中央味噌研究所研究報告ᆅ ሱ Ӓ ਽ ‫֖ ڨ‬
ࢲ਽ ²¹ ࢳ࣊ᆅሱӒ਽Ⱦɛɞᆅሱ‫֖ڨ‬

─ 49 ─

No.40（2019）中央味噌研究所研究報告

No.40（2019）

研 究 報 告味噌による DNA 損傷抑制効果Ⅱ

石田

万里 1，坂井千恵美 1，田代聡 2，粟井和夫 3，吉栖

正生 4，石田隆史 4

The effect of Miso on radiation-induced DNA damage

Mari ISHIDA 1, Chiemi SAKAI 1, Satoshi TASHIRO 2, Kazuo AWAI 3,
Masao YOSHIZUMI 4, Takafumi ISHIDA 4
1

Department of Cardiovascular Physiology and Medicine,2
3

Research Institute for Radiation Biology and Medicine,

Department of Diagnostic Radiology, Hiroshima University,
1-2-3 Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551, Japan.

4

Departmrnt of Cardiovascular Medicine, Fukushima Medical University,
1 Hikarigaoka, Fukushima, 960-1295, Japan.

作用をもつ成分が被ばくの影響を減弱させる可能性が【背景と目的】ある3)。本研究の目的は，放射線被ばくによる障害を2004年の Lancet 誌に，医療先進国15カ国の年間の薬品などではなく，抗酸化作用をもち古来十分に安全

エックス線検査件数は，単位人口あたりで日本が世界性が認められている味噌という食品によって防御でき

一多く，日本ではがんの3.2％が医療被曝，特に画像るか否かを明らかにすることにある。

診断における被曝に起因すると推測される，との報告がされた1)。しかしその一方で，日本は放射線被曝の少ない国よりも平均余命は長く，各種画像診断によっ【方法】て疾病が早期に発見されるなど，メリットがデメリッ
トを上回っているとも考えられる。

（１）味噌の抽出

一方，2013年の British Medical Journal に，0 ～味噌は中央味噌研究所より供与された米味噌３種

19歳までに診断目的でCT検査を行った68万人の約10(米味噌，米味噌（白），米味噌（麹入り），麦味噌

年後までの発がんリスクは，CT 検査を受けていない

１種，豆味噌１種を使用した。味噌の成分の抽出方

人に比べ1.24倍であったと報告された 2)。コホートの法として，手順の煩雑さ，抽出液中の塩分濃度，浸規模を考慮すると，私たち医療従事者はこのエビデン

透圧等を鑑み，メタノールを用いた抽出法を選定しスを真摯に受け止めるべきであり， CT 検査時の被ばた。これまでの報告を参考に 4)，各味噌10ｇを20 mL

く量そのものと被ばくの影響の低減に力を注ぐ必要がのメタノールに溶解し，濾紙で濾過後，0.20μmセある。

ルロースアセテートフィルター（DISMIC® - 28CP，

被ばくの影響とは，細胞内でラジカルが生じること

ADVANTEC，東洋濾紙）を通して滅菌した。

によって化学結合が切断されたり分子の酸化が生じ，DNA の切断が起こることである。したがって抗酸化
広島大学大学院医歯薬保健学研究科
TEL: (082) 257-5122

心臓血管生理医学〒 734-8551

FAX: (082) 257-5124

E-mail: mari@hiroshima-u.ac.jp

─ 50 ─

広島市南区霞 1-2-3

中央味噌研究所研究報告

No.40（2019）

3.00

（２）細胞
培養細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を使用した。細胞は内皮細胞基本培地 - 2（EBM ® - 2）2.50を用いて，37 ℃，5 ％（v/v）CO2 の条件下で培養した。

