抽出結果から，酸素ガスの代わりに空気を利用することで，簡便に２-オキソ-IDPsの生成が可能であ液の調製法の検討
鶏ムネ肉の熱水抽出液を食肉加工残渣のモデルとして，我々が開発した銅・アスコルビン酸法

ることが示された。

２）を用いて２-オキソ-IDPsの高含量化を検討した

４．要約（Fig.３）。本実験で調製した熱水抽出液中には，

イミダゾールジペプチド（IDPs）は食肉中にカルノシン，アンセリン，２-オキソ-カルノシン，

高濃度存在し，抗酸化能などの多様な生理活性を

２-オキソ-アンセリンが，それぞれ1.30mM，持つことが知られている。最近，申請者らは，© The Ito Foundation

90

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

IDPsの機能性酸化生成物である２-オキソ-カル

気したところ，２-オキソ-IDPsがそれぞれ359倍，

ノミンや２-オキソ-アンセリンなどの２-オキソ

140倍に増加した。これらの結果は，食肉加工残-IDPsの生体内産生を明らかにし，筋肉に最も多渣中に存在する機能性分子２-オキソ-IDPsを増く含まれること，２-オキソ-IDPsがIDPsよりも加させることによって，食肉加工残渣の付加価値はるかに高い抗酸化能を持つことを示した。これを高め，有効利用に展開していく可能性を示唆しまでに食肉中の２-オキソ-IDPsに関する知見はている。

皆無である。本研究では，さまざまな食肉中の２-オキソ-IDPsを定量することと，食肉熱水抽出
液中の２-オキソ-IDPs含量を高める方法を開発することを目的とした。
哺乳類，鳥類由来の食肉中には，IDPsが72.8～
397.2nmol/mg protein含まれていた。また食肉中に，0.026～0.90nmol/mg proteinの２-オキソ-IDPsが存在することを明らかにした。外国産牛サーロ
インの２-オキソ-カルノシン，鶏の２-オキソ-アンセリンの含量が高かった。また，食肉加工残渣
モデルとして鶏ムネ肉熱水抽出液を調製し，硫酸
銅，アルコルビン酸存在下で酸素または空気を通文
献１） A. A. Boldyrev, G. Aldini, W. Derave：Physiology
and Pathophysiology of Carnosine, Physiol. Rev.,93, 1803～1845, 2013.
２）
 Ihara, H., Kakihana, Y., Yamakage, A., Kai, K.,
Shibata, T., Nishida, M., Yamada, K., Uchida, K.：２
-Oxo-histidine-containing dipeptides are functionaloxidation products, J. Biol. Chem., 294, 1279～1289,2019.
３）
 垣花優希，笠松真吾, 居原秀：酸化イミダゾール
ジペプチドによる生体機能調節，実験医学増刊，
38，1637～1643，2020.
４）
 Kakihana, Y., Kasamatsu, S., Uchida, K., Ihara,
H.：Distribution and quantitative analysis ofhomoanserine and its 2-oxo derivative in mouse
tissues, Free Radic. Res., 2021 in press.

© The Ito Foundation

91

国際基準および国内と畜場の現場実態に適合した
牛枝肉の生物的危害要因制御のための内部検証方法の開発
Development of internal verification methods for control of biologicalhazard in beef carcasses adapted to both global standard and domesticslaughterhouses

猪

島

康

雄

（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

Yasuo Inoshima（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

In slaughterhouses in Japan, the cleanliness of all carcasses（lots）is generally evaluatedby examining the viable bacteria count by the “cotton ball method.” In this method, cotton balls
are used to wipe the surface of a certain number of carcasses determined according to thenumber of slaughtered animals. However, the testing accuracy of this method is not high due
to its low acquisition of viable bacteria from the carcass surface. In addition, no clear method
has been established to evaluate the cleanliness of all carcasses（lots）based on the test resultof extracted carcasses. This study compared the viable bacterial counts examined by four test
methods: excision（EC）,sponge swab（SS）,cotton ball（CB）, and cotton stick（CS）. In addition,
the number of samples required to evaluate the cleanliness of all carcasses（lots）at internalverification was calculated by probability estimation based on the three-level method
recommended by the International Commission on Microbiological Specifications for Foods.
EC displayed a high value in the comparative quantification of the sample collection
methods and was considered appropriate for evaluating the true value. However, the EC
method could not be easily performed on multiple samples, and was therefore economically andoperationally challenging. The viable bacteria count determined by EC is equivalent to theviable bacteria count measured by the CB multiplied by 50. In addition, the three-level method
revealed that 10 samples were required for adequacy evaluation of lot at internal verification.
Therefore, microbial testing by CB with 10 samples was considered practical for internalverification.
To control microbial hazards of beef carcasses in slaughterhouses, we successfully
developed an internal verification method. Statistical evaluation demonstrated that the method
is compatible with the actual situation of domestic slaughterhouses and is scientificallysupported by international standards.

© The Ito Foundation

92
１．目

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）と報告された１,２）。一般にわが国のと畜場では，的と畜頭数に応じて抽出した一定数の枝肉の表面を2018年６月，食をとりまく環境変化や国際化等

綿球で拭き取る「綿球法」により，一般生菌数をに対応し，食品の安全を確保するため，食品衛生調べることで枝肉全数（ロット）の清浄度を評価

法，と畜場法の一部が改正された。2020年６月かしている。しかし，同法は枝肉表面からの生菌のら は ，規 模 に よ ら ず す べ て の と 畜 場 に お い て回収性が低く，検査精度が高くない。また，抽出

HACCP（Hazard Analysis Critical Control Point）

した枝肉の検査結果から枝肉全数（ロット）をどに基づく衛生管理の実施が義務化された（１年間う評価するかについても明確な手法が確立されての猶予期間あり）。と畜業者等は，衛生管理計画

いない。食品製造においては，原材料搬入およびの妥当性や枝肉の微生物汚染検査について，食肉製造から流通に至るまで，すべての関係者の同意

衛生検査所による「外部検証」を受けることになくしては，実際に食の安全に係る検証や見直しなった。国は，外部検証における微生物汚染検査を実施することはできない。HACCPの内部およにおいては枝肉を一定面積，かつ一定数切除してび外部検証においても，科学的根拠に基づき，か微生物検査する「切除法」を採用し，全国の食肉つ国際基準にも適合し，さらに現場の同意を得て衛生検査所に通知している。枝肉の微生物検査方

日常的に運用可能であることが必須である（Fig.

法は国によって異なっており，EUでは「切除法」，

１）。

米国では表面積の広いスポンジで枝肉の表面を拭

そこで本研究は，と畜場での牛枝肉の生物危害き取る「スポンジ法」が採用されている。一方，要因のうち微生物危害を制御するために，国際基と畜場管理者が行う「内部検証」については，枝準に適合し，かつ国内と畜場の現場実態にも適合肉を傷つける「切除法」は商品価値を損ない，ました内部検証方法を統計学に基づいて開発するこた，時間と手間を要し，多検体の実施が困難なことを目的とした。

とから，日常的に実施することは経済的にも運用的にも困難である。外部検証において「切除法」

２．方法を採用しているEUにおいても，内部検証に「切2.1除法」を適応することは同様の理由により難しい

国 際 食 品 微 生 物 規 格 委 員 会 ICMSF

検体採取法の比較

Scientiﬁcevidence

Daily
operation

International
standard

Fig. 1 Requirements for internal and external verifications.

© The Ito Foundation

国際基準および国内と畜場の現場実態に適合した牛枝肉の生物的危害要因制御のための内部検証方法の開発

93（International Commission on Microbiologicalcotton stick）にて10×10cm ２ ずつ各12検体，合Specifications for Foods）およびEUの枝肉の微わせて48検体を採取した（Fig.２，Table１）。細生物検査方法を参考にした。

菌検査は，厚生労働省の要領に従い調整および培と畜場内で解体時に牛伝染性リンパ腫と診断さ養を行い，一般生菌数（logCFU/cm２）を算出し，れ，廃棄が決定した肥育牛２頭を用いた。１頭は多重比較（Dunnet，p ＜0.05）を行った。

25か月齢の去勢黒毛和種，一般畜として搬入，も2.2

う１頭は13か月齢の去勢交雑種，病畜として搬入

ICMSFの考え方に基づく国立医薬食品衛生研された。枝肉の温と体の胸部からEUの切除法

究所の生食用食肉の規格基準の設定を参考に摂食（EC，excision），米国のスポンジスワブ法（SS，

時安全目標値を定め，摂食までの加熱等に伴う増sponge swab），わが国で広く採用されている綿減率を考慮し，と畜場の牛枝肉での一般生菌数の球 法（CB ，cotton ball），お よ び 綿 棒 法（CS ，達成目標値（PO，Performance Objective）を決

内部検証時に必要な検体数の検討（A）

excision（EC）

sponge swab（SS）

cotton ball cotton stick
（CS）
（CB）

abdominal side

Back side（B）
Back side
①

②

③

CS

CB

EC

SS EC

EC

CS CB SS
CS CB

EC

SS

EC

EC

SS

CB

①

CS

SS CB

②

CS

③

CB CS

SS

Right carcass

Left carcass

Fig. 2 Sampling methods compared in this study（A）and sampling sites（B）.

Table 1 Comparison of sampling methods and sampling number
MethodJapanese Black

Cross bred

Total

Left

Right

Left

Right

ExcisionSponge swab
Cotton ball
Cotton stick

3
3
3
3

3
3
3
3

3
3
3
3

3
3
3
3

12
12
12
12

Total

12

12

12

12

48

© The Ito Foundation

94

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

定 し た 。PO よ り 低 値 側 に 微 生 物 学 規 格 基 準

比較した４種類の検体採取法の中では，EUで採（MC，Microbiological Criteria）を設け，三階級用されている切除法（EC）が最も多く細菌数を法 に よ り MC～PO の 検 体 数 を １ と し た 場 合 に検出できることが明らかとなった。しかし，最初ロットの95％がPOを達成することを90％の信頼に述べたように，枝肉を傷つけ，商品価値を損な度で確認するために必要な検体数を算出した。

い，また時間と手間を要し，多検体の実施が困難な切除法（EC）は，経済的にも運用的にも困難

３．結果と考察である。綿球法（CB）により測定した一般生菌

一般生菌数（logCFU/cm ）の平均は切除法

数を50倍すれば切除法（EC）による菌数に換算（EC），3.93；スポンジスワブ法（SS），2.49；綿できることが明らかとなったことから，内部検証

球法（CB），2.23；綿棒法（CS），0.86で，切除法においては，三階級法により算出された10検体を（EC）群から見たDunnettでは，スポンジスワブ

用いた綿球法による微生物検査が実用的であると法（SS），綿球法（CB），綿棒法（CS）いずれも，考えられた。ICMSFは適正な検体数について，

p ＜0.05であり，切除法（EC）が有意に高値を示

微 生 物 学 規 格 基 準（MC），摂 食 時 安 全 目 標 値

した（Fig.３）。また，１群12検体では正規分布（FSO ， Food Safety Objective）， 達 成 目 標 値に収まり，等分散であったことから群としてなら（PO）に ，検 査 特 性 曲 線（OC 曲 線 ，Operating

各拭き取り検査法から切除法を推定することが可Characteristic curve）に基づいた三階級法での能と考えられた。すなわち，綿球法（CB）によサンプリングプランを提唱している３）。

２り測定した一般生菌数を50倍することで，切除法

切除法（EC）を採用しているEU域内のイタリ（EC）による一般生菌数に換算できることが明ら

アでは，切除法（EC）での一般生菌数は，綿球かとなった。

法（CB）を含む拭取法により測定した菌数の５

内部検証時に必要な検体数は，三階級法により倍で換算すると規定している２）。我々の換算率と10検体と算出された。

大きく異なるのは，拭取法は施設間や作業者間でViable bacteria count (log/cm2)

今回の研究により，枝肉の微生物検査法としての差が大きいため４～６），異なる換算率が算出され

5
4

＊

＊

＊

SS

CB

CS

3
2
1
0
－1
－2

EC

Fig. 3 Comparison of viable bacteria count among four

sampling methods. Statistical significance between EC andothers was calculated using an ordinary one-way ANOVA
test followed by pairwise comparisons using the Dunnett
test. ＊, p<0.05. EC, excision；SS, sponge swab；CB, cotton
ball；CS, cotton stick.

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国際基準および国内と畜場の現場実態に適合した牛枝肉の生物的危害要因制御のための内部検証方法の開発

95

考 え ら れ た が ，多 検 体 の 実 施 が 困 難 な 切 除 法たと思われる。
以上より，本研究により，と畜場での牛枝肉の（EC）は，経済的にも運用的にも困難である。綿

微生物危害を制御するために，国内と畜場の現場

球法（CB）により測定した一般生菌数を50倍す

実態に適合し，かつ国際基準にも科学的裏付けをれば切除法（EC）による菌数に換算できること

持って適合した内部検証方法を，統計学に基づきが明らかとなり，三階級法によりロットの妥当性

開発することに成功した。

評価のために内部検証時に必要な検体数は10検体と算出された。よって，内部検証においては，10約４．要検体を用いた綿球法による微生物検査が実用的で一般にわが国のと畜場では，と畜頭数に応じてあると考えられた。

抽出した一定数の枝肉の表面を綿球で拭き取る

本研究により，と畜場での牛枝肉の微生物危害「綿球法」により，一般生菌数を調べることで枝を制御するために，国内と畜場の現場実態に適合

肉全数（ロット）の清浄度を評価している。しかし，かつ国際基準にも科学的裏付けを持って適合し，同法は枝肉表面からの生菌の回収性が低く，した内部検証方法を，統計学に基づき開発するこ検査精度が高くない。また，抽出した枝肉の検査とに成功した。

結果から枝肉全数（ロット）をどう評価するかについても明確な手法が確立されていない。そこで今回，切除法（EC，excision），スポンジスワブ
法 （SS ， sponge swab）， 綿 球 法 （CB ， cottonball），および綿棒法（CS，cotton stick）の各検査法による一般生菌数を比較した。また，内部検証時に，枝肉全数（ロット）の清浄度の評価をするために必要な検体数を，国際食品微生物規格委
員

会

ICMSF （International Commission on

Microbiological Specifications for Foods）が推奨する三階級法に基づく確率推計により算出することを試みた。
検体採取法の比較定量から，高値を示した切除法（EC）が真値を評価するうえで妥当であると

引用文献
１）
 Milios, K. T., Drosinos, E. H., Zoiopoulos, P. E.：
Food Control, 43, 74～81, 2014.
２）
 Gallina, S., Bianchi, D. M., Ru, G., Maurella, C.,
Barzanti, P., Baioni, E., Virgilio, S., Mioni, R., Lanni,L., Migliazzo, A., Losio, M. N., Bove, D., Scuota, S.,
Goffredo, E., Decastelli, L.：Food Control, 50, 919～
924, 2015.
３）
 van Schothorst, M., Zwietering, M. H., Ross, T.,
Buchanan, R. L., Cole, M. B.：Food Control, 20, 967～979, 2009.
４）
 Lindblad, M.：International Journal of Food
Microbiology, 118, 180～185, 2007.
５）
 Martínez, B., Celda, M. F., Anastasio, B., García, I.,
López-Mendoza, M. C.：Journal of Food Protection,
73, 81～87, 2010.
６）
 Seager, T., Tamplin, M. L., Lorimer, M., Jenson, I.,
Sumner, J.：Food Protection Trends, 30, 336～339,
2010.

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96

ハム・ソーセージに配合する食品添加物に関するリスクコミュニケーション手法の開発ならびに効果検証
Development and evaluation of smart risk communication method on thefood additives formulated in ham and sausage

山﨑

毅・山﨑

深雪・阿紀

雅敏

（特定非営利活動法人食の安全と安心を科学する会）

Takeshi Yamasaki, Miyuki Yamasaki and Masatoshi Aki（NPO, Science of Food Safety and Security（SFSS））

Risk perception bias on certain food hazards is generated by consumers even when foodsafety experts evaluated them as safe. In this study, we aimed to verify the effect of “smart
risk communication” method targeting the risk perception bias, particularly “confirmation bias”
on food additives. We hypothesized the “smart risk communication” that the consumers should
understand the proper “risk size” of food hazards calmly when they are sympathized on theirrisk concerns and get the precise academic explanation on them.
We performed the internet questionnaire survey to 2,500 female consumers（age 20’s to50’s）who have health concerns on the processed meat, such as ham, sausage, and bacon due tofood additives（who think that the processed meat with food additives is unhealthy）. First, wegave them the questions to sympathize their worry on the health risk of food additives, andsubsequently, we gave the scientific explanation on their concerns by the food safety expert.
Although there was certain limitation due to internet communication, the health concernsof food additives were corrected up to approximately 30％ to 45％ of respondents by “smart
risk communication”. However, 72％ of respondents answered that they are willing to buy theprocessed meat products without food additives, if available. As a result, we found the strong
relevancy of risk perception bias to the cause of the lack of understanding the risk/safety offood additives, which should be expected for good opportunity to develop the new method of“smart risk communication”.

１．目

響を与えている。2017年，山﨑はリスク認知バイ

的

アスの原因をターゲットとした食のリスクコミュ

食品安全の専門家がヒトへの健康リスクが十分

ニケーション（リスコミ）手法が重要と考え，リ

小さく安全と評価しているハザードにもかかわらスク認知バイアスの社会心理学的原因を具体的にず，一般消費者がリスクを過大に知覚／認識して４つあげてそのリスコミ手法のあり方を提案しリスク認知バイアスを生み出し，社会に大きな影た１）。すなわち，①二者択一の原理２），②Slovic© The Ito Foundation

ハム・ソーセージに配合する食品添加物に関するリスクコミュニケーション手法の開発ならびに効果検証

97のリスクイメージ過大因子／未知性因子など３），「まあまあそう思う」と回答した女性2,500人（20③リスク情報発信者への不信感 ，④リスクコ

歳代／30歳代／40歳代／50歳代：各625人）をラ

ミュニケーションのパラドックス５）である。

ンダム抽出し，いくつかの設問に対する回答を得

４）

また2018年，山﨑らはリスク認知バイアスの一た。

つとして「確証バイアス」を採り上げて調査研究

設問は，①加工肉食品に配合される食品添加物を実施した 。「確証バイアス」とは，消費者にの健康リスクに関する不安要因（リスク認知バイ

はもともと「危険重視の本能」があるので，危険アス），②各不安要因に関する専門家の学術的説

情報のほうを信じる傾向にあり，それが先入観と明に対する理解度，③各不安要因に関する学術的なって肯定する情報ばかりを集めて，そうでない説明を受けての安心度合い（リスク認知バイアス

情報は拒絶するという現象に陥るということだ。

の補正）について選択肢を与え，回答者に自由に

この確証バイアスを補正するために，以下のよう選択させた。また，食品添加物不使用のハム・な仮説を立て，「スマート・リスクコミュニケー

ソーセージに対する購買意識や食品添加物によるション」と命名した。すなわち，まず「確証バイ

アレルギーや複合影響の可能性に関する不安につアス」の要因となっている信念や不安に共感した

いては，４段階の選択肢による設問を設定して分設問を投げかけたうえで，次に専門家から学術的析した。なお，それぞれの回答傾向の相関関係に説明を分かりやすく提供することで，市民の不安関する統計解析については，Microsoft Excelの要因への理解が深まり，自らリスクの大小を冷静分析ツール「回帰分析」を用いて単線形回帰分析に判断できるのではないかとの仮説を立てたのを実施し，重相関係数（R），重決定係数（R2），だ。インターネット調査の結果，「食品添加物は

X値係数，切片，危険率（p value）を求めて，意識的に使わない」と回答のあった30歳代～40歳

危険率が0.05未満の場合を有意な相関と評価した。

６）

代の女性100人において，スマート・リスコミ手法により79％の回答者で確証バイアスの補正を認

３．結果と考察
最初に食品添加物が健康によくないという「確めた。
本インターネット調査研究では，ハム・ソー

証バイアス」にいたった不安要因の選択肢を10項

セージ・ベーコンなどの加工肉食品における食品

目あげて，回答者の不安に共感する設問を与えた

添加物の健康リスクに懸念を感じている女性（Table 1a）。その結果をTable 1bに示す。

2,500人に対して，このスマート・リスコミ手法

食品添加物が健康によくないと考える理由に関の効果検証を実施したので，以下に報告する。

して，30％以上の回答者が選択した不安要因（Ｑ２．方１－３：添加物の使用目的が不明，Ｑ１－４：無法

添加と添加物使用を比較すると無添加が安全，Ｑ

インターネットアンケート調査は，楽天インサ

１－５：添加物でも一部健康によくないものあイト（株）の日本人モニターから，最低週１回はり，Ｑ１－９：添加物は体内に蓄積する）につい料理をする方を抽出し，その中から「ハム・ソーては，より分かりやすいリスクの説明が必要と思セージ・ベーコンなどの加工肉食品は，食品添加われた。また，年代別（20歳代～50歳代）での不物が入っているので健康によくないと思います

安要因選択率の違いを比較したところ，20歳代にか」という設問に，「たしかにそう思う」または

おいて10項目中５項目で全体より５％以上低い選© The Ito Foundation

98

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 1a Questionnaire #1（in Japanese）to ask respondents to select the reasons（anything in 10

choices）why they have health concerns on food additives used in ham, sausage, and bacon.

Ｑ１．ハム・ソーセージ・ベーコンなどの加工肉食品は，食品添加物が入っているので健康によくないと考える理由として，あてはまる項目をすべて選んでください。（いくつでも）１

食品添加物が原因で健康被害が起こった事故の歴史があるから

２

過去に家庭科の授業や栄養学の講義で食品添加物はできるだけ使わないように教わったから

３
４
５
６
７

ハム・ソーセージの食品ラベルを見ると，知らない化学物質（食品添加物）が多く書かれていて，何の目的で使用されているのかよく分からないから
無添加食品と添加物使用の加工食品を比較すると，天然の無添加食品の方が安全だから
ハム・ソーセージによく入っている食品添加物の中でも，一部ソルビン酸や亜硝酸Naなど，健康によくないものがあるから
国際がん研究機関が，ハム・ソーセージを発がん性物質に分類したと聞いた。ハム・ソーセージに配合された食品添加物がその原因と思うから「食品添加物を使用していないから安心して食べられる。」と宣伝販売の店員さんが言っていたし，食品
企業も「無添加」が安心として販売しているから

８

食品添加物の入った加工食品は「食べてはいけない・・」などという書籍や雑誌／インターネット記事を読んだことがあるから

９

食品添加物は体内に蓄積して，食べ続けているうちに後から影響が出るかもしれないから

10

海外で禁止されている食品添加物が，日本では使用許可されているものがあるから

11

上記以外のその他の理由をご記入ください：

択率が認められた。それは，若年ほど不安要因にと評価した。なお，子供と同居することや専業主

対する感受性が低いことを意味するものと評価さ婦であることは，Ｑ１と同様，全体の理解率とのれた。なお，子供と同居することや専業主婦であ明確な差を認めなかった。

ることは，全体の不安要因選択率との明確な差を認めなかった。

上記の有識者による学術的説明の後，食品添加物が入った加工肉食品を安心して食べられるかど

次に，上記であげた各不安要因Ｑ１の10項目にうか聞いた。その結果をTable 3a，Table 3bに示す。

対する食品安全の有識者（大学教授）の見解を提Ｑ１の不安要因をうかがい共感する設問に続い示し，理解度を確認した。その結果をTable 2a，て，Ｑ２で各不安要因に関する専門家の学術的説

Table 2bに示す。

明の設問への理解度を確認したのち，Ｑ３では各

Table１であげた10項目の不安要因に対して，

不安要因に対する安心度を確認したが，おおむねそれぞれのリスク認知バイアスを補正する学術的各項目に関して30％～45％が「食品添加物の入っ説明が食品安全の専門家から与えられると，上記

た加工食品を安心して食べられそうだ」と回答しのTable 2bのとおり48％～68％の回答者（おおむた。また，「有識者の説明（10項目）を読んでもね２人に１人から３人に２人）から説明が理解で結局納得できないので，食品添加物の入ったハ

きたとの回答を得た。また年代別で見ると，とくム・ソーセージなどの加工食品はできるだけ避けに30歳代の理解率が10項目中８項目で全体平均よたい」という選択肢を選んだ回答者は9.4％で，り５％以上高かったことから，比較的難易度の高

９割以上の回答者はいずれかの「安心して食べらい学術的説明に対して理解しようという前向きなれそうだ」の選択肢を選んでいた。以上の結果よ

姿勢が，30歳代の女性に認めることができたもの

り，ほぼ９割の回答者で「確証バイアス」の補正© The Ito Foundation

99

ハム・ソーセージに配合する食品添加物に関するリスクコミュニケーション手法の開発ならびに効果検証

Table 1b Results of Questionnaire #1（Q1）：Percentage of respondents who select the reason why they have

health concerns on food additives used in ham, sausage, and bacon.

＊over ５％ less to average indicates ％ number with underbar

The reasons why you have health concerns onfood additives used in ham, sausage, and bacon

All

20s

30s

40s

50s

live withchildrenhousewife

No. of respondents：

2,500

625

625

625

625

1,139

697

１－１

Because there were some histories of healthaccidents by food additives in the past.

15.2

13.6

13.6

17.8

16.0

14.2

13.5

１－２

Because I was taught not to use foodadditives in nutrition class at school in the
past.

26.2

29.8

29.1

25.9

20.2

28.2

24.7

１－３

Because I see many unknown chemicalnames on the label of ham and sausage, anddo not know the purpose of their role.

36.9

31.4

37.1

39.2

40.0

38.5

37.3

Because the natural food without additives
１－４ should be safer than process food withadditives.

31.2

33.9

33.9

29.1

28.0

31.6

32.4

Because some food additives, such as sorbic
１－５ acid and sodium nitrite, should be
unhealthy.

30.4

21.9

31.7

32.6

35.4

33.0

33.0

Because food additives should be the main
reason why International Agency of
１－６
Research on Cancer（IARC）categorized
ham and sausage as carcinogen.

24.4

18.4

24.6

27.7

26.9

25.8

26.4

Because sales persons in supermarkets
１－７ promote the process food without additives
claiming its safety.

7.3

9.6

9.3

5.6

4.6

8.5

5.9

22.7

18.2

25.8

24.6

22.1

23.5

19.9

Because food additives should beaccumulated in human body and make the１－９
bad influence to your health if you consume
every day.

36.5

30.1

38.1

37.0

40.8

38.2

38.5

Because the food additives which are
１－10 prohibited in overseas can be marketed inJapan.

16.8

10.1

19.4

21.0

17.0

18.0

17.2

１－11 Other than above reasons

2.0

2.2

2.4

1.4

1.9

1.5

1.7

１－８

Because I read the books and internet
articles claiming that you should not eat
process foods if formulated with foodadditives.

が一定程度認められたと考える。

とが分かってからでは遅い

なお，３－11で有識者の説明（10項目）を読ん・理解はするが「安心して食べられそうだ」とはでも結局納得できず，食品添加物の入ったハム・

言い切れないと思う

ソーセージなどの加工食品はできるだけ避けた・まだ安心できないからい，とした回答者の理由（自由回答：236人）を・信頼できるまで怖いからランダムに抜粋したので，以下でいくつかを参照

・生物多様性の観点から食品添加物は人工物であされたい。

るため，環境によくない・有識者が御用学者でメーカーの都合の良いこと・安心と言っておきながら，後で有害だというこしか言わないから怖い© The Ito Foundation

100

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 2a Questionnaire #2（in Japanese）to ask respondents whether or not they understand the scientific explanation

about the accurate risk information on food additives by food safety expert（university professor）．

Ｑ２．ハム・ソーセージ・ベーコンなどに使用される食品添加物のリスクについて，食品安全に詳しい有識者（大学教授）に見解を伺いました。説明が理解できた番号をすべて選んでください。なお，１つも理解できるものがなかった場合は，その理由を11番にご回答ください。
（いくつでも）１

過去に食品添加物が原因で健康被害が起こった事故の歴史はたしかにありますが，もう数十年以上前のことであり，日本国内
ではそれ以降，何十年もの間事故は発生していません。反対に食品添加物を使用しなかったことにより，Ｏ157などの食中毒死亡事故が何度も発生しており，食品事故を未然に防ぐためには，食品添加物を適切に使用することが望まれます。

２

家庭科や栄養学の教科書には食品添加物を使用しない調理がよいなどの記載があるようですが，これまで文科省の教科書審議会に食のリスクの専門家が含まれていなかったことも要因といえるでしょう。家庭での料理を学ぶ際に，加工食品を使用せず，天然の食材を活かした料理を学ぶこと自体は問題ありません。食のリスクに関して，正しいリスク評価を学ぶ環境の必要性を強く感じます。

３

食品添加物の使用目的は多種多様にわたり，具体的には風味や食感・色調の改善，微生物の増殖を抑制して保存性を向上させるとともに，栄養強化・減塩食品への使用や低カロリーにするために使用されます。ハム・ソーセージに用いられる食品添加物も，食材に適した調味料・発色剤・結着剤・保存料・酸化防止剤・着色料など役割を担って，味，食感の改善，食の安全・安心に貢献し，食べやすい動物性タンパクとして様々なメニューの材料として便利に使用されています。

４

天然の無添加食品と添加物を配合した加工食品を比較すると，「無添加」「天然」が安全そうに見えるかもしれませんが，食の安全の専門家にとっては，むしろ逆です。食品添加物は安全性試験をクリアし，リスクが無視できるものしか認可されていないのに比べて，天然の食品は安全性の評価すらされておらず，相対的にみると天然物のほうが健康リスクは大きいと言われています。1980年代に遺伝毒性試験を開発したエイムズ博士によると発がん物質の99.9％は天然物だと指摘しています。そう考
えると専門家のリスク評価では，合成の食品添加物の方が，むしろ安全性が高いといえます。

５

食品添加物のうち「保存料」や「発色剤」など一部の化学物質は健康に悪影響があるとの誤解があるようですが，『毒か安全かは量で決まる“The Dose Makes Poison”』というパラケルススの名言のとおり，食品添加物も使用基準の範囲内では，人体への悪影響が出ない微量の摂取量＝許容範囲のリスク＝「安全」と考えてよいでしょう。なお，これら食品添加物は，毎日食べ続けても安全な１日摂取許容量（ADI：国際的な機関が動物実験により無害と確認した量の1/100量）を下回る使用基準
が「食品衛生法」に規定されており，我々がソルビン酸や亜硝酸塩を一般食品からも摂取している事実も考慮されています。

６

食品添加物に発がん性や遺伝毒性が疑われる場合には，内閣府食品安全委員会が専門家を集めて詳しくリスク評価を実施した
うえで，使用してもよいかどうかの評価判定をする国の仕組みができています。実際に使用禁止の措置がとられた「アカネ色素」などがありますので，発がん性や遺伝毒性の懸念がある食品添加物は一掃されたと考えてよいでしょう。また，国際がん研究機関（IARC）がハム・ソーセージを「グループ１（発がん性がある）」と分類したことは事実ですが，これは欧米での疫学研究報告をもとに科学的根拠の強さを分類したもので，発がんリスクの大小は摂取量に依存すると考えられます。実際，
国立がん研究センターの疫学研究でも，食肉の喫食量が多い人に大腸がんが多いことは確認されたものの，加工肉（ハム・ソーセージ等）では大腸がん発症率の上昇はなく，日本人のような少ない喫食量で心配の必要はありません。ハム・ソーセー
ジに限らずお肉を食べすぎること，野菜をほとんど食べないことなどの偏食が発がんリスク上昇につながることは古くから知られており，バランスのとれた食事が生活習慣病予防には肝要です。

７

食品は，自然界に存在する有毒な微生物やウイルスに汚染されている可能性があり，食品添加物を用いないと，これらが繁殖して食中毒を起こすリスクがあります。とくにハム・ソーセージで食品添加物を使用しないと，万が一ボツリヌス菌※が増殖したら大変危険なのです。無添加が健康に良いと思われがちですが，添加物の小さなリスクを恐れ，食中毒の大きなリスクを抱えることに繋がります。（「リスクのトレードオフ」と呼びます）。※ボツリヌス菌（ウィキペディアより）：ボツリヌスの語
源はラテン語のbotulus（腸詰め，ソーセージ）であり，19世紀のヨーロッパでソーセージやハムを食べた人の間に起こる食中毒であったためこの名がついた。ハムやソーセージに発色剤として添加される硝酸塩は，発色作用よりもボツリヌス菌の繁殖を抑える目的で使用されている。

「食べてはいけない」など食品の裏事情に関する書籍や記事において，食品添加物は危険との不安を煽る誤情報が多く，消費者のリスク誤認につながっています。これら主張の決定的な誤りは，摂取量の観点が完全に欠落していることです。動物実験
等で添加物を大量に投与した時に起こる障害を，実際の食品でごく僅かに使用している添加物でも健康被害が起るかもしれな
８
いと消費者を煽るのは大きな社会問題です。例えば，塩も多く摂り過ぎれば健康被害が出ます。食品添加物も使用基準の範囲内であれば問題ありません。このような記事で「専門家」と称する個人・団体が，ご自身の利害（商売）のため無添加食品を販売していたとしたら，冷静に判断できないでしょうか。
９

食品も食品添加物も，含まれる成分の多くは，消化管で消化・吸収され，肝臓で代謝・解毒された後，尿あるいは糞とともに体外に排せつされます。各食品添加物の安全性試験データや文献情報からその代謝・生体内動態は概ね分かっておりますので，体内に長期間にわたって蓄積されるというご心配は不要と考えます。

10

海外と日本では食文化や食材が違うため，使用する食品添加物も同じではありません。たとえば，EUではカツオブシやヒジキが輸入できないなど，一般食品でも使用禁止となっています。逆にEUで使えるのに日本では使用できない食品や食品添加物もあります。したがって，海外で使えないのは食文化の違いから使う必要性がない食材のため，国が認めた食品添加物リストに入っていないものと考えます（たとえば，和菓子によく使用される「クチナシ色素」などの着色料はEUで使用できない
そうです）
。

11

上記１から10のうち，１項目も理解できるものがなかった。その理由をご記入ください：© The Ito Foundation

101

ハム・ソーセージに配合する食品添加物に関するリスクコミュニケーション手法の開発ならびに効果検証

Table 2b Results of Questionnaire #2（Q2）：Percentage of respondents who understand the scientificexplanation about the accurate risk information on food additives by food safety expert（university
professor）．
＊over ５％ more to average indicates ％ number with bold

Percentage of respondents who understand the scientific explanation

All

20s

30s

40s

50s

No. of respondents：

2,500

625

625

625

625

Scientific explanation about the following health concerns（Q1-1）：
２－１ Because there were some histories of health accidents by foodadditives in the past.

68.7

69.0

75.0

66.9

63.8

Scientific explanation about the following health concerns（Q1-2）：
２－２ Because I was taught not to use food additives in nutrition class at
school in the past.

60.9

61.4

66.7

58.2

57.3

Scientific explanation about the following health concerns（Q1-3）：
２－３ Because I see many unknown chemical names on the label of hamand sausage, and do not know the purpose of their role.

59.0

59.0

65.0

54.2

57.8

Scientific explanation about the following health concerns（Q1-4）：
２－４ Because the natural food without additives should be safer thanprocess food with additives.

51.6

50.1

57.3

48.6

50.6

Scientific explanation about the following health concerns（Q1-5）：
２－５ Because some food additives, such as sorbic acid and sodium nitrite,
should be unhealthy.

48.6

45.6

52.6

46.7

49.4

Scientific explanation about the following health concerns（Q1-6）：
Because food additives should be the main reason why International
Agency of Research on Cancer（IARC）categorized ham andsausage as carcinogen.

50.7

48.5

53.6

47.7

53.0

Scientific explanation about the following health concerns（Q1-7）：
２－７ Because sales persons in supermarkets promote the process foodwithout additives claiming its safety.

50.7

46.4

57.4

47.5

51.4

Scientific explanation about the following health concerns（Q1-8）：
２－８ Because I read the books and internet articles claiming that you
should not eat process foods if formulated with food additives.

51.0

48.2

57.1

49.3

49.6

Scientific explanation about the following health concerns（Q1-9）：
２－９ Because food additives should be accumulated in human body andmake the bad influence to your health if you consume every day.

48.9

47.7

55.4

46.9

45.6

Scientific explanation about the following health concerns（Q1-10）：
２－10 Because the food additives which are prohibited in overseas can bemarketed in Japan.

51.8

47.5

57.1

49.8

52.8

２－11 Select if you do not understand any of above explanation.

3.3

2.2

2.9

3.7

4.3

２－６

・証拠がないからはないが今までよりは手に取りやすくなった・イメージ的に避けたい

・美味しく食べられるけど，安心して食べられそ・完全に安心はしていない

うだとは思わない。無添加は美味しくないので

・これも１つの見解でしかなく，国も信用できな

あまり買わないですが…

いので，疑念は残る

・やはり自然に近いものの方が体への負担が少な

・安心して食べられる，というほどまでは理解できていないと思われる

い気がする・全ての説明は，食品添加物の有識者の解説であ・安心して食べられるとまでの信用性は感じなかったり，説明を読み納得はしたが，「安心」という言葉にはまだ抵抗がある。安心なわけでり，反対派の解説がないために説明が偏りすぎで参考にならないため
・自分の知らない食品添加物があると思うし，そ© The Ito Foundation

102

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 3a Questionnaire #3（in Japanese）to ask respondents whether or not their health concerns

on food additives are cleared by the scientific explanation.

Ｑ３．前問の有識者の説明を読んで，あてはまる番号をすべて選んでください。（いくつでも）
１
２

食品添加物が原因で健康被害が起った事故の歴史はあるが，説明を読んで，ほぼ納得したので，食品添
加物の入った加工食品も安心して食べられそうだ。
家庭科や栄養学の授業で食品添加物はできるだけ使わないように教わったが，説明を読んでほぼ納得したので，食品添加物の入った加工食品も安心して食べられそうだ。
多種多様な化学物質（食品添加物）を使用する必要性がよくわからなかったが，むしろ食の安全・安心

３が維持される役割があるとの説明を読んで，ほぼ納得したので，ハム・ソーセージも安心して食べられ
そうだ。

４

５

天然の無添加食品と食品添加物を配合した加工食品を比較すると，むしろ後者の方が安全という説明を読んで，ほぼ納得したので，ハム・ソーセージなどの加工食品も安心して食べられそうだ。
食品添加物の中でも，一部「保存料」や「発色剤」の中に健康によくないものがあると思っていたが，摂取量の概念や１日摂取許容量などの説明を読んで，ほぼ納得したので，ハム・ソーセージなどの加工食品も安心して食べられそうだ。

６

ハム・ソーセージの発がん性や遺伝毒性を心配していたが，そのような懸念のある食品添加物は使用されておらず，またハム・ソーセージ自体の発がん性も国内では認められていないという説明を読んで，ほぼ納得したので，ハム・ソーセージも安心して食べられそうだ。

７

無添加が安心という広告宣伝などを信じていたが，むしろ無添加では食中毒の危険があるとの説明を読んでほぼ納得したので，食品添加物の入った加工食品も安心して食べられそうだ。

８「食べてはいけない・・」など食品の裏事情に関する書籍や記事（週刊誌・TV番組・ネット情報など）を読んで，やはり食品添加物は危険と感じていたが，説明を読んでほぼ納得したので，食品添加物の入った加工食品も安心して食べられそうだ。

９

食品添加物は体内に蓄積するので怖いと思っていたが，代謝・排せつされるという説明を読んでほぼ納得したので，食品添加物の入った加工食品も安心して食べられそうだ。

10

海外で禁止の食品添加物が国内で許可されているのはよくないと思っていたが，食文化の違いによるものとの説明を読んでほぼ納得したので，食品添加物の入った加工食品も安心して食べられそうだ。

11

有識者の説明（10項目）を読んでも結局納得できないので，食品添加物の入ったハム・ソーセージなどの加工食品はできるだけ避けたい。その理由を記入してください：の添加物が，良いか悪いかも分からないので・とらなくても生きていけるから・加工されていない肉を食べることで問題ないので・家族の持病で，できるだけ加工品を避けるよう・発色剤などはやっぱり体に悪いと思う

言われているから。遺伝性のある病気なので，・結局まったく害がないとは思えない

自分自身も気を付けなければならないから・塩分も多いし不安は残りました

上記の不安要因に関する学術的説明に対する設・文章がむずい問の後，「食品添加物不使用のハム・ソーセー

・避けたいとは考えませんが，有識者の意見もジ・ベーコンを購入するか」など，個別の質問に様々ありどこまでいっても，このように意見や対して「たしかにそう思う」，「まあまあそう思

主張は出てくるわけで，押し付けのようにも感う」，「あまりそう思わない」，「そう思わない」のじられ残念な気持ちになりました

４つの選択肢に回答していただいたので，Table

・一個人の意見では

4a，Table 4bを参照いただきたい。

・そもそもあえて買わなくても生活に支障がないのでＱ３において，「ハム・ソーセージなどの食品
添加物を配合した加工食品を安心して食べられそ© The Ito Foundation

103

ハム・ソーセージに配合する食品添加物に関するリスクコミュニケーション手法の開発ならびに効果検証

Table 3b Results of Questionnaire #3：Percentage of respondents where their health concerns on food additives

are cleared by the scientific explanation.

Percentage of respondents where their health concerns on food additives
are cleared by the scientific explanation.

All

20s

30s

40s

50s

2,500

625

625

625

625

Respondents who claimed no more health concerns（Q1-1）：
３－１ Because there were some histories of health accidents by foodadditives in the past．

45.2

47.8

48.8

41.8

42.2

Respondents who claimed no more health concerns（Q1-2）：
３－２ Because I was taught not to use food additives in nutrition class at
school in the past．

38.6

43.5

38.6

35.7

36.8

Respondents who claimed no more health concerns（Q1-3）：
３－３ Because I see many unknown chemical names on the label of hamand sausage, and do not know the purpose of their role．

40.5

39.0

45.9

37.9

39.2

Respondents who claimed no more health concerns（Q1-4）：
３－４ Because the natural food without additives should be safer thanprocess food with additives．

35.8

32.3

39.2

33.3

38.4

Respondents who claimed no more health concerns（Q1-5）：
３－５ Because some food additives, such as sorbic acid and sodium nitrite,
should be unhealthy．

41.9

41.6

44.5

39.5

41.9

Respondents who claimed no more health concerns（Q1-6）：
Because food additives should be the main reason why International
３－６Agency of Research on Cancer（IARC）categorized ham andsausage as carcinogen．

34.6

30.7

37.8

33.8

36.0

Respondents who claimed no more health concerns（Q1-7）：
３－７ Because sales persons in supermarkets promote the process foodwithout additives claiming its safety．

33.4

28.0

37.6

33.6

34.4

Respondents who claimed no more health concerns（Q1-8）：
３－８ Because I read the books and internet articles claiming that you
should not eat process foods if formulated with food additives．

31.0

28.3

35.2

29.4

31.2

Respondents who claimed no more health concerns（Q1-9）：
３－９ Because food additives should be accumulated in human body andmake the bad influence to your health if you consume every day．

35.2

31.0

37.0

35.8

37.0

Respondents who claimed no more health concerns（Q1-10）：
３－10 Because the food additives which are prohibited in overseas can bemarketed in Japan．

30.6

26.9

33.0

30.4

32.2

３－11 Select if you claim still big health concerns on any of above．

9.4

6.9

9.6

9.9

11.4

No. of respondents：

うだ」と回答した方がトータルで９割を超えたもが，Ｑ４で「ハム・ソーセージ・ベーコンが食品のの，Ｑ４で「ハム・ソーセージ・ベーコンなど

添加物不使用ならば購入する」と回答する傾向にの加工肉食品は，食品添加物不使用ならば購入しあったと解釈できるだろう。

ますか」との設問には，７割以上の回答者が「たまた，Ｑ５で食品添加物の複合影響を懸念する

しかにそう思う」または「まあまあそう思う」を

回答者が78％を超えたが，Ｑ６での学術的説明の選択した，という逆の結果となった。またその際理解の回答と有意な相関が認められなかったことに，Ｑ３－１～Ｑ３－10の回答との有意な正の相から，複合影響を懸念する確証バイアスに陥った

関が認められたことから，Ｑ３－１～Ｑ３－10の回答者が今回の学術的説明に前向きな理解の姿勢

各設問を選択しなかった回答者たち（個別の不安はなかったと評価すべきだろう（今回のリスコミ

要因の学術的説明を聞いて安心しなかった方々）

が確証バイアスの補正に寄与していない）。その© The Ito Foundation

104

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 4a Questionnaire #4 to #8（in Japanese）to ask respondents about other questions about foodadditives（purchase attitude and extra health concerns）．

その他の設問内容
ハム・ソーセージ・ベーコンなどの加工肉食品は，食品添加物不使用ならば購入しますか。あてはまる
Ｑ４ 回答を，以下から１つだけ選んでください：①たしかにそう思う，②まあまあそう思う，③あまりそう思わない，④そう思わない
複数の食品添加物を摂取することで複合影響が出ると聞いたから，食品添加物は避けたい。あてはまる
Ｑ５ 回答を，以下から１つだけ選んでください：①たしかにそう思う，②まあまあそう思う，③あまりそう思わない，④そう思わない
食品添加物の併用に関する安全性は十分に調査し，必要に応じて制限される場合があります。例えば，安息香酸とビタミンＣは，どちらも安全な食品添加物ですが，これら２つの化学反応により有害物質（ベンゼン）を生成するとのデータがあるため，国から食品事業者に併用してはならないと通知されています。一方で，体内には生体成分や食品／医薬品成分などに関係する膨大な種類の化学物質が存在し，
これらすべての化学物質同士の併用による安全性試験を実施することは不可能です。そのため，化学物
Ｑ６ 質ＡとＢを併用するとこんな毒性（複合影響）が発現したという事故報告情報や文献情報など具体的な根拠データがわかった段階で，それら物質の併用によるリスク評価を実施することで安全性を担保しています。そう考えると，何の具体的根拠もなく「食品添加物はとにかく複合影響がこわい」という言説がナンセンスだと，わかるのではないでしょうか。以上の有識者の説明を読んで，あてはまる回答を，
以下から１つだけ選んでください：①たしかにそう思う，②まあまあそう思う，③あまりそう思わない，④そう思わない
アレルギーの子が増えているのは，食品添加物の入った食品を多く食べるようになったからだと聞いＱ７ た。あてはまる回答を，以下から１つだけ選んでください：①たしかにそう思う，②まあまあそう思う，③あまりそう思わない，④そう思わない
近年，食の欧米化に伴って食材も多様化しています。食品成分の種類が増えれば，アレルゲンとなりうるタンパクや脂質などの化学物質が天然の食品中に増えたと考えるのが自然です。アレルギーを持つ子どもの増加と食品添加物の摂取量に因果関係があるという科学的根拠は聞いたことがありません。それよりも現代社会の衛生環境が改善したことにより，環境中のアレルゲンに曝露されない分，免疫学的にＱ８
弱い体質の子どもが増えた可能性は十分に疑われるところと考えます（呉艶玲ほか「アレルギーと衛生仮説」化学と生物 Vol44.21－26,2006）。以上の有識者の説明を読んで，あてはまる回答を，以下から１つだけ選んでください：①たしかにそう思う，②まあまあそう思う，③あまりそう思わない，④そう思
わない

Table 4b Questionnaire #4 to #8 to ask respondents about other questions about food additives（purchaseattitude and extra health concerns）．
Other questions

Yes,
certainly

so-and-so

NotreallyNo
way

Ｑ４

Do you purchase process meat, such as ham, sausage, and bacon, if
without food additives? Please select the following choice．

21.8

50.4

24.4

3.4

Ｑ５

You want to refrain food additives since there should be bad effecton human body when some chemicals are combined withinteraction. Please select the following choice．

24.0

54.3

19.7

2.0

Ｑ６

Scientific explanation about the following health concerns（Q5）:there should be bad effect on human body when some chemicals
are combined with interaction. Please select the following choice．

18.5

68.1

10.7

2.7

Ｑ７

You heard about the possible effect of food additives to cause foodallergy. Please select the following choice．

15.4

38.7

37.4

8.5

Ｑ８

Scientific explanation about the following health concerns（Q7）:there should be bad effect on human body when somechemicals are combined with interaction. Please select the following
choice．

16.4

67.1

14.2

2.3

© The Ito Foundation

ハム・ソーセージに配合する食品添加物に関するリスクコミュニケーション手法の開発ならびに効果検証

105

反面，Ｑ７で食品添加物のアレルギーへの関与の目）を読んでも結局納得できないので，食品添加懸念を示した回答者は54％にとどまったが，Ｑ８物の入ったハム・ソーセージなどの加工食品はででの学術的説明の理解と有意な相関が認められた

きるだけ避けたい」という選択肢を選んだ回答者

ことから，食品添加物のアレルギーへの関与といは全体の9.4％で，９割以上の回答者はいずれか

う確証バイアスに陥った回答者に対して，今回のの「安心して食べられそうだ」の選択肢を選んでリスコミがある程度機能したことを意味するものいた。以上の結果より，ほぼ９割の回答者で「確と考える。

証バイアス」の補正が一定程度認められたことか

山﨑は2017年の日本リスク研究学会にて，リスら，消費者の不安要因を傾聴により見つけだしてク認知バイアスの原因をターゲットとした食のリ

共感し，それぞれの不安要因にピンポイントで学

スコミ手法を提案し，①二者択一の原理 ，②術的説明を提供する「スマート・リスクコミュニ

Slovicのリスクイメージ過大因子／未知性因子なケーション」の効果検証が一定程度認められ，消ど ，③リスク情報発信者への不信感 ，④リス

費者の「確証バイアス」の補正＝食の安心につな

クコミュニケーションのパラドックス など４つがる可能性を示唆する結果と評価したい。

２）

３）

４）

５）

のリスク認知バイアスを逆手に取ったリスコミ手

このスマート・リスコミ手法は，すでに食品添法開発の可能性を考察した１）。また，2018年にも加物８）だけでなく，ゲノム編集食品９）や食の放射同学会において，食品添加物の健康リスクに対す

能汚染 10）などに関しても社会実装が始まっておる「確証バイアス」をターゲットとしたスマー

り，徳島県／消費者庁が主催で開講された消費者

ト・リスコミの開発と効果検証について発表し大学校大学院の食のリスクコミュニケータ養成講た６）。インターネットでの無機的な情報伝達に限座においても応用が始まっている。今後のスマー

界はあるものの，相当数の回答者で確証バイアス

ト・リスコミ手法のさらなる改良／バージョンの補正が認められたことから，スマート・リスコ

アップにつながることを期待したい。

ミ手法の有効性が示唆された。このように，安全・安心につながるリスクコミュニケーションの

４．要

約

ポイントは，消費者市民のリスク認知バイアスの

食品安全の専門家がヒトへの健康リスクが十分原因である不安要因を具体的なターゲットとした

小さく安全と評価しているハザードにもかかわら

情報発信／議論と我々は考えている 。

ず，一般消費者がリスクを過大に知覚／認識して７）

今回のインターネット消費者アンケート調査にいるために，ひとつのリスク認知バイアスを生みおいても，ハム・ソーセージ・ベーコンなどの加出し，社会に大きな影響を与えていることがあ

工肉食品に配合された食品添加物の健康リスクにる。そこで我々は，インターネット調査によりハついて不安を感じる20歳代～50歳代の女性2,500

ム・ソーセージ・ベーコンなどの加工肉に配合さ人を対象として，スマート・リスコミ手法の効果れる食品添加物の健康リスクに過敏な20代～50代

検証を行ったところ，それぞれの不安要因に関すの女性を抽出し，リスク認知バイアス（とくに確る学術的説明に対して，30％～45％の回答者が食証バイアス）をターゲットとして開発したリスク

品添加物を使ったハム・ソーセージ・ベーコンなコミュニケーション手法（スマート・リスクコ

どの加工肉食品を安心して食べられるとの選択肢

ミュニケーション）の効果検証を実施した。

を選んだ。また，最終的に「有識者の説明（10項

インターネットでの情報伝達に限界はあるもの© The Ito Foundation

106

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）の，30％～45％の回答者が食品添加物を使ったハ
ム・ソーセージ・ベーコンなどの加工肉食品を安心して食べられると選択し，リスク認知バイアスの補正が認められた。ただし，食品添加物不使用のハム・ソーセージ・ベーコンを購入するかとの質問には，72％の回答者が「たしかにそう思う」
または「まあまあそう思う」と回答した。以上の結果より，スマート・リスクコミュニケーション
手法開発の起点となることが期待された。
文献１） 山﨑毅：リスク認知バイアスを逆手にとったリス
コミ，日本リスク研究学会第30回年次大会，滋賀，
講演論文集Vol.30, 2017.
２） 中谷内一也：リスクのモノサシ，NHK出版，東京，
2006.
３） 岡本浩一：リスク心理学入門，サイエンス社，東京，1992.

４）
 広田すみれ，増田真也，坂上貴之：心理学が描く
リスクの世界，慶應義塾大学出版会，東京，2006.
５） 関谷直也：「災害」の社会心理，ワニ文庫（ベストセラーズ），東京，2011.
６）
 山﨑毅，大瀧直子，冨岡伸一，広田鉄磨，山口治子：リスク認知バイアスをターゲットとした食のリ
スクコミュニケーション手法の開発ならびに効果検証，日本リスク研究学会第31回年次大会，福島，講演論文集Vol.31, 2018.
７）
 山﨑毅：安全・安心とリスクコミュニケーション―食品分野を中心に，一橋ビジネスレビュー 67－
No. ３ ，『特 集：安 全・安 心 の イ ノ ベ ー シ ョ ン』，
p92-p102, 2019.
８） 大瀧直子，山﨑毅：食品添加物のスマート・リス
クコミュニケーション～社会実装例～，日本リスク学会第33回年次大会，講演論文集Vol.33, p43,2020.
９）
 山﨑毅，佐々義子，山口治子：ゲノム編集食品のスマート・リスクコミュニケーション，日本リスク学会第33回年次大会 講演論文集Vol.33, p46, 2020.
10）
 山﨑毅：福島原発のトリチウムを含む処理水～海洋放出のリスクはどの程度？～，BLOGOS 2020年
10月25日 https：//blogos.com/article/493348/, 2020.

© The Ito Foundation

107

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究（Ⅱ）
Study on awareness of consumers about safety of food additives（Ⅱ）

堀江

正一・渡邉

萌・堀井

千枝

（大妻女子大学家政学部食物学科）

Masakazu Horie, Moe Watanabe and Chie Horii（Department of Food Science, Faculty of Home Economics, Otsuma Women’s University）

It is important to clarify how consumers have fostered or fostered awareness of foodadditives, and to bridge the large gap between scientific safety and consumer perception.
Continuing from last year, in this study, we conducted an awareness survey on food additives
through an online survey（1,800 people）.
An online survey revealed that younger age groups, and especially individuals in their 20s,
tended to have less concern about food additives while women in their 50s to 70s were highly
concerned. Women in their 50s to 70s heard frequent media reports of food safety incidents intheir early childhood, and women in those age groups often purchase ingredients and prepare
meals. Presumably women in their 50s to 70s steadfastly perceive food additives as dangerous.
Once one is convinced that “food additives are harmful and dangerous,” dispelling that belief iswell-nigh impossible, but repeatedly providing accurate information that is easy to understandcould lead to a change in one’s perception of risk.

１．目

にとって食品添加物は「有害なもの，危険なも的の」と認識されている１～３）。なぜ，「食品添加物

食品添加物は，「人の健康を損なう恐れのない場合」のみ厚生労働大臣により使用が認められては危険である」との認識を払拭できないでいるのかについて明快な回答は得られていない。

いるものである。その安全性は科学的な根拠に基昨年度は，栄養士・管理栄養士養成課程に籍をづいたものであり，ラットやマウスを用いた動物

置く学生およびその両親を対象に，食品添加物の実験により，無毒と確かめられた量のさらに100

安全性に対する意識調査を実施した４）。その結果，分の１以下となるように使用されている。国際的学生と母親の食品添加物に対する認識には大きなに も FAO と WHO か ら な る 国 際 食 品 規 格

相違が見られ，母親の不安度が高いことが認めら（CODEX）委員会により科学的な根拠に基づき，れた。また，インターネット調査（1,700名）にその使用が認められている。このように，国内外

おいても，食品添加物に対する不安度は，男性よにおいて食品添加物の安全性は，科学的根拠に基り女性が高く，40代から70代と高齢になるほど高づき十分確保されている。しかし，多くの消費者

くなる傾向が見られた。1960年代から1970年代に© The Ito Foundation

108

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

かけては，食品の安全性に関する事件・事故がテレビ，新聞等で頻繁に報道され，学校教育におい

３．結果および考察ても食品添加物は良くないものとされていた。こ3.1のような時期に幼少期を過ごしてきた女性，およ食品の安全性について，不安の程度を尋ねたとびその女性により教育を受けた40代から70代の女

ころ，男性に比べ，女性のほうが有意（ｐ＜0.05）

性は現在家庭において，食材の購入から調理等をに高く，年齢階層別に見ると20代が最も低く，年主に担っており，家族の健康を支える立場にあ

齢が40～70代と高くなるに従い不安度も高くなるる。このような環境が，食品添加物は危険なもの，傾向を示した。食品添加物に対する不安度も，ほ体に良くないものと認識するに至った原因と思わぼ同様の傾向を示した。食品の安全性で具体的にれる。

何が不安ですかという質問（３つまで選択可）に食品の安全性について

そこで本年度は，昨年度に引き続き食品添加物

対する調査結果の概要をTable１（2020年度調査

に対する科学的な安全性評価と消費者，特に40代

1,700名）およびTable２（2021年度調査1,800名）

から70代の女性の抱くリスク認知の間にある大きに示した。2021年の調査では，食中毒（29.4％），な溝（乖離）を埋める手段として，正しい情報を

食品添加物（27.1％），残留農薬（25.4％），昨年

分かりやすく，かつ繰り返し提供する学校教育やから１年以上国際的にきわめて深刻な問題となっ市民参加型の双方向的リスクコミュニケーショている新型コロナ感染症（24.7％）の順であっンた。昨年の調査４）と同様，男女とも不安要因とし５,６）の有用性を検証することを目的とする。

２．方
2.1

て食品添加物が第２位であったが，男性（22.6％）

法に対して女性（31.6％）は10ポイント近く高い値

アンケート調査

2.1.1

であった。女性でも20代では18.7％と低い数値で調査方法あるが，年齢が増すごとに不安傾向が高くなり，

インターネット調査

70代以上では40％を占めるに至っている。過去に2.1.2実施された国内外のアンケート調査でも，昨年度

調査対象①インターネット調査（GMOリサーチ株式会

および今回実施したアンケート調査においても消社に委託；20代，30代，40代，50代，60代，70代

費者の多くが食品の安全性に不安を抱いており，

以上，男女各141～142名，合計1,700名（有効回

その要因として今なお食品添加物を上位にあげて

答数1,471名；有効率86.5％，別紙１）），②イン

いる。食品の安全性に対する事件・事故が頻繁にターネット調査（GMOリサーチ株式会社に委報道された幼少期を過ごし，かつ食材の購入から

託；20代，30代，40代，50代，60代，70代以上，調理に携わる機会の多い40代から70代の女性は，

男女各150名，合計1,800名（有効回答数1,541名；

食品添加物は危険なものと認識する傾向が高いと有効率85.6％，別紙２））推察される。

2.1.3

調査期間

なお，国内外できわめて大きな問題となってい①2020年２月，②2021年２月

る新型コロナウイルス感染症に対する不安より，

2.1.4

食品添加物に対する不安のほうが高い結果となっ

統計解析

調査データの統計解析は，IBM SPSS Statistics

たが，この結果は驚きである。

ver. 26を用いた。

© The Ito Foundation

109

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究（Ⅱ）
別紙１ 食の安全性に関するアンケート調査のお願い（2020年２月調査）

性別

1.男 性

2.女 性

年齢

1. 20 代

2. 30 代同居家族の有無

3. 40 代

1.同居家族あり

家族構成（複数回答可）
職業

1.

5. 60 代6. 70 以 上

2.同居家族 な し（ 単 身）

1.乳幼児がいる

2.小 学 生 がい る

3.中 高生 が い る

4.そ の 他

1.自 営 業 ， 2.会社員， 3.公 務 員 ， 4.派 遣 ・ﾊﾟｰﾄ， ｱﾙﾊﾞｲﾄ， 5.学 生， 6.専 業 主 婦 ， 7.無 職

職種（専攻）
居住地

4. 50 代1.町 村

1.事務系（文科系）， 2.技術系（ 理 科系 ）2.市

3.大 都 市

食品の安全性についてどう思いますか？
（1）不安である（2）やや不安である（3）余り不安でない（4）不安でない

2.

食品の安全性で具体的に何が不安ですか？（上位 3 個まで選んでください）（1）食中毒，（2）遺伝子組換え食品，（3）BSE，（4）家畜への薬剤投与，（5）残留農薬，（6）食品添加物，（7）食物アレルギー，（8）消費期限，賞味期限，（9）外食の安全性，（10）家庭食の安全性，（11）食品汚染物質（ﾀﾞｲｵｷｼﾝ，ｶﾄﾞﾐｳﾑ等），（12）食品偽装表示，（13）放射性物質，（14）輸入食品，（15）いわゆる健康食品，（16）その他（）

3.

食品添加物の安全性について どう思いますか ？
（1）不安である（2）やや不安である（3）余り不安でない（4）不安でない

4.

食品添加物は体に悪いと思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない

5.

問 4 で「思う」「ある程度思う」と答えた方にお聞きします．いつ頃から不安に思うようになりましたか？
（1）小中学生，（2）高校生，（3）大学生，（4）社会人，（5）よく分からない

6.

問 4 で「思う」「ある程度思う」と答えた方にお聞きします．何が体に悪いと思いますか？
（1）発ガン性，（2）アレルギー，（3）胎児への影響，（4）脳への影響，（5）なんとなく

7.
食品を購入する際に，食品添加物が使用されているか気に掛けますか？
（1）常に気に掛ける，（2）時々気に掛ける，（3）余り気に掛けない，（4）ほとんど気に掛けない
8.

食品添加物が使われている食品を購入しますか？
（1）買わない，（2）なるべく買わない，（3）時々買う，（4）余り気にしない

9.

食の安全性に関する情報は，主に何処から得ていますか？（複数回答可）（1）テレビ，（2）新聞，（3）雑誌，（4）教科書，（5）授業，（6）友人，（7）家族，（8）インターネット，（9）厚生労働省，保健所等，（10）食品安全委員会，（11）その他（

10. 食品を購入する際，重視 することはなんですか ？ （複数回答可）(1)価 格 ， (2)鮮 度 ， (3)安 全 性 ， (4)無 添 加 ， (5)無 農 薬 ， (6)産 地 ， (7)見 た 目 ， (8)お い し さ ，(9)栄 養 ， (10)旬 ， (11)生産者，メーカー， (12)天 然 ・ 自 然 ， (13)そ の他 （）
11．化学物質と聞くと有害・危険と思ってしまいますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない© The Ito Foundation

）

110

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

12. 天然と聞くと“安全・安心”，合成と聞くと“危険・不安”と思いますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない13. 食品添加物「無添加」，「不使用」と表示されている食品は，安全性が高いと思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない
14. 食品は，栄養成分（タンパク質，炭水化物など）を含め，さまざまな化学物質が集まったものです．
食品添加物も化学物質の一種ですが，このことについてどの様に思いますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない
15.

毒性の強い化学物質でも，その摂取量が極微量であれば健康に影響を及ぼさないとされています．
このことについてどの様に思いますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない

16.

食品添加物は，法律により「人の健康を損なう恐れのない場合」のみ，国により使用が認められ ています．このことについて信用できますか？
（1）信用できる，（2）ある程度信用できる，（3）やや信用できない，（4）信用できない

17. 生野菜を食品添加物，次亜塩素酸ナトリウムにより処理（最終食品に残らない）することにより，食中毒の発生を少なくすることができます．次亜塩素酸ナトリウムの使用は不安ですか？
（1）不安である（2）やや不安である（3）余り不安でない （4）不安でない
18. 豆腐を作る時に「にがり」が用いられます．「にがり」も食品添加物の一種ですが，にがりの使用は不安ですか？
（1）不安である（2）やや不安である（3）余り不安でない （4）不安でない
19. 癌の主な原因は，タバコ，普通の食べ物や高齢化が大きく影響しており，食品添加物の影響は無視できるレベルとされています．このことについて信用できますか？
（1）信用できる，（2）ある程度信用できる，（3）余り信用できない，（4）信用できない
20．かつて（40～50 年前）危険な添加物も使われていましたが，現在使用されている添加物は国により安全性が確保されており，食生活の中で食品添加物を不安視することはありません．どう思いますか？
（1）信用できる，（2）ある程度信用できる，（3）やや信用できない，（4）信用できない
21. 食品添加物は，使うことにより，消費者にとって利点（保存性や香りを高める）がないと認められません．ご存知でしたか？
（1）知っていた，（2）ある程度知っていた，（3）余り知らなかった，（4）知らなかった
22. 普段，食事をとる時に食品に含まれる「食品添加物」のことを考えますか？
（1）よく考える，（2）ある程度考える，（3）余り考えない，（4）ほとんど考えない
23. 改めてお聞きします．食品添加物の安全性についてどう思いますか？
（1）不安である（2）やや不安である（3）余り不安でない （4）不安でない
24. 食品添加物に対する不安度はどの程度ですか？
（1）非常に強い，（2）やや強い，（3）余り強くない，（4）強くない（普段気にしない）

ご協力ありがとうございました。

© The Ito Foundation

111

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究（Ⅱ）
別紙２ 食の安全性に関するアンケート調査のお願い（2021年２月調査）

性別

1.男 性

2.女 性

年齢

1. 20 代

2. 30 代同居家族の有無

3. 40 代

1.同居家族あり

家族構成（複数回答可）
職業

1.

5. 60 代6. 70 以 上

2.同居家族 な し（ 単 身）

1.乳幼児がいる

2.小 学 生 がい る

3.中 高生 が い る

4.そ の 他

1.自 営 業 ， 2.会社員， 3.公 務 員 ， 4.派 遣 ・ﾊﾟｰﾄ， ｱﾙﾊﾞｲﾄ， 5.学 生， 6.専 業 主 婦 ， 7.無 職

職種（専攻）
居住地

4. 50 代1.町 村

1.事務系（文科系）， 2.技術系（ 理 科系 ）2.市

3.大 都 市

食品の安全性についてどう思いますか？
（1）不安である（2）やや不安である（3）余り不安でない（4）不安でない

2.

食品の安全性で具体的に何が不安ですか？（上位 3 個まで選んでください）（1）食中毒，（2）遺伝子組換え食品，（3）BSE，（4）家畜への薬剤投与，（5）残留農薬，（6）食品添加物，（7）食物アレルギー，（8）消費期限，賞味期限，（9）外食の安全性，（10）家庭食の安全性，（11）食品汚染物質（ﾀﾞｲｵｷｼﾝ，ｶﾄﾞﾐｳﾑ等），（12）新型コロナ感染症，（13）放射性物質，（14）輸入食品，（15）いわゆる健康食品，（16）その他（）

3.

食品添加物の安全性について どう思いますか ？
（1）不安である（2）やや不安である（3）余り不安でない（4）不安でない

4.

食品添加物は体に悪いと思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない

5.

問 4 で「思う」「ある程度思う」と答えた方にお聞きします．いつ頃から不安に思うようになりましたか？
（1）小中学生，（2）高校生，（3）大学生，（4）社会人，（5）よく分からない

6.

問 4 で「思う」「ある程度思う」と答えた方にお聞きします．何が体に悪いと思いますか？
（1）発ガン性，（2）アレルギー，（3）胎児への影響，（4）脳への影響，（5）なんとなく

7.
食品を購入する際に，食品添加物が使用されているか気に掛けますか？
（1）常に気に掛ける，（2）時々気に掛ける，（3）余り気に掛けない，（4）ほとんど気に掛けない
8.

9.

食の安全性に関する情報は，主に何処から得ていますか？（複数回答可）（1）テレビ，（2）新聞，（3）雑誌，（4）教科書，（5）授業，（6）友人，（7）家族，（8）インターネット，（9）厚生労働省，保健所等，（10）食品安全委員会，（11）その他（
食品を購入する際，重視 することはなんです か ？ （複数回答可）(1)価 格 ， (2)鮮 度 ， (3)安 全 性 ， (4)無 添 加 ， (5)無 農 薬 ， (6)産 地 ， (7)見 た 目 ， (8)お い し さ ，(9)栄 養 ， (10)旬 ， (11)生産者，メーカー， (12)天 然 ・ 自 然 ， (13)そ の他 （）

10．化学物質と聞くと有害・危険と思ってしまいますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない
11. 天然と聞くと“安全・安心”，合成と聞くと“危険・不安”と思いますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない© The Ito Foundation

）

112

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

12. 食品は，栄養成分（タンパク質，炭水化物など）を含め，さまざまな化学物質が集まったものです．
食品添加物も化学物質の一種ですが，このことについてどの様に思いますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない
13.

毒性の強い化学物質でも，その摂取量が極微量であれば健康に影響を及ぼさないとされています．
このことについてどの様に思いますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない

14.

食品添加物は，法律により「人の健康を損なう恐れのない場合」のみ，国により使用が認められています．このことについて信用できますか？
（1）信用できる，（2）ある程度信用できる，（3）やや信用できない，（4）信用できない

15. 生野菜を食品添加物，次亜塩素酸ナトリウムにより処理（最終食品に残らない）することにより，食中毒の発生を少なくすることができます．次亜塩素酸ナトリウムの使用は不安ですか？
（1）不安である（2）やや不安である（3）余り不安でない （4）不安でない
16. 豆腐を作る時に「にがり」が用いられます．「にがり」も食品添加物の一種ですが，にがりの使用は不安ですか？
（1）不安である（2）やや不安である（3）余り不安でない （4）不安でない
17. 癌の主な原因は，タバコ，普通の食べ物や高齢化が大きく影響しており，食品添加物の影響は無視できるレベルとされています．このことについて信用できますか？
（1）信用できる，（2）ある程度信用できる，（3）余り信用できない，（4）信用できない
18．かつて（40～50 年前）危険な添加物も使われていましたが，現在使用されている添加物は国により安全性が確保されており，食生活の中で食品添加物を不安視することはありません．どう思いますか？
（1）信用できる，（2）ある程度信用できる，（3）やや信用できない，（4）信用できない
19. 食品添加物は，使うことにより，消費者にとって利点（保存性や香りを高める）がないと認められません．ご存知でしたか？
（1）知っていた，（2）ある程度知っていた，（3）余り知らなかった，（4）知らなかった
20. 改めてお聞きします．食品添加物の安全性についてどう思いますか？
（1）不安である（2）やや不安である（3）余り不安でない （4）不安でない
21. 食品添加物に対する不安度はどの程度ですか？
（1）非常に強い，（2）やや強い，（3）余り強くない，（4）強くない（普段気にしない）
22. 新型コロナウイルス感染症は，会食を通して感染するリスクが高いと思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない
23. 新型コロナウイルス感染症は，食品を通して感染するリスクが高いと思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない
24. 食品，食品容器等に起因するコロナウイルス感染のリスクは非常に低いとされています．どう思いますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない

ご協力ありがとうございました。

© The Ito Foundation

34.2
29.1
21.4
19.2
17.9
16.6
16.2
13.5
11.6
11.5
9.6
8.9
6.6
4.0
1.7
1.7
0.3

Total
33.6
24.0
17.9
19.2
23.5
14.7
15.4
11.4
11.2
10.9
9.3
7.8
6.0
3.6
1.6
1.5
0.2

M-Total
44.0
16.3
8.5
19.9
29.8
6.4
10.6
5.7
11.3
5.7
15.6
5.7
7.1
4.3
2.8
1.4
0.0

M-20s
42.6
21.3
8.5
11.3
22.7
15.6
16.3
5.7
13.5
8.5
15.6
7.1
6.4
5.0
2.1
2.1
0.0

M-30s

Male
36.2
15.6
11.3
12.8
29.1
14.9
10.6
10.6
14.2
9.9
7.8
9.9
9.9
2.1
0.7
0.7
0.0

M-40s
27.7
29.1
20.6
20.6
23.4
16.3
14.2
10.6
9.2
10.6
5.7
5.7
7.1
4.3
0.0
1.4
1.4

M-50s
28.4
26.2
23.4
27.0
22.7
13.5
17.7
18.4
10.6
14.2
5.7
7.1
3.5
2.8
2.1
2.1
0.0

M-60s
24.0
35.9
35.2
23.9
14.1
21.8
23.2
17.6
8.5
16.9
5.6
11.3
2.1
3.5
2.1
1.4
0.0

M-70+
34.7
34.1
24.8
19.3
12.4
18.5
16.9
15.5
12.1
12.1
9.9
10.0
7.3
4.4
1.8
1.9
0.4

F-Total© The Ito Foundation

29.4
27.1
25.4
24.7
18.7
18.6
14.9
11.7
11.7
9.7
8.7
7.6
6.1
2.5
1.9
1.1
0.4

Total
29.2
22.6
21.1
22.8
22.6
17.9
13.6
10.1
12.3
9.6
8.0
6.7
5.8
3.1
1.8
1.2
0.7

M-Total
44.7
15.3
6.7
16.7
28.7
10.0
8.7
5.3
9.3
17.3
6.7
8.0
6.7
4.7
2.7
0.7
0.7

M-20s
29.3
15.3
8.0
20.0
31.3
10.7
8.7
6.0
10.0
12.0
8.7
7.3
8.0
4.7
2.7
2.0
0.7

M-30s

Male
34.0
18.7
16.7
29.3
20.7
18.7
12.0
6.0
10.7
8.7
15.3
7.3
10.0
2.7
1.3
0.0
0.0

M-40s
26.7
22.0
24.0
21.3
18.7
22.7
18.0
12.7
17.3
6.0
6.0
4.7
5.3
1.3
1.3
1.3
1.3

M-50s
20.0
27.3
28.0
27.3
22.0
20.7
16.0
12.7
11.3
6.0
5.3
6.7
3.3
2.7
1.3
2.0
0.0

M-60s
20.7
36.7
43.3
22.0
14.0
24.7
18.0
18.0
15.3
7.3
6.0
6.0
1.3
2.7
1.3
1.3
1.3

M-70+

29.6
31.6
29.7
26.6
14.9
19.2
16.3
13.3
11.0
9.9
9.3
8.6
6.3
1.9
2.1
1.0
0.1

F-TotalWhich of these food issues are you concerned about, if any? Please select 3 that apply. Internet survey（1,800 people, 2021）

Food poisoning
The use of food additives
The use of pesticides
New corona infection
Not particularly
Genetically modified（GM）foods
Imported foods
Hormones, antibiotics in foodChemicals from the enviroment
Best-before date , expiration dateRadioactivity in food
Food hygiene when eating out
Food allergen
BSE
Food hygiene at home
So-called health food
OthersFood issue

Table 2 Food safety issues of concern

Which of these food issues are you concerned about, if any? Please select 3 that apply. Internet survey（1,700 people, 2020）

Food poisoning
The use of food additives
The use of pesticides
Genetically modified（GM）foods
Not particularly
Imported foods
Food impersonation label
Hormones, antibiotics in foodRadioactivity in foodChemicals from the enviroment
Datelabels（best before ,use by）
Food hygiene when eating out
Food allergen
BSE
Food hygiene at home
So-called health food
OthersFood issue

Table 1 Food safety issues of concern

48.0
18.7
10.0
25.3
21.3
6.0
10.0
5.3
6.0
21.3
4.7
8.0
9.3
1.3
1.3
0.7
0.0

F-20s

51.1
26.2
8.5
9.9
22.0
9.9
7.8
9.2
4.3
8.5
12.1
8.5
14.9
0.7
2.8
2.8
0.0

F-20s

38.0
27.3
18.0
28.0
18.7
10.7
15.3
8.7
10.0
7.3
12.0
5.3
14.7
0.7
2.7
0.7
0.0

F-30s

42.6
32.6
19.9
12.1
17.7
15.6
9.9
5.7
10.6
6.4
10.6
12.8
12.1
2.1
4.3
1.4
0.0

F-30s

33.3
34.7
28.0
24.0
13.3
18.7
14.7
15.3
8.7
7.3
7.3
12.0
7.3
3.3
2.7
0.7
0.0

F-40s

Female

34.8
30.5
24.1
23.4
12.1
14.9
15.6
11.3
15.6
11.3
11.3
9.9
9.9
2.8
1.4
2.8
1.4

F-40s

Female

25.3
34.0
34.7
29.3
12.7
25.3
26.0
10.7
8.0
6.0
10.0
8.7
2.7
2.0
2.0
0.7
0.0

F-50s

34.0
36.9
27.0
21.3
7.8
26.2
21.3
15.6
14.9
14.2
12.8
8.5
4.3
3.5
0.7
1.4
0.0

F-50s

20.0
34.7
40.0
25.3
12.0
25.3
20.0
18.0
16.7
10.0
9.3
8.7
2.7
2.7
2.0
2.0
0.0

F-60s

23.4
41.8
37.6
28.4
5.0
19.9
17.7
24.8
13.5
19.1
7.1
9.9
2.1
7.1
0.7
2.1
0.0

F-60s

12.7
40.0
47.3
27.3
11.3
29.3
12.0
22.0
16.7
7.3
12.7
8.7
1.3
1.3
2.0
1.3
0.7

F-70+

23.4
37.6
32.6
21.3
9.9
24.8
29.8
27.0
14.2
13.5
5.7
10.6
0.7
9.9
0.7
0.7
0.7

F-70+

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究（Ⅱ）

113

114
3.2

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

食品添加物に対する安全性についてのがある。

食品の安全性で具体的に「食品添加物に対するしかし一方では，食品添加物に対する不安の程

安全性についてどう思いますか」と尋ねてみた。

度を調べた結果では，女性では，「とても心配」

全体では，不安である16.4％，やや不安であるが 2.0～8.2 ％（平 均 5.1 ％ ），「あ る 程 度 心 配」が47.7％，あまり不安でない28.8％，不安でない7.1％

24.6～36.1％，男性では，「とても心配」が1.4～であった。インターネット調査者の2/3近くが食

6.7 ％（平 均 3.7 ％ ），「あ る 程 度 心 配」が 20.2～

品添加物に対して不安感を抱いていることが分

28.1％であり，食品添加物の安全性に対して不安かった。Fig.１に示すように，50代～70代以上のを抱くものの，深刻度は高くないものと推測され女性では，約８割が「不安である，やや不安である。すなわち，食品添加物の安全性について問わる」と不安感を抱いていた。この結果は昨年の調れてみると「なんとなく不安，なんとなく体に良査とほぼ同様であった４）。過去に実施されたアン

くないもの」と考える割合が高いものと考えられケート調査でも，最近実施されたアンケート調査る。しかし，食品添加物に対して，「とても不安」

においても，消費者の多くが食品添加物の安全性と感じている消費者が2020年調査で4.9％（男性に不安を抱いている。食品の安全性に関する各種

3.9％，女性6.0％），2021年調査で4.4％（男性3.7％，

アンケート調査では，牛海綿状脳症（BSE）や福

女性5.1％）いることも事実であり，必要以上の島原発事故による放射性物質汚染問題のように，

不安感については取り去るべき課題である。

食品の安全性に関する事件・事故により報道される記事数は大きく異なり，消費者が抱く具体的な

3 . 3 食品添加物に対するリスク認知バイアスについて

不安項目も事件や事故の影響を強く受ける７）。し

今日の豊かな生活は，特に合成された化学物質

かし，最近食品添加物による事件・事故等の問題

なしには語れない。しかし，言い尽くされてきてはまったく起こっていないのに係わらず，消費者いるが，メチル水銀による水俣病，ヒ素によるミの食品添加物に対する不安感，不信感は根強いも

ルク中毒事件，有害金属カドミウムによるイタイ

70s+
60s
50s
40s
30s
20s
0%

20%
Concerned

40%
Little concerned60%
Not very concerned

80%

100%

Unconcerned

Fig. 1 Differences in women’s awareness of the safety of food additives by age.

 Age groups：20s= 20～29 years, 30s= 30～39 years, 40s= 40～49 years, 50s= 50～

59 years, 60s= 60～69 years, 70s+ = 70 over years© The Ito Foundation

115

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究（Ⅱ）

イタイ病，亜硫酸ガス等による四日市喘息，最近と思われる。すなわち，食品の安全性に対する事

ではダイオキシンや内分泌かく乱化学物質の問題

件・事故が頻繁に報道された幼少期を過ごし，か等があげられる。Fig.２は，化学物質の安全性に

つ食材の購入から調理に携わる機会の多い50代か

対する意識調査の結果を示したものである。やはら70代の女性は，化学物質は危険なものと強く認り男性よりも女性のほうが化学物質に対する不安識するに至ったことが推察される。

感は強く，９割前後の女性が不安感を抱いてい3.4

る。私たちは，豊かな生活を得た反面，化学物質

世界的に大流行となっている「新型コロナウイ

によるこれらの事件・事故に遭遇し，大きな被害

ルス感染症」でも，科学的に根拠のない情報に翻を受けた人も少なくない。これらの事件・事故に弄されることが問題とされている。過去の事件・よる報道などにより「化学物質，特に合成化学物

事故や学校教育等で消費者の脳裏に一度刷り込ま質は有害であり危険である」との情報は，その後れた科学的根拠のない「食品添加物を有害なも「改善されて心配はない」と言われても，一度刷の，危険なもの」とする考えはなかなか拭い去る

り込まれた「有害・危険」のイメージはなかなかことができないでいる８）。

リスク認知バイアスの低減化に向けて

拭い去れないと言える。さらに，今日においても食品添加物に対する科学的な安全性評価と消費食品に関する事件・事故（豚コレラ，鳥インフル者のリスク認知の間にある大きな溝（乖離）を埋

エンザ，異物混入，偽装表示，食品異臭等）が比める手段として，学校教育や市民参加型の双方向較的頻繁に報道されている。過去に起こった化学

的リスクコミュニケーションを通して，消費者の物質や食品添加物に対する事件・事故，今日でも科学リテラシーを高めていくことが有効であ

時々報道される食品危害情報が消費者の食品添加

る９,10）。また，科学リテラシーを向上させる手段

物に対するリスク認知形成に大きく係わっているとして正しい情報を分かりやすく，繰り返して提Female
70s+
60s
50s
40s
30s
20s
70s+

Male

60s
50s
40s
30s
20s
0%
Concerned

20%

40%

Little concerned60%
Not very concerned

80%

100%

Unconcerned

Fig. 2 Differences in awareness of the safety of chemical substances by gender and age.

 Age groups：20s= 20～29 years, 30s= 30～39 years, 40s= 40～49 years, 50s= 50～

59 years, 60s= 60～69 years, 70s+ = 70 over years© The Ito Foundation

116

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

供することが効果的と考える。そこで，今回の調問した時に比べて，男女とも「不安である，やや査においても前回調査

不安である」と答えた割合が５～10ポイント低くと同様に，質問形式によ４）る食品添加物の情報の提供を試みた。

なっている。特に40代以上の女性では，有意な減「Ｑ12：食品は，栄養成分（タンパク質，炭水少を示した（ｐ＜0.05）。食品添加物に対して不化物など）を含め，さまざまな化学物質が集まっ安感を抱く消費者，特に40代以上の女性にとったものです。食品添加物も化学物質の一種ですて，正しい情報を知り，自ら考えることにより，が，このことについてどのように思いますか？」

食品添加物に対する不安感がわずかであるが低減「Ｑ13：毒性の強い化学物質でも，その摂取量化されたと推察される。食品添加物に対するリスが極微量であれば健康に影響を及ぼさないとされ

ク認知を低減する手段として，双方向性のある学ています。このことについてどのように思います

校教育や講演会・勉強会などのリスクコミュニ

か？」ケーションを通して，正しい情報を分かりやす「Ｑ15：生野菜を食品添加物，次亜塩素酸ナト

く，かつ繰り返し提供することが効果的であるとリウムにより処理（最終食品に残らない）するこ考える。

とにより，食中毒の発生を少なくすることができます。次亜塩素酸ナトリウムの使用は不安です

４．要

約

消費者がどのような経緯で食品添加物に対するか？」「Ｑ16：豆腐を作る時に「にがり」が用いられ認識を醸成してきたか，あるいは醸成していくのます。「にがり」も食品添加物の一種ですが，にかを明らかにし，科学的な安全性と消費者の認識

がりの使用は不安ですか？」の大きな乖離を埋めていくことは重要である。本

「Ｑ17：癌の主な原因は，タバコ，普通の食べ研究では，昨年度に引き続きインターネット調査

物や高齢化が大きく影響しており，食品添加物の（1,800名）を通して，食品添加物に対する意識調

影響は無視できるレベルとされています。このこ

査を実施した。消費者の食品添加物に対する不安とについて信用できますか？」感は，50代から70代の女性が高く，20代の若い世「Ｑ18：かつて（40～50年前）危険な添加物も代になるほど低くなる傾向が見られた。食品の安使われていましたが，現在使用されている添加物

全性に対する事件・事故が頻繁に報道された幼少は国により安全性が確保されており，食生活の中期を過ごし，かつ食材の購入から調理に携わる機

で食品添加物を不安視することはありません。ど会の多い50代から70代の女性は，食品添加物は危う思いますか？」険なものと強く認識していることが推察される。

「Ｑ19：食品添加物は，使うことにより，消費

一度脳裏に刷り込まれた「食品添加物を有害なも者にとって利点（保存性や香りを高める）がないの，危険なものとする」考えはなかなか拭い去ると認められません。ご存知でしたか？」等の問いことができないが，正しい情報を分かりやすく，に答えてもらった後に，最後に，「Ｑ20：改めてかつ繰り返し提供することにより，リスク認知のお聞きします。食品添加物の安全性についてどう

変容が可能であると考えられる。

思いますか？」と質問を投げかけてみた。その結果の概要をFig.３に示す。本調査の最初に「食品添加物の安全性についてどう思いますか？」と質

文
献１）
 国政モニター課題報告「食の安全性に関する意識© The Ito Foundation

117

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究（Ⅱ）●Male, after the lecture
70s+
60s
50s
40s
30s
20s
●Male, before the lecture
70s+
60s
50s
40s
30s
20s
●Female, after the lecture
70s+
60s
50s
40s
30s
20s
●Female, before the lecture
70s+
60s
50s
40s
30s
20s
0%

20%
Concerned

40%

Little concerned

60%

80%

Not very concerned

100%

Unconcerned

Fig. 3 Effect of correct information on the safety of food additives．

 Age groups：20s= 20 ～ 29 years, 30s= 30 ～ 39 years, 40s= 40 ～ 49 years,

50s= 50～59 years, 60s= 60～69 years, 70s+ = 70 over years

調 査」：内 閣 府 食 品 安 全 委 員 会 ，https://www.fsc.
go.jp/monitor/1512kokumoni-houkoku.pdf
２） 東京都平成25年度インターネット都政モニターア
ン ケ ー ト：食 品 の 安 全 性 に つ い て ，http://www.
metro.tokyo.jp/INET/CHOUSA/2013/10/60nat100.
htm３） Public Attitudes tracker Wave 19, Food Standards
Agency, https://www.food.gov.uk/sites/default/files/
media/document/public-attitudes-tracker-wave19-final-report.pdf４） 堀江正一，渡邉萌，堀井千枝：食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究，食肉に関する助成研究調査成果報告書，38, 88～98, 2020.

５）
 楠見孝：日本リスク研究学会誌，23, 298～36, 2013.
６） 荒井祥：食品衛生学雑誌，54, Ｊ319-Ｊ326, 2013.
７） 食品安全モニターからの報告：内閣府食品安全委
員会，https://www.fsc.go.jp/monitor/monitor_report.
html
８） 山﨑毅，大瀧直子，桑原正貴：日本リスク研究学
会誌, 31, Nov. 9-11, 2018.
９）
 Zhong, Y., Wu, L., Chen, X., Huang, Z., Hu, W.：
Int J Environ Res Public Health, 15, 2394, 2018.
https://www.mdpi.com/1660-4601/15/11/2394/htm
10）
 Kornelis, M., Jonge, J. D,, Frewer, L., Dagevos, H：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/
j.1539-6924.2007.00885.x© The Ito Foundation

118

牛の新規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への影響（Ⅱ）
Molecular basis of novel genetic disorders in cattle and their adverse
impact（Ⅱ）

大和

修・矢吹

映・Md Shafiqul Islam・Shahnaj Pervin（鹿児島大学共同獣医学部臨床病理学分野）

Osamu Yamato, Akira Yabuki, Md Shafiqul Islam and Shahnaj Pervin（Laboratory of Clinical Pathology, Department of Veterinary Clinical Sciences,
Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

The present study was carried out in order to identify the causes in Japanese Black calves
with congenital spongiform neurodegeneration and multiple ocular defects, respectively. This
study was also carried out to determine the mutant allele frequency of the bovine isoleucyltRNA synthetase（IARS）gene in the population of Japanese Black cattle, and investigate
differences between the carrier and wild-type cows with respect to either metabolic profile
test（MPT）results or reproductive performance related to the IARS mutation（c.235G>C）.
Immunohistochemical analyses revealed that the central nervous system in a case withspongiform neurodegeneration might lack two subunits of branched chain keto aciddehydrogenase（BCKDH）：BCKDHA and BCKDHB, suggesting that the calf might be affectedwith maple syrup urine disease caused by either BCKDHA or BCKDHB gene. Sequencing
analysis of the bovine WFDC1 gene in a calf with multiple ocular defects revealed that there
were no distinct mutations in the exons’ region including the known mutation （c．
198_199insC）, suggesting another novel molecular cause in this calf. Genotyping of the IARS
mutation revealed that the carrier rate was 6.9％ in 2009 and 1.5％ in 2018, the difference of
which was statistically significant（p<0.005）. There were no statistically significant differences
between the carrier and wild-type cows with respect to either MPT results or reproductive
performance, indicating that the carrier cows have necessary IARS activity to maintainminimal health and reproductive potential.

１．目

深刻な影響をもたらしている。具体的に，北海道

的人工授精師協会発行の最新報告（2019年度）を例

国内の主要牛群である肉用の黒毛和種牛およびにとると，周産期疾患や泌乳の影響がない未経産

乳肉用のホルスタイン牛は，近年，その受胎率，牛の初回受胎率は，肉用種牛で59.8％（2008年度

出生率および生産性の低下が無視できない問題とは65.7％），乳用種牛で53.9％（2008年度は59.9％）

なっており，乳肉用牛生産現場ならびに牛市場にで，いずれも過去10年間に約６％低下している。

© The Ito Foundation

牛の新規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への影響（Ⅱ）

その原因は多様であると推測されるが，潜在する
遺伝的不良形質も主因のひとつであると考えられ
る。

２．方

119

法

2 . 1 海綿状脳症の子牛の中枢神経組織に対す

黒毛和種牛においては，現在９種の遺伝的不良

る免疫染色

形質，すなわち，バンド３欠損症，血液凝固第13先天性の海綿状脳症にて死亡した黒毛和種子

因子欠損症，クローディン16欠損症，チェディ

牛 の大脳および小脳のパラフィン包埋ブロック

アック・ヒガシ症候群，眼球形成異常症，モリブからミクロトームにて薄切した切片を用い，ポリデン補酵素欠損症（正確にはキサンチン尿症Ⅱ

マー法にて免疫染色した。対照として，正常な黒型），イソロイシルtRNA合成酵素欠損症（IARS

毛和種子牛の中枢神経組織のパラフィン包埋ブ異常症），前肢帯筋異常症およびバーター症候群

ロックを使用した。免疫染色のための一次抗体Ｉ型が，ホルスタイン牛においては，現在６種の（ウサギ・ポリクローナル，アブカム社）には，

遺伝的不良形質，すなわち，白血球粘着不全症，抗ヒトアスパルトアシラーゼ（ASPA），および複合脊椎形成不全症，単蹄，短脊椎症／ブラキス

分枝鎖α-ケト酸脱水素酵素（BCKDH）を構成

パイナ，HH１およびコレステロール異常症が，する４つのサブユニットタンパクに対する抗体で一般財団法人家畜改良事業団（家畜改良技術研究ある抗ヒトBCKDHA，抗ヒトBCKDHB，抗ヒト所）により指定疾患として検査可能であり，種雄DBTおよび抗ヒトDLD抗体を用い，ならびに二牛の遺伝子型が明らかにされている

次抗体にはペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG

。

１，２）

５）

本研究は，昨年度から，主に黒毛和種新生子で（ヤギ，ニチレイバイオサイエンス社）を用いた。

報告された未同定かつ未解明の遺伝的不良形質で発色基質としては3,3’-ジアミノベンジジン（メルある２疾患，すなわち，ライソゾーム蓄積病ク社）を用いた。

および海綿状脳症

５）３，４）について，その疾患を同定（確定診断）して分子基盤（原因変異と発症機序）

2 . 2 眼球形成異常症の症例におけるWFDC1
遺伝子エクソンシーケンス解析を解明するために実施され，今年度もそれらにつ最近，臨床的かつ組織病理学的に眼球形成異常

いて調査を継続してきた 。さらに，これらの目症と診断された黒毛和種子牛（未報告）のパラ的に加えて，昨年度からはIARS異常症の原因変

フィン包埋ブロックから抽出したDNAを用いて，異の変異アレル頻度とその牛生産性への影響の

過去に黒毛和種牛の眼球形成異常症の原因として

調査，ならびに今年度から黒毛和種子牛の新たな同 定 さ れ た 牛 WFDC1 遺 伝 子 変 異 （c.

眼球形成異常症の未報告症例で，WFDC1遺伝子

８）
198_199insC）の有無，ならびに７つの全エクソ８）の既知変異（c. 198_199insC）
を有していない個

ン領域を増幅してサンガーシーケンス法にて配列体における新規原因変異解析についても目的に加を解読し，既知変異以外の新規変異を検索した。

えて研究を進めてきた。その結果，海綿状脳症，

2 . 3 IARS異常症の変異アレル頻度および牛

６）７）

眼球形成異常症およびIARS異常症に関する解析において，明確な成果が得られたため，それらについて以下に報告する。

生産性への影響の調査７）
鹿児島県内の複数の農場で2009年（130検体）
および2018年（462検体）に収集した黒毛和種繁殖牛の血液から抽出したDNAを用いた。IARS異常症の原因変異（c.235G>C）の遺伝子型を識別© The Ito Foundation

120

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

するTaqMan MGBプローブを用いたリアルタイの結果は，以前に本症例のASPA遺伝子のエクソ

ムPCR法を作成して，それぞれの個体の遺伝子型

ン領域を調査して変異候補が認められなかったこを決定し，集団におけるキャリア率を算出した。

とに一致するため６），本症例はASPA欠損で生じまた，2018年に収集した牛の中で同じ環境で生るカナバン病を発症していない可能性が高いと考育した牛群（62頭，平均年齢11.5歳）において，えられた。

上記の遺伝子型検査で識別された野生型ホモ接合

一方，症例牛の小脳において，抗BCKDHAお体（58頭）とヘテロ接合体（４頭）の代謝プロ

よび抗BCKDHB抗体による組織の染色性が対照

ファイル試験（MPT）成績および繁殖・生育成

牛 に 比 較 し て 著 し く 減 弱 し て い た 。ま た ，抗績を比較した。MPTでは，総タンパク（TP），

DLDおよび抗DBT抗体による神経細胞の染色性

アルブミン（Alb），グルコース（Glu），血中尿は対照牛と同程度であった。この結果から，症例

素態窒素（BUN），中性脂肪（TG），総コレステ

牛がBCKDHを欠損していることを示唆している

ロール（T-Cho），遊離脂肪酸（FFA），３-ヒドと考えられた。BCKDH複合体におけるBCKDHA

ロキシ酪酸（３-HB），カルシウム（Ca），無機とBCKDHBサブユニットは，そのどちらかが欠リン（iP），マグネシウム（Mg）濃度，ならびに損するともう一方が不安定化することが知られてアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ

おり，またBCKDHAとBCKDHBのどちらかが欠（AST）およびγ-グルタミルトランスフェラー

損してもDLDとDBTタンパクは安定的に維持さゼ（GGT）活性を測定した。アルブミン／グロ

れることも報告されている。そのため，本症例牛

ブリン比（A/G）は，TPとAlbから計算した。繁はBCKDHAあるいはBCKDHBのどちらかを欠損

殖・生育成績としては，出生子牛数，新生子体重，することでメープルシロップ尿症（MSUD）を

一日増体量，治療回数および治療費を評価した。

発症していると推測された。以前の研究では，

統計学的解析として，2009年と2018年のキャリ

MSUDの原因となるBCKDHA，BCKDHB，DBT

ア率はFisher’s exact検定を用いて比較し，MPT

およびDLD遺伝子について調査したが，変異候

および繁殖・生育成績については，野生型ホモ接補が同定できていなかった。それはDNAの断片

合体およびヘテロ接合体群の平均値の差を化によりすべての領域をシーケンスすることがで

Mann-Whitney U検定で比較した。p＜0.05を有きなかったことが原因と考えられていた。今回，意差として定義した。

BCKDHAおよびBCKDHB遺伝子のどちらかに本症例のMSUDの原因となる変異が存在するの３．結果と考察で は な い か と 考 え ら れ た 。し か し ，本 症 例 の3 . 1 海綿状脳症の子牛の中枢神経組織に対す
る免疫染色

DNAは断片化しているため，これ以上の正確な調査は難しいと思われた。

免疫染色の結果をFig.１に示した。症例牛の大脳において，抗ASPAに対する染色する細胞は存

3 . 2 眼球形成異常症の症例におけるWFDC1
遺伝子エクソンシーケンス解析

在し，対照牛と同程度であった。これは，症例牛

牛WFDC1遺伝子の７つのエクソンを増幅するの大脳組織はASPAタンパクを対照牛と同程度にために，イントロン領域にプライマーを設計して有していることを示しており，症例牛はASPAタ

PCR増幅したPCR産物について，サンガーシーケ

ンパクを欠損していないことを示唆していた。こンス法にて配列を解読した。その結果，既知変異© The Ito Foundation

牛の新規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への影響（Ⅱ）
Case

121

Control

ASPA

BCKDHABCKDHB

DLD

DBT

Fig. 1 Immunohistochemistry for the detection of bovine ASPA（cerebral

cortex）, BCKDHA, BCKDHB, DLD, and DBT proteins（cerebellum）in acalf（Case）with congenital spongiform neurodegeneration and a clinically
healthy calf（Control）.Counter stain：Mayer’s hematoxylin.

およびその他原因候補となる新規変異も認められ0.005）低下していた。これは，農場ごとの種雄なかった。この結果は，眼球形成異常症を示す本牛の選択性が異なることや，虚弱子牛を産んだ繁症例の遺伝的原因として，WFDC1遺伝子が原因

殖牛を早期に退役させる傾向など，いつかの要因である可能性も残されるものの，同遺伝子以外のによってキャリア率が減少したものと考えられた。

遺伝子に変異が存在する可能性が高いと考えられキャリアと野生型ホモ接合牛の間には，MPTた。今後のさらなる解析が必要であると思われた。

（Table１）および繁殖・生育成績（Table２）の有3 . 3 IARS異常症の変異アレル頻度および牛意な差が認められなかった。したがって，キャリ生産性への影響の調査

ア牛は野生型牛と最低限変わらない健康状態と生IARS異常症の遺伝子型調査によって，キャリ産性は維持していると考えられた。しかし，キャ

ア率は2009年の調査集団で6.9％，2018年の調査

リア牛の中には，脂質濃度が高く血糖値が低い牛集団で1.5％であった。統計解析の結果，2018年も含まれていたことや，治療費は比較的高い傾向のキャリア率は2009年に比較して有意に（p＜を示したため，なんらかの代謝異常や疾患に陥り© The Ito Foundation

122

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 1 Results of serum biochemical analyses in homozygous wild-type and heterozygous

carrier cows for the IARS mutation
AnalyteWild-type cows（n=58）

Carrier cows（n=4）

Reference range

TP（g/dl）

7.6 ± 0.4

8.0 ± 0.4

6.6-8.1

Alb（mg/dl）

3.4 ± 0.2

3.3 ± 0.2

3.0-3.8

A/G ratio

0.83 ± 0.14

0.72 ± 0.13

0.8-1.3

Glu（mg/dl）

42.2 ± 8.9

38.8 ± 2.4

44.6-67.0

BUN（mg/dl）

8.4 ± 1.5

7.5 ± 1.1

5.0-16.6

TG（mg/dl）
T-Cho（mg/dl）

39.8 ± 84.2
136.4 ± 37.5

252.2 ± 383.0
176.2 ± 42.7

8.5-43.4
76.7-141.7

FFA（mmol/l）

284.7 ± 186.8

340.9 ± 121.7

28.9-354.2

3-HB（μmol/l）

252.3 ± 121.2

224.3 ± 56.8

110.0-545.0

Ca（mg/dl）

8.8 ± 0.4

9.1 ± 0.3

8.8-10.4

iP（mg/dl）
Mg（mg/dl）

5.2 ± 0.9
2.1 ± 0.2

5.2 ± 0.4
1.9 ± 0.1

4.2-6.7
1.5-2.2

AST（U/l）
GGT（U/l）53.7 ± 8.5
18.9 ± 4.5

62.6 ± 6.9
17.8 ± 7.2

44.0-76.8
11.3-21.6

The results obtained for each parameter are expressed as the mean ± standard deviation. There
was no significant difference between the two groups. TP, total protein；Alb, albumin；A/G, albumin
to globulin；Glu, glucose；BUN, blood urea nitrogen；TG, triglyceride；T-Cho, total cholesterol；
FAA, free fatty acid；3-HB, 3-hydroxybutyrate；Ca, calcium; iP, inorganic phosphorus；Mg,
magnesium；AST, aspartate aminotransferase；GGT, γ-glutamyl transferase.

Table 2 Comparison of the reproductive and developmental status of homozygous wild-

type and heterozygous carrier cows for the IARS mutation
Performance

Calf data：
Number of live births
Birth weight of male calf（g）
Daily weight gain after castration（g/calf）
Birth weight of female calf（g）
Daily weight gain of female calf（g/calf）
Cow data：
Frequency of treatment（/year/cow）
Treatment cost（Japanese yen/year/cow）

Wild-type cows（n=58）

Carrier cows（n=4）

8.8 ± 0.7
29,730 ± 303
1.1 ± 0.1
26,084 ± 298
0.9 ± 0.1

9.0 ± 0.7
29,538 ± 322
1.1 ± 0.2
26,529 ± 25
0.9 ± 0.1

2.6 ± 1.8841 ± 620

3.3 ± 1.6
1,066 ± 605

The results obtained for each performance parameters are expressed as the mean ± standard
deviation. There were no significant differences between the two groups with respect to any of theassessed parameters.

やすい傾向も存在するのではないかと考えられ異常症について，その疾患を同定して原因変異をた。今後，分析する頭数を増やしてさらなる調査

解明することを目的として実施された。さらに，が必要であると考えられた。

黒毛和種牛集団におけるイソロイシルtRNA合成

４．要

酵 素 欠 損 症 （IARS 異 常 症） の 原 因 変 異約（c.235G>C）の変異アレル頻度を算出するととも本研究は，過去に黒毛和種新生子で報告されたに，同変異のヘテロ接合体キャリアと野生型ホモ

原因が未解明の先天性海綿状脳症，ならびに最近

接合体において代謝プロファイルテスト（MPT）

臨床的かつ組織学的に診断された先天性眼球形成

成績および繁殖・生育成績についても分析・比較© The Ito Foundation

牛の新規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への影響（Ⅱ）

した。
先天性海綿状脳症の牛の中枢神経組織における免疫染色の結果，分枝鎖α-ケト酸脱水素酵素（BCKDH）を構成する４つのサブユニットタン
パクのうち，BCKDHAおよびBCKDHBに関して，
症例牛が対照牛に比較して染色性が著しく減弱していたため，本症例はメープルシロップ尿症を発症していたと推測された。また，先天性眼球形成異常症の牛では，WFDC1遺伝子エクソン上に既知および新規変異も認められなかったため，同遺伝子のエクソン以外の領域，あるいはその他の遺伝子に原因が存在すると考えられた。さらに，
IARS異常症の遺伝子型調査によって，キャリア率は2009年の調査集団で6.9％，2018年の調査集団で1.5％であり，両キャリア率には有意な（p＜0.005）差が存在した。キャリアと野生型ホモ接合牛の間には，MPTおよび繁殖・生育成績の有意な差が認められなかったため，キャリア牛は野生型牛と変わらない健康状態と生産性は維持していると考えられた。

123

文
献
１）
 黒毛和種の遺伝的不良形質，一般財団法人家畜改良 事 業 団 家 畜 改 良 技 術 研 究 所 ，http：//liaj.or.jp/
giken/usi_gntyp_disease_kuro.html
２）
 ホルスタイン種の遺伝的不良形質，一般財団法人
家畜改良事業団家畜改良技術研究所，http：//liaj.
or.jp/giken/usi_gntyp_disease_hol.html
 Mikami, O., Anjiki, T., Yamato, O., Nakajima, Y.：３）
A case of suspected lysosomal storage disease in aneonatal Japanese black calf, J Vet Med A Physiol
Pathol Clin Med, 53（2）,77～80, 2006.
 Masoudi, A. A., Yamato, O., Yoneda, K., Tsuji, T.,４）
Mikami, O., Kunieda, T.：Exclusion of NEU1 and
PPGB from candidate genes for a lysosomal
storage disease in Japanese black cattle, Anim Sci
J, 80（5）,611～615, 2009.
 Kato, K., Uchida, K., Murakami, T., Tateyama, S.：
５）
A neurological disease with spongy degeneration
in a newborn Japanese Black calf, J Vet Med Sci, 67（10）,1067～1070, 2005.
 大和修，矢吹映，Islam, M. S., Pervin, S．：牛の新６）規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への影響（Ⅱ），平成31年度（令和元年度）食肉に関する助成
研究調査成果報告書 VOL. 38, pp. 112～117.
 Islam, M. S., Shinya, U., Takagi, M., Akahoshi, T.,
７）
Yabuki, A., Pervin, S., Rakib, T. M., Rahman, M. M.,
Tacharina, M. R., Yamato, O.：Carrier rate of thec.235G>C mutation in the bovine isoleucyl-tRNA
synthetase（IARS）gene of Japanese Black cows at
Kagoshima prefecture, Japan, and analysis of themetabolic profiling and reproductive performanceof heterozygous cows, J Vet Med Sci, 83（2）, 254～
259, 2021.
 Abbasi, A. R., Khalaj, M., Tsuji, T., Tanahara, M.,
８）
Uchida, K., Sugimoto, Y., Kunieda, T.：A mutationof the WFDC1 gene is responsible for multiple
ocular defects in cattle, Genomics, 94（1）, 55～62,
2009.

© The Ito Foundation

124

肉用牛の枝肉形質および肉質の診断マーカーとしての血中マイクロRNAの動態解析
Analysis of dynamics of circulating microRNAs as biomarkers fordiagnosis of carcass traits and meat quality in beef cattle

横

井

伯

英

（京都大学大学院農学研究科）

Norihide Yokoi（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

To establish the blood microRNA（miRNA）-based diagnosis method of carcass traits andmeat quality in beef cattle, we examined the extraction and detection methods of plasma
exosomal and non-exosomal miRNAs in Japanese Black cattle, investigated changes in plasma
miRNAs between early and late stages during fattening, and tried to detect these miRNAs inskeletal muscle and subcutaneous fat tissue. At first, we examined the internal controls forblood miRNA analysis in Japanese Black cattle and found that bta-miR-15a is appropriate forplasma exosomal miRNA analysis and that bta-miR-15a and bta-miR-93 are appropriate forplasma non-exosomal miRNA analysis. Then, we examined whether the 23 miRNAs found inblood and skeletal muscle in cattle are detected in plasma exosomal and non-exsosomal
fractions in Japanese Black cattle. We found that 11 and 13 miRNAs are specifically amplified
in exosomal and non-exsosomal fractions, respectively. Among them, two miRNAs tended tochange in plasma between early and late stages during fattening. Finally, we tried to detect
these 23 miRNAs in skeletal muscle and subcutaneous fat tissue at the end of fattening. We
found that eight miRNAs are specifically amplified in skeletal muscle and subcutaneous fat
tissue. Further study is needed to perform longitudinal and comprehensive analysis of plasma
miRNAs in beef cattle to identify novel biomarker candidates for carcass traits and meat
quality and to examine candidate miRNAs in large populations of cattle.

１．目

定的にかつ低コストで生産するには，生体におい的て枝肉形質および脂肪の質を含めた肉質を的確に

近年の遺伝的改良および飼養法の進歩により，評価する技術の開発が必要である。生体における黒毛和種牛の脂肪交雑をはじめとする各種枝肉形

枝肉形質や肉質の評価法としては，超音波などを質は飛躍的に向上した。最近は筋肉内脂肪の量だ

用いて推定する方法と血液などに含まれるバイオ

けでなく，脂肪の質（脂肪酸組成）や筋肉内へのマーカーを用いて推定する方法が試みられてい入り方（サシ）の細かさも重要視されている。国る。前者は専用機器を用いることが必要であり，際競争力が高く，安心・安全・高品質な牛肉を安汎用性に難がある。従来，脂肪交雑の向上を目的© The Ito Foundation

肉用牛の枝肉形質および肉質の診断マーカーとしての血中マイクロRNAの動態解析

として飼料中のビタミンＡを制限した飼養とともに血中ビタミンＡ濃度の測定が行われているが，血中ビタミンＡ濃度はリアルタイムの脂肪交雑の指標ではない。現状においては，血中バイオマー
カーによる枝肉形質や肉質の診断技術は実用化されていない。

２．方

125

法

2 . 1 血中エクソソーム内外のマイクロRNAの抽出とqPCRによる定量
京都大学農学研究科附属牧場において飼養中の黒毛和種牛を対象として，肥育初期の15カ月齢

最近，血中に存在するマイクロRNAが疾患を（ｎ＝４）および肥育後期の30カ月齢（ｎ＝３）

はじめとする生体の状態の指標となる新たなバイにおいて経静脈からEDTA採血管（テルモ社）

オ マ ー カ ー と し て 注 目 さ れ て い る 。マ イ ク ロ

を用いて血液を採取し，低温下での遠心により血RNAは22塩基ほどの一本鎖RNAであり，真核生

漿を分離して凍結保存した。次に，融解した血漿物において遺伝子発現制御に関与している１）。マ

１mLをサンプルとして，Plasma/Serum Exosome

イクロRNAは細胞内に限らず，動物においてはand Free-Circulating RNA Isolation Mini Kit（ノ

体液中にも存在しており，血液，尿，および唾液

ルジェン社）を用いて血漿中のエクソソーム画分等で検出することができる 。これまで多くの血およびそれ以外の画分からRNAを抽出した。抽中マイクロRNAの解析は，血中に存在するエク出 し た RNA か ら の cDNA 合 成 に は ， Mir-X

ソソーム（各種細胞から分泌される微小な膜小胞miRNA First-Strand Synthesis Kit（タカラバイ

顆粒）の中に存在するマイクロRNAに限定してオ社）を用いた。

２）

行われてきた。しかし，血中マイクロRNAはエqPCR用のForward Primerは，マイクロRNA

クソソーム以外にも多量に存在するだけでなく，

デ ー タ ベ ー ス（miRBase, www.mirbase.org）か

それが生体制御にも関与していることが明らかに

ら牛のマイクロRNAの配列を入手し，配列中のなってきた。したがって，血中マイクロRNAを

ウラシルをチミンに置換して作製した。qPCR用

バイオマーカーとして捉えるには，エクソソームのReverse PrimerはMir-X miRNA First-Strandに限らず血中に存在するマイクロRNA全体を解

Synthesis Kit（タカラバイオ社）付属のmRQ3’

析することが必要である。

Primerを使用した。qPCRは，KOD SYBR qPCR

そこで本研究においては，血中マイクロRNA

Mix（TOYOBO社）を用いて反応液を調製したによる肉用牛の枝肉形質および肉質の診断技術を後， qPCR マ シ ン （StepOne Plus, Applied

開発することを最終目標として，黒毛和種肥育牛

Biosystems社）を用いて行った。また，特異的から採取した血中のエクソソーム画分とそれ以外な増幅を確認するため，qPCR後に温度を0.3℃ごの画分の両者について，マイクロRNAの抽出おとに99℃まで上昇させて融解曲線を作成した。

よび検出方法について検討するとともに肥育初期

2 . 2 肥育終了時における骨格筋および皮下脂と後期における存在量の変動について検討した。

肪のマイクロRNAの抽出とqPCRによる定

さらに，血中で検出されたマイクロRNAについ量て肥育終了時の骨格筋および皮下脂肪での検出を試みた。

京都大学大学院農学研究科附属牧場から京都食肉市場に出荷された黒毛和種去勢肥育牛（ｎ＝５）について，と畜後すぐに頸最長筋および皮下
脂 肪 を 採 取 し， RNA later Tissue Collection© The Ito Foundation

126

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）（Applied Biosystems社）に浸漬して４℃で一晩血中マイクロRNA解析に最適な内部コントロー

保存した後，凍結保存した。次に，QIAzol Lysis

ル に つ い て 検 討 し た 。そ の 結 果 ，qPCR 時 のReagent（QIAGEN 社）に 頸 最 長 筋 サ ン プ ル 25

threshold cycle（Ct）値のばらつきおよび融解曲mgまたは皮下脂肪100 mgを浸し，ビーズ破砕機

線による特異的増幅の確認により，血漿中エクソ（ビーズクラッシャー

μT-12，TAITEC社）を

ソ ー ム 内 の マ イ ク ロ RNA 解 析 に お い て は bta-

用いて破砕した後，miRNeasy Mini Kit（QIAGEN

miR-15ａが内部コントロールとして最適である

社）を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAかことが示された（Fig.１）。また，同様の検討のら の cDNA 合 成 に は， Mir-X miRNA First-

結果，血漿中エクソソーム外のマイクロRNA解

Strand Synthesis Kit（タカラバイオ社）を用い

析においてはbta-miR-15aおよびbta-miR-93がた。qPCRは，Ｕ６を内部コントロールとして上

内部コントロールとして最適であることが示され記の血中エクソソーム内外のマイクロRNAの場

た（Fig.１）。

合と同様の方法を用いて行った。

次に，牛の血中および骨格筋に存在することが報告されている23種類のマイクロRNAについて，

３．結果と考察

黒毛和種去勢肥育牛の血漿中エクソソーム内外に

qPCRによるマイクロRNA解析を行うには，試おける検出の可否について検討した。その結果，料の保存状態，RNAの抽出効率，およびcDNA

血漿中エクソソーム内画分では，11種類のマイク

合成効率の差異等に起因するデータのばらつきをロRNA（bta-miR-16a，18a，19b，26b，27b，補正するために，内部コントロールとなる遺伝子

29c，128，142-5p，451，2373-5p，2478）が特が必要である。しかし，牛の血中に含まれるマイ

異的に増幅されたのに対して，それ以外の12種類

クロRNA解析を行う際の最適な内部コントローのマイクロRNAは，今回のqPCR条件では特異的

ルは確立されていない。そこで本研究では，牛をな増幅が認められなかった。一方，血漿中エクソ

対象とするこれまでの研究において内部コント

ソーム外画分では，13種類のマイクロRNA（bta-

ロールとして使用されたことのあるU6, bta-miR-

miR-16a，18a，19b，26b，27a-3p，27b，29c，

15a，-93，-127を候補として，黒毛和種肥育牛の128，142-5p，451，874，2373-5p，2478）が特

38
37
36
35
34
33
32
31
30
29
28

B

Exosomal fractions

Non-exosomal fractions

38
36
34
Ct valueCt value

A

32
30
28
26

U6

miR-15amiR-93miR-127

24

U6

Fig. 1 Examination of internal controls for plasma miRNA analysis in beef cattle

miR-15amiR-93miR-127

Ct values in qPCR analysis of internal controls in plasma exosomal（A）and non-exosomal（B）fractions arepresented as box-and-whisker plots.

© The Ito Foundation

肉用牛の枝肉形質および肉質の診断マーカーとしての血中マイクロRNAの動態解析

127

異的に増幅されたのに対して，それ以外の10種類の マ イ ク ロ RNA で あ り 脂 質 生 成 に 関 与 す るのmiRNAは，今回のqPCR条件では特異的な増幅

stearoyl-CoA desaturase 1（SCD1）を標的とすが認められなかった。血漿中エクソソーム外画分るとの報告がある３）。今回，血漿中のエクソソー

のみで特異的に増幅されたマイクロRNAはbta-

ム内画分に存在するbta-miR-2478が肥育初期と

miR-27a-3pとbta-miR-874の２種類であり，11

肥育後期の間で変動する傾向が見られたことか

種類のマイクロRNAは両画分において特異的なら，血漿エクソソーム内のbta-miR-2478が骨格増幅が認められた。

筋における脂質形成のバイオマーカーとなる可能

さらに，上記の検討により特異的な増幅が認め性が示唆された。また，bta-miR-26bは歩留まりられたマイクロRNAについて，肥育初期と後期

等級とよく相関するとの報告がある４）。今回，血における血漿中エクソソーム内外におけるマイク

漿中のエクソソーム外画分に存在するbta-miR-

ロRNAの存在量の変動について検討した。血漿26bが肥育初期と肥育後期の間で変動する傾向が中エクソソーム内画分においては，肥育初期と比見られたことから，血漿エクソソーム外のbta-

較して肥育後期により多くのbta-miR-2478が存

miR-26bが歩留まり等級のバイオマーカーとなる

在する傾向が認められた（Fig.２）。一方，血漿

可能性が示唆された。今後，血中マイクロRNA

中エクソソーム外画分においては，肥育初期と比についての経時的かつ網羅的な解析により新たな較して肥育後期により多くのbta-miR-26ｂが存

バイオマーカーの探索を行うとともに，同定され在する傾向が認められた（Fig.２）。

たバイオマーカー候補について多数頭の検討を行

最後に，上記の血漿中に検出されたマイクロう必要がある。

RNAについて肥育終了時の骨格筋および皮下脂４．要

肪での検出の可否を検討した。頸最長筋および皮約

下 脂 肪 に お い て ，共 通 し て ８ 種 類 の マ イ ク ロ

血中マイクロRNAによる肉用牛の枝肉形質おRNA（bta-miR-16a，19b，26b，27a-3p，27b，

よび肉質の診断技術を開発することを最終目標と

29c，451，2478）の特異的な増幅が認められた。

して，黒毛和種肥育牛から採取した血漿中のエク

血漿および頸最長筋においてともに検出された

ソソーム画分とそれ以外の画分の両者についてママイクロRNAの中で，bta-miR-2478は，牛特有

イクロRNAの抽出および検出方法，肥育初期と

miR-24783

p = 0.087

2
1
0No.1 No.2 No.3
Early stagemiR-26b

B
Relative expression

Relative expression

A

No.4 No.5

No.6

4

p = 0.1632
10Late stage

No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6
Early stage

Late stage

Fig. 2 Changes in plasma miRNAs between early and late stages during fatteningExpression levels of miRNAs in plasma exosomal（A）and non-exosomal（B）fractions are presented as fold-change relative to those of animal No.1. Welch’s t-test was used for evaluation of statistical significance.

© The Ito Foundation

128

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

後期における存在量の変動について検討するとと肪において，共通して８種類のマイクロRNAのもに，肥育終了時の骨格筋および皮下脂肪での検特異的な増幅が認められた。今後，血中マイクロ出を試みた。

RNAについて経時的かつ網羅的な解析により新

まず初めに，黒毛和種肥育牛の血中マイクロ

たなバイオマーカーの探索を行い，同定されたバ

RNA解析に最適な内部コントロールについて検イオマーカー候補について多数頭の検討を行う必

討した結果，血漿中エクソソーム内のマイクロ要がある。

RNA解析においてはbta-miR-15aが，また血漿中
エクソソーム外のマイクロRNA解析においては謝

bta-miR-15a お よ び bta-miR-93 が 内 部 コ ン ト

本研究の遂行にあたりご協力頂きました京都大学

ロールとして最適であることが示された。

辞

農学研究科附属牧場の職員の皆様に感謝申し上げま次に，牛の血中および骨格筋に存在することがす。

報告されている23種類のマイクロRNAについて，
黒毛和種去勢肥育牛の血漿中エクソソーム内外における検出の可否について検討した。その結果，
血漿中エクソソーム内画分では11種類のマイクロRNAが，また血漿中エクソソーム外画分では13種類のマイクロRNAが特異的に増幅された。このうち２種類の血漿中マイクロRNAは肥育初期と後期において変動する傾向が認められた。
最後に，上記の血漿中に検出されたマイクロ
RNAについて肥育終了時の骨格筋および皮下脂
肪での検出を試みた結果，頸最長筋および皮下脂文
献１） Bartel, D. P.：MicroRNAs：genomics, biogenesis,
mechanism, and function, Cell, 116, 281～297, 2004.
２）
 梅村創：マイクロRNA解析の臨床応用．生物試料分析, 39, 311～320, 2016.
３）
 Muroya, S., Shibata, M., Hayashi, M., Oe, M.,
Ojima, K.：Differences in Circulating microRNAs
between Grazing and Grain-Fed Wagyu Cattle Are
Associated with Altered Expression of Intramuscular
microRNA, the Potential Target PTEN, and Lipogenic
Genes, PLoS One, 11, e0162496, 2016.
４） Lee, S., Park, S. J., Cheong, J. K., Ko, J. Y., Bong, J.,
Baik, M.：Identification of circulating miRNA
involved in meat yield of Korean cattle, Cell Biology
International, 41, 761～768, 2017.

© The Ito Foundation

129

豚胎児の成長性に影響する生体内因子の探索
Investigation of biological factors associated with growth of pig fetuses

谷口

雅章・中島

郁世・荒川

愛作

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Masaaki Taniguchi, Ikuyo Nakajima and Aisaku Arakawa（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

Due to the long-term effort of breeding scheme for genetic improvement of pig
reproductive traits, the litter size of pigs has been increased. However, that also increased
relatively smaller and weaker fetuses and piglets compared to the other littermates, leading tostillborn and loss of piglets before weaning. In our previous study, we revealed that gene
expression differences in liver tissues affected more on pork meat productivity than skeletal
muscle and subcutaneous adipose tissues during the earlier periods of pig growth. Therefore,
in this study, we focused on investigating potential metabolic pathways which are associatedwith pig fetus development by the trans-omics approach including metabolomics andtranscriptomics. We collected pig fetus liver samples at 63d, 77d, and 98d of gestation. For the
metabolomics, we employed a gas chromatography-mass spectrometry（GCMS）due to its
wide range of target detection features with reproducibility in analysis data. Additionally, weapplied RNA-seq for transcriptomics. The results of our study identified in total 145
metabolites detected by the GCMS. The number of differentially detected metabolites with >2fold threshold between large and small pig fetuses were 9, 11, and 11 in 63d, 77d, and 98d,
respectively. In contrast to the size differences, 27 metabolites were differentially detectedamong time points. Transcriptomics by RNA-seq showed 20, 12, and 16 differentially expressed
genes with >2-fold threshold on 63d, 77d, and 98d, respectively. There are no genes commonly
detected through time points. Based on this research, we are going to elucidate the key
metabolic pathway that is potentially associated with pig fetus development. Candidate
metabolites and genes can be applied as possible biomarkers, for safety and effective fetus
growth by a nutritional fine-tuning of sows during the gestation period, and for genetic
improvement by detecting causative genetic variants and clarifying gene function.

１．目

で，産子間の成長性の差異が顕著となるケースが的増え，成長性の劣る産子が離乳に至らず損耗して豚の生産性向上は，養豚業にとって主要な課題

しまう割合が高まっている。このような子豚きょである。そのため多産系統の造成による産子数のうだい間の成長性の差異は，いつ頃から，どのよ

増産が図られ，一定の効果が見られている。一方

うな要因により引き起こされるのだろうか？

© The Ito Foundation

こ

130

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）の点を解明することができれば，将来的に生涯生同腹内の最大および最小の雌胎児より，肝臓組織

産性の高い母豚の育種改良，妊娠母豚および授乳

約１ｇを採取し，液体窒素中で急速凍結した後，産子の効率的・効果的な飼養管理にも寄与する技－80℃フリーザーにて保存した。凍結した肝臓組術開発につながる。そのため養豚における生産性

織40mgを用いてメタボローム解析，ならびに，の向上への波及効果は高いと考えられる。

100mgを用いてRNA-seq解析に供した。いずれ研究代表者らは，豚品種間および成長期間中のの解析においても３回繰り返し実験を実施し，最採材時期の違いで発現量の異なる遺伝子を骨格

大および最小の胎児間の差の検定は分散分析に筋，肝臓，ならびに皮下脂肪組織を用いて検討しよ っ て 行 い ，得 ら れ た ｐ 値 を False discovery

た 。その結果，若齢時の豚では，肝臓組織でのratio（FDR）補正したＱ＜0.05を有意とした。

１）

遺伝子発現量の顕著な差違が，豚品種間の肉質のメタボローム解析には多種類の代謝物を網羅的差違となって現れる一因となることを示した。

に同定することができる，比較的再現性の高い手

そこで本研究では，豚の胎児期において，最大法であるガスクロマトグラフィー質量分析

および最小の胎児間における肝臓組織中の生体内（GCMS）により，胎児の大小差と関連する代謝因子を網羅的に検討することで，胎児の成長性と物の同定を実施した。豚胎児の凍結肝臓組織を粉関連するものを同定し，その背景となる生物学的砕したものに，内部標準物質として２-isopropyl

プロセスを解明することを試みることにした。豚malic acidを加え，超純水・メタノール・クロロ

胎齢63日，77日および98日において，きょうだい

フォルム前処理液と混和し，遠心分離後の上清をのうち最大および最小の雌胎児より肝臓組織を採乾 固 処 理 し た も の を 誘 導 体 化 し て か ら ，島 津

取した。生体内因子として低分子代謝物および遺QP2020にてGCMS分析を行った。代謝物データ

伝子発現量を検討した。

はSmart Metabolite DatabaseおよびMS-DIALを２．方用いて同定した後，MetaboAnalyst２）を用いて統法

計解析，ならびにエンリッチメント解析を行った。

本研究の材料には，豚胎児の肝臓組織を用い遺伝子発現量の検討には，全RNAを次世代シーた。採材は胎齢63日，77日，および98日の３時点

ケンサーで網羅的に解読するRNA-seq解析によで行った。全胎児の体重測定を行った（Fig.１）。

り実施した。豚胎児の凍結肝臓組織より抽出した

(g)
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

50

60

70

80
Large

90
Small

100

110
(d)

Fig. 1 D ifference in body weight of pig fetus between largest and smallest individuals© The Ito Foundation

131

豚胎児の成長性に影響する生体内因子の探索

全 RNA か ら TruSeq Stranded mRNA Library を

種類，77日齢，ならびに98日齢では，ともに11種作製し，NovaSeq6000（Illumina）により，各個類が検出された。一方，時点間で変動する代謝物

体につき４Gb相当の100塩基ペアエンドリードを

は27種類が検出され，大小差よりも多くの物質

Fastq形式で取得した。シーケンスリードは，が，時間の推移によって変動した。これらの代謝

HISAT2

によりブタリファレンスゲノム

物に関してエンリッチメント解析も行ったが，代（Sscrofa11.1 ： https ： //www.ncbi.nlm.nih.gov/

謝物の数が少なかったためか，有意水準Ｑ＜0.05

genome/84?genome_assembly_id=317145）にマッを満たす代謝物セットは同定されなかった。

３）

を用い

RNA-seq解析において，検出したリード数おた。遺伝子発現量の豚胎児の大小差の比較解析によびクオリティーはそれぞれ十分に高く，遺伝子

は ，edgeR お よ び DESeq2 を 内 包 し た TCC パ ッ発現量の比較に耐えるものであった（Table１）。

ピングし，発現情報取得にはStringTie

４）RNA-seqリードのブタリファレンスゲノムへ

ケージ５）を用いた。

のマッピングならびに発現遺伝子情報の取得によ

３．結果と考察り，63日齢では32転写物，20遺伝子，77日齢では豚胎児肝臓組織のメタボローム解析により，最12転写物，11遺伝子，および，98日齢では29転写

大および最小の胎児間で差違を示した代謝物は，物，16遺伝子が同定された。これら発現遺伝子は，胎齢63日，77日および98日を通じて145物質で豚胎児の大小差により差違を示したものの，時点あった。各胎齢において，大小差を比較した結果，間で共通して検出されたものはなく，大小差に関２倍以上の差違を示した物質数は，63日齢では９わる遺伝子発現量は，胎児の発達段階において独Table 1 Raw data Stats
Sample ID＊1

Total read bases（bp）

Total reads

GC（%）

AT（%）

Q20（%）＊2＊3Q30（%）

63L1
63L2
63L3
63S1
63S2
63S3
77L1
77L2
77L3

4,239,219,874
4,681,564,524
4,070,470,690
5,717,461,126
4,067,365,142
4,212,296,506
4,701,669,584
4,426,511,244
4,367,265,048

41,972,474
46,352,124
40,301,690
56,608,526
40,270,942
41,705,906
46,551,184
43,826,844
43,240,248

52.16952.40352.91052.71052.66752.92552.29652.28152.487

47.83
47.6
47.09
47.29
47.33
47.08
47.7
47.72
47.51

98.22098.34298.39198.26898.28998.23798.21898.33698.31894.77595.07795.19094.91294.99694.85894.78295.04195.024

77L4
77S1
77S2
77S3
77S4
98L1
98L2
98L3
98S1

4,099,881,284
4,803,701,400
4,604,223,774
4,340,854,558
4,225,204,710
4,834,529,428
5,350,648,114
5,325,731,010
6,099,328,592

40,592,884
47,561,400
45,586,374
42,978,758
41,833,710
47,866,628
52,976,714
52,730,010
60,389,392

52.71352.26052.72452.61752.72652.24952.04851.914

47.29
47.74
47.28
47.38
47.27
47.75
47.95
48.09

98.20698.16998.33898.26298.07998.26898.20498.21194.80394.68095.07694.85794.45394.88794.71194.671

98S2
98S3

4,718,090,972
4,672,899,532

46,713,772
46,266,332

52.26952.25352.468

47.73
47.75
47.53

98.19698.062
98.11494.71294.42594.531＊1 Sample ID is defined by fetus age, large or small and serial number.
＊2 Q20（%）and ＊3 Q30（%）denote ratio of bases that have phred quality score of over 20 and 30, respectively.

© The Ito Foundation

132

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

立している可能性が考えられる。また，発現変動に達しない産子の増加が問題となっている。本研

遺伝子に関するエンリッチメント解析を行ったと

究では豚胎児期の中期から後期にかけて，大小差

ころ，66および77日齢において有意水準Ｑ＜0.05の原因となりうる代謝経路を検討すべく，栄養代を満たす遺伝子セットは見いだせなかったが，98

謝の要と考えられる肝臓組織の代謝物および遺伝

日齢においては３変動遺伝子により構成される４

子 発 現 に 関 し て ，GCMS メ タ ボ ロ ー ム お よ び

種類の遺伝子セットが同定された（Ｑ＜0.05）。

RNA-seqにより，それぞれ検討した。これらに本研究により，豚胎児の成長過程において，大より，胎児の大小差に関わる代謝経路は見いだせ

小差を生じさせる要因となりうる代謝物ならびになかったものの，関連しうる候補代謝物ならびに遺伝子の候補を特定することができた。しかしな候補遺伝子を特定した。

がら，エンリッチメント解析では，代謝物セット
および遺伝子セットのいずれも，63日齢ならびに77日齢で有意なものが認められなかった。その原
因は，いずれの時点においても，胎児の大小差間
で差違が同定された代謝物および遺伝子の数が少なかったためと考えられる。今後は，胎児期の後期である98日齢に焦点を絞り，サンプル数を増大させた解析を実施することにより，本研究で見いだした候補代謝物および候補遺伝子が関わる代謝経路の解明に向けた取り組みを継続し，将来的には母豚の栄養制御による胎児の成長に寄与する代謝物の供給の可能性，ならびに，原因候補となる遺伝子の機能解析，遺伝的変異の探索等，育種改
良への適用を検討する。
４．要

約

豚の生産性は育種により多産系統が作出される

文
献１）
 Kojima, M., Nakajima, I., Arakawa, A., Mikawa, S.,
Matsumoto, T., Uenishi, H., Nakamura, Y., Taniguchi,
M.：Differences in gene expression profiles for
subcutaneous adipose, liver, and skeletal muscle
tissues between Meishan and Landrace pigs withdifferent backfat thicknesses, PLoS ONE, 13（9）,e0204135. 2018.
２）
 C h o n g , J . , W i s h a r t , D . S . , X i a , J . ：U s i n g
MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive andIntegrative Metabolomics Data Analysis, Current
Protocols in Bioinformatics, 68, e86, 2019.
３）
 Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg,
S. L.：Graph-based genome alignment andgenotyping with HISAT2 and HISAT-genotype,
Nat Biotechnol, 37, 907～915, 2019.
４）
 Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T.,
Salzberg, S. L.：Transcript-level expression analysisof RNA-seq experiments with HISAT, StringTie
and Ballgown, Nat Protocols, 11, 1650～1667, 2016.
５）
 Su, W., Sun, J., Shimizu, K., Kadota, K.：TCCGUI：a Shiny-based application for differential
expression analysis of RNA-Seq count data, BMC
Research Notes, 12, 133, 2019.

ようになった一方，未熟なため出生あるいは離乳© The Ito Foundation

133

黒毛和種における体型評価部位「肋付き」の客観的評価手法の開発
Research for objective evaluation of forerib conformation of Japanese Beef
Cattle鈴木洋美（北海道立総合研究機構畜産試験場）

Hiromi Suzuki（Hokkaido Research Organization, Agricultural Research Department Animal Research Center）

In Japanese beef cattle, the between the backward part of scapula and forward part of rib
called “forerib” is observed for estimation of combining form of rib and backbone. However, themethod of evaluation of forerib is a visual judgment only and we have no objective
measurement method. Therefore, in this study, we verified the validity of the angle ofdepression at that point of the cow body（forerib angle）as an objective value for theevaluation of forerib. In the 1st study, we measured the forerib angle using the digital level in
66 Japanese black cattle judged body size and shape, and compared forerib angle with thejudged results. As a result, there are correlations between forerib angle and body condition
score（BCS）, and this indicates that forerib angle reflects fatty of cow body. In the 2nd study,
we surveyed the variation factor of forerib angle through measurement of forerib angle andbody measurement in 1,279 Japanese black calves at the calf market and estimation of genetic
parameters. Heritability of forerib angle with the standard error was 0.32±0.10, and thisindicates that forerib angle is a trait that can be improved genetically. In the 3rd study, we
examined forerib angle measurement at an early period in calf through forerib angle
measurement 6 times from 0 to 12 months after birth in 24 calves born at our farm in 2020.
The highest correlation of forerib angle was calculated between 5 mo and 12 mo. This result
suggests we can predict forerib angle at 12 mo through one at 5 mo. Therefore, the forerib
angle should be examined moreover as an objective value for the evaluation of forerib. The
selection using measurements of chest width will lead to improvement of body shape（including forerib angle）of Japanese beef cattle.

１．目に対して採点する（審査成績）。この評価を通し的て発育，産肉，繁殖能力を推定する。既往の報告

黒毛和種では，個体の能力評価や選抜指標の一では，審査成績による選抜改良が有効であり１,２），つとして体型の評価が古くから行われている。黒体測値と枝肉重量および歩留まりなどの枝肉成績

毛和種雌牛の登録審査において，資格を持つ登録との間で高い正の遺伝相関がある３）。また，登録審査員が体測値と牛体の目視評価をもって，体型審査得点と繁殖性との間での相関性も報告されて© The Ito Foundation

134

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

いる４）。

そこで本研究では，肋付きの客観的な評価手法

登録審査における体型の評価項目のうち，産肉の開発を目的として，肋付きの観察部位の角度を能力の評価項目の一つに「中躯（ちゅうく）」が測定し（肋付き角度），それが肋付きの改良に向ある。登録審査員は胸深や胸幅，体長の体測値とけて有効な客観的数値となるかを検討検証した。

ともに特定の部位を目視評価し，体の体積を推定する。大きな体積は産肉性が良いとされる５）。
中躯の目視評価部位のうち，肩甲骨後方部分と

２．方
2.1

法

肋付き角度と審査成績との相関分析

肋骨前方部分の部位は「肋付き」と呼ばれ，肋骨

小型デジタル水準計を用いて，牛体の肩甲骨後と背骨の付着の形状を推定するために観察され方部分と肋骨前方部分の水平線からの角度（Fig.

る。肋骨がより開いた形で背骨と結合している

１）を測定し，肋付き角度とした。調査牛は，北と，体積や内臓容積が大きいと想定されるためで海道内で黒毛和種繁殖雌牛の登録審査を受けた基ある 。肋付きの改良により，肉牛としての能力

本・本原登録受審牛（36頭），および高等登録受の改良が期待されることから，肋付きの評価はき審牛（30頭）とした。肋付き角度と，登録審査時

わめて重要である。しかしながら，同部位の評価に登録審査員が測定した体測値および牛体各部位

手法は目視のみであり，客観的な測定手法が確立の外貌の目視評価との関係について，相関分析をされていない。そのため，肋付きの改良について行った。計算は統計解析ソフトR version 4.0.2６）

調査研究報告はない。

お よ び RStudio version 1.3.1056（RStudio 社）を

５）

ScapulaHorizontal line
Angle ofdepression

Rib
Fig. 1 Measurement of forerib angle（photograph）and the scaled point of forerib angle at cattle

body. That point is angle of depression from horizontal line at back（indicated by arrow）.

© The Ito Foundation

135

黒毛和種における体型評価部位「肋付き」の客観的評価手法の開発

用いて行った。

３．結果と考察2 . 2 肋付き角度における遺伝的パラメータの推定

3.1

肋付き角度と審査成績との相関分析

2019年９月から2021年11月にホクレン十勝地区

基本・本原登録受審牛の肋付き角度は25.4±

家畜市場および南北海道家畜市場に出荷された黒7.1°となり，最大値は40.6°，最小値は10.3°であっ毛和種子牛1,279頭（去勢：724頭，めす：554頭）た。高等登録受審牛では21.7±8.4°となり，最大の肋付き角度を測定した。また，体高，十字部高，値は39.5°，最小値は1.8°であった。いずれも，頻

胸幅，胸囲，および腹囲についても測定を行った。

度分布はおおむね正規分布を描いた。このことか

遺伝的パラメータは，PEST version 4.2.3および

ら肋付き角度は，さまざまな統計的分析が可能な

VCE-6 version 6.0.2を用いて単形質および２形質

数値であると考えられた。

アニマルモデルによるREML法により推定した。

Table１に肋付き角度と体測値および目視評価

対象形質は，体重，体高，十字部高，胸幅，胸囲，成績を含む審査成績との相関係数を示した。有意

腹囲，体重体高比および肋付き角度の８形質としな相関性は認められなかったものの，角度が小さた。変量効果として，個体の直接遺伝効果，農家い，すなわち水平に近いと審査成績が向上する傾（92水準）および残差を取り上げ，母数効果とし向が認められた。また，肋付き角度と栄養度とのて，性（２水準），出生年月（17水準），個体の日間で最も高い負の相関関係が認められ，胸囲およ齢（１次回帰）を取り上げた。血縁遡及個体数は

び胸幅との間でもわずかに負の相関関係が認めら

3,163頭（３代祖まで）であった。

れた。一方で，基本・本原登録受審牛において肋2.3

牛の成長過程における肋付き角度の変動付き角度と体高との間では正の相関が認められた

北海道立総合研究機構畜産試験場で2020年に生が，高等登録受審牛においては認められなかった。

産された黒毛和種雌子牛24頭を用いて，出生時かTable１から，肋付き角度は小さいほど良い評

ら1，3，5，9，12ヶ月齢の肋付き角度を測定した。

価につながると考えられた。したがって，後述の月齢ごとに肋付き角度の相関分析を行い，12ヶ月

さまざまな相関分析において，肋付き角度との間

齢の肋付き角度と高い相関係数を持つ月齢を調べで負の相関関係にあるものは好ましい関係にあるた。

とした。肋付き角度は栄養度と胸囲および胸幅と連動して減少すると考えられた。栄養度や胸幅，

Table １ Correlations between forerib angle（°）and records of judged body shape.
withersheighthipheightbody
length

chest
girth

chest
depth

chest
width

croup
length

hip
width

thurl
width

pin bone
width

bcs

－0.01

－

－0.05

－

＊＊＊－0.55

－0.29

－0.19

0.00

standard
registry

＊0.34

－

－

＊－0.40－0.03

excellent
grade registry

－0.06

－0.07

－0.15

＊－0.41

0.14＊－0.400.01

body
capasity

fore
quarter

middlehindquarter quarter proportion

feet,hoof

impressivness

－0.26

－0.26

－0.23

－0.01

－0.19

0.02

－0.01

－0.01

－0.15

－0.06

－0.10

－0.09

standard
registry
excellent
grade registry－＊＊－0.56

face quality

dairy final score

－0.04

0.15

－0.06

－0.04

－0.16

0.02

－0.29

－0.22

－0.08

－0.11

＊＊＊p<0.001, ＊＊p<0.01, ＊p<0.05© The Ito Foundation

136

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

胸囲の充実は良好な産肉性や飼料利用性が推定さ

Table２に各形質の遺伝率および農家分散割合をれ，審査成績において牛体の体積や前駆および中標準誤差とともに示した。肋付き角度の遺伝率は躯の評価につながる５）。一方で，体高の増加に伴0.32±0.10を示した。体高は比較的高い遺伝率をい肋付き角度も増加し，評価が低下すると考えら示した一方で，体重や胸囲などは中程度の遺伝率れた。過大な体高は正常な発育と見なされず，審を示し，これらは既往の報告と同様な結果であっ査得点の採点においては減点の対象となる 。そた７）。Table３に肋付き角度と各形質との間におけして，これらの結果は肋付き角度と，審査成績にる遺伝相関と農家効果間の相関および表型相関をおける体積や前駆，中躯との間で認められたわず示した。肋付き角度と体高との間で，最も高い正か な 負 の 傾 向 を 支 持 す る と 考 え ら れ た（Tableの遺伝相関が認められた。一方で農家効果間の相１）。審査成績と肋付き角度との間での有意な関関は，肋付き角度と体重や胸幅，胸囲との間で比係性を明らかにするためには，調査頭数を増やす較的大きい負の値を示した。また，肋付き角度とことでより精度の高い検証を行う必要がある。

胸幅との間では，遺伝相関および農家効果間の相５）

3 . 2 肋付き角度における遺伝的パラメータの推定

関いずれにおいても同程度の値となった。
Table２から，肋付き角度は遺伝的な改良が可十勝および南北海道肉用素牛市場における肋付能な形質であると考えられた。また，Table３から，

き角度は21.0±7.7°となり，最大値は43.9°，最小体高の改良が進むと肋付き角度は悪化することが値は1.2°であった。頻度分布は正規分布を描いた。

懸念された。一方で，飼養管理において体重や胸Table 2 Heritability and ratio of farm variance of each traits.1
traitsheritability

ratio of farm varianceratio of residual
variance

forerib angle
body weight
withers height
hip heightchest width
chest girth
stomach girthweight/height ratio

0.32±0.10
0.42±0.13
0.54±0.14
0.52±0.17
0.21±0.08
0.18±0.08
0.56±0.15
0.36±0.11

0.23±0.04
0.22±0.04
0.12±0.04
0.14±0.04
0.27±0.06
0.31±0.05
0.15±0.04
0.26±0.05

0.45±0.09
0.63±0.12
0.34±0.14
0.34±0.15
0.53±0.09
0.51±0.08
0.29±0.14
0.38±0.11

1 estimation value ± standard error
Table 3 Genetic, environmental and phenotypic correlations between forerib angle and each

traits.1

traitsgenetic correlation

environmental
correlation

phenotypic correlationbody weight
withers height
hip heightchest width
chest girth
stomach girthweight/height ratio

0.17±0.23
0.91±0.11
0.80±0.18－0.65±0.15
0.07±0.31
0.18±0.23－0.04±0.24－0.93±0.45－0.31±0.20－0.36±0.19－0.79±0.09－0.96±0.39－0.74±0.10－0.95±0.03

－0.37
0.17
0.11
－0.51
－0.47
－0.28
－0.49

1 estimation value ± standard error© The Ito Foundation

黒毛和種における体型評価部位「肋付き」の客観的評価手法の開発

137

幅，胸囲の改善に取り組むことで肋付き角度も改されていることを意味する。したがって，肋付き善できると考えられた。

角度を生産現場で活用するには，調査頭数を増や3.3

牛の成長過程における肋付き角度の変動

Fig.２に０ヶ月齢から12ヶ月齢までの肋付き角すほか，栄養度の差が少ない牛群において調査す
るなど，さらなる検討が必要である。

度 の 推 移 を 示 し た 。５ ヶ 月 齢 の 肋 付 き 角 度 は

胸幅の改良が肋付き角度の改良につながること

34.1°±5.6°となり，他の全月齢と有意差が認めらが示唆された（Table３）。胸幅と体高，または十れた。肋付き角度の推移は，出生時から５ヶ月齢

字部高との間では負の遺伝相関を示した（それぞをピークに増加し，以降は減少した。12ヶ月齢にれ－0.26±0.24，－0.14±0.29）ものの比較的小さ

おける肋付き角度と他の月齢での肋付き角度とのい。一方で，胸幅と胸囲や体重との間では正の遺相 関 で は ，５ ヶ 月 齢 と の 間 で 最 も 高 く な っ た

伝 相 関 を 示 し た（そ れ ぞ れ 0.63 ± 0.17 ，0.57 ±（0.64 p＜0.001）。したがって，５ヶ月齢の時点で0.16）。したがって，遺伝および飼養管理のいず

肋付き角度の評価は可能と考えられた。

れの面においても，胸幅の改良を進めることで，黒毛和種の体型評価において，目視評価の手法

他の形質に悪影響を及ぼすことなく，肋付き角度に焦点を当てた研究はほとんどなく，本研究ではも同時にゆるやかに改良を進めることができると初の試みとして角度によるアプローチを行った。

考えられる。
肋付き角度が栄養度との間で明確な相関性が認であり，遺伝的な改良効果があることが明らかとめられたことから，肋付き角度が産肉性の評価になった。一方で，肋付き角度は審査成績におけるつながる可能性が示唆された。デジタル水準計で体積，前駆，中躯との間でわずかに負の関係の傾の測定部位は第６-７肋骨周囲に相当し，これは向があるものの，栄養度との間で有意な相関性を

枝肉格付けの際の評価対象となる部位でもある。

持つことが明らかとなった。これは，肋付き角度

体型測定値と枝肉成績の分析は向井らの報告があには「肋付き」だけでなく，牛の太り具合も反映

り，体測値と枝肉重量や歩留まりなどとの遺伝相

010Angle of depression（°）
20
30
40

その結果，肋付き角度は遺伝の影響を受ける形質

０mo

１mo

３mo

５mo

９mo

12mo

Fig. 2 Changes of forerib angle during growing period. Forerib angle wasmeasured from 0 month after birth（mo）to 12 mo.

© The Ito Foundation

138

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

関は比較的高く，体型による選抜の改良効果は大

相関は５ヶ月齢との間で最も高くなったことかきいとしている 。しかし，ロース芯面積と関連

ら，５ヶ月齢において肋付き角度の評価が可能と性のある体測値は少ない３）。肋付き角度は５ヶ月考えられた。以上の結果から，体型評価における齢で評価可能であり，ロース芯面積改良のための「肋付き」の評価指標としては，肋付き角度はさ選抜指標として有効である可能性がある。したらなる検討が必要であるが，胸幅を選抜指標とすがって今後，枝肉成績と肋付き角度の関連性の調ることで肋付き角度も含めて，体型の改良につな査が望まれる。

がると考えられた。

３）

４．要

約

黒毛和種では，肩甲骨後方部分と肋骨前方部分の部位は，「肋付き」と呼ばれ肋骨と背骨の付着の形状を推定するために観察されるが，同部位の評価手法は目視のみであり，客観的な測定手法が確立されていない。そこで本研究では，同部位の水平からの角度（肋付き角度）が評価に有効な客観的数値となるかを検証した。研究１では登録審査受審牛66頭（基本36頭，高等30頭）を対象に，
デジタル水準計を用いて肋付き角度を測定し，肋付き角度と審査成績を比較した。その結果，肋付き角度と最も相関性が高いのは栄養度であった。
研究２では，肉用素牛市場において黒毛和種子牛
1,279頭（去勢：724頭，めす：554頭）の測定を行い，遺伝的パラメータを推定した。肋付き角度の遺伝率は0.32±0.10を示し，遺伝的な改良が可能な形質であると考えられた。研究３では，黒毛和種雌子牛24頭に対して，経時的に肋付き角度の測定を行った。12ヶ月齢における肋付き角度との文
献１） 佐々木義之，祝前博明，向井文雄，並河澄：日本
畜産学会報, 47（6）,359～370, 1976.
 佐々木義之，祝前博明，向井文雄，並河澄：日本
２）
畜産学会報, 47（6）,371～377, 1976.
３） 向井文雄，野村英明，福島豊一：神戸大学農学部
研究報告，15巻２号, 437～444, 1983.
 鹿島聖志，森井泰子，酒井稔史，杉本昌仁，藤川朗，
４）
草刈直仁，田村千秋，田川広美：「繁殖性を考慮した黒毛和種の交配計画法」平成23年度北海道農業試
験会議（成績会議）資料，８～11，（地独）北海道
立総合研究機構畜産試験場，（社）北海道酪農畜産協会，北海道，2012.
５） 公益社団法人全国和牛登録協会，一般社団法人全
国肉用牛振興基金協会：令和２年度和牛入門ゼミ
ナール和牛の登録審査と見方，（3），17～21，公益社団法人全国和牛登録協会，2020.
 Douglas Bates, John Chambers, Peter Dalgaard,
６）
Robert Gentleman, Kurt Hornik, Ross Ihaka, Tomas
Kalibera, Michael Lawrence, Friedrich Leisch, Uwe
Ligges, Thomas Lumley, Martin Maechler, Martin
Morgan, Paul Murrell, Martyn Plummer, Brian
Ripley, Deepayan Sarkar, Duncan Temple Lang,
Luke Tierney, Simon Urbanek：R Core Team
（2020）：https：//www.R-project.org/.
 鹿島聖志，米川武，遠藤哲代，佐藤幸信，山本裕介，
７）
藤川朗：令和２年肉用牛研究会報，第108号，33,
2020.

© The Ito Foundation

139

遺伝子情報を用いた黒毛和種の枝肉形質と脂肪酸組成に及ぼす系統と遺伝様式の影響の解明
Investigation of sire lines and genetic transmission modes on carcass traits
and a fatty acid trait in Japanese Black cattle using genomic information

広岡

博之・井上

慶一＊・竹田将悠規＊・井上喜信＊＊（京都大学大学院農学研究科，＊家畜改良センター，＊＊鳥取県畜産試験場）

Hiroyuki Hirooka, Keiichi Inoue＊, Masayuki Takeda＊ and Yoshinobu Inoue＊＊（Kyoto University, ＊National Livestock Breeding Center, ＊＊Tottori Prefectural Livestock Research Center）

Historically, several divergent sub-populations with sire lines have played important roles
as suppliers of breeding animals to the Japanese Black breed. In this study, the effects of threesire lines（Kedaka, Tajima and Fujiyoshi line）and genetic transmission modes on five carcass
traits（carcass weight, rib eye area, rib thickness, subcutaneous fat thickness and beef
marbling standards（BMS））and a fatty acid trait（oleic acid）were investigated using
conventional pedigree and genomic breeding values. The transmitted modes （genetic
contributions of sire and dam）were quantitatively represented based on path coefficients（standardized regression coefficients）of sire and dam breeding values on progeny breedingvalues. Phenotypic and genomic information of 1,901 fattening progeny and genomic
information of their parents were used to estimate both breeding values（pedigree breedingvalues from BLUP method and genomic breeding values from GBLUP method）. There weresignificant differences among sire lines for carcass weight in both breeding values；Kedaka line
had largest breeding values of carcass weight and Tajima line had smallest ones of carcass
weight. For BMS, only significant difference was obtained for pedigree breeding values andTajima line was highest. For the genetic transmission modes, there was no difference for all
traits when genomic breeding values were used, but the larger genetic contribution of dam
was obtained for BMS when pedigree breeding values were used. The genetic contributions ofparents varied among sire lines in the same trait；for instance, with respect to rib eye area,larger genetic contribution of sire was in Kedaka line, larger genetic contribution of dam wasin Fujiyoshi line and equal genetic contribution in Tajima line, when genomic breeding values
were used. It was suggested that each sire line in the Japanese Black breed may have different
type of non-Mendelian transmission modes and further research considering the difference ofsire line would be needed to investigate complex genetic mechanisms of inheritance of thebreed.

