平成31年度（令和元年度）

食肉に関する
助成研究調査成果報告書

公益財団法人

伊藤記念財団

VOL. 38

「伊藤記念財団」設立趣意書
私，伊藤傳三は，昭和３年食肉加工業を創業して以来五十有余年の永きにわた
り食肉加工品の製造販売に従事して参ったところであります。
この間，昭和47年からは日本ハム・ソーセージ工業協同組合理事長，社団法人
日本食肉加工協会理事長，加えて，ハンバーグ・ハンバーガー協会理事長等の重責を担わせていただく等，業界団体の役員を勤めさせていただいてきたところであります。
こうした中で昭和55年，はからずも勲二等瑞宝章受章という身にあまる栄誉に浴したのでありますが，受章に際し私自身の過ぎ来し方を振り返り，食肉及び食
肉加工業界の行く末に思いを致し，２つの事柄を決意致しました。
第１は，食肉加工団体の指導体制の若返りであり，第２は，食肉加工業の基礎的研究の充実であります。
諸情勢が激しく変わりつつある中で食肉加工業界をさらに大きく発展させるには，新しいリーダーの登場が望ましいことは論をまちません。また，食肉加工品については，これまでも日本独自の技術開発は行われてきましたものの，いずれも企業内技術であると言っても過言でなく，大学等における基礎的研究の不足が将来の日本の食肉加工業の発展を遅らせるおそれがあり，この現状を打破する必要があると考えたところであります。
以上のような基本的考えの下に私は，食肉関係団体等の役員を辞すると共に，
食肉及び食肉加工に関する基礎的かつ広汎な研究を行い，あるいは助長するための財団の設立を発起するものであります。
昭和56年６月
設立発起人

伊

藤

傳

三

Philosophy Behind the Establishment of
the Ito Foundation
Approximately half of a century has passed since I established a meat
packing corporation for commercial products in 1928. While involved in thisbusiness, I have had occasion to serve as chairman of the boards of trustees
of several organizations related to the meat industry, such as the HamSausage Industrial Association of Japan in 1972, the Meat Packing Industrial
Association of Japan, and the Hamburg-Hamburger Association of Japan.
In 1980, unexpectedly, I was highly honored to receive the Order of the
Sacred Treasure, Gold and Silver Star from the emperor in acknowledgement of my contributions to the meat industry and improved human nutrition
during my career. This illustrious award provided a strong impetus for me toact on my long-standing concern for the future of meat packing industries.
My commitment to the establishment of a new research foundation for thepromotion of meat science was based on two fundamental philosophies : first,
leadership of the Association of the Meat Packing Industry should be transferred to people with novel ideas and, second, an advanced system for basic
research should be established in meat industries. Clearly, fresh leadership isneeded in changing situations for intensive development in the meat packing
industry. Although some technical product developments have been achievedin certain individual corporations, the lack of basic research in meat scienceat universities and other research organizations certainly will impede future
development of Japanese meat packing industries. It is urgent to end the stagnation in the meat industry through research support.
On the basis of these philosophies, I myself will resign from any official
positions in meat-related associations and will establish a new researchfoundation to support and promote basic and applied research in meat
science.
Denzo Ito, Founder
June© The Ito Foundation

1981

事 業 の あ ら ま し（目

的）本財団は，食肉に関する研究及び調査を行い，もって畜産業及び食品産業の振興と国民食生活の安定に資することを目的とする。
（事業）

本財団は，上述の目的を達成するため，次の事業を行う。
⑴

食肉の生産，処理，加工等に関する基礎的研究及び調査⑵

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査を行う大学等の研究機関に対する助成⑶ 食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査に優れた業績が認められる研究者の表
彰⑷

食肉の生産，処理，加工等に関する情報の普及及び広報（事業実績）
年度
昭和57年度
58
59
60
61
62
63
平成元年度
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
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28
29
30
31（令和元年度）

第１回
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38

研究調査助成48件 60,000千円
52
54,40060
49,80062
48,00070
53,00079
58,90095
70,50086
74,25079
60,00070
50,00086
60,00081
60,00081
60,00082
65,00081
69,10078
59,00082
60,00067
47,00057
41,00053
37,00058
40,00055
41,00055
48,00056
48,00011
10,00012
10,00015
16,90011
10,000
11
10,40012
12,00013
13,00038
37,00058
54,80069
66,00071
69,00074
75,00084
101,200
74
105,000© The Ito Foundation

ご

挨

拶

当伊藤記念財団は，伊藤ハム株式会社の創業者故伊藤傳三による巻頭の「設立趣意書」に掲げた趣意をもって，昭和56年７月３日に財団法人として農林水産大臣から設立を許可され、平成24年４月１日に公益財団法人伊藤記念財団に移行登記したものであり，事業の内容は，「事業のあらまし」にあるとおりであります。
おかげ様で当財団は，平成24年度からは公益財団法人として活動することとなり，その活動は本年で38年となります。この間，当財団の研究調査助成事業の存在が畜産関係の方々の間に浸透いたし，事業内容も逐次充実して参りつつあります。
これは，ひとえに関係各位のご指導ご鞭撻の賜と深く感謝申し上げるとともに，今後とも，
食肉加工等の基礎的研究の充実を希う創設者の意志にそって，益々食肉産業ひいては畜産業の振興及び国民食生活の安定のために役立つべく，更に努力を重ねて参りたいと存じております。
本書は，第38回（平成31年度／令和元年度）助成事業における74件の研究調査助成対象研究者の皆様からいただいた研究成果報告とともに，第５回となります伊藤記念財団賞授賞事業の受賞者とその業績概要と学会等事業助成の概要をとりまとめたものでありますが，以上の目的にしたがって，食肉産業の基礎的研究等に携わる諸氏の研究の一助ともなれば幸甚でございます。
令和２年11月

理事長

伊

藤

功

一

Dear Sir：
I am very pleased to send you and your organization a complimentary copy of theresearch reports of the Ito Foundation. This research foundation was founded by the late
Mr.Denzo Ito to advance research in meat science. The research reports are publishedannually. Unfortunately, the articles are largely in Japanease ; however, in the future wehope to contribute to the international development of meat science. Any constructive
suggestions or critiques from others involved in meat-related research would be accepted
gratefully.
You will find out philosophy behind the establishment of the Ito Foundation describedby Mr.Denzo Ito, in the research report of the Ito Foundation, Vol.38 enclosed here. We
appreciate any interest you may have in our research efforts.
It is my great pleasure to publish this report as the chief director.
Sincerely yours,
Nov. 2020
Koichi Ito
The chief director
The Ito Foundation© The Ito Foundation

i

研究助成事業目

次筋肉内間葉系前駆細胞の機能改変による肉質制御技術開発に向けた基盤研究山内啓太郎（東京大学大学院農学生命科学研究科）

3

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発


竹

中

慎

治（神戸大学大学院農学研究科）

9

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンⅨの形成様相と存在形態に関する研究


若

松

純

一（北海道大学北方生物圏フィールド科学センター）

15

ドライエイジングビーフの香気に及ぼす真菌の影響
中川

麻衣・小室

春菜・中島

誠人・猪口

由美・高鳥

浩介＊

＊



（一般社団法人食肉科学技術研究所， NPO法人カビ相談センター）

20

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作
本山

三知代・渡邊

源哉・中島

郁世・佐々木啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

26

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）


西村

敏英・力石

麗奈（女子栄養大学栄養学部）

33

一（岩手大学理工学研究科）

42

次世代畜産学のための培養肉技術の開発


福

田

智

官能特性をベースとした分光分析による赤身肉評価装置の開発
口田

圭吾１・阿佐玲奈１・小林１

２

健一２（ 帯広畜産大学， 一関工業高等専門学校）

47

枝肉の異臭クレーム防止のためのと畜場における最適な冷却温度管理法の開発


猪

島

康

雄（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

51

本

田

58

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明（Ⅲ）
和久（神戸大学大学院農学研究科）

非加熱食肉製品における生理活性発現に関与する微生物の解明
竹田志郎１・水野谷

１



航１・内山

淳平２

２

（ 麻布大学獣医学部動物応用科学科， 麻布大学獣医学部獣医学科）

63

神経細胞保護効果を有する畜産物由来タンパク質の探索研究


糸井

亜弥・吉川

豊（神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科）© The Ito Foundation69

ii
和牛肉のおいしさを「見える化」する（Ⅱ）輸入牛肉との比較
山


田

知

哉

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構中央農業研究センター）78

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究（Ⅲ）
林

利哉・長澤

麻央・小川

幸彦＊・芳賀聖一＊

（名城大学農学部， 名城大学農学部附属農場）

82

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究


堀江

正一・渡邉

萌・堀井

千絵（大妻女子大学家政学部食物学科）

88

食材の低温貯蔵履歴が大腸菌 O157：H ７の凍結損傷回復ならびに低温加熱耐性に及ぼす影響


本城

賢一・宮本

敬久（九州大学大学院農学研究院）

99

ソーセージに混入する非金属異物の検出技術に関する研究


河

野

俊

夫（高知大学農林海洋科学部）

106

牛の新規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への影響
大和

修・矢吹

映・Md Shafiqul Islam・Phahnaj Pervin（鹿児島大学共同獣医学部臨床病理学分野）

112

沖縄県の島々の黒毛和種集団の多様性，近交度のゲノムの視点からの評価
佐々木慎二（琉球大学農学部）

118

牛の小型ピロプラズマ病に対する感染抵抗性遺伝子の同定
博樹１・藤川

平山


１

朗２・和田

健太１

２

（ 東京農業大学生物産業学部， 北海道立総合研究機構畜産試験場）

123

地鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺伝的多型の探索（Ⅱ）


青

谷

大

希（秋田県畜産試験場）

128

周史（千葉科学大学危機管理学部）

134

豚の暑熱ストレス耐性マーカーの開発
佐藤

牛の暑熱ストレス耐性を担う HSP70.1 遺伝子多型に関する研究（Ⅱ）
森

美幸・上田

修二・林



武司・和田

卓也

（福岡県農林業総合試験場）

140

肉用地鶏の増産を目指した雌系名古屋種の産卵率および卵殻強度に関する遺伝子座の効率的な探索（Ⅱ）
後藤

達彦１・力丸宗弘２（１帯広畜産大学，２秋田県畜産試験場）

147

OPU-IVP を活用したステーション型牛胚生産システムの構築
及川俊徳１・矢島１りさ１・沼邊

孝２２（ 宮城県畜産試験場， みやぎ農業振興公社）

151

牛の子宮疾患や機能診断に資する子宮内バイオマーカーの検索


田中

知己・遠藤

なつ美（東京農工大学農学部）© The Ito Foundation

157

iii
豚における体表温と行動の変化に基づく分娩予測の試み
檜垣


彰吾・吉岡

耕治・鈴木

千恵

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

162

牛体外受精胚の染色体異常予測技術の開発


杉

村

智

史（東京農工大学大学院農学研究院）

168

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロ RNA 定量に関する基盤的研究（Ⅱ）
木崎景一郎・高橋透（岩手大学農学部共同獣医学科）

172

暑熱ストレスによる牛子宮内膜内分泌機能攪乱への温度感受性チャンネルの関与


木

村

康

二（岡山大学大学院環境生命科学研究科）

177

黒毛和種体外受精卵のゲノム選抜技術確立に向けた割球分離卵凍結保存法の開発


藤

井

貴

志（北海道立総合研究機構畜産試験場）

183

卵胞由来生理活性ペプチドによる牛の卵巣機能調節メカニズムの解明
松田１



二子１・大蔵聡２

２（ 東京大学大学院農学生命科学研究科， 名古屋大学大学院生命農学研究科）

189

移植可能な牛伸長胚培養系評価法の検討
細江


実佐・林

憲悟

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

194

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明（Ⅲ）
武田

久美子・緒方和子・木村

和輝＊・佐藤伸哉＊＊・今井昭＊＊（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，＊＊＊

 茨城県畜産研究センター肉用牛研究所，

広島県立総合技術研究所畜産技術センター）

199

分娩後の空胎期間短縮をもたらす新規卵巣機能賦活化技術の開発研究
山村


崇・阪谷

美樹

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

204

ホルモンおよび成長因子の複合添加培地を用いた賦活培養による牛体外受精由来胚の着床能力向上に関する研究
髙﨑

久子・宍戸

福井


裕史・松本

浩道＊・

えみ子＊・関澤

文夫＊＊

容子・湯澤
＊

＊＊

（栃木県畜産酪農研究センター， 宇都宮大学，

関沢アニマルクリニック）

209

分娩後のプロスタグランジン製剤投与が牛子宮修復の促進およびその後の繁殖機能に及ぼす影響
伊

賀

浩

輔

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター


畜産飼料作研究領域）

215

繁殖雌牛における栄養コントロールが過剰排卵処置の反応性および回収胚数に与える影響（Ⅱ）
林


武司・深水

大・上田

修二・磯崎

良寛

（福岡県農林業総合試験場畜産部）© The Ito Foundation

220

iv
黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査（Ⅱ）
星野

洋一郎（京都大学大学院農学研究科附属牧場）

225

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御（Ⅲ）
佐藤繁（岩手大学農学部共同獣医学科）

232

消化管寄生性コクシジウム，Eimeria krijgsmanni における発育休止期の解析（Ⅱ）


松

尾

智

英（鹿児島大学共同獣医学部寄生虫病学分野）

239

豚インフルエンザウイルス国内分離株の抗原性解析小澤真（鹿児島大学共同獣医学部）

247

食肉の薬剤耐性菌による汚染菌数の測定法の開発・評価（Ⅱ）
石原

加奈子１・Shwe Thiri Maung Maung Khin１，２
１



２

255

真悟（鹿児島大学共同獣医学部）

260（ 東京農工大学農学研究院， 日本獣医師会）

牛呼吸器病症候群（BRDC）発症機序の解明


帆保

誠二・石川

天然化合物による牛白血病ウイルス感染制御を目指した基礎的研究


紙透

伸治・村上

裕信・藤野

寛・佐藤

礼一郎（麻布大学獣医学部）

266

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索（Ⅲ）－より効果的なワクチン接種部位を求めて－
市居

修・中村

鉄平・小千田

圭吾・山下



祐輔・池田

哲平

（北海道大学大学院獣医学研究院）

272

豚赤痢菌の全ゲノム系統解析および薬剤耐性機序の解明
岩


田

剛

敏

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

277

豚高親和性乳酸菌を用いた新規経口ワクチンの開発
大松


勉・堤

椋哉

（東京農工大学農学部附属国際家畜感染症防疫研究教育センター）

282

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査（Ⅱ）


森

本

素

子（宮城大学食産業学群）

288

鶏を対象としたトキソプラズマ症の抗体検査法の開発
吉田

彩子・長安

＊



英治＊・高島＊＊（宮崎大学農学部， 宮崎大学医学部，

康信＊＊

岐阜大学応用生物科学部）

293－

牛ウイルス性下痢ウイルスの準種 END は弱毒生ワクチンになるか？
－より効果的に免疫を誘導するための可能性の追求―塩川舞（日本獣医生命科学大学獣医学部獣医保健看護学科）© The Ito Foundation

299

v
筋肉中の虫体数を予測できるトキソプラズマ感染豚の検出法（Ⅱ）
康弘１・谷口高島

裕二２・斎藤大蔵２・

Duong Duc Hieu３・吉田
１

彩子４

２

（ 岐阜大学応用生物科学部， 岐阜大学大学院連合獣医学研究科，


３

４

宮崎大学大学院医学獣医学総合研究科， 宮崎大学農学部）

305

網羅的ジェノタイピングによる新規牛白血病抵抗性遺伝子の同定


目

堅

博

久（宮崎大学テニュアトラック推進機構）

310

豚腸管細胞モデルを用いた豚サーコウイルス関連疾病の重症化機序解明（Ⅱ）


岡

林

環

樹（宮崎大学農学部獣医学科）

315

反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索（Ⅱ）
青山１

真人１・蕪山由己人２

２（ 宇都宮大学農学部生物資源科学科， 宇都宮大学農学部応用生命化学科）

319

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅲ）
黒木


香澄・仁田

義弘・関崎

勉

（東京大学大学院農学生命科学研究科食の安全研究センター）

325

アフリカ豚コレラの侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅱ）


杉浦

勝明・芳賀

猛（東京大学大学院農学生命科学研究科）

332

牛における PTH/PTHrP 受容体シグナルの肥満とインスリン抵抗性への関与


恩田

賢・風間

啓（麻布大学獣医学部）

338

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究 －飼養成績と免疫能に及ぼす影響－


勝俣

昌也・鈴木

武人（麻布大学獣医学部）

344

暑熱ストレスによる筋成長阻害のブレークスルー：筋幹細胞の活性化・増殖因子 HGF のニトロ化（不活化）の関与の検証
辰巳

隆一・増原

夏海・Mohamed Zakaria Elhussiny・

Vishwajit Sur Chowdhury・城戸
Elgaabari Alaa Magdi Hassanein・松吉

祐児・中村



潤力・今冨
真子・古瀬

奈々・
充宏

（九州大学大学院農学研究院）

349

骨格筋肥大を促進する植物由来成分の探索（Ⅱ）－質的向上も目指して－


米

倉

真

一（信州大学農学部）354

黒毛和種繁殖雌牛の放牧行動における群内個体差は生産成績と関連するか？


安

在

弘

樹（宮崎大学農学部）359

茎葉多収型飼料用イネの茎部に蓄積する炭水化物の栄養的意義と生産現場との技術的連携
近藤

誠・Budi Wardiman・Randi Mulianda（三重大学大学院生物資源学研究科）© The Ito Foundation

364

vi
養鶏における個体管理と清掃ロボット導入による IoT 型食肉生産技術の開発（Ⅱ）
健一１・Meng Tong１・片平

堀口

１



光彦１・市浦茂２

２（ 山形大学農学部， 岩手大学大学院連合農学研究科）

371

成熟後の効率的な筋肥大の誘導に寄与する筋幹細胞の探索（Ⅱ）


鈴

木

貴

弘（北海道大学大学院農学研究院）

378

ルーメン内繊維消化ダイナミクスに着目した採食可能量の予測モデルの開発
珠子１・田中谷川

常喜２

１（ 地方独立行政法人北海道立総合研究機構酪農試験場，
２

地方独立行政法人北海道立総合研究機構畜産試験場）

385

鶏肉中のイミダゾールジペプチド含量を増やす飼養方法とその活用に関する研究
久恒

辰博１・戸塚

護２・江草

１

愛２・青谷

大希３・福田２

栞３

３（
 東京大学大学院新領域創成科学研究科， 日本獣医生命科学大学， 秋田県畜産試験場）391

豚の未熟産子（ひね豚）の発育遅延をもたらす生理的要因の解明（Ⅱ）
中島

郁世・谷口
渡邊



雅章・芦原

源哉・本山

茜・荒川

愛作・

三知代・佐々木啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

397

黒毛和種育成牛のアミノ酸要求量に関する研究


寺

田

文

典（東北大学大学院農学研究科）

403

敏（弘前大学農学生命科学部）

409

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可能性


松

﨑

正

鶏の飼養管理における労力低減のための距離センサによる体重推定に関する研究
阿野

裕司・伊藤

直弥＊・宇髙
木村

優美＊・水上嘉樹＊＊・裕昭＊＊＊・原田宏明＊＊＊＊＊（地方独立行政法人山口県産業技術センター， 山口県農林総合技術センター，


＊＊

＊＊＊

国立大学法人山口大学，＊＊＊＊

伊藤忠飼料株式会社）

413

加（酪農学園大学獣医学群）

419

深川養鶏農業協同組合，

哺育期子牛の消化管機能を強化するための管理技術の開発


福

森

理

© The Ito Foundation

vii

CONTENTS
Elucidation of regulatory mechanisms of intramuscular mesenchymal progenitor cell function
for the establishment of meat quality control technology
Keitaro Yamanouchi（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

3

Developments in technology for meat processing by fungal aspartic protease
Shinji Takenaka（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

9

Studies on the formation and the existence form of zinc protoporphyrin IX in dry-cured ham
Jun-ichi Wakamatsu（Field Science Center for Northern Biosphere, Hokkaido University）

15

Effect of mold on the aroma of dry aging beef
Mai Nakagawa, Haruna Komuro, Yoshito Nakashima, Yumi Inoguchi and Kousuke Takatori ＊（Japan Meat Science & Technology Institute, ＊Center for fungal Consultation Japan）

20

Development of a system for rendering 3D computer graphics of meat carcasses
Michiyo Motoyama, Genya Watanabe, Ikuyo Nakajima and Keisuke Sasaki（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

26

Clarification of the enhancement mechanism of “koku attributes” by lipids in pork sausages（Ⅱ）
Toshihide Nishimura and Reina Chikaraishi（Faculty of Nutrition Science, Kagawa Nutrition University）

33

Cultured clean meat technology for next generation livestock science
Tomokazu Fukuda（Graduate School of Science and Technology, Iwate University）

42

Development of meat evaluation system by spectroscopic analysis based on sensory score forred meat
Keigo Kuchida １, Reina Asa １ and Ken-ichi Kobayashi ２（１Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, ２National Institute of Technology,
Ichinoseki College）

47

Development of an appropriate method of cooling temperature control for prevention of bonetaint of beef carcasses in slaughterhouses
Yasuo Inoshima（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu
University）

51© The Ito Foundation

viii
Identification of the main factor determining the taste of Jidori meat（Ⅲ）
Kazuhisa Honda（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

58

Investigation of microorganism for expression of bioactivity in the uncooked meat products
Shiro Takeda １, Wataru Mizunoya １ and Jyunpei Uchiyama ２（１School of veterinary medicine, Department of animal science and biotechnology, ２ Department ofveterinary medicine, Azabu University）

63

The study of protective effect on neuronal cell by animal product protein
Aya Itoi and Yutaka Yoshikawa（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Women’s University）

69

Studies on the new evaluation method of Wagyu beef quality（Ⅱ）Comparison of Wagyu beef
with imported beef
Tomoya Yamada（Central Region Agricultural Research Center, NARO）

78

Retort processing and cold lactic acid fermentation induce protein degradation and functional
peptides derivation in myofibrillar protein system（Ⅲ）
Toshiya Hayashi, Mao Nagasawa, Yukihiko Ogawa＊ and Seiichi Haga
（Faculty of Agriculture, Meijo University, ＊Experimental Farm, Meijo University）

82

Study on awareness of consumers about safety of food additives
Masakazu Horie, Moe Watanabe and Chie Horii（Department of Food Science, Faculty of Home Economics, Otsuma Women’s University）

88

Effects of storage history of food materials at low temperature on recovery from freezing
injury and thermotolerance of Escherichia coli O157：H７
Ken-ichi Honjoh and Takahisa Miyamoto（Faculty of Agriculture, Graduate School, Kyushu University）

99

Study on the detection technology of non-metal extraneous materials in sausages
Toshio Kawano（Department of Agriculture, Forestry, Bioresource and Environmental Sciences, Kochi University）

106

Molecular basis of novel genetic disorders in cattle and their adverse impact
Osamu Yamato, Akira Yabuki, Md Shafiqul Islam and Phahnaj Pervin（Laboratory of Clinical Pathology, Department of Veterinary Clinical Sciences, Joint Faculty of
Veterinary Medicine, Kagoshima University）

112

Genomic evaluation of genetic diversity and inbreeding of Japanese Black cattle in the Okinawa
islands
Shinji Sasaki（Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus）

© The Ito Foundation

118

ix
Identification of genes involved with resistance to small piroplasmosis in cattle
Hiroki Hirayama １, Akira Fujikawa ２ and Kenta Wada １（１Fuculty of Bioindustry, Tokyo University of Agriculture, ２Animal Research Center, Hokkaido
Research Organization）

123

The search for genetic polymorphisms involved in behavioral stress response in slow-growing
meat type chickens（Ⅱ）
Daiki Aoya
（Akita Prefectural Livestock Experiment Station）

128

Development markers associated with heat tolerance in pigs
Shuji Sato
（Faculty of Risk and Crisis Management, Chiba Institute of Science）

134

The study of polymorphism in the bovine HSP70.1 gene associated with thermotolerance（Ⅱ）
Miyuki Mori, Shuji Ueda, Takeshi Hayashi and Takuya Wada
（Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center）

140

Rapid genetic mapping for egg production and eggshell strength in Nagoya breed for productionof meat-type chicken（Ⅱ）
Tatsuhiko Goto １ and Kazuhiro Rikimaru ２（１Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, ２Akita Prefectural Livestock Experiment
Station）

147

Construction of station type bovine embryo production system using OPU-IVP
Toshinori Oikawa １, Risa Yajima １ and Takashi Numabe ２（１Miyagi Prefectural Livestock Experiment Station, ２Miyagi Agricultural Development
Corporation）

151

Investigation of uterine bio-markers for evaluation of uterine disease and function in cows
Tomomi Tanaka and Natsumi Endo
（Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

157

Farrowing prediction based on changes of body surface temperature and behavior in sows
Shogo Higaki, Koji Yoshioka and Chie Suzuki（National Institute of Animal Health, NARO）

162

Development of predictive system of chromosomal abnormality on bovine in vitro fertilized
embryos
Satoshi Sugimura（Tokyo University of Agriculture and Technology, Institute of Agriculture）

168

Study of circulating microRNA as biomarker for pregnancy in cattle（Ⅱ）
Keiichiro Kizaki and Toru Takahashi（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University）

© The Ito Foundation

172

x
Involvement of temperature sensing channels in disorder of endocrine function of bovine
endometrium by heat stressKoji Kimura（Graduate School of Environmental and Life Science, Okayama University）

177

Development of cryopreservation method for bovine demi-blastocysts produced by blastomere
separation technique for establishment of preimplantation genomic selection system using invitro fertilized embryos
Takashi Fujii（Animal Research Center, Hokkaido Research Organization）

183

The role of a bioactive peptide derived from follicular cells on cattle ovarian function
Fuko Matsuda １ and Satoshi Ohkura ２（１Graduate School of Agricultural and Biosciences, The University of Tokyo, ２Graduate School of
Bioagricultural Sciences, Nagoya University）

189

Evaluation of culture system to elongate and transplant in bovine embryos
Misa Hosoe and Ken-Go Hayashi（Institute of Livestock and Grassland Sciences, NARO）

194

Effect of antioxidant supplementation on quality improvement of cryopreserved bull semen（Ⅲ）
Kumiko Takeda, Kazuko Ogata, Kazuteru Kimura＊, Nobunari Sato＊＊ and Akira Imai＊＊（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, ＊Beef Cattle Institute, Ibaraki Prefectural
Livestock Research Center, ＊＊Hiroshima Prefectural Livestock Research Center）

199

Development of novel method for reactivation of ovarian function in postpartum period that
achieves shortening the open period
Takashi Yamamura and Miki Sakatani（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

204

Study on improvement of implantation potential in bovine embryo derived from IVMFC bycombined treatment with hormone and growth factor
Hisako Takasaki, Yoko Shishido, Hirohumi Yuzawa, Hiromichi Matsumoto＊, Emiko Fukui＊ andFumio Sekizawa＊＊（Tochigi Prefectural Livestock & Dairy Experimental Center, ＊Utsunomiya Universitiy,＊＊Sekizawa Animal Clinic）

209

Stimulatory effects of prostaglandin administration on bovine uterine involution and its
subsequent effects on reproductive function
Kosuke Iga（Division of Livestock and Forage Research, Tohoku Agricultural Research Center, NARO）

© The Ito Foundation

215

xi
Effect of nutrition control on superovulation response and the number of recovered embryoin heifer（Ⅱ）
Takeshi Hayashi, Dai Fukamizu, Shuji Ueda and Yoshihiro Isozaki（Department of Animal production, Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center）

220

Survey of the low durability of motile sperm in the frozen semen of Japanese Black cattle（Ⅱ）
Yoichiro Hoshino（Kyoto University livestock farm）

225

Prediction and control of subacute ruminal acidosis in periparturient dairy cows
Shigeru Sato
（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University）

232

Analysis of the resting stage in the life cycle of the intestinal coccidian parasite, Eimeria
krijgsmanni（Ⅱ）
Tomohide Matsuo（Laboratory of Parasitology, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

239

Antigenic analyses of swine influenza viruses isolated in Japan
Makoto Ozawa（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

247

Development and evaluation for determination of number of antimicrobial-resistant bacteria inmeats（Ⅱ）
Kanako Ishihara １ and Shwe Thiri Maung Maung Khin １, ２
（１Institute of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology, ２Japan Veterinary Medical
Association）

255

Breakthrough of pathogenic mechanism of bovine respiratory disease complex（BRDC）
Seiji Hobo and Shingo Ishikawa（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

260

Basic research for controlling infection of bovine leukemia virus
Shinji Kamisuki, Hironobu Murakami, Kan Fujino and Reiichiro Sato
（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

266

Study of mucosa-associated lymphoid tissues in farm animals（Ⅲ）－to identify more effective
regions for their vaccination－
Osamu Ichii, Teppei Nakamura, Keigo Kosenda, Yusuke Yamashita and Teppei Ikeda（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University）

272

Whole-genome phylogenetic analysis and investigation of drug resistance mechanism ofBrachyspira hyodysenteriae
Taketoshi Iwata（National Institute of Animal Health, Agriculture and Food Research Organization, NARO）

© The Ito Foundation

277

xii
Development of novel oral vaccine using genome editing lactic acid bacteria with high affinity
for pigs
Tsutomu Omatsu and Ryoya Tsutsumi（Research and Education Center for Global Infectious Diseases of Animals, Department of Agriculture,
Tokyo University of Agriculture and Technology）

282

A survey of gastrointestinal parasites infection and implementation of parasite control programin cattle（Ⅱ）
Motoko Morimoto（School of Food Industrial Sciences, Miyagi University）

288

Development of serological tests for Toxoplasma infection in poultry
Ayako Yoshida, Eiji Nagayasu＊ and Yasunobu Takashima＊＊（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki, ＊Faculty of Medicine, University of Miyazaki,＊＊

Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

293－

Can END , a quasispecies of bovine viral diarrhea virus, be a live－attenuated vaccine？
－Pursing the possibility of more effectively inducing immunity－
Mai Shiokawa（School of Veterinary Nursing and Technology, Faculty of Veterinary Science, Nippon Veterinary andLife Science University）

299

Detection strategy of Toxoplasma gondii infected pig and estimation of cysts burden in muscles（Ⅱ）
Yasuhiro Takashima １, Yuji Taniguchi ２, Taizou Saitou ２, Duong Duc Hieu ３ andAyako Yoshida ４（１Faculty of Applied Biological Sciences, The United Graduate School of Veterinary Sciences, Gifu
University, ２Graduate School of Gifu University, ３Graduate School of Medicine and Veterinary Medicine,
University of Miyazaki, ４Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

305

Identification of novel bovine leukosis resistance-associated alleles by comprehensive genotyping
Hirohisa Mekata（Organization for Promotion of Tenure Track, University of Miyazaki）

310

Mechanism of progression of sever porcine circovirus associated diseases by porcine intestine
cell model（Ⅱ）
Tamaki Okabayashi（Department of Veterinary Science, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Investigation of the physiological markers indicating
Masato Aoyama

１and Yukihito Kabuyama

315‘nausea’ in domestic ruminants（Ⅱ）

２（１Department of Agrobiology and Bioresources, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University,２

Department of Applied Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University）

© The Ito Foundation

319

xiii
Comprehensive analysis of the behavior of Campylobacter and coexistent bacteria in chicken
food chain（Ⅲ）
Kasumi Kuroki, Yoshihiro Nitta and Tsutomu Sekizaki（Research Center for Food Safety, Graduate School of Agricultural Life Science, The University ofTokyo）

325

Epidemiological research on the risk assessment of introduction of African swine fever intoJapan
Katsuaki Sugiura and Takeshi Haga
（Laboratory of Global Animal Resource Science, Department of Global Agricultural Sciences, Graduate
School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

332

Influence of PTH/PTHrP receptor signals for obesity and insulin resistance in dairy cows
Ken Onda and Kei Kazama（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

338

A study on requirements of lysine in weanling pigs
－Effects on growth performances and immune functions－
Masaya Katsumata and Takehito Suzuki（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

344

Breaking-through the heat stress-induced suppression of postnatal muscle growth : possible
implication of nitration of myogenic stem cell activation factor HGF
Ryuichi Tatsumi, Natsumi Masuhara, Mohamed Zakaria Elhussiny, Vishwajit Sur Chowdhury,
Hirochika Kido, Nana Imatomi, Elgaabari Alaa Magdi Hassanein, Yuji Matsuyoshi,
Mako Nakamura and Mitsuhiro Furuse（Graduate School of Agriculture, Kyushu University）

349

Screening for phytochemicals that induce skeletal muscle hypertrophy－Aiming for quantitative improvement－
Shinichi Yonekura（Faculty of Agriculture, Shinshu University）

354

Are inter-individual differences in grazing behavior of Japanese Black cows in a herd relatedwith production performance？
Hiroki Anzai（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

359

Nutritional value of carbohydrates accumulated in forage rice with high stem yield, anddevelopment of research-based cooperative extension service
Makoto Kondo, Budi Wardiman and Randi Mulianda（Graduate School of Bioresources, Mie University）

© The Ito Foundation

364

xiv
Development of IoT type meat production system to introduce for individual management
and cleaning robot of poultry farming（Ⅱ）
Kenichi Horiguchi １, Tong Meng １, Mitsuhiko Katahira １ and Shigeru Ichiura ２（１Faculty of Agriculture Yamagata University, ２The United Graduate School of Agricultural Sciences,
Iwate University）

371

The search study about myogenic stem cell population which can promote muscular hypertrophy
efficiently in adult animals（Ⅱ）
Takahiro Suzuki（Research Faculty of Agriculture, Graduate School of Agriculture, Hokkaido University）

378

Prediction of feed intake capacity based on dynamic models of fiber digestion and passage inthe rumen
Tamako Tanigawa １ and Tsuneki Tanaka ２（１Local Independent Administrative Agency, Hokkaido Research Organization Dairy Research Center,２

Local Independent Administrative Agency, Hokkaido Research Organization Animal Research Center）



385

Feeding methods to increase imidazole dipeptide content in animal meat
Tatsuhiro Hisatsune １, Mamoru Totsuka ２, Ai Egusa ２, Daiki Aoya ３ and Shiori Fukuda ３（１Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, ２Nippon Veterinary and Life 
Science University, ３Akita Prefectural Livestock Experiment Station）

391

Factors affecting mortality and growth retardation in runt pigs（Ⅱ）
Ikuyo Nakajima, Masaaki Taniguchi, Akane Ashihara, Aisaku Arakawa, Genya Watanabe,Michiyo Motoyama and Keisuke Sasaki（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

397

Amino acid requirements for growing Japanese Black cattle
Fuminori Terada（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

403

Colostral programming of physiological properties related to meat production
Masatoshi Matsuzaki（Faculty of Agriculture and Life Science, Hirosaki University）

© The Ito Foundation

409

xv
Research on weight estimation using a distance sensor for reducing labor of bird breeding
management
Yuji Ano, Naoya Ito＊, Yumi Udaka＊, Yoshiki Mizukami＊＊, Hiroaki Kimura＊＊＊andHiroaki Harada＊＊＊＊（Local Incorporated Administrative agency, Yamaguchi prefectural Industrial Technology Institute,＊

Yamaguchi Prefectural Agricultural Technology Center, ＊＊Yamaguchi Prefectural Agriculture andForestry General Technology Center, Yamaguchi University, ＊＊＊FUKAWA Poultry Agricultural
Cooperative, ＊＊＊＊Itochu Feed Mills Co. Ltd．）

413

The study on the development of management method to strengthen the gut functions in calves
Rika Fukumori（School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University）

© The Ito Foundation

419

xvi

伊藤記念財団賞
目

佐々木

啓

次

介（農研機構畜産研究部門畜産物研究領域

ユニット長）

食肉の官能特性評価と消費者受容に関する研究 

中

島

郁

世（農研機構畜産研究部門畜産物研究領域

431

上級研究員）

肉用家畜における脂肪組織の形成・制御機構に関する研究― in vitro から in vivo まで ― 

永

野

昌

432

志（北里大学獣医学部動物資源科学科教授）

牛卵子の体外発育培養系の開発と卵胞発育機構研究：臨床現場における牛胚生産への応用 © The Ito Foundation

433

xvii

学会等事業助成目次

シンポジウム「食鳥肉検査における日本とアジア諸国の HACCP の現状」に関する開催報告
公益社団法人日本獣医学会

代表理事

久和

茂（東京大学） 437

平成 31（令和元）年度事業実施報告書
日本畜産学会第 126 回大会

公開シンポジウム「畜産研究の成果を獣医臨床フィールドへ」

公益社団法人日本畜産学会

理事長

柏崎直巳（麻布大学） 439

日本食肉研究会への平成 31 年度・令和元年度事業助成実施報告
日本食肉研究会会長

坂田亮一（麻布大学・明治大学） © The Ito Foundation441

研究助成事業© The Ito Foundation

3

筋肉内間葉系前駆細胞の機能改変による肉質制御技術開発に向けた基盤研究
Elucidation of regulatory mechanisms of intramuscular mesenchymal
progenitor cell function for the establishment of meat quality control
technology

山

内

啓太郎

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Keitaro Yamanouchi（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

Accumulation of intramuscular adipose tissue（IMAT）and development of fibrous tissues
due to accumulation of collagen both affect meat quality such as tenderness, texture and flavor.
Thus, it is important for the production of high quality meat to regulate the amount of adipose
and fibrous tissues in skeletal muscle. IMAT is comprised of adipocytes, while collagens
included in fibrous tissues are mainly produced by activated fibroblasts. Both adipocytes andfibroblasts are differentiated from their common ancestors, called mesenchymal progenitor cells（MPC）. We previously identified Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine（SPARC）and
Chondroitin Sulfate Proteoglycan 4（CSPG4）as possible regulator of MPC differentiation. In
the present study, the effects of loss of these factors were examined both in vitro and in vivo.
The results suggested that meat quality could be improved by controlling the function of
SPARC and CSPG4.

１．目細胞とよばれる一種の細胞群が存在する。間葉系

的前駆細胞は脂肪細胞への分化能をもち，いわゆる脂肪交雑割合や柔らかさ等，付加価値の高い食

脂肪交雑にみられる脂肪細胞の主たる起源とされ肉の生産は重要な課題であり，我が国の食肉産業ている。また，間葉系前駆細胞は線維芽細胞へのの国際競争力強化にも資するものである。現在，分化能をもあわせもつ。線維芽細胞はコラーゲン

付加価値をもつ食肉生産は和牛にみられるようにをはじめとする細胞外基質の主要な供給源である

主として遺伝的な選抜と飼養管理によりなされてが，線維芽細胞からの過剰なコラーゲン産生・蓄いるが，さらなる向上に向けた新技術開発には脂積は結果として筋肉の硬化を生じる。したがっ肪交雑成立のメカニズムや肉の柔らかさに影響をて，肉質を制御するうえで，筋肉内に存在する間与えるコラーゲンの蓄積等についての科学的な理葉系前駆細胞からの脂肪細胞や線維芽細胞への分解が重要である。

化ならびに線維芽細胞による細胞外基質の産生や主として食肉を構成する筋肉内には間葉系前駆蓄積についての制御機構を明らかにすることには© The Ito Foundation

4

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

にて飼育し，固形飼料，水は自由に摂取させた。

大きな意義がある。
われわれは間葉系前駆細胞の機能制御に関わる因子としてこれまでにSPARC（Secreted Protein
Acidic and Rich in Cysteine）とCSPG4１～３）すべての動物実験は東京大学農学部動物実験委員会の承認を受けて行った。
2.2

細胞培養

（Chondroitin Sulfate Proteoglycan 4） を同定しラット間葉系前駆細胞2G11細胞は10％牛胎子

た。SPARCは分泌性の非構造性マトリクスタン

血清を含むDMEM中で培養維持した。bFGFで一

パク質で，脂肪分化抑制作用をもつだけでなく，晩処理したのちに，インスリン，デキサメタゾン，

細胞外コラーゲンタンパク質の凝集と安定化に関

IBMXおよびトログリタゾンを含む培地で培養すわることが知られている。一方，CSPG4は細胞ることで脂肪細胞への分化誘導を行った。線維芽膜表面に発現するタンパク質で，その一部は切断細胞へ分化誘導する際は，TGF-βを添加した培されて遊離型としても作用する。申請者のこれま

地で４日間培養した。脂肪細胞の検出はオイルでの研究によりCSPG4は間葉系前駆細胞の脂肪

レッドＯ染色およびPPARγの免疫染色により分化能維持に必要であるとともに，線維化を抑制行った。線維芽細胞の検出は細胞抽出液を調整する可能性が示されている。つまりSPARCは抗し，αSMAのウェスタンブロットを用いて行っ脂肪分化作用と線維化促進作用，CSPG4は脂肪た。CSPG4欠損2G11細胞はCRISPR/Cas法を用い分化促進作用と抗線維化作用という相反する作用て作製した。最終的にB2G9およびC1B3の２つのをそれぞれもつ因子と位置づけられる。この仮説

欠損株が得られた。

４）が実証できれば，SPARCの作用を減弱する一方

2.3

組織学的解析

でCSPG4の作用を増強するというストラテジー

イソフルラン麻酔の過剰吸入により動物を安楽により肉質を飛躍的に向上させる技術開発に繋が死させたのち，骨格筋サンプルを採取した。採取る。

した骨格筋は液体窒素で冷却したイソペンタン中

そこで本課題では間葉系前駆細胞クローンや筋で急速凍結し，使用時まで－80℃で保存した。骨

肉内に脂肪蓄積や線維化を生じるモデルラットを格筋サンプルから凍結切片を作製し，マッソント

用いてSPARCやCSPG4の欠損が脂肪分化（脂肪リクローム染色による線維化の検出，オイルレッ

蓄積）や線維芽細胞分化（線維化）に与える影響

ドＯ染色による脂肪化の検出を行った。また，について解析を行い，in vitroならびにin vivoのPPARγの免疫染色による脂肪細胞の検出もあわ両方面から上記ストラテジーの蓋然性について検せて行った。
2.4

証することを目的とした。
２．方
2.1

クリープメータによる骨格筋の硬度解析

高分解能型クリープメータ（RE2-33005C：山法電，東京）を用い，ラットの腓腹筋に20Ｎまでの負荷圧をかけた時の筋の歪み率を測定した。

使用動物

SPARC欠損マウスはC57BL/6Jを背景とし，Dr. Amy D. Bradshawから分与された。SPARC
欠損ラットおよびCSPG4欠損ラットは，当研究室にてCRISPR/Cas法を用いて作製した。いずれの動物も温度23℃，湿度60％に維持された動物室

３．結果と考察3 . 1 SPARC 欠 損 マ ウ ス お よ び SPARC 欠 損
ラット骨格筋の表現型解析
本項目ではSPARC欠損が骨格筋の表現型にど© The Ito Foundation

5

筋肉内間葉系前駆細胞の機能改変による肉質制御技術開発に向けた基盤研究のような影響を与えるかについて知ることを目的

SPARCが線維化促進作用を示すことが明らかと

とした。

なった。

まず，既存のSPARC欠損マウスと野生型マウ

次に，ゲノム編集によりSPARC欠損ラットをス前脛骨筋における月齢ごとの前脛骨筋重量を測作製し，マウスにおけるのと同様の解析を行っ定したところ，調べたいずれの月齢においても，た。その結果，５ヶ月齢における前脛骨筋重量は，

SPARC欠損マウスでは野生型マウスに比べ減少

野生型ラットとの間で違いがみられなかったもの

していることが分かった５）。この重量減少の要因の ，筋 線 維 径 に つ い て は 野 生 型 ラ ッ ト に 比 べの１つとして筋線維の発育不全が生じている可能

SPARC欠損ラットで有意な減少がみられた。一性を考え，筋線維径の定量的な解析を行ったが，方，線維組織形成については両ラット間で違いが両マウス間で違いは観察されなかった 。SPARC

観察されなかった。興味深いことに，クリープ

は細胞外コラーゲンタンパク質の凝集と安定化にメータを用いて長指伸筋の歪み率を測定したとこ

関わることが報告されている。そこで，SPARC

ろ，野生型ラットに比べSPARC欠損ラットで有欠損マウスにおける筋重量の減少が，線維組織形

意に硬度が低下していた（Fig.２）。

５）成の減少による可能性について調べた。マッソン

SPARC欠損により，マウスでは線維組織形成

トリクローム染色による定量的解析の結果，が減少する一方，筋線維自体には変化がみられな

SPARC欠損マウス前脛骨筋では，２ヶ月齢以降，かったのに対し，ラットでは線維組織形成に違い

調べたいずれの月齢においても，野生型マウス前がなく，筋線維径の減少がみられた。これらの結脛骨筋でみられる線維組織形成が抑制されてい果は，骨格筋におけるSPARCの作用が必ずしもた５）（Fig.１）。このことから，マウス骨格筋では哺乳類全般に普遍的ではないことを示すものかもArea（pixel x 105）40

2 month

30

30

20

20

10

10

0

WT

5 month

40

30

WT

30

0

KO
40

WT

KO

22 month

30
＊

20
10
0

＊

10

16 month

40

20

＊

0

KO

11 month

40

＊

20
10

WT

KO

0

WT

KO

Fig. 1 Fibrillar collagen accumulation in tibialis anterior muscles of wild-type（WT）and SPARC-null（KO）

mice５）. Graphed data are quantitative analysis of area stained with Masson trichrome. Data are means±
SEM（n＝3-9）.＊, p＜0.05 vs WT mice.

© The Ito Foundation

6

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Load（N）

10

WT
KO
＊

5

0

＊＊

25

50
Distortion factor （％）

75

Fig. 2 The distortion factor of extensor digitorum longus muscles of wild-type（WT）and SPARC-

null（KO）rats at 5 month-old. Graphed data are are means ± SEM（n ＝ 6）.＊ and ＊ ＊ , p ＜ 0.05
and 0.01 vs WT rats, respectively.

しれない。ゲノム編集技術の発達により，家畜でsiRNA導入により得られた過去の知見と一致するも積極的に遺伝子欠損動物を作出することが可能かについて検証した。B2G9およびC1B3という２となっていることから，今後は広く家畜をも含めつのCSPG4欠損2G11細胞が樹立された。2G11細た比較動物学視点からの検証が求められる。

胞の特徴であるbFGF依存性の脂肪分化能７）につ一方，食肉のテクスチャーは肉質評価の１つをいて調べたところ，両者ともに野生型の2G11細構成する重要な指標であるが，今回，少なくとも胞に比べて脂肪分化能が低下していることが確認

ラット骨格筋ではSPARC欠損により硬度の低下

された（Fig.３）。一方，TGF-β依存性の線維芽が生じていることが定量的に示された。今後さま細胞への分化については，両細胞で野生型2G11

ざまな因子を欠損させた動物を作出する際，ク細胞に比べて亢進がみられた（Fig.３）。これら

リープメータによる骨格筋硬度の測定は重要なパの結果はいずれも，CSPG4が脂肪分化促進作用

ラメーターになると考えられる。

と抗線維化作用をもつというわれわれの仮説に合3 . 2 CSPG4欠損間葉系前駆細胞の樹立とその分化能致するものであった。
3 . 3 CSPG4欠損筋ジストロフィーラットの作

われわれはラット骨格筋からの間葉系前駆細胞

出とその骨格筋表現型解析の単離とそのクローン化に成功している 。得ら

前記のin vitroでの結果を受け，CSPG4のもつれた間葉系前駆細胞クローン2G11細胞は，脂肪脂肪分化促進作用と抗線維化作用がin vivoでも細胞，線維芽細胞両者への分化能を示す。CSPG4再現されるかどうかについて検討を行った。われは2G11細胞を抗原としてマウスを免疫すること

われが作出した筋ジストロフィーラット（DMD

で得られた単クローン抗体5C12が認識する分子ラット）は，病態の進行に伴い，骨格筋内に著しである４）。これまでの研究により，siRNAを用い

い脂肪化や線維化を呈する８）。そこでまずゲノムて2G11細胞のCSPG4発現を低下させると，脂肪編集によりCSPG4欠損ラットを作出し，さらに細胞への分化能が低下することが示されていこのラットをDMDラットと掛け合わせることにる 。そ こ で 本 項 目 で は ，ゲ ノ ム 編 集 に よ り

よりCSPG4欠損DMDラットを作製した。５からCSPG4発現を完全に欠損した2G11細胞を作成し，６ヶ月齢における前脛骨筋およびヒラメ筋の脂肪

その脂肪細胞や線維芽細胞への分化について，

化 や 線 維 化 の 程 度 に つ い て ，DMD ラ ッ ト と

６）

４）© The Ito Foundation

7

10
8
6
4
2
0

2G11

CSPG4

WT

B2G9

C1B3

KO

B
8
6
4
2
0

CSPG4

4

αSMA expression（/α-tubulin）

Oil Red O-positive area（＋bFGF/－bFGF）

A

Ratio of PPARγ-positive cells（＋bFGF/－bFGF）

筋肉内間葉系前駆細胞の機能改変による肉質制御技術開発に向けた基盤研究

2G11
WT

B2G9

C1B3

KO

c

3

c

2

b

1

0
TGFβ

a

a

a

－ ＋

－ ＋

－ ＋

2G11

B2G9

CSPG4

WT

C1B3
KO

Fig. 3 Adipogenic（A）and fibrogenic（B）potential of 2G11 cells lacking CSPG4（clones B2G9 and C1B3）. In B, data

are means ± SEM（n ＝ 3）.Different letters indicate statistically significant differences by Tukey-Kramer test（p ＜0.05）.
B

Fibrotic area（% total）

40
35
30
25
20
15
10
5
0
CSPG4

Perilipin positive area（% total）

A
＊

（＋/＋）

（－/－）

2.5
2
1.5
1
0.5

0
CSPG4

（＋/＋）

（－/－）

Fig. 4 Fibrillar collagen accumulation（A）and appearance of adipocytes（B）in soleus muscles of DMD rats with（＋/＋,n ＝ 5）or without（－/－, n ＝ 4）CSPG4. Graphed data are quantitative analysis of area stained with Masson trichrome（A）and anti-perilipin（B）. Data are means±SEM. ＊, p＜0.05 vs DMD（＋/＋）rats.

CSPG4欠損DMDラットとの間で比較を行った。
その結果，前脛骨筋における脂肪化や線維化の程

４．要

約

度には違いはみられなかったものの，ヒラメ筋で本研究では，筋肉内に存在する間葉系前駆細胞

はCSPG4欠損により線維化の亢進（マッソント

が脂肪細胞・線維芽細胞両者へと分化することにリクローム染色）と脂肪化の抑制（ペリリピンの着目し，その分化制御に関わる因子SPARCや免疫染色）がみられた（Fig.４）。現段階で，こCSPG4 の 発 現 を 人 為 的 に 改 変 し た 場 合 の inのような筋によるCSPG4欠損の影響に差異が生

vitro，in vivoにおける表現型を観察した。これ

じる原因については明らかではないが，前脛骨筋

らの因子がどのような機序により脂肪細胞や線維がいわゆる速筋型筋線維優位であるのに対し，ヒ芽細胞への分化能を制御するかについては今後引ラメ筋が遅筋型筋線維優位であることを鑑みる

き続き研究を進める必要があるが，得られた成果と，in vivoにおけるCSPG4の作用は，周囲に存は，実際にこれらの因子を改変することにより肉在する筋線維の型により修飾される可能性が考え質を制御できる可能性を強く示すものであった。

られた。

© The Ito Foundation

8

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

文献１） Nakamura, K., Nakano, S. I., Miyoshi, T.,
Yamanouchi, K., Matsuwaki, T., Nishihara, M.：
Age-related resistance of skeletal muscle-derived
progenitor cells to SPARC may explain a shift frommyogenesis to adipogenesis, Aging, 4, 40～48, 2012.
２） Nakamura, K., Nakano, S. I., Miyoshi, T.,
Yamanouchi, K., Nishihara, M.：Loss of SPARC inmouse skeletal muscle causes myofiber atrophy,
Muscle Nerve, 48, 791～799, 2013.
３） Nakamura, K., Yamanouchi, K., Nishihara, M.：
Secreted protein acidic and rich in cysteineinternalization and its age-related alterations inskeletal muscle progenitor cells, Aging Cell, 13, 175～184, 2014.
４） Takeuchi, S., Nakano, S., Nakamura, K., Ozoe, A.,
Chien, P., Yoshihara, H., Hakuno, F., Matsuwaki, T.,
Saeki, Y., Takahashi, S., Yamanouchi, K., Nishihara,
M.：Roles of chondroitin sulfate proteoglycan 4 infibrogenic/adipogenic differentiation in skeletal
muscle tissues, Exp Cell Res, 347, 367～377, 2016.

５） Omi, S., Yamanouci, K., Nakamura, K., Matsuwaki,T., Nishihara, M.：Reduced fibrillar collagenaccumulation in skeletal muscle of secreted protein
acidic and rich in cysteine（SPARC）-null mice, J
Vet Med Sci, 81, 1649～1654, 2019.
６） Murakami, Y., Yada, E., Nakano, S. I., MiyagoeSuzuki, Y., Hosoyama, T., Matsuwaki, T.,
Yamanouchi, K., Nishihara, M.：Establishment of
bipotent progenitor cell clone from rat skeletal
muscle, Anim Sci J, 82, 764～772, 2011.
７） Nakano, S. I., Nakamura, K., Teramoto, N.,
Yamanouchi, K., Nishihara, M.：Basic fibroblast
growth factor is pro-adipogenic in rat skeletal
muscle progenitor clone, 2G11 cells, Anim Sci J, 87,
99～108, 2016.
８） Nakamura, K., Fujii, W., Tsuboi, M., Tanihata, J.,
Teramoto, N., Takeuchi, S., Naito, K., Yamanouchi,
K . , N i s h i h a r a , M . ：G e n e r a t i o n o f m u s c u l a r
dystrophy model rats with a CRISPR/Cas system,
Sci Rep, 4, 5635, 2014.

© The Ito Foundation

9

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発
Developments in technology for meat processing by fungal aspartic
protease

竹

中

慎

治

（神戸大学大学院農学研究科）

Shinji Takenaka（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

During postmortem aging and meat processing, endogenous proteolytic degradation ofmuscle fibers into oligopeptides and release of nucleotides and free amino acids etc. lead toincrease meat flavor. In addition, treatment by commercially obtained hydrolytic enzymes is
one of efficient methods to improve meat flavor and its texture with reducing conditioningand processing periods. In the food industry, several proteases such as papain, bromelain, andcalpain are widely used for proteolytic hydrolysis, to improve meat tenderness. Aspartic
protease from Aspergillus repens shows decolorization activity toward myoglobin. Our aim is to
apply the limitedly hydrolysis of heme proteins by the aspartic protease for meat processing.
The substrate specificity toward myofibrillar, myogenic, and extracellular matrix proteins were
examined using the recombinant aspartic protease（rPepA）. Among 9 tested natural proteins,rPepA showed the extremely high activity toward hemoglobin from Porcine, Human, andBovine blood；and the hydrolytic activity toward collagen and elastin from Bovine were very
low. The relative activity of rPepA toward casein（1）and elastin（0.08）was similar that ofpapain and bromelain as previously reported. The hydrolysis profile in rPepA probably would
be able to apply for meat tenderizing. The limitedly hydrolysis and decolorization of myoglobin
by rPepA are expected for adjusting the color of sausages and salami. We tried to propose themechanism of the limited hydrolysis and decolorization of myoglobin by rPepA. Afterhydrolysis of myoglobin by rPepA, released peptides were separated by SDS-PAGE andreverse phase chromatography by ODS column and the N-terminal amino acid sequenceswere analyzed. Based on analyses of the amino acid sequence of myoglobin and the
3D-structure model, myoglobin was hydrolyzed at least at 13 positions by rPepA. Especially,heme-binding regions were limitedly hydrolyzed．

１．目

成を一定期間行うことが好ましいとされ，うま的

味・こく味を増大させるためには１週間から１か

香味や食感に優れた食肉やハム，ソーセージ，

月以上も熟成させる。長期熟成の目的は，自己のベーコン等の食肉加工品を得るためには，低温熟

プロテアーゼによって自己消化を引き起こすこと© The Ito Foundation

10

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

で呈味性の遊離アミノ酸やペプチドの含量を増大

筋原線維タンパク質は，オーストラリア産牛ももさせることにある。一方，熟成期間を短縮化する

肉から調製した。アスパルティックプロテアーゼ

ことは，冷蔵・保蔵コストの削減，微生物によるは，既報の方法に従って調製した６）。

腐敗や品質劣化の防止につながるが，うま味を付

2 . 2 組換えアスパルティックプロテアーゼの与するために別の熟成手段が必要となる。

調製

食肉やその加工品のおいしさを決める重要な要

A. repens MK88由来アスパルティックプロテ

因として「肉の柔らかさ」，「くちどけ」，「うま味」

アーゼ（rPepA）は，Pichia pastoris-pPICZaA-があげられる。肉はおいしさだけでなく，咀嚼し

PepA６）をBMMY培地（100ml/500ml坂口コルベ

やすいやわらかさも消化効率や栄養摂取の面で重ン）にて0.5％（v/v）となるようにメタノールを要である。特に，高齢化が進む先進諸国では肉質添加しながら９日間培養し，遠心上清を回収しの改善のためにプロテアーゼが検討されている。

た。つづいて，上清にアセトンを添加し，沈殿と例えば，植物由来のパパイン，ブロメライン，ア

して回収して得られた酵素を20mM酢酸ナトリウ

クチニジンやコラーゲンを加水分解する微生物由ム緩衝液（pH5.0）に対して透析することで成熟

来コラゲナーゼ等があげられる

rPepA（200から250Ｕ）を得た。

。一方，うま１～３）

味の因子のひとつである遊離アミノ酸含量の増大

2.3のために，微生物由来ペプチダーゼも検討されて牛もも肉のミンチ（５ｇ）に対し，６倍量のいる 。近年，肉を「塩麴」に漬け込むことで「うTEK 溶 液（0.1M KCl/1mM EDTA/10mM Tris-

ま味やこく味を増しつつ，中までしっとりとした

HCl（pH7.0））を加え，ホモジナイズ（10,000rpm,

深い味わい」を引き出す調理法が注目されてお1min）（エースホモジナイザーAM-5，日本精機

り，食肉やその加工品の高付加価値化はこれから製作所）した。遠心分離（600×g，10min）後，ますます重要視されると思われる。

６倍量のTEK溶液で懸濁・再度ホモジナイズし，

４）

筋原線維タンパク質の調製申請者オリジナルの好乾性糸状菌由来アスパル

遠心して沈殿物を得た。メッシュフィルターで結ティックプロテアーゼは，ヘムタンパク質を限定

合組織を除去し，遠心後の沈殿をTEK溶液で穏分解する 。よって，肉由来のタンパク質を過剰や か に 懸 濁 し た 。得 ら れ た 筋 原 線 維 画 分 を ，に加水分解することなく，「肉の柔らかさ」とTEK溶液での懸濁と遠心による上清の廃棄を繰

「うま味」両方をほどよく改善できると期待されり返し，均質化した。

５）る。そこで，本研究では，同アスパルティックプ
ロテアーゼについて筋原線維・筋形成・結合組織

2 . 4 筋原線維・筋形成・結合組織タンパク質に対する分解活性タンパク質に対する分解活性を調べるとともにミ

既報の方法に従い５），0.6％（w/v）基質-50mM

オグロビンの限定分解機構を明らかにし，食肉加

酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）550μlに対して工への潜在能力を明らかにすることを目的とする。

2.5μgの精製rPepAを添加し，30℃で１時間反応

２．方
2.1

を行った。加水分解により遊離したペプチド量を法

Folin-Ciocalteu試薬（和光純薬工業）にて定量し材料た。同条件で標準のＬ-チロシン（和光純薬工業）

分解活性試験で使用した基質は，筋原線維タンを用いて算出したモル吸光係数は9.43×10３cm－１・

パク質以外Sigma Aldrichから購入した。また，

Ｍ－１であった。酵素単位１unitは，１分間に１μmol© The Ito Foundation

11

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発のチロシンを含むペプチドを生成させる酵素量と・溶離液：Solvent A：5mM TFAおよびSolvent

定義した。試験した基質は，Table１に記載の９

B：5mM TFA-アセトニトリル（４：６，v/v）

種類である。

・溶 出：Sol.A-Sol. B（100：0, v/v）→（75min）

2 . 5 ヘムタンパク質の加水分解と生成ペプチドの解析→Sol.A-Sol. B（0：100, v/v）
・流速：0.5ml/min，・検出：UV 280nm

ミオグロビン（馬心筋由来）を基質とし，2.4
で 述 べ た 方 法 に て 加 水 分 解 物 を 得 て ，SDS-

３．結果と考察

PAGE解析とODSカラムによる分析によって，精3.1製ペプチドを解析した。

筋形成・結合組織・筋原線維タンパク質等に対

2.5.1

rPepAにおける基質特異性試験

SDS-PAGEによる生成ペプチドの解析

する分解活性を調べた（Table１）。親株MK88株

ATTO AE-6530Ｍラピダス・ミニスラブ電気

由来アスパルティックプロテアーゼにおけるヘモ

泳動装置（アトー株式会社，東京）を用いた。同グロビンに対する活性（pH3.0）を100％とした装置マニュアルに従い，15％（w/v）ポリアクリ際の相対活性はミオグロビン（23.3％），カゼイ

ルアミドゲル（ePagel ET-15L）を用いて，泳動

ン（33.3％），BSA（28.3％）である５）。本研究でした。タンパク質検出方法も同マニュアルに従は食肉の加工や熟成への応用を念頭に，pHをよい，Coomassie brilliant blue R-250（CBB）染色り弱酸性側にシフトさせて加水分解活性を調べた法を行った。メインバンドについては，PVDF膜が，相対活性は類似していた（Table１）。今回市に転写後，Ｎ末端アミノ酸配列解析を行った。

販品として入手できなかったが，Table１の脚注

2.5.2

HPLCによる生成ペプチドの解析に述べたように牛由来ミオグロビンやヘモグロビ

以下に示す条件で分析し，主要なピーク由来のンは，馬や豚由来同タンパク質とアミノ酸レベル

ペプチド画分についてＮ末端アミノ酸配列解析をで82-88％の高い類似性があることから，rPepA行った。

は牛由来ミオグロビンやヘモグロビンに対しても・カラム：COSMOSIL 5C18-AR-II（4.6×150mm，同程度の活性を示すと予想される。

ナカライテスク，京都）

牛，豚，鶏などの食肉の硬さは筋細胞内の筋原

Table 1 Hydrolytic activity of rPepA toward various natural proteins
Substrate / Source
Myoglobin

Enzymeactivity（U/ml）
Relative
activity（%）

Hemoglobin

Horse
SkeletalmusclePorcineHuman

Bovineblood

0.47±0.020

1.55±0.054

1.62±0.040

1.52±0.045

29.1

95.9

100

93.8

Collagen

Elastin

Myofibrillar
proteins

BSA

CaseinBovine（Achilles）

Bovine（neck）

BovineBovineBovine0.15±0.030 0.038±0.030
9.4

2.4

0.35±0.045
23.5

0.43±0.019 0.50±0.054
29.3

30.9

＃The amino acid sequence of myoglobin from Equus caballus（DDBJ/EMBL/GenBank accession no. P68082, 154 a.a.）showed 88%
identity（136/154 a.a.）with that from Bos taurus. The sequence of hemoglobin alpha- and beta-subunits from E. caballus（1QPW_
C, 141 a.a.；1QPW_B, 146 a.a.）showed 86%（122/141 a.a.）and 82%（119/144 a.a.）identities with those from B. taurus（1FSX_C, 141a.a.；1FSX_D, 145 a.a.）. Means±SD.

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12

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

繊維タンパク質の構造とエラスチン，コラーゲン

い，肉の柔らかさを25-30％改善する ９）。rPepAなどの硬質タンパク質による筋細胞外の構造が関もまたpH7.0においても70-80％の残存活性があ与している。前者の構造は熟成によって変化を受り，筋原線維タンパク質の限定加水分解が期待さ

けるが，筋細胞外の構造は内在するエンドペプチれる。本研究では，筋原線維タンパク質のSDS-

ダーゼの作用を受けず，熟成によっても，変化をPAGEによる加水分解パターンの解析に至ってい受けない。そこで，機械的に破壊した後にパパイ

ないが，今後検討したい。

ンやブロメラインなどの植物由来のプロテアーゼ

3 . 2 rPepAの加水分解によって生じるミオグ

による軟化が行われている。細菌由来エラスター

ロビン由来ペプチド類の解析

ゼ，パパインおよびブロメラインについてエラス

牛肉の購入に際し，判断基準として食肉の色調

チンに対する活性比較では，エラスターゼ，パパがあげられる。肉の色は主にミオグロビンの量とイ ン ，ブ ロ メ ラ イ ン の 相 対 値（elastin/casein）

酸化状態によるが，還元状態のミオグロビンは深は0.53，0.035，0.045である 。また，メタロプロ

紅色を示し，酸化したオキシミオグロビンは好ま

テ ア ー ゼ は ，15 ％NaCl 存 在 下 で は elastin/

しい鮮紅色となる。rPepAはミオグロビンやヘモ

caseinの相対値は5.78と結合組織タンパク質の加グロビンを限定分解することが予備的な知見で分水分解に優れるが，塩非存在下では0.97と同程度かっているが５），加水分解位置の詳細は明らかでとなる８）。一方，rPepAの相対値（elastin/casein）

ない。そこで，加水分解によって生じたペプチドは0.076であり，パパインやブロメラインと同程の配列を解析することで分解位置の推定を行った。

７）

度であることが分かった。肉の軟化には，筋原線

3.2.1

SDS-PAGEによる生成ペプチドの解析

維タンパク質の分解も重要であるが，過剰に分解

rPepAとミオグロビンを反応し，得られた分解が進むと肉組織が脆くなり，べたつき感が生じ肉物をSDS-PAGEに供した（Fig.1（Ａ））。主要な本来の弾力感が損なわれる。A. oryzae由来アス

バンドをPVDF膜に転写後，Ｎ末端アミノ酸配列

パルティックプロテアーゼを中性条件下で作用さ解析を行った結果，加水分解位置を５か所明らかせると，筋原線維タンパク質の限定加水分解を行にできた（Table２）
。

（A）
M

（B）

S

42
30
20
17

Myoglobin

6.5

Produced
peptidesAbsorbance at 280 nm

<kDa>
1
6

2

0

11

5

9
10
8
12
13

20

30

4
3

10

7

14

15

40

Retention time（min）
Fig. 1 SDS-PAGE（A）and HPLC（B）analyses of hydrolysate of myoglobin by rPepA© The Ito Foundation

50

13

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発

3.2.2

HPLCによる生成ペプチドの解析

結 果 ，加 水 分 解 位 置 を ９ か 所 明 ら か に で き た

ミオグロビン由来加水分解ペプチドを逆相クロ（Table３）。同定できた配列を基にrPepAによるマトグラフィーに供し，ペプチドマッピングを

ミオグロビン加水分解位置をまとめた（Fig.２）。

行った（Fig.1（Ｂ））
。同クロマトグラムを参考

ミオグロビンの高次構造モデル（1DWS）から，に分取を行い，Ｎ末端アミノ酸配列解析を行った

加水分解位置は，ヘムが結合している領域とは反Table 2 N-terminal amino acid sequence analysis of produced peptides from myoglobin separated by SDS-PAGE
Produced peptide

Size（kDa）

N-terminus a.a.

1

10

GLSDG

5

N.A.

TALGGIL

2

9

LFTGHPE

6

N.A.

GLSDGEWQQV

7

N.A.

N.A.

3

7.8

FDKFKHLKTE

4

7.3

AEMKASE

Produced peptide

Size（kDa）

N-terminus a.a.

Table 3 N-terminal amino acid sequence analysis of produced peptides from myoglobin separated by HPLC
Fraction

Retentiontime（min） N-terminus a.a.

1
2
3
4
5
6
7
8

10
12.56
14.08
15.38
19.53
20.44
24.12
25.38

Fraction

KGHHE
N.A.
N.A.
FRND
GLSDG
ATKHK/GFQG
ELKPL
NVWGK

Retentiontime（min） N-terminus a.a.

9
10
11
12
13
14
15

25.95
28
29.76
31.52
32.82
35.57
39.03

N.A.
ISDAI
ADIAG/NVWGK
N.A.
N.A.
N.A.
N.A.

（A）
MGLSDGEWQQ VLNVWGKVEA DIAGHGQEVL IRLFTGHPET LEKFDKFKHLKTEAEMKASE DLKKHGTVVL TALGGILKKK GHHEAELKPL AQSHATKHKI
PIKYLEFISD AIIHVLHSKH PGDFGADAQG AMTKALELFR NDIAAKYKEL
GFQG
（B）
EA

EA

LN

RL
FI

LT
N

KF
C
HA

LG

LF

KK

AE

Fig. 2 Hydrolysis positions of myoglobin by rPepA
（A）amino acid sequence of myoglobin.（B）3D-structure of myoglobin. Hydrolysis sites analyzed by protein sequencer
with SDS-PAGE and HPLC fractionations were shown in black and gray, respectively. Heme was shown in magenta.

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14

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

対側に多数存在することが分かった。配列未同定

は，同プロテアーゼについて筋原線維・筋形成・のサンプルが７つあり（Table３），SDS-PAGEで結合組織タンパク質に対する分解活性やミオグロ検出したポリペプチド由来のペプチドも含まれてビンの限定分解機構を調べ，食肉加工への潜在能いると思われる。

力を明らかにすることを目的とした。エラスチン

ミオグロビンに含まれるヘムのまわりには，／カゼインの相対値を算出すると同プロテアーゼ

Leu， His， Val， His， His， Phe， Ile残はパパインやブロメラインと同じく結合組織タン基が配位している10）。rPepAは少なくともこれら

パク質に対する活性は低かった。また，ミオグロの近傍の３か所を加水分解できることから，ヘムビン由来加水分解ペプチドのＮ末端アミノ酸配列の遊離によるミオグロビンの脱色が引き起こされ解析を行った。同酵素はミオグロビンのヘム近傍

ると予想される。A. niger由来glutamic peptidaseの３か所を加水分解し，ヘムの遊離によるミオグ

は，ヘモグロビンの部分分解はHis残基を好んでロビンの脱色５）が引き起こされると予想される。

加水分解し，加水分解物は乳化性を有することが今後，食肉に対する分解様式や遊離ペプチドにつ報告されているが，ミオグロビンの加水分解について調べることで，食肉加工・熟成工程におけるいては明らかではない 。rPepAによるミオグロ

熟成の短縮化，呈味性や食感の向上への寄与を明

ビンの脱色は，サラミやドライエージングハムのらかにできると考えられる。

29

64

68

93

95

138

142

11）

色調調整にも利活用可能である。本研究では，
rPepAを用いて食肉に含まれるタンパク質について個々に加水分解能を調べたが，それらの混合物
や食肉に対する分解様式や遊離ペプチドについて調べることで，食肉加工・熟成工程における熟成の短縮化，呈味性や食感の向上への寄与を明らかにできると考えられる。
４．要

約

香味や食感に優れた食肉やハム，ソーセージ，
ベーコン等の食肉加工品を効率よく製造するためには，「肉の柔らかさ」，「くちどけ」，「うま味」
といったおいしさを決める要因を向上しながら熟成期間を短縮化することが重要である。肉質改善法の１つとして酵素処理法があげられる。申請者
オリジナルのアスパルティックプロテアーゼは，
ミオグロビンに対して限定分解を示す。本研究で

文
献１） 味の素株式会社，特開平05-007476
２） 昭和産業株式会社，特開平05-252911
３） エーザイ株式会社，特開平06-169729
４）
 Flores, M., Toldrá, F.：Trends in Food Science &Technology, 22, 81～90, 2011.
５）
 Aoki, K., Matsubara, S., Umeda, M., Tachibana, S.,
Doi, M., Takenaka, S.：J. Sci. Food Agric, 93, 1349
～1355, 2013.
６）
 Takenaka, S., Umeda, M., Senba, H., Koyama, D.,
Tanaka, K., Yoshida, K., Doi. M.：J. Sci. Food Agric,97, 95～101, 2016.
 Qihe, C., Guoqing, H., Yingchun, J., Hui, N.：Food
７）
Chem, 98, 624～629, 2006.
８）
 Kim, M., Nishiyama, Y., Mura, K., Yokue, C., Arai,
S.：Biosci. Biotech. Biochem, 68, 1533～1540, 2004.
 Ashie, I. N. A., Sorensen, T. L., Nielsen, P. M.：
９）
Food Sci, 67, 2138～2142, 2002.
10）
 Chu, K., Vojtchovský, J., McMahon, B. H., Sweet,
R. M., Berendzen, J., Schlichting, I.：Nature, 403,
921～923, 2000.
 Shi, J., Roos, A., Schouten, O., Zheng, C., Vink, C.,
11）
Vonk, B., Kliphuis, A., Schaap, A., Edans, L.：Food
Sci, 80, 1202～1208, 2015.

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15

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンⅨの形成様相と存在形態に関する研究
Studies on the formation and the existence form of zinc protoporphyrin Ⅸ
in dry-cured ham

若

松

純

一

（北海道大学北方生物圏フィールド科学センター）

Jun-ichi Wakamatsu（Field Science Center for Northern Biosphere, Hokkaido University）

In order to elucidate the mechanism by which zinc protoporphyrin IX（ZnPP）in nitrite/
nitrate free dry-cured meat products, we tried to clarify ZnPP-binding protein in waterextractable ZnPP from Parma ham and to observe the aspect of ZnPP formation in dry-cured
ham. It was clarified that ZnPP was bound to hemoglobin and myoglobin in Parma ham waterextract. When the aspect of ZnPP formation was observed in dry-cured ham during
processing, the strong red fluorescence was emitted at the inside but the formation of ZnPP
was not occurred in the peripheral part due to oxygen. In the inner area of the cross-section,
the strong ring-like fluorescence of ZnPP was formed compared to the center area of ham.
According to the microscopic observation, there were no difference of ZnPP distribution
between the ring and center areas in ham section and the formation speed in the ring area
seemed to be faster than that in the center area. However, these results would be a useful clue
to elucidate the mechanisms by which ZnPP is formed in meat products without the additionof nitrite/nitrate.

１．目

いるが，酸性条件下でアミンやアミド類と反応し的て発がん性物質を形成することから，発色剤を嫌イタリアの伝統的な生ハムの１つであるパルマ

う消費者が存在する。ZnPPの形成は発色剤を使

ハ ム（Prosciutto di Parma）は ，硝 酸 塩 や 亜 硝

用しない無塩漬食肉製品の色調改善に期待できる。

酸塩などの発色剤を使用していないにもかかわら

ZnPPの前駆物質に関する研究では，ZnPPはヘず，鮮やかな色調をしている。この色調は発色剤

ムに配位している鉄が亜鉛に置換した構造であるを用いた食肉製品に存在するニトロシルミオグロ

ため，食肉内に多量に存在するミオグロビン内のビンによるものではなく，亜鉛プロトポルフィリ

ヘムがZnPPの前駆物質である３，４）とする「ヘムンIX（ZnPP）が多量に形成されて １，２），パルマ

由来説」が多い。置換反応にはフェロケラターゼ

ハムの特徴的な色調に寄与していることが明らか（FECH）が関与するという報告があるものの，にされた。発色剤は色調だけでなく，風味形成や

ミオグロビンよりも３倍程度分子量の大きい

ボツリヌス菌の増殖抑制など多彩な機能を有してFECHが，ミオグロビン内部に位置するヘムの鉄© The Ito Foundation

16

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

を亜鉛に置換する触媒作用を物理的に可能かは疑色LED（中心波長400nm）を照射して，600nm付

わしい。さらに，FECHは哺乳動物ではミトコン

近の光を透過するバンドパスフィルターを装着しドリア内膜に結合するため，作用するにはミオグ

たデジタルカメラでZnPPの蛍光を撮影した。そロビンがミトコンドリア内に侵入してFECHに近の後，ただちにCBB染色を行い，タンパク質のづくか，FECHがミトコンドリア内から遊離する染色を行った。

必要がある。このようにヘム由来説は物理的な矛

2 . 2 分離した水溶性ZnPP結合タンパク質の同定盾点が多い。
一方，我々はヘムからではなく，ヘム生合成系

パルマハム水抽出物を尿素ゲル電気泳動で分離の前駆物質から形成すると報告した 。また，パしたバンドを回収したもの，またはパルマハム水

ルマハム内のZnPPは水溶性と不溶性のものが存

抽出物を各種クロマトグラフィにて分離したもの

在し，なんらかのタンパク質と結合して存在してをSDS-PAGEに供試して，PVDF膜に転写した

いるが，水溶性ZnPPは分子量からはミオグロビ

ものをエドマン分解によりＮ末端のアミノ酸配列

ンではないようで（未発表データ），結合タンパを解析した。さらに，エドマン分解により同定しク質を明らかにすれば形成場所の推測ができるかたタンパク質に対する抗体を用いて，尿素電気泳もしれない。さらに，ZnPPの蛍光による局在検動で分離したものをウェスタンブロッティングに出技術を確立しているため，製造中のZnPP分布

よりPVDF膜に転写して化学発光法で検出した。

５）

様相を明らかにすれば，ZnPPがどの時期にどこ

2.3

小型乾塩漬ハムの製造で作られるかを視覚的に明らかにできるかもしれ豚大腿二頭筋から100-150ｇの肉塊を切り出し，食塩を肉重量の３％加えて混ぜ，真空包装して３ない。
そこで本研究では，ZnPP形成機構を解明する

日間乾塩漬を行った。セロハンケーシング（折径ため，水溶性のZnPPに着目してZnPP結合タンパ６cm）に充填して結紮し，４℃で１週間吊るし

ク質の解明と，乾塩漬ハム製造中のZnPP形成様た。その後，20℃で８時間加温後，７℃に温度を相を明らかにすることにした。

下げた。その後，２日に１℃ずつ，２週間かけて

２．方

14℃まで温度を上げ，そのまま14℃で保持した。

法

なお，乾燥・熟成期間中の湿度は75％にした。製

2 . 1 パルマハム水抽出物の調製と尿素ゲル電

造期間中に適宜サンプリングと凍結切片のブロッ
ク の 作 製 を 行 い ，実 験 ま で 凍 結 保 存 し た

気泳動による分離
市販のパルマハム原木から切り出して細切した（－35℃）。

ものに，６倍量の純水を加えて，ホモジナイズし2.4

た。懸濁液を遠心＆ろ過して，ろ液をパルマハム

サンプリングしたパルマハムの断面を，上述の水抽出物とした。尿素ゲル電気泳動は，Laemmli

尿素ゲル電気泳動と同様にZnPPの自家蛍光を観の緩衝液系を用いて，0.1％SDSの代わりに４Ｍ察・撮影した。また，微細局在の観察では，凍結尿素を加えたゲルを調製した。なお，泳動緩衝液

切片を作製後，共焦点レーザー顕微鏡を用いて，中のSDSも加えなかった。電気泳動後，ただちに

405nm Blue diodeレーザーにより励起して590nm

暗室内で，ガラス板から外さないで，420nm付近で観察した。

の光を透過するバンドパスフィルターを通して紫© The Ito Foundation

小型乾塩漬ハム中のZnPPの分布観察

17

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンⅨの形成様相と存在形態に関する研究により分離して同様にＮ末端アミノ酸配列を解析

３．結果と考察したところ，バンド１（Fig.１）はヘモグロビン

3 . 1 水抽出可能なZnPP結合タンパク質の分離と同定

αサブユニットと同定された。
次に，パルマハムの水抽出物を尿素ゲル電気泳

市販の３本のパルマハムの水抽出物を尿素ゲル動で分離したものをPVDF膜に転写して，抗ミオ

電気泳動に供したところ，いずれの個体においてグロビン抗体ならびに抗ヘモグロビン抗体を用いも，同様に７本の赤色の蛍光バンドが観察されたてウェスタンブロッティングにより検出したとこ（Fig.１）。しかし，CBB染色像では，蛍光バンド

ろ，ZnPP由来の６本の蛍光バンドの上３本が，の位置には多くの他のタンパク質が共存してい抗ヘモグロビン抗体に，下３本が抗ミオグロビン

た。また，ゲル下端の泳動先端のバンド（バンド抗体と陽性反応を示した（Fig.２，PHE）。一方，

７）は，試薬のZnPPと同じ移動度を示したため，新鮮な豚肉水抽出物を同様に分離して同様に反応

遊離のZnPPであることが示されたが，パルマハ

させたところ，いずれも一番上のバンドのみが陽ム中に遊離で存在しているか，４Ｍ尿素により外性反応を示し（Fig.２，PE），残り２本は各々のれたかは明らかにできなかった。このため，中央分解産物であることが推察され，大部分の水溶性部で分離された６本の蛍光バンド（バンド１-６）

ZnPPはヘモグロビンとミオグロビンと結合してを以降の実験で検討した。

存在することが示唆された。

尿素ゲル電気泳動で分離したバンドを，さらに3.2

小型乾塩漬ハム中におけるZnPPの分布

SDS-PAGEで分離したものをPVDF膜に転写し小型の乾塩漬ハムを製造して，製造中に経時的てエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列を解析にサンプリングを行い，断面におけるZnPPの分したところ，バンド４（Fig.１）のみがミオグロ布を観察した。蛍光は経時的に強くなり，外縁部

ビンと同定された。これは夾雑タンパク質の影響とその内側にリング状の強い蛍光が観察されたであると考えられたため，各種クロマトグラフィ（Fig.３）。これは，酸素がZnPP形成を阻害する
FL

CBB
kDa

kDa

FL

46
31
26

PHE

Anti-Hb
PE

PHE

PE

Anti-Mb
PHE

PE

96

M ZnPP PH1 PH2 PH3 ZnPP PH1 PH2 PH3

73

96
73

M

1
2
3
4
5
6

46

31

7

Fig. 1 Urea-PAGE image of three Parma ham water-

extracts（PH1-3）. Immediately after electrophoresis
the fluorescence image of the gel was taken（FL）
and then the gel was stain with CBB （CBB）.
ZnPP：ZnPP reagent was applied. M：Marker.

Fig. 2 Urea-PAGE fluorescence and western-blotting

images. Anti-hemoglobin（Hb）and anti-myoglobin（Mb）antibodies were used in western-blotting.
PHE：Parma ham water extract, PE：pork waterextract, M：Marker.

© The Ito Foundation

18

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Sampling days
Day 24

Day 38

Day 84

Fluorescence
ImagesVisual Images

Day 10

Bar：1 cm
Fig. 3 Changes on the aspect of appearance and fluorescence in the cross section of dry-cured ham

during processing.

Fluorescence images
Red
Green
C

Fluorescence intensity (Ex：420 nm)

800

R

P

G
P

600

400

200

0
500

590 nm↓R
630 nm
↓

G

550

600
650
Wave length (nm)

C

700

750

Fig. 4 Green and red fluorescence images and fluorescence spectra at each area. C：center area, R：

ring-like area, G：gap area, P：peripheral area.

というこれまでの報告６）と合致した。外縁部の蛍光が観察された（Fig.４）。代表的な低温細菌で光は目視によると黄緑色であったことから，各部あるPseudomonas属が産生するピオベルジンと分における蛍光スペクトルを観察したところ，外色が類似していたこと７）から，ZnPP由来ではな縁部だけ異なる蛍光スペクトルがみられ，緑色のいことが示された。一方，他の部分はZnPP特有

フィルターを介して蛍光像を観察すると，強い蛍の590nmと630nmにピークを有する蛍光スペクト© The Ito Foundation

19

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンⅨの形成様相と存在形態に関する研究
Sampling days
Day 24

Day 66

Day 94

Ring

CenterDay 10200 μmFig. 5 Changes on the microscopic aspect of red fluorescence in the center and ring areas of ham during processing.

ルが観察された。

成様相を経時的に観察したところ，製品の内部に

次に，リング部と中心部で蛍光の強さ，すなわ

ZnPPの強い蛍光が観察され，外縁部には酸素の

ちZnPP形成量が異なる原因を検討するため，凍影響でZnPPの形成が認められなかった。しかし，結切片を作製して，ZnPPの分布の微細観察を行っ

内部のZnPPの蛍光は中心部より外側にリング状た。断面の蛍光と同様に，製造に伴い，筋線維にの強い蛍光が観察されたが，形成速度の違いによ

おけるZnPP由来の蛍光は強くなり，断面で蛍光ると考えられ，その原因を明らかにすることはでの強かったリング部のほうが強い蛍光が観察されきなかった。

た（Fig.５）。しかし，ZnPPの分布様相について
は，リング部と中心部では違いが認められず，形
成速度の違いによるものと思われたが，その原因を明らかにすることはできなかった。
４．要

約

発色剤無添加の食肉製品中のZnPP形成機構を解明するため，水溶性のZnPPに着目してZnPP結合 タ ン パ ク 質 の 解 明 と ，乾 塩 漬 ハ ム 製 造 中 のZnPP形成様相を明らかにすることにした。水抽出可能なZnPPは，主にヘモグロビンとミオグロビンと結合して存在することが明らかにされた。

文
献１） Wakamatsu, J., Nishimura, T., Hattori, A.：Meat
Sci., 67, 95～100, 2004.
 Wakamatsu, J., Odagiri, H., Nishimura, T., Hattori,
２）
A.：Meat Sci., 82, 139～142, 2009.
３）
 Taketani, S., Ishigaki, M., Mizutani, A., Uebayashi, M.,
Numata, M., Ohgari, Y., Kitajima, S.：Biochemistry,
46, 15054～15061, 2007.
 Paganelli, M. O., Grossi, A. B., Dores-Silva, P. R.,
４）
Borges, J. C., Cardoso, D. R., Skibsted, L. H.：Food
Chem., 210, 491～499, 2016.
 Wakamatsu, J., Okui, J., Hayashi, N., Nishimura, T.,
５）
Hattori, A.：Meat Sci., 77, 580～586, 2007.
６）
 Wakamatsu, J., Okui, J., Ikeda, Y., Nishimura, T.,
Hattori, A.：Meat Sci., 68, 313～317, 2004.
 Meyer, J.：Arch. Microbiol., 174, 135～142, 2000.
７）

一方，小型の乾塩漬ハムを製造して，ZnPPの形© The Ito Foundation

20

ドライエイジングビーフの香気に及ぼす真菌の影響
Effect of mold on the aroma of dry aging beef

中川

麻衣・小室

春菜・中島

誠人・猪口

由美・高鳥

浩介＊

（一般社団法人食肉科学技術研究所，＊NPO法人カビ相談センター）

Mai Nakagawa, Haruna Komuro, Yoshito Nakashima, Yumi Inoguchi and Kousuke Takatori＊（Japan Meat Science & Technology Institute，＊Center for fungal Consultation Japan）

In this study, we attempted to effect of molds on aging-aroma of dry-aging beef. The timecourse of aging-aroma and molds during the aging period was investigated. Aging-aroma
increased after 20 days of aging. The psychrophilic molds Thamnidium elegans and Mucor
strictus were detected in the sample. These increased as aging period. When the isolated
M.strictus was incubated at 5℃ for 20 days, a strong nutty-flavor similar to that of agingaroma was generated from the colony. It was possible that the aroma produced by molds wasadded to meat as aging-aroma. In addition, T.elegans and M.strictus has the enzyme
productivity. These were confirmed to be able to proceed even under low temperature by
aging for 15 days or more. The fact that the time required for enzyme production by the molds
coincided with the time until the appearance of the aging-aroma showed that the enzymatic
reaction might also influence aging-aroma. These results suggest that aging-aroma is related
to enzyme productivity of molds and the aroma produced by M.strictus. In particular, it’s
thought probability that of M.strictus had a great effect on aging-aroma. There is a possibility
that aging-aroma can be efficiently give by controlling molds.

１．目

古くから取り組まれている。この熟成方法は，食的

肉が空気と接することができる点において，フィ

食肉の熟成による効果には，軟化，呈味の向上
および独特の香りの発現など食肉の品質特性の変ルム包装により空気と食肉を遮断するウェットエ
イジング法と区別される。

化がある。近年，これらの品質特性に多様性をも

熟成は呈味の向上に必要不可欠であり，それにたらし，その食肉に付加価値を与える熟成方法とは食肉内在性の酵素による遊離のアミノ酸やペプ

して，ドライエイジング法が盛んに行われていチドの増加の寄与が明らかにされているが１），こる。ドライエイジング法は，温度および湿度を一

れら以外の物質の関与が示唆されており２），熟成

定に保ち，空気を循環させた熟成庫内において，期間中に起こる化学的あるいは生物的反応の全容

フィルム等に包装せず食肉を空気と接することが解明には至っていない。

できる条件下で熟成させる方法であり，世界では一方，熟成によって発現する香り（熟成香）に© The Ito Foundation

ドライエイジングビーフの香気に及ぼす真菌の影響

21

関 し て は ，微 生 物 の 影 響 が 示 さ れ て お り ，

り除くトリミング作業を行う。試料はトリミング

Brochothrix thermosphactaがミルク臭に似た生鮮作業によって，取り除いた表面部分と可食部分に香気を発現するとの報告がある３）。ドライエイジ分割した。熟成０，
５，10，14，20，30，40およ

ング法では，熟成された牛肉（ドライエイジング

び50日目の試料は，表面より２cmまでをトリミビーフ）に，特徴的な香りとされるナッツ臭様のングし，それを表面試料として微生物試験に供し熟成香が発現することが，経験的に知られていた。一方，表面試料を除いた可食部分の胸最長筋る。しかし，その発現メカニズムについては，ほをトリミング後試料として微生物試験，理化学試

とんど研究が進んでいない。ドライエイジング法

験および官能試験に供した。官能試験用の試料はでは，温度，湿度および気流を管理することに加真空包装し，試験まで－30℃で凍結保管した。試えて，真菌を利用する場合がある。真菌はチーズ

験前日に２℃の冷蔵庫に移し，一晩かけて解凍しやサラミの製造に利用されており，その香りの発た後，官能試験に供した。

現の因子となっている。ドライエイジング法

４，５）

2.2

理化学試験

においても，真菌が熟成香の発現に関与する可能

トリミング後試料（胸最長筋）において，水分性が報告されているが，特定の真菌との関連性は活性の分析には３cm幅に切り出したもの，pHお明確にされていない６）。熟成香の生成に真菌が与よび水分含量の分析にはフードカッター

える影響や真菌による熟成の指標を特定すること（GRANDMIX GM200，Retsch）で均一化したもができれば，商品価値や安全性の高い熟成肉を効のを試料とした。水分活性は電気抵抗法（AW-率的に製造することが可能となり，食肉業界に与ラボ２，ROTRONIC），pH測定はガラス電極（PH-える経済的ならびに衛生的なメリットは大きいとMETER F52，堀場製作所）を用いて測定，水分考えられる。本課題では，ドライエイジング法には常圧加熱乾燥法により測定した。

より長期熟成を施した牛肉を用いて，菌叢の変化

2.3

ならびに菌叢より得られた真菌の特性のほか，熟試料を４cm×４cm×0.8cmに整形し230℃に設成に伴う食肉の水分含量および水分活性値の変化定したホットプレート（ATF-500，アサヒ理化

ならびにpHを調べた。さらに，熟成中の香りの製作所）上で両面を60秒ずつ加熱調理した。調理

経時的変化を官能試験によって評価し，ドライエ後の試料をただちに当研究所所属の訓練された分

イジングがもたらす熟成香と真菌の関連性を解明

析型パネル５名により評価した。
熟成香評価の方法は特性プロファイル法を用いすることとした。
２．方
2.1

官能試験による熟成香評価

た。同一個体の熟成０日目をコントロールとし，

法

熟成香（ナッツ臭）の強度を－３点～＋３点の７段階で評価した。

試験材料

供試料には国産交雑牛（と畜月齢27ヶ月）の３

2.4

微生物試験

頭を用いた。と畜から３日目にサーロインを採取

試料を食品衛生検査指針に準じて一般生菌数，

後厚さ９cmに８等分した。温度を４℃以下，相乳酸菌数，真菌数を測定した。B.thermosphacta

対湿度を75％に調節した熟成庫内に，試料を常に数はISO13722：1996に準じて測定した。真菌の送風があたるように静置した。ドライエイジング

培養条件は25℃７日間およびドライエイジング法

法では一般的に食肉表面に付着した微生物等を取熟成条件と同じ４℃以下を保つため３℃15日間と© The Ito Foundation

22

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

した。得られた真菌は同定後，追加試験としてポthermosphactaはワンオーダー上昇した。一方，

テ ト デ キ ス ト ロ ー ス 寒 天 培 地 に 接 種 し ５ ℃，

トリミング後試料（胸最長筋）は生菌数・乳酸

10℃，15℃，20℃の４温度帯で40日間培養した。

菌・B.thermosphactaいずれも検出されず，可食また，真菌の生育至適温度を確認するとともに酵部として良好な状態を熟成期間中維持していた。

素産生性確認の試験に供した。リパーゼ産生用培

3.2

地は，Cz寒天培地にCaCl２・H２Oとクロラムフェ

官能試験によって熟成期間中の熟成香の強さのニコールを添加し加圧滅菌後，Tween20を添加

変化を調べた（Fig.１）。その結果熟成香は熟成し平板としたもの，プロテアーゼ産生用培地は，５日目には香りが感知され，熟成期間に連動して寒天培地にSkim Milkとクロラムフェニコールを増強していく傾向が認められた。特に20日目以降

添加し加圧滅菌後平板にしたものとし，それぞれは15日目までと比較して顕著に増強が確認されに得られた真菌を接種し生育至適確認の培養条件た。以上の結果より一定の期間を経過後熟成香はに３℃，25℃を加えた６温度帯で酵素産生性を判

熟成期間に依存して増強していることが示唆され定した。なお，微生物の菌数は試料１ｇ当たりのた。
3 . 3 ドライエイジングビーフより検出されたコロニー形成数で表した。

真菌

３．結果と考察3.1

熟成期間中の熟成香の変化

今回のドライエイジングの条件下において熟成日数が進むと，試料表面には明らかな真菌の発生

理化学的特性と微生物試験結果

理化学試験の結果をTable１に示す。水分含量が観察された。表面試料を一部採取して25℃で培は熟成開始時には61.9％であったものが50日目に養したところ，Penicillium spp.が５日目より検は38.8％にまで減少した。この結果は，ドライエ

出され，その数は増減しながらも熟成期間中検出

イジング法では熟成庫内の空気と触れられる条件

さ れ 続 け た 。３ ℃ 培 養 で は ，５ 日 目 か らにあることから，熟成期間中に乾燥が進んだこと

Thamnidium.elegansとMucor.strictusの２種類のを示している。しかしながら水分活性値は熟成期真菌が検出され，これらは熟成日数の経過ととも間中に変動がなかった。微生物の増殖できる環境に増加した。両者の生育至適温度は，T.elegansを維持していたにもかかわらず後述する生菌数・が５℃および15℃，M.strictusが15℃および20℃

乳酸菌は検出されなかった。pHは熟成期間中にであった。両者は好冷性であるがT.elegansの生

0.1ユニット増加した。

育至適温度はM.strictusと比べて低温にある傾向がみられた。

微生物試験の結果をTable２に示す。表面試料
は40日目までは多少の増減はあるものの安定して次にT.elegansおよびM.strictusに着目し，表面

推 移 し て い た が ， 50 日 目 に 乳 酸 菌 数 ・ B.

試料について熟成期間の経過に伴う菌数の変化をTable 1 Changes in water, pH and water activity of beef during dry-aging.
dry-aging periods（day）

trimmed meatwater（％）
pH
Aw

0

5

10

15

20

30

40

50

61.9
5.54
0.97

61.9
5.55
0.97

57.1
5.54
0.97

54.2
5.55
0.97

44.5
5.53
0.97

41.2
5.54
0.97

36.7
5.58
0.97

38.8
5.64
0.97

Values show the mean of three samples.

© The Ito Foundation

23

ドライエイジングビーフの香気に及ぼす真菌の影響
Table 2 Changes in microorganisms of beef during dry-aging.
dry-aging periods（day）

meat surface

trimmed meat

0

5

10

15

20

30

40

50

aerobic bacteria（cfu/g）＜300

1.5.E＋04

6.2.E＋04

8.5.E＋04

6.3.E＋04

2.2.E＋05

5.2.E＋04

2.5.E＋05

Lactic acidbacteria（cfu/g）＜300

5.3.E＋03

5.6.E＋04

1.5.E＋04

3.4.E＋04

6.7.E＋04

2.4.E＋04

6.8.E＋05

Brochothrix
thermosphacta（cfu/g）＜100

1.6.E＋03

7.0.E＋04

9.5.E＋04

9.3.E＋04

1.5.E＋04

6.4.E＋03

2.7.E＋05

aerobic bacteria（cfu/g）

＜300

＜300

＜300

＜300

＜300

＜300

＜300

＜300

Lactic acidbacteria（cfu/g）

＜300

＜300

＜300

＜300

＜300

＜300

＜300

＜300

Brochothrix
thermosphacta（cfu/g）

＜100

＜100

＜100

＜100

＜100

＜100

＜100

＜100

10

20

30

40

50

Values show the mean of three samples.

3.0
2.5

scores

2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5

0

dry-aging periods（day）

Fig. 1 Changes in the sensory scores of beef during dry-aging.

The strength of aging aroma of dry-aging beef（n＝3）are estimatedby sensory evaluations（mean±standard error）.

比較したところ（Table３，Fig.２），全熟成期間ビーフにおける熟成香の発現には，M.strictusがを通してT.elegansの菌数がM.strictusより高かっ

関与しており，これが食肉表面で発育し食肉に熟た。この結果は，T.elegansはM.strictusと比べて成香を付与するという発現機構の存在が示唆され生育至適温度が熟成条件に近いことによると考えた。このM.strictusによる熟成香は，生育至適温られる。

度での培養では確認できないことは非常に興味深

T.elegansはドライエイジングビーフの肉質向い。

上に有益な真菌として報告されている。一方，トリミング後試料（胸最長筋）では，25℃培養

M.strictus に つ い て は ，生 育 至 適 温 度 で は な い

で全熟成期間中真菌は検出されなかった。３℃培

５℃で培養すると20日間で形成された集落より熟養では15，30および40日熟成においてT.elegans

成香（ナッツ臭）が発現した。この20日間は，先とM.strictusが検出されたが，50日熟成のトリミの官能試験において，熟成香が顕著となった日数

ング後試料からは再び検出されなかった。この結と一致していた。すなわち，ドライエイジング

果は，熟成期間中に真菌が試料の表面から内部に© The Ito Foundation

24

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 3 Comparison of Mucor and Thamnidium in meat surface（incubation at 3℃）
dry-aging periods（day）
0
Thamnidiium（cfu/g）
untrimmed meat（incubation at 3℃）
Mucor（cfu/g）

5

10

15

20

30

40

50

＜10

1.E＋03

3.E＋03

7.E＋04

2.E＋05

1.E＋06

4.E＋06

7.E＋06＜10

8.E＋01

1.E＋02＜10

5.E＋04

9.E＋05

3.E＋05

6.E＋05

Values show the mean of three samples.

7.E＋06
Thamnidiium

4.E＋06mold count（cfu/g）

Mucor

1.E＋3

7.E＋04

3.E＋038.E＋010

1.E＋06
2.E＋055.E＋04 9.E＋05 3.E＋05

1.E＋02

10

20

30

40

6.E＋0550

dry-aging periods（day）
Fig. 2 Changes in mold detected by incubation at3℃on the surface of dry-aging beef（n＝3）

侵入した可能性が考えられるが明らかでない。
3.4

環境中に存在する真菌

両者のプロテアーゼ産生性は３℃培養で培養開始直後から非常に強い反応を示した。40日後には表面試料では25℃培養と３℃培養で真菌の種類

集落の発育とともに培地上の基質は完全に分解さと 検 出 量 に 大 き く 差 が あ っ た 。25 ℃ 培 養 で はれた。リパーゼ産生性は両者ともに至適温度帯以Penicillium spp.が一定量検出された。３℃培養

外では反応が弱かった。３℃培養では陽性反応をではT.elegansとM.strictusが熟成日数に連動して示すまでに20日以上の培養期間を必要とした。こ増加しPenicillium spp.は検出されなかった。検れまでにも低温下での酵素産生性は活発でないた

出されたPenicillium spp.は環境中の浮遊真菌がめ肉に与える影響は少ない８）との報告がされてい付着したものの熟成庫内の温度環境が適していなる。しかし，酵素産生性が進む速度と熟成香の発かったため試料表面上では発育しなかったと考え現が重なることから長期間の熟成においては酵素られる。低温による温度管理は熟成に不要な真菌がなんらかの熟成香付与に関連する可能性も示唆の増殖を抑制できている可能性が高いと思われされた。

た。しかしながらPenicillium spp.の一部は低温でも長期間培養することにより発育するため７），
熟成日数の長さによっては少なからず影響を与え

約

本研究では，ドライエイジングビーフの熟成香に真菌が及ぼす影響を検討した。熟成期間中におる可能性も示された。
3.5

４．要

ける香りと真菌の経時的変化を調査した。

真菌の酵素産生性の特定

T.elegansとM.strictusのリパーゼ産生性，プロ

試料は熟成20日経過後熟成香が上昇した。試料

テアーゼ産生性を確認した結果をFig.３，Fig.４

からは好冷性真菌であるT.elegansとM.strictusがに示す。

検出された。これらは熟成が進むにつれ増加して© The Ito Foundation

25

ドライエイジングビーフの香気に及ぼす真菌の影響

（A）

（B）

（A）

Mucor

（A）

（B）

Mucor

（B）

（A）

（B）

Thamnidium

Thamnidium

Fig. 3 Proteolytic activity of incubation at 3℃, （A）

Fig. 4 L i p a s e a c t i v i t y o f i n c u b a t i o n a t 3 ℃, （ A ）いった。分離されたM.strictusを５℃で20日間培

文献１）
 西 村 敏 英：日 本 味 と 匂 学 会 誌 ，８（2），161～
168，2001.
 市村さやか，高橋真佐郎，中村幸信，吉田由香，
２）
猪口由美，服部昭仁：平成30年度食肉に関する助成
研究成果報告書，37，54～63，2018.
３）
 沖谷明紘：日本食品工業学会誌，40（7），535～
541，1993.
 川端史郎：Milk Science，59（3），303～307，2010.
４）５）
 沼田正寛，冨家崇弘，橋本小由利，中村豊郎：日畜会報，59（1），12～22，1988.
 安里直和，下地秀作，津嘉山勤子，大城隼人，花６）ケ崎敬資，荷川取秀樹：沖縄県畜産研究センター研究報告，55，9～12，2017.
７）
 諸角聖，藤川浩，和宇慶朝昭，千葉隆司：東京健
安研セ年報，55，3～12，2004.
 A. W. KOTULA, S. G. CAMPANO, D. M.
８）
KINSMAN：Journal of Food Protection, 45, No.13，
1242～1244，1982.

incubated for 14days（B）incubated for 40days.

養したところ，熟成香と同様の強いナッツ臭が集落より発生した。真菌が熟成香を産生し，それを食肉に付与している可能性が考えられた。また，
T.elegansとM.strictusは酵素産生性を有していた。これらは15日間以上の熟成を行うことにより低温下でも反応が進むことが確認できた。真菌の酵素産生に必要な期間が熟成香の発現に至るまでの期間と一致することにより酵素反応も熟成香に影響を与えている可能性が示された。
以上より熟成香は真菌の酵素産生性とM.strictusの産生する香りが関係していることが示唆された。特にM.strictusの存在は熟成香の付

incubated for 14days（B）incubated for 40days.

与に大きく影響していると思われた。今後，真菌をコントロールすることにより熟成香を効率的に付与できる可能性が示された。

© The Ito Foundation

26

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作
Development of a system for rendering 3D computer graphics of meat
carcasses

本山三知代・渡邊

源哉・中島

郁世・佐々木啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Michiyo Motoyama, Genya Watanabe, Ikuyo Nakajima and Keisuke Sasaki（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

With the recent improvement of computer performance, three-dimensional（3D）graphicthat visually expresses objects with a three-dimensional feeling on a two-dimensional monitor
has become our familiar technology. If it becomes possible to create 3D graphics for meat
carcasses, it will be possible to digitize information on the carcass shape and appearance thatare not currently evaluated. 3D graphics also enable us to easily check more realistic carcasses
from 360° around anywhere on portable devices such as smartphones with combining ICT
technology, which will lead to the creation of new value in meat production and distribution.
We had previously developed a basic technology for rendering 3D graphics of carcasses.
In this research, a prototype device for carrying this basic technology to practical use wasdesigned, manufactured and tested.
This prototype device was a simultaneous releasing system controlled by a note PC, withtwenty GigE Vision cameras powered by an ethernet switching hub. With this device, it
became possible to acquire 3D data without stopping the carcasses proceeding the production
line. Through trials on site, we were able to clarify the camera and lens specifications, shutter
speed, camera placement, lighting, and other appropriate conditions for rendering sharplydefined 3D carcasses without blind angle. The obtained 3D graphic made it possible to measure
the carcass cross-sectional shape, which was difficult to digitize before.
This research revealed the hardware and software that are necessary for the practicalmachine. In the future we will add cameras to the prototype to develop a practical machine,
aiming to acquire 3D carcass data constantly.

１．目

我々の身近なものとなり，その作製と表示のため的の技術進歩と低価格化が目覚ましい。

近年のコンピュータの性能向上により，物体や枝肉についても３Ｄグラフィックが作製可能に空間を二次元のモニタ上に奥行き感（立体感）をなれば，現在は枝肉の価格形成に活用されていな持って視覚表現する三次元（３Ｄ）グラフィック

い立体形態や外観の情報を新たに数値化できるよ

技術は，さまざまなゲームやデジタル映像など

うになるだけでなく，ICT技術と組み合わせるこ© The Ito Foundation

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作

27とでスマートフォン等でよりリアルな枝肉を確認

価値の高い枝肉形態を持った家畜の改良や飼養法することが簡単に可能になり，新しい価値の創造

改善にも役に立つと考えられる。このような枝肉に結び付くと考えられる。

形態や外観に関する新しい数値情報の蓄積は，例えば，枝肉３Ｄグラフィックは，生産者が食

ビッグデータの形成・活用を促し，将来的には枝肉センターに赴くことなく農場に居ながらにして肉の写真１枚から，さまざまな品質が分かるよう

スマートフォン等のインターネット端末で枝肉をになり，ニーズに応じた製品のオンデマンド供給

任意の方向から確認することを可能にするため，が可能な社会（Society 5.0）の実現に貢献する。

省力化・家畜防疫に貢献するだけでなく，枝肉の申請者らはこれまでの研究により，枝肉の３Ｄ

オンライン取引等にも活用できる（Fig.１）。まグラフィックを作製するための基盤技術を開発した，３Ｄグラフィックから枝肉の任意の部分の体たことから，本研究では当該基盤技術を実用化に積や断面積が求められるため，現行の格付制度に繋げるために，１．プロトタイプ装置製作，２．

おいて目視評価されている「肋張り」や「均称」，

実 際 の 現 場 で の 試 用 ，３ ．得 ら れ た ３ Ｄ グ ラ

部分肉構成等の立体形態が，客観的に数値化できフィックの精度検証，により実用機に必要な要件

るようになる。さらに，枝肉形態が精度良く計測を明らかにし，装置を最適化することを目的としできるので，整形やカットの自動化への貢献や，

た。

枝肉３Ｄ
グラフィック
基盤技術を開発

生産者
省力化・家畜防疫

枝肉市場会社
インターネット売買

３Ｄ計測値

食肉生産

枝肉格付，家畜改良
新しい枝肉評価指標

３Ｄカット

断面積，「肋張り・均称」の数値化

さらに，枝肉３Ｄビッグデータの形成・活用により食肉のオンデマンド供給など新たな価値創造へ
Fig. 1 New values from the use of carcass 3D graphics© The Ito Foundation

28

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

２．方

定した。

法

2.1.2

レンズ

申請者らが開発した枝肉３Ｄグラフィック製作

写真のボケは３Ｄグラフィックの精度の悪化にの基盤技術は，写真計測に用いられる手法である

直結することが分かっており，被写界深度が深く

Structure from Motion法を枝肉に応用したもの

ピントの合いやすいレンズを検討した。また，枝である 。本法は，異なる方向から撮影した複数肉は生産ラインを動いておりブレやすいため，の写真から抽出した同じ特徴点について，画像間

シャッタースピードが速くても明るい画像が撮影の対応関係により対象物の三次元座標データを計可能な，瞳の大きいレンズであることも条件とし測する技術である。

た。食肉センターの生産ライン周囲には空間的余１）

本基盤技術の実用化には，枝肉生産ラインの流裕が一般的にないことから，枝肉近傍からの撮影れに干渉することなく枝肉周囲から複数の画像をを可能にする広角レンズを中心に２社６種類を検同時撮影可能なシステムを製作する必要があり，

討した。
2.1.3

そのプロトタイプを構築した。
2.1

プロトタイプシステムの具体的構成

2.1.1

カメラ支持フレーム

枝肉の動線に干渉しない位置（枝肉の下方）に，枝肉を中心とする環状のフレームを塩ビ管でカメラ

産業用カメラの規格にはさまざまあるが，申請

作製し，雲台を介してカメラ20台を設置した。

者らは過去に実施した別の研究において食肉セン

2.1.4

ハブ

ターの場所依存的にノイズの影響を受け計測に問GigEカメラにLANケーブル経由で給電可能な題が出た経験があることから，想定される電気的Power over Ethernet（PoE）ハブで，サイズのノ イ ズ を 考 慮 し て ，ノ イ ズ に 強 い 規 格 で あ る

大きい画像データの通信に適切なジャンボフレー

GigEを採用した。本規格では，LANケーブル経ムに対応した１ギガビットハブを採用した。

由でカメラに給電も可能で配線が簡単になること

2.1.5に加え，生産ライン近傍は水濡れの恐れからパソ

画像処理が高速に行えるグラフィックチップをコンを遠隔に設置する場合でもシグナルが減衰し備え，現場への持ち運びが便利なノート型パソコ

難い利点がある。

ンを準備した。

また，これまでの研究から，３Ｄグラフィック

2.1.6

コンピュータソフトウエアの完成精度には画像のピクセルサイズが大きいこ

枝肉生産ラインの流れに干渉せずに３Ｄ計測をと（２μｍ×２μｍ以上）が重要であることが分行うには，枝肉を静止させなくとも計測を瞬時にかっている。家庭用コンパクトデジタルカメラな完了できる必要があるため，パソコンから全カメ

どの民生品カメラは，記録画素数の高い画像が安ラに同時シャッターの信号を送り，撮影した画像

価に得られる長所がある一方，ピクセルサイズがを取り込むためのソフトウェア（Character User

小さく３Ｄグラフィックの精度が悪くなる傾向がInterface）を準備した。また，カメラのシャッあるため，本研究ではピクセルサイズの大きい産ター速度とゲインの調整には，カメラ付属のソフ

業用カメラを中心に，枝肉の３Ｄグラフィック化

トウェアを用いた。

に適当と考えられた，記録画素数が約３Mbのカ

2.2

ラー画像が撮影可能な機種（３社５種類）より選

実用機に必要な要件を明らかにするために，製© The Ito Foundation

現地検討

29

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作作したプロトタイプ装置を実際の食肉センターにかにするために，複数のGigEカメラとレンズをおいて試用した。計測対象として，剥皮後に背割試用・検討した結果，カメラはOmron-Sentec社

りした，奇形や瑕疵のない豚枝肉（77.5kg）を用のSTC-MCS312POE（ピクセルサイズ3.45×3.45

いた。左右の半丸（正中線に沿って左右に分割しμｍ，有効画素数2,048×1,536），レンズは東京パーた枝肉）を，腹腔を内側に向けてハンガーの腕にツセンター社のTPC-GO6F18-3M（焦点距離６

吊り下げ，ハンガーを介してレールに吊り下げた。

mm，Ｆ1.8）が，明るく鮮明で歪みも少ない画像

枝肉生産ラインの速度が速い場合，ブレのないが得られ，最適であった。

写真を得るためには速いシャッタースピードが必これらのカメラとレンズを用いて，枝肉３Ｄ計要になるため照明が明るいことが好ましく，環境測のためのプロトタイプ装置を製作した（Fig.

光や装置への照明の搭載なども検討した。

２）。本研究助成金で準備したカメラ10台の他に，

2.3

作製した３Ｄグラフィックの精度検証

自己研究資金（農研機構）で準備した10台を加え選定したカメラおよびレンズが適切であったか

た計20台により，枝肉を瞬時に計測するシステムの検討のために，得られた写真からソフトウェアとした。

Zephyr Aerial（3Dflow社）を用いて，Structure

3.2

from Motion法により三次元モデル（テクスチャ

3 . 1で製作したプロトタイプ装置を食肉セン付メッシュデータ）を作製し完成度を確認した。

ターに持ち込み，組み立て，試用した。これまで

三 次 元 グ ラ フ ィ ッ ク 断 面 は ，ソ フ ト ウ ェ アの研究から枝肉全体について３Ｄグラフィックを

Netfabb（Autodesk社）を用いて確認した。

作製する場合，カメラは約40台必要なことが分かっているが，本研究ではカメラ台数の制約か

３．結果と考察
3.1

現地検討

ら，計測したのは枝肉の一部分とした。

プロトタイプシステムの具体的構成

プロトタイプは現地への持ち運びの必要から塩

枝肉の３Ｄ計測に適したカメラとレンズを明ら

ビ管の組み立て式としたが，フレームの組み立て

生産

ライ

同時シャッター・画像取込

ン

枝肉

PC

PoEハブ

LANケーブル

カメラ・レンズ（20台）

カメラ支持フレーム

Fig. 2 Prototype system to acquire 3D data of carcass proceeding production line

© The Ito Foundation

30

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

やすさと，カメラ台数を増やして重量が増加したときの強度の点で，実用機製作時には留意が必要

可能となった（Fig.３）。
枝肉の３Ｄグラフィック化の利点として当初考えられたことの１つに，これまで難しかった枝肉と考えられた。
レールに沿って移動中（秒速約0.5ｍ）の豚枝

断面形状の評価が可能になることがあった。Fig.

肉をプロトタイプ装置で撮像し，その画像を確認

３の３Ｄグラフィックの断面を確認したところ，した結果，枝肉の移動速度が秒速約0.5ｍの場合，断裂のない輪郭線に囲まれており，枝肉の腹腔のシャッタースピードは15ms程度以下としないと，窪みも死角もなく３Ｄ計測できることが明らかに画像にブレが生じることが分かった。このシャッなった（Fig.４）。断面の形状は，「豚枝肉取引規

タースピードにおいて明るさが十分な画像を取得

格の概要」（公益社団法人日本食肉格付協会）にするためには，撮影装置に照明を設置することが掲載のものと齟齬はなかった。これらの断面か効果的であった。

ら，面積および周囲長を数値化することも可能で

また，現場環境に由来する電気的ノイズの影響
は，画像を目視確認する限り認められなかった。

あった（Fig.４）。
また，枝肉から垂れ下がった皮下脂肪組織や同作製した３Ｄグラフィックの精度検証

じハンガーに吊るした他方の半丸の陰になり，計

秒速約0.5ｍで移動する枝肉を，シャッタース

測できない部分（腹腔の窪みなど）が出ることがピード15msで撮像した画像データを用いて作製想定されたが，枝肉の下方から見上げるアングル

した３ＤグラフィックをFig.３に示す。画像に収で撮影することにより死角を作らず，欠けのないめることができた枝肉下側の一部分について，３

３Ｄグラフィックが作成できた２）。

3.3

Ｄグラフィックが問題なく構築できた。

本研究により，実用機開発に必要なハードウェ

枝肉の下方にカメラを配置したことによって，

アおよびソフトウェアの要件が明らかになったこ

枝肉の動線を妨げることなく，枝肉に対してカメとから，今後カメラ台数を増やして実用機製作を

ラを環状に360°配置することが可能になり（Fig.

行い，枝肉の３Ｄ形態データの利活用に向けた２），枝肉の向いている方向にかかわらず計測がデータ取得を進める。

Fig. ３ Carcass 3D graphic constructed from 20 image data measured

instantaneously by the prototype device（from two points of view）© The Ito Foundation

Area：
1415.27mm

593.36cm2
Contours：

Area：
1426.01mm

617.34cm2

Contours： 1471.98mm

Area：

Contours： 1543.05mm

Area：

613.55cm2

672.96cm2

Contours：

C6

605.44cm2C51469.72mm

C4

Area：

C3

Contours：

C2
626.61cm2C11532.56mm

642.15cm2

Area：

C12

Contours：

C11

Area：

C10

Contours： 1935.42mm

C9Contours： 1887.31mm

Area：

C8

Area：

C7

Contours： 1832.44mm

634.69cm2

Area：

634.61cm2

Contours： 1786.43mm

626.19cm2

Area：

679.01cm2

Contours： 1699.83mm

694.57cm2

Area：

1931.19mm

644.51cm2

Contours：

Area：

1864.83mm

674.64cm2

Contours：

Area：

1775.10mm

715.29cm2

Contours：

Area：

1727.22mm

794.05cm2

C1
C2

Contours： 1621.93mm

Area：

C17

Contours：

C16

626.23cm2

C151945.09mm

C14

Area：

C13
Contours：

・
・
・
・
・
・

C17

Fig. 4 Cross sections of the 3D graphic（left-side half carcass, 17 sections）, section area and contours at the positions of rib, fillet, loin and shoulder loin.

© The Ito Foundation

31
枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作

32
４．要

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

がると考えられた。今後，本プロトタイプを基に

約

実用機の製作を行い，Fig.１に示したような枝肉

枝肉の３Ｄグラフィック作製のための計測を瞬時に可能とする装置のプロトタイプを製作した。
枝肉を静止させる必要がないため，生産ラインのの３Ｄグラフィックの利活用を目指す。
謝

辞

流れに干渉せずにデータを取得することが初めて

株式会社栃木県畜産公社，栃木県畜産酪農研究セ可能となった。食肉センターでの試用により，カンターおよび公益社団法人日本食肉格付協会のご協

メラとレンズのスペックやシャッタースピード，力に感謝申し上げます。

カメラの配置，照明等の適切な条件を明らかにすることができた。また，得られた３Ｄグラフィッ
クより，これまで数値化が難しかった枝肉断面形

文献１）
 本山ら，特願（2019年２月28日）
２） 本山ら，特願（2020年２月28日）

状の数値化が可能となり，新しい価値創造につな© The Ito Foundation

33

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）
Clarification of the enhancement mechanism of “koku attributes” by lipids
in pork sausages（II）

西

村

敏

英・力

石

麗

奈

（女子栄養大学栄養学部）

Toshihide Nishimura and Reina Chikaraishi（Faculty of Nutrition Science, Kagawa Nutrition University）

It is well known that pork sausage is very popular as one of delicious foods. Recently, it
has been shown that pork sausage gives us Koku attributes such as mouthfulness andlingeringness in the flavor sensation. However, the clarification of factors involved in its Koku
attribute has not been carried out yet.
In the previous research, the addition of umami compounds or fats was shown to enhance
the intensity and lingeringness in the flavor sensation of pork sausage, resulting that umami
compounds and fats contribute to “Koku attribute” of pork sausages. Furthermore, the analysesof aroma compounds of smoked and non-smoked pork sausages showed that common aroma
compounds were clarified to be β-Pinene, 3-Carene, D-Limonene, Octanal, Nonanal,
Caryophyllene, and Methyl eugenol. In addition, the amounts of aroma compounds released
from the sausages containing fats was much lower than that non-containing fats, indicatingthat fats in sausages are holding aroma compounds, and make the lingeringness of Koku
attribute stronger. Therefore, in this research, the mechanisms for the release of aroma
compounds in oral cavity was examined.
GC/MS analyses have shown that the amount of aroma compounds released from thesausages containing fat minced with saline was 2-4 times larger than that from the sausages
without fat minced with saline. This indicates that saliva can release aroma compounds holding
with fats in sausages during biting sausages.
GC/MS and GC-O analyses clarified that some of the key compounds contributing to thecommercial smoked pork sausages were 2-Hydroxy-3-methyl-2-cyclopentenone, Hexanoic
Acid, 2-Methoxy-4-ethylphenol, Guaiacol, m-Cresol, Eugenol, 2,6-Dimethoxyphenol,
1,2,4-Trimethoxybenzene. The aroma re-constituted with these aroma compounds was similar
with that of the commercial smoked pork sausages in smoky aroma, but not in spicy andmeaty aromas.
The flavor wheal for smoked pork sausages was made by sensory evaluation. The
dominant aroma groups were smoky and spicy aromas, and weak honey and ammonia aromas
were also observed. The precise flavor wheal will be made by using more panelists.

© The Ito Foundation

34

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

目を手掛けた。まず，ポークソーセージの製造では，

的調味料としてうま味物質を添加すると同時に，適近年，多くの食品にコクという言葉が表示さ量の脂肪を添加していることから，これらの物質

れ，おいしさの代名詞のように使用されている。

によるコク形成・増強メカニズムに焦点を当ててしかし，コクには，これまでにきちんとした定義研究を実施している。先の研究 12～15）において，がないため，それぞれの製造者が独自の基準で評

ポークソーセージの食味性を官能評価で解析し，価して，表示しているのが現状である。そこで，

ポークソーセージの官能的特徴として，うま味，

我々は，コクを「味，香りならびに食感のすべて

持続感，濃厚な味，広がりのある味，深みのあるの刺激で形成される総合感覚であり，多くの刺激

味，香ばしい，後をひく香り，広がりのある香り，で形成される「複雑さ」，その刺激が口腔内で膨スモーキー，スパイシーな香り，弾力，歯ごたえ，らむ「広がり」ならびに，それが持続する「持続ジューシー，プリプリなど，全部で22項目の用語性」の３つの要素（基本コク）で形成されるものを見出し，ポークソーセージの食味性には，コクである」と定義した。また，食べ物の複雑さに当てはまる感覚が存在することを明らかにしは，熟成，発酵，加熱などの処理により形成された12）。また，ソーセージに添加されているうま味る。その複雑な刺激の広がりと持続性を増強する

物質は，ポークソーセージの口中香を強く感じさ

物質として，うま味物質と脂質が重要な役割を果せると同時に，風味の複雑さや味の持続性を強くたしていることを明らかにしてきた。さらに，感じさせることから，コク増強物質であることがコクのある食べ物としてよく知られている食品に判明した。さらに，スモークドポークソーセージ

関して，コクの形成・増強因子とその形成メカニとノンスモークドソーセージから抽出した香気成ズムを研究している。

分を臭いかぎガスクロマトグラフィー（GC-O）

１～５）

６～９）

ポークソーセージは，食べ物の中でもとりわけと質量分析ガスクロマトグラフィー（GC/MS）

美味な食べ物の１つであり，食肉加工製品の中でで解析し，ポークソーセージの特徴的な臭いに寄

最も消費量が多い。そのおいしさは，うま味，独与する候補成分を特定した14）。ノンスモークソー

特の香りならびに食感によることはよく知られてセージでは16種類の香気成分が検出され，GC/O

いる。これまでの食肉製品の香気に関する研究か分析を用いたAEDA法により，16成分のうち，ら，塩漬肉特有のフレーバーは，亜硝酸塩の脂質

β-Pinene ， 3-Carene ， D-Limonene ， Acetic

酸化抑制作用による香りであるとの報告がある

acid，Copaene，Methyl eugenolが，ノンスモー

が ，完 全 に 解 明 は さ れ て い な い 。ま た ，

クソーセージの特徴的な臭いに寄与する候補成分

Mottramの報告により，硝として特定ならびに同定された。これらの６成分

酸アルキル，ベンゾニトリル，フェニルアセトニ

は，スモークソーセージにおいても検出されていトリル，４-メチル-２-ペンタノン，２-ブチル-

たことから，すべて原料の豚肉由来，または香辛２-オクテナールなどの香気成分が亜硝酸塩を添料由来であると推察された。スモークソーセージ

加したものから多く検出されることが明らかとでは，これらに加えて，燻煙由来のポークソー

なっているが，食肉製品の食味性との関連での研セージを特徴付ける香気成分としてp-Cresolと

究は，ほとんどなされていない。

2,6-Dimethoxy-phenolの存在が明らかとなった。

10）

やRamarathnam

11）

我々はポークソーセージの食味性に関する研究

このように，ポークソーセージが，特徴のある香© The Ito Foundation

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）

35

りを有する複雑さを持ち，味わいに広がりや持続

エチルエーテルで捕集香気成分を抽出した。これ性を有するコクのある食品であることを明らかとを分析試料とした。

してきた。また，ソーセージの製造時に添加する（３） GC/MSによる香気成分の比較・同定

脂肪が，ソーセージの食味性に与える影響を調Mono Trapから得られた試料を，以下の条件

べ，添加する脂質含量を増やすと，うま味や塩味で分析した。

を増強するだけでなく，風味の広がりや持続性を昇 温 条 件 は ，40 ℃（10min）→（５ ℃ /min）

強め，コクを増強することが明らかとなり，脂質→240℃（20min），計70分のプログラムを用いた。

がソーセージの香気成分保持していることが推察

検出器には，MS（250℃）を使用した。GC/MSは，された

GCMS-QP2010（島津製作所（株））で，TC-wax

。

９，
15）

そこで，本研究では，ポークソーセージを喫食（長さ30ｍ×内径0.25mm i.d.，膜厚0.25μｍ，使用した時に，放出される香気成分を解析し，香気成

温度上限260℃）（GL Sciences（株））を使用した。

分が脂質に保持されていることを解明することを注入量は，２μl（スプリットレス）で，内部標目的とした。また，ポークソーセージの香りの再準としてDimethyl phthalateを用いた。また，各構成ならびに，フレーバーホイールの作成を試み

成分の量的な変化は，サンプルに添加した内部標た。

準物質で補正した後，比較した。

１ 咀嚼されたソーセージからの香気成分の放出

結果および考察
脂肪無添加および脂肪添加スモークドポーク

我々が，ポークソーセージを咀嚼している時の

ソ ー セ ー ジ か ら は ，主 な 香 気 成 分 と し て ，①状態を模倣し，その際に放出される香気成分が脂β-Pinene ， ② 3-Carene ， ③ D-Limonene ， ④

肪の有無で変化するか否かを調べた。

Caryophylleneが検出された（Fig.１）。これらは，

実験方法

いずれも我々の先行研究で，スモークドポーク（１） 供試試料

ソーセージおよびノンスモークドソーセージのい脂肪通常添加および脂肪無添加のスモークポー

ずれからも検出された香気成分である14）。また，

クソーセージ（ウインナーソーセージ）を伊藤ハ

これらの成分の放出量は，脂肪添加製品では，脂ム米久ホールディングス（株）中央研究所に製造

肪無添加物製品よりも少ないことが明らかとなっしていただいた。冷凍保存しておいたソーセージており，ソーセージに添加された脂肪が香気成分を袋ごと流水にかけて解凍し，試料として用いた。

を保持していると推察されている15）。

（２） Mono Trap（シ リ カ モ ノ リ ス 捕 集 剤）
による香気成分の捕集

そこで，本研究では，我々が口腔内でソーセー
ジを咀嚼した時に，唾液の存在により香気成分が各ソーセージの中心部を採取し，生理食塩水と放出されると考え，脂肪無添加スモークドポーク

混合しながらすり潰した後，10ｇを取り，40ml

ソーセージと脂肪添加スモークドポークソーセーのバイアル瓶に入れたものを60℃，30分間ウォー

ジの中心部分の肉に生理食塩水を添加した時の香ターバスで湯煎した。その後，60℃で２時間加熱

気成分の放出量を測定した。Fig.１で検出されたした。この間に揮発したヘッドスペース香気成分

４つの成分は，いずれも脂肪添加製品からの放出

を Mono Trap （シ リ カ モ ノ リ ス 捕 集 剤 ： GL

量が，脂肪無添加製品からのものより約２～４倍

Sciences（株））で捕集した。Mono Trapからジ多いことが判明した（Fig.２）。ソーセージ製品© The Ito Foundation

36

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
拡大クロマトグラム
14,387,760

内部標準（A）脂肪無添加
ピーク強度①β-Pinene②3-Carene③D-Limonene①②④Caryophyllene③④
TIC＊1.00

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

69.0
min

保持時間（分）拡大クロマトグラム
13,277,823

内部標準（B）脂肪添加ピーク強度①β-Pinene②②3-Carene③③D-Limonene④Caryophyllene④①

TIC＊1.00
20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

69.0
min

保持時間（分）Fig. 1 GC/MS chromatogram of aroma compounds released from smoked pork sausages non-containing（A）and

containing（B）fats

ピーク強度（×1000）

4000

3486

3461

3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0

972

1170

918

1201
587

283

①β-Pinene② 3-Carene③D-Limonene

脂肪無添加④Caryophyllene

脂肪添加Fig. 2 Comparison of amount of aroma compound released from sausages non-containing and containing fats

© The Ito Foundation

37

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）

では，添加されている脂肪がこれらの香気成分を紙に言葉出しをした。これは，２名体制で行った。

保持しているが，生理食塩水存在下では，放出さ（４） GC/MSによる香気成分の同定れることが明らかとなった。これらの結果は，

１．
（３）GC/MSによる香気成分の同定の手順

我々がソーセージを喫食した時に，脂肪が添加さと同様である。注入量は２μlとした。

れているソーセージからは，脂肪無添加のものと（５） 匂いの再構成比べてより多くの香気成分が放出され，味わいや

2-Hydroxy-3-methyl-2-cyclopentenone,

持続性をより強く感じられることを示していると

Hexanoic Acid, 2-Methoxy-4-ethylphenol,

推定した。

Guaiacol,m-Cresol,

Eugenol,

以上の結果から，ポークソーセージに添加され2,6-Dimethoxyphenol, 1,2,4-Trimethoxybenzeneている脂肪は，香気成分を保持することで味わいは，東京化成工業（株）より購入した。それぞれの持続性を強くし，コク増強に寄与していることの純度は最低97％から99％であった。香気成分をが裏付けられた。

エタノールで100倍希釈後，クロマトグラムのピークの高さに基づいて混合した。

２．スモークドポークソーセージの香りに寄与する成分の分析

混合した香気成分を匂い紙（ムエット）に滴下
し，スモーキー，スパイシー，肉らしいに関して，先の研究でスモークドポークソーセージの香気

スモークドソーセージとの類似性を官能評価で調成分を解析したが，香りへの寄与を検討するにはべた。パネリストは，嗅覚テストにて同一３段階

至らなかった。そこで，本研究では，再分析し，濃度の香りが識別できる者が選定され，延べ６名寄与度の高い香気成分の再構成を実施し，香りので評価を行った。

形成に重要な香気成分を特定することを試みた。

結果および考察実験方法（１）
 スモークドポークソーセージの香りに寄（１） 供試材料

与する成分の分析

Ａ社が販売しているスモークドポークソーセー

スモークドポークソーセージの香気成分をジを用いた。

SAFE蒸留法で抽出し，それを濃縮後，GC/MS（２） SAFE蒸留で分析した。その結果，多数の香気成分が検出さソーセージの中心部を乳鉢ですり潰した後，25れた。同じ試料を用いて，GC-Oで検出された香ｇを精秤し，100mlのジエチルエーテルを添加し気成分の香りの特徴を調べた。Fig.３には，Tableて香気成分を抽出した。その後，SAFE蒸留し，１に示されている香気成分を含めて，22個の成分

香気成分の捕集を行った。捕集した原液を無水硫が同定された。これらには，先行研究14）で明らか

酸ナトリウムで脱水後，窒素ガスを吹き付けて９となったいくつかの成分が検出された。

倍に濃縮し，AEDAおよびGC/MSの分析試料と次に，AEDA法により，ポークソーセージのした。

香りに寄与する重要な候補物質として，８成分が（３） AEDA法

推定された。具体的には，２倍希釈試料では21成

窒素濃縮試料をジエチルエーテルで２倍ずつ16分が，４倍希釈試料では14成分が，８倍希釈試料

倍まで段階的に希釈し，各希釈試料をAEDA試では11成分が，そして，16倍希釈試料では８成分料とした。これを用いて匂い嗅ぎを行い，メモ用が検出され，同定された。FD＝16の値まで匂い© The Ito Foundation

38

拡大クロマトグラム⑦

37,660,898①

23,730平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

⑧

ピーク強度

③

⑥

⑤

②

④
TIC＊1.00

14.0

15.0

16.0

17.0

18.0

19.0

20.0

21.0

22.0

23.0

24.0

25.0

26.0

27.0
min

保持時間（分）Fig. 3 Aroma-gram of aroma compounds in commercial smoked pork sausages measured by GC/MS and GC-O

Table 1 Candidate aroma compounds in commercial pork sausages identified by GC/MS and GC-O
保持時間
（分）

候補化合物

ピークの高さ（×10７）GC-Oで感じた匂いの特徴（FD＝16）①

18.56

2-Hydroxy-3-methyl-2cyclopentenone

3.1

カフェラテ

②

18.73

Hexanoic Acid

1.1

正露丸

③

18.94

2-Methoxy-4-ethylphenol

2.6

カフェラテ

④

20.90

Guaiacol

0.6

スモーキー

⑤

21.46

m-Cresol

1.2

めんま

⑥

22.38

Eugenol

1.1

ソース

⑦

23.34

2,6-Dimethoxyphenol

3.5

正露丸

⑧

24.21

1,2,4-Trimethoxybenzene

2.6

線香

嗅ぎを行い，FD値と保持時間に基づいてアロマ
グラムの作成をした。

また，スモークソーセージに特徴的な匂いに寄与 す る 成 分 と し て ， 2-Hydroxy-3-methyl-2-

Table１の結果より，絞り込まれた香気成分は

cyclopentenone, Hexanoic Acid, 2-Methoxy-4-

必ずしもピークが大きいわけではなく，含まれてethylphenol, Guaiacol, m-Cresol, Eugenol,

いる量は少なくともソーセージの匂いへの寄与が

2,6-Dimethoxyphenol, 1,2,4-Trimethoxybenzene

大きい成分が存在するということが分かった。今の８成分に絞りこむことができた。これらは必ず

回は２名体制で匂い嗅ぎを行ったが，今後は，匂しもピークが大きいわけではなく，含まれている

い嗅ぎの人数を増やし『確かにこの時点で匂いを量は少ないが，ソーセージの匂いへの寄与が大き感じた』という確かな匂い嗅ぎができれば，もっい成分であると推察された。

と精度の高い匂い嗅ぎができるのではないかと考えられた。

© The Ito Foundation

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）（２） スモークドポークソーセージの寄与候補
物質による再構成

39

結果および考察Fig.４より，ソーセージの匂いは，大別すると，

前項で明らかとなったソーセージの香りに寄与

燻煙臭とスパイス臭に分けられることが明らかとする候補物質の標準試薬を用いて，スモークドなった。その他の匂いとして，メープル臭やアンソーセージの香りを再構成した。この再構成品のモニア臭なども観察された。また，鼻先香では燻

香りと市販のスモークドポークソーセージの鼻先

煙臭が，口中香ではスパイス臭やその他の香りが香および口中香とを比較した。スモーキーな香り見出された。特に，スパイス臭は鼻先香では感じ

は６名中４名が似ていると答えたが，スパイシー

られなかったが，咀嚼することによってその匂いな香りは２名，肉らしい香りは１名しか似ているを感じることができた。これは，ケーシングに包としなかった。具体的なコメントでは，「絵の具，

まれた原料肉に香辛料の香りが閉じ込められてい焼き芋様のスモーク臭がある」，「再構成品の香りることから，鼻先香が感じにくかったと推定されのスモーク臭が弱い」，「似ているが，再構成品のた。また，市販のソーセージには約30％の脂肪が香りのほうが弱い」，「スパイシーさが弱い」，「肉添加されていることから，先行研究や本研究で明らしい香りがなかった」があった。今回の実験でらかになったように，香気成分は添加されているは，ポークソーセージの匂いを完全に再現するこ

脂肪に保持されており，咀嚼により口腔内の唾液とはできなかったが，今後は，香気成分の捕集方と混じり，ソーセージの本来の香りが感じられた法を検討し，ソーセージのスモーキーな匂いや肉と推察された。

らしい香りに寄与する成分を探索していきたい。

今回は，パネリスト３名と少人数で行ったが，パネリストを増やすことでソーセージのアロマホ

３．スモークドポークソーセージのフレーバー
ホイールの作成

イールをより充実させることができると考えられた。

実験方法
市販のスモークドソーセージ（ウィンナーソー

要約セージ）の中心温度が60℃以上になるよう，電子

ポークソーセージは，美味な食品の１つであレンジ（600Ｗ，30秒）または湯煎（沸騰後５分）

り，コクのある食品である。一昨年度の研究におで供試試料を袋ごと加熱した。ソーセージを試食

いて，ポークソーセージの製造時に添加された脂後，鼻先香（アロマ），口中香（フレーバー），味

肪が，ソーセージの特徴を示す香気成分を保持を区別して，言葉出しを行った。この際，スパイ

し，味わいの広がりや持続性を強めていることがス（ホワイトペッパー，ブラックペッパー，ナツ

明らかとなり，添加された脂肪がソーセージのコ

メグ，オールスパイス，コリアンダー，セージ）

クの増強に寄与していると推察された。

とナッツ（アーモンド，マカダミアナッツ，カ

本研究では，咀嚼を模倣し，すりつぶしたソー

シューナッツ），アロマフレーズ一覧を参考資料

セージの肉に生理食塩水を添加した時の香気成分として使用した。

の放出量が，脂質の添加によって変化するか否か

パネリストには，味覚テストにて味の濃度差がを調べた。その結果，脂肪無添加および脂肪添加

識別できる者を選定し，延べ３名で評価を行った。

スモークドポークソーセージからは，主な香気成分 と し て ， ①β-Pinene ， ② 3-Carene ， ③© The Ito Foundation

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

ィー

シ

と
し

舌

た

い

触

味

た匂

後残り

ッ

ー

リ
ま

すーっとした

ッテ

ー

した
ッと
ピリ

ウエ

ュ

シ
プ
う

焼い

40

り

塩

味

他
その

甘味

煙臭

味

酸味

ー

ーキ

マ

スモ

くん

アロ

味

ハムの味
魚肉ソーセージ
の味
プル

他

の

そ

香剤

セージ

ア臭

し

た
モニ

と
ン
ツ

アン

う

ナツメグ

しょ

白こ

ス臭

す

た

し

り

き

っ

スパイ

の芳

レ
トイ

木

フレ

みつ

はち

ーバ

ー

メー

Fig. 4 Flavor wheal of commercial smoked pork sausages

D-Limonene，④Caryophylleneが検出された。

cyclopentenone, Hexanoic Acid, 2-Methoxy-4-

両ソーセージに含まれている肉をすりつぶし生理

ethylphenol, Guaiacol, m-Cresol, Eugenol,

食塩水を添加した時の香気成分の放出量を測定し2,6-Dimethoxyphenol, 1,2,4-Trimethoxybenzene

た結果，４つの成分は，いずれも脂肪添加製品かが重要な候補物質であると推定された。これら８らの放出量が，脂肪無添加製品からのものより約成分から構成する香りは，スモーク臭とスパイ

２～４倍多いことが判明した。ソーセージ製品でシーな香りが強く，市販のソーセージの燻煙臭とは，添加されている脂肪がこれらの香気成分を保似たものが得られたが，完全には再現できなかっ持しているが，生理食塩水存在下では，放出された。今後は，捕集方法を検討し，本物に近い匂いることが明らかとなった。

の再構成品を構築したい。

市販のスモークドポークソーセージの香気成分

市販のスモークドソーセージを用いて，官能評をSAFE蒸留法で抽出し，それを濃縮後，GC/

価方法でフレーバーホイールを作成した。スモー

MSで分析した。22個の成分が同定されたので，

ク臭とスパイシーな香りに大別された。それ以外

AEDA法により，ソーセージの香りに寄与するに，ハチミツの香りとアンモニア臭が観察され成分を特定した結果，2-Hydroxy-3-methyl-2-

た。今後は，パネリストを増やし，より正確なフ© The Ito Foundation

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）

レーバーホイールを作成したい。
謝辞脂肪含量の異なるスモークドポークソーセージを製造して下さった伊藤ハム米久ホールディングス（株）中央研究所の皆様に，心から感謝申し上げます。
文献１） Nishimura, T.：Definition of “Koku” Involved inFood Palatability （Koku in Food Science andPhysiology, Eds. Nishimura, T. & Kuroda, M.）, 1～
16, Springer Nature, Singapore, 2019.
２） 西村敏英：食肉のおいしさとそれを引き出すコクと は ！，JATAFF ジ ャ ー ナ ル ，3（12），29～35 ，
2015.
３） 西村敏英：食品のおいしさを改善するコク増強物
質のチョイ足し技術，月刊フードケミカル，20179，23～27，2017.
４） 西村敏英：コクの要素と寄与成分を活かした食品
開発，食品と開発，53（６），20～23，2018.
５） 西村敏英：食品のコクとおいしさへの活用，醤油の研究と技術，45（３），161～168，2019.
６） Nishimura, T., Goto, S., Miura, K., Takakura, Y.,
Egusa, S. A., Wakabayashi, H.：Umami compounds
enhance the intensity of retronasal sensation ofaromas from model chicken soups, Food Chemistry,
196, 577～583, 2016.
７） Nishimura, T., Egusa, S. A., Nagao, A., Odahara,
T., Sugise, T., Mizoguchi, N., Nosho, Y.：

41

Phytosterols in onion contribute to a sensation of
lingering of aroma, a koku attribute, Food
Chemistry, 192, 724～728, 2016.
８） 西村敏英：食肉のおいしさを引き出すうま味物質の役割，食肉の科学，57（２），177～180，2016.
９） Nishimura, T., Saiga, A.：Umami Compounds
and Fats Involved in Koku Attribute of Pork
Sausages（Koku in Food Science and Physiology,
Eds. Nishimura, T. & Kuroda, M.）,47～58, Springer
Nature, Singapore, 2019.
10） Mottram, D. M.：Organic Nitrates and Nitriles inthe Volatiles of Cooked Cured Pork, J. Agric. Food
Chem, 32, 343～345, 1984.
11）
 Ramarathnam, N., Rubin, L. J., Diosady, L. L.：
Studies on meat flavor. 3. A novel method fortrapping volatile components from uncured andcured pork, J. Agric. Food Chem., 41（6）, 933～938,
1993.
12） 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明，平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.33，101～108，2015.
13） 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明（その２），平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.34，72～
80，2016.
14） 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明（その３），平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.35，31～
39，2017.
15） 西村敏英：ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂質の役割，平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.36，59～67，2018.

© The Ito Foundation

42

次世代畜産学のための培養肉技術の開発
Cultured clean meat technology for next generation livestock science

福

田

智

一

（岩手大学理工学研究科）

Tomokazu Fukuda（Graduate School of Science and Technology, Iwate University）

The meat production is mainly depend on the animal growth and reproduction. However,based on the global warming, the development of meat production in vitro becomes key
technology for our next generation. The major problem of cultured meat is the cost of the cell
expansion process. To decrease the cost for the cell culture, the rapid cell growth within the
short time period would contribute to reduce the cost for the production. Based on this idea,
we introduced the mutant cyclin dependent kinase 4 and Cyclin D, and telomerase reverse
transcriptase to primary chicken myoblasts. The introduced cells showed smaller size in cellmorphology and showed transient acceleration of growth speed. However, the introduced cells
halted cell proliferation after passage 3.
Furthermore, we also introduced the mutant cyclin dependent kinase 4 and Cyclin D,
cyclin dependent kinase 1 and Cyclin B. However, new cell also stopped cell proliferation after
three passages. These results indicate that cell cycle basic machinery is not evolutionallyconserved among mammalian and avian. Although the detailed difference how diversity has
developed between mammalian and avian, our findings would be the first report about the
species difference of cell growth and cell cycle control.

１．目

つある。

的

一方，欧米では培養肉と言われる産業に注目が食肉生産は家畜の生産および成長に依存してい

集まっている１）。欧米では具体的な事業化に向けると言える。しかし家畜の生産は環境への負荷がてすでに大型投資が行われている。培養肉技術は大きいことも近年の研究によって指摘されてい組織培養の大型版であると言える。具体的には，る。具体的には反芻動物や動物の排泄物から発生動物の小さな筋肉組織を元に培養を行い，大量のするメタンガスは畜産由来の割合が37％と指摘さ筋肉細胞へ拡大する。培養による細胞の拡大は排れている。さらにメタンガスは二酸化炭素の25倍泄物も発生しないうえ，メタンガスも発生しなの地球温暖化係数を持っている。このことから従い。さらに培養を実施した場合，最初に使用する

来の森林を切り開き，牧草地を作り，家畜を食肉

組織に関して検査体制を整えれば，感染症のリス生産のために家畜を飼育することは困難になりつ

クは低くなることが期待される。また，飼料作物© The Ito Foundation

次世代畜産学のための培養肉技術の開発を得るための牧草地，そして森林伐採を必要としない。このような良いことづくめに見える培養肉

２．方

43

法

産業であるが，培養にかかるコストが最も問題と細胞周期に関連する遺伝子群のタンパク質コーなっている。培養コストを上昇させている原因

ド領域を化学的に合成した。近年，化学合成技術

は，培養肉の培養に必要となる期間が長いこと，の発達によって，従来不可能であった遺伝子全域

加えて培養に使用される血清を含む培養液と増殖を化学合成することが可能になっている。化学合因子である。研究代表は細胞増殖を効率よく加速成の利点は長鎖であっても任意に研究者のデザイすることができれば，コストの削減が可能になるンしたとおり合成できる点にある。サイクリン依と発想した。

存性キナーゼ４（CDK4），サイクリンＤ１遺伝研究代表者は牛，豚 ，サル ，スイギュウ ，子，テロメラーゼ逆転写酵素（TERT），サイク

アメリカ平原ハタネズミ５），ラット６），オオコウ

リン依存性キナーゼ１（CDK1），サイクリンＢ

モリ ，ネコ ，ウミガメにいたるまで，変異遺伝子，サイクリン依存性キナーゼ２（CDK2），型サイクリン依存性キナーゼ４（CDK4）およびサイクリンＥ遺伝子，Aurora B遺伝子に関して

サイクリンＤ遺伝子の発現によって元の細胞の性開始コドンから停止コドンにいたる領域のDNA質を保存したまま，無限分裂できることを示しを化学合成した。合成したコード領域のcDNAをた 。特筆すべきことは，多くの動物種の細胞にレンチウィルスプラスミドである，CSII-CMV-

おいて元の染色体パターンを保持したまま無限分

EGFPのマルチクローニングサイトへ制限酵素切裂が可能になった点である。従来のSV40ラージ

断と結合を介して組み換えレンチウィルスを作製

Ｔ抗原などの癌遺伝子産物を用いた無限分裂方法

した（Fig.１）。293Ｔ細胞へ，各遺伝子を搭載しでは高頻度に染色体異常が発生することが報告さたレンチウィルスプラスミド，そしてパッケージれている 。我々の用いた無限分裂方法の特徴は，

ングプラスミドとして，HIV-gpおよびpCAG-

変異型CDK4およびサイクリンＤ遺伝子のアミノ

VSVG-Rsv-Revプラスミドをリポフェクション

酸配列が動物の進化上，高度に保存されているこ法にて導入した。パッケージングプラスミドは理とを利用している。具体的には，ヒト－サル間で化学研究所バイオリソースセンターより分与を受はCDK4のアミノ酸配列は99％保存されている。

けた。導入後48時間目に培養上清を回収し，0.45

このことは細胞分裂の基本的な仕組みは哺乳動物

μｍのフィルターにて濾過し，パッケージング細や爬虫類において動物進化を超えて保存されてい胞を除去した。さらにポリエチレングリコールることを示している。

6000を主成分としたウィルス濃縮溶液を添加し，

２）

７）

８）

３）

９）

４）

７）

10）

本研究では鳥類の胎児由来筋芽細胞へ変異型

30倍の濃度へ濃縮した。得られたウィルスを鶏胎

CDK4およびサイクリンＤを導入し，培養肉とし児由来初代筋芽細胞へ暴露した。なお，おおよそて拡大培養する段階で細胞増殖を加速し増殖効率の遺伝子導入効率を推定するために，オワンクラを高めること，コストの削減を目的とした。本研

ゲの蛍光タンパク質（EGFP）を産生するレンチ

究は鳥類由来の細胞を効率よく無限分裂させ，培ウィルスを使用した。遺伝子導入は48時間行い，養肉の効率を高めることを試みた。鳥類由来の細その後基礎培地に戻した。鶏胎児由来初代筋芽細胞においてこのような細胞増殖を制御した報告は

胞は，鶏胎児を24匹使用し，胸筋にあたる部分をいまだ存在せず，新たな試みである。

切除，筋芽細胞のみ得られるようにサンプリング© The Ito Foundation

44

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

無限分裂させるためのパッケージングプラスミド

293Ｔ細胞へ導入

筋芽細胞から筋肉誘導

鶏筋芽細胞

Fig. 1 Experimental flow of the study.

を行った。得られた組織は37℃，トリプシン存在

である無処理の鶏筋芽細胞ではまったく蛍光が検下で細胞集団が得られるように処理し，35mmプ

出されなかった一方，EGFPを導入した筋芽細胞

ラスチックシャーレ上で培養を行った。初代培養においてはおおよそ70％の細胞が陽性を示し，高細胞において細胞融合および筋管形成能力を持つ

い導入効率が得られた。同様の条件にて，まず，ことを確認した。得られた初代培養細胞はコラー

従来のCDK4およびサイクリンＤを導入した筋芽ゲン処理を行った細胞培養用35mmディッシュ中細胞を得た。これらの細胞を今後，K4D細胞と記で維持した。培養には199基礎培地に10％の牛胎

述する。K4D細胞は哺乳類においては劇的に細胞

児血清，ペニシリンおよびストレプトマイシンを増殖を加速することが判明している。一方，鶏筋添加した。

芽細胞においては一時的な細胞増殖の亢進が見られた。Fig.２の中央に細胞の形態を示すが，野生３．結果および考察

型細胞と比較して極度に小型化した細胞が認めら実験に用いた鶏胎児由来筋芽細胞を初代培養しれた。これは細胞分裂が大幅に加速された細胞のたところ，従来の結果に合致し，細胞密度が増加

特徴である。形態変化を示し，細胞増殖が一時的するにつれ，細胞融合が生じ筋管形成しているこに加速したK4D細胞であるが，３世代の細胞継代とが確認された。

操作で増殖を停止した。この実験データを我々はEGFPを発現するレンチウィルスを導入後の鶏

鳥類の細胞においては哺乳類と異なる細胞増殖制

筋芽細胞の細胞像をFig.２に示す。コントロール

御が行われている結果と解釈した。研究代表者は© The Ito Foundation

次世代畜産学のための培養肉技術の開発

45

Fig. 2 The chick derived myoblasts infected with EGFP expressing lentivirus andmutant CDK4 and Cyclin D. Upper panels, EGFP expressing cells, Middle panels,
Myoblasts expressing mutant CDK4 and Cyclin D（K4D cell） . Note that cellsize becomes much smaller than wild type cells. Lower panels, wild type check
derived myoblasts.

細胞周期調節因子，特にCDK4およびサイクリン

なる細胞分裂制御が行われていると考察した。

Ｄによって細胞増殖が制御されている共通のメカ

我々はさらに，鳥類の細胞周期制御遺伝子としニズムであることを爬虫類から哺乳類に至るまでて，CDK2およびサイクリンＥ遺伝子，Aurora B

実験的に証明した２～９）。一方で本研究実験結果は遺伝子に着目した。特にCDK2およびサイクリン

細胞周期を制御する遺伝子群が，爬虫類から鳥類

Ｅは細胞周期のDNA合成期から分裂期へと橋渡に変化した段階で変化したことを意味する。

しする重要な分子群である。また，Aurora Bタ

我々はさらにCDK4およびサイクリンＤに加えンパク質は細胞分裂の完了に関与し，細胞質分裂てCDK1およびサイクリンＢを加えた４種の遺伝が終了する際に生まれる細胞質の切れ目に局在す子を導入し，細胞増殖への効果を検討した。このることが知られている 11）。これらのCDK2および４種の遺伝子を選択した理由は，マウスにおいて

サイクリンＥ遺伝子，Aurora B遺伝子を発現す

この４種の遺伝子を導入すると心臓由来の筋肉細るレンチウィルスを293Ｔ細胞において作成し，胞においても分裂再開が可能である報告があった

鶏筋芽細胞に導入を行った。現在，細胞継代の実ことに由来する 。導入した遺伝子の末尾の文字

験を進行中である。今後，哺乳類の細胞のようにからK4DK1B細胞と記述する。鶏筋芽細胞由来の元の細胞の性質を保持したまま，細胞分裂を効率

K4DK1B細胞は，先のK4D細胞と同様に３世代のよく加速できる操作技術の開発が鳥類の細胞にお継代操作を行った後に細胞分裂を停止した。このいて開発が必要である。それらの細胞増殖を加速ことから，我々は鳥類の場合，哺乳類と大きく異する技術によって，培養肉生産のコストの低下が

11）© The Ito Foundation

46

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

可能になると考えられる。
４．要

約

本研究では，培養肉技術を低コスト化することを目的に，細胞増殖速度を加速させることを目的に，鶏胎児由来の筋芽細胞へサイクリン依存性キナーゼ４（CDK4）およびサイクリンＤ遺伝子を導入した。細胞増殖速度は一時的に加速されたが，３回の継代の間に細胞分裂が停止した。このことは爬虫類から鳥類へ進化する動物の進化の過程で細胞周期を制御する基本メカニズムが変化したことを意味する。細胞周期を調節する遺伝子群であるCDK1およびサイクリンＢを発現する細胞も同様に３回の細胞継代の後に分裂を停止した。
鳥類においても，効率的に細胞増殖を制御するため，新たにさまざまな遺伝子発現システムを構築している。研究代表が見出した，爬虫類から鳥類の細胞制御のメカニズムの変化は動物の分子進化の謎を解くために重要な発見である。
文
献１） Bodiou, V., Moutsatsou, P., Post, M. J.：
Microcarriers for Upscaling Cultured Meat
Production, Frontiers in Nutrition, 7, 10, 2020.
２） Donai, K., et al.：Bovine and porcine fibroblasts
can be immortalized with intact karyotype by theexpression of mutant cyclin dependent kinase 4,
cyclin D, and telomerase, J. Biotechnol., 176, 50～57,
2014.
３） Kuroda, K., et al.：Establishment of cell lines
derived from the genus macaca through controlled

expression of cell cycle regulators, J. Cell. Biochem.,
116, 205～211, 2015.
４） Fukuda, T., et al.：Cellular conservation ofendangered midget buffalo（Lowland Anoa, Bubalus
quarlesi）by establishment of primary cultured cell,and its immortalization with expression of cell
cycle regulators, Cytotechnology, 68, 1937～1947,
2016.
５） Katayama, M., et al.：Establishment of animmortalized cell line derived from the prairie volevia lentivirus-mediated transduction of mutant
cyclin-dependent kinase 4, cyclin D, and telomerase
reverse transcriptase, Exp Anim, 65, 87～96, 2016.
６） Katayama, M., et al.：Rat-derived feeder cells
immortalized by expression of mutant CDK4,
cyclin D, and telomerase can support stem cell
growth, Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res.,
1866, 945～956, 2019.
７） Tani, T., et al.：Establishment of immortalized
primary cell from the critically endangered Bonin
flying fox（Pteropus pselaphon）, PLoS One, 14,e0221364, 2019.
８） Gouko, R., et al.：Efficient immortalization of cells
derived from critically endangered Tsushima
leopard cat（Prionailurus bengalensis euptilurus）
with expression of mutant CDK4, Cyclin D1, andtelomerase reverse transcriptase, Cytotechnology,
70, 1619～1630, 2018.
９） Fukuda, T., et al.：Expression of human mutant
cyclin dependent kinase 4, Cyclin D and telomerase
extends the life span but does not immortalize
fibroblasts derived from loggerhead sea turtle（Caretta caretta）,Sci. Rep., 8, 9229, 2018.
10） Fukuda, T., et al.：Efficient Establishment of Pig
Embryonic Fibroblast Cell Lines with Conditional
Expression of the Simian Vacuolating Virus 40
Large T Fragment, Biosci. Biotechnol. Biochem.,
76, 1372～1377, 2012.
11） Mohamed, T. M. A., et al.：Regulation of Cell
Cycle to Stimulate Adult Cardiomyocyte Proliferation
and Cardiac Regeneration, Cell, 173, 104～116.e12,
2018.

