MASCOT Server 修飾の定義方法

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修飾の定義方法（mod_file）
Mascot 検 索 に お け る ア ミ ノ 酸 の 修 飾 （ Mascot 検 索 設 定 画 面 の Fixed modifications お よ び Variable
modifications リストに表示される修飾名に対応）は mod_file ファイルの中で定義されています。mod_file ファ
イルはテキストで構成されており、次の書式にしたがって既存の修飾の定義内容を変更したり、新規の修飾を追加することができます。

■ mod_file ファイルの存在場所 ■C:\inetpub\mascot\config フォルダにあります。

■ 編集方法 ■テキストエディタを使って mod_file を開き、編集してください。または、[スタート]メニュー → [プログラム] → [Mascot] → [config] → [Mascot modifications file]を選択するとメモ帳で開かれまので、編集してください。
ひとつの修飾の定義は数行で構成され、他の修飾定義の行ブロックとはアスタリスク（＊）で区切ります。

Title:Acetyl (K)Residues:K 170.105528 170.2090*
Title:Acetyl (N-term)
Nterm:43.018390 43.0446

Mascot は次の３つのクラスの修飾定義をサポートしています。

■ クラス１ – Residues ■指定したアミノ酸残基に対して修飾を付与する場合に対応します。
アスパラギン酸残基（D）とグルタミン酸残基（E）に対するメチルエステル化（-O-H → -O-CH3、アスパラギン酸残基(115) -1 + 15 = 129 / グルタミン酸残基（129）-1 + 15 = 143 ）の定義例を示します。

Title:Methyl ester (DE)Residues:E 143.05825 143.142
Residues:D 129.04260 129.115

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１行目：Title
タイトル行です。Title キーワードの後に文字列 Methyl ester (DE) が続きます。この文字列は Mascot 検索
設定画面の Fixed modifications および Variable modifications リストおよび Mascot 検索結果の中で表示されます。短くかつ意味が把握できる文字列を定義してください。括弧内の文字は英数文字（alphanumericcharacter）およびスペースに限られます。また、文字と文字の間のスペースは意味を持ちます（保持されます）。

２行目：Residues
残基定義行です。Residues キーワードの後に次の文字列が続きます。
・１文字表記のアミノ酸コード E・スペース " "・修飾されたグルタミン酸（E）残基のモノアイソトピック質量（Monoisotopic mass） 143.05825
・スペース " "・修飾されたグルタミン酸（E）残基の平均質量（Average mass） 143.142

３行目：Residues
２行目と同様です。

■ クラス２（ペプチド）- Nterm / Cterm ■ペプチドの C 末端または N 末端に対して修飾を付与する場合に対応します。
ペプチドの C 末端に対するメチルエステル化（～HN-R-CO- → ～HN-R-CO-O-CH3, +31）の定義例を示します。

Title:Methyl ester (C-Term)
Cterm:31.01839 31.03422

１行目：Titile
タイトル行です。Title キーワードの後に文字列 Methyl ester (C-Term) が続きます。この文字列は Mascot
検索設定画面の Fixed modifications および Variable modifications リストおよび Mascot 検索結果の中で表示されます。短くかつ意味が把握できる文字列を定義してください。括弧内の文字は英数文字（alphanumericcharacter）に限られます。また、文字と文字の間のスペースは意味を持ちます（保持されます）。

２行目：Cterm
末端定義行です。Cterm（または Nterm）キーワードの後に次の文字列が続きます。
・メチルエステル基のモノアイソトピック質量（Monoisotopic mass） 31.01839
・スペース " "・メチルエステル基の平均質量（Average mass） 31.03422

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3■ クラス２（タンパク質）- ProteinNterm / ProteinCterm ■タンパク質（intact protein）の C 末端または N 末端に対して修飾を付与する場合に対応します。
タンパク質の N 末端に対するホルミル化（-NH-CR-CO～ → HCO-NH-CR-CO～, +29）の定義例を示します。