© The Ito Foundation

140
１．目

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）との関連性を解明できるならば，黒毛和種の遺伝的様式の解明と生産現場に対する貢献がきわめて大わが国の黒毛和種には，明治時代に短期間に県きいと期待できる。

別地域別に異なる外国種が交雑された過去があ

そこで本研究の目的は，黒毛和種の枝肉５形質

り，その結果，地域的な多様性が生じ，1944年に（枝肉重量，BMSナンバー，ロース芯面積，バラ

１つの品種と認定された後でも，同一品種内で系の厚さ，皮下脂肪厚）と脂肪酸組成の表現型デー統が残されてきた。実際，現在でも家畜改良事業

タと従来の血統情報および遺伝子型情報（父，

団では黒毛和種種雄牛が父系統別に主要５系統と母，本牛）を用いて，これらの形質の遺伝伝達様希少２系統に分類され，全国各地の生産者に精液式を解明し，さらに系統とこれらの形質との関連が供給されている。

性を遺伝子レベルで明らかにすることである。

他方，黒毛和種の国や道府県レベルでの育種改
良では，20世紀後半からアニマルモデルBLUP法

２．方法

を用いた育種価評価システムが確立され，雌雄と2.1

も種牛の遺伝的改良が大いに進んできた。した本研究では，協同研究機関である鳥取県と家畜がって，系統の考え方は前時代の遺物で不確かな

改良センターの枝肉形質（BMSナンバー，枝肉

ものと認識され，現代の家畜育種学では学術的に重量，ロース芯面積，バラの厚さ，皮下脂肪厚）

は受け入れがたいものと考えられてきた。しかし

および鳥取県の脂肪酸組成（オレイン酸）の表現

ながら，生産者や流通業者の間では，系統を重視

型値（観測値）のデータを測定，収集し，そのする風潮が現在でもあり，特に繁殖農家が自分のデータに関連する血統情報を整理して，以下のさ持つ雌牛への交配相手の種雄牛の選択や肥育農家

まざまな分析に利用できるように加工・編集した。

の子牛市場での肥育素牛の購入の意思決定には，

鳥取県内および（独）家畜改良センターで肥育系統が重視される傾向が続いている。現代育種学された黒毛和種肥育牛1,908頭について，（公社）の理論では，その前提としては，形質はメンデル

日本食肉格付協会により格付された枝肉格付成績

遺伝様式に従って父と母の遺伝子は等しく1/2ず（枝肉重量，ロース芯面積，バラの厚さ，皮下脂

つ伝わると仮定されている。しかし，もし黒毛和肪厚，歩留基準値，BMS）を得た。また，これ種の肉質に関連する遺伝子が特殊な遺伝様式で伝ら肥育牛のうち，鳥取県内で肥育された個体1,000

達されているのであれば，これまでの理論は不完頭については，ガスクロマトグラフィー（島津製全となる。実際，最近，申請者らのグループは黒作所，GC-2014）を用い，Nogi et al.２）の報告に

毛和種のBMSナンバー（霜降り）やロース芯面

記載する手法によりオレイン酸割合を算出した。

積が，父と母の遺伝子の伝達割合が異なるゲノム

血統情報については，これら肥育牛より５代祖

インプリント遺伝子の関与を示唆する結果を得てさかのぼった血統情報8,312頭（肥育牛1,908頭含いる 。

む）を血統育種価の予測に用いた。なお，オレイ

１）

表現型データと血統情報の収集

近年，わが国の黒毛和種の遺伝子情報（SNP型

ン酸については鳥取県で飼育された表現型値を持情報，ゲノム情報）が蓄積され，ゲノム育種が実

つ肥育牛のデータのみを分析に用いたため，デー用化されつつある。このような遺伝子情報によっ

タ数がかなり少なくなったため（肥育牛743頭），て黒毛和種の種雄牛の系統と肉質などの産肉形質

枝肉形質とは別に分析して補足分析として最後に© The Ito Foundation

遺伝子情報を用いた黒毛和種の枝肉形質と脂肪酸組成に及ぼす系統と遺伝様式の影響の解明

ゲノム育種価は，上記ゲノム関係行列を用いて示すことにした。
2.2

141

AI-REML法により推定した遺伝的パラメータを

遺伝子情報の収集および処理上記肥育牛とその両親から，脂肪，血液，また用いて，BLUPF90プログラム４）によりGBLUP法

は毛根のサンプルを採取し，DNA抽出処理後にで予測した。ただし，ゲノム育種価予測の際には，

SNP遺伝子型を判定した。SNP遺伝子型判定を行

肥育牛の両親のゲノム育種価も得るため，肥育牛

う チ ッ プ は ，Bovine GGP LD v4.0 を 用 い た 。

の両親（1,743頭）のSNP情報を肥育牛のSNP情SNP情報を用いてクオリティコントロール（QC）

報に結合させて作成したゲノム関係行列を用いた。

を実施し，個体自身のコールレートが95％未満の2.4

個体を除外した。判定されたSNPのうち，常染色わが国の黒毛和種の系統は兵庫県美方郡生まれ

体（29本）に位置づけられているSNPについて，の田尻を祖先とする田尻系，同じく美方郡生まれ

SNP自身のコールレートが95％以上，マイナーアの茂金波を始祖とする茂金系，岡山県生まれの第リル頻度が１％より大きく，ハーディ・ワインベ

６藤良を祖先とする藤良系，鳥取県生まれの気高

ルク平衡が10 より大きい条件を満たすSNPを抽を祖先とする気高系などがあるが，本研究では，出した。これらのQC後の個体について，651頭の系統は父系のみをさかのぼった始祖牛で決定し肥育牛のリファレンス集団を用いてBeagle3でた。田尻系と茂金系をまとめて但馬系とし，但馬

34,481SNPsにインピュテーションを行った。

系，藤良系，気高系の３系統の種雄牛とその後代

－4

2.3

系統の設定

について分析した。その結果，種雄牛数は233頭，

血統育種価とゲノム育種価の予測

血統育種価とゲノム育種価を予測するために，後代肥育牛数は1,901頭となった。

上記血統情報とSNP情報をそれぞれ用いて単形質

2.5のアニマルモデルを想定して遺伝的パラメータを本研究では，得られた種雄牛の後代肥育牛につ推定した。モデルに含めた母数効果は，肥育牛のいて血統育種価とゲノム育種価に関して各枝肉形性（２水準），格付年（13水準），格付月（12水質間の相関を全体データと系統別に算出した。さ準），出荷市場（５水準）および格付月齢の１次らに，父と母の育種価が子に伝達する遺伝的影響

および２次回帰とし，変量効果は個体および残差の大きさを評価する指標として，Wright５,６）が開とした。なお，血統情報を用いた遺伝的パラメー

発したパス係数（標準偏回帰係数）を用いた。すタの推定には，上記血統情報から作成した分子血

なわち，この育種価（EBV０）に対する父の育種縁行列を，SNP情報を用いた遺伝的パラメータの価（EBVs）と母の育種価（EBVd）の重回帰式

推 定 に は ，上 記 肥 育 牛 の み の SNP 情 報 か ら

EBVo＝b0＋bs EBVs＋bd EBVd

VanRadenより，父と母のパス係数（βsとβd）を３）の方法で作成したゲノム関係行列を用 い て ，AIREMLF90 プ ロ グ ラ ム

４）に よ り AI-REML法で推定した。
血統育種価は，上記分子血縁行列を用いてAIREML法により推定した遺伝的パラメータを用いて，BLUPF90プログラム

βs＝bs
βd＝bd

育種価の分析

σEBVs
σEBVo

σEBVd
σEBVo

によりBLUP法で予として推定した。ここでσEBVo ，σEBVs ，σEBVαはそ測した。この結果，肥育牛とその両親を含む血縁

れぞれ後代牛，その父と母の育種価の標準偏差で個体すべての血統育種価を得た。

ある。この父と母のパス係数を比較することで，４）© The Ito Foundation

142

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

父と母から遺伝的影響度の大きさが評価できる。

分な研究が必要と推察された。
後代肥育牛に関する父の系統別のゲノム育種価

３．結果および考察と血統育種価を見ると（Table１の下部），ゲノム

Table１は種雄牛と後代肥育牛の枝肉形質に関

育種価については後代肥育牛の表現型値とSNP値

する系統別のゲノム育種価と血統育種価を示したに基づいて育種価が推定されているため，すべてものである。Table１の上部に書かれた種雄牛のゼロとなっていることがうかがえる。それに対し育種価については，ゲノム育種価については，枝て，血統情報に基づく育種価は血統をさかのぼっ

肉重量に関しては気高系が最も大きく，但馬系がた基礎集団の育種価がゼロと仮定されているの最も小さかった。また，バラの厚さは同じく気高で，現集団における血統育種価は正の値となって系，藤良系，但馬系の順で小さくなり，皮下脂肪いる。すべての形質についてゲノム育種価も血統厚については藤良系が最も厚く，但馬系が最も薄

育種価も父の系統の効果は有意で，すべての形質かった。BMSナンバーについては有意差が認めに関して父が気高系の個体がすぐれており，またられなかったものの但馬系が最も高く，藤良系が枝肉重量，ロース芯面積，バラの厚さのような増最も低かった。

体に関する形質は但馬系が最も劣っていた。

他方，血統育種価については，ゲノム育種価のBMSナンバーについては，後代肥育牛に関して場合とほぼ同じ結果が得られているが，BMSナ

は肉質系である但馬系よりも増体系の気高系がンバーについては血統の違いによって有意性が認勝っていた。Table１の種雄牛の育種価（上部）められ，肉質系である但馬系が最も高かった。こと後代肥育牛の育種価（下部）を比較すると，いのことから，血統情報から得られた従来の育種価

ずれの形質に関しても後代肥育牛の育種価のほうとその育種価に対する系統の違いの影響は，ゲノが望ましい方向に高くなっており，これは前世代

ム情報に基づく遺伝子レベルの分析では必ずしもか ら の 育 種 改 良 の 効 果 と 考 え ら れ る が ，特 に一致するとは限らず，その理由については今後十

BMSナンバーについては気高系の改良が進んだ

Table 1 Means of genomic and pedigree breeding values for carcass traits
Genomic estimated breeding valueNo.
animals

Carcass
weight（kg）

Rib eye
area
（cm2）

Rib
Subcutaneous
thickness fat thickness
（cm）
（cm）

Pedigree estimated breeding value
BMS no.

Carcass
weight（kg）

Rib eye
area
（cm2）

Rib
Subcutaneous
thickness fat thickness
（cm）
（cm）

BMS noSire
All data

233－8.396－1.149－0.1050.004－0.283－0.716

2.112

0.151

0.043

1.259

Sire line
Kedaka72

18.267a－0.5640.1690a0.085a－0.26422.501a2.416

0.403a0.098a1.268aTajima109－33.196b－1.263－0.330c－0.116b－0.157－22.708b2.331－0.068b－0.060b1.414abFujiyoshi

54

6.888a－1.699－0.009b0.141a－0.57013.409a1.254

0.262a0.183a0.929b

1901

0.022

－0.007

0.000

0.000

0.002

6.134

3.338

0.240

0.036

1.587

Progeny
All data
Sire line
Kedaka779

9.097a0.856a0.120a－0.038b0.183a15.103a4.150a0.357a－0.010b1.753aTajima734－10.639c－0.275c－0.130c－0.021b－0.065b－4.546c

3.071b

0.106c0.025b

1.529b

Fujiyoshi

388

1.971b

－1.233b0.008b

0.118a－0.235b8.454b

2.164c0.262b0.151a1.370bMeans with different letters differ significantly among sire lines（p<0.05）
BMS no is beef marbling score which is represented by the 12-point scale with a minimum value of 1 and a maximum value of 12© The Ito Foundation

遺伝子情報を用いた黒毛和種の枝肉形質と脂肪酸組成に及ぼす系統と遺伝様式の影響の解明

ことがうかがえる。
広岡と青木

143

できると考えられる。

は，本研究と異なる集団に関する全体のデータについては，ゲノム育種価と血統

枝肉成績のデータを用いて父の系統別に表現型値

育種価の相関（対角下線）は0.845（ロース芯面を比較したところ，枝肉重量については気高系が積）から0.912（枝肉重量）の範囲にあった。こ

最も大きく，次いで藤良系となり，肉質系であるの関係を系統別に見ると，両育種価間の相関は枝

田尻系（本研究では但馬系と定義）が最も小さ

肉形質，バラ厚，皮下脂肪厚については藤良系がく，他方，BMSナンバーについては田尻系が最最も高く，BMSナンバーについては但馬系が最も高いと報告している。この結果は，本研究におも高かった。各形質に関するゲノム育種価間の相ける血統育種価の結果とよく一致していた。

関（上三角）を見ると，枝肉重量とバラ厚の相関７）Table２は種雄牛に関する形質ごとの育種価のは藤良系で相対的に低く，枝肉重量とBMSナン

相関を全体と系統別に示したものである。育種価

バーの相関は気高系と但馬系ではほぼゼロであっ間の相関は遺伝相関とは異なるものの，形質間のたのに対して，藤良系では中程度（0.369）であっ遺伝的能力の関係を示す指標として用いることがた。また，BMSナンバーと皮下脂肪厚との相関は，Table 2 Correlations of sire genomic and pedigree estimated breeding values for the same traits（on diagonal）

and sire genomic estimated breeding values among carcass traits（above diagonal） and sire pedigree
estimated breeding values among carcass traits（below diagonal）

All data
Carcass weight（kg）
Rib eye area（cm2）
Rib thickness（cm）
Subcutaneous fat
thickness（cm）
BMS noKedaka line
Carcass weight（kg）
Rib eye area（cm2）
Rib thickness（cm）
Subcutaneous fat
thickness（cm）
BMS noTajima line
Carcass weight（kg）
Rib eye area（cm2）
Rib thickness（cm）
Subcutaneous fat
thickness（cm）
BMS noFujiyoshi line
Carcass weight（kg）
Rib eye area（cm2）
Rib thickness（cm）
Subcutaneous fat
thickness（cm）
BMS noCarcass weight

Rib eye area

Rib thickness

Subcutaneous fat
thickness

BMS no

0.912
0.135
0.779

0.245
0.845
0.243

0.798
0.280
0.877

0.415
－0.1310.378－0.005
0.608
0.073

0.422

－0.217

0.343

0.898

－0.031－0.054

0.623

0.075

－0.053

0.893

0.807
0.239
0.686

0.292
0.863
0.190

0.696
0.182
0.813

0.248
－0.297
0.441

0.035
0.690
0.171

0.346

－0.310

0.419

0.897

－0.256－0.009

0.762

0.124

－0.261

0.866

0.856
0.218
0.725

0.322
0.831
0.408

0.738
0.385
0.819

0.355
0.031
0.197

－0.0490.613－0.0070.373－0.091

0.188

0.849

－0.104－0.089

0.591

0.122

－0.089

0.901

0.876
0.151
0.468

0.237
0.843
0.298

0.574
0.401
0.852

0.399
－0.148
0.253

0.369
0.507
0.389

0.378

－0.214

0.221

0.931

0.477

0.349

0.458

0.318

0.447

0.902

© The Ito Foundation

144

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

気高系では－0.256，但馬系では－0.104，藤良系

やInoueら８）は，従来の血統情報と表現型値のみ

では0.447と大きく異なり，血統育種価（下三角）を用いる統計育種学的手法から，BMSナンバーに関しても同様の傾向があった。また，ロース芯に関しては母由来の遺伝子の効果が大きいことを面積と皮下脂肪厚との相関も系統によって大きく示し，BMSナンバーについては母方ゲノムイン

異なっていた。このことから，種雄牛の系統にプリント遺伝子の関与があるのではないかと考察

よって一方の形質の改良が他方の形質の改良に及した。本研究の結果でも血統育種価に関してはこぼす影響に差があり，選抜しようとする種雄牛のれらの結果を裏付けるような結果が得られた。し系統を考慮した育種が必要と考えられた。

かしながら，ゲノム情報を用いた分析ではそのよ

表現型値を持つ肥育牛に対する父と母からの遺うな結果が得られず，今後，ゲノム情報を用いて伝的伝達の寄与度の違いはパス係数（標準偏回帰

ゲノムインプリント遺伝子の影響を証明する方法係数）によって表すことを考え，その結果を示しの確立が必要であると考えられた。

たものがTable３である。一般的なメンデル遺伝

次に系統別に見ると，ゲノム育種価では気高系を想定する場合，父の育種価のパス係数と母の育はロース芯面積で父方の遺伝的寄与度が大きい

種価のパス係数は等しくなると考えられ，両者にが，その他の形質については父母間差は小さかっ

差があれば，それが遺伝的伝達能力の寄与度の差た。しかし，但馬系は枝肉重量とバラの厚さで母と見なすことができる。全体のデータについて方の遺伝的寄与度が大きく，藤良系では枝肉重は，ゲノム育種価を用いた場合，いずれの形質も量，ロース芯面積，バラ厚，BMSナンバーで母

父と母の育種価のパス係数間の差は小さく，メン方の遺伝的寄与度が大きく，皮下脂肪厚で父方のデル遺伝と仮定して誤りではないと判断できた。

遺伝的寄与度が大きかった。このように特に藤良ところが血統育種価に関しては，BMSナンバー

系の種雄牛で遺伝的伝達に父母間差があり，今について母の育種価の標準偏回帰係数（0.681）

後，このような結果が得られた理由についての解は父からのもの（0.490）よりも0.1以上大きく，明が必要と考えられた。同じく，血統育種価に関母からの遺伝的伝達の寄与度が父よりも大きいのしても形質によって系統間で遺伝的伝達に差異がではないかと考えられた。最近，Okamotoら認められた。

１）

Table 3 Path coeffients（standerized regression coefficients）from sire or dam to progeny for carcass traits
Subcutaneous fat
thickness

Carcass weight

Rib eye area

Rib thickness

Sire

Sire

Dam

Sire

Dam

Sire

Dam

Sire

Dam

0.571

0.532

0.607

0.565

0.616

0.529

0.546

0.568

0.629
0.521
0.415

0.498
0.559
0.612

0.514
0.509
0.426

0.553
0.607
0.624

0.595
0.587
0.618

0.515
0.564
0.492

0.559
0.538
0.425

0.574
0.550
0.614

0.598

0.618

0.616

0.650

0.644

0.633

0.490

0.681

0.643
0.551
0.474

0.602
0.627
0.683

0.521
0.523
0.461

0.651
0.691
0.698

0.633
0.611
0.618

0.632
0.646
0.632

0.489
0.489
0.405

0.681
0.635
0.692

Dam

Genomic estimated breeding value
All data
0.567
0.549
Sire Line
Kedaka0.458
0.490
Tajima0.437
0.628
Fujiyoshi
0.463
0.612
Pedifree estimated breeding value
All data
0.674
0.645
Sire Line
Kedaka0.555
0.614
Tajima0.471
0.727
Fujiyoshi
0.571
0.700

© The Ito Foundation

BMS no遺伝子情報を用いた黒毛和種の枝肉形質と脂肪酸組成に及ぼす系統と遺伝様式の影響の解明

145

本研究では，これまでにない以下の３つの視点

第３は，父と母から子へのパス係数を用いて，から分析を行った。まず第１に，近年一般的に用父母の遺伝的伝達能力の寄与度の違いを比較した

いられているss-GBLUP法９,10）ではなく，GBLUP点である。筆者らの知る限り，父と母，およびそ法と従来のBLUP法を用いて，得られた推定育種の後代のSNP情報がそろっているようなデータは価の比較を行った。ss-GBLUP法では，従来の血家畜においてはほとんどなく，さらにパス係数で統情報による分子血縁行列（Ａ行列）とゲノム情親から子への遺伝的伝達様式を表した研究は世界報からなるゲノム関係行列（Ｇ行列）の融合したで初めての試みといえる。このような新規の手法

Ｈ行列を用いて混合モデル方程式を構築しているを用いることで，これまでメンデル遺伝と決めつが，Ａ行列とＧ行列はそれぞれベースとしている

けていた家畜のさまざまな形質の遺伝伝達方式を集団が異なり，前者は血統をさかのぼって到達す

再確認できる可能性を示せたことが，本研究の大る始祖個体をベース集団としているのに対して，きな貢献といえる。

Ｇ行列では表現型値とゲノム情報を収集した現集団をベース集団としているため，これらの異なる

４．補足分析

行列を融合するために経験的な重みづけを設定せ

本研究では，脂肪酸組成として現在，牛肉のおざるを得なくなっている。本研究では，血統情報

いしさに関連するものとして注目されているオレとゲノム情報との相違による推定育種価の違いを

イン酸含量も分析対象形質とした。分析方法とし

調 べ る た め に あ え て ss-GBLUP 法 で は な く ，ては枝肉形質と同様で，得られた育種価のうち表BLUP法とGBLUP法の両方を用いることにした。

現型値を持つ個体のみを選んだため，種雄牛頭数

第２の点は，これまで学術的にはほとんど検討

は52頭，後代肥育牛数は743頭となった。

されてこなかった黒毛和種の系統について科学的Table A１は，オレイン酸含量に関する種雄牛な視点からその影響を検討した。わが国では閉鎖と表現型値を持つ肥育牛のゲノム育種価と血統育育種を実施している兵庫県以外の道府県では，種種価の平均値を示したものである。種雄牛のゲノ

雄牛の精液は広域で流通しており，黒毛和種におム育種価については系統間差が認められ，気高系

ける系統は，いわゆる他の品種における系統とは

種雄牛のオレイン酸含量が最も高かった。また，異なり，系統と言っても父方と母方が一つの系統

後代肥育牛の育種価はいずれも父の系統が気高系で固まっているケースはまれである。しかしそれであるものが最も高く，但馬系が最も低かった。

にもかかわらず，生産現場では種牛の交配は系統

このことから，オレイン酸含量に関しては肉質系を重視して行われていることが多く，遺伝学的にである但馬系種雄牛の後代肥育牛が最も劣ることはあいまいで，科学的根拠はないと考えられてきが示唆された。

た。ところが，本研究のTable１で示したように，

オレイン酸含量に関する父と母のパス係数は

たとえば増体系である気高系の種雄牛の推定育種

Table A２に示すとおりである。父と母の育種価

価は枝肉重量やロース芯面積，バラの厚さが大きのパス係数は全体のデータでは，母からの遺伝伝

く，生産現場で言われていることとよく一致し達の貢献度は大きく，さらに父の系統別に見るとた。このような結果から，今後このような生産者

父が気高系と藤良系の場合，母からの遺伝的伝達の知恵から生み出された知見を最先端の手法で解の寄与の大きいことが示された。一方，血統育種

明するような研究の必要と考えられた。

価については全体のデータの分析では，父と母の© The Ito Foundation

146

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table A1 Means of genomic and pedigree breeding values for oleic acidNo. animals

Genomic breeding value

Pedigree breeding value

52－0.197－0.174

Kedaka20

0.251

0.353aTajima21－0.437－0.531b

Fujiyoshi

11－0.554－0.449ab

All data

743－0.0050.007

Sire line
Kedaka410

0.158aTajima203－0.285b0.172a－0.294b

Fujiyoshi

130－0.081ab－0.066b

Sire
All data
Sire line

Progeny

Means with different letters differ significantly among sire lines（p<0.05）

Table A2 Path coeffients（standerized regression coefficients）

from sire or dam to progeny for oleic acid

Genomic estimated breeding value
All data
Sire Line
KedakaTajimaFujiyoshi
Pedigree estimated breeding value
All data
Sire Line
KedakaTajimaFujiyoshi

Sire

Dam

0.511

0.623

0.346
0.639
0.341

0.643
0.583
0.666

0.661

0.688

0.460
0.727
0.471

0.752
0.583
0.738

パス係数はほぼ等しかった。しかし，父の系統別たしてきた。本研究では，父系統と遺伝伝達様式に見るとゲノム育種価の場合と同じく，父が気高の違いが５つの枝肉形質（枝肉重量，ロース芯面

系と藤良系では母からの遺伝伝達が強く，他方，

積，バラの厚さ，皮下脂肪厚，BMSナンバー）父が但馬系では父からの遺伝伝達の強いことが示と脂肪酸組成のうちのオレイン酸に及ぼす影響された。オレイン酸含量においてはこのように系を，従来の血統育種価とゲノム情報に基づくゲノ

統によって遺伝伝達の様式が大きく異なり，今ム育種価を用いて検討した。遺伝伝達様式は，後後，オレイン酸の遺伝的分析には系統も考慮する

代の育種価に対する父と母の育種価のパス係数

必要性が示唆された。

（標準偏回帰係数）に基づく遺伝的寄与度によっ

５．要て定量的に表した。1,901頭の肥育後代牛の表現

約

型値とゲノムデータとその父と母のゲノム情報を歴史的に，黒毛和種のいくつかのサブ集団

用いてBLUP法から血統育種価を，GBLUP法か（父系統）は種畜の供給源として重要な役割を果

らゲノム育種を推定した。どちらの育種価を用い© The Ito Foundation

遺伝子情報を用いた黒毛和種の枝肉形質と脂肪酸組成に及ぼす系統と遺伝様式の影響の解明た時も枝肉重量において父の系統間に差があり，
気高系が最も大きく，但馬系が最も小さかった。
BMSに関しては，血統育種価を用いた時のみに有意な差が得られた。遺伝伝達様式については，
ゲノム育種価を用いた場合，いずれの形質においても有意な差は認められなかったが，血統育種価を用いた時にはBMSで母の遺伝的寄与が父よりも大きかった。また，遺伝的寄与は同じ形質でも系統によって異なるケースがあり，たとえばゲノ
ム育種価を用いた時のロース芯面積については，
気高系では母の遺伝的寄与が大きく，藤良系では父の遺伝的寄与が大きく，但馬系ではほぼ等しい
寄与であった。以上の結果から，黒毛和種の系統は異なるタイプの非メンデル型遺伝様式を有しており，この品種の複雑な遺伝伝達様式のメカニズムを調べるためには，父の系統の差異を考慮した
さらなる研究が必要なことが示唆された。
文献１） Okamoto, K., Oishi, K., Nakamura, R., Abe, A.,
Inoue, K., Kumagai, H., Hirooka, H.：Parent-oforigin effects on carcass traits in Japanese Black
cattle, Journal of Animal Breeding and Genetics,
136, 190～198, 2019.
２） Nogi, T., Honda, T., Mukai, F., Okagaki, T.,147

Oyama, K.：Heritabilities and genetic correlationsof fatty acid compositions in longissimus muscle
lipid with carcass traits in Japanese Black cattle,
Journal of Animal Science, 89, 615～621, 2011.
３）
 VanRaden, P. M.：Efficient Methods to Compute
Genomic Predictions, Journal of Dairy Science, 91,
4414～4423, 2008．
４）
 Misztal, I., Tsuruta, S., Strabel, T., Auvray, B.,
Druet, T., Lee, D.：BLUPF90 and related programs（BGF90）,Proceedings of the 7th World Congress in
Genetic Applied Livestock Production, Montpellier,France.［CD-ROM］Comm. no.28.07, 2002.
５）
 Wright, S.：Correlation and causation, Journal of
Agricultural Research, 20, 557～585, 1921.
６）
 Wright, S.：Path coefficients and path regression：
alternative or complementary concepts? Biometrics,
16, 189～202, 1960.
７） 広岡博之，青木義和：黒毛和種の枝肉形質の評価に関する系統の再検討, 肉用牛研究会報，103, 32～
37, 2017．
８）
 Inoue, K., Nishio, M., Shoji, N., Hirooka, H.：
Effects of parent-of-origin models with different
pedigree information on beef carcass traits andfatty acid composition in Japanese Black cattle,
Journal of Animal Breeding and Genetics, 91, 45～
55, 2020.
９） Aguilar, H., Misztal, I., Johnson, D. L., Legarra, A.,
Tsuruta, S., Lawlor, T. J.：Hot topics：A unified
approach to utilize phenotypic, full pedigree, andgenetic information for genetic evaluation of
Holstein final score, Journal of Dairy Science, 93,743～752. 2010.
10）
 Misztal, I., Lourenco, D., Legarra, A.：Current
status of genomic evaluation, Journal of Animal
Science, 98, skaa101, 2020.

© The Ito Foundation

148

牛子宮内膜での単核球の出現が分娩後の子宮修復に及ぼす影響
The effect of monocyte appearance in endometrium to uterine involution
in cattle

三

浦

亮太朗・田

島

剛

（日本獣医生命科学大学獣医学部）

Ryotaro Miura and Tsuyoshi Tajima（Department of Veterinary Medicine, Nippon Veterinary and Life Science University）

In our previous study, we found that mononuclear cell（MNC）increased in endometrium
after inflammation convergence of endometrium during uterine involution in lactating dairy
cows. In the present study, we examined the cell type of MNC, relationship of the timing of
MNC increase and uterine involution, and the timing of MNC increase and fatty acid［eicosapentaenoic acid（EPA）and arachidonic acid（AA）］. In Experiment 1, we used 15
lactating Holstein dairy cows. From 2 to 10 week（0 week = 1 ～ 7 day after parturition）, we
conducted cytobrush for taking samples of endometrial cells and uterine lavage for collecting
intrauterine cells to detected CD4＋T cell using fluorescence-activated cell sorting every week.
MNC increase was confirmed 93.3％（14/15）of cows, and CD4＋T cell was confirmed 93.3％（14/15）of cows. In addition, concordance rate of the timing of MNC increase and CD4＋T cell
detection was 63.3％. Experiment 2, we used 51 lactating Holstein dairy cows. From 2 to 10
week, we examined the timing of MNC increase decrease of polymorphonuclear cells（PMN）,
vagainal discharge disappearance, equal in diameter of left and right uterine horn, intrauterine
fluid disappearance. Timing of MNC increase was 5.4 ± 0.3 week, decrease of PMN was 4.4 ±0.3 week. vaginal discharge disappearance was 2.8 ± 0.3 week, equal in diameter of left andright uterine horn was 2.8 ± 0.3 week, intrauterine fluid disappearance was 3.0 ± 0.2 week.
Experiment 3, we used 23 lactating Holstein dairy cows. From 2 to 10 week, we examined
endometrial cells for detecting MNC increase. We collected blood for measuring of EPA andAA on 0 week. There were norelationship between timing og MNC increase and serum EPA
and AA concentrations．
From the present study, cell type of MNC which was increase during uterine involution
was CD4＋T cell, and the timing of MNC increase occured at the end of uterine involution.
Therefore, it was suggested that the MNC increase may have an effect to uterine involution.

１．目

産効率を低下させ，経済性を圧迫する要因であ的る。牛においては分娩後に生殖器が正常な状態に肉牛生産や酪農において，繁殖成績の低下は生まで回復することで，次の繁殖に供することがで© The Ito Foundation

牛子宮内膜での単核球の出現が分娩後の子宮修復に及ぼす影響きるため，生殖器の回復，特に子宮修復が早期に問題なく完了することは繁殖成績向上のためにき

２．方

149

法

わめて重要なことである。近年，分娩後の子宮内2 . 1 試験①膜の炎症の有無を評価するにあたり，ブラシ状の

特定器具で子宮内膜の表層細胞を採取し，顕微鏡下で供試牛：

子宮内に出現するMNCの種類の全細胞数に対する多形核白血球（PMN）の割合

日本獣医生命科学大学付属牧場（富士アニマルを算出し評価するサイトブラシという方法が注目

ファーム）にて飼養されていた泌乳乳牛（ホルスされている。サイトブラシを用いて子宮内膜炎のタイン種：15頭）を用いた。

診断を行い，その後の繁殖成績を評価した報告は試験方法：多数存在する。しかしながら，子宮内膜炎の１）富士アニマルファームに週１回訪問し，前回診断を実施する時期や子宮内膜炎のPMN割合の訪問日から訪問日にかけて分娩した牛を対象と診断基準は文献により大きく異なり，統一した診

し，分娩２～10週にかけて調査を行った（分娩断基準が確立していない。この背景には，分娩後後１～７日：０週）。

１～３）の子宮修復の過程における子宮内膜の細胞動態が２）子宮内膜に出現するPMNおよびMNCの動態

十分に理解されていないことが考えられる。申請を評価するために，サイトブラシ（メトリブラ者は，分娩後の子宮内膜においてPMN割合が低

シ，富士平工業株式会社，東京）により子宮内下する週に単核球（MNC）割合が上昇すること，

膜スメアを採取し，スライドグラスに塗布しまた，サイトブラシにより回収した子宮内膜組織た。その後，定法に従いメイグリュンワルド・に発現するmRNA解析からMNCがCD4＋T細胞でギムザ染色を行い，顕微鏡下にてスライドグラある可能性を示した。しかしながら，子宮内で出スを鏡検し，子宮内膜上皮細胞，PMNおよび

現するMNCの種類，MNC増加のパターンと古典

MNCの数を300個計測し，PMN比およびMNC

的な子宮修復の完了の指標との関係については十比を算出した。MNCが＞5.0％となった週を分に明らかにされていない。また，不飽和脂肪酸

MNCが増加した週とした。

には炎症を抑制するもの（ω-３脂肪酸）および３）子宮内に出現しているMNCの評価を行うた

促進するもの（ω-６脂肪酸）が存在し，MNCがめに，子宮内にバルーンカテーテルを挿入し，Ｔリンパ球である可能性が示唆されていることか

リン酸緩衝生理食塩水（PBS）20mlを注入後，ら，MNCの増加時期に分娩後の不飽和脂肪酸の子宮内腔を還流した。回収したPBSはその後，組成が影響を与えている可能性がある。そこで本遠心分離により細胞を回収し，CD4＋ および研究の目的は，『分娩後の子宮内膜に存在する

CD8＋ 抗体を反応させた。蛍光活性化セルソー

MNCは子宮修復に関与している』という仮説をティング（FACS）を実施し，CD4＋Tリンパ球，基に，MNCの種類の特定（試験①），子宮修復とCD8＋Ｔリンパ球の存在を評価した。

MNC増加時との関連（試験②），そしてMNC増2.2

加時期と分娩直後の血中脂肪酸組成との関連（試

供試牛：

試験②

子宮修復とMNC増加時との関連

験③），について調査を行い，分娩後の子宮修復

日本獣医生命科学大学付属牧場（富士アニマル

における子宮内膜でのMNCの役割を解明するこファーム）にて飼養されていた泌乳乳牛（ホルスとである。

タイン種：51頭）を用いた。

© The Ito Foundation

150

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

試験方法：とし，炎症が収束した時期を評価した。試験１１）富士アニマルファームに週１回訪問し，前回よりMNCが＞5.0％となった時期をリンパ球の訪問日から訪問日にかけて分娩した牛を対象とし，分娩２～10週にかけて調査を行った（分娩後１～７日：０週）。

上昇時期とした。
４）EPAおよびAAとMNC増加時期との相関関係を評価した。

２）試験１と同様の方法でサイトブラシを用い

2.4

統計解析

て，PMNおよびMNC比を算出した。PMN比試験③におけるEPAおよびAAとMNC増加週

が＞5.0％である場合を“子宮内膜に炎症あり”との相関にはSpearmanの順位相関係数を用いとし，炎症が収束した時期を評価した。試験１

た。危険率5.0％未満を有意差ありとした。すべ

よりMNCが＞5.0％となった時期をリンパ球のてのデータは平均および標準誤差にて示した。

上昇時期とした。
３） 超 音 波 画 像 診 断 装 置（My Lab Alpha Vet,

３．結果と考察

Esaote, Genova, Italy）を用いて，左右子宮角

3.1

試験①

MNC種類の特定

基部の直径を計測し，左右直径が一致した時期

試験期間中のMNC増加およびCD4＋Tリンパ球を評価した。さらに，子宮内の貯留物（直径＞が検出された週をTable１に示す。試験期間中に3.0mm）の消失した時期を評価した。

MNC の 増 加 が 確 認 さ れ た 牛 は 15 頭 中 14 頭４）腟鏡検査により腟内の膿性排出物の有無を評（93.3％）であった。MNCが増加する時期は牛に価した。膿性排出物が確認されなくなった時期

より大きく異なり，MNCが増加した週が１回のを評価した。

牛は11頭，２回の牛は２頭，３回の牛は１頭で2 . 3 試験③

MNC増加時期と分娩直後の血中あった。子宮内還流液中にCD4＋Tリンパ球が検出された牛は15頭中14頭（93.3％）であった。

EPAおよびAA濃度との関係

CD4＋Tリンパ球が検出された時期は牛により大供試牛：
日本獣医生命科学大学付属牧場（富士アニマル

きく異なり，CD4＋Tリンパ球が増加した週が１

ファーム）にて飼養されていた泌乳乳牛（ホルス

回の牛は12頭，２回の牛は１頭，３回の牛は１頭

タイン種：23頭）を用いた。

であった（Table１）。また，MNCが増加した週

１）富士アニマルファームに週１回訪問し，前回の子宮内腔を還流したPBS中にCD4＋Tリンパ球

訪問日から訪問日にかけて分娩した牛を対象とが検出されたのは18回中12回（66.7％）であり，し，分娩２～10週にかけて調査を行った（分娩CD8＋Tリンパ球は検出されなかった。

後１～７日：０週）。

本試験より，およそ90％の牛で子宮内において２）分娩０週に尾静脈より採血（血漿；プレーン

MNCの増加およびCD4＋Tリンパ球の検出される

管：株式会社テルモ，東京）を行い，エイコサ

ことが示された。また，その増加および出現は牛ペ ン タ エ ン 酸（EPA）お よ び ア ラ キ ド ン 酸

により異なり，さらに期間を通して観察されるの（AA）の測定を行った。

ではなく，短期間にのみ限局して観察されること３）試験２と同様の方法で，サイトブラシを用いが明らかになった。また，MNC増加とCD4＋TリてPMNおよびMNC比を算出した。PMN比がンパ球が検出される時期はおよそ70％で一致する＞5.0％である場合を“子宮内膜に炎症あり”

ことが示された。このことから，MNCはCD4＋T© The Ito Foundation

151

牛子宮内膜での単核球の出現が分娩後の子宮修復に及ぼす影響
Table 1 The relationship of the timing of MNC increase and CD4+T cell during experiment.
Cow No.
No.1
No.2
No.3
No.4
No.5

End point

Week after postpartum
2

3

4

5

6

7

8

9

10

MNC

－

－

－

＋

＋

－

－

－

－

CD4+T cell

－

－

－

＋

＋

－

－

－

－

MNC

－

－

－

－

－

＋

－

－

－

CD4+T cell

－

－

－

－

＋

－

－

－

－

MNC

－

＋

－

－

－

－

－

－

－

CD4+T cell

－

＋

－

－

－

－

－

－

－

MNC

－

－

－

－

－

＋

－

－

－

CD4+T cell

－

－

－

－

－

＋

－

－

－

MNC

－

－

－

＋

－

－

－

－

－

CD4+T cell

－

－

－

－

－

－

－

－

－

MNC

－

－

－

－

＋

－

－

－

－

CD4+T cell

－

－

－

＋

＋

＋

－

－

－

No.7

MNC
CD4+T cell

－

－

－

－

－

－

＋

－

－

－

－

－

－

－

－

＋

－

－

No.8

MNC
CD4+T cell

－
－

－
－

－
－

－
－

－
－

－
－

－
－

－
－

＋
＋

No.9

MNC
CD4+T cell

－
－

＋
－

＋
－

－
－

－
－

－
－

－
＋

－
－

－
－

No.10

MNC
CD4+T cell

－

－

－

－

＋

－

－

－

－

－

－

－

－

＋

－

－

－

－

No.11

MNC
CD4+T cell

－
－

－
－

－
－

－
－

－
－

－
－

－
－

－
－

－
＋

No.12

MNC
CD4+T cell

－
－

＋
－

＋
＋

＋
－

－
－

－
－

－
－

－
－

－
－

No.13

MNC
CD4+T cell

－
－

－
－

－
－

－
－

＋
＋

－
－

－
－

－
－

－
－

No.14

MNC
CD4+T cell

－

－

－

－

＋

－

－

－

－

－

－

－

－

＋

－

－

－

－

No.15

MNC
CD4+T cell

－

－

－

＋

－

－

－

－

－

－

－

－

＋

－

－

－

－

－

No.6

（－）
：Non MNC increase or CD4+T cell negative（＋）：MNC increase or CD4+T cell positive

リンパ球である可能で高いことが推測された。
3.2

試験②

が一致する週は3.0±0.1週であった。子宮内貯留

子宮修復とMNC増加時との関連物が消失する週は3.0±0.2週であった。腟内から

本試験では，子宮修復の指標として使用され膿が消失する週は2.8±0.3週であった。これらのる，腟からの膿性排出物の有無４），左右子宮角の結果から，MNCの増加は子宮修復の最終過程で平均直径の一致 ，子宮内貯留物の消失時期

お観察される現象であることが示唆された。組織修する週

復過程において，CD4＋Tリンパ球のTh1，Th2おとMNC増加週との関連を評価した。MNCが増加

よ び Treg が 関 与 す る こ と が 示 さ れ て お り ７），

する週は5.4±0.3週であった。子宮内膜の炎症が

MNCの増加は子宮内膜修復におけるＴリンパ球

収束する週は4.4±0.3週であった。左右子宮直径の出現と活性化を示している可能性が推測された。

５）

よびサイトブラシによるPMN比の低下

４）６）© The Ito Foundation

152

Week of MNC increase in endometrium

Week of MNC increase in endometrium

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

10
9

EPA

8

y = 0.1287x + 4.1295
R2= 0.048

7
6
5
4
3
2
1
0

0

5
10
15
Serum EPA concentration on 0 week（ug/ml）

20

10
9

AA

8
7
6

y =－0.0681x + 7.0636
R2 = 0.0323

5
4
3
2
1
0

15

20
25
30
35
Serum AA concentration on 0 week（ug/ml）

40

Fig. 1 Relationship between the serum eicosapentaenoic acid（EPA）or arachidonicacid（AA）concentration and week of MNC increase in endometrium.

3 . 3 試験③

MNC増加時期と分娩直後の血中と が 示 さ れ て い る 。そ の た め ，子 宮 内 膜 で のMNCの増加時期に分娩直後のEPAおよびAA濃

EPAおよびAA濃度との関連
MNCが増加した週と血中EPAおよびAA濃度度が関与する可能性を検討したが，関連は認めらに有意な相関関係は認められなかった（Fig.１）。

れなかった。このことから，MNC増加時期と分

EPAはω-３脂肪酸の多価不飽和脂肪酸の１つで娩直後の血中EPAおよびAA濃度は関連しないこあり，抗炎症作用，心血管保護作用および脳神経とが示唆された。

系保護作用を有することが示されている，一方，
AAはω-６脂肪酸の不飽和脂肪酸の１つであり，

４．要

約

プロスタグランジンやロイコトリエンなどの脂質本研究では，分娩後の子宮修復過程における子

メディエーターが産生され，血管透過性の亢進や宮内膜で増加が確認されるMNCの種類の特定，好中球の浸潤や活性化に中心的な役割を果たすこ

古典的な子宮修復指標との関連および分娩直後の© The Ito Foundation

牛子宮内膜での単核球の出現が分娩後の子宮修復に及ぼす影響

血中脂肪酸濃度とMNC増加時期との関連を調査した。その結果，MNCはCD4 Tリンパ球である＋可能性が高く，子宮修復の最終段階で増加すること，またMNC増加時期と分娩後の血中EPAおよびAA濃度に関連は認められないことが示された。このことは，子宮修復においてCD4＋Tリン
パ球が重要な役割を果たしていることが示唆された。しかしながら，本調査では子宮修復過程におけるCD4＋Tリンパ球が子宮内膜に出現するメカ
ニズムや機能的役割について十分に明らかにできなかったことから，今後さらなる調査が必要と考
えられる。

153

文
献
１）
 Kasimanickam, R., Duffield, T. F., Foster, R. A.,
Gartley, C. J., Leslie, K. E., Walton, J. S., Johnson, W.
H.：Theriogenology, 62, 9～23, 2004.
２）
 Barlund, C. S., Carruthers, T. D., Waldner, C. L.,
Palmer, C. W.：Theriogenology, 69, 714～723, 2008.
３）
 Madoz, L. V., Giuliodori, M. J., Jaureguiberry, M.,
Plöntzke, J., Drillich, M., de la Sota, R. L.：J Dairy
Sci, 96, 4333～4339, 2013.
４）
 Dubuc, J., Duffield, T. F., Leslie, K. E., Walton, J. S.,
LeBlanc, S. J.：J Dairy Sci, 93, 5225～5233, 2010.
５）
 Sheldon, I. M., Noakes, D. E., Rycroft, A. N.,
Dobson, H.：Theriogenology, 59, 1357～1371, 2003.
６）
 López-Helguera, I., López-Gatius, F., GarciaIspierto, I., Herzog, K.：Theriogenology, 77, 1334～
1342, 2012７） 増田治史：血栓止血誌, 25, 593～602, 2014.

© The Ito Foundation

154

黒毛和種における経腟採卵前のヒアルロン酸添加
ブタFSH製剤１回筋肉内注射の効果に関する研究
Effect of intramuscular injection of porcine FSH in hyaluron acid prior to
ovum pick-up in Japanese Black cattle

及川俊徳１・植田郁恵１・沼邊

孝２（１宮城県畜産試験場，２みやぎ農業振興公社）

Toshinori Oikawa１, Ikue Ueda１ and Takashi Numabe２（１Miyagi Prefectural Livestock Experiment Station, ２Miyagi Agricultural Development Corporation）

The objective of this study was to compare the efficacy of superstimulation treatment
with porcine FSH（pFSH）plus hyaluronic acid（HA）before the ovum pick-up（OPU）on invitro production（IVP）in Japanese black cattle.
IVP after OPU was compared in untreated Japanese black cattle oocyte donors and those
superstimulated with a single intramuscular（IM）injection of pFSH in HA, and pFSH only.
The control group received no treatment, whereas the FSH group received 8AU of pFSH. The
FSH＋HA group received 8AU pFSH in 4mL of saline plus 4ml of a HA solution by a single IM
injection. In Experiment 1, 6 animals were prepared for each test group and the study was
performed. There was no difference among groups in the number of follicles that wereaspirated per OPU session. However, p-FSH-treated cows had a higher percentage of
medium-sized follicles（６-10 mm）at the time of the OPU than control cows. The FSH＋HA
group had a higher oocyte collection rate（79.5 ％ vs. 66.5 ％）and blastocyst rate（30.7 ％ vs.
18.2 ％）than the control group. In the field demonstration experiment of Experiment II, theOPU and embryogenesis results were similar to those of the FSH＋HA group in Experiment I.
In conclusion administration of the hyaluronic acid preparation before OPU is expected to
improve the oocyte collection efficiency in OPU and also improve the embryonic development
results after in vitro fertilization.

１．目

される子牛が減少し子牛価格の高騰が続いてお的り，牛肉需要はやや回復し枝肉価格は上昇傾向に牛の体外受精技術は食肉処理場由来卵巣を利用あるものの，肥育素牛価格の高騰が肥育農家の経することで急速に発展してきたが，近年，牛生体営を大きく圧迫している。OPUはホルモン製剤

から超音波診断装置でモニターしながら卵子を採を投与しなくても繰り返し実施することが可能で取する経腟採卵（OPU）-体外胚生産（IVP）技術あり，妊娠牛やホルモン剤に対する反応が低い牛が畜産現場でも実施される機会が増えている。肉にも応用できることから過剰排卵処理に代わる技

用牛では，繁殖雌牛の飼養頭数の減少に伴い生産術として期待されている。

© The Ito Foundation

黒毛和種における経腟採卵前のヒアルロン酸添加ブタFSH製剤１回筋肉内注射の効果に関する研究

155

OPUはホルモン製剤を投与せずに実施可能でを設定した。この３区を宮城県畜産試験場で飼養あるが，OPU前に外因性の豚卵胞刺激ホルモンする黒毛和種繁殖雌牛６頭を用いて実施した。

（pFSH）製剤を投与すると卵胞が大きくなり作

OPU実施前に卵胞数をサイズ別に計測した。採業がスムーズに行えること ，良好な胚発生成績取した未成熟卵子は卵丘細胞の付着の程度で分類が得られることがメリットとしてある。pFSH

した（Ａランク：卵丘細胞が４層以上付着，Ｂラ製剤の投与は過剰排卵処理で用いられている投与

ンク：卵丘細胞が２～３層付着，Ｃランク：卵丘

量で連続してOPUを実施した場合には牛生体へ細胞が１層付着，Ｄランク：卵丘細胞が部分的にの影響が考えられるが，我々の先行研究において付着，変性（degenerated）：卵細胞質が不均一

比較的低容量で連続して実施可能であることを明で変性，裸化（denuded）：卵丘細胞がまったくらかにした。しかし，良質卵子の採取や採取卵子付着していない，膨化卵子（expanded）：卵丘細数の増加等の成績を得ることはできなかった３）。

胞が膨化）。採取卵子のうち，Ａ～Ｄランクの卵

ヒアルロン酸製剤は徐放性およびドラッグデリ

子を体外受精に供した。未成熟卵子の体外成熟培

バリーシステムが備わっていることが知られてい地 は 牛 胎 子 血 清 （FBS）， 上 皮 成 長 因 子

る 。Biancucciらは５％ヒアルロン酸溶液を溶（Epidermal Growth Factor：EGF），卵胞刺激ホ媒に用いることで過剰排卵処置におけるゴナドト

ルモン（FSH），ピルビン酸ナトリウムおよびゲ

ロピン投与量・頻度が少なくてすむこと，受精卵

ン タ マ イ シ ン を 加 え た Medium199 を 使 用 し ，

数や譲渡・凍結可能胚が増加することを報告して38.5℃，５％CO2 ，95％空気で約22時間成熟培養いる 。

を実施した。体外受精は当場繋養の黒毛和種種雄

１）

２）

４）

５）

そこで本研究では，OPU前にpFSH製剤とヒア

牛１頭の凍結精液を使用し，媒精はカフェインおルロン酸を混合し筋肉内投与することが卵巣反応

よびヘパリン添加mTALP液を使用し，38.5℃，

および採取卵子の体外受精後の胚発生成績に及ぼ

５％CO2，95％airで約６時間培養した。発生培地

す影響を検討することを目的とした。

はBSA添加mSOF培地を使用し，38.5℃，５％２．方

CO2 ，5％O2 ，90％N2 で体外受精後８日目まで培

法

2 . 1 実 験Ⅰ養を継続した。調査項目はOPU実施前の卵胞数，
OPU 前 の ヒ ア ル ロ ン 酸 添 加

採取卵子数，培養卵子数および胚発生成績とした。

pFSH製剤投与による採取卵子成績および

2.2

実験Ⅱ

現場での実証試験

体外受精成績の検討

みやぎ農業振興公社白石牧場で飼養する黒毛和

我々の先行研究結果から，ホルモン製剤の投与

種繁殖牛をランダムに選定しOPU実施48時間前

はOPU実施48時間前とし，試験区としてpFSH製にpFSH製剤８Ｕを生理食塩水４mlで溶解し，ハ剤８AUを生理食塩水４mlで溶解し，ヒアルロン

イオネート４mlを加え筋肉内に投与しOPUを実酸製剤（ハイオネート：ベーリンガーインゲルハ施した。採取した未成熟卵子は当場に輸送し体外

イムアニマルヘルスジャパン株式会社）４mlを受精を実施し胚発生成績を検討した。採取した未加え，筋肉内に投与するFSH＋HA区を設定し，成熟卵子の輸送については，昨年度検討した輸送

またpFSH製剤８アーマーユニット（AU）を生

ボックスを用いた。すなわち，採取した未成熟卵

理食塩水４mlで溶解し筋肉内に投与するFSH区

子は実験Ⅰと同様の体外成熟培地とともにポリスを設定した。対照区としてはpFSH製剤未投与区

チレン製チューブに入れ，アネロパックCO2でガ© The Ito Foundation

156

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

ス制御を行い，iP-TEC定温輸送ボックスで保温8AUを投与した場合に未投与の場合に比較してしながら輸送した。輸送後の成熟培養，体外受精

中卵胞率が高く，小卵胞率は未投与の場合が高い

および発生培養は実験Ⅰと同様の方法で実施し，成績であったが１），本研究においても同様の成績

OPU実施前の卵胞数，採取卵子数，卵割およびであり，pFSH製剤を投与することで中卵胞の割

胚発生成績を調査した。

合が高くなることが明らかになった。OPU時の統計処理

採取卵子数については，FSH＋HA区は卵胞数平

胚発生成績の卵子数および胚発生数等は一元配

均32.5±2.7個に対して平均25.8±2.8個が採取さ置分散分析後にTurkey-Kramer法により多重検れ，FSH区は卵胞数平均39.2±5.0個に対して平均定を行った。パーセンテージのデータはχ二乗検28.3±3.1個採取され，対照区は卵胞数平均32.8±

定にて実施した。統計的な有意差判定に用いたｐ3.7個に対して平均21.8±4.1個が採取され，いず

値は５％未満を有意差ありとした。

れの区間においても有意な差は認められなかった。卵子採取率はFSH＋HA区が79.5％，FSH区

３．結果と考察が72.3％および対照区が66.5％であり，FSH＋HA

実験Ⅰ

区は対照区よりも有意に高い成績であった（Fig.

OPU実施前の卵胞のサイズ別割合をFig.１に示

２）。これは，OPU実施前の卵胞のサイズ別割合した。中卵胞率は，FSH＋HA区およびFSH区がにおいて中卵胞率が対照区と比較して高い成績で対照区と比較して有意に高い成績であった。小卵あったことから，吸引しやすい卵胞が多く存在し胞率は，対照区が他の２区と比較して有意に高いたためと考えられた。

成績であった。我々の先行研究においてもpFSH

Follicle size proportion %

100
80

5.6
a
15.9

3.8
a
22.1

ランクの割合においてFSH区は32.9％であり，

2.5
8.1b

採取卵子のランク別割合をFig.３に示した。Ｃ

Large

FSH＋HA区の20.0％と比較して有意に高い成績であった。A，Bランクといったより良質な卵子

Medium
60
40

a
78.5

a
74.0

b
89.3

Small

（％）
85

FSH+HA

FSH

Control

a
ab

20
0

70

FSH+HA

FSH

Controlb

55

Fig. 1 Proportion of small（< 6 mm）, medium（6-10mm）, and large（> 10 mm）follicles suitable forpuncture immediately before ovum pick-up（OPU）
in Japanese black cattle submitted to OPU without
previouss uperstimulation treatment （control）, aftertreatment with pFSH（FSH）,or pFSH in hyaluronicacid（FSH＋HA）.
ａ-b
Columns with different superscripts are
statistically significant（p＜0.05）.

40

25
Fig. 2 Proportion of oocyte collection by ovum pick-up

in Japanese black cattle
Columns with different superscripts are
statistically significant（p＜0.05）.
ａ-b© The Ito Foundation

157

黒毛和種における経腟採卵前のヒアルロン酸添加ブタFSH製剤１回筋肉内注射の効果に関する研究
40

FSH+HA（％）

FSH

Control

b
30

ab

a

20

10

0

A-rankb-rankc-rankD-rankDegenerate

Denuded

ExpandedCategory of oocyte
Fig. 3 Proportion of oocyte category recovered after ovum pick-up in Japanese black cattle

Recovered oocytes were classified into four morphological categories based on the number anddensity of cumulus cell layers and the color and structure of the ooplasm．
ａ-b Columns with different superscripts are statistically significant（p＜0.05）.

の採取割合に有意な差は認められなかったものの，ヒアルロン酸製剤を添加したことで，pFSH（％）
70

FSH+HA

FSH

Control

製剤のみでの投与よりもより良質な卵子を採取できる可能性が考えられた。

50

体外受精に用いる培養卵子数はFSH＋HA区は平均21.2±1.7個，FSH区は平均24.7±3.0個および対照区は平均16.8±3.3個と有意な差は認められなa

30

かったが，培養卵子割合においてFSH区は87.1％
であり，対照区の77.1％と比較して有意に高い成績であった。
胚発生成績をFig.４に示した。平均の卵割卵数
および胚盤胞数には有意な差は認められなかった
ものの，胚盤胞率においてFSH＋HA区は30.7％であり，対照区の18.2％と比較して有意に高い成績であった。これはヒアルロン酸製剤のpFSH製

ab
b

10

Cleavege

Blastocyst

Fig. 4 Proportion of embryo development on in vitro

fertilization after ovum pick-up in Japanese black
cattleａ-b
 Columns with different superscripts are statisticallysignificant（p＜0.05）.

らなる検討が必要である。

剤に対する徐放性の効果が影響していると考えら実験Ⅱれるが，今後ヒアルロン酸製剤のpFSH製剤に対黒毛和種繁殖牛６頭を供試したOPUおよび胚する徐放効果と胚発生に及ぼす影響について，さ発生成績は，実験ⅠのFSH＋HA区と同様の成績© The Ito Foundation

158

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 1 Results of in vitro embryo development using oocyte by ovum pick-up in the field
No. of cows

No. of follicles

No. ofcollected
oocytes（%）

No. ofculturedoocytes（%）

No. ofcleavages（%）

No. ofblastocysts（%）

6

190

150（78.9）120（80.0）85（70.8）

49（40.8）を示した（Table１）。

意に高い成績であった。また，体外受精に供する以上のことからOPU実施前に投与するpFSH製

培養卵子割合はFSH区が対照区と比較して有意剤にヒアルロン酸製剤を添加することで，OPUに高い成績であった。さらに，体外受精後の胚盤

時の卵子採取効率が向上し，体外受精後の胚発生

胞率はFSH＋HA区が対照区と比較して有意に高成績の向上が期待できる。

い成績であった。実験Ⅱの実証実験においても

４．要

OPUおよび胚発生成績は，実験ⅠのFSH＋HA区

約と同様の成績を示した。以上の結果から，OPU

本研究は，経腟採卵（OPU）技術の効率化を前に投与するpFSH製剤にヒアルロン酸製剤を添目的とし，OPU実施前に，ヒアルロン酸製剤と加することで，卵子採取効率が向上し，体外受精

豚卵胞刺激ホルモン（pFSH）製剤を混合し筋肉後の胚発生成績の向上が期待できる。

内投与することが卵巣反応および採取卵子の体外
受精後の胚発生成績に及ぼす影響を検討した。実験ⅠではOPU前のpFSH製剤投与量は８AUとし，
pFSH 製 剤 の み 投 与 の FSH 区 と 試 験 区 と し て
pFSH製剤にヒアルロン酸製剤４mlを添加した
FSH＋HA区，対照区としてpFSH製剤未投与区を設定した。OPU前の中卵胞率は，FSH＋HA区
およびFSH区が対照区と比較して有意に高く，卵子の採取率はFSH＋HA区が対照区と比較して有文
献１）
 Seneda, M. M., et al.：Animal Reproduction Science.,
67, 37～43, 2001.
２）
 Vieira, L. M., et al.：Theriogenology, 82, 318～324,2014.
３）
 及川俊徳，板橋知子，沼邊孝：東北畜産学会報,
66（3）,57～64, 2017.
４）
 Yu-Jin Jin, et al.：Jounal of Pharmaceutical
Investigation, Vol.40, Special issue, 33～43, 2010.
５）
 Biancucci, A., et al.：Theriogenology, 85, 914～
921, 2016.

© The Ito Foundation

159

沖縄在来豚アグーを絶滅から守るべきＬ-カルニチン処理による凍結精子作製技術の改良
Improvement of the sperm freezing procedure by treatment with
L-carnitine to protect Okinawan native Agu pig from extinction

建

本

秀

樹

（琉球大学農学部）

Hideki Tatemoto（Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus）

The present study aimed to evaluate the effect of the addition of L-carnitine（LC）tofreezing extender on qualities of frozen-thawed Okinawan native Agu pig sperm. Ejaculated
sperm frozen in the extender supplemented with 0, 1, 2.5, or 5 mM LC was thawed, and thenevaluated the post-tawed sperm parameters. Treatment with LC effectively improved themitochondria and plasmalemma integrities and the proteolytic activity of the acrosomal
contents among the concentrations tested（p<0.05）. In particular, the mitochondrial activity
and the proteolytic activity of the acrosomal contents were markedly increased by treatment
with 2.5 mM LC during the freezing procedure in all individuals. It was further shown thattreatment with 2.5 mM LC remarkably kept higher levels of sperm motility in the post-thaw
sperm after 3 h of incubation compared with other doses of LC treatment（p<0.05）. Although
the addition of LC to the freezing extender had no effect on interference with DNA damage
and caspases activity, sperm treated with 2.5 mM LC during freezing possessed significantly
higher penetrability levels to matured oocytes in vitro than untreated sperm in all individuals.
Therefore, the present findings indicate that the addition of LC to the freezing extenderefficiently improves the post-thaw qualities, but not DNA damage and caspases activity, of
Age sperm by blocks against the damages of mitochondria and plasmalemma andconservations of the proteolytic activity of the acrosomal contents and sperm motility.

１．目

持するためにもアグー精子凍結保存技術を確立す的ることが必要である。しかし，ブタ精子の凍結保沖縄在来豚アグーは我が国の唯一の在来豚とし存に関してはウシ凍結精液と比べて，凍結処理過て沖縄の特筆すべき畜産物である。しかし，現在

程での酸化ストレスやコールドショックなどによの雄アグーには長期間の閉鎖的小集団での交配にる細胞障害の影響を受けやすい。その結果，凍結よる近交退化が認められ，夏季には精子性状が極融解後のブタ精子の運動性および受精能力維持に端に悪化する。したがって，アグーを通年的に効関する生理学的機能は新鮮精子と比較して著しく率的かつ安定的に生産し，その貴重な遺伝子を保低下し１～３），いまだにブタ凍結精子は実用化には© The Ito Foundation

160

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

至っていない。

で繁用されているアグー３頭（Ａ-１，Ａ-２およ活 性 酸 素 種（reactive oxygen species；ROS）

びＡ-３）から手圧法により採取し実験に供した。

によって引き起こされる酸化ストレスは凍結障害

凍結用希釈液には，BF517）を用いた。採取したの原因の一つである。Ｌ-カルニチン（LC）は，精液は２時間以内に研究室に持ち帰り，遠心操作

脂肪酸がATPのエネルギー基質としてミトコン（1,600×g，３分間，30℃）することで精漿を除ドリア内でβ酸化される際のミトコンドリア内へ去し，BTS17）で2.0×10８ sperm/ml濃度に精子をの脂肪酸の輸送に関わっており，この作用によっ懸濁した。その後，ただちに再度遠心（1,600×g，て脂質の過酸化を抑制している。同時に，３分間，30℃）して上清を除去した後，一次凍結

LCにはミトコンドリア機能低下を抑制する能力用希釈液（１st BF5）で10×10 ８ sperm/ml濃度があることも示されている７～９）。さらに，精巣上に希釈した。そして，プログラム低温水槽（NCB-

体細胞および精子は精巣上体液中に存在するLC

3100 ，EYELA ，東 京）を 用 い て ２ 時 間 か け てのβ酸化の作用機序を介してATPエネルギーを25℃から５℃まで冷却し５℃の状態で1.5時間静誘導されることから，哺乳動物の精子の成熟およ置した。その後，５％（v/v）glycerolを含む二び代謝に対してLCは重要な役割を果たすことも

次凍結用希釈液（２nd BF5）を等量添加し，素知られている10）。また，精巣上体液中の高濃度の早く攪拌した後，小穴を成型したドライアイス上LCは，精子原形質膜を安定化させ，さらに代謝に100μｌの凍結ペレットを作製した。凍結ペレッ

機能を維持し，精子運動能力を増加させる作用を

トは，ドライアイス上で15分以上静置して完全に有すると示唆されている。しかし，凍結保護

凍結した後，液体窒素中に浸漬し保存した。なお，

プロセスならびに精子凍結過程で使用される凍結

凍結用希釈液へのLC添加が凍結融解後のアグー

保護物質は，LCの精子細胞内濃度を低下させる

精子性状に及ぼす影響を調査するため，０，１，2.5

ことが知られておりおよび５mMになるようにLCを各凍結用希釈液

４～６）

11，12），ヒト精子において，凍13～15）

結保存時のLC添加が精子運動性と活性化型前進に添加し，凍結処理を行った。

運動精子率を改善する16）。しかしながら，ブタ精

2.2

ミトコンドリア正常性の観察

子の凍結保存時の凍結用希釈液へのLC添加によ

凍結精子１ペレットをDulbecco’s phosphatebuffered saline（PBS）に １ ％（w/v）polyvinyl

る効果は，まだ検証されていない。
したがって，本研究ではアグー精子の凍結用希alcohol（PVA）お よ び １ mg/ml D-glucose を 加

釈液へのLC添加が凍結融解後の精子性状に及ぼえたPBS-PVA（3 ml）中において39℃で融解したす影響を調べるため，さまざまな濃度のLCを凍融解精子を処理区ごとに750μｌを分注した。そ結用希釈液へ添加し，その効果を検証した。

して，既報に準じ18～20），Mito Tracker Red CMXRos

２．方（Lifetachologies，DcriveRockville，MD，USA）

法と SYBR GreenⅠ（TaKaRa Bio ，滋 賀）で 染 色特に提示していない試薬を除いて，すべての試した。その後，蛍光顕微鏡（H600L，Nikon，東京）

薬 は Sigma-Aldrich（St. Louis, USA）か ら 購 入下で観察し，中片部に強い赤色蛍光が認められたした。

精子を正常なミトコンドリアを保持している精子

2.1

ブタ射出凍結精子の作成とした。

射出精液は，農業生産法人有限会社我那覇畜産© The Ito Foundation

沖縄在来豚アグーを絶滅から守るべきＬ-カルニチン処理による凍結精子作製技術の改良

2.3

精子細胞膜正常性の観察

精子細胞膜正常性の評価は，既報

2.6

161

DNA正常性の観察の方法に準精子のDNA障害は既報に従い中性コメットじて行った。PBS-PVA（4 ml）中で凍結精子をアッセイ法で評価した 18，19）。電気泳動後のアガ39℃で融解後，精子濃度が2.0×10６ sperm/mlにロース内のDNAのテーリング像を，蛍光顕微鏡

なるように調整した。その後，CFDA/PI staining

下で観察しDNA障害を明らかにした。

21）

solutionを用い遮光状態の39℃で15-30分間染色

2.7

し，0.03％ glutaraldehyde（和光純薬工業，大阪）

精 子 細 胞 内 カ ス パ ー ゼ 活 性 の 測 定 は，で固定した。そして，蛍光顕微鏡下で観察し，緑CaspGLOWTM Red Active Caspase Staining

色蛍光のみを呈している精子は正常細胞膜を保持

Kit（Bio Vision，Atlanta，GA，USA）を用いてしている精子とし，一部もしくは全体的に赤色蛍行った20，22）。凍結精子を融解後，39℃に加温した光を呈している精子は膜障害を受けている精子と８mlのPBS-PVA中へ懸濁し，その精子懸濁液した。

（300μｌ）に１μｌのRed-VAD-FNK溶液を添加

2 . 4 精子先体由来のタンパク質分解酵素活性した。その後は，キットのプロトコールに従い，蛍光顕微鏡下で中片部に鮮やかな赤色蛍光が認めの測定
スライドグラス上のゼラチン皮膜に塗布した精子により形成される光輪（halo）を測定すること
で精子先体由来タンパク質分解酵素活性を測定した細胞内カスパーゼ活性の測定られる精子を，活性型カスパーゼを有する精子とした。
2 . 8 体 外 受 精 （in vitro fertilization；IVF）。観察は位相差顕微鏡下で，精子先体からによる精子受精能力の評価

18～20）

ゼラチン被膜上に露出したタンパク質分解酵素の

卵胞卵の体外成熟（IVM）ならびに体外受精作用により形成された光輪（halo）の直径を，マ（IVF）は既報に準じて行った18，19）。なお，未経産

イクロメーターで各処理区当たり25個以上計測

豚卵巣からの直径２-６mmの小卵胞から採取しし，その光輪直径を先体由来のタンパク質分解酵た卵丘細胞卵子複合体をNCSU3723）で44時間培養

素活性すなわち先体正常性として評価した。

することでIVMを行った。IVF培地にはmTBM24）

2.5

精子運動性の測定を用い，前培養を行った精子をIVF培地で2.0×

凍結精子を39℃に加温した2.5 mlのCa，Mg-

10６ sperm/ml濃度に希釈し，卵丘細胞を除去しfree Tyrode-HEPES solution中で融解して2.0×

た裸化卵に媒精した。媒精10時間後に卵子を固定

10７ sperm/ml濃度になるように調整し，39℃でし，位相差顕微鏡下で卵細胞質内に膨化した精子

インキュベートした。そして，融解後０，１なら頭部もしくは雄性前核が認められ，同時に精子尾びに３時間に精子運動解析装置（SMAS；Sperm

部も認められた卵子を精子侵入卵として判定した。

Motility Analysis System ，DITECT，東 京）を2.9

用いて精子運動性を計測し，「運動精子率」と各試験区におけるすべての操作を計４回繰り返「活性化型前進運動精子率」を解析した。なお，

し，データは平均±標準誤差で示した。また，統運動精子率は７μm/sec以上の経路平均速度を示

計 処 理 は 統 計 解 析 ソ フ ト R （http ： //www.

した精子の全精子に占める割合とし，活性化型前R-project.org/）を用いて行った。Shapiro-Wilk

進運動精子率は50μm/sec以上の直線係数を示し

normality testで正規性を確認した後，パラメトた精子の全精子に占める割合とした。

リック関数を適用した一因子もしくは二因子の一© The Ito Foundation

統計処理

162

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

般 化 線 形 モ デ ル （Generalized Linear Model；
GLM）-ANOVAを行い，有意性が認められた場

３．結果と考察

合には，Tukey-Kramer testによる多重比較検定

最近，水牛精子の凍結保存時に，LCの添加がで有意差を検討した。なお，％データには，二項

ATP産生量を増加させるとともに，ROSを消去

分布関数を適用したGLM解析を行ったうえでノする作用によって凍結融解後の精子の質を改善しンパラメトリック型Tukey法

により多重比較検た26）。本研究においても，いずれの個体のアグー定を行った。そして，すべてのデータにおいて凍結精子でも2.5 mM LC処理区で正常なミトコン

p<0.05を統計的に有意と判断した。

ドリアを有する精子の割合が劇的に増加し保護効

25）

果が確認できた（p<0.05）（Fig. 1A）。一方，５Concentration of L-carnitine (mM)Concentration of L-carnitine (mM)
0
2.5

60

b

Mitochondria-intact
sperm (%)

50

a

40

ac

1
5
b

a a

30

70

c
b

a

ab

c

ac

20
10
0

A-1A

A-2B

0
2.5

B

60
Plasmalemma-intact
sperm (%)

A

b

50
40

1
5
c

b

a

b
c

b
b b

b

a

a

30
20
10
0

A-3A

A-1A

A-2B

A-3C

Agu

Agu
Concentration of L-carnitine (mM)
0
2.5

C

1
5

70
Halo diameter (µm)

60
50
40
30

b

c

a

c
b

a b

d

b

c
d

a

20
10
0

A-1A

A-2A

A-3B

Agu
Fig. 1 Effect of various concentrations of L-carnitine（LC）added to the freezing extender on mitochondrial integrity（A）, plasmalemma integrity（B）, and halo diameter（C）in post-thaw Agu sperm. Values are expressed as themean±SEM for four ejaculates from the three Agu. The total number of sperm examined was 720-726（Ａ）, 720740（B）, and 103-112（C）in each treatment group. a-d Significant differences were observed within the LC
treatment groups in the same pigs as determined by a one-way ANOVA（p<0.05）.A-C Significant differences wereobserved among individuals as determined by a two-way ANOVA（p＜0.05）.

© The Ito Foundation

沖縄在来豚アグーを絶滅から守るべきＬ-カルニチン処理による凍結精子作製技術の改良

163

Table 1 Total motile spermatozoa after freeze-thawing with various concentrations of L-carnitine.
Agu

A-1 A

A-2 B

A-3 C

Concentration of
L-carnitine（mM）

Incubation time after thawing（h）
01

3

84.9 ± 1.0 a, x

73.4 ± 1.4 a, y81.1 ± 1.2 b, x87.6 ± 0.9 b, x

22.4 ± 1.4 a, z
34.4 ± 1.5 b, y2.5

87.4 ± 0.9 a, x85.4 ± 1.0 b, x

41.7 ± 1.6 c, y568.0 ± 1.5 c, x76.4 ± 1.3 a, y39.6 ± 1.4 c, z

064.5 ± 1.7 a, x

62.8 ± 1.7 a, x

24.3 ± 1.9 a, y1
2.5

64.6 ± 1.6 a, x
69.4 ± 1.6 a, x

66.3 ± 1.5 a, x
67.4 ± 1.6 a, x

32.8 ± 1.5 b, y38.2 ± 1.6 c, y567.2 ± 1.6 a, x

63.2 ± 1.5 a, x

43.9 ± 1.7 c, y082.8 ± 1.1 a, x

82.6 ± 1.4 a, x

24.9 ± 1.4 a, y1
2.5

81.1 ± 1.2 a, x
83.3 ± 1.3 a, x

72.1 ± 1.5 bc, y78.4 ± 1.3 ac, y29.1 ± 1.6 ab, z33.4 ± 1.6 b, z

5

81.7 ± 1.2 a, x

69.6 ± 1.5 b, y25.8 ± 1.6 a, z

0
1

Values are expressed as the mean ± SEM for four ejaculates from the three Agu.
a-c Values with different superscripts in the same column are significantly different within the LC treatmentgroups in the same individuals（p<0.05）.
x-z Values with different superscripts in the same row are significantly different（p<0.05）.
A-C Values with different superscripts are significantly different among individuals（p<0.05）.

mM LC処理区では，逆にミトコンドリア正常性

凍結融解後の精子運動性では，全個体の融解後は有意に低下した（p<0.05）。次に，凍結融解後３時間の運動精子率が2.5 mM LC処理区で対照区の精子細胞膜の正常性では，Ａ-１とＡ-３においより有意に高い値であった（Table１）。また，融て2.5 mM LC処理区で最も高い正常な細胞膜を有解後３時間の活性型精子前進運動精子率でも，対する精子の値が示された（Fig. 1B）。また，Ａ-

照区と比較してLC処理区で有意な増加が観察さ２においても2.5 mM LC処理区で対照区と比べ有れた（p<0.05）（Table２）。したがって，LCの添

意に高い数値が見られた（p<0.05）。これまで過加が精子運動率と活性型精子前進運動精子率に対剰なROSによる脂質過酸化が膜損傷を引き起こして改善効果があることが証明された。これは，すといった報告がされており ，凍結用希釈液へ

ヒト精子において凍結保存時のLCの添加によっのLC添加によってROS生成量が減少した結果，て精子運動性と活性化型前進運動精子率が改善さ

凍結融解後の精子細胞膜正常性が改善したと考えれたといった報告と一致する16）。

27）

られる。また，精子先体由来のタンパク質分解酵

一方，凍結融解後の精子のDNA正常性に関し

素活性について検討したところ，実験に供したすては，明確なLC処理区によるDNA断片化に対すべての個体で2.5 mM LC処理区においてタンパクる抑制効果は示されなかった。同様に，カスパー

質分解酵素によってゼラチン皮膜に形成された

ゼ活性においてもLC処理により有意に活性が低halo直径が最も増加した（p<0.05）（Fig. 1C）。こ下することはなかった。DNA断片化は，物理的れらの結果から，LC処理により，ミトコンドリア，

障害だけでなくカスパーゼ活性に伴うアポトーシ

細胞膜ならびに先体の正常性が維持されることがス様細胞死によっても誘導される 28，29）。これまで確認できた。

の我々の研究から，アグー精子凍結融解時に凍結© The Ito Foundation

164

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 2 Rapid progressive motility spermatozoa after freeze-thawing with various concentrations of

L-carnitine.

Agu

A-1 A

A-2 A

A-3 B

Concentration of
L-carnitine（mM）

Incubation time after thawing（h）
0

1

3

0

12.5 ± 0.9 ac, x

13.9 ± 1.1 a, y

0.7 ± 0.3 ab, z

1
2.5
5

17.0 ± 1.2 b, x10.0 ± 0.8 a, x
14.4 ± 1.1 c, x12.5 ± 0.9 a, y11.3 ± 0.9 ab, x13.5 ± 1.0 a, x

1.6 ± 0.4 bc, z
2.9 ± 0.6 c, y
1.7 ± 0.4 bc, y0

9.8 ± 1.1 ab, x15.1 ± 1.3 a, y

1.8 ± 0.6 a, z

1
2.5

8.9 ± 1.0 ab, x
16.6 ± 1.3 c, x

9.5 ± 1.0 b, x
17.0 ± 1.3 a, x

1.8 ± 0.4 a, y
3.0 ± 0.6 ab, y5

6.4 ± 0.8 a, x10.0 ± 0.9 b, y

4.7 ± 0.7 b, y019.8 ± 1.2 a, x

16.9 ± 1.3 a, x

0.7 ± 0.3 a, y1

17.0 ± 1.2 a, x

21.0 ± 1.4 ab, x

1.7 ± 0.5 a, y

2.5
5

18.5 ± 1.4 a, x
26.7 ± 1.4 b, x

15.0 ± 1.1 a, x
14.9 ± 1.2 a, y

1.6 ± 0.4 a, y
0.7 ± 0.3 a, z

Values are expressed as the mean ± SEM for four ejaculates from the three Agu.
a-c Values with different superscripts in the same column are significantly different within the LC treatmentgroups in the same individuals Agu（p<0.05）.
x-z Values with different superscripts in the same row line are significantly different（p<0.05）.
A, B Values with different superscripts are significantly different among individuals（p<0.05）.

Table 3 Effects of L-carnitine added to the semen freezing extender on fertilization parameters in post-thaw Agu

sperm.

Agu

Oocytes（%；mean ± SEM）

L-carnitine（mM）

No. ofoocytes
examined

Penetrated

Polyspermic1）

Malepronucleus 1）

0
2.5
0
2.5

151
173
143
128

28.5 ± 3.7
48.0 ± 3.8＊
39.2 ± 4.1
55.1 ± 4.4＊

34.9 ± 7.3
39.0 ± 5.4
30.6 ± 6.4

72.1 ± 6.8
82.9 ± 4.2
57.1 ± 6.6

1.4 ± 0.0
1.5 ± 0.0
1.3 ± 0.2

0
2.5

116
137

36.2 ± 4.5
54.0 ± 4.3＊

30.0 ± 4.7
42.9 ± 7.6
31.1 ± 5.4

68.6 ± 5.5
66.7 ± 7.3
66.2 ± 5.5

1.4 ± 0.1
1.6 ± 0.1
1.5 ± 0.2

A-1
A-2
A-3

No. of sperm per
penetrated oocyte（mean ± SEM）

1）Percentage of oocytes that were penetrated.
＊ Values are significantly different between two treatments in each individual（p<0.05）.

障害を受けた精子では，ミトコンドリア依存型の最後に，2.5 mM LC処理区におけるIVF後の精カスパーゼ活性が惹起されることが明らかになっ子侵入率をはじめとする各種パラメーターを観察た 。しかしながら，凍結用希釈液へのLCの添し た 結 果 ，す べ て の 個 体 で 対 照 区 と 比 較 し て加は，凍結融解後の精子ミトコンドリア正常性を

2.5 mM LC処理区の卵子への精子侵入率が有意に改善したものの，カスパーゼ活性とDNA断片化増加した（p<0.05）（Table３）。ブタ精子においを抑制することはなかった。すなわち，ミトコンて正常な精子先体が受精時に必要不可欠であるとドリア依存型カスパーゼ活性化以外のプログラム

いった報告がされている30）。すなわち，凍結用希細胞死に関わる作用機序が関与している可能性が釈液へのLCの添加による精子先体への改善効果示唆された。

が卵子への精子侵入率の増加の要因であると考え

22）© The Ito Foundation

沖縄在来豚アグーを絶滅から守るべきＬ-カルニチン処理による凍結精子作製技術の改良られる。したがって，2.5 mM LCを添加した精子
凍結用希釈液で凍結処理したアグー精子は，凍結融解後も高い受精能力を維持していることが証明された。
本研究の結果から，凍結用希釈液への2.5 mMのLC添加が，ミトコンドリア障害と細胞膜障害の抑制，ならびに精子先体と精子運動性の維持によって，凍結融解後のアグー精子性状を効果的に改善することが明らかになった。本研究結果は，アグー精子凍結保存技術の確立を促進し，アグーの効率的かつ安定的な増産に貢献できると思われ
る。
４．要

約

我が国唯一の在来豚である希少なアグーの年間を通しての生産を行うには，精子凍結保存技術の確立が必要である。そこで，本研究ではアグーにおける凍結用希釈液へのLC添加が凍結融解後の精子性状に及ぼす影響について調べた。2.5 mM
LC処理によって正常なミトコンドリアと細胞膜を有する精子の割合が顕著に増加した（p<0.05）。
精子先体由来のタンパク質分解酵素活性は2.5 mM
LC処理区で増加し，先体の正常性が高められた（p<0.05）。凍結融解後３時間における精子運動性は，2.5 mM LC処理区で対照区より有意に高くなった。しかし，DNA障害と活性型カスパーゼの存在を示す精子の割合に関しては，LC処理による抑制効果は認められなかった。一方，IVF試
験を行い凍結融解精子の受精能力を検定したところ，対照区と比べて2.5 mM L-カルニチン処理区の精子侵入率が有意に増加した。すなわち，本研究の結果から，凍結時の2.5 mMのLC処理が，融解後のミトコンドリア，細胞膜および精子先体の正常性と精子運動性を維持し，アグー凍結精子の性状を効果的に改善することが明らかになった。

165

文
献
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166

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

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Improvement of the post-thaw qualities of Okinawa
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supplemented with ascorbic acid 2-O-α-glucoside,
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Yakabi, T., Muto, N., Nakada, T., Ashizawa, K.,
Tatemoto, H.：Characteristics if Okinawa native
Agu pig spermatozoa after addition of low-density
lipoprotein to freezing extender, J. Reprod. Dev., 55,
558～565, 2009.
20） Tatemoto, H., Osiro, R., Shimada, H., Konno, T.,
Yamanaka, K., Ashizawa, K.：Addition of casein to
the diluents during semen transportation improves
the post-thaw qualities of Okinawan native Agu pig
spermatozoa, J. Warm Regional Soci. Anim. Sci.,
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21） Brito, L. F. C., Barth, A. D., Bilodeau-Goeseels, S.,
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post-thaw qualities of Okinawa native Agu pig
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Ock, S. A., Kumar, B. M., Balasubramanian, S., Rho,
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during boar semen cryopreservation on sperm
characteristics and expression of apoptosis related
genes, Cryobiology, 58, 181～189, 2009.

© The Ito Foundation

167

抗酸化物質を利用した牛体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発
Improvement of bovine in vitro fertilized embryo production technology
using antioxidants and development of calf production system by new
OPU-IVF-ET method

日巻

武裕１，２・草薙

志穂２・多治見弘史３（１岐阜大学応用生物科学部，２岐阜大学自然科学技術研究科，３多治見牛ETクリニック）

Takehiro Himaki１，２, Shiho Kusanagi２ and Hiroshi Tajimi３（１Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University,
２Graduate School of Natural Science and Technology, Gifu University, ３Tajimi bovine ET clinic）

One of the factors that influencing the in vitro embryo production efficiency is oxidative
stress. The objective of this study is to investigate the effect of α- lipoic acid（ALA）
treatment, which is a strong antioxidant, on the production of bovine in vitro fertilized（IVF）
embryos. Oocytes collected from slaughterhouse were cultured for 22 h in maturation medium
supplemented with 0, 50, 100 or 200μM ALA and IVF embryos were cultured for 7 days. At
first, examined the antioxidant efficacy of ALA from the levels of Reactive Oxygen Species（ROS）and Glutathione（GSH）in the cytoplasm of in vitro matured oocytes, and revealed thatthe significant decrease in ROS and significant increase in GSH in the all ALA treated groups
compared to the control group. Next, as a result of evaluating the effects on the status of invitro development, the rate of blastocyst formation on Day 7 was significantly higher in 50μM
ALA treatment than that in other groups. Whereas, the rates of maturation, fertilization,cleavage and apoptotic cells of blastocyst did not differ. On the other hand, the number of total
cells and ICM were significantly higher in 50μM ALA treatment compared with the control
group. In addition, the morphological quality of blastocysts obtained on Day 7 and the survival
rate after cryopreservation tended to improve in the 50 or 100μM ALA treatment group.
Finally, after treating the immature oocytes collected by Ovum Pick Up（OPU）with 50μM
ALA, IVF embryos were produced, and fresh embryo or freeze-thawed embryo weretransferred to recipient respectively. As a result, conception was confirmed in both cases. In
conclusion, it was revealed that treatment with 50μM ALA during in vitro maturation was
effective in improving the developmental capacity of bovine IVF embryos and had no negative
effects on the developmental potential on in vivo.

© The Ito Foundation

168
１．目

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

および脂溶性抗酸化物質（ビタミンＥ）の両者を的再生できる６）。さらに，ビタミンＣの約400倍の牛体外受精（IVF）技術は，受精卵の大量かつ抗酸化力を持つきわめて強力な抗酸化剤であ

安価な生産，雌雄両方からの優良遺伝形質の継承る７）。したがって，IVM過程におけるALA処理が，などの利点があり，経膣採卵を介したIVF卵生産

卵成熟とその後の胚発生能改善に有効であることと受精卵移植（ET）による効率的な産仔生産にが期待される。

有効な手段である。しかし，ET可能なIVF卵のそこで本研究では，卵子のIVM過程における生産効率やその品質は，体内受精卵と比べて低ALA処理が牛IVF卵の発生能や品質ならびにETく，その要因に体内環境と体外培養環境の違いが後の体内発生能に及ぼす影響を検討することを目あげられる。

的とした。

初期胚の発生能や品質には，体外培養環境の高酸素条件がもたらす酸化ストレスの影響が大きい。酸化ストレスは活性酸素種（ROS）が過剰に産生され，細胞内抗酸化力とのバランスが崩れる

２．方法

2 . 1 種々濃度のALA処理によって成熟培養した卵子の品質評価

ことで引き起こされる。過剰となったROSは，細食肉処理場由来卵巣から卵丘細胞-卵母細胞複胞膜やDNAの損傷，正常な遺伝子発現およびシ合体（COCs）を採取した。COCsは，10％ FBS

グナル経路を阻害し，アポトーシスカスケードを

添加HEPES-Ｍ199を基礎培地として，ALAを０，誘発することで，卵成熟や胚発生能を低下させ50，100または200μＭ添加し，それぞれの成熟培る１）。IVF卵生産過程の中でも卵子の体外成熟培

地微小滴でCOCsを22時間培養した。その後，卵養（IVM）は，高酸素条件下で行うため酸化ス

丘細胞をすべて剥離し，2’，7’-Dichlorofluorescin

トレスの影響を受けやすい 。ET後の受胎率に

diacetate （H2DCFDA） お よ び CellTrackerTM

おいても，移植する受精卵の品質が高いことが不Blueにて染色し，ROSおよびGSHの細胞質内含

可欠であり，ET技術のさらなる発展には，IVF

有量を蛍光観察画像における蛍光輝度を数値化す

卵の品質を向上させ，確実に受胎し体内で順調にることで評価した。

２）

2 . 2 種々濃度のALA処理によって生産した発生する能力を有することが重要となる。
これまで種々の抗酸化剤添加が酸化ストレスをIVF卵の発生能および品質の評価

軽減し，卵子の成熟率や胚発生率を向上させ，胚各ALA処理区で培養したCOCsは，人工授精用

盤胞期胚における総細胞数の増加やアポトーシス

凍結-融解精液をBO液で処理した精子懸濁液中で細胞数の減少など胚の品質が改善されることが明精子と６時間共培養することでIVF卵を生産しらかにされているた。発生培地には0.3％ BSA添加修正CR1aa培地

。

３，
４）

抗酸化物質の一つであるα-リポ酸（ALA）お（発生培養前期２日間）および10％ FBS添加修正

よびその還元型であるジヒドロリポ酸（DHLA）

CR1aa培地（発生培養後期５日間）を用いた。媒は，ROSの生成を抑制または直接除去すること精から12時間後に一部の胚を固定し，成熟状況なで，酸化的損傷から細胞を保護する 。また，細らびに受精状況を評価した。残りの胚は，発生培

胞内のさまざまな所に局在でき，内因性の水溶性養を継続し，媒精２日後の卵割状況ならびに７日

抗酸化物質（ビタミンＣ，グルタチオン：GSH）

後の胚盤胞形成状況を評価した。得られた胚盤胞

５）© The Ito Foundation

抗酸化物質を利用した牛体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発

169は，１）国際胚移植学会（IETS）が定めた基準検定を行い，多重比較としてTurkey Kramerまによる形態的品質の評価，２）Hoechst33342とたはSchefféの検定を行った。

TUNEL染色による総細胞数とアポトーシス細胞
数 の 評 価 ，３）免 疫 染 色 法 に よ る 内 部 細 胞 塊（ICM）と栄養外胚葉（TE）の分化比率の評価，

３．結果と考察3 . 1 体外成熟培養後の卵子の成熟ならび品質

４）ガラス化凍結保存に対する耐凍能（生存性）の評価，を行った。

評価
成熟率は，０μＭ区，50μＭ区および100μＭ区

2 . 3 ALA処理によって生産したIVF卵のET後の体内発生能評価の間に差は認められなかったが，200μＭ区において有意（p＜0.05）に低くなった。マウスでは，

本学附属岐阜フィールド科学教育研究センター

高濃度のALA処理が細胞周期を停止させる８）。本

美濃加茂農場で飼養されている黒毛和種より経腟

研究でも200μＭ区は，第１減数分裂中期の卵子採卵法（OPU）で採取した卵子を速やかに研究が多く観察されたことから第２減数分裂中期に至室に持ち帰り，50μM ALAを添加した成熟培地

る減数分裂が途中で停止したことが原因であるとで20時間培養した。その後，IVF卵を生産し，発考えられる。

生培養７日目に得られた胚盤胞のうち形態的に良成熟卵子の細胞質内におけるROSおよびGSH

好なものを１個選抜し，ホルモン処理にて発情周含有量についてはFig.１に示した。ROS含有量は，期を同期化した本学附属岐阜フィールド科学教育

すべてのALA処理区で０μＭ区と比較して有意研究センター柳戸農場で飼養されている未経産の（p＜0.01）に低くなり，GSH含有量は，すべてのホルスタイン牛の子宮深部にETした。残りの胚ALA処理区で０μＭ区と比較して有意（p＜0.01）

盤胞はガラス化凍結保存し，自然発情が観察されに高くなった。ALAはROSを分解できることにた未経産のホルスタイン牛の子宮深部に融解後の加え，GSH合成や酸化型グルタチオン（GSSG）

回復が良好な胚盤胞を１個選抜しETした。２頭の還元に寄与し，細胞質内GSH含有量を増加させの受胚牛の妊娠診断はノンリターン法および超音る。その結果，ROSをより活発的に分解，除去し波検査法で行った。ETから14日前後に発情が回たことが考えられる。

帰していないことを確認し，その後，１頭目は

3.2

ET55日後に，２頭目はET38日後に超音波画像診

体外受精率は，０μＭ区，50μＭ区および100断装置を用いて受胎の有無について評価した。

μＭ区の間に差は認められず，適度なALA処理

2.4

統計解析

体外受精および体外発生能の評価

は体外受精に影響しないことが明らかとなった。

成熟率，受精率，胚発生率および凍結融解後の一方，200μＭ区では，有意（p＜0.05）な低下が生存性評価ではArc-sin変換後の数値を用いた。

認められ，成熟卵の減少に起因するものであるとBartlett検定を用いた分散の均一性を確認後，考えられる。

One-Factor ANOVAにて検定を行い，多重比較

体外発生状況についてはTable１に示した。卵と し て Turkey Kramer ま た は Scheffé の 検 定 を

割率は，各処理区間で差はなかったが50μＭ区が行った。形態的品質の評価にはX 検定を行った。

最も高くなった。胚盤胞形成率は，０μＭ区と比総細胞数，アポトーシス細胞数，ROS，GSH，

較して50μＭ区が有意（p＜0.05）に高くなった。

ICMおよびTE細胞数はOne-Factor ANOVAにてGSHの合成は卵子成熟過程で起こり，発生初期段

２© The Ito Foundation

170

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Fluorescence intensity

1.6
1.2

1.42b

1.37b

ROS

GSH

1.28b

1.00a1.00a
0.80b

0.8

0.69c

0.61c

0.4
0.0

0

50

100

200

Concentrations of α-lipoic acid (μM）
Fig. 1 Effect of α-lipoic acid treatments of the IVM period on intracellular

ROS and GSH levels in matured bovine oocytes. Fluorescenceintensity are normalized to that of the control. Different superscripts
indicate a significant difference（p ＜ 0.01）. Experiments repeated fivetimes（Sample numbers of each groups＝76）.

Table 1 Effect of α-lipoic acid treatments during in vitro

development of bovine embryos＊

maturation period on in vitro＊＊ of embryos develop toNo.（% ± SEM）

ALA conentration（µM）

Number ofembryos
cultured

2-cell ≤Blastocyst ≤0160

99（61.9 ± 2.8）ab

50

160

114（71.3 ± 2.9）aa
54（33.8 ± 1.9）b70（43.8 ± 2.4）

139.4 ± 6.0ab
143.4 ± 5.1a

100

160

101（63.1 ± 2.9）aba
48（30.0 ± 2.6）

130.8 ± 5.3ab

200

160

91（56.9 ± 1.8）bc
17（10.6 ± 3.5）

112.1 ± 8.4b

Day 2

Day 7

Total cell number（mean ± SEM）

＊Experiments were replicated seven times.
＊＊Rate to the number of cultured embryos.
a, b, c Values with different superscripts within each column differ significantly（p＜0.05）.

階の牛胚はGSHの合成が制限されるため，発生初間で差はなかったが，Code １の胚は，０μＭ区期段階で産生されるROSの分解には成熟卵内に（54.1％）と比べて，50μＭ区（60.4％）と100μＭ

蓄積されたGSHを消費する 。卵細胞質内GSHの区（61.0％）で高くなる傾向を示した。一方，総蓄積がその後の抗酸化能を左右し発生能に影響す細胞数は，100μＭ区や200μＭ区と比較して，50ることから，ALA処理がGSHの合成促進とROS

μＭ区で有意（p＜0.05）に高くなった。アポトー

分解によって酸化ストレスを軽減し，細胞オルガ

シス細胞数および総細胞数に対するアポトーシス

ネラの機能改善を介して細胞質成熟が促進され，細胞数の割合は，各処理区間に有意な差は認めら発生能の向上につながったと考えられる。

れなかった（Table２）
。

９）

3.3

総細胞数にしめるICMおよびTE細胞数をTable

胚盤胞期胚の品質評価

形 態 的 品 質 評 価 で は ，Code 1（Excellent or

３に示した。総細胞数は，50μＭ区が他の処理区

Good）およびCode 2（Fair）の数は，各処理区に比べて有意（p＜0.05）に高くなり，ICM細胞© The Ito Foundation

抗酸化物質を利用した牛体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発

171

Table 2 Effect of α-lipoic acid treatments during in vitro maturation period on total cell number andapoptotic cell number of bovine blastocysts＊

ALA conentration（µM）

Number ofembryos
examined

Total cell number

Apoptotic cellnumberApoptotic rate＊＊（% ± SEM）

0

15

176.7 ± 7.0ab

10.5 ± 1.2

6.0 ± 0.7

50

15

195.7 ± 5.4a

100
200

15
15

167.7 ± 3.8b117.8 ± 8.4c

10.6 ± 1.5
9.9 ± 1.4
8.3 ± 1.1

5.4 ± 0.8
5.9 ± 0.8
7.2 ± 0.9

＊Data are mean ± SEM values for 15 embryos.
＊＊Rate of apoptotic cell number to total cell number.
a, b, c Values with different superscripts within each column differ significantly（p＜0.05）.

Table 3 Effect of α-lipoic acid treatments during in vitro maturation period on inner cell mass,

trophectoderm and total cell number of bovine blastocysts＊

ALA conentration（µM）

Number ofembryos
examined

Total cell number

TE cell number

ICM cell number

ICM cell rate＊＊（%±SEM）

110.2 ± 7.4a
129.1 ± 7.8a105.2 ± 6.7a
73.3 ± 9.3b

57.1 ± 5.1ac
88.4 ± 6.6b67.7 ± 4.1ab
39.8 ± 6.2c

34.9 ± 2.1
42.2 ± 3.5
40.5 ± 2.1
35.0 ± 2.4

010167.3 ± 9.5a

50
100
200

10
10
10

217.5 ± 5.7b
172.9 ± 8.8a
113.1 ± 14.8c＊Data are mean ± SEM values for 10 embryos.
＊＊Rate of ICM cell number to total cell number.
a, b, c Values with different superscripts within each column differ significantly（p＜0.05）.

数は，０μＭ区と比較して，50μＭ区において有区（34.4±7.0％）で高くなる傾向を示した。凍結意（p＜0.05）に高くなった。総細胞数に対する融解で起こる細胞損傷の要因に，細胞内脂質があ

ICM細胞数の割合では，各処理区間に差はなかっげられる。卵子や初期胚中に存在する脂質は，耐たが，50μＭ区と100μＭ区が高くなる傾向を示

凍性の低下に関連する11）。複数の抗酸化剤処理にした。牛においてICMへの分化には，組織分化関より，脂質代謝またはミトコンドリア活性化関連

連遺伝子SOX2が関与するとされており，ALA

遺伝子の発現が増加し，脂質量が低下することが処理が当遺伝子の発現動態に影響を及ぼした可能報告されており12，13），ALA処理がミトコンドリア性が考えられる。また，豚やヤギの体外胚生産で機能の活性化を介して代謝機能に影響を及ぼし，は，種々の抗酸化剤処理がOCT4，SOX2および脂質量を減少させることで耐凍性の向上に寄与しCDX2など組織分化関連遺伝子の発現を増加さた可能性がある。また，初期胚の細胞膜を構成す

せ，発生能および分化能を改善することから，本る脂質はROSと反応して過酸化脂質となり，凍結研究でも分子生物学的なアプローチによって発生損傷の要因となる。しかし，内因性の抗酸化物質

能改善の理由を探ることは興味深い。

であるビタミンＥがROSから細胞膜を保護して10）凍結融解した胚の耐凍能は，融解24時間後におおり，ALAおよび還元型のDHLAによるビタミ

ける胚盤胞期胚の回復率を凍結胚数に対する割合

ンＥの再生６）が細胞膜を保護し，耐凍性を向上さで評価した。回復率は，０μＭ区（22.6±9.8％）せた可能性がある。以上のことから，ALAは卵と比べて，50μＭ区（27.9±7.3％）および100μＭ

子の細胞質および細胞膜機能の増強に働くこと© The Ito Foundation

172

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

A

B

Fig. 2 Ultrasound diagnostic images of the fetus. A：48 days after ETof fresh embryo. B：32 days after ET of freeze-thaw embryo.
Wavy circle indicates fetus.

で，耐凍性の向上に有効である可能性が示唆され（IVF）卵生産技術の高度化を目的として，ALAた。

処理が牛IVF卵の生産効率と得られた受精卵の品3.4

体内発生能の評価質に及ぼす影響ならびに受精卵移植（ET）後の新鮮胚，凍結融解胚を移植した受胚牛の両個体において，発情兆候発現の確認から20～22日後に体内発生能（受胎能）に及ぼす影響について検討した。

おいて発情回帰は確認されなかった。超音波画像

その結果，体外成熟培養過程における50μM

妊娠診断では，新鮮胚移植した個体ＡはETから

ALA処理は，成熟卵子における酸化ストレスを55日後に，胎仔の心拍ならびに形態を確認し，凍軽減し，細胞質成熟を向上させることで，体外発結融解胚を移植した個体Ｂは，ETから38日後に生能および胚盤胞の品質を改善することが明らか

胎膜および胎仔の心拍を確認した（Fig.２）。ETとなった。さらに，50μM ALA処理によって生後の受胎能には，胚の発育段階および形態的品産したIVF卵を用いて，２頭の受胚牛に対して新質，胚を構成する細胞や脂質，ミトコンドリアの鮮胚移植ならびに凍結融解胚移植を実施したとこ

数および状態など，胚側の要因も多数あげられ

ろ，いずれの場合も十分な受胎能を有することがる。特に，将来胎仔を形成するICM細胞は，胚の確認された。

着床およびその後の発生に重要なことが明らかと結論として，ALA処理の有効性は，牛IVF卵なっており，総細胞数に対するICM細胞の割合が生産技術の発展に新たな知見を提供し，さらに同

20～40％であることが望ましい 。本研究では，技術のさらなる改善に係わる諸要因の解明と産仔50μM ALA処理区のIVF卵はICM細胞数が最も生産への応用の可能性が示された。本研究で得ら多く，その割合も40％以上と高い値を示した。しれた知見は，牛IVF卵研究の基盤となり，畜産現

たがって，ALA処理によるICM細胞数の増加が場における効率的かつ発展的な産仔生産システム

ET後の受胎能に関与した可能性が考えられる。

の確立に大いに貢献することが期待される。

14）

４．要

約

本研究では，強力な抗酸化物質として知られる
α-リ ポ 酸 （ALA） 処 理 に よ る 牛 体 外 受 精

文献１） Takahashi, M.：Journal of Reproduction andDevelopment, 58, 1～9, 2012.
 Wale, P. L., Gardner, D. K.：Human Reproduction
２）© The Ito Foundation

抗酸化物質を利用した牛体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発
Update, 22, ２～22, 2016.
３） Nikoloff, N., Campagna, A., Luchetti, C., CarranzaMartín, A. C., Pascua, A. M., Anchordoquy, J. M.,
Anchordoquy, J. P., Lombardo, D. M., Seoane, A.,
Furnus, C. C.：Theriogenology, 146, 152～161, 2020.
４）
 An, Q., Peng, W., Cheng, Y., Lu, Z., Zhou, C.,
Zhang, Y., Su, J.：Journal of Cellular Physiology,
234, 17370～17381, 2019.
５） Valko, M., Morris, H., Cronin, M. T. D.：Current
Medicinal Chemistry, 12, 1161～1208, 2005.
６）
 Rochette, L., Ghibu, S., Richard, C., Zeller, M.,
Cottin, Y., Vergely, C.：Molecular Nutrition & Food
Research, 57, 114～125, 2013.
７） Zhang, H., Wu, B., Liu, H., Qiu, M., Liu, J., Zhang,Y., Quan, F.：Theriogenology, 80, 228～233, 2013.
８） T a l e b i , A . , Z a v a r e h , S . , K a s h a n i , M . H . ,Lashgarbluki, T., Karimi, I.：Journal of Assisted
Reproduction and Genetics, 29, 175～183, 2012.

173

 Lim, J. M., Liou, S.S., Hansel, W.：Theriogenology,
９）46, 429～439, 1996.
10）
 Goissis, M. D., Cibelli, J.B.：Biology of Reproduction,
90, 1～10, 2014.
 George, F., Daniaux, C., Genicot, G., Verhaeghe, B.,
11）
Lambert, P., Donnay, I.：Theriogenology, 69, 612～
623, 2008.
12）
 Abe, T., Kawahara-Miki, R., Hara, T., Noguchi, T.,
Hayashi, T., Shirasuna, K., Kuwayama, T., Iwata,
H.：Journal of Reproduction and Development, 63,455～461, 2017.
13）
 Chowdhury, M. M. R., Choi, B. H., Khan, I., Lee, K.
L., Mesalam, A., Song, S. H., Xu, L., Joo, M. D., Afrin,F., Kong, I. K.：Theriogenology, 103, 173～184, 2017.
14）
 Zullo, G., Albero, G., Neglia, G., De Canditiis, C.,
Bifulco, G., Campanile, G., Gasparrini, B.：
Theriogenology, 85, 688～697, 2016.

© The Ito Foundation

174

牛体外受精胚の染色体異常予測技術の開発（Ⅱ）
Development of predictive system of chromosomal abnormality on bovine
in vitro fertilized embryos（II）

杉

村

智

史

（東京農工大学大学院農学研究院）

Satoshi Sugimura（Tokyo University of Agriculture and Technology, Institute of Agriculture）

Chromosomal abnormalities are one of the causes of low viability of bovine in vitro
fertilized（IVF）embryos. This study revealed that＞50％ of bovine IVF embryos that reached
to blastocyst stage have chromosomal aberrations. Chromosomal aneuploidy was confirmed in
more than 50％ of in vitro fertilized embryos that reached the blastocyst. This was suggested
to be a chromosomal aneuploidy of de novo due to in vitro manipulation of the embryo. It wasalso suggested that it is difficult to predict the chromosomal aneuploidy of bovine IVF
blastocysts by conventional morphological quality evaluation or by morphokinetics using timelapse imaging with light microscope.

１．目

つ安価に供給が可能な体外受精卵への期待が高的まっている。さらに，世界に目を向けると生産さ乳用後継牛の激減により，生乳生産量が減少しれている受精卵の50％が体外受精卵という報告もている。他方，和牛繁殖農家戸数の減少により和あり，本邦でも今後は体外受精卵移植が牛生産技

牛素牛価格が高騰しており，その生産性拡大が急術の一翼を担うことが予想される。しかしなが務となっている。そのため，生乳生産を行う雌牛

ら，牛体外受精卵を移植した場合の受胎率は，（乳用後継牛）を計画的に確保しつつ，和牛繁殖

30－50％にとどまっており，農家の経済的損失の雌牛や肥育用の和牛子牛（素牛）も増産する必要一因となっている。また，国レベルでもその損失がある。これらの課題を解決する既存の方法としは無視できず，受胎率の向上は農林水産研究基本て，乳牛に雌の性選別精液を人工授精して後継牛計画の重要目標の一つとなっている。受胎率の向を生産しつつ，性選別精液を人工授精しない残り上において，高品質（生育性の高い）な受精卵をの乳牛群には和牛受精胚を移植することで和牛生確実に選別することが重要であるが，現在，受精産する方法が試みられている。これは，農林水産

卵の品質は国際胚移植学会（IETS）が推奨する省の「酪農及び肉用生産の近代化を図るための基

主観的な形態観察でのみ評価されている。そのた本方針」にも示されている。現在では受精卵移植

め，高受胎が期待できる受精卵を客観的かつ確実による和子牛生産の需要の高まりから，効率的かに選別できる技術の開発が渇望されている。これ© The Ito Foundation

牛体外受精胚の染色体異常予測技術の開発（Ⅱ）

175

までに，形態学的に良好と判断した牛IVF胚の中2.2にも核や染色体異常を有するものが約半数で含ま

体外培養後７日もしくは８日の胚盤胞の透明帯れていることを明らかにし１），この染色体異常のを除去し，PVP-PBS 2μlを含むPCRチューブに有無を予測できないことが受胎率が頭打ちになっ１個ずつ入れた。SurePlex（illumina）により全ている最大の原因であることが示唆されている。

ゲノム増幅（WGA）を施した後，VeriSeq PGS

したがって，この染色体異常の有無を事前に予測

kit（illumina）を用いてライブラリーを作成し，することができれば，受胎率の向上が期待でき

次世代シーケンサーMiSeq（illumina）によるシーる。一方で，近年，ヒト生殖補助医療の分野では，

ケンシングを行った。Btau_4.6.1/bos Tau7のＹ

次世代シーケンサー（NGS）を用いた染色体異染色体の配列を追加したBos taurus参照ゲノム

数性解析が注目されているが，解析コストがかか

ARS-UCD1.2/bos Tau9にマッピングした。そのるほか，瞬時に結果が得られないこと，さらに，後，bowtie2を用いて抽出したユニークリードを

胚の一部をマイクロマニピュレーターを用いて切SAMtools v1.8を用いてBAMファイルに変換し除する必要があることが課題としてあげられる。

た 。全 29 本 の 常 染 色 体 と Ｘ 染 色 体 に お い て ，

そこで本研究では，染色体異常に関連する新規パ

CNV-seqを用いて解析を行った２）。

受精胚のコピー数多型解析

ラメータをタイムラプスシネマトグラフィ

2.3（TLC）を用いて探索することで，牛IVF胚の染発生カイネティクスと染色体異数性との関係に色体異常を簡便かつ非侵襲的に予測可能な新技術

ついては，t-検定，それ以外の有意差検定においの開発を目的とする。

ては，カイ二乗検定を用いた。ｐ＜0.05を統計学的に有意とした。統計解析にはＲを用いた。

２．材料・方法
2.1

統計解析

３．結果・考察

胚の培養とタイムラプス観察

食肉処理場由来卵巣から卵丘細胞卵子複合体（COCs）を採取した。COCsは５％牛血清および3 . 1 体外受精胚および体内受精胚における染色体異数性

0.1IU/ml卵胞刺激ホルモン添加HEPES-TCM199

国際胚技術学会（IETS）の基準をもとに，変で20－22時間培養した。その後，BO液により６性部位が50％以下の胚を移植可能胚であると判断

時間の体外受精を行った。125ul CR1aa培養液をした。移植可能と判断した全32個の体外受精胚の含むマイクロウェル個別培養ディッシュ

うち，Aneuploid胚は18個（56.25％），Euploid胚（LinKID25，大日本印刷）に受精卵を入れ，タイは14個（43.75％）であった。Aneuploid胚のうち，

ム ラ プ ス シ ネ マ ト グ ラ フ ィ（TLC）搭 載 イ ン

ICMのみaneuploidの胚は３個（16.7％），TEのみ

キュベーターで培養および画像所得を行った。

aneuploidの胚は９個（50.0％），ICMおよびTE双TLC画像は15分間隔８日間撮影し，取得した。

方で aneuploidの胚は６個（33.3％）であった。

TLCでは初期卵割のタイミングおよび異常卵割

移植可能胚のうち，半数以上の胚がAneuploid胚の有無［Direct Cleavage（DC）：１細胞から直であり，ICMおよびTE双方でaneuploidの胚より

接3－4細胞に卵割する現象，Reverse Cleavage

も，ICMもしくはTEいずれかで aneuploidの胚（RC）：分裂後に融合する現象，フラグメント：のほうが多く認めれた（Fig. 1A）。

細胞質の断片化］を解析した。

移植可能と判断した全８個の体内受精胚のう© The Ito Foundation

176

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

A

ICM
16.7%
Euploid43.8%

Aneuploid
56.2%

Euploid75.0%

Aneuploid
25.0%

TE
50.0%

ICM・TE
33.3%

B
ICM・TE
50.0%
TE
50.0%

Fig. 1 Frequency of chromosomal aneuploidy in in vitro fertilized（A）and in vivo fertilized embryos（B）. ICM, TE,

ICM・TE show aneuploid in inner cell mass only, trophectoderm only, and both ICM and TE, respectively.

Code2

11.1 11.1 11.1

Code1

8.7
0%

66.7

34.8
20%
ICM

21.7
40%

TE

60%

ICM・TE

34.8
80%

100%

Euploid

Aneuploid
Fig. 2 Relationship between morphological quality and chromosomal aneuploidy. ICM, TE, ICM･TE show aneuploid in

inner cell mass only, trophectoderm only, and both ICM and TE, respectively.

ち，Aneuploid胚は２個（25％），Euploid胚は６移植可能胚をさらに２つのグレードに分けて評価

個（75％）であった。Aneuploid胚のうち，TEのした。変性部位が15％以下のものはCode1，変性

みAneuploidの胚は１個（50％），ICMおよびTE部位が50％以下のものはCode2とした。Code1の双 方 で aneuploid の 胚 は １ 個（50 ％ ）で あ っ た

胚は23個，Code2の胚は９個であった。Code1と（Fig. 1B）。以上の結果より，胚盤胞における高Code2の胚で，Euploid胚，ICMのみAneuploidの頻度での染色体異数性は体外受精特有の現象であ胚，TEのみAneuploidの胚，ICMおよびTE双方ることが示された。

で aneuploidの胚の割合を比較したいずれの群で3 . 2 形態的品質コードと染色体異数性との関係もCode1とCode2において有意差は認められな

IETSによる胚の品質評価基準にしたがって，かった。計24個のCode1の胚のうち，Aneuploid© The Ito Foundation

177

牛体外受精胚の染色体異常予測技術の開発（Ⅱ）
Table 1 Duration of each cell cycle of aneuploid and euploid bovine IVF embryos. Values indicate mean±SD.
cc1

cc2

cc3

cc4

Aneuploid26.34±1.40  10±0.81

8.74±1.07

48.26±13.41

Euploid

26.51±1.98

9.86±1.05

8.21±0.86

47.34±1.91

胚は15個（62.5％）であり，形態的評価によりいことから，今後は倍数性の解析も含めた染色体

excellentもしくはgoodと判断した胚のなかにも，の解析が必要である。

Aneuploid胚が半数以上存在していた（Fig.２）。
以上，従来の形態学的な品質評価では染色体異数性の可否は予測できないことが示された。
3.3

４．要

約

胚盤胞に到達した体外受精胚の50％以上で染色発生速度と染色体異数性との関係

体異数性が確認された。これは，胚の体外操作に

TLCによって２細胞（t2），３細胞（t3），５細起因するde novoの染色体異数性であることが示胞（t5），９細胞（t9）の出現のタイミングを観唆された。また，従来の形態学的品質評価か可視察し，cc1（＝t2），cc2（＝t3－t2），cc3（＝t5－

光タイムラプスによる発生カイネティクスによるt3）， cc4 （＝ t9 － t5） の 期 間 を 算 出 し た 。

評価では，牛IVF胚盤胞の染色体異数性を予測す

Aneuploid胚とEuploid胚を比較したところ，cc1

ることは困難であることが示唆された。

からcc4のいずれの期間においても有意差は認められなかった（Table１）。
3.4

異常卵割と染色体異数性との関係

第一卵割でDCを起こした胚は全８個であった。
このうちEuploid胚は５個（62.5％），Aneuploid
胚は３個（37.5％）であった。また，部位別に見る と ，TE の み aneuploid の 胚 が ４ 個（80 ％ ），ICM と TE 双 方 で aneuploid の 胚 が １ 個（20 ％ ）であった。また，RCを起こした胚は１個であり，この胚はICMのみaneuploidの胚であった。フラ
グメントを放出した胚は２個であった。そのうち
１ 個 は Euploid 胚 で あ り ， １ 個 は ICM の み
aneuploidの胚であった。以上の結果から，必ずしも異常卵割が染色体異数性の原因になるとは限らないことが示唆された。一方で，胚盤胞に到達した胚の約12％が多前核を有すること３），異常卵文
献１） Yao, T., Suzuki, R., Furuta, N., Suzuki, Y., Kabe, K.,
Tokoro, M., Sugawara, A., Yajima, A., Nagasawa, T.,
Matoba, S., Yamagata, K., Sugimura, S. : Live-cell
imaging of nuclear-chromosomal dynamics inbovine in vitro fertilised embryos, Sci Rep, 8, 7460,
2018.
２）
 Nagai, H., Okada, M., Nagai, Y., Sakuraba, Y.,
Okae, H., Suzuki, R., Sugimura, S. : Abnormal
cleavage is involved in the self-correction of bovine
preimplantation embryos, Biochem Biophys Res
Commun, 562, 76～82, 2021.
３）
 Suzuki, R., Okada, M., Nagai, H., Kobayashi, J.,
Sugimura, S. : Morphokinetic analysis of pronuclei
using time-lapse cinematography in bovine
zygotes, Theriogenology, 166, 55～63, 2021.
４）
 Sugimura, S., Akai, T., Hashiyada, Y., Somfai, T.,
Inaba, Y., Hirayama, M., Yamanouchi, T., Matsuda,
H., Kobayashi, S., Aikawa, Y., Ohtake, M.,
Kobayashi, E., Konishi, K., Imai, K. : Promisingsystem for selecting healthy in vitro-fertilized
embryos in cattle, PLoS One, 7, e36627, 2012.

割した多くの胚が混倍数体であることを明らかにしている４）。今回用いた染色体解析方法では，半数体や多倍体といった倍数性の異常を検出できな© The Ito Foundation

178

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基盤的研究（Ⅲ）
Study of circulating microRNA as biomarker for pregnancy in cattle（Ⅲ）

木崎景一郎・金澤朋美・髙橋

透（岩手大学農学部共同獣医学科）

Keiichiro Kizaki, Tomomi Kanazawa and Toru Takahashi（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University）

The development of new early pregnancy diagnostic methods is very important inconsidering livestock productivity. However, the method for early and reliable diagnosis has
not been established at present. In this study, we showed that miR-2455

is an optimalreference gene for comparing plasma miRNA content in estrous cycle cows and pregnant andnon-conceived cows on day 21 after artificial insemination. In addition, further validation was
performed on seven plasma miRNAs, which are candidates for gestational diagnostic
biomarkers at day 21 post-artificial insemination in cattle. These results suggest that miR-G
has a specific low level in pregnant herds and may be an indicator for diagnosing pregnancy.
There was no significant difference in other miRNAs between pregnant and non-pregnant
cows, but there was a trend toward higher levels at pregnancy compared to non-pregnant
cows when compared individually, suggesting that a possible indicator of pregnancy may beprovided by examining comparative methods.

１．目

あるが，早期における正確な診断には熟練した手的技が必要である２）。こうした背景から，簡易的か

畜産業において，空胎期間をできるだけ短くすつ低侵襲的に採取可能な血液の検査による妊娠診ることは繁殖成績の評価や生産性向上のために重断法が求められている。近年では，末梢白血球の要であり，人工授精後に不受胎牛を早期に発見す

遺伝子発現を指標とした手法３）や，血液中の妊娠る必要がある。牛においては，発情周期日数であ

関連糖タンパク質を指標とした手法４）も提案される21日以内に受胎していない個体を発見することている。

で次回の発情時に速やかに再授精を行うことがで

マイクロRNA（microRNA，miRNA）は，21

きる 。牛の妊娠診断法として，現在日本では主～25塩基対の短い一本鎖non-cording RNAであに直腸検査法，超音波診断法，ノンリターン法なり，遺伝子発現の調節において重要な役割をもっどが用いられている。直腸検査法では早くても人ている５）。miRNAの前駆体はヘアピン構造をも工授精後30日以降で可能である。超音波診断法でつpre-miRNAで，RNA polymeraseⅡによっては最短で人工授精後25～27日以降で診断が可能で転写されたpri-miRNAがRNaseⅢの一種である

１）© The Ito Foundation

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基盤的研究（Ⅲ）

Droshaによって切断されることで生成される。
pre-miRNAは核内から細胞質へ輸送され，同じ

２．方

179

法

くRNaseⅢの一種であるDicerによって切断され2.1

ることで２本鎖miRNAとなる。２本鎖miRNAは

人工授精後21日目（Ｄ21）の黒毛和種牛から採Argonaute2（Ago2）タンパク質と複合体を形成血を行い，超音波検査による妊娠診断（人工授精することで１本鎖の成熟型miRNAとなり，さら

後40日目頃）の結果により妊娠牛群（P21，n＝に標的のメッセンジャーRNA（mRNA）と特異

22）および不受胎牛群（NP21，n＝15）に分けた。

的に結合し，標的mRNAの翻訳抑制や切断を引

また，人工授精前の発情周期牛から採血を行い，き起こす。miRNAはこのようにして遺伝子の発発情周期牛群サンプルとした（E，n＝５）。採取

現を調節することで，生体内のさまざまな生理的した血液サンプルから前述のとおりにして血漿を現象を制御していると考えられている。細胞で生分離し，－80℃で保存した．

成されたmiRNAはその細胞内で働くだけではな
く，エクソソームなどの細胞外小胞や高密度リポ

供試材料

2 . 2 miRNA抽出と定量的リアルタイムRTPCR

タンパク質（HDL）などのリポタンパク質に内血 漿 試 料 か ら の miRNA 抽 出 に は miRNeasy

包されたり，Ago2タンパク質と結合した状態でSerum/Plasma Kit（QIAGEN）を使用し，Mir-X

細胞外に分泌され，輸送された他の細胞に影響を

miRNA First-Strand Synthesis Kit（TAKARA）

与える。血液中を循環するmiRNAの種類は生体を用いて逆転写反応を行い，miRNAからcDNA

内の現象を反映しているとされ，がんをはじめとを 合 成 し た 。定 量 的 リ ア ル タ イ ム PCR に は ，した各種疾病のバイオマーカーとしての利用が盛

KOD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）を使用し，んに研究されている 。一方で，獣医療において7300 リ ア ル タ イ ム PCR シ ス テ ム （Appliedは近年，循環miRNAが牛のヨーネ病や乳房炎診

Biosystems）により増幅反応および検出を行っ

断のバイオ―マーカーとしての可能性が報告された。本実験では，昨年度まで本助成研究で同定している７，８）が，実用化された例はまだない。

たmiR-ＡからＤを検証した（現在論文執筆中で

６）

昨年度までの伊藤記念財団助成研究によって，あることから，ここでは具体名の記載はせず，Ａ人 工 授 精 後 18 お よ び 21 日 目 に お け る 牛 血 中からＤとした）。なお，リファレンスmiRNA（内miRNAのプロファイル，さらには発情周期にお在性コントロール）には，同様に先行研究で明らけるmiRNAの動態が明らかになった。そこで本かにしたmiR-2455およびmiR-128を使用した。

研究では，血中miRNAに着目した牛の早期妊娠診断法の基盤確立を目指す。具体的には，昨年度

2 . 3 Receiver operating characteristic curve（ROC）解析までの成果をもとに，多数例の受胎および不受胎

人工授精後21日目の妊娠牛・非妊娠牛群におけ牛の試料を用いた実証試験を実施することによっる血漿中含有量に有意差のあったmiRNAに関して，標的miRNA分子種を用いた妊娠診断の陽性て，診断の指標とした場合の妥当性を評価した。

的中率および陰性的中率の解析を実施し，判定可JMP 統 計 解 析 ソ フ ト ウ エ ア （SAS Institute,

能日齢を含めた妊娠診断の精度を検証し，基準策USA）によりROC解析を行い，ROC曲線線下面定の基盤を構築する。

積（Area under curve：AUC）およびカットオ
フ 値（Youden’s index）を 算 出 し た 。算 出 し た© The Ito Foundation

180

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

カットオフ値と超音波診断による診断結果から感周期も含めたリファレンス遺伝子としての妥当性

度，特異度，陽性的中率および陰性的中率を求めを検討した。発情周期０～20日における平均血漿た。感度＝（TP/TP＋FN）
×100，特異度＝（TN/

中含有量と，Ｄ21妊娠牛群および不受胎牛群におTN＋FP）
×100，陽性的中率＝（TP/TP＋FP）
×

ける血漿中含有量を比較したところ，各群の間に100，陰性的中率＝（TN/TN＋FN）
×100から算出

有意差は認められなかった（Fig.１）。

した。TP：True Pregnant，血漿中miR-126-3p

RT-qPCRによる定量では，適切なリファレンによる診断において妊娠と診断され，かつ超音波

ス遺伝子によるデータの標準化が重要であり，診断装置による診断においても妊娠と診断された

誤ったリファレンス遺伝子の選択は定量結果に大もの。FP：False Pregnant，血漿中miRによる診

きく影響する９）。通常，細胞や組織で発現する遺断において妊娠と診断されたが，超音波診断装置

伝 子 の 発 現 解 析 で は ， glyceraldehydeによる診断では非妊娠と診断されたもの。TN：

3-phosphate dehydrogenase や beta-actin な ど とTrue Nonpregnant，血漿中miRによる診断においったハウスキーピング遺伝子が用いられるが，いて非妊娠と診断され，かつ超音波診断装置によ

血漿中におけるリファレンス遺伝子についてはまる診断においても非妊娠と診断されたもの。

だ確立していない部分が多い10）。本研究では，リFN：False Nonpregnant，血漿中miRによる診断

ファレンス遺伝子としてmiR-2455およびmiR-

において非妊娠と診断されたが，超音波診断装置

128の二種類に着目し，血漿中含有量を調べたとによる診断では妊娠と診断されたもの。

ころ，今回比較対象とした三群の間では安定しており，リファレンス遺伝子として適切であった。

３．結果と考察

しかし，miR-128に関しては，miR-2455や測定

3 . 1 血漿中miRNA定量におけるリファレンス

した他のmiRNA分子種に比べて血漿中含有量が少ないことから，発情周期牛と妊娠・不受胎牛の遺伝子の検討昨年度までの研究において，Ｄ21妊娠牛群およ

血漿中miRNA含有量の測定において，血漿中含び不受胎牛群間の比較でリファレンス遺伝子とし有量が十分あり安定性の高いmiR-2455のほうがて適切であることが示されたmiR-2455，およびリファレンス遺伝子としてはより適切であるとい既報の論文でリファレンス遺伝子として用いられえる。

Circulating miRNA(copy number)ていたmiR-128の２個のmiRNAについて，発情miR-128

miR-2455
150000

40000

100000

20000

50000
0

E

NP21

P21

0

E

NP21

P21

Fig. 1 Abundances of circulating miR-2455 and -128 in estrous, pregnant and non-pregnant cows.

Plasma miR-2455 and -128 quantities were measured by quantitative RT-PCR. Peripheral

blood was collected from estrous cycle（E）, day 21 pregnant（P21）and day 21 non-pregnant（NP21）cows.

© The Ito Foundation

181

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基盤的研究（Ⅲ）

Circulating miRNA (miR/miR-2455)

10
8
6
4
2
0

miR-A

6
4
2
P21

NP21

miR-C

4

NP21

P21

miR-D

4

2

2

1
NP21

P21

miR-E

6

0

NP21

P21

miR-F

0.08
0.06

4

0.04

2
0

0
6

3

0

miR-B

8

NP21

P21

0.02
0

NP21

P21

miR-G

3
2

＊

1
0

NP21

P21

Fig. 2 Circulating miRNA quantities in pregnant and non-pregnant cow on day 21 gestation.

Circulating miRNA（miR-A to G）from day 21 pregnant（P21）and day 21 non-pregnant（NP21）cows were analyzed by quantitative RT-PCR. Each values represent number ofdetected miRNA. Data are shown as mean±SEM. ＊p＜0.05.

3.2

小規模実証試験1

Ｄ 21 妊 娠 牛 お よ び 不 受 胎 牛 に お け る 血 漿 中た検証を行った。各種miRNAの血漿中含有量については，miR-Ｇが妊娠牛群で有意に低値を示

0.8
Sensitivity

miRNA含有量について，さらに試料数を増やし

0.6
0.4

したが，そのほかのmiRNAに関しては両群で有0.2

意な差は認められなかった（Fig.２）。miR-Ｇに0関して，実際に診断に用いた際の妥当性をROC
解析により評価した。算出されたカットオフ値は1.25であった。また，検査法としての診断能の程度を示すAUCは0.75であり，中程度の妥当性であると予測された（Fig.３）。ROC解析により算出

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1-Speciﬁcity
Fig. 3 ROC curve of circulating miR-G as a biomarker

for diagnosis of gestation.

T he values of circulating miR-G from day 21

pregnant（P21）and day 21 non-pregnant（NP21）
cows were analyzed by ROC curve analysis.

© The Ito Foundation

182

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

されたカットオフ値に基づいて血中miR-Ｇ値に期にかつ確実に診断する方法は確立されていない

よる妊娠診断を行った結果と，超音波診断法によのが現状である。本研究では，まず発情周期牛おる診断の結果から算出した感度は73％，特異度はよび人工授精後21日目の妊娠・不受胎牛における73％，陽性的中率は80％，陰性的中率は67％で血漿中miRNA含有量を比較する際のリファレン

あ っ た 。miR-G の ROC 解 析 に よ り 算 出 さ れ たス遺伝子として，miR-2455が最適であることを

AUCは0.75であり，現段階では診断法としての妥示した。さらに，牛の人工授精後21日目における当性は高くないことが示された。人工授精後の牛妊娠診断バイオマーカー候補である７個の血漿中においては，再授精に備えて不受胎牛を早期に摘miRNAについて，さらなる検証を行った。その発することが重要である。したがって，人工授精

結果miR-Gが妊娠牛群で特異的な低値を示し，妊後21日目における早期妊娠診断法では特異度が高娠診断の指標となることが示唆された。また，他

いことが望ましいが，現段階での血中miR-Gを用のmiRに関しては，妊娠牛群と不受胎牛群の間でいた診断の特異度は73％と高くはなかった。診断

有意な差は認められなかったものの，個体別に比法としての実用化に向けては，今後さらに検体数

較すると非妊娠時に比べて妊娠時に高値となる傾を増やした検証を行う必要がある。miR-Gはさま向がみられ，比較方法を検討することで妊娠の指ざまな動物種の間で保存されているmiRNAであ標となる可能性があることが示唆された。

り，免疫や血管新生の経路に関与しているとされる。一方で妊娠に関連する報告はまだなく，妊娠
牛血漿における含有量の低下の機序に関しても今後の課題であると考えている。
さらに，連続して人工授精を行った個体に関して，それぞれのＤ21における血漿中miRNA含有量を比較した（data not shown）。最初の人工授精で不受胎，次の人工授精で妊娠した個体においては，不受胎時に比べて受胎時にいくつかのmiRが有意に高値，もしくは高値となる傾向がみられた。最初の人工授精で不受胎，次の人工授精でも不受胎であった個体に関しても同様の比較を行ったところ，いずれのmiRに関しても血漿中含有量の変化は認められなかった。これらの結果は，各
miRの血漿中含有量には個体差が存在するが，各個体では妊娠により血漿中含有量が増加する可能性を示唆している。
４．要約

新たな早期妊娠診断手法の開発は，家畜の生産

文
献１）
 Lucy, M., Green, J., Poock, S.：Proceedings,
Applied Reproductive Strategies in Beef Cattle(August 31-September 1), 367～375, 2011.
２）
 Balhara, A. K., Gupta, M., Singh, S., Mohanty, A.
K., Singh, I.：The Scientific World Journal, 958540,
2013.
３）
 Kizaki, K., Shichijo-Kizaki, A., Furusawa, T.,
Takahashi, T., Hosoe, M., Hashizume, K.：
Reproductive Biology and Endocrinology, 11, 6,
2013.
４）
 Reese, S. T., Pereira, M. H. C., Edwards, J. L.,
Vasconcelos, J. L. M., Pohler, K. G.：Theriogenology,
106, 178～185, 2018.
５） Bartel, D. P.：Cell, 116, 281～297, 2004.
６）
 Mitchell, P. S., Parkin, R. K., Kroh, R. M., et al.：Proceedings of the National Academy of Sciences,
105, 10513～10518, 2008.
７）
 Farrell, D., Shaughnessy, R. G., Britton, L.,
MacHugh, D. E., Markey, B., Gordon, S. V.：PLoS
One, 10, e0134310, 2015.
８）
 Lai, Y. C., Fujikawa, T., Maemura, T., Ando, T.,
Kitahara, G., Endo, Y., Yamato, O., Koiwa, M.,
Kubota, C., Miura, N.：PLoS One, 12, e0177182, 2017.
９） Pfaffl, M. W., Tichopad, A., Prgomet, C., Neuvians,
T. P.：Biotechnology Letter, 26, 509～515, 2004.
10）
 Liu, X., Zhang, L., Cheng, K., Wang, X., Ren, G.,
Xie, P.：Journal of Affective Disorders, 163, 133～
139, 2014.

性を考えるうえで非常に重要である。しかし，早© The Ito Foundation

183

妊娠末期の黒毛和種における子宮動脈血流動態および胎盤の血流面積による胎盤機能および新生子牛の健全性の推定Estimation of placental function in dums and health of newborn inJapanese Black cattle based on uterine arterial and placental blood flow
hemodynamics in late pregnancy

伊

賀

浩

輔

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター畜産飼料作研究領域）

Kosuke Iga（Division of livestock and Forage Research, Tohoku Agricultural Research Center, NARO）

In this present study, the relationship between the peripheral blood estrone sulfate（E1S）
concentration of Japanese Black cows and the uterine artery blood flow（BFV）dynamics on
the pregnant horn side or the placental blood flow area（PBFA）at the end of pregnancy, andthe relationship between these blood flow dynamics and the birth weight and vitality of
newborn calves were investigated. As a result, peripheral blood E1S and BFV in cows thatdelivered normal calves（N group：n=9）were increased significantly（p<0.05）from day 270 to
290 of pregnancy, and there were showed similar transition pattern. The ratio of PBFA
remained in the range of 0.13 ± 0.01 to 0.14 ± 0.01

regardless of the days of pregnancy, andit showed a different transition pattern from the peripheral blood E1S production rate. The
peripheral blood E1S concentration in the stillbirth（S group：n=1）remained lower than thatin the N group regardless of the days of pregnancy. In addition, the ratio of PBFA was lower
than that of the N group and decreased from 0.12 to 0.08 on the 275 to 280 days of pregnancy.
On the other hand, with some exceptions in N group, when BFV at the near the day ofparturition is high, the birth weight is heavy, and when BFV is low, it is light. In the S group,
BFV was lower than in the N group, and the birth weight was the lightest at 29 kg. The ratioof PBFA at the near the day of parturition was concentrated in the range of 0.1 to 0.15
regardless of the birth weight of newborn calves, but it was low（0.08）in the S group. In
conclusions, it was suggested that the normality of placental function and fetal development
could be evaluated by examining BFV dynamics or the ratio of PBFA on Japanese Black cows
in the end of pregnancy.

１．目

常が60％を占めており，そのうち子牛虚弱症候群

的やその他の胎子異常が大部分を占めている。加え2017年度農林水産省家畜共済統計によると，肉て，難産を起因とする母牛の廃用や分娩後の繁殖

用牛の胎子・出生子牛の死廃事故のうち新生子異機能の回復遅延などを含めると，潜在的な子牛生© The Ito Foundation

184

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

産に及ぼす影響は大きく，安定的な子牛生産は期待できない。

２．方法

妊娠末期に胎盤性ステロイドホルモンであるエ2 . 1 妊娠末期の黒毛和種牛における末梢血

ストロンサルフェート（E1S）を経時的に測定す

E1S濃度と妊娠角側子宮動脈血流動態，まることで，胎盤発育と機能の正常性だけでなく，たは胎盤の血流動態との関係

新生子牛の体重・活力（自力で起立・吸乳）を推

妊娠末期の黒毛和種牛10頭を供試し，妊娠270

定できることが報告されている１）。しかしながら，日から分娩まで５日ごとに頸部静脈よりヘパリン

E1S測定系構築に要する時間やコスト，あるいは

加真空採血管を用いて採血した。血液は遠心分離診断薬として販売されていないことから，臨床現後，血漿を採取しE1S濃度の測定まで－35℃で保場での利用は限定されている。

存 し た 。血 漿 中 E1S 濃 度 は 市 販 の ELISA kit

近年，繁殖検診に利用する一部のポータブル型（Estrone-3-sulfate ELISA kit, Arbors Assay

超音波画像診断装置に血流動態の測定が可能なカ

LLC，No. K038-Ｈ1）を用いて測定した。また，

ラーおよびパルスドプラ機能が標準装備されてい妊娠270日から分娩まで５日ごとにカラーおよびる。これらの機能を利用して，牛黄体の血流分布

パルスドプラ機能を有する超音波画像診断装置と黄体機能，ならびに受胎性との関係２），妊娠経（ARIETTA 60 ，日 立 ア ロ カ メ デ ィ カ ル（株））

過に伴う子宮動脈血流量の推移などが報告されてを用い，妊娠角側子宮動脈血流量（BFV）の推

おり ，最近では，臨床現場においても黄体の血移を調べるとともに，直腸検査により触知可能な

流分布を指標とした黄体機能や受胎性の評価が試

複数個の胎盤の直径および血流分布を調べた。なみられている。一方，未発表の成果であるが，自お，BFVの測定，ならびに胎盤の血流分布の観力で起立・吸乳できず，その後死亡した生時体重察に使用したカラーおよびパルスドプラの設定は15kgの低体重子を分娩した黒毛和種牛において，Table１に示した。妊娠270日から分娩まで５日ご

妊娠末期の妊娠角側子宮動脈血流量は正常体重子とにカラーおよびパルスドプラ機能を用い，超音を分娩した群と比較して低く推移する所見を得て波画像診断装置の自動計測機能を用いて１分間当いる。この結果は，妊娠末期に妊娠角側子宮動脈たりのBFV（ml/min）を調べた。測定した各妊血流量を測定することで，新生子牛の体重・活力

娠日数のBFVは妊娠270日のBFVに対する百分率を推定できる可能性を示唆している。

を算出した。また，カラードプラ機能を用い，直３）

そこで本研究課題では，臨床現場において，胎腸検査により触知可能な複数個の胎盤の最大直径

盤発育と機能の正常性，ならびに新生子牛の体における血流分布状況を調べた。カラードプラ画

重・活力を簡便に推定できる診断法の開発のた像は保存し，画像解析ソフト（Image J, Wayne

め，妊娠末期の黒毛和種牛の末梢血E1S濃度と妊

Rasband（NIH））を用いて胎盤面積に占める血娠角側子宮動脈血流動態，あるいは胎盤の血流面

流面積の割合（PBFA）を算出し，末梢血E1S濃積との関係，これら血流動態と新生子牛の体重・度，BFVおよびPBFAとの関係を調べた。

活力との関係を調べた。

2 . 2 新生子牛の体重・活力と妊娠角側子宮動
脈血流動態，または胎盤の血流動態との関係
2 . 1の妊娠末期の黒毛和種牛10頭を供試し，末© The Ito Foundation

妊娠末期の黒毛和種における子宮動脈血流動態および胎盤の血流面積による胎盤機能および新生子牛の健全性の推定

185

Table 1 Setting of ultrasound imaging diagnostic apparatus for measuring uterine arteryblood flow on the pregnancy horn side and placental blood flow distribution.

B modeDoppler mode

Frequency

Uterine arteryblood flow

Placental blood flow
distribution

7.5 MHz

6.5 MHz

Gain

72

65

Dynamic range

7065Frequency

1.6-6.25 MHz

1.3-6.25 MHz

Color gain

115

115

Velocity
Angle

10.0 cm/s
60゜

8.18 cm/s

梢血E1S濃度，BFV，またはPBFAと新生子牛のに増加した。しかしながら，Ｓ群の末梢血E1S濃生時体重・活力との関係を調べるため，新生子牛度およびBFVは，妊娠日数の経過に関わらずＮの生時体重は分娩後８時間以内に測定するととも

群 と 比 較 し て 低 値 を 推 移 し た（Fig. 1a お よ びに，活力は目視，あるいは分娩監視カメラの画像

1b）。さらに，Ｎ群の末梢血E1S産生割合およびより自力で起立・吸乳したか否かで評価した。まBFVは同様の推移パターンを示した（Fig. 2a）。

た，末梢血E1S濃度，BFVおよびPBFAは，それ一方，Ｎ群のPBFAは妊娠日数が経過しても0.13

ぞ れ 分 娩 日 直 近 に 測 定 し た 濃 度 ，BFV お よ び±0.01～0.14±0.01の範囲を推移し，妊娠日数間

PBFAを解析に用いた。

に有意な差は認められなかった。Ｓ群のPBFAは
Ｎ群と比較して低値であり，妊娠275～285日に３．結果と考察PBFAは最大比の0.12から0.08まで低下した（Fig.

3 . 1 妊娠末期の黒毛和種における末梢血E1S
濃度と妊娠角側子宮動脈血流動態，または胎盤の血流動態との関係

1c）。さらに，Ｎ群の末梢血E1S産生割合およびPBFAは異なる推移を示した（Fig. 2b）。
3 . 2 新生子牛の体重・活力と妊娠末期の黒毛本研究に供試した妊娠末期の黒毛和種牛の概和種における末梢血E1S濃度，妊娠角側子

要，新生子牛の生時体重や性別，分娩後の供試牛

宮動脈血流動態，または胎盤の血流動態とおよび新生子牛の所見はTable２に示した。10頭の関係の供試牛のうち，１頭は死産であり，９頭は正常

供試牛は3 . 1と同様にＮおよびＳ群に分類し解な子牛を分娩した。供試牛（ｎ＝10）の平均妊娠析した。その結果，Ｎ群において分娩日直近の末

日数は292.4±1.4日であったことから，本研究で梢血E1S濃度が高い（≧40.0 ng/ml）と新生子牛は，妊娠270～290日の末梢血E1S濃度，BFVおよの生時体重は重く（31～46kg），E1S濃度が低い

びPBFAのデータを用い，正常な子牛を分娩した（＜40.0 ng/ml）と生時体重は軽い（29kg）こと群（Ｎ群）および死産した群（Ｓ群）に分類し，が示され，特にＳ群の分娩日直近の末梢血E1S濃妊娠末期の黒毛和種牛における末梢血E1S濃度と度は28.7 ng/ml，生時体重は29kgであった（Fig.

BFV，またはPBFAとの関係を調べた。その結果，

3a）。また，Ｎ群において一部例外はあるが，分Ｎ群の末梢血E1S濃度およびBFVは妊娠日数の経娩日直近のBFVが多いと新生子牛の生時体重は過に伴い有意（それぞれｐ＜0.05およびｐ＜0.03）

重く，BFVが少ないと生時体重は軽くなること© The Ito Foundation

186

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 2 Age, reproductive histry, days of pregnancy, birth weight and sex, and postpartum clinical findings on

Japanese Black cows and newborn calves.

Newborn calf

Postpartum clinical findings

Cow No.

Age

Reproductive
history

Days ofpregnancy

Birth weight
（kg）

Sex

Cows

Newborn calf

B938

2

1

293

41

♂

Assistance,
Released placentaStand up and suckling

B920

3

1

286

34

♂

Released placenta

B445

7

5

289

42

♀

Released placentaStand up and suckling
ET, Stand up andsuckling

B638
B849

6
3

2
2

297
300

46
41

♂
♂

Released placenta
Released placentaStand up and sucklingStand up and suckling

9

7

287

29

♀

Released placenta

ET, Stillbirth

1

0

292

40

♂

Assistance,
Released placentaStand up and suckling

B1903

2

0

293

41

♂

B204
B326

10
10

8
6

292
295

31
39

♀
♂

30

bc

20

（a）

10
0

Ratio of BFV on the pregnancy
horn (% of day 270)

c

180
160
140

day 270 day 275 day 280 day 285 day 290
Days of pregnancy
Normal（n=9）
Stillbirth（n=1）＊：p<0.03（vs day 270）
＊

＊

120
100
80

（b）
day 270 day 275 day 280 day 285 day 290
Days of pregnancy

180
160
140

Ratio of PBFA
(PBFA / placental area)

0.12

80

0.16

（a）
day 270 day 275 day 280 day 285 day 290
Days of pregnancy
Placenta（n=9）
E1S（n=9）

（b）

0.14
0.12

180
160

0.1

140

0.08
0.06

120

0.04

100

0.02
0

200

day 270 day 275 day 280 day 285 day 290
Days of pregnancy

80

Fig. 2 Relationship between the ratio of the peripheral

0.10

Normal（n=9）
Stillbirth（n=1）

0.08

（c）

0.06

E1S（n=9）
BFV（n=9）Group：None
Days：p<0.01
Inetraction：None

100

0.16
0.14

Stand up and sucklingStand up and suckling

120

0.18

＊

＊

200

Died 40 min postpartum

Ratio of E1S production(% of day 270)

40

Normal（n=9）
Stillbirth（n=1）
a-c：p<0.05bba

Ratio of E1S production and BFV(% of day 270)

60
50

Assistance,
Released placenta
Released placenta
Released placenta

Ratio of PBFA
(PBFA / placental area)

E1S conc.（ng/ml）

B317
B1852

day 270 day 275 day 280 day 285 day 290
Days of pregnancy

Fig. 1 Comparisons of the peripheral blood estrone

sulfate（E1S）concentration（a）, the ratio of uterine
artery blood flow volume（BFV）on the pregnancy
horn side（b）and the ratio of placental blood flowarea（PBFA）from 270 to 290 days of pregnancy inJapanese Black cows（c）that delivered normal
calves and stillborn.

blood estrone sulfate（E1S）production and uterine
blood flow volume（BFV）on the pregnancy hornside（a）,or the ratio of E1S and placental blood flowarea（PBFA）from 270 to 290 days of pregnancy on
Japanese Black cows（c）.

が示された（Fig. 3b）。Ｓ群においては，Ｎ群と比較してBFVが少なく，新生子牛の生時体重も29kgと最も軽かった。一方，分娩日直近のＮ群におけるPBFAは，新生子牛の生時体重に関わらずPBFAが0.1～0.15の範囲に集中したが，Ｓ群の© The Ito Foundation

妊娠末期の黒毛和種における子宮動脈血流動態および胎盤の血流面積による胎盤機能および新生子牛の健全性の推定

187

PBFAは0.08と低値であった（Fig. 3c）。以上の結子の発育および活力は胎盤機能と密接な関係があ果から，妊娠末期の黒毛和種牛において，BFV

り，母体の血中E1S濃度はこれらを的確に反映すは胎子発育や胎盤機能の評価指標として利用可能る指標となり得ることが報告されている１）。本研

であり，また，妊娠末期のPBFAも胎子発育や胎究においても，妊娠末期の黒毛和種牛における末盤機能の評価指標となり得る可能性が示唆された。

梢血E1S濃度は妊娠日数の経過に伴い有意な増加

妊娠257～271日の黒毛和種牛において，子牛のを示し，死産した供試牛では低値を推移（22.4～

生時体重が正常および低体重に関わらず母体の血28.7 ng/ml）することから，過去の報告と同様に，

中E1S濃度は増加する。しかし，低体重子では正妊娠末期の黒毛和種牛において，血中E1S濃度は常体重子と比べてE1S濃度は低く，子牛体重との胎子発育や胎盤機能を反映する指標であることが間に正の相関が認められ，虚弱子では母体の血中示された。

E1S濃度は低値を推移する。これらのことから胎肉用牛（アンガス種）において，妊娠の経過に伴いBFVは増加する。妊娠90日以降から妊娠おBirth weight（kg）

50に最大流量に達する３）。本研究においても，分娩20

日直近のBFVは妊娠270日と比較して有意に高

10
0

10
20
30
40
50
60
70
E1S conc.
（ng/ml）most recent on the day of parturition

50
Birth weight（kg）

胎子発育に伴い妊娠角側BFVは増加し，分娩前

（a）

30

0

のBFVは妊娠270日と比較して増加するが，正常ることが示された。新生子牛の生時体重およびStillbirth（n=1）（b）

30

く，特に，死産した供試牛において，分娩日直近
な子牛を分娩した供試牛と比較して低値を推移す

Normal（n=9）

40

BFVとの関係を調べた結果，BFVの低い供試牛20が分娩した新生子牛の生時体重は低い。また，未10発表の成果であるが，自力で起立・吸乳できず，

0

0

2000
4000
6000
8000
BFV
（ml/min）most recent on the day of parturition

50
Birth weight（kg）

よび非妊娠角側のBFVに差が生じ始め，その後，Normal（n=9）
Stillbirth（n=1）

4030

した黒毛和種牛において，妊娠末期のBFVは正常体重子を分娩した群と比較して低く推移する所

Normal（n=9）
Stillbirth（n=1）

40

その後死亡した生時体重15kgの低体重子を分娩見を得ていることから，BFVと胎子発育や健全（c）

性には密接な関係があると考えられ４），BFVを指20標とした胎子発育の正常性評価の可能性が示唆さ

10
0
0.0

れる。
0.1

0.1

0.2

0.2

Ratio of PBFA
（PBFA/ placental area）most recent on the
day of parturition

Fig. 3 Relationship between the birth weight of newborn

Japanese Black calves and the peripheral blood
estrone sulfate（E1S）concentrations（a）, uterine
artery blood flow（BFV）on the pregnancy hornside（b）,or the ratio of the placental blood flow area
（PBFA）most recent on the days of parturition（c）.

一般的に胎盤は母体・胎子間で呼吸ガス，栄養素および老廃物の交換が行われる器官であり，胎盤を介したこれらの交換は，子宮および臍帯の血流に依存していることが知られている。ヒツジでは生時体重と胎盤重量に正の相関が認められ，また，子宮や臍帯動脈血流量と胎盤重量にも正の相© The Ito Foundation

188

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

関が認められており５），子宮や臍帯動脈血流量のとは異なる推移パターンを示した。死産した群増減が胎子発育や胎盤機能に影響を及ぼすことが（Ｓ群）の末梢血E1S濃度は，妊娠日数の経過に報告されている６）。本研究において，死産した供関わらずＮ群と比較して低値を推移した。また，試牛のPBFAは正常な子牛を分娩した供試牛と比PBFAはＮ群と比較して低値であり，妊娠275～

較して低値であり，妊娠日数の経過に伴いに減少

280日に面積比0.12から0.08まで低下した。一方，する。また，新生子牛の生時体重と分娩日直近の

新生子牛の生時体重および分娩日直近のBFVとPBFAの関係を調べた結果，正常な子牛を分娩，の関係を調べた結果，Ｎ群において一部例外はあまたは死産した供試牛のPBFAは0.1を境界としてるが，分娩日直近のBFVが多いと新生子牛の生分類できることから，PBFAを指標とした胎子発時体重は重く，BFVが少ないと生時体重は軽い

育や胎盤機能の正常性評価の可能性が示唆されことが示された。Ｓ群においては，Ｎ群と比較しる。今後，妊娠末期の黒毛和種牛のBFV，PBFAてBFVは少なく，新生子牛の生時体重も29kgとおよび新生子牛の体重・活力などの所見を積み上最も軽かった。また，分娩日直近のＮ群におけるげることで，臨床現場でカラーおよびパルスドプ

PBFAは，新生子牛の生時体重に関わらず0.1～

ラ機能を有するポータブル型超音波画像診断装置

0.15の範囲に集中したが，Ｓ群では0.08と低値でを利用し，胎子発育や胎盤機能の正常性および新あった。以上のことから，妊娠末期の黒毛和種牛

生子牛の体重・活力を簡便に推定できる診断法のにおけるBFA,PBFAを調べることで胎盤機能の開発が期待できる。

正常性や胎子発育を評価できる可能性が示唆され

４．要

た。

約

本研究では，妊娠末期の黒毛和種牛の末梢血エストロンサルフェート（E1S）濃度と妊娠角側子
宮動脈血流動態（BFV），または胎盤の血流面積（PBFA）との関係，これら血流動態と新生子牛の体重・活力との関係を調べた。その結果，正常な子牛を分娩した群（Ｎ群）の末梢血E1S濃度およ び BFV の 割 合 は 妊 娠 日 数 の 経 過 に 伴 い 有 意（それぞれｐ＜0.05およびｐ＜0.03）に増加し，末梢血E1S産生およびBFVの割合は同様の推移パターンを示した。PBFAは妊娠日数を通じて0.13±0.01～0.14±0.01の範囲を推移し，E1S産生割合

文
献１）
 小形芳美，高橋浩吉，阿部浩之，三澤隆，加藤敏英，
酒井淳一，大崎和栄，南保泰雄，中田健，中尾敏彦：
J. Reprod. Dev., 42, j85～j89, 1996.
２）
 Kanazawa, T., Seki, M., Ishiyama, K., Kubo, T.,
Kaneda, Y., Sakaguchi, M., Izaike, Y., Takahashi,
T.：Theriogenology, 86, 1436～1444, 2016.
３）
 Panarace, M., Garnil, C., Marfil, M., Jauregui, G.,
Lagioa, J., Luther, E., Medina, M.：Theriogenology,
66, 2113～2119, 2006.
４） Van Eetvelde, M., Kamal, M. M., Hostens, M.,
Vandaele, L., Fiems, L. O., Opsomer, G.：Animal, 10,1342～1350, 2016.
５）
 Redmer, D. A., Wallace, J. M., Reynolds, L. P.：
Domest. Anim. Endcrinol., 27, 199～217, 2004.
６） Ferrell, C. L.：J. Anim. Sci., 69, 1954～1965, 1991.