γH2AX foci

2.00

（３）DNA 損傷刺激HUVEC を 22 x 24 mm カバーガラスに播種し，接

米味噌２
（白）

1.50

着後メタノール抽出した味噌を添加し24時間後に，Ｘ線照射装置 CP - 160 を用いてＸ線を照射した。

米味噌３

1.00

味噌なし
豆味噌

（４）DNA 損傷の程度の評価

米味噌１
麦味噌 （麹入り）

0.50

DNA 損傷とくに二本鎖切断が生じると傷周辺のヒストン H2AX は直ちにリン酸化される。これを利用し，DNA 損傷（二本鎖切断）の程度はリン酸化

0.00

H2AX（γH2AX）の抗体を用いた蛍光免疫染色によ

Ctl

Rad後 30 min

Rad後 24 h

5)

り評価した 。X線照射後30分（最大 DNA 損傷時），

図１．放射線照射後のγH2AX focus 数の変化
および各味噌の効果

24時間（DNA 修復後）に細胞を 4 ％パラフォルムア
ルデヒドにより固定し，γH2AX 抗体を用いた蛍光免（n = 3, mean ± SD）

疫染色を行った。Zeiss 社 Metapher を用いて画像を撮影し，細胞核内のDNA damage focus の数を自動表１．対象者背景

カウントした。細胞100個分の平均値を算出し，溶媒（メタノール）のみを添加したコントロールと比較し´µ®° Ă ±³®¶

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た。

႒‫ܤ‬෗

２．In vivo 実験
In vitro 実験で効果のあった味噌を15ｇ使用して味֞‫أ‬෯ɂ

噌汁を作成し健常人に摂取させた。摂取前と摂取翌日に採血を行い，Ｘ線照射装置 CP - 160 を用いて血液にＸ線（100 mGy）を照射した。照射30分後に，検体からリンフォプレップを用いて単核球を分離・固定し，DNA 二本鎖切断をリン酸化ヒストン H2AX
（γH2AX）抗体を用いて免疫染色した。

加し，24時間後にほぼ前値に戻った（図１）。放射線照射前（ 0 Gy），100 mGy 照射後30分，100 mGy 照射後24時間において，それぞれ味噌を投与していな【結果と考察】い細胞の DNA 損傷量と比較を行った。放射線照射後

１．In vitro 実験

30分においては米味噌１（麹入り）および麦味噌が最近の CT による医療被曝と同等の DNA 損傷量

DNA 損傷を抑制していた。照射後24時間では，米味を得るため，100 ｍGy，200 mGyの放射線照射を行

噌１（麹入り），麦味噌と豆味噌において DNA 損傷

い，DNA 損傷の程度を比較した。最近の低線量肺が抑制されていた。以上より，麹入り米味噌および麦CT によってできる DNA 損傷（γH2AX focus 数）

味噌は放射線照射直後の DNA 損傷の生成を抑制し，は 3.30 ± 2.4 個 / 細胞，今回の実験のＸ線照射装置に

米味噌１（麹入り），麦味噌１および豆味噌は生じたよる照射 100 mGy で 4.07 ± 0.66 個 / 細胞，200 ｍGy

DNA 損傷の修復を促進すると考えられた。

で7.29 ± 0.99 個 / 細胞であることから，本実験では100 mGyを照射量として選択した。

２．In vivo 実験

ヒト内皮細胞に放射線 100 mGy を照射すると，味In vitro 実験で用いた味噌のうち DNA 損傷抑制効

噌の有無にかかわらずγH2AX focus 数は30分後に増果のあった麦味噌を実験に用いた。細胞に投与した濃─ 51 ─

中央味噌研究所研究報告

No.40（2019）度から人に投与する量を15ｇと算出し，これを用いて加率を算出したところ，味噌の摂取による差が認めら

味噌汁を作成し摂取させた。対象は健常人８名で背景れなかった（図２）。

は表１に示す。
照射前（ Ctl ）のリンパ球のγH2AX focus 数を100

リンパ球のγH2AX focus 数の実数を味噌摂取前後％とし，100 mGy Ｘ線照射後のγH2AX focus 数の増で比較すると，味噌の摂取によってγH2AX focus