© The Ito Foundation

47

官能特性をベースとした分光分析による赤身肉
評価装置の開発
Development of meat evaluation system by spectroscopic analysis basedon sensory score for red meat

口田

圭吾１・阿佐玲奈１・小林健一２（１帯広畜産大学，２一関工業高等専門学校）

Keigo Kuchida１, Reina Asa１ and Ken-ichi Kobayashi２（１Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, ２National Institute of Technology, Ichinoseki College）

Near infrared spectroscopy is an easy-to-use, low-cost measurement device. Furthermore,
spectroscopy can be non-destructive and objectively evaluated. For estimating the oleic acidcontent in the cross section of beef carcass using a portable spectroscopic sensor, theabsorbance of intermuscular fat in beef carcass was measured. Seventy-eight（78）crossbreds
cow slaughtered in Hokkaido from August to October 2019 were used. A portable
spectroscopic sensor was appressed to the intermuscular fat area of the carcass cross-section.
The spectrum（1,100 to 1,350 nm）was shifted in 1nm wavelength, and their absorbance
spectra were collected from 251 wavelengths. The near-infrared spectroscopic sensor used forthe spectroscopic measurement is the NM module of SPECTRAL ENGINES. In the fatty acidanalysis, the oleic acid percentage was measured by gas chromatographic analysis. Oleic acidpercentage was estimated by PLS regression analysis using the absorbance spectrum, and therelationship between the measured value and the estimated value was investigated. The
average value and standard deviation of the oleic acid percentage obtained by gas
chromatographic analysis were 55.51 ± 3.80 ％．The coefficient of determination between themeasured value and the estimated value using the absorbance spectrum from 6 to 15 seconds
was high（r ２＝ 0.87）.

１．目

同様に脂質を評価する試みも進められている。お的いしさを評価する従来の方法には，ワーナーブ

牛肉の品質評価は，市場での取引価格や消費者

ラッツラー剪断力を用いた食感の測定や訓練されが牛肉を購入する際に影響を与える。肉質は牛枝た官能パネルを使用した官能分析などがあり，こ肉取引規格で定められた項目に従って，格付員のれらは高価な装置を用い，牛肉を少量であるが切目視によって評価されており，現在では画像解析

り取らなければならないため破壊的で，時間がかにより客観的に評価する技術が開発され，実用化かる。

が進んでいる。一方で，脂質はおいしさに深く関牛肉の品質に関する情報の取得や提供は消費者与していることが知られており ，肉質の評価との嗜好性に沿った牛肉を流通するにあたって重要

１）© The Ito Foundation

48

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

な試みである。近赤外分光法は，従来の品質評価

1,100から1,350nmの間を１nm間隔で251波長分測方法と比較し，使いやすく低価格な測定装置であ定した。スキャン時間は20秒であった。分光センることに加え，非破壊的かつ客観的な評価ができ

サーはSPECTRAL ENGINESのNMモジュール

る。われわれは平成30年度に可視・近赤外分光放を用いた（Fig.１）。測定した同一箇所から，長射計（Advanced Spectral Devices）を用い，十さ６cm，幅2.5cmのポリエステル板を用いて，まⓇ

勝若牛 における消費者嗜好性をベースとした分

んべんなく10mg程度の脂肪サンプルを削りとり，

光分析による赤身肉に関する研究を実施した。そ脂肪サンプルを採取した。分析までの間，チャッの結果，食味試験での香りの評価値ならびにオレ

ク付きのプラスチック製の袋に入れ，－20℃で冷

イン酸割合の推定が可能であるのではないかとい凍保存した。脂肪サンプルを５％の塩酸を含むメう結果が得られた（それぞれ，Ｒ ＝0.53，Ｒ ＝チルアルコール３mlが入った試験管に入れ，

0.68）。しかしながら，同装置は，据え置き型で100℃で３時間加熱しメチル化した。その後へキあり，枝肉冷蔵庫内での利用は不可能である。

サンを３ml加え，１分間振とうし，分離した上

２

２

そこで本研究では，ポータブルな分光センサー

層をバイアル瓶に移してガスクロマトグラフィーを用いた牛枝肉の食味性評価ならびに横断面のオ（GC2010；島津製作所，京都）で分析した。分析

レイン酸割合の推定を目的とし，枝肉冷蔵庫内でにはキャリアーガスとしてヘリウムを用い，流量の近赤外分光センサーの実用化に向け，牛枝肉をは 毎 分 1.4mL と し た 。 キ ャ ピ ラ リ ー カ ラ ム

用いた測定時間および測定方法を検討し，筋間脂（ULBON HR-SS-10，0.25mm×25ｍ；信和化工

肪の吸光度測定を行い，今回は，オレイン酸割合社，京都）を用い，分析開始時温度は140℃，昇の推定可能性を検討した。

温は210℃まで毎分５℃とし，その後10分の保持

２．方

時間を設けた。インジェクター，検出器の温度は法

250℃とした。各脂肪酸の同定には標準試料のメ分光測定には2019年８月から10月にかけて北海

チルエステルキット（GLサイエンス社，東京）

道内の食肉センターで処理された交雑牛78頭を用を分析し，脂肪酸のピーク面積を数値化すること

い，枝肉横断面の筋間脂肪部分のスペクトルをで脂肪酸割合を算出した。同定した脂肪酸はミリ

1cm

Fig. 1 Small size module used for spectroscopic analysis and installation of this module to

MIJ camera available in a carcass chiller room

© The Ito Foundation

官能特性をベースとした分光分析による赤身肉評価装置の開発

49

ス チ ン 酸（Ｃ 14：０），ミ リ ス ト レ イ ン 酸（Ｃらつきの要因の一つも種雄牛の違いによるものと

14：１），パルミチン酸（Ｃ16：０），パルミトレ

考えられる。

イン酸（Ｃ16：１），ステアリン酸（Ｃ18：０），

PLS回帰分析によって個体ごとの平均スペクト

オレイン酸（Ｃ18：１）およびリノール酸（Ｃルを用いて推定されたオレイン酸と近赤外分光セ18：２）の７種類であり，同定した７種類の脂肪ンサーで測定可能な251波長において，およそ酸に占めるオレイン酸の割合をオレイン酸割合と1,170および1,240nmの波長で相関が高い傾向がみして計算した。なお，同定した脂肪酸以外の脂肪られた。さらに測定された吸光度スペクトルであ酸も少量認められたが，ここでは同定した脂肪酸

る 測 定 波 長 範 囲 の 1,100～1,350nm の な か で ，濃度の合計を100％として各脂肪酸の濃度を算出

1,230nm付近の吸光度スペクトルが下にシフトしした。

た。Pullanagariら４）は，脂肪酸のC-H結合が行わ

理化学的に分析したオレイン酸割合をターゲッ

れる1,100～1,400nmは，牛肉風味特性の正確な予ト値とし，分光分析により測定されたスペクトル測が可能なスペクトル領域であると報告した。まを用いてPLS回帰分析を行った。78頭から得られた，田中ら５）は，近赤外画像において，オレイン

た一個体につき20本のスペクトルのうち，吸光度

酸割合が高い試料ほど近赤外スペクトルは下にシが比較的安定していた６秒以降の計1,170本のス

フトする傾向にあると報告しており，本研究におペクトルを用いた。

いては1,230nm付近が，脂肪酸中のC-H結合由来推定に用いたスペクトルは，すべて測定時に吸の波長帯であることが示唆された。

光度計算がされているabsorbance（吸光度）デー

ガスクロマトグラフ分析によって測定されたオ

タ か ら 用 い た 。同 一 の オ レ イ ン 酸 な ら び に

レイン酸割合の実測値と，PLS回帰分析によって

MUFA 割 合 の 実 測 値 が 多 数 存 在 す る た め ，

近赤外分光センサーより得られた６秒から20秒の

n-Fold Cross-Validationを行った。

吸光度スペクトル1,170本から推定されたオレイン酸割合の推定値との相関をFig.2-aに示した。

３．結果と考察

推定モデルを作成せず，すべてのスペクトルを訓用いた材料牛の筋間脂肪におけるオレイン酸割

練データとして用いたため，ガスクロマトグラフ

合は，55.51±3.80％であった。牛の筋間脂肪中脂分析による実測値とPLS回帰分析による推定値に

質および脂肪酸組成に対する品種，性および蓄積おける決定係数は高くなった（ｒ２＝0.91）。６秒

部位の影響２）より，オレイン酸割合の品種間におから15秒の吸光度スペクトル702本を用い，PLS

ける差は，黒毛和種（57.3％）がホルスタイン種回帰を実施した場合のオレイン酸割合実測値と推（50.3％）よりも高く，交雑種（53.4％）は両品種

定値との関連性をFig.2-bに示した。決定係数は，の中間値をとる傾向を示したと報告されている。

0.87であり，一頭当たりの測定時間を15秒まで短本研究で用いた供試牛は肥育月齢の少し長い（平縮できる可能性が示唆された。

均34か月齢）交雑牛であり，一般的な交雑牛より今回使用した分光センサーは，非常に小型であも若干オレイン酸割合等が高い値となったと推察

り，今回の測定においては，冷蔵庫内にて温度をした。また，脂肪酸組成は種雄牛により有意な差安定化させるための静置をすることなく，即時にがあることが認められており３），本研究で測定さ使用した。また，同装置はコンピュータのUSB端れたオレイン酸割合における最小値と最大値のば子に接続し，専用のソフトウェアをインストール© The Ito Foundation

50

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

62

60

60

58

58

56
54
52

値

62

56

定

64

54

推

推

定

値

ａ）From 6 to 30 seconds spectrum

64

52
50

50

48

48
r2CV＝0.913322（ncomp＝19）＝＞Mean

46
44
40

ｂ）From 6 to 15 seconds spectrum

45

50

実

55

測

60

値

65

70

r2CV＝0.868497（ncomp＝16）＝＞Mean

46
44
40

45

50

実

55

測

60

値

65

70

Fig. 2 Relationship between measured and spectroscopically predicted oleic acid content

of intermuscular fat in Crossbred

すると，利用できるものであるため，例えば，一ガスクロマトグラフ分析によってオレイン酸割合

般社団法人ミート・イメージ

ジャパンが開発し（実測値）を測定した。PLS回帰分析によって吸たMIJ-30などのUSB端子を持つ枝肉カメラとの光度スペクトルを用いたオレイン酸割合の推定を親和性も高く，食肉流通の現場で活用する次世代行った。オレイン酸割合（実測値）の平均値と標の格付システムとして大きな期待が持たれる。

準偏差は，55.51±3.80％であった。オレイン酸割

４．要合の実測値と推定値との決定係数は，６秒から15

約秒の吸光度スペクトルを用いた時で，その決定係

ポータブルな分光センサーを用いた牛枝肉横断

数は0.87と高かった。

面のオレイン酸割合や食味性の推定を目的とし，牛枝肉の筋間脂肪の吸光度測定を行い，今回は，オレイン酸割合の推定可能性を検討した。供試牛として北海道内の食肉センターで処理された交雑
牛78頭を用いた。枝肉横断面の筋間脂肪部分のス
ペクトルを1,100～1,350nmの間を１nm間隔で251
波長分測定した。スキャン時間は20秒であった。
分光測定に用いた近赤外分光センサーはSPECTRAL ENGINESのNMモジュールである。

文献１） Wood, J. D., Richardson, R. I., Nute, G. R., Fisher,
A. V., Campo, M. M., Kasapidou, E., Sheard, P. R.,
Enser, M.：Meat Science，66，21～32，2004.
２）
 Yoshimura, T., Namikawa, K.：Japanese Journalof Zootechnical Science，56，122～129，1985.
 井上慶一，平原さつき，撫年浩，藤田和久，山内
３）
健治：日本畜産学会報，73，381～387，2002.
 Pullanagari, R. R., Yule, I. J., Agnew, M.：Meat
４）
Science，100，156～163，2015.
５） 田中等幸，丸山新，棚橋英樹：肉用牛研究会報，
91，２～７，2011.

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51

枝肉の異臭クレーム防止のためのと畜場における最適な冷却温度管理法の開発
Development of an appropriate method of cooling temperature control for
prevention of bone taint of beef carcasses in slaughterhouses

猪

島

康

雄

（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

Yasuo Inoshima（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

Failures of carcass chilling at slaughterhouses can cause severe quality damage orbacterial proliferation. Currently, in many slaughterhouses, the surface temperature and thecore temperature of carcasses（surface temperature, core temperature）are rarely measured indaily operation. Whereas, the temperature in the chilling room（room temperature）is
measured over time and automatically. In this study, development of an appropriate method
was conducted to statistically estimate the surface and core temperatures from room
temperature.
First, a causal analysis of factors affecting carcass temperature was performed by usinggraphical modelling generated from daily business reports provided by chilling operators. Next,
the surface and core temperatures were measured under the conditions most likely to fail fromthe result of causal analysis, with the consent of stakeholders. All model equations were
calculated by the least square method. Finally, the confidence limit of room temperature wascalculated by considering defrosting inevitable in the chilling process. A simplified referencetable based on the model formula was created.
The analysis revealed that the factor that mostly affected carcass temperature was thenumber of carcasses loaded in the chilling room. The surface and core temperatures wererepresented by a logistic curve and an exponential curve, respectively. The confidence limit ofroom temperature was indicated by a modified Gompertz curve.
Since the correlation which is charted and recognizable, it may help chilling operators tounderstand the causality. Understanding of the causality may lead to immediate correction incase of chilling failures. With the model formulas, approximate core temperature can be
grasped approximately from the room temperature in various situations of carcass loading. The
values in the simplified reference table can be applied as the upper limit of the room
temperature. These methods are adaptable to actual operation, easy to use, and based on
statistical evidence.

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52

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

１．目

３．冷却室の経時的温度変化の早見表作成

的異臭クレーム肉はと畜場併設の食肉処理場でも大腿骨の脱骨時に検出されることがあり，と畜処
理後の枝肉の緩慢な冷却時間が原因と考えられて

法

２．方2 . 1 枝肉の温度の推移に影響する因子の因果関係の統計学的解析

い る 。大 腿 骨 周 辺 部 位 の 異 臭 肉 に つ い て は

と畜場における2016年度の管理記録データを原Clostridium属菌に起因する異臭（ボーンテイン，中間特性
因（外部気温，外部湿度，と畜頭数）ト）が古くから知られており，その抑制には（入庫終了時刻，庫内設定温度，と畜当日16：30

枝肉深部温度を24時間以内に15℃以下に下げるこの庫内温度），結果（冷却室から保管庫への移動とがJamesらによって推奨されている 。欧州規日の８：00の庫内温度，同時点の枝肉表面温度）

則853/2004（Regulation EC No 0853/2004）ではの３層に分け，統計解析ソフト（StatWorks，

深部温度７℃未満とされ，欧 州 安 全 機 関

JUSE）の グ ラ フ ィ カ ル モ デ リ ン グ（Graphical（European Food Safety Authority ； EFSA） に

modelling；GM）に供した。適合度指数を0.9以よる科学的意見書も公表されている 。我が国で上として，共分散選択の閾値を0.1から開始，標は 厚 生 労 働 省 の 食 品 製 造 に お け る HACCP

本集団での偏相関を順次切断し，母集団の相関係（Hazard Analysis and Critical Control Point） 入数を算出，相互関係を示すパス図を描画した。こ門のための手引書（と畜・食肉処理編）においてれにより最も枝肉が冷えにくい条件を導き出した。

冷却工程の管理基準（Critical limit；CL）を作業

2 . 2 冷却室の庫内温度と保管場所の違いによ

終了後24時間以内に枝肉表面温度10℃以下を一例

る牛枝肉の表面および深部温度変化の解析としてあげている 。しかし，10℃に達するまで

2 . 1 の結果から得られた，枝肉冷却に最も負荷の「時間の規定」はない。また，その管理はと畜のかかる条件下（冷却室への最大格納容量）にお業者等が負うが，冷却中あるいは出庫時に数百頭いて，以下の２つの調査を行った。

１）

２，３）

４）

５，６）

７）

８）

すべての温度を計測することは現実的に不可能で2.2.1ある。深部温度の計測については，温度計刺入に

冷却室の四隅と中央の５群（１群３頭）の15頭よる品質劣化を危惧する食肉関係団体の抵抗もあについて，異臭（ボーンテイント）のクレームがる。さらに，食のグローバル化等を背景に，2018

多発する大腿骨近傍の深部温度を測定した。測定年６月13日に公布された食品衛生法の一部を改正

は肉用温度計（サーモミート，佐藤計量器製作する法律は2020年に施行され，猶予期間の１年を所）を用いて観測者と記録者の２名体制で冷却開経て，2021年にはHACCPによる衛生管理が義務

始から１時間ごとに８時間，経時的に測定した。

化される。

統計解析ソフト（JMP，SAS）を用いてLevene

そこで，以下について解析し，牛枝肉の新しい配置場所による枝肉温度差の調査の 検 定 に よ り 等 分 散 性 を 調 べ ，等 分 散 な ら
Tukey-Kramer の 検 定 を ，等 分 散 で な け れ ば

冷却温度管理法を開発することとした。
１．枝肉の温度の推移に影響する因子の因果関

Kruskal-Wallisの検定より群間比較を行った。
2 . 2 . 2 冷却室の庫内温度と枝肉温度の相関の係の統計学的解析

調査

２．冷却室の庫内温度と保管場所の違いによる
牛枝肉の表面および深部温度変化の解析

最も冷えにくいと判明した配置場所の１群（中© The Ito Foundation

枝肉の異臭クレーム防止のためのと畜場における最適な冷却温度管理法の開発53央群）において，庫内温度ならびに表面および深誰でも簡便に利用可能である必要がある。そこ

部温度を測定した。庫内温度の測定には枝肉冷却で，日報報告時刻における庫内温度の信頼限界を

室温度の監視装置（デマンド監視装置，三菱電把握するための早見表を作成した。

機）を用い，枝肉温度にはロガー（表面温度；

３．結果と考察

サーモクロンＧタイプ，KNラボラトリーズ，深部 温 度；デ ー タ ロ ガ ー 記 憶 計 本 体 お よ び セ ン

3 . 1 枝肉の温度の推移に影響する因子の因果サー，佐藤計量器製作所）を用いて冷却開始から関係の統計学的解析

出庫までの48時間，経時的に測定した。JMPを用

GMによる因果解析は工業品の製造分野では用いて庫内温度から表面および深部温度を推定する

いられているが，食品の製造分野では国内外ともためにモデル式を非線形最小二乗法により算出しに報告がなく，本調査が初の試みである。項目間た。

で得られた相関係数の符号と現場の実情との間に

2.3

冷却室の経時的温度変化の早見表作成

相違があった場合，その項目間に看過されている

庫内温度から枝肉温度の制御を可能とするた潜在因子が存在することを意味する。潜在因子とめ，以下の解析を行った。
2.3.1

して，搬入家畜数の季節変動，と畜作業の効率お

庫内温度の信頼限界の算出

よび冷却設備の性能が存在することが示唆された

冷却には霜取りが不可避であるため，一時的な（Fig.１）。また，枝肉温度に最も影響を及ぼすの冷却の中断が生じる。この霜取りの影響を小さく

は入庫枝肉数であることが明らかとなった。実際するため，通常，冷却装置は２系統で構成されてに，過去の品質クレームは，従来注意が払われているが，それでも一時的な庫内温度の上昇は避けきた気温の高い夏季ではなく，入庫枝肉数の多いられない。そこで，霜取りによる一時的な庫内温場合に生じている。気温については細菌増殖への度の上昇を信頼限界の上限とし，信頼限界のモデ

影響と混同されてきたものと思われた。

ル式を算出した。

3 . 2 冷却室の庫内温度と保管場所の違いによ

2 . 3 . 2 日報報告時における庫内温度管理限界

る牛枝肉の表面および深部温度変化の解析の早見表の作成

3.2.1

実際の運用は，と畜場管理者が任命する冷却工
程管理の責任者が行うため，専門知識が不要で，配置場所による枝肉温度差の調査

20時間経過時で中央群が最も冷却状態が悪かった（分散分析にてｐ＝0.0132）（Fig.２）。

Chilling
performance
Seasonal
ﬂuctuationWork
eﬃciency

Carcasses
In the day

Room temp
at next 8:00

Surfacetemp

Fig. 1 Causality hypothesis by graphical modelling among affectors of chilling

processes for beef carcasses. Gray boxes show the data recorded. Whiteovals indicate the estimated lurking factor. Arrows show causality.

© The Ito Foundation

54

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

3 . 2 . 2 冷却室の庫内温度と枝肉温度の相関の

Ｙ＝Ymin＋（Ymax－Ymin）/

調査（１＋exp（－b＊（X－X50）））


庫 内 温 度 の 変 化 に 伴 い ，表 面 温 度 は ロ ジ ス［Ymin＝ 0.78 ，Ymax ＝ 15.20 ，b ＝ － 0.63 ，

ティック式（Ａ），深部温度は指数式（Ｂ）で表

X50＝9.32］

すことができた（Fig.３）。

＊
Ｙ＝Yinf－（Yinf－Y0）
exp∧（－b＊X）

D

A

20

（Ａ）

（Ｂ）

Core temperature（℃）

18
C

16
14

E

B

12

A

B

C

D

E

Fig. 2 Comparison of core temperature of beef carcasses among

five groups in different position at 20 hours chilling. Diamondindicates95 ％ confidence interval of population mean. Center
horizontal line indicates overall average.

40

Chilling roomSet－7.2℃

35

Storage roomSet－1.0℃

Temperature （℃）

3025Solid line：Chilling curve

20：Observed valueCore temperature

15
10
5

Surface temperature0

Room temperature

－5
－10
0

3

6

9

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48
Time lapsed （hr）

：Defrost. clock time setting
Fig. 3 Modelling of chilling curves by least squares method. When the model formula was applied to the observed

values, the error was minimized in the case of the exponential formula for the core temperature and in the case of
the modified Gonpertz for the surface and the room temperatures. According to the modelling of chilling curves,the surface temperature 10℃ notified by the Ministry of Health, Labor and Welfare, Japan was 7 hours later, thesurface temperature 4.4℃ of the Federal Regulations before revision was 11 hours, and the core temperature 15℃
of bone taint suppression proposed by James et al. within 24 hours, it reached after just 20 hours, and the coretemperature 7℃ of the European regulations reached after 34 hours, and all conditions were satisfied.

© The Ito Foundation

枝肉の異臭クレーム防止のためのと畜場における最適な冷却温度管理法の開発

55［Yinf＝39.72，Y0＝2.14，b＝0.057］

う必要があるが，仮に，枝肉の深部温度でなく表表面温度において初期値の維持が見られるが，面温度を対象に非接触式の赤外線放射温度計ある一方の深部温度については冷却開始直後から低下

いは赤外線サーモグラフィカメラで測定するとししている。その理由は，最終洗浄後の枝肉表面にても，すべての枝肉温度を計測あるいは監視を行

は水切り後であっても薄い水の膜ができており，

うためには新たに人員を配置しなければならな

表面の気化熱変換にいたるまでは一定であるためい。しかし，いずれのと畜場においても配置できと考えられる。

る余剰人員はないため，全枝肉についてモニタリ

3.3

冷却室の経時的温度変化の早見表作成

3.3.1

ングを実施することは困難である。本研究により

庫内温度の信頼限界の算出得られた早見表を用いれば，全枝肉の温度を測定

庫内温度の信頼限界上限は次の修正ゴンペルツ

しなくても，庫内温度から枝肉温度を適正に管理式（Ｃ）で示された（Fig.４）。

することができる。新たな設備投資，人員配置おＹ＝Y0＋（Yinf－Y0）exp（－exp（－b（X－X50）））＊＊

よび手技は不要である。どのと畜場にも配置され（Ｃ）ている庫内温度の監視装置を使用するため，と畜［Yinf＝－2.5，Y0＝7.5，b＝0.373，X50＝8.03］

場管理者の負担や，食肉の小売り価格への影響も

3 . 3 . 2 日報報告時における庫内温度管理限界

なく，早期に，かつ容易に導入できる。また，枝

肉温度の適正管理により，ボーンテイント等のクの早見表の作成

レーム肉発生を低減できる。同じ手法を用いるこ

上述の式をもとに，早見表を作成した（Tableとで，全国のさまざまな規模のと畜場に導入が可

１）
。

能である。

HACCPでは全枝肉についてモニタリングを行：Observed value

Room temperature（̊C）

5

0

－5
Solid line：Chilling curve
Inside dashed line：Predicted conﬁdence limit－10Outside dashed line：individual conﬁdence limit
0

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19：Defrost. clock time setting

Time lapsed（hr）

Fig. 4 Confidence limit of room temperature. Temporary temperature rise appears immediately after defrosting. Since

defrost is set on a clock time basis, the operation timing varies depending on the work end time.

© The Ito Foundation

56

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 1 Simplified table for critical limit.
Chilling start
Clock time

Critical limit（˚C）
The day of slaughter
16：30

The next day
8：00

13：00
13：10

6.0
6.1

-2.4
-2.3

13：20

6.2

-2.3

13：30

6.2

-2.3

13：40

6.3

-2.2

13：50

6.4

-2.2

14：00

6.4

-2.2

14：10
14：20

6.5
6.5

-2.1
-2.1

14：30

6.6

-2.0

14：40

6.6

-2.0

14：50
15：00
15：10
15：20
15：30
15：40
15：50
16：00

6.7
6.7
6.8
6.8
6.9
6.9
7.0
7.0

-1.9
-1.9
-1.8
-1.8
-1.7
-1.7
-1.6
-1.6

16：10
16：20
16：30

7.0
7.1
7.1

-1.5
-1.4
-1.4

Chilling operators can apply the values in the table as the upper limit of theroom temperature. By checking of air circulation, number of carcasses and the
distribution in the chilling room when the room temperature continuously
exceeded the upper limit twice, deviation of carcass temperature can beprevented before happens.

今後は，微生物増殖について検証を行う予定である。具体的には，食のグローバリズムに対応できるサンプリングプランを検討し，その方法にて冷却前および後の指標菌の増減を検証する。
４．要拠に基づいた冷却工程管理法を開発することとした。
まず，冷却担当者の日々記録されている冷却工
程管理日報の記録から最新の多変量解析法である
グラフィカルモデリング（GM）を用いて枝肉温

約度に影響する因子についての因果解析を行った。

と畜場での枝肉の冷却工程の逸脱は深刻な品質

次に，因果解析で判明した最も温度管理の逸脱の劣化や細菌増殖を引き起こす。現在，多くのと畜起こりやすい条件下において関係団体の合意のも場では日々の運用において枝肉の表面温度およびと表面温度および深部温度を測定し，庫内温度か深部温度（以下，表面温度，深部温度）は恒常的

ら表面温度および深部温度を推定するためモデルには計測されていない。一方で，冷却室内の庫内式を最小二乗法にて算出した。最後に，冷却工程

温度（以下，庫内温度）は多くのと畜場で経時的に不可避である霜取り作動を考慮した庫内温度のかつ自動的に計測されている。そこで本研究で信頼限界を算出した。冷却開始時刻は当日のと畜は，現場の運用実態に適合し，簡便で，統計的根処理状況によって異なるため，日報報告時刻にお© The Ito Foundation

枝肉の異臭クレーム防止のためのと畜場における最適な冷却温度管理法の開発

ける庫内温度の管理限界をただちに把握できるよ
うに早見表を作成した。
その結果，枝肉温度に最も影響を及ぼすのは，入庫枝肉数であることが明らかとなった。表面温度についてはロジスティック式，深部温度について指数式で表すことのできるモデル式が得られた。霜取り作動も考慮した庫内温度の信頼限界については修正ゴンペルツ式でのモデル式が得られた。
GMでは因果関係が視覚的に示されるため，冷却担当者が冷却工程の因果関係を包括的に把握しやすく，温度管理の逸脱の防止，予測および是正措置を的確に実行できる。モデル式ではさまざまな入庫状況において庫内温度からおおよその深部
温度を把握することができ，庫内温度管理限界早見表を冷却担当者はただちに運用できることか

57

引用文献
１）
 Nychas, E. G-J., Skandamis, N. P., Tassou, C. C.,
Koutsoumanis, P. K.：Meat Science, 78, 77～89,2008.
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３）
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４）
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５）
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EN ed. 47, L139/55, 2004.
https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=OJ:L:2004:139:TOC
６）
 Food Standards Agency：Meat Industry Guide,
Chap.10, 12-13, 2015.
https://www.food.gov.uk/business-guidance/meatindustry-guide７）
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European Food Safety Authority Journal, 12, 3601,
2014.
８） 厚生労働省：食品製造におけるHACCP入門のための手引書（と畜・食肉処理編）
h ttps://www.mhlw.go.jp/file/06-Seisakujouhou11130500-Shokuhinanzenbu/0000098996.pdf

ら，ボーンテイント低減が可能となった。

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58

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明（Ⅲ）
Identification of the main factor determining the taste of Jidori meat（Ⅲ）

本

田

和

久

（神戸大学大学院農学研究科）

Kazuhisa Honda（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

Jidori is one of tasty and popular meats in Japan. However, the main factor determining
the taste of Jidori meat have not been identified. In the present study, we compare theunsoluble collagen ratio and share force value of skeletal muscles of breast and thigh muscle ofbroiler and Jidori chicken in order to identify the candidate index indicating the palatability ofJidori meat. The unsoluble collagen ratio of biceps femoris of Hyogo ajidori was higher thanthat of broiler meat. The share force value of biceps femoris of Hyogo ajidori meat was higher
than that of broiler meat. The share force values of biceps femoris of Hakata Jidori, Hinai jidori,Miyazaki Jidokko, Nagoya, and Tamba Kurodori meat was higher than that of broiler meat.
There is no significant difference in the concentration of amino acids and nucleic acid-related
components in these meats. These findings suggest that share force value of biceps femoris of
Jidori meat is the common main factor of the taste of Jidori meat.

１．目

善が進められているが，地鶏肉の美味しさの決定

的要因が明らかにされないまま，増体性のみによっ

地鶏肉は我が国が誇る優れた食味の食材であて地鶏の品種改良が進められれば，地鶏肉の価格

り，その美味しさは我が国鶏肉市場の約９割を占低下は達成されても，その美味しさが損なわれてめる安価な若どり（ブロイラー）の肉とは一線をしまうことが懸念される。それゆえ，地鶏肉の美画す。しかしながら，地鶏肉は鶏肉としては高価

味しさの決定要因を明らかにすることは急務と言格であるにも関わらず，牛肉の肉質等級のようなえるが，これまでの主に「むね肉」を用いた化学品質を保証し得る評価基準が確立されていない。

分析や官能検査の結果からは，その決定要因を明

そのため，平成11年に地鶏肉のJAS規格が決定さらかにすることはできなかった。

れて以降も，地鶏肉とブロイラー肉との美味しさ

地鶏肉の美味しさは，「適度な歯ごたえ」やの違いが十分に消費者に認識されず，その市場拡「うま味」という言葉で表現される。このうち，

大が思うように進まない状況が続いている。この「うま味」を形成するとされているアミノ酸およ

ような状況下，地鶏肉の価格低下による需要増加

び核酸関連物質については，地鶏肉とブロイラーを目的として，地鶏の品種改良による増体性の改

鶏肉の抽出液に含まれるアミノ酸や核酸関連物質© The Ito Foundation

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明（Ⅲ）

59の含量には大きな違いは見られないことが報告さす骨格筋（Ⅰ型，ⅡＡ型，およびⅡＢ型筋繊維かれている。一方，「適度な歯ごたえ」は骨格らなる縫工筋，ⅡＡ型筋繊維からなる大内転筋，筋の筋線維組成の相違に基づくものであることがⅡＢ型筋繊維からなる浅胸筋，ⅡＡおよびⅡＢ筋

示唆されており ，日齢７）

繊維からなる大腿二頭筋，およびⅢ型筋繊維からにより影響されることが報告されている。また，なる長内転筋）を減圧包装後，－30℃で冷凍保存

比内地鶏においては雌のみが鶏肉生産用に供されした。各骨格筋の総コラーゲン含有率および可溶ており，雄の食味を改善するべく効率的な去勢方性コラーゲン含有率はLiuらの方法９）に従い測定法も検討されている８）。ここで，食肉の歯ごたえした。剪断力価は，測定日に凍結保存した骨格筋

は不溶性コラーゲン含有率の上昇によって増加すを解凍後，その中心部から最も長い辺が筋線維にることが知られている 。我々は，これまで鶏肉平行になるように，1.5cm×1.0cm×0.5cmのブの高需要部位でありながら，構成する骨格筋の多ロック状の肉片を切り出した。肉片を減圧包装

様性から均一な試料を調製することが困難であっ

し，80℃の温浴中で10分間加熱した。氷上で冷また「もも肉」の官能検査法を確立し，地鶏肉の美した後，Warner-Bratzler剪断力価計（イマダ，

味しさは一般的なうま味成分であるアミノ酸や核FR-NB-80，ZTA-DPU，mx2-500N）を用い，酸関連物質の含量の増加によるものではなく，骨剪 断 力 価 を 測 定 し た 。な お ，肉 片 は 剪 断 速 度

格筋繊維の質，すなわち食感の違いによる可能性

60mm/秒で筋線維の向きに垂直に剪断した。

１～３）

４）

，あるいは飼育方法

５，６）

９）

を示した 。さらに，兵庫県の地鶏であるひょう10）

ご味どりの美味しさは，不溶性コラーゲン含有率

2 . 2 種々の地鶏肉の大腿二頭筋と浅胸筋の剪
断力価の測定の上昇に基づく食感の改善に基づくことを示唆し

ブロイラー，はかた地どり，比内地鶏，みやざた 。しかしながら，浅胸筋のみから構成される

き地頭鶏，名古屋コーチン，および丹波黒どりをむね肉とは異なり，多様な骨格筋の組み合わせに購入し，大腿二頭筋および浅胸筋の剪断力価をよって構成されるもも肉の，どの骨格筋が食感を2 . 1と同様の方法で測定した。

11）

2.3

決定づけているのか不明である。

アミノ酸および核酸関連物質の分析

本研究では，種々の地鶏肉の不溶性コラーゲン

2 . 2で購入したもも肉から大腿二頭筋に含まれ含有率と剪断力価との関係を明らかにするとともる遊離アミノ酸をワコーパックⓇワコーシルⓇ-PTC4.0に，我が国を代表する種々の地鶏肉の物性を明ら（和光純薬工業株式会社）を用いて，核酸関連物

かにすることにより，地鶏肉の美味しさの決定要

質をAtlantisⓇ dC18 Column（日本ウォーターズ

因を確定する。

株式会社）を用いて，それぞれ解析した。

２．方
2.1

2.4

法

統計解析

２群間の比較はスチューデントのｔ検定によ剪断力価測定部位の決定

り，多重比較はブロイラーを対照としたDunnet

０日齢の雄の地鶏（ひょうご味どり）およびブロイラー（ROSS308）を，それぞれ97日齢および42日齢まで飼育した。12時間絶食後，炭酸ガス法により，それぞれ統計解析した。
３．結果と考察

麻酔下で安楽死させ，脱羽後，むね肉およびももブロイラーとひょうご味どりの浅胸筋，大腿二肉を24時間冷蔵保存後，特徴的な筋線維組成を示

頭筋，縫工筋，および長内転筋の不溶性コラーゲ© The Ito Foundation

60

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

ン含有率と剪断力価の測定を行った結果，ブロイ

はかた地どり，比内地鶏，みやざき地頭鶏，名古ラーと比較して，ひょうご味どりの大腿二頭筋と屋コーチン，および丹波黒どりと，ブロイラーの縫工筋の不溶性コラーゲン含有率が高い傾向にあ

大腿二頭筋と浅胸筋の剪断力価を比較した。そのること（Table１），大腿二頭筋の剪断力価が有意

結果，ブロイラーと比較して，調べたすべての地に高い値を，縫工筋の剪断力価が高い傾向を，そ

鶏肉の大腿二頭筋の剪断力価が有意に高い値を示

れぞれ示すこと（Table１）が明らかになった。

した（Table２）。一方，浅胸筋の剪断力価につい

これらの結果から，ブロイラーと地鶏肉のもも肉ては，比内地鶏と丹波黒どりのみが，ブロイラーの食味の違いに影響する骨格筋は大腿二頭筋であの値よりも有意に低い値を示した（Table２）。

り，その指標として剪断力価を用いることができ

Sasakiらは，薩摩地鶏の大腿二頭筋の剪断力価はることが示唆された。また，ブロイラーとひょう

ブロイラーのそれに比べ高いことを報告してい

ご味どりの浅胸筋の不溶性コラーゲン含有率にはる12）。これらの結果から，地鶏においては，剪断

有意差が認められないものの，剪断力価はひょう

力価がその品質を示す指標になることが強く示唆

ご味どりのほうが有意に低い値を示したことかされた。鶏肉の物理学的特性は鶏種13～15）だけでは

ら，むね肉の柔らかさが地鶏肉の新たな特徴としなく，飼育方法にも影響を受ける。例えば，屋内て提案できる可能性が示された。

よりも屋外で飼育された鶏の肉は歯ごたえや多汁

ひょうご味どりの大腿二頭筋と浅胸筋で認めら性に富むことが報告されている16）。本研究においれた剪断力価における特徴が，その他の地鶏でもては，市販の地鶏肉を購入し，その物理学的特性認められる可能性について明らかにする目的で，を調べたが，今後，大腿二頭筋の剪断力価の高さ

Table 1 C omparison of unsoluble collagen ratio and share force value of skeletal muscles between

broiler and Hyogo ajidori

Unsoluble collagen ratio（%）

Share force value（N）

Skeletal muscles

Broiler

Hyogo ajidori

Broiler

Hyogo ajidori

Pectralis major
Biceps femoris
Adductor longus
Sartorius

70.6 ± 6.2
72.0 ± 3.4
75.6 ± 5.6
66.3 ± 5.0

72.5 ± 6.8
79.7 ± 1.8†
78.6 ± 3.7
78.5 ± 3.7†

10.93 ± 1.4
6.19 ± 1.1
6.14 ± 1.2
6.41 ± 1.4

5.63 ± 1.0＊
8.57 ± 1.2＊
7.27 ± 2.1
8.60 ± 1.1†

Values are means±SE of 4～6 piecies.
† and ＊ indicate significant difference between broiler and Hyogo ajidori meats（†, p ＜0.1；＊, p ＜0.05）

Table 2 Comparison of share force value of Biceps femoris and Pectaralis

major of different kind of chickens

Chickens

Biceps femoris

Pectralis major

Broiler
Hakata jidori
Hinai jidori
Miyazaki jidokko
NagoyaTammba kurodori

5.87 ± 0.60
10.49 ± 0.95＊
12.80 ± 2.08＊
11.01 ± 1.22＊
12.19 ± 1.09＊
10.94 ± 1.92＊

9.98 ± 0.79
6.38 ± 0.90
4.61 ± 1.02＊
6.55 ± 1.01
9.94 ± 2.39
4.24 ± 0.52＊

Values are means±SE of share force value（N）of 5～8 piecies.
＊indicates significant difference between broiler and Jidori meats（p＜0.05）.

© The Ito Foundation

61

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明（Ⅲ）

Table 3 Comparison of amino acids and nucleic acid-related components of Biceps femoris extract of different kindof chickens

Broiler

Hakata jidori

Hinai jidori

Miyazaki jidokko

NagoyaTamba kurodori

Amino acids（nmol/ml）
Asｐ59.3 ± 20.1

119.0 ± 51.7

25.2 ± 5.7

56.0 ± 4.8

73 ± 62.9

62.2 ± 26.8

Glu

23.0 ± 2.7

62.6 ± 14.9

26.8 ± 7.3

26.7 ± 9.5

59 ± 17.2

60.2 ± 36.5Ser

6.9 ± 2.2

11.1 ±

4.8

8.4 ± 3.2

4.5 ± 0.2

34 ± 18.0

11.5 ± 3.1

Gly

5.1 ± 1.0

6.1 ±

2.6

4.9 ± 2.2

8.1 ± 5.927 ± 23.9

18.0 ± 13.0

His
Ala

9.1 ± 2.5
14.5 ± 7.5

21.0 ± 10.5
79.5 ± 17.8

7.7 ± 1.4
24.8 ± 7.7

11.7 ± 6.9
13.8 ± 12.8

45 ± 17.7
74 ± 71.5

18.7 ± 13.4
3.8 ± 1.4

Pro

59.1 ± 36.9

254.3 ± 191.2

8.0 ± 5.6

3.4 ± 2.0

114 ± 110.8

Tyr26.0 ± 21.5

24.5 ±

6.7

3.5 ± 1.3

3.4 ± 2.1

9±

5.4

10.0 ± 8.3

Val15.0 ±

11

16.9 ±

7.6

3.0 ± 0.8

1.6 ± 0.7

10 ±

7.2

4.5 ± 3.4

Met
Cys

11.2 ± 4.3
11.2 ± 7.4

21.9 ±
22.7 ±

7.1
5.4

2.5 ± 0.0
5.2 ± 1.3

6.3 ± 3.4
5.5 ± 2.5

8±
11 ±

3.3
1.6

6.7 ± 4.1
6.8 ± 4.6

Ile
Leu
Phe
Lys

12.2 ± 3.8
18.9 ± 11.9
6.6 ± 4.2
20.8 ± 7.1

32.9 ± 21.2
61.2 ± 26.8
14.3 ± 6.0
21.7 ± 4.5

15.3 ± 6.6
2.5 ± 0.7
4.2 ± 0.5
15.7 ± 3.3

4.7 ±
3.3 ±
3.7 ±
27.4 ±

2.8
0.8
1.9
5.8

10 ± 4.5
12 ± 9.7
19 ± 14.7
35 ± 2.2

11.9 ± 11.0
36.5 ± 32.4
6.3 ± 4.9
35.7 ± 9.2

Nucleic acid related components（nmol/ml）
Inosinic acid48.9 ± 19.5
99.8 ± 46.7
Inosine126.3 ± 6.7
158 ± 12.3
Hypoxanthine
158.7 ± 27.9
124.5 ± 11.4

112.9 ± 34.4
124 ± 25.3
76.9 ± 9.6

53.8 ± 6.5
126.1 ± 14.2
183.9 ± 21.2

85.7 ± 37.2
122.8 ± 21.3
128 ± 10.9

74.6 ± 39.1
71.8 ± 24.3＊
63.5 ± 19.8

9.5 ± 7.6

Values are means±SE of 3 piecies. ＊indicates significant difference between broiler and Jidori meats（p＜0.05）.

を地鶏肉のゆるぎない特長として訴求するためにる要因として，大腿二頭筋の剪断力価の高さが示は，その特長が，飼育環境に関わらず認められるされた。今後，非侵襲的な剪断力価の測定法を開ことを確認する必要があると考えられた。

発することによって，地鶏肉の肉質評価基準が構

アミノ酸および核酸関連物質の値には，丹波黒どりのイノシンを除いて有意な差は認められなかった（Table３）。これらの結果から，アミノ酸

築されることが期待された。
４．要

約

や核酸関連物質は地鶏肉に共通性の高い特長には

本研究では，地鶏肉の美味しさの決定要因を明

ならないことが示唆された。しかしながら，アミ

らかにする目的で，地鶏肉とブロイラーの種々のノ酸および核酸関連物質の含有率については解体

骨格筋における不溶性コラーゲン含有率および剪

前の生体の生理的条件と，解体後の流通過程にお断力価を比較した。その結果，種々の骨格筋の中ける熟成が大きく影響する。それゆえ，本実験にで，もも肉を構成する主要な骨格筋である大腿二

おいても鶏種間だけではなく同鶏種の個体間でも頭筋の剪断力価がブロイラーのそれに比べて高い

大きなばらつきが見られた。今後，分析サンプル

こと，その特徴は，種々の地鶏肉に共通の特徴での増加や同じ条件下における飼育実験の実施なあることが明らかになった。アミノ酸組成およびど，複数の都道府県の協力による研究の推進が必

核酸関連物質の組成に有意な違いは見られなかっ要と判断される。

た。これらの結果から地鶏肉の美味しさの決定要

これらの結果から，地鶏肉の美味しさを決定す

因は，大腿二頭筋の剪断力価の高さにあることが© The Ito Foundation

62

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

示唆された。
文献１） 尾関教生，吉田行夫，加藤貞臣，河村孝彦，伊藤
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Journal of Poultry Science, 54, 87～96, 2017.
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A. A.：Quality characteristics of broiler chicken
meat from free-range and industrial poultry system
for the consumers, Journal of Food Science andTechnology, 54, 1818～1826, 2017.
14） Mueller, S., Kreuzer, M., Siegrist, M., Mannale, K.,
Messikommer, R. E., Gangnat, I. D. M.：Carcass
and meat quality of dual-purpose chickens（Lohmann
Dual, Belgian Malines, Schweizerhuhn）in comparison
to broiler and layer chicken types, Poultry Science,
97, 3325～3336, 2018.
15） Wattanachant, S., Benjakul, S., Ledward, D. A.：
Composition, color, and texture of Thai indigenous
and broiler chicken muscles, Poultry Science, 83,
123～128, 2004.
16） Stadig, L. M., Rodenburg, T. B., Reubens, B., Aerts,J., Duquenne, B., Tuyttens, F. A.：Effects of freerange access on production parameters and meat
quality, composition and taste in slow-growing broiler
chickens, Poultry Science, 95, 2971～2978, 2016.

© The Ito Foundation

63

非加熱食肉製品における生理活性発現に関与する微生物の解明Investigation of microorganism for expression of bioactivity in the
uncooked meat products

竹田志郎１・水野谷

航１・内山

淳平２

（１麻布大学獣医学部動物応用科学科，２麻布大学獣医学部獣医学科）

Shiro Takeda１, Wataru Mizunoya１ and Jyunpei Uchiyama２（１School of veterinary medicine, Department of animal science and biotechnology,
２Department of veterinary medicine, Azabu University）

We investigated the antioxidant activity and angiotensin I-converting enzyme（ACE）
inhibitory activity in ten types of uncooked pork meat products. According to our results, the
Coppa and Milano salami demonstrated the high antioxidation and ACE inhibitory activities
among the tested samples. However, a correlation between the high activities of Coppa and
Milano salami and their total peptide levels was not observed. The levels of carnosine andanserine, which are the functional peptides in meats, also did not correlate with the highantioxidation and ACE inhibitory activities. Our results indicate that these meat products
possibly have the specific bioactive substances.
The Coppa and Milano salami which demonstrated high antioxidation and ACE inhibitory
activities, and the Jamon Serrano and Italiano prosciutto which had the low antioxidation and
ACE inhibitory activities, were subjected to pH, and total bacterial and lactic acid bacteria（LAB）counts estimation. We observed that the total bacterial and LAB counts of Coppa and
Milano salami were significantly higher than those of Jamon Serrano and Italiano prosciutto.
Further, no significant differences were observed between the Coppa and Milano salami.
Notably, the pH value of Milano salami was significantly lower than the other tested products.
We further assayed the species of isolated LABs from Coppa and Milano salami and our results
showed that the Lactobacillus sakei and Pediococcus pentosaceus, which are known as the LAB
starter in meat products, were present more frequently in Coppa and Milano salami,
respectively. Thus, our results suggest that the expressions of antioxidation and ACE
inhibitory activities of the uncooked pork meat products is related to their bacterial counts andtypes. Further studies are required to identify the major bacterial genera that contribute to
the high antioxidation and ACE inhibitory activities in the meat products.

１．目

おり，生理活性物質に関する研究が盛んに行われ的ている。食肉の保健機能性としては，血圧調整に

近年，食品による保健機能への関心が高まって関連するアンジオテンシンＩ変換酵素（ACE）© The Ito Foundation

64

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

阻害活性や活性酸素の働きを抑える抗酸化活性が２），イタリアンプロシュット24か月熟成（イタ

報告されており，我々もこれまでに研究成果とし

リア，サンプル番号３），パンチェッタ（イタリて報告した１，２）。これら機能性の発現には，食肉ア，サンプル番号４），コッパ（イタリア，サンから生じてくるペプチドとの関連性が高い。

プル番号５），ミラノサラミ（イタリア，サンプ

非加熱食肉製品とはイタリアのプロシュート・ル番号６），パルマサラミ（イタリア，サンプル

ディ・パルマやスペインのハモンセラーノハムと番号７），トリュフサラミ（イタリア，サンプル

いった非加熱（生）ハムやドライソーセージ，セ

番号８），ロンガニーザ（スペイン，サンプル番

ミドライソーセージといった製品のことであ号９），フエスライス（スペイン，サンプル番号

る 。これらの製品は海外の食肉製品として知名10）を使用した。各製品は一般社団法人

度が高く，国内においても高付加価値食肉製品とハム協会を通じて購入した。

３）

日本生

して普及されている。非加熱食肉製品は発酵また各製品10ｇを採取し，40mLの滅菌蒸留水を加は熟成工程により，食肉タンパク質由来ペプチド

え，無菌的にホモジナイズおよび肉片残渣をろ過が産生され，それらの中には，ACE阻害活性やした水抽出液を作製し，試料として各試験に用い抗酸化活性を示すものが報告されている 。

た。

４）

我々の過去の研究においては，乳酸菌スター

2.2

抗酸化活性

ターにより調製した非加熱食肉製品（発酵ソー

DPPHラジカル消去活性の測定は，DPPH分光

セージ）にACE阻害活性や抗酸化活性が認めら測定法に準じて行った。すなわち，400μmol/L

れ，これらの発現には乳酸菌の発酵との関連性が

DPPH ，200mmol/L MES buffer pH6.0 ，20 ％ エ

示唆された５）。しかしながら，スターター未添加

タノールを同量ずつ加え，混合液を作製した。なタイプの非加熱食肉製品のACE阻害活性や抗酸

お，サンプル濃度はペプチド濃度１mM（Gly-Leu

化活性の発現については，発酵または熟成に関与換算値）に調整し，必要に応じ，希釈したものをする主要な微生物等についての研究が十分行われ供試した。混合液を20分間室温で反応させた。そていないため，それら発現機構の解明に向けた微の後，分光光度計にて吸光度520nmで測定した。

生物学的な検討が必要である。

また，サンプルの代わりに，0.2mmol/L Trolox

本研究では，スターター未添加タイプの非加熱食肉製品からACE阻害活性や抗酸化活性を示すをスタンダードとして測定し，検量線からサンプルのTrolox相当量を算出した。

製品を選抜した。機能性発現に関与する微生物と

2.3

して，過去に報告した乳酸菌に着目し，生理活性ACE阻害活性の測定は，蛍光検出法を用いてを有する非加熱食肉製品の乳酸発酵性と主要乳酸評価した。すなわち，50μLサンプル，100μL

菌種の検討を行った。

0.01U/mL ACE溶液，20μL 25mmol/L Hip-His-

２．方
2.1

ACE阻害活性Leu溶液を混合し，96wellプレートで37℃，40分法

間インキュベートした。なお，サンプルの濃度はペプチド濃度１mmol/L（Gly-Leu換算値）に調整

供試非加熱食肉製品

本研究で使用する非加熱食肉製品はハモンセ

し，必要に応じ，希釈したものを供試した。その後，

ラーノ９か月熟成（スペイン，サンプル番号１），

100μL 1 N NaOH，10μL 0.2％ o-phthalaldehyde

ブラックフォレストハム（ドイツ，サンプル番号（OPA），と15μL 3.6mol/Lリン酸を加え蛍光強度© The Ito Foundation

65

非加熱食肉製品における生理活性発現に関与する微生物の解明を測定した。蛍光プレートリーダーは360nm励起

料中の細菌検査として一般生菌数および乳酸菌数

波長，460nm蛍光波長の条件で測定し，ACEのを標準寒天培地ならびにBCP加プレートカウント

阻害活性を算出した。試料濃度を横軸，阻害活性寒天培地を使用し評価した。また，乳酸菌についを縦軸としたプロットにおいて，直線的に阻害活ては分離同定を行うため，変法GYP培地も使用性が減少する範囲で，ACE活性阻害率が50％をし細菌検査を行った。変法GYP培地上に形成さ示すときの反応液中の試料添加量・試料濃度をれたコロニーについて，純化後，DNAの抽出を

IC50値とした。

行い，16S r-DNAを標的としたPCRならびにシー

2.4

ケンス解析を行った。得られたシーケンス配列はペプチド濃度の測定

生命情報・DDBJセンターのBLAST解析を用い

試料中のペプチド量はOPA法に従い，OPA試て菌種を同定した。

薬を調製し吸光度340nmを測定した。Gly-Leu溶液をスタンダードとして用い，得られた値からペ３．結果と考察

プチド濃度（Gly-Leu換算値）を算出した。
アンセリンとカルノシン濃度の測定はHPLCを

非加熱食肉製品の中には，活性酸素の働きを抑用いて分析した。試料を限外ろ過後，一定量に合える抗酸化活性ならびに血圧調整に有効と知られ

わせ，0.45μｍのフィルターでろ過したものを分るACE阻害活性を有する製品があることが報告

析用試料とした。移動相は200mmol/Lリン酸二されている４）。豚肉を原料とする非加熱食肉製品

水素アンモニウム，100mmol/Lペンタンスルホ

10種が有する抗酸化活性ならびにACE阻害活性

ン酸ナトリウム，４％アセトニトリル，pH2.0溶を調査した。その結果，コッパ，ミラノサラミ，液（塩酸で調整）を使用した。分析条件は検出器およびフエスライスにおいて高い抗酸化活性値が220nm，カラムオーブン30℃，流量0.8mL，注入確認され，いくつかの製品と比べ有意差を示した

量20μＬで行った。

（Fig.１）。一方，ACE阻害活性について，IC50 値

pH測定および細菌検査と検出菌株の同定を調査したところパンチェッタ，コッパおよびミ

試料中のpHはpHメーターにより測定した。試ラノサラミにおいて低値を示した（Fig.２）。コッ

DPPH radical scavenging activity（μM Trolox/g）

2.5

30
b

25
20

ab

15

ab

a

10

a

5
0

b

ab

b

a

nd
1

2

3
4
5
6
7
8
Sample ID of tested meat products

910Fig. 1 DPPH radical scavenging activities of the tested uncooked pork meat products‘nd’ means not detected. The bars show the standard deviation.

The each tested meat products and sample ID are described in the method section.
The different letters are significantly different（p＜0.05）.

© The Ito Foundation

66

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

パのIC50値はもっとも低値であり，いくつかの製

24か月熟成製品のペプチド濃度が高い値を示し品と比べ有意に低い値を示した。抗酸化作用およた。一方，抗酸化作用およびACE阻害活性を示

びACE阻害活性を示さなかった製品として，ハしたコッパとミラノサラミは10.37mMと8.26mM

モンセラーノ，ブラックフォレストハム，イタリ

であり，供試試料の中で，著しく高いまたは低い

アンプロシュットがあげられた。したがって，各値ではなかった。食肉由来の機能性ペプチドとし非加熱食肉製品が有する抗酸化活性ならびにてカルノシンやアンセリンが知られており，抗酸ACE阻害活性は，各製品において異なることが化作用およびACE阻害活性を有することが知ら認められた。本研究では，コッパ，ミラノサラミ

れている６，７）。各製品由来水抽出物のカルノシンに高い抗酸化作用およびACE阻害活性が認めらとアンセリン濃度を調べたところ，コッパとミラ

れ，生理活性成分を含んでいることが示唆された。

ノ サ ラ ミ の カ ル ノ シ ン 濃 度 は 0.18mM お よ び

食肉製品の抗酸化作用およびACE阻害活性の0.15mMであり，著しく高いまたは低い値ではな

活性成分として，食肉由来のペプチドが知られてかった。また，アンセリンは各製品において検出いる。Table１に各非加熱食肉製品由来水抽出物

されなかった。したがって，コッパとミラノサラのペプチド濃度を示した。その結果，ハモンセ

ミの抗酸化作用およびACE阻害活性の発現と総ラーノ９か月熟成製品やイタリアンプロシュット

ペプチド濃度，カルノシン・アンセリン濃度とのIC50 （mM：peptide conc.）

3.5
3

a

a

a

ab

ab

ab

3
4
5
6
7
8
Sample ID of tested meat products

9

2.5

ab

ab

2

b

b

1.5
1
0.5
0

1

2

10

Fig. 2 ACE inhibitory activities of the tested uncooked pork meat products
The bars show the standard deviation.

The each tested meat products and sample ID are described in the method section.
The different letters are significantly different（p＜0.05）.

Table1 Peptide levels of the tested uncooked pork meat products
Sample ID of tested products

Total peptide（mM：Gly-Leu relative conc.）
Carnosine（mM）
Anserine（mM）

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

21.25

8.12

27.71

4.96

10.37

8.26

6.86

6.75

6.05

5.21

0.12
nd

0.19
nd

0.20
nd

0.21
nd

0.18
nd

0.15
nd

0.17
nd

0.17
nd

0.14
nd

0.08
nd

‘nd’ means not detected.
The each tested meat products and sample ID are described in the method section.

© The Ito Foundation

67

非加熱食肉製品における生理活性発現に関与する微生物の解明

間に関連性は認められなかった。これらの製品のある変法GYP培地上で形成されたコロニーをラ

抗酸化作用およびACE阻害活性の発現には，独ンダムに10個釣菌し，菌種の同定を行った。その

自に含まれる成分が寄与していると考えられた。

結果，コッパでは10株中８菌株がLactobacillus

我々は，非加熱食肉製品である発酵食肉製品に

sakeiに属し，その他２株はEnterococcus faecalis

おいて，抗酸化活性およびACE阻害活性の発現に属した。一方，ミラノサラミにおいては10株中には乳酸菌の発酵が関与していることを報告しすべてがPediococcus pentosaceusに属する乳酸菌た５）。本研究で使用した非加熱食肉製品は，乳酸株であった（Table３）。さらに，各製品のホモジ

菌スターターの使用はないとされる製品である

ネート中のpHについて調べたところ，ミラノサ

が，製品ごとに製造条件は異なるものの熟成工程

ラミのpHは他の製品と比べて有意に低い値を示があるため，微生物による影響を受けていると推した。抗酸化活性およびACE阻害活性を示した察される。また，食肉の熟成に関与する細菌群のコッパおよびミラノサラミには総生菌数および乳１つとして乳酸菌があげられる 。乳酸菌は食品

酸菌生菌数の高い値が認められたため，コッパおの加工でしばしば使用され，プロバイオティクス

よびミラノサラミにおける抗酸化活性および効果をもたらす有用細菌である。そこで，抗酸化ACE阻害活性の発現には製品中の細菌または微活性およびACE阻害活性を示した製品（コッパ

生物による関与が考えられた。ミラノサラミにおおよびミラノサラミ）と活性を示さなかった製品

いては他の製品と比べpHの低下が認められたた（ハモンセラーノおよびイタリアンプロシュット）

め，乳酸菌による発酵が進んでいると推察された。

について，培養法により総生菌数と乳酸菌生菌数

一方，コッパにおいては総生菌数と乳酸菌生菌数について調べた（Table２）。コッパおよびミラノの増加が認められたものの，pHの低下は認めら

サラミ間に総生菌数と乳酸菌生菌数（BCP寒天培

れなかった。コッパとミラノサラミから出現した地使用）に有意差は認められなかった。しかし，乳酸菌種において違いが推察されたことから，各

コッパおよびミラノサラミ製品中の総生菌数と乳製品で形成されている乳酸菌細菌叢だけでなく，酸菌生菌数はハモンセラーノおよびイタリアンプ

他の細菌叢もまた異なることも考えられた。食肉ロシュットの菌数に比べ，有意に高い値であっの発酵熟成に関与する細菌として，乳酸菌の他にた。コッパおよびミラノサラミ製品中に含まれる

Staphylococcus carnosusやStaphylococcus xylosus

主要な乳酸菌種を調べるため，乳酸菌選択培地でといったコアグラーゼ陰性のブドウ球菌類や

８）Table 2 Bacterial counts and pH of the tested uncooked pork meat products
Sample ID of tested products
1

3

5

6

Total bacterial counts （log10 CFU/g）

2.21 ± 0.29a

3.75 ± 0.04b4.61 ± 0.17c

4.48 ± 0.36c

Lactic acid bacteria counts （log10 CFU/g）
BCP agar plate2.27 ± 0.14a

3.95 ± 0.04b

4.21 ± 0.31c

4.66 ± 0.08c

GYP agar platepHnd6.05 ± 0.13and
6.07 ± 0.06a

3.67 ± 0.70a
6.70 ± 0.12b4.63 ± 0.30b5.74 ± 0.09c‘nd’ means not detected.
The each tested meat products and sample ID are described in the method section. Date shown are means ±SD.
The different superscript letters are significantly different（p<0.05）.

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68

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 3 Lactia acid bacterial species isolated from the Coppa and Milano salami samples
Isolated strain number

Coppa

Milano salami1Lactobacillus sakei

Pediococcus pentosaceus

2

Lactobacillus sakei

Pediococcus pentosaceus

3Enterococcus faecalis

Pediococcus pentosaceus

4Enterococcus faecalis

Pediococcus pentosaceus

5Lactobacillus sakei

Pediococcus pentosaceus

67Lactobacillus sakei
Lactobacillus sakei

Pediococcus pentosaceus
Pediococcus pentosaceus

8

Lactobacillus sakei

Pediococcus pentosaceus

9

Lactobacillus sakei

Pediococcus pentosaceus

10Lactobacillus sakei

Pediococcus pentosaceus

Micrococcaceae科，Kocuria spp.に属する細菌が製品独自の乳酸菌をはじめとする微生物群の関与

知られている 。したがって，コッパとミラノサが考えられた。

９）

ラミの抗酸化活性およびACE阻害活性の発現には，乳酸菌の他にも関与している細菌群の存在が推測された。今後，非加熱食肉製品の生理活性の謝

辞本研究を遂行するにあたり，非加熱食肉製品の入発現に関与する微生物について，乳酸菌の菌叢の手にご協力いただいた一般社団法人

詳細な解析ならびに乳酸菌に属さない細菌類につ会理事長

日本生ハム協桜岡盛一様に厚く御礼申し上げます。

いての検討を進めることで，食肉の生理活性発現に関与する微生物の解明が期待される。
４．要

約

豚肉を原料とする非加熱食肉製品10種の抗酸化活性ならびにACE阻害活性を調査したところ，
イタリアのコッパとミラノサラミに高い活性を認めた。これら製品の抗酸化活性とACE阻害活性の発現には総ペプチド濃度やカルノシン・アンセ
リン濃度との関連性は認められなかったため，製品独自の生理活性成分の存在が考えられた。コッパとミラノサラミの発酵性を評価したところ，総生菌数と乳酸菌数に違いは認められなかったが，pHは著しく異なった。また，主要乳酸菌種も異なることが推察された。したがって，非加熱食肉
製品の生理活性の発現は異なり，それに寄与する

文
献１）
 竹田志郎，久保田大樹，竹之山愼一，河原 聡，
六車三治男：暖地畜産学会報，58，103～108，2015.
 坂田亮一，竹田志郎，時田昇臣：平成29年度食肉２）に関する助成研究調査成果報告書，36，118～122，2018.
３）
 若松純一：乳肉卵の機能と利用，アイケイコーポ
レーション，食肉製品の種類と製造法，207～219，
2011.
４）
 Gallego, M., Mora, L., Escudero, E., Toldrá, F：Int
J Food Microbiol., 276, 71～78, 2018.
 Takeda, S., Matsufuji, H., Nakade, K., Takenoyama,
５）
S. I., Ahhmed, A., Sakata, R., Kawahara, S.,
Muguruma, M.：Anim Sci J., 88, 507～516, 2017.
６）
 Hou WEN-CHI, Chen HSIEN-JUNG, Lin YAWHUEI：J Agric Food Chem., 51, 1706～1709, 2003.
 Hipkiss, A. R.：Adv Food Nutr Res., 57, 87～154,
７）
2009.
８）
 Juárez-Castelán, C., García-Cano, I., EscobarZepeda, A., Azaola-Espinosa, A., Álvarez-Cisneros,Y., Ponce-Alquicira, E.：Meat Sci., 150, 7～13, 2019.
 Laranjo, M., Potes, M. E., Elias, M.：Front
９）
Microbiol., 10, 853, 2019.

© The Ito Foundation

69

神経細胞保護効果を有する畜産物由来タンパク質の探索研究
The study of protective effect on neuronal cell by animal product protein

糸

井

亜

弥・吉

川

豊

（神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科）

Aya Itoi and Yutaka Yoshikawa（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Women’s University）

Major neurocognitive disorder is a decline in mental ability severe enough to interferewith independence and daily life. The patients of Japan was 4620 thousand peoples in 2012. In
this study, we challenged the treatment used animal products, globin or liver extracts. We
have concluded that protein derived from animal products has a protective effect on glycationstress on nerve cells from in vitro experiments or in vivo experiments with streptozotocin
diabetes mellitus mice. In particular, the effect was remarkable in a study of SH-SY5Y
neuronal cells. In addition, it was found that the short-term memory abnormalities caused by aglycation stress model animal due to diabetes mellitus was improved by administration of aprotein derived from animal products. In this experiments, we did not elucidate these detailed
mechanisms, but found that it has a definite protective effect on neuronal cells. In conclusion,
we found that it is worth pursuing research on animal-derived proteins in fields related tomemory such as major neurocognitive disorder．

１．目病（DM）とも指摘され，生活習慣の中に深く根的付いていることが最も懸念すべきことである。ま日本国内において，高齢者人口の急増とともにた，これらの疾患に罹患すると，患者だけでなく，認知症患者数も増加しており，厚生労働省の発表

その周囲の家族への影響も甚大であるため，早急によると，2012年時点で約462万人，予備軍も合に予防法や治療法を確立しなければならない。

わせると約900万人と推計されている。また，

このような背景の下，多くの研究者が認知症治

2025年には認知症患者だけで700万人前後に達す

療可能な治療薬やサプリメント開発，神経細胞死ると見込まれている。一方，世界の認知症人口も，を予防する物質の探索研究を行っている。かねて2015年は4,680万人と推定されているが，2050年

より，畜産物由来ペプチドには，骨粗しょう症改までには１億3,150万人に到達すると予測されて善，血圧上昇抑制，コレステロール低下などの生いる。認知症は，神経変性（神経細胞死）に起因

体調節機能を有することが報告されており１），畜し，アルツハイマー病（AD）がその中の代表例

産物由来タンパク質に注目が寄せられている。特であり，ADをはじめとする認知症が第三の糖尿に近年，脊椎動物の神経細胞に特異的に発現し可© The Ito Foundation

70

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

逆的な酸素結合が可能なタンパク質であるニューテックスミキサーで撹拌した。糖化反応阻害剤でログロビン（Ngb）が発見され ，そのうちの哺あるアミノグアニジン（AG）または，各サンプ

乳類Ngbには，酸化ストレスに伴う細胞死を抑制

ルを添加し，総量を１mlとし，60℃で40時間イする働きを持つことが示唆されている 。また，

ンキュベーションした（Ａ）。同時に，各反応ブ

最近では，Ngbがアポトーシスやインスリン抵抗

ランクを用意した（Ｂ）。リファレンスとして，性などを解除し，脳内のアミロイドβ（Ａβ）の各サンプルまたはAGを添加しない試料を調整し蓄積を抑制することから認知症に対してプラスにた（Ｃ）。反応ブランクとして，グルコース溶液

働くというデータの蓄積もある 。そこで本研究の 代 わ り に Elix 水 を 添 加 し た も の を 用 意 し たでは，「畜産物由来のグロビンやレバーエキスに（Ｄ）。糖化反応終了後，反応液の終末糖化産物

よる神経細胞保護効果」を評価することにより，（AGEs） 由 来 蛍 光 （励 起 ； 370 nm ， 検 出 ；サプリメント素材として手軽に入手しやすい食材

440 nm）をプレートリーダーで測定した。次いで，認知症予防効果に繋げられるかを明らかにす

で，下式を用いて，リファレンスに対するAGEs

ることを目的とした。

生成阻害率を算出した。

２）

３）

４）

２．方

蛍光性AGEs生成阻害率（％）＝

法

2 . 1 畜産物由来タンパク質の抗酸化作用の評｛１－［（Ａ－Ｂ）/（Ｃ－Ｄ）］｝×100
2 . 3 畜産物由来タンパク質の神経細胞保護効
果の評価

価
本実験は，藤田らの文献に基づいて行った 。

AGEs中間体物質であるメチルグリオキサール

各サンプル，DPPH/エタノール混液を試験管に（MG）やグリオキサール（GO），グリセルアル

添加し撹拌したのち室温にて30分放置した（Ａ）。

デヒド（GA）をSH-SY5Y細胞に作用させると神同時に，各反応ブランクとしてDPPH/エタノー

経細胞死を誘導する。細胞を播種し，37℃，5％ル混液の代わりにエタノールを添加したものを調

CO２インキュベータで培養を行い，96時間後の培整した（Ｂ）。コントロールとして，エタノール，

地交換の際に1％のFBSとペニシリン－ストレプ

DPPH/エタノール混液を添加したものを調整しトマイシン-アムホテリシンＢ懸濁液をDMEMに（Ｃ），同時に反応ブランクとして，エタノールを混合調製したものを1％培養液として使用した。

添加したものを調整した（Ｄ）。30分経過後，分そ の 際 ，各 濃 度 に 調 製 し た サ ン プ ル と 終 濃 度

光光度計を用い，波長517 nmにて吸光度を測定

2 mMになるように調製した各神経細胞死誘導物

し，下式から，DPPHラジカル消去活性を算出し質をそれぞれ全体量の1/10量添加し，5時間培養た。

後，細胞の形態変化を観察・撮影した。さらに，

５）

DPPHラジカル消去活性（％）＝


テトラゾリウム塩を用いて生細胞数を計測し，

（Ａ－Ｂ）
］
（Ｃ－Ｄ）
/
｝
×100
｛
［
（Ｃ－Ｄ）－
2 . 2 畜産物由来タンパク質の抗糖化作用の評
価

AGEs中間体物質による神経細胞死に対する保護効果を細胞生存率から評価した。
2 . 4 in vivo実験における認知症予防効果の評

本実験は，堀らの文献に基づいて行った 。0.1６）価

Ｍリン酸緩衝液（pH7.4），ヒト血清アルブミン溶

16週齢のC57BL/6Jマウスに，ストレプトゾト

液，2Ｍグルコース溶液，Elix水を添加し，ボルシン（50 mg/kg/day）を5日間連続腹腔内投与© The Ito Foundation

神経細胞保護効果を有する畜産物由来タンパク質の探索研究

71

し，投与開始１週間後，採血を行い，血糖値が方法は，「120°Ｙ字迷路での連続試行型の実験モ

200 mg/dL以上のマウスを，糖尿病モデルマウス

デル」で行い，8分程度の探索を許し，どの走路として実験に供した。糖尿病発症後に，生理食塩をどのような順番で選択したかを記録した（総水とAG（50 mg/kg・BW）は週6日間，腹腔内投アーム進入回数；SLA）。3回連続で異なる走路に与し，グロビン（400 mg/kg・BW）は毎日給水

入った数（交替行動数；SWM）が総アーム進入

瓶から72日間投与した。糖化反応阻害剤である

回数中どれだけの割合であったかを交替行動率

AGの投与は，AGEs，Ａβの蓄積評価の対照群（；Alterations，％）とし，短期記憶の指標としとして用いた。解剖時には，マウスの全脳を採取た。なお，計算式はSarnyaiらの報告に従い，下し，免疫染色による解析を実施した。なお，動物記の式から求めた８）。

実験では，健常動物のノーマル群（Ｎ群），生理
食塩水を投与したDMコントロール群（Ｃ群），
AG投与群（Ａ群），グロビン投与群（Ｇ群）の４群で行った。

交替行動率（％）＝


交替行動数÷（総アーム進入回数－2）×100
す べ て の 実 験 に お い て ，群 間 の 有 意 差 は ，免疫染色では，4％パラホルムアルデヒド・リ

Microsoft Excel 2016を用い，Excel統計2012によン酸緩衝液にて組織を固定し，脱水，置換，パラり，Dunnet法，もしくは，Tukey-Kramer法を

フィン包埋後に，厚さ７μｍの連続切片を作製し用いて検定した。

た。切片を脱パラフィン後，10 mMクエン酸ナ

なお，本実験は，神戸女子大学動物飼育室利用

トリウム緩衝液にて121℃，20分間処理し，抗原

内規に従い，神戸女子大学動物実験倫理委員会のを賦活化した。さらに室温で30分間0.3％過酸化承認を得たうえで実施した。

水素水に反応させ，PBSで洗浄した後，続けて5分間Protein Block（abcam）に反応させ，PBSで洗 浄 し た 。抗 体 は ，抗 ウ サ ギ Ａ β 抗 体（GeneTex），抗 ウ サ ギ AGEs 抗 体（Bioss）を 使

３．結果と考察3 . 1 畜産物由来タンパク質の抗酸化作用への影響用した。一次抗体として抗ウサギＡβ抗体は100

グロビン，レバーエキスについて，3.5×10－２％倍，抗ウサギAGEs抗体は200倍に希釈して切片の濃度で測定した。グロビンについては低値ではに載せ，4℃で一晩反応させた。二次抗体として，あるが抗酸化作用を示したが，レバーエキスはほ

VECTASTAIN Elite ABC Kit（VECTOR）を用

とんど示さなかった（Fig. 1［A］）。グロビンにい，PBS-Tで希釈して免疫反応を行った。発色は高い抗酸化力があり，さらに，グルコースおよ

はDAB染色で行った。冠状断で薄切りした切片

びアラビノースによって糖修飾されたグロビンでスライドの海馬のCA1からCA2，CA3あたりが切は抗酸化性が増大するといった研究報告があ片スライドにのっているものを選んで脳全体を染り９），今回の結果はこの報告を支持するものであ色し評価した７）。

る。本実験にてグロビンには抗酸化作用が認めら

行動的学習能力の変化は，自発的交替行動を短れたが，糖修飾したグロビンについてのDPPHラ期記憶として評価するのに適しているＹ迷路装置

ジカル消去活性の測定を行うことができれば，本を 用 い た 。こ の 迷 路 は ，高 さ が 25 cm ，幅 が実験で得られた結果よりも高い抗酸化作用が認め

10 cm，長さが35 cmのアーム3本からなり，評価られるのではないかと推定した。

© The Ito Foundation

［A］
16
12
8
4
0

globin3.5×10‒2%

liver
3.5×10‒2%

［B］
7
6
5
4
3
2
1
0

globinglobinglobin3.5×10‒6％ 3.5×10‒5％ 3.5×10‒4％

AGEs inhibitory activity（％）

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
AGEs inhibitory activity（％）

DPPH antioxidant assay
（％）

72

［C］

12
10
8
6
4
2
0

liver
liver
liver
3.5×10‒6％ 3.5×10‒5％ 3.5×10‒4％

Fig. 1 DPPH radical scavenging activity of globin or liver extract［A］. Inhibitory effect of globin［B］or liver［C］

extract on HSA-derived fluorescent AGE formation.

3 . 2 畜産物由来タンパク質の抗糖化作用への影響
10多い濃度の様子を示した（Fig. 2［B］）
。MG単体
曝露時よりもMGと同時にサンプル含有時の写真

グロビンおよびレバーエキスについて3.5×のほうが，多く生細胞がみられた。メカニズムは％以上の濃度では自家蛍光が強く発生し，本不明であるが，レバーエキスもグロビンエキス－３

実験では測定することができなかった。そのため，本実験では3.5×10－６％～3.5×10－４％の濃度も，細胞死誘導を抑制することができた。
3.3.2

神経細胞死に対する保護効果

で測定を行った。このように低濃度しか使用でき

テトラゾリウム塩を用いた生細胞数計測結果でなかった点，また，グロビン，レバーエキスはとは，レバーエキスによる神経細胞死誘導物質の無もにFe含有物質であり，硫酸鉄（Ⅱ）七水和物

添加時における細胞への影響は，8.8％，4.4％のがAGEs生成を促進するため，高濃度では糖化促

溶液曝露時において有意な神経細胞増殖活性を認

進作用が働いているのではないかと考えた。そのめた（Fig. 3［A］）。また2 mM MGとサンプルを予想どおり，グロビンでは各濃度とも約6％程度

同時曝露した結果，17.5％，8.8％，4.4％の溶液の阻害率，レバーエキスでは，4-10％程度の阻害において（Fig. 3［B］）
，2 mM GOとサンプルの率であり（Fig. 1［B］［C］），AGEs生成抑制作用

同時曝露時では，4.4％の溶液において（Fig. 3は弱い結果となった。また，グロビンはグルコー［C］），有 意 な 神 経 細 胞 保 護 効 果 が 確 認 さ れ たスおよびアラビノースと強く糖化反応を示すとい（Fig. 3［D］）。

う報告もあり９），そのため，本実験ではグロビン

またグロビンエキスによる神経細胞死誘導物質

自身がグルコースと糖化反応を起こし，結果としの無添加時における細胞への影響は，17.5％，て，AGEs生成促進作用をほとんど示さない結果

8.8％，4.4％の溶液曝露時において，有意な差でとなったのではないかと結論付けた。

はなかったが，神経細胞増殖活性を認めた（Fig.

3 . 3 畜産物由来タンパク質の神経細胞保護効した結果，35％，17.5％，8.8％の溶液曝露時にお

果
3.3.1

3［E］
）
。また2 mM MGとサンプルを同時に曝露いて（Fig. 3［F］），2 mM GOとサンプルの同時形態変化による評価

2 mM MGと各濃度のレバーエキス添加時の中曝露時では，17.5％，8.8％，4.4％の溶液曝露時で一番生細胞数の多い濃度の様子（Fig. 2［A］）

において（Fig. 3［G］），同様に2 mM GA曝露時と，グロビンエキス添加時の中で一番生細胞数のでは，17.5％，8.8％，4.4％の溶液において，有© The Ito Foundation

73

神経細胞保護効果を有する畜産物由来タンパク質の探索研究［Ａ］

MediumMedium + MG

Medium + MG + liver［Ｂ］

MediumMedium + MG

Medium + MG+ globin

Fig. 2 Cell status by liver extract（8.8％）exposure［A］or globin extract（17.5％）exposure［B］

99

60
40
20
0

Cell（+） 35% 17.5% 8.8%
medium conc. conc. conc.

4.4%
conc.

2.2%
conc.

Concentration of samples（%）

120
100
80

＊
100

85

＊

＊
82

20
0

100

＊

80

80

26

Cell（+）medium 35% 17.5% 8.8% 4.4% 2.2%
medium + GA conc. conc. conc. conc. conc.

60

46

51

20
0

Cell（+）medium 35% 17.5% 8.8% 4.4% 2.2%
medium + MG conc. conc. conc. conc. conc.
Concentration of samples（%）

160
140
120
100
80
60
40
20
0

109

105

100

82
39

Cell（+） 35%
medium conc.

17.5%
conc.

8.8%
conc.

4.4%
conc.

100

100

＊

74

80

2.2%
conc.

＊
＊

＊

110

100
66

72

66

Cell（+）medium+ 35% 17.5% 8.8%
medium GO
conc. conc. conc.

4.4%
conc.

2.2%
conc.

＊

140
120
100

100

80

＊

＊
66

60

＊

100

Cell（+）medium 35% 17.5% 8.8% 4.4% 2.2%
medium + GO conc. conc. conc. conc. conc.
Concentration of samples（%）

100

＊
＊

80

＊

＊

60

35

40

16

20
0

85

22

20

120

87
72
44

40
0

＊＊

43

37
21

11

Cell（+）medium+ 35% 17.5% 8.8 4.4% 2.2%
medium MG conc. conc. conc.% conc. conc.
Concentration of samples（%）［H］＊
124 125

＊

60

［F］

120

＊

120

Concentration of samples（%）［G］
Cell viability（% of control）

80
79

43

40

Concentration of samples（%）

160
140
120
100
80
60
40
20
0

＊

＊

65

［E］

57

60
40

93

100

Cell viability（% of control）

119

69

80

［D］
Cell viability（% of control）

126

108

［C］

＊

Cell viability（% of control）＊

120

Cell viability（% of control）

100

100

Cell viability（% of control）

120

［B］

＊

＊

140

Cell viability（% of control）

Cell viability（% of control）

［A］

109

＊

121

117

51

51

40
20
0

Cell（+）medium+ 35% 17.5% 8.8% 4.4% 2.2%
medium GA conc. conc. conc. conc. conc.

Concentration of samples（%）

Concentration of samples（%）

Fig. 3 Viability of SH-SY5Y cells after exposure to liver or globin extract for 5 hours cytotoxicity at each sample

concentrations［A］or［E］, cytotoxicity at 2 mM MG exposure［B］or［F］,cytotoxicity at 2 mM GO exposure［C］
or［G］and cytotoxicity at 2 mM GA exposure［D］or［H］.Data are expressed as mean ± SDs. Significance ＊ ＊ p ＜0.05，＊p＜0.01.

© The Ito Foundation

74

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

意 な 神 経 細 胞 保 護 効 果 が 確 認 さ れ た（Fig. 3

ま た Fig. 3 ［D］［H］ よ り GA と GA 由 来 の［H］）。

AGEsであるGlycer-AGEsの毒性からも一部の濃両サンプル自身の毒性の有無を確かめるため，度によっては，両物質は防御できたと考えられ細胞にサンプルのみを曝露したところ，いくつかる。Glycer-AGEsは高血圧症，認知症，非アルコーの濃度においてサンプル未曝露の細胞数よりも生

ル性脂肪肝炎などの多様な疾患にも関与すること

細胞は増加傾向にあることを認めた（Fig. 3［A］

が示されており，生活習慣病に深く関係している［E］）。つまり，コントロールの細胞増殖率よりといわれている物質である。よって，これらの疾もサンプル曝露時のほうが増殖率は高いことよ

患にも両物質は予防や治療に寄与できる可能性がり，細胞増殖活性が上がったことが考えられる。

ある。

すでに報告されているニューログロビン（Ngb）

これらの結果より，in vitro実験ではグロビン

は，酸化ストレスにより惹起された神経細胞死をエキスのほうが総合的に抗糖化効果を有している

保護する作用が報告されている 。レバーエキスと判断したため，in vivo実験ではグロビンエキスやグロビンエキスにおいても，そのような作用をを使用することとした。

10）

3.4

［C］［F］［G］の結果から，MGとGOによる細胞

3.4.1

死誘導毒性からの神経細胞保護作用を示したこと

マウスの体重は同じ群間ではほぼ一定であっより，人の体内にもともと備わっている毒性処理た。摂食量と摂水量は，10日目あたりからＮ群よ機構のグリオキサラーゼシステムに寄与している

りもDMを併発している群のほうが多く摂取して可能性も示唆された。

いた（Fig.４）
。

［A］

［B］

35

7

Food intake (g)Body weight（g）有する可能性があると考えられた。Fig. 3［B］

30

25

0

10

Water intake (g)N group

30 40 50 60 70
days
C group
A group
G group
［C］
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10
N group20

投与期間中の体重の変動

6
5
4
3
2

20

in vivo実験における認知症予防効果

010

N group20

30 40 50 60days
C group
A group70
G group30

40 50 60 70
days
C group
A group
G groupFig. 4 Changes of body weight［A］, food intake［B］,and water intake［C］during the administration period.

N：Normal, C：Control, A：Aminoguanidine, G：Globin.

© The Ito Foundation

神経細胞保護効果を有する畜産物由来タンパク質の探索研究

Ｙ字迷路による短期記憶の評価

進入回数はＣ群と比較し若干低いが，血糖値や群ごとの平均でみると，Ｃ群やＡ群は血糖値やHbA1cが高値にも関わらず交替行動数は高かっ

HbA1cの値に相関して，総アーム進入回数，交

た。また，Ｇ群はＡ群と比較して有意に認知機能

替行動数ともに低下しており，それにより交替行は改善していた。つまり，認知機能障害の改善に動率も低下していた。しかしＧ群では，総アーム

グロビンエキスが正の寄与を示す可能性が認めら

［A］
500

［B］
10

HbA1c level（%）

Blood glucose level (mg/dL）

3.4.2

75

＊＊

400
300
200
100
0

N group C group A group G group50

N group C group A group G group［C］

Ｇ groupFig. 5 Blood glucose level［A］and HbA1C value［B］before the behavioral test. Data areexpressed as mean±SDs. Y-maze approach route and alternation rate［C］. Significance＊＊p＜0.05，＊p＜0.01
N：Normal, C：Control, A：Aminoguanidine, G：Globin.

© The Ito Foundation

76

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）［A］

N groupC group［B］ N group

C group

A group

G group

A group

G groupFig. 6 Immunostaining of Aβ［A］and AGEs［B］around mouse hippocampus（×400）

N：Normal, C：Control, A：Aminoguanidine, G：Globin.

グロビンエキスは血糖値やHbA1cの改善を伴れた（Fig.５）。
3 . 4 . 3 免疫染色によるAGEs，Ａβの蓄積評

わず，行動試験の結果を改善する結論が得られた
ため，糖尿病に起因する認知症のみならず，その価
Ａβ染色は，シミのような染まり方をしてお他の影響による認知機能障害に対しても効果を示

り，その部分を矢印で示した。すべての群においす可能性があり，今後の追加試験に期待したい。

てＡβはあまり観察されなかったが，Ｃ群では他の群より多く見られた（Fig. 6［A］
）
。

約

４．要

AGEs染色は，錐体神経層の細胞内から樹状突

抗酸化，抗糖化，細胞，動物の実験を通して，起，軸索，シナプスまで染まっている可能性が高神経細胞への糖化ストレスに対して，畜産物由来く11），そのように染まっている部分を矢印で指しタンパク質には保護効果があることが明らかとた。AGEs染色は同じ群の中でも個体差が大きなった。また，糖尿病に起因する糖化ストレスモ

かったが，これは高齢マウス（週齢は16週以降でデル動物により生じる短期記憶も，畜産物由来タ

ある条件以外はバラバラ）を使用したため，飼育

ンパク質投与により，改善することが分かった。

開始の週齢やそれまでの環境差も大きかった可能

今年度の研究では，これらの詳細なメカニズムの性がある（Fig. 6［B］）。

解明にまでは至らなかったが，神経細胞保護効果

グロビンエキスによる脳細胞への影響に関してに関しては，確実な作用があることが分かったたは，まだまだ不明瞭な部分は多いが，本研究結果

め，今後も認知症をはじめとする記憶に関係するより竹内が提唱している 12）AGEs生成経路中の分野での畜産物由来タンパク質の研究を進めていMGO-AGEs や GO-AGEs,Glycer-AGEs の 生 成 抑く価値があることを，本研究では見いだすことが制に関与したと考えられる。免疫染色では糖化のできた。

期間が短かったことやリタイアマウス使用による個体の状態差の問題もあり，AGEsやＡβの蓄積量に明らかな差がみられなかった可能性もある。

謝

辞

本実験において，グロビンタンパク分解物をご© The Ito Foundation

神経細胞保護効果を有する畜産物由来タンパク質の探索研究

提供いただいた，ILS株式会社様には深くお礼申し上げます。免疫染色の諸技術に関しましては，
姫路獨協大学薬学部の角山圭一准教授にご指導いただきましたこと，また，本実験を進めるにあたり，神戸女子大学大学院健康栄養学研究科，ならびに，神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科の学生諸氏に多くの協力をいただきました
ことを深謝いたします。
文献１） 西村敏英：日本調理科学会誌，41，221～226，
2008.
２） Sun, Y., Jin, K., Mao, X. O., Zhu, Y., Greenberg, D. A.,
Sun, Y.：Proc Natl Acad Sci, 98, 15306～11, 2001.
３） Sun, Y., Jin, K., Peel, A., Mao, X. O., Xie, L.,
Greenberg, D. A.：Proc Natl Acad Sci, 100, 3497～
500, 2003.
４） Li, R. C., Pouranfar, F., Lee, S. K., Morris, M. W.,

77

Wang, Y., Gozal, D.：Neurobiology of Aging, 29, 1815
～22, 2008.
５） 藤田修三，山田和彦：食品学実験書 第３版，医歯薬出版株式会社，東京，146～147，2017.
６） 堀未央，八木雅之，埜本慶太郎，北野貴大，宮崎亮，
米井嘉一：同志社大学理工学研究報告，52，223～
229，2011.
７） Jono, T., Kimura, T., Takamatsu, J., Nagai, R.,
Miyazaki, K., Yuzuriha, T., Kitamura, T., Horiuchi,
S.：Pathology International, 52, 563～571, 2002.
８） Sarnyai, Z., Sibille, E. L., Pavlides, C., Fenster, R. J.,
McEwen, B. S., Toth, M.：Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 97, 14731～14736, 2000.
９） 宮口右二，堤将和，永山精美：日本食品科学工学
会誌，46，514～520，1999.
10） Li, R. C., Morris, M. W., Lee, S. K., Pouranfar, F.,
Wang, Y., Gozal, D.：Brain Res., 1190, 159～66, 2008.
11） Jono, T., Kimura, T., Takamatsu, J., Nagai, R.,
Miyazaki, K., Yuzuriha, T., Kitamura, T., Horiuchi,
S.：Pathol Int., 52, 563～71, 2002.
12） 竹 内 正 義：J Kanazawa Med Univ, 37, 141～161,
2012.

© The Ito Foundation

78

和牛肉のおいしさを「見える化」する（Ⅱ）
輸入牛肉との比較
Studies on the new evaluation method of Wagyu beef quality（II）
Comparison of Wagyu beef with imported beef

山

田

知

哉

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構中央農業研究センター）

Tomoya Yamada（Central Region Agricultural Research Center, NARO）

In this experiment, we studied the metabolomic analysis of sirloin sample among Wagyu
beef, Australasian beef and USA beef to determine the key components associated with Wagyu
beef quality. GC-MS analysis detected 83 metabolites in the sirloin samples among threegroups. The Principal component analysis（PCA）score plots showed that the metabolomic
profile was divided into Wagyu, Australasian and USA groups. Wagyu beef were characterized
by the abundance of components such as sugar phosphates and nucleic-acid metabolites. In
contrast, Australasian beef and USA beef were characterized by the abundance of components
such as amino acids. The present study also showed that the relative amount of inosine
monophosphate（IMP）in Wagyu sirloin samples was higher than that in Australasian and
USA sirloin samples. These results suggest that the metabolomic analyses is an optimum
approach to identify quality-related chemical components of Wagyu beef.

１．目

2018年12月のTPP発効，ならびに2020年１月の的

日米貿易協定発効によって，特にオーストラリア

メタボローム解析は，癌の早期発見のための特やアメリカからの牛肉輸入量は急増しており，今異的な血中バイオマーカーの同定など，これまで後もさらなる輸入量の増加が予想されている。そ主に医学分野において活用されてきた。これに対こで日本国内においてはこれら輸入牛肉と和牛肉

し畜産分野では，牛肉のメタボローム解析を行っの差別化を明確にするため，さらには和牛肉の積た事例は少なく，特に牛肉品質に影響を及ぼ

極的な輸出によって海外における「和牛ブラン

すバイオマーカーに関しては不明な点が多い。

ド」を確立するため，脂肪交雑以外の和牛肉の特

我々は平成30年度伊藤記念財団研究助成課題にお徴を明確にすることが今後重要になると考えられいて，和牛肉とホルスタイン種牛肉のメタボロー

る。

１，
２）

ム解析結果を実施した結果，和牛肉は糖類の含量

そこで本研究では，黒毛和種とオーストラリアが多く，このことが和牛肉の大きな特徴である肉産およびアメリカ産アンガス種牛肉のメタボローの「甘み」に影響している可能性を示唆した 。

ム解析結果を比較することにより，和牛肉のおい

３）© The Ito Foundation

79

和牛肉のおいしさを「見える化」する（Ⅱ）輸入牛肉との比較

しさに影響を及ぼす牛肉中成分を特定することをた。PC１軸方向では，正の方向に和牛肉がプロッ目的とした。

トされ，アメリカ産牛肉とオーストラリア産牛肉

２．方
2.1

は負方向にプロットされた（Fig.１）。PC２軸方法

向では，正の方向に和牛肉とアメリカ産牛肉がプロットされ，オーストラリア産牛肉は負方向にプ

サンプル

黒毛和種去勢牛（ｎ＝４），オーストラリア産

ロットされた（Fig.１）。これらの結果から，和アンガス牛肉（ｎ＝４），アメリカ産アンガス牛

牛肉，アメリカ産牛肉，オーストラリア産牛肉は肉（ｎ＝４）の，サーロイン部位サンプルを用い成分のプロファイルが異なっていることが示された。黒毛和種サンプルは，農研機構那須塩原事業た。PC１の因子負荷量上位の代謝物質は和牛肉所で生産されたものを用いた。オーストラリア産

で高値を示す物質であり，主に核酸代謝物質と解およびアメリカ産牛肉のサンプルは，食肉販売店

糖系代謝物質によって構成されていた。これに対で購入したものを用いた。サンプルは分析時までし，PC１の因子負荷量下位の代謝物質は和牛肉

ディープフリーザーで冷凍保存した。

で低値を示す物質であり，主にアミノ酸によって2.2構成されていた。これらの結果から，和牛肉と輸メタボローム解析

メタボローム解析は，既報に基づき実施した３）。

入牛肉を比較した場合，和牛肉は核酸代謝物質と牛肉サンプルは，液体窒素下で乳鉢を用いパウ

解糖系代謝物質が，輸入牛肉はアミノ酸がそれぞダー状に粉砕し，粉砕したサンプル100mgにメタれの品種を特徴づける代謝産物であると考えられノールを添加してジルコニアビーズを用いたホモた。

ジナイズおよび，超音波処理を実施後，遠心分離

Fig.２に，階層的クラスタリング解析（HCA）を行い上清を回収した。上清はMonoSpin C18カで得られたヒートマップを示した。クラスター１

ラ ム（GL Science Cat.5010-21701）を 用 い て 精
製処理を行った。カラム透過画分は窒素ガス吹付6

下で濃縮乾固処理を実施後，メトキシム化処理を行った。次に，これらサンプルにトリメチルシリ

4ル化誘導化処理を行った。これら誘導化サンプル

2にて網羅的解析を実施した（（公財）かずさDNA
研究所）。データ解析は，GC/MSsolution（島津製 作 所） お よ び GC/MS Metabolite DatabaseVer.2（島津製作所）を用いた。

％PC2
（24）

を 用 い ，GC-MS（QP2010Ultra ，島 津 製 作 所）

U-2
U-1 U-3
U-4

W-4
W-3
W-1

0
-2
-4

A-4
A-3

-6
-8
-10 -8

３．結果と考察
和牛，オーストラリア産牛肉，アメリカ産牛肉のGC-MS解析を行った結果，83の代謝産物が検出された。この結果に対し主成分分析を実施した
ところ，３群がそれぞれ分かれてプロットされ

W-2

A-1
-6

-4

-2

A-2
0

2

4

6

8

10 12

PC1
（58.9％）
Fig. 1 Principal component analysis（PCA）of sirloin

sample among Wagyu beef, Australasian beef andUSA beef.
W1-W4：Wagyu beef（n＝4）, A1-A4：Australasianbeef（n＝4）,U1-U4：USA beef（n＝4）.

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80

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
１
3
4

２

5

6

7

-2

-1

0

1

W-4

W-3

W-2

W-1

U-4

U-3

U-2

U-1

A-4

A-3

A-2

A-1

8

2

Fig.2 Heatmap for the metabolites of sirloin sample among Wagyu beef, Australasian beef and USA beef.

W1-W4：Wagyu beef（n＝4）,A1-A4：Australasian beef（n＝4）,U1-U4：USA beef（n＝4）.

は和牛肉に特徴的な代謝産物で構成されており，

食肉中に含まれる代表的な旨味成分である４～６）。

グルコース-６-リン酸，フルクトース-６-リン

そこで，和牛肉，オーストラリア産牛肉，アメリ酸，イノシン酸（IMP）が含まれていた。一方，

カ産牛肉のIMPを比較した結果，和牛肉中のIMP

クラスター６はアメリカ産およびオーストラリア

は輸入牛肉より高い傾向が認められた（Fig.３）。

産牛肉に特徴的な代謝産物によって構成されてお牛肉の官能評価において，オーストラリア産おより，バリン，ロイシン，メチオニン，ヒスチジン

びアメリカ産牛肉と比較し，和牛肉の旨味が有意

等のアミノ酸が多く含まれていた。これらの結果に高いことが報告されている７）。したがって，和から，和牛肉成分は糖リン酸と核酸代謝物質，輸牛肉のIMPが輸入牛肉より高値傾向にあること

入牛肉成分はアミノ酸によって特徴付けられるこは，和牛肉の旨味の強さを示す主要な要因であるとが示された。

と推察された。

これらの結果から，和牛肉成分は糖リン酸と核

本研究によって，和牛肉と輸入牛肉のメタボ酸代謝産物によって，輸入牛肉成分はアミノ酸にローム解析を行った結果，和牛肉と輸入牛肉の代よって特徴付けられることが明らかとなった。今謝成分プロファイルが異なっていること，さらに回GC-MS解析によって検出された和牛肉に特徴

輸入牛肉と比較した場合の和牛肉に特徴的な牛肉

的な代謝産物のうち，特に輸入牛肉との比較にお中成分としてIMPが同定された。これらの結果かいて重要だと考えられる物質としてIMPがあげらら，今後輸入牛肉との差別化を行い和牛肉のブラれる。IMPはATPの分解によって生成される，ンドを確立していくうえで，従来強調されてきた© The Ito Foundation

和牛肉のおいしさを「見える化」する（Ⅱ）輸入牛肉との比較

物質，輸入牛肉はアミノ酸によって特徴付けられIMP
9.0E+05

ることが明らかとなった。さらに，旨味成分であ8.0E+05

るIMPを比較した結果，和牛肉中のIMPはアメリ

7.0E+05

カ産およびオーストラリア産牛肉より高い傾向が6.0E+05
Rel. Area81

5.0E+05

認められた。これらの結果から，輸入牛肉と比較

4.0E+05

した和牛肉の特徴として，旨味成分が有効な指標

3.0E+05となり得る可能性が考えられた。

2.0E+05
1.0E+05
0.0E+00

Australia

USA

Wagyu

Fig.3

Relative quantity of inosine monophosphate（IMP）
in sirloin sample among Wagyu beef, Australasian
beef and USA beef.
The middle line in the box plot represents themedian, the dotted line indicates the mean value,
and the vertical bars indicate the range of data.

脂肪交雑に加え，旨味成分が有効な指標となり得る可能性が考えられた。
４．要約

和牛肉と輸入牛肉のおいしさの違いに影響を及ぼしている牛肉中成分を明らかにするため，黒毛和種，オーストラリア産アンガス牛肉，アメリカ
産アンガス牛肉を用いてGC-MSによるメタボ
ローム解析を行った。その結果，83の代謝産物が同定された。主成分分析を実施した結果，和牛肉と，アメリカ産およびオーストラリア産牛肉は成分のプロファイルが大きく異なっていることが示された。和牛肉と輸入牛肉を比較した場合，主要な成分として和牛肉は核酸代謝物質と解糖系代謝

文
献１）
 Muroya, S., Oe, M., Ojima, K., Watanabe, A.：
Metabolomic approach to key metabolites
characterizing postmortem aged loin muscle ofJapanese black cattle, Asian-Australas. J. Anim.
Sci., 32, 1172～1185, 2019.
２）
 Ueda, S., Iwamoto, E., Kato, Y., Shinohara, M.,
Shirai, Y., Yamanoue, M.：Comparative metabolomicsof Japanese black cattle beef and other meats using
gas chromatography-mass spectrometry, Biosci.
Biotechnol, Biochem., 83, 137～147, 2019.
 山田知哉：和牛肉のおいしさを見える化する，平３）
成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，
37，38～44，2019.
４）
 三上正幸，木下康信，三浦弘之：電気刺激した牛肉における核酸関連物質の変化について，日本畜産学会報，62，398～400，1991.
 柳原一美，矢野幸男，中村豊郎，中井博康，田邊５）
亮一：牛肉の長期熟成中における官能評価，物性および化学成分の変化，日本畜産学会報，66，160～
166，1995.
 千国幸一：食肉の特性と利用，日本調理科学会誌，
６）40，33～36，2007.
７）
 Sasaki, K., Ooi, M., Nagura, N., Motoyama, M.,
Narita, T., Oe, M., Nakajima, I., Hagi, T., Ojima, K.,
Kobayashi, M., Nomura, M., Muroya, M., Hayashi,T., Akama, K., Fujikawa, A., Hokiyama, H.,
Kobayashi, K., Nishimura, T.：Classification andcharacterization of Japanese consumer's beef
preferences by external preference mapping, J.
Sci. Food Agric., 97, 3453～3462, 2017.

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82

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原
線維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究（Ⅲ）
Retort processing and cold lactic acid fermentation induce protein
degradation and functional peptides derivation in myofibrillar protein
system（Ⅲ）

林

利哉・長澤

麻央・小川

幸彦＊・芳賀聖一（名城大学農学部， 名城大学農学部附属農場）＊

Toshiya Hayashi, Mao Nagasawa, Yukihiko Ogawa＊ and Seiichi Haga
（Faculty of Agriculture, Meijo University, ＊Experimental Farm, Meijo University）

In this study, the expression of food functionality by chilled lactic acid fermentation were
investigated using myofibrillar protein fraction as a simple model system of cured meatproduct, i.e., the differentiation-promoting activity in an osteoblast-like cell culture, andinhibitory activity against angiotensin I-converting enzyme（ACE）and dipeptidyl peptidase（DPP）IV were evaluated. The pH values of myofibrillar protein fractions reached toapproximately 5.3 by cold lactic acid fermentation at 4℃. The peptide contents in the
myofibrillar protein fractions significantly increased during cold fermentation compared to thatof control（70℃-heated）. Therefore, we suggest that cold lactic acid fermentation leads todegradation of myofibrillar proteins as a result of cold fermentation at 4℃. The peptide
fractions of the fermented myofibrillar protein were found to have a higher ACE and DPP IV
inhibition activities than that of control, respectively. Furthermore, alkaline phosphatase andcollagen synthesis activities of osteoblast-like cell cultures were also significantly higher in thefermented fractions than the control fraction. These results suggest that chilled lactic acidfermentation may contribute to an improvement in functionalities of cured meat products, suchas fermented sausages, rather than compromising their functionalities．

１．目

することにより，その物性や微細構造が乳酸菌を的添加しない対照区と比較して大きく変化し，かつ

著者らはこれまで，ソーセージ等の食肉製品の筋原線維構造の脆弱化やそれを構成する筋原線維

高付加価値化を念頭に，低温性乳酸菌による低温タンパク質の分解等も生じることを明らにしてい発酵や，レトルト等の高温加熱処理といった食品る１）。また，120℃以上の高温加熱であるレトル加工技術が食肉製品の品質に及ぼす影響について

ト加熱によっても著しい物性低下が起こるととも

継続的かつ多面的に検討してきた１～３）。その結果，に，構成タンパク質の分解もみられ，その結果と低温乳酸発酵をソーセージ製造の塩漬工程に導入

して遊離アミノ酸や低分子ペプチドが派生するこ© The Ito Foundation

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究（Ⅲ）とも併せて見出している４，５）。このような低温乳
酸発酵や高温加熱に伴う筋原線維タンパク質の分83

２．実験材料と方法

解は，肉塊や肉粒子が良好に結着して得られる食2.1

肉製品の好ましい食感の発現を阻害するものと考できる限り脂肪と結合組織を取り除いた新鮮なえられるが，その一方で保健的機能性の発現・向豚ロース肉から，一部改変したPerry and Grey８），

上という観点においては，場合によっては機能性

Etlinger９）らの方法に準じて筋原線維を調製し，を有する低分子ペプチドが派生してくるという付

最終的に0.6M-NaCl溶液（pH6.0）に対して透析，加価値をもたらす可能性も示すものと考える。し遠心分離（35,000×ｇ，15分，４℃）して得られたがって，低温乳酸発酵やレトルト加熱に伴うタた上澄み画分を筋原線維タンパク質試料とした。

ンパク質分解挙動の詳細を明らかにし，かつ機能終濃度を15mg/mlに調整した筋原線維タンパク性発現の有無を評価することは，食肉・食肉製品

質溶液にグルコースが２％（w/v）となるようにの高付加価値化を図るうえできわめて意義深いこ

添加し，さらに乳酸菌スターターLactobacillusとといえる。これまでに，筋原線維タンパク質に，

sakei D-1001（L. D-1001），同No.１（L. No.１）

数種類の低温性乳酸菌Lactobacillus sakeiを用いおよび同No.３（L. No.３）を同溶液１mlあたりた低温乳酸発酵や，120～140℃のレトルト加熱処

10６個レベルとなるように接種し，４℃の低温下理を施すことによって，筋原線維タンパク質の分で静置したものを発酵区とした。発酵期間中，解が昂進し，そのタンパク質分解に伴って，血圧

pHを経時的に測定し，乳酸菌を接種した筋原線

上昇や血糖値上昇の関連酵素であるアンジオテン

維タンパク質溶液のpHが5.3付近に達するまで発シンⅠ変換酵素（ACE）やジペプチジル・ペプ

酵を続けた後，70℃で30分間の加熱処理を施しチダーゼ（DPP）Ⅳの阻害活性が高まる傾向にた。乳酸菌を接種せずに70℃で30分間の加熱処理あること等を報告してきた。またそれは，レのみを施したものを対照区とした。いずれの試料

トルト加熱よりも発酵区においてより顕著である

も，加熱後速やかに氷冷した。各加熱後試料を遠ことも同時に示した７）。

心分離（35,000×ｇ，15分，４℃）して得られた

６，７）

試料調製

そこで本研究では，これまでと同様に，食肉の上 澄 み を ，蒸 留 水 に 対 し て 透 析（Spectra/por

主要タンパク質である筋原線維タンパク質を単純CE M.W.500）した後，凍結乾燥したものを試料モデル系として用いて，既報

とした。

６，７）

とは異なる低温性乳酸菌株を用いた低温発酵を施した筋原線維タ

2.2

ペプチド量の測定

ンパク質における血圧上昇抑制作用のin vitro指上記凍結乾燥試料を蒸留水で溶解したものに対標であるACEや血糖値上昇抑制剤の標的酵素でして等量の４％トリクロロ酢酸（TCA）を加えもあるDPPⅣの阻害活性を評価し，さらに骨形成ることにより２％TCA可溶性画分を調製し，三に関与する骨芽細胞の分化（アルカリホスファ

上ら10）の方法に準じてペプチド量を測定した。

ターゼ活性とコラーゲン合成能）に及ぼす影響を2.3

評価することで，単純モデル系における低温乳酸

ACE 阻 害 活 性 は ，ACE（Sigma-Aldrich）と発酵による機能性発現の有無について検討を加え合成基質Hip-His-Leu（ペプチド研究所）を用い，た。

CushmanとCheungの方法11）に準じて測定した。

ACEならびにDPPⅣ阻害活性測定

すなわちACEと基質が反応した結果，遊離する© The Ito Foundation

84

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

馬尿酸を酢酸エチルで抽出し，その吸光度（波を測定するとともに13），細胞破砕上清のタンパク

長：228nm）を測定する方法である。DPPⅣ阻害

質 濃 度 を BCA Protein Assay Kit（PIERCE）用

活 性 は ， DPP Ⅳ （NKMAX） と 基 質 Gly-Pro-

いて測定し，以下の式を用いてALP活性値（nNA ・ p-tosylate（ペ プ チ ド 研 究 所）を 用 い ，

mol/min/μg protein）を算出した。

Ikeharaらの方法

12）を一部改変して測定した。すなわち，DPPⅣと基質が反応した結果，遊離するALP活性値（n mol/min/mg protein）

p-NA量を分光光度計（波長：385nm）で測定す＝ p-Nitrophenol（n mol/ml）× 30（min）／ 細 胞

る方法である。いずれの活性も，それぞれの酵素

タンパク質量（μg/ml）

活性を50％阻害するのに必要な試料タンパク質濃コラーゲンの定量は，試料添加後３日間培養し度（mg/ml），IC50として表した。
2 . 4 培養骨芽様細胞（MC3T3-E1）を用いた

た 後 の 培 養 上 清 中 の コ ラ ー ゲ ン 濃 度 を Sircol
Soluble Collagen Assay Kit（Biocolor）によって分化指標評価
マウス由来骨芽細胞様株MC3T3-E1（RIKEN

測定することで行った13）。なお，各試料中に含まCell Bank ： RCB1126） を 使 用 し ， ４ mMれるコラーゲン量を考慮するため，10％の各試料

L-Glutamineおよび10％FBS（MultiSer）を含むを含むα-MEMを本測定のブランクとして用い

Minimum Essential Medium Eagle’s （α-MEM）

た。

培地（SIGMA）にて継代・前培養等を行った。
培養はすべてCO２インキュベーター（37℃，５％３．結果と考察3 . 1 低温乳酸発酵を施した筋原線維タンパク

CO２）内で行った。
細胞濃度2.5×10 cells/mlに調整したMC3T3-E1
５

質画分のACEとDPPⅣ阻害活性を 3.5 φ デ ィ ッ シ ュ に 播 種 し ，増 殖 培 地（10 ％L. D-1001，L. No.１およびL. No.３を接種しFBSを含むα-MEM）で３日間培養した。そのて低温乳酸発酵を施した筋原線維タンパク質にお後，新鮮なα-MEM培地に交換し，タンパク質

ける降圧薬の代表的標的酵素の一つであるACE

濃 度 が １ mg/ml の 各 試 料 を 培 地 に 対 し て 10 ％阻害活性の発現の有無について検討したところ，（v/v）になるように添加して，３日間培養を行っ既報７）で示した低温性乳酸菌（L. No.７とNo.９）

たものを以下の実験に供した。

接種区と同様，対照区と比較して有意に低いIC50

試料添加後３日間培養した細胞の表面（3.5φ値，すなわち高い活性を示し，低温乳酸発酵にディッシュ）をPBSで３回洗浄後，0.25M Sucrose

よって，ACE阻害活性が上昇することが確認さ

水溶液0.5mlを添加し，セルスクレイパーにて細れた（Fig.１Ａ）。なかでもL. No.３接種区が最も胞を剥離・回収した。回収した細胞を超音波破砕

高い活性を示したが，接種菌株間の差は有意なも機（トミー精工，UD-201）で10秒間破砕した後，のではなかった。一方，高血糖治療の標的酵素の破砕液を遠心分離（2,000×g，3min）して得られ一つであるDPPⅣ阻害活性についても同様に検た上清を活性測定用試料とした。

討したところ，本指標もACE阻害活性と同様，

アルカリホスファターゼ（ALP）活性は，ラいずれの菌株接種区においても有意なIC50の低下

ボアッセイALP（和光純薬）を用いて，細胞破がみられ，特にL. No.３接種区においてそれが顕砕上清中のp-ニトロフェノール（n mol/ml）量

著かつ有意であった（Fig.１Ｂ）。データには示© The Ito Foundation

85

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究（Ⅲ）（A）

4.0 （B）

0.2

IC50（mg/ml）

IC50（mg/ml）

a
b

b

b

0.1

0

NonL.
L.
fermented D-1001 No. 1

a

3.0

b

2.0

b
c

1.0
0

L.
No. 3

NonL.
L.
fermented D-1001 No. 1

L.
No. 3

Fig. 1 Inhibitory effect of water-soluble protein fractions from non-fermented and fermented myofibrillar protein on

angiotensin I-converting enzyme（A）and dipeptidyl peptidase IV（B）activities．

Data represent the means±SD of at least five independent experiments．

0.03 （A）
0.02

a

a

b

b

b

0.01
0

L.
PBS NonL.
fermented D-1001 No. 1

L.
No. 3

Collagen content (mg / ml)

ALP activity(n mol / min /μg protein)Values with different superscript letters are significantly different（p＜0.05）.

0.04 （B）
b

0.03
0.02

c

c
b

a

0.01
0

PBS

L.
L.
Nonfermented D-1001 No. 1

L.
No. 3

Fig. 2 Effect of water-soluble protein fractions from non-fermented and fermented myofibrillar protein on ALP activity（A）and collagen synthesis（B）in osteoblast-like cell culture, MC3T3-E1 cells.
PBS was used as a vehicle control.
Data represent the means±SD of at least four independent experiments.
Values with different superscript letters are significantly different（p＜0.05）.

していないが，いずれの菌株接種区においてもペを指標に低温乳酸発酵を施した筋原線維タンパク

プチド量の有意な増加がみられたことから，これ

質の骨芽細胞分化に及ぼす影響について検討したらの活性本体がペプチドであると仮定した場合，結果をFig.２ＡとＢにそれぞれ示した。まず，対系中に含まれる活性の総量も増大しているものと照区である70℃加熱区と各種低温発酵区のALP推察される 。

活性値を比較すると，いずれの菌株接種区も有意

14）3 . 2 低温乳酸発酵を施した筋原線維タンパクに高い活性値を示したが，接種菌株間の差異はみ

質が骨芽様細胞（MC3T3-E1）の分化指標られなかった（Fig.２Ａ）。この時，PBS（溶媒対に及ぼす影響照）区と70℃加熱区との間には差はなく，低温発

骨芽細胞の分化の程度を評価する際に，骨形成酵が筋原線維タンパク質のALP活性発現に寄与

時の石灰化に寄与するとされるALP活性や，骨する可能性が示された。その活性値は，骨形成にの構成成分であるコラーゲンの生成量がその生化寄与するとされるβ-クリプトキサンチン（10－８学的指標としてしばしば用いられる13，15）。これら～10－６Ｍ）に相当程度であった16）。

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86

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

一方のコラーゲン量では，対照区である70℃加発現に及ぼす影響について調査した。機能性評価

熱区と各種発酵区を比較すると，L. D-1001とL.

には，血圧上昇および血糖値上昇抑制作用のinNo. ３ 接 種 区 は 有 意 に 高 い 値 を 示 し た が ，L.

vitro指標であるACE阻害活性，DPPⅣ阻害活性No.１接種区はこれら２菌種よりも低値を示し，を用いるとともに，骨形成のモデル細胞である培70℃加熱区とも有意な差がなかった（Fig.２Ｂ）。

養骨芽細胞におけるALP活性やコラーゲン合成

本指標においては70℃加熱区がPBS（溶媒対照）を指標として用いた。

区と比較して，有意に高い値を示したことから，

その結果，ACE，DPPⅣのいずれの阻害活性加熱のみを施した筋原線維タンパク質にも骨芽細においても，非発酵区である対照区（70℃加熱

胞のコラーゲン合成に寄与する成分が存在し，L.

区）と比較して有意に低いIC50値，すなわち高い

No.１接種区も同程度であったことが示された。

阻害活性を示し，低温乳酸発酵によって，これらデータには示していないが，ペプチド量についての酵素を阻害する機能が亢進する可能性が示唆さは L. No. １ 接 種 区 が ，70 ℃ 加 熱 区 な ら び に L.

れた。

D-1001，L. No.３接種区と比較して有意かつ最低温乳酸発酵を施した筋原線維タンパク質画分も高い値を示したものの，その傾向と，これらのを添加した培養骨芽細胞におけるALP活性は，機能性指標値との対応は必ずしもみられなかっ対照区である70℃加熱区と溶媒対照区であるPBSた。また，先に述べたACEとDPPⅣ阻害活性に

区と比較して，有意に高い値を示し，低温発酵がおいても，L. No.３接種区が最も高い値を示して筋原線維タンパク質のALP賦活性に寄与する，おり，タンパク質分解の程度とは必ずしも一致す

すなわち骨芽細胞における石灰化を促進させる可るものではなかった。

能性が示された。一方のコラーゲン量では，対照

現在，培養骨格筋細胞の成長に及ぼす影響につ区である70℃加熱区の値が溶媒対照区よりも有意いても試行的に検討を進めており，発酵もしくはに高い値を示したことから，筋原線維タンパク質

加熱処理を施した筋原線維タンパク質が骨格筋細画分そのものに骨芽細胞のコラーゲン合成を賦活

胞の分化促進に寄与する可能性も確認している。

する作用が存在する可能性が示唆されたが，低温それも含めて今後は，これまでにその存在を示し

発酵によってその活性がより強化される傾向も併てきた筋原線維タンパク質に由来する種々の活性せて示された。この時，低温乳酸発酵に伴うペプ因子の特定を急ぎたい。

チド量の増大が認められたが，その程度と，各種本研究の成果は，公益財団法人伊藤記念財団の活性値との間には明瞭な関係性はみられなかった。

支援によって得られたものであり，ここに深く感以上のことより，低温乳酸発酵処理によって筋謝申し上げます。また，名城大学農学部食品機能

原線維タンパク質は分解し，その結果生じた低分学研究室の学生・院生諸氏に深謝申し上げます。

子ペプチド群にこれらの機能性を有する因子が存

４．要在する可能性が示唆されたが，その分解の程度と約活性の強度は必ずしも一致するものではなかった。

食肉の主要タンパク質であり，食肉製品の良好な結着性発現に寄与する筋原線維タンパク質を単純モデル系として用いて，低温性乳酸菌を利用した低温発酵処理が，筋原線維タンパク質の機能性

文
献１） 芳賀聖一，林利哉，大場正春，坂田亮一：名城大
学 総 合 研 究 所 総 合 学 術 研 究 論 文 集 ，8, 91～96,
2009.

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低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究（Ⅲ）
 芳賀聖一：ミートジャーナル，36（1）,107～113,
２）
1999.
３）
 藤田利宗，林利哉，芳賀聖一：日本食品科学工学
会誌，53, 423～429, 2006.
 Hayashi, T., Toyoda, N., Arakawa, M., Haga, S.：
４）Int. Cong. Meat Sci. Technol., 56, E60, 2010.
５）
 Hayashi, T., Washio, S., Arakawa, M., Taguchi, M.,
Toyoda, N., Haga, S.：Int. Cong. Meat Sci. Technol.,
57, P395, 2011.
 林利哉，長澤麻央，芳賀聖一，小川幸彦：平成29
６）
年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，36,
135～139, 2018.
 林利哉，長澤麻央，小川幸彦，芳賀聖一：平成30
７）
年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，37,
84～88, 2019.
８）
 Perry, S. V., Grey, T. C.：Biochem. J., 64, 184～
192, 1956.

87

９）
 Etlinger, J. D., Zak, R., Fischman, D. A.：J. Cell
Biol., 6, 123～141, 1976.
10） 三上正幸，長尾真理，関川三男，三浦弘之：日本
畜産学会報，66, 630～638, 1994.
 Cushman, D. W., Cheung, H. S.：Biochem.
11）
Pharm., 20, 1637～1648, 1971.
12） Ikehara, Y., Ogata, S., Misumi, Y.：Methods In
Emzymology, 244, pp.215-227, Academic Press,
New York, 1993.
13）
 Choi, E. M.：Biochem. Pharmacol., 70, 363～368,
2005.
14）
 伊部さちえ，吉田恵子，熊田薫：日本食品科学工学会誌，53, 189～192, 2006.
 芹澤篤，鳥羽保宏：月刊フードケミカル, 23（3）,15）
24～29, 2007.
16）
 Uchiyama, S., Yamaguchi, M.：J. Cell. Biochem.,
95, 1224～1234, 2005.

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88

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究
Study on awareness of consumers about safety of food additives

堀江

正一・渡邉

萌・堀井

千絵

（大妻女子大学家政学部食物学科）

Masakazu Horie, Moe Watanabe and Chie Horii（Department of Food Science, Faculty of Home Economics, Otsuma Women’s University）

The current study surveyed students in a dietitian and registered dietitian training course
and their parents regarding their attitudes towards the safety of food additives. Results
revealed that students and their mothers differed widely in their perceptions of food additives,with mothers being highly concerned about food additives.
An online survey（1,700 individuals）revealed that younger age groups, and especiallyindividuals in their 20s, tended to have less concern about food additives while women in their
40s to 60s were highly concerned. Women in their 40s to 60s heard frequent media reports offood safety incidents in their early childhood, and women in those age groups often purchaseingredients and prepare meals. Presumably women in their 40s to 60s steadfastly perceive foodadditives as dangerous. Once one is convinced that “food additives are harmful and dangerous,”
dispelling that belief is well-nigh impossible, but repeatedly providing accurate informationthat is easy to understand could lead to a change in one’s perception of risk.

１．目

もの，危険なもの」と認識されている。そのこと的は，今まで実施された種々の意識調査や，マスメ

食品添加物は，「人の健康を損なう恐れのない

ディアによる報道等でもうかがい知ることができ場合」のみ厚生労働大臣により使用が認められて

る１～５）。なぜこれほどまでに科学的な評価と消費いる。その安全性は科学的な根拠に基づいたもの

者の認識の間に乖離が見られるのであろうか。しであり，ラットやマウスを用いた動物実験によかし，食品添加物のリスク認知について男女別，り，無毒と確かめられた量のさらに100分の１以

年齢階層別に詳細に調査した報告はほとんど見ら

下 と な る よ う に 使 用 さ れ て い る 。国 際 的 に もれない。そこで，科学的な安全性評価と消費者のFAOとWHOからなる食品規格（CODEX）委員

リスク認知の大きな乖離を埋めるため，まず男女会により科学的根拠に基づき，その使用が認めら

別，年齢階層別における食品添加物に対するリスれている。このように，食品添加物の安全性は，

ク認知状況を調査した。次に，科学的な安全性評

科学的な根拠に基づき十分確保されている。しか価と消費者のリスク認知の大きな乖離を埋める手し，多くの消費者にとって食品添加物は「有害な法として，正しい情報の有用性について検討し© The Ito Foundation食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究89た。本研究は，食品添加物の科学的な安全性評価

食品の安全性に不安を抱いており，その要因としと多くの消費者が抱いている認識の大きな乖離をて今なお食品添加物を上位にあげている ２，３）。

埋め，より健全で快適な食生活の営みに寄与する

Fig.１に示すとおり，女子大学生（２年生）とそことを目的とする。

の母親（主に40代から50代）間での食品添加物に2.1

対するリスク認知では，母親のほうが食品添加物法

２．方に対して，より強く不安感を抱いており，有意なアンケート調査

2.1.1

差が認められた（ｐ＜0.05）。なお，父親の食品調査方法

添加物に対する不安度は母親に比べると，かなり質問紙によるアンケート調査およびインター

低く，学生と同程度であった。

ネット調査

今まで報告されている食品の安全性や食品添加2.1.2物に対する不安度に関する内外の調査では，一般

調査対象①大妻女子大学食物学科２年生に在籍する学に女性のほうが不安感が高いことが報告されてい生，食安全学の授業開始前（配布数133部，有効る３，６～８）。今回の調査においても，女子学生に比回収数128部（有効回収率：96.2％）），および食べ50代前後の母親のほうが食品添加物に対して不安全学の授業終了時（配布数130部，有効回収数

安感が高かった。家庭においては，食品の購入か

122部（有効回収率：93.8％）），にアンケート調

ら調理まで主婦が主に担っている。すなわち，食査を実施した（Table１）。

品の安全を守ることが主婦の役割となっており，②大妻女子大学食物学科２年生に在籍する学生

このことが，食品の安全性や食品添加物に対するの両親（配布数133部，有効回収数91部（有効回

不安感を募らせる主要因の一つになっていると推

収率：68.4％），父親33名，母親58名），にアンケー

察される。

ト調査を実施した（Table２）。

次に，「食安全学の講義を受けて食品添加物に③インターネット調査（GMOリサーチ株式会

対する考え方が変わりましたか？」との問いに多社に委託；20代，30代，40代，50代，60代，70代

くの学生が「より安全と考えるようになった」と

以上，男女各141～142名，合計1,700名，（有効回

回答している。Fig.２に食品添加物の安全性につ

答数1,471名；有効率86.5％））（Table３）

いて，食品安全学の授業前後での調査結果を示し

2.1.3

調査期間

た。授業を通して，食品添加物に対する正しい情①2019年４月および７月，②2019年４月，③2020年２月
2.1.4

有意に減少している（ｐ＜0.01）。

統計解析

食品添加物に対して，偏った，間違った虚偽情調査データの統計解析は，IBM SPSS Statistics
ver.26を用いた。

報に振り回されないためには，正しい知識を学び，自ら考えることが基本である。学生にとって正しい知識を学ぶ機会は，学校教育の中にあり，

３．結果および考察
3.1

報を知ることにより，不安感を抱く学生の割合が科学リテラシーを向上させる教育の推進が重要で質問紙によるアンケート調査ある。一度，脳裏に刷り込まれた「食品添加物を過去に実施されたアンケート調査でも，今回実有害なもの，危険なものとする」考えはなかなか施したアンケート調査においても消費者の多くが

拭い去ることができないが，正しい情報を分かり© The Ito Foundation

90

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 1
食の安全性に関するアンケート調査のお願い1.

食品の安全性についてどう思いますか？
（1）不安である

2.

（2）やや不安である（3）余り不安でない（4）不安でない

食の安全性で具体的に何が不安ですか？（上位３個まで選んでください）（1）食中毒，（2）遺伝子組換え食品，（3）BSE，（4）家畜への薬剤投与，（5）残留農薬，（6）食品添加物，（7）アレルギー，（8）消費期限，賞味期限，（9）外食の安全性，（10）家庭食の安全性，（11）食品汚染物質（ｶﾄﾞﾐｳﾑ，ﾒﾁﾙ水銀等），（12）表示違反，（13）放射性物質，（14）輸入食品，（15）いわゆる健康食品，（16）その他（

3.

食品添加物の安全性についてどう思いますか？
（1）不安である

4.

）（2）やや不安である（3）余り不安でない （4）不安でない

食品添加物は体に悪いと思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない5.

問4で「思う」「ある程度思う」と答えた方にお聞きします．何が体に悪いと思いますか？
（1）発ガン性，（2）アレルギー，（3）奇形，（4）脳への影響，（5）なんとなく

6.

現在，食品添加物には発ガン性があるものが使われていると思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない

7.

食品を購入する時に食品添加物の表示を見ますか？
（1）必ず見る，（2）よく見る，（3）時々見る，（4）余り見ない，（5）ほとんど見ない

8.

食品添加物が使われている食品について（1）買わない，（2）なるべく買わない，（3）時々買う，（4）余り気にしない

9.

食品添加物「無添加」と表示されている食品は，安全性が高いと思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない

10.

食の安全性に関する情報で，何処の情報を信用していますか？（複数回答可）（1）テレビ，（2）新聞，（3）雑誌，（4）教科書，（5）授業，（6）友人，（7）家族，（8）インターネット，（9）厚生労働省，保健所等，（10）その他（

11.

）

食品を購入する際，重視することはなんですか？（複数回答可）（1）価格，
（2）鮮度，（3）安全性，（4）無添加，（5）無農薬，（6）産地，（7）見た目，（8）おいしさ，（9）栄養，（10）旬，（11）生産者，メーカー，（12）その他（）

12．化学物質に対して有害・危険と思っていますか？
（1）思っている，（2）ある程度思っている，（3）余り思っていない，（4）思っていない

ご協力ありがとうございました。

© The Ito Foundation

91

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究
Table 2
食の安全性に関するアンケート調査のお願い

あなたの年齢，性別を教えてください。
年齢：30歳代，40歳代，50歳代，60歳代，70歳代以上
性別：男性 ・ 女性
1.

食品の安全性についてどう思いますか？
（1）不安である

2.

（2）やや不安である（3）余り不安でない （4）不安でない

食の安全性で具体的に何が不安ですか？（上位３個まで選んでください）（1）食中毒，（2）遺伝子組換え食品，（3）BSE，（4）家畜への薬剤投与，（5）残留農薬，（6）食品添加物，（7）アレルギー，（8）消費期限，賞味期限，（9）外食の安全性，（10）家庭食の安全性，（11）食品汚染物質（カドミウム，メチル水銀等），（12）表示違反，（13）放射性物質，（14）輸入食品，（15）いわゆる健康食品，（16）その他（

3.

食品添加物の安全性についてどう思いますか？
（1）不安である

4.

）（2）やや不安である（3）余り不安でない（4）不安でない

食品添加物は体に悪いと思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない5.

問4で「思う」「ある程度思う」と答えた方にお聞きします．何が体に悪いと思いますか？
（1）発ガン性，（2）アレルギー，（3）奇形，（4）脳への影響，（5）なんとなく

6.

現在，食品添加物には発ガン性があるものが使われていると思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない

7.

食品を購入する時に食品添加物の表示を見ますか？
（1）必ず見る，（2）よく見る，（3）時々見る，（4）余り見ない，（5）ほとんど見ない

8.

食品添加物が使われている食品について（1）買わない，（2）なるべく買わない，（3）時々買う，（4）余り気にしない

9.

食品添加物「無添加」と表示されている食品は，安全性が高いと思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない

10.

食の安全性に関する情報で，何処の情報を信用していますか？（複数回答可）（1）テレビ，（2）新聞，（3）雑誌，（4）教科書，（5）授業，（6）友人，（7）家族，（8）インターネット，（9）厚生労働省，保健所等，（10）その他（

11.

）

食品を購入する際，重視することはなんですか？（複数回答可）（1）価格，
（2）鮮度，（3）安全性，（4）無添加，（5）無農薬，（6）産地，（7）見た目，（8）おいしさ，（9）栄養，（10）旬，（11）生産者，メーカー，（12）その他（）

12．化学物質に対して有害・危険と思っていますか？
（1）思っている，（2）ある程度思っている，（3）余り思っていない，（4）思っていない

ご協力ありがとうございました。

© The Ito Foundation

92

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 3
食の安全性に関するアンケート調査のお願い
性別

1. 男性

年齢

1. 20代同居家族の有無

2. 女性
2. 30代

3. 40代1. 同居家族あり

4. 50代家族構成（複数回答可） 1. 乳幼児がいる
職業

5. 60代6. 70以上

2. 同居家族なし（単身）2. 小学生がいる

3. 中高生がいる

4. その他

1. 自営業，2. 会社員，3. 公務員，4. 派遣・パート，アルバイト，5. 学生，6. 専業主婦，7. 無職

職種（専攻） 1. 事務系（文科系），2. 技術系（理科系）
居住地
1.

1. 町村

2. 市

食品の安全性についてどう思いますか？
（1）不安である

2.

3. 大都市（2）やや不安である（3）余り不安でない（4）不安でない

食品の安全性で具体的に何が不安ですか？（上位３個まで選んでください）（1）食中毒，（2）遺伝子組換え食品，（3）BSE，（4）家畜への薬剤投与，（5）残留農薬，（6）食品添加物，（7）食物アレルギー，（8）消費期限，賞味期限，（9）外食の安全性，（10）家庭食の安全性，（11）食品汚染物質（ダイオキシン，カドミウム等），（12）食品偽装表示，（13）放射性物質，（14）輸入食品，（15）いわゆる健康食品，（16）その他（

3.

食品添加物の安全性についてどう思いますか？
（1）不安である

4.

）（2）やや不安である（3）余り不安でない （4）不安でない

食品添加物は体に悪いと思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない

5. 問4で「思う」「ある程度思う」と答えた方にお聞きします．いつ頃から不安に思うようになりましたか？
（1）小中学生，（2）高校生，（3）大学生，（4）社会人，（5）よく分からない
6.

問4で「思う」「ある程度思う」と答えた方にお聞きします．何が体に悪いと思いますか？
（1）発ガン性，（2）アレルギー，（3）胎児への影響，（4）脳への影響，（5）なんとなく

7.

食品を購入する際に，食品添加物が使用されているか気に掛けますか？
（1）常に気に掛ける，（2）時々気に掛ける，（3）余り気に掛けない，（4）ほとんど気に掛けない

8.

食品添加物が使われている食品を購入しますか？
（1）買わない，（2）なるべく買わない，（3）時々買う，（4）余り気にしない

9.

食の安全性に関する情報は，主に何処から得ていますか？（複数回答可）（1）テレビ，（2）新聞，（3）雑誌，（4）教科書，（5）授業，（6）友人，（7）家族，（8）インターネット，（9）厚生労働省，保健所等，（10）食品安全委員会，（11）その他（

10.

）

食品を購入する際，重視することはなんですか？（複数回答可）（1）価格，
（2）鮮度，（3）安全性，（4）無添加，（5）無農薬，（6）産地，（7）見た目，（8）おいしさ，（9）栄養，（10）旬，（11）生産者，メーカー，（12）天然・自然，（13）その他（

11．化学物質と聞くと有害・危険と思ってしまいますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない© The Ito Foundation）食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究
12.

天然と聞くと“安全・安心”，合成と聞くと“危険・不安”と思いますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない

13.

食品添加物「無添加」，「不使用」と表示されている食品は，安全性が高いと思いますか？
（1）思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない

14. 食品は，栄養成分（タンパク質，炭水化物など）を含め，さまざまな化学物質が集まったものです．食品
添加物も化学物質の一種ですが，このことについてどの様に思いますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない15. 毒性の強い化学物質でも，その摂取量が極微量であれば健康に影響を及ぼさないとされています．
このことについてどの様に思いますか？
（1）そう思う，（2）ある程度思う，（3）余り思わない，（4）思わない，（5）よく分からない
16. 食品添加物は，法律により「人の健康を損なう恐れのない場合」のみ，国により使用が認められています．
このことについて信用できますか？
（1）信用できる，（2）ある程度信用できる，（3）やや信用できない，（4）信用できない
17.

生野菜を食品添加物，次亜塩素酸ナトリウムにより処理（最終食品に残らない）することにより，食中毒の発生を少なくすることができます．次亜塩素酸ナトリウムの使用は不安ですか？
（1）不安である（2）やや不安である（3）余り不安でない （4）不安でない18. 豆腐を作る時に「にがり」が用いられます．「にがり」も食品添加物の一種ですが，にがりの使用は不安ですか？
（1）不安である
19.

（2）やや不安である（3）余り不安でない （4）不安でない

癌の主な原因は，タバコ，普通の食べ物や高齢化が大きく影響しており，食品添加物の影響は無視できるレベルとされています．このことについて信用できますか？
（1）信用できる，（2）ある程度信用できる，（3）余り信用できない，（4）信用できない

20．かつて（40～50年前）危険な添加物も使われていましたが，現在使用されている添加物は国により安全性が確保されており，食生活の中で食品添加物を不安視することはありません．どう思いますか？
（3）やや信用できない，（4）信用できない（1）信用できる，（2）ある程度信用できる，
21. 食品添加物は，使うことにより，消費者にとって利点（保存性や香りを高める）がないと認められません．
ご存知でしたか？
（1）知っていた，（2）ある程度知っていた，（3）余り知らなかった，（4）知らなかった22.

普段，食事をとる時に食品に含まれる「食品添加物」のことを考えますか？
（1）よく考える，（2）ある程度考える，（3）余り考えない，（4）ほとんど考えない

23.

改めてお聞きします．食品添加物の安全性についてどう思いますか？
（1）不安である

24.

（2）やや不安である（3）余り不安でない （4）不安でない

食品添加物に対する不安度はどの程度ですか？
（1）非常に強い，（2）やや強い，（3）余り強くない，（4）強くない（普段気にしない）



ご協力ありがとうございました。

© The Ito Foundation

93

94

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

percentage of respondents

60

Mother50

Student

40
30
20
10
0

Concerned

Little concerned

Not veryconcerned

Unconcerned

Fig. 1 Attitude of female college students and their mothers about thesafety of food additives

percentage of respondents

80

Before

70

After

60
50
40
30
20
10
0

Concerned

Littleconcerned

Not veryconcerned

Unconcerned

Fig. 2 Attitude survey before and after class on safety of food additives

やすく，かつ繰り返し提供することにより，リス

そこで，男女別，年齢階層別（20代，30代，40代，

ク認知の変容が可能であり，このことが重要と考50代，60代および70代以上）に分けて，食品の安える。

全性や食品添加物に対する認識を調査した。な

3.2

インターネット調査

お，回答時間が著しく短い回答者221名（回答時

食品添加物のリスクは，十分小さく安全と評価

間２分以下の回答者；平均回答時間4.75分，なお，されている。しかし，消費者の多くは，食品添加同一質問を当大学の学生10名に回答させた時の平物は危険なもの，発癌性があるものと不安感を抱

均回答時間は4.5分であった）は本調査から除外いている 。食品添加物の安全性に不安感を抱いした（インターネット回答者合計1,700名，有効ている傾向は，男性より女性が強く，特に40代か回答1,471名；有効率86.5％）。

６）

ら60代の女性に強いことが食品安全委員会や英

3.2.1

国・食品基準庁の調査により報告されている食品の安全性について，不安の程度を尋ねたと

。

１，３）

© The Ito Foundation

食品の安全性に対する意識について

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究

95

ころ，男性に比べ，女性のほうが優位に高く，年らず消費者の食品添加物に対する不安感，不信感

齢階層別に見ると20代が最も低く，年齢が40～60

は根強いものがある２，６，７）。

代と高くなるに従い不安度も高くなり，70代以上

3 . 2 . 3 食品添加物に対する不安感を低減化すになるといくぶん低くなる傾向を示した。食品添る方法

加物に対する不安度もほぼ同様な傾向を示した。

食品添加物に対する科学的な安全性評価と消費食品の安全性で具体的に何が不安ですかという者のリスク認知の間にある大きな溝（乖離）を埋質問（３つまで選択可）に対する調査結果の概要

める手段として，効果的リスクコミュニケーショ

をTable４に示した。全体では，食中毒（34.2％），

ンを通して，消費者の科学リテラシーを高めてい

食品添加物（29.1％），残留農薬（21.4％），遺伝

くことが必要である９，10）。また，科学リテラシー

子組換え食品（19.2％）の順であった。男女とも，を向上させる手段として正しい情報を分かりやす

不安要因として食品添加物が第２位であったが，く，繰り返して提供することが効果的と考える。

男性（24.0％）に対して，女性は34.1％と10ポイ

今回，「化学物質と聞くと有害・危険と思ってしント高い値であった。また，50代以上の女性ではまいますか？」，「天然と聞くと“安全・安心”，

食品に対する不安要因として，食品添加物が第１合成と聞くと“危険・不安”と思いますか？」，位（50 代 ＝ 36.9 ％，60 代 ＝ 41.8 ％，70 代 以 上 ＝「食品添加物「無添加」，「不使用」と表示されて37.6％）であった。

いる食品は，安全性が高いと思いますか？」，「食3 . 2 . 2 食品添加物の安全性に関する意識について品は，栄養成分（タンパク質，炭水化物など）を含め，さまざまな化学物質が集まったものです。

食品の安全性で具体的に「食品添加物に対する

食品添加物も化学物質の一種ですが，このことに安全性についてどう思いますか？」と尋ねてみついてどのように思いますか？」，「毒性の強い化た。全体では，非常に不安である15.2％，やや不学物質でも，その摂取量が極微量であれば健康に安である49.5％，あまり不安でない20.6％，不安影響を及ぼさないとされています。このことにつでない7.6％であった。インターネット調査者のいてどのように思いますか？」，「生野菜を食品添

約2/3が食品添加物に対して不安感を抱いている

加物，次亜塩素酸ナトリウムにより処理（最終食ことが分かった。Fig.３に示すように，50代，60

品に残らない）することにより，食中毒の発生を代の女性では，約80％が不安感を抱いていた。

少なくすることができます。次亜塩素酸ナトリウ

過去に実施されたアンケート調査でも，最近実ムの使用は不安ですか？」，「豆腐を作る時に「に施されたアンケート調査においても，消費者の多がり」が用いられます。「にがり」も食品添加物

くが食品添加物の安全性に不安を抱いている。食の一種ですが，にがりの使用は不安ですか？」，

品の安全性に関する各種アンケート調査では，牛「癌の主な原因は，タバコ，普通の食べ物や高齢

海綿状脳症（BSE）や福島原発事故による放射性化が大きく影響しており，食品添加物の影響は無物質汚染問題のように，食品の安全性に関する事

視できるレベルとされています。このことについ件・事故により報道される記事数は大きく異なて信用できますか？」，「かつて（40～50年前）危り，消費者が抱く具体的な不安項目も事件や事故

険な添加物も使われていましたが，現在使用されの影響を強く受ける。しかし，最近食品添加物にている添加物は国により安全性が確保されておよる問題はほとんど起こっていないのにもかかわり，食生活の中で食品添加物を不安視することは© The Ito Foundation

17.9

11.4
11.2

6.0
3.6

21.4

19.2

17.9

16.6

16.2

13.5

11.6

11.5

9.6

8.9

6.6

4.0

1.7

1.7

0.3

The use of pesticides

Genetically modified（GM）foods

Not particularly

Imported foods

Food impersonation label

Hormones, antibiotics in foodRadioactivity in foodChemicals from the enviroment

Datelabels（best before, use by）

Food hygiene when eating out© The Ito Foundation

Food allergen

BSE

Food hygiene at home

So-called health food

Others

0.0

1.4

2.8

4.3

7.1

5.7

15.6

5.7

11.3

5.7

10.6

6.4

29.8

19.9

8.5

16.3

44.0

M-20s

0.0

2.1

2.1

5.0

6.4

7.1

15.6

8.5

13.5

5.7

16.3

15.6

22.7

11.3

8.5

21.3

42.6

M-30s

0.0

0.7

0.7

2.1

9.9

9.9

7.8

9.9

14.2

10.6

10.6

14.9

29.1

12.8

11.3

15.6

36.2

M-40s

Men

Which of these food issues are you concerned about, if any? Please select 3 that apply.

0.2

1.5

1.6

7.8

9.3

10.9

15.4

14.7

23.5

19.2

24.0

29.1

The use of food additives

33.6

M-Total

34.2

Total

Food poisoning

Food issue

Table 4 Food safety issues of concern

1.4

1.4

0.0

4.3

7.1

5.7

5.7

10.6

9.2

10.6

14.2

16.3

23.4

20.6

20.6

29.1

27.7

M-50s

0.0

2.1

2.1

2.8

3.5

7.1

5.7

14.2

10.6

18.4

17.7

13.5

22.7

27.0

23.4

26.2

28.4

M-60s

0.0

1.4

2.1

3.5

2.1

11.3

5.6

16.9

8.5

17.6

23.2

21.8

14.1

23.9

35.2

35.9

24.0

M-70+

0.4

1.9

1.8

4.4

7.3

10.0

9.9

12.1

12.1

15.5

16.9

18.5

12.4

19.3

24.8

34.1

34.7

F-Total

0.0

2.8

2.8

0.7

14.9

8.5

12.1

8.5

4.3

9.2

7.8

9.9

22.0

9.9

8.5

26.2

51.1

F-20s

0.0

1.4

4.3

2.1

12.1

12.8

10.6

6.4

10.6

5.7

9.9

15.6

17.7

12.1

19.9

32.6

42.6

F-30s

1.4

2.8

1.4

2.8

9.9

9.9

11.3

11.3

15.6

11.3

15.6

14.9

12.1

23.4

24.1

30.5

34.8

F-40s

Female

0.0

1.4

0.7

3.5

4.3

8.5

12.8

14.2

14.9

15.6

21.3

26.2

7.8

21.3

27.0

36.9

34.0

F-50s

0.0

2.1

0.7

7.1

2.1

9.9

7.1

19.1

13.5

24.8

17.7

19.9

5.0

28.4

37.6

41.8

23.4

F-60s

0.7

0.7

0.7

9.9

0.7

10.6

5.7

13.5

14.2

27.0

29.8

24.8

9.9

21.3

32.6

37.6

23.4

F-70+

96
平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

97

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研究
70s+
60s
50s
40s
30s
20s
0

20
Concerned

40
Little concerned60

80

Not very concerned

100
Unconcerned

Fig. 3 Differences in women’s awareness of the safety of food additives by age

age groups：20s＝20～29years, 30s＝30～39years, 40s＝40～49years，50s＝50～59years,

60s＝60～69years, 70s＋＝70over years，Female 1

Female 2

Men 1

Men 2
0%
Concerned

20%

40%

Little concerned60%
Not very concerned

80%

100%

Unconcerned

Fig. 4 Effect of correct information on the safety of food additives

Female 1＝female, before the lecture, Female 2＝female, after the lectureMen 1＝men, before the lectute, Men 2＝men, after lectureありません。どう思いますか？」，「食品添加物は，

ネット調査の最初に「食品添加物の安全性につい使うことにより，消費者にとって利点（保存性やてどう思いますか？」と質問した時に対して，男香りを高める）がないと認められません。ご存知

女とも，「不安である，やや不安である」と答えでしたか？」等の問いに答えてもらった後に，最た割合が５～10ポイント低くなっている。特に，後に「改めてお聞きします。食品添加物の安全性

40代以上の女性では，優位な減少を示した（ｐ＜についてどう思いますか？」と質問を投げかけて0.05）。食品添加物に対して不安感を抱く消費者，みた。その結果の概要をFig.４に示す。インター

特に40代以上の女性にとって，正しい情報を知© The Ito Foundation

98

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

り，自ら考えることにより，食品添加物に対する正しい情報を分かりやすく，かつ繰り返し提供す不安感を低減化されたと推察された。食品添加物

ることにより，リスク認知の変容が可能であるとに対するリスク認知を低減する手段として，正し考える。

い情報を分かりやすく，かつ繰り返し提供することが，効果的であると考える。
４．要約

消費者がどのような経緯で食品添加物に対する認識を醸成してきたか，あるいは醸成していくのかを明らかにし，科学的な安全性と消費者の認識の大きな乖離を埋めていくことは重要である。本
研究では，栄養士・管理栄養士養成課程に籍を置く学生およびその両親を対象に，食品添加物の安全性に対する意識調査を実施した。その結果，学生と母親の食品添加物に対する認識には大きな相違が見られ，母親の不安度が高いことが認められた。
インターネット調査（1,700名）においても，
食品添加物に対する不安感は，40代から60代の女性が高く，20代の若い世代になるほど，低くなる傾向が見られた。食品の安全性に対する事件・事故が頻繁に報道された幼少期を過ごし，かつ食材の購入から調理に携わる機会の多い40代から60代の女性は，食品添加物は危険なものと強く認識していることが推察される。一度，脳裏に刷り込まれた「食品添加物を有害なもの，危険なものとす文献１）
 国政モニター課題報告「食の安全性に関する意識
調 査」：内 閣 府 食 品 安 全 委 員 会 ，https://www.fsc.
go.jp/monitor/1512kokumoni-houkoku.pdf
２）
 東京都平成25年度インターネット都政モニターア
ン ケ ー ト：食 品 の 安 全 性 に つ い て ，http://www.
metro.tokyo.jp/INET/CHOUSA/2013/10/60nat100.
htm３） Public Attitudes tracker Wave 19, FoodStandards Agency, https://www.food.gov.uk /sites/default/files/media/document/public-attitudestracker-wave-19-final-report.pdf
 P. Williams, E., Stirling, N., Keynes, Foodfears：
４）
Asia pacific J Clin Nutr. 13, 32～39, 2004.
５）
 Kaptan, B., Kayısoglu, S.：American Journal of
Food Science and Nutrition Research, 2, 21～25,2015.
 食品に係るリスク認識アンケート調査の結果につ６）
いて：内閣府食品安全委員会，平成27年５月13日，
https://www.fsc.go.jp/osirase/risk_questionnaire.
html７） 東京都消費者月間実行委員会：食の安全に関する
消費者意識と消費行動調査
h ttp://kurashifesta-tokyo.org/2013/special/pdf/
chosahokoku.pdf
 Flynn, J., Slovic, P., Mertz, C. K.：Risk Analysis,
８）
14, 1101～1108, 1994.
９）
 Zhong, Y., Wu, L., Chen, X., Huang, Z., Hu, W.：
Int J Environ Res Public Health, 15, 2394, 2018.
https://doi.org/10.3390/ijerph15112394
 Kornelis, M., Jonge, J .D., Frewer, L., Dagevos, H.,
10）
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/
j.1539-6924.2007.00885.x

る」考えはなかなか拭い去ることができないが，© The Ito Foundation

99

食材の低温貯蔵履歴が大腸菌O157：H7の凍結損傷
回復ならびに低温加熱耐性に及ぼす影響
Effects of storage history of food materials at low temperature on
recovery from freezing injury and thermotolerance of Escherichia coli
O157：H７

本

城

賢

一・宮

本

敬

久

（九州大学大学院農学研究院）

Ken-ichi Honjoh and Takahisa Miyamoto（Faculty of Agriculture, Graduate School, Kyushu University）

Enterohaemorrhagic Escherichia coli（STEC）including different serotypes strains such as
O157：H7 were stored by three different low-temperature storage methods, “refrigerated”,“frozen”, and “refrigerated after freezing” and then their heat resistances were investigated.
Damages of some strains by heat treatment after storage at low temperature were increased,
while damages of the other strains whose damage was suppressed. In particular, EC57, EC69,
and EC110 strains, which were stored at low temperatures, suppressed the damages caused by
the following heat treatment, thereby improving the heat resistance. Furthermore, EC110
strain was inoculated into beef and subjected to three low-temperature storage methods andfollowing heat treatment experiments. As similar to the above results, low-temperature storage
seemed to suppress damages caused by heat treatment. As described above, it was suggested
that the heat resistance of EC57, EC69, and EC110 strains could be increased by lowtemperature storage. In the future, we will investigate heat resistances of STEC at different
temperatures, identify low-temperature-induced genes relevant to heat resistance and findways to suppress functions of the genes, leading to safer processed meat products.

１．目

考えられるが，消費者のニーズもあってより低温

的での調理が好まれ，ほとんど生に近い状態で提供

近年，食品衛生に関する知識が広く普及してはされ食中毒につながっているケースもある。まいるが，食肉を原因食品とした大腸菌O157：H7

た，食材に目を向けるとコールドチェーンは発達による食中毒は後を絶たない。これは不十分な加しているが，貯蔵履歴によっては汚染している菌

熱処理によるものであると推察されるが，食の現の耐性や生育挙動も変化していると予想され，食状としては美味しさを追求するローストビーフに品業界のみならず一般家庭における貯蔵法につい代表されるような低温調理が好まれる傾向にあても低温調理食品を視野に入れて検討する必要がる。このような低温調理食品は食品衛生法に則りある。

適切な加熱が行われれば，安全性の問題はないと

微生物の凍結損傷や加熱損傷機構に関する研究© The Ito Foundation

100

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

はそれぞれにフォーカスを当てた研究は多数報告されているが，この二つを合わせた研究は少ない。実際，一般家庭における調理過程においてはことを目的としている。
２．方法

貯蔵履歴が異なる原料が用いられることから，想2.1定される貯蔵履歴を再現した研究が必要である。

本研究に使用した11菌株をTable１に示した。

大腸菌O157：H7についても基本的に凍結損傷を

志 賀 毒 素 産 生 性 大 腸 菌 （STEC） と し て ，受けた菌を加熱処理することで耐熱性が弱められ

Escherichia coli O157：H7；７株，E. coli O26：

ることは十分予想されるが，菌株によって異なる

Ｈ 11；１ 株 ，E. coli O111：H-；１ 株 ，E. coli

可能性も示唆されている 。また，大腸菌O157：

O103：H2；１株，E. coli O119：H-；１株を用H7に着目した凍結貯蔵後の耐熱性についての研いた。

究報告はあるが２，３），他の血清型のSTECや複数2.2の菌株についての研究報告はない。さらに，一般

供 試 菌 株 を ５ ml の Tryptic soy broth（TSB）

家庭においてよく行われている解凍後の冷蔵貯蔵で 37 ℃，一 夜 培 養 し た 前 培 養 液 か ら 遠 心 分 離時に，解凍肉から生じたドリップ中の栄養分が菌（2,000×g，10分間）により集菌後，0.85％NaClの損傷回復を促進し，回復した菌では耐熱性が高で２回洗浄し，OD600＝0.1（10４cfu/ml）となるよ

まる可能性も十分に考えられる。

うに0.85％NaClに懸濁し，次の実験に用いた。

１）

食肉を原因とする食中毒事例が多々報告されて

2.3

供試菌株

培養方法

低温貯蔵ならびに加熱処理法

いる大腸菌O157：H7ならびにその他の志賀毒素

菌懸濁液を２mlずつ15 ml容プラスチック製試

産生性大腸菌（STEC）の耐熱性に及ぼす低温貯験管に分注し，３つの低温貯蔵処理を行った。①

蔵履歴の影響について研究報告が少ないことか

４℃で24時間冷蔵，②－20℃で24時間凍結，③

ら ，本 研 究 で は 低 温 貯 蔵 さ れ た 異 な る 菌 株 の－20℃で24時間凍結し，25℃で５分間融解後，２STECが，その後の加熱調理時において示す耐熱倍濃度のTSB培地を等量添加して４℃で７日間性に違いがあるのか，また異なる低温貯蔵の違い

冷蔵を行った。①～③のいずれかの方法で低温貯がSTECの耐熱性に影響するのかを明らかにする

蔵されたサンプルを，25℃で５分間インキュベー

Table 1 STEC strain list used for this study
Strain No.