© The Ito Foundation

189

糞および尿を検査検体として用いる簡便かつ正確な馬の妊娠診断法の開発
Development of simple and accurate procedure for pregnancy diagnosis
by using fecal and urine samples in the mare

髙

橋

透

（岩手大学農学部）

Toru Takahashi（Faculty of Agriculture, Iwate University）

The aim of this study was to establish simple and reliable procedure for pregnancy
diagnosis in mares. In the present study, the author tried to quantify the urine chemical test
that formerly reported by Cuboni as a qualitative assay. Urinary samples were collected fromdraft mares in Iwate Prefecture, Japan. Collected urine was hydrolyzed by heating withhydrochloric acid to generate free steroids then extracted with toluene. The toluene layer wascollected and mixed with sulfuric acid and further heated. The sulfuric acid layer wastransferred to the

96-well plate and the fluorescence （355/535） was measured byfluorescence counter. The urine fluorescence was quite greater in pregnant samples. Dosedependent increments of fluorescent intensity were observed when estrone, estradiol or equilin
was added to the charcoal-treated urine, whereas progesterone, testosterone and cortisol did
not induce dose-dependent fluorescence. Results in the present study suggested that intense
fluorescence in pregnant mare urine was caused by estrogens excreted to the urine. Urinary
fluorescence greatly increased from the second trimester of gestation to term and thedifference between the pregnant and open samples was quite prominent. Urine samples
collected from the pony and miniature breed mares with impracticability of rectal palpation
owing to smaller body size were subjected to quantitative fluorescent assay. Although the dateof mating were not checked in most mares, all mares（7/7）were diagnosed as pregnant by
urine fluorescent assay and confirmed subsequent foaling. Results in the present study showedthat the Cuboni test, the urine fluorescent determination for pregnancy diagnosis in the mare,could be quantitatively evaluated by fluorometry. Quantitative Cuboni test could be utilized for
pregnancy diagnosis beyond the second trimester of gestation not only in the draft mare but
also pony and miniature breed mares with impracticability of rectal palpation owing to smaller
body size.

１．目

判定法の開発を目的とする。農用馬は，春の繁殖的期に受胎が確認された後は晩秋まで牧野に放牧さ本研究は，農用馬（ブルトン種，ペルシュロン

れる場合が多い。競走馬として手厚く管理される

種および日本輓系種など）の簡便かつ正確な妊娠

サラブレッド種に比べて，農用馬は粗放な環境で© The Ito Foundation

190

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

飼養される傾向があり，受胎率や分娩率，産駒生

塩酸0.5mlを加えて攪拌して，90℃で15分間加熱

産率などの指標は，競走馬よりも劣ることが報告した後に室温に放置して放冷した。室温まで冷えされている１）。

た試験管にトルエン３mlを加えて２分間攪拌し

秋の退牧時に妊娠診断を行って「山落ち（牧野た後に３分間静置してトルエン層が明瞭に分離しでの流産）」をチェックすることは，妊娠後期のた後にトルエン層２mlを別のガラス試験管に移飼料の増給や，流産の場合に翌年早くからの繁殖

して濃硫酸0.5mlを加えて攪拌した後に80℃で20を準備するために欠かせないが，秋の妊娠診断は分間加熱した。

農用馬の生産現場ではあまり普及していない。そ試験管を室温に放置して放冷し，トルエン層のこで本研究では，農用馬生産者が容易に採取でき下の硫酸層0.3mlを透明96穴プレートに分注し，る検体を検査試料として，簡便な手法で実施でき

励起波長355nm，蛍光波長535nmの蛍光強度を測る妊娠判定法を確立することを目的とする。

定した。
2 . 2 定量Cuboni反応のステロイド特異性の検

法

２．方

討

岩手県内で飼養されている農用馬の繁殖牝馬27

活性炭処理した馬尿にエストロン，エストラジ

頭から尿を採取して分析に供した。また，臨床例

オール，エクイリン，プロゲステロン，テストスの実証試験では，岩手県内で飼養されているポ

テロン，コルチゾールをそれぞれ0.5μg/ml，５ニーやミニホースなどの牝馬７頭（いずれも体格

μg/mlおよび50μg/mlの濃度になるように添加が小さく，直腸検査が実施不可能）から採尿し，して，上記2 . 1 . 3の方法で蛍光強度を測定した。

定量Cuboni反応による妊娠判定を実施し，その2 . 3 尿検体の加水分解と有機溶媒抽出が蛍光後の分娩経過を調べた。

強度に及ぼす影響2 . 1 妊娠馬の尿と硫酸の反応によって生じる

上記2.1.3の方法では尿検体を塩酸で加水分解処

蛍光反応を応用した定量測定法の開発

理した後にトルエン抽出を行ったが，加水分解処

2.1.1

理とトルエン抽出が蛍光強度に及ぼす影響を検討

Cuboni反応２）の三宅変法３）

100mlのガラスフラスコに被験尿１mlと蒸留水
９mlを加え，さらに濃硫酸15mlを添加した。濃した。
2 . 4 定量Cuboni反応の蛍光強度と尿中エスト

硫酸の添加によって溶液が発熱するので，フラス

ロゲン濃度との関連性

コの外側を水道水の流水で冷却しつつ内容液を攪

上記2 . 1 . 3の方法で蛍光強度を測定したすべて拌した。溶液が室温まで冷えた後にフラスコを強の尿検体を用いて，尿中エストロン濃度を酵素免

光にかざして蛍光を観察した。

疫測定法で測定した。測定に先立ち，尿検体を塩2.1.2

観察法の比較

酸で加水分解処理し，加水分解物をジエチルエー

受胎馬と不受胎馬の尿を試料として上記のCuboni反応を行い，フラスコを，①太陽光，②テルで抽出してエーテル抽出物のエストロン濃度を測定した。

蛍光灯，③紫外線ランプ，にかざした時の蛍光を

2.5

観察した。

馬の妊娠ステージの前期（妊娠120日齢まで），

2.1.3

中期（妊娠121～240日齢）および後期（妊娠241

Cuboni反応の定量評価

尿検体３mlをガラス試験管にとり，これに濃定量Cuboni反応の妊娠判定精度の検証日以降）の尿検体を試料として定量Cuboni反応© The Ito Foundation

糞および尿を検査検体として用いる簡便かつ正確な馬の妊娠診断法の開発

による妊娠判定検査を行い，判定精度を検証した。
2.6

臨床例の検証3.1.3

191

Cuboni反応の定量評価

上記2 . 1 . 3に記述した方法で尿を検体とした牡馬と同居しても交配日を確認していなかった

Cuboni反応を行い，蛍光光度計（マルチラベル

り，自然交配を実施しても妊娠診断を実施しなカウンターSX，パーキンエルマー社）を用いてかった妊非不明の小格馬７頭から採尿して定量

励起波長355nm，蛍光波長535nmの蛍光測定を実Cuboni反応による妊娠判定を行い，その後の分施したところ，強い蛍光が妊娠検体のみで観察さ娩の有無を調査した。妊娠判定の基準として，蛍れた。蛍光光度計による測定は蛍光強度が数値と光カウントが500万以上の場合を妊娠陽性とした。

して表されるので，蛍光の判定を定量的に実施することが可能であった。蛍光強度は励起光を上方

３．結果と考察から照射した場合により強く認められたが，これ3 . 1 妊娠馬の尿と硫酸の反応によって生じるは下方からの照射では96穴プレートの素材に波長

蛍光反応を応用した定量測定法の開発

355nmの励起光が一部吸収されてしまい，蛍光強3.1.1

度が弱まるためと思われた。よって，以降の実験

Cuboni反応（三宅変法）

非妊娠馬と妊娠馬（妊娠中期）から採取した尿検体を用いて三宅らの方法によるCuboni反応を実施したところ，妊娠尿を検体としたフラスコをは355nmの励起光を上方から照射して535nmの蛍光強度を測定することとした。
3 . 2 定量Cuboni反応のステロイド特異性の検

強光にかざした場合に緑色蛍光が観察された。一討方，非妊娠馬の検体では蛍光は観察されなかっ活性炭処理してステロイドを除去した尿にエスた。蛍光観察の可否は光にかざした際の角度やフトロン，エストラジオール，エクイリン，プロゲ

ラスコの内容を見る眼の位置などによる影響を受

ステロン，テストステロン，コルチゾールをそれ

け，一つのフラスコを複数人で観察した場合にぞれ0.5μg/ml，５μg/mlおよび50μg/mlの濃度

は，全員が同時に蛍光を観察できない場合もあっになるように添加して，Cuboni反応を行って蛍た。また，蛍光はかなり微弱で，肉眼で蛍光あり光強度を測定したところ，エストロン，エストラと判定されてもフラスコを撮影した写真では蛍光ジオール，エクイリンについては濃度依存的に蛍が認められない場合が多かった。

光強度が高まったが，プロゲステロン，テストス

3.1.2

観察法の比較

テロン，コルチゾールには濃度依存的な蛍光強度

Cuboni反応を観察する際には，フラスコを窓の増大は認められなかった（Fig.１）。蛍光強度から入射する天空光や蛍光灯に近づけると蛍光観はエクイリン，エストロン，エストラジオールの察が容易であった。妊娠馬の尿検体が緑色の蛍光順に高かった。よって，Cuboni反応の蛍光は尿を発することから，その励起波長は緑色光よりも中のエストロゲンに由来することが示唆された。

短波長側にあると予想して，UVトランスイルミ

また，この実験で用量依存的な蛍光が観察されたネーター（核酸アガロースゲル電気泳動の臭化エステロイド化合物は，芳香化されたＡ環を有する

チジウム染色観察用）の波長365nmの紫外線ランという点とＣ３に水酸基を有する点で共通していプをフラスコに照射したところ，妊娠馬の尿検体た。

では強烈な蛍光が観察されたが，非妊娠馬の検体
では蛍光が認められなかった。

© The Ito Foundation

192

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

加水分解後のトルエン抽出の有無が蛍光強度に

25
equilinestroneestradiolprogesterone
testosterone
cortisol

Fluorescence（x 106）2015

及ぼす影響を検討したところ，抽出操作によって非妊娠馬の尿検体の蛍光カウントは低下したが，妊娠馬の尿検体の蛍光カウントは４倍以上に増加した。この実験の成績から，加水分解後のトルエン抽出によって非特異蛍光が減少し，エストロゲ

10ンに由来する特異蛍光が効率よく検出されることが示唆された。

50

3 . 4 定量Cuboni反応の蛍光強度と尿中エスト
0

0.5
5
50
Concentration（μg/ml）

Fig. 1 Effects of steroid hormones on urinary fluorescence

ロゲン濃度との関連
定量Cuboni反応の蛍光強度と酵素免疫測定法で測定した尿中エストロン濃度との間には弱い正の相関が認められた（Fig.２）。しかし。決定係
数（Ｒ２）は0.245と高いものではなかった。この3 . 3 尿検体の加水分解と有機溶媒抽出が蛍光原因としては，妊娠ステージによってエストロ
ン，エストラジオール，エクイリンの分泌パター

強度に及ぼす影響
上記の2 . 1 . 3に記述した方法で尿を検体としたンに差があり，イムノアッセイによるエストロン

Cuboni反応を行った際に尿検体に塩酸を添加しの測定値と定量Cuboni法の蛍光強度が一致しなて加熱したが，これは尿中に多量に存在する抱合い場合があることが示唆された。

型ステロイドを加水分解して遊離型ステロイドを

3.5

定量Cuboni反応の妊娠判定精度生成させることが目的であった。血中や尿中には妊娠馬と非妊娠馬の尿検体の定量Cuboni反応

抱合型のステロイドが遊離型の数十倍の濃度で存の蛍光強度を比較すると，妊娠中期（妊娠121～

在しており，これを加水分解することでCuboni

240日）以降は発情期や発情休止期と比較して顕反応に供されるステロイドの量を増やすことがで著な蛍光が観察され，妊娠馬と非妊娠馬の判別はきる。妊娠尿と非妊娠尿を検体としてCuboni反容易であった（Fig.３）。

応を行い，塩酸を加えて加熱する加水分解，塩酸

3.6を加えない加熱処理，および無処理の場合の蛍光

臨床例７頭は，定量Cuboni反応の結果から７強度の違いを検討したところ，塩酸を加えて加熱

頭すべてが妊娠と判定され，後日全頭が分娩した処理した場合には，塩酸無添加の加熱処理や無処（Table１）。

理の場合と比較して，蛍光強度が10倍～100倍以上に増加した。塩酸処理による蛍光強度の増加の臨床例の検証４．要約程度は非妊娠に比べて妊娠馬の尿で大きかった。

本研究で開発した定量Cuboni法で検査した妊

この実験の成績から，塩酸で抱合型ステロイドを娠中期以降の馬尿の蛍光強度は，発情期や非繁殖

加水分解して遊離型を生成させることで，季節（空胎）の場合に比べて著しく高値で，非妊Cuboni反応の判定をより明瞭に行えることが示

娠との差異はきわめて明瞭であった。本研究の成唆された。

績から，定量Cuboni法の蛍光は尿中に含まれる© The Ito Foundation

糞および尿を検査検体として用いる簡便かつ正確な馬の妊娠診断法の開発

193

Fluorescence（x 106）20

15
y = 0.1911x + 7.6805
R２ = 0.24515

10

5

0

0

10
20
30
40
Urinary estroneconcentration（μg/ml）

50

Fig. 2 The relationship between the urinary fluorescence and estrone

concentration during pregnancy in the mare＊Fluorescence （x 10６）

20
15
10
5

0

Estrusn=2

Diestrus
n=9

Early
Mid
Late
pregnancy pregnancy pregnancy
n=3
n=6
n=6

Fig. 3 Urine fluorescence intensities in different reproductive stages

in the mare（＊p < 0.05）

Table 1 Pregnancy diagnosis by quantitative fluorescent assay
No.

mare

breed

breeding method

fluorescence（x10E6）

diagnosis

foaling

1
2
3
4
5
6
7

pony
pony
pony
pony
pony
pony
miniature

crossbredcrossbredcrossbredcrossbredcrossbredcrossbredfalabellapairing
pairing
pairing
pairing
pairing
pairing
natural service

12.53
13.17
12.91
15.41
12.89
12.39
6.88

pregnant
pregnant
pregnant
pregnant
pregnant
pregnant
pregnant

foaledfoaledfoaledfoaledfoaledfoaledfoalednegative control
positive control

draft horse
draft horse

Japanese draft
Japanese draft

nonpregnant
6 mo. Pregnant

1.41
7.47

© The Ito Foundation

194

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

エストロゲンに由来することが示唆された。定量

馬は長日季節繁殖動物であるために繁殖季節がCuboni法にはイムノアッセイに必要な抗体やト

春から夏に限定される。受胎後の試料採取と解析レーサーが不要で，一般試薬を用いて簡便に実施の時期が限定され，まず尿試料の解析に注力した可能であり，蛍光光度計がない場合であっても紫結果，当初の研究計画に予定されていた糞中ステ

外線ランプ（ブラックライト）の照射によって定

ロイドの分析まで着手できなかった。糞中の成分性的な判定が可能という実用上の利点がある。ま

分析による妊娠判定法は今後の課題である。

た，ポニーやミニチュアホースなどの小格馬は，直腸検査が困難である場合が多いが，このような場合でも尿が採取できれば妊娠の有無を検査することが可能である。本研究で測定法の開発に供した尿検体は農用馬から採取したが，本検査法は直腸検査の難しい小格馬においても価値があると思
われる。

文
献
１）
 島村嶺花，和田春菜，北川アミ，窪友瑛，安田出，
暦本学，居在家義昭，髙橋透：産業動物臨床医学雑誌, 8, 98～99, 2017.
２）
 Cuboni, E.：La Clinica Veterinaria, 57, 85～93,
1934.
３） 三宅勝，佐藤邦忠：農用馬増産の手引き（私家版），
pp36-37, 1992.

© The Ito Foundation

195

牛におけるルーメン非分解性ナイアシン給与による子宮，卵巣への血流促進による分娩後の繁殖性向上
Improvement of post-partum reproductive performance by Rumen
protected niacin supplementation in cattle

森

田

康

広＊・松

山

秀

一

（名古屋大学大学院生命農学研究科， 名古屋大学アジアサテライトキャンパス学院）＊

Yasuhiro Morita＊ and Shuichi Matsuyama（Graduate School of Bioagricultiral sciences, ＊Asian Satellite Campuses Institute, Nagoya University）

Niacin（NA）supplementation as rumen-protected niacin（RPN）in cattle increases milk
production and dry matter intake；moreover, side effects, such as niacin-associated skintoxicity and their effect to reproduction performance, have not been investigated in detail. This
study attempts to determine whether oral administration of RPN increases uterine arteryblood flow and whether RPN feeding promotes uterine repair and improves fertility in
postpartum cattle. Experiment 1 involved 6 non-lactating multiparous healthy Japanese Blackcows. The estrus cycles were synchronized and cows were randomly assigned to 2 treatments［control group（0 g RPN, C and supplementation group（60 g RPN, RPN）］and were orally
administered once at 1000 h before the morning feeding. Uterine artery diameter wasmeasured by ultrasonography every 4 hours from 2 hours before RPN supplementation to 42
hours later. In RPN group, the uterine artery diameter was significantly increased at 6 hours
after RPN administration compared to other time points（p<0.05）. In addition, there was asignificant increase in artery diameter at 6 hours after administration in the RPN groupcompared with the C group（p<0.05）. Experiment 2 involved 6 multiparous cows, and cows
were randomly assigned to 2 treatments［control group（0 g RPN, ACC and supplementationgroup（15g RPN, ACRPN）］and were orally administered niacin once at 1000 h every day
before the morning feeding from 1 week after calving. There were no significant differences in
the reproductive performance, however, RI value in ACRPN was tended to higher than ACC
group in 2, 5, and 6 weeks after calving（p<0.1）. The present study indicates that RPN
supplementation could affect uterine blood flow. Moreover, inflammatory tissue needs more
blood flow and decreases RI value in related blood vessels, thereby suggesting RPN
supplementation could support uterine repair in the postpartum period.

１．目

り，酪農や肉牛生産においては，暑熱ストレス下的での繁殖性や乳汁生産性低下を防ぐことは喫緊の地球温暖化に伴う気温上昇によって農業生産は課題である。水溶性ビタミンの一種であるナイア

世界的に甚大な影響を受けることが予想されておシンは，ルーメンバイパス処理をしたものが暑熱© The Ito Foundation

196

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

対策として，一部飼料へ添加されており，乳牛の牛房において子牛と同居させ，子牛の哺乳制限は夏季における乳汁生産量の増加，体温低下作用が行わなかった。その後，分娩後１週間で母子分離報告されている１）。このような効果が報告されてし，その後は別の牛舎で個別に管理した。給餌はいる一方で，ヒトにおいて，高濃度のナイアシン

朝夕の２回行い，飼料としてスーダン，チモシー

摂取はナイアシンフラッシュと呼ばれる表皮直下の乾草のみを日本家畜飼養標準（和牛編）に従いの過剰な毛細血管の拡張を引き起こすことが知ら

規定量給与した。また，水，固形塩は自由に摂取れている２）。

させた。本研究における動物実験は，「名古屋大ナイアシンは皮膚のランゲルハンス細胞のナイ学における動物実験等に関する取扱規程」に準拠

アシンレセプターであるGPR107A受容体に結合

し，名古屋大学大学院生命農学研究科動物実験委

し，プロスタグランディン系を介し，毛細血管に員会の審査・承認を得たうえで実施した。

作用して血管を拡張させ，皮膚からの熱放散を促

2.2

実験プロトコールす 作 用 が あ る 。ま た ，牛 の 子 宮 ，卵 巣 に も2 . 2 . 1 実験１：ルーメン非分解性ナイアシン

GPR107A受容体が存在することも報告されてい（RPN）の給与による腹腔内血流の変化る が反芻動物の生体にどのように作用している

RPN（ナイアコート；日産合成工業株式会社，

か，詳しい作用機構はいまだ明らかになっていな

東京）の給与によって子宮動脈の血流が変化する

い。

かを検証した。６頭の実験牛をランダムにRPN

３）

そこで本研究では，牛においてルーメン非分解

給与群（RPN）と対照群（Ｃ）に３頭ずつ分け，性ナイアシンの経口投与によって子宮への血流量実験を行った。１回目の投与実験終了後に十分なが増加するか，また産後の牛に給与することで子回復期間（約１ヶ月）をおき，両群の個体を入れ

宮修復が促進するかを検討するとともに，分娩後替え同様にもう一度投与実験を行った。供試牛のの初回排卵が早まるかを検討した。

発情をプロスタグランディン製剤投与後に膣内留

２．方
2.1

置型プロジェステロン製剤を挿入することで，黄法体期に合わせ，RPN群はRPN60g（ナイアシンとして31ｇ）を配合飼料100ｇに混合し，午前10時

動物

本実験には，名古屋大学大学院生命農学研究科に経口給与し，Ｃ群は配合飼料のみを給与した。

附属フィールド科学研究センター東郷フィールド

RPN給与開始前２時間から４時間ごとに48時間で飼育されている黒毛和種経産牛を実験１では，子宮動脈の直径を超音波画像診断装置を使用し発情同期化した牛６頭，および実験２では正常にて，測定し記録した。同時に膣内留置型プロジェ

分娩を行った６頭をそれぞれ用いた。実験１ではステロン製剤に組み込んだ小型の温度ロガーにて

コンクリート床にオガクズを敷いたパドックにタ

膣温を体温として実験期間中に継続的に記録した。

イストール形式で３頭ずつ飼養した。実験１では2 . 2 . 2 実験２：分娩後のRPN給与が子宮修復

飼料由来のビタミンによる実験結果への影響を考に与える影響慮し，実験の１週間前から実験期間中は稲ワラの供試牛６頭を分娩後１週間から８週間まで１日みを飼料として給餌は朝夕の２回（朝９時，夕16

15ｇのRPNを朝の給餌に合わせて配合飼料100ｇ時）給与した。また実験２では分娩後１週間までとともに給与した群（ACRPN群），配合のみ給はコンクリート床にオガクズを敷いた単飼の分娩与した対照群（ACC群）にそれぞれ３頭ずつラ© The Ito Foundation

牛におけるルーメン非分解性ナイアシン給与による子宮，卵巣への血流促進による分娩後の繁殖性向上

197

ンダムに振り分けた。その後，１週間に一度，超体間における２元配置分散分析を行い，多重比較音波検査による子宮動脈の観察とメトリチェック

検定としてHolm法を用いた。すべての統計処理による膣内貯留物検査を行った。

は R version 3.5.1（http://www.R-project.org/）

2.3

子宮動脈の観察法

にて行った。

実験１では５MHzリニア型プローブを装着し３．結果と考察た 超 音 波 画 像 診 断 装 置（SonoScape Ⓡ，S6V ，Shenzhen，China）を用いて行った。子宮動脈の3.1

観察はAndo（2007）ら

3.1.1

４）

の報告をもとに外腸骨

実験１
臨床変化

動脈，外腸骨静脈，子宮動脈を描出し，その後静実験期間を通して，実験個体に食欲不振などの止画を保存，画像解析ソフトにて血管径を測定し行動の変化は見られなかったが，RPN投与群のた。実験２では同様に子宮動脈を描出し，ドップ

６頭中４頭でRPN投与後６時間から22時間後にラーモードにてマニュアル操作により，血管抵抗

かけて一過性の体温上昇が観察された。

（RI），拍動係数（PI），平均血流速度（TAMV）

3.1.2を測定した。

RPN経口投与前後の子宮動脈の血管径の変化

2.4

血管径の変化率をFig.１に示す。Ｃ群では実験期間を通して子

メトリチェック宮動脈径は一定していたが，RPN群ではRPN給

メトリチェックによる腟粘液スコアは，の報告を参考にし，膣粘液

与後６時間である16：00において，有意に子宮動に含まれる膿の割合に応じてスコア０からスコア

脈の血管径が給与前２時間，投与後22，26，34，

４までの５段階で評価した。

38，42時間後に比べ増大していた（ｐ＜0.05）。

Sheldon（2006）ら

2.5

５）

また，Ｃ群に比較しRPN群では投与後６時間で統計解析

有意に血管径の増大が見られた（ｐ＜0.05）。

実 験 １ お よ び ２ に お け る 血 管 径 ，RI ，PI ，
TAMVの各値，および変化率については同一個

1.20

＊

1.15
1.10
1.05

↓

1.00
0.95
0.90
0.85
0.80

－2

2

6

10

14

18

22

26

30

34

38

42

Time after RPN administration（h）
Fig. 1 Change
of the diameters of the uterine arteries in six cows in control（C, open circle）and rumen-protectedniacin administration（RPN, filled circle）groups. Values are means±SD of rate change of both right and left
vessels of each six cows from two hours before administration（arrow indicates the time of RPN administration）.
Values of different parameters with different asterisks（＊,）on the same day differ between groups（p＜0.05）.

© The Ito Foundation

198
3.2

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

実験２

3.2.1

RPN給与によって変化せず，また分娩後の時間

臨床変化

経過によっても変化しなかった（ACRPN：1.48

今回実験に供試した６頭すべての個体におい±0.19cm/sec，ACC：1.63±0.11cm/sec）。また，て，難産，後産停滞，産褥熱などの子宮回復に影wk1を基準とした変化率においても有意な差はな

響を与えるとされる疾病は観察されなかった。すかった（Fig. 3b）。

べての産仔に活力があり，母子分離の産後１週間

3.2.5

中に子牛に疾病は観察されなかった。

実験期間中にRPN給与によってTAMVは変化

3.2.2

初回排卵

せず，また分娩後の時間経過によっても変化しな

妊娠黄体の消失および初回排卵後の黄体形成にか っ た（ACRPN：23.01 ± 3.72cm/sec ，ACC：

ついては，ACRPN群：3.3±3.7wk，ACC群：4.0

21.62±1.84cm/sec，Fig. 3c）。

±5.1wkと両群で差はなかった。
3.2.3

TAMV

3.2.6

血管径の変化

メトリチェック

分娩後１週間ではそれぞれ，ACRPN群ではス

実験期間中にRPN給与によって子宮動脈の血コア３が２頭，スコア２が１頭，Ｃ群はスコア３

管径に差はなかった。また，分娩後１週間から８が３頭，８週間後ではACC群はスコア１が２頭，週間の間においても差はなく，ほぼ一定の血管径

スコア０が１頭，Ｃ群はスコア１が１頭，スコアを示した（ACRPN：0.81±0.03cm，ACC：0.81

０が２頭であり，RPNの給与による差は見られ±0.02cm，Fig.２）。

なかった。

3.2.4

RIとPI

3.3

考察

末梢組織の血管抵抗を示すRI値はACRPN群と

RPN高容量の経口投与によって子宮動脈の血ACC群で差は見られなかったが，wk1を基準と管が拡張することが確認された。また，分娩後かした変化率ではACRPN群では分娩後からACC群

らの継続的な低容量のナイアシン投与によってはに比較し，wk2，5，6では有意に高く推移する傾子宮への血流の増加は観察されなかったが，子宮向であった（p<0.1，Fig. 3a）。拍動係数PI値はの炎症反応が減少する可能性が示された。

1.20
1.15
1.10
1.05
1.00
0.95
0.90
0.85
0.80

wk1

wk2

wk3

wk4

wk5

wk6

wk7

wk8

Time after calving （week）
Fig. 2 Change of the diameters of the uterine arteries in three cows in control（C, open circle）and rumen-protectedniacin administration（RPN, filled circle）groups. Values are means ± SD of rate change of both right and left
vessels of each three cows from 1 week after calving.

© The Ito Foundation

牛におけるルーメン非分解性ナイアシン給与による子宮，卵巣への血流促進による分娩後の繁殖性向上

(a)

1.30
1.25
1.20
1.15
1.10
1.05
1.00
0.95
0.90

wk1

wk2

†

†

†

wk3

wk4

wk5

199

wk6

wk7

wk8

Time after calving（week）

(b)

(c)

2.00
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60

1.50
1.30
1.10
0.90
0.70
0.50
0.30

wk1

wk2

wk3
wk4
wk5
wk6
Time after calving（week）

wk7

wk8

wk1

wk2

wk3
wk4
wk5
wk6
Time after calving（week）

wk7

wk8

Fig. 3 （a）Change of Resistance Index（RI）values from uterine artery in three cows in control（ACC, open circle）andrumen-protected niacin supplement（ACRPN, filled circle）groups. Values are means ± SD of rate change of bothright and left vessels of each three cows from 1 week after calving. Values of different parameters with different
daggers（†,）on the same day differ between groups（p< 0.1）.（b）Change of Pulsatility index（PI）of the uterine
arteries after calving in both group cows. Values are mean ± SD of rate change of both right and left vessels of
three cows each.（c）Change of Time-averaged maximum velocity（TAMV）from the uterine arteries. Values aremean ± SD of rate change of both right and left vessels of three cows each.

ナイアシンの重要な副作用としてナイアシンフの血液供給が増加しているかは不明であった。

ラッシュと呼ばれる一過性の血管拡張が知られて以前の報告では分娩直後は子宮の炎症などによおり，ヒトでは皮膚の発赤や掻痒感，発汗が見らり，血液量が多く，血管抵抗は低下し，その後子れ，ストレスとなることが知られている。本実験

宮回復に伴って上昇し，安定することが示唆されでも牛において動脈の拡張に伴うと推察される体ている６）。

温上昇が観察されたため，60ｇは血管の拡張を引加えて，以前の本研究室の研究において，黄体

き起こすが，副作用も生じる給与量であることが期における黒毛和牛の平均腹腔内動脈のRIは0.8示された。そのため，続く実験２では規定量であ前後であることが示されている（データ未掲載）。

る15ｇの継続投与で実験を行った。また，実験１

本 研 究 で も 分 娩 後 ８ 週 で は ACRPN 群 が 0.76 ，

では血流量の指標であるRIやPI，TAMVを計測

ACC群が0.80と正常範囲であった。また，炎症組できなかったため，実際に血管拡張に伴い子宮へ織への血流は一般的に上昇することが知られ，そ© The Ito Foundation

200

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）の時の血管抵抗も減少すると考えられる。今回の８週間まで１日15ｇのRPNを朝の給餌に合わせ実験ではRIの変化率の推移から，RPN給与によって配合飼料100ｇとともに給与した群（ACRPNて分娩後１週目から８週目にかけて子宮組織への群），配合のみ給与した対照群（ACC群）にそれ血流抵抗が上昇すること，すなわち，炎症が早期ぞれ３頭ずつランダムに振り分け，１週間に一に収束した可能性が示された。

度，超音波検査による子宮動脈の観察を行った。

本研究により，RPN高容量の経口投与によっその結果，実験１のRPN群ではRPN給与後６時て以前から示唆されている皮膚の毛細血管だけで間において，有意に子宮動脈の血管径が給与前２なく，腹腔内の動脈も拡張することが示唆され

時間，投与後22，26，34，38，42時間後に比べ増た。また，RPN低容量の経口投与は子宮の炎症

大 し て い た（ｐ ＜ 0.05）。ま た ，Ｃ 群 に 比 較 しを早期に収束させる効果があることが示唆されRPN群では投与後６時間で有意に血管径の増大た。本研究では初回排卵などの繁殖成績には差がが見られた（ｐ＜0.05）。実験２では初回排卵や見られなかったが，子宮の炎症が早期に収束する

子宮修復の指標には有意な差が見られなかった可能性があることから，さらなる検討が必要であが，末梢組織の血管抵抗を示すRI値は分娩後１る。

週を基準とした変化率はACRPN群ではACC群に

４．要

比較し，分娩後２，５，６週では有意に高く推移す約る傾向であった（ｐ＜0.1）。以上の結果から，

ルーメンバイパス処理をしたナイアシン給与はRPN高容量の経口投与によって子宮動脈の血管

乳牛の夏季における乳汁生産量の増加，体温低下が拡張することが確認された。また，分娩後から作用が報告されているが詳しい作用機序，繁殖改の継続的な低容量のナイアシン投与による子宮へ

善効果は十分に検討されていない。そこで本研究の血流の増加は観察されなかったが，子宮の炎症では，牛においてルーメン非分解性ナイアシン

反応が減少する可能性が示された。

（RPN）の経口投与によって子宮への血流量が増加するか，また産後の牛に給与することで子宮修復が促進するかを検討するとともに，分娩後の初回排卵が早まるかを検討した。本実験には，名古屋大学大学院生命農学研究科附属フィールド科学
研究センター東郷フィールドで飼育されている黒毛和種経産牛を実験１では発情同期化した牛６頭，および実験２では正常に分娩を行った６頭をそれぞれ用いた。実験１ではRPN60gの給与によって子宮動脈の血流が変化するかを検証するため に ６ 頭 の 実 験 牛 を ラ ン ダ ム に RPN 給 与 群（RPN 群）と 対 照 群（Ｃ 群）に ３ 頭 ず つ 分 け ，
RPN給与時の子宮動脈径を測定した。実験２では分娩後のRPN給与が子宮修復に与える影響を検討するために，供試牛６頭を分娩後１週間から

文
献１） Pineda, A., Drackley, J. K., Garrett, J., Cardoso, F.
C.：Effects of rumen-protected niacin on milk
production and body temperature of middle andlate lactation Holstein cows, Livest Sci, 187, 16～23,
2016.
２）
 Banka, S. S., Thachil, R., Levine, A., Lin, H.,
Kaafarani, H., Lee, J.：Randomized controlled trialof different aspirin regimens for reduction of
niacin-induced flushing, Am J Heal Pharm, 74（12）,898～903, 2017.
３）
 Xiao, Y., Rungruang, S., Hall, L. W., Collier, J. L.,
Dunshea, F. R., Collier, R. J.：Effects of niacin andbetaine on bovine mammary and uterine cells
exposed to thermal shock in vitro, J Dairy Sci, 100（5）, 4025～37, 2017.
４）
 Ando, T., Kamimura, S., Hamana, K., Ohtsuka, H.,
Watanabe, D.：Uterine and ovarian blood flow in a
Holstein Friesian cow with aplasia of one uterine
horn, J Vet Med Sci, 69（4）,429～32, 2007.
５）
 Sheldon, I. M., Lewis, G. S., LeBlanc, S., Gilbert, R.

© The Ito Foundation

牛におけるルーメン非分解性ナイアシン給与による子宮，卵巣への血流促進による分娩後の繁殖性向上
O.：Defining postpartum uterine disease in cattle,
Theriogenology, 65（8）,1516～30, 2006.
６） Heppelmann, M., Krüger, L., Leidl, S., Bollwein,
H.：Transrectal Doppler sonography of uterine
blood flow during the first two weeks after
parturition in Simmenthal heifers, J Vet Sci, 14（3）,323～7, 2013.

© The Ito Foundation

201

202

発情期における牛子宮内膜機能調節因子および調節機序の解明
Study on bovine endometrial function regulator and regulatory mechanism
during estrus

杉

浦

智

親・中

田

健

（酪農学園大学獣医学群動物生殖学ユニット）

Tomochika Sugiura and Ken Nakada（Laboratory of Theriogenology, Department of Veterinary Medicine, Rakunogakuen University）

Recently, poor reproductive efficiency in cattle has become serious problem. The objectiveof study was to clarify the physiological function in bovine endometrium, which is the place ofconception. The expression of VEGF mRNA was noted as an up-regulator of bovine
endometrial thickness that changes throughout the estrous cycle, and the relationship between
VEGF mRNA expression and endometrial thickness, and the mechanism of endometrial
thickness regulation were investigated. Natural estrus（= Day 0）of 12 cows was observed, andmeasuring endometrial thickness with ultrasonography, collecting uterine endometrial tissues,
and blood sampling were performed on Day 0 and 14. The expression of VEGF, VEGF receptor
1, VEGF receptor 2, estrogen receptorα（E-Rα）, estrogen receptor β and progesterone
receptor in endometrial tissues were measured by quantitative PCR. As a result, theexpression of VEGF mRNA in bovine endometrium during the estrous phase was higher thanthat during the luteal phase, and the expression level showed a positive correlation with theratio of changes in endometrial thickness. In the estrous cycle, an increase in blood E 2
concentrations and a significant increase in the expression of E-Rα mRNA in the endometrium
were observed, and a positive correlation was detected between VEGF and E-Rα mRNA
expression. In conclusion, it was clarified that bovine endometrial thickness during estrus wasincreased by increasing the expression of VEGF through the increase of blood E 2
concentrations and E-Rα in endometrium. Since it has been suggested that the degree of theincrease in endometrial thickness is related to fertility, it is necessary to investigate thephysiological role of VEGF and the positive effect on conception caused by the increase inendometrial thickness.

１．目

殖雌牛（母体）の確保あるいは生産効率の低下が的問題となっている。国内の食用肉牛は90％以上が近年，飼養管理の改善や遺伝的改良により家畜

人工授精による産子であり，雌牛が顕著な発情徴としての牛の能力が飛躍し続ける一方で，肉用お候を示す場合には人工授精が実施されるものの，よび乳用牛ともに，その受胎率は低迷し続け，繁そのうち約50％は不受胎に終わり，発情が回帰す© The Ito Foundation

発情期における牛子宮内膜機能調節因子および調節機序の解明

203る。発情徴候が著明であっても受胎しない要因の2.1

一つに子宮内膜機能の異常が推測される。牛子宮

我々のこれまでの研究報告と同様に４），経直腸

内膜は，黄体期の厚さを基本として発情期に血管超音波診断装置を用いて牛の左右子宮角の角間間透過性が亢進し，その厚さが一時的に厚くなる。

膜付着部における横断面像を描出し，画像解析ソ

発情が終了し，排卵が起こった後に子宮内膜は元フトを用いて計測した。子宮内膜の形態は円形かの厚さに戻るという変化を繰り返している。我々

ら楕円形を呈すことが多いため，子宮内膜領域ののこれまでの研究より，黄体期の子宮内膜厚を

長径および短径の平均値を直径として算出した。

ベースとして発情期の子宮内膜厚変化が大きいほ

子宮内腔領域があった場合，子宮内腔領域の長径うが有意に高い受胎率を示すこと，すなわち，発および短径の平均値を同様に算出し，子宮内膜領

情期の子宮内膜は厚いほうが高い受胎性を示すこ

域の直径から減じた。この測定方法によって左右とが示唆された１）。このことから，発情期の牛子角それぞれ子宮内膜厚を測定し，左右子宮内膜厚

宮内膜厚の増加調節に関与する因子とその発現機の平均値を子宮内膜厚とした。また，黄体期の子序を明らかにすることが，低迷する受胎率の改善

宮内膜厚は産次数に応じて個体差があることを考に対する新たな知見となる。牛子宮内膜厚の増加

慮し，子宮内膜厚の変化を客観的に評価するためには，生体内で最も強力な血管透過性亢進あるいに実測値を用いるのではなく，黄体期（Day 14）は血管新生作用をもつ因子である血管内皮細胞増

子宮内膜厚に対する変化の割合に換算し，発情期

殖因子（VEGF）の関与が推測される。VEGFは（Day０）の子宮内膜厚変化率を比較した。

超音波検査による子宮内膜厚の測定

胎生期の脈管形成，あるいは悪性腫瘍の血管新生

2.2

子宮内膜組織の採取や転移に関与することで知られるが，げっ歯類の子宮内膜組織の採取は，２％リドカインによる

２，３）

。

尾椎硬膜外麻酔処置下でバイオプシーガンを用いそこで本研究では，このVEGFが牛子宮内膜厚のて実施した。滅菌したバイオプシーガンを子宮角調節に関与し，その発現が受胎性に影響するとい分岐部から卵管子宮接合部のおおよそ中間地点まう仮説を立て，発情期における牛子宮内膜厚とで挿入し，直腸壁越しに子宮内膜組織を左右の子VEGF発現との関係を明らかにし，VEGFの子宮宮角それぞれ12時，３時，９時方向の３箇所から内膜厚調節因子としての役割とその調節機序を検採取した。採取した子宮内膜組織は採取後，すぐ討した。

にRNA安定溶液に浸漬した。

子宮内膜にも発現することが報告されている

２．方

2.3

法

子宮内膜厚調節因子のmRNA発現

採取した子宮内膜組織中の子宮内膜厚調節因子

健康なホルスタイン種乳牛（ｎ＝12，空胎日数の発現変化をリアルタイムPCRによって測定し200日以上）に対し，プロスタグランジンF2α 製

た。トータルRNAの抽出にはキットを用い，分剤25mg/頭を用いて発情を誘起し，発情を確認し光光度計で定量した1000ngのトータルRNAに対た。その約３週間後に到来した自然発情（のべ14し逆転写反応を行い，cDNAを作製した。その回）を観察し，発情日をDay０とした。Day０おcDNAを鋳型にリアルタイムPCRを行い，子宮内よびDay 14に超音波検査および子宮内膜採取を

膜組織中のVEGF，VEGF受容体１（VEGF-R1），

実施し，同時に血液も採取した。

VEGF受容体２（VEGF-R2），エストロジェン受
容 体 α（Ｅ -Rα），エ ス ト ロ ジ ェ ン 受 容 体 β© The Ito Foundation

204

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）（Ｅ-Rβ），プロジェステロン受容体（Ｐ-Ｒ）の1.8はβactinの発現量を内部標準として補正し，比1.6
Converted endometrial thickness

mRNA発現量を測定した。各種mRNAの発現量
較Ct値法によりmRNAの相対的発現量を比較した。
2.4性ステロイドホルモン濃度測定

採取した血液から血漿を分離後，プロジェステロン（P４）およびエストラジオール（E２）濃度を酵素免疫測定法により測定した。
３．結果と考察
3.1

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

子宮内膜厚変化とVEGF発現との相関性

Day 14を基準とし，Day０の発情期には子宮内Day 0Day 14

Fig. 1 Changes in endometrial thickness.

E ndometrial thickness was converted to a ratio

膜厚が1.5倍に増加したことが確認された（Fig.

based on the reference day（Day 14）. Data wereshown as the mean ± SEM. Peak in endometrial
thickness in the Day 0 was 1.5-fold greater thanbasal level（Day 14 as the reference）.

１）。子宮内膜組織中のVEGF mRNA発現はDay
14と比較してDay０ではその発現に差のある傾向が認められた（0.05＜＊p ＜ 0.1，Fig. 2a）
。また，

（a）

VEGF

＊

0.30
0.25

（b）

VEGF-R1

0.16

0.20

0.12

0.20

0.15

0.08

0.15
0.10

0.10

0.04

0.05
0.00

Day 0 Day 14

（d）
1.0

E-Rα

＊＊

0.00

（c） VEGF-R2
0.25

0.05
Day 0 Day 14

（e）

E-Rβ

0.20

0.00
（f）
2.5

0.8

0.16

2.0

0.6

0.12

1.5

0.4

0.08

1.0

0.2

0.04

0.5

0.0

Day 0

Day 140.00

Day 0 Day 14

0.0

Day 0 Day 14
P-R＊＊

Day 0 Day 14

Fig. 2 mRNA expression in the endometrium.

Expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）, VEGF-Receptor（R）1, VEGF-R2,

estrogen（E）-Rα, E-R β, and progesterone-R mRNA were compared between the Day 0 and
14 using paired t-test（a-f）. Data（mean ± SEM）were shown as relative values of βactin.
0.05＜＊p ＜ 0.1, ＊＊p ＜ 0.05.

© The Ito Foundation

（a）

（b）

2.2

1.4

2.0
1.8
1.6
1.4

y = 0.063x + 1.3702
R² = 0.3618

1.2
1.0

0

2
4
6
Ratio of VEGF mRNA expression

8

VEGF mRNA expression

Converted endometrial thickness

発情期における牛子宮内膜機能調節因子および調節機序の解明

205

y = 0.7308x－0.3048
R² = 0.3796

1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

0

0.5
1
E-Rα mRNA expression

1.5

Fig. 3 Correlation between endometrial thickness and expression of VEGF mRNA（a）, and expression of VEGF and

E-Rα（b）on Day ０.

Endometrial thickness and expression of VEGF mRNA were converted to a ratio based on the Day 14 in panel（a）.

Positive correlation between converted endometrial thickness and ratio of VEGF mRNA expression was suggested.
Similarly, positive correlation between VEGF and E-Rα mRNA expression was suggested.

6

P₄

10

E₂

8

5

7

4

6

3

4

5
3

2

2

1
0

1
Day 0

た。さらに，子宮内膜厚の増加の強度はVEGF発

9

Day 14E2 concentration（pg/ml）

P4 concentrartion（ng/ml）

70

現レベルに正比例すると考えられる。これまでに，発情期の子宮内膜厚変化率が大きい牛のほうが有意に高い受胎性を示すことを報告してきた１）。本研究の結果から，発情期の高いVEGF発
現レベルが子宮内膜厚のより大きな増加に作用し，高い受胎性に結び付いたことが推測される。
3.2

子宮内膜厚調節機序

子宮内膜組織中の各種mRNA発現をDay０とFig. 4 Progesterone（P4）and estradiol（E2）concentrations

on the Day 0 and 14.
B l a c k a n d w h i t e b a r s r e p r e s e n t P 4 a n d E 2
concentrations, respectively. Data were shown as themean±SEM.

Day 14で比較したが，Ｅ-ＲαおよびＰ-ＲのDay０における発現量がDay 14よりも有意に高かった（＊＊p ＜ 0.05，Fig. 2b-f）。そこで，Day０におけ る VEGF mRNA 発 現 と E-Rα お よ び P-R
mRNA発現との相関性を検討した（Fig. 3b）。そDay 14に対するDay０における子宮内膜変化率おの結果，VEGFとE-Rα mRNA発現との間で正よびVEGF mRNA発現変化率との関係を検討しの相関のある傾向が認められた。また，Day０お

た と こ ろ ，正 の 相 関 の あ る 傾 向 が 認 め ら れ た

よびDay 14における平均 P４，E２濃度をそれぞれ（Fig. 3a）。なお，子宮内膜厚変化率とVEGF-R1，

測定したが，Day０には E２ 濃度が高く，Day 14

VEGF-R2，Ｅ-Ｒα，Ｅ-Ｒβ，およびＰ-Ｒとのには P４濃度が高かったことが確認できた（0.02±

相関性はいずれも認められなかった。

0.006 vs 5.7±2.9，5.5±0.6 vs 0.6±0.3，Fig.４）。

以上の結果より，発情期にはVEGFの発現が増

これらの結果より，発情期に子宮内膜厚の増加

加することにより子宮内膜の血管透過性が亢進をもたらすVEGFは単独で作用しているのではな

し，子宮が浮腫を伴って厚くなることが示唆され

く，E２濃度の上昇とともに増加するＥ-Ｒαの増© The Ito Foundation

206

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

加を介して作用していることが示唆された。一方

宮内膜厚の増加調節因子としてVEGF発現に着目

で，子宮内膜組織中のVEGF-R1およびVEGF-R2

し，VEGFと子宮内膜厚との関係ならびにその調は，Day０およびDay 14において一定量発現して節機序について検討した。その結果，発情期の子いたことから，VEGFはVEGF-Rの増加ではなく，宮内膜におけるVEGF発現は黄体期よりも増加

VEGFタンパク自体の増加によりその作用を発現し，その発現量は子宮内膜厚変化率と正の相関をすると考えられる。同一個体でも発情周期ごとに示した。また，発情期には血中 E２ 濃度の上昇と子宮内膜厚のピークが異なることから，発情時のともに，子宮内膜におけるＥ-Rαの有意な増加

子宮内膜厚変化が小さい場合のデータを蓄積し，を認め，さらにVEGF発現とＥ-Rαの発現には正子宮内膜厚調節機序，すなわちVEGF発現が低調の相関性を認めた。以上のことより，発情期におとなる要因を検討していくことで受胎性の改善にける牛の子宮内膜は E２およびＥ-Rαの増加を介つながる可能性がある。

してVEGFの発現が増加することにより子宮内膜

家畜としての牛の生産効率向上のためには順調厚が増加することが明らかとなった。子宮内膜厚な繁殖サイクルの維持が不可欠である。適期の授の増加の大きさは受胎性に関係することが示唆さ

精および受胎率の改善が求められる中，子宮内膜れていることから，今後はVEGFの生理的役割な厚の増加をもたらすVEGFの生理的役割の解明はらびに子宮内膜厚増加により生じる受胎に対する牛の受胎性の向上につながると考えられる。ま正の効果を検討し，受胎性の改善につなげる必要

た，子宮内膜厚増加という生理的反応は，「妊娠がある。

への準備」とされているが具体的な意義は明らかにされていない５）。今後は，発情期の子宮内膜厚増加によりもたらされる妊娠に向けた子宮内膜の生理的変化，あるいは反応について追究する必要
がある。
４．要

約

肉用および乳用牛ともに生産効率の向上には，低迷する受胎性の改善が重要な課題となっている。本研究では受胎の場となる子宮の生理的機能

文
献１）
 杉浦智親，奥山みなみ，中田健，片桐成二：第162回日本獣医学会学術集会講演要旨集，ｐ264，つくば，2019.
２）
 Shweiki, D., Itin, A., Neufeld, G., Gitay-Goren, H.,
Keshet, E.：J. Clin. Invest, 91, 2235～2243, 1993.
３）
 Cullinan-Bove, K., Koos, R. D.：Endocrinology,
133, 829～837, 1993.
４）
 Sugiura, T., Akiyoshi, S., Inoue, F., Yanagawa, Y.,
Moriyoshi, M., Tajima, M., Katagiri, S.：J. Reprod.
Dev, 64, 135～143, 2018.
５）
 Rockwell, L. C., Pillai, S., Olson, C. E., Koos, R. D.：
Biol Reprod, 67, 1804～1810, 2002.

の解明を目的に，発情周期を通して変化する牛子© The Ito Foundation

207

温度センサと加速度センサを内蔵する
多機能尾部センサの乳牛周産期管理への利用
Peripartum management using a multimodal tail-attached devise with athermistor and a triaxial accelerometer in dairy cattle

檜垣

彰吾１・櫻井玲奈１・松井義貴２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門，
２

地方独立行政法人北海道立総合研究機構酪農試験場）

Shogo Higaki１, Reina Sakurai１ and Yoshitaka Matsui２（１National Institute of Animal Health, NARO, ２Dairy Research Center, Hokkaido Research Organization）

In this study, we determine the applicability of a new multimodal tail-attached device toperipartum management in dairy cows, especially to calving prediction. The tail-attacheddevice equipped with thermistor and 3-axis accelerometer can monitor physiological（surface
temperature：ST）and behavioral（activity intensity, standing time, posture changes, and tailraising intensity）parameters simultaneously. Sensor data were collected from 50 and 12
pregnant cattle reared in farms A（tie-stall barn）and B（free stall barn）, respectively. Since
one cattle showed astasia before calving in farm A, the data was omitted and the following
analysis were done using the remaining data. Based on the sensor data, substantial changes inphysiological and behavioral parameters were detected before calving; namely, decreasing in
ST and increasing in activity intensity, standing time, posture change, and tail raising intensity.
Two machine learning models were constructed for predicting calving within the next 24 h
and 6 h using the randomly selected 30 datasets（training data）of farm A. When theprediction models were applied to the data of pregnant cattle that were not part of the training
process in farm A, calving within the next 24 h and 6 h were predicted with 94.7％ sensitivity
and 94.7％ precision, and 68.4％ sensitivity and 100％ precision, respectively（n = 19）. While infarm B, the prediction models were relatively ineffective; sensitivity and precision of thecalving prediction models were 75.0％ and 45.0％ within the next 24 h, and 58.3％ and 87.5％
within the next 6 h, respectively（n = 12）. Since machine learning is the search for algorithms
that reasons from externally supplied instances（training data）to produce general hypotheses（models）, these results suggest that a tail-attached device may have the potential to achieveeffective calving prediction, if enough training data is available.

１．目の20年間でほぼ倍増して乳牛では90頭程度，肉牛

的では55頭程度となっている１）。その一方で，畜産

近年，乳牛・肉牛を問わず多頭飼育化が急速に従事者の高齢化と後継者不足が深刻な問題となっ進みつつあり，一農場当たりの平均飼養頭数はこており，少人数で効率よく多数の牛を管理可能な© The Ito Foundation

208

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

技術の開発が喫緊の課題となっている。

で，正確に分娩時期を予測可能なアルゴリズムな周産期（分娩の前徴が現れてから産褥期までの期間）には難産や乳熱，胎盤停滞，乳房炎などの異常・疾病が多発する。分娩に立ち会い，必要に応じて処置を施す看護分娩は，難産による子牛および母牛の損耗防止のほか，周産期疾病の重症化を回避する疾病の早期発見に有効である。しからびに早期に周産期疾病を検知可能なアルゴリズ
ムの構築を試みた。
２．方法

2 . 1 分娩前後における多機能尾部センサデー
タの採取し，適切なタイミングで分娩に立ち会うためには

試験は，Ａ農場（タイストール飼育，ホルスタ

昼夜を問わない頻回の分娩監視が必要であるだけ

イン種）とＢ農場（フリーバーン飼育，ホルスタ

でなく，周産期疾病の早期発見には妊娠牛・産褥

イン種・ブラウンスイス種）の２農場で実施し，牛を対象とした注意深い観察が必要となることかそれぞれの農場から50頭と12頭，計62頭の妊娠牛ら，従事者への身体的・精神的な負担が大きい。

を供試した。

したがって，正確に分娩予測や周産期疾病の早期

多機能尾部センサ（幅20.0mm，長さ26.0mm，検知が可能となれば，妊娠牛や産褥牛を対象とし厚さ10.0mm，重さ5.4g）（Fig. 1A）は，専用に開た観察に要する労力が大幅に軽減されるだけでな発した装着器具に封入した後（Fig. 1B），尾根部

く，難産に伴う子牛・母牛の損耗防止ならびに周腹側に温度感知部が位置するよう，また，尾の左産期疾病の重症化予防を通じ，農場全体の生産性

右，上下，前後方向がそれぞれＸ軸，Ｙ軸，Ｚ軸

向上につながると期待できる。

となるように粘着テープおよび面ファスナーベル

そこで本研究では，省力的かつ客観的なデータトを用いて装着した（Fig. 1C）。センサは分娩予に基づく分娩予測法ならびに周産期疾病の早期検定日の約２週間前（14.5±4.0日）から分娩約１週知法を開発するため，申請者らが開発した多機能間後（7.8±3.3日）まで装着し，体表温（３分間

尾部センサを用い，分娩前や周産期疾病罹患時に隔で測定），活動量（５Hzで測定した値の５秒間

特異的な生理学的変化（体表温）や行動の変化をにおける最小値の３分間の標準偏差），ロール角

明らかにし，体表温データおよび行動解析データ（５Hzで測定した値の３分間平均値）およびＹ軸

を人工知能（機械学習法）により解析すること

加速度（５Hzで測定した値の３分間平均値：挙Fig. 1 Shape of the tail-attached device and the attachment unit, and position of the trail-attached device

A. Shape of the multimodal tail-attached device. The device characteristics were：21.0mm×26.0mm×9.7mm and5.8 g with battery. B. Attachment unit of the tail-attached device. C. Attaching position of the tail-attached device.
The device was attached to the base of the tail. Orientation of the x-, y-, and z-axis were lateral, proximal/distal,and dorsal/ventral of tail, respectively. Roll indicates rotate the x- and z-axis around the y-axis.

© The Ito Foundation

温度センサと加速度センサを内蔵する多機能尾部センサの乳牛周産期管理への利用

209

Fig. 2 Representative of sensor data for 24 h obtained by the tail-attached device
Gray horizontal bar indicates the range of roll angle at standing position.

尾の程度を推定可能）を計測した（Fig.２）。

いた。ロール角の数値から各時点における姿勢

センサデータは無線通信により専用の受信機で（起立あるいは横臥）の判別が可能であることか

受信し，クラウド上へ収集した。また，試験期間

ら，ロール角データからは１時間ごとの起立時間

中は目視あるいはビデオ撮影を行うことで正確なならびに起臥回数を算出し，解析に用いた。また，分娩時刻を記録するとともに，周産期疾病への罹Ｙ軸加速度データについては，１時間ごとの平均

患の有無ならびに治療の有無・方法についても記値を算出し，解析に用いた。

録を行った。

それぞれのデータから日内変動等の影響を排除

2 . 2 分娩前後におけるセンサデータ変動の解明するため，体表温データは前３日間の同時刻平均値との差（体表温差），活動量データ・起立時間

体表温データは１時間ごとの最高値，活動量

データ・起臥回数データは過去24時間における合データは１時間ごとの平均値を算出し，解析に用計値をその前24時間（過去48時間～過去24時間）© The Ito Foundation

210

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）の合計値で割った値（活動量比・起立時間比・起を正例とし，Ｒ言語で提供されているニューラル

臥回数比）を解析した。また，Ｙ軸加速度データ

ネットワークパッケージ２）を用いてモデルを作成

については，過去３時間における平均値をその前した。

24時間の平均値で割った値（Ｙ軸加速度比）を解析した。

分娩前24時間以内あるいは分娩前６時間以内のアラートを真陽性，それ以外のアラートを偽陽産子が娩出された時刻を０時間として，体表温性，分娩前24時間以内あるいは分娩前６時間以内

差・活動量比・起立時間比・起臥回数比・Ｙ軸加にアラートがなかった場合を偽陰性として，分娩速度比のそれぞれについて，分娩240時間前から予測の感度（真陽性／［真陽性＋偽陰性］），精度

分娩169時間前の値を対照とし，分娩168時間前か（真陽性／［真陽性＋偽陽性］），Ｆ１スコア（２×ら分娩48時間後の各時点との比較を行った。統計

感度×精度／［感度＋精度］）を算出した。

学的解析にはSteel法を用い，ｐ＜0.05で有意差ありと判定した。
2.3

３．結果と考察

機械学習による分娩予測法の開発

供試した62頭の多機能尾部センサの装着期間は多機能尾部センサにより得られた体表温差，活平均22.1±5.1日間であった。加速度センサを内蔵

動量比，起立時間比，起臥回数比，Ｙ軸加速度比

した市販の尾装着型センサを用いた研究では，装のデータを指数移動平均法により平滑化した後，着した牛の約17％で尾の浮腫や疼痛が認められたそれぞれから５個ずつ計25個の特徴量（統計解析と報告されているが３），本研究では明瞭な浮腫やの説明変数に相当）を抽出した。なお，特徴量と疼痛，擦過傷などの異常が認められなかったこと

しては，分娩前の特異的な変化を表現可能な値とから，申請者らの開発した多機能尾部センサは侵して，現在の値だけでなく，過去12時間や24時間襲性が低いと考えられた。

における最高値・最低値などを使用した。これら分娩前後における体表温差，活動量比，起立時

センサデータから抽出した特徴量と非センサデー

間比，起臥回数比およびＹ軸加速度比の推移を

タの特徴量である「分娩予定日までの日数」を合

Fig.３に示す。既報において，分娩前における二わせた計26個の特徴量を用い，分娩予測が可能な相性の体表温の低下４），活動量・起立時間・起臥機械学習モデルの作成・評価を行った。

回数の増加５～７），挙尾回数・時間の増加８）が報告

具体的には，Ａ農場で採取したデータのうち，されており，本研究においても，多機能尾部セン

分娩前から起立困難となった１頭分のデータを除サを用いることでそれらの変化を検知可能である

外した49頭分のデータからランダムに30頭分を抽ことが示された。すなわち，体表温差は分娩前48

出後，それらを教師データとして24時間以内の分

時間ごろから徐々に低下し始め，その後，分娩前娩（24-h prediction model）および６時間以内の６時間～分娩まで急激に低下することが確認され分娩（6-h prediction model）を予測可能な２つた。また，活動量比は分娩前24時間ごろから，起の機械学習モデルを作成し，Ａ農場の残りの19頭

立時間比は分娩前48時間ごろから，起臥回数比は分とＢ農場の12頭分のデータをテストデータとし

分娩前12時間ごろから分娩に向けて増加することてモデルの評価を行った。なお，24-h predictionが確認された。Ｙ軸加速度は尾が下垂している状

model は 分 娩 前 24 時 間～ 分 娩 後 12 時 間 を ，6-h

態で正の値を示し，水平で０，挙尾の状態で負のprediction modelは分娩前６時間～分娩後６時間

値を示すため，分娩前６時間～分娩までのＹ軸加© The Ito Foundation

温度センサと加速度センサを内蔵する多機能尾部センサの乳牛周産期管理への利用

211

Fig. 3 Changes in residual tail surface temperature（ST）and ratios of activity intensity, standing time, posture change,

and Y-axis acceleration throughout a natural estrous cycle

Residual ST was calculated as actual ST-mean ST for the same time on the previous 3 days. Ratios of activity

intensity, standing time, and posture change were calculated as sum of hourly values during the last 24 h / sum ofhourly values during the last 24 to 48 h. Y-axis acceleration ratio was calculated as average value during the last 3
h / average value during the last 24 h. Data were standardized to calving（0 h：vertical line）. Black dots indicate
the time points with significant differences between values at the indicated time point and the mean values during
the reference period（-240 h to -169 h from ovulation）（p < 0.05）. Data are expressed as mean±standard error（n= 61）.

速度比の急激な低下は，挙尾回数・時間の増加を示している。

多機能尾部センサデータに基づき24時間以内および６時間以内の分娩を予測した結果をTable１© The Ito Foundation

212

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 1 Calving prediction efficiency based on the data obtained by the tail attached device
Farm＊

No. of cattle

Prediction
model

True
positive

False
positive

False
negative

Sensitivity

A

19

24-h

18

1

1

6-h

13

0

6

24-h

9

11

6-h

7

24-h
6-h

B

12

Total

31

Precision

F1

94.7

94.7

0.947

68.4

100.0

0.813

3

75.0

45.0

0.563

1

5

58.3

87.5

0.700

27

12

4

87.1

69.2

0.771

20

1

11

64.5

95.2

0.769

Calving prediction models were developed using 30 cattle in Farm A through artificial neural network. Sensitivity, precision, andF1 score were calculated as TP/（TP + FN）
, TP/
（TP + FP）
, and 2 × sensitivity × precision/（sensitivity + precision）, respectively,
where TP, true positive; FN, false negative; and FP, false positive. ＊Housing system of Farm A（dairy cattle）and B（dairy cattle）
were tie-stall and free-stall, respectively.

に示す。Ａ農場において，24時間以内の分娩の予う。本研究では，Ａ農場で得られたデータのみを

測結果は感度・精度ともに約95％であった。これ

教師データとして分娩予測モデルを構築しているは，生理学的変化（腟内温度，ルーメン内温度，ことから，Ｂ農場で予測性能が低かったのは，飼９～13）
体表温度：感度62～89％・精度49～80％）
あ養環境によって分娩前におけるセンサデータの変

るいは行動学的変化（歩数や臥位時間ならびにそ動が異なっていたことを示唆している。そのたれらの比や起臥回数：感度50～83％・精度30～

め，さまざまな飼養環境下における教師データが35％）のみに基づいた従来の分娩予測法より十分に蓄積されれば，飼養環境に依存しない，高も高値であり，生理学的変化と行動学的変化の両感度・高精度な分娩予測が可能になると期待され者を評価可能な多機能尾部センサの有用性を示し

る。

12，
14）

ていると考えられる。また，６時間以内の分娩を本研究の供試牛では，主要な周産期疾病である

予測した結果（感度68％・精度100％）について

乳熱やケトーシス，第四胃変位などの罹患は認め

も，尾装着型加速度センサを用いた従来の報告られなかった。そのため，当初予定していた周産（４時間以内の分娩を予測：感度47～66％，精度期疾病の予測アルゴリズムの開発には至らなかっ

34～43％） に比べて著しく高い精度が得られた。

た。しかし，Ａ農場において，分娩前に起立困難

今回の研究では，非センサデータの「分娩予定日となり，分娩後に斃死した個体について，臨床症までの日数」を特徴量のひとつに利用しており，状と合致したセンサデータが得られた（Fig.４）。

これは，センサデータだけでなく非センサデータ

すなわち，健康牛に比べて活動量が低く，終日横である「分娩予定日までの日数」を特徴量として臥しており，挙尾や体表温の変動が著しく不整で加えることで，分娩予測性能が向上したとする報あることを示す結果が得られた。このことから，

告と合致する４，５）。

周産期疾病罹患牛のデータ収集を進めることで，

３）

上記のように，Ａ農場では分娩予測の感度・精度ともに非常に高い値が得られたものの，Ｂ農場
では低値を示した。機械学習では，与えられた多個体の教師データから共通するパターンを見つけ出し，そのパターンの数式化（モデル化）を行

周産期疾病の検知・予測が可能になると考えられ
る。
４．要

約

本研究はＡ農場（タイストール飼育）とＢ農場© The Ito Foundation

温度センサと加速度センサを内蔵する多機能尾部センサの乳牛周産期管理への利用

213

Fig. 4 Representatives of sensor data around calving in cows with and without diseaseGraphs in the left and right column show the sensor data of the cows with and without of

disease（astasia）,respectively. Data were standardized to calving（0 h：vertical line）.

（フリーバーン飼育）の２農場で実施した。申請95％で予測することに成功した。これらのことか者らが開発した多機能尾部センサを用い，分娩前ら，さまざまな飼養環境下における教師データの後におけるセンサデータを採取・解析した結果，蓄積を進めることで，飼養環境によらず，高感

分娩前に特異的な体表温・活動量・起立時間・起度・高精度な分娩予測が可能になると期待される。

臥回数・挙尾に関する変化を検知可能であることが示された。また，Ａ農場で得られたデータの一部を教師データとして機械学習による分娩予測モデルを作成し，Ａ農場の残りのデータおよびＢ農場で得られたデータを対象に性能評価を行った結果，Ｂ農場では予測性能は低かったものの，Ａ農場では24時間以内の分娩を感度・精度ともに約文
献１）
 農林水産省：畜産統計調査，https://www.maff.
go.jp/j/tokei/kouhyou/tikusan/（ accessed：2021
March 10）２）
 Ripley, B., Venables, W., Ripley, M. B.：Package‘nnet’, R package version, 7, 3～12, 2016.
 Vos, A., Fischer-Tenhagen, C., Bartel, A.,３）
Heuwieser, W.：Journal of Dairy Science, 104, 3353

© The Ito Foundation

214

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）～3363, 2020.
４）
 Higaki, S., Koyama, K., Sasaki, Y., Abe, K.,
Honkawa, K., Horii, Y., Minamino, T., Mikurino, Y.,
Okada, H., Miwakeichi, F., Darhan, H., Yoshioka,
K.：Journal of Dairy Science, 103, 8535～8540, 2020.
５）
 Borchers, M., Chang, Y., Proudfoot, K.,
Wadsworth, B., Stone, A., Bewley, J.：Journal of
Dairy Science, 100, 5664～5674, 2017.
 Fadul, M., Bogdahn, C., Alsaaod, M., Hüsler, J.,
６）
Starke, A., Steiner, A., Hirsbrunner, G.：Animal
Reproduction Science, 187, 37～46, 2017.
７）
 Rutten, C., Kamphuis, C., Hogeveen, H., Huijps, K.,
Nielen, M., Steeneveld, W.：Computers andElectronics in Agriculture, 132, 108～118, 2017.
８）
 Krieger, S., Sattlecker, G., Kickinger, F., Auer, W.,
Drillich, M., Iwersen, M.：Biosystems Engineering,
173, 79～84, 2018.

９）
 Burfeind, O., Suthar, V., Voigtsberger, R., Bonk, S.,
Heuwieser, W.：Journal of Dairy Science, 94, 5053～
5061, 2011.
 Costa, Jr. J., Ahola, J., Weller, Z., Peel, R., Whittier,
10）J., Barcellos, J.：Journal of Dairy Science, 99, 4839～
4850, 2016.
11）
 Koyama, K., Koyama, T., Sugimoto, M., Kusakari,N., Miura, R., Yoshioka, K., Hirako, M.：The
Veterinary Journal, 240, 1～５, 2018.
12）
 Ouellet, V., Vasseur, E., Heuwieser, W., Burfeind,O., Maldague, X., Charbonneau, E.：Journal of Dairy
Science, 99, 1539～1548, 2016.
 Ricci, A., Racioppi, V., Iotti, B., Bertero, A., Reed,
13）
K., Pascottini, O., Vincenti, L.：Theriogenology, 113,
27～33, 2018.
14）
 Maltz, E., Antler, A.：Proceedings Precision
Livestock Farming, 7, 141～146, 2007.

© The Ito Foundation

215

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の確立
Identification of a molecular marker for the uterine involution to affirm
the female fertility

久保田

海

雄

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Kaiyu Kubota（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

Longer post-partum interval causes huge economic loss in the cattle management. Estrus
detection followed by certain performance of artificial insemination is the initial step to shorten
its duration. After that, the full recovery of the uterus from the damage by parturition, socalled “uterine involution” is required to achieve the embryonic implantation into uterus for
pregnancy success. Even to date, the conventional rectal palpation with ultrasonography is thealmost only choice to evaluate the genital tract, however, it only gives a gross information, e.g.
size of uterus and loss of discharge, but not the details including the probability to become
pregnant, i.e. infertility. Therefore, the aim of the present study was to investigate themolecular profile of the endometrium during the uterine involution for the identification of aquantitative and reliable molecular marker for the uterine involution to affirm the female
fertility. Endometrial samples from Japanese Black beef cows were collected by the cytobrushcontinuously during the uterine involution for the RT-qPCR gene expression analysis. Protein
localization was also analyzed by immunohistochemistry for the endometrial mass specimen
from slaughtered cows. The results showed that expressions of the inflammatory factors suchas interleukin 1B were upregulated at the beginning and immediately reduced, indicating its
usability as a marker for the condition of the inflammation like metritis but not for the uterine
involution. On the other hand, insulin-like growth factor 1（IGF1）expression was high at firstand gradually decreased along with the involution beyond the timing of lochia loss. IGF1 isknown to function in cell proliferation and, thus, seems to play a role in involution and bediminished once the process is over, demonstrating its usage as a marker for the involution. In
addition, the expression of epithelial membrane marker, MUC1 did not altered throughout the
involution period, but increased after involution. Because MUC1 is believed to inhibit theembryonic implantation, it might be used as a marker for uterine receptivity. Taken together,although there are still numbers of bottlenecks to be solved in future, IGF1 and MUC1 could
be the potential candidates for the malecular marker of the uterine involution and uterine
receptivity.

© The Ito Foundation

216
１．目

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

間隔の短縮や人工授精実施回数の縮小に貢献する的ことが考えられる。そこで本研究では，分娩後の分娩間隔の延長は農業経営に負の影響を与える

哺乳中黒毛和種雌牛において，細胞診用サイトブため，分娩後なるべく早い時期に受胎させることラシにより非侵襲的かつ経時的に子宮内膜検体をが必要である。近年の分娩後初回人工授精日数は採取・解析し，また三次元的な理解のためには子黒毛和種で最頻値55日（平均値73日），乳牛で最宮内膜片を組織学的に解析することで子宮修復の頻値71日（平均値93日）となっているが，実際の分子生物学的機構・特徴を明らかにし，その結果

初回発情はこれより早期に起こっており，人手不として子宮修復の分子指標（マーカー）因子を特足や外部徴候を見せない発情（鈍性発情）のため定することを目的とした。

に見逃されている。近年では各種センサーを活用
し，また超音波診断を併用することで，現状の初２．方法

回人工授精日数より早い時期での発情，特に鈍性

2.1

発情を検出可能となってきた。この分娩後早期の子宮内膜炎や乳房炎等の外的要因が少ない黒毛

発情期に確実に人工授精を行うことが分娩間隔短和種雌牛を初産・経産の区別なく供試した。本研

縮につながると期待されている。

究に用いた母牛は分娩前後とも臨床上異常所見が供試牛

発情検出・人工授精実施により妊娠が成立（受見られず正常分娩と考えられた。分娩１週前に分胎）するためには，分娩により損傷した子宮が修娩房へ移動し，分娩後約10日間は子牛同居の元で復される必要がある（子宮修復）。超音波画像診

分娩房にて管理した。分娩後約10日目に屋外コン断によると子宮内滞留物は分娩約30日後までに排クリートパドックへ移し，自由採食（乾草），自出され，子宮角・頚は40日後までに妊娠前の大き由飲水条件下で集団での親子飼育を分娩後約90日さに戻るが，分娩50日後においても20％の子宮での離乳まで継続した。

は子宮滞留物とともに排出される細菌が検出され2.2る。つまり，早期に人工授精を実施しても子宮側

卵巣周期特定のために２～３日おきに頸静脈かに問題があれば受胎しないが，現在においては子ら採血を行い，プロゲステロン濃度を測定した。

宮修復を定量的・客観的に評価するシステムが存並行してヒートマウントディテクター，活動量セ

在しない。ここで，受胎までに要する人工授精のンサーを常時装着し発情行動のモニタリングを回数は黒毛和種1.5回，乳牛2.5回であり，受胎成行った。また，卵巣周期とともに悪露消失を評価

立までに複数回の人工授精が必要とされるが，子するため，分娩後10日目から60日目まで10日おき

宮修復が完了していないことも受胎不成立や早期に卵巣・子宮の超音波診断を行った。

胚死滅の要因の一つとして考えられる。

2.3

卵巣（発情）周期検出

遺伝子発現解析（RT-qPCR解析）

ヒトにおけるインフルエンザ診断キットや妊娠

細胞診用サイトブラシを用いて，分娩後20日目

検査薬は，ウイルスを構成するタンパク質の量やより50日目まで10日ごとに経時的に子宮内膜検体

妊娠により胎盤が分泌するホルモン（hCG）のタを採取した。また，子宮修復後の分娩後60日目かンパク質量を定量することを原理としている。こら150日目までに発情期，黄体期の子宮修復後子のように迅速かつ容易な判定法により牛の子宮修

宮内膜検体を同様に採取した。さらに比較対象と復を判定可能となれば，生産現場へ普及し，分娩して空胎500日以上の雌牛から，長期空胎牛とし© The Ito Foundation

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の確立

217て同様に検体を採取した。それぞれの検体より全最初に炎症性因子について解析した。炎症性サRNAを抽出し，cDNAに逆転写後に定量的リア

イトカインであるインターロイキン１B（IL1B），

ルタイムPCRによりIL1B，IL8，SAA2，EGF，その急性相反応物質である血清アミロイドA2

IGF1およびMUC1遺伝子の発現解析を行った。

（SAA2）の発現は，分娩後20日目に最も高く，

解析には18S rRNAを内部標準として，ΔΔCT法

30日目には急速に減少し，以降は低値を維持してを用いて相対的発現量を評価した。

いた（Fig.１）。IL1により誘導されるIL8に関し

2 . 4 タンパク質局在解析（蛍光免疫組織化学
染色解析）ても同様であった。また免疫組織化学染色解析より，SAA2は子宮内膜上皮細胞に局在しており，分娩後20日目と，60日目以降の黄体期および発その発現は分娩後20日目に認められるものの，子情期の計３点においてと殺を行い，子宮小丘およ

宮修復後には消失していた。子宮内膜は分娩後２び小丘間部位を採取した。検体は速やかに凍結し週目をピークに炎症を起こし，通常その後すぐに

凍結切片を薄切した。４％パラフォルムアルデヒ

解消されるが，そうでない場合に内膜炎となるこ

ドにて固定し0.2％TRITONxで透過処理後，４℃とがわかっている。これまでにも内膜炎では炎症で一晩SAA2，IGF1およびMUC1特異的１次抗体性因子の発現が高いことが報告されている１）。以（Abcam）と結合させ，蛍光標識した２次抗体

上より，上記因子は炎症マーカーとして内膜炎の（Invitrogen）により染色した。また，DAPIによ

検出には適応可能であるが，子宮修復マーカーとり核を対比染色した。

しての適応性は低いことが示唆された。

2.4

培養細胞系における発現制御解析

次に，成長因子について解析した。まず，上皮

卵巣周期変動により発現が変化するMUC1遺伝

成長因子（EGF）について遺伝子発現解析を試子について，性ステロイドホルモンによる発現制

みたが，検出限界以下であり解析が困難であっ御を培養細胞において解析した。サイトブラシにた。タンパク質発現解析も含め，詳細な条件検討

より子宮内膜上皮細胞を単離し，10％牛血清を含により評価法を改善していく必要がある。続いて

むダルベッコ改変培地/Ｆ12培地により培養した。

インスリン様成長因子１（IGF1）に注目した結コンフルエント後に血清フリー培地に変換し果，その発現は分娩後30日目をピークに緩やかに

100nMエストラヂオールおよび10μＭプロゲステ減少した（Fig.１）。タンパク質発現に関してもロンで48時間処理し，処理後細胞を回収しMUC1

子宮内膜上皮細胞において分娩後20日目に強い発遺伝子発現を解析した。

現 が 検 出 さ れ る が ，修 復 後 に は 減 少 し て い た（Fig.２）。IGF1は細胞増殖に作用し創傷治癒を促

３．結果と考察

進することが広く知られており，ヒト子宮内膜に

本研究に用いた牛群では，超音波診断による子

おいては月経周期中の内膜の亢進に関与すると考宮検査の結果から悪露消失は41.0±1.8日目であえられている２）。以上から，IGF1は損傷した内膜

り，またその他卵巣周期評価より初回排卵は44.0細胞を増殖させるために分泌され，悪露消失後に±6.2日目，初回発情は53.9±5.9日目であった。

修復が完了するまで緩やかに減少し，修復後に最以上の基礎パラメーターを元に，複数の因子につ低値を示す可能性が示唆された。つまり，IGF1

いて以下に子宮修復マーカーとしての応用性を評を定量することで子宮修復を評価するマーカーに価した。

なる可能性が期待される。人工授精時にサイトブ© The Ito Foundation

218

Relative expression

令和２年度

1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

IL1B

20

30

40

50

IGF1

1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

SAA2

20

30

40

50

40

50

MUC1

2.5
2
1.5
1
0.5

20

30

40

50

0

20

30

（Days after parturition）
Fig. 1 Time-course expression of IL1B, SAA2, IGF1, and MUC1 in the endometrium ofJapanese Black beef cattle during the uterine involution. Expressions were analyzed
by RT-qPCR. Data are presented as the mean±standard error.
before

after
LE
S

S

Nucleus

IGF1

LE

Fig. 2 Localization of IGF1 in the endometrium of Japanese Black

beef cattle during uterine involution. A representative picture of
IGF1 expression analyzed by immunohistochemistry in theendometrium before（20 days after parturition）or after uterine
involution. Nucleus was counter-stained by DAPI. Scale Bar =20μm. LE；luminal endometrium. S；stroma.

ラシによって子宮内膜検体を採取することは受胎の成否とIGF1発現の相関性を検討する必要があ

率に悪影響を及ぼさないことが報告されておる。また，IGF1は液性因子であることから膣粘り ，IGF1の低発現が人工授精実施の判断材料と液へ放出されている可能性も考えられる。一方こなり得るか評価するために，今後は人工授精時にこで，Fig.２に示すようにIGF1は子宮内膜間質細おけるIGF1の発現を解析すること，さらに受胎胞においても発現が見られ，また受胎にも関与す

３）© The Ito Foundation

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の確立

219

る，つまり修復後も子宮内膜で産生されている可高 い 発 現 が 認 め ら れ た（Fig. ３）。こ れ ま で に能性もあり，単純に低値を良しとすることは安直

MUC1はリピートブリーダー牛の子宮内膜で高いであるかもしれない。以上より，EIAのような定発現を示すことが報告されており５），本研究結果

量検出法の確立，高低判断のための閾値の設定，と一致する。つまり，長期空胎牛等の受胎性の低生産現場に適応し得るデバイスの開発等のさまざい 子 宮 内 膜 で MUC1 の 発 現 が 高 い ，も し く は

まな研究開発が今後は必要とされる。

MUC1の発現が高いことから受胎性が低いことが最後に，上皮細胞膜抗原または粘液糖鎖タンパ示唆された。前述のIGF1のように，このMUC1クとして知られるムチン１（MUC1）について解に関しても今後，受胎性との相関を比較・評価す析した。MUC1は上皮細胞の頂端側（腔側）表面ることで，受胎性マーカーとしての適応が期待さに細胞膜貫通型タンパクとして局在し，その細胞れる。

外ドメインの立体構造から病原体の接触や炎症反応を調節するとされ，またマウスやヒトにおいて

４．要

約は子宮内膜への胚の着床を抑制すると考えられて牛の分娩間隔短縮を達成するために，子宮修復いる 。本研究の結果，分娩後子宮修復前の牛子を客観的に評価するマーカーを確立することを目

宮内膜ではMUC1の発現は変動しなかった（Fig.

指して，黒毛和種繁殖雌牛の分娩後子宮内膜の分１）。子宮修復後では発情期において黄体期より

子プロファイルを経時的に解析した。その結果，高い発現を示した。培養細胞における解析の結子宮修復に伴い発現が減少するIGF1，そして子果，プロゲステロンがMUC1の発現を抑制してい宮修復後に発現が上昇するMUC1を同定した。今た。その局在は分娩後20日目および黄体期には検後，このIGF1やMUC1の発現と受胎性との相関出されないが，子宮修復後の発情期子宮内膜上皮や定量的測定方法，そして基準となる閾値の設定

細胞内腔側表面に認められた。さらに，子宮修復等を検討することによって，子宮修復・受胎性を後の受精適期雌牛の子宮内膜におけるMUC1の発定量的に評価するマーカーに適応することが期待

現と比較して，長期空胎牛の子宮内膜では有意に

される。

４）

MUC1
Relative expression

20
＊

15
10
5
0

ctrl

long

Fig. 3 U pre gul at i on of MUC1 ex p ression in th eendometrium of Japanese Black beef cattle without
p r e g n a n c y f o r m o r e t h a n 5 0 0 d a y s （ l o n g ）.
Expression was analyzed by RT-qPCR. Data arepresented as the mean±standard error. Asterisk
indicates statistical significance compared with
control（p＜0.05）.

文献１）
 Dadarwal, D., González-Cano, P., Dickinson, R.,
Griebel, P., Palmer, C.：Theriogenology, 126, 128～
139, 2019.
２）
 Zhou, J., Dsupin, B. A., Giudice, L. C., Bondy, C.
A.：J Clin Endocrinol Metab, 79, 1723～1734, 1994.
３）
 Kaufmann, T. B., Drillich, M., Tenhagen, B.-A.,
Forderung, D., Heuwieser, W.：Theriogenology, 71,
385～391, 2009.
４）
 Meseguer, M., Pellicer, A., Simón, C.：Mol Hum
Reprod, 4, 1089～1098, 1998.
 Kasimanickam, R., Kasimanickam, V., Kastelic, J.
５）
P.：Theriogenology, 81, 952～958, 2014.

© The Ito Foundation

220

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討
Examination of new selection method of recipient cow based on ovarian
reserves

小山毅（北海道立総合研究機構畜産試験場）

Takeshi Koyama（Animal research center, Hokkaido research organization）

The purpose of this study was to investigate the effect of ovarian reserve on reproductive
physiology after estrus synchronization for embryo transfer and performance of embryotransfer. In experiment 1, the effect of ovarian reserve（antral follicle count（AFC）and antiMüllerian hormone（AMH））on reproductive physiology after estrus synchronization forembryo transfer was investigated using 22 Japanese black cows. The mean value of crosssectional area of right and left uterine horn was larger in cows with high AFC（AFC >62）
than that in cows with low AFC（AFC ≤ 62）. This result suggested that cows with high AFC
had a thicker endometrium after estrus and might have higher fertility. AMH concentration
had no effect on reproductive physiology after estrus synchronization for embryo transfer. In
experiment 2, frozen thawed in vivo derived embryos were transferred to 32 tested cows toinvestigate the relationship between ovarian reserve and fertility outcome. The odds ratio of
AFC for conception at 40 or 60 days after estrus were 1.21（95％ confidence interval（CI）：0.94
to 1.56, p = 0.14）and 1.24（95％ CI：0.93 to 1.57, p = 0.16），respectively. The odds ratio of AMH
concentration for conception at 40 or 60 days after estrus were 1.24（95％ CI：1.00 to 1.55, p =0.05）and 1.12（95％ CI：0.93 to 1.34, p = 0.23），respectively. These results suggested that cows
with high AFC or AMH concentration might be more likely to conceive. Future studies arenecessary to increase the number of embryo transfer, as well as a detailed mechanism of theeffect of ovarian reserve on endometrium function.

１．目

めには別の方法，すなわち受卵牛側からの受胎成的績向上のための取り組みが必要である。

これまで受精卵移植成績の向上のために，高品

近年，牛の繁殖領域において卵巣予備能が注目

質卵回収の効率化や回収卵の保存，培養技術の改されている。卵巣予備能は卵巣における卵胞の量

良など，供卵牛側からの取り組みが主であった。

と定義され，末梢血中の抗ミューラー管ホルモン

日本における近年の受精卵移植成績は停滞気味で（Anti-Müllerian hormone ，AMH）濃 度 ま た はあり，受精卵移植成績のさらなる高位安定化のた

前 胞 状 卵 胞 数（antral follicle count ，AFC）に© The Ito Foundation

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討

221

よって評価することが可能である。卵巣予備能が対する超音波検査を行った。また，発情時に活動

高い牛は過剰排卵処理における高品質卵の回収成量の計測および発情行動の観察を行い，血中ホル

績が良いことが報告されており１），供卵牛の選定

モン濃度，左右子宮角の断面積平均，主席卵胞の指標の一つとしての活用が期待されている。一大きさおよび黄体の数と大きさの測定，左右卵巣方，卵巣予備能と受精卵移植における受胎成績との長径平均，発情に伴う活動量の変化および発情の関係は調査されていないが，卵巣予備能が高い

スコア３）を調査した。AFCは発情後４日目に，

牛では発情周期中のプロジェステロン（Ｐ４）や左右卵巣に含まれる直径３mm以上の卵胞数を数

エストラジオール（Ｅ２）などの性ホルモン濃度

えることで評価した。血中Ｐ４濃度は発情後０～が高く，子宮内膜が厚い

ことが報告されてい10日目，Ｅ２濃度は発情後－１，
０および１日目る。これらの特徴から卵巣予備能が高い牛は受胎の血漿サンプルを測定に用いた。有機溶媒を用い性が高い可能性がある。

てヘパリン血漿サンプルからＰ４およびＥ２の抽

２）

日本では諸外国と比較して牛の飼養頭数が少な出を行った後，ELISA４，５）により測定した。血中

く，限りある受卵牛を効率的に使用するために，

AMH濃度は発情後10日目のヘパリン血漿サンプ

受胎確率がより高い牛に受精卵を優先的に移植すルを用い，牛用ELISAキット（AL-114，Ansh

る必要がある。卵巣予備能と受精卵移植におけるLab社）により測定した。

受胎成績との関係が示されれば，受卵牛の選定指2 . 2 受卵牛の卵巣予備能が受精卵移植におけ標として卵巣予備能が利用できる可能性がある。

る受胎成績へ及ぼす影響の解明

本試験では黒毛和種雌牛を用い，胚移植に伴う本実験では実験2.1と同じ供試牛に10頭を追加

発情同期化処置後（以下，受精卵移植条件下）にした，合計32頭を受卵牛として用いた。CIDR抜

おいて卵巣予備能が繁殖生理状態および受精卵移去後に発情観察を行い，発情後８日目に２種類の植成績に及ぼす影響を調査し，卵巣予備能を活用

精液を用いて作出した同品質の凍結体内受精卵した受卵牛選定技術を開発するための基盤となるを，黄体側の子宮角深部に同一の技術者が移植し研究を行うことを目的とした。

た。発情後約40および60日目に超音波検査による

２．方

妊娠診断を行い，卵巣予備能と受胎成績の関係を

法

解析した。

2 . 1 受精卵移植条件下における受卵牛の卵巣

2.3

統計解析

予備能が繁殖生理状態へ及ぼす影響の解明

実験2.1において，供試牛22頭のAFCまたは本実験では畜産試験場で飼養されていた黒毛和AMHの中央値を算出し，中央値を上回った牛を種繁殖雌牛22頭を供試し，受精卵移植のための発Ｈ群（AFC-Ｈ群またはAMH-Ｈ群），中央値以情同期化処理を行った。供試牛に対して発情周期

下の牛をＬ群（AFC-Ｌ群またはAMH-Ｌ群）との任意の時期に膣内留置型プロジェステロン徐放した。発情周期中の左右子宮角の断面積平均，左剤（CIDR）を膣内に挿入し，同時にエストラジ

右卵巣の長径平均，Ｐ４濃度，発情前後24時間のオール製剤を投与した。CIDR挿入８日後にプロ

歩数変化量は，AFCまたはAMHによる群分けとスタグランジン製剤（PG）を投与し，PG投与２

発情後日数による二元配置分散分析によって解析

日後にCIDRを抜去した。CIDR抜去から発情後10した。発情スコアおよびＥ２濃度はｔ検定により日目まで毎日尾静脈からの採血，および生殖器に解析した。実験2.2における卵巣予備能と受胎成© The Ito Foundation

222

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

績の関係は，発情後40または60日時点の妊娠状態

中 央 値 は 6.8 歳（4.7～14.9 歳），61.5 個（14～208（受胎，不受胎）を目的変数，AFCまたはAMH個），646pg/ml（96～2,325pg/ml）であった。黒および受卵牛の移植時年齢を説明変数とした一般

毛和種のAFCおよびAMH濃度はホルスタイン種

化線形モデルにより解析した。AFCは10個当た乳牛のそれ６）よりも大きかった。Fig.１にAFCとり，AMHは100pg/ml当たりの変化量に対するAMHの関係を示した。AFCとAMHの相関係数オッズ比とその95％信頼区間を算出した。AFCは0.855であり，高い相関が認められた。Fig.２におよびAMHは別々のモデルで検討した。

AFC-Ｈ群およびＬ群における発情周期中の左右子宮角の断面積平均の推移を示した。発情直前に

３．結果と考察

両群ともに断面積が大きくなり，時間の経過とと

3 . 1 受精卵移植条件下における受卵牛の卵巣もに断面積が小さくなった。発情周期中，左右子

予備能が繁殖生理状態へ及ぼす影響の解明

宮角の断面積平均はAFC-Ｈ群のほうがＬ群より供試牛22頭の移植時年齢，AFCおよびAMHのも大きく推移した。一方で，発情前後のＥ２濃度，

AMH concentration (pg/ml)

2500

R= 0.855（p<0.05）

2000
1500
1000
500
0

0

50

100

150

200

250

AFC

Average cross-sectional area ofright and left uterine horn (mm2)Fig. 1 Relationship between AFC and AMH concentration.

350

AFC-High
AFC-Low

300
250
200
150
100

AFC group：p ＝0.01
Days：p <0.01
AFC group × Days：p = 0.96
－2 －1 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Days after estrus
Fig. 2 Effect of AFC level to the average cross-sectional area of rightand left uterine horn.

© The Ito Foundation

223

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討

発情周期中の黄体断面積およびＰ４濃度は群間でめ，多くの卵胞が存在したためＬ群よりも卵巣が差が認められなかった（データ略）。牛では発情大きかったと考えられた。

周期中の生理状態の変化に伴い子宮内膜の厚さがFig.４に，AFC-H群およびＬ群における発情

大きく変化するため，断面積の変化は子宮内膜の前後24時間の歩数変化量を示した。発情後の歩数

厚さの変化を反映したものと考えられた。乳牛で変化量の最大値はAFC-H群のほうがAFC-L群よはAFCが大きい個体では，黄体細胞のＰ４産生

りも少なかった。また，発情スコアは両群間に差能力が高く，血中Ｐ４濃度が高くなるため排卵後は認められなかった。発情当日（発情後０日目）

４日間の子宮内膜面積が大きくなると報告されての血中Ｅ２濃度は群間に差は認められなかった。

いる 。しかし，本試験ではＰ４濃度は両群間で発情時の活動量は血中Ｅ２濃度の影響だけではな差が認められなかったため，AFC-Ｈ群で子宮角く，同時に発情した個体の頭数等の飼養環境の影

断面積が大きくなった機序は不明である。今後，響も大きく受けるため，本実験で観察された歩数

頭数を増やしての検証およびAFCが異なる黒毛

変化量の差はAFCの差に起因する可能性は低い

和種雌牛由来の黄体細胞を用いたＰ４産生能の調と考えられた。

２）

AMH-H群とＬ群間で各変数を比較した結果，査が必要である。
Fig.３にAFC-Ｈ群およびＬ群における発情周

すべての項目で群間に差が認められなかった。

期中の左右卵巣の長径平均の推移を示した。発情

AMH濃度の個体間差はかなり大きく，統計的検後，両群ともに長径平均は漸増した。排卵後の黄出力が低かった可能性も考えられる。今後，頭数

体形成および発育，ならびに第一卵胞波におけるを増やしての検証が必要である。

主席卵胞の発育に伴い，卵巣全体が大きくなった

3 . 2 受卵牛の卵巣予備能が受精卵移植におけと考えられる。一方，AFC-Ｈ群のほうが左右卵る受胎成績へ及ぼす影響の解明
供試牛32頭の，発情後40日目および60日目の受れた黄体の大きさおよび主席卵胞の大きさは両群

胎率は41％（13/32）および34％（11/32）であ間に差は認められなかったことから，Ｈ群では卵り ，２ 頭 で 胚 死 滅 が 認 め ら れ た 。AFC ま た は巣には超音波検査では検出できない小型卵胞を含AMHが発情後40または60日における受胎成績にAverage long diameter of rightand left ovary (mm)

巣の長径平均が大きく推移した。排卵後に形成さ50

AFC-High

45

AFC-Low

40
35
30
AFC group：p <0.01
Days：p <0.01
AFC group × Days：p = 0.56

25
20

－2 －1 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Days after estrus
Fig. 3 Effect of AFC level to the average long diameter of right and leftovary.

© The Ito Foundation

224
Amount of change in the number of steps

令和２年度
800

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

700

AFC-High

600

AFC-Low

500
400
300

AFC group：p ＝0.03
Days：p <0.01
AFC group × Days：p = 0.47

200
100
0
－100
－200
－24－20－16－12 －8 －4

0

4

8

12

16

20

24

Time after estrus begins (hour)Fig. 4 Effect of AFC level to the amount of change in the number ofsteps relative to the average number of steps during the 10 days
prior to estrus.

Table 1 Association among antral follicle count（AFC）or plasma anti-Müllerian hormone（AMH）

concentration and pregnancy by embryo transfer 40 and 60 days after estrus.
Estimate

Std. Error

Odds ratio（95％CI）

p value

AFC model at 40 days post estrusAFC
Age at embryo transfer

0.19
-0.31

0.13
0.20

1.21（0.94 - 1.56）
0.74（0.49 - 1.10）

0.14
0.13

AMH model at 40 days post estrus
AMH concentration（pg/ml）
Age at embryo transfer

0.22
-0.24

0.11
0.20

1.24（1.00 - 1.55）
0.78（0.53 - 1.16）

0.05
0.22

AFC model at 60 days post estrusAFC
Age at embryo transfer

0.19
-0.46

0.13
0.28

1.21（0.93 - 1.57）
0.63（0.36 - 1.09）

0.16
0.09

AMH model at 60 days post estrus
AMH concentration（pg/ml）
Age at embryo transfer

0.11
-0.37

0.09
0.25

1.12（0.93 - 1.34）
0.69（0.42 - 1.12）

0.23
0.14

Variables

及ぼす影響をTable１に示した。いずれのモデル

合度が高くなる場合が多かった（データ略）。こ

においても，AFCおよびAMHのオッズ比の95％のことから，黒毛和種における大きいAFCまた信頼区間に１を含んでいるが，信頼区間の下限がはAMH濃度は，ホルスタイン種乳牛の人工授精

0.93～1.00であるのに対し，上限は1.34～1.56であにおける受胎成績と同様に，受胎成績を向上させり，AFCが10個またはAMHが100pg/ml上昇する

る可能性があると考えられ，受卵牛の選定に活用ことは，受胎する可能性を34％から56％増加しう

できる可能性がある。AFCまたはAMH濃度が大ることを示唆している。また，説明変数を移植時きくなると受胎確率が高くなる要因として，これ年齢のみにしたモデルと比較して，AFCまたはらが大きい個体では子宮角断面積，すなわち子宮

AMH濃度を説明変数に加えた場合，モデルの適内膜が厚かったことが考えられる。議論の余地は© The Ito Foundation

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討

225あるものの，ヒトの生殖医療において，子宮内膜および1.12（95％CI：0.93-1.34，p＝0.23）であり，の厚さは着床や妊娠率と正の関係があることが報AFCまたはAMH濃度が高い個体では受胎する可

告されている７，８）。牛においても同様の報告がな

能性が高くなることが示唆された。今後は受精卵されている 。今後さらに移植頭数を増やすとと移植頭数を増やすとともに，卵巣予備能が子宮内もに，卵巣予備能が高い牛における子宮内膜の機膜の機能に及ぼす影響について詳細な検討が必要

能について，組織学，内分泌学および分子生物学

である。

９）

的な検討を行う予定である。
４．要

約

本試験は，卵巣予備能が胚移植に伴う発情同期化処置後（受精卵移植条件下）における繁殖生理状態および受精卵移植成績に及ぼす影響を調べることを目的とした。実験１では黒毛和種22頭を用い，卵巣予備能（前胞状卵胞数（AFC）または
抗ミューラー管ホルモン（AMH）濃度）が受精
卵移植条件下における繁殖生理状態に及ぼす影響を調べた。AFCが高い群では低い群と比較して，発情後の左右の子宮角断面積平均が大きく推移したことから，AFCが高い個体では発情後の子宮内膜が厚く，受胎しやすい状態になっていたことが推察された。AMH濃度と繁殖生理状態には関連が認められなかった。実験２では32頭の供試牛に対して凍結受精卵を移植し，卵巣予備能と受胎成績の関係を調べた。発情後40日目または60日目
時 点 の 受 胎 に 対 す る AFC の オ ッ ズ 比 は ，1.21（95％信頼区間（CI）：0.94-1.56，p＝0.14）および1.24（95％CI：0.93-1.57，ｐ＝0.16）
，AMH濃

文
献
１）
 Hirayama, H., Naito, A., Fukuda, S., Asada, M.,
Inaba, Y., Takedomi, T., Kawamata, M., Moriyasu,
S., Kageyama, S.：J. Reprod. Dev., 63, 95～100, 2017.
２）
 Jimenez-Krassel, F., Folger, J. K., Ireland, J. L. H.,
Smith, G. W., Hou, X., Davis, L. S., Lonergan, P.,
Evans, A. C. O., Ireland, J. J.：Biol. Reprod., 80,
1272～1281, 2009.
３）
 Van Eerdenburg, F. J. C. M., Loeffler, H. S. H.,
Van Vliet, J. H.：Veterinary Quarterly, 18, 52～54,
1996.
４）
 Takenouchi, N., Oshima, K., Shimada, K.,
Takahashi, M.：J. Vet. Med. Sci., 66, 1315～1321,
2004.
５）
 Yanagawa, Y., Matuura, Y., Suzuki, M., Saga, S.,
Okuyama, H., Fukui, D., Bando, G., Nagano, M.,
Katagiri, S., Takahashi, Y., Tsubota T.：J. Reprod.
Dev., 61, 61～66, 2015.
６）
 Gobikrushanth, M., Purfield, D. C., Canadas, E. R.,
Herlihy, M. M., Kenneally, J., Murray, M., Kearney,
F. J., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Butler, S. T. J.：
Dairy Sci., 102, 11622～11635, 2019.
７）
 Raga, F. R., Bonilla-Musoles, F., Casañ, E. M.,
Klein, O., Bonilla, F.：Human Reproduction, 14, 2851
～2854, 1999.
８）
 Basir, G. S., So, W., So, W. W. K., Ng, E. H. Y., Ho, P.
C.：Ultrasound Obstet Gynecol, 19, 484～489, 2002.
９）
 Souza, A. H., Silva, E. P. B., Cunha, A. P., Gümen,A., Ayres, H., Brusveen, D. J., Guenther, J. N.,
Wiltbank, M. C.：Teriogenology, 75, 722～733, 2011.

度のオッズ比は1.24（95％CI：1.00-1.55，p＝0.05）© The Ito Foundation

226

ドライ精子による牛生産に関する研究
Studies of cattle production using dried spermatozoa

松

川

和

嗣

（高知大学農林海洋科学部）

Kazutsugu Matsukawa（Faculty of Agriculture and Marine Science, Kochi University）

Currently, sperm, an important genetic resource for mammals, are cryopreserved in liquid
nitrogen. However, cryopreservation of sperm has various problems. In this study, I focused on
dry storage as a new sperm storage that does not use liquid nitrogen, and examined DNA
damage, in vitro development, and in vivo development of bovine sperm after drying. DNA
damage rates of dried sperm of Japanese Black, Holstein, and Japanese Brown Kochi were
examined, it was found that the buffer solution containing glycerin and trehalose had low DNA
damage. In addition, the blastocyst rate of embryos after intracytoplasmic sperm injection ofdried sperm was 10％，which was not significantly different from the development rate offreeze-dried sperm. When the blastocysts were transferred to three cows, conception was notconfirmed by embryo transfer.

１．目

取り扱いには人体への安全面で問題がある，など

的

さまざまな欠点がある１）。さらに，2011年３月11

現実または潜在的な価値を有する生物遺伝資源日に発生した東日本大震災では，地震による直接は，農業，生命科学，医薬品開発，材料等さまざの被害だけでなく，電力や液体窒素の供給が途絶

まな分野で研究・産業発展のために必要不可欠のえることによって貴重な生物遺伝資源が多数失わものであるが，一度失われると再現不可能なためれた。また，家畜では口蹄疫など家畜法定伝染病にその保管は非常に重要である。牛精子は，現在が発生した場合，個体だけでなく液体窒素内に保では液体窒素中に保存する凍結保存によって人工存された家畜精子も移動や使用が制限され，家畜授精（artificial insemination）あるいは体外受精生産に大きな被害が生じることになる。

（in vitro fertilization）に供試され，牛の育種改

家畜品種の多様性は，気候変動による環境への良，生産，および増頭に重要な役割を担っている。

適応力と新たな感染症への抵抗力を高め，生産性

しかし，液体窒素を用いた保存には，生産にかかの向上や生産者，消費者，社会全体のニーズ対応

る環境負荷が発生する，凍結精液の維持には液体を目的とする品種改良のための基礎となるもので窒素を常に供給しなければならずコストやスペー

あ る 。 国 際 連 合 食 糧 農 業 機 関 （Food andスが恒常的に必要である，輸送が容易ではない，

Agriculture Organization of the United© The Ito Foundation

ドライ精子による牛生産に関する研究

Nations；FAO）は，2007年に引き続き2015年に「食料・農業のための世界動物遺伝資源白書第２

２．方

227

法

回報告」を発行し，世界的に地域の特徴的な家畜

2.1

品種の遺伝資源が失われていることに警鐘を鳴ら

国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究している 。2005年から2014年までに99品種が絶機構（茨城県つくば市）および高知県畜産試験場

滅し，絶滅の危機に瀕していると分類される家畜（高知県高岡郡）で採精された黒毛和種，ホルスの割合は15％から17％に増加し，その他の58％のタイン種，および褐毛和種高知系由来の新鮮射出品種については不測の危機に直面していると分類

精液を０℃で輸送し，実験に供試した。実験室にされている。また，発展途上国における牛乳およ

到着後，各品種の精液からパーコール密度遠心分

び肉類の需要は，2050年までに46％および76％増離法によって運動精子を回収し，８mMグルタチ

加すると予測しており，地域に適応した品種の保オン（SIGMA）添加BO培地にて38.5℃で15分間

全対策を講じないと生産性を重視し育種改良され処理を行った。遠心洗浄後，精子を浮遊させる緩た単一の家畜品種が，さらに世界的に蔓延するこ衝 液 に は 50mM EGTA ， 50mM NaCl ， 10mMとが考えられる。

Tris-HClで構成されたNaEGTA（コントロール

２）

牛精子の乾燥および凍結乾燥保存

家畜における生体試料については，国内では国区）を基本緩衝液として用い，10％グリセリン添

立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

加区（＋Ｇ区），200mMトレハロース添加区（＋が本部として独立行政法人家畜改良センターと連Tre 区），10 ％ グ リ セ リ ン お よ び 200mM ト レ ハ

携して，遺伝資源の探索収集から特性評価，保存，ロース添加区（＋G，Tre区）を設けた。それぞ配布および情報公開までを行うジーンバンク事業

れの緩衝液に精子を浮遊させた精子浮遊液50μｌが存在し，家畜の精液・受精卵が凍結保存されてをガラスアンプルに入れ，低温乾燥機（アズワいる。さらに，大学連携バイオバックアッププロン）にて42℃で20時間乾燥しドライ精子を作製しジェクト（IBBP）は，予期せぬ事故や災害等にた。一方，フリーズドライ精子は精子浮遊液200

よる毀損や消失を回避するために，大学等におけμｌ を ガ ラ ス ア ン プ ル に 入 れ ，凍 結 乾 燥 機

る生物遺伝資源をバックアップするための体制と（CHRIST）にて凍結2.5時間，一次乾燥５時間，して東日本大震災後の2012年から新たに開始されおよび二次乾燥３時間のプロフラムで作製した。

たプロジェクトである。近年，このように貴重なドライ精子およびフリーズドライ精子は20℃の恒動物遺伝資源の大量保管や分散保存の体制が整備

温箱の中で保存した。

されつつあるが，液体窒素保存に替わる哺乳動物

2.2

遺伝資源の保存技術が望まれている 。

DNA損傷精子の割合は，Halo Sperm Test法

１）

精子のDNA損傷評価

そこで本研究では，牛精子の乾燥（ドライ）保により測定した。ガラスアンプルに超純水を加え存技術を検討し，ドライ精子による牛生産技術のて復水し（ドライ精子：50μｌ，フリーズドライ精基盤を構築する。そのためにすでに子牛生産に成子：200μｌ），１％アガロース（ナカライ）と混功している凍結乾燥（フリーズドライ）精子およ

合し高撥水性印刷スライド（MATSUNAMI）にびそれらを供試して作出した胚を対照区とし，牛貼付した。スライドを冷蔵庫に５分間入れアガ

精子のドライ技術，胚の体外発生能，および胚移ロースをゲル化させ，Lysis Solution（TREVIGEN）

植後の体内発生能を検討した。

で 15 分 間 ，ジ チ オ ト レ イ ト ー ル（DTT）添 加© The Ito Foundation

228

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Lysis Solutionで30分間，および3.5-ジョードサリ

型プロゲステロン製剤（ファイザー）およびプロ

チル酸リチウム（Wako）添加Lysis Solutionで15

スタグランジンFsα類縁体製剤（あすかアニマ

分間処理した。さらにアルカリ液にて20分間処理

ルヘルス株式会社）にて発情の同期化を行った。

し，脱水・乾燥後，SYBR Gold（Life technologies）

褐毛和種高知系のドライ精子および卵母細胞の顕にて染色し，蛍光正立顕微鏡（NIKON）で観察

微授精によって胚盤胞期胚を作出した。発情発現した。Haloが認められるものをDNA損傷精子と後７日目の受胚牛にYTガン（ヤマネテック）をして，スライド１枚当たり75個以上の精子を測定用いて胚移植を実施し，発情発現後37日目に超音した。乾燥または凍結乾燥直後，１週間後，１カ波画像診断装置により受胎の確認を行った。

月後，および２カ月後のDNA損傷を評価した。
2.3

顕微授精（ICSI）および体外発生培養

３．結果と考察

食肉処理場由来の褐毛和種高知系卵巣から採取

乾燥とは，湿った材料に熱を加えて水を蒸発除した卵丘卵母細胞複合体（COCs）を10％牛胎児去する操作であり，乾燥対象物に水の蒸発に必要血清（FBS）添加199培地にて22時間体外成熟培

なエネルギーが供給された結果，熱移動，相変化，養した。ヒアルロニターゼによって卵丘細胞を除および物質移動が起こる。哺乳動物精子は攪拌な

去し，第一極体を放出した卵母細胞を顕微授精にどの物理的刺激に弱く高温耐性が低いため，材料供試した。顕微授精は，倒立顕微鏡（NIKON）

静置型の対流電熱乾燥機（定温乾燥機）で乾燥しに接続したピエゾマイクロマニピュレーター（プた。その結果，黒毛和種，ホルスタイン種，およライムテック）によって行った。褐毛和種高知系

び褐毛和種高知系由来のドライ精子は＋Tre区おの精子を用い，乾燥および凍結乾燥後１週間20℃

よび＋G, Tre区で２か月間保存後にDNA損傷がで保存したものを腹水し，卵母細胞に注入した。

低率であった（Fig.３，４）。一方，＋Ｇ区では乾精子の注入後，カルシウムイオノフォアＡ23187

燥直後から50％以上のDNA損傷が認められ，２および６ジメチルアミノプリンによって卵母細胞

か月間の保存後にはすべての品種で100％の精子の活性化処理を行い，SOF培地にて培養した。顕がDNA損傷を受けていた（Fig.２）。NaEGTA区

微授精後２日目に卵割率，７日目に胚盤胞期胚発では，ホルスタイン種がほかの品種と比較して１生率を記録した。

か 月 後 に 有 意 に 損 傷 率 が 増 加 し た（p<0.05）

2.4

ドライ精子由来胚の胚移植（Fig.１）。フリーズドライ精子では，直後では全受胚牛には褐毛和種高知系を供試し，膣内留置処理区でDNA損傷が低率であったが（Fig.５，

100

100

80

80

60

60

40

40

20

20

0

0 day
Holstein

1 week1 monthJapanese Black

2 month

0 day
HolsteinJapanese Brown

Fig. 1 Rate of DNA damaged sperm in NaEGTA after

drying0

1 week1 monthJapanese Black

2 monthJapanese Brown

Fig. 2 Rate of DNA damaged sperm in 10％ glycerol

after drying© The Ito Foundation

229

ドライ精子による牛生産に関する研究
100

100

80

80

60

60

40

40

20

20

0

0 day
Holstein

1 week1 monthJapanese Black

2 month00 day
HolsteinJapanese Brown

1 week1 monthJapanese Black

2 monthJapanese Brown

Fig. 3 Rate of DNA damaged sperm in 200 mM trehaloseFig. 4 Rate of DNA damaged sperm in 10％ glycerol

100

100

80

80

60

60

40

40

20

20

after drying

0

0 day
Holstein

1 week1 monthJapanese Black

2 monthand 200 mM trehalose after drying

0

0 day
HolsteinJapanese Brown

1 week1 monthJapanese Black

2 monthJapanese Brown

Fig. 5 Rate of DNA damaged sperm in NaEGTA afterFig. 6 Rate of DNA damaged sperm in 10％ glycerol

100

100

80

80

60

60

40

40

20

20

freeze drying

0

0 day
Holstein

1 week1 monthJapanese Black

2 monthJapanese Brown

after freeze drying

0

0 day
Holstein

1 week1 monthJapanese Black

2 monthJapanese Brown

Fig. 7 Rate of DNA damaged sperm in 200 mM

Fig. 8 Rate of DNA damaged sperm in 10

６，７，８），＋Ｇ区では１か月保存後から損傷が精子内で細胞内自由水がグリセリンと置換され，増加し，２か月後にはホルスタイン種と褐毛和種

氷晶形成が防止される。また，水和水の脱水に伴高知系で100％の損傷が認められた（Fig.６）。

うタンパク質の変性を防止する３）。グリセリンの

trehalose after freeze drying％ glyceroland 200 mM trehalose after freeze drying

哺乳動物の精子においては，グリセリン，トレ

添加濃度は，牛では約８～10％であり，グリセリ

ハロースともに凍結保存時の凍結保護剤として利ン濃度が高すぎると本来の目的である自由水の置用されている。グリセリンは，添加溶液を高浸透換のみならず，タンパク質や脂質に結合しその機圧化させる，細胞膜透過に優れるといった特徴が能を低下させる。ドライ精子の＋Ｇ区では，乾燥ある。そのため，凍結時精子内部から脱水が生じ，直後からDNA損傷率が50％以上となり，乾燥処© The Ito Foundation

230

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 1 In vitro development of bovine embryos injected with dried or freeze-dried

spermatozoa by ICSI

No. of oocytes

No. of cleaved embryos（%）

No. of blastocysts（%）

DRY ICSI

95

43（45.3）

10（10.5）

FD ICSI107

74（69.2）

14（13.1）

理中にグリセリンがDNAに悪影響を及ぼしていを使用しない新たな精子の保存技術として乾燥保ることが示唆された。乾燥処理によって細胞の脱存に着目し，牛精子の乾燥後のDNA損傷，体外水が促進され，浸透圧の差でグリセリンが細胞内胚発生能，および産子生産能力を検討した。黒毛に多く流入，高濃度のグリセリンに暴露され細胞

和種，ホルスタイン種，および褐毛和種高知系３

毒性を受けた結果，精子DNAに損傷を与えた可品種の乾燥精子のDNA損傷率を検討したところ，能性が考えられる。一方，トレハロースの細胞膜

グリセリンおよびトレハロースを添加した緩衝液

保護効果によってグリセリンの作用が抑制され，でDNA損傷が低いことが認められた。また，乾＋G，Tre区で最もDNA保護効果が高かったと推燥精子の顕微授精後の胚の胚盤胞期胚発生率は測される。

10％となり，凍結乾燥精子の発生率と有意な差は

これまでの研究では，牛のフリーズドライおよ

認められなかった。作出した胚盤胞期胚を３頭のびドライ精子による顕微授精後の胚盤胞期胚発生

雌牛に胚移植したところ，乾燥精子由来胚の胚移率 は 18.7 ％ （Keskintepe et al., 2002） ， 14.2 ％植からは受胎が確認されなかった。今後，精子５）６）（Hara et al., 2014），15％（Lee and Niwa，2006）

DNAの損傷以外の要因を特定し，乾燥精子を用４）と報告されている。本実験の結果，ドライ精子おいた牛産子の成功を目指す。

よびフリーズドライ精子由来の胚盤胞期胚発生率
はそれぞれ10％および13％となり，既報とは差が認められなかった（Table１）。
さらに，ドライ精子由来胚の胚移植による産子生産の可能性について検討した。３頭の雌牛に胚移植したところ受胎が確認されなかった。本実験で評価したDNA損傷以外に産子生産にかかわる要因があると考えられ，今後検討する必要がある。
４．要約

現在，哺乳動物の重要な遺伝資源となる精子は，液体窒素内で凍結保存されている。しかし，

文
献１）
 Loi, P., Iuso, D., Czernik, M., Zacchini, F., Ptak G.：
Trends in Biotechnology, 31, 688～695, 2013.
２）
 FAO.：The Second Report on the State of theWorld’s Animal Genetic Resources, 2015.
３）
 一般社団法人日本家畜人工授精師協会：家畜人工授精講習会テキスト（家畜人工授精編），p.306, 東京，
平成27年.
４）
 Keskintepe, L., Pacholczyk, G., Machnicka, A.,
Norris, K., Curuk, M. A., Khan, I., Brackett, B. G.：
Biology of Reproduction, 67, 409～415, 2002.
５）
 Hara, H., Tagiri, M. Hwang, I. S., Takahashi, M.,
Hirabayashi, M., Hochi, S.：Cryobiology, 68, 354～
360, 2014.
６） Lee, K. B., Niwa, K.：Biology of Reproduction, 74,
146～152, 2006.

精子の凍結保存には，液体窒素を恒常的に供給するためのコストおよび環境負荷，自然災害等による遺伝資源の損失，人体への危険性などのさまざ
まな問題点がある。そこで本研究では，液体窒素© The Ito Foundation

231

MTT（3[4,5-dimethylthiazolyl]-2,5-diphenyltetrazolium
bromide）を用いた豚精液の評価法の開発
The development of evaluation method of porcine sperm using MTT（3［4,5-dimethylthiazolyl］-2,5-diphenyltetrazolium bromide）

内倉

健造・田島

茂行・相良

鮎美・豊島

浩一

（愛知県農業総合試験場）

Kenzo Uchikura, Shigeyuki Tajima, Ayumi Sagara and Koichi Toyoshima（Aichi Agricultural Research Center）

In this study, for establishing a simple evaluation method for the number of motile sperm
in porcine semen, we examined various conditions for the reduction reaction of MTT（3［4,5-dimethylthiazolyl］-2,5-diphenyltetrazolium bromide）by sperm and examined a simpler
evaluation method. First, in order to examine the effect of the solution on the MTT reduction
reaction, the MTT reduction reaction was performed using a MODENA solution containing alarge amount of glucose or PBS, and the absorbance was measured as an index of reduction of
MTT. The higher absorbance was observed in MODENA solution compared with PBS. Whenthe MTT reduction reaction was induced at 30℃ or 39℃, a high relationship between theabsorbance and the number of motility sperm was observed at 39℃. This suggests that a rapid
MTT reduction reaction occurs in a glucose-rich solution at a high temperature. For thedevelopment of a simple evaluation method, reduction reaction of MTT by sperm was caused
in 5 minutes on the filter paper under the conditions determined in this study, and the changeof color brightness of the filter paper was investigated using a digital scanner. A regression
analysis of brightness for motile sperm revealed that the regression coefficient was significant（p<0.05）and the coefficient of determination of the regression equation was 0.64. It wassuggested that rapid evaluation method for the number of porcine motile sperm was able toperformed using MTT.

１．目ている欧州に比べて低いといわれている１）。雄豚

的の利用効率の低下は，飼養しなければならない雄

近年，我が国の養豚産業では急速に人工授精

豚の頭数を増加させ養豚経営のコスト上昇を招（AI）の利用が進み，AIを取り入れている農場がく。１頭の雄から採取した精液をより多くの雌に70％を超えている。しかし，日本におけるAIは活用するためには，安定した受胎率および産子数

普及途上であると考えられ，半数の農場では自然を得られる必要十分の運動精子濃度まで精液を希交配も併用するなど，雄豚１頭あたりの飼養する

釈する必要がある。雄豚の利用効率が低い原因の繁殖母豚数（雄豚の利用効率）は先行して普及し一つとして，農場レベルにおいて豚の精液性状の© The Ito Foundation

232

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

正確な評価が難しく，適正な希釈が行われていな
いことが考えられる。精液中の運動精子の濃度を評価するためには精子活力（運動率）および精子数の２項目の測定を行わなければならない。さらに，顕微鏡下における精子活力の検査には習熟がより簡便な評価法を検討した。
２．方法

2 . 1 精子のMTT還元反応に対する反応液および温度の影響調査必要であるとともに，主観的な観測データとなる

2.1.1

ため検査員ごとにデータがばらつく可能性があ

豚精液は10ヶ月齢のランドレース種および大る。近年，精子数や運動率などをコンピューター

ヨークシャー種雄各２頭から採取した。顕微鏡下で 自 動 解 析 す る 精 子 運 動 解 析 （Computer

で精子の85％以上が前進運動を示すことを確認しAssisted Sperm Analysis ，CASA）シ ス テ ム がたものを，モデナ液５）で等倍希釈し，試験に用い開発され，試験研究機関や一部の種豚場への導入

るまで24～30時間，15℃で保存した。すべての試が進んでいる。しかし，CASAシステムは使用す験において雄ごとに４回の採精を行い，各精子浮る機器が高価であるため，すべての農場で使用す遊液は１×10８ 個/mlになるようにモデナ液で調ることが困難である。

整 し た 。 MTT 還 元 反 応 は 0.4mg/ml MTT

MTT還元反応に与える反応液の影響［
3 4,5-dimethylthiazolyl］-2,5-diphenyltetrazolium（Sigma-Aldrich）を含んだ900μｌのモデナ液もbromide（MTT）は水溶性の黄色い試薬であり，し く は リ ン 酸 緩 衝 液（PBS）に 精 子 浮 遊 液 100

細胞内の脱水素酵素により還元され，不溶性の青μｌを添加し，30分間反応させ，紫外可視分光光

色のホルマザンを生成する。さまざまな動物種の度計（UV-1800，株式会社島津製作所）を用いて精子においてMTT還元反応と精子の生存性は関

波長570nmの吸光度を測定した。

連しているといわれており，豚精子においても

2.1.2

MTTの還元反応が精子の生存性の評価に有効と

上記と同様に作成した精子浮遊液の一部についする報告がある 。近年，MTTを浸透させたクて液体窒素で凍結，豚体温に近い39℃で融解する

ロマトグラフィーペーパー上で精子による還元反行程を２回繰り返し，精子を死滅させた後，通常応を起こし，その変化が精子の運動性と関連しての精子浮遊液と精子を死滅させた浮遊液とを10：いたという報告

０，８：２，６：４の３種類の混合割合のサンプル

２）３）

や顕微鏡による観察でMTT還

MTT還元反応に与える温度の影響があを作成した。各精子浮遊液は39℃で５分間加温しる。これらのことからMTTを用いて簡易な精子て，精液分析装置（iSperm，株式会社ピィアイ

検査法を開発できれば，CASAシステムに変わる

シイ・バイオ）で精子運動率を測定した。各精子

低コストな豚精液性状の評価法を生産者へと提供

浮遊液100μｌを0.4mg/ml MTTを含んだ900μｌ

できると考えられる。一方で，精子の脱水素酵素のモデナ液に添加し，30もしくは39℃で10，20おの還元反応は反応液中の組成や反応温度によってよび30分間反応させ，吸光度を測定した。３種類異なると考えられ，その最適条件は報告されていの混合割合のサンプルのデータをプールして回帰ない。

分析を行った。

元能をもつ精子の判別が可能という報告

４）以上のことから，本研究では，豚精液の簡易的

2.2

な評価方法の確立を目的とし，精子によるMTT

2.2.1の還元反応のための諸条件を検討するとともに，ランドレース種２頭から採取した精液を30℃に© The Ito Foundation

簡易的なMTT検査法の開発
青染精子計数法の開発

MTT（3[4,5-dimethylthiazolyl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide）を用いた豚精液の評価法の開発

233

保温し，30分以内に実験室に運び試験に用いた。

報告されている３）。モデナ液はグルコース濃度が一部の精液は39℃で５分間加温後，精液分析装置

27.5mg/mlであり，精子の解糖系の基質であるグで運動精子数を計測した。精液100μｌを0.4mg/

ルコースを多量に含むことから，今回の実験におml MTTを含んだ900μｌのモデナ液に添加し，いては反応液内のグルコースがMTT還元反応を

39℃で20分間反応させた。反応後に，通常の精子促進したことが考えられた。このことから反応液数の計測と同様の手順で血球計算盤を用いて１にはグルコースを含むモデナ液等が適しているこ

ml中における中片部が青染した精子（Fig.１）ととが示唆された。

青染していない精子を算出した。
2.2.2

ろ紙反応法の開発

直 径 ２ cm の 円 形 に 切 り 取 っ た ろ 紙（ADVANTEC）に４mg/ml MTTを含んだ蒸留
水35μｌを浸透させ，遮光して５分間乾燥させた。
2 . 2 . 1と同様に採取した精液について，精液分析装置で運動精子数を計測後，モデナ液で２倍，2.5
倍もしくは3.3倍に希釈し，スライドグラス上に載せた円形ろ紙に35μｌ添加し，39℃で５分間反応させた（Fig.２）。反応後，２枚のろ紙をスキャ
ナー（PM-A920，EPSON）およびデジタルカメ

Fig. 1 Porcine spermatozoa that have the midpiece

stained by formazan reduced from MTT.

ラ（COOLPIX A 100，NIKON）で撮影した。記録した画像はパソコン上において，画像処理ソフト（GIMP）を用いてろ紙上の平均明度をデータ化した。３種類の希釈倍率のデータをプールし，回帰分析を行った。
2.3

ろ紙反応法の実証試験

上記の2 . 2 . 2で新鮮精液を用いて開発した簡易Fig. 2 Round filter paper stained by MTT solution.（Left:control, Right: dropping sperm suspended liquid）

MTT検査を養豚農場で実施し，精度の検証と作業時間の記録を行った。検証にはデュロック種雄
２頭分の希釈精液（それぞれ新鮮精液および２日

0.4
Absorbance

間保存した精液）を用いた。
３．結果と考察
MTT還元反応の指標として吸光度を測定した

0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1

結果，PBSを反応液としたものに比較してモデナ

0.05

液で有意に高い吸光度がみられた（Fig.３）。過0去の研究では豚精子の運動性およびMTT還元能
は，解糖系でのエネルギー産生と関係していたと

＊

0.45

MODENA

PBS

Fig. 3 Absobance of different MTT reduction reaction

solution. ＊：p＜0.05© The Ito Foundation

234

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

MTT還元反応に対する反応温度の影響を調査

粒が認識できず，判定することが困難であることするために30もしくは39℃で精子のMTT還元反が分かった。また，計数する際には，高倍率顕微応を行い，反応時間10，20および30分でそれぞれ鏡下での観察を必要とし，計数に時間を要するこ

説明変数を運動精子数，従属変数を吸光度としてとが示唆された。一方で，反応温度39℃反応時間

回帰分析を行ったところ，いずれの場合も回帰係

20分の条件を用いて青染した精子を顕微鏡下計数数は有意であった（p<0.05，Fig.４）。また決定したところ，運動精子数に対する回帰係数は有意

係数は30℃10，20および30分間でそれぞれ0.45，であり（ｐ＜0.05），決定係数0.70の回帰式ｙ＝0.65および0.50，39℃10，20および30分でそれぞ

0.78ｘ＋56.24が得られた（Fig.５）。このことから

れ0.83，0.84および0.71であり，39℃で安定して作業性はよくないものの，MTTの還元反応後の高い値を示した。これは30℃に比較して39℃で精精子を計数することで運動精子数を推定すること

子運動が活発化し，MTT還元反応が速く進み，が可能であることが示唆された。

ホルマザンが十分に生成されたことにより吸光度ろ紙上で精子によるMTTの還元反応を起こし，が上昇したためと推察され，反応温度は39℃が適ろ紙の色の変化を調査した（ろ紙反応法）。ス

していると考えられた。

キャナーおよびデジタルカメラで読み取ったろ紙

予備実験におけるMTT還元反応後の精子の顕画像の明度について，運動精子数に対する回帰係

微鏡下観察では，吸光度の測定と異なり，精子中数は有意であった。
（p<0.05，Fig.６）。スキャナー

辺部の微少なホルマザン顆粒の有無で青染かどう

およびデジタルカメラでの回帰式はそれぞれｙ＝かを判定するため，反応後20分を経過しないと顆

－8.52ｘ＋833.78およびｙ＝－3.79ｘ＋323.08であ

0.25

30℃ 10min

0.2

Absorbance

0.1

-0.05

0

100

300

400 0.05

R2= 0.45

0200

39℃ 10min

0.3
Absorbance

0.2

0.1

-0.1

0.15
0.1
0.05

R2= 0.65
0

100

200

300

400

39℃ 20min

0.5

0.25

0.4

0.2

0.3

0.15

0.2

0.1
0.05
0

0.3
0.25

0.15

0.05

R2= 0.83
0

100

200

300

400

0.1
0

30℃ 30min

0.35

0.2

0.15

0

30℃ 20min

R2= 0.84
0

100

200

300

400

0

0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0

R2= 0.50
0

100

200

300

39℃ 30min

R2= 0.71
0

100

200

Number of motile sperm（×10 /ml）
6

Fig. 4 Relationship between number of motile sperm and absorbance in different temperature and time.

© The Ito Foundation

400

300

400

Number of motile sperm（×106/ml）

MTT（3[4,5-dimethylthiazolyl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide）を用いた豚精液の評価法の開発

235

350
300
250
200
150
100
50
0

0

50

100

150

200

250

300

Number of sperm with formazan granules（×10 /ml）
6

Fig. 5 Relationship between number of motile sperm and sperm containing

Number of motile sperm (×106/ml)

formazan granules.

Digital scanner

250
200
150
100
50
0

70

75

80

85

90

95

Number of motile sperm (×106/ml)

Brightness of ﬁlter paper
250

Digital camera

200
150
100
50
0

40

45

50

55

60

65

Brightness of ﬁlter paper
Fig. 6 Relationship between number of motile sperm and brightness of filter

paper.

り，決定係数はそれぞれ0.64および0.18であった。

における条件下では運動精子数の推定が可能であ

このことから，スキャナーを用いることで本研究ることが分かった。一方で，デジタルカメラを用© The Ito Foundation

236

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

いる方法では撮影時の誤差が大きいと考えられ，液の影響を検討するため，グルコースを多く含む推定に用いることが難しいことが示唆された。

モデナ液もしくはPBSを用いてMTT還元反応を実証実験での養豚農場において，市販の精液性行い，還元の指標として吸光度を測定したとこ

状測定機器を用いた場合，運動精子数の計測に要ろ，モデナ液で吸光度が高いことが分かった。ました時間は，新鮮精液および保存精液でそれぞれた，反応温度についても30℃と39℃で比較したと10および19分間であったのに対して，ろ紙反応法

ころ，39℃において吸光度と運動性指数に正の相では14および17分間であった。複数検体を効率よ関が確認された。このことから反応温度39℃でグく処理していくためには，雄豚の採精時間（１頭

ルコースを多く含む溶液内で速いMTT還元反応

あたり６分間程度）より短い必要であるため，作が起こることが示唆された。簡易的な評価法の開

業性の向上が求められると考えられる。次新鮮精

発のために本研究で決定した条件下でろ紙上で精液および保存精液の運動精子数は，測定機器がそ子による５分間のMTTの還元反応を起こし，ス

れぞれ46.8×10 および64.9×10 個/mlに対して，キャナーを用いてろ紙の色の明度を評価した。運ろ紙反応法で推定したものがそれぞれ46.8×10

６動精子に対する明度の回帰分析を行ったところ，

および90.3×10 個/mlとなり，新鮮精液で同値と回帰係数が有意（ｐ＜0.05）であり，回帰式の決なった。このことから新鮮精液であれば，本研究

定係数が0.64であった。開発したろ紙反応法を用で新鮮精液を用いて作成した回帰式を用いて，運いて養豚農場において精液の運動精子数を測定し動精子の推定が可能であることが示唆された。今たところ，測定時間および測定結果は市販の測定後，養豚現場へと普及させるためには，より推定

機器と同等であった。

６

６

６

精度を向上させるとともに，作業時間を短縮する
方法を検討する必要があると考えられる。
４．要

約

本研究では，豚精液の簡易的な評価方法の確立を目的とし，精子によるMTTの還元反応のための諸条件を検討するとともに，より簡便な評価法を検討した。まず，MTT還元反応に対する反応

文
献１）
 河原崎達雄，片岡岳志：日豚会誌，56, 106～118,2019.
 Byun, J. W., Choo, S. H., Kim, H. H., Kim, Y. J.,
２）
Hwang, Y. J., Kim, D. Y.：Asian-Aust. J. Anim. Sci.,
21, 494～498, 2008.
 Matsuura, K., Huang, H. W., Chen, M. C., Chen, Y.,
３）
Cheng, C. M.：Sci. Rep., 7, 46213, 2017.
 van den Berg, B. M.：Open. Vet. J., 5, 58～63, 2015.
４）
５）
 Sone, M., Chikyu, M., Yoshida, M., Bamba, K.,
Ogasa, A.：Jpn. J. Swine Sci., 29, 41～50, 1992.

© The Ito Foundation

237

牛初期黄体におけるPG抵抗性の解明－低酸素環境による抗アポトーシス機構－
The mechanisms of PG-resistance in bovine early corpus luteum－hypoxia-induced anti-apoptotic mechanism－

西

村

亮・菱

沼

貢

（鳥取大学農学部共同獣医学科獣医繁殖学）

Ryo Nishimura and Mitsugu Hishinuma（Laboratory of Theriogenology, Joint Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Tottori University）

Transforming growth factor（TGF）-β superfamily is known to play important roles invarious reproductive functions including cellular growth, development and angiogenesis, bybinding to specific serine/threonine kinase receptors. Betaglycan and endoglin werecharacterized as a type III receptor for TGF-β superfamily. To clarify possible physiologicalroles of betaglycan and endoglin in bovine corpus luteum（CL）, we examined betaglycan（TGFBR3）and endoglin（ENG）mRNA expressions in bovine CL corrected at each stage of
estrous cycle. We also investigated the effects of human chorionic gonadotropin（hCG）and
hypoxia on TGFBR3 and ENG mRNA expression in cultured bovine luteal cells. Luteal cells
obtained from early and mid CL were incubated under different O2 concentrations（20％ , ３％O2）with or without hCG（1 U/ml）for 24 hr. TGFBR3 mRNA expression in bovine CL wastended to be higher during developing, mid and late luteal stages, compared with that at the
regressed luteal stage. ENG mRNA expression in bovine CL was higher during developing andmid luteal stages than at the regressed luteal stage. Furthermore, in early and mid luteal cells,
TGFBR3 mRNA expression was increased by hCG under hypoxic conditions, while ENG
mRNA expression was affected neither by hCG nor by hypoxia. The overall results suggestthat betaglycan induced by cooperative action of hypoxia and luteinizing hormone have a role
for luteal formation during early luteal stage, while endoglin support luteal function during
developing and mid luteal stages.

１．目

黄体細胞（初期細胞）は低酸素環境に曝されてい的る。低酸素環境に曝された細胞の多くは低酸素誘

黄体は排卵後に卵胞の構成細胞から形成され，

導 性 転 写 因 子 （Hypoxia-inducible factor 1 ；妊娠の成立および維持に必須であるプロジェステ

HIF1）の活性化を介してさまざまな遺伝子発現ロン（Ｐ４）を合成・分泌する一過性の内分泌器を誘導することで低酸素環境へ適応することが知官である。牛卵巣動脈の血流量は黄体退行期からられており，牛の初期黄体においてもHIF１の機減少し，排卵後の黄体初期においても低く，初期能することが明らかにされている１）。

© The Ito Foundation

238

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Transforming growth factor（TGF）-β１は，

割は明らかにされていない。

TGF-βスーパーファミリーに属するサイトカイ

本研究では，betaglycanおよびendoglinの牛黄ンであり，さまざまな細胞の増殖，分化に関わっ

体形成における役割を明らかにする目的で，１）ている 。TGF-βスーパーファミリーのシグナ

牛の黄体におけるbetaglycan（TGFBR3）およル伝達には，TGF-βＩ型受容体（TGFBR1）とびendoglin（ENG）の周期的なmRNA発現を調

Ⅱ型受容体（TGFBR2）の両者が必要である 。

べるとともに，２）培養した牛の黄体期初期の黄これらはヘテロ四量体を形成し，TGFBR2に結合

体細胞（初期細胞）および中期の黄体細胞（中期したTGF-βスーパーファミリーのリガンドが，細胞）におけるTGFBR3およびENGのmRNA発TGFBR1をリン酸化し，Smadを介した細胞内シ現に及ぼす低酸素環境の影響について検討した。

２）

３）

グナル伝達が励起される 。TGF-βⅢ型受容体
３）（補助受容体）であるbetaglycanは，TGF-βのア

２．方法

イソフォームと高い親和性をもって結合すること

2.1

により，TGF-βのTGFBR1およびTGFBR2とのと畜場においてと畜直後の牛より発情周期各期

親和性を高め，シグナル伝達を促進することが知（初期（Ｅ）：排卵後２-３日，形成期（Ｄ）：５-

られている４，５）。betaglycanはラットの顆粒層細６日，中期（Ｍ）：８-12日，後期（Ｌ）：15-17日，胞において発現が認められており，卵胞刺激ホル

退行期（Ｒ）：19-21日）の牛黄体を採取し，組織

モンやプロテインキナーゼＡの刺激によって発現中のmRNA発現解析用に液体窒素中で凍結した。

が亢進する 。ラット卵管において，betaglycan

細胞培養用には，初期あるいは中期黄体を有するの発現は黄体形成ホルモン（LH）サージのあと卵巣を選抜し，氷冷した生理食塩水に浸漬し，研に顕著に高まること，また，ヒト絨毛性性腺刺激究室に運搬した。

６）ホルモン（hCG）によっても増加することが報告

牛卵巣の採取2 . 2 牛 黄 体 に お け る 発 情 周 期 を 通 じ た

さ れ て い る 。し か し ，牛 の 黄 体 に お け る

TGFBR3およびENGのmRNA発現

７）betaglycanの生理的な役割は明らかにされていな

発情周期各期（Ｅ：初期２-３日，Ｄ：形成期

い。同じく，TGF-βⅢ型受容体であるendoglin

５-６日，Ｍ：中期８-12日，Ｌ：後期15-17日，は血管の形成ならびに維持に関与する骨形成因

Ｌ：退行期19-21日）の牛黄体組織から抽出した

子-９（BMP-9；GDF2）の補助受容体として知

total RNAからcDNAを合成し，real-time PCRにられており８），TGF-βスーパーファミリーの受よりTGFBR3およびENGのmRNA発現量を調べ

容 体 で も 特 に activin receptor-like kinase-1

た。

（ALK-1）およびALK-5と複合体を形成すること

2 . 3 初期および中期細胞のTGFBR3およびで血管新生シグナルの調節に関わっている 。まENGのmRNA発現に及ぼす低酸素環境のた，endoglinはヒトの血管内皮細胞において，低影響

９）酸素環境により発現が増加することで血管新生に

黄体期初期および中期の黄体を有する牛卵巣

関わることが示されている 。牛の黄体形成にお（１回の実験につき２-４卵巣）から初期細胞，中いても低酸素環境に起因する血管新生の起こるこ期細胞をそれぞれ単離し，培養プレートに播種しとから１），endoglinが牛の黄体形成に関わる可能て12時間培養後，hCG（1.0 U/ml）を添加し，通性が考えられるが，endoglinの牛黄体における役常の培養環境（20％ O ２，５％ CO ２ ，75％ N ２）

10）

© The Ito Foundation

239

牛初期黄体におけるPG抵抗性の解明－低酸素環境による抗アポトーシス機構－

および低酸素環境（３％ O２，
５％ CO２，92％ N２）

RNA（18S rRNA）を用い，各遺伝子のmRNA発において24時間培養した。

現量は，ΔΔCt法で算出した。実験に用いた牛特異

2.4

total RNAの抽出とcDNAの合成

的プライマーをTable１示す。

2 . 2において発情周期各期の牛黄体組織から，

３．結果と考察2 . 3 に お い て 24 時 間 培 養 し た 牛 黄 体 細 胞 か ら
RNeasy mini kit（Qiagen，74106）を用いてtotal

発情周期におけるTGFBR3 mRNA発現は形成RNA を 抽 出 し た 。total RNA（１μg）か ら ，期から後期黄体において高く，退行期で低い傾向

PrimeScript

RT reagent Kit（Takara，RR037A）が認められた（Fig. 1（A））
。また，初期細胞のを用いて一本鎖cDNAを合成し，real-time PCRTGFBR3 mRNA発現は通常気相においてhCGにに供した。

よって増加し，低酸素環境によりその作用が増強

TM

2.5

された（Fig. 2（A）；p＜0.05）。中期細胞におい

real time-PCR

2 . 2および2 . 3におけるreal-time PCRには7500ても，低酸素環境でhCGを添加することにより

FAST thermal cycler （Applied Biosystems） お

TGFBR3 mRNA発現が増加した（Fig. 2（B）；

よびKAPA FAST ABI prism qPCR kit（KAPA，

p＜0.05）。BetaglycanはTGF-βスーパーファミ

KK4604）を用いた。内部標準には18S ribosomal

リーの中でも卵巣に発現の認められているアイソ

Table 1 Primers used in real-time PCR.
18S rRNA

forward：reverse：5’- TCGCGGAAGGATTTAAAGTG -3’
5’- AAACGGCTACCACATCCAAG -3’

TGFBR3

forward：reverse：5’- CCTATCCCACAAGCCGAGAT -3’
5’- GCACACACTTGGGTAGCTTC -3’

ENG

forward：reverse：5’- TGCACCATCAAAAGCCTGAC -3’
5’- GACCACCTCGTTACTGACCA -3’

（A）

（B）
0.9

8.0

0.8

6.0

0.6

ENG mRNA(Arbitrary units)TGFBR3 mRNA
(Arbitrary units)

9.0

4.0
2.0
0

E

D

M

L

a

a

ab

ab
b

0.4
0.2

R

0

E

D

M

L

R

Fig. 1 Change in the relative amounts of TGFBR3 mRNA（A）and ENG mRNA（B）in the bovine CL throughout the

estrous cycle（E：early, Days 2-3；D：developing, Days 5-6；M：mid, Days 8-12；L：late, Days 15-17；R：
regressed luteal stages, Days 19-21）.Data are the means ± SEM for 4 samples/stage and are expressed as relative
ratios of TGFBR3 or ENG mRNA to 18S rRNA. Different letters indicate significant differences（p<0.05）, as
determined by ANOVA followed by a multiple comparison with Bonferroni correction.

© The Ito Foundation

240

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）(A)

P=0.054

3.0

a
2.0

a

a

1.0
0

3%
20%
None

b

3.5
TGFBR3 mRNA
(Arbitrary units)TGFBR3 mRNA
(Arbitrary units)

4.0

P=0.080

(B)

b

3%
20%
hCG

3.0
2.0

ab

a

a

1.0
0

O2

20%
3%
None

20%
3% O2
hCG

Fig. 2 Effects of hCG and hypoxia on TGFBR3 mRNA expression in bovine early luteal cells（A）and mid luteal cells（B）.The cells were cultured in the medium without or with hCG（1.0 U/ml）under 20% O 2 or 3% O2 for 24 hr. The
amount of TGFBR3 mRNA is expressed relative to the amounts of 18S rRNA. Different letters indicate significant
differences（p<0.05）,as determined by ANOVA followed by a multiple comparison with Bonferroni correction.
（A）（B）
ENG mRNA(Arbitrary units)

ENG mRNA(Arbitrary units)

3.0
2.0

1.0

0

20%
3%
None

20%
3%
hCG

4.5
4.0
3.0
2.0
1.0
0

O2

20%
3%
None

20%
3%
hCG

O2

Fig. 3 Effects of hCG and hypoxia on ENG mRNA expression in bovine early luteal cells（A）and mid luteal cells（B）.

The cells were cultured in the medium without or with hCG（1.0 U/ml）under 20% O2 or 3% O2 for 24 hr. The
amount of ENG mRNA is expressed relative to the amount of 18S rRNA.

フォームTGF-β１，TGF-β２およびTGF-β３

低酸素環境に曝される黄体初期において，の補助受容体である

betaglycanが卵胞構成細胞の黄体化を含めた黄体。TGF-β１，TGF-β２

４，５）

およびその受容とシグナル伝達を担うⅠ型受容体形成に関与することが推察された。

（TGFBR1）とⅡ型受容体（TGFBR2）は豚の排

EndoglinのリガンドであるBMP-9は血管の新卵後卵胞において黄体化しつつある顆粒層細胞お生や維持に関わるTGF-βスーパーファミリーのよび卵胞内膜細胞において認められており，一つである 12，13）。発情周期におけるENG mRNA

TGF-βが黄体化に関わることが示唆されてい発現は形成期から中期黄体において高く，退行期

る 。本研究において，TGFBR3 mRNA発現がで有意に低かった（Fig. 1（B）；p＜0.05）。しかhCGによって増加し，さらにその発現が低酸素環

し，初期および中期細胞のENG mRNA発現に及境によって増強されたことから，牛黄体細胞におぼすhCGあるいは低酸素環境の影響は認められな

けるTGFBR3 mRNA発現にはLH/CG受容体シかったことから（Fig.３），形成期および中期黄グナルと低酸素環境が関与しており，特に細胞が体組織におけるENG mRNA発現の亢進は黄体細11）© The Ito Foundation

牛初期黄体におけるPG抵抗性の解明－低酸素環境による抗アポトーシス機構－

241

胞よりも，むしろ黄体内の血管内皮細胞などの黄現を定量的RT-PCRにより解析した。初期細胞お体細胞以外の細胞におけるものと推察された。

よび中期細胞を通常（20％ O ２）または低酸素

endoglinはBMP-9と結合し，血管の形成だけで（３％ O２）の気相条件下において黄体形成ホルなく維持にも関与することから，endoglinはモン（LH）作用のあるヒト絨毛性ゴナドトロピ

黄体形成における血管新生よりも，発育過程あるン（hCG）添加あるいは非添加にて24時間培養

いは成熟した黄体機能に必要な血管の維持に関与

し，TGFBR3およびENG mRNA発現量の変化している可能性が示唆された。

を調べた。その結果，初期細胞において，hCGは12，13）

本研究において，牛の初期黄体における低酸素

通常気相でTGFBR3 mRNA発現を増加させ，低誘導性因子として，betaglicanを見出した。現在，

酸素環境はその作用を有意に増強した。ENG

その生理機能，特に初期黄体のアポトーシス抑制

mRNA発現に及ぼす低酸素環境あるいはhCGのへの関与について，結合リガンドであるTGF-β

影響は初期細胞と中期細胞のいずれにおいても認

１-３の作用とあわせて検討を進めている。また，

められなかった。本研究より，低酸素環境とLH

低酸素誘導性ではなかったものの，endoglinにつによって誘導されるbetaglycanが牛の黄体形成にいても牛黄体の機能維持に関与することを示唆す

関与すること，endoglinが黄体の形成と維持に関る結果が認められたことから，今後は黄体におけ与することが示唆された。今後，本研究で解析しるBMP-９の生理的役割とあわせてendoglin発現

たTGF-βⅢ型受容体betaglycanおよびendoglinの意義について解析する。

それぞれの結合リガンドであるTGF-β１-３お４．要

よびBMP-９の牛初期黄体における生理的役割の

約

解析をあわせて進め，初期黄体における抗アポ血 管 形 成 を 調 節 す る Transforming growth
factor（TGF）-β Ⅲ 型 受 容 体 betaglycan

トーシス機構と低酸素環境の関係を明らかにする必要がある。

（TGFBR3）およびendoglin（ENG）の牛黄体における発現や機能は不明である。本研究では，牛黄体の機能調節におけるTGFBR3およびENGの役割を明らかにする目的で，黄体における発情周期を通じたTGFBR3およびENGの発現を調べるとともに，その発現量に及ぼすhCGの影響について培養牛黄体細胞（初期細胞・中期細胞）を用いて検討した。排卵直後の黄体内は低酸素環境であることから，黄体細胞のTGFBR3およびENG
mRNA発現に及ぼす低酸素環境の影響についても検討した結果，TGFBR3 mRNA発現は形成期-後期に高く，退行期に低い傾向を示し，ENG
mRNA発現は形成期-中期に高く，発現の最も低い退行期と比較して有意に高かった。牛黄体の発情周期を通じたTGFBR3およびENG mRNA発

文献１）
 Nishimura, R., Okuda, K.：J Reprod Dev, 56, 110～116, 2010.
２）
 Topper, J. N.：Trends Cardiovasc Med, 10, 132～
137, 2000.
３）
 Groppe, J., Hinck, C. S., Samavarchi-Tehrani, P.,
Zubieta, C., Schuermann, J. P., Taylor, A. B.,
Schwarz, P. M., Wrana, J. L., Hinck, A. P.：Mol Cell,
29, 157～168, 2008.
４）
 Massague, J.：Annu Revl Biochem, 67, 753～791,
1998.
５）
 Lopez-Casillas, F., Wrana, J. L., Massague, J.：
Cell, 73, 1435～1444, 1993.
６）
 Omori, Y., Nakamura, K., Yamashita, S., Matsuda,
H., Mizutani, T., Miyamoto, K., Minegishi, T.：
Endocrinology, 146, 3379～3386, 2005.
７）
 Kubota, K., Omori, Y., Ikeda, S., Minegishi, T.：J,
Reprod Dev, 55, 200～205, 2009.
８）
 Kienast, Y., Jucknischke, U., Scheiblich, S., Their,M., de Wouters, M., Haas, A., Lehmann, C., Brand,V., Bernicke, D., Honold, K., Lorenz, S.：J Biol

© The Ito Foundation

242

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Chem, 291, 3395～3410, 2016.
９） Blanco, F. J., Santibanez, J. F., Guerrero-Esteo, M.,
Langa, C., Vary, C.P., Bernabeu, C.：J Cell Physiol,
204, 574～584, 2005.
10） Tian, F., Zhou, A. X., Smits, A. M., Larsson. E.,
Goumans, M. J., Heldin, C. H., Borén, J., Akyurek, L.
M.：Biochem Biophys Res Commun, 392, 283～288,
2009.

11）
 Sriperumbudur, R., Zorrilla, L., Gadsby, J. E.：
Anim Reprod Sci, 120, 84～94, 2007.
12）
 David, L., Mallet, C., Keramidas, M., Lamandé, N.,
Gasc, J. M, Dupuis-Girod, S., Plauchu, H., Feige, J. J.,
Bailly, S.：Circ Res, 102, 914～922, 2008.
13）
 David, L., Mallet, C., Mazerbourg, S., Feige, J. J.,
Bailly, S.：Blood, 109, 1953～1961, 2007.

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243

黒毛和種牛における妊娠期の栄養状態が産子の繁殖能力に及ぼす影響
Effects of maternal nutritional condition for fertility of their offsprings inJapanese Black cattle

北

原

豪

（宮崎大学農学部）

Go Kitahara（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

The objective of this study is to clarify the effects for the fertility of the offsprings bynutritional conditions in the dam. Thirteen Japanese Black dam and the female offsprings were
examined. The dams’ blood in 8, 4, 2 and 1 weeks before parturition were measured on NEFA,
total-cholesterol（T-Cho）, blood urea nitrogen, albumin, calcium, magnesium, aspartate
aminotransferase and gamma glutamyl transpeptidase. The offsprings’ blood biweekly collecteduntil 20 weeks old were measured anti-müllerian hormone（AMH）. The ten offsprings were
investigated the timing of the puberty, which found the first corpus luteum, by transrectal
ultrasonography. The blood AMH levels in them which found puberty on and after 360 days
old were higher than in them which found puberty before 300 days old. In addition, the dam of
the former offsprings had the higher level of NEFA at 4 and 2 weeks before the parturition
than them of the latter. The AMH levels in 6 offsprings showed > 800 pg/mL during theneonatal period. The dam of them have the lower T-Cho（p = 0.09）at 8 week and the higher
NEFA at 4 and 2 weeks（p < 0.05）before parturition than the dam of the other offsprings. The
three of the 6 offsprings had the puberty on and after 360 days olds. In conclusion, the puberty
in offsprings were related by metabolic condition on the third trimester in the dam, especially
NEFA and T-Cho. In addition, the AMH levels on the neonatal period in them were changedhigh, and tended to delay the puberty.

