Scaffold Elements
トレーニング資料■ Scaffold Elements でできる事 … 2■ 対応フォーマット、データ変換…3■ データ取り込み操作…4■ Samples画面… 10

Volcano plot

■ Score、定量… 13

まとめ、または図の補足説明■ Samples以外の画面… 16■ 検定… 30

■ Flux Analysis

… 32

■ その他

… 35

→ P.34
英語マニュアルの該当ページ
×対応するスライド番号1←スライド番号オリジナルのマニュアル（英語）https://cdn.proteomesoftware.net/user_guides/scaffold_elements_user_guide.pdf

Scaffold Elements■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・データ変換

Scaffold Elementsでできる事■ MS,MS/MSデータをもとに低分子の同定・定量解析(+ Waters MSE )■データ取り込み操作■Samples画面■ 各社rawデータの読み込みに対応 [msconvert.exe]■Score、定量■Samples以外の画面■ データの階層構造化・属性付与■ 検定■ Flux Analysis■ その他■ 定量値に基づく統計解析■ 代謝フラックス解析 対応■ Viewerによる結果ファイルのシェア

2

Scaffold Elements

対応フォーマット→ P.31■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・データ変換■データ取り込み操作■Samples画面■Score、定量■Samples以外の画面■ 検定■ Flux Analysis■ その他* ProteoWizard - msconvert.exe を使用* mzMLはほぼすべてのメーカーで変換可能なフォーマット
3

データ取り込み操作:開始方法

Scaffold Elements→ P.30■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・
データ変換■データ取り込み操作- 取り込み操作の開始- Search タブ- Feature Finding,
Adduct タブ- Library タブとLibrary Manager- Advanced タブ

・以下のいずれかの操作を実施- メニューのFile -> New- Ctrl + N- メニューバー下にあるアイコンをクリック- メニューのFile -> Reanalyze■Score、定量- 開いている解析結果と同じ■ 検定■ Flux Analysis
■ その他
4

↑取り込む
rawデータを選択

・newでなくReanalylzeもある■Samples画面■Samples以外の画面

左フレームは５つのタブから構成されている[後述]パラメータで開く- データを加えたい時、検索条件を変えて再検索したい時に使用“Chrinatigraphic Systems”は「mass and retention time」 指定時に選択（→スライド5,”Matach Type”）

→ P.33

Search タブ

Scaffold Elements■ Scaffold Elementsでできること

Search タブ■ 対応フォーマット・データ変換■データ取り込み操作- 取り込み操作の開始- Search タブ- Feature Finding,
Adduct タブ- Library タブとLibrary Manager- Advanced タブ

ModePositive/Negative/Mixed
イオン化モード(Mixed : 中身を適切に解釈可)

Mass Range

解析対象とする m/zの範囲

Retention Time

解析対象とする 保持時間の範囲■Samples画面

Match Type

Mass only / mass and retention time
同定時、質量のみか保持時間も組み合わせるか。「mass and retention time」
選択時、Chromatographic System の選択が必須となる■Score、定量

Tolerance

MS1,MS2の誤差 (あるいは保持時間の誤差)■Samples以外の画面

Treat each MS1 peak groupas a single analyte

コンセンサスを持つ化合物をグループ化して表示
保持時間のアライメント実施■ 検定

Perform retention timealignment■ Flux Analysis

Perform cross-sample
feature reextraction

見つかったfeatureが別のサンプルで見つからない場合、基準を緩めてもう一度探索する

Report unknown analytes

ライブラリとマッチしなかったものの特徴的なポイントをunknownとしてレポート

Only retain analytes withMS2 data

MS2データの存在をリストアップの必須条件とする

■ その他
5項目

選択肢と意味Featureタブ、Adductsタブ
Feature Finding タブ

項目

選択肢と意味Noise Threshold% of max signal / Specific value
ノイズとみなすピークの強度 (同位体ピーク使用時には適用されない)。
Edit ->Preferences -> Proteowizard タブで“Create filtered mz5files”にチェックを入れると、rawデータ変換時にフィルターリングをかける事も可能。データサイズが小さくなるが、後でソフトウェア上で調整できなくなったり、同位体ピークの探索に影響を及ぼす。