SourceSerotype

EC14

Clinical

O26：H11

Stx1

EC38

Clinical

O111：H-

Stx1

EC47

ClinicalO103：H2

Stx1

EC49

Clinical

O119：H-

Stx1

EC55

Clinical

O157：H7

Stx1, Stx2

EC57

Clinical

O157：H7

Stx1, Stx2

EC69

Clinical

O157：H7

Stx1, Stx2

EC75

Clinical

O157：H7

Stx1, Stx2

EC80

Clinical

O157：H7

Stx1, Stx2

EC83

Clinical

O157：H7

Stx1, Stx2

EC110

Clinical

O157：H7

Stx1, Stx2

© The Ito Foundation

Stx productivity

食材の低温貯蔵履歴が大腸菌O157：H7の凍結損傷回復ならびに低温加熱耐性に及ぼす影響

101

トして常温に戻したものを未加熱サンプルとしのAmp添加TSA平板培地に，健常菌数測定のたた。また，常温に戻した後，57.5℃で10分間加熱

め に CHROMagar O157（BD 社）平 板 培 地 に ，処理後，25℃で５分間インキュベートしたものを100μｌ塗抹した。その後，37℃で48時間培養し，加熱サンプルとした。なお，①～③の冷蔵貯蔵せ

コロニー数を測定することで全生残菌数ならびにずに加熱処理したサンプルをコントロールとした。

健常菌数を算出した。

2.4

生菌数の測定ならびに減少菌数の算出

前項で得られた未加熱サンプルならびに加熱サ
ンプル（菌懸濁液）を段階希釈し，全生菌（健常菌 ＋ 損 傷 菌）数 測 定 の た め に Tryptic soy agar

３．結果と考察3 . 1 試験管レベルでのSTECの低温貯蔵法の違いによる耐熱性への影響（TSA）平板培地に100μｌ塗布後，37℃で48時間

本 研 究 室 が 保 有 す る STEC11 菌 株 （STEC

培養後のコロニー数から生菌数を算出した。な

O157：H7，O26：H11，O111：H-，O103：H2，

お，未加熱サンプルの生菌数（Ｎ０），加熱サンプO119：H-）の中から，低温貯蔵（冷蔵，冷凍，ルの生菌数（Ｎ１）としてlog N１/N０ を算出し加冷凍後の冷蔵）によって誘導される耐熱性に変化

熱による損傷の程度を表した。

がある菌株を選抜するために，試験管レベルでの2.5実験を行った。低温貯蔵されたSTECについて

Amp耐性STECの取得

本実験で低温貯蔵後の耐熱性が高い結果が得ら

57.5 ℃ で の 加 熱 処 理 前 後 の 全 生 菌 数 を 調 べ た

れたO157：H7（EC57，69，110）株を用い，畜（Fig.１）。コントロールサンプルとしては，低温

肉中の自然汚染菌と識別するために，緑色蛍光タ貯蔵を行っていない培養直後の菌を同様の処理にンパク質（GFP）遺伝子ならびにアンピシリン

供した。

（Amp）耐 性 遺 伝 子 を 有 す る pGFP ベ ク タ ー

まず，①の４℃24時間冷蔵処理中にすべての菌（Clontech社）で形質転換を試みた。形質転換さ株で生菌数が増えることはなかった。しかし，加れたAmp耐性STECは牛肉の汚染に用いられた。

熱処理後のO119：H-株（EC49），O157：H7の４

2 . 6 STECの牛肉への接種ならびに肉の低温株（EC69，EC80，EC83，EC110）は，コントロー
ルよりも高い生菌数を示し，冷蔵中に加熱処理に貯蔵
福岡市内のスーパーで購入したオーストラリア

対する耐性が高まることが認められた。この理由

産牛肉を20ｇとなるように成型した。成型した牛としては，STECに関する論文は見当たらないが，肉サンプルを入れたポリ塩化ビニル袋の中に菌懸非病原性大腸菌の論文４）を参照すると，ヒート

濁液を１ml添加し，約５×10８cfu/pieceとし，よショック時にも誘導されるσ因子であるrpoEタ

く手で揉んで菌液を牛肉サンプルに馴染ませた。

ンパク質が低温処理によっても誘導されることが15分静置後，真空パック後，前述の①～③の低温報告されている。このように熱ストレスに応答す貯蔵を行った。その後，袋のまま25℃で５分間イるタンパク質が低温貯蔵中に発現し，耐熱性の向ンキュベート後，57.5℃で15分間加熱処理し，さ上に寄与したためであろうと推察された。

らに25℃で５分間インキュベートを行った。その次に，②の－20℃24時間の冷凍後についてであ

袋の中に９倍容の0.85％NaClを加え１分間ホモジ

るが，ほとんどのSTECで未加熱サンプルの生菌

ナイズし，段階希釈液を作製し，全生菌数（健常数はコントロールと比べて低下が認められた。し

菌数＋損傷菌数）測定のために終濃度100μg/ml

かし，O157：H7の２株（EC75，EC83）の生菌© The Ito Foundation

Viable counts（log CFU/ml） Viable counts（log CFU/ml） Viable counts（log CFU/ml） Viable counts（log CFU/ml）

102
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
EC14

Control Chilled Frozen F-C7
EC49

Control Chilled Frozen F-C7
EC69

Control Chilled Frozen F-C7
EC83

Control Chilled Frozen F-C7

9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0

EC38

Control Chilled Frozen F-C7
EC55

Control Chilled Frozen F-C7
EC75

Control Chilled Frozen F-C7

9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0

9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0

EC47

Control Chilled Frozen F-C7
EC57

Control Chilled Frozen F-C7
EC80Control Chilled Frozen F-C7

EC110

Before heat treatment
After heat treatment

Control Chilled Frozen F-C7

Fig. 1 Viable counts of STEC before and after heat treatment at 57.5℃.

Cell suspensions of STEC were incubated by chilled at 4℃ for 24 h, frozen at －20℃ for 24 h, or frozen at －20℃

followed by chilled at 4℃ for 7 d. Then the incubated samples were heat-treated at 57.5℃ for 10 min. Then,sequentially diluted samples were spread onto TSA. Colonies were counted after incubation at 37℃ for 48 h.
Control samples were STEC cells just before incubation at low temperatures. Data are means±standard deviations（SD）（n＝3）.

数はコントロールの生菌数とほとんど違いが認め

株（EC69，EC83，EC110）はコントロールと比られず，比較的冷凍に強い菌株であると推定され較した差が0.3 log未満と小さく，冷凍処理によった。さらに，解凍後加熱処理を行ったものでは，て加熱損傷を高めるということは認められなかっほとんどのSTECの生菌数はコントロールとの差た。

（0.5～２log程度）が大きい一方，O157：H7の３

さらに，③の冷凍24時間と冷蔵７日を組み合わ© The Ito Foundation

103

食材の低温貯蔵履歴が大腸菌O157：H7の凍結損傷回復ならびに低温加熱耐性に及ぼす影響

せた低温貯蔵を行った後の生菌数，さらにその加ことで加熱による損傷程度が抑えられるグループ

熱処理後の生菌数はいずれも低下していた。加熱に分かれることが明らかになった。特に，EC57，

後のSTECの生菌数をコントロールと比べると1.8

EC69，EC110といったO157：H7については冷蔵～4.3 logの幅での減少があり，菌株ごとで違いがならびに冷凍貯蔵によって加熱に対する耐性が誘あることが認められた。特に，O157：H7の２株

導され，損傷程度が抑えられるという結果が得ら（EC69，EC110）とコントロールとの差は最も小れた。また，冷蔵と冷凍を組み合わせた貯蔵は

さく，加熱によって受けた損傷の程度が小さいこ

STECにとっても厳しい貯蔵条件と考えられるとが示された。このように，加熱によって受ける

が，この低温貯蔵後の加熱処理による損傷程度は損傷の程度にはSTEC菌株間で違いがあると推察

コントロールと同程度に抑えられていることが明された。

らかになった。

そこで，加熱前の生菌数をＮ０，加熱後の生菌

また，③の冷凍24時間の際にSTECが受けた凍数をＮ１ とし，log N１/N０ を算出して損傷程度と結損傷が，その後の７日間４℃の冷蔵期間中に，して評価した（Fig.２）。その結果，コントロー

回復するかどうかについて，Fig.１を基にした考ルを基準として判断したものであるが，O26：

察を行った。加熱処理していない24時間冷凍①のH11株（EC14），O38：H-株（EC38），O103：H2

サンプルの生残菌数のものを比較対象とした。

株（EC47），O157 ： H7 の ２ 株（EC55 ，EC75）

O103：H2（EC47）については24時間冷凍した生のように低温貯蔵されることで加熱による損傷程

残率とほぼ変化はなかったものの，その他の菌株

度が大きくなる傾向にあるグループと，O119：については７日間の冷蔵中に生残菌数が減少して

H-株（EC49），O157：H7の５株（EC57，EC69，

いたことから，７日間の冷蔵貯蔵中のSTECの損

EC80，EC83，EC110）のように低温貯蔵される

傷回復は考慮する必要がないと推察された。しかO26：H11 O38：H- O103：H2 O119：H1.0

EC14

EC38

EC47

EC49

O157：H7
EC55

EC57

EC69

EC75

EC80

EC83

EC110

0.0

log N1/N0

－1.0
－2.0
－3.0
－4.0

Control

ChilledFrozenF-C7－5.0
Fig. 2 Damages of STEC caused by heat treatment.

STEC were kept under different low temperature storage methods before heat treatment.
 ０ and N１ are viable counts of before and after heat treatments, respectively. For other details, see caption to Fig. 1.
N© The Ito Foundation

104

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

し，肉に接種されたSTECが受ける凍結損傷がそ培地で生育した全生菌数では約７log CFU/gであの後の冷蔵中に回復するか否かについては別途検り，三種類の低温貯蔵法の違いによる影響はほと討する必要があると考える。

んどなかった。また，CHROMagar培地で生育し3 . 2 低温貯蔵が汚染牛肉中におけるSTECの耐熱性に及ぼす影響

た健常菌数は若干の減少は認められたが，損傷程度は低いと判断された。さらに加熱後の全生菌

まず，もともと牛肉を汚染しているSTECの存数，健常菌数については未加熱のものと比べて１在を考慮し，それとの識別のために，Amp耐性～２log程度の低下が認められた。そこで，試験を有し緑色蛍光タンパク質を発現するSTECの作管の実験と同様に加熱による損傷程度について製を試みた。対象としては低温貯蔵することで加Fig.４で表現した。その結果，全生菌数の減少は熱による損傷程度が抑えられたEC57，EC69，

コントロールと比較し，冷凍貯蔵することで耐熱

EC110の３株とし，形質転換を行ったところ，性が若干強くなり，冷蔵しても差は小さかった。

EC110のみGFP発現形質転換体が得られた（data

また，健常菌の割合についても低温貯蔵によって

not shown）。そこで，EC110株で汚染した牛肉

損傷程度が抑えられていることが認められた。

の低温貯蔵による加熱による損傷程度の違いについて検討した。

今回の汚染した肉の加熱処理温度は57.5℃で，処理時間は15分間だった。食品衛生法の特定加熱

前項の実験と同様，EC110で汚染した牛肉を①食肉製品の食肉製造基準によると，ローストビー～③の低温貯蔵後，57.5℃で15分間の加熱処理に供

フを調理する際の中心温度の幅は55～63℃であした。Amp添加TSA培地でSTEC（EC110）の全り，温度ごとに処理時間が定められ，57℃の場合

生菌（健常菌＋損傷菌）数を測定し，CHROMagar

は43分以上の時間処理されなければならない。今

培地で健常菌数の測定を行った（Fig.３）。まず，後，低温貯蔵後のEC110株を含めた低温貯蔵によ

加熱処理前のデータを比較するとAmp添加TSA

り耐熱性に向上が認められる菌株について，さらViable counts（log CFU/g）

9.0

Before heat treatment

8.0

After heat treatment

7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0

TSA

CHROM
agar

Control

TSA

CHROM
agar

TSA

Chilled

CHROM
agar

Frozen

TSA

CHROM
agar
F-C7

Fig. 3 Viable counts of EC110 inoculated in beef meat before and after heat treatment at 57.5℃．

Beef meats were incubated by chilled at 4℃ for 24 h, frozen at －20℃ for 24 h, or frozen at －20℃ followed bychilled at 4℃ for 7 d. Then the incubated samples were heat-treated at 57.5℃ for 10 min. Then, samples were
homogenized in 9 volumes PBS for 1 min. The suspensions were sequentially diluted and spread onto TSA.
Colonies showing green color caused by GFP expression were counted after incubation at 37℃ for 48 h.

© The Ito Foundation食材の低温貯蔵履歴が大腸菌O157：H7の凍結損傷回復ならびに低温加熱耐性に及ぼす影響
Controllog N1/N0

0.0

TSA

CHROM
agar

Chilled
TSA

Frozen

CHROM
agar

TSA

CHROM
agar

105

F-C7
TSA

CHROM
agar

－1.0

－2.0

－3.0
Fig. 4 Damages of EC110, inoculated in beef meats, caused by heat treatment.

Beef meats were inoculated with EC110 and stored using three different low temperature storage methods. N０
and N１ are viable counts of before and after heat treatments, respectively. For other details, see caption to Fig. 3.

に異なる温度での加熱処理に対する耐性評価を行る可能性が示された。さらに，EC110についてはうとともに，これらの耐性向上に関与する遺伝子牛肉に接種して低温貯蔵ならびにその後の加熱処の同定を進める。それにより，耐熱性に関わる因理を行ったところ，試験管レベルの実験と同様に子を抑えることがより安全な食品加工方法に結び

低温貯蔵されることで加熱処理による損傷程度がつくものと考えられる。

抑えられることが明らかになった。このように，

４．要

EC57，EC69，EC110などの菌株によっては低温

約

貯蔵により耐熱性が高まる可能性が示された。

O157：H7を含めた異なる血清型の腸管出血性大腸菌（STEC）を「冷蔵」，「凍結」，「凍結後に冷蔵」の三つの異なる低温貯蔵法で貯蔵後，加熱処理を行うことで耐熱性の変化について検討を行った。その結果，低温貯蔵によってその後の加熱処理に基づく損傷程度が大きい菌株が認められる一方，その逆に損傷程度が抑えられる菌株が認められた。特に，EC57，EC69，EC110といったO157：H7株は低温貯蔵によってその後の加熱処

文
献１）
 Zhao, T., Doyle, M. P., Kemp, M., Howell, R. S.,
Zhao, P.： J. Food Protect., 67, 1760～1764, 2005.
 Manios, S. G., Skandamis, P. N.：Meat Sci., 101, 25
２）～32, 2015.
３）
 Smith, S. E., Maurer, J. L., Orta-Ramirez, A.,
Ryser, E. T., Smith, D. M.： J. Food Sci., 66, 1164～
1168, 2001.
 Polissi, A., Laurentis, W. D., Zangrossi, S., Briani,
４）F., Longhi, V., Pesole, G., Dehó, G.：Res. Microbiol.,
154, 573～580, 2003.

理による損傷程度が抑えられ，耐熱性が高められ© The Ito Foundation

106

ソーセージに混入する非金属異物の検出技術に関する研究
Study on the detection technology of non-metal extraneous materials insausages

河

野

俊

夫

（高知大学農林海洋科学部）

Toshio Kawano（Department of Agriculture, Forestry, Bioresource and Environmental Sciences, Kochi University）

For the detection of undesirable foreign materials accidentally mixed in sausages during
its production, diffused reflectance spectra in near infrared region of six commercial sausages,
ten non-metal and six bio foreign materials were measured with FT-NIR system. Spectra
were collected in the region between 4,000cm －１ and 12,000cm －１，and after smoothingtreatment of Savizky-Golay method, principal components for sausages and foreign materials
were obtained by PCA software. In the PCA space, spectrum points of foreign materials almost
gathered near the first principal component axis（PC1）but each type of material made an
individual group around the axis. Then, PCA was applied for each type of material and PC1
component vector was obtained. From the component distribution data in original wave
number space of the first principal component vector, ten wave numbers for identifying eachmaterials were selected. A neural-network based model, which has ten input neurons, 2 hidden
layers and one output neurons, was constructed for estimating whether sausage tested
contains foreign materials. Each hidden layer has 30 neurons and output layer brings out two
dimensional unit vector（1,0）or（0,1）which means the sausage has undesirable foreignmaterials or not. After training and validating the model with randomly selected data, trainedmodel was tested with the rest data which had not used for training. As the results, for bio
foreign materials such as spiders and moths, the identification rate ％ of the model reached toca. 80％, and for non-metal foreign materials such as EPS（used for packing polystyrene）, therate does to 90％. However, cockroaches have common constituents to sausages such asprotein, and that made it difficult to detect the bug mixed in the sausage.

１．目

るうえでも，これは大きな問題である。その原因的は何なのか。素材調達から製造に至るまでの，

日本の食品は品質の良さと安全性の高さが売り

メーカーサイドでの異物混入検査では，主として物である。ところが昨今，我が国では新聞紙面に金属類の混入検査がメインであり，非金属・生物

おいて，流通する食品に異物が混入する事例をよ

系の異物はヒトの目視による検出以外にはない。

く見かけるようになった。食品の海外展開を考えしたがって，表面的に目視確認できなかった内部© The Ito Foundation

ソーセージに混入する非金属異物の検出技術に関する研究

107

混入の異物は，家庭やレストラン等で提供された物混入事例１）を参考として，「非金属異物」とし時点で「消費者による発見」という形で検出されて，布，発泡スチロール，ガラス片，食品包装用ることになる。インターネットの一般化によって

ラップ，紙，プラスチック，ゴム，小石，ティッ

消費者は発信者となり，異物発見の情報はメー

シュペーパーの９種類を，また「生物異物」としカーの窓口に届くことなく，瞬時にして社会一般てハエ，蚊，蛾，カメムシ，蜘蛛の５種類を用意の知るところとなる。このことがメディアによるした。

事例報告の増加につながっているものと思われガラス製のシャーレ上に試料を載せ，試料の厚る。しかし，食品メーカーにとって「消費者によみに相当するスペーサーを橋桁のように両側よりる異物の発見」は企業生命を危うくする。現代の立てた上に白色反射版を置き，フーリエ変換赤外

食品生産工場では徹底した衛生管理のもとに混入

分光光度計（日本分光，FT/IR-4100）にInGaAs

異物を入口の時点で排除する努力はしているが，型 高 感 度 近 赤 外 分 光 セ ン サ ー を 付 加 し た FT-

ソーセージ製品の場合，素材搬入，ミンチ化と混NIR，または近赤外分光器（相馬光学，S-2730，

捏（練り込み）作業の各過程で異物混入の可能性

S-2830）と高輝度ハロゲン光源による分離型測がある。ロボット化した生産工場とはいえ，作業定 シ ス テ ム を 用 い て ，波 数 4,000cm － １ （波 長機械に含まれる非金属部品の破損や小さな昆虫の833nm）から12,000cm－１（波長2,500nm）の近赤

侵入はハイテクの網の目をくぐる。こうした非金外反射分光スペクトル（測定点数8,300点）を取

属異物・生物系異物に対する検出手法の確立が急得した。なお，上記の試料を取り除いた場合のスがれる。

ペクトルも同時に測定し，間隙空気や測定系にそこで本研究では，製品の非破壊・非接触検査

よって生じる試料以外のノイズスペクトルとしてを前提として，光センシングによって非金属異物

試料のスペクトルから控除した。ラップ，ティッ

や生物系異物を検出する原理手法について検討しシュペーパー，紙，ゴム，布はその厚さを１枚かた。検査対象のソーセージに光を照射し，その反ら10枚までの10パターン，発泡スチロールは厚さ射光に含まれる近赤外域のスペクトル情報の中かを２mmから22mmの範囲で８パターン（２，４，ら，非金属異物や生物系異物固有の情報を引き出

６，８，10，14，18，22mm），プラスチック（最し，ニューラル・ネットワークを用いたAI（人外径1.2mm）とガラス（同0.93mm）は適当に３工知能）型モデルによって，異物の有無やその種

つ の サ イ ズ に 粉 砕 し て ３ パ タ ー ン ，小 石 は ２類を推定する手法である。これにより，ソーセー

mm，４mm，5.3mmの３パターンのものに対しジ製品の安全性を高め，消費者の信頼を獲得するて測定を行った。上記の異物およびソーセージ単ことを目標とした。

体のほか，ソーセージと反射版の間に異物を挟ん

２．方だ，擬似的異物混入ソーセージ試料についても，

法同様に近赤外スペクトルを取得した。

異物混入の対象であるソーセージ試料には，
2019年での市販品６種（IH社１種（記号GAB）

３．結果と考察で以下表記），NH社２種（同，記号OB，SE），

各試料の近赤外スペクトルは8,300点の波数でMS社２種（同，記号OR，KS），PH社（同，記構成されるため，測定スペクトルは8,300次元の号KK）を用いた。一方，混入異物試料には，異超空間上の点の集合体として表現される。それぞ© The Ito Foundation

108

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

れの試料の特徴的波数がどこにあるかを検討する

く，異物の種類ごとにPCA分析を行ってそれぞた め ， 解 析 ソ フ ト Unscrambler Ver.10.5.1

れの異物ごとの主成分軸を求める必要があること（CAMO，ノルウェー）を用いて原スペクトルをも同時に分かる。一方Fig.２は，供試した2019年

サビツキー・ゴレイ法でスムージング（平準化）

市販主要４社のソーセージ６種の近赤外スペクト

したのち，PCA（主成分）分析した。Fig.１は，ル全データを異物試料と同様にPCA分析した結供試した非金属異物および生物系異物のスペクト果である。６種の供試ソーセージともに固有の集

ル全体についてのPCA分析結果（8,300次元で構合（グループ）は形成せず，市販のソーセージの成されるスペクトルの超空間上の各点を，PCA

種類をPCA空間上で類別することは困難である。

空間上の主成分第１軸と第２軸で構成される超空

これは供試ソーセージを構成する素材成分の共通間上の平面に射影したもの）である。横軸および性が高いことを意味しており，逆に言えば，異物

縦軸の丸カッコ内の数値は，試料の全スペクトルが混入する先のソーセージに関して言えば，ソーの超空間上の分散（ばらつき）に対して得られたセージの種類ごとに個別にスペクトルを求めて異主成分第１軸（以下PC１軸）および第２軸（以物との差異を比較する必要がないことになる。

下PC２軸）の寄与率（説明率）である。この図

Fig.２によれば，異物の場合に比較してソーセーによれば，全データを一括した第１主成分の寄与

ジの場合は，データ分散のPC１軸寄与率（説明率は99％を占めており，PC１軸とPC２軸のス率）は94％であり，残り６％をPC２軸に依存すケーリングの大きさから判断しても，異物のスペることになるが，ソーセージ製品一般に共通する

クトルはPC１軸のごく近傍に並んでいることが近赤外スペクトル上の固有波数を決めるうえで分かる。しかしさらに細かく見ていけば，重なりは，PC１軸のみを分析の対象としても問題はな

部分は一部あるものの，異物の種類ごとに点の集いと考える。

合がグループ化しており，スペクトル情報から異

そこで，異物試料とソーセージ試料とを近赤外

物を類別（識別）するためには，全体一括ではな

スペクトルによって識別するため，PC１軸を分PC2 Axis（１％）

20

Cockroach15

Cotton

10

Fly

EPS
Glass

５

Mosquito０Moth
P. Wrap

－５

Paper

－10

Plastic
Rubber－15

S. Bug－20－200

Spiders
０

200

400

PC1 Axis（99％）
Fig. 1 Spectra distribution of foreign materials in PCA space© The Ito Foundation

600

800

Stone
Tissue109

ソーセージに混入する非金属異物の検出技術に関する研究

PC2 Axis（６％）

90

GAB

70

KK

50

KS

30

OB
OR

10

SE

－10
－30
－50
－70
－100

０

100

200

300

PC1 Axis（94％）

0.0112β Coeﬃcient（－）

β Coeﬃcient（－）

Fig. 2 Spectra distribution of commercial sausages in PCA space

0.01100.01080.01060.0104
4000

6000

8000

10000

12000

0.01120.01100.01080.01060.0104
4000

6000

8000

10000

12000

Wave Number（cm－１）

Wave Number（cm－１）
Fig. 3 PC1 vector for moths tested

Fig. 4 PC1 vector for plastic pieces tested

析の対象とし，それぞれのPC１軸，すなわちPC

陥ることになる。そこで，波数領域を10分割し，１軸を示すベクトルを構成する元波長の成分

各分割波数領域内での極大波数もくしは最大波数（PC１軸を示すベクトルの，元波長軸への射影成を抽出して，異物やソーセージの識別波数として分で，以下ではβ係数と呼ぶ）の大きさから識別抽出した（Table１）。

波数を選び出すことにした。Fig.３およびFig.４

ソーセージに混入する異物を検出するには，こは，それぞれ生物異物試料の「蛾」と非金属異物のうち異物の識別波数での異物のスペクトル信号

試料の「プラスチック」について，原スペクトルと「ソーセージのスペクトル信号」を用いる。異をPCA分析して得られるPC１軸ベクトルを，そ

物の識別波数でのソーセージのスペクトル信号

れを構成する波数とその波数での成分の大きさでは，異物の場合と異なってそれを特定する信号情表したもの（PC１軸を元の8,300次元から見たベ報は基本的に少ないはずで，その一方，異物が混クトル成分）である。この中から単純に，β係数入しているソーセージの場合は異物の識別波数での絶対値の大きさのみで識別波数を数十点選び出のスペクトル信号に固有の信号強度が期待できる

すと，全体として8,300点あるため，特定の波数からである。そこで異物の識別波数での原スペクのごく近傍だけを抽出することになり，異物とトルの信号強度を入力，異物の有無を出力とする

ソーセージをPC１軸の差異で識別する際にほぼニューラル・ネットワーク・モデル（以下，NN

一点のみで識別する，分析上のピットフォールにモデル）を構築し，有無判別の精度を確認した。

© The Ito Foundation

110

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 1 Selected wave numbers for identification of each materials
Target Food（Sausage）

Unit：cm－１
5494.27328.25757.4
8394.65908.88672.36333.110381.94527.15030.45351.55476.85793.15922.37184.57349.47739.98356.04303.48411.04879.08775.55238.710326.96330.210741.6

7889.411691.3

4343.94497.24969.75405.55781.56012.07124.77374.58195.08472.74789.35192.45608.95730.46271.47188.47418.87483.48160.38316.54330.44808.65377.55519.36071.86380.36892.37241.48266.48594.2

EPS

4409.47856.64720.98217.25804.78380.25846.18664.67065.98935.6

Cotton4158.75928.14354.56114.24536.77102.55012.17326.25321.68263.5

Plastic

4551.26191.34826.07339.75205.97446.85373.78427.45732.48837.2Stone

4220.56602.14535.87340.75183.77514.35676.48131.45958.011000.9

Glass

5927.17855.66374.58192.16708.28567.27254.98642.47342.68953.9Cockroach

5416.17280.05479.77595.36079.57742.86220.38208.57246.28489.1

Mosquito4589.87406.35244.57533.65410.38233.66193.38612.57271.38745.6

Fly4476.98662.75196.38693.57235.69145.87420.79415.78350.311348.1

Spider5376.67245.35771.97385.16292.68700.36715.99413.87050.59691.5

Stink Bug

5424.87999.35729.58475.66034.28678.17272.210196.8

7438.110360.74692.95471.15851.96222.26400.67549.07784.38024.48332.98730.2

Sausage

4561.87304.1Non-metal foreign materials
Paper
Cardboard
Tissue Paper
Paper
Rubber

Bio foreign materials

Moth

NNモデル構築には，MATLAB Ver.2019b上の認を行った。その結果，生物異物では蜘蛛や蛾なDeep Learning Toolbox を 用 い た 。入 力 層 10 点

どは80％程度，非金属異物では発泡スチロールが（10波数信号），隠れ層２層各30点，出力１点（有90％程度識別できるなど，良好な結果を得た。し無）のニューロン構成で，全データをトレーニン

かし一方で，タンパク質などの点でソーセージとグ用60％，検証用10％，モデル学習に使わない未似通った成分を含むゴキブリは，今回選定した識知データ30％に分割して学習とその判定制度の確別波数では正解率が低かった。

© The Ito Foundation

ソーセージに混入する非金属異物の検出技術に関する研究

４．要

111

ロン，隠れ層２層，出力ニューロンで構成する

約

NNモデルを構築した。隠れ層の２層は各30個の生産中に偶発的にソーセージに混入した異物をニューロンで構成されており，出力層は２次元の検出することを目的に６種の市販ソーセージ，10

単位ベクトル（1,0）もしくは（0,1）（前者は異物

種の非金属異物と６種の生物異物の近赤外拡散反混入あり，後者は異物混入なし，を意味する）で射スペクトルをFT-NIR装置で測定した。スペク

結果を出すものである。ランダム抽出したデータ

トル測定は，波数4,000cm－１から12,000cm－１までによる学習および検証プロセスを経たあと，学習の範囲で行い，サビツキー・ゴレイ法によるス済みのモデルを，学習時に用いないデータ（未知ムージング処理のあと，主成分分析ソフトを用いデータ）で推定精度を確認した。その結果，蜘蛛

てソーセージと異物とに分けて主成分を求めた。

や蛾に関しては，特定成功率は約80％，EPS（梱PCA空間上では，異物のスペクトル点はほとん

包用に用いる発泡スチロール）のような非金属異ど主成分第１軸（PC１軸）周辺に集まっていた。

物に関しては90％であった。しかしゴキブリは，

しかし，第１主成分軸の回りで異物の種類ごとにタンパク質のようにソーセージと共通する成分を個別の集合を形成していた。そこで，異物の種類もつがために，ソーセージに混入した場合に検出ごとに改めてPCAを適用し，異物ごとのPC１ベすることを難しくしていた。

クトルを算出した。このベクトルの元の波数空間での成分分布から，それぞれの異物を特定するための10個の波数を選び出した。ソーセージに異物が混入しているかどうかを推定する10入力ニュー

文
献１）
 桝富賢二朗，真鍋純一，松永兼充，穴井元昭，江川洋：異物検査事例集－食品中の異物を中心として－，サイエンティスト社，2013年．

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112

牛の新規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への影響
Molecular basis of novel genetic disorders in cattle and their adverse
impact大和

修・矢吹映・Md Shafiqul Islam・Phahnaj Pervin（鹿児島大学共同獣医学部臨床病理学分野）

Osamu Yamato, Akira Yabuki, Md Shafiqul Islam and Phahnaj Pervin（Laboratory of Clinical Pathology, Department of Veterinary Clinical Sciences, Joint Faculty of Veterinary Medicine,Kagoshima University）

The present study was carried out in order to identify causative mutations in two typesof undetermined inherited diseases, which had been found in Japanese Black calves. The wholegenome sequencing analysis was performed by a next-generation sequencer using DNA
extracted from paraffin-embedded tissue samples of case 1 with lysosomal storage disease andcase 2 with congenital spongiform encephalopathy, and a sperm sample of case 1’s sire（heterozygous carrier）. There was no specific abnormal sequence and alteration in exons andexon-intron junction areas in approximately 60 genes associated with lysosomal storage
diseases in case 1 and case 1’s sire. In addition, two types of sequence alterations（c.1-151C>T
and c.1252-12C>G）were found in introns 1 and 12, respectively, in the bovine CTSA gene.
Real-time PCR assays with TaqMan minor groove binder probes were developed to knowwhether these alterations are pathogenic or not. Based on the data of genotyping survey indozens of clinically healthy Japanese Black cattle, these alterations were demonstrated not tobe pathogenic because a number of healthy cattle possessed the alterations homozyously andheterozygously. There was no abnormal sequence and alteration in six genes including
BCKDHA, BCKDHB, DBT, DLD, PRNP, and ASPA genes associated with congenital
spongiform encephalopathy in case 2, because the quality of case 2’s DNA was not good.
Further studies are required to identify the causative mutations in these inherited diseases
especially using molecular analysis in case 1 and immunohistochemical analysis in case 2.

１．目

つであると考えられる。黒毛和種牛においては，

的

現在９種の遺伝的不良形質，すなわち，バンド３

日本が世界に誇るべき黒毛和種牛は，近年，そ欠損症，血液凝固第13因子欠損症，クローディンの受胎率，出生率および生産性の低下が重大な問

16欠損症，チェディアックヒガシ症候群，眼球形

題となっており，黒毛和種牛の市場に深刻な影響

成異常症，モリブデン補酵素欠損症（正確には，をもたらしている。その原因は多様であると推測

キサンチン尿症Ⅱ型），IARS異常症，前肢帯筋異されるが，潜在する遺伝的不良形質も主因のひと常症およびバーター症候群Ｉ型が，一般財団法人© The Ito Foundation

牛の新規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への影響

家畜改良事業団（家畜改良技術研究所）により指定疾患として検査可能であり，種雄牛の遺伝子型

２．方

113

法

が明らかにされている１）。なかでも，近年同定さ2.1

れたIARS異常症は，虚弱子牛症候群の主な原因

研究対象のライソゾーム蓄積病および先天性海として同定され，現行でも子牛損耗率に大きく関綿状脳症を発症したそれぞれの黒毛和種子牛（症与していることが分かってきており，黒毛和種の例１および２）には，DNA抽出に適した新鮮凍生産性にきわめて深刻な影響を及ぼしていること

結組織は残されていなかったため，パラフィンブが明らかとなっている。しかし，黒毛和種牛には，ロック組織を用いた。パラフィンブロックをミク

さらに多くの遺伝的不良形質が潜在していること

ロトームで３～４μｍの厚さで十数枚薄切し，キは明白であり，それら未同定の遺伝的不良形質がシレンにてパラフィンを除いた後，純水を加えて子牛損耗率に与える影響は依然大きいと推定され

超音波式ホモジナイザーで懸濁し，その懸濁液かる。

ら DNA 抽 出 キ ッ ト （QIAamp DNA Mini Kit,

DNAの抽出

本研究は，過去に黒毛和種新生子で報告された

Qiagen）を用いてDNAを抽出・精製した。また，

未同定かつ未解明の遺伝的不良形質である２疾

症例１の父牛（ヘテロ接合体）と想定される凍結患，すなわちライソゾーム蓄積病２，３）および海綿精子から，ジチオスレイトールによる還元作用で状脳症について，その疾患を同定（確定診断）

DNAと核タンパク質プロタミンとのSS結合を切して分子基盤（原因変異と発症機序）を解明し，断した後，同様に，超音波ホモジナイザーによるこれらの疾患が黒毛和種牛の生産性に及ぼす悪影

懸濁液から前述のDNA抽出キットにてDNAを抽響を明らかにするために実施された。

出・精製した。

４）

ライソゾーム蓄積病には，約50疾患（約60種の2.2

全ゲノムシーケンス

遺伝子に起因）が存在し，一方，先天性の海綿状上記の３検体，すなわち症例１およびその父牛脳症には，アスパルトアシラーゼ欠損症（カナバならびに症例２のDNAの全ゲノム解析を実施しン病），メープルシロップ尿症（MSUD），遺伝性

た。アガロース電気泳動およびマイクロチップ電

クロイツフェルトヤコブ病等が知られている。本気泳動によるDNA品質確認をした後，ライブラ

研究では，次世代シーケンサーによる全ゲノム解リー調整試薬（TruSeq Nano DNA Library Prep

析を実施し，主に対象となる遺伝子領域のデータ

Kit, Illumina）によってライブラリーを作成した。

を解析し，本研究対象の２疾患の原因遺伝子およ

次世代シーケンサー（HiSeq 2500, Illumina）をび原因変異を解明することを目指した。また，遺使って，リード長150bpのペアエンド読取法にて，伝子型検査法を開発して，黒毛和種種雄牛および全長約90Gb（３億リードペア）を解析した。一繁殖牛集団における変異アレル頻度を解明し，本連の処理およびデータ解析は，北海道システムサ

疾患の黒毛和種牛集団への浸潤状況および生産性

イエンス株式会社に依頼して実施した。

への悪影響を明らかにすることも，原因変異同定

2.3

リアルタイムPCRを用いた遺伝子型調査後の目的として実施した。

症例１において，原因遺伝子および原因変異候補として，牛CTSA遺伝子の２種類の一塩基置換に対して，TaqMan minor groove binder（MGB）
プローブを用いたリアルタイムPCR法を設計し© The Ito Foundation

114

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 1 Characteristics of the primers and TaqMan probes used for genotyping of two types ofnucleotide alterations in the bovine CTSA gene.
Targetc.1-151C>T

Primer/probe

Reporter

Forward primer

GGAGGCTGGAGGCGATC

Reverse primer

CCGTGCCTCCTCCGT

Wild-type probe

VIC

CGGGTGGCTCCCG

Mutant-type probeFAM

CGGGTGACTCCCG
GCAGGGACAATTAAAGATATAGT

Forward primer
c.1252-12C>GSequence（5’→3’）

TACAAGATATGC

Reverse primer

CCATGACAATCCCAGCCAAATCTT

Wild-type probe

VIC

TGGGTTTCACGTTGACAG

Mutant-type probe

FAM

TGGGTTTCACCTTGACAG

VIC, 6-carboxyrhodamine; FAM, 6-carboxyfluorescein.

た 。そ の プ ラ イ マ ー お よ び プ ロ ー ブ の 配 列 はめ，きわめて高い確率で両者が父子関係を有してTable１に示した。

いることが確認できた。
これらのスニップのパターンにおいては，父牛３．結果と考察
3.1

がヘテロ接合であり，症例１がホモ接合である領

症例１およびその父牛の全ゲノム解析

域が原因遺伝子に強く関連した領域であると考え

症例１の父牛の全ゲノム解析データは高品質でられるため，そのようなタイプのスニップが比較明瞭であったものの，症例１のデータはところど的多く存在する牛CTSA遺伝子に着目して，エク

ころ不明確な領域が存在した。これは，症例１の

ソン近傍のイントロン領域の配列異常を検索しDNAがホルマリン固定後にパラフィン包埋された。今回は，同遺伝子のイントロン１および12にた組織標本から抽出されたものであり，すでに存在した一塩基置換を絞り込んだ。イントロン１

DNA断片化が進んでいるためであると考えられに存在する置換は第13染色体のg.75,368,422におた。しかし，ライソゾーム蓄積病に関連する約60

けるシトシンのチミンへの置換（c.1-151C>T）種の遺伝子のエクソンおよびエクソン－イントロであり（Fig.１），イントロン12に存在する置換

ン接合部に関しては，症例１においてほぼシーケ

はg.75,373,834におけるシトシンのグアニンへのンスデータは確認可能であった。それらの関連遺置換（c.1252-12C>G）であった（Fig.２）。

伝子のエクソンおよびエクソン－イントロン接合

これらの一塩基置換が，本疾患に関連している部において，父牛はヘテロ接合で症例１がホモ接かを判定するために，これらの置換を識別する

合の配列異常を検索したが，そのようなタイプのTaqMan MGB プ ロ ー ブ を 用 い た リ ア ル タ イ ム

配列異常は認められなかった。したがって，原因

PCR法を作成した（Table１）。これらの遺伝子型

変異はイントロンあるいはプロモーター領域に存検査法を用いて，国内黒毛和種牛数十頭を調査し在するのではないかと強く推測された。

た結果，両置換は通常の健康牛も高頻度に有する

なお，症例１およびその父牛のゲノムに散在す

いわゆる疾患に関連しないスニップであった。以る多数のスニップを解析したところ，両者が親子上の結果から，今回候補にあげた両配列異常は，関係であることの矛盾をまったく生じなかったた

残念ながら症例１が発症しているライソゾーム蓄© The Ito Foundation

牛の新規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への影響

Fig. 1 A part of the whole genome sequence data including n alteration of intron 1（c.1-

151C>T）in the bovine CTSA gene in Case 1 and case 1’s sire.
The upper sequence（Case 1’s sire）heterozygously has the alteration（c.1-151C>T）,and
the lower sequence（Case 1）homozygously has the alteration.

Fig. 2 A part of the whole genome sequence data including an alteration of intron 12（c.1252-

12C>G）in the bovine CTSA gene in Case 1 and case 1’s sire.
The upper sequence（Case 1’s sire）heterozygously has the alteration（c.1252-12C>G）,and the lower sequence（Case 1）homozygously has the alteration.

© The Ito Foundation

115

116

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

積病とは関連がないことが明らかとなった。

症例２の解析に関しては，今後は免疫組織学的

今後は，CTSA遺伝子の他のイントロン領域な方法を駆使して，欠損タンパクを明らかにする必らびにその他のライソゾーム蓄積病関連遺伝子の要があると思われたため，現在，その解析を進めイントロン領域およびプロモーター領域から，配ているところである。

列異常を示す病原性変異候補をあげて，その真偽を牛群スクリーニングによって順次評価していく

４．要約必要があると考えられた。すでに解析済みである

本研究は，過去に黒毛和種新生子で報告された

症例１および症例１の父牛の全ゲノムシーケンス

未同定かつ未解明の遺伝的不良形質である２疾データに基づいて，ひとつひとつ病原性候補をあ患，すなわちライソゾーム蓄積病および海綿状脳

げて評価・確認することで，確実に本疾患の原因症について，その疾患を同定して原因変異を解明

遺伝子（疾患）および原因変異を明らかにするこすることを目的として実施された。ライソゾームとが可能であると思われた。そのため，現在も継蓄積病を発症した子牛（症例１）のパラフィン包

続して解析を実施しているところである。

埋組織および症例１の父牛の精子，ならびに先天

3.2

症例２の全ゲノム解析

性海綿状脳症を発症した子牛（症例２）のパラ

症例２の全ゲノムシーケンスデータは，比較的フィン包埋組織からそれぞれ抽出・精製された

低品質であり，かなりの領域においてデータが欠

DNAを用いて，次世代シーケンサーによる全ゲ落していた。これは，症例２のDNAがホルマリ

ノム解析が実施された。ライソゾーム蓄積病の解ン固定後にパラフィン包埋された組織標本から抽析においては，関連する約60種の遺伝子のエクソ出されたものであり，DNA断片化が高率に進んンおよびエクソン－イントロン接合部には候補とでいたためであると考えられた。

な る 配 列 異 常 が 認 め ら れ な か っ た 。な お ，牛こ の デ ー タ を 用 い て ，MSUD の 原 因 と な る

CTSA遺伝子のイントロン領域における２種類のBCKDHA，BCKDHB，DBTおよびDLD遺伝子

配列異常（c.1-151C>Tおよびc.1252-12C>G）をについて調査して変異候補を検索した。これに加原因変異候補として見出した。これらが原因変異

えて，ヒトにおいて報告されている先天性海綿状であるかを判別するために，TaqManプローブを脳症に関連する遺伝子（PRNP遺伝子）の領域も用いたリアルタイムPCR法を作成して，牛群数十調査した。また，すでに以前，サンガーシーケン

頭について遺伝子型調査を実施した。しかし，こスにてエクソン領域のみ調査したアスパルトアシ

れらの配列は多くの健康牛も有していたため，病ラーゼ欠損症（カナバン病）の原因となるASPA

原性変異ではないと証明された。一方，先天性海遺伝子についても，今回のデータで再調査した。

綿状脳症の解析においては，関連する６種の遺伝

しかし，シーケンスが判別できる領域において子 （BCKDHA, BCKDHB, DBT, DLD, PRNP おは，これらの遺伝子のいずれにも原因変異候補によびASPA遺伝子）について調査したが，DNAあげるべき配列異常は認められなかった。データの品質不良から原因変異候補となる配列異常は見の品質から考慮すると，この症例２のみの全ゲノ出すことができなかった。今後は，両疾患解明のムシーケンスデータだけでは，遺伝子レベルで本ため，さらなる分子生物学的かつ免疫組織学的調疾患およびその原因を解明することが非常に難し査を進める必要があると考えられた。

いと考えられた。

© The Ito Foundation

牛の新規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への影響
文献１） 黒毛和種の遺伝的不良形質：一般財団法人家畜改良 事 業 団 家 畜 改 良 技 術 研 究 所 ．http://liaj.or.jp/
giken/usi_gntyp_disease_kuro.html
２） Mikami, O., Anjiki, T., Yamato, O., Nakajima, Y.：A case of suspected lysosomal storage disease in aneonatal Japanese black calf, J Vet Med A Physiol
Pathol Clin Med, 53（2）,77～80, 2006.
３） Masoudi, A. A., Yamato, O., Yoneda, K., Tsuji, T.,117

Mikami, O., Kunieda, T.：Exclusion of NEU1 and
PPGB from candidate genes for a lysosomal
storage disease in Japanese black cattle, Anim Sci
J, 80（5）,611～615, 2009.
４） Kato, K., Uchida, K., Murakami, T., Tateyama, S.：
A neurological disease with spongy degeneration
in a newborn Japanese Black calf, J Vet Med Sci,
67（10）,1067～1070, 2005.

© The Ito Foundation

118

沖縄県の島々の黒毛和種集団の多様性，近交度のゲノムの視点からの評価
Genomic evaluation of genetic diversity and inbreeding of Japanese Black
cattle in the Okinawa islands

佐々木

慎

二

（琉球大学農学部）

Shinji Sasaki（Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus）

The control of inbreeding and the maintenance of genetic diversity are important for thesustainability of Japanese Black cattle production. To estimate the inbreeding coefficients ofJapanese Black cattle in Okinawa, long stretches of consecutive homozygous genotypes（runsof homozygosity；ROH）from 1,031 dams were evaluated using an SNP array, and ROH-based
inbreeding coefficients（FROH）were estimated in 1,031 dams in 10 islands of Okinawa. The
results indicate that FROH values in dams in Okinawa are equivalent to that found in locations
across Japan. However, FROH in dams of one island was higher in comparison with the other
Okinawa islands. Additionally, for FROH, the expected level of homozygosity was higher than
expected in 85.5％ of cases when compared to pedigree-based inbreeding coefficients（F PED）.
The results indicate that ROH can serve as a useful tool to evaluate inbreeding in JapaneseBlack cattle．

１．目ている。近交が高まった集団では，エリート種雄的

牛が有害変異など生産阻害因子を保因した場合，沖縄県は，約4.26万頭の黒毛和種・繁殖雌牛をその子孫で遺伝的不良形質が発生するなど，持続有する子牛生産拠点の１つで（全国４位），子牛的生産が脅かされることになる。近交の尺度は従の多くは島外に供給され全国の黒毛和種生産を支来，血縁情報から任意の遺伝子座位の両アレルがえている。しかし，島々は1,000kmの距離に点在ともに共通の祖先由来である確率（近交係数）でし移動が制限されるなど，島内で遺伝的な多様性評価されてきたが，仮定として祖先に関連がなが失われ，近交が高まりやすい地理的特性があく，染色体のすべての領域が等価に振る舞うことる。現在，これらの地域においてもゲノム育種価を前提に算出されるなど，家畜集団の実態に即しが実用化されつつあり，枝肉成績に優れたエリーていない部分がある。牛の他品種の解析では，真ト種雄牛と繁殖雌牛を選抜，交配することで育種の近交係数より低く推定されることが報告されて改良のスピードアップが図られているが，一方でおり１），遺伝的特徴を正確に捉えているとは言い

近交が高まり，多様性が低下する危険性が高まっ難い。そこで，本申請では多様性が失われ，近交© The Ito Foundation

沖縄県の島々の黒毛和種集団の多様性，近交度のゲノムの視点からの評価

119が高まりやすい地域の一つとして沖縄県の黒毛和あるROHを個体ごとに集計し，常染色体ゲノム

種集団をモデルケースとして取り上げ，SNP情報に対するホモ接合領域の割合を算出し，近交係数を使って各個体で連続する比較的広いホモ接合領

FROHを算出した。沖縄県の繁殖雌牛のFROHが0.063

域（Runs of Homozygosity：ROH）を特定する

で ，一 般 集 団 の 繁 殖 雌 牛 と 有 意 差 は な か っ た

ことで真の近交係数を算出し，また多様性を把握（Fig.１）。これらの個体では約157Mbpのゲノムすることで，ゲノムの視点から遺伝的特徴を正確

領域がホモ化していることを意味している。まに捉える試みを行った。

た，最もホモ化が進んだ個体では，FROHが0.24と２．方

ゲノム領域の1/4がホモ化していた。３Mbp以上

法の長いROHは，比較的最近の共通祖先から分離

沖縄県内10島の繁殖雌牛1,031頭からSNPチッ

したゲノム領域であると考えられている６,７）。そプを用いて得られた30,106個のSNPを解析に用いのため，このようなROHを構成する両ハプロタ

た。SNP解析のための事前処理として，マイナー

イプ，そしてハプロタイプ領域に存在する変異は

アレル頻度＜５％，SNPごとの型判定率＜５％，ともに同祖性である可能性が高く，またすでにホ

個 体 ご と の 型 判 定 率 ＜ ５ ％，遺 伝 子 型 の ハ ー

モ接合化していることから致死などに関連する有ディーバインバーク平衡検定 p 値＜１％のSNPを害な劣性変異が存在する可能性が低いと考えられ取り除いた。次に，欠損データの補完を行うととる。今後，さらに多くの個体でROHを詳細に調もに，高密度のハプロタイプ情報を得るため，黒べることで，有益なゲノム領域をホモ化し育種改

毛 和 種 1,997 頭 を BovineHD Beadchip で 型 判 定良を進めるとともに，有害な劣性変異を効率よく後２），上記の同じ条件で前処理し得られた573,739

探索・把握できると考えられる。

で相決定を行っ

次に，沖縄県の繁殖雌牛で血縁情報とSNP情報

た。その後，このSNPデータを参照データとして，の両方の情報が得られた1,004頭の個体について，

沖縄県SNPデータの補完を行い（インピューテー

血統情報から求められた近交係数FPEDとFROHを比ション），以降の解析に用いた。ROH解析は，較した結果，相関係数は0.59で有意な中等度の正Plink1.9ツール

を用い３Mbp以上のROHをそれの相関が認められた。85.5％の個体ではFPED はぞれ個体ごとに算出し後，ARS-UCD1.2ウシ参照

FROHの値より小さく，FPEDは近交係数を過小評価

ゲノムの 常 染 色 体 の 全 長 を 2,489,385,779bp としているとの既報の結果１）と一致していた（Fig.

し，近交係数FROH を算出した。主成分分析は，

２）。今後，ゲノム育種価算出の過程で多くの個

SNPデータからゲノム関係行列を作成後，固有体 で SNP 情 報 の 取 得 が 予 想 さ れ る こ と か ら ，値，固有ベクトル，第20主成分までの寄与率を求ROH解析による正確な集団の近交係数の評価がめた。また，沖縄県サンプルと他地域との比較検可能となると思われる。

個のSNPを用いて，Beagle5.1

５）

４）

３）

討を行うため，全国から収集した繁殖雌牛788頭

沖縄県の島間の近交度の比較評価のため，沖縄を黒毛和種・繁殖雌牛の一般集団のSNP情報とし

県内10島ごとに繁殖雌牛のFROHを算出した結果，て解析に用いた 。

１つの島（Island_10）で他の９島と比較しFROH

２）が高い傾向にあり，１つの島（Island_07）に対３．結果と考察し て 有 意 に FROH が 高 い こ と が 明 ら か と な っ た

３Mbp以上の連続するSNPのホモ接合領域で（Fig.３）。今回の調査から，多くの島は全国の一© The Ito Foundation

120

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
N

Average

Min

Max

SD

SEM

Okinawa_dam

1031

0.063

0.0059

0.242

0.032

0.001

dam

788

0.063

0.0018

0.272

0.044

0.002

300

Okinawa_dam

200
100
0
200

dam

100

0.5

0.46

0.42

0.38

0.34

0.3

0.26

0.22

0.18

0.14

0.1

0.06

0.02

0

FROH
Fig. 1 Inbreeding estimates derived from runs of homozygosity（FROH）for dams in Okinawa and in locations acrossJapan（Uppertable）Descriptive statistics of FROH.（Middle panel）Histogram of FROH of dams in Okinawa.
（Lowerpanel）Histogram of FROH of dams in locations across Japan

0.3
85.5％

0.2
FROH

0.1

14.5％
0
0

0.1

FPED

0.2

0.3

Fig. 2 Scatter plot between FROH and FPED for dams in Okinawa

Scatter plot between FROH and FPED for 1,004 dams in Okinawa. The individuals were plotted in a two-dimensionalgraph, with the first（x-axis：FPED）and the second（y-axis：FROH）.

般集団と同等のFROHであったが，Island_10のFROH

価することで劣性変異による遺伝的不良形質が発は他の島より高く，独自の交配戦略が立てられて生しない交配計画を立てる必要があると考えられいることが示唆された。今後，経時的にFROHを評た。

© The Ito Foundation

沖縄県の島々の黒毛和種集団の多様性，近交度のゲノムの視点からの評価

121

＊

0.1
0.09
0.08
0.07
FROH

0.06
0.05
0.04
0.03
0.02

Island_11

Island_10

Island_09

Island_08

Island_07

Island_06

Island_04

Island_03

Island_020Island_01

0.01

Fig. 3 FROH of dams in 10 islands of Okinawa

FROH were estimated in 1,031 dams in 10 islands of Okinawa. The values represent the mean±standard error ofmean（SEM）. The results were tested using a one-way ANOVA, followed by the Tukey-Kramer test for multiple
comparisons. ＊ p＜0.05.

dam

Okinawa_dam

PC２

PC１

PC２

PC１

Fig. 4 Principal component analysis of dams and Okinawa dams

Principal component analysis of 1,819 Japanese Black cattle including 788 dams and 1,031 Okinawa dams. The

individuals were plotted in a two-dimensional graph, with the first（x-axis：PC1）and the second（y-axis：PC2）.

主成分分析の結果，第１成分は3.65％の分散を説 明 し ，第 １ か ら 第 ５ ま で の 累 積 寄 与 率 は 約
10％，第１から第20までの累積寄与率は約17％であった。沖縄県の繁殖雌牛と全国から収集した繁

また，沖縄県内10島間でも特徴を見いだすことはできなかった。
４．要

約

殖雌牛（一般集団）を比較した結果，沖縄県の繁本研究では，SNPデータを使用しゲノムの視点

殖雌牛では第１主成分，第２主成分がともに負にから沖縄県の島々の和牛集団の多様性，近交度を位置する個体が多く存在することが分かったが

把 握 す る た め Runs of Homozygosity（ROH）解（Fig.４），各主成分の分布は一般集団とほぼ一致

析を行い近交係数FROHの算出を行った。今後，解し，大きな特徴を見いだすことができなかった。

析頭数を増やし，また個体ごとに個々のROHゲ© The Ito Foundation

122

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

ノム領域をさらに詳細に調べることで，沖縄県における和牛の持続的な生産性の基盤となるゲノム技術が開発されることが期待される。
謝辞

本研究は，沖縄県畜産研究センター末澤遼平氏，荷川取秀樹氏の協力のもと行われた。ここに感謝致
します。
参考文献
１） Forutan, M., Ansari Mahyari, S., Baes, C., Melzer,N., Schenkel, F. S., Sargolzaei, M.：Inbreeding andruns of homozygosity before and after genomic
selection in North American Holstein cattle, BMC
Genomics, 19, 98, 2018.
２） Sasaki, S., Ibi, T., Watanabe, T., Matsuhashi, T.,

Ikeda, S., Sugimoto, Y.：Variants in the 3’UTR of
General Transcription Factor IIF, polypeptide 2
affect female calving efficiency in Japanese Black
cattle, BMC Genet, 14, 41, 2013.
３） Beagle5.1. https://faculty.washington.edu/
browning/beagle/beagle.html Accessed 10 Mar
2020.
４） Plink1.9. https://www.cog-genomics.org/plink2
Accessed 10 Mar 2020.
５） Bos taurus assembly ARS-UCD1.2. https://www.
ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_002263795.1/
Accessed 14 Apr 2020.
６） Zhang, Q., Calus, M. P., Guldbrandtsen, B., Lund,
M. S., Sahana, G.：Estimation of inbreeding using
pedigree, 50k SNP chip genotypes and fullsequence data in three cattle breeds, BMC Genet,
16, 88, 2015.
７） Zhang, Q., Guldbrandtsen, B., Bosse, M., Lund, M.
S . , S a h a n a , G . ：R u n s o f h o m o z y g o s i t y a n d
distribution of functional variants in the cattle
genome, BMC Genomics, 16, 542, 2015.

© The Ito Foundation

123

牛の小型ピロプラズマ病に対する感染抵抗性遺伝子の同定
Identification of genes involved with resistance to small piroplasmosis incattle平山

博樹１・藤川朗２・和田健太１（１東京農業大学生物産業学部，２北海道立総合研究機構畜産試験場）

Hiroki Hirayama１, Akira Fujikawa２ and Kenta Wada１（１Fuculty of Bioindustry, Tokyo University of Agriculture, ２Animal Research Center, Hokkaido Research Organization）

Cattle that are infested with ticks develop anemia due to tick-borne protozoan. Worldwide,
tick-borne diseases have a detrimental impact on cattle production. Genetic variations on thehost resistance to tick-borne diseases have been suggested in cattle. In this study, we
attempted to find quantitative trait loci for the host resistance to bovine theileriosis withgenome-wide association study（GWAS）. Genotyping of single nucleotide polymorphisms（SNPs）was performed with the Genotyping by Random Amplicon Sequencing-Direct（GRASDi）method using next generation sequencing. We identified 7,146 SNPs in cattle that wereexperimentally infected by Theileria sergenti. Probability principal component analysis
indicated that SNPs closely reflect genetic variation between susceptibility breed（Hereford）
and resistance breed（Japanese Black）to bovine theileriosis. GWAS indicated that a SNP in
chromosome 18 was significantly（p＜0.05）associated with minimum hematocrit value inexperimental infected animals. Five protein-coding genes and a microRNA were located insurrounding region of the SNP. Four genes of them encoded proteins involved in
immunoreaction of leukocytes. These results suggest that the genetic variation on the hostresistance to bovine theileriosis may be attributed to polymorphisms in immunologically
relevant genes. Further investigations of genetic polymorphisms in the surrounding region of
the SNP are needed to determine responsible genes for the host resistance to bovine
theileriosis．

１．目

色素尿等を引き起こす疾病であり，致死率が高的

く，世界的に牛の生産性を低下させる重大な問題

ダニ媒介性疾患は家畜の健康被害の原因となるとなっている。

重大な疾患であり，地球上のおよそ80％の牛がそ

我が国では，育成牛の預託管理のための公共牧のリスク下にあるとされている 。ピロプラズマ場において古くからTheileria sergenti（以下TS）

病は，ダニが媒介するTheileria属などの原虫がによる小型ピロプラズマ病が問題となってきた。

牛の赤血球に寄生し，発熱，貧血，黄疸および血1980年代以降，牛体への殺ダニ剤投与と牧野整備

１）© The Ito Foundation

124

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

により被害は減少したが，現在もTS保有ダニは血球容積（fl）および最大赤血球容積（fl）を調査

牧野周辺に浸潤しているした。

。全国の放牧牛12.8

２，３）万頭（Ｈ29年度）に対する衛生対策費用は，約10ライブラリー作製は，2-step tailed PCR法を用億円と試算されている。本疾病の発症数低下や薬いて行った。塩基配列データは，次世代シーケン剤投与の労力と費用負担を要因とした衛生対策のサー（HiSeqX ten, Illumina社）を用いて実施し中止，放牧地の再林野化などの結果，近年では小た。シーケシングは，150bpのペアエンド解析に型ピロプラズマ病の再興による被害が多発していより，１サンプルあたり約100万リードを取得し，る。

Genotyping by Random Amplicon Sequencing-

本研究の目的は，本病に対する抵抗性遺伝子のDirect（GRAS-Di）専用ソフトウェア（ver1.0.3）

同定と多型選抜に基づく抵抗性個体の増頭によるを用いてジェノタイピング解析を行った。得られ本病の発生低減である。本病は，ホルスタイン種

た塩基配列は，Sickle（ver1.33）を用いてクオリなどのヨーロッパ系牛や和牛である日本短角種でティースコアが20未満の塩基を削除した後，20塩

発症数が多いのに対し，黒毛和種ではあまり問題基に満たない低品質リードを除去した。得られたにされない。我々は，多大な労力をかけて品種間高品質リードは，bowtie2（ver2.3.2）を用いて参の実験交配家系の造成と感染試験を実施し，抵抗

照配列（ARS-UCD1.2）にマッピングした。マッ

性遺伝子の同定に迫りつつあるが，その染色体上

ピ ン グ デ ー タ の 一 塩 基 多 型 は ， Samtoolsのマッピングには至っていない。そこで，本研究（ver0.1.19）のmpileupとbcftoolsを用いて，それでは次世代シーケンサー解析を活用し，ゲノム全

ぞれ一塩基多型と挿入欠損を出力した後，体に対する一塩基置換の網羅的探索を実施した。

vcftoolsを用いて最低品質10，最低深度10，挿入

また，本病に対する抵抗性の責任遺伝子同定を目

欠損削除の条件でクオリティーフィルタリングを的にゲノムワイド関連解析を試みた。

行った。

２．方

取得した一塩基多型マーカー情報のうち，144

法

個体のマーカータイプ判明率が50％以上となった

北海道立総合研究機構畜産試験場で造成された

7,146マーカーを用いて確率的主成分分析を実施

小型ピロプラズマ病抵抗性に関する実験交配家系した。次に，7,146マーカーの多型情報を用い，より，感受性品種であるヘレフォード種（16頭），

供試個体の感染試験で得られた赤血球データとの抵抗性品種である黒毛和種（13頭），それらの交ゲノムワイド関連解析により小型ピロプラズマ抵

雑種（８頭）およびヘレフォード種による戻し交抗性遺伝子のQTL領域を探索した。ゲノムワイ

配個体（107頭）の合計144個体の血液からDNA

ド関連解析は，Ｒ（version3.6.3）のrrBLUPパッを抽出した。これらの供試個体（生後３～６ヶ月

ケージを用いて実施した。欠損データの補完は齢）は，TS寄生赤血球（１もしくは５×10８個／EMアルゴリズムを用いて実施した。

体重１kg）を静脈内に接種し，その後３ヶ月間にわたり週３回の採血を行い，平均TS寄生率，３．結果と考察

最大TS寄生率，平均赤血球数（×10 ４ /mm ３），

次世代シーケンサーを用いたGRAS-Di解析に

最小赤血球数（×10４/mm３），平均ヘマトクリッ

よって，12,933種類の一塩基多型マーカーを取得

ト値（％），最小ヘマトクリット値（％），平均赤することができた。それらのマーカーをウシゲノ© The Ito Foundation

125

牛の小型ピロプラズマ病に対する感染抵抗性遺伝子の同定

ムにマッピングしたところ，全染色体を幅広くカ

れらの交雑種およびヘレフォードによる戻し交配

バーする一塩基多型情報が得られていることが示個体のゲノム配列の差異を非常によく反映していされた（Fig.１）。次に，得られた一塩基多型マーることが確認された（Fig.２）。

カーから，供試個体144頭のマーカータイプ判明

TS感染データのゲノムワイド関連解析の結果，率が50％以上となった7,146マーカーを抽出し，最小ヘマトクリット値を除き有意な関連は検出さ

確率的主成分分析を実施した。その結果，得られれなかった（Fig.３）。最小ヘマトクリット値のた一塩基多型マーカーは，小型ピロプラズマ病にゲノムワイド関連解析では，明白なQTL領域は感受性のヘレフォード種，抵抗性の黒毛和種，そ検出されなかったものの，18番染色体の１マー

180
160
140

cM

120
100
80
60
40
20
0

0

10

X

20
Chromosome

Fig. 1 Single nucleotide polymorphisms identified by the Genotyping by Random

10

Amplicon Sequencing-Direct method－5F1－20 －15 －10

PC2

0

5

Hereford

Japanese black
Back cross

－30

－20

－10

0

10

20

PC1
Fig. 2 Probability principal component analysis of single nucleotide polymorphisms© The Ito Foundation

126

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Maximum parasitization rate

Minimum erythrocyte count

4

4

4

4

3

3

3

3

1

0

1 3 5 8 11 15 20 26
Chromosome
Mean hematocrit value0

1 3 5 8 11 15 20 26
Chromosome
Minimum hematocrit value5‒log10（ p ）20

1 3 5 8 11 15 20 26
Chromosome

4

4

4
3

1 3 5 8 11 15 20 26
Chromosome

Maximum corpuscular volume

5

5

4

2

1

Mean corpuscular volume

6

3

2

1

‒log10（ p ）

0

2

3

3

‒log10（ p ）2‒log10（ p ）5‒log10（ p ）51‒log10（ p ）Mean erythrocyte count5‒log10（ p ）‒log10（ p ）Mean parasitization rate
5

2

2

2
1

0
1 3 5 8 11 15 20 26
Chromosome

0

1

1

1

0
1 3 5 8 11 15 20 26
Chromosome

1 3 5 8 11 15 20 26
Chromosome

0

1 3 5 8 11 15 20 26
Chromosome

Fig. 3 Manhattan plot of genome-wide single nucleotide polymorphisms associated with hematological data inexperimental infection of Theileria sergenti

カーで有意（p＜0.05）な関連が認められた。そ

0.61％）に比較して有意に高いことが示されていこで，このマーカーの周囲約400kbpにコードさる。戻し交配個体の平均TS寄生率は，ヘレフォー

れる遺伝子を検索したところ，５種類の遺伝子おド種，黒毛和種および交雑種の範囲にばらついてよび１種類のmicroRNAがリストアップされた。

おり，小型ピロプラズマ病に対する抵抗性遺伝子

このうち４種類の遺伝子は白血球の機能に関わるの分離が認められている。これらの知見から，小ことが知られる遺伝子であった。小型ピロプラズ

型ピロプラズマ病抵抗性遺伝子は，TS原虫の赤マ病は，原虫であるTSが赤血球に寄生すること

血球内への侵入阻止もしくは血液中のTS原虫生で引き起こされる疾患である。北海道立総合研究

存性に関わるタンパク質であることが予想され機構畜産試験場では，TS寄生赤血球をTS未感染る。本研究でリストアップされた４遺伝子は，細子牛に接種する感染試験を実施してきた。これま

胞性免疫によるTS原虫の排除に関わる可能性がでに，小型ピロプラズマ病感受性のヘレフォード

示唆された。

種では赤血球の平均TS寄生率（3.93±2.20％）が海外でこれまでに実施されたダニ媒介性疾患に黒毛和種（1.30±0.93％）および交雑種（1.20±

対する遺伝学的研究は，体表に付着した吸血ダニ© The Ito Foundation

牛の小型ピロプラズマ病に対する感染抵抗性遺伝子の同定

127

数を表現型として解析が行われ，ダニ抵抗性に関の確率主成分分析により，一塩基多型マーカーが連する一塩基置換や染色体候補領域が報告されて供試個体の品種をよく反映していることが確認さいる４，５）。しかし，吸血ダニ数は牧野の状況や気れた。ゲノムワイド関連解析の結果，18番染色体

候などのさまざまな環境要因の影響を強く受け上の１マーカーで，最小ヘマトクリット値との有る。近年は，吸血ダニ数に対するゲノム育種価を意な関連が検出された。このマーカーの周辺配列用いた選抜技術の開発も進められているが，抵抗を調査したところ，５種類の遺伝子と１種類の性遺伝子の同定は取り組まれておらず，ダニ媒介microRNAがコードされていた。これらのうち，性原虫の感染メカニズムの解明にもつながってい４遺伝子は白血球の機能に関わることが知られるない 。今後，本研究で同定された５遺伝子およ

遺伝子であり，細胞性免疫を介してTS原虫の寄びmicroRNAに関して，品種間の遺伝的多型を探生抑制に関与することが示唆された。今後，これ索し，TS感受性との関係について解析を進めるらの遺伝子あるいはmicroRNAの遺伝的多型を検必要がある。

索し，小型ピロプラズマ病抵抗性との関係を調査

６）

４．要

する必要がある。

約

ピロプラズマ病は，ダニが媒介するTheileria
属などの原虫が牛の赤血球に寄生し，発熱，貧血，
黄疸および血色素尿等を引き起こす疾病であり，致死率が高く，世界的に牛の生産性を低下させる
重大な問題となっている。本研究では，北海道立
総合研究機構畜産試験場で造成された小型ピロプ
ラズマ病抵抗性に関する実験交配家系を利用し，Theileria sergenti感染試験データに対するゲノム
ワイド関連解析を実施した。供試牛の一塩基多型
情報は，次世代シーケンサーを用いたGenotyping
by Random Amplicon Sequencing-Direct 解 析 により取得した。本方法で得られた7,146マーカー

文献１）
 Shyma, K. P., Gupta, J. P., Singh, V.： J Parasit
Dis, 39, 1～6, 2015.
 前野和利，松井伸一，河合孝弘，鈴木真生，千葉
２）友行，横山直明，猪熊壽：産業動物臨床医誌，7,169～174, 2016.
 佐藤裕太，前野和利，斉藤昭，中瀬愛，横山直明，
３）
猪熊壽：北獣会誌，56, 615～618, 2012.
 Neto, L. R. P., Jonsson, N. N., Ingham, A., Bunch, R.
４）J., Harrison, B. E., Barendse, W.：Immunogenetics,
64, 379～388, 2012.
 Mapholi, N. O., Maiwashe, A., Matika, O., Riggio,
５）V., Bishop, S. C., MacNeil, M. D., Banga, C., Taylor, J.
F., Dzama, K.：Ticks Tick Borne Dis, 7, 487～497,
2016.
 Junqueira, V. S., Cardoso, F. F., Oliveira, M. M.,
６）Sollero, B. P., Silva, F. F., Lopes, P. S.： J Anim
Breed Genet, 134, 14～26, 2017.

© The Ito Foundation

128

地鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺伝的多型の探索（Ⅱ）
The search for genetic polymorphisms involved in behavioral stressresponse in slow-growing meat type chickens（II）

青

谷

大

希

（秋田県畜産試験場）

Daiki Aoya
（Akita Prefectural Livestock Experiment Station）

This study was conducted for two aims；Experiment 1：To verify the accuracy of
frequencies of genetic variants estimated by whole-genome sequencing of bulked DNA
samples reported in a previous study; Experiment 2：To identify behavioral stress response
related genes in Jidori based on the results of previous study．
Ten loci were selected for this study from the candidate regions detected in the previous
study. In Experiment 1, 61 female Hinai-Jidori chickens used for gene analysis in the previous
study were individually genotyped by allele-specific PCR. In Experiment 2, 39 newly hatchedfemale Hinai-Jidori chicks were subjected to behavioral test and subsequent genotyping．
In Experiment 1, the variants frequencies obtained by the two methods showed asignificant and strong positive correlation. This result indicates that whole-genome sequencingof bulked DNA sample is practical for estimating the variants frequency in a population. In
Experiment 2, no significant association was found between the score of behavioral test andthe genotype of the candidate region. Further investigation for other candidate regions isneeded to clarify the behavioral stress response-related genes in Jidori．

１．目ては圧死事故の発生が大きな問題となっている。

的

そこで申請研究者は，圧死事故の発生に関与す

本研究は，地鶏産業における生産性向上に資すると考えられる行動的ストレス反応性に着目し，るため，鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺鶏における行動的ストレス反応性の品種間差や生伝子を探索する試みである。

産性との関連について調査を行い，比内地鶏の初

現在，全国各地において，在来種や日本鶏を交生時における行動的ストレス反応性と，その後の配に利用した地鶏が生産されている。地鶏は日本

発育や悪癖（つつき；feather pecking）の発生

農林規格等の飼養基準によって，平飼いや放し飼との間に有意な関連があることを明らかにした。

いにより飼養することとされており，鶏が自由に

さらに，初生時のストレス反応性には，遺伝的な運動できることから，歯ごたえのある締まった肉

要因が大きく影響していると推察されることか質が評価されている一方で，その育成過程においら，育種への応用を目指し，平成29年度の本財団© The Ito Foundation

129

地鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺伝的多型の探索（Ⅱ）

助成研究により，鶏の行動的ストレス反応性関連査した個体について多型判定を行い，行動反応試

遺伝子のスクリーニング調査を試みた 。その方験の結果との関連解析を行った。

１）

法と結果について次に示す。

法

２．方

はじめに，これまでに行動反応試験に供した
882個体のデータを用いて，行動的ストレス反応

2 . 1 先行研究において用いた手法の精度の検証

性の異なる２つの仮想の調査群（ｎ＝31または

2.1.130）を作出した。続いて，各個体の血液サンプル

先行研究において集団内遺伝子変異頻度を調査

からDNAを抽出して調査群ごとに等量ずつ混合した２つの群のいずれかに選抜された比内地鶏メ

し，DNAバルクサンプルを調製した。DNAバル

ス61羽の血液サンプルをDNA抽出に供した。

材

料

クサンプルを，次世代シーケンサーを用いた全ゲ

2.1.2

DNAサンプルの調製

ノムシークエンス解析に供し，得られたリードを各 個 体 の 血 液 サ ン プ ル か ら DNeasy Blood &セキショクヤケイのゲノムを参照配列としてマッTissue Kit（キアゲン

ピ ン グ し た 。情 報 解 析 に よ り 検 出 さ れ た 変 異

い て ゲ ノ ム DNA を 抽 出 し た 。溶 媒 は 蒸 留 水（SNP；一塩基多型，挿入および欠失）のうち，（UltraPure TM DNase/RNase-Free Distilled

変異の影響度が大きいと推測されたものを抽出

Water サーモフィッシャーサイエンティフィッ

し，当該部位における冗長度に占める変異塩基のク割合を調査群における変異の頻度と仮定して，カDNAサンプルは濃度を20ng/μｌに調整した。

ウォルサム

ヒルデン

ドイツ）を用アメリカ）とした。抽出したイ二乗検定により，変異頻度のちがいを検定し2.1.3

た。その結果として，変異の影響度が大きく，か多型判定を行う座位は先行研究の結果をもとにつ有意に変異頻度が異なる多型が2,732座位検出

Table１に示す10座位を選定した。選定にあたっされた。

ては，両群における変異頻度の比および遺伝子のこの先行研究により地鶏における行動的ストレ

解析する座位の選定

機能を考慮した。

ス反応性関連遺伝子に関する基礎的な知見が得ら

2.1.4

れたが，この方法は次世代シークエンス解析にお多型の判定はアリル特異的PCR２）とアガロース

ける冗長度を利用して両群の変異頻度を仮定した

ゲル電気泳動により行った。プライマーの設計はものであり，各群における真の変異頻度をどの程

株式会社リーゾ（つくば市）に委託した。プライ

度正確に表しているかは不明である。また，関連

マーの配列ならびにアニーリング温度をTable２

遺伝子を特定するためには，遺伝的多型と行動的に示す。

ストレス反応性との関連について，個体レベルの2.1.5

解析を行う必要がある。そこで本研究では，まず，PCR反応液は１ウェルあたり５units/μl HiDi

先行研究により見出した行動的ストレス反応性関DNA Polymerase 0.2μL，酵素添付の10x Reaction

連遺伝子候補領域の中から10座位を選定し，先行

Buffer（ともにマイポルスバイオテック

研究において変異頻度を調査した２つの群についタンツ

プライマーの設計

アリル特異的PCR

コンスドイツ）２μL，２mM dNTPs（東洋紡て，個体レベルで多型判定を行い，先行研究で用大阪市）２μl，10μＭプライマー各0.4μl，テ

いた手法の精度について検証した。続いて，新規

ンプレートDNA２μl，蒸留水13μlにより調製しに行動反応試験により行動的ストレス反応性を調た。PCRプロトコルは酵素の標準に従い，初期変© The Ito Foundation

130

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 1 Candidate regions for behavioral stress response-related genes in Hinai-Jidori chicken.
Locus

Chromosome

Position

REF

1

7

21292638C

ALT

Change Type

Description

2271510967

A

G

SNP

solute carrier family 4, sodium bicarbonate transporter,
member 10
phospholipase C, delta 33716869011

TC

T

DEL

cholinergic receptor, nicotinic, alpha 14421658159

GGA

G

DEL

glutamate receptor, ionotropic, AMPA 251111309061

T

C

SNP

monoamine oxidase A
lysine（K）-specific demethylase 8

CT

INS

6

14

7327125

G

A

SNP

7

19

170850CCTINS

MLX interacting protein-like

8
9

4
5

24073667
27353663

G
A

GGTTT
AG

INS
INS

carboxypeptidase E
mitogen-activated protein kinase kinase kinase 9-like

10

916482903

C

G

SNP

ATPase, class VI, type 11B

性95℃120秒，３ステップPCR（変性95℃15秒，において用いた手法の精度を検証した。統計処理

アニーリング10秒，伸長反応72℃30秒）とした。

にはエクセル統計（社会情報サービス

PCRのサイクル数は，座位１については野生型，ソフトウェアを用いた。

変異型ともに40サイクル，座位10の変異型につい2 . 2 新規の試験鶏における候補領域の多型とては43サイクルとし，その他のプライマーセット

行動反応試験結果との関連解析

では35サイクルとした。
2.1.6

2.2.1

遺伝子型の判定材料

令和元年６月19日にふ化した比内地鶏のメス39

PCR後の反応液を２％アガロース（Agarose S
ニッポンジーン新宿区）

羽の行動反応試験結果と血液サンプルを供試し千代田区）ゲルで電気泳動し，た。供試鶏の作出にあたっては，遺伝的な多様性

バンドの有無を確認することにより，遺伝子型をを持たせるため，当場で保有する秋田比内鶏20家

判 定 し た 。泳 動 バ ッ フ ァ ー は Tris-borate with

系のオスから精液を採取し，混合したものを人工

EDTAバッファー（タカラバイオ

授精して種卵を採取した。

草津市）と

した。

2.2.2

Tonic Immobility試験

標的とした多型に対する各プライマーセットの行動的ストレス反応性を評価するための行動反特異性を確認するため，あらかじめ全ゲノムシー

応試験として，Tonic Immobility（TI；緊張不動）

クエンス解析により当該座位の遺伝子型を個々に３）調査した標準検体を設定した。標準検体の遺伝子の誘導操作は，先行研究における方法と同一の操型について両者の結果を比較し，特異性の低かっ作により行い，不動状態の持続時間は600秒を上た座位についてはPCR条件を再検討したうえで再限として測定した。なお，本研究においては持続試験を行った。

時間が上限に達した個体は見られなかった。

2.1.7

先行研究の結果との比較試験を用いた。試験は２日齢で行った。TIへ

2.2.3

候補領域の遺伝子型判定

本研究によって得られた，候補領域10座位の各

上記2 . 1における方法と同様にDNAサンプルの群における真の変異頻度と，先行研究において調製，アリル特異的PCRおよびアガロースゲル電

DNAバルクサンプルの全ゲノムシークエンス結

気泳動によって遺伝子型を判定した。

果から仮定した遺伝子頻度について，無相関の検2.2.4

定ならびに回帰分析を行うことにより，先行研究

候補領域10座位の相加的遺伝的効果を検証する© The Ito Foundation

統計処理

131

地鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺伝的多型の探索（Ⅱ）
Table 2 Oligonucleotide primers and annealing temperature for allele specific PCR.
Locus

primer sequence（5’-3’）
WT

1
VT
WT
2
VT

F

CCATTAGATGTTTTCCCCCATAR

CCTTCTAATGTTTTTGTGAAtGg

F

CCATTAGATGTTTTCCCCCATAR

CCTTCTAATGTTTTTGTGAAcGaF

GGTGTTATGGGACGAGGAGAR

TCCATATGGGGACAACCgAt

F

GGTGTTATGGGACGAGGAGAR

TCCATATGGGGACAACCtAc

Size（bp）

Annealing（˚C）

163

55

164

55

197

55

197

55

229

62

229

62

220

60

218

60

150

60

150

60

249

55

249

55

181

60

184

60

171

62

175

62

201

60

174

60

F

CTGTGGGCAGCACGTcaCT

R

TGCCTACCACATTGATGAGC

F

CCTGTGGGCAGCACGTaCT

R

TGCCTACCACATTGATGAGCF

AAGTATCTGTACAGACAGAGgaGARFRGACATTGCCAAGGTTTTCTTTT
AAGTATCTGTACAGACAGAGGACTGACATTGCCAAGGTTTTCTTTT

F
R
F
R

TGTTGGAGGGTTAAGACTgAt
TGGGGCCAAAAGTTTGACTATGTTGGAGGGTTAAGACTgAc
TGGGGCCAAAAGTTTGACTA

F
R
F
R

GAAAAGGATAAGGCAAAcGg
AGGAGCTGGTTTTCAGTAATGAAAAGGATAAGGCAAAcGa
AGGAGCTGGTTTTCAGTAAT

F
R
F
R

ATCACCCACAGAGCCTCgTG
CCAGATGCGCAGTATGTTTG
CTGGGAGCAATTGCCTATGTTGGGATCCGTCCTTCTCgAa

F
R
F
R

GAAGGCAGCATCACAGGTAA
AGGTGCTCAGAGTCCTGTCCGAAGGCAGCATCACAGgttt
AGGTGCTCAGAGTCCTGTCC

F
R
F
R

TGTATTTAGCTTCTTGTTATTGcGTCAAACTGGGACCAGGAGAAA
TTATCACCCTCTCAGCAGCAAGAGGACACATTTGTTTTGAAtCc

WT

F
R

GTGCGTCTTCTGTGCATATAcTc
CATCTGTGTGTCTGGCTGCT

179

51

VT

F
R

GCGTGTTTCTTCGGTAACCTGCTTTTACCATGCAAATACAgTc

171

51

WT
3
VT
WT
4
VT
WT
5
VT
WT
6
VT
WT
7
VT
WT
8
VT
WT
9
VT

10

WT：wild type. VT：variant type.
Mismatch sites are shown in lowercase character.

ため，各個体の候補領域10座位それぞれにおける分析を行った。また，変異型アリルの保有がTI

変異型アリルの保有数（０，１または２）を説明

試験の結果に及ぼす影響を検証するため，各個体

変数，TI試験により得られた，TIまでの潜時まを候補領域ごとに，野生型ホモのグループと，変たは不動状態の持続時間を目的変数として重回帰

異型ホモおよびヘテロのグループに分け，潜時，© The Ito Foundation

132

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Allele frequency（Bulk）

0.5
0.4
0.3
y = 1.0849x－0.0113
R2 = 0.6317

0.2
0.1
0

0

0.1
0.2
0.3
0.4
Allele frequency（Ind）

0.5

Fig. 1 Linear regression of allele frequency obtained by whole-genome resequencingof bulked DNA sample to that calculated from result of individual genotyping.

持続時間それぞれに関して，マン・ホイットニー

かった（Data not shown）。今回解析した候補領のＵ検定を行った。統計処理にはエクセル統計ソ

域は，アノテーションにより遺伝子名が明らかに

フトウェアを用いた。

なっていた座位の中から，神経伝達物質の関連遺伝子を選定してのものであったため，今後はそれ３．結果と考察

以外の遺伝子についても広く解析を進めていく必

3 . 1 先行研究において用いた手法の精度の検証要がある。また，実験設備の都合で今回は解析対先行研究における方法によって仮定した変異頻象から除外したが，数塩基から数十塩基の欠損を度をｙ座標，本研究により得られた変異頻度をｘ持つ変異も候補領域の中に存在しており，それら

座標として，プロットした散布図をFig.１に示す。

についても検証の余地がある。以上を踏まえて引両 手 法 に よ り 得 ら れ た 変 異 頻 度 の 相 関 は 0.795

き続き地鶏の行動的ストレス反応性関連遺伝子の（ p＜0.0001）であり，有意な強い正の相関がある

探索を進めていく。

ことが確認された。また，回帰分析の結果，ｙのｘに対する回帰係数は1.0849（ p＜0.0001）と有意

４．要約であったが，決定係数は0.632と中程度であった。

本研究は２つの目的をもって遂行された。第一

これらの結果から，DNAバルクサンプルの全ゲ

は，先行研究において実施した，バルクサンプル

ノムシークエンスによる，集団における遺伝子変の全ゲノムシークエンスによる，集団における遺異頻度の推定には一定の実用性があることが実証

伝子変異頻度の推定について，その精度を検証すされた。

ること（試験１）であり，第二は，先行研究の結3 . 2 新規の試験鶏における候補領域の多型と行動反応試験結果との関連解析

果をもとに，新規に作出した比内地鶏集団を用いて，候補領域と行動的ストレス反応性との関連解

本研究において実施したいずれの解析方法にお析を行い，地鶏の行動的ストレス反応性関連遺伝

いても，今回選定した候補領域の多型と行動反応

子を特定すること（試験２）であった。先行研究

試験の結果との間には有意な関連は認められなにおいて検出した候補領域の中から10座位を選定© The Ito Foundation

地鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺伝的多型の探索（Ⅱ）

133

し，試験１では先行研究において遺伝子解析に供域の遺伝子型との間に有意な関連は認められなした比内地鶏メス61羽について，試験２では新規かった。今後は，他の候補領域についても解析をにふ化し，２日齢で行動反応試験に供した比内地

進め，引き続き地鶏における行動的ストレス反応

鶏メス39羽についてアレル特異的PCRにより，個性関連遺伝子の探索を進めていく。

体ごとの多型の判定を行った。
試験１では，先行研究に用いた個体の多型判定により得られた真の遺伝子変異頻度と，バルクサ
ンプルを用いて推定した遺伝子頻度との間には，有意な強い正の相関が認められ，集団における遺伝子変異頻度の推定に，DNAバルクサンプルの全ゲノムシークエンスが有効であることが実証さ

文
献１）
 青谷大希：地鶏の行動的ストレス反応性に関与す
る遺伝的多型の探索，平成29年度食肉に関する助成
研究調査成果報告書，36, 162～165, 2018.
２）
 成澤邦明：Allele Specific PCR（ASPCR）法，臨
床検査 43, 1641～1647, 1999.
３）
 Jones, R. B.：The tonic immobility reaction of
the domestic fowl：a review, W Poultr Sci J, 42, 82～96, 1986.

れた。試験２では行動反応試験のスコアと候補領© The Ito Foundation

134

豚の暑熱ストレス耐性マーカーの開発
Development markers associated with heat tolerance in pigs

佐

藤

周

史

（千葉科学大学危機管理学部）

Shuji Sato
（Faculty of Risk and Crisis Management, Chiba Institute of Science）

Heat stress（HS）is one of the limiting factors negatively affecting pig production, health,and fertility. Characterizing responsible genes for variation in HS tolerance would be useful indevelop genetic markers that are associated with HS could be used to select for and breed
more heat-resilient pigs. The objective of this study was to investigate and compare the effectsof HS during lactation period in 60 crossbred sows. Three fragments of heat shock protein
genes were amplified in crossbred pigs and eight single nucleotide polymorphisms（SNPs）
were identified in the noncoding and untranslated regions of heat shock protein genes. We
analyzed the eight SNPs and examined their involvement in HS tolerance in 60 crossbred sowsrecorded reproductive performance. Sows can be classified into three groups, first was
designated in summer season correspond with lactation and then artificial insemination, second
and third were before and after month. Each hour, ambient temperature humidity index（THI）
was calculated using outside temperature and relative humidity. Plasma was harvested fromsows on high THI, before and after, and assayed for concentrations of cortisol. As the results
revealed plasma concentration of cortisol was affected by summer high ambient temperatureand lactating. It is important to prevent HS through improved cooling devices and management
practices for reducing the negative impact on lactating sows during summer season. The one
SNP in heat shock protein gene, HSP90AA1 associated with plasma concentration of cortisol（ p<0.01）, genotype GA was higher level in summer season than genotype GG. Although thisSNP indicated biased allele frequency, further research on this gene would clarify the
judgment whether exclude genotype GA from the population. We presume that this SNP may
be useful in the future as molecular genetic markers to assisted selection for heat tolerance in
pig.

１．目

を招く。豚における暑熱ストレスも，生産性，抗的病性および繁殖性に影響し経済的損失につながっ家畜が受ける暑熱ストレスは，乳量の減少，飼ている。そのため，アニマルウェルフェアの考え

料摂取量の減少，顕著な増体低下，繁殖能力の低方に対応した豚の飼養管理指針では，豚にとって下および致死など，畜産業にとって経済的な損失

快適な温度域の維持のため，暑熱等対策を講じる© The Ito Foundation

豚の暑熱ストレス耐性マーカーの開発

135

よう示されており，物理的な対策が必要とされて種の交雑種母豚60頭を供試した。試験期間は，いる 。また，栄養管理による対策として，飼料

2019年７月から2020年２月までとし，この間，母摂取低減個体に対する飼料への飼料米添加技術，

豚の産歴（２～８産），産子数（総産子数，生存

繁殖能力の低下には酸化ストレスが大きく関与し産子数，死産など）を収集した。母豚は，陰圧にていることから抗酸化物質が豊富な紫黒米を給与よるウィンドレス式分娩舎，あるいは自然換気にする技術などが開発され，増体および繁殖性低下

よる開放式雌豚舎の換気システムが採用されていの抑制に利用されている２）。

る舎内で管理されている。また，血中コルチゾー

１）

一方，暑熱ストレス反応を遺伝的にコントロー

ルの測定および遺伝子型判定のため，尾静脈よりルする研究が進められている。暑熱環境下でも増２mL採血し，あらかじめ用意したヘパリンNa注体が優れる個体が選抜され熱耐性の集団が造成さ

５千単位／５mL「Ｆ」（FujiPharma）10μl入り

れていることから，熱耐性の遺伝的バリエーショ

遠沈管へ移し，保管した。なお，血液は１頭当た

ンは存在する 。そこで，暑熱ストレス反応と関り，３回（不快指数としてtemperature-humidity

連する遺伝子探索のため，牛，豚などではゲノム

index：THIを計測し，THIの高い８月，およびワイド関連解析が行われている。それらの結その前後の月）採材し，これらの日が母豚の授乳

果から，ゲノム上の関連する領域およびその領域期に当たるよう60頭を20頭ずつ３グループに設定

内の遺伝子の存在が報告されている。また，ゲノした。具体的には，グループＡ）７月に授乳期，

ム全体をスキャンする方法とは別に，牛，めん羊

グループＢ）High THIとなる８月に授乳期，グおよび鶏では，暑熱ストレス反応において機能的ループＣ）９月に授乳期の計３群を７月から９月に候補と考えられる遺伝子が調べられ，暑熱スト

までそれぞれ１ヵ月おきに採血した。各グループ

レスとの関連が報告されているについて，その後の人工授精により生産された産

３）

４～６）

。

７～12）

本研究では，豚のゲノムワイド関連解析の報告６）に基づき，有意な領域内において，他動物種で報

子数および各時期の血中コルチゾール濃度を解析に用いた。

告のある暑熱ストレス反応と関連する３つの遺伝

2.2

子，DNAJA4，HSP90AA1およびHSP90AB1に血中のコルチゾールをELISAキット（Cortisol

着目し，遺伝子の多型とストレス指標であるコルEIA Kit, DetectX, Arbor Assays, United States

チゾールの関連性を調べるとともに，産子数のよof America）に よ り 測 定 し た 。具 体 的 に は ，うな繁殖性との関連についても調査する。対象集

1,500rpm10分間の遠心分離で得られた血漿のう団における暑熱ストレス耐性マーカーの開発を目

ち10μlを用いて，Dissociation Reagent 10μl，お的とし，暑熱ストレス反応にかかわる遺伝子を検よびAssay Buffer 280μlと混合し30倍希釈とした出，熱耐性の集団が効率的に造成できる技術の確後，50μl使用した。以降，キットのプロトコー

立を目指す。

ルに沿って進め，マイクロプレートリーダーを用

２．方
2.1

コルチゾール測定とTHI

いて，波長450nm OD値を測定し，それら測定値

法からMyassaysオンラインツール（www.myassays.
com/arbor-assays-detectx-cortisol-（extended-

供試動物千葉県旭市の有限会社Pig Fertilize松ケ谷にて

range）.assay）によって検量線を作成し，コルチ繋養されているランドレース種と大ヨークシャー

ゾール濃度を換算した。なお，各サンプルおよび© The Ito Foundation

136

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

スタンダードは２回重複して測定した。

Cartridge（EdgeBio）で余計な低分子物質など

温湿度については，気象庁の千葉県銚子市のを除去後，ABI3130 Genetic Analyzer（Thermo

デ ー タ を 用 い て ，THI を 算 出 し た 。計 算 式 はFisher Scientific）により塩基配列を決定した。

Crossら一方，HSP90AA1およびHSP90AB1のPCR産物

による。

６）

（0.55－（0.0055ｘ湿度））
THI（℃）＝気温－

は，電気泳動後，ゲルから目的とするフラグメンｘ（気温－14.5）

ト を 切 り 出 し ， Nucleospin PCR clean-up Gel

THIのカテゴリーとしては，正常（23.33℃未満），警戒（23.33以上26.11℃未満），危険（26.11

extraction（Macherey-Nagel）を用いて精製し，
前述同様，塩基配列を決定した。

以上28.88℃未満），および非常事態（28.88℃以上）

2.4の４段階とした。

７月から９月に測定したコルチゾール濃度は，

2.3

統計解析

各グループにおいて採血時期の有意差検定に分散

遺伝子型判定全血から白血球を回収し，フェノール法により分析を実施した。また，３つの遺伝子の各遺伝子

DNAを抽出した。DNAJA4，HSP90AA1および型 と コ ル チ ゾ ー ル 値 の 関 連 性 は ，分 散 分 析 と

HSP90AB1のPCR，ダイレクトシーケンシング

Tukeyの多重比較検定を実施した。さらに，繁殖法により多型を調査した。PCRに用いたプライ

成績とコルチゾール濃度の相関を算出した。

マー（Eurofins）は，Table１に示す。酵素は，３．結果と考察

KOD-FX（ToYoBo）を用い，PCRは，94℃２分の熱変性後，98℃10秒，60℃30秒，68℃30秒を30

3.1

血中コルチゾールとTHIの関連サイクルのプログラムとした。

７月に分娩したグループＡの血中コルチゾール

DNAJ4 の PCR 産 物 は ， Exo-CIP Rapid PCR

濃度は，７月に24.8±8.64pg/μLと高い状態にあCleanup Kit （New England Biolabs） に よ り 精り，９月の14.9±4.42pg/μLとの間に有意差が認

製し，ダイレクトシーケンシングに用いた。具体められた（ p＜0.05；Fig.１）。８月に分娩したグ

的には，PCR産物５μlにExo-CIP A 1μl，Exo-

ループＢでは，８月に24.2±17.93pg/μLと高い状

CIP B 1μlを添加し，37℃４分，次いで80℃１分

態にあり，前後の月と比較して高い傾向がみられで失活させた。精製したうちの３μlは，dGTP

た。９月に分娩したグループＣでは，９月に26.4

BrilliantDye Terminator Cycle Sequencing Kit±13.16pg/μLと高い状態にあり，７月の15.8±

v3.1（EdgeBio）により蛍光標識し，Gel Filtration

5.67pg/μLとの間に有意差が認められた（ p＜Table 1 Primers for comparative sequencing of heat shock protein genes
Forward primer（5’-3’）

Reverse primer（5’-3’）

Size（bp）

Tm（℃）

Acc No.

SNPs

Position

DNAJA4Gene
intron 1

agctccggggagtcagat

tgggtctccttcaccatctt

423

60

CU467054

1 SNP

159,124 G>T

HSP90AA1

5’ UTR

ttccgagctctgttcacggt

cagcagcttgtacagacctt

549

60

CU633632

3 SNPs91,753 A>G
91,769 A>G91,802 G>AHSP90AB1

5’ UTR

ctcccggagattcaagcata

cgtggctctagggaacagaa

518

60

CT009542

4 SNPs51,934 A>G
52,039 G>A
52,074 G>A
52,284 A>G© The Ito Foundation

137

豚の暑熱ストレス耐性マーカーの開発
35

＊
＊＊

30

Cortisol, pg/μL

25
20
15
10
5
0
7/8

8/12

9/13

Fig. 1 Concentration of plasma cortisol in hot season（8/12）, before（7/8）and after（9/13）corresponding to eachgroup. Group A refers to lactation period in early July, Group B refers to lactation period in early August, andGroup C refers to lactation period in early September．＊ p＜0.05，＊＊ p＜0.01. Bars＝standard error（mean±SE）.

0.01；Fig.１）。このように分娩・授乳期を迎える

精により交配，分娩した。供試母豚の系統や産次月における母豚の血中コルチゾール濃度が高く，がさまざまであるため，分娩成績には明確な有意また，THIが上昇した８月では分娩・授乳の有無差は認められなかったが，グループＣの総産子にかかわらず，すべてのグループで同程度の高い数，生存産子数ともに比較的高い傾向を示した

血中コルチゾール濃度が認められた。

（Fig.３）。また，母豚の繁殖成績と血中コルチゾー

THIについて，グループＡの授乳期間の各カテ

ル濃度の間には，相関は認められなかった。

ゴリー頻度は，正常0.724，警戒0.238，危険0.038

3.3であり，グループＣの正常0.536，警戒0.257，危

３つのHeat Shock Protein遺伝子，DNAJA4，

険0.103，非常事態0.004と同様な傾向を示す一方，

HSP90AA1およびHSP90AB1の多型を調べた結グループＢは，正常0.064，警戒0.663，危険0.264，

果，1 SNP，3 SNPs，4 SNPsがそれぞれ検出さ非常事態0.010であり，授乳期間に強い暑熱スト

れ た （Table ２）。 そ の う ち ， HSP90AB1 の 3

レスも受けていたと考えられた。

SNPs（rs332821014, rs326194268, rs340238587）

3.2

THIと母豚の繁殖成績の関連

遺伝子型と血中コルチゾールの関連

は，連鎖不平衡の関係にあること，また，検出し７月初旬から中旬までは，THIのカテゴリーがたすべての多型の遺伝子型頻度から，ハーディー

正常もしくは警戒レベルであったが，７月下旬か

ワインベルグ平衡にあることも明らかとなった。

ら８月中旬にかけて，危険レベルに達し，非常事

分散分析の結果，８月の血中コルチゾール濃度が態レベルを示す日も確認された。９月中旬から

HSP90AA1の多型91,802G>Aにおいて有意差がは，正常レベルに戻ることが確認された（Fig.

認められた（ p＜0.01）。遺伝子型GAがGGよりも２）。各時期で授乳期を経た３グループが人工授

血中コルチゾール濃度が高く，暑熱への感受性を© The Ito Foundation

138

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

35

35

30

30

25

25

20

20

15

15

Group A lactation

19

20

20

20

THI

20

19

/8
/
19 1
2 0 /8 /19 3
2 0 /8 /5
19
2 0 /8 /19 7
2 0 /81 9 /92 0 /8 /1
19 1
2 0 /8 /1
19 3
2 0 /8 /19 15/
2 0 8 /1
19 7
/
20 8/
19 19
/
2 0 8 /2
19 1
2 0 /8 /19 23/
2 0 8 /2
19 5
2 0 /8 /19 27
2 0 /8 /
19 29
/8
/3
1

10

/7
/
19 1
2 0 /7 /19 3
2 0 /7 /5
19
2 0 /7 /1 7
20 9/71 9 /92 0 /7 /1
19 1
2 0 /7 /1
19 3
2 0 /7 /19 15/
2 0 7 /1
19 7
2 0 /7 /19 19/
2 0 7 /2
19 1
2 0 /7 /19 23/
2 0 7 /2
19 5
2 0 /7 /19 27
2 0 /7 /
19 29
/7
/3
1

10

Group B lactation

35

35

30

30

25

25

20

20

15

15

Group C lactation

/1

19

19

20

20

20

19

20 /9/
19 3
20 /9/5
19
20 /9/
1 7
20 9/919 /9
20 /9/1
19 1
20 /9/1
19 3
20 /9/
19 15/
20 9/119 7
20 /9/
19 19/
20 9/219 1
20 /9/
19 23/
20 9/219 5
20 /9/
19 27
/9
/2
9

/1
/9
19
20

0/
1
20 /1019 /3
20 /10
19 /5
20 /101 /20 9/1 719 0/
920 /1019 /11
20 /10
19 /1
20 /10 3
19 /1/ 5
20 10/
19 17
20 /1019 /1/ 9
20 10/
19 21
20 /10
19 /2
/ 3
20 10
19 /2520 /1019 /2
7
20 /10
19 /2
/1 9
0/
31

10

10

Fig. 2 Plot of temperature-humidity index（THI）from July to OctoberTriangle＝sampling. Straight line＝THI 26.11, category “Danger”. Bold line＝average daily THI. Dashed line＝maximum daily THI.

25

Total number born

20
15

10

5

0

group A

group B

group C

Fig. 3 Boxplot of total number of born piglets in the reproductive season. The minimum, first quartile, median, third

quartile and maximum are indicated with the box and whiskers with outliers. The mean is plotted as cross mark.

示したが，遺伝子型GAを保有する個体が１頭のみであり，76.11pg/μLと高いことに起因する。
さらに，この個体は受胎しなかったことで淘汰さする必要がある。
４．要

約

れており，分娩成績は得られなかった。今後，調本研究では，豚の暑熱ストレスへの耐性マー

査対象を増頭し，遺伝子型GAの効果を明らかにカーを開発し，強健性と生産性の改善を目指すた© The Ito Foundation

139

豚の暑熱ストレス耐性マーカーの開発
Table 2 Genotype and allele frequencies in each single nucleotide polymorphisms
Gene

SNP

DNAJA4rs708056267

G>T

HSP90AA1

CU633632

91,753 A>G
91,769 A>GHSP90AB1

rs332821014
rs80867856

Genotype

Allele frequency

GG

GT

TT

G

T

9

23

28

0.342

0.658

AA

AG

GG

A

G

51

9

0

0.925

0.075

AA

AG

GG

A

G

HWE
p = 0.7-0.5

p = 0.9-0.8

38

20

2

0.8

0.2

GG

GA

AA

G

A

91,802 G>A

59

1

0

0.992

0.008

p > 0.99

A>G

AA
51

AG
7

GG
2

A
0.908

G
0.092

p = 0.1-0.05

GG

GA

AA

G

A

G>A

rs326194268

G>A

rs340238587

A>G

55

5

0

0.958

0.042

GG

GA

AA

G

A

51
AA
51

7
AG
7

2
GG
2

0.908
A
0.908

0.092
G
0.092

め，暑熱ストレスのゲノムワイド関連解析の研究
報告に基づき，有意な領域内において，暑熱スト
レス反応と関連する３つの遺伝子，DNAJA4，
HSP90AA1およびHSP90AB1に着目し，遺伝子の多型とストレス指標であるコルチゾールの関連性を調べるとともに，産子数のような繁殖性との関連についても調査した。また，THI，コルチゾー
ルおよび繁殖性の関連も調査した。
その結果，授乳と暑熱により母豚のコルチゾー
ル濃度が上昇し，ストレスを受けていることが明らかとなった。暑熱期に授乳することになる母豚において，十分な暑熱対策を講じることが必要であり，授乳期間と暑熱期が分散できれば，次の分娩成績の向上が見込まれる。また，血中コルチ
ゾール濃度と関連がみられたHSP90AA1は，遺伝子型GAでは暑熱期に血中コルチゾール濃度が非常に高く，暑熱への感受性を示したが，頻度が偏っているため，集団からこの遺伝子型を排除すべきか否か判断するにはさらなる研究が必要である。
文献１） 公益社団法人畜産技術協会：アニマルウェルフェ

p = 0.95-0.9

p = 0.95-0.9
（LD）
（LD）

アの向上を目指して 豚．
２） 松本光史，井上寛暁，山崎信，村上斉，梶雄次：
日本養豚学会誌，49, 109～116, 2012.
３） Hoffmann, I.：Animal Genetics, 41, 32～46, 2010.
４） Dikmen, S., Cole, J. B., Null, D. J., Hansen, P. J.：
Plos One, 8, e69202, 2013.
５） Kim, K-S., Seibert, J. T., Edea. Z., Graves, K. L.,
Kim, E-S., Keating, A. F., Baumgard, L. H., Ross, J.
W., Rothschild, M. F.： Journal of Animal Science,
96, 2074～2085, 2018.
６） Cross, A. J., Keel, B. N., Brown-Brandl, T. M.,
Cassady, J. P., Rohrer, G. A.：Genetics Selection
Evolution, 50, 11, 2018.
７） Basirico, L., Morera, P., Primi, V., Lacetera, N.,N a r d o n e , A . , B e r n a b u c c i , U . ：C e l l S t r e s s
Chaperones, 16, 441～448, 2011.
８） Charoensook, R., Gatphayak, K., Sharifi, A. R.,
Chaisongkram, C., Brenig, B., Knorr, C.：TropicalAnimal Health and Production, 44, 921～928, 2012.
９） Collier, R. J., Collier, J. L., Rhoads, R. P.,
Baumgard, L. H.： Journal of Dairy Science, 91, 445～454, 2008.
10） Marcos-Carcavilla, A., Mutikainen, M., Gonzalez,C., Calvo, J. H., Kantanen, J., Sanz, A., Marzanov, N.
S., Perez-Guzman, M. D., Serrano, M.：Cell Stress
Chaperones, 15, 67～81, 2010.
11） Seibert, J. T., Adur, M. K., Schultz, R. B., Thomas,
P. Q., Kiefer, Z. E., Keating, A. F., Baumgard, L. H.,
Ross, J. W.： Journal of Animal Science, 97, 4965～
4973, 2019.
12） Wang, S-H., Cheng, C-Y., Tang, P-C., Chen, C-F.,
Chen, H-H., Lee, Y-P., Huang, S-Y.：Theriogenology,
79, 374～382, 2013.

© The Ito Foundation

140

牛の暑熱ストレス耐性を担うHSP70.1遺伝子多型に関する研究（Ⅱ）
The study of polymorphism in the bovine HSP70.1 gene associated withthermotolerance（Ⅱ）

森

美幸・上田

修二・林

武司・和田

卓也

（福岡県農林業総合試験場）

Miyuki Mori, Shuji Ueda, Takeshi Hayashi and Takuya Wada
（Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center）

Single nucleotide polymorphisms（SNPs）located in the partial regions of 5’ untranslated
regions（UTR）of Heat Shock Protein 70.1（HSP70.1）gene was detected by cumulus cells,
blastocyst, frozen semen in Japanese black and hair roots in Holstein cows. One deletion atbase position g.895 and three SNPs（g.1125 A/C, g.1128 G/T, g.1204 T/C）detected in 5’UTR
have relation of the linkage disequilibrium by clustering analysis. And then, the effect of heatshock to frozen-thawed in vitro derived blastocyst on survivability, frozen-thawed semen on
survivability and sperm motility and conception rate of embryo tansfer during summer season
was investigated. The survival rate of frozen thawed embryos that have haplotype（g.895 C-,
g.1125 AC, g.1128 GT）were lower than that of haplotype（g.895 CC, g.1125 AA, g.1128 GG）
and（g.895 CC, C-, --, g.1125 CC, g.1128 TT）by heat shock treatment. The viability of post
thawed semen with allele type C- of g.895 was tended to decrease dramatically compared toallele type CC of g.895. The conception rate of cows with haplotype（g.1125 CC, g.1128 TT,
g.1204 CC）were tended to higher than other genotypes. This study suggests that theseinformation of HSP70.1 SNPs（haplotype）may be useful as a genetic marker to evaluation ofheat tolerance.

１．目

ためには，耐暑性に優れる個体の選抜や育種とい的う戦略が有効であると考えられる。

暑熱は生体にストレスを与え，国内においても熱ショックタンパク質HSP70.1は，細胞質に存

猛暑下では乳牛はもとより肉用牛においても発情在する分子シャペロンタンパク質であり，生命活

微弱化，交配実施頭数の減少，受胎率低下が起こ動を担うさまざまなタンパク質を熱変性から保ることが報告されている。一方で，現場では護，修復する役割を持つ。申請者はこれまでの研

夏季の繁殖成績には個体差が認められることがあ

究 で ，夏 季 の 牛 子 宮 内 膜 上 皮 細 胞 に お け る

り，個体の遺伝的差異が高温感受性になんらかの

HSP70.1遺伝子の発現増加，着床関連遺伝子の影響を及ぼしている可能性が示唆される。そのた発現低下が起こることを明らかにしている。国外

め，暑熱による生産性低下という問題を克服するに お い て は ，HSP70.1 遺 伝 子 多 型（HSP70.1-

１，２）© The Ito Foundation

牛の暑熱ストレス耐性を担うHSP70.1遺伝子多型に関する研究（Ⅱ）141

SNPs）と乳牛の供用年数や交雑種の子牛生産率，ローに封入，プログラムフリーザーを用いて緩慢

直腸温度との関連を示唆する報告がある。こ法にて0.3℃／分で－30℃まで冷却した後，液体

れらは，HSP70.1遺伝子多型が母胎や胚の高温

窒素中で保存した。凍結保存した胚は融解し，高感受性に関与することを示唆すると考えられる

温負荷試験に供試した後，１個ずつサンプリング

が，個体の暑熱ストレス耐性や繁殖性との関連にし，NucleoSpin Tissue XS（タカラバイオ）を用ついては不明な点が多い。また，HSP70.1-SNPs

いてDNAを抽出した。HSP70.1遺伝子の非翻訳

３～５）のアレル頻度は品種や生息地域により異なるが

領 域 5’UTR （GenBank accession No M98823.1）

６），国内の主要な肉用種である黒毛和種についての 一 部 配 列 を 特 異 的 プ ラ イ マ ー （F：は，これまで明らかにされていなかった。申請者

G C C A G G A A A C C A G A G A C A G A ，Ｒ：は，黒毛和種のHSP70.1遺伝子の非翻訳領域に

CCTACGCAGG AGTAGGTGGT）を用いてPCR

複数のハプロタイプを含む多型（SNPs）が存在増幅した。増幅産物をExoSAP-IT Express PCRすること，末梢血単核細胞を用いた高温負荷試験

Cleanup Reagents（サーモフィッシャーサイエ

では，ハプロタイプにより細胞の生存率に違いがン テ ィ フ ィ ッ ク）で 精 製 後 ，DNA シ ー ケ ン ス

認められることを明らかにした 。

（ユーロフィンジェノミクス株式会社）により

７）

本研究では，HSP70.1遺伝子多型（ハプロタイプ）と繁殖機能に着目した高温耐性との関連について明らかにするため，胚と精子の生存性と高SNPsの検出およびアレル頻度について調べた（Table１）。
2 . 1 . 2 精子からのHSP70.1-5’UTR配列情報の取得

温耐性，夏季の雌牛の受胎率について調べた。
２．方

市販の黒毛和種凍結精液１本を37℃の温湯にて法

融解，DPBSで洗浄した。Buffer GuSXを用いて

2 . 1 HSP70.1遺伝子多型（ハプロタイプ）情Tissueを用いてDNAを抽出した。HSP70.1遺伝報の取得
2 . 1 . 1 黒 毛 和 種 卵 丘 細 胞 お よ び 胚 か ら の食肉処理場由来の黒毛和種雌牛卵巣から卵子を６～７子の5’UTR領域のDNA増幅およびDNAシーケン
スについては，2 . 1 . 1と同様に行った。

HSP70.1-5’UTR配列情報の取得
採取，周囲の卵丘細胞１×10

前処理をオーバーナイトで行った後，Nucleospin

2 . 1 . 3 毛根からのHSP70.1-5’UTR配列情報の取得個程度を体外受

精直前に回収し，－80℃で保存した後NucleoSpin

体外受精胚の移植を実施した県内酪農家飼養のTissue（タカラバイオ）を用いてDNA抽出を行っホルスタイン種雌牛17頭より毛根50～80本を採取た。また，体外受精胚を凍結保存，融解して高温

し，NucleoSpin Tissueを用いてDNAを抽出した。

負荷試験に供試した後，DNAを抽出した。卵巣HSP70.1遺伝子の5’UTR領域のDNA増幅およびから個体別に卵子を採取，培養（個体別培養）あDNAシーケンスについては，2 . 1 . 1と同様に行っ

るいは複数の個体から集めた卵子を１ウェルあた

た。

り平均50個ずつ培養（集団培養）し，成熟培養，

2.2

市販の凍結精液を用いて体外受精後８日目まで発2.2.1

生培養を行った。受精後７あるいは８日目に胚盤

2 . 1 . 1にて個体別あるいは集団培養により体外胞まで発育した胚を凍結液に浸し，胚移植用スト

受精，発生培養，凍結保存した胚盤胞を30～35℃© The Ito Foundation

高温耐性評価胚における評価142

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 1 Genotype of HSP70.1-SNPs at 5’UTR
Genotype frequency（％）
Position

895

C/Del

983

C/T

1036

C/T

1045

G/A

1058

A/G

1076

G/A

1096

A/G

1117

Japanese Black

SNPs

G/A

CC

♂

♀

♀

Bull’s semen

Cumulus cells or blastocyst

Recipients

C30.0

CC

-10.0
TT
10.0

CC

10.0

TT

CC

CT
80.0

GG

10.0
GA

70.0
AA
GG

AA

AG

10.0

AA
10.0

GA
50.0

40.0

AA
20.0

AC

GG

GT

1125

A/C

1128

G/T

1132

A/G

AA
80.0

AG

1134

T/C

TT
70.0

TC

1138

C/T

CC

CT

1154

C/G

1204

T/C

30.0

80.0

GG

GA

CC

AA
28.8

AC
GT

50.0

40.0

40.0
TT
20.0

GG

50.0

GG

AA
86.5

AG

10.0
0

TT
67.3

TC

30.0

TT
10.0

CC

CT

10.0
-

34.6

TC

CC
10.0

70.0

GG

AA
94.1

AG

AA
13.5

GG

GA

CC

AA
11.8

AC

GG

GT

13.5

0

36.5
28.8

42.3

38.5

TT
26.9

5.9
CC

23.5

64.7

29.4

TT
52.9

7.7
5.8

TT
7.7

7.7

GG
13.5

CC

CG

0

94.1

27.3

TT
11.8

CC
36.4

5.9
AA

0

17.6

CC

TC

GG
0

94.1

GG

CG

TT
36.4

7.7

26.9

86.5
TT
20.0

AA

5.8

84.6
CC

9.6

5.8

AA
10.0

CC

GG

GA
AG

5.8

5.8

AA
86.5

10.0

AA

AG

86.5

7.7

30.8

84.6

41.2

-

TT

GA

-35.3

7.7

7.7

63.5

C23.5

TT

CT

GG

CC
23.1

7.7

84.6

AA
10.0

GG

CT

GG

GG

-34.6

84.6

0

10.0
GA

80.0

C42.3

10.0

30.0

80.0

CC

60.0
CT

80.0
CC

Holstein

GG
0

TC

5.9
CC

11.8

76.5

Shaded SNPs of g.895 C/DEL, g.1125 A/C, g.1128 G/T, g.1204 T/C have relation of the linkage disequilibrium by clustering analysis.

の温湯にて融解し，38.5℃５％CO２で平衡化した

2.2.2

回復培地20％牛胎仔血清，100μMシステアミン

凍結精液を37℃の温湯で融解後，５mMカフェ

添 加 199 に 移 し ，恒 温 槽（Major Science）に てイン，５mMテオフィリン加BO液８）にて洗浄し，38.5℃（対照区）または41.0℃（試験区）で６時

20×10 ６ 個/mlに調整後，20mg/ml BSA，5μg/

間高温負荷処理を行った。処理後は38.5℃にて融mlヘパリン添加BO液にて等量希釈した。恒温槽

解後48時間まで培養を継続して胚の形態を実体顕にて38.5℃（対照区）または41.0℃（試験区）で微鏡にて観察し，生存率を調査した。

３時間高温負荷処理を行い，精液性状検査板（富精子における評価

士平工業株式会社）を用いて０～３時間後におけ© The Ito Foundation

牛の暑熱ストレス耐性を担うHSP70.1遺伝子多型に関する研究（Ⅱ）

る精子生存率および前進運動率を調査した。
2.2.3

受胎調査

143

3 . 2 HSP70.1遺伝子多型（ハプロタイプ）と高温耐性

2019年７～９月に当場常法にて作出した黒毛和3 . 2 . 1 胚におけるHSP70.1遺伝子多型（ハプ種の体外受精由来凍結胚２個を，県内酪農家飼養ロタイプ）と高温耐性

ホルスタイン種雌牛に直腸腟法にて移植した。７

本試験では個体別培養を行い卵丘細胞から母月１日から９月20日の期間に計17頭に胚移植を実側，体外受精で用いた精子から父側，そして胚の施，胎膜スリップ法にて妊娠鑑定を実施した。

HSP70.1-SNPs情報の取得を試みた。しかし，個体別培養では高温負荷処理の有無に関わらず胚の３．結果と考察3.1

凍結融解後の生存率が低く，48時間における生存

HSP70.1遺伝子多型（HSP70.1-SNPs）

率は試験区で11.1％，対照区で18.8％であり，融黒毛和種の卵丘細胞，胚，精子，ホルスタイン

解後に一旦生存・回復を確認できても48時間まで雌牛の毛根から抽出したDNAよりHSP70.1遺伝に死滅する胚が多くを占めた。個体別培養では１子5’UTRの多型（HSP70.1-SNPs）を検出できた

ウェルで培養する卵子の数が通常の集団培養と比（Table１）。卵丘細胞，精子，毛根からはすべて

べて少ない。体外受精胚では培養する胚の個数がの供試サンプルから配列情報を取得できた。胚に少ない場合，集団培養と比べて胚発生率が低いとついては，43個中40個の配列情報を取得できた。

いう報告がある９）。本試験での個体別培養での胚

黒毛和種の卵丘細胞および胚においては，g.895

発生率は平均16％（データ略）と，凍結融解後の（C/DEL），g.983（C/T），g.1036（C/T），g.1045

生存率，脱出率ともに当場常法の集団培養で作出（G/A）， g.1058 （A/G）， g.1076 （G/A）， g.1096

した胚と比較しても低いことから，個体別培養に（A/G），g.1117（G/A），g.1125（A/C），g.1128（G/よる胚の高温耐性評価には培養方法の検討や新鮮T），g.1132（A/G），g.1134（T/C），g.1154（C/G），

胚での比較が必要である。一方，集団培養によりg.1204（T/C）の計15か所，黒毛和種精液10頭か作出した胚盤胞については母親の遺伝的情報は特らは，そのうちのg.1096（A/G），g.1154（C/G）

定できないが，胚１個からHSP70.1-SNPs情報をを除く計13か所に多型が検出された。胚移植供試取得できたことから（Table１，２），本手法によ牛であるホルスタイン種雌牛からは，g.895（C/り個々の胚のHSP70.1-SNPsと生存性評価の解DEL），g.1096（A/G），g.1117（G/A），g.1125（A/析が可能であることが明らかとなった。生存胚がC），g.1128（G/T），g.1154（C/G），g.1204（T/C）

得られた個別培養胚のロットおよび集団培養胚のの計７か所に多型が検出された。これらをクラス

HSP70.1-SNPsについて，類似度の高いg.895，

ター分析したところ，g.895，g.1125，g.1128，g.1204

g.1125，g.1128，g.1204に着目し，ハプロタイプの４か所については類似度が高く，連鎖不平衡のとして胚の生存性との関連を調べた。本試験で作関係，つまりハプロタイプであると推定された出した胚ではg.1204のアレル頻度にCCホモ型が（データ略）。この結果は，平成30年度の黒毛和種

多く認められた（Table２）。このことは，体外授

雌牛卵巣を用いた解析結果と同様であった 。

精に供試した種雄牛のg.1204のアレルがCCホモ７）型であったことに起因する。このため，g.895，
g.1125，g.1128の３か所あるいは２か所の遺伝子型で分類したハプロタイプＡ（g.895 CC，g.1125© The Ito Foundation

144

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 2 Genotypes of four HSP70.1-SNPs at 5’UTR
Breed

Cells

No.

）

Blastocyst, control 2）

Blastocyst, Heat shock treatment 2

Japanese Black（ Semen）Bull（ hair roots）
Recipients cows

Holstein

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
1
2
3
4
5
6
71）
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

g.895
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CCCCCCCCC----CC
CC
CC
CC
CC
CCCCC-CCC-----CCC
CC
CC
CCCCCC-CC
CC
CC
CC
CCCCCC--------

Positiong.1125g.1128
AA
GG
AA
GG
AA
GG
AA
GG
AC
GG
CC
GG
AA
GT
AC
GT
AA
GT
AC
GT
AC
GT
AC
GT
AC
GT
CC
GT
CC
GT
CC
TT
CC
GG
AC
GT
CC
TT
CC
TT
AA
GG
AA
GG
AA
GG
AA
GG
AA
GG
AC
GT
AC
GT
AC
GT
AC
GT
AC
GT
CC
TT
CC
TT
CC
TT
CC
TT
CC
TT
CC
TT
CC
TT
CC
TT
CC
TT
CC
GT
AA
GG
AA
GG
CC
GG
AC
GT
AC
GT
AC
GT
AC
GT
CC
GT
CC
TT
CC
TT
AA
GG
AA
GG
CC
GG
CC
TT
AC
GT
AC
GT
AC
GT
AC
GT
CC
GT
CC
TT
CC
TT
CC
TT
CC
TT
CC
TT
CC
TT
CC
TT
CC
TT

1）No.7 was used for IVF experiments.
2）Cultured at 38.5℃ after thawing as a control.
3）Cultured at 41℃ for 6h after thawing.

g.1204
TC
TC
CC
CC
TC
CC
CC
TC
CC
CC
CC
CC
CC
TC
CC
CC
TC
CC
CC
CC
T
Y
Y
CC
CC
TT
TC
TC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
TT
CC
CC
CC
CC
CC
TT
TT
CC
TC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
TT
TT
CC
CC
Y
Y
CC
TT
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC

AA，g.1128 GG），ハプロタイプＢ（g.895 CC，C-，--，g.1125 CC，g.1128 TT），ハプロタイプ
Ｃ（g.895 C-，g.1125 AC，g.1128 GT）を比較した結果，ハプロタイプＣの胚の生存性が低い傾向が認められたが，今後さらに例数を重ねて検討を行う必要がある（Fig.１）。
3 . 2 . 2 精子におけるHSP70.1遺伝子多型（ハプロタイプ）と高温耐性
本 試 験 に 供 試 し た 黒 毛 和 種 種 雄 牛 10 頭 の
HSP70.1-SNPs（g.895，g.1125，g.1128，g.1204）
をTable２に示す。供試数が少なく，同一のハプ
ロタイプを有する複数の個体群が得られなかった
ため，以前の報告にて交雑種種雄牛の精液性状や凍結融解後の生存性との相関10）が報告されている
g.895（CC型，Ｃ-型）について，高温負荷処理による精子生存性への影響を比較した（Fig.２）。
g.895 C-型は，融解直後の生存率，前進運動率が高かったが，時間の経過に伴う生存率，全身運動率の低下がCC型と比較して顕著である傾向が認められた。
3 . 2 . 3 HSP70.1遺伝子多型（ハプロタイプ）と夏季における受胎性
夏季に胚移植を実施した17頭のうち７頭が受胎し，受胎率は41.2％であった。供試牛のHSP70.1SNPs（g.895 ，g.1125 ，g.1128 ，g.1204）を Table２に示す。うち，３か所のSNPs（g.1125 CC，g.1128
TT，g.1204 CC）のハプロタイプを持つ個体の受胎率が55.6％（5/9頭）と，その他の型を有する個体の受胎率25.0％（2/8頭）と比較して高い傾向 を 示 し た 。 g.1125 CC ， g.1128 TT ， g.1204
CC は，昨年度実施した末梢血単核細胞への高温負荷試験で高温に対する抵抗性が高かったハプロ
タイプと同じ型であった７）。また，g.895についてはＣ欠損型の乳牛の供用年数や交雑牛の子牛生産率が低いという報告がある３，４）。しかしながら，本試験ではg.895を完全欠損あるいはヘテロで欠© The Ito Foundation

145

牛の暑熱ストレス耐性を担うHSP70.1遺伝子多型に関する研究（Ⅱ）
g. 895, 1125, 1128

（%）
100
80

38.5℃
41℃

60
40
20
0

A

B

C

HaplotypeFig. 1 Comparison of blastocyst survivability after thawing among HSP70.1-SNPs haplotype.

H aplotype A（g.895 CC, g.1125 AA, g.1128 GG）：38.5℃, n＝4，41℃，n＝5. Haplotype B（CC or C- or --, CC, TT）：
38.5℃, n＝3, 41℃, n＝9. Haplotype C（C-, AC, GT）：38.5℃, n＝5, 41℃, n＝5.

（%）
100

（%）
100

90

90

80

80

CC, 38.5℃

70

70

C-,38.5℃

60

60

CC, 41℃

50

50

C-,41℃

40

40

30

30

20

20

10

10

0

0

1

2

3
（h）

0

0

1

2

3
（h）

Fig. 2 Effect of heat shock on sperm survivability and mortility after thawing in genotype g.895.

A：Sperm survival rate. B：Sperm mortility. Genotype CC, n＝4. Genotype C-, n＝6.

損している型を持つ個体の受胎率はCC型より高いて，雄側と雌側の両方の視点から解明することい傾向であった（Fig.３）。HSP70.1遺伝子多型を目的に，胚と精子の生存性と高温耐性，夏季の（ハプロタイプ）と受胎性との関係については，

雌牛の受胎率について調べた。黒毛和種の卵丘細今後もさらに例数を重ねて評価を行って検証する

胞，胚盤胞，凍結精液，ホルスタイン種雌牛の毛必要がある。

根よりHSP70.1遺伝子の非翻訳領域である5’UTR

４．要の多型情報を取得した。高温耐性とハプロタイプ

約との関係について，類似度の高い４か所のSNPs

本研究では，HSP70.1遺伝子多型（ハプロタ（ハプロタイプ）に基づき比較したところ，凍結イプ）と繁殖面に着目した高温耐性との関連につ

融解後に高温負荷処理した精子の生存率，前進運© The Ito Foundation

146

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

（%）
80

（%）
80

g.1125, 1128, 1204

60

60

40

40

20

20

0

CC,TT,CC

0

Others

g.895

CC

C-

--

Genotype

HaplotypeFig. 3 Conception rate of embryo transfer during summer season.

Haplotype（g.1125 CC, g.1128 TT, g.1204 CC）, n＝9, Others, n＝8. p＝0.22（Fisher’s exact test）. g.895（CC, C-, --）,

n＝4, n＝6, n＝7.

動率，夏季における胚移植の受胎性との関連が示
唆されるハプロタイプが認められた。
文献１） 竹之内直樹，福重直輝：発情行動・微弱発情，日本胚移植学雑誌，35, 97～108, 2013.
２） 阪谷美樹：暑熱による低受胎，日本胚移植学雑誌，
35, 109～115, 2013.
３） Schwerin, M., Sanftleben, H., Grupe, S.：Arch
Tierz, 46, 177～185, 2003.
４） Rosenkrans Jr, C., Banks, A., Reiter, S., Looper,
M.：Ani Rep Sci, 119, 178～182, 2010.
５） Xiong, Q., Chai, J., Xiong, H., Li, W., Huang, T.,
Liu, Y., Suo, X., Zhang, N., Li, X., Jiang, S., Chen,

M.：Cell Stress and Chaperones, 18, 711～718, 2013.
６） Oner, Y., Keskin, A., Ustuner, H., Soysal, D.,
Karakas, V.：S Afr J Anim Sci, 47, 424～439, 2017.
７） 森美幸：牛の暑熱ストレス耐性を担うHSP70.1遺伝子多型に関する研究，平成30年度食肉に関する助成研究成果報告書, 37, 150～156, 2019.
８） Brackett, B. G., Oliphant, G.：Biol Reprod, 12, 260～274, 1975.
９） Donnay, I., Van Langendonckt, A., Auquier, P.,
Grisart, B., Vansteenbrugge, A., Massip, A., Dessy,
F.：Theriogenology, 47, 1549～1561, 1997.
10） Deb, R., Sajjanar, B., Singh, U., Kumar, S., Sengar,
G. S., Alex, R., Das, A. K., Tyagi, S., Raja, T. V.,
Alyethodi, R. R., Singhi, R., Bhanuprakash, V.,
Prakash, B.： J Genet, 95, 1035～1038, 2016.

© The Ito Foundation

147

肉用地鶏の増産を目指した雌系名古屋種の産卵率および卵殻強度に関する遺伝子座の効率的な探索（Ⅱ）
Rapid genetic mapping for egg production and eggshell strength in
Nagoya breed for production of meat-type chicken（Ⅱ）

後

藤

達

彦１・力

丸

宗

弘２

（１帯広畜産大学，２秋田県畜産試験場）

Tatsuhiko Goto１ and Kazuhiro Rikimaru２（１Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, ２Akita Prefectural Livestock Experiment Station）

Further improvement of egg production in maternal lines of meat-type chickens is crucial
to enhance amount of chicken meat. The purposes of this study are to find genetic loci for egg
production rate and to collect information for future breeding of meat-type chickens. We foundthat Hinaidori breed has 9,853,894 SNPs by using whole genome resequencing technique. By
whole genome comparison with high（n＝8）and low（n＝8）egg production populations, 65
candidate regions were found on chromosomes 1-9, 11-15, 22-23, and 26-28. These candidate
regions are quite high-resolution than those of previous quantitative trait locus（QTL）
analyses. Further analyses are planned to reveal that which variants of genes affect egg
production rate using a large number of hens in Nagoya breed.

１．目

いで自然交配が行われているため，破卵を防ぐ目

的

的で高い卵殻強度の卵が求められる。また，卵殻

鶏卵は栄養価が高く，世界中で最も利用される

質が悪い卵は，孵化率が低いため，産卵率の上昇

動物性タンパク源の一つである。卵に関わる特徴

とともに，卵殻質の向上も同時に求められる１）。

（卵形質）は，卵用鶏産業においては，とりわけつまり，肉用鶏の親鶏において，産卵率および卵重要視される。鶏肉生産用のブロイラー産業や地殻質のさらなる向上は，世界の鶏肉増産に向けた

鶏産業においても，コマーシャル鶏を生産する親最重要課題の一つとなる。

世代において，卵形質は重要なものとなる。すな

北海道の特産品である新得地鶏は，これまでにわち，一定期間内に100個の卵を生産する個体と，さまざまな改良がなされ，地域の鶏肉生産を支え50個を生産する個体では，受精卵の生産効率が２ている。開発元である北海道立総合研究機構畜産倍異なる。そのため，より多くのコマーシャル鶏試験場では，継続した改良が行われており，雌系を生産するためには，高い産卵率を示す親鶏が求には日本の品種である名古屋種が使われている。

められる。しかしながら，たとえ２倍の産卵率を名古屋種の卵は，新得地鶏コマーシャル世代を生示しても，孵化率が低い場合には，そのメリット

み出すために重要な働きをしている。現在，名古を最大限に引き出せない。地鶏の種鶏は主に平飼

屋種の雌は，約500個体の規模で継代維持されて© The Ito Foundation

148

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

いるが，産卵ピークを含む180日から300日齢の産による全ゲノムリシークエンスより検出される数

卵率は，低いもので20％程度，高いもので90％程

百万の変異を対象に，これらの集団それぞれが保度と分布の範囲が広く，平均67％（標準偏差16）有する変異のパターンを比較することによって，と大きなバラツキがあるため，今後の改良が強く産卵率に関与する遺伝子座の迅速な探索を行った。

求められている。これらの鶏肉産業上，重要な形

各 個 体 の 血 液 サ ン プ ル を 収 集 し ，個 体 別 に質に関与する遺伝子座が同定できれば，将来，新DNAを抽出し，濃度測定および品質管理を行っ

得地鶏の雌系名古屋種の改良を効率的に行うことた。次世代シークエンサー（illumina社のHiSeqに貢献する。

X Ten）を用いた全ゲノムリシークエンス解析

平成30年度の食肉に関する助成研究調査によっは，受託会社において行った。DNAの断片化をて，名古屋種の産卵率に関与する候補ゲノム領域

行い，250-350bpのDNAを精製し，ライブラリをを同定した２）。名古屋種と同様に，日本の地鶏産作成した。この際，各個体を同定できるように，業で活躍している比内鶏を対象に，集団ゲノム解アダプター配列を付与した。ペアエンドのシーク析を行うことによって，産卵率に関与する候補ゲ

エンスを行い，鶏のゲノムサイズ（約１Gbp）のノム領域を明らかにすることができれば，広く地５倍のゲノムカバレッジ（約５Gbp）になるよう

鶏産業の親鶏の改良に貢献できるものと考えられに調整して，次世代シークエンサーの生データる。そこで本研究では，比内鶏の集団を対象に，（fastqファイル）を取得した。

産卵率の表現型の多様性に関与する遺伝子座を同生データ取得後のバイオインフォマティクス

定すること，地鶏産業の親鶏集団を効率良く改良は，帯広畜産大学後藤研究室のLinux serverを用するための基礎的知見を得ることを目的とした。

い て 行 っ た 。Lawal et al の 手 法 ３） の よ う に ，

２．方GATK, BWA, Picard toolおよびSAMtoolsを用い法て，fastqファイルを参照配列（galGal5）にマッ

秋田県畜産試験場で継代維持されている比内鶏

ピングすることにより，数百万箇所の遺伝的変異

集団の雌（n＝671）を対象に，24週齢から65週（SNPs）を同定した。VCFtoolsを用いて，全ゲ齢の産卵率の表現型のヒストグラムを作成し，両ノム領域を約９万の20-KBウィンドウに分けて，極端な位置に存在する個体群（上位群８個体およ産卵率の高／低の集団における変異パターンの違び下位群８個体）を選定した。集団全体の平均産いを，FSTの指標を基にして比較した。FSTは遺伝

卵率は38.6±19.8標準偏差（％）であったが，上的分化の程度を示し，０に近ければ両集団が近い

位８個体では65.7±3.8％，下位８個体では25.8±

関係性にあり，１に近ければ両集団が遠い関係性

7.6％であった（Table１）。次世代シークエンサーにあることを示す。表現型の高／低の集団間の比

Table 1 Phenotype and genome coverage of high and low groups in

egg production
Group

n

Genomecoverage

Phenotype
EP（%）

High_EP8

4.8 ± 0.3

65.7 ± 3.8

Low_EP85.2 ± 0.4

25.8 ± 7.6

平均±SD© The Ito Foundation

肉用地鶏の増産を目指した雌系名古屋種の産卵率および卵殻強度に関する遺伝子座の効率的な探索（Ⅱ）

149

較を行うことによって，両集団が遠い関係性にあLocus；QTL）を明らかにする試みがなされてきるゲノム領域を明らかにすることができれば，当た４）。従来のQTL解析は，遺伝子座の信頼区間が該表現型に関与する遺伝子座を含む可能性が高い

広範囲にわたることから，それぞれのQTL領域

候補領域として検出できる。本研究では，標準化に多数の候補遺伝子があげられることが課題点とし た FST で あ る Z-FST の 値 が き わ め て 高 い 領 域されてきた５）。本研究の結果，産卵率に関与する（Z-FST＞４）を高低の集団間において有意に異な

多くの候補領域のサイズは20-60KBであったこと

る候補領域として検出した。

から，従来のQTL解析の結果と比較して，きわめてマッピングの解像度が高く候補領域を検出す

３．結果と考察ることができたことが分かる。このことは，今後

次世代シークエンサーを用いた全ゲノムリシー

計画している大規模な集団を対象にした産卵率にク エ ン ス の 結 果 ，比 内 鶏 の 雌 は ，集 団 と し て関する関連解析を効率よく進めるために有益な情9,853,894SNPs を 保 有 し て い る こ と が 明 ら か に報を与えるものと考えられる。さらなる研究になった。それらのSNPsを，20-KBウィンドウ単

よって，本研究において検出された候補領域が比位の染色体領域ごとに集計し，各ウィンドウにお内鶏に特異的なものであるのか，他の日本鶏において30SNPs以上が存在する87,564ウィンドウをいても共通なものであるのかを明らかにするとと対象に，遺伝的分化の程度を明らかにする集団ゲ

もに，名古屋種の大規模集団を対象にした関連解

ノム解析を行った。

析によって結果の妥当性を検証していきたいと考

24週から65週齢の産卵率が有意に異なる上位群
８ 個 体（65.7 ± 3.8 ％ ），下 位 群 ８ 個 体（25.8 ±7.6％）からなる２集団を用いた集団ゲノム解析

えている。
４．要

約

の結果，産卵率に関与する計65の候補領域が検出

肉用地鶏の雌系において，産卵率および卵殻質された（Table２）。これらの候補領域は，第１-９，のさらなる向上は，鶏肉増産に向けた産業上の最11-15，22-23および26-28染色体上に存在し，候重要課題の一つである。本研究では，産卵率の表

補領域のサイズは，平均268KB，最小20KB，最現型の多様性に関与する遺伝子座を同定するこ

大4.1MBであった。候補領域サイズの中央値がと，今後の地鶏集団を効率よく改良するための基50KBであることから明らかなように，ほとんど

礎的知見を得ることを目的とした。次世代シークの候補領域は，20-60KBのサイズであり，１MB

エンサーを用いた全ゲノムリシークエンスによを超える候補領域は６つであった。

り，比内鶏の雌は，集団として9,853,894SNPsを

これまでに多くの研究グループによって，鶏の保有していることが明らかになった。産卵率の表

産卵率に関与する遺伝子座（Quantitative Trait

現型に基づき上位８個体および下位８個体の集団

Table 2 Number, size, and chromosomes of candidate genomic regions
Candidate region（Z-FST＞４）
Targetphenotype
Egg production

No.
65

Size
Median

Min

Ave

Max

50 KB

20 KB

268 KB

4.1 MB© The Ito Foundation

Chromosomes
1-9, 11-15, 22-23, 26-28

150

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

を対象に，集団間の遺伝的分化の程度をゲノムワイドで比較した結果，第１-９，11-15，22-23および26-28染色体上に計65の候補領域を検出した。
これらの候補領域は，従来のQTL解析の結果と比較して，きわめて高解像度にマッピングされた。今後のさらなる解析によって，どのような遺伝子における変異が産卵形質に関与しているのかを，名古屋種の大規模集団を用いて明らかにする計画である。
文献１） Goto, T., Fernandes, A. F. A., Tsudzuki, M., Rosa,
G. J. M.：Causal phenotypic networks for egg traits
in an F2 chicken population, Molecular Genetics

and Genomics, 294, 1455～1462, 2019.
２） 後藤達彦，國重享子，西村健志，佐藤駿：肉用地
鶏の増産を目指した雌系名古屋種の産卵率および卵殻強度に関する遺伝子座の効率的な探索，平成30年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，37, 146～149, 2019.
３） Lawal, R. A., Martin, S. H., Vanmechelen, K.,
Vereijken, A., Silva, P., Al-Atiyat, R. M., Aljumaah,R. S., Mwacharo, J. M., Wu, D. D., Zhang, Y. P.,
Hocking, P. M., Smith, J., Wragg, D., Hanotte, O.：
The wild species genome ancestry of domestic
chickens, BMC Biology, 18, 13, 2020.
４） Goto, T., Tsudzuki, M.：Genetic mapping ofquantitative trait loci for egg production and egg
quality traits in chickens： a review, Journal of
Poultry Science, 54, 1～12, 2017.
５） Andersson, L., Georges, M.：Deciphering thegenetics of complex traits, Nature Reviews Genetics,
5, 202～212, 2004.

© The Ito Foundation

151

OPU-IVPを活用したステーション型牛胚生産システムの構築
Construction of station type bovine embryo production system using
OPU-IVP

及川俊徳１・矢島りさ１・沼邊

孝２（１宮城県畜産試験場，２みやぎ農業振興公社）

Toshinori Oikawa１, Risa Yajima１ and Takashi Numabe２（１Miyagi Prefectural Livestock Experiment Station, ２Miyagi Agricultural Development Corporation）

The purpose of this study was the establishment of a station-type bovine embryo
production system to transport oocytes collected using the ovum pick-up（OPU）technique on
field farms to research facilities for the in vitro production of embryos. We investigated atransportation system where the oocytes were stored in tubes in a transportation box, and thegas concentration was controlled with a gas-generating agent. In Experiment 1, the use of
AnaeroPack CO２（AP）was compared with atmospheric conditions（AIR）to investigate theeffect on embryo development in oocytes that were matured in vitro in the transport box.
Furthermore, the embryo development after in vitro fertilization was examined in control（using a drop in the incubator）, 4-h（transport box 4 h＋incubator 18 h）, and 22-h groups（using a tube in the transport box）. We found that under AIR, the blastocyst rate on day 8
was significantly lower in the 22-h group than in the control group, but there was no differencein the cleavage rate and cell number of blastocysts. Under AP, the embryo development rate
was not significant. In Experiment 2, OPU was performed in the field, and the collected oocytes
in the 4-h group were transported under conditions of AP or AIR. Thereafter, the embryo
development was examined. There was no difference in embryo development under the AIR
and AP conditions. Moreover, the blastocyst-stage embryos were transferred 7-8 days after invitro fertilization, and the pregnancy rates were 50.0% for both groups. In conclusion, themethod of culturing for 4 h in a transport box and in a tube is effective for in vitro embryo
production using OPU.

１．目

きく圧迫している。子牛の増頭が求められるなか的で，受精卵移植はホルモン製剤を投与した過剰排肉用牛では，繁殖雌牛の飼養頭数の減少に伴卵処理による胚生産によって１頭の雌牛から一度い，生産される子牛が減少し子牛価格の高騰が続に複数の子牛生産が可能となり，黒毛和種の増頭いている。牛肉の需要はやや回復し枝肉価格は上対策に有効な方法と考えられる。

昇傾向にあるものの，子牛頭数の減少に起因する

一方で，牛の体外受精技術は食肉処理場由来卵

肥育素牛価格の高騰によって肥育農家の経営を大巣を利用することで急速に発展してきたが，近© The Ito Foundation

152

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

年，超音波診断装置を用いて生体から卵子を採取する生体内卵子吸引（OPU）を行い，体外で胚を生産する生体内卵子吸引－体外受精胚生産（OPU-IVP）技術が畜産現場でも実施される機会

２．方法

2 . 1 実験Ⅰ

輸送ボックスによる体外成熟卵

子の体外受精の検討が増えている。OPUはホルモン製剤の投与を必現場でOPUにより採取した卵子を培養施設ま要とせず繰り返し実施可能であり，妊娠牛やホルで輸送することを想定して，食肉処理場由来卵子

モン製剤に対する反応が低い牛にも応用できるこを利用し，輸送ボックスによる体外成熟（IVM）とから，過剰排卵処理に代わる胚生産技術としてが体外受精（IVF）成績に及ぼす影響を検討し期待されている。OPU-IVPを活用した体外受精

た。卵子のIVMは通常，インキュベーターによ胚の作出によって子牛の増頭が可能となるが，体り温度およびガス制御を行い，培養液の微小滴

外受精による胚生産を成功させるためには精子，（ドロップ）を作製しオイルカバーされたシャー卵子，受精および胚の発生培養等に関する広範なレを用いて実施されている。本研究では採取した知識や技術と施設設備が必要である。そのため新卵子を輸送するため，体外成熟培地を入れたポリ規に民間の獣医師が安定して体外受精胚を生産す

スチレン製試験管（チューブ：FALCON）を使るには多大な労力を必要とし，体外受精専属の技用した。また，温度制御は電源を用いずに潜熱蓄術者の雇用も視野に入れなければならない。しか熱材を使用するiP-TEC定温輸送ボックス（輸送し，体外受精の技術は，各地域の公設畜産研究施

ボックス：サンプラテック）で行った。ガス制御

設がすでに保有しており，民間獣医師と公設研究は，ガス発生剤としてアネロパックCO２（三菱ガ施設が 連 携す るこ とでOPU-IVP を活用したスス化学）を使用または不使用について検討した。

テーション型牛胚生産システムが構築できると考OPU後に卵子を輸送する場合に４時間あれば県える。すなわち，現場で民間獣医師がOPUによ

内のどこからでも畜産試験場へ輸送可能と想定さり卵子を採取して公設研究施設に輸送し，それ以れるため，試験区は輸送ボックスで４時間保存し降の体外受精は公設研究施設が行う。その後，作た後，シャーレに作製したドロップで培養する４

出した体外受精胚を民間獣医師に戻して受精卵移

時間区，輸送ボックスで22時間保存した後そのま植を実施することで，効率的な体外受精胚の生産

ま体外受精に供試する22時間区，対照としてインシステムによる子牛の増頭促進が期待できる。

キュベーターを用いてドロップで約22時間培養す

そこで本研究では，OPU後の卵子を安定的にる対照区の３区を設定した。IVM終了以降はす培養施設まで輸送する方法を確立するため，ポリ

べての区で同じ方法で実施した。体外成熟培地はスチレン製試験管（チューブ）を用いた卵子の輸

牛胎子血清（FBS），上皮成長因子（Epidermal

送と，潜熱蓄熱材を利用した輸送ボックスによる

Growth Factor：EGF），卵胞刺激ホルモン（FSH），

電源不要の保温およびガス発生剤を用いた簡易なピルビン酸ナトリウムを加えたMedium199，体ガス制御によるIVPについて検討した。

外受精はIVF100（機能性ペプチド研），発生培地
はFBS添加CR1aaを使用した。輸送ボックス内の温度推移，IVM培地のpH変化，卵子の体外成熟
成績，体外受精後８日目まで発生培養を継続し，胚発生成績ならびに胚盤胞の細胞数について調査© The Ito Foundation

OPU-IVPを活用したステーション型牛胚生産システムの構築153した。なお，卵子の体外成熟成績は，IVM（約

統計処理

22時間）後に卵丘細胞を剥離，アセトオルセイン

胚発生成績のパーセンテージのデータはχ二乗染色を行い卵子の核相を位相差顕微鏡にて確認し検定またはFisherの正確確率検定，細胞数は一元た。また，胚盤胞の細胞数はPropidium Iodideと

配置分散分析後にTukey-Kramer法により多重検Hoechst33342を用いた二重蛍光染色法を行い計定を行った。統計的な有意差判定に用いたｐ値は測した。

５％未満を有意差ありとした。

2 . 2 実験Ⅱ

現場でのOPUによる卵子輸送後の体外受精成績
みやぎ農業振興公社白石牧場で飼養する黒毛和３．結果と考察3.1

実験Ⅰ

種繁殖牛４頭を用いて，OPUを２週間間隔で反輸送ボックス内および設置した室内の温度推移

復し，輸送中のガス制御についてアネロパック

をFig.１に示した。室内の温度は開始時23℃から

CO２ を使用する区（AP区）と何も使用せず大気徐々に低下し，15時間後には11.4℃まで低下した条件で行う区（AIR区）をそれぞれ３回実施しが，輸送ボックス内の温度は開始１時間以内に約た 。採 取 し た 卵 子 は ，体 外 成 熟 培 地 を 入 れ た

36.0℃まで上昇し，22時間後も維持された。

チューブおよび輸送ボックスを用いて畜産試験場

IVM中のpHは，大気条件下（AIR）では培養まで輸送し，実験Ⅰの４時間区と同様に４時間経

開始から４時間後と22時間後のチューブでpH7.6

過後にシャーレに作製したドロップに移しイン

以上まで上昇したが，アネロパック使用（AP）

キュベーターで培養した。その後の体外受精およでは大きな変化はみられず，対照区と同様の値をび体外発生培養も実験Ⅰと同様の方法で実施し胚示した（Fig.２）。

発生成績を調査した。また，体外受精後７日目ま体外受精による胚発生成績は，AIRでのDay８

たは８日目の胚盤胞期胚を発情後７日目の受胚牛における胚盤胞率は22時間区が16.8％であり，対に移植し，その受胎成績を調べた。

照区31.8％と比べて有意に低い成績であったが，Transport box（℃）
40

Room Temperature

35

Temperature

30
25
20
15
10
5
0
0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10h 11h 12h 13h 14h 15h 16h 17h 18h 19h 20h 21h 22hTimeFig. 1 Hourly changes in temperature in the transport box and in the laboratory© The Ito Foundation

154

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

卵割率および胚盤胞の細胞数に差はみられなかっを用いた従来の方法よりも低い温度であったが，た（Fig.３，
４）。APにおいては，胚発生成績やIVM時の温度制御については，牛では36.5℃と胚盤胞の細胞数に有意な差は認められなかった。

38.5℃で比較して卵子の成熟率や胚発生成績に差

卵子の体外成熟率は，AIRでは有意な差は認めらがなかったとの報告がある１）。今回は既報よりもれなかったが，APでは４時間区36.2％，22時間

わずかに低く約36.0℃でIVMを行ったが，従来法

区30.4％，対照区43.2％であり，22時間区が４時である対照区と同等の成熟率や胚発生成績を得ら

間区および対照区と比べて有意に低い成績であっれることが分かった。

た。

AIRでは対照区に比べ，22時間区で胚盤胞率が今回，輸送ボックス使用ではインキュベーター

低い成績であった。これは体外成熟時のpHが影

7.8

0h

7.7

4h

22 h

Control

7.6
7.5
pH 7.4
7.3
7.2
7.1
7

AIR

AP

Fig. 2 Effect of atmospheric conditions on the pH of bovine oocyte maturation medium

Abbreviations：AIR, atmospheric conditions；AP, CO２ gas concentration-adjusting agent
Each column shows the mean ± SEM

（％）
100

a

a

80

4h

22 h

Control

b

60
40

b

ab
a

20
0

MⅡ

Cleavage

Blastocyst

MⅡ

AIR

Cleavage

Blastocyst

AP

Fig. 3 Effect of oocyte culture conditions on the rate of oocyte maturation and embryo development

 bbreviations：AIR, atmospheric conditions；AP, CO２ gas concentration-adjusting agent, MII, metaphaseII oocytesAa,b Different letters indicate a significant difference（p＜0.05）© The Ito Foundation

155

OPU-IVPを活用したステーション型牛胚生産システムの構築
180

ICM

160

TE

Total

Cell number

140
120
100
80
60
40
20
0

4h

22 h

Control

4h

AIR

22 h

Control

AP

Fig. 4 Effect of oocyte culture conditions of blastocysts on the total number of cells and numbers of inner cell mass andtrophectderm cells

Abbreviations：AIR, atmospheric conditions；AP, CO２ gas concentration-adjusting agent
Each column shows the mean ± SEM

響していると考えられた。また，APでは５％有意に低かった。これは，密閉した容器内部のCO２に制御されているためpHに変化はみられず，

Ｏ２をCO２変換するAPの特性から大気条件よりも胚 発 生 成 績 に も 差 は み ら れ な か っ た 。細 胞 外

酸素濃度が多少低くなるため，４時間区よりも長pH7.0～7.4の範囲内では胚の細胞内pHは変化せ

時間暴露される22時間区で影響が出たのではない

ず，発生に影響を与えないが，この範囲外の環境かと考えた。４時間区ではＯ２濃度低下にさらさpHの変動は胚の発生に悪影響を及ぼすことや，れる時間が短いため，APを使用することで高い牛とヒトは他の動物種と比べて環境pHのアルカ

体外成熟率が得られることが明らかとなった。

リ性に弱いことが報告されている２）。さらに，環3.2

境pHのわずかな上昇が胚盤胞の発生に影響を及AIR区とAP区で胚発生成績に差はなかった。

ぼすとの報告もある 。本試験ではAIRにおける受胎成績においても両区に差はなく，受胎率はど

pHは４時間区および22時間区でpH7.6であった

ちらも50.0％であった（Fig.５）
。

３）

実験Ⅱ

が，22時間区では適正pH範囲外とされるpH7.6に

実験Ⅱでは実験Ⅰの結果から４時間区の条件で長時間暴露されたことで胚発生成績が低くなった

現地での実証試験を行った。AIRとAPどちらのと考えた。また４時間区ではIVM開始から４時

条件も検討したが，ガス制御条件による差はみら間でシャーレに移し，それ以降は対照区と同様のれず，同等の成績および受胎率であった。搬送中

pH7.3前後の環境pHとなることから，胚発生成績のIVMはチューブを用いることで輸送が容易でには大きな影響を及ぼさなかったと推察された。

あり，胚発生成績へのガス制御の影響は少ないと一方でAPではpHの上昇がみられなかったこと思われた。

から，22時間区でもpHの影響を受けずに他の試以上のことから，今回考案した方法により受胎験区と同等の成績が得られたものと思われた。成可 能 な IVF 胚 の 安 定 的 な 作 出 が 可 能 で あ り ，

熟率では，４時間区や対照区と比べて22時間区でOPU-IVPを活用することで効率的な子牛生産シ© The Ito Foundation

156

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
70

10Number of recipient cows

60
50
40
30
20
10
0

AP
AIR
Cleavage

AIR

Pregnant
8
6
4
2
0

AP
Blastocyst

Non-pregnant

AP
AIR
Embryo Transfer

Fig. 5 Results of embryo developmental rate and embryo transfer rate on in vitro fertilization using oocytes collectedby the ovum pick-up techniqueAbbreviations：AIR, atmospheric conditions；AP, CO２ gas concentration-adjusting agent

ステムの構築が期待できる。
４．要なかった。APでは，卵割率および胚盤胞率に有意な差は認められなかった。

約

実験Ⅱでは黒毛和種繁殖牛４頭を用いてOPU

受精卵移植技術を活用した子牛の増頭を目的とを行い，輸送中のガス制御はAP区とAIR区につして，現場で生体内卵子吸引（OPU）により卵いて体外受精成績を検討したが胚発生成績に差は子を採取，培養施設に輸送して体外胚を生産するなかった。また，IVF後７～８日目の胚盤胞期胚

ステーション型牛胚生産システムの構築を目指

を受胚牛に移植したところ両区とも50.0％の受胎し，体外胚生産（IVP）について検討した。

率であった。

実験Ⅰでは食肉処理場由来卵子を利用し，輸送以上の結果から，チューブおよび輸送ボックス

ボックスによる体外成熟卵子の体外受精（IVF）

を用いたIVPにより受胎可能な胚の安定的な作出成績について検討した。卵子はポリスチレン製試が可能であり，OPU-IVPを活用した効率的な子験管（チューブ）にて体外成熟（IVM）を行い，牛生産システムの構築が期待できる。

温度制御はiP-TEC定温輸送ボックス（輸送ボックス）で実施した。ガス制御はアネロパックCO２
使用（AP）と，アネロパックを使用しない大気条件下（AIR）を検討した。AIRでは胚盤胞率が22時間区で対照区と比べて有意に低い成績であったが，卵割率および胚盤胞の細胞数に差はみられ

文献１）
 Sen, U. et. al.：Asian-Australasian Journal ofAnimal Science, 31, 827～834, 2018.
 J. E. Swain：Reproductive BioMedicine Online,
２）
21, 6～16, 2010.
３）
 J. E. Swain：Human Reproduction Update, 18,
333～339, 2012.

© The Ito Foundation

157

牛の子宮疾患や機能診断に資する子宮内バイオ
マーカーの検索Investigation of uterine bio-markers for evaluation of uterine disease andfunction in cows

田

中

知

己・遠

藤

なつ美

（東京農工大学農学部）

Tomomi Tanaka and Natsumi Endo
（Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

The purpose of this study was to evaluate the effects of intrauterine iodine injection on
C-reactive protein（CRP）and 13,14-dihydro-15-keto-PGF２α（PGFM）concentrations incollected solution of uterine lavage, to establish a new biochemical examination for diagnosis ofuterine disease and function in cows. After administration of the iodine agent, a significant
increase in the polymorphonuclear leukocyte（PMN）ratio was observed in the cytologicalexamination, indicating that local inflammation was induced by the iodine agent. Under these
conditions, the uterine CRP concentration significantly increased as compared with that of thecontrol. The present results showed that detection of CRP in the uterine lavage fluid could bea useful biochemical marker reflecting the inflammatory status of the uterus. On the other
hand, the PGFM concentration did not show any specific change related to the inflammatory
condition induced by iodine administration．

１．目性子宮内膜炎は顕著な臨床症状を示さないため確的定診断が困難な場合が多く，原因不明の低受胎牛

畜産業にとって繁殖率の向上は経営に直結すると診断される症例の多くに潜在性子宮内膜炎罹患重要な要素である。近年酪農業では，分娩後の初牛が含まれていることが推測されている。近年，回人工授精の前に定期繁殖検診を行って繁殖障害

臨床現場における超音波画像診断技術の普及によを早期に診断し，適切な治療処置により繁殖成績

り子宮画像解析に基づく子宮疾患の診断指針が提を向上させる取り組みが盛んに行われている。本

唱されつつあるものの，牛の子宮内部の炎症疾患

研究課題は，獣医臨床における牛繁殖検診の診断や機能状態を診断する特殊検査技術に関しては，精度を向上させる新たな生化学的子宮疾患・機能

そのほとんどが旧来の臨床細胞学的および臨床細診断指針を確立するための基盤的知見を得ること

菌学的検査法にとどまっており，より精度の高いを目的とするものである。

子宮機能診断技術の確立が望まれる。一方，獣医

子宮疾患は分娩後の乳牛に多発し，妊娠の成立

療やヒト医療における血液生化学検査では，各種を妨げる主要な原因の一つである。なかでも潜在臓器の機能を評価するさまざまなバイオマーカー© The Ito Foundation

158

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）が同定され，それらの血中濃度の変化が病態の推

CRP 濃 度 は 市 販 の 測 定 キ ッ ト（C Reactive

移を捉えるための貴重な臨床所見の一つとして活Protein ELISA kit，CLOUD-CLONE CORP，ア

用されている。しかしながら，牛を含む家畜におメリカ）を用い測定した。塗抹染色標本について

いて子宮疾患や機能診断に資する生化学的検査法

は，顕微鏡下で細胞の観察を行い，多形核白血球の検討はほとんど行われていない。現在，我々の（PMN），リンパ球およびその他の有核細胞数を研究室では，ヒトおよび動物の全身性炎症疾患の計測し，全細胞数に対するPMN割合を算出した。

バイオマーカーであるＣ反応性タンパク質（CRP）

2.2に着目し，牛における子宮洗浄回収液中のCRPの子宮機能を評価する新たなバイオマーカーの候検出によって子宮内局所の炎症状態を評価するこ補として，本課題においては，子宮から分泌されとが可能であるという仮説を提唱している 。

る重要なホルモンの一つであるプロスタグランジ

１）

子宮内膜機能評価マーカーの検索本研究では，子宮洗浄により得られる回収液をンに焦点を当て検証を行った。我々がこれまでの検査材料とし，我々の仮説を基に子宮内生化学検研究において採取した分娩後早期の乳牛における査法の確立に向けた基礎データを収集することを子宮洗浄回収液サンプル（分娩後３週および６目的とする。具体的には，CRPの子宮内炎症マー週，ｎ＝７）および上記実験にて採取されたサンカーとしての特異性および子宮内膜炎診断基準のプルを活用し，プロスタグランジン代謝産物であ設定を行い，子宮内膜機能を評価しうる新たな診

る 13,14-dihydro-15-keto-PGF ２ α （PGFM）を 市

断マーカーの検索を試みた。

販の測定キット（PGFM Enzyme Immunoassay

２．方キット，ARBOR ASSAYS，アメリカ）を用い法て測定した。PGFM濃度の推移に基づき，分娩後

2 . 1 実験的子宮内炎症誘発時のCRP産生反応
調査の子宮修復過程およびヨード剤注入時における子宮内膜のプロスタグランジン分泌能を評価し，子臨床現場で多用され子宮内への刺激により炎症を引き起こすことが知られているヨード剤（２％ポビドンヨード）を炎症誘発薬剤として使用した。分娩後40日以上を経過し，発情周期を回帰す
るホルスタイン種経産牛に対し黄体期にヨード剤
50ml（ヨード群，ｎ＝10）を子宮内に投与した。

宮内膜機能マーカーとしてのプロスタグランジン
代謝産物の測定の有用性を検証した。
３．結果と考察3 . 1 実験的子宮内炎症誘発時のCRP産生反応調査

対照群には生理食塩液50ml（ｎ＝９）を子宮内ヨード剤投与前後における子宮洗浄回収液中に投与した。投与翌日，診断的子宮洗浄の要領で，PMN割合およびCRP濃度をTable１にまとめた。

バルーンカテーテルを黄体が存在する側の子宮角

PMN割合は，ヨード群（55.4±31.8％）が対照群に留置し，50mlの生理食塩液を注入して子宮内（7.9±21.9％）に比べて有意に高かった。回収液で還流させた後，注入した液を回収した。回収し中CRP濃度はヨード群（58.7±40.7ng/ml）が対た液を遠心分離し，上清をCRP測定まで冷凍保存

照 群（17.2 ± 6.0ng/ml）に 比 べ て 有 意 に 高 か っした。また，沈渣からは目視により細胞成分が含た。ヨード剤は，子宮内に投与することで子宮内まれていると思われる部分を２μｌ程度採取して膜に一過性の炎症を起こし，発情を誘起すること

塗抹染色標本を作成した。

が知られている。また，乳牛において黄体初期に© The Ito Foundation

牛の子宮疾患や機能診断に資する子宮内バイオマーカーの検索

159

Table 1 Effects of intra-uterine iodine treatment on PMN ratio

and CRP concentrations in the uterine lavage fluid in cows

GroupsIodine（n=10）

Control
（n=9）

Cow #

PMN（%）

CRP（ng/ml）

1

97

12.4

2

0

40.5

3

65

40.6

4

85

56.1

5

68

36.3

6
7

27
37

20.6
120.0

8

76

47.5

9

22

77.5

10

77

135.3

Mean

55.4±31.8＊

58.7±40.7＊

11
12
13
14
15
16
17
8-2
9-2

0
0
62
0
0
0
0
1
―

27.0
12.1
16.8
22.7
19.4
18.3
13.4
18.6
6.8

Mean

7.9±21.917.2±6.0

Mean±SD＊, p<0.05 vs control―：Less than 100 cells were detected.
Cows # 8 and 9 were assigned in iodine and control groups.