１．目

10年後には23.5カ月に，分娩間隔を13.2カ月から

的

12.5カ月にそれぞれ短縮させることが掲げられ

日本では家畜の改良増殖を計画的に行うことをた。これまでも同目標に向け，発情誘起や排卵同通じ畜産の振興を図るべく，家畜改良増殖目標と期化，ICTを活用した飼養管理などの取り組みがして，おおむね５年ごとに家畜の能力，体型およ行われてきたが，達成できていない。その理由のび頭数などに関する10年後の目標を定めることに１つに，個々の雌牛が有す繁殖能力の差異が考えなっている。令和２年３月の改訂で，肉用牛の繁られる。

殖能力目標数値として，初産月齢を24.5カ月から

最近，ヒトではエピジェネティクスと関連し© The Ito Foundation

244

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）て，胎児期および新生児期におけるプログラミン

可能性をこれまで明らかにしてきた。その中で，グやインプリンティングによって，生後の恒久的同一飼養条件下で繋養している黒毛和種雌牛の哺な変化をもたらすことが着目されている。例えば

乳および育成期において，１）春機発動時期の違

妊娠期に低栄養状態であった母親から生まれた児

いによって血中AMHレベルの動態が異なるこは，肥満，心臓疾患，糖尿病や高血圧などになりと，２）生後約２カ月にそのレベルに差異がみらやすいことが報告されている 。

れ る こ と ，を 明 ら か に し て い る ５）。し か し ，１）

日本の固有種である黒毛和種牛では，母牛の妊AMHの差異をもたらす要因は分かっていない。

娠期の栄養状態とその後の産子の免疫能を調べた

本研究では，黒毛和種牛について，妊娠第３期

報告がある。妊娠第３期（妊娠約180日以降，に母牛の代謝プロファイルを行い，産子の春機発分娩まで）における母牛の栄養が充足していない

動時期を出生後からの血中AMH動態と経直腸超場合，産子の免疫機能が低下したと報告されてい音波検査で確認し，相互関係を明らかにすることる。繁殖能力についても，雌では卵巣内の卵子ので，産子の繁殖能力に及ぼす妊娠期の母牛におけ数は胎子期に決定することから，妊娠期におけるる栄養評価指標を確立することを目的に調査を

母牛の状態が影響することは想像に難くない。し

行った。

２，
３）

かし，黒毛和種牛の妊娠期の栄養と産子の繁殖性については，調べられていない。

２．方法

肉用牛の妊娠期の栄養状態を調整し産子の繁殖

宮崎大学農学部附属住吉フィールドで繋養され性を調べた報告は，国外に１報ある 。交雑種未ている黒毛和種妊娠牛13頭（２産以上，以降は母経産牛の交配から妊娠110日までの妊娠第１期の牛と称す）およびその雌産子を調査した。

４）

栄養水準を60％と120％に設定し，産子の繁殖能

2.1

採血

力を調べた結果，卵巣内にある卵胞数に違いはみ

母牛は，妊娠230日，260日および260日以降はられたが，春機発動の時期に違いはみられなかっ分娩するまで１週間隔で採血を行った。産子は，たことを報告している。しかし，胎子の成長が著

出生後７日以内を生後０週とし，生後０週から２

しい時期は妊娠約180日から分娩までの妊娠第３

週間隔で20週まで採血を行った。採取した血液期である。そのため，妊娠第１期における栄養制

は，1,500 g で15分間の遠心分離を行い，血漿を分限を行ったとしても，胎子の成長や出生後の発育

離後，測定まで－30℃で保存した。

に及ぼす影響は，大きくないかもしれない。よっ

2.2

体重計測

て，妊娠第３期の栄養状態の違いによる影響を調産子は，出生時に体重の計測を行った。

査する必要がある。

2.3

血液化学検査抗ミューラー管ホルモン（AMH）は，卵胞を母牛の分娩前－8 週，－4 週，－2 週および－1構成する顆粒層細胞からのみ合成，分泌されるホ週の血液を用い，エネルギー代謝の指標として遊ルモンで，原始卵胞の過剰な成長の開始や成長し離脂肪酸（NEFA），脂質代謝の指標として総コた卵胞における卵胞刺激ホルモンの感受性を低下

レステロール（T-Cho），タンパク質代謝の指標させる作用を有し，卵巣から卵胞を早期に枯渇さとして総タンパク（TP），尿素窒素（BUN）おせないための重要な役割を担っている。我々はこよびアルブミン（Alb），ミネラルの指標としてのAMHに着目し，雌雄の繁殖性の指標としての

カルシウム（Ca）とマグネシウム（Mg），肝機© The Ito Foundation

245

黒毛和種牛における妊娠期の栄養状態が産子の繁殖能力に及ぼす影響能の指標としてアスパラギン酸アミノトランス

日齢未満で春機発動が確認できた産子と360日齢

フェラーゼ（AST）とγグルタミルトランスペまでに春機発動が確認できなかった産子に分け，プチターゼ（γ-GT）を，生化学自動分析装置

母牛の分娩前の血液化学測定項目を比較した。ま（JCA-BM8060, JEOL Ltd., Tokyo, Japan）
を用いた ，El-Sheikh ら ５）の 報 告 を 基 に ，産 子 の 血 中て測定した。

AMH濃度が期間中に800pg/mLを超えた産子と，

2.4

内分泌学的検査

それ以下だった産子に分け，その母牛の分娩前の産子より採取した血液を用い，生後０週から20

血液化学測定項目を比較した。群間の比較では，

週までの２週間間隔で抗ミューラー管ホルモン

Mann-Whitney U test（JMPⓇ16, SAS Institute（AMH）濃 度 を 市 販 の ELISA（AL-114 ，Ansh

Inc., USA）を用いた。数値は平均±標準誤差でLab，USA）を用いて，測定した。

示す。

2.5

経直腸超音波検査

３．結果と考察

供試した産子のうち10頭は，10カ月齢時より２週間隔で，超音波診断装置（トリンガ リニア

産子の出生時体重は31.7±0.9kg（n＝13，28.2

VET, Esaote Europe B.V., Netherlands）を用い，～37kg），春機発動は350±16日齢（ｎ＝10，269

経直腸にて卵巣を観察し，黄体が初めて確認でき～420日齢）だった。

た時を春機発動とした。なお，420日齢を過ぎて

Fig.１は13頭の産子の生後０日目から147日齢

も春機発動がみられなかった場合，420日とした。

までに採取した血中AMH濃度の推移を個体ごと

2.6

統計解析

に示している。春機発動が300日齢未満にみられ

経直腸超音波検査を行った10頭について，300

た産子は２頭（#201および212；実線および円のBlood AMH concentration（pg/mL）

2500

#3116

2000

#3121

1500

#3115
#3111

1000

#206

500

#218
#3110
#207
#230
#3131
#212
#201
#216

0

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Days after birthFig. 1 Blood levels of anti-Müllerian hormone（AMH）in each offspringsolid line + square；the puberty after 360 days old, solid line + circle；the puberty before 300days old,solid line + cross；the puberty between 300-360 days old, broken line + triangle；not decided the timing of the puberty© The Ito Foundation

246

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

マーカー），360日齢まで春機発動がみられなかっあるこの時期の平均＋標準偏差の値の0.4mEq/L

た産子は３頭（#3111，3115および3116；実線おより高く推移した。よって，これらの母牛ではこよび四角のマーカー）だった。300日齢未満で春の時期に体脂肪の動員が起こっていたことが示唆

機発動がみられた産子に比べ，春機発動が360日された。負のエネルギーバランスや妊娠期におけ齢までにみられなかった産子は，血中AMH濃度

るインスリン抵抗性と相まって，直接的に，あるが高く推移した。春機発動が360日齢までにみら

いはIGF-1やインスリンなどを介して間接的に，れなかった産子の母牛は，分娩前－4 週と－2 週

産子の視床下部―下垂体―性腺軸や卵巣におけるの血中NEFA濃度が，春機発動が300日齢未満に卵胞動員に対して影響を及ぼしたかもしれない。

みられた産子の母牛に比べ，高かった（Fig.２）。

産子の血中AMH濃度が，期間中に800pg/mL

乳牛において，分娩予定前３週にインスリン感受を超えた６頭（#3110，#3111，#3115，#3116，

性試験を行い，インスリンに対して反応が悪かっ#3121および#206）と，超えなかった７頭に分けた母牛の産子は，出生時体重，血中インスリン様て比較したところ，血中AMH濃度が800pg/mL

成長因子１（IGF-1）濃度および血中インスリンを超えた産子の母牛は，超えなかった産子の母牛

濃度が低かったことが報告されている 。本研究に比べ，分娩前－8 週の血中T-Cho濃度が低い傾では，産子の春機発動が遅れた産子の母牛は，分向がみられ（ｐ＝0.09），分娩前－4週と－2 週の娩前４週から２週にかけてのNEFAが，既報

血中NEFA濃度が高かった（それぞれp < 0.01，

６）

－4

－2

－1

－8

－4

－2

－1

50
0

－8

－4

－2

－1

10

0.6

9.5

0.4
0.2
0

－8

－4

－2

－2

－1

60
40
0

－4

－2

－1

－8

－4

－2

－1

－8

－4

－2

－1

8.5

2.5

80

20
－4

－8

9

8

－1

100

－8

30
25
20
15
10
5
0

0.8

Mg (mg/dL)

12
10
8
6
4
2
0

－8

γ-GT(U/L)

6.6

100

Ca(mg/dL)

6.8

NEFA (mEq/L)

Alb (g/dL)
BUN (mg/dL)

T-Cho (mg/dL)

7

AST (U/L)

TP (g/dL)

7.2

2.9
2.8
2.7
2.6
2.5
2.4
2.3

に

150

7.4

6.4

７）

－8

－4

－2

－1

2
1.5
1
0.5
0

Weeks before parturition
Fig. 2 Metabolic profiles on dam by timing of puberty in the offsprings

solid line（n = 2）
；the puberty before 300 days old, broken line（n = 3）；the puberty after 360 days old© The Ito Foundation

247

黒毛和種牛における妊娠期の栄養状態が産子の繁殖能力に及ぼす影響

－4

－2

－8

－4

－2

－8

－4

－2

Ca(mg/dL)

＊＊

0.4
0.2
－4

－2

5

－8

－4

－2

－1

－8

－4

－2

－1

－8

－4

－2

－1

－8

－4

－2

－1

9.4
9.2
9
8.8

2.5

60
40
20
0

10

8.6

－1

80

10

20

9.6

0.6

－8

30

0

－1

＊

0.8

0

－1

AST (U/L)

BUN (mg/dL)

50

1

15

0

100

0

－1

γ-GT(U/L)

T-Cho (mg/dL)
－8

40

†

Mg (mg/dL)

2.85
2.8
2.75
2.7
2.65
2.6
2.55

150

NEFA (mEq/L)

Alb (g/dL)

TP (g/dL)

7.3
7.2
7.1
7
6.9
6.8
6.7
6.6

－8

－4

－2

－1

2
1.5
1
0.5
0

Weeks before parturition
Fig. 3 Metabolic profiles on dam by anti-Müllerian level（AMH）in the offsprings

solid line（n = 7）
；the AMH levels less than 800 pg/mL, broken line（n = 6）；the AMH levels more than 800 pg/mL†；p < 0.1, ＊；p < 0.05, ＊＊；p < 0.01

p < 0.05）（Fig.３）。さらに血中AMH濃度が800

発現と，それに伴う卵巣アンドロゲン活性の過剰

pg/mLを超えた産子６頭のうち，春機発動が360亢進のためとされ，その病因として，インスリン日齢までにみられなかった産子が３頭いた。一方抵抗性による高インスリン血症や高LH血症が考で血中AMH濃度が800pg/mLを超えなかった産えられている ９）。本研究でみられた生後早期の子７頭のうち，経直腸超音波検査を行った４頭す

AMHレベルが高い産子では，このヒトにおけるべてで360日齢までに春機発動がみられた。今回，PCOSと同様の病態も考えられ，その原因として出生後早い段階から血中AMH濃度がこれまでの妊娠末期における母牛の負のエネルギーバランス

既報が産子に影響を及ぼした可能性も考えられるが，より高く推移する産子がみられ，その中の５）半数で春機発動が遅延していた。ヒトでは多嚢胞さらなる調査が必要である。

性卵巣症候群（PCOS）と呼ばれる疾病があり，結論として，黒毛和種牛において産子の春機発

卵巣に多数の小卵胞を形成し無排卵となる。この動時期は，母牛の妊娠第３期のエネルギー代謝と場合，血中のAMHレベルが高くなることが報告関係する可能性があること，また，妊娠第３期のされている８）。PCOSにおける卵胞発育が停止す

NEFAが高く，T-Choが低かった母牛の産子では，る病態として，卵巣局所におけるLH作用の過剰

新生子期の血中AMHレベルが高く，春機発動時© The Ito Foundation

248

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

期が遅れた。しかし，母牛の代謝状況と産子の繁結論として，黒毛和種牛において，産子の春機発殖性の関係性は，さらに多くの頭数を調査し，メ

動時期は，母牛の妊娠第３期のエネルギー代謝とカニズムも含め，明らかにしていく必要がある。

関係する可能性があること，また，妊娠第３期の

４．要NEFAが高く，T-Choが低かった母牛の産子では，約

新生子期の血中AMHレベルが高く，春機発動時

本研究では，黒毛和種牛について，妊娠第３期期が遅れた。

に母牛の代謝プロファイルを行い，産子の春機発動時期を出生後からの血中AMH動態と経直腸超音波検査で確認し，相互関係を明らかにすることを目的に調査を行った。黒毛和種妊娠牛13頭およびその雌産子を調査した。母牛の分娩前－8 週，－4 週，－2 週および－1 週の血液を用い，遊離
脂肪酸（NEFA），総コレステロール（T-Cho），
総タンパク（TP），尿素窒素（BUN），アルブミ
ン（Alb），カ ル シ ウ ム（Ca），マ グ ネ シ ウ ム（Mg），アスパラギン酸アミノトランスフェラー
ゼ（AST）およびγグルタミルトランスペプチ
ターゼ（γ-GT）を測定した。産子の血液を用い ，生 後 ０ 週 か ら 20 週 ま で の ２ 週 間 間 隔 で 抗
ミューラー管ホルモン（AMH）濃度を測定した。供試した産子のうち10頭は，10カ月齢時より２週間隔で，経直腸超音波検査を行い，黄体の有無を記録し，黄体が初めて確認できた時を春機発動とした。なお，420日齢を過ぎても春機発動がみられなかった場合，420日とした。春機発動が360日齢までにみられなかった産子（ｎ＝３）は，300日齢未満で春機発動がみられた産子（ｎ＝２）に比べ，血中AMH濃度が高く推移し，その母牛の分娩前－4 週と－2 週の血中NEFA濃度が高かった。産子の血中AMH濃度が期間中に800pg/
mLを超えた６頭の母牛は，超えなかった７頭の母牛に比べ，分娩前－8 週の血中T-Cho濃度が低く（ｐ ＝ 0.09），分 娩 前 －4 週 と －2 週 の 血 中NEFA濃度が高かった（それぞれp＜0.01，p＜
0.05）。さらにその産子６頭のうち，春機発動が文
献１）
 Langley-Evans, S. C.：Developmental programmingof health and disease, Proc. Nutr. Soc., 65, 97～105,2006.
２）
 芝野健一，大塚浩通，嵐泰弘，黒木智成，斎藤隆
文：黒毛和種牛の周産期における低栄養が出生子牛の血液性状に及ぼす影響，日獣会誌, 62, 538～541,
2009.
３）
 田波絵里香，大塚浩通，向井真知子，小比類巻正幸，安藤貴朗，小形芳美，川村清市：妊娠末期における母牛の栄養状態が出生後の黒毛和種産子の末梢血白血球ポピュレーションに及ぼす影響，日獣会誌,
62, 623～629, 2009.
４）
 Mossa, F., Carter, F., Walsh, S. W., Kenny, D. A.,
Smith, G. W., Ireland, J. L., Hildebrandt, T. B.,
Lonergan, P., Ireland, J. J., Evans, A. C.：Maternal
Undernutrition in Cows Impairs Ovarian andCardiovascular Systems in Their Offspring, Biol.
Reprod., 88, 92, 2013.
５）
 El-Sheikh Ali, H., Kitahara, G., Takahashi, T.,
Mido, S., Sadawy, M., Kobayashi, I., Hemmi, K.,
Osawa T.：Plasma anti-Müllerian hormone profilein heifers from birth through puberty andrelationship with puberty onset, Biol. Reprod., 97,
153～161, 2017.
６） 川島千帆：乳牛における分娩前後の栄養代謝状態
が分娩後の繁殖機能回復と産子の体質に及ぼす影
響，家畜感染症学会誌，6，39～46, 2017.
７）
 上松瑞穂：黒毛和種繁殖雌牛の血液代謝プロファ
イルテスト, 臨床獣医 臨時増刊号 新しい牛の繁殖～新技術の現場応用と近未来の展望～，68～74,2017.
８） Stylianos, V., Kaitlyn, E. J., Caitlin, R. S., Jennifer,
Y. H., Irene, D., Charles L. B., Irene S.：A patientspecific model combining antimüllerian hormone
and body mass index as a predictor of polycystic
ovary syndrome and other oligo-anovulation
disorders, Fertil. Steril., 115, 229～237, 2021.
９）
 折坂誠：高LH環境はFSH誘導性の卵胞発育を抑制する―アジア系女性に典型的なnon-obese PCOSの病態解明を目指して―，日本生殖内分泌学会雑誌,
17, 27～31, 2012.

360日齢までにみられなかった産子が３頭いた。

© The Ito Foundation

249

リピートブリーダー牛の原因の多角的解析によるその対策のための基礎情報収集
Gathering basic information for the solution of repeat-breeder cows bymultiple analysis of its causes

羽

田

真

悟・真

方

文

絵＊

（帯広畜産大学獣医学研究部門，＊東京大学大学院農学生命科学研究科）

Shingo Haneda and Fumie Magata＊（Department of Veterinary Medicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine,＊Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

This study aimed to gather basic information for the solution of repeat-breeder cows bymultiple analysis of its causes. Ultrasonographic and hysteroscopic observation, bacterial
analysis, cytological（PMN and lymphocyte）count, protein（EGF, IL6 and AOPP）and gene
expression（MUC1 and IL8）measurement were performed for 7 milking cows. One cow
showed slight accumulation of the fluid in the uterus by ultrasonography. Corynebacterium
renale was detected from cell debris from uterine flushing and also PMN ratio was high bycytological count. These were clinical finding to diagnose as endometritis. In this cow, IL8mRNA expression was also upregulated notably. As findings that not found in common clinicalexaminations（ultrasonography, bacterial analysis and cytology）, discolored endometrium anddesquamated endometrial epithelium were observed by utroscopic analysis. An increase of
AOPP was also recognized in the cow with desquamated endometrium. EGF and IL6 protein
in uterine flush solution were lower than the minimal level of the assays（for EGF, the solution
was concentrated 50 times）. Then, rearrangement concentration of the solution was required.
These multiple analyses make it possible to diagnose the cause of repeat-breeder cows.
Accordingly, reproductive performance will be improved.

１．目

産性低下の原因となっている。異常が認められな的い不受胎は，その要因が上記の検査では診断でき

牛の繁殖の現場において，超音波検査などの臨ないものと考えられる。不受胎の要因を正しく診

床検査で異常が認められるものは，異常に合わせ断することができれば，状態の悪い牛に人工授精た治療が行われている。臨床検査で異常が認めらを行うなどの無駄な行為を減らすことができ，状れないものは，細胞診，細菌検査など検査室での態に合わせた治療を行うことで繁殖効率および経検査が実施されるか，そのまま繁殖に供され続け済性の改善が期待できる。

るが，原因が分からず３回人工授精を行っても受他種動物の情報から，生殖器の状態を検査する

胎しないものはリピートブリーダーと呼ばれ，生方法としては，上記以外に，子宮内に分泌されて© The Ito Foundation

250

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

いる成分を調べる方法や内視鏡で直接観察する方

した生理食塩水は回収し，解析に用いた。逆側の法がある。分泌物は，炎症に関連するタンパク質１）

子宮角も同様に観察および採材を行った。また，や そ の mRNA ２），エ キ ソ ソ ー ム 中 の マ イ ク ロ

重度炎症の陽性対象として，子宮蓄膿症の牛からRNA（miRNA） が子宮内膜炎時には増加する

膿汁を採取した。

３）と考えられることや，炎症の結果生じるタンパク

回収液は，1,600 xg，４℃で15分間遠心し，上質過酸化物（AOPP） などが診断の指標となり清をタンパク質の解析に，沈殿物を細菌培養，細うる。内視鏡は，申請者が最近牛における観察方

胞診，DNA抽出，RNA抽出に用いた。

４）法を確立し，子宮内膜表面の様子を観察すること

EGF 測 定 は ，限 外 濾 過 フ ィ ル タ ー（Amiconができる。分娩後の子宮の修復を観察した結果か

Ultra-0.5，PLBCウルトラセル-３メンブレン，

ら子宮内膜の異常な所見をいくつか得られている

３kDa，メルク）を使用して回収液５mlを50倍濃ことから，臨床現場における診断法として有用で

縮 し ，ELISA キ ッ ト（Bovine Epithelial growth

ある。

factor（EGF）ELISA Kit ，CUSABIO）を 用 い

以上のことから，本研究では，リピートブリーて 行 っ た 。IL6 測 定 は ，ELISA キ ッ ト（IL-6

ダー牛の生殖器について，細菌検査，細胞診，子Bovine Uncoarted ELISA Kit，Invitrogen）を用

宮内分泌物の検査，内視鏡による観察といった多い て 行 っ た 。AOPP 測 定 は ，ア ッ セ イ キ ッ ト

角的な検査を実施し，正常牛および明らかな子宮（OxiSelect AOPP Assay Kit ，CELL BIOLABS）

内膜炎罹患牛と比較することでその病態を把握を用いて行った。細菌培養は外注した。細胞診は，し，治療方針を検討するための基礎情報を得るこ

沈殿物を懸濁液にし，スライドグラスに塗抹後，とを目的に行った。

ディフ・クイック染色により有核細胞200個中の２．方

PMNおよびリンパ球の割合を算出した。DNA抽法

出 は ， DNA 抽 出 キ ッ ト （DNeasy Blood &本学畜産フィールド科学センターにて繋養されTissue Kit，QIAGEN）を用いて行い，細菌DNAているホルスタイン種泌乳牛７頭を使用した。検をPCR法により検出した。検出用のプライマー

査に最適な発情後日数を検討するために，EGF

は，細菌ユニバーサルな16srDNAを対象にした発現が高いとされるday3，4，14（排卵確認日＝ものを使用した（fD1 fwd：5’-AGA GTT TGA

day1，n＝2，3，2）に観察および採材を行った。

TCC TGG CTC AG-3’，rev：5’-TAC GGT TAC

まず，超音波画像診断装置（MyLabOne VET，CTT GTT ACG AC-3’）。RNA 抽 出 は ，RNA 抽

esaote）を用いて卵巣および子宮の観察を行っ

出用試薬（ISOGENⅡ，ニッポンジーン）を用いた。子宮は，全体をスキャンし，子宮角先端，中て行い，続く逆転写反応にはcDNA合成キット

部，基部および子宮体部の画像を記録した。次に，（SuperScript IV VILO，Thermo Fisher Scientific）

ポータブル内視鏡（aViewおよびaScope Large，を用いた。得られたcDNAはリアルタイムPCRにAmbu）を人工授精の要領で子宮内に挿入し，片より，MUC1（fwd：5’-ATG ACC ACC CGC TCT

方の子宮角へと進め，炭酸ガスを注入することで

ATG TC-3’，rev：5’-GGA GGT GGA AAG TGC

内腔を膨らませて観察した。いったんガスを抜

TAT GC-3’）お よ び IL8（fwd：5’-CAC ATT

き，そのまま25mlの生理食塩水を注入すること

CCA CAC CTT TCC AC-3’ ， rev ： 5’-CTT

で液体が充満した状態でも内腔を観察した。注入TTC CTT GGG GTT TAG GC-3’）mRNA 発 現© The Ito Foundation

251

リピートブリーダー牛の原因の多角的解析によるその対策のための基礎情報収集を 比 較 し た 。補 正 に は GAPDH（fwd：5’-GAA

において観察された（Fig.１）。day３の２頭は，

GCT CGT CAT CAA TGG AAA-3’，rev：5’-CCA

生殖器の異常以外の問題で繁殖除外されていた

CTT GAT GTT GGC AGG AT-3’）を使用した。

が，day３-ｂにみられた変色部が子宮内膜の正常な機能を発揮できないようなものであった場

３．結果と考察合，内視鏡でのみ発見できる異常であり，通常の結果の一覧をTable１に示した。細菌検査によ繁殖管理ではリピートブリーダーとなる可能性がり菌が検出されたものはday４-ｂのみであった。

ある。day４-ａは長期不受胎であったが，炎症

また，細菌を検出するPCRにおいてもday４-ｂ等の所見はみられなかった。しかし，超音波所見のみが陽性であった。細菌の存在にともない，回において子宮内膜内に高輝度な部分が散見された

収液中のPMN割合も42％と増加していた。加え（Fig.２）。内視鏡による観察では特に異常が認めて，炎症時に好中球の走化性活性作用を持つIL8られなかったことから，子宮内膜の内部に異常部

mRNAの発現が顕著に増加していた。以上から，位があると考えられるが，生体での調査は難しい

この個体は典型的な子宮内膜炎であると考えられため，高輝度部位がどのようになっているかは，る。一方，超音波初見では明らかな貯留物は認めと場材料で同様の所見が認められるものを調査す

られず，子宮内から採材する積極的な検査をしなる必要がある。もしこれが繁殖機能に影響するもい限り発見しづらい潜在性子宮内膜炎であり，このであった場合，超音波画像診断において着目すの牛は長期不受胎で繁殖除外されていたので慢性べき点として認識する必要がある。day４-ｃは，的な潜在性子宮内膜炎が原因であったと推察され

IL8 mRNA発現がやや増加していた。細菌が未る。day３の２頭は，発情時のものと考えられる検出であることとPMN割合が増加していないこ

出血が回収液中に強く認められた。その影響か，とから原因は不明であるが，非感染性の弱い刺激

PMNおよびリンパ球の割合が若干増加していた。

物が存在するのかもしれない。day14-ａは，炎また，AOPPの値が高いことも，血中のAOPPは症性の反応はみられなかったが，内視鏡所見にお

ヒトにおいて100μＭ程度の濃度であることを考いて，ガス注入時には白色の筋が不規則に走る像

えると，出血の影響で増加していると推察されがみられ，生理食塩水注入時には子宮内膜上皮がる。その他炎症性の反応はみられなかったが，広範囲に剥離する様子が描出された（Fig.３）。

day３-ｂにおいて子宮内膜の変色が一定の範囲

生理食塩水注入後に子宮をマッサージすることでTable1 T
 he results of multiple analyses in 7 cows and pus.
細菌検査

細菌
PCR

PMN

Lym

day3-aday3-b

－
－

－
－

6
6.5

1.5
1.5

day4-a－－00

day4-b+42

0

day4-cCorynebacterium
renale
－

－

0.5

1

day14-a

－

－

0

0.5

day14-b－
Trueperellapyogenes

－

8

19

膿汁

超音波
所見

内膜内
高輝度点
わずかな
貯留
わずかな
貯留

内視鏡
所見
変色

EGF

IL6

AOPP
μM

MUC1
mRNA

IL8
mRNA

限界以下
限界以下

限界以下
限界以下

23.1
27.2

1.0
0.5

1.0
1.2

限界以下

限界以下

3.8

1.0

0.4

不受胎
不受胎

限界以下

限界以下

3.0

1.2

116.2

限界以下

限界以下

10.6

0.8

15.8

上皮剥離 限界以下

限界以下

31.5

1.0

0.4

限界以下

限界以下

6.8

1.1

4.4

>10ng/ml

86.3+© The Ito Foundation

繁殖
履歴

備考
出血多
出血多

不受胎

252

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Fig.1 Discolored endometrium.

Fig.3 Desquamated endometrial epithelium.

中球による貪食作用の結果を反映すると言われて
おり４），実際膿汁中のAOPPは86.3μＭと高かったが，この個体では炎症細胞の遊走はみられな
かったことから，子宮内において別の酸化ストレ
スがかかっていて，それが子宮内膜上皮の剥離と関連したかもしれない。また，この個体は長期不受胎であったことから，このような非炎症性の異常が原因であった可能性が示唆される。day14ｂは，PMNとIL8 mRNAの軽度な増加と，リンパ球の増加が確認された。day４-ｃと同様，細Fig.2 High echogenic structure in the endometrium（arrow）.

菌の存在が検出できなかったため，炎症の原因については不明である。リンパ球の増加についても情報が少なく，どのような病態を反映しているの

子宮内膜上皮が剥離していたことを組織学的に示か，細菌以外の病原体や炎症を引き起こす状態にした報告があるが，本実験において，注入するだ

ついて今後調査していく必要がある。

けで剥離するような状態は他の個体ではみられな

今回の試験では，回収液中のEGFおよびIL6をかったことから，子宮内膜上皮の機能異常が疑わ検出することはできなかった。EGFは子宮の機れる。剥離した上皮の性質を確認し異常の原因を能を反映し，リピートブリーダーでは子宮内膜組推定するために，接着因子の発現状況やアポトー

織での濃度が低いことが知られているため，子宮シスの状況などを調査する必要がある。加えて，の機能不全による不受胎予測のマーカーとなりう

この個体はAOPP濃度が高かった。AOPPは，好る。今回の試験では回収液を50倍濃縮して測定し© The Ito Foundation

リピートブリーダー牛の原因の多角的解析によるその対策のための基礎情報収集

253

たが，検出限界以下ではあったものの個体によりみられた子宮内膜上皮の剥離について調査できる反応の差がみられた。このことから，濃縮率を上可能性がある。また，今回は間に合わなかったが，げることにより測定できる可能性がある。IL６は内視鏡による卵巣の観察を実施することで，癒着回収液原液で測定したが，子宮蓄膿症の牛から採など解剖学的な異常を調査する予定である。

取した膿汁では検出限界以上の非常に高い値を示した。day４-ｂのように明らかに炎症を起こし

４．要約ているような個体でも検出できなかったことか

リピートブリーダーの原因を特定するための基ら，ある程度濃縮して感度を上げる必要がある。

礎情報を得ることを目的に，牛７頭に対し画像診

MUC1 mRNA発現は，炎症時に増加するとい断，細菌検査，タンパク質，遺伝子発現と多角的う報告があるが，今回測定したday３～14の個体な解析を行った。リピートブリーダーの定義か間ではその発現に大きな差はみられなかった。あら，現在臨床で実施できる超音波画像診断，細菌る条件下では増加するのかもしれないが，そのタ検査，細胞診で異常が発見できるものは，それぞイミングなど詳しく調査する必要がある。回収液

れに応じた治療が可能である。一方，本調査から，におけるエキソソーム中のmiRNAの解析は準備

成分的な要素としてAOPP濃度が長期不受胎の牛中であるが，次世代シーケンサーにより網羅的にで高いことや，内視鏡による肉眼的観察にて異常発現の解析を行う予定である。

所見がみられることが分かった。EGFやIL６濃２）

今後の課題として，まず採材日の決定があげら

度の測定を改善しつつ，症例を継続して収集するれる。EGFを検出する目的で，採材の日を発情ことで，現在リピートブリーダーと診断される牛後day3，4，14に設定して比較したが，EGFが検のうち原因が診断できる例を増やすことで繁殖効

出できなかったので，まずはさらなる濃縮を試み率の改善を目指す。

る必要がある。一方，day３では発情後の出血の影響で内視鏡による子宮内の観察が阻害されることや，出血由来の白血球の増加，AOPP濃度が高く検出されることなどの問題が考えられることか
ら採材候補日から除外する。day４は，内視鏡の挿入が比較的容易になることと，黄体期早期に増加していく血中プロジェステロン濃度の比較もできるメリットがあり，day14では，今回の観察で

文
献１）
 Brodzki, P., Kostro, K., Krakowski, L., Marczuk,
J.：Vet Res Commun, 39（2）,143～149, 2015.
 Kasimanickam, R., Kasimanickam, V., Kastelic, J.
２）
P.：Theriogenology, 81（7）,952～958, 2014.
３）
 Wang, X., Tian, F., Chen, C., Feng, Y., Sheng, X.,
Guo, Y., Ni, H.：Reprod Biol, 19（2）,204～209, 2019.
 Gabai, G., Luca, E. D., Miotto, G., Zin, G., Stefani, A.,
４）
Dalt, L. D., Barberio, A., Celi, P.：Antioxidants, 8（1）,21, 2019.

© The Ito Foundation

254

オリゴクローナルな持続性リンパ球増多症を示す
牛白血病ウイルス感染牛の生産性解析
Productivity analysis of cattle infected with bovine leukemia virus whichshow oligoclonal persistent lymphocytosis

猪

熊

壽

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Hisashi Inokuma（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

The aim of this study is to clarify the actual percentage of cows which showed oligoclonal
B-lymphocyte proliferation in bovine leukemia virus （BLV）-infected individuals withpersistent lymphocytosis（PL）, and its change over time and examine the effect of oligoclonal
status on cattle productivity. B-lymphocyte clonality of 274 cows was analyzed over time byusing clonality-PCR. As a result, none showed monoclonality, but 10 showed minor-clonality（3.7％）and 31 oligoclonal（11.3％）, that suggested a total of 14.0％ of PL cows had sometumors. Onset of Enzootic bovine leukosis（EBL）was not found in all 233 polyclonal cows
within 1 year, whereas 2（6.5％）of 31 specimens that exhibited oligoclonal were confirmed todevelop EBL one year later. Oligoclonal status might be a high-risk factor for developing EBL.
In addition, 16 of the 31 specimens exhibiting oligoclonal were continuously tested one year
later, and found to be 1 minorclonal, 3 oligoclonal, and 12 polyclonal status. It was thought that
B-lymphocyte clonality does not always progress in one direction but changes reversibly.

１．目

リクローナル増殖とされている３，４）。しかし，近的年，PLと発症の間にはオリゴクローナルなリン

牛伝染性リンパ腫（enzootic bovine leukosis：

パ球の増殖期，つまりいくつかの腫瘍細胞がクEBL）は牛伝染性リンパ腫ウイルス（旧：牛白血

ローン化する段階が存在することが明らかとなっ病 ウ イ ル ス bovine leukemia virus：BLV）感 染

た５）。リンパ球のオリゴクローナル増殖はBLV近により生じる疾患で，近年その発症数が増加して縁のヒトＴ細胞白血病ウイルス感染で生じる成人

いる １，２）。BLV感染牛の大部分は無症状だが，型Ｔ細胞白血病（Adult T-cell leukemia：ATL）

30 ％ は 持 続 性 リ ン パ 球 増 多 症 （persistentでも知られており，ATLでは発症の一病型と認

lymphocytosis：PL）に進行し，さらにうち10％

識されている６）。一方，牛ではPL牛は腫瘍化してがEBLを発症する２）。EBL発症牛のリンパ球は腫いないとして生産に供されている。オリゴクロー

瘍化しており，単一細胞由来モノクローナル増殖

ナルなPL牛が本当に腫瘍か否かについては確認であるのに対し，非腫瘍化PL牛のリンパ球はポされておらず，またオリゴクローナルなPL牛の© The Ito Foundation

オリゴクローナルな持続性リンパ球増多症を示す牛白血病ウイルス感染牛の生産性解析

255

臨床的意義も明らかになっていない。そこで本研

ライマーBoVHF1：5’-AGCCCTGAAATCCCGG

究では，オリゴクローナルなＢリンパ球増殖を示

CTCA-3’/BoVHR1：5’-TCCAGGAGTCCTTGG

すPL牛の実態とその経時的変化，および発症とCCCCA-3’を用いたPCRを実施した８）。PCR産物の関連を明らかにし，オリゴクローナルな状態がはキャピラリ電気泳動装置（Agilent 2100バイオ

腫瘍発生による全廃棄により，牛の生産性に及ぼアナライザー，Agilent Technologies，California）

す影響を考察することを目的として，BLV感染

お

PL牛274頭について，Ｂリンパ球クローナリティ

Technologies，California）を用いてクローナリ

を経時的に解析した。

ティを解析した。ピークを伴わない波形を示すも

２．方

よ

び

DNA 1000 Lab Chip kit （Agilentのをポリクローナル，マーカーの高さを超える法

ピークを持つものをモノクローナルとした（Fig.

茨城県が実施するBLV清浄化対策モデル農家

１）。また，１つ以上の小ピークが存在するもの

18戸に飼養される牛のうち，2018年度にBLV抗をオリゴクローナルとした（Fig.１）。さらに，

体陽性かつPLを呈した274検体を材料とした。うモノクローナルのような高いピークを示さない

ち168検体はホルスタイン種，106検体は黒毛和種

が，ポリクローナル波形の高さの最大値より大きであった。モデル農家とはBLV清浄化のため茨く，マーカーの高さを超えないピークが１つ存在

城県家畜保健衛生所の指導のもとに，年１回のするものをマイナークローナルと定義した（Fig.

BLV抗体検査および感染対策指導を受けている

１）。

農家である。リンパ球増多症の基準は，ホルスタ

解析結果の品種間の差についてはピアソンのカイン種ではECの鍵，黒毛和種においては黒毛和

イ２乗検定により検定した。有意水準は５％とし種用に作成されたAkagamiらの基準を用いた 。

た。

７）

2018年度検体のうち2019年度も継続して検査できた検体については継続検査を実施した。継続検

３．結果と考察

査できなかった個体については，その転帰につい2018年度のPL牛274検体を解析したところ，マて，個体識別情報検索サービスを用いて死亡の有イナークローナル10検体（3.7％），オリゴクロー無を調べた。死亡個体のうち聞き取り等で追跡でナル31検体（11.3％），ポリクローナル233検体

きるものについてはEBL発症の有無を確認した。

（85.0％）であったが，モノクローナルを示した

DNAの抽出は，PL牛の末梢血から自動核酸抽

ものはいなかった。品種別ではホルスタイン種で器 （Automate Express Nucleic Acid

マイナークローナル７検体，オリゴクローナル18

Extraction System，サーモフィッシャーズ，日検体，ポリクローナル143検体であった。一方，本）を用いて実施した。DNAはクローナリティ

黒毛和種ではそれぞれ３検体，13検体，90検体で，解析まで－30℃で保存した。陽性対照として病理品種によるクローナリティの割合に差はみられな

学的にリンパ腫と診断された個体のリンパ節およかった（ｐ＝0.796）。リンパ球のオリゴクローナ

び血液を用いた。陰性対照としてBLV陰性PL陰ル増殖は，ヒトのATLでは発症の一病型と認識性の４検体のEDTA末梢血を用いた。

されていることから６），牛においてもPL牛の約出Ｂリンパ球クローナリティ解析は，牛免疫グロ
ブリンＨ鎖の可変領域を含む領域を標的としたプ

15％は，すでに一部の細胞が腫瘍化していることが示唆されるデータである。

© The Ito Foundation

256

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）（A）Monoclonal（B）Minorclonal（C）Oligoclonal（D）Polyclonal

Fig.1 Representative patterns of（A）monoclonal,（B）minorclonal,（C）oligoclonal and（D）

polyclonal B-lymphocyte proliferation of clonality PCR by using a capillary electrophoresis
device, Agilent 1000.

2019年度にも継続してクローナリティ解析が可2018年度にポリクローナルを呈した233検体を能であったのは157検体であった。残り117検体は追跡したところ，136検体で2019年度に継続検査

解析しなかった（Table１）。

が可能であった。うち131検体はポリクローナル

2018年度にオリゴクローナルを呈した31検体をが継続したが，マイナークローナルとなったもの

追跡したところ，16検体で2019年度に継続検査がが１検体，オリゴクローナルとなったものが４検可能であった。内訳はマイナークローナル１検体であった。継続検査できなかった97検体のう体，オリゴクローナル３検体，ポリクローナル12

ち，と畜検査でEBL発症が確認されたものはいな

検体であった（Table１）。継続検査できなかった

かった。

15頭のうち，と畜検査でEBL発症が２検体あっ本研究では，PL牛157検体で約１年後のクローた。EBL発症２検体は，それぞれ12歳齢の黒毛和

ナリティ解析を行うことが可能であった。解析の種と６歳齢のホルスタイン種であった。

結果，クローナリティは必ずしも一方向に進行す2018年度のマイナークローナル10検体を追跡しるものではなく，可逆的に変化することが明らかたところ，５検体で2019年度に継続検査可能でとなった。これは腫瘍発生と宿主免疫の攻防によあった。内訳はマイナークローナル継続４検体おる変化である可能性が考えられた。

よびオリゴクローナル１検体であった。残り５頭

EBL発症については，2018年度にポリクローナのうち，EBLを発症したものはいなかった（Table

ルを呈した233検体から１年後には発症牛はいな

１）。

かった。一方，2018年度にオリゴクローナルを呈© The Ito Foundation

オリゴクローナルな持続性リンパ球増多症を示す牛白血病ウイルス感染牛の生産性解析

257

Table 1 Change of pheripheral B-lymphocyte clonality in cattle with persistent

lymphocytosis from 2018 to 20192018

Clonality states
Monoclonal

Minorclonal

2019

Numbers of cattle

Consequence clonality status

0

10

－

0

Monoclonal

0

Minorclonal

4

Oligoclonal

1

Polyclonal

0
5
Total

31

Total

233

10

EBL（Slaughtered）

2

Monoclonal

0

Minorclonal

1

Oligoclonal

3

Polyclonal

12

Others13
Total

Polyclonal

0

EBL（Slaughtered）

OthersOligoclonal

Numbers of cattle

31

EBL（Slaughtered）

0

Monoclonal

0

Minorclonal

1

Oligoclonal

4

Polyclonal

131

Others

97

274

Total

233

Total

274

した31検体のうち２頭（6.5％）で１年後にEBL症リスクが高く，食肉検査所での全廃棄により生発症が確認された。ヒトの慢性リンパ球性白血病

産性に影響を及ぼしていることが示唆された。まにおいては，末梢血のオリゴクローナルは腫瘍発た，クローナリティは時間経過によりさまざまに生を意味する 。PL牛におけるオリゴクローナル

変化し，すべてのオリゴクローナルまたはマイは，EBL発症のリスク指標となりうると考えられナークローナル個体がEBL発症に至るものではな

た。

いことも明らかとなった。今後は，Ｂリンパ球の９）

これまでEBL発症牛は食肉検査所にて全廃棄されてきたが，PL牛は淘汰の対象とされていなかっクローナリティ状態の変化とEBL発症の関連をより詳細に調べていく必要があると思われた。

た。しかし，本研究によりPL牛の約15％でマイナークローナルまたはオリゴクローナルが確認さ謝辞れ，それらはポリクローナル個体に比べてEBL発

いた茨城県農林水産部県北家畜保健衛生所の川上© The Ito Foundation

検体をご提供ならびに実験にご協力いただ

258

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

純子先生をはじめとする家畜保健衛生所の先生

ナークローナル１検体，オリゴクローナル３検方。茨城県畜産センター肉用牛研究所の大内義尚

体，ポリクローナル12検体であった。クローナリ

先生。県南家畜保健衛生所の都筑智子先生に深謝ティは必ずしも一方向に進行するものではなく，いたします。

可逆的に変化することが明らかとなった。

４．要

約

本研究は，オリゴクローナルなＢリンパ球増殖を示すPL牛の割合を明らかにするとともに，その経時的変化を明らかにすること，またオリゴク
ローナルな状態が牛の生産性に及ぼす影響を考察することを目的として実施された。BLV感染PL
牛274頭のＢリンパ球クローナリティをクローナ
リティーPCRにより経時的に解析したところ，モ
ノクローナルを示したものはいなかったが，マイナークローナル10検体（3.7％），オリゴクローナ
ル31検体（11.3％）であり，PL牛の14.0％が一部腫瘍化した細胞を保有していることが示唆された。ポリクローナルを呈した233検体からは１年後のEBL発症牛がまったく発生しなかったのに対し，オリゴクローナルを呈した31検体のうち２頭（6.5％）で１年後にEBL発症が確認されたことから，オリゴクローナルはEBL発症について高いリスクを有していると考えられた。また，オリゴク
ローナルを呈した31検体のうち，１年後の継続検

文献１）
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258，文永堂出版，東京，2014.
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Alberto, O.：Blood, 102, 2994～3002, 2003.

査を実施できた16検体を解析したところ，マイ© The Ito Foundation

259

牛難治性伝染性蹄病であるヘアリーアタックの病態解析
Pathophysiological analysis of bovine hairy attack as a refractory infectious
hoof disease

谷

口

喬

子１・三

澤

尚

明１，２

（１宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター，２宮崎大学農学部獣医学科獣医公衆衛生学研究室）

Takako Taniguchi１ and Naoaki Misawa１，２（１Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki, ２Laboratory of Veterinary Public Health,
Department of Veterinary Medical Science, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

In the last few decades, bovine hairy attack has been reported as a new lesion affecting
the dermis of the bovine hoof. Although, as well as papillomatous digital dermatitis, it has beenshown to be a polymicrobial infection, predominantly involving Treponema sp., the major
pathogenic bacterium has not been clarified. We examined such lesions in four cows that had
been diagnosed as having hairy attack on two farms, and tested them for Treponema sp. andTreponema phagedenis by PCR using DNA extracted from them. However, in 1 of the 4
samples PCR amplified neither of the DNAs. In addition, T. phagedenis antigen was notdetected in 2 of the 4 samples by immunohistochemistry using a rabbit polyclonal antibody
against T. phagedenis. These results suggest that Treponema sp. and T. phagedenis may not
be present in some hairy attack lesions. Further population analysis using 16S rRNA sequences
and metagenomic analysis using next-generation sequencers were conducted to clarify thebacterial species predominantly present in hairy attack lesions. The prevalence of Treponema
sp. was found to be low, suggesting that Treponema sp. may not be a major pathogen of hairy
attack. Although Pseudomonas sp. was detected at a high rate in all four lesions, it seems
unlikely to the major pathogenic bacterium of hairy attack in view of its biochemical
characteristics. It will be important to further analyze not only Pseudomonas sp. but also otherpathogens that may cause bovine hairy attack.

１．目

罹患牛は疼痛を伴うため跛行を呈し，体重減少，的泌乳量低下等が認められるため，経済的損失の高牛の趾皮膚炎は，疼痛を伴う蹄の伝染性限局性い感染症として重要視されている。近年，ヘア皮膚炎である。その病変からは多くの細菌が検出

リーアタックと呼ばれる白帯の真皮を侵す新しいされており，難培養性のTreponema属菌を中心病変が報告されている。ヘアリーアタックの病態とする細菌性複合感染であると考えられていについては，最初に2008年米国とオランダで，る

2011年には英国で報告されている３，４）。白帯真皮。全国各地の乳牛で発生が確認されており，

１，
２）© The Ito Foundation

260

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）の増殖性病変を伴う難治性の局所的肉芽病変で，断 さ れ た 乳 牛 各 ２ 頭 の 病 変 部 生 検（Ａ 農 場：

白帯病や蹄尖潰瘍と併発することが多い。病変部

HD44，HD142，B農場：HD2586，HD2877）をは真皮が赤く充血し，独特な刺激臭を発する。趾

供試した。また，コントロールとして健康な乳牛

皮膚炎同様，疼痛を伴うため，重度の跛行を引きの蹄踵部皮膚の生検（C642，C817）を供試した。

起こし，経済的損失へつながる。初期報告では，

2 . 2 Treponema 属 菌 お よ び Treponema

趾皮膚炎の蔓延した農場から生じたため，趾皮膚phagedenisの検出炎同様Treponema属菌の関与が疑われ，実際に病変部約100mgをBlood&Tissue Kit（QIAGEN）

PCRで高率に病変部からTreponema属菌が検出を用いて組織中に存在する細菌のDNAを抽出しされた 。しかしながら，ヘアリーアタックと趾た。これを鋳型としてTreponema属菌およびT.

皮膚炎との明確な診断根拠がなかったため，初期

phagedenisを対象とした特異的プライマーを用い段階ではこれらが混合していた可能性も考えられたPCRを実施した（Table１）。抽出したDNAをる。現在では，病変の病歴，局在，臨床所見およ

２μl，Taq DNA polymerase（5 U/μl）（Takara）

び特徴的な臭いなどから診断されており，を 0.1μl ， １×PCR buffer を ２μl ， 2.5mM のTreponema 属 菌 だ け で な く ， Fusobacterium

deoxynucleoside triphosphate mixtureを1.6μｌ，necrophorum，Porphyromonas endodontalisの関そして各プライマーを0.16μＭになるように加え与も報告されている 。しかしこれらは，病変部て合計20μｌとした。Treponema属菌の検出では，DNAからPCR法によって細菌の遺伝子が検出さ95℃を30秒，65℃を30秒，72℃を１分のプログラれたものであり，どのような細菌群がどのようなム を 30 サ イ ク ル ，T. phagedenis の 検 出 で は ，

ポピュレーションで病変を形成しているのかは明

95℃を30秒，57℃を30秒，72℃を40秒のプログラらかになっていない。

ムを35サイクルで実施した。PCR産物は，1.5％

３）５）

そこで本研究では，Treponema属菌がヘアリーのアガロースゲル電気泳動によって確認した。

アタック病変内に存在するのかを明らかにすると

2.3

ともに，病変内に存在する細菌群を網羅的に検出

PCR 産 物 は ，illustra ExoProStar（cytiva）でして優勢菌を特定し，その病態解明に資すること精製した。ダイレクトシークエンスは，Big Dyeを目的として実施した。

3.1v（Applied Biosystems）を用いて添付のプロ

2.1

ト コ ー ル 通 り に 行 い ， 3130 DNA sequencer法

２．方

増幅遺伝子のシークエンス解析（Applied Biosystems）で実施した。得られた塩
基配列データは，National Center for Biotechnology

材料

北海道の２農家においてヘアリーアタックと診

Information （NCBI） の BLAST （http://blast.

Table 1 Primer used in study
Species
Treponema sp.

T. phagedenisPrimer sequence（5’-3’）

Predicted band size（bp）

Reference

657

Asai et al.6）

785

Beninger et al.7）

F: TTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAC
R: GTCRYMGGCAGTTCCGCCWGAGTCF: TCCGCCTACGACTGCGATACCA
R: CGGAACTGTCACAACTGGCGGA© The Ito Foundation

牛難治性伝染性蹄病であるヘアリーアタックの病態解析

261

ncbi.nlm.nih.gov/）にて相同性を調べ，98％以上

Kit（Illimina）を用いて２nd PCRを実施した。

の一致をもってその菌種として同定した。

再 度 ， Ampure XP Beads で 精 製 し ， MiSeq

2.4

病変組織の免疫組織化学的解析（Illumina）を用いて300bpペアエンドシークエン

組織を10％中性リン酸緩衝ホルマリン溶液で固スを行った。すべての工程はIlluminaのプロト

定後，常法によって病理組織標本を作製した。こコールに従った。得られた配列情報をQiime 2の標本について，牛の趾皮膚炎病変部より分離し（https://qiime2.org/）により解析した。

たT. phagedenisを家ウサギに免疫して作成した
抗血清およびエンビジョンポリマー（Dako）を用いることにより免疫組織化学的検査を実施し３．結果と考察3 . 1 Treponema属菌およびT. phagedenisの検た 。陰性コントロールとしてNormal rabbitの出

８）

Treponema属菌特異的PCRでは４検体中３検血清を使用した。
2 . 5 病 変 部 の 16S rRNA 配 列 を 利 用 し た ポ

体，T. phagedenis特異的PCRでは４検体中２検体で遺伝子増幅が確認され，ヘアリーアタック病

ピュレーション解析
病変部から抽出したDNAを型として細菌の16S

変内にTreponema属菌およびT. phagedenisが存

rRNA遺伝子をユニバーサルプライマー（8F：

在 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た （Fig. １）。

5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ ，15 Ｒ ：Treponema属菌特異的PCRの遺伝子産物につい5’-AAGGAGGTGATCCARCCG CA-3’） に よ りて ，シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 っ た と こ ろ ，HD

増幅し，大腸菌ベクターであるpT7 Blue vector

2586，HD 2877は，ともにTreponema pedisと同（Takara）にクローニングした１）。得られた形質定された。T. pedisは，趾皮膚炎から高頻度に分転換体約100個体をランダムに選択し，アルカリ離されるTreponema属菌の１つである。趾皮膚

ボイル法によりDNA抽出後，クローニングされ炎の原因菌との報告もあるため ９），ヘアリーアた遺伝子（16S rRNA）の塩基配列をダイレクト

タックの病原性にも関与している可能性が推測さ

シークエンスにより決定した。得られたデータれる。HD142については，シークエンスピークがは，BLASTにて相同性を調べ，98％以上の一致

混合しており同定できなかったことから，いくつをもってその菌種として同定した。

かのTreponema属菌が混合している可能性が考2 . 6 病変部の次世代シークエンサーを用いた
メタゲノム解析えられる。T. phagedenis特異的PCRの遺伝子産物については，HD142，HD2877ともにT. phagedenis

病変部から抽出したDNAを鋳型として，プラと同定された。しかしながらHD44については，

イマー（515Ｆ：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGAT

どちらのPCRでも遺伝子増幅が確認できず，一部

GTGTATAAGAGACAG-GTGYCAGCMGCCGCのヘアリーアタック病変内には，Treponema属

GGTAA-3’，806Ｒ：5’-GTCTCGTGGGCTCGGA

菌およびT. phagedenisが存在していない可能性

GATGTGTATAAGAGACAG-GGACTACNVGが示唆された。

GGTWTCTAAT-3’）を用いて，5’末端にアダプ

3.2

ター配列が挿入されるよう16S rRNA遺伝子のＶ

病変組織のT. phagedenis特異的免疫染色の結４領域を増幅した。Ampure XP Beads（Beckman

果， HD 142，HD 2877の２検体から抗原が検出

Coulter）を 用 い て 精 製 後 ，Nextera XT Index

され，病変組織内にT. phagedenisの存在が示唆© The Ito Foundation

病変組織の免疫組織化学的解析

262

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）
1

2

3

4

5

6

657 bp785 bpFig. 1 PCR products obtained by PCR assay for Treponema

sp. and T. phagedenis.
Lanes：1, HD44；2, HD142；3, HD2586；4, HD2877；5,
Negative control；6, Positive control.
HD44

HD142

HD2586

HD2877

Normal rabbit
serum

Rabbit polyclonal
antibodies against
T. phagidenisFig. 2 Immunohistchemical analysis for hairy attack lesions using normal rabbit serum and rabbit

polyclonal antibodies against T. phagedenis. Scale bar = 200μm.

さ れ た （Fig. ２）。 HD 142 に お い て は ， T.

あり，P. fragiの新鮮肉の腐敗と悪臭のある揮発phagedenis抗原は主に角質層に分布しており，顆

性化合物の生成能力が，その臨床徴候に関与して粒層への浸潤も一部確認できた。HD 2877においいる可能性が考えられる。またHD2586から優勢ては増生した角質層に広く分布しており，角質層に検出されたJanthinobacterium lividumは，土壌への好中球の浸潤も確認された。しかしながら由来の好気性グラム陰性菌で，独特の暗紫色を有HD 44，HD 2586の２検体では抗原が検出されず，している11）。しかしながら，これら両菌種とも，

こ の 結 果 は ，T. phagedenis 特 異 的 PCR の 結 果

好気性グラム陰性菌で環境中に広く生息してお（Fig.１）と一致していた。

り，低温でも増殖することから，採材から組織の3 . 3 病 変 部 の 16S rRNA 配 列 を 利 用 し た ポ
ピュレーション解析

固定までの過程で本菌が増殖した可能性も考えられる。

４検体中３検体（HD44，HD142，HD2877）で優勢に検出されたのは，Pseudomonas fragiであ3 . 4 病変部の次世代シークエンサーを用いた
メタゲノム解析

り，特にHD44においては，51％という高い確率

16S rRNA配列を利用したポピュレーション解で検出された（Table２）。P. fragiは好気性冷蔵

析の結果と同様，病変部からはPseudomonas属

条件で保存された肉の主な腐敗微生物であり，新が共通して大きな割合を占めていた（Fig.３）。

鮮肉の物理的損傷，異臭の発生，および粘液の形

次いでAcinetobacter属，Aeromonas属の環境由来

成の原因となることが知られている10）。ヘアリー

菌の相対率が高い傾向にあった。正常な蹄踵部にアタックの臨床診断根拠の一つに独特な刺激臭がおいては，Acinetobacter属，Psychrobacter属の© The Ito Foundation

263

牛難治性伝染性蹄病であるヘアリーアタックの病態解析
Table 2 Predominant clones at species level from 5 hairy attack lesions.
Number（%）of clone
HD44（n=103）HD142（n=79）

HD2586（n=107）

HD2877（n=100）Psudomonas fragi

51

10

9

45

Psueudomonas taetrolens

20

Aeromonas salmonicida

10

Pseudomonas psychrophila
Pseudomonas syringae

52

Vagococcus fluvialis

2

Description

33

Hericobacter ovis

3Moryella indoligenes
Filifactor alocis

33

Fusobacterium necrophorum
Brochothrix thermosphacta

22Candidatus Peptoniphilus
Peptostreptococcaceae bacterium
Janthinobacterium lividum
Comamonas testosteroni
Buttiauxella agrestis
Beta proteobacterium
Citrobacter werkmanii
Pseudomonas psychrophila
Aeromonas veronii
Lactococcus raffinolactis
Lactococcus piscium
Other
unknown

2
2

4

20
14
6
4
3
3
2

7
3

15
53

8
25

4
2
3

4
7
2
5
11

（1） Proteobacteria;c__Gammaproteobacteria;o__Pseudomonadales;f__Pseudomonadaceae;g__Pseudomonas（2） Proteobacteria;c__Gammaproteobacteria;o__Pseudomonadales;f__Moraxellaceae;g__Acinetobacter（1）（3） Proteobacteria;c__Gammaproteobacteria;o__Aeromonadales;f__Aeromonadaceae;g__Aeromonas（4） Proteobacteria;c__Gammaproteobacteria;o__Pseudomonadales;f__Moraxellaceae;g__Psychrobacter80（2）
R el at i v e abu n dance（％）

2

Filifactor villosus

100
90

14
2

（5） Bacteroidetes;c__Flavobacteriia;o__Flavobacteriales;f__[Weeksellaceae];g__Wautersiella

（4）

70

Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Streptococcaceae;g__Lactococcus
Bacteroidetes;c__Flavobacteriia;o__Flavobacteriales;f__[Weeksellaceae];g__Chryseobacterium

60

Proteobacteria;c__Betaproteobacteria;o__Burkholderiales;f__Comamonadaceae;__

50

Proteobacteria;c__Gammaproteobacteria;o__Enterobacteriales;f__Enterobacteriaceae;__（3）

Proteobacteria;c__Betaproteobacteria;o__Burkholderiales;f__Oxalobacteraceae;__40

Actinobacteria;c__Actinobacteria;o__Actinomycetales;f__Corynebacteriaceae;g__Corynebacterium
Bacteroidetes;c__Bacteroidia;o__Bacteroidales;f__;g__

30

（5）

Bacteroidetes;c__Bacteroidia;o__Bacteroidales;f__Porphyromonadaceae;g__Porphyromonas

（6）

20

Firmicutes;c__Bacilli;o__Bacillales;f__Staphylococcaceae;g__Staphylococcus
Firmicutes;c__Clostridia;o__Clostridiales;__;__

10

Fusobacteria;c__Fusobacteriia;o__Fusobacteriales;f__Fusobacteriaceae;g__0

Proteobacteria;c__Betaproteobacteria;o__Burkholderiales;f__Oxalobacteraceae;g__Janthinobacterium
H

D

44

H

D

14

2
H

D

8
25

6
H

D

7
28

7

C

64

2

C

81

7 （6） Other of minor populations (<5%)

Fig. 3 Population analysis of hairy attack lesion-associated microbiota by next generation sequencing. One box showedsingle taxonomic classification of microorganisms at genus level.

© The Ito Foundation

264

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

比 率 が 高 く ，病 変 部 に 高 率 で 存 在 し て い た

頭 の 病 変 部 生 検 の DNA を 用 い て ，PCR に よ り

Pseudomonas 属 は 検 出 さ れ な か っ た 。一 方 ，Treponema属菌およびTreponema phagedenisを

Treponema属は，HD142で2.6％，HD2586で2.7％，検出した。しかしながら，４検体中１検体についHD2877で1.5％検出され，HD44および正常な蹄ては，どちらのPCRでも遺伝子増幅が確認できな

踵部であるC642，C817では検出されなかった。

かった。また，病変組織のT. phagedenis特異的

牛の趾皮膚炎では，Treponema属菌が10-90％程

免疫染色においては，４検体中２検体で抗原が確度の高率で存在することが報告されており，

認できなかった。これらの結果より，一部のヘア

Treponema属菌を中心とする細菌性複合感染でリーアタック病変内には，Treponema属菌およあると考えられている

１，２）。しかしながら，今回

びT. phagedenisが存在していない可能性が示唆

ヘアリーアタックの病変部におけるTreponema

された。さらに，16S rRNA配列を利用したポピュ

属菌の存在率は非常に低く，検出されない場合もレーション解析および次世代シークエンサーを用

あ っ た こ と か ら ，ヘ ア リ ー ア タ ッ ク へ のいたメタゲノム解析によって，ヘアリーアタック

Treponema属菌の関与の可能性は低いことが示

病変部に優勢に存在する菌種を特定した。その結唆された。これまでヘアリーアタックは趾皮膚炎

果，Treponema属菌の検出率は非常に低く，ヘ同様，Treponema属菌の関与が疑われていたた

アリーアタックへのTreponema属菌の関与の可め，今回の結果は非常に重要な知見であると推測

能性は低いことが示唆された。４検体に共通してされる。16S rRNA配列を利用したポピュレー

高 率 に 存 在 し て い た の は Pseudomonas 属 菌 でション解析および次世代シークエンサーを用いたあったが，その生化学的特徴よりヘアリーアタッ

メタゲノム解析によって，ヘアリーアタック病変

ク の 真 の 原 因 菌 と は 考 え に く い 。今 後 は部から優勢に検出されたPseudomonas属菌は，

Pseudomonas属菌だけでなく，発症の原因とな

正常な蹄踵部からは検出されなかった。しかしなる複数の病原体を対象とした解析を進めることががら，Pseudomonas属菌は好気性グラム陰性菌

重要である。

であるため，単独で蹄踵部に侵入，増殖する可能性は低いと考えられる。蹄踵部に存在する細菌叢との相互作用を利用して感染が成立している可能性もあるため，今後はPseudomonas属菌だけでなく，発症の原因となる複数の病原体を対象とした解析を進めることが重要である。
４．要

約

近年，牛の蹄踵部の白帯の真皮を侵す新しい病変としてヘアリーアタックが報告されている。牛の趾皮膚炎と同様，難培養性のTreponema属菌を中心とする細菌性複合感染であると考えられているが，真の原因菌は不明である。我々は，２農家においてヘアリーアタックと診断された乳牛４

文献１）
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© The Ito Foundation

牛難治性伝染性蹄病であるヘアリーアタックの病態解析
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© The Ito Foundation

266

カンピロバクター・ジェジュニの「生きているが培養できない状態」を復帰させるための生物学的因子の解明
Clarification of biological factors to restore Campylobacter jejuni from“viable but non culturable” status

三

澤

尚

明

（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）

Naoaki Misawa（Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki）

Campylobacter jejuni is the leading cause of foodborne infections in Japan and many otherdeveloped countries. When bacterial cells are exposed to a stressful environment, C. jejuni caneasily enter a “viable but non culturable cell（VBNC）” state accompanied by morphologicalchanges ranging from a spiral to a coccoid form. Furthermore, several reports have shown thatsome strains of C. jejuni are aerotolerant and may survive efficiently under aerobic conditions.
Since the importance of the aerotolerant state for food poisoning remains unclear, further
studies are required to clarify whether it can revert to a culturable form with restoration ofvirulence potential. The first experiment was conducted to examine the effect of temperatureand suspension on the culturability and viability. When C. jejuni strain 81-176 was suspended
in phosphate buffered saline（PBS）, the culturability was longest compared to the suspensions
in distilled water（DW）and in Brucella broth at ４℃. Next, when the bacterial cells weresuspended in DW at ４℃, the ratio of VBNC increased within a short storage time but notsuspended in PBS and Brucella broth, and that the viability decreased by the rise intemperature. Furthermore, the transition to the VBNC state tended to be higher for C. jejuni
strains with increased aerotolerance. Finally, it was examined whether the C. jejuni strain
isolated from a broiler chicken in the VBNC state would restore to the culturable bacteria after
being exposed to chicken bile, three types of bile acids, hydrochloric acid, pepsin-addedhydrochloric acid, and anaerobic conditions. During 14-day culture period, there was noculturable bacteria in response to any exposure stimulus.

１．目

感染者があると推定されている２）。感染源として的重要視されているのは鶏で，養鶏場，食鳥処理場，

厚生労働省の食中毒統計によると，2010年以降

さらには流通・販売に至る過程において本菌の防カンピロバクターによる食中毒が増加してい除対策を講じることが急務となっている１）。しかる１）。この増加傾向は多くの先進諸国においてもしながら，カンピロバクターは多様に変化する環

見られており，地球規模では，毎年４～５億人の境に対してすばやく適応し，生存できる能力を兼© The Ito Foundation

カンピロバクター・ジェジュニの「生きているが培養できない状態」を復帰させるための生物学的因子の解明

ね備えているため，その制御は容易ではない。細

267

復活因子ではないかとの発想に至った。

菌学を扱う者は，菌の生死は人工的培地におけるこのように，カンピロバクター食中毒の成立を増殖の可否で判断していた。しかしながら，近年考える際には，病原性や発症機序にとどまらず，「生きているが培養できない」生理状態となった保菌動物や環境中での生存様式（環境適応機構）

細菌の存在が明らかとなり ，英語ではこのようなどについても理解することが必要であることかな菌の状態をViable but non culturable cellsと表ら，本研究では，VBNC状態になったC. jejuniがし，その頭文字を取ってVBNCと呼んでいる。

培養可能状態に復帰する機序を，宿主側と細菌側

３）

主要な食中毒菌であるカンピロバクター・ジェ

から明らかにし，培養を可能とする手法を確立さジュニ（Campylobacter jejuni）はVBNC状態にせる。そして，本菌の病原性や発症機序にとどま移行することが知られ，菌の形態もラセン状かららず，保菌動物や環境中での生存様式（環境適応

球状に変化し，条件によっては好気状態で６か月

機構）について理解することを目的としている。

以上VBNC状態を維持することが報告されている４）。しかしながら，人工培地で培養できなくなっ

２．方法

た菌を培養可能菌に復活させる手法が確立してい

2.1

供試菌株

ないため，VBNCが感染性や病原性の発現能力を基礎的な研究には，VBNCへの移行条件がすで維持または復元できるかどうかについては不明なに分かっているC. jejuni 81-176株（米国で分離点が多い。

された生乳による食中毒由来株）を用いて実施しカンピロバクター属菌は，家畜，家禽，伴侶動

た。VBNCの培養可能菌への復帰試験には，当研物および野生動物の消化管や生殖器などに広く分究室で保有するC. jejuni株の中から，由来の異な布している 。カンピロバクターは保菌動物の腸る菌株（鶏，牛，環境，ヒト）で，好気耐性能を管内容物や排泄物を介して飲料水や食品等に混入有する株（B1，B5，C67）と非好気耐性株（H70，

し，ヒトに感染する機会を待つが，微好気性細菌

H84，C70）を供試した６）。

２）であるので，大気中の酸素分圧下では食品等の中で長時間生残することは困難である。しかしなが2 . 2 培養可能期間およびVBNCへの移行に及ぼす温度と懸濁液の影響

ら，このような菌にとって生存するには厳しいと

C. jejuni 81-176株を血液寒天培地に接種し，考えられる環境下においてでもカンピロバクター

37℃，48時間微好気培養した菌を３～５×10 ７は感染環を維持していることから，多様に変化す

cfu/mlとなるよう蒸留水（DW），10mMリン酸る環境に適応するための生存戦略として，VBNC

緩衝液（PBS，pH7.2）およびBrucella Broth（日への移行と復帰するためのスイッチを兼ね備えて

本ベクトン・ディッキンソン・東京）に懸濁し，いると考えられる。研究代表者は，VBNCからの1.5mlのマイクロチューブに１mlずつ分注した。

復帰は動物の消化管内で起こることから，胃酸に分注した菌液は，好気条件下で４，10および25℃

よるpH，胃腸から分泌される消化酵素類，胆汁で静置保存した。経時的に培養可能菌を５％馬脱酸等のさまざまな生体由来の因子が関与している

繊維血液加Brucella寒天平板（日本ベクトン・のではないかとの仮説を立てた。特に，C. jejuni

ディッキンソン）に0.1ml接種し，37℃微好気条

は胆汁中で長期間生存することを観察してお件（80％Ｎ２ ，10％CO２，
５％Ｏ２，
５％Ｈ２）で培

り ，胆汁酸刺激や消化酵素による刺激が重要な養し，培養可能菌数を測定した。さらに，生菌と５）© The Ito Foundation

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令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

死菌をLIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability
Kit（サーモフィッシャー・東京）で染色後，蛍光顕微鏡を用いて計測した。

３．結果と考察3 . 1 培養可能期間およびVBNCへの移行に及2 . 3 VBNCへの移行に及ぼす菌の好気耐性能

ぼす温度と懸濁液の影響
C. jejuni 81-176株を３種類の懸濁液に懸濁し，の影響
C. jejuni好気耐性株（B1，B5，C67）と非好気

好気条件下で異なる３つの温度で静置保存して，耐性株（H70，H84，C70）を１×10８ cfu/mlとな

培養可能期間を比較したところ，菌をPBSで懸濁

るようDWに懸濁し，1.5mlのマイクロチューブ

し，４℃で静置した条件が最も長期間（140日間）に１mlずつ分注した。分注した菌液は，25℃で培養可能であり，保存温度が高くなるにつれて培

好気条件下で静置保存し，経時的に培養可能菌を養可能期間が短くなる傾向を示した（Fig. 1A，B，

上記と同様に培養法と蛍光法にて生菌と死菌を計C）。培養可能期間に及ぼす懸濁液の影響は，４℃測した。

と10℃においてPBSに懸濁した場合，最も長期間

2 . 4 VBNCの培養可菌への復帰条件に関する培養可能状態を維持し，次いでBrucella broth，
DW の 順 で あ っ た 。VBNC の 検 出 は ，LIVE/

検討
ブロイラー由来C. jejuni B１株を４℃，５週間

DEAD BacLight Bacterial Viability Kitによる染好気培養してVBNC状態にした後，種々の感作刺色に続く蛍光顕微鏡観察により確認できた。PBS

激を与え，培養可能菌への復帰条件を精査した。

に懸濁直後の菌の多くはラセン形状を示し，生き消化管内の環境を想定し，胆汁酸（デオキシていることを示す緑色の強い蛍光が検出された

コール酸ナトリウム，コール酸ナトリウム，ケノ（Fig. 2A）
。一方，好気条件下で４℃，７週間保デオキシコール酸：いずれもナカライテクク・京

存すると，菌の形状の多くは球状菌に変化してい都）を１％に調整し，VBNC菌の懸濁液１mlに各たが，約70％の菌が生きていた（Fig. 2A，B）。

胆汁 酸 を 10μｌ 添 加し，復帰用培地（Brucella

VBNCへの移行に及ぼす温度の影響を見ると，broth，７％馬脱繊血，10％牛胎児血清，カンピ

４ ℃ で は DW に 懸 濁 す る と ， PBS ， Brucella

ロバクター発育サプリメント）４mlと混合し，brothに比べ短期間でVBNCとなり，高いVBNC

37℃，１時間静置させた後，復帰用培地に寒天を状態の菌数を維持していたが，保存温度の上昇と1.5％添加した平板に0.1ml接種して，37℃，２週

ともにVBNC状態の菌数は減少した。10℃以上の

間微好気培養を行い，菌の増殖を確認した。この温度で保存すると，Brucella brothに懸濁した菌

他に，VBNC懸濁液に10％鶏胆汁，１規定塩酸がDW，PBSよりも長期間VBNC状態を維持して（pH 4.0），0.1％ペプシン添加１規定塩酸の感作おいた。

よび嫌気条件下で37℃48時間暴露を行い，復帰用

以上の結果から，保存温度と懸濁液の種類が好培地にて培養可能菌への復帰を観察した。対照と気条件下においてC. jejuni 81-176株の培養可能

して，VBNCのみの懸濁液を用いた。

菌の状態に影響を与えることが示唆された。特に低温での保存条件が培養可能状態に強く影響しており，保存温度の上昇に伴って培養可能菌は速やかに減少した。DWの懸濁では培養可能状態が短く，さらに栄養豊富なBrucella broth培地よりも© The Ito Foundation

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days after incubation at 10℃

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No. of VBNC (%)

No. of culturable cells (log10 cfu/ml)

B

0
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DW
PBS

9
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BB
DW
PBS

7
6
5

BB

4

Culturable cells

90
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VBNC

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No. of VBNC (%)

No. of culturable cells (log10 cfu/ml)

C

0
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days after incubation at 25℃
Fig. 1 Number of culturable（solid line）and VBNC（dotted line）cells ofCampylobacter jejuni strain 81-176 suspended in different suspensions（DW；distilled water, PBS；phosphate buffered saline, BB；Brucellabroth）and temperatures. Cells were incubated aerobically at 4℃（A）,
10℃（B）,and 25℃（C）.

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食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

A

B

Fig. 2  Detection of viable cells of C. jejuni strain 81-176 suspended in PBS bystaining with LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit. Viable cells
are seen as strong bright（arrows）. Bacterial cells were incubated
aerobically for 0 hr（A）and 28 days（B）at 4℃.

PBSのほうがより長い期間培養可能状態を維持で3 . 3 VBNCの培養可菌への復帰条件に関するきる傾向が観察されたことから，浸透圧が培養可

検討

能状態の維持にとって重要な因子であることが示

VBNC状態になったブロイラー由来C. jejuni株唆された。一方，４℃の保存温度では，DWで菌に対し，鶏胆汁液，３種類の胆汁酸，塩酸，ペプを懸濁すると最も速くVBNC状態に移行し，観察

シン添加塩酸，嫌気条件の暴露刺激を与えた後にした150日間高率に生きた状態を維持していたが，培養可能菌へ復帰するか検討したが，14日間の培

10℃の保存温度ではそのような傾向は認められな養期間中いずれの暴露刺激に対しても，培養可能

かった。したがって，C. jejuniの生死や培養可能菌へ復帰することはなかった。これらの試験は，状態の保持には，複雑な環境要因が関与している

VBNC状態の菌が，動物の消化管内で培養可能菌と考えられた。

に復帰することを想定して実施したものである。

3 . 2 VBNCへの移行に及ぼす菌の好気耐性能今後はさらに異なる消化酵素刺激や複数の暴露刺激の組み合わせなどを検討するとともに，環境中の影響
C. jejuni株の中には，好気耐性能を有する菌株におけるC. jejuniの培養可能状態とVBNC状態のと非耐性株が存在する。本研究において，培養可

発現遺伝子の比較等の解析が必要であると思われ能状態とVBNCへの移行が好気耐性能と関連するる。

か調べた。その結果，好気耐性能は培養可能状態の維持とは関連していなかった。一方，VBNCへ

４．要

約の移行は好気耐性能を有する菌株のほうが高い傾C. jejuniの生存様式は２つに分けることができ

向 を 示 し た（Fig. 3A ，B）。以 上 の 結 果 か ら ，る。一つは活動期で，菌は宿主腸管内を鞭毛によ

VBNCへの移行が好気耐性能獲得株に備わっていり活発に運動し，宿主粘膜上皮に付着する能力をることが考えられるが，今回の実験では保存温度持つ。第２の生存様式は休止期で，増殖した菌体が25℃，懸濁液がDWであったことから，さらにが運動を止め，お互いに接着してバイオフィルム

異なる条件下でのVBNCへの移行に及ぼす菌の好を形成したり，環境の変化に応じて生きているが気耐性能の影響を調べる必要がある。

培養できないVBNC状態に移行する。VBNCの特© The Ito Foundation

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No. of VBNC (%)

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No. of VBNC (%)

No. of the culturable cells (log10 cfu/ml)

B

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days after incubation at 25℃

50

0Fig. 3 Number of culturable（solid line）and VBNC（dotted-line）cells of C.

（A）andjejuni strains. Aerotolerant strains（B1 ―●―, B5 ―▲―, C67 ―■―）
（B）were suspended
Aero-sensitive strains（H70 ―●―, H84 ―▲―, C70 ―■―）
in DW and incubated at 25℃.

性は，カンピロバクターによる食中毒発症機序の

DWに懸濁すると，PBS，Brucella brothに比べ解明を難しくしている要因の一つとなっている。

短期間でVBNCとなり，高いVBNC状態の菌数を本研究では，VBNCを培養可能な状態に戻すため維持していたが，保存温度の上昇とともにVBNCの生物学的因子を明らかにすることを主目的とし状態の菌数は減少した。次にVBNCへの移行に及て実施した。培養可能期間およびVBNCへの移行

ぼす菌の好気耐性能の影響を調べたところ，に及ぼす温度と懸濁液の影響を調べるため，C.

VBNCへの移行は好気耐性能を有する菌株のほう

jejuni 81-176株を３種類の懸濁液に懸濁し，好気が高い傾向を示した。一方，VBNC状態になった

条件下で異なる３つの温度で静置保存して，培養ブロイラー由来C. jejuni株に対し，鶏胆汁液，３

可能期間を比較したところ，菌をPBSで懸濁し，種類の胆汁酸，塩酸，ペプシン添加塩酸，嫌気条

４℃で静置した条件が最も長期間（140日間）培

件の暴露刺激を与えた後に培養可能菌へ復帰する養可能であり，保存温度が高くなるにつれて培養か検討したが，14日間の培養期間中いずれの暴露

可能期間が短くなる傾向を示した。一方，VBNC

刺激に対し，培養可能菌へ復帰することはなかっへの移行に及ぼす温度の影響を見ると，４℃ではた。

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令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

文献１） Vetchapitak, T., Misawa, N.：Current status ofCampylobacter food poisoning in Japan, Food Safety,
7（3）,61～73, 2019.
２） Ruiz-Palacios, G. M.：The health burden ofCampylobacter infection and the impact of
antimicrobial resistance： playing chicken, Clinical
Infectious Diseases, 44（5）,701～703, 2007.
３） Rollins, D. M., Colwell, R. R.：Viable but
nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its
role in survival in the natural aquatic environment,
Applied and Environmental Microbiology, 52（3）,531～538, 1986.
４） Buck, G. E., Parshall, K. A., Davis, C. P.：Electron
microscopy of the coccoid form of Campylobacter

jejuni, Journal of Clinical Microbiology, 18, 420～421,
1983.
５） Enokimoto, M., Kubo, M., Bozono, Y., Mieno, Y.,
Misawa, N.：Enumeration and identification ofCampylobacter species in the liver and bile ofslaughtered cattle, International Journal of Food
Microbiology, 118, 259～263, 2007.
６）
 Kiatsomphob, S., Tarigan, P., Taniguchi, T., Latt,
K. M., Jeon, B. H., Misawa, N.：Aerotolerance andmultilocus sequence typing among Campylobacter
jejuni strains isolated from humans, broiler
chickens, and cattle in Miyazaki Prefecture, Japan,
Journal of Veterinary Medical Science, 81（8）, 1144
～1151, 2019.

© The Ito Foundation

273

豚熱（CSF）ワクチン接種繁殖母豚から初乳摂取条件の異なる子豚へのCSF抗体移行と存続に関する研究
Investigation for classical swine fever virus specific maternal antibody
levels and persistence of piglets acquired colostrum under different
condition from sow

長井

誠１・野口

倫子１・鈴木武人１・青木博史２（１麻布大学，２日本獣医生命科学大学）

Makoto Nagai１, Michiko Noguchi１, Takehito Suzuki１ and Hiroshi Aoki２（１Azabu University, ２Nippon Veterinary and Life Science University）

Classical swine fever（CSF）is a significant threat for the pig industry. To protect neonatal
piglets with CSF infection during lactational period under the prevention using vaccine, it isimportant to consume a sufficient amount of colostrum containing maternal antibody against
vaccine strain. However, owing to a significant improvement in litter size at birth under thecurrent pig raising system, neonatal piglets often fail to consume a sufficient amount ofcolostrum. In the present study, we investigated antibody revel against CSF vaccine strain,
blood property, immunoglobulin concentration, and peripheral blood mononuclear cells
subpopulations. We also studied CSF virus（CSFV）specific maternal antibody levels andpersistence of piglets acquired colostrum from sows with or without vaccination under different
conditions．
As a result, two weeks after vaccination of CSF 50％（5/10）sows had neutralizing
antibodies against CSF; whereas, antibodies were not detected by a commercially available
enzyme immunoassay（ELISA）. Antibodies were detected by both the neutralization test and
ELISA in all serum samples collected from sows four weeks after vaccination. Relative
percentage of CD4, CD8, CD21, and CD4/8DP T-cells, which relate with adaptive immune
response of sows, who did not possess the neutralization antibodies against CSF at two weeks
after vaccination, were lower than those of seropositive sow. These findings suggest that
acquisition of immunity by CSF vaccination may be influenced by immune system variations ofsow. IgG and IgM concentrations on days 7, 14, and 21 after birth of piglets, who were restrictedconsuming colostrum for 6 hours after birth were significantly lower than control piglets.
Antibody titers against CSFV of 6 hours colostrum restriction were ＞ 3-fold lower than thoseof control piglets. Furthermore, piglets of sow, who was vaccinated on 21 days before farrow,
did not acquire sufficient maternal antibody against CSF. These results clearly showed that
acquisition of colostrum from sufficiently immunized sows within adequate period is importantfor prevention of CSFV infection.

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274
１．目

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

ラス解析を行った。これらの成績をもとにCSFワ

的

クチンの移行抗体を子豚へ十分に移行させること

豚熱（CSF）は養豚経営において最も重要な伝ができる初乳給与の指標を確立することは，我が染病であり ，2018年９月に26年ぶりに我が国で国の養豚場におけるワクチンによるCSF防疫の効

発生し，その後，豚における発生は中部地方から，果を向上させるための大きな一助となると考えて

現在，西は近畿地方，東は東北地方にまで広がっ

いる。

１）

ている。さらには2020年１月に沖縄県にも飛び火し，国内はどこも等しく発生の危険にさらされて

２．方法

いることが示された。関東地方の養豚場で発生し2.1

供試繁殖母豚たのを機に，国内において地域限定で豚への予防

これまで感染症が疑われる臨床症状を呈した経的ワクチン接種による防疫が開始された。しかし歴のない，産歴が６～11産のランドレース種（Ｌながら，ワクチン接種が実施されていた養豚場で種）８頭および３産のランドレース×大ヨークのあるにもかかわらず，ワクチン未接種の子豚に交雑種（LW種）２頭を用い，オーエスキー病，

CSFが発生する事例が起こり，移行抗体の重要性

豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）および豚サーが改めて認識された。近年，１回あたりの分娩頭

コウイルス２型（PCV 2）のフリーが証明されて数の増加を狙った育種改良が行われ，多産系の種いる豚舎にて試験に供した。CSFワクチンはCSF

豚が生産現場に普及されてきた。その結果，母豚

生ワクチン（スワイバックＣ，共立製薬株式会の乳頭数を超える産子を哺育しなければならない社）を使用し，ワクチン接種後２，
４，
６，
８，10

ケースが増えてきており，初乳の摂取を確実にす

および12週目に採血を行った。

るために農場によってさまざまな手法がとられて

2.2

授乳子豚および初乳摂取制限

いる。CSF清浄化の取り組みが行われていた20年分娩した子豚については６時間の初乳摂取制限

以上前に，CSFワクチン接種に伴うワクチン抗体

区と自由摂取区を設定した。CSFワクチン未接種

および移行抗体の推移の調査が行われ，移行抗体（LW種１頭）およびワクチン接種後21日目およの消失の目安が定められている。しかし多産系のび161日目に分娩したLW種それぞれ１頭につい豚が普及し，初乳の給与も手法がさまざまであるて，その産子を試験に供した（ワクチン未接種自現状では，単に母豚のCSFワクチン抗体価を測定

由摂取区10頭，ワクチン接種後21日目分娩初乳摂するだけでは十分ではなく，母豚の抗体価と初乳取制限区７頭，161日目分娩初乳摂取制限区７頭の摂取状況，子豚の免疫機能の状態および抗体価

および161日目分娩自由摂取区７頭）。初乳摂取量を関連させて調査する必要があると考えられる。

の推定は体重を既報２）の公式に当てはめて推定しそこで本研究では，CSFワクチンの移行抗体がた。出生直後，１，
２および３週後に採血を行った。

十分に移行する初乳給与条件を検討することを目

2.3

的とし，近年野外で普及している純粋種あるいは迫田ら３）が樹立した無血清培養順応CPK-NS細交雑種の繁殖母豚にCSFワクチン接種を行い，そ胞とCSFワクチン株であるGPE－ 株による中和試の後の一般血液性状，免疫グロブリンおよび白血験でCSFウイルスに対する中和抗体価を測定し球のサブクラスの比率変化を調べ，さらに子豚のた。96穴マイクロプレート上で，56℃30分で非働

初乳摂取状況，健康状態調査および白血球サブク化した豚被検血清50μＬを培養液で２倍階段希釈© The Ito Foundation

CSFワクチンに対する抗体価の測定

豚熱（CSF）ワクチン接種繁殖母豚から初乳摂取条件の異なる子豚へのCSF抗体移行と存続に関する研究

275

し，200 TCID50に調整したGPE－株を50μＬ加え，

お よ び 20017-2-1 for IgM， Alpha diagnostic

37 ℃ で １ 時 間 の 中 和 反 応 を 行 っ た 。そ の 後 ，international）あるいは検体100μｌを分注して反CPK-NS細胞を加え７日間培養を行い，細胞変性応させた。各ウェルを洗浄した後，検出物質標識

効果（CPE）を阻止した血清の最高希釈倍数の逆

抗 体（A100-104A for IgG お よ び A100-117A for

数をウイルス中和抗体価とした。

IgM, Bethyl laboratories, Inc.）を 分 注 し て 反 応

さらに，市販の酵素結合免疫吸着法（ELISA

さ せ ， 洗 浄 後 発 色 液 BCL-TMB-01/BCL-法）（豚コレラエライザキットII，ニッポン・ジー

TMB-21, Beacle, Inc.）を分注し静置した。15分ン）を用いてCSF抗体検査を実施した。判定は，後に反応停止液（１Ｍリン酸）を重層してマイク取扱説明書に従ってS/P値を求めた後，同キット

ロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。

の判定基準に従った。

2.5

2 . 4 一般血液学的検査，免疫グロブリン濃度

統計処理

試 験 区 お よ び 週 齢 間 に お け る 子 豚 の IgG ，
IgM，CSF中和抗体の比較には線形混合効果モデ測定および白血球サブクラス解析
EDTA加およびプレーンの採血管を用いて採ルを用いた。固定効果として試験区および週齢血を行い，EDTA加で採血した全血は一般血液学

を，変量効果として個体IDを用いた。主効果が的検査，血液塗抹検査および白血球サブクラス解

有意な差は交互作用を検定した。多重比較には析，プレーン採血管で採血した血液は遠心し，Tukey-Kramer法を用い，有意水準は0.05とした。

CSF抗体測定および免疫グロブリン濃度測定に用繁殖母豚における２週齢のサブクラスの割合についた。得られた全血は自動血球計数機を用いて，いてＦ検定により両群の等分散性の検定を行い，白血球数，赤血球数，ヘモグロビン濃度，ヘマト

等分散の場合はStudent’s t-test，非等分散の場

クリット値および血小板数を計測した。また血液合はWelch’s t-testを用いて，p＜0.05の時に統計塗抹標本を作製し，顕微鏡下で有核細胞を200個的有意差があると判定した。

カウントし，白血球の比率を計測した。末梢血中の白血球サブクラス解析は，フローサイトメー

３．結果と考察

ターで白血球5,000個あたりの各標的細胞数を測

3 . 1 繁殖母豚におけるCSF抗体獲得と免疫動定して各標的細胞が全体に占める率を計算した。

態およびCSFワクチンに対する抗体の存続

一次抗体は，ヘルパーＴ細胞が抗CD4抗体，細胞繁殖母豚へのCSFワクチン接種後における白血

障害性Ｔ細胞が抗CD8抗体，単球が抗CD14抗体，

球数は平均10.5～12.1×10３/μｌの範囲内で12週

成熟Ｂ細胞が抗CD21抗体，NK細胞が抗CD335抗目まで変化は認められなかったが，CSFワクチン体を使用した。さらに，抗CD4抗体と抗CD8抗体

接種後６週目に赤血球系パラメータに貧血所見をの両方に陽性を示す細胞をCD4/CD8両陽性性Ｔ示す変化が認められた（Fig. 1-A，C）。CSFワク細胞として測定した。ブタ免疫グロブリン（Ig）

チン接種後のIgGおよびIgM濃度はほぼ一定で

GおよびIgM濃度測定は，ELISA法で行った。そあった（Fig. 1-B）
。CSF中和抗体価は，接種後れぞれ，洗浄した抗ブタ山羊抗体（A100-104P

２週目で上昇している個体の割合は50％（5/10

for IgG お よ び A100-117P for IgM， Bethyl頭）であり，ELISA判定では１頭の擬陽性を除

laboratories, Inc.）固相化プレートのウェルに標いてすべて陰性であった。４週目以降ではすべて

準液（P100-105 for IgG, Bethyl laboratories, Inc.

の個体で中和抗体の上昇およびELISA判定での© The Ito Foundation

276

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

陽性が確認され（Fig. 1-D，Table１），抗体産生

3-A，B）。初乳摂取制限を行った３区を比べると，が安定して起こるまでにはCSFワクチン接種から母豚へのCSFV接種の有無は子豚へのIg移行に影少なくとも４週間は要することが確認された。

響しなかった。IgM濃度についても同様の結果でCSFワクチン接種により抗体価の上昇が起こってあったが，生後21日目において初乳摂取の有無にもIgGおよびIgM濃度変化が認められないこと

よる濃度の差は認められなかった。また，子豚のは，ワクチン効果をIgGおよびIgM濃度により推体 重 は ４ 区 間 で 差 は 認 め ら れ な か っ た（Fig.

定することは不可能と思われた。また，中和試験

3-C）。

による抗体検出のほうがELISAよりも早くに抗体上昇を検出することが分かった。

授乳中子豚の中和抗体の保有量は，初乳摂取状
況によって変化した（Fig. 3-D）
。CSFワクチン

白血球サブクラス解析では，白血球数の変化がを分娩の161日前に接種した母豚から娩出されたみられないもののほとんどの細胞がワクチン接種

子豚に比べ，分娩の21日前に接種された母豚から６週後に比率が大きく減少したが，同じ時点で赤娩出された子豚ではほとんど末梢血中にCSFワク

血球系パラメータの減少とあわせてもワクチン接チン抗体は検出されなかった（Fig. 3-D）。なお，

種との関連性は不明瞭であった（Fig. 1-Ｃ）
。一

この母豚は，分娩後32日目（CSFV接種後53日目）

方，ワクチン接種２週後の中和抗体価は個体差がでは中和抗体価は32倍に上昇していることが確認

大きいことが分かったことから，ワクチン接種２された。このことから，免疫機能が正常な繁殖母

週後に中和抗体価が陽性（≧１）を示した群と低豚であっても，分娩前少なくとも21日目よりも早い（＜１）群に分け，白血球動態を解析した結果，

くワクチン接種が必要であることが示された。ま

＜１群では適応免疫に関わる細胞（CD4，CD8，

た，CSFワクチンを分娩の161日前に接種した母

CD21 お よ び CD4/8DP）が 有 意 に 少 な く（Fig.

豚から娩出された子豚のうち，初乳摂取制限を受

2-A），特に＜１群は適応免疫系の細胞の増殖ピーけた子豚では，生後21日目においてELISA判定

クが≧１群に対し２週間遅れていることが明らか

による擬陽性の割合が57.1％（4/7頭）であり，となった（Fig. 2-B，C）。自然免疫系の細胞では，自由摂取区と比較して移行抗体が減少しているこCD335（NK細胞）は，≧１群が先行して増加し，とが明らかとなった（Table２）。このことは，生＜１群は２週後に同様に変化するという適応免疫

後初乳を接種するまでの時間が移行抗体獲得に非系の細胞と類似した動きが観察され，CD14（単常に重要であることを示している。近年，多産子

球）は，≧１群が常に低値を示した（Fig. 2-D）。

の対策として分割授乳が行われているが，摂取量3 . 2 授乳子豚における初乳６時間摂取制限区を基準にするのみでは十分ではなく，分娩後に初と自由摂取区間のCSF抗体移行状況および乳を摂取するまでの時間も重要視しなければならそれぞれの移行抗体半減期および存続の比ないことが示された。

較
初乳摂取制限したワクチン未接種区，ワクチン４．要約

接種後21日目分娩区および161日目分娩区の３区

CSFは養豚産業界では最も重要な疾病であり，は，初乳摂取制限をしなかった区より，生後７日

ワクチン使用による防疫が行われている環境下で以降のIgG濃度は減少し，６時間の初乳摂取制限

は新生子豚にワクチン抗体を含む十分な初乳を給が総Igの移行に影響することが確認された（Fig.

与することが，CSF発生を予防するうえで重要で© The Ito Foundation

豚熱（CSF）ワクチン接種繁殖母豚から初乳摂取条件の異なる子豚へのCSF抗体移行と存続に関する研究
20

50

18

45
40
35

14

30

12

25

RBC

10

20

Hgb

15

HCT

8

10

6

5

4

0

2

4

6

8

10

Post vaccination (weeks)

12

32

7

30

6
5

28

4

26

3

24
22
0

2

6

2

IgM

1

8

10

12

0

CD4

CD8

CD14

CD4/8DP

WBC

CD21

0.5

12

0.4

10
0.3

8
6

0.2

4
0.1

2
0

0

2

4

6

8

Cell count (CD21, CD335;
×10^3/μL)

14

0

12

Post vaccination (weeks)

(D)
10

2

9
8
7

CSF NT

1.8

CSF ELISA

1.4

1.6

6

1.2

5

1

4

0.8

3

0.6

2

0.4

1

0.2

0

0

2

4

6

8

Post vaccination (weeks)

10

12

0

negative positive

Cell count (WBC, CD4, CD8,
CD4/CD8 DP, CD14; ×10^3/μL)

4

IgG

Post vaccination (weeks)(C)

Antibody titers against CSFV
（Log 2）0

CSF ELISA（s/p value）

IgG（mg/ml）

(B)

20

Hct（%）

RBC（×106/μl）
Hgb (g/dl）

16

IgM（mg/ml）

(A)

277

Fig. 1 Red blood cells, hemoglobin, and hematocrit（A）, concentration of IgG and IgM（B）, white blood cells andperipheral blood mononuclear cells subpopulations（C）, and antibody titers against CSFV GPE-（D）of the sows
post vaccination with CSF GPE- vaccine.

© The Ito Foundation

278

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

180

Relative percentage (%)

160
140
120
100
80
60

＊

＊

＊

40

＊

20
0

CD4

CD8

CD14
CSF Ab ≧1

CD21
CSF Ab <1

200.0%

CD4/8DP

CD4 (≧1)
CD4 (<1)
CD8 (≧1)
CD8 (<1)180.0%
160.0%
Relative percentage

CD335

140.0%
120.0%
100.0%
80.0%
60.0%
40.0%
20.0%
0.0%

0

2

4
6
Post vaccination (weeks)

250.0%

12

CD21 (≧1)
CD21 (<1)
CD4/8DP (≧1)
CD4/8DP (<1)

200.0%
Relative percentage

8

150.0%
100.0%
50.0%
0.0%

0

2

300.0%

8

12

8

12

CD14 (≧1)
CD14 (<1)
CD335 (≧1)
CD335 (<1)

250.0%
Relative percentage

4
6
Post vaccination (weeks)

200.0%
150.0%
100.0%
50.0%
0.0%

0

2

4
6
Post vaccination (weeks)

Fig. 2 Comparison of relative percentages of peripheral blood mononuclear cells subpopulations between theneutralization antibody against CSFV positive（≥ 1）and negative（<1）sows. ＊ indicates p<0.05 compared with ≥ 1sows, determined by the Student t-Test.（A）. Mean relative changes in peripheral blood mononuclear cells
subpopulations（CD4 and CD8（B）, CD21 and CD4/8DP（C）, and CD14 and CD335（D））from CSFV positive（≥1）
and negative（<1）sows.

© The Ito Foundation

279

豚熱（CSF）ワクチン接種繁殖母豚から初乳摂取条件の異なる子豚へのCSF抗体移行と存続に関する研究(A) IgG

CSF Vac (+) 161D restrict (+)
CSF Vac (+) 21D restrict (+)

25

CSF Vac (-) restrict (+)

20

mg/mL

mg/mL

(B) IgM

CSF Vac (+) 161D restrict (-)

30

15
10
5
0

7

14
Days after birth

21

Kg

Log 2
7

7

14
Days after birth21(D) Neutralization antibody titers against CSFV(C) Body wieght
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

14
Days after birth

21

10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

7

14
Day after birth21Fig. 3 IgG and IgM concentrations（A and B）, body weight（C）and neutralization antibody titers（D）of pigs with andwithout CSF vaccination and with and without restricted consuming colostrum for 6 hours after birth.

Table 1 Antibosy tests against classical swine fever virus of the sows
Breed（reproductive
history）
Antibody test
Week after inoculation
2
4
6
8
10
12

L（10）

L（7）

L（8）

L（10）

L（9）

L（6）

L（10）

L（11）

LW（3）

LW（3）

NT*

ELISA

NT

ELISA

NT

ELISA

NT

ELISA

NT

ELISA

NT

ELISA

NT

ELISA

NT

ELISA

NT

ELISA

NT

ELISA

<1＊＊
<1
4
5
7
ND＊＊＊

+
+
+
ND

<1
<1
5
6
8
9

+
+
+
+

<1
1
4
5
8
9

+
+
+
+

<1
<1
5
5
5
7

+
+
+
+

<1
1
6
8
9
9

+
+
+
+

<1
<1
4
3
8
8

+
+
+
+

<1
<1
7
6
8
9

+
+
+
+

<1
1
4
4
5
ND

+
+
+
ND

<1
3
5
5
6
7

+
+
+
+

<1
3
6
5
6
6

±
+
+
+
+

＊: neutralization test, ＊＊: antibody titer against CSFV（Log 2）, ＊＊＊: not done

Table 2 Antibosy tests against classical swine fever virus of pigs with and without CFS vaccination and with andwithout restricted consuming colostrum for 6 hours after birth
Antibody test

CSF Vac（+）161 D restrict（-）

CSF Vac（+）162 D restrict（+）

CSF Vac（+）21 D restrict（+）

NT

ELISA

NT

ELISA

NT

ELISA

7

7/7＊

7/0/7＊＊

7/7

7/7

6/7

0/2/7

14

7/7

5/2/7

7/7

7/7

1/7

0/0/7

21

7/7

3/4/7

7/7

7/7

0/7

0/0/7

day after inoculation＊: positive pigs / total pigs, ＊＊: positive pigs / false positive pigs / total pigs

© The Ito Foundation

280

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）ある。生産性向上のための改良による１頭当たり比率が低いことが分かった。これらのことから，の産子数の増加のもとでの近年養豚システムの中

繁殖母豚個々の免疫機能の違いがCSFワクチンににおいては，新生子豚はしばしば十分量の初乳をよる免疫獲得に影響することが示唆された。生後摂取できないことがある。本研究では，CSFワク

７，14および21日目の授乳子豚のIgGおよびIgM

チン接種後の繁殖母豚のワクチン抗体の推移を血濃度は，生後６時間の初乳摂取制限を行った子豚

液性状，免疫グロブリンおよび白血球サブクラス

が自由摂取の子豚より有意に低かった。CSFVにの推移とともに観察した。また，豚熱ワクチン接対する抗体価は６時間摂取制限を行った子豚では種または非接種繁殖母豚から産出された新生子豚

自由摂取の子豚よりも３管以上低かった。さらが異なる条件下で初乳を摂取した時の豚熱ワクチに，分娩前21日目にワクチン接種を受けた繁殖母

ン株に対する移行抗体のレベルおよび持続につい豚は十分な移行抗体を子豚に給与できなかった。

て調査を行った。

これらのことは，適切な時間に十分にワクチンにその結果，繁殖母豚のCSF中和抗体価は接種後より免疫された繁殖母豚から初乳を摂取すること

２週目で上昇している個体の割合は50％（5/10

はCSF感染防止に重要であることが示された。

頭）であったのに対し，ELISA法ではすべて陰性であった。４週目以降ではすべての個体で中和抗体の上昇およびELISA判定での陽性が確認された。適応免疫にかかわるCD4，CD8，CD21およびCD4/8DPは，ワクチン接種後２週目に中和抗体陽性を示した個体と比べ，抗体陰性の個体は

文
献１）
 Coronado, L., Perera, C. L., Rios, L., Frías, M. T.,
Pérez, L. J.：Vaccines, 9, 154, 2021.
２）
 Devillers, N., van Milgen, J., Prunier, A., Le
Dividich, J.：Animal Science, 78, 305～313, 2004.
３）
 Sakoda, Y., Hikawa, M., Tamura, T., Fukusho,
A.：J Virol methods, 75, 59～68, 1998.

© The Ito Foundation

281

尾根部の体表温度から黒毛和種育成子牛の発熱を検知する手法の開発
Detection of fever of Japanese Black calves by ventral tail base surface
temperature

佐々木

羊

介・上

松

瑞

穂＊

（宮崎大学農学部，＊NOSAI宮崎）

Yosuke Sasaki and Mizuho Uematsu＊（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki, ＊NOSAI Miyazaki）

Bovine respiratory disease is the most common and costly disease of beef cattle. Our
research goal is to identify sustainable approaches to reducing bovine respiratory disease
impacts by assessing fever of Japanese Black calves by ventral tail base surface temperature（ST）. The present study investigated appropriate methods for attachment of sensor for calves
to measure their ST and evaluated diagnostic accuracy of assessment for fever by the ST.
Data were collected from 53 Japanese Black calves aged 4 to 7 months. A wearable wirelessST sensor was attached to the surface of ventral tail base of each calf. Three types of tailattached methods were performed to compare the effectiveness of the methods： Group 1 usedvelcro belt, Group 2 used vetrap and Group 3 used athletic supporter. The ventral tail base ST
was measured every 10 min for one month. Among three types, Groups 1 was the mostsuitable method to measure ST. However, some calves had hair loss in the position of sensor
attached. Since circadian change of ST was found, ST was converted to residual ST that
calculated by the ST minus mean ST for the same time on the previous 3 days. Of 53 calves, 8calves showed clinical sing of respiratory disease during experimental period. Associations ofactual rectal temperatures with ST and residual ST was evaluated, and the results showed
high agreement if calves had clinical sing of respiratory disease. When defining fever as a calf
had ≥ 39℃ ST or ≥１℃ estimated ST for four consecutive hours, sensitivity was 1.00 in bothmeasurements, but precision in ST and estimated ST were 0.48 and 0.37, respectively. In
conclusion, calves with bovine respiratory disease can be detected by ventral tail base ST, but
diagnostic accuracy for assessing fever should be modified to improve precision.

１．目

る死廃事故や病傷事故の多発傾向が続いており，的多大な経済損失が発生している。農林水産省の家

黒毛和種牛の飼養戸数は年々減少する一方で，畜共済統計表によると，平成29年度における呼吸

１農場あたりの飼養頭数は増加傾向にあり，少頭器病を原因とする死廃事故および病傷事故はそれ数飼育から多頭経営へと推移してきている１）。こぞれ15.8％および35.5％と報告されている２）。子の多頭化と反比例して，肉用子牛の呼吸器病によ

牛の肺炎は，主に哺乳期から育成期の子牛に発生© The Ito Foundation

282

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

し，呼吸不全により死亡することがあるほか，慢始時期の検知８，９），腟内温度の変化10）が測定可能性化し発育不良を呈する症例も多い。育成子牛のであることが明らかにされている。しかし，これ預託育成農場では，肺炎を主徴として治療されたらの研究は成牛を対象としており，子牛を対象と育成子牛は約50％存在し，治療された子牛はそのした研究は実施されていない。

後の増体成績が低下したと報告されている 。子

そこで本研究では，子牛の尾根部の体表温度を牛の呼吸器病の発生には，環境・病原体・個体の無線小型センサによってリアルタイムに測定する

感染性と複雑な要因が絡むため，一般的には牛呼ことにより，黒毛和種育成子牛の発熱を早期に検

吸器病症候群と呼称される。牛呼吸器病症候群知する手法を開発することを目的とする。そのたは，輸送や環境変化等に伴うストレス感作（離めに，子牛の体表温度を安定的に測定する方法の乳，群編成，寒暖の変化，換気不良等）や，ウイ

検討，および測定した体表温度から呼吸器疾患のルス・細菌等の病原微生物による感染が複雑に絡異常がみられた個体を検出する方法の検討を行っ

み合って発生する。牛呼吸器病症候群は経済的損た。

３）失が大きい疾病であり，発症した場合には早期の治療が重要である。そのため，牛呼吸器病症候群

２．方法やその他発熱を伴う問題を早期に発見するために

2.1

試験実施農場および供試個体

は，簡易的かつ迅速なモニタリング技術を確立す

本研究では，宮崎県内における黒毛和種牛農場る必要がある。疾病の早期発見は，症状の重篤化で飼育されている育成子牛を対象として，育成子を防ぐだけではなく，その治療に要する日数およ

牛の尾根部に無線小型センサを装着した。宮崎県

びコストの低減にもつながる。

内における複数の黒毛和種牛農場を対象として，

農林水産省では，近年スマート農業の推進を

試験実施期間における育成子牛の飼養頭数および行っており，農林水産省が公表している「スマーその子牛群の日齢や健康状態を調査し，試験実施

ト農業技術カタログ」においても，疾病を早期にの協力農場を選定した。試験実施農場は預託育成発見するセンシング・モニタリング，生体データ

農場１農場であり，本農場では県内の黒毛和種繁活用，飼養環境データ活用など，さまざまな技術

殖農場から３-４ヶ月齢の子牛を導入して10ヶ月が紹介されている 。その中で，無線小型センサ

齢まで育成していた。子牛はフリーストールで群を活用した家畜のモニタリング技術は国内外で数飼育され，１ストールあたり５-７頭で飼育され多く開発されており，その用途として，発情を検

ていた。

４）

知するための腟内留置型センサ ，反芻状態を測
５）

試験は2020年９月から2021年２月までに実施しなどが報告された。上記期間において飼養されていた個体のうている。しかし，これらの無線小型センサは侵襲

ち，以下４つの除外条件に当てはまらない牛を選的センサであり，装着する個体に対して身体的負定した。除外条件：①過去１ヶ月の間に治療履歴

担を伴うケースが多い。一方，非侵襲的にバイオがある，②同月齢の育成子牛と比較して体重が極センシング可能な無線小型センサとして，体表温端に低い，③同月齢の育成子牛と比較して体重が度を測定するセンサがあげられる。この無線小型

極端に高い，④将来の種雄牛候補の血統である

センサを用いた事例として，体表温度の変化によ牛。その結果，本試験には育成子牛53頭（去勢牛り，繁殖雌牛の発情の検知 ，繁殖雌牛の分娩開21頭，雌牛32頭）を試験に供した。

定するための胃内留置型センサ

７）６）© The Ito Foundation

尾根部の体表温度から黒毛和種育成子牛の発熱を検知する手法の開発

2.2

試験方法

283

USA）
。装着方法の検討として，３つの装着方法

試験には無線小型センサ（縦26mm×横21mm

間で非脱落割合および装着日数を比較した。脱落

×高さ9.7mm）を用いた。本センサを子牛の尾根

は，体表温度が24時間以上30℃を下回った場合と部の体表面に装着し，体表温度のデータを経時的定義した。次に，収集した体表温度の実測値の変に収集した。センサの装着方法として，以下３つ換を行った。異常値の除去（≦30℃，≧45℃，連の手法を用いた。方法１：成牛用に用いられてい続記録が±１℃以上等）を行い，１時間幅で最大る資材９）を子牛用に改良した資材（脱落防止用腰値を算出することにより，１時間ごとの温度に変部補助布およびセンサ梱包用マジックベルト），

換した。また，体表温度の実測値とともに，過去

方 法 ２：セ ン サ を 装 着 後 に 包 帯 資 材 で 梱 包

３日間の同時刻平均値も算出し，直腸温度の実測（Vetrap；3M, St. Paul, MN, USA）
，方 法 ３：セ値との関連性を分析した。また，呼吸器疾患によンサを装着後に医療用伸縮性ゴムサポーターで梱る異常が検知された際の敏感度（Sensitivity）お包。また，センサと尾根部の体表面の間には，切よび陽性反応的中度（positive predictive value）

傷防止用のためにウレタンゲルカバーを挿入した。

を算出した。

センサ装着時点における子牛の平均日齢は175±32日であった。センサは約１ヶ月間の装着を予３．結果と考察

定したが，センサのズレや明らかな脱落兆候，も3.1

しくはセンサ装着部位やその周囲に明らかな外貌

本試験に用いた育成子牛53頭のうち，装着予定

異常がみられた際はセンサを取り外した。また，期間である１ヶ月間の装着ができた個体は17頭でセンサの取り外し後は，センサの接触部位であるあった（32.1％）。３つの装着方法に関する非脱尾根部の体表面を観察し，切傷の有無を確認した。

落割合および装着日数をTable１に示した。３つデータの収集方法として，センサに内蔵されての装着方法のうち，各方法の非脱落割合は方法１

いる無線アンテナの受信機を試験農場に設置し，で80.0％（12/15），方法２で17.2％（5/29），方法

体表温度を装着後10分間隔で収集した。また，食３で０％（0/9）であり，方法１が方法２および

欲不振や呼吸器疾患の異常がみられた際はセンサ

方法３よりも有意に非脱落割合が高かった（ｐ＜装着牛を繋留し，直腸温度を計測した。

0.05）。このうち，センサが尾根部から完全に脱2.3

装着方法間における安定性の比較

落し，牛床に落ちた個数は，方法１で０個，方法

統計解析

統計解析として，分析には一般化線形モデルを２で７個，方法３で２個であった。また，装着日

用 い た （SAS Ver. 9.4, SAS Inst. Inc., Cary, NC,

数の平均（±標準誤差）は方法１で25.6±2.4日，Table 1 Comparisons of proportions of calves that not drop their sensor and thenumber of days from attachment to drop/removal of sensor between three
types of tail-attached methods

Types1

Proportions of calves thatnot drop their sensor

Number of days from attachment
to drop/removal of sensor

Group 1

80.0%（12/15）

25.6±2.4 days

Group 2

17.2%（5/29）

8.6±1.8 days

Group 30%（0/9）6.1±3.1 days

1Group 1 used velcro belt, Group 2 used vetrap and Group 3 used athletic supporter.

© The Ito Foundation

284

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

方法２で8.6±1.8日，方法３で6.1±3.1日であり，た際に体温が低下し，朝の給餌に伴う活動量の増方法１が方法２および方法３よりも有意に装着日加によって体温が上がり始めたことが考えられる。

数が長かった（ｐ＜0.05）。本試験では，センサ

体表温度に日内変動がみられたことより，直腸装着部位やその周囲に明らかな外貌異常がみられ温度の実測値との関連性を分析するために，体表た個体は確認されなかった。一方，センサを取り温度の実測値の他に，体表温度の過去３日間の同外した際に，方法１では，一部の個体において，

時刻平均値も算出した。体表温度の実測値および脱落防止用腰部補助布を装着していた箇所に被毛

過去３日間の同時刻平均値と直腸温度の関連性を短縮が確認された。方法２および方法３では，セ分析した結果，直腸温度との関連性における決定

ンサ取り外し後における装着部分の被毛短縮はほ係数は，体表温度の実測値でR２＝0.16，過去３日

とんど確認されなかった。また，方法１から３に間の同時刻平均値でR２＝0.19であった。両指標において，センサ接触部分における重篤な切傷は確おける決定係数は低かったものの，直腸温度の実認されなかった。

測値はある１時点における数値であるため，経時本試験の結果より，成牛用に用いられている資的な変化との関連性は反映していない。また，直材を子牛用に改良した資材を用いた方法１が最も腸温度が40℃を超えていた場合，体表温度の実測

安定した装着方法であった。しかし，方法１の欠値および過去３日間の同時刻平均値ともに，その点として，装着に時間を要すること，取り外した

前後において数値の明らかな上昇がみられた。

後に装着部分の被毛短縮がみられたことがあげら

3.3

れる。一方，方法２および方法３は，装着に要す

本試験に用いた育成子牛53頭のうち，装着期間る時間が方法１よりも短いこと，装着部分の被毛

中に呼吸器疾患による異常がみられた個体は８頭短縮がみられないことが利点としてあげられた。

であった。異常の定義として，体表温度の実測値

しかし，体表温度を安定的に測定するという観点が４時間以上39℃を超えた場合，または過去３日

より，方法２および方法３の活用は困難であるこ間の同時刻平均値が４時間以上１℃を超えた場合とが示唆された。今後はセンサ装着の簡易化およとしたところ，呼吸器疾患による異常がみられた

び外貌初見への影響を軽減するために，方法１で８頭のすべてにおいて，両指標の異常の基準値を活用した資材を改良することが求められる。

超えていた。そのため，上記指標の定義における3 . 2 実測値と変換値および同時刻平均と直腸異常が検知された際の感度および特異度

敏感度は100％であった。しかし，上記指標の定義における陽性反応的中度は，体表温度の実測値

温度の関連性
体表温度の実測値に関して，センサ装着後の経で0.48，過去３日間の同時刻平均値で0.37であった。

時的変化および日内変動の事例として，実験期間

本試験より，尾根部の体表温度を用いることに中に異常がみられなかった１頭の個体の推移をより，呼吸器疾患の異常を伴う個体をすべて検出

Fig.１に示した。体表温度の実測値は37-39℃のすることができた。敏感度は100％であったもの

間で推移していた。体表温度の実測値には日内変の，陽性反応的中度が低かったことより，現状の動がみられ，６時前後に最も体表温度が低くな

定義では偽陽性のケースが多くなってしまうことり，17時前後において最も高くなった。この時間

が課題としてあげられた。この点を解決するため

帯は，それぞれ午前および午後の給餌の時間帯でには，体表温度を変換する推定式を構築することあった。これは，夜間において休息行動をしていや，異常の検知を機械学習アルゴリズムによって© The Ito Foundation

Ventral tail base surface temperature, ℃

Ventral tail base surface temperature, ℃

尾根部の体表温度から黒毛和種育成子牛の発熱を検知する手法の開発

285a）Daily change

40
39
38
37
36
35

0

3

6

9

12
15
18
21
Days from attachment

24

27

30

20

22

b）Circadian change

40
39

Feeding38
Feeding

37
36
35

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Time (hour)Fig. 1 Daily change（a）and circadian change（b）of ventral tail base surface

temperature

自動的に検出する方法などが必要であり，これらの点が今後の課題として考えられる。

しかしながら，本研究では安定的な装着方法および取り外し後の外貌所見への影響という課題も本研究の結果より，子牛の尾根部の体表温度をみられたことより，本手法を生産現場で普及して無線小型センサによって非侵襲的にリアルタイム

いくためには，これらの点の改善が必要となる。

に測定することにより，黒毛和種育成子牛の発熱

また，異常の検知の敏感度は高かったものの，陽を早期に検知することが明らかになった。この手性反応的中度が低かったことより，体表温度を変法により，発熱を早期に検知することができれ換する推定式を構築することや，異常の検知を機ば，適切な時期に治療を行うことができ，死廃事械学習アルゴリズムによって自動的に検出する方

故や病傷事故を減少させることが期待できる。さ法の開発が望まれる。

らに，無線小型センサの活用は従業員の労働負担の軽減につながり，畜産における働き方改革の一助となることが期待される。

４．要約

牛呼吸器病症候群は，経済的損失が大きい疾病© The Ito Foundation

286

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

であり，肉用牛において好発する疾病である。本
研究では，黒毛和種育成子牛の尾根部の体表温度から発熱を早期に検知する手法を開発することを目的とし，子牛の体表温度を安定的に測定する方法の検討および測定した体表温度から呼吸器疾患の異常がみられた個体を検出する方法の検討を行った。データは４-７ヶ月齢の黒毛和種育成子
牛53頭から収集した。無線小型センサを子牛の尾根部の体表面に装着し，体表温度のデータを経時的に収集した。センサの装着方法として，以下３つの方法を用いて有効性を検討した：方法１．成牛用に用いられている資材を子牛用に改良した資材，方法２．センサを装着後に包帯資材で梱包，方法３．センサを装着後に医療用伸縮性ゴムサ
ポーターで梱包。体表温度は約１ヶ月間，10分間
隔で収集した。３つの方法のうち，方法１が最も体表温度を適切に測定できたが，一部の個体において，脱落防止用腰部補助布を装着していた箇所に被毛短縮が確認された。体表温度に日内変動がみられたことより，体表温度の実測値は過去３日間の同時刻平均値に変換した。53頭中，試験期間中に８頭が呼吸器疾患による異常がみられた。子牛に呼吸器疾患による異常がみられた際における
体表温度の実測値および過去３日間の同時刻平均値の間には高い相同性がみられた。異常の定義として，体表温度の実測値が４時間以上39℃を超えた場合，または過去３日間の同時刻平均値が４時間以上１℃を超えた場合としたところ，上記指標の敏感度は100％であったが，陽性反応的中度は，
体表温度の実測値で0.48，過去３日間の同時刻平均値で0.37であった。結論として，子牛の尾根部の体表温度により発熱を早期に検知できることが明らかになったが，その精度はまだ改善が必要で
ある。

文
献
１）
 農 林 水 産 省：畜 産 統 計 調 査 2020. https://www.
e-stat.go.jp/stat-search/file-download?statInfId=
000032029741＆fileKind=0２）
 農林水産省：家畜共済統計表2017. https://www.
e-stat.go.jp/stat-search/file-download?statInfId=
000031766760＆fileKind=0３）
 Sasaki, Y., Hashimoto, K., Iki, Y., Anan, T., Hayashi,J., Uematsu, M.：Associations between calf factorsof Japanese Black calves arriving at a backgrounding
operation and bovine respiratory disease, Prev.
Vet. Med., 182, 105100, 2020.
４）
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 https://www.maff.go.jp/j/kanbo/smart/smart_agri_technology/smart_agri_catalog_hinmoku/pdf/
catalog_chikusan_20210325.pdf
５） Andersson, L. M., Okada, H., Miura, R., Zhang, Y.,
Yoshioka, K., Aso, H., Itoh, T.：Wearable wireless
estrus detection sensor for cows, Comp. Elect.
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Somerville, L., Jonsson, N. N.：Identification of therumination in cattle using support vector machineswith motion-sensitive bolus sensors, Sensors, 19,1165, 2019.
７）
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O k a d a , H . , I t o h , T . ：E s t r o u s d e t e c t i o n b ymonitoring ventral tail base surface temperatureusing a wearable wireless sensor in cattle, Anim.
Reprod. Sci., 180, 50～57, 2017.
８）
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240, 1～5, 2018.
９）
 Higaki, S., Koyama, K., Sasaki, Y., Abe, K.,
Honkawa, K., Horii, Y., Minamino, T., Mikurino, Y.,
Okada, H., Miwakeichi, F., Darhan, H., Yoshioka,
K.：Technical note：Calving prediction in dairy
cattle based on continuous measurements ofventral tail base skin temperature using supervisedmachine learning, J. Dairy Sci., 103, 8535～8540,
2020.
10）
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comparison with vaginal temperature and behavior
indices, and effect of ambient temperature, J.
Reprod. Dev., 65, 515～525, 2019.

© The Ito Foundation

287

牛呼吸器病症候群（BRDC）発症機序の解明（Ⅱ）
Breakthrough of pathogenic mechanism of bovine respiratory disease
complex（BRDC）
（Ⅱ）

帆

保

誠

二

・

石

川

真

悟

（鹿児島大学共同獣医学部）

Seiji Hobo and Shingo Ishikawa（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

This study carried out the bronchoalveolar lavage（BAL）for the cattle clinicallydiagnosed as a disease state of bovine respiratory disease complex（BRDC）in the acute phase,and it was made that the antibiotics susceptibility tests of various bacteria was clarified, whilebacteria and virus isolated from the bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were investigated to
be a purpose. BALF examinations were carried out as well as blood examinations in 38 cattle.
As the results, Pasteurella multocida and Mycoplasma bovis were mainly isolated from BALF,
and it was guessed that it was related to the deterioration of the disease state. In the viral
genetic screening of BALF, bovine respiratory syncytial virus（BRSV）and bovine herpes
virus-1（BHV1）were mainly detected. From this fact, it was guessed that several kinds ofviruses which invaded in the farm were concerned in the crisis of BRDC, and that it became atrigger of the secondary infection of bacteria. And, it was guessed that P. multocida and M.
bovis were concerned in the deterioration of BRDC, and that it chronically shifts to thepneumonia. From them, it was guessed that in the initial disease state of BRDC, these bacteria
were not always strongly concerned, and that virus such as BRSV and BHV3 infects
respiratory tract mucosa, and that it attenuates the infection resistance, and that crisis anddeterioration of BRDC are caused by the involvement of various factors such as generalcondition and feeding environment of afterwards cattle.

１．目ている３～７）。

的

これまでに我々は，伊藤記念財団の研究助成を

牛肺炎の病態は，牛呼吸器病症候群（BRDC）

受け，牛での気管支肺胞洗浄（BAL）を確立すとして捉えられ，獣医療において最も重要な感染るとともに，慢性期のBRDCの病態にあると診断症のひとつとして注目されている。BRDCはされた牛に対してBALを実施し，真の肺炎原因菌

さまざまなストレスによる感染抵抗性（免疫力）を特定した６～８）。その結果，Pasteurella multocidaの低下，ウイルス感染，細菌感染を主体とした複およびMycoplasma bovisが肺炎病態の悪化や慢性

合的な要因が絡まりあって発症することが知られ化に強く関与していることが明らかとなった。そ１，２）© The Ito Foundation

288

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

こで平成31年度に伊藤記念財団の研究助成を受身体検査が実施された。

け，８～10ヶ月齢の肥育素牛20頭（のべ30頭）を2.2

供試し，セリ市場導入後のBRDC発症機序を解明

供試牛に対して，臨床検査，血液検査およびすべく調査を実施した 。その結果，臨床的には
８）方法

BALF検査を実施した。

40℃以上の発熱と呼吸器症状が認められる牛，お2.2.1

臨床検査，血液検査

よび気管支肺胞洗浄液（BALF）から牛RSウイ臨床検査においては直腸温，心拍数および呼吸

ルス（BRSV）遺伝子が検出される牛では，高率数を，血液検査においては末梢血中の白血球数にBRDCを発症することが明らかとなった。すな（WBC），赤血球数（RBC），ヘモグロビン濃度

わち，セリ市場導入後のBRDC発症にはBRSVが（Hgb），ヘマトクリット（Ht）および好中球／リ強く関与し，その病態は40℃以上の発熱および呼ンパ球比（N/L比）を常法により測定した。

吸器症状として出現することが明らかとなった。

2.2.2

このことから，セリ市場導入後のBRDC発症を予まず，殺菌消毒液に浸漬した綿花を用いて鼻孔防するためには，BRSV感染症をはじめとしたウ

周辺を清拭した。続いて，ビデオエンドスコープ

イルス感染症をワクチン接種や飼養環境の改善にを供試牛の鼻孔から挿入し，塩酸リドカインによより抑制することが重要であると考えられた。しる気道粘膜の表面麻酔を実施しながら気管およびかし，BRDCの重症化や慢性化に強く関連する

気管支内腔を観察した。その後，ビデオエンドス

P. multocidaおよびM. bovisの分離結果とBRDC

コープを滲出液が観察される気管支へと進め楔入発症との間に関連性は見いだせなかった。このこした。楔入部位にビデオエンドスコープ経由で滅とを解決するためには，BRSV感染症をはじめと菌生理食塩水を注入し，即座に回収することによした呼吸器におけるウイルス感染症から，これら

りBALFを得た。得られたBALF検体は微生物学

細菌を主体とした細菌感染症に移行する病態を捉的検査に供した。
2.2.3

えることが重要であると思われた。

呼吸器検体の採取および検査

ウイルス遺伝子検査

本研究は，臨床的に急性期のBRDCの病態にあ牛の肺炎発症に関連すると考えられているる牛に対してBALを実施し，その洗浄液である

BRSV，牛ヘルペスウイルス１型（BHV-1），牛BALFから分離される細菌やウイルスについて調

パラインフルエンザウイルス３型（BPIV3）およ査することによりBRDC発症機序を解明するととび牛コロナウイルス（BCoV）について，既報９）

もに，各種細菌の薬剤感受性を明らかにすることに準じてBALFを検体として，マルチプレックスを目的とした。

定 量 RT-PCR 法（Multiplex qRT-PCR）に よ り
各種ウイルスの遺伝子の有無を検査した。

２．材料と方法
2.1

2.2.4

供試材料

細菌分離および同定検査

BALF検体は，５％ウマ血液含有コロンビア寒臨床的に急性期のBRDCの病態にあると診断さ天培地（BA培地）およびマッコンキー寒天培地

れた牛38頭（黒毛和種；オス14頭，メス15頭，去（MAC培地）に接種し，BA培地は微好気条件下

勢９頭；検査時日齢：162.8±81.1（平均値±標準および嫌気条件下で，MAC培地は好気条件下で偏差）日，中央値130日）を供試した。臨床的な培養した。培養後のBA培地から各種細菌を分離

BRDCの診断には，体温測定や聴診を主体としたし，純培養後にグラム染色検査および細菌同定検© The Ito Foundation

289

牛呼吸器病症候群（BRDC）発症機序の解明（Ⅱ）

査（飛行時間型質量分析：Time of Flight Mass
Spectrometry ： TOF-MS），PCR 検 査 あ る い は

３．結果と考察

Loop-Mediated Isothermal Amplification

3.1（LAMP）を常法により実施し，菌種を同定した。

供試牛の平均直腸温は39.6℃であり，健常牛に2.2.5

マイコプラズマ分離検査

臨床検査，血液検査

比較し軽度に高体温であった（Table１）。このう

マイコプラズマ分離検査は，BALF検体をマイ

ち，40.0℃以上の発熱を38頭中８頭（供試牛のコプラズマ分離用寒天培地に塗布し，微好気条件

21.1％）で認めた。また，供試牛の平均心拍数は下で７日間培養（直接培養）するとともに，マイ101.4回／分，平均呼吸数は48.8回／分であり，健コプラズマ増菌培地に接種し，微好気条件下で２常牛に比較し高値であった（Table１）。

日間培養（増菌培養）した。その後，増菌培養液

末梢血中白血球数は平均9,630/μｌ，好中球／は，１白金耳をマイコプラズマ分離用寒天培地にリンパ球比（N/L比）は平均0.9であり，他の血塗布し，微好気条件下で７日間培養した。培養後

液検査項目も含めおおむね正常範囲内であったのマイコプラズマ分離用寒天培地は，実体顕微鏡（Table２）。

で観察するとともに，培地上の目玉状のコロニー

これらのことから，臨床的に急性期のBRDCのについてTOF-MSあるいはLAMP検査により同病態にあると診断された牛であっても，体温以外定した。

の臨床検査所見では，その病態把握が比較的困難

2.2.6

薬剤感受性試験であると思われた。

同 定 さ れ た 各 種 細 菌 の う ち ， Pasteurella

3.2

細菌分離検査およびウイルス遺伝子検査

multocidaおよびMycoplasma bovisについて，動ウイルス遺伝子検査では，BRSVが供試牛38頭

物用抗菌剤研究会が定める微量液体希釈法に準じ中２頭（5.3％）から，BHV1が同20頭（52.6％）て薬剤感受性試験を実施した。

から，BCoVが同２頭（5.3％）から検出されたが，Table 1 Results of clinical examinations in the tested Japanese black.
Clinical examinations

Mean
Standard deviation
MedianRT（℃）

HR（/min）

RR（/min）

39.6
0.6
39.6

101.4
22.6
102.0

48.8
15.6
52.0

RT：Rectal temperature, HR：Heart rates, RR：respiratory rates

Table 2 Results of blood examinations in the tested Japanese black.

Mean
Standard deviation
Median

WBC
（/µL）

RBC
（×104/µL）

Hgb（g/dL）Ht（%）

N/L ratio
-

9,630
3,240
8,700

1,066.7
159.0
1,068.5

11.5
0.9
11.4

35.2
3.8
34.8

0.9
0.5
0.7

WBC：White blood cells, RBC：Red blood cells, Hgb：Hemoglobin, Ht：Hematocrit, N/L ratio：Neutrophil tolymphocyte ratio© The Ito Foundation

290

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

BPIV3は検出されなかった（Table３）。本研究の菌感染症の治療方針の決定は，BALFの検査を実供試牛は，BRDC発症から比較的早期の病態であ施しなければ，感染の有無や感染している細菌のり，BALFから各種ウイルス遺伝子が検出された。

種類を予測することは不可能であることも明らか

特に，BHV1遺伝子が半数以上の供試牛で検出さとなった。

れ，同一農場内では同様の検査結果であったこと

分 離 さ れ た 細 菌 の 薬 剤 感 受 性 試 験 で は ，P.

から，牛へのウイルス感染が農場全体で人や物，

multocidaに対してはフルオロキノロン系抗菌薬

あるいは牛を介して拡散する傾向が明らかとなっおよびフロルフェニコールが，M. bovisに対してた。

はフルオロキノロン系抗菌薬が比較的感受性で

BALF を 用 い た 細 菌 分 離 検 査 で は ， P.

あった（Table５）。M. disparは，分離はされるもmultocidaが供試牛38頭中13頭（34.2％）から，M.

のの純培養の段階でほとんどの株が死滅したた

bovis が 同 14 頭 （36.8 ％ ） か ら ， Mycoplasma

め，薬剤感受性試験結果としてまとめることはで

dispar が 同 13 頭（34.2 ％ ）か ら 分 離 さ れ た が ，きなかった。なお，少ないながらも薬剤感受性試

Mannheimia haemolytica お よ び Histophilus

験が実施できたM. dispar２株の薬剤感受性は，M.

somniは分離されなかった（Table４）。また，P.

bovisと同様であった。全供試牛に対して，抗菌

multocidaとM. bovisの混合感染が供試牛38頭中薬療法が臨床獣医師により実施されていたが，原４頭（10.5％）であり，BALFからまったく細菌

因細菌に効果的な抗菌薬療法は多くの供試牛で実が 分 離 さ れ な か っ た 供 試 牛 が 38 頭 中 ８ 頭

施されていなかった。このことから，BRDCの病（21.1％）であった。本研究の供試牛は，BRDC発態把握や原因細菌の特定にはBALFを用いた検査症から比較的早期の病態であったことから，細菌の必要性が改めて示された。

が分離されなかった一方で，混合感染している症

BALFから細菌が分離されなかった供試牛のほ例も存在した。このことから，BRDC発症牛の細とんどでは，ウイルス遺伝子が検出されたことか

Table 3 Positive rates of viral genetic testing in the tested Japanese black.
BRSVa

BHV1

BCoV

BPIV3

Positive
Nagative

2
36

20
18

2
36

0
38

% of Positive

5.3

52.6

5.3

0.0

BRSV：bovine respiratory syncytial virus, BHV1：bovine herpesvirus 1, BCoV：bovine
coronavirus, BPIV3：bovine parainfluenza virus type 3a

The viruses were identified by a multiplex quantitative reverse transcription-PCR system

according to previous reports9）.
Table 4 Positive rates of bacterial isolations in the tested Japanese black.
P. multocidaa

Mycoplasma bovis

Mycoplasma dispar

M. haemolytica

H. somni

Other bacteria

Positive
Nagative

13
25

14
24

13
25

0
38

0
38

4
34

% of Positive

34.2

36.8

34.2

0

0

10.5

P. multocida：Pasteurella multocida, M. haemolytica：Mannheimia haemolytica, H. somni：Histophilus somniaBacteria were identified by TOF-MS, PCR or LAMP method after cultivations.

© The Ito Foundation

291

牛呼吸器病症候群（BRDC）発症機序の解明（Ⅱ）
Tabke 5 Results of antibiotics susceptibility testing of Mycoplasma bovis and Pasteurella multocida

isolated from bronchoalveolar lavage fluid.

Mycoplasma bovis

Pasteurella multocida

Antibiotics

Antimicrobial
abbreviations

MIC50

MIC90

MIC50

MIC90

Amoxicillin

AMPC

> 16＊

> 16

>8

>8

Ampicillin

ABPC

> 16

> 16

>8

>8

Thiamphenicol

TP

8

> 16

2

8

Florfenicol
Tylosin

FF
TYL

4
> 16

8
> 16

1
>8

2
>8

Tilmicosin

TIL

> 16

> 16

>8

>8

Kanamycin

KM

8

> 16

4

>8

Oxytetracycline

OTC

> 16

> 16

>8

>8

Chlortetracycline
Enrofloxacin
Marbofloxacin

CTC
ERFX
MBFX

4
0.5
1

> 16
4
8

1
0.5
1

2
2
4

Orbifloxacin

OBFX

2

16

2

4

＊ μg/mL

ら，BRDCの初期病態の形成にはウイルス感染がその結果，BALFからは主にP. multocidaおよび強く関与し，その後の細菌感染につながることがM. bovisが分離され，病態の悪化に関連している

確認された。このことは，平成31年に伊藤記念財ものと推察された。またBALFのウイルス遺伝子団の助成で実施した未治療BRDC発症牛でのデー検査では，主にBHV1やBRSVが検出された。こタに一致するものであった８）。しかし，本試験ののことから，BRDCの発症には農場内に侵入した

供試牛には抗菌薬の投与が実施されていたので，数種類のウイルスが関与し，細菌の二次感染の引一部の細菌はその効果により死滅していた可能性

き金になっているものと推察された。またBRDCも否定できない。このことから，BRDCとの診断の悪化には，P. multocidaおよびM. bovisが関与がなされた牛に対しては，ウイルス感染症を念頭し，慢性的な肺炎へと移行することが推察されとした対症療法を実施するとともに，細菌感染をた。以上より，BRDCの初期病態では必ずしもこ考慮した抗菌薬療法の実施が必要であると考えら

れらの細菌が強く関与するのではなく，BRSVやれた。

BHV3のようなウイルスが気道粘膜に感染し，そ４．要の感染抵抗性を減弱させたところに，牛の全身状

約

態や飼養環境をはじめとしたさまざまな要因が関本研究は，臨床的に急性期のBRDCの病態にあると診断された牛に対して気管支肺胞洗浄

与して，BRDCの発症や重症化を引き起こすことが推察された。

（BAL）を実施し，その洗浄液である気管支肺胞洗浄液（BALF）から分離される細菌やウイルスについて調査することによりBRDC発症機序を解明するとともに，各種細菌の薬剤感受性を明らかにすることを目的とした。供試牛38頭に対して，
臨床検査，血液検査およびBALF検査を実施した。

文
献１）
 Snowder, G. D., Van Vleck, L. D., Cundiff, L. V.,
Bennett, G. L.：J. Anim. Sci., 84, 1999～2008, 2006.
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３）
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Kokotovic, B., Heegaard, P. M., Enemark, J. M.：© The Ito Foundation

292

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Vet. Microbiol., 28, 165～171, 2009.
４） Maunsell, F. P., Woolums, A. R., Francoz, D.,
Rosenbusch, R. F., Step, D. L., Wilson, D. J., Janzen,
E. D.：J. Vet. Intern. Med., 25, 772～783, 2011.
５） 藏前哲郎，石川真悟，林淳，津曲圭太，乙丸孝之介，
帆保誠二：日獣会誌, 73, 31～36, 2020.
６） 帆保誠二，野口倫子，安藤貴朗：公益財団法人伊藤記念財団 平成25年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書, 32, 215～221, 2014.

７）
 帆保誠二，野口倫子：公益財団法人伊藤記念財団
平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書,
33, 189～193, 2015.
８）
 帆保誠二，石川真悟：公益財団法人伊藤記念財団
平成31年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，38, 260～265, 2020.
９）
 Goto, Y., Yaegashi, G., Fukunari, K., Suzuki, T.：J.
Appl. Microbiol., 129, 832～847, 2020.

© The Ito Foundation

293

病原性因子を欠損した生後感染アカバネウイルスの作出と生ワクチンへの応用
Establishment of Akabane virus mutant deleted pathogenetic determinant
and application for live vaccine

正

谷

達

謄・岡

島

美

鈴

（岐阜大学応用生物科学部）

Tatsunori Masatani and Misuzu Okajima（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

There are two strains of Akabane virus（AKAV）： a conventional strain that infects
pregnant cows and is pathogenic to the fetus, and a “postnatal” strain that causes fatal
encephalitis in adult cattle. The genotypes of the two types differ greatly, and it is considereddifficult to prevent the live postnatal strain of AKAV with the current live vaccine for theprevention of the conventional type. In this study, we used the reverse genetics system of
AKAV to generate a postnatal AKAV strain lacking the NSs gene, which is considered avirulence-related gene, and evaluated its potential as a live vaccine strain. Two different
postnatal AKAV strains（KM and FI）were genetically engineered to generate NSs genedeficient viruses. Both NSs gene-deficient strains showed the same proliferative ability in Verocells as the parental strains, indicating that the loss of the NSs gene does not affect the
production of infectious viruses. When mice were inoculated intracerebrally, both parental
strains caused lethal infections in mice. On the other hand, mice infected with the NSs-deficientFI strain did not die, although the inoculum dose was equal to that of the parental strain.
Notably, the pathogenicity of the NSs-deficient KM strain was high and showed the samelethality as that of the parental KM strain. These results strongly suggest that the NSs proteinof the FI strain contributes significantly to the virulence, whereas the NSs protein of the KM
strain may contribute almost nothing. In the future, it will be necessary to compare andanalyze the functions of NSs proteins in various virus strains in detail, as well as to identify
other virulence-related gene regions other than NSs for KM strains, to accumulate basic
information for the development of live vaccines.

１．目に鹿児島・熊本・宮崎県など南日本を中心に毎年的流行する。本ウイルスは，通常は成牛に対する病

アカバネ病は，ブニヤウイルス科に属するアカ

原性は低く，無症状のまま耐過する。しかし，本

バネウイルス（AKAV）によって引き起こされウイルスが妊娠牛に感染し子宮内の胎子に到達・る牛や山羊の疾病である。AKAVは小型吸血昆

増殖した場合，流産・死産および子牛の奇形を生虫（ヌカカなど）によって媒介され，夏季-秋季

じる。このため，本疾病による牛繁殖農家へ対す© The Ito Foundation

294

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

る経済的ダメージは大きい１，２）。AKAVに対するを決めているかを明らかにしてきた６）。本技術をワクチンは存在するものの，いまだに毎年散発的

AKAVに適用することで，病原性因子を欠損さに発生しており，時として数十戸の農家に同時発せることで著しく病原性が欠落した，弱毒生ワク

生して多大な損害を与える。そのため，牛繁殖農

チン候補株を作出することも可能となる。さらに家にとっては対策を要する疾病の一つである。特生ワクチンであれば，従来の不活化ワクチンに比に，流行地である南日本は我が国の重要な肉牛生

べ単回接種でより高い抗体価を得られると期待で産基地でもあるため，予防の徹底が求められてい

きる。

る。

以上より，生後感染型AKAVの病原性決定遺AKAV株のなかには，胎子のみに奇形を起こ

伝子を遺伝子組換え技術により欠損させること

す「従来型」の株とは別に，成牛にも時に致死的で，病原性復帰が起こらない安全なワクチン候補な脳炎を引き起こす「生後感染型」と呼ばれるウ株の人工的創出が重要である。本研究ではこの技

イルス株が存在し，我が国でもたびたび流行して術を駆使し，病原性関連遺伝子を欠損した生後感いる。生後感染型ウイルスによる被害は従来型ウ

染型AKAVを作出し，その生ワクチン株としてイルスに比べて甚大であり，2006年に熊本県・鹿の可能性を評価することを目的とする。

児島県で集団流行した際は数百頭を超える被害を出している３）。したがって，生後感染型AKAVの２．方法

発生をコントロールすることは養牛業界において

2.1

細胞

喫緊の課題となっている。

ハ ム ス タ ー 肺 由 来 HmLu-1 細 胞 お よ び

これまでの疫学調査により，生後感染型アカバ

BHKT7-9細胞（岐阜大学・伊藤直人博士より分ネ病を起こすウイルスは遺伝子型Ⅰに属し，従来

与）７）はともに10％Tryptose phosphate broth，型を引き起こす遺伝子型Ⅱのウイルスとは遺伝的５％牛胎子血清およびペニシリン・ストレプトマに大きく異なることが示されている 。さらに，

イシンを含むイーグル最小必須培地（EMEM，

これら２つは抗原性状が大きく異なり，交差性もWako）で培養した。アフリカミドリザル腎由来低い。そのため，従来型AKAVを予防するため

Vero細胞は，10牛胎子血清およびペニシリン・に使用されている現行型生ワクチンでは生後感染

ストレプトマイシンを含むEMEMで培養した。

４）型アカバネ病を予防することは困難である。一

2.2

ウイルス

方，最近になって生後感染型AKAV株をもとに2006年に熊本県で集団流行した際に分離された

不活化ワクチンが販売されることとなったが，免KM-2/Br/06株（KM株）２），2008年に福井県で分疫原性が弱く複数回の接種が必要であり，手間も離されたFI-1/Br/08株（FI株）３）は，それぞれ動コストもかかり煩雑である５）。

物衛生研究所および福井県家畜保健衛生所より供申請者はこれまでに，狂犬病ウイルスにおいて与されたものを使用した。遺伝子操作による組換

遺伝子組換え技術（リバースジェネティクス）をえウイルスおよびNSs遺伝子欠損ウイルスは後述

駆使し，強毒株と弱毒株の遺伝子を入れ替えたキの 方 法 で 回 収 し た 。こ れ ら ウ イ ル ス は す べ て

メラウイルスを作出しその性状（増殖性，病原

HmLu-1細胞で増殖させたのちストックウイルス性，免疫回避能力など）を比較することで，どのとして分注し，使用するまで－80℃にて保存した。

遺伝子のどのアミノ酸の変異がウイルスの病原性© The Ito Foundation

病原性因子を欠損した生後感染アカバネウイルスの作出と生ワクチンへの応用

2.3

フルゲノムプラスミド

295

録した。本実験は鹿児島大学動物実験委員会に

Ｔ７プロモーター配列およびデルタ肝炎ウイル
ス 由 来 リ ボ ザ イ ム 配 列 を 有 す る pT7riboSM2 ８）（Friedemann Weber教授：ギーセン大学より分与）に，各種ウイルス株の完全長のゲノム分節

よ っ て 承 認 さ れ た 上 で 実 施 し た（承 認 番 号：
VM19032）。
３．結果と考察（Ｌ，ＭおよびＳの３分節ずつ）をそれぞれ組み

アカバネウイルスが属するブニヤウイルス目ウ込んだものを使用した。Ｓ分節の中で，Ｎ遺伝子

イルスの多くにおいて，非構造タンパク質の１つとオーバーラップして存在するNSs遺伝子の欠損であるNSsタンパク質が宿主自然免疫を抑制するは次のように行った。

重要な病原性因子であることが示されている９）。

2.4

感染性ウイルスの回収

そこで，NSs遺伝子を欠損した生後感染AKAVは，

BHKT7-9細胞へ，各株のフルゲノムプラスミ

病原性が著しく減弱した生ワクチン候補株になるドを既報に準じてトランスフェクションした 。

と考え，その作出を試みた。NSs遺伝子のオープ

なお，トランスフェクション試薬はTransIT-X2

ンリーディングフレームはＮ遺伝子の内部に存在を使用した。トランスフェクション後４日目に明し，Ｎ遺伝子とは異なるフレームで翻訳される。

瞭な細胞変性効果を認めた細胞の培養上清を回収

そこで，KM株およびFI株のＳ分節フルゲノムプ

し，新たにコンフルエントになるよう培養したラスミドに対し，Ｎ遺伝子のコードするアミノ酸

HmLu-1細胞に接種しストックを作成した。スを変化させないように，NSs遺伝子の開始コドン

トックウイルスの力価は，抗AKAV Nタンパクを除去し，さらに複数の終始コドンを導入した

質モノクローナル抗体（東京大・堀本泰介教授よ（Fig.１）。得られたプラスミドを用いてウイルスり 分 与）を 使 用 し て 間 接 蛍 光 抗 体 法 に 基 づ く

回収を試みたところ，いずれの株も回収すること

フォーカスアッセイにより測定し，フォーカス形

ができた。

８）

得られたNSs遺伝子欠損ウイルスの増殖能を調成単位（FFU）として算出した。
2 . 5 培養細胞における各種ウイルスの増殖曲

べるため，Vero細胞におけるKMΔNSs株および
FIΔNSs株と，それぞれの組換え親株ウイルス

線
Vero細胞を６穴プレートに培養した。コンフ（rKM株およびrFI株）のVero細胞における増殖

ルエントとなった後，各細胞に対し，「細胞数100

曲線を作成した。その結果，いずれの株も，その個あたり１FFU」となるようEMEMで希釈した増殖能は親株と欠損株との間で大きな差はみられ

各ウイルスを接種した。１時間の吸着後，ハンクなかった（Fig.２）。すなわち，NSs遺伝子欠損にス氏液で洗浄し，通常培養に用いている培地を入

よって感染性ウイルス粒子の形成が抑制されないれた。感染後12，24，48時間後の上清を回収し，ことが示された。このことより，安定したワクチ－80℃にて保存した。これら上清中のウイルス力

ン生産に不可欠なウイルス株の性状の１つである

価を，TCID50法によって測定した。

「高効率のウイルス増殖能」に，同遺伝子操作に2.6よる影響はほぼないと考えられた。

各種ウイルスのマウスへの接種

EMEMで希釈した各ウイルスを，麻酔下の４次に，得られたNSs遺伝子欠損ウイルスのマウ

週齢雌ICRマウス（日本クレア）に脳内接種しスに対する病原性を調べるため，４週齢マウスにた。接種後14日間観察し，症状および生残率を記

各株を脳内接種し，その致死性を検討した（Fig.

© The Ito Foundation

296

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）(a)nt：34 59

168

nt：60
T →C

nt：138
C →G

334

736

S segment

nt：168C →G(b)nucleotides ・・ A T GTT C ・・ AGCT C AACT ・・ T CCTC A
※

N

・・ D

NSs

・・

V

M

Q
F

L

N

S

S

F
T

L
S

・・
・・

S

・・

Wild type(c)
nucleotides ・・ A C GTTC ・・ AGCT G AACT ・・ TCCTG A ・・
※

N

・・ D

NSs

・・

V

T

Q
F

L

N

＊

S

F
T

ΔNSs mutation

S

L

・・

＊

・・

※：amino acids＊：Stop codon

Fig. 1 Mutagenesis for deletion of NSs protein.（a）Three single nucleotide mutations

were introduced to delete the NSs protein：T to C in nt : 60, C to G in nt：138, andC to G in nt：168. This mutation resulted in the loss of the start codon of the NSs
protein and the change of the 27th and 37th amino acid positions to the termination
codon. The area enclosed by the square box is described in detail in（b）and（c）.
 c）The nucleotide sequence and amino acid sequence before（b）and after（c）（b,
the mutations are shown. Under bar and Bold letters indicate targeted nucleotides
and amino acids respectively.

(a)

(b)
TCID50/ml（log）

TCID50/ml（log）

10
8
6
4
2
0

0

12

24

36

48

10
8
6
4
2
0

Hours post inoculation

0

12

24

36

48

Hours post inoculation

Fig.2 Growth curves of（a）rKM, KM２ΔNSs,（b）rFI and FIΔNSs strains in Vero cells. Cells were inoculatedwith each strain at a multiplicity of infection 1. White, parental strains；Black, NSs-deficient strains.

３）。親株であるrKM株およびrFI株のいずれの接種量であるにもかかわらず，死亡個体はみられ

株も，マウスに対して致死的感染を引き起こしなかったのに対し，KMΔNSs株の病原性は高く，た。一方，FIΔNSs株感染マウスは親株と等量の親株であるrKM株と同等の致死率を示した。以© The Ito Foundation

病原性因子を欠損した生後感染アカバネウイルスの作出と生ワクチンへの応用

Number of micerKM2 10^5rKM2dNSs 10^5

4

4

3

3

2

2

1

1

0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

rFI 10^5

rFIdNSs 10^5

8

8

6

6

4

4

2

2

0

297

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Days post inoculation
Fig.3 M
 orbidity and mortality changes in adult mice inoculated intracerebrally with rKM, KM2ΔNSs, rFI and FIΔNSs

strains. Four or eight mice per group were inoculated with 105 FFU of each strain. The mice were observed forneurological symptoms for 14 days and classified into three grades: normal（white）,neurological symptoms（suchas motor incoordination, paralysis, seizure and coma）（gray）and dead（black）.

上より，異なる２株の生後感染AKAV株のうち，元となったOBE-1株のNSs欠損変異体が，哺乳マ

FI株のNSsタンパク質は病原性に大きく寄与する

ウスへの病原性を失ったことから10），同遺伝子型のに対し，KM株のNSsタンパク質はほぼ寄与しウイルスの病原性にはNSsタンパク質が寄与してない可能性が強く示された。

いる可能性がある。一方，KM株がNSs遺伝子欠本研究より，NSsタンパク質はウイルスの株に損によっても病原性を維持したことから，同株のよって病原性に対する役割が大きく異なることが病原性には別の遺伝子領域が重要な役割を担って示された。KM株は生後感染を起こすとされる遺いると考えられた。

伝子型Ⅰに属し，100頭以上の牛に生後感染が拡

KM株とFI株のNSsタンパク質はともに91アミ

大した2006年の事例において発症牛から分離されノ酸で構成されており，その間には４アミノ酸のた株である４）。一方，FI株は，生後感染における相違がある。今後，両株NSsタンパク質の病原性発症牛から分離されたものの，これまで生後感染への寄与の差，とくに自然免疫抑制機能にこれらを起こさないとされてきた遺伝子型Ⅱに属する，アミノ酸のいずれの違いが関与するかどうか検討

数少ない生後感染AKAV株である。同じ遺伝子していく必要がある。

型Ⅱであり哺乳マウスに致死性を示すものの成熟

今後，さまざまなウイルス株におけるNSsタン

マウスへの病原性を持たない，現行ワクチン株の

パク質の機能を詳細に比較・解析するとともに，© The Ito Foundation

298

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

KM株に関してはNSs以外の別の病原性関連遺伝

解析するとともに，KM株に関してはNSs以外の子領域を特定し，生ワクチン開発へ向けた基礎的別の病原性関連遺伝子領域を特定し，生ワクチン

情報を蓄積していく必要がある。

開発へ向けた基礎的情報を蓄積していく必要があ

４．要

る。

約

アカバネウイルス（AKAV）には，妊娠牛に感染し胎子に病原性を発揮する従来タイプの株と，成牛に対しても致死的な非化膿性脳炎を引き起こす「生後感染型」と呼ばれるタイプの株が存在する。両タイプは遺伝子型が大きく異なり，従来型AKAV予防のための現行型生ワクチンでは生後感染型アカバネ病を予防することは困難とされる。本研究ではAKAV遺伝子操作技術を駆使し，病原性関連遺伝子とされるNSs遺伝子を欠損した生後感染型AKAVを作出し，その生ワクチン株としての可能性を評価することを目的とした。異なる２株の生後感染型AKAV株（KM株およびFI株）について，遺伝子操作によりNSs遺伝
子 欠 損 ウ イ ル ス の 作 出 に 成 功 し た 。こ れ ら の
Vero細胞における増殖能はいずれも親株と同等であったことから，NSs遺伝子の欠損が感染性ウ
イルス粒子形成に影響を与えないことが示された。マウスへ脳内接種したところ，両株の親株はいずれも，マウスに対して致死的感染を引き起こした。一方，FI株のNSs遺伝子欠損ウイルス感染
マウスは親株と等量の接種量であるにもかかわらず，死亡個体はみられなかったのに対し，KM株のNSs遺伝子欠損ウイルスの病原性は高く，親株であるKM株と同等の致死率を示した。以上より，異なる２株の生後感染AKAV株のうち，FI株のNSsタンパク質は病原性に大きく寄与するのに対し，KM株のNSsタンパク質はほぼ寄与しない可能性が強く示された。今後，さまざまなウイルス

文
献１）
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Y., Kono, Y.：Encephalitis of cattle caused by Iriki
isolate, a new strain belonging to Akabane virus,
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２）
 Kato, T., Yanase, T., Suzuki, M., Katagiri, Y.,
Ikemiyagi, K., Takayoshi, K., Shirafuji, H., Ohashi, S.,
Yoshida, K., Yamakawa, M., Tsuda, T.：Monitoring
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Res, 12, 125, 2016.
３） 山川睦，筒井俊之：アカバネ病の最近の流行動向と対策，家畜診療, 59, 395～401, 2012.
４）
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Yanase, T., Kato, T., Tanaka, S., Tsutsui, T., Imada,T . , Y a m a k a w a , M . ：B o v i n e e p i z o o t i c
encephalomyelitis caused by Akabane virus insouthern Japan, BMC Vet Res, 4, 20, 2008.
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クチンの効果的なワクチネーションプログラムの検討，日本獣医師会雑誌, 70, 584～588, 2017.
６）
 Masatani, T., Ito, N., Shimizu, K., Ito, Y.,
Nakagawa, K., Sawaki, Y., Koyama, H., Sugiyama,
M.：Rabies virus nucleoprotein functions to evadeactivation of the RIG-Ｉ-mediated antiviral response,
J Virol, 84, 4002～4012, 2010.
７）
 Ito, N., Takayama-Ito, M., Yamada, K., Hosokawa,J., Sugiyama, M., Minamoto, N.：Improved recoveryof rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia
virus-free reverse genetics system, Microbiol
Immunol, 47, 613～617, 2003.
８） 三竹博道，生水誠一，武田佳絵，加藤信正，田中省吾，梁瀬徹，加藤友子，山川睦：アカバネウイル
スgenogroup Ⅱによる育成牛の非化膿性脳脊髄炎，
日本獣医師会雑誌, 64, 140～144, 2011.
９）
 Ly, H. J., Ikegami, T.：Rift Valley fever virus
NSs protein functions and the similarity to otherbunyavirus NSs proteins, Virol J., 13, 118, 2016.
10）
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H.：Rescue of Akabane virus（family Bunyaviridae）
entirely from cloned cDNAs by using RNA
polymerase I, J. Gen. Virol., 88, 3385～3390, 2007.