Title:N-Formyl (Protein)
ProteinNterm:29.002740 29.0180

１行目：Title
タイトル行です。Title キーワードの後に文字列 N-Formyl (Protein) が続きます。この文字列は Mascot 検索
設定画面の Fixed modifications および Variable modifications リストおよび Mascot 検索結果の中で表示されます。短くかつ意味が把握できる文字列を定義してください。括弧内の文字は英数文字（alphanumericcharacter）に限られます。また、文字と文字の間のスペースは意味を持ちます（保持されます）。

２行目：ProteinNterm
末端定義行です。ProteinNterm（または ProteinCterm ）キーワードの後に次の文字列が続きます。
・ホルミル基のモノアイソトピック質量（Monoisotopic mass） 29.002740
・スペース " "・ホルミル基の平均質量（Average mass） 29.0180■ クラス３ – ResiduesNterm / ResiduesCterm ■指定した末端アミノ酸残基の C 末端または N 末端に対して修飾を付与する場合に対応します。
タンパク質の N 末端グルタミン（Q）残基が環化されて Pyro-Glutamine になる場合（NH2 相当分の消滅, -16）の定義例を示します。

グルタミン（Q）

ピログルタミン酸（pyro-Glu）＋ NH3[ 1 + 128 ][ 128 - 16 ] + 1 + 16

H－NH－CH－CO－＼CH2／
O=C－CH2|NH2HN－CH－CO－|＼O=CCH2＼ ／CH2→+ H－NH2

Title:Pyro-glu (N-term Q)
ResiduesNterm:Q -16.01872 -16.023

１行目：Title
タイトル行です。Title キーワードの後に文字列 Pyro-glu (N-term Q) が続きます。この文字列は Mascot 検索設定画面の Fixed modifications および Variable modifications リストおよび Mascot 検索結果の中で表示されます。短くかつ意味が把握できる文字列を定義してください。括弧内の文字は英数文字（alphanumericMASCOT Server 修飾の定義方法

4character）に限られます。また、文字と文字の間のスペースは意味を持ちます（保持されます）。

２行目：ResiduesNterm
末端定義行です。 ResiduesNterm（または ResiduesCterm）キーワードの後に次の文字列が続きます。
・１文字表記のアミノ酸コード Q
・NH2 分のモノアイソトピック質量（Monoisotopic mass） -16.01872
・スペース " "・NH2 分の平均質量（Average mass） -16.023

なお、クラス３では末端定義行にはひとつの残基のみを定義することができます。従いまして、N 末端グルタミン酸（E）残基が環化されて Pyro-Glutamine になる場合（OH 相当分の消滅, -17）も考慮したい場合は独立に定義する必要があります。

グルタミン酸（E）

ピログルタミン酸（pyro-Glu）+ H20[ 1 + 129 ][ 129 - 17 ] + 1 + 17

H－NH－CH－CO－＼CH2／
O=C－CH2|OH

HN－CH－CO－|＼O=CCH2＼ ／CH2→+ H－OH

Title:Pyro-glu (N-term E)
ResiduesNterm:Q -17.002740 -17.0074

別の例として、N 末端グリシン残基（G）のミリストイル化（myristoylation）の例を示します。

H-Gly～→

H3C-(CH2)12-CO-Gly～[ 1 + 57 ][ 211 + 57 ]Title:Myristoylaton (N-term Q)
ResiduesNterm:G 211.206191 211.3635■ 定義した修飾を検索設定画面に表示させたくない場合 ■定義した修飾を Mascot 検索設定画面の Fixed modifications および Variable modifications リストに表示させたくない場合は、次の例のように、Title キーワード行の次の行に Hidden を追加してください。

Title:Pyridyl (K)HiddenResidues:K 247.13208 247.29880

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5■ ニュートラルロス ■フラグメンテーションの際に修飾がニュートラルロスを引き起こす場合は、NeutralLoss キーワードを使って指定することができます。
リン酸化されたセリン（S）、スレオニン（T）を含むフラグメントイオンがニュートラルロス（脱リン酸 H3PO4、98）を引き起こす場合の定義例を示します。

Title:Phospho (ST)Residues:S 166.998359 167.0572
Residues:T 181.014010 181.0838
NeutralLoss:97.976896 97.9952