ヨード剤を子宮に投与すると，きわめて短時間の研究において，分娩後６週における子宮洗浄回収

うちに粘膜上皮細胞は変性剥離を起こすが，24時

液中CRP濃度は，25.3±6.6ng/ml（ｎ＝６）であ間以内にすでに再生が開始され，72時間後にほぼることが示されており，対照群で示されたCRP濃注入前の状態に復元される 。今回観察された度（17.2 ± 6.0ng/ml）は い く ぶ ん 低 い 値 で あ っ

PMN割合の増加はヨード剤の投与により子宮内た。本研究での供試牛は分娩後40日以上を経過し膜に炎症が誘発され，炎症細胞の子宮内への遊走ており，先行研究で解析された牛に比べて子宮修が促進されたことによるものと考えられる。本研

復がさらに進行している個体が多く含まれている

究ではヨード剤を投与した翌日の子宮洗浄回収液

ためCRP濃度が低下した可能性が考えられる。こ中のCRP濃度が対照群に対して高い値を示していれらの結果から，一般に子宮修復が完了し，分娩たことから，CRP濃度の上昇はヨード剤投与によ後の授精開始時期と言われる分娩後40日以降でり生じた子宮内膜上皮の炎症に起因したものであは，子宮内における子宮洗浄回収液中のCRP濃度ると考えられる。この結果は，我々が提唱していは10-30ng/mlであることが示唆される。

２）

る仮説，すなわち子宮内局所の炎症過程の評価指3.2

標としての子宮洗浄回収液中のCRP濃度測定が子分娩後３週および６週におけるPGFM濃度を宮内膜機能を評価しうる新たな診断マーカーとしTable ２ に ，対 照 群 お よ び ヨ ー ド 群 に お け るて有用であることを示すものである。我々の先行

PGFM濃度をTable３に示した。PGFM濃度は分© The Ito Foundation

子宮内膜機能評価マーカーの検索

160

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 2 PGFM concentrations in the uterine lavage fluid

at 3 and 6 weeks postpartum in cows

においてPGFMを検出することができた。プロス

Weeks postpartum

Cows ID

ことが特徴であった。今回，牛の子宮洗浄回収液
タグランジンの中で繁殖機能調節に関与するプラ

3

6

A

2335.81689.2B

275.0

1205.4

されることが知られている。今回の結果は子宮内C4763.8566.5

においてもプロスタグランジンＦ２α が局所的にD

2120.0444.8

PGFMに代謝されている可能性を示すものであ

E

317.4

466.8

F

90.2

201.6

る。また，子宮洗浄回収液中PGFM濃度は分娩後

G

991.7

125.9

Mean

1556.3±1676.2

671.5±569.1

スタグランジンＦ２αは血中においてPGFMに代謝の週数およびヨード処置において群間で有意な差は認められず，このことには各個体間の濃度のばらつきが大きいことが関与していると思われる。

Mean±SD

子宮からのプロスタグランジンＦ２αの分泌は発情
Table 3 Effects of intra-uterine iodine treatment on PGFM

concentrations in the uterine lavage fluid in cows

２日以降の黄体初期および黄体開花期に注入する

GroupsCow #Iodine（n=10）

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

421.8
75.6
1536.9
824.8
966.1
196.4
4424
1185.14020.1441.6

Mean1409.2±1551.7

ることから，今回検出されたPGFM濃度の違いは

11
12
13
14
15
16
17
8-2
9-2

2869.81448.61643.33637.6
639.9
301.7
1508
544.5
230.8

発情周期の異なるステージで診断的子宮洗浄をMean1424.9±1178.9

Control（n=9）

PGFM（ng/ml）

周期のステージにより変化する。ヨード剤を排卵

Mean±SD
Cows # 8 and 9 were assigned in iodine and control groups.

と，子宮内膜に一過性の炎症が起こり，その炎症の修復過程にあたる処置後３～４日に黄体退行因
子が子宮内膜で産生され，それによって黄体が退行する２）。また，ヨード剤注入後の黄体退行の時
期は発情周期のステージにおける処置の時期に左右されることが分かっている３）。対照群においてもPGFM濃度のばらつきが非常に大きくなってい行ったことが反映しているのかもしれない。牛においてプロスタグランジンＦ２αは発情発現の３～５日前に子宮内膜から拍動性に分泌される。今後，発情後日数が特定された牛を用いて処置を行
い ，さ ま ざ ま な 発 情 周 期 の ス テ ー ジ に お け る
PGFM濃度の変化を検討する必要があろう。
４．要

約

娩後３週（1556.3±1676.2pg/ml）と６週（671.5

牛の子宮疾患や機能診断に資する新たな生化学± 569.1pg/ml）の 間 お よ び ヨ ー ド 群（1409.2 ±的検査法の確立を目的として，ヨード剤子宮内注

1551.7pg/ml）と 対 照 群（1424.9 ± 1178.9pg/ml）

入が子宮洗浄回収液中CRPおよびPGFM濃度に及の間で有意差は認められなかった。また，全群にぼす影響を評価した。ヨード剤投与後，有意なおいてPGFM濃度は各個体間のばらつきが大きい

PMN割合の増加が認められ，ヨード剤による局© The Ito Foundation

牛の子宮疾患や機能診断に資する子宮内バイオマーカーの検索

所炎症の誘発が確認された。この条件下において，回収液中CRP濃度は有意に増加した。したがって子宮洗浄回収液中のCRP濃度は子宮の炎症状態を反映する有用な生化学的炎症マーカーとな
りうることが示された。一方，PGFM濃度はヨード剤投与による炎症状態と関連した特異的な変化

161

文
献
１）
 棚井俊介，遠藤なつ美，田中知己：第161回日本
獣 医 学 会 学 術 集 会 講 演 要 旨 集 ，p407 ，つ く ば ，
2018．
２）
 金田義弘：プロスタグランジンＦ２αによるウシの発情同期化，実験生殖生理学の展開（鈴木善祐編），
303～312，ソフトサイエンス社，東京，1982．
 Nakahara, T., Domeki, I., Yamauchi, M.：Nat.
３）
Inst. Anim Hlth. Quart., 11，211～216，1971．

は確認されなかった。

© The Ito Foundation

162

豚における体表温と行動の変化に基づく分娩予測の試み
Farrowing prediction based on changes of body surface temperature andbehavior in sows

檜垣

彰吾・吉岡

耕治・鈴木

千恵

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

Shogo Higaki, Koji Yoshioka and Chie Suzuki（National Institute of Animal Health, NARO）

In this study, we proposed two approaches to predict farrowing using a newly developed
tail-attached device equipped with a thermistor and a tri-axial accelerometer, and acommercially available low-cost video camera. In the first phase of the study, we developed
algorithms to automated classification and quantification of sow postures and posturetransitions by the tail-attached device. By setting appropriate thresholding values, laterally
lying posture and posture transition were correctly classified with F1 score of 0.945 and 0.754,
respectively. In the next experiment, we attached the tail-attached device to 10 pregnant sowsand measured tail skin temperature, activity, laterally lying time, and posture transition
frequency from 9.2 ± 2.0 days before the expected farrowing day to 7.3 ± 3.1 days post actual
farrowing day. The behavior of the sows was also recorded by video camera located 1 mbehind and 2 m above the maternity pen. After processing to the binary backgroundsubtracted images for analysis, the number of pixels was counted. As the results, substantialchanges were revealed in means of data from the tail-attached device and backgroundsubtracted pixel counts before farrowing. Briefly, posture transition frequency significantly
increased and skin temperature and lying time tended to decrease. Background-subtracted
pixel counts also increased before farrowing. At the last, we evaluated the farrowing prediction
ability of three machine learning models based on tail-attached sensor data and a thresholding
value for the background-subtracted pixel count. Sensitivities and precisions of the machinelearning models and thresholding value for predicting farrowing within the next 24 h were ashigh as 100 ％ and 90.9 ％，and 88.9 ％ and 100 ％，respectively. These results suggest that a
tail-attached device and video camera system may have the potential to achieve effective
automated farrowing prediction．

１．目

2000頭を超えるまでに至っている１）。また，養豚的従事者の高齢化と後継者不足も深刻な問題となっ養豚の多頭飼育化は急速に進みつつあり，一農場当たりの平均飼養頭数はこの15年間で倍増してており，少人数で効率よく多数の豚を管理可能な技術の開発が喫緊の課題となっている。

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豚における体表温と行動の変化に基づく分娩予測の試み

163

現在，豚の分娩時期の予測は従事者の経験に頼尾部センサ（幅20.0mm，長さ26.0mm，厚さる部分が大きく，常に適切なタイミングで分娩に10.0mm，重さ5.4ｇ）は専用のシリコンベルト内

立ち会うことは困難である。さらに，豚は“お産に封入した後，温度感知部が尾根部腹側に位置すが軽い”ため，多くの農場では従事者の労力面かるように，また，動物の左右，上下，前後方向がら無看護分娩が基本となっている。しかし，子豚

それぞれＸ軸，Ｙ軸，Ｚ軸となるように粘着テーの体温低下や圧死，母豚の難産による損耗を低減

プおよび面ファスナーベルトを用いて装着したさせるには看護分娩が有効であり，看護分娩を（Fig.１）。本試験では，各軸の加速度を５Hzで計行った場合，無看護分娩に比べ子豚の生後直死を測・データ送信できる尾部センサを用い，各個体含む死産率が10％程度低下することが知られていにつき約24時間連続的に測定した。また，実際のる 。また，近年ではダンブレッド，トピックス

行動や姿勢の変化とセンサデータとを紐づけるた等の多産系統豚の導入が進んでおり，これまで以め，供試豚の後方からビデオ撮影（VStarcam,

上に看護分娩の必要性が増している。したがっC7816，恵安株式会社）を行った。

２）て，精度の高い分娩予測が可能となれば，妊娠豚

加速度センサデータは，突発的な変化を減じるの見回りに要する労力が大幅に軽減されるだけでためにロール角の３分間の平均値を算出して解析なく，難産や圧死に伴う母豚・子豚の損耗も軽減に用いた。ビデオデータは，Ringgenbergらの報され，結果として生存子豚数の増加による生産性

告３）に準じ，姿勢を横臥（laterally lying）・伏臥の向上につながることが期待できる。

（ventrally lying）・犬座（sit）・起立（stand）のそこで本研究では，省力的かつ客観的なデータ

４種類に分類し，３分間ごとの姿勢を記録した。

に基づく分娩予測法を開発するための基礎データ

ビデオデータの姿勢の記録を基に，姿勢判別の感として，申請者らが開発した多機能尾部センサ度（真陽性／［真陽性＋偽陰性］），精度（真陽性（体表温と加速度を測定可能）ならびに入手・設／［真陽性＋偽陽性］），Ｆ１スコア（２×感度×

置が容易な市販のビデオカメラを用い，分娩前特精度／［感度＋精度］）を算出・比較することで，異的な生理学的あるいは行動学的変化を明らかに

ロール角の値から姿勢を判別するための至適な閾することを目的とした。また，それに先立ち，多値の決定を試みた。また，連続する２時点間の

機能尾部センサを用いた姿勢判別・姿勢変化検知

ロール角の差分と，その２時点間における姿勢変アルゴリズムを開発するとともに，当該アルゴリ化の有無を比較することで，姿勢変化の検知に適ズムを用いて得られたセンサデータやビデオデー

した閾値の決定を試みた。

タを基に，分娩時期を感度・精度よく予測可能か
検討した。
２．方

2 . 2 分娩前後における多機能尾部センサデー
タおよびビデオデータの採取
人工授精によって受胎した妊娠豚10頭（未経産法

５頭，経産５頭，2.5±1.4歳：Ｌ２頭，LW８頭）

2 . 1 多機能尾部センサを用いた姿勢判別・姿勢変化検知アルゴリズムの作成を供試した。供試豚は分娩予定日の８～13日前（9.8 ± 1.5 日）に 分 娩 ス ト ー ル（幅 50cm ，長 さ

ストール飼育されているランドレース種（Ｌ）

210cm）へ移動し，センサデータおよびビデオ

２頭と交雑種（ランドレース種×大ヨークシャー

データを収集した。ただし，ビデオカメラの故障

種：LW）２頭の計４頭（2.7±1.5歳）を供試した。

により，ビデオデータについては９頭分のみ採取© The Ito Foundation

164

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

A

B

C

D
Y

Roll
angl eX

Fig. 1 Shape and usage of the tail-attached sensor

A. Shape of the tail-attached sensor. B. Attachment unit of the tail-attached sensor. C. Attaching position of thetail-attached sensor. D. Attaching direction of the tail-attached sensor．

することができた。

るグレースケール画像であり，可変フレームレー

多機能尾部センサを用いた試験では，体表温ト（おおむね10～25fps）であったことから，す（３分間隔で測定），活動量（５Hzで測定した値

べての動画をグレースケール化・５fpsへの固定の５秒間における最小値の３分間の標準偏差），

フ レ ー ム レ ー ト 化 を 行 い ，解 析 に 用 い た

ロール角（５Hzで測定した値の３分間平均値）（Fig.２）。動画の解析にはOpenCVライブラリ４）を計測・データ送信するようにファームウェアをを用い，背景差分処理により変化部分を抽出後二変更した多機能尾部センサを用いた。分娩予定日

値化し，そのピクセル数を算出した。得られたピ9.2±2.0日前に供試豚の尾根部腹側に多機能尾部

クセル数データは，１時間ごとの平均値を算出

センサを装着し，分娩後7.3±3.1日までデータを後，過去24時間の合計値とし，解析に用いた。

収集した。体表温データは１時間ごとの最高値を多機能尾部センサデータおよびビデオ解析デー

抽出後，活動量データは１時間ごとに過去24時間

タはともに，最初の産子が娩出された時刻を０時における総活動量を算出後，解析に用いた。ロー

間として，分娩168時間前から分娩121時間前の値

ル角データは上記姿勢判別および姿勢変化検知アを対照とし，分娩120時間前から分娩48時間後のルゴリズムを適用後，１時間ごとに過去24時間に各時点との比較をSteel法を用いて行った。

おける総横臥時間および総姿勢変化回数を算出

2.3

し，解析に用いた。

多機能尾部センサにより得られた体表温，活動分娩予測法の開発

ビデオカメラを用いた試験では，カメラを分娩量，横臥時間，姿勢変化回数から，分娩前の変化

ストールの後ろ約１ｍ，高さ約２ｍの位置に設置を表す特徴量を各３個ずつ（計12個）抽出し，分し，妊娠豚を分娩ストールへ移動後すぐに撮影を娩予測モデルの作成・評価を行った。具体的に開始した。撮影した動画は，昼間は可視光によるは，10頭分のセンサデータから１頭分を除外した

カラー画像，夜間はカメラ内蔵の赤外線照明によ

データを教師データとし，機械学習法（ランダム© The Ito Foundation

165

豚における体表温と行動の変化に基づく分娩予測の試み

Original video
Color and grayscale image
Variable frame rate (~25 fps)

Modiﬁed video
Grayscale image
Constant frame rate (5 fps)

Background subtracted video
Binary image
Constant frame rate (5 fps)

CSV ﬁlePixel count5 data/sec

Fig. 2 Workflow of the video data analysis

フォレスト，サポートベクターマシン，ニューラ

80.8％，精度70.7％，Ｆ１スコア0.754で姿勢の変ルネットワーク）を用いて分娩24時間以内を予測化を検知可能であることが明らかとなった可能なモデルを作成した。次に，除外しておいた（Table２）。

１頭分のデータを試験データとして機械学習モデ

分娩前後における体表温，活動量（24時間合計

ル で 分 娩 予 測 を 行 い ，こ れ を 頭 数 分 繰 り 返 す値），横臥時間（24時間合計値），姿勢変化回数（Leave-one-out法）ことで，分娩予測の感度・（24時間合計値）の推移をFig.３に示す。分娩前精度・Ｆ１スコアを算出した。ビデオ解析データ

168～121時間の値（対照）に対し，統計学的に有による分娩予測法の開発では，さまざまな閾値を意な差は認められなかったものの，体表温は分娩用いた際の分娩予測の感度・精度・Ｆ１スコアを前に低下，活動量は分娩に伴い上昇傾向にあっ算出・比較することで至適な閾値の決定を試みた。

た。また，横臥時間は分娩前12時間～分娩後３時

多機能尾部センサとビデオ解析データを用いた間に有意に低値を，姿勢変化回数は分娩前24時間

分娩予測ではともに，分娩前24時間以内のアラー～分娩後17時間に有意に高値を示した。ビデオ

トを真陽性，それ以外のアラートを偽陽性，分娩データを基に算出したピクセル数（24時間合計

24時間以内にアラートがなかった場合を偽陰性と値）においても，分娩前14時間～分娩後31時間でして評価した。

有意に高い値を示した（Fig.３）。
多機能尾部センサデータおよびビデオ解析デー

３．結果と考察タに基づき分娩前24時間以内を予測した結果を各姿勢時におけるロール角および姿勢変化時にTable３に示す。機械学習の手法による違いはあおけるロール角差分に対し，姿勢判別および姿勢

るものの，多機能尾部センサを用いることで，最変化検知が可能な閾値の設定を試みた結果，姿勢大で感度100％，精度90.9％，Ｆ１スコア0.952で

判別では閾値を±0.9とした場合，横臥を感度

分娩前24時間以内を予測可能であることが示され92.5％，精度96.7％，Ｆ１スコア0.945で判別可能

た。また，ビデオ解析データを用いた場合にも，であることが明らかとなった（Table１）。また，

適切な閾値（本試験条件下では1.41）を設定する

姿勢変化検知の至適な閾値は±0.2であり，感度ことで，最大で感度88.9％，精度100％，Ｆ１ス© The Ito Foundation

166

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 1 Posture estimation efficiency based on roll angle of tri-axial accelerometer included in the tail-attached device
False
positive

False
negative

Sensitivity（%）

Precision（%）

F1 score

1221

42

99

92.5

96.7

0.945

610

99

42

93.6

86.0

0.896

ThresholdPostureTrue positive±0.9

Laterally lying
OthersTotal number of observations was 1972 including 1320 laterally lying and 652 other postures based on the videos.

Table 2 Posture transition detection efficiency based on residual roll angle of tri-axial accelerometer

included in the tail-attached device

Threshold

True positive±0.2

False positive

164

68

False
negative

Sensitivity（%）

Precision（%）

F1 score

80.8

70.7

0.754

39

Total number of posture transitions based on the videos was 203.

Table 3 Farrowing prediction efficiency based on tail attached sensor and video recording
Data

Tail attachedsensor

Video

n

10

9

MethodMachinelearning

Threshold

Algorithm

Truepositive

False
positive

False
negative

Sensitivity（%）

Precision（%）

F1 scoreRandomforest

7

1

3

70.0

87.5

0.778

Supportvectormachine

10

8

0

100

55.6

0.714

Artificial
neuralnetwork

10

1

0

100

90.9

0.952

8

1

0

88.9

100

0.941

４．要

約

コア0.941で分娩予測可能であることが示された。
本研究により，新規多機能尾部センサを用いる
ことで，体表温や活動量だけでなく横臥時間や姿

多機能尾部センサに内蔵される加速度センサを

勢変化回数を自動的かつ連続的に評価可能な手法

用いることで，高感度・高精度に姿勢の推定ならの開発に成功した。また，機械学習法を用いるこびに姿勢変化を検知可能なアルゴリズムの作成にとで，分娩に先立つ体表温や行動学的な変化を検成功した。また，このアルゴリズムを内蔵した多知することで，分娩予測に利用可能であることが機能尾部センサを用いることで，分娩に伴う体表示された。さらに，ビデオデータを用いた場合に温・活動量・臥位時間・姿勢変化回数の変化を明おいても，適切な動画処理および閾値の設定を行らかにするとともに，機械学習法を用いることでうことで，分娩予測に利用可能であることが示唆

高感度・高精度に分娩前24時間を予測可能であるされた。今後，さらに多くの妊娠豚を対象としたことが示された。さらに，ビデオデータに対し，追加試験が必要であると考えられるものの，本研

適切な動画処理および閾値の設定を行うことで，究で開発した多機能尾部センサやビデオカメラを分娩予測に利用可能であることも示された。

用いた分娩予測法は，客観的なデータに基づく省力的な分娩予測技術として応用が期待される。

© The Ito Foundation

Tail skintemperature（̊C）

豚における体表温と行動の変化に基づく分娩予測の試み
38.0
37.5
37.0
36.5
36.0
35.5
35.0
‒168 ‒144 ‒120 ‒96

‒72

‒48

‒24

0

24

48

‒72

‒48

‒24

0

24

48

‒72

‒48

‒24

0

24

48

‒72

‒48

‒24

0

24

48

‒72

‒48

‒24

0

24

48

Activity（24 h sum）

300
250
200
150
100
‒168 ‒144 ‒120 ‒96

文献１）
 農林水産省，畜産統計調査／確報 平成31年畜産
統 計：www.e-stat.go.jp/stat-search/files?page=1&
layout=datalist&toukei=00500222&tstat=000001015
614&cycle=7&year=20190&month=0&tclass1=0000
01020206&tclass2=000001134566 （accessed：2020
March 10）
 White, K. R., Anderson, D. M., Bate, L. A.：
２）
Canadian Journal of Animal Science, 76, 491～495,
1996.
３）
 Ringgenberg, N., Bergeron, R., Devillers, N.：
Applied Animal Behaviour Science, 128, 37～44,
2010.
４）
 OpenCV, Open Source Computer Vision
Library：www.opencv. org （accessed：2019 Aug.
11）

Laterally lying time
（24 h sum）

20

15

10
‒168 ‒144 ‒120 ‒96

Background subtracted
pixel count（24 h sum）

Posture transition（24 h sum）

200

150

100

50
‒168 ‒144 ‒120 ‒96
x1000
130
120
110
100
90
80
70
60
50
‒168 ‒144 ‒120 ‒96

167

Fig. 3 Tail-attached sensor data and background-subtracted pixel count changes around farrowing

Horizontal lines indicate the periods with differences

between values at the indicated time point and theaverage values from 168 to 121 h before farrowing（p＜0.05）.Values presented as mean ± SD.

© The Ito Foundation

168

牛体外受精胚の染色体異常予測技術の開発
Development of predictive system of chromosomal abnormality on bovine
in vitro fertilized embryos

杉

村

智

史

（東京農工大学大学院農学研究院）

Satoshi Sugimura（Tokyo University of Agriculture and Technology, Institute of Agriculture）

Chromosomal abnormalities are one of the causes of low viability of bovine in vitro
fertilized（IVF）embryos. This study revealed that ＞ 50％ of bovine IVF embryos thatreached to blastocyst stage have chromosomal aberrations. The observed chromosomal
abnormalities were segmental or mosaic aneuploidy. Interestingly, it was shown that theembryos with chromosomal abnormalities had earlier timing of the first cleavage comparedwith normal embryos one. Hence, it may be possible to predict non-invasive chromosomal
abnormalities by using developmental kinetics as biological biomarkers．

１．目

まっている。さらに世界に目を向けると生産され的ている受精卵の50％が体外受精卵という報告もあ

乳用後継牛の激減により，生乳生産量が減少しり，本邦でも今後は体外受精卵移植が牛生産技術ている。他方，和牛繁殖農家戸数の減少により和の一翼を担うことが予想される。しかしながら，

牛素牛価格が高騰しており，その生産性拡大が急

牛体外受精卵を移植した場合の受胎率は，30―

務となっている。そのため，生乳生産を行う雌牛

50％にとどまっており，農家の経済的損失の一因（乳用後継牛）を計画的に確保しつつ，和牛繁殖となっている。また，国レベルでもその損失は無

雌牛や肥育用の和牛子牛（素牛）も増産する必要視できず，受胎率の向上は農林水産研究基本計画がある。これらの課題を解決する既存の方法としの重要目標の一つとなっている。受胎率の向上にて，乳牛に雌の性選別精液を人工授精して後継牛

おいて，高品質（生育性の高い）な受精卵を確実を生産しつつ，性選別精液を人工授精しない残りに選別することが重要であるが，現在，受精卵のの乳牛群には和牛受精胚を移植することで和牛生品質は国際胚移植学会（IETS）が推奨する主観

産する方法が試みられている。これは，農林水産的な形態観察でのみ評価されている。そのため，

省の「酪農及び肉用生産の近代化を図るための基

高受胎が期待できる受精卵を客観的かつ確実に選本方針」にも示されている。現在では受精卵移植

別できる技術の開発が渇望されている。これまでによる和子牛生産の需要の高まりから，効率的かに，形態学的に良好と判断した牛IVF胚の中にもつ安価に供給が可能な体外受精卵への期待が高核や染色体異常を有するものが約半数で含まれて© The Ito Foundation

牛体外受精胚の染色体異常予測技術の開発

169いることを明らかにし１），この染色体異常の有無

１細胞から直接３－４細胞に卵割する現象），胚を予測できないことが受胎率が頭打ちになってい盤胞出現のタイミングを解析した。

る最大の原因であることが示唆されている。した2.2

受精胚のコピー数多型解析

がって，この染色体異常の有無を事前に予測する

体外培養後７日もしくは８日の胚盤胞の透明帯

ことができれば，受胎率の向上が期待できる。一を除去し，PVP-PBS ２μｌを含むPCRチューブ方で，近年，ヒト生殖補助医療の分野では，次世に１個ずつ入れた。SurePlex（illumina）により代シーケンサー（NGS）を用いた染色体異数性

全 ゲ ノ ム 増 幅（WGA）を 施 し た 後 ，VeriSeq

解析が注目されているが，解析コストがかかるほPGS kit（illumina）を用いてライブラリーを作成

か，瞬時に結果が得られないこと，さらに，胚のし，次世代シーケンサーMiSeq（illumina）によ

一部をマイクロマニピュレーターを用いて切除する シ ー ケ ン シ ン グ を 行 っ た 。マ ッ ピ ン グ に はる必要があることが課題としてあげられる。そこ

bostau９を用い，
CNV-seqによりCNVを予測した。

で，本研究では，染色体異常に関連する新規パラ

2.3

メータをタイムラプスシネマトグラフィ（TLC）

統計処理はｔ検定もしくはカイ二乗検定によりを用いて探索することで，NGSを用いることなく
牛IVF胚の染色体異常を簡便かつ非侵襲的に予測可能な新技術の開発を目的とする。

行った。ｐ＜0.05を統計学的に有意とした。
３．結果・考察実験１

２．材料・方法
2.1

統計解析

牛IVF胚のCNV解析

胚盤胞へ到達した27検体について解析を行っ胚の培養とタイムラプス観察た。14検体（51.9％），計31個のCNVが性染色体

食肉処理場由来卵巣から卵丘細胞卵子複合体

以外で検出され，14番染色体において最も多くの（COCs）を採取した。COCsは５％牛血清およびCNVが観察された。検出されたCNVの多くが分

0.1IU/ml卵胞刺激ホルモン添加HEPES-TCM199

節的なものであり，一部でモザイク染色体異数性

で20―22時間培養した。その後，BO液により６が検出された。完全な染色体異数性は減数分裂過時間の体外受精を行った。前核（PN）の可視化

程で生じるのに対し，分節的もしくはモザイクのを可能にするため，培養に先駆け，脂肪適除去を

染色体異数性は体細胞分裂（胚発生）過程で生じ行った。サイトカラシンＤ添加培地に受精卵を入ることが知られている。今回の研究で，完全な染れ遠心し脂肪適を偏極させた後，マイクロマニ

色体異数性が観察されなかったことから，胚盤胞

ピュレーターにより脂肪適を除去した。125μｌに到達したIVF胚で生じる染色体異数性は，減数CR1aa 培 養 液 を 含 む マ イ ク ロ ウ ェ ル 個 別 培 養

分裂ではなく胚発生過程に起因することが示唆さディッシュ（LinKID25，大日本印刷）に脂肪適れた（Fig.１）。

を除去した受精卵を入れ，タイムラプスシネマト

実 験 ２ 発生カイネティクスと染色体異常の関係

グラフィ（TLC）搭載インキュベーターで培養
および画像所得を行った。TLC画像は15分間隔

２PNを有した胚盤胞19検体を対象に解析を８日間撮影し，取得した。TLCでは前核の数，行った。正常胚９検体，染色体異常胚は10検体で出現および消失のタイミング，第一卵割のタイミあった。前核の出現，前核の消失，前核の出現か

ング，異常卵割の有無（ダイレクトクリベージ：

ら消失まで，前核の消失から第一卵割まで，胚盤© The Ito Foundation

170

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
12
10

CNV数

8
6
4
2
0

1

3

5

7

9

11

13

15

17

19

21

23

25

27

29

染色体番号
Fig.1 各染色体におけるコピー数多型（CNV）出現数

Table 1 染色体異常と発生カイネティクスの関係
N

前核の出現

前核の消失

前核の出現から消失

第一卵割

前核の消失から第一卵割

胚盤胞の出現

第一卵割から
胚盤胞の出現正常胚910.5±0.925.7±2.2

15.2±2.028.7±2.0a

3.0±2.5

133.7±12.0

105.1±12.1

染色体異常胚1010.6±0.924.6±1.4

14.0±1.526.3±1.5b

1.7±0.2

131.4±7.8105.2±7.9

平均値 ± SD（時間），a, b：p < 0.05

胞の出現，第一卵割から胚盤胞の出現までの時３PNであった。染色体異常の出現頻度は有意差

間，いずれにおいても，２区間で有意差は認めらは認められなかったものの，異常受精胚で高い傾れなかった。一方，第一卵割のタイミングに有意向にあった。興味深いことに３PN胚でも染色体差が認められ，染色体異常胚でそのタイミングが異常を有さない胚が確認された。また，１PN胚早かった。細胞分裂のタイミングはスピンドル形

では14および23番染色体のモザイクモノソミーが成チェックポイント（SAC）によって制御されて確認された。以上，必ずしも受精異常によって染いる。これまでに，SACの阻害剤であるreversine

色体異常が生じわけではないが，前核数と染色体でマウス胚を処理することで，第一卵割のタイミ

異常の関係性が示唆された（Table２）。

ングが早まり，染色体分離異常が生じることが報告されている２）。したがって，染色体異常を有し

４．要

約

た胚では，SACに異常が生じた結果，第一卵割

NGSによる牛胚の染色体異常解析技術を確立のタイミングが早まったのかもしれない（Table

した。胚盤胞に到達した胚の多くが染色体異常を１）。

有していることが明らかになった。また，染色体
前核数と染色体異常の関係

異常を有する胚で第一卵割のタイミングが早まる

正常受精胚（２PN）は22検体（84.6％），異常ことが示された。今後は，第一卵割速度といった受精胚（１PNもしくは３PB）の４検体（15.4％）

発生カイネティクスを指標とすることで非侵襲的であった。そのうち，１検体が１PN，３検体がな染色体異常の予測が可能になりうる。

実験３© The Ito Foundation

171

牛体外受精胚の染色体異常予測技術の開発
Table 2 染色体異常と前核数の関係

正常受精
異常受精

前核数

N

染色異常胚

頻度（%）

2

22

10

45.5

1

1

1

100.0

3

3

2

66.7

合計

4

3

75.0

文
献
１）
 Yao, T., Suzuki, R., Furuta, N., Suzuki, Y., Kabe, K.,
Tokoro, M., Sugawara, A., Yajima, A., Nagasawa, T.,
Matoba, S., Yamagata, K., Sugimura, S.：Live-cell
imaging of nuclear-chromosomal dynamics inbovine in vitro fertilised embryos, Sci Rep，8，
7460，2018．

２）
 Bolton, H., Graham, S. J. L., Van der Aa, N.,
Kumar, P., Theunis, K., Fernandez Gallardo, E.,
Voet, T., Zernicka-Goetz, M.：Mouse model ofchromosome mosaicism reveals lineage-specificdepletion of aneuploid cells and normal
developmental potential, Nat Commun，7，11165，
2016．

© The Ito Foundation

172

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基盤的研究（Ⅱ）
Study of circulating microRNA as biomarker for pregnancy in cattle（Ⅱ）

木

崎

景一郎・高

橋

透

（岩手大学農学部共同獣医学科）

Keiichiro Kizaki and Toru Takahashi（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University）

It is very important to develop a new method for early pregnancy diagnosing in cattle forconsideration of cow productivity. However, a method for early and reliable diagnosis has notbeen established. In this study, we focused on circulating blood miRNAs and conducted basic
research on its usefulness as a biomarker for pregnancy diagnosis. The results of this study
revealed that the kinetics of each candidate miRNA（miR-A, B, C and D）in the blood plasma
were stable throughout the estrous cycle, indicating that the measured values of the estrous
cycle could be used as diagnostic threshold value around day 21 of pregnancy. On the other
hand, we examined miRNA microarray analysis using plasma samples on the day 18 after
artificial insemination, no miRNA whose content was different between the pregnant and nonpregnant groups could not be found. Further studies to verify the accuracy of the pregnancy
diagnosis and the usefulness of the judgment on days 19 and 20 after artificial insemination are
required, and the study lead to the construction of new pregnancy diagnosis technology．

１．目

断法，特に末梢血白血球における遺伝子発現を指的標とした早期妊娠診断が提唱されているが１～３），

家畜における早期の妊娠診断は生産効率の向上

操作手技等の問題点もあり，必ずしも簡便な手法

にとって重要である。特に牛では，発情周期回帰とは言えない。このようなことから，新たな早期の有無，直腸検査，ホルモン測定および超音波に

妊娠診断バイオマーカーが求められている。

よる診断が用いられている。しかし，これらの方マイクロRNA（miRNA；miR）は，短鎖の１法は診断手技の熟練度や牛の正常な発情周期21日

本鎖RNAであり，臓器特異的な発現様式を示し，を過ぎてしまう問題点もあるため，不受胎牛へのエクソソームに内包され血中に分泌されることが次回授精の時期が遅れ，繁殖効率の低下につな

知られている。ヒトでは血中エクソソーム由来のがっている。家畜生産性の向上を考えるうえで

miRNAを測定することにより，各種のがんを早は，より早期の妊娠の成否判断が望まれるが，現期発見するプロジェクトが開始されているが，在のところ早期に，確実に診断する方法は確立さ

miRNA発現動態情報を妊娠診断に応用し，確定れていない。一方，分子生物学的手法を用いた診できる手法はいまだ開発されていない４）。

© The Ito Foundation

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基盤的研究（Ⅱ）

173

本研究では，血中miRNAに着目した牛の早期からＤを検証した（現在論文執筆中であることか

妊娠診断法の基盤確立を目指す。具体的には，昨ら，ここでは具体名の記載はせず，ＡからＤとし年度の伊藤記念財団助成研究の成果をもとに，実た）。なお，リファレンスmiRNA（内在性コント

際の早期妊娠診断への適用を考慮した基盤的研究

ロール）には，同様に先行研究で明らかにしたとして，発情周期牛の血中における標的miRNA

miR-2455を使用した。

の変動を検証した。さらに，現在までに得ている

2.3

標的miRNA候補は，妊娠21日齢にて受胎群およ

血漿中のmiRNAの網羅的発現解析には，独自

び不受胎群との間で変動が認められた分子種であに開発したmiRBase19.0対応の牛カスタムmiRNA

り，18日齢では受胎群と不受胎群間では差異は認

マイクロアレイ（アジレント社，755miRNA対応

められなかった。したがって，より早期に受胎が配列搭載）を用い，人工授精後18日の血漿（妊娠判別できるmiRNA分子種が求められる。そこで

群ｎ＝３，非妊娠群ｎ＝３）から抽出したmiRNA

本研究では，18日齢においても妊娠判別が可能なを試料として供した。miRNAマイクロアレイ実

新たなmiRNA分子種の探索についても実施した。

験で得られた発現データは，GeneSpring GX（ア

２．方
2.1

miRNAマイクロアレイ解析

ジレント社）を使用して解析し，階層型クラス

法

タ ー 解 析 は Multiple Experiment Viewer（MeV,

供試材料

The Institute for Genomic Research），各 試 料 中

人工授精後18日および21日の黒毛和種牛からに含有されるmiRNA分子種の比較ではベンダイ

EDTA・２Na採血管を用いて採血後，遠心分離

アグラム計算プログラム（Ghent University）をして血漿を得た。授精後約30日および60日後に超用いた。

音波検査により妊娠鑑定を実施し，妊娠群（ｎ＝３）と非妊娠群（ｎ＝３）とした。発情周期血液３．結果と考察

試料については，分娩後の黒毛和種牛（ｎ＝５）

3.1を用いて，１発情周期経過後の発情日を０日（Ｅ

昨年度の伊藤記念財団助成研究において同定し０）として，発情後20日（Ｅ20）まで一定間隔でたmiR-AからＤ（人工授精後21日の非妊娠群と採血した。

比較し妊娠群で高値を示す）について，定量的リ

2 . 2 miRNA抽出と定量的リアルタイムRTPCR

発情周期牛の血中miRNA含有量の変動

アルタイムRT-PCRにより発情周期中の発現動態を比較した（Fig.１）。発情０日（Ｅ０），３日（Ｅ血 漿 試 料 か ら の miRNA 抽 出 に は miRNeasy３），７ 日（Ｅ ７），14 日（Ｅ 14），18 日（Ｅ 18）

Serum/Plasma Kit（QIAGEN）を使用し，Mir-X

および20日（Ｅ20）の各発情日で比較したとこ

miRNA First-Strand Synthesis Kit （TAKARA）

ろ，発情日に高値を示す傾向にあったが，いずれを用いて逆転写反応を行い，miRNAからcDNAをのmiRNAにおいても各発情日間の統計学的な差合成した。定量的リアルタイムPCRには，KOD

異は認められず一定の水準で推移した。

SYBR qPCR Mix（TOYOBO）を使用し，7300リ

牛の発情周期におけるホルモン動態として，プ

アルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）

ロゲステロン分泌は黄体形成期から増加が始まにより増幅反応および検出を行った。本実験では，り，黄体開花期には高い血中濃度を示し，黄体退研究代表者の昨年度の助成研究で同定したmiR-A

行期には急激に減少する。一方，エストラジオー© The Ito Foundation

Circulating miRNA（miR/miR-2455）

174

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

1.5

A

1.5

1

1

0.5

0.5

0

1.5

E0

E3

E7

E14

E18

E20

C

0

1.5

1

1

0.5

0.5

0

E0

E3

E7

E14

E18

E20

B

E0

E3

E7

E14

E18

E20

E0

E3

E7

E14

E18

E20

D

0

Fig. 1 Abundances of circulating miRNA during the estrous cycle．

Plasma miR-A（A）， -B（B）， -C（C）and -D（D）quantities were measured by quantitative RT-PCR during estrous

cycle. Peripheral blood were collected from cows that displayed a normal estrous cycle throughout the cycle（detection
day of estrous designated as Day 0（E0）as detected by their behavior；E0 to E20）．Data are shown as mean ±SD．

ル分泌は卵胞期に急激に上昇して黄体形成ホルモで変動が認められた分子種であり，定量的リアルンのサージ状分泌（LHサージ）の誘発および黄タイムRT-PCRの結果でも21日齢では有意な差異

体形成期から開花期での増加が認められる。昨年が認められたが，18日齢では妊娠群と非妊娠群間度の研究結果から，妊娠群では人工授精後18日かで差異はなかった。人工授精後の不受胎牛に対すら21日にかけて標的miRNA含有量が増加したこ

る効率良い次回授精の機会を得るためには，妊娠とから，血中プロゲステロンによる制御の可能性

21日齢での診断では遅すぎることになる。したが考えられたが，少なくとも今回検証した４つのがって，より早期に受胎が判別できるmiRNA分

miRNA分子種の血中含有量は，プロゲステロン

子種が求められる。そこで，18日齢の妊娠群およやエストロゲンといった卵巣由来ステロイドホル

び非妊娠群の血液試料中のmiRNA含有量についモンによる影響を受けないことが明らかとなった。

てmiRNAマイクロアレイを使用して網羅的に解

一般的に，検査値を使用した疾患や生理的状態

析し，バイオマーカーとしての新たなmiRNA分の判定を実施する場合には，ある一定の基準値

子種の抽出を試みた。

（閾値）の設定が必要となる。末梢血白血球の遺網羅的miRNA解析には，牛カスタムmiRNAマ

伝子発現を利用した牛の妊娠診断においては，発イクロアレイを用い，人工授精後18日の妊娠牛

情周期牛の測定値が閾値として有用であることが（ｎ＝３）および非妊娠牛（ｎ＝３）での比較を示されている。すなわち，本研究で得られた実施した。755個の牛miRNAを標的にしたマイク

発情周期の各miRNAの測定値が妊娠判定の基準

ロアレイで検出可能であったmiRNAは，人工授（閾値）に使用できる可能性がある。

精後18日の妊娠群および非妊娠群において67分子

５，６）3 . 2 miRNA マ イ ク ロ ア レ イ を 用 い た 血 中種であった（Fig.２）。妊娠群と非妊娠群のどちらにおいても含まれているmiRNA分子種間では，

miRNAの網羅的解析
現在までに得ている標的miRNA候補は，人工

その含有量に統計学的な有意差は認められなかっ

授精後21日の妊娠群および非妊娠群の網羅的解析た。人工授精後18日の妊娠群（D18P）および非© The Ito Foundation

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基盤的研究（Ⅱ）

175

NP１
NP２
NP３
Ｐ１
Ｐ２
Ｐ３
Fig. 2 Hierarchical clustering analysis of circulating miRNA detected in pregnant（P）and non-pregnant（NP）cows．

Each columns represent miRNA intensities. The gradation from gray to black in the columns indicates the intensity ofeach miRNA. White column, non-detected miRNA；Gray, low；Black, high．

D18P

れるmiRNAは，D18Pでは16分子種，D18NPでは

2
0

1
0

38

1

21 日 の 妊 娠 群 （D21P） お よ び 非 妊 娠 群（D21NP）では，D21Pで24分子種，D21NPでは

13
46

0

４分子種であった（Fig.３）。一方，人工授精後
P
21
D

D
18
N
P

3

3

妊娠群（D18NP）のいずれか一方のみで検出さ

D21NP

24

２分子種だった。D18Pのみで検出された数種のmiRNA分子種について，定量的リアルタイム

0

RT-PCRにより検証したところ，D18PとD18NP

0間の含有量に有意差は認められなかった（datanot shown）。

0以上の結果から，今回の研究では妊娠18日齢にFig. 3 Venn diagram of circulating miRNA detected in

pregnant（P）and non-pregnant（NP）cows on day 18
and 21 after artificial insemination．
Circulating miRNA from day 18 pregnant（D18P）, day
18 non-pregnant（D18NP）, day 21 pregnant（D21P）and
day 21 non-pregnant（D21NP）were analyzed by miRNA
microarray. Each values represent number of detected
miRNA．

おける妊娠判定のバイオマーカーとしてのmiRNAを同定することはできなかった。妊娠18
日頃は受精胚が著しく伸張し，子宮内膜に着床を始める時期であることから，妊娠21日に比べると個体による差も大きく，受胎による血中miRNAの変化，変動も検出が難しい時期である可能性も© The Ito Foundation

176

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

考えられた。
3.4

含有量に差異が認められるmiRNAを見出すこと

今後の展開はできなかった。今後は，妊娠診断の精度の検証

今後は，発情周期牛の各miRNAの測定値を閾

および人工授精後19日，20日での判定の有用性に値として，より例数を増やした解析を実施し，妊ついて検証し，新規妊娠診断技術の構築につなげ娠診断時の精度（陽性適中率，陰性適中率などのたい。

解析）を検証する。また，妊娠18日齢における網羅的解析の結果から，適切な妊娠診断バイオマー
カーを見出すことはできなかったが，21日齢で有意差が認められた各miRNAについて妊娠21日齢付近（19日および20日）を中心により早期の判定が可能か否かを検討する。
４．要

約

牛の生産性を考えるうえで，新たな早期妊娠診
断手法の開発は非常に重要である。しかし，早期，かつ確実に診断する方法は確立されていない。本
研究では血中miRNAに着目し，妊娠診断のバイ
オマーカーとしての有用性に関する基盤的研究を行った。本研究の結果，候補とした各miRNAの血中動態は発情周期を通して安定していることを明らかにし，発情周期の測定値が妊娠21日頃の診文
献１） Gifford, C. A., Racicot, K., Clark, D. S., Austin, K. J.,
Hansen, T. R., Lucy, M. C., Davies, C. J., Ott, T. L.：
Journal of Dairy Science，90（1），274～80，2007．
２）
 Green, J. C., Okamura, C. S., Poock, S. E., Lucy, M.
C.：Animal Reproduction Science，121（1-2），24～
33，2010．
 Kizaki, K., Shichijo-Kizaki, A., Furusawa, T.,３）
Takahashi, T., Hosoe, M., Hashizume, K.：
Reproductive Biology and Endocrinology，11，6，
2013．
 Wang, J., Chen, J., Sen, S.：Journal of Cellular４）
Physiology，231（1），25～30，2016．
５）
 Yoshino, H., Toji, N., Sasaki, K., Koshi, K.,
Yamagishi, N., Takahashi, T., Ishiguro-Oonuma, T.,
Matsuda, H., Yamanouchi, T., Hashiyada, Y., Imai,
K., Izaike, Y., Kizaki, K., Hashizume, K.：
Theriogenology，107，188～193，2018．
６）
 Yoshino, H., Kizaki, K., Iga, K., Hirata, T. I.,
Matsuda, H., Yamanouchi, T., Hashiyada, Y., Toji, N.,
Ishiguro-Oonuma, T., Takahashi, T., Hashizume,
K.：Animal Reproduction Science，214，106283，
2020．

断基準値に利用できる可能性を示した。一方，人工授精後18日においては，妊娠群と非妊娠群間で© The Ito Foundation

177

暑熱ストレスによる牛子宮内膜内分泌機能攪乱への温度感受性チャンネルの関与
Involvement of temperature sensing channels in disorder of endocrine
function of bovine endometrium by heat stress

木

村

康

二

（岡山大学大学院環境生命科学研究科）

Koji Kimura（Graduate School of Environmental and Life Science, Okayama University）

Recently, the global warming makes a big impact on the livestock industry. Especially,
pregnancy rate in cattle dramatically decreases during the summer season. It is known that
attenuation of endometrial secretion of PGF2α is necessary for establishment of pregnancy inruminant species, resulting in maintaining of corpus luteum（CL）. However, our previous study
showed that heat stress（HS）enhances the secretion of both PGF2α and PGE2（PGs）in
cultured bovine endometrial cells, although the underlying mechanisms of this effect have notbeen manifested. Cells can sense various environmental stimuli. Transient receptor potential（TRP）channels are ion channels and some of which are involved in temperature sensing of
the cell. The present study investigated the role of temperature sensing via TRP channel on
the secretion of PGs from bovine endometrial cells.
Firstly, the location of TRP channels（TRPV3, V4, and M2, sensitive to bovine bodytemperature）in bovine endometrium was examined by immunohistochemistry. Uterine horns
ipsilateral to CL at late luteal stage（day 14-17）were fixed and sliced. Each section was
immunostained with antibodies against TRPV3, TRPV4, or TRPM2. While TRPV3 was notclearly observed, TRPV4 was slightly detected in luminal epithelial cells. TRPM2 was observedin each region of the uterine tissues, especially in luminal and glandular epithelial cells, which
presented stronger signals than stromal cells, myometrium, and endothelial cells.
Next, the effect of inhibition of TRP channels on the production of PGs from endometrial
cells under HS was investigated. Endometrial stromal cells were cultured in the presence ofeach of the antagonists for TRPV3, V4, and M2（TRPV3：Icilin, TRPV4：HC-067047, TRPM2：
2-APB, respectively）for 34 hours at 38.5 ℃（control）or 40.5 ℃（HS）. After incubation, theconcentrations of PGs in the culture media were measured. TRPV3 or TRPV4 antagonists did
not affect the enhancement of PGs secretion by HS. Meanwhile, TRPM2 antagonist significantly
inhibited the secretion of PGs（p < 0.05）under HS.
Temperature-sensing TRP channels were located on the bovine uterine endometrium and
TRPM2 might be involved in the increase of PG production of endometrial stromal cells underHS.

© The Ito Foundation

178
１．目

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

を４℃で一晩反応させ，さらに２次抗体処理を的行った後，蛍光顕微鏡で観察した。

肉用牛において子畜の効率的生産は，繁殖農家

実験２ 牛子宮内膜細胞における温度感受性の経営のみならず，安定的な肥育素牛供給を通し

TRPチャンネル阻害剤による暑熱環境て肥育農家にも大きく影響を及ぼしている。とこ

下でのPG分泌の変化

ろが近年，我が国の牛の受胎率は低下の一途をた

これまでの研究の中で暑熱ストレス処理

どり，20年前には７割あった人工授精における受（40.5℃）すると子宮内膜細胞においてプロスタ

胎率が現在は４～５割にまで低下している。このグランジン（PG）分泌が上昇することが明らか

牛の低受胎は現在最も喫緊に解決すべき問題の一となっている１）。本実験では上述の１で検討したつとして捉えられているものの，具体的な解決手

TRPのチャンネル阻害剤を添加し，暑熱条件下

段はいまだに得られていない。さらに近年の地球でのPG分泌の変化について検討した。食肉セン

温暖化はこの状況に拍車をかけている。夏季の暑ター由来の子宮から子宮内膜間質細胞をSakaiら

熱環境下において，牛の生殖器官内の温度は40℃の方法で単離し，暑熱環境下（40.5℃），TRPチャ

以上まで上昇するとされており，この暑熱ストレンネル阻害剤（V3：icilin, V4：HC-06704，M2：

スによる内分泌機能の攪乱や，卵子の品質の低下

2-APB）存在・非存在状態で培養した。34時間が夏季の受胎率の低下を助長していると考えられ

後培養上清を回収し，その中のPG（PGE2およびている。事実，我が国において，夏季の受胎率低

PGF2α）濃度を酵素免疫測定法（EIA）により下は著しく，子牛生産に多大な影響を及ぼしてい測定した。

る。しかしながら，その詳細なメカニズムは定か

実験３ 牛子宮内膜細胞における温度感受性

でなく，牛舎環境の改善やミスト散布などの一時

TRPチャンネルアゴニストのプロスタ的な対処しか実施されておらず，抜本的な解決にグランジン分泌への影響至っていない。

暑熱環境下における子宮内膜細胞からのプロス

本申請課題では，妊娠の場である，牛の子宮内タグランジン分泌に温度感受性TRPチャンネル

膜，特にその内分泌機能に着目し，夏季の暑熱スが関与していることをさらに確認するために本実

トレスによりその機能攪乱が生じるメカニズムを験を実施した。実験１および２の結果からTRPM2

明らかにすることによって，牛暑熱環境下におけの ア ゴ ニ ス ト（Salicyl-AMS）を 牛 正 常 体 温 下る受胎率向上をもたらす技術開発の基礎的知見を（38.5℃）で牛子宮内膜間質細胞に添加・48時間得ることを目的とする。

培養し，PG分泌が暑熱環境と同様に上昇するか

２．方について検討した。

法

実験１ 牛子宮内膜組織における温度感受性
TRPチャンネルの局在３．結果と考察3.1

食肉センター由来牛子宮より子宮内膜を採取

結果

実験１ 牛子宮内膜組織における温度感受性

し，４％パラホルムアルデヒドで固定後，パラ

TRPチャンネルの局在

フィンに包埋し，切片を作製した。これに牛体温

牛子宮内膜組織におけるTRPチャンネルのタ付近で機能するTRPV3，TRPV4，TRPM2抗体

ンパク質発現をFig.１に示した。TRPV3のタンパ© The Ito Foundation

179

暑熱ストレスによる牛子宮内膜内分泌機能攪乱への温度感受性チャンネルの関与

ク質局在は子宮内膜内腔上皮・間質層で強く確認

TRPV3およびTRPV4アンタゴニストの添加は牛された（Fig. 1A）。一方，TRPV4は子宮内膜に

子宮内膜間質細胞からのPGE2およびPGF2α産生

お い て 明 確 な 存 在 が 確 認 で き な か っ た（Fig.

に影響を与えず，暑熱ストレスによって有意に増1B）。それに対し，TRPM2は子宮内膜内腔上皮，加した（Fig. 2A，B，C，D：p＜0.05）。

間質層，血管内皮，および腺上皮すべてにおいて

一方，暑熱環境下におけるTRPM2アンタゴニ

局在が確認され，なかでも内腔上皮・腺上皮で発スト添加において，HS環境下で牛子宮内膜間質

現が強く見られた（Fig. 1C）。

細胞からのPGE2，PGF2α分泌を濃度依存的に有実験２ 牛子宮内膜細胞における温度感受性

意に減少させたが，常温区では濃度に有意な変化

TRPチャンネル阻害剤による暑熱環境はなかった（Fig. 2E，F：p＜0.05）。さらに，０，下でのプロスタグランジン分泌の変化

10，50nMの添加区において，HSはPGE2および暑熱環境下における各種TRPアンタゴニスト

PGF2α濃度を有意に増加させたが，100nM添加

添加によるPG分泌量の変化をFig.２に示した。

区では常温区とHS区に有意な差はなかった（Fig.

（A）
（ⅰ）

（ⅱ）

（ⅲ）

（ⅰ）

（ⅱ）

（ⅲ）

（ⅰ）

（ⅱ）

（ⅲ）

（B）

（C）

Fig. 1 Representative images for protein localization of TRPV3, TRPV4, and TRPM2 in bovine endometrium in the

middle luteal stages by immunohistochemistry（n＝3）. Immunohistochemistry for（A）TRPV3,（B）TRPV4, and（C）TRPM2.（ⅰ）TRPV3, V4, or TRPM2（green）signal. （ⅱ）DAPI（blue）signal.（ⅲ）the merged images of
TRPV3, TRPV4, or TRPM2 and DAPI（ⅰ and ⅱ）. TRPV3, V4, M2 were visualized by Alexa 488（green）. Cell
nuclei were counter-stained with DAPI（blue）.Bars indicate 50 μm（A, B, and C）.

© The Ito Foundation

180

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）＊

PGF2α（ng/ml）

0.2
10
100
TRPV3 antagonist

＊

0.6
0.4
0.2
0

（E） 0.5

0

10
100
TRPV4 antagonist

0.4
0.3

＊

＊
bc

0.1
0

0

0

0

0.6

10
50
TRPM2 antagonist

c

10
100
TRPV3 antagonist

＊

＊

＊

1000
（nM）

＊

0.4
0.2
0

（F）0.5

ab

0.2

0.1

1000（nM）＊
a0.2（D）0.8

＊

＊

＊

0.3

1000（nM）

＊

＊

0.4

PGF2α（ng/ml）

0.8

0

＊

（B）
0.5

0.4

（C） 1

PGE2（ng/ml）

＊

0.6

0

PGE2（ng/ml）＊＊

PGF2α（ng/ml）

PGE2（ng/ml）（A）0.8□ Control■ HS＊

100 （nM）

0

10
100
TRPV4 antagonist

＊

0.4

a
＊

0.3

b

0.2
0.1
0

1000
（nM）

0

＊
bc

10
50
TRPM2 antagonistc100（nM）

Fig. 2 The effect of TRP channel antagonists（TRPV3 antagonist：A and B, TRPV4 antagonist：C and D, TRPM2

antagonist：E and F）on PGs secretion in endometrial stromal cells（mean±SEM）under HS（TRPV3 and
TRPV4：n＝5, TRPM2；n＝11）. Black and white bars indicate 40.5℃（HS）and 38.5℃（control）, respectively.
Different superscripts（a, b, and c are compared among HS and x, y, and z are compared among control）and
asterisks（compared between HS and control on the same concentration of the antagonists）indicate significant
differences（p＜0.05）, as determined by Tukey’s multiple range test following one way ANOVA, or Student’s
t-test, respectively.

2E，F：p＜0.05）。

に増加した（Fig. 3A：p＜0.05）。PGF2αにおい

実験３ 牛子宮内膜細胞における温度感受性てもTRPM2アゴニストを10nM添加した場合，

TRPチャンネルアゴニストのプロスタ

0.1nM添加した場合と比べ，PGF2α分泌量は有グランジン分泌への影響

意に増加した（Fig. 3B：p＜0.05）。

暑熱環境下におけるTRPM2 agonist添加によ

3.2

考

察

るPG分泌量の変化をFig.３に示した。常温区にお

本研究において，牛子宮内膜に温度感受性TRP

い て TRPM2 agonist を 10nM 添 加 し た 場 合 ，０

チャンネルが存在すること，また，TRPチャン

nM，0.1nM，1nM添加区と比べPGE2濃度は有意

ネルがHS環境下でのPG産生に関与していること© The Ito Foundation

181

暑熱ストレスによる牛子宮内膜内分泌機能攪乱への温度感受性チャンネルの関与
（B）

0.2
b

0.15
0.1

a

a

a

0.05
0

0

0.1
1
TRPM2 agonist

PGF2α（ng/ml）

PGE2（ng/ml）(A)

10（nM）

0.3
0.2

ab
ab

0.1
0

0

bc

a

0.1
1
TRPM2 agonist

10
（nM）

Fig. 3 The effect of TRPM2 agonist on PGs secretion in endometrial stromal cells（mean±SEM, n＝8）
. Different superscripts（a, b, and c）indicate significant differences（p ＜ 0.05）as determined by Tukey’s multiple range test following one
way ANOVA.

が示唆された。

かったことから，TRPV4は牛子宮内膜には発現

通常，牛の腟内温度は38.0～39.0℃であり，夏しておらず，PG産生に関与しないと考えられる。

季 に HS 環 境 下 に な る と 40.5 ℃ に ま で 達 す る た

また，本実験において牛子宮内膜でTRPV3の局

め２），子宮内も同程度の温度まで上昇すると考え在が観察されたにも関わらず，TRPV3アンタゴられる。細胞が温度を感知するセンサーとしてニストはHS環境下におけるPG分泌増加を抑制しTRPチャンネルが知られており ，いくつかの動なかった（Fig.２）。鶏やマウスなど他の動物種

物種ではTRPチャンネルの活性化温度閾値も報においてTRPチャンネルの温度域が異なること

告されているが４），牛においてTRPチャンネルのは報告されており ４），牛とヒトではTRPV3の温温度域は今までに報告されていない。そのため，度域が異なり，牛においてTRPV3は体温付近の本研究ではヒトのTRPチャンネル温度域を代用

温度で機能しない可能性が考えられる。

３）した。ヒトにおいてTRPV3，V4，M2が牛の腟内

TRPM2アンタゴニスト（2-APB）は，HS環境

温度付近で開閉すると報告されているため４），本

下におけるPG濃度を有意に抑制し（Fig.２），

研究ではTRPV3，V4，M2に着目し，牛子宮内膜

TRPM2アゴニストは38.5℃においてもPG濃度をにおけるこれらの局在を免疫組織化学にて検討し有意に増加させた（Fig.３）。これらの結果より，た。実験１の免疫組織化学において，牛子宮内膜

TRPM2の開閉がPG産生に関連していることが示

で の TRPV4 の 局 在 は 確 認 さ れ な か っ た が ，唆された。また，PG合成は細胞内のCa２＋濃度上TRPV3，TRPM2の局在は確認された（Fig.１）。

昇によって産生が刺激され５），TRPM2はCa２＋ のこのため，牛においてTRPV3，M2は子宮内の温細胞外から細胞内流入に関与することが報告され度センサーとして機能する可能性が示された。

ている６，７）。以上から，HSによってTRPM2を介次にTRPV3，V4アンタゴニストを添加し，牛
子宮内膜間質細胞におけるHS環境下でのPG産生

して細胞内へのCa２＋流入が増加しPG分泌量が増加した可能性が考えられる。

への影響を検討した。TRPV4アンタゴニストを本研究から，HS環境下において牛子宮内膜は添加した際，HS環境下でのPG分泌増加は抑制さ

TRPM2により温度を感知し，内分泌機能に影響れなかった（Fig.２）。さらに実験１の免疫組織を与える可能性が示唆された。牛子宮内膜のPG

化学の結果においてTRPV4の局在が確認できな分泌の異常は夏季の受胎率低下に関与することが© The Ito Foundation

182

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

示唆されているため８），今後TRPM2とPG産生の

牛子宮内膜組織の全域に存在し，特に内腔上皮細関係についてさらなる研究を進めることができれ胞および腺上皮細胞では，間質細胞，子宮筋層，ば，牛の夏季受胎率の向上に貢献できるかもしれ

血管内皮細胞よりも強いシグナルが検出された。

ない。

子宮内膜間質細胞におけるPG産生はHSによって４．要有意に増加するが，TRPV3，V4アンタゴニスト

約

添 加 は こ の 増 加 を 抑 制 し な か っ た 。一 方 ，

地球温暖化に伴い夏季の牛受胎率の低下が問題

TRPM2アンタゴニスト添加はHSによるPG分泌

視されており，暑熱ストレスによる生殖系内分泌増 加 を 有 意 に 抑 制 し た （p ＜ 0.05）。ま た ，の異常がその一因として考えられている。培養牛

TRPM2アゴニスト添加はPG分泌を有意に増加さ

子宮内膜間質細胞においてHSがプロスタグランせた（p＜0.05）。以上の結果より，温度感受性

ジン（PG）分泌を促進することが報告されていTRPチャンネルは牛子宮内膜に存在し，その中るが，その詳細なメカニズムは明らかにされていでも特にTRPM2がHSによる牛子宮内膜間質細胞

ない。細胞の温度感受システムとしてTransient

からのPG分泌上昇に関与する可能性が示された。

Receptor Potential（TRP）チャンネルの関与が報告されている。TRPチャンネルは細胞膜に存在する非選択的なカオチンチャンネルであり，その中でもヒトでは体温付近でTRPV3，V4，M2が機能することが明らかとなっている。本研究では
牛子宮内膜においてHS環境下でのPG産生に対す
るTRPV3，V4，M2の関与について検証した。
牛子宮内膜組織において，TRPV3，V4，およびＭ2の局在を免疫組織化学により検討するとともに，牛培養子宮内膜間質細胞にTRPV3，V4，
M2のアンタゴニストまたはＭ2アゴニストを添加して40.5℃もしくは38.5℃で34時間培養し，培養
上清中のPG濃度をEIAにより測定した。
TRPV3は牛子宮内膜内腔上皮細胞，間質細胞文
献１）
 Sakai, S., Hagihara, N., Kuse, M., Kimura, K.,
Okuda, K.：J Reprod Dev, 64, 311～317, 2018.
 Sakatani, M., Balboula, A. Z., Yamanaka, K.,
２）
Takahashi, M.：Anim Sci J, 83, 394～402, 2012.
３）
 Huang, J., Zhang, X., McNaughton, P. A.：Semin
Cell Dev Biol, 17, 638～45, 2006.
 Hoffstaetter, L. J., Bagriantsev, S. N., Gracheva, E.
４）
O.：Pflugers Arch, 470, 745～759, 2018.
５） A s s e l i n , E . , D r o l e t , P . , F o r t i e r , M . A . ：Endocrinology, 138, 4798～4805, 1997.
 Sullivan, M. N., Earley, S.：Am J Physiol Cell
６）
Physiol, 305, C999～C1008, 2013.
７）
 Burns, P. D., Hayes, S. H., Silvia, W. J.：Domest
Anim Endocrinol, 15, 477～487, 1998.
 Scenna, F. N., Edwards, J. L., Rohrbach, N. R.,
８）
Hockett, ME., Saxton, A. M., Schrick, F. N.：
Prostaglandins Other Lipid Mediat, 73, 215～226,2004.

のみで検出されたが，TRPV4は牛子宮内膜において明瞭な発現は観察されなかった。TRPM2は© The Ito Foundation

183

黒毛和種体外受精卵のゲノム選抜技術確立に向けた
割球分離卵凍結保存法の開発
Development of cryopreservation method for bovine demi-blastocysts
produced by blastomere separation technique for establishment ofpreimplantation genomic selection system using in vitro fertilized embryos

藤

井

貴

志

（北海道立総合研究機構畜産試験場）

Takashi Fujii（Animal Research Center, Hokkaido Research Organization）

Preimplantation genomic selection（PGS）using genomic estimated breeding values basedon single nucleotide polymorphism（SNP）genotypes is expected to accelerate genetic
improvement in cattle. Recently, we developed PGS system using in vivo-derived embryos inJapanese Black cattle. On the other hand, PGS combined with ovum-pick up-in vitro
fertilization（OPU-IVF）technology enables cattle genetic improvement to more efficient.
However, IVF embryo is sensitive to biopsy using microblade to obtain DNA sample for SNP
genotyping, and fertility of biopsied and cryopreserved IVF embryo is extremely low. In thisstudy, therefore, we focused on blastomere separation technique and examined optimal
cryopreservation method for bovine separated demi-blastocyst for establishment of PGS
system using IVF embryos. In Experiment 1, in vitro development of separated blastomeres inwell of the well culture dish was examined. The production rates of monozygotic pair
blastocysts and pair of blastocyst and embryo developed to 16-cell ≦ were 67.7％ and 72.9％ ,respectively. In Experiment 2, effect of equilibrium time on viability of demi-blastocysts after
vitrification-warming was investigated. Demi-blastocysts vitrified by placing them in
equilibrium solution containing 7.5％ ethylene glycol（EG）, 7.5％ dimethyl sulfoxide（DMSO）,
and 20％ calf serum（CS）for 2.5 min and vitrification solution containing 15％ EG, 15％ DMSO,
0.5M sucrose, and 20％ CS for 50 sec showed highest viability after warming. In Experiment 3,
6 demi-blastocysts were vitrified based on Experiment 2, and transferred to recipient cows.
The conception rate at day 37 of gestation was 50 ％（3/6）. No abortions were observed inany of the pregnant cows until at day 65 of gestation. These results suggest that blastomere
separation technique may contribute to practical application of PGS system in bovine IVF
embryos．

１．目

雄牛および雌牛両側からの改良を不断なく行う必的

要 が あ る 。近 年 ，黒 毛 和 種 の 育 種 改 良 で は ，

良質な黒毛和種牛肉を安定生産するためには，

DNA上の一塩基多型（SNP）情報から各個体の© The Ito Foundation

184

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

遺伝的能力（産肉能力）を直接推定するゲノム育要するため，割球分離胚を一定期間保存する必要

種価評価が確立され，育種改良速度を高める手法があるが，割球分離胚に適した保存法は確立されとして活用されている１，２）。さらに最近我々は，ていない。

黒毛和種体内受精卵から一部の細胞を切断採取しそこで本研究では，IVF胚を用いた着床前ゲノてSNP解析とゲノム育種価評価を行い，胚移植にム選抜技術の開発を目的に，割球分離技術によりより高能力個体を選択的に生産する着床前ゲノム

作出した胚盤胞期胚に適したガラス化保存条件に選抜技術を開発した３）。この着床前ゲノム選抜技

ついて検討し，ガラス化保存した割球分離胚の移術の活用により，黒毛和種改良のさらなる効率化

植後の受胎性を調査した。

が期待されている。
一方，これまでの牛胚生産方法の主流は，過剰２．方法

排卵処理を施した供卵牛から体内受精胚を得る方2.1法であったが，近年その効率性から，経膣採卵－

食肉処理場由来の牛卵巣から未成熟卵子を吸引

体外受精技術（OPU-IVF）を用いたIVF胚生産

採取し，IVMD101培地（機能性ペプチド研究所）にシフトしている 。OPU-IVF技術と着床前ゲで22時間培養することで体外成熟（IVM）卵子

ノム選抜技術を融合することで，黒毛和種改良のを得た。凍結融解精子を遠心洗浄後，最終精子濃さらなるスピードアップと効率化が可能になると度が５×10６/mlとなるようIVF100培地（機能性考えられる。しかし，IVF胚は，ゲノム育種価評

ペプチド研究所）を用いて希釈し，IVM卵子を価に必要な細胞の切断採取といったダメージに弱６時間媒精することでIVF胚を得た。媒精後のく，凍結保存・移植後の受胎率が低い。そのため，

IVF胚は，ピペッティングにより卵丘細胞を除去

IVF胚を用いた着床前ゲノム選抜技術の実用化はし，BO-IVC培地（IVF Bioscience）で体外発生

現状困難と考えられる。

培養（IVC）を行った。IVMおよびIVFは38.5℃・

４）

割球分離技術は，２―８細胞期胚の割球を分離・再構築して一卵性双子胚／子牛を生産する技

体外受精胚の作出

５％CO２，IVCは38.5℃・５％Ｏ２・５％CO２の気相条件下で行った。

術であり ，効率的な種雄牛造成などに活用され2.2てきた 。割球分離技術を利用し，一卵性双子胚

媒精開始後24～27時間目に均等分割しフラグメの片方をゲノム育種価評価用試料，残りの片方をントのない２細胞期胚を供試した。0.5％プロナー

移植胚とすることで，細胞の切断採取によるダゼ（Sigma）を含むmPBS中で２細胞期胚の透明メージとそれに伴う凍結保存・移植後の受胎性低帯を溶解し，その後BO-IVC培地に移して約15分

下を回避でき，IVF胚を用いた着床前ゲノム選抜

間静置後，ピペッティングにより割球を分離し技術を実用化できる可能性がある。また，ゲノム

た 。分 離 割 球 は ，個 別 管 理 培 養 デ ィ ッ シ ュ

育種価評価のために胚から一部の細胞を切断採取（LinKIDmicro25，大日本印刷株式会社）を用いするには，マイクロマニピュレーター等の高価なて，BO-IVC培地内で６日間IVCを行った。割球

機材と熟練した技術が必要であるが，割球分離技

分離処理をしない２細胞期胚についても，分離割術ではそれらの必要がなく，着床前ゲノム選抜技

球と同様にIVCを行い，対照区とした。

５）

６）

割球分離

術の活用幅を広げることが期待できる。一方，

2.3

SNP解析には少なくとも数日から数週間の期間を割球分離により作出した胚盤胞期胚を7.5％エ© The Ito Foundation

割球分離胚のガラス化保存黒毛和種体外受精卵のゲノム選抜技術確立に向けた割球分離卵凍結保存法の開発

185

チレングリコール（EG，Wako），7.5％ジメチルにより発情同期化した。ガラス化保存した割球分

スルホキシド（DMSO，Wako）および20％子牛

離胚は，加温後にBO-IVC培地で３時間培養し，血清（CS，Gibco）を含むTCM199培地（Gibco）

発情発現後８日目の受胚牛に１胚移植した。胚移（平衡液）に浸漬した後，15％EG，15％DMSO，

植にはYTガン（ヤマネテック）を用いた。受胚

0.5Mスクロースおよび20％CSを含むTCM199培

牛の妊娠診断は，受胚牛の発情発現後37日目およ地（ガラス化液）に浸漬して平衡処理を行った。

び65日目に，超音波画像診断装置を用いて胎児の平衡液／ガラス化液での平衡時間が，それぞれ３

有無と心拍を確認することにより行った。

分／60秒，2.5分／50秒，２分／40秒および1.5分／30秒となるように試験区を設定した。平衡処理

３．結果と考察

後の胚は，微量（＜１μｌ）のガラス化液ととも

3.1にクライオトップ（北里コーポレーション）上に計96個の２細胞期胚から，192個の分離割球を乗せ，液体窒素中に直接浸漬してガラス化した。

作出した。割球分離後24時間目における再分割率

ガラス化保存した割球分離胚の加温は，37℃の0.2

および１対の分離割球の双方が再分割するペア再Ｍスクロースおよび20％CSを含むPBS中に３分

分割率は，それぞれ91.7％（176/192個）および間浸漬することで行った。

84.4％（81/96組）であった。IVF後７日目におけ2 . 4 ガラス化保存した割球分離胚の生存性評
価

割球分離胚の初期発生

る胚盤胞期への発生率および１対の分離割球の双方が胚盤胞期へと発生するペア胚盤胞発生率は，ガラス化－加温後の割球分離胚を，BO-IVC培

そ れ ぞ れ 78.1 ％ （150/192 個） お よ び 67.7 ％地内にて38.5℃・５％O２・５％CO２の気相条件下（65/96組）であった。また，割球分離胚の片方がで24時間培養し，実体顕微鏡下で再拡張率（生存胚盤胞期へ発生し，もう片方がSNP解析可能な16率）を評価した。また，総細胞数および死細胞率

細胞期以上の胚へ発生した割合は72.9％（70/96を評価した。死細胞核の染色は，LIVE/DEAD組）であった。対照区（割球分離処理なし）におCell Imaging Kit （488/570）（Thermo Fisher

ける胚盤胞発生率は81.4％（79/97個）であり，Scientific）を用いて行った。死細胞核染色後，割球分離区（78.1％）と比較して有意差はなかっ

胚を５μg/mlのHoechst33342（Sigma）を含むエた。

タノールに浸漬し，４℃で一晩静置することで総本研究における割球分離胚の胚盤胞発生率およ細 胞 核 の 染 色 を 行 っ た 。蛍 光 顕 微 鏡（Nikon

びペア胚盤胞発生率は，既報６）と比較して高い値

E800）を用いて各胚の写真撮影を行い，Image Jであった。この要因として，本研究では均等分割

ソフトの細胞カウントツールを用いて総細胞数おしかつフラグメントのまったくない２細胞期胚のよび死細胞数を測定し，各胚における死細胞率みを実験に供試したことや，IVM・IVF・IVC系（死細胞数／総細胞数×100）を算出した。

の違い等が考えられる。本研究より，個別管理培

2.5

胚移植

養ディッシュを用いることで割球分離胚を効率よ

受胚牛にはアンガス種牛を用い，膣内留置型プく胚盤胞期へ発生させることができ（Fig.１），

ロジェステロン製剤（CIDR1900，ファイザー）約70％の１対の割球分離胚について，片方を胚移およびプロスタグランジンＦ２α類縁体製剤（レ植に，もう片方をSNP解析用試料に供試できるこ

ジプロン-Ｃ，あすかアニマルヘルス株式会社）とを確認した。

© The Ito Foundation

186

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

A

B

C

Fig. 1 Production of monozygotic twin blastocysts by blastomere separation in well of the well culture dish．
A：Separated blastomeres obtained from two-cell embryos（27 h post IVF）

B：Re-cleaved blastomeres at 48 h post IVF. C：Separated demi-blastocysts at 168 h post IVF．

Table 1 Effect of equilibrium time on viability of separated demi-blastocysts after vitrification-warming．
Experimental Group

Blastomeres separation

Control

Equilibrium time

No. of embryos

No（％）．of viable＊
embryos60

20

18（90）ab

2.5

50

20

19（95）ab

2

40

20

18（90）ab

1.5

30

20

14（70）b3

60

20

20（100）a

Equilibrium sol（min）

Vitrification sol（sec）

3＊Re-expanded blastocyst after 24 h culture post warming．

Experiment were replicated six times．
Equilibrium sol：TCM-199 containing 7.5％EG，7.5％DMSO, and 20％ calf serum
Vitrification sol：TCM-199 containing 15％EG，15％ DMSO, 0.5M sucrose, and 20％ calf serum
Different superscripts indicate a significant difference（p＜0.05）

3 . 2 ガラス化保存液中での平衡時間が割球分
離胚の加温後の生存性に及ぼす影響

時間後の死細胞率をFig. 2Bに示した。割球分離
区の平衡液3，2および1.5分／ガラス化液60，40

割球分離胚のガラス化－加温後の培養成績をおよび30秒区における死細胞率は，対照区と比較

Table１に示した。割球分離区の平衡液1.5分／ガ

して有意（ｐ＜0.05）に高かった。一方，割球分

ラス化液30秒区における再拡張率は，対照区と比離区の平衡液2.5分／ガラス化液50秒区と対照区

較して有意（ｐ＜0.05）に低かった。その他の割の間に有意差は認められなかった。

球分離区と対照区との間に差はなかった。ガラス

割球分離由来の胚盤胞期胚は，通常の胚盤胞期化保存した割球分離胚の加温培養24時間後の総細胚と比較して，胚全体のサイズや細胞数が半分程胞数をFig. 2Aに示した。対照区における総細胞度となる。耐凍剤による細胞毒性の影響を考慮す

数は，割球分離区のすべての試験区と比較して有ると，割球分離胚をガラス化する場合，平衡液や意（ｐ＜0.001）に多かった。割球分離区の各試

ガラス化液中での平衡時間は，通常の胚盤胞期胚

験区の総細胞数に差はなかったが，平衡液2.5分

よりも短いほうが良いと考えられる。本研究で／ガラス化液50秒区の総細胞数が最も多かった。

は，その仮説のとおり，平衡時間が対照区よりもまた，ガラス化保存した割球分離胚の加温培養24

短い平衡液2.5分／ガラス化液50秒区においてガ© The Ito Foundation

黒毛和種体外受精卵のゲノム選抜技術確立に向けた割球分離卵凍結保存法の開発
AaTotal cell number

200
150

187

b

b

b

b

2/40

1.5/3010050
0Equilibrium time

3/60

Equilibrium sol（min）/ Vitriﬁcation sol（sec）

Experimental group

Rate of dead cell（%）

B

Equilibrium time
Experimental group

2.5/50Blastomere separation
8aaControl
a

ab

6

b

4
2
0

3/60

2.5/502/40

1.5/30Equilibrium sol（min）/ Vitriﬁcation sol（sec）
Blastomere separation

Control

Fig. 2 （A）Mean total cell number in blastocysts in blastomere separation group and in control group after 24 hculture post vitrification-warming. （B）Rate of dead cell in blastocysts in blastomere separation group and incontrol group after 24 h culture post vitrification-warming. Blastomere separation：Blastocysts were vitrified byplacing them in equilibrium solution and vitrification solution for 3 min and 60 sec（3/60, n＝17），2.5 min and 50
sec（2.5/50, n＝18），2 min and 40 sec（2/40, n＝18），and 1.5 min and 30 sec（1.5/30, n＝13），respectively.
Control：Blastocysts were vitrified by placing them in equilibrium solution and vitrification solution for 3 min and
60 sec（n＝20）．Columns and bars indicate mean value and SE, respectively. Different superscripts indicate asignificant difference（p＜0.05）．

ラス化加温培養後の生存性が最も良好であった。

胚 を 新 鮮 移 植 し た 場 合 ，そ の 受 胎 率 は 50 ％以上より，牛割球分離胚のガラス化条件として，（8/16）であったとの報告がある６）。今後さらな現状では平衡液2.5分／ガラス化液50秒で平衡処る追加試験が必要であるが，本研究結果から，ガ理する方法が好適と考えられた。

ラス化保存した割球分離胚についても，ガラス化

3.3

ガラス化保存した割球分離胚の移植試験過程における平衡時間を調節することで新鮮移植

3. 2で最適化した条件（平衡液2.5分／ガラス化と遜色ない受胎率が得られることが示唆された。

液50秒）でガラス化した割球分離胚６個を１胚移本研究の結果から，割球分離技術を活用した牛植し，３頭を受胎させることに成功した。すべて

IVF胚の着床前ゲノム選抜技術の実用可能性が示の受胎牛について，初回（Day37）の妊娠診断かされた。今後は，ゲノム評価用の割球分離胚由来

ら２回目（Day65）の妊娠診断までの妊娠喪失はDNAを用いたSNP解析と算出されたゲノム育種なかった（Table２）。これまでに，割球分離胚１価の精度を確認するとともに，OPU-IVF胚を用© The Ito Foundation

188

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 2 The conception rate following embryo transfer of vitrified

demi-blastocyst produced by blastomere separation．

No. of blastocysts＊
transffered

No.（％）of cows
Day 37

Day 65

3（50）

3（50）

6
＊

pregnant

Blastocysts were vitrified by placing them in equilibrium solution for 2.5 min

and vitrification solution for 50 sec．

いた試験を行い，技術の実装につなげたい。
４．要

ム選抜技術を実用化できる可能性が示された。今後は，移植試験の例数を増やすとともに，OPU-

約

IVF胚を用いた試験を行い，技術の実装につなげ本研究では，黒毛和種体外受精胚を用いた着床たい。

前ゲノム選抜技術を確立することを目的に，割球分離技術により作出した牛胚盤胞期胚に適したガラス化保存条件について検討し，ガラス化保存した割球分離胚の移植後の受胎性を調査した。ガラ
ス化保存液中での平衡時間が割球分離胚の加温培
養後の生存性に及ぼす影響を調査したところ，平
衡液2.5分／ガラス化液50秒で平衡処理してガラス化した割球分離胚の生存性が最も良好であることが示された。最適化した条件でガラス化保存した割球分離胚を１胚移植したところ，その受胎率は50％（3/6）であり，実用可能な数値が得られた。本研究の結果から，割球分離技術を活用する
ことで，黒毛和種体外受精胚を用いた着床前ゲノ

文献１）
 Ogawa, S., Matsuda, H., Taniguchi, Y., Watanabe,T., Sugimoto, Y., Iwaisaki, H.：Anim Sci J，87，
1106～1113，2016．
２）
 Watanabe, T.：The Journal of Animal Genetics，
44，3～10，2016．
３） Fujii, T., Naito, A., Hirayama, H., Kashima, M.,
Yoshino, H., Hanamure, T., Domon, Y., Hayakawa,
H., Watanabe, T., Moriyasu, S., Kageyama, S.：J
Reprod Dev，65，251～258，2019．
４）
 Joao Viana.：Embryo Technology Newsletter, vol36, No.4，7～25，International Embryo Technology
Society，2019．
５）
 Tagawa, M., Matoba, S., Narita, M., Saito, N.,
Nagai, T., Imai, K.：Theriogenology，69，574～
582，2008．
 Hashiyada, Y. ：J Reprod Dev，63，527～538，
６）
2017．

© The Ito Foundation

189

卵胞由来生理活性ペプチドによる牛の卵巣機能調節
メカニズムの解明
The role of a bioactive peptide derived from follicular cells on cattle
ovarian function

松

田

二

子１・大

蔵

聡２

（１東京大学大学院農学生命科学研究科，２名古屋大学大学院生命農学研究科）

Fuko Matsuda１ and Satoshi Ohkura２（１Graduate School of Agricultural and Biosciences, The University of Tokyo,
２Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University）

The present study aimed to clarify the role of the Peptide A, which is expressed in bovine
ovarian granulosa cells, in the reproductive function of domestic ruminants. mRNA expressionsof Peptide A and Peptide A receptor were detected in bovine granulosa cells of tertiary
follicles and caprine hypothalamic tissues. The amount of Peptide A was suggested to be larger
in granulosa cells of smaller tertiary follicles both at mRNA and peptide levels. In addition, theamount of Peptide A in follicular fluids showed similar tendency to granulosa cells in tertiary
follicles. The single intracerebroventricular injection of Peptide A into female goats suppressed
the plasma gonadotropin levels, while failed to affect the activity of the center of reproductionin the hypothalamic arcuate nucleus. Taken together, our results suggested that Peptide A has
an effect to inhibit the secretion of gonadotropin into plasma, which may lead to suppress
follicular development. It is also suggested that Peptide A and Peptide A receptor signaling in
ovaries may have role（s）to control ovarian function, such as follicular growth and selection.
Further studies are necessary to determine the provider and the direct target of Peptide A
that suppresses the gonadotropin secretion, as well as the detailed mechanism of granulosa
cell-derived Peptide A to regulate the follicular function．

１．目

も大きな問題のひとつとなっている。受胎率低下

的を引き起こす牛の繁殖障害のうち30％前後を占め日本における動物性タンパク質の消費量は平成

るのが卵胞発育障害である。卵胞発育が十分でな

18年に畜産物が水産物を上回り，その差は年々広いと，卵子が排卵されない，卵子が未熟なまま排がりつつある。また，中国をはじめとする新興国

卵され胚発生に至らない，性ホルモン分泌が不足においても経済発展により食肉等の畜産物消費量

し発情が鈍化する，等の障害が起こる。哺乳類のが急増している。すなわち，国内外において畜産

卵巣機能は視床下部と下垂体から分泌されるホル物の効率的増産がますます求められている。そのモンによって制御されており，これらのホルモン

一方，牛の受胎率は年々低下しており，生産上最製剤が卵胞発育障害の治療に使われているが，効© The Ito Foundation

190

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

果が不十分な場合も多く，新たな技術開発が求め卵巣におけるペプチドＡのmRNA局在をin situ

られてきた 。

hybridizationにて確認した。さらに抗ペプチドＡ１）

我々は最近，牛の卵胞においてある生理活性ペ
プチド（ペプチドＡ）が多く産生・分泌されてい抗体を用いて免疫染色を行い，ペプチドレベルでの局在を調べた。

ることを発見した。ペプチドＡと卵巣機能との関2 . 2 ペプチドＡの視床下部繁殖制御中枢活動連についてはほとんど報告がないことから，本研

および性腺刺激ホルモン分泌に対する作用

究はペプチドＡが牛の卵胞発育において果たす役の解析

割を明らかにすることを目的とした。ペプチドＡ

山羊の視床下部組織を採取し，全RNAを抽出の卵胞発育促進作用あるいは抑制作用が明らかに後，cDNAを合成した。ペプチドＡおよびペプチ

なれば，そのメカニズムを利用した新たな卵胞発

ドＡ受容体のmRNA発現をRT-PCRにて調べた。

育促進剤の開発につながる。さらに，牛の繁殖技

視床下部の神経活動（MUA）を記録可能な山術として近年重要性が増している過排卵誘起法の羊（ｎ＝４）を用いて２，３），繁殖制御中枢へのペ効果を高める新たな薬剤の開発にもつながると期

プチドＡの作用を調べた。MUA記録用電極を卵待できる。

巣除去雌山羊の視床下部弓状核に留置し，脳室内

卵胞由来ペプチドＡの作用点として，視床下にペプチドＡ（５nmol）または生理食塩水を投部，下垂体あるいは卵巣の可能性が考えられる。

与した。投与開始２時間前から９時間後の間，繁本研究では牛卵巣におけるペプチドＡとその受容

殖中枢活動の記録と血中性腺刺激ホルモン（黄体体の局在を調べることで，ペプチドＡの卵巣に対形成ホルモンLH）濃度測定を同時に行った。投する作用を明らかにすることを目的とした。さら与により繁殖中枢のMUAおよびLH分泌のパターに，牛のモデル動物である山羊を用いて，ペプチンに変化が見られれば，ペプチドＡが視床下部のドＡが視床下部の繁殖制御ニューロンの活動に与繁殖中枢の活性化／抑制作用を持つことを明らかえる影響を解析し，ペプチドＡの視床下部に対すにできる。

る作用を明らかにすることも目的とした。
２．方
2.1

さらに，卵胞由来のペプチドＡが視床下部に作用して繁殖活動に影響を与えているのであれば，

法

性周期の間，血中ペプチドＡ濃度が周期的に変化

牛卵巣におけるペプチドＡの局在していると予測される。そこで，牛の性周期中に食肉処理場にて卵胞期であることを確認した牛

１日１回採血を行い，EIAにより血中ペプチドＡ

卵巣を採取し，直径４mm以上の三次卵胞からそれぞれ顆粒層細胞を分離して全RNAを抽出し，cDNAを合成した。同時に卵胞液も採取した。卵濃度変化を特定した（ｎ＝４）。
３．結果と考察

胞からのサンプリングの際，卵胞直径を測定し3.1た。顆粒層細胞におけるペプチドＡおよびペプチ

牛卵胞顆粒層細胞において，ペプチドＡとペプ

ドＡ受容体のmRNA発現を，RT-PCRによって

チ ド Ａ 受 容 体 の mRNA が 発 現 し て い る こ と を調べた。また，卵胞液中に分泌されたペプチドＡ

RT-PCRにて確認した。牛卵巣におけるペプチド量をEIA（酵素抗体測定法）によって測定した。

Ａのin situ hybridizationでは，顆粒層細胞にお卵巣全体を固定・包埋後，組織切片を作製し，牛いて強いmRNA発現が認められた（Fig. 1A）。三© The Ito Foundation

牛卵巣におけるペプチドＡの局在卵胞由来生理活性ペプチドによる牛の卵巣機能調節メカニズムの解明

次卵胞の大きさごとに顆粒層細胞での染色を比較191ある傾向が認められた（Fig.２）。

したところ，直径が小さいものは強く，直径の大以上の結果から，牛卵胞顆粒層細胞においてペきい主席卵胞では弱い傾向が認められた。免疫染

プチドＡが発現し，卵胞液中に分泌されているこ色の結果，mRNAと同様に，ペプチドレベルでとが示された。顆粒層細胞ではペプチドＡ受容体

もペプチドＡは顆粒層細胞に多く局在し，直径がの発現も認められ，顆粒層細胞から分泌されたペ小さい卵胞ほど顆粒層細胞での局在が多い傾向が

プチドＡがオートクライン的に，あるいは近傍の認められた。

卵胞の顆粒層細胞に作用する可能性が示された。

牛卵胞液中のペプチドＡ量をEIAにて測定した

直径の小さい卵胞で多く発現・分泌される傾向が結果，卵胞直径とペプチドＡ量の間に負の相関が認められたことから，ペプチドＡが発育初期の三A

B
Granulosa layer

100 μm

100 μmFig. 1 Localization of Peptide A in bovine tertiary follicles.

（A）Peptide
A mRNA was detected by in situ hybridization. The signal was observed in granulosa cells.
（B）Peptide
A was detected by immunohistochemistry. The signal was observed in granulosa cells.

Peptide A concentration（ng/mL）

10
9
8
7
6
5
4
3
y = －0.1553x ＋ 7.8636
R2 = 0.2909

2
1
0

0

10

20

30

Follicular diameter（mm）
Fig. 2 The concentration of Peptide A in follicular fluid and follicular diameter of bovine tertiary follicles. Negative

correlation between Peptide A concentration and follicular diameter was suggested.

© The Ito Foundation

192

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

次卵胞において顆粒層細胞の分化・増殖に関与す

接の作用部位，顆粒層細胞が分泌するペプチドＡる可能性や，次席卵胞や主席卵胞への卵胞選抜にの卵胞機能に対する具体的な作用を含めた詳細な関与する可能性が考えられる。卵巣におけるペプ解析が必要である。

チドＡの機能を解明するため，今後はペプチドＡ
受容体の詳細な局在解析や，卵胞細胞の初代培養等による解析を実施する必要がある。

４．要

約

本研究は，牛の卵胞顆粒層細胞で発現するペプ

3 . 2 ペプチドＡの視床下部繁殖制御中枢活動

チドＡの繁殖機能における役割を明らかにするこおよび性腺刺激ホルモン分泌に対する作用とを目的として実験を行った。牛顆粒層細胞と山山羊視床下部において，ペプチドＡとペプチド

羊視床下部においてペプチドＡとその受容体のＡ 受 容 体 の mRNA が 発 現 し て い る こ と を RT-

mRNAが発現していることを確認した。顆粒層

PCRにて確認した。このことから，反芻動物の視細胞では，mRNAおよびペプチドレベルの両方

床下部内においてペプチドＡとその受容体のシグで，直径の小さい三次卵胞ほどペプチドＡ発現量

ナル伝達系が機能している可能性が示唆された。

が多い傾向があり，卵胞液中のペプチドＡ量も同

山羊脳室内へのペプチドＡ投与によって，視床様の傾向が認められた。雌山羊の脳室内にペプチ

下部弓状核の繁殖制御中枢の活動は変化しなかっドＡを投与したところ，視床下部弓状核の繁殖制た。一方，血中LH濃度は抑制される傾向が認め

御中枢の活動は変化しなかった一方，血中LH濃られた。この結果から，ペプチドＡは血中への度は抑制される傾向が認められた。以上より，ペLH分泌を抑制する作用を持つことが示され，そプチドＡが性腺刺激ホルモン分泌の抑制を介しての結果，反芻動物の卵胞発育を抑制する機能を持

卵胞発育を抑制する作用を持つこと，および卵巣つ可能性が示唆された。その際のペプチドＡの作

局所において卵胞発育制御等の機能を持つことが用部位として，弓状核の繁殖中枢ではなく，視床示唆された。今後，下垂体からのLH分泌を抑制下部の別の繁殖制御ニューロン，あるいは下垂体するペプチドＡの由来と直接の作用部位，顆粒層の性腺刺激ホルモン産生細胞である可能性が考え細胞が分泌するペプチドＡの卵胞機能に対する具られる。

体的な作用を含めた詳細な解析が必要である。

牛の性周期中における血中ペプチドＡ濃度を測定したところ，明確な周期的変化は認められなかった。今後精査を要するものの，卵胞から分泌されたペプチドＡは血中に移行して血中濃度を変化させるまでには至らず，卵巣内での局所的な作用が主要な機能であるのかもしれない。
以上より，ペプチドＡが性腺刺激ホルモン分泌の抑制を介して卵胞発育を抑制する作用を持つことが示唆された。さらに，顆粒層細胞からペプチドＡが分泌され，卵巣局所において卵胞発育制御等の機能を持つ可能性が示された。今後，下垂体からのLH分泌を抑制するペプチドＡの由来と直文
献１）
 松田二子，前多敬一郎，大蔵聡，上野山賀久，束村博子：中枢からのアプローチ：新たな神経内分泌メカニズムを利用した繁殖制御，35（7），98～101，2017.
２）
 Ohkura, S., Takase, K., Matsuyama, S., Mogi, K.,
Ichimaru, T., Wakabayashi, Y., Uenoyama, Y., Mori,Y., Steiner, R. A., Tsukamura, H., Maeda, K. I.,Okamura, H.：Gonadotrophin-releasing hormone
pulse generator activity in the hypothalamus of thegoat, Journal of Neuroendocrinology, 21, 813～821，
2009．
 Wakabayashi, Y., Nakada, T., Murata, K., Ohkura,３）
S., Mogi, K., Navarro, V. M., Clifton, D. K., Mori, Y.,
Tsukamura, H., Maeda, K., Steiner, R. A., Okamura,
H.：Neurokinin B and dynorphin A in kisspeptin© The Ito Foundation

卵胞由来生理活性ペプチドによる牛の卵巣機能調節メカニズムの解明
neurons of the arcuate nucleus participate ingeneration of periodic oscillation of neural activity
driving pulsatile gonadotropin-releasing hormone
secretion in the goat, Journal of Neuroscience, 30,
3124～3132，2010．

© The Ito Foundation

193

194

移植可能な牛伸長胚培養系評価法の検討
Evaluation of culture system to elongate and transplant in bovine embryos

細

江

実

佐・林

憲

悟

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Misa Hosoe and Ken-Go Hayashi（Institute of Livestock and Grassland Sciences, NARO）

In order to evaluate culture condition to reproduce the normal process of epiblast andtrophoblastic cell differentiation in bovine embryos in vitro, we attempt to analyze the RNA
expression of cell differentiation marker proteins of embryos, and to validate the lipophilic dye
staining of embryos before transfer to recipient cows. Day 7 bovine blastocysts developed inconventional medium were cultured further in embryonic stem（ES）cell medium with GSK
inhibitor（＋i）, with GSK and MEK inhibitor（＋2i）or without inhibitors（control）until D10.
The expression levels of NANOG mRNAs in embryos cultured with GSK inhibitor weresignificantly higher than those in embryos cultured without inhibitors. The expression levels of
SOX17, CDX2 and IFNtau mRNAs in embryos cultured with GSK inhibitor were no significant
difference with those in embryos cultured without inhibitor. The expression levels of SOX17
mRNAs in embryos cultured with GSK and MEK inhibitor were significantly lower than thosein embryos cultured without inhibitors. Day 9 IVF embryos were stained by DiI（control）or
DiO（＋i）and transferred to a recipient cow once, and after 6 days, Day 16 embryos werecollected by non-surgical uterine flashing. When 30 embryos were transferred to recipient, 17
embryos were collected, and the embryos were able to classify by colors of fluorescencestaining. These results suggest that the evaluation methods of this research are effective for
improvement of embryo culture conditions.

１．目

化した胚盤となり，さらに羊膜腔が形成されるな

的ど，大きな形態変化が起きる。通常受精卵移植に牛胚は，受精後およそ３週間，着床することなは，受精７日目前後の胚盤胞を用いるため，伸長く子宮内を浮遊しながら伸長する，独特の発生形

胚が繁殖技術研究の対象になることはなかった態をとる。胚の伸長は受精後10日目ごろから顕著が，2014年，木村らが，14日目前後の伸長胚（長になるが，これは主に胎盤の構成組織となる栄養

さ0.5-15mm）を子宮から回収し，その一部を切膜細胞の増殖によるものである。この時期，将来り取って（バイオプシー）性判別などの診断をし胎子へ発生する胚体外胚葉（エピブラスト）におた後に再び子宮に戻して産仔を得る技術を開発しいても，内部に生じた腔が開裂して胚表面で平板た１）。さらに2017年，藤井らが受精14-16日目の© The Ito Foundation

移植可能な牛伸長胚培養系評価法の検討

195

伸長胚のバイオプシーでSNPチップ解析が可能で培地に，分化阻害剤であるMEK阻害剤（分裂促あること，また，少数例ながら，緩慢凍結した受進因子活性化プロテインキナーゼキナーゼ：10

精14日目の胚を融解・移植して産仔を得ることに

μM PD0325901，フナコシ）とGSK阻害剤（グリ

成功したことを報告した 。これらの技術をさらコ ー ゲ ン 合 成 酵 素 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 ： ６ μMに発展させ，体外受精胚から直接移植可能な伸長

CHIR-99021，フナコシ）（２ｉ区）もしくはGSK胚を作成することができれば，新たな繁殖技術の阻害剤のみ（ｉ区）を加えて培養10日目まで行っ開発となり，家畜改良にかかる期間とコストを削た。培養10日目まで発生させた胚の一部は常法に減できる。我々はこれまでに，胎盤形成を体外でより固定，包埋し，組織切片を作成後，Ｈ-Ｅ染再現するモデル系として体外伸長胚培養系を構築

色して形態を比較した。また，10日目まで発生さし，胚盤胞を約20日間安定して生存させ，一部のせた体外培養胚を内部細胞塊（ICM）と栄養膜細栄養膜細胞（TE）が胎盤特異的な二核細胞に分胞（TE）に分けて，これらの細胞からRNAを抽化すること，この細胞が二核細胞特異的因子であ出（RNeasy micro kit ，Qiagen）し て 分 化 関 連るプラセンタルラクトジェン（PL）の遺伝子やマーカータンパク質OCT3/4，NANOG（未分化タンパク質を発現していることを確認した 。し細胞マーカー），CDX2，IFNT（栄養膜細胞マーかしながら，本培養系では，将来胎子になる内部カ ー ）の 遺 伝 子 発 現 を 定 量 的 RT-PCR（qRT-

細胞塊（ICM）は早い段階から退行あるいは栄養

PCR）により調べて分化阻害剤添加の影響を比較

膜細胞特異的遺伝子であるインターフェロンタウ

解析した。一方，内胚葉マーカーであるSOX17（IFNT）を発現し，胚盤の形成は確認できないについては，ICMとTEを分けず，胚盤胞をそのなど，移植して産仔を生産できる胚培養系の確立

まま解析した。qRT-PCRは既報５）に準じて行い，には至っていない。本課題では，胎子への生育能

GAPDH 発 現 量 を 内 部 標 準 と し て ，OCT3/4 ，力のある伸長胚を体外で作製するため，これまで

NANOG，CDX2，IFNTおよびSOX17の各遺伝開発してきた伸長胚培地にICM維持効果が期待で子の相対発現量を算出した。

２）

３）

きる分化阻害剤を加え，胚盤形成の指標となる

2.2

マーカー分子の遺伝子発現量を比較するととも実験区と対照区で培養した胚を同一子宮内で発に，体外で受精９-10日目まで培養した胚を子宮育させて発生を検証する手法として，細胞膜をラに移植後５-６日目に回収して胚盤形成を調べる

ベリングする脂溶性カルボシアニン色素のマーことで改良効果の評価が可能かを検証する。

カーの有効性を調べるため，培養後10日目の胚２．方を，血清無添加の培地で洗浄後，５μM DiIある法

いはDiO（Vybrant Multicolor Cell-Labeling Kit，

2 . 1 胚培養および遺伝子発現解析（定量的RT-PCR）

V22889，Thermo Fisher）で20分間染色し，３回洗浄後，培養を継続し，その後の胚発生と染色

牛卵母細胞の体外成熟，体外受精，発生培養は既報に準じて行った

胚染色・胚移植・胚回収を観察した。また，体外で培養した伸長胚が，移。７日目以降の培養は，植後，子宮内で発生を継続させられるかどうかを

10 ％ 牛 胎 子 血 清 ，２ mM GlutaMAX- Ｉ ，１ ％検証するために，阻害剤添加区あるいは対照区でMEM非必須アミノ酸，10.5mMモノチオグリセ

培養した体外受精後９日目の胚を染色して，発情ロール（Wako），20ng/ml LIFを含むKO-MEM

同期化した２頭の受胚牛にDiIで染色した対照区

３，４）© The Ito Foundation

196

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）とDiOで染色したｉ区の胚を各15個混ぜて，１頭一方どの胚においてもTEの細胞は扁平化していにつき30個を黄体側に移植し，移植後６日目に熟た。ICMにおけるOCT3/4の遺伝子発現量および練者が伸長胚用に穴を大きくしたバルーンカテー

TEにおけるCDX２の発現量は，どの区でも有意テルを用いて子宮全体を灌流し，受胚牛から回収差がなかった。ICMにおけるNANOGの遺伝子発できた胚の染色状態，数，回収胚の大きさ，回収現量は，対照区と比較してｉ区で有意に高く，胚における胚盤形成を調べた。

IFNtの発現は，対照区，ｉ区では確認されたが，２ｉ区では検出されなかった。TEにおけるIFNT

３．結果と考察

発現量および胚のSOX17の発現量は，２ｉ区で培養10日目までの胚の生存率と孵化率は，対照有意に低かった（Fig.３）。これらのことから，区（阻害剤無添加区）と比較して，ｉ区，２ｉ区

阻害剤の添加は未分化細胞の維持に有効である

で差はなかったが，胚の直径は，２ｉ区で有意にが，２ｉ区では内胚葉分化や栄養膜細胞への分化小さかった（Fig.１）。胚組織のＨ-Ｅ染色により，阻害が顕著であるのに対し，ｉ区では内胚葉およ

培養10日目の胚を観察したところ，対照区では

び栄養膜への分化阻害なく，ICMも維持される可ICMの核が壊れて断片化している像が多くみられ能性が示唆された。阻害剤を添加しない培養液でたのに対し，ｉ区，２ｉ区の胚ではICMが丸く塊

培養10日目の胚にDiIおよびDiO染色を施し，20状で，ｉ区ではICMとTEの内側に内胚葉への分日目まで培養を継続したとき，胚の生存性と大き化細胞の形成がみられた胚もあった（Fig.２）。

さは，染色していないものと差がなかった。１頭につき30個の胚を移植した受胚牛からは，それぞれ17個と14個の生存胚が回収できた。１頭の受胚

（μm）
800

牛から回収されたDiIで染色された胚は９個，Diameter of D10 embryos

DiOで染色された胚は８個であった（Fig.４）
。そ

600

＊

のうち，３個と２個に胚盤が確認でき，GSK阻害

400

剤の添加が胚の生存率や胚盤形成に及ぼす影響は

200
0

cont

+i

確認できなかった。胚の長さは，対照区のDiI染+2i

Fig. 1 Dimeter of D10 embryos cultured with or without

GSK and/or MEK inhibitor. ＊ p ＜ 0.05（vs. control）.
Error bar shows means±SD.

Control

色 胚 で 3.5 ± 2.9mm ，ｉ 区 の DiO 染 色 胚 で 1.3 ±
0.7mmで，ｉ区で小さい傾向がみられ（ｐ＜0.1），
GSK阻害剤の添加が移植後の胚の栄養膜細胞の

+i

+2i

Fig. 2 Staining image of D10 embryos cultured with or without GSK and/or MEK inhibitor. Scale bar indicates 50μm.

© The Ito Foundation

197

移植可能な牛伸長胚培養系評価法の検討
OCT3/4 in ICM

5IFNT in ICM

1.5

4

1

3
2

0.5

1
0

Cont

+i

+2i

NANOG in ICM

10

4

+2i

IFNT in TE

0.5

2
Cont

+i

+2i

CDX2 in TE

1.5

0

＊

Cont

+i

+2i

SOX17 in embryos

2
1.5

1

1

0.5
0

+i

1

6

0

Cont

1.5

＊

8

0

0.5
Cont

+i

+2

0

＊

Cont

+i

+2i

Fig. 3 Expression analysis of cell differentiation marker genes in ICM, TE or whole embryos cultured with or without. Error bar shows
GSK and/or MEK inhibitor. Values are shown as relative values of GAPDH. ＊ p ＜ 0.05（vs. control）
means±SD.

７mm以下の大きさの４個はDiIおよびDiOの染色DiOが確認されたが，これら以外の大きく伸長した胚（2-8 cm）では，蛍光が観察できなかった。これらのことから，１頭の受胚牛に移植した培養条件の異なる胚を，回収後に蛍光色素により選別する

DiI

ことは可能であるが，移植・回収時期に注意が必Fig. 4 Fluorescent staining image of D16 embryos

collected from recipient transferred D10 embryos
cultured with（DiO：Green）or without（DiI：Red）
GSK inhibitor. Scale bar indicates 500μm.

要であることが示唆された。
４．要

約

胎子への生育能力のある牛伸長胚を体外で作製するための，培養系の評価法を検証した。体外受増殖に関係する可能性が示唆された。ただし，例

精後７日目以降の胚の培養系に，分化阻害剤であ数が少ないため，今後のさらなる検討が必要であるMEK阻害剤とGSK阻害剤を添加して３日後にる。一方，別の１頭から回収された胚14個のうち胚のqRT-PCR解析を行い，分化マーカーの遺伝© The Ito Foundation

198

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

子発現を比較した。阻害剤を添加した区では，性等を比較する方法は，有効である可能性が示唆

ICMにおける未分化細胞の分化マーカーの発現がされた。

高く，形態的にも退行が抑制されていた。一方で，２種類の阻害剤を両方添加して発生させた胚では，内胚葉や栄養膜細胞の分化マーカーがほとん
ど発現しておらず，胚発生に伴う正常な分化も阻害されると考えられた。GSK阻害剤のみを添加して発生させた胚では，未分化マーカーのNANOG
が対照区の胚よりも有意に高く発現しており，内胚葉および栄養膜細胞マーカーは，対照区と発現量の差がなかった。10日目の培養胚を脂溶性カル
ボシアニン色素で染色したところ，その後の生存性に影響を及ぼすことなく，胚をトレースすることが可能であった。培養系の評価法として，染色した胚を受胚牛の生体内に移植し，回収後に生存

文
献１）
 Kimura, K., Matsuyama, S.：J Reprod Dev, 60,
210～215, 2014.
 Fujii, T., Hirayama, H., Naito, A., Kashima, M.,
２）
Sakai, H., Fukuda, S., Yoshino, H., Moriyasu, S.,
Kageyama, S., Sugimoto, Y., Matsuyama, S.,
Hayakawa, H., Kimura, K.：J Reprod Dev, 63, 497～
504, 2017.
 Hosoe, M., Furusawa, T., Hayashi, K-G.,
３）
Takahashi, T., Hashiyada,Y., Kizaki, K., Hashidume,K., Tokunaga, T., Matsuyama, S., Sakumoto, R.：
Reprod Fertil Dev, 31, 1157～1165, 2019.
 Hosoe, M., Shioya, Y.：Zygote, 5, 371～376, 1997.
４）５）
 Furusawa, T., Ohkoshi, K., Kimura, K.,
Matsuyama, S., Akagi, S., Kaneda, M., Ikeda, M.,
Hosoe, M., Kizaki, K., Tokunaga, T.：Biol Reprod,
89, 1～12, 2013.

© The Ito Foundation

199

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明（Ⅲ）
Effect of antioxidant supplementation on quality improvement ofcryopreserved bull semen（Ⅲ）

武田

久美子・緒方和子・木村

和輝＊・佐藤伸哉＊＊・今井昭＊＊（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，＊茨城県畜産研究センター肉用牛研究所，＊＊

広島県立総合技術研究所畜産技術センター）

Kumiko Takeda, Kazuko Ogata, Kazuteru Kimura＊, Nobunari Sato＊＊ and Akira Imai＊＊（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, ＊Beef Cattle Institute, Ibaraki Prefectural Livestock Research Center,＊＊Hiroshima Prefectural Livestock Research Center）

It is known that spermatozoa suffer various damages by freezing. It is thought that
excessive reactive oxygen species（ROS）induces oxidative stress and increases DNA damage
in sperm during the manufacturing process of frozen semen. The aim of this study was toclarify the efficiency of supplementation of bull spermatozoa during freezing with antioxidants,
such as reduced glutathione（GSH）, astaxanthin（Ax）and Coenzyme Q10（COQ10）toimprove fertilization ability. The quality of bovine cryopreserved semen was assessed bysperm motility, DNA fragmentation index（DFI）, viability, acrosome integrity, and thedevelopmental ability of embryos after in vitro fertilization（IVF）. Addition of GSH to semen
improved the penetration and subsequent embryo developmental rates in samples
characterized with poor embryo development. However, in some ejaculates, it dramaticallyincreased the frequency of DNA damage in spermatozoa. Further studies are required toclarify this phenomenon. The blastocyst-stage embryos obtained from GSH-treated sperm
appeared healthy and could develop to normal offspring. When Ax was dissolved in
tetrahydrofuran（THF）and added to the semen extender, the motility of the spermatozoa
increased slightly when incubated at 37 ℃ . However, the motility decreased when stored at
4℃ . Similarly, for COQ10 dissolved in THF, the motility increased when the temperature was
kept at 37℃；however, it decreased when stored at 4℃ . When Ax-rich egg-yolks were used
for cryopreservation extender, the sperm motility was not improved. It was concluded that theeffect of antioxidant addition to improve sperm quality is bull-dependent. Further studies areneeded to clarify the effects of antioxidant supplementation to spermatozoa．

１．目

精液凍結技術の飛躍的な改良を進める必要があ的る。凍結融解後の牛精液は活力が凍結前の25－凍結により精子はさまざまなダメージを受ける

75％に低下し，DNAダメージを受け，機能が低ことが知られており，受胎率の向上を目的とした下することが知られている。凍結精液の製造過程© The Ito Foundation

200

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

もしくは利用時に過剰な活性酸素種（ROS）が直進性（STR），直線性（LIN），曲線性（CUR），

酸化ストレスを惹起するため，精子の成熟，先体頭部振幅（ALH），頭部振動数（BCF）を調査し反応，運動性などに影響を及ぼすとともにDNAた。

ダメージを増大させると考えられている。近年，また，４頭の種雄牛（Ｎ１，Ｎ２，Ｈ１，Ｈ２）

家畜においてもDNAダメージを軽減する手法のより採取した新鮮精液を用い，上記のタイミング

ひとつとして抗酸化物質の添加が試みられておでGSHを添加し，常法に従って凍結を行った。凍り，還元型グルタチオン（GSH）やコエンザイム

結融解後の精液についてSMASを用いて運動性を

Q10（COQ10）等の添加が精子の品質を改善し，計測した。精子核DNAダメージの評価は，DNA胚発生率に寄与したとの報告がある。本研究

断 片 化 を 蛍 光 標 識 す る 方 法（TUNEL 法）を 用

課題では，GSHの実用性を明らかにするとともにい，DNA断片化指数（DFI）値を求めた３）。精子

アスタキサンチン（Ax）等の脂溶性抗酸化物質

生存率および先体膜変化の評価には，死細胞を染の利用方法とその効果について検討を行い，これ色するPropidium Iodide（PI）と先体の内膜を染

ら抗酸化物質の利用により牛凍結精液の品質を向色するPeanut Agglutinin（PNA）を組み合わせ

上させることを目的とした。昨年度まで我々は，た蛍光（PNA/PI）染色を行った。

１，２）

GSHの添加効果は体外受精発生率の劣る牛精液に対してみられるが，精子のDNAダメージが増2 . 2 GSH添加した精子由来体外受精胚の品質評価

大する可能性を確認した。また，Axの希釈液へ

広島県立総合技術研究所畜産技術センターにおの添加方法として最も有効であると考えられる

いて，２頭の種雄牛（Ｈ１，Ｈ２）の射出精液

Ax高含有卵黄（Ax/E）を用いた凍結方法につい（各３ロット）についてGSH添加処理のタイミンて精子運動性や体外受精後の胚発生率向上効果を

グを凍結融解前後で行ったものについて体外受精調査したが，その効果は一定ではなかった。本年試験を行った。また，凍結融解後に５mMのGSH

度も引き続き，抗酸化物質添加による凍結精液品処理を施した精子を体外受精に用いた際の前核形質向上効果について詳細な検討を行った。

成率について調査した。さらに，凍結融解後に２．方GSH処理を施した精子由来体外受精胚盤胞期胚

法について移植試験を行い，その受胎性を検証した。

2 . 1 GSH添加した精子の運動性および品質評
価

精液へのGSH添加によりDFI値が増大する場合の体外受精胚発生能や胚の正常性へ与える影響を材料として２頭の種雄牛（Ｎ１，Ｎ２）より採解明するため，当該精液を用いた体外受精による取した新鮮精液を用いた。GSHを凍結時最終濃度

胚盤胞期胚の品質評価を，PIおよびYOPRO-Ｉ

が１，
５，10mMとなるよう一次希釈液に添加し，の２重染色による死細胞・アポトーシス細胞検出

新鮮精液と混合した。37℃で１時間および３時間

およびTUNELによるDNAダメージ検出により保温したもの，ゆるやかに４℃に平衡化したもの行った。

について，精子運動解析装置（SMAS）を用いて

2 . 3 アスタキサンチン等難溶性抗酸化物質を運動性を計測した。計測項目として，総運動精子

添加した精子の運動性および品質評価

率（TM），前 進 運 動 精 子 率（PM），直 線 速 度

２頭の雄牛（Ｎ１，Ｎ２）より採取した新鮮精（VSL），曲線速度（VCL），平均速度（VAP），

液を用いて，テトラヒドロフラン４）（THF）に溶© The Ito Foundation

201

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明（Ⅲ）

解したAx（Ax/T）の添加が運動性へ与える影響

かった（Table１）。

を調査した。１％もしくは４％の濃度で溶解した

以上の結果から，GSHの添加が精子凍結融解のAx/Tを一次希釈液に１μL/mL，５μL/mL，10

際の運動性を低下させること，ロットによっては

μL/mL添加した。それぞれの区を37℃で１時間

DNAダメージを増大すること，生存率および先あるいは３時間保温後，ゆるやかに４℃へ冷却

体正常性にはあまり影響しないことが示唆され後，および４℃で一晩置いたものについて精子運た。GSHの添加は解凍後の精子の質を高め，受精

動性をSMASで測定した。次に難溶性抗酸化物質

能力を高めるとの報告が数多くあるが，今までにであるCOQ10も10mMとなるようTHFに溶解しGSH添加によるDNAダメージ率が増大する場合（COQ/T），一次希釈液に５～10μL/mLとなるよがあることの報告はなく，詳細な検討はされていう添加し，同様に運動性への効果をSMASで測定ない。GSHの添加により精子にどのような作用をした。

及ぼすかは，今後さらに検討する必要がある。

2 . 4 アスタキサンチン含有卵黄の使用した凍3 . 2 GSH添加が体外受精後の胚の品質に与え結精液の運動性および品質評価

る影響

茨城県肉用牛研究所にて製造したAx/Eを用い２頭の射出精液３ロットずつについて体外受精

た凍結精液のうち３頭の種雄牛３ロットずつにつ試験を行った結果，Ｈ２精液の２ロットでGSH添

いて，融解直後および37℃１時間保温後の精子運加のタイミングが凍結融解前と後で共通して胚発動性をSMASで測定した。

生率の改善効果が認められた。また，体外受精に用いた場合の前核形成率を調査したところ，Ｈ２

３．結果と考察3.1

はGSH処理により前核形成率が改善された（ｐGSH添加が精子の品質に与える影響＜0.01）。このことから，Ｈ２雄牛の精液で体外Ｎ１，Ｎ２，Ｈ１，Ｈ２の新鮮精液にGSHを添

受精胚生産効率が改善したのは受精および正常な加し凍結した場合，融解後の精子は添加濃度に前核形成までの段階が改善するためと考えられ伴ってTMおよびPMが減少した（Table１）。また。GSH添加後に精子のDFI値の高くなる凍結精

た，Ｎ１-１，Ｎ１-２，Ｈ２-１の精液はGSHの液を用いて作成した体外受精由来胚の品質を調査

添加濃度に伴って著しいDFI値の上昇がみられするため，顕微鏡下で正常とみられる拡張胚盤胞

た。Ｈ１，Ｈ２の凍結精液について，GSHの添加

期胚を選んで，死細胞検出およびDFI評価を行っによる生存率および先体正常率の差はみられなたところ，品質の差異は検出されなかった。さらTable 1 Effects of different concentration of GSH in the extender of bull spermatozoa （N1, N2, H1, H2）on the quality

parameters after freezing and thawing.

GSH

0mM

1mM

5mM

10mM

ｎ

Viability（％）

71.3±11.6

72.6±19.8

70.9±20.1

79.1±10.7

5

Acrosome integrity（％）

80.2±16.881.3±4.6

80.4±5.477.2±5.3

5DFI（％）

3.9±4.2

7.4±6.1

14.7±22.5

18.0±25.2

9

TM（％）

57.3±19.5ａ

52.0±20.2ａ

43.2±18.9ｂ

35.8±23.2ｂ

10

PM（％）

37.3±21.9ａ

33.6±19.6ａ

24.1±17.8ｂ

19.0±20.3ｂ

10

Different letters indicate differences at p＜0.05 among groups. DFI ： DNA fragmentation index, TM ： total motility, PM ：progressive motility, n：the number of ejaculates. Values are means ± SD．

© The Ito Foundation

202

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）に，凍結融解後に５mM GSH処理を行ったＨ１

かった（Fig. 1B）。

精子由来体外受精胚の移植試験を実施したとこ

Ｎ１およびＮ２の精液にCOQ10/Tを添加後，ろ ，GSH 処 理 を 行 わ な い 対 照 区 で ３ 頭 中 ２ 頭

37℃で３時間保温した場合にTMが無添加区より（66.7％），GSH処理区で５頭中２頭（40％）が受高くなる傾向がみられた。しかし，４℃で保存し胎し，それぞれ正常分娩した。GSH処理精液由来

た場合は添加精子の運動性は悪くなる傾向がみら

体外受精産子は，２頭とも，黒毛和種正常発育曲れた。

線を上回る発育であった。

市販のAx/Eを用いた場合，一次希釈液におけ3 . 3 アスタキサンチン等難溶性抗酸化物質添加が精子の運動性に与える影響

るAx濃度は0.0004％，凍結時におけるAx最終濃度は0.00013％となる。THFに溶解したAxを１４％のAx/Tを卵黄含有希釈液に１μL/mLもμＬの添加でAx/Eと同等の濃度のAxを添加する

しくは５μL/mL添加したところ，１μＬ添加のためには，0.4％濃度のAx/Tストック溶液を一次場合（0.004％）に37℃で保温した際の運動性が希釈液に１μL/mL添加（濃度0.0004％）する方よくなる場合がみられた（Fig. 1A, B）。しかし，法が適当と考えられた。AxをDMSOで溶解する

４℃で冷却後の運動性は改善されなかったには400μg/mL（0.04％）濃度が限界となるため，（Fig. 1A）
。また，静置後に不溶アスタキサンチ

脂溶性抗酸化物質を添加する場合に溶解性の非常ンとみられる沈殿が生じた。一方で，１％のAx/に高いTHFを利用する価値は高いと考えられた。

Tを添加した場合は希釈液全体が赤みがかり，水添加効果については，今後さらに検討を要する。

溶化アスタキサンチンを用いた場合に近い状態で

3 . 4 アスタキサンチン高含有鶏卵の利用が凍溶解したものと考えられた。しかし，１％のAx/
Tを添加した場合に必ずしも運動性は改善されな

結精液の運動性に与える影響
３頭の種雄牛の測定値（ｎ＝９）をとりまとめ

A）

B）

100

100

80

80

60

60

N1-1

N1-2

N2-1

C

1Ax/T5

4℃ 1d

C

0

1Ax/T14℃ 4h

T Ax/T

4Ax/T5

37℃ 3hT Ax/T C

4Ax/T1

37℃ 1hT Ax/T C

1Ax/T5

T Ax/T C

1Ax/T1CC

0

20
4Ax/T5

20

±
＋
PM

40

C

40

4Ax/T1

±
＋
PM

N2-2

Fig. 1 Motility of fresh ejaculated spermatozoa supplemented with astaxanthin dissolved in THF（Ax/T）measured

by SMAS. A）Motility of spermatozoa（N1）measured at 1 hour（h）and 3 h after incubation at 37℃, 4h and1day after storage at 4℃. Semen diluted by egg yolk-Tris extender（ETE, C）, ETE supplemented with 1μL/mL
of 4% Ax/T, ETE supplemented with 1μL/mL of THF（T）. B）Motility of spermatozoa（N1-1, N1-2, N2-1, N2-2）
measured at 1h after incubation at 37 ℃ . C；ETE, 4Ax/T1；supplemented with 1μL/mL of 4 ％ Ax/T, 4Tx/T5；
supplemented with 5μL/mL 4％ Ax/T, 1Ax/T1；supplemented with 1μL/mL 1％ Ax/T, 1Ax/T5；supplemented
with 5μL/mL 1％ Ax/T.

© The Ito Foundation

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明（Ⅲ）
PM（％）

100.0

品質や受胎性向上効果について検討を行った。そ

TM（％）

＊

203

＊

の結果，GSH処理により前核形成までの段階が改

80.0

善し，体外受精成績の低い精液に改善効果がある
ことが示唆された。一方でGSH処理により精子の60.0

DFI値が非常に高くなる場合のあることが示唆された。GSH処理した精子の生存率および先体正常

40.0

性に影響はみられず，体外受精由来胚盤胞期胚の
20.0
0.0

品質への影響も特にみられなかった。また，体外受精胚を移植したところ正常な産子が得られた。
Control

0h

Ax/E

Control

1h

Ax/E

Fig. 2 Total motility（TM）and progressive motility（PM）

of freezing and thawing semen using control egg
yolk or Ax/E egg yolk（mean ± SD）.Each motility
was measured immediately after thawing （0h）andthen kept at 37℃ for 1 hour（1h）.

難溶性抗酸化物質の希釈液への添加方法としてテトラヒドロフラン（THF）に融解する方法が有効と示唆された。AxおよびCOQ10添加により精子の運動性は37℃保温で若干上昇するが，４℃保存下では低下するなど添加効果は限定的であった。一方でAx高含有卵黄を利用して凍結した精たところ，Ax/Eを使用の場合は通常卵の場合よ子の運動性の明確な改善効果はみられなかった。

り，TMは低下した（ｐ＜0.05)（Fig.２）。また，以上の結果から，抗酸化物質の添加による精子のCURはAx/Eを使用の場合は通常卵の場合より上

品質向上効果については，雄牛ごとの精子の特徴昇した（ｐ＜0.05）。凍結融解直後には有意差はに影響されうること，難溶性抗酸化物質について

み ら れ な か っ た が ，１ 時 間 保 温 後 に は VCL ，は溶媒に影響されることが明らかとなり，その効

VAP，ALHおよびBCFが低下した（ｐ＜0.05）。

果的についてさらに検討していく必要がある。

種雄牛ごとに調査した結果，種雄牛Ｉ１で融解後１時間のTMが低下し（ｐ＜0.05），また，種雄牛
Ｉ３で融解直後のSTR，LIN，CURが有意に増加した（ｐ＜0.05）
。
４．要

約

本研究は，牛凍結精液の製造過程で抗酸化物質
をあらかじめ添加することで，凍結融解時に精子が受ける酸化ダメージを低減させ，受精能を改善することが目的である。我々は，牛凍結精液希釈
液への水溶性抗酸化物質である還元型グルタチオン（GSH）や脂溶性抗酸化物質であるアスタキ
サンチン（Ax）やコエンザイムＱ10（COQ10）の添加による精子の運動性，DNAダメージ率文
献１）
 Gangwar, C., Saxena, A., Patel, A., Singh, S. P.,
Yadav, S., Kumar, R., Singh, V.：Effect of reduced
glutathione supplementation on cryopreservationinduced sperm cryoinjuries in Murrah bull semen,
Anim Reprod Sci，192，171～178，2018.
 Gualtieri, R., Barbato, V., Fiorentino, I., Braun, S.,
２）
Rizos, D., Longobardi, S., Talevi, R.：Treatment
with zinc, d-aspartate, and coenzyme Q10 protectsbull sperm against damage and improves theirability to support embryo development, Theriogenology, 82，592～598，2014.
 武田久美子：精子核DNAダメージを利用した牛
３）
凍結精液品質評価の試み，日本胚移植学雑誌，38，
71～74，2016.
 Boesch-Saadatmandi, C., Rimbach, G., Jungblut,
４）A., Frank, J.：Comparison of tetrahydrofuran, fetal
calf serum, and Tween 40 for the delivery ofastaxanthin and canthaxanthin to HepG2 cells,
Cytotechnology, 63，89～97，2011.

（DFI），体外受精による胚発生率等，凍結精液の© The Ito Foundation

204

分娩後の空胎期間短縮をもたらす新規卵巣機能賦活化技術の開発研究
Development of novel method for reactivation of ovarian function in
postpartum period that achieves shortening the open period

山

村

崇・阪

谷

美

樹

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Takashi Yamamura and Miki Sakatani（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

The duration from parturition to first postpartum ovulation is directly associated withreproductive efficiency in domestic animals. Insufficient gonadotropin-releasing hormone（GnRH）/luteinizing hormone（LH）pulses due to the suckling stimulus and negative energybalance cause anovulation and incomplete development of the dominant follicle in cows in theearly postpartum period and prolongation of calving intervals. Recent emerging evidence
suggests that neurokinin B and its receptor, neurokinin-3 receptor（NK3R）, plays a pivotal
role in generating GnRH/LH pulse. Central and intravenous administration of NKB or NK3Rselective agonist, senktide, stimulates pulsatile LH secretion. Here we aimed to develop of anovel method for reactivation of ovarian function in postpartum period cows using a sustained
release vaginal senktide capsule containing a mixture of mucoadhesive polymer and silicone
fluid. The administration of 0.9 g senktide capsule for 24 h gradually augmented LH secretion
during 0 to 4 h sampling period in lactating beef cows. Ultrasonography diagnosis of ovaries
was performed to identify the first postpartum ovulation in senktide-administered lactating
cattle. The interval from calving to first postpartum ovulation was 20 days in cattle treatedwith senktide capsule at 6 days postpartum, while it was 43 and 83 days in cattle treated with
it at 10 days postpartum. Taken together, although doses, the duration and period ofadministration of NK3R agonist should be investigated in the future study, the results implicatethat NK3R agonist via vaginal route may hold promise for noble therapeutic applications toachieve shortening open period in lactating cattle．

１．目

あった分娩間隔が平成29年の時点で433日程度と的

約１ヶ月も延長している。肉用牛に関しては平均

家畜生産において，受胎率低下や分娩間隔の延410日程度で推移しているものの，家畜改良増殖長などにより，生産性が低下している。牛の分娩目標では分娩間隔を380日にすることが目標と間隔は特に乳用牛で年々延長傾向にあり，牛群能なっており，繁殖サイクルを短縮することが求め

力検定成績によると平成元年に平均410日程度でられている。分娩間隔の延長の一因として，空胎© The Ito Foundation

分娩後の空胎期間短縮をもたらす新規卵巣機能賦活化技術の開発研究

205

期間の延長があげられている。分娩後の吸乳刺激起することが明らかにされている４）。加えて，分や負のエネルギーバランス状態になることによ娩後の泌乳期である牛へNKB受容体作動薬（セり，子宮修復や初回排卵の遅延，発情微弱・無発ンクタイド）を血中持続投与すると，投与直後か情等の繁殖障害を抱える個体は少なくなく，これらパルス状LH分泌が亢進し，その後の初回排卵

らが空胎期間の延長に大きく寄与していることがが15～25日程度早まることが示された５）。これら考えられる。その中で，初回排卵の遅延には卵巣のことから，NKB受容体作動薬を用いることにの卵胞発育の遅延や排卵障害が関与しており，こより分娩後の卵巣機能を高め，卵胞発育や排卵をれらの改善が生産性向上に向けての課題となって促進することにより分娩後の初回排卵に至るまでいる。

の期間を短縮できる可能性が示された。

ほ乳類において，繁殖機能は視床下部―下垂体本研究は，これらの成果をさらに発展させ，牛―性腺軸によって制御されている。脳の視床下部の分娩後の空胎期間の短縮を達成するため，分娩で産生された性腺刺激ホルモン放出ホルモン

後の牛の卵巣機能を賦活化し初回排卵を促進する（GnRH）は下垂体門脈血中へ放出され，下垂体ための最適なNKB受容体作動薬の投与条件を決に運ばれ黄体形成ホルモン（LH）などの放出を定し，さらに簡便な投与方法の開発研究を行うこ

促進し，これらが卵巣などに作用することによりとを目的とした。

繁殖機能が制御されている。GnRHおよびそれに続くLHの分泌は，数十分ないし数時間の周期で

２．方法

パルス状に変動することが知られており，このパ

2.1

ルス頻度が卵巣の活動を制御していると考えられ

農研機構那須塩原事業場で飼養している分娩後ている。乳牛では，優性卵胞はLHパルスが0.6～の授乳中の黒毛和種４頭を供試した。冬期に実施

0.75回／時間で排卵するが，0.3回／時間では閉鎖した。いずれも初産であり，分娩時の月齢の平均することや，分娩後に授乳している肉牛ではLH

は32.0±2.9であった。母牛は分娩７日前に分娩房パルス頻度が0.2回／時間程に抑制されているこへ移動し，分娩後10日間は子牛同居の元で分娩房とが示されている。よって，LHパルスの頻度にて管理した。温度，明暗調節は行わず，自然条を人為的に制御することで，卵巣の機能を高める

件下の屋内で自由飲水とし，給餌は１日２回（１ことができることが考えられた。

回：濃厚飼料1.0kg，乾草4.0kg）行った。分娩10

１，
２）

供試牛

近年，脳の弓状核に存在し，GnRH/LHパルス

日目以降は屋外のコンクリートパドックに移し，を 上 位 か ら 制 御 し て い る と 考 え ら れ る KNDy

自由採食（乾草），自由飲水条件で，集団の親子

ニューロンが発見された。山羊を用いた電気生理

飼育を離乳時期（約90日まで）継続した。すべて学的手法を用いた試験により，KNDyニューロンの試験は，農研機構動物実験等実施規則に則り

近傍で周期的な神経発火活動の上昇が起き，それ行った。

がLHのパルス状分泌と一対一で応対していたこ

2.2とから，その神経活動がGnRH/LHのパルス状分

NKB受容体作動薬としてセンクタイド（WuXi

泌を制御している可能性が示されている 。さらAppTec）を用いた。簡便な投与経路として腟内

に ，KNDy ニ ュ ー ロ ン を 構 成 す る 因 子 で あ る

投与を検討し，山羊を用いた予備実験において腟

ニューロキニンＢ（NKB）がこの神経活動を誘内から血中への移行性が９割程度と推測でき，牛３）© The Ito Foundation

NKB受容体作動薬徐放性製剤

206

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

においては50nmol／分でセンクタイドを血中持−30℃で保存した。また，センクタイド投与後は続投与するとLHパルスが亢進することを確認し２～３日おきに，排卵の指標となる血中プロジェていることから，これを24時間投与するとし，0.9

ステロン濃度測定のための採血と，初回黄体形成

ｇのセンクタイドを用いた。また，センクタイド

確認のため直腸検査ならびに超音波検査を行っを徐放的に作用させるためシリコーンを基材とした。血中LH濃度測定は放射免疫測定法にて行い，た徐放製剤とセンクタイドを混合し，000号ゼラ

血中プロジェステロン濃度測定は株式会社ビー・

チンカプセル２個に封入した。

エム・エルに委託した。

2.3

投与具

３．結果と考察

センクタイドカプセルを腟内で安定的に維持するための投与具を用いた。投与具はシリコーン製

NKB受容体作動薬が経腟投与により卵巣機能で薬剤装填部位と前進駆動部からなり，投与具のを刺激しているかどうかの指標として，投与前後

先端が薬剤装填部位となっている。投与具は陰門の血中LH濃度を観察した。投与前は低い数値でより腟浅部に挿入し，挿入後は腟の脈動と投与具推移していた血中LH濃度が，投与後に徐々に上の構造により投与具が自ら前方に進み腟深部に滞昇していった（Fig. 1A）。また，投与終了直前に留する仕組みとなっている。

は，その上昇は収まっていたものの，パルス状の2 . 4 分娩後の牛へのセンクタイド徐放製剤のLH分泌が確認された（Fig. 1B）。これらのことか

投与試験

ら，牛においてもNKB受容体作動薬は腟内投与

分娩日を０日とし，分娩後６～10日目に試験をでも血中投与と同様LH分泌を刺激することが明行った。試験日前日に採血用のカテーテルを頚静らかとなった。作動薬として用いたセンクタイド

脈の片側に留置した。センクタイドカプセルを投は分子量842と比較的小さく，他のステロイド製

与具に装填したものを試験日の13：30に腟内へ挿剤と同様腟壁から吸収され作用したものと考えら入し，24時間後に抜去した。挿入日および抜去日れる。作用部位に関しては，血液循環によりセンの９：30～17：30（８時間）に12分おきに採血をクタイドが脳の弓状核のKNDyニューロンを刺激行い，血漿を遠心分離により採取し，測定までした結果，GnRH/LH分泌が誘導されたものと推LH（ng/ml）

2.5
2.0

A

B

1.5
1.0
0.5
0.0
－４

－２

０
Time（ｈ）

２

４

20

22

24
Time（ｈ）

26

28

Fig. 1 Effects of 24-h infusion of the NKB receptor-selective agonist, senktide, on LH secretion in postpartum

cows. A representative profile of LH concentrations in postpartum cows from -4 to 4 hours（A）and from
20 to 28 hours（B）after administration. The shaded area represents a period of administrations．

© The Ito Foundation

207

分娩後の空胎期間短縮をもたらす新規卵巣機能賦活化技術の開発研究

Table 1 Effects of the NKB receptor-selective agonist, senktide, on the first postpartum ovulation in lactating cows
Treatment days
after parturition

Days of animals
showing corpus luteum

Days of plasma progesteronlevels above 1 ng/ml

26

6

20

26

31

10

83

80

44

10

43

NA

Cow No.

Treatment

Age of month1

Senktide2

Senktide3

Senktide

測されるが，ヒトにおいては卵巣顆粒膜細胞におが影響していることが考えられた。排卵促進が見い て ス テ ロ イ ド 産 生 に 関 わ る CYP11A とられた個体の試験日は分娩後６日であったのに対CYP19AI遺伝子発現を増加させる作用を持つこ

し，そうでなかった個体の試験日は分娩後10日でとが知られている

ことから，卵巣へ直接作用しあった。わずか数日の違いではあるが，分娩後のている可能性も排除できず，今後の研究が待たれ肉牛では新しい卵胞波の出現が分娩後２週間程度る。投与後に徐々に血中LH濃度が上昇しているで表れるとされ，分娩後10日の投与がこの卵胞波ことから，薬剤が徐放的に作用しており，徐放性や初回優性卵胞の出現に悪影響を与えた可能性が製剤が有効であることを示している。抜去直前に考えられた。また，上記のとおり，薬剤が想定よLHパルスが確認されたが，これがセンクタイド

りも強く作用している可能性が考えられ，予期せ刺激由来のものか自発的なものかの判断はつかな

ぬ反応が起きたことも考えられた。これらのこと

いが，抜去後に投与具に装填した薬剤がすべて消から，薬剤量や濃度だけでなく，投与時期が初回失していたことから，薬剤が想定よりも早く溶け排卵日に及ぼす影響を検討し，確実に初回排卵を切り，効果が24時間続いていないことが考えられ促進できる条件を決定する必要がある。

６）たため，今後は徐放性製剤の粘度を調整し，効果の持続性を高める必要があると考えられる。

分娩後初回排卵促進において，GnRHやそのアナログを用いた方法が試みられているが，分娩後センクタイド徐放性製剤投与による分娩後初回

10～15日目の単回投与で排卵が見られたり見られ排卵を示す結果をTable１にまとめた。分娩後初なかったりとその効果が明確ではないが，これは回排卵の指標として，超音波検査により黄体形成

投与時の優性卵胞の状態に左右されているものとと血中プロジェステロン濃度を測定し，その濃度考えられる。また，単回投与では卵胞発育よりもが１ng/mlを超えた日を確認した。まず，本研究

排卵への刺激となっており，卵胞が十分に発育しで用いた個体と同時期に分娩した同牛群（ｎ＝ていない質の良くない排卵となっていることが考11）における平均初回排卵日は分娩後33.4±8.5日えられる。本研究はセンクタイドにより卵胞発育（平均±SE）であった。Cow No.１においては，を促すことにより正常な排卵を早期に誘起するこ

分娩後20日に黄体形成確認および26日にプロジェとを目的としており，適切な投与期間や量，タイ

ステロン濃度の上昇を確認し，早期の排卵を確認

ミングを模索することで，従来の方法よりも優れできた。一方，Cow No.２とNo.３においては，た方法になることが期待される。

初回黄体確認日が83および43日であり，特にCow
No.２において排卵が牛群平均と比較しても遅れ

４．要約ていることが分かった。これらの効果の表れ方の牛の分娩後の空胎期間短縮を達成するために，違いに関して，投与時における分娩後日数の違い

GnRH/LH分泌を促進する作用を持つNKB受容体© The Ito Foundation

208

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

作動薬を経膣持続投与し，卵巣機能を賦活化させることによる，分娩後の初回排卵の促進効果を検討した。その結果，初回排卵が促進する個体があった一方，遅延する個体もあり，処置するタイ
ミングや投与濃度が影響していることが示唆され，今後適切な投与量や投与時期を検討することで，新たな卵巣機能賦活法として利用できることが期待される。
文献１） Beams, S. W., Bulter, W. R.：Biol Reprod，56，

133～142，1997．
２）
 Canfield, R. W., Butler, W. R.：Domest Anim
Endocrinol，7，323～330，1990．
３） Wakabayashi, Y., Nakada, T., Murata, K., Ohkura,S., Mogi, K., Navarro, V. M., Clifton, D. K., Mori, Y.,
Tsukamura, H., Maeda, K. I., Steiner, R. A.,
Okamura, H.：J Neurosci，30，3124～3132，2010．
４） Yamamura, T., Wakabayashi, Y., Ohkura, S.,
Navarro, V.M., Okamura, H.：J Reprod Dev，61，20～29，2015．
５） Nakamura, S., Wakabayashi, Y., Yamamura, T.,
Ohkura, S., Matsuyama, S.：Biol Reprod，97，81～
90，2017．
 Qi, X., Salem, M., Zhou, W., Sato-Shimizu, M., Ye,
６）
G., Smitz, J., Peng, C.：Endocirnol，157，3355～
3365，2016．

© The Ito Foundation

209

ホルモンおよび成長因子の複合添加培地を用いた賦活培養による牛体外受精由来胚の着床能力向上に関する研究Study on improvement of implantation potential in bovine embryo derived
from IVMFC by combined treatment with hormone and growth factor

髙﨑

久子・宍戸

容子・湯澤

裕史・松本

浩道＊・福井えみ子＊・関澤

文夫＊＊（栃木県畜産酪農研究センター，＊宇都宮大学，＊＊関沢アニマルクリニック）

Hisako Takasaki, Yoko Shishido, Hirohumi Yuzawa, Hiromichi Matsumoto＊, Emiko Fukui＊
and Fumio Sekizawa＊＊（Tochigi Prefectural Livestock & Dairy Experimental Center, ＊Utsunomiya Universitiy, ＊＊Sekizawa Animal Clinic）

The reduction in the number of Japanese black cattle means the technical development ofefficient production using bovine embryos derived from in vitro Matured, fertilized andcultured（IVMFC）is a pressing need. The purpose of this study was to examine the effects ofembryo development and implantation of bovine embryos cultured in culture medium（PEC）
containing prolactin（PRL）, epidermal growth factor（EGF）, and 4-hydroxyestradiol（4-OHE2）after IVMFC. The results of this study suggest that this medium of PEC restrain the early
development of the bovine embryo. Compared with the control division, the number of cells in
the morula or blastocyst stage increased. Moreover, when these embryos were transplanted,
the conception rate tended to be higher than that with the control division.

１．目

受胎率：新鮮卵36％，凍結卵37％，平成27年度農的林水産省調べ）ことから，子牛の増産技術として

近年，和牛繁殖農家の戸数減少などにより子牛活用するためには，受胎成績の改善が必要である。

生産基盤の弱体化が見られ，生産頭数の減少によ

ところで，胚が着床する過程で，子宮内では多る素牛価格の高騰が続いており，和牛子牛の増産

くの成長因子が作用し，胚の発達を促進させる。

技術の開発が求められている。その一つとして，

これまで，胚盤胞への成長を促成する多くの因子と体卵巣を活用し，体外受精技術により作出されが同定され，栄養膜細胞の分化調整に対する細胞た胚を用いて借腹移植により和牛子牛を生産する

内シグナルに関する作用が報告されている１）。ま

方法は，肥育素牛を低コストで増産する技術とした，体外胚の受胎率は，胚盤胞の品質が低いことて注目されている。しかし，体外受精によって作が着床に大きく影響していると言われており２），出された胚は，体内胚に対し凍結保存時の耐凍能

胚の成長促進を働きかけることによって受胎率のが劣り，受胎率も低い傾向が見られる（体内胚移改善が図られると考えられる。松本らは，哺乳類

植受胎率：新鮮卵50％，凍結卵49％，体外胚移植

胚の着床に関する研究分野において，マウス胚の© The Ito Foundation

210

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

着床能力獲得過程におけるタンパク質の発現や分びプロカイン塩酸塩（動物用塩プロ注「KS」，共解の制御機構に関する報告を行っており，この立製薬）100mgの尾椎硬膜外麻酔を行った。OPU

研究成果の一つとして，胚盤胞期胚をプロラクチ

は10MHzの経腟プローブを接続した超音波診断

ン（PRL），上皮成長因子（EGF），４ヒドロキシ装 置 （MyLabOneVET, Esaote Europe B.V. 社）

エストラジオール（4-OH-E２）の３つの成長因と吸引装置（FV６，富士平工業）に接続した17子を複合添加（PEC処理）した培養系により賦活

Ｇ×540mmの採卵針（アロカタイプ，ミサワ医化し，着床能力に影響する遺伝子を活性化して関科工業）を用いて一定の陰圧（120mmHg，20―

連するタンパク質の発現を促進させ，母体由来の25ml／分）で行った。超音波ガイド下にて採卵シグナルに対する応答能力を高めることで，移植針を卵巣に誘導し，卵胞液とともに卵胞内卵母細４）時の胚の着床能力を高める手法を構築している 。

胞を吸引した。回収液には10IU/mlヘパリンナト

本研究では，牛体外胚の受胎能力を向上させる

リウム（ヘパリンNa注10,000単位，持田製薬），

ため，松本らがマウス胚に対して実施したPEC処

0.1％（v/v）子牛血清および抗菌薬を添加した乳理による成長因子の賦活化処理を牛体外胚の作出

酸加リンゲル液（ハルゼンＶ注射液，日本全薬工時に応用し，胚の発生状況や遺伝子の発現を解析

業）を用いた。

３）することで胚の発生および着床能力に対する効果の検討を行った。また，処理胚を実際に受胚牛に2.1胚のPEC処理

PEC処理の効果および処理の最適な時期を検討

法するために，体外受精により発生した胚をPEC処理区と対照区の２群に分け，次の３つの添加実験

体外受精卵の作出

2.1.1の方法で体外受精を行った。
2.2

移植し受胎率の検証を行った。
２．方採取した卵子はと場由来卵巣からの卵子と同様と場由来卵巣を用いた体外胚作出と場由来卵巣より採取した卵子を５％（v/v）

を行った。なお，対照区は無添加（実験１，２および３）とした。

牛胎児血清（FBS），0.02AU/mlFSH（共立製薬）

2 . 2 . 1 発生培養初期（Day０）および後期桑および10μg/mlゲンタマイシン（SIGMA）を添

実胚期（Day６）添加区（実験１）

加したTCM-199（Thermo Fisher Scientific）培

媒精終了直後（Day０），胚を卵丘細胞から完養液を用いて38.5℃，５％CO２気相にて20時間の全に除去し，試験区はSOF-BE１基礎培地へPEC

体外成熟を行い，その後IVF100媒精液（機能性処理して38.5℃，５％CO２，
５％Ｏ２気相で24時間

ペプチド研究所）で希釈した凍結融解精液（1.0

培養後，Day１にSOF-BE１基礎培地（無添加）×10 /ml）とともに38.5℃，５％CO２気相で５時にて38.5℃，５％CO２，5％Ｏ２気相で５日間培養間媒精した。

し，さらにDay６に後期桑実胚まで発生している

７

2 . 1 . 2 OPU（Ovum Pick-Up）による生体由来卵子からの体外胚作出

胚をSOF-BE１基礎培地へPEC処理して38.5℃，
５％CO２，５％Ｏ２気相で24時間培養した。

発情周期の任意の時期に未成熟卵をOPUによ2 . 2 . 2 発生培養初期（Day０）添加区（実験り採取した。センター飼養黒毛和種繁殖雌牛を供

２）

試し，供試牛は枠場に保定してキシラジン塩酸塩

媒精終了後（Day０），胚を卵丘細胞から完全（セラクタール注２％，バイエル薬品）10mgおよに除去し，試験区はSOF-BE１基礎培地へ，PEC© The Ito Foundation

ホルモンおよび成長因子の複合添加培地を用いた賦活培養による牛体外受精由来胚の着床能力向上に関する研究

211

処理して，38.5℃，５％CO２，
５％Ｏ２気相で24時し，ガラスボトムディッシュ（日本ジェネティク

間培養後，Day１にSOF-BE１基礎培地（無添加）ス）に載せ，共焦点レーザー走査顕微鏡（Leica

にて38.5℃，５％CO２，
５％Ｏ２気相で５日間培養

TCS SP8, Leica Microsystems）で観察した。
2.4

した。
2 . 2 . 3 後期桑実胚期（Day６）添加区（実験

胚移植および妊娠診断

実験３で胚盤胞期胚まで発生した胚のうち，code１と評価され発現解析に用いたもの以外の

３）
媒精終了後（Day０），SOF-BE１基礎培地に胚について移植を行った。受胚牛にはホルスタイて38.5℃，５％CO２，
５％Ｏ２気相で６日間培養し，ン種を用いて，発情から６―８日後に黄体側の子Day６に桑実胚期以上の発育ステージの胚を試験宮角に新鮮胚を１個移植した。移植には牛受精卵区と対照区に区分し，試験区はSOF-BE１基礎培

深部注入カテーテルYTガン（ヤマネテック）を地へPEC処理して24時間培養し，Day７および８用いた。移植後，発情から40～60日後に直腸検査に胚盤胞期胚を得た。

法による妊娠診断を行った。

対 照 区（実 験 １，２および３）は媒精終了後（Day ０），SOF-BE １ 基 礎 培 地（無 添 加）に て
38.5℃，５％CO２，５％Ｏ２気相で７―８日間培養

３．結果と考察
実験１，実験２および実験３を比較しPEC処理の効果と最適時期を検討した。実験１のPEC処理

し，Day７および８に胚盤胞期胚を得た。
なお，OPUによる採取卵についても，体外受

区 で は 68 個 の 卵 子 を 体 外 受 精 し 媒 精 終 了 直 後（Day０）およびDay６の２回PEC処理を行った

精後に実験３と同様の処理を行った。
EGFRおよびBRCA１の発現分析

が，対照区で76個の卵子に対しDay６の時点で17

実験３で胚盤胞期胚まで発生した胚の一部に個（22.4％）の桑実胚を得たのに対し，PEC処理

つ い て ，免 疫 蛍 光 染 色 法 に よ り EGFR お よ び

区は桑実胚まで発生したものは０個（0.0％）でBRCA １ の 発 現 に 関 す る 分 析 を 行 っ た 。胚 はあり，その後の発生も認められなかった。実験２International Embryo Technology Society（IETS）の媒精終了後（Day０）のみPEC処理を行った区マニュアルで定められている基準に従って評価

でも，実験１と同様にPEC処理区では桑実胚以上し，発生培養７日目にcode１と評価した胚盤胞期の発生は認められなかった。また，実験２では対胚を分析に用いた。免疫蛍光染色は既報

照区と比較してPEC処理区では有意に分割率が低

2.3

に従っ

３，
４）

た。Ca２＋およびMg２＋を含まないダルベッコのリ

かった（Table１）。

ン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）で調整した3.7％ホ

これに対し，実験３では，Day６の後期桑実胚

ルムアルデヒド液で胚を30分間固定し，0.25％

期に24時間のPEC処理を行った処理区において，Tween20のD-PBSで５分間透過処理し，免疫蛍光Day７に胚盤胞まで発生した胚数が対照区よりも染色に供するまで４℃で保存した。BRCA１に特多い結果であり（Table２），また，細胞数におい異 的 な 一 次 抗 体 （Santa Cruz Biotechnology）ても有意差は認められないものの対照区と比較しD-PBSで数回洗浄した後，胚を室温でFITC標識てPEC処理区で細胞数が多い傾向が見られた（ｐ（MP Biomedicals）MP二次抗体とともに室温で１＜0.18）（Table３）。

時間反応させた。次いで，胚を室温で５μg/mlの

なお，OPUは延べ５頭の黒毛和種繁殖雌牛に

ヘキスト33342（SIGMA）で１時間染色し，洗浄対し実施し72個（平均14.4個）の培養可能卵子を© The Ito Foundation

212

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 1 Effect of 3-factor composite addition in vitro development of the early bovine embryos
Day

Day 0

Day 2

Day 6

Day 7

Day 8

Treatment

No. of embryos

No. of cleaved embryos

No. of morulae

No. of blastocysts

No. of blastocysts

Exp. 1
Exp. 2Control

68

36（52.9%）0（0.0%）

0（0.0%）

0（0.0%）PEC
Control76
4250（65.8%）5（11.9%）a17（22.4%）0（0.0%）

7（9.2%）
0（0.0%）

15（19.7%）0（0.0%）

PEC

45

18（40.0%）b8（17.8%）7（15.6%）9（20.0%）a, b Values with different superscript letters within a column differ significantly（p<0.05）.

Table 2 Effect of 3-factor composite addition in vitro development of bovine embryos（Exp. 3）
Day

Day 0

Day 2

Day 6

Day 7

Day 8

Treatment

No. of embryos

No.（%）of cleaved embryos

No. of morulae

No. of blastocysts

No. of blastocysts

ControlPEC

386

228（59.1）

54（28.0）54（28.0）31（16.1）a20（10.4）b32（16.6）24（12.4）a, b Values with different superscript letters within a column differ significantly（p<0.05）.