リンパ球 γH2AX focus 数

300
250
200

■ Ctl

％

150

■ Radiation 後

100
50
0

味噌投与前

2.5
2

味噌投与前

味噌投与後

1.5
1
0.5
0

Ctl

放射線照射後Ctl

放射線照射後味噌投与後図３．味噌摂取前と後のγH2AX focus 数

図２．放射線照射によるγH2AX focus 数増加に対する味噌の効果（n = 3, mean ± SD）（n = 3, mean ± SD）

2.5
2
1.5
1
0.5
0

2.5
2
1.5
1
0.5
0

Ａ

Ctl

IR

miso miso IR

Ｄ

Ctl

IR

miso miso IR

2.5
2
1.5
1
0.5
0

2.5
2
1.5
1
0.5
0

Ｂ

2.5
2
1.5
1
0.5
0

Ctl

IR

miso miso IR

Ｅ

Ctl

IR

IR

miso miso IR

2.5
2
1.5
1
0.5
0

Ｃ

Ctl

2.5
2
1.5
1
0.5
0

miso miso IR

Ｇ

Ctl

2.5
2
1.5
1
0.5
0

IR

Ｆ

Ctl

─ 52 ─

IR

Ｈ

Ctl

IR

miso miso IR

図４．味噌摂取前と後のγH2AX focus 数（個別例）（n = 3, mean ± SD）

miso miso IR

miso miso IR

中央味噌研究所研究報告

数が増加する傾向が認められた（図３：p = 0.052）。

No.40（2019）【文献】

しかし個々の症例をみると，味噌によりリンパ球
γH2AX focus 数が増加しない症例もあり（図４Ａ，１）Berrington de Gonzalez A and Darby S. Risk of

Ｂ，Ｃ），今回の検討ではこの差が何によるものかは

cancer from diagnostic X-rays: estimates for the

明らかでなかった。

UK and 14 other countries. Lancet . 2004;363:345-

細胞を用いた実験からは味噌による DNA 損傷抑制

51.

効果を確認することができた。放射線照射は酸化ス２）Mathews, J. D., Forsythe, A. V., Brady, Z.,

トレスを生じることにより DNA 損傷を引き起こすの

et al. Cancer risk in 680,000 people exposed to

で，今回 DNA 損傷抑制効果のあった味噌は抗酸化作

computed tomography scans in childhood or

用によって DNA 損傷の生成を抑制した可能性がある

adolescence ; Data linkage study of 11 millionと考えられた。また，DNA 損傷が生じると損傷応答

Australians. BMJ. 2013; 346:f2360.

および修復機転が活性化される。放射線照射24時間後

３）Xiao R, Su Y, Simmen RC and Simmen FA.

の味噌による DNA 損傷の低減は，味噌が DNA 修復

Dietary soy protein inhibits DNA damage and機構に影響を与え，生じた DNA 損傷の修復を促進しcell survival of colon epithelial cells throughた可能性も考えられた。

attenuated expression of fatty acid synthase.

は，今回の実験条件では認められなかった。味噌のAmerican journal of physiology Gastrointestinal
and liver physiology . 2008;294:G868-76.

量，投与期間，放射線照射後の時間等，実験条件を変４）Teranaka T, Ezawa, M., Matsuyama, J.,

ヒトへの味噌投与による味噌の DNA 損傷抑制効果化させ検討を続けたい。

Ebine, H., and Kiyosawa, I. Inhibitory effects
of extracts from rice-koji miso, barley-koji
miso, and soybean-koji miso on the activityof angiotensin I converting enzyme. Nippon
Nogeikagaku Kaishi (in Japanese) . 1995;69:1163-〈謝辞〉
本研究の遂行にあたり，味噌サンプルのご提供なら

1169.

びに平成29年度研究助成を頂きました一般社団法人中５）Ishida M, Ishida T, Tashiro S, Uchida H, Sakai

央味噌研究所をはじめ各関係者の方々に深謝申し上げ

C, Hironobe N, Miura K, Hashimoto Y, Arihiro

ます。

K, Chayama K, Kihara Y and Yoshizumi M.
Smoking cessation reverses DNA double-strand
breaks in human mononuclear cells. PLoS One .
2014;9:e103993.