株におけるNSsタンパク質の機能を詳細に比較・© The Ito Foundation

299

熊本系褐毛和種における地方病性牛白血病抑制
メカニズムの解明
Analyses of the susceptibility for Enzootic Bovine Leukosis in Japanese
Brown cattle of Kumamoto strain

稲

永

敏

明

（東海大学農学部応用動物科学科）

Toshiaki Inenaga（Department of Animal Sciences, School of Agriculture, Tokai University）

Enzootic bovine leukemia（EBL）, induced by bovine leukemia virus（BLV）-infection, isreported many times in these years and becomes one of large problem threatening livestockhygiene in this country. Because most infected cattle show no symptoms for many years, it issuggested that the susceptibility for lymphoma is affected by the heritable factor of eachanimal. In order to elucidate these genetic factors, I conducted this study using Japanese
Brown cattle of Kumamoto strain, which could be suggested to have resistance for theelevation of the blood proviral loads（PVL）after BLV-infection. I selected 21 candidate genes
by RNA sequencing analysis and from the information about related viruses. Using real-timequantitative PCR analyses, I compared the expressions of these genes among non-infected,
infected（low PVL）, and infected（high PVL）cattle of Japanese Brown or Japanese Black,rearing in some commercial farms in Kumamoto prefecture. It was detected that theexpression of 5 genes significantly varied dependently on PVL level in Japanese Brown.
Among these 5 genes, 3 genes’ expression levels were significantly affected by the difference of
breed（Japanese Brown or Japanese Black）.More studies are needed to confirm whether thesedifferences fundamentally bring the variation of PVL after BLV-infection.

１．目

瘍化を起こし，感染牛の30％程度に持続性リンパ的球増多症をもたらす。感染牛にはこの段階でもと地方病性牛白血病（EBL）は牛白血病ウイルス

くに症状はないものの，一部は全身に多発性のリ（BLV）感染が原因で起こる牛の伝染病である。

ンパ腫を発症し，起立不能や食欲不振といった牛EBLを含む牛白血病の発生数は，平成10年は日本

白血病の症状を発症する１）。現在のところ，本疾全国で99頭であったが，令和元年は4,110頭と，病に対するワクチンや治療法はなく，農場で発症増加の一途を示している。EBLの原因病原体であすると自衛殺処分に，と畜検査で判明した場合はるBLVはレトロウイルスであり，血液中のＢリ

全部廃棄となる。近年，感染率（抗体陽性率）がンパ球に感染し，宿主細胞のゲノムに「プロウイ

地域や農場によってはかなり高いため，生産現場ルス」として組み込まれ，やがてＢリンパ球の腫で非常に問題となっており，対策方法が強く求め© The Ito Foundation

300

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

られている家畜伝染病の一つとなっている。

抗体検査，DNA抽出～ウイルス検査を行った。

本研究では，多くが熊本県内で飼養されている

BLV抗体検査は，熊本県の各家畜保健衛生所に和牛の一品種である熊本系褐毛和種（褐毛和種）て実施され（BLVエライザキット，ニッポンジー

において，牛白血病の発生が非常に稀であることン），抗 体 陽 性 牛 に つ い て は ，血 液 よ り 抽 出に注目した。2018年度より，熊本県と共同で疫学（QIAmp DNA Blood Mini Kit，キアゲン）した調査を行ったところ，褐毛和種の抗体陽性牛におDNAを用いて，熊本県中央家畜保健衛生所検査

いて，血中プロウイルス量が，黒毛和種やホルス課にて，CoCoMo-BLV検出キット（理研ジェネ

タイン種と比べて顕著に低く保たれていることをシス）により血中のプロウイルス量（PVL）の明らかにした。

測定が行われた。抗体検査結果および測定したプ

たとえ感染していても，血中プロウイルス量がロウイルス量をもとに，供試牛を陰性牛，低PVL

低い牛は，農場内で他の牛への感染源にならない

牛，高PVL牛のグループに分類した。なお，分類ことが分かってきたが ，血中プロウイルス量のの 基 準 は ，低 PVL 牛 を 検 出 限 界 以 下～ 数 百制御機構の全容はいまだ明らかにされていない。

copies/105cells 程 度，高 PVL 牛 を 20,000copies/

したがって，褐毛和種抗体陽性牛で血中プロウイ

105cells～35,000 copies/105cells程度とした。

２）

ルス量が低く抑えられるメカニズムが解明されれ

2.3ば，予防や治療の手掛かりとなりえる。さらに，

血液からのRNAの抽出は，Paxgene RNA採血

このような牛の遺伝的なマーカーが分かれば，そ管（日本ベクトン・ディッキソン）に分注した血れを指標に選抜淘汰することが可能である。

液を用い，「PAXgene Blood RNA Kit」（キアゲ

RNA抽出～RNAシークエンス解析

これらのことから，本研究は，褐毛和種のBLVン）によりRNAを抽出し，供試牛の中から，褐

感染牛における血中プロウイルス量が低いレベル

毛和種のBLV抗体陰性牛４頭，抗体陽性牛８頭で保たれるメカニズムを解明することで，EBLに（低PVL牛４頭，高PVL牛４頭）の血液から抽出

対する新たな対策を提案することを目的とする。

したRNAを用い，外注にてRNAシークエンス（RNA-seq）解 析（富 士 フ ィ ル ム 和 光 純 薬）を

２．材料と方法
2.1

行った。この結果，とくに高PVL牛と低PVL牛の供試牛

発現レベルに差があった遺伝子から解析対象とす2019年度から2020年度にかけて，熊本県内の一る候補遺伝子を選抜した。

般農場計24農場で飼育されている褐毛和種および2.4

黒毛和種繁殖雌牛計798頭の採材および調査を行

候補遺伝子の発現レベルの差を検出するため，い，本研究にはそのデータおよびサンプルの一部

抽 出 し た RNA よ り 合 成（ReverTra Ace qPCRを用いた。なお，これらの一般農場には，熊本県

RT Master Mix with gDNA Remover ，東 洋 紡）の各家畜保健衛生所を通じて研究への協力を依頼

し た cDNA を 鋳 型 に ，リ ア ル タ イ ム PCR 装 置

し，了承が得られた農家を選定した。また本研究「Step One Plus

は，東海大学動物実験委員会の承認を受けて実施（ライフテクノロジーズジャパン）を用いて実施された（承認番号202040）。

した。試薬はTHUNDERBIRD NextSYBR qPCR

2.2

採材およびウイルス検査

リアルタイム定量PCR

リ ア ル タ イ ム PCR シ ス テ ム」

Mix（東洋紡）を使用した。

供試牛の尾静脈から採取した血液より，BLV

リアルタイムPCRは，供試牛の中から５農場由© The Ito Foundation

301

熊本系褐毛和種における地方病性牛白血病抑制メカニズムの解明

来の褐毛和種18頭および黒毛和種６頭（Table１）

３．結果と考察を用い，実験１と実験２に分けて行った。実験１は褐毛和種の陰性牛６頭，低PVL牛７頭，高PVL

RNA-seq解析結果については，とくに低PVL

牛５頭の３区間で比較し，実験２は月齢やPVLの牛と高PVL牛の間で発現レベルに差の見られた量が同等な，褐毛和種の低PVL牛３頭，高PVL牛

遺伝子やGene Ontology（GO）解析の結果，有２頭を，また黒毛和種の低PVL牛３頭，高PVL牛意に発現変動遺伝子が多く含まれていたGOより３頭を用い，二元配置の計４区間で比較した。

候補遺伝子を選抜した。また，近縁なウイルスでいずれも得られた結果のうち，GAPDHのCt値

あるヒトＴ細胞指向性リンパ腫ウイルス１型との差であるΔCt値を用いて，ハウスキーピン（HTLV-1）の知見からも候補遺伝子を選抜し３），グ遺伝子であるGAPDHの発現量を１としたとき

2020年度は，遺伝子Ａ～Ｕまでの，計21個の候補の各遺伝子の相対発現量を算出した。

遺伝子についてリアルタイム定量PCRによる発現

2.5

統計処理

レベルの解析を実施した。なお，遺伝子名につい統計処理プログラムＲを用い，実験１について
は，褐毛和種のみを要因とした陰性牛，低PVL牛ては都合により伏せており，実験１と実験２で同じ遺伝子名のものは同一遺伝子である。

と高PVL牛の３区の比較のため，一元配置の分散

3.1

分析を行い，有意差があった場合，多重比較検定

21個の候補遺伝子のうち，一元配置分散分析のを行った。実験２については，PVLレベルに加え

結果，ｐ＜0.1まで含めると遺伝子Ａ～Ｅまでの品種の違いを要因とした，二元配置の分散分析を５遺伝子に，発現レベルの差が認められた。遺伝

行い，有意差があった場合，多重比較検定を行っ

子Ａ：陰性牛vs低PVL牛vs高PVL牛（平均相対た。有意水準は５％未満とし，ｐ値がｐ＜0.1で

発 現 量 ± 標 準 偏 差 ， 以 下 同 様）
＝ 0.0169 ±あれば傾向あり，ｐ＜0.05であれば有意差あり，0.0079vs0.0189 ± 0.0086vs0.0071 ± 0.0017 （ｐ＜として表した。

0.05）， 遺 伝 子 Ｂ：0.0002 ± 0.0000vs0.0001 ±実験１

褐毛和種間での比較

0.0000vs0.0002±0.0001（ｐ＜0.05），遺伝子Ｃ：
0.1912 ± 0.0316vs0.1323 ± 0.0488vs0.0481 ± 0.0236

Table 1 The information of cattle used in the real-time quantitative PCR tests.
A
Test 1

sample number

not-infected
infected

PVL（copies/10５cells）

age（month-old）6

not tested

low PVL

7high PVL

5

not detected〜286
27122～34510

18.4〜108.3
29.0〜67.8
18.1〜177.9

sample number

PVL（copies/10５cells）

age（month-old）

6〜1927122～27568

60.9〜67.0
65.0〜68.5

B
Test 2
Japanese Brown
infected

low PVL

3high PVL

2

Japanese Black
infected

low PVL

3

10〜12

50.7〜59.5

high PVL

3

29881〜34680

50.7〜71.2

PVL：proviral loads
age：months from the birth day until the sampling day© The Ito Foundation

令和２年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）（ｐ＜0.001），遺伝子Ｄ：16.8932±3.4748vs15.7634± 3.9229vs10.5748 ± 1.2537（ｐ ＜ 0.05），遺 伝 子
Ｅ：0.1444 ± 0.1016vs0.1708 ± 0.1025vs0.0447 ±0.0187（ｐ＜0.1）。多重比較検定の結果もあわせると，遺伝子Ａ，Ｄ，Ｅは高PVL牛が他の２区に比較して発現量が低く，遺伝子ＣはPVLが上がるA
relative expression level

302

Gene A
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005

につれて発現量が低下していた。また，遺伝子Ｂていた。これらの遺伝子については，BLVの感染が起こっても発現レベルが維持されることでPVLの上昇を抑制している可能性が考えられる。
その一方で，これらの現象が，PVLの差による結果である可能性も考えられ，またサンプル数も十分とは言えない。このため，サンプル数を追加す

RL

B
relative expression level

は低PVL牛に比べて高PVL牛で発現量が上昇し0

わせて，PVLの差による影響を排除するために，
PVLが同程度の褐毛和種および黒毛和種を比較することを目的として，実験２を実施した。
3 . 2 実験２

褐毛和種および黒毛和種間の比較牛を選抜し，実験１と同様に，21個の候補遺伝子

BL

BH

BL

BH

0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0

RL

RH

Gene C
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0

供試牛の中から，褐毛和種および黒毛和種の，それぞれPVLを同程度とした低PVL牛と高PVL

BH

Gene BC
relative expression level

子の発現レベルを比較する必要がある。また，あ

BL

0.35

るとともに，これらの遺伝子のタンパクレベル
や，さらに，これらの遺伝子の上流にあたる遺伝

RH

RL

RH

Fig. 1 Relative expression levels of 3 genes whichsignificantly differed between 2 breeds.

data are mean ± standard deviation（SD）の発現レベルの比較を行った。二元配置である

RL：Japanese Brown with low PVL

が，実験２の目的から，品種の差による影響が有BL：Japanese Black with low PVL意であった３遺伝子（遺伝子Ａ，ＢおよびＣ）の

RH：Japanese Brown with high PVL
BH：Japanese Black with high PVL

発現レベルのデータをFig.１に示した。遺伝子Ａ
およびＢは，黒毛和種に比べて褐毛和種で有意に種におけるBLV感染牛におけるPVLの差に影響低く，遺伝子Ｃは逆に，褐毛和種で有意に高かっを及ぼしている可能性がある。実際に，これらのた（いずれもｐ＜0.01）。これらの遺伝子は，い遺伝子は，HTLV-1やその他のレトロウイルスのずれも実験１における，褐毛和種間での比較でも細胞から細胞への伝播などへの関与が知られてい差が見られており，これらの遺伝子の発現レベル

るため，BLVの伝播において，これらの遺伝子の差はPVLの差による結果ではない可能性が示が関与していることが考えられる。ただし，これ

唆され，本研究の目的である，褐毛和種と黒毛和らの遺伝子の発現量の差が，本研究の最終的な目© The Ito Foundation

熊本系褐毛和種における地方病性牛白血病抑制メカニズムの解明

303的である，褐毛和種と黒毛和種のBLV感染牛にれる熊本系褐毛和種（以下，褐毛和種）に注目おけるPVLの差に影響を及ぼす根本原因である

し，褐毛和種を用いたRNAシークエンス解析おとは断定できず，一現象を捉えているに過ぎな

よび近縁なウイルスにおける知見から，21個の候い。このため，これらの遺伝子においても，サン

補遺伝子について，褐毛和種の陰性牛，低PVL牛，

プル数を増やすとともに，これらの遺伝子のタン

高PVL牛間および，褐毛和種と黒毛和種の低PVL

パクレベルや，さらに，これらの遺伝子の上流に牛，高PVL牛間で，リアルタイム定量PCRによりあたる遺伝子の発現レベルを比較する必要がある。

発現量の比較を行った。その結果，５遺伝子が以上のことから，本研究では，2020年度に上記

PVLによって発現量に差が見られ，うち，３遺伝のような調査・採材および解析を行い，本研究の子については，品種間での比較においても発現レ目的である褐毛和種と黒毛和種のBLV感染牛にベルに有意差が認められた。ただし，これらの遺おけるPVLの差に影響を及ぼす遺伝因子の探索

伝子の発現レベルに差があることが，PVLの差のの手がかりとなる現象をつかむことができたと考根本的な原因となっているとは断定できないた

えているが，上記でも述べたとおり，この現象がめ，さらなる解析を行う必要がある。

根本原因となっているかどうかを見極めるには，
SNPなどのゲノムDNAレベルや，上流の遺伝子の発現レベルを調査することで，この現象が，どのようなメカニズムで起こっているかを解明する必要がある。また，生産現場での問題を解決するためには，これらの現象が，どのようにBLV感
染後のPVLの変動の差に影響を与えるかを，タン
パクレベルや細胞レベルで解析する必要があり，これらによって，育種や予防技術への応用の手掛かりとなる知見が得られるものと考えている。
４．要約

地方病性牛白血病（EBL）は牛白血病ウイルス（BLV）によって引き起こされ，近年，発生件数の増加が大きな問題となっている。しかし，BLV
感染牛のほとんどは悪性のリンパ腫を発症せず無症状のままである。このため，リンパ腫発症に対する感受性は，牛側の遺伝的要因により変動する
可能性がある。これを解明するため，遺伝的にEBLに対する発症抵抗性やBLV感染後に示す血中プロウイルス量の上昇の抵抗性を持つと考えら文
献１）
 Della Libera, A. M., de Souza, F. N., Batista, C. F.,
Santos, B. P., de Azevedo, L. F., Sanchez, E. M.,
Diniz, S. A., Silva, M. X., Haddad, J. P., Blagitz, M.
G.：Effects of bovine leukemia virus infection on
milk neutrophil function and the milk lymphocyte
profile, Veterinary Research, 46, 2, 2～8, 2015.
２）
 Juliarena, M. A., Barrios, C. N., Carolina Ceriani,
M. C., Esteban, E. N.：Bovine leukemia virusinfected cows with low proviral load are not asource of infection for BLV-free cattle, J Dairy Sci,
99, 4586～4589, 2015.
３）
 Kataoka, K., Nagata, Y., Kitanaka, A., Shiraishi, Y.,
Shimamura, T., Yasunaga, J., Totoki, Y., Chiba, K.,
Sato-Otsubo, A., Nagae, G., Ishii, R., Muto, S.,
Kotani, Y., Watatani, Y., Takeda, J., Sanada, M.,
Tanaka, H., Suzuki, H., Sato, Y., Shiozawa, Y.,
Yoshizato, T., Yoshida, K., Makishima, H., Iwanaga,M., Ma, G., Nosaka, K., Hishikawa, M., Itonaga, H.,
Imaizumi, Y., Munakata, W., Ogasawara, H., Sato, T.,
Sasai, K., Muramoto, K., Penova, M., Kawaguchi, T.,
Nakamura, H., Hama, N., Shide, K., Kubuki, Y.,
Hidaka, T., Kameda, T., Nakamaki, T., Ishiyama, K.,
Miyawaki, S., Yoon, S-S., Tobinai, K., Miyazaki, Y.,
Takatori-Kondo, A., Matsuda, F., Takeuchi, K.,
Nureki, O., Aburatani, H., Watanabe, T., Shibata, T.,
Matsuoka, M., Miyano, S., Shimoda, K., Ogawa, S.：
Integrated molecular analysis of adult T cellleukemia/lymphoma, Nat Genet, 47（ 11）, 1304～
1318, 2015.

© The Ito Foundation

304

豚の筋ジストロフィーの病態解明と生前検査法の開発
Study of pathogenesis and detection method of porcine muscular
dystrophy

相

原

尚

之・野

口

倫

子

（麻布大学獣医学部）

Naoyuki Aihara and Michiko Noguchi（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

Porcine muscle degeneration characterized by excessive fat deposition within muscles has
been detected in pigs which had no clinical symptoms in meat inspection centers. Among theselesions, a case of human Becker muscular dystrophy-like myopathy characterized by decreased
dystrophin staining at the sarcolemma was previously reported. The present study
histologically and molecularly analyzed porcine muscle degeneration lesions and investigated
the antemortem inspection method of pig muscular dystrophy. The distribution of macroscopic
lesions was classified into four types: mainly in the gracilis, localized in the tongue, mainly inthe trapezius, and mainly in the heart. Histologically, all types of lesions had severe fibrosis andfat infiltration. The muscular fibers in skeletal muscles exhibited necrotic and regenerative
features. Immunofluorescence using antidystrophin antibody showed focal and severely weakstaining at the sarcolemma. Analysis of dystrophin mRNA showed that point mutations on
different sites were detected in two cases, 62 base pairs insertion was detected in one case, anddeletion of 1,041 base pairs was detected in two cases. Based on these findings, all cases werediagnosed as dystrophinopathy（Becker muscular dystrophy）. In addition, a muscle biopsy of
six male piglets was done from carrier sow. Three piglets showed muscular regeneration andweakened dystrophin immunoreactivity, diagnosed with Becker muscular dystrophy. Pig
dystrophinopathy is caused by various dystrophin mutations, and the distribution ofmacroscopic lesions may be related to its dystrophin mutation. These dystrophin mutations
may be latent in pigs because of the mild clinical symptoms. Muscle biopsy can be used as anantemortem dystrophinopathy inspection method for screening at selective pig breeding.

１．目

著者は，このような変性性筋病変の中にジストロ的フィンの発現異常による筋症が存在することを明健康豚としてと畜場に搬入された豚において，らかにした１）。ジストロフィンは細胞内骨格と筋

食肉検査時に脂肪浸潤と褪色を特徴とする筋病変

細胞膜，細胞外マトリックスを繋ぎ，筋細胞の構が発見されることがある。このような病変は古く造安定化に関与しており，ジストロフィンの機能から知られているが，その原因は不明であった。

異常は筋細胞を変性，壊死に至らせ，臨床的には© The Ito Foundation

豚の筋ジストロフィーの病態解明と生前検査法の開発

筋力低下を呈する。

2.2

305

病理組織学的検索

ジストロフィンの発現異常（ジストロフィン異採材した材料を10％中性緩衝ホルマリンで固定常 症）は ，ヒ ト の 遺 伝 性 筋 疾 患（筋 ジ ス ト ロ

後，常法に従いパラフィンブロックに包埋した。

フィー）の最大の原因である。ジストロフィン遺ミクロトームを用いて３μｍに薄切し，ヘマトキ

伝子はＸ染色体上に位置するため，伴性劣性の遺シリン・エオジン染色（HE染色）を実施した。

伝様式を取り，保因母親を持つ男性で発症する。

また必要に応じて，アザン染色を実施した。

ヒトのジストロフィン異常症は，重症型で早期発2.3症のデュシェンヌ型と比較的軽症で遅発性のベッ

免疫組織染色により，上記解析材料中のジスト

カー型筋ジストロフィーに大別される 。食肉検

ロフィン発現を評価した。抗ジストロフィン一次査時に発見される豚のジストロフィン異常症は，抗体には，Ab15277（希釈倍率500倍，Ｃ末端認

生前に運動機能に異常はみられないことから，ヒ識抗体）を用いた。二次抗体には，Alexa fluor

トのベッカー型筋ジストロフィーに類似する病態

488標識抗ウサギIgG抗体（希釈倍率1,000倍）をを示すと考えられる。

用いた。

２）

脂肪浸潤と褪色を特徴とする豚の筋病変は日2.4

免疫組織学的検索

遺伝学的検索本，米国等で発生があることから１，３），その原因

採材した筋肉はドライアイスとともに粉砕し，の一つと考えられる豚の筋ジストロフィーは，潜RNeasy Plus Micro Kit （QIAGEN） を 用 い て

在的に広く存在している可能性がある。また，そRNAを抽出した。逆転写反応はReverTra-Plus-の病態は十分に明らかになっておらず，生前検査（東洋紡）を用い，付属説明書に従い行った。得法も検討されていない。本研究では，ジストロられたcDNAテンプレートとして，Table１に示

フィン異常症を疑う豚を全国各地から収集し，病すプライマーを用いてPCRを実施した。PCR産物

理学および遺伝子学的性状を解析するとともに，は１％アガロースゲルで電気泳動し，目的のバン

生前検査法を検討した。

ドをNucleoSpin Gel and PCR Clean-up（タカラ２．方

バイオ株式会社）を用いて精製し，シークエンス

法

解析（ユーロフィンジェノミクス株式会社）を実本研究に関わる動物実験は，麻布大学動物実験施した。

委員会の許可を受け（承認番号：191108-2），麻2.5

布大学動物実験指針を遵守して実施した。

心不全を示した母豚から確立した豚家系の雄子

2.1

生前検査法の検討

豚６頭を対象に，生前検査法の検討を行った。生動物および検査材料

と畜場に健康畜として搬入され，食肉検査時に後70日齢において，麻酔下で薄筋から１cm大の変性性筋病変として摘発された約６ヶ月齢の豚24

筋肉を採取し，2 . 2，2 . 3に示す方法で病理学的，頭（雄12頭，雌12頭）を対象に，筋病変の肉眼的

免疫組織学的解析を行った。

分布を記録し，病変部から筋肉を採取した。また，本学で飼育中に心不全で死亡した母豚とその家系

３．結果と考察の雄子豚６頭の計７頭から，骨格筋および心筋を3.1採取した。正常対照には７週齢の雄豚２頭の骨格筋病変の発現部位として，以下の４つのタイプ筋を用いた。

病変の肉眼分布と形態学的特徴が認められた。

© The Ito Foundation

306

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 1 PCR primer pairs used for amplification of the dystrophin gene.
NM_001012408.1_604-623F

GAGCTGGGTCCGACAATCAA

NM_001012408.1_1475_1496_R

CACTTGCTACCCTGAGGCATTC

NM_001012408.1_1029_1048_F
NM_001012408.1_2474_2494_R

CGCAGGGCTATGAACGAACTGGCTTTTTCTCGCTCTATGGC

NM_001012408.1_2027_2048_F

ACCATGGACAAACTCAGTTCAC

NM_001012408.1_3437_3457_R

CCTGCACTGTTTCAGCTGTTT

NM_001012408.1_3002_3021_F

CCAATGCGCTATCAGGAGAC

NM_001012408.1_4470_4491_R

GCAGCTTCCTTTCCCTGGTAAT

NM_001012408.1_4068_4088_F

CTGGTGGAGCTGAGGAAATCT

NM_001012408.1_5468_5489_R
NM_001012408.1_5016_5036_F

TGTGAGAAATGGCTGCAAATCG
TCTGGGGAAAGGCTACTCAGA

NM_001012408.1_6403_6422_R

GCTGTGAGAGAGCTTCCTGT

NM_001012408.1_6046_664_F

CTGGCGGGAAATTGAGAGC

NM_001012408.1_7450_7471_R
NM_001012408.1_7025_7044_F

AGGTGCTTCAATAGTGGTCAGT
CCCATAAGCCCAGAAGAGCA

NM_001012408.1_8461_8480_R
NM_001012408.1_8158_8176_F
NM_001012408.1_9382_9402_R
NM_001012408.1_9166-9185F
NM_001012408.1_10413_10430_R
NM_001012408.1_10111-10130F
NM_001012408.1_11236-11255R

GGATGGCATCATCGGAACCTCAATGCCTCCTGGGCAAAC
GTTGTTTGGGTCTCGTGGTTG
CACCACATTGGGCATTCAGC
AGGCAGGCGCAGAATCTA
GGAGTGTCCAATCATCGGCTGCTCTGCCCAAATCATCTGC

3 . 1 . 1 病変が主に薄筋・腹直筋に出現するタイプ（ｎ＝21）て，ジストロフィンを発現する筋線維が著しく減少していた（Fig.４）。発現を認める筋線維にお食肉検査時に変性性筋病変として摘発された24

いても，断続的な発現となり発現量も減弱した。

頭のうち21頭が本タイプであり，４つのタイプの

3 . 1 . 2 病変が主に舌に出現するタイプ（ｎ＝中で最も多くみられた。

１）

肉眼所見：薄筋と腹直筋を中心に全身の筋肉の褪

食肉検査時に変性性筋病変として摘発された症

色，脂肪浸潤が顕著であり，筋肉以外に著変は認例のうち１頭がこのタイプであった。

められなかった。

肉眼所見：舌は高度に腫大し，口腔から突出して組織所見：骨格筋への脂肪浸潤が高度であり，残いた。その他の部位に著変は観察されなかった。

存する筋線維は好酸性を増し円形化し，大小不同

組織所見：舌において，脂肪浸潤と筋線維の変が顕著であった（Fig.１）。変性壊死した筋線維性，壊死および再生性変化を認めた。また，アザをマクロファージが貪食するような像も観察され

ン染色標本では，変性した筋線維の周囲に青く染た（Fig.２）。肥大した筋線維を区画するように色される膠原線維の増生（線維化）が確認でき線維が入り込む分割線維や核の中心化といった再た。肉眼的には著変がみられなかった骨格筋にお生性変化を認めた。

いても，軽度な筋線維の変性と線維化が観察され免疫染色：抗ジストロフィン抗体を用いた免疫染

た。

色により，正常個体では筋線維膜に一致して全周

免疫染色：抗ジストロフィン抗体による免疫染色

性かつ均一にジストロフィンの発現が認められたにおいて，舌筋ではジストロフィンがほとんど発（Fig.３）。一方，本タイプの21症例すべてにおい現しておらず，ごく一部分が弱い発現を示した。

© The Ito Foundation

豚の筋ジストロフィーの病態解明と生前検査法の開発

Fig. 1 Microscopic findings after staining with hematoxylin

and eosin from the skeletal muscle of a pig with
Becker muscular dystrophy. Severe fat infiltrationand varied diameters and rounded shapes of theremaining muscular fibers.

307

Fig. 2 Microscopic findings after staining with hematoxylin

and eosin from skeletal muscle of a pig with Becker
muscular dystrophy. Hyalinized fibers, accumulationof macrophages, internal disposition of nuclei, andfiber splitting.

Fig. 3 Immunohistochemistry for dystrophin. Staining is

Fig. 4 Immunohistochemistry for dystrophin. Staining is

骨格筋では一部で発現の減弱が認められた。

免疫染色：抗ジストロフィン抗体による免疫染色

intense and continuous in healthy pigs.

3 . 1 . 3 病変が主に僧帽筋・広背筋に出現する
タイプ（ｎ＝２）

focal and severely weak in the Becker muscular
dystrophy case.

では，一部の筋線維が弱いジストロフィンの発現を示した。

と畜場で変性性筋病変として摘発された豚のう3 . 1 . 4 病変が主に心筋に出現するタイプ（同

ち２頭がこのタイプに属した。

一家系）

肉眼所見：僧帽筋に高度な脂肪浸潤がみられ，広麻布大学で飼育され，心不全で死亡した母豚と背筋の一部にも浸潤が観察された。一方，最長筋

その雄子豚で観察された。

には病変がみられなかった。

母豚の肉眼所見：心内膜に多数の出血を認めた。

組織所見：薄筋タイプと同様に，病変部に脂肪浸

母豚の組織所見：心筋線維の萎縮と変性がみら

潤と筋線維の変性壊死が認められた。

れ，右心室で高度であった。また，薄筋でも筋線© The Ito Foundation

308

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

維の変性や再生性変化が観察された。

において，アミノ酸置換を伴う点変異を確認し母豚の免疫染色：抗ジストロフィン抗体を用いたた。１頭目は，exon20において827番目のアミノ免疫染色では，心筋における顕著なジストロフィ

酸がアルギニンからスレオニンに，834番目のアン発現の低減を認めた。

ミノ酸がグルタミンからヒスチジンに変化する一子豚の所見：麻酔後に異常を示した雄子豚では，塩基置換が検出された。２頭目ではexon22にお心筋線維の萎縮および薄筋の変性，壊死，再生所

いて939番目のアミノ酸がアルギニンからヒスチ見を認めた。また，心筋および骨格筋のジストロジンに変化する一塩基置換が検出された。病変がフィン発現の低減を認めた。

主に舌に出現するタイプでは，exon26，27間に以上より，検査したすべての豚は，骨格筋にお62塩基の挿入が確認された（Fig.５）。病変が主ける変性，壊死，再生所見と免疫染色におけるジに僧帽筋・広背筋に出現するタイプでは，２頭とストロフィンの低減の所見からジストロフィン異もに正常なジストロフィン遺伝子配列に加え，常症と診断した。筋病変の発現分布は，大きく４

exon21～28領域に1041塩基の欠損を持つジスト

つのタイプに分類されることが示された。

ロフィン遺伝子が検出された（Fig.６）。

3.2

ジストロフィン遺伝子の変異解析

以上より，複数のジストロフィン遺伝子の変異病変が主に薄筋・腹直筋に出現するタイプの６が豚のジストロフィン異常症には含まれることが頭，病変が主に舌に出現するタイプ１頭，病変が示された。過去，豚ではexon41の１アミノ酸置

主に僧帽筋・広背筋に出現するタイプ２頭の計９換によるジストロフィン異常症が１例報告されて頭を解析した。

いる４）。豚ではさまざまなジストロフィン遺伝子

薄筋・腹直筋に出現するタイプ６頭のうち２頭変異が淘汰されることなく存在し，食肉検査時にExon26 Exon27
Case_sequence1
Exon26

Insertion (62bp)

Exon27

Case_sequence2
Fig. 5 Sequencing of the reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）of the dystrophin

gene. A 62 base pair insertion between exons 26 and 27 was detected.

2955

4015

NM_001012408.1
Control
Case 1Case 22965

4007

Fig. 6 Sequencing of the RT-PCR of the dystrophin gene. A 1,041 base pair deletion from 2,966 to 4,006

of dystrophin gene was detected.

© The Ito Foundation

豚の筋ジストロフィーの病態解明と生前検査法の開発

変性性筋病変として摘発されることが示唆された。
3.3

309

に共通して筋への脂肪浸潤，筋線維の変性・壊死，再生性変化が観察された。免疫染色では，ジ生前検査法の検討

心不全で死亡した母豚から確立した家系は，ジストロフィンを発現する筋線維が正常筋肉と比較

ストロフィン遺伝子変異の保因家系であることがして著しく減少または発現強度が減弱していた。

明らかになった。そこで保因母豚から生まれた雄遺伝子解析を実施した症例のうち，２症例では症

子豚６頭について，薄筋の筋生検を実施したとこ

例ごとに異なる部位でアミノ酸置換を伴う点変

ろ，３頭において病理組織学的に筋線維の変性，

異，１症例では62塩基の挿入，２症例では同一部

壊死を認め，免疫染色ではジストロフィン発現の位で1041塩基の欠損を確認した。ジストロフィン

低減を認めた。残り３頭は，病理組織学的および遺伝子変異を持つ母豚の雄産子６頭で筋生検を

免疫組織学的に著変を認めなかった。以上，筋生行ったところ，３頭で筋線維の変性・壊死および検を実施することにより，生後70日齢の時点で保ジストロフィンの発現低減を認め，生前に変異保因豚を検出することが可能であった。筋生検は，因豚が特定された。豚のジストロフィン異常症

種豚の選抜などでジストロフィン遺伝子の変異のは，病変発現部位が異なるさまざまなタイプがあ有無を検査する方法として有用であると考えられり，それぞれに異なる変異が認められた。豚のジるが，今後より侵襲性の少ない検査法を検討してストロフィン異常症は，と畜まで運動障害を認めいくことが汎用性の高い生前検査法としての課題

ないために摘発されることなく潜在的に広く存在と考えられる。

している可能性が示唆された。筋生検を実施する

４．要ことで，筋肉の変性，壊死病変，およびジストロ

約フィンの発現低減の所見により，生前に変異保因健康豚としてと畜場に搬入された豚において，食肉検査時に脂肪浸潤と褪色を特徴とする筋病変豚を検出することが可能であり，この方法は種豚の選抜などに活用できる可能性がある。

が発見され，このような筋病変の中にジストロフィンの発現異常によるベッカー型筋ジストロ
フィー様筋症が存在することが明らかになった。
本研究では，ジストロフィン異常症を疑う豚の筋病変を全国から収集し，その病理学および遺伝子学的性状を解析するとともに，生前検査法を検討した。その結果，筋病変の発現部位はさまざまで，
と畜場では病変が主に薄筋にみられるもの，病変が舌に限局するもの，僧帽筋にみられるものが摘文献１） Horiuchi, N., Aihara, N., Mizutani, H., Kousaka, S.,
Nagafuchi, T., Ochiai, M., Ochiai, K., Kobayashi, Y.,
Furuoka, H., Asai, T., Oishi, K.：J. Vet. Med. Sci., 76,
243～248, 2014.
２）（3）, 671～688, 2014.
 Flanigan, K. M.：Neurol Clin, 32
 Cooper, B. J., Valentine, B. A.：Pathology of３）
Domestic Animals, 6th ed, 164～249, Elsevier,
Missouri, 2015.
４） Nonneman, D. J., Brown-Brandl, T., Jones, S. A.,
Wiedmann, R. T., Rohrer, G. A.：BMC Genomics,
13, 233, 2012.

発され，心不全死亡豚では病変が心筋に高度に，骨格筋で軽度にみられた。組織学的には，全症例© The Ito Foundation

310

リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法とナノポア
シークエンス技術を用いた超迅速なウイルス塩基配列解読法の開発Development of a rapid diagnostic system for detection and sequencing ofviral nucleic acid using recombinase polymerase amplification andnanopore sequencing technology

堀

江

真

行１，２，３・安藤清彦４（１京都大学白眉センター，２京都大学ウイルス・再生医科学研究所，３大阪府立大学大学院生命環境科学研究科獣医学専攻，
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

４

Masayuki Horie１，２，３ and Kiyohiko Andoh４（１Hakubi Center for Advanced Research, ２Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, ３Division of
Veterinary Science, Graduate School of Life and Environmental Sciences, Osaka, ４National Institute of Animal Health, NARO）

Diagnosis of viral infections in livestock is essential for the control of infectious diseases.
Various methods were used to diagnose viral infections, and one of the most frequently usedmethods is nucleic acid detection, such as PCR and LAMP. These nucleic acid detection
methods are relatively sensitive and easy to perform, and their product can be subjected tosequencing, which can be helpful in epidemiology. However, these nucleic acid detection
methods are time-consuming, high cost, and/or complex to analyse the data. In this study, we
integrated the rapid isothermal nucleic acid amplification method, recombinase polymerase
amplification (RPA), and the Nanopore sequencing technology to develop a viral diagnostic
method that overcomes the above shortcomings. Using bovine RS virus as a model, we
succeeded in developing a method that can complete the process from nucleic acid extraction
to sequencing analysis within four hours. The method developed in this study is useful for the
diagnosis of viral infections, and further investigations would lead to a more rapid, simple, androbust method for the diagnosis of viral infections．

１．目

増幅産物の塩基配列を解析することによって疫学的的対策へと役立てることができ，感染症の制御に

家畜のウイルス感染症の診断は感染症の制御に非常に効果の高い診断法である。

必須である。ウイルス感染症の診断にはさまざま

現在使用されている主なウイルス核酸検出法

な 手 法 が 用 い ら れ る 。ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応

は，PCR法あるいは逆転写PCR（RT-PCR）法で（polymerase chain reacgion：PCR）を代表とすある。PCRは比較的感度が高く，増幅産物の塩基るウイルス核酸検出法は，比較的簡易かつ高感度配列の解析も容易であるため，幅広いウイルス感にウイルス核酸を検出できる。さらには得られた染症の診断に用いられている。しかし，PCR反応© The Ito Foundation

リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法とナノポアシークエンス技術を用いた超迅速なウイルス塩基配列解読法の開発

311には「変性，アニーリング，伸長」の３段階の厳

ガーシークエンス法が用いられている。サンガー

密な温度管理が必要であり，サーマルサイクラー

シークエンス法は十分な実績のある信頼性の高いのような比較的高価な機器が必要である。また，手法であるものの，シークエンスの準備に時間が検出にかかる時間も比較的長いという欠点がある。

かかるうえ，シークエンスには非常に高価な機械

上記の欠点を克服した核酸検出法として，を必要とする。近年は比較的安価でかつ迅速な受Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）

託解析が増えているものの，結果を得るまでは数法が知られている １）。LAMP法は４つのプライ日を要する。

マーと鎖置換型ポリメラーゼによって，標的核酸

ナノポアシークエンスはタンパク質であるナノの増幅を行う。鎖置換型ポリメラーゼを用いるた

ポアを用いたシークエンス技術である。代表的なめ，一定の温度（約65度）で伸長反応を行うこと製品であるMinIONは小型（長さ105mm，厚みが可能な等温増幅法であり，PCRのような高価な

23mm，幅33mm）であり，ノートPCにUSB接続

機械を必要としない。さらに，反応時間も約１時してシークエンスが可能な革新的デバイスであ間程度と平均的なPCR法と比べて短いという利点る。近年はFrongleという安価なフローセル（約も有する。しかし，LAMP法によって増幅された

10,000円程度）も開発されている。シークエンス

DNAはPCR産物のように単純ではなく，その後も高速で，増幅産物の場合は数分で解析に十分なの塩基配列解析を行うには複雑な処理が必要とな数のリードが得られることも報告されており５），る。

PCR産物やLAMP産物の迅速な塩基配列の解読

リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（Reconbinaseに応用されてきた。これらのことから，RPA法

polymerase amplification：RPA）法 は ，上 記 のによって核酸増幅を行い，その増幅産物をナノポ

核酸検出法の種々の問題点を改良した手法であアシークエンスに供することによって，きわめてる

迅速なウイルス感染症の診断法へと応用可能であ。RPA法はPCR法のように２つのプライ

２～４）マーを用いる核酸増幅法である。RPA法では大ることが考えられる。

腸菌由来リコンビナーゼおよび一本鎖DNA結合本研究では，RNAウイルスであるウシRSウイ

タンパク質によって二本鎖DNAの解離と一本鎖ルス（BRSV）をモデルとして，上記のRPA法とDNAの安定化を行うため，PCRのような熱変性

ナノポアシークエンスを組み合わせ，ウイルス感

ステップを必要としない。そのため等温増幅が可染症の検出から塩基配列の解読までを含む，超迅能である。さらに，RPA法はLAMP法と比較し速診断法の開発を目的として行った。

て低温（37―42度）で反応が可能であり，反応時間も20分以内ときわめて短い。また，得られる増２．方

法

幅産物はPCR産物と同様に，電気泳動による増幅

2.1

産物の確認や，塩基配列の解析に容易に用いるこBRSVの研究室株であるNMK株をVero細胞でとができる。このようにRPA法は迅速かつ簡便培 養 し た 。培 養 上 清 か ら ，Viral RNA mini kit

なウイルス核酸検出法として有用であると考えら（QIAGEN）を用いてRNAを抽出した。牛パライ

れ，実際にいくつかのウイルス感染症の診断法のンフルエンザウイルス３型の研究室株であるBN-開発も行われている４）。

１株をMDBK細胞で培養し，同様に培養上清か現在，PCR産物の塩基配列解析には主にサン

核酸抽出

らRNAを抽出した。

© The Ito Foundation

312

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

臨床検体については，家畜保健衛生所から送付されたスワブ液（ｎ＝32）からViral RNA mini
kitを用いてRNAを抽出した。
2.2

行った。
得られたfastqファイルからSeqkit７）を用いて，得られたリードの１％を抽出し，さらに280-380

Nested RT-PCRによるウイルス核酸検

出

塩基長のリードを抽出した。MAFFT８）を用いて多重配列アライメントを行い，得られたアライメ

８μｌの抽出RNAとReverTra Ace qPCR RTⓇ

ントのコンセンサス配列を配列解析に用いた。

Master Mix（TOYOBO）あるいはSuperScript Ⓡ

得られたコンセンサス配列を用いて，BLASTn

IV Reverse Transcriptase （Thermo Fisher（megablast, ntデータベース，webインターフェー

Scientific）を用いて，説明書の通りに逆転写反ス）解析を行った。BLASTn解析ではデフォルト応を行った。得られたcDNAとTks Gflexのパラメーターを用いた。

TM

DNA

Polymerase（TaKaRa）を 用 い て nested PCR 反応を行った。プライマーはValarcherらによって３．結果と考察設計されたもの６）を用いた。得られたPCR産物を

3.1

BRSV標準株を用いたRT-RPA法の確立

アガロースゲル電気泳動によって解析した。

RPA 法 で は PCR 法 と 比 べ て 長 い プ ラ イ マ ー

2 . 3 ２-step RT-RPAによるウイルス核酸増幅（30塩基程度）が必要となる。はじめにプライ

逆転写反応は上記のNested RT-PCRの項と同様

マーを設計するため，既知のBRSVの配列の多重に行った。RPA法はTwistAmp Basic（TwistDx）

配列アライメントを行った。本研究ではBRSVのを用いて説明書の通りに行った。39度４分の反応

RT-PCR診断に用いられる領域を参考にして，Ｇ

後に10回の転倒混和を行い，さらに39度で16分の遺伝子にプライマーを設計した。なお，すべての反応を行った。得られたRPA産物をアガロース

既知のBRSV配列に100％一致するプライマーの

ゲル電気泳動によって解析した。

設計は困難であったため，縮重プライマーの設計Ⓡ

2 . 4 １-step RT-RPAによるウイルス核酸増幅
TwistAmpⓇ Basic, SuperScriptⓇ IV Reverseも行った（Table１）。
Vero細胞によってBRSV NMK株から抽出した

Recombinant

RNAと上記のプライマーを用いて，２-step（RTRibonuclease Inhibitor （Thermo Fisher

反応とRPA反応を別々に行う）RT-RPA法を行っ

Scientific）を用いてRT-RPA法を行った。42度た。その結果，どちらのプライマーセットにおい５分の反応後に10回の転倒混和を行い，さらに42てもBRSV由来のRNAサンプルでのみ，特異的な度15分の反応を行った。得られたRPA産物をア

増幅産物が得られた（Fig.１）。この結果から，ガロースゲル電気泳動によって解析した。

設計したプライマーを用いたRT-RPA法はBRSVTranscriptase, RNaseOUT

2.5

TM

の検出に使用可能であることが示された。

ナノポアシークエンスと配列解析

innuPREP PCRpure Kit（Analytik Jena）を用いて得られたRPA産物の精製を行った。精製し3 . 2 ２-step RT-RPA法による臨床検体からのBRSV核酸の検出

た RPA 産 物 と Ligation Sequencing Kit（Oxford

確立した２-step RPA法によって，臨床検体由Nanopore）を用いてシークエンスライブラリを来のRNAからBRSVの核酸の検出を試みた。既知作成した。その後，Frongleフローセル（Oxfordの診断法との比較のため，標準診断法の１つであNanopore）を 用 い て ナ ノ ポ ア シ ー ク エ ン ス をるNested RT-PCRも行った。呼吸器病の牛から© The Ito Foundation

リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法とナノポアシークエンス技術を用いた超迅速なウイルス塩基配列解読法の開発

313

Table 1 Primers used in this study.
Name

Sequence (5ʼ - 3ʼ)BRSV.RPA.F1

AACACAACAGCCCCAAAACCATACCTCACC

BRSV.RPA.R1

AGAGTGATAAGCAAGCAAGATTACCTTCACBRSV.RPA.F2

AACACAACAGCCCCAAAACCWTACCTCACC

BRSV.RPA.R2

AGAGTGATAAGCADGCAAGATTACCTTCAC

BPIV3

F2-R2
BRSV

BPIV3

M

BRSV

F1-R1

M

1000

1000

500

500

100

100

(bp)

(bp)

Fig. 1 Development of a two-step RT-RPA for detectionof BRSV
Two primer pairs (sequences are available in Table 1)
were tested for a two-step RT-RPA. RNAs extracted
from the lab strains of the indicated viruses were used.
RT-RPA products were analyzed by agarose gelelectrophoresis. The arrow indicates the expected size of
RPA amplicon. M，100-bp ladder marker；BRSV, bovine
respiratory syncytial virus；BPIV3, bovine parainfluenza
virus 3．

Fig. 2 Representative results of two-step RT-RPA for

detection of BRSVA two-step RT-RPA was performed using RNAs

extracted from clinical samples. RT-RPA products wereanalyzed by agarose gel electrophoresis. The arrow
indicates the expected size of RPA amplicon. M ，100-bp
ladder marker．

採材した32検体中，RT-RPA法では４検体が陽次に臨床検体由来のRNAを用いて，１-step

性 で あ っ た（代 表 例 を Fig. ２ に 示 す）
。一 方 ，

RT-RPA法を検討した。多くの検体ではスメア

nested RT-PCR法では５検体が陽性であった。

が目立ち，判定が困難であった。一方で，一部のこ れ ら の こ と か ら ，本 研 究 に よ っ て 確 立 し た

検体では陽性と判定できる増幅産物も得られた

２-step RT-RPA法は従来のnested RT-PCR法と（代表例をFig.３に示す）。

比較してわずかに感度が劣ると考えられた。

これらの結果から，本研究において作成した

3 . 3 １-step RT-RPA法によるBRSV核酸検出

１-step RPA法はBRSVの核酸検出が可能である

RT反応とRPA反応を１つのチューブで同時にものの，今後は詳細な条件検討を行う必要がある

行う１-step RT-RPA法の確立を試みた。はじめと考えられた。

に ，細 胞 上 清 よ り 抽 出 し た BRSV NMK 株 由 来

3.4

RNAを用いて検討を行った。その結果，特異的

最後に，２-step RPA法によって得られた増幅な増幅産物が得られ（代表例をFig.３に示す），産物について，ナノポアシークエンスによる塩基

１-stepでもRPA法が機能することが示された。

配列の解析を行った。本研究では２つの増幅産物© The Ito Foundation

ナノポアシークエンスによる配列解析

314

令和２年度

M

Water

b
NMK

a

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

M

Fig. 3 Development of a one-step RPA for detection of BRSVA one-step RPA was performed using RNAs extracted from (a) the strain NMK or (b)clinical samples. M, 100-bp ladder marker. (a) This figure was extracted from a picture.
(b) Representative picture is shown．

について解析を行ったが，ここでは１例の結果の１-step RT-RPA法ではスメアが目立った。これみを示す。

らのことから，より多くのプライマーを設計し，約２日のシークエンスによって，約125,000リー

改良する必要がある。しかし，公共データベース

ドが得られた。これらのリードの一部（1120リーにおけるBRSVの配列の登録数はきわめて少なド）からコンセンサス配列を作成し，BLAST検く，他の部位にプライマーを設計するのは困難で索を行った。得られたコンセンサス配列は，2019あった。例えば，NCBI GenBankに登録されてい年に日本の牛から検出されたBRSVの塩基配列

るウイルスゲノムの全長配列は海外から登録され（アクセッション番号：LC549485.1）と99.2％一た４エントリのみである。また，日本のBRSVは致であり，正しくシークエンスができていると考独自の進化をしていることも報告されており９），えられた。今後はサンガーシークエンスを行い，上記の４つの全長配列をもとに設計したプライ

ナノポアシークエンスによって得られた配列の正マーが，国内の流行株でワークしないということ

確性を検討する必要がある。

も十分に考えられる。今後，日本国内においても本研究では２日間にわたるシークエンスを行っ

定期的にBRSVの全ゲノム配列の解読を進めていたが，得られたリードの約１％（1120リード）のくことによって，より良い診断法の開発へとつなみを解析に用いた。今回のシークエンスでは，がるであろう。

シークエンスの開始から少なくとも１時間以内に本研究ではすべてが開発段階であるため，

1200以上のリードが得られており，今後はシークRNA抽出や増幅産物の精製，ライブラリの作成

エンス時間についても大幅な短縮が可能であるとにはごく一般的な試薬を用いた。驚くことに，こ考えられる。これらも含め，今後より詳細に検討のような一般的な試薬を用いた方法であっても，する必要がある。

全行程を４時間以内（RNA抽出に約30分，逆転

3 . 5 本研究によって浮かび上がった課題，今写に約30分，RPA法に約30分，RPA産物の精製に10分，ライブラリ作成に１時間，シークエンス

後の展望
本研究で確立したRT-RPA法は，従来のnestedに１時間）に終えることができる。現在，これら

RT-PCRと比べて感度がやや劣っていた。また，のすべての過程において，より迅速なキット・試© The Ito Foundation

リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法とナノポアシークエンス技術を用いた超迅速なウイルス塩基配列解読法の開発

315

薬も販売されている。例えば本研究ではライブラ対策に有用であり，今後のさらなる検討によっ

リ の 作 成 に お い て 約 １ 時 間 を 要 す る Ligationて，より迅速・簡便かつ頑強なウイルス感染症のSequencing Kitを使用したが，Oxford Nanopore

診断法となる可能性を秘めている。

社からは約10分でライブラリを作成可能なRapid
sequencing kitも販売されている。今後，上記の１-step化およびより迅速な試薬等の使用によって，さらに時間を短縮し，迅速・簡便かつ頑強なウイルス検出法へとつながるであろう。
４．要約

家畜のウイルス感染症の診断は感染症の制御に必須である。診断方法にはさまざまなものが存在
し，頻繁に用いられる手法としてPCRやLAMPのようなウイルスの核酸検出法があげられる。これ
らの核酸検出法は比較的感度が高く，比較的容易
であり，またその塩基配列を解読することによって疫学的対策へと役立てることができる。しかし，これまでに使用されている核酸検出法は時間，コスト，解析の複雑さなどの面で欠点があった。本研究では，迅速な等温核酸増幅法であるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（RPA法）と，
迅速かつ簡便なナノポアシークエンス技術を統合し，上記の欠点を克服した迅速・簡便なウイルス診断法の開発を行った。ウシRSウイルスをモデ
ルとし，種々の検討を行った結果，核酸の抽出か
らシークエンス解析までをおよそ４時間で終える
ことのできる手法の開発に成功した。本研究によって開発した手法は，今後のウイルス感染症の文
献１）
 Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H.：
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)：
principle, features, and future prospects,
J Microbiol，53，1～5，2015．
２）
 Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L.,
Armes, N. A.：DNA detection using recombination
proteins, PLoS Biol, 4, e204，2006．
３）
 Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron,M. G.：Recombinase Polymerase Amplification for
Diagnostic Applications, Clin Chem，62，947～958，
2016．
４）
 Li, J., Macdonald, J., von Stetten, F.：Review：acomprehensive summary of a decade developmentof the recombinase polymerase amplification,
Analyst，144，31～67，2018．
５）
 Kai, S., Matsuo, Y., Nakagawa, S., Kryukov, K.,
Matsukawa, S., Tanaka, H., Iwai, T., Imanishi, T.,
Hirota, K.：Rapid bacterial identification by direct
PCR amplification of 16S rRNA genes using the
MinION nanopore sequencer, FEBS Open Bio，9，548～557，2019．
６）
 Valarcher, J. F., Schelcher, F., Bourhy, H.：
Evolution of bovine respiratory syncytial virus,
J Virol，74，10714～10728，2000．
７）
 Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F.：SeqKit：A CrossPlatform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File
Manipulation, PLoS One, 11, e0163962，2016．
８）
 Katoh, K., Standley, D. M.：MAFFT multiple
sequence alignment software version 7：
improvements in performance and usability, Mol
Biol Evol，30，772～780，2013．
９）
 Kumagai, A., Kawauchi, K., Andoh, K., Hatama,
S.：Sequence and unique phylogeny of G genes ofbovine respiratory syncytial viruses circulating inJapan, J Vet Diagn Invest，33，162～166，2021．

© The Ito Foundation

316

牛白血病ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する
宿主タンパク質の同定
Identification of host-derived proteins interacting with BLV non-coding RNA

安

藤

清

彦

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

Kiyohiko Andoh（National Institute of Animal Health, NARO）

Bovine leukemia virus（BLV）infects bovine B-cells and causes a malignant lymphoma,
resulting in severe economic losses in livestock industry. Although a number of studies havebeen intended to clarify molecular mechanisms of BLV pathogenesis, the detail of themechanism is still enigmatic. Currently, viral non-coding RNAs are attracting attention as anovel player for BLV pathogenesis because these transcripts can evade from host immune
response and persistently express in latently infected cells. BLV genome encodes novel longnon-coding RNA, AS1, in its antisense strand, and the AS1 consists of two isoforms, AS1-L and
AS1-S. Previous reports showed that the AS1-S RNA was persistently expressed in both
lymphoma cell and persistently infected cell line, suggesting that AS1-S RNA might play animportant role in BLV life cycle. In the present study, we intended to identify host-derived
proteins which bind to AS1-S RNA for clarifying molecular functions of AS1-S. Combination of
RNA-protein pull-down assay and LC-MS/MS technique revealed that host derived protein X
specifically bound to AS1-S RNA. Protein X is an RNA-binding protein and is also involved inmRNA processing and innate immunity. MDBK cells expressing AS1-S RNA decreased
expression of interferon-stimulated genes, OAS1, ISG15 and Mx1, compared with mock cells in
the presence of poly（I：C）,suggesting that AS1-S RNA may modulate innate immune system
by interacting with protein X. These findings might contribute to understand the molecularmechanism of BLV lifecycle.

１．目

引き起こす。BLVに感染した個体は生涯ウイル的スを保持するが，すべての感染個体がリンパ腫を本研究は，牛白血病ウイルス（BLV）がコー発症するわけではなく，大半は無症状でありリンドする非翻訳性RNA AS１-Ｓと結合する宿主タパ腫を発症するのはわずか数％のみであることな

ンパク質を同定することを目的としている。

ど，BLVの病態進行やリンパ腫発症機構にはい

BLVはレトロウイルスに属する腫瘍ウイルス

まだ不明な点が多い。日本においては，2011年のであり，牛のＢ細胞に感染した後，長い潜伏期を

全国調査で約35％の牛がBLVに感染していると経て致死性のリンパ腫である牛伝染性リンパ腫を報告されており，2019年度には牛伝染性リンパ腫© The Ito Foundation

牛白血病ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する宿主タンパク質の同定

317の届出件数が4,000件を超えるなど，その発生は出し，RNA合成用プラスミドpSPT19に挿入した

年々増加している（pSPT19/AS1-S）。

。リンパ腫を発症した牛は１，２）

廃棄対象となり畜産業に大きな経済的被害を引き

2 . 2 AS1-S RNAの合成とビオチンラベル付加起こすため，BLV対策は臨床現場において重要

RiboMAX Large Scale RNA Production

な課題となっている。しかしながら，いまだ有効

Systems（Promega）を用いて，pSPT19/AS１-

なワクチンや治療薬の実用化には至っていないた

ＳのＴ７およびSP６プロモーターからAS1-S RNA

め，現在の対策は一般的な衛生対策など限定的なおよびその相補RNAをそれぞれ合成した。合成しものにとどまっている。

た RNA 断 片 に Pierce RNA 3ʼ End Biotinylation

BLVは，そのゲノム中にタンパク質に翻訳されない非翻訳性RNAをコードしていることが知Kit（Thermo Fisher）を用いてビオチンラベルを付与したものをRNAプローブとした。

られているが，その機能はいまだ解明されていな

2.3

い。この非翻訳性RNAの一つであるAS１-Ｓは，BLV 持 続 感 染 牛 Ｂ 細 胞 株 で あ る BL3.1 細 胞

潜伏感染状態である腫瘍細胞やBLVが持続感染（ATCC CRL-2306）をRIPAバッファー（Thermo

している細胞株でも恒常的に発現しているため，

Fisher）で処理して調製した細胞抽出液をRNAプ

BLV感染において重要な役割を果たすことが示ローブと混合し，Pierce Magnetic RNA-Protein

唆される。一般的に，非翻訳性RNAは宿主タ

Pull-Down Kit（Thermo Fisher）を用いてRNA

ンパク質と複合体を形成することでさまざまな遺プローブと結合する宿主タンパク質をpull-down

伝子の発現を制御するため，その機能解明には結した。

合パートナーとなる宿主タンパク質の同定が必要

2.4

不可欠である。AS１-S RNAと結合する宿主タ2 . 3で調整したサンプルに４×Laemmli Sample

ンパク質の同定は，BLVの病態進行や発症メカ

Buffer（Bio-Rad）を加えて95℃で５分間熱変性

ニズムの解明に大きく貢献することが期待される。

させ，SDS-PAGEで分離後，銀染色MSキット

２．方

３，
４）

RNA-protein pull-down assay

nanoLC-MS/MSによるタンパク質同定（Wako）で染色した。銀染色したゲルからAS1-S

法

RNAプローブと特異的に結合したタンパク質バ

2 . 1 AS１-S cDNAのクローニングと発現プラス

ンドを切り出し，nanoLC-MS/MSによりタンパ
ク質を同定した。

ミド構築
BLV感染性クローン（pFLK-BLV）を導入し2.5

ウェスタンブロット解析

た293Ｔ細胞から抽出したRNAをテンプレートとSDS-PAGEで分離したサンプルをPVDF膜にし て ， PrimeScrip One Step RT-PCR Kit Ver.2

転写し，５％スキムミルクでブロッキング後，抗（TaKaRa）を用いてAS 1-S RNAのcDNAを増幅

protein Xウサギ抗体または抗beta-tubulin抗体

し た 。増 幅 し た 遺 伝 子 断 片 を QIAquick PCR（Merck）で室温１時間感作した。その後，HRP

Purification Kit（QIAGEN）により精製し，In-

標識抗ウサギ抗体（Zymed）または抗マウス抗Fusion HD Cloning Kit（Clontech）を 用 い て 発体（abcam）で室温１時間感作し，SuperSignal

現 プ ラ ス ミ ド pCAG neo に ク ロ ー ニ ン グ し たWest Dura Extended Duration Substrate（pCAG/AS1-S）。さらに，pCAG/AS１-Ｓから（Thermo Fisher）でタンパク質を検出した。

制限酵素処理によってAS１-Ｓ遺伝子断片を切り© The Ito Foundation

318
2.6

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

AS１-Ｓ持続発現MDBK細胞の作出(a)

Nucleofector 2b（Lonza）を 用 い て pCAG/AS

SP6

T7

１-Ｓを牛腎由来細胞株であるMDBK細胞に導入

AS1‒S cDNA

し，Ｇ418（gibco）存在下で培養してAS１-Ｓ持
続発現細胞MDBK/AS１-Ｓを作出した。コント

pSPT19/AS1‒S

ロールとして，空プラスミドpCAG neoを導入し(b)bp

RNAおよびbeta-actin mRNAを検出した。
2 . 7 Poly（I：C）刺激下における自然免疫関

A（
SP
RN

nt
ro
l

RT-PCR Kit Ver.2（TaKaRa）を 用 い て AS1-S

Co

を テ ン プ レ ー ト と し て ，PrimeScrip One StepASの発現確認のため，培養細胞から抽出したRNA

1‒
S（
T7
）

6）

たMDBK/CAG細胞を作出した。導入した遺伝子

1,000‒連遺伝子の発現量の解析
500‒

MDBK/AS１-ＳおよびMDBK/CAG細胞を10μg/mlのpoly（I：C）（Invivogen）存在下で一晩培養し，RNAを抽出した。One Step PrimeScript
RT-PCR Kit （Perfect Real Time）（TaKaRa）

Fig. 1 （a）Schematic diagram of constructed plasmid.

AS1-S cDNA was flanked by T7 or SP6 promotersand transcribed from both strands. （b） Gelelectrophoresis of synthesized RNA．

を 用 い て 自 然 免 疫 関 連 遺 伝 子 で あ る OAS1 ，
ISG15およびMx1の発現量を測定し，GAPDHのおよび15-20kDa付近の２本のバンドを切り出し発現量で補正して比較した。

て nanoLC-MS/MS 解 析 に 供 試 し た 結 果 ，70
kDa付近のバンドがprotein Xとして同定された。

３．結果と考察15-20kDa付近のバンドについては，本解析では

3 . 1 AS1-S RNA プ ロ ー ブ の 調 製 と AS1-S

有意な結果を得ることができなかった。ウェスタ

RNAが結合する宿主タンパク質の同定

ン ブ ロ ッ ト に よ る 解 析 の 結 果 ，AS1-S RNA で

BLV感染性クローンを導入した細胞中のRNA

pull-downしたサンプルにのみprotein Xが検出さからAS1-S cDNA断片をクローニングし，Ｔ７

れ，protein XがAS1-S RNAと特異的に結合する

およびSP６ポリメラーゼを用いたin vitro合成とことが示された（Fig. 2b）。

ビオチンラベルによりRNAプローブを調製した

protein Xは核内に存在するRNA結合タンパク（Fig.１）。調製したRNAプローブをBL3 . 1細胞の質であり，mRNAのプロセッシングなどに関与

抽 出 液 と 混 合 し て pull-down し た 結 果 ，SDS-

するとともに，ウイルス感染時の自然免疫経路にPAGE／銀染色で70kDaおよび15-20kDa付近においても重要な役割を果たすことが報告されていAS１-Ｓ特異的に結合するタンパク質バンドが確る。そのため，AS1-S RNAはprotein Xと結合す認された（Fig. 2a）。興味深いことに，AS１-Ｓ

ることでその機能に干渉し，さまざまな遺伝子発の相補RNAをプローブとしたコントロールRNA

現を上流工程から制御している可能性が示唆されにも，30kDaおよび50kDa付近に特異的なバンドた。

が認められた。AS１-Ｓ特異的に結合した70kDa

なお，相補RNAサンプルに特異的に認められ© The Ito Foundation

319

牛白血病ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する宿主タンパク質の同定
(b)

100‒
75‒

6）
NA
（
SP

）

Co
nt
ro
lR

1‒
S（
T7

1

AS

M

kDa

BL
3.

ar
ke
r

lys
at
e

NA
（
SP

Co
nt
ro
lR

1‒
S（
T7
AS

M

kDa

ar
ke
r

）

6）

(a)

100‒
75‒

50‒

50‒

37‒

37‒

25‒
20‒

25‒
20‒

15‒

15‒
SDS‒PAGE

IB: proteinX

Fig. 2 SDS-PAGE or immunoblot analysis of precipitated samples. Precipitated samples were separated by SDS-PAGE,

followed by silver stain（a）or immunoblot analysis using anti-protein X antibody（b）. Arrows or arrow heads
indicate specific bands in AS1-S or control RNA, respectively.

たバンドについては，相補配列中に含まれるBLV

染細胞における自然免疫シグナルに干渉しているLTR由来配列が何らかの宿主由来プロモーター

可能性が示唆された。

タンパク質と結合したのではないかと考えられたが，今回は解析を実施しなかった。
3 . 2 AS1-S RNAを持続発現するMDBK細胞

４．要約

牛白血病ウイルス（BLV）は，牛のB細胞に感染して致死性のリンパ腫を引き起こし，畜産業の解析
AS1-S RNA を 持 続 発 現 す る MDBK 細 胞 のに大きな経済的被害を与える病原体である。BLV

protein X発現を解析した結果，ウェスタンブロッの病態メカニズムを解明するためにこれまでさま

ト解析ではMDBK/AS１-ＳおよびMDBK/CAG

ざまな研究が行われてきたが，その発症メカニズ細胞でprotein Xの発現量に差は認められなかっムの詳細はいまだ解明されていない。近年，BLVた（Fig.３）。Poly（I：C）刺激時の自然免疫遺が潜伏感染している細胞において宿主免疫に捕足伝子発現を比較すると，MDBK/AS１-Ｓ細胞はされずに恒常的に発現しているウイルス由来非翻対 照 細 胞 で あ る MDBK/CAG 細 胞 と 比 較 し て

訳性RNAが重要な病原性因子ではないかと注目

OAS1，ISG15およびMx1の発現量が低下していを集めている。BLVは，そのゲノムのantisenseた（Fig.４）。

鎖 に AS1-S お よ び AS1-L と い う 二 つ の ア イ ソ

Poly（I：C）刺激条件下でOAS1，ISG15およ

フォームからなる非翻訳性RNA AS1をコードしびMx1の発現量に有意な差が認められたことかており，AS1-S RNAはリンパ腫細胞とBLV持続ら，AS1-S RNAがprotein Xと結合することで感感染細胞株の両方において恒常的に発現している© The Ito Foundation

320

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

AS
K/

M
DB

M
DB

K/

CA

G

1‒

S

令和２年度

AS1‒S
beta‒actin
Protein X
beta‒tubulin

RT‒PCR

IB

Fig. 3 Confirmation of the expression of AS1-S RNA and protein X in established cells. Expression of AS1-S RNA and

Relative expression

control mRNA（beta-actin）were confirmed by RT-PCR, and expression of protein X and control protein（betatubulin）were detected by immunoblot analysis.
OAS1
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00

Poly（I:C）

＊

ISG15

2.00

Mx1

＊

0.30

1.50

＊

0.20

1.00

MDBK/CAGMDBK/AS1‒S

0.10

0.50
0.00

0.00

（－） （＋） Poly（I:C） （－） （＋） Poly（I:C） （－） （＋）

Fig. 4 Quantitative RT-PCR of interferon-stimulated genes in established cells. Expression of OAS1, ISG15 and Mx1 in

the presence or absence of poly（I：C）were normalized to the expression of GAPDH. t-test was used for thestatistical analysis（n＝3）.

ことが過去の報告により明らかとなっている。こするMDBK細胞は，対照細胞と比較してpoly（I；の事実は，AS1-S RNAがBLV感染細胞においてC）刺激条件下におけるインターフェロン誘導性

重要な役割を担っていることを示唆している。本遺伝子OAS1，ISG15およびMx1の発現が低下し研究において，我々はAS1-S RNAの機能の一端ていた。この結果は，AS1-S RNAがタンパク質を解明するためにAS1-S RNAと結合する宿主由

Xとの相互作用により自然免疫シグナルに干渉し来タンパク質の同定を試みた。その結果，RNA-ていることを示唆している。これらの発見はBLV

protein pull-down assay と LC-MS/MS 解 析 の 組の感染動態の理解に役立つものと思われる。

み 合 わ せ に よ り ，宿 主 タ ン パ ク 質 X が AS1-S
RNAと結合することを明らかにした。タンパク質 X は RNA 結 合 タ ン パ ク 質 の 一 種 で あ り ，mRNAのプロセッシングや自然免疫に関与することが報告されている。AS1-S RNAを持続発現文献１）
 Murakami, et al.：J. Vet. Med. Sci., 75, 1123～1126，
2013．
２） 農林水産省：監視伝染病発生年報
３） Durkin, et al.：Retrovirology, 13, 33, 2016．
４）
 Andoh, et al.：Arch. Virol., 165（12）, 2869～2876,
2020．

© The Ito Foundation

321

豚消化器病ウイルスの感染メカニズムを解明するための豚腸管オルガノイドを用いた画期的な
インビトロ実験感染系の開発
Development of a new in vitro experimental system using swine intestinalorganoid to clarify infection mechanism of porcine enteric viruses

鈴

木

亨

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

Tohru Suzuki（National Institute of Animal Health, NARO）

Diarrheas that caused by mainly swine enteric viruses, are one of major diseases in pigs,
resulting in severe economic losses. It is important for uncovering of their infection mechanisms
in order to control and treat enteric viruses in pigs. However, it is often difficult to cultivate
swine enteric viruses using a cell culture in laboratory. It is also difficult to conduct
experimental infections of swine enteric viruses using animals, because of animal welfare in
addition to huge costs, labors, and specific facility. Therefore, it is important to establish a newexperimental tool that can observe infectious dynamics of swine enteric viruses．
Intestinal organoid, mini organ that mimic in vivo intestine produced in three dimensions
in vitro have been recently constructed in mice, pigs, and humans. In addition, a previous study
reported that human norovirus which had yet been isolated for a long time using various cell
cultures could cultivate in human intestinal organoid. In this study, I attempted to validate
whether swine intestinal organoid that derived from a natural host is useful to cultivate
effectively swine enteric viruses. In experimental infection into swine intestinal organoids using
two major swine enteric viruses （porcine epidemic diarrhea virus and porcinedeltacoronavirus）, the analysis with quantitative real-time RT-PCR revealed that their virus
loads reached at peak（increase of over 10 ２ -10 ３ times from initial doses）on 24 hours after
infection, and then kept on the level. Moreover, the data showed that two swine enteric viruses
isolated from swine intestinal organoid had also their infectivity after passage. These findings
demonstrated that swine intestinal organoid would be a useful experimental tool to observe
infectious dynamics of swine enteric viruses．

１．目

大疾病に位置付けられ，我が国の下痢による被害

的額は年間100億円を上回ると試算されている。家家畜の下痢は，発育や体調管理の阻害要因であ畜に下痢を引き起こす大半の原因はウイルスであり，生産活動に影響を与えるため容易に看過する

り，ウイルスの制御法を確立するためにはその性ことはできない。下痢は肺炎とともに，家畜の２状や感染メカニズムを知ることが重要である。従© The Ito Foundation

322

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

来は実験室内で維持・管理できる単層の培養細胞を用いたインビトロ実験感染系あるいは家畜への感染実験を通じて，それらウイルスの性状解析や感染メカニズム解明が行われてきた。しかしながら，消化器病ウイルスは一般的に培養細胞で分離することが困難である。また仮に分離できたとしても，ウイルスが増殖する細胞は本来の自然宿主

Fig. 1 Photo of swine intestinal organoidに由来するものではなく，異種動物に由来するものが多いことから，細胞環境の相違に伴いウイルス（PEDV），豚デルタコロナウイルス（PDCoV）

スの性状や反応が変化するといった問題点を含んは通常それぞれVero細胞（アフリカミドリザル

でいる。一方，家畜を用いた感染実験は一度に多腎細胞），ST細胞（豚精巣細胞）で分離することくの動物を必要とすることやそれに伴う多大な費が可能である。しかしながら，それらウイルスの用と労力，特殊な施設や設備を必要とすることか分離を本来の自然宿主である豚の腸管由来細胞をら，豚や牛などの中・大型動物での実施は困難で用いて試みた報告はない。そこで，ウイルス分離ある。そのうえ，家畜に消化器病ウイルスを接種における豚腸管オルガイドの有用性について以下

しても感染が成立しないことや無症状のまま経過のように解析・検討した（Fig.１）。

するといったリスクを伴うなどの問題点を含んで2.1いる。さらに，社会環境の変化に伴い，動物福祉

豚 消 化 器 病 ウ イ ル ス と し て ，PEDV OKN/の観点から動物実験の削減が強く求められている

JPN/2014分離株（ウイルス力価10４TCID50/mL）

とともに，リスク管理の観点からも中・大型動物とPDCoV YMG/JPN/2014分離株（ウイルス力価を用いた感染実験の実施は今後ますます困難とな

10６TCID50/mL）を使用した。96ウエルプレートる。

に播種した豚小腸オルガノイドに対して上記２種ウイルスとインビトロ接種試験

本研究では，ヒトなどに比べて研究が遅れてい類のウイルス1/100希釈液をそれぞれ接種（37℃る豚消化器病ウイルスの感染メカニズムの研究をで１時間吸着）した後，経時的に次の６点（接種

飛躍的に進展させるため，本来の自然宿主である

後０時間，８時間，24時間，32時間，48時間，56

豚の腸管に由来する豚腸管オルガノイド

時間）で培養上清を回収した。

１，２）

に注

目し，それを用いた消化器病ウイルスのインビト

2.2

ロ実験感染系を開発することで豚の感染実験に代回 収 し た 培 養 上 清 の 一 部 か ら QIAamp Viral

わる画期的な研究ツールを開発することを目的と

RNA Mini Kit（キアゲン社，オランダ）を用いて，する。なお，腸管オルガノイドは腸管構造を疑似

プロトコールに従ってウイルスRNAを抽出した。

した３次元構造体であり，これまで分離がきわめ

それらRNAについて，PEDVあるいはPDCoV特て困難であったヒトノロウイルスの分離に初めて異的プライマーおよびプローブを用いたリアルタ

成功しているイムRT-PCR定量解析を実施し，ウイルスの増殖

２．方

。

３，
４）

ウイルスRNAの定量解析

性を観察・解析した。なお，リアルタイムRT-

法

PCRはQuantStudio Ⓡ ３リアルタイムPCRシステ

豚消化器病ウイルスである豚流行性下痢ウイル

ム（Thermo Fisher Scientific 社 ，ア メ リ カ）を© The Ito Foundation

豚消化器病ウイルスの感染メカニズムを解明するための豚腸管オルガノイドを用いた画期的なインビトロ実験感染系の開発

使用し，それぞれのウイルスに対するリアルタイ

３．結果と考察

ムRT-PCRの詳細はTable１にまとめた。
2.3

323

3.1

感染性の確認

ウイルスRNAの定量解析

経時的に回収した培養上清の残りを再度豚腸管

経時的に回収した培養上清より抽出したウイル

オルガノイドに接種して，分離ウイルスの感染性

スRNAを用いて，それぞれのウイルスについてを検証し，インビトロ実験感染系としての有用性

上記の方法に従ってリアルタイムRT-PCRによるを確認した。

定量解析を実施した。その結果，いずれのウイル
スも接種後24時間をピークとするウイルスの増殖（接種後０時間と比べ10２～10３ 倍以上）が認めら

Table 1 List of primers and probes used in quantitative real-time RT-PCR
Targetgene

Virus

Porcine epidemic
diarrhea virus（PEDV）

Reaction condition
Reagent：Luna Universal
Probe One-Step RT-qPCR kit（NEB）

Primers and probe sequence＊
Forward：5’-GAA TTCCCAAGGGCGAAAAT-3’

Ｎ

Reverse：5’-TTTTCGA-CAAATTCCGCATCT-3’
FAM-G TAGCAGCTTGCTTCGGACCCA-TAMRA

55℃ for 10 min and 95℃ for 1 min,followed by 45 cycles of 95℃ for 10 sec
and 60℃ 30 sec

Forward：5’-ATCGACCACATGGCTCCAA-3’
Porcinedeltacoronavirus（PDCoV）

Ｍ

Reverse：5’-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3’
FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-TAMRA

55℃ for 10 min and 95℃ for 1 min,followed by 45 cycles of 95℃ for 10 sec
and 60℃ 30 sec＊See refence５，
６）

1.00E+11
1.00E+10

Genomic copies/mL

1.00E+09
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03

0h

8h

24h

32h

48h

56h

PEDV

PDCoV

Post infection［hours］
Fig. 2 Growth curves of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） and porcinedeltacoronavirus（PDCoV）in swine intestinal organoid© The Ito Foundation

324

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

れ ，そ の 後 プ ラ ト ー に 達 す る こ と を 確 認 し た

した。豚腸管オルガノイドに２種類の豚消化器病（Fig.２）。このことは豚腸管オルガノイドが豚消ウイルス（豚流行性下痢ウイルスおよび豚デルタ化器病ウイルスの分離に適していることを示して

コロナウイルス）を感染させ，経時的にそれらのおり，今後それが豚消化器病ウイルスのインビト増殖性を定量リアルタイムRT-PCRで解析した結ロ実験感染系の有用なツールとなり得ることを示果，いずれのウイルスも豚腸管オルガノイドで効唆している。

率的に増殖することが明らかとなった。また，豚

3.2

感染性の確認

腸管オルガノイドで豚消化器病ウイルスを継代し回収した培養上清を再度豚腸管オルガノイドにた後もその感染性が維持されることを確認した。

接種し，その感染性を検証した結果，分離された

以上のことから，豚腸管オルガノイドは今後，豚ウイルスは感染性を維持していることを確認し消化器ウイルスの感染機構を解明するうえで有用た。このことは豚腸管オルガノイドが性質上，生なツールとなることが示された。

体に近い環境を有していることを示唆している。
４．要約

豚消化器病ウイルスによって引き起こされる下
痢は豚における重大疾病の１つであり，その経済的被害は甚大である。豚消化器病ウイルスの制御法および治療法を開発するためには，それらの感染機構を明らかにすることが重要である。しかしながら，豚消化器病ウイルスは単層の培養細胞での分離が難しく，また生体を用いた感染実験は労力や費用，施設の問題に加えて，動物福祉の観点から実施は困難である。そのため，豚消化器ウイルスの感染機構を解明するための新たな研究ツー
ルの開発は急務の課題である。
近年，生体の腸管構造を模倣した３次元構造体
である腸管オルガノイドがマウス，豚，ヒトでそれぞれ樹立された。また，この腸管オルガノイドを用いることで，これまでさまざまな培養細胞で分離が困難であったヒトノロウイルスが初めて分離された報告がある。本研究では，本来の自然宿
主に由来する豚腸管オルガノイドが豚消化器病ウ

文献１）
 Sasaki, N., Sato, T., Clevers, H.：Chapter
8-Intestinal Epithelial Lgr5＋ Stem Cell Niche andOrganoids, In：Biology and Engineering of Stem
Cell Niche（Academic Press）.pp.111-125，2017．
 Sugimoto, S., Sato, T.：Establishment of 3D２）
intestinal organoid cultures from intestinal stem
cells, Methods Mol Biol，1612，97～05，2017．
３）
 Ettayebi, K., Crawford, S. E., Murakami, K.,
Broughman, J. R., Karandikar, U., Tenge, V. R.,
Neill, F. H., Blutt, S. E., Zeng, X. L., Qu, L., Kou, B.,
Opekun, A. R., Burrin, D., Graham, D. Y., Ramani, S.,
Atmar, R. L., Estes, M. K.：Replication of humannoroviruses in stem cell-derived human enteroids,
Science，353，1387～1393，2016．
 Ramani, S., Crawford, S. E., Blutt, S. E., Estes, M.
４）K.：Human organoid cultures：transformative newtools for human virus studies, Curr Opin Virol，
29，79～86，2018．
 Suzuki, T., Shibahara, T., Yamamoto, T., Nakade,５）
K., Yamaguchi, R., Miyazaki, A., Ohashi, S.：Pig
epidemic diarrhoea virus S variant with a large
deletion non-lethal to colostrum-deprived newborn
piglets, J Gen Virol，97，1823～1828，2016．
 Suzuki, T., Shibahara, T., Imai, N., Yamamoto, T.,６）
O h a s h i , S . ：G e n e t i c c h a r a c t e r i z a t i o n a n dpathogenicity of Japanese porcine deltacoronavirus,
Infect Gent Evol，61，176～182，2018．

イルスの効率的な分離に有用であるか否かを検証© The Ito Foundation

325

アフリカ豚熱の侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅲ）
Epidemiological research on the risk assessment of introduction of Africanswine fever into Japan

杉

浦

勝

明・芳

賀

猛

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Katsuaki Sugiura and Takeshi Haga
（Laboratory of Global Animal Resource Science, Department of Global Agricultural Sciences,
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

A risk assessment was conducted to assess the risk of ASFV entry into Japan throughpork products illegally brought in by air passengers from China and fed to pigs in Japan.
Scenario tree modelling was used with the following entry and exposure pathway considered
to be the most likely route of ASF entry：an ASFV infected pork product is illegally brought
into Japan by air travellers from China；this pork product is then used in a restaurant where
scrap waste is recycled for animal feed and subsequently fed to pigs without being heattreated. Input parameter values were based on surveys conducted by the authors, scientific
data gathered from the literature and official data published by government agencies. The
annual probability of ASFV entry into Japan via this pathway was predicted to be 0.20（90％prediction interval：0.00-0.90）．The wide prediction interval was mainly caused by theuncertainty regarding the dose response relation of ASFV, followed by the probability of an
ASF infected pig dying on affected farms, the loading of ASFV in an infected pig and theprobability of an illegally imported pork product being heat-treated in China and used inrestaurants. The results of scenario analysis revealed that the annual probability of ASFV
entry into Japan will increase with an increase in the number of ASF affected farms in China.
The probability of ASFV entry will increase substantially even if only a small proportion of
Ecofeed is not heat-treated during the production process. The probability will decrease if anincreased proportion of farms that feed swill apply heat-treatment before feeding swill to theirpigs. These findings indicate that stringent application of heat-treatment of Ecofeed and swill
is key to protecting the Japanese pig industry from the introduction of ASFV．

１．目が高く，ダニや感染動物との直接的または間接的的接触により感染する。発症すると発熱や全身性のアフリカ豚熱（ASF；旧名称：アフリカ豚コ

チアノーゼを呈し致死率が高い。有効なワクチンレラ）は，ASFウイルスによって引き起こされや治療法は存在せず，国内で発生した場合には養る豚やイノシシの感染症である。きわめて伝播力

豚産業に甚大な被害をもたらすため，家畜伝染病© The Ito Foundation

326

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

予防法に基づき家畜伝染病に指定されている。

されていたが，2007年コーカサス諸国に侵入後，ASFウイルスは動物の感染症の原因となるウ

東欧諸国およびロシアに拡がっている。2018年中

イルスでは最も複雑な構造をしたウイルスの１つ国で初めて確認され，2019年にはアジア13か国にである。大型のDNAウイルスで，ゲノムサイズ

拡がり，日本への侵入リスクはかつてなく高まっ

は170～190キロバイトである。ウイルスの直径はている。

200nmで，100以上の構造タンパクを有する。さASFウイルスは，前述のとおり豚肉や豚肉製

まざまな遺伝子変異が認められており，現在22の品中に長期間生存することから，かつて豚肉製品

ジェノタイプが存在する。

の違法持ち込みにより侵入を許した事例が多数報

ASFウイルスが感染する宿主はさまざまであ

告されている（スペイン，キューバ，ブラジル，

り，複雑な関係にある。アフリカではイボイノシ

モーリシャス，ジョージアなど）。我々の先行研

シが感染するが，ウイルスの血中濃度はイボイノ究においても豚肉製品の違法輸入が侵入経路としシシの体内では高くなく，症状を表さない。血中て最も可能性が高いことが指摘され，中国からの濃度は１ml中に数百個程度であるが，ヒメダニ

航空旅客の2.8％が豚肉製品を違法に持ち込んでが吸血し感染するには十分な濃度で，ヒメダニがいることが確認されている４）。本研究では，中国感染すると体内でウイルスが増殖する。ヒメダニ

からの航空旅客によって不法に持ち込まれた豚肉がほかのイノシシや豚を吸血すると，イノシシや製品が加熱されずに残飯として日本の豚に給与さ豚は感染する。このようにして，アフリカではウれることが最も可能性の高いASFの侵入経路とイルスが長期間にわたり維持されている。ヨー

考え，この経路による侵入確率を定量的に予測しロッパではアフリカと少し異なる様相がみられた。

る。ウイルスは家畜の豚のほかにイノシシにも感染するが，アフリカと異なり，イノシシも豚と同２．材料と方法

様の臨床症状を示す。ヨーロッパにもヒメダニが2.1

生息しており，感染しASFウイルスを媒介する本研究で使われたリスク評価モデルの考え方はことが判明している。また，ヒメダニを介さずにFig.１のとおりである。最終的に加熱処理されず

ASFウイルスが広がることも知られている。

に残飯として豚に給与される感染豚肉製品重量

リスク評価モデル

ASFウイルスは加熱に弱く，70℃30分の加熱に，単位重量あたりのウイルス量（ウイルス濃により死滅するが，他の処理には抵抗性を示し，度）を乗じることで，国内の豚が摂取するウイル

豚肉や豚肉製品中には長期間生存する 。感染しス量（L_exposure）を計算し，この値とドーズレた豚の糞，尿，血液などにも長期間生存し，これスポンスの関係と給与される豚の頭数（ｎ）からにより汚染された衣服などは感染源となる。

ら，少なくとも一頭の豚が感染豚肉製品を含む残ASFに感染した豚の組織中のウイルス濃度は，飯を給与されて感染する確率（P_introduction）

ウイルスが赤血球に吸着していることもあり，きを予測した。

１）

わめて高いことが分かっている。このことも２，３）

ASFの伝搬力の強さに影響していると考えられる。

nP_introduction＝１-（1-P_infection）

ここでP_infectionは，感染豚肉製品を含む残飯を摂取した豚が感染する確率で，以下のドーズレ

ASFは2006年まで主にアフリカで発生が確認

スポンスの関係から推定した（cは係数）。

© The Ito Foundationアフリカ豚熱の侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅲ）

327

Infectious load of ASFV fed to pigs without being heat-treated (HAD50s)（L_exposure）
Amount of infected pork scraps
fed to pigs as swill without
being heat-treated (g）×（W_exposure）

Infectious load of infected pork
product (HAD50/g）（L_infected pork）

Dose-response relation

Probability of at least one pig getting infected（P_introduction）

Fig. 1 Model structure for assessing the probability of ASF introduction

P_infection＝１-exp（-c×L_exposure/n）

103.8～105.0HAD50 と 仮 定 し た（HAD50 は 50 ％ の中国から違法に輸入される感染豚肉製品のうち

確率で血球凝集を生じさせるウイルス濃度）。

最終的に加熱されずに残飯として豚に給与される

ASFVのドーズレスポンスの関係については，

感染豚肉製品の重量の推定にあたっては，感染豚

過去にさまざまな感染実験が実施されている。

から生産された豚肉を原料として製造された豚肉

1990年代には感染を起こすには105HAD50 のウイ製品が中国内で十分な加熱処理されておらず，まルス量が必要とされていたが，最近では液体で給た，日本国内に持ち込まれて外食産業で調理残差与すると100HAD50 で感染が成立したという研究として排出され，最終的に飼料として再利用され報告があり，これらの知見を反映させた確率分布

るケースを想定した（Fig.２）。

を用いた（Fig.４）。

2.2

入力変数の値

このリスク評価モデルの変数に入力するデータ輸入される感染豚肉重量の推定にあたっては，については，上述のとおり文献調査のほか，政府

昨年度の研究成果４）をもとに中国からの航空旅客公表統計資料に基づき推定した。エコフィードにの2.8％，すなわち，約18万人の中国人が豚肉製

ついてはベースラインモデルでは製造工程で品を違法に持ち込むと予測した。一人あたりの持100％加熱処理されると想定した。一部の変数にち込む重量は，動物検疫所の公表データから平均

ついては，データの不確実性を反映した確率変数

0.834kg，標準偏差1.139の対数正規分布（Fig.３）

を入力して，統計ソフト＠Risk（Palisade社）をに従うと仮定し，さらに別の先行研究 からこの用いて繰り返し計算することにより，確率論的なうち２kg以上の場合にはレストランで使われる評価を行った６）。

５）と仮定した。
感染豚肉製品の単位重量あたりのウイルス量に３．結果と考察

ついては，ASFVはさまざまな処理に対し抵抗性

中国から違法に輸入される豚肉製品が加熱されがあり，環境中にも長く生存することから，残飯ずに残飯として豚に給与されることで，ASFがとして給与される時点の豚肉製品中には感染豚の日本に侵入するリスクは20％と予測された（90％

筋肉中と同一の濃度でウイルスが存在すると仮定

予測区間：０～90％）。予測区間が広く不確実性

し，先行研究の結果から１mlまたは１ｇあたりが高いのは，主にASFウイルスのドーズレスポ© The Ito Foundation

328

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Amount of infected pork products illegally imported by air travelers from China（W_release）

Prob_restaurant×Ratio_restaurant
Amount of infected pork products for restaurant use
P_wasteAmount of infected pork scraps from restaurant
P_recycle
Amount of infected pork product scraps recycled
P_recycle for feed
Amount of infected pork scraps for feed use
P_recycle for Ecofeed
Amount of infected pork
scraps used for Ecofeed

1-P_recycle for Ecofeed

Amount of infected pork
products fed to pigs as swill

P_ecofeed heat-treatedP_swill heat-treated on farm

Amount of infected pork scraps
fed to pigs as swill without beingheat-treated (W_exposure）

No riskFig. 2 Model structure for estimating the amount of infected pork scraps fed to pigs as swill without

being heat-treated（W_exposure）

1.4
1.2

Frequency

1.0
0.8
0.6

Lognormal（0.83403,1.1391）

0.4
0.2
0.0

0

1

2

3

4

5

6

Weight of pork products（kg）
Fig. 3 Frequency distribution of the weight of pork products tested positive by theJapanese Animal Quarantine Service during the period from 1 October to 18
February 2020（columns）, fitted with a log-normal distribution（line）with a meanof 834g and a standard deviation of 1,139g．

ンス関係の不確実性，ASF発生農場における豚

加熱されている確率の不確実性に起因している。

の死亡率，感染豚の筋肉中でのASFウイルス量

また，シナリオアナリシスを行い，中国におけおよび違法に輸入された豚肉製品が中国で十分にるASF発生農家数，豚肉製品の違法持ち込み率，© The Ito Foundation

329

Probability of oral infection in pigs

アフリカ豚熱の侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅲ）
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
10^0

10^1

10^2

10^3

10^4

10^5

Dose（HAD50s）
Fig. 4 Dose response curves depicting the model P_infection＝1-exp（-c x dose

（HAD50s））, where c＝10^Uuniform（-4.155, -1.558）. This dose response model
assumes any doses between 25 HAD50s and 10^3 HAD50s as a median infectious
dose. 30 dose response curves randomly selected from the model are shown toprovide a visual image of the distribution．

エコフィードの十分な加熱処理の確率，養豚農家

フィードの原料となる食品廃棄物の成分によってにおける残飯の加熱確率の値を変化させると侵入は，この加熱処理を行ってもASFVが不活化されリスクがどのように変化するかについても検証しな い 可 能 性 が あ る と さ れ て い る 。ま た ，エ コ

た（Fig.５）。中国でのASF発生の農家数が増加

フィードの原料として使われる食品廃棄物は多様すると日本への侵入リスクが高まることが分かっであるため，均一な加熱が行われない可能性があた。例えば，中国でのASF発生農家数が10倍にり，一部の成分はASFVを保護する可能性があるなると日本への侵入リスクは現在の20％が51％にからである。このため，国際獣疫事務局（OIE）

上昇する。

は残飯の加熱処理方法として，継続的に攪拌しな

豚肉製品が違法に輸入される確率が上がると，

がら90℃60分間または３bar 121℃10分間の加熱

日 本 へ の ASF の 導 入 リ ス ク が 上 が る こ と が 分を推奨していることを考えると，熱処理条件の強かった。豚肉製品の違法輸入率がベースラインの化も検討する必要があると考えられた。

2.8％から１％に減少すると，侵入リスクは10％残飯を給与する農場では，残飯の加熱処理を行に減少するが，違法輸入率が10％に増加すると侵うことで侵入リスクを大幅に下げることができる

入リスクは35％に上昇する。

と分かった。ベースラインモデルでは残飯給与農

エコフィードの製造過程での加熱処理が不十分

家の57％が加熱処理を行っていると仮定したが，であるとASF侵入リスクは上昇する。ベースラ

99％が加熱処理すれば侵入リスクはゼロに近づく。

インモデルでは，エコフィードはすべて製造過程

さらに，エコフィードの加熱処理と農家におけで70℃30分で加熱されておりウイルスは不活化さる加熱処理のどちらが重要かを検証するために二れると仮定したが，仮に１割が加熱不十分であっ次元シナリオ分析の結果，エコフィードの加熱処た場合，侵入リスクは38％に上昇することが分

理が不十分だと急激に侵入リスクが上がることがかった。ASFVは実験により56℃70分または60℃

分かり，エコフィードの加熱処理を確実に実施す20分で不活化されることが示されているが，エコ

ることが重要であることが判明した（Fig.６）。

© The Ito Foundation

330

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）
1.0

0.8

0.6
0.4

0.6
0.4

0.0

0.0
0.9

0.2

0.95

0.2

0.99

d

P_ecofeed heat-treated

0.57（baseline）c1（baseline）

P_illegal importation

1.0

P_introduction

0.8

10 fold

N_aﬀected farms

0.1

0.0
0.01

0.0

5 fold0.2

2 fold0.2

1.0

P_introduction

0.4

0.99

0.4

0.6

0.9

0.6

b

0.05

P_introduction

0.8

0.75

a

56（baseline）

P_introduction

0.8

0.028（baseline）

1.0

P_swill heat-treated on farmFig. 5 Scenario analysis depicting the effects of tested scenarios on the probability of at least one pig becoming infectedby consuming untreated swill originating from pork products illegally imported by air travelers from China（P_introduction）. For each box-whisker plot, the line in the box indicates the mean ; the length of the box indicatesthe inter-quartile range；the whiskers indicate the 5th percentile and the 95th percentile respectively. For Fig. 5b
and Fig. 5d, fixed values of 0.028 and 0.57 were used as the baseline respectively．

2020 年 に 入 り 新 型 コ ロ ナ ウ イ ル ス 感 染 症（COVID-19）流行下でさまざまな水際対策，国３月－98.5％，４月－99.97％，５月－99.996％，
６月－99.97％と，２月以降大幅に減少した。

内での流行防止対策がとられた結果，侵入リスク

レストランの営業時間短縮については，2020年

評価モデルで使われた入力変数のうち，中国から２月最終週の日本政府による大規模なイベントのの航空旅客数の減少およびレストランの営業時間

中止要請，３月下旬の東京都知事による外出制限

短縮に伴う食品廃棄物量の減少が考えられた。そ要求，４月７日の総理大臣による東京その他６県

こで，これらの入力変数を変化させて今年に入っの住民への不要不急の外出制限の緊急要請，レスてからの侵入リスクの予測を行った 。

トランの営業時間短縮の要請などにより，レスト

７）

すなわち，COVID-19の防疫対応の一環として，ランの活動は大幅に減少した。日本フードサービ

日本政府は2020年２月14日のCOVID-19を検疫法

ス協会の調査によると，2020年１～６月のディに基づく検疫対象疾病に指定し，日本への旅行者

ナーレストランの売上高は対前年比で，それぞれに対して入国制限を課すなどの措置をとった結102.3％，97.4％，59.5％，16.0％，28.5％，57.0％

果，2020年の最初の６か月間，中国からの航空旅であった。違法輸入された豚肉製品を含む食品廃客数は対前年比で，１月＋22.6％，２月－87.9％，

棄物は，これらの割合で減少したと仮定した。

© The Ito Foundation

331

アフリカ豚熱の侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅲ）

0.7

P_introduction

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
00
0.2
0.4
P_ecofeed heat0.6
treated
0.8
1

0.4

0.2

0

1

0.8

0.6

P_swill heat-treated on farmFig. 6 Two-way scenario analysis depicting the effects of P_ecofeed heat-treaed and P_

swill heat-treated on farm on the mean value of P_introduction. The red X
indicates the mean value of P_introduction with P_ecofeed heat-treaed and P_swill
heat-treated on farm taking the baseline values（1.0 and Beta（8, 6）respectively）．

0.25

0.2
0.002
0.15

0.001

0.1

0.05

May

April

June

0
March

Monthly probability of ASF entry

0.3

DecemberNovember

October

SeptemberAugust

July

June

May

April

March

February

January0

Fig. 7 Monthly risk of ASF entry into Japan during 2019（dotted line with open circles）

and 2020（solid line with filled circles）.Circles indicate the mean and error bars 90％
prediction intervals. Inset shows the months March-June 2020 in more detail．

これら２つの入力変数を変化させて，月間侵入0.001％），５月0.00005％（０～0.0003％），６月

確率を計算したところ，2020年１月4.2％（90％0.0009 ％（０～0.005 ％ ）で あ っ た（Fig. ７ の 実

予測区間：0.0～24.9％），２月0.45％（０～2.5％），線）。前年の月間侵入確率が４％前後であった

３ 月 0.03 ％ （０～0.2 ％ ）， ４ 月 0.0002 ％ （０～（Fig.７の破線）ことを考えると，10分の１から© The Ito Foundation

332

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

７万分の１に減少したことになる。
４．要から，エコフィードおよび残飯の加熱処理の徹底がアフリカ豚熱の侵入防止のために最重要である

約

ことが示された。

中国からの航空旅客によって不法に持ち込まれる豚肉製品によりアフリカ豚熱が日本へ侵入するリスクを予測するためリスク評価を行った。以下の侵入および曝露経路による侵入リスクが最も高いと考え，シナリオツリーを作成しモデルを構築した。すなわち，アフリカ豚熱ウイルスに汚染された豚肉製品が中国からの航空旅客により違法に日本に持ち込まれ，その豚肉製品が外食産業で使用され，その調理残渣が飼料の原料として再利用され，加熱処理されずに豚に供給される場合に侵入すると仮定した。入力パラメータの値は，著者らが先行して実施した調査結果，文献調査および政府機関公表のデータに基づき推定した。その結果，この経路によりアフリカ豚熱が日本に侵入する年間確率は0.20（90％予測区間：0.00-0.90）と予測された。広い予測区間は，アフリカ豚熱ウイ
ルスの用量反応関係に関する不確実性が最大の原因であり，続いて発生農場における感染豚の死亡確率，感染豚の筋肉中のアフリカ豚熱ウイルス濃度，違法に輸入される豚肉製品が中国内で加熱処理されている確率の不確実性が原因であった。また，シナリオ分析の結果，中国でのアフリカ豚熱
発生農場数が増えると，日本に侵入する年間確率が上昇し，製造工程で十分に加熱処理されていな
いエコフィードが一部でも存在すると，アフリカ
豚熱の侵入確率は大幅に上昇する。残飯を給餌する際に加熱処理をする農場の割合が増えると，侵文献１） EFSA Panel on Animal Health and Welfare（AHAW）, Scientific Opinion on African Swine
Fever EFSA Journal, 8（3）,1556, 2010．
２）
 Mebus, C. A., et al.：Survival of foot and mouthdisease, African swine fever, and hog cholera
viruses in Spanish serrano cured hams and Iberianc u r e d h a m s ；s h o u l d e r s a n d l o i n s , F o o dMicrobiology, 10, 133～143, 1993．
３）
 Mebus, C., et al.：Survival of several porcine
viruses in different Spanish dry-cured meatproducts, Food Chemistry, 59（4）,555～559, 1997．
 Zhihao, L., Takeshi, H., Hiroko, O., Hiroki, S.,
４）
Satoshi, S., Amy, H., Miho, F., Lisha, L., Shin, H.,
Xiying, Z., Iori, I., Yamato, A., Takeshi, S., Katsuaki,
S . ：A q u e s t i o n n a i r e s u r v e y o f t h e i l l e g a limportation of pork products by air travelers into
Japan from China and exploration of causal factors,
Preventive Veterinary Medicine, 177, 104949, 2020．
５）
 Adkin, A., Coburn, H., England, T., Hall, S.,
Hartnett, E., Marooney, C., Wooldridge, M., Watson,
E . , C o o p e r , J . , C o x , T . , S e a m a n , M . ：R i s kassessment for the illegal import of contaminatedmeat and meat products into Great Britain and thesubsequent exposure of GB livestock（IIRA）：footand mouth disease（FMD）, classical swine fever（CSF）,African swine fever（ASF）,swine vesiculardisease（SVD）Veterinary Laboratories Agency,
New Haw, 2004．
 Sugiura, K., Lei, Z., Holley, C., Haga, T.：
６）
Assessing the risk of ASFV entry into Japanthrough pork products illegally brought in by air
passengers from China and fed to pigs in Japan,
PLoS One, 2020 May 5；15（5）：e0232132. doi：
10.1371/journal.pone.0232132．
 Sugiura, K., Kure, K., Kato, T., Kyutoku, F., Haga,
７）
T.：Change in the ASF entry risk into Japan as aresult of the COVID-19 pandemic, TransboundEmerg Dis, 2020 Sep 24. doi：10.1111/tbed.13836．

入確率は低下することが判明した。これらの結果© The Ito Foundation

333

肉用牛から分離された新規病原体 Rhodococcus equi の国内感染状況の疫学調査
Epidemiological investigation of domestic transmission of a new pathogen,Rhodococcus equi, isolated from beef cattle

鈴木

康規・角田

勤・髙井

伸二

（北里大学獣医学部）

Yasunori Suzuki, Tsutomu Kakuda and Shinji Takai（Kitasato University School of Veterinary Medicine）

Rhodococcus equi, which has long been known in veterinary medicine as the causative
agent of pyogenic pneumonia in foals, has recently been shown to be pathogenic to ruminants.
This study aimed to elucidate the infection status of ruminant-pathogenic（RP）R. equi and toanalyse the molecular biological characteristics of RP R. equi isolated from infected cattle. We
established a serodiagnostic method for the RP R. equi infection that specifically detects antiVapN antibodies in a small amount of serum sample by chemiluminescence ELISA using
rGST-VapN and rGST as a solid-phase antigen（VapN is a major virulence factor for RP R.
equi）. Using this method, we conducted screening tests in nine farms in Oita Prefecture using
207 serum samples collected during 2019-2020. We found that 96.6％ of the animals did notshow a significant increase in the antibody titer, suggesting that the RP R. equi infection had
not been established. However, individuals with high antibody titers were found in three farms,
including the farm where the infected cattle were raised in 2017, suggesting that theestablishment of RP R. equi in Oita Prefecture is progressing and intermittent infections may
be occurring. The strains isolated from the infected cattle in 2017 had almost identical genome
structures, suggesting that one type of RP R. equi spread to multiple organs and caused lesions
in this case. However, the Oita1907 strain harbored a virulence plasmid pVAPN, but did not
express the VapN protein, which induced growth inhibition within cultured macrophages.
Genome analysis revealed that the change in virulence in Oita1907 was not due to mutations in
the pVAPN sequence. Because there may be factors affecting VapN expression in the mutatedregions between the expressing and non-expressing strains, further characterisation of the RP
R. equi genome is required to elucidate the regulatory mechanism of VapN expression．

１．目

近年，豚やイノシシ，ヒトなどさまざまな動物種

的からの分離例が報告され，宿主域の広い病原性細Rhodococcus equiは，土壌中に広く存在する常菌であることが分かってきた１）。本菌の病原性は，在菌であるとともに，子ウマの化膿性肺炎の起因

特定のプラスミド（病原性プラスミド）上に存在菌として獣医学領域では古くから知られている。

する毒力関連抗原（Virulence-associated protein© The Ito Foundation

334

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Antigens；Vap）群がリソソーム内のpHを中性

清疫学調査と本菌感染症発症牛から分離されたとする細胞内ニッチを作成し，菌の増殖を促進す

RP R. equiの病原性ならびに遺伝学的特性の検討ることで発揮される２）。病原性プラスミドは存在を実施した。

するVap遺伝子の違いによりの３種類（pVAPA，
pVAPBおよびpVAPN）に分類され，これらのプ

２．方法

ラスミドと宿主との間には疫学的に密接な関連性

2.1が存在する。すなわち，VapAなどが存在する

2017年に大分県のＢ農場で発生した本菌感染症

pVAPAはウマ，VapBなどが存在するpVAPBは発症牛の肺（Oita1901，Oita1906，Oita1908株），

豚の病変部からそれぞれ検出される 。さらに，

鼠 径 リ ン パ 節（Oita1902 株），内 腸 骨 リ ン パ 節

2015年に牛の肺膿瘍・肉芽腫性リンパ節炎からの（Oita1903，
Oita1905，
Oita1907株），腎臓（Oita1904

分離菌株が新規毒力関連抗原VapNをコードする

株）から分離されたR. equi８菌株を使用した。

pVAPNを保有することがヨーロッパで初めて報また，本発症牛の血清ならびにＢ農場を含む大分

告 さ れ た （pVAPN 保 有 R. equi ； Ruminant-

県の９農場207個体から2019年から2020年に採取

pathogenic（RP）R. equi） 。
RP R. equi感染症は，した血清を使用した。

１）

３）

使用菌株および血清

肺の多発性腫瘤および全身のリンパ節に肉芽腫を2.2形成し結核様の病相を示す感染症であり，特にと先行研究においてヤギの血清疫学調査に使用し畜検査における牛結核病との鑑別・精査が必要なたELISA６）を一部改良して実施した。組換えGST

新たな病原体と考えられる。また，結核と似た臨融合VapNタンパク質（rGST-VapN）を10ng／

床症状を示す人獣共通感染症の病原体である本菌

ウェル，組換えGST（rGST）を20ng／ウェルをのヒトへの感染源として公衆衛生学上においてもWhite 96-Well Immuno Plates, PolySorp

重要視される。このため，牛の汚染率や罹患率な（Thermo Fisher Scientific）に固相化した。一次

どの疫学的特性を明らかにすることは喫緊の課題

血清には上記ウシ血清をCan Get Signal Solutionである。

１（東洋紡）で1,000倍希釈したもの，二次抗体

2016年以降，わが国でも牛やヤギの膿瘍病変部からのRP R. equiの分離が報告され

ELISAを用いた血清診断法の確立に は HRP 標 識 抗 ウ シ IgG 抗 体（フ ナ コ シ）を，反芻動

Solution２（東洋紡）で100,000倍希釈したものを物における世界的な分布が示唆されている。2017

そ れ ぞ れ 使 用 し ，化 学 発 光 基 質（LumiFlash

年には，大分県の肥育農場において黒毛和種の感

Ultima ； フ ナ コ シ） お よ び Infinite 200 PRO

染例が報告された。本事例は，腸骨下リンパ節の（Tecan）を用いて検出した。rGSTを固相化した腫大と間欠的な排膿が認められ予後不良となり，ウェルとPBSのみ添加したウェルの数値を比較

肉芽腫および乾酪壊死様病巣が顕著であった組織

し，rGSTに対する抗体反応がないことを確認し（肺，腸骨下リンパ節，内腸骨リンパ節および鼠た後，rGST-VapのウェルとrGSTのウェルとの径リンパ節）からR. equiが分離された。本研究

差を各血清の抗VapN抗体価とした。

４～６）では，国内の牛におけるRP R. equiの感染状況の2.3

把握ならびに分離菌株の分子生物学的特性を解析

PFGEは既報の方法４）に従って実施した。上記することを目的とし，まずは大分県内の肉用牛飼菌株をBHI液体培地で36時間振盪培養した。菌体

育農場の抗VapN抗体価を測定することによる血を回収し，1.5％アガロースと１：１で混合して© The Ito Foundation

パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）

肉用牛から分離された新規病原体 Rhodococcus equi の国内感染状況の疫学調査

335

プラグを作製した。プラグを18時間リゾチーム処

るように培養用DMEMで調整し，細胞に添加し理した後，24時間プロテイナーゼＫ処理を行った。37℃で１時間培養後，PBSで３回洗浄し，細た。制限酵素未消化のプラグおよびPshBI（タカ

胞外の菌体を除去するために20μg/mLのアミカ

ラバイオ）で消化したプラグをアガロースゲルにシン添加培養用DMEMを用いて37℃で24および埋め込み，A CHEF Mapperパルスフィールド電

48時間培養した。培養後，細胞をPBSで３回洗浄

気泳動システム（Bio-Rad）を用いて電気泳動をし，カバーガラスを逆さにして細胞側が下になる行った。

ようにスライドグラスに載せ，蛍光顕微鏡を用い2.4

ウェスタンブロットて観察した。

上記８菌株のVapN発現量をウェスタンブロッ

2.6

全ゲノム解析

トを用いて定量した。各菌株をpH6.5または8.0にOita1901，Oita1905およびOita1907株のゲノム調整した自家調整液体培地（20g/Lペプトン，

DNA を QIAamp DNA Mini Kit （QIAGEN） を

８g/LNaCl，300mL/L馬肉エキス）で48時間培養

用 い て 抽 出 し た 。DNA の 濃 度 は Qubit dsDNA

し た 。菌 体 を 回 収 し ，Laemmli サ ン プ ル バ ッ

HS Assay Kit （Thermo Fisher Scientific） を 用

ファー（Bio-Rad）に溶解した。各サンプルを

い て 測 定 し ，純 度 は NanoDrop OneC （Thermo

SDS-PAGEで分離した後，PVDF膜に転写した。

Fisher Scientific）を用いて評価した。全ゲノム

一次血清には先行研究で作製したマウス抗rGST-

配 列 は ，MiSeq（Illumina）と MinION（Oxford

VapN血清を1,000倍希釈したもの，二次抗体にNanopore Technologies）の両シーケンサーから

はHRP標識抗マウスIgG抗体（MP Biomedicals）

得られた配列データを組み合わせて（ハイブリッ

を100,000倍希釈したものをそれぞれ使用し，化学

ドアセンブル）決定した。MiSeqによるシークエ

発 光 基 質 ECL Prime Western Blotting Detection

ン ス は ，Nextera XT DNA Library Preparation

Reagent（GE Healthcare）およびiBright Imaging

Kit（Illumina）を用いてDNAライブラリーを調

System（Thermo Fisher Scientific）を 用 い て 検

製し，300bpのペアエンドリードを用いた。また，出した。

MinION シ ー ク エ ン ス は ，Ligation Sequencing

６）

2 . 5 分離菌株の培養マクロファージ内増殖のKitとNative Barcoding Expansion 1-12（Oxford
Nanopore Technologies）を用いてDNAライブラ

比較
Oita1901，Oita1902，Oita1905およびOita1907

リーを調製し，フローセルはＲ9.4.1を使用した。

株にEGFPを発現させマウス培養マクロファージ

MinIONから得られたFast５データのベースコー

内 で の 増 殖 を 比 較 し た 。当 研 究 室 で 作 製 し た

ル と バ ー コ ー デ ィ ン グ は Guppy （Oxford

７）

EGFP遺伝子補完用プラスミドpINT : : PaphII-egfp

Nanopore Technologies）を用いて行った。各々を各株に形質転換し，アプラマイシン添加LB寒のシークエンサーから取得したリードについて，

天培地で形質転換体（EGFP発現株）を選択しUnicycler８）を用いてハイブリッドアセンブリをた。カバーガラスを置いた24ウェル細胞培養プ実施し，ゲノム配列を決定した。決定したそれぞ

レートにマウスマクロファージ様細胞株J774A.１

れの塩基配列からの遺伝子の抽出およびアノテー

を1.5×10 細胞／ウェルで播種し，10％FBS添加

ションはDFAST９）を用いた。また，全ゲノム配DMEM（培養用DMEM）で24時間培養した。各

列マップはCGview Serverを用いて作製した。

５

EGFP発現株を多重感染度が10（MOI＝10）とな© The Ito Foundation

336

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

equi感染症のスクリーニング検査として利用でき

３．結果と考察ることが示された。

3 . 1 VapN抗体価測定のELISAの確立と血清

続いて，本法を用いて大分県内の肉用牛計207

スクリーニング

血清中の抗体価を測定した。発症牛と同等もしく

当初，血清中VapN抗体へ特異性向上のため，はそれ以上の抗体価を示した個体が，３農場計４

タグを除去したrVapNタンパク質を作出し，固相

頭 （高 値 か ら 1,018,072 ， 920,817 ， 783,257 ，化抗原とした検出系を検討した。しかし，本抗原

435,550）存在した一方で，今回調査した96.6％のはPolySorp処理プレートへの吸着が悪く，PBSの個体の実測値は200,000以下であった（Fig.１）。

み添加したウェルの数値と差が認められなかった

多くの個体で抗VapN抗体価の大幅な上昇が認めことから，上述のrGST-VapNとrGSTを用いた方られず，本菌の感染が成立していないことが推測

法を採用した。陽性対照である発症牛の実測値はされた。しかし，高い抗体価を示した牛が異なる

それぞれ462,226（rGST-vapN），13,465（rGST），

農場で散見され，また発症牛が飼育されていたＢ

7,434（PBS）であり，陰性対象である市販のウ

農場で2019年にも高い抗体価を保有する牛が存在

シ胎児血清の平均値はそれぞれ29,359（rGST-

したことから，大分県内におけるRP R. equiの定

vapN），3,515（rGST），2,814（PBS）であった。

着が進行し，間欠的な感染が起こり得ることが示

以上の結果から，本法は少量（１μｌ）のウシ血唆された。また，これらの高い抗体価を示した牛清 で 抗 VapN 抗 体 価 を 特 異 的 に 検 出 し ，RP R.

は，体内におけるRP R. equiの増殖が強く疑わ

1200000

Luminescence intensity

1000000

800000600000400000200000

0
A

B

C

D

E

F

G

H

I

Patient

Fig. 1 Anti-VapN antibody titers in beef cattle raised in nine farms in Oita Prefecture. The vertical axis

indicates the luminescence intensity and the horizontal axis indicates the farm. The number of beef cattle
tested at each farm is as follows：Farm A（n ＝ 30）， Farm B（n ＝ 40）， Farm C（n ＝ 40）， Farm D（n ＝10），Farm E（n＝20），Farm F（n＝20），Farm G（n＝17），Farm H（n＝20）and Farm I（n＝10）．

© The Ito Foundation

肉用牛から分離された新規病原体 Rhodococcus equi の国内感染状況の疫学調査

337

れ，肉眼的な臨床症状はないが，臓器内にRP R.

の み 100kb 付 近 の バ ン ド が 検 出 さ れ な か っ た

equiの増殖を伴う肉芽腫病変を形成している可能（Fig. 2B）。このことから，当該症例は１種類の性が推測された。実際に，三重県で発生した国内

RP R. equiが複数の臓器に播種し，病変を引き起初事例

では，生体検査では著変が認められない

こしたと考えられる。また，筆者らは先行研究に一般畜として搬入され，解体後検査にて肺をはじ

おいて，RP R. equiが保有する100kb付近のバンめとした臓器に多発性腫瘤が認められたため全廃

ドはpVAPNプラスミドであることを報告してい棄（敗血症）されており，今後本菌が蔓延した場る ４）。すなわち，Oita1907株はpVAPNを欠落し合，経済的損失も示唆される。特に陽性農場ではていることが明らかとなった。

５）

今回確立した血清診断法を活用した網羅的抗体価

ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 の 結 果，Oita1901，

測定を定期的に実施し，陽性の疑いのある個体のOita1902，Oita1903，Oita1904，Oita1906，

隔離や飼育環境の除菌など感染拡大の防除に努め

Oita1908株において，既報のVapN発現条件６）でる必要がある。また，今後調査対象を国内全域にある37℃，pH6.5で培養した場合，VapNタンパ

広げ，RP R. equiの感染状況を明らかにする必要

ク質を最も多く産生した。一方で，Oita1905およがある。

びOita1907株ではいずれの培養条件においても，

3.2

VapNタンパク質を発現しなかった（Fig. 3A）。

発症牛分離菌株の病原性と遺伝学的特性

プラグをPshBI処理した後，電気泳動した結果，また，培養マクロファージ内増殖を比較したとこ

どの菌株もほぼ同一の制限酵素切断パターンが認ろ，VapNを発現したOita1901およびOita1902株められたが，Oita1907株のみ100kb付近のバンド

では培養48時間後にマクロファージ内での菌体増が検出されなかった（Fig. 2A）。一方，プラグを殖 が 認 め ら れ た 。 一 方 で ， Oita1905 お よ び

制限酵素処理せず電気泳動した結果，Oita1907株

Oita1907株はマクロファージ内での顕著な増殖がFig. 2 PFGE images of eight R. equi strains isolated from lesions of infected cattle.（A）PshB1 digested and（B）

restriction enzyme untreated were shown. Lambda PFG ladder was used as a marker. Arrowheads
indicate the positions of pVAPN in each strain．

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338

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Fig. 3 Pathogenicity evaluation of R. equi strains isolated from lesions of infected cattle.（A）Detection of VapN

protein produced by these strains. Western blotting was conducted using self-made mouse anti-GSTVapN serum. Each cell lysate was separated via sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis
and then transferred onto PVDF membranes.（B）The growth of these strains in J774A.1 macrophage wasobserved via fluorescence microscopy at 48 h post infection. Bar＝50μm．

認めらなかった（Fig. 3B）。興味深いことに，

塩基長や遺伝子の数に若干の相違が認められた

pVAPN保有株であるOita1905株が，いずれの培（Table１，Fig.４）。アノテーションの結果，株間養条件においてもVapNタンパク質が発現しないの変異領域には機能が解明されていない遺伝子もことが明らかとなり，マクロファージへの感染実含まれており，例えばOita1901株の機能不明の験の結果とも一致していた（Fig.３）。VapNタンC a l c i u m - b i n d i n g p r o t e i n をコードする

パク質を発現しない要因を明らかにするため，

Locus_17590は他の２株ではその塩基配列に変異

Oita1901，Oita1905およびOita1907株の全ゲノムを生じていた（Fig. 4B）。クロモゾームの変異領解析を行い，それぞれの配列を比較した。全ゲノ

域にVapN発現に影響する因子が存在する可能性

ム配列の概要をTable１に示す。Oita1907株はプがあるため，その機能解析を含め引き続きRP R.

ラスミドを保有しておらずPFGEの結果と一致しequiゲノムの特性の解析を進めていく必要がある。

た 。Oita1901 株 お よ び Oita1905 株 が 保 有 す る
pVAPNの塩基配列は99％以上一致しており，

４．要約

Pathogenicity island内の変異は認められなかっR. equiは，子ウマの化膿性肺炎の起因菌とした。このことはOita1905株がVapNを発現しないて獣医学領域では古くから知られていたが，近要因として，vapN遺伝子自体やvapN遺伝子の発年，反芻動物に対する病原性が明らかになってき現に関与するPathogenicity island内の転写制御た。本研究は，国内におけるRP R. equiの感染状遺伝子に変異が入ったために起きたものではない

況の把握ならびに分離菌株の分子生物学的特性をことを示している。続いてクロモゾームの配列を解析することを目的とした。rGS-VapNとrGST比較した結果，３株の配列は99％一致したが，総を固相化抗原とし，化学発光系を用いたELISA© The Ito Foundation

339

肉用牛から分離された新規病原体 Rhodococcus equi の国内感染状況の疫学調査
Table 1 Whole-genome information for vapN-harboring Rhodococcus equi isolated from infected cattle
Strain and genome information
OriginData for vapN-harboring Rhodococcus equi strain：
Oita1901

Oita1905

Oita1907

Lung

Internal iliac lymph nodesInternal iliac lymph nodes
5,258,530

Chromosome description＊
Genome size（bp）

5,267,390

5,259,097

G＋C content（％）
No. of CDSs＊＊

68.7

68.7

68.7

4,931

4,941

4,934

No. of rRNA

15

12

12

No. of tRNA

61

61

61

No. of CRISPRS
pVAPN description＊0

0

0
Not found

Genome size（bp）≤109,877＊＊＊≤109,562＊＊＊

G＋C content（％）
No. of CDSs＊＊

65.6

65.6

127

128

No. of rRNA
No. of tRNANo. of CRISPRS

0
0
0

0
0
0

＊All genomic stats are output from DFAST pipeline．
＊＊CDSs, coding sequences．
＊＊＊The number of bases may be slightly extended due to the undetermined invertron sequence at both the 3’ and 5’ ends．

Fig. 4 Comparative genomics of R. equi strains isolated from lesions of infected cattle.（A）Comparisons of

three genome sequences（strain Oita1901, Oita1905 and Oita1907）were performed using the CGView
server. The outermost and next rings show features of the Oita1901 genome. The next three rings show
the positions of BLAST hits detected through blastn comparisons of the sequence against itself and two
genomes. The height of each arc in the BLAST result rings is proportional to the percent identity of thehit. Overlapping hits appear as darker arcs. The next two rings show the GC content and GC skew of theOita1901 genome.（B）Enlarged view around Locus_17590. As shown in BLAST results, Oita1905 andOita1907 did not harbor homology in 5’ side sequence of Locus_17590．

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340

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

により，少量の血清サンプルから抗VapN抗体を特異的に検出するRP R. equi感染症の血清診断法を確立した。本法を用いて，2019年から2020年に大分県内の９農場で採取した207血清のスクリー
ニング検査を実施した。96.6％の個体では抗体価の顕著な増加は認められず，感染が成立していな
いことが推測された。しかし，発症牛が飼育されていた農場を含む３農場で高い抗体価の個体が確認されたことから，大分県内におけるRP R. equiの定着が進行し，間欠的な感染が起こり得ることが示唆された。また，発症牛から分離された菌株はほぼ同一のゲノム構造を持ち，当該症例は１種類のRP R. equiが複数の臓器に播種し，病変を引き起こしたと考えられた。しかし，分離菌株の一つであるOital907株は病原性プラスミドpVAPNを保有するにもかかわらずVapNタンパク質を発現せず，培養マクロファージ内で増殖が抑制された。ゲノム解析の結果，Oital907株の病原性の変化は，pVAPN上の塩基配列の変異によるものではないことが判明した。発現株と非発現株間の染色体の変異領域には，VapNの発現に影響を与える因子が存在する可能性がある。VapN発現の制御機構解明のため，引き続きRP R. equiゲノムの特性の解析を進めていく必要がある。
文献１） Vázquez-Boland, J. A., Meijer, W. G.：The
pathogenic actinobacterium Rhodococcus equi：what’s in a name?, Mol Microbiol, 112, 1～15, 2019．
２） von Bargen, K., Scraba, M., Krämer, I., Ketterer,M., Nehls, C., Krokowski, S., Repnik, U., Wittlich, M.,
Maaser, A., Zapka, P., Bunge, M., Schlesinger, M.,
Huth, G., Klees, A., Hansen, P., Jeschke, A., Bendas,G., Utermöhlen, O., Griffiths, G., Gutsmann, T.,
Wohlmann, J., Haas, A.：Virulence-associatedprotein A from Rhodococcus equi is anintercompartmental pH-neutralising virulence
factor, Cell Microbiol, 21, e12958, 2019．
３） Valero-Rello, A., Hapeshi, A., Anastasi, E.,
Alvarez, S., Scortti, M., Meijer, W. G., MacArthur, I.,
Vázquez-Boland, J. A.：An invertron-like linear
plasmid mediates intracellular survival andvirulence in bovine isolates of Rhodococcus equi,
Infect Immun, 83, 2725～2737, 2015．
４） 中尾聡子，石塚駿，川島豪，中川竜太朗，佐々木由香子，角田勤，鈴木康規，髙井伸二：2015年に沖縄で山羊とその飼育環境土壌から分離されたロド
コ ッ カ ス・エ ク イ の 毒 力 の 再 検 討 ，73, 582～584,
2020．
５） Nakagawa, R., Moki, H., Hayashi, K., Ooniwa, K.,
Tokuyama, K., Kakuda, T., Yoshioka, K., Takai, S.：A case report on disseminated Rhodococcus equi
infection in a Japanese black heifer, J Vet Med Sci,
80, 819～822, 2018．
６） Suzuki, Y., Takahashi, K., Takase, F., Sawada, N.,
Nakao, S., Toda, A., Sasaki, Y., Kakuda, T., Takai,
S.：Serological epidemiological surveillance for
vapN-harboring Rhodococcus equi infection ingoats, Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 73,101540, 2020．
７） Sangkanjanavanich, N., Kawai, M., Kakuda, T.,
Takai, S.：Rescue of an intracellular avirulent
Rhodococcus equi replication defect by the
extracellular addition of virulence-associatedprotein A, J Vet Med Sci, 79, 1323～1326, 2017．
８） Wick, R. R., Judd, L. M., Gorrie, C. L., Holt, K. E.：
Unicycler：Resolving bacterial genome assemblies
from short and long sequencing reads, PLoS
Comput Biol, 13, e1005595, 2017．
９） Tanizawa, Y., Fujisawa,.T., Nakamura, Y.：
DFAST：a flexible prokaryotic genome annotation
pipeline for faster genome publication,
Bioinformatics, 34, 1037～1039, 2018．

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341

畜産動物用粘膜ワクチンアジュバントの開発
Development of mucosal vaccine adjuvant for livestock

若

尾

雅

広

（鹿児島大学学術研究院理工学域工学系）

Masahiro Wakao（Department of Science and Engineering, Kagoshima University）

Infectious disease outbreaks of farm animals cause serious problems not only in the
livestock industry but also in the economy and human health. Vaccination is one of theeffective strategies to prevent infectious animal diseases, and various vaccines have beendeveloped. Among vaccines, mucosal vaccines have been attracted much attention since they
can induce immune responses that mimic the infection route of pathogens and can activate not
only local mucosal immune responses but also systemic immune responses including humoral
and cellular immunity. To elicit immune responses effectively by mucosal vaccination, selective
targeting and activation of immune cells are of importance. Therefore, various adjuvants suchas synthetic polymers and natural polysaccharides that can be easily taken up by immune cells
have been studied. Recently, we have developed glyco-adjuvants, which activate immune cells
via innate immune receptors such as Toll-like receptors（TLRs）and C-type lectin receptors（CLRs）and sugar moiety is involved in targeting of immune cells. In this study, in order toapply our glyco-adjuvant as a mucosal vaccine adjuvant for farm animals, we investigated theimprovement of glyco-adjuvants and their in vitro and in vivo immunostimulatory activities. In
the synthesis of sugar and TLR ligand moieties, several kinds of novel structures weresynthesized on the basis of the methods reported previously. The conjugation of ligand
moieties was performed by amidation or click reaction to produce glyco-adjuvants efficiently.
In vitro study with mouse bone marrow-derived dendritic cells（mBMDCs）, glyco-adjuvants
have higher potencies than that of unconjugated ligand moieties. In the in vivo immunization
study using ovalbumin（OVA）as a model antigen, the glyco-adjuvant significantly induced the
production of OVA-specific IgA and IgG both in nasal and serum samples. The results indicatethat our glyco-adjuvants are useful for the mucosal vaccine adjuvant. Further optimization of
glyco-adjuvant can lead to the development of a novel mucosal vaccine．

１．目

物の損耗や畜産物の生産性の低下を招き，大きな的

経済的損失につながる。また，我々にとっては，畜産産業において，飼育動物の感染症対策は重人獣感染や食中毒，畜産物の安定供給などの公衆要な課題である。伝染性感染症の発生は，飼育動

衛生，食品衛生上の課題が生じる。飼育動物の感© The Ito Foundation

342

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

染症対策ではワクチンによる予防が有用であり，

TLRL複合体（以下，グライコアジュバント）を生ワクチンをはじめ，不活化ワクチン，抗原成分

開発してきた。このグライコアジュバントは，糖を含むコンポーネントワクチンなどが開発されて鎖機能による細胞へのデリバリー能を有しておいる。生ワクチンは効率よく免疫誘導できるもの

り，複合化していないTLRL単体に比べ低濃度で，の，弱毒化した病原体を使用するため感染症のリ

樹状細胞などの免疫細胞を活性化できる２）。近年

スクをあわせ持つ。一方，抗原などを含む不活化の研究では，CLRとTLRの協働作用によって，ワクチンは，ワクチンによる感染症のリスクはな

サイトカイン産生などの免疫シグナルが増強されいが，免疫誘導能が低く，アジュバントによる活ることが報告されており，CLRとTLRのリガン性化が必要である。ワクチン開発においては，よ

ド成分の精査によって，高機能性のグライコア

り安全で，かつ，より効果的に免疫を誘導できる

ジュバントの創製が可能になると考えられる。本

ワクチンが求められており，これら両機能を持つ研究では，グライコアジュバントを粘膜ワクチン

ワクチンとして，近年，粘膜ワクチンが注目されのアジュバント成分として活用することを研究目ている。粘膜ワクチンでは，自然感染による免疫的とし，グライコアジュバントの改良と粘膜投与

応答プロセスに沿って粘膜の局所免疫応答ならび型ワクチンのアジュバントとしての評価を行った。

に全身免疫応答が誘導される。また，病原体が感染する際の第一段階である粘膜での感染予防も期

２．方法待される。しかし，粘膜組織の免疫細胞へワクチ

本研究では，粘膜用ワクチンアジュバントの開ン成分を送達し，活性化する方法は確立されてお発に向け，１）グライコアジュバントの合成，２）らず，その手法の開発が求められている。

グライコアジュバントのin vitroでの免疫増強活

一方，近年のワクチンのアジュバント開発においては，パターン認識受容体（PRRs）が関与す性評価，３）グライコアジュバントのin vivoでの免疫増強活性評価について検討した。

る自然免疫を活性化するリガンド分子の利用が注

2.1

目されている１）。PRRsは，病原体などの外来性

グライコアジュバントの糖鎖成分には，Ｃ型レの分子パターン（PAMPs）や細胞などが傷害をクチン様受容体（CLR）に結合すると考えられる

受けた際に生じる内因性の分子パターン

糖鎖を使用した。トール様受容体（TLR）に結（DAMPs）を認識する受容体で，免疫応答初期

合するリガンド（TLRL）には，TLR４リガンドの自然免疫を活性化する。自然免疫の活性化は，（TLR4L）とTLR７リガンド（TLR7L）を使用し抗体産生などの液性免疫やＴ細胞などが関与するた。TLR4Lは，ピリミドインドール骨格をもとに，

細胞性免疫などの獲得免疫も誘導する。そのた

これまでの方法３）を改良して合成した（Fig. 1A）。

め，自然免疫を活性化できるリガンド分子はワク

TLR7Lの合成は，プリン骨格をもとに既法４）をチンアジュバントとして有望と考えられている。

参考にFig. 1Bの経路にしたがって合成した。グ

我々の研究グループでは，PRRsの中でも，糖ライコアジュバントへの誘導は，in vitroの免疫鎖を認識するＣ型レクチン受容体（CLR）と，脂増強活性評価で高い効果を示したリガンドを用い質，核酸由来のPAMPs，DAMPsを認識するトーて検討し，アミド縮合またはクリック反応によっル様受容体（TLR）に着目し，これまでに糖鎖て行った（Fig. 1C）。

とTLRリガンド（TLRL）を複合化した糖鎖－© The Ito Foundation

グライコアジュバントの合成

畜産動物用粘膜ワクチンアジュバントの開発

343

Fig. 1 Synthesis of glyco-adjuvant A, B, C, D and E. A）Synthesis of TLR4L, B）Synthesis of TLR7L,C）Conjugation of glycan with TLRL．

2 . 2 グライコアジュバントのin vitroでの免疫

１週間後にサクリファイし，鼻腔洗浄液，血清を回収して，それぞれのサンプル液中に存在する増強活性評価合成したグライコアジュバントの免疫増強活性

IgA，IgM，IgG抗体成分を分析した。抗体成分

は，マウス骨髄由来樹状細胞（mBMDC）を用いの 評 価 は ELISA 法 に よ っ て 行 い ，任 意 単 位て評価した。mBMDCは既法 に従い，マウス骨（arbitrary unit, AU）で評価した。

５）髄細胞を，顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-2.4

CSF）を含むRPMI培養液で７日間培養して調製

デ ー タ は ， GraphPad Prism 7 （GraphPad

した。その後，96穴プレートに播種し，グライコ

Software）を用いて解析した。データは，平均値

アジュバントを段階希釈で添加し，18時間培養し±標準偏差で示した。一元配置分散分析で解析た後，培養上清を回収し，産生されたインターロ

し，多重比較にはDunnett法を用いた。ｐ＜0.05

イキン-６（IL-６）をELISA法により測定した。

を統計学的に有意であるとした。

2 . 3 グライコアジュバントのin vivoでの免疫増強活性評価統計解析

３．結果と考察

高い免疫増強活性を示したグライコアジュバン

畜産動物である豚，牛，鶏に対するワクチン開トと抗原を混合してワクチン製剤を調製し，マウ発を目指すことから，それぞれの動物に発現が確ス（Balb/C，７週齢，雌）への投与実験を行った。

認されている受容体を標的にグライコアジュバン

抗原にはオボアルブミン（OVA）を使用した。

トを設計・合成した。すなわち，糖鎖成分の受容グライコアジュバントの投与量については３段階

体には，CLRであるデクチンやマンノース受容体で検討した。ワクチン製剤の投与は，マウス経鼻に結合すると予想される，グルコースやガラクより行い１週間ごとに３回実施した。最終投与のトース，キシロース，アラビノースから構成され© The Ito Foundation

344

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

る糖成分に加え，それらのオリゴ糖を選択した。

使用した。免疫活性は，OVAに対して誘導される，

TLRL成分には，ピリミドインドール骨格を有す

IgAやIgM，IgGの抗体産生量で評価した。まず，るTLR4L成分とプリン骨格を有するTLR7L成分

グライコアジュバントＥとOVAを混合してワクを選択した。TLR4L成分の合成では，構造改変

チン製剤を調製した。ワクチン製剤の調製においを 行 っ て TLR4L- １ ，TLR4L- ２ を 調 製 し た 。

ては，相分離が起こることなく均一な水溶液とし

TLR7L成分の合成では，カルボキシル基の改変て製剤化できることが分かった。この溶液をワクを行い，TLR7L-１，TLR7L-２を調製した。調チン製剤として用いて，マウス経鼻への投与を製したそれぞれの糖鎖成分とTLRL成分との縮合行った。投与は１週間おきに３回行い，最終投与を行い，グライコアジュバントＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，の１週間後にサクリファイし鼻腔洗浄液と血清をＥを合成した。

回 収 し た 。そ れ ぞ れ の サ ン プ ル 液 に 含 ま れ る

合成したグライコアジュバントＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ

OVA特異的な抗体の産生価は，OVAを固定化しについては，mBMDCを用いて，IL-６の産生量たプレートを用いてELISA法によって算出した。

を指標に免疫増強活性の評価を行った。その結結果をFig.３に示す。IgA，IgGの産生価について

果，糖鎖と複合化したグライコアジュバントが，は，鼻腔洗浄液，血清ともに，高容量のアジュバ

複合化していないTLR7Lに比べ，高い免疫増強

ントを添加したときに抗体価の増強が見られた。

活性を有することが分かった（Fig.２）。糖構造一方，IgMに関しては，いずれの容量においてもよる活性増強効果は観察されなかったことから，

あまり変化が見られなかった。鼻腔洗浄液中の縮合の際に構築される架橋構造が，活性増強に寄IgAの抗体価が増強されていることから，グライ

与したと考えられる。今後，糖鎖の多価（クラス

コアジュバントＥは，鼻腔粘膜における局所免疫ター）効果を利用することで，さらなる活性向上を誘導できると考えられる。また血清中のIgG抗が期待される。

体価も増強されることから，全身性の免疫も誘導

グライコアジュバントＥについては，ワクチンできると考えられる。IgMに関しては，最初のワアジュバントとして利用できるか，in vivoでのクチン製剤投与後から３週間経過しており，IgG

免疫活性評価を行った。モデル抗原にはOVAを産生も増強されていることから，クラススイッチ

Fig. 2 IL-6 production by glyco-adjuvats in mBMDC（1×10５cell/well）. IL-6 was measured by ELISA．

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畜産動物用粘膜ワクチンアジュバントの開発

345

Fig. 3 In vivo adjuvant activities of glyco-adjuvant E. Balb/C mice（n＝4）were immunized with OVA protein（20μg）

and TLR7L（2nmol）or glyco-adjuvant E（0.2nmol, 2nmol, 20nmol）on days 0, 7, and 14. Nasal wash and blood wascollected on day 21 and nasal and serum OVA-specific IgA, IgM, or IgG antibodies were evaluated by ELISA.
One-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison test was performed to determine the statistical differences（＊p＜0.05）using GraphPad Prism 7（GraphPad Software）．

が起こり，通常の抗体価を示したと考えられる。
４．要は，生ワクチンに比べ，感染症のリスクがなく安全に使用できることから，現在でも精力的に研究約されており，既存ワクチンの改良が進められてい畜産動物の感染症に対する防疫対策は，畜産産る。一方，不活化ワクチンは，効率よく免疫誘導

業だけでなく，地域の公衆衛生や食環境の維持のできないことから，アジュバントの開発や投与経面においても重要である。畜産動物の感染症対策

路の探索も進められている。近年，投与経路の探としては，ワクチンが有効であることからさまざ

索では，粘膜を介した投与経路が注目されておまなワクチンが開発されてきた。不活化ワクチン

り，さまざまな粘膜ワクチンの開発が行われてい© The Ito Foundation

346

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

る。粘膜ワクチンは，病原体の感染経路を模倣しいては，優れた活性を有する新規化合物を得るこた免疫誘導が可能で，粘膜の局所免疫を誘導するとができた。また，マウスを用いたin vivo活性だけでなく，液性免疫，細胞性免疫を含めた全身評価では，アジュバントとモデル抗原の経鼻投与

性免疫応答の誘導が期待できる。粘膜ワクチンにによって，鼻腔中のIgAの抗体産生誘導に加え，よる免疫誘導では，粘膜の免疫細胞への抗原成分

血清中のIgG抗体の産生誘導を行うことができのデリバリーと担当組織での免疫細胞の活性化がた。本結果は，今後，アジュバントと不活化抗原重要となるため，免疫細胞へのデリバリー機能をを用いた粘膜ワクチンの開発につながると期待さ持つ合成高分子や天然多糖などのさまざまなアれる。

ジュバントが検討されているが，実用化に至っていない。
一方，我々の研究グループでは，自然免疫の活性化機構に着目し，免疫細胞へのデリバリー能と免疫細胞の活性化能を持つグライコアジュバントを開発している。本研究では，これまでに開発してきたグライコアジュバントを畜産動物用粘膜ワ
クチンのアジュバントとして利用することを研究目的とし，グライコアジュバントの改良と活性評
価について検討した。糖成分，TLRL成分の合成
においては，これまでの方法を参考に，数種類の新規なリガンド成分を合成することができた。また，合成したリガンド成分を複合化してグライコ
アジュバントへの誘導も行った。グライコアジュ

文献１） Coffman, R. L., Sher, A., Seder, R. A.：Immunity,
33, 492～503，2010．
２）
 Baba, A., Wakao, M., Shinchi, H., Chan, M.,
Hayashi, T., Yao, S., Cottam, H. B., Carson, D. A.,
Suda, Y.：Bioorg. Med. Chem. Lett., 30, 126840,
2020．
３）
 Chan, M., Kakitsubata, Y., Hayashi, T., Ahmadi, A.,
Yao, S., Shukla, N. M., Oyama, S., Baba, A., Nguyen,
B., Corr, M., Suda, Y., Carson, D. A., Cottam, H. B.,
Wakao, M.：J. Med. Chem., 60, 9142～9161, 2017．
４）
 Wu, C. C. N., Hayashi, T., Takabayashi K., Sabet,
M., Smee, D. F., Guiney, D. D., Cottam, H. B.,
Carson, D. A.：Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 104,
3990～3995, 2007．
５）
 Chan, M., Hayashi, T., Mathewson, R. D., Yao, S.,
Gray, C., Tawatao, R. I., Kalenian, K., Zhang, Y.,
Hayashi, Y., Lao, F. S., Cottam, H. B., Carson, D.
A.：Bioconjug Chem., 22, 445～454, 2011．

バントのmBMDCを用いた免疫増強活性評価にお© The Ito Foundation

347

UV-LED光殺菌を用いた，鶏病原性大腸菌殺菌システムの開発
Development of UV-LED inactivation system for avian pathogenic
Esherichia coli

下

畑

隆

明１・粟飯原睦美２（１徳島大学大学院医歯薬学研究部，２徳島大学大学院社会産業理工学研究部）

Takaaki Shimohata１ and Mutsumi Aihara２（１Department of Preventive Environment and Nutrition, Institute of Biomedical Sciences, Tokushima University Graduate School,
２Graduate School of Technology, Industrial and Social Sciences,Tokushima University）

Breeding of broiler is becoming more systematic and larger in Japan. According to largescale of poultry houses, it can be severely damaged by the invasion of external pathogens, sothat poultry houses are changing conventional open house to semi-windless or windless
poultry to prevent infections. In the windless type of poultry house, the infectious risks are
significantly reduced, but when pathogens contaminated in poultry house, it will spread into
the dramatically. UV-LED is a light emitting diode that emits light in the ultraviolet region.
UVA-LED, involved in sunlight, emitting light indicates mild bacterial killing ability and it canbe used for inactivation of bacteria in food suppling systems and animals or organisms existing
conditions. In this study, we estimated the killing ability of UVA-LED for avian pathogenic
Escherichia coli（APEC）, which often causes infectious disease in poultry houses. UVA-LED
irradiation shows the effective bactericidal killing ability for APEC as well as clinical or foodisolated Escherichia coli. Here we applied UVA-LED into the poultry house and estimateddifference of hygienic condition. UVA-LED did not affect the number of bacterial cells but itchanged bacterial composition in the bedding of the poultry house. The genomic study
revealed that UVA irradiation reduced the Gammaproteobacteria, which contains many typesof pathogenic bacteria for humans and chickens. From these results, we showed the benefit of
UVA-LED light irradiation device into the poultry house, it may help an effective means for
improvement of hygiene in poultry house．

１．目

おり，世界的な需要の増加が見込まれている。世的界的な鶏の需要に対応するため，鶏の生産技術向鶏肉は肉類の中で安価である以外にも，高タン
パク質低脂質で健康視点から好まれ，また宗教に上に向けて，飼育環境や飼料の選択などさまざまな検討がこれまで行われている。

よる摂食制限がないことから世界的に安定的に消日本におけるブロイラー肉養鶏の生産は微増傾費されている。また今後も発展途上国の経済成長向にある。近年では鶏舎のシステム化・大規模化に伴って，世界規模での摂取量増加が見込まれてが進み，農家あたりの生産量が増加している。大© The Ito Foundation

348

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

型鶏舎においては，鳥インフルエンザなどの外部からの病原体の侵入で大きな打撃を受けてしまう
ため，感染予防の観点から，従来の開放型の鶏舎から，セミウインドレス，ウインドレスの鶏舎へ

２．方法

2 . 1 鶏病原性大腸菌に対するUVA-LED殺菌
評価と環境の移行が進んでいる。ウインドレス鶏舎で鶏に病原性を示す大腸菌に対し，UVA-LEDがは，外部との接触が極端に低減するため感染症の有効な殺菌効果を示すのかを調べるため，鶏大腸リスクを著しく低下させることができるが，一度菌症の起因菌（６株）を用い殺菌試験を行った。

病原体が混入すると一気に鶏舎内に拡散してしま

実験に使用する大腸菌は－80℃で保管し，実際にうリスクもはらんでいる。

使用する際には菌を少量採取し，LB培地で一晩

UV-LEDは紫外（UV）領域の光（400nm以下

振盪培養したものを実験に使用した。12,000rpmの光）を発する，発光ダイオード（LED）であ

３分間の遠心により，菌を沈殿させ，上清の培養り，特に太陽光に近い紫外線（UVA）を発する

液を取り除いた。リン酸バッファー（PBS）を加LEDライトは市販され，さまざまな分野に応用

えて菌体を洗浄し，遠心，PBS洗浄操作を３回繰されている。UVAを発光するUV-LEDは，水銀

り返し，細胞外成分を取り除き，菌体を洗浄した。

発光管による紫外線殺菌（UVC）に比べ殺菌効

殺菌実験にはOD600＝1.0の懸濁液に調整した菌果は弱いものの，食品や生物が存在する環境下で懸濁液を用いている。異なる背景の大腸菌間でもマイルドな殺菌効果を発揮することができるた

UVA感受性に違いが生じるのかを調べるため，

め衛生環境を向上させる新しい殺菌システムとし臨床分離株，食品から分離された大腸菌株を用て注目を集めている。

い ，96well プ レ ー ト の UVA 同 時 照 射 モ デ ル

LED光源は水銀発光管と異なり廃棄時に水銀が（0.1mlの菌液に対して0.23Ａ設定で５分UVA照生じない環境に優しい光源となっている。また

射：38.85J/cm２）で殺菌評価を行った。鶏病原性

LED光源は点灯後すぐに安定した発光を行うこと

大腸菌のUVA感受性を調べる検討では，効率よができ，熱線を発しないため熱に弱い食品や生物

くUVAを照射するため，ステンレス製容器を用にも適応が可能であり，必要な波長のみ効率的にいた照射モデル（0.3mlの菌液に対して0.5Ａ設定

照射することもできる。さらにLEDは衝撃に強い

でUVA照射）で検討を行った。殺菌効果についため応用性が高く，寿命も長く経済的であるため，て は 得 ら れ た CFU の 数 値 か ら Log 生 存 比 {Log

照射の用途によってさまざまな利点が存在する。

（UVA照射で得られたCUF/コントロールで得ら

我々の研究グループでは，近年開発が進んでいれたCFU）}を算出した。

るUVA-LEDの有用性に着目し，これまでにさま2.2

ざまな病原性細菌に対してUVA-LEDの殺菌効果

徳島県立農林水産総合技術支援センター鶏舎にを研究してきた１～10）。

UV-LED照射による床敷菌叢の変化

UVA-LED光源を導入し，UVA照射区と，コン

本研究では，鶏舎で問題となる鶏病原性大腸菌

トロールとしての非照射区の２区画を作成し鶏のをターゲットに，UVA-LEDによる殺菌効果を評飼育を行った。肉用鶏（ブロイラー）は１回の実

価し，UVA-LEDを導入した鶏舎で，床敷中に含験につき飼育密度が１ｍ２ あたり11.5羽となるよ

まれる大腸菌群の分布変動から衛生環境の変化をうに雌雄を混合させ部屋に入れた。UVA照射区評価した。

におけるLEDのUVA放射照度は15.1μW/cm２ と© The Ito Foundation

349

UV-LED光殺菌を用いた，鶏病原性大腸菌殺菌システムの開発なるように設置した。６週間の飼育期間中，床敷の大腸菌について，UVAに対する殺菌効果につ状態をモニタリングするため，床敷中の水分量のい て 評 価 を 行 っ た 。同 条 件 の UVA-LED 照 射測定を行った。また各週床敷を採取し（鶏飼育期（0.23Ａ設定で５分UVA照射：38.85J/cm２）によ

間１-６週間），これをサンプルとして菌数・菌叢る同条件でUVA照射し殺菌効率を評価した結果，の解析に用いた。

鶏病原性大腸菌は，食品由来の大腸菌，臨床由来

床敷は秤量後，リン酸バッファー（PBS）を加の大腸菌などと同程度の感受性（殺菌効率）を示

えて床敷懸濁液を作成した。床敷懸濁液をPBSですことが明らかとなった（Fig.１）。この実験結希釈し，標準寒天培地に塗抹し，37℃で48時間培果からUVA-LEDはヒトに対して病原性を示す大養 を 行 い ，菌 数 を コ ロ ニ ー 数（colony forming

腸菌同様に，鶏病原性大腸菌に対しても有効な殺unit：CFU）で定量的に評価した。殺菌効果につ菌効果を示すことが確認できた。また，おおむね

いては得られたCFUの数値からLog生存比{Log１桁大腸菌の生菌数を減らすためには15-30J/（UVA照射区で得られたCUF/非照射区で得られcm２ の光量（放射照度）のUVAが必要となるこたCFU）}を算出し，グラフ化している。

とも明らかとなった（Fig.２）。

また，床敷よりバクテリアのゲノムDNAを抽

3 . 2 鶏舎へのUVA-LED導入による床敷中雑出し，次世代シークエンサーを用い，雑菌組成に菌数の変化，および床敷中菌組成の変化

ついても解析を行った。

3.1の検討の結果からUVAはしっかり照射する
ことで，大腸菌を殺菌することはできるが，短時

３．結果と考察間の照射で殺菌効果を得ることが難しいことが明3 . 1 鶏病原性大腸菌に対するUV-LED殺菌評

らかとなった。そこで実際に徳島県立農林水産総合技術支援センター鶏舎にUVA-LED光源を導入

鶏病原性大腸菌，臨床由来の大腸菌，食品由来

LOG SURVIVAL
RATIO

A

LOG SURVIVAL
RATIO

C

1

1

2

APEC
3

4

5

－1
－3
－5

5 Min

－7

1
－1
－3
－5
－7

1

し，照射区非照射区で床敷中の雑菌数と菌組成

B

1
－1
－3
－5
－7

1

E. coli : Clinical isolate
2345LOG SURVIVAL
RATIO

価

6

5 Min

E. coli : Food isolate
2
3
4
5
6

5Min

Fig. 1 Bacterial killing ability of UVA irradiation in several type of E. coli．

Different type of E. coli were categorized in 3 groups,（A）Avian Pathogenic E.

coli,（B）Clinical isolated E. coli, and（C）food isolated E. coli. Bacterial cells weresuspended in PBS and irradiated same power of UVA-LED（0.23A for 5min：
388.85 J/cm２）.Each number（1-5，1-6）indicated different strain of E. coli. Values
are shown as means±SD（n＝3，n＝number of independent replicates）© The Ito Foundation

350

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Log survival ration

J/cm２
0
0

10

20

30

40

－1
－2
－3
－4
1

－5

2

3

4

5

6

Fig. 2 Bacterial killing ability by UVA irradiation in APEC strains．
Each number（1-6）indicated different strain of APEC. UVA

irradiations decreased living APEC cells number （CFU）
energy （J/cm ２） dependently. According to Log survival
ration，15-30J/cm２ energy were required for 90％（Log-1）
bacterial killing. Values are shown as means ± SD（n＝3，n＝number of independent replicates）

CFU（/g）
1E+10

UVA（－）
UVA（＋）

100000000
1000000
10000
100
1

1W

2W

3W

4W

5W

6W

Fig. 3 Bacterial cell number of bedding in the poultry house．

The bacterial cell numbers were estimated by colony forming

unit on standard agar plate. The bedding were collected each
week, but we could not find any colony in 0 week. Bacterialcell number of 1 week to 6 week were indicated 1 g of
bedding. Values are shown as means ± SD（n＝3，n＝numberof independent replicates）（菌叢）について比較検討を行い，UVA-LED光

た。またシークエンスデータからγ-proteobacteria

源導入による衛生環境の改善効果を調べた。床敷を抽出し，UVA照射区と非照射区での比較検討

中の雑菌数を継時的に評価した結果，UVA照射を行った結果，６週の床敷で有意に減少している区と非照射区の間で菌数に大きな変化は認められことが明らかとなった（Fig.４）。γ-proteobacteria

なかった（Fig.３）。一方で床敷懸濁液からDNAには大腸菌など，鶏や人に対して病原性を示す菌を抽出し，次世代シークエンサーで菌組成についが多く含まれている。実際にUVA照射で減少して評価すると，興味深いことにUVA照射区では，特た菌を特定するために，さらに目レベルでの解析に６週 で Proteobacteria 門 -Gammaproteobacteria

を 実 施 し た 結 果 ，大 腸 菌 な ど が 含 ま れ る綱の菌組成が減少していることが明らかとなっEnterobacteriales で は 有 意 な 変 化 は 認 め ら れ な© The Ito Foundation

UV-LED光殺菌を用いた，鶏病原性大腸菌殺菌システムの開発

351

γ-proteobacteria
10000
8000
＊：p＜0.05

6000
4000

＊

2000
0

UVA（－） UVA（＋）
3w

UVA（－） UVA（＋）
6w

Fig. 4 Different composition of bacterial flora in bedding of thepoultry house．
The next generation sequencer revealed different compositionof bacterial flora in the bedding of poultry house. The “Class”
level data of Gammaproteobacteria were extracted andindicated in 3 weeks and 6 weeks bedding. Values are shownas means±SD（n＝3，n＝number of independent replicates）

γ-proteobacteria
1200
1000
800

＊：p＜0.05

600
400
200
0

＊

N. D.

N. D.

N. D.

UVA（－） UVA（＋）UVA（－） UVA（＋）UVA（－） UVA（＋） UVA（－）UVA（＋） UVA（－） UVA（＋） UVA（－）UVA（＋） UVA（－）UVA（＋）
Aeromonadales

Alteromonadales

Enterobacteriales

Oceanospirillales

p＝0.64786

p＝0.32063

Pseudomonadales

p＝0.02573

Thiotrichales

Xanthomonadales

p＝0.20286

p＝0.17780

Fig. 5 Different composition of bacterial flora inγ-proteobacteria．

The next generation sequencer revealed different composition of bacterial flora in the bedding of poultry

house. The Class of γ-proteobacteria were analyzed in “Order” level. Values are shown as means ± SD
（n＝3，n＝number of independent replicates）

かったが，日和見感染の起因菌として知られていからはγ-proteobacteriaに特有の変化を見出すこる，Pseudomonadalesで有意な減少が確認されたとに成功したが，その中でヒトや鶏に対して高い（Fig.５）。次世代シークエンサーの解析から，病原性を示すEnterobacterialesでは有意な変化は

Fig.３で示した寒天培地上でのCFUによる生菌数

認 め ら れ な か っ た 。し か し な が ら ，全 体 的 にの評価では判断できない，床敷中の病原性細菌のUVAの導入によって減少傾向を示していたこと

組成の変化を見出すことに成功した。今回の実験から，今後サンプル数を増やすことや，UVAの© The Ito Foundation

352

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

照射エネルギーの適正化を図ることで再評価を続ると，ヒトや鶏に対して病原性を示す菌が多く含けていく必要があると考えている。また，しばしまれる，Gammaproteobacteria綱の菌を減少させば雛鶏で感染拡大が問題となる日和見菌

ることが明らかとなった。これらの結果から鶏舎

PseudomonadalesはUVAの導入によって明らか

内へのUVA-LED光照射装置の導入は，衛生状態に減少していたため，UVAによって鶏舎内の衛の改善に有効な手段となる可能性が示された。

生環境は部分的ではあるが改善傾向にあることが確認できた（Fig.５）
。
４．要

約

日本におけるブロイラー肉養鶏の飼育は，シス
テム化・大規模化が進んでいる。大規模鶏舎は，鳥インフルエンザなど外部からの病原体の侵入により，大きな打撃を受けてしまう可能性があるた
め，感染予防のため従来の開放型鶏舎から，セミ
ウインドレス，ウインドレスの鶏舎へと環境の移行が進んでいる。ウインドレス鶏舎では，外部との接触が極端に低減するため感染症のリスクを著しく低下させることができるが，一度病原体が混入すると一気に鶏舎内に拡散してしまうリスクもはらんでいる。UV-LEDは紫外領域の光を発光する発光ダイオードであり，特に太陽光に近い紫外線（UVA）を発するUVA-LEDライトは，マイルドな殺菌効果を発揮することができるため，食品や生物が存在する環境下で衛生環境を向上させる新しい殺菌システムとして注目を集めている。本研究では，近年開発が進んでいるUV-LEDの有用性に着目し，鶏舎で問題となる鶏病原性大腸菌をターゲットにUV-LEDによる殺菌効果を評価し，UVA-LED導入による鶏舎内の衛生環境の変化を，床敷中の菌数・菌の分布から評価した。UVA-LED照射は，臨床由来の大腸菌や食品由来の大腸菌と同様に，鶏病原性大腸菌に対しても有効な殺菌効果を示すことが確認できた。実際に鶏舎にUVA-LEDを導入して実証検証を行った
結果，UVA-LEDは鶏舎内床敷中の雑菌数に影響しなかったが，菌叢（菌組成）に着目して評価す文献１） Le, N. T., Nagata, H., Aihara, M., Takahashi, A.,
Okamoto, T., Shimohata, T., Mawatari, K., Kinouchi,
Y., Akutagawa, M., Haraguchi, M.：Additional
effects of silver nanoparticles on bactericidal
efficiency depend on calcination temperature anddip-coating speed, Appl Environ Microbiol, Aug 15,
77（16）,5629～34, 2011．
２）
 Nhung le, T. T., Nagata, H., Takahashi, A.,
Aihara, M., Okamoto, T., Shimohata, T., Mawatari,K., Akutagawa, M., Kinouchi, Y., Haraguchi, M.：
Sterilization effect of UV light on Bacillus sporesusing TiO（2）films depends on wavelength, J Med
Invest, 59（1-2）,53～8, 2012．
３）
 Aihara, M., Lian, X., Shimohata, T., Uebanso, T.,
Mawatari, K., Harada, Y., Akutagawa, M., Kinouchi,Y., Takahashi, A.：Vegetable surface sterilization
system using UVA light-emitting diodes, J Med
Invest, 61（3-4）,285～90, 2014．
４）
 Nakahashi, M., Mawatari, K., Hirata, A., Maetani,
M., Shimohata, T., Uebanso, T., Hamada, Y.,
Akutagawa, M., Kinouchi, Y., Takahashi, A.：
Simultaneous irradiation with different wavelengths
of ultraviolet light has synergistic bactericidal
effect on Vibrio parahaemolyticus, Photochem
Photobiol, Nov-Dec, 90（6）,1397～403, 2014．
５）
 Hou, Y., Nakahashi, M., Mawatari, K., Shimohata,
T., Uebanso, T., Harada, Y., Tsunedomi, A., Emoto,T., Akutagawa, M., Kinouchi, Y., Takahashi, A.：
Combined treatment of UVA irradiation andantibiotics induces greater bactericidal effects on
Vibrio parahaemolyticus, J Med Invest, 63（1-2）, 63～7，2016．
６）
 Tsunedomi, A., Miyawaki, K., Masamura, A.,
Nakahashi, M., Mawatari, K., Shimohata, T.,
Uebanso, T., Kinouchi, Y., Akutagawa, M., Emoto,T., Takahashi, A.：UVA-LED device to disinfecthydroponic nutrient solution, J Med Invest, 65（3. 4）,
171～176, 2018．
７）
 Nishisaka-Nonaka, R., Mawatari, K., Yamamoto,T., Kojima, M., Shimohata, T., Uebanso, T.,
Nakahashi, M., Emoto, T., Akutagawa, M., Kinouchi,
Y., Wada, T., Okamoto, M., Ito, H., Yoshida, K. I.,
Daidoji, T., Nakaya, T., Takahashi, A.：Irradiation
by ultraviolet light-emitting diodes inactivatesinfluenza a viruses by inhibiting replication and© The Ito Foundation

UV-LED光殺菌を用いた，鶏病原性大腸菌殺菌システムの開発
transcription of viral RNA in host cells, J
Photochem Photobiol B, Dec, 189, 193～200, 2018．
８） Shimohata, T., Mawatari, K., Uebanso, T., Honjo,
A., Tsunedomi, A., Hatayama, S., Sato, Y., Kido, J.,
Nishisaka, R., Yoshimoto, A., Yamashita, T., Amano,S., Maet ani - Y asu i, M. , Ib a, H. , Harad a, Y. ,Nakahashi, M., Yasui-Yamada, S., Hamada, Y.,
Nakagawa, T., Sogabe, M., Emoto, T., Akutagawa,
M., Okahisa, T., Kinouchi, Y., Takahashi, A.：
Bacterial Contamination of Hemodialysis Devices in
Hospital Dialysis Wards, J Med Invest, 66（1.2）, 148～152, 2019．
９） Maria, U., Azuma, M., Sato, M., Shimohata, T.,
Fukushima, S., Kido, J., Nakamoto, M., Uebanso, T.,
Mawatari, K., Emoto, T., Akutagawa, M., Kinouchi,

353

Y., Takahashi, A.：Inactivation of Extendeds p e c t r u m β- l a c t a m a s e （ E S B L ）- p r o d u c i n g
Escherichia coli by UVA-LED irradiation system, J
Med Invest, 67（1. 2）,163～169, 2020．
10）
 Kojima, M., Mawatari, K., Emoto, T., NishisakaNonaka, R., Bui, T. K. N., Shimohata, T., Uebanso, T.,
Akutagawa, M., Kinouchi, Y., Wada, T., Okamoto,M., Ito, H., Tojo, K., Daidoji, T., Nakaya, T.,
Takahashi, A.：Irradiation by a Combination ofDifferent Peak-Wavelength Ultraviolet-Light
Emitting Diodes Enhances the Inactivation of
Influenza A Viruses, Microorganisms, Jul, 8；8（7）,1014, 2020．

© The Ito Foundation

354

網羅的ジェノタイピングによる新規牛白血病抵抗性遺伝子の同定（Ⅱ）
Identification of novel bovine leukosis resistance-associated alleles bycomprehensive genotyping（Ⅱ）

目

堅

博

久

（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）

Hirohisa Mekata（Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki）

Bovine leukemia virus（BLV）is an etiological agent of malignant lymphoma in cattle
which is called enzootic bovine leukosis（EBL）. Approximately 35％ of cattle in Japan havebeen infected with BLV. BLV can cause lifelong infection, and no vaccines or therapeutic
procedures are currently available to prevent BLV infection or the development of EBL.
Therefore, novel control methods to reduce the incidence of EBL are required from livestockindustries. Cattle with higher BLV proviral loads represent a higher risk of both horizontal andvertical transmission. Thus, development of methods reducing the proviral load in cattle shouldbe effective to protect BLV-free cattle. A genome-wide association study to identify single
nucleotide polymorphisms（SNPs）associated with BLV proviral load was conducted in thisstudy. The study examined 142 cattle with a low proviral load and 146 with a high proviralload. Single SNP（ID；AX-168291905）on chromosome 1 was significantly correlated with
proviral load. The result indicates the SNP could be associated with proviral load. We believethat this study will promote the construction of effective measures to prevent BLV infection
and control the spread of BLV．

１．目

一の対処法である。2009 - 11年に行われた全国調的査の結果，日本では約35％の牛がBLVに感染し

牛伝染性リンパ腫は，最も報告数が多い牛の監ていた１）。発症届出数も20年間，増加の一途をた視伝染病であり，その多くを牛伝染性リンパ腫ウ

ど っ て お り ，新 し い 対 策 法 が 求 め ら れ て い る

イ ル ス（bovine leukemia virus ： BLV）の 感 染（Fig.１）。

を原因とする地方病型が占める。BLV感染牛のBLVは主に昆虫の吸血活動，血液や体液が付

多くは症状を示さないが，約５％が感染から数年着した器具の使い回し，胎盤や初乳を介して伝播

後に牛伝染性リンパ腫を発症して死亡もしくは全する。感染から半年ほど経過すると，血液中のプ

廃棄処分となる。BLVは生涯持続感染するうえ，

ロウイルス量は安定するが，その量は個体ごとに感染や発症に対するワクチンや治療薬はない。そ大きく異なる（Fig.２）。我々は長期に及ぶ農場のため，BLV感染を防ぐことが農場でできる唯で の 試 験 か ら ， 500 copies/50 ng （of genomic© The Ito Foundation

網羅的ジェノタイピングによる新規牛白血病抵抗性遺伝子の同定（Ⅱ）

355

Fig. 1 Year change of the notification number of bovine leukosis in JapanT he figure was made by data from the occurrence of the monitoredinfectious diseases in MAFF（https://www.maff.go.jp/j/syouan/douei/
kansi_densen/kansi_densen.html）．

Fig. 2 Histogram of bovine leukemia virus proviral load in Japanese Black and Holstein cattle．

BLV proviral load in a total of 2,560 BLV-infected cattle are depicted in frequency distributions.