Table 3 Blastocysts cell number on Day 7 and 8（Exp. 3）
Day

Day 7

Day 8

total

Treatment

No. of blastocysts

cell number

No. of blastocysts

cell number

No. of blastocysts

cell number

ControlPEC

10
16

121.7±13.2148.5±11.652119.0±38.2
55.5±3.2

15
18

120.8±15.5138.2±12.4得た。これを体外受精した結果，Day２において添加は卵子から胚盤胞への発生率を有意に高め

２細胞以上に発生が進んだ胚は17個（23.6％）にる７，８，11）と報告されている。このような報告からとどまり，Day７―８で胚盤胞まで発生したのは

実験１および２においてもPEC処理区の発生率が０個であった。今回，OPUにより採取した卵子高まることが期待されたが，今回の実験では胚盤からの胚の発達が悪かった点については，今後培胞への発生が認められなかった。このことから，

養方法も含め検討する必要があると考える。

初期胚においてはPRLまたは4-OH-E２ が，もし以上の結果から，PEC処理による牛体外胚へのくは３因子の複合添加が発生に抑制的に働く可能効果は次のとおり考察される。今回用いた３因子性があると考えられる。しかし，実験３において複合添加剤のうちの１因子であるEGFにおいてはDay７における胚盤胞数がPEC処理区で有意には，卵胞液や雌生殖器に存在することが知られて多く，細胞数の多い胚盤胞胚が多く得られる傾向

おり，培地に添加することで胚盤胞発生率の向があったことから（Fig.１），胚盤胞期のPEC処

上や細胞数増加効果があると報告されている７～９）。

理は胚の発生を促進している可能性があると思わ

このEGFは細胞表面の受容体に結合し，受容れる。今後は，さらに牛胚培養時における最適な

５，６）体に備わるタンパク質チロシンキナーゼ活性を刺

添加濃度の検討も課題であると考えられる。

激し，これによりシグナル伝達カスケードを開始

また，得られた胚盤胞胚のEGFRおよびBRCA

して，最終的にDNA合成，細胞増殖などに関与

１の発現について分析したところ，PEC処理区とする 。これまでの報告でも，EGFの培養液への対照区で差は認められなかった。マウスにおいて

10）© The Ito Foundation

ホルモンおよび成長因子の複合添加培地を用いた賦活培養による牛体外受精由来胚の着床能力向上に関する研究

Nuclei

Merge

PEC

Control

Brightﬁeld

213

Fig. 1 Morphology and nuclear stain in bovine blastocysts derived

from IVMFC. Blastocysts obtained by control and PEC were
examined on day 8 and day 7, respectively．

は胚盤胞をPRL，EGF，4-OH-E２ を複合添加した培養系により，着床能力に影響する遺伝子を活性化して，関連するタンパク質の発現を促進させ，母体由来のシグナルに対する応答能力を誘導し，移植時の胚の着床能力を高める手法が報告さPECれている４）。３つの因子とも，マウス胚盤胞の栄
養外胚葉において，BRCA１の発現を促進させる

Control

Fig. 2 Transplanted blastocyst

が，それぞれ単独では異なるタンパク質の発現を促進させる。PRLとEGFはともにEGF受容体のスタイン雌牛にPEC処理区と対照区のそれぞれの発現を誘導させるが，PRLはEGFRの発現に作用

胚（Fig.２）を移植し受胎率を調査した。受胎率するのに対し，EGFはEGFRとERBB４の発現をはそれぞれ37.5％（5/8），0.0％（0/5）であり，賦活化させる。一方で4-OH-E２ は基底膜の構成

有意差は認められないもののPEC処理区のほうが成分であるTINAGL１の発現を賦活化させる。し高い傾向であった（ｐ＜0.12）。しかし，胚移植

かしながら牛胚におけるPRLや4-OH-E２ の作用の受胎率に関する要因は胚の品質だけではなく，については未解明な点が多い。牛体外受精由来胚

受胚牛の状態や移植手技も関連することから12），の着床能力を向上させる手法を構築するために，さらに検体を集積することで精査していきたい。

今後は牛胚における３つの因子の作用機序の解析を進める方向性が示唆された。また，本試験では４．要約得られた胚盤胞胚のうち良質胚を移植試験に用い本研究では，牛体外胚の受胎能力を改善させるており，免疫蛍光染色法による分析は一部胚にため，体外胚を，着床に重要な基底膜形成等の成限って実施したことから，今後は検体を集積し十長促進因子やホルモンなどであるPRL，EGFおよ分に精査していく必要があると考えられた。

び4-OH-E２ の３因子複合添加した培養系で処理得られた胚盤胞胚の受胎性評価について，ホルし，胚の発生および着床能力に対する効果の検討© The Ito Foundation

214

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）を行った。初期胚において３因子の培地への複合添加は発生に抑制的に働くことが示唆された（実験１，２）が，桑実胚期～胚盤胞期胚における３因子の複合添加は，細胞増殖が促進され，細胞数の増加や胚盤胞への発育速度が速まる可能性が示唆された（実験３）。また，これらの処置を施した胚の移植では無添加区と比較して，受胎率が高い傾向があった。
しかし牛体外胚におけるPRLや4-OH-E２ の作用については未解明な点が多く，着床能力を向上させる手法を構築するために，今後は牛体外胚における３つの因子の作用機序を解析するとともに添加剤の牛胚における最適濃度の検討も課題であると考える。
文献１） Yoshinaga, K.：Am J Reprod Immunol，63，413～424，2010．
２） Urman, B., Yakin, K., Balaban, B.：Reprod

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Yoshizawa, M., Mastumoto, H.：Mol.Hum.Reprod.,
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５） Ohtani, S., Okuda, K., Ohtani, M., Yamada, J.：J
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８） Sirisathien, S., Brackett, B. G.：Mol Reprod Dev，
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Brackett, B. G.：Anim Reprod Sci，77，21～32，
2003．
10） Graham, C., Stanley, C.：J Biol Chem，14，7709～7712，1996．
11） Y a n g , B . K . , Y a n g , X . , F o o t e , R . H . ：Theriogenology，40，521～530，1993．
12） 小林大誠，久保田尚，千葉耕司，山下秀幸：千葉
畜セ研報，13，15～20，2013．

© The Ito Foundation

215

分娩後のプロスタグランジン製剤投与が牛子宮修復の促進およびその後の繁殖機能に及ぼす影響
Stimulatory effects of prostaglandin administration on bovine uterine
involution and its subsequent effects on reproductive function

伊

賀

浩

輔

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター畜産飼料作研究領域）

Kosuke Iga（Division of Livestock and Forage Research, Tohoku Agricultural Research Center, NARO）

The aim of the present study was to evaluate the effects of dinoprost on uterine involution
in Japanese black cows and its subsequent effects on fertility after parturition, and the effect ofphysiological uterine function recovery on 35 and 40 days after parturition using oxytocinl_（OT）_challenge test. Administration of dinoprost on 14 days after parturition had no effectshortening the days of morphological uterine involution and first ovulation but showed atendency（p＜0.07）to promote the elimination of lochia. The days of standing heat, first
artificial insemination（AI）and embryo transfer（ET）also had no shortening effect. In
addition, the conception rate after the first AI or ET showed a higher value（75.0％）than thecontrol group（50.0％）, but there was no significant difference. On the other hand, in thephysiological uterine function recovery at 35 days after parturition, the prostaglandin F
metabolite（PGFM）production rate from 15 min after OT load was significantly higher（p＜0.05）than that at 0 minutes with and without administration of dinoprost. The PGFM
production rate after administration of dinoprost tended to be higher（p＜0.06）than that in thecontrol group. At 40 days after parturition, the PGFM production rate from 15 min after OTload tended to be higher（p＜0.09）than that at 0 minutes. A similar transition pattern wasshown regardless of whether dinoprost was administered or not. Based on these findings, inJapanese black cows under natural feeding after normal parturition, administration of dinoprost
on 14 days after parturition promotes the elimination of lochia during the uterine involution
process, and it was suggested that physiological uterine function may be recovered to normal
condition at 35 days after parturition. By establishing a more effective administration methodin the future, it is expected that the uterine involution will be promoted and that the fertility
will be recovered early, and then the delivery interval will be shortened.

１．目

盤強化が行われている。和牛・乳用牛の増頭対策的として，輸出に適した優良な黒毛和種増産のた

近年，牛肉や乳製品の国内需要の増加への対応

め，繁殖雌牛の増頭や受精卵の増産が進められてと輸出の一層の拡大のため，畜産・酪農の生産基いる。子畜の生産性向上のためには繁殖雌牛の効© The Ito Foundation

216

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

率的な利用が必須となることから，分娩後に早期かつ正常に卵巣と子宮を回復させ，遅滞なく繁殖

２．方法

2 . 1 分娩後14日の黒毛和種へのジノプロスト

技術を適用する必要がある。
牛の子宮修復は飼養環境や分娩に伴う疾病の有の投与がその後の形態的な子宮修復，悪露無により完了する時期は変動するが，正常分娩後の排出，初回排卵，初回発情，初回人工授30～45日の生理的空胎期間を経て形態的な子宮修精あるいは受精卵移植日およびその後の受復が完了する。分娩直後に高濃度な内因性のプロ胎率に及ぼす影響

スタグランジンＦ２α（PGF２α）は日数経過に正常分娩後，自然哺乳下の黒毛和種経産牛８頭

伴い急激に減少し，その後低値を推移する。PGFを供試し，分娩後14日に子宮修復を促すため４頭２αは平滑筋収縮作用を有することから，分娩後にジノプロスト（パナセランHi，Meiji Seikaファの持続的な子宮収縮に伴い後産や悪露の排出を促

ルマ（株））を30mg筋肉内投与（ジノプロスト

すとともに，妊娠により拡張した子宮や子宮動脈区）し，４頭は無投与（対照区）とした。いずれを妊娠前の状態へと修復する。

の試験区においても，分娩後０から40日まで５日

自然哺乳下の黒毛和種において，分娩後０日のごとに超音波画像診断装置を用い，形態的な子宮内因性PGF２α濃度が高い牛群は悪露の排出も早

修復の完了（左右の子宮角中央部直径が同等とな

く，分娩後40日には子宮修復が完了し，さらに，る日），悪露の排出，初回排卵（排卵あるいは黄生理的な子宮機能の一部がすでに回復しているこ体形成の有無）の時期を調べた。初回発情の発見とを明らかにしている 。また，Nakaoら

は胎

は朝夕２回30分程度の目視による観察および発情盤停滞を発症したホルスタイン種において，持続発見補助具（エストロテクト：野澤組）による乗型のPGF２α製剤（フェンプロスタレン）の投与

駕行動を確認し発情日を確定した。また，初回発が子宮修復，卵巣周期の再開およびその後の繁殖情を確認した供試牛については，人工授精（AI）

性の改善に効果があることを報告している。これ

あるいは発情後７日に受精卵移植（ET）を実施

らの結果から，PGF２αは分娩後の子宮修復を促し，AI後30日，あるいはET後28日に超音波画像

す重要な因子であることが考えられる。

診断装置を用い妊娠診断（妊娠腔および胎子心拍

１）

２）

そこで本研究では，正常分娩した自然哺乳下のの確認）を行い，分娩後14日でのジノプロストの黒毛和種を供試し，分娩後の子宮修復過程におけ投与がその後の受胎率に及ぼす影響を調べた。なる天然型のPGF２α製剤（ジノプロスト）の投与

お，本研究では，休薬期間の設定されている持続が子宮修復や生理的な子宮機能の回復やその後の型のPGF２α製剤であるdl-クロプロステノール

繁殖性に及ぼす影響を明らかにし，牛の繁殖サイではなく，休薬期間がなく，用法に子宮平滑筋のクルを維持しながら生理的空胎期間内に子宮修収縮作用による産後疾患の治療が記載されている

復，卵巣周期の再開および子宮機能の回復を促

天然型のPGF２α製剤であるジノプロストを用いし，１年１産を達成するための分娩間隔短縮技術た。

の開発へと繋げることを目的とした。

2 . 2 分娩後14日の黒毛和種へのジノプロストの投与がその後の生理的な子宮機能の回復に及ぼす影響
分娩後35および40日にオキシトシン（OT）負© The Ito Foundation

217

分娩後のプロスタグランジン製剤投与が牛子宮修復の促進およびその後の繁殖機能に及ぼす影響

荷による子宮からの一過性のPGF２α産生促進作

28.8±2.4日）は対照区（33.8±2.4および31.3±2.4

用を指標とした機能評価法を用い，分娩後14日で日）と比較して短縮されたが，両区に有意な差はのジノプロストの投与がその後の生理的な子宮機認められなかった。しかしながら，悪露の排出時能の回復に及ぼす影響を調べた。頸部静脈より期は対照区と比較して早い傾向（ｐ＜0.07）を示

100単位OT（動物用アトニン-Ｏ，あすかアニマした。ジノプロスト区における分娩後の初回発情ルヘルス㈱）を投与し負荷を行い，負荷後０，15，

および初回AI，あるいはET時期（49.8±5.7およ30，60および90分にヘパリン加真空採血管を用い

び56.0±10.1日）は対照区（55.8±9.7および65.3±

頸部静脈より採血した。血液サンプルは遠心分離7.0日）と比較して短縮されたが，両区に有意な（1930x g，４℃，60分）後に血漿層を採取し，差は認められなかった。また，ジノプロスト区に

PGF代謝産物（PGFM）の測定まで－35℃で保存

おける初回AI，あるいはET後の受胎率（75.0％）した。血漿中のPGFMは，エーテル抽出・乾固後，は対照区（50.0％）と比較して高い値を示した

１％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液で調整が，有意な差は認められなかった（Table１）。

し測定サンプルとした。測定は酵素免疫測定法を

3 . 2 分娩後14日の黒毛和種へのジノプロスト

用いPGFM濃度を測定した。OT負荷後15から90の投与がその後の生理的な子宮機能の回復

分のPGFM濃度は０分の濃度に対する百分率に換に及ぼす影響算し，PGFM産生割合の推移より子宮機能の回復を評価した。

分娩後35日では，いずれの試験区においてもOT負荷後15分以降のPGFM産生割合は０分と比較して有意（ｐ＜0.05）に高く，また，ジノプロ

３．結果と考察

スト区におけるPGFM産生割合の推移は対照区と3 . 1 分娩後14日の黒毛和種へのジノプロスト

比較して高く推移する傾向（ｐ＜0.06）が認めらの投与がその後の形態的な子宮修復，悪露れた。一方，分娩後40日では，いずれの試験区にの排出，初回排卵，初回発情，初回人工授

おいてもOT負荷後15分以降のPGFM産生割合は精あるいは受精卵移植日およびその後の受０分と比較して高い傾向（ｐ＜0.09）を示し，ま胎率に及ぼす影響た ，い ず れ の 試 験 区 に お い て も OT 負 荷 後 のジノプロスト区における分娩後の形態的な子宮修復の完了および初回排卵時期（30.0±0.0およびPGFM産生割合は同様の推移パターンを示した（Fig.１）。

Table 1 Effect of dinoprost administration at 14 days after parturition on the days（mean ± SE）of completion ofmorphological uterine involution, elimination of lochia, confirmation of first ovulation or corpus luteum（CL）, firststanding heat, first artificial insemination（AI）or embryo transfter（ET）and conception rate in Japanese blackcows.

Ex. groupnCompletion ofmorphologicaluterine involution

Elimination oflochiaControl

433.8 ± 2.4

38.8 ± 2.4a

Dinoprost4

30.0 ± 0.0

32.5 ± 1.4b

Confirmation of
first ovulation
or CL

First
Standing heatFirst
AI or ET

Conception
rate（%）

31.3 ± 2.4
28.8 ± 2.4

55.8 ± 9.7
49.8 ± 5.7

65.3 ± 7.0
56.0 ± 10.1

50.0
75.0

Dinoprost（30 mg）was administered intramuscularly at 14 days after parturition.
a, b： p<0.07© The Ito Foundation

218
PGFM production ratio（％ of ０min）

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
300 （b）
Control（ｎ＝４）
Dinoprost
（ｎ＝４）
200

600 （a）
Control（ｎ＝４）
500
Dinoprost
（ｎ＝４）
400
300
200

100
Ex. group：ｐ＜0.06
Time：ｐ＜0.05

100
0

0

15
30
60
90
Time after OT injection（min）

0

Ex. group：NS
Time：ｐ＜0.09
0

15
30
60
90
Time after OT injection（min）

Fig. 1 Effects of dinoprost administration on 13,14-dihydro-15-keto prostaglandin F２α（PGFM）production rate after

oxytocin（OT）challenge test at 35（a）and 40（b）days after parturition. Dinoprost（30 mg）was administeredintramuscularly at 14 days after parturition. Meanwhile, 100 iu OT were administered intravenously for oxytocin
challenge test.

本研究の結果から，分娩後14日の黒毛和種へのテロイドホルモン環境の変化に伴うOT受容体のジノプロストの投与により，子宮修復過程におけ発現に関与することが報告されている７，８）。OT負る悪露の排出が促され，分娩後35日には生理的な荷を利用した分娩後の子宮機能の回復評価におい子宮機能は回復し，OT負荷に対する反応性も高ては，形態的な子宮修復完了前後から機能回復はいことが示唆された。乳用牛において，分娩後の進行し，少なくとも分娩後40日には回復すること初期にPGF２αの単回投与により子宮修復を促が示されている１）。これらのことから，分娩後14し，受胎可能な卵巣周期の回復を早めることが報日の黒毛和種へのジノプロストの投与により，分

告されている。また，分娩後14～28日でのジ娩後35日には形態的な子宮修復や悪露の排出は完

ノプロストトロメタミンの単回投与により初回了し，初回排卵も生じていることから，臨床所見

AI後の受胎率は向上する 。この向上効果は，特からも子宮は妊娠前の状態へと回復していることに，ジノプロストトロメタミン投与時の血中プロが十分に考えられる。これに対して，対照区におジェステロン濃度が0.5ng/ml未満の牛群に見られいては，悪露の排出は完了しておらず妊娠前の状ることから，ジノプロストトロメタミンによる黄態へと回復途上であることがうかがえる。いずれ

体退行の効果ではなく，子宮筋の収縮により子宮の試験区においてもOT負荷に対するPGFM産生修復が促進された効果であることが示されていの有意な反応は有するが，子宮内環境の回復状況

る。これらのことから，本研究においても，の違いからPGFM産生割合の推移パターンに違い

機能性黄体が存在しない分娩後14日の黒毛和種へが生じたものと推察される。今後，さらに効果的のジノプロストの投与により，子宮筋が収縮し悪な投与時期や量などを確立することで，分娩後の露の排出が促された結果，初回AI，あるいはET

子宮修復を促し，早期の繁殖機能の回復や分娩間後の受胎率も高くなった可能性が推察される。一隔の短縮が期待できる。

３，
４）

５）

５，
６）

方，OTは黄体退行調節機構に重要な役割を果た
し，子宮からのPGF２α分泌を促進することが知４．要約られている。OT負荷後，子宮からのPGF２α分

本研究では，正常分娩後の自然哺乳下の黒毛和泌は発情周期の時期で異なり，その差違は卵巣ス

種経産牛を供試し，分娩後14日にPGF２α製剤で© The Ito Foundation

分娩後のプロスタグランジン製剤投与が牛子宮修復の促進およびその後の繁殖機能に及ぼす影響219

あるジノプロストの投与による子宮修復過程およ

無に関わらず同様の推移パターンを示した。以上

びその後の繁殖性に及ぼす影響を調べるととものことから，正常分娩後の自然哺乳下の黒毛和種に，分娩後35および40日に生理的な子宮機能の回において，１）分娩後14日にジノプロストの投与復状況をOT負荷後のPGFM産生割合の推移を指により子宮修復過程における悪露の排出が促され標とした機能評価法で調べた。その結果，形態的ること。２）分娩後35日には生理的な子宮機能はな子宮修復の完了および初回排卵時期は対照区

回復し，OT負荷に対する反応も高いことが示唆（無投与）と比較して有意な差は認められないが，された。今後，さらに効果的な投与法を確立する

悪露の排出時期は早い傾向（ｐ＜0.07）を示しことで，分娩後の子宮修復を促し，早期の繁殖機た。分娩後の初回発情および初回AI，あるいは能の回復や分娩間隔の短縮が期待できる。

ET時期においては，対照区と比較して有意な差は認められなかった。また，初回AI，あるいはET後の受胎率においては，対照区（50.0％）と比較して高い値（75.0％）を示したが有意な差は認められなかった。一方，生理的な子宮機能の回
復状況において，分娩後35日では，OT負荷後15分以降のPGFM産生割合は０分と比較して有意（ｐ＜0.05）に高く，また，ジノプロストの投与によるPGFM産生割合の推移は対照区と比較して高く推移する傾向（ｐ＜0.06）が認められた。分
娩後40日では，35日と同様にOT負荷後15分以降のPGFM産生割合は０分と比較して高い傾向（ｐ文献１） 伊賀浩輔：日本胚移植学雑誌 35，117～122，
2013.
２） Nakao, T., Gamal, A., Osawa, T., Nakada, K.,
Moriyoshi, M., Kawata, K.：J Vet Med Sci, 59, 791～
794, 1997.
３） Lindell, J. O., Kindahl, H.：Acta Veterinaria
Scandinavica, 24, 269～274, 1983.
４） Young, I. M.：Vet Rec, 124, 511～512, 1989.
５） Young, I. M., Anderson, D. B., Plenderleith, R.
W.：Vet Rec, 115, 429～431, 1984.
６） Garcia-Villar, R., Marnet, P. G., Laurentie, M. P.,
Toutain, P. L.：Theriogenology, 28, 467～480, 1987.
７） Mayer, H. H., Mittermeier, T., Schams, D.：Acta
Endocrinol, 118, 96～104, 1988.
８） Goff, A. K.：Biol Reprod, 71, 11～16, 2004.

＜0.09）を示すとともに，ジノプロスト投与の有© The Ito Foundation

220

繁殖雌牛における栄養コントロールが過剰排卵処置の反応性および回収胚数に与える影響（Ⅱ）
Effect of nutrition control on superovulation response and the number ofrecovered embryo in heifer（Ⅱ）

林

武司・深水

大・上田

修二・磯崎

良寛

（福岡県農林業総合試験場畜産部）

Takeshi Hayashi, Dai Fukamizu, Shuji Ueda and Yoshihiro Isozaki（Department of Animal production, Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center）

The purpose of this study was to examine the effect of controlling nutritional status (lowto high nutrition) on the number of small and medium follicles in the ovaries, the response tosuperovulation, and the number of normal fertilized oocytes in Japanese Black cows. Nine
Japanese Black cows were fed for 2 weeks in a low nutritional state（TDN：90％ , CP 105％）
for 2 weeks, and changed to a high nutritional diet（TDN：115％ , CP：160％）, and after one
week, CIDR was inserted Thereafter, superovulation treatment was performed, and periodic
artificial insemination and uterus flash were performed. The control group was fed thestandard nutrients（TDN：106％ , CP：140％）for the same period as the test group. There
was no difference between test group and the control group in body weight change during thetest period. After the change to high nutrition, BUN increased in test group. Although thenumber of small and medium follicles did not change during the low nutrition period, thenumber of small and medium follicles in the test group increased numerically after changing tohigh nutrition. However, the number of large follicles due to superovulation was not different
between the two groups. About uterus flash results, there was no difference in the number ofoocytes obtained by embryo collection, but the number of normal fertilized embryos washigher in test group, although there was no significant difference. The number of non-fertilized
oocytes was significantly higher in the control group. As a result, pre-superovulatory
nutritional control in Japanese Black cows increases small-medium follicle but does not affectfollicular development responsiveness after superovulation. On the other hand, it wassuggested that pre-superovulatory nutritional control may reduce the rate of non-fertilizationand increase the number of normal fertilized embryos．

１．目る体内受精胚の採胚による雌側からの改良であ的る。しかしながら，過剰排卵処置におけるホルモ

家畜の生産性向上のために，畜産農家では牛群能力の改良が随時行われている。一般的には人工授精による雄側からの改良と，過剰排卵処置によン投与に対する卵巣の反応性は個体差が大きく，
採胚成績は安定していないのが現状である。
過剰排卵処置と卵巣内卵胞数の関係性について© The Ito Foundation

221

繁殖雌牛における栄養コントロールが過剰排卵処置の反応性および回収胚数に与える影響（Ⅱ）

福田らは処置前の小卵胞数と処置後の大卵胞数と相関が高いことを明らかにしている１）。また山之内らは乳牛未経産牛において給与飼料を低TDN

法

２．方2 . 1 栄養コントロールと試験開始のタイミングからの高TDNへの切替えは卵巣内の小中卵胞数を増加させることを報告している 。これらの報

栄養コントロールと，試験開始のタイミングに告から，申請者は昨年度黒毛和牛雌牛（経産牛）ついてFig.１に示した。試験開始前に試験牛体重を 用 い ，低 TDN（92 ％ ）を ２ 週 間 給 与 後 ，高を測定し，必要養分量を計算したうえで，試験牛TDN（120％）に切り替えるとともにCIDR挿入の標準栄養量（TDN：106％，CP：140％），低を行い，６日後にFSHの漸減投与等の過剰排卵処

栄 養 量（TDN：90 ％，CP：105 ％ ），高 栄 養 量

置を実施し，卵胞数の推移，採胚成績等を調査し（TDN：115％，CP：160％）を設定した。試験た３）。その結果，高TDNへの切替え後６日目で小開始１週間前から標準栄養量の飼料を給与し馴致

中卵胞数の増加傾向がみられたが，その後過剰排期間を設けた。試験開始から試験区では２週間低卵処置による大卵胞数の増加にはつながらなかっ

栄養量を給与した後，高栄養量に変更した。さらた 。これらは低TDNから高TDNへの切替えがに変更から１週間後にCIDR挿入を行い，採胚に急激であること，また高TDNへの移行から過剰よる試験終了まで高栄養量状態を維持した。対照

排卵処置までの期間が短いことが原因ではないか

区は基準栄養量を試験期間中給与した。

２）３）と考えられた。そこで本年度では栄養コントロー

2.2

試験牛の頭数および体重測定・血液検査

ル方法について低TDNから高TDNへ切替えから試験牛は福岡県農林業総合試験場において飼養

CIDR挿入までに１週間期間を設置し，さらに高されている黒毛和種雌牛９頭を用い，試験区と対TDNの値を見直した（昨年度：高TDN120％，

照区を反復して試験を実施した。過剰排卵処置か

本年度：高TDN115％）。この新しい栄養コント

らの回復期間として，各試験の反復間は２ヵ月以

ロール方法が卵胞数や採胚成績に及ぼす影響につ上の休止期間を設けた。体重測定および血液分析

いて調査した。

用の採血は飼料給与から２時間後とし，試験開始から１週間ごとおよび採胚日に実施した（Ｄ０，
Ｄ７，Ｄ14，Ｄ21，Ｄ28，Ｄ35，Ｄ38）
。体重に
AM:PG
PM:CIDRout

D-7

US1

US2

US3

EB
+
CIDRin
+
US4

D0

D7

D14

D21

test

Acclimatization
periodcontrol

Acclimatization
periodUS5

AM:GnRH
PM:AI+US6

FSH

D27 D28 D29 D31 D32 D35

Low TDN

High TDN
Standard dietsFig. 1 Schematic illustration of the superovulation protocol and diets stage in embryo donors© The Ito Foundation

US7

Flushing
+
US8
D38

222

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

ついては個体差の影響を除外するために，試験開た 。卵 巣 の 観 察 は 超 音 波 画 像 診 断 装 置

始時を起点として，体重増減について記録した。

（MyLabOne Vet）を用い，卵胞の発育を調査し2.3

過剰排卵処置および採胚，採取胚の処理た。試験開始の２週間前にPGF２α を４ml投与し過剰排卵処置についてFig.１に示した。試験開試験牛の発情周期をそろえたうえで観察を開始し始をＤ０として，Ｄ21にCIDR（Zoetis）を挿入た。試験開始からCIDR挿入までの４週間は１週

しCIDR挿入後６日目（Ｄ27）からFSH（アント

間ごと（Ｄ０：US1，Ｄ７：US2，Ｄ14：US3，

リンＲ：18AU）（共立製薬株式会社）を漸減投

Ｄ21：US4），CIDR挿入後はFSH投与前（Ｄ27：

与 し た 。CIDR 挿 入 後 ８ 日 目（Ｄ 29）の 朝 にUS５），人工授精時（Ｄ31：US６），人工授精翌

PGF２α（ダルマジン）（共立製薬株式会社）を３日の排卵確認日（Ｄ32：US７），採胚時（Ｄ38：

ml筋肉注射し，同日の夕方にCIDRを除去した。

US８）に超音波画像診断装置を用いて観察し，

PGF２α投与から48時間後（Ｄ31）にGnRH（エス小中卵胞数，大巨卵胞数を記録した（小卵胞：トマール）（インターベット）４ml投与し同日の２～４mm，中卵胞：５～８mm，大卵胞：９～

夕方に人工授精を行った。人工授精から７日目

19mm，巨卵胞：20mm以上）。

（Ｄ38）の朝，バルーンカテーテルを用い非外科

３．結果および考察

的な子宮灌流を実施し胚を回収した。回収した胚

3 . 1 体重変動および血中BUN・Glu・BUN/

は 実 体 顕 微 鏡 下 で International Embryo Tech-Glu

nology Society（IETS）のマニュアルに従って分類し，採胚成績として記録した。回収胚のうち，試験期間中の体重変動および血中成分について

Code１胚を凍結可能胚として，プログラムフリー

Fig.２に示した。試験区は低栄養状態に置かれた

ザを用いて緩慢凍結後，胚移植に供試した。

２週間後にやや体重を減少させたが，高栄養飼料

2.4に切り替えると増加に転じた。ただし，対照区

卵胞数の観察（control）との差は認められなかった。申請者は卵胞観察のタイミングについてFig.１に示し

Glu（㎎/dl）C

control

B

test

15

BUN（㎎/dl）

12
11

5

-5

10

0

7

14

21

28

35

38

9
8

-10

75
70
65
60
55
50
45
40
35

test

13

10

0

control

14

15

7

Day

controlD

test

BUN/Glu

Body weight change（kg）

A 20

0

7

14

21

28

35

38
Day

0.26
0.24
0.22
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1

0

7

14

21

control

28

7

14

38
Day

test
†

0

35

21

28

†

35

†

38
Day

Fig. 2 Relationship between change in feed content and（A）Body weight change,（B）BUN,（C）Glu,（D）BUN/Glu（mean±SEM）© The Ito Foundation

繁殖雌牛における栄養コントロールが過剰排卵処置の反応性および回収胚数に与える影響（Ⅱ）

223

低TDN（92％）から高TDN（120％）に切替え後，試験開始時および低栄養時には試験区および対照

体重の増加が進み，切替えから17日後には有意に区に差は認められない。一方で，試験区において体重が増加することを報告している３）。このこと

高栄養になると，有意差はないものの小中卵胞のは本試験に比べて増減の栄養コントロールが急激増加が観察された。しかしながら，FSH投与後，で，かつ栄養増量時に与えるTDNは120％と高AI時（Ｄ31）の大卵胞数では対照区と試験区はかったためと考えられる。本試験では栄養増時のほぼ同数であった。その後排卵確認時（Ｄ32），

TDNを115％に抑え増減を緩やかにしたことか

採胚時（Ｄ38）においても両区の卵胞数に差は認ら，過肥を防ぐことができたと考えられる。血中

められなかった。低栄養から高栄養への切替えに

BUNについて，試験区は低栄養時には対照区とよる小中卵胞の増加は山之内らの報告２），および同等であったが，高栄養切替え後，有意差はない

申請者らによる平成30年度の報告と同様である３）。

ものの数値的には試験区が高くなり，採胚時（Ｄ

採胚結果についてTable１にまとめた。回収の38）には有意に試験区は対照区よりも高くなっ結果得られた卵子数は対照区および試験区においた。栄養増による血中BUNの増加については，て大きな差は認められなかった。一方で正常受精

申請者の平成30年度の報告と同様に本試験の栄養

卵，ランク１受精卵数は試験区が高く，未授精卵

コントロールでも低栄養状態では変化せず，高栄

子数は対照区が有意に高かった。このことについ養状態に移行後，増加することが確認された 。

て短期間の低栄養状態は小中卵胞数の増加および

また，BUN/Gluについて，試験開始から低栄養生産胚の品質を高めることが報告されている４）。

状態および高栄養状態切替え１週間後（Ｄ21）ままた細川らは給与飼料濃度差によって過剰排卵処では差は認められないが，過剰排卵処置開始時

置時にBUN/Gluが低くなり，そのことが採胚時（Ｄ28）以降は試験区が高い傾向にあった。

の正常受精卵率を増加させると報告している５）。

３）

3.2

本試験では過剰排卵処置以降のBUN/Gluは対照

卵胞数推移と採胚成績

試験期間中の卵胞数の推移についてFig.３に示区に比べて高い傾向にあり，細川らの報告とは異した。小卵胞，中卵胞は小中卵胞として集計した。

なる結果が得られた。本試験の結果から低栄養状

80
70control Large follicles
test Large follicles

control small and middle follicles
test small and middle follicles

The number offollicles

60
50
40
30
20
10
0
US1

test

D0

control

US2

US3

CIDRinD7
Low diets

D14

D21

befor FSH

AI

D27
D31
High dietsthe next
day of AI

Flushing

D32

D38

Standard dietsFig. 3 Relationship between change in fed content and number of follicles（mean±SEM）© The Ito Foundation

224

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 1 Embryo production of bovine that was fed test or control diets
total embryos

the number of code
1 embryos（％）

the number ofnormal embryos（％）

the number ofunfertilized oocytes（％）

control19.3±5.47

test

16.7±3.82

4.8±1.73（24.9）

5.4±2.23（28.0）

12.3±3.8（63.7）

10.6±3.0（63.5）

11.1±3.31（66.5）

p value0.694

3.4±1.43（20.3）

0.114

0.175

0.044

Date are represented as mean ± SEM

態で維持された後高栄養へ切り替えるとBUNが試験区と同等の期間給与した。試験期間中の体重増加するが，血中Gluは変化しない（Fig.２）。こ

変動には試験区，対照区に差はなかったが，採胚のことによりBUN/Gluは試験区が高くなったと時には試験区が有意に高くなった。試験期間中の考えられる。一方で短期間の低栄養状態は小中卵

卵胞数について，小中卵胞数は低栄養期間中，変胞数の増加および生産胚の品質を高めるという報化がなかったが，高栄養に切り替わると有意差は告があり ，本試験でも過剰排卵前の低栄養状態

認められないものの試験区の小中卵胞は数値的ににより正常受精率が向上した可能性がある。

は増加した。しかしながら，過剰排卵処置後の大４）

これらの結果から，２週間の低栄養から高栄養

卵胞数は両区で差は認められなかった。採胚成績への切替えにより卵胞中の小中卵胞数の増加が促について，採胚により得られた卵子数は，差は認されるが，引き続き行われる過剰排卵処置の反応

められなかったが，正常受精胚数および高品質胚性については影響が少ないことが明らかになっ数については，有意差はないものの試験区が高くた。また栄養コントロールを実施することによりなった。また未受精卵数は対照区が有意に高かっ

正常受精率向上の可能性，未受精卵の減少が示さた。これらの結果から，黒毛和種雌牛に対する過れた。今後は小中卵胞増加が過剰排卵処置による

剰排卵前の栄養コントロールは卵胞内小中卵胞を大卵胞数増加につながらなかった原因を明らかに増加させるが，過剰排卵処置後の卵胞発育の反応することで，過剰排卵処置によって得られる正常性には影響しない。また一方で過剰排卵処置前の受精胚のさらなる増加につなげたい。

栄養コントロールは未受精率を低下させ正常受精

４．要

胚数を増加させる可能性があることが示唆された。

約

本研究は過剰排卵処置に用いる黒毛和種雌牛に対し，栄養状態の切替え（低栄養→高栄養）を行
い卵巣内の小中卵胞数，過剰排卵処置の反応性や正常受精卵数への影響を調べたものである。黒毛
和 種 雌 牛 ９ 頭 を 用 い ，低 栄 養（TDN：90 ％，CP：105％）で２週間維持し，高栄養（TDN：
115％，CP：160％）に切り替えたのち，１週間経過後にCIDRを挿入した。その後，過剰排卵処置を実施し定時人工授精後に採胚を行った。対照
区は基準栄養量（TDN：106％，CP：140％）を

文
献１）
 福田卓己，大澤健司，打座美智子，鳶岡奈々恵，
遠藤保，大井隆弘，荒屋幸一，下村紀夫，広沢悠子，
居在家義昭：家畜臨床誌，31，137～142，2008．
２）
 山之内忠幸，吉岡一，橋谷田豊，今井敬：日本繁殖生物学会，p133，2013．
３）
 林武司，深水大，上田修二，稲田淳：平成30年度
食肉に関する助成研究調査成果報告書，37，250～
254，2019．
４）
 Nolan, R,, O’Callaghan, D., Duby, R. T., Lonergan,
P., Boland, M. P.：Theriogenology，50，1263～74，
1998．
 細川泰子，福成和博，吉川恵郷，佐藤洋一，菊池５）
雄：日獣会誌，61，699～704，2008．

© The Ito Foundation

225

黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査（Ⅱ）
Survey of the low durability of motile sperm in the frozen semen of
Japanese Black cattle（Ⅱ）

星

野

洋一郎

（京都大学大学院農学研究科附属牧場）

Yoichiro Hoshino（Kyoto University livestock farm）

We investigated the tendency of the change of the sperm motility of Japanese Black cattle,
and the genetic factors that thought to be associated with the sperm motility. In addition to
the data of the sperm motility of 37 bulls from prefecture A that were analyzed in last year,
we analyzed the motility of frozen semen from 26 bulls from prefecture A and 22 fromprefecture B, and examined the correlation between birth date of bulls and sperm motility andsperm motility durability score. There was no difference in the sperm motility between
prefecture A and B, although there was a downward trend in the motility of sperm fromyoung bulls. The sperm motility durability score was higher in the semen of the bulls fromprefecture B than from prefecture A, and there was a tendency that the recent bulls weredivided into the high durability group that was higher than 2.5 in sperm motility durability
score and the rest low durability group. The genome association study between SNP type ofbulls and sperm motility durability score showed a significant association in two SNPs. These
SNPs were different from the SNPs those were thought to have associations in the study lastyear. Although expressions of candidate genes that thought to be associated with sperm
motility in the study of last year were investigated by the RT-PCR of RNA in the sperm andthe testis and immunohistochemistry of the seminiferous tubule, correlation of sperm motility
and gene expressions were remain unclear. RT-PCR revealed that LOC101907140 was not
expressed in both testis and sperm, therefore LOC101907140 might not associate with sperm
motility. Immunohistochemistry revealed that GABABR2 and KCTD8 were not localized in the
spermatid. Further studies are required to investigate the role of GABABR2 during
spermatogenesis．

１．目

標となる精子運動持続性スコアの算出方法を開発的した。Ａ県の黒毛和種種雄牛56頭の凍結精液の精平成30年度伊藤記念財団助成研究において，牛子運動性を解析したところ，製造時年齢が８歳以

人工授精受胎率に影響する要因として，凍結精液

上の時に運動精子率が低下したため，製造時８歳

精子の運動性が維持される時間に着目し，その指以上の37頭の凍結精液の生年月日と運動精子率お© The Ito Foundation

226

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

よび精子運動持続性の相関を調べた。その結果，調査で製造時年齢が８歳以上であったため集計か両者に増加・減少傾向は見られなかったことか

ら除外された種雄牛のうち，５頭の製造時８歳以ら，育種改良過程における凍結精液の運動性の変下の精液を再解析した。さらに，近年の種雄牛21化はないと考えられたが，種雄牛によって精子運頭（2011年５月～2018年生）の凍結精液を解析し動持続性の個体差が大きかった。そこで，精子運た。また，Ｂ県研究機関から22頭の黒毛和種凍結

動持続性と種雄牛のSNP型との相関を調べたとこ

精液の提供を受けた。

ろ，１つのSNP（ARS-BFGL-BAC-16113）につ

凍結精液ストローを37℃の温水に浸漬して融解いて有意な相関が見出され，それは機能未知の長鎖

し，ストロー１本につき200μｌを48wellプレー

ノンコーディングRNA（lncRNA）LOC101907140

トの１wellに入れ，38℃の培養器（高湿度，空気上にあった。精子ではRNAの転写は起こらないの気相）内で培養した。融解直後（０時間）からが，精子内にもRNAが存在することが報告され１時間ごとに４時間後まで動画を撮影し，精子運ており ，牛では精子運動性や受胎率と精子内動性解析を行った。

１）

mRNA 量 に 相 関 が あ る こ と が 報 告 さ れ て い

2.2

る。そ の 後 ，新 た に ２ つ の 近 接 す る SNP

精液２μｌを精子検査用チャンバー（Leja，８（ARS-BFGL-NGS-116332,118302）で有意な相関検体用）に注入し，倒立顕微鏡に設置した37℃のが見出され，それらはKCTD８のイントロン領域

マイクロウォームプレート上に置き，顕微鏡に接に存在した。KCTD８を含むKCTDファミリーは続したデジタルカメラを用いて約３秒間の動画

GABAB受容体サブユニット２（GABABR2）の（1920×1080，秒間60フレーム）を撮影した。自補助サブユニットである。ラットでは精子上に作の精子運動性解析プログラムを用い，動画中１

GABAAおよびGABAB受容体があり，先体反応秒間（60フレーム）の精子運動軌跡を解析した。

の誘起に関わっているという報告がある 。また，精子の軌跡の最も遠い二点の距離が20μｍ以上でKCTD８下流近傍にあるGuf１は，ミトコンドリあった精子を，運動精子と判定した。動画中で解アタンパク質の合成に関わる遺伝子であり，精子析した全精子に占める運動精子の割合を運動精子の運動性に関与する可能性がある。

率とした。特に０時間における運動精子率を，融

２，
３）

４）

精子運動性の動画解析

本研究では，平成30年度研究の発展として，Ａ

解時運動精子率とした。精子運動持続性スコア

県種雄牛の精子運動性解析頭数を増やすとともは，運動精子率が融解時の1/2になるまでの時間に，Ｂ県の種雄牛の精子運動性も解析し，種雄牛を運動精子率の経時データから推定した値とした。

のSNP型と精子運動持続性との相関を再検討した。

2 . 3 黒毛和種種雄牛集団における精子運動持さら に ，LOC101907140 ，KCTD8 ，KCTD12 ，
GABABR2，Guf１の精子および精巣における発2.1

種雄牛48頭（Ａ県：再検査５頭，新規21頭，Ｂ
県：新規22頭）の凍結精液について，融解時運動現を調べた。
２．方続性の調査

精子率と精子運動持続性スコアを解析した。これ

法らのデータを前年度解析のＡ県37頭と合わせた85
頭の種雄牛の生年月日と，融解時運動精子率およ

凍結精液の体外培養

凍結精液はＡ県研究機関が製造・保管していたび精子運動持続性スコアとの相関を調べた。

黒毛和種凍結精液の提供を受けた。平成30年度の© The Ito Foundation

黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査（Ⅱ）

2.4

精子運動に関わる遺伝的要因の探求

種雄牛のSNP情報は，各県と（公社）畜産技術

227

2 . 6 牛精巣におけるGABABR2，KCTD８の局在

協会との共同研究によって得られたSNP情報を使ブアン液で固定した精巣実体小片をパラフィン用した。各種雄牛において，34481個のSNPがタ

包 埋 し ，５μｍ 厚 の 切 片 を 作 製 し た 。Anti-

イピングされているが，ハーディー・ワインベル

GABA B Receptor 2 Polyclonal Antibody お よ び

グ平衡検定のｐ値が0.001以下，およびマイナー

Anti-KCTD8 Polyclonal Antibody （Bioss Inc.）

アリル頻度５％以下のSNPは除外した。85頭のを用いて，免疫蛍光染色により，精細管断面におSNPデータを用い，ゲノム相関解析ソフトPLINK

けるGABABR２とKCTD８の局在を調べた。

を用いて相関解析を行った。
2 . 5 精子運動持続性関与候補遺伝子の牛精巣および精子における発現

３．結果と考察3 . 1 種雄牛生年月日と融解後運動精子率およ2 . 5 . 1 牛精子および牛精巣組織のサンプリン
グび精子運動持続性スコアの関係
融解直後の運動精子率と種雄牛生年月日との相SNP型の異なる４頭の種雄牛の凍結精液（AG-

関をFig. 1Aに示す。融解時運動精子率は若干のCC，GG-AC，AA-AC-1，AA-AC-2：各名前は低下傾向となった。新規解析した2011年以降の種

BAC-16113とNGS-116332のSNP型を表す）を，

雄牛は現場後代検定に供した牛であるため，若齢下層90％，中間層45％のパーコール密度勾配遠心時に精液を採取していることが精子運動性の低下

によって分画し，45％下部（運動性低），および傾向として現れている可能性がある。新たに解析

90％下部（運動性高）の精子を各500μｌ分採取

したＢ県22頭の精液の融解後運動精子率は，Ａ県した。それぞれをSP-TALP液で２回洗浄し，精と差は見られなかった。

子約10 個分を集め，1000Ｇで遠心後上清を除去
8

精子運動持続性スコアと種雄牛生年月日との相関をFig. 1Bに示す。Ａ県のスコアよりＢ県のス

し，－80℃で凍結保存した。
牛精巣組織は，Ａ県研究機関において23ヶ月齢

コアが高い傾向が見られた。また，近年においてで去勢された雄牛の精巣から採取した。精巣実体

スコアが高い種雄牛と低い種雄牛に二分される傾の小片を切り出し，一部はブアン液で24時間固定向が見られた。2007年以降生まれの種雄牛集団のし，残りは液体窒素上で急速凍結し，－80℃で保精子運動性持続性スコアをk-means法で２群に分存した。

割したところ，スコア2.5を閾値として上位群と2 . 5 . 2 牛精子および精巣組織における遺伝子

下位群に分かれることが分かった。
3 . 2 種雄牛のSNP型と精子運動持続性との相発現量調査
凍結保存した牛精子，および精巣組織から，

関解析

TRIzol（Thermo Fisher）を用いてRNAを抽出

これまでに精子運動持続性と有意な相関がある

し ， ReverTra AceR （TOYOBO） を 用 い て

３つのSNPが見出されたが，これにＡ県26頭のcDNAを合成した。リアルタイムPCR（RT-PCR）

データを加えて相関解析を行ったところ，いずれに よ っ て GABABR2 ， KCTD8 ， KCTD12 ，のSNPも有意な相関が見られなかった。新規解析

Guf1，LOC101907140の発現を調べた。

した種雄牛は同じ父牛の産子が多く，遺伝的に偏りがあるため，これらのデータを加えたことに© The Ito Foundation

228

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
A80%

Sperm motility

70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1985

1990

1995

2000

2005

2010

2015

2020

2010

2015

2020

Birth date of bulls

B

Sperm motility durability score

4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1985

1990

1995

2000

2005

Birth date of bulls
Pref.A

Pref.B

Liner（A）

Liner（B）

Fig. 1 Correlations between the birth date of bulls and（A）sperm motility or（B）sperm motility durability score．

Table 1 Regional difference of genotype frequency of the SNPs associated with sperm motility durability score.

SNP

Chr.

p-value*

Genotype

ARS-BFGL-NGS-75342

50.01493

AA/AG/GG

ARS-BFGL-NGS-31729

19

0.0262

AA/AC/CC

Genotype frequency

Average score of
genotype

AA

AC
AG

CC
GG

AA

AC
AG

A

68%

32%

0%

1.87

1.94

B

18%

36%

45%

1.32

2.99

3.20

A

63%

35%

2%

1.70

2.19

3.14

B

41%

36%

23%

1.91

3.34

3.46

Pref.

CC
GG

Neighboring
genes

CSNK1EKCNJ4PRKCA＊Bonferroni single-step adjusted p-values

よって相関が弱まった可能性が考えられる。

り，Ａ県では持続性スコアが高い遺伝子型（GG/

Ｂ県22頭のデータを加え，精子運動持続性スコ

CC）がないか，きわめて低かった（Table１）。

アが2.5以上を陽性とした相関解析を行ったとこ

このようなSNPは，Ａ県の解析だけでは相関が検ろ ， ２ つ の SNP ： ARS-BFGL-NGS-75342 と出できなかったと考えられる。SNP：31729は31729において有意な相関が見られた。これらの

PRKCA（プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ Ｃα）遺 伝 子 を

SNPはＡ県とＢ県では遺伝子型頻度が異なっておコードする領域に含まれているが，PRKCAは牛© The Ito Foundation

229

黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査（Ⅱ）

精子の受精能獲得に対して抑制的に働くという報補 助 サ ブ ユ ニ ッ ト に 持 つ GABABR ２ の 精 子 内

告があり ，精子運動持続性に関与する可能性がmRNA量をRT-PCRによって調べ（Table２），さ考えられる。

らに精子PCR産物と精巣PCR産物を電気泳動で比５）較した（Fig.２）。GABABR２は各区で増幅が確

3 . 3 精子内RNA量にSNP型および精子運動性認 さ れ た が ，電 気 泳 動 の 結 果 ，目 的 の バ ン ドとの相関が見られるか
精子および精巣のRT-PCRの結果，KCTD８と（114bp）が得られたのは２区（AG-CC
AA-AC-2

同ファミリーに属するKCTD12，およびこれらを45％，45％）のみであり，他はプライマー

Table 2 Relative quantity of cDNA in sperm from the bull of different SNP type and different motility.
Bull（SNP Types）

AG-CC

GG-AC

AA-AC-1

AA-AC-2

Percoll45％

Percoll90％

Percoll45％

Percoll90％

Percoll45％

Percoll90％

Percoll45％

Percoll90％

GABABR2

1

0.33

0.036

0.549

0.228

0.461

0.02

0.181

KCTD8

1

-

-

-

2.433

-

-

1.826

Sperm motility

KCTD12

1

-

0.712

-

1.062

1.725

0.673

3.127

GUF1

-

-

-

-

-

-

-

-

LOC101907140

-

-

-

-

-

-

-

-

Numbers are the relative quantities of cDNA of each gene compared with the reference sample（AG-CC, Percoll 45%）.
Hyphens（-）means no amplification were detected.

AG-CC

GG-AC

AA-AC-1

AA-AC-2

45％ 90％ 45％ 90％ 45％ 90％ 45％ 90％

testisGABABR2（114bp）

KCTD8（107bp）

KCTD12（73bp）

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products of GABABR2, KCTD8 and KCTD12 from frozen semen of 4bulls fractionated by percoll（45％ and 90％）and a bull testis. Lane 1 and 12：50bp DNA ladder, lane 2 and 3：semenof AG-CC in 45％ and 90％ percoll fraction, lane 4 and 5：semen of GG-AC in 45％ and 90％ percoll fraction, lane 6
and 7：semen of AA-AC-1 in 45％ and 90％ percoll fraction, lane 8 and 9：semen of AA-AC-2 in 45％ and 90％
percoll fraction, lane 10 and 11：testis.

© The Ito Foundation

230

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Bright ﬁeld

NuclearProteinSGSPGABABR2
SC

LD

ST

KCTD8

SC

SP

Fig. 3 Localization of GABABR2 and KCTD8 in the bull seminiferous tubule. Nuclei：fluorescence of nuclei with

Hoechst 33342, Protein：immunohistochemistry of GABABR2 and KCTD8. SG：nucleus of spermatogonia, SC：
nucleus of spermatocyte, SP：nucleus of spermatid, ST：nucleus of sertoli cell, LD：nucleus of leydig cell．

ダイマーと見られる非特異的増幅であることが分

精子運動持続性には関与していないと考えられた。

かった。KCTD８は３区で増幅が見られたが，目3 . 4 牛精巣におけるKCTD８およびGABABR

的のバンド（107bp）が得られたのは１区（AAAC-2２の局在90％）のみであった。KCTD12ではプラ

牛精巣の精細管におけるGABABR２とKCTD

イマーダイマーは見られず，６区で目的のバンド

８ の 免 疫 蛍 光 染 色 の 結 果 を Fig. ３ に 示 し た 。

（73bp）が得られた。LOC101907140は精子，精GABABR２は精母細胞に局在しており，精原細巣のいずれにおいても発現が見られなかった。ま胞および精子には見られなかった。KCTD８はラた，Guf１は精巣では発現が確認されたが，精子

イディヒ細胞と基底膜およびセルトリ細胞に局在ではmRNAの増幅が見られなかった。

しており，精子には見られなかった。これらの結精子内にもRNAが存在し，mRNAは精子形成果から，KCTD８とGABABR２が精子上に存在過程における遺伝子発現を反映していると考えらし，KCTD８の多型がGABABR２の機能に影響れているが，本研究のリアルタイムPCRでは正常することにより精子運動性に関与している可能性

なcDNAの増幅が見られず，遺伝子発現量を推定

は 低 い と 考 え ら れ た 。GABA は 牛 精 子 で はするのは困難であり，精子のSNP型および精子運GABAA受容体を介して先体反応を誘起するが，動性分画（45％，90％）との関連は分からなかっGABAB，C受容体は作用しないという報告があた。また，各遺伝子と近接するSNPと精子運動持り ６），本研究の結果はこれと一致する。一方，続性の相関が再解析により見られなくなったた

GABABR２は精原細胞で見られず精母細胞で発め，精子運動性に関与する可能性は低くなった。

現していることから，精子形成に関与している可

特にLOC101907140は，精子内だけでなく精巣に能性がある。しかし，KCTD８は精母細胞でなくおいてもRNAの存在が確認されなかったため，

セルトリ細胞に局在していると見られ，© The Ito Foundation

黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査（Ⅱ）

231

GABABR２の補助サブユニットとして機能して現を精子や精巣RNAのRT-PCRおよび精細管のいない可能性がある。GABABR２の精巣におけ免疫組織染色で調べたが，精子運動性と遺伝子発る働きについては，他のKCTDファミリーの精巣

現 の 相 関 は 不 明 で あ っ た 。RT-PCR の 結 果 ，における局在も含め，今後の研究が必要である。

LOC101907140は精巣，精子ともに発現していな

４．要いことから，LOC101907140は精子の運動性と関約連していないと考えられた。免疫組織染色の結黒毛和種凍結精液の精子運動性の変化傾向と，果，GABABR２とKCTD８は精子には局在して関与する可能性のある遺伝的要因について調査しい な い こ と が 分 か っ た 。精 子 形 成 に お け る

た。昨年度に解析を実施したＡ県37頭に加え，ＡGABABR２の役割を調べるために，さらなる研県26頭，Ｂ県22頭の種雄牛の凍結精液の運動性解究が必要である。

析を行い，種雄牛の生年月日と融解後運動精子率
および精子運動持続性の相関を調べた。融解後運動精子率は若齢の種雄牛で低下傾向が見られたが，Ａ県とＢ県の間に差は見られなかった。一方，精子運動持続性はＡ県よりＢ県の種雄牛の精液が高く，また近年の種雄牛では持続性スコア2.5以上の高持続性グループと，それ以外の低持続性グ
ループに分かれる傾向が見られた。種雄牛のSNP型と精子運動持続性の相関解析を行ったところ，
平成30年度の解析で有意な相関が見られた３つのSNPは相関がなくなり，新たに別の２つのSNPで有意な相関が見られた。昨年度の研究で精子運動

文
献１）
 Jodar, M., Selvaraju, S., Sendler, E., Diamond, M.
P., Krawetz, S. A.：Reproductive Medicine Network,
Hum. Reprod. Update, 19（6），604～624，2013．
２）
 Bissonnette, N., Lévesque-Sergerie, J. P.,
Thibault, C., Boissonneault, G.：Reproduction, 138（1），65～80，2009．
 Arangasamya, A., Kasimanickama, V. R.,
３）
DeJarnettec, J. M., Kasimanickama, R. K.：
Theriogenology，76（3），570～577，2011．
４）
 Hu, J. H., He, X. B., Wu, Q., Yan, Y. C., Koide, S.
S.：Arch. Androl., 48（5），369～78，2002．
 Rotman, T., Etkovitz, N., Spiegel, A., Rubinstein, S.,
５）
Breitbart, H.：Reproduction, 140（1）,43～56, 2010．
６）
 Puente, M. A., Tartaglione, C. M., Ritta, M. N.：
Anim. Reprod. Sci．127（1-2），31～7，2011

性と関連する可能性が考えられた候補遺伝子の発© The Ito Foundation

232

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御（Ⅲ）
Prediction and control of subacute ruminal acidosis in periparturient dairy
cows

佐

藤

繁

（岩手大学農学部共同獣医学科）

Shigeru Sato
（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University）

The objectives of the project were to clarify the pathogenesis of subacute ruminal acidosis(SARA) in dairy cows using radio transmission pH measurement system, and further, to control
and predict the postpartum SARA in advance of parturition. Eighteen dry period andmultiparous Holstein cows were used, and were categorized in the SARA（n ＝ 9）or healthy（n＝ 9）cows depending on whether they developed SARA during the 2 weeks after parturition.
Rumen fluids were collected at 3 weeks pre-partum and 2, and 6 weeks post-partum foranalysis of VFA, ammonia, and lactic acid, LPS activity, and bacterial community by next
generation sequencing method. Furthermore, liver tissues were biopsied at 3 weeks prepartum, 2, and 6 weeks post-partum for analysis of liver transcriptomic dynamics by
microarray method during the periparturient period．
As a result, the ruminal pH was depressed postpartum in both groups, whereas depression
was more severe in the SARA group simultaneously with significantly longer duration of time（for pH ＜ 5.6 and 5.8）. No significant changes was observed in the composition of major
bacterial phyla or genera during the periparturient period, but the non-SARA group had asignificantly higher Simpson diversity index in the postpartum. In the microarray data analysis,
PCA plots showed no close similarity within and between groups during the periparturient
period, but were clustered into two separated cluster those irrelevant to the groups andperiparturient periods. From these findings, postpartum predicted functional pathway analysis
may indicate the underlying mechanisms causing SARA in Holstein cows during theperiparturient period. Further, analysis of liver transcriptomic dynamics may reveal the
relationship between the occurrence of SARA, and it can provide the rapid prediction of SARA
after parturition at the pre-partum stage in dairy cows．

１．目

持・向上させるために濃厚飼料が多給され，その的結果，潜在性第一胃アシドーシス（SARA）が増

乳牛の泌乳量は栄養管理や育種改良の進展に加している。SARAは粗飼料の不足と濃厚飼料なよって飛躍的に増加してきた。一方で泌乳量を維ど 易 発 酵 性 飼 料 の 多 給 に よ り ，揮 発 性 脂 肪 酸© The Ito Foundation

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御（Ⅲ）233（VFA）の産生量と吸収量のバランスが崩れて第（非SARA群）に区分した。なお，供試したすべ

一胃液pHが低下し，グラム陰性菌が死滅して細ての牛において分娩前後に臨床的異常は認められ

胞壁由来のリポポリサッカライド（LPS）産生がなかった。

増加する病態である 。分娩後の濃厚飼料多給に2.2伴って発生するSARAは，種々の代謝病（生産第一胃液はカテーテルを用いて分娩前３週，分病）の発生と密接な関連のあることが示唆されて娩後２週および６週の計３回，経口的に採取しおり，農家経営に多大な影響を及ぼす代謝障害リた。また，肝組織は生検（自動生検針エースカッスクである。

ト14Ｇ×115mm

１）

本研究の目的は，申請者らが開発した無線伝送
式pHセンサ２～５）を用いて，乳牛の分娩後に多発

採材

22mmタイプ，タスク（株），

栃木）により分娩前３週と分娩後２週および６週の計３回採取した。

するSARAの病態を明らかにし，さらには分娩前

2.3

検査項目および方法の段階で分娩後SARAの発症予知と制御を目指す

2 . 3 . 1 胃液pHと第一胃液VFA，アンモニア態窒素および乳酸濃度ことである。これによって，乳牛の周産期に発生する種々の生産病を予防し，乳牛の健康を維持し前胃液pHは無線伝送式pHセンサ（山形東亜て食品としての牛乳と食肉の安全確保に貢献する

DKK（社））を用いて分娩前３～２週から分娩後ことが最終的な目標である。具体的には，分娩前６～８週までの間，10分間隔で連続測定した。第後の乳牛における前胃液pHや第一胃液の発酵産

一 胃 液 VFA 濃 度 の 測 定 は ガ ス ク ロ マ ト グ ラ

物（VFA，乳酸，LPS），細菌叢構成を解析し，フィー（HITACHI-163型，日立，東京）を用い分娩後にSARAを発症した牛（SARA群）と発症て，アンモニア態窒素濃度の測定は窒素自動蒸留

しなかった牛（非SARA群）における各性状の差装置（ケルティックオート1035型，アクタック，

異を検討して，細菌叢構成を考慮したSARAの予東京）を用いた水蒸気蒸留法，また，乳酸濃度の防・軽減方策を検討する。また，分娩前後の乳牛測定は市販の乳酸測定キット（Ｆキット，D-/L-

における肝組織の網羅的遺伝子発現を解析し，

乳酸，R-Biopharm，ドイツ）を用いて行った。

SARA牛の分娩前における遺伝子発現の特徴を明2.3.2

らかにして，分娩前におけるSARA発症予知の可LPS 活 性 値 は LAL （Limulus amebocyte
lysate）試薬（パイロクロム，生化学工業，東京）

能性について検討する。
２．方
2.1

第一胃液LPS活性値を用いたカイネティック比色法により測定した。

法

2.3.3

第一胃液の細菌叢解析

細菌叢解析は第一胃液の洗浄，溶菌，抽出およ

供試牛群および供試牛

試験は，前年度と同様，移行期の給与飼料内容

び精製の後，次世代シークエンス法により16S

や飼養管理状況が明らかな３牛群を対象とし，乾Metagenomic Sequencing Library Preparation

乳期の経産牛18頭（Ａ牛群・８頭，Ｂ牛群・６（Illumina, USA）に従って実施した。すなわち，

頭，Ｃ牛群・４頭）を用いて行った。分娩後に抽出したDNA溶液を16S rRNAのＶ３-Ｖ４領域

SARAを発症した牛９頭（SARA群：分娩後２週で 増 幅 ， Nextera XT Index Kit （Illumina ，間に１日３時間以上にわたって前胃液pH＜5.6をUSA）を用いて反応液を調整後，プロトコール

示す日が３日以上出現）と発症しなかった牛９頭に従ってPCRを行った。アガロースゲル電気泳動© The Ito Foundation

234

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

を行い，均一濃度および330bp付近のバンドを確は分娩前に比べて低下し，SARA群では非SARA認した。その後，次世代シークエンサー（Illumina

群に比べて分娩前に差異がみられなかったが，分MiSeq, Illumina, USA）に よ る シ ー ク エ ン ス を

娩後５，
６，
８，
９および10日に有意または有意傾行った。

向な低値を示した（Fig.１）。その後は分娩後２2.3.4

肝組織の網羅的遺伝子解析

週にかけてpHが徐々に回復し，分娩後11日以降

肝組織の遺伝子解析は，総RNAを抽出した後，は両群間に有意な差がみられなかった。また，前マイクロアレイ法により行った。マイクロアレイ

胃液pH＜5.8あるいは＜5.6を呈する24時間あたり法は約15,000のウシ遺伝子を搭載したウシ・オリの時間は，いずれもSARA群で非SARA群に比べ

ゴ DNA マ イ ク ロ ア レ イ（Agilent Technologies,て分娩後に有意な高値を示した（Fig.２）。

USA）を用いて実施した。RNAサンプルからのSARA群では非SARA群に比べて，第一胃液総cDNA合成，cDNAからのCyanine3（Cy3）-CTP

VFAおよび酢酸濃度は分娩後に低値傾向，プロ

標識cDNAの合成，標識cRNAの精製，ハイブリ

ピオン酸濃度は分娩後６週に有意な低値を示し，

ダイゼーション，洗浄，スキャンおよびデータ解LPS活性値は分娩前３週に低値傾向を示した。

析は，既報 と同様に行った。

3 . 2 SARA群と非SARA群における第一胃液

６）

2.4

の細菌叢構成統計解析

次世代シークエンス法の結果はMOTHURプロ

両 群 と も 分 娩 前 後 に Bacteroidetes 門，

グラム（version 1.41.1；University of Michigan ;Firmicutes門およびProteobacteria門の割合が多

http://www.mothur.org/wiki/;Schloss） に よ りく，これら３細菌門で全体の約90％を占めていた。

解析した。SARA群と非SARA群の比較は，正規

また，SARA群では非SARA群に比べて，分娩前分布している場合は対応のない t 検定，正規分布

３週にBacteroidetes門が低値傾向，Actinobacteria

していない場合はMann-Whiteny U-testにより門が有意な高値を示した（Fig.３）。一方，両群とも

解析し，いずれもp＜0.05を有意差ありとした。また，分娩前後における細菌属構成では，Prevotella属，

マイクロアレイ法のデータは，DESeq2package（R

未 分 類 の Lachnospiraceae 科 お よ び 未 分 類 のprojectソフトウェア）を用いて解析し，その後，

Ruminococcaceae科の割合が多く，これら３細菌

Gene Spring GX12.0 （Agilent Technologist,

属で全体の約50％を占めていた。また，SARA群

USA）を用いて主座標解析（PCoA）を行うととでは非SARA群に比べて，分娩前３週にPrevotella

もに，同採材日のSARA群で非SARA群に比べて属が有意な低値，未分類のLachnospiraceae科，発現量に有意差（p＜0.05）があり，Fold change

Barnesiella属などが有意な高値を示した。さら（FC）の 絶 対 値 が 1.5 以 上 の 遺 伝 子 を Ingenuityに，分娩後２週にPrevotella属が有意な低値，

Pathway Analysis （IPA, Ingenuity System,

Barnesiella属が有意な高値を示した。
SARA群で非SARA群に比べて，Prevotella属

USA）を用いて解析した。

の構成比が分娩前３週と分娩後２週に有意な低値

３．結果と考察を 示 し た こ と は ，分 娩 後 SARA 牛 で は ，長 期

3 . 1 SARA群と非SARA群における前胃液pH

SARA誘発牛と同様，Prevotella属が低値を示し，デンプン分解能が低下している可能性のあること

および第一胃液性状
前胃液pHの24時間平均値は，両群とも分娩後を示している。また，SARA群で非SARA群に比© The Ito Foundation

235

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御（Ⅲ）
6.8

SARA group
Non-SARA group

pH

6.5

6.2

5.9

5.6

＊ ＃

＊

＊

－2

－1

0

1
2
3
Weeks after parturition

4

5

6

Fig. 1 The 24-h mean reticulo-ruminal pH in Holstein cows diagnosed with SARA （SARA group, n ＝ 9）and in cows

without SARA（non-SARA group, n＝9）at 2 weeks after parturition．*and# denote significant differences（p＜0.05
and ＜ 0.10, respectively）between the SARA and non-SARA groups at each sampling time. Values represent themean±SE.

pH < 5.8

900

Non-SARA

＊＊

720

min/d

SARA

＊

＊
＊

540

＊
＊

360

＊

＊

＊

＊

＊
＊

180

＊

0
pH < 5.6

900

n

min/d

720
540

＊
＊

360
＊

180

＊
＊

＊
＊
＊

＊

＊

＊

＊

＊

0
－2

－1

0

1

2

3

4

5

6

Weeks after parturition
Fig. 2 The duration of time where pH was ＜ 5.6 and 5.8 in Holstein cows diagnosed with SARA （SARA group, n ＝ 9）

and in cows without SARA（non-SARA group, n＝9）at 2 weeks after parturition（gray square）.*Significant
difference（p＜0.05）between the SARA and Non-SARA groups. Values represent mean±SE．

© The Ito Foundation

236

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

80

60

Anaerocella

Bacteroidetes

OthersFirmicutes

Unclassiﬁed
Veillonellaceae
Pseudobutyrivibrio

Relative abundance（%）

Alloprevotella
60

Paraprevotella

Selenomonas

40

Barnesiella
40

Ruminococcus

Unclassiﬁed
Porphyromonadaceae
Unclassiﬁed Bacteroidetes

20

Butyrivibrio
20

Unclassiﬁed Clostridiales
Unclassiﬁed Firmicutes

Unclassiﬁed
Prevotellaceae
0

Unclassiﬁed Bacteroidales
－3

2

6

－3

Non-SARA
5

2

6

SARA

Prevotella

－3

2

6

－3

Non-SARA

OthersProteobacteria

Succiniclasticum
0

3

2

6

SARA

Rhodococcus

Actinobacteria

Relative abundance（%）

Vampirovibrio
4

Unclassiﬁed
Alphaproteobacteria
Desulfovibrio

3

Curtobacterium
Unclassiﬁed
Microbacteriaceae
Unclassiﬁed
Actinomycetales
Unclassiﬁed
Actinobacteria
Pseudoscardovia

2

Unclassiﬁed
Desulfovibrionaceae
Desulfobulbus

2

Ruminobacter1

Succinimonas

0

Unclassiﬁed
Proteobacteria
Succinivibrio

－3

2

6

Non-SARA

－3

2
SARA

6

Unclassiﬁed
Gammaproteobacteria

Unclassiﬁed
Ruminococcaceae
Unclassiﬁed
Lachnospiraceae

1

Atopobium
Denitrobacterium
Biﬁdobacterium

0

－3

2

Non-SARA

6

－3

2
SARA

6

Unclassiﬁed
Coriobacteriaceae
OlsenellaFig. 3 Relative abundances of the four major bacterial phyla and genera in Holstein cows diagnosed with SARA
（SARA

group, n ＝ 7）and those without SARA（non-SARA group, n ＝ 8）at 2 weeks after parturition. Data are shown asa percentage of the total identified sequences per sampling period in each group（SARA and non-SARA）．

べ て ，分 娩 前 ３ 週 と 分 娩 後 ２ 週 に Prevotella

伝子について，SARA群では非SARA群に比べて，ruminicola が 有 意 な 低 値 を 示 し た こ と は ，P.

分 娩 前 ３ 週 に は CPA1, LOC780933 お よ びruminicolaがタンパクの分解，ペプチドの取り込

KLK12 を 含 む 349 遺 伝 子 が Up-regulate, GPC3,

みおよび発酵に重要な細菌であることから，分娩CXCL3およびSEPX1を含む16遺伝子がDown-

後SARA牛におけるタンパク分解能の減少は線維

regulateした。分娩後２週ではCYP2B6, PDYN

分解能の減少と関連する可能性がある。これ

お よ び SOCS2 を 含 む 156 遺 伝 子 が Up-regulate,

らのことから，SARA群では分娩前後におけるP.

MYOM1, APOD お よ び JUN を 含 む 364 遺 伝 子 がruminicolaの減少により，第一胃内の線維分解能

Down-regulate し た 。ま た ，分 娩 後 ６ 週 で はとタンパク分解能が低下しており，これには給与

STEAP4, GPX3およびCCL24を含む395遺伝子

飼料による前胃液pHの低下や第一胃液LPS活性が Up-regulate し ， AKR1B10, APOA4 お よ び

値の増加が関与している ことが示唆された。

HMGSC1を含む87遺伝子がDown-regulateした。

７，８）

９）

3 . 3 SARA群と非SARA群における肝組織中

発現変動遺伝子の機能とネットワーク解析の結果，分娩前と分娩後およびSARA群と非SARA群の遺伝子発現分娩前後における肝組織中の主要な発現変動遺における遺伝子発現に有意な差異は認められな© The Ito Foundation

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御（Ⅲ）

237

60
40

PC2 = 16.9%

20

SARA, -3 Wks
SARA, 2 Wks
SARA, 6 Wks

0

Non-SARA, -3 Wks
Non-SARA, 2 Wks－20

Non-SARA, 6 Wks

－40
－60
－50

0

50
100
PC1 = 23.4%

150

200

Fig. 4 Principal component analysis plots generated from normalized microarray data in Holstein cows diagnosed with

SARA（SARA group, n＝7）and in cows without SARA（non-SARA group, n＝8）at 2 weeks after parturition.
PC1 and PC2 represent principal components 1 and 2, respectively．

かった（Fig.４）。しかし，SARA群では非SARA

現を検討した。

群に比べて，分娩前２週にサイトカインシグナル

その結果，分娩後SARAの発症牛では非発症牛の活性化，分娩後２週にLPS関連経路とサイトカに比べて，分娩前から第一胃液の細菌叢構成が異インシグナルの抑制，分娩後６週にLPS関連経路

なり，分娩後には細菌叢の多様性が低下することと炎症応答の活性化および脂質代謝機能の低下にから，分娩前の細菌叢構成は分娩後のSARA発症

関連する遺伝子の発現が変動することが認められと関連があり，SARAによる前胃液pHの低下はた。このことから，分娩後SARA牛の肝組織では，細菌叢の多様性低下に影響することが示唆され分娩前後における脂質代謝機能に影響する炎症応た。分娩前の第一胃液細菌叢構成に差異がみられ

答やサイトカインシグナル抑制機構に関連する遺た原因は不明であるが，細菌叢構成は分娩前後の伝子の発現が変動しており，これら遺伝子群は分給与飼料のほか乾乳前後の飼養管理や以前の娩前におけるSARA発症の予知に応用可能である

SARA発症の有無も関与している可能性がある。

ことが示唆された。

一方，肝組織中の遺伝子発現解析の結果，SARA

４．要牛では分娩前にサイトカインシグナルの活性化が約認められたが，分娩前後およびSARA発症の有無

乳牛の分娩後におけるSARAの病態および分娩によって遺伝子発現に有意な差異がみられなかっ前の段階でのSARA発症予知の可能性を明らかにたことから，分娩後のSARA発症は分娩前後の給する目的で，分娩後SARAの発症牛（９頭）と非

与飼料と第一胃発酵状態が主な要因であることが発症牛（９頭）を対象とし，前胃液pH，第一胃示唆された。

液の各性状と細菌叢構成および肝組織の遺伝子発

なお，本研究の成果は文献10）に公表した。

© The Ito Foundation

238

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

文献１） Sato, S.：Anim Sci J, doi：10.1111/asj. 12415，
2015．
２） Sato, S., Mizuguchi, H., Ito, K., Ikuta, K., Kimura,A., Okada K.：Prev Vet Med, 103, 274～279，2012.
３） Sato, S., Kimura, A., Anan, T., Yamagishi N.,
Okada, K., Mizuguchi, H., Ito, K.;Vet Med
Commun，36，85～89，2012.
４） Sato, S., Ikeda, A., Tsuchiya, Y., Ikuta, K.,
Murayama, I., Kanehira, M. Okada, K., Mizuguchi,
H.：Vet Med Commun，36，85～89，2012．
５） Nagata, R., Yo-Han Kim, Ohkubo, A., Kushibiki, S.,
Ichijo, T., Sato, S.：J Dairy Sci, 101, 1～13, 2018．
６） Kim, Y. H., Toji, N., Kizaki, K., Kushibiki, S.,
Ichijo, T., Sato, S.：Physiol Genomics, 48, 803～809,
2016.

７） Nakamura, S-I., Yo-Han Kim, Takashima, K.,
Kimura, A., Nagai, K., Ichijo, T., Sato, S.：J Amin
Sci, doi：10.2527/jas2017-1431，2017．
８） Yo-Han Kim, Nagata, R., Ohkubo, A., Ohtani, N.,
Kushibiki, S., Ichijo, T., Sato, S.：BMC Vet Res, 14：
310, doi.org/10.1186/s12917-018-1637-3，2018．
９） Chang, G., Zhuang, S., Seyfert, H-M., Zhang, K.,
Xu, T., Jin, D., Guo, J., Shen, X.：Oncotarget, 6,38578～38590，2017．
10） Tsuchiya, Y., Chiba, E., Sugino, T., Kawashima, K.,
Hasunuma, T., Kushibiki, S., Yo-Han Kim, Sato, S.：
J Dairy Sci, 103, 4702～4716, 2020．

© The Ito Foundation

239

消化管寄生性コクシジウム，Eimeria krijgsmanniにおける発育休止期の解析（Ⅱ）
Analysis of the resting stage in the life cycle of the intestinal coccidianparasite, Eimeria krijgsmanni（II）

松

尾

智

英

（鹿児島大学共同獣医学部寄生虫病学分野）

Tomohide Matsuo（Laboratory of Parasitology, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

Eimeria spp. are intestinal coccidia and cause serious damages especially in cattle andpoultry worldwide. Their infection is known to be self-limited and hosts can acquire resistantagainst secondary infection. However, we clarified that only 2nd generation meronts wereremained in the epithelial cells of the caeca after end of oocyst shedding in a mouse intestinal
coccidium, Eimeria krijgsmanni. In the present study, in order to investigate effect of
secondary infection, we performed infection experiments in immunocompetent（BALB/c）micewith artificial immunosuppression by the dexamethasone and innate immunodeficient（nudeand SCID）mice. All mice were inoculated twice（day 0 and day 21）. As the results, oocyst
shedding status were almost similar to the results of experiments only with primary infection.
That is, the number and duration of oocyst shedding increased and extended in all experimentalgroups. It is suspected that parasites were supplied by challenge infection but oocyst shedding
status were not affected because zoites from primary infection of E. krijgsmanni also survived
in the epithelial cells of the ceca. On the other hands, it was reported that the number of shedoocysts increased by challenge infection with immunosuppression in poultry eimerian species.
Survival of zoites after primary infection has not been known in poultry species, so only zoites
from challenge infection might be able to develop normally by immunosuppression treatment.
Furthermore, cytokine assay clearly indicated move of host immune system with their infection
in immunocompetent mice. In addition, including antibody titer and intestinal IgA assay inprogress, detailed correlation between these host immune response and development of E.
krijgsmanni will investigate in near future．

１．目を衰弱させることで生産性を低下させ，また時に的致死的となるコクシジウム症を引き起こす１，２）。

世界中に分布し，特に牛および鶏において大きこれらに対しては一定の効果のある治療薬や一部な被害をもたらしているEimeria属原虫は宿主のの鶏寄生種に対するワクチンはすでに存在し３，４），消化管上皮に寄生し，激しい下痢症によって宿主重篤な場合は死に至るケースがあるものの，軽症© The Ito Foundation

240

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

ならば一定期間で自然治癒する一過性の感染と考過し抵抗性を獲得した宿主において虫体が生存えられてきた。そのため新たな研究が停滞していし，再発源となり得るのかを明らかにするため，るのが現状である。しかしながら，治療薬・ワク

再感染時の感染様態をさらなる感染実験によってチンの安全性やコストはもちろん，薬剤耐性株の精査した。さらに，これらの現象と宿主免疫との出現など新たな問題も知られるようになってき相関を調べるため，感染中の宿主免疫の「動き」

た。そしてなによりEimeria属原虫はいまだを，網羅的なサイトカイン解析および血中抗体

各地で蔓延しており，これらによるコクシジウム

価，腸管IgA検査によって明らかにすることを試症を制圧したとは言い難い現状である。

みた。

５，
６）

一方，Eimeria属原虫はin vitro培養によって生活環を完全に再現できず，また牛のような大型動２．方法

物を用いた感染実験は現実的に困難であるため，

2.1

申 請 者 は マ ウ ス 寄 生 性 Eimeria krijgsmanni

７，８）

５週齢，雌のBALB/cマウス，免疫不全モデル。

であるSCIDマウスおよびnudeマウスが供試されその結果，これまでEimeria属原虫感染は「オーた。供試されたEimeria krijgsmanniは鹿児島大

シストの経口摂取→無性生殖ステージ→有性生殖

学共同獣医学部寄生虫病学研究室にてマウスを用

ステージ→オーシスト排泄」という生活環を経いて継代維持されている。オーシストは感染マウて，オーシスト排泄終息後には虫体は宿主体内か

スの糞便から集められ，25℃，２％重クロム酸カら排除される一過性のものであると信じられてきリウム水溶液中でスポロゾイトを形成させた後，た常識を覆す新知見を得た。すなわち，無性生殖使用まで４℃で保管した。なお，本動物実験は鹿期の１ステージ，第２代メロントの虫体のみが児島大学における所定の認可の下で行われた。

を感染モデルとして基礎研究を続けてきた

９～12）

実験動物と寄生虫

オーシスト排泄終息後も長期間，寄生部位にとど2.2

まっていることを確認した 。このステージの虫再感染による虫体が免疫抑制下または先天性免体は宿主が感染を耐過して抵抗性を獲得した後だ

疫不全宿主において，どのような感染動態を示す

けでなく，オーシスト排泄を完全に抑制することか調べるため，感染実験を行った。単回感染実験のできる治療薬の投薬下でも残留していることが同様，免疫抑制剤としてデキサメタゾンを使用確認されている 。このことは，これまで「治癒」し，これを滅菌水に１mg/mlとなるよう懸濁し，したと考えられていた宿主において感染が継続し100μl/匹/日で皮下投与を行った。デキサメタゾていることを意味し，宿主の健康状態悪化によっン投与日程により次のように実験群（各５匹）をて症状が再発する可能性を示唆する。すなわち，設定した：感染２日前から第２代メロントの宿主

この潜在的な感染を抑制する新たな防除法が必要

盲腸上皮内における存在が確認されている最長のとなる。そこで，この潜在的な感染の意義と特定期間である感染後56日目まで（-2-56 DXM群），のステージの虫体が残留を可能にするメカニズム

感染２日前から感染後一度オーシスト排泄が終了

解明の第一歩として，免疫抑制下または先天性免する15日目まで（-2-15 DXM群），感染後15日目

疫不全マウスにおいて感染が再発もしくは長期継から感染後56日目まで（15-56 DXM群），および

続することを，昨年度の本助成の成果として報告

宿主が抵抗性を獲得し，再感染を行ってもオーシした。本研究においては，引き続き，初感染を耐スト排泄に至らないことが明らかな初感染後21日

10）

12）

© The Ito Foundation

免疫抑制実験

消化管寄生性コクシジウム，Eimeria krijgsmanniにおける発育休止期の解析（Ⅱ）

241

目から感染後56日目まで（21-56 DXM群）。加えされるスポロゾイトが寄生部位である腸管上皮細て ，免 疫 不 全 モ デ ル で あ る SCID マ ウ ス の 群胞に侵入し，メロゾイトの増殖過程であるメロン（SCID 群）と nude マ ウ ス 群（nude 群），コ ン トトを形成，それが崩壊し放出されたメロゾイトがロールとして感染前２日から感染後56日目まで

他の細胞に再び侵入するというサイクルを，種に100μl滅菌水を皮下投与した群（DW群）も設定

よって規定の回数繰り返す。E. krijgsmanniは盲した。以上のすべての実験群において，２回目の腸上皮細胞に寄生し，第４代メロントまで形成し感染は初感染後21日目に接種された。さらに，昨ていた７，10）。この無性生殖ステージ後の有性生殖年度の研究で結果が得られなかった，感染後，完ステージを経てオーシスト排泄に至る生活環によ全に抵抗性を獲得したあとも残留虫体が再発源にり，Eimeria属原虫の感染はこれまで「一過性のなるのかを調べるための感染実験も追加した。す

自己治癒する感染」と信じられてきた。また，初なわち，免疫正常のまま初感染を耐過した感染後

感染耐過後は獲得免疫を得て再感染に対して抵抗

28日から14日間，デキサメタゾンを１mg/匹/日

性を示すことはよく知られ13，14），E. krijgsmanniにで投与して免疫抑制を施すことによって，残留虫

おいても再感染への抵抗性は確認されており５），体の発育が再開し，オーシスト排泄が再発するか

本研究のコントロール群（DW群）でも再現されを調べる単回感染実験の追加試験を行った。

ている。

2.3

感染の評価

免疫抑制下および先天性免疫不全宿主においてすべての感染は2.0×10 個/匹のオーシストをも，昨年度の単回感染に類似した結果が得られ経口的に接種した。感染状態はオーシスト排泄数た。すなわち，宿主免疫の低下または不全状態に（OPG ： oocysts per gram of feces）を 毎 日 計 測

よって，オーシスト排泄数は増加し，排泄期間もして評価した。

延長した。単回感染との明らかな差が認められな

２

2.4

かったことは，再感染によって接種された虫体のサイトカイン解析

BALB/cマウスにおいて，感染直前（day０），感

影響はほとんどなかったことが強く示唆され，明染後７日（day７），14日（day14），21日（day21），

らかに潜在的長期感染の影響のためであろう。虫

28日（day28），35日（day35），42日（day42）に体の残留が確認されているE. krijgsmanniにおい

それぞれ採血し，その血清をサイトカイン解析にては初感染由来の虫体がすでに存在しており，再供試した。解析はLuminex System を用いたタ感染によって感染虫体は「補充」されたが，オーンパク発現量解析（ジェネティックラボ：札幌市）

シスト排泄には大きな影響が現れなかったことがによって実施した。

推察される。一方，鶏寄生種を用いた実験では，Ⓡ

免疫抑制によって再感染後のオーシスト排泄の変３．結果と考察化が認められている15）。免疫機構の異なる哺乳類

各免疫抑制および先天性免疫不全モデルマウスと鳥類とを単純に比較することはできないが，鶏実験群のオーシスト排泄数の推移をFig.１に示し

寄生種では虫体の残留は確認されておらず，初感た。Eimeria属原虫は，宿主体内において無性生染を耐過して虫体が一度排除された後，免疫抑制

殖ステージと有性生殖ステージを経てオーシスト

状態の宿主において，再感染によって侵入した虫を形成する単一宿主性の発育環をもつ。無性生殖

体が初感染同様に発育できたことが推察される。

ステージでは，経口摂取されたオーシストに内包

一方，昨年度の本助成研究において，単回感染© The Ito Foundation

242

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
A
OPG

108
107
106
105
control 群

104
103
+
0

7

14

21

28

35

42

56

49

d.p.i

B
OPG

108
107
106

-2－15DXM 群

105-2－21DXM 群

104-2－56DXM 群

103

15－56DXM 群

+
0

7

14

21

28

35

42

49

56
d.p.i

C
OPG

108
107
106
105
104
nude 群103

SCID 群
+
0

7

14

21

28

35

42

49

56
d.p.i

Fig. 1 Oocyst shedding of DW group（A）, 4 groups treated by DXM（B）, and immunodeficient（SCID and nude mice）

group（C）. All mice were inoculated twice on day 0（primary infection）and day 21（challenge infection）（arrows）.（A）Twice oocyst shedding periods were confirmed.（B and C）The number and duration of oocyst
shedding increased and prolonged in DXM, SCID and nude groups. ＋：Oocyst positive by sugar flotation method.
OPG：oocysts per gram of feces；d.p.i., days post infection.

後，完全に耐過した後の免疫抑制によって残留虫

メタゾンの投与量や投与法などの条件設定に問題体の再発育が誘導され，オーシスト排泄が起こるがあったと考えられた。本研究では，初感染後約のかという問題が未解決であった。これはデキサ

３週間でオーシスト排泄が収束し，宿主が再感染© The Ito Foundation

消化管寄生性コクシジウム，Eimeria krijgsmanniにおける発育休止期の解析（Ⅱ）

243

108
OPG

107

28－41DXM 群

106
105
104
103
+
0

5

10

15

20

25

30

35

40
d.p.i

Fig. 2 Oocyst shedding in mice treated by DXM from day 28 to 41 after only primary infection. Oocyst shedding

clearly recurred from day 34 to day 41. ＋：Oocyst positive by sugar flotation method. OPG：oocysts per gram offeces；d.p.i., days post infection.

に対する抵抗性を獲得したことが明らかで，残留として論文発表する予定である。

虫体の発育も停止している初感染後28日から２週

感染症の制圧にはワクチンをはじめとする予防

間，比較的高用量のデキサメタゾンを投与するこ法と治療薬の開発は必須の課題である。これまでとにより，明らかなオーシスト排泄が認められたの本種における成果により，当然のことながら，（Fig.２）。これにより，免疫学的に感染を防御で

まず宿主の免疫状態の変化により，虫体の再発育きるはずの宿主においても虫体が生存でき，さらが起こり，オーシスト排泄が惹起されることは明にはそれが再発源になり得るということが明確にらかである。他方で，すべての感染マウスで認め証明されたことになる。

られた１回目と２回目のオーシスト排泄期の分今回，免疫正常BALB/cマウスにおいて解析を割，および免疫不全モデルマウスで認められた長行った32種中10種の，明確に「動き」が確認され期のオーシスト排泄期において，一定間隔で発育たサイトカインの結果を示した（Fig.３）。本種の休止と再開を繰り返す現象は，宿主免疫の影響

感染におけるサイトカインごとの詳細な評価は今ではなく，虫体の独自の発育周期によるものでは後行っていく予定であるが，少なくともこれらのないかと予想される。これら感染延長を可能とす

サイトカイン解析結果によって，感染に伴って正るのは，宿主免疫や薬剤にさえも抵抗性であると常に宿主免疫が反応していることは明らかにされ推測される第２代メロントの「生存」という特殊た。解析が完了せず本報告では結果を示せなかっな性状であろう。したがって，この抵抗性ステー

たSCIDマウスにおけるサイトカイン解析，およジの虫体を排除することなくコクシジウム症の対び免疫正常および免疫不全マウスにおける血中抗策は完了しないであろう。今後，この特殊なス

E. krijgsmanni抗体価，腸管IgAの解析も進行中

テージにある虫体をより詳細に調べ，これらを排である。抵抗性を獲得した免疫正常宿主において除するメカニズムを明らかにすることは，これまさえも特定の発育ステージにある虫体が生存する

でとは戦略の異なる新たな予防法や治療法の開発ことによって起こる，これら潜在的感染延長現象に貢献する重要な情報となる。本助成で得られたと宿主免疫との相関を明らかにし，本助成の成果

知見を基に，Eimeria属原虫の感染に対する宿主© The Ito Foundation

244

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
IFNy

15

MCP-1

2
1.5

10

1
5
0

0.5
0

7

14

21

28

35

42

IL-1α

４

21

28

35

42

28

35

42

28

35

42

28

35

42

28

35

42

IL-2

２
１
0

7

14

21

28

35

42

IL-６

２

0

0

7

14

21
IL-9

3
2.5

1.5

2

1

1.5
１

0.5

0.5
0

7

14

21

28

35

42

IL-10

２

0

1.5

1

1

0.5

0.5
0

7

14

21

28

35

42

IL-17

1.1

0

8

1

6

0.95

4

0.9

2
7

14

21

7

14

28

35

42

0

21

IL-12p40

0

7

14

21
IP-10

10

1.05

0

0

2

1.5

0.85

14

３

１

0

7

４

２

0

0

５

３

0

0

0

7

14

21

Fig. 3 Analysis of 10 cytokines on days 0, 7, 14, 21, 28 35 and 42 after primry infection in BALB/cmice. Data were shown as relative values to that of day 0, respectively. All cytokines were clearly
moved with time after infection.

© The Ito Foundation

消化管寄生性コクシジウム，Eimeria krijgsmanniにおける発育休止期の解析（Ⅱ）

245

免疫および特殊な虫体の詳細な性状解析を継続し

krijgsmanni虫体の発育との相関をより詳細に調ていく予定である。

べていく予定である。

４．要

約

Eimeria属原虫は，主に脊椎動物の消化管に寄生するコクシジウム類で，特に鶏や牛において世界中で多大な被害をもたらしている。Eimeria属
原虫の感染は一過性で自己治癒し，また宿主は初感染を耐過すると再感染に抵抗性を獲得することも知られている。しかしながら，我々のこれまでの研究により，マウスを宿主とするE. krijgsmanniにおいて，第２代メロントがオーシスト排泄終了
後も寄生部位である盲腸上皮細胞に存在し続けているということが明らかになった。本研究では，再感染の影響を調べるため，免疫正常のBALB/c
マ ウ ス お よ び 先 天 性 免 疫 不 全（nude お よ びSCID）マウスにおいて，デキサメタゾンによる免疫抑制下において感染実験を実施した。すべての マ ウ ス に 対 し て ２ 回 の 接 種（day ０ お よ び
day21）が行われた。その結果，オーシスト排泄
状況は初感染のみの実験とほとんど同様の結果が得られた。すなわち，すべての実験群において，
オーシスト排泄数および排泄器官になんらかの増加と延長が認められた。このことは再感染由来の虫体が補充されたものの，本種においては初感染
由来の虫体が生存しているため，オーシスト排泄に影響しなかったことが推察された。一方，鶏寄
生種を用いた免疫抑制再感染実験では，再感染後のオーシスト排泄が認められている。鶏寄生種では初感染後の虫体の生存は知られておらず，そのため再感染で接種された虫体が免疫抑制処置によって正常に発育した結果ではないだろうか。さらに，免疫正常マウスにおけるサイトカイン解析
によって，宿主免疫の明らかな動きが示された。
加えて，進行中の血中抗体価および腸管IgAの解析 と 併 せ て ， こ れ ら 宿 主 免 疫 反 応 と E.

文献１） Daugschies, A., Najdrowski, M.：Eimeriosis incattle：current understanding, Journal of Veterinary
Medicine, 52, 417～427, 2005.
２）
 Williams, R. B.：A compartmentalized model forthe estimation of the cost of coccidiosis to theworld’s chicken production industry, International
Journal for Parasitology, 29, 1209～1229, 1999.
 Philippe, P., Alzieu, J. P., Taylor, M. A., Dorchies,
３）
P.：Comparative efficacy of diclazuril（VecoxanⓇ）
and toltrazuril（Baycox bovisⓇ）against naturalinfections of Eimeria bovis and Eimeria zuernii in
French calves, Veterinary Parasitology, 206, 129～
137, 2014.
４） Wallach, M.：Role of antibody in immunity andcontrol of chicken coccidiosis, Institute for the
Biotechnology of Infectious Diseases, 26, 382～387,
2010.
５） Chapman, H. D., Jeffers, T. K.：Vaccination ofchichens against coccidiosis ameliorates drug
resistance in commercial poultry production,
International Journal for Parasitology, 4, 214～217,2014.
６） Wnderlich, F., AI-Qurasishy, S., Steinbrenner, H.,
Sies, H., Dkhil, M. A.：Towards identifying novelanti-Eimeria against：trace elements, vitamins,
and plant-based natural products, Parasitology
Research, 133, 3547～3556, 2014.
７） Matsui, T., Fujino, T., Kobayashi, F., Morita, T.,
Imai, S.：Life cycle of Eimeria krijgsmanni-likecoccidium in the mouse（Mus musculus）,Journal of
Veterinary Medical Science, 68, 331～336, 2006.
８） Takeo, T., Tanaka, T., Matsubayashi, M., Maeda,
H., Kusakisako, K., Matsui, T., Mochizuki, M., Matsuo,
T.：Molecular and phylogenetic characterizationsof an Eimeria krijgsmanni Yakimoff & Gouseff,
1938（Apicomplexa：Eimeriidae）mouse intestinal
protozoan parasite by partial 18S ribosomal RNA
gene sequence analysis, Parasitology International,
63, 627～630, 2014.
９） Hashimoto, K., Tanaka, T., Matsubayashi, M.,
Endo, K., Umemiya-Shirafuji, R., Matsui, T., Matsuo,
T.：Host specificity and in vivo infectivities of themouse coccidian parasites Eimeria krijgsmanni,
Acta Parasitologica, 59, 337～342, 2014.
10） Ono, Y., Matsubayashi, M., Kawaguchi, H., Tsujio,M., Mizuno, M., Tanaka, T., Masatani, T., Matsui, T.,
Matsuo, T.：Course of induced infection by
Eimeria krijgsmannni in immunocompetent andimmunodeficient mice, Parasitology Research, 115,

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246

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

211～215, 2016.
11） Takeo, T., Tanaka, T., Matsubayashi, M., Tsujio,M., Umemiya-Shirafuji, R., Tsuji, N., Fujisaki, K.,
Matsui, T., Matsuo, T.：Evaluation of Eimeria
krijgsmanni as a murine model for testing theefficacy of anti-parasitic agents, Acta Parasitologica,
61, 195～200, 2015.
12） Inoue, K., Tsujio M., Matsubayashi, M., Inoue, R.,
Hatai, H., Andoh, M., Abe, K., Matsui, T., Matsuo,
T.：Susceptibility to various coccidiostats in themurine coccidian parasite Eimeria krijgsmanni,
Acta Parasitologica, 64, 418～422, 2019.
13） Mesfin, G. M., Bellamy, J. E. C.：Effects of acquired

resistance on infection with Eimeria falciformis
var. pragensis in mice, Infection and Immunity, 23,
108～114, 1979.
 Rose, M. E., Wakelin, D., Hesketh, P.：Gamma
14）interferon controls Eimeria vermiformis primary
infection in BALB/c mice, Infection and Immunity,
57, 1599～1603, 1989.
 Isobe T., Lillehoj, H. S.：Dexamethasone suppresses
15）
T cell-mediated immunity and enhances diseasesusceptibility to Eimeria mivati infection, Veterinary
lmmunology and lmmunopathology, 39, 431～446,
1993.

© The Ito Foundation

247

豚インフルエンザウイルス国内分離株の抗原性解析
Antigenic analyses of swine influenza viruses isolated in Japan

小

澤

真

（鹿児島大学共同獣医学部）

Makoto Ozawa（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

Since the influenza pandemic in 2009, the causative agent, the so-called “A（H1N1）
pdm09
virus” has been circulating in both human and swine populations. Although phylogenetic
analyses of the hemagglutinin（HA）gene segments have revealed broader genetic diversityof swine influenza viruses（SIVs）compared with human viruses, it remains unclear whether
the genetic diversity is reflected in their HA antigenicity. To assess the impact of the genetic
diversity in the HA gene segments from A（H1N1）pdm09 virus-related SIVs on their HAantigenicity, we characterized the HA antigenicity of our 12 SIV Japanese isolates in
microneutralization assays with ferret antiserum and 20 mouse monoclonal antibodies raised
against early A（H1N1）pdm09 virus isolates. The HA antigenicity characterized with the ferret
antiserum revealed that five out of the 12 SIVs were significantly different in their HAantigenicity from that of the early A（H1N1）pdm09 viruses. The HA antigenicity characterizedwith the mouse monoclonal antibodies revealed that the HA antigenicity of the 12 SIVs varied
each other. By using the artificial generation technique of influenza viruses, a single amino acidsubstitution found in one of the 12 SIVs, a serine-to-arginine substitution at position 190（theH1 numbering）in HA, was demonstrated to be a critical determinant of the HA antigenicity.
These results indicate that the genetic diversity in the A（H1N1）
pdm09 virus-related SIVs isreflected in their HA antigenicity. These results also imply the importance of SIV surveillance
not only for swine production, but also for public health．

１．目

フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス を 起 源 と す る A（H1N1）

的

pdm09ウイルスがヒトの間で世界的な大流行―

豚インフルエンザウイルスは，養豚産業に経済

パンデミック―を引き起こして以来，豚インフル被害をもたらすだけでなく，ヒトへ伝播して人獣

エンザウイルスの制御へ向けた研究の重要性は高共通感染症も引き起こす。そのため，家畜衛生とまっている。A（H1N1）
pdm09ウイルスは，パン

公衆衛生の両面において重要な病原体であり，そデミック発生以降もヒト社会で冬季の流行を繰りの特性の解明や制御方法の確立は社会的命題の一返しており，現在では季節性インフルエンザの原つに位置づけられる。とりわけ，2009年に豚イン因ウイルスのひとつに分類されている１）。さらに© The Ito Foundation

248

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

A（H1N1）pdm09ウイルスは，世界各地で飼養さ価することを目的として，豚インフルエンザウイれる豚からも相次いで分離されており，われルス12株の抗原性を，パンデミック初期分離株をわれも国内でA（H1N1）
pdm09ウイルスまたはA

抗原として調整されたフェレット抗血清ならびに（H1N1）pdm09ウイルス由来のHA遺伝子分節をマウスモノクローナル抗体を用いた中和試験によ有する豚インフルエンザウイルスを分離してきり解析した。

た

２～６）

。

７，
８）

インフルエンザウイルスのウイルス粒子表面に発現するヘマグルチニン（HA）タンパク質は，

２．方
2.1

法

細胞とウイルス

宿主細胞への付着・感染を担う糖タンパク質で，犬腎臓由来α2,6結合シアル酸過剰発現AX4細その遺伝子情報はHA遺伝子分節にコードされて胞 （東京大学医科学研究所・河岡義裕教授よりいる。ウイルス感染やワクチン接種によって宿主

分与）は５％新生子牛血清含有MEM培地で，ヒ体内で産生される抗体がHAタンパク質に結合す

ト胎児腎臓由来HEK293T細胞（河岡義裕教授よると，ウイルスの細胞への感染が阻害―中和―さり分与）は10％牛胎児血清含有DMEM培地で，れる。そのため，各ウイルス分離株が有するHA

それぞれ５％CO２・37℃条件下において継代培養

遺伝子分節の遺伝子解析や，HAタンパク質と抗した。またインフルエンザウイルスを感染させた体との反応性―抗原性―の解析は，ウイルス学おAX4細胞は，TPCK処理トリプシン（0.5μg/ml）

よび免疫学的に重要で，ワクチン株の評価・選定を添加した0.15％牛血清アルブミン含有MEM培などに不可欠な知見をもたらす。

地で培養した。

10）

これまで実施されたA（H1N1）
pdm09 ウ イ ル

A（H1N1）pdm09ウイルス由来のHA遺伝子分節

ス・ヒト分離株の解析は，HA遺伝子分節の遺伝を有する豚インフルエンザウイルス国内分離株12

的特性およびHAタンパク質の抗原性に関して，

株（Fig.１，灰色ハイライト）のほか，リバース

他の季節性インフルエンザウイルスと同様で，経ジェネティクス法（2. 2参照）で作出したパンデ

年的な変化は確認されるものの多様性はきわめて

ミ ッ ク 初 期 分 離 株 A/California/04/2009（H1N1）

乏しく，単一方向へ変異・進化していることを示（CA04株）の野生型，ならびにHA遺伝子分節にしている。一方，近年われわれが豚から分離した

特定のアミノ酸変異を導入したHA変異体を使用

A（H1N1）pdm09ウイルスは，同系統のヒト分離した。各ウイルス株はAX４細胞へ接種して増殖株よりも高い遺伝的多様性を示した７，８）。約30年させ，その培養上清を回収・分注して－80℃で凍前に実施された研究において，インフルエンザ

結保存した後，AX４細胞を用いた50％組織培養

ウイルスの豚における変異速度はヒトにおける変感染量（TCID50）アッセイによりウイルス力価

異速度よりも遅いことが示されて以来，この知見を測定した。

９）は当該研究領域において広く支持されてきた。し2.2

かしわれわれの研究結果は，従来の知見に対するプラスミドを用いた遺伝子組換えウイルス人工再考の必要性を示唆している。

リバースジェネティクス法

作出技術，いわゆるリバースジェネティクス法11）

本研究では，A（H1N1）
pdm09ウイルス国内豚により，CA04株の野生型ならびにHA変異体を分離株に認められたHA遺伝子分節の遺伝的多様作出した。CA04株に由来する８本の遺伝子分節性が，HAタンパク質の抗原性に与える影響を評に対応した８種類のウイルス遺伝子発現プラスミ© The Ito Foundation

豚インフルエンザウイルス国内分離株の抗原性解析

249

A/Hong Kong/95/2019（H1N1）
A/Brisbane/02/2018（H1N1）
99
A/Hong Kong/98/2019（H1N1）
99
A/Oman/5878/2018（H1N1）
91
A/Amasya/642/2017（H1N1）
A/TOKYO/17258/2017（H1N1）
A/Guangdong-Chancheng/SWL1263/2017（H1N1）
97
80
A/Mali/086/2017（H1N1）
A/Macao/611299/2016（H1N1）
78
A/swine/Aichi/KU-MI2-3/2016（H1N1）
A/swine/Aichi/KU-MI1-1/2016（H1N1）
100
82
A/Parana/110/2016（H1N1）
A/Costa Rica/0513/2016（H1N1）
99 A/Maryland/28/2016（H1N1）
99
A/Laos/4319/2016（H1N1）
A/Michigan/45/2015（H1N1）
A/swine/Aichi/10/2015（H1N1）
A/California/56/2014（H1N1）
A/Indonesia/1239 S17 L001/2012（H1N1）
A/Finland/142/2011（H1N1）
A/Singapore/GP027/2013（H1N1）
99 A/Bangkok/SIMI509/2010（H1N1）
A/Brisbane/10/2010（H1N1）
A/Narita/1/2009（H1N1）
A/California/07/2009（H1N1）
90
94 A/California/04/2009（H1N1）
A/swine/Nagasaki/KU-FK5/2016（H1N1）
A/swine/Saga/KU-FK1/2016（H1N1）
A/Kagoshima/KU-M17/2018（H1N1）
A/swine/Ehime/10/2015（H1N1）
A/swine/Ehime/01/2015（H1N1）
A/Kagoshima/KU-JAA7/2018（H1N2）
92
A/swine/Aichi/02/2016（H1N2）
A/swine/Japan/KU-HY5/2013（H1N1）
A/swine/Kagoshima/KU-FK1/2014（H1N1）
100
A/swine/Japan/KU-YG5/2013（H1N1）
98

Fig. 1 Phylogenetic tree of the HA gene segments from A（H1N1）pdm09 viruses. The nucleotide sequences of the A（H1N1）pdm09 virus-related HA gene segments from swine isolates used in this study （highlighted in gray）andearly isolates of the 2009 influenza pandemic （highlighted in black） were phylogenetically analyzed withcounterparts from the representative human isolates by using the maximum likelihood method with abootstrapping set of 1,000 replicates. Bootstrap values of＞70％ are shown at the nodes．

ド12）（河岡義裕教授より分与）およびウイルス遺後に，上清へ産生された各ウイルス株を回収し伝子（マイナス鎖RNA）の転写・複製を担う４た。野生型ウイルスの作出には先行研究で調整さ種類のウイルスタンパク質の発現プラスミド

12）

れたCA04株野生型HA遺伝子分節の発現プラス（河 岡 義 裕 教 授 よ り 分 与） を 混 和 し，

ミド12）を使用し，HA変異体の作出には，野生型

TransIT-293 Reagent （Mirus 社） を 用 い て

HA遺伝子分節の発現プラスミドを鋳型に任意のHEK293T細胞へ導入した。２～３日間培養した

アミノ酸変異を導入した変異HA遺伝子分節の発© The Ito Foundation

250

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

現プラスミドを調製して使用した。
2.3

抗３．結果と考察体

パンデミック初期分離株A/California/07/2009

3 . 1 フェレット抗血清を用いた中和試験（H1N1）を免疫抗原として調製されたフェレット

フェレットは，インフルエンザウイルスの感染

抗血清（国立感染症研究所・渡辺真治室長より分に伴う症状や免疫応答が最もヒトに近い実験動物与）， お よ び パ ン デ ミ ッ ク 初 期 分 離 株 A/のひとつで，その抗血清は古くから野外ウイルス

Narita/1/2009（H1N1）に対して中和活性を示し，の抗原性やワクチン株の有効性の評価に利用されそのエピトープも同定されている20クローンのマてきた。そして，あるフェレット抗血清の試験ウウスモノクローナル抗体（北海道大学・高田礼人

イルス株に対する中和抗体価が，免疫抗原ウイル

教授より分与）を使用した。なお，CA04株を含ス株に対する中和抗体価（ホモ血清抗体価）と比めたこれら３株のパンデミック初期分離株は，そべて８倍以上低い場合，「その試験ウイルス株とのHAタンパク質の抗原性に明確な差異はないこ

免疫抗原ウイルス株のHAタンパク質の抗原性はとが先行研究有意に異なる」とみなされる14）。

2.4

により確認されている。

13）

中和試験

HA遺伝子分節を対象とした分子系統解析によフェレット抗血清ならびにマウスモノクローナ

り，これまでわれわれが国内で分離してきた豚イ

ル抗体を，RDE（II）「生研」（デンカ生研社）でンフルエンザウイルスのうち，A（H1N1）
pdm09

処理して非特異的ウイルス感染阻止因子を除去しウイルス由来のHA遺伝子分節を有する12株の多10倍希釈液とした後，さらに0.15％牛血清アルブ

くは，A（H1N1）pdm09ウイルスのヒト分離株とミン含有MEM培地を用いて，Ｕ底96穴プレート

遺伝的に遠縁であることが分かっている７，８）（Fig.

上に２倍階段希釈列を作成した（30μｌ／穴）。

１）。これらの豚インフルエンザウイルス12株にこの抗体希釈列へ120TCID50/30μｌに調製した試ついて，パンデミック初期分離株とのHAタンパ

験ウイルス株30μ／穴を加えてよく混和し，37℃

ク質の抗原性の差異を明らかにするため，A/で１時間静置した。調製した抗体―ウイルス混合

California/07/2009（H1N1）を免疫抗原として調製

液のうち50μｌ／穴（100TCID50 のウイルスを含されたフェレット抗血清の各試験ウイルス株に対む）を，あらかじめPBSで２回洗浄し0.15％牛血する中和抗体価を，AX４細胞を用いた中和試験

清アルブミン含有１μg/ml TPCK処理トリプシにより決定した（Table１）。CA04株に対する中ン添加MEM培地（50μｌ／穴）を満たした96穴

和抗体価は640倍で，多くの豚インフルエンザウ

プレート上のAX４細胞へ接種した。この接種細イルス国内分離株が同程度の中和抗体価を示し胞を５％CO２・37℃条件下で３日間培養し，顕微た。その一方で，A/swine/Japan/KU-YG5/2013

鏡下で確認した細胞変性効果を基にして，フェ（H1N1）, A/swine/Japan/KU-HY5/2013（H1N1）,

レット抗血清ならびにマウスモノクローナル抗体

A/swine/Kagoshima/KU-FK1/2014（H1N1）, A/

ごとの各試験ウイルス株に対する中和抗体価を決

swine/Kagoshima/KU-M17/2018（ H1N1）, A/

定した。

swine/Aichi/KU-JAA7/2018（H1N2）の ５ 株 に 対する中和抗体価は80倍と８倍低かった。以上の結果は，これら５株とパンデミック初期分離株のHAタンパク質の抗原性が有意に異なることを示© The Ito Foundation

A/swine/Aichi/KU-JAA7/2018（H1N2）

A/swine/Kagoshima/KU-M17/2018（H1N1）

A/swine/Saga/KU-FK1/2016（H1N1）

A/swine/Aichi/02/2016（H1N2）

A/swine/Aichi/KU-MI1-3/2016（H1N1）

A/swine/Aichi/KU-MI2-1/2016（H1N1）

A/swine/Nagasaki/KU-FK5/2016（H1N1）

A/swine/Ehime/10/2015（H1N1）

A/swine/Ehime/01/2015（H1N1）

A/swine/Kagoshima/KU-FK1/2014（H1N1）

A/swine/Japan/KU-HY5/2013（H1N1）

A/swine/Japan/KU-YG5/2013（H1N1）

A/California/04/2009（H1N1）

Virus strain

80

80

640

160

2560

2560

2560

320

320

80

80

80

640

ferretantiserum

80
160
160
40

5120
80
320
640
2560
2560
10

＜10
＜10
＜10
10
＜10
＜10
40
320

80
＜10

10

5120

160

20

＜10

10

160

5120

＜10

320

40

5120

80

40

40

2560

160

320

Ｄ

Ｃ

Ｂ

A（H1N1）pdm09ウイルスのHAタンパク質の抗

20

320

160

10

80

10

10

320

20

10

10

160

160

Ａ
＜10
＜10

＜10
＜10

160
80
320
160
160

2560
＜10
＜10
20
10
＜10
＜10

5120
20
160
5120
40

20

40

2560

1280

5120

40

80

80

20

＜10
＜10

10
＜10

80

40

80

640

Ｈ
640

Ｇ

Ｋ

Ｍ

20

320

320

640
＜10

160
＜10

160

320

40

160
10

20

40

160
40

160

1280

40

5120

＜10

160
160

40

320

＜10

40

5120

5120

2560

＜10

20

＜10
＜10

160
160

2560
＜10

2560

5120

5120

2560

＜10

5120

5120

5120

320

80

5120

5120

1280

20

160

＜10

80

＜10

1280

1280

1280

1280

＜10

5120

640

5120

160

1280

5120
1280

5120
5120

640

＜10
640

2560
＜10

2560

640
＜10

Ｔ
160

Ｓ
80

80

Ｒ

10

2560

640

5120

160

320

20

80

10

80

80

Ｑ

A（H1N1）pdm09ウイルス由来のHA遺伝子分節を有する豚インフルエンザウイルス12株のHAタ

40

320

40

80

1280

320

2560 1280

20
202560 1280

プも同定されている20クローンのマウスモノク

ローナル抗体を用いて，上述のフェレット抗血清

20

20

80

10

20

160

1280

640

＜10

80

＜10

80

＜10

40

＜10

＜10 ＜10 ＜10

1280

10

20

40

Ｐ

＜10

10
＜10

Ｏ

Ｎ
640

＜10 ＜10 ＜10 ＜101280＜10 ＜10 ＜10

40

Ｌ

40

320

＜10

80

Ｊ

た中和抗体価が同一となる組み合わせは１組もな

＜10

320

20

20

20

20

5120

40

＜10

＜10

＜10

＜10

640

Ｉ

mouse monoclonal antibody clone：

Microneutralization titer of：Ｆ

遺伝子分節の遺伝的特性だけでなく，HAタンパ

160

160

5120

160

160

160

1280

320

40

160

40

80

160

Ｅ

Table 1 Microneutralization titer against A（H1N1）
pdm09 virus-related viruses．

豚インフルエンザウイルス国内分離株の抗原性解析ていることが分かった。

© The Ito Foundation

251

ンパク質の抗原性についてさらに詳しく解析するしている。
3 . 2 マウスモノクローナル抗体を用いた中和
試験と同様の手順で，各試験ウイルス株に対する中和

ため，パンデミック初期分離株A/Narita/1/2009（H1N1）に対して中和活性を示し，そのエピトー

かった。以上の結果は，すべての試験ウイルス株

抗体価を決定した（Table１）。試験ウイルス12株の中に，20クローンのモノクローナル抗体の示しのHAタンパク質の抗原性が互いにバラバラであることを示している。さらにこれらの結果は，国内で流行する豚インフルエンザウイルスが，HA

ク質の抗原性においても多様性を備えていることを示している。

原性を規定するアミノ酸を同定するため，パンデ
3 . 3 HAタンパク質の抗原性を規定するアミノ酸の同定

ミック初期分離株との優位な抗原性の差異が認められた豚インフルエンザウイルス５株のHAタン

パク質のアミノ酸配列を詳しく解析した。20ク

ローンのマウスモノクローナル抗体が認識するエ

ピトープ全９ヵ所のアミノ酸残基を，CA04株を含むA（H1N1）
pdm09ウイルスのヒト分離株と比較した結果（Table２），豚インフルエンザウイル

ス５株はHAタンパク質141位（Ｈ１ナンバリン

グ 15）），183位，および190位の３ヵ所に，ヒト分離株には見られない６種類のアミノ酸残基を有し

252

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 2 HA amino acid residues unique to antigenically-distinct A（H1N1）pdm09 virus swine isolates.
Amino acid residue* at position（H1 numbering）：

Virus strain

125

141

153

154

155

156

163

183

190

Human isolates

Ｎ

Ａ

K/E/N

Ｋ

G/E

N/D

A/swine/Japan/KU-YG5/2013（H1N1）

Ｎ

Ａ

Ｋ

Ｋ

Ｅ

Ｎ

K/Q/I

Ｓ

Ｓ

Ｋ

Ｓ

Ｔ

A/swine/Japan/KU-HY5/2013（H1N1）

Ｎ

Ｅ

Ｋ

Ｋ

Ｇ

A/swine/Kagoshima/KU-FK1/2014（H1N1）

Ｎ

Ａ

Ｋ

Ｋ

Ｅ

Ｎ

Ｑ

Ｐ

Ｎ

Ｎ

Ｋ

Ｔ

Ｔ

A/swine/Kagoshima/KU-M17/2018（H1N1）

Ｎ

Ａ

Ｋ

Ｋ

Ｇ

Ｄ

Ｋ

Ｐ

Ｓ

A/swine/Aichi/KU-JAA7/2018（H1N2）

Ｎ

Ｅ

Ｎ

Ｋ

Ｅ

Ｎ

Ｉ

Ｐ

Ｒ

*HA amino acid residues that are not found in A（H1N1）pdm09 viruses isolated from humans are shown in bold and underlined．
Table 3 Microneutralization titer against CA04 HA mutants.
Microneutralization titer of：Virus strain

ferretantiserumwild-type CA04

CA04 HA mutants withmouse monoclonal antibody
clone：
Ｎ

Ｑ

640

640

80

A141E

640

NT*

NT

S183P

640

NT

NT

S183T

640

NT

NT

S190T

640

NT

NT

S190N

320

NT

NT

S190R

80

80

10

*NT, not tested.

そこでCA04株の人工作出技術を基に，豚イン

およびＱ―の当該HA変異体に対する中和抗体価

フルエンザウイルス５株に特有の３ヵ所６種類のを決定した（Table３）。抗体クローンＮおよびＱ

HAタンパク質アミノ酸置換―141位のアラニンのCA04株に対する中和抗体価は640倍および80倍― グ ル タ ミ ン 酸 置 換 （A141E）, S183P, S183T,だった一方で，これら抗体の当該HA変異体に対S190N, S190T，およびS190R―を個別に有する遺する中和抗体価は80倍および10倍と，いずれも８

伝子組み換えウイルス（HA変異体）を作出し倍低かった。以上の結果は，HAタンパク質190て，フェレット抗血清との反応性を中和試験によ位のアミノ酸残基が，A（H1N1）pdm09ウイルスり調べた（Table３）。フェレット抗血清は，ほとのHAタンパク質の抗原性を規定する要因のひと

んどのHA変異体に対してCA04株と同程度の中つであることを示している。さらにこれらの結果

和抗体価を示したが，S190Rを有するHA変異体

は，独自に変異・進化を重ね多様性を示す豚インに対する中和抗体価は80倍と，CA04株に対するフルエンザウイルスの中に，ヒト流行株とは抗原

中和抗体価（640倍）と比べて８倍低かった。さ性の異なるウイルスが含まれていることを示唆しらに，190位のセリンをエピトープとする２クている。

ローンのマウスモノクローナル抗体―クローンＮ

以上の研究結果は，A（H1N1）pdm09ウイルス© The Ito Foundation

豚インフルエンザウイルス国内分離株の抗原性解析

国内豚分離株の，遺伝子だけでなくHAタンパク
質の抗原性における多様性を示すだけでなく，豚
インフルエンザサーベイランスの家畜衛生と公衆衛生の両面における重要性を示唆している。
４．要

約

2009年にインフルエンザのパンデミックを引き起こしたA（H1N1）
pdm09ウイルスは，その後ヒトと豚の両方で流行を続けている。これまでの同ウイルス系統のHA遺伝子分節の遺伝的解析により，豚分離株はヒト分離株よりも高い遺伝的多様性を示すことが明らかとなっているが，ウイルス学および免疫学的により重要な「抗原性」との関連性は解明されていない。本研究では，A（H1N1）
pdm09ウイルス系統の国内豚分離株に認められたHA遺伝子分節の遺伝的多様性が，HAタンパ
ク質の抗原性に与える影響を評価することを目的として，豚インフルエンザウイルス12株の抗原性を，パンデミック初期分離株を抗原として調整されたフェレット抗血清ならびにマウスモノクロー
ナル抗体を用いた中和試験により解析した。試験
ウイルス12株のうち５株のHAタンパク質が，パンデミック初期分離株とは有意に異なる抗原性を示した。また試験ウイルス12株の中に，HAタン
パク質の抗原性が一致する組み合わせはなく，互いにバラバラであった。さらに，インフルエンザ
ウイルスの人工作出技術を用いて，試験ウイルスのひとつに見られたHAタンパク質の１ヵ所のアミノ酸置換が，その抗原性を規定していることを明らかにした。これらの研究結果は，A（H1N1）
pdm09ウイルス系統の国内ブタ分離株が，HAタ
ンパク質の抗原性においても多様性を備えていることを示すだけでなく，豚インフルエンザサーベ
イランスの家畜衛生と公衆衛生の両面における重要性を示唆している。

253

文
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255

食肉の薬剤耐性菌による汚染菌数の測定法の開発・評価（Ⅱ）
Development and evaluation for determination of number of antimicrobialresistant bacteria in meats（Ⅱ）

石原

加奈子１・Shwe Thiri Maung Maung Khin１，２（１東京農工大学農学研究院，２日本獣医師会）

Kanako Ishihara１ and Shwe Thiri Maung Maung Khin１，２（１Institute of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology, ２Japan Veterinary Medical Association）

Antimicrobial resistance arising from antimicrobial use is of global concern. The WHO andOIE require programs to monitor antimicrobial resistance in zoonotic bacteria, animal
pathogens and commensal bacteria. Escherichia coli, one of coliform bacteria, found in thecommensal fecal flora of animals and contaminates meats such as chicken. It has been widelyused as indicator bacteria for monitoring of antimicrobial resistance. In order to estimate thenumber of coliform bacteria harbored antimicrobial resistance genes contaminated chickenmeats, combined method of most probable number method（MPN）and PCR（MPN-PCR）
were applied in our previous study. To evaluate the MPN-PCR, amplified antimicrobial
resistance genes by MPN-PCR were confirmed by sequencing in this study．
The blaTEM detected by the MPN-PCR method in chicken meats were identified to mainly, two（2.9％）and
blaTEM-1（59/68, 86.8％）, and three types of mutants of blaTEM-1（five（7.4％）
two samples（2.9％）, respectively）were observed. It was also confirmed that ampicillinresistant coliform bacteria isolated from chicken meats harbored blaTEM-1（8 isolates）and thesame three types of mutants（two, one and one isolates, respectively）. Therefore, the estimatednumber of blaTEM-harboring coliform bacteria by MPN-PCR was considered to be reliable.
, blaCMY-34（3 samples）and
Detected blaCMY-2 by MPN-PCR was identified to blaCMY-2（4 samples）
other novel mutant（1 samples）. It was considered possible to estimate the number of blaCMY-2-harboring coliform bacteria by MPN-PCR. Among 59 cefazolin-resistant coliform bacteria

group

isolated from chicken meats, blaCTX-M was not detected. On the other hand, MPN-PCR method
could detect blaCTX-M in 5 samples out of 120 chicken samples（4.2 ％）in our previous study.
The detection sensitivity of MPN-PCR method to detect blaCTX-M is higher than that in theconventional method of isolation of bacteria and antimicrobial susceptibility test. However,
MPN-PCR method targeting blaCTX-M needed determination of the DNA sequence to confirm
blaCTX-M or others.

© The Ito Foundation

256

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

１．目

ン耐性株を中心に67株を選び，blaTEMを保有して的

い る か PCR 法 で 確 認 し た 。ま た ，先 行 研 究 で食用動物への抗生物質の使用が選択した薬剤耐

blaTEM を検出したDNA176検体のうち，鶏肉１検性菌による人の健康危害が危惧される 。食用動

体ごとにDNA１検体を選び，DNA73検体から物や食肉を中心に薬剤耐性菌の保菌・汚染割合がblaTEM を増幅しなおした。MPN-PCR法では，効報告されている 。食肉中の薬剤耐性菌の菌数が率的に耐性遺伝子を検出するため，マルチプレッ

多いほど，薬剤耐性菌が加熱調理後も，食肉に生

クスPCR法を用いたが４），本研究では，blaTEM の残しやすく，調理過程で他の食品を汚染しやす

ほぼ全長を増幅した５）。

１）２）い。また，人の腸管内に定着しやすく，他の細菌

2.3に耐性遺伝子を伝達するリスクも高い。しかし，先行研究でblaCMY-2 を検出したDNA26検体のう

食品中の薬剤耐性菌の菌数を測定した報告はほと

ち ，鶏 肉 １ 検 体 ご と に DNA １ 検 体 を 選 び ，んどない。そこで先行研究で，最確数法（Most

DNA14検体からblaCMY-2を増幅しなおした。blaTEM

Probable Number Method ，MPN 法）に ，耐 性と同様に，blaCMY-2のほぼ全長を増幅した５）。

blaCMY-2の増幅遺伝子を検出するPCR法を組み合わせた“MPN-

2.4

PCR 法”に よ り ，鶏 肉 120 検 体 中 の tetA, tetB,

鶏肉から分離した大腸菌群のうち，セファゾリ

blaTEM, blaCTX-M およびblaCMY-2 の保有細菌数を推定

ン耐性株を中心に59株を選び，blaCTX-M の保有をした 。MPN-PCR法で検出したtetAおよびtetB

PCR法で確認した６）。

３）

blaCTX-Mの増幅の塩基配列は，既報の該当遺伝子と一致した。

2.5

MPN-PCR法で鶏肉28検体中５検体から検出した

増 幅 で き た 薬 剤 耐 性 遺 伝 子 は ，GEL/PCR

blaCTX-M は，blaCTX-M-36 およびblaCTX-M-2 group と同定でPurification Mini Kit（株式会社チヨダサイエン

きたが，鶏肉23検体から検出した遺伝子は，同じ

ス，東京，日本）で精製し，株式会社ファスマッ

クラスＡのβラクタマーゼ遺伝子ではあるが，ク（神奈川，日本）に塩基配列の決定を依頼し

blaCTX-Mとは異なるblaOXY等と同定された。そこで，た。決定した塩基配列は，遺伝子情報処理ソフト

本研究では，先行研究で検出したblaTEM および

ウェアGENETYX ver.15（株式会社ゼネティッ

blaCMY-2を再度増幅して，塩基配列を決定し，目的

ク，東京，日本）を用いて，Blastn検索および既の耐性遺伝子が検出されているかを確認し，報の耐性遺伝子の塩基配列と比較した。

MPN-PCR法の評価を行った。
２．方
2.1

塩基配列の決定３．結果と考察法

3 . 1 blaTEMの検出および塩基配列の決定

被検菌および被検DNA検体

先行研究３）でblaTEMが検出されたDNA73検体中先行研究で，鶏肉から分離した大腸菌群117株

68検体（93.2％）からblaTEM の全長が増幅でき，およびMPN-PCR法に用いた鶏肉培養液から抽出

塩基配列を決定できた。DNA68検体のうち，59

したDNA806検体から，検査項目に応じて菌株お検体から検出された遺伝子は，blaTEM-1と同定されよびDNA検体を選んで以下の検査に供試した 。

た。blaTEM-1と比べ，T396Gの１塩基変異が５検体，

３）

2.2

blaTEMの増幅

C665Tの１塩基変異が２検体ならびにT396Gおよ

鶏肉から分離した大腸菌群のうち，アンピシリ

びT539Cの２塩基変異が２検体から検出された。

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食肉の薬剤耐性菌による汚染菌数の測定法の開発・評価（Ⅱ）

257

ア ン ピ シ リ ン 耐 性 大 腸 菌 群 67 株 中 12 株 か ら性の鶏の糞便由来または乳房炎由来の大腸菌群もblaTEMを検出した。12株のうち８株が保有する遺追加して，blaCTX-M 保有を調べ，増幅が認められ伝子はblaTEM-1 と同定された。他の株が保有する

た場合，塩基配列を決定・解析した。これら分離

blaTEM には，blaTEM-1 と比べ，T396Gの１塩基変異

株からの増幅遺伝子に加え，先行研究３）で鶏肉培が ２ 株 ，C665T の １ 塩 基 変 異 が １ 株 な ら び に養液から検出し，決定した塩基配列および既報のT396GおよびT539Cの２塩基変異が１株で認めら

blaCTX-M等を含め作成した系統樹をFig.１に示す。

れた。

鶏肉から分離した大腸菌群２株から増幅された遺鶏肉から分離した大腸菌群が保有するblaTEMお伝子は，blaOXY-2およびblaOXY-6で，blaCTX-Mは認めら

よびMPN-PCR法で検出したblaTEM はいずれも，れなかった。blaCTX-M保有細菌およびblaOXY保有細blaTEM-1が主要で，前述の３つの変異型が共通して菌の抽出DNAを用いて，特異性の高いPCR法を認められ，MPN-PCR法によるblaTEM 保有細菌数検討する予定であったため，その検討はできなの推定は信頼性が高いと考えられた。

かった。２株が保有していたblaOXY-2およびblaOXY-6

3.2

blaCMY-2の検出および塩基配列の決定

は，先行研究３）のMPN-PCR法でも，それぞれ鶏先行研究３）でblaCMY-2 を検出したDNA14検体中

肉１検体由来DNA３検体および鶏肉８検体由来

８検体（57.1％）から，blaCMY-2の全長が増幅でき，

DNA９検体から検出された遺伝子であり，先行

塩基配列を決定できた。そのうちDNA４検体お研究で用いた鶏肉を汚染していた大腸菌群に多くよび３検体から検出された遺伝子は，それぞれ認められた耐性遺伝子であることが示唆された。

blaCMY-2 およびblaCMY-34 と同定された。blaCMY-34 は，鶏肉から分離した大腸菌群からはblaCTX-M を検

blaCMY-2 と比べ，C373A, G437CおよびG933Aの３

出できなかったが，先行研究３）では，鶏肉５検体

塩 基 変 異 が 認 め ら れ る 遺 伝 子 型 で あ る 。残 るの培養液の抽出DNA検体から，blaCTX-M-1 group であDNA１検体から検出された遺伝子はblaCMY-2 と比るblaCTX-M-36およびblaCTX-M-2 groupが検出され，検体かべC373T, G381T, G437CおよびT822Cの４塩基変ら分離した細菌の薬剤感受性や薬剤耐性遺伝子を異 が 認 め ら れ た 。こ の 変 異 型 は ，NCBI（The

調べる従来の方法より，MPN-PCR法の検出感度

National Center for Biotechnology Information）

が高いと考えられた。

に登録されておらず，新たな遺伝子型であった。

国内のブロイラーに関するblaCTX-M 保有細菌の再増幅できた検体数が先行研究の約半数であっ報告を見ると，2004年から2009年に分離された糞たことについては，再検討が必要であるが，増幅

便 由 来 大 腸 菌 で は ，blaCTX-M-2 （６ 株）が 最 も 多できた遺伝子は，blaCMY-2またはその変異型で，いく ７）， 2010 年 の 国 産 鶏 肉 由 来 大 腸 菌 で は ，ず れ も CMY 型 酵 素 の 遺 伝 子 で あ っ た 。MPN-

blaCTX-M-2 （11株），blaCTX-M-1 group のblaCTX-M-15 （５株）

PCR法によりblaCMY-2 group 保有細菌数の推定が可能

およびblaCTX-M-1（４株）が多かった８）。2012年３と考えられた。

月に，広域セファロスポリン抗生物質の適用外使

3.3

blaCTX-Mの検出用が自主的に中止され，その後，ブロイラーにお鶏肉から分離したセファゾリン耐性大腸菌群59

ける広域セファロスポリン耐性大腸菌は減少した

株のblaCTX-M 保有をPCR法で確認したが，２株でと報告されている９）。しかし，2015年から2016年

のみ遺伝子の増幅が認められた。陽性数が少なの国産鶏肉の約40％から，基質拡張型βラクタ

かったため，別の研究で分離したセファゾリン耐

マーゼ（ESBL）産生大腸菌が分離され，その大© The Ito Foundation

258

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

0.100000

HugA （AF324468.1）
SED （NG047543）
MPN_98-51）
SED-1 （NG049979）
CTX-M-2 （X92507）
CTX-M-59 （MH661247）
CTX-M-4 （Y141156）
CTX-M-5 （AF286192）
M1883）
tori 203）
MPN_30-11）
MPN_13-21）
CTX-M-9 （AJ416345）
CTX-M-18 （AF325133）
CTX-M-8 （AF189721）
CTX-M-25 （AF518567）
MPN_48-81）
MPN_94-21）
MPN_114-51）
CTX-M-3 （AB059404）
CTX-M-15 （AY044436）
CTX-M-1 （KP634899）
CTX-M-36 （NG048986）
MPN_29-21）
M2193）
tori 373）
CTX-M-10 （AF255298）
OXY-2-1 （NG049846.1）
OXY-2-11 （NG049848.1）
C2632）
MPN_66-41）
MPN_66-31）
MPN_66-21）
OXY-3-1 （NG049859.1）
OXY-1-1 （NG049841.1）
OXY-5-1 （NG049860.1）
OXY-4-1 （NG050613.1）
OXY-6-1 （NG049861.1）
OXY-6-2 （NG049862.1）
OXY-6-4 （NG049864.1）
OXY-6-3 （NG049863.1）
MPN_8-41）
MPN_13-31）
MPN_79-51）
C742）
MPN_44-21）
MPN_17-11）
MPN_13-11）
MPN_60-31）
MPN_61-11）
MPN_97-31）

TEM-1（NG_050145.1）

Fig. 1 Phylogenetic tree based on bla gene sequences of using the neighbor-joining method with GENETYX-tree（Genetyx Corp.,
Japan）．
 1）The sequences of 19 genes detected by MPN-PCR in the previous study, 2）2 genes of bacterial isolates obtained fromchicken meats and 3）4 genes of bacterial isolates from fecal （tori20 and tori37）or mastitis samples （M188 and M219）wereused for phylogenetic trees （bold type）.The remaining sequences were obtained from the National Center for Biotechnology
Information database [enzyme name and accession number（in parentheses）are shown]．

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食肉の薬剤耐性菌による汚染菌数の測定法の開発・評価（Ⅱ）

259

腸 菌 で は blaCTX-M-14 （17 株）お よ び blaCTX-M-2 （10よりblaCMY-2 group保有細菌数の推定が可能と考えら株）が多かった 。日本のブロイラーが保菌またれた。鶏肉由来大腸菌群のうち，セファゾリン耐

は鶏肉を汚染する大腸菌が保有する主要な性耐性株を中心にblaCTX-M の検索を行ったが，検blaCTX-M の 型 は ，blaCTX-M-1 group, blaCTX-M-2 group お よ び

出されなかった。一方で，MPN-PCR法では，鶏blaCTX-M-14を含むblaCTX-M-9 groupが中心であった。先行

肉120検体中５検体からblaCTX-M が検出されてお研究で も ， blaCTX-M-1 group, blaCTX-M-2 group お よ び

り，検体から分離した細菌の薬剤感受性を調べる

blaCTX-M-9 group が検出されており，本法で用いたプ

従来の方法より，MPN-PCR法の検出感度が高い

ライマー

は，標的としていないblaOXY 等を増幅と 考 え ら れ た 。た だ し ，blaCTX-M を 標 的 と し たしてしまう欠点もあるが，多様なblaCTX-M を検出

MPN-PCR法には，塩基配列の決定を併用する必でき，塩基配列の決定を併用することで，blaCTX-M

要があった。

10）

３）

６）

保有細菌数を推定することが可能と考えた。塩基配列の決定により，blaOXY等を識別すると同時に，
blaCTX-M の 型 も 決 定 で き ，医 療 上 問 題 と な る
blaCTX-Mとの比較も可能となる。
４．要

約

鶏肉中の耐性遺伝子保有細菌数を推定するため，最確数法（Most Probable Number Method,
MPN法）に，耐性遺伝子を検出するPCR法を組み合わせた“MPN-PCR法”により検出した薬剤
耐性遺伝子の塩基配列を決定し，目的の耐性遺伝子が検出されているかを確認し，MPN-PCR法の評価を行った。
MPN-PCR法で検出したblaTEM は，blaTEM-1 が主要で（59/68, 86.8％），そのほかに３つの変異型が認められ（各５検体（7.4％），２検体（2.9％）および２検体（2.9％）），鶏肉から分離した大腸菌群が保有するblaTEM とも一致し，MPN-PCR法
によるblaTEM保有細菌数の推定は信頼性が高いと考えられた。MPN-PCR法で検出したblaCMY-2は，当該遺伝子またはその変異型で，MPN-PCR法に文献１） WHO：Antibiotic resistance, https://www.who.
int/news-room/fact-sheets/detail/antibioticresistances，2018．
２）
 動物医薬品検査所：http://www.maff.go.jp/nval/
yakuzai/pdf/h27cyousakekkagaiyou.pdf
 Ishihara, K., Nomura, S.：平成30年度食肉に関す
３）
る助成研究調査成果報告書，37，269～274，2019．
 Kozak, G. K., Boerlin, P., Janecko, N., Reid-Smith,
４）
R. J., Jardine, C.：Appl. Environ. Microbiol., 75, 559～566，2009．
 Kojima, A., Ishii, Y., Ishihara, K., Esaki, H., Asai, T.,
５）
Oda, C., Tamura, Y., Takahashi, T., Yamaguchi,
K.：Antimicrob. Agents Chemothe., 49, 3533～
3537，2005．
 Edelstein, M., Pimkin, M., Palagin, I., Edelstein, I.,
６）Stratchounski, L.：Antimicrob. Agents Chemother.,
47，3724～3732，2003．
７）
 Hiki, M., Usui, M., Kojima, A., Ozawa, M., Ishii, Y.,
Asai, T.：Foodborne Pathog. Dis., 10, 243～249,
2013．
 Kawamura, K., Goto, K., Nakane, K., Arakawa,
８）
Y.：Foodborne Pathog. Dis., 11，104～110，2014．
９）
 Hiki, M., Kawanishi, M., Abo, H., Kojima, A.,
Koike, R., Hamamoto, S., Asai, T.：Foodborne
Pathog. Dis., 12，639～643，2015．
 Hayashi, W., Ohsaki, Y., Taniguchi, Y., Koide, S.,
10）
Kawamura, K., Suzuki, M., Kimura, K., Wachino, J.,
Nagano, Y., Arakawa, Y., Nagano, N.：Int. J. Food
Microbiol., 284，98～104，2018．

© The Ito Foundation

260

牛呼吸器病症候群（BRDC）発症機序の解明
Breakthrough of pathogenic mechanism of bovine respiratory disease
complex（BRDC）

帆

保

誠

二・石

川

真

悟

（鹿児島大学共同獣医学部）

Seiji Hobo and Shingo Ishikawa（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

The purpose of this study was to investigate the viruses and bacteria associated withbovine respiratory disease complex（BRDC）by clinical examinations, blood examinations, andbronchoalveolar lavage fluid examinations on Japanese Black cattle introduced from the calf
auction market. In April and December, we exermined 20 Japanese Black cattle（April
introduction group, December introduction group; 10 each）introduced from the calf auction
market. The December induction group was exermined twice on days 6 and 11 after induction.
The results of clinical examinations showed that patients with a fever of 40 ℃ or higher andrespiratory symptoms had developed BRDC and could be treated. In addition, the results ofbacterial isolation from bronchoalveolar lavage fluid were not necessarily associated with thedevelopment of BRDC, but the positive bovine respiratory syncytial virus（BRSV）genetic test
was more likely to develop BRDC. Previous studies have shown that Mycoplasma bovis andPasteurella multocida are strongly involved in the chronicity of BRDC. However, these bacteria
are not necessarily involved in the initial pathology of BRDC, but viruses such as BRSV infectthe airway mucosa, reduce the resistance of the airway to infection, and the overall condition
and feeding of subsequent cases. It was presumed that various factors including theenvironment were involved in the development and worsening of BRDC．

１．目

した複合的な要因が絡まりあって発症することが的知られている１，２）。しかし，その初期病態につい肺炎は，牛の死因の上位に位置する疾患であては不明な点が多い。特に，セリ市場導入後の肥り，獣医療において最も重要な感染症のひとつで育素牛が，どの時期に，どのような病態でBRDCある。牛肺炎の病態は牛呼吸器病症候群（BRDC）を発症するかはほとんど不明である。さらに，従として捉えられ注目されている。BRDCは，

来のBRDC発症時の病態解明については，鼻腔ぬさまざまなストレスによる感染防御能，いわゆるぐい液の解析が実施されてきた程度であったた

免疫力の低下，ウイルス感染，細菌感染を主体と

め，BRDCの主要発症部位である気管支肺胞領域

１，２）© The Ito Foundation

牛呼吸器病症候群（BRDC）発症機序の解明の情報についてはまったく不明であった３，４）。

261

数（HR），呼吸数（RR）を聴診器により計数し牛医療においては，特に子牛が肺炎を発症するた。その後，鼻漏の有無を肉眼的に観察するとととその成長が著しく停滞し生産性に大きく影響すもに，聴診上の異常所見の程度を気管の腹側部おることから，生産現場においては肺炎発症のコンよび胸部で聴取し，相対的に４段階（－：正常，

トロールとともに，早期かつ確実な診断法および＋：軽度，＋＋：中等度，＋＋＋：重度）で評価

治療法の開発が急務であった。そこで申請者らした。なお，本研究では39.6℃以上の体温を発熱

は，これまでに伊藤記念財団の研究助成を受け，と判断し，呼吸器症状を伴う試供牛をBRDC発症

牛における気管支肺胞洗浄法を確立するととも牛と診断した。また，子牛導入日から２ヶ月間にに，慢性期の肺炎の病態にあると診断された牛において，臨床獣医師がBRDCを対象とした治療を対して気管支肺胞洗浄を実施し，それぞれの真の実施した日数（治療日数）を計数した。

肺 炎 原 因 菌 を 特 定 し た ５，６）。 そ の 結 果 ，

血液検査：抗凝固剤（EDTA）を含有した真Pasteurella multocidaおよびMycoplasma bovisが空採血管を用いて頸静脈から採血し，一般血液検

BRDC病態の慢性化に強く関与していることが明査（白血球数（WBC），赤血球数（RBC），ヘモ

らかとなった。しかし，８～10ヶ月齢の肥育素牛

グロビン濃度（Hgb），ヘマトクリット値（Ht））のセリ市場導入直後のBRDC発症機序に関する情を実施した。

報がないため，BRDCの予防法や治療法は確立さ

気管支肺胞洗浄液検査：殺菌消毒液に浸漬した

れていない。この時期の病態を解明できれば導入滅菌綿花を用いて鼻孔周辺を清拭した後，ビデオ

牛の生産性をさらに向上できることが期待される。

エンドスコープを供試牛の鼻孔から挿入した。ビ

本研究は，セリ市場で導入された肥育素牛に対デオエンドスコープにより鼻腔および咽喉頭部をして臨床検査，血液検査および気管支肺胞洗浄液

観察後，塩酸リドカインによる気道粘膜の表面麻検査を実施し，BRDC発症に関連するウイルスや酔を実施しながら気管および気管支内腔を観察し細菌を特定することを目的とした。

た。ビデオエンドスコープ上の異常所見は，滲出
液の相対量により４段階（－：正常，＋：少量，

２．材料と方法
2.1＋＋：中等量，＋＋＋：多量）で評価した。続いて，ビデオエンドスコープを滲出液が観察される

供試材料

４月および12月にセリ市場から導入された肥育場合は当該気管支へ，観察されない場合は肺炎発

素牛20頭（４月導入群，12月導入群；各10頭）を症の可能性が最も高い肺葉である中葉の気管支へ供試した。供試牛は，南九州のセリ市場から牛輸と 進 め 楔 入 し た 。楔 入 部 位 に 滅 菌 生 理 食 塩 水

送専用車両による約１時間の輸送後，セリ当日に30mlをビデオエンドスコープのチャンネル経由

飼育場所に導入された。４月導入群は導入後８日で注入し，即座に回収する操作を２回連続で繰り目に，12月導入群は導入後６日目および11日目の返すことにより気管支肺胞洗浄液（BALF）を得

２回の検査を実施された。

た。得られたBALF検体を微生物学的に解析した。

2.2

方微 生 物 学 的 検 査：本 研 究 に お い て は ，法

供試牛に対して，臨床検査，血液検査および気Mannheimia haemolytica, P. multocida, Histophilus
somniおよびM. bovisを主要分離・同定対象細菌

管支肺胞洗浄液検査を実施した。
臨床検査：体温（直腸温：BT）計測後，心拍とし，その他の分離細菌はその他細菌とした。

© The Ito Foundation

262

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

BALF検体は，５％馬血液含有コロンビア寒天培

では６頭（同60％），導入11日後の検査時では３地（BA 培 地）お よ び マ ッ コ ン キ ー 寒 天 培 地頭（同30％）で認め，それぞれ３頭（No.７，
８，（MAC 培 地）に 接 種 し ，BA 培 地 は 微 好 気 条 件９），４頭（No.14，15，17，20），３頭（No.11，（５％CO２）下および嫌気条件下で，MAC培地は

15，18）をBRDC発症牛と診断した。また，40℃

好気条件下で培養（37℃）した。培養後のBA培

以上の発熱を認めた症例ではBRDCに対する治療地から主要な細菌を分離し，純培養後にグラム染が臨床獣医師により実施されていたが，40℃未満

色検査および細菌同定検査（飛行時間型質量分析の発熱の症例では治療との関連性は認められな

法 ： Time of Flight Mass Spectrometry ： TOF-

かった。このように，臨床所見からは発熱の有無

MS）, Loop-Mediated Isothermal AmplificationとBRDCに対する治療日数との間には明らかな関（LAMP）検査あるいはPCR検査により菌種を同連性は認められなかったが，40℃以上の発熱があ定した。マイコプラズマ分離検査は，細菌分離検

り呼吸器症状が観察される症例ではBRDCを対象

査と同様の検体をマイコプラズマ分離用寒天培地とした治療が行われることが示された。

に塗布し，微好気条件下で７日間培養（直接培

末梢血中白血球数は４月導入群では平均7,410/

養）するとともに，マイコプラズマ増菌培地に接μｌ，12月導入群では導入６日後の検査時では平種し微好気条件下で２日間培養（増菌培養）する

均 7,3210/ μｌ ，導 入 11 日 後 の 検 査 時 で は 平 均

ことにより増菌した。その後，増菌培養液は，１8,140/μｌであり，他の血液検査項目も含めおお白金耳をマイコプラズマ分離用寒天培地に塗布

むね正常範囲内であった（Table１，２）。

し，微好気条件下で７日間培養した。培養後のマ

これらのことから，導入後間もない時期の子牛

イコプラズマ分離用寒天培地は，実体顕微鏡で観の臨床検査においては，40℃以上の発熱と呼吸器

察するとともに，培地上の目玉状のコロニーにつ症状がBRDC発症の可能性を示唆することが示さ

いてTOF-MS, LAMP検査あるいはPCR検査によれた。しかし，一般的な血液検査ではBRDCの病り菌種を同定した。一方，ウイルス遺伝子検査は，態を捉えることは困難であると思われた。

牛の肺炎発症に関連すると考えられている牛RS

3.2

ウ イ ル ス （BRSV）， Ｄ 型 イ ン フ ル エ ン ザ

供試牛のほとんどで気管内腔や気管支内腔に滲

（FluD），牛 パ ラ イ ン フ ル エ ン ザ ３ ウ イ ル ス

出液の増量が観察されたが，発熱の有無，臨床所（BPIV3），牛 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス １ 型（BHV-1）

見および治療日数との間には明らかな関連性は認をRT-PCR法あるいはPCR法により実施した。

められなかった（Table１，２）。これらのことから，導入後間もない時期の子牛のビデオエンドス

３．結果と考察3.1

ビデオエンドスコープ所見

コープ検査において，気管内腔や気管支内腔における滲出液の増量は，必ずしもBRDCの発症には臨床検査および血液検査

供試牛の平均直腸温は４月導入群では39.4℃，

関連しないものと思われた。

12月導入群では導入６日後の検査時は39.7℃，導3.3

入11日後の検査時は39.5℃であり，健常牛に比較

細菌分離検査では，P. multocidaが４月導入群

し軽度に高体温であった（Table１，２）。このうでは８頭から，12月導入群では導入６日後および

ち，39.6℃以上の発熱を４月導入群では３頭（供11日後の検査時にそれぞれ４頭から分離された試牛の30％），12月導入群の導入６日後の検査時が，分離細菌数とBRDCに対する治療日数との間© The Ito Foundation

細菌分離検査およびウイルス遺伝子検査

263

牛呼吸器病症候群（BRDC）発症機序の解明

Table 1 Clinical examinations, blood examinations, endoscopy findings and days of treatment in the group introduced in April.
Clinical examinations
No.

Sex

BT

HR

Nasal
RR dischrage/min /min gradea

Tracheal Vesicularbreathbreathsoundssoundsgradeagradea

WBC

RBC

×102/

×104/

Videoendoscopic findings

Hgb

Ht

Nasal
passage Larynx Trachea Bronchus％

gradebgradebgradebgradebDays oftreatmentc
days

μL

g/dL

1

gelding

39.2

82

30

＋

－

－

74

947

12.1

36.1

＋

－

－

－

6

2

gelding
gelding

39.1
39.3

102
106

34
32

＋
－

＋
＋

－
－

77
62

982
802

12.4
10.2

35.3
29.2

＋
－

＋
－

＋
＋

＋
＋

3
0
0

3
4

℃

Blood examinations

μL

gelding

39.4

102

44

＋

＋

－

51

856

10.8

31.5

＋＋

＋

＋＋

＋＋

5

gelding

39.4

108

36

＋

＋

＋

73

906

10.5

31.8

＋＋

＋

＋＋

＋

0

6

gelding

39.2

102

32

＋

＋＋

＋

104

1120

12.1

37.2

－

－

＋

＋

0

7

gelding

39.8＊ 88

36

＋

＋

±

78

940

10.1

30.3

－

－

－

－

3

8
9

gelding
gelding

39.6＊ 104
39.7＊ 96

36
38

＋
＋

＋＋
＋＋

－
±

79
75

944
926

10.7
10.1

31.7
30.5

－
－

－
－

＋＋
＋＋

＋
＋

0
0

10

gelding

39.0

34

－

－

－

68

836

10.2

29.9

－

－

－

－

0

120

BT：Body temperature, HR：Heart rates, RR：respiration rates
gradea：−（Normal）, +（Slight）,++（Moderate）,+++（Massive）
gradeb：Exudate volume; −（Normal）,+（Small amount）,++（Moderate amount）,+++（Large amount）
c
Days of treatment ：Number of treatment days for two months after introduction.
＊BRDC affected cow.
Table 2 Clinical examinations, blood examinations, endoscopy findings and days of treatment in the group introduced in December.
Clinical examinations
No.

Sex

Blood examinations

Nasal Tracheal VesicularbreathRR dischrage breathsoundssoundsBT

HR℃/min /min gradea

gradeagradeaVideoendoscopic findings

RBC

Hgb

Ht

Nasal
passage Larynx Trachea Bronchus

×102/ ×104/
μL
μL

g/
dL

％

gradebgradebgradebgradebWBC

Days oftreatmentcdays

11-6d gelding

39.0

66

36

－

－

－

49

813

9.8

28.3

－

＋

＋＋

＋＋＋

3

12-6

gelding

39.6

124

24

－

－

－

81

975

12.6

36.7

－

－

－

－

0

13-6
14-6
15-6

gelding
gelding
gelding

39.6 9039.7＊ 12839.7＊ 90

24
36
36

－
－
－

－
＋
＋

－
－
＋

75
85
67

920
811
1,012

11.6
9.5
10.4

34.6
28.5
32.1

＋
＋
＋

＋
＋
＋

＋＋
＋
＋

－
－
＋

0
0
0

16-6

gelding

39.5

120

42

＋

＋

－

43

878

10.5

31.2

－

＋＋

－

3

17-6
18-6

gelding
gelding

40.0＊ 120
39.5 96

42
36

＋
－

＋
－

－
－

96
72

989
852

120
9.5

36.5
29.5

＋＋
－

＋＋
＋

＋
＋＋

＋
＋

5
2

19-6
20-6

gelding
gelding

39.5 11240.7＊ 128

30
48

－
＋

－
＋

－
＋

75
89

859
921

11
12.4

31
35.4

－
＋

－
＋

＋＋
＋＋

－
＋

0
5

11-11e gelding

41.0＊ 90

66

＋

＋

＋

102

897

10.6

30.5

－

＋

＋＋＋ ＋＋＋

12-11 gelding
13-11 gelding

38.7
38.9

132
90

24
30

－
＋

－
＋

－
＋

98
81

934
975

11.7
12.2

34.6
36.6

－
＋

－
＋

－
＋＋＋

＋
＋

14-11
15-11
16-11
17-11
18-11

39.0 86
39.8＊ 12839.3 1639.5 120
40.2＊ 90

36
48
30
30
36

＋
＋
＋
＋
＋

＋
＋
－
＋
＋

＋
＋
－
＋
－

78
91
53
98
78

823
927
829
1,009
912

9.5
11.2
9.7
12.1
9.9

28.6
33.7
28.7
36.2
30.8

＋
＋
－
＋＋
－

＋
－
－
－
－

＋＋＋
＋＋＋
＋
＋＋
＋

＋
＋＋
＋
＋
＋

39.0
39.5

36
44

－
＋

＋
＋

＋
＋

71
64

894
881

11.2
11.8

32.3
33.6

－
＋

＋
＋

＋＋
＋＋＋

＋
＋

gelding
gelding
gelding
gelding
gelding

19-11 gelding
20-11 gelding

96
96

BT：Body temperature, HR： Heart rates, RR： respiration rates
gradea：−（Normal）, +（Slight）, ++（Moderate）,+++（Massive）
gradeb：Exudate volume; −（Normal）,+（Small amount）,++（Moderate amount）,+++（Large amount）
Days of treatmentc：Number of treatment days for two months after introduction.
d indicates 6 days after introduction.
［No.-6］e indicates 11 days after introduction.
［No.-11］＊BRDC affected cow.

© The Ito Foundation

264

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 3 Bacterial isolations and genetic tests in the group introduced in April.

No.

M. haemolytica

P. multocida

H. somni

Mycoplasma
bovis

Other
bacteria

x103 CFU/mL

x103 CFU/mL

x103 CFU/mL

CulturefCulturef

BRSV

FluD

BPIV3

BHV1

RT-PCRg RT-PCRg RT-PCRg

PCRg

1

0

0.4

0

nd

nd

nd

D

nd

nd

2

0

0.4

0

nd

nd

nd

nd

nd

nd

3

0

0

0

nd

nd

nd

nd

nd

nd

4
5

0
0

0
10

0
0

nd
nd

nd
nd

D
nd

nd
nd

nd
nd

nd
nd

6

0

4

0

nd

nd

nd

D

nd

nd

7＊

0

6

0

nd

nd

nd

nd

nd

nd

8＊

0

5,000

0

nd

nd

nd

nd

nd

nd

9＊

0

5

0

D

nd

nd

nd

nd

nd

10

0

0.2

0

nd

nd

nd

nd

nd

nd

M. haemolytica：Mannheimia haemolytica, P. multocida, Pasteurella multocida, H. somni：Histophilus somni
Culturef, RT-PCRg or PCRg ; D：detected, nd：not detected
BRSV：bovine respiratory syncytial virus, FluD：influenza D virus, BPIV3：bovine parainfluenza 3 virus, BHV1：bovine herpesvirus 1＊BRDC affected cow.

Table 4 Bacterial isolations and genetic tests in the group introduced in December.
M. haemolytica

P. multocida

H. somni

Mycoplasma
bovis

Other
bacteria

BRSV

FluD

BPIV3

BHV1

x103 CFU/mL

x103 CFU/mL

x103 CFU/mL

CulturefCulturefRT-PCRg

RT-PCRg

RT-PCRg

PCRg

11-6d
12-6
13-6
14-6＊

0
0
0

25
0
0

0
0
0

nd
nd
D

nd
nd
nd

D
D
D

nd
nd
nd

nd
nd
nd

nd
nd
nd

0

0

0

nd

nd

D

nd

nd

nd

15-6＊

0
0
0
0
0

0
0
0
0.5
0.1

0
0
0
0
0

nd
nd
nd
nd
nd

nd
nd
nd
nd
nd

D
D
D
D
D

nd
nd
nd
nd
nd

nd
nd
nd
nd
nd

nd
nd
nd
nd
nd

0

50

0

nd

nd

D

nd

nd

nd

0
0
0
0

25
0
0.3
25

0
0
0
0

nd
nd
D
nd

nd
nd
nd
nd

D
D
D
D

nd
nd
nd
nd

nd
nd
nd
nd

nd
nd
nd
nd

0
0
0

10
0
0

0
0
0

nd
nd
nd

nd
nd
nd

D
D
D

nd
nd
nd

nd
nd
nd

nd
nd
nd

19-11

0
0

0
0

0
0

nd
nd

nd
nd

D
D

nd
nd

nd
nd

nd
nd

20-11

0

0

0

nd

nd

D

nd

nd

nd

No.

16-6
17-6＊
18-6
19-6
20-6＊
11-11e＊
12-11
13-11
14-11
15-11＊
16-11
17-11
18-11＊

M. haemolytica：Mannheimia haemolytica, P. multocida, Pasteurella multocida, H. somni：Histophilus somni
Culturef, RT-PCRg or PCRg ; D：detected, nd：not detected
BRSV：bovine respiratory syncytial virus, FluD：influenza D virus, BPIV3：bovine parainfluenza 3 virus, BHV1：bovine herpesvirus 1［No.-6］d indicates 6 days after introduction.
e indicates 11 days after introduction.
［No.-11］＊BRDC affected cow.