１行目：Title
タイトル行です。Title キーワードの後に文字列 Phospho (ST) が続きます。この文字列は Mascot 検索設定画面の Fixed modifications および Variable modifications リストおよび Mascot 検索結果の中で表示されます。
短くかつ意味が把握できる文字列を定義してください。括弧内の文字は英数文字（alphanumeric character）に限られます。また、文字と文字の間のスペースは意味を持ちます（保持されます）。

２行目：Residues
残基定義行です。Residues キーワードの後に次の文字列が続きます。
・１文字表記のアミノ酸コード S
・リン酸化されたセリン残基のモノアイソトピック質量（Monoisotopic mass） 166.998359
・スペース " "・リン酸化されたセリン残基の平均質量（Average mass） 167.0572

３行目：Residues
２行目と同様です。

４行目：NeutralLoss
脱リン酸 H3PO4 の定義行です。NeutralLoss キーワードの後に次の文字列が続きます。
・脱リン酸 H3PO4 のモノアイソトピック質量（Monoisotopic mass） 97.976896
・スペース " "・脱リン酸 H3PO4 の平均質量（Average mass） 97.9952

希に複数のニュートラルロスを同時に引き起こす場合があります。リン酸化の例がよく知られていますが、ニュートラルロスを引き起こさない場合と、80 Da（HPO3）あるいは 98 Da（H3PO4）のニュートラルロス引き起こす場合とが同時に生じることがあります。たとえば、0 Da と 98 Da のニュートラルロスが同時に起こりうる場合の設定は次のようになります。

Title:Phospho (STY)
Residues:S 166.998359 167.0572
Residues:T 181.014010 181.0838

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Residues:Y 243.029660 243.1532
NeutralLoss:97.976896 97.9952 0
NeutralLoss:0 0 0

5 行目と 6 行目の NeutralLoss 行の 3 番目の数字（0：master または 1：slave）を使ってニュートラルロスに起因するピークを Mascot のスコアに加味するかどうかを指定することができます。

５行目：NeutralLoss
脱リン酸 H3PO4 の定義行です。NeutralLoss キーワードの後に次の文字列が続きます。
・脱リン酸 H3PO4 のモノアイソトピック質量（Monoisotopic mass） 97.976896
・スペース " "・脱リン酸 H3PO4 の平均質量（Average mass） 97.9952
・スペース " "・ニュートラルロスに起因するピークをスコアに加味する（master ニュートラルロス） 0

６行目：NeutralLoss
ニュートラルロスを引き起こさないこと（すなわちニュートラルロス "0"）の定義行です。NeutralLoss キー
ワードの後に次の文字列が続きます。
・モノアイソトピック質量（Monoisotopic mass） 0・スペース " "・平均質量（Average mass） 0・スペース " "・ニュートラルロスに起因するピークをスコアに加味する（master ニュートラルロス） 0

なお、NeutralLoss 行の 3 番目の数字（master＝0 または slave＝1）はオプションです。このオプションが存在しない場合は 0 と見なされます（すなわち指定したニュートラルロスに起因するピークは Mascot スコアに加味されます）。
Mascot は master ニュートラルロスに起因するピーク群の組合せの中で最もスコアの高い結果を表示します。もし slave ニュートラルロスに起因するピークが存在する場合はそれらのピークはノイズのピークリストからは除外され、その分 Mascot スコアは相対的に高くなります。次の Mascot 検索例は、(1) 修飾設定なし(2) Phospho (STY) + 0 Da master + 98 Da master(3) Phospho (STY) + 0 Da master + 98 Da slaveの例です。

[ 質量データ（MS/MS ピークリスト）]# Enzyme: Lys-C/P# Modification: Phospho (STY)# Peptide Tol = 50 ppm, MS/MS tol = 0.3 Da# Instrument: ESI-QUAD-TOF

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7# PROTEIN KINASE ELM1 (EC 2.7.1.-), IPTPIK + Phospho (STY)BEGIN IONS
TITLE=CID Spectrum of a Candidate of Phosphopeptide by Dr. Ken-ichi Yoshino
PEPMASS=748.43
CHARGE=1+748.43 100
730.05 10668.11 9650.45 40
537.36 6440.31 70
392.72 10357.27 30
294.19 10260.20 2147.12 6
END IONS[ Mascot 検索結果 ]