─ 53 ─

中央味噌研究所研究報告

No.40（2019）

研 究 報 告味噌の生体防御能の賦活機能に関する研究
─ ストレス誘導性記憶減衰の味噌摂取による改善 ─

河村幸雄

Enhancement of self-defence system by Miso intake
─ Stress-induced memory decrement is improved by Miso intake ─

Yukio KAWAMURA
Department of Food Biochemistry, Kyoto women's University
35 kitahiyoshi-cho Imakumano, Higashiyama-ku, Kyoto, 605-8501, Kyoto, Japan.

日本を含めて多くの先進国ではガン，感染症，脳神Ⅰ．味噌汁２杯分の味噌摂取はストレス誘導性
認知／学習／記憶能の喪失を防止するか？

経機能異常による健康からの逸脱者が増加している。
これらはいずれも広い意味で生体防御系の破綻に起因する。

近年，平均寿命の伸びに伴うアルツハイマー型およ本研究では，生体防御能の低下防止及び賦活化が上

びレビー小体型認知症やパーキンソン病など脳神経系

記の疾病予防に重要であることから，味噌摂取が単に異常起因する認知症症状に大きな社会的関心が集まっ

栄養改善の面からでなく，疾病予防に機能している可ている。その理由は，これらの疾患が老化に伴い誰に能性を推定している。その主な理由は，味噌が，素材でも起こりうる状態であり，不可逆性が大きく予防がの大豆，米，麦由来物質に加えて，発酵微生物（菌

必須の疾病あるいは生理的状況であるためである。

体）とそれらによる無数の代謝産物を多く含む多成分

マウスは，繰り返し拘束ストレス負荷により容易に系の発酵食品であり，生理機能の未解明な物質が生成

鬱状態に陥り，そのような状況の継続は，周囲に対すしている可能性が高いからである。特に，麹菌だけでる無関心から短期記憶の喪失（一種の認知症状）につなく酵母などの多種類の微生物の細胞壁由来物質が存ながる事が知られている。既に，我々は，味噌アルコ

在していることはこの可能性を強く示唆する。この事

ール抽出物の摂取が，マウスの記憶の衰弱抑制に効果から，我々は味噌＝生理機能性物質ライブラリー説をのあることを示した。

提唱しているが，事実，味噌（成分）には，高血圧抑ものの摂取がこのような記憶喪失に対してどのような制，脂質代謝や骨代謝改善，ガン抑制など種々の異効果をもたらすのかを，強度水中拘束ストレスマウス

なった症状の軽減に効果のある事が in vitro，in vivoを使って検討した。

の研究で示されている。

今回は，味噌（豆味噌）そのマウスは，直径 120 cmの円形プール中央にある退本研究では，味噌の趣好性，癒し効果に注目し，脳避プラットフォームの位置を５日～１週間のトレーニ

神経機能との関係で学習とストレス誘導記憶喪失症状

ングで記憶するが，この定着記憶は，ストレスによりとの関係について検討した。

衰弱する。このような記憶衰弱／減衰に対して，味噌摂取がどのように影響するかを検討した。
５日間の学習トレーニングによりマウスの空間位置

京都女子大学家政学部食物栄養学科
TEL: (075) 531-7131〒 605-8501

京都府京都市東山区今熊野北日吉町 35

FAX: (075) 531-7159

E-mail: kawamury@kyoto-wu.ac.jp

─ 54 ─

中央味噌研究所研究報告

No.40（2019）

記憶は，速やかに定着し５日後では，一日目のプラッ

なり，５日目で記憶水準が強度に低下，発見までに，

トフォームの発見時間平均45秒に対して平均３秒となコントロール食（カゼイン食）群15秒を要するようにった。このマウスに７日間，１日１時間水中拘束ストなった（Fig. 1）。