には関連性は認められなかった（Table３，
４）。

そ れ ぞ れ １ 頭 ず つ 認 め ら れ た が ，分 離 結 果 とまた，M. bovisが４月導入群および12月導入群でBRDCに対する治療日数との間には関連性は認め© The Ito Foundation

牛呼吸器病症候群（BRDC）発症機序の解明265られなかった（Table３，
４）。一方，ウイルスの入群は導入後８日目に，12月導入群は導入後６日

遺伝子検査では，BRSV陽性が４月導入群では１目および11日目の２回検査を実施した。その結頭で，12月導入群では全頭で認められた（Table

果，臨床検査では40℃以上の発熱があり呼吸器症

３，４）。

状が認められる症例ではBRDCを発症しており，

こ れ ら の こ と か ら ，気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 中 の治療対象となることが示された。また，気管支肺

BRSV遺伝子が高率に陽性である群では，発熱の胞洗浄液からの細菌分離結果はBRDC発症と必ず割合が高くなり，BRDCの病態を発症する可能性

しも関連しないが，BRSVの遺伝子検査が陽性のが高いことが示された。しかし，気管支肺胞洗浄

場合には，BRDCを発症する可能性が高いことが液中のP. multocidaやM. bovisが関連する重度の示された。これまでの我々の研究では，BRDCの肺炎へ移行するには，感染抵抗性や飼養環境をは

慢性化には，M. bovisやP. multocidaが強く関与じめとしたさまざまな要因が関与することが推察していることが示された。しかし，BRDCの初期された。一方，導入後のBALF検査は一般的には病態では必ずしもこれら細菌が強く関与するので困難であるので，導入前後におけるBRSV対策がはなく，BRSVをはじめとしたウイルスが気道粘重要であると思われた。

膜に感染し，気道の感染抵抗性を減弱させ，そのこれまでの我々の研究では，BRDCの慢性化に後の牛の全身的な状態や飼養環境をはじめとしたは，M. bovisやP. multocidaが強く関与している

さまざまな要因が関与して，BRDCの発症や重症ことが示された。しかし，BRDCの初期病態では化を引き起こすものと推察された。

必ずしもこれら細菌が強く関与するのではなく，BRSVのようなウイルスが気道粘膜に感染し，気道の感染抵抗性を減弱させ，その後の牛の全身的な状態や飼養環境をはじめとしたさまざまな要因が関与して，BRDCの発症や重症化を引き起こすことが推察された。
４．要

約

本研究は，セリ市場で導入された肥育素牛に対して臨床検査，血液検査および気管支肺胞洗浄液
検査を実施し，BRDC発症に関連するウイルスや細菌を特定することを目的とした。４月および12月にセリ市場から導入された肥育素牛20頭（４月文献１） Snowder, G. D., Van Vleck, L. D., Cundiff, L. V.,
Bennett, G. L.：J. Anim. Sci., 84, 1999～2008, 2006．
２） Portis, E., Lindeman, C., Johansen, L., Stoltman,
G.：J. Vet. Diagn. Invest., 24, 932～944, 2012．
３）
 Angen, O., Thomse, J., Larse, L. E., Larsen, J.,
Kokotovic, B., Heegaard, P. M., Enemark, J. M.：
Vet. Microbiol., 28, 165～171, 2009．
 Maunsell, F. P., Woolums, A. R., Francoz, D.,
４）
Rosenbusch, R. F., Step, D. L., Wilson, D. J., Janzen,
E. D.：J. Vet. Intern. Med., 25, 772～783, 2011．
 帆保誠二，野口倫子，安藤貴朗：公益法人伊藤記５）念財団平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報
告書，32, 215～221, 2014．
６）
 帆保誠二，野口倫子：公益法人伊藤記念財団平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，33,
189～193，2015．

導入群，12月導入群；各10頭）を供試し，４月導© The Ito Foundation

266

天然化合物による牛白血病ウイルス感染制御を目指した
基礎的研究
Basic research for controlling infection of bovine leukemia virus

紙透

伸治・村上

裕信・藤野

寛・佐藤

礼一郎

（麻布大学獣医学部）

Shinji Kamisuki, Hironobu Murakami, Kan Fujino and Reiichiro Sato
（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

Bovine leukemia virus（BLV）is the etiological agent of a lethal infectious disease, enzootic
bovine leukosis（EBL）. The BLV infection results not only in EBL development but also in
reductions in lifetime milk production, reproductive efficiency, and lifespan. The BLV infection
leads to significant economic losses in livestock industry because the prevalence of BLV
infection is high in several regions worldwide including Japan. The controlling of the spread of
BLV infection is important of reducing the economic losses. However, useful and feasible
countermeasures have not been developed. Thus, development of antiviral drug would be
useful for controlling of the infection. The aim of study is analysis of a compound with antiviral
activity for development of antiviral drug. The screening of chemical library revealed that
Compound A had an antiviral activity. In addition, the compound did not show cytotoxicity. An
integration of viral genome into host genome could not be inhibited by the compound whilevirus production was inhibited by it. In addition, the compound could reduce the expression
level of viral proteins in cells. The reporter assay revealed that the compound inhibited theviral transactivation through interaction between viral protein, Tax, and viral promoter region,
5’LTR. These results showed that the identified compound inhibited viral transactivation via
impairing Tax function. Because the compound target would be viral protein, Tax, it issuggested that the antiviral activity of the compound is specific to BLV replication. In addition,
because Tax protein promote expression of viral production and associated withleukemogenesis, the compound would be useful for an inhibitor against viral spread and EBLdevelopment. Taken together, the identified compound, Compound A, could be useful a leadcompound for development of anti-BLV drug.

１．目多症となり，数％がＢ細胞性白血病や全身のリン的パ肉腫を発症し，死の転機をたどる１，２）。EBLを牛白血病ウイルス（BLV）は牛に地方病性牛

発症した牛は全部廃棄の対象となり，経済的に大白血病（EBL）を誘発する。牛がBLVに感染す

きな損失を招く。我が国におけるBLV感染率はると，ウイルスは終生，持続感染するが，約70％

30～40％（約120～160万頭）に達しており，30年

は不顕性感染となり，約30％が持続性リンパ球増前と比較して30倍以上に拡大している。EBLによ© The Ito Foundation

天然化合物による牛白血病ウイルス感染制御を目指した基礎的研究

る経済的損失は20億円と試算されており，今後も267

ルス陽性のシンシチウムとした。

拡大することが予想されており，有効なBLV対2 . 4 プロウイルスDNAおよびウイルスRNA策を確立することが望まれている。通常家畜のウの精製とqPCRによるゲノム数の定量

イルス感染症を制御するためにはワクチンが主に感染細胞からゲノムDNAをWizard Genomic

用いられるが，現在のところ有効なワクチンの開DNA Purification Kit（Promega）を用いて，抽発にはいたっていない。そこで本研究では低分子

出，精製した。また，感染細胞内で発現している

有機化合物を用いたアプローチによりBLV感染

ウイルスRNA（vRNA）はISOGENⅡ（富士フイの制御を最終目標とし，BLVの増殖を特異的に

ル ム 和 光 純 薬） を ， 培 養 上 清 中 の vRNA は阻害する化合物を探索した。さらに得られた抗ウMagExtractor-Viral RNA-（東洋紡）を用いて抽イルス物質の作用機序を解明することを目的とし出，精製した。得られた精製vRNAは，ReverTraて研究を行った。

AceⓇ qPCR RT Master Mix with gDNA Remover

２．方
2.1

（東洋紡）を用いて，cDNAに逆転写した。

法

精製したDNAおよびcDNAを鋳型として過去

天然化合物ライブラリーに報告された方法によりプロウイルスコピー数お日 本 各 地 で 採 取 し た 真 菌 を 単 離 し ，Potato

よびvRNAコピー数を測定した４，５）。

Dextrose Brothで培養した。培養液を有機溶媒で2.5

抽出後，シリカゲルクロマトグラフィーや逆相化合物を添加して培養したFLK-BLV細胞を回HPLCにより化合物を精製し，天然化合物ライブ

収し，Laemmli sample Bufferを加え，100℃で熱ラリーを作成した３）。

変性させた。そのタンパク質をSDS-PAGEで分

2.2

ウェスタンブロット

離後，PVDF膜に転写した。PVDF膜をブロッキ

ウイルス液の調製

BLV持続感染細胞のFLK-BLV細胞（ヒツジ胎ング後，抗BLV-gp51抗体（BLV2）（Veterinary

子腎臓細胞由来）を用いた。コンフルエント状態

Medical Research & Development （VMRD）；のFLK-BLV細胞の上清を回収して，遠心後，そ1：2000），抗BLV-p24抗体（BLV3）（VMRD；の上清をフィルター（0.45μｍ）で濾過した。こ1：2000）あるいは抗β-Actin抗体（beta Actinの濾液を増殖培地で２倍希釈し，ポリブレンを加Monoclonal Antibody（Invitrogen；1：5000）とえてウイルス液とした。

ともに４℃で一晩，感作した。メンブレンを洗浄

2 . 3 ウイルス感染価の測定（シンシチウム

後 ，二 次 抗 体 HRP-conjugated anti-mouse IgG（Jackson Immuno Research ； 1 ： 5000）と と もアッセイ）
96ウェルプレートにCC81細胞（ネコ腎臓細胞に室温で１時間，感作した。そのメンブレンを洗由来）を播種して24時間培養後，ウイルス液およ

浄後，Clarity Western ECL Substrate（Bio-Rad）び化合物を添加してさらに48時間培養し，シンシを用いて，ウイルスタンパク質を検出した。

チウムを形成させた。培養上清を除去し，100％
メタノールで固定後にギムザ溶液で染色した。光

2 . 6 遺伝子転写活性の測定（ルシフェラーゼ
アッセイ）

学 顕 微 鏡 で シ ン シ チ ウ ム 数 （Syncytium-

96ウェルプレートに293Ｔ細胞（ヒト胎児由来

Forming Units；SFU）を測定した。シンシチウ

腎臓上皮細胞由来）を播種して24時間培養後，ムは細胞当たり５個以上の核を持つものを，ウイ

pBApo-Pur-5’LTR-Luc ， CAGGS-Tax-Flag ，© The Ito Foundation

268

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

pRL-TKをFuGENE HD（Promega）を用いてト
ランスフェクションし６時間培養後，増殖培地で3 . 2 化合物Ａの吸着からプロウイルスの挿入までの過程に与える影響

希釈した化合物を添加した。化合物添加してからBLVを含むレトロウイルスの増殖サイクルは

42 時 間 後 に 細 胞 を 回 収 し ， Pikka Gene Dual

大きく２つのステップに分けられる。前半は細胞Assay Kit（Toyo Ink）を用いて，ホタルルシフェ受容体への吸着，侵入，脱殻，逆転写，宿主染色

ラーゼとウミシイタケのルシフェラーゼの活性を体へのプロウイルスの挿入までの過程で，後半は測定した。ウイルスの転写活性は，ホタルルシ

vRNAの転写，翻訳，集合，出芽，放出の過程でフェラーゼ値をウミシイタケルシフェラーゼ値である。本実験では，化合物Ａの抗ウイルス効果が標準化した。

ウイルス増殖サイクルの前半に作用するのか，後

2.7

統計処理

半に作用するのかを調べた。

統計解析はソフトウェアＲ（Ver.3.6.2）を用いまず，吸着からプロウイルスの挿入までの過程て一元配置分散分析（Bonferroniの多重比較）おに影響を与えるかを調べた。CC81細胞を化合物

よび t 検定を行った

Ａで前処理した後，培地を除去し，ウイルス液を

。

６，７）

添加した。その後再度上清を除去して，増殖培地

３．結果と考察と置換した。この細胞を24時間培養後，細胞ゲノ

BLVの増殖を抑制する化合物の同定

ムDNAを抽出して，細胞の染色体に組み込まれシンシチウムアッセイによって細胞から産生さているプロウイルスのコピー数をqPCRにより定れる感染性BLVの量を測定することで，抗BLV量した。その結果，細胞ゲノムに組み込まれたプ

物質のスクリーニングを行った。173種類の化合ロウイルスコピー数は化合物Ａで処理しても変化物についてシンシチウムアッセイを行った結果，しなかった（Fig.２）。以上の結果から，化合物

シンシチウム形成数が最も低値を示したのは化合

ＡはBLVの増殖サイクルの前半には作用しない物Ａ（特許出願済み，未公開）であった（Fig. 1A）。

ことが明らかになった。

3.1

次に，化合物ＡによるBLVのシンシチウム形成抑制効果が，化合物の添加濃度に依存するかを調3 . 3 化合物Ａのプロウイルスの転写からウイ
ルス放出までの過程に与える影響

べた。その結果，シンシチウム形成は1.25μＭか

次に化合物ＡがBLVのプロウイルスの転写から有意に抑制され，その作用は濃度依存的であっらウイルス放出までの過程に影響を与えるかを，た（Fig. 1B）。ま た ，化合物Ａの50％阻害濃度

BLV持続感染細胞であるFLK-BLV細胞を用いて（IC50）は8.4μＭであった。

調べた。FLK-BLV細胞を化合物Ａで処理し，そ

シンシチウム形成の抑制は，化合物による抗ウの培養上清中のvRNA量をqRT-PCRを用いて定イルス効果ではなく，化合物そのものによる細胞量した。その結果，感染細胞を化合物Ａで処理す毒性に起因することも考えられる。化合物Ａのシることによって，培養上清中のvRNA量は有意にンシチウム形成抑制効果が，抗ウイルス効果によ減少した（Fig. 3A）。さらに，化合物Ａ処理でウるものか，あるいは細胞毒性によるものかを確認

イルスタンパク質であるｐ24およびgp51のタンするために，CC81細胞を用いてWST-1アッセイ

パク質量が変化しているかをウェスタンブロットを行った。その結果，CC81細胞では50μＭであっによって調べた。その結果，化合物Ａを添加するても細胞毒性は見られなかった（Fig. 1C）。

ことによりｐ24およびgp51のタンパク質量が低© The Ito Foundation

269

天然化合物による牛白血病ウイルス感染制御を目指した基礎的研究
（A）
DMSO

Compound A

（C）
120

140

100

120
Relative cell viability

Relative SFU（%）

（B）

80
60
40
20

100
80
60
40
20
0

50

30
40

5
10
20

0. 0
62
5
1.
25
2.
5

0

Compound A concentration（µM）

0

10

20

30

40

50

Compound A concentration（µM）

Fig. 1 Estimation of antiviral activity in Compound A.（A）Inhibition of syncytium formation by Compound A.

The bar shows 100 μm. The left and right panel show treatment of DMSO and Compound A, respectively.
（B）Antiviralactivity of dose dependent manner.（C）Cell viability in Compound A-treated cells. Means±SE.

Relative proviral copy number

120

下することが分かった（Fig. 3B）。以上の結果か100

ら，化合物ＡはBLVの増殖サイクルの後半を抑制していることが明らかとなった。

80

3 . 4 化合物Ａのウイルスタンパク質Taxによ60

る転写活性化への影響
BLV遺伝子のプロモーターは5’-long terminal

40

repeat（5’-LTR）であり，ウイルスタンパク質20

で あ る Tax が 5’-LTR に 結 合 す る こ と に よ り ，

0
DMSO

Compound A

Fig. 2 vRNA copy number in supernatant of CompoundA-treated CC81. The bar graph with an error bar
indicates the mean value and standard error.

BLV遺伝子の転写を強力に促進する。化合物Ａ
がTaxによる転写活性化に及ぼす影響を調べるた
めに，発現プラスミド系を用いてウイルス転写活性への抑制効果の有無を調べた。293Ｔ細胞に© The Ito Foundation

270

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
（A）

（B）

＊＊

Relative vRNA copy
number（%）

120
100
80
60
40
20
0

DMSO

Compound A

Fig. 3 Effect of Compound A on viral replication after viral genome integration.（A）Relative vRNA

copy number in supernatant of Compound A-treated FLK-BLV. The bar graph with an error
bar indicates the mean value and standard error. Significant difference is indicated by double
asterisk（p＜0.01, Student’s t-test）.（B）Analysis of viral protein, p24 and gp51, in CompoundA-treated FLK-BLV.

（A）

（B）

＊

35

1
0.9
Fireﬂy/Renilla luciferase
activity

Fireﬂy/Renilla luciferase
activity

30
25
20
15
10
5
0

0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1

DMSO

0

Compound A

DMSOCompound A

Fig. 4 Effect of Compound A on viral transactivation. Viral transactivation in the presence（A）and absence（B）

of Tax. The bar graph with an error bar indicates the mean value and standard error. Significant difference
is indicated by single asterisk（p＜0.05, Student’s t-test）.

pCAGGS-Tax-Flag と pBApo-Pur-5’LTR-Luc を

ラーゼの発現は変化しなかった（Fig. 4B）。以上

共トランスフェクション後，化合物Ａを添加し，の結果から，化合物Ａによるウイルス転写の抑制

ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果，化合はTax依存的であることが分かった。以上の結果

物Ａ処理によりルシフェラーゼの発現が有意に減から，化合物Ａはウイルスタンパク質であるTax

少した（Fig. 4A）。一方，pCAGGS-Tax-Flag非の機能を特異的に抑制することによって，ウイル

存在化でpBApo-Pur-5’LTR-Lucのみをトランススの転写を抑制することが明らかとなった。

フェクションした時は，化合物Ａ処理でルシフェ© The Ito Foundation

天然化合物による牛白血病ウイルス感染制御を目指した基礎的研究

４．要

271

の抗ウイルス活性はBLV複製に特異的であるこ約とが示唆された。さらに，Taxタンパク質はウイ

牛白血病ウイルス（BLV）は，致命的な感染

ルス産生の発現を促進し，EBL発症と関連してい症である地方病性牛白血病（EBL）の病原体であるため，この化合物はウイルスの感染拡大やEBLる。BLV感染は，EBLの発生だけでなく，生涯の発症に対する阻害剤として有用と考えられる。

の乳生産，生殖効率，および寿命の短縮の原因とこれらのことから，同定された化合物Aは，抗なる。日本を含む世界中のいくつかの地域でBLV

BLV薬の開発に役立つリード化合物となりうる

感染率が高いため，BLV感染は家畜産業に大きことが示唆された。

な経済的損失をもたらす。そのため，BLV感染の拡大抑制は，経済的損失の軽減に重要である。
しかし，実現可能な簡便な対策は存在しないため，抗ウイルス薬の開発は感染の抑制に有用である。本研究では，抗ウイルス薬の開発のために，
抗ウイルス活性を持つ化合物の探索を試みた。最初に，微生物二次代謝産物由来の化合物ライブラ
リーのスクリーニングを行い，化合物Aが抗ウイルス活性を有することが明らかになった。さらに，この化合物は細胞毒性を示さなかった。化合物Aによりウイルス生産が阻害された一方で，ウ
イルスゲノムの宿主ゲノムへの組み込みは阻害されないことも明らかとなった。また，この化合物
は細胞内のウイルスタンパク質の発現レベルを低下させることが示唆された。さらにレポーター
アッセイにより，この化合物がウイルスタンパク
質Taxおよびウイルスプロモーター領域5’
LTR間の相互作用を介したウイルス転写活性を阻害することが明らかとなった。これらの結果は，同定された化合物が，Tax機能の障害を介してウイルス
転写活性を阻害したことを示した。化合物Aの標的はウイルスタンパク質Taxであるため，化合物

文
献１） Schwartz, I., Levy, D.：Pathobiology of bovine
leukemia virus, Veterinary Research, 25, 521～536,
1994.
２）
 Aida, Y., Murakami, H., Takahashi, M.,
Takeshima, S.：Mechanisms of pathogenesis
induced by bovine leukemia virus as a model forhuman T-cell leukemia virus, Frontiers in
Microbiology, 4, 328, 2013.
３）
 Kanno, K., Tsurukawa, Y., Kamisuki, S., Shibasaki,
H., Iguchi, K., Murakami, H., Uchiyama, J.,K u r a m o c h i , K . ：N o v e l n e u r o p r o t e c t i v ehydroquinones with a vinyl alkyne from thefungus, Pestalotiopsis microspora, Journal of
Antibiotics, 72, 793～799, 2019.
 Murakami, H., Asano, S., Uchiyama, J., Sato, R.,
４）
Sakaguchi, M., Tsukamoto, K.：Bovine leukemia
virus G4 enhances virus production, Virus
Research, 238, 213～217, 2017.
５）
 Murakami, H., Uchiyama, J., Nikaido, S., Sato, R.,
Sakaguchi, M., Tsukamoto, K.：Inefficient viral
replication of bovine leukemia virus induced byspontaneous deletion mutation in the G4 gene,
Journal of General Virology, 97, 2753～2762, 2016.
 R Core Team （2019）. R：A language and６）environment for statistical computing. R
Foundation for Statistical Computing, Vienna,
Austria. URL https://www.R-project.org/.
７）
 Kanda, Y.：Investigation of the freely available
easy-to-use software‘EZR’for medical statistics,
Bone Marrow Transplantation, 48, 452～458, 2013.

© The Ito Foundation

272

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索（Ⅲ）―より効果的なワクチン接種部位を求めて―Study of mucosa-associated lymphoid tissues in farm animals（Ⅲ）― to identify more effective regions for their vaccination ―

市居

修・中村

鉄平・小千田

圭吾・山下

祐輔・池田

哲平

（北海道大学大学院獣医学研究院）

Osamu Ichii, Teppei Nakamura, Keigo Kosenda, Yusuke Yamashita and Teppei Ikeda（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University）

In recent years, the development of a mucosal vaccine is progressing rapidly and has been
put to practical use in respiratory diseases of chickens, such as highly pathogenic avian
influenza. These methods target to mucosa-associated lymphoid tissues, in particular the roleof “eye-associated lymphoid tissue（EALT）” would be important for the achievement ofeffective ophthalmic vaccination. In the previous study, we clarified the histologicalcharacteristics of EALT in cow and pigs（miniature pigs）. Further, in the genital organs ofboth species, we also found the genital organ-associated lymphoid tissue（GOALT）of theirvaginal vestibule. In this study, we morphologically investigated the uptake of mimic antigens
in GOALTs by using goats. The investigated goats possessed the diffused or follicular GOALTs
in the vaginal vestibules, and they tended to localize around the external urethral orifice orfossa clitoridis. The exposed mimic antigens were detected in a few cells composing GOALTs,
and they were also localized to the deep inguinal lymph nodes, but they were scarce. Althoughfurther studies were needed to clarify the mechanism and dynamics of antigen uptake, thesethe mucosa associated lymphoid tissues have the possibility of future development of local
mucosal vaccination to induce a host mucosal immunity in these animal species. In further
study, we would continue to focus on the possibility of mucosa-associated lymphoid tissue torealize the efficient immunity induction in farm animals.

１．目

を主役とする局所粘膜免疫誘導による感染防御が的より効果的であると考え，本研究を進めている。

産業動物獣医療において，全身免疫を誘導する

近年，粘膜免疫を誘導して粘膜への病原体侵入を注射型ワクチンが感染症予防の主体となってい未然に防ぐ“粘膜型ワクチン”の開発に大きな関る。一方，全身免疫誘導は病原体侵入後の防御・心が寄せられている。

回復に有効であるが，多くの産業動物感染症で

粘膜局所では，粘膜関連リンパ組織（MALT）

は，眼，消化器，呼吸器および生殖器等の粘膜がが主役となり，外界に接する上皮細胞と下層の免病原体の侵入門戸となる。そのため，我々はIgA

疫細胞が密接に関連する。特に，ワルダイエルの© The Ito Foundation

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索（Ⅲ）―より効果的なワクチン接種部位を求めて―

273

咽頭輪に存在する扁桃や鼻咽頭関連リンパ組織

Cytokeratin18陽性細胞（Ｍ細胞マーカー）の局（NALT），腸管関連リンパ組織（GALT，パイエ

在を明らかにした。また，両動物種の腟前庭に散ル板）が教科書でもよく知られている。鶏では，在性および濾胞性のリンパ組織を発見し，生殖器

特にNALTを標的とした経鼻ワクチンが開発さ

関連リンパ組織（GOALT）と命名した。本年度

れ，ヒトでも経鼻インフルエンザ生ワクチン“フは ，こ れ ら MALT の 機 能 解 析 の た め ，山 羊 のルミスト”が有名である。2015年に牛ではTSVGOALTをモデルとして模倣抗原を暴露し，その２（牛伝染性鼻気管炎と牛パラインフルエンザ３

動態を組織学的に探索した。

型）経鼻ワクチンが実用化され，豚では回虫抗原を応用した粘膜免疫が検討されてきた。さらに近２．方法年，点眼ワクチンの開発も日進月歩であり，高病

2.1

動物実験倫理および供試動物

原性鳥インフルエンザ等，鶏の呼吸器疾患で実用

本研究のすべての過程において，北海道大学な化されている。粘膜型ワクチン接種には高価な医らびに同学獣医学研究院における動物実験ガイド

療基材や高度な技術を必要とせず，開発途上国へ

ラインに従って実験を行った（承認番号19-0097，の応用という面からも新たな技術として期待され

本 研 究 院 の 動 物 実 験 プ ロ グ ラ ム は Theている。

Association for the Assessment and Accreditation

我々は，牛と豚における将来の粘膜型ワクチン

of Laboratory Animal Care International に よ るの発展と普及を想定し，研究を進めている。昨年

認証を受けている）。１歳齢の雌山羊（ザーネン

度までの研究において，ワクチンを接種しやすい種，４頭）を用い，未処置あるいは模倣抗原とし

粘膜免疫誘導部位として“眼と腟”に注目し，特て墨汁を染み込ませた綿を腟前庭に留置した。留に両動物種の眼球結膜部分にMALTが存在する

置後１時間および24時間後に麻酔前投与薬としてこ と を 明 ら か に し た（結 膜 関 連 リ ン パ 組 織

セラクタール（1.5ml/100kg体重）を筋肉内注射（CALT）や涙道関連リンパ組織（LTALT）を併し，全身麻酔薬としてペントバルビタールナトリ

せて眼関連リンパ組織（EALT）と呼ぶ）。口やウム（500mg/kg）を静脈内に投与し，その後飽直腸も外界接するため，ワクチン接種候補部位と和塩化カリウム溶液を10ml/100kg体重以上を投なるが，前者は食渣に，後者は糞便に邪魔される

与して安楽死させ，腟前庭を採取した。またそのだろう。また，眼と腟の所属リンパ節を考慮に入付近のリンパ節として，浅鼠径リンパ節，深鼠径れると，眼は上部気道疾患に，腟は付近の尿生殖リンパ節，内側腸骨リンパ節，仙骨リンパ節およ

器や乳房等への免疫誘導に有用であると考えられ

び腸骨下リンパ節を採取した。

る。MALTには特徴的な濾胞被蓋上皮が存在し，

2.2

組織解析

特に抗原取り込み能を有する“Ｍ細胞”が重要で上記のように採取した臓器を10％中性緩衝ホルある。Ｍ細胞は基底膜側に樹状細胞等を集簇さ

マリン／0.1Ｍリン酸緩衝液で24時間以上室温固せ，外来抗原に対する粘膜免疫誘導に重要な役割定した。生殖器のホールマウント標本観察のたを果たす。

め，固定組織を流水洗後，マイヤーヘマトキシリ

これまでの研究において，両動物種ともに結膜ン液（武藤化学，東京，日本）に浸漬し，塩酸アおよび第三眼瞼にEALTを具備すること，また，ルコールで脱色しながら観察した。肉眼観察後，

牛 の EALT に お け る Ｔ 細 胞 ， Ｂ 細 胞 ，すべての組織を階段希釈アルコール系列で脱水© The Ito Foundation

274

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

後，定法に従いパラフィン包埋組織を作成した。

り込み細胞が，リンパ組織内あるいは上皮内に観パラフィンブロックから３μｍ厚の組織切片を作察された（Fig. 2G，H）。墨汁取り込み細胞は，成後，無染色あるいはヘマトキシリン・エオジン

探索したリンパ節では稀であり，深鼠径リンパ節（HE）染色を施して，観察した。

にわずかに存在する程度だった。

2.3

画像解析

3.2

考

察

組織スライドグラスについて，BZ-X710（キー

これまでの予備実験ならびに昨年度の解析か

エ ン ス ，大 阪 ，日 本）で 撮 影 ，あ る い は Nano

ら，牛，馬，猫，豚（ミニ豚）およびマウス１）のZoomer 2.0-RS（浜松ホトニクス，静岡，日本）

EALT（結膜関連リンパ組織）ならびに牛と豚でバーチャルスライド化することで組織画像を得（ミニ豚）のGOALTを発見しているが，本研究た。

において，山羊の腟前庭部分にもGOALTが存在することを明らかにした。山羊のGOALTは外尿３．結果と考察3.1

結道口付近に多く，外界からの経尿路感染を防ぐた

果

めの免疫学的関門を形成していると考えられた。

ホールマウントヘマトキシリン標本観察におい

近年，尿路に関連するリンパ組織がヒトやマウスて，これまで明らかにした牛やミニ豚と同様，山発見されている２）。陰核窩周囲GOALTの存在意

羊の腟前庭粘膜にはヘマトキシリンに濃染する小義は不明だが，当該部位は外界に近い粘膜部であ円構造が散在性に認められた（Fig. 1A，B）。こ

るため，GOALTを配備しているのかもしれない。

のような小円構造は，外尿道口周囲や陰核窩周囲

解析に供したヤギの腟前庭粘膜に出血巣が観察に高率に認められた（Fig. 1C，D）。小円構造のされた。これは綿栓による圧迫や摩擦あるいは性パラフィン包埋組織を作製し，その組織切片を観周期による生殖器粘膜の形態変化３）を示している

察したところ，上皮下に散在性および濾胞性のリ可能性もある。後者の可能性検証については，今ンパ組織が見られ，GOALTであることが示され後の実験で発情同期化後の採材等が必要であるとた（Fig. 1E，F）。濾胞性GOALTの直上では，粘考えられた。また，GOALTにおける墨汁取り込

膜上皮が欠損し，リンパ組織が一部粘膜面に露出

み細胞は少数であり，所属リンパ節における検出していた（Fig. 1F）。

も深鼠径リンパ節においてのみ見られた。今後

Fig. ２に墨汁暴露後１時間の解析結果を示す。

は，より分子量や粒子径の小さい蛍光標識タンパ

標本を流水で水洗後，茶褐色領域が腟と腟前庭のク・ビーズの投与４）でGOALTの抗原取り込みを境界部ならびに腟前庭の遠位部分に認められた評価する必要がある。

（Fig. 2A，B）。一方，茶褐色領域とヘマトキシリ

将来の粘膜型ワクチン投与部位候補として，こン陽性小円構造の局在は必ずしも一致しなかった

れまで動物のEALTとGOALTを明らかにした（Fig. 2C）。次に腟前庭粘膜の組織像を示す（Fig.

が，作業性と動物福祉・愛護的な側面から，腟前

2D-F）。腟前庭粘膜上皮の直下には，多数の赤血庭へのワクチン投与のほうが現実的かもしれな球が認められ（Fig. 2D），ホールマウント標本でい。また，腟前庭粘膜の組織像から，粘膜摩擦（上見られた茶褐色領域は出血部位であることが示唆皮剥離）によるGOALTへの抗原塗布が粘膜型ワされた。また，上皮が一部欠損し，その上皮間にクチン投与に有用であろう。今後も既存のワクチ

赤血球が見られた（Fig. 2E，F）。少数の墨汁取

ン接種部位よりも効率的な免疫誘導を実現する可© The Ito Foundation

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索（Ⅲ）―より効果的なワクチン接種部位を求めて―

275

Fig. 1 Morphology of genital organ-associated lymphoid tissue（GOALT）in goat.
Ａ）Whole-mount specimens of genital organs stained by hematoxylin.
Ｂ）High magnified area of mucosa in vaginal vestibule.

Ｃ）High magnified area of mucosa around fossa clitoridis.

Ｄ）High magnified area of mucosa around external urethral orifice. Arrowheads indicate the GOALTs.
Ｅ）Histological image of diffuse GOALT.

Ｆ）Histological image of follicular GOALT. HE staining

能性に着目したい。
４．要

膜関連リンパ組織（MALT）を標的としており，
特 に 点 眼 ワ ク チ ン で は“眼 関 連 リ ン パ 組 織

約（EALT）”の役割が重要である。我々はこれまで

近年，粘膜型ワクチンの開発は日進月歩であ牛や豚のEALTの組織構造を明らかにしてきた。

り，高病原性鳥インフルエンザ等，鶏の呼吸器疾

また，これらの動物種の生殖器，特に腟前庭に生患で点眼ワクチン実用化されている。これらは粘殖器関連リンパ組織（GOALT）を発見した。本© The Ito Foundation

276

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

H

G

50μm

50μm

Fig. 2 Morphology of genital organ-associated lymphoid tissue（GOALT）in goat after expose of mimic antigens.
Ａ）Whole-mount specimens of genital organs.

Ｂ）High magnified area of mucosa in vaginal vestibule.

Ｃ）High magnified area of mucosa in vaginal vestibule after staining by hematoxylin.
D-F）Histological images of GOALT. HE staining.

G and H）Histological images of GOALT. Arrows indicate the incorporation of mimic antigens. Hematoxylin staining

研究では，山羊をモデルとして，GOALTからのもこれらを利用して効率的な免疫誘導を実現する

模倣抗原取り込みを形態学的に評価した。牛や豚可能性に着目したい。

と同様，山羊の腟前庭には散在性および濾胞性
GOALTが存在し，特に外尿道口や陰核窩の周囲に認められた。腟前庭粘膜に暴露された模倣抗原
は少数のGOALT形成細胞に取り込まれ，また，付近のリンパ節では深鼠径リンパ節に模倣抗原取り込み細胞がわずかに局在した。抗原取り込み機
構・動態についてさらなる解析が必要だが，腟前
庭のMALTは牛と豚における将来の粘膜型ワクチンの発展と普及への可能性を有しており，今後

文
献１）
 Kosenda, K., Ichii, O., Otsuka, S., Hashimoto, Y.,
Kon, Y.：Clin Exp Ophthalmol, 41, 788～797, 2013.
 Ligon, M. M., Wang, C., Jennings, Z., Schulz, C.,
２）
DeJong, E. N., Lowder, J. L., Bowdish, M. D. E.,
Mysorekar, I. U.：bioRxiv, 749200, 2019.
３）
 Hamilton, W. J., Harrison, R. J.：J Anat, 85, 316～
324, 1951.
 Elewa, Y. H. A., Mizoguchi, T., Ichii, O.,
４）
Nakamura, T., Kon, Y.：PLoS One, 13, e0201330,
2018.

© The Ito Foundation

277

豚赤痢菌の全ゲノム系統解析および薬剤耐性機序の解明
Whole-genome phylogenetic analysis and investigation of drug resistancemechanism of Brachyspira hyodysenteriae

岩

田

剛

敏

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

Taketoshi Iwata（National Institute of Animal Health, Agriculture and Food Research Organization, NARO）

Brachyspira hyodysenteriae is known to be an cause of swine dysentery. In Japan, tylosin,
lincomycin, and the pleuromutilins tiamulin and valnemulin are officially accepted as veterinary
drugs for treatment of swine dysentery. Some previous studies revealed that multidrugresistant B. hyodysenteriae have emerged since early 2000s in Japan, however, the detailcharacteristics of B. hyodysenteriae distributed in Japan remain unknown. In this study, we
tried to perform a phylogenic analysis of 86 isolates of B. hyodysenteriae obtained in Japanbetween 1985 and 2019 using whole-genome sequencing data. Eighty-six B. hyodysenteriae
isolates were divided into 28 sequence types（STs）by multilocus sequence typing（MLST）
method. Of the 28 STs, 25 STs were novel types in Brachyspira MLST Databases. In addition,
20 of 86 B. hyodysenteriae isolates were pleuromutilin resistance gene, tvaA positive. Of the 20
tvaA positive isolates, 17 were pleuromutilin resistant, but 3 were sensitive. All tvaA negative
isolates were sensitive to pleuromutilins. We compared the levels of tvaA expression between
pleuromutilin sensitive（Bh57）and resistant（Bh64）isolates. The tvaA expression level of
pleuromutilin resistant Bh64 isolate was significantly higher than that of sensitive Bh57 isolate
in exponential growth phase（p ＜ 0.05, p ＜ 0.01）. This study suggested that TvaA plays animportant role in pleuromutilin resistance of B. hyodysenteriae distributed in Japan, and theexpression level of TvaA also strongly affect the level of the drug resistance.

１．目

豚の導入をきっかけとして養豚場全体に蔓延する的ことが多く，一度常在化した場合，その根絶は困豚 赤 痢 は Brachyspira hyodysenteriae（以 下 ，難である。

Bh）により引き起こされる粘血性下痢便の排泄

本症は発育遅延および飼料効率の低下をもたらを主徴とする急性または慢性の腸管感染症で，わすため，その経済的損失は大きい。Bhは問題をが国においては家畜伝染病予防法の届出伝染病に起こしているごく一部の養豚場にのみに分布する

指定されている。本症は品種，性別に関係なく発わけではなく，実際には国内に広く浸潤している

病するが，離乳後の肥育豚での発生が多い。保菌ことが示唆されている。それら養豚場の多くでは© The Ito Foundation

278

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

典型的な豚赤痢の症状は認められないが，水腫性析を行い，その情報に基づき系統解析を実施する大腸炎を原因とした生産性の低下およびと畜場にことで，国内に分布するBhの遺伝的背景を詳細

おける腸管廃棄率の上昇により，潜在的な経済損に明らかにすることを目的とした。また，薬剤耐失を被っている可能性が指摘されている。

性機序についても検討し，遺伝学的系統との関連

農場における細菌性疾病の治療と予防，清浄化
対策において，強力な資材となるのが抗菌性物質である。現在，わが国では，豚赤痢を適応症とす性についても明らかにすることを目的とした。
２．方法

る抗菌性物質としてタイロシン（TS）
，リンコマ

2.1

イシン（LCM），チアムリン（TML）およびバ

1985～2019年の間に21都道県の豚から分離されルネムリン（VML）の４剤が認可されているが，

たBh86株（北海道・東北地方10株，関東地方11

近年，これらへのBhの耐性化が進んでいること

株，中部地方９株，近畿地方３株，四国・中国地が懸念されている。これまでの疫学調査により，

方２株，九州・沖縄地方51株）から市販キット

1980年代からTSおよびLCMに対するBhの耐性率（DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen）を用いては非常に高いことが明らかとなっており ，過去DNAを抽出し，次世代シークエンサー（Illuminaには認められなかったTMLおよびVMLといった

HiSeq）による全ゲノム解析を実施した。取得した

プレウロムチリン系抗菌性物質への耐性株が2000

全ゲノム塩基配列から，本菌の主要な分子疫学解年以降に確認され ，近年ではその耐性率が上昇

析手法であるMultilocus sequence typing（MLST）

していると報告されている 。すなわち，豚赤痢において対象となる７遺伝子（adh, alp, est, gdh,を適応症とする４薬剤すべてに耐性を示すBh株

glpK, pgm, thi）の配列を抽出し，これをもとにの分布が拡大している可能性があり，このままで系統樹を作成した。また，ゲノムデータベースかは本症への治療・予防に使用できる有効な抗菌性

らBh14株が保有するtvaA遺伝子の塩基配列情報

物質がなくなる恐れがある。

を取得し，相同性検索により当該遺伝子の保有状

１）

２）

３）

また，海外では2018年にABC-Fタンパク質のBhの全ゲノム解析

況を調べた。

一種（TvaA）がプレウロムチリン系抗菌性物質

2.2と23S rRNAの結合を防ぐことでBhの耐性化に関本研究で解析を実施したBh86株のうち，tvaA

与することが報告されており ，申請者が国内で遺伝子を保有していたBh20株について，tvaA遺分離されたBhについてこれまで調査した結果，

伝子および23S rRNA遺伝子の塩基配列を比較し当該薬剤に耐性の全株がtvaA遺伝子を保有するた。また，Bhが１コピー保有することが明らか

ことが明らかとなっている。しかし，TvaAの役となっているrpsJ遺伝子をコントロールとしてリ

割についてはまだ不明な点が多いのが現状である。

アルタイムPCRを行い，tvaA遺伝子のコピー数

４）

耐性菌に対する有効な対策を確立するためにtvaA遺伝子を保有するBh株の比較解析を算出した。

は，その遺伝的背景や薬剤耐性機序を把握するこ

2.3とが欠かせないが，これまで国内では，Bhの分

プレウロムチリン系抗菌性物質の感受性が大き子疫学解析や薬剤耐性機序の検討を行った報告は

く異なる２株（Bh57およびBh64）を対象に，リ見当たらない。そこで本研究では，過去30年間にアルタイムRT-PCRによりtvaA遺伝子の発現量

国内で分離されたBh株を対象として全ゲノム解を比較した。供試菌は37℃，嫌気条件で振盪培養© The Ito Foundation

tvaA遺伝子の発現解析

279

豚赤痢菌の全ゲノム系統解析および薬剤耐性機序の解明（100rpm）し，RNAの抽出は培養28, 44, 52, 68時間で行った。
３．結果と考察
本研究に供試したBh86株は，MLSTでは28の遺伝子型（ST）に型別され，そのうち３つの型（ST124, 129, 197）のみがデータベース（https://
pubmlst.org/brachyspira/）にすでに登録されており，他の25の型は新規のSTであった（Fig.１）。
2020年４月現在，データベースには263のSTがBhにおいて登録されているが，本研究により，わが国では諸外国に分布していないユニークなSTが広く分布している可能性が示唆された。さらに，現在までのところ，ゲノムデータベースに完全長ゲノム配列が登録されているBhは３株とST197

非常に少ない。このため，今後，本研究によって得られた国内Bh株の全ゲノム塩基配列をもとに

ST124

高精度系統解析を実施するためには，少なくとも数菌株について第３世代シークエンサーを用いた解析により参照配列を得る必要があると考えられる。
国内に分布するBhのSTと分離地域には関連が認められ，地域によっては特定のSTが1990年代から現在に至るまで分布していることが明らかとなった。それらのSTでは，2000年以前には認められなかったプレウロムチリン系抗菌性物質への耐性株が2010年前後から確認され，そのすべてがtvaA遺伝子を保有していた。今後，全ゲノム塩
基配列をもとに高精度系統解析を行うことで，国内に分布するBhがどのようにtvaA遺伝子を獲得
し，プレウロムチリン系抗菌性物質に耐性となったか明らかとなることが期待される。

ST129

tvaA遺伝子を保有していた20株についてまとめた結果をFig.２に示す。tvaA遺伝子保有株のうち，３株（Bh57, Bh74, Bh78）を除く17株は寒天
平板希釈法による薬剤感受性試験でプレウロムチ

Fig. 1 A phylogenetic construction of B. hyodysenteriae 86

isolates in Japan. Black circles mean tvaA gene positive.

© The Ito Foundation

280

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
MIC（μg/ml） tvaAtype

TML VML
32
64
64
>128
64
>128
64
0.5
64
64
64
1
>128
32
1
64
32
128
>128
128

128
32
16
>128
64
>128
32
0.25
32
32
32
0.5
>128
32
1
32
16
64
>128
64

Ⅲ
Ⅰ
Ⅲ
Ⅲ
Ⅰ
Ⅲ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ

23S rRNA gene
G2032 A2058 G2201 T2528 G2535
A
A
A
A

T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
G
T
T
T
G
G
T

A
A

A

A
A
C
C

A

Fig. 2 Summary of the 20 B. hyodysenteriae isolates harboring a tvaA gene.

リン系抗菌性物質（TMLおよびVML）に耐性とプレウロムチリン系抗菌性物質への感受性が大き判定された。また，tvaA遺伝子の塩基配列比較

く異なるtvaA遺伝子保有株を確認し，両株の間の結果，大きく３つの異なる配列（タイプⅠ～

でtvaA遺伝子および23S rRNA遺伝子の配列に差

Ⅲ，類似度はそれぞれのタイプの間で90～94％）

を認めなかったことから，Bhのプレウロムチリが確認された。tvaA遺伝子のコピー数は20株のン系抗菌性物質への耐性化には未解明の機序があ間で有意差を認めず，約１コピーであった（data

ると思われた。

not shown）。Fig.２に示すtvaA遺伝子保有株のう以上のことからまず，Bhのプレウロムチリン

ち，Bh57およびBh27, 62, 64は，MLSTが対象と抗菌性物質への耐性とtvaA遺伝子発現量の関連する７遺伝子中６遺伝子の配列が完全に一致してについて検討するため，耐性株（Bh64）と感受おり，tvaA遺伝子の配列が完全に一致していた。

性株（Bh57）の間でtvaA遺伝子の発現量を比較

また，これらの株間ではBhのプレウロムチリン

した（Fig.３）。プレウロムチリン系抗菌性物質

系抗菌性物質の耐性に関与すると報告されるに耐性のBh64は，感受性のBh57と比較して，

23S rRNA 遺 伝 子 の 部 位（G2032, A2058, G2201,

tvaA遺伝子の発現量が対数増殖期から定常期初

T2528, G2535）に差を認めなかった。tvaA遺伝子

期にかけて有意に高く，定常期後期にかけて低下について2018年にはじめて報告したCardら４）は，していた。これにより，tvaA遺伝子保有株では，tvaA遺伝子を保有するBh株にはプレウロムチリ

遺伝子のコピー数を原因としない，対数増殖期にン系抗菌性物質への耐性が高度なものと，中程度おける当該遺伝子の高発現がプレウロムチリン系のものが認められ，両者の差は23S rRNA遺伝子

抗菌性物質への耐性のレベルに大きな影響を与えにおける変異の蓄積の差によると推察している。

ることが示唆された。そこでtvaA遺伝子の周辺

しかしながら，本研究において遺伝的に近縁で，配列についても両株の間で比較したところ，当該

４，５）© The Ito Foundation

281

豚赤痢菌の全ゲノム系統解析および薬剤耐性機序の解明

OD600

0.3
0.2
0.1
0

t0

t1

t2

t3

t4

（0h）

（28h）

（44h）

（52h）

（68h）

Bh57

Bh64

Relative expression of TvaA

（A）

0.4

200

（B）
＊＊

150

＊

100
50
0
－50

t1

t2
Bh57

t3

t4

Bh64

Fig. 3 Comparison of tvaA gene expression between pleuromutilin sensitive（Bh57）and resistant（Bh64）isolates.

（A）Growth curves of Bh57 and Bh64 isolates.（B）Relative mRNA expression of TvaA. *p＜0.05, **p＜0.01

遺伝子の発現に大きく影響するような差は確認さられ，地域によっては特定のSTが約30年にわたれなかった。Bhは発育が非常に遅く，培養材料

り分布していることが明らかとなった。それらからの分離から薬剤感受性試験の結果を得るまでSTにおいて2000年以降，特に2010年前後からプ

早くとも１週間以上かかる。Bhのプレウロムチ

レウロムチリン系抗菌性物質への耐性株が確認さ

リン系抗菌性物質への耐性機序の解明は，耐性菌

れ，すべての耐性株がtvaA遺伝子を保有していを迅速に検出可能な遺伝子学的検査法の確立につた。また，tvaA保有株を対象とした解析の結果，ながるため，今後，さらなる詳細な解析を進めて遺伝子のコピー数によらない，対数増殖期におけいく予定である。

る当該遺伝子の高発現がプレウロムチリン系抗菌４．要性物質への耐性のレベルに大きな影響を与えるこ約とが示唆された。

本研究では，過去30年間に国内で分離された
Bh86株を対象として全ゲノム解析を行い，その情報に基づき高精度系統解析を実施することで，国内に分布するBhの遺伝的背景を詳細に明らかにすることを目的とし，薬剤耐性機序についても検討した。Bh86株は，MLSTでは28のSTに型別され，うち25がデータベースに登録されていない
新規のSTであった。このため今後，全ゲノム塩
基配列を対象とした高精度系統解析を実施するた
めには，複数株の参照配列を得る必要があると考えられる。また，STと分離地域には関連が認め文
献１）
 内田幸治，原田良和，塚口誠：日獣会誌，36, 21～24, 1983.
２） Ohya, T., Sueyoshi, M.：J. Vet. Med. Sci., 72,
1651～1653, 2010.
３）
 黒田まほ，高橋紗野香：Brachyspira, 6, 3～10, 2016.
４）
 Card, R. M., Stubberfield, E., Rogers, J., NunezGarcia, J., Ellis, R. J., AbuOun, M., Strugnell, B.,
Teale, C., Williamson, S., Anjum, M. F.：Front.
Microbiol., https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.
01183, 2018.
 Mahu, M., Pasmans, F., Vranckx, K., Pauw, N. D.,
５）
Vande Maele, L., Philip Vyt, Tamara Vandersmissen,
Martel, A., Haesebrouck, F., Boyen, F.：Vet.
Microbiol., 207, 125～132, 2016.

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282

豚高親和性乳酸菌を用いた新規経口ワクチンの開発
Development of novel oral vaccine using genome editing lactic acidbacteria with high affinity for pigs

大

松

勉・堤

椋

哉

（東京農工大学農学部附属国際家畜感染症防疫研究教育センター）

Tsutomu Omatsu and Ryoya Tsutsumi（Research and Education Center for Global Infectious Diseases of Animals, Department of Agriculture,
Tokyo University of Agriculture and Technology）

Vaccine is one of the most effective measures against infectious diseases. In recent years,
mucosal vaccine has attracted attention as a new vaccine administration method, and oralvaccine using lactic acid bacteria is one of candidates. In this study, in order to implement anoral vaccine for swine using lactic acid bacteria, we will proceed with the development of anoral vaccine expressing Japanese encephalitis virus antigen, and search for and identify
Lactobacillus spp. with high affinity for swine M cells. To identify the bacteria, we tried todevelop an expression system for porcine uromodulin.
In the production of Japanese encephalitis virus antigen-expressing Lactobacillus
acidophilus, a fusion gene containing the antigen sequence of Japanese encephalitis virus
envelope domain III into SlpA of L. acidophilus was amplified and inserted into pTRK892, anexpression vector for Lactobacillus, to develop recombinant protein SlpA-Ejev expression
vector. Then, the produced expression vector was introduced into L. acidophilus NCFM byelectroporation, and the expression of Japanese encephalitis virus antigen was confirmed byWestern Blotting. As a result, although a band reacting with the anti-Japanese encephalitis
virus antibody was confirmed, its expression level was extremely low.
In the identification of lactic acid bacteria with affinity for swine M cells, total RNA wasextracted from porcine kidney and amplified the uromodulin gene and the sequence including
ORF with 1,929 bases was identified. Then, in order to obtain the porcine uromodulin protein,gene amplification using a His-Taq addition primer was performed, and the gene wasintroduced into an expression vector. Although the expression vector was introduced into E.
coli Stbl2 by the heat shock method and amplification was attempted, amplification of thetarget expression vector was not confirmed so far. To obtain porcine uromodulin, additional
approaches have to be developed.

© The Ito Foundation

豚高親和性乳酸菌を用いた新規経口ワクチンの開発

１．目

283

び TOP10 の 培 養 に は LB 培 地（Sigma-Aldrich）

的を用いた。また，乳酸菌用ウイルス抗原発現ベク

感染症の発生は該当農場のみならず地域社会やターとしてpTRK892（Addgene，Watertown，

国内全体の食の安定供給に多大な影響を及ぼす可MA）を，豚ウロモジュリンタンパク質の発現ベ能性があることから，その対策は非常に重要であクターとしてpBApo-CMV Pur DNA（TaKaRa,

る。有効な感染症対策の一つにワクチンがある。

Shiga，Japan）を用いた。
2 . 2 日本脳炎ウイルス抗原発現ベクターの作

近年，新たなワクチン投与法として粘膜ワクチン

成が注目を集めている。なかでもLactobacillus属な日本脳炎ウイルスに対するウイルス抗原とし

どの乳酸菌にウイルス抗原を発現させ経口投与す。して，日本脳炎ウイルスに対する抗体誘導能の高い

かし，現在で利用されている菌株はヒトの腸管やエンベロープ（Ｅ）のdomain IIIの一部をエピ

食品から分離された乳酸菌であり，マウスにおけト ー プ 配 列 と し て 選 択 し た 。 L. acidophilus

る抗体誘導能は確認されているものの，どのようNCFMの表面タンパク質であるSlpA上に日本脳な菌が豚腸管免疫の誘導に効果的かといった知見

炎ウイルス抗原を発現するように融合遺伝子は少ない。Ｍ細胞は腸管粘膜上皮に存在し，腸管（SlpA-Ejev）を設計し，オーバーラップPCR法

免疫の誘導に必要な抗原の取り込みを行っているにより作製した。作製にはL. acidophilus NCFMと考えられている。近年，Lactobacillus属菌の認か識にＭ細胞表面に発現するウロモジュリンが重要

Hulsterweg ，Netherlands）を 用 い て 抽 出 し たな役割を果たすことが明らかにされた３）。そこで，

genome DNAを鋳型に，制限酵素EcoRI（TOYOBO,

本研究では，豚ウロモジュリン遺伝子を同定し，Osaka, Japan）およびNotI（TOYOBO）認識領

その発現系を利用して豚Ｍ細胞に高い親和性を示

域 を 含 む プ ラ イ マ ー（PF-1 ： GCT GAA TTC

す乳酸菌を同定するとともに，Lactobacillus属菌

ATG AAG AAA AAT TTA AGA ATC GTTに養豚業と公衆衛生上問題となる日本脳炎ウイル

AGC GCT G-3，PR-JEV：CAG TTT GATスの抗原エピトープを発現した組換え乳酸菌を作

TAT CAC TGT TTG TTT TGC AGG GGC

製することを目的とした。

CAT CAC TCC CAG AGT AGG AGA GTTる粘膜ワクチンの研究が進められている

２．方

１，２）

ら

QIAamp DNA Mini Kit （QIAGEN,

C-，PF-JEV：GAA CTC TCC TAC TCT GGG

法

AGT GAT GGC CCC TGC AAA ACA AAC

動物，細菌株および発現ベクター

AGT GAT AAT CAA ACT G，PR-1：AGA

国内のと畜場より豚１頭の腎臓の分与を受け

GCG GCC GCT TAT CTA AAG TTT GCA

た。経口ワクチンのプラットホームとなる乳酸菌

ACC TTA AC）でSlpA-Ejevの増幅を行った。

としてLactobacillus acidophilus NCFM（ATCC,

増幅をアガロース電気泳動で確認した後，Manassas， VA） を， プ ラ ス ミ ド 複 製 に はpTRK892 に 挿 入 す る た め に SlpA-Ejev お よ び

Escherichia coli MC1061（ATCC）およびTOP10

pTRK892をEcoRIおよびNotIで処理し，MonoFasⓇ（ThermoFisher Scientific，Waltham, MA）を用

DNA精製キットⅠ（GL Science）を用いて精製いた。L. acidophilus NCFMの培養にはMRS培地

し た 。精 製 し た SlpA-Ejev お よ び pTRK892 を（BD ，Sparks ，USA）を ，E. coli MC1061 お よ

DNA Ligation Kit <Mighty Mix>（TaKaRa）で2.1© The Ito Foundation

284

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

結合し，E. coli MC1061にヒートショック法によタルRNAを抽出・精製した。抽出したRNAからり導入した。組換え株はエリスロマイシン加LB

SuperScriptTM First-Strand Synthesis System

寒天培地で選択培養し，PCR法にて形質転換を確

for RT-PCR（ThermoFisher Scientific）を 用 い

認後，発現ベクターの塩基配列をシーケンスにててcDNAを合成した。まず，豚ウロモジュリン遺確認した。得られた組換え株はエリスロマイシン

伝子の塩基配列を同定するために，NCBIより豚加LB液体培地にて培養し，FastGene

Plasmid

ウロモジュリンの予想配列情報（accession no.

Mini Kit（NIPPON Genetics, Tokyo, Japan）で 精

XM_021086524）を基にmRNA増幅用プライマー製した。

を設計し，合成cDNAをテンプレートとして豚ウ

2.3

日本脳炎ウイルス抗原乳酸菌株の構築

ロモジュリン遺伝子を増幅した。増幅産物をアガ

作 製 し た SlpA-Ejev 発 現 ベ ク タ ー を L.

ロース電気泳動で目的サイズの増幅を確認した上

acidophilus NCFM に Gene Pulser Ⅱ （Bio-Rad）

で，MonoFasⓇDNA精製キットⅠ（GL Science）

を用いて導入した。L. acidophilus NCFMを培養を用いて精製し，シーケンスを決定した。His-

後，精製水で３回洗浄し，発現ベクターとともに

Tag付加ウロモジュリンタンパク質を得るため

0.2cmギャップのキュベットで1,000Ω，2.5kVのに，His-Taq配列および制限酵素（XbaIおよび条件下にて導入した。作製した組換え株はMRS

HindIII） 認 識 領 域 を 付 加 し た プ ラ イ マ ー

液体培地で37℃，200rpm，１時間で振盪培養し（pUMOD_pBA_F1：TCC TCT AGA ATG AGG

た後，エリスロマイシンを添加し，２日間培養し

TGG CTT TTC TCT CTG CCC TCG ATA,

た。

pUMOD_pBA_R2 ： TCC AAG CTT CTA ATG

TM

日本脳炎ウイルス抗原発現はWestern Blotting

GTG ATG GTG ATG GTG ACT GCG GAA

法により確認した。組換えL. acidophilus NCFM

TCT GGT CCC GGA GCA G）を 用 い た PCR でを洗浄後，buffer 200μl（SM尿素，50mM HCl-

ウロモジュリン遺伝子領域の一部を増幅した。増Tris）で ペ レ ッ ト を 溶 解 し ，Maxwell 用 イ ー

幅産物をMonoFasⓇDNA精製キットⅠで精製し，ジー・ビーズ（AMR，Gifu，Japan）で１min×pBApo-CMV Pur DNA と と も に ，XbaI お よ び

３回ボルテックスした後，13,000rpm，２min遠

HindIII で 処 理 し た の ち に DNA Ligation Kit

心 分 離 し ，上 清 を SDS-PAGE お よ び Western<Mighty Mix>（TaKaRa）を用いて発現ベクター

Blottingに用いた。日本脳炎ウイルス抗原の検出を作成し，ヒートショック法で導入したE. coliに は 一 次 抗 体 と し て Anti-envelope protein

TOP10をアンピシリン加LB寒天培地で選択培養（Japanese encephalitis virus），Rabbit poly

を行った。

Ⓡ

（GeneTex，Irvine，CA）を5,000倍希釈で，二次抗 体 と し て マ ウ ス 血 清 由 来 の Anti-rabbit Ig

３．結果と考察horseradish peroxidase linked （Cell Signaling

3 . 1 SlpA-Ejev発現ベクターの作製および日Technology，Tokyo，Japan）を2,000倍希釈で用本脳炎ウイルス抗原発現乳酸菌の構築

いた。
2.4

アガロース電気泳動により増幅された融合遺伝
豚ウロモジュリン発現ベクターの作成

子SlpA-Ejevの断片およびオーバーラップPCR法

と畜場より分与を受けた豚腎臓の一部を分取により全長の増幅を確認した（Fig.１）。また，

し，RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いてトー

増 幅 し た SlpA-Ejev お よ び SlpA-Ejev 発 現 ベ ク© The Ito Foundation

285

豚高親和性乳酸菌を用いた新規経口ワクチンの開発

ターの塩基配列はシーケンス解析により100％の結 果 ，40kDa 付 近 に バ ン ド が 確 認 さ れ た（Fig.

相同性を確認した。エレクトロポレーションによ２）。この結果から，本乳酸菌組換えシステムをり作製したSlpA-Ejev発現L. acidophilus NCFM

用いた日本脳炎ウイルスに対する豚用経口ワクチ

および元株のタンパク抽出液をSDS-PAGEで確ン開発の可能性が示唆された。しかし，確認され認したところ，タンパク抽出に問題がないことをたタンパク発現量は非常に低かったことから，今確認した。さらにAnti-envelope protein（Japanese

回得られた組換え株では発現ベクター導入による

encephalitis virus）を用いたWestern Blottingのタンパク発現量が非常に少ない可能性も考えられ

A）

M

1

B）

2

M

1

1,000 bps

1,000 bps

500 bps

500 bps

Fig. 1 The results of amplification of L. acidophilus SlpA attached with JEV antigen region.

A）PCR products of each segment. M：100bp DNA ladder（WATSON）, 1：PF-JEVand PR-1（917 bps）, 2：PF-1 and PR-JEV（532 bps）
. B）Overlap PCR product. M：
100bp DNA ladder（New England Biolabs）,1：PF-1 and PR-1（1391 bps）.
A）

B）
M 1 2

（kDa）

3 4

100

80

50

50
40

25

M

1

2

3 4

5

6

7 8

（kDa）

30
20

Fig. 2 SDS-PAGE（A）and Western blotting（B）of L. acidophilus with and without SlpA-

Ejev express vector. A）M：Precision Plus Protein Standards（Bio-Rad）, 1, 2：L.
acidophilus with SlpA-Ejev vector, 3, 4：normal L. acidophilus, 1, 3：sample
pretreated with 2-ME, 2, 4：sample non-treated with 2-ME. B）M：MagicMark XP
Western Protein Standard（ThermoFisher Scientific）, 1～4：L. acidophilus with
SlpA-Ejev vector, 5～8：normal L. acidophilus.

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286

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Mど，ベクターの増幅方法を改良していく必要があ1

ると考えられた。
４．要

約

養豚業で利用可能な乳酸菌を用いた新規経口ワ2,000 bps

クチンの実用化に向けて，日本脳炎ウイルス抗原

1,000 bpsを発現する経口ワクチンの開発を進めるとともに，豚Ｍ細胞に高い親和性を持つLactobacillus属

500 bps菌の探索・同定に用いる豚ウロモジュリンの発現系の開発を試みた。日本脳炎ウイルス抗原発現乳酸菌の作成に関しては，Lactobacillus用発現ベクターであるpTRK892にL. acidophilusのSlpA内にFig. 3 Amplification of porcine uromodulin. M：100bp

DNA ladder（WATSON）, 1：porcine uromodulin（1,930 bps）

日本脳炎ウイルスエンベロープdomain IIIの抗原配列を含む融合遺伝子を組み込んだ発現ベクター
を 作 製 し ，エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン に よ り L.
acidophilus NCFM に 導 入 し Western Blotting にた。今後，他の組換え株についてもウイルス抗原

より日本脳炎ウイルス抗原の発現の有無を確認しの発現量を確認するとともに，他の抗日本脳炎ウた。その結果，抗日本脳炎ウイルス抗体に反応す

イルス抗体を用いた検出も行い，よりウイルス抗るバンドが確認されたものの，その発現量は非常

原の発現量の高い組換え株の選定を進める予定でに少なかった。豚Ｍ細胞親和性乳酸菌の同定につある。

いては，豚腎臓由来RNAから1,929塩基のタンパ

3 . 2 豚ウロモジュリンタンパク質発現ベク

クコード領域を含む豚ウロモジュリン遺伝子を同定した。次に，豚ウロモジュリンタンパク質発現ターの作製
PCR法により約２kbpsの増幅産物が確認され系の構築をE. coli Stbl２を用いて試みたが，こ（Fig.３），シーケンスの結果，同定された豚ウロ

れまでに目的とする発現ベクターの増幅は確認さモジュリン遺伝子の配列は既報の予想配列と塩基れなかった。本研究で得られた成果を基に実用化

で５つ，アミノ酸で３つの置換が確認された（いに向けたさらなる研究を進める予定である。

ずれも相同性99％）。His-Taq付加豚ウロモジュ
リン発現ベクターの増幅をStbl２を用いてさまざ
まな条件下で試みたが，目的とする発現ベクターの増幅は確認されなかった。ウロモジュリンは尿路において抗細菌作用を発揮することが知られている４）。そのため，ベクター導入後の増幅時に欠損等の遺伝子変異の導入が高頻度で起こってしまう可能性が考えられた。したがって，今後，より耐性の高い菌株を用いた発現ベクターの増幅な文
献１） Kajikawa, A., Zhang, L., LaVoy, A., Bumgardner,
S., Klaenhammer, T. R., Dean, G. A.：Mucosal
Immunogenicity of Genetically Modified
Lactobacillus acidophilus Expressing an HIV-1
Epitope within the Surface Layer Protein, PLoS
One, 10（10）,e0141713, 2015.
 LeCureux, J. S., Dean, G. A.：Lactobacillus
２）
Mucosal Vaccine Vectors：Immune Responses
against Bacterial and Viral Antigens, mSphere,
2018 May 16；3（3）, pii：e00061-18.

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豚高親和性乳酸菌を用いた新規経口ワクチンの開発
３） Yanagihara, S., Kanaya, T., Fukuda, S., Nakato, G.,
Hanazato, M., Wu, X. R., Yamamoto, N., Ohno, H.：
Uromodulin-SlpA binding dictates Lactobacillus
acidophilus uptake by intestinal epithelial M cells,
Int Immunol, 29（8）,357～363, 2017.

287４） Becknell, B., Schwaderer, A., Hains, D. S.,
Spencer, J. D.：Amplifying renal immunity：therole of antimicrobial peptides in pyelone-phritis,
Nat Rev Nephrol, 11, 642～655, 2015.

© The Ito Foundation

288

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査（Ⅱ）
A survey of gastrointestinal parasites infection and implementation ofparasite control program in cattle（II）

森

本

素

子

（宮城大学食産業学群）

Motoko Morimoto（School of Food Industrial Sciences, Miyagi University）

Lean meat from pasture grazing cattle has become popular for Japanese consumers as
healthy and tasty. However, it is a challenging task to control internal parasites in grazing
livestock. When the gastrointestinal nematode infects with the host, intestinal epithelium andinnate lymph cells are activated and induce Th2 immune responses. However, it is rare thatcattle show extremely severe clinical disease during parasite infection so that many owners failto recognize the loss of productivity. Ivermectin is a highly effective medication against ticks
or nematodes; however, the incidents of anti-parasitic drug resistance increase these days. The
field study to investigate an infestation of gastrointestinal parasites has been conducted nationwide in Japan in the 1990s, but not recently.
In this study, the field study was performed to investigate an infestation of gastrointestinal
parasites and deworming practice in public pastures in Miyagi. Feces were collected from 1021 cattle from four pastures and investigated with the modified Wisconsin technique.
In this fiscal year, we carried out a follow-up survey of the four farms that were
investigated last year, and compared them with the results of indoor cattle.
Survey 1： Samples from 10 to 21 cattle were collected from four pastures. Grazing farms
with improved deworming programs have improved parasite transmission. On the other hand,the pastures where the program was not changed showed further spread.
Survey 2： In indoor cattle, there were almost no infected cows, and even if they were,
coccidium was only slightly infected, and there were no examples of concern.
The results of this study clarify the importance of an anthelmintic program for grazing
cattle.

１．目

牛の赤身肉は健康的で食べ応えがあるとして，消的費者にも人気が高まっている。しかし，放牧は感

近年，生産コストの削減や省力化だけでなく，染のリスクを高め，その結果甚大な経済的損失を家畜のアニマルウェルフェアや畜産物の付加価値もたらす場合がある。線虫感染により，腸管粘膜生産を目的とした放牧が注目を浴びている。放牧下の免疫細胞が活性化し，上皮に作用して粘液産© The Ito Foundation

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査（Ⅱ）

生を増し，平滑筋の運動が活発になって蠕動運動

289

実施した。

。その結果，腸内細菌叢も変化し，他①

使用している駆虫剤の種類の病原体に対する免疫応答にも変化をもたらす。

②

投薬時期および回数

しかし一方で臨床に目を移すと，消化管内寄生虫

③

放牧の時期

感染では死に至る重篤な病態はまれであり，外観④

駆虫プログラムの継続年数

からは家畜のダメージを見きわめるのが難しいこ⑤ 消化管寄生虫の感染による家畜への影響に

が増す

１，
２）

ついての認識とも多い。そのため，寄生虫感染が宿主消化管の生理機能の変化をもたらし，潜在的な損耗を与え⑥駆虫プログラム実施による診療回数の変化ていることを見逃しがちである。その結果，生産

2.2

調査２

性を上げることを目的に給与される免疫賦活飼料

舎飼いの牧場３か所の５～11頭から採材し，調や生菌剤も，期待される効果を発揮することが困難になる。駆虫薬として，イベルメクチン系の製剤が開発され，効果をあげるようになったが３～５），
開発から時間が経ち，近年では適切な駆虫プログ

査１と同様に検査およびヒアリングを行った。
３．結果と考察3 . 1 調査１：宮城県内の４か所の公営牧場のラムが行われず，効果が十分得られなかったり，

消化管内寄生虫の浸潤度追跡調査

耐性をもつ虫が出現して感染をコントロールでき【Ａ牧場】和牛10頭，ホルスタイン種10頭から直ていない例が報告されるようになってきた 。わ

腸便を採取した。消化管内線虫の感染率は前回のが国では，1990年代に消化管内寄生虫感染につい29％から15％に半減していた。コクシジウムは依ての全国的な疫学調査が行われた７）が，その後は然として高く，感染率は80％だった。ベネデン条

地域限定的に調べられている程度で，まとまった虫の感染率は前回の19％から35％に増加していデータはない。そこで本研究では，まず宮城県をた。前回の調査よりも感染牛の割合も増加してい中心に，東北圏内の牧場において駆虫プログラム

るが，検出される卵数も増加していた。前回からのヒアリングを行うとともに，採糞して虫卵検査

継続して調査を行ったホルスタイン種が１頭確認を実施し，消化管内寄生虫の浸潤度を調査するこできた。この牛は前回の調査時から寄生虫感染はととした。本年度は昨年と同じ牧場で採材し，追ほとんどなく，今回の調査でも寄生虫感染は確認

跡調査を行うとともに，舎飼いの牧場からも採材されなかった。この牧場では，前回の調査から駆を行い，放牧牛と比較した。

虫薬の見直しを行っていた。2018年度の放牧期間

６）

２．方
2.1

中はイベルメクチンを月に１回の割合で使用して法いたが，2019年度はバイチコールを新たに採用し月に１回の割合で使用されていた。イベルメクチ

調査１

昨年度調査を行った宮城県内の４か所（Ａ，ンは，７月に１回のみの使用に変更されていた。

Ｂ，Ｃ，Ｄ）の公営放牧場でホルスタイン種また【Ｂ牧場】和牛10頭から直腸便を採取した。消化は和牛10～20頭から直腸便を採取した。ウィスコ

管内線虫の感染率は前回の50％から70％に増加しンシン変法を用いて虫卵検査を実施し，虫卵数のていた。前回の調査では乳頭糞線虫の感染が見ら

計測，虫の種類の同定を行った。

れる牛が２頭確認されたが，今回は乳頭糞線虫に同時に，以下の項目についてヒアリング調査を感染している牛は確認されなかった。しかし一般© The Ito Foundation

290

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

線虫に感染している牛の数は増加していた。コクぼ同程度だった。前回からの継続調査ができた牛

シジウムは20％から80％に増加していたが，濃厚は３頭だった。感染状況はほぼ同じで卵数もほぼ感染している牛は確認されなかった。ベネデン条同じだった。使っている駆虫薬もバイチコールで虫は20％から０％に減少していた。前回から継続

駆虫薬に変更はなかった（Fig.１）。

調査できた牛が１頭いるが，前回の調査では寄生3.2

虫に感染していなかったが今回の調査で消化管内

宮城県内の３か所（Ｅ，Ｆ，Ｇ）の牧場の和牛

線虫に感染していた。駆虫については依然としてまたはホルスタイン種より調査１と同様に採材

定期的な駆虫は行われておらず，寄生虫感染の症

し，糞便検査を行った。

状が現れたときにイベルメクチンを使用していた。

【Ｅ牧場】和牛３頭，ホルスタイン種６頭を供試【Ｃ牧場】和牛10頭，ホルスタイン種10頭から直した。駆虫薬はまったく投与していないとのこと

腸便を採取した。消化管内線虫は58％から70％にであった。線虫および条虫は不検出。コクシジウ

増加していた。前回調査では乳頭糞線虫に感染しム陽性率は22％だが，オーシストの数はわずかでている牛が４頭，牛鞭虫に感染している牛が３頭あった。

に確認されたが今回は乳頭糞線虫２頭，牛鞭虫０【Ｆ牧場】和牛２頭，ホルスタイン種３頭を供試頭と減少していた。しかし，新たに前回調査ではした。和牛にはアイボメック，ホルスタイン種に検出されなかったネマトジュルスに感染しているはエプリメックスを使用していた。ホルスタイン

牛が１頭，毛細線虫に感染している牛が２頭確認

種の場合経産牛は分娩の１か月くらい前，子牛はされた。また，一般線虫感染牛の数と卵数が増加

分娩後１か月・６か月位，和牛の経産もホルスタしていた。コウシジウムの感染率は95％で前回とイン種同様分娩の１か月前，子牛も同様１か月・同じだった。ベネデン条虫は５％から15％に増加

６か月，子牛は生後２週間後にバイコックスを経しており，ホルスタイン種での増加が見られた。

口投与し，コクシジウム対策を行っているとのこ

前回からの継続調査ができた牛は和牛が７頭，ホとであった。検査の結果，線虫，条虫，コクシジ

ルスタイン種が４頭と今回調査した牧場４カ所でウムともに不検出であった。

最多であった。感染している寄生虫種もほぼ同じ【Ｇ牧場】ホルスタイン種11頭を供試した。駆虫で変化は見られなかった。使用している駆虫薬も薬はほとんど意識しておらず，バイコックスを投バイチコールで薬剤の使用頻度などに変更はな

与することがある程度とのことであった。検査のかった。

結果，線虫，条虫，コクシジウムともに不検出で【Ｄ牧場】和牛10頭から直腸便を採取した。消化あった（Table１）。

調査２：舎飼い牛の調査

管内線虫の感染率は前回の70％から60％に減少し宮城県において，昨年度の調査で寄生虫感染がていた。前回の調査で確認された毛細線虫，捻転

広がっていることが明らかになっているにもかか胃虫に感染している牛はいなかったが，乳頭糞線

わらず，適正な処置がとられていない公営牧場が虫 に 感 染 し て い る 牛 が い た 。コ ク シ ジ ウ ム はあった。新しく導入される預託牛への感染予防の100％から90％に減少していた。オーシストの数ためにも駆虫を実施してもらいたいが，放牧場のについても，前回の調査では３桁以上の数が検出

管理者に検査結果を伝えるだけでは不十分で，農される牛もいたが，今回の調査では減少が見られ家の啓蒙が必須と考えられた。また，ベネデン条

た。ベネデン条虫は前回と同様に10％で卵数もほ虫感染はこれまであまり問題視されていなかった© The Ito Foundation

291

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査（Ⅱ）
A farm

B farm
2018
2019

80
60
40
20
0

Nematodes

Coccidia100
positive ratio（%）

positive ratio（%）

100

2018
2019

80
60
40
20
0

Moniezia benedeni

Nematodes

C farm60
40
20
Coccidia

Moniezia benedeni

100
positive ratio（%）

positive ratio（%）

2018
2019

80

Nematodes

Moniezia benedeni

D farm100

0

Coccidia

2018
2019

80
60
40
20
0

Nematodes

Coccidia

Moniezia benedeni

Fig. 1 Changes in infection rates

The changes in ratio of gastrointestinal parasite-infected cattle between 2018 and 2019 on each farm. The positive ratioof nematodes and coccidia in A farm decreased after the change of the deworming program. In addition, the number of
eggs also declined in infected cattle in 2019. B, C, and D farm continued the same program as last year. Infection status
has not been improved.

Table 1 Infection rate in cattle bred indoors
Nematodes

Coccidia

Moniezia benedeni

E farm0

00

F farm0

22

0

G farm000Infection rate in E farm（n＝5），F farm（n＝9）and G farm（n＝11）in 2019.

が，10か月齢以下の放牧乳牛での増体不振が見ら生産を目的とした放牧が注目を浴びているが，放れたので，今後は注意が必要である。一方，調査

牧は感染のリスクを高め，その結果甚大な経済的した舎飼い牛には感染はほとんど認められず，放損失をもたらす場合がある。駆虫薬として，イベ

牧における課題が明確になった。今後，他の地域

ルメクチン系の製剤が開発され，効果をあげるよ

でも調査が必要であると考える。

うになったが，近年では適切な駆虫プログラムが４．要

行われず，効果が十分得られなかったり，耐性を約もつ虫が出現して感染をコントロールできていな

近年，生産コストの削減や省力化だけでなく，い例が報告されるようになってきた。わが国で家畜のアニマルウェルフェアや畜産物の付加価値

は，1990年代に消化管内寄生虫感染についての全© The Ito Foundation

292

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

国的な疫学調査が行われたが，その後は地域限定

く，あってもコクシジウムが軽微に感染している的に調べられている程度で，まとまったデータは程度で，問題になる例はなかった。

ない。そこで本研究では，宮城県内の４か所の公営牧場において，駆虫プログラムのヒアリングを本研究の結果，放牧牛に対する適切な駆虫プロ
グラムの重要性が明らかになった。

行うとともに，採糞してウィスコンシン変法により虫卵検査を実施し，消化管内寄生虫の浸潤度を調査した。本年度は，昨年度調査した牧場の追跡
調査，および舎飼い牛の調査を行い，放牧牛と比較した。
調査１：４か所の牧場からそれぞれ10～21頭のサンプルを採取した。駆虫プログラムを改良した放牧場では，寄生虫感染が改善された。一方，プ
ログラムを変更しなかった放牧場では，さらに感染が広がっていることが分かった。

文献１）
 森本素子：家畜感染症学会誌，5，63～68，2016.
２） Zhao, A., McDermott, J., Urban, J. F. Jr., et al.：J.
Immunol., 171，948～54，2003.
３）
 及川伸，川匂文男，平賀健二，本川正人，千葉由見，
小川徹三，福本真一郎：日獣会誌，51，237～240，
1998.
 髙橋俊彦：家畜診療，50，339～347，2003.
４）
５）
 Nagata, T., Roncalli, R. A., Mishiba, T., Yamada, K.,
Ura, S.：Jpn. Bull. Animal Hyg., 42, 3～7, 1995.
６） Geurden, T., Chartier, C., Fanke, J., et al.：Int J
Parasitol Drugs Drug Resist, 5, 163～71, 2015.
７） 髙橋史昭：臨床獣医，36，14～20，2018.

調査２：舎飼い牛では，感染牛はほとんどな© The Ito Foundation

293

鶏を対象としたトキソプラズマ症の抗体検査法の開発
Development of serological tests for Toxoplasma infection in poultry

吉田

彩子・長安

英治＊・高島康信＊＊（宮崎大学農学部，＊宮崎大学医学部，＊＊岐阜大学応用生物科学部）

Ayako Yoshida, Eiji Nagayasu＊ and Yasunobu Takashima＊＊（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki, ＊Faculty of Medicine, University of Miyazaki,＊＊Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite that causes the mostcommon zoonotic parasitic disease worldwide in multiples species of mammals and birds. Freerange chickens may play a role as an important reservoir for T. gondii, therefore, it has beensuggested that consuming raw or undercooked poultry products can be a risk of toxoplasmosis
to humans. However, there is no reliable and commercially available diagnostic test for
Toxoplasma infection in chickens. In this study, we aimed to develop a novel luciferase-linked
antibody capture assay（LACA）for the serodiagnosis of T. gondii infection in chickens．
Recombinant nanoluciferase fused- T. gondii dense granule antigen 8（rNluc-GRA8）wasapplied to LACA assay as a diagnostic antigen. When GRA8-LACA was tested with the serafrom uninfected and experimentally infected chickens with T. gondii and other parasitic
pathogens, Eimeria tenella and Ascaridia galli, high sensitivity（90.5％）and specificity（95.4％）
for toxoplasmosis were validated. Interestingly, E. coli lysate expressing rNluc-GRA8 could beapplied in GRA8-LACA and gave similar results as using purified rNluc-GRA8 antigen. Then,
we applied our diagnostic system to examine 267 free-range and 100 broiler chicken sera
collected from the poultry abattoirs. The overall seroprevalence of Toxoplasma infection in
free-range chickens was 10.1％ , while no positive case was detected in broiler chickens．
In brief, GRA8-LACA is a useful diagnostic technique for T. gondii infection in chickens
and could be a promising diagnostic platform for other animal species and humans as well.
Relatively high seroprevalence of T. gondii in free-range chickens was observed which warns
of a risk of Toxoplasma transmission by the consumption of raw or undercooked chicken meat．

１．目

胎児に感染した場合は流産や奇形，発達遅延の原的因となることが知られており，成人でも抗癌剤投

トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）は猫を終宿主とし，ヒトをはじめ牛，豚，ネズミ，

与等により免疫抑制状態にある場合は重症化して死に至ることもある。

鶏等の多くの動物が感染して中間宿主となる人獣

ヒトへの感染は，猫の糞便中に含まれるオーシ

共通寄生虫である。トキソプラズマ原虫がヒトのストの経口摂取以外に，食肉に由来する感染，つ© The Ito Foundation

294

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

まり，トキソプラズマに感染した中間宿主動物のD-TOPOベクター（Invitrogen）を発現ベクター

原虫シストを含んだ筋肉を加熱不十分な状態で摂とし，BL21 star（DE3）（Invitrogen）を宿主細取することによっても起こり，原因食材として胞とする大腸菌発現系により，Ｎ末端にHis-tag

は，豚肉が以前から重要視されてきたが，近年でを融合した組換タンパク質として作成した。

は豚以外の食肉からの感染経路も無視することは0.5mMのIPTGで発現を誘導して37℃で２時間培できないとして，対策を求める声が高まってい養した大腸菌を超音波で破砕し，10,000 x g，４℃

る１）。

で30分間遠心分離して上清を回収した。さらに，

トキソプラズマ症の中間宿主における診断は，

Ni-NTAカラム（WAKO）を用いて，アフィニ

宿主体内の原虫の検出が困難なことから，抗体検

ティークロマト精製を行った。精製したrNluc-

査による診断が一般的である。食肉家畜を対象とGRA ８ は Qubit 4 Fluorometer（Invitrogen）にしたものとして，わが国では豚用のラテックス凝よりタンパク質濃度を測定し，－80℃で保存し集反応やELISA法を利用した抗体検出キットがた。同様に，rNluc, rGRA８も作成して検討に用広く利用されてきたが，豚以外の家畜・家禽を対いた。

象とした診断キットは流通しておらず，抗体検査

2.2の方法も標準化されていない。そのため，これま

１ｘ10 ７ のTgCatJpGi1/TaJ GRA Red strainトで行われてきた家畜・家禽における抗体保有状況

キソプラズマ原虫タキゾイトを７日齢または30日の調査については，ヒトや豚用の診断キットの転齢の雄の交雑鶏10羽に腹腔内接種，または，1,500，

用により実施されてきた 。しかしながら，検査

2,000，3,000個の筋肉内シストを30日齢の雄の交キットを対象外の家畜・家禽に適応する評価法に

雑鶏７羽に経口接種し，感染後14～42日に翼下静は 感 度・特 異 性 に 問 題 が あ る と す る 報 告 も あ

脈より採血を行った。非感染鶏血清は，生後１日齢

り ，食肉由来の感染リスクを正確に評価するたよりアイソレーター内で飼育した交雑鶏58羽より準めには新たな検査法の開発と標準化が必須である備した。また，鶏コクシジウム（Eimeria tenella）と考えられる。

実験感染鶏血清２検体，鶏回虫（Ascaridia galli）

２）

３）

本研究では，刺身やたたきといった加熱不十分な状態で喫食される機会の多い鶏肉に注目し，家血清

実験感染鶏血清５検体を，交差反応性の評価に用いた。

禽 を 対 象 と す る Luciferase-linked antibody

野外サンプルとして，ブロイラー血清100検体，

capture assay（LACA）法 ４）による抗トキソプ

地鶏血清267検体を宮崎県内の食鳥処理場で採材

ラズマ抗体検査法を開発した。さらに，開発した

して検討に用いた。血清は，－30℃で保存した。

抗体検査法による血清疫学調査を実施し，鶏肉に

2.3

よるトキソプラズマ症の感染リスクを評価した。

精製した組換タンパク質はNuPAGE 10％ Bis-

２．方

法

2.1

原

抗

ウエスタンブロッティング

Trisゲル（Invitrogen）を用いてSDS-PAGEを行い，親水化処理したPVDF膜（Bio-Rad）に転写した。その後，１％ BSA-TBST（１％ BSA，0.1％

診断抗原には，ナノルシフェラーゼ・トキソプ

Tween20加TBS）で，４℃で１晩ブロッキング

ラ ズ マ GRA ８ 融 合 組 換 タ ン パ ク 質 （rNluc-を行い，400倍に希釈した血清と室温で２時間反GRA8）を用いた 。rNluc-GRA８は，pET100/応させた。次に，１％ BSA-TBSTで洗浄した後，５）© The Ito Foundation

鶏を対象としたトキソプラズマ症の抗体検査法の開発

295

5,000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標

substrate（Promega）を加えて室温で２分イン

識抗鶏IgG抗体（Bethyl Laboratories）と室温でキ ュ ベ ー ト し ， VICTOR ３ Multilabel Plate

２ 時 間 反 応 さ せ た 。さ ら に 洗 浄 後 ，Western

Reader （PerkinElmer） で 発 光 量 （counts/s ＝ⓇBlue Stabilized Substrate（Promega）を用いてCPS）を測定した。
2.5

陽性バンドの検出を行った。
2 . 4 Luciferase-linked antibody capture

統計解析

デ ー タ は GraphPad Prism 6 （GraphPad
Software）を用いて解析した。カットオフ値はassay（LACA）法LACA 法 の 原 理 を Fig. １ に 示 し た 。 0.05M

ROC解析により求めた。感染鶏と非感染鶏血清

carbonate-bicarbonate（pH9.6）で希釈した抗鶏のGRA8-LACAにおける発光量の比較を，マンIgY Fc 領 域 抗 体 （Immunology Consultants＝ホイットニーのＵ検定で行い，p＜0.05を有意Laboratory）をアッセイプレート（white OptiPlate-とした。野外サンプルにおける抗トキソプラズマ

96 HB microplates, PerkinElmer）に４℃で１晩抗体の保有率は，フィッシャーの正確確率検定に吸着させた。PBST（0.05％ Tween20加PBS）でより解析し，95％信頼区間を推定した。

ウェルを洗浄した後，１％カゼインPBSTを加え，室温で２時間インキュベートしてブロッキングし

３．結果と考察た。１％カゼインPBSTで10倍に希釈した血清を

3.1

50 μｌ 加 え ，37 ℃ で １ 時 間 反 応 さ せ ，そ の 後ウエスタンブロッティングにより，実験感染鶏

PBST で ５ 回 洗 浄 し ，さ ら に ，１ ％ カ ゼ イ ン

血清５検体，非感染鶏血清８検体のそれぞれの

PBSTで希釈したrNluc-GRA８（１μg/ml）また

プール血清を用いて，rGRA8, rNluc, rNluc-GRA

はrNluc-GRA８発現大腸菌ライセート（５μg/８に対する抗トキソプラズマ抗体との反応性を確ml）を加えて37℃で１時間反応させた。PBSTで認した（Fig.２）。実験感染鶏血清はrGRA８と５ 回 洗 浄 し た 後 ， Nano-Glo-luciferase assay

rNluc-GRA ８ に 対 し て 陽 性 反 応 を 示 し た が ，buffer （Promega） で 希 釈 し た Nano-GlorNlucに対しては陰性であった。また，非感染鶏

T.gondii GRA8 speciﬁc lgY
Irrelevant IgY

rNluc-GRA8

rNluc-GRA８の抗原性の確認

Nano-Glo substrate

Anti-lgY Fc

Fig. 1 Schematic concept of LACA using rNluc-GRA8. The anti-chicken IgY （Fc region） was

immobilized on the surface of the white solid ELISA plate to capture the chicken antibodies fromserum samples. rNluc-GRA8 was used as a target antigen, which binds to the T. gondii specific
IgY, as well as a bioluminescent reporter when exposed to Nano-Glo substrate. The obtained
signals were measured in relative light units（counts/second（CPS））using the luminometer．

© The Ito Foundation

296

65

50

50

40

40

30

30

25

25

RA
8

Uninfected

rN

rN

lu
cG

Infected

RA
8
lu
c
rG

RA
8

65

RA
rN 8
lu
c
rN
lu
cG

（ｂ） M

rG

lu
cG

rN

lu
c

rN

rG

（ａ） M

RA
8

RA
8

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Fig. 2 SDS-PAGE and Western Blot of rGRA8, rNluc and rNluc-GRA8. （a）SDS-PAGE analysis of

purified recombinant proteins which were separated in 10 ％ Bis-Tris gel and stained by
SimplyBlueTM SafeStain. （b）Western Blot of purified recombinant proteins probed with pooledsera from experimentally T. gondii infected chickens（n＝5）and healthy uninfected chickens（n＝8）.M, molecular weight maker in kDa．

血清ではいずれの抗原に対しても陽性バンドは検85.7％，特異度96.9％と依然として高い感度と特出されなかった。以上より，rGRA８は鶏におけ異度を維持していた。

る抗トキソプラズマ抗体の検出に有用な診断抗原

抗体検査法としてよく用いられるELISA法等候補分子であり，Nlucが融合していてもその抗において組換タンパク質を抗原とする場合，宿主原性に変化はないことが示された。

細胞に発現させた組換タンパク質を分離・精製す

3 . 2 GRA8-LACAによる抗トキソプラズマ抗体の検出る必要がある。しかしながら，精製には手間と時間，コストがかかるうえに，大腸菌を用いた組換トキソプラズマ感染鶏血清（21検体），非感染

タンパク質の発現システムではしばしば目的とす

鶏血清（58検体），鶏コクシジウム感染鶏血清

る組換タンパク質が封入体に局在して不溶性とな（２検体），鶏回虫感染鶏血清（５検体）を用い，るため，その精製自体が困難なこともある。本研

rNluc-GRA８を検出抗原としてLACAを実施し究において開発したLACA法は，精製した組換タ

た（Fig. 3a）。GRA8-LACA の カ ッ ト オ フ 値 は

ンパク質はもちろんのこと，未精製の大腸菌ライ180.0CSPとなり，鶏コクシジウムや鶏回虫感染

セートを抗原として用いた場合においても高い感

血清との交差反応はなく，その感度と特異度はそ度と特異度を示した。このことから，LACA法のれぞれ90.5％と95.4％であった。また，検出抗原

プラットフォームは，これまで組換タンパク質をと し て 未 精 製 の rNluc-GRA ８ 発 現 大 腸 菌 ラ イ

抗原とする血清診断法開発において，しばしばセートを用いてアッセイを実施したところ

ネックとなった抗原の精製ステップを省くことに（Fig. 3b）
，カットオフ値は755.0CSPと精製した抗より，診断抗原の多様化と診断法開発の効率化に原を使用した場合に比べ高い値となったが，感度寄与することができると考えられた。

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297

鶏を対象としたトキソプラズマ症の抗体検査法の開発
（a）
（CPS）
100,000

＊

（b）
（CPS）
1,000,000

＊＊

＊

＊＊

100,000

10,00010,000
1,000
1,000
100

100

te

U

ni

nf

ec

A.
g

al

li

la
el
en

E.
t

go
T.

ni

nf

ec

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nd

ii

d

li
al
U

A.
g

en

el

la

ii
E.
t

nd
go
T.

d

10

10

Fig. 3 Fig.3

Diagnostic capability of rNluc-GRA8 antigen and GR8-LACA platform. GRA8-LACA
using purified rNluc-GRA8 antigen（a）and unpurified E. coli expressing rNluc-GRA8 lysate（b）were performed by T. gondii, E. tenella and A. galli infected and uninfected chicken sera.
The y-axis displayed the relative light unit（CPS）obtained from GRA8-LACA. The cut-off lines
were determined ROC analysis and were marked by the broken line. The asterisk indicates asignificant difference regarding Mann-Whiney`s test（＊p＜0.01；＊＊p＜0.001）．

3 . 3 肉用鶏における抗トキソプラズマ抗体保有状況の検討
rNluc-GRA８を検出抗原とするGRA8-LACA
を用いて，ブロイラー血清100検体，地鶏血清267

（CPS）
900

800
700
600

検体について，抗トキソプラズマ抗体の検出を試500みた（Fig.４）。実験感染鶏血清を用いて算出し400

た180.0CSPをカットオフ値としたところ，ブロ300

イラーでは全例が陰性であったが，地鶏では267200

検体中27検体（陽性率：10.1％，95％CI：9.9％―

100

10.3％）が抗体陽性となり，ブロイラーに比べ有0意に高い抗トキソプラズマ抗体の保有が示された（オッズ比22.98，p＝0.0002）。
トキソプラズマ原虫の鶏への感染ルートを考えた場合，終宿主である猫の糞便に排出されたオーシストを飼料や水とともに経口摂取することによるルートの可能性が高い。一般にブロイラーは密0.5Free-range

1.5

Broiler

2.5

Fig. 4 Distribution of specific IgY in sera of free-range

and broiler chickens against T. gondii GRA8 antigen.
The y-axis displayed the relative light unit （CPS）
obtained from GRA8-LACA. Black and open circles
represent individual serum samples from free-range（n＝ 267）and broiler chickens（n ＝ 100）,respectively. The
cut-off value was marked by broken line．

閉型の鶏舎で飼養されることが多く，出荷にかか育されることも多く，飼育期間も80日以上と長る時間も孵化から50日程度と短い。一方で，地鶏い。このような飼育形態の違いが，肉用鶏におけは平飼いで外環境と接する機会のある環境下で飼るトキソプラズマ感染率の違いにつながったのか© The Ito Foundation

298

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

もしれない。

GRA8-LACAを開発した。GRA8-LACAは高い

今回，鶏肉の中でも生食に供される機会が多い

感度と特異性を有しており，さらに，組換タンパ

地鶏においては，10％を超える高い抗体陽性率とク質を大腸菌ライセートから精製することなくなった。ヒトへの感染は鶏肉に含まれるシストのア ッ セ イ に 使 用 が 可 能 で あ っ た 。こ の GRA8-

経口摂取により起こる。本研究において，抗体陽LACAにより，肉用鶏における抗トキソプラズマ

性鶏からの筋肉内シストの検出は実施しておら抗体の保有状況を調査したところ，ブロイラー鶏

ず，すべての抗体陽性鶏がヒトへの感染源になるでは全例陰性であったが，地鶏においては10.1％

かは不明である。しかしながら，ヒトへの感染リという高い抗体陽性率が確認された。抗体陽性鶏

スクの低下，そして，動物のQOLの向上といっがヒトへの感染源となる筋肉シストを保有していた観点からも，鶏への感染リスクを低減するためるかは不明であるが，公衆衛生上のリスク管理のの飼養管理対策を実施していくべきであり，さらためにも鶏への感染リスクを低減するための対策に，肉の生食によるトキソプラズマ感染のリスクは必須であり，さらに，筋肉シスト保有鶏の検出を消費者に啓発していく必要があると考えられた。

法開発は今後の重要な課題であると考える。

４．要

約

食肉からのトキソプラズマ感染のリスク評価については，豚以外の家畜・家禽に関しては確立された検査法がないため，十分な検討が行われていないのが現状である。わが国には牛肉や鶏肉，馬肉などの生食を好む食文化があり，肉の生食がト
キソプラズマの感染リスクとなっていることが知られている。本研究では，刺身やたたきといった加熱不十分な状態で喫食される機会の多い鶏肉に注目し，家禽を対象とする抗トキソプラズマ抗体検査法として，rNluc-GRA８を検出抗原とする

文
献１）
 Sakikawa, M., Noda, S., Hanaoka, M., Nakayama,
H., Hojo, S., Kakinoki, S., Nakata, M., Yasuda, T.,
Ikenoue, T., Kojima, T.：Clin Vaccine Immunol, 19（3），365～367，2012．
２）
 Matsuo, K., Kamai, R., Uetsu, H., Goto, H.,
Takashima, Y., Nagamune, K.：Parasitol Int, 63（4），638～639，2014．
 田中舜，吉田彩子，Aye, K. M., 長安英治，西川義３）
文，野中成晃：第160回日本獣医学会学術集会講演
要旨集，336，2017．
 He, S. X., Song, G., Shi, J. P., Guo, Y. Q., Guo, Z. T.：
４）
Biochimie，106，140～148，2014．
５） Aye, K. M., Nagayasu, E., Baba, M., Yoshida, A.,
Takashima, Y., Maruyama, H.：Immunol Methods，462，91～100，2018．

© The Ito Foundation

299

牛ウイルス性下痢ウイルスの準種END－は
弱毒生ワクチンになるか？
―より効果的に免疫を誘導するための可能性の追求―
Can END－, a quasispecies of bovine viral diarrhea virus, be a liveattenuated vaccine？
― Pursing the possibility of more effectively inducing immunity ―

塩

川

舞

（日本獣医生命科学大学獣医学部獣医保健看護学科）

Mai Shiokawa（School of Veterinary Nursing and Technology, Faculty of Veterinary Science,
Nippon Veterinary and Life Science University）

Bovine viral diarrhea virus（BVDV）is an RNA virus classified in the Pestivirus genus of
the Flaviviridae family, which is the same genus to which the classical swine fever virus（CSFV）belongs. BVDV and CSFV are together known to form quasispecies and include atleast two quasispecies, namely, the END＋ virus that suppresses the host's innate immune
response and the END－ virus that induces it. Although this ability of the END－ virus to induce
an innate immune response has a disadvantageous effect on viral propagation, it is considered
to be a useful property for a live attenuated vaccine. In fact, live attenuated vaccines of CSFV
are developed in Japan using END－ as a seed virus. This study investigated whether BVDV/END－ could also be applied as a live attenuated vaccine strain．
For attenuating the virus, BVDV/END－ isolated from rabbit kidney-derived cell lines（Rb/END－）was passaged 25 times using rabbit kidney-derived primary cultured（RKp）cells.
Rb/END－ began adapting to RKp cells at approximately 5 passages（P.5）and maintained theirpropagation until P.25. When the immunological properties of the adapted virus obtained by
the viral passages（adapted Rb/END－；aRb/END－）were examined, aRb/END－ was observed
to induce an innate immune response in the infected cells. Moreover, it was confirmed thatreverse plaques, a characteristic feature of the END－ virus, were formed in the aRb/END－-infected cells．
These results indicated that BVDV/END －（Rb/END －） adapted to RKp cells andmaintained the properties of END－ after adaptation. This study strongly suggests that aRb/
END－ could be applied as a live attenuated vaccine strain of BVDV that could more effectively
confer immunity．

© The Ito Foundation

300

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

１．目

BVDVのワクチンは存在しているが，準種であ的るEND－をもとに製造されたワクチンは国内外を

牛 ウ イ ル ス 性 下 痢 ウ イ ル ス（Bovine Viral

問わず存在していない。BVDV/END－ がより効

Diarrhea Virus；BVDV）の持続感染（Persistently

果的に免疫を誘導し，感染を確実に防御できる生

Infection；PI）牛は，自身の分泌液からウイルス

ワクチン株として利用できれば，今後のBVDVのを排出し続けるため農場の慢性的な汚染源とな防疫対策に大きく貢献できるだけでなく，感染がる１）。PI牛の存在は生産性の低下および経済的損

散発している国内の現状を変えることができると失に繋がるため，PI牛を作らないこと，または，考えている。

PI牛をいかに早期摘発できるかが食肉生産の安定性やBVDV感染症を制御するうえで重要である。

２．方法

しかし，PI牛を早期に発見できるシステムは未確

2 . 1 ウサギ腎由来初代培養細胞（RKp細胞）

立であり，ワクチンがあるにもかかわらず発生がと人工的に不死化したiRKp細胞の作出

後を絶たない。また，BVDVは近縁の豚熱ウイル

ペースト状になるまでハサミで処理したウサギ

ス（豚 コ レ ラ ウ イ ル ス ，Classical Swine Feverの腎臓を，0.25％トリプシン溶液に加えて温めな

Virus；CSFV）とは異なり宿主域が広いため２），

がら約１時間撹拌した。得られた上清に培養液

さらに感染制御を困難にしている。したがって，（イーグル最小必須培地，10％牛血清，抗生物質

BVDV感染症の制御においては，まずは高感受性

含）を加えてよくピペッティングし，細胞培養用宿主である牛に対する感染を徹底的に予防するこ

フラスコに分注した。培養後にシートした細胞をとがなによりも重要である。

RKp細胞とし，適宜継代しながら実験に使用し

BVDVとCSFVは類似したウイルス学的特徴がた。４回継代したRKp細胞にSV40のlarge T抗原

多く，その１つとして宿主に対する免疫誘導能が遺伝子を導入し，Ｇ418（200μg/ml）入りの培養液

異なる準種を包含している点がある。感染宿主ので培養することで，不死化RKp細胞（immortalized

自然免疫応答を抑制するEND＋と，それを誘導す

RKp細胞；iRKp細胞）も作出した。

るEND という２つの準種を包含しており
－

，

３，４）

2.2

ウイルスの継代

CSFVの弱毒生ワクチンGPE 株は，このEND をウイルスはウサギ腎由来株化細胞から単離され種ウイルスとして製造されたものである 。

たBVDV/END－ であるRb/END－ を使用した６）。

CSFV と 同 様 に END － を 準 種 と し て 包 含 す る

RKp 細 胞 に 感 染 多 重 度 が 1.0 に な る よ う に Rb/

BVDVにおいても，このEND を応用することで，END－を接種し，４～５日間培養した。培養後に既存のものより効果的に宿主の免疫を誘導し，感得られた感染細胞の上清（Ｐ．
１）を接種材料とし，染を防御できる生ワクチン株を作出できるのでは

前日に分散してシートしたRKp細胞に接種した。

ないかと考えた。そこで，本研究では，BVDVのこの上清継代をＰ．
25の上清試料が得られるまで

END を弱毒生ワクチン株として応用できるかを繰り返し行った。

－

－

５）

－

－

明らかにするために，①病原性を減弱させるための異種動物細胞への馴化，②その馴化ウイルスの免疫学的性状の解明，この２点を目的として研究を行った。

2 . 3 ウイルスの増殖動態および宿主指向性の解析
継代で得られた上清に感染性粒子が含まれるか
ウイルスタイトレーションで確認した。タイト© The Ito Foundation

301

牛ウイルス性下痢ウイルスの準種END－は弱毒生ワクチンになるか？

レーションには牛腎由来株化MDBKとiRKp細胞

初代BT細胞に１ml/wellで接種した。１時間ウイを使用し，宿主指向性の変化も調べた。10倍階段

ルスを吸着させた後，３％メチルセルロースを重希釈した上清を両細胞に同時接種し，５日間培養

層して５日間培養した。培養後にメチルセルロー

した。全BVDV力価を測定する場合には，培養後スを除き，VSVを重感染させた。VSVを１時間の 細 胞 を 免 疫 染 色 法 （Peroxidase-Linked

吸着させた後，２％メチルセルロースを重層し，Assay；PLA）に 供 し ，ウ イ ル ス 力 価（Tissue

さらに２日間培養した。培養後，メタノールで細Culture Infectious Dose；TCID50）を算出した７）。

胞を固定し，クリスタルバイオレット溶液で形成

END ウイルスの力価を測定する場合には，水胞された逆プラックを染色した。

－

性口炎ウイルス（VSV）の重感染を阻止する性状を利用した方法（VSV干渉法）を用いた。
2 . 4 RKp 細 胞 馴 化 ウ イ ル ス （adapted Rb/
END ；aRb/END ）の免疫学的性状の解析－－

３．結果と考察3 . 1 RKpおよびiRKp細胞の作出とその性状解析馴 化 ウ イ ル ス aRb/END と 親 ウ イ ル ス Rb/

RKpとiRKp細胞の作出に成功した（Fig. 1A）。

END およびEND を同条件でMDBK細胞に接種

本研究対象であるBVDVは培養細胞や牛血清に迷し，感染細胞内の自然免疫関連遺伝子（bovine

入する代表因子であるため，実験に供する前にそISG15；bISG15およびbMx1）の継時的な発現をの迷入を確認した。RKp細胞（Ｐ．
０）から全RNA

リアルタイムPCRで調べた。得られたCt値をもを 抽 出 し ，RT-PCR 法 を 用 い て BVDV 遺 伝 子とにΔΔCt法で両mRNAの発現量を算出した。

（５’非翻訳領域）の増幅の有無を調べたところ，

－

－

2.5

＋

RKp細胞にBVDV遺伝子が迷入していないことが逆プラック形成アッセイ８）分かった（Fig. 1B）。両細胞の性状をより明確に25）を，６wellプレートにシートした牛精巣由来するために，iRKp細胞ゲノムへのlarge T抗原遺

co

nt

ro

l

ro
nt

ive

Po

sit

ive

lls

at

ce
p
RK

Ne
g

B

RKp
（P.3）

（

P.

0）

×100

×40

co

A

l

100倍または1000倍に希釈したaRb/END （Ｐ．
－

300 bpiRKp（P.4-16）200 bpFig. 1 Establishment of RKp and iRKp cells．

（A）
Primary cultured cells derived from rabbit kidney（RKp cells）were established in this study.
Artificially immortalized RKp（iRKp）cells were also established by introducing a large T antigen
of SV40.（B）BVDV gene（5’untranslated region, 290 bp）was not detected in the RKp cells. The
RKp cells are BVDV antigen-free cultured cells．

© The Ito Foundation

302

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

伝子の挿入の有無も確認した。RKp（P.６）およとができた。一方，iRKp細胞ではＰ．
１上清試料

びiRKp（P.４-15）細胞からゲノムDNAを抽出し，からウイルスを検出することができなかったが，PCR法でlarge T抗原遺伝子の検出を試みた。そＰ．５以降は102.97～5.22TCID50/mlの間で推移した。

の結果，iRKp細胞にのみ目的遺伝子の挿入があMDBK細胞で検出されたＰ．１試料中のウイルスることが確認できた（データ未掲載）。また，両は，残存した接種ウイルスを検出している可能性

細胞の構成細胞種を明らかにするため，上皮系細が高いが，両細胞でＰ．
５以降も継続してウイル

胞のマーカーであるサイトケラチンと間葉系細胞スが検出されたことから，Rb/END－ をRKp細胞のマーカーであるビメンチン抗体を用いて蛍光抗に馴化できている可能性が示された。BVDVの自体染色も実施した。いずれの細胞でもサイトケラ

然宿主（牛）ではないウサギ由来細胞に対する指チンの発現のみが認められ，両細胞が上皮系細胞

向性を高めるためにRKp細胞で繰り返し継代を集団で構成されていることも明らかになった

実施したが，ウイルス力価はMDBK細胞で測定（データ未掲載）。以上より，ウイルス継代に使用した場合のほうが高く，ウサギ由来細胞に対するするウサギ由来初代培養細胞の作製と，ウイルス指向性を高められてはいるものの，自然宿主に対タイトレーション等に使用しやすい不死化細胞のする指向性を減弱させることは困難であると考え作製に成功した。

られた。今後は，宿主に対する指向性と病原性の3.2

ウイルスの増殖動態と宿主指向性の変化

RKp細胞を用いたウイルス継代を実施し，５継

関連についても詳細な検討が必要であると考えられる。

代ごとに上清を保存した。その上清をMDBKお

また，タイトレーションで検出されたウイルス

よびiRKp細胞でタイトレーションし，ウイルスがEND － の性状を保持しているか確認するため力価を算出した（Fig.２）。その結果，MDBK細に，END－ウイルスが持つVSVの感染を阻止する胞では全上清試料からウイルス力価を算出するこ能 力（VSV 干 渉 能）を 指 標 と し た タ イ ト レ ー

6
5
4
Total BVDV titer using MDBK cells
Total BVDV titer using iRKp cells
BVDV/END－ titer using MDBK cells

3
2
1
0

ND

BVDV titer（log10 TCID50/mL）

7

P.1

P.5

P.10

P.16

P.20

P.25

－
in RKp cells．
was passaged using RKp cells, and the culture supernatants of infected cells were collected
for viral titration. Viral titration by peroxidase-linked assay as performed using MDBK and iRKp
cells, and the total BVDV titer was calculated. Viral titration by VSV-interference was also performed
using MDBK cells, and the BVDV/END－ titer was calculated. ND implies not detected．

Fig. 2 Viral growth kinetics of Rb/END－

Rb/END© The Ito Foundation

303

牛ウイルス性下痢ウイルスの準種END－は弱毒生ワクチンになるか？

ションも実施した。その結果，上清試料を接種し現を誘導するタイミングが異なるものの，aRb/

た細胞でVSV干渉が観察され，それによって算END－は感染細胞の自然免疫応答を誘導できるこ

出されたウイルス力価も免疫染色法の結果とほぼとが示された。今回は牛由来MDBK細胞を用い一致した。以上から，Rb/END をRKp細胞で維て評価を実施したが，ウサギ由来細胞に対する自持・培養することに成功し，また，得られたウイ然免疫誘導能も検討する必要がある。

－

ルスはEND の性状を保持していることも分かっ－

3 . 4 END－ ウイルス感染によって形成されるた。

逆プラックの検出

3 . 3 馴化ウイルス（aRb/END ）の免疫学的
－

性状の解析

END－ウイルスが持つVSV干渉能によって形成される逆プラックがaRb/END－感染でも形成されウイルス継代によって得られた上清を馴化ウイるかどうか検討を行った。その結果，aRb/END－

ルスとし，adapted Rb/END － ；aRb/END － と名を感染させたBT細胞に複数の逆プラックが形成付けた。このウイルスの免疫学的性状を明らかにされ，aRb/END－がEND－の性状を保持しているするために，培養細胞を用いて自然免疫誘導能をことが改めて確認できた（Fig.４）。さらに，形評価した（Fig.３）。親ウイルス（Rb/END およ

成された逆プラックの大きさがさまざまであるこ

びEND－）と，aRb/END－P.10，20，25をMDBKとも分かった。この大きさの違いは，aRb/END－

細 胞 に 接 種 し ，継 時 的 な bISG15（Fig. ３ ，左）集団の中にも自然免疫誘導能（VSV干渉能）がおよびbMx1（Fig.３，右）の発現を調べた。そ強いものと弱いものが混在している可能性を示唆の結果，親ウイルスRb/END 感染細胞では両遺している。サイズが大きい逆プラックからaRb/

伝子の発現誘導は認められず，Rb/END－ 感染細END－を単離することで，より免疫誘導能の強い胞では感染１日目から強い発現誘導が認められ

馴化ウイルスを獲得できる可能性がある。

＋＋

た。aRb/END 感染細胞では，感染後期（３日目－以降）に両遺伝子の発現が誘導されることが分

ΔΔCt value (mock = 1.0)

かった。親ウイルスとは自然免疫関連遺伝子の発

300

day1
day3

本申請課題を遂行することで，BVDV/END－

300

day2
day4

200

200

100

100

0

END＋

END－

Parent

P.10

P.20

P.25

約

４．要

0

day1
day3

day2
day4

END＋

END－

Adapted

P.10

ParentP.25

Adapted－Fig. 3 Expressions of bISG15 and bMx1 were induced in MDBK cells by aRK/END－

P.20

infection．

MDBK cells were inoculated with aRK/END （P.10, 20, and 25）, and the infected cells were harvested

at 1-4 days post infection. Total RNA was extracted from the collected cells and used for real-time
PCR to detect bISG15（left graph）and bMx1（right graph）．

© The Ito Foundation

304

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）－

Fig. 4 Reverse plaques were formed in aRK/END -infected cells．
－

BT cells were infected with aRK/END

of P.25（100-fold dilution；left, 1000-fold dilution；right）andincubated for 5 days. The infected cells were superinfected with VSV and were then incubated for an
additional 2 days. When the END－ virus infects the cells, it can block the cytopathic effect of thesuperinfected VSV, so that the cells survive and are stained as reverse plaques．

（Rb/END－）をウサギ腎由来初代RKp細胞に馴化させることができた。また，馴化後も感染宿主の自然免疫応答を誘導するEND－の性状を保持していることがin vitroの実験系から明らかになった。
以上より，より効果的に免疫を付与できる可能性を有したBVDVの弱毒生ワクチン候補株を得ることに成功した。
文献１） Fourichon, C., Beaudeau, F., Bareille, N., Seegers,
H.：Prev Vet Med，72，177～181，2005．
２） Moening, V.：Vet Microbiol，23，35～54，1990．

３）
 Shiokawa, M., Omatsu, T., Katayama, Y., Nishine,K., Fujimoto, Y., Uchiyama, S., Kameyama, K.,
Nagai, M., Mizutani, T., Sakoda, Y., Fukusho, A.,
Aoki, H.：Virology，538，97～110，2019．
 Kozasa, T., Abe, Y., Mitsuhashi, K., Tamura, T.,
４）
Aoki, H., Ishimaru, M., Nakamura, S., Okamatsu, M.,
Kida, H., Sakoda, Y.：J Vet Med Sci, 77, 511～518 ，2015．
 Suzuki, S.：Ann Rep Natl Assay Lab, 38, 1-10,
５）
2001．
６）
 Muhsen, M., Aoki, H., Ikeda, H., Fukusho, A.：
Arch Virol，158，753～763，2013．
 Kärber, G.：Arch Pharmacol, 162, 480～483,
７）
1931．
８）
 Fukusho, A., Ogawa, N., Yamamoto, H., Sawada,
M., Sazawa, H.：Infect Immun, 14, 332～336，1976．

© The Ito Foundation

305

筋肉中の虫体数を予測できるトキソプラズマ感染豚の検出法（Ⅱ）
Detection strategy of Toxoplasma gondii infected pig and estimation ofcysts burden in muscles（Ⅱ）

高島康弘１・谷口裕二２・斎藤大蔵２・Duong Duc Hieu３・吉田彩子４（１岐阜大学応用生物科学部，２岐阜大学大学院連合獣医学研究科，
３

宮崎大学大学院医学獣医学総合研究科，４宮崎大学農学部）

Yasuhiro Takashima１，Yuji Taniguchi２，Taizou Saitou２，Duong Duc Hieu３ and Ayako Yoshida４（１Faculty of Applied Biological Sciences, The United Graduate School of Veterinary Sciences, Gifu University，
２Graduate School of Gifu University，３Graduate School of Medicine and Veterinary Medicine, University of Miyazaki，
４Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Toxoplasma gondii is a zoonotic protozoan that causes pneumonia in pigs and also infects
humans via meat products. With the improvement of animal hygiene, the number of cases ofswine toxoplasmosis in Japan has decreased drastically in recent years, and “swine
toxoplasmosis as economic threat in the pig farming industry” has become to be considered asa thing of the past. However, human toxoplasmosis is still sporadic. In Japan as well, about 5％of pigs are asymptomatic but positive for antibodies, and it is considered that infection ofhumans via meat products even now. In addition, latently infected pigs do not form lesions at
all and are not detected by meat inspection. Subsequently, 800,000 anti-Toxoplasma antibodypositive individuals, which account for 5％ of the annual number of livestock (about 16 million),are on the market every year as meat. On the other hand, there are few data on the number
and position of the parasites contained in the muscles of antibody-positive individuals. Recent
study suggested that among experimentally infected pigs that showed antibody positivity,
some individuals contained almost no cysts in their muscles. In other words, even for antibodypositive pigs, the risk as a source of infection to humans is not uniform among individuals. In
the future, it is necessary to scrutinize not only the presence or absence of antibodies but also
the relationship between the number of cysts in the tissue and the type and amount ofantibodies produced. Therefore, in this study, we clarified what kind of anti-T. gondii
antibodies are produced by pigs containing a small number of cysts, and established anexperimental system that can easily detect latent cyst in tissues．

１．目ある。家畜衛生状態の改善とともに，我が国にお的ける豚での発症例は近年激減し「養豚業を経済的

トキソプラズマは豚に肺炎を起こすほか，食肉に脅かす豚の病気」としては過去のものになったを介してヒトにも感染する人獣共通感染性原虫で感がある。一方でヒトのトキソプラズマ症は今な© The Ito Foundation

306

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

お散発的に発症している。わが国でも５％程度の2.3

豚が無症状ながら抗体陽性を示しており，食肉を３頭には10７虫体のTgCatJpOk４株タキゾイト

介したヒトへの感染は引き続き起こっているもの

を皮下接種した（第１群）。２頭には感染前日かと考えられる 。また潜伏感染豚は病変を一切形ら実験終了時までピリメタミン４mg，スルファ

成しないため食肉検査で摘発されることもない。

ジメトキシン36mgを１日１回経口投与したうえ

すなわち，年間と畜数（約1600万頭）の５％にあで同株タキゾイトを10３虫体皮下接種した（第２たる80万頭の抗トキソプラズマ抗体陽性個体が食群）。１頭は感染させないまま飼育した。これら

肉として毎年市場に出ている 。

の豚から継時的に採血し血清を得た。

１）

２）

一方で抗体陽性個体の筋肉に含まれる虫体の数

2.4

感染

バイオアッセイや位置についてはほとんどデータがない。2018年

第２群の実験感染豚を感染35日後に安楽殺し，度の貴財団のご支援で実施した研究により，抗体

筋肉組織および脳組織を採取して細片したのちト陽性を示した実験感染豚の中に筋肉中にシストをリプシンで消化し0.5mlずつ計35匹のC57BLマウ

ほとんど含まない個体も存在することが示唆され

スに腹腔摂取した。接種後に死亡したマウスの脾た。つまり，抗体陽性豚といえどもヒトへの感染

臓からDNAを抽出しPCRにてＢ１遺伝子の一部

源としてのリスクは個体ごとに一様ではないといを増幅し，トキソプラズマゲノムDNAを検出した。

うことである。今後は単に抗体の有無だけでな

2.5

抗体の検出

く，組織内のシスト数と生産される抗体の種類・

豚血清中に含まれる抗Gra6，Gra7，Gra８およ

量の関係について精査する必要がある。そこで本びBag1 IgGをLIPS法にて検出した。検出の方法

研究では，組織内に少数のシスト数が含まれる豚は既報論文の方法にしたがった４）。

においてどのような抗トキソプラズマ抗体の清算2.6が見られるか明らかにするとともに，組織内の潜PLK株を親株として，既報の手法により近赤外

伏虫体を容易に検出できる実験系を確立するた

蛍光タンパク遺伝子をSAG１プロモータ―下流

め，近赤外光を発する組換えトキソプラズマ虫体に挿入した組換え虫体を作成した。作成した虫体を作成することを目的とする。

はタキゾイトとしてVero細胞に感染させ，CCD

２．方
2.1

カメラで近赤外線発光の有無を確認した。

法

３．結果と考察

実験動物

５―12か月齢のマイクロミニピッグ（富士マイクラ）６頭を用いた。
2.2

組換え原虫の作成と観察

薬剤投与なしで10７虫体を接種した３頭の豚は感染後７―９日目から抗体の産生が確認された。

寄生虫

これらの豚は感染７日目ごろから元気消失，頻呼マ ウ ス ，豚 に 対 し て 高 い 病 原 性 を 示 す

吸などの急性症状を呈し１頭は感染12日目に死亡

TgCatJpOk４株 ，世界中で研究に広く用いられした。抗Gra６抗体の産生はこれら３頭すべてでる弱病原性のPLK株を本研究に用いた。これらの確認されたが，抗Gra７抗体は１頭のみで感染11

株は7.5％ FCSを含むRPMI培地で培養したVero

日目から検出されたのみであった。抗Gra８抗体

細胞に感染させた状態で継代維持した。

は感染18日目までは確認されなかった。以上の結３）

果から豚において感染後早期に検出できるのは抗© The Ito Foundation

307

筋肉中の虫体数を予測できるトキソプラズマ感染豚の検出法（Ⅱ）

Gra６抗体であることが示唆された。類似の条件

ンとスルファジメトキシンの濃度は，生産現場でで実験感染させた豚の血清を虫体粗抗原を用いた使用される動物用抗原虫剤とほぼ同等である。こウエスタンブロッティング法に供すると，感染後れら２頭の豚は飼育期間中症状を示すことはな

７－11日目以降の血清で反応が見られることが報かった。しかし感染35日後に安楽殺して筋肉およ

告されており ，今回の実験結果と一致する。以

び脳組織を採材し，これをマウスに接種したとこ

上のことから感染豚の早期検出のためには抗Gra

ろ一部のマウスが死亡した。また死亡したマウス

６抗体の検出が有用であることが示唆された。なのうち１頭の脾臓からDNAを抽出し，トキソプ

おこれら３頭の豚については途中で死亡した個体

ラズマＢ１遺伝子領域をターゲットとするPCRをを除き感染後18日目まで観察したが，潜伏型虫体実施したところ陽性となり，マウスの死亡原因が特異的抗原であるBag１に対する抗体は検出でき

トキソプラズマ感染によるものであることが確認なかった。感染後18日では十分な数のシストが組された。一方これらの豚の筋肉および脳の組織切織内に形成されていない可能性がある（Table１）。

片からはトキソプラズマのシストが検出できな

次に抗原虫作用のあるピリメタミンとスルファ

かった。以上のことから組織内のシスト数はかな

ジメトキシンを投与しながら10 虫体を接種した

り少ないものと思われる。これらの実験結果か２頭のマイクロミニピッグを35日間飼育し，感染ら，抗原虫剤投与下で少数の虫体に暴露された豚当日と35日後に血清を得た。投与したピリメタミ

はまったく感染しないのではなく，少数のシスト

４）

３

Table 1Antibody Detection
Infection dose

Antiprotozoal
drug

Pig 1

Pig 2

107

NonAdministrated

Pig 3

Sampling
dateanti-Gra6

anti-Gra7

anti-Gra8

anti-Bag1

Day 0

-

-

-

-

Day 7

-

-

-

-

Day 9

+

-

-

-

Day11

+

+

-

-

Day18

+

+

+

-

Day 0

-

-

-

-

Day 7

+

-

-

-

Day 9

+

-

-

-

Day11

+

-

-

-

Day18

+

-

-

-

Day 0

-

-

-

-

Day 7

-

-

-

-

Day 9

+

-

-

-

Day11

+

-

-

-

Day 0

-

-

-

-

Day35

-

-

-

-

Day 0

-

-

-

-

Day35

-

-

-

-

Day18
Pig 4
103
Pig 5

Administrated© The Ito Foundation

death

308

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

を組織内に有するようになると考えられる。組織内に存在するシスト数がきわめて少ないことから，このような豚に由来する肉製品からヒトが感染するかどうかは現時点で不明である。しかしバイオアッセイで一部のマウスに感染が成立したことから，決してそのリスクを無視することはできない。そこで，少数のシストを組織内に持つことが示されたこれらの豚の血清を調べたが抗トキソプラズマ抗体（抗Gra6，Gra7，Gra８およびBag１抗体）は検出できなかった（Table１）。以上の結果から，抗原虫剤接種下では組織内に少数のシFig. 1 Recombinant T. gondii that emits near infrared

rays．

ストを形成しながらも検出可能なレベルの抗体が血清中に見られない可能性が示唆された。畜産現場で抗原虫剤の飼料添加は禁止されておらず，このような豚がヒトへのトキソプラズマの感染源となるリスクについてさらなる精査が必要であるものと思われる。

できる可能性がある。
４．要約

トキソプラズマは豚に肺炎を起こすほか，食肉を介してヒトにも感染する人獣共通感染症病原体

以上の結果から，豚において抗体価と体内の潜である。近年の家畜衛生環境の向上により豚のト

伏虫体数の相関について精査するには，組織内にキソプラズマ症の発生件数はわが国では激減して少数感染しているシストの定量的評価が不可欠でおり，「養豚業を経済的に脅かす病」としてはすあることが分かる。ところが通常の組織学的手法

でに過去のものになりつつある。しかし，ヒトので豚の筋肉中のシストを検出することは効率が悪

トキソプラズマ症は現在も散発しており，国内のい。そこで近赤外線を発する組換え原虫を作成

豚の約5％（約80万頭）は抗トキソプラズマ抗体

し，シストの存在を簡便に可視化できるシステム

陽性であると推測される。このため無症状で感染の構築を試みた。波長の長い蛍光は組織深部からした豚がヒトへの感染源となっている可能性は否

散乱することなく表層まで届くため，可視光より定できない。一方で，抗体陽性の豚がどの程度の波長の長い近赤外線は深い部分のイメージングに数のシストをどの組織に有するのかについては知適している。このような組換え虫体が作成できれ見が少ない。抗体陽性の豚であってもシスト保有

ば，豚の筋肉断片をイメージングすることで深部数はきわめて少ないとする近年の知見もあり，抗に存在する少数のシストまで定量化できる可能性

体陽性豚のヒトへの感染源としてのリスクは未知がある。本研究ではPLK株に近赤外線発光タンパの部分が大きい。したがって，豚の抗トキソプラ

クの遺伝子を組み込んだ

ズマ陽性率だけを議論するのではなく，感染豚の組換え虫体を作成し，得られた虫体が近赤外線

個体ごとの抗体の産生状況とシスト数の相関を明を発することを確認した（Fig.１）。今後このよらかにする必要がある。そこで本研究では，少数うな組換え原虫を豚に接種すれば，体内のシストのシストが潜伏感染している豚において，どのよ

数や分布状況と抗体価の関係について詳細に理解

うな抗トキソプラズマ抗体が誘導されているのか© The Ito Foundation

筋肉中の虫体数を予測できるトキソプラズマ感染豚の検出法（Ⅱ）

を調べた。また，組織中の少数のシストを効率的に検出する実験系の確立を試みた。
文献１） Matuo, K., Kamai, R., Uetsu, H., Goto, H.,
Takashima, Y., Nagamune, K.：Parasitol. Int., 63,
638～639，2014．
２） 高島康弘：All about Swine，50，16～19，2017．
３） Taniguchi, Y., Yanagihara, I., Nakura, Y.,
Ichikawa, C., Saito, T., Appiah-Kwarteng, C.,309

Matsuzaki, M., Fukumoto, J., Nagamune, K., Kyan,
H., Takasu, M., Kitoh, K., Takashima, Y.：Parasitol.
Int., 72，101935，2019．
４） Aye, K. M., Nagayasu, E., Baba, M., Yoshida, A.,
T a k a s h i m a , Y . , M a r u y a m a , H . ：J I m m u n o l
Methods，46，91～100，2018．
５） Appiah-Kwarteng, C., Saito, T., Toda, N., Kitoh, K.,
Nishikawa, Y., Adenyo, C., Kayang, B., Owusu, E. O.,
Ohya, K., Inoue-Murayama, M., Kawahara, F.,
Nagamune, K, Takashima, Y.：Parasitol Int., 69,
114～120，2019．

© The Ito Foundation

310

網羅的ジェノタイピングによる新規牛白血病抵抗性遺伝子の同定Identification of novel bovine leukosis resistance-associated alleles bycomprehensive genotyping

目

堅

博

久

（宮崎大学テニュアトラック推進機構）

Hirohisa Mekata（Organization for Promotion of Tenure Track, University of Miyazaki）

Bovine leukemia virus（BLV）is an etiological agent of fatal B-cell leukemia and malignant
lymphoma in cattle which are called enzootic bovine leukosis（EBL）. Approximately 35 ％ of
cattle in Japan have been infected with BLV. BLV can cause lifelong infection, and no vaccinesor therapeutic procedures are currently available to prevent BLV infection or the developmentof EBL. Therefore, novel control methods to reduce the incidence of EBL are required fromlivestock industries. Cattle with higher BLV proviral loads represent a higher risk of bothhorizontal and vertical transmission. Therefore, development of methods reducing the proviralload in cattle should be effective to protect BLV-free cattle. A genome-wide association study
to identify single nucleotide polymorphisms（SNPs）associated with BLV proviral load was
conducted in this study. The study examined 45 cattle with a low proviral load and 50 with ahigh proviral load. Single SNP（dpSNP ID；rs210304280）on chromosome 25 showed acoloration with proviral load. The result indicates the SNP might be associated with proviralload. Further study is required to identify the SNPs associated with proviral load. We believethat this study will promote the construction of effective measures to prevent BLV infection
and control the spread of BLV．

１．目法である。2009-11年に行われた全国規模の調査

的の結果，日本では約35％の牛がBLVに感染して地方病性牛白血病（牛白血病）は，牛白血病ウいた１）。発症届出数も20年間，増加の一途をたどっ

イ ル ス（bovine leukemia virus ： BLV）の 感 染ており，新しい対策法が求められている（Fig.１）。

を原因とする牛の白血病および悪性リンパ腫であ

BLVは主に昆虫の吸血活動，血液や体液が付る。BLV感染牛の約５％が，感染から数年後に着した器具の使い回し，胎盤や初乳を介して伝播

牛白血病を発症して死亡もしくは全廃棄処分となする。感染から半年ほど経過すると，血液中のプる。BLVは生涯持続感染するうえ，感染や発症

ロウイルス量は安定するが，その量は個体ごとにに対するワクチンや治療薬はない。そのため，大きく異なる（Fig.２）。我々は12―22ヶ月に及ぶ

BLV感染を防ぐことが農場でできる唯一の対処

農場での試験から，500copies/50 ng（of genomic© The Ito Foundation

網羅的ジェノタイピングによる新規牛白血病抵抗性遺伝子の同定

311（Head）
5,000
4,000
3,000
2,000
1,000
0

2000

2005

2010

2015

（Year）
Fig. 1 Year change of the notification number of bovine leukosis in Japan

The figure was made by data from the occurrence of the monitored infectious diseases in MAFF
（https://www.maff.go.jp/j/syouan/douei/kansi_densen/kansi_densen.html）．

40

40

30

30

（％）

50

Japanese Black（n＝2039） （ｂ）
50

20

0
50

0
50
10 0
0
15 0
0
20 0
0
25 0
0
30 0
0
35 0
0
40 0
0
45 0
0
50 0
00

0
10 0
0
15 0
0
20 0
0
25 0
0
30 0
0
35 0
0
40 0
0
45 0
0
50 0
00

10

copies/50 ng

Holstein（n＝521）

20

10
0

（％）

（ａ）

copies/50 ng

Fig. 2 Histogram of bovine leukemia virus proviral load in Japanese Black and Holstein cattle．

BLV proviral load in a total of 2,560 BLV-infected cattle are depicted in frequency distributions.

The median values were 572.0 and 1,679 copies/50 ng in Japanese Black and Holstein cattle,
respectively．

DNA）以下の感染牛が日本の飼養環境下におい抑える方法が有効である。細胞表面に発現するて，ほぼ感染源とならないことを証明した 。つ

MHC class II分子はウイルス由来の抗原ペプチド

まり，これまでのすべての感染牛を対象とした牛を免疫担当細胞へと提示し，獲得免疫反応の惹起

白血病対策ではなく，プロウイルス量が高い高リにつなげる。牛のMHC class II遺伝子の一種であスク牛に対象を絞った効率的な牛白血病対策が可る BoLA class II DRB3 ＊ 0902 遺 伝 子（0902 遺 伝能である。感染率が高い農場では，経営を維持す

子）をヘテロもしくはホモで持つ牛は，プロウイ

るためにも高リスク牛による繁殖が欠かせない。

ルス量が極端に低い４）。つまり，高リスクの母牛

しかし，高リスク牛は約40％の確率でBLVを母に0902遺伝子をヘテロで持つ種牛を交配すること

子間伝播するため３），新生子牛を新たな感染源とで，新生子牛を50％の確率で低リスク牛にするこしない，すなわち，新生子牛のプロウイルス量をとができる。一方で，特定の遺伝子への偏りは，

２）© The Ito Foundation

312

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

遺伝的多様性の消失につながり，異なる感染症等

電気泳動をした６）。112，87，85bpの断片を確認

に対して重篤な被害をもたらす可能性が否めなしたものは0902遺伝子を保有する可能性があるた

い。そこで，0902遺伝子以外にもプロウイルス量

め，解析から除外した。

を制御できる牛白血病抵抗性遺伝子の特定が望ま

2.3

れる。

リアルタイムPCRの結果，3,000copies/50ngを

SNP Array解析

これまでの調査で，0902遺伝子は6.8％の牛が超えた50検体を高ウイルス群，100copies/50ng以保有していた５）。一方，感染牛の33％は非常にウ下の46検体を低ウイルス群とした。なお，遺伝的イルス量が低い。つまり，0902遺伝子以外にも牛な偏りを防ぐため，１農場あたり最大２検体を白血病抵抗性遺伝子が存在する可能性がある。そSNP Array に 供 し た 。 SNP Array （Axiom

こで本研究では，プロウイルス量と宿主遺伝子一

Bovine Genotyping v3 Array；サ ー モ サ イ エ ン

塩基多型（SNPs）とのゲノムワイド関連解析か

ティフィック社）はタカラバイオ社（草津，日ら，新規牛白血病抵抗性遺伝子を同定することを本） に 受 託 解 析 し た 。 デ ー タ 解 析 は Axiom

目的とした。

Analysis Suite（サーモサイエンティフィック社）

２．方
2.1

およびSNP & Variation Suite（ゴールデンヘリッ

法クス社，ボーズマン，米国）を用いた。サンプル
データのクオリティーチェックはCall rate＞0.95

検体2018 年 ４ 月 か ら 2019 年 ８ 月 ま で に 採 取 し たを，ジェノタイピングデータのクオリティチェッ

BLV感染牛（黒毛和種，12ヶ月齢以上，雌）のクはCall rate＞0.95, Minor allele frequency＞0.01,

血液を使用した。指示書に従いELISA法（牛白Hardy Weinberg平衡p＞0.001を条件とした。本

血病エライザキット；JNC，東京，日本）により研究では，ヘテロでプロウイルス量に寄与する遺抗BLV抗体を検出した。抗BLV抗体陽性の検体

伝子を探索することを目的としたため，優性およについては，Wizard Genomic DNA Purification

び劣性モデルによるSNP関連解析を行った。統計

Kit（プ ロ メ ガ ，マ デ ィ ソ ン ，米 国）も し く は

解析はカイ２乗検定で行い，p＜5.0x10－６ を有意magLEAD 12gc（プレシジョン・システム・サ

差あり，p＜1.0x10－５を傾向ありとした。

イエンス，松戸，日本）を用いてゲノムDNAを抽 出 し た 。 抽 出 し た DNA は 分 光 光 度 計

３．結果と考察（NanoDrop8000；サーモサイエンティフィック，

３検体で112，87，85bpのPCRバンドを確認しウォルサム，米国）を用いてDNAの純度およびた。そこで，これら３検体は0902遺伝子を保有す濃度を測定した。抽出DNAを鋳型にして既報のる可能性が高いためにSNP Arrayには使用しなプライマー／プローブ配列を用いてリアルタイム

かった。SNP Arrayに供した96検体のうち，低PCRを行い，プロウイルス量を定量した５）。本研

ウイルス群１検体がサンプルのクオリティコント

究では，ELISA法とqPCR法でともに陽性の検体

ロールを満たさなかった。そのため，50検体の高をBLV感染とし，以後の解析に用いた。

ウイルス群と45検体の低ウイルス群を以後の解析

2.2に 用 い た 。Axiom Bovine Genotyping v3 Array

0902遺伝子を持つ牛の除外

既報のプライマー配列を用いてDRB3 Exon２に配置された65,003個の常染色体上のSNPsのうの遺伝子配列を増幅後，制限酵素BstYIで切断し，ち，40,308個がクオリティーコントロールを満た© The Ito Foundation

313

網羅的ジェノタイピングによる新規牛白血病抵抗性遺伝子の同定（ａ）
5-log10（ｐ）

4
3
2
1

（ｂ）

1

2

3

4

5

6

7

8

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Chromosome

14

15 16

17 18 19 20 21 22 23 24 25

27

29

X

5

-log10（ｐ）

4
3
2
1

9

10

11

12

13

Chromosome

14

15

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

27

29

X

Y

Fig. 3 Manhattan plot of a genome-wide association study on bovine leukemia virus proviral load in 95

cattle．

Manhattan plot of dominant（a）and recessive model（b）are depicted. The number of chromosomes

and the negative logarithm of the association p values are displayed along the x-axis and y-axis,
respectively. The upper and lower line indicated the 1.5x10－６ and 1.0x10－５, respectively．

した。そこで，これらのSNPについてプロウイル

牛白血病抵抗性遺伝子の特定につなげることが期

ス量との相関解析を行った。

待される。

マンハッタンプロットに示すように，有意水準
で あ る p ＜ 5.0x10 － ６ を 満 た す SNP は 認 め ら れ な４．要約

かった（Fig.３）。そこで，p＜1.0x10－５ を差があ

牛白血病ウイルス（BLV）の感染を原因とする傾向としたところ，１つのSNP（dbSNP ID；

る牛白血病は，2008年以降，最も多い牛の監視伝

rs210304280）が存在した。rs210304280は25番染染病である。日本では30―40％の牛がBLVに感染

色体上31,453,057bpに位置する遺伝子間領域であしていることから，新たな対策法の開発が必要でる。今後は，rs210304280とプロウイルス量とのある。すべての感染牛がBLVの感染源となるの相関について検体数を増やしてさらに検討する必ではなく，プロウイルス量が高い牛のみが感染源

要がある。

となる。そこで，プロウイルス量を遺伝学的な手本研究では，96検体のうち，クオリティコント

法で抑えるアプローチが有効である。牛のBoLA

ロールを満たした計95検体をゲノムワイド関連解class IIの多型領域は，個体により大きく異なり，

析に用いた。しかし，プロウイルス量との相関解

それがプロウイルス量の決定に寄与することが明析において有意な差を持つSNPを特定することがらかとなっている。そこで，それ以外の宿主遺伝できなかった。原因として，解析に用いたサンプ

子にもプロウイルス量に寄与する遺伝子があるのル数が充分でなかったことがあげられる。今後かを，宿主遺伝子の一塩基多型（SNP）とのゲノ

は，さらに解析する検体数を増やすことで，新規

ムワイド関連解析から明らかにすることを目的と© The Ito Foundation

314

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

した。本研究では，50検体の高ウイルス群と45検する必要がある。

体の低ウイルス群をSNP Array解析に用いた。
その結果，25番染色体上の１つのSNP（dpSNP
ID；rs210304280）にのみ差がある傾向が認められた。rs210304280は25番染色体上31,453,057bpに位置する遺伝子間領域であり，その機能等は不明である。本研究の結果，BLVプロウイルス量に関与する可能性があるSNPを１つ同定することができた。しかし，解析に供した検体数が充分とはいえず，そのことが解析結果に影響したと考えら

文献１）
 Murakami, K., et al.：J. Vet. Med. Sci., 75, 1123～
1126，2013．
 Mekata, H., et al.：Jpn. J. Vet. Res., 66, 157～
２）
163，2018．
３）
 Mekata, H., et al.：Vet. Rec., 176，254，2015．
 Hayashi, T., et al.：J. Vet. Med. Sci., 79, 1552～
４）
1555，2017．
５） Takeshima, S.-N., et al.：Arch. Virol., 160, 1325～
1332，2015．
６） van Eijk, M. J., et al.：Anim. Genet., 23, 483～
496，1992．

れる。今後はさらに検体数を増やして解析を継続© The Ito Foundation

315

豚腸管細胞モデルを用いた豚サーコウイルス関連疾病の重症化機序解明（Ⅱ）
Mechanism of progression of sever porcine circovirus associated diseases
by porcine intestine cell model（Ⅱ）

岡

林

環

樹

（宮崎大学農学部獣医学科）

Tamaki Okabayashi（Department of Veterinary Science, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Post-weaning multi-systemic wasting syndrome（PMWS）has emerged as a major disease
that poses a significant threat to the economics of global swine industry. Porcine circovirus
type 2（PCV2）is the causal agent of PMWS in pigs. Furthermore, not only PMWS, some pig
diseases（eg； PDNS, PRDC）are reported with the relation of PCV2 infection and termed it,
PCVD（Porcine circovirus diseases）. To clarify the pathogenicity of PCV2, it is necessary toestablish PCV2 culture system in vitro. The PK-15 cells, which is widely used for PCV2
propagation, is not efficient due to contamination with PCV1. To clarify the pathogenicity of
PCV2 in vitro, we performed two research as follows； 1. The screening with limited dilution of
PK-15 to select the clone that is available to culture PCV2, and 2. The Searching new
supplements to promote PCV2 propagation in PK-15．
Our screening with limited dilution showed that clone PK-15-C1 and C2 cell lines were
the susceptible to PCV2 infection. The highly viral propagations were confirmed in the clone
PK-15-C1 and C2 cell lines. To validate the ability of serum derived from some animals for
PCV2 propagation in cell lines, PCV2 in PK-15 cell lines were maintained for 5 days post
infection with 5 species animal serum（5％ final concentration）. After 5 days treatment withsera, viral copy number in cultured supernatant were measured with quantitative PCR. The
PCV2 copy number in PK-15-C1 and C2 those were treated one serum derived from animal A
were significantly higher than those of were treated derived from animals B, C, and D．
Establishment of the effective culture system for PCV2 in pig cells will useful for resolve
the virus propagation and immune reposes in pig. These culture systems will contribute theclarify the pathogenisity of Pig diseases in near future．

１．目

Multisystemic Wasting Syndrome；PMWS） と的

豚繁殖・呼吸障害症候群（Porcine reproduction

肉豚の死亡事故，特に離乳以降肥育初期時に多and respiratory syndrome；PRRS）に よ る 疾 患

く淘汰されていく子豚の原因としては，豚の離乳が原因と考えられている１～５）。両疾患ともに豚産

後 多 臓 器 性 発 育 不 良 症 候 （Postweaning

業界においては新しく認識された感染症であり，© The Ito Foundation

316

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

まだその防疫対策は確立されておらず，莫大な経明されない理由の一つとして，PCV２細胞培養

済的被害を及ぼしている。

系確立の難しさが指摘されている。一般的には豚PMWSの原因が豚サーコウイルス２型ウイル

腎臓上皮細胞列であるPK-15を用いた分離・培養

スPCV２であることが明らかになって以降，欧が 行 わ れ て い る 。し か し な が ら ，American

米では90％以上の農場にPCV２の検出が確認さType Culture Collection（ATCC）で購入できるれた。その後，PCV２がPMWSだけでなく，豚PK-15にはPCV１やPCV１抗原の検出がなされ

皮膚炎症腎臓症候群，増殖性壊死性肺炎，またダて お り ，PCV ２ の 培 養 の た め に は ，購 入 し た

ンス病との関連性との関連性が指摘されるように

PK-15からPCV２培養に適した細胞株の単一化なってきた。これにより，PCV２の感染を原因（クローニング）が必要とされる。また，継代をとするこれらの疾病は豚サーコウイルス関連疾病

繰り返すことによるPCV２の複製レベルの低下（Porcine circovirus associated diseases；などが問題となる。

PCVAD）として取り扱われるようになった。こそこで今年度の申請課題としては，PCV２がのように潜在的なPCV２の感染は，PRRSやマイ

潜在的に感染した状況において，他病原体との相コプラズマ症など経済的被害の大きい疾患に関連互関係がどのように重症化を誘導しているのかをしており，養豚界においては無視できない状況で明らかにするために，十分なウイルス量を獲得す

あ る 。し か し な が ら ，上 述 の よ う に 欧 米 で はるための安定したPCV２培養を行う方法の確立

90％，日本においても100％近い農場からPCV２を目指した。

が検出され，また，その培養が困難であることか
らも，確実に病原性を明らかにはされていない。

２．方法

平成30年度の本研究助成課題において，申請者

一般的にPCV２培養に用いられるPK-15細胞

は豚の腸管より腸管上皮細胞Porcine intestinal（JCRB9040）をJCRB細胞バンクより購入した。

epithelial cell（PIE細胞）を用いて豚サーコウイ

本細胞株はATCC株を起源としており，すでにルス２型（PCV2）の分離に成功した。これによ

PCV１の混入があることが明示されていた。培りPCV２の新しい分離方法としてPIE細胞の有用養液にはペニシリン―ストレプトマイシン溶液

性を見出すことができた。またPCV２が感染し（シグマ

た豚腸管上皮細胞に豚流行性下痢ウイルス

イーグル最小必須培地（シグマ（PEDV）が重複感染すると，PEDVの増殖性が社）にトリプトースリン酸ブロス（シグマ亢進され，細胞障害性が強く誘導されることを明

ドリッチ社）を終濃度0.3％，ウシ胎児血清（バらかにした。本研究で確立したPIE細胞を用いた

イオウエスト社，フランス）を終濃度10％になる

PCV２感染モデルが，病原性が明瞭でないPCV

よう加え使用した。これらの細胞を，96穴プレー

２とPEDVやその他の病原体との相互関係により

トを用いた限界希釈培養を行い，単一細胞クロー

重症化を示唆するような細胞障害，炎症反応を起ンの選出を行った。それぞれのクローン由来細胞

こすのかを調べるための有用なツールになると考にPCV２を感染させ，PCV２感染感受性のあるえられた。

細胞を選出した。選出した細胞を十分に増殖さアルドリッチ社，アメリカ）１％添加
アルドリッチアル

しかしながら，PCV２における直接的な病原せ，これらの細胞からDNAを抽出した。PCV１

性解明には至っていない。PCV２の病原性が解およびPCV２特異的定量PCRを行い，PCVが感© The Ito Foundation

豚腸管細胞モデルを用いた豚サーコウイルス関連疾病の重症化機序解明（Ⅱ）

317

染していないPK-15細胞であることを確認した。

高かった２株を選出した。これらの細胞株は定量

ウイルスは，平成30年度に本助成を受けて分離

PCRによりPCV感染のないことを確認した。Fig.

したPCV２を使用した。豚腸管より樹立した腸１に，選出されたPK-15細胞株クローン１（PK-管上皮細胞Porcine intestinal epithelial cells（PIE

15-C1），クローン２（PK-15-C2）におけるPCV細胞）に，PCV２感染豚血清をPIE細胞に接種し，２増殖曲線を，培養上清中DNAを定量PCRによ接種された細胞を1/3継代―７日間培養にて３代り測定して示した。これらの結果より，親株同様繰り返すことで分離に成功したPCV２を試験ににPCV感染を受けているPK-15ではPCV２の増供与した。ウイルス増殖性，細胞障害性，免疫誘殖が抑えられることが明らかとなった。また，導性への影響を比較した。ウイルス増殖性を定量

PCV２感染感受性PK-15細胞のクローニングに成PCR法により解析した。

功し，
PCV２の安定した培養系の確立に成功した。

また，安定したPCV２の増殖・培養を行うた

3.2

動物血清によるPCV２増殖性への影響

めに，各種動物血清を添加剤として加えて比較検

濾過およびガンマ滅菌した動物血清における討を行った。各種動物血清（豚，馬，羊，ウサギ）

PCV２増殖性への影響を検討した。使用した血を購入し，直径穴0.2mmフィルターにて濾過を行

清からDNA抽出し，PCV1/2特異定量PCRにより

い，25-40kGyのガンマ線照射処理を行いPK-15

PCV1/2の感染がないことを確認した。続いてそ細胞におけるPCV２培養時に添加し，ウイルスれぞれの動物血清（Ａ-Ｄ）を，最終濃度５％と増殖性への影響を比較検討した。

して培養液に混和させて，PCV２感染PK-15細胞を培養した。コントロールとしては，「材料と方３．結果と考察
3.1

法」に記載した10％FBSイーグル最小必須培地を

PCV２感染感受性細胞の樹立用いた。動物血清の添加は，10％FBSイーグル最購入したPK-15細胞を増殖させ，限界希釈を小必須培地に５％最終濃度として添加している。

行ったPK-15細胞におけるPCV感染性を確認しPCV2の感染量は添加培養５日後に，培養上清かた 。親 細 胞 の 15 ％ が PCV ２ 感 染 性 を 示 し た 。

らDNAを抽出し，定量PCRにより測定して示し

PCV２感染性を示した細胞ストックから新たにた（Fig.２）。これらの結果より，PK-15-C１株

細胞培養を開始させて，PCV２感受性PK-15細胞

およびPK-15-C２株において，血清Ａを５％添株を樹立した。特にその中でもPCV２感受性の加した状態において，PCV２の増殖性が亢進す

PCV2 copy number
Log10 copies/ml

8
7
6
5
4
3
2

PK15-C1

1
0

0

3
Post Infection days

PK15-C2
5

Fig. 1 PCV2 virus yields produced in cloned PK-15 cells© The Ito Foundation

318

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
PK-15-C1

PCV2 copy number
Log10 copies/ml

7

＊＊
7

＊＊

6

6
5

5

4

4

3

3
2

2

1

1

0

PK-15-C2

control

A

B

C

D

0

control

Serum species

A

B

C

Serum speciesD

PI 5daysFig. 2 Difference of PCV2 propagation in PK-15 depend on serum species

ることが明らかとなった。これらの現象は，血清

豚疾病関連ウイルスの細胞感染時におけるウイル

Ｂ，Ｃ，Ｄでは観察できなかったことから，動物

ス増殖性，免疫誘導性，病態形成を明らかにする

種Ａの血清中はなんらかのPCV２増殖に関連すのに有用であると考える。

る特異的な因子が含まれていることが確認できた。
４．要約

豚腎臓細胞であるPK-15を限界希釈法を用いたクローニングにより，PCV２感染感受性クローンの選択に成功し，PCV２の安定した培養を可能とした。
また，動物種Ａの血清を，豚細胞に添加することによって，PCV２の増殖が亢進されることが明らかとなった。この動物種Ａの血清を添加した
PCV２の豚細胞における増殖亢進効果は，PCV
２のみならず豚感染症由来病原体の増殖性を活性することが期待できる。また，豚生体内における病原性を反映するモデルとしての有用性が考えられる。PCV２をはじめとする今まで培養の難し
かった豚疾病関連ウイルスの豚細胞における培養系が確立できたことは，今後，これらの実験系が文
献１）
 Zimmerman, J., Benfield, D. A., Murtaugh, M. P.,
Osorio, F., Stevenson, G. W., Torremorell, M.：
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© The Ito Foundation

319

反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索（Ⅱ）
Investigation of the physiological markers indicating ‘nausea’ in domestic
ruminants（II）

青

山

真

人１・蕪

山

由己人２

（１宇都宮大学農学部生物資源科学科，２宇都宮大学農学部応用生命化学科）

Masato Aoyama１ and Yukihito Kabuyama２（１Department of Agrobiology and Bioresources, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University,
２Department of Applied Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University）

Introduction：Farm ruminants, such as cattle, sheep and goats, don't possess the emetic
reflex, thus there have been no reports investigating the nausea in them. The aim of this study
is to find the physiological marker（s）for nausea in goats. In this research, we investigatedthe effects of administration of cisplatin（CisP）, a common emetic agent, on the behavior andblood concentrations of some hormones in goats．
Methods：Six adult Shiba goats received intravenous administration of CisP（1.0 mg/0.5
ml saline per kg body weight）or the same volume of saline as the control. The behavior ofanimals was observed for four hours. The blood samples were collected for the assays ofplasma levels of cortisol（Cor）,arginine vasopressin（AVP）and cholecystokinin（CCK）．
Results：At the first 60 - 120 min, CisP administration did little affect behavior in goats,and they started to feed when the new hay was presented at the 60 min after theadministration. However, after a while, CisP administrated goats became sick：they stopped
feeding within 135 min（average of six goats）and lay down, meanwhile the control goats still
continued to feed at the same period. At the 60 min after the administration, plasma Cor levels
in CisP administrated goats was slightly higher than those in controls but did not differ those
before the administration. At 120 min after the administration, the plasma Cor levels in CisP
administrated goats were significantly higher than those in controls or pre-administration, andit became higher at 180 and 240 min after the administration. CisP did not influenced plasma
AVP nor CCK levels．
Conclusion：CisP induced the remarkable behavioral changes in goats, and thesebehavioral responses seemed to be induced by the severe stress because the plasma Cor levels
were increased. These results indicate that CisP might induce nausea or some similar aversion
in goats．

１．目

や「暑さ・寒さ」と同じく代表的な不快感の一つ的である。人を含めたいくつかの動物種において，「悪心」（吐き気，気分が悪いこと）は，「痛み」

悪心によって起こる最も明確な反応は「嘔吐」で© The Ito Foundation

320

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）ある。一方，齧歯目，兎，馬など，嘔吐反射を持宇 都 宮 大 学 動 物 実 験 委 員 会 の 承 認（承 認 No.