Minimum time
between scans :Scan時間によるデータの間引き

Storing Indexed
feature Files

解析時にindexファイル(mz5ファイルとfeatureの情報が紐づけられたファイル)の名称とパス

Saving Indexed
feature Files

解析後もindexファイルを残すかどうか。基本的には“Save”をお勧め。
残しておくと後ほど再解析時に処理が早くなる。

Adducts タブ- 検索対象とするAdductsに関する設定- SearchタブMode選択項目に連動してリストが変動- チェックが入ったAdductsを検索- 右クリック→ “Show unknown adducts”選択により、より多種のAdductsをリストに表示- 表の上に検索フィルター- In-source fragment にチェックを入れると、MS2のピーク（Precursorピークの可能性があるもの）とのマッチングも行う
6

Scaffold Elements

Libraries タブとLibrary Manager→ P.37■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・データ変換■データ取り込み操作- 取り込み操作の開始- Search タブ- Feature Finding,Adduct タブ- Library タブとLibrary Manager- Advanced タブ

Libraries タブ
ライブラリの中身は、「Library」板で確認可能

検索対象時のライブラリを選択■Samples画面■Score、定量■Samples以外の画面■ 検定■ Flux Analysis■ その他
7

ライブラリは「Library Manager」で管理

補足 : Proteome Software社で公開しているライブラリー
https://www.proteomesoftware.com/spectrum-libraries

8

Scaffold Elements→ P.41

Advancedタブ■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・データ変換■データ取り込み操作- 取り込み操作の開始- Search タブ- Feature Finding,
Adduct タブ- Library タブとLibrary Manager- Advanced タブ■Samples画面■Score、定量■Samples以外の画面■ 検定■ Flux Analysis■ その他
9Advanced タブ

項目

選択肢と意味ID Score retention
threshold

さまざまなスコアから算出した、化合物同定に関するスコアの最低値。
スコア: →P.213以降を参照の事

In-source fragment
intensity threshold

MS2ピークにおいてピークかノイズかを判定する基準値。Maxピークに対する比率

RT alignment spectrum min
reproducibility

アライメントにおいてアンカーポイントととして採用するかどうかの判定に考慮する（最小）サンプルの割合

RT MS1 peak groupinclusion threshold (sec)

同一MS1グループに含まれるフューチャーの保持時間の許容誤差

RT MS1 cross-charge
threshold (sec)

極性の異なるサンプルをアライメントする際に許容される保持時間の許容誤差

Max aligned RT diff (sec)

アライメント実施時に許容する保持時間の誤差。アライメント実施後

Max unaligned RT diff(sec)

アライメント実施時に許容する保持時間の誤差。アライメント実施前
で、”Max aligned RT diff”以上の値である必要がある

Ignore Experimental MS2
SpectraMS2スペクトルを無視しMS1のみを利用した解析を行う

Samples 画面

Scaffold Elements→ P.91■ Scaffold Elementsでできること→スライド11■ 対応フォーマット・データ変換■データ取り込み操作→スライド12■Samples 画面■Score、定量■Samples以外の画面■ 検定■ Flux Analysis

低分子

■ その他

同定された化合物の一覧
並びに定量値をはじめとする関連情報10

解析結果の概要を確認する上で主体となる画面

CAS No,
分子式 等

定量値

Scaffold Elements

Samples画面：画面上部の選択項目→ P.39■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・
データ変換■データ取り込み操作■Samples 画面- 画面上部の選択項目- 画面内の表示項目

Summarization :階層構造化されたデータの分類に基づいて結果表示を切り替える

Display Type :サンプル各列に表示する内容を指定- Precursor Intensity : ピーク強度を基にした定量値- Log2 Fold Change : 定量値の比、2を底にしたLog変換- Max Score : featureで比較した際の最大 ID Score
Normalized : Normalized 実施
Log Intensities : Log変換実施■Score、定量■Samples以外の画面■ 検定■ Flux Analysis
■ その他

11

Thresholds:表示化合物の数値による足切り。
同定スコア最低値、定量値の最低値、化合物が同定されているサンプル数の最低値

Filters
表示化合物のフィルターリング- Hidden check- 2種類の色がついた星印- 構造- Name
11

Samples 画面の表示項目

Scaffold Elements→ P.93■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・
データ変換■データ取り込み操作■Samples 画面- 画面上部の選択項目- 画面内の表示項目■Score、定量■Samples以外の画面項目