レスを負荷すると，ストレスから解放されると外見上の行動はそれほど大きな変化は示さないが，学習させこの記憶減衰が通常の味噌汁２杯分（12ｇx２杯，た位置記憶を水迷路試験で検証すると，日にちの経過

試料中0.48％）の味噌摂取で抑制されるかどうかを測（ストレスの蓄積）と伴に徐々に位置記憶が不確実と定した（Fig. 2）。

コントロール食（Ｎ＝６，ストレス後Ｎ＝５）

味噌0.48％食（Ｎ＝７）
180

プラットフォーム到達時間︵秒︶プラットフォーム到達時間︵秒︶

180
160

160

140

140

120

120

100

100

80
60

45

40
12

20
0

１日目

4

２日目

15

4

３日目

４日目

3
５日目

学習期間

80
60

47

40

0
ストレス
後

23

17

20
１日目

２日目

Fig. 1

3

３日目

４日目

５日目

ストレス
後

Fig. 2（n = 3, mean ± SD）

コントロール食（Ｎ＝６）

味噌食0.96％食（Ｎ＝７）
180

プラットフォーム到達時間︵秒︶プラットフォーム到達時間︵秒︶

180

160

160

140

140

120

120

100

100
80
45

40

27

20
0

3

学習期間

（n = 3, mean ± SD）

60

5

8

4

4

3

3

2

0.96％
食時
学習
期間

60

ストレス
後

47

40
20
0

１日目 １日目 ２日目 ３日目 ４日目 ５日目 ６日目
0.48％
食時
学習
期間

80

5

6

7

4

0.96％
食時
学習
期間

Fig. 4

Fig. 3（n = 3, mean ± SD）

─ 55 ─

3

10

１日目 １日目 ２日目 ３日目 ４日目 ５日目 ６日目
0.48％
食時
学習
期間

（n = 3, mean ± SD）

3

ストレス
後

中央味噌研究所研究報告

No.40（2019）

その結果， 味噌汁２杯分の味噌摂取では，ストレ時間が遅延（ 2 秒：27秒）していたのに対して，味噌ス後のプラットフォーム発見時間は平均23秒とな

食ではストレス前とストレス後のプラットフォーム

り，コントロール食と有為な差は認められなかったの発見時間（ 3 秒：10秒）に有為差が認められなかっ（Fig. 2）。

た。つまり，味噌汁４杯分の味噌含有餌料の摂取によ

この位置記憶喪失状態は，ストレス解放後も少なくり，ストレス誘導性の記憶減衰が抑制される事が示さ

とも２週間までは継続していた。この拘束ストレスにれた。

よるマウスの位置記憶喪失は，味噌アルコール抽出物

この抑制効果は，マウスの性別に関係なく雄，雌のを１％添加した給餌群では，添加しないコントロール

両群で認められた（雄のデータは省略）。

群と比べて軽度であるが有意（n = 5，p < 0.05）に抑制されていた。そのため，味噌汁２杯分の味噌摂取で，記憶減衰抑制効果が認められなかったのは，摂取Ⅲ．考察とまとめ（味噌のストレス誘導性
記憶減衰抑制効果の分子機構は？）量が少なかった可能性が考えられたので，次に味噌汁
４杯分（味噌含量0.96％） の効果を検討した。

１日味噌汁４杯に相当する豆味噌摂取が，どのような分子機構によりストレス誘導性記憶減衰を抑制しているのかを明らかにするため，現在，味噌摂取に伴うⅡ．味噌汁４杯（／１日）量の味噌摂取は
記憶減衰を抑制するか？