たず，嘔吐をしない動物種も少なくない 。しかA18-0008）を得て，同大学動物実験等管理規程

し，齧歯目であるラットやマウスにおいては，嘔に従って行った。餌と水は不断給餌とし，毎日吐はしないが悪心は感じると考えられている。こ

10：00に新しいものに交換した。

１）

れらの動物においては，「異食症」（カオリンとい2.2

う瀬戸物の原料を摂食する異常行動）が嘔吐に代６頭の山羊について，同じ性のペア３組に分けわる悪心の行動学的指標となると考えられていた。９：00に，各ペアのうち一方にはCisP（Cis-

る。一方，悪心経験時に特異的に起こる生理

ジアミン白金（Ⅱ）二塩化物：シグマ・アルド

学的反応，特に血液中に現れる成分については，

リッチ社，Ｐ4394）を投与した。投与法について

いまだ明確な知見が得られていない。

は，CisPを2.0mg/1.0mlとなるように生理食塩水

２，３）シスプラチンの投与

牛や羊，山羊などの反芻動物も嘔吐をしない。

に溶解し，これを山羊の体重１kgあたりCisPとそのため，反芻動物における悪心の研究はこれまして1.0mgとなる量を静脈内に注入した。もう一で皆無に近い。一方，著者は山羊を反芻家畜のモ

方の山羊には，対照として同じ量の生理食塩水をデルとして家畜の輸送ストレスのメカニズムやそ投与した。１～２週間の間隔を空け，各個体の処の軽減法を研究してきた４，５）過程から，山羊は嘔置を入れ替えて再び実験を行った。

吐をしないが，輸送中の様子から乗り物酔いをし

2.3ている，つまり，悪心を感じているのではないか

山羊の行動を，８：30（投与30分前）から13：と考えてきた。家畜が悪心を経験する可能性のあ00（投与４時間後）まで，ビデオカメラで撮影しる要因は，輸送以外にも，感染症やカビ毒など多た。飼料の交換後に，伏臥位姿勢を取るまでの時

く存在する。そのため，反芻家畜が悪心を経験す

間（投与からの時間），伏臥位姿勢であった時間，る可能性は確かめておく必要がある。本研究の目

伏臥位姿勢を取った回数，摂食を停止するまでの的は，反芻動物において悪心の生理学的指標を見時間（投与からの時間），摂食に費やしていた時

つけ出すことである。今年度（令和元年度）は，間，反芻をしていた時間，について実験区間で比催吐剤であるシスプラチン（CisP）投与の影響較した。血液採取のため，実験者が房に入った際を検討した。CisPは抗癌剤であるが，副作用としには山羊の摂食は中断されたが，採血終了後２分て強い悪心・嘔吐を引き起こすことが分かってお以内に再開した場合は，摂食行動は継続していたり，その生理学的メカニズムについても研究が進ものとみなした。観察時間中に一度も起こらなんでいる 。それゆえ，犬やフェレット，ジャコ

かった行動については，それが起こるまでの時間

ウネズミ（食虫目に属する）など嘔吐する動物をは便宜的に240分（投与から観察時間終了までの用い，悪心の研究材料として頻繁に使用されてい時間）とした。

６）

2.4

る７～９）。
２．方
2.1

行動観察

血中成分の分析

８：30（投与30分前），９：00（投与直前），

法

10：00（餌交換直前），11：00，12：00，13：00の計６回，頚静脈より血液を採取した。採取した

実験動物

実験にはシバ山羊（Capra hircus）６頭（オス

血液はすぐにヘパリンを込めた遠沈管に移し，そ２頭，メス４頭，２～４歳）を使用した。実験は，の後遠心分離（４℃，3,000rpm，10分）で得た© The Ito Foundation反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索（Ⅱ）

血漿を各成分の測定まで－30℃で保存した。スト321に多かった（p＜0.05）。

レスの生理的マーカーとして一般に用いられていSal区については，６頭中４頭は飼料交換からる血中のコルチゾル（Cor），悪心との関連が報観察時間終了まで摂食を継続していた。摂食を中告されているアルギニンバソプレッシン（AVP）

断した２頭についても，観察時間内に再び摂食をおよびコレシストキニン（CCK） の各濃度を測開始した，あるいは摂食をしていない時間帯には定した。ラットにおいて，悪心との関連が指摘さ反芻を行っていた。一方，CisP区においては，すれているオキシトシン10）の測定も試みたが，測定

べての個体が98～157分後に摂食を停止した。飼系に問題が生じ，正確な結果が得られなかった。

料交換以降に摂食を停止するまでの時間は，CisP

血中のCor濃度については６頭すべての山羊で測区のほうが有意に速く（p＜0.05），摂食に費やし定したが，AVPおよびCCKについては，３頭（オていた時間はCisP区のほうが有意に短かった（pス１頭，メス２頭）について検討した。

＜0.05）。また，反芻は，Sal区においては６頭中

１）

2.5

２頭で観察できたが，CisP区においては６頭中い

統計解析

生理食塩水を投与した対照区をSal区，CisPをずれの個体においても観察されなかった。

投与した区をCisP区として，両実験区を比較し

CisP区において，伏臥位を取っている個体は，た。行動については，Wilcoxonの符号化順位検

Fig. 1Cのように瞼を閉じ，顔を下に向けてじっと

定によって比較した。血中成分については，二元している様子が確認できた。また，立位であって配置（処置×時間）反復測定分散分析によって比も，壁に顔を向けてしばらく動かないでいる様子較した。

が頻繁に観察できた（Fig. 1D）。Kenwardら11）は犬において，嘔吐以外の悪心に対する行動学的反３．結果と考察
3.1

応として「瞼を閉じる」「顔を下に向ける」「摂食行動

行動の停止」等をあげている。今回，CisPを投与

投与から給餌（飼料の交換）までの約60分間にされた山羊で観察された様子は，悪心を経験してついては，いずれの実験区においても伏臥位姿勢いる犬の行動に類似していた。山羊を含む反芻家や反芻が観察できた（特にデータとしては示して

畜は，摂食後にはたいてい反芻を行うが，CisP区いない）。また，飼料を交換した直後（投与からではこれがまったく観察できなかったことから60分後）には，いずれの実験区においても山羊はも，CisP投与による伏臥位姿勢は，通常の休息行

すぐに摂食を開始した。

動ではないことは明らかである。

Sal区において，飼料交換後は，６頭中４頭は3.2

血中コルチゾル濃度

一度も伏臥位姿勢を取らなかった。一方，CisP区

Sal区においては，血中Cor濃度は実験中変化しにおいては，６頭すべてが遅くとも投与から157なかった（Fig. 2A）。一方，CisP区においては，分後に伏臥位姿勢を取った（Table１，Fig. 1A,

投与60分後にわずかに増加し，同じ時間帯のSalB）。伏臥位姿勢を取るまでの時間は，CisP区で区におけるそれよりも有意に高かった（p＜0.05）

はSal区と比較して有意に速かった（p＜0.05）。まが，CisP区内の比較においては，投与前との値のた，観察時間中に伏臥位姿勢を取っていた時間間に有意な差はなかった。投与120分後以降にはは，CisP区において有意に長かった（p＜0.05）。

CisP区の血中Cor濃度は著しく増加した（p＜0.01

伏臥位姿勢を取った回数はCisP区のほうが有意～0.05）。投与180分後以降にはさらに血中Cor濃© The Ito Foundation

322

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 1 The effects of cisplatin administration on lying and feeding behavior

in goats

Treatment
Saline（control）

Cisplatin

222.8±11.3

142.5±9.5＊（176―240）（98―157）

4.4±4.3（0―26）

51.5±8.7＊（24―80）Latency to lying（min）
Total time spent in lying（min）
Frequency of lying
Latency to stop feeding（min）
Total time spent in feeding（min）
Total time spent in rumination（min）

0.5±0.3

6.2±1.5＊（0―2）（3―13）

220.8±12.2

135.0±11.0＊（176―240）（98―157）

170.8±8.2

115.2±9.1＊（130―180）（90―144）5.0±4.3（0―26）

0.0±0.0（0―0）

Each data represents the average ± SE and（minimum value-maximum value）of six
goats．
＊：Significant difference from the results in the saline administrated control test（＊：p＜0.05, Wilcoxon signed rank test）．

A

B

C

D

Fig. 1 The typical examples of the effects of cisplatin（CisP）administration on behaviors in goats. A：Left or rightfemale goat was given saline（control）or CisP. About 150 min after the administration, the control goat（left）still
continued to feed but the CisP administrated goat（right）had stopped feeding and lain down. B：On the next
week, each goats in the picture A received the reversed treatment. C：A female goat received CisP. She lay down
without ruminating, and facing downward with eyes closed. D：A male goat received CisP. He stood without
feeding or ruminating, directed toward the wall．

度が増加し，120分後の値よりも有意に高くなっ

濃度は最も一般定に用いられているストレスの指た（p＜0.01）。著しい血中Cor濃度の増加が観察標である。悪心を引き起こす処置によって行動学された時間帯は，上述の行動学的変化が観察され的な変化とともにCorあるいは類似の糖質コルチた時間帯とほぼ一致していた。Corはストレスにコイドの血中濃度が増加することは，犬やラット

対してその分泌量が多くなることから，血中Corでも報告されている11，12）。悪心は強いストレスと© The Ito Foundation

323

Plasma CCK level（ng/ml）

Plasma AVP level（ｐg/ml）

Plasma Cor level（ng/ml）

反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索（Ⅱ）
150
A

Saline

100

ｂ

50
a

a
0

ｃ

Cisplatin

－30

＊ a

＊＊

ｃ
＊＊

＊＊

0

60

120

180

240

0

60

120

180

240

0

60

120

180

240

300
B
200
100

0

－30

4.0
3.0

C

2.0
1.0
0.0

－30

Time from administration（min）
Fig. 2 The effects of cisplatin administration on blood levels of cortisol（Cor）（A）, arginine vasopressin（AVP）（B）orcholecystokinin（CCK）（C）. The same volume of saline was administrated as the control. Each data represents
the average ± SE of six（A）or three（B, C）goats.
‘＊’：significantly differed from the results in the saline administrated control at the same period（＊：p＜0.05,＊＊：p＜0.01）. ‘a, b, c’：Having no same letter represents the significant difference among each time period within
cisplatin administrated test（p＜0.05）（repeated measures two way ANOVA and Tukey’s test）．

なることは明らかであり，CisP投与によって山羊できなかった（Fig. 2B, C）。AVPは嘔吐に伴ってに起こる反応は，やはり悪心（少なくとも，それ血中濃度が増加することが報告されており，悪心に類似した嫌悪感）であると考えられた。

の生理学的指標となり得るという説も存在する１）。

3 . 3 血中アルギニンバソプレッシンおよびコ
レシストキニン濃度

一方，嘔吐をしないラットにおいては，塩化リチ
ウムや硫酸銅の投与（これらも悪心を引き起こ

血中AVPおよびCCK濃度については，Sal区とす）によって，行動学的な変化が観察されたにもCisP区の間に差は見られず，また，いずれの実験かかわらず血中AVP濃度は増加しなかった 10）。

区間内においても，時間帯間に明確な違いは確認

ラットと同様，山羊においてもCisPによって起こ© The Ito Foundation

324

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

る顕著な行動学的反応に，血中AVP濃度の変化

コレシストキニンの血中濃度は変化しなかった。

は伴わなかった。AVPの主な働きは体内の水分と塩分の調節である。嘔吐は脱水症状を引き起こすことがあり，嘔吐する動物で悪心に伴って血中
AVP濃度が変化するのは，嘔吐した結果起こる，
あるいは，嘔吐によって起こるであろう脱水症状に備えた反応であって，嘔吐をしない動物には起こらない現象であるのかも知れない。CCKは通常時の摂食行動の調節の他に，悪心の発生にも関与していることが指摘されている１）。しかし，少なくとも山羊においては，CisP投与によって変化しなかった。
今回は測定に失敗してしまったが，今後，山羊におけるCisP投与による反応にオキシトシンが関与しているかどうかを確かめる必要がある。前
述のようにラットにおいては悪心を引き起こす処置によってオキシトシンの血中濃度が増加することが報告されている10）。また，今回は紹介できる
ような結果はまだ得られていないが，昨年度に引き続き，二次元電気泳動による網羅的な解析の試みを継続している。
４．要

約

牛や山羊などの反芻動物は嘔吐反射を持たない
が，「悪心」（気分が悪いこと）を経験する可能性が否定されているわけではない。本研究では，悪心を引き起こす副作用のある抗癌剤「シスプラチン」を山羊に投与し，その行動学的・生理学的反応を観察することによって，将来的に悪心を評価できる生理学的マーカーの探索を試みた。
シスプラチン投与によって山羊に起こった変化は，１）伏臥位姿勢を取り，動きが制限される，
２）摂食の著しい抑制，３）ストレスマーカーとなる血中コルチゾル濃度の増加であった。しかし，これまで悪心のマーカーになる可能性が指摘されていたアルギニンバソプレッシン，あるいは文
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© The Ito Foundation

325

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅲ）
Comprehensive analysis of the behavior of Campylobacter and coexistentbacteria in chicken food chain（Ⅲ）

黒木

香澄・仁田

義弘・関崎

勉

（東京大学大学院農学生命科学研究科食の安全研究センター）

Kasumi Kuroki, Yoshihiro Nitta and Tsutomu Sekizaki（Research Center for Food Safety, Graduate School of Agricultural Life Science, The University of Tokyo）

Campylobacteriosis is one of major bacterial food-borne diseases mainly caused byCampylobacter jejuni and C. coli. Colonization of Campylobacter in chicken intestines in broiler
farms induces the bacterial contamination to chicken meat throughout the food chain fromfarm to fork. Our previous study showed that the bacterial composition of chicken meat wasdifferent at each store, regardless of the season, and suggested contamination of Campylobacterin processing factories or processing places in stores via equipment. In this study, weinvestigated the prevalence of Campylobacter on commercial meat including chicken, pork, andbeef, and compared the bacterial population structure on commercial meat to examine the factof cross-contamination in processing factories or stores. First, commercial meat was tested bynested PCR combined with an enrichment culture, and 10-50％ of chicken and pork were

found to be Campylobacter-positive. Campylobacter was not detected from beef. Next, types
and abundance of dominant bacterial genera of commercial meat were shown to be different
among meat types by 16S rRNA gene-based metagenomic analysis. Diversity indices of mince
were higher than cut meat. In addition, those of Campylobacter-positive meat were significantly
higher than Campylobacter-negative meat. Finally, principal coordinate analysis based on
unweighted UniFrac distances indicated that overall bacterial compositions were not different
between Campylobacter-positive meat and -negative meat. These results suggested that
Campylobacter contamination to commercial meat occurred via multiple sources with highdegree of bacterial contamination. However, further study is needed to investigate the fact ofcross-contamination of Campylobacter．

１．目の安全を確保するうえで本菌の汚染防止は喫緊の的課題である。本菌はヒトには前述の症状を呈する

カンピロバクターは細菌性食中毒の主要な原因

一方で，養鶏場で鶏の腸管に無症候的に定着する菌であり，下痢や嘔吐などを引き起こす。さらに，

ことが明らかにされている１）。すべての養鶏場で本菌に感染した場合には致死的な症状を呈するギ

鶏へのカンピロバクター汚染を防ぐことができれ

ラン・バレー症候群を発症することもあり，食卓

ば，鶏肉が本菌に汚染されるリスクは激減すると© The Ito Foundation

326

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

考えられるが，養鶏場での汚染防止策は完全にはを用い42℃，微好気条件下で48時間培養した。な

確立されていないため，現状では難しい。たとえ

お，１試料につき，各液体培地が入った試験管を一つの養鶏場で本菌の汚染を防御できても，食鳥３本用意し，培養した。

処理場には複数の養鶏場由来の鶏が集まるため，

2 . 3 増 菌 培 養 後 の 試 料 か ら の DNA 抽 出 と食鳥処理の過程で鶏肉へのカンピロバクター汚染

nested PCR法によるカンピロバクター遺伝を完全に防ぐことは難しい。平成29，30年度の研子の検出究助成課題で，我々は市販鶏肉の70％以上が本菌培養後の液体培地をチューブに移して12,000×に汚染されていたことを示した。さらに，鶏肉のｇで５分間遠心後，得られた沈殿物を滅菌生理食

購入時期に関係なく，店舗ごとに鶏肉の細菌叢が塩 水 で 洗 浄 し た 。洗 浄 後 の 沈 殿 物 か ら ，

類似していたことから，店舗のバックヤードや加PureLinkTM Genomic DNA Mini Kit（Thermo

工場での加工作業が細菌叢に影響を与えたことがFisher Scientific）を用いてメーカーの手順書に示唆された。つまり，加工器具などの加工環境がDNAを抽出した。

鶏肉に付着する細菌の種類に影響している可能性

抽出したDNAをCampylobacter jejuniのmapAがあり，加工時にもカンピロバクターの交差汚染

遺 伝 子 お よ び C. coli の ceuE 遺 伝 子 特 異 的 なは起きるのではないか，と考えた。そこで，本研

nested PCRに供試し，カンピロバクターDNAを

究では鶏肉以外の豚肉や牛肉などの市販肉につい検出した２）。PCR増幅産物はアガロースゲル電気てカンピロバクター汚染状況と細菌叢を明らかに泳動後にGelRedTM（Biotium）で可視化し，目的し，店舗や加工場でカンピロバクターの交差汚染の増幅産物の有無を確認した。なお，増菌培養しが起きる可能性について調査した。

た３本の試験管由来DNAのうち，１本以上で細

２．方
2.1

菌DNAが検出された場合に陽性と判定した。

法

2 . 4 16S rRNA メ タ ゲ ノ ム 解 析 に 使 用 す る

試料の収集

DNAの抽出

関東の複数の店舗で市販の鶏肉（内臓肉，カッDNeasy PowerBiofilm Kit（Qiagen） を 用 い

ト肉，挽き肉），豚肉（内臓肉，カット肉，挽き肉），て，メーカーの手順書に従い2. 1で得られた試料

牛肉（カット肉，挽き肉），牛豚合挽き肉を購入からDNAを抽出した。ただし，菌体破砕はキッした。市販肉は各試料125ｇを計り取り，滅菌ス

ト付属のビーズではなく，より破砕力の強い直径

トマッカー袋に試料と滅菌生理食塩水を入れ，30

0.5mmと５mmのジルコニアビーズ（東レ）を用

秒間手で揉んだ後，液体だけをチューブに移して

い て Beads Crusher μT-12（タ イ テ ッ ク）で 破

12,000×ｇで５分間遠心し，得られた沈殿物を試砕した３）。

料とした。
2.2

2.5

増菌培養

16S rRNAメタゲノム解析

各試料から抽出したDNAを用い，試料中に存2. 1で調整した試料中のカンピロバクターを増在する細菌由来の16S rRNA遺伝子の可変領域

菌するため，各試料を液体培地に加えて培養し（Ｖ３-Ｖ４）に対してPCR増幅を行った。調製さた 。具 体 的 に は Oxoid

Bolton Broth Selective

れたPCR増幅産物は，次世代シーケンサーMiSeq

Supplement（Thermo Fisher Scientific） を 加 え（Illumina）に供試した。取得した配列の前処理

たBolton broth（BB）（Thermo Fisher Scientific）

は複数のソフトウェアを内包するパイプライン

TM© The Ito Foundation

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅲ）

327

Illinois Mayo Taxon Organization from RNA

合挽き肉は１試料からC. coliが検出された。豚は４）

Dataset Operations（IM-TORNADO）ver.2.0.3.2

C. coliの保菌率が高いことが知られており８），そを用いて，東京大学ヒトゲノム解析センターのれが豚肉のカンピロバクター汚染率に影響したと

スーパーコンピューターSHIROKANE（http://

考えられた。また，鶏肉の汚染率は50％未満であsc.hgc.jp/shirokane.html）上で行った。精度の低り，これまでの我々の成績より低かったが，これい 配 列 や キ メ ラ 配 列 を 削 除 し た 後 IM-

は試料数が少ないことや購入店舗が異なることがTORNADO内のmothur ５）を用いて配列が100％原因と考えた。
3 . 2 16S rRNAメタゲノム解析による市販肉一致していた塩基配列をクラスタリングし，１つ細菌叢の特徴の operational taxonomic unit（OTU）と し た 。
OTU配列と97％以上一致する配列の細菌属を3.2.1

主要な構成細菌

Ribosomal Database Project（RDP）データベー

IM-TORNADOで処理後のリード数は17,294～から検索し，各OTUの細菌分類群を属

127,741だった。いずれの試料においてもGood’s

レベルで推定した。それ以降の解析はMacQIIME

coverage値が0.99以上であったことなどから，

ver.1.9.1

データ量は本解析に十分であると考えられた。

スver.11６）

７）を用い，多様度指数の算出や主座標分

平均存在率が５％以上の優占細菌属を比較する析を行った。

と，試料の種類によって構成細菌属の種類や存在

３．結果と考察率 は 異 な っ て い た（Fig. １）。鶏 肉 は 共 通 し て

市販肉からのカンピロバクター検出率

Pseudomonasの存在率が高く，Acinetobacterの増菌培養後にカンピロバクター遺伝子を検出し存在率は鶏内臓肉で高かった。また，鶏内臓肉でた結果，鶏肉ではC. jejuni，豚肉ではC. coliの検は Janthinobacterium が ， 鶏 挽 き 肉 で は出率が高かった（Table１）。ただし豚挽き肉では

Carnobacteriumが多く存在していた。豚内臓肉

C. jejuniのほうが検出率は高かった。また牛肉かは豚精肉と比べてAcinetobacterの存在率が高かっらはカンピロバクター遺伝子が検出されず，牛豚た。また，すべての試料の中でStreptococcusの存

3.1

Table 1 Prevalence of C. jejuni and C. coli in commercial meat
Number of positive/positive rate（%）
Meat type
Chicken

Pork

Number of samples

C. jejuni

C. coli

7

1（14）

0（0）

- cut meat

5

2（40）

2（40）

- mince

7

4（57）

2（29）

- organ meat62

21（34）

30（48）- cut meat

25

5（16）

11（44）- organ meat- mince

11

5（45）

2（18）

Beef

- cut meat

3

0（0）

0（0）

- mince

2

0（0）

0（0）

Beef & Pork

- mince

4

0（0）

1（25）

126

38（30）

48（38）

Total© The Ito Foundation

328

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Relative abundance（%）

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

Organ
meat

Cut meat

Mince

Organ
meat

ChickenCut meatMince

Cut meat

Pork

Mince

Beef

Mince
Beef & pork

Pseudomonas

Acinetobacter

Janthinobacterium

Bacteria＊

Carnobacterium

Psychrobacter

Kocuria

Macrococcus

Streptococcus

Brochothrix

Lactobacillus

Lactococcus

Leuconostoc

Other
＊

Fig. 1 Averaged bacterial genera of each meat type（relative abundance＞5％）． Bacterial taxa thatis not classified as the phylum level．

在率が最も高かった。豚精肉はカット肉，挽き肉と同程度の試料もあり，店舗によって多様度指数

ともにPseudomonas, Carnobacterium, Brochothrixは異なっていたことから，店頭に並ぶまでの工程の存在率が高かった。牛肉，牛豚合挽き肉は共通の違いによって鶏内臓肉の細菌汚染の程度に差がしてLactobacillusの存在率が高く，存在率は10％生じた可能性が考えられた。さらに，肉の種類ご以上だった。

とにカンピロバクター汚染試料と非汚染試料を区3.2.2

別し，それぞれ３試料以上あった鶏挽き肉と豚内多様度指数の比較

試料中に存在する細菌の種類の豊富さを示す多臓肉，豚カット肉について，多様度指数を比較す

様度指数を比較すると，鶏肉では挽き肉が最も高ると，汚染試料のほうが有意に高かった（Table

かった（Table２）。豚肉では内臓肉が最も高く，

３）。このことから，カンピロバクターは細菌に

挽き肉はカット肉よりも高かった。牛肉でもカッよる汚染度が高いものを介して，鶏肉や豚肉を汚ト肉よりも挽き肉のほうが，多様度指数が高かっ染すると示唆された。

た。いずれの肉においても挽き肉の多様度指数が3.2.3

高かったことから，挽き肉に使用された肉が他のカンピロバクター汚染試料と非汚染試料で多様肉に比べて細菌汚染の程度が高かったか，挽き肉

度指数に有意な差が認められたことから，両者の加工自体が細菌汚染の原因と示唆された。また，構成細菌は顕著な違いがあると推測した。そこ

鶏肉も豚肉と同様に内臓肉の多様度が最も高いとで，細菌の量は考慮せず，種類だけを考慮する予想したが，成績は予想に反するものだった。鶏unweighted UniFrac距離を用いて主座標分析を

内臓肉の多様度指数を試料ごとにみると，挽き肉

行 い ，各 試 料 の 構 成 細 菌 の 類 似 性 を 比 較 し た© The Ito Foundation

各試料間の関連性の検証

329

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅲ）
Table 2 Differences of diversity indices among sample types（average±SE）
Meat type
Chicken

Pork

SimpsonShannon

Chao1

Observed OTUs

- organ meat

0.83 ± 0.03

3.37 ± 0.20

85.4 ± 29.7

76.7 ± 26.5

- cut meat

0.83 ± 0.03

3.59 ± 0.31

155.3 ± 17.5

145.8 ± 15.5

- mince0.87 ± 0.02

4.11 ± 0.18

200.8 ± 30.2

178.1 ± 27.1

- organ meat

0.87 ± 0.01

4.24 ± 0.12

242.4 ± 14.8

212.7 ± 12.6

- cut meat

0.82 ± 0.02

3.53 ± 0.18

144.7 ± 13.9

130.2 ± 12.8

- mince0.86 ± 0.03

4.36 ± 0.28

219.3 ± 32.8

201.4 ± 31.3

Beef

- cut meat

0.53 ± 0.04

1.85 ± 0.21

35.9 ± 10.0

31.7 ± 7.8- mince0.81 ± 0.02

3.15 ± 0.19

217.8 ± 16.5

178 ± 25.0

Beef & Pork

- mince0.83 ± 0.01

3.55 ± 0.11

280.7 ± 10.5

258.3 ± 10.5

Table 3 Comparison of diversity indices between Campylobacter positive and negative samples（average±SE）
Meat typeCampylobacter

SimpsonShannon

Chao1

Observed OTUs

Chicken- mince+0.88 ± 0.02

4.51 ± 0.13**

271.4 ± 21.1**

241.2 ± 20.8**-

0.86 ± 0.03

3.63 ± 0.20

116.2 ± 32.6

102.4 ± 27.9

Pork

- organ meat+0.90 ± 0.01*

4.59 ± 0.12**

301.5 ± 17.5**

262.1 ± 14.8**-

0.84 ± 0.03

3.88 ± 0.19

181.2 ± 17.6

161.4 ± 15.4+

0.86 ± 0.02

4.02 ± 0.22**

195.5 ± 19.1**

175 ± 18.7**-

0.79 ± 0.03

3.27 ± 0.23

117.8 ± 15.4

106.4 ± 14.0

- cut meat

* p<0.05（Welch’s t-test）** p<0.01（Welch’s t-test）（Fig.２）。全試料で主座標分析を行うと，カンピある場合が多いと推察された。豚肉試料で主座標

ロバクター汚染試料はプロット図の左側にプロッ分析を行うと，カンピロバクター汚染試料はプトされる傾向が認められた（Fig. 2A）。同一プ

ロット図の右側にプロットされる傾向が認められロット図を試料の種類ごとに記号を分けると，汚た（Fig. 2E, F）。しかし，豚肉では概して，汚染染試料がプロットされた位置には豚内臓肉が多く試料で明確なクラスターは形成されなかったことあった（Fig. 2B）。しかし，豚内臓肉にもカンピから，カンピロバクター汚染肉と非汚染肉の構成

ロバクター非汚染試料は複数存在していたことか

細菌の種類に顕著な違いはなかったと考えられ

ら，豚内臓肉と構成細菌が類似した試料がカンピた。多様度指数が汚染肉で有意に高かったこともロバクターの汚染源だとは考えられなかった。鶏考慮すると，カンピロバクターは細菌汚染の程度

肉試料で主座標分析を行うと，カンピロバクターが高いものを介して肉を汚染するが，その汚染源

汚染試料はプロット図の右側中央にプロットされは鶏肉では内臓よりも精肉で，豚肉では複数存在る傾向が認められた（Fig. 2C, D）。しかし，内臓する可能性があると考えた。

肉の多くは左側にプロットされており，カンピロ

本研究では複数の店舗から市販肉を収集し，肉バクターの汚染源は，内臓肉よりもむしろ精肉での種類ごとのカンピロバクター汚染状況や構成細© The Ito Foundation

330
A

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
B

0.4

Campylobacter（－）
PC3 - Percent variation explained 9.10％

0.3
PC3 - Percent variation explained 9.10％

0.4

Campylobacter（＋）

0.2
0.1
0.0

－0.1
－0.2
－0.3
－0.4
－0.4 －0.3 －0.2 －0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
PC1 - Percent variation explained 24.13％

0.5

D

C

Campylobacter（－）

0.3
0.2
0.1
0.0
－0.1
－0.2

E

－0.3
－0.4 －0.3 －0.2 －0.1 0.0
0.1
0.2
0.3
PC1 - Percent variation explained 37.04％

F

PC2 - Percent variation explained 10.31％

PC2 - Percent variation explained 10.31％

0.1
0.0
－0.1

Organ meatCut meat

0.0

Mince

－0.1

Beef
Cut meat

－0.2

Mince
Beef & pork

－0.3

Mince

－0.4
－0.4 －0.3 －0.2 －0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
PC1 - Percent variation explained 24.13％

0.5

Chicken
Organ meat

0.4

Cut meat
Mince

0.3
0.2
0.1
0.0
－0.1
－0.2

0.4

Pork

0.3

Cut meat
Mince

0.2

0.1
0.0

－0.1

－0.2
－0.3
－0.5 －0.4 －0.3 －0.2 －0.1 0.0 0.1 0.2 0.3
PC1 - Percent variation explained 27.58％

0.1

Organ meat

Campylobacter （－）

0.2

Mince
Pork

0.4

Campylobacter （＋）

0.3

Cut meat0.2－0.3－0.4 －0.3 －0.2 －0.1 0.0
0.1
0.2
0.3
PC1 - Percent variation explained 37.04％

0.4

0.4

Organ meat

0.5

Campylobacter（＋）

0.4

PC2 - Percent variation explained 9.65％

PC2 - Percent variation explained 9.65％

0.5

Chicken

0.3

－0.2
－0.3
－0.5 －0.4 －0.3 －0.2 －0.1 0.0 0.1 0.2 0.3
PC1 - Percent variation explained 27.58％

0.4

0.4

Fig. 2 Comparison of bacterial composition by principal coordinate analysis based on unweighted UniFrac

distances. All samples（A, B）,chicken samples（C, D）,or pork samples（E, F）were used．

菌の特徴を明らかにした。カンピロバクターの汚染源や加工時の交差汚染の実態を明らかにするには，同一店舗で多数の市販肉を収集し調査するな
ど，さらなる研究が必要だと考えられる。

４．要

約

カンピロバクター汚染率は鶏肉，豚肉ともに10～50％程度であり，鶏肉ではC. jejuni，豚肉では© The Ito Foundation

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅲ）

C. coliの検出率が高かった。16S rRNAメタゲノ
ム解析で優占細菌属を比較すると，試料の種類によって構成細菌属の種類や存在率は異なることが分かった。多様度指数はいずれの肉においてもカット肉で低く，挽き肉で高かった。また，カンピロバクター汚染試料と非汚染試料で比較すると，汚染試料のほうが多様度指数は有意に高かった。Unweighted UniFrac距離を用いて主座標分析を行った結果，汚染試料で明確なクラスターは形成されなかったことから，汚染試料と非汚染試料の構成細菌の種類に顕著な違いはなかったと考
えられた。
文
献
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２）
 Inglis, G. D., Kalischuk, L. D.：Use of PCR for
direct detection of Campylobacter species in bovine
feces, Applied and environmental microbiology,
69，3435～3447，2003．
３）
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Tohya, M., Ishida-Kuroki, K., Võ, T. H., Nguyễn, T.
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G, A., Kelley, S, T., Knights, D., Koenig, J, E., Ley, R,
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Pirrung, M., Reeder, J., Sevinsky, J, R., Turnbaugh,P, J., Walters, W, A., Widmann, J., Yatsunenko, T.,
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© The Ito Foundation

332

アフリカ豚コレラの侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅱ）
Epidemiological research on the risk assessment of introduction of Africanswine fever into Japan

杉

浦

勝

明・芳

賀

猛

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Katsuaki Sugiura and Takeshi Haga
（Laboratory of Global Animal Resource Science, Department of Global Agricultural Sciences，Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

With the aim of obtaining information to establish an import risk assessment on Africanswine fever （ASF） and other transboundary animal diseases （TADs） into Japan, aquestionnaire survey was conducted between 1 August and 20 September 2019 on air
travellers arriving into Japan from China. There were 248 responses with 2.8％ of respondents
illegally importing pork products. The quantity imported per traveller varied between 250g
and 2kg. Concerning the travellers' perception in regard to the difficulty of importing a pork
product in their luggage, 32 respondents（12.9％）considered it very easy or rather easy and216（87.1％）very difficult or rather difficult. In regard to the recognition of respondents of theillegality of importing pork products into Japan, seven respondents（2.8％）did not consider
this practice to be illegal whilst 241（97.2％）had some idea of the illegal nature of thisbehaviour. The regression analysis revealed that the practice of illegal importation of pork
products was significantly affected by the level of difficulty perception held by the traveller（p<0.001）and that the difficulty perception is significantly affected by the level of recognitionof illegality by the traveller（p<0.001）. The result of this study will not only provide useful data
in developing a model to assess the probability of introduction of ASF and other TADs into
Japan and other countries, but also in monitoring the effect of measures taken by thegovernment to reduce the illegal importation of meat and meat products．

１．目

国は侵入防止のためにさまざまな対策をとってい的る。しかしながら，多数の国においてTADの侵ヒトや物の国際移動の増加に伴い，アフリカ豚熱（ASF）その他の越境性動物疾病（TAD）が入が報告されており，その原因として肉製品の違法輸入（またはその疑い）があげられる。

国境を越えて広がるリスクが高まっている。これ1997年の台湾への口蹄疫の侵入，1967年およびらの疾病は一旦侵入すると，畜産だけでなく経

2001年の英国への侵入は，肉または肉製品の密輸

済，貿易に大きな影響を及ぼすことがあり，清浄によるものと疑われている。同様に，2000年代初© The Ito Foundationアフリカ豚コレラの侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅱ）

333

頭の一部のヨーロッパ諸国における豚熱（CSF）

国と日本の間の地理的な近接性と動物製品の価格の発生は，イノシシの移動または豚肉製品の違法差は，豚肉製品の違法輸入を促進する要因となる輸入による可能性が高いとされている。ASFに可能性がある。訪日旅行者数が増加すると，日本

ついては，旅行客による豚肉製品の違法輸入，まへの豚製品の違法輸入も増加し，ASFの日本へ

たはASF汚染国から到着した船舶・航空機からの侵入リスクが高まる可能性がある。

の廃棄物の違法処理により清浄国に侵入したケー

本研究は，将来の定量的リスク評価モデルの開スが多数報告されている（1960年代のスペイン，

発に役立てるという期待の下，中国から日本への1970年代のキューバおよびブラジル，最近では豚肉製品の違法輸入に関するデータを収集するこ2007年のモーリシャス，2007～2008年のコーカサとを目的としている。この研究ではまた，日本へ

ス諸国）。

の豚肉製品の違法輸入に関して，旅行者の行動や日本への動物疾病の侵入防止策の検討にあたり侵入リスク評価の実施が定着してきているが，侵入の原因が肉や肉製品の違法な輸入に関連してい認識に影響を与える潜在的要因の特定も試みた。
２．材料と方法

ると認識されているにもかかわらず，肉や肉製品

2.1の違法な輸入による疾病の侵入リスクを評価した

回答者の属性（年齢，性別，訪日目的，滞在期

研究事例は少ない。

アンケート調査

間，同行者の人数）に関する質問に続いて，７つ肉および肉製品の違法輸入に基づく動物疾病のの多肢選択質問と１つの記述式質問からなるアン

侵入リスクを検討した過去の研究で畜産物の違法ケート調査票を作成した。豚肉製品を持ち込んだ

輸入量を定量化することの難しさが主な制約であと回答した者には追加で製品数，種類，重量およることが強調されている。一部のリスク評価でび持込みの目的（自己消費用・プレゼント用）をは，肉および肉製品の違法輸入の確率を税関押収尋ねた。違法性の認識に関する質問については，に関するデータに基づいて推定している。ただ回答者が「非常によく認識している」，「違法であし，そのようなデータは，肉および食肉製品の違ることをある程度知っている」，「聞いたことはあ法輸入全体の一部にすぎない可能性がある。

るがよくわからない」，「聞いたことがない」と回

2018年８月に始まった中国でのASFの流行直答した場合，それぞれ４，
３，
２，
１のスコアを与後に実施された日本への侵入リスクに関する杉浦

えた。同様に，豚肉製品の持込みに関する質問におよび芳賀による先行研究１）で，特に豚肉製品のついては，「非常に難しい」，「やや難しい」，「や違法輸入を介した侵入リスクが最も高いと推定さや簡単」，「非常に簡単だ」と回答した場合，それれている。その後，モンゴル（2019年１月），ベ

ぞれ４，３，２，１のスコアを与えた。

ト ナ ム（2019 年 ２ 月）
，カ ン ボ ジ ア（2019 年 ３

また，アンケート調査票を配布する前に，調査月），香港（2019年５月），北朝鮮（2019年５月），の背景と目的に関する情報を提供し，口頭による

ラ オ ス（2019 年 ６ 月）
，フ ィ リ ピ ン（2019 年 ７

同意が得られた回答者にアンケート調査票を配布

月），ミャンマー（2019年８月），韓国（2019年９した。正直な回答を促すために，アンケート結果月），インドネシア（2019年９月），東チモールは調査目的のみに使用し，機密とするとのメッ（2019年９月）でもASFの発生が報告されASFのセージを調査票の冒頭に示したうえで，匿名で回日本への侵入リスクはさらに高まっている 。中答を回収した。

２）© The Ito Foundation

334

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

調査対象者については，2019年８月１日～９月

ム，ソーセージ，ポークジャーキーであり，すべ

20日まで東京大学の本郷キャンパス，秋葉原，浅て市販品であった。持ち込んだ製品に関する情報

草，上野，銀座，新宿エリアおよび大阪の難波エを記入しなかった回答者１人を除き，輸入目的は

リアの中国人旅行者から無作為に選んだ248人のすべて個人消費であった。持ち込んだ製品の重量

中国人旅行者に配布し回答を回収した。旅行者がは250ｇ～２kgであった（Table１）。

家族または知人を伴い訪日していた場合，家族ま豚肉製品を持ち込むのが難しいか否かの認識にたはグループを代表する者に回答してもらった。

ついては，32人（12.9％）が非常に簡単またはや

2.2

データベース

や簡単と答え，216（87.1％）は非常に難しいか

248人の回答者ごとに回答者の属性，豚肉製品

やや難しいと答えた（Fig. 2A）。豚肉製品の輸入の違法持込みの有無，難易度の認識，違法性の認に関する違法性についての認識については，７人

識に関する回答結果を入力し，データベースを作（2.8％）が豚肉製品の持込みを違法とは認識して成した。難易度の認識と違法性の認識に関するいなかった。残りの回答者は違法性についてなん

データは，それぞれの回答に与えられたスコアにらかの認識を持っていた（Fig. 2B）。

従って，１～４の値を順序データとして入力し豚肉製品の持込みの有無を従属変数とする二項た。滞在期間に関する回答も順序データとして入ロジスティック回帰分析の結果，難易度の認識レ

力した。

ベルを独立変数とする有意なモデルが得られた

2.3（ｐ＜0.001，Ｒ ２ ＝0.49）（Table２）。また，難易

統計分析

まず，違法持込みの有無を従属変数，豚肉製品

度認識のスコアを従属変数とする順序ロジスの違法輸入という行為に影響を与える可能性のあ

ティック回帰分析の結果，違法性レベルを独立変る潜在的要因を独立変数としての単変数二項ロジ数とする有意なモデルが得られた（ｐ＜0.001，

スティック回帰分析を実施した。次に，難易度知R２CS＝0.205）（Table３）。

覚のスコアを従属変数とし，不法輸入が困難であ

日本農業新聞が５月中旬から６月上旬に実施しると旅行者に思わせる潜在的要因を独立変数としアンケート調査３）で中国人旅行者の８％が豚肉製て単変数順序ロジスティック分析を実施した。い品を違法に持ち込んでいたとの調査結果を考える

ずれの回帰分析においても，ｐ値が0.05未満の独と，その後の３か月間で違法輸入の割合が大きく

立変数を最終モデルに採用した。統計分析は，減少していることが明らかとなった。おそらく，

BellCurve for Excel ver. 3.00（Social Survey

2019年４月22日以降，航空旅客による食肉およびResearch 150 Information Co., Ltd.）をアッドオ

食肉製品の違法輸入に対する措置の強化，ポス

ンしたExcel 2010（Microsoft Corporation）を用

ターや機内放送を用いた啓発，肉および肉製品のいて行った。

違法輸入者に対する罰則の強化，検疫探知犬の増加など，日本政府がさまざまな措置を導入したこ

３．結果と考察とによるものと考えられる。

248人の回答者の訪日目的および滞在期間別の

また，中国でのASFの発生による豚肉の生産割合は，Fig.１のとおりである。豚肉製品の違法量の減少に伴い，中国内での豚肉価格が上昇した

輸入の割合については，７人（2.8％）が豚肉製ことも，豚肉製品を日本に持ち込む経済的優位性

品を違法に持ち込んだ。持ち込まれた製品は，ハを低下させた可能性がある。

© The Ito Foundation

335

アフリカ豚コレラの侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅱ）
More than

Other
1.2%
Business
Study
6.0%
8.5%

1 month to less 3 months
than 3 months 10.1%
1.2%

A

1 week to lessthan 1 month
27.0%
Tourism
84.3%

B

Less than 1 week
61.7%

Fig. 1 Proportions of respondents by purpose of visit（A）and duration of stay（B）
Table 1 Details of the pork products illegally imported by Chinese travelers visiting Japan as a result of

the questionnaire survey conducted from 1 August to 20 September 2019

Case No.

Purpose of visit

Pork product brought inApproximate quantity

Use

1
2

Business

Ham

2kg

Personal consumption

Tourism

Ham

--a

--a

3

Tourism

Sausage

500ｇ

Personal consumption

4

Tourism

Sausage

300ｇ

Personal consumption

5

Business

Jerky

400ｇ

Personal consumption

6

Tourism

Jerky

600ｇ

Personal consumption

7

Tourism

Jerky

250ｇ

Personal consumption

aThe respondent did not disclose exact information.

Very easy
1.2%

A

Rather
easy
11.7%

Have
heard
about itbut not
clear
12.1%

Have neverheard of it…

B

Understandvery well
44.0%

Very diﬃcult
44.0%
Know it isillegal41.1%

Rather
diﬃcult
43.1%

Fig. 2 Proportions of respondents by difficulty perception（A）and illegality recognition（B）

日本農業新聞の調査と今回の調査とで豚肉製品加している（93％から97％）。動物検疫所によるの持込みを難しいとする旅行者の割合が大幅に増

啓発キャンペーンが効果的であったことが示唆さ加している（69％から87％）。また，豚肉製品のれる。

持込みの違法性を認識している旅行者の割合も増

ロジスティック回帰分析により，旅行者の違法© The Ito Foundation

336

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 2 Result of logistic regression analysis identifying factors that may affect the behavior ofillegal importation of pork products using data of 248 Chinese air travelers visiting Japan
Variable

Coefficient（β）

Odds ratio（95％CI）

p value

Difficulty perception－3.5220.030（0.004―0.221）＜0.001

Constant term

5.199

181.132（2.746―11947.4）

0.015

Model statistics

p＜0.001，R２＝0.490

Table 3 Result of ordinal logistic regression analysis identifying factors that may affect thedifficulty perception using data of 248 Chinese air travelers visiting Japan
Coefficient（β）

Odds ratio（95％CI）

p value

Illegality recognition

Variable

1.238

3.449

（2.469―4.890）＜0.001Threshold （Difficultyscore 1/2）

－0.9020.406（0.093―1.771）＜0.001Threshold （Difficultyscore 2/3）

1.737

5.678

（1.977―16.308）＜0.001Threshold （Difficultyscore 3/4）

4.330

75.958（23.042―250.393）＜0.001Model statistics

p＜0.001，R２Cox-Snell＝0.205

輸入の難易度の認識と行動および難易度と違法性

法輸入の割合（2.8％）から，調査対象となったの認識レベルとの間の有意な関連性が明らかにな

旅行者が一般的な中国人旅行者を代表しているとり，旅行者は豚肉製品を持ち込むことの違法性に仮定すると，中国からの約17万人の旅行者が毎年ついて認識しているほど，豚肉製品を持ち込むこ

違法に肉や肉製品を持ち込んでいる可能性があとを難しいと認識し，その認識は最終的に違法輸る。これは，検疫探知犬や税関職員による尋問に入の実際の行動に反映されていた。アンケート調よって摘発された豚肉製品の違法輸入件数の3.8査に使用された回答者のサンプルサイズが小さ倍（2018年42,280件）であり，空港での摘発件数かったことから，回帰モデルの統計的検出力は限は氷山の一角であることを示している。航空旅客

定的で，いずれのモデルも有意なリスク要因を１が肉や肉製品を違法に輸入し，その後国内の豚につ し か 特 定 で き な か っ た 。ま た ，順 序 ロ ジ ス

給与されることで，ASFその他のTADが日本に

ティック回帰モデルのＲ２乗値は低く（R ２ CS ＝侵入するリスクが実際にある。飼育豚への曝露に0.205），中国の旅行者の違法性の認識を集団とし至る経路を特定し，このリスクを定量化するにて予測できるが，個人ベースでは予測できないこ

は，追加データを用いたさらなる研究が必要であとが示された。これらの結果は，航空旅行者による。

る豚肉製品の違法輸入を減らすために，啓発キャ

アンケートには，豚肉製品の違法輸入に関するンペーンが有効であることを示唆している。中国

質問が含まれ，反応バイアス（社会的望ましさバの旅行者を対象とした啓発キャンペーンの継続・イアス）が生じる可能性がある。アンケート調査

強化の重要性が示された。

を実施する際に匿名性と機密性を確保することで中国から日本を訪れる航空旅行者の数（2018年

このバイアスを最小限に抑えようとした。しかしには約600万人）とこの調査で明らかになった違ながら，本研究結果を解釈する際には，このバイ© The Ito Foundationアフリカ豚コレラの侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅱ）

337

アスにより一部の変数が過小または過大評価され品の違法輸入を最小限にするためにとられた措置

る可能性があることに留意する必要がある。

の有効性を確認するとともに，日本へのASFそ４．要の他のTADの侵入リスク評価モデルを開発する

約のに有用な情報を提供する。

アフリカ豚熱が中国などで発生し，日本への侵入が危ぶまれるなか，2019年８月～９月，中国人
旅行者248人を対象に豚肉製品の持込みの実態を把握するためのアンケート調査を実施した。その結果，７人（2.8％）の回答者が豚肉製品を持ち込んでいることが判明し，一人当たり250ｇ～２kgを持ち込んでいた。持込みは「簡単だ」また
は「少し簡単だ」と考える人は32人（12.9％），
７人（2.8％）は違法性の認識を持っていなかった。回帰分析の結果，違法性の認識が高い人ほど持込みを困難と考え，持込みを控える傾向がある

文献１）
 Sugiura, K., Haga, T.：A rapid risk assessmentof African swine fever introduction and spread inJapan based on expert opinions, J Vet Med Sci, 80,
1743～1746, 2018. https://doi.org/10.1292/jvms.180543
２）
 World Organisation for Animal Health（OIE）：
Situational updates os African swine fever in Asiaand the Pacific, 2020. https://rr-asia.oie.int/en/
projects/asf/situational-updates-of-asf-in-asiaand-the-pacific/
 Obara, H., Sekiyama, H.：Meat products from３）countries with outbreaks of African swine fever,
The Japan Agri News, 2019 June 11. https://www.
agrinews.co.jp/p47896.html

ことが示された。この研究結果は，肉および肉製© The Ito Foundation

338

牛におけるPTH/PTHrP受容体シグナルの肥満とインスリン抵抗性への関与
Influence of PTH/PTHrP receptor signals for obesity and insulin
resistance in dairy cows

恩

田

賢・風

間

啓

（麻布大学獣医学部）

Ken Onda and Kei Kazama（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

Fat cows in transition period become easy to suffer from many types of periparturient
disorders because of fat mobilization, insulin resistance and fatty liver. It is a desirable thingthat body condition score of the obese cow decreases, but the skeletal muscle atrophy must
avoid in astasia cow. Therefore, at first, we investigated the expressions of amyotrophy related
genes in the muscle which is the biggest insulin sensitivity organ in the body. And next, weconsidered whether RQUICKI（surrogate index of insulin resistance）and kynurenic acid（tryptophan metabolite）were useful for the insulin-resistance evaluation in cows. As a result,the gene expression of FBXO32, which is a responsible gene for amyotrophy, in the quadriceps
femoris muscle suffering atrophy of the arthritis calf is higher than that of the healthy cow,
and it became clear that the ubiquitin proteasome pathway participated in amyotrophy in thecalf. In addition, the value of RQUICKI of fat cow group divided by BCS and BHBA wasstatistically lower than that of healthy cow group and it supposed insulin sensitivity decreased.
However, the rise of serum kynurenic acid concentration was not detected in fat cows（Healthy
cows：5.31±1.41 mM, Fat cows：6.10±1.83 mM, no significant difference）. It is necessary to
carry further research out considering specific tryptophan metabolism of the ruminant animals
and we need to elucidate the mechanism of obesity and insulin resistance in dairy cows．

１．目症する。また，体重の40％を占める筋肉は最大の的インスリン感受性臓器であるが，脂肪沈着すると乳牛において周産期は最も疾病に罹患しやすい

インスリン感受性が低下する。さらに，この時期時期であり，その背景には負のエネルギーバランには筋肉よりアミノ酸を動員して糖新生するたスが大きく影響している。不足したエネルギー分

め，25％も筋線維が細くなることが知られておを蓄積した体脂肪から動員する際に，非エステル

り，このこともインスリン抵抗性増大の原因とな化脂肪酸（NEFA）が肝臓や筋肉などさまざまなる１）。不適切な飼養管理により過肥になった牛ほ組織に中性脂肪として沈着する。肝臓に沈着する

ど脂肪肝の程度は重く，ケトーシスは重篤になと牛は容易に脂肪肝となり，Ⅱ型ケトーシスを発り，治癒が困難になる。しかし，過肥牛のボディー© The Ito Foundation

牛におけるPTH/PTHrP受容体シグナルの肥満とインスリン抵抗性への関与

コンディションスコア（BCS）を乾乳期に下げることは，より重篤な脂肪肝を引き起こす危険性があり，その対応が非常に難しい２）。

２．方

339

法

本研究にかかわる動物実験のすべては，麻布大カルシウムとリンの代謝には，副甲状腺ホルモ

学 動 物 実 験 委 員 会 の 許 可 を 受 け（承 認 番 号：

ン（PTH）と副甲状腺ホルモン関連タンパク質160616-3），麻布大学動物実験指針を遵守し計画（PTHrP）が重要な役割を果たしている。近年，どおりに行った。

両者に共通のＧタンパク質結合型受容体である

2 . 1 牛の筋肉におけるPTH1Rはじめ代謝関連遺伝子の発現

PTH１型受容体（PTH1R）からのシグナルを介して，白色脂肪細胞に脱共役タンパク質（Ucp1）2.1.1の発現を誘導し，エネルギーを熱として放散する

予後不良と判断された，繁殖障害のホルスタイ

ことによって，脂肪細胞が縮小することが報告さ

ン種成雌牛（３歳齢）と，左側後肢足根関節の関れた 。さらに近年，筋肉におけるカルシウムポ節炎に罹患したＦ１去勢子牛（２ヶ月齢）の２頭

ンプの負の調節因子であるサルコリピンが発見さが安楽殺された後，ただちに組織（大腿四頭筋ほれ，ATP浪費により非ふるえ熱産生を起こし，か）を採取し－20℃で保存した。

３）

体脂肪を減少することも報告された ４）。また，

動物

2 . 1 . 2 １本鎖相補的DNA（cDNA）の合成とPCR法による遺伝子増幅

PTH1Rからのシグナルはタンパク質合成の刺激因子であるインスリン様成長因子１を抑制し，骨凍結組織を細切し，常法にてトータルRNAを格筋におけるタンパク質分解に関与する，ユビキ

抽出後，逆転写酵素によって１本鎖cDNAを合成

チン・プロテアソーム系とオートファジー系などし た 。 FBXO32 ，サ ル コ リ ピ ン ，PTHrP ，の経路を刺激することによって，筋萎縮の原因とPTH1R ， GAPDH （glyceraldehyde 3 phosphate

なることが明らかとなった 。

dehydrogenase）のプライマーを作成し（Table１），

３）

痩せるといっても，肥満牛の脂肪が減少するこ

PCR法にて遺伝子の増幅を調べた。

とは望ましいことであるが，起立不能牛の骨格筋

2.2

周産期乳牛のインスリン抵抗性の評価

減少は，より起立を困難にさせて問題である。そ2.2.1

こで本研究ではまず，牛においてもインスリン感

９酪農場で飼養されていた，分娩後２週間以内

受性臓器である筋肉に，非ふるえ熱産生を引き起のホルスタイン種成雌牛22頭を実験に用いた。供こすサルコリピン，筋萎縮原因遺伝子とされる

試牛はボーディーコンディションスコア（BCS）

FBXO32（F-box protein 32）の遺伝子発現の有が ４ 未 満 で ，か つ 血 中 β - ヒ ド ロ キ シ 酪 酸

無について検討した。さらに，乳牛においてはイ（BHBA）濃度が1.2mM未満の12頭と（健常群），

ンスリン抵抗性の評価方法が確定していないこと

BCSが４以上で，かつ血中BHBA濃度が1.2mM以から，サロゲートインデックスとして医学で用い上の10頭に群分けした（過肥群）。

動物

られるRQUICKIの有用性，さらに近年インスリ

2.2.2

採材方法

ン抵抗性の指標として注目されている，トリプト

採血は頸静脈から行い，血液の凝固後に遠心分

ファン代謝産物のキヌレン酸が，乳牛においても離し，得られた血清は分析するまで－20℃で保存有用なマーカーになるかを検討した。

した。血中BHBA濃度は採血直後に，プレシジョ
ンエクシード（アボットジャパン，東京，日本）© The Ito Foundation

340

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 1 Primer sequences used in this experiment.
Primer（nt）

Sequence（5’to 3’）

Swine Sarcolipin

Forward271-290

GTCCTTGACGCTGTTCAGGA

Reverse799-780

TTGGTTGCTGAGTGTGGGTTBovine FBXO32

Forward515-539CAAGAAGAGAAAGAAGGACATGCTG

Reverse869-845

GGTACATAAGGATGTGTAGAGGGTCBovine PTHrP

Forward

71-95

GTGGTGTGGAAAAAACACGGTT

Reverse554-534

TCTTTTCCTGCTCCTTGCGTTBovine PTH1R

Forward1566-1585

GCGAGGTACAGGCTGAGATC

Reverse2020-2001

ACTGTCCAACAACCCGTCTC

Bovine GAPDH

Forward490-509

ACCACTGTCCACGCCATCAC

Reverse942-922

TCCACCACCCTGTTGCTGTA

Product size（bp） Accession number
529

NM_001044566.2

355

NM_001046155.1

481

AB097837

455

NM_001075332.1

453

U85042.1

FBXO32：F-box protein 32, PTHrP：parathyroid hormone-related protein, PTH1R：PTH type 1 receptor, GAPDH：
glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase.

を用いて測定した。
2.2.3

３．結果と考察分析項目⑴ RQUICKIはインスリン感受性の指標であり，その値が低いほどインスリン感受性が低いと考えられている。その算出のために以下の３項目

3 . 1 牛の筋肉におけるPTH1Rはじめ代謝関連遺伝子の発現牛の筋肉におけるPTH1Rはじめ筋萎縮や非ふを測定し，計算式に代入して値を求めた。

るえ発熱などに関連する遺伝子の発現を検討した＋log insulin
RQUICKI＝1/［log glucose（mg/dl）

ところ，FBXO32とサルコリピンは今回用いたす（μU/ml）＋log NEFA（mM）］

べてのサンプルにおいて遺伝子発現が認められた①血清グルコース濃度（Cobas6000，ロシュ・ダ（Fig.１）。PTHrPはＦ１子牛の健康な右側大腿四イアグノスティック，東京，日本）。②血清インスリ頭筋のみでわずかな発現を認めたが，他の部位でン活性値（Bovine Insulin ELISA Kit, Merucodia,は認めなかった。また，PTH1Rはホルスタイン

Osaka, Japan）。③血清NEFA濃度（NEFA Test

種成雌牛ではその遺伝子発現が認められなかった

Waco C，和光純薬，東京，日本）。

が，関節炎Ｆ１子牛では認められ，筋萎縮した左⑵ インスリン抵抗性の指標として，トリプト

側後肢の大腿四頭筋で，右側健康肢よりも発現がファン・キヌレニン経路の代謝産物である以下の３項目を測定した。

多かった。
FBXO32はラット筋萎縮モデルの網羅的解析に① 血 清 ト リ プ ト フ ァ ン 濃 度（L-Tryptophan

よって同定された筋萎縮原因遺伝子であり，そのELISA kit, ImmuSmol, Talence, France）。② 血

遺伝子産物はSCF複合体型ユビキチンリガーゼに

清 キ ヌ レ ニ ン 濃 度（L-Kynurenine ELISA kit,

属する。癌などの悪液質で骨格筋が委縮すること

ImmuSmol）。③血清キヌレン酸濃度（Kynurenicが知られていたが，これにFBXO32が関与するこAcid ELISA Kit, Cloud-Clone, Texas, USA）。

とが明らかとなり，インスリン抵抗性の上昇やサ
ルコペニアの原因になると考えられている。本研© The Ito Foundation

牛におけるPTH/PTHrP受容体シグナルの肥満とインスリン抵抗性への関与発現が認められ，サルコリピンの発現においてQuadriceps femoris muscle
Cow
Healthy

も，PTH1R遺伝子発現が観察されない成牛よりPatient calf
Atrophy

341

Healthy

FBX032も，子牛でやや多いことが分かった。起立不能や筋委縮は，牛や馬などの大型産業動物においては予後不良の大きな要因であり，PTH1Rシグナル

Sarcolipin

がFBXO32とサルコリピンを介してどのように筋萎縮を引き起こすか，メカニズムの解明が期待さ

PTHrPれる。また，子牛では関節炎だけでなく，骨折やPTH1R脱臼などの運動器疾患も，その後の発育と生産性

GAPDHに 大 き く 関 与 す る こ と か ら ，予 後 の 判 断 に もFig. 1 Gene expressions of FBXO32（F-box protein 32）,

sarcolipin, PTHrP（parathyroid hormone-related
protein）,PTH1R（PTH type 1 receptor）and GAPDH（glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase）in thequadriceps femoris muscle of a healthy cow and a calf
suffering from arthritis. Atrophy：atrophy muscle in theleft hindlimb because of arthritis．

PTH1Rシグナルが活用できないか検討したい。
3.2

周産期乳牛のインスリン抵抗性の評価

健常群と過肥群の血清グルコース濃度，血清イ
ンスリン活性値，血清NEFA濃度を比較したところ，過肥群の血清NEFA濃度が健常群よりも有意に高値を示した（Table２）。上記３項目からインスリン感受性の指標であるRQUICKIを算出した究において当初，乳熱やダウナー牛症候群に罹患

ところ，過肥群で健常群に比べ有意に低値を示した成乳牛の筋肉を用いる予定であったが，実験

し，過肥群のインスリン感受性が健常群に比べて期間中に検体を得ることができなかった。そこ低下していると考えられた（Fig.２）。分娩後３で，重度関節炎で予後不良となったＦ１子牛の大週間以内の健康な乳牛237頭のRQUICKIが0.48±

腿四頭筋を用いて，FBXO32の遺伝子発現を検討

0.15という報告と比較しても５），本研究におけるした。その結果，負重が可能であった右側後肢で過肥群のRQUICKIの値は顕著に低値であり，イはなく，負重不可能で明らかな筋萎縮が認められンスリン感受性の低下が推測された。

た左側後肢の大腿四頭筋で，FBXO32遺伝子発現

トリプトファン・キヌレニン経路の代謝産物でが多いことが明らかになった。このことは，体重ある，トリプトファン，キヌレニン，キヌレン酸

や寿命，糖脂質代謝が大きく異なる牛においての血清濃度については，キヌレニンにのみ有意差

も，筋萎縮にユビキチン・プロテアソーム系のタが認められ，健常群に比較して過肥群で高値を示

ンパク質分解が関与している可能性を示したもの

した（Table３）。血清キヌレン酸濃度において健といえる。

常群と過肥群の間に有意な差が認められなかった

以前は非ふるえ発熱による体温維持と体脂肪のことは，ヒトや実験動物の肥満で知られるよう調整についてはUcp１が最も重要とされていた

な，血清キヌレン酸濃度の上昇に由来するインスが，現在では筋肉に発現するサルコリピンのほう

リン感受性の低下が牛では認められなかったことがより影響が大きいと考えられている。今回は成になり，過肥群のRQUICKI低値を裏付ける結果

牛においてはPTH1R遺伝子の増幅が観察されなとならなかった。トリプトファンからキヌレン酸

かったが，子牛においては健康肢でも罹患肢でもに代謝される過程において，トリプトファン2,3-© The Ito Foundation

342

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 2 Serum concentrations of glucose, insulin and nonesterified fatty acid（NEFA）in

postparturient Holstein dairy cows.
Items

Healthy cows

Fat cows（n = 12）（n = 10）

Glucose（mg/dl）

61 ± 1059 ± 17

Insulin（mU/ml）

6.58 ± 1.77

5.89 ± 1.93

NS
NS

NEFA（mM）

0.43 ± 0.18

1.10 ± 0.58

P < 0.05

Healthy cows：BCS < 4 and BHBA <1.2 mM. Fat cows：BCS ≧ 4 and BHBA ≧ 1.2 mM. BCS：
body condition score. BHBA：β - hydroxybutyric acid. NS：not significant. Mean ± SD.

Table 3 Serum concentrations of tryptophan（TRP）, kynurenine（KYN）and kynurenicacid（KYNA）in postparturient Holstein dairy cows.

TRP（mM）
KYN（mM）
KYNA（mM）

Healthy cows

Fat cows（n = 12）（n = 10）22.2 ± 7.51
4.82 ± 1.35
5.31 ± 1.41

16.74 ± 7.19
5.50 ± 1.66
6.10 ± 1.83

NS
P < 0.05
NS

Healthy cows：BCS < 4 and BHBA <1.2 mM. Fat cows：BCS ≧ 4 and BHBA ≧ 1.2 mM. BCS：
body condition score. BHBA：β - hydroxybutyric acid. NS: not significant. Mean ± SD.

肝臓，腎臓，および脳で発現している。本研究でp＜0.05得られた牛のキヌレン酸の濃度は，ヒトの基準値

0.6

RQUICKI（40.6±16.1nM）よりも非常に高い値だが ６），牛は他の動物種と比較し，TDOの酵素活性が低い

0.4

ことが知られている７）。肝臓でのTDO活性が低い
場合は，IDOによる代謝に依存する傾向があり，

0.2

IDOが多く存在する肺や胎盤でのトリプトファン
0.0

代謝量が増加する８）。肝臓で代謝されたトリプト
Heaithy cows
（ｎ＝12）

Fat cows（ｎ＝10）

Fig. 2 RQUICKI value in postparturient Holstein dairy

cows. Healthy cows：BCS < 4 and BHBA＜1.2 mM.
Fat cows：BCS≧4 and BHBA≧1.2mM. BCS：bodycondition score. BHBA：β - hydroxybutyric acid.
Mean±SD．

ファンは最終的に水と二酸化炭素に分解されるが，肺などで代謝されたトリプトファンはキヌレ
ン酸となり血中に放出される。これらのことか
ら，牛で血中キヌレン酸濃度が高値を示した要因
として，肺や胎盤のIDOに依存したトリプトファン代謝経路の活性化が，血中キヌレン酸濃度の増加に影響を及ぼしていると推測した。

ジオキシゲナーゼ（TDO），インドールアミン

なお3. 2の内容は，第162回日本獣医学会学術集

2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO），キヌレニンアミ会（令和元年９月11日，茨城県つくば市）で，「周ノトランスフェラーゼ（KAT）の３つの酵素が産期ホルスタイン種乳牛におけるキヌレニン代謝

関与している。ヒトやマウスでは，TDOは主に産物の特徴」として口頭発表した９）。

肝臓に発現しており，IDOは肺や胎盤，KATは© The Ito Foundation

牛におけるPTH/PTHrP受容体シグナルの肥満とインスリン抵抗性への関与

４．要

343

して，乳牛の肥満とインスリン抵抗性発現のメカ

約

ニズムを解明したい。

不適切な飼養管理により過肥になった牛はイン
スリン抵抗性が増加するなどして，さまざまな周産期疾患に罹患しやすくなる。肥満牛の脂肪が減少することは望ましいことであるが，起立不能牛の骨格筋減少は避けなくてはいけない。そこで本研究ではまず，牛においてもインスリン感受性臓器である筋肉における関連の遺伝子発現について
検 討 し ，次 い で イ ン ス リ ン 抵 抗 性 の 評 価 に
RQUICKIとキヌレン酸が有用かを検討した。その結果，関節炎子牛の筋萎縮が認められた大腿四頭筋でFBXO32遺伝子発現が多いことが分かり，牛においても筋萎縮にユビキチン・プロテアソー
ム系のタンパク質分解が関与していることが明らかとなった。またBCSとBHBA濃度で群分けした
過肥群のRQUICKIの値は顕著に低値であり，イ
ンスリン感受性の低下が推測されたが，血清キヌレン酸濃度の上昇は認められなかった。今後は反芻動物の特異なトリプトファン代謝の関与も考慮

文
献１）
 Bell, A. W.：J. Anim. Sci., 73, 2804～2819, 1995．
２） Bobe, G., Young, J. W., Beitz, D. C.：J. Dairy Sci.,
87, 3105～3124, 2004．
３）
 Kir, S., Komaba, H., Garcia, A. P., Economopoulos,
K. P., Liu, W., Lanske, B., Hodin, R. A., Bruce, M.,
Spiegelman, B. M.；Cell Metab., 23, 315～323, 2016．
 Bal, N. C., Maurya, S. K., Sopariwala, D. H., Sahoo,
４）
S. K., Gupta, S. C., Shaikh, S. A., Pant, M., Rowland,
L. A., Bombardier, E., Goonasekera, S. A., Tupling,
A. R., Molkentin, J. D., Periasamy, M.：Nat. Med.,18, 1575～1579, 2012．
 Holtenius, P., Holtenius, K.：Acta Vet. Scand., 49,
５）29～49, 2007．
６）
 Wurfel, B. E., Drevets, W. C., Bliss, S. A.,
McMillin, J. R., Suzuki, H., Ford, B. N., Morris, H. M.,
Teague, T. K., Dantzer, R., J B Savitz, J. B.：
Transl. Psychiatry, 7, e1115, 2017.
７）
 Badawy, A. A., Evans, M.：Biochem. J., 158, 79～
88, 1976．
 Shibata. K.： J. Nutr. Sci. Vitaminol.（Tokyo）, 64,８）90～98, 2018．
９） 興梠一成，小川いづみ，竹田湊一朗，風間啓，佐藤礼一郎，恩田賢：第162回日本獣医学会学術集会・
講演要旨集，45, 2019．

© The Ito Foundation

344

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究―飼養成績と免疫能に及ぼす影響―
A study on requirements of lysine in weanling pigs
―Effects on growth performances and immune functions―

勝

俣

昌

也・鈴

木

武

人

（麻布大学獣医学部）

Masaya Katsumata and Takehito Suzuki（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

We conducted this study in order to determine lysine requirements of weanling-growing
pigs estimated from their growth performances. Further, we also determined the effects of
dietary lysine concentrations on ratios of subclasses of leukocytes in weanling-growing pigs.
We prepared four tests diets of which concentrations of lysine were 0.95, 1.20, 1.70, and 1.95％ ,respectively and fed these diets to 5-week old barrows for 3 weeks. We estimated a lysine
requirement of weanling-growing pigs from feed efficiencies during the latter 2 weeks of thefeeding trial using broke-line regression analysis; the estimation is 1.69％ as the concentrationof total lysine in diets. The dietary lysine concentrations did not affect the magnitudes ofincrease in the ratios of subclasses of leukocytes during the feeding trial. Dietary lysine levels
may not affect development of immune functions of weanling-growing pigs．

１．目

パク質蓄積能力が高い豚を視野に入れて新しい的データを採用した。このことが，20％以上のちが本研究は，離乳育成豚のリジン要求量を，飼養

いにつながっている。農林水産省の「豚の改良増成績と免疫能，２つの切り口から明らかにするこ殖をめぐる情勢」によると，1980年代の肥育豚のとを目的として実施した。

１日平均増体量は749g/dだったのに対し，2010

日本飼養標準・豚（2013年版） によると，体年代になると1057g/dまで改良された。したがっ重10～20kg（期待増体量470g/d）の豚の総リジ

１）て，日本飼養標準・豚（2013年版）に記載され

ン要求量は飼料中含量として1.13％である。一方，ているリジン要求量を参考にして飼料を調製する

２）
米国のNRC飼養標準（2012年版）
では，体重11と，リジン不足に陥るおそれが大きい。本研究で～25kg（同 585g/d）の 豚 の 総 リ ジ ン 要 求 量 はは，日本国内で飼養されている豚のアミノ酸要求1.40％となっている。NRC飼養標準に記載されて量を再検討する一環として，離乳育成豚のリジン

いるリジン要求量のほうが20％以上高い。日本飼要求量を明らかにする。

１）

養標準では1980年代のデータを使って推定していアミノ酸には，体タンパク質合成の材料となるるのに対し，NRC飼養標準では多産系などタン「栄養素としての一次機能」のほかに，生体制御© The Ito Foundation

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究

345

や疾病の予防に寄与する「栄養素としての三次機

晶アミノ酸を添加して調製した。後半２週間の飼能」がある。デキストラン硫酸ナトリウム投与で料効率を指標としてSASのNLINプロシジャ―で大腸炎を誘起したマウスにメチオニンを給与する

折れ線モデル（ガウス・ニュートン法６））にあてと，大腸炎の症状が緩和され，抗酸化ストレス指

はめ，総リジン要求量を推定した。さらに，飼養標が改善し，大腸の炎症性サイトカイン含量が低試験開始前と終了時に供試豚から採血し，末梢血下した 。また，分岐鎖アミノ酸が不足した飼料

中の白血球サブクラスを解析した。具体的には，をマウスに給与すると免疫能が低下した４）。さらフローサイトメーターで白血球5,000個あたりのに，飼料に添加するアミノ酸の量を減らすと子豚

各標的細胞数を測定して各標的細胞が全体に占めの増体効率は悪くなるが，清浄度が低い環境ではる率を計算した。使用した一次抗体は，ヘルパー

一層効率が悪くなった 。これらのことは，アミＴ細胞が抗CD４抗体，細胞傷害性Ｔ細胞が抗CD

ノ酸が不足すると免疫能が低くなること，アミノ８抗体，単球が抗CD14抗体，成熟Ｂ細胞が抗酸の要求量は飼育環境の清浄度に依存することを

CD21抗体，NK細胞が抗CD335抗体であった。さ示唆している。しかし，アミノ酸の要求量というらに，抗CD４抗体と抗CD８抗体の両方に陽性を切り口で，豚の免疫能を詳細に解析した報告はな

示す細胞をCD4/CD８両陽性Ｔ細胞として測定しい。本研究では，アミノ酸の要求量と免疫能の関

た。

３）

５）

係を解明する第一歩として，飼料中のリジン濃度

飼養成績に関する統計処理；反復をブロック，が離乳育成豚の血液中の白血球サブクラスの割合

飼料のリジン濃度を要因とし，乱かい法にのっに及ぼす影響を明らかにすることも目的とした。

とった１元配置の分散分析をSASのGLMプロシ

２．方ジャで実施して，飼養成績に及ぼす飼料のリジン法

濃度の影響を検定した。リジン濃度の影響を検出

本研究は麻布大学動物実験委員会により審査さした飼料効率については，SASのGLMプロシジャ

れ，承認を受けて麻布大学の豚舎施設で実施したでTukey法により，平均値間の差を検定した。リ

（承認番号190701-4）。４週齢の去勢雄豚（品種名

ジン要求量の推定；SASのNLINプロシジャ―をスイートマミー）を株式会社シムコの館山農場か使い，ガウス・ニュートン法で折れ線モデルにあら導入した。導入後の１週間は市販人工乳を給与てはめて，リジン要求量を推定した。白血球サブ

して予備飼育期間とし，その後，総リジンとしてクラスに関する統計処理；全供試豚14頭の白血球

0.95％，1.20％，1.45％，1.70％，1.95％の５種類

サブクラスの試験開始前の割合と終了時の割合のの飼料を給与して３週間飼育した。これらの試験差を，サンプルの採取時を固定効果，豚をランダ

飼料は試験担当者が設計し，一般社団法人科学飼

ム効果とし，SASのMIXEDプロシジャ上で検定料協会に配合を外注した。なお，試験期間中は１した。反復をブロック，飼料のリジン濃度を要因

豚房に１頭を収容し，不断給餌，自由飲水，午前とし，乱かい法にのっとった１元配置の分散分析

７時点灯・午後７時消灯の条件とした。飼育室のをSASのGLMプロシジャで実施して，各白血球

気温は制御しなかったが，床暖房とコルツヒー

サブクラスの割合が試験期間中に増加した割合にターを使い，床暖房直上の温度は33～34℃になる

及ぼす飼料のリジン濃度の影響を検定した。なようにした。試験飼料は，トウモロコシ，大豆粕，

お，京都大学学術情報メディアセンターのスー

魚粉，脱脂粉乳をベースとし，リジンを含めた結パーコンピューターを使ってSASによる解析を実© The Ito Foundation

346

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

率は0.70という推定値を得た。ガウス・ニュート

施した。

ン法による解析では推定値の95％信頼区間が示さ

３．結果と考察れ て お り ，総 リ ジ ン 要 求 量 の 高 い ほ う の 値 は方法に記載したように，総リジン濃度が0.95％，

1.69％であった。要求量の推定値は安全率も考慮

1.20％，1.45％，1.70％，1.95％の５種類の飼料をする必要があるので，本報告では総リジン要求量調製した。確認のためにリジン濃度を測定したとの推定値は1.69％を採用する。前述したように，

ころ，総リジン濃度1.45％として調製した飼料の１）
日本飼養標準・豚（2013年版）に記載されていリジン濃度が，1.20％として調製した飼料と同じ

る体重10～20kg（期待増体量470g/d）の豚の総濃度だった。そのためか，1.45％の飼料を給与しリジン要求量は1.14％である。本研究の供試豚のた供試豚の飼料効率が0.64となり，1.20％の飼料

飼養試験後半２週間の体重は10～20kgに相当すを給与したものより低くなった。また，日増体量

るが，日増体量は745～827g/dだった（Table１）。

は735g/dで0.95％の飼料を給与したものより低く

仮に期待増体量750g/d，飼料摂取量1000g/d，離なった。以上のことから，1.45％の飼料は調製に

乳育成豚用の人工乳の回腸末端リジン消化率を問題があったと判断し，総リジン濃度が0.95％，

１）90％とし，日本飼養標準・豚（2013年版）
で採

1.20％，1.70％，1.95％の４種類の飼料を給与し用されている推定式（１kgの増体に必要な標準

た供試豚から得たデータを本報告書に示す。

化可消化リジンは17.4ｇ）を使って総リジン要求

Table１に飼養成績を示す。飼料摂取量に飼料量を計算すると1.45％となる。これはNRC飼養標の総リジン濃度の影響はなかったが，0.95％と２）
準（2012年版）に記載されている体重11～25kg

1.20％の平均値が高かった。飼料のリジン不足を（期 待 増 体 量 585g/d）の 豚 の 総 リ ジ ン 要 求 量補うために，飼料摂取量を高くすることで，必要（1.40％）に近い。本研究では供試豚を単飼条件とするリジンを摂取しようと供試豚が反応した可で飼育した。一方で，一般の養豚場では群飼で飼能性がある。飼料摂取の影響を受けたためか，日育する。単飼と群飼で日増体量がどのように変化増体量にも飼料の総リジン濃度の影響は検出できするのか一概には言えないが，群飼した時の飼育なかった。飼料効率は飼料の総リジン濃度の影響

密度が高いと日増体量は低くなるという報告が多受け（ｐ＜0.05），0.95％と1.70％ならびに1.95％

い（例 え ば ７））。10～20kg の 豚 の 期 待 増 体 量 をの間には差があった（ｐ＜0.05）。

750g/d と す る の は 高 す ぎ る か も し れ な い が ，Table２とFig.１に飼料効率を反応指標として折470g/dは低すぎると考えるのが妥当であろう。

れ線モデルにあてはめた結果を示す。総リジン濃１）
いずれにしても，日本飼養標準・豚（2013年版）

度の要求量は1.27％と推定され，その時の飼料効に記載されている体重10～20kgの豚のリジン要

Table 1 Effects of dietary lysine concentrations on growth performances of weanling-growing pigs．
0.95％

1.20％

1.70％

1.95％

SE

p value

Feed intake（g/d）

1267

1225

1077

1088

80

0.3229Daily body weight gain（g/d）

748

827

745

760

62

0.7670Feed efficiency

0.60ｂ

0.67ab

0.69ｂ

0.70ｂ

0.02

0.0281ｎ＝３a, b；p＜0.05© The Ito Foundation

347

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究
Table 2 Results of broken-line regression analysis．
Estimation

SE

95％ confidence limits

p value

Feed efficiency

0.69500.005

0.63150.75850.0864

Concentration of lysine

1.26730.03350.84181.69280.76
0.74
Feed eﬃciency

0.72
0.70
0.68
0.66
0.64
0.62
0.60
0.58

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Concentrations of total lysine（%）
Fig. 1 The linear broken line．

95％ confidence limits of concentration of lysine
95％ confidence limits of feed efficiency

求量は，日本国内で現在飼育されている豚には低疫能の発達が遅延する――各白血球サブクラスのすぎると結論する。

割合の増加が鈍くなる――と予想して本研究を企

Table３は白血球サブクラスの割合の結果であ画したが，結果は予想を否定した。0.95％と1.20％

る。全供試豚14頭の白血球サブクラスの試験開始の飼料摂取量の平均値は1.70％と1.95％の平均値

前の割合と終了時の割合を比較した。CD4/CD８よりも高かった。この現象は，飼料のリジン不足

両陽性Ｔ細胞は試験開始前よりも試験終了時に割を補うために，飼料摂取量を高くすることで，必合が高くなる傾向があった（ｐ＝0.0638）。それ要とするリジンを摂取しようと供試豚が反応した以外のサブクラスでは終了時の平均値のほうが開可能性があると前述した。実際，リジン濃度には始前よりも低く，細胞障害性Ｔ細胞と単球では低十分な差があるように飼料を調製したにも関わらくなる傾向があった（ｐ＝0.0881とｐ＝0.0725）。

ず，日増体量には飼料のリジン濃度の影響はな

各白血球サブクラスの割合の試験期間中の増加倍かった。栄養素の飼料中の濃度だけでなく，栄養率に及ぼす飼料のリジン濃度の影響をTable４に素の摂取量も栄養状態に影響することを考慮する示した。いずれの白血球サブクラスにも飼料のリと，各供試飼料のリジン濃度の違いほどは，供試

ジン濃度の影響はなかった。わたしたちは，豚が豚の栄養状態に差はなかったのかもしれない。

成長すると各白血球サブクラスの割合が漸次高く

本研究は３反復が終了したところで，さらに反なることを観察している 。この現象は，豚の成復数を増やして，リジン要求量の推定精度を高く

長に伴い免疫能が発達することを反映したものとする必要がある。また，飼料のリジン濃度が豚の考えている。飼料中のリジン濃度が不足すると免

腸内細菌叢や小腸のアミノ酸トランスポーターの

８）© The Ito Foundation

348

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 3 Effects of timing of taking blood samples on ratios of each subclass of leukotytes（％）．
Antibodies used

Before*End**SE

p value

7.2

7.5

0.9

0.7658Helper T cells

CD4

Cytotoxic T cells

CD8

7.3

5.2

1.1

0.0881

Monocytes

CD14

28.2

21.1

3.5

0.0725Mature B cells

CD21

3.7

3.2

0.6

0.4959Natural killer cells

CD335

3.9

3.5

1.4

0.6647

CD4/CD8 double-positive T cells

CD4/CD8

1.9

2.9

0.3

0.0638ｎ＝12*Before the feeding trial，**At the end of feeding trial

Table 4 Effects of dietary lysine concentrations on magnitudes of changes in ratios of each subclass of leukocytes

during the feeding trial．

Antibodies used

0.95％

1.20％

1.70％

1.95％

SE

p values

Helper T cells

CD4

1.3*

0.9

1.0

1.7

0.5

0.6574

Cytotoxic T cells

CD8

1.1

0.7

0.9

0.9

0.4

0.8950

Monocytes

CD14

1.2

0.6

1.0

0.8

0.3

0.6345Mature B cells

CD21

1.7

0.7

0.8

1.4

0.4

0.3941Natural killer cells

CD335

1.3

1.2

1.7

2.1

0.8

0.8325

CD4/CD8 double-positive T cells

CD4/CD8

2.3

1.0

2.9

2.3

0.6

0.4712ｎ＝３*Indicating ratio of positive cells was 1.3-fold higher at the end of the feeding trial as compared with before the feeding trial．

遺伝子発現に及ぼす影響についても今後の検討課増加した割合に飼料のリジン濃度の影響はなかっ

題としたい。

た。

４．要

約

本研究は，飼養成績を指標とした時の離乳育成
豚のリジン要求量を明らかにするとともに，飼料中のリジン濃度が離乳育成豚の白血球サブクラスの割合に及ぼす影響を明らかにすることを目的として実施した。総リジンとして0.95％，1.20％，
1.70％，1.95％の４種類の飼料を５週齢の去勢雄豚に３週間給与した。これまでに３反復の飼養試
験を終了している。給与期間の後半の２週間（体重10～20kgに相当）の飼料効率を反応指標とし，折れ線モデルにあてはめてリジン要求量を推定したところ，総リジンとして1.69％を推定値として得た。各白血球サブクラスの割合が試験期間中に

文
献１）
 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構：
日本飼養標準・豚，2013年版，18，中央畜産会，東京，
2013．
２） National Research Council of the National
Academies：Nutrient Requirements of Swine, 11th
Revised Edition, 211, The National Academies
Press, Washington, D.C., 2012．
３） Liu, G., et al.：Oncotarget, 8, 44511～44520, 2017．
４） Calder, P. C.：Journal of Nutrition, 136, 288S～
293Ｓ，2006．
５） Van der Meer, Y., et al.：Journal of Animal
Science，94，4704～4719，2016．
６） Robbins, K. R. et al.：Journal of Animal Science,
84, E155～E165，2006．
７） Wolter, B. F., et al.：Journal of Animal Science,
81，836～842，2003．
８） 鈴木ら：日本畜産学会第123回大会講演要旨集，
Ｉ06～04，2017．

© The Ito Foundation

349

暑熱ストレスによる筋成長阻害のブレークスルー：筋幹細胞の活性化・増殖因子HGFのニトロ化（不活化）の関与の検証Breaking-through the heat stress-induced suppression of postnatal muscle
growth : possible implication of nitration of myogenic stem cell activation
factor HGF

辰巳

隆一・増原

夏海・Mohamed Zakaria Elhussiny・Vishwajit Sur Chowdhury・
城戸 潤力・今冨 奈々・Elgaabari Alaa Magdi Hassanein・
松吉 祐児・中村 真子・古瀬 充宏（九州大学大学院農学研究院）

Ryuichi Tatsumi, Natsumi Masuhara, Mohamed Zakaria Elhussiny, Vishwajit Sur Chowdhury,
Hirochika Kido, Nana Imatomi, Elgaabari Alaa Magdi Hassanein,
Yuji Matsuyoshi, Mako Nakamura and Mitsuhiro Furuse（Graduate School of Agriculture, Kyushu University）

Hepatocyte growth factor（HGF）is known to be an essential factor that activatesquiescent myogenic stem satellite cells to enter the cell cycle and contributes to postnatal
muscle growth and regeneration after injury. Very recently, we found that recombinant HGF
is nitrated by incubation with peroxynitrite（ONOO －：a highly reactive biomolecule generated
by reaction of NO and superoxide radicals）to lose the biological activity in vitro in a moleratio（HGF：peroxynitrite）dependent manner. Here we show that nitration of HGF has clear
pH dependence with a maximum range at pH 7.3-7.4；the reaction occurs quickly within a few
seconds after adding of peroxynitrite to recombinant HGF. These emerging results wereobtained by ECL-Western blotting and hence possibly provides strong evidence forphysiological significance of HGF nitration that abolishes satellite cell activation and thesubsequent cell proliferation. Importantly, nitration of extracellular HGF was detected inpectoralis（breast）muscle of 10-day-old chicks that received acute heat-stress（housing at
37℃ for 3 hr）, as revealed by comparable direct-immunofluorescence microscopy of control（28℃ for 3 hr) and heat-stressed samples stained with monoclonal antibody against nitrated
HGF. More results on this novel issue await further study including species（broilers andhens）, sex（male and female）, housing temperature, duration of heat-stress, muscles（breast
and thigh muscles）, and fiber-types（slow and fast types）, and may help in developing a novel
strategy for application in meat production technologies and human sports science.

© The Ito Foundation

350
１．目

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

線維芽細胞の増殖を抑制する働きもあるので，

的HGFのニトロ化（不活化）は筋肉内結合組織の地球温暖化の進行に伴い，特に家禽産業において，夏季の暑熱環境における肉用鶏の産肉量・肉発達を招き，結果として産肉量や肉質が低下すると予想される。

質低下は経済的損失を招く深刻な問題であり，こしたがって本研究ではまず，HGFのニトロ化

れを抑制する研究の進展は急務である。暑熱環境による不活化現象をさらに追究するとともに，暑下の家禽で生じる代謝反応として，呼吸性アルカ

熱ストレスによって上述の衛星細胞活性化・増殖

ローシス，酸化ストレス（活性酸素種の生成），

因子HGFがニトロ化（不活化）するかどうかを，

筋タンパク質分解亢進があげられる。このうち，

新規ツールであるニトロ化HGFに対する特異的

酸化ストレスと筋タンパク質分解亢進は産肉量やモノクローナル抗体（昨年度末に作出済み）を用

肉質を低下させる要因と考えられているが，それいて検証した。研究初年度の研究成果を報告する。

らの作用機構も含めた詳細は依然として不明である。
一方，骨格筋の成長（および肥大，萎縮，再生）は筋幹細胞（衛星細胞）の増殖活性に大きく依存していることが知られている

２．方
2.1

法

HGFのニトロ化のpH・反応時間依存性

マ ウ ス リ コ ン ビ ナ ン ト 精 製 HGF （R&D

。申請者は，衛Systems社製，キャリアタンパク質不含）にペル星細胞の増殖活性を決定する活性化（休止期から

オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト（Dojindo 社 製）を モ ル 比Ｇ１期への復帰）と休止化（セルフリニューア

１：2000（HGF：ペルオキシナイトライト）でル）の制御機構に関する一連の研究の過程で，添加し，37℃で30分間保持した。この際の反応液「筋幹細胞の活性化の抑制機構」の存在を洞察し，のpHは生理的値を含む7.1から7.6まで設定した。

その後の研究により，これが活性化因子HGF（肝反応終了後，試料を10％ポリアクリルアミドゲル

細胞増殖因子；現在認知されている唯一の活性化によるSDS-PAGE・ECL-Western blottingに供因子）のチロシン残基のニトロ化による不活化で試した。用いた１次抗体は抗ニトロチロシンモノ

あることを明らかにしつつある。タンパク質のニ

ク ロ ー ナ ル 抗 体（Santa Cruz Biotechnology 社

トロ化とは，芳香族アミノ酸（主にチロシン残製），２ 次 抗 体 は HRP 標 識 抗 マ ウ ス IgG 抗 体基）にNO２が導入される化学修飾であり，生体内（Sigma社製）であり，ECL試薬にて免疫反応をにおいては，NOラジカルと活性酸素の反応によ可視化した。また，同一の転写膜をSDS溶液で洗り速やかに生成するペルオキシナイトライト（ペ浄し結合した抗体を除去した後，抗HGFポリク

ルオキシ亜硝酸イオン：高反応性の短寿命の生体

ローナル抗体（R&D Systems社製）によるECL-内分子）によって非酵素的にニトロ化が起こるこWestern blottingを行いHGFを可視化した（リプとが知られている（NOが導入されるニトロソ化

ロービング）。

１～４）とは異なる）。HGFは衛星細胞の増殖も促進する

同様に，モル比１：2000（HGF：ペルオキシ

ので，家畜・家禽の成長期，特に，衛星細胞のほナイトライト），pH 7.2の条件下でHGFのペルオ

とんどが増殖期にある肉用雛鶏の初期成長期におキシナイトライト処理を行い，反応開始後（ペルいては，HGFのニトロ化（不活化）は筋の成長

オキシナイトライト添加後），7.5，45，60，300

を大きく阻害すると考えられる。また，HGFは秒後にSDS処理にて反応を停止させた。先と同様© The Ito Foundation

暑熱ストレスによる筋成長阻害のブレークスルー：筋幹細胞の活性化・増殖因子HGFのニトロ化（不活化）の関与の検証

351にECL-Western blottingを行い，HGFのニトロ照区と比較した（細胞数および細胞融合率の測化の反応時間依存性を調べた。

定）
。

2.2

実験動物（暑熱感作）

室 温 28 ℃ で 育 雛 し た 10 日 齢 の 雄 性 肉 用 雛 鶏（チャンキー：Gallus gallus domesticus）を湿度
60±５％，室温35℃で３時間飼育し暑熱ストレス

３．結果と考察3 . 1 HGFのニトロ化のpHおよび反応時間依存性（in vitro実験）（Fig.１）を負荷した。対照区の飼育温度は28℃とした。頸種々のpH条件下でリコンビナント精製HGFを動脈放血後，浅胸筋を採取した後，マイナス80℃

ペルオキシナイトライトで処理し，ニトロ化誘導で試料を保存した。常法に従い，厚さ20μｍの凍に及ぼす影響を調べた。パイロット実験で見出し

結切片を作成し蛍光免疫顕微鏡法に供試した。使

たHGFのニトロ化（不活性化）の生理学的重要

用した抗ニトロ化HGF特異的モノクローナル抗性を追究するうえで重要な実験である。Fig. 1A体は，ヒトHGFのクリングルドメイン２のチロのWestern blotting像が示すように，pH 7.4で最シンのニトロ化（ニトロチロシン）を認識するもも強いシグナル（ニトロチロシンの生成）を検出ので，その特異性はWestern blottingとELISAでした。pH 7.4より酸性側およびアルカリ性側では確認済みである。また，ラット・ニワトリ凍結筋

シグナルは減少し，特にアルカリ側ではpH変化

切片の蛍光免疫顕微鏡法により反応性も十分であの影響は大きいことが分かった（Fig. 1Aのデンることも確認済みである（未発表）。この抗体をシトグラム参照）。これらの結果から，HGFのニ

蛍光物質（ALEXA）で標識し，蛍光免疫顕微鏡

トロ化反応には，ほぼ生理的pHで極大となる顕法に使用した（２次抗体は必要としない）。

著なベル型のpH依存性があることが明らかに

2.3

筋幹細胞培養系での暑熱感作なった。

10日齢の雄性肉用雛鶏の胸肉・腿肉からAllenら

同様にペルオキシナイトライト処理時間を変えの方法に従い衛星細胞を単離し，poly-L-てニトロ化誘導に及ぼす影響を調べた（Fig. 1B）。

lysine と fibronectin で ２ 重 コ ー ト し た 培 養 用 プ

最短の処理時間である7.5秒でも明瞭なシグナル

レートに播種した（純度95％以上の初代培養系のが観察され，その強度は300秒（最長時間）まで

作出）。10％正常ウマ血清を含むDMEM基礎培地

大きな違いは認められなかった。したがって，

にて24時間培養した後，44℃で３時間暑熱ストレ

HGFのニトロ化はきわめて短時間で起こる化学スを負荷した。対照区の培養温度は37℃とした。

修飾反応であり，このことは，ペルオキシナイト

両群の衛星細胞を，Naldiniらの方法に従い１

ライトの短寿命性（37℃，pH 7.2で約２秒）と一M NaCl溶液で10分間処理し，細胞外マトリック

致する。生体内においても，ペルオキシナイトラ

スに結合・保持されているHGFを回収した。得イトが生成されると極短時間でHGFのニトロ化られた抽出液を遠心分離し，上澄液を先と同様にが進行すると考えられた。

５）６）

抗 ニ ト ロ 化 HGF モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 で ECLWestern blottingに供試した。また，抗HGFポリ

3 . 2 暑熱感作によってHGFはニトロ化されるか（in vivo実験）

クローナル抗体によるリプロービングを行い，10日齢の雄性肉用雛鶏を室温35℃で３時間飼育

ECL-Western blottingによりHGFを可視化した。

し暑熱ストレスを負荷した（対照区の飼育温度は

暑熱感作後も培養を続け，細胞増殖・分化能を対28℃）。採取した胸肉（浅胸筋）の凍結切片を蛍© The Ito Foundation

352

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
pH-dependenceA
Western blotting
a
b
c

d

recombinant mouse HGF（carrier-free）
e
f
a’
b’
c’
d’
e’
f’

60

anti-nitrotyrosine

50
60
50
（kDa） 7.1

re-probed after SDS-wash
7.2

7.3

7.4

7.5

7.6

7.1

（relative to pH 7.2）

ONOO--treated HGF

4.0

7.2

7.3

7.4

7.5

anti-HGF（neutralizing ab.）

7.6 （pH）

control HGF （1 : 2000, 30 min）

HGF Nitration（HGFnitro/ HGFwhole）
densitometry（panel A）

3.0
2.0
1.0

B

0
7.1

7.2

7.3
7.4
pH

7.5

7.6

reaction time-dependence
Western blotting
a
b
c

d

recombinant mouse HGF（carrier-free）
e60

anti-nitrotyrosine

50
60
re-probed after SD S-wash

50（kDa） 0

7.5

45

60

anti-HGF（neutralizing ab.）300（sec）

ONOO--treated HGF （1 : 2000, pH 7.2）

Fig. 1 Nitration of recombinant HGF by peroxynitrite（ONOO－）.（A）pH-dependence of HGF nitration, as revealed by

ECL-Western blotting with anti-nitrotyrosine（upper row）and anti-HGF antibodies（lower row, re-probed
image）. Densitogram analysis standardized with HGF amount（relative unit）.（B）Reaction time-dependence of
HGF nitration. Incubated at mole ratio of 1：2000（HGF：peroxynitrite）at 37℃ for 30 min.

direct-immunoﬂuorescence, 10-day-old chicken breast muscle
control（28℃, 3hr）heat-stressed（35℃, 3hr）

250 µmFig. 2 Heat-stress may induce nitration of extracellular HGF （fluorescence white）, as revealed by direct-

immunofluorescence microscopy with monoclonal antibody against nitrated HGF. Ten-day-old chicks were heatstressed by housing at 37 ℃ for 3 hr and assayed for nitration of extracellular HGF of breast muscle. Control,
chicks at 28℃ for 3 hr. Blue, nuclei visualized with DAPI.

光標識抗ニトロ化HGF特異的モノクローナル抗

光強度は対照区に比べて高いことが認められた体で染色すると，筋線維の周囲（細胞外マトリッ（Fig.２；n＝３／グループ）。同じ胸肉（浅胸筋）

クスと考えられる）が陽性反応を示した。その蛍であっても，試料を採取する部位によっては上記© The Ito Foundation

暑熱ストレスによる筋成長阻害のブレークスルー：筋幹細胞の活性化・増殖因子HGFのニトロ化（不活化）の関与の検証

353の差に大きなばらつきが認められた。したがっなり，この化学修飾反応の生理学的意義がより明て，初年度ではまだ，暑熱感作によって細胞外マ確になった。暑熱ストレスによって活性酸素が生

トリックスに存在するHGF（衛星細胞の活性化成されることは知られているので，衛星細胞の活因子の供給源）がニトロ化されるかどうかを断言

性化に必要なNOラジカルと反応してペルオキシ

するに至らなかった。試料の採取から再度実施すナイトライトが生成されることは強く予想されるなど，試料の条件を整備してから再度検討するる。したがって，家畜・家禽に負荷される暑熱スこととした。さらには，暑熱感作温度，時間，鶏トレスによって衛星細胞の活性化・増殖が阻害さの日齢なども含めて，実験条件を至適化する必要れ，筋の成長・肥大が抑制されると考えられる。

があると判断した。

肉用雛鶏を用いたin vivo・in vitro実験によって3 . 3 暑熱感作によってHGFはニトロ化される

その可能性を検証し，それを示唆する結果を得る
ことができた。新規の研究プロジェクトの初年度

か（in vitro実験）
10日齢の雄性肉用雛鶏から単離・培養した衛星に続き，次年度ではさらに実験データを蓄積する細胞に，前項のin vivo実験と同様に暑熱ストレス必要がある。「筋幹細胞の活性化・増殖因子HGFを負荷した。培養開始後24時間目に細胞外マトのニトロ化（不活化）による筋の成長・肥大の抑リックスに存在するHGFを含む画分を回収し抗制」という新奇作業仮説を実証し，夏季の暑熱環

ニトロ化HGF特異的モノクローナル抗体を用い境における産肉量・肉質低下を改善する新しい飼てWestern blottingを行った。対照区と明瞭な差

育・管理技術の構築に貢献が期待される。

は認められなかった。細胞増殖・分化能も対照区と有為な差は観察されなかった。細胞培養系での暑熱感作条件の至適化が必要であることは明白であるが，別のアプローチとして，前項で暑熱感作した個体（筋）から衛星細胞を単離・培養し，同様に抗ニトロ化HGF特異的モノクローナル抗体を用いたWestern blottingにより解析するほうが確実であると判断した。
４．要約

本研究により，筋幹細胞（衛星細胞）の活性化・増殖因子HGFのニトロ化（不活化）には顕

文 献
１） Tatsumi, R., Anderson, J. E., Nevoret, C. J.,
Halevy, O., Allen, R. E.：Dev. Biol., 194, 114～128,
1998.
２）
 Tatsumi, R., Hattori, A., Ikeuchi, Y., Anderson, J.
E., Allen, R. E.：Mol. Biol. Cell, 13, 2909～2918,
2002.
 Tatsumi, R., Allen, R. E.：Anim. Sci. J., 79, 279～３）
290, 2008.
４） Tatsumi, R.：Anim. Sci. J., 81, 11～20, 2010.
５）
 Allen, R. E., Temm-Grove, C. J., Sheehan, S. M.,
Rice, G. M.：Methods in Cell Biol., 52, 155～176,
1997.
６）
 Naldini, L., Vigna, E., Bardelli, A., Follenzi, A.,
Galimi, F., Comoglio, P. M.：J. Biol. Chem., 270, 603～611, 1995.

著なpH・反応時間依存性があることが明らかに© The Ito Foundation

354

骨格筋肥大を促進する植物由来成分の探索（Ⅱ）―質的向上も目指して―
Screening for phytochemicals that induce skeletal muscle hypertrophy―Aiming for quantitative improvement―

米

倉

真

一

（信州大学農学部）

Shinichi Yonekura（Faculty of Agriculture, Shinshu University）

So far, we have shown from studies using cultured cells that thermal stimulation induceda fast-to-slow fiber-type shift of C2C12 mouse myoblasts. Thermal stimulation-induced shifting
fiber type from fast to slow is through temperature-sensitive transient receptor potential（TRP）channels present on membranes. Interestingly, not only temperature but also
phytochemicals are known as ligands as TRP channels. Therefore, in this study we investigatedthe direct effects of capsaicin, which is an agonist of TRPV1, on shifting fiber type from fast to
slow. In C2C12 cells and muscle satellite cells exposed to capsaicin, mRNA level of myosin
heavy chain type I（MyHC I）was increased compared with the control cultures. The mRNAlevel of MyHC IIb was unaltered in both cells, compared with cells that were not exposed tocapsaicin. These results indicated a fast-to-slow fiber-type shift in myoblasts. I also examined
upstream signals that might be responsible for the fast-to-slow shift of fiber types. Capsaicinenhanced the mRNA of peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α（PGC-1α）in C2C12 cells and muscle satellite cells. These data suggest that capsaicin induces
a fast-to-slow fiber-type shift of myoblasts through PGC-1α．

１．目

食肉を構成する大部分を占める骨格筋は，筋管的の集合体である筋繊維と，それを包む筋膜および世界規模の人口増加や気候変動によって食料危

結合組織から構成されている。筋線維には，酸素機が叫ばれるなか，良質な動物性タンパク質の安利用や運動性の違いで分類された３つのタイプの定供給は我が国のみならず，人類の生存にきわめ線維が存在しており，Ⅰ型筋線維（遅筋線維），て重要である。また，食肉の品質に対する消費者

Ⅱａ，Ⅱｂ型筋線維（速筋線維）がある１）。各筋のニーズは多様であり，消費者を満足させるため線維の割合は食肉の嗜好性を左右する。一般的にも肉質を自在に制御できる技術が求められていに，豚では，Ⅰ型筋線維の割合の多い骨格筋ほどる。食肉は家畜骨格筋が由来であることから，家食肉としての嗜好性は高いとされる２）。また黒毛

畜１個体当たりの骨格筋量を増加させ，食肉の質

和種牛の筋肉内脂肪交雑は，筋肉内のＩ型筋線維も向上させる技術開発が強く望まれている。

の割合と正の相関関係を持つことが明らかになっ© The Ito Foundation

骨格筋肥大を促進する植物由来成分の探索（Ⅱ） ―質的向上も目指して―355ている３）。よってⅠ型筋線維を増やすことが食肉

ン－ストレプトマイシン）を１％の濃度になるよの嗜好性向上につながる。

うに添加した増殖用培地を用いて培養した。２％

これまで我々は培養細胞を用いた研究から，温HS（Horse serum）含有DMEM（分化培地）に度刺激によって筋肥大が促進することを明らかに置換し，分化誘導刺激を行った。筋サテライト細している 。具体的には，骨格筋の分化や再生を胞の培養は，マウスのヒラメ筋および前脛骨筋を研究するためのin vitroモデルとして広く利用さ

Collagenase II溶液を用いて単離した後，ダルベッ

れているマウス筋芽細胞株C2C12を用いて検討しコ変性イーグル培地（DMEM, high glucose）に，た結果，通常温度（37℃）で培養したC2C12細胞

胎児由来血清（FBS）を10％，抗生物質（ペニシと比べて，マイルドヒート条件下（39℃）で培養

リン―ストレプトマイシン）を１％の濃度になるした細胞は分化が促進することを明らかにした。

ように添加した増殖用培地を用いて培養した。

また温度刺激による筋肥大は，骨格筋細胞の膜上２％HS（Horse serum）含有DMEM（分化培地）に存在する温度感受性のTRPV１受容体を介してに置換し，分化誘導刺激を行った。カプサイシン

生じることを見出した。興味深いことに，このが筋繊維タイプに及ぼす影響の検討には，１μＭ

TRPV１受容体は温度のみならず植物由来成分をのカプサイシンを含む分化培地（コントロールと特異的リガンドとする受容体であることが知られして溶媒を添加）で分化誘導刺激を行った。

４）ている。昨年度の研究により，TRPV１のアゴニ

2.2

リアルタイムPCRストであるカプサイシンは，筋芽細胞同士の融合

ト ー タ ル RNA 抽 出 に は TRIzol を 使 用 し た 。

を促進させることで筋形成能を高める作用を有す

TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with

ることを明らかとした。

gDNA Eraserの手順に従い，cDNAを作成した。

一方，温度刺激はTRP受容体を介して遅筋繊

PCR反応試薬にはTaKaRa SYBR Premix ExTaq

維（Ⅰ型筋線維）の発現量増加および遅筋線維へを用い，リアルタイムPCRを行った。GAPDHをの移行も促進することを明らかにしている。昨年

内部標準として相対定量解析を行った。統計解析度の研究助成の成果と合わせて考えると，TRPVには t 検討を用い， p ＜0.05を有意差ありと判定

１のアゴニストもまたⅠ型筋線維への移行を促進した。

する効果を有することが考えられる。よって本研

2.3

究では，肉牛の筋肉量・肉質を向上させる飼養技

マウス前脛骨筋もしくはヒラメ筋にヘビの毒素術開発を目指すうえで，TRPV１のアゴニストとであるカルディオトキシン（CTX）を10μＭ注入

して知られている植物由来成分がⅠ型筋線維へのし，障害に伴う筋再生を誘導した。CTX注入の移行を促進する効果を有するのか明らかにするこ

３日前より毎日１μＭのカプサイシンを注入し，とを目的に検討した。

カプサイシン注入後８日目の筋組織を摘出した。

２．方
2.1

マウスを用いた評価

RNAを単離後，リアルタイムPCR法を用いて，

法

MyHCアイソフォームおよびPGC-１α遺伝子の発現量を解析した。統計解析には t 検討を用い，細胞培養

マウス筋芽細胞株C2C12は，ダルベッコ変性

p ＜0.05を有意差ありと判定した。

イーグル培地（DMEM, high glucose）に，牛胎児由来血清（FBS）を10％，抗生物質（ペニシリ© The Ito Foundation

356

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

3 . 2 カプサイシンが筋サテライト細胞の筋繊３．結果と考察維タイプに及ぼす影響

3 . 1 カプサイシンがC2C12筋芽細胞の筋繊維

続いて，マウスのヒラメ筋（遅筋タイプ優位）タイプに及ぼす影響および前脛骨筋（速筋タイプ優位）よりサテライ

C2C12細胞の分化誘導刺激と同時に，TRPV１ト細胞を単離培養し，カプサイシンが筋サテライの代表的なアゴニストとして広く知られているカト細胞の筋繊維タイプに及ぼす影響を検討した。

プサイシン１μＭを培地に添加し，72時間後の細ヒラメ筋由来のサテライト細胞では，カプサイシ

胞を用いて検討した（Fig.１）。その結果，カプン処理によりMyHC I遺伝子およびPGC-１α遺サイシン処理により遅筋タイプ筋繊維で発現する伝子の発現量は，未処理群に比べ，有意に上昇しMyHC I遺伝子の発現量が，未処理群に比べ，有ていることが明らかとなった（Fig. 2A）。また意に上昇していることも明らかとなった。一方，

MyHC IIb遺伝子の発現量に変化は認められな速筋タイプ筋繊維で発現するMyHC IIb遺伝子のかった。一方，前脛骨筋由来のサテライト細胞で発現量には変化が認められなかった。これらの結は，カプサイシン処理によりMyHC IおよびMyHC

果より，カプサイシンに筋繊維タイプの遅筋化をIIb遺伝子の発現量に変化は認められなかったが，促進する作用があることが示唆された。これまで

PGC-１α遺伝子の発現量は，未処理群に比べ，

ミ ト コ ン ド リ ア の 生 合 成 に 関 わ る peroxisome

有意に上昇していることが明らかとなった

proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α（Fig. 2B）。これらの結果から，少なくとも遅筋（PGC-1α）骨格筋において筋繊維タイプの遅筋

タイプ優位のヒラメ筋由来のサテライト細胞に対化を促す作用があることが報告されている５）。続

して，カプサイシンは遅筋化を促進する作用があいて，カプサイシン処理によるPGC-１α遺伝子ることが示唆された。速筋タイプ優位の前脛骨筋

発現量の変化を検討した結果，カプサイシン処理

由来のサテライト細胞では，カプサイシン処理にによりPGC-１α遺伝子の発現量も，未処理群に比よりMyHC I発現量に変化が認められなかったこ

べ，有意に上昇していることが明らかとなった。

とから，遅筋化を促進する作用を見出せなかった

MyHC I

2
1.5
1
0.5
0

Control

Capsaicin

PGC-1α2

3.5Relative mRNA levels＊

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

2.5

MyHC IIb

1.5
1
0.5
0

Control

Capsaicin

＊

3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

Control

Capsaicin

Fig. 1 Capsaicin induces a fast-to-slow fiber-type shift of C2C12 myoblasts. Myofiber-related gene

expression in conrol and 1 μM of Capsaicin-treated C2C12 cells for 72 h, assessed using real-time
PCR of MyHC I, MyHC IIb, and PGC-1α mRNA. Data are represented as the mean ± SEM forthree independent experiments. ＊ indicates p < 0.05 compared with the control, determined using
the Student t-Test.

© The Ito Foundation

357

骨格筋肥大を促進する植物由来成分の探索（Ⅱ） ―質的向上も目指して―

MyHC I
＊

2.5
2
1.5
1
0.5
0

Control Capsaicin

MyHC IIb

2

Relative mRNA levels

3

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

A

1.5
1
0.5
0

Control Capsaicin

3

PGC-1α

＊

2.5
2
1.5
1
0.5
0

Control Capsaicin

MyHC I

1.5
1
0.5
0

Control Capsaicin

MyHC IIb

2

Relative mRNA levels

2

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

B

1.5
1
0.5
0

Control Capsaicin

2.5
2

PGC-1α
＊

1.5
1
0.5
0

Control Capsaicin

Fig. 2 Capsaicin induces a fast-to-slow fiber-type shift of satellite cells in soleus muscle（A）and

tibialis anterior muscle. Myofiber-related gene expression in control and 1 μM of Capsaicintreated satellite muscle cells for 72 h, assessed using real-time PCR of MyHC I, MyHC IIb, and
PGC-1α mRNA. Data are represented as the mean ± SEM for three independent experiments.
＊
indicates p < 0.05 compared with the control, determined using the Student t-Test.

が，PGC-１α遺伝子発現量の有意な上昇が見らし た 。そ の 結 果 ，MyHC I ，MyHC IIb お よ びれた。よって現在，異なるカプサイシン濃度と刺PGC-１α遺伝子発現量に変化は認められなかっ

激時間による検討を行っているところである。

た。現在，より高いカプサイシン濃度を用いて検3 . 3 カプサイシンがマウスの筋再生能に及ぼす影響
培養細胞を用いた実験より，カプサイシンには討中である。
４．要約

少なくともヒラメ筋由来のサテライト細胞に対し骨格筋の肥大，肉質を制御する飼養技術が強くて遅筋化を促進する作用を有することが明らかと望まれているものの，骨格筋形成の分子機構はいなった。続いて，マウスモデルを用いた検証を

まだ未解明な点が多く，また筋繊維タイプの制御行った。マウスヒラメ筋にヘビの毒素であるカル機構も不明な点が多いことから，筋肥大や筋繊維

ディオトキシ（CTX）を10μＭ注入し，障害に伴タイプの制御を促す効果的な作用点が定められてう筋再生を誘導した。CTX注入の３日前より毎いないことが，ボトルネックとなっている。これ

日１μＭのカプサイシンを注入し，カプサイシン

まで我々は，培養細胞を用いた研究から温度刺激

注入後８日目の筋組織を摘出，RNAを単離後，によって筋肥大が促進することを明らかにしておリ ア ル タ イ ム PCR 法 を 用 い て ，MyHC ア イ ソり，また温度刺激による筋肥大は，骨格筋細胞のフォームおよびPGC-１α遺伝子の発現量を解析

膜上に存在する温度感受性のTRPV１受容体を介© The Ito Foundation

358

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

して生じることを見出した。また前年度の研究よ検討することも，将来，家畜の飼料化を考えるう

り，TRPV１のアゴニストとして知られているカえで重要であると考える。

プサイシンが，筋芽細胞の融合を促進すること
で，筋形成を促進することを明らかにしている。
さらに温度刺激は遅筋繊維（Ⅰ型筋線維）の発現
量増加および遅筋線維への移行も促進することを明らかにしていることから，カプサイシンがⅠ型
筋線維への移行を促進する効果を有するのか明ら
かにすることを目的に検討した。本研究により，カプサイシンは，PGC-１α遺伝子発現の上昇を促すことで，遅筋化を促進する作用を有することが明らかとなった。今回の研究では，速筋タイプ
優位の前脛骨筋由来のサテライト細胞では，遅筋化を促進する明白な効果が認められなかったことから，その可能性を探ることが重要である。また，動物個体レベルにおいてもカプサイシンに遅筋化を促進する作用を有するのか検討する必要がある。またカプサイシン以外にもギンゲロールやア
リシン等，TRPV１の植物由来アゴニストは知ら文献１） Staron, R. S., Hikida, R. S.：Histochemical,
biochemical and ultrastructual analysis of single
human muscle fibers, with special reference to theC-fiber population, Journal of Histochemistiy &Cytochemistry, 40, 563～568, 1992.
２） 渡邊康一：筋線維型と食肉のおいしさ ―反芻動物特異的Ⅰ型筋線維の産肉論的機能形態学解析―，
東北畜産学会報，６（61）, １～６, 2016.
３）
 衛藤哲次，篠原孝，文田登美子，川畑健次，阪下邦仁，大園正陽，岩元久雄，後藤貴文：黒毛和牛骨格筋における筋繊維型構成と骨格筋内脂肪含量の関係に関する研究，九州大学農学部附属農場研究報告，
11, 51～55, 2003.
４）
 Hayashi, S., Yonekura, S.：Thermal stimulation
at 39℃ facilitates the fusion and elongation of
C2C12 myoblasts, Animal Science Journal, 90（8）,1008～1017, 2019.
５）
 Lin, J., Wu, H., Tarr, P. T., Zhang, C. Y., Wu, Z.,
Boss, O., Michael, L. F., Puigserver, P., Isotani, E.,
Olson, E. N., Lowell, B. B., Bassel-Duby, R.,
Spiegelman, B. M.：Transcriptional co-activator
PGC-1α drives the formation of slow-twitch
muscle fibres, Nature, 418, 797～801, 2002.

れていることから，これら物質の遅筋化促進能を© The Ito Foundation

359

黒毛和種繁殖雌牛の放牧行動における群内個体差は生産成績と関連するか？
Are inter-individual differences in grazing behavior of Japanese Blackcows in a herd related with production performance？

安

在

弘

樹

（宮崎大学農学部）

Hiroki Anzai（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Maintenance and social behavior of 12 breeding Japanese Black cows under grazing wasmeasured through a grazing season to find behavioral traits that consistently differ amongindividual cows across time and situations and to examine the relationships of the behavioral
traits with production-related traits of individuals. Time spent grazing and resting, dominanceindex, actor and reactor frequency of agonistic behavior, activity intensity and traveling
distance were consistently differ among the focal cows across the days of the investigation
although sward and climate conditions varied across the grazing season. Time spent grazing
was negatively correlated with age and body condition score（BCS）, and time spent resting
was inversely correlated with these traits. Dominance index and actor frequency werepositively correlated with age, and reactor frequency was negatively correlated with age and
BCS. Time budget, activity intensity and traveling distance were not correlated with traits ofreproductive performance. Individual management for cows that spent more time grazing andless time resting than the herd mates will have a potential to maintain BCS of all animals
within an appropriate range and consequently improve reproductive performance．

１．目

個体間でどの程度一貫した傾向を示し，生産性に的関わる指標とどの程度関連するのかについては不動物における行動の個体差は，気象条件や餌の明な点が多い。

質と量，捕食者リスクといった日々変化する環境

本研究では，同一牛群に属し，同一の環境下でに対する適応能力を制限してしまうため，個体の放牧される黒毛和種繁殖雌牛を対象として，個体適応度（fitness，生存と繁殖）に影響を及ぼす１）。

の生存や繁殖との関連が大きいと考えられる採食

そのため，家畜の場合は成長や繁殖成績などの生などの主要な維持行動および攻撃性や群内での社産性に直結すると考えられる 。しかしながら，会的順位などに関連する社会行動を測定し，状況

家畜の放牧行動の個体差に着目し，生産成績とのや時間の変化によらず一貫した個体差を示す行動

関連を検討した研究は限られており，放牧中のどを探索するとともに，それらの行動間の関連およのような行動が状況や時間の変化によらず群内のび生産に関わる個体の特徴・指標との関連につい２）© The Ito Foundation

360

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）て検討した。
２．方

個体管理データによった。
各行動の時間割合，敵対行動のActorおよび法

Reactorとなった頻度，DI，活動量および移動距

宮崎大学農学部附属フィールド科学教育研究セ

離について，調査期間を通した個体間一貫性をケ

ンター住吉フィールド内の試験草地（1.1ha）おンドールの一致係数（W）を用いて評価した。まよび休息場（0.4ha）からなる放牧地において，

た，それらの行動変数と齢，体重，BCS，分娩後

2019年５～10月の各月に３～５日間，黒毛和種牛

日数および繁殖成績（初産月齢，平均分娩間隔，

群（成雌牛29～33頭，子牛10～15頭）を，およそ子牛の生時体重および日増体）の関係をスピアマ

９～10時から16時まで放牧した。放牧期間中に分ンの順位相関係数（rs）を用いて評価した。

娩等によって群から離れる予定のない成雌牛12頭を主調査個体とし，放牧中の行動（採食，休息，

３．結果と考察反芻，歩行およびその他）を５分間隔で観察する

放牧時間の大半が採食に費やされ，その割合はとともに，１日１頭当たり60～90分間，敵対行動

全調査日の平均で10％（１日当たり約40分）程度を観察した（５～10月，合計11日）。観察個体がの間で個体によって異なった（Table１）。また，

敵 対 行 動 を 起 こ し た か （Actor），受 け た か

敵対行動のActorおよびReactorとなる頻度はと（Reactor），勝敗，相手個体を記録した。群内でもに，１時間当たり１回以下から８回以上と個体の優位性を表す指標として，以下の式を用いて各によって大きく異なった。採食時間割合，休息時

個体のDI（dominance index）を算出した。

間割合，調査日ごとに求めたDI，Actorおよび

DI＝Ｄ/（Ｄ＋Ｓ）

Reactor頻度，活動量および移動距離は調査期間

ここで，Ｄはその個体が優勢だと確認された相にわたって一貫した個体差を示した（Table２）。

手の数を，Ｓはその個体が劣勢だと確認された相これらの行動時間割合は，放牧季節を通して気象

手 の 数 を 表 す 。主 調 査 個 体 に 加 速 度 ロ ガ ー

条件や草地の状態が大きく変動したにも関わら（GDCD X16-4 ， Gulf Coast Data Concepts, MS,ず，ある程度一貫して維持された個体差を持つ行USA） お よ び GPS ロ ガ ー （i-gotU GT-600 ，

動特性であると考えられた。一方で，放牧時間がMobile Action, Taipei, Taiwan）を固定した首輪限られ，採食に多くの時間を割いた本研究の放牧を 取 り 付 け ，放 牧 期 間 中 の 牛 の 加 速 度 情 報 を条件下では，歩行および反芻の時間割合は一貫し25Hzで測定し，位置情報を30秒間隔で測位した。

た個体差を持つ行動特性ではないと考えられた。

加速度データから動的加速度のベクトル和を算出

そのため，以降の相関解析からは除外した。社会

し，放牧時間中の平均値を活動量の指標とした的優位性は，その長期安定性が報告されており３），（８，10月，合計８日間）。また，位置情報の推移

安定した個体の性格特性のひとつであると考えらから放牧時間中の移動距離を算出した（７，９，れる。Reactor頻度はDIよりもわずかに個体間一10月，合計14日間）。

貫性が小さかったが，Actor頻度はDIと同程度，

ボディコンディションスコア（BCS）は各月の状況や時間の変化によらず一貫した個体の行動特

放牧最終日に３人の観察者が１（痩せている）～性であると考えられた。活動量および移動距離も10（太っている）で評価し，平均値を当月の値と調査期間にわたって一貫した個体差が見られた。

した。その他の生産関連指標は住吉フィールドのこれらの行動変数はその他の行動変数と調査期間© The Ito Foundation

黒毛和種繁殖雌牛の放牧行動における群内個体差は生産成績と関連するか？

361

Table 1 Descriptive statistics of behavioral and production-related variables by cow
Variables

n

Mean

SE

Minimum

Maximum

Proportion of grazing time

12

0.868

0.011

0.807

0.911

Proportion of resting time

12

0.057

0.007

0.024

0.096

Proportion of walking time

12

0.039

0.002

0.030

0.050

Proportion of ruminating time

12

0.017

0.002

0.005

0.028

DI

12

0.62

0.08

0.06

0.93

Actor frequency（/h）
Reactor frequency（/h）

12
12

4.20
3.05

0.76
0.61

0.58
0.55

9.21
8.45

Activity intensity（g）

12

0.28

0.01

0.24

0.38

Traveling distance（m）

12

2076

45

1837

2362

Age（year）

12

10.1

1.1

3.9

15.9

Body weight（kg）
Body condition score

12
12

485.2
5.0

16.0
0.6

430.6
2.6

633.9
8.6

Days after last calving
Age at first calving（month）

12
12

198.9
30.8

31.7
1.7

88.0
22.9

453.0
40.2

Mean calving interval（day）
Mean birth weight of calves（kg）
Mean daily gain of calves（steer）
Mean daily gain of calves（heifer）

12
12
8
11

409.8
33.9
0.84
0.72

14.0
0.8
0.02
0.02

367.8
29.3
0.78
0.57

522.0
39.5
0.98
0.90

Behavioral variables were averaged across days of investigation.
Age and days after calving were at 25th May 2019.
Body weight and body condition score were averaged from May to October 2019.

Table 2 Inter-individual consistency of behavioral variables

among 12 focal cows across days of investigation
W

Significance

Proportion of grazing time

Variables

0.368

＊＊＊

Proportion of resting time
Proportion of walking time
Proportion of ruminating timeDI（on a daily basis）

0.376
0.111
0.044
0.593

＊＊＊

Actor frequency（/h）
Reactor frequency（/h）
Activity intensity（g）

0.601
0.493
0.771

＊＊＊

Traveling distance（m）

0.431

＊＊＊

NS
NS
＊＊＊

＊＊＊
＊＊＊

W：Kendall’s coefficients of concordance.
NS p ≥ 0.1 ; ＊＊＊ p < 0.001.

が異なるため比較はできないが，状況や時間の変り，Reactorによる反撃でReactor側が勝ちとなる

化によらず一貫した個体の行動特性であると考えケースはきわめてまれであったためであると考えられた。

られる。敵対行動のReactor頻度は採食時間割合

採食と休息の時間割合は，両者の排他的な関係との間に正の，休息時間割合との間に負の相関がにより強い負の相関があった（Table３）。DIはあったが，Actor頻度およびDIは行動時間割合とActor頻度との間に強い正の相関が，Reactor頻有意な相関はなかった。このことから，個体の社

度との間に強い負の相関があった。これは観察さ

会的優位性や攻撃性は採食や休息といった維持行

れた全敵対行動においてActorの勝率が0.97であ動の割合には大きな影響を及ぼさなかったと考え© The Ito Foundation

362

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 3 Spearman’s rank correlation coefficients between behavioral variables
Proportion ofresting timeActorfrequency

DI

Reactorfrequency

Activity
intensity

Daily traveling
distance

Proportion of grazing time -0.965＊＊＊-0.462 NS-0.329 NS

0.622＊

0.259 NS

0.231 NS

Proportion of resting time

0.448 NS

0.280 NS

-0.643＊-0.322 NS-0.224 NS

0.895＊＊＊-0.944＊＊＊-0.014 NS-0.364 NS-0.762＊＊-0.077 NS-0.189 NS

0.203 NS

0.413 NS

DI
Actor frequency
Reactor frequency
Activity intensity-0.014 NS

n = 12.
NS p ≥ 0.1 ; ＊p < 0.05 ; ＊＊p < 0.01 ; ＊＊＊p < 0.001.

Table 4 Spearman’s rank correlation coefficients between behavioral and production-related variables
Body
condition
score

Days
after lastcalving

Age atfirst
calvingMeancalving
interval

Mean
Mean
Mean
daily
daily
birth
gain
of
gain ofweight of calves
calvescalves（steer） （heifer）

Age

Body
weightProportion of grazing time

-0.622＊

Proportion of resting timeDI

0.615＊
0.657＊-0.245 NS -0.636＊
0.336 NS 0.734＊＊-0.476 NS -0.182 NS 0.462 NS 0.042 NS 0.359 NS -0.273 NS
0.490 NS 0.210 NS -0.434 NS -0.091 NS -0.261 NS 0.161 NS

Actor frequency
Reactor frequency
Activity intensity
Daily traveling distance

0.657＊-0.755＊＊-0.455 NS-0.448 NS

0.357 NS
0.126 NS
-0.392 NS
0.168 NS
-0.336 NS

0.469 NS
0.189 NS
-0.657＊-0.273 NS-0.175 NS

0.385 NS
0.161 NS
-0.594＊-0.210 NS-0.210 NS

0.385 NS
0.196 NS
-0.462 NS
0.070 NS
-0.315 NS-0.601＊-0.538†0.573†-0.112 NS
0.287 NS

-0.035 NS-0.217 NS
0.014 NS
0.441 NS
-0.455 NS-0.429 NS-0.639†0.380 NS
0.592 NS
-0.150 NS

0.152 NS
0.225 NS
-0.145 NS
0.225 NS
0.080 NSn = 12 except for mean daily gain of calves（steer, n = 8; heifer, n = 11）.
NS p ≥ 0.1 ; †p < 0.1 ; ＊ p < 0.05 ; ＊＊ p < 0.01 ; ＊＊＊ p < 0.001.

られた。活動量および移動距離は他のどの行動変考えられる。BCSが低い状態が続くと繁殖成績の数とも有意な相関がなかった。これらの変数はい低下を引き起こすと言われている５）。本研究ではずれも個体の活動性を表し，代謝体重当たりのエ

行動時間割合と繁殖成績の間に有意な相関はな

ネルギー消費の指標となると考えられる 。しかかったが，採食時間が他個体より長く，休息時間

し，同日に取得したデータにおいても，両者の間が短い個体に対して補助飼料の給与などの個体別

および採食時間割合との間に相関はなかった。

管理を行うことができれば，群内の個体のBCSを

４）

採食時間割合は，齢およびBCSとの間に負の相

適切な範囲に維持することができ，繁殖成績の改関があり，休息時間割合とこれらの変数の関係

善 に も 繋 が る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。DI お よ び

は，ほぼ逆の傾向を示した（Table４）。BCSが低Actor 頻 度 は 齢 と の 間 に 正 の 相 関 が あ っ た 。

い個体は，他個体より長く採食することでエネル

Reactor頻度は齢およびBCSとの間に負の相関が

ギー摂取を補おうとしたと考えられる。行動時間あった。以上より，加齢は敵対行動を起こす頻度

割合と分娩後日数の間に有意な相関はなかったの増加と受ける頻度の減少によって，社会的優位

が，BCSと分娩後日数の間で正の相関があった

性に正の影響を及ぼすが，BCSは敵対行動を受け（rs＝0.685，p ＜ 0.01）ことから，分娩や泌乳等にる頻度との関係を通じて，社会的優位性と間接的伴う一時的な負のエネルギー収支によるBCSの低に関連すると考えられた。DIおよびActor頻度が下も採食時間の増加と休息時間の減少に繋がると高く，Reactor頻度が低い個体は平均分娩間隔が© The Ito Foundation

黒毛和種繁殖雌牛の放牧行動における群内個体差は生産成績と関連するか？

363

短い傾向にあった。齢とこれらの行動変数との相BCSとの間に負の相関があり，休息時間割合とこ関を考慮すると，高齢で繁殖成績の優れない個体

れらの変数の関係は，ほぼ逆の傾向を示した。

はすでに群から淘汰されていたためである可能性

DIおよびActor頻度は齢との間に正の相関があっが考えられる。また，Actor頻度と子牛（去勢）た。Reactor頻度は齢およびBCSとの間に負の相の増体に負の相関の傾向があった。しかし，子牛関があった。行動時間割合，活動量および移動距（去勢）の増体は８頭分のデータしかなく，過去

離と繁殖成績との間に有意な相関はなかった。採の研究でも優位性と繁殖成績との間に有意な関係

食時間が他個体より長く，休息時間が短い個体には見られていない

ことから，社会的優位性や攻対して個体別管理を行うことができれば，群内の撃性と繁殖成績との関係については今後さらなる個体のBCSを適切な範囲に維持することができ，検討が必要であろう。活動量および移動距離はい

繁殖成績の改善にも繋がる可能性が示唆された。

６）ずれの生産関連指標とも有意な相関はなかった。
個体へのセンサーの装着に基づくこれらの指標
は，長期間にわたって多個体に対するデータ収集が可能である。本研究では全調査個体のデータを収集できた時期と日数が限られたが，今後，より長期的で多くの個体を対象とした行動モニタリン
グを実施し，放牧牛の行動における群内の個体差と繁殖成績の関連性を詳細に検討することは，個体の繁殖管理や健康管理の精密化に役立つだろう。
４．要

約

放牧下の黒毛和種繁殖雌牛12頭を対象とし，放牧季節を通して個体の維持や社会性に関わる行動を測定し，状況や時間の変化によらず一貫した個体差を示す行動を探索するとともに，生産に関わる個体の指標との関連について検討した。放牧季
節を通して気象条件や草地の状態が大きく変動したにも関わらず，採食時間割合，休息時間割合，
DI，敵対行動におけるActorおよびReactor頻度，
活動量および移動距離は調査期間にわたって一貫文献１）
 S m i t h , B . R . , B l u m s t e i n , D . T . ：F i t n e s sconsequences of personality：a meta-analysis,
Behav. Ecol., 19, 448～455, 2008．
２）
 Wesley, R. L., Cibils, A. F., Mulliniks, J. T., Pollak,
E. R., Petersen, M. K., Fredrickson, E. L.：An
assessment of behavioural syndromes inrangeland-raised beef cattle, Appl. Anim. Behav.
Sci., 139, 183～194, 2012．
３）
 Foris, B., Zebunke, M., Langbein, J., Melzer, N.：
Comprehensive analysis of affiliative and agonisticsocial networks in lactating dairy cattle groups,
Appl. Anim. Behav. Sci., 210, 60～67, 2019．
４）
 Brosh, A., Henkin, Z., Ungar, E. D., Dolev, A.,
Orlov, A., Yehuda, Y., Aharoni, Y.：Energy cost ofcows’ grazing activity： Use of the heart rate
method and the Global Positioning System fordirect field estimation, J. Anim. Sci., 84, 1951～1967,
2006．
５）
 Mulliniks, J. T., Cope, E. R., McFarlane, Z. D.,
Hobbs, J. D., Waterman, R. C.：Drivers of grazing
livestock efficiency： how physiology, metabolism,
experience and adaptability influence productivity,
J. Anim. Sci., 94, 111～119, 2016．
 Šárová, R., Špinka, M., Ceacero, F.：Higher
６）
dominance position does not result in higher
reproductive success in female beef cattle, J. Anim.
Sci., 95, 3301～3309, 2017．

した個体差を示した。採食時間割合は，齢および© The Ito Foundation

364

茎葉多収型飼料用イネの茎部に蓄積する炭水化物の栄養的意義と生産現場との技術的連携
Nutritional value of carbohydrates accumulated in forage rice with highstem yield, and development of research-based cooperative extension
service近藤

誠・Budi Wardiman・Randi Mulianda（三重大学大学院生物資源学研究科）

Makoto Kondo, Budi Wardiman and Randi Mulianda（Graduate School of Bioresources, Mie University）

Whole crop rice silage has been used as feed for dairy cattle in Japan. Indigestibility ofunhulled grains in the digestive system of cattle causes an energy loss through excretion.
Thus, rice cultivars that produce large shoot biomass with extremely small panicles（small
panicle cultivars）have been developed to reduce the energy loss as well as to supply a large
quantity of fibers. Last year, we reported that small-panicle cultivars Tachiayaka（TA）and
Tachisuzuka（TS）accumulated a higher concentration of sugars and starch in stems during
the grain filling period than large-panicle cultivars, Hoshiaoba（HA）and Kusanohoshi（KH）
did. Small-panicle cultivars also showed higher fiber digestibility in rumen than large ones.
However, these experiments used forage rice at harvesting, and the characteristics on
carbohydrates after ensiling are still not clear. Therefore, the present study is aimed atinvestigating whether panicle size and ensiling affect the nutritional characteristics ofcarbohydrates in stems of forage rice and ruminal fermentation afterwards. Two large-panicle
cultivars, HA and KH, and two small-panicle cultivars（TA and TS）were grown andharvested at 45 days after full-heading stage. These rice plants were cut into 2 ～ 3 cm andensiled in plastic bags. These silos were stored in a room at 20 ～ 22 ℃ for 45 and 120 days.
Stem and leaf parts at harvesting and opening silos were collected and used for chemical
analysis and in vitro ruminal fermentation study. As similar to last year, both sugar and starchconcentrations were significantly higher in small-panicle cultivars, than in large-panicle
cultivars at harvesting. After ensiling, soluble sugars concentration decreased to one tenth offorage rice at harvesting. On the contrary, starch concentration remained even after ensiling.
Fiber digestibilities and in vitro ruminal short-chain fatty acids（SCFAs）concentrations of TA,
TS were also significantly higher than those of HA and KH both at harvesting and after
ensiling. These results indicated that rice plants with small-sized panicles contain a large
amount of ruminal fermentable carbohydrate in stems even after ensiling and could supply
more energy as a form of SCFAs to ruminants．

© The Ito Foundation

茎葉多収型飼料用イネの茎部に蓄積する炭水化物の栄養的意義と生産現場との技術的連携

１．目

的

２．方

水田を活用した国産の飼料の必要性が高まるな

2.1

365

法

飼料用イネの栽培とサイレージ調製

か，乳牛や肉牛に対しては，飼料用イネをサイ

イネWCSとして利用される品種として，穂重レージとして貯蔵させたイネホールクロップサイ型のホシアオバ，クサノホシ，極短穂型のたちあレージ（WCS）が利用されている。イネWCS用やか，たちすずかを用いた。播種後３週目の苗をの品種としては，従来はデンプンを蓄える穂部が６月中旬に三重県津市の水田に移植した。各品

大きい品種（穂重型）が選ばれていたが，牛の消種，出穂後45日目に地上部の植物体を収穫した。

化管内では籾は消化しづらく，未消化のまま籾が植物体を約３cmに切断した後，ナイロン樹脂を排泄されることが判明した。そこで穂が小さく，含むポリエチレン製の袋（横450mm×縦600mm

繊維質に富む茎葉が多いタイプの品種が開発さ

×厚さ0.07mm）に約500ｇ入れ，脱気後にヒートれ，「たちすずか」や「たちあやか」などの極短シーラーで密封し，20～22℃の室内に貯蔵させて穂型の品種が普及され，乳用牛や肉用牛に給与さサイレージとして調製した。また茎葉の一部をれている。

60℃で48時間乾燥させて収穫時の試料をとした。

我々はこのような茎葉収量が多い極短穂型の品
種では，茎部には可溶性糖類に加えて，デンプンが蓄積していることを報告してきた

。さらに，

１，２）

これらの品種では茎部の繊維消化性が高いことをサイレージは45日あるいは120日後に開封し，茎葉と穂を分けて，60℃で48時間乾燥させた。
2 . 2 イネ茎葉部に含まれる炭水化物画分の分
析とルーメン内消化性の評価

示し，それらの結果としてルーメン内で産生され収穫時のイネとサイレージとして貯蔵させたイる短鎖脂肪酸が高まることをin vitroルーメン内

ネの茎葉部を対象に，可溶性糖類やデンプン，繊の培養系で明らかにしてきた 。極短穂型の品種

維含量を測定した。単少糖類はフェノール硫酸

は穂重型の品種と比べて茎が太く草丈も高くなり

法３），デンプンはtotal starch assay kit（Megazyme

やすいが，質的には消化しやすい炭水化物を含ん社）に よ り 測 定 し た 。繊 維（neutral detergent

でいることが推察された。しかし，これらの結果

fiber，NDF）はデタージェント法４）により測定

は，実験の便宜上収穫時のイネを使っており，畜した。ついで，ルーメン内消化性を評価するため産農家で利用されるサイレージとして貯蔵されたに ，め ん 羊 か ら ル ー メ ン 微 生 物 を 採 取 し ，in

後の評価は行われていない。サイレージとしての

vitroのルーメン培養を行った。基質として各品貯蔵過程では，微生物による発酵でイネ中の単少種のイネ茎葉部を加え，48時間後に未消化の培養

糖類やデンプン，繊維の一部が変化することは予

残渣を回収し繊維消化率を測定した。また，ルー想される。

メン微生物が主に炭水乾物を発酵して産生し，宿２）

そこで本研究では，飼料用イネの炭水化物（単主である牛のエネルギー源として利用される短鎖

少糖類，デンプン，繊維）の牛に対する栄養的意

脂肪酸（SCFA，hort-chain fatty acids）につい義を，イネの品種やサイレージ調製と関連付けてて，培養上清中の濃度をHPLCにより測定した５）。

明らかにすることを目的とした。

2 . 3 酪農家が利用するイネWCSに含まれる可溶性糖類およびデンプン含量の調査
イネWCSを生産している農業生産法人を訪問© The Ito Foundation

366

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

し，イネの品種と収穫時期を聞き取りした。また
それらのイネWCSが貯蔵された後に酪農家へ搬送された際に一部採取し，上記の方法で可溶性糖類とデンプン含量を測定した。

３．結果と考察Fig.１に飼料用イネ４品種の収穫時（貯蔵０日目）と45日あるいは120日間貯蔵させてサイレージに含まれる可溶性糖類，デンプン，繊維（NDF）
含量を示した。収穫時における可溶性糖類は，極

sugar content（%DM）

14
12

Cultivar
Ensiling period
Interaction

p<0.01p<0.01p<0.01

Cultivar
Ensiling period
Interaction

p<0.01
p=0.39p=0.56

Cultivar
Ensiling period
Interaction

p<0.01p<0.01p<0.01

10
8
6
4
2
0

starch content（%DM）

18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

NDF content（%DM）

80
70
60
50
40
30
20
10
0

0 45 120

0 45 120

0 45 120

0 45 120

Hoshiaoba

Kusanohoshi

Tachiayaka

Tachisuzuka

Ensiling
period（day）
Cultivar

Fig. 1 Sugar, starch and neutral-detergent fiber（NDF）contents in the stem＋leaf part of 4 cultivarsof forage rice before（day 0）and 45, 120 days after ensiling. Error bars represent SEM.

© The Ito Foundation

茎葉多収型飼料用イネの茎部に蓄積する炭水化物の栄養的意義と生産現場との技術的連携

367

短穂型品種であるたちあやかとたちすずかでは乾デンプンの形で茎葉部に多く含有されると考えら物中で10～12％程度，穂重型品種であるホシアオ

れる。本研究ではこれらのイネをサイレージとし

バとクサノホシでは４～６％程度であり，本研究て貯蔵させた結果，茎葉部のデンプン含量についにおいても先行研究と同様に極短穂型品種の特徴てはサイレージの発酵による影響は認められなである高糖性の性質が確認された 。一方，サイ

かった。したがって，極短穂型イネの収穫時に茎レージとして貯蔵した後ではいずれの品種も可溶部に蓄えられていたデンプンはサイレージとして性糖類の含量は約１％程度と低かった。このこと貯蔵した後にも残存していることが明らかとなっから，高糖性のイネにおいても，可溶性糖類はサた。サイレージの貯蔵過程におけるデンプン含量

イレージ内で発酵に関与する微生物に９割近くはの変化についてはトウモロコシを対象にした報告

消費され，家畜に給与される時点では多くは残っが複数あり，それらの報告では本研究と同様に収ていないことが示された。草ら７）は，たちすずか穫時と貯蔵後のデンプンの含量は変化が少ない事を対象にした実験室内の小規模サイロの実験に例や，品種や貯蔵期間によっては減少する事例もて，収穫時に含まれていたスクロース，グルコー

報告されている８，９）。本研究では実験室内の小規ス，フルクトースがサイレージの発酵後ではほぼ模サイロにて120日間の貯蔵と条件が限定的で消費されていることを示しており，本研究の結果あったが，生産現場では収穫されたイネはサイを支持している。また，収穫時の飼料用イネ茎葉

レージとして調製された後，屋外で貯蔵され，ほ部に含まれるデンプン含量は品種間で有意に異なぼ１年近くにわたり順次給与されていく。したり，可溶性糖類と同様に極短穂型品種で多く，穂がって発酵に関わる温度や貯蔵期間が異なること

重型品種で低かった。極短穂型品種の中では，たで，デンプンの残存性に影響をする可能性も考え

ちあやかのほうがたちすずかより３ポイント近くられるため，飼料用イネ茎部のデンプンが屋外で２）多く含まれており，昨年の結果と同様であった 。

長期保管した場合でも残存し，家畜に対して栄養

飼料作物の中では，トウモロコシやオオムギのよ

素としての供給に関与するかを明らかにすること

うに子実が発達する作物では子実中にデンプンをが必要である。本研究では飼料用イネの茎葉部に蓄積するが，我々が行った別の調査ではイネ科や含まれる炭水化物として，可溶性糖類やデンプン

マメ科の牧草類ではデンプンを10％以上と多く蓄に加えて，繊維含量を測定した結果，品種とサイ積するものはなく，牧草中のその含量も１～２％レージとしての貯蔵期間の交互作用が認められ程度と低い。また，極短穂型のイネでは葉部のデた。繊維含量としては特に穂重型であるホシアオ

ンプン含量は１％程度と低いことから ，本研究

バとクサノホシのほうが極短穂型のたちあやかとで対象とした茎葉部のデンプンもほぼ茎部由来したちすずかよりも高かった。これは極短穂型ではている。これらのことから，たちあやかやたちす

可溶性糖類やデンプンが蓄積することで相対的にずかのように茎部にデンプンを蓄積する飼料作物

含量として繊維が低下するためと考えられた。

６）

１）は稀であり，極短穂型飼料用イネの特徴と言え続いて，これらの飼料用イネ４品種の茎葉部をる。このように極短穂型のイネでは，光合成産物

in vitroのルーメン内にて消化性の評価を行った。

の貯蔵器官である穂部が小さくなった一方で，葉乾 物 消 化 率 （dry matter digestibility, DMD），

部からの光合成は収穫時でも維持されることで，

繊 維 消 化 率（NDF digestibility, NDFD）に お い

穂部では収容できない光合成産物が可溶性糖類やて，品種とサイレージの貯蔵による交互作用が認© The Ito Foundation

368

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 1 in vitro ruminal digestibility, SCFA concentration from stem+leaf

fraction of forage rice before and after ensiling.
DMD
%

NDFD
%NDF

SCFA
mM

Hoshiaoba

50.4

42.6

40.6

Kusanohoshi
Tachiayaka

44.7
57.0

40.9
45.6

35.2
48.4

Tachisuzuka

59.2

48.8

49.5

Hoshiaoba

46.8

41.1

37.5

Kusanohoshi

40.7

38.9

32.4

Tachiayaka
Tachisuzuka

57.7
57.6

46.7
49.0

47.9
48.9

120d after ensiling
Hoshiaoba

46.8

39.9

38.0

Kusanohoshi
Tachiayaka
Tachisuzuka

40.8
55.9
57.8

37.2
46.8
48.1

33.1
48.1
50.0

<0.01
<0.01
<0.01

<0.01
<0.01
<0.01

<0.01
<0.01
<0.01

Treatment
Before ensiling45d after ensiling

Significance
Cultivar（C）
Ensiling period（E）
CxE

DMD, dry matter digestibility; NDFD, neutral detergent fiber digestibility, SCFA,
short-chain fatty acids

められた（Table１）。乾物消化率は，品種間でそ濃度は，品種とサイレージ調製の期間による交互の差は大きく，極短穂型品種のたちあやかとたち作用が認められた。特にイネの収穫時とサイレー

すずかは穂重型のホシアオバとクサノホシよりもジ調製後のいずれにおいても，極短型の２品種が高かった。可溶性糖類やデンプンはルーメン微生

穂重型の２品種と比べて高い値を示した。また穂物により速やかに利用されやすい栄養素であるた重型の２品種ではサイレージ調製後は短鎖脂肪酸

め，これらの含量が高い品種では，乾物消化率が濃度が低下したが，極短穂型の２品種では収穫時高くなったと考えられる。また繊維消化率についと同程度に維持されていた。これらのことから，ても極短穂型品種が穂重型品種よりも高い値を示

たちあやかとたちすずかは収穫時のみならず，サした。昨年度の研究においても，収穫時のイネでイレージとして貯蔵させた後でも，ルーメン微生

同様の結果を報告しており，２年間繰り返して栽物により代謝される炭水化物の量が多く，牛への培したイネにより再現性が確認された。さらに，

エネルギー源供給量が多く維持されていることがサイレージとして貯蔵された後でも，極短穂型の推察された。可溶性糖類とデンプン，そして可消

２品種は，穂重型の２品種と比べて繊維消化率が化の繊維含量の総量を発酵可能な炭水化物含量と高く維持されていた。河野ら

ではたちすずかのして算出した値をＸ軸に，in vitroルーメン内に繊維消化率がクサノホシと比べて有意に高いことおける短鎖脂肪酸濃度をＹ軸に取った散布図をを羊と牛を使ったin vivoの実験により示しておFig.２に示した。これらの結果から計算によってり，今回の結果を支持している。また，本研究で求めた発酵可能な炭水化物含量は，ルーメン微生

行ったin vitroルーメンの培養液中の短鎖脂肪酸物により産生された短鎖脂肪酸の濃度と正の相関

10）© The Ito Foundation

short chain fatty acids concentration inin vitro rumen（mM）

茎葉多収型飼料用イネの茎部に蓄積する炭水化物の栄養的意義と生産現場との技術的連携

369

55
50
45
40
r = + 0.86
p < 0.01
n = 48

35
30
25
20

20

25

30

35

40

45

50

55

fermentable carbohydrate contents（%DM）
Fig. 2 Correlation between fermentable carbohydrate contents（sum of sugar, starchand digestible neutral-detergent fiber（NDF）contents）and in vitro ruminal
short-chain fatty acids concentration in the stem ＋ leaf part of 4 cultivars of forage
rice before（day 0）and 45, 120 days after ensiling□，Hoshiaoba；■, Kusanohoshi；○，Tachiayaka；●，Tachisuzuka（ｒ＝＋0.86）が認められた。特に，品種間で比較すると，極短穂型の２品種がグラフ上の右上に４．要

約分布し，たちあやかとたちすずかはルーメン微生

本研究では，飼料用イネの品種のうち，茎葉多物により利用される炭水化物含量が高いことが確

収で穂部割合が小さい（極短穂型）たちあやかと認された。

たちすずかには，穂部割合が大きい（穂重型）ホ以上の実験室規模での結果を受け，生産現場のシアオバとクサノホシと比べて，茎葉部に可溶性調製されるイネWCSを対象に可溶性糖類やデン

糖類やデンプンが多く含まれること，さらに，サプン含量の調査を行った。生産されていたイネ

イレージ調製後には，可溶性糖類は９割近く減少

WCSの品種はたちあやかとたちすずかで，収穫しているが，デンプン含量はほぼ収穫時と同程度

は９月下旬から10月中旬にかけて行われていた。

に残存していることを明らかにした。さらに，極収穫時に約４，５cmに切断され，１ロールが約

短穂型の２品種は，収穫時，サイレージ調製後と250kgのロールベールサイレージとして調製されもにルーメン内における繊維消化率が穂重型の２ていた。イネWCSは貯蔵２か月後から随時酪農

品種と比べて高いことを示した。また，極短穂型

家で給与されていた。調査は貯蔵後７か月目に行の２品種の茎葉ではサイレージとして貯蔵された

い，両品種ともに６ロールずつ，合計12ロールを後もルーメン内で発酵可能な炭水化物量が多く，調査した。その結果，可溶性糖類は両品種ともに牛へ供給可能なエネルギー量が穂重型品種と比べ平均1.2％（0.8～1.5）と低かったが，デンプンはて多い可能性が示された。生産現場で栽培されたちあやかで平均14.1％（11.8～17.4），たちすず

ロールベールサイレージとして長期保管された極かで平均12.4％（11.6～13.9）であり，生産現場

短穂型のイネWCSを調査した結果，実験室規模

で収穫，調製，貯蔵されたイネWCSでもデンプの結果と同様に，可溶性糖類は少なく，デンプンンが残存していることが確かめられた。

は残存していることが確かめられた。今後，極短© The Ito Foundation

370

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

穂型のイネWCSに蓄積するデンプンについて家畜を用いた栄養特性を明らかにすることが必要である。
文献１） 太田怜奈，関谷信人，近藤誠：日本作物学会講演
会要旨集，111，2017.
２） 近藤誠：伊藤記念財団平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書, 37, 449～454, 2019．
３） Hall, M. B.：Anim Feed Sci Techonol, 185, 94～
100, 2013.
４） Van Soest, P. J., Robertson, J. B., Lewis, B. A.：J
Dairy Sci, 74, 3583～3597, 1999.

５）
 Kondo, M., Shimizu, K., Jayanegara, A., Mishima,T., Matsui, H., Karita, S., Goto, M., Fujihara, T.：J
Sci Food Agric, 96, 1175～1180, 2016.
 Matsushita, K., Iida, S., Ideta, O., Sunohara, Y.,
６）
Maeda, H., Tamura, Y., Kouno, S., Takakuwa, M.：
Breeding Sci, 61, 86～92, 2011.
７） 草佳那子，上垣隆一，木村俊之：日本草地学会誌，
64, ７～17, 2018.
 Der Bedrosian, M. C. , Nestor Jr. K. E., Kung Jr.,
８）
L.：J Dairy Sci, 95, 5115～5126, 2012.
９）
 Windle, M. C., Walker, N., Kung Jr., L.：J Dairy
Sci, 97, 3053～3060, 2014.
 河野幸雄，新出昭吾，神田則昭，城田圭子，福馬10）
敬紘，塚崎由子：日本草地学会誌, 60, 91～96，2014.

© The Ito Foundation

371

養鶏における個体管理と清掃ロボット導入による
IoT型食肉生産技術の開発（Ⅱ）
Development of IoT type meat production system to introduce forindividual management and cleaning robot of poultry farming（Ⅱ）

堀口

健一１・Meng Tong１・片平

光彦１・市浦茂２（１山形大学農学部，２岩手大学大学院連合農学研究科）

Kenichi Horiguchi１，Tong Meng１，Mitsuhiko Katahira１ and Shigeru Ichiura２（１Faculty of Agriculture, Yamagata University，２The United Graduate School of Agricultural Sciences, Iwate University）

Management techniques for reliable and efficient livestock production is demanded feedingwith consideration for the comfort of livestock, maintenance of the hygienic feeding
environment and reduction of the burden of its management work. Broiler’s chicken production
system does not have the less effort technology to manage the individual because of the low
profits per broiler. So, we need to develop the less effort technology for broiler management.
And it is also required to check the health of broilers. From these backgrounds, we conducted
several experiments and obtained the following results. In artificial intelligence learned using
broiler's behavior images, Chainer v1.23.0 can classify images, but it is not possible to detecteach individual from multiple broilers in image, so it is used to grasp the outline of behavior
pattern in a group. In the case of using Darknet - YOLO v3, it was shown that each individualin an image could be detected, and each individual behavior of eating, drinking, and resting
could be identified. RFID is effective for broiler individual identification and behavior analysis,
and it is necessary to consider how to attach a tag and low-cost small tag. Although theprototype system for body weight measurement and behavior monitoring has some points tobe improved, it is possible to acquire growth-related data such as broiler's body weight andbehavior in real time. By establishing a monitoring function based on deep learning, thissystem will be able to realize reduction of monitoring labor and optimization of feeding
conditions in broiler farming. The body weight of broiler was determined to the class of correct
body weight in 70 - 100％ range by artificial intelligence using test images of same individual.
It was confirmed that moving cart of assisting robot for chemical spray can travel following an
operator with the control system, and can work stably while towing a hose．

１．目

個体管理は，その重要性が増していくと考えられ的る。家畜の個体管理において，家畜の快適性を評

消費者ニーズを踏まえた安全・安心な畜産物を価する情報にもなる飲水や飼料摂取，休息などの生産・提供していくうえで，生産現場での家畜の行動データ，成育状況を把握するための体重デー© The Ito Foundation

372

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

タ，それらに関連する飼育環境データとなる温度

では管理作業者の負担が増す課題を抱えており，や湿度などさまざまな情報を総合的に解析して評

清掃や消毒などの管理作業のロボット化に対する価することが求められる。これら多くの情報はこ要望が高い。

れまで観察や個別でのデータ収集にとどまってい

このような背景から，消費者志向に合致した安た が ， も の の イ ン タ ー ネ ッ ト （Internet of

全・安心な畜産物生産，家畜の快適性に配慮した

Things「IoT」）の促進により，監視カメラによ

飼養，衛生的な飼育環境の整備とその作業の負担

る家畜の各種行動の画像データや各種センサによ軽減などの点を意識した管理技術の必要性が増す

る家畜の飼育環境データなどを収集して活用できと思われる。本研究では大規模飼養が進んでいる

るようになり，高精度なGPUによる深層学習を養鶏（群飼管理下のブロイラー）において，衛生用 い た 人 工 知 能（Artificial Intelligence「AI」）

的な飼育環境での安全・安心な鶏肉生産を，ヒトによる解析が可能になっている。しかし，AIのの介在を極力減らした管理，限られた人員で労力適用については工業面での実装が進んでいるものを軽減できる管理で実現することを目的に，畜産の，畜産業の現場での実装例は少ないのが現状で業における家畜の個体管理手法と清掃ロボット開ある。

発によるIoT型の食肉生産技術を確立する。

国内の肉用若鶏（ブロイラー）の生産において，飼養戸数は小規模の飼養者層を中心に減少傾２．方法

向にあるものの，飼養羽数は平成20年の102,987

2.1

千羽から平成30年の138,776千羽へ増加し，出荷

供 試 動 物 は ブ ロ イ ラ ー（チ ャ ン キ ー ブ ロ イ

羽 数 50 万 羽 以 上 の 大 規 模 の 飼 養 者 層 が 全 体 のラー）を用いた。飼育実験は山形大学動物実験委

12.0％（平成30年）を占めており，大規模化が進

員会（学長）の承認を受けた動物実験飼養施設にんでいる 。ブロイラーの飼養管理は，開放型やて動物実験計画書にしたがって実施した。ブロイ

ウンドウレス型などの鶏舎にて，その大半が平飼

ラーの雛（雄）を導入し，３週齢まで同一条件下

いの群れ（群飼）で行われており，群飼管理下でで管理した。飼育実験のための飼養管理は市販のの生産効率や衛生面などに関する技術開発が不可

仕切り板（メッシュ型）で飼育用の囲いを設置

欠であり，大規模化に合わせた適正な飼育環境下し，給餌器と給水器を配置して不断給餌，自由飲で最適な飼養管理を行うことが重要となる。一水とし，敷料として籾殻を用いて行った。

１）

供試動物と飼養管理方，ブロイラーの生産現場では各種疾病に対応す

2.2

るため，作業施設への立ち入り制限や消毒の徹底

ブロイラーの飼育スペースを３つに仕切り（各などの対策が取り組まれている。鶏の出荷後にはスペースには自由に移動できるよう一部を仕切

防疫の観点から徹底した清掃と消毒を行い，生産り），左右のスペースに給餌器または給水器を置施設の衛生管理を厳密に実施している。鶏舎の清き，監視カメラを用いてブロイラーの行動を撮像

掃と消毒には乗用のホイールローダによる敷料のし，各行動画像のデータを保存した。撮像した画除去，牽引式の散布機による薬剤散布などが行わ像については摂食行動，飲水行動，休息行動の特れている。これらの衛生管理は基本的にヒトの立徴的な行動ごとに分類して教師データを作成し，ち入りを制限した条件下において限定された管理

それらをオープソースソフトウェア２，３）を用いて作業者により実施されている。このような状況下深層学習させ，その特徴抽出を行った。オープ© The Ito Foundation

鶏の行動識別のための教師データとAI

養鶏における個体管理と清掃ロボット導入によるIoT型食肉生産技術の開発（Ⅱ）

373

ソ ー ス ソ フ ト ウ ェ ア に は ，フ レ ー ム ワ ー ク のち，ブロイラーの体重を約2,000ｇ，3,000ｇ，4,000

Chainer v1.23.0に畳み込みネットワーク構造であｇの３つのクラスに分け，体重ごとに４羽の学習るNIN（Network in Network）を組み合わせた画像（個体の姿勢を統一するために座っている状

ものを，フレームワークのDarknetと物体検出ア

態のもの，１羽当たり600枚）を用い，学習回数

ルゴリズムのYOLO v３を，それぞれ使用した。

を500回としてAIを作成した。このAIによる体重

これらの条件下で各行動の画像を用いて学習させ判別の評価はテスト画像を用いて行った。テスト

たAIにより，それぞれの行動識別を評価した。

画像については，学習画像の個体（各体重とも４

行動識別の評価は，各行動のテスト画像（各行動羽，計12羽）から学習画像とは異なる画像を１羽

とも20枚，計60枚）を用いて行った。テスト画像

当たり５枚（計60枚），学習画像の個体とは異なは学習画像として撮像した画像から学習画像とはる個体から体重ごとに学習画像の体重に近い各３異なる画像を無作為に選んだ。なお，Chainer羽（計９羽）の画像を１羽当たり５枚（計45枚），

v1.23.0では，学習画像を行動ごとに1,000～8,000

それぞれを無作為に選んだ。

枚，学習回数を50回と500回，Darknet-YOLO v

2.5

３では，学習画像を行動ごとに50～500枚，学習

薬剤散布補助ロボットとしての走行台車は，４

回数を1,000回，10,000回，30,000回の条件で検討

輪駆動の移動ロボットに自動運転で使われるした。

LiDARを搭載し，ロボットの制御システムと連2.3

薬剤散布補助ロボット

鶏の体重計測・行動撮像システム

携して作業者に追従して動作する機能を組み込ん

群飼管理下でのブロイラーを個体識別しながらだ。薬剤散布補助ロボットの走行特性としては敷体重を計測していくため，RFIDのタグと受信機による体重の計測では試作体重計の構造を見直し，体重データの記録状況を評価しながら実証試料に見立てた砂丘地での走行性を調査した。
３．結果と考察験に向けた改良を行った。改良したRFID受信機

3.1

能内蔵の体重計は，ブロイラーのIDと体重値のChainer v1.23.0を用いて作成したAIにおけるブ各データを連続的に取得するため，動物実験飼養

ロイラーの摂食行動，飲水行動，休息行動の識別

施設内に設置したWiFiルータを介してクラウド

割合をTable１に示した。群れでの画像を教師デー

サーバに記録した。また，広角の可視光センサのタとしているため，各行動の画像とも複数のブロ

監視カメラ，サーマルセンサと可視光センサが一

イラーが存在する条件下での検討結果において，体化した監視カメラを利用し，ブロイラーの行動

それぞれの学習画像や学習回数で作成したAIは，や成育に関連するデータを取得した。これらの各

一部を除き各行動ともおおむね識別できていた。

種データを総合的に活用できる飼育判断システム

ただ，学習画像4,000枚のAIは，両学習回数ともの検討を行った。

摂食行動と休息行動において，他の枚数の学習画

2.4

鶏の体重判別のための教師データとAI

AIによる鶏の行動識別像で作成したAIより識別が低かった。同様な結体重区分の明確なブロイラーの体重判別を試み

果は昨年度もあり，この要因には各AIの行動識るため，体重を計測した個体の画像を監視カメラ

別時の閾値が変化していることが考えられる。

で撮像し，これらのデータを利用して作成した

よって，行動の識別精度を高いレベルで安定させ

AI（Chainer v1.23.0）を用いて評価した。すなわ

る必要があり，群れ画像を用いてChainer v1.23.0© The Ito Foundation

374

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 1 Recognition percentage of various behavior by artificial intelligence（Chainer v1.23.0）

using broiler images.

Number of images

Training times

1,000
1,000

50
500

Recognition percentage（%）
Eating behavior

Drinking behavior

Rest behavior

97.57
99.53

99.96
100

51.15
90.84

2,000

50

100

100

100

2,000

500

100

100

100

4,000

50

57.06

100

87.42

4,000

500

53.94

100

87.01

8,000

50

99.99

100

100

8,000

500

99.98

100

100

Table 2 Detection rate of broiler and accurate rate of detected broiler behavior by artificial

intelligence（Darknet-YOLO v3）using broiler images.