The median values were 572.0 and 1,679 copies/50 ng in Japanese Black and Holstein cattle,
respectively.（Mekata, H.：The Journal of Farm Animal in Infectious Disease, 7, 163-168, 2018）

DNA）以下の感染牛が日本の飼養環境下においめ３），新生子牛を新たな感染源としない，すなわて，ほぼ感染源とならないことを証明した２）。つち，新生子牛のプロウイルス量を抑える方法が必

まり，すべての感染牛を対象とした牛白血病対策要である。細胞表面に発現するMHC classⅡ分子ではなく，プロウイルス量が高い高リスク牛に対はウイルス由来の抗原ペプチドを免疫担当細胞へ象を絞った牛白血病対策が効率的である。感染率と提示し，獲得免疫反応の惹起につながる。牛のが高い農場では，経営を維持するためにも高リス

MHC classⅡ遺伝子の一種であるBoLA class Ⅱ

ク牛による繁殖が欠かせない。しかし，高リスク

DRB3 *0902遺伝子（0902遺伝子）をヘテロもし

牛 は 約 40 ％ の 確 率 で BLV を 母 子 間 伝 播 す る た

くはホモで持つ牛は，プロウイルス量が極端に低© The Ito Foundation

356

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）い４）。つまり，高リスクの母牛に0902遺伝子を持

2.2

つ種牛を交配することで，新生子牛を50％以上のリアルタイムPCRの結果，2,000copies/50ngを確率で低リスク牛にすることができる。一方で，

超えた146検体を高リスク群，100copies/50ng以

特定の遺伝子への偏りは，遺伝的多様性の消失に下の142検体を低リスク群とした。なお，遺伝的つながり，異なる感染症等に対して重篤な被害をな偏りを防ぐため，１農場あたり最大３検体をもたらす可能性が否めない。そこで，0902遺伝子

SNP Array に 供 し た 。SNP Array（GeneTitan,

以外にもプロウイルス量を制御できる牛白血病抵

Axiom Bovine Genotyping v3 Array；サ ー モ サ

抗性遺伝子の特定が望まれる。

イエンティフィック社）はタカラバイオ社（草SNP Array解析

これまでの調査で，0902遺伝子は6.8％の牛が津，日本）およびサーモサイエンティフィック社

保有していた 。一方，感染牛の33％は非常にウに受託解析した。データ解析はSNP & Variation

イルス量が低い。つまり，0902遺伝子以外にも牛Suite（ゴールデンヘリックス社，ボーズマン，

白血病抵抗性遺伝子が存在する可能性がある。そ米国）を用いた。サンプルデータのクオリティ

こで本研究では，プロウイルス量と宿主遺伝子一チェックはCall rate＞0.95を，ジェノタイピング

塩基多型（SNPs）とのゲノムワイド関連解析か

データのクオリティチェックはCall rate>0.95，

ら，新規牛白血病抵抗性遺伝子を同定することをMinor allele frequency>0.01 ， Hardy Weinberg

目的とした。

平衡p＞0.001を条件とした。本研究では，ヘテロ

４）

２．方
2.1

でプロウイルス量に寄与する遺伝子を探索するこ法とを目的としたため，優性および劣性モデルによる SNP 関 連 解 析 を 行 っ た 。統 計 解 析 は フ ィ ッ

検体2018 年 ４ 月 か ら 2020 年 10 月 ま で に 採 取 し た

シャーの正確確率検定で行い，ボンフェローニ補BLV感染牛（黒毛和種，12ヶ月齢以上，雌）の正より算出した値（＝0.05/比較したSNP座位数）

血液を使用した。指示書に従いELISA法（牛白未満を有意差ありとした。

血病エライザキット；ニッポン・ジーン，東京，
日本）により抗BLV抗体を検出した。抗BLV抗３．結果と考察体 陽 性 の 検 体 に つ い て は ， Wizard Genomic

SNP Arrayに供した全288検体がサンプルのク

DNA Purification Kit（プロメガ，マディソン，

オリティコントロールを満たした。また，Axiom

米国）もしくはmagLEAD 12gc（プレシジョン・Bovine Genotyping v3 Arrayに配置された65,003

システム・サイエンス，松戸，日本）を用いてゲ個の常染色体上のSNPsのうち，39,338個がクオノムDNAを抽出した。抽出したDNAは分光光度

リティーコントロールを満たした。そこで，これ計（NanoDrop8000；サーモサイエンティフィッ

ら39,338個のSNPsについてプロウイルス量とのク，ウォルサム，米国）を用いてDNAの純度お相関解析を行った。優性モデルによるSNP関連解

よび濃度を測定した。抽出DNAを鋳型にして既析において，有意水準であるp<1.27ｘ10－６を満た

報のプライマー/プローブ配列を用いてリアルタ

すSNPが１つ存在した（Fig. 3a）。また，劣性モ

イムPCRを行い，プロウイルス量を定量した 。

デルでは，有意水準を満たすSNPは存在しなかっ本研究では，ELISA法とqPCR法でともに陽性のた（Fig. 3b）。有 意 差 が あ っ た SNP（ID ： AX-

検体をBLV感染とし，以後の解析に用いた。

168291905）は１番染色体上95，193，165bpに位

５）© The Ito Foundation

357

網羅的ジェノタイピングによる新規牛白血病抵抗性遺伝子の同定（Ⅱ）

Fig. 3 Manhattan plot of a genome-wide association study on bovine leukemia virus proviral load in

288 cattle．
Manhattan plot of dominant and recessive model are depicted. The number of chromosomes andthe negative logarithm of the association p values are displayed along the x-axis and y-axis,
respectively. p value was calculated by Bonferroni correction and the line indicated the p value of
1.27x10-6．

Table 1 Allele type of AX-168291905 SNP among cattle with high and low BLV proviral load．
A_A

A_G

G_G

Total

High proviral load（＞2000copies/50 ng）

69

60

13

142

Low proviral load（＜100copies/50 ng）

111

31

3

145

Total

180

91

16

287*

*1 sample could not be identified the allele

置し，epithelial cell transforming sequence 2

かった（Fig.３）。一般的に，DNAチップはSNP（ECT2）をコードする遺伝子にある。メジャー

座位を密に観測するため，真の関連座位であれアレルはＡ，マイナーアレルはＧであり，このば，その付近の座位も小さなｐ値を示すことが多SNPとプロウイルス量の関係はTable１のとおり

い。このことから，AX-168291905は偶然に有意であった。オッズ比は3.45，p＝9.75ｘ10 であっ

水準を満たした可能性も考えられる。牛のSNPアた。つまり，このSNPにおいて，Ｇをホモもしく

レイは，一般的なヒトやマウスでのSNPアレイ

はヘテロで持つ牛は，Ａをホモで持つ牛に比べ（50 - 100万座位）と比べて，座位数が圧倒的に少て，有意に低リスク群が多いことを示す。一方で，ない。このことが，マウスやヒトのアレイとは異このSNPの近傍では，小さなｐ値が観測されななる傾向を示した可能性も考えられる。今後は，－７© The Ito Foundation

358

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

このSNPとプロウイルス量との相関について，型（SNP）とのゲノムワイド関連解析から明らか

SNPを検出するプローブを作成したうえで，リアにすることを本研究の目的とした。本研究では，

ルタイムPCR法もしくはデジタルPCR法によって高ウイルス牛と低ウイルス牛の血液146および142

検体数を増やして検討する必要がある。本研究で検体をSNP Array解析に用いた。その結果，１は，23番染色体において，少ないｐ値が多く検出

番染色体上の１つのSNP（ID：AX-168291905）

される傾向にあった。BLVでは，23番染色体ににのみ有意差が認められた。AX-168291905は１コードされているBoLA classⅡの多型領域がプ番染色体上95，193，165bpに位置し，epithelial

ロウイルス量と相関を示すことが多くの研究で明cell transforming sequence 2（ECT2）をコード

らかにされている。このことから，SNPアレする。本研究の結果，BLVプロウイルス量に関イに供した検体数としては，充分な数だったと判与する可能性があるSNPを１つ同定することがで断できる。

きた。しかし，近傍の座位ではプロウイルス量と

４．要

６，７）

の相関が認められないことから，偶然の可能性も約否定できない。今後は，本研究で特定したSNPと

牛伝染性リンパ腫ウイルス（BLV）の感染を原因とする牛伝染性リンパ腫は，2008年以降，最プロウイルス量との相関について，さらに検体数を増やして解析を継続する必要がある。

も多い牛の監視伝染病である。日本では30 - 40％の牛がBLVに感染していることから，新たな対策法の開発が必要である。すべての感染牛がBLVの感染源となるのではなく，プロウイルス量が高い牛のみが感染源となる。そこで，プロウイルス
量を遺伝学的な手法で抑えるアプローチが有効である。牛のBoLA classⅡの多型領域は，個体により大きく異なり，それがプロウイルス量の決定に寄与することが明らかとなっている。そこで，それ以外の宿主遺伝子にもプロウイルス量に寄与

文献１） Murakami, K., et al.：J. Vet. Med. Sci., 75, 1123～
1126, 2013．
２）
 Mekata, H., et al.：Jpn. J. Vet. Res., 66, 157～163,2018．
３）
 Mekata, H., et al.：Vet. Rec., 176, 254, 2015．
４）
 Hayashi, T., et al.：J. Vet. Med. Sci., 79, 1552～
1555, 2017．
５）
 Takeshima, S.-N., et al.：Arch. Virol., 160, 1325～
1332, 2015．
６） van Eijk, M. J., et al.：Anim. Genet., 23, 483～496,
1992．
７） Lo, C. W., et al.：Viruses, 12, 352, 2020．

する遺伝子があるのかを，宿主遺伝子の一塩基多© The Ito Foundation

359

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査（Ⅲ）
A survey of gastrointestinal parasites infection and implementation ofparasite control program in cattle（Ⅲ）

森

本

素

子

（宮城大学食産業学群）

Motoko Morimoto（School of Food Industrial Sciences, Miyagi University）

Lean meat from pasture grazing cattle has become popular for Japanese consumers as
healthy and tasty. However, it is a challenging task to control internal parasites in grazing
livestock. When the gastrointestinal nematode infects the host, intestinal epithelium and innate
lymph cells are activated and induce Th2 immune responses. However, cattle rarely show
extremely severe clinical disease during parasite infection, so that many owners fail torecognize the loss of productivity. Ivermectin is a highly effective medication against ticks ornematodes；however, antiparasitic drug resistance incidents increase these days. The fieldstudy investigating an infestation of gastrointestinal parasites has been conducted nation-wide
in Japan in the 1990s, but not recently．
In this study, the field study was performed to investigate an infestation of gastrointestinal
parasites and deworming practice in public pastures in Miyagi so far．
This year, we conducted a survey in prefectures other than Miyagi and compared it withthe results in Miyagi. Rectal stools were collected from 10 to 20 cattle in 6 pastures（A, B, C, D,
E, F）in Iwate, Akita, Ehime（2 locations）, Oita, and Miyazaki prefectures. An egg test was
performed using the modified Wisconsin method, the type of insect was identified from themorphology of the egg, and the number of eggs was measured. The test targeted nematodes,
coccidia, and Moniezia benedeni in the gastrointestinal tract. Gastrointestinal nematode eggs
were detected at a relatively high rate in farms that did not use ivermectin, and it wasconsidered necessary to review the anthelmintic program. It is important for pastures hygieneto actively conduct parasite egg tests on grazing cattle to understand the actual situation andimplement an appropriate anthelmintic program．

１．目

牛の赤身肉は健康的で食べ応えがあるとして，消的費者にも人気が高まっている。しかし，放牧は感

近年，生産コストの削減や省力化だけでなく，染のリスクを高め，その結果甚大な経済的損失を家畜のアニマルウェルフェアや畜産物の付加価値もたらす場合がある。線虫感染により，腸管粘膜生産を目的とした放牧が注目を浴びている。放牧下の免疫細胞が活性化し，上皮に作用して粘液産© The Ito Foundation

360

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

生を増し，平滑筋の運動が活発になって蠕動運動が増す。その結果，腸内細菌叢も変化し，他

１，
２）

実施した。
①牧場規模

の病原体に対する免疫応答にも変化をもたらす。

②使用している駆虫剤の種類

しかし一方で臨床に目を移すと，消化管内寄生虫③投薬時期および回数

感染では死に至る重篤な病態はまれであり，外観④放牧の時期からは家畜のダメージを見極めるのが難しいことも多い。そのため，寄生虫感染が宿主消化管の生３．結果と考察

理機能の変化をもたらし，潜在的な損耗を与えて【Ａ牧場】放牧地面積は14ha，採草地は14.6ha，いることを見逃しがちである。その結果，生産性

放牧牛は黒毛和種８頭，日本短角種21頭を飼育しを上げることを目的に給与される免疫賦活飼料やている。このうち黒毛和種４頭，短角種18頭を供

生菌剤が，期待される効果を発揮することが困難

試した。消化管内線虫卵は９％（2/22）の牛が陽になる場合がある。駆虫薬として，イベルメクチ

性 で あ っ た 。コ ク シ ジ ウ ム オ ー シ ス ト は 73 ％ン系の製剤が開発され，効果をあげるようになっ（16/22）が陽性であった。ベネデン条虫卵は検出たが，開発から時間が経ち，近年では適切なされなかった。駆虫薬として，イベルメクチン製

駆虫プログラムが行われず，効果が十分得られな剤であるバイメックトピカルが月に一度の割合でい例や，耐性をもつ虫が出現して感染をコント投与されていた。今回の調査は最終投薬日から13ロールできていない例が報告されるようになって日後であった。

きた 。わが国では，1990年代に消化管内寄生虫【Ｂ牧場】放牧地面積1.3ha，黒毛和種成牛39頭，

感染についての全国的な疫学調査が行われた ７）

育成牛13頭，日本短角種成牛13頭を飼育していが，その後は地域限定的に調べられている程度る。このうち黒毛和種13頭，日本短角種３頭を供で，まとまったデータはない。そこで本研究では，試した。消化管内線虫卵は31％（5/16）が陽性で昨年度までに宮城県の牧場において駆虫プログラあった。コクシジウムオーシストは69％（11/16）

ムのヒアリングを行うとともに，採糞して虫卵検が陽性であった。ベネデン条虫は検出されなかっ査を実施し，消化管内寄生虫の浸潤度を調査した。放牧直前にフルメトリン製剤が投与され，そた。本年度は他県の状況を調査して，宮城県の状の後８月中旬に再度投与されていたが，採材直近

況と比較することとした。

に投薬は実施されていなかった。

３～５）

６）

２．方

【Ｃ牧場】放牧地面積９ha，ホルスタイン種51頭

法を飼育している。このうち10頭を供試した。消化

岩手県，秋田県，愛媛県（２か所），大分県，

管内線虫卵は40％（4/10）が陽性であった。コク宮崎県の６か所（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ）の放シジウムは70％（7/10）が陽性であった。ベネデ

牧場で10～20頭を抽出し，直腸便を採取した。

ン条虫は検出されなかった。駆虫薬は投与されてウィスコンシン変法を用いて虫卵検査を実施し，いなかった。

虫卵の形態から虫の種類を同定し，虫卵数の計測【Ｄ牧場】放牧地面積３ha，褐毛和種15頭を飼育を行った。消化管内線虫，コクシジウム，ベネデ

している。このうち10頭を供試した。消化管内線

ン条虫を対象とした。

虫卵は検出されなかった。コクシジウムは70％

同時に，以下の項目についてヒアリング調査を（7/10）が陽性であった。ベネデン条虫は10％© The Ito Foundation

361

化管内線虫卵が検出され，コクシジウムオーシス

0（0/16）0（0/22）9（2/22）100（16/16）
75（12/16）

90.1（20/22）
135（65-209）

14（13-1４）
16

22
2020.12020.8.20
ivermectin

flumethrin

0（0/17）10（1/10）70（7/10）100（17/17）
76（13/17）0（0/10）78.1（18-136）

14（13-14）17

102020.6
ivermectin2020.50（0/16）0（0/10）70（7/10）73（16/22）

69（11/16）
31（5/16）40（4/10）25.5（24-79）

88（44-164）16

102020.4.15－7.20

2020.8.31

2020.12.1
F

和種22頭を供試した。90.1％（20/22）の牛に消

ivermectin

60頭，肥育牛45頭を飼育している。このうち黒毛2020.8.9

ルスタイン種30頭，黒毛和種繁殖母牛50頭，子牛

2020.8.20【Ｆ牧場】放牧地面積15ha，採草地面積25ha，ホEの変更など対策が必要であると考えられた。

D

イベルメクチン製剤の効果が低下しており，薬剤

flumethrin

100％（16/16）の牛で陽性であった。Ｅ牧場では2020.8.4

線虫卵が検出され，コクシジウムオーシストは2020.8.1011頭）を供試し，75％（12/16）の牛に消化管内B

く16頭（ブラウンスイス種５頭，ホルスタイン種

C

目の調査では，糞便がうまく取れなった１頭を除

date ofmedication

れた。ベネデン条虫卵は検出されなかった。２回

Table 1 The ratio of gastrointestinal parasites positive cattle（17/17）の牛にコクシジウムオーシストが検出さ

medicineに 消 化 管 内 線 虫 卵 が 検 出 さ れ ， 全 頭 100 ％date of sampling

評価した。１回目の調査では76％（13/17）の牛

farm

し，10日後に２回目の採材を行って投薬の効果を

the numberof samples

average age ofmonths（minimummaximum）

回目の採材と同時にイベルメクチン製剤を投与

9（2/22）間隔でバイチコールが投与されていた。今回は１55（12-161）

イベルメクチン製剤が投与され，その後は２週間

22

タイン種12頭を供試した。Ｅ牧場では，入牧前に2020.7.30ている。このうちブラウンスイス種５頭，ホルス

ivermectin

用牛（黒毛和種，交雑牛）1,000頭以上を飼育し2020.8.13

タイン種・ブラウンスイス種）3,000頭以上，肉A【Ｅ牧場】放牧地面積は150ha，乳用牛（ホルスCoccidia

日後であった。

Nematodes

positive ratio（%）（positive/total）

ンプアオン剤が投与されていた。採材日は投薬40

Moniezia
benedeni（1/10）が陽性であった。６月末にイベルメクチ

0（0/22）

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査（Ⅲ）

トが９％（2/22）の牛に検出された。ベネデン条虫卵は検出されなかった。Ｆ牧場ではイベルメク

管内寄生虫感染が拡がっていることが明らかにチン製剤は投与されておらず，フルメトリン製剤

なった８，９）。今回の調査により，全国各地の放牧が３月と10月に投与されていた。Ｆ牧場では消化場においても消化管内寄生虫感染対策についての管内線虫の保有率が高いので，イベルメクチン製関心は高くなく，一定の管理がなされていない牧剤の使用を検討する必要があると考えられた場が存在する実態が明らかになった。その中で（Table１）。

も，Ｅ牧場を除き，イベルメクチン製剤を使用し昨年までの調査で，宮城県において高率に消化ている牧場では線虫卵陽性率が低い傾向が認めら© The Ito Foundation

362

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

近では耐性を示す虫の事例が報告されている。消Positive ratio（％）

Positive ratio of nematodes
100

化管寄生虫の浸潤状況を調べるため，1990年代に80は全国的な調査が行われたが，近年は実施されて

60
40

いない。

20
0

＋

本研究では，これまでに宮城県の放牧場におけ－る消化管寄生虫の浸潤度と駆虫状況を調査した。

Ivermectin
Fig. 1 Positive ratio of nematode with（＋）/without（－）

今年度は，宮城県以外の県において調査を実施

administration of ivermectin. Comparison ofnematode egg positive rates between farms treatedwith ivermectin and farms not treated with
ivermectin (mean ± SEM)
Farm A：▲ Ｂ：■ Ｃ：△ Ｄ：● Ｅ：○Ｆ：□

し，宮城県の結果と比較した。岩手県，秋田県，れたことから，イベルメクチン製剤の適切な投与

定し，虫卵数の計測を行った。検査は消化管内線が牧野衛生に重要であることが示唆された。一虫，コクシジウム，ベネデン条虫を対象とした。

方，Ｅ牧場では，イベルメクチン製剤に対する耐イベルメクチン製剤を使用していない牧場では比性を獲得した虫が出現している可能性があり，薬較的高率に消化管内線虫卵が検出され，駆虫プロ剤の感受性についてさらに調査して，駆虫薬を選グラムの見直しが必要と考えられた。放牧牛は積択していく必要があると考えられた（Fig.１）。

極的に寄生虫卵検査を行って実態を把握し，適切

本研究の結果，多くの放牧場で消化管内寄生虫が広く浸潤していること，その原因の一つとし愛媛県（２か所），大分県，宮崎県の６か所（A，B，C，D，E，F）の放牧場で10～20頭を抽出し，直腸便を採取した。ウィスコンシン変法を用いて虫卵検査を実施し，虫卵の形態から虫の種類を同な駆虫プログラムを実施することが牧野衛生に重要であると考えられた。

て，適切な駆虫プログラムに従った投薬が行われていない現状が明らかになった。今後は生産農家，家畜保健衛生所および自治体担当者への情報提供や粘り強い啓蒙が重要であると考えられた。
４．要

約

放牧牛の赤身肉は，健康的でおいしいとして日本の消費者に人気がある。しかし，放牧家畜の寄生虫駆除は容易ではない。消化管線虫が宿主に侵入すると，消化管上皮や自然免疫細胞が活性化され，Th2免疫応答を誘導する。しかし，寄生虫感
染は重篤な臨床症状を示さないことが多く，飼養者は生産性の低下を認識しにくい。イベルメクチ

文献１） 森本素子：家畜感染症学会誌，5, 63～68, 2016．
２）
 Zhao, A., McDermott, J., Urban, J. F. Jr., et al.：J.
Immunol., 171, 948～54, 2003．
３）
 及川伸，川匂文男，平賀健二，本川正人，千葉由見，
小川徹三，福本真一郎：日獣会誌，51, 237～240，
1998．
４）
 髙橋俊彦：家畜診療，50, 339～347, 2003．
５）
 Nagata, T., Roncalli, R. A., Mishiba, T., Yamada, K.,
Ura, S.：Jpn. Bull. Animal Hyg., 42, 3～7, 1995．
６）
 Geurden, T., Chartier, C., Fanke, J., et al.：Int J
Parasitol Drugs Drug Resist, 5, 163～71, 2015．
７） 髙橋史昭：臨床獣医，36, 14～20, 2018．
８） 平成30年度 食肉に関する助成研究調査報告書
VOL.37，2019．
９） 平成31年度（令和元年度）食肉に関する助成研究
調査成果報告書 VOL.38，2020．

ンはダニや線虫に対して効果の高い薬剤だが，最© The Ito Foundation

363

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究（Ⅱ）―飼養成績と腸内細菌叢に及ぼす影響―
A study on requirements of lysine in weanling pigs（Ⅱ）- Effects on growth performances and microbiota -

勝

俣

昌

也・鈴

木

武

人

（麻布大学獣医学部）

Masaya Katsumata and Takehito Suzuki（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

We conducted this study in order to determine lysine requirements of weanling-growing
pigs estimated from their growth performances. Further, we also determined the effects of
dietary lysine concentrations on cecal microbiota in weanling-growing pigs. We prepared four
test diets of which concentrations of total lysine were 0.95, 1.20, 1.70, and 1.95％, respectively
and fed these diets to 5-week old barrows for 3 weeks. We estimated lysine requirements of
weanling-growing pigs from feed efficiencies during the latter 2 weeks of the feeding trial
using broken-line regression analysis; the estimation is 1.54％ as the concentration of totallysine in diets and 1.46％ as the concentration of standardized ileal digestible lysine. The
dietary lysine concentrations did not affect the cecal microbiota in this study; supplementationof antibiotics to test diets may be a reason of this.

１．目

本国内でも豚の育種改良は進んでいる。したがっ的て，日本飼養標準に記載されているリジン要求量

本研究は，離乳育成豚のリジン要求量を，飼養を参考にして飼料を調製すると，リジン不足に陥

成績と腸内細菌叢，２つの切り口から明らかにするおそれがある。そこで本研究では，日本国内でることを目的として実施した。

飼養されている豚のアミノ酸要求量を再検討する

日本飼養標準・豚（2013年版） と米国のNRC一環として，離乳育成豚のリジン要求量を明らか

飼養標準（2012年版） に記載されている体重10にすることを目的とした。令和元年度の３反復分～25kg程度の豚のリジン要求量を比較すると，のデータから，体重10～20kgの豚のリジン要求

NRC飼養標準に記載されているリジン要求量の量は飼料の総リジン濃度として推定値1.69％を得

ほうが20％以上高い。NRC飼養標準では多産系

た。さらに推定値の精度を高くするため，令和２などタンパク質蓄積能力が高い豚を視野に入れて

年度はさらに３反復の飼養試験を実施した。

１）

２）

新しいデータを採用したことがこの差の一因であところで，腸内細菌叢に関わる研究は近年の進る。さらに，日本飼養標準，NRC飼養標準，と展が著しい研究分野であり，摂取する食餌の内容

もに出版からやがて10年が経過する。この間，日が腸内細菌叢に影響を及ぼし，ひいては宿主のエ© The Ito Foundation

364

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

ネルギー代謝の制御に関わっていることが分かり測定値を示した。なお，試験期間中は１豚房に１つつある 。豚でも飼料中のタンパク質濃度の制頭を収容し，不断給餌，自由飲水，午前７時点灯・

限や，タンパク質源の違いによって，腸内細菌叢

午後７時消灯の条件とした。飼育室の気温は制御が影響を受けることが報告されている。これしなかったが，床暖房とコルツヒーターを使い，らの知見は，豚の飼料中の単一のアミノ酸の濃度

床暖房直上の温度は33～34℃となるようにした。

の違いが，豚の腸内細菌叢に影響を及ぼすことを試験飼料は，トウモロコシ，大豆粕，魚粉，脱脂

示唆している。本研究では，飼料のリジン濃度が粉乳をベースとし，リジンを含めた結晶アミノ酸

離乳育成豚の腸内細菌叢に及ぼす影響を明らかにを添加して調製した。後半２週間の飼料効率を指するため，盲腸内容物を採取して腸内細菌叢を解標としてSASのNLINプロシジャ―で折れ線モデ

析した。

ル（ガウス・ニュートン法７））にあてはめ，総リ

３）

２．方

４～６）

ジン要求量を推定した。さらに，飼養試験終了時

法に供試豚から盲腸内容物を採取し，16S rRNA

本研究は麻布大学動物実験委員会により審査さ

コード領域の系統的シーケンスにより盲腸内細菌

れ，承認を受けて麻布大学の豚舎施設で実施した叢を解析した。解析は（株）マイクロバイオータ（承認番号190701-4）。４週齢の去勢雄豚（品種名に依頼した。

スイートマミー）を株式会社シムコの館山農場か飼養成績に関する統計処理；反復をブロック，ら導入した。導入後の１週間は市販人工乳を給与

飼料のリジン濃度を要因とし，乱かい法にのっして予備飼育期間とし，その後，総リジンとしてとった１元配置の分散分析をSASのGLMプロシ

0.95％，1.20％，1.70％，1.95％の４種類の飼料をジャで実施して，飼養成績に及ぼす飼料のリジン

給与して３週間飼育した。標準化可消化（SID）

濃度の影響を検定した。リジン濃度の影響を検出

リジン含量の設計値は0.86％，1.11％，1.61％，

した後半１週間の飼料摂取量と飼料効率について

1.86％である。これらの試験飼料は試験担当者がは，SASのGLMプロシジャでTukey-Kramer法

設計し，一般社団法人科学飼料協会に配合を依頼

により，平均値間の差を検定した。

した。Table１に供試飼料の化学組成の設計値とリ ジ ン 要 求 量 の 推 定 ； SAS の NLIN プ ロ シ

Table 1 Concentrations of crude protein, total lysine, standardized ileal digestible

lysine, digestible energy in diets in fed basis.

Calculated values
Crude protein（%）
Total lysine（%）
SID lysine＊（%）
DE＊＊（Mcal/kg）
Analyzed values
Crude protein（%）
Total lysine（%）
SID lysine†（%）＊＊＊†

Lysine 0.95

Lysine 1.20

Lysine 1.70

Lysine 1.95

16.9

17.2

17.9

18.3

0.95

1.20

1.70

1.95

0.86
3.43

1.11
3.43

1.61
3.42

1.86
3.41

15.5
0.88

16.2
1.07

17.7
1.63

19.0
1.83

0.80

0.99

1.54

1.75

Standardized ileal digestible lysine
Digestible energy
Calculated from analyzed value of total lysine© The Ito Foundation

365

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究（Ⅱ）―飼養成績と腸内細菌叢に及ぼす影響―

ジャーを使い，ガウス・ニュートン法で折れ線モ

ニュートン法による解析では推定値と標準誤差がデルにあてはめて，リジン要求量を推定した。こ示される。本研究では推定値と標準誤差から95％の推定には，総リジン濃度の測定値，総リジン濃信頼区間を計算した。総リジン要求量推定値の度の測定値から計算したSIDリジン濃度を用い95％信頼区間の高いほうの値は1.54％であった。

た。そして，折れ線モデルにより得た推定値と標要求量の推定値は安全率も考慮する必要があると準誤差を用いて95％信頼区間を計算し，95％信頼

考 え ，本 報 告 で は 総 リ ジ ン 要 求 量 の 推 定 値 は区間の上限をリジン要求量の推定値とした。

1.54％を採用する。SIDリジン要求量は1.19％となお，SASによる解析は，京都大学学術情報メ推定され，95％信頼区間を考慮すると1.46％とディアセンターのスーパーコンピュータを使ってなった。前述したように，日本飼養標準１）に記載

実施した。

されている体重10～20kg（期待増体量470g/d）の豚の総リジン要求量は1.14％，SIDリジン要求

３．結果と考察量は0.96％である。本研究の供試豚の飼養試験後

Table２に後半２週間の飼養成績を示す。飼料

半２週間の体重は10～20kgに相当するが，日増摂取量に飼料のリジン濃度の影響はなかったが，体量は660～723g/dだった（Table２）。本研究の0.95％と1.20％の平均値が高かった。一方，平均リジン要求量の推定値が日本飼養標準より高く値間の差は検出できなかったが，後半１週間の飼なった理由として「日増体量から分かるように供料摂取量に及ぼす飼料のリジン濃度の影響を分散試した系統の遺伝的能力が高い」をあげることが分析で検出した。すなわち，飼料のリジン不足をできる。現在日本国内で飼育されているほかの系補うために，飼料摂取量を高くすることで，必要統の豚も―多産系品種は言うに及ばず―遺伝的能とするリジンを摂取しようと供試豚が反応した可力は高くなっていると考えるのが妥当であろう。

能性がある。飼料摂取の影響を受けたためか，日以上のことから，日本飼養標準に記載されている増体量には飼料のリジン濃度の影響は検出できな

体重10～20kgの豚のリジン要求量は，日本国内

かった。飼料効率は飼料のリジン濃度の影響受けで現在飼育されている豚には低すぎると結論す（ｐ＜0.05），0.95％と他の３つの濃度の間には差る。日本国内で飼育されている豚のリジン（ほかがあった（ｐ＜0.05）。

の栄養学的必須アミノ酸も含めて）要求量を見直Table３とFig.１に飼料効率を反応指標として折すために，日本国内でのデータ蓄積が必要である。

れ線モデルにあてはめた結果を示す。総リジン濃Fig.２は各供試豚の盲腸内細菌叢の結果であ度の要求量として推定値1.27％を得た。ガウス・る。凡例は示していないが，Prevotellaceae科にTable 2 Growth performances of pigs during the latter two weeks of experiment period.

Daily feed intake（g/d）
Daily feed intake
during the last week（g/d）
Daily body weight gain（g/d）
Feed efficiency

Lysine 0.95

Lysine 1.20

Lysine 1.70

Lysine 1.95

SE

p
Value

1324

1209

1117

1080

77

0.1545

1461

1421

1207

1130

88

<0.05

705
0.54b

723

713

660

43

0.739

0.61a

0.64a

0.62a

0.02

<0.01

a, b；p<0.05© The Ito Foundation

366

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 3 Results of broken-line regression analysis.
Estimation

SE

95% confidence

limitsConcentration of total lysine

1.2737

Concentration of SID lysine

1.19370.1340

1.011

1.536

0.13400.9311

1.456

p value
0.1766

0.66
Feed eﬃciency

0.64
0.62
0.6
0.58
0.56
0.54
0.52

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

Concentrations of total lysine in diets（%）
Fig. 1 A quadratic broken line for estimating requirement of totallysine of weanling-growing pigs.

Bars are SEs.


95% confidence limits of concentration of total lysine

属する菌種の割合がもっとも高く，それ以外では，

これぐらいの差がなければ腸内細菌叢は影響を受

Bacteroidaceae科，Lactobacillaceae科（Lactobacillus

けないのかもしれない。また，リジン要求量の推taiwanesis），Lachnospiraceae科，Ruminococcaceae

定が本研究のもっとも重要な目的なので，供試豚科，Veillonellaceae科の菌種の割合が高かった。

の体調を整えるために，合成抗菌剤と抗生物質

Fig.２の結果からは飼料のリジン濃度が盲腸内細（クエン酸モランテルとアビラマイシン）を供試

菌叢に影響を及ぼしたようにはみえない。吟味す

飼料に添加している。先行研究４～６）では供試飼料るために主成分分析を実施した（データは示してに抗菌剤は添加していないことも結果が違った理いない）。１頭をのぞき，飼料のリジン濃度に関由かもしれない。

係なく，ほかの供試豚は１つのクラスターを形成した。したがって，本研究の飼料のリジン濃度の４．要

約

違いは供試豚の盲腸内細菌叢に影響を及ぼさな

本研究は，飼養成績を指標とした時の離乳育成

かったと考えている。もっともリジン濃度が低い

豚のリジン要求量を明らかにするとともに，飼料

供試飼料ともっとも高い供試飼料のリジン濃度は中のリジン濃度が離乳育成豚の腸内細菌叢に及ぼ

測定値で約２倍（0.88％と1.83％）の差があるが，す影響を明らかにすることを目的として実施し粗タンパク質濃度は1.2倍（15.5％と19.0％）と差た。総リジンとして0.95％，1.20％，1.70％，1.95％が小さい。Fanらの報告では，飼料の粗タンパの４種類の飼料を５週齢の去勢雄豚に３週間給与

ク質濃度を16％から10％に低くすると回腸の細菌した。給与期間の後半の２週間（体重10～20kg

叢の多様性が低下している。粗タンパク質濃度にに相当）の飼料効率を反応指標とし，折れ線モデ

５）© The Ito Foundation

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究（Ⅱ）―飼養成績と腸内細菌叢に及ぼす影響―

367

（％）
100
90
80
70
60
50
40
30
20

1.95-5

1.95-4

1.95-3

1.95-2

1.95-1

1.70-5

1.70-4

1.70-3

1.70-2

1.70-1

1.20-5

1.20-4

1.20-3

1.20-2

1.20-1

0.95-50.95-40.95-30.95-200.95-1

10Each pig
Fig. 2 C ecal microbiota of each pig.

ルにあてはめてリジン要求量を推定したところ，
総リジンとして1.54％，SIDリジンとして1.46％を推定値として得た。腸内細菌叢（盲腸内細菌叢）に飼料のリジン濃度の影響はなかった。供試
飼料に合成抗菌剤と抗生物質を添加したことが一因かもしれない。
文献１） 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構：
日本飼養標準・豚，2013年版，18，中央畜産会, 東京,
2013.
２） National Research Council of the National

Academies, Nutrient Requirements of Swine, 11th
Revised Edition, 211, The National Academies
Press, Washington, D.C., 2012.
３） 木村郁夫：実験医学，37（2）,263～270, 2019.
４） Rist, V. T. S., et al.：Anaerobe, 25, 72～79, 2014.
５） Fan, P., et al.：Scientific Reports, 7, 43412, 2017,
DOI：10.1038/srep43412.
６）
 Chen, X., et al.：Frontiers in Cellular and Infection
Microbiology, 8, 246, 2018, doi：10.3389/fcimb. 2018.
00246.
７）
 Robbins, K. R., et al.：Journal of Animal Science,
84, E155-E165, 2006.

© The Ito Foundation

368

牧草サイレージの高品質化に向けた
バイオガスプラント消化液施用量の評価
Optimum application of biogas plant slurry for improving grass silage
quality

三

谷

朋

弘１・上

田

宏一郎２

（１北海道大学北方生物圏フィールド科学センター，２北海道大学大学院農学研究院）

Tomohiro Mitani１ and Koichiro Ueda２（１Field Science Center for Northern Biosphere, Hokkaido University, ２Reserach Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

To assess an optimum application of biogas plant slurry（BGPS）for making high-quality
grass silage, the effect of amount of BGPS application on orchardgrass sward mass, silage
quality, intake and digestibility in sheep were investigated. The results clearly showed that,when using BGPS, the doubled nitrogen of the standard application（360 kg N/ha/year）was
required to obtain the same amount of sward mass by the standard nitrogen application ofchemical fertilizer. However, this doubled nitrogen application of BGPS significantly decreased
the fermentation quality of grass silage and decreased organic matter digestibility in sheep
when compared with the grass silage harvested from the sward applied with standard nitrogenby both chemical fertilizer and BGPS. Thus, it was concluded that less than 360 kg N/ha/year
BGPS application to the sward was favorable to obtain a moderate grass yield as well asavailable grass silage quality.

１．目

とっては即効性の高い肥料となる。このような特的性により，乳牛糞尿BGP消化液の飼料作物の肥料

家畜糞尿バイオガスプラントとは，家畜の糞尿として利用に関するいくつか報告では，デントをメタン発酵させ，メタンガスをエネルギーとし

コ ー ン １），オ ー チ ャ ー ド グ ラ ス ２） お よ び チ モて利用する施設である。家畜糞尿バイオガスプラ

シー３）の圃場に乳牛糞尿BGPSを施用すると，同ント消化液（BGPS）は肥料成分（窒素，リン，

窒素量を施用した化学肥料と同様に十分利用できカリウム）を豊富に含んでいるため，適正に扱えることが実証されている。

ば良質な耕種作物や飼料作物の肥料として利用できることが明らかにされている。

家畜糞尿バイオガスプラントによるエネルギー
回収システムの有効利用は，副産物としての消化

消化液は炭素が主にメタンとして回収されるた液を飼料生産と家畜生産の循環系に有効に組み込

め炭素／窒素比が他の堆肥やスラリーといった有むことが必要条件である。しかしながら，家畜糞機性肥料に比べると低く，窒素のほとんどはアン

尿BGPS施用の飼料作物の収量に及ぼす研究は比モニア態窒素の形で溶解しているため作物成長に較的多くなされてきたものの，乳肉牛の飼料とし© The Ito Foundation

牧草サイレージの高品質化に向けたバイオガスプラント消化液施用量の評価

369ての品質や家畜の生産性の評価はこれまでほとんの通風乾燥機で48時間乾燥し，１mmのスクリーど報告されていない。BGPSは堆肥やスラリーとンを通過するように粉砕し化学成分分析に供しは著しく異なる成分的組成を有することからも，た。サイレージの発酵品質を測定するため，新鮮消化液を施用して収穫・調製した飼料の品質，家サンプルを蒸留水に浸し抽出液を得た。抽出液を畜による採食量および消化性への影響を明らかに用いてpH，揮発性塩基態窒素（VBN）および各

しつつ，最適な施用方法について明確にしておく

種有機酸を測定した。VBNの測定には原子吸光必要がある。

光度計を用い，有機酸の測定にはガスクロマトグ

本研究では，乳牛糞尿BGPSの施用量の違いが，ラフを用いた。また，サイレージの発酵品質を総

サイレージの発酵品質，ヒツジによる採食量およ

合的に表すＶ２スコアをFukawaga et al. ４）の方

び消化性に及ぼす影響を化学肥料施用の場合と比法により算出した。

較しつつ検討することで，牧草サイレージの高品

牧 草 サ イ レ ー ジ 中 の 乾 物（DM），有 機 物質化に向けたBGPSの最適施用量を明らかにする（OM），粗タンパク質（CP），無灰分中性デターことを目的とする。

ジ ェ ン ト 繊 維 （NDFom）， 水 溶 性 炭 水 化 物

２．方（WSC），硝酸態窒素（NO３ －N）およびミネラル

法（Ca，Mg，K，P）の含量を測定した。

オーチャードグラス主体草地内に約3.5ａの小コリデール種去勢雄ヒツジ６頭を供試し，３種

区画を３つ設置し，施肥標準窒素量（180kg/ha/のサイレージの消化率と物質出納を測定した。ヒ年）の化学肥料を施用する区（CF-180），乳牛糞

ツジは代謝試験ケージで飼養管理し，全糞採取法

尿BGPSを施肥標準窒素量施用する区（BGPS-

による予備期間９日，本期間５日の消化代謝試験180），およびBGPSを施肥標準窒素の２倍量施用を実施した。３処理を３×３ラテン方格法によりする区（BGPS-360）に配置した。各区画への化

供試ヒツジに割り当てて実験を行った。

学肥料とBGPSの施用は，本実験で用いる１番草

サイレージは１日の給与量を２等分し朝９：30の刈り取り前に３回（前年５月26日，前年７月４および夕方18：00の１日２回給与した。残食があ日，当年５月10日）に分けて行い，各回につき年る場合には計量し，毎日の飼料摂取量を測定し間施肥量の半量ずつ散布した。

た。水および固形塩は自由摂取させた。代謝ゲー

１番草を６月20日にモアコンディショナーで刈ジにより回収される糞と尿を毎日計量し，サンプり取った。予乾せずにフォーレージハーベスタでルを採取した。サイレージと同様に糞サンプルの設定切断長６mmに細切し，実験用サイロ（200

乾燥と粉砕を行ったのち化学成分含量を測定しＬ）に詰め込み密閉し実験用サイレージを調製した。尿サンプルについては窒素含量を測定した。

た。なお，刈り取り直前に牧草地の草量を地際でヒツジの血液を本期間の最終日に頚静脈から採取

刈り取って重量を測定，あわせて草高，冠部被度した。血液成分（尿素態窒素（BUN），P，K，を測定した。

Ca）は各種分析キットを用いて測定した。

サイロを調製３か月後に開封し，ヒツジを用い採食量，消化率，窒素利用，血液成分に及ぼすた消化試験のためにビニール袋に１kgずつ小分

影響については，ヒツジ個体を変量効果とし時期

けして脱気して冷蔵保存した。同時に，サイレーと処理を固定効果とする混合モデルにより処理のジのサンプルを採取した。サンプルの一部は60℃

影響を検討した。５％水準で有意な差が認められ© The Ito Foundation

370

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

た場合にTukeyの多重比較を行った。

収量が得られた。
Table２にサイレージの化学成分と発酵品質を３．結果と考察
3.1

示した。CF-180区とBGPS-180区を比較すると，牧草収量への影響

BGP-180区ではCP含量が低く，NDFom含量が高

牧草収穫前の草地構造および収量をTable１にく，硝酸態窒素およびミネラル含量については大示した。収量は，CF-180区では8.7tDM/haであっ

きな差はなかった。一般的に，イネ科牧草の葉部

たが，これに比べBGPS-180区では等量の窒素施にはCPが多く含まれ茎部にはNDFomが多く含ま用を行ったにも関わらず，6.2tDM/haと2.5t/haもれることから，BGPS-180区の原料草は葉部が少少なかった。一方，CF-180区の２倍量の窒素をなく茎部が多かったことが推察される。一方，

施用したBGPS-360区ではCF-180区と同等の牧草

BGPS-360区ではCP含量はCF-180区と同等であ

Table 1 Effect of fertilizer source（BGPS：biogas plant slurry, CF：chemical fertilizer）and

nitrogen application（180, 360 kg/ha/year） on mass and structure of orchardgrass sward
CF-180

BGPS-180

BGPS-360

8.68
106.9

6.15
104.9

8.81
104.8

1024

1124

1120

96.7
1.7
1.7
0.0

98.3
0.0
1.7
0.0

100.0
0.0
0.0
0.0

Herbage mass（tDM/ha）Grass height（cm）
Tiller density（tillers/m2）
Canopy coverage（%）
Grass
White clover
Weed
Bare area

Table 2 Effect of fertilizer source（BGPS：biogas plant slurry, CF：chemical fertilizer）and

nitrogen application（180, 360 kg/ha/year）on chemical composition and fermentation
quality of orchardgrass silage
CF-180

BGPS-180

BGPS-360

24.5
90.5
10.6
63.8

25.8
90.4
8.4
69.1

21.8
88.7
10.2
68.6

Ca（% of DM）
Mg（% of DM）
K（% of DM）
P（% of DM）

0.0020
0.37
0.26
2.67
0.26

0.0026
0.30
0.22
2.67
0.28

0.0069
0.43
0.25
2.86
0.34

pH
Lactic acid（%）
Actic acid（%）
Propionic acid（%）
Butylic acid（%）
VBN（mg/100g）
V2-score

3.98
0.85
0.24
0.00
0.00
33.0
97.9

4.37
0.65
0.50
0.08
0.58
28.6
54.7

4.83
0.14
0.32
0.12
1.19
68.7
44.6

DM（%）
OM（% of DM）
CP（% of DM）
NDFom（% of DM）
NO3-N（% of DM）

DM： dry matter, OM： organic matter, CP： crude protein, NDFom： ash free neutral detergent fiber,
V2-score indicates fermentation quality of silages with judging by the score of good（above 80）,fair（60–80）and poor（below 60）.

© The Ito Foundation

牧草サイレージの高品質化に向けたバイオガスプラント消化液施用量の評価

371

り ，NDFom 含 量 は CF-180 区 よ り 高 か っ た 。

BGPS-360区のいずれとも4.2を上回っていた。さBGPS-360区では葉部の成長はCF-180区と同等でらに，BGP-360区はBGP-180区に比べpHが高く，あったが，茎部の成長に対してもCF-180区より

乳酸含量もBGPS-360区では0.14と低かった。ま肥料効果が高かったため，CF-180区と同等の収た，乳酸以外の有機酸の含量およびVBN含量は，量が得られたと思われる。

BGPS-180区およびBGPS-360区でCF-180区のサ

BGPSからは無機態Ｎであるアンモニア態窒素

イレージよりも高く，BGPS-360区はBGPS-180が揮散することが報告されている５）。松中ら２）は，区より高かった。これらの結果，サイレージの発その程度を30～55％程度と報告している。スラ

酵品質を総合的に評価する指標であるＶ２スコア

リーにおいても同様に，アンモニア態窒素が揮散

は，BGPS区はCF区よりも顕著に低く，BGPS-すると報告されている 。BGPSは牧草地に施用

180区よりBGPS-360区で低かった。

６）

しても利用可能な窒素が投入量より少ない可能性

本実験で調製したサイレージをヒツジに給与が示唆され，施肥標準窒素量の化学肥料施用と同し，採食量，全消化管消化率および窒素出納を測等の牧草収量をBGPSによって得るためには，定して結果をTable３に示した。サイレージの乾BGPSの施用量は施肥標準窒素量の２倍量が必要

物摂取量は，サイレージ間で差はなく，１日あたであると考えられた。

り800gDM程度であった。DMおよびOMの消化

サイレージ中のNO３－Nの含量は，BGPS-360区

率は，BGPS-360区で他区より低く，CF-180区とはCF-180区およびBGPS-180区よりも，２～３倍

BGPS-180区の間には差はなかった。NDFom消程 度 高 か っ た 。窒 素 施 与 量 を 増 や す と 牧 草 の化率は，サイレージ間で差はなかった。BGPS区

NO３ －N含量が高まり，硝酸塩中毒を引き起こすのサイレージは発酵品質が低下したため摂取量，可能性がある。本試験において散布量の増加とと可消化エネルギーの供給量の点では，BGPS-180

もにNO３ －N含量は増加傾向を示したが，危険値

区はCF-180区と同等の飼料価値を有するものとである0.1％より著しく低い値であった。また，推察される。

BGPS-360区のCa，Mg，K，P含量は，CF-180区

CP消化率については，CF-180区とBGPS-360

およびBGPS-180区のものと比べ，同等もしくは

区 の 間 に 有 意 な 差 は な い が ，こ れ ら に 比 べ て高い値を示した。これらのことから，BGPSを施

BGPS-180区では低い値を示した。窒素摂取量お肥標準窒素量の２倍量を施用すると，飼料中の硝よび糞中窒素排泄量は，サイレージ間に有意差は酸態窒素と各種ミネラル含量が高まることが示さなかった。しかし，尿中窒素排泄量は，CF-180

れたが，その程度は家畜に悪影響をもたらすほど

区に比べBGPS-180区は有意に低く，BGPS-360区

大きなものではなかった。

は両者と有意差がなかった。蓄積窒素量について

牧草サイレージの発酵品質は，BGPSの散布には，サイレージ間に有意差はなかった。CF-180

より明確に低下した。CF-180区では乳酸含量が区で尿中排泄量が少なかったのは，CP消化率が高く，嫌気性乳酸発酵が十分に行われたもので低く体内に吸収される窒素量が少なかったためであった。一般的に良質サイレージの調製にあたっ

あるが，そのことが体蓄積窒素バランスに大きなてはpHを4.2以下とすることが必要とされてい負の値をもたらすことはなかった。本実験では供る。本実験におけるサイレージのpHは，CF-180

試動物として成熟したヒツジを用いたため，CF-

区 で は 3.98 と 下 回 っ て い た が ，BGPS-180 区 と180区における低CP消化率は蓄積に負の影響をも© The Ito Foundation

372

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 3 Effect of fertilizer source（BGP：biogas plant slurry, CF：chemical fertilizer）and

nitrogen application（180, 360 kg/ha/year）on silage intake, total tract digestibility, andnitogen balance in sheep
CF-180

BGP-180

BGP-360

818

858

771

DM

58.3ａ

56.5ａ

50.6ｂ

OM
CP

55.3ａ

50.0ａ

54.6ａ

47.7ｂ

48.9ｂ
53.1ａ

NDFom

50.2

49.3

49.6

12.0
5.4

11.8
6.2

12.6
6.0

Urine

7.6ａ

Retained

－1.0

5.3ｂ
0.3

7.0ab
－0.3

DM intake（g/day）Digestibility（%）

N balance
IntakeFeces

DM：dry matter, OM：organic matter, CP：crude protein, NDFom：ash free neutral detergent fiber,abp＜0.05

Table 4 Effect of fertilizer source（BGP：biogas plant slurry, CF：chemical fertilizer）and

nitrogen application（180, 360 kg/ha/year） on nitrogen metabolites and minerals in bloodplasma in sheep

BUN（mg/dl）
NH3-N（μg/dl）
Mg（mg/dl）
Ca（mg/dl）
P（mg/dl）

CF-180

BGP-180

9.1

7.1

BGP-360
8.1

220ａ
2.2
10.7
5.3

163ｂ
2.1
10.4
5.4

130ｂ
2.1
10.3
6

BUN： blood urea nitrogen
abp＜0.05

たらさなかった。生産動物にBGPS-180区を給与合したから形態のものが多かったものと思われ，する場合にはCP消化率が低いため，生産に負のこれにより第一胃での分解が遅延し，血液中に吸影響をもたらす可能性があり，飼料配合等に注意

収されるアンモニア態窒素の量が少なかったと考を要するであろう。

えられる。

ヒツジの血液中の窒素代謝物およびミネラル濃

血液中のMg，Ca，およびＰ含量には，サイレー

度をTable４に示した。BUN含量にサイレージ間

ジ間に有意な差は認められなかった。牧草中のＫに差はなかったが，アンモニア態窒素含量は，含量が著しく高いとCaおよびMgの吸収が低下

CF-180区はBGPS-180区およびBGPS-360区よりし，このような牧草を摂取した牛は低Mg血症とも有意に高い値を示した。血液中のアンモニア態なる。本研究におけるBGPS-360区ではＫ含量が窒素は，主に第一胃において微生物によってタン高い傾向にあったが，低Mg血症に対してはすべ

パク質に再合成されなかったアンモニアが吸収さての番草およびサイレージで安全範囲にあった。

れたものである。BGPS-180区およびBGPS-360

また，BGPS-360区のサイレージを摂取したヒツ

区のサイレージについては，NDFom含量が高い

ジの血液中のCaやMg濃度は他区よりも低下する

ことから，サイレージ中のCPのうち繊維中に結ことはなかった。

© The Ito Foundation

牧草サイレージの高品質化に向けたバイオガスプラント消化液施用量の評価

373

以上の結果から，施肥標準窒素量の化学肥料を

BGPSを標準窒素量施用した場合よりも低かっ

施用した牧草地と同等の収量を得るためには，乳た。BGPSを肥料として用いサイレージ生産する

牛糞尿BGPSは標準窒素量の２倍程度の施用が必場合には，サイレージの消化率や発酵品質を低下

要であるが，この施用量では牧草サイレージの発させない標準窒素施肥量の２倍以下での施用が好

酵品質は大幅に低下することが示された。ヒツジ

ましいことが示唆された。

へのBGPSの２倍量施用サイレージよって採食量，窒素出納およびミネラル代謝に負の影響はなかったものの，有機物消化率は化学肥料および
BGPSを標準窒素量施用した場合よりも低いことが明らかになった。これらから，BGPSを草地肥料として用いサイレージ生産する場合には，サイレージの消化率や発酵品質を低下させない標準窒素施肥量の２倍以下での施用が好ましいことが示
唆された。
４．要

約

乳牛糞尿BGP消化液の施用量の違いが，サイ
レージの発酵品質，ヒツジによる採食量および消化性に及ぼす影響を化学肥料施用の場合と比較し，牧草サイレージの高品質化に向けたBGP消化液の最適施用量を検討した。施肥標準窒素量の化学肥料を施用した牧草地と同等の収量を得るためには，乳牛糞尿BGPSは標準窒素量の２倍程度の施用が必要ではあるが，この施用量では牧草サイ
レージの発酵品質は大幅に低下することが示され

文献１）
 善平大樹，鈴木清恵，山中七瀬，成瀬佳代，松中照夫：サイレージ用トウモロコシに対するバイオガ
スプラント消化液の施肥効果，日本草地学会誌，
48，378～379，2002.
２）
 松永照夫，熊井実鈴，千徳あす香：バイオガスプ
ラント消化液由来窒素のオーチャードグラスに対する肥料的効果，日本土壌肥料学会雑誌，74，31～
38，2003.
３）
 三枝俊哉，渡部敢：乳牛ふん尿を主原料とするバ
イオガスプラント消化液のチモシー採草地に対する肥効と効果的分施法，北海道立農業試験場集報，
90，29～39，2006.
４）
 Fukagawa, S., Kataoka, K., Ishii, Y.：Round-balesilage harvesting and processing effects on
overwintering ability, dry natter yield, fermentation
quality, and palatability of dwarf napiergrass（Pennisetum purpureum Schumach）,Agrnomy，7，
10～16.2017.
５）
 Sommer, S. G., Jensen, L. S., Clausen, S. D.,
Sogaard, H. T.：Ammonia volatilization fromsurface-applied livestock slurry as affected byslurry composition and slurry infiltration depth,
Journal of agricultural Science, 144, 229～235, 2006.
６）
 Amberger, A.：Ammonia emission during andafter land spreading of slurry. In：Odour andammonia emissions from livestock farming, V. C.
Nielsen, J. H. Voorburg, and P. L’ Hermite（eds）,pp
126-131, Elsevier Applied Science, London, 1991.

た 。ヒ ツ ジ の 有 機 物 消 化 率 は 化 学 肥 料 お よ び© The Ito Foundation

374

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究
Studies on the enhancement of calf immunity appraised by rumen mat
score

保田

昌宏１，２・今泉法子２・阿部

信介１，３（１宮崎大学大学院医学獣医学総合研究科，２宮崎大学農学部，３宮崎県農業共済組合）

Masahiro Yasuda１，２, Noriko Imaizumi２ and Shinsuke Abe１，３（１Graduate School of Medicine and Veterinary Medicine, University of Miyazaki,
２Faculty of Agriculture, University of Miyazaki, ３Miyazaki Agricultural Mutual Aid Association）

Effect of ruminal mat formation（RMF）to peripheral blood leukocyte subsets andphagocytosis in pre-weaned calves were evaluated. The score of RMF was measured by giving
manual repeated pressures to the ventral sac of rumen 10 times. The examination was
performed every month for three months. Healthy Holstein Friesian and Japanese Blackcrossbred pre-weaned calves in a commercial farm were divided according to the score of
RMF. The number of B-cell in high score calves were significantly increase compared to thatin low score calves. The numbers of CD4＋ and CD8＋ cells in high core calves were increase
compared to those in low score calves. In addition, the phagocytosis of monocytes andgranulocytes in high score calves were higher than that of low score calves. In the peripheral
blood of high score calves, the phagocytosis of monocytes and granulocytes responsible fornatural immunity was higher, the number of T cells and B cells responsible for secondary
immunity was also higher than those of low score calves. In conclusion, the evaluation of scoreof RMF can be useful for understanding health condition of calves. In addition, the feeding
management for making high score of RMF calves may be possible to reduce antimicrobial
agent usage and production loss due to disease.

１．目

牛の剖検を年間に約100頭実施してきた。その結的果，肺炎，下痢および関節炎が子牛の三大炎症性

肺炎，下痢，関節炎などの慢性炎症性疾患で廃疾患であり，そのほとんどの個体で胸腺が矮小化用となる子牛は多く，NOSAI連みやざきの平成

していることが明らかになった。つまり慢性炎症

30年度家畜共済事業実績表によると，新生子異常性疾患は，獲得免疫系の機能低下により自然免疫を除いたとき，肥育子牛や肉子牛の死廃理由の約系の著しい亢進を誘導していると考えられた50％（約4,500頭）が慢性炎症性疾患であり，そ（Yasuda et. al., submitted）。よ っ て 多 く の 子 牛れによる損失は膨大な額に及んでいる。これまでの事故は，飼養管理の不行き届きによって起こるに申請者は，慢性炎症性疾患で廃用認定された子と考えられ，疾病に強い子牛にする飼養管理方法© The Ito Foundation

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究の確立が求められている。

375

最後の計測時のRM形成状況によって次の４群に牛の第一胃内容物は，気体層，固体層および液分けた。①RM形成良好→RM形成良好群，②RM層からなる階層構造をなしており，液層に浮いた形成 不良 →RM形成 良好 群，③RM形 成良好 群

状態で存在する固体層はルーメンマット（RM）→RM形成不良群，④RM形成不良→RM形成不良と称される。乳用種成牛のRMは給与飼料によっ群である。なお本研究の供試牛には，呼吸器病やて固さと厚さが変化することや，固さと厚さが１下痢症などを発症した例は用いなかった。

日の総反芻時間と正の相関があることが示されて

2.2

いる

。一方，子牛のRM形成に関する報告は

血液サンプルを比重遠心分離して末梢血単核球

ほとんどなく，子牛の粗飼料給与の是非についてを回収した。赤血球を溶血させリン酸緩衝液で洗は見解が分かれている。しかしながら近年，阿部浄したのち，細胞を蛍光標識した抗体と４℃で１

ら３）によって，離乳後子牛群のRMスコアと哺育時間反応させ洗浄後，リンパ球ゲートを用いフ

育成期の死亡事故率と給与飼料の粗飼料割合の関ローサイトメーターで陽性細胞率を測定した。リ係が調査され，第一胃が粘土状で固い子牛が多く

ンパ球サブセット解析の表面抗原と標識は，Ｔ細なるように給餌管理すると，疾病の発症率が有意

胞 の マ ー カ ー と し て 抗 CD4 抗 体 （ILA11A,に減少することが報告された。つまり，RMスコ

Monoclonal Antibody Center at Washington

アの利用は牛群の管理に有用で，事故発生リスク

State University, Pullman, WA, USA），抗CD8抗の評価に使えると考えられるが，抗病性に関わる体（CC63, Bio Rad, Tokyo, Japan）および抗γδメカニズムは明らかにされていない。

Ｔ抗体（GB21A, Monoclonal Antibody Center at

１，２）

免疫学的検査方法

そこで本研究では，子牛のRMの固さをスコア

Washington State University） を ， NK 細 胞 の化した基準を用いて，離乳後の子牛群について，マーカーとして抗CD335抗体（AKS1, Bio Rad）

RMが固い群と，軟らかい群において，末梢血サを，Ｂ細胞のマーカーとして抗MHC classⅡ抗体

ブセット解析，顆粒球や単球の貪食能などを指標（TH14B, Monoclonal Antibody Center atにして，両群の自然免疫および獲得免疫を比較評

Washington State University）および抗IgM抗体

価した。

（P-PIG45A2, Monoclonal Antibody Center at
Washington State University）を 用 い た 。各 サ

２．材料と方法
2.1

ブセット細胞数は，サブセット比率（％），白血
球数（個/ml）およびリンパ球比率（％）から実試験農場

民間農場で飼育される健康な交雑種（ホルスタ

数値を算出した。貪食率の解析は，バフィーコー

イン×黒毛和種）の子牛群（58日齢から173日齢，

トを採取し，赤血球を溶血後，細胞数を調整し24頭）について，RM形成状況を月に１回，３ヶ10％牛胎子血清添加RPMI1640溶液に，φ１μm

月間計測した。RM形成状況は，第一胃腹嚢上部の 蛍 光 標 識 し た ラ テ ッ ク ス ビ ー ズ（No. 1030,

を拳あるいは手のひらで10回反復圧迫する間に，

Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO, USA）

波動感を検出したものをRM形成不良，波動感をを加え，37℃で１時間培養しラテックスビーズを検出しなかったものをRM形成良好とした。頚静貪食させたのち洗浄して，蛍光標識した抗体でリ脈から７mlの血液をEDTA-2Na採血管で採取しンパ球サブセットと同様に細胞を染色した。顆粒

免疫学的な検査を実施した。本研究では，最初と球のマーカーとして蛍光標識した抗顆粒球抗体© The Ito Foundation

376

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）（CH138A, Monoclonal Antibody Center at

RM形成良好→RM形成良好群，②RM形成不良

Washington State University），単球のマーカー→RM形成良好群，③RM形成良好群→RM形成不と し て 蛍 光 標 識 し た 抗 MHC classⅡ 抗 体良群の３群間で有意差はなかった。

（TH14B）を用いた。単球と顆粒球ゲートを用い

3.2て各細胞分画の陽性率を算出した。

リンパ球数は平均値が高い群から並べると，①

2.3

統計処理

リンパ球数および単球数，単球数の推移

RM形成良好→RM形成良好群，③RM形成良好群

体側結果，サブセット結果，貪食結果はそれぞ→RM形成不良群，②RM形成不良→RM形成良好

れ Welch’s T test, Mann-Whitney U test あ る い

群，④RM形成不 良→ RM形成不 良群 となっ たは共分散分析を用いて解析し，ｐ＜0.05を有意，（Fig.２）。①から③の３群間で有意差はなかった。

ｐ＜0.1を傾向ありと評価した。

次に，単球数の平均値が高い群から並べると，①
RM形成良好→RM形成良好群，②RM形成不良

３．結果と考察
3.1→RM形成良好群，③RM形成良好群→RM形成不胸囲および腹囲

良群，④RM形成不良→RM形成不良群となった

胸囲および腹囲は平均値が高い群から並べる（Fig.２）。①から③の３群間で有意差はなかった。

と，①RM形成良好→RM形成良好群，②RM形成

さらに単球数を測定前と後の増加曲線の傾きで比不良→RM形成良好群，③RM形成良好群→RM形

較すると，①RM形成良好→RM形成良好群が③

成不良群，④RM形成不良→RM形成不良群となっRM形成良好群→RM形成不良群に比べて高くなた（Fig.１）。今回④RM形成不良→RM形成不良

る傾向があった（ｐ＝0.08）。

群が２頭しか認められなかったため，平均値で一3.3

番低値であるものの，④RM形成不良→RM形成

CD 4＋

不良群と他の群の統計解析はできなかった。①

160
cm

G→G

サブセット解析
細胞数，γδＴ細胞数およびＢ細胞数は平均値が高い群から並べると，①RM形成良好

P→G

G→P

P→P

140
120
100
80
60
40
20
0

chest circumference

Fig. 1 chest and abdominal circumference© The Ito Foundation

abdorminal circumference

377

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究
Cell/μl

10000
9000

G→G

P→G

G→P

P→P

8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0

Lymphocyte

Monocyte

Fig. 2 lymphocytes and monocyte counts

Cell/μl

2000

G→G

P→G

G→P

P→P

1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0

sCD4

sCD8

γδT

Bcell

NK

Fig. 3 lymphocyte subsets analysis→RM形成良好群，③RM形成良好群→RM形成不→RM形成不良群，④RM形成不良→RM形成不良

良群，④RM形成不良→RM形成不良群，②RM形群となった（Fig.３）。②RM形成不良→RM形成

成不良→RM形成良好群となった（Fig.３）。特に，良好群の平均値が高いのは興味深い結果である。

④RM形成不良→RM形成不良群のＢ細胞数が著次に，NK細胞数は平均値が高い群から並べると，しく低値を示した。①から③の３群間で有意差は④RM形成不良→RM形成不良群，③RM形成良好なかった。CD 8＋細胞数は平均値が高い群から並群→RM形成不良群，①RM形成良好→RM形成良

べると，②RM形成不良→RM形成良好群，①RM

好群，②RM形成不良→RM形成良好群であった。

形成 良好 →RM形成良好群，③RM形成良好群

RM形成不良群でNK細胞数が高くなったことは© The Ito Foundation

378

令和２年度

X100%

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

1.2

G→G

P→G

G→P

P→P

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

granulocyte

monocyte

Fig. 4 phagocytosis of granulocyte and monocyte

他のリンパ球サブセット数が低いことによる代償

0.052）。試験全体を通して各群間の比較では有意作用かも知れない。

な結果が得られなかったが，個々の状態をまった

3.4

顆粒球と単球の貪食率

く同一条件にすると，RM形成良好群でRM形成

顆粒球の貪食率は各群でほとんど差がなかった

不良群に比べて各パラメータに有意あるいは傾向（Fig.４）。単球の貪食率は平均値が高い群から並ありの結果が得られた。また，RM形成不良群はべると，①RM形成良好→RM形成良好群，③RM

亜急性ルーメンアシドーシスによく似た病態であ形成 良好 群→RM形 成不良群，②RM形成不良

るといえよう。つまり，CD 4＋細胞数やCD 8＋細→RM形成良好群，④RM形成不良→RM形成不良

胞数など細胞性免疫の低下が報告されている４，５）。

群となった（Fig.４）。①から③の３群間で有意単球や顆粒球の貪食能についてはこれまでに報告差はなかった。

がなく，今回RM形成良好群で有意に貪食率が高3 . 5 月齢，胸囲および腹囲を同一条件にした

くなったことは初めての報告となる。現在，本研究結果を取りまとめ投稿準備中である。

場合の各解析
さらに月齢，胸囲および腹囲が同じ値である子

3.6

今後の展望

牛（81.0±5.0日齢）を選別してRM形成良好群とこれまでにRM形成不良の生産農家は事故率がRM形成不良群について各パラメータを比較し高いことが明らかになっている３）。そこで事故率た。Ｂ細胞数はRM形成良好群で有意に多い結果の高い農家を選定して，RM形成状況を検査し，が得られた（ｐ＝0.03）。CD 4＋細胞数（ｐ＝0.069），

RM形成不良の状態からRM形成良好の状態でのCD 8 細胞数（ｐ＝0.073），MHC classⅡ 細胞数

飼養管理を実施した場合の抗病性と生産性も評価（ｐ＝0.069）はRM形成良好群で多い傾向が認めしていきたい。さらに，自然あるいは特異的な抗られた。RM形成良好群の顆粒球の貪食率は有意

体価やサイトカインの発現量比なども評価していに高かった（ｐ＝0.017）。さらにRM形成良好群

くことで，RM形成と免疫強化の関係をさらに詳の単球の貪食率も高い傾向が認められた（ｐ＝

細に明らかにし，家畜生産の向上へ貢献していき＋＋© The Ito Foundation

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究

たい。
４．要

約

本研究では，離乳後の子牛群について，RMが固い群（RM形成良好群）と，軟らかい群（RM
形成不良群）において，末梢血サブセット解析，
顆粒球や単球の貪食能などを指標にして，両群の自然免疫および獲得免疫を比較評価した。体格や月齢を同じ条件にした子牛で比較すると，RM形
成良好群ではRM形成不良群に比べてＢ細胞数が有意に多く，CD 4＋細胞数，CD 8＋細胞数，MHC
classⅡ＋細胞数に高い傾向が認められた。さらに
RM形成良好群ではRM形成不良群に比べて，顆
粒球の貪食率は有意に高く，単球の貪食率は高い傾向があった。よって本研究結果より，離乳後の子牛群について，RMが固い子牛では自然免疫系
も獲得免疫系の増強作用が認められた。RM形成

379

文
献
１）
 Izumi, K., Unno, C.：Effects of feeding ratio of beet
pulp to alfalfa hay or grass hay on ruminal mat
characteristics and chewing activity in Holstein
dry cows, Anim. Sci. J., 81, 180～6, DOI：10.1111/
j.1740-0929.2009.00724.x, 2010.
２）
 Izumi, K., Tamura, T., Fujii, R., Nakatsuji, H.,
Morita, S.：Effects of substituting kraft pulp withcorn silage on dry matter intake, ruminal mat
formation, rumen fermentation, and rumination
activity in non-lactating cows, Anim. Sci. J., 90, 205～213, 2019.
３）
 阿部信介，出口祐一郎，壱岐佳浩：ルーメンマッ
トスコア低値持続子牛における血液性状の特徴と病
態生理，家畜診療，66（2）,87～96, 2019.
４）
 Sato, S.：Subacute ruminal acidosis（SARA）
challenge, ruminal condition and cellular immunity
in cattle, Jpn. J. Vet. Res., 63, S25-36, DOI：
10.14943/jjvr.63.suppl.s25, 2015.
５）
 Schnabel, K., Schmitz, R., Frahm, J., Meyer, U.,
Breves, G., Dänicke, S.：Functionality and DNAdamage properties of blood cells in lactating cows
exposed to glyphosate contaminated feed at
different feed energy levels, Arch. Anim. Nutr., 74,
87～106, DOI：10.1080/1745039X.2020.1718474,
2020.

を良好にした牛の飼養管理方法により，抗生剤の使用や病気の発症や事故などを低減させることができると思われた。

© The Ito Foundation

374

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究
Studies on the enhancement of calf immunity appraised by rumen mat
score

保田

昌宏１，２・今泉法子２・阿部

信介１，３（１宮崎大学大学院医学獣医学総合研究科，２宮崎大学農学部，３宮崎県農業共済組合）

Masahiro Yasuda１，２, Noriko Imaizumi２ and Shinsuke Abe１，３（１Graduate School of Medicine and Veterinary Medicine, University of Miyazaki,
２Faculty of Agriculture, University of Miyazaki, ３Miyazaki Agricultural Mutual Aid Association）

Effect of ruminal mat formation（RMF）to peripheral blood leukocyte subsets andphagocytosis in pre-weaned calves were evaluated. The score of RMF was measured by giving
manual repeated pressures to the ventral sac of rumen 10 times. The examination was
performed every month for three months. Healthy Holstein Friesian and Japanese Blackcrossbred pre-weaned calves in a commercial farm were divided according to the score of
RMF. The number of B-cell in high score calves were significantly increase compared to thatin low score calves. The numbers of CD4＋ and CD8＋ cells in high core calves were increase
compared to those in low score calves. In addition, the phagocytosis of monocytes andgranulocytes in high score calves were higher than that of low score calves. In the peripheral
blood of high score calves, the phagocytosis of monocytes and granulocytes responsible fornatural immunity was higher, the number of T cells and B cells responsible for secondary
immunity was also higher than those of low score calves. In conclusion, the evaluation of scoreof RMF can be useful for understanding health condition of calves. In addition, the feeding
management for making high score of RMF calves may be possible to reduce antimicrobial
agent usage and production loss due to disease.

１．目

牛の剖検を年間に約100頭実施してきた。その結的果，肺炎，下痢および関節炎が子牛の三大炎症性

肺炎，下痢，関節炎などの慢性炎症性疾患で廃疾患であり，そのほとんどの個体で胸腺が矮小化用となる子牛は多く，NOSAI連みやざきの平成

していることが明らかになった。つまり慢性炎症

30年度家畜共済事業実績表によると，新生子異常性疾患は，獲得免疫系の機能低下により自然免疫を除いたとき，肥育子牛や肉子牛の死廃理由の約系の著しい亢進を誘導していると考えられた50％（約4,500頭）が慢性炎症性疾患であり，そ（Yasuda et. al., submitted）。よ っ て 多 く の 子 牛れによる損失は膨大な額に及んでいる。これまでの事故は，飼養管理の不行き届きによって起こるに申請者は，慢性炎症性疾患で廃用認定された子と考えられ，疾病に強い子牛にする飼養管理方法© The Ito Foundation

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究の確立が求められている。

375

最後の計測時のRM形成状況によって次の４群に牛の第一胃内容物は，気体層，固体層および液分けた。①RM形成良好→RM形成良好群，②RM層からなる階層構造をなしており，液層に浮いた形成 不良 →RM形成 良好 群，③RM形 成良好 群

状態で存在する固体層はルーメンマット（RM）→RM形成不良群，④RM形成不良→RM形成不良と称される。乳用種成牛のRMは給与飼料によっ群である。なお本研究の供試牛には，呼吸器病やて固さと厚さが変化することや，固さと厚さが１下痢症などを発症した例は用いなかった。

日の総反芻時間と正の相関があることが示されて

2.2

いる

。一方，子牛のRM形成に関する報告は

血液サンプルを比重遠心分離して末梢血単核球

ほとんどなく，子牛の粗飼料給与の是非についてを回収した。赤血球を溶血させリン酸緩衝液で洗は見解が分かれている。しかしながら近年，阿部浄したのち，細胞を蛍光標識した抗体と４℃で１

ら３）によって，離乳後子牛群のRMスコアと哺育時間反応させ洗浄後，リンパ球ゲートを用いフ

育成期の死亡事故率と給与飼料の粗飼料割合の関ローサイトメーターで陽性細胞率を測定した。リ係が調査され，第一胃が粘土状で固い子牛が多く

ンパ球サブセット解析の表面抗原と標識は，Ｔ細なるように給餌管理すると，疾病の発症率が有意

胞 の マ ー カ ー と し て 抗 CD4 抗 体 （ILA11A,に減少することが報告された。つまり，RMスコ

Monoclonal Antibody Center at Washington

アの利用は牛群の管理に有用で，事故発生リスク

State University, Pullman, WA, USA），抗CD8抗の評価に使えると考えられるが，抗病性に関わる体（CC63, Bio Rad, Tokyo, Japan）および抗γδメカニズムは明らかにされていない。

Ｔ抗体（GB21A, Monoclonal Antibody Center at

１，２）

免疫学的検査方法

そこで本研究では，子牛のRMの固さをスコア

Washington State University） を ， NK 細 胞 の化した基準を用いて，離乳後の子牛群について，マーカーとして抗CD335抗体（AKS1, Bio Rad）

RMが固い群と，軟らかい群において，末梢血サを，Ｂ細胞のマーカーとして抗MHC classⅡ抗体

ブセット解析，顆粒球や単球の貪食能などを指標（TH14B, Monoclonal Antibody Center atにして，両群の自然免疫および獲得免疫を比較評

Washington State University）および抗IgM抗体

価した。

（P-PIG45A2, Monoclonal Antibody Center at
Washington State University）を 用 い た 。各 サ

２．材料と方法
2.1

ブセット細胞数は，サブセット比率（％），白血
球数（個/ml）およびリンパ球比率（％）から実試験農場

民間農場で飼育される健康な交雑種（ホルスタ

数値を算出した。貪食率の解析は，バフィーコー

イン×黒毛和種）の子牛群（58日齢から173日齢，

トを採取し，赤血球を溶血後，細胞数を調整し24頭）について，RM形成状況を月に１回，３ヶ10％牛胎子血清添加RPMI1640溶液に，φ１μm

月間計測した。RM形成状況は，第一胃腹嚢上部の 蛍 光 標 識 し た ラ テ ッ ク ス ビ ー ズ（No. 1030,

を拳あるいは手のひらで10回反復圧迫する間に，

Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO, USA）

波動感を検出したものをRM形成不良，波動感をを加え，37℃で１時間培養しラテックスビーズを検出しなかったものをRM形成良好とした。頚静貪食させたのち洗浄して，蛍光標識した抗体でリ脈から７mlの血液をEDTA-2Na採血管で採取しンパ球サブセットと同様に細胞を染色した。顆粒

免疫学的な検査を実施した。本研究では，最初と球のマーカーとして蛍光標識した抗顆粒球抗体© The Ito Foundation

376

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）（CH138A, Monoclonal Antibody Center at

RM形成良好→RM形成良好群，②RM形成不良

Washington State University），単球のマーカー→RM形成良好群，③RM形成良好群→RM形成不と し て 蛍 光 標 識 し た 抗 MHC classⅡ 抗 体良群の３群間で有意差はなかった。

（TH14B）を用いた。単球と顆粒球ゲートを用い

3.2て各細胞分画の陽性率を算出した。

リンパ球数は平均値が高い群から並べると，①

2.3

統計処理

リンパ球数および単球数，単球数の推移

RM形成良好→RM形成良好群，③RM形成良好群

体側結果，サブセット結果，貪食結果はそれぞ→RM形成不良群，②RM形成不良→RM形成良好

れ Welch’s T test, Mann-Whitney U test あ る い

群，④RM形成不 良→ RM形成不 良群 となっ たは共分散分析を用いて解析し，ｐ＜0.05を有意，（Fig.２）。①から③の３群間で有意差はなかった。

ｐ＜0.1を傾向ありと評価した。

次に，単球数の平均値が高い群から並べると，①
RM形成良好→RM形成良好群，②RM形成不良

３．結果と考察
3.1→RM形成良好群，③RM形成良好群→RM形成不胸囲および腹囲

良群，④RM形成不良→RM形成不良群となった

胸囲および腹囲は平均値が高い群から並べる（Fig.２）。①から③の３群間で有意差はなかった。

と，①RM形成良好→RM形成良好群，②RM形成

さらに単球数を測定前と後の増加曲線の傾きで比不良→RM形成良好群，③RM形成良好群→RM形

較すると，①RM形成良好→RM形成良好群が③

成不良群，④RM形成不良→RM形成不良群となっRM形成良好群→RM形成不良群に比べて高くなた（Fig.１）。今回④RM形成不良→RM形成不良

る傾向があった（ｐ＝0.08）。

群が２頭しか認められなかったため，平均値で一3.3

番低値であるものの，④RM形成不良→RM形成

CD 4＋

不良群と他の群の統計解析はできなかった。①

160
cm

G→G

サブセット解析
細胞数，γδＴ細胞数およびＢ細胞数は平均値が高い群から並べると，①RM形成良好

P→G

G→P

P→P

140
120
100
80
60
40
20
0

chest circumference

Fig. 1 chest and abdominal circumference© The Ito Foundation

abdorminal circumference

377

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究
Cell/μl

10000
9000

G→G

P→G

G→P

P→P

8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0

Lymphocyte

Monocyte

Fig. 2 lymphocytes and monocyte counts

Cell/μl

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G→G

P→G

G→P

P→P

1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0

sCD4

sCD8

γδT

Bcell

NK

Fig. 3 lymphocyte subsets analysis→RM形成良好群，③RM形成良好群→RM形成不→RM形成不良群，④RM形成不良→RM形成不良

良群，④RM形成不良→RM形成不良群，②RM形群となった（Fig.３）。②RM形成不良→RM形成

成不良→RM形成良好群となった（Fig.３）。特に，良好群の平均値が高いのは興味深い結果である。

④RM形成不良→RM形成不良群のＢ細胞数が著次に，NK細胞数は平均値が高い群から並べると，しく低値を示した。①から③の３群間で有意差は④RM形成不良→RM形成不良群，③RM形成良好なかった。CD 8＋細胞数は平均値が高い群から並群→RM形成不良群，①RM形成良好→RM形成良

べると，②RM形成不良→RM形成良好群，①RM

好群，②RM形成不良→RM形成良好群であった。

形成 良好 →RM形成良好群，③RM形成良好群

RM形成不良群でNK細胞数が高くなったことは© The Ito Foundation

378

令和２年度

X100%

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

1.2

G→G

P→G

G→P

P→P

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

granulocyte

monocyte

Fig. 4 phagocytosis of granulocyte and monocyte

他のリンパ球サブセット数が低いことによる代償

0.052）。試験全体を通して各群間の比較では有意作用かも知れない。

な結果が得られなかったが，個々の状態をまった

3.4

顆粒球と単球の貪食率

く同一条件にすると，RM形成良好群でRM形成

顆粒球の貪食率は各群でほとんど差がなかった

不良群に比べて各パラメータに有意あるいは傾向（Fig.４）。単球の貪食率は平均値が高い群から並ありの結果が得られた。また，RM形成不良群はべると，①RM形成良好→RM形成良好群，③RM

亜急性ルーメンアシドーシスによく似た病態であ形成 良好 群→RM形 成不良群，②RM形成不良

るといえよう。つまり，CD 4＋細胞数やCD 8＋細→RM形成良好群，④RM形成不良→RM形成不良

胞数など細胞性免疫の低下が報告されている４，５）。

群となった（Fig.４）。①から③の３群間で有意単球や顆粒球の貪食能についてはこれまでに報告差はなかった。

がなく，今回RM形成良好群で有意に貪食率が高3 . 5 月齢，胸囲および腹囲を同一条件にした

くなったことは初めての報告となる。現在，本研究結果を取りまとめ投稿準備中である。

場合の各解析
さらに月齢，胸囲および腹囲が同じ値である子

3.6

今後の展望

牛（81.0±5.0日齢）を選別してRM形成良好群とこれまでにRM形成不良の生産農家は事故率がRM形成不良群について各パラメータを比較し高いことが明らかになっている３）。そこで事故率た。Ｂ細胞数はRM形成良好群で有意に多い結果の高い農家を選定して，RM形成状況を検査し，が得られた（ｐ＝0.03）。CD 4＋細胞数（ｐ＝0.069），

RM形成不良の状態からRM形成良好の状態でのCD 8 細胞数（ｐ＝0.073），MHC classⅡ 細胞数

飼養管理を実施した場合の抗病性と生産性も評価（ｐ＝0.069）はRM形成良好群で多い傾向が認めしていきたい。さらに，自然あるいは特異的な抗られた。RM形成良好群の顆粒球の貪食率は有意

体価やサイトカインの発現量比なども評価していに高かった（ｐ＝0.017）。さらにRM形成良好群

くことで，RM形成と免疫強化の関係をさらに詳の単球の貪食率も高い傾向が認められた（ｐ＝

細に明らかにし，家畜生産の向上へ貢献していき＋＋© The Ito Foundation

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究

たい。
４．要

約

本研究では，離乳後の子牛群について，RMが固い群（RM形成良好群）と，軟らかい群（RM
形成不良群）において，末梢血サブセット解析，
顆粒球や単球の貪食能などを指標にして，両群の自然免疫および獲得免疫を比較評価した。体格や月齢を同じ条件にした子牛で比較すると，RM形
成良好群ではRM形成不良群に比べてＢ細胞数が有意に多く，CD 4＋細胞数，CD 8＋細胞数，MHC
classⅡ＋細胞数に高い傾向が認められた。さらに
RM形成良好群ではRM形成不良群に比べて，顆
粒球の貪食率は有意に高く，単球の貪食率は高い傾向があった。よって本研究結果より，離乳後の子牛群について，RMが固い子牛では自然免疫系
も獲得免疫系の増強作用が認められた。RM形成

379

文
献
１）
 Izumi, K., Unno, C.：Effects of feeding ratio of beet
pulp to alfalfa hay or grass hay on ruminal mat
characteristics and chewing activity in Holstein
dry cows, Anim. Sci. J., 81, 180～6, DOI：10.1111/
j.1740-0929.2009.00724.x, 2010.
２）
 Izumi, K., Tamura, T., Fujii, R., Nakatsuji, H.,
Morita, S.：Effects of substituting kraft pulp withcorn silage on dry matter intake, ruminal mat
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activity in non-lactating cows, Anim. Sci. J., 90, 205～213, 2019.
３）
 阿部信介，出口祐一郎，壱岐佳浩：ルーメンマッ
トスコア低値持続子牛における血液性状の特徴と病
態生理，家畜診療，66（2）,87～96, 2019.
４）
 Sato, S.：Subacute ruminal acidosis（SARA）
challenge, ruminal condition and cellular immunity
in cattle, Jpn. J. Vet. Res., 63, S25-36, DOI：
10.14943/jjvr.63.suppl.s25, 2015.
５）
 Schnabel, K., Schmitz, R., Frahm, J., Meyer, U.,
Breves, G., Dänicke, S.：Functionality and DNAdamage properties of blood cells in lactating cows
exposed to glyphosate contaminated feed at
different feed energy levels, Arch. Anim. Nutr., 74,
87～106, DOI：10.1080/1745039X.2020.1718474,
2020.

を良好にした牛の飼養管理方法により，抗生剤の使用や病気の発症や事故などを低減させることができると思われた。

© The Ito Foundation

380

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による
家畜腸内細菌叢改善効果の検証
Verification of the effect of feed supplemented with mass-producible
oligosaccharides on the improvement of intestinal flora in livestock

西本（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

１

完１・遠野

雅徳２・山崎信３

食品研究部門，２中央農業研究センター，３畜産研究部門）

Mamoru Nishimoto１, Masanori Tohno２ and Makoto Yamazaki３（１Food Research Institute, ２Central Region Agricultural Research Center, ３Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

With the international population increase, there is an urgent need to increase theproduction of livestock products. On the other hand, the addition of antibiotics to feed for the
purpose of promoting the growth of livestock has begun to be significantly restricted due tothe spread of drug-resistant bacteria, and a material that can replace antibiotics is required.
To collect and accumulate basic data on health functionality for the earlycommercialization of new oligosaccharide materials, lacto-N-biose I（LNB）, which an enzyme
synthesis method was developed, and ryegrass seed, which contains specific oligosaccharides,
loliose, we investigated the health function of livestock by adding these materials. When the
LNB-added feed was fed to chicken chicks, no difference was found in their feeding results.
However, when bifidobacteria isolated from various livestock were cultured in a medium
containing LNB, strain-specific growth was observed. Although bifidobacteria could not be
isolated from the cecal contents of the chicks tested, the possibility was suggested that theintestinal flora improvement effect will be exhibited in livestock carrying the strain.
Furthermore, when a feed containing a loliose composition prepared from ryegrass seeds was
fed to chicken chicks, a significant body weight gain effect was observed. Further verification
tests are expected for practical use of this composition as a new feed additive.

１．目

れつつあり，善玉菌によるプロバイオティクスや的

それらを増やすオリゴ糖を利用したプレバイオ

国際的な人口増加を受け，畜産物の生産量増大

ティクスが畜産業界においても注目を集めていは急務である。一方で，家畜の成長促進を目的とる。実際に酵母や乳酸菌等の生菌剤や機能性オリした抗生物質の飼料への添加は，薬剤耐性菌の蔓

ゴ糖を添加した飼料が国内，海外を問わず販売さ

延を招くことから著しく制限され始めており，抗れている。したがって，飼料に添加する機能性素

生物質の代替となる素材が求められている現状が材に関する研究分野は非常に注目度が高く，さまある。近年，腸内細菌叢の改善が，ヒトも含めた

ざまな研究が実施されている。しかしながら，ど

動物の健康に重要な働きをすることが明らかにされほど優れた機能を有する素材であっても，飼料© The Ito Foundation

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証

381

用添加物に見合った価格でなければ実用化にはたに収容し，それぞれのケージに市販の採卵鶏幼雛

どり着けないことから，実際に市販されている機用飼料（対照飼料，アジャスト幼雛，豊橋飼料株

能性素材はその数が限られている。本研究の目的

式会社），対照飼料とライグラス種子を等量配合

は，低コストでの供給が見込める新たなオリゴ糖した飼料（ライグラス飼料（粒））の双方を自由

素材の早期実用化に向けた健康機能性に関する基摂取できるように餌箱を設置した。試験期間は６

礎データを収集・蓄積することである。具体的に日間とし，奇数日は対照飼料を向かって左側，ラは，ヒトの母乳に含まれるビフィズス菌増殖因

イグラス飼料（粒）を右側に，偶数日はその逆に子なるように毎日餌箱の位置を入れ替え，６日間の１）でありながらも，これまで大量調製法が確立していなかったラクト- N -ビオースⅠ （以下，
２）それぞれの飼料の摂取量を測定した。

LNB），および研究が立ち遅れていて機能が未知

2.3であるロリオース３～５）を含有するライグラス種子

35日齢の白色レグホーン種の雄ヒナを供試しを，実用化が未達のオリゴ糖素材候補として，そた。卵用鶏育成幼雛期の養分要求量を満たすようれらの家畜に対する健康機能性を検証する。

に設計した，トウモロコシ・大豆粕主体の対照飼

２．方
2.1

第一次給与試験料（Table１），対照飼料と粉砕したライグラス種

法

子を等量配合した飼料（ライグラス飼料（粉）），対照飼料にLNBを１％添加した飼料の合計３種

オリゴ糖素材の調製

LNBは以前開発された方法に従って調製した類の飼料を調製した。それぞれの飼料に，平均体

高純度粉末（純度99％）を使用した 。ロリオー

重が等しくなるようにヒナを５羽ずつ割り付け，スを含有するイタリアンライグラス種子は，市販８日間給与した。配合したライグラス種子の代謝のワセアオバ（雪印種苗株式会社）を用い，嗜好

エネルギー（ME）含量および回腸アミノ酸消化性試験には種子そのものを，第一次給与試験で率を酸化クロムによるインデックス法により求めは，種子を超遠心粉砕機（ZM-100，レッチェ社）

た。

にて，１mmメッシュのスクリーンで粉砕したラ

2.4

イグラス種子（粉）を用いた。また，3 . 2に後述

16日齢の黄斑プリマスロック種の雄ヒナを供試するように，ライグラス種子（粉）においてエネした。卵用鶏育成幼雛期の養分要求量を満たすよ

ルギー不足が示唆されたことから，第二次給与試

うに設計した，トウモロコシ・大豆粕主体の対照

験では，粉砕前に低速撹拌によるもみすりを行う

飼料，2.1に記述したように精製したライグラス

とともに，粉砕後に180μｍのふるいを通過した

種子を50％配合し，栄養素含量が対照飼料と同等画分を除去したものをライグラス種子（製粉）とになるように調製したライグラス飼料（製粉）して用いた。これによりロリオース含有量を維持（Table１），LNBを0.1％および1.0％添加した飼料

したまま，不要な成分を除去した組成物を給与試を調製した。それぞれの飼料に，平均体重が等し験に用いた。

くなるようにヒナを５羽ずつ割り付け，16日間給

６）

2.2

第二次給与試験与した。なお，本研究における動物実験は，農研

嗜好性試験

31日齢のロードアイランドレッド種の雄ヒナを10羽供試して嗜好性試験を行った。平均体重がお機構動物実験委員会の承認を受け，農研機構動物実験等実施規程に従って行った。

およそ等しくなるように２羽ずつ５区画のケージ© The Ito Foundation

382

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table１ Composition of experimental dietControl dietFirst trial
Milled seed diet

Second trial
Dehulled seed diet

21.00

Ingredients, %
Corn

65.63

32.82

Milled rygrass seed

-

50.00

-

Dehulled ryegrass seed

-

-

50.00

31.14

15.57

16.10

-

-

4.00
5.00

Dicalcium phosphate

1.27

0.64

1.50

Calcium carbonate

1.22

0.61

1.05

Sodium chloride

0.34

0.17

0.35

L-Lysine-Cl
DL-Methionine

-

-

0.35
0.15

L-Threonine
Vitamin mixture
Mineral mixture
Chromic oxide

0.20
0.10
0.10

0.10
0.05
0.05

0.10
0.20
0.10
0.10

2.90
19.00
0.86
0.62
0.40
0.61
1.06
0.73

2.59
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.

2.90
19.00
0.88
0.64
0.40
0.60
1.05
0.73

Soybean meal
Corn gluten meal
Vegetable oil

Calculated value（%）
Metabolizable energy（kcal/g）
Crude protein
Calcium
Total phosphorus
Non-phytate phosphorus
Methionine + Cystine
LysineThreonine

2.5

LNB資化性試験養した。ネガティブコントロールとして糖質無添

19種類のBifidobacterium属細菌種の基準株を加区，ポジティブコントロールとしてグルコース

理化学研究所バイオリソース研究センター微生物

添加区，機能性オリゴ糖の比較対象としてフラク

材料開発室より入手し，これらのLNBに対する

トオリゴ糖添加区についても同時に試験を行っ

資 化 性 を 検 討 し た 。Man-Rogosa-Sharpe 培 地

た。培養終了後の培養上清pHと濁度（OD600）（55g/L）にPhytone peptone（5g/L）とL-cysteineを測定することにより，各菌株の各種糖質資化性

HCl（0.5 g/L）を加えた液体培地を用いて24時間嫌を判定した。

気条件で前培養後，糖源フリー基礎培地［tryptone（5.0 g/L），yeast extract（5.0 g/L）
，peptone（10３．結果と考察g/L），K２HPO４（2.0 g/L）
，diammonium citrate

3.1（2.0 g/L），sodium acetate（5.0 g/L）
，manganese

ライグラス種子の飼料利用性を検証するため，

sulfate monohydrate（0.25 g/L）
，magnesium sulfate

市販の飼料とライグラス飼料（粒）の嗜好性を比

heptahydrate （0.58 g/L）
， Tween 80 （1 ml/L）較した。その結果，給与期間中の摂取量は，対照

およびL-cysteine HCl（0.5 g/L）］にLNBを最終

飼料＝332±15ｇ，ライグラス飼料（粒）＝304±25ｇ

濃度１％（w/v）添加した条件にて72時間嫌気培（平均値±標準誤差，ｎ＝５）であり，有意な差© The Ito Foundation

嗜好性試験

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証

383

Table２ Effect of feeding ryegrass seeds and LNB on growth performance in Laying-type chicks
First trial
Control+LNB（1.0%）+Ryegrass seed（Milled）

Body weight gain（g/8 days）

124±3a123±8a80±16bFeed intake（g/8 days）

428±20410±22418±310.291±0.010a

0.300±0.011a

0.185±0.026b

Feed efficiency
Second trial

Body weight gain（g/16days）
Feed intake（g/16days）
Feed efficiency

Control+LNB（0.1%）+LNB（1.0%）+Ryegrass seed（Partially Purified）

245±7b254±12b267±8ab301±14a586±9616±19684±39675±380.418±0.010

0.412±0.010

0.394±0.022

0.449±0.018

Mean±S.E., n=5
Means within rows with no common superscript differ significantly（p<0.05）は認められなかった。供試したヒナは，試験前よいては，対照区と有意な差は認められなかったもり対照飼料を摂取していたのにもかかわらず両区のの，飼料効率が良くなる傾向が見られた。ライ

の間に差が見られなかったことを考えると，ライグラス種子の回腸アミノ酸消化率は50％前後と一グラス種子の嗜好性は悪くないと推察される。

般的な飼料原料よりもおおむね低く，配合設計す3.2

第一次給与試験る際にはアミノ酸消化率を加味する必要があると

LNBおよびライグラス種子（粉）を添加した考えられた。

飼料を用いて給与試験を行った。ライグラス種子

3.3は飼料の形状をそろえるため，2 . 1に記述のとお

LNBおよびエネルギーを調整したライグラス

り粉砕したライグラス種子（粉）を用いた。飼養（製粉）を添加した飼料を用いて給与試験を行っ

成績についてTable２に示す。飼料摂取量は各区た。ライグラス種子は飼料の形状およびエネル

間に差は認められなかったが，増体量はライグラ

ギーをそろえるため，2 . 1に記述のとおり粉砕後ス区が他区よりも有意に低かった。飼料効率につに製粉したライグラス種子（製粉）を用いた。ないてもライグラス（粉）区が他区よりも有意に低

お，ライグラス種子の製粉処理により繊維性成分

かった。配合したライグラス種子のME含量は，が除去され，ロリオース含有量にほぼ変動がな

2.22±0.06kcal/gと推定された。ライグラス（粉）かったため，ロリオース含有率は1.4倍に向上し区の増体量および飼料効率が低かった理由としていた。飼養成績についてTable２に示す。LNBて，飼料中のエネルギーが不足したことが考えら

区については，対照区と飼料摂取量および増体量れる。対照飼料のME含量の実測値が2.97kcal/gが向上する傾向が認められたものの，有意差がつで あ っ た の に 対 し て ，ラ イ グ ラ ス（粉）区 は

くほどではなかった。一方，ライグラス（製粉）2.59kcal/gと約0.4kcal/gほど低かった。飼料摂取区においては，増体量に５％水準の有意な向上が

量は区間に差が見られなかったことから，ライグ観察された。なお，飼料摂取量および飼料効率は

ラス飼料中のエネルギーを対照飼料と同等になる区間において差は認められなかった。ライグラス

ように調製することにより，対照区と同程度の飼（製粉）区の飼料を調製する際，エネルギー源と料成績が期待できると考えられた。LNB区につなる油脂および不足する一部のアミノ酸を配合© The Ito Foundation

第二次給与試験

384

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table３ Growth of bifidobacteria in the presence of various sugars
Bifidobacterium species

StrainIsolation source

B. animalis subsp. animalis

JCM 1190T

B. breve
B. catenulatum subsp. catenulatum

JCM 1192T
JCM 1194T

B. dentium

JCM 1195T

B. pseudocatenulatum

Acid production from:
none

Glc

FOS

LNB

Rat feces
Intestine of infant

−
−

＋
＋

＋
＋

−
＋

Human feces

−

＋

＋

−

Dental caries

−

＋

＋

−

JCM 1200T

Feces of an infant

−

＋

＋

＋

B. thermophilum

JCM 1207T

Swine feces

−

＋

＋

−

B. boum

JCM 1211T

B. longum subsp. longum
B. longum subsp. infantis

JCM 1217T
JCM 1222T

Rumen of cattle
Intestine of adult

−
−

＋
＋

−
＋

−
＋

Intestine of infant

−

＋

＋

＋

B. bifidum

JCM 1255T

Feces of a breast-fed infant

−

＋

−

−

B. adolescentis

JCM 1275T

Intestine of adult

−

＋

＋

−

B. pullorum subsp. gallinarum

JCM 6291T

B. angulatum
B. merycicum
B. ruminantium
B. gallicum

JCM 7096T
JCM 8219T
JCM 8222T
JCM 8224T

Chicken cecum
Human feces

−
−

＋
＋

＋
＋

−
−

Bovine rumen
Bovine rumen

−
−

＋
＋

＋
＋

−
−

B. scardovii
B. psychraerophilum

JCM 12489T
JCM 15958T

Human feces
Human blood

−
−

＋
＋

＋
＋

−
＋

B. porcinum

JCM 16945T

Porcine caecum
Piglet feces

−
−

＋
＋

＋
＋

−
−

し，対照区と同等の栄養素となるようにした。そした場合は，同一の分離源であっても菌種によっの結果，第一次給与試験で観察された増体量の低て資化性が異なることから，菌種・菌株依存的な下は解消され，さらに対照区よりも良好な増体が資化性の多様性が示唆された。このビフィズス菌確認された。その要因として，有意差はなかったのLNB資化における高い選択性について，特徴

ものの，ライグラス（製粉）区の飼料摂取量は他的な代謝経路の存在が報告されている２）。今回，区よりも多かったことがあげられる。第一次給与

LNB資化性を示した５菌株はゲノム中にその代試験においても，ライグラス配合飼料区の増体量

謝関連酵素遺伝子を保有していたことから，本試は低かったものの，飼料摂取量は他区と比較して

験結果はその代謝経路の重要性を支持するもので遜色がなかったことから，ライグラス自体の嗜好ある。本データを基礎知見とし，LNBの飼料用性が良好であることを推察された。なお，対照飼

オリゴ糖素材単独利用時の対象家畜の選定や，オ

料およびライグラス配合飼料のME含量は，それリゴ糖資化性に優れる有用ビフィズス菌と飼料用

ぞれ3.09および3.05kcal/gと，ほぼ同等であった。

オリゴ糖素材の共利用（シンバイオティクス）に

3.4

LNB資化性試験

つなげられるだろう。

ヒトや家畜を分離源とするビフィズス菌株19株

以上，LNBについてはそのビフィズス菌選択に対して，培地中にオリゴ糖を添加した資化性試的増殖機能を活用したシンバイオティクスとして験を実施した。その結果，５株においてLNBのの飼料添加の可能性が，また，調製したライグラ

資化性が認められた（Table３）。機能性オリゴ糖

ス種子組成物については，増体効果を活用した新として知られるフラクトオリゴ糖（FOS）を添

たな飼料添加物としての可能性が示唆された。こ加した場合はほぼすべて（19菌株中17菌株）におれらを新たな飼料用素材として実用化するため，いて資化性が観察されたのに対し，LNBを添加

さらなる実証試験等に取り組んでいきたい。

© The Ito Foundation

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証

４．要約

新たなオリゴ糖素材の早期実用化に向けた健康
機能性に関する基礎データを収集・蓄積するため，酵素合成法が開発されたラクト- N -ビオース
Ⅰ（LNB），および特異的なオリゴ糖を含有する
牧草ライグラス類を対象として，それらの家畜に対する健康機能性について検証した。LNBを添加した飼料を鶏ヒナに給与したところ，飼養成績に大きな違いは認められなかった。しかしながら，さまざまな家畜より分離されたビフィズス菌
を，LNBを含む培地で培養したところ，菌株特
異的な増殖が認められ，当該菌株を保有する家畜
において腸内細菌叢改善効果を発揮する可能性が示唆された。さらに，ライグラス類の種子から調製した組成物を添加した飼料を鶏ヒナに給与したところ，有意な増体効果が認められた。本組成物

385

文
献
１）
 Kiyohara, M., Tachizawa, A., Niahimoto, M.,
Kitaoka, M., Ashida, H., Yamamoto, K.：Prebiotic
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2009.
２）
 Kitaoka, M., Tian, J., Nishimoto, M.：Novelputative galactose operon involving lacto-N-biose
phosphorylase found in Bifidobacterium longum,
Appl. Environ. Microbiol., 71（6）,3158～3162, 2005.
３）
 Macleod, A. M., McCorquodale, H.：Trisaccharides
of Lolium and Festuca, Nature, 182（4638）,815～816,
1958
４）
 Chatterton, N. J.：Loliose-a novel trisaccharide
in leaves of Lolium and Festuca species, Plant
Physiology（Life Science Advance）, 12, 113～116,
1993.
５）
 Amiard, V., Morvan-Bertland, A., Billard, J. P.,
Huault, C., Keller, F., Prud’Homme, M. P.：Fructans,but not the sucrosyl-galactosides, raffinose andloliose, are affected by drought stress in perennial
ryegrass, Plant Physiol., 132（4）,2218～2229, 2003.
６）
 Nishimoto, M., Kitaoka, M.：Practical Preparationof Lacto-N-biose I, the Candidate of the Bifidus
Factor in Human Milk, Biosci. Biotechnol. Biochem.,
71（8）,2101～2104, 2007.

の新たな飼料添加物としての実用化に向け，さらなる実証試験の実施が期待される。

© The Ito Foundation

386

子牛の健全な発達を目指した消化管の上皮細胞
接着微生物叢の相互関係の解明
Revealing gastrointestine development by understanding gastrointestineepithelial attached cells in calves

西

原

昂

来

（東北大学大学院農学研究科）

Koki Nishihara（Faculty of Agriculture, Tohoku University）

The objective of this study was to reveal the relationship between diarrhea,
gastrointestinal development and immunology. In this study, Holstein male calves（n=6）were
randomly assigned to pre-weaning group（Day35）and weaned group（Day63）. Calves wereraised and slaughtered at 35 and 63 days of age. Calves were weaned at 56 days of age. Rumen
tissues were obtained after slaughter. The length of rumen papillae was higher in Day63 groupthan that in Day35 group. The mRNA expression of tight junction and antimicrobial peptides
were analyzed using qRT-PCR. No changes were observed in the expression of tight junction
and antimicrobial peptides between Day35 and Day63. The correlation between fecal score,
body weight, the length of rumen papillae, gene expression of tight junction and antimicrobial
peptides were analyzed using R software. There were no correlations between fecal score andthese factors. From these results, there were no relationship between diarrhea andgastrointestinal development and immunology during weaning period. In the future, we plan toanalyze the relationship between fecal score and gastrointestinal attached microbiota, andsample gastrointestinal tissues at younger age to clarify process of microbiota attaching toepithelial cells.

１．目

であることなどが考えられる。下痢を呈した子牛的は，のちに発育不良になりやすいことも知られて離乳前の子牛を健全に育てることは，肉用牛といる。これらの損失を合わせると，離乳前子牛の乳用牛の生産において重要な課題である。アメリ

消化器病は農家に大きな経済的損失を与える。一カ・カナダといった畜産が発展している国におい方で，下痢等の症状は離乳後には少なくなることても，消化器病は離乳前子牛の死廃原因の３割，から，早期に離乳させる，もしくは消化管を早期罹患する疾病の約半分を占める 。消化器病の代に発達させることで消化器病による損失を減らせ

表 的 な 症 状 は 下 痢 で あ り ，原 因 と し て は ，E.

るのではないかと考えられる。そのためには，上coli，ロタウイルス，コクシジウムといった細菌・皮の発達，消化管免疫の獲得，消化管内容物の微ウイルス・寄生虫感染や飼料の衛生状態が不適切

生物叢，消化管上皮と微生物叢の関係といったこ

１）© The Ito Foundation

子牛の健全な発達を目指した消化管の上皮細胞接着微生物叢の相互関係の解明

387とを包括的に理解し，応用することが必要であろ

給餌量は過去の文献を参考にした６）。飼養中は，う。

朝の給餌前に糞スコアを測定した。また，毎週，消化管上皮細胞には微生物が接着し，宿主と体重測定を行った。Day35，63の８：00にランダ

win-winな共生関係を築いていることが示唆され

ムに３頭ずつ解剖した。解剖時にルーメン組織をてきた。例えば，反芻動物のルーメン上皮細胞に採材した。採材したルーメン組織より組織切片をはSCFA産生菌が接着し ，ルーメン上皮細胞に作製し，ルーメン絨毛の長さを測定した。また，接着する微生物は宿主の栄養獲得にポジティブに

ルーメン組織よりルーメン免疫に関わる遺伝子発働くと考えられる。マウスの回腸パイエル板に接

現量，解剖時に得られた消化管組織の抗菌ペプチ

着するセグメント細菌は，IgA産生細胞の増加

３）

ド遺伝子発現量をqRT-PCRにより測定した。結や，パイエル板からの細菌侵入・ウイルス感染の果は，Student’s t -test（Day35 vs Day63，有意阻止４）といった作用を持つ。また，マウスにおい水準 p＝0.05）により解析した。また，糞スコアては離乳前にはセグメント細菌が観察されず，離と他の項目について，ピアソンの積率相関係数を

乳に伴い菌数が増える

ことが知られる。これら

解析した（有意水準 p＝0.05）。また，ルーメン上の報告から，離乳前子牛が下痢をしやすく，発育皮を含む組織からはDNAを抽出した。現在，16S

不良になる要因の一つとして，宿主に対してポジ

rRNA解析中である。なお，１．目的のために，ティブに働く微生物が上皮細胞に接着していない

今後，サンプル数を増やす予定である。

２）

５）からではないかと考えた。この場合，消化管上皮細胞に接着する微生物の同定や接着する時期の解３．結果

明は，新規の飼料・飼料管理法開発のヒントにな実 験 期 間 中 の 糞 ス コ ア の 平 均 は ，1.6 ± 0.4

る可能性がある。また，他の哺乳類と異なり出生（Day35），0.8±0.3（Day63）であった。解剖時のした翌日には固形飼料を摂取し始める牛におい体重は，58.7±1.9kg（Day35），86.3±5.2（Day63）て，いつから消化管上皮細胞に微生物が接着するであった。組織切片よりルーメン絨毛の長さを測かは比較生物学的に興味深い。よって本研究の目定したところ，571.3±40.9μm（Day35），1155.1±

的は，１）出生から離乳までの期間における牛消160.1μm（Day63）であった（ p＜0.01）。Day63

化器の上皮細胞接着微生物叢の形成過程を明らかのルーメン絨毛長が有意に長かったことから，離にし，２）下痢や消化器発達・免疫との関連を明乳により消化管が発達したと考えられる。採材しらかにすることである。

たルーメン組織において，タイトジャンクション

２．方（OCLD（オクルディン），CLD（クローディン）１，

法

CLD4，CLD7）の遺伝子発現量を解析したとこ

本研究の動物実験は東北大学動物実験センター

ろ，発現に有意差の見られるものはなかった（ p＝0.10， p＝0.82， p＝0.35， p＝0.74）。また，抗に承認を得た上で行った。
新生ホルスタイン（雄：ｎ＝６）を供試した。

菌 ペ プ チ ド （S100A2 ， S100A7 ， S100A8 ，

出生日をDay０とし，Day56の離乳日までは代用

S100A9）の遺伝子発現量をqRT-PCRで解析した乳を給餌した。消化管の発達を促すため，Day１

ところ，発現に有意差の見られるものはなかったの９：00よりスターター（固形飼料）を給餌し（ p＝0.15， p＝0.20， p＝0.22， p＝0.08）。糞スコ

た。給餌は一日二回（９：00と17：00）とした。

アと解剖時体重，ルーメン絨毛長の相関関係を解© The Ito Foundation

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令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

析したところ，相関関係は見られなかった（ r＝に相関関係は見られなかった。また，Day35と－0.53 and p＝0.28，r＝－0.68 and p＝0.13）。まDay63日齢でタイトジャンクション・抗菌ペプチ

た，糞スコアとタイトジャンクション・抗菌ペプ

ドの遺伝子発現量を比較したところ，発現量に有チドの遺伝子発現量との相関関係を解析したとこ

意な差は見られなかった。これらのことから，離ろ，相関関係は見られなかった。これらの結果よ

乳期間中のルーメン絨毛の成長やルーメン上皮のり，糞スコアの平均と各項目の相関関係は見られ免疫に関わる因子は，下痢と因果関係がないものなかった。バイオプシーなど７）で糞スコア測定しと考えられる。今後，消化管の微生物叢と糞スコている各時点でのルーメン組織の遺伝子発現量をアの相関関係を解析し，また，より若い日齢での検討すると差が見られる可能性がある。今後，

サンプリングすることで，上皮に接着する微生物

ルーメン上皮に付着している微生物叢を解析し，叢の形成過程を明らかにする予定である。

糞スコアと相関関係のある微生物を解析する予定である。また，糞中のIgA濃度を測定し，糞スコアとの相関関係を解析する予定である。また，空腸，回腸，結腸組織に関しても，組織片の観察，遺伝子解析を行う予定である。
４．要

約

本研究の目的は，下痢や消化器発達・免疫との関連を明らかにすることである。本研究では，ホルスタイン子牛（雄，ｎ＝６）を35日齢と63日齢まで飼養した。63日齢まで飼養した牛は56日齢で解剖した。解剖後，これらの牛よりルーメン組織を採材した。ルーメン絨毛長はDay63で有意に長くなっていたため，離乳により消化管機能が発達したと考えられる。試験期間中の各個体の糞スコ
アの平均と，体重，ルーメン絨毛長，タイトジャ

文献１）
 Urie, N. J., Lombard, J. E., Shivley, C. B., Kopral, C.
A., Adams, A. E., Earleywine, T. J., Olson, J. D.,
Garry, F. B.：Journal of Dairy Science, 101, 9229～
9244, 2018.
２）
 Liu, J. H., Bian, G. R., Zhu, W. Y., Mao, S. Y.：
Frontiers in Microbiology, 6, 167, 2015.
３）
 Klaasen, H. L., Van der Heijden, P. J., Stok, W.,
Poelma, F. G., Koopman, J. P., Van den Brink, M. E.,
Bakker, M. H., Eling, W. M., Beynen, A. C.：
Infection and Immunity, 61（1）,303～306, 1993.
４）
 Shi, Z., Zou, J., Zhang, Z., Zhao, X., Nriega, J.,
Zhang, B., Zhao, C., Ingle, H., Bittinger, K., Mattei, L.
M., Pruijssers, A. J., Plemper, R. K., Nice, T. J.,
Baldridge, M. T., Dermody, T. S., Chassaing, B.,
Gewirtz, A. T.：Cell, 179（3）,644～658, 2019.
５）
 Snel, J., Hermsen, C. C., Smits, H. J., Bos, N. A.,
Eling, W. M., Cebra, J. J., Heidt, P. J.：Can. J.
Microbiol, 44, 1177, 1998.
６）
 Nishihara, K., Suzuki, Y., Kim, D., Roh, S. G.：
Animal Science Journal, 90, 1287～1292, 2019.
７）
 Van Niekerk, J. K., Middeldorp, M., Steele, M. A.：
Journal of Dairy Science, 101, 7212～7218, 2018.

ンクション・抗菌ペプチドの遺伝子発現量との相関関係を解析したところ，糞スコアとこれらの間© The Ito Foundation

389

ゲノム編集による高消化性暖地型イネ科牧草の開発
Development of high digestibility warm-season forage grass by genome
editing

権

藤

崇

裕

（宮崎大学フロンティア科学総合研究センター）

Takahiro Gondo（Frontier Science Research Center, University of Miyazaki）

Genome editing has now become a powerful tool for plant breeding. In this study, we
attempted to develop high forage digestibility for warm-season grasses by genome editing of
the cinnamyl alcohol dehydrogenase （CAD） genes involved in lignin biosynthesis bytransformation in bahiagrass（Paspalum notatum）as a model. The plasmid vector for particle
bombardment was constructed by inserting sgRNA which is the target sequence of the CAD
gene into the genome editing vector. A total of 720 pieces of calli was treated with particle
bombardment and 44 transformed callus lines were selected under bialaphos, seven of themfound mutations in the target sequence. This mutation efficiency was 15.9％（7/44）,which was
almost the same with the other crops. Three out of the seven transformed callus lines（T9,
T13, T26）were regenerated into complete plants and almost all had mutations. As a result of
sequence analysis, the T9 and T13 lines were both heterozygous mutants in which a mutation
was inserted on one side of the allele. On the other hand, the T26 line was a biallelic mutant inwhich different mutations were inserted in both alleles. Only the T26 line showed asignificantly lower lignin content than the wild type in both pseudostems and leaves. It is
accepted that a decrease in lignin synthesis is due to knockout of the targeted CAD gene. In
addition, this line was more of a creeping phenotype than the other lines, which suggest that
decrease in lignin content affect the morphology of plants. Henceforth, it is expected that thenovel forage grass cultivar will be created with genome editing by removing the vector.

１．目

異なるが，約５～10％に満たない。家畜の肉質お的よび生産性は，飼料の品質に大きく左右され，牧

暖地型イネ科牧草は，乾物生産性は高いもの

草のリグニン含量を１％減少させた場合，消化率の，家畜による消化性に問題があるため，消化性が約10％上がると試算され１），牧草のリグニン含の向上は重要な育種課題の一つである。飼料成分

量の減少は，家畜生産性の飛躍的な向上につながの一つであるリグニンは，牧草の消化性に深く関ると考えられる。

わっており，その含量は草種や生育段階で大きくこれまで，遺伝子組換えによりリグニン生合成© The Ito Foundation

390

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

遺伝子を逆方向（アンチセンス）または逆位反復

暖地型イネ科牧草が開発できるのかを明らかにす（RNAi）に導入することで標的遺伝子の発現をる。

抑制し，リグニン含量を低下させた成功例がトールフェスク２），ペレニアルライグラス３），スイッ法

２．方

チグラス等４）で報告されている。また著者らも，

2.1

バヒアグラスにおいてリグニン生合成のキー酵素

標的配列であるガイドRNAは，バヒアグラス

であるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼのCAD遺伝子の塩基配列から検索し，PAM配列（CAD）の発現を抑制した高消化性暖地型イネ科（NGG）の手前に制限酵素サイトを有する配列を牧草の開発に成功している 。しかしながら，こ

公開ソフトウェアCRISPRdirect（https://crispr.

れら開発した遺伝子組換え体については，外来遺dbcls.jp）より選定した。設定したガイドRNAは，伝子の拡散や安全性などの規制が厳しく，また，

MluⅠ 制 限 酵 素 サ イ ト を 含 む 5’

社会的にも容認されていないため，品種として実-GGGCGCGGACGCGTACC-3’ の 17bp で あ り

用化することは困難である。

（Fig.１），こ の 配 列 を ゲ ノ ム 編 集 ベ ク タ ー

５）

ゲノム編集技術は，任意の配列を認識できる人
工ヌクレアーゼ（CRISPR/Cas9）の働きにより，狙った遺伝子をピンポイントで切断することができ，遺伝子のノックアウトを自在に行うことがで

ゲノム編集ベクターの構築（CRISPRPL, Sigma）に挿入し，導入ベクターとして用いた。
2 . 2 エンブリオジェニックカルス（Ｅカルス）の誘導と形質転換きる画期的な技術である。医学，理学，農学系な

バヒアグラスは，完熟種子を用い，種子の内・どのさまざまな研究分野で活用されつつあり，植外穎を取り除き，滅菌処理後（70％エタノール２物の分野については，作物の品種改良への利用が分，２％次亜塩素酸ナトリウム15分），滅菌水で試みられ，遺伝子組換え技術とは異なる実用化を３回洗浄し，実験に供した。カルスは，滅菌種子見据えた新しい育種技術として注目されている。

を２mgL－1 2,4-D，0.1mgL－1 BAP，50μM CuSO４

この技術は外来遺伝子の導入を伴わないため，こおよび0.3％ゲランガムを添加したMS固形培地

れまでの遺伝子組換えの規制を受けず，日本では（DBCH培地）に置床し，31℃，明条件下にて誘2019年度より，ゲノム編集により開発された食品導した。形成されたＥカルスはコンパクトで増殖

は，遺伝子組換えの規制対象外として流通が認め旺盛なカルスのみを選抜し，同培地に14日間隔でられている（厚生労働省，2019年９月13日発表）。

継代を行い，形質転換に用いた。

そのため本技術により，牧草の実用化を見据えた品種開発が現実のものとなっている。

形質転換は，Gondoら６）のパーティクルガン法
により行い，ガン処理後，カルスはDBCH培地で本研究は，ゲノム編集による高消化性暖地型イ

３日間培養した後，５mgL－1 ビアラホス添加の同ネ科牧草を開発するため，バヒアグラスをモデル培地で60～70日間選抜培養した。ビアラホスに耐に形質転換によるCAD遺伝子のゲノム編集を試性を示す形質転換カルスは，標的配列の変異を確み，標的遺伝子のノックアウトを行った。また，認した後，５mgL－1 ビアラホス添加のMS培地で作出された編集個体についてリグニン含量を調査

21日間，２mgL －1 BAP，0.01mgL －1 NAAおよび

し，（１）ゲノム編集技術が暖地型イネ科牧草に５mgL－1 ビアラホス添加のMS培地で30日間培養適用できるのか，（２）リグニン含量が低下したすることで植物体再分化を行った。再分化した植© The Ito Foundation

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ゲノム編集による高消化性暖地型イネ科牧草の開発
ATG
89 bp

114 bp663 bp229 bpgRNA target site
GGGCGCGGACGCGTACC (TGG)
PAM
Mlu I

Transgenic callus Lines

WT
U

D

TAA

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

124 bpFig. 1 Sequence of an sgRNA designed with target site of CAD gene and confirmation of mutations of 35 transgenic

callus lines by PCR and restriction with Mlu I in bahiagrass.

Bahiagrass CAD gene has four exons, which was estimated from the genetic information of sorghum. The

protospacer-adiacent motif（PAM）sequence is indicated brackets and the Mlu I restriction site is underlined. PCR
products amplified by primers F626 and R749 were digested with Mlu I. Lanes labelled D and U of WT are PCR
fragments amplified from WT plants with and without Mlu I. Lanes 1-35 show blots of PCR fragments amplified
from transgenic callus lines digested with Mlu I. The bands marked arrows of transgenic callus lines are caused by
CRISPR/Cas9-induced mutation.

物体は，５mgL－1 ビアラホス添加の1/2MS培地で

ル酸リグニン定量法（rTGA法）により行った。

発根を促し，土へと順化した。

非形質転換体（WT）と形質転換体（Ｔ）の未展

2 . 3 形質転換カルスおよび植物体の変異挿入の解析

開葉と展開葉を採取し，乾燥・粉砕・脱脂した
後，20mgを用いて解析を行った。最後に溶解し形質転換カルスにおける標的配列の変異は，たサンプルは，1N NaOHで希釈した後，OD：

PCR/RE解析により評価した。すなわち，カルス

280nmの波長で計測し，イネ科全般の検量線（ｙよりDNAを抽出した後，標的配列を含むDNA領＝127.12ｘ）を用いて８），細胞壁成分中のリグニ域でPCRを行い，変異が挿入される配列に位置す

ン含量を換算した。

る制限酵素（MluⅠ）で処理した後，バンドパ
ターンの違いにより，変異の有無を確認した。変

３．結果と考察

異が認められたカルス系統は，PCR産物をサブク

3.1

ローニング後，シークエンス解析を行い，標的配

パーティクルガンによりゲノム編集ベクターを列を確認した。形質転換カルスより再分化した植

カルスに導入し，ビアラホス存在下で形質転換カ

物体についても，PCR/RE解析を行い，PCR産物

ルスを選抜した。合計720個のカルスにガン処理

をExoSAP-IT処理後，ダイレクトシークエンスを行ったところ，ビアラホスに耐性を示す形質転を行い，遺伝子型配列を決定した。

換カルスが44個得られ，その形質転換効率は6.1％

2.4

リグニン含量の測定であった。Fig.１は，形質転換カルスのPCR/RE

リグニン含量は，島田ら の迅速チオグリコー
７）

形質転換カルスの獲得とゲノム編集

解析による変異の有無を示したものである。７個© The Ito Foundation

392

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）の形質転換カルス系統において，非形質転換カルされたことが推察された。また，シークエンスにスとは異なるバンドパターンが認められ，ゲノムよる標的配列の解析では，１～２bpの塩基の挿編集による制限酵素サイト（MluⅠ）の変異によ入や欠失が多く，なかには数十塩基の欠失や数百り，消化されないバンドやそれらがシフトしたバ

塩基の挿入も認められた。

ンドが確認された。

3.2

再分化植物体における変異の確認

その後，ゲノム編集が確認された形質転換カル

上記のゲノム編集された形質転換カルスを再分スのPCR産物を用いて，サブクローニングを行化培地に移植したところ，７系統のカルスのうち

い，得られたクローンをシークエンスすることで３系統（Ｔ９，Ｔ13，Ｔ26）で植物体再分化が認

標的配列の変異パターンを調査した。７系統の形

められ，それらは発根し，土へと順化した。これ

質転換カルスについて，標的配列に変異が認めららの個体について，RCR/RE解析を行ったところ，れるクローンの割合は，22～100％の範囲であっ再分化したほとんどの個体でPAM配列手前の制た（Fig.２）。このことから，編集されたカルスは，

限酵素配列の変異による不消化のバンドが認めら

ほとんどが形質転換初期に標的配列に変異が挿入

れ，個体レベルで標的配列の変異が確認できたMuta�on 2/9 (22.2 %)TC Line #9
AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTACCTGGTGAGCTCGGA WT ×7
AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTTACCTGGTGAGCTCGGA +1 ×2
TC Line #13
Muta�on 3/6 (50 %)AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTACCTGGTGAGCTCGGA WT ×3
AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCG−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−TCGGA - 20 ×3
TC Line #18
Muta�on 16/17 (94.1 %)AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTACCTGGTGAGCTCGGA WT × 1
AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTACCTGGTGAGCTCGGA +30 ×13
AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTACCTGGTGAGCTCGGA +364 × 3

TC Line #22
Muta�on 4/11 (36.4 %)AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTACCTGGTGAGCTCGGA WT ×7
AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTTACCTGGTGAGCTCGGA +1 ×4
TC Line #24
Muta�on 9/9 (100 %)AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTACCTGGTGAGCTCGGA WT ×0
AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGAC−−−−ACCTGGTGAGCTCGGA -4 ×5
AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTTACCTGGTGAGCTCGGA +1 ×4
TC Line #26
Muta�on 12/12 (100 %)AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTACCTGGTGAGCTCGGA WT ×0
AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGC−−ACCTGGTGAGCTCGGA -2 ×6
AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTTACCTGGTGAGCTCGGA +1 ×6

TC Line #35
Muta�on 5/14 (35.7 %)AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTACCTGGTGAGCTCGGA WT ×9
AAGCGCGCGGAGGCGATGGACCACCTGGGCGCGGACGCGTTACCTGGTGAGCTCGGA +1 ×5
Fig. 2 Sequence of target site in transgenic calli detected band patterns with mutation on fig. 1.

Alignment of target region sequences was obtained by colony sequencing of PCR products.

The wild type（WT）sequence is shown at the top, and the PAM sequence is indicated bold.
DNA deletions and insertions are shown as dashes and underlines, respectively. The arrowshows the place of the nucleotide insertion. The net changes in length are shown on the rightof each sequence（＋, insertion；－, deletion；×, number of clones）.

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ゲノム編集による高消化性暖地型イネ科牧草の開発

WT
U

D

393

Transgenic plant line
T6

T9

T13

T26

236 bpFig. 3 Confirmation of mutations by PCR and restriction with Mlu I inbahiagrass transgenic plant lines.

PCR products amplified by primers F514 and R749 were digested with

Mlu I. Lanes labelled D and U of WT are PCR fragments amplified from
WT plants with and without Mlu I. Lanes T6, T9, T13, T26 show blots of
PCR fragments amplified from independent regenerated transgenic line
digested with Mlu I.. The number corresponds with the transgenic callus
number in Fig. 1. The bands marked arrows of transgenic plant lines arecaused by CRISPR/Cas9-induced mutation.

（Fig.３）。また，そのバンドパターンは，カルス

完全な酵素タンパクが翻訳されないため，発現がでのRCR/RE解析の結果（Fig.１）と同様であっ

ノックアウトされると推測できる。

た。

3 . 3 ゲノム編集された形質転換体のリグニン

Fig.４は，再分化植物体のPCR産物を用いたダ

含量

イレクトシークエンスの結果である。Ｔ９系統はリグニン含量は，出穂前の野生型（WT）と標

PAM配列の上流４塩基目に１塩基（Ｔ）の挿入

的配列に変異の挿入がない形質転換体Ｔ６系統おが，Ｔ13系統はPAM配列も含めて20塩基の欠失

よび変異の挿入が認められたＴ９，Ｔ13，Ｔ26系が認められ，どちらも対立遺伝子の片方に変異が統を用いて測定した（Table１）。その結果，Ｔ26

挿入されたヘテロ変異体であった。Ｔ26系統は，系統のみが未展開葉と展開葉のどちらも野生型に

PAM配列の上流４塩基目に変異が挿入され，対比べ，１％水準で有意に低いリグニン含量を示し

立遺伝子の一方は１塩基（Ｔ）の挿入が，他方はた。本系統は，対立遺伝子の双方に変異が挿入さ２塩基（GT）の欠失が認められ，対立遺伝子のれており，標的としたCAD遺伝子の発現がノッ双方に異なる変異が見られるバイアレリックな変クアウトしたため，リグニン合成が低下したもの

異体であった。標的としたCAD遺伝子は，このと考えられる。また，本系統の形態は，他の系統変異の挿入により，塩基のフレームシフトによるに比べ，匍匐性が強く，リグニン含量の低下は，コドンの読み枠のずれが生じ，アミノ酸の配列が植物の形態にも影響することが推察された。

変化するだけでなく終止コドンの位置も変わり，

以上のことから，本研究において，暖地型イネ© The Ito Foundation

394

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

WT
T G G G C G C G G A C G C G T A C C T G G T G A G C T C G G A C G C C
T G G G C G C G G A C G C G T A C C T G G T G A G C T C G G A C G C C

T9T G G G C G C G G A C G C G T A C C T G G T G A G C T C G G A C G C C
T G G G C G C G G A C G C G T T A C C T G G T G A G C T C G G A C G C

T13
T G G G C G C G G A C G C G T A C C T G G T G A G C T C G G A C G C C
T G G G C G T C G G A C G C C G C G G C C AT G G C G G C G G C C G CCGGACGCGTACCTGGTGAGC

T26
T G G G C G C G G A C G C G T T A C C T G G T G A G C T C G G A C G C
T G G G C G C G G A C G C A C C T G G T G A G C T C G G A C G C C G C
GTFig. 4 Chromatograms of DNA sequencing of target region of WT and three mutated transgenic

plant lines.

Sequences from target region were obtained by direct sequencing of PCR products. PAM

sequence is underlined；the arrowhead indicates the insertion and deletion. The sequence isshown allelic information.

Table 1 Lignin content（％ dry cell wall residues）of wild type, non-mutant transgenic plant（T6）and mutant transgenic plants（T9,
T13, T26）.
Line

Pseudostem

Leaf

WT

6.2±0.3

8.7±0.6Ｔ6

5.4±0.2＊

Ｔ9
Ｔ13
Ｔ26

6.9±0.5
6.6±0.4＊
4.8±0.2＊＊

6.8±0.4
8.8±0.7
6.4±0.4＊＊
5.3±0.6＊＊

Values are average and standard deviation of three biological replicates.
Asterisks indicate a significant difference（t test）relative to the wild-type
control（＊, p＜0.05；＊＊, p＜0.01）

科牧草のゲノム編集個体の作出に成功した。この物の報告とほぼ同様の結果であったことから９），

ゲノム編集効率は15.9％（7/44）であり，他の作本手法は，牧草のゲノム編集に十分適用できると© The Ito Foundation

ゲノム編集による高消化性暖地型イネ科牧草の開発

395

判明した。また，標的配列のバイアレリックな変体であるＴ26系統のみが未展開葉と展開葉のどち

異体（Ｔ26）では，リグニン含量の減少が認めら

らも野生型に比べ，１％水準で有意に低い値を示れたことから，配列の変異が形質に作用したことした。このことは標的としたCAD遺伝子のノッを確認できた。今後は，交配によりゲノム編集個

クアウトにより，リグニン合成が低下したものと体の導入ベクターを除去し，新しい育種素材を開考えられた。また，本系統の形態は他の系統に比発するとともに，飼料特性やリグニンモノマーのべ，匍匐性が強く，リグニン含量の低下は，植物分析を進めていきたい。

の形態にも影響することが推察された。今後は，

４．要

交配によりゲノム編集個体の導入ベクターを除去

約することで，牧草における新しい品種育成が期待

本研究は，ゲノム編集による高消化性暖地型イされる。

ネ科牧草を開発するため，バヒアグラスをモデルに形質転換によるCAD遺伝子のゲノム編集を試みた。パーティクルガンに用いる導入ベクター
は，CAD遺伝子の標的配列であるgRNAをゲノム編集ベクターに挿入し，構築した。合計720個のカルスをガン処理したところ，44系統の形質転
換カルスが得られ，そのうち７系統で標的配列に変異の挿入が認められた。このゲノム編集効率は
15.9％（7/44）であり，他の作物の報告とほぼ同様の結果であった。植物体再分化は，変異が挿入された形質転換カルス７系統のうち３系統（Ｔ９，Ｔ13，Ｔ26）で認められ，シークエンス解析の結果，Ｔ９，Ｔ13系統は，どちらも対立遺伝子の片側に変異が挿入されたヘテロ変異体であった。一方で，Ｔ26系統は，対立遺伝子の双方に異なる変異が挿入されたバイアレリックな変異体であった。リグニン含量は，バイアレリックな変異文献１）
 Halpin, C.：Current Opinion Biotech, 56, 223～229,
2019.
 Chen, L., Auh, C. K., Dowling, P., Bell, J., Chen, F.,２）
Hopkins, A., Dixon, R. A., Wang, Z. Y.：Plant
Biotechnology Journal, 1, 437～449, 2003.
 Tu, Y., Rochfort, S., Liu, Z., Ran, Y., Griffith, M.,
３）
Badenhorst, P., Louie, G. V., Bowman, M. E., Smith,
K. F., Noel, J. P., Mouradov, A., Spangenberg, G.：
The Plant Cell, 22, 3357～3373, 2010.
４）
 Nelson, R. S., Stewart, J. C. N., Davison, B. H.：
Biotechnology for Biofuels, 10, Article No.309, 2017.
 Muguerza, M., Gondo, T., Ishigaki, G., Akashi, R.：
５）
Asian Journal of Plant Sciences, 13, 8～17, 2014.
６） Gondo, T., Tsuruta, S., Akashi, R., Kawamura, O.,
Hoffmann, F.：Journal of Plant Physiology, 162,
1367～1375, 2005.
 島田菜津美, 津山濯, 亀井一郎：木材学会誌, 65, 25
７）～32, 2019.
８） Suzuki, S., Suzuki, Y., Yamamoto, N., Hattori, T.,
Sakamoto, M., Umezawa, T.：Plant Biotechnology,
2, 337～340, 2009.
９）
 Bortesi, L., Fischer, R.,：Biotechnology Advances,33, 41～52, 2015.

© The Ito Foundation

396

牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技術の開発
Development of fattening method that maintain the flavor of beef andshorten the feeding period in Japanese Black cow

庄

司

則

章１・上

野

豊２

（１山形県農業総合研究センター畜産研究所，２信州大学農学部）

Noriaki Shoji１ and Yutaka Uyeno２（１Livestock Research Institute, Yamagata Integrated Agricultural Research Center, ２Faculty of Agriculture, Shinshu University）

In order to develop a technique for shortening the fattening period that can maintaincarcass weight, BMS, and beef flavor, we examined the feeding effect of SF（feed fermented byadding sake lees to steamed grain mixed feed）using Japanese Black cows. Compared withGroup C, which was fed the conventional diet, in the 50％ SF group in which 50％ of thecompound feed was replaced with SF, the daily gain increased after 4 months and showed
good growth. In addition, plasma GGT, which is an index of liver dysfunction, was low in the
50％ SF group. It is considered that this effect was brought about by the suppression of liver
dysfunction caused by sake lees and the stabilization of pH in the rumen due to thediversification of feeding and feeding behavior by combining feeds with different fermentation
rates. Furthermore, the low concentrations of amino acids, monosaccharides and nucleic acidrelated substances in the rumen solution and feces in the 50％ SF group suggested that theavailability of feed nutrients may be increased. This study is ongoing, and the group 50％ SF
will be slaughtered at the end of Reiwa 3 at the age of 29 months, which is 3 months earlier
than the group C.