(1)

(2)

(3)

リン酸化による翻訳後修飾では、98 Da のニュートラルロスによって生じたプロダクトイオンの強いピークが観測された場合は配列中にリン酸化されたセリンあるいはスレオニンの存在が期待されます。逆に、このプロダクトイオンのピークが観測されない場合はチロシンの存在が示唆されます。Mascot ではこれらの現象をサポートするために次の２つのキーワード（PepNeutralLoss、ReqPepNeutralLoss）を使うことができます。
PepNeutralLoss キーワードはニュートラルロスによって生じたピークをノイズのピークリストから除外します。したがって、その分 Mascot スコアは相対的に高くなります。
ReqPepNeutralLoss キーワードは PepNeutralLoss キーワードと同様の機能を持ちますが、スペクトルの中にMASCOT Server 修飾の定義方法

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ニュートラルロスによって生じたピークが必ず存在しなければなりません。もしそのピークが存在しない場合はニュートラルロス由来のピークが存在したとしても Mascot スコアには反映されませんので ReqPepNeutralLoss
キーワードを使用する際は注意が必要です。ReqPepNeutralLoss キーワードを含む定義例を示します。

Title:Phospho (ST-ReqPepNL)
Residues:S 166.998359 167.0572
Residues:T 181.014010 181.0838
NeutralLoss:97.976896 97.9952 0
NeutralLoss:0 0 0
ReqPepNeutralLoss:97.976896 97.9952

また、前に示した質量データからニュートラルロスによって生じた 650.45 のピークを削除した質量データとVariable modifications として上に示した定義例の Phospho (ST-ReqPepNL) を使用した Mascot 検索例を示します。

[ Mascot 検索結果 ]MASCOT Server 修飾の定義方法

9■ アミノ酸配列に関係しないピーク ■
アミノ酸配列に関係しないピークの出現が予想される場合は、Ignore キーワードを使ってそれらを無視するように定義することができます。

Title:ICAT_light
HiddenResidues:C 545.23419 545.71100
NeutralLoss:345.17224 345.45600
Ignore:227.08543 227.30070
Ignore:284.14328 284.39570
Ignore:328.16950 328.44870
Ignore:403.23791 403.55890
Ignore:477.22055 477.65610
Ignore:501.22055 501.67810■ キーワードのまとめ ■mod_file ファイルの中で使用できるキーワードと書式は次の通りです。

Title:string
HiddenCterm:mono avg
Nterm:mono avg
ProteinCterm:mono avg
ProteinNterm:mono avg
Residues:X mono avg
ResiduesCterm:X mono avg
ResiduesNterm:X mono avg
NeutralLoss:mono avg flag（0/1）
PepNeutralLoss:mono avg
ReqPepNeutralLoss:mono avg
Ignore:mono avg

string は Mascot 検索設定画面の Fixed modifications および Variable modifications リストおよび Mascot
検索結果の中で表示される識別子（identifier）です。括弧内の文字は英数文字（alphanumeric character）に限られます。また、文字と文字の間のスペースは意味を持ちます（保持されます）。

mono はモノアイソトピック質量（Monoisotopic mass）、avg は平均質量（Average mass）です。
X は一文字表記の残基名です。

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NeutralLoss の flag は master=0 、slave=1 のどちらかの値をとります。

Mascot 検索設定画面にある ICAT □ をチェックすると自動的に ICATHeavy と ICATLight の２つの修飾が有効になります。デフォルトでは ICATHeavy は修飾名 ICAT_heavy に、 ICATLight は修飾名 ICAT_light に設定されています。他の ICAT を指定したい場合は、mascot.dat ファイルの Option セクションに次の行を追加してください。

ICATHeavy ICAT_heavy
ICATLight ICAT_light--- 修飾の定義方法（mod_file）説明ここまで何かお困りのことがありましたら弊社技術サポートにご連絡ください。

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