ストレスホルモンである血中コルチゾール他のホルモ
ンレベルの変動と脳内における海馬や歯状回などや辺味噌汁４杯（／１日）量（0.96％）の味噌摂取の記

縁系領域のアミロイドβ生成系の変動について，分析

憶減衰抑制効果を検討した。その結果，味噌汁４杯を進めている。

（／１日）量の味噌摂取群のストレス誘導性記憶減衰

なお，この位置記憶喪失が，ストレス誘導性である

は，コントロール群と比べて，有為に抑制されていたため単なる味噌（成分）の抗ストレス作用を測定した（Fig. 3，4）。

ものであるのか，あるいは記憶喪失そのものの喪失あるいは，記憶の呼び出しを抑制したのかの明確な判断

すなわち，コントロール食ではストレス負荷によは現時点では下せないが，どちらであるかに興味が持り，有為に（P＜0.05）に，プラットフォームの発見たれる。

─ 56 ─

中央味噌研究所研究報告

No.40（2019）

研 究 報 告エピゲノム変化を指標とする味噌成分の探索と機能解析中村文彬 1，新井 大祐 2，大塚 悟史 2，木村
塩田 邦郎 2，中尾 洋一 1，2

宏 3，

Bioactive constituents of“miso”
─ search for new substances and analysis of the modes of actions ─

Fumiaki NAKAMURA 1, Daisuke ARAI 2, Satoshi OTSUKA 2, Hiroshi KIMURA 3,
Kunio SHIOTA 2, Yoichi NAKAO 1, 2
1

Department of Chemistry and Biochemistry, Graduate School of Advanced Science and Engineering, Waseda University
2

Research Institute for Science and Engineering, Waseda University
3-4-1 Okubo, Shinjuku-ku, Tokyo 169-8555, Japan.

3

Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo Institute of Technology
4259 Nagatsuta-cho, Midori-ku, Yokohama, Kanagawa 226-8503, Japan.

進し，さらにマウスモデルにおいて顕著な抗うつ活性１．研究目的を示し，抗ストレス食品成分として期待されている。

日本食は日本人の長寿を支える「ヘルシーな食事」

しかしながら，この FAEE による H4K5ac レベル

として世界的にも広く受け入れられている。しかしなの変化が起こる遺伝子領域や仕組みについては未解明

がら，そこに含まれる有効成分の作用は薬と比較してのままであり，FAEE の抗ストレス作用メカニズム

微弱であるため，薬と同様の生物活性評価系ではそのはまったくわかっていない。低分子化合物の作用メカ

作用メカニズムを解明することは至難の業である。そニズム解明へのアプローチは様々あるが，ヒストン修

こで，われわれは食品成分の微弱な影響を検出しうる

飾は酵素だけでなく，様々な補酵素や補因子など数多評価基準としてエピゲノムの変化に着目して研究を行

くの制御因子によって巧妙に制御されているため，っている。われわれが開発したエピゲノム変化誘導活

2)性の評価系と ES 細胞などの幹細胞に対する分化誘導

分子を同定することがメカニズムを理解する上で重要活性の評価系を組み合わせることで，食品に含まれであると考えた。

FAEE によるヒストン修飾調節に関わる直接の標的

るさまざまな成分の微弱な影響を検出することが可能となる。以上のような生物活性を指標として，食品に含まれる有効成分を探索した結果，ヒストン修

２．実験手法飾（H4K5ac）レベルを抑制する味噌中の活性成分としてフェルラ酸エチルエステル（FAEE）を見出して【プローブの設計および活性】

1)いる。 FAEE は，H4K5ac レベルを抑制するとともFAEE 類縁体の構造－活性相関を検討し，そのに，神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導を促

結果をもとにプローブ分子の設計および合成を行っ早稲田大学

先進理工学部〒 169-8555

東京都新宿区大久保 3-4-1

TEL: (03) 5286-3100

化学・生命化学科

中尾研究室（ケミカルバイオロジー研究室）

FAX: (03) 5286-3100

E-mail: ayocha@waseda.jp

─ 57 ─

中央味噌研究所研究報告

No.40（2019）た。合成したプローブ分子については，ヒストン修飾

３．結果

H4K5ac 特異的なモノクローナル抗体3) を用いたヒス
トン修飾調節活性試験 1) にて活性を確認した。

【プローブの設計および活性】【FAEE 様分子の細胞内局在の確認】

活性相関を検討したところ，H4K5ac レベルの抑制

FAEE をもとに24種類の類縁体を合成し，構造－
ヒト子宮頸がん細胞 HeLa 細胞をプローブ分子添には C4 位のヒドロキシ基および C3 位のメトキシ基加培地にて20時間培養後，細胞を固定し，ゴルジ体が活性を示す重要な構造であり，側鎖長も活性に影をレクチン HPA， Alexa Fluor ™ 647 Conjugate