１．目

３ヵ月齢程度の早期出荷が可能であることが報告的されている。しかし生産現場では，肥育期間短縮

肥育経営のコスト低減には肥育期間の短縮が効への取り組みが広がらない。その理由として，子果的である。令和２年３月に公表された「家畜改牛市場から肥育素牛を導入する場合には肥育開始

良増殖目標」においても，黒毛和種の現在の出荷

月齢を早めることが困難であること，肥育開始月

平均29.5ヵ月齢を26～28ヵ月齢に短縮することを齢が変更できない場合には枝肉重量や脂肪交雑量

目標としている。出荷月齢の短縮については以前を確保するために飼料の増給速度を速めたり給与

より目標とされてきたものの，直近10年間の全国量を増量したりして肥育期間の短縮を図る必要が

平均はほとんど変動していない。去勢牛では肥育あるが，ルーメンアシドーシスや肝機能低下，ビ開始月齢を早めたり肥育前期の粗タンパク質

タミンＡ欠乏等のトラブルが生じやすくなること（CP）含量を高めたりするなどの対応により，があげられる。また脂肪交雑量は十分であって© The Ito Foundation

牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技術の開発

397

も，経験的に肥育期間を短縮することにより牛肉

肉の風味を慣行と同等の成績とすることを目標との風味が低下することが知られており，去勢牛よし，現地農場の協力を得て給与試験を実施した。

りも風味が重視される黒毛和種雌肥育では特に肥農場で利用している配合飼料を105℃で40分間蒸育期間の短縮を望まない枝肉購買者が多い。

煮し，酒粕溶解液を添加して水分率約45％に調製

牛肉の風味向上には「炊いた飼料」を給与する

した後，外気の逆流防止弁のあるビニール袋にことが効果的であることが経験的に知られてお20kgずつ包装し，常温で２週間程度発酵させてり，枝肉成績もよいことから市場取引でも高い評

膨潤酒粕発酵飼料を調製した。農場の慣行体系の価を得ている。一方で，なぜそのような効果が現飼料を給与するＣ区，慣行体系で給与する配合飼れるのかについて，科学的な検証はなされていな料の原物重量50％を膨潤酒粕発酵飼料で代替するい。我々は飼料を蒸して軟らかい状態に維持する

50％SF区を設定した。宮城県子牛市場より約新たな飼料調製技術（以下「膨潤発酵技術」とい10ヵ月齢の黒毛和種雌子牛を18頭導入して３頭ずう）を開発した。本技術により調製した飼料

つの群飼とし，Ｃ区ならびに50％SF区に９頭ずは消化性が高いうえ，既存配合飼料と組み合わせつ配置した。導入後３週間を馴致期間とし，約て給与することにより，肥育牛のルーメンアシ

11ヵ月齢より給与試験を実施した。

１，
２）

ドーシスを抑制できる。また，酒粕を加工して飼

飼料摂取量（牛房ごと），体重（導入時，15ヵ料に添加し発酵させる飼料調製技術（以下「酒粕月齢時）より牛房ごとの飼料要求率を算出した。

発酵技術」という）も開発しており ，本技術に血液ならびに糞は11，13，15ヵ月齢時，ルーメンより調製した飼料を肥育牛に給与することによ

液は15ヵ月齢時，それぞれ朝の飼料給与６時間後り，肥育期間中の肝機能を向上したり，と畜時のに採取した。血液は一般生化学検査とメタボロー

肝臓廃棄率を低減したりすることができる。

ム解析，ルーメン液は細菌叢構成，一般性状検査，

３）

この２つの技術を組み合わせた新たな飼料（以メタボローム解析，糞はVFA含量とメタボロー

下「膨潤酒粕発酵飼料」）を肥育牛に給与するこ

ム解析を行った。メタボローム解析では，メタボとにより，高い消化性や疾病低減により良好な枝

ロミクス前処理ハンドブック４）の方法によりサン

肉格付成績が得られるとともに，肥育期間短縮時

プ ル 調 製 を 行 い ， 島 津 製 作 所 製 GCMS-の風味低下を抑制できる可能性が高い。そこで本QP2010plusおよびSmart Metabolites Databaseに研究では，本飼料を既存配合飼料と組み合わせてより測定した。メタボローム解析におけるサンプ

給与することにより，従来の肥育開始月齢を維持

ル定量では，分析対象サンプルすべての抽出液かしたまま，枝肉重量と脂肪交雑量に加えて牛肉のら一定量を分取して混合させたQCサンプルを調

風味も維持するとともに，肥育期間中の疾病が少製し，定期的に分析するとともに，LOWESS平

なく生産現場で受け入れやすい黒毛和種雌牛の短滑化とSplineによりQC定量値を補間し，その補期肥育技術を確立する。

間値によりサンプルの定量値の標準化を行っ２．方た５）。細菌叢構成の測定では採取ルーメン液から法

微生物ゲノムDNAを抽出後，リアルタイムPCR

本研究では，黒毛和種雌肥育牛において一般的法により細菌16S rRNA遺伝子配列に基づくプラな10ヵ月齢程度より肥育を開始したうえで肥育期

イマーセットを用いて総細菌数を，古細菌特異的間を３ヵ月間短縮し，枝肉重量，脂肪交雑量，牛

遺伝子配列に基づくプライマーセットを用いて古© The Ito Foundation

398

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

細 菌 数 を そ れ ぞ れ 求 め た 。ま た ，抽 出 ゲ ノ ム

肝障害効果を有するとの報告７）があることから，

DNAを用いて次世代シーケンシング（MiSeq）

膨潤酒粕発酵飼料中の酒粕の効果により肝機能がにより網羅的塩基配列情報を取得し，アンプリコ

良好に推移したものと考えられた。また，本研究

ン解析ソフトウェア（QIIME）により細菌叢構では採食行動調査を行っていないが，農場担当者

成を定量した。ルーメン液と糞のVFAは高速液によると「Ｃ区に比べて50％SF区の飼料摂取速体クロマトグラフィーにより定量した。

度は緩やかである」とのことであった。肥育牛に発酵TMRを給与すると飼料採食行動は分散し，３．結果と考察

一般的な分離給与に比べて消化器疾病および肝機発育成績をTable１に示した。試験開始４ヵ月

能障害による治療頭数および回数が低減する８）。

後となるおおむね15ヵ月齢時点での体重ならびにまた，濃厚飼料中の膨潤発酵飼料割合が高まるに日増体量は，50％SF区391kg，0.78kg/日，Ｃ区

つれて，肥育牛のルーメン内pHが上昇し日内変357kg，0.63kg/日であり，50％SF区が良好であっ

動幅も小さくなる（未発表データ）。本研究におた。また，牛房ごとの飼料要求率は50％SF区7.08，

いて50％SF区の飼料摂取速度が緩やかであるこ

Ｃ区9.81であった。阿部らは，飼料用米を40％（丸とや，消化速度が異なる配合飼料と膨潤酒粕発酵

粒玄米25％，粗砕玄米15％）配合した穀物原料に飼料を組み合わせて給与することにより，ルーメ

よる膨潤発酵飼料を黒毛和種雌肥育牛に給与し，ンアシドーシスやエンドトキシン産生が抑制され28ヵ月齢時までの日増体量が良好であったことをている可能性が考えられる。膨潤酒粕発酵飼料の報告している 。膨潤酒粕発酵飼料を給与した本

給与においては，酒粕による肝機能障害の抑制，研究においても，肥育途中経過ではあるが同様の発酵速度の異なる飼料の組合せ給与や採食行動の傾向を示しており，肥育期間の短縮に向けて今後分散化によるルーメン内pHの安定化の両効果にの発育が期待される。

より，肝機能が良好に保たれているのかもしれな

６）

血液性状の推移をTable２に示した。給与４ヵい。血漿メタボローム解析では，50％SF区のク

月後の50％SF区において，肝機能の指標である

レアチニン濃度が給与４ヵ月後で有意に増加し

GGTはＣ区よりも有意に低かった。蒸煮した飼た。血清クレアチニンは筋肉量にほぼ比例９）し，料用米に酒粕を添加して発酵させた飼料を肥育牛

50％SF区では体重が有意に大きかったことから，に給与したところ，血中GGTが低下し，と畜時筋肉量の増加が血漿クレアチニンの増加の要因との肝臓廃棄率は大きく低減したとの報告２）や，酒考えられた。
飼料給与６時間後に採取したルーメン液性状を

粕に多く含まれるＳ－アデノシルメチオニンは抗Table１ Weight gain and feed conversion ratio
At the start

4 months later

Group１

Numbermonthsoldbodyweight（kg）

monthsoldbodyweight
（kg）

50%SF
C

9
9

10.1
10.2

280
268

14.7
14.8

391＊
357

AverageDry matterweight gain
intake（kg/day） （kg/head）（kg）
Daily gain

0.78＋
0.63

111
89

Group１： 50%SF : 50% Steamed fermented feed and 50% Grain mixed feed，C : Grain mixed feed
Significant difference＊：p<0.05，+：p<0.1© The Ito Foundation

780
814

Feed
conversion ratio
7.08
9.81

399

牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技術の開発
Table 2 Transition of plasma biochemical components
Elapsed months

0

2

4

Months old

11

13

15

Group１

50%SF

Number

Generalbiochemical
test

C

50%SF

C

50%SF

C

9

8

9

8

9

8

30
8.7
3.5
7.1
94
91
22
92
80
102
22

26
9.9
3.5
7.7
96
86
25
94
69
88
19

36
8.9
3.5
7.0
63
109
15
82
75
153
5

33
8.7
3.5
6.6
68
100
13
84
61
147
3 ＊

27
12.3
3.5
7.0
79
128
17
79
72
257
12

32 ＊
11.2
3.5
7.2
84
140
21
83
72
278
10

Amino
Acid

5-Oxoproline-2TMS
Alanine-2TMS
Glutamine-3TMS
Glycine-3TMS
Isoleucine-2TMS
Leucine-2TMS
Lysine-4TMS
Ornithine-4TMS
Phenylalanine-2TMS
Proline-2TMS
Serine-3TMS
Threonine-3TMS
Tyrosine-3TMS
Valine-2TMS

0.99
0.96
1.18
0.90
0.84
0.79
0.83
0.73
0.87
0.74
0.75
0.83
0.92
0.82

1.10
1.26
0.83 ＊
0.88
0.98
0.91
0.83
0.79
0.93
0.84
0.72
0.75
0.80
0.87

0.89
1.09
1.04
1.05
1.01
0.99
0.95
0.98
1.04
1.04
0.98
0.97
0.99
0.99

0.95
0.97
0.97
1.01
0.89
0.88
0.92
0.98
0.91
0.97
0.88
0.95
0.97
0.94

0.91
1.06
1.11
1.11
1.10
1.11
1.23
1.40
1.06
1.26
1.23
1.11
1.17
1.16

0.92
1.02
0.94 ＊＊
1.03
1.11
1.20
1.18
1.29
1.10
1.20
1.29
1.12
1.12
1.15

Suger

Glucose-meto-5TMS（1）Glucose-meto-5TMS（2）Mannose-5TMS（2）Mannose-meto-5TMS（1）Xylose-4TMS（2）

1.11
1.04
1.07
1.32
0.81

1.01 ＊
1.01
1.13
1.52
1.08 ＊＊

1.03
0.94
1.08
0.97
0.95

1.03
1.04 ＊
1.21
1.01
1.04

0.97
0.94
1.00
0.73
0.88

1.01
0.97
0.92
0.78
0.97

Fatty
Acid

Lauric acid-TMS
Margaric acid-TMS
Myristic acid-TMS
Palmitic acid-TMS
Stearic acid-TMS

1.26
1.09
1.13
1.11
1.07

1.24
1.04
1.08
1.09
1.11

1.33
1.08
1.08
1.09
1.08

1.31
1.03
1.01 ＊
1.02
1.00 ＊

1.09
1.12
1.13
1.13
1.12

1.20
1.09
1.07
1.07
1.11

Other

3-Hydroxybutyric acid-2TMS
3-Hydroxypropionic acid-2TMS
Citric acid-4TMS
Creatinine-3TMS
Inositol-6TMS（2）Lactic acid-2TMS
Phosphoric acid-3TMS
Pyruvic acid-meto-TMS
Succinic acid-2TMS
Taurine-3TMS
Urea-2TMS
Uric acid-4TMS

1.08
1.01
1.24
0.91
1.06
0.96
0.98
0.79
1.06
0.54
0.91
1.03

1.03
0.85
0.71 ＊
0.81
1.22
1.22
0.88
1.08 ＊
0.99
0.86 ＊
0.92
0.76

0.98
0.77
0.97
0.90
0.97
1.11
0.98
0.98
1.05
0.89
0.90
1.00

0.84
0.96
0.93
1.17
0.99
1.09
0.83
1.18
0.95 ＊＊
0.98
0.86
0.79

0.99
0.84
1.14
1.59
0.94
1.30
1.11
1.14
1.13
1.12
1.27
1.27

0.93
0.98
0.71 ＊＊
0.94 ＊＊
0.95
1.04
0.99
1.12
1.08
1.33
1.09 ＊
1.25

GGT
Urea nitrogen
AlbmineTotal protein
Ammonia
Total choresterol
Triglyceride
GlucoseRetinolα-Tocopherol
β-Carotene

Metabolomic
analysis２（U/L）（mg/dL）（g/dL）（g/dL）（μg/dL）（mg/dL）（mg/dL）（mg/dL）（IU/dL）（μg/dL）（μg/dL）

Group１：50%SF：50% Steamed fermented feed and 50% Grain mixed feed，C：Grain mixed feed
Metabolomic analysis２：Standardized data by Quality Control sample
Significant difference＊＊：p<0.01，＊：p<0.05© The Ito Foundation

400

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 3 Rumen liquid properties
Group１

50%SF

Number

9

8

pH

6.77

6.67

（mmol/ml）（mol%）（mol%）（mol%）

69.17
61.57
22.64
15.78

67.42
57.25
24.24
18.51

（mg/dL）

1.11

0.61

5-Oxoproline-2TMS
Cysteine-3TMS
Glycine-3TMS
Lysine-4TMS
Ornithine-4TMS
Threonine-3TMS
Valine-2TMS

0.75
0.97
0.96
0.79
0.75
0.83
0.87

1.33
1.38
1.07
1.30
1.30
1.19
1.11

＊

PentoseArabinose-meto-4TMS
Lyxose-meto-4TMS（1）Ribose-meto-4TMS

0.60
0.72
0.70

1.73
1.91
1.38

＊

HexoseGlucose-meto-5TMS（1）Glucose-meto-5TMS（2）Mannose-meto-5TMS（1）

0.36
0.37
0.46

1.95
1.92
1.71

Disaccharide

Maltose-meto-8TMS（1）Maltose-meto-8TMS（2）Trehalose-8TMS

0.62
0.53
0.61

1.68
1.76
1.68

Fatty Acid

Elaidic acid-TMS
Lauric acid-TMS
Margaric acid-TMS
Myristic acid-TMS
Palmitic acid-TMS
Stearic acid-TMS

0.81
0.96
0.95
0.98
0.95
0.96

1.26
1.08
1.04
1.01
1.01
1.06

Nucleic Acid
Rerated Substance

Adenine-2TMS
Hypoxanthine-2TMS
Inosine-4TMS
Uracil-2TMS

0.84
0.72
0.88
0.79

1.27
1.32
1.30
1.29

Other

2-Hydroxyglutaric acid-3TMS
3-Hydroxyphenylacetic acid-2TMS
3-Hydroxypropionic acid-2TMS
5-Aminovaleric acid-3TMS
Azelaic acid-2TMS
Benzoic acid-TMS
Dodecanedioic acid-2TMS
Glutaric acid-2TMS
Inositol-6TMS（2）Malic acid-3TMS
N-Acetylneuraminic acid-6TMS
Nicotinic acid-TMS
Phosphoric acid-3TMS（1）Phosphoric acid-3TMS（2）Putrescine-4TMS
Sebacic acid-2TMS
Spermidine-5TMS
Succinic acid-2TMS
Tryptamine-3TMS
Xanthine-3TMS

0.58
0.70
1.30
1.06
1.06
0.98
1.14
0.63
1.17
0.84
0.62
0.80
1.02
1.01
0.84
1.19
1.01
0.75
0.92
0.63

1.66
1.57
0.79
0.93
0.90
1.04
0.97
1.49
1.26
1.30
1.71
1.22
1.02
0.99
1.32
0.75
1.54
1.34
1.20
1.46

Total VFA
AcetatePropionate
Butyrate

Volatile fatty acid
Ammonia nitrogen

Amino Acid

Suger

Metabolomic
analysis２

Rumen liquid was collected 6 hours after feeding at 15months old.
Group１： 50%SF : 50% Steamed fermented feed and 50% Grain mixed feed，C : Grain mixed feed
Metabolomic analysis２： Standardized data by Quality Control sample
Significant difference＊＊：p<0.01，＊：p<0.05© The Ito Foundation

C

＊
＊

＊＊
＊＊

＊

＊

＊

＊＊
＊＊
＊
＊＊
＊

＊＊

＊＊
＊＊

＊

401

牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技術の開発
Table４ Rumen fluid bacterial flora composition
Group１

50%SF

C

Number

9

8

0.783

0.708

Prevotellaceae

0.622

0.568

RF16_f

0.077

0.061

AC160630_f

0.040

0.039

AY244965_f

0.027

0.023

other Bacteroidetes

0.015

0.016

0.067

0.093

Gammaproteobacteria；Aeromonadales；Succinivibrionaceae

0.064

0.087

Alphaproteobacteria；Rhodospirillales；Rhodospirillaceae

0.002

0.004

+

Proportions of respective groups
Bacteroidetes

Proteobacteria

Firmicutes

＊＊

0.068

0.089

＊＊

Clostridia；Clostridiales；Ruminococcaceae

0.029

0.035

+

Clostridia；Clostridiales；Lachnospiraceae

0.014

0.018

+

Negativicutes；Selenomonadales；Selenomonadaceae

0.011

0.009

Negativicutes；Acidaminococcales；Acidaminococcaceae

0.006

0.007

other Firmicutes

0.008

0.020

Spirochaetes

0.021

0.037

Tenericutes

0.014

0.022

Fibrobacteres

0.004

0.005

Cyanobacteria

0.023

0.028

Verrucomicrobia

0.011

0.008

Others

0.010

0.010

＊

Rumen liquid was collected 6 hours after feeding at 15months old.
Group１： 50%SF ： 50% Steamed fermented feed and 50% Grain mixed feed，C ： Grain mixed feed
Significant difference＊＊：p<0.01，＊：p<0.05，+：p<0.1

Ｃ区2.4％となっており，有意差は認められなかっ

Table３，細菌叢構成をTable４に示した。
細菌叢の一部が変化しており，特にFirmicutes

た。メタボローム解析では，50％SF区でアミノ

門 に 属 す る 繊 維 分 解 菌 を 含 む 菌

酸，糖類，脂肪酸，核酸関連物質が少ない傾向が（Ruminococcaceae, Lachnospiraceae）が 50 ％ SF認められた。黒毛和種去勢牛に配合飼料と膨潤発区で減少傾向にあった。このことは，膨潤酒粕発

酵飼料を等量ずつ混合して給与し，１時間ごとに酵飼料は易消化性炭水化物割合が高いことを反映

ルーメン液を採取してpHならびにVFA産生量をしているのではないかと考えられた。また，50％調査したところ，配合飼料のみを給与した場合にSF区では酪酸モル比率が低下しており，酪酸を比べて次の飼料給与時までpHとVFA産生量は常発酵産物の一つとするLachnospiraceaeの減少がに高く推移していた（未発表データ）。本研究で要因の一つと推察された。なお，ルーメン液中細は酒粕を添加して発酵させた飼料という点は異な菌数に対するメタン生成菌比率は50％SF区1.5％，

るが，膨潤発酵飼料の給与によってルーメン内の© The Ito Foundation

402

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 5 Transition of fecal properties
Elapsed months

0

2

4

Months old

11

13

15

Group１

50%SF

C

50%SF

C

50%SF

Number

9

9

9

8

9

8

Total VFA（mmol/g）
Acetate（mol%）
Propionate（mol%）
Butyrate（mol%）

37.1
74.1
15.1
10.8

36.0
72.1
16.0
11.9

35.8
63.3
17.6
19.1

43.7 ＊
65.6
20.4 ＊
14.0 ＊

53.8
61.8
16.3
21.9

45.8
59.7
20.9 ＊＊
19.4

3-Aminopropanoic acid-3TMS
4-Aminobutyric acid-3TMS

0.46
1.15

0.39
0.46 ＊

1.56
1.83

0.72
1.27

1.25
1.35

2.20
0.44
1.53 ＊＊
1.52 ＊＊
1.43 ＊＊

Volatile fatty acid（mol/dL）

Amino Acid

Suger

0.71

0.91

0.87

1.04

0.84

0.78

0.83

0.92

1.04

0.84

Glycine-3TMS

0.97

1.15

0.89

1.09

0.79

Isoleucine-2TMS

1.22

1.27

1.23

1.59

0.64

Lysine-4TMS

0.87

0.94

1.02

1.20

0.87

1.23 ＊＊
1.19 ＊
1.69

Ornithine-4TMS

0.66

0.75

1.17

1.21

1.24

Phenylalanine-2TMS

1.13

1.10

0.88

1.20

0.62

Threonine-3TMS

1.03

1.11

0.92

1.17

0.64

Valine-2TMS

1.05

1.11

0.92

1.13

0.61

PentoseArabinose-meto-4TMS
Ribose-meto-4TMS
Xylose-4TMS（2）

0.38
0.57
0.82

0.42
0.74
0.72

1.42
0.97
3.22

1.24
1.53
1.43

1.50
0.86
3.19

2.20
1.54 ＊＊
2.97

HexoseFructose-meto-5TMS（1）Fructose-meto-5TMS（2）Fucose-meto-4TMS（1）Glucose-5TMS（1）Glucose-meto-5TMS（1）Glucose-meto-5TMS（2）Mannose-meto-5TMS（2）

0.78
0.71
0.89
0.45
0.83
0.41
0.82

0.85
0.82
1.12
0.94
1.05
0.37
0.89

1.09
1.14
1.39
1.53
3.45
1.84
1.09

0.83
0.83
0.57 ＊
1.56
1.01
0.86 ＊
1.16

0.67
0.65
0.74
6.85
1.50
1.41
0.89

1.85
1.68
1.62
2.67
0.99
1.69
1.26

Maltose-meto-8TMS（1）Disaccharide
Maltose-meto-8TMS（2）

0.27
0.38

0.19
0.22

2.88
2.72

0.52 ＊
0.59 ＊

2.21
2.13

0.52 ＊
0.58 ＊

Lauric acid-TMS
Margaric acid-TMS
Myristic acid-TMS
Nonanoic acid-TMS
Palmitic acid-TMS
Stearic acid-TMS

0.89
0.87
0.88
0.69
0.90
0.84

0.89
0.89
0.91
0.90 ＊＊
0.89
0.90

0.98
0.99
1.04
1.06
1.02
1.03

0.97
1.05
1.06
0.82 ＊
1.00
1.02

1.04
0.94
1.01
0.91
0.96
0.95

1.27 ＊
1.00
1.09
1.06
1.08
1.04

Hypoxanthine-2TMS
Inosine-4TMS
Thymine-2TMS
Uracil-2TMS

0.77
1.33
1.05
0.91

0.73
1.22
0.95
0.91

1.06
1.16
1.13
1.10

1.21
1.17
1.25
1.35

0.83
0.73
0.74
0.77

1.14 ＊
0.99
1.03 ＊
1.22 ＊＊

Metabolomic Fatty Acid
analysis２

Nucleic Acid
Rerated SubstanceOther

5-Oxoproline-2TMS
Alanine-2TMSC

1.23 ＊＊
1.23 ＊＊
1.28 ＊＊

4-Hydroxyphenylacetic acid-2TMS

2.47

1.57

0.85

1.36

1.19

1.55

Azelaic acid-2TMS

1.13

1.40

1.36

0.77

0.82

0.69

Benzoic acid-TMS

0.91

1.26 ＊＊

0.84

0.99

0.87

1.13

Galacturonic acid-5TMS（1）

0.31

0.60

1.66

1.36

2.10

2.45

＊
＊
＊

＊

Galacturonic acid-meto-5TMS（1）

0.57

0.76

1.92

1.24

0.84

2.75 ＊＊

Glutaric acid-2TMS

1.51

0.95

1.06

0.98

0.84

0.68

Glyceric acid-3TMS

0.66

1.06 ＊

1.14

0.70 ＊＊

1.09

1.81

Glycerol-3TMS

0.91

0.77

1.21

1.13

1.08

1.41
1.15

Glycolic acid-2TMS

1.34

0.88

1.14

2.35 ＊＊

1.22

Malic acid-3TMS

0.72

0.73

0.84

1.15

0.64

1.81 ＊＊

N-Acetylmannosamine-meto-4TMS（1）

0.79

0.88

1.09

1.08

0.94

1.31

N-Acetylmannosamine-meto-4TMS（2）

0.99

1.75

1.08

1.30

0.91

1.29

Nicotinic acid-TMS

0.67

0.62

1.14

1.15

1.15

1.43

Phosphoric acid-3TMS

1.25

1.16

1.04

0.93

1.15

1.05

Putrescine-4TMS

0.54

0.46

1.25

1.20

1.47

1.68

Succinic acid-2TMS

0.81

0.80

0.99

1.00

1.00

1.05

Urea-2TMS

0.80

1.07

0.92

1.99

0.99

1.08

Ureidosuccinic acid-3TMS

0.35

0.29

1.70

0.81 ＊

1.34

1.58

Xanthine-3TMS

0.91

1.01

1.01

1.13

0.69

0.97 ＊

Group１： 50%SF : 50% Steamed fermented feed and 50% Grain mixed feed，C : Grain mixed feed
Metabolomic analysis２： Standardized data by Quality Control sample
Significant difference ＊＊：p<0.01，＊：p<0.05© The Ito Foundation

牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技術の開発

403

微生物活性が高位安定して代謝産物の利用率が高50％SF区では，４ヵ月後に日増体量が向上してくなり，飼料給与６時間後のルーメン液のアミノ良好な発育を示した。また，50％SF区では，肝酸や糖類などの濃度が低下したのかもしれない。

機能障害の指標である血漿GGTが低かった。こ

今後，人工第１胃発酵法により，ルーメン液内代の効果は，酒粕による肝機能障害の抑制と，発酵

謝産物の経時変化を調査することにより，膨潤酒

速度の異なる飼料を組合せ給与と採食行動の分散粕発酵飼料のルーメン内発酵特性を明らかにして化に起因するルーメン内pHの安定化，がもたらいく計画である。

したものと考えられた。さらに，50％SF区では糞の性状をTable５に示した。50％SF区においルーメン液および糞のアミノ酸，単糖，核酸関連てプロピオン酸モル比率が低くなるとともに，ア

物質濃度が低かったことから，飼料中栄養素の利

ミノ酸，糖類，核酸関連物質が少ない傾向が認め

用性が高まる可能性が示唆された。本研究は継続られた。犬10）やウサギ11）に好熱菌を給与したとこ中であり，50％SF区はＣ区よりも３ヵ月早い

ろ，糞中のアミノ酸や糖が減少し栄養利用効率が29ヵ月齢で令和３年度末にと畜する予定である。

上昇したとの報告があり，本研究でも同様に糞中のアミノ酸や糖類が少なかったことから，50％
SF区では飼料消化率が向上している可能性が示唆された。これには腸内細菌叢の変動に伴い下部
消化管発酵特性が変化した可能性が考えられることから，次年度に腸内細菌叢の調査を実施していきたい。
本給与試験は継続中であり，次年度は18，21，
24ヵ月齢時の血液および糞について同様の調査を実施する計画である。また，50％SF区は29ヵ月齢となる令和４年３月に，Ｃ区は農場の慣行である32ヵ月齢となる令和４年６月にと畜し，枝肉格付ならびに牛肉食味成分を取りまとめるとともに，消費者型官能評価を実施して，膨潤酒粕発酵
飼料による肥育期間短縮効果を明らかにする予定
である。
４．要

約

枝肉重量，BMS，牛肉の風味を維持できる肥育期間の短縮技術を開発するため，黒毛和種雌牛を用いて，膨潤酒粕発酵飼料（SF：蒸煮した穀物混合飼料に酒粕を添加して発酵させた飼料）の給与効果を検討した。慣行体系の飼料を給与した
Ｃ区に比べ，配合飼料の50％をSFで代替した

文
献１）
 庄司則章，野川勝弘：穀物発酵飼料の製造方法，
および，それによる穀物発酵飼料，特許第5391506号，
2013．
２）
 庄司則章，野川勝弘：膨潤化穀物発酵飼料の製造方法，および，それによる膨潤化玄米発酵飼料，特許第5887673号，2016．
３）
 庄司則章，野川勝弘：酒粕添加発酵飼料の製造方法，特許第6547959号，2019．
４）
 島津製作所，https://www.an.shimadzu.co.jp/sites/an.shimadzu.co.jp/files/ckeditor/apl/lifescience/
metabolomics/c146-2181a.pdf
５）
 ESI友の会編：メタボロームデータの標準化方法，
https://sites.google.com/site/esitomonokai/jie-xibu-wu/metaboromudetano-biao-zhun-hua-fangfa/2-lowesstosplineno-li-lun
６） 阿部正博，小松正尚ら：膨潤発酵飼料の給与が黒
毛和種雌肥育牛の発育性および飼料効果に及ぼす影
響，山形農業研報，11，31～40，2019．
７）
 藤井力，伊豆英恵，松原主典：発酵食品「酒粕」
による老化抑制および脳機能活性化の検討，生物工学，97（10），595～598，2019．
８） 安部亜津子，成相伸久ら：黒毛和種去勢牛26ヵ月
齢出荷体系における発酵TMR給与が肥育成績および牛肉品質に及ぼす影響，日本畜産学会報，90（2），121～131，2019．
９） 孫大輔，南学正臣：BUN，クレアチニン高値を認めたときの鑑別診断の進め方，日本内科学会誌，97（5），21～25，2008．
10） 枡岡久志，井藤俊行ら：好熱菌Bacillus hisashiiを経口給与した犬の糞中の代謝物の網羅的解析，ペット栄養学会誌，20，39～40，2017．
11） 枡 岡 久 志 ，中 西 裕 美 子 ら：好 熱 性 細 菌 Bacillus
hisashiiの経口給与がウサギの腸内環境に与える影響
評価，ペット栄養学会誌，20，41～42，2017．

© The Ito Foundation

404

木材クラフトパルプの混合割合の異なる濃厚飼料の給与が黒毛和種去勢牛の飼料消化性および第一胃内発酵に及ぼす影響
Effect of various ratio of wood kraft pulp in concentration feed on feed
digestibility and rumen fermentation in Japanese Black fattening steer

前

田

友

香

（宮崎県畜産試験場）

Yuka Maeda（Miyazaki Livestock Research Institute）

The effects of feeding various ratio of wood kraft pulp in concentrated feed on feed
digestibility and rumen fermentation in Japanese Black（JB）fattening steer was examined inthis study. The feeding experiment was carried out a replicated 3 × 3 Latin square designusing 6 JB steers（16.2±0.8months of age）. Steers were fed rice straw and three concentrated
feeds：commercial formula feed（control）, formula feed containing 7.5％ KP on a dry matter（DM）basis（7.5％ KP）, and formula feed containing 15％ KP on a DM basis（15％ KP）. Feeddigestibility and rumen fermentation parameters were measured on 3-day during themeasurement period after an 11-day adaptation period. There was no significant difference in
DM intake per day among diets. In steers fed 15％ KP, a slightly higher digestibility of neutral
detergent fiber was observed compared with steers fed other diets（p=0.059）. The compositionof butyric acid in rumen fluid was higher in steers fed KP diets than in steers fed control（p=0.083）. The average ruminal pH was unaffected by KP diets. This study suggested that
there is little effect on feed digestibility and rumen fermentation by replacing 7.5％ and 15％ ofconcentrated feed with KP for JB fattening steer.

１．目

等の生産性低下につながる。したがって，黒毛和的種肥育牛を飼養する場合，飼料のエネルギーレベ

わが国において，黒毛和種牛の肥育では，デンプン等の易発酵性炭水化物を多く含む濃厚飼料をルを低下させることなく，第一胃内発酵を安定的に維持することを考慮する必要がある。

多給する１）。しかしながら，反芻家畜が易発酵性

木材クラフトパルプ（KP）は，木材由来の繊炭水化物を多量に摂取した場合，あるいは粗飼料

維からリグニンを選択的に除去するクラフト処理の摂取量が少ない場合には，第一胃内のpHが低によって製造される，セルロース主体の飼料であ下し，第一胃内発酵の恒常性が阻害される 。第る。KPはトウモロコシと同等の可消化養分総量

一胃内発酵の不安定化は，食欲不振や下痢といっ（TDN）を有し，その消化速度は粗飼料と濃厚飼た代謝障害を引き起こすリスクを高め，発育停滞

料の中間程度である３）。そのため，KPは粗飼料４）２）© The Ito Foundation木材クラフトパルプの混合割合の異なる濃厚飼料の給与が黒毛和種去勢牛の飼料消化性および第一胃内発酵に及ぼす影響

405

だけでなく，濃厚飼料の代替として牛へ給与する

16.2±0.8か月齢）を用いて，１期14日間（予備期ことが可能である 。さらに，最近の研究では，11日間，本期３日間）とする３×３ラテン方格法

ホルスタイン種泌乳牛へトウモロコシの代替としによる給与試験を反復して実施した。供試牛にてKPを給与すると，第一胃内pHの低下を抑制し，は，稲わらと以下の３つの濃厚飼料を給与した。

結果として胃液エンドトキシン（LPS）活性値がすなわち，市販の配合飼料（対照），市販の配合減少することが報告されている 。一方で，我々

飼料に乾物（DM）あたり7.5％のKPを含む飼料のこれまでの研究では，濃厚飼料の10％をKPに（7.5％KP），そして，市販の配合飼料にDMあた

置き換えた飼料を肥育後期の黒毛和種去勢牛へ給り15.0％のKPを含む飼料（15％KP）である。各

与しても，第一胃内発酵にはほとんど影響がない

飼料の配合割合および化学成分をTable１に示しことを確認している 。しかし，他の肥育ステー

た。なお，KP配合飼料には，CP含量を調節する

ジの黒毛和種牛へKPを給与した場合の影響や，ために，非タンパク態窒素（NPN）を配合した。

KPの代替割合を変えた場合の影響については不各飼料の給与量は，日本飼養標準１）に基づいて，明である。そこで本研究では，KPの配合割合を

日増体量0.75kgに要するTDNを充足するよう設10％よりも低下（7.5％）または増加（15％）さ定した。給与飼料の粗飼料と濃厚飼料の比率はせた濃厚飼料を黒毛和種去勢牛へ給与した場合

１：９とし，各飼料は１日量を半量ずつ９：00との，飼料消化性および第一胃内発酵に及ぼす影響

16：00に給与した。試験期間中，供試牛はラバーについて検討した。

マットを敷いた単房で飼養し，水とミネラルブ

５）

５）

６）

ロックは自由摂取とした。

２．材料および方法
2.1

2.2

サンプルの採取と分析

供試牛，処理区，および飼養方法

本期３日間では，全糞全尿採取による消化試験

黒毛和種去勢牛６頭（体重520.0±20.3kg，月齢を実施した。本期間中に採取した残餌，糞，およ

Table 1 Ingredients and nutritional compositions of the experimental diets
Concentrate feed

Ingredients, ％DM
Commercial formula feed†
KP
NPN‡
Rice straw
Nutritional composition
DM, ％OM, ％DM
CP, ％DM
EE, ％DMaNDFom ％DM
Starch, ％DM

RoughageControl

7.5％ KP

15％ KP

100.0
―
―
―

92.2
7.5
0.3
―

84.5
15.0
0.5
―

―
―
―
100.0

87.0
96.8
13.9
3.3
22.2
53.0

86.8
96.9
13.5
3.3
26.8
47.7

86.5
97.3
13.2
2.9
31.9
43.7

84.0
79.1
4.6
1.9
63.8
3.0

KP, Kraft pulp；DM, dry matter；OM, organic matter；CP, crude protein；EE, ether extract；
aNDFom, α-amylase treated ash-free neutral detergent fiber.
†Miyazaki shimofuri tokugou shiageyou, Minami nihon kumiai shiryo.
‡Optigen, Alltech Japan godo kaisha.

© The Ito Foundation

406

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

び尿をそれぞれ計量した。そして，残餌および糞素（UN），遊離脂肪酸（NEFA），および総ケト

は，60℃で24時間乾燥させた後，１mmメッシュ

ン体をHITACHI7070（株式会社日立製作所，東のウィリーミルで粉砕し，分析サンプルとした。

京）を用いて，VAをHPLC L-2130（株式会社日各サンプルのDM，有機物（OM），粗タンパク質

立製作所，東京）を用いて，それぞれ測定した。

（CP），粗脂肪（EE），および非繊維性炭水化物

EDTA入り採血管で採取した血漿では，LPS結合（NFC）は常法により測定した。耐熱性α-アミタンパク質（LBP），血清アミロイドＡ（SAA），

ラーゼ処理中性デタージェント繊維（aNDFom）

お よ び ハ プ ト グ ロ ビ ン（Hp）を 市 販 の キ ッ ト

はVan Scestらの方法により，デンプンは市販（HK503 kit ； Hycult Biotech, The Netherlands,の キ ッ ト （TOTAL STARCH ASSAY KIT ；TP-802；Tri-Delta Diagnostics Inc., USA，およMegazyme, Wicklow, Ireland）を 用 い て ，そ れび HAPT-11 ； Life Diagnostics, Inc., USA）を 用

ぞれ定量した。乾燥前の糞および尿のCP含量もいて，それぞれ定量した。

７）８）

胃液pHの測定には，学術研究用に開発された常法により測定した。
第一胃液および血液は，本期最終日の朝の飼料

無線伝送式pHセンサー（YCOW-S；山形東亜

給与前の９：00と，飼料給与４時間後の13：00に

DKK株式会社，山形）を用いて，10分間隔で連採 取 し た 。第 一 胃 液 は ，経 口 胃 液 採 取 器

続的に測定した。得られた本期３日間のデータに（NFM90，富士平工業株式会社，東京）を用いてついて，１時間ごとのpHの平均値を算出した。

採取し，滅菌４重ガーゼでろ過した後，ろ液の一2.3部を用いてHirabayashiら

解 析 に は SAS MIXED プ ロ シ ジ ャ （JMP Ⓡ

９）の方法によりLPS濃度を評価した。残りのろ液はチューブに入れ，

統計解析

13.2.1；SAS Institute Inc., USA）を用いた。

1,840×g ４℃で10分間遠心し，その上澄みを揮

飼料摂取，飼料消化率，窒素出納，および胃液

発性脂肪酸（VFA）およびアンモニア態窒素分

pHに関する項目は，以下の混合モデルにより解析に供した。胃液中のVFAは，高速液体クロマ

析した。

トグラフィー（CTO-10，島津工業株式会社，京Yijkl＝μ＋αi＋β（α）ij＋γ（α）
ik＋δl＋εijkl

都）を用いてBTBポストラベル法により測定し，Yijkl：測定値

胃液中のアンモニア態窒素濃度は，市販のキット

μ：総平均（アンモニアテスト，富士フィルム和光純薬株式

αi：時期ｉの効果（変量効果）

会社，大阪）により定量した。血液は，ヘパリン

β（α）
時期ｉにおける個体ｊの効果
（変量効
ij：

入 り 採 血 管 と EDTA 入 り 採 血 管（Venoject Ⅱ
VP-H100K と Venoject Ⅱ VP-DK050K ，テ ル モ

果）
γ
（α）
時 期ｉにおける期間ｋの効果
（変量
ik：

株式会社，東京）を用いて採取し，1,840×g ４℃

効果）

で15分間遠心した。採取した血漿は，各血漿成分

δl：処理ｌの効果（母数効果）分析まで－30℃で保管した。ヘパリン入り採血管

εijkl：誤差ijkl

で採取した血漿では，総タンパク質（TP），アル

血液性状，胃液性状，胃液pHの日内変動は，ブミン（Alb），アルブミン／グロブリン比（A/以下の混合モデルにより解析した。

G比），総コレステロール（T-Cho），アスパラギYijklm ＝μ＋α i ＋β（α）ij ＋γ（α）ik ＋δ l ＋ε 1ijkl

ン酸アミノトランスフェラーゼ（AST），尿素窒＋km＋δklm＋ε2ijklm© The Ito Foundation木材クラフトパルプの混合割合の異なる濃厚飼料の給与が黒毛和種去勢牛の飼料消化性および第一胃内発酵に及ぼす影響

Yijklm：測定値

407

した。

μ：総平均

本研究は「産業動物の飼養及び保管に関する基

αi：時期ｉの効果（変量効果）

準」（昭和62年10月９日総理府告示第22号）に基β（α）
時 期ｉにおける個体ｊの効果（変量
ij：

づいて実施された。

効果）

３．結果と考察γ（α）
時 期ｉにおける期間ｋの効果（変量ik：

飼料摂取量，飼料消化率，および窒素出納を効果）
δl：処理ｌの効果（母数効果）

Table２に示した。１日当たりのDM摂取量は，飼εlijkl：一次誤差

料間に差はなかった。しかし，代謝体重当たりのkm：採取時間ｍの効果（母数効果）

DM摂取量およびCP摂取量は，対照飼料給与時にε2ijklm：二次誤差

比べて15％KP給与時に有意に少なかった。反芻

そして，処理の効果が有意であった場合に，家畜のDM摂取量は，飼料中のNDF含量に影響をTukeyの検定により処理区間の差を判定した。ｐ

受け，飼料中のNDF割合が30％を超えると，低＜0.05を有意差あり，ｐ＜0.10を有意傾向ありと下する１，９）。さらに，繊維成分の摂取量が増える

Table 2 Effect of feeding kraft pulp on nutrient intake, digestibility, and N metabolism in the JapaneseBlack fattening steers
Parameter

Feed intake, kg/day
DM
Feed intake, g/BW0.75/dayDM
CP
aNDFomStarchTDN
Concentrate feed ratio‡, ％aNDFom ratio§, ％Digestibility, ％
DM
OM
CP
EE
aNDFomNFC
StarchRatio of N intake, ％Feces N excretion
Urine N excretion
N retention

Treatmnt

SEM†

p-value

7.54

0.12

NS

70.44
8.93ab
21.31b

68.07
8.44b
23.51a

1.70
0.21
0.36

†
＊＊
＊＊

55.84
90.83
26.02c30.61b
54.61
90.65
30.26b

27.35c
53.37
91.42
34.58a

0.86
1.02
0.64
0.63

＊＊
NS
NS
＊＊

77.7
79.7
71.6
72.6
63.9
89.8
97.0

76.4
78.4
71.4
72.9
63.4
89.8
97.0

77.3
79.3
72.6
70.1
67.2
90.5
97.4

1.6
1.5
1.9
2.9
1.9
2.4
1.7

NS
NS
NS
NS
†
NS
NS

28.4
26.1b

28.6

27.4

1.9

NS

37.6ab
33.9ab

41.7a
30.9b

4.6
4.4

＊
＊

Control

7.5％ KP

15％ KP

7.92

7.83

70.95
9.28a
18.46c34.35a45.5a

KP, Kraft pulp；DM, dry matter；CP, crude protein；aNDFom, α-amylase treated ash-free neutral detergent
fiber；TDN，total digestible nutrients；OM, organic matter；EE, ether extract；NFC, non-fibrous carbohydrate；
NS, not significant；†, p＜0.10；＊, p＜0.05；＊＊, p＜0.01．
† Standard error of the mean. ‡ The ratio of concentrate feed to dry matter intake. §The ratio of aNDFom to dry

matter intake. abcMeans within a row with different superscript letters differ（p＜0.05）.

© The Ito Foundation

408

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）と，飼料片の消化管内滞留時間が増加するため，あげられ（前回研究vs.今回研究＝84日間vs.14日

DM摂取量は減少する 。本研究では飼料中の間），KPの給与期間の違いが第一胃内発酵に影響

NDF割合は，対照飼料と15％KPで，それぞれする可能性が示唆された。

10）

22.2％と31.9％であり，これがDM摂取量の違い

Fig.２に胃液pHの日内変動を示した。本研究では，胃液pHおよび胃液LPS活性値にはKP給与のに影響したと考えられた。
飼料消化率では，NDF消化率が対照飼料給与

効果は認められず，乳用牛へ給与した場合５）と異時に比べて15％KP給与時に高い傾向であった。

なる結果であった。黒毛和種の肥育では，濃厚飼

KPはそれ自体が消化性に優れる飼料であるた料を多給する飼養が一般的であり１），本研究でもめ３），市販の配合飼料摂取時よりも高い消化率を

給与飼料の粗濃比は１：９と設定している。これ示したものと考えられる。

に対して，乳用牛を対象としたKP給与に関する

Table３に血液性状を示した。血中UN濃度は，報告では，給与飼料の粗濃比は４：６程度であっ

KPの配合割合が増加すると高まる傾向が認めらた５）。したがって，濃厚飼料の一部をKPに置きれた。第一胃液性状をFig.１に示した。このうち，換えても，肥育牛は依然としてデンプンの摂取が胃液中アンモニア態窒素濃度はKP給与により有多く，胃液pHに対する影響はほとんどなかった意に増加した。本研究では，KPの配合割合が増ものと考えられた。

えると窒素代謝が変動を示した。一般に飼料中の以上より，濃厚飼料の一部をKPに置き換える

CPやNPN含量が増加すると，窒素代謝は影響をことで，黒毛和種肥育牛の飼料消化性へ影響を及受け，本研究と同様に尿中窒素含量の増加，血中ぼすことが示された。しかし，第一胃液性状や胃UN濃度や胃液中アンモニア態窒素濃度の上昇が液pH等の第一胃内発酵に対する影響は，7.5％や生じることが確認されている 。このことから，15％程度の代替では弱いものであった。この原因

KP飼料へのNPN添加が本研究の結果に影響してとして，肥育が進行した肥育中期および後期でいるものと考えられる。しかしながら，我々の前は，濃厚飼料の給与量がきわめて多いことがあげ回の研究では，尿素添加による窒素代謝への影響られる。したがって今後は，濃厚飼料多給の開始は認められていない。結果が一致しなかった原因時期であり，肥育中期や後期に比べて濃厚飼料のは不明であるが，本研究と前回の研究では，供試

給与量が少ない，肥育前期におけるKP給与の効

牛の月齢に違いがあり，このことが影響している果を検討する必要がある。

11）

可能性もある。
本研究では，胃液中の総VFA含量や酢酸／プ

４．要

約

ロピオン酸（Ａ/Ｐ）比にKP給与の影響は認めら

黒毛和種肥育牛の第一胃内発酵の安定化を目的れなかった（Fig.１）。乳用牛へKPを給与した場に，肥育中期の黒毛和種肥育牛へ濃厚飼料のDM

合，胃液中のVFA組成は粗飼料多給時と類似す

当たり7.5％もしくは15％をKPに代替した飼料をることが分かっている 。具体的には，胃液中の給与した。その結果，KPの配合割合を15％まで

酢酸割合とＡ/Ｐ比が高まる。我々の前回の研究

高めると，DM摂取量が減少することと繊維消化でも，KP給与後８週目において胃液中のＡ/Ｐ比率が向上することが示された。しかし，第一胃液が高まった６）。結果が一致しなかった原因として，性状，胃液LPS活性値，および胃液pH等の第一KP給与期間が本研究と前回研究で差がある点が胃内発酵に関する項目については，KP給与によ

５）© The Ito Foundation木材クラフトパルプの混合割合の異なる濃厚飼料の給与が黒毛和種去勢牛の飼料消化性および第一胃内発酵に及ぼす影響
Table 3 Effect of feeding kraft pulp on blood profiles in the Japanese Black fattening

steersParameter
TP, g/dl
Alb, g/dl
A/G ratio

Treatment
Control

7.5％ KP

15％ KP

7.0
3.5

6.9
3.5

7.1
3.5

1.12

1.11

1.08

SEM†

p-value

0.7
0.6

NS
NS

0.06

NS

T-Cho, mg/dl

130

132

134

17

NS

AST, U/l

91

129

128

39

NS

UN, mg/dl

11.4

13.1

15.2

2.0

†

Glu, mg/dl

77.0

72.2

76.1

6.4

NS

VA, IU/dl
LBP, ng/ml

81
426.1

79
546.3

79
489.3

7
233.0

NS
NS

SAA,μg/ml

24.19

5.05

10.58

9.60

NS

Hp, ug/ml

0.79

0.43

0.65

0.25

NS

KP, Kraft pulp；TP, total protein；Alb, albumin；A/G, albumin/globulin；T-Cho, total cholesterol；
TG, triglycerides；AST, aspartate transaminase；UN, urea nitrogen；Glu, glucose；Ins,
insulin；NEFA, non-esterified fatty acid；T-KB, total ketone bodies；IP, inorganic
phosphorus；Ca, calcium；VA, vitamin A；LBP,lipopolysaccharide binding protein；SAA,
serum amyloid A；Hp, haptoglobin.
†Standard error of the mean.

Acetic/Propionic ratio

120
80
60
40
20

Ammonia-nitrogen, mg/dl

0Control

7.5% KP

15% KP

10

6
4
2
0

5
4
3
2
1
0

Control

7.5% KP

15% KP

Control

7.5% KP

15% KP

8

8

c

b

a

Control

7.5% KP

15% KP

LPS, log10EU/ml

Total VFA, mmol/l

100

6
4
2
0

Fig. 1 The rumen fermentation parameters in Japanese Black fattening steer when fed

commercial formula feed（control, white square）,formula feed containing 7.5％KP on a
dry matter（DM）basis（7.5 ％ KP, light gray）,and formula feed containing 15 ％ KP on
a DM basis（15％KP, dark gray）.
abcMeans within a row with different superscript letters differ（p＜0.05）.

© The Ito Foundation

409

410

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

7.0

Ruminal pH

6.5

6.0

5.5

Treatment：p= 0.7614
Time：p<.0001

5.0Treatment×Time：p= 0.8494
8

10

12

14

16

18

20

22

0

2

4

6

Time of day
Fig. 2 Diurnal changes in the ruminal pH of Japanese Black fattening steers when fed commercial formula feed（circles）,

formula feed containing 7.5％ KP on a dry matter（DM）basis （7.5％ KP）（squares）,and formula feed containing
15％ KP on a DM basis（15％ KP）（triangles）.The values are presented as the mean±SEM. Arrow：feed time.

る影響はほとんど認められなかった。このことには，肥育が進行した肥育中期および後期では，濃厚飼料の給与量がきわめて多いことが影響している可能性が考えられた。
文献１） 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構（編）：日 本 飼 養 標 準・肉 用 牛 ，2008 年 度 版 ，1～
234，中央畜産会，東京，2009.
２） Owens, F. N., Secrist, D. S., Hill, W. J., Gill, D. R.：
Journal of animal science, 76, 275～286, 1998.
３） Hada, M., Yashiro, J., Machida, M., Kajikawa, H.：
Japanese Patent No.5994964, granted 2 September
2016.
４） Izumi, K., Tamura, T., Fujii, R., Nakatsuji, H.,
Morita, S.：Animal Science Journal, 90, 205～213,
2019.

５）
 Nishimura, K., Kurosu, K., Terada, F., Mizuguchi,
H., Sato, S., Kushibiki, S.：Animal Science Journal,
90, 189～195, 2019.
６）
 Maeda, Y., Nishimura, K., Kurosu, K., Mizuguchi, H.,
Sato, S., Terada, F., Kushibiki, S.：Animal Science
Journal, 90, 523～532, 2019.
７） 自給飼料利用研究会（編）：粗飼料の品質評価ガ
イドブック 三訂版，1～196，日本草地畜産種子協会，東京，2009.
８） Van Soest, P. J., Robertson, J. B., Lewis, B. A.：
Journal of dairy science, 74, 3583～3597, 1991.
９）
 Hirabayashi, H., Kawashima, K., Okimura, T.,
Tateno, A., Suzuki, A., Asakuma, S., Isobe, N.,
Obitsu, T., Sugino, T., Kushibiki, S.：Animal Science
Journal, 88, 1162～1170, 2017.
10）
 Balch, C. C., Campling, R. C.：Physiology ofdigestion in the ruminant, 108～123.Ames, Iowa：
Butterworths, 1965.
11） Huntington, G. B.：British journal of nutrition, 57,
109～114, 1987.

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411

耕畜連携を目指した国産トウモロコシ子実の高品質サイレージ化に向けた調製条件の探索
Exploration of preparation conditions for high-quality silage from domestic
corn grain aiming at integration systems between crop and animal
production

神

園

巴

美・嶝

野

英

子

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター）

Tomomi Kamizono and Eiko Touno（Tohoku Agricultural Research Center, NARO）

In this study, in order to clarify the effect of different preparation methods on feed
composition and fermentation quality of corn grain silage, silage preparations were conductedin which the moisture content, the degree of crushing, and the addition of lactobacillus
preparation were combined. Feed composition did not show any significant difference due tothe moisture content at the time of harvest, the degree of crushing, and the addition of
lactobacillus preparation, and was comparable to those on the market. The moisture content
had a large effect on the fermentation quality of corn grain silage. At a moisture content of
37%, it was possible to prepare high-quality silage regardless of the degree of crushing and the
addition of lactobacillus preparation if corn grains could be packed at high density. At amoisture content of 29%, it was suggested that high-quality silage could be obtained by
combining crushing and the addition of lactobacillus preparation. When the moisture content
was 23%, the effect of the addition of the lactobacillus preparation was minor in both uncrushed
and crushed cases. Therefore, to obtain high-quality silage at a moisture content of 23%, it wasnecessary to combine crushing and the addition of lactobacillus preparation with hydration.

１．目

行われている。その中でサイレージは，高水分か的ら低水分域の原料でも調製が可能で，乾燥施設や我が国の水田転換畑における飼料用のトウモロ
コシ子実生産は，国産飼料を用いることによる畜貯蔵施設を必要としないことから，低コストで穀実の飼料化ができる有用な方法である。

産物の高付加価値化，水田転換畑における省力的

近年，国内でも取り組みが始まったトウモロコ

輪作作物としての地力維持の観点から注目されて

シ子実サイレージ調製は，乳酸発酵の促進と家畜いる。水田転換畑で収穫されたトウモロコシ子実

給与時の消化性向上を目的として，調製時に子実をはじめとする飼料用穀物は，家畜への給与にあの破砕処理が行われている。しかし，子実の破砕

たり，乾燥またはサイレージ（発酵飼料）調製が処理には人手や時間がかかるため，米や大豆等の© The Ito Foundation

412

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

収穫と競合する繁忙期においては，人員や作業時場を意識した科学的根拠に基づくトウモロコシ子間の確保が難しい。また，トウモロコシ子実栽培

実サイレージの最適調製条件の検討が急務となっの取り組みが広がっている耕種農家においては，ている。

新たに破砕機の導入が必要なため，取り組みへのそこで本研究では，水分含量，破砕程度およびハードルが高い。そこで，耕種農家でもトウモロ

乳酸菌製剤の添加の３つに焦点を絞り，これらをコシ子実サイレージ調製が容易に行えるよう，無組み合わせた調製方法の違いがトウモロコシ子実

破砕（丸粒）のままでサイレージ化を行い，そのサイレージの飼料成分および発酵品質に及ぼす影

まま家畜に給与したいとの要望がある。しかし，響を明らかにすることを目的とした。これによ

無破砕のままでは子実の水分含量や破砕粒度の違り，畜産農家と耕種農家の双方が取り組みやすいいが影響し，サイレージ調製時の乳酸発酵が十分

トウモロコシ子実サイレージ調製利用技術の開発に進まない場合がある。現在，国内のトウモロコに資することを目指した。

シ子実サイレージの調製においては実用化の研究

法

２．方が先行しており１～４），調製条件の違いによる飼料
成分や発酵品質の変化を精査した研究報告はあま2.1

りない。また国外においては，1970年代にトウモ本研究のサイレージは，食品用の真空パックをロコシ子実サイレージの栄養価の比較がなされて利用した小規模サイレージ発酵試験法（パウチいるが，日本とは気候・土壌条件，品種およ７）法）
で調製した（各区３パウチ）。サイレージ調

び収穫時期が異なるため，厳密にデータ値を比較

製の試験概要をFig.１に示した。水分含量についすることは難しい。このような背景から，生産現ては，目標値として生育ステージの異なる３段階

５，
６）

Degree of crushing

Expected harvester

Expected popularization target（General-purpose combine with diﬀerent heads）

CultivatedfarmerReel head

Snapper head

Moisture

Incorporates ears
and foliage into thebody

サイレージ調製

LivestockfarmerNo crush(Owns a rice crusher
for feed)(Large crusher can be
introduced)

Coarse crush

Fine crush

25%

Incorporates
only ears into
the body

30%35%No Addition

Addition

Lactobacillus preparation
Fig. 1 Experimental design of this study.

© The Ito Foundation

TMR center
Contractor

耕畜連携を目指した国産トウモロコシ子実の高品質サイレージ化に向けた調製条件の探索

413の収穫時期（黄熟後期から完熟期にかけて），すて，収穫時期の水分含量，破砕程度および乳酸菌

なわち，35％（スナッパヘッド装着汎用コンバイ

製剤の添加の交互作用の有意差検定を行った。交ンのみ収穫可能：９月中下旬），30％（リール

互作用が p＜0.001の場合は，すべての組み合わせ

ヘッド，およびスナッパヘッド装着汎用コンバイに対してTukey法による多重比較を行った。

ンで収穫可能：10月上旬），25％（10月下旬に収穫）に設定した。破砕程度については，普及する

３．結果と考察

経営体を想定した３段階，すなわち，無破砕（丸3.1粒；耕種農家），粗挽き（畜産農家：飼料米用破本試験でのトウモロコシ子実の水分含量の実測砕機を保有），細挽き（TMRセンター，耕畜連携

値（目標値）は，収穫時期１回目が37％（35％），

コントラクター：大型破砕機の導入が可能）とし２回目が29％（30％），３回目が23％（25％）でた。乳酸菌製剤の添加については，代表的な市販あった。よって，いずれの収穫時期においても，乳酸菌製剤（雪印種苗株式会社）であるサイマス

水分含量の目標値をおおむね達成することができ

ターLP（初期発酵を促進）を使用した。よって，た。CP，EE，CA，NDFomおよびADFom含量（乾処理数は水分含量が３段階，破砕程度が３段階，

物当たり）は，収穫時期の水分含量，破砕程度，

乳酸菌添加の有無から，計18（３×３×２）と乳酸菌製剤の添加による著しい違いは現れなかっなった。また，反復数を３とし，計54サンプルのた。なお，それぞれの値の範囲は，CPで10.5-

サイレージを調製した。これらサイレージは20℃

11.4％，EEで3.3-4.4％，CAで1.4-2.2％，NDFomの制御環境下で貯蔵し，貯蔵１ヵ月後で開封しで10.1-13.8％，ADFomで3.4-4.7％を示した。日た。なお，トウモロコシ子実の品種は，SL0746

８）本飼料成分表（2009年版）に記載されているト（RM95，雪印種苗株式会社）を使用した。
2.2

飼料成分含量ウ モ ロ コ シ 子 実 の 成 分（乾 物 当 た り）は ，CP

飼料成分とサイレージ発酵品質

8.8 ％， EE 4.4 ％， CA 1.4 ％， NDFom 12.5 ％，上記の開封後のサンプルを凍結乾燥し，飼料成

ADFom3.6％であった。これらと本試験の結果を分である粗タンパク質（CP），粗脂肪（EE），粗

比較すると，本試験のCP含量がやや高いものの，

灰分（CA），中性デタージェント繊維（NDFom），

その他の成分はほぼ同様であった。したがって，

酸性デタージェント繊維（ADFom）の含量を測

本試験のトウモロコシ子実サイレージの飼料成分定した 。また，生サンプルを用いて発酵品質，

は，一般に流通しているものと遜色ないことが明すなわちpH，有機酸含量（乳酸，酢酸，プロピ

らかになった。

７）

オン酸，n-酪酸），揮発性塩基態窒素（VBN）を3.2

測定し，V-スコア（酢酸，プロピオン酸，酪酸，収穫時期の水分含量，破砕程度および乳酸菌製

ならびに総窒素に占めるVBNの割合（VBN/TN）

剤の添加の交互作用で p＜0.001の測定項目は，から点数化）７）により発酵品質を科学的に評価しpH，乳酸含量，VBN/TNおよびＶ-スコアであった。

た（Table１）。まず，pH値の動きを見ると，水2.3

サイレージ発酵品質

分含量が下がることで上昇していき，破砕程度が

統計解析

サイレージ発酵品質の統計解析はR

細かくなり，乳酸菌製剤を添加することで低下し

version3.6.1を用いて行った。採取したサンプル

た。次に，乳酸含量の値の動きを見ると，水分含を反復（ｎ＝３）とする三元配置分散分析によっ量が下がることで低下していき，破砕程度が細か© The Ito Foundation

Measured value

0.87e

100a

1.39cd100a

3.84gh

5.30e

1.28d
100a

3.58a

98b

0.51f 1.78b

AdditionNo

Coarse crush

3.71h

4.57f

1.45c
100a

2.57b
100a

0.94d 2.12a

AdditionNo

Fine crush
Addition
6.32ab0.01j
0.12hi
100a

No
6.36a
NDj
0.13hi100a

No crush

29

30

2nd

100a

0.32fg0.04ij6.25ab

No

100a

0.88e

0.74e

4.44f

Addition

Coarse crush

100a

0.95e

は全体的に発酵が進んでいた。本試験の水分含量

100a

0.39f

1.20c

4.03g

6.28ab0.01ijAdditionNo

Fine crush
Addition
6.16b
0.03ij0.13hi
100a

No
6.17b
0.03ij
0.11i
100a

No crush

23

25

3rd

Addition
5.82cd0.14h
0.28fgh100a

No6.29ab0.01j
0.18ghi
100a

Coarse crush

100a

0.35f

NDj

6.23ab

No

100a

0.43f

0.09hi

5.95c

Addition

Fine crush

ANOVA< 0.001< 0.001< 0.001< 0.001

M＊C＊L

p value

令和２年度

Values with different superscript letters are significantly different（p < 0.01）.

ND： not detected（< 0.01% dry matter）.

V-ScoreVBN/TN（%）

0.82e

Lactic acid（% dry matter） 0.30g

pH

4.41f

5.70d

Addition

No crush

37

35

1st

Lactobacillus preparation（L） No

Degree of crushing（C）

Moisture（M, %）

Targeted value

Harvest time

Table 1 Effects of moisture contents at harvest time, degree of crushing, and addition of lactobacillus preparation on fermentation quality in corn grain silages.

414
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

くなり，乳酸菌製剤を添加することで上昇した。

VBN/TNの値の動きについては，水分含量が下がることで低下していき，破砕により上昇した。

また，VBN/TNについては，乳酸菌製剤の添加による影響は水分含量で異なり，37％では低下

し，29％以下では上昇した。なお，プロピオン酸

はすべての調製方法で不検出（＜0.01％乾物）であった。ｎ-酪酸は水分含量37％の乳酸菌製剤を添加しない粗挽きと細挽きの２つの調製方法でのみ検出されたが，その値は0.03％以下であった（データ省略）。Ｖ-スコアは，すべての調製方法
７）で良（80点以上）と判定された。

本試験のサイレージにおいて，水分含量37％で37％においては，最も乳酸含量が低い条件の無破

砕・乳酸菌製剤の無添加であっても，同じ条件で実規模（実際の農家での利用を想定）の調製４）を行った結果，pHは4.3まで下がり，乳酸含量は0.8％まで高まった（嶝野ら，未発表）。上記の結果の違いは，実規模のほうがトウモロコシ子実をより高密度に充填できたことで，乳酸発酵が促進されたためと推察された。したがって，水分含量37％においては，無破砕であってもトウモロコシ子実を高密度に充填できれば，破砕程度や乳酸菌製剤の添加に左右されずに高品質なサイレージを調製可能と考えられた。また，水分含量29％では，破砕と乳酸菌製剤の添加の処理を組み合わせることで良質なサイレージを得られることが示唆された。さらに，水分含量23％では，無破砕・破砕のいずれにおいても発酵が進んでおらず，乳酸菌製剤の添加の影響も小さかったことから，良質なサイレージを得るためには，破砕と乳酸菌製剤の添加に加えて加水処理も組み合わせることが重要だと考えられた。今後の検討事項としては，水分含量37％と同様に，29％および23％についても実規模でのトウモロコシ子実サイレージの調製を行© The Ito Foundation

耕畜連携を目指した国産トウモロコシ子実の高品質サイレージ化に向けた調製条件の探索

415

い，小規模調製との発酵品質の違いを精査する必を得られることが示唆された。さらに，水分含量要がある。

23％では，無破砕・破砕のいずれにおいても発酵

４．要が進んでおらず，乳酸菌製剤の添加の影響も小さ約

かったことから，良質なサイレージを得るために

本研究は，調製方法の違いがトウモロコシ子実
サイレージの飼料成分および発酵品質に及ぼす影

は，破砕と乳酸菌製剤の添加に加えて加水処理も組み合わせる必要があると考えられた。

響を明らかにするために，収穫時期の水分含量，
破砕程度および乳酸菌製剤の添加の３つに焦点を絞り，これらを組み合わせたサイレージの調製試験を行った。飼料成分については，水分含量，破砕程度，乳酸菌製剤の添加による著しい変化はな
く，一般に流通しているトウモロコシ子実と遜色はなかった。サイレージ発酵品質については，水分含量による影響が大きかった。水分含量37％においては，トウモロコシ子実を高密度に充填できれば，破砕程度や乳酸菌製剤の添加に左右されずに高品質なサイレージを調製可能と考えられた。
また，水分含量29％では，破砕と乳酸菌製剤の添加の処理を組み合わせることで良質なサイレージ

文
献１）
 青木康浩，大下友子，上田靖子，根本英子，青木
真理：日草誌，62，146～151，2016．
 大下友子，根本英子，青木康浩，上田靖子，青木２）
真理：日草誌，62，140～145，2016．
３） 大下友子，青木康浩，根本英子，上田靖子，青木
真理：日畜会報，87，125～131，2016．
 魚住順，嶝野英子，宮路広武，河本英憲，出口新，４）
内野宙：日草誌，64，180～188，2018．
５）
 Jones, G. M., Donefer, E., Elliot, J. I.：Can. J.
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 Clark, J. H., Frobish, R. A., Harchbarger, K. E.,
６）
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ガ イ ド ブ ッ ク ，日 本 草 地 畜 産 種 子 協 会 ，東 京 ，
2009．
 農業・食品産業技術総合研究機構編：日本標準飼８）
料成分表（2009年版），中央畜産会，東京，2010．

© The Ito Foundation

416

母子同品種のホルスタイン種および黒毛和種における分娩直後の母牛，分娩時の臍静脈および出生直後の子牛のアミノ酸濃度の比較
Comparison of blood amino acid levels in dams immediately after calving,in the umbilical veins at calving, and in their calves immediately following
birth between Holstein and Japanese Black cattle

川島

千帆１・草場

信之１・山岸則夫２（１帯広畜産大学畜産フィールド科学センター，２大阪府立大学大学院生命環境科学研究科獣医学専攻）

Chiho Kawashima１, Nobuyuki Kusaba１ and Norio Yamagishi２（１Field Center of Animal Science and Agriculture, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine,
２Division of Veterinary Science, Graduate School of Life and Environmental Sciences, Osaka Prefecture University）

In general, pregnant Japanese Black cattle receive individual management, whereas dairy
cattle receive herd management. However, dairy cattle pregnant with beef breeds receive herd
management. Our previous study indicated that the supply of glucose and amino acids from
Holstein dams to the beef fetuses（Japanese Black or F1 cross；Holstein×Japanese Black）was
lower than that to the Holstein fetuses, although the previous study lacked the information ofblood parameters in Japanese Black dams with similar fetal breed. Therefore, the aim of thepresent study was to investigate the blood glucose, insulin, and amino acid levels in latepregnant Holstein and Japanese Black dams with similar breed fetuses, umbilical cords, andcalves immediately after birth. We investigated blood parameters in 28 late-pregnant Holsteindams and four Japanese Black dams. Samples were obtained from dams 2-3 weeks before
calving and immediately after calving, from the umbilical vein at calving, and from calves
immediately after birth. From serum glucose and plasma insulin concentrations in dams 2-3
weeks before calving and immediately after calving, Holstein dams had lower insulin sensitivity
compared with Japanese Black dams, whereas there were no significant differences of aminoacid between both breeds. Japanese Black calves showed lower serum glucose levels thanthose in Holstein calves（p ＜ 0.01）. In addition, a similar tendency was observed in umbilicalveins. On the other hand, plasma total amino acid, total essential amino acid, and total nonessential amino acid did not differ between Japanese Black and Holstein calves. Overall, it isconsidered that the amount of glucose transferred from dam to beef fetus was low regardlessof the breed of dams. In the case of the Holstein dams pregnant with beef breeds, the amountof amino acid transferred to the fetus was small.

１．目

離農が進み，酪農現場では乳牛（特に未経産牛）

的に肉用種の受精卵や精液を用いて肉用素牛を生産

近年の災害や農家の高齢化により肉用牛農家のすることが日常的に行われており，その割合も© The Ito Foundation

母子同品種のホルスタイン種および黒毛和種における分娩直後の母牛，分娩時の臍静脈および出生直後の子牛のアミノ酸濃度の比較

417

年々増加している。日本飼養標準にはその場合の性が示された。しかし，母子ともに肉用種の場合

飼育方法の留意点について記されている 。しかを比較しておらず，この違いをもたらした要因はし酪農現場では，乳用未経産牛に肉用種を妊娠さ不明である。

１）

せた場合でも乳用種を妊娠させた場合と同じ群飼

そこで本試験では，母子の品種が同じ乳用種

育による管理が行われている。そのため，個体に（ホルスタイン種）と肉用種（黒毛和種）の分娩合わせて飼育管理されている肉用牛の繁殖農家か直後の母牛，分娩時の臍静脈および出生直後の子ら得られた場合に比べて，乳用牛から得られる肉

牛のアミノ酸濃度を中心とした血液性状を比較す

用子牛は虚弱や増体不良が問題視されているが，ることとした。

科学的な根拠は明確にされていない。一方，妊娠した肉用種における研究では，妊娠期の母牛の低２．方法

栄養により胎子の重さは変わらないものの胎盤が

本試験は帯広畜産大学動物実験等に関する規定

重くなること や，妊娠中期の低タンパク質給餌に基づき実施した（承認番号#20-147）。2020年が出生後の増体を促進させる可能性が報告されて７月から2021年１月に分娩したホルスタイン種28

いる 。

頭（うち未経産牛14頭）と黒毛和種４頭ならびに２）

３）牛における胎子の主要な栄養源はグルコースとその産子を対象とした。ホルスタイン種妊娠牛にアミノ酸である 。グルコースは母牛と胎子の血は，グラスサイレージとコーンサイレージに乾乳

中濃度差に応じて供給されるため，妊娠末期の母用配合飼料を加えた完全混合飼料の１日１回の給牛のインスリン感受性が強く関与している。

与に加えて，乾草を自由摂取とした。黒毛和種妊一方，アミノ酸は母牛と胎子の血中濃度差に関係

娠牛は，チモシー主体の放牧地での自由採食に加なく，能動輸送で胎子に取り込まれるため，母牛え，１日２回の配合飼料を個別に給与した。さらの栄養状態はそれほど重要視されてこなかった。

に両品種ともに鉱塩と水は自由摂取とした。血液しかし，牛と同様の胎盤構造を持つヒツジでは，は，母牛では分娩予定２～３週前と分娩直後の計

母体が低栄養の場合，胎子へのアミノ酸供給が減

２回を尾静脈から採取し，分娩時の臍静脈血は娩

少することが報告されている 。そこで申請者は，出直後の臍帯切断前に鉗子でクランプし，子牛側

以前の本助成事業における研究で，乳用種（ホルの臍帯を鈍性切断後に母牛側の臍静脈から採取しスタイン種）または肉用種（黒毛和種または交雑た。出生直後の子牛は初乳摂取前に頸静脈から採種）を妊娠しているホルスタイン種未経産牛の分血した。また，分娩状況や出生直後の子牛の体重娩直後や，分娩時の臍静脈，子牛の血液性状を調を記録した。採取した血液から血中グルコース，

査した。その結果，胎子の品種にかかわらず母牛インスリンおよび20種類のアミノ酸濃度を測定しは同程度の血液性状を示したが，分娩時の臍静脈た。測定したアミノ酸から総アミノ酸，総必須ア

や出生直後の子牛において，肉用種は乳用種に比ミノ酸および総非必須アミノ酸をそれぞれ算出しべて血中グルコース濃度ならびにほとんどのアミて統計解析に用いた。分娩予定２～３週間前のノ酸濃度が低かった。したがって，肉用種のデータにおいて，サンプリング漏れによりホルス

胎子は体重が軽く乳用種に比べてグルコースやアタイン種妊娠牛１頭を除外した。臍静脈は，死産

ミノ酸をあまり必要としない，もしくは母牛とのや逆子，分娩の見逃し，採取前の臍帯切断により品種の違いが胎子への栄養供給を妨げている可能

採血できなかった牛を除くとホルスタイン種10頭

４）

５～７）

８）

９，10）

© The Ito Foundation

418

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

および黒毛和種１頭となり，統計解析ができな

性別の分布は品種間で差はなかったが，出生時体かったため，参考値としてデータを記載した。

重はホルスタイン種（43.6±1.0kg）が黒毛和種

データは正規性を検定した後，スチューデントのより重かった（37.1±1.7kg，ｐ＜0.05）。分娩難t 検定またはマンホイットニーのＵ検定を行っ

易度は両品種間で差がなかった。分娩直後の母牛た。ｐ＜0.05を有意差ありとし，データは平均±の血中グルコース，インスリンおよびアミノ酸濃標準誤差で示した。

度をFig.２に示した。血中インスリン濃度はホルスタイン種のほうが黒毛和種より低くなったが３．結果と考察（ｐ＜0.01），その他の項目においては両品種間に分娩予定２-３週間前の母牛の血中グルコース，

差はなかった。

インスリンおよびアミノ酸濃度をFig.１に示し

血中グルコースやインスリン濃度はエネルギーた。血中グルコースおよびインスリン濃度はホル代謝の指標であり，エネルギー状態が良好な場合

スタイン種のほうが黒毛和種より高くなった（ｐは高値を示すが，妊娠末期は胎子の成長や泌乳開＜0.05）。一方，血中アミノ酸濃度は両品種間に始に伴いインスリンの感受性が低くなるため，ど差はなかった。

ちらも濃度が高くなり，特に乳量の多いホルスタ

妊娠期間をホルスタイン種280日間，黒毛和種

イン種では高インスリン血症になりやすい５，７）。

285日間とした場合の分娩予定日とのずれは，ホ

加えて，一般的にホルスタイン種のほうが子牛のルスタイン種より（－0.7±0.9日）黒毛和種で長出生時体重が重いため，分娩２-３週前の血中グくなった（7.5±1.5日，ｐ＜0.01）。また，子牛のルコースおよびインスリン濃度はホルスタイン種

100

60
40
20
H

0.2
0.0

H

JB

2000
TEAA (nmol/ml)

TAA (nmol/ml)

0.4

JB

3000
2000
1000
0

0.6

H

2000
TNEAA (nmol/ml)

0

＊

0.8

Insulin (ng/ml)

80

Glucose (mg/dl)

1.0

＊

1500
1000

JB

500
0

H

JB

1500
1000
500
0

H

Fig. 1 Blood glucose, insulin and amino acid concentrations 2-3 weeks before expected calving in dams.
Data are presented as the mean±SEM.

H；Holstein dams（n＝23），JB；Japanese Black dams（n＝4）

TAA；Total amino acid, TEAA；Total essential amino acid, TNEAA；Total nonessential amino acid；ｐ＜0.05

＊© The Ito Foundation

JB

母子同品種のホルスタイン種および黒毛和種における分娩直後の母牛，分娩時の臍静脈および出生直後の子牛のアミノ酸濃度の比較

100
50

H

TEAA (nmol/ml)

TAA (nmol/ml)

0.6
0.4
0.2
H

JB

1500

1500

1500

1000

1000
500
0

0.8

0.0

JB

2000

1.0

TNEAA (nmol/ml)

0

＊＊

1.2
Insulin (ng/ml)

Glucose (mg/dl)

150

H

JB

419

500
0

H

JB

1000
500
0

H

JB

Fig. 2 B lood glucose, insulin and amino acid concentrations after calving in dams.
Data are presented as the mean±SEM.

H；Holstein dams（n＝24），JB；Japanese Black dams（n＝4）

TAA；Total amino acid, TEAA；Total essential amino acid, TNEAA；Total nonessential amino acid
 ；ｐ＜0.01＊＊のほうが高くなったと考えられる。また，ホルス

有意差はなかった。以前の研究においても母牛のタイン種の分娩直後の血中インスリン濃度が低く

血中濃度に差がないにもかかわらず，ホルスタイなったのは，乳量の多さに伴うエネルギー状態のン種から生まれた肉用種子牛（52.2±7.1mg/dl）

低下が反映されたことが推察される。しかし，両はホルスタイン種子牛（139.8±28.6mg/dl）に比

品種ともにこの時期の一般的な数値であったと考べ て 血 中 グ ル コ ー ス 濃 度 が 低 か っ た（ｐ ＜

えられる

９，
10）
0.01）
。ヒツジにおいて，取り込まれたグルコー。

７，
11～13）

Fig.３に出生直後の子牛，Fig.４に参考値とし

スの一部は胎盤でフルクトースや乳酸塩に変換さて分娩時の臍静脈の血中グルコース，インスリンれる14）。乳用牛では，乳酸塩の変換についてはいおよびアミノ酸濃度を示した。子牛の血中グルまだ不明であるが，母牛の血中グルコース濃度が

コース濃度はホルスタイン種よりも黒毛和種で低低い場合は，子牛の血中グルコースおよびフルク

く（ｐ＜0.01），またデータ数が少ないために統

トース濃度も低くなることが報告されている15）。

計解析できなかったものの臍静脈血にも同様の傾

そのため，黒毛和種子牛を妊娠している母牛から向がみられた。その他の項目においては両品種間胎子へのグルコース移行が少ない要因を解明するに差はなかった。

ためには，子牛の血中フルクトース濃度もあわせ一般的に，母牛から子牛へのグルコース輸送はた評価が必要である。一方，以前の研究において，促通拡散により行われるため，母体と胎子の濃度

ホルスタイン種から生まれた肉用種子牛はホルス差が重要とされている４，14）。しかし，本研究の分タイン種子牛に比べて血中アミノ酸濃度が低かっ

娩直後の母牛の血中グルコース濃度に両品種間でたが９，10），本試験では品種間による差はなかった。

© The Ito Foundation

420

令和２年度
＊＊

0.5

100
50

H-C

0.2
0.1
0

H-C

JB-C

3000
2000
1000
H-C

3000
TNEAA (nmol/ml)

1500
TEAA (nmol/ml)

TAA (nmol/ml)

0.3

JB-C

4000

0

0.4

Insulin (ng/ml)

Glucose (mg/dl)

1500

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

1000
500
0

JB-C

H-C

2000
1000
0

JB-C

H-C

JB-C

Fig. 3 Blood glucose, insulin and amino acid concentrations after birth in calves.
Data are presented as the mean±SEM.

H-C；Holstein calves（n＝24），JB-C；Japanese Black calves（n＝4）

TAA；Total amino acid, TEAA；Total essential amino acid, TNEAA；Total nonessential amino acid
 ；ｐ＜0.01

80

0.20

60

0.15

Insulin (ng/ml)

40
20
0

H-UV

H-UV

JB-UV

1500

4000

TEAA (nmol/ml)

TAA (nmol/ml)

0.05
0.00

JB-UV

5000

3000
2000
1000
0

0.10

H-UV

JB-UV

4000
TNEAA (nmol/ml)

Glucose (mg/dl)

＊＊

1000
500
0

H-UV

3000
2000
1000

JB-UV

0

H-UV

JB-UV

Fig. 4 Blood glucose, insulin and amino acid concentrations at calving in umbilical veins.
Data of H-UV are presented as the mean±SEM.

H-UV；Umbilical veins of Holstein dams（n＝10），JB-UV；Umbilical veins of Japanese Black dams（n＝1）
TAA；Total amino acid, TEAA；Total essential amino acid, TNEAA；Total nonessential amino acid

© The Ito Foundation

母子同品種のホルスタイン種および黒毛和種における分娩直後の母牛，分娩時の臍静脈および出生直後の子牛のアミノ酸濃度の比較

421

本試験の黒毛和種母子のデータは少なく，さらにが，酪農現場では胎子の品種に関係なく一元的な妊娠末期の飼料設計が以前の研究と異なるため単飼育管理が実施されている。申請者は以前，乳用純に比較できないが，以前の研究におけるホルス

種（ホルスタイン種）または肉用種（黒毛和種まタイン種妊娠のホルスタイン種母牛（未経産），

たは交雑種）を妊娠している乳用未経産牛の分娩

肉用種妊娠のホルスタイン種母牛，本試験におけ直後，分娩時の臍静脈や出生直後の産子の血中代るホルスタイン種妊娠のホルスタイン種母牛（未謝物や代謝ホルモン，アミノ酸濃度を調査した。

経産）の分娩直後の血中総アミノ酸濃度は，それその結果，血中グルコースと多くのアミノ酸濃度

ぞ れ 1,898.3 ± 114.2nmol/ml ，1,788.3 ± 75.8nmol/

が，ホルスタイン種妊娠と比べて肉用種妊娠の臍

ml，1,633.3±69.4nmol/mlであり，それらの子牛

静脈と肉用種子牛で低かった。しかし，母子ともの 血 中 総 ア ミ ノ 酸 濃 度 は そ れ ぞ れ 5,361.7 ±に肉用種の場合を比較しておらず，この違いの要

576.8nmol/ml，3,133.0±162.7nmol/ml，3,771.0±

因は不明である。そこで本試験では，母子の品種

348.8nmol/mlであった（以前の研究のホルスタが同じ乳用種（ホルスタイン種）と肉用種（黒毛イン種子牛と肉用種子牛間；ｐ＜0.01）。胎盤に和種）の分娩直後の母牛，分娩時の臍静脈およびおけるアミノ酸移行速度はアミノ酸の種類によっ

出生直後の子牛の血液性状を比較することとして異なり16），また，アミノ酸は代謝の違いによりた。試験は帯広畜産大学畜産フィールド科学セン

ケト原性アミノ酸や糖原生アミノ酸等に分類されターで2020年７月から2021年１月に分娩したホルる 。しかし，これらの特性と品種間で異なった

スタイン種28頭と黒毛和種４頭ならびにその産子

アミノ酸に一貫性はなかったため，本試験では肉を対象とした。分娩予定日２～３週間前と分娩直用種を妊娠したホルスタイン種においてアミノ酸

後の母牛，分娩時の臍静脈および出生直後（初乳移行量が減少する理由は明らかにできなかった。

摂取前）の子牛から血液を採取し，血中グルコー

そのため，胎盤のアミノ酸移行システムを含めた

ス，インスリンおよびアミノ酸濃度を測定した。

さらなる研究が必要である。

分娩予定日２～３週間前および分娩直後の母牛の17）以上より，先行研究ならびに本研究の結果か

血液性状からホルスタイン種のほうが，黒毛和種

ら，母牛の品種にかかわらず，子牛へのグルコーに比べてインスリン感受性が低いことが考えられ

ス移行量が少ないことは黒毛和種の特徴であり，たが，血中アミノ酸濃度は同程度であった。分娩

またホルスタイン種が黒毛和種を妊娠している場

時の母牛の血中グルコース濃度は両品種間で差が合のみ胎子へのアミノ酸移行量が少ない可能性がなかったが，黒毛和種の子牛で低値を示し（ｐ＜考えられた。しかし，本研究では黒毛和種牛の供0.01），臍静脈血においても同様の傾向が認めら

試頭数が少なかったため，乳用種に肉用種を妊娠れた。一方，血中総アミノ酸，総必須アミノ酸おさせた場合の適切な飼育管理方法を構築するためよび総非必須アミノ酸濃度は，両品種間で差がなには，さらにデータ数を増やして検討する必要がかった。先行研究ならびに本研究の結果から，母ある。

牛の品種にかかわらず，子牛へのグルコース移行

４．要

量が少ないことは黒毛和種の特徴であり，またホ約

ルスタイン種が黒毛和種を妊娠している場合は，酪農現場では乳牛に肉用種の受精卵や精液を用
いて肉用素牛を生産する割合が年々増加している胎子へのアミノ酸移行量が少ない可能性が考えられた。

© The Ito Foundation

422

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

文献１） 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機
構：日本飼養標準乳牛（2017年版），76～77，中央
畜産会，東京，2017.
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Rice, L. E., Wallace, C. R.：J. Anim. Sci., 68, 4267～
4276, 1990.
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Gentili, S., Perry, V. E.：Mol. Cell Endocrinol.,
332，234～241，2011.
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５） Hayirli, A.：Vet. Res. Commun., 30, 749～774. 2006.
６） Kawashima, C., Munakata, M., Shimizu, T.,
Miyamoto, A., Kida, K., Matsui, M.：J. Vet. Med.
Sci., 78, 739～745, 2016.
７） Hasegawa, R., Iwase, I., Takagi, T., Kondo, M.,
Matsui, M., Kawashima, C.：Anim. Sci. J., 90, 1544
～1555, 2019.
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Nathanielsz, P. W., Nijland, M. J., Hess, B. W., Wu,
G.：Biol. Reprod., 71, 901～908, 2004.
９） 川島千帆，山岸則夫：妊娠末期の乳用牛へのバイ
パスリジン給与がその産子の栄養代謝へ及ぼす影
響，平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，VOL.37, 424～430, 2019.

10）
 Kawashima, C., Kume, S., Yamagishi, N.：Anim.
Sci. J., 2021. 92, e13555.
11）
 Kawashima, C., Fukihara, S., Maeda, M., Kaneko,E., Amaya, Montoya, C., Matsui, M., Shimizu, T.,
Matsunaga, N., Kida, K., Miyake, Y-I., Schams, D.,
Miyamoto, A.：Reproduction, 133, 155～163, 2007.
12）
 Kawashima, C., Kida, K., Matsuhashi, M., Matsui,
M., Shimizu, T., Matsunaga, N., Ishii, M., Miyake,
Y-I., Miyamoto, A.：J. Reprod. Dev., 54, 46～51,
2008.
13）
 渡邉貴之，小西一之，熊谷周一郎，野口浩正，武井直樹：日本畜産学会報，85, 295～300, 2014.
14）
 Bell, A. W., Ehrhardt, R. A.：Nut. Res. Rev., 15,
211～230, 2002.
15）
 Lucy, M. C., Green, J. C., Meyer, J. P., Williams, A.
M., Newsom, E. M., Keisler, D. H.：J. Dairy Sci., 95,
5095～5101. 2012.
16）
 Paolini, C. L., Meschia, G., Fennessey, P. V., Pike,
A. W., Teng, C., Battaglia, F. C., Wilkening, R. B.：
Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 280, E31～39,
2001.
17）
 Meier, S., Mitchell, M. D., Walker, C. G., Roche, J.
R., Verkerk, G. A.：J. Dairy Sci., 97, 1364～1376, 2014.

© The Ito Foundation

423

肉用鶏の成長効率に関与する腸管内Wnt
およびその受容体の探索
Search for intestinal Wnt and its receptors involved in the growthefficiency of broiler chickens

伊

藤

謙

（秋田県立大学生物資源科学部）

Ken Ito（Faculty of Bioresource Science, Akita Prefectural University）

It is known to be associated with chicken growth and intestinal development.
Furthermore, in recent years, studies on chicken embryos have revealed that Wnt signaling
pathway-related genes are involved in chicken intestinal development.
However, it has been reported that the gene expression patterns of Wnt and its receptors
differ with embryogenesis. Therefore, the gene expression pattern associated with the Wnt
signaling pathway in grown chickens is unknown. In the present study, we investigated Wnt
signaling pathway-related genes expression in the grown chicken’s intestine and searched forgenes related to growth efficiency in meat-type chickens（broilers）.
First, broilers were used as a model for rapid intestinal development and growth rate, andwhite Leghorn species were used as control animals to explore the Wnt signaling pathway
genes related to chicken growth. As a result, LRP5 and FZD3 in the intestinal tract showedsignificantly high expression levels in all of the duodenum, jejunum, ileum and rectum of hens.
Next, the Pearson correlation coefficient was calculated for the daily weight gain of broilers
and the gene expression levels of LRP5 and FZD3, and a significant difference test was
performed, but no correlation was found. Not only Wnt, but also EGF, BMP, Notch andHedgehog signaling pathways are involved in the formation of the intestinal tract. In the
future, we will clarify the relationship between other signal pathways and broiler growth.

１．目ており，遺伝育種の改良，飼養管理の見直しとと的もに飼料の改良が求められている。

農林水産省が令和２年３月に公表した「鶏の改

鶏の成長は腸管の発達具合と関連があり，事良増殖目標」では，ブロイラー（肉用鶏）の現在

実，絨毛の発達と成長効率の間に正の相関が認めの出荷日数である47.1日（令和２年現在）から，られている１）。また，腸の発達にはWntシグナル

10年後に出荷日数が45日となるよう目標数値が掲伝達が関与しており，特に腸上皮細胞構成にWnt

げられている。また，目標体重である2,970ｇにシグナル伝達が関わっている２）。鶏のWntやWnt

達する日数を2.1日減らすことも目標に掲げられの 受 容 体 で あ る Frizzled class receptor（FZD）© The Ito Foundation

424

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）の遺伝子発現パターンに関する報告は鶏胚を用いたin situ hybridizationによる報告が多い。さらした。
2 . 2 肉用鶏の成長成績とWntシグナル関連遺に鶏胚は，発生過程で腸管内の多くのWntおよび伝子の相関の有無

FZDの遺伝子発現の消失と出現が起こるため ，

ブロイラー（チャンキー種）の有精卵を孵卵機成体における明確なWntシグナル伝達経路関連遺を用いて37.6℃で21日間孵卵し，孵化した初雛40

伝子の発現パターンは不明である。

羽の体重を測定後，育雛器内で平飼いした。飼料

３）

そこで本研究では，鶏の腸管におけるWntシグ

および水は自由摂取とし，飼料は市販幼雛用飼料

ナル伝達経路に関与する遺伝子発現のパターンを（パワーチックZK前期，JA全農北日本くみあい

調査するとともに，肉用鶏の成長に関与する遺伝

飼料株式会社）を用いた。飼養期間終了後，ラン子を見出すことを目的とした。

ダムに幼雛を30羽選抜し，体重を測定した。体重

本研究の目的を達成するため，腸管の発達が著

測定後，十二指腸，空腸，回腸および直結腸を採しいモデルとして肉用鶏（ブロイラー）を，通常取し，total RNAを抽出した。2.1で有意差の認めの成長と腸管発達を行うモデル動物として採卵鶏られた遺伝子をターゲットとしてRT-qPCRを（単冠白色レグホン種）を用いた。

行った後，半定量化した遺伝子発現量とブロイ

２．方
2.1

ラーの成長効率に対して無相関検定を行い，相関法が認められるか統計解析を行った。本研究は秋田県立大学動物実験委員会の承認を得て行った（承採卵鶏と肉用鶏の比較

単冠白色レグホンおよびブロイラー（チャン

認番号：21-03）。

キー種）の有精卵を孵卵機を用いて37.6℃で21日

2.3

統計解析

間孵卵した。孵化後，育雛器内で初雛を２週間平統 計 処 理 ソ フ ト『Ｒ』お よ び 統 合 開 発 環 境

飼いした。飼料および水は自由摂取とし，給与飼（IDE）『RStudio』 を 用 い て 一 般 線 形 モ デ ル

料は市販幼雛用飼料（パワーチックZK前期，JA（GLM）による統計解析を行った。パッケージは

全農北日本くみあい飼料株式会社）を用いた。飼

Statsを使用し，鶏種を説明変数とし，各mRNA

養期間終了後，幼雛から十二指腸，空腸，回腸お発現量を目的変数とした。分布はGaussian分布をよび直結腸を採取した後，total RNAを抽出し，指定し，リンク関数はIdentityを選択した。モデ

RT-qPCRを行った。本研究では，Wntシグナル

ル の 適 合 度 合 い は AIC （Akaike’s information

伝達経路におけるリガンドであるWnt1，Wnt2，

criterion）により判断した。＊p ＜0.05，＊＊p ＜0.01，

Wnt2b，Wnt3，Wnt3a，Wnt4，Wnt5a，Wnt5b，＊＊＊

p ＜0.001をそれぞれ有意差とした。

Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt8a，Wnt8b，Wnt9a，無相関検定はStasパッケージのcor.test関数を

Wnt9b ，Wnt10a ，Wnt11 ，Wnt11b ，Wnt13 ，使用し，ピアソンの積率相関係数の無相関検定を

Wnt16とその受容体であるFZD1，FZD2，FZD3，

行い，＊p ＜0.05を有意差とした。

FZD4，FZD5，FZD6，FZD7，FZD8，FZD9，FZD10，Low-density lipoprotein receptor-related

３．結果と考察

protein 5（LRP5），LRP6，Receptor tyrosine kinase-

鶏の腸管で発現が認められた遺伝子はWnt1，

like orphan receptor 1（ROR1）お よ び ROR2 のWnt2，Wnt2b，Wnt4，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，

計34遺伝子をターゲットとしたプライマーを設計

Wnt7a，Wnt9a，Wnt11b，FZD1，FZD2，FZD3，© The Ito Foundation

425

肉用鶏の成長効率に関与する腸管内Wntおよびその受容体の探索

FZD4，FZD5，FZD6，FZD7，FZD8，FZD9，ラーの成長効率における無相関検定を行ったが，FZD10，LRP5，LRP6，ROR1およびROR2の計

Table１に示したとおり，相関は認められなかっ24遺伝子であった。上記の遺伝子の中でも，十二た。さらに，浅胸肉，深胸肉および腿肉重量と無指腸，空腸，回腸および直結腸にすべてに共通し相関検定を行ったが，日増体量と同様相関は認めて有意に遺伝子発現量に変化が認められた遺伝子られなかった。

はFZD3およびLRP5であった。Fig.１に示したよ

LRP5はFZD受容体の共役受容体の役割を果た

うに，FZD3およびLRP5はブロイラーよりも単冠

し，リガンドと結合することでWntシグナル伝達

白色レグホン種で有意に高い発現量を示した。

経路の１つであるβ-カテニン経路（古典的経路）

以上の結果から，FZD3およびLRP5が鶏の成長を活性化する。β-カテニン経路の活性化は腸陰効 率 に 関 与 す る 遺 伝 子 で あ る と 予 想 し ，次 に

窩における細胞増殖や分化に関与し，マウスの腸

LRP5およびFZD3とブロイラーの成長効率の間の発達に関与していることが報告されている４）。

に相関が認められるか調査した。ブロイラーの日

FZD3はWntの受容体として働き，非古典的経路

増 体 量（ｇ / 日）と LRP5 お よ び FZD3 と ブ ロ イ

であるPlanar cell polarity（PCP）経路に関与す

100
＊＊＊

Gene expression level

80

White leghorn
Broiler

60
40

＊＊＊
＊＊＊

20

＊＊＊
＊＊

0

Duodenum

Ileum

Jejunum

Colorectum Duodenum

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

Jejunum

Ileum

Colorectum

FZD3

LRP5

Fig. 1 C omparison of gene expression levels of Wnt related genes in white leghorns and broilers.
Data are expressed as mean±SEM（n＝8）. ＊＊p ＜0.01, ＊＊＊p ＜0.001.

Table 1 Correlation between Wnt receptor gene expression level, broiler growth efficiency, and skeletal muscle weight（n=30）.

Gene expression of LRP5

Body weight gain, g/day
BreastTenderThighGene expression of FZD3Duodenum

Jejunum

Ileum

Colorectum

Duodenum

Jejunum

Ileum

Colorectum－0.181－0.051－0.014－0.019－0.225－0.071－0.110－0.005－0.115－0.003－0.1610.122－0.131－0.071－0.015－0.142－0.0300.151－0.017
0.094

0.030
0.044
－0.0940.023－0.151－0.002－0.1370.007－0.0090.013－0.149－0.027＊p<0.05© The Ito Foundation

426

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

る受容体である５）。しかし，LRP5およびFZD3のイラー）における成長効率に関与する遺伝子の探

双方とも鶏の腸管における生理的機能に関する報索を行った。まず，成長と腸管発達の著しいブロ

告はないため，今後の調査課題である。

イラーと対照区として採卵鶏（単冠白色レグホン

腸管の形成に関与するシグナル伝達経路はWnt

種）を用意し，Wntシグナル伝達経路関連遺伝子

だけではなく，EGF（Epidermal growth factor），の遺伝子発現量を比較することで，成長に関与す

BMP （Bone morphogenetic protein）， Notch お

るWntシグナル伝達経路関連遺伝子の探索を行っ

よびHedgehogシグナル伝達経路の関与が明らかた。その結果，腸管内におけるLRP5およびFZD3となっている 。Wnt，NotchおよびEGFシグナ

が採卵鶏の腸管で有意に高い発現量を示した。そルは腸陰窩で高発現しており，腸幹細胞の増殖・こで，ブロイラーの日増体量とLRP5およびFZD3維持に関与している。これに対して，Hedgehogの遺伝子発現量に対して無相関検定を行ったとこ

およびBMPシグナルは腸絨毛で高発現することろ，LRP5およびFZD3の双方とも相関が認められで腸細胞の分化に寄与している。Wntシグナル伝なかったため，Wntシグナル伝達経路に関与する達経路関連遺伝子と成長鶏の腸管発達はWntシグ

遺伝子と肉用鶏の成長に直接的な関与がないこと

ナ ル 伝 達 経 路 活 性 で は な く ，分 化 に 関 与 す るが明らかとなった。

６）

HedgehogおよびBMPシグナル伝達の関与の可能性があるため，次の課題として，HegehogおよびBMPシグナルと肉用鶏の成長との関連について調査する必要がある。
４．要

約

鶏の成長と腸管の発達に関連があることが知られている。さらに近年，鶏の腸管発達にWntシグ
ナル伝達経路に関連する遺伝子が関与していることが鶏胚の研究から明らかとなっている。しかし，胚の発生に伴いWntおよびその受容体の遺伝
子発現様式も異なることが報告されており，成体におけるWntシグナル伝達経路に関連する遺伝子発現の様式は不明である。そこで，本研究では，
鶏腸管におけるWntシグナル伝達経路関連遺伝子

文
献１）
 Smith, W. M., Mitchell, A. M., Peacock, A. M.：
Effects of genetic selection on growth rate andintestinal structure in the domestic fowl（Gallus
domesticus）, Comparative Biochemistry andPhysiology, 97A, 57～63, 1990.
２）
 Czerwinski, M., Shroyer, F. N., Spence, R. J.：
Physiology of the Gastrointestinal Tract, Sixth
Edition, Page185-196, Academic Press, USA, 2018.
３）
 McBride, J. H., Fatke, B., Fraser, E. S.：Wnt
signaling components in the chicken intestinal
tract, Developmental Biology, 256, 18～33, 2003.
４）
 MacDonald, B. T., He, X.：Frizzled and LRP5/6
receptors for Wnt/β-catenin signaling, Cold Spring
Harbor Perspectives in Biology, 4, a007880, 2012.
５）
 Corda, G., Sala, A.：Non-canonical WNT/PCP
signaling in cancer：Fzd6 takes centre stage,
Oncogenesis, 6, e364, 2017.
６）
 Baulies, A., Angelis, N., Li, S. W. V.：Hallmarksof intestinal stem cells, Development, 147, dev182675
doi：10.1242/dev.182675, 2020.

の遺伝子発現を調査するとともに，肉用鶏（ブロ© The Ito Foundation

427

ルーメン内繊維消化ダイナミクスに着目した
採食可能量の予測モデルの開発（Ⅱ）
Prediction of feed intake capacity based on dynamic models of fiber
digestion and passage in the rumen（Ⅱ）

谷

川

珠

子１・田

中

常

喜２

（１地方独立行政法人北海道立総合研究機構酪農試験場，２地方独立行政法人北海道立総合研究機構畜産試験場）

Tamako Tanigawa１ and Tsuneki Tanaka２（１Local Independent Administrative Agency, Hokkaido Research Organization Dairy Research Center,
２Local Independent Administrative Agency, Hokkaido Research Organization Animal Research Center）

This study demonstrated prediction of dry matter intake（DMI）of total mixed rations（TMR）based on dynamics simulation of neutral detergent fiber（NDF）remain in the rumen.
Parameter tunning for passage rate of the model, which was developed in previous study, wascarried by the Bayesian optimization. The parameter tunning resulted in stationarity of NDF
pool size in case of change of TMR. The simulation based on the optimized parameters showedthat NDF remain related to traits of dairy cattle such as metabolic body weight, parity, anddays in milk（DIM）. In addition, the simulation showed a plausible periodicity in a day andDIM. Predictions of DMI per day, where predictions were performed using test data of rearing
by sixteen TMR menu with eight dairy cattle, resulted in low accuracy（RMSE=3.3 and r =－0.01）. In addition, uniform parameter tunning for intake frequency in the simulation and
NDF pool size did not relate to prediction accuracy, despite increase/decrease of prediction
value itself. This study suggested model extensions with a seasonal periodicity, or escape fromthe passage due to ruminal mat formation and rumen fermentation. Further studies would be
required to improve accuracy of prediction model of DMI.

１．目

量に強く影響する要因であることが知られてい的る。これまでの試みの多くは，生産性レベルや給飼料の採食量は，反芻家畜の乳肉の生産性に最

与飼料中の粗飼料割合などが一定の条件下においも影響し，採食量を高めることは生産性向上に重て採食量の予測が検討されてきた。それにより，要である。反芻家畜の採食量は，飼料の種類，成

採食量に影響する要因は整理されたが，さまざま

分，物理的特性，消化管内での消化速度および通な条件下での採食量の予測に向けた，多くの要因

過速度などの飼料側，体重，体型，乳量，乳期おを含む体系的なモデルの構築には至っていない。

よび妊娠などの動物側，設備や給与回数などの環

ルーメン内の許容量の把握は，ルーメン内の物境といった多くの要因に影響される。特に飼料側理的な膨満に制限される採食量の予測や，ルーメの要因のうち，粗飼料由来の繊維の特性は，採食

ン性状の解析に，有益な情報となり得る。前課題© The Ito Foundation

428

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

で，採食と，消化および下部消化管への通過によい（搾乳日数150日前後で増加が確認される）牛る時間経過に伴ったルーメン（第一胃）内の繊維を10頭選定し，最適化に用いるトレーニングデー（NDF）の動態に着目し，採食量を予測するため

タとし，残りを確認用のデータとした。

に，モデルの骨格となるフレームワークを構築し設定するパラメータは，ルーメンからの通過にた。その計算結果では，TMR設計が切り替わる

関するパラメータのうち，粗飼料の通過速度の関

搾乳日数150日前後を境に，ルーメン内に滞留す数の係数，通過速度を算出する変数となる摂取量

るNDF量（ルーメン内NDF滞留量）の増加が確を遡及する時間とした。粗飼料の通過速度（％/

認され，弱定常性が担保できなかった。そこで本２）hr）は，Krizsan et al.（2010）の推定式を初期

課題では，本モデルのパラメータの最適化を試み

値 と し た：kp ＝ 1.19 ＋ 0.0879 × NDFI ＋ 0.792 ×

た。具体的には，（ⅰ）ルーメン内滞留量の弱定

c-NDFI/NDFI＋1.21×iNDFI/NDFI，ここで，常性に着目したルーメンから下部消化管への通過

NDFI ； 体 重（BW）当 た り の NDF 摂 取 量（gに関連するパラメータ最適化，（ⅱ）モデルのフ

day －1/kg of BW），c-NDFI；体重当たりの濃厚

レームワーク構築に使用したデータと異なる検証

飼 料 由 来 NDF 摂 取 量 （g day －1 BWkg －1），

用データの取得，（ⅲ）パラメータ最適化後の日

iNDFI ； 体 重 当 た り の 不 消 化 NDF 摂 取 量（g単位の採食量を予測精度の変化と，パラメータのday－1 BWkg－1）。通過速度を算出するための摂取再調整による予測精度への影響を検証した。

量の初期値は，直近６hr以内の採食量を合計し２．方た。ルーメン内NDF滞留量は，60分間隔で計算し，法その値を移動平均法により平滑化（Window size

モデルの骨格となるフレームワークの構築は，＝2day 1hr）後，個体内分散の平均値の逆数を最

北海道立総合研究機構酪農試験場（北海道中標津

大化するスコアとし，最適化を行った。その他の町）において，フリーストールで２群管理（泌乳設定は，前課題と同一である。パラメータ最適化

前期，泌乳中・後期）されたホルスタイン種泌乳

は，BayesianOptimizationパッケージを用いた。

牛 群 の 飼 養 デ ー タ を 用 い た（谷 川 ＆ 田 中 ，2 . 2 日単位の採食量の予測に向けた精度検証2020） 。2018年３月１日～2019年６月30日にか
１）用のデータ取得

けて，個体別に，リアルタイムで自動記録された

北海道立総合研究機構酪農試験場，酪農学園大

採食量を解析対象とし，全126頭中，治療歴が少学（北海道江別市）およびホクレン訓子府実証農

なく，フリーストールでの滞在が連続した32頭を場（北海道常呂郡訓子府町）において調査された抽出し，ルーメン内NDF滞留量のモデル構築の飼養データを収集し，粗飼料の成分分析と合わせ基礎データとした。データ解析は，Python３のて，精度検証用のデータとした。北海道立総合研

各種パッケージを用いた。

究機構酪農試験場では，８種類の牧草サイレージ

2 . 1 ルーメン内に滞留する繊維（NDF）量のについて，２通り（高NDF設計区，低NDF設計

弱定常性に着目したパラメータ最適化区）のTMR設計を行い，タイストールで飼養さモデル構築の基礎データのうち，搾乳日数100れた８頭（反転法，２期）の摂取量が調査されて～200日のデータを抽出した。その結果，対象といる。酪農学園大では，牧草サイレージとトウモなる牛が32頭中24頭となった。さらに，特にルーロコシサイレージを用いてTMR設計し，フリー

メン内NDF滞留量で弱定常性が担保できていなストールで飼養された１群17頭について，群全体© The Ito Foundation

ルーメン内繊維消化ダイナミクスに着目した採食可能量の予測モデルの開発（Ⅱ）の摂取量が調査されている。ホクレン訓子府実証
農場では，牧草サイレージとトウモロコシサイ
レージを用いてTMR設計し，タイストールで飼３．結果と考察3 . 1 ルーメンから下部消化管への通過速度に養された10頭の55日間分の摂取量が調査されている。

429

関するパラメータの最適化後の変化
前課題で設定したパラメータの最適化前後の値

2 . 3 日単位の採食量の予測とパラメータの再をTable１に示した。パタメータ最適化によって，定数項を除き，各係数は高くなり，通過速度が速調整による変化
パラメータ最適化後，モデル構築の基礎データ

くなる方向へ修正された。通過速度を算出する変について，ルーメン内NDF滞留量を６分間隔で数となる摂取量を遡及する時間は，約8.5hrと長再計算し，搾乳日数350日以前のデータを抽出し３）
く な っ た 。 Cabezas-Garcia et al.（2018）とた。その後，前課題と同様に，代謝体重（kg0.75），

４）Kammes & Allen（2012）
が調査したiNDFの通産次（初産，２産，３産以降），搾乳日数（day），

過速度の測定値と比較すると，本試験で算出した

朝の飼料給与からの経過時間（AM９：26からの通過速度は，測定値よりも約２倍高かったが，測経過時間，min）を説明変数としたルーメン内

定 値 と の 相 関 は r ＝ 0.84 と NRC2001 の 推 定 式

NDF滞留量の線形加法モデルを，pyGAMパッ（ r ＝ － 0.40）や CNCPS（ r ＝ － 0.41）よ り も 高

ケージにより作成した。

かった（Table２）。既報の推定式は日単位の通過

日当たりのTMRの乾物摂取量の予測は，規定速度であるのに対して，本課題ではリアルタイム

したルーメン内NDF滞留量に達するように30分で変化する通過速度の推定をしていることが一因

間隔で採食するシミュレーションを行い，日当たであると考えられた。加えて，Cabezas-Garcia

りのTMRの乾物摂取量（kg day ）の測定値と４）
et al.（2018）３）とKammes & Allen（2012）
は，比較した。加えて，採食頻度やルーメン内NDF

潜 在 的 な 消 化 可 能 な NDF（pdNDF）と 不 消 化

滞留量を変化させた場合の予測値と測定値の関係

NDF（iNDF）で通過速度や平均滞留時間が異なの変化を検討した。

るという結果を報告している。しかしながら，本－1

試験で構築したモデルでは，一律の通過ラグタイ
ムの設定にとどまっている。ルーメンマット層のTable 1 Change of coefficients for passage ratio（%/hr）by parameter tuning based on the Bayesian

optimization

Model

Score＊

InitialBefore optimization

0.886
5.884

Passage rate（kp）equation for roughage†
fkp_a

fkp_b

fkp_c

fkp_d

Rolling time（min）‡

1.190
0.821

0.08790.2981

0.792
2.796

1.210
4.731

360
606

＊Score is calculated by reciprocal number of averaged variance within cow for NDF pool size（NDFkg）, largevalue of the score means stationarity for NDF pool size in the rumen between 100-200 days in milk.
† kp = fkp_a + fkp_b × NDFI + fkp_c × CProp （NDF）+ fkp_d × iNDF：NDF, where NDFI is NDF intake
per body weight（g day －1 BWkg －1）for a rolling time, and CProp（NDF）is a proportion of concentrates on a
NDF basis, and iNDF：NDF is ratio between diet iNDF and NDF concentrations, respectively.
‡ Rolling time for NDFI, CProp（NDF）and iNDF：NDF in kp equation.

© The Ito Foundation

430

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 2 Passage ratio（kp, %/hr）by best equation on the Bayesian optimization＊, NRC2001 equation†,or CNCPS equation‡

Estimated kp（%/hr）

Trial

Observed kp（%/hr）

Best models

NRC2001

CNCPS

1L

3.54

6.65

4.92

4.51

1LE

3.37

6.45

4.82

4.40

''

1EL

3.51

6.45

4.82

4.40

''

1E

2.94

6.28

4.74

4.29

2AL
2OG

3.27
2.52

6.84
5.73

5.38
5.29

4.97
4.91

Refference
Cabezas-Garcia et al., 2018３）''
Kammes & Allen, 2012４）''＊kp = 0.821 + 0.2981 NDFI + 2.796 CProp（NDF）+ 4.731 iNDF：NDF, where NDFI is NDF intake per bodyweight（g day－1 BWkg－1）, CProp（NDF）is proportion of concentrates on a NDF basis, and iNDF：NDF is
ratio between iNDF and NDF concentrations, respectively.
５）† kp = 3.054 + 0.614 DMI, where DMI is dry matter intake（% of BW）（NRC, 2001）.

‡ kp = 2.365 + 0.0214 FpBW + 0.0734 CpBW + 0.069 FDMI, where FpBW is forage dry matter intake per bodyweight（g day－1 BWkg－1）, CpBW is concentrate dry matter intake per body weight（g day－1 BWkg－1）, andInitial model
16

16

14

14
NDF remain（kg）

NDF remain（kg）

６）.
FDMI is forage dry matter intake（kg day－1）,respectively（Fox et al., 2004）

12
10
8
6
4

12
10
8
6
4

2

2
0

100

200
300
Days in milk

400

0

200 400 600 800 1000 1200 1400
Elapsed time (min) after AM9 : 26

0

200 400 600 800 1000 1200 1400
Elapsed time (min) after AM9 : 26

16

14

14
NDF remain（kg）

NDF remain（kg）

Best model by optimization
16

12
10
8
6
4

12
10
8
6
4

2

2
0

100

200
300
Days in milk

400

Fig.1 Relationship between neutral detergent fiber（NDF）remain（kg）in the rumen by dynamic simulation based ona real-time total mixed rations（TMR）intake data and days in milk（left）, or elapsed time after AM9：26（right）.
The simulation carried on initial parameter（upper）and optimized parameter shown in Table1（bottom）.The realtime TMR intake data were collected from thirty-two dairy cattle reared in free-stall during March, 2018-June,
2019, at Nakashibetsu, Hokkaido. The dynamic simulation was carried on the assumption of the follow digested and（tpassaged NDF model with a 6-min pitch：NDF remain＝pdNDF×e－kd（ t -Ld）＋pdNDF×e－kp（ t -Lp）＋iNDF×e－kp（ t -Lp）
＞ Ld and t ＞ Lp）,where NDF remain is NDF（kg）in the rumen after t hours after an intake, pdNDF is potential
digestible NDF（kg）,iNDF is indigestible NDF（kg）,kd is digestion rates（/hr）,Ld is lag time（hr）of degradation,
kp is passage rates（/hr）, Lp is lag time（hr）of passage. NDF were analyzed with thermostable α-amylase andash correction without sodium sulfite.

© The Ito Foundation

431

ルーメン内繊維消化ダイナミクスに着目した採食可能量の予測モデルの開発（Ⅱ）
MBW

Parity

0.7

0.3

6.5

0.2

6.0

0.1

5.5

0.0

5.0

－0.1

4.5

－0.2

4.0

－0.3
90

100 110 120 130 140 150 160

－0.5

0.0

DIM

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

ElapsedTime
1.00

0.9

0.75

0.8

0.50

0.7

0.25

0.6

0.00

0.5

－0.25

0.4

－0.50

0.3

－0.75

0.2
0

50

100

150

200

250

300

350

0

200 400 600 800 1000 1200 1400

Fig. 2 Coefficient values of parameters in linear additive model for predicting neutral detergent fiber remain（kg）in

the rumen before the Bayesian optimization. The model includes metabolic body weight（kg 0.75, MBW）,parity（first［＝1］, second［＝2］and over third［＝0］）, days in milk（day, DIM）, and elapsed time after AM9：26（min,ElapsedTime）. The solid and dashed lines show coefficient values（kg）, and confidence intervals at the 0.95-level,
respectively.

形成消化に伴ったVFA発生による浮力による通た。前課題で問題点として指摘された搾乳日数と過からのエスケープについて，モデル拡張の余地の関係は，分娩直後のNDF滞留量は小さく，搾があると考えられる。

乳日数100日をピークとする緩やかな曲線となり，最適化後のパラメータでルーメン内のNDF滞留量を再計算した結果（Fig.１），最適化前に比べて大きく減少した。また，個体間差や日内変動が確認され，その範囲は３～８（kg）であった。

一般に言われる乾物摂取量の推移と同様の傾向となった。
3 . 2 精度検証用データと給与粗飼料のNDF消化特性

日内のピークに相当する値は，泉ら（2008） の報

収集した精度検証用データの乾物摂取量は，

告（7.2～8.8kg）やKononoff & Heinrichs（2003）８）20.0～25.3（DMkg day－1 cow－1）と，体重に対しの報告（7.8～8.2kg）とおおむね一致した。パラて2.9～3.8％の摂取量であった。酪農学園大学おメータ最適化後のルーメン内NDF滞留量のモデ

よびホクレン訓子府実証農場でのデータは，各１

ル（Fig.２）は，代謝体重と産次の効果や，朝の例の収集にとどまったため，以降の解析は，酪農

給餌600～700分後に日内ピークがある曲線となる試験場でのデータを中心に実施した。

７）

日内変動が，最適化前のモデルと同様に確認でき各試験で給与したTMR中の粗飼料割合は42～© The Ito Foundation

432

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

35

Observed DMI（kg day－1）

30

25

20

15
r =－0.01（all), 0.17（○Spring）, －0.19（●Winter）
RMSE（kg）= 3.3（all）, 2.7（○Spring）, 4.7（●Winter）
10

10

15

20
25
Predicted DMI（kg day－1）

30

35

Fig. 3 Prediction of dry matter intake（DMI, kg day －1）of total mixed rations（TMR）based on neutral

detergent fiber（NDF）-based dynamic simulation model. Test-data were examined rearing by sixteen
TMR-menu with eight dairy cattle（Table 4）. The NDF-based dynamic simulations were carried on the
NDF remain（kg）prediction model（Fig.1）with a 30-min pitch. The NDF-based dynamic simulations
resulted in RMSE＝3.3（kg）and r＝－0.01 for all data. The open and closed circles show data examined in
Spring（March-June）and in Winter（November-February）,respectively. The lines are Y＝X.

64％，デンプン含量は18.3～27.8％と，一般的な季に試験を実施した飼養データに，当てはまりがTMR設計の範囲内の変異があった。牧草サイ

低く，予測を過大評価しているものが含まれ，そ

レージのNDF消化特性は，pdNDF含量，iNDF含れを除くと，RMSE＝2.7（kg），r ＝0.17であった。

量，消化速度ともに比較的大きな変異が確認できモデルの基礎となるデータが約１年間と少なかった。一方で，トウモロコシサイレージのNDF消たため，本課題では検討できなかったが，季節に化特性は，NDF含量がほぼ同じ値であったが，よる周期性も考慮する必要性が示唆された。

iNDF含量や消化速度には変異が見られた。以上

採食シミュレーション時の採食頻度や，ルーメ

より，多様な環境における変異の大きな飼養デー

ン内NDF滞留量を変化させた場合の予測値は，タを収集できた。

絶対値としての変化は見られたが，予測値と観測

3 . 3 パラメータ最適化による日当たり乾物摂（データ省略）。そのため，前述のモデル再構築の取量の予測精度パ ラ メ ー タ 最 適 化 後 の 乾 物 摂 取 量（DMkgday－1値の相関関係には影響がきわめて小さかったcow ）の予測値と観測値の関係をFig.３に－1示した。ルーメン内繊維消化ダイナミクスにより予測された乾物摂取量の予測精度は，RMSE＝3.3（kg）， r ＝－0.01と低かった（Fig.３）。特に，冬必要性に加えて，相関関係に影響する要因の感度分析が必要であると考えられた。
４．要

約

本課題は，前課題で構築したルーメン内繊維消© The Ito Foundation

ルーメン内繊維消化ダイナミクスに着目した採食可能量の予測モデルの開発（Ⅱ）

化ダイナミクスに基づく採食量予測モデルについて，パラメータ最適化を試みた。ルーメン内繊維

謝

433

辞

滞留量（NDF滞留量）の弱定常性に着目した通本研究の実施にあたり，有益なご助言と飼養過速度に関連するパラメータ最適化によって，データを提供いただきました酪農学園大学農食環

TMR 設 計 が 変 更 さ れ た 搾 乳 日 数 150 日 前 後 の境学群循環農学類

NDF滞留量の変化は小さくなった。パラメータ

実証農場

最適化後のNDF滞留量のモデルは，最適化前のす。

泉賢一教授，ホクレン訓子府

渡邊龍之介氏に心より感謝申し上げま

モデルと同様に代謝体重，産次の影響と日内周期が確認できた。搾乳日数との関係は，100日頃をピークとする緩やかな曲線となった。パラメータ
最適化後の日単位の採食量の予測精度は，RMSE＝3.3kg， r ＝－0.01と低く，採食シミュレーショ
ン時の採食頻度やNDF滞留量を一律に変化させてもその予測精度は高くならなかった。今後の予測精度の向上に向けて，季節性やルーメンマット
構造などの通過のエスケープを考慮したモデルの再構築を検討したい。

文献１）
 谷川珠子，田中常喜：平成31年度食肉に関する助成研究調査成果報告書 Vol.38, 385～390, 2020.
２）
 Krizsan, S. J., Ahvenjärvi, S., Huhtanen, P.：J.
Dairy Sci., 93（12）,5890～5901, 2010.
３）
 Cabezas-Garcia, E. H., Krizsan, S. J., Shingfield, K.
J., Huhtanen, P.：J. Dairy Sci., 101（2）, 1177～1189,
2018.
４）
 Kammes, K. L., Allen, M. S.：J. Dairy Sci., 95（6）,3269～3287, 2012.
５）
 National Research Council：Nutrients Requirementsof Dairy Cattle, Seventh Revised Edition, 2001.
６）
 Fox, D. G., Tedeschi, L. O., Tylutki, T. P., Russel, J.
B., Van Amburg, M. E., Chase, L. E., Pell, A. N.,
Overton, T. R.：Anim. Feed Sci. Technol., 112, 29～
78, 2004.
７）
 泉賢一，坂本孝仁，柴山草太，辻秀雄：日本畜産学会報，79（3）,361～368, 2008.
８）
 Kononoff, P. J., Heinrichs, A. J.：J. Dairy Sci., 86（4）,1445～1457, 2003.

© The Ito Foundation

434

国産トウモロコシ子実の乾燥温度および貯蔵条件がトウモロコシの栄養価に及ぼす影響
Effects of drying temperature and storage conditions on nutritive value ofdomestic grain of corn

篠遠

善哉１・金井源太１・芦原茜２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター，
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

２

Yoshiya Shinoto１, Genta Kanai１ and Akane Ashihara２（１Tohoku Agricultural Research Center, NARO, ２Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

The objective of this study was to determine the optimal drying and storage conditions
for corn as a domestic grain for swine by comparing nutritional values estimated by an in vitro
digestion method. Following harvesting under the standard moisture condition or a highmoisture condition, corn grains were dried at two temperature levels（40 or 60℃～80℃）and
then stored under a high temperature and humidity condition or a low temperature condition
for two months. Grain yield was lower under the standard condition than the high moisture
condition and was attributed to decreased kernel number, while ear length and 100-grain
weight were not obviously different. Compared to the high moisture condition, the standard
moisture condition consumed more energy for water removal due to the outside airtemperature during the drying test. There was no effect of harvest drying temperature on theestimated nutritional values；however, the digestibility of dry matter（DM）and crude protein（CP）in grains in the high moisture condition group was higher compared to the standard
condition group. In addition, the digestibility of DM and CP in grains stored under the lowtemperature condition was higher compared to storage under the high temperature and humid
condition. In conclusion, it was suggested that domestic corn grains should be harvested undera higher moisture condition than the standard condition, and the grains should be stored at low
temperatures during extended storage to prevent quality deterioration during the summer
season in Japan.

１．目

したトウモロコシ子実の利用が主である。した的がって，子実用トウモロコシの栽培面積の拡大を水田の有効活用および濃厚飼料の増産という背促進していくには豚での利用拡大に向けた乾燥・景から水田転換畑での子実用トウモロコシ栽培が貯蔵に関する基礎的な情報の集積がきわめて重要広がりつつある。トウモロコシをホールクロップ

である。

でサイレージ利用できる牛と比較して，豚は乾燥

これまで水稲などで使われてきた機械体系をト© The Ito Foundation

国産トウモロコシ子実の乾燥温度および貯蔵条件がトウモロコシの栄養価に及ぼす影響

ウモロコシ子実の収穫や飼料調製のために有効利用できることは大きなメリットである。トウモロ
コシ子実の乾燥には，既存の汎用循環式乾燥機が

２．方

435

法

2 . 1 子実用トウモロコシの栽培試験および収主に使われているが，コメの胴割れを防ぐために

穫試験

乾減率１％/h程度に抑える基本設計となってい試験は，2020年に農研機構東北農業研究センることもあり，作業上の律速となっている。そのター内（岩手県盛岡市）でトウモロコシ（Zeaため，比較的高温かつ短時間で乾燥できる技術開

mays L.,cv. 36B08）を供試して実施した。

発が必要である。特に，トウモロコシ主要産地で試験区は，立毛子実水分25～30％で収穫する慣あるアメリカと比べてわが国の気候は多湿であ行水分区と立毛子実水分30～35％で収穫する高水

り，収穫時における子実水分が５～10％高い傾向

分区の２処理区を設けた。慣行水分区は水田転換にある。子実水分の高い状態で乾燥処理を開始す

畑（前作，乾田直播水稲），高水分区は畑で実施

ると成分変化は大きくなると想定され，独自の検した。両区とも，播種前に牛糞堆肥を１t/10a，討が必要であると考えられる。さらに，国産トウ基肥として配合肥料をN，P2O5 ，K2Oの成分でそ

モロコシ子実の利用拡大を図るうえで重要なこと

れぞれ15，20，15g/m2 施用した。播種は，真空は，畜産農家に通年供給できること，すなわち，播種機を用いて，慣行水分区と高水分区それぞれ収穫期である秋から翌年の秋までの好適な保存方

2020年５月27日と2020年５月24日に条間75cm，

法を明示することである。生産現場では夏季の多株間17cmの設定で行った。収穫作業は，高水分

湿高温条件による品質劣化の可能性が課題として

区において2020年９月23日に，慣行水分区においあがっているが，トウモロコシ子実の貯蔵条件にて2020年10月19日～20日にトウモロコシ子実の収関する検討はまだ行われていない。多湿高温条件

穫を想定して試験用部品を装着した普通コンバイ

下では，貯蔵中に脂質成分の酸化亢進などが起こ

ン（WRH1000c，クボタ社）にタイ製サードパー

り，栄養素の利用低下が懸念されることから，飼ティー品（３条刈仕様，KIJ VANICH社）を装料として利用するうえで重要な貯蔵による栄養価

着して行った。なお，収穫時の立毛子実水分は慣の変化を明らかにする必要がある。

行水分区，高水分区それぞれ23％，32％であった。

そこで本研究では，子実水分が慣行あるいは比2020年９月22日，10月９日にそれぞれ高水分区

較的高い条件で収穫した国産トウモロコシ子実と慣行水分区の３カ所において，隣接する２条をを，異なる温度水準で乾燥し，多湿高温条件ある

２ｍの長さ（3.0ｍ 2）で雌穂を収穫して，収量おいは低温条件で貯蔵した後，豚における各種栄養

よび収量構成要素を調査した。

素の利用性が評価できるin vitroの人工消化法を2.2

用いて栄養価を評価して比較検討することによ

乾燥試験は，コンバインで収穫した慣行水分区

り，国産トウモロコシの乾燥・貯蔵についての好と高水分区のトウモロコシ子実をそれぞれ供試し

適条件を明らかにすることとした。

た。試験区は，循環式乾燥機を用いてコメの乾燥

トウモロコシ子実の乾燥および貯蔵試験の慣行温度（約40℃）で乾燥する低温（LT）区と平型乾燥機を用いて比較的高い温度（60℃～80℃）で乾燥する高温（HT）区を設け，飼料として適した水分15％以下となるまでの乾減率と除© The Ito Foundation

436

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

水量あたりの消費熱量を調査した。乾燥機は循環式乾燥機（RTM250-XLD5，金子農機社）と平型乾燥機（HAD-180F，金子農機社）を用いた。
貯蔵試験は，慣行水分区と高水分区のトウモロ

定にはTukeyの多重検定法を用いた。
３．結果と考察3.1

子実収量および収量構成要素

コシ子実をそれぞれLT区とHT区の条件で乾燥しコンバインによる全刈収量は慣行水分区，高水た４種類を供試した。試験区は，わが国の夏季を分区でそれぞれ707kg/10a，895kg/10aであり，想定した多湿高温（温度32℃，湿度80％）と常湿

高水分区より慣行水分区で少ない傾向であった。

低温（温度15℃，湿度60％）の条件の２区を設

収量構成要素のうち，雌穂長と100粒重に処理区

け，収穫・乾燥後の11，12月の２カ月間丸粒のまの顕著な差はみられなかったが，粒数は高水分区

まで貯蔵後，分析に供した。一方，本研究で収穫・で多い傾向であった。したがって，高水分区と比乾燥したトウモロコシ子実では，実際の夏季に曝較して慣行水分区では，粒数が減少したため全刈露することは時間的に不可能であったため，収収量が少ない傾向であった。これは，前作におけ穫・乾燥後に10℃の低温下で貯蔵しておいた2019

る畑作と水稲の違いによると考えられた。

年産のトウモロコシ子実を供試して，北関東（茨3.2

城県つくば市）の実際の夏季３カ月（７～９月）

乾燥試験の結果をTable１に示した。慣行水分の間，温度調節機能のない一般的な飼料保管庫区と高水分区における乾燥時の初期水分はそれぞ（常温区）と温度15℃に制御された低温貯蔵庫

れ24.8％，35.8％であった。乾燥後の仕上水分は，（低温区）において丸粒のままで貯蔵する試験も循環式乾燥機ではおおむね目標水分の15％以下で行った。貯蔵前後の各丸粒トウモロコシ子実の一あった。平型乾燥機では上層と下層で水分が異な部は，１mm以下に粉砕した後，乾物（DM），粗るため，上層まで十分に乾燥されたことを確認しタンパク質（CP），粗灰分（CA），粗脂肪（EE），てから運転を停止したため，15％を大きく下回

粗繊維（CF）および総エネルギー（GE）を各公り，慣行水分区では9.2％，高水分区では7.8％で定法により測定して品質を評価した。

あった。乾燥温度について，慣行水分区ではLT

2.3

乾燥試験および貯蔵試験

トウモロコシ子実の栄養価に関する試験区で33.8℃，HT区では通風温度がセンサーの最①乾燥試験で調製された２（慣行水分区，高水

大測定値80℃を上回り，測定不可であり，高水分分区）×２（LT区，HT区）の４種類，②①の４区ではLT区で37.6℃，HT区で66.2℃であった。

種類×２（多湿高温区，常湿低温区）の８種類，

高水分区と比較して慣行水分区では，乾燥試験時③2019年産トウモロコシ子実を北関東の実際の夏の外気温が低いため，除水量あたりエネルギー消季に３カ月間貯蔵した２（常温区，低温区）種類

費量が大きかった。

の合計14種類のトウモロコシ子実について，栄養本研究で収穫・乾燥されたトウモロコシ子実の価を評価するために豚の消化管における消化・吸貯 蔵 試 験 で は ，多 湿 高 温 条 件 下 の 平 均 温 度 は収反応を試験管内で再現した人工消化法によ31.9℃，平均湿度は79.7％，常湿低温下での平均

りDMとCPの消化率を求めた。トウモロコシ子実

温度は14.2℃，平均湿度は54.8％であり，おおむの栄養価に関する統計処理は，収穫時の水分条

ね設定どおりであった。開始時および貯蔵後の慣件，収穫後の乾燥温度，貯蔵温度および湿度条件

行水分区および高水分区の一般成分値をTable２を要因とする分散分析を行い，平均値の有意差検に示した。開始時および貯蔵後のDM含量は85～

１，２）© The Ito Foundation

437

国産トウモロコシ子実の乾燥温度および貯蔵条件がトウモロコシの栄養価に及ぼす影響
Table 1 Drying conditions
Harvesting
condition
High moistureStandard moisture

Initial Moisutre

Final Moisture

Ave. Hot Air

Content

Content

Temp.

（%）

（%）

（℃）

13.8

37.6

1.5

4.4

7.8

66.2

2.8

3.5

14.8

33.8

1.6

5.4

9.2

Over 80＊＊

2.4

5.9

Dryer＊
LT

35.8

HT
LT

24.8

HT

Drying Speed（%/h）

Energy Consumption to
Remove 1 kg of Water（MJ/kg-water）＊LT：low temperature condition, HT：high temperature condition.
＊＊Range of the sensor was up to 80℃.

Table 2 Chemical analysis of corn (on a DM basis) harvested in 2020
Harvesting

Dryingcondition

condition

Storage condition

DM（%） CP（%） CA（%） EE（%） CF（%） GE（MJ/g）

High moisture

LT
HT
LT
HT
LT
HT

Initial
InitialLow temperature
Low temperature
High temperature and humid
High temperature and humid

86.2
87.7
88.5
89.2
85.6
85.9

8.8
8.5
8.9
9.1
9.3
9.1

1.3
1.5
1.5
1.5
1.3
1.3

4.01
4.41
4.25
3.90
5.93
5.16

2.27
1.81
2.51
2.05
2.47
2.52

18.9
18.9
18.9
19.0
19.1
19.0

Standard moisture

LT
HT
LT
HT
LT
HT

Initial
InitialLow temperature
Low temperature
High temperature and humid
High temperature and humid

85.9
87.9
87.1
88.7
84.9
85.6

8.2
8.6
8.8
8.9
9.0
9.1

1.6
1.5
1.7
1.7
1.4
1.5

3.92
3.52
3.26
3.47
4.08
3.80

2.19
2.68
2.55
2.69
2.56
2.36

18.8
18.8
18.9
18.8
18.9
18.9

LT：low temperature condition, HT：high temperature condition.
DM：dry matter, CP：crude protein. CA：crude ash, EE：ethel extract, CF：crude fiber, GE：gross energy.

89％程度であり，多湿高温下で貯蔵することにより，乾燥温度に関わらず両区ともに開始時よりも

3 . 3 乾燥温度および貯蔵条件がトウモロコシ
子実の栄養価に及ぼす影響

低値となった。一方で，常湿低温下で貯蔵するこ①2020年度産の慣行水分区と高水分区のトウモとにより，開始時よりも高値となったことから，

ロコシ子実を40℃あるいは60℃～80℃で乾燥処理

貯蔵中の湿度と温度がDM含量に影響したと考えした後のDM消化率は，慣行水分区のうちLT区られた。一方，CP，CA，EE，CF，GEは貯蔵には73.5％，HT区は73.0％であり，高水分区はそれよる影響はみられなかった。

ぞれ74.5％と75.1％であった。また，CP消化率は，

2019年産のトウモロコシ子実の貯蔵試験では，

慣行水分区はそれぞれ85.8％と85.3％，高水分区

常温区の平均温度は25.5℃，平均湿度は72.6％，

は87.6％と88.0％であり，DMおよびCP消化率の低温区の平均温度は13.4℃，平均湿度は58.2％でいずれも乾燥温度の影響はないが，高水分区が慣あった。開始時および貯蔵後の常温区および低温

行水分区よりも有意に（ p＜0.05）高い値を示し

区の一般成分値をTable３に示した。DM含量につた。②の結果はTable４に示した。高水分区のト

いては，常温区では開始時と大きな違いはなかっウモロコシは乾燥温度に関わらず，慣行水分区のたが，低温で貯蔵すると高値となった。

トウモロコシよりもDM消化率およびCP消化率が有意に（ p＜0.05）高かった。また，慣行水分© The Ito Foundation

438

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 3 Chemical analysis of corn（on a DM basis）harvested in 2019
Storage condition

DM（%）

CP（%）

CA（%）

EE（%）

CF（%）

GE（MJ/g）

Initial

85.56

10.2

1.5

3.2

2.2

1.87

Low temperature

87.98

10.1

1.5

3.5

2.2

1.88

High temperature and humidity

85.74

10.2

1.6

2.8

1.6

1.88

DM：dry matter, CP：crude protein. CA：crude ash, EE：ethel extract, CF：crude fiber, GE：gross energy.

Table 4 In vitro digestion test ② after drying at various temperatures and storage under ahigh temperature and humidity condition or a low temperature condition

Harvesting condition
High moisture

Drying condition

DM（%） CP（%）

Low temperature

79.0Aa88.6AaHT

Low temperature

78.2Aa88.7AaLT
HTHigh temperature and humidity
High temperature and humidity

77.5Ba76.7Ba86.0Ba85.6BaLT
HTLT

Low temperature
Low temperature
High temperature and humidity

76.3Ab
75.0Ab
74.7Bb

86.9Ab
87.0Ab
85.4BbHTHigh temperature and humidity

75.3Bb

85.9BbLT

Standard moisture

Storage condition

LT：low temperature condition, HT：high temperature condition.
DM：dry matter, CP：crude protein.
Values are expressed as least square means. A, B： p<0.05, a, b： p<0.05.

Table 5 In vitro digestion test ③ after drying at various temperaturesand storage under a high temperature and humidity condition ora low temperature condition
Storage condition

InitialLow temperature
High temperature and humiditySD
p value

DM（%）

CP（%）

76.63
75.99
73.75
1.85
0.05

83.3
84.3
82.3
1.22
0.06

DM：dry matter, CP：crude protein.
Values are expressed as least square means and pooled standard deviation.

区，高水分区のいずれも多湿高温下で貯蔵するこ

トウモロコシよりも低くなる傾向（ p＝0.05）をとにより常湿低温下での貯蔵と比較してDM消化示した。また，CP消化率も同様に，多湿高温下率およびCP消化率が有意に（ p＜0.05）低かっで貯蔵すると開始時および常湿低温下で貯蔵したた。以上から，慣行水分区と高水分区のトウモロ

トウモロコシよりも低くなる傾向（ p＝0.06）でコシの消化率は高水分区のほうが高く，また，常あった。以上から，丸粒のままトウモロコシ子実

湿低温下で貯蔵することにより消化率の低下を抑を長期保管する場合でも，夏季常温下ではなく常制できる可能性が示された。③の結果はTable５

湿低温下で貯蔵する必要があると考えられた。

に示した。多湿高温下で貯蔵したトウモロコシのDM消化率は開始時および常湿低温下で貯蔵した© The Ito Foundation

国産トウモロコシ子実の乾燥温度および貯蔵条件がトウモロコシの栄養価に及ぼす影響

４．要

439

乾燥温度による影響はなかったが，高水分区が慣

約

行水分区よりDMおよびCP消化率が高く，また常本研究では，慣行条件と高水分条件で収穫した

湿低温下のほうが多湿高温下で貯蔵した場合より

国産トウモロコシ子実を，異なる温度水準で乾燥もDMおよびCPの消化率が高かった。以上から，し，多湿高温条件あるいは低温条件で貯蔵した

国産トウモロコシ子実の栄養価を低下させること後，豚におけるin vitroの人工消化法を用いて栄なく豚に給与するには，高水分条件下で収穫した養価を比較検討することにより，国産トウモロコ

国産トウモロコシ子実を常湿低温下で貯蔵したもシの乾燥・貯蔵についての好適条件を明らかにしのが最適である可能性が示唆された。

た。高水分区より慣行水分区で粒数が少なく，坪刈収量と全刈収量が少ない傾向であった。高水分区と比較して慣行水分区では，乾燥試験時の外気温が低いため，除水量あたりエネルギー消費量が大きかった。慣行水分区および高水分区のトウモ

文献１） Boisen, S., Fernandez, J. A. : Animal Feed
Science and Technology , 68，277～286, 1997.
２）
 Regmi, P. R., Ferguson, N. S., Zijlstra, R. T. :Journal of Animal Science , 87, 3620～3629, 2009.

ロコシを乾燥・貯蔵して栄養価を比較した場合，© The Ito Foundation

440

黒毛和種肥育牛の部分尿による尿中窒素排泄量の推定方法の確立
Method development to estimate total urinary nitrogen excretion in
fattening Japanese black beef cattle

近藤

誠１・股村

真也１・岡本俊英２・梅木俊樹２（１三重大学大学院生物資源学研究科，２三重県畜産研究所）

Makoto Kondo１, Masaya Matamura１, Toshihide Okamoto２ and Toshiki Umeki２（１Graduate School of Bioresources, Mie University, ２Mie prefectural Livestock Institute）

We determine daily urinary creatinine excretion in Japanese black cattle and also
evaluated the partial urine sampling to estimate daily excretion of nitrogen（N）in urine. In
total, 125 samples of daily excreted urine were collected from 7 heifers of Japanese black cattle.
The daily excretion of urinary creatinine was 24.8 mg/kg of body weight（BW）. The creatinine
excretion was influenced neither by diets（12 and 18％ of crude protein contents）nor collection
day even urine volume ranged widely（3.3～27.6 L/d）
. Among these cattle, creatinine excretion
was variable from 22.6 to 27.2 mg/kgBW as individual average. To evaluate partial samplingtechnique, daily urinary N excretion was estimated from urine collected in 4-h daytime urine（9-13h or 13-17h）for 5 consecutive days from 4 heifers, and was compared with actual N
excretion in total（24-h）urine collection. Percentages of the difference between actual andestimated urine N excretion were 4.8％ and 13.9％ in the urine collected in 9-13h and 13-17h,
respectively. Urinary N excretion estimated from 4-h urine in 9-13h was comparable withthem in 24-h urine. Overall, we have developed the following equation ; urinary N excretion(mg/d）＝24.8（mg/kg）×BW（kg）/creatinine concentration in partial urine sample（mg/dL）
×N concentration in partial urine sample（mg/dL）. The partial sampling technique may be
used to estimate the daily excretion of urinary N in Japanese black cattle under practicalconditions.

１．目

量では16％，格付けの主要部位であるロース芯面

的積では23％も増加した１）。

霜降り肉を生産する黒毛和種は，全国各地でも食肉の部位となる筋肉を生産するためには栄養さまざまなブランド牛の名で生産されており，優素としてタンパク質が重要である。主なタンパク

れたおいしさから国民の食を豊かにする一因と質供給源は大豆や大豆粕であり，それらの価格はなっている。近年では各地で育種改良が進み，黒飼料原料の中でも高いことから，肥育農家の経営

毛和種肥育牛が大型化している。平成14年から令上，飼料費を抑え，肉牛の生産性を向上させるた

和１年までの18年間で，黒毛和種去勢牛の枝肉重めにもタンパク質は適量給与することが望まれ© The Ito Foundation

黒毛和種肥育牛の部分尿による尿中窒素排泄量の推定方法の確立

441

る。特に大型化している黒毛和種肥育牛の歩留まを用いて，４×４ラテン方格法により実施した。

りを高めるためには，摂取したタンパク質（窒素

月齢は17.3～22.4か月，体重は386～618kgであっ量）を，いかに体内に蓄積させるか（体蓄積率）

た。処理区は粗タンパク質含量として（濃厚飼料が重要となる。この体内に蓄積した窒素量を調べ

中12％，18％）と圧ペン度合いが異なる２種類のるためには，摂取した窒素量から糞と尿に排泄さトウモロコシから４処理区を設計した。飼料の給れた窒素量を差し引くことで求められるが，通与は９：00と15：00に行った。１期14日間のう常，連続した５日間以上の期間に排泄された糞おち，予備期間を９日間，全尿を採取する期間を５よび尿をすべて回収することが必要である。牛を日間とした。合計４頭×４処理区×５日間で合計

対象に糞や尿を全量回収することは非常に労力が80サンプルの一日尿を採取した。２回目の実験で大きく，試験データが蓄積しづらい一因となっては同様に黒毛和種雌牛３頭を用いて３×３ラテンいる。そこで，糞量については消化管でリグニン

方格法により実施した。月齢は14.6～17.6か月齢，

や酸不溶性灰分などの吸収不可能な指示物質をも

体重は446～538kgであった。処理区は２水準のとに，部分的に採取した糞から全糞量推定する方

粗タンパク質含量（濃厚飼料中12％，18％）と非法が確立されており，品種を問わず利用が可能と繊維性炭水化物含量（飼料中39％，45％）の組みなっている。一方，尿量については筋肉量に依存合わせにより３処理区を設計した。合計３頭×３

して尿中に排泄されるクレアチニン量をもとにし処理区×５日間で合計45サンプルの一日尿を採取て，部分的に採取した尿（部分尿）から１日に排した。供試牛の外陰部に尿採取用の受け器とホー

泄された全尿量を推定することが可能である 。

スを装着し，自然排尿した尿をプラスチック製コ

これまでにさまざまな品種で研究が進んでおり，ンテナで回収した。コンテナ内に20％硫酸を加固有のクレアチニン排泄量が明らかにされている

え，尿はpH３以下を保つようにした。回収したが尿は重量を測定後，よく混合し，一部を冷凍庫で２），黒毛和種では研究例がなく部分尿から全２，３）保存した。残りの尿のうち一定割合で尿を取り５尿量を推定することができていない。
そこで，本研究では黒毛和種肥育牛を対象に，日目まで冷蔵庫で保管した。その後，５日間の尿１）尿中へのクレアチニン排泄量を明らかにし，を一定割合ずつ混合した後に冷凍庫で保存した。

部分尿から１日の全尿量を推定する方法を確立す

また，１回目の実験では４期目の最終５日間

ること，２）部分尿中のクレアチニンおよび窒素に，９時～13時および13時～17時の４時間間隔で濃度から１日の尿中窒素排泄量を推定する方法を尿を回収した（部分尿）。
2.2

確立することを目的とした。
２．方

尿中成分の分析

尿 中 に 含 ま れ る ク レ ア チ ニ ン は George et al法（2006）の方法に準じてHPLCにより分析した４）。

2 . 1 黒毛和種肥育牛における一日尿および部

尿はリン酸カリウム緩衝液を用いてpH6.5に調整した後，50倍に希釈したものを分析に供した。

分尿の回収
本研究は「産業動物の飼養及び保管に関する基HPLCの移動相はpH6.5に調整した200mMリン酸

準」（昭和62年総理府告示第22号）に基づき実施

カリウム緩衝液とし，流量は毎分1.0mlとした。

した。２回の実験により延べ125日分の一日尿を分析カラムはInertsil ODS-3（ジーエルサイエン回収した。１回目では黒毛和種の未経産雌牛４頭ス）を用い，カラムオーブンは25℃とした。検出© The Ito Foundation

442

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

35

Creatinine excretion（mg/kg BW/d）

30
25
20
15
10
5
0
Fig. 1 Daily creatinine excretion in Japanese black cattle.

Each bar indicates daily creatinine excretion（n＝125）,and horizontal dotted line indicates the mean（24.8±2.6mg/
kgBW/d）.

は220nmの吸光度を測定した。また，尿中に含ま大きく変動する条件下においても，黒毛和種のクれる窒素はケルダール法により測定した。

レアチニン排泄量としては飼料中の栄養素含量により影響を受けないことが明らかとなった。ま

３．結果と考察た，クレアチニン排泄量は日にちにより影響を受Fig.１に７頭の黒毛和種雌牛から採取した延べけなかったことから，本研究で行った連続５日間

125日分の尿を対象に測定したクレアチニン排泄のような短期間であれば，クレアチニンは安定し量を示した。本研究で得られたクレアチニン排泄た 量 で 排 泄 さ れ る こ と が 確 認 さ れ た 。一 方 ，

量は１日当たり平均で24.8±2.6mg/kg体重（最小Chizzotti et al（2008）では，ホルスタイン種の17.0～最大29.8mg/kg体重）であった。クレアチ

未経産雌牛において体重が100～500kgと幅広い

ニン排泄量に対する要因の解析を行った結果，飼牛群で調査した結果，体重１kg当たりのクレア

料や日にちによる影響は認められなかった（p＞

チニン排泄量は体重と明瞭な負の相関を示すこと

0.05）。ホルスタイン種の泌乳牛を対象にしたいを報告している３）。これは牛の成長に伴い体重当

くつかの先行研究では，給与飼料中の粗タンパク

たりの筋肉量が相対的に減少したことで，クレア

質含量や非繊維性炭水化物含量によりクレアチニ

チニン排泄量も減少していったことを示唆していン排泄量は影響を受けないことが示されておる。黒毛和種では他の品種と比べ脂肪の蓄積能力り，これらの先行研究は本研究で得られた黒が高く，肥育過程では筋肉内の脂肪量も増えてい毛和種での結果を支持している。なお，本研究でくことから７），体重当たりの筋肉量が相対的に変対象とした125日分の尿では，１日当たりの尿量化すれば，クレアチニン排泄量も変化することがが3.3～27.6Ｌ（平均10.4Ｌ）と広い範囲に及んで予想される。本研究では肥育中期にあたる牛からおり，特に給与飼料により有意に影響を受けてい得た結果であるため，異なる肥育段階の黒毛和種た（ｐ＜0.01）。本研究では２回の実験ともに給においてクレアチニン排泄量を明らかにすること

与飼料中の粗タンパク質含量が異なる２水準で設が必要と考えられる。また，本研究で供試した７計しており，高タンパク質飼料を与えた処理区で頭に対して個体ごとの平均排泄量を算出すると最は尿量が高まっていた。これらのことから尿量が小 値 22.6mg/kg 体 重～ 最 大 27.2mg/kg 体 重 で あ

５，６）© The Ito Foundation

443

黒毛和種肥育牛の部分尿による尿中窒素排泄量の推定方法の確立
Table 1 Published data of daily creatinine excretion in cattle.

Daily creatinine
Studies

Breed

Sex

Number of animals

excretion（mg/kgBW/d）

Chizotti et al. 2008３）

Holstein

bull

4

28.1

Chizotti et al. 2008
Leal et al. 2007９）
Whittet et al. 2019 10）

Hosltein
Hoslteinheiferheifer22
11

26.5-30.3
30.5

crossbredheifer, cow

21

28.6

Whittet et al. 2019crossbredheifer18

28.1

Whittet et al. 2019crossbred

cow

6

27.7

Whittet et al. 2019
Whittet et al. 2019crossbredcrossbredheiferheifer

9
7

30.5
26.2

Japanese black

heifer7

24.8

This study
BW; body weight

り，個体間で変動が認められた。クレアチニン排和種が他の品種と比べて脂肪の蓄積量が多く，相泄量は尿量を推定するマーカーとして広く使われ

対的に体重当たりの筋肉量が少ないことでクレアているが，個体間でクレアチニン排泄量が変動す

チニン排泄量が低値を示したことが推察される

ることはホルスタイン種での先行研究においてもが，品種間でのクレアチニン排泄量の比較を明確報告されているに行うためには，今後より詳細な検討が必要であ。本研究では17～22か月齢の２，３）

黒毛和種を対象としたが，この時期は黒毛和種でる。

は筋肉内の脂肪含量が直線的，あるいは曲線的に

続 い て ，上 記 で 求 め た ク レ ア チ ニ ン 排 泄 量増加する時期である７）。本研究においても個体間24.8mg/kg体重を用いて，部分尿からの尿中窒素で体組織の発育程度に差が生じていたことが予想

排泄量の推定を行った。Fig.２に５日間の全尿をされ，その結果，体重当たりの筋肉量が異なった

回収して実測した１日当たりの尿中窒素排泄量ことでクレアチニン排泄量の変動に影響した可能と，同期間にて９～13時と13～17時の各時間帯で性が考えられた。

採取した部分尿により推定した尿中窒素排泄量をTable１に牛のクレアチニン排泄量について今示した。実測した尿中窒素排泄量は４頭の間で67回明らかになった黒毛和種と他の品種で報告され～143ｇと個体により広く分布したが，部分尿かている値を示した。牛を対象にしたクレアチニン

ら推定した尿中窒素排泄量も同様の傾向を示し排泄量に関する研究では，泌乳牛の研究例が多い

た。推定精度の指標として，実測値に対する推定が，本研究では肉牛を対象にしているため，泌乳

値と実測値の差の割合を算出すると，９～13時でしていない牛を対象に調べた研究例を列挙した。

4.8％となり，実用的にも十分な精度と考えられ限定的な比較ではあるが，ホルスタイン種や交雑た。一方，13～17時では13.9％であり，実測値と種（アンガス種，ヘレフォード種など）では体重の差は比較的大きくなった。Table２に全尿と部１kg当たりおおむね26～30mgと報告されていた

分尿中のクレアチニン濃度，窒素濃度を示した。

のに対して，本研究は比較的低い値を示した。ク

また，全尿については実測した尿量および尿中窒レアチニンは，筋肉中のクレアチンリン酸から素排泄量を，部分尿についてはそれらの推定値を

ATPを産生する際に生じ，尿中へ排泄されるた示した。統計解析上の有意差は認められないもの

め ，その排泄量は主に筋肉量に依存する。黒毛の，尿中クレアチニン濃度が13～17時の各時間帯

８）© The Ito Foundation

444

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）
Ⅱ

180
160
140
120
100
80
60
40
20
0

180

Urinary N excretion（g/d）

Urinary N excretion
（g/d）

Ⅰ

令和２年度

A

B

Animal

C

160
140
120
100
80
60
40
20
0

D

A

B

C

D

AnimalFig. 2 Daily urinary N excretion in Japanese black cattle.

I, II ; estimated from urine collected at 9-13h and 13-17h, respectively.
White and black bars indicate observed values and estimated values in each animal, respectively.

Table 2 Creatinine and N concentration in urine, urine volume and urinary N excretion determined from total collectionor spot sampling.

Spot collection

Total collection
Urinary Creatinine（mg/dL）
Urinary N（mg/dL）
Urine volume（L/d）
Urinary N excretion（g/d）

174
1241
8.05
98a

SEM

p-value

160
1307
8.65

11
44
0.28

0.30
0.44
0.19

112b

3

0.03

9-13

13-17

186
1320
7.87
102a

a, b：Means in rows with different superscripts indicate significantly different.

で９～13時と比べて低かったことで，推定尿量は中のクレアチニンや窒素濃度が変化する可能性も数値上高くなっていた。一方で，尿中窒素濃度にあり，今後は例数を増やして検証することが必要

ついては両時間帯で差は比較的小さかったことかである。

ら，推定された尿中窒素排泄量は13～17時の各時間帯で高い値を示した。このように採尿した時間

４．要約

帯により推定窒素排泄量が異なる原因として，牛本研究では，黒毛和種肥育牛において１日当たの尿中のクレアチニン濃度と窒素濃度の比率が一りの尿中窒素排泄量を，４時間で採取した部分尿様ではないことが考えられる。尿中のクレアチニから推定する方法を示した。部分尿から１日の尿ンと窒素濃度の比率は日内で変動が小さく安定し量を推定するための指標として，黒毛和種肥育牛ているという報告がある一方で11，12），それらの比のクレアチニン排泄量が24.8mg/kg体重であるこ率は日内で変動するとの報告もあり ，研究事例とを明らかにした。この結果より，１日当たりのにより一定ではない。本試験の結果からは，全尿尿中窒素排泄量は，回収の代替手段として部分尿を採取する場合，９尿中窒素排泄量（mg/日）＝24.8（mg/kg体重）×体～13時の尿で精度が高かったが，この回収時間は

重（kg）／部分尿中のクレアチニン濃度（mg/dL）

飼養状況（飼料の給与方法や時間など）により尿×部分尿中の窒素濃度（mg/dL）

13）© The Ito Foundation

黒毛和種肥育牛の部分尿による尿中窒素排泄量の推定方法の確立

により求まることを示した。また，日中の時間帯
として９～13時に５日間連続で採取した尿から推定した尿中窒素排泄量は実測値と平均５％以内の差であり，実用的にも十分な精度であった。ただし，尿量を推定するためのクレアチニン排泄量は肥育段階でも異なる可能性があり，また精度の高い採取時間は飼養状況により異なる可能性もある
ことから，さらに例数を増やして検証することが必要である。
文献１） 家畜改良センター（2020） 改良部情報分析課
枝 肉 成 績 ま と め 概 要 http://www.nlbc.go.jp/
kachikukairyo/data/pr/edadbgaiyou_r01.pdf
２） Lee, C., Morris, D. L. , Dieter, P. A. : J Dairy Sci,
102, 236～245, 2019.
３） Chizzotti, M. L., Valadares Filho, S. C., Valadares,
R. F. D., Chizzotti, F. H. M., Tedeschi, L. O. : Livest
Sci, 113, 218～225, 2008.
４） George, S. K., Dipu, M. T., Mehra, U. R., Singh, P.,

445

Verma, A. K., Ramgaokar, J. S. : J Chromato B, 832,
134～137, 2006.
５）
 Valadares, R. F. D., Broderick, G. A., Valadares
Filho, S. C., Clayton, M. K. : J Dairy Sci, 82, 2686～
2696, 1999.
６）
 Moorby, J. M., Dewhurst, R. J., Evans, R. T.,
Danelon, J. L. : J Dairy Sci, 89, 3552～3562, 2006.
７） 山崎敏雄：草地試験場研究報告, 18, 69～77, 1981.
８） 岡田秦信ら：医科生理学展望，原書20版 p310311, 2002.
９）
 Leal, T. L., Valadares, R. F. D., Valadares Filho, S.
C., Leão, M. I., Detmann, E., Barbosa, A. M.,
Chizzotti, M. L., Paixão, M. L. : R Bras Zootec, 36,905～911, 2007.
10）
 Whittet, K. M., Watson, A. K., Erickson, G. E.,
Klopfenstein, T. J. : Transl Anim Sci, 3, 532～540,
2019.
11）
 Albin, R. C., Clanton, D. C. : J Dairy Sci, 25, 107～
112, 1966.
12） 田村哲生，井上和典，篠原晃，古賀照章：日本畜産学会報, 78, 311～316, 2007.
13）
 Silva Júnior, J. M., Rennó, L. N., Valadares Filho, S.
C., Paulino, M. F., Detmann, E., Menezes, G. C. C.,
Martins, T. S., Paula, R. M., Rodrigues, J. P. P.,
Marcondes, M. I. : Livest Sci, 217, 85～91, 2018.