説明

■ 検定
■ Flux Analysis
■ その他

12項目

説明

#

上からつけた通し番号

Accession NumberID（使用したライブラリにより異なる）

VisibleHidden/Not Hidden(=Visible)の切り替え

Molecular Formula

分子式Star

リスト内の化合物に付ける事ができるマーク。
黄色/青,あるいはその両方、を指定する事ができる

Molecular Weight

分子量XXX Score

Scaffold Elementsで計算された各種スコア。
詳細はスライド13

Retention Time

保持時間

RT Match(状況に応じて表示)保持時間の誤差

サンプルの列Display Type(スライド11)で指定した数字

Analyte Name

化合物名

Scaffold Elements

Score→ P.213■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・データ変換■データ取り込み操作

項目ID Score■Samples以外の画面

以下スコアから算出した、化合物同定に関するスコア。揃っているデータによって算出方法が異なる。
（具体的な式は→P.214以降を参照の事）
Precursorスペクトルで理論値と実測スペクトルでどれくらい誤差が少ないか（以下の式）。差が全くない場合は1,誤差範
囲いっぱいいっぱいの場合は0.5となる■Samples画面■Score、定量- Score- 定量値- Normalization

説明

Mass Accuracy Score

Isotopic Distribution
Score

同位体比の強度が理論値とどれくらい一致しているか

MS2 Score

MS2の実測スペクトルがライブラリとどれくらい一致しているか。複数のエントリーがライブラリに存在している場合、最高スコアを採用。ピーク強度は実測値と理論値それぞれ標準化処理してからマッチング。実測ピークと理論ピークの関連付けはより誤差が小さい方を採用。各対応ピーク[標準化処理済み]のコサイン積の和。

■ 検定■ Flux Analysis■ その他

XICカーブの滑らかさ。ID Score算出には利用されない。
Zig Zag Indexを利用
XIC Score

13

MS1 Annotation Score

MS1ピークのマッチ数。付加体やIn-source フラグメントも対象。

Scaffold Elements

定量値→ P.151■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・データ変換■データ取り込み操作■Samples画面■Score、定量- Score- 定量値- Normalization■Samples以外の画面■ 検定■ Flux Analysis
■ その他

14

定量値 … XIC、台形近似の面積。
Featureの各イオンすべてが対象

Normalization

Scaffold Elements■ Scaffold Elementsでできること

・Menu のexperiment で2択を選ぶ- Normalized to internal Standard- Normalized to Sample Intensity Distributions■ 対応フォーマット・
データ変換■データ取り込み操作■Samples画面■Score、定量- Score- 定量値- Normalization■Samples以外の画面■ 検定■ Flux Analysis■ その他

15→ P.152

内部標準

サンプル強度分布・ 指定した化合物（３つまで）の定量値がtechnical replicates 内
全サンプルの平均値になる
・ 他の化合物は、原点と標準物質の点を結ぶ直線に従って変換される

・ 全データ vs 各sample
・ 25%,50%,75%にあたる定量値を、全データ平均にそろえる・ 各四分位数の間は点間を結ぶ直線に従って変換する

Scaffold Elements

Organize→ P.71■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・データ変換■データ取り込み操作■Samples画面■Score、定量■Samples以外の画面- Organize- Analyte- Visualize- Analysis- Publish

サンプルの階層構造・ 属性付与を実施
結果表示の際、データを取りまとめる階層等を変更できる■ 検定■ Flux Analysis
■ その他
16

Organize操作について、参考になる別資料(Scaffold DIA 日本語マニュアル)
https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/scaffold/ScaffoldDIAManual.pdf#page=34

補足 : データの階層構造化と属性

17→ P.79補足 : Organize実施と表示内容の切り替え

Summarizationでの項目切り替えにより、表示項目を変更可能(対象間のmedian）

18

Scaffold Elements

Analyte : 画面切り替え■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・データ変換■データ取り込み操作■Samples画面■Score、定量■Samples以外の画面- Organize- Analyte- Visualize- Analysis- Publish■ 検定■ Flux Analysis
■ その他
19

化合物を選択した状態でダブルクリック、または Analytes パネルをクリックすると…
→次スライドAnalyte : 表示画面

Scaffold Elements■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・
データ変換→ P.107