響する要因のひとつであることを明らかにした（図（Thermo Fisher）で染色した。染色後，固定細胞に

3.1）。

緑色蛍光化合物である Carboxyrhodamine110 - Azide（Click Chemistry Tools）を含む反応溶液を添加

アルキンとアジド基とのヒュスゲン環化付加反応はし，30分，室温の条件にて細胞内クリック反応を行っクリックケミストリーの代表的な反応として知られてた。反応後，サンプルの洗浄を行い，共焦点顕微鏡でおり，それら部分構造を持つ２分子は容易に結合する撮影した。

ことが可能となる。4) そこで，FAEE のプローブ分子として，末端のエチルエステル基をプロパルギルエス【FAEE 標的分子の探索】

テル基に変えた末端アルキン型フェルラ酸（FAPG）

合成したプローブ分子を azide - FG beads（多摩川を設計した。導入したプロパルギルエステル基は大き精機）にクリック反応にて結合させた。その複合体をな構造の変化を伴うことなく，末端にアジド基を持つ

用いて，HeLa 細胞から抽出したタンパク質に対しプリンカーを導入することが可能となる。しかしなが

ルダウンアッセイを行った。得られたタンパク質混合

ら，通常，プローブ分子による標的分子のつり上げに物はSDS - PAGE にて分離を行ったのち，銀染色にては，複数の標的分子候補が浮かび上がることから，真タンパク質のバンドを検出した。

の標的分子を同定するためには，これらの標的候補の絞り込みに工夫が求められる。そこで，ネガティブコ
ントロールとしてイソフェルラ酸プロパルギルエス

Ａ

Ｂ
1.2

FAEE

置換基のパターンが変わると活性が顕著に低下する

FAPG

コントロール比

1.0

短すぎても長すぎても活性が低下する

0.8
0.6
0.4
0.2

フェルラ酸エチルエステル（FAEE）IFAPG

図３．
１．H4K5ac レベルの抑制を示す
重要な FAEE の部分構造

0.0

cntorol FAEE

FAPG

IFAPG

図３．
２．プローブおよびネガティブコントロールの構造と活性（n = 3, mean ± SD）

Ａ；各化合物の構造（上；フェルラ酸エチルエステル，
FAEE，中；フェルラ酸プロパルギルエステル，FAPG，
下；イソフェルラ酸プロパルギルエステル，IFAPG）．
Ｂ；各化合物による H4K5ac への影響（control = DMSO，
samples = 50 µ M， n = 3， mean ± S.D.， ***：p <0.001）．

─ 58 ─

中央味噌研究所研究報告

テル（IFAPG）を置いた。ヒドロキシ基とメトキシ

No.40（2019）【FAEE 標的分子の探索】

基が入れ替わったイソフェルラ酸エチルエステルはHeLa 細胞の細胞質由来タンパク質に焦点を当てて

H4K5ac レベル抑制を示さないため，FAEE の構造を

標的分子の探索を行ったところ，複数の標的分子候補

特異的に認識している標的分子のみを明らかにできるが得られた（図 3.4. A）。標的分子候補の絞り込みをことが期待された。予想通りネガティブコントロー

行うために FAPG と azide FG beads を結合させた複ルである IFAPG は H4K5ac レベルを変化させなかったが，FAEE のエチルエステル基をプロパルギルエ
ステル基に変えた FAPG では活性が確認された（図
BF