© The Ito Foundation

446

ビタミンＡ投与が黒毛和種子牛の骨格筋成長に与える
影響
Effects of administration of vitamin A on skeletal muscle growth inJapanese black calves

二瓶

直浩１・佐藤祐介２・湯澤裕史１・川田智弘１（１栃木県畜産酪農研究センター，２宇都宮大学）

Naohiro Nihei１, Yusuke Sato２, Hiroshi Yuzawa１ and Tomohiro Kawada１（１Tochigi Pref. dairy & livestock experimental research center, ２Utsunomiya University）

The number of reports on the effects of vitamin A（VA）administration in Japanese Black
calves is small, and there are no reports especially focusing on skeletal muscle growth.
Therefore, in this study, we administrated VA intramuscularly to Japanese Black calves, andthe effects on skeletal muscle growth and blood components were examined. 10 Japanese black
cattle were donated and divided into control group（n=5）and administration group（n=5）.
After separation of the dam at 7 d, feeding was performed by the feeding robot until 90 d. VA（150,000IU）was intramuscularly administered at 7 and 30 d in the administration group.
Cattle’s physical measurement, blood sampling, and ultrasonic skeletal muscle（biceps femoris）
diagnosis were performed over time. At 90 d, skeletal muscle（biceps femoris）samples werecollected by biopsy needles to examine skeletal muscle related mRNA expression. Ultrasoundskeletal muscle diagnosis showed administration group was significantly thicker than control
group, but no significant difference was observed in body weight and other physicalmeasurements. In addition, there was no significant difference in the expression of skeletal
muscle-related mRNA at 90 d. According to the results, it was suggested that the VA
intramuscular administration effect on skeletal muscle growth of Japanese Black calves, but it
was considered that constant VA administration is necessary to maintain the skeletal muscle
development.

１．目

分化に重要な役割を担っている。

的

和牛肥育では，筋肉内の脂肪交雑の発達を重要

ビタミンＡ（VA）は哺乳類において必須の栄視することから，VAを抑制し脂肪交雑の発達を養素であり，成長・発達に重要な役割を担ってい促進する飼養管理が一般的である。しかし，VAる。VAの生理活性は核内受容体のレチノイン酸

は肥育牛のIGF-1（Insulin-like growth factor-1）受容体（RAR）を介して行われており，RARは代謝に関与し，増体の向上に影響を及ぼすことがレチノイドＸ受容体（RXR）とヘテロ二量体を報告されており１），VAの給与制限は欠乏症など形成し対象遺伝子の転写制御を行い，筋細胞等のの発生とともに生産性への弊害が懸念される。近© The Ito Foundation

ビタミンＡ投与が黒毛和種子牛の骨格筋成長に与える影響

447

年の報告で，アンガス種の子牛へVAを投与する

2.2と，筋衛星細胞の活性化を介して骨格筋量が増加

経時的に供試牛の頸静脈からヘパリン加真空採する２）との報告があり，VAを投与することで哺血管を用いて採血し，ただちに3,000rpm，４℃

乳期および育成期における筋肉の増大が期待でき下で10分間遠心し，血漿を測定まで－30℃で保存ると考えられる。しかし，先行研究では，アンガした。血漿中の総タンパク質，総コレステロール

ス種などの外国種を対象とした研究であり，脂肪（T-Cho），血中尿素窒素，トリグリセロール，ア

蓄積能力などが異なる黒毛和種において，新生期

ルブミン，AST，HDL-C，グロブリンは，臨床のVA投与が同様の作用をするかは不明である。

化学分析装置（富士フイルム（株））により分析

そこで本研究では，和牛経営における収益性をした。また，血漿中レチノール濃度は高速液体ク

改善する観点から，多様な牛肉生産需要に対応し血液成分分析

ロマトグラフィー法により分析した。

た肥育素牛の生産技術を確立するための一環とし

2.3て，黒毛和種子牛の初期発育に着目し，哺乳期の30，60，90日齢の供試牛を診断に用いた。第黒毛和種子牛にVAを投与して筋肉組織の発達へ

６-７肋間部位における胸最長筋断面積を推定すの影響を分析することで，子牛の筋肉発達に対するため，供試牛を正姿勢で直立させ，肩甲骨後部

るVAの作用について検証を行うことを目的としに正中線と直角になるようプローブを当て，超音た。

波画像を取得した。また，大腿二頭筋を診断する

２．方
2.1

超音波による骨格筋診断ため，左後肢の座骨端から飛節までの長さを測定

法

し，中心部を測定部位とし，正中線に平行となる
ようにプローブを当て，超音波画像の取得を実施

供試牛および処理

栃木県畜産酪農研究センターで生産された黒毛した。この診断には動物用超音波画像診断装置

和種子牛10頭を供した。供試牛は７週齢で母子分（MyLabTMOne Vet, Esaote Europe B.V.）お よ び

離した後，90日齢まで群飼とし，哺乳ロボットにリ ニ ア 型 プ ロ ー ブ（SV3513Vet, Esaote Europe

よる人工哺乳を行った。このとき最大1,280ｇ/日

B.V.）（繁殖性等向上対策事業：農林水産省の繁給与する設定とし，代用乳は保証成分可消化養分

殖性等の向上対策事業により公益社団法人畜産技

総量105％以上，粗タンパク質28％以上のものを術協会から貸付）を用い，得られた画像は画像解使用した。試験期間中，人工乳は現物3.0kg/日を析フリーソフトImageJ３）により胸最長筋断面積

上限として給与し，チモシー乾草は飽食，自由飲

および大腿二頭筋の厚さを測定した。

水とした。

2.4

骨格筋関連遺伝子発現

供試牛10頭を母牛の産歴，生時体重，雌雄，父

90日齢の供試牛を超音波診断時と同様に正姿勢の血統を考慮し５頭ずつ，対照群および試験群にで直立させ，左後肢の座骨端から飛節までの長さ

分 け た 。 試 験 群 は ７ 日 齢 お よ び 30 日 齢 にを測定し中心部を剃毛した。その後，セラクター

150,000IUのビタミンＡ（チョコラＡ筋注，エール（エランコジャパン（株））により鎮静をかけ，

ザイ）を筋肉内注射により投与した。

筋生検部位を消毒した後，動物用塩プロ注「KS」

なお，本研究は栃木県畜産酪農研究センター動（共立製薬（株））により局部麻酔をし，メスを用物実験規程に基づき，動物福祉に配慮して実施しいて大腿二頭筋の筋膜まで切開した。切開した部た。

位に対し垂直となるように14Ｇの生検針（（株）© The Ito Foundation

448

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

タスク）を挿入し，大腿二頭筋サンプルを得た。

また，遺伝子発現については線型モデルによる分得られた骨格筋サンプルは液体窒素下で凍結し，散分析後，Student’s t検定により有意差検定を解析まで－80℃で保存した。

行った。有意水準は p ＜0.05とし，0.05≦ p ＜0.1

骨 格 筋 サ ン プ ル は TRIzol （Thermo Fisher
Sientific）によりトータルRNAを抽出し，iScript

TMを傾向ありとし，結果は最小二乗平均値±標準誤差で表記した。

Reverse Transcription Supermix （Bio-Rad） に

３．結果と考察

よ り 逆 転 写 し た 。PCR 反 応 試 薬 に は Universal
SYBR Green Supermix（Bio-Rad）を 用 い て 定

3 . 1 ビタミンＡ投与が子牛の発育値に及ぼす量PCRを実施した。なお，GAPDHを内部標準と影響し，相対的定量解析を行った。
2.5

供試牛の発育値についてTable１に示した。試統計処理

験終了（90日齢）時の体重は，非投与群110.5±

体測値，血液成分値，超音波診断値については，

3.4kg，投与群116.2±3.4kgであり，投与群が大き各項目を応答変数，群および日齢，雌雄を固定効

い値を示したものの有意な差は認められなかっ果，子牛をランダム効果とした混合モデル分析にた。また，他の発育値（体高，胸囲，腹囲，日増よる分散分析を行った後，Tukey法による有意差体量）についても同様の結果となり，投与群が高検定を行った。これらの統計解析は統計フリーソ

値を示す日齢も見られたが，有意な差は認められ

フトＲ（version 4.0.3）のlme4およびlmerTest，なかった（Table１）。この両群の体重は日本飼養

emmeans，pbkrtestのパッケージを使用した。

標準４）の発育標準値を超しており，発育が良好でTable 1 Effects of administration of vitamin A on physical measurements in Japanese black cattle

Body weightDay 0

ControlVA

p-valuekg

29.7±3.450.0±3.479.2±3.4
110.5±3.433.8±3.4
57.9±3.4
86.3±3.4
116.2±3.4

0.984
0.700
0.803
0.916

cm

70.8±1.377.0±1.385.6±1.3
92.3±1.372.8±1.3
80.1±1.3
88.5±1.3
95.3±1.3

0.937
0.667
0.749
0.714

cm

70.0±1.773.0±1.70.890

82.4±1.7
96.0±1.7
105.8±1.7

86.4±1.7
100.0±1.7109.6±1.7

0.681
0.681
0.729

cm

69.5±1.986.3±1.9
106.7±1.9125.3±1.9

71.7±1.990.7±1.9
110.9±1.9127.7±1.9

0.989
0.708
0.751
0.982

kg/day   0.67±0.07   0.80±0.07

0.751   1.00±0.07   1.08±0.07   0.97±0.07   1.03±0.07

0.999
0.996

Day 30Day 60Day 90HeightDay 0
Day 30Day 60Day 90

Chest circumference

Day 0
Day 30Day 60Day 90Abdominal circumference

Day 0
Day 30Day 60Day 90Daily gain

Day 0-30
Day 31-60
Day 61-90

Lsmean±SE
Control group（n=5）,VA；Vitamin A injection group（n=5）© The Ito Foundation

449

ビタミンＡ投与が黒毛和種子牛の骨格筋成長に与える影響あった。TDNやCPの摂取量は子牛の体重といっしていた。そのため，両群は良好な発育を示し，た発育にとって重要な要素であると考えられる。

群間での差が見られなかったと考えられる。

本研究では哺乳ロボットを用いた代用乳多給の人

3 . 2 ビタミンＡ投与が子牛の血液成分値に及工哺乳であり，代用乳によるTDN，CP給与量はぼす影響

日本飼養標準における養分量の大きい割合を満た

供試牛の血液成分値についてTable２に示した。

Table 2 Effects of administration of vitamin A on blood plasma components in Japanese black cattle

Total Protein

ControlVA

p-value5.34±032

5.50±032

1.000

Day 305.28±032

5.18±032

1.000

Day 605.56±032

5.60±032

1.000

Day 906.20±032

6.22±032

0.999

Day 0

g/dL

Albumin

Day 0
Day 30Day 60Day 90g/dL

2.04±0.08
2.66±0.08
2.94±0.08
2.96±0.08

2.18±0.08
2.62±0.08
3.04±0.08
3.00±0.08

0.896
1.000
0.980
1.000

Globulin

Day 0
Day 30Day 60Day 90g/dL

3.30±0.28
2.62±0.28
2.62±0.28
3.06±0.28

3.32±0.28
2.56±0.28
2.56±0.28
3.22±0.28

1.000
1.000
1.000
1.000

Blood Urea Nitrogen

Day 0
Day 30Day 60Day 90mg/dL

11.5±1.0
13.8±1.0
12.2±1.0
13.8±1.0

8.9±1.0
11.26±1.0
12.1±1.0
12.4±1.0

0.629
0.655
1.000
0.979

Triglyceride

Day 0
Day 30Day 60Day 90mg/dL

15.7±4.8
20.7±4.815.2±4.8
13.9±4.8

20.3±4.8
20.1±4.8
24.6±4.8
10.4±4.8

0.997
1.000
0.858
1.000

Total Cholesterol

Day 0
Day 30mg/dL

28.1±7.6
110.7±7.6a

Day 60Day 90
HDL-C

157.2±7.6
74.8±7.6

Day 0
Day 90

mg/dL

AST

Day 0
Day 30Day 60Day 90Retinol

Day 029.2±7.6

1.000

162.1±7.6b
179.1±7.6102.8±7.6

＜0.01
0.474
0.188

18.6±3.673.0±3.6a

19.4±3.60.997

96.8±3.6b

＜0.01

U/L

58.6±8.2
43.4±8.2
55.0±8.2
77.6±8.2

69.0±8.2
46.4±8.2
55.4±8.2
90.4±8.2

0.984
1.000
1.000
0.951

IU/dL

24.0±5.1

25.1±5.1

1.000

40.4±5.1
26.1±5.1
46.8±5.1
39.4±5.1
36.6±5.1
41.2±5.164.9±5.1

40.0±5.1
27.2±5.1
46.1±5.1
41.5±5138.6±5.143.9±5.1
61.0±5.1

1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000

Day 7
Day 15
Day 30Day 45
Day 60Day 75
Day 90Lsmean±SE
Control group（n=5）,VA；Vitamin A injection group（n=5）

a, b values with different superscript letters are significantly different（ p <0.01）© The Ito Foundation

450

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

30日齢における投与群のT-Choは162.1±7.6mg/

3 . 3 ビタミンＡ投与が子牛の骨格筋発達に及dLとなり，非投与群110.7±7.6mg/dLよりも有意ぼす影響に高値となった（ p ＜0.01）。また，90日齢のHDL

供試牛における骨格筋の超音波診断値についても同様に投与群で有意に高い値となった（ p ＜Fig.１に示した。超音波による左後肢の大腿二頭0.01）。一方，その他の一般血液成分値については，筋の厚さの診断では，30，60日齢で投与群が非投

各日齢において群間での有意な差は認められな与群より大きい値を示したが，90日齢では有意なかった。さらに，血漿レチノール濃度も各日齢に差は見られなくなった。一方，第６-７肋間の胸おいて群間での差は認められなかった。先行研

最長筋断面積は各日齢群間で有意な差は認められ究において，VA剤を投与するとコレステローなかった。筋肉部位間で異なった結果であったこ

ルが高値を示すが，血漿VA濃度とコレステローとから，VAの感受性が筋肉部位により異なるこ

ル値との間に相関は見られなかったことが報告さとが示唆された。筋肥大には筋組織幹細胞である

れており，今回の結果と一致していた。なお，発筋衛星細胞が不可欠である。筋衛星細胞は増殖し育期におけるVAの過剰な投与は骨格の発育異常て筋芽細胞へ分化し，互いに融合することで筋管をきたすハイエナ病を引き起こすことが報告されへとなり，最終的に新しい筋線維へと分化成長すており６～８），本研究においても骨格の発育異常等ることで筋肥大が生じることが知られている。

の発生が危惧されたが，VAを投与した群においIGF-１は主に肝臓より分泌され，骨格筋の筋衛て異常は見られなかった。これまでの報告で，ハ星細胞の増殖に関与することが報告されていイエナ病は若齢時に高単位のVAを連続的に投与る９）。VAを欠乏した黒毛和牛では血中IGF-1濃されたことにより発症するとされているが，本研

度が低いことが報告されており 10），VAはIGF-1

究では，VA投与を７日齢と30日齢の２回とし，濃度に関与していることが示唆される。また，筋かつ間隔を開けて投与しており，投与したVAの衛星細胞は遅筋型の筋線維に多いことが知られて作用は一過性であったと思われ，本研究の方法ど

おり，さらに黒毛和種育成牛の大腿二頭筋は胸最おり哺育中にVA（150,000IU）を２回筋肉投与し長筋よりも遅筋型の割合が多いことが報告されててもハイエナ病を誘発しないと考えられる。

いる11）。これらのことから，今回の大腿二頭筋の

５）

A

B
5

10
5
0

Control
Day 30Day 60Age

VA
Day 90Thickness of bicep
femoris（cm）

Longissimus muscle
area（cm2）

15

4.5
4

＊
＊

3.5
3

Control

2.5
2

Day 30Day 60Age

VA

Day 90Fig. 1 Diagnosis of longiessimus muscle area and thickness of bicep femoris by ultrasound. A：longiessimus muscle

area（cm２）, B：thickness of bicep femoris（cm）, Control group（n=5）, VA：vitamin A injection group（n=5）, The
bar graph with an error bar indicates the lsmean value and standard error. ＊：p＜0.05（Control vs VA）© The Ito Foundation

451

ビタミンＡ投与が黒毛和種子牛の骨格筋成長に与える影響

Relative expression GAPDH(Fold change)3
2.5
Control

2

VA

1.5
1
0.5
0

RARα

PAX7

MYOD

MYOG

MSTN

Fig. 2 Effects of administration of vitamin A on mRNA expression in Japanese black cattle.

RARα：retinoic acid receptor alpha, MSTN：myostatin, Control group（n=5）, VA：vitamin A injection group（n=5）, Values are shown as relative values of GAPDH. The bar graph with an error bar indicates the lsmeanvalue and standard error.

発達における機序の１つとしてIGF-1の関与が考
えられた。

４．要

約

90日齢の供試牛の大腿二頭筋における骨格筋関

黒毛和種哺乳子牛におけるビタミンＡ（VA）

連遺伝子（RARα，PAX7，MYOD，MYOG，投与効果の報告は少なく，特に骨格筋発達に着目

MSTN）の発現について有意な差は今回認めらした報告は見られない。そこで，黒毛和種哺乳子れなかった（Fig.２）。ビタミンＡの代謝産物で牛にVAを筋肉内投与し，骨格筋発達および血液あるレチノイン酸は筋細胞のPax3やMyoDを含ん成分に及ぼす影響を検証した。黒毛和種子牛10頭だシグナル伝達を行っている 。先行研究 では，を供し，VA非投与群５頭と投与群５頭に分けた。

アンガス種子牛へのVA投与により，MYF5，

両群ともに７日齢で母子分離した後，90日齢まで

MYOD，MYOGの遺伝子発現が高くなることが哺乳ロボットによる哺乳を行い，投与群は７日齢報告されていることから，品種間でのVAに対すおよび30日齢にVAを筋肉内投与した。経時的にる感受性が異なると考えられる。

体測および採血，超音波による骨格筋の診断を実

12）

3.4

２）

施し，90日齢には大腿二頭筋から筋サンプルを採今後の展望

本研究において黒毛和種子牛の大腿二頭筋は取し，骨格筋関連遺伝子発現について調べた。そ

VA投与により厚みが増す可能性が示唆されたの結果，体重等の体測値について有意な差は認めが，試験終了時（90日齢）では群間の差が見られられなかった。また，90日齢における骨格筋関連なくなった。本研究ではVA投与が７日齢および遺伝子の発現に有意な差は見られなかったが，超30日齢であり，試験終了時まで60日間の間が空い

音波診断によって投与群の大腿二頭筋が有意に厚ていたことが要因として考えられる。適切なVA

いことが観察された。これらのことから，黒毛和の投与量および投与方法，投与時期について模索

種子牛へのVA投与は骨格筋の発達に寄与する可することで，より初期発育に富む素牛生産が可能

能性が示唆され，この効果を維持するためには継となることが期待される。

続的なVA投与や投与量の検討が必要であると考© The Ito Foundation

452

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

えられた。
文
献
１） Akio Oka, Taiji Dohgo, Masakatsu Juen,
Takemitsu Saito：Animal Science Technology, 69,
90～99, 1998.
２） Bo Wang, Wei Nie, Xing Fu, Jeanene M de Avila,
Yannan Ma, Mei-Jun Zhu, Martin Maquivar, Steven
M Parish, Jan R Busboom, Mark L Nelson, Min Du：
Journal of Animal Science and Biotechnology, 9, 82,
2018.
３） Caroline A. Schneider, Wayne S. Rasband, Kevin
W. Eliceiri：Nat Methods, 9, 671～675, 2012.
４） 日本飼養標準・肉用牛，2008年版，51～63，社団
法人中央畜産会，東京，2009.
５） T. W. Knight,A. F. Death：Animal Science, 69,
607～612, 1999.

６） 高木久：東北家畜臨床研究会誌, 19, 74～86, 1996.
７） 高木久，藤田茂，佐藤えれ子，岡田幸助，内藤善久：東北家畜臨床研究会誌, 16, 22～28, 1993.
８） 加藤伸悦，佐々木和夫，佐々木良悦，阿部博行，
山田稲生，伊藤敦：日本獣医師会雑誌, 45, 555～558,
1992.
９）
 Shuichi Machida, Frank W. Booth：Proceedingsof the Nutrition Society, 63, 337～340, 2004.
10）
 石橋瑞穂，牛之浜寛治，上村俊一，浜名克：日本獣医師会雑誌, 52, 427～430, 199911）
 Takafumi Ggotoh：Animal Science Journal, 74,
339～354, 2003.
12）
 Reijntjes, S., Francis-West, P., Mankoo, B. S.：The
International journal of developmental biology, 54,
125～134, 2010.

© The Ito Foundation

453

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用
交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響
Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed fermented
loquat leaf tea on development and meat quality of Tsushima-Jidori
crossbred chicken for meat

深

川

聡・松

永

将

伍

（長崎県農林技術開発センター）

Satoru Fukagawa and Shogo Matsunaga（Nagasaki Agricultural and Forestry Technical Development Center）

This study demonstrated the use of residues of fermented loquat tea leaves, a heretofore
unused resource, as feed. We investigated the residue effects on meat development and quality
in meat-type cross chickens of a native variety：Tsushima-Jidori. Results show that theresidues of fermented loquat tea leaves contained significantly less（ p ＜ 0.01）β-carotene,
α-tocopherol, and total catechin than residues of green tea leaf infusion, although total
polyphenol was significantly higher（ p ＜ 0.01）and DPPH radical-scavenging activity tended
to be significantly higher（ p ＜ 0.10）, indicating high antioxidant properties. When meat-type
Tsushima-Jidori crossbred chickens were fed on a diet supplemented with 1.0％ of residues offermented loquat tea leaves for 4 weeks of the finisher period, the α-tocopherol content in thebreast muscle was higher. An increase in the K value, which is an indicator of meat freshness,
was suppressed. Drip loss was less than that of the control group without supplementation
with residues of fermented loquat tea leaves, demonstrating that effects meat quality
improvement can be expected.

１．目

方，ビワ葉混合発酵茶は，長崎県農林技術開発セ的ンターが中心となって，「産・学・官」連携で開

長崎県で入手可能な低・未利用資源の中で，緑発した商品で，ヒトにおいて食後の血糖上昇の抑

茶製造残渣（緑茶粕）は，比較的抗酸化活性が高制や血中の中性脂肪濃度減少などの効果３）や内臓い１）ことが明らかになっており，暑熱期におい脂肪低減効果４）が報告されている。工場から製造て，飼料中に３％添加して給与することで，緑茶される過程で篩を通らないものが加工残渣（ビワ粕を添加していない飼料を給与した場合と比べ

葉混合発酵茶製造加工残渣）として排出される。

て，保水性の高い豚肉 やハウユニット値の高い

このビワ葉混合発酵茶製造加工残渣は乾燥されて卵 を生産できる可能性がある。しかし，緑茶粕

いるため，取り扱いが容易であるものの，産業廃は高水分であるため，配合飼料に混合するために棄物として処理されており，飼料としてほとんどは乾燥させて水分を低下させる必要がある。一利用された実績がない。

１）

２）© The Ito Foundation

454

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

そこで，未利用資源であるビワ葉混合発酵茶製

雄120羽を用い，餌付けから試験終了まで長崎県

造加工残渣の一般成分や機能性成分を緑茶粕と比農林技術開発センター内のウインドレス鶏舎で平較調査するとともに，仕上げ期の対馬地鶏肉用交飼いとした。試験期間は2020年９月30日～10月27

雑鶏にビワ葉混合発酵茶製造加工残渣を添加した日（９週齢から12週齢）までの４週間とし，ビワ

飼料を給与し，発育成績および肉質に及ぼす影響

葉混合発酵茶製造加工残渣を配合飼料

を明らかにすることを本研究の目的とした。

（CP16.5％，ME2,990kcal）に重量比１％を出荷

２．方
2.1

前４週間の仕上げ飼料として給与するビワ葉混合法

発酵茶区と配合飼料のみを給与する対照区との２区を設け，１区20羽の各区３反復の乱塊法に配置

飼料分析

ビワ葉発酵茶製造加工残渣は，乾燥・粉砕されした。

ているものをそのまま使用し，緑茶粕は80℃で482.3

時間通風乾燥して，１mmの篩を通るように粉砕

試験期間中（９週齢～12週齢）における発育成

し，各分析項目とも３点ずつ分析した。分析項目

績（試験開始時体重，試験終了時体重，飼料摂取は，一般成分と機能性成分とし，機能性成分では量，飼料要求率，増体量，生存率および生産指数）

βカロテン含量，α-トコフェロール含量，総ポを調査した。解体調査は13週齢の体重が区の平均

リフェノール含量，総カテキン含量（エピカテキ

値に比較的近い４羽を選び，18時間絶食させた

ン，エピガロカテキン，エピカテキンガレードお後，と体を解体して，正肉重量（ムネ，モモ，サ

よびエピガロカテキンガレードの合計値）およびサミ），組織重量（心臓，肝臓，筋胃，および腹DPPHラジカル消去活性を調査した。βカロテン

腔内脂肪量）および色差計を用いて浅胸筋の肉色

含量およびα-トコフェロール含量は食品分析を測定した。肉質分析には解体後，５℃の冷蔵庫

法 ，総ポリフェノール含量は鈴木ら ，カテキで 24 時 間 静 置 し た 左 浅 胸 筋 を ４ cm × ２ cm ×

ン類は後藤

1.5cmに切り出して加熱損失率およびさらに24時

５）

６）

７）

およびDPPHラジカル消去活性は柚間冷蔵庫で静置した時のドリップロスを調査し木崎ら８）に各々準じて分析した。
2.2

発育成績，解体成績および肉質分析た。残った部位はプロセッサーを用いてミンチ状

供試動物および実験計画

動物実験は「実験動物の飼養及び保管並びに苦にし，α-トコフェロール含量，遊離アミノ酸組

痛の 軽 減 に 関 す る 基 準」（環境省2006）に則り成，核酸含量を調査した。TBARSは右浅胸筋を行った。

用い，解体してから24時間後をDay０として冷蔵本試験にビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の添加

保存期間をDay１，Day３およびDay５とし，肉割合を検討するために，対馬地鶏原種の雌に2020

片を切り出して分析に供した。加熱損失率は「食年８月13日～９月10日（18週齢～21週齢）までの肉の理化学分析及び官能評価マニュアル」（Ⅰ．

４週間，ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣を配合飼

理化学分析）９），ドリップロスは井尻ら 10），α-ト料（CP13.0 ％，ME2,850kcal）に ０ ％，0.25 ％，コフェロール含量はFaustman11），遊離アミノ酸

0.5％および1.0％を添加して給与し，1.0％までの組成はAzuma12），核酸含量は「食肉の理化学分析

水準でも増体や飼料摂取量に影響がないことを確及び官能評価マニュアル」（Ⅰ．理化学分析）９）お認した。

よ び TBARS は Ohkawa13） に 各 々 準 じ て 分 析 を2020年７月29日餌付けの対馬地鶏肉用交雑鶏の行 っ た 。な お ，ATP 関 連 化 合 物 含 量（ATP ，© The Ito Foundation

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響

455

ADP，AMP，IMP，InoおよびHyp）に占めるメーターの平均値の違いを示すために，平均値±

InoおよびHypの割合を求め，その合計値をＫ値

標準誤差（SE）で表示した。また，食味官能評として表した。

価の嗜好点は８段階の評価を１～８点に評点付け

2.4

食味官能評価し，評点を応答変数，提示順序および肉の種類を

ビワ葉混合発酵茶区および対照区の浅胸筋から固定効果，パネリストをランダム効果とした線形

３cm×1.5cm×1.0cm（筋繊維は３cmの方向に走混合モデル分散分析によって解析し，最小二乗平る）に切り出し，230℃に設定したホットプレー

均値±SEで表示した。

トで表裏それぞれ４分30秒調理して官能評価に供した。訓練されていない一般パネル31名に「味や３．結果と考察香り」，「食感」および「全体評価」の嗜好性を

3.1「非常に好ましい，とても好ましい，まあまあ好

一般成分および機能性成分の各含量をTable１

ましい，どちらかと言えば好ましい，どちらかとに示した。ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣は，緑言えば好ましくない，好ましくない，とても好ま茶粕と比べて，粗繊維含量に有意差はなかった

しくない，非常に好ましくない」の８段階で評価

が，粗タンパク質含量および粗脂肪含量が１％水させる評点法を実施した。

準で有意に低く，粗灰分含量が１％水準で有意に

2.5

統計処理

一般成分および機能性成分

高い値であった。蔡ら14）は，緑茶製造残渣の粗タ

飼料分析，発育成績，解体成績および肉質分析

ンパク質含量は乾物で27～28％と高く，良質な飼の調査項目は，ｔ検定により平均値の差の検定を料であることを報告している。今回，供試した緑行った。なお，百分率で表記した値はアークサイ

茶 粕（緑 茶 製 造 残 渣）の 粗 タ ン パ ク 質 含 量 はン変換後，ｔ検定を行った。飼料成分は標本デー

Table１に示したように34.5％と７ポイント程度高タから母集団の成分のバラツキを推定するためい値であったが，ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣に，平均値±不偏標準偏差（SD）で表示した。

の24.9％と比べるとほぼ同程度の値であり，ビワ

発育成績，解体成績および肉質については，ビワ

葉発酵茶製造加工残渣についても良質な飼料とな葉混合発酵茶製造加工残渣の給与による各パラる可能性が認められた。

Table 1 Chemical composition and functional ingredients in residues of fermented loquat and green tea infusions.
Fraction
Chemical composition

Functional ingredientsResidues of fermented
loquat tea leaves

CompoundResidues of green
tea leaves infusion

Crude protein（%DM）

24.9 ± 0.02 B1）

34.5 ± 1.35 A

Crude fiber（%DM）
Crude fat（%DM）
Crude ash（%DM）

15.1 ± 2.31 ns
2.59 ± 0.08 B
5.63 ± 0.12 A

17.7 ± 1.01 3）
5.20 ± 0.13 A
3.48 ± 0.08 B

α-tocopherol（µg/g）
β-carotene（µg/g）

4.33 ± 0.09 B
0.96 ± 0.04 B

13.1 ± 0.66 A
39.1 ± 1.71 A

Total catechins（mg/g）
Total polyphenol（mg/g）
DPPH radical-scavenging activity（µM TE 2）/g）

10.0 ± 1.58 B
209.1 ± 31.9 A
396.8 ± 22.2 α40.4 ± 1.85 A
113.1 ± 26.8 B
324.1 ± 41.4 β1） Values with different capital letters（A, B）and Greek alphabets（α, β）within the same row differ significantly at the
1% and 10% levels, respectively, by the Student t-test（ns：not significant）.
2） TE：Trolox Equivalent.
3） Means ± SD.

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456

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

βカロテン含量，α-トコフェロール含量およ

ノールのほとんどはカテキン類であるのに対しび総カテキン含量では，ビワ葉混合発酵茶製造加て，ビワ葉混合発酵茶ではカテキン類とカテキン

工残渣が緑茶粕に比べて１％水準で有意に低い値

類の酸化重合により生成される紅茶ポリフェノーであったが，抗酸化活性の指標となるDPPHラジルの両方を含み，他の茶では検出されない比較的

カル消去活性が10％水準で有意に高い傾向にあっ分子量の小さい高分子ポリフェノールを含んでいた。これは，総ポリフェノール含量において，ビるという特徴３）があるためと考えられた。

ワ葉混合発酵茶製造加工残渣が，緑茶粕よりも

3 . 2 発育成績，解体成績および肉質成績（加１％水準で有意に高い値であったことと関係して熱損失率およびTBARS）

いると考えられた。

ビワ葉混合発酵茶区および対照区の発育成績，

総カテキン含量では，ビワ葉混合発酵茶製造加解体成績および肉質成績をTable２に示した。試工残渣が緑茶粕よりも有意に低い値であったのに

験開始時体重，試験終了時体重，増体量，飼料摂も関わらず，総ポリフェノール含量では逆の傾向

取量，飼料要求率，生存率および生産指数のいずとなった。この理由として，緑茶粕のポリフェれの調査項目において，両区に有意差は認められTable2 Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed fermented loquat leaf tea

on growth performance parameters, weight and meat quality.

Measurements

Control

Examines

p-value

Growth performance parameters
Initial body weight（g）

2186.50 ± 6.22 1）

Final body weight（g）
Body weight gain（g）
Feed intake（g）
Feed conversion ratio
Survival rate
Production score

3327.83 ± 90.2
1141.33 ± 93.0
154.66 ± 6.32
3.67 ± 0.16
100 ± 0115.67 ± 14.06

2189.67 ± 5.53
3284.17 ± 15.7
1094.50 ± 11.8
150.71 ± 4.73
3.72 ± 0.10
100 ± 0109.08 ± 2.69

ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns

Weight of tissues
Breast muscle（g）
Breast tender muscle（g）
Leg muscle（g）
Liver（g）
Heart（g）
muscular stomach（g）
Abdominal fat tissue（g）

384.42 ± 6.84
101.72 ± 1.58
709.60 ± 6.31
16.17 ± 0.25
42.83 ± 1.21
39.32 ± 1.54
102.25 ± 8.10

389.02 ± 7.25
100.95 ± 2.51
717.14 ± 4.38
15.57 ± 0.25
43.96 ± 0.81
36.33 ± 1.09
93.25 ± 14.55

ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns

Color of breast muscles
L＊
a＊
b＊

49.45 ± 0.87
1.99 ± 0.38
10.60 ± 0.72

48.32 ± 0.99
1.79 ± 0.09
10.57 ± 0.21

ns
ns
ns

Cooking loss（%）

18.51 ± 0.36

18.27 ± 0.22

ns

TBARS（nmol/mg protein）
Day1
Day3
Day5

1.21 ± 0.38
1.43 ± 0.31
2.13 ± 0.82

1.06 ± 0.35
1.40 ± 0.30
2.56 ± 0.97

ns
ns
ns

Meat quality

1） Means±SE（ns：not significant）.

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457

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響なかった。佐々木および出口 15）は茶を粉砕して3 . 3 肉質成績（α-トコフェロール，Ｋ値お1.0 ％ 添 加 し た 飼 料 を 銘 柄 鶏 「伊 勢 赤 ど り」

よびドリップロス）（シェーバーロッド種）に11～16週齢まで給与す

ビワ葉混合発酵茶区および対照区の肉質成績

ると，茶を添加していない対照区と比べて，１％（α-トコフェロール含量，Ｋ値およびドリップロ

あるいは５％水準で有意に増体量が低下したことス）をFig.１に示した。ビワ葉混合発酵茶区は対を報告しており，茶に含まれるカテキン類が渋味

照区と比べて，浅胸筋において，肉の新鮮度を示を有するので，鶏の嗜好性を低下させたのではな

すＫ値（14.95±0.96％ vs. 18.02±0.96％）および

いかと考察している。本研究で使用したビワ葉混

ド リ ッ プ ロ ス（9.94 ± 0.10 ％ vs. 10.62 ± 0.20 ％ ）合発酵茶製造加工残渣は，Table１で示したようが５％水準で有意に低い値であった。これは，浅に緑茶粕よりも総カテキン量が有意に少ないた

胸筋中のα-トコフェロール含量（2.70±0.14 vs.

め，1.0％添加では飼料摂取量に影響せず，増体

2.15±0.16）が５％水準で有意に高かったことと量において対照区と同等であったと考えられた。

関係していると考えられた。

正肉重量，組織重量，腹腔内脂肪量，加熱損失

ビワ葉混合発酵茶区および対照区の浅胸筋中の率およびTBARSのいずれの調査項目においても遊離アミノ酸含量をTable３に示した。ビワ葉混両区に有意差は認められなかった。茶葉1.0％添

合発酵茶区は対照区と比べて，ヒスチジンが５％

加飼料

をブ

水準で有意に低い値となり，アルギニン，アラニ

ロイラーに各々給与した結果，無添加の対照区とンおよびチロシンにおいて10％水準で低い傾向で比べて，腹腔内脂肪量が有意に低下したことが報あった。そのうち，ヒスチジン，アルギニンおよ

告されている。本研究では，ビワ葉混合発酵茶をびアラニンは鶏の必須アミノ酸であることから，

1.0％添加した飼料の給与が飼料摂取量や増体量

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の摂取により体内に影響しなかったため，腹腔内脂肪量において対におけるアミノ酸の合成に影響があったと考えら

照区との間に有意差が認められなかったと考えら

れた。

15）

を銘柄鶏に，茶殻2.5％添加飼料

16）

3.4

れた。

食味官能評価

食味官能評価の結果をTable４に示した。それ
ぞれの項目についてビワ葉混合発酵茶区と対照区
15
a

3
b
2
1
0

Control

Examines

20

a
b

15
10

Drip loss（%）

25
K value（%）α-tocopherol (µg/g tissue)

4

a

b

10

5

5
0

Control

Examines0

Control

Examines

Fig. 1 Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed fermented loquat leaf tea on α-tocopherol, K-valueand Drip loss in the breast muscle of Tsushima-Jidori crossbred chickens. Result are expressed as Means±SE.

Symbols with different small letters（a, b）denote significantly at the 5％ levels, by the student t-test.

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458

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 3 Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed fermented loquat leaf

tea on free amino acids in the breast muscle of Tsushima-Jidori crossbred chickens.

Amino acids（mg/100g）

Control
0.35 1）

Examines

p-value

Aspartic acid

5.40 ±

4.90 ± 0.29

ns

Glutamic acid

11.38 ± 0.69

10.54 ± 0.45 2）

nsAsparagine

3.27 ± 0.20

3.34 ± 0.20

ns

Serine10.32 ± 0.39

10.43 ± 0.36

nsGlutamine
Histidine

42.19 ± 2.94
2.85 ± 0.17a

39.76 ± 1.84

ns

2.27 ± 0.18b<0.05

Glycine5.51 ± 0.15

5.26 ± 0.26

ns

Threonine

5.91 ± 0.21

5.73 ± 0.44

ns

Arginine

7.18 ± 0.32α

6.31 ± 0.41β

<0.1
<0.1

Alanine93.84 ± 1.86α

88.47 ± 2.67βCarnosine
Tyrosine

363.87 ± 15.53
6.96 ± 0.60α

367.58 ± 17.14

ns

5.91 ± 0.62β<0.1

ValineMethionine
Norvaline

5.34 ± 0.18
4.12 ± 0.35
20.11 ± 0.91

4.92 ± 0.14
3.85 ± 0.10
20.58 ± 0.70

ns
ns

CystineTryptophan
Phenylalanine
Isoleucine
LeucineLysineProline75.25 ± 4.83
49.76 ± 1.82
4.85 ± 0.17
3.96 ± 0.19
8.86 ± 0.38
5.97 ± 0.62
3.32 ± 0.39

81.92 ± 4.86
44.15 ± 1.69
4.33 ± 0.17
3.72 ± 0.12
8.10 ± 0.34
5.74 ± 0.35
3.08 ± 0.65

ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns

1）
 Values with small letters（a, b）and Greek alphabets（α, β）within the same row differ significantly
at the 5% and 10% levels, respectively, by the Student t-test（ns : not significant）.
2） Means ± SE.

Table 4 Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed

fermented loquat leaf tea on sensory characteristics ofTsushima-Jidori crossbred chicken breast.
Control
0.58 1）

Examines

p-value

Taste and Odor

5.16 ±

5.18 ± 0.58

ns

Texture4.77 ± 0.61

4.99 ± 0.61

nsOverall judgment

4.96 ± 0.56

5.33 ± 0.56

ns1）Least square means ± SE（ns：not significant）.

では浅胸筋の嗜好性に差は見られなかった。肉質

製造加工残渣を添加していない飼料を給与した場において遊離アミノ酸含量および肉質のＫ値およ合と比べて，飼料摂取量および増体量などの発育

びドリップロスで有意差が認められたものの，消成績や正肉重量および組織重量などの解体成績に費者の嗜好性には影響を及ぼさなかったと考えら影響を及ぼさず，浅胸筋中のＫ値の上昇を抑制れた。

し，ドリップロスを低減でき，肉質の改善効果が以上のことから，ビワ葉混合発酵茶製造加工残期待できることが示された。これまで利用されて渣を1.0％添加した飼料を対馬地鶏肉用交雑鶏のいなかったビワ葉混合発酵茶製造加工残渣が，対仕上げ期４週間に給与すると，ビワ葉混合発酵茶

馬地鶏肉用交雑鶏の飼料として利用できる可能性© The Ito Foundation

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響が認められた。
４．要

約

本研究では，未利用資源であるビワ葉混合発酵
茶製造加工残渣の飼料としての可能性を明らかにし，対馬地鶏肉用交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響について調査した。ビワ葉混合発酵茶製造
加工残渣は，緑茶粕と比べて，βカロテン含量，
α-トコフェロール含量および総カテキン含量は有意に低い値（ｐ＜0.01）であったが，総ポリフェノール含量が有意に高く（ｐ＜0.01），DPPH
ラジカル消去活性が有意に高い傾向（ｐ＜0.10）にあったことから，高い抗酸化機能を有することが明らかとなった。ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣を1.0％添加した飼料を対馬地鶏肉用交雑鶏の仕上げ期４週間に給与すると，ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣を添加していない対照区と比べて，発育成績や解体成績に影響を及ぼさず，浅胸筋中のα-トコフェロール含量を高め，肉の鮮度の指標となるＫ値の上昇を抑制し，ドリップロスを低減できることから，肉質の改善効果が期待できる
ことが示された。
謝

辞

本研究の実施にあたり，ビワ葉発酵茶製造加工
残渣は株式会社サンダイ，緑茶粕はJA全農長崎
大村果汁工場より各々提供して頂いた。また，機
能性成分および肉質の分析手法については，鹿児島大学農学部の井尻大地准教授にご指導およびご助言頂いた。ここに厚く御礼申し上げます。
文献１） 深川聡：農林水産省

研究成果発表会資料，地球459

温暖化時代の日本の農業・水産業，農林水産議会事務局他，146, 2018.
h ttps://www.naro.affrc.go.jp/org/niaes/ccaff/
conference2018/index_1.html
２） 高木英恵，深川聡，嶋澤光一：九州沖縄農業試験研究，2018.
h ttp://www.naro.affrc.go.jp/laboratory/karc/
prefectural_results/files/30_3_13.pdf
３） 田中一成，湯浅正洋，山本咲暁子，大曲勝久，宮田裕次，玉屋圭，田中隆：薬理と治療，44, 1613～
1619, 2016.
４） 田中一成，湯浅正洋，山本咲暁子，大曲勝久，宮田裕次，玉屋圭，吉野豊，小野博之，丸勇史，山村春男：薬理と治療，46, 539～547, 2018.
５）
 文部科学省：日本食品標準成分表2015年版（七訂）分析マニュアル，第３章ビタミン類，88～93,2016.
h ttps://www.mext.go.jp/component/a_menu/
science/detail/_icsFiles/afieldfile/2016/03/25/
1368932_03_1.pdf
６）
 鈴木誠，渡辺敏郎，三浦麻子，原島恵美子，中川靖枝，辻啓介：日本食品科学工学会誌，49, 71～75,
2002.
７） 後 藤 哲 久：食 品 機 能 研 究 法 ，東 京 ，pp328-331,
2000.
８）
 柚木崎千鶴子，酒井美穂，小阪妙子，堂園眞澄，
窄野昌信，福田亘博：日本食品科学工学会誌，55,
293～298, 2008.
９） 家畜改良センター：技術マニュアル「食肉の理化学分析及び官能評価マニュアル」（Ⅰ．理化学分析），
18～76, 2010.
10） 井尻大地，宝蔵直樹，島元紗希，川口真奈，古川愛理，多田司，友永省三，中島一樹，大塚彰：日畜会報，89（2）,191～198, 2018.
11）
 Faustman, C., Cassens, R. G., Schaefer, D. M.,
Buege, D. R., Willianms, S. N., Scheller. K. K.：
Jounal of Food Science, 54, 858～862, 1989.
12）
 Azuma, K., Hirao, Y., Hayakawa, Y., Murahata, Y.,
Osaki, T., Tsuka, T., Imagawa, T., Okamoto, Y., Ito,
N . ：A p p l i c a t i o n o f p r e - c o l u m n l a b e l i n gchromatography for canine plasma-free amino acidanalysis, Metabolites., 6（1）,3, 2016.
13）
 Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K.：Assay for lipid
peroxides in animal tissues by thiobarbituric acidreaction., Anal Biochem, 95, 351～358, 1979.
14）
 蔡義民，増田信義，藤田泰仁，河本英憲，安藤貞：
日本畜産学会報，72, 536～541, 2001.
15）
 佐々木健二，出口裕二：三重県農業技術センター
研究報告，23, 69～72, 1995.
16）
 金子国雄，迫宏一，飛佐学，木戸康博，古瀬充宏，
六車三治男：日本家禽学会誌，42, 153～158, 2005.

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460

暑熱ストレスによる筋成長阻害のブレークスルー：
筋幹細胞の活性化・増殖因子HGFのニトロ化（不活化）の関与の検証（Ⅱ）
Breaking-through the heat stress-induced suppression of postnatal muscle
growth:possible implication of nitration of myogenic stem cell activation
factor HGF（part Ⅱ）

辰巳 隆一・増原 夏海・Mohamed Zakaria Elhussiny・
Vishwajit Sur Chowdhury・Alaa Elgaabari１・城戸 潤力・今冨 奈々・関
美弓・松吉 祐児・鈴木 貴宏・中村 真子・古瀬 充宏（九州大学大学院農学研究院，１Kafrelsheikh University, Egypt）

Ryuichi Tatsumi, Natsumi Masuhara, Mohamed Zakaria Elhussiny, Vishwajit Sur Chowdhury,
Alaa Elgaabari１, Hirochika Kido, Nana Imatomi, Miyumi Seki, Yuji Matsuyoshi, Takahiro Suzuki,
Mako Nakamura and Mitsuhiro Furuse（Graduate School of Agriculture, Kyushu University, １Kafrelsheikh University, Egypt）

Hepatocyte growth factor（HGF）is known to be an essential factor that activatesquiescent myogenic stem satellite cells to enter the cell cycle and contributes to postnatal
muscle growth and regeneration after injury. Very recently, we found that recombinant HGF
is nitrated by incubation with peroxynitrite（ONOO－：a highly reactive biomolecule generated
by reaction of NO and superoxide radicals）to lose the biological activity in vitro in a moleratio（HGF：peroxynitrite）dependent manner. The subsequent experiments showed thatnitration of HGF has clear pH dependence with a maximum range at pH 7.2-7.4 and thereaction occurs quickly within a few seconds after adding of peroxynitrite to recombinant HGF.
These emerging results were obtained by ECL-Western blotting and may provide
physiological significance of HGF nitration that abolishes satellite cell activation and thesubsequent cell proliferation. Here we show that nitration of extracellular and intracellular
HGF was detected in calf muscle of 6-day-old male ROSS chicks（broiler：Gallus gallus
domesticus）that received acute heat-stress for 3 days（housing at 36℃ for 5 hr and 28℃ at
the subsequent 19 hr in a day）, as revealed by comparable direct-immunofluorescencemicroscopy of control（housing at 28℃）and heat-stressed samples stained with monoclonal
antibody against nitrated HGF. Importantly, nitration of HGF was abundant for fast（type II）
myofibers as revealed by immunostaining of serial cryo-sections with anti-slow myosin heavy
chain antibody. More results on this novel finding await further study including species（broilers and hens）, sex（male and female）, housing temperature, duration of heat-stress, andmuscles（breast, thigh and calf muscles）, and may help in developing a novel strategy for
application in meat production technologies and human sports science.

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暑熱ストレスによる筋成長阻害のブレークスルー：筋幹細胞の活性化・増殖因子HGFのニトロ化（不活化）の関与の検証（Ⅱ）

１．目

461

しく阻害すると考えられる。また，HGFは線維的芽細胞の増殖を抑制する働きもあるので，HGF

地球温暖化の進行に伴い，特に家禽産業においのニトロ化（不活化）は筋肉内結合組織の過剰なて，夏季の暑熱環境における肉用鶏の産肉量・肉発達を招き，結果として産肉量や肉質（軟らか

質低下は経済的損失を招く深刻な問題であり，こさ）が低下すると予想される。

れを抑制する研究の進展は急務である。暑熱環境

一昨年度の貴財団研究助成を受け，ペルオキシ

下の家禽で生じる代謝反応として，呼吸性アルカ

ナイトライトによるHGFのニトロ化は顕著な対

ローシス，酸化ストレス（活性酸素種の生成）の

HGFモル比依存性（反応時のHGF：ペルオキシ

増加，筋タンパク質分解の亢進があげられる。こナイトライトのモル比）のほか，pH 7.2-7.4を至のうち，酸化ストレスと筋タンパク質分解亢進は適とするpH依存性や数秒でニトロ化反応が完了

産肉量や肉質を低下させる要因と考えられているする高反応特性を有することを明らかにした（令が，それらの作用機構を含めた詳細は依然として

和元年度研究成果報告書参照）。これらの実験結不明である。

果は，HGFのニトロ化が生理学的現象に密接に一方，骨格筋の成長（および肥大，萎縮，再生）

関わっていることを示唆するものである。本研究は筋幹細胞（衛星細胞）の活性化とこれに続く増では初年度に続き，「暑熱ストレスによって上述

殖の活性に大きく依存していることが知られていの衛星細胞活性化・増殖因子HGFがニトロ化・る。申請者は，衛星細胞の増殖活性を決定す

不活化する」という作業仮説を，新規ツールである活性化（休止期からＧ１期への復帰）と休止化

るニトロ化HGFに対する特異的モノクローナル（セルフリニューアル）の制御機構に関する一連抗体（一昨年度末に作出済み）を用いてさらに検の研究の過程で，「筋幹細胞の活性化の抑制機構」

証した。

１～５）

の存在を洞察し，これが活性化因子HGF（肝細胞増殖因子；現在認知されている唯一の活性化因

２．方法子）のチロシン残基のニトロ化による不活化であ2.1

肉用雛鶏の暑熱感作（実験動物）ることを明らかにした（論文投稿準備中）。

室 温 28 ℃ で 育 雛 し た ６ 日 齢 の 雄 性 肉 用 雛 鶏タンパク質のニトロ化とは，芳香族アミノ酸（ROSS ： Gallus gallus domesticus）を 湿 度 60 ±（主にチロシン残基のε位の炭素）にNO２基が導５％，室温36℃で５時間飼育し暑熱ストレスを負入される翻訳後化学修飾であり，生体内において荷した後，室温28℃で19時間飼育した。この暑熱は，NOラジカルと活性酸素の反応により速やか

負荷操作を３日間繰り返した後，頸動脈放血によに生成するペルオキシナイトライト（ペルオキシ

りと鳥し，ふくらはぎの筋肉を採取した。試料は亜硝酸イオン：高反応性の短寿命の生体内分子）

マイナス80℃で凍結保存した。対照区の飼育温度によって非酵素的にニトロ化が起こることが知らは28℃とした。本研究に関するすべての動物実験れている（NO基が導入されるニトロソ化とは異は九州大学動物実験委員会の審査・承認の下，実なる）。HGFは衛星細胞の増殖も促進するので，施した（承認番号：A23-047）。

家畜・家禽の成長期，特に，衛星細胞のほとんど

2.2が増殖期にある肉用雛鶏の初期成長期において常法に従い，厚さ20μｍの凍結筋切片を作成しは，HGFのニトロ化（不活化）は筋の成長を著蛍光免疫顕微鏡法に供試した。使用した抗ニトロ© The Ito Foundation

筋肉内のニトロ化HGFの可視化

462

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

化HGF特異的モノクローナル抗体は，ヒト・マ

モンであるコルチコステロン濃度の増加も認めら

ウス・ラットHGFのクリングルドメイン２のチれたことから，雛鶏が暑熱感作されたことが確認

ロシンのニトロ化（ニトロチロシン）を特異的にされた。

認識するもので，その特異性はWestern blotting

採取したふくらはぎの筋肉の凍結切片を蛍光標とELISAで確認済みである。また，鶏のHGF部

識抗ニトロ化HGF特異的モノクローナル抗体で分ペプチド（クリングルドメイン２のチロシンを染色すると，筋線維の周囲（細胞外マトリック

含む13残基の合成ペプチド）のニトロ化を検出すス）および細胞質が陽性反応を示し，その蛍光強ることもELISAで確認した（data not shown）。

度は対照区に比べて明らかに高いことが認められラット凍結筋切片の蛍光免疫染色での反応性は充た（Fig.１；n＝３/グループ）。したがって，暑分であったので（論文投稿準備中），この抗体を熱ストレス負荷によって筋肉内に存在する衛星細蛍光物質（ALEXA）で標識し蛍光免疫顕微鏡法

胞活性化・増殖因子HGFがニトロ化され不活化に使用した（２次抗体は必要としない）。

することが明らかになった。暑熱感作温度・時間，ニワトリの日齢などの条件を変えてさらに詳３．結果と考察

細な基礎データを集積することにより，暑熱スト

3 . 1 暑熱ストレス負荷によってHGFはニトロ化されるか（in vivo実験）

レス負荷による筋肉内HGFのニトロ化・不活化
による筋の初期成長阻害が，より明確になると期６日齢の雄性肉用雛鶏を室温36℃で５時間飼育し暑熱ストレスを負荷した（３日間連続処理；対照区の飼育温度は28℃）。５時間の暑熱ストレス待された。
3 . 2 HGFのニトロ化・不活化と筋線維型との関係性

負荷直後の直腸温度が有意に約２℃上昇し（ｐ＜暑熱ストレス負荷によるHGFのニトロ化は同

0.01，n＝６/グループ），またストレス応答ホル

一筋でも部位によって強弱があることが先のFig.

control（28℃）

heat-stressed（36℃, 5 h/day for 3 days）

Gas

anti-HGF nitrated Y

Gas

2.5 mm

2.5 mmFig. 1 Nitration of HGF in calf muscle by heat-stress treatment of broiler chicks. Cryo-sections of calf muscle were stained with Alexa-labeled anti-nitrated HGF（nitratedY）monoclonal antibody. Gas, gastrocnemius muscle（white dotted line）. Blue dotted
line, other muscle group in calf muscle. Lower panel, boxed areas of upper panels.

© The Ito Foundation

暑熱ストレスによる筋成長阻害のブレークスルー：筋幹細胞の活性化・増殖因子HGFのニトロ化（不活化）の関与の検証（Ⅱ）

463

heat-stressed（36℃, 5 h/day for 3 days）
anti-HGF nitrated Y

anti-slow myosin heavy chain
merge (phase contrast)

100µm

Fig. 2 Close relationship between slow/fast fiber types and nitration of HGF in broiler

chick calf muscle. Serial cryo-sections of calf muscle were single-stained with Alexalabeled anti-nitrated HGF（left）and anti-slow myosin heavy chain monoclonal
antibodies（right）, respectively. Typical nitrated HGF-positive fibers were indicatedby arrows.

１で観察された。筋肉中のHGFの存在量とは相接的に阻害されることは明らかであるので，

関 は な い こ と は ， 抗 HGF 抗 体 （SantaCruZ

HGFのニトロ化・不活化の抑制が暑熱対策の重Biotech．社製：HGFのＮ末端のNK１領域を認識

要なターゲットになると確信している。

するモノクローナル抗体で鶏HGFを認識することを確認済み）による蛍光免疫染色像との比較か

４．要約

ら明らかであった。そこで，筋線維型（速筋型・本研究により，肉用雛鶏に暑熱ストレスを負荷遅筋型）と関係性があると予想し，連続切片を遅すると筋肉内に存在する筋幹細胞（衛星細胞）活筋型myosin重鎖（遅筋型筋線維のマーカー）に性化・増殖因子HGFがニトロ化され不活化する

対する抗体で蛍光免疫染色した。Fig.２に示すよことが明らかになった。この現象は速筋型筋線維

うに，緑色の蛍光で可視化された遅筋型筋線維でで顕著であることから，速筋型筋線維がきわめてはない筋線維，すなわち，速筋型筋線維のニトロ

優勢な鶏胸肉の生産に及ぼす影響は大きいと予想化が顕著であった。したがって，速筋型筋線維はさ れ た 。衛 星 細 胞 の 活 性 化・増 殖 因 子 で あ る

遅筋型筋線維に比べてHGFのニトロ化を受けやHGFがニトロ化・不活化すると筋線維の初期成

すいことが分かった。この知見は，暑熱ストレス長・肥大が直接的に阻害されることは明らかであが負荷されると速筋型筋線維の初期成長は阻害さるので，HGFのニトロ化・不活化を抑制するこ

れやすいことを示唆しており，速筋型筋線維を主とが，夏季の暑熱環境における産肉量・肉質低下

体とする鶏胸肉の初期成長・肥大に及ぼす影響はを改善する新しい飼育・管理技術の鍵になると期大きいと予想された。

待される。

現時点では，暑熱ストレスによるHGFのニト
ロ化・不活化が鶏の初期筋成長阻害の主要因であるとの直接的な証明はできていないが，前述どおり，衛星細胞の活性化・増殖因子であるHGFがニトロ化・不活化すると筋線維の成長や肥大が直文
献１） Allen, R. E., Temm-Grove, C. J., Sheehan, S. M.,
Rice, G. M.：Methods in Cell Biol., 52, 155～176,
1997.
２）
 Tatsumi, R., Anderson, J. E., Nevoret, C. J.,© The Ito Foundation

464

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Halevy, O., Allen, R. E.：Dev. Biol., 194, 114～128,
1998.
３） Tatsumi, R., Hattori, A., Ikeuchi, Y., Anderson, J.
E., Allen R. E.：Mol. Biol. Cell, 13, 2909～2918, 2002.
４） Tatsumi, R., Allen, R. E.：Anim. Sci. J., 79, 279～
290, 2008.
５） Tatsumi, R.：Anim. Sci. J., 81, 11～20, 2010.

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465

家畜糞の分解効率に関わる土壌・糞中微生物の関連性～多様性と量の謎を解く～
Relationship between microbiomes related to the decomposition efficiencyof livestock dung-the importance of diversity and the abundance－

内田義崇・龍見（岩岡） 史恵（北海道大学大学院農学研究院）

Yoshitaka Uchida and Chikae Tatsumi（Iwaoka）（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

This study aimed to evaluate the bacterial abundance and diversity in soils and livestock
excreta, sampled from dairy farms in Hokkaido, Japan. The decomposition of dung on grazed
pasture soils is very important to sustain pastoral growth rates because the pasture coveredby dung reduces its growth rate, temporarily. As a control factor of the decomposition rates ofdung on soils, microbiomes both in dung and in soils are important, but their contribution to
the decomposition is not well understood. Also, the identification of key microbes related to therates of dung decomposition can be useful to establish feed or soil management techniques toutilize the pasture more efficiently. We sampled dairy cow dung and grazed pasture soils from
fifteen farms across Hokkaido, Japan（with four replicates per sample type）. We extracted
their DNA and investigated for their bacterial abundance using a qPCR approach. Also, thebacterial community structures were determined by an amplicon sequencing approach,targeting the 16S rRNA region. The decomposition rates of dung were measured by incubating
the soil in a plastic cup with dung applied on top, placing each cup in a bottle with cap andsampling gases over time to measure an increase in carbon dioxide concentrations. In results,
the soil and unexpectedly, dung microbiomes showed regional similarity, when the samples
from east, north and central Hokkaido were compared. The dung microbial diversities might
be weakly correlated to the decomposition rates of the dung on soils, but further experiments
are needed to confirm this．

１．目て，放牧は糞尿や飼料管理に関わる労力を減らす的観点から注目されている。しかし，排出される糞本研究は，家畜糞が土壌表面で分解する際の，が固まりとなり牧草表面を覆い，その生育を阻害「土壌微生物」と「家畜糞中微生物」それぞれのする場合がある放牧では，糞が土壌表面で迅速に増減や多様性の変化を調べ，家畜糞が効率よく分分解されるかどうかが，放牧の生産性と関連して解する土における二つの異なる微生物群集の役割いる可能性が高い。

を明らかにすることを目的とした。畜産業におい

放牧地土壌表面での糞分解速度をコントロール© The Ito Foundation

466

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

している要因として，分解に関わる微生物叢を調べることが重要である。糞分解に関わっているの2 . 2 土壌，糞中DNA抽出，バクテリアコミュ
ニティ構造解析は，糞中の微生物叢と土壌中微生物叢，両方であ培養前の土壌，糞に関しては野外調査後、速やると考えられるが，この異なる二つの微生物叢がかにDNA抽出用チューブへのサンプルの取り分それぞれどのように糞分解と関連しているのかはけ作業を行った。すべてのサンプルに対して，

これまで調べられていなかった。

QIAGEN社のPower Soilキットを用いて，提供さそこで，糞分解の速度を糞分解由来の二酸化炭れているプロトコルに従って抽出作業を行った。

素（CO２）排出量として測定し，その量と，糞中，DNA抽出後の分析については，まず，リアルタ

土壌中のバクテリアの量，多様性との関連性を調イムPCR法を用いバクテリアの定量を行った。ラ

べる実験を行った。

イマとして，515Ｆ・806Ｒというプライマーを用

２．方いて，16S rRNA遺伝子を増幅することによって

法定量した。反応液には，日本ジェネティック社の2 . 1 家畜糞分解速度を調べるためのCO２排出KAPA SYBR Fast qPCRKit（ROXLowqPCRキット）を用い，機械には，ロシュ・ダイアグノス

量測定
この部分の実験では，家畜糞の分解速度を調べるために，北海道内の放牧農家から家畜糞とそれ

テ ィ ッ ク ス 社 の LightCycler Ⓡ 480 リ ア ル タ イ ム
PCRシステムを使用した。

が散布される土壌を採取し，糞分解時に排出されさらに，定量に加えて，バクテリアコミュニ

る二酸化炭素量を調べた。そのために，北海道内

ティ構造を明らかにするために515Ｆ・806Ｒのアの15件（道央５件，道北５件，道東５件）の放牧

ダプター（シーケンサー用チップに受容されるた

酪農家を訪問し，牛糞と土壌のサンプルを，各４めに必要な配列）およびバーコード（サンプルを反復ずつ採取した。

区別するために必要なユニークな配列）付きプラ

これら土壌をそれぞれ90mlのプラスチック容

イマーを使って，バクテリアの16S rRNA遺伝子器に充填し（土壌密度は0.78g cm－３），水分量をを 増 幅 し た 。増 幅 さ れ た サ ン プ ル に 対 し て ，60％の水分飽和度（Water-filled pore space）にGlobal Life Science Technology 社 の 磁 器 ビ ー ズ

合わせ，25℃で15日間予備培養した後，約10ｇの試薬Sera-Mag Selectおよびワケンビーテック社

糞（土壌採取場所と同じ農場で採取したもの）をの 磁 器 ビ ー ズ 吸 着 プ レ ー ト 96R Ring Magnet

表面に置き，さらに24日間培養した。

Plateを用いて，プロトコルどおりにターゲット

糞分解速度をCO２排出量として測定するため，

DNA の 精 製 を 行 っ た 。 精 製 し た DNA は ，

土壌と糞が入ったプラスチック容器を1.5 ｌ瓶にPromega 社 の 試 薬 QuantiFluor ONE dsDNA

入れ蓋をし，０，30，60分後にそれぞれ30mlのSystemおよび機械QuantusTM Fluorometerを用いガスを真空バイアルに採取し，ガスクロマトグラて，プロトコルどおりに定量を行った。作成した

フィー（メタナイザー，FID付き）でCO２量を測ライブラリは，Thermo Fisher Scientific社の機定し計算した。ガス採取は週に１～３回行い，得械 Ion Chef シ ス テ ム お よ び 試 薬 Ion PGM Hi-Q

られたCO２排出量を積算し，糞分解量とした。

View Chef Kitを用いて，チップIon 318 Chip Kit
v2 BCにローディングさせた。その後，機械Ion
Torrentにチップを設置してシーケンスを行った。

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家畜糞の分解効率に関わる土壌・糞中微生物の関連性～多様性と量の謎を解く～

シーケンス完了後，各サンプルのシーケンス
データをfastqファイル形式で取り出し，Ｒソフ
ト ウ ェ ア を 用 い て ， dada2 Pipeline （https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html） に 従 っ467

３．結果と考察3 . 1 土壌・糞中のバクテリア量・多様性と家畜糞分解能の関連性て解析を行った。データベースとしては，Silva

土壌や糞中のバクテリア量と多様性に関して

version132を用いた。また，多様性指数としては，家畜糞分解能とのはっきりした相関はなかっ

Shannon指数を計算した。使用したＲコードの詳細た。しかし，糞中バクテリアコミュニティ構造のは ，龍 見 の GitHub に て 公 開し て い る（https://

多様性と糞分解速度（Fig.１右上）には弱い相関

g i t h u b. c o m / C h i k a e-Ta t s u m i / N G S -Da t a -が見られたため，今後，反復数などを増やし検証

Processing/blob/master/dada2_16S_IonTorrent.r）。

する必要がある。また，今回の研究では培養日数

2.3

統計解析

が短い（30日以下）ため，主に糞中の易分解性炭土壌，糞それぞれのバクテリア量，バクテリア

素がCO２として放出されたと考えられる。難分解

コミュニティ多様性と，糞分解量（積算したCO２性の炭素が分解する分解後期により土壌や糞中の排出量）の相関を計算した。さらに，バクテリア

バクテリアコミュニティ多様性が重要となる可能

コミュニティ構造データに関してはNMDS法を性もあるため，より長期の培養試験やフィールド

用いてコミュニティ間の類似性を示した。

レベルの試験が求められる。先行研究によると，Fig. 1 The relationship between the diversity（Shannon index）of soil microbiome and the decomposition rate of dung

applied on a soil（top left）, the diversity of dung microbiome and the decomposition rate of dung（top right）, the, and the dungsoil bacterial abundance（log copy number g－１ soil）and the decomposition rate of dung（bottom left）
bacterial abundance（log copy number g－１ dung）and the decomposition rate of dung（bottom right）,respectively.

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468

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

フィールドレベルでは気温などにより糞分解速度

3 . 3 糞分解効率と関連性が高いバクテリア門が大きく変化することが分かっており ，現場でまた，バクテリアコミュニティ構造をより精緻の課題解決には，より多様な環境要因について考に解析し，糞分解効率と関連性が高いと考えられ察するべきである。

る門について考察した。その結果，土壌や糞中の１）

3 . 2 土壌・糞中のバクテリアコミュニティ構

Alphaproteobacteriaが糞分解効率の高い農場の土や糞に他農場サンプルと比較して相対的に多く造をコントロールしている要因
土壌や糞中のバクテリアコミュニティ構造と生息していることが分かり（Fig.３），これらがはっきりと関連している要因として，地域差が本

有機物分解に関わっているという先行文献デー研究で明らかとなった。本研究では，道央，道東，

タ３）とも合致した結果が得られた。

道北の放牧酪農家を対象に調査したが，NMDS法

しかし，この結果は初期の土壌中，糞中バクテ

でバクテリアコミュニティ構造を調べると特に土リアと糞分解能を比較しており，分解ステージに壌ではっきりとした地域差があり，糞においてもよって変化するバクテリアコミュニティ構造を精特に道北由来の糞バクテリアコミュニティはクラ緻に調べる実験がさらに必要である。また，先述

スター化し類似していることがわかった（Fig.

したバクテリアコミュニティ構造の地域差を踏ま２）。土壌バクテリアコミュニティには地域特性

えて，より反復を増やした大がかりな調査研究もがある程度あることは先行研究でも報告されてお必要であろう。

り ，北海道でも火山灰土壌や泥炭など土壌に特２）性のある北海道内の地域ごとに独特の土着バクテ

４．要

約

リアコミュニティが形成されていると考えられ

本研究は，北海道における酪農場由来の家畜糞る。今後はよりサンプル数を増やし，地域ごとにと土壌微生物（バクテリア）コミュニティ多様性

糞分解をコントロールする微生物的要因を評価すと量を評価し，家畜糞の放牧地土壌表面での分解るなどのアプローチが必要である。

を説明することを目的とした。放牧地において，Fig. 2 The similarity among the soil microbiomes（left）and dung microbiomes（right）, sampled from grazed dairy

farms within Hokkaido, Japan. The colour indicates the sampling regions（black, grey and white for centre, northan east Hokkaido, respectively）.

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家畜糞の分解効率に関わる土壌・糞中微生物の関連性～多様性と量の謎を解く～

469

Fig. 3 Dung（left）and soil（right）bacterial community structures at the class level. The alphabets indicate different

dairy farms in Hokkaido. The farms C and F showed relatively higher dung decomposition rates and had relatively
higher abundances of Alphaproteobacteria, shown in black squares. Please see colour images（online）for moredetails.

家畜糞が適正に分解されることは，家畜糞に覆わ

場全体をまとめて評価するとはっきりしなかった

れた牧草の生育阻害を最低限にとどめるために重が，家畜糞中バクテリアコミュニティの多様性と要である。しかし，その糞分解速度のコントロー

家畜糞分解量の間には弱い相関が見られた。さらル要因として，糞中バクテリア，土壌バクテリアに，綱レベルではAlphaproteobacteriaが分解量のどちらがどれほど重要なのかという問いに対すと関連している可能性が示唆されているが，分解る答えははっきりしていない。この問いに答える

ステージにおけるバクテリアコミュニティの変動ことで，家畜糞の適正な分解を目指すための飼料や先述した地域差を踏まえた，さらなる研究が必

設計や土壌改良などの技術を確立するための基礎要である。

情報が蓄積できる。15の酪農場から糞と土壌を各４反復で採取し，DNAを抽出し，定量PCR法によりバクテリアの量，次世代シーケンス法を用いてバクテリアコミュニティの多様性を定量した。
その結果，土壌，糞どちらのバクテリアコミュニ
ティにおいても地域差があることが分かった（道東，道北，道央を比較）。そのため，糞と土壌微生物量や多様性と家畜糞分解量との関係は15の農

文
献１） Yoshitaka, S., Soutome, H., Koizumi, H.：
Ecological Research, 29（4）,673～684, 2014.
 Kuramae, E. E., Yergeau, E., Wong, L. C., Pijl, A. S.,２）v a n V e e n , J . A . , K o w a l c h u k , G . A . ：F E M S
Microbiology Ecology, 79, 12～14, 2012.
３）
 Buresova, A., Kopecky, J., Hrdinkova, V.,
Kamenik, Z., Omelka, M., Sagoa-Mareckova, M.：
Applied and Environmental Microbiology, 85（24）,e01760-19, 2019.

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470

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可能性（Ⅱ）
Colostral programming of physiological properties related to meatproduction（Ⅱ）

松

𥔎

正

敏

（弘前大学農学生命科学部）

Masatoshi Matsuzaki（Faculty of Agriculture and Life Science, Hirosaki University）

Based on its higher colostral concentration and possible maternal nutritional influence,
effect of neonatal oral administration of insulin to one of twin sheep littermate was examined.
Single physiological dose（2.5μg/kg BW）of bovine insulin was administered to one of twins
within 2 hours after birth. Change of body weight from birth to 20 weeks of age（around
puberty）was not affected by the insulin administration in the 3 litters that completed trial.
Plasma concentrations of metabolite and hormones including glucose and insulin were notinfluenced by neonatal insulin administration. The results indicate that neonatal insulin
fortification does not have noticeable impacts on growth and blood chemistry of young sheep.

１．目

影響して，成人期の肥満の予防に関与することが的示唆されている５～７）。さらに，母乳中のエクソソー

初乳は豊富な栄養素に加えて，母から子への移ムに含まれるメッセージ物質の産子の生理機能の行抗体の供給源として家畜動物の新生子の受動免発達や成長に及ぼす影響が研究され始めてい疫確立に不可欠である。さらに最近では，初乳中る８）。しかしながら，これらの乳中メッセージ物のホルモンその他のメッセージ物質が新生子の成質の反芻家畜の初乳中含有量に関する知見はきわ長や生理特性の形成に不可逆的な影響を及ぼしう

めて少なく，産子の成長後の生理特性との関連をることが明らかにされつつある 。初乳中のメッ解析した研究は見当たらない。そこで，昨年度はセージ物質としてIGF-Iやインスリンなどの ホル

妊娠末期と哺育中の母めん羊の栄養制御を行った

モンが新生子期の急速な成長や腸管の発達，体タ実験モデルを用いて，母畜の初乳中ホルモン濃度

ンパク質蓄積や糖代謝の活性化に重大な影響を及と産子の成長および生理特性の関連を調べた。そぼしていることが明らかにされている。乳中の結果，初乳中のインスリンは分娩直後の母畜血に含まれるその他のホルモン類として，レプチ

中に比べてきわめて高濃度で存在しており，妊娠ン，アディポネクチン，グレリン，レジスチンや末期の母畜への給与タンパク質レベルに反応してグルココルチコイドなどが母乳哺育児の成長や発初乳中濃度が変化する可能性が示唆された。そこ

達，さらには食欲やエネルギーバランスの調節にで，反芻家畜の産肉特性に長期的な代謝的プログ

１）

２～４）

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471

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可能性（Ⅱ）

ラミングを引き起こす初乳成分の候補物質としてれ人工哺育で飼育したため，離乳後の成長試験にインスリンに着目して，出生直後のめん羊双子産供試できたのは３腹でインスリン投与群および対子の一方にインスリンを経口投与することによ

照群それぞれ３頭ずつとなった。産子は生時体重り，その後の成長，飼養成績ならびに血液成分にの測定の後，3，7，14，28，56，84，112および及ぼす影響の解明を試みた。

140日齢に体重測定と頸静脈血採取を行い，代謝２．方成分とホルモンの血漿中濃度を測定して出生直後

法の経口インスリン投与の影響を調査した。

本研究における動物実験は弘前大学動物実験委

３．結果と考察

員会で審査，承認された動物実験計画（承認番号
A08019）に従って実施した。

出生直後のインスリン経口投与は同腹産子の増同一の種雄畜との自然交配により妊娠したサ体には影響しなかった（Fig.１）。

フォーク種母めん羊を供試して，妊娠末期（交配Fig.２には出生後３日齢以降，自然哺育中およ

開始後16週以降）から自然分娩を経て産子が８週

び離乳後におけるめん羊産子の血漿中グルコー

齢で離乳するまで個別飼育ペンに収容して飼養試ス，インスリンおよび遊離トリヨードサイロニン

験を実施した。妊娠末期の母めん羊には，双胎妊濃度を示した。いずれも，試験処理による有意な娠末期に必要なTDN要求量を市販の配合飼料

影響は認められなかった。結果を示していない（CP12％，TDN75％）から50％，アルファルファ

が，総タンパク質，尿素態窒素，トリグリセライ

ペレットから45％，チモシー乾草から５％，それド，リン脂質，遊離脂肪酸，総コレステロール，

ぞれ充足するように給与した。分娩後１週間から

HDL-コレステロール，LDL-コレステロール，

８週間までは哺育頭数に応じたTDN要求量を妊ならびにコルチゾールの血漿中濃度も，出生直後

娠末期と同様に給与したが，TDN供給量は配合のインスリン経口投与による影響は認められな飼料から50％，アルファルファペレットからはかった。

40％，チモシー乾草から10％とした。自然分娩で初乳中に高濃度で存在し，妊娠末期の母畜の栄出生した双子産子５腹の一方に対して，生時体重養状態を反映して初乳中濃度が変化する可能性が１ kg あ た り 2.5 μg の ウ シ イ ン ス リ ン（SigmaAldrich I5500-100MG, Lot# SLBW1822, 25USP
乳介助時に経口投与した。出生から初乳吸入介助，すなわちインスリン投与までの時間は，おおむね２時間以内であった。産子は８週齢で離乳させた後，体重比原物２％の配合飼料（CP12％，
TDN75 ％ ）と 体 重 比 １ ％ の ア ル フ ァ ル フ ァ ペ
レットならびに体重比１％のチモシー乾草を給与して20週齢まで成長試験を実施した。５腹の供試
双子のうち，１腹は産子の一方が母畜による圧死，もう１腹の産子の一方は母畜に授乳を拒否さBW（kg）

units/mg）を2.5μg/ml生理食塩水として初乳吸

50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0

0

20

40

60
80
Age（d）

100

120

140

Fig. 1 Body weighs（BW）of lambs in either control（●）

or insulin administered（△）groups during sucklingand postweaning period.

© The Ito Foundation

472

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

んらかの特異的なシグナル伝達に関与する可能性

120は否定できない。実際，腸管上皮の細胞に存在す

glucose（mg/dL）

130
110

る受容体群を介してIGF-Iやインスリンが，新生100

子牛の腸管の発達やグルコース代謝の活性化を促90

すことなどが報告されている２～４）。本研究では初80

乳中に含まれる生理的レベルのインスリンの追加

70
60

0

20

40

60
80
Age（d）

100

120

140

る免疫グロブリンの摂取レベルや吸収状況との関insulin（μg/L）

2.5

連を含めた生産形質への影響の解析が必要と考え

2.0

られる。

1.5

４．要

1.0

約

初乳中に高濃度で存在し，妊娠末期の母畜の栄

0.5
0

20

40

60

80

100

120

140

Age（d）

養状態を反映して初乳中濃度が変化する可能性が示されたインスリンの新生子めん羊への経口投与の影響を，双子のめん羊産子を用いて調べた。初14

乳中に含まれる生理的レベルのインスリン（2.512FT3（pg/mL）の余地はあるものの，実際の家畜生産レベルでの効果を評価するうえでは初乳特有の含有成分であ

3.0

0.0

投与を実施した。薬理レベルでの投与効果の検討

μg/kg生時体重）を最初の初乳摂取のタイミン

108

グで同腹の双子産子の一方に経口投与して，その6後の増体ならびに血中の代謝成分やホルモン濃度4を調べたが，明らかな影響はみられなかった。

2
0
0

20

40

60
80
Age（d）

100

120

140

Fig. 2


Plasma concentrations of glucose, insulin and free
triiodethyronine（FT3）of lambs in either control（●）
or insulin administered（△）groups during sucklingand postweaning period.

示されたインスリンの新生子めん羊への経口投与
は成長や血液成分に検出しうる変化を引き起こさなかった。IGF-Iのようなホルモンの新生子豚の腸管からの吸収は否定されてはいるものの９），初乳摂取あるいは腸管上皮への初乳中生理活性物質の接触が出生直後の産子のホルモン分泌などのな

文
献１） Hammon, H. M., Liermann, W., Frieten, D., Koch,
C.：Importance of colostrum supply and milk
feeding intensity on gastrointestinal and systemic
development in calves, Animal, 14：S1, s133-s143,2020.
２）
 Blum, J. W.：Nutritional physiology of neonatal
calves, Journal of Animal Physiology and Animal
Nutrition, 90, 1～11, 2006３）
 Hammon, H. M., Steinhoff-Wagner, J., Flor, J.,
Schönhusen, U., Metges, C. C.：Lactation Biology
Symposium：role of colostrum and colostrum
components on glucose metabolism in neonatal
calves, Journal of Animal Science, 91, 685～695, 2013.
４）
 Ontsouka, E. C., Albrecht, C., Bruckmaier, R. M.：
Invited review：growth promoting effects ofcolostrum in calves based on interaction withintestinal cell surface receptors and receptor-like© The Ito Foundation

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可能性（Ⅱ）
transporters, Journal of Daily Science, 99, 4111～
4123, 2016.
５） Savino, F., Liguori, S. A., Lupica, M. M.：
Adipokines in breast milk and preterm infants,
Early Human Development, 86, S77-S80, 2010.
６） Eilers, E., Ziska, T., Harder, T., Plagemann, A.,
Obladen, M., Loui, A.：Leptin determination incolostrum and early human milk from mothers ofpreterm and term infants, Early Human
Development, 87, 415～419, 2011.
７） Hollanders, J. J., Heijboer, A. C., van der Voorn, B.,
R o t t e v e e l , J . , F i n k e n , M . J . J . ：N u t r i t i o n a lprogramming by glucocorticoids in breast milk：
Targets, mechanisms and possible implications,473

Best Practice & Research Clinical Endocrinology &Metabolism, 31, 397～408, 2017.
８）
 Samuel, M., Chisanga, D., Liem, M., Keerthikumar,S., Anad, S., Ang, C. S., Versteegen, E., Jois, M.,
Mathivanan, S.：Bovine milk-derived exosomesfrom colostrum are enriched with proteins
implicated in immune response and growth,
Scientific Reports, 7（1）,5933～10, 2017.
９）
 Donovan, S. M., Chao, J. C. L., Zijlstra, R. T., Odle,
J.：Orally administered iodinated recombinanthuman insulin-like growth factor-I（I-125-rh IGF-I）
is poorly absorbed by newborn piglet, Journal of
Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 24, 174～
182, 1997.

© The Ito Foundation

474

異なる月齢時の輸送が子牛の福祉性および生産性に与える影響
Influence on welfare and production by transporting calves at different ages

戸

澤

あきつ

（帝京科学大学生命環境学部）

Akitsu Tozawa（Faculty of Life & Environmental Sciences, Teikyo University of Science）

The objective of this study is to investigate the influence on welfare and production bytransporting calves at different ages. Japanese Black calves were transported about 1,200km
distances by ferry and truck. After arriving at the fattening farm, 12 calves were divided in 3
pens with 4 calves each. The mean age of each pen was 9.25 months old（Pen 1）, 8.25 months
old（Pen 2）and 8 months old（Pen 3）. Behaviour, physiological reactions by blood sampling
and live weight estimated by measuring chest girth were observed for assessing welfare andproduction. Behaviour was observed 3 consecutive days from arriving, after a week and amonth. The percentage of time spent ingestive behaviour at day time of Pen 3 was significantly
lower than Pen 1 and that of resting behaviour of Pen 3 was higher than Pen 1（p < 0.05）. In
addition, social play behaviour in Pen 1 was expressed significantly more times than in Pen 3（p < 0.05）. These results suggest that the older calves might recover faster from stress bytransport. Blood sampling was carried at arriving day, after a week and a month. Serum
creatinine concentration was significantly higher in Pen 1 than Pen 2 and 3（p < 0.01）. Serum
creatinine can be high due to months old, further studies are needed to identify the effect oftransport. There were no clear differences between pens in other physiological reactions andlive weight. However, the concentrations of cortisol, NEFA, BUN, TP, blood glucose and T3
become higher after arriving the farm than a week or a month later in all pens. These results
suggest that calves had stress under transport regardless of age between 8 to 10 months old
and recover in a week．

１．目

定められており，アニマルウェルフェアを考える

的

うえでも家畜の輸送は重要な課題であることがい

肉用牛はもとより，乳用牛も最終的にと場へ出える。

荷されることから，ほとんどの牛は生涯に少なか輸送による牛へのストレス負荷については，輸らず一度は輸送を経験する。OIE（国際獣疫事務

送直後の血液性状や心拍数といった生理状態を把局）が定めている陸生動物衛生規約のなかのアニ握した研究１）や，免疫力の低下に関する研究につマルウェルフェアの基準でも輸送に関する項目がいては報告がある２）。しかし，ストレスを受けた© The Ito Foundation

異なる月齢時の輸送が子牛の福祉性および生産性に与える影響

475

動物の福祉状態を把握する場合，生理状態だけで分休憩を取りながら９時間かかった。輸送日時は判断するのではなく，快・不快や心理的健康状態

2020年８月19日に市場を出発し，翌20日の14：00

をとらえる必要がある３）。また，輸送中の牛の行頃搬入された。

動に関する報告はあるものの ，輸送によるスト

供試動物は黒毛和種の去勢オス，１ペン当たり

レスからの回復に伴う行動変化についての研究は４頭飼育を３ペン，計12頭であった。各ペンの導ほとんど行われていない。

入時月齢は，ペン１で9.25ヶ月齢（９ヶ月齢３頭，１）

肥育牛において，体重の変化は生産性の重要な

10ヶ月齢１頭），ペン２で8.25ヶ月齢（８ヶ月齢指標のひとつである。輸送時には通常，絶食絶水

３頭，９ヶ月齢１頭），ペン３で８ヶ月齢であっであることや排糞・排尿により体重は通常12～た。搬入日にチアンフェニコール系合成抗菌剤

15％程度減少する。しかし，体重の急激な減少は（15ml/300kg）および牛５種混合生ワクチン（２体内恒常性に負荷がかかるため，その後の成長を

ml ／ 頭）を 接 種 し ，次 の 日 に イ ベ ル メ ク チ ン

妨げる可能性や体力の低下，疾病罹患率の上昇に（0.02ml/kg）を投与した。

つながるといわれている 。つまり，血液性状と飼育環境は，開放型牛舎で，20.2ｍ２（6.5ｍ×3.1

いった生理的評価だけでなく，体重も輸送時の牛ｍ）の広さのペン内に４頭ずつ飼育されていた。

の肉体的健康状態の指標となりうる。

稲わらとチモシーを不断給餌していた。配合飼料

４）

繁殖農家で飼育された子牛は市場でセリにかけは１kgからスタートし，２週間ごとに0.5kg増量

られ，肥育農家に移動する場合がある。セリにかしていった。給与時間は９：00と15：00の１日２けられる子牛は９～10ヶ月齢であるが，この時期回であった。加えて，機能性飼料であるBIOバガ

は成長段階であるため１ヶ月の違いでも体格や体ス（バ イ オ 科 学 株 式 会 社）を １ 日 当 た り 0.5～

内恒常性機能の適応力は異なる可能性がある。多1.0kg／頭給与していた。

少の違いではあるが，子牛の血液性状の標準値は2.2

月齢ごとに異なっている 。

調査項目は，福祉状態をとらえるために，維持５）

調査項目および調査日程

そこで本研究では，異なる月齢時での輸送が，行動とイベント的に発生する行動の発現状況を観輸送後の子牛の福祉性および生産性にどのように察し，生産性として生理状態の把握および体重と影響を与えているか，明らかにすることを目的と相関が高い胸囲測定を行い６），体重に換算し，指した。

標とした。それぞれの調査日程をTable１に示した。

２．方
2.1

2.3

法

行動観察

行動は，維持行動およびイベント的に発現する供試動物および飼養管理

行動を観察した。維持行動については搬入当日

本研究は，帝京科学大学動物実験委員会により承認され，実施された（承認番号20C027）。

18：00から５分間隔の瞬間サンプリングで24時間観察を行った。18：00から翌６：00までを夜間と調査は，茨城県鉾田市に所在する肥育農家で実し，ビデオカメラで撮影した動画を後日解析し施 し た 。調 査 地 の 農 家 ま で ，輸 送 は 全 行 程 約

た。６：00から18：00までを日中とし，２名交代

1,200km，北海道の子牛市場から陸路で苫小牧港で目視により直接観察を行った。観察した行動に行き，苫小牧港から八戸港まではフェリーによは，飼料の摂食，飲水，舐塩を合わせた摂取行動

る海上輸送，八戸港からは陸路で４時間ごとに30と，休息，反芻，睡眠を合わせた休息行動，およ© The Ito Foundation

476

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

Table 1 Sampling schedule
Day 1

Day 2

Day 3

Week1

Month 1

Arriving at the farm

2nd day

3rd day

a week after arrivinga month after arriving

day time night time

day time night time

day time night time

day time night time

day time night timeMonth 2Month 3Month 4Month 5day time

day time

day time

day time

Maintenance behaviour

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

―

―

―

―

Behaviour as events
Blood sampling

○
○

―
―

○
―

―
―

○
―

―
―

○
○

―
―

○
○

―
―

―
―

―
―

―
―

―
―

Measuring chest girth（Body Weight）

○

―

―

―

○

―

○

―

○

―

○

○

○

○

びそれ以外の行動をその他とした。採血や胸囲測

2.5定の作業時間があったため，全観察回数に対する各データについて，Shapiro-Wilk検定により正発現回数の割合を算出した。イベント的に発現す

規分布に従わないことを確認した。維持行動割合

る行動については，日中の時間帯に維持行動観察については逆正弦変換，イベント的に発現する行と並行して30秒ごとに３分間連続で１－０サンプ

動および血液検査の各項目，体重については対数リングを行った。１頭につき，１時間のうちに３変換を行った。各データについて，反復測定二元分間を４回観察した。観察した行動は，模擬闘争，

配 置 分 散 分 析 を 行 い ，多 重 比 較 検 定 に は模擬乗駕，追いかけ合いを合わせた社会的遊戯行

Bonferroni法を用いてｐ＜0.05を統計学的有意差

動，他個体に触れる，嗅ぐ，舐める行動を合わせあ り と し て 判 定 し た 。統 計 解 析 ソ フ ト は IBM

た社会的探査行動，他個体舐めを親和行動，頭振SPSS Statistics version 23（IBM, Armonk, NY,り，頭突き押し，闘争を合わせた敵対行動とした。

USA）を用いた。

2.4

生理状態と体重の評価

生理状態については，血液生化学検査によって統計解析

３．結果と考察評価した。頸静脈から採血を行い，総タンパク

3.1

（TP）
，AST（GOT），ALT（GPT），コルチゾー

維持行動の結果をTable２に示した。ペン間でル，血糖，総コレステロール（T-CHO），中性脂

有意な違いが見られた行動は，日中の摂取行動と肪 （TG）， 遊 離 脂 肪 酸 （NEFA），尿 素 窒 素休息行動であった。ペン３はペン１と比較して日（BUN），クレアチニン（CRE），トリヨードサイ

中の摂取行動の発現割合が低く，休息行動の発現

ロニン（T3），ビタミンＡを測定した。採血は搬割合が高かった（ｐ＜0.05）。また，経日変化を入日および１週間後，１ヶ月後に行った。

見てみると，日中の摂取行動発現割合は搬入１日

行動

胸囲については，肩後第８肋骨の基部を通過す

目で各ペン18.8～28.8％であったが，１ヶ月後にる帯径部における周囲の長さをメジャーで測定しは52.1～63.4％に増加していた（ｐ＜0.01）。対した。胸囲による体重の推定式は以下のとおりであて，日中の休息行動発現割合は搬入１日目ではる。

62.8～77.1 ％ で あ っ た が ，１ ヶ 月 後 に は 33.5～

推定体重
（kg）
＝55.256－2.114190×胸囲（cm）＋
0.024323×
［胸囲
（cm）
］

44.4％と低下している（ｐ＜0.01）。これは，搬入直後の12～24時間は輸送や新規の群編成によるス

２

胸囲は搬入日，搬入３日後，１週間後，そしてトレスにより，摂取行動を発現するよりも休息を１ヶ月後以降は１ヶ月おきに５ヶ月後まで測定し優先させたと考えられる。搬入３日後および１週た。

間後には日中の摂取行動発現割合がどのペンでも© The Ito Foundation

477

異なる月齢時の輸送が子牛の福祉性および生産性に与える影響
Table 2 The percentage of time spent in maintenance behaviours during day time or night time in each pen
Day 1（%） pen no.
Day time
Ingestive behaviour

mean

Day 2

±

S.D.

1

25.5 ±

2

28.8 ±

3

18.8 ±

1
2
3

mean

S.D.

18.8

40.8 ±

21.4

37.3 ±

13.7

1.9

67.0 ±
62.8 ±
77.1 ±

Month 1

S.D.

mean

±

15.5

39.8 ±

24.4

41.6

±

22.3

52.1

±

30.3

x

17.2

38.3 ±

21.5

37.9

±

25.1

53.3

±

27.4

xy

±

3.7

37.4

±

21.1

37.3

±

23.0

63.4

±

24.8

y

17.2

54.3 ±

17.5

53.6

±

26.4

55.7

±

23.0

44.4

±

28.3

x

22.5
13.5

52.3 ±
97.9 ±

15.9
4.2

54.6 ±
57.4 ±

25.6
22.1

54.0 ±
58.8 ±

25.1
33.5

42.0 ±
33.5 ±

27.9
24.8

xy
y

a

a

mean

Week 1±aResting behaviour

Day 3

±

b

a

S.D.

mean

b

b

±

S.D.

pen

day

pen*dayp valuep valuep value0.04< 0.01< 0.01< 0.01< 0.01< 0.01

0.57

0.06

0.56

< 0.01

0.45

c

b

c

Night time
Ingestive behaviour

Resting behaviour

1

12.8

±

14.7

8.5

±

8.6

10.6 ±

10.6

9.0

±

11.8

8.9

±

9.0

2
3

7.2 ±
10.2 ±

9.0
8.4

6.1 ±
6.1 ±

9.6
10.6

10.4 ±
9.9 ±

15.2
15.1

7.6 ±
8.2 ±

12.0
15.1

6.4 ±
8.5 ±

11.0
11.4

1
2
3

85.9 ±
89.7 ±
87.2 ±

14.8
10.1
10.0

89.8 ±
90.5 ±
92.0 ±

8.8
11.9
12.1

85.6 ±
83.2 ±
87.0 ±

13.1
20.4
15.5

86.5 ±
87.7 ±
89.1 ±

16.8
17.7
16.1

88.9 ±
91.0 ±
87.8 ±

9.8
12.5
13.2

0.80

pen

day

pen*dayp valuep valuep value< 0.05< 0.01< 0.05

ab

b

a

ab

b

Two-way repeated measures ANOVA
a, b, c : Different superscripts indicate a significant difference between days（ p < 0.05）
x, y : Different superscripts indicate a significant difference between pen（ p < 0.05）

Table 3 Expression times of behaviours as event during day time in each pen
Day 1（times / h）pen no.

Day 2

mean

±

S.D.

mean

Day 3

±

S.D.

mean

Week 1Month 1

±

S.D.

mean

±

S.D.

mean

±

S.D.

Social play

1

0.08

±

0.08

0.04 ±

0.04

0.35 ±

0.11

0.06

±

0.07

0

±

0

x

behaviour

2
3

0.04
0

±
±

0.07
0

0.10 ±
0 ±0.09
00.13 ±
0.04 ±

0.22
0.04

0
0

±
±

0
0

0.06
0

±
±

0.036
0

xy
y

Social investigative
behaviour120.10 ±
0.08 ±

0.18
0.14
0

0.06
0.22
0.11

0.23 ±
0.25 ±
0.23 ±
ab

0.31
0.31
0.12

0.06 ±
0.08 ±
0.02 ±
b

0.07
0.06
0.04

0.73

±

0.33 ±
0.38 ±
0.15 ±a< 0.01

0
ab

0.04
0.16
0.18

0.49

3

0.02 ±
0.17 ±
0.17 ±ab1
2
3

0.27 ±
0.35 ±
0 ±

0.28
0.27
0

0.25 ±
0.35 ±
0.04 ±

0.19
0.38
0.04

0.15 ±
0.48 ±
0.08 ±

0.16
0.37
0.14

0.13 ±
0.44 ±
0.25 ±

0.09
0.37
0.25

0.35 ±
0.19 ±
0.04 ±

0.41
0.16
0.07

0.12

0.93

0.63

0.67

< 0.010.10

abAffiliative behaviour

Agonistic behaviour

ab

a

ab

b

1

0

±

0

0.29 ±

0.22

0.31 ±

0.22

0.25 ±

0.06

0.31 ±

0.19

2
3

0.29 ±
0.10 ±

0.41
0.11

0.33 ±
0.10 ±

0.44
0.09

0.19 ±
0.21 ±

0.11
0.15

0.17 ±
0.15 ±

0.24
0.12

0.60 ±
0.21 ±

0.36
0.07

a

ab

ab

ab

b

Two-way repeated measures ANOVA
a, b, c : Different superscripts indicate a significant difference between days（ p < 0.05）
x, y : Different superscripts indicate a significant difference between pen（ p < 0.05）

40％程度であり，ストレスが緩和され，環境にもには活動性が高くなってきたと考えられる。

慣れてきたと考えられる。また，夜間の休息行動

イベント的に発現される行動の結果をTable３

発 現 割 合 を 見 て み る と ，搬 入 ３ 日 目 が 83.2～に示した。ペン間で有意な違いが見られた行動は87.0％であり，搬入２日目および１ヶ月後よりも社会的遊戯行動であり，ペン１がペン３よりも多有意に低かった（ｐ＜0.01）。搬入から２日は体く発現していた（ｐ＜0.05）。ペン１はペン３よ力的疲労や身体的ストレスにより，心身の回復のりも月齢が高い個体であるが，３日目には他個体ため休息行動が多く発現されるが，３日目の夜間と遊戯行動を発現していたということは月齢が高© The Ito Foundation

478

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）

い個体のほうが搬入２日で環境に慣れ，疲労回復の影響を受けて上昇したと考えられるが７，８），１

等も早かった可能性が考えられる。しかし，ペン

週間後には低下していた。

３は観察期間中，社会的遊戯行動を発現した回数

3.3

はわずかであった。このことから，ペン内の個体

胸囲から体重を推定した結果をFig.１に示しの気質や個体の組み合わせが影響している可能性た。ペン間で有意な違いは見られなかったが，経も考えられた。経日変化を見てみると，社会的遊

日変化では搬入後１日から３ヶ月と比較して４ヶ戯行動および社会的探査行動が３日目に発現が多月 お よ び ５ ヶ 月 で 体 重 が 増 加 し て い た（ｐ ＜く見られ，敵対行動は搬入１日目で発現が少な0.01）。搬入直後から３ヶ月程度までは体重が大かったものの，１ヶ月後には多く見られた（ｐ＜幅に増減することなく維持され，搬入後４ヶ月か

0.01）。導入後数日は社会的遊戯行動や社会的探ら順調に増加した。給与飼料のうち，濃厚飼料を査行動により，親和的関係性の構築を図っていた

20～30日につき１日当たり１kgずつ増加してお可能性が考えられた。また，１ヶ月後には環境にり，搬入４ヶ月で１日当たり８kgの給与量とな慣れて活動的になり，給餌飼料や給水器，快適なる設計で給与されていた。体重の増加は，給与飼

休息場所といった資源の争奪が起こることにより料の影響を多大に受けるため飼料設計が重要とな敵対行動が多く発現したと考えられた。

るが，本研究ではペンごとの違いは認められな

3.2

生理状態

体重変化

かったため，搬入時の月齢による影響は少ないと血液生化学検査の結果をTable４に示した。ペン間で有意な違いが見られた項目は血清CRE濃度で，ペン１がペン２および３よりも高値を示し考えられた。
４．要

約ていた（ｐ＜0.01）。血清CRE濃度は，８ヶ月齢

本研究では，異なる月齢時での輸送が，輸送後の子牛よりも10ヶ月齢でわずかに高い値を示す可の子牛の福祉性および生産性にどのように影響を能性があることから ，月齢が高いペン１で高値与えているか，明らかにすることを目的とした。

を示した可能性が考えられる。個体の影響も考え

約1,200kmの行程をフェリーによる海上輸送とトられるため，今後さらなる検討が必要である。そラックによる陸上輸送された黒毛和種の去勢オスのほかの項目において，ペン間に大きな違いは認12頭を各ペン４頭ずつ，３ペンで飼育した。各ペめられなかった。

ンの月齢は9.25ヶ月齢（ペン１），8.25ヶ月齢（ペ５）経日変化では，血清CRE濃度以外の項目で違

ン２），８ヶ月齢（ペン３）であった。福祉状態

い が 見 ら れ た（ｐ ＜ 0.01）。輸 送 直 後 に お け る

評価のために，維持行動として摂取行動と休息行

TP，血糖，T3の上昇はこれまでも報告されてい動を日中および夜間観察し，イベント的に発現するとおりであり ，１週間後には低下していたこる行動のうち社会的遊戯行動，社会的探査行動，とから輸送ストレスが解消したと考えられた。ま

親和行動，敵対行動を日中のみ観察した。生産性

た，NEFAやBUNが搬入日に上昇していたが１評価のために，血液生化学検査と体重変化をとら週間後には低下していた。NEFAやBUNの上昇

えた。体重は胸囲測定により推定した。

１）は負のエネルギーバランスによって生じるが，輸搬入時の月齢による違いは，日中の摂取行動発

送時の絶食が影響していたと考えられる。同様

現割合がペン３でペン１よりも低く，日中の休息に，搬入日のコルチゾールや血糖は輸送ストレス

行動発現割合が高かった（ｐ＜0.05）。また，社© The Ito Foundation

479

異なる月齢時の輸送が子牛の福祉性および生産性に与える影響
Table 4 Physiological reactions of calves after transported
Day 1
pen no.

Week 1

±

S.D.

1
2

7.3 ±
7.2 ±

3

7.4 ±

Serum AST（GOT）

1

（U/l）

Serum Total Protein（g/dl）

mean

pen

day

pen*day±S.D.

p valuep valuep value

0.2
0.1

6.2 ±
6.2 ±

0.3
0.2

0.63

< 0.01

0.47

0.4

6.4 ±

0.5

Month 1

±

57

92 ±

24

80

±

22

72 ±

11

0.13

< 0.01

0.11

87
b

±

6

72 ±
c

21

0.37

< 0.010.54

0.16< 0.010.83

0.31< 0.010.26

0.12< 0.010.41

0.75< 0.010.03

0.73< 0.010.79

0.83< 0.010.19< 0.01

0.52

0.32

0.85

< 0.010.05

0.62< 0.01

0.76

±

S.D.

0.2
0.3

6.4 ±
6.6 ±

0.4

6.8 ±

190 ±

112

164

2

120 ±

26

3

154 ±
a

22

a

mean

mean

b

c

Serum ALT（GPT）

1

35.5 ±

3.6

30.5 ±

7.4

21.5 ±

3.2

（U/l）

2

35.8 ±

2.9

25.3

±

7.4

19.5 ±

3.8

3

36.5

±

2.1

23.0 ±

1.7

17.5 ±

5.4

1
2

1.5 ±
3.2 ±

0.9
1.9

0.7 ±
1.1 ±

0.3
0.1

0.7 ±
0.9 ±

0.3
0.2

3

2.3
a

±

0.3

1.9
b

±

2.1

0.9 ±
b

0.3

Blood glucose（mg/dl）

1
2
3

83.8 ±
72.5 ±
76.5 ±

7.2
9.1
7.1

65.0 ±
63.3 ±
70.0 ±

2.1
5.1
4.3

60.8
57.0
58.5

±
±
±

5.1
6.0
2.7

Serum total cholesterol（mg/dl）

1
2

148.8 ±
159.3 ±

15.4
40.8

133.0 ±
131.8 ±

10.0
18.9

79.0 ±
73.8 ±

11.2
9.3

3

204.0 ±

27.6

182.0 ±

30.3

78.8

±

22.5

Serum TG
（mg/dl）

1
2
3

3.3 ±
8.5 ±
5.0 ±

0.4
7.8
1.6

9.5 ±
8.0 ±
8.0 ±

0.5
2.5
3.5

12.8 ±
9.5 ±
7.3 ±

4.7
3.5
4.5

Serum NEFA
（mEq/l）

1
2

0.77 ±
0.69 ±

0.13
0.32

0.28 ±
0.31 ±

0.04
0.05

0.35 ±
0.31 ±

0.10
0.15

3

0.72 ±

0.13

0.35 ±

0.09

0.47 ±

0.29

1
2

14.0 ±
12.3 ±

3.2
3.6

5.3 ±
6.2 ±

1.4
0.8

6.0 ±
7.1 ±

1.1
1.7

3

16.1 ±
a

2.5

4.7 ±
b

1.5

7.2 ±
b

1.7

Plasma Cortisol
（U/l）

a

b

a

b

a

c

b

a
Serum BUN
（mg/dl）

c

b

b

b

Serum creatinine

1

1.19 ±

0.04

1.24 ±

0.08

1.24

±

0.12

x

（U/l）

2
3

1.00 ±
1.03 ±

0.11
0.05

1.05 ±
0.97 ±

0.09
0.11

0.98 ±
0.94 ±

0.09
0.07

y
y

Serum T3
（ng/dl）

1
2

157.3 ±
168.3 ±

27.6
48.7

130.0 ±
103.3 ±

17.6
19.2

100.5 ±
103.8 ±

17.4
21.6

3

135.3 ±

19.0

134.8 ±

15.4

115.3 ±

17.2

1
2
3

97.5 ±
85.8 ±
93.3 ±
a

12.6
22.3
15.3

66.7 ±
54.2 ±
57.5 ±
b

6.2
9.5
12.3

60.0 ±
57.5 ±
52.5 ±
baVitamin A（mEq/l）

b

c
17.2
13.2
14.6

Two-way repeated measures ANOVA
a, b, c : Different superscripts indicate a significant difference between days（ p < 0.05）
x, y : Different superscripts indicate a significant difference between pen（ p < 0.05）

会的遊戯行動の発現回数がペン３よりもペン１で生理状態のうち，ペン間で違いが見られた項目多かった（ｐ＜0.05）。ペン１はペン３よりも月は血清クレアチニン濃度であり，ペン１がペン２

齢が高い個体であったため，月齢が高い個体のほおよび３よりも高値を示していた（ｐ＜0.01）。

うが疲労回復や環境への慣れが早い可能性が考え

クレアチニン濃度は月齢が高いことで高値になるられた。

ことがあるため，輸送が影響していたかどうかは© The Ito Foundation

480

令和２年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.39）
Pen p = 0.73
Day p < 0.01
Pen＊Day p= 0.65

BW（kg）
500

b

400

a

a

a

a

a

a

c

a

300
200
pen 1
pen 2

100
0

pen 3

Before Day 1
transport

Day 3

Week 1 Month 1 Month 2 Month 3 Month 4 Month 5

Fig. 1 Live weight of calves in each pen estimated by measuring chest girthTwo-way repeated measures ANOVA

a, b, c : Different superscripts indicate a significant difference between days（ p＜0.05）

今後さらなる検討が必要である。体重変化はペン遭われるまでに調査のご協力を賜ったことを深謝間で違いが認められなかった。

するとともに，一日も早い再建をお祈り申し上げ

生理状態および体重変化について，ペン間で違ます。

いは認められなかった。しかし，輸送直後にコル
チゾール，NEFA，BUN，TP，血糖，T3濃度の上昇といったストレス状態下の生理状態が見られた（ｐ＜0.01）。搬入月齢に関係なく，１週間後には生理状態の回復状態が認められ，体重も順調に増加していった。これらのことから，８～10ヶ
月齢の月齢間では輸送ストレス負荷は同程度であると考えられた。
謝

辞本研究を遂行するにあたり，行動調査およびサンプリングのご協力を賜った茨城県鉾田市に所在する肥育農場に厚く御礼申し上げます。また，
2019年度に本研究実施のために尽力してくださっ文献１） Ishiwata, T., Uetake, K., Eguchi, Y., Tanaka, T. :Anim. Sci. J., 79, 510～517, 2008.
２） Kegley, E. B., Spears, J. W., Brown Jr., T. T. : J.
Anim. Sci., 75, 1956～1964, 1997.
３）
 Appleby, M. C., Olsson, I. A. S., Galindo, F. :A n i m a l W e l f a r e 3 r d E d i t i o n , 1 6 ～3 5 , C A BInternational, Oxfordshire, 2018.
４）
 Grandin, T. : Livestock Handling and Transport
4th Edition, 143～173, 2014.
５） 家畜感染症学会編：子牛の医学 胎子期から出生・育成期まで，441～453，緑書房，東京，2014.
６）
 高橋俊彦，中辻浩喜，森田茂監修：ライフステー
ジでみる牛の管理―栄養・行動・衛生・疾病―，48～56，緑書房，東京，2017.
７）
 Villarroel, M., María, G., Sañudo, C., GarcíaBelenguer, S., Chacón, G., Gebre-Senbet G, :Deutsche Tierarztliche Wochenschrift, 110, 105～
107, 2003.
８） 植竹勝次：家畜診療, 55, 177～181. 2008.

た千葉県旭市に所在する肥育農場は令和元年房総半島台風により甚大な被害を受けました。被害に© The Ito Foundation

令和２年度助成研究調査一覧

本年度の対象とする研究または調査：
食肉に関する研究または調査（品質・製造加工技術，食品的価値，食品安全，遺伝育種，繁殖，動物
衛生，家畜飼養・飼料など）
単位：千円
代

表

研

究

者

継続
年数

代表者名

和牛肉のおいしさを「見える化」する（Ⅲ）
和牛ブランド間の比較

H30～

山田

知哉

農研機構中央農業
研 究 セ ン タ ー

1,000

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅱ）

R1～

竹中

慎治

神 戸 大 学 大 学 院農 学 研 究 科

1,000

牛枝肉のモモ抜けの非破壊検査用磁気共鳴スキャナー
の開発

中島

善人

国立研究開発法人
産業技術総合研究所

1,750

イミダゾール化合物が食肉の熟成に及ぼす影響につい
て

早川

徹

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,400

研
Ⅰａ

究

課

題

所属機関

助成金額

食肉の品質・製造加工技術（10件）

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅲ）

H30～

西村

敏英

女 子 栄 養 大 学栄 養 学 部

1,300

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作（Ⅱ）

R1～

本山三知代

農 研 機 構 畜 産研 究 部 門1,950

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンⅨの形成様相と存在形態に関する研究（Ⅱ）

R1～

若松

北 海 道 大 学 北 方
生物圏フィールド
科 学 セ ン タ ー

1,750

純一

食肉の風味を構成する呈味性化合物の分画およびメタ
ボローム解析

水野谷

航

麻布大学獣医学部

1,250

食肉製品の香気分析に基づく品質管理手法の開発

河原聡

宮崎大学農学部

900

次世代の培養肉作製のための骨格筋タイプ変換技術の
基礎的研究

久保

純

東 北 大 学
加齢医学研究所

1,950

畜産副生物から再生医療部材への高付加価値加工

神田

英輝

名古屋大学大学院
工 学 研 究 科

1,000

産肉量増加を目指した間葉系前駆細胞による新規血管新生機構の解明山内啓太郎

東 京 大 学 大 学 院農学生命科学研究科

1,400

コリン供給源としての食肉機能の評価

三浦豊

東京農工大学大学院
農 学 研 究 院

1,250

食肉中に含まれる２-オキソ-イミダゾールジぺプチド
に関する研究居原秀

大阪府立大学大学院
理 学 系 研 究 科

1,000

猪島

康雄

岐 阜 大 学応 用 生 物 科 学 部共 同 獣 医 学 科

1,000

Ⅰｂ

Ⅰｃ

食肉の食品的価値（４件）

食品安全（３件）

国際基準および国内と畜場の現場実態に適合した牛枝
肉の生物的危害要因制御のための内部検証方法の開発© The Ito Foundation

ハム・ソーセージに配合する食品添加物に関するリス
クコミュニケーション手法の開発ならびに効果検証

山﨑

毅

（特非）
食の安全と
安心を科学する会

1,500

R1～

堀江

正一

大 妻 女 子 大 学家 政 学 部

1,400

R1～

大和

修

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,400

肉用牛の枝肉形質および肉質の診断マーカーとしての血中マイクロRNAの動態解析

横井伯英

京 都 大 学 大 学 院農 学 研 究 科

1,600

豚胎児の成長性に影響する生体内因子の探索谷口雅章

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

1,600

黒毛和種における体型評価部位「肋付き」の客観的評
価手法の開発鈴木洋美

北海道立総合研究機構畜産試験場

1,000

遺伝子情報を用いた黒毛和種の枝肉形質と脂肪酸組成に及ぼす系統と遺伝様式の影響の解明

広岡博之

京 都 大 学 大 学 院農 学 研 究 科

1,400

牛子宮内膜での単核球の出現が分娩後の子宮修復に及
ぼす影響

三浦

亮太朗

日本獣医生命科学
大 学 獣 医 学 部

1,000

黒毛和種における経腟採卵前のヒアルロン酸添加ブタ
ＦＳＨ製剤１回筋肉内注射の効果に関する研究

及川俊徳

宮城県畜産試験場

1,400

沖縄在来豚アグーを絶滅から守るべきＬ-カルニチン処理による凍結精子作製技術の改良

建本

秀樹

琉球大学農学部

1,300

牛の低受胎を改善する技術創出を目指した子宮マイク
ロバイオーム解析内山淳平

麻布大学獣医学部

1,600

抗酸化物質を利用した牛体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産シ
ステムの開発日巻武裕

岐 阜 大 学
応用生物科学部

1,300

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究（Ⅱ）Ⅱａ

遺伝育種（５件）

牛の新規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への
影響（Ⅱ）

Ⅱｂ

繁殖（19件）

牛体外受精胚の染色体異常予測技術の開発（Ⅱ）

R1～

杉村

智史

東京農工大学大学院
農 学 研 究 院

1,300

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基礎的研究（Ⅲ）

H30～

木崎景一郎

岩手大学農学部
共 同 獣 医 学 科

1,400

妊娠末期の黒毛和種における子宮動脈血流動態および胎盤の血流面積による胎盤機能および新生子牛の健全
性の推定

伊賀

浩輔

農研機構東北農業
研 究 セ ン タ ー

900

糞および尿を検査検体として用いる簡便かつ正確な馬の妊娠診断法の開発髙橋透

岩手大学農学部

1,000

牛におけるルーメン非分解性ナイアシン給与による子宮，卵巣への血流促進による分娩後の繁殖性向上

森田康広

名古屋大学大学院
生命農学研究科

1,500

発情期における牛子宮内膜機能調節因子および調節機
序の解明

杉浦

智親

酪 農 学 園 大 学獣 医 学 群1,000

温度センサと加速度センサを内蔵する多機能尾部センサの乳牛周産期管理への利用

檜垣彰吾

農 研 機 構
動物衛生研究部門

1,100

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の
確立

久保田

海雄

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

1,300

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討小山毅

北海道立総合研究機構畜産試験場

1,200

ドライ精子による牛生産に関する研究松川和嗣

高 知 大 学
農林海洋科学部

1,400© The Ito Foundation

M T T （3［ 4 , 5 - d i m e t h y l t h i a z o l y l ］- 2 , 5 -diphenyltetrazolium bromide）を 用 い た 豚 精 液 の 評
価法の開発

内倉

健造

愛
知
県
農業総合試験場

1,100

牛初期黄体におけるPG抵抗性の解明―低酸素環境による抗アポトーシス機構―

西村亮

鳥 取 大 学
農学部共同獣医学科

1,300

黒毛和種牛における妊娠期の栄養状態が産子の繁殖能力に及ぼす影響北原豪

宮崎大学農学部

1,200

リピートブリーダー牛の原因の多角的解析によるその対策のための基礎情報収集羽田真悟

帯 広 畜 産 大 学
獣医学研究部門

1,300

オリゴクローナルな持続性リンパ球増多症を示す牛白血病ウイルス感染牛の生産性解析

猪熊壽

東 京 大 学 大 学 院農学生命科学研究科

1,600

牛難治性伝染性蹄病であるヘアリーアタックの病態解
析

谷口

喬子

宮 崎 大 学
産 業 動 物 防 疫リサーチセンター

700

カンピロバクター・ジェジュニの「生きているが培養できない状態」を復帰させるための生物学的因子の解
明

三澤

尚明

宮 崎 大 学
産 業 動 物 防 疫リサーチセンター

1,500

豚熱（CSF）ワクチン接種繁殖母豚から初乳摂取条件の異なる子豚へのCSF抗体移行と存続に関する研究長井誠

麻布大学獣医学部

1,200

尾根部の体表温度から黒毛和種育成子牛の発熱を検知する手法の開発佐々木羊介

宮崎大学農学部

1,000

帆保

誠二

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,500

病原性因子を欠損した生後感染アカバネウイルスの作
出と生ワクチンへの応用

正谷達謄岐 阜 大 学
応用生物科学部

1,600

熊本系褐毛和種における地方病性牛白血病抑制メカニ
ズムの解明

稲永

敏明

東 海 大 学 農 学 部応用動物科学科

1,200

豚の筋ジストロフィーの病態解明と生前検査法の開発

相原尚之

麻布大学獣医学部

1,600

リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法とナノポアシーク
エンス技術を用いた超迅速なウイルス塩基配列解読法
の開発

堀江

真行

京 都 大 学白 眉 セ ン タ ー

1,600

牛白血病ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する宿主タンパク質の同定

安藤清彦

農 研 機 構
動物衛生研究部門

1,700

豚消化器病ウイルスの感染メカニズムを解明するための豚腸管オルガノイドを用いた画期的なインビトロ実
験感染系の開発

鈴木亨

農 研 機 構
動物衛生研究部門

1,600

H30～

杉浦

勝明

東 京 大 学 大 学 院農学生命科学研究科

1,700

牛ウイルス性下痢ウイルスの準種END－は弱毒生ワクチンになるか？（Ⅱ）－より効果的に免疫を誘導する R1～
ための可能性の追求－塩川舞

日本獣医生命科学
大 学 獣 医 学 部

1,100

肉用牛から分離された新規病原体Rhodococcus equiの
国内感染状況の疫学調査鈴木康規

北里大学獣医学部

1,400

畜産動物用粘膜ワクチンアジュバントの開発

若尾雅広

鹿 児 島 大 学学 術 研 究 院理工学域工学系

1,500

UV-LED光殺菌を用いた，鶏病原性大腸菌殺菌シス
テムの開発

下畑

隆明

徳 島 大 学 大 学 院医歯薬学研究部

1,600

Ⅲ

動物衛生（19件）

牛呼吸器病症候群（BRDC）発症機序の解明（Ⅱ）

アフリカ豚熱の侵入リスク評価に関する疫学研究
（Ⅲ）

R1～

© The Ito Foundation

網羅的ジェノタイピングによる新規牛白血病抵抗性遺伝子の同定（Ⅱ）

R1～

目堅

博久

宮 崎 大 学産 業 動 物 防 疫
リサーチセンター

1,600

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査（Ⅲ）

H30～

森本

素子

宮 城 大 学
食 産 業 学 群

1,000

R1～

勝俣

昌也

麻布大学獣医学部

900

牧草サイレージの高品質化に向けたバイオガスプラン
ト消化液施用量の評価

三谷朋弘

北 海 道 大 学
北方生物圏フィールド科学センター

1,300

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法
の研究

保田

昌宏

宮崎大学農学部

1,500

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家
畜腸内細菌叢改善効果の検証

西本完

農 研 機 構
食 品 研 究 部 門

1,600

子牛の健全な発達を目指した消化管の上皮細胞接着微
生物叢の相互関係の解明

西原昂来

東 北 大 学 大 学 院農 学 研 究 科

1,800

ゲノム編集による高消化性暖地型イネ科牧草の開発

権藤崇裕

宮 崎 大 学フロンティア科学
総合研究センター

800

牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技
術の開発

庄司

則章

山 形 県 農 業総合研究センター
畜 産 研 究 所

1,600

木材クラフトパルプの混合割合の異なる濃厚飼料の給与が黒毛和種去勢牛の飼料消化性および第一胃内発酵に及ぼす影響前田友香

宮崎県畜産試験場

1,400

耕畜連携を目指した国産トウモロコシ子実の高品質サ
イレージ化に向けた調製条件の探索

神園

巴美

農研機構東北農業
研 究 セ ン タ ー

800

母子同品種のホルスタイン種および黒毛和種における分娩直後の母牛，分娩時の臍静脈および出生直後の子
牛のアミノ酸濃度の比較

川島千帆

帯 広 畜 産 大 学
畜 産 フ ィ ー ル ド科 学 セ ン タ ー

1,400

肉用鶏の成長効率に関与する腸管内Wntおよびその受
容体の探索

伊藤

謙

秋 田 県 立 大 学
生物資源科学部

1,600

谷川

珠子

北海道立総合研究機構酪農試験場

1,400

国産トウモロコシ子実の乾燥温度および貯蔵条件がト
ウモロコシの栄養価に及ぼす影響篠遠善哉

農研機構東北農業
研 究 セ ン タ ー

1,100

黒毛和種肥育牛の部分尿による尿中窒素排泄量の推定
方法の確立

近藤

誠

三 重 大 学 大 学 院
生物資源学研究科

1,000

ビタミンA投与が黒毛和種子牛の骨格筋成長に与える
影響

二瓶

直浩

栃 木 県 畜 産 酪 農研 究 セ ン タ ー

1,200

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用
交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響深川聡

長 崎 県 農 林 技 術開 発 セ ン タ ー

900

暑熱ストレスによる筋成長阻害のブレークスルー：筋幹細胞の活性化・増殖因子HGFのニトロ化（不活化） R1～の関与の検証（Ⅱ）

辰巳隆一

九 州 大 学 大 学 院農 学 研 究 院

1,600

家畜糞の分解効率に関わる土壌・糞中微生物の関連性～多様性と量の謎を解く

内田義崇

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,500

松﨑

正敏

弘 前 大 学農学生命科学部

1,500

Ⅳ

家畜飼養，飼料など（19件）

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究（Ⅱ）－飼養成績と腸内細菌叢に及ぼす影響－

ルーメン内繊維消化ダイナミクスに着目した採食可能量の予測モデルの開発（Ⅱ）

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可
能性（Ⅱ）
合

計

R1～

R1～

79件

105,000© The Ito Foundation

伊藤記念財団賞© The Ito Foundation

487

安部

亜津子

島根県畜産技術センター

肉用牛科長〔業績の課題名〕

黒毛和種牛肥育経営の収益性向上を目指した短期肥育技術
ならびに和牛肉の特性評価に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
黒毛和種肥育牛の生産費は肥育素牛価格の高騰や飼料価格の高止まりによって年々上昇し，収益性の確保が喫緊の課題となっている。そのために，生産コストの低減と生産された牛肉の市場価値を高めることが必要である。そこで短期肥育によるコスト低減と，和牛肉の特徴の客観評価について研究を行い，以下の成果を得た。
１．黒毛和種牛の短期肥育技術の開発（１）黒毛和種去勢牛の短期肥育における飼料給与技術
短期肥育は飼料費等の生産コストの低減に有効な手段の一つであるが，慣行肥育（29か月齢）と同等の枝肉重量と肉質を安定的に確保する技術が求められている。24か月齢出荷の短期肥育体系において，肥育前期（８～13か月齢）にバイパスタンパク質飼料を補給することで，増体量が向上し，慣行肥育と同等の枝肉成績が得られることを明らかにした。さらに飼料給与方法として，短期肥育牛に対する発酵
混合飼料（TMR）の給与効果を検討し，租飼料と濃厚飼料を分離給与する従来法で問題となっている，
濃厚飼料多給に起因する消化器等の疾病が低減され，濃厚飼料摂取量を高く維持できることを証明した。これらの肥育試験成績をもとに行った経営試算により，短期肥育は飼料費低減と牛舎回転率向上に
よって１頭あたり約５万円の収益向上効果があることを示した。
（２）短期肥育における国産飼料の活用
飼料用米，飼料イネ科の国産飼料の利用拡大は，飼料の安定確保，安全安心な牛肉生産から重要な課題である。飼料用米（破砕籾米）の配合割合が異なる肥育牛用発酵TMRの消化試験を行い，飼料の摂取量と消化・利用性の観点から，適正配合割合は乾物中14％であることを明らかにした。また，輸入乾草を飼料イネで全量代替した発酵TMRを全期間給与する肥育試験の結果，慣行と比べて肉質を大きく低下させることなく枝肉重量を確保できることを示した。
２．和牛肉の市場評価向上における官能評価技術の活用
和牛肉の市場評価向上を目指し，給与飼料の検討と牛肉の特性評価を実施してきた。特に脂肪酸組成について，嗜好型パネルによる官能評価により，脂肪含量を考慮した消費者嗜好への影響調査を行い，脂肪酸組成の違いにより脂肪含量の高低のほうが大きく影響することを明らかにし，脂肪含量を考慮した評価の重要性を示した。また，味覚センサー測定値の官能評価による検証を行い，項目によっては味覚センサー強度とヒトの官能特性とは必ずしも一致せず，官能特性評価における官能評価の必要性を示した。

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岩 崎
酪農学園大学農食環境学群

智 仁
食と健康学類

教授〔業績の課題名〕

食肉加工への超高圧利用，新規顕微鏡による食肉の顕微解析
ならびに鶏の異常硬化胸肉に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
食肉を対象とした研究領域は，食資源としての家畜の骨格筋特性からその加工特性等の理解までと広範囲に及ぶ。これまでにはいくつかの新規手技手法の食肉加工への展開と食肉科学分野での応用に関する研究を行ってきた。その内容は主に，（１）食肉加工への超高圧処理の利用，（２）原子間力顕微鏡の食肉科学への応用，（３）肉用鶏の異常硬化胸肉の性状と発現機序に関する研究に分類される。
（１）食肉加工への超高圧処理の利用「超高圧処理を利用した新規加工食肉製品の開発」を目的とし，筋原繊維タンパク質，特にミオシン
ならびにそのフィラメントの圧力変性について分光学的，電子顕微鏡学的手法等にて詳細に検討した。
さらに肉パティを適切な圧力強度で処理した後に加熱することで，低温濃度においても良好なテクス
チャーを持つエマルジョン型の肉製品製造の可能性を見出した。
（２）原子間力顕微鏡の食肉科学への応用
走査プローブ顕微鏡の一種である原子間力顕微鏡を用いた食肉科学分野でのナノレオロジー解析において実績をあげた。主たる業績として，溶液中の加熱あるいは加圧変性したミオシンフィラメント線維の微細構造観察と局所物性（ナノレオロジー）解析を実施し，それら弾性率の温度ならびに圧力依存性
がゲル（バルク）の弾性率変化と一致していることを見出した。さらに，食肉の熟成過程における筋原
線維構造のナノ弾性計測に成功し，食肉の軟化機構における脆弱部位を明確に示してその理解の一助とした。
（３）肉用鶏の異常硬化胸肉の性状と発現機序に関する研究
2013年ごろから世界的に肉用鶏の胸肉異常である異常硬化胸肉（wooden breast）が頻発している。
この異常硬化胸肉の組織化学的特徴と発現鶏の臨床的所見から，飼育の比較的初期にその兆候が現れることを明らかにした。また，異常硬化胸肉を発現する鶏では筋ミトコンドリアに異常があり，その異常の程度が発現の有無に関係していることを明らかにした。さらに，異常硬化胸肉の死後熟成による生化
学的組織学的変化についても明確にし，その利用の可能性についても調査を進めた。

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学会等事業助成© The Ito Foundation

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令和２年度学会等事業助成実施報告書
シンポジウム『豚の感染症と私たちの暮らし―豚熱とアフリカ豚熱の現状と対策』に関する開催報告
公益社団法人日本獣医学会

代表理事

久和

茂（東京大学）〔開催主旨〕
畜産動物の健康管理は獣医学の主要な研究テーマの１つである。なかでも家畜の感染症は多くの動物に拡散する可能性があり，発生した場合には莫大な経済的損失をもたらすため，一般市民の方からも大きな関心が寄せられている。近年，豚の重大感染症の発生が国内外で頻発しており，マスコミで報道されることも多いため，一般市民の関心も大きくなっている。豚熱（旧：豚コレラ）は，2018年９月に岐阜県で発生したのち，終息することなく2020年12月現在，北は東北地方，南は沖縄県にも拡大している。
一方，アフリカ豚コレラは中国，韓国をはじめとするアジア各国で猛威を振るっており，旅行客によってウイルスに汚染された食品が日本国内に持ち込まれるリスクが現実のものとなっている。つまり，これらの感染症により，豚肉の安定供給に大きなリスクが生じており，病原体の海外からの侵入と国内での拡散を防ぐには，いまや国民が一団となって協力し行動しなければならない状況である。このため，
市民公開講座「豚の感染症と私たちの暮らし」を開催し，豚熱とアフリカ豚熱とはどのようなものであるか，またそれがどのように拡がり，それを防ぐにはどのような対策をとる必要があるのか，現状と対策について，一般市民の方が理解できることを目的として市民公開講座を開催した。なお，本年はCOVID-19のまん延の影響から，ZOOMを利用したオンラインセミナー方式で実施した。
〔開催概要〕
令和３年２月７日（日）14：00－15：40にZOOMを利用したオンラインセミナー方式にて，一般市民を対象とした市民公開講座を開催した。事前に約700名の申込があったが，当日の参加者は約280名であった。また，シンポジウムの講演を動画に編集し，本学会HPにて，同年３月31日まで一般に無料公開した。さらに，講演内容については小冊子にまとめ，3000部を印刷し，関係機関（獣医系大学，日本養豚協会，日本養豚開業獣医師協会等）へ無償配布した。
〔シンポジウムプログラム〕
開会挨拶
講演①

14：00－14：05

久和茂（日本獣医学会理事長）

14：05－14：45

演題：豚熱（CSF）の現状と今後の展望－食生活への影響はあるのか
演者：迫田義博

北海道大学大学院獣医学研究院教授

座長：内田和幸東京大学大学院農学生命科学研究科

准教授© The Ito Foundation

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講演②

14：45－15：25

演題：アフリカ豚熱（ASF）の脅威および国内／農場侵入ルートと対応策
演者：末吉益雄

宮崎大学大学院医学獣医学総合研究科教授

座長：大澤健司

宮崎大学大学院医学獣医学総合研究科

教授

総合討論・質疑応答
閉会

15：25－15：35

司会

猪熊壽（日本獣医学会理事）

15：40〔講演概要〕
講演①「豚熱（CSF）の現状と今後の展望－食生活への影響はあるのか」
迫田

義博（北海道大学大学院獣医学研究院教授）

2018年９月に26年ぶりに国内で豚熱（CSF，以前の病名は豚コレラ）が発生し，２年が過ぎたが，ウ
イルスが野生動物であるイノシシで感染拡大しており，結果として豚での発生も60事例を超えた。豚にワクチンを接種して対応しているものの，ワクチンはその性能上，ウイルス感染を完全に防ぐことができないため，今後もワクチン接種農場での発生が懸念される。問題の根本解決には，イノシシからウイ
ルスを完全に追い出す必要があるが，そのゴールには10年以上の努力の継続が必要であり，生産者にはそのための支援が必要である。豚熱ウイルスは豚とイノシシのみに感染し，ヒトへは感染しない。豚熱清浄化への道のりは長いが，関係者は最善の衛生管理を続けており，スーパーに並ぶ豚肉はこれまで通り美味しく安全なので，各位には安心して豚肉の消費をお願いしたい。
講演②「アフリカ豚熱（ASF）の脅威および国内／農場侵入ルートと対応策」
末吉

益雄（宮崎大学大学院医学獣医学総合研究科

教授）

アフリカ豚熱（ASF）は国内で発生している豚熱とは原因ウイルスが違う，まったく異なる豚の高致死性の熱性出血性伝染病である。ASFウイルスは４℃で525日間以上，pH 3.9～13.4で７日間生残する。
死亡イノシシ体中，感染豚由来加工肉製品内では３～６ケ月間生残する。ASFの伝播は感染豚・イノ
シシ等との直接的・間接的接触だけではなく，ダニの媒介もある。ASF流行はアフリカと一部の地域に限局していたが，2007年４月にジョージアに侵入して約10年間で欧州・ロシアにまん延し，2018年８月に中国に侵入して，約１年間で東・東南アジア諸国にまん延した。国内の国際空港等で摘発された手荷物等の肉製品等からASFウイルス遺伝子が89件（うち３件は感染性有）検出された（2020. 10. 25）。
これらは氷山の一角であり，すでに国内にはASFウイルスが侵入している可能性もあり，いつ，どこで発生してもおかしくない状態である。有効なワクチンはなく，消石灰散布による消毒も期待できない病気である。一般の皆様にもご注意を願いたい。

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日本食肉研究会 令和２年度事業助成の実施報告
日本食肉科学会理事長

坂田亮一（麻布大学名誉教授）

１．はじめに
標記の事業の項目として，（公財）伊藤記念財団から今回助成を受けたのは，（１）海外派遣事業の補助（国際食肉科学技術会議派遣），（２）国内における研究会でのセミナー，および（３）第68回国際食肉科学技術会議（2022年

神戸開催，日本食肉科学会主催）の組織委員会の運営の補助などである。

昨年８月に実施された（１），昨年９月および今年３月に行った（２），および昨年度の組織委員会の活動（３）まで，各項目の実施内容を順次報告するが，これらの助成を受けた「日本食肉研究会」の概要について以下に記す。
２．日本食肉研究会等の概要
本会は昭和34年（1959年）４月に発足し，食肉に関する分野について広く学界，業界，団体関係者がお互いの研鑽の場として，学術と産業の発展を目指し，「日本食肉研究会」の名称で長年活動を行ってきた。
本会では毎年，研究会大会（学術講演会）の開催，ならびに会誌として「食肉の科学」を発行している。研究会は通常，日本畜産学会大会の開催に合わせて春に実施され，食肉および食肉加工に関連する分野のエキスパートによる特別講演，ならびに会員による研究発表を行い，活発な意見交換がなされている。これらの研究会の発表要旨ならびに，総説，解説，海外事情，最近の文献紹介などが「食肉の科学」に満載されている。
設立40周年の1999年に横浜で第45回国際食肉科学技術会議（International Congress of Meat Scienceand Technology, 通称ICoMST）を開催し，会員相互一体となって運営を行った経緯がある。この国際会議は毎夏に欧州と他の国々で交互に開催されている。その各国代表者会議での話し合いで，2022年（第68回）にわが国で再び開催する運びとなり，ICoMST2022の成功に向けて国内受入組織である本会は重要な役割を担っている。
一昨年は，研究会創設60周年という記念すべき年となり，３月30日の大会で記念式典が開催された。
ヨーロッパから２名の招待講演者を迎え，会場となった麻布大学に多くの参加者が詰めかけ盛大なセレ
モニーとなった。これらの行事に関しても，日本食肉科学会ホームページで紹介している（http://
jmeatsci.org/）。その詳細は，一昨年発行した本財団助成研究報告書１）に，また同内容で「食肉の科学」
60巻１号２）にも掲載した。
昨年３月の第61回日本食肉研究会大会は，京都大学農学部での畜産学会大会に関連して行うことになっており，また多数の演題申し込みと協賛もあったため，鋭意準備を進めていたが，新型コロナウイ
ルスの感染拡大により，やむなく中止となった。前回を超す演題申し込みと協賛もあっただけに，真に残念な決断であった。2022年に開催する国際食肉科学技術会議を見据え，学術情報交換や人脈拡大など© The Ito Foundation

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期待されていた大会であっただけに断腸の思いであった。
このことは昨年の本報告書にも記述している３）。そこで，本会の活動が停滞することを懸念し，春の大会に代わる特別セミナーを昨年秋（９月19日）に開催した（図１）。初のリモートでの大会であったが，コロナ禍中の医療と食肉産業の現場の話題は大きな反響があり，約80名の参加があった。そこで，活発な意見交換が交わされ，会員にも現状を知るよい機会になった４）。
本研究会は，今年度から「日本食肉科学会」に改称した。その理由は，来年に迫った第68回国際科学技術会議の神戸開催を成功させるには産官学からの会員が一体となって内部強化を図ることが急務であること，また関係諸方面に主催団体の活動を訴えるためにも，学会化は重要であるとの会員の声を受けてのことである。この学会化にあわせ

図１ 昨秋のセミナー要旨集の表紙て，本会が発行している「食肉の科学」のバックナンバー
すべてを電子化しており，会員はオンラインで閲覧可能となった（発行後２年経過した全号）。
本学会の会員数は，本年６月30日現在で，正会員178名（前年160名），学生会員17名（前年６名），賛助会員６社（前年６社），特別会員32社（前年31社），名誉会員８名（前年９名）である。
３．今回の助成結果（１）海外派遣事業の補助
国際食肉科学技術会議ICoMSTは毎年８月中旬に開催され，本会からは，会長，副会長あるいは常任
幹事の中から１名を派遣してきた。その際，代表者会議に出席し，会議報告を本会機関誌の「食肉の科学」に掲載し，内容を会員に周知することが義務づけられている。この海外派遣事業の補助を受け，2019年の第65回会議には本会から会員４名が参加した。
2022年に神戸で開催される68th ICoMSTに向けて，組織委員会メンバーの大半が，昨年８月USAフ
ロリダのオーランドでの国際会議に参加すべく準備を行っていたが，その年になってCOVID-19の勃発という思いもよらない事態が生じ，前年春の日本食肉研究会も余儀なく中止となった。
ICoMST本部（アイルランド）からは，この世界的なパンデミックにより米国の会議は１年延ばし，それに続く予定国の会議は１年スライドし，日本も中止にしないでもらいたいとの通告を昨春に受けた。ICoMST2022組織委員会としても，それに従い，神戸での会議を延期することで意思統一していた。
しかし，まもなくして，exclusively virtual meeting すなわち，オンラインでの開催がアナウンスされた。
毎年開かれてきたこの会議としては，このような形式での開催は初めてのことであった。これまでと違って，会議登録は早割をやめて開催間際まで受け付けられ，一般参加は１名200ドル（学割あり）に抑えられた。我々組織委員会としても，この海外派遣事業の補助を活用し，大いに参加を呼びかけた結果，参加人数は30名にのぼり，これは主催の米国に次ぐ人数であった５）。写真１に初日（８月３日）の© The Ito Foundation

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開会式の様子を示す。
ICoMST2020のバーチャル開催に対して，参加した日本の組織委員会メンバーからの意見をうかがった。ある委員から，良かった点は講演画面の字幕が講演内容の理解の助けになったことと，講演（録画）を後から見直すことができたことで（写真２），良くなかった点は，学会自体のHPがなく，スケジュールがわかりにくかったことや，使用する機器の性能（マイク感度や画面の解像度など）に影響を受け，小さい文字が見えにくく，

写真１ 会議開始のカウベルを鳴らすLonergan委員長，

毎回恒例のセレモニー（WEB画面より。最終日の終了時も鳴らす）

またZoomによる質疑応答では音声が聞き取り難いことなどであった。また，講演の字幕付き配信
はネイティブでない視聴者からでも理解しやすいものであったが，事前録画や大会運営は非常に苦労があったものと思われる。
本来顔と顔を合わせ，１週間近く一緒に同じ空気を吸うことで，学術上の意見交換が保たれ，国際的な人的交流も図られるのが，この会議の伝統であり特徴である。コロナショックの中，リモー
ト様式が当たり前になり，画面越しにしかコンタ
クトできないのは，この会議の主旨にそぐわないことも事実である。実際コロナ感染拡大が起こった当初，会議開催に関して，延期してでも従来方式を踏襲するようICoMST本部でも声明を出していたが，米国側に押し切られた感がある。2022年，
日本主催の時にいまだコロナ禍が収束に至ってな

写真２ 日ごとの講演画像と論文が見られる会議WEB

いならば，その判断が問われるであろう。
（２） 国内における研究会でのセミナーの補助「日本食肉研究会」は，周知のようにミートサイエンスに関する研究者，業界人などの集まりで，毎春に大会（学術講演会）を開催してきたが，先に記したようにコロナ禍で2020年は中止となった。今回，春の大会に代わる集会を「秋期特別セミナー2020」という形でオンライン開催し，コロナ禍の中での医療・家畜生産および食肉産業の現場での話題をあげ，専門家による講演を行った４）。
このセミナーは東京飯田橋にあるTKP市ヶ谷カンファレンスをキーステーションとして，2020年９月19日13：30～17：00の設定で開催した。Zoom配信により，令和元年度伊藤記念財団賞受賞講演（受賞者は林利哉・名城大学農学部教授：司会は宮口右二・茨城大学農学部教授）に続き，本題のセミナー© The Ito Foundation

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が始まった（写真３）。セミナーでは，順に桑平一郎
氏（東海大学：東京病院呼吸器内科特任教授），伊藤貢氏（愛知県：あかばね（有）動物クリニック代表・
獣 医 師）お よ び 竹 内 裕 嗣 氏（東 京：大 和 食 品 工 業（株）代表取締役社長）の諸氏が講演を行った。総合
司会は松石昌典氏（日本獣医生命科学大学教授，日本
食肉研究会副会長）で，それぞれの講演の座長は坂田，押田敏雄会員（麻布大学名誉教授，日本食肉研究会監事）および西海理之会員（新潟大学教授，日本食

写真３ 特別セミナー配信会場で講演者と進行役

肉研究会常任幹事）の順に担当した。また，閉会挨拶
は有原圭三会員（北里大学獣医学部教授，日本食肉研究会副会長）が執り行った。
林氏の「伊藤記念財団賞受賞講演」の受賞題名は「筋肉・食肉タンパク質の機能・加工特性に関する研究：ゲル化特性，変性・分解挙動，生理活性」で，その詳細内容は「食肉の科学」2020年第１号６）に掲載されている。研究の概略は食肉・食肉製品の機能改善に関する内容で，特に有用微生物を用いた発酵や加熱処理といった食肉加工技術によって，より安全で美味しく，かつ機能性が強化された高付加価
値な製品の創製を目指し，①レトルト食肉の機能維持・改善，②低温性乳酸菌を用いた食肉の機能改善についてであった。
今回の秋期特別セミナーの受講者はあらかじめオンライン登録をした日本食肉研究会会員が主で，北海道から九州まで80名が受講した。講演で，桑平氏は発症の機序，症例のCT画像，感染対策などについて詳述された。伊藤氏は，コロナ以外の畜産や食肉産業に影響を及ぼす可能性がある感染症についても触れ，それらの対応についても述べられた。竹内氏は信用をベースに事業を展開し，消費者ニーズに合致した商品開発を進めたいと力説され，それぞれの講師からコロナ社会で我々が生活していくために貴重な情報を拝聴できたと，会員からも賞讃の声が得られた。
本年３月の定例大会（第62回日本食肉研究会大会）もオンライン形式で開催し，令和２年度伊藤記念財団賞の佐々木啓介会員（農研機構）の受賞講演「食肉の官能特性評価と消費者受容に関する研究」，
ならびに特別講演で，Dr. Wangang Zhang（南京農業大学教授）による「Protein post-translational
modification in fresh meat: emphasis on the effects of S-nitrosylation on beef tenderness」および Dr.
Peter McGilchrist（University of New England上級講師）による「Japanese consumer perception ofAustralian grass fed and Japanese Holstein beef」（写真４）を配信し，質疑応答をライブで行った。
前大会では，米国，ロシアから招聘予定だった研究者の講演が大会中止によって実現できなかったが，今回の成功により本助成による国際交流事業を継続できたことは，来年に迫った国際会議の主催にあた
り大きな収穫であった。
（３） 第68回国際食肉科学技術会議運営の助成
2022年，神戸開催を目指し，組織委員会を３年前に立ち上げ，鋭意準備を進めている。一昨年８月は，
上記ポツダムでの65th ICoMSTに組織委員会メンバーを派遣し，情宣活動を実施した。昨年は上記の© The Ito Foundation

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通り米国での66th ICoMSTがコロナ感染拡大でリモートになり，派遣の機会がなかったが，大勢の組織委員会メンバーが参加した。昨年から組織委員会はほぼ２カ月ごとに精力的に会議を開き，そこで活発な意見交換を行っている。
農林水産省，厚生労働省ならびに各種食肉関連
団体，学会等から後援承諾を得ており，作成した趣意書を関連企業や団体に配布し，協賛金の写真４ 特別講演セミナーの講演者と座長（河原聡会員，宮崎大学教授）

依頼活動を展開している。そのためにNews
Letterを本年から発行し（図２），組織委員会
活動の広報に努めている。
一方で，コロナウイルス感染拡大の中で，会議の様式について，ICoMST本部ならびに本年第67回会議をバーチャル形式で開催するポーラ
ンドの組織委員会と連携し，国際情勢も見ながら開催に向けて鋭意検討中である。
４．おわりに（公財）伊藤記念財団からの学会・研究会など学術集団への活動助成は今年で５回目となった。平成30年度まで順調に大会を開催し，外国人研究者招聘等を実施することができた。しかし，その後の予期せぬ新型コロナの発生により，大会の中止に至るなど混乱をきわめた。このパンデミックの中で，昨年度はリモート方式を駆使し，すべての助成事業を行うことができ

図２ 第 68 回 国 際 食 肉 科 学 技 術 会 議 組 織 委 員 会 の News

Letter No.1

たことは，本会を運営するうえでも大きな進歩と言える。国際会議参加，来年神戸での国際会議開催を見据えての諸外国のキーパーソンとの交流など，
この海外派遣とセミナーの事業助成効果は確実に上がってきたと判断する。実際，昨年度の活動の中で画面越しに英語でのコミュニケーションも図られたことは，この助成による成果であると感謝する。
来夏の神戸開催が予定通りできるよう，コロナ社会の中でもできる限りの準備は，組織委員会をフルに稼働させて進める方針である。
ここに，助成をいただいた（公財）伊藤記念財団の皆様に深謝し，引き続き本助成の増強を日本食肉研究会あらため日本食肉科学会として衷心よりお願い申し上げます。

© The Ito Foundation

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参考資料
１）
 坂田亮一：日本食肉研究会への平成30年度事業助成実施報告，平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書．
Vol.37, 521～524, 2019．
 坂田亮一，山之上稔，若松純一，本山三知代，参加者13名：第65回国際食肉科学技術会議に出席して，食肉の科学，
２）
Vol.60, No.2, 203～217, 2019．
３）
 坂田亮一：日本食肉研究会への平成31年度・令和元年度事業助成実施報告，令和元年度食肉に関する助成研究調
査成果報告書，Vol.38, 443～447, 2020．
 押田敏雄，坂田亮一：日本食肉研究会秋期特別セミナー2020 －新型コロナウイルス感染症における医療・家畜生
４）
産および食肉加工の現状－，食肉の科学，Vol.61, No.2, 194～201, 2020．
５）
 坂田亮一，日本食肉研究会 ICoMST2022 組織委員会一同：第66回国際食肉科学技術会議（ICoMST2020）米国
開催の概要，畜産技術，2020年１号, 51～58, 2020．
 林 利哉：筋肉・食肉タンパク質の機能・加工特性に関する研究 －食肉製品の高付加価値化を目指して－，食肉６）の科学，Vol.61, No.1, 25～35, 2020．

© The Ito Foundation

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令和２年度事業実施報告書
日本畜産学会第 128 回大会（オンライン開催）
公開シンポジウム
市民公開シンポジウム１「地球温暖化：暑熱ストレスによる家畜・家禽の生産性低下の科学的理解と対応策の展望」
公益社団法人日本畜産学会

理事長

柏崎直巳（麻布大学）〔日時〕2021年３月28日（日）13：00～15：30〔会場〕Zoom第１会場（講演録画配信とライブ質疑応答）および講演動画とライブ質疑応答の録画を一般公開（シンポジウム終了後から４月３日24時までオンデマンド配信）〔主催〕公益社団法人日本畜産学会〔共催〕九州大学大学院農学研究院〔企画〕日本畜産学会第128回大会実行委員会（大会長：古瀬充宏）〔プログラム〕（それぞれ約20分の講演）
講演１．
「飼料給与面からの肥育豚における暑熱対策」
脇屋裕一郎氏（佐賀県畜産試験場）
講演２．
「夏季暑熱による乳牛の生産性低下の科学的理解と対応策の展望」
黒川勇三氏（広島大学・瀬戸内圏フィールド科学教育研究センター農場）
講演３．
「現代ブロイラーの暑熱対策と生菌剤を用いた夏場生産性の改善」
山下祐樹氏（株式会社ジャパンファーム）
講演４．
「株式会社ニチレイフレッシュファームにおける暑熱ストレスによる生産成績への影響とその対策」
佐々木隆行氏（株式会社ニチレイフレッシュ）
講演５．Livestock Production Concerning Global Warming：A Case Study in Thailand」
Sanchai Jaturasitha氏（Chiang Mai University, Thailand）
総合司会者（座長）：
豊後貴嗣氏（広島大学大学院統合生命科学研究科）
Vishwajit Sur Chowdhury氏（九州大学基幹教育院）
ライブ質疑応答（総合討論：約30分）：© The Ito Foundation

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Zoomのチャット機能により各講演に対する質問を受け付けた。すべての講演が終了した後，寄せられた質問に対して演者が回答した。時間内に対応できなかった質問とその回答を質疑応答集として４月５日にHPに掲載した。
〔講演動画とライブ質疑応答録画の一般公開〕
本シンポジウムの市民公開にあたり，福岡県内の農業高校４校および農業関係者にパンフレットなどを配布したほか，九州全域の農業関係者に電子媒体にて案内を行った。すべての講演動画とライブ質疑
応答の録画を，シンポジウム終了後から４月３日24時までオンデマンド配信するとともに質問を受け付けた。
〔開催概要〕
地球温暖化を原因とする諸問題の１つに食料生産効率の低下がある。家畜・家禽産業において，特に夏季の暑熱環境による生産性の低下は大きな経済的損失を招く深刻な問題である。世界人口の急速な増加と関連して，食肉（特に鶏肉）の消費量がアジア諸国や南米などで急増していることを考えると，良質なタンパク質供給源である畜産物の夏季における生産性を格段に向上させる方策が喫緊の課題であると言える。
暑熱環境による家畜・家禽の生産性低下をブレークスルーするためには，繁殖・育種・栄養・生産物などのさまざまな要素を統合的に理解することが重要である。それぞれの専門分野で精力的に研究をされている２名の日本人研究者から最新の知見をご講演頂いたほか，国内企業２社と国外の大学（タイのチェンマイ大学）の講演者から暑熱環境下での畜産業の現状と改善策が紹介された。総合司会者２名を配置し，本課題の現状と解決策を展望するため約30分の質疑応答を行った。
本シンポジウムにより，研究者および農業関係者に対しては，今後求められる「暑熱環境下での畜産業の発展モデル像」がより鮮明になったとともに，オンデマンド配信により「地球温暖化」の影響を考える市民公開型事業に相応しい良質な情報発信になったと評価された。
講演録画配信とライブ質疑応答を行ったZoom第１会場には150名前後の参加者があり（最大数は159
名；本大会の参加登録者総数634名の約25％相当数），質疑応答は計14件であった。また，オンデマンド
配信による市民公開の視聴者数は91名であった。そのうち46％にあたる42名が農業関連の会社員等（会社員／公務員／自営業者）であった。一方，農業以外の会社員等が29％（26名），研究教育者が11％（10名），その他10％（９名）と，多様な属性を持つ方々に視聴いただくことができた。さらに報道関係者
も４％（４名）確認され，講演内容の積極的な取材が行われたと考えられた。次にシンポジウムの情報を得た方法については，視聴者の48％が日本畜産学会128回大会HPからと答えている。これに知人から教えてもらったという回答を含めると82％にのぼり，多くの視聴者がシンポジウムのみならず日本畜産学会128回大会に関心を持っていたと考えられた。それ以外に，配布された広告で知ったという回答も６％（６名）あり，積極的な広報活動が今後も望まれる。これらの分析結果が上記の総評を裏付けている。高校生や大学生の視聴がなかったことは残念であった。
なお，本シンポジウムを含む第128回大会を従前通り対面式で実施することを予定していたが，コロ© The Ito Foundation

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ナ禍によりオンライン式に変更を余儀なくされた。このため，当初予定していたとおりに予算を執行することが困難となった。貴財団の了解を得て，助成金は本シンポジウムを含めて第128回大会の運営に適切に支出したことを申し添える。ここに記して，貴財団のご理解と柔軟なご対応に感謝の意を表するものである。

© The Ito Foundation食肉に関する助成研究調査成果報告書
Final Reports for Research Grants for Meat and Meat Products

令和２年度（Vol. 39）
2021年11月

発行

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