化合物の 定性/定量
結果をより詳細に検証■データ取り込み操作■Samples画面■Score、定量

現在選択中の化合物

サンプル別の解析結果■Samples以外の画面- Organize- Analyte- Visualize- Analysis- Publish■ 検定■ Flux Analysis■ その他
20Visualization→ スライド 22～24

補足 : Visualization タブ [1]References
マッチした化合物のリファレンス情報→ P.110Analyte Level Charts
化合物定量値の比較。
3種類のグラフ- 箱ひげ図- 棒グラフ- バイオリンプロット

Statistics[検定実施時]
検定数値

Isotopic Distribution
同位体分布の実測値と実験値の比較

21

補足 : Visualization タブ [2]→ P.112XIC(Feature)
上: XIC
下: m/z誤差 [monoisotopic vs同位体クラスター加重平均]

MS2 Spectra
MS2スペクトルについて、実測値とライブラリのマッチング状況を確認可能。
・ 右クリックで表示方式切り替えなどが可能
・ 表示しているスペクトルを個人ライブラリに追加する事が可能

XIC(Overlay)
複数サンプル間でのXIC比較。
Samples/Ions 切り替え可能- Samples -> 選択中のIonのみ- Ions-> すべてのイオン22

補足 : Visualization タブ [3]Feature 3D Plot & Feature 3D Plot Controls
Plot
3D (RT, m/z, Intensity)グラフ。
Plot Controls
2Dヒートマップ表示で、さらに表示対象の調整も可能。Controlの選択内容によりPlot図も連動して変更
23→ P.118

Scaffold Elements

Visualize 画面→ P.121■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・データ変換

3種類のタブ切り替え■データ取り込み操作

Scatter plot
→スライド28■Samples画面■Score、定量■Samples以外の画面- Organize- Analyte- Visualize- Analysis- Publish

Volcano plot
→スライド28■ 検定■ Flux Analysis

CV→スライド29

■ その他
24

Trend Chart→スライド2924

補足 : Quantitation タブのグラフ [1]→ P.122
Volcano plot
縦軸 -Log10 (p)横軸 Log2 (Fold Change)
赤点線 多重検定検証の p(q,α)

変動タンパク質をratio, p-value両面から探す
25

Scatterplot→ P.124y=x や回帰直線から大きく外れる化合物を探す

補足 : Quantitation タブのグラフ [2]→ P.125

26

Trend Chart

CV

左から、箱ひげ図、棒グラフ、Trend line、Violin Plot。
サンプル毎の定量値ばらつきをチェックする

CV50%信頼区間ならびに中央値 ＋
カーネル密度推定値を使った分布線
26

補足 : PCA タブのグラフ→ P.126

主成分の寄与率と累積PCA Score Scatterplotｓ
主成分別
プロットはsampleに相当

27

Score plot
PCA Score Scatterplotで選択した主成分組み合わせの拡大図

Loadings plot
化合物の主成分への寄与を表す
プロット

Analysis

Scaffold Elements■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・
データ変換→ P.139

TICとLC保持時間のサンプル間誤差を確認できる■データ取り込み操作■Samples画面■Score、定量

上各サンプルのRTとTIC■Samples以外の画面- Organize- Analyte- Visualize- Analysis- Publish■ 検定■ Flux Analysis
■ その他
28

下各サンプルのRTとReferenceとの誤差

Scaffold Elements

Publish→ P.141■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・
データ変換

検索パラメータの確認、論文のMethodのような文章の作成■データ取り込み操作■Samples画面■Score、定量■Samples以外の画面- Organize- Analyte- Visualize- Analysis- Publish

パラメータ一覧■ 検定■ Flux Analysis
■ その他
29

Method文章検定

Scaffold Elements→ P.156■ Scaffold Elementsでできること
代表的な検定■ 対応フォーマット・
データ変換

Permutation Test
- ノンパラメトリック- 2群 〇 3群以上 〇- ベースはF検定、群間のランダムなデータを入れ替えてF値を計算し続けます- 10000回の 入れ替え計算を行い、入れ替え前のF値より有意差以上に超えた回数を10000（データ入れ替えの試行回数）で割った値をp-value とする。

■データ取り込み操作■Samples画面■Score、定量■Samples以外の画面
■ 検定
- 検定
- 多重検定の補正■ Flux Analysis
■ その他