3.2）。

HPA 647

FAEE【FAEE 様分子の細胞内局在の確認】

Azide 488

活性成分 FAEE および合成したプローブ分
子 FAPG，IFAPG で処理した細胞について，
carboxyrhodamine110 - Azide を用いて細胞内クリック反応による細胞内局在イメージングを行ったとこ

FAPG

ろ，FAPG で処理した細胞のみに強い緑色蛍光が認められた。緑色蛍光は細胞の細胞質全体から観察され，特に核の周りの緑色蛍光は共染色したゴルジ体（HPA 染色）の一部と重なっていた。一方，IFAPG

IFAPG

で処理した細胞は緑色蛍光が僅かにしか観察されなかった。このことから，活性成分 FAEE が HeLa細胞の細胞質に局在しており，細胞質に FAEE の
H4K5ac 抑制機能を介在する標的分子が存在することが示唆された（図 3.3）。

図３．
３．細胞内クリック反応による各化合物の局在イメージング（BF；明視野， scale bar；10 µ m）

Ａ

Ｂ

FA -FG beads 複合体
IFA -FG beads 複合体

特異的
バンド

特異的
バンド

IFA
標的分子の大きさ
（種類）

非特異的
バンド

拡大図

FA

SDS-PAGE：FA -FG beads にのみ結合したタンパク質

FG beads
FAPG

FAEE の標的分子候補

cytoplasm

バンド強度

図３．
４．標的分子候補の探索
Ａ；FA- FG beads 複合体を用いたプルダウンアッセイ結果（左；FG beads のみによるプルダウンサンプル，左；FAPG と
FG-beadsを結合させた複合体，FA-FG beadsによるプルダウンサンプル）．
Ｂ；FA- FG beads と IFA - FG beads によるプルダウンサンプルの比較．

─ 59 ─

中央味噌研究所研究報告

No.40（2019）

合体（FA - FG beads）とネガティブコントロールでて，これまで明らかにされてこなかったヒストン修飾

ある IFAPG と azide FG beads を結合させた複合体（H4K5ac）レベルにおよぼす影響と細胞分化や抗ス（IFA - FG beads）によるプルダウンサンプルと比較

トレス作用の関係について新たな知見を得ることによしたところ，１つのバンドが浮かび上がった（図 3.4.

り，味噌の効能のさらなる理解へと繋げていきたい。

B）。

５．謝辞
４．考察

本研究は平成29年度一般社団法人中央味噌研究所研研究で実施したヒストン修飾パターンの大規模なス

究助成を受けて実施されました。

クリーニングの結果より，味噌にはエピジェネティク
スに対して異なる作用を有する様々な成分が含まれ，これらが複合的に働いていると考えられた。また，そ６．参考文献のような活性成分の一つと，既に見出されていた抗ス
トレス作用をリンクさせうるデータを提示することが１）松原英祐，本多芳孝，嶋川淳，新井大祐，中村文できた。すなわち, 細胞機能の基盤であるエピジェネ

彬，加藤妙子，中野京子，大池昶威，中尾洋一，他

ティクスを仲立ちとして，味噌に含まれる有効成分と７名，中央味噌研究報告，一般社団法人 中央味噌

健康増進作用とを紐づけることに成功したといえる。

研究所，第38号，pp.34-48，2017年．
２）Chen, T.; Dent, S. Y. Nat. Rev. Genet . 2014, 15,

活性成分 FAEE の作用メカニズム解明を目指して，
FAEE のプローブ分子を用いた細胞内局在および標93-106.

的タンパク質候補のバンドを得た。現在，バンドの解

３）Kimura H, Hayashi-Takanaka Y, Goto Y,

析を行い，RNAi によって標的分子候補ノックダウン

Takizawa N, Nozaki N. Cell Struct. Funct . 2008,

時のフェノタイプを確認し，FAEE の真の標的分子

33, 61-73.
４）Huisgen, R. Proc. Chem. Soc . 1961, 357-396.

であるか否かの確認を行っている。味噌の成分につい─ 60 ─