30

MenuのExperiment →Quantitative Analysis
で実施

ANOVA/ t-test- パラメトリック- 2群 〇 3群以上 〇- ANOVA両側検定を行う。
(2群しかない場合 t検定と同じ。)
Mann Whiteney U test / Kruskal-Wallis test
- ノンパラメトリック- 2群→Mann Whiteney U, 3群以上→Kruskal-Wallis- 同じ分布の形、スケールである事を前提とする

選択した実験計画と選択可能な検定について、参考になる日本語による別資料(Scaffold DIA 日本語マニュアル)
https://www.matrixscience.co.jp/supportpdf/scaffold/ScaffoldDIAManual.pdf#page=86

Scaffold Elements

多重検定の補正→ P.162■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・
データ変換■データ取り込み操作■Samples画面■Score、定量■Samples以外の画面
■ 検定
- 検定
- 多重検定の補正■ Flux Analysis■ その他

多重検定時の第一種過誤に対応する補正。

FDR: (False Discovery Rate)
BH法
FWER: Family Wise Error Rate
ホッホベルクのステップアップ手順＆ホルムのステップダウン

31

Scaffold Elements

Flux Analysis→ P.147■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・
データ変換■データ取り込み操作■Samples画面■Score、定量■Samples以外の画面■ 検定■ Flux Analysis■ その他

MenuのExperiment -> Flux Analysis で実施■ 同位体ラベルを使用して代謝経路を通る代謝物の変化を追跡■ 対応同位体ラベル : 13C,15N,18O,D(重水素)■ 非ラベルサンプルを解析 → インデックスファイルを保存→ インデックスと照らし合わせながらラベルサンプルの解析■ 質量並びに保持時間の誤差範囲指定■ リファレンス : アンラベル全て or 特定ファイル間の対応付け

32

補足説明 : アンラベル全てをリファレンス指定

33→ P.148

補足説明 : ファイル毎に対応するリファレンスを指定

34→ P.148

Scaffold Elements■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・データ変換■データ取り込み操作■Samples画面■Score、定量■Samples以外の画面■ 検定■ Flux Analysis■ その他- 解析操作の流れ- Appendix 内容- インストール環境

35

その他 : 解析操作の流れ■ ソフトウェア起動■ 新規作成、Ctrl + N(menuの「File」-> New やアイコンクリック)■ 検索パラメータ指定、解析開始■ データ取り込み完了■ 属性付与、階層構造化■ データ解析（定性解析、定量解析、検定）■ レポートその他 : Appendix

Scaffold Elements■ Scaffold Elementsでできること■

Appendix A. Creating A Personal Spectral Library■

Appendix B. Creating a Custom Spectral Library using a tab-delimited text file■

Appendix C. Elements Scoring Algorithms■データ取り込み操作■

Appendix D. Rolling up Values■Samples画面■

Appendix E. Agglomerative Point Clustering Feature Finding Algorithm■

Appendix F. Isotopic Clustering■

Appendix G. Forming Consensus MS1 peak groups■

Appendix H. Exporting a Transition List to Skyline■

Appendix I. Structure of Scaffold Elements files (*.metdb)■ Flux Analysis■

Appendix J. Terminology■ その他- 解析操作の流れ- Appendix 内容- インストール環境■

Appendix K. Heat map clustering■

Appendix L. Techniques to Control the Family-wise Error Rate■

Appendix M. Using Principal Component Analysis in Scaffold Elements■

Appendix N. How PCA is Performed in Scaffold Elements■

Appendix O. Description of Mouse Right Click Context Menu Commands■ 対応フォーマット・
データ変換■Score、定量■Samples以外の画面■ 検定36

Scaffold Elements■ Scaffold Elementsでできること■ 対応フォーマット・
データ変換■データ取り込み操作その他 : インストール環境
・対応OS
Windows 10,11 (64bit)* MacやLinux版使用の場合、解析前にmzMLを準備■Samples画面■Score、定量■Samples以外の画面

・メモリ
最低 4GB以上、32GB以上を強く推奨■ 検定■ Flux Analysis■ その他- 解析操作の流れ- Appendix 内容- インストール環境

37

・ストレージ
最低 数百 MB 以上。高速SSD の使用を推奨

・CPU
使用可能なコア数の上限が 64コア