Number of images

Training times

Detection rate（%）

Accurate rate（%）

50
50
50
100
100
100
300
300
300
500
500
500

1,000
10,00030,0001,000
10,00030,0001,000
10,00030,0001,000
10,00030,000

20.8
35.3
35.3
22.0
35.3
35.3
23.7
35.8
35.3
15.0
35.8
35.3

91.7
96.7
98.4
52.6
96.7
98.4
92.7
98.4
98.4
100
96.8
98.4

で作成したAIを利用する場合には，群れの行動

り，学習回数1,000回が他の学習回数よりも低かっパターンの概要を把握するような使い方が有用でた。作成したAIはテスト画像内のブロイラーのあると思われた。Chainer v1.23.0を使用して作成ある行動をほぼ１羽検出していた。これにより検したAIは，画像を分類できるが，画像内にいる出率が３割程度になったと考えられる。

複数のブロイラーを個体ごとに検出することがで

Darknet-YOLO v３を用いて作成したAIにおいきない。群れ管理下の画像には複数の行動を含むて，テスト画像内の１羽のみを検出することが多

データがあり，この点も考慮すべきである。群れかった要因としては，AI作成時の学習画像内の管理下におけるブロイラーの行動を識別するため１羽のみにラベル付けを行って教師データを作成には同時に複数の個体とその行動を検出できる

し，それを用いて深層学習して特徴抽出を行った

AIが必要であり，物体検出に特化したDarknet-

ことが考えられる。一方，テスト画像内でAIにYOLO v３を用いて検討を行った。その結果をより検出されたブロイラーの行動が正しく識別さ

Table２に示した。テスト画像内にいる複数のブれた割合を示す正確率（各行動の平均値）は，学

ロイラーのうちでAIが検出した羽数を示す検出

習画像100枚で学習回数1,000回のAIを除き，90％率（各行動の平均値）は，15～36％の範囲にあ以上と高かった。よって，汎用性が高いAIであ© The Ito Foundation

養鶏における個体管理と清掃ロボット導入によるIoT型食肉生産技術の開発（Ⅱ）

375

るかを確認するため，まったく別の飼育環境でのごとに体重の記録を自動的に行う仕組みも確立で画像を用いてブロイラーの各行動識別を検証するきた。一方，監視カメラで撮像できた画像データことが必要かと思われるが，群れ管理下のブロイ

からは，ブロイラーの行動や発熱に関するデータ

ラーの行動識別において，Darknet-YOLO v３をが取得できた。行動データの解析・評価は今後の使用して作成したAIは画像内の個体を検出でき，検討となるが，個体の行動だけでなく，群れとし個体ごとの摂食行動，飲水行動，休息行動を識別て行動パターンの把握も可能ではないかと考えらできることが示された。

れる。発熱データは個体の特徴（羽の生え方）を

3.2

鶏の体重計測・行動撮像システムの評価示す情報になるのではないかと考えられ，この個改良した体重計は，鶏の成長に伴う体重の変化

体の特徴をAI（Darknet-YOLO v3）で認識できに対応したデータを取得できていることが確認でないか調査した（Fig.１）。その結果，作成したきた。体重計の測定性能を外部環境に影響されにAIは，同じIDのブロイラーを複数検出する「誤くい構造とするため，改良にあたって鶏がのるパ検出」，検出できない「未検出」，違うブロイラー

ネルの部分を金属板で補強した。これにより，体を同IDとする「誤認識」といった事例が認めら

重計は構造を補強できたものの，成育の後半時期れたものの，すべてのテスト画像で複数のブロイに体重計通過時のRFIDタグのデータが記録できラーを検出でき，群れとしての行動解析に活用でない事例が発生した。この要因には，金属板によきることが示唆された。したがって，本試作シスる構造補強で磁束が変化してRFIDタグの受信感

テムは，改良すべき点があるものの，ブロイラー

度が低下しまうこと，RFIDタグの取り付け位置の体重や行動といった成育関連のデータをリアル

が鶏の成長に伴い地面から離れてしまうことが考タイムで取得することが可能であり，鶏の成育関えられた。これらの点を改良することにより，個連情報を取得するうえで，管理者の人手に代わる体を識別しながらの体重把握が可能であることが省力手法として利用できると考えられる。

確認できた。なお，欠落したID情報があった場

3.3

合でも，取得できたデータをつなぐことで，個体AI に よ る ブ ロ イ ラ ー の 体 重 の 判 別 結 果 をA

AIによる鶏の体重判別

G

D

I
E

F

B
C

J
H

Fig. 1 Individual identification by artificial intelligence（Darknet-YOLO v3）

using thermal images of broiler.

© The Ito Foundation

376

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 3 Identification percentage of body weight by artificial intelligence（Chainer

v1.23.0）using broiler images.

Identification percentage（%）
Test image

Class 12,010～2,055g

Class 2
3,004～3,064g

Class 3
4,004～4,044g

2,010～2,055g

69.46

30.55

0

3,004～3,064g

0.04

99.97

0

4,004～4,044g

0

0

100

44.58

55.42

0

2,934～3,098g

0.01

99.56

0.31

3,966～4,136g

16.65

83.35

0

Same broiler image

Another broiler image
1,990～2,170g

Table３に示した。同個体のテスト画像において，じ個体であっても姿勢や形状等が異なる画像，カ作 成 し た AI は 正 解 と な る 体 重 の ク ラ ス に 70～

メラと個体の距離により画面内の個体が占める割

100％範囲で判別した。AIの学習時に用いた同じ合よりも背景の部分が広い画像などがあった。ま

個体の画像による体重判別は可能であることが示

た，背景を統一するためのブルーシートの青色や唆された。体重2,010～2,055ｇのテスト画像では，台のシートの黒色などさまざまな色が混在した画

他のテスト画像の体重判別より正解割合がやや低像となった。これらの画像を学習画像に用いたこかった。間違った体重に判別された個体は，首がとにより，画面内の情報が複合的になり，画像か

身体と重なって体の表面が現れていないことが原ら読みとれる体重に関連する特徴が複雑になって因として考えられた。また，体重2,000ｇ前後のしまい，体重の判別精度が低くなったのではない

個体は，3,000ｇや4,000ｇの個体より頻繁に動き，かと考えられる。

羽が生えそろっていなかった。このことから，個3.4

体の形状が不安定な学習画像の枚数が増えたこと

薬剤散布補助ロボットとして試作した４輪駆動

で，画像内の体重に関する情報が複雑になり，体式ロボットでのヒトの追従試験の状況をFig.２に重の判別精度が低くなったと考えられる。一方

示 し た 。ロ ボ ッ ト 台 車 は ，幅 800mm ，長 さで，別個体のテスト画像において，体重2,934～

1,004mm，高さ460mm，積載量が100kgであり，3,098ｇのテスト画像では正解となる体重のクラ

昨年度の機体よりも重心が低く牽引力も高い。こスにほぼ判別されたものの，体重1,990～2,170ｇの ベ ー ス 機 体 に RiDAR （light detection andのテスト画像では４割程度の判別であり，体重ranging：光による検知と測距）を搭載し，ベー3,966～4,136ｇのテスト画像ではまったく判別さス機体の制御システムと連携させた追従試験でれず，ほとんどがクラス２（約3,000ｇ）の体重は，走行性に難のある砂丘地でも安定した走行がに判別された。この結果の要因には次のようなこ可能であり，鶏舎内で薬剤散布用ホースを牽引しとが考えられる。学習画像には，接触により羽がながら作業できることが確認できた。

膨らんだ画像，姿勢を変えることによって鶏の足が映っている個体や映っていない個体といった同© The Ito Foundation

薬剤散布補助ロボットの走行性評価

養鶏における個体管理と清掃ロボット導入によるIoT型食肉生産技術の開発（Ⅱ）

377

休息の各行動を識別できることが示された。
RFIDはブロイラーの個体識別や行動解析に有効であり，タグの取り付け方法や低コストで小型なタグの検討が必要である。本試作の体重計測・行
動撮像システムは，改良すべき点があるものの，ブロイラーの体重や行動といった成育関連のデー
タをリアルタイムで取得することが可能であり，深層学習による監視機能を確立することで，養鶏における監視労力の軽減や飼育状態の最適化を実現できると考えられる。AIによるブロイラーの体重判別では，同個体のテスト画像において，正解となる体重のクラスに７割以上で判別した。薬剤散布補助ロボットの走行台車は，制御システム
で作業者に対して追従する走行が可能であり，薬Fig. 2 Moving cart for chemical spray.

剤散布用ホースを牽引しながら作業できることが４．要確認できた。

約

ブロイラーの行動画像を用いて学習させたAI
において，深層学習のフレームワークの１つであるChainer v1.23.0では画像を分類できるが，画像内にいる複数のブロイラーを個体ごとに検出することができないので，群れの行動パターンの概要を把握するような使い方が有用である。
Darknet-YOLO v３を用いた場合では，画像内の複数の個体を検出でき，個体ごとの摂食，飲水，

文献１）
 農林水産省生産局畜産部食肉鶏卵課：食肉鶏卵をめ ぐ る 情 勢 ， http://www.maff.go.jp/j/chikusan/
shokuniku/lin/index.html, 2019.
２）
 Tokui, S., Oono, K., Hido, S., Clayton, J.：Chainer：a Next-Generation Open Source Framework for
Deep Learning, Proceedings of Workshop on
Machine Learning Systems（LearningSys）in The
Twenty-ninth Annual Conference on Neural
Information Processing Systems（NIPS）, 2015.
３）
 Joseph, R., Ali, F.：YOLOv3：An Incremental
Improvement, arXiv：1804.02767, 2018.

© The Ito Foundation

378

成熟後の効率的な筋肥大の誘導に寄与する筋幹細胞の探索（Ⅱ）
The search study about myogenic stem cell population which can promotemuscular hypertrophy efficiently in adult animals（Ⅱ）

鈴

木

貴

弘

（北海道大学大学院農学研究院）

Takahiro Suzuki（Research Faculty of Agriculture, Graduate School of Agriculture, Hokkaido University）

Skeletal muscle hypertrophy is greatly dependent on the contributions of myogenic stem
cells（satellite cells）in the maturity period. To investigate the mechanisms of efficient myohypertrophy, we focuse on the myogenic capability differences as“the functional-heterogeneity”
of satellite cells during myogenic differentiation stage depending on mice-strains in this study.
Here, we performed comparative analysis of the ratio of myotube formation and the expression
levels of myogenic regulatory transcription factors（MyoD, myogenin, Myf5, MRF4 andmyocyte enhancer factor2 families）among three-mice-strains（ICR, C57BL/6 and BALB/c）.
Each satellite cells formed myotubes, whereas the myotube fusion index of satellite cells
isolated from ICR showed in a lower level than C57BL/6 and BALB/c. Moreover, theexpression levels of MyoD, myogenin, MEF2A and C were lower in ICR derived-satellite cells
than other two-strains. On the other hand, the expression level of Platelet-Derived Growth
Factor Receptor alpha（PDGFRα）, which is a key marker for the origins of fibrosis andadipogenesis in skeletal muscles, was higher in ICR satellite cells than C57BL/6 and BALB/c.
These results suggested that the satellite cells isolated from matured ICR mice may have thelow myogenic capability by highly expressing PDGFRα. So, we will continue this search study
focusing on the inhibitory mechanisms about myogenic capability of satellite cells. These basic
scientific knowledges would be beneficial to not only the meat science field but also medical
and sports sciences.

１．目

期待される。しかし，成熟個体内の骨格筋細胞

的（細長い構造のために“筋線維”と呼称される）家畜の骨格筋は主に食肉の原料となるが，採取は最終分化しており，自身で増殖することができできる可食肉量は個体体重の約35％程度にしか至ないため，その数や容積を増加させることは困難

らない。そのため，家畜１個体あたりの骨格筋量

である１）。一方で，骨格筋には筋再生に重要な役が一生を通じて増加し続けることが可能となれ

割を担う筋幹細胞（衛星細胞）も局在する。衛星ば，効率的な食肉生産技術の開発へ寄与できると細胞は，筋線維の基底膜と細胞膜の間隙に位置© The Ito Foundation

成熟後の効率的な筋肥大の誘導に寄与する筋幹細胞の探索（Ⅱ）

379し２），普段は休止状態にあるが激しい運動や筋疾ス（B6；日 本 ク レ ア 株 式 会 社）お よ び BALB/

患などに伴う刺激を受けて活性化状態に入る

cAJclマウス（Ｃ；日本クレア株式会社）の骨格と３～５），増殖して筋芽細胞へと分化し，細胞同士筋から単離した衛星細胞の初代培養系を使用しで互いに融合して新生筋線維（筋管）を形成したた。本研究における動物実験（動物実験承認番

り既存の筋線維に融合することで損傷部を修復す

号：15-0173）は，国立大学法人北海道大学動物る 。その際，衛星細胞は筋線維の数や容積を増実験に関する規定に基づく北海道大学動物実験実加させる超再生を通した筋肥大能が備わっている

施マニュアルに従った。

６）

ため，本細胞の動態変化を正確に捉えて制御でき

2.2

衛星細胞の初代培養系

れば，成熟個体における効率的な骨格筋量の増加

本研究では，Allenら（1997年）の方法を参考に，改良した衛星細胞の単離培養方法を採用しが見込まれる。
最近，著者らの研究グループでは，衛星細胞のた９～12）。ICR，B6およびＣそれぞれのマウス骨格

筋管形成能が単離した骨格筋部位によって異なる筋（脊柱起立筋群，大殿筋，ヒラメ筋，足底筋，“機能的不均一性”を報告した 。つまり，衛星腓腹筋，長趾伸筋，前脛骨筋および大腿直筋）を

細 胞 は 局 在 し て い る 環 境 に よ っ て myogenic

摘 出 し ，37 ℃ に 温 め た リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水

capabilityに差が生じる細胞集団であることが示（PBS）により洗浄しながら結合組織や脂肪を取唆された。そこで前年度に引き続き本研究では，り除いた後に，細切した。1.0 mg/mlとなるよう成熟後においても効率的に筋肥大を誘導できる優PBS に 希 釈 し た プ ロ テ ア ー ゼ（Streptomyces

れたmyogenic capabilityを有する衛星細胞集団

griseus；ストレプトマイシスグリゼウス由来）を探索することを目的とした。過去の報告においと細切した骨格筋を37℃の恒温槽内で60分間反応て，野生型マウス系統間では筋再生能に差異があ

させ，遠心分離（1,700 x g，25℃，４分間）したり，特にクローズドコロニー系のSJL/Jマウスは後に上清を捨てた。反応後の筋組織に37℃に温め

近交系のBALB/cマウスよりも筋再生を開始する

た PBS を 加 え て 懸 濁 し ，遠 心 分 離（190 x g ，タイミングと再生のスピードが速いことが明らか

25℃，10分間）を行った後に上清を回収した。本にされているにも関わらず ，以降の研究を通し作業は，遠心分離時間を８分間，５分間に変更してもそのメカニズムについて，衛星細胞に着目して繰り返した。集めた上清を遠心分離（1,700 x g，たアプローチは見受けられない。よって，成熟し25℃，４分間）して，細胞ペレットを回収した。

た野生型マウスの３系統間（クローズドコロニー

そこに，４℃に冷ました２％ FBS-PBS（Wash系；ICR，近郊系；C57BL/6およびBALB/c）のBuffer）を加えて攪拌した後，100μｍセルスト

それぞれから単離した衛星細胞の筋管形成能およレ ー ナ ー を 通 し て 不 純 物 を 除 去 し ，遠 心 分 離び筋分化能の比較実験を行うとともに，差が生じ（1,700 x g，４℃，４分間）を行った。上清を捨て，た要因を検証した。

４℃に冷ました溶血バッファーを３分間反応させ

７）

８）

２．方
2.1

た後に，Wash Bufferでメスアップしてから遠心法

分離（1,700 x g，４℃，４分間）を行った。上清を捨て，増殖誘導培養液（20％ FBS-F10）を加実験動物

本 研 究 で は ，８ -10 週 齢 の Jcl ： ICR マ ウ ス

えて攪拌した後，40μｍセルストレーナーを通し（ICR；日本クレア株式会社），C57BL/6NJclマウ

不純物を除去し，遠心分離（430 x g，５℃，10© The Ito Foundation

380

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）分間）を行った。再度20％ FBS-F10を加えてよ

PCR（Light Cycler 480 system II, Roche）によっく攪拌した後，fibronectinコーティングした24て定量的解析を行った。データの分析は，添付のwell poly-L-lysine coated multiplate に 骨 格 筋 量

ソフトウェアを用いて行った。

0.5-1.0 g/mlの濃度となるように調製した細胞懸2 . 5 タンパク質の抽出およびWestern Blotting

濁液を500μl/wellで播種し，５％ CO２，95％大気，

各培養細胞をPBSで洗浄後，Laemmli sample

37℃の条件下で各細胞の密度が50％コンフルエン

bufferでタンパク質を抽出した。サンプルは10％

トになるまで培養した。その後，分化誘導培養液

ポリアクリルアミドゲルによるSDS-PAGEに供（５％HS-DMEM）に切り換えて，筋管形成が十試し，泳動後のゲルよりPVDFメンブレンにタン

分に認められた分化144時間目まで培養した。な

パク質を転写した。転写後のメンブレンは，５％

お，本法を用いて単離した細胞は，増殖誘導培養（w/v）のスキムミルクを添加したtween20含有

液で24時間培養した際，衛星細胞マーカーPax７

トリス緩衝液により30分間ブロッキングし，免疫およびMyoDがそれぞれ90％および95％以上陽性

反応促進試薬（Can Get Signal, TOYOBO）で希であることを確認している。

釈した１次抗体溶液中で一晩インキュベーション

2.3

した。メンブレンを洗浄後，同様に希釈したHRP

培養細胞の蛍光免疫染色

各培養細胞をPBSで洗浄後，４％パラホルムア

標識２次抗体溶液で１時間インキュベーションしル デ ヒ ド で 固 定 し た 。固 定 し た 細 胞 は ，0.2 ％た 。そ の 後 ，ECL Western Blotting Reagents（GETriton X-100（Shigma-Aldrich）で 15 分 間 処 理

Helth care）とメンブレンを反応させ，ChemiDocTM

後，３％（w/v）の牛血清アルブミンを添加した

XRS＋システム（Bio-Rad）を用いて化学発光検

tween20含有PBSにより40分間ブロッキングし，出を行った。

同ブロッキング液で希釈した１次抗体溶液中で一2.6

晩インキュベーションした。細胞を洗浄後，同様

測定値は平均値±標準誤差で示した。

に希釈した蛍光標識２次抗体溶液で１時間イン

Microsoft Office Excel 2013（Microsoft）を 用 い

キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 。 そ の 後 ， ProLongTMて，各測定値から得られたデータをTukeyの多重Diamond Antifade Mountant with DAPI（Thermo

比較により有意差検定を行い，ｐ＜0.05をもってFisher Scientific）で 封 入 し ，蛍 光 フ ィ ル タ ー

統計学的に有意であるとした。

キ ュ ー ブ を 搭 載 し た 倒 立 顕 微 鏡 DMI4000 B（Leica）を用いて観察した。
2.4

RNA抽出およびreal-time qRT-PCR

各 培 養 細 胞 を PBS で 洗 浄 後 ，RNA 抽 出 試 薬

統計解析

３．結果と考察3 . 1 マウス系統間における衛星細胞の筋管形
成能の違い（ISOGEN II，ニッポンジーン）により溶解し，

野生型マウスに筋損傷誘導や筋移植などの処置

メーカー推奨のプロトコルに従ってtotal RNAをを行うと，系統間では筋再生能に大きな差異を生抽出した。total RNAの濃度を15 ng/μｌに希釈じることが報告されている８，13，14）。よって，野生し て か ら ，逆 転 写 に 供 試 し て（ReverTra Ace

型マウスの系統が異なると衛星細胞のmyogenic

qPCR RT Kit, TOYOBO）, cDNAを作成した。作

capabilityに差が生じる可能性が予想される。そ製したcDNAを含む逆転写反応液を鋳型とし，こで本項では，ICR，B6およびＣのそれぞれから

TaqMan Probe Assay を 用 い た real-time qRT-

単離した衛星細胞の初代培養系における筋管形成© The Ito Foundation

成熟後の効率的な筋肥大の誘導に寄与する筋幹細胞の探索（Ⅱ）

381

能について比較した。まず，位相差顕微鏡像より，ずれの系統での筋管形成は認められたが，筋管融３系統の衛星細胞はいずれも分化誘導後の経過時合率を測定したところ，ICRは34.7％±6.56％，

間とともに分化して互いに融合する様子が観察さ

B6は49.0％±2.47％，およびＣは43.2％±6.13％

れ，96時間目ではどの系統においても筋管の形成（平均値±標準誤差）となり，ICRは他の２系統が認められた（Fig.１）。しかし，分化誘導時のよりも有意に低い値であった。よって，ICRから細胞密度が同程度にも関わらず，B6およびＣで単離した衛星細胞はB6およびＣと比べて筋管形

は筋管の形成が盛んに行われたのに対し，ICRで成能が低いことが明らかとなった。

は形成数が少ないように見受けられた。そこで，

3 . 2 衛星細胞における筋分化の制御に関わる

分化誘導後72時間目における筋管のマーカータン

転写因子の発現パターンの比較

パク質であるミオシン重鎖（myosin heavy chain；

本項では，衛星細胞による筋分化すなわち筋管

MyHC）陽性の細胞を，蛍光免疫染色法を用いて形成能の制御に深く関わる転写因子群myogenic

検出した（Fig.２）。本免疫染色像においてもいregulatory factors （MRFs ； MyoD, myogenin,

Phase-contrast Microscopy
0

48

96h

ICR

B6

C

Fig. 1 Satellite cells isolated from each mouse strain formed myotubes during myogenic differentiation. Satellite cell

primary cultures, isolated from the back, buttock, and upper hind limb of each mouse, were maintained indifferentiation medium after the induction of proliferation. During differentiation stage, phase-contrast microscopy
was taken for observation of aspects about myotube-formation on every 48 h. Upper panels show satellite cells
isolated from ICR, middle panels are from B6, and lower panels are from C. White arrowheads indicate myotubes.
Scale bar；100μm.
Immunocytochemistry
ICR

B6

C

Fig. 2 Comparative analysis about the myotube fusion index of satellite cells among three-mice-strains. Satellite cell

primary cultures, prepared as shown in Figure 1, were maintained a differentiation medium until 72 h.
Immunofluorescence microscopy for total MyHC（red）and DAPI（blue）shows myotubes and nuclei. Scale bar inpanel, 100 ・ m. Myotube fusion index was evaluated and defined as the ratio of myonuclei on myotubes containing
more than two nuclei.

© The Ito Foundation

382

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Myf５およびMRF４）と，MRFsと協調的に作用高かった（Fig.４）。よって，ICRから単離した衛する転写因子myocyte enhancer factor２ファミ

星細胞はB6およびＣよりもMRFsやMEF２の各

リー（MEF2A，2B，2Cおよび2D）に着目し，サブタイプの発現量が低く，筋分化が活発に起こ

各系統の衛星細胞における分化誘導後96時間目のらないと予想された。一方で，本研究においても発 現 量 を 比 較 し た（Fig. ３ お よ び ４）
。ま ず ，

前年度の研究報告と同様に，B6から単離した衛MRFsにおいてMyoDおよびmyogeninに関して

星細胞は特にMyoDおよびmyogeninのタンパク

は，ICRに対してB6およびＣが有意に高いmRNA

質発現量が他の２系統よりも相対的に高いことか発現量を示すとともに，タンパク質レベルでも同ら，筋分化へのスイッチングが盛んに行われたと様な発現パターンが認められた（Fig.３）。続い

推 測 さ れ た 15）。よ っ て ，B6 は 優 れ た myogenicてMEF２ファミリーでは，MEF2Aおよび２Ｃのcapabilityを有する衛星細胞集団が局在する系統

mRNA発現量はICRに対してB6が有意に高く，である。

MEF2BのmRNA発現量はB6に対してＣが有意に
real-time RT-qPCR
ICR

B6

＊

C
＊＊

5.0

Western Blotting
MyoD（45 ｋDa）＊

Target Genes/HPRT（relatiｖe unit）

Target Genes/HPRT（relatiｖe unit）

15

myogenin（34 ｋDa）
β-actin（42 ｋDa）

10

ICR B6 C

＊

5

0

MyoD

myogenin

Myf5

4.0

patterns of myogenic regulatory factors（MRFs）in
satellite cells isolated from each mouse strain.
Satellite cell primary cultures, prepared as shown in
Figure 1, were maintained differentiation medium
until 96 h and evaluated for the expression of
MyoD, myogenin, Myf5 and MRF4 by real-time
RT-qPCR. mRNA expression was normalized to thelevel of HPRT. Bars depict the mean±SEM of three
independent cultures by relative units as comparedto the ICR strain（open bars）. Significant differencesfrom the mean of ICR at p ＜ 0.05 and p ＜ 0.01 are
indicated by single and double asterisks,
respectively.（inset）MyoD and myogenin protein
expression by ECL-Western Blotting standardized
to・-actin expression.

ICR

B6

C
＊＊

＊

＊＊

3.0

2.0

1.0

0

MRF4

Fig. 3 Comparative experiments about the expression

real-time RT-qPCR

MEF2A

MEF2B

MEF2C

MEF2D

Fig. 4 Comparative analysis about the mRNA expression

patterns of myocyte enhancer factor2 （MEF2）
families in satellite cells isolated from each mousestrain. Proliferated satellite cells from each mousestrain were maintained in differentiation medium
until 96 h. The cell lysates were evaluated for themRNA expression of MEF2A, B, C and D by realtime RT-qPCR standardized to HPRT expression.
Bars depict the mean ± SEM of three independentcultures by relative units as compared to ICR
cultures（open bars）. Significant differences among
mice strains at p ＜ 0.05 or p ＜ 0.01 are indicated bysingle or double asterisks.

© The Ito Foundation

383

成熟後の効率的な筋肥大の誘導に寄与する筋幹細胞の探索（Ⅱ）

3 . 3 衛星細胞が非筋系譜へと形質転換する可2.0

能性に着目した検証

real-time RT-qPCR
B6

ICR

C

胞は筋管形成能および筋分化能が他の系統と比較して低いことが明らかとなったが，本項ではその要因の検証を行った。筋組織内において，血小板
由 来 増 殖 因 子 受 容 体 で あ る Platelet-Derived
Growth Factor Receptor alpha （PDGFRα） 陽性の細胞は，組織の線維化や脂肪化の起源となることが報告されている16，17）。そこでICR由来の衛PDGFRα/HPRT（relatiｖe unit）

これまでの結果より，ICRから単離した衛星細
1.5

1.0
＊＊

0.5

星細胞は，PDGFRαの発現量が相対的に高くな＊り非筋系譜の細胞へと形質が転換した可能性に着0目した（Fig.５）。分化誘導直後から，いずれの系統の衛星細胞においてもPDGFRαの発現が認められたが，特にICRの発現量は０時間後でＣよりも，48時間後ではB6よりもそれぞれ有意に高かった。なお，０時間後においてＣはB6よりも有意に発現量が低かった。分化誘導96時間目以降
では，系統間における有意な差は認められなかった。以上より，ICRから単離した衛星細胞は分化誘導初期の段階において，PDGFRαを高発現していたために筋管形成能ならびに筋分化能が他の系統よりも低いことが示唆された。しかし，過去の報告では筋組織中のPDGFRα陽性細胞と衛星

＊

0

48

96

144

diﬀerentiation phase（ｈ）
Fig. 5 Comparative experiments about the expression

levels of Platelet-Derived Growth Factor Receptoralpha（PDGFRα） in satellite cell cultures isolated
from each mouse strain during differentiation stage.
Each satellite cell primary cultures, prepared asshown in Fig. 1, were maintained in differentiation
medium after the induction of proliferation andevaluated for the expression of PDGFRαby realtime RT-qPCR. mRNA expression was normalized
to the level of HPRT at all time points indicated.
Bars depict the mean±SEM of three independentcultures by relative units as compared to the ICR
strain（open bars）. Significant differences among
mice strains at p ＜ 0.05 or p ＜ 0.01 are indicated bysingle or double asterisks.

細胞は区別されていることから16，17），本研究結果の妥当性を確かめるためにも，シングルセルレベ

することで筋再生を担い，さらには超再生を通しルでのより詳細な解析を行う必要があるとともた筋肥大にも寄与する。最近では，衛星細胞は局に，他の因子にも着目したさらなる要因探索作業

在する環境に応じて機能的不均一性を示すため，を進める必要がある。

myogenic capabilityの異なる細胞集団が存在する

４．要と推測され，優れた集団を同定できれば効率的な

約筋肥大制御メカニズムを明らかにできる。そこで成熟個体の筋線維は最終分化しており，かつ自本研究は，野生型マウスの系統間で筋再生能に差身で増殖することができないため，細胞容積や数異があるという過去の知見に着目し，ICR，B6おを増加させることが難しい。しかし，骨格筋に局よびＣの３系統のマウスからそれぞれ衛星細胞を在する衛星細胞は増殖能を有するとともに，互い単離した初代培養系を用いて，筋管形成能ならびに融合して筋管を形成したり既存の筋線維に融合に筋分化能を比較するとともに，差異が生じる要© The Ito Foundation

384

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

因の検証を行った。その結果，ICRはB6およびＣから単離した衛星細胞よりも筋管形成率ならびに筋分化を制御する転写因子の発現量が相対的に低いことが明らかとなった。一方で，分化誘導初期において，筋組織の線維化や脂肪化に寄与する
PDGFRαの発現量がICRでは他の系統よりも高い こ と が 明 ら か と な っ た 。 つ ま り ， ICR は
myogenic capabilityが抑制された衛星細胞集団を有することが示唆された。今後は，系統間における衛星細胞のmyogenic capabilityの差を生み出す要因を，より詳細に解析する予定である。
文献１） 水野谷航：食肉の科学, 57, ７～17, 2016.
２） Mauro, A.：J. Biophys. Biochem. Cytol., 9, 493～
495, 1961.
３） Tatsumi, R., Allen, R. E.：Anim. Sci. J., 79, 279～
290, 2008.
４） Tatsumi, R.：Anim. Sci. J., 81, 11～20, 2010.
５） Hara, M., Tabata, K., Suzuki, T., Do, M.-K. Q.,
Mizunoya, W., Nakamura, M., Nishimura, S., Tabata,S., Ikeuchi, Y., Sunagawa, K., Anderson, J. E., Allen,
R. E., Tatsumi, R.：Am. J. Physiol. Cell Physiol.,
302, C1741-C1750, 2012.
６） Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A.：Physiol. Rev.,93, 23～67, 2013.
７） 鈴木貴弘：食肉の科学, 59, 33～38, 2018.

８） Grounds, M., McGeachie, J.：Cell Tissue Res.,
255, 385～391, 1989.
９）
 Allen, R. E., Temm-Grove, C. J., Sheehan, S. M.,
Rice, G.：Methods in Cell Biol., 52, 155～176, 1997.
 Tatsumi, R., Sankoda, Y., Anderson, J. E., Sato, Y.,
10）
Mizunoya, W., Shimizu, N., Suzuki, T., Yamada, M.,
Rhoads, R. P. Jr., Ikeuchi, Y., Allen, R. E.：Am. J.
Physiol. Cell. Physiol., 297, C238-C252, 2009.
 Suzuki, T., Takaishi, H., Sakata, T., Do, M.-K. Q.,
11）Hara, M., Sato, A., Mizunoya, W., Nishimura, T.,
Hattori, A., Ikeuchi, Y., Tatsumi, R.：Anim. Sci. J.,
81, 245～251, 2010.
 Tatsumi, R., Suzuki, T., Do, M.-K. Q., Ohya, Y.,
12）
Anderson, J. E., Shibata, A., Kawaguchi, M., Ohya,
S., Ohtsubo, H., Mizunoya, W., Sawano, S., Komiya,Y., Ichitsubo, R., Ojima, K., Nishimatsu, S-I., Nohno,T., Ohsawa, Y., Sunada, Y., Nakamura, M., Furuse,
M., Ikeuchi, Y., Nishimura, T., Yagi, T., Allen, R.
E.：STEM CELLS, 35, 1815～1834, 2017.
13） Grounds, M., McGeachie, J.：Muscle Nerve, 13,
305～313, 1990.
 Mitchell, C., MeGeachie, J., Grounds, M.：Cell
14）
Tissue Res., 269, 159～166, 1992.
15） 鈴木貴弘：平成30年度食肉に関する助成研究調査
報告書, 37, 441～448, 2019.
 Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S.,
16）
Tsuchida, K.：Nat. Cell Biol., 12, 143～152, 2010.
17）
 Uezumi, A., Ito, T., Morikawa, D., Shimizu, N.,
Yoneda, T., Segawa, M., Yamaguchi, M., Ogawa, R.,
Matev, M. M., Miyagoe-Suzuki, Y., Takeda, S.,
Tsujikawa, K., Tsuchida, K., Yamamoto, H., Fukada,
S.：J. Cell Sci., 124, 3654～3664, 2011.

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385

ルーメン内繊維消化ダイナミクスに着目した
採食可能量の予測モデルの開発
Prediction of feed intake capacity based on dynamic models of fiber
digestion and passage in the rumen

谷

川

珠

子１・田

中

常

喜２

（１地方独立行政法人北海道立総合研究機構酪農試験場，２地方独立行政法人北海道立総合研究機構畜産試験場）

Tamako Tanigawa１ and Tsuneki Tanaka２（１Local Independent Administrative Agency, Hokkaido Research Organization Dairy Research Center,
２Local Independent Administrative Agency, Hokkaido Research Organization Animal Research Center）

This study demonstrated prediction of dry matter intake（DMI）of total mixed rations（TMR）based on dynamics simulation of neutral detergent fiber（NDF）remain in the rumen.
This model was carried by real-time TMR intake data of thirty-two dairy cattle reared in afree-stall on the assumption of the digested and passaged NDF model. The simulation resulted
in that NDF remain in the rumen was a mean of 8.0±1.2 kg, and that NDF remain related totraits of dairy cattle such as metabolic body weight, parity, and days in milk. In addition, thesimulation showed a periodicity in a day for NDF remain in the rumen. This study developed aframework of DMI prediction model based on the NDF-based dynamics simulation. In addition,
results in this study indicated that the approach of NDF-based dynamics simulation could
achieve a robust and precise DMI prediction, if parameters in the simulation were optimized
by training data from other environments and/or rearing conditions.

１．目

与飼料中の粗飼料割合などが一定の条件下におい

的て採食量の予測が検討されてきた。それにより，飼料の採食量は，反芻家畜の乳肉の生産性に最

採食量に影響する要因は整理されたが，さまざまも影響し，採食量を高めることは生産性向上に重な条件下での採食量の予測に向けた，多くの要因要である。反芻家畜の採食量は，飼料の種類，成を含む体系的なモデルの構築には至っていない。

分，物理的特性，消化管内での消化速度および通ルーメン内の許容量の把握は，ルーメン内の物

過速度などの飼料側，体重，体型，乳量，乳期お理的な膨満に制限される採食量の予測や，ルーメ

よび妊娠などの動物側，設備や給与回数などの環

ン性状の解析に，有益な情報となり得る。本研究境といった多くの要因に影響される。特に飼料側では，採食と，消化および下部消化管への通過にの要因のうち，粗飼料由来の繊維の特性は，採食よる時間経過に伴ったルーメン（第一胃）内の繊量に強く影響する要因であることが知られてい維の動態（ルーメン内繊維消化ダイナミクス）にる。これまでの試みの多くは，生産性レベルや給着目し，採食量を予測するためのモデル化を試み© The Ito Foundation

386

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

た。具体的には，（ⅰ）フリーストールで２群管ンスコア（BCS），個体別日乳量（kg day－１）の理された牛群（泌乳前期，泌乳中・後期）の採食データを整理した。体重とBCSは線形補完で日単量について，リアルタイムで自動記録されたデー位の値とし，解析対象とした。給与飼料は，牧草タを用い，採食量と，繊維の消化速度および通過

サイレージとトウモロコシサイレージ，大豆粕，

速度で表現したルーメン内に滞留する繊維量のモ

圧ぺんトウモロコシ，乾草，炭カル，第２リンカル

ニタリング，（ⅱ）体重や乳期などから繊維滞留を用いて，混合飼料（TMR, Total Mixed Rations）

量を規定するモデルの構築を行った。

とし，１日１回，午前の搾乳直後に給与した。泌

２．方

乳前期用のTMR設計は，粗タンパク質（CP）含法

量で16.7±1.2％DM，中性デタージェント繊維

本研究は，北海道立総合研究機構酪農試験場（NDF）含量で38.6±1.9％DM，非繊維性炭水化（北海道中標津町）において，フリーストールで物（NFC）含量で34.0±1.3％DM，粗濃比で58.4

２群管理（泌乳前期，泌乳中・後期）されたホル±2.2％であった。泌乳中・後期用のTMR設計は，スタイン種泌乳牛群の飼養データを用いた。2018

CPで14.1±1.1％DM, NDFで43.5±2.3％DM, NFC

年３月１日～2019年６月30日にかけて，個体別で30.6±1.5％DM，粗濃比で68.5±3.7％であった。

に，リアルタイムで自動記録された採食量（ｎ＝

搾乳は，１日２回，９：00と19：00頃に行った。

1,994,849）を解析対象とし，全126頭中，治療歴

各種解析は，統計ソフトＲ（GUN）を用いた。

が少なく，フリーストールでの滞在が連続した32

2 . 1 ルーメン内に滞留する繊維（NDF）量の頭を抽出した（Table１）。これら各個体について，

モニタリング産 次 ，搾 乳 日 数 ，お お よ そ １ 週 間 お き の 体 重

飼槽の訪問時間，退出時間およびその前後の飼（kg），おおよそ１週間おきのボディコンディショ

槽の重量差で記録される採食量は，採食開始時刻

Table 1 Summary of thirty-two dairy cattle reared in free-stall during March, 2018 - June, 2019, at Nakashibetsu,

Hokkaido

Category
Parity1st-parity
2nd-parity
3rd-parity
4th-parity
5th-parity
6th-parity
7th-parity
Days in milk（DIM）
under 150 DIM
over 150 DIM
Total

n＊

Days†

BW‡

DMI§

NDF remain||

NDFD¶

24
12
5
4
1
1
1

199±86155±97204±76
182±65156
259
297

584±50626±40730±97723±52729
723
678

18.2±1.722.2±1.921.6±1.523.2±1.8
25.6
23.3
21.6

7.5±0.9
8.6±0.99.4±1.0
9.3±0.8
11.3
9.5
9.0

48.2±3.948.8±4.345.2±2.449.2±2.6
42.0
48.4
47.1

32
32
32

133±35152±87284±96605±72636±76618±7420.9±3.519.1±2.4
19.8±2.7

7.6±1.1
8.5±1.3
8.0±1.252.2±2.544.4±3.9
48.3±2.9

Values show the mean ± standard diviation among the cattle.
＊ Number of the cattle.

† Averaged rearing period（days）per cow.
‡ Averaged body weight（kg）during rearing period.
§ Dry matter intake of total mixed rations（kg day-1）.
|| Mean of neutral detergent fiber（NDF）remain（kg）in the rumen based on the simulation in this study.
¶ NDF digestibility based on the simulation, NDFD = 100×digested NDF/（digested NDF+passaged NDF）.

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ルーメン内繊維消化ダイナミクスに着目した採食可能量の予測モデルの開発

387（分単位）に採食したとして集計した。摂取した

day－１/kg of BW），c-DMI；体重当たりの濃厚飼

TMR中の各飼料についてルーメン内のNDF残存

料の乾物摂取量（g day－１/kg of BW）。通過ラグ量を次式により算出し，その合計値をルーメン内

タイムは，６hr（固定値）とした。通過速度を算NDF滞留量とした：uNDFt＝pdNDF×e－kd（t-Ld）

出するための摂取量は，直近６hr以内の採食量を（ただし，t合計した。通過速度定数を算出後，６分単位に再＞ Ldかつ t ＞Lp）
，ここで，uNDFt；採食 t 時間

集計し，ルーメン内に滞留するNDF量（kg），

後のルーメン内のNDF量（kg），pdNDF；潜在

NDF消化量（kg）とNDF通過量（kg）を算出し的 可 消 化 NDF 量（kg），iNDF；不 消 化 NDF 量

た。

＋pdNDF×e－kp（t-Lp）＋iNDF×e－kp（t-Lp）（kg），kd；消化速度定数（/hr），Ld；消化ラグ
タイム（hr），kp；通過速度定数（/hr），Lp；通2 . 2 ルーメン内に滞留する繊維（NDF）量のモデリング

過ラグタイム（hr）。消化速度定数は，NDF（％

ルーメン内NDF滞留量のモデリングは，体重DM，耐熱性α-アミラーゼ添加，亜硫酸ナトリ（kg）あるいは代謝体重（kg0.75），産次（初産，ウム無添加，灰分補正あり）とin vitro培養30，

２産，３産以降），搾乳日数（day），朝の飼料給120 ，240 時 間 後 の 未 消 化 NDF 含 量（％ DM ，与からの経過時間（搾乳作業のため，採食行動が

uNDF30h ， uNDF120h ， uNDF240h） の 分 析 値 を ，

完 全 に な か っ た AM9 : 26 か ら の 経 過 時 間 ，

iNDF＝uNDF240h ，Ｌ＝５として，分解曲線（次min），日乳量（kg day－１）を説明変数の候補と式）に当てはめて算出した：uNDFt＝pdNDF×

し，搾乳日数と朝の飼料給与からの経過時間を平e＋iNDF（ただし， t ＞Ｌ），ここで，Ｌ；

滑化スプライン関数に当てはめた加法モデル，あin vitro消化試験における消化ラグタイム。消化る い は 線 形 モ デ ル に お い て ，赤 池 情 報 量 規 準

ラグタイムは，最小0.5hr～最大6.0hrとなるTMR（AIC）に基づく変数選択を行った。個体の効果

中のデンプン含量（％DM，Starch）の応答関数

は，いずれのモデルにおいても変量効果として考とした：Ld＝0.5＋（6.0－0.5）/{１＋e慮した。モデルの当てはめは，mgcvパッケージ，－kd（t-L）}。

（22－Starch）/2.5

通過速度定数は，粗飼料と濃厚飼料別に設定した。粗飼料の通過速度は，Krizsan et al.（2010）の 推 定 式 を 用 い た １）：kp ＝ 0.0119 ＋ 0.000879 ×
NDFI ＋ 0.00792 × c-NDFI/NDFI ＋ 0.0121 ×
iNDFI/NDFI，ここで，NDFI；体重（BW）当basicパッケージをそれぞれ用いた。
３．結果と考察3 . 1 ルーメン内に滞留する繊維（NDF）量とNDF消化率/kg of BW），

ルーメン内NDF滞留量は，平均で8.0±1.2kgでc-NDFI；体重当たりの濃厚飼料由来NDF摂取量あり，産次数に伴って増加する傾向が見られた（g day/kg of BW），iNDFI；体重当たりの不（Table１）。乾乳牛のルーメン内容物を調査した

消化NDF摂取量（g day －１ /kg of BW）。濃厚飼泉ら３）の報告では，朝の給餌直後や２時間後の料 の 通 過 速 度 は ， CNCPS （The Cornell Net

ルーメン内NDF滞留量は7.2～8.8kg，同様に泌乳

Carbohydrate and Protein System，Fox et al.

牛について給餌４時間後に調査したKononoff and2004） の 推 定 式 を 用 い た：kp ＝ 0.01169 ＋

Heinrichsの報告４）では，7.8～8.2kgであり，本結0.001375×f-DMI＋0.001721×c-DMI，ここで，果の平均値8.0kgとおおむね一致した。TMR設計

f-DMI；体重当たりの粗飼料の乾物摂取量（gが変更される搾乳日数150日の前後で，ルーメン

た り の NDF 摂 取 量 （g day
－１

－１

２）

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388

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

数150～160日以降に増加する傾向が確認された１左下），乾物摂取量とも正の相関関係（r＝0.60）（Fig.１左上）。本研究ではルーメン内NDF滞留量が確認された（Fig.１右下）が，体重当たりのの定常性を前提としているが，TMR設計の変更

ルーメン内NDF滞留量と乾物摂取量の相関は低によってルーメン内NDF滞留量が変化した本研

く，ルーメン内NDF滞留量と乾物摂取量は，そ究での結果は，各設定値の見直しの必要性を示唆

れぞれが体重と関連するものと考えられた。
NDF消化量とNDF通過量から算出した消化率て，検証が必要であると考えられた。日内周期がは ， 泌 乳 前 期 用 TMR （under 150 DIM） であり，朝の給餌から600～700分後（PM20 : 00頃）

52.2％，泌乳中・後期用TMRで44.4％であったに日内ピークが見られた（Fig.１右上）。ルーメ（Table１）。高泌乳牛の消化率について解析した

4

4

し，特に消化速度定数や消化ラグタイムについ

NDF remain（kg）
6 8 10 12 14 16

ン内NDF滞留量は，体重と比例関係にあり（Fig.

NDF remain（kg）
6 8 10 12 14 16

内NDF滞留量が異なり（7.6 vs. 8.5 kg）
，搾乳日

200
300
Days in milk

400

400

500

600
700
800
Body weight（kg）

900

0200 400 600 800 1000 1200 1400
Elasped time（min）after AM9:26

4

4

NDF remain（kg）
6 8 10 12 14 16

100

NDF remain（kg）
6 8 10 12 14 16

0

10
20
30
Dry matter intake（kg day－1）

40

Fig. 1 Relationship between neutral detergent fiber（NDF）remain（kg）in the rumen by dynamic simulation basedon a real-time total mixed rations（TMR）intake data and days in milk（upper left）,elapsed time after AM9：26（upper right）,body weight（bottom left）,or dry matter intake（bottom right）.The real-time TMR intake data
were collected from thirty-two dairy cattle reared in free-stall during March，2018-June, 2019, at Nakashibetsu,
Hokkaido. The dynamic simulation was carried on the assumption of the follow digested and passaged NDF model（t＞Ld and t＞Lp）,
with a 6-min pitch：NDF remain＝pdNDF×e－kd（t-Ld）＋pdNDF×e－kp（t-Lp）＋iNDF×e－kp（t-Lp）
where NDF remain is NDF（kg）in the rumen after t hours after an intake, pdNDF is potential digestible NDF（kg）,
iNDF is indigestible NDF（kg）,kd is digestion rates（/hrs）,Ld is lag time（hrs）of degradation, kp is passage
rates（/hrs）,Lp is lag time（hrs）of passage. NDF were analyzed with thermostable α-amylase and ashcorrection without sodium sulfite.

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389

ルーメン内繊維消化ダイナミクスに着目した採食可能量の予測モデルの開発
５）
de Souza et al.（2017）の 報 告 の 値（NDF 消 化

3 . 2 ルーメン内に滞留する繊維（NDF）量に

率＝42±11％，95％信頼区間19～63％）とおおむ

影響する要因ね一致した。一方，体重当たりの乾物摂取量が高

代謝体重（kg0.75），産次（初産，２産，３産以

く，TMR中のデンプン含量が高く，TMR中の牧降），搾乳日数（day），朝の飼料給与からの経過

草割合が低い泌乳前期では，泌乳中・後期と比較

時間（AM9 : 26からの経過時間，min），個体ID（変し て ，NDF 消 化 率 が 高 か っ た 。こ れ は ，de量効果）を説明変数としたモデルが最適であった

Souza et al.（2017）５）の推定式の結果とは一致し（Table２）。代謝体重を説明変数としたモデルは，な か っ た 。de Souza et al.（2017） の 推 定 式 が

説明変数を体重に置き換えたモデルと比較して，

NDF消化特性を考慮していないことが一因で，

モ デ ル 間 の 分 散 分 析 に お い て 有 意（F ＝ 3.6 ×

泌乳前期用TMRは１番草牧草サイレージを利用

1012 ，p＜0.001）に当てはまりが高かった。産次しているのに対して，泌乳中・後期用TMRは２については，３群（初産，２産，３産以降）と２

番草牧草サイレージを中心に使用していたことが群（初産，２産以降）について比較した結果，３

大きな要因であると考えられた。

群 に 分 け た モ デ ル の 当 て は ま り が 高 く（F ＝５）54182，p＜0.001），初産のルーメン内NDF滞留量
Table 2 The best fit equation for generalized additive model of neutral detergent fiber remain（kg）

in the rumen（RMSE＊ = 1.08 kg）

Item（fixed effects）†

Unit

Intercept
Metabolic body weightkg0.75

ParityFirst-parity
Second-parity
Third to Seventh-parity（s Days in milk）（
s Elasped time after AM9 : 26）

day
min

Coefficients for fixed effects

Analysis of variance

EstimateSE

p-value

-0.33

0.012

< 0.001

0.0653
0.00
1.19
0.66
-

0.00010
0.002
0.003
-

< 0.001< 0.001< 0.001-

df / edf

F-valuep-value12440887137338< 0.001< 0.001

1.442
8.998

58526
48125

< 0.001< 0.001＊ Root mean suquare of error in calibration data.

0.5）means fitting a smoothing spline. The coefficients were shown in Fig. 2.

Coeﬃcients－1.0 －0.5 0.0

Coeﬃcients－1.0－0.8－0.6 －0.4－0.2

†（
s

0

100

200

300

400

0

Days in milk（day）

200

400

600

800 1000 1200 1400

Elasped time（min）after AM9:26

Fig. 2 Smoothing spline for days in milk（left）and elapsed time after AM9：26（right）in the best fit generalized

additive model of neutral detergent fiber remain（kg）in the rumen by dynamic simulation based on a real-time
total mixed rations intake data（see Table 2）.

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390

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）が低かった。搾乳日数とルーメン内NDF滞留量

NDF滞留量は，代謝体重，産次の影響と，日内の関係については，搾乳開始後からルーメン内周期を確認した。搾乳日数の影響も確認され，泌

NDF滞留量が増加し，搾乳日数200日にピークと乳中期以降でルーメン内NDF滞留量が高くなり，なる曲線となった（Fig.２左）。朝の飼料給与か定常性が確認できなかった。設定値の最適化が必らの経過時間とルーメン内NDF滞留量の関係は，要であると考えられた。本研究は，ルーメン内繊

朝の給餌から600～700に日内ピークがある曲線に維消化ダイナミクスに基づく採食量予測モデルのなった（Fig.２右）。本研究では，同一の飼養環骨格を開発することができた。

境（農場）の飼養データを用いた検証にとどまっ
た。より頑健な予測モデルの構築に向けて，給与
回数や搾乳回数，TMR設計，乳量水準などが異謝

辞本研究の実施にあたり，有益なご助言をいただきなる農場のデータによる検証および設定値の最適ました酪農学園大学化が，今後の検討課題として残された。

泉賢一教授に心より感謝申し上げます。

４．要

約

本研究では，採食と，消化および下部消化管への通過による時間経過に伴ったルーメン（第一胃）内の繊維（中性デタージェント繊維，NDF）の動態（ルーメン内繊維消化ダイナミクス）に着目し，採食量を予測するためのモデル化を試みた。リアルタイムで自動記録されたデータを用
い，採食量と，繊維の消化速度および通過速度から計算したルーメン内NDF滞留量は，8.0±1.2kg
であり，既報とおおむね一致した。ルーメン内

農食環境学群

循環農学類

文
献
１）
 Krizsan, S. J., S. Ahvenjärvi, Huhtanen, P.：J.
Dairy Sci., 93（12）,5890～5901, 2010.
 Fox,D. G., Tedeschi, L. O., Tylutki, T. P., Russel, J.
２）B., Van Amburg, M. E., Chase, L. E., Pell, A. N.,
Overton, T. R.：Anim. Feed Sci. Technol., 112, 29～
78, 2004.
 泉賢一，坂本孝仁，柴山草太，辻秀雄：日本畜産３）
学会報, 79（3）,361～368, 2008.
４）
 Kononoff,P. J., Heinrichs, A. J.：J. Dairy Sci., 86（4）,1445～1457, 2003.
 de Souza,R. A., Tempelman, R. J., Allen, M. S.,
５）
Weiss, W. P., Bernard, J. K., VandeHaar, M. J.：J.
Dairy Sci., 101（2）,1123～1135, 2017.

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391

鶏肉中のイミダゾールジペプチド含量を増やす
飼養方法とその活用に関する研究
Feeding methods to increase imidazole dipeptide content in animal meat

久恒

辰博１・戸塚

護２・江草

愛２・青谷

大希３・福田栞３（１東京大学大学院新領域創成科学研究科，２日本獣医生命科学大学，３秋田県畜産試験場）

Tatsuhiro Hisatsune１, Mamoru Totsuka２, Ai Egusa２, Daiki Aoya３ and Shiori Fukuda３（１Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, ２Nippon Veterinary and Life Science University,
３Akita Prefectural Livestock Experiment Station）

In this study, we focused on imidazole dipeptide, which is a functional ingredient containedin chicken, and establish a method to increase its content by improving the feeding method.
Regarding the brain aging prevention mechanism of imidazole dipeptides（carnosine andanserine）, the results from Alzheimer’s disease model mice and human healthy elderly
volunteers have well shown that imidazole dipeptides have a strong scavenging activity to trap
hypochlorite（HClO）radical, which is an oxidative radical released from activated neutrophils
and microglias. It has been suggested that imidazoledipeptide suppresses the inflammation of
the cerebral blood vessels that occur in the capillaries in the brain, and prevents the damage
due to the inflammation of the cerebral vascular endothelial cells and pericytes. In order todevelop the results of this research and to conduct a human intervention study using chicken
meet food itself, this time, we investigated the increase of imidazoledipeptide in meat by
improving the feeding method of chicken. Carnosine is synthesized by binding β-alanine andhistidine by carnosine synthase in chicken muscle. Furthermore, there is a converting enzyme
in chicken muscle, and anserine is produced by methylating the imidazole ring of the histidine
residue of carnosine. Therefore, in principle, it is possible to increase the amount of imidazole
dipeptide in meat by adding the substrates β-alanine and histidine to the feed. The animals
were fed with normal feed or added feed（β-alanine（final concentration 0.5％）, histidine（final
concentration 0.25％）, magnesium oxide（final concentration 0.24％）added to normal feed）for
4-5 weeks. It has been found that the amount of imidazole dipeptide was increased by adding
these amino acids, act as substrates of carnosine synthase, and magnesium oxide, as a catalyst
thereof．

１．目

応を抑制するはたらきがあることを見出してき的た１～７）。本研究においては，食肉中，特に鶏肉に

これまでに行った動物モデル研究ならびにヒト

おいて，筋組織内のイミダゾールジペプチド（カ介入試験研究の結果から，食肉に多く含まれるイ

ルノシンとアンセリン）の含量を増やす飼料ならミダゾールジペプチドに脳の老化や体の炎症性反びに飼養方法を確立させることを研究目的とし© The Ito Foundation

392

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

た。これまでの研究においては，鶏肉から高度にゾールジペプチド（アンセリンとカルノシン）の精製したイミダゾールジペプチド顆粒状食品を用量を増加させることができる。Kralikらの最近のいてヒト介入試験を実施した。記憶機能に対する報告によると，飼料中にβアラニンとヒスチジン効果を得るために，１日あたりイミダゾールジペを添加しさらに酵素活性を高めるMgOを加える

プチドを１ｇ必要とした。高度精製食品を用いたことによる飼養方法の改良により，イミダゾール

ために，最終製品の単価が高価なものとなり，現ジペプチドの含量を約1.5倍に増加することがブ

時点では社会実装できるに至っていない。そこ

ロイラーにおいて確認されている８）。イミダゾー

で，鶏肉食品を用いた健康機能性エビデンスの獲ルジペプチドの含量が多い比内地鶏においても，得が求められている。

この飼養方法の改良によりさらにイミダゾールジ

通常のブロイラーでは，ムネ肉中に100ｇ当たペプチドの量を増加させることができるのであろり 約 1000mg（ア ン セ リ ン 750mg ，カ ル ノ シ ンうか。この点を検証することが本研究の目的であ250mg）， モ モ 肉 中 に 約 400mg （ア ン セ リ ン

る。鶏肉そのものによる記憶機能改善への効果を

280mg，カルノシン120mg）のイミダゾールジペ

調べるにあたり，高齢者が一回あたりに食べる肉

プチドが含まれている。地鶏においては，その種量としては，50ｇ程度が妥当であるとの予備的な類によって，イミダゾールジペプチドを多く含調査結果がある。そこで本研究では，さらに，比む。含有量が最も多い系統である比内地鶏におい

内地鶏のムネ肉を用いて試作食品を製作し，長期ては，ムネ肉100ｇ当たり約1500mg（アンセリンの喫食にも適したイミダゾールジペプチド含有食1000mg ，カ ル ノ シ ン 500mg），モ モ 肉 に は 約品を開発することが可能であるかについての検討

550mg（アンセリン400mg，カルノシン150mg）も行った。

のイミダゾールジペプチドが含まれている。比内
地鶏のムネ肉を利用して試験食品を作成すること

２．方法

ができれば１日当たりに摂取する肉の量を高齢者

比内地鶏の筋肉中のイミダゾールジペプチドの喫食に適した量にすることができると考えられ（アンセリンとカルノシン）の含有量を増やす飼た。そこで，本研究においては，比内地鶏に着目料・飼養の方法を見出し，これを安定して生産す

し，イミダゾールジペプチドの増量に適した飼料

るための生産技術の確立を進めた。本研究においならびに飼養方法を開発することを目的とした。

ては，すでに予備的検討からイミダゾールジペプ

これらのイミダゾールジペプチド（アンセリン

チドの含量が多いことが確認されている地鶏であとカルノシン）は，２つのアミノ酸が結合したジる比内地鶏を対象に研究を行った。飼料ならびにペプチドである。鶏の筋肉中でカルノシン合成酵

飼養の方法として，合成酵素の触媒である酸化マ素によりβアラニンとヒスチジンがペプチド結合

グネシウムを用い，基質であるβアラニンとヒスすることによりカルノシンが合成される。さらにチジンとともに仕上げ期の飼料に添加した。

鶏筋肉中では変換酵素のはたらきにより，カルノ

2.1

シンのヒスチジン残基のイミダゾール環がメチル

飼養条件のパイロット検討を行った。10羽の比化されることによって，アンセリンが生成され内地鶏を用いて２区の試験（従来の飼養方法と基る。したがって，基質であるβアラニンとヒスチ

質添加の飼養方法）を実施した。日本獣医生命科

ジンを飼料中に添加することにより肉中のイミダ

学大内に設置された鶏舎内において，比内地鶏を© The Ito Foundation

パイロット飼育試験

鶏肉中のイミダゾールジペプチド含量を増やす飼養方法とその活用に関する研究393

孵化させ，４週齢まで雛用の飼料で飼育した。先るに至っていない。そこで本研究では，鶏肉その行研究であるブロイラーでの場合に合わせて，９ものの食品を使用してヒト試験を実施するための週あるいは15週の時点で比内地鶏をと鳥した。最製造技術の確立を進めた。本研究では，１包装あ後の５週間は，通常の飼料と添加飼料（βアラニ

たり15～30ｇ程度のムネ肉を含む鶏肉食品を製造

ン（添加量0.5％）・ヒスチジン（添加量0.25％）・

し，１個あたりにイミダゾールジペプチドが0.3

酸化マグネシウム（添加量0.24％）を通常飼料に～0.5ｇ含まれるようにした。

添加）で飼育した。そして，ムネ肉とモモ肉に分け分析用の検体とした。各検体中のイミダゾール
ジペプチド，カルノシンとアンセリンの含有量を定量した。

３．結果と考察
鶏研究の分野において，飼養期間が短く最も生産量の多いブロイラーに関係した研究が，全世界

2 . 2 通常の飼育期間に基づいた比内地鶏の飼育試験的に多く実施されている。一方で地鶏に関係する研究は，産地である各県の畜産試験場によって研比内地鶏100羽を用いて，７月より22週間にわ究が進められているが，飼養条件なども産地にたる飼育試験を実施した。17週までは通常に飼料

よって異なっていることから，個別での研究実施

で飼育を行った。添加飼料は比内地鶏の仕上げ期が求められている。本研究で研究対象とする比内にあたる17週から22週の期間に与えた。４区での地鶏は，平飼いであり，通常の飼養期間が160日

飼養には，１）通常の飼料，２）通常の飼料に酵と長くその期間はブロイラーと比べて３倍以上と素 活 性 を 高 め る 酸 化 マ グ ネ シ ウ ム（添 加 量

なる。しかしそれゆえ，肉質が良く，美味であり，0.24％）のみを加えた飼料，３）通常の飼料に酸

消費者のニーズが高い。高価であることから，利化マグネシウムとβアラニン（添加量0.5％）を益率が高く，潜在的には輸出を含めて，高付加価

加えた飼料，４）通常の飼料に酸化マグネシウム

値なバリューチェーンを構築しやすい。地鶏につとヒスチジン（添加量0.25％）を加えた飼料，５）

いては，日本各地に産地があり，同じような飼養

通常の飼料に酸化マグネシウム，ヒスチジンとβ方法で，新しい需要を拡大していけるものと考えアラニンを加えた飼料を用い，自由摂取とした。

られた。本研究の目的は，ブロイラーにおいて見22週の時点でと鳥し，先の方法にならって，ムネ出された飼養方法が，地鶏においても適応可能で

肉およびモモ肉中のイミダゾールジペプチド（アあるのか，この飼養方法の改良によって比内地鶏

ンセリンとカルノシン）の量を定量した。

のイミダゾールジペプチド含量を増加させること

2 . 3 鶏肉そのものを使用したヒト介入試験用の試験食品の開発ができるのか，を検証した。
3.1

パイロット飼育試験の結果

比内地鶏の食材を用いてヒト試験に使用する試

本試験の実施のための検討研究として，通常の作食品の開発を行った。これまでのヒト試験で飼料と特別に配合した飼料（β-アラニン，ヒスは，鶏肉から高度に精製したイミダゾールジペプ

チジンおよび酸化マグネシウム添加飼料）を用いチド含有顆粒状食品を用いた。この高度精製品をて９週から15週齢までの間，比内地鶏を飼育し，用いたヒト試験結果，１日あたりイミダゾールジ

筋肉中のイミダゾールジペプチド量（アンセリンペプチドとして１ｇを摂取する必要があり，最終量とカルノシン量）を分析した。また，このパイ製品の単価が千円程となり高価すぎて社会実装すロット試験のさらに予備検討として，４週から９© The Ito Foundation

394

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

週齢までの間，比内地鶏を通常飼料と特別配合飼ド量の定量分析を実施した。慣行区では中部飼料料で飼育し，同様にイミダゾールジペプチド量

株式会社製の比内地鶏用前期（～４週齢），中期（アンセリン量とカルノシン量）を分析した。な（４～17週齢）および仕上げ飼料（17週齢～）を

お ，イ ミ ダ ゾ ー ル ジ ペ プ チ ド 含 量 の 計 測 は ，用いた。試験区においては，17週齢より各添加物

MoraらのHILIC-HPLCによるイミダゾールジペを仕上げ飼料に混ぜ込み，使用した。混ぜ込みのプチドの定量方法 に基づいて実施した。Table１

際に，攪拌操作を行ったために，飼料の粒径が小に本パイロット試験の結果を表した。試験区におさくなる傾向があった。なお，飼育条件としては，いて有意にアンセリンの量が増加することが認め４週齢までバタリー式育雛器を使用した。４週齢られた（18％増量，ｐ＜0.05）。イミダゾールジ

以降パイプハウスで飼育した。飼育密度は４～17ペプチドの全体量においても増加傾向（約５％の週齢：4.5羽／ｍ２，17週齢～：1.6羽／ｍ２とした。

増量）が認められた。この傾向は，予備的に実施

自然日長，不断給餌，自由飲水とした。発育調査

した４週から９週の間に試験区と対照区を設けては，初生時ならびに4,14および22週齢で行った。

実施した試験においても観察された（対照区・試各群間で，体重などの差異は特に認められなかっ験区，各ｎ＝５）。ブロイラーと同等の９週間のた。22週齢で解体調査を行った。その後，上述し飼育，ならびに15週間の飼育期間において，飼料た方法により，筋肉中のイミダゾールジペプチドの改良によりイミダゾールジペプチド，特にアン量を定量計測した。Table２に本試験の結果を表

セリンの増量が可能になることが示された。

した。アンセリン量，カルノシン量，ともに各群

９）3 . 2 通常の飼育期間に基づいた比内地鶏の飼育試験の結果間（ｎ＝10）で有意な差は認められなかった。むしろ試験区１でわずかに低下している傾向を認め

試験飼料を調製して通常の飼育期間である22週た（アンセリンは３％減，カルノシンは３％減）。

齢まで比内地鶏を飼育し，発育成績や解体成績を

通常の飼育条件においては，すでに最適化がなさ評価するとともに，筋肉中イミダゾールジペプチ

れており，これ以上のイミダゾールジペプチドのTable 1 Imidazole dipeptide content in chicken breast meat（15-week test）
Test group（n = 5）

Anserine（g/100g）

Carnosine（g/100g）

Imidazoledipeptide（g/100g）

Control

1.02±0.0

0.49±0.1

1.51±0.1

Test（MgO + βAla + His）

1.20±0.2

0.35±0.0

1.55±0.2

Data was shown by average±SD

Table 2 Imidazole dipeptide content in chicken breast meat（22-week test）
Test group（n = 10）Anserine（g/100g）

Carnosine（g/100g）

Imidazoledipeptide（g/100g）

Control
Test 1（MgO）
Test 2（MgO + βAla）
Test 3（MgO + His）
Test 4（MgO + βAla + His）

1.15±0.06
1.12±0.08
1.10±0.05
1.15±0.07
1.07±0.07

0.51±0.06
0.50±0.07
0.51±0.04
0.48±0.08
0.55±0.10

1.66±0.07
1.61±0.05
1.62±0.04
1.62±0.05
1.62±0.05

Data was shown by average ± SD

© The Ito Foundation

鶏肉中のイミダゾールジペプチド含量を増やす飼養方法とその活用に関する研究

395

15g

20g

30g

Fig. 1 Chicken porridge retort food containing imidazoledipeptide（Left）Chicken breast meat（15～30g/piece）used for cooking.（Middle）Chicken porridge after regular cooking.
（Right）Chicken porridge after retort processing．

増量は困難であると考えられた。

いることが分かった。ムネ肉100ｇあたり，アン3 . 3 鶏肉そのものを使用したヒト介入試験用の食品開発

セリン1313mg，カルノシン533mgとなることが算出された。この量は，Table２に示した慣行区

比内地鶏のムネ肉を使用した食品開発においのデータに比べて同等か，やや高い値であり，食て，高齢者にとって食べやすく，日常的に長期に品加工中の損失されるイミダゾールジペプチドの継続して喫食できる食品を開発することに重きを量はきわめて少ないことが推察された。

おいた。まずは，レトルト加工などにより長期保存が可能な食品を念頭に，開発を進めた。また，

４．要約

高齢者だけでなく，幅広い年代にも支持されうる本研究においては，鶏肉中に含まれる機能成分

食品を開発することとした。通常の飼育条件で飼であるイミダゾールジペプチドに着目し，飼養方養された市販されている比内地鶏のムネ肉を使用法を改良することによってその含量を高める方法

した。１回あたりの喫食量（30ｇを想定）あたを見出すことができた。イミダゾールジペプチド

り，イミダゾールジぺプチドを0.5ｇ摂取できる（カルノシンとアンセリン）の脳老化防止機構に食品を開発対象とした。予備的に10種類の食品を関しては，アルツハイマー病モデルマウスや健常

製作し，高齢者モニターの参加による試作食品検

高齢者参加研究の結果から，イミダゾールジペプ

討会を実施し，これらの味と食べやすさの観点

チドには，酸化ラジカルである次亜塩素酸ラジカ

で，評価した。この検討会の経験に基づき，鶏かルを捕捉する強力な作用があり，脳内の毛細血管

ゆを試作食品として設定した。レトルト工場にに生じる脳血管の炎症を抑制し，そして脳血管ペて，鶏ムネ肉を１パックあたり15～30ｇ入れたか

リサイトの炎症による脳組織傷害を抑制すること

ゆ状食品を製造した。

が示唆されている。地鶏であっても，イミダゾー

レトルト加工をした後，２週間以上を経過した

ルジペプチド合成酵素の基質ならびにその触媒と食品サンプル（Fig.１）を用いてイミダゾールジ

して作用する酸化マグネシウムを飼料に添加するペプチドの含量を定量分析した。その結果，15ｇ

飼養方法によって，さらなるイミダゾールジペプの比内地鶏ムネ肉から調整したレトルト食品中にチドの増量が可能となることが分かった。

アンセリン197mg，カルノシン80mgが含まれて© The Ito Foundation

396

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

文献１） Herculano, B., Tamura, M., Ohba, A., Shimatani,M., Kutsuna, N., Hisatsune, T.：β-Alanyl-L-histidine
rescues cognitive deficits caused by feeding a highfat diet in a transgenic mouse model of Alzheimer’s Disease, Journal of Alzheimer’s Disease, 33, 983～
997, 2013.
２） Rokicki, J., Li, L., Imabayashi, E., Kaneko, J.,
Hisatsune, T., Matsuda, H.：Daily carnosine andanserine supplementation alters verbal episodic
memory and resting state network connectivity inhealthy elderly adults, Frontiers in Aging
Neuroscience, 7, 219, 2015.
３） Hisatsune, T., Kaneko, J., Kurashige, H., Cao, Y.,
Satsu, H., Totsuka, M., Katakura, Y., Imabayashi, E.,
Matsuda, H.：Effect of Anserine/Carnosine
Supplementation on Verbal Episodic Memory in
Elderly People, Journal of Alzheimer’s Disease, 50,
149～159, 2016.
４） Kaneko, J., Enya, A., Enomoto, K., Ding, Q.,
Hisatsune, T.：Anserine（beta-alanyl-3-methyl-Lhistidine）improves neurovascular-unit dysfunction
and spatial memory in aged A β PPswe/PSEN1dE9
Alzheimer's-model mice, Scientific Reports, 7,12571, 2017.
５） Katakura, Y., Totsuka, M., Imabayashi, E.,

Matsuda, H., Hisatsune, T.：Anserine/Carnosine
Supplementation Suppresses the Expression of theInflammatory Chemokine CCL24 in Peripheral
Blood Mononuclear Cells from Elderly People,
Nutrients, 9, 1199, 2017.
６） Ding, Q., Tanigawa, K., Kaneko, J., Totsuka, M.,
Katakura Y., Imabayashi, E., Matsuda, H.,
H i s a t s u n e , T . ：A n s e r i n e / c a r n o s i n e
supplementation preserves blood flow in theprefrontal brain of elderly people carrying APOE
e4, Aging and Disease, 9, 334～345, 2018.
７） Masuoka, N., Yoshimine, C., Hori, M., Tanaka, M.,
Asada, T., Abe, K., Hisatsune, T.：Effects ofAnserine/Carnosine Supplementation on Mild
Cognitive Impairment with APOE4, Nutrients, 11,1626, 2019.
８） Kralik, G., Sak-Bosnar, M., Grcevic, M., Kralik,Z.：Effect of Amino Acids on Growth Performance,
Carcass Characteristics, Meat Quality, andCarnosine Concentration in Broiler Chickens, J
Poult Sci, 55（4）,239～248, 2018.
９） Mora, L., Sentandreu, M. A,, Toldrá, F.：
Hydrophilic chromatographic determination ofcarnosine, anserine, balenine, creatine, andcreatinine, J Agric Food Chem, 55（12）, 4664～4669,
2007.

© The Ito Foundation

397

豚の未熟産子（ひね豚）の発育遅延をもたらす
生理的要因の解明（Ⅱ）
Factors affecting mortality and growth retardation in runt pigs（Ⅱ）

中島 郁世・谷口 雅章・芦原

茜・荒川 愛作・渡邊 源哉・本山 三知代・佐々木 啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Ikuyo Nakajima, Masaaki Taniguchi, Akane Ashihara, Aisaku Arakawa, Genya Watanabe,Michiyo Motoyama and Keisuke Sasaki（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

It is widely accepted that low birth weight in piglets（≤ 1.0 kg）correlates with decreased
survival and lower postnatal growth rates than those born with normal body weights. The
objective of this study was to figure out whether these problems might come from some kindof disordered physiological condition in runt pigs, such as stress, inflammation or malnutrition.
Three-way crossbred female pigs originated from 21 litters were categorized in two groups by
their birth weights；birth weight of 1.0 kg and under as “runt pig”, and the heaviest weight inthe same litter as “normal pig”. Runt pigs exhibited lower postnatal growth performancethroughout the experiment compared to normal pigs. At 10 wk-old of age（approximately 30kg）, blood and saliva samples were collected from both fed and fasted conditions. Circulatinglevels of amino acids and blood metabolites in runt and normal pigs responded similarly when
they were fasted. There were significant differences in levels of several essential and limiting
amino acids between these two groups, which concentrations were lowered in runt pigs. We
also verified that runt pigs had lower amount of serum immunoglobulins than normal pigs.
Conversely, the levels of blood cholesterols and alkaline phosphatase（ALP）activity werehigher in runt pigs. However, runt pigs did not seem to show any chronic stress and/or
inflammatory status by measuring those concentrations of stress hormone and inflammatory
cytokines in both serum and saliva. Overall, our data strongly indicate that runt pigs can becharacterized by some sort of under nutritional condition and deterioration of its immune
system．

１．目の家畜改良増殖目標（平成27年３月）において一的

腹当たりの生産頭数向上を掲げているように，今養豚業界において，離乳まで十分生存しうる生後も多産化傾向が続く。他方で総産子数の増加を

時体重の子豚をバラツキなく生産することは積年指標とする改良は，死産子数や未熟産子の割合をの課題である。近年の大規模養豚農場の種豚は，増すリスクを伴う。肉質形質に比べて繁殖形質そ

欧米から導入される驚異的な繁殖成績を示す多産のものの遺伝率が低いなか，未熟産子や生時体重系ハイブリッド種が主流を占め，また農林水産省のバラツキに関する遺伝率はさらに低いことから© The Ito Foundation

398

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

育種改良を望むのは非常に困難な形質となってい今年度（H31年度）は，ひね豚ペアの供試頭数をる。

新たに追加し上記２点についてまず検証する。次生時体重１kg以下で生まれる未熟産子（以下いで，栄養代謝の基幹臓器である肝臓に着目し，「ひね豚」と呼ぶ）は，離乳までの死亡率が40～

血液生化学検査や遺伝子発現解析によりひね豚と60％にもなる 。したがって，死亡率の高いひね

正常豚では肝代謝機能に違いがあるのか明らかに豚の存在は，一腹当たりの生存産子数および離乳

する。

１）

子豚数を低下させるため養豚農場の繁殖成績に直結する。また生存したひね豚は発育が遅いため，

２．方法

出荷までの日数が長期化することからやはり養豚

2.1

農場の収益に悪影響を及ぼす。さらにひね豚は，今年度（H31年度），農研機構畜産研究部門に平均的な体重の子豚に比べてPRRS（豚繁殖・呼て新たに生産された三元交雑豚（LWD種）11腹

吸障害症候群）に罹患しやすく ，ひね豚の感染から同腹の雌子豚のうち生時体重が１kg以下のをきっかけに養豚農場でPRRSが発生すれば甚大最小の産子（ひね豚）と最大の産子（正常豚）のな経済被害をもたらすことになる。

ペアを選出し，昨年度の10腹分と合わせて供試頭

２）

供試豚および材料

日本養豚開業獣医師協会の生産性評価システム

数21組とした。子豚は４週齢で離乳後，飽食給餌

PigINFO（2017/4/7現在）によると，平均的な農にて飼養し10週齢（正常豚の目安体重約30kg）

場では一腹当たりの総産子数と生存産子数の間にでと畜した。採材は，と畜予定の約１週間前に211.1頭，さらに生存産子数と離乳子豚数の間に1.3

時間の絶食処理を行い唾液採取および頸静脈より頭の差があり，分娩してから離乳までに一腹当た

血清用真空採血管を用いて採血を行った（絶食り2.4頭損失するとされる。いかに一腹当たりの時）。また，と畜前に唾液，と畜時に放血血液（飽

離乳子豚数を総産子数に近づけられるかが，養豚食時），およびと畜直後に肝臓を採取した。細切における生産性向上のための技術開発において重した肝臓は速やかに液体窒素で凍結した後，－要な要素となる。我々は，まずは一定の割合で娩

80℃にて保管した。唾液と血液は遠心分離後，上出されるひね豚を強健化し，平均的な離乳体重に清を回収して各分析に供試するまで－80℃にて保仕上げることが問題解決上有効であると考えた。

管した。

しかしながら，ひね豚の死亡率を高めている虚弱

2.2

性あるいは増体の低さが何に起因するのか不明で

飽食時および絶食時の血清を用いて，血清と同血清中遊離アミノ酸濃度の測定

量の６％スルホサリチル酸水溶液を加えて除タンある。
本研究課題では，ひね豚強健化の第一段階としパクし，上清を限外濾過膜（倉敷紡績）でろ過してひね豚の虚弱性および発育遅延をもたらしていた後，高速アミノ酸自動分析計（日立Ｌ-8900）

る生理的要因を明らかにすることを目的としていにより41種類のアミノ酸を解析した。

る。昨年度（H30年度），同腹のひね豚と正常豚の絶食時と飽食時の血液および唾液中の成分を比2 . 3 血清および唾液中ストレス・炎症マー
カーの測定

較した結果，ひね豚の虚弱や発育不良に関連して

ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）

いる要因として「栄養障害」および「免疫機能」

法により，ストレスおよび炎症の主要マーカーであの２点に問題がある可能性が示唆された。そこでる血清および唾液中の飽食時および絶食時のＣ反応© The Ito Foundation

豚の未熟産子（ひね豚）の発育遅延をもたらす生理的要因の解明（Ⅱ）

399

性タンパク
（CRP, R&D Systems），インターロイキン検定の後，Ｒのp.adjust関数を用いてBenjamini（IL）-1β（R&D Systems）, IL-6（R&D Systems），腫とHochberg法５）による多重比較検定を行った。

瘍壊死因子
（TNF）
-α
（R&D Systems），免疫グロブリ ン（Ig）G（Bethyl Laboratories）, IgA（Bethyl

３．結果と考察

Laboratories） と IgM（Bethyl Laboratories） の今年度（H31年度）新たに供試した11腹につい

濃度について測定した。コルチゾール濃度について，母豚の繁殖成績をTable１に示した。平均一ては，Beckman Coulter Access 2 PROイムノアッ

腹あたりの生存産子数は14頭であり，その平均生

セイシステムを用いて測定を行った。

時体重は1.33kgとなった。子豚の生時体重は0.4～

2.4

血液生化学検査

1.9kgとばらつき（Fig.１），生時体重１kg以下の飽食時および絶食時の血清を用いて，オリエン

未熟産子（Fig.２）が生まれる頻度は全体の２割

タル酵母工業株式会社が実施する肝・胆疾患スクを占めた（Table１）。そのうち本試験で用いた正リーニングセットに含まれる21項目に尿素窒素

常豚（雌子豚の最大産子）の生時体重は1.6kgで（BUN），クレアチンキナーゼ（CK），遊離脂肪

あったのに対して，ひね豚の生時体重は0.9kgで酸（NEFA），グルコース（GLU）およびピルビあった。離乳時（４週齢）には正常豚の体重がン酸（PA）を加えた計26検査項目について依頼

9.9kgに到達したのに対し，ひね豚の体重は4.9kg

分析を行った。

であった。最終的にと畜時（10週齢）における正2.5

肝臓の遺伝子発現マイクロアレイ解析

常豚の体重が40kgを超える一方でひね豚の体重

約 100mg の 肝 組 織 か ら 抽 出・精 製 し た total

は目安の30kgに満たず（26.6kg），生時から10週

RNAをバイオアナライザ2100（Agilent社）にて齢に至るまで両者の間で体重（Fig. 3A）およびRNAの品質を確認した後，Cyanine３を用いて標平 均 日 増 体 量（Fig. 3B）が 逆 転 す る こ と は な

識し，Agilent社のPig Gene Expression Microarray

かった。平均日増体量が５週目と７週目で低下し（４×44Ｋ）に１個体／アレイ（計20アレイ）でたのは，それぞれ１週前に行った離乳および飼料

ハイブリダイゼーションを行った。Agilent社のの切り替えが原因と考えられる。

DNAマイクロアレイスキャナ（G2505B）を用い

血液および唾液中成分を分析するにあたって，てアレイ上の蛍光シグナルを検出し，Feature

豚の絶食時と飽食時の両方から採材を行った。飽Extractionソフトウェア（ver9.5）により検出シ

食時に比べ，絶食時の血清中NEFA濃度は７倍高

グナルを数値化した。

値を示しかつ血糖値が４割低下したことから採材

2.6

統計解析

試料が絶食状態であることを確認した。摂食の有統計解析は，統計パッケージSAS（ver9.12）

無による影響は血清中CRP，IgA，コルチゾール，プログラムのMIXEDプロシジャを用い，生時体唾液中IgAとコルチゾール，および多種の血液成重による分類と摂食の有無を主効果とした一般線分において観察された（Table２）。摂食による効型混合モデルで解析した。最小二乗平均値間の多果が認められなかったアミノ酸はArg，α-アミノ

重比較はTuckey-Kramerの方法で行い，ｐ＜0.05

アジピン酸，シスタチオニン，ヒドロキシプロリの場合に差が有意であると判定した。マイクロア

ンと３-メチルヒスチジンであり，血液成分に

レイデータについてはＲ３）のlimma４）を利用して至ってはわずかにA/G, Fe, LDHとCKのみであっデータの補正を行った。補正されたデータは，ｔた。

© The Ito Foundation

400

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
Table 1 Reproductive performance of sows at farrowing１）
TraitsLitter size（born alive）,n14.0±2.2

Total litter weight, kg

18.6±3.1

Average birth weight, kg

1.33±0.13

Average birth weight of females, kg

1.28±0.26

Average birth weight of males, kg

1.37±0.33

Stillborn piglets, nPiglets ≤ 1.0 kg, ％1.82±1.66
21.1±11.4

１）Values are the mean±SD. There were 11 sows with a total numberof 154 piglets born alive with n＝76 for females and n＝78 for males．

Animal numbers

40
30
20
10
0

－0.4 －0.6 －0.8 －1.0 －1.2 －1.4 －1.6 －1.8 －2.0

Birth weight（kg）
Fig. 1 Number frequency distribution of piglet birthweight. Histograms are the distribution pattern of
154 piglets from 11 sows．

45
40
35
30
25
20
15
10
5
0

its littermates．

B
Normal pigs
Runt pigs

0

1

2

3

4

5

Average daily gain（kg）

Body weight（kg）

A

Fig. 2 Extremely small-sized piglet（arrowhead）with

6

7

8

9

10

1

Normal pigs
Runt pigs

0.8
0.6
0.4
0.2
0

Age（wk）

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Age（wk）

Fig. 3 Differences in body weight increase（A）and average daily gain（B）of selected female littermates with therespectively highest（normal）and the lowest（runt）body weight at birth. Values are least square means±SEfrom 11 litters．

昨年度（H30年度）同様，アミノ酸分析計によな効果が認められた。なかでも必須アミノ酸であり血清から検出されたのは計31種類の物質であっるHis, PheとTrpはひね豚において血中濃度が低た。ひね豚ペア21組を用いて比較した結果，11種

く，特定のアミノ酸不足がひね豚の増体を遅延さ類のアミノ酸について生時体重の違いによる有意

せている一因である可能性は高いと考えられ© The Ito Foundation

豚の未熟産子（ひね豚）の発育遅延をもたらす生理的要因の解明（Ⅱ）

401

Table 2 Effects of feeding and birth weight difference on blood metabolites
Measurements

p value１）
Feeding２）

Birth weight３）

Feeding×BW

A/G

n.s.

n.s.

n.s.

ALP

＊＊＊＊

＊＊

n.s.

ALT

＊＊＊＊

n.s.

n.s.

AST

＊

n.s.

n.s.

BUN

＊＊

n.s.

＊

ChE

＊＊＊＊

n.s.

n.s.

CK

n.s.

n.s.

n.s.

＊＊＊＊

n.s.

n.s.

＊＊

n.s.

n.s.

E-CHO

＊＊＊＊

＊＊

n.s.

F-CHO

＊＊＊＊

＊＊

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

＊＊＊＊

n.s.

n.s.

GLU
HDL-CHO
I-BIL

＊＊＊＊

n.s.
n.s.

n.s.
n.s.

LAP
LDH
LDL-CHO

＊

n.s.
n.s.
n.s.

n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.

D-BIL
E/T

Fe
GGT

＊＊＊＊
＊＊＊＊

n.s.
＊＊＊＊

＊

NEFA
PA
TBA

＊＊＊＊

n.s.
n.s.

T-BIL
T-CHO
TG
TP

＊＊＊＊

＊＊＊＊
＊＊＊＊

n.s.
n.s.

＊＊＊＊

＊＊

＊＊＊＊

n.s.
n.s.

＊＊＊＊

n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.

１）＊ｐ＜0.05，＊＊ｐ＜0.01，＊＊＊ｐ＜0.001，＊＊＊＊ｐ＜0.0001, n.s., not significant. n＝21２）Asterisks indicate difference between fed and fasted condition.
３）Asterisks indicate low birth weight piglets different from normal birth weight piglets.

た６，７）。一方，血液成分については，ひね豚のほに顕著なストレスおよび慢性炎症の状態にあるわ

うでALPおよびHDLを除くコレステロール群のけではない点についても確証が得られた。また，

高値が再確認された（Table２）。さらに，ひね豚

両者でALPおよびコレステロール値に差が認めの血清中IgA濃度が正常豚より低いことも再現性られたことから，ひね豚の代謝制御には肝臓が影が認められた。同様に，炎症性サイトカインであ響している可能性が示唆された。マイクロアレイ

るCRPとIL-６およびストレスマーカーであるコを用いた正常豚とひね豚の肝臓の遺伝子発現比較

ルチゾールは血清・唾液ともに生時体重による影については，現在解析モデルの検討中である。

響が認められず，より重度な炎症促進マーカーであるIL-１βおよびTNFαについては両者ともほぼ検出レベル以下となった。

４．要

約

生時体重１kg以下で生まれる未熟産子（ひね以上の結果から生時体重の小さいひね豚は，必豚）は，死亡率が高く，また生存したとしても発須アミノ酸の一部が低い「栄養障害」と血中IgA

育が遅いことから養豚農家の繁殖成績や肥育成績

濃度が低い「免疫機能」の両面で問題を抱えていに直結する。本研究では，ひね豚の死亡率を高めることが明白になった。一方で，ひね豚が生理的ている虚弱性あるいは増体の低さが何に起因する© The Ito Foundation

402

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

かを明らかにすることを目的として，ひね豚と同腹の正常豚（いずれも雌）を用いて10週齢時（約30kg）の血清および唾液中の成分を比較し，ひね豚がストレス・炎症および栄養障害の状態にあるか否かを検討した。ひね豚として生まれる割合
は一腹あたり約２割を占め，10週齢に至るまでひね豚の体重および平均日増体量は常に正常豚のそれを下回った。ひね豚において，正常豚よりも血清中の必須アミノ酸の一部およびIgA濃度が低い
一 方 で ，HDL を 除 く コ レ ス テ ロ ー ル 類 お よ び
ALPが高い特徴を認めた。血清および唾液中のコルチゾールや炎症性サイトカインを測定した結果，ひね豚が生理的に顕著なストレスおよび炎症環境に曝露されているわけではないと考えられた。本研究の結果，ひね豚の増体遅延および虚弱性の要因は，栄養障害と免疫機能の両面にあることが強く示唆された。

文献１）
 武田浩輝：生時体重の小さい豚, 淘汰か？隔離飼養か？, Pig Journal, 11, 14～17, 2008.
 伊藤貢：ヒネ豚が生じないための飼養管理, Pig
２）
Journal, 9, 84～86, 2006.
３）
 Ihaka, R., Gentleman, R.：R：a language for data
analysis and graphics, Journal of Computational
and Graphical Statistics, 5, 299～314, 1996.
 Ritchie, M. E., Phipson, B., Wu, D., Hu, Y., Law, C.
４）
W., Shi, W., Smyth, G. K.：limma powers differential
expression analyses for RNA-sequencing andmicroarray studies, Nucleic Acids Research, 43, e47,
2015.
５）
 Benjamini, Y., Hochberg, Y.：Controlling theFalse Discovery Rate： a Practical and PowerfulApproach to Multiple Testing, Journal of the Royal
Statistical Society：Series B, 57, 289～300, 1995.
 Le Floc'h, N., Gondret, F., Matte, J. J., Quesnel,
６）
H.：Towards amino acid recommendations for
specific physiological and patho-physiologicalstates in pigs, Proceedings of the Nutrition Society,71, 425～432, 2012.
７）
 Regmi, N., Wang, T., Crenshaw, M. A., Rude, B. J.
Wu, G., Liao, S. F.：Effects of dietary lysine levels
on plasma free amino acid profile in late-stage
finishing pigs, Springer Plus, 5, 888, 2016.

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403

黒毛和種育成牛のアミノ酸要求量に関する研究
Amino acid requirements for growing Japanese Black cattle

寺

田

文

典

（東北大学大学院農学研究科）

Fuminori Terada（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

In order to clarify the protein and amino acid requirements of growing Japanese black
cattle at high daily body weight gain（DG）, the relationship between feeding performance andplasma amino acid concentration was examined by three experiments. Experiment 1 examinedthe effect of increasing the supply of soybean meal on feeding performance, Experiment 2
examined the effect of increasing the supply of roasted soybean meal, and Experiment 3
examined the effect of the rumen degradable protein（RDP）/crude protein（CP）rate byreplacing the soybean meal with roasted soybean meal. An effect of treatment on DG was notobserved in any of the experiments. In Experiment 1, the blood urea nitrogen concentration
significantly increased in the treatment group where the CP intake was increased by 23％（p＜ 0.01）. An effect of treatment on the plasma essential amino acid concentrations was notobserved in any of the experiments, but in Experiments 1 and 3 the plasma amino acidconcentration evidently increased as gaining of month-old. When the relationship between themetabolizable protein （MP） sufficiency rate, plasma lysine, and plasma methionine
concentration was analyzed by a single slope, broken-line model, the break point was around
90％ , and when the MP sufficiency rate was more than 100％ , the deficiency of essential aminoacids was not recognized. In addition, the results suggested that when the RDP was more thanapproximately 11％, there would have been no effect on feeding performance due to theincrease in RDP．

１．目

ことが必須である。このような素牛の育成につい的て３ヶ月の哺育期間を設けることを前提として試

和牛肉の生産コストを削減するため，肥育期間算すると，育成期間の増体日量（DG）として1.0を短縮することが課題となっており，現行の出荷～1.2kgが必要となる。この値は従来の育成速度

月齢29ヶ月を24～25ヶ月とすることが求められてに比べて著しく速く，エネルギー（濃厚飼料）のいる（農林水産省家畜改良増殖目標，平成27年 ）。

増給によってこれを実現することは可能であるも肥育期間短縮型の飼養管理を実践するためには，のの，その場合には過剰な脂質の蓄積が問題とな８ヶ月齢で体重270kg程度となる素牛を確保するることも多い。そのため，過剰な脂質の体蓄積を

１）© The Ito Foundation

404

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

避けて高増体を実現するために，適切なタンパクは，次の実験に用いた育成牛（雄）より採取した質給与水準を明らかにすることが求められていものである。

る。しかし，黒毛和種育成牛の高増体時のタンパ【実験１】CP給与水準の異なる２群（大豆粕の給ク質要求量に関する研究はきわめて少ない。ま与 水 準 を ２ 水 準 設 定）を 設 け（Table １），３～た，過剰なタンパク質給与は窒素排泄量の増加に８ヶ月齢の黒毛和種育成牛26頭を供試した個体管よる環境負荷の増大にもつながることから，代謝理による飼養試験を２回に分けて実施した。

タンパク質（MP）あるいは代謝アミノ酸要求量【実験２】MP給与水準の異なる２群を設け（加を明らかにし，高増体に必要十分な量を給与する

熱大豆粕の給与水準を２水準設定）（Table１），ことが可能となるよう，適切な飼養基準を設定す

４～８ヶ月齢の黒毛和種子牛10頭を供試した単飼ることが重要である。

または２頭群飼による飼養試験を実施した。

本報告では，黒毛和種牛における育成期のDG【実験３】RDP/CPが異なる２群（大豆粕を加熱

1.0kgを超える高増体時のタンパク質およびアミ

大豆粕で置換することで２水準を設定）を設け

ノ 酸 要 求 量 を 明 確 に す る た め ，粗 タ ン パ ク 質（Table１），４～８ヶ月齢の黒毛和種子牛10頭を（CP）給与水準，MP給与水準あるいは分解性タ供試した単飼または２頭群飼による飼養試験を実

ンパク質割合（RDP/CP）が異なる飼養成績を用施した。
血漿中アミノ酸の分析は，除脂肪除タンパク質いて，育成期の血漿中アミノ酸濃度との関連につ操作ののち高速液体クロマトグラフィー（島津製

いて検討した。
２．方作所HPLC CTO-20AC）を用いて，オルトフタ

法

ルアルデヒド試薬によるポストカラム蛍光誘導体

血漿中アミノ酸濃度の分析に供試したサンプル化法により測定した。

Table 1 Amount and chemical composition of feeds supllied
Amount of feed supplied（kg/day）

DM

TDN

Control

Treatment%-------------％DM --------------

CP

RDP

RUP

Exp.1
Formula feed
Soybean meal
Bagasse
Orchard glass hay
Rice straw

4.20
0.20
2.25
0.30

3.55
0.64
0.20
2.25
0.30

86.4
88.2
90.4
85.5
83.8

74.1
87.0
28.5
60.1
42.9

19.8
51.1
1.9
13.0
5.4

68.2
75.0
11.8
68.0
51.0

31.9
25.0
88.2
32.0
49.0

Exp.2
Total mixed ration
Formula feed
Soybean meal
Rosted soybean meal

6.28
0.35
0.10
-

5.96
0.33
0.43

84.5
88
88.2
89.8

72.9
80.8
87.0
89.7

15.6
17.1
51.1
52.9

69.5
65.6
75.0
55.0

30.5
34.4
25.0
45.0

Exp.3
Total mixed ration
Kraft pulp feed
Soybean meal
Rosted soybean meal

5.44
0.54
0.40
-

5.43
0.55
0.39

85.4
86.8
88.2
89.8

72.9
95.7
87.0
89.7

15.6
0.4
51.1
52.9

69.5
69.1
75.0
55.0

30.5
30.9
25.0
45.0

DM : dry matter, TDN : total digestible nutrients, CP : crude protein, RDP : rumen degradable protein,
RUP : rumen undegradable protein.

© The Ito Foundation

405

黒毛和種育成牛のアミノ酸要求量に関する研究

量／（DGx0.96））／0.492

なお，飼養試験成績におけるMP摂取量およびMP充足率の計算は日本飼養標準肉用牛（2008）

と して求めた。なお，体タンパク質蓄積

３）およびNASEM飼養標準肉用牛（2016）
を参考

量は，0.0639xBW0.75xDGとして求めた。

２）に次のように行った。

統計解析は，JMP Ver.14.0を用い，飼養成績お１） 給与飼料の成分含量および可消化養分総

よび血漿中アミノ酸濃度については，処理効果と量（TDN）含量は，日本標準飼料成分表

月齢効果を母数効果とし，実験１では個体を，実（2009年版）４），日本飼養標準肉用牛（2008験２，
３では群を変量効果とする混合モデルに年版） ，推定値（十勝農協連）および表

よって行った。MP充足率と血漿中アミノ酸濃度

示値を用いた。

との関連については折れ線モデルを当てはめるこ

２）２） ルーメン微生物態タンパク質（MCP）量は，（ 4 2 . 7 3 ＋0 . 8 7 x T D N 摂取量x 1 0 0 ）/1000kgとして，非分解性タンパク質消化率は，粗飼料の場合は0.6，その他の飼とにより検討した。
３．結果と考察【実験１】大豆粕の増給による効果
大豆粕の増給が飼養成績および血漿中必須アミ料は0.8として計算した。
３） 維 持に要するMP要求量は，3.8ｘ（体重ノ酸濃度に及ぼす影響についてTable２に示した。
CP摂取量（CPI）,MP摂取量（MPI）は，試験区

ｘ0.96） ｇ／日として求めた。
0.75

が対照区に比べてそれぞれ23％，11％有意に高い

４） 増体に要するMP要求量は，
DGx0.96x（（268-29.4ｘ体タンパク質蓄積値を示したが，平均体重，DG，DMIのいずれに

Table 2 Effect of increasing soybean meal on feeding performance and plasma essential amino acid concentration（Exp. 1）
Control group
Feeding performance
Body weight, kg

Treatment groupp value
TreatmentMonth-old

Interaction

196

±

7＊

Daily body weight gain, kg
Dry matter intake, kg
TDN intake, kg
Crude protein intake, kg
Metabolizable protein intake, kg

1.06
5.30
3.53
0.87
0.48

±
±
±
±
±

0.04
0.11
0.08
0.02
0.01

207
1.13
5.53
3.75
1.07
0.53

±
±
±
±
±
±

7
0.04
0.10
0.07
0.02
0.01

0.19
0.17
0.14
0.04
<.01
<.01

<.01
0.71
<.01
<.01
<.01
<.01

0.52
0.58
0.76
0.73
0.18
0.62

Sufficency rate of MP requirement, %

102.2

±

2.1

109.4

±

1.9

0.02

<.01

0.80

Plasma amino acid（nM/ml）
LysineMethionine
Phenylalanine
Threonine
Tryptophan
ValineIsoleucine
LeucineHistidin
Arginine

105.4
21.9
79.0
102.2
69.5
486.5
141.8
189.1
93.5
116.5

±
±
±
±
±
±
±
±
±
±

4.1
0.7
2.7
4.2
1.9
170.2
4.6
10.2
14.3
7.0

111.7
23.1
81.4
103.9
70.8
539.0
151.4
203.0
97.4
130.7

±
±
±
±
±
±
±
±
±
±

3.7
0.7
2.5
3.8
1.7
169.6
4.1
9.6
14.2
6.6

0.25
0.27
0.41
0.75
0.63
0.23
0.13
0.21
0.43
0.05

<.01
0.01
0.07
<.01
0.26
0.90
<.01
<.01
<.01
<.01

0.07
0.11
0.08
<.01
0.78
0.14
0.01
0.04
0.07
0.21

Plasma Urea nitrogen（mg/dl）

12.2

±

1.5

15.0

±

1.5

<.01

<.01

0.95

＊：Least squares mean ± standard error.

© The Ito Foundation

406

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

お い て も 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。一 方 ，た。血漿中尿素態窒素（PUN）濃度は，個体差

PUNは対照区に比べて試験区が23％高い値を示

が大きく処理間に有意性は認められなかったが，した。血漿中必須アミノ酸濃度については，全般

月齢間では有意な違いが認められ，月齢の進行にに対照区に比べて試験区においてやや高い値を示

伴って大きく増加した（ｐ＜0.01）。

したが，５％水準で有意差が認められた項目は【実験３】RDP/CPを抑制することによる効果

Argのみであった。月齢の効果は顕著であり，

RDP/CPの抑制が飼養成績および血漿中必須ア

Trp, Valを除く他の項目において月齢の進行に

ミノ酸濃度に及ぼす影響についてTable４に示し伴って血漿中の濃度が増加する傾向あるいは有意た。給与飼料の試験区の平均RDP/CPは66％，対差が認められた。

照 区 は 71 ％ で あ り ，試 験 区 の RDP ％ は 10.9 ％【実験２】加熱大豆粕増給による効果（７ヶ月齢）～11.4％（４ヶ月齢），対照区11.3％

加熱大豆粕の増給による飼養成績および血漿中（７ヶ月齢）～12.6％（４ヶ月齢）であった。DG

必須アミノ酸濃度に及ぼす影響についてTable３

はいずれもの区も1.18kgであり，月齢による違いに示した。MP摂取量は対照区に比べて試験区にが認められた（1.05kg（４ヶ月齢）～1.31kg（６ヶおいて13％多い値を示した（ｐ＝0.09）がDGに月齢））。血漿中必須アミノ酸濃度に処理区間の差差は認められず，いずれも1.2kgを上回る値を示は認められなかったが，月齢による違いはLys,した。血漿中必須アミノ酸濃度において，処理間，His, Arg, Trp, Phe, Metにおいて有意差あるいは月齢間のいずれにおいても差は認められなかっ傾向が認められた。PUNにおいても処理区間差

Table 3 E ffect of increasing roasted soybean meal on feeding performance and plasma essential amino acidconcentration（Exp. 2）

Control group

Treatment groupp value
TreatmentMonth-old

Interaction

8
0.07
0.21
0.16
0.04
0.02

0.95
0.63
0.78
0.62
0.08
0.09

<.01
0.20
<.01
<.01
<.01
<.01

0.95
0.91
0.59
0.60
0.16
0.50

±

3.8

0.01

<.01

0.96

99.0
21.5
75.7
73.5
59.4
292.8
158.0
131.0
74.4
97.6

±
±
±
±
±
±
±
±
±
±

8.9
1.5
5.9
16.4
3.1
31.6
16.6
10.9
12.5
12.0

0.56
0.40
0.90
0.43
0.44
0.96
0.89
0.98
0.38
0.37

0.28
0.95
0.18
0.89
0.34
0.98
0.88
1.00
0.26
0.60

0.38
0.12
0.55
0.72
1.00
0.90
0.70
0.69
0.47
0.27

11.3

±

2.8

0.42

<.01

0.63

Feeding performance
Body weight, kg
Daily body weight gain, kg
Dry matter intake, kg
TDN intake, kg
Crude protein intake, kg
Metabolizable protein intake, kg

197
1.29
5.44
4.00
0.88
0.50

±
±
±
±
±
±

8＊
0.07
0.22
0.16
0.04
0.02

196
1.24
5.53
4.12
1.01
0.57

±
±
±
±
±
±

Sufficency rate of MP requirement, %

95.5

±

4.3

112.2

Plasma amino acid（nM/ml）
LysineMethionine
Phenylalanine
Threonine
Tryptophan
ValineIsoleucine
LeucineHistidin
Arginine

107.2
23.6
74.6
94.0
55.6
295.5
154.6
130.5
91.8
114.6

±
±
±
±
±
±
±
±
±
±

9.4
1.6
6.0
16.6
3.3
32.2
17.0
11.2
12.6
12.2

Plasma Urea nitrogen（mg/dl）

14.7

±

2.9

＊：Least squares mean ± standard error.

© The Ito Foundation

407

黒毛和種育成牛のアミノ酸要求量に関する研究

Table 4 Effect of the rumen degradable protein /crude protein rate by replacing the soybean meal with roasted

soybean meal on feeding performance and plasma essential amino acid concentration（Exp. 3）
Control group

Feeding performance
Body weight, kg
Daily body weight gain, kg

Treatment groupp value
TreatmentMonth-old

Interaction

187

±

11＊

184

±

11

0.82

<.01

0.91

1.18

±

0.09

1.18

±

0.09

0.99

0.01

0.90

Dry matter intake, kg

5.20

±

0.20

5.17

±

0.20

0.90

<.01

0.54

TDN intake, kg
Crude protein（CP）intake, kg

3.94
0.87

±
±

0.15
0.03

3.93
0.86

±
±

0.15
0.03

0.95
0.92

<.01
<.01

0.56
0.39

Metabolizable protein（MP）intake, kg

0.48

±

0.02

0.51

±

0.02

0.37

<.01

0.56

Sufficency rate of MP requirement, %

97.0

±

1.6

101.7

±

1.5

0.12

<.01

0.83

Rumen degradable protein/CP％

70.6

66.4

Plasma amino acid（nM/ml）
Lysine

89.3

±

6.9

82.4

±

6.8

0.50

0.01

0.40

Methionine
Phenylalanine
Threonine
Tryptophan
ValineIsoleucine
LeucineHistidin
Arginine

20.4
69.0
65.7
52.5
228.6
129.4
110.4
83.9
88.9

±
±
±
±
±
±
±
±
±

1.7
3.1
5.3
2.9
14.0
9.7
5.8
7.2
6.1

17.6
62.8
57.1
53.4
204.3
118.8
103.9
82.6
90.9

±
±
±
±
±
±
±
±
±

1.7
3.0
5.1
2.8
13.6
9.5
5.6
7.1
6.1

0.32
0.23
0.36
0.83
0.29
0.49
0.46
0.91
0.82

0.08
0.03
0.18
0.01
0.17
0.11
0.26
<.01
0.01

0.43
0.30
0.28
0.57
0.51
0.61
0.42
0.40
0.52

10.3

±

1.0

10.9

±

1.0

0.69

<.01

0.44

Plasma Urea nitrogen（mg/dl）＊：Least squares mean ± standard error.

は認められなかったが，月齢の進行に伴い有意に増加した（7.9mg/dl（４ヶ月齢）～13.0mg/dl（８ヶ判断された。
一方，月齢の進行に伴いMP充足率が大きく過

月齢））（ｐ＜0.01）。

剰となり，これに伴い血漿中のPUN濃度が増加【総括】し，血漿中アミノ酸濃度の推移においても実験

本実験で供試した育成牛は平均で体重200kg

１，３において明らかな増加が認められた。また，（125～323kg）, DG 1.13kg（0.69～1.81kg）の牛群MP充足率と血漿中Lys, Met濃度の関係を見るとであり，MPIはNASEM飼養標準の要求量に対いずれもMP充足率の増加に伴い血漿中Lysおよ

する充足率として105％程度であった。実験１でびMet濃度が増加することが認められた。さらには，大豆粕を増給することでMPI11％の増加を，

両者の関係を折れ線モデルによって解析すると，

実験２では加熱大豆粕を用いてMPIを13％増加さ

変曲点はいずれも90％前後に存在することから

せ，実験３ではMCPとRUP由来MPの割合を変え（Fig.１），MP充足率が100％を上回っていた６，ることでMPIの５％増加を認めたが，いずれの実７ヶ月齢時のMP給与量は過剰であったものと推験においても血漿中アミノ酸濃度については処理

測される。

３）

による明確な差異は認められなかった。これらの本実験ではMP充足率の評価を血漿中アミノ酸ことから，黒毛和種雄牛の育成期におけるDG1.0

濃度によって考察することを企図したが，充足率程度の増体を確保するためのMP給与量は，本実が大きく不足する状況が認められなかったことか験における対照区程度の給与水準で可能であると

ら，明確な結論を得るには至らなかった。しかし，© The Ito Foundation

408

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）
nM/ml
160
140

nM/ml
35

Break point ＝ 88.2%

120

25

100

20

80

15

60

MP suﬃciency rate（%）

10

MP suﬃciency rate（%）

5

40
60

Break point ＝ 95.2%

30

80

100

120

140

160

60

80

100

120

140

160

b. Methionine

a. LysineFig. 1 Relationship between metabolizable protein（MP）sufficiency rate and amino acid concentration

MP充足率と血漿中LysおよびMet濃度の間には

験においても認められなかったが，実験１，３に有意な回帰係数が認められることから，その有用おいては，月齢の進行に伴い明らかに血漿中アミ性については，さらにデータを収集して検討する

ノ酸濃度が増加した。MP充足率と血漿中Lys，こととしたい。

Met濃度の関係を折れ線モデルによって解析する

４．要と，変曲点は90％前後に存在しており，MP充足

約率100％を基準とした場合，必須アミノ酸の欠乏

黒毛和種育成牛の高増体時のタンパク質（アミは認められなかった。また，RDPの適正な水準ノ酸）要求量を明らかにするため，３回の実験成については，これを11％程度が確保できれば，飼績を用いて飼養成績と血漿中アミノ酸濃度の関連

養成績への影響も認められないものと判断された。

について検討した。実験１では飼養成績における大豆粕の増給効果，実験２では加熱大豆粕の増給効果，実験３では大豆粕を加熱大豆粕で置換する
ことによるRDP/CPの違いによる効果について検討した。いずれの実験においても処理による違い
がDGに及ぼす効果は認められなかった。実験１においてはCPIを23％増給した試験区においてPUNの有意な増加が認められた（ｐ＜0.01）。血漿中アミノ酸濃度の及ぼす処理効果はいずれの実

文献１） 農林水産省：家畜改良増殖目標 平成27年.
 https://www.maff.go.jp/j/chikusan/kikaku/lin/l_
hosin/pdf/h27_katiku_mokuhyo.pdf
２） 農業・食品産業技術総合研究機構編：日本飼養標準肉用牛（2008年版），中央畜産会，東京，2009.
３） National Academies of Science, Engineering andMedicine：Nutrient Requirement of Beef Cattle,
Eighth Revised Edition. National Academy Press,
Washington, DC, 2016.
４） 農業・食品産業技術総合研究機構編：日本標準飼料成分表（2009年版），中央畜産会，東京，2010.

© The Ito Foundation

409

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可能性
Colostral programming of physiological properties related to meatproduction

松

﨑

正

敏

（弘前大学農学生命科学部）

Masatoshi Matsuzaki（Faculty of Agriculture and Life Science, Hirosaki University）

To investigate the impact of periparturient maternal protein nutrition on colostral andplasma hormone levels, and on growth and physiological properties of offspring, 3-4 pregnant
Suffolk ewes were assigned to one of the 4 treatments in a 2 × 2 factorial design experiment：
gestational and lactational protein levels for high（H）or low（L）. Ewes were fed on alfalfa
pellet, timothy hay and either of isoenergetic concentrate contained 22 or 11％ CP. Lamb’s
birth weight and subsequent growth rates was not affected by gestational and periparturient
protein levels, respectively. Glucose tolerance was worse in ewe than ram lambs while
periparturient maternal nutritional treatment did not affect any of the parameters measured ininsulin and glucose challenges performed at the age of 20wk. Insulin levels in colostrum tended
to be higher in the H ewes, however, it was not correlated to any of the offspring’s parameters
except for a positive correlation to plasma adiponectin levels measured at 20wk．

１．目

ン，アディポネクチン，グレリン，レジスチンや的

グルココルチコイドなどが母乳哺育児の成長や発初乳は豊富な栄養素に加えて，母から子への移達，さらには食欲やエネルギーバランスの調節に

行抗体の供給源として家畜動物の新生子の受動免影響して，成人期の肥満の予防に関与することが疫確立に不可欠である。さらに最近では，初乳中示唆されている５～７）。さらに，母乳中のエクソソーのホルモンその他のメッセージ物質が新生子の成ムに含まれるメッセージ物質の産子の生理機能の長や生理特性の形成に不可逆的な影響を及ぼしう

発達や成長に及ぼす影響が研究され始めている８）。

ることが明らかにされつつある１）。初乳中のメッ

しかしながら，これらの乳中メッセージ物質の反セージ物質としてIGF-Ｉやインスリンなどのホ

芻家畜の初乳中含有量に関する知見はきわめて少ルモンが新生子期の急速な成長や腸管の発達，体なく，産子の成長後の生理特性との関連を解析しタンパク質蓄積や糖代謝の活性化に重大な影響をた研究は見あたらない。

及ぼしていることが明らかにされている２～４）。乳

そこで，本研究では妊娠末期と哺育中の母めん中に含まれるその他のホルモン類として，レプチ

羊の栄養制御を行った実験モデルを用いて，母畜© The Ito Foundation

410

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）の初乳中ホルモンを中心としたメッセージ物質の漿サンプル中のインスリン，アディポネクチン，

濃度と産子の成長および生理特性の関連を調べ

レプチンおよびグレリンの濃度を，市販のめん羊て，反芻家畜の初乳成分による産肉に関わる生理あるいは牛用のELISA測定試薬を用いて測定し特性の形成に果たす役割を調べるとともに，初乳た。出生時から性成熟期に相当する20週齢までの成分による長期的な代謝的プログラミングの可能増体パターンを調査するとともに，経時的な採性を明らかにすることを目的とする。

血，さらに20週齢時にインスリン（0.1U/kg体重）

２．方とグルコース（0.25g/kg体重）の静注負荷試験を法実施した。負荷試験時のグルコースならびにイン同一の種雄畜との自然交配により妊娠したサスリンの血中濃度を測定して反応面積（AUC）

フォーク種母めん羊を供試して，妊娠末期（交配を算出し，インスリン感受性，耐糖能およびイン開始後16週以降）から自然分娩を経て産子が８週

スリン分泌能を調査した。初乳中および血漿中の齢で離乳するまで個別飼育ペンに収容して飼養試

ホルモン濃度と生時体重や成長履歴，インスリン験を実施した。母めん羊はタンパク質含量の異な感受性や耐糖能との関係を解析した。

る配合飼料とアルファルファペレット，チモシー
乾草の給与により，高タンパク区（Ｈ）あるいは

３．結果と考察

低タンパク区（Ｌ）に配置して，妊娠末期およびTable１に示したように，産子の生時体重や出哺育期のタンパク栄養レベルの異なる２×２の４生後の増体には母めん羊の周産期のタンパク栄養

試験区（HH区，HL区，LH区，LL区）の母子め制御の影響は見られなかった。生時体重は，そのん羊群を作出した。配合飼料のCP含量はＨ区後の増体速度との間には正の相関が認められた。

22％，Ｌ区11％とし，TDN含量は75.8％で一定と20週齢時のグルコース負荷後の血中グルコース濃した。産子は８週齢で離乳させた後，体重比原物

度のAUCは雌で大きい傾向が検出され，耐糖能２％の配合飼料（CP12％，TDN75％）と体重比が雌で雄よりも劣ることが示唆された。一般に，１％のアルファルファペレットとチモシー乾草を加齢とともに進行する耐糖能の低下と考え合わせ

給与して20週齢まで成長試験を実施した。各区とると，生理的な加齢は雌の方が速やかに進行するも３～４腹の産子を得ることができた。分娩直後ことを示す結果と言えるかもしれない。また，イの母めん羊から乳と血液のサンプルを，20週齢時

ンスリン分泌能は出生後の増体と正の相関を示すの産子から血液サンプルを採取した。乳および血ことが明らかとなった。しかしながら，20週齢時

Table 1 Body weights（BW）and average daily gains（ADG）in the lambs born to and nursed bydams subjected to late-gestational and lactational nutritional treatments（average, kg）．

Nutritional treatment（Number of lambs）

BW
at birthBW
at 8wkBW
at 20wk

ADG
0-4wk

ADG
0-8wk

ADG
0-20wkHH（n＝3 ram, 2 ewe）
HL（n＝2 ram, 2 ewe）
LH（n＝3 ram, 2 ewe）
LL（n＝4 ram, 2 ewe）

4.99
5.39
5.36
5.21

25.93
26.13
26.59
26.52

46.88
50.23
51.68
48.66

0.379
0.350
0.369
0.370

0.374
0.370
0.379
0.381

0.299
0.320
0.331
0.310

HH ： gestational and lactational high protein levels, HL ： gestational high and lactational low protein levels,
LH ： gestational low and lactational high protein levels, and LL ： gestational and lactational low protein
levels, respectively．

© The Ito Foundation

411

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可能性
Table 2 C olostral concentrations of insulin, adiponectin, leptin and ghrelin in the dams

immediately after parturition．

Nutritional treatment（Number of dams）

insulin,μg/L

Adiponectin,
μg/mL

leptin,ng/mLghrelin,
ng/mL

Ｈ（ｎ＝７）
Ｌ（ｎ＝７）

42.4±16.3
28.3±12.0

0.17±0.06
0.14±0.03

2.04±2.28
1.41±2.53

3.52±3.45
9.39±23.02

p-values

0.09

0.31

0.64

0.52

H：gestational high protein level, and L：gestational low protein level, respectively（mean ± SD）．

Table 3 Plasma concentrations of insulin, adiponectin, leptin and ghrelin in the dams immediately

after parturition．

Nutritional treatment（Number of dams）

insulin,μg/L

Adiponectin,
μg/mL

leptin,ng/mLghrelin,
ng/mL

Ｈ（ｎ＝７）

2.84±2.82

15.3±1.5

0.37±0.46

6.69±2.98

Ｌ（ｎ＝７）
p-values

1.32±0.76
0.1917.1±3.1
0.20

0.46±0.70
0.78

7.48±4.21
0.69

H：gestational high protein level, and L：gestational low protein level, respectively（mean ± SD）．

の負荷試験によって評価した耐糖能，インスリン本研究で観察された妊娠末期高タンパク群におけ分泌能およびインスリン感受性といった増体や脂る初乳中インスリン濃度の上昇傾向は母畜の栄養肪蓄積などとも関連するパラメーターには，母め制御を通した産子の生理機能発達の可能性を示すん羊の周産期における栄養制御による影響は認め

結果として興味深い。初乳中のインスリン濃度はられなかった。インスリン感受性とインスリン分

母めん羊の血漿中インスリン濃度と正の相関が認泌能の間には負の相関が認められ，インスリン感

められたことから，妊娠末期のタンパク栄養強化

受性の低下をインスリン分泌の亢進によって代償による母めん羊のインスリン合成分泌の亢進ともしようとする加齢の進行に伴う生理応答が推察さ関連している可能性が考えられる。また，母めん

れたものの，周産期の母畜の栄養制御による長期

羊の初乳中インスリン濃度と産子の20週齢時にお的な影響は明らかでなく，初期成長期の栄養条件

ける血漿中アディポネクチン濃度との間に正の相の違いによる生理特性の修飾は明らかでなかった。

関が認められており，初乳中のホルモンと産子の妊娠末期の給与タンパク質レベルを高くすると成長後のアディポカイン分泌との関連を示唆する

初乳中インスリン濃度が上昇する傾向が示されたものかもしれない。Kesser（2015）らは，子牛が，その他の初乳中ホルモン濃度には妊娠末期のの循環血中アディポネクチン濃度が出生後速やか

栄養制御の影響は認められなかった（Table２）。

に上昇することを認めており，代用乳給与に比べまた，分娩直後の母めん羊の血中のホルモン濃度て初乳給与時にその上昇が大きいことを報告してに比べると，初乳中ではインスリンならびにレプいる９）。ホルモンなど初乳中の生理活性物質の腸チンの濃度が高く，アディポネクチンは低いこと

管からの吸収は否定されてはいるものの10），初乳が明らかとなった（Table２および３）。腸管上皮

摂取あるいは腸管上皮への初乳中生理活性物質のの細胞に存在する受容体群を介してIGF－Ｉやイ接触が出生直後の産子のホルモン分泌などのなんンスリンが，新生子牛の腸管の発達やグルコース

らかの特異的なシグナル伝達に関与する可能性は代謝の活性化を促すことなどが報告されており否定できない。

，

２～４）© The Ito Foundation

412
４．要

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

約

妊娠末期の母畜への給与タンパク質レベルを高低２水準として７腹ずつの産子が得られ，さらに哺育期の給与タンパク質を２水準として，周産期のタンパク栄養を制御した４群のめん羊産子で検討を行った。周産期の栄養制御は，産子の生時体重だけでなく，哺育中あるいは離乳後のいずれのステージにおける増体に対しても影響を及ぼさなかった。生時体重など出生後早期の体重がその後の増体と正の相関を示した。20週齢時に実施したインスリンとグルコースの負荷試験の結果から，グルコース負荷後のグルコースのAUCは雌で雄よりも大きく，耐糖能の性差が見られたが，周産期母畜のタンパク栄養制御による影響は認められなかった。妊娠末期のタンパク栄養強化によって初乳中インスリン濃度が高くなる傾向が示され，産子の20週齢時の血漿中アディポネクチン濃度と正の相関が見られたが，増体や生理特性との関連は明らかでなかった。
文献１） Hammon, H. M., Liermann, W., Frieten, D., Koch,
C.：Importance of colostrum supply and milk
feeding intensity on gastrointestinal and systemic
development in calves, Animal, 14：S1, s133-s143,
2020.
２） Blum, J. W.：Nutritional physiology of neonatal
calves, Journal of Animal Physiology and Animal
Nutrition, 90, 1～11, 2006３） Hammon, H. M., Steinhoff-Wagner, J., Flor, J.,

Schönhusen, U., Metges, C. C.：Lactation Biology
Symposium：role of colostrum and colostrum
components on glucose metabolism in neonatal
calves, Journal of Animal Science, 91, 685～695,
2013.
４） Ontsouka, E. C., Albrecht, C., Bruckmaier, R. M.：
Invited review：growth promoting effects ofcolostrum in calves based on interaction withintestinal cell surface receptors and receptor-like
transporters, Journal of Daily Science, 99, 4111～
4123, 2016.
５） Savino, F., Liguori, S. A., Lupica, M. M.：
Adipokines in breast milk and preterm infants,
Early Human Development, 86, S77-S80, 2010.
６） Eilers, E., Ziska, T., Harder, T., Plagemann, A.,
Obladen, M., Loui, A.：Leptin determination incolostrum and early human milk from mothersof preterm and term infants, Early Human
Development, 87, 415～419, 2011.
７） Hollanders, J. J., Heijboer, A. C., van der Voorn, B.,
R o t t e v e e l , J . , F i n k e n , M . J . J . ：N u t r i t i o n a lprogramming by glucocorticoids in breast milk：
Targets, mechanisms and possible implications, Best
Practice & Research Clinical Endocrinology &Metabolism, 31, 397～408, 2017.
８） Samuel, M., Chisanga, D., Liem, M., Keerthikumar,S., Anad, S., Ang, C. S., Versteegen, E., Jois, M.,
Mathivanan, S.：Bovine milk-derived exosomes
f r o m c o l o s t r um a r e e nr i c he d w i t h pr o t e i ns
implicated in immune response and growth,
Scientific Reports, 7, 5933, 2017.
９） Kesser, J., Hill, M., Heinz, J. F., Koch, C., Rehage, J.,
Steinhoff-Wagner, J., Hammon, H. M., Mielenz, B.,
Sauerwein, H., Sadri, H.：The rapid increase of
circulating adiponectin in neonatal calves depends
on colostrum intake, Journal of Daily Science, 98,7044～7054, 2015.
10） Donovan, S. M., Chao, J. C. L., Zijlstra, R. T., Odle,
J.：Orally administered iodinated recombinanthuman insulin-like growth factor-I （I-125-rh
IGF-I） is poorly absorbed by newborn piglet,
Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,
24, 174～182, 1997.

© The Ito Foundation

413

鶏の飼養管理における労力低減のための距離センサ
による体重推定に関する研究
Research on weight estimation using a distance sensor for reducing laborof bird breeding management

阿野

裕司・伊藤

直弥＊・宇髙

優美＊・水上嘉樹＊＊・木村裕昭＊＊＊・原田宏明＊＊＊＊（地方独立行政法人山口県産業技術センター，＊山口県農林総合技術センター，＊＊国立大学法人山口大学，
深川養鶏農業協同組合，＊＊＊＊伊藤忠飼料株式会社）＊＊＊

Yuji Ano, Naoya Ito＊，Yumi Udaka＊，Yoshiki Mizukami＊＊，Hiroaki Kimura＊＊＊ and Hiroaki Harada＊＊＊＊（Local Incorporated Administrative agency, Yamaguchi prefectural Industrial Technology Institute，＊Yamaguchi Prefectural
Agricultural Technology Center，＊＊Yamaguchi Prefectural Agriculture and Forestry General Technology Center, Yamaguchi
University，＊＊＊FUKAWA Poultry Agricultural Cooperative，＊＊＊＊Itochu Feed Mills Co. Ltd．）

Due to the recent aging of chicken farm workers and the shortage of human resources, it
is a heavy labor to carry out breeding management such as measuring the weight of birds, andreducing the labor is an issue that must be solved immediately. The purpose of this study was
to automate the weight measurement of birds aged 30 weeks and older, which requires thelongest time in the process for raising broiler breeders. We proposed a bird weight estimation
method based on bird shape data obtained by using a distance sensor, and evaluated theusefulness of the proposed method using measured data. Six White Cornish males and six
White Plymouth Rock females had been bred since July 2019, and bird shape data was
acquired using a measurement system composed of a distance sensor and an actuator. We
compared two methods for estimating bird weights, that is, a method of estimating the weightusing the bird volume and a method of estimating the weight using deep learning. The
accuracies of the volume-based estimation method were 6.8％ for males and 5.7％ for females.
On the other hand, the accuracies of the deep learning-based estimation method were 10.7％
for males and 7.8 ％ for females. One of the reasons why the deep learning-based estimation
method is inferior to the volume-based estimation method is that the amount of the bird shapedata is insufficient for the deep learning procedure. As a future work, we would like to improvethe estimation accuracy by considering the pose of the bird, that is, whether it is sitting or
standing. The amount of bird shape data should be increased by observing more birds in alonger period．

１．目の多い食肉となっている１）。また，平成29年度に的は年間８億羽を超える鶏が処理されており２），養日本国内における鶏肉消費量は，平成24年に豚鶏産業の規模も年々拡大傾向にある。しかしなが肉を抜いて１位となり，それ以降鶏は最も消費量

ら，近年の農作業従事者の高齢化や人材不足によ© The Ito Foundation

414

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）り３），鶏舎環境の最適化や鶏の体重測定など多岐

30週齢以降の雄は大型化し，攻撃性が増すため捕にわたる飼養管理を実施するのは大きな作業負担

鳥が困難であり，体重測定にかかる作業時間も他となっている。さらに，高病原性鳥インフルエンの週齢に比べて長く，体重測定時に暴れるため測ザなどの疾病予防を目的とした「定期的な消石灰

定値のばらつきも大きい。さらに，実際の測定作散布・消毒薬の交換」，「鶏舎ごとに履物や衣服を業だけでなく測定体重データのPC入力にも膨大交換」，「鶏舎等に持ち込む機材や敷料等の消毒」

な労力が必要となっている。

など，家畜衛生に関する作業工程も加わった結以上から本研究では，体重測定がより重要視さ果，飼養管理に関する作業工程の維持はより困難

れている種鶏場において，作業時間および飼養期となっており，その労力低減は早急に解決すべき間が最も長い30週齢以降の鶏を対象とする体重測課題となっている。

定の自動化を目的とした。具体的には，距離セン

養鶏産業における肉用鶏の養鶏場は，コマー

サを用いて取得した鶏の形状データに基づいた鶏

シャル鶏の卵を産む種鶏を飼養する「種鶏場」の体重推定手法を提案し，実測データを用いて提と，コマーシャル鶏を飼養し，一般流通する鶏肉案手法の有用性を評価した。なお，目標として実を生産する「コマーシャル農場」の大きく２つに際に種鶏場で要求される相対誤差±5.0％以内の分けられる。種鶏場において飼養管理項目の一つ

体重推定精度を目指した。

である体重は，給餌制限のために用いられており，１～20週齢時は目標体重に到達しているかど

２．方法

うか，20～30週齢時は期待される産卵率を将来達2.1

成できるかどうか，30～65週齢時は過肥となって代表的なコマーシャル鶏ブロイラーの種鶏であいないかどうかの指標となっているため，毎週行

るホワイトコーニッシュの雄とホワイトプリマス

われる体重測定は重要な作業工程といえる。

ロックの雌をそれぞれ６羽ずつ供試鶏とし，雌雄一方，コマーシャル農場では，鶏を早く成育さ

実地実験

別に開放鶏舎において飼養した。

せるため体重による給餌制限を実施していないた

Fig．
１に鶏の形状データを取得するシステム構め（不断給餌），毎週の体重測定を実施していな成図を示す。床面から約２ｍの高さの鶏舎天井付

い農場も多いが，成育途中の体重推移を把握でき

近に２次元走査型距離センサ（UBG-04LX-F01：

れば効率的な成育につながるため，体重測定に対

北陽電機製）を設置し，その下に鶏を１羽ずつ配するニーズはあると考えられる。

置した。なお，距離センサの走査方向はFig．１に

一般に鶏は個体でなく群として取り扱うため，

示すx-z平面であり，角度分解能は0.36°，測定誤

体重測定は全数ではなく抽出して行われる。種鶏

差は測定距離２ｍで±20mmである。鶏の形状

場では，１棟あたり3,000羽から5,000羽の鶏舎に

デ ー タ を 取 得 す る た め に ，ア ク チ ュ エ ー タ

おいて５％抽出で行われ，雌雄判別，捕鳥，体重（Dynamixel MX-64T ： Best Technology 製） を測定，帳簿への記録の流れで実施される。しかし用いて，距離センサと同等の角度分解能0.36°にながら，１鶏舎当たり３か所以上の場所で捕鳥作なるようにｘ軸を中心として回転させた。

業を行うため，相当の手間と時間が必要となる。

また，鶏の体勢変動によって安定した形状デー

さらに，捕鳥しやすい鶏ばかり捕鳥してしまい，

タの取得は困難となるが，暗所では鶏は体勢変動

偏った体重測定となっている可能性がある。またを低減するという習性がある。そこで，自然光が© The Ito Foundation

鶏の飼養管理における労力低減のための距離センサによる体重推定に関する研究

入り込まない環境（縦横1.8×1.8ｍ）を構築し，

415

認できる。

環境内の鶏を１日平均３回入れ替えた。さらに，

2.2

ターゲットとする30週齢以降の鶏の形状データを

Fig．２に示した形状データを用いて，鶏の体重できるだけ早く取得するために，種鶏場の飼養方

推定手法の検討を行った。取得した形状データに法よりも６週齢以降の制限給餌量を増やし，早期は，鶏のほかに壁や床などの不要な点群データもに30週齢の鶏とみなせる体重に到達するように飼含まれているため，それらのデータを削除するこ養した。形状データ（点群）と暗視カメラによるとで，鶏の点群データのみを抽出した。さらに

撮影画像の一例をFig．
２に示す。四方を壁で囲ま

データ処理を容易にするため，３次元データであれた床上で座位の体勢を取っている鶏の形状が確る形状データを，床面からの鶏の高さ情報を画素

体重推定手法の検討値とする2.5次元画像に変換した（Fig．３）。
体重推定手法として，鶏の体積を求めて体重をA distance sensor

線 形 推 定 す る 手 法 １ と ， SSD ４）（Single ShotxyzMultiBox Detector）と呼ばれる画像分類ネット
ワークを用いて，AIの１つであるディープラー
2m

ニングによる体重推定を行う手法２の二手法を構築し，体重推定精度の比較検討を行った。Fig．４に体重推定処理の流れを示す。
手法１の具体的な方法としては，鶏の個体抽
出・位置の特定を行った後，特定した鶏の高さ情報から積分処理によって体積を算出し，体積と測定体重から回帰分析によって得られた回帰直線に基づいて体重の推定を行った。

Fig. 1 Bird-shape acquiring system．

（a）Obtained bird shape as a pointcloud.

（b）Image taken by a night vision camera

Fig. 2 Shape and image of a bird．

© The Ito Foundation

416

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

手法２で用いたSSDはECCV2016（European
Conference on Computer Vision

証用にそれぞれ6591枚の画像を用いた。学習用画

2016） で 発 表

像で学習し，検証用画像で学習結果を検証する作された画像分類ネットワークであり，広く用いら業を繰り返すことにより，ネットワークの学習をれている物体検出アルゴリズムYOLO

実施する。なお，学習回数は250回とした。

５）

より高速

と同等の高精度な分類が可能

手法１，２に共通する条件として，鶏の形状とされるディープラーニングの一手法である。使

データは10月中旬から12月末までのデータを用い用するデータセットは，Fig．
３に示すような2.5

た。また，分析や学習には昼間（７時～18時）の次元画像と画像上の鶏の位置や測定体重をまとめ

データを用い，体重の推定には夜間（18時～翌７たものである。今回は100ｇ単位でのクラス分け時）のデータを用いた。さらに，鶏の最上部の高を行い，雌雄別々に学習を行った。また，雄は学さ情報から鶏の体勢が座位と推定される場合の習用・検証用にそれぞれ3978枚，雌は学習用・検データのみを利用した。

でFaster R-CNN

６）

３．結果と考察
供試鶏の飼養は2019年７月から開始した。６週
齢以降の制限給餌量を増やすことで，14週齢を迎える頃には種鶏場における30週齢の鶏と同等の体重となる個体が現れたため，10月頃から30週齢の鶏とみなして形状データの取得を行った。なお，供試鶏のうち早期に30週齢の鶏と同等の体重に達した雄４羽，雌５羽を解析に用いた。
手法１の鶏の体積を用いた体重推定手法について，Fig．５に鶏の体積と測定体重の関係の一例を示す。これは，雄の鶏の形状データから求めた鶏の体積と，その時の測定体重の関係を表したもの
Fig. 3 Converting bird shape to 2.5D image．

Shape
data

Individual
extraction

Position

Integralcalculation

VolumeConversion（a）Method 1

Shape
data

Individual extraction
andWeight estimation by AI（b）Method 2

Fig. 4 Processing flows of two weight estimation methods．

© The Ito Foundation

WeightWeight鶏の飼養管理における労力低減のための距離センサによる体重推定に関する研究

417

6500
6000

Weight[g]

5500
5000
4500
4000
3500
3000
2500
5000

7000

9000 11000 13000 15000 17000
Volume[cm3]Fig. 5 Correlation between volume and weight．

である。Fig．
５から体積と体重には相関関係があめることで体重推定精度を確認した。結果としることが確認できる。そこで，雌雄それぞれのて，雄が10.7％，雌が7.8％の誤差となった。手法

データに対して回帰分析を行い，回帰直線を求め

１より誤差が大きくなった要因として，ディープ

た。求めた回帰直線を式（１）（２）に示す。式

ラーニングの学習・検証を行うには鶏の画像枚数（１）は雄の回帰直線で，wmが体重，vmが体積をが少なかったことがあげられる。今回は100ｇ単表し，同様に式（２）は雌の回帰直線で，wfが体位でクラス分けを行ったが，画像枚数が少ないた

重，vfが体積を表す。

め特定のクラスにおいては学習・検証用のデータ

wm＝0.2866vm＋1489.9

（１）が存在しないことがあった。さまざまな体重の鶏

wf＝0.2376vf＋1610.9（２）の形状データを取得し画像枚数を増やすことで，式（１）（２）より求められる推定体重と測定

特定のクラスにおけるデータの抜けがなくなり，体重から相対誤差を求め，その平均を求めること

さらにクラス分けを100ｇ以下に細分化することで体重推定精度を確認した。結果として，雄がも可能となるため，体重推定精度の向上が見込め

6.8％，雌が5.7％の誤差となった。なお，さらにる。また，それらを実現するために，より多くの精度を向上させるための手法として，鶏の座位状

形状データを効率的に取得可能な実験環境を構築

態を判定するアルゴリズムの改良があげられる。

することも今後の課題としてあげられる。

本手法では，鶏の最上部の高さ情報から鶏の体勢

手法１，
２ともに，目標とした体重の±5.0％以が座位かどうかの判定を行っているが，最上部の内の体重推定精度には至らなかったものの，想定高さ情報だけでは正確に座位状態を判定できていしている精度向上のための手法を加えることで，ない可能性がある。最上部の高さだけでなく，鶏目標とした体重推定精度に到達できる可能性は高の背部の最大高さを求めたり，Fig．
３における鶏いと考えられる。

の面積情報も利用したりすることで，さらなる精度向上を実現できると考えられる。

４．要

約

続いて，手法２のディープラーニングを用いた

本研究は，体重測定がより重要視されている種

体重推定手法についても，手法１と同様に推定体

鶏場において，作業時間および飼養期間が最も長重と測定体重から相対誤差を求め，その平均を求い30週齢以降の鶏を対象とする体重測定の自動化© The Ito Foundation

418

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）を目的とした。具体的には，距離センサを用いての実験環境の構築，クラス分けの細分化等につい取得した鶏の形状データに基づいた鶏の体重推定て検討を行い，相対誤差±5.0％以内の体重推定手法を提案し，実測データを用いて提案手法の有精度の実現を目指す。また，種鶏場だけでなくコ用性を評価した。体重推定手法としては，鶏の体マーシャル農場における体重測定の自動化につい積を用いた体重推定手法と，ディープラーニングても検討を行う。

による体重推定手法の比較検討を行った。
鶏の体積を用いた体重推定手法における体重推
定精度は，雄が6.8％，雌が5.7％の誤差となった。
さらに精度を向上させるための手法として，鶏の座位状態を判定するアルゴリズムの改良があげられる。
ディープラーニングを用いた体重推定手法における体重推定精度は，雄が10.7％，雌が7.8％の誤差となった。鶏の体積を用いた体重推定手法より誤差が大きくなった要因として，ディープラーニ
ングの学習・検証を行うには鶏の画像枚数が少な
かったことがあげられる。さまざまな体重の鶏の形状データを取得し画像枚数を増やすことで，クラス分けを100ｇ以下に細分化することも可能となるため，精度の向上は可能と考えられる。
今後は，鶏の座位状態を判定するアルゴリズム

文献１） 農畜産業振興機構：鶏肉が食肉消費の主役に，
2017年12月28日
https://www.alic.go.jp/koho/mng01_000157.html
２） 厚生労働省：と畜・食鳥検査等に関する実態調査の結果について，2018年７月19日
h t t p s : / / w w w . m h l w . g o . j p / c o n t e n t / 1 1 1 3 0 5 0 0 /000335447.pdf
３） 農林水産省：平成22年度 食料・農業・農村白書，2010年５月31日
https://www.maff.go.jp/j/wpaper/w_maff/h22/pdf/
z_２_３_２.pdf４） Wei Liu, Dragomir Anguelov, Dumitru Erhan,
Christian Szegedy, Scott Reed, Cheng-Yang Fu,
Alexander C. Berg, SSD：Single Shot MultiBox
Detector, ECCV 2016, 2016.
５） Joseph Redmon, Santosh Divvala, Ross Girshick,Ali Farhadi：You Only Look Once：Unified, RealTime Object Detection, CVPR 2015, 2015.
６） Shaoqing Ren, Kaiming He, Ross Girshick, andJian Sun, Faster R-CNN：Towards Real-Time
Object Detection with Region Proposal Networks,
CVPR 2015, 2015.

の改良や，より多くの鶏の形状データ取得のため© The Ito Foundation

419

哺育期子牛の消化管機能を強化するための管理技術の開発
The study on the development of management method to strengthen thegut functions in calves

福

森

理

加

（酪農学園大学獣医学群）

Rika Fukumori（School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University）

Our objective was to evaluate the relationship between plasma gut hormone concentrationand growth and feed intake in calves during the weaning transition period. In exp.1, 13
Holstein calves weaned at 7 wk of age were used until 13 wk of age in this study. The calves
were fed calf starter ad libitum until 2.5 kg/d（as fed）and chopped hay ad libitum. Based on
their body weight at 13 wk of age, calves were divided to 3 groups as HIGH（≧ 120kg）, MED（＜ 120kg, and ≧ 100kg）, and LOW（＜ 100 kg）and plasma concentrations of hormones andmetabolites and feed intake（calf starter and chopped hay）were compared. In exp.2, 32
Holstein × Japanese Black bull calves were used in this study. The calves were born in nearby
dairy farms and transported into the farm at approximately 40 days of age, and randomly
assigned to 2 treatments with or without adaptation housing（treatment and control）. The
AD calves were housed in individual cow hatches for 1 wk after the transport and then moved
to the group housing（16 head per group）, whereas the CON calves moved to group housing
immediately after arrive at the farm, then plasma concentrations of hormones and metabolites
were measured temporally related to the day of transportation. In exp. 1, plasma GLP-2
concentrations were higher and starter intake reached 2.5 kg/d earlier for H calves than M
and L calves. In exp. 2, calves in the treatment group showed higher serum concentrations of
GLP-2 and insulin, and lower serum cortisol concentration and pepsinogen activity. Our results
suggest that higher plasma GLP-2 concentration may contribute to growth of calf andmanagement to reduce stress may improve gastrointestinal function in calves．

１．目

高栄養哺乳は哺乳期の増体を高めることを目的と的したものであるが，反芻胃の発育が抑制されやす

近年，高栄養哺乳や哺乳ロボットの導入による

く離乳の移行が難しくなることがデメリットにな

集団飼育等，子牛の哺育期（哺乳～離乳期）管理る。慣例哺乳法は哺乳量を１日４ℓ程度に制限す方法に変化や見直しがなされている。初生期の発るため，子牛の空腹感による固形飼料（スター

育は，将来の生産性に大きく貢献することから，

ター；人工乳）の摂取が哺乳期間中に促され，６© The Ito Foundation

420

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

週齢には離乳可能な飼料を十分に摂取できるようもに自由摂取させた。給飼はすべて１日２回行っになる。一方で，高栄養哺乳では，８～10ℓのミた。子牛は13週齢時の体重によって，発育成績のルクを摂取させるため，子牛の満腹感によって哺異なる以下の３群（Ｈ群４頭：120kg以上，Ｍ群

乳期間中の固形飼料摂取量が少なくなり，離乳直

６頭：100kg以上120kg未満，Ｌ群１頭：100kg未後に摂取量が急増するため，消化性の下痢ならび満）に分け，固形飼料の摂取量，血漿GLP-１おに成長遅延が生じやすくなる。子牛の哺育期は，よびGLP-２濃度を比較した。

消化器官が未熟な時期であり，子牛の消化生理機

2 . 2 試験２：導入直後の単独飼育による馴致

能に無理のある飼料給与や環境ストレスによってが消化管機能に子牛の消化管機能に及ぼす

軟便・下痢が容易に引き起こされる。消化吸収機影響

能を早期に発達させることは栄養素の消化・吸収

１軒の肥育農場において，導入された黒毛和種

効率を高め発育の向上につながると同時に，離乳×ホルスタイン種交雑種雄子牛32頭を供試した。

の移行がスムーズかつ早まることによって省力化

当農場では，市場から約40日齢で導入した直後にもつながる。

に ，ロ ボ ッ ト 哺 乳 牛 舎（牛 床 1110cm× 680cm）

下部小腸から分泌されるグルカゴン様ペプチ

において集団飼育を開始していた。本研究では16ド-１や２（GLP-１/GLP-２）は，出生直後や離頭（導入時平均日齢：37.2日，導入時平均体重：

乳後に血中濃度が増加し，摂取飼料に対する消化81.6±1.8kg）を対照群として，肥育農場従来の飼管の適応変化に重要な役割を果たしていることが養管理を施した。残りの16頭（導入時平均日齢：考えられるが，発育の違いとの関係については明41日，導入時平均体重：89.5±1.5kg）は馴致群とらかにされていない。そこで本研究では，哺育期

して導入後１週間は個別ハッチ（90cm×180cm）

における血中GLP-１/GLP-２濃度の変化が，固で飼育され，その後対照群同様にロボット哺乳牛

形飼料の摂食行動，消化機能および発育成績と関舎で集団飼育された。馴致群の子牛は，個別飼育連しているかについて解析を行うことを目的とし中に毎日９：00と16：00に２回哺乳されたが，そた。

の他の条件は対照群と同じであった。子牛は代用

２．方乳（粗タンパク質30％，粗脂肪18％）を導入直後

法から２週間は6.0ℓ／日，３週間目は4.5ℓ／日，

2 . 1 試験１：哺育期における血中GLP濃度の４週間目は3.0ℓ／日，５週間目は1.5ℓ／日給与推移がスターターの摂取量，採食行動およされた。固形飼料としてチモシー乾草およびス

び増体成績に及ぼす影響

ターターを給与された。農場導入直後，導入後１

ホルスタイン種子牛を13頭供試した。子牛は，週間後と２週間後に採血し，血清コルチゾール，

個別のペンにて飼養され，出生後５日間は初乳おペプシノーゲン活性値，血漿GLP-１，GLP-２，

よ び 移 行 乳 を 給 与 し ，代 用 乳（粗 タ ン パ ク 質

インスリンおよびIGF-１濃度を測定した。成長28％，粗脂肪20％）をその後１週齢まで１日４の指標として，採血と同様に農場導入直後，導入ℓ，２週齢まで６ℓ，３～４週齢まで１日８ℓ給後１週間後と２週間後に胸囲の測定を行った。

与し，５週齢で６ℓ，６週齢で４ℓに漸減哺乳さ

各測定値はJMP13.0（SAS Institute Japan，東れ，７週齢で離乳された。試験期間中，スターター京，日本）のフィットモデルを用いて統計解析さは現物2.5kgを給与上限とし，チモシー乾草ととれた。モデルには処理区が固定効果，個体が変量© The Ito Foundation

哺育期子牛の消化管機能を強化するための管理技術の開発

421

効果に含まれた。処理区間の差はp＜0.05で有意（Fukumori et al ３））。こ の こ と か ら ，Ｈ 群 で は差あり，p＜0.10で傾向ありとした。

GLP-２濃度の高まりによって，消化管が早期に発達していたことが推察される。消化管が発達す

３．結果と考察
3.1

ることによって栄養素の吸収効率が高まると同時

試験１に，揮発性脂肪酸などの酸が消化管から除去されスターター摂取量は，５週齢から増加し始め，ることによってルーメンや大腸におけるアシドー

離乳後に急速に増加した（Fig．
１）
。離乳時点にシスが緩和され，これが離乳後のスターター食い

お け る ス タ ー タ ー 摂 取 量 は Ｈ 群 1.60kg ，Ｍ 群込みの増加につながったと推察される。

1.55kgに対しＬ群では0.46kgと少なかった。また，

3.2

Ｈ群はＭ群に比べて早期にスターター給与上限に

馴致群の胸囲は対照群と比較してすべての時期達した（58日齢vs．73日齢）。Ｈ群における血漿において有意に高値を示した（p＜0.05，Table１）。

GLP-１およびGLP-２濃度は２～４週齢から増加

導入時点で子牛の胸囲に差が見られたため，本研し始め，Ｍ群と比較して高値を示した（p＜0.05，

究では発育に及ぼす影響を明らかにできなかっ

なお，Ｌ群は１頭のみであったため比較から除外た。血中の総タンパク質，グルコースおよび非エした）。離乳後の増体はスターターから供給されステル型脂肪酸（NEFA）濃度はすべての時期にる栄養素に依存する。また，離乳後の日増体量はおいて有意な差は見られなかった（Table２）。血

離乳前３日間のスターター摂取量と高い正の相関

清コルチゾール濃度は７日目の時点で馴致群が対があり，Stameyらによると，離乳後に１kgの照 群 と 比 べ て 有 意 に 低 値 を 示 し て お り（p ＜日増体を実現させるためには離乳前３日間の平均

0.05），輸送によるストレスが馴致群よりも対照

スターター摂取量が1.38kg／日に達していると報群で大きかったと推察された。血漿インスリンお告されている。本研究ではＨ群およびＭ群では離よびGLP-２濃度は，14日目に馴致群において馴

乳時点でこの基準以上のスターターを摂取してお致群と比べ高値を示しており（p＜0.05），馴致にり，離乳後の日増体も良好であった。一方，Ｌ群よる確実な哺乳給与が子牛の栄養状態の改善に寄の子牛は哺乳期～離乳時点でのスターター摂取量与したと考えられた。血漿IGF-１濃度は，７日が他群に比べて低く，これが離乳後の低増体に繋目では馴致群が対照群と比較して高いのに対し，がった。さらに，Ｈ群の子牛は離乳後のスター

14日目では馴致群が対照群と比べ低値を示した

ター摂取量の伸びがＭ群よりも早く，結果として（p＜0.05）。血中IGF-１濃度はタンパクやエネル

哺育終了時の体重差につながったと考えられる。

ギー摂取量と関連することが知られている。７日

Ｈ群の子牛は，他群に比べて哺乳漸減期以降の目は対照群において，哺乳ロボットに移動して１

GLP-２分泌が大きく増加していることが観察さ週間経過した時点であり，施設の移動，群飼，ロ

れた（ p ＜0.05，Fig．
２）。子牛においてGLP-２

ボット哺乳への適応過程におけるストレスによっは消化管への血流を増加させ小腸絨毛の発達を促て一時的に低下し，その後，環境への適応によっ

１）

試験２

すことが報告されている（Taylor-Edwards et alて濃度が回復したと考えられる。一方で馴致群に２））。また，我々は泌乳牛において，酪酸塩の給おける14日目の採材は，哺乳ロボット牛舎に移動

与によってGLP-２分泌を高めたところ，乾物おして７日目にあたり，対照群同様に施設への適応

よび有機物消化率が増加したことを報告している

過程において栄養摂取が一時的にダウンし，© The Ito Foundation

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Body weight

1

2

3

4

5

6 7 8 9 10 11 12 13 14
Week of age

3.0（kg/d; as fed）

●H group■M group▲L group

Weaning

（kg）

130
120
110
100
90
80
70
60
50
40

Starter intake

2.5
2.0

Weaning

1.5
1.0
0.5
0.0

1

2

3

4

5

6 7 8 9 10 11 12 13 14
Week of age

1.4

Hay intake

1.2
1.0

（kg/d; as fed）

422

0.8

Weaning

0.6
0.4
0.2
0.0

1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

0

1

2

3

4

5

6 7 8 9 10 11 12 13
Week of age
ADG（kg/d）

Weaning□H group■M group■L group

0 wk 1 wk 2 wk 3 wk 4 wk 5 wk 6 wk 7 wk 8 wk 9 wk 10 wk 11 wk 12 wk

Fig. 1 Summary of body weight, starter and hay intake, and ADG incalves from 0 to 14 week of age．H group：n=4．M group：
n=6．L group：n=1．

© The Ito Foundation

423

哺育期子牛の消化管機能を強化するための管理技術の開発
Plasma GLP-1, % of base line1
700%
600%
500%
400%
300%
200%
100%
0%

＊

5

6

7

＊

8
9 10
Week of age

Plasma GLP-2, % of base line
400%

11

12

13

14

Group：p< 0.01＊
Week：p< 0.05
Interaction：p< 0.05
＊

＊

300%

＊

＊

＊

2～4

Group：p<0.1
Week：p<0.01
Interaction：p<0.05

＊

＊

＊

＊

200%
100%
0%

2～4

5

6

7

8
9 10
Week of age

11

12

13

14

Fig. 2 Changes in plasma concentrations of GLP-1 and GLP-2 incalves around the weaning period. Data were normalized tothe baseline（mean concentrations of 2 to 4 week of age）for
each calf．＊ p＜0.05 compared with the concentration in M
group．

Table 1 Heart girth of calves in treatment group and control group（mean±SE）
Day０
胸囲
（cm）

Day７

Day14

Control

Treatment

Control

Treatment

Control

Treatment

99.31±0.77

106.13±0.86＊＊＊

104.50±0.91

108.31±0.95＊＊

104.69±1.03

109.13±1.08＊＊

Asterisk shows the significant difference between the treatment at each point（＊：p＜0.1，＊＊：p＜0.05，＊＊＊：p＜0.001）．

IGF-１が低下したのではないかと推察された。

いが，本研究では２群間でペプシノーゲン活性の

血清ペプシノーゲン活性値の変動比率は７日目お変動に違いが見られた。対照群においては，導入

よび14日目において，対照群が馴致群と比べ高値

後直後からの群飼ストレスによって，第四胃の透で推移していた（Ｄ７でp＜0.1，Ｄ14でp＜0.05）。

過性が上昇し，これがペプシノーゲン活性値の増血清ペプシノーゲン濃度の増加は，第四胃の損傷

加に反映されているのではないかと考えられた。

を反映していることが成反芻動物では知られているが子牛において詳細は明らかにされていない。
哺乳子牛のペプシン分泌は成牛のそれと比べて低４．要

約

本研究では，哺育期における子牛の消化管発達© The Ito Foundation

424

平成31年度（令和元年度） 食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.38）

Table 2 Serum concentration of biochemical component, hormones, and pepsinogen activity ration of calves in treatment

or control group

Day０

Day７

Day14

Control

Treatment

Control

Treatment

Control

Treatment

Total protein（g/dl）

5.63±0.10

5.49±0.076

5.58±0.079

5.53±0.064

5.49±0.088

5.56±0.064

Glucose（mg/dl）

108±3.41

115±3.06

97.4±2.58

98.0±3.28

92.8±2.45

88.9±1.62

572.63±43.5

616±94.2

399±37.4

380±48.1

319±32.9285±29.8

5.00±1.85

3.30±1.85

0.900±0.289

1.35±0.271

0.717±0.0828

1.03±0.0828＊＊

GLP-1（ng/ml）

0.186±0.050

0.224±0.050

0.342±0.078

0.286±0.075

0.30±0.070

0.328±0.070

GLP-2（ng/ml）

0.186±0.050

0.224±0.050

1.96±0.356

1.53±0.345

0.629±0.403

1.92±0.0403＊＊

IGF-1（ng/ml）

178±16.0

161±16.0

90.0±10.2

132±10.2＊＊

111±7.85＊＊

75.4±7.85

Cortisol（μg/dl）
Pepsinogenactivity ratio１

1.64±0.20

1.62±0.24

1.55±0.25＊＊

0.94±0.15

0.64±0.11

0.85±0.15――

1.30±0.139＊

1.05±0.059

1.53±0.156＊＊＊

0.972±0.0531

NEFA（μEq/l）
Insulin（ng/ml）

１Pepsinogen activity ratio was obtained by dividing the value of D7 or D14 by D0 of each calf．

Asterisk shows the significant difference between the treatment at each point（＊：p＜0.1，＊＊：p＜0.05，＊＊＊：p＜0.001）．

や機能と発育の関係性について解析を行った。試
験１では，哺育期に発育の良い個体は離乳後のス
ターター摂取量が順調に伸び，離乳移行期から離乳後にかけて血中GLP-２濃度が大きく増加していたことが明らかにされた。試験２では，子牛の導入ストレスを緩和させるための管理（個別管理による馴致）によって，血清コルチゾール濃度が抑えられ，血清GLP-２およびインスリン濃度の増加，ペプシノーゲン活性値の増加が抑制されたことから管理によるストレスの低減が消化管機能に好適な効果をもたらすことが示された。

文献１） Stamey, J. A., Janovick, N. A., Kertz, A. F.,
Drackley, J.：K.Influence of starter protein content
on growth of dairy calves in an enhanced early
nutrition program, Journal of Dairy Science，95，
3327～3336，2012．
２） Taylor-Edwards, C. C., Burrin, D. C., Holst, J. J.,
McLeod, K. R., Harmon, D. L.：Glucagon-like
peptide-2（GLP-2）increases small intestinal bloodflow and mucosal growth in ruminating calves,
Journal of Dairy Science，94，888～898，2011．
３） Fukumori, R., Oba, M., Izumi, K., Otsuka, M.,
Suzuki, K., Gondaira, S., Higuchi, H., Oikawa, S.：
Effects of butyrate supplementation on blood
glucagon-like peptide-2 concentration andgastrointestinal functions of lactating dairy cows fed
diets differeing in starch content, Journal of Dairy
Science，103，3656～3667，2020．

© The Ito Foundation

平成31年度（令和元年度）助成研究調査一覧

本年度の対象とする研究または調査：
食肉に関する研究または調査（品質・加工，食品的価値，食品安全，遺伝育種，繁殖，動物衛生，家
畜飼養・飼料など）
単位：千円
研

究

課

継続
年数

題

代

表

研

究

者

助成金額

代表者名

所属機関

筋肉内間葉系前駆細胞の機能改変による肉質制御技術開発に向けた基礎研究

山内啓太郎

東京大学大学院
農学生命科学研究科

900

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発竹中慎治

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンIXの形成様相と存在形態に関する研究若松純一

北海道大学北方
生物圏フィールド
科 学 セ ン タ ー

2,000

ドライエイジングビーフの香気に及ぼす真菌の影響

中川麻衣

一 般 社 団 法 人
食肉科学技術研究所

900

枝肉の３Dグラフィック化システムの製作

本山三知代

国立研究開発法人
農 業 ・ 食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

2,000

西村

敏英

女 子 栄 養 大 学
栄 養 学 部

1,200

次世代畜産学のための培養肉技術の開発

福田智一

岩 手 大 学
理 工 学 研 究 科

1,900

官能特性をベースとした分光分析による赤身肉評価装
置の開発

口田

圭吾

帯 広 畜 産 大 学

940

枝肉の異臭クレーム防止のためのと畜場における最適な冷却温度管理法の開発

猪島康雄

岐 阜 大 学
応用生物科学部
共 同 獣 医 学 科

2,000

本田

和久

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,300

非加熱食肉製品における生理活性発現に関与する微生
物の解明

竹田

志郎

麻布大学獣医学部
動物応用科学科

900

神経細胞保護効果を有する畜産物由来タンパク質の探
索研究

糸井

亜弥

神 戸 女 子 大 学
健 康 福 祉 学 部

1,890

山田

知哉

国立研究開発法人
農 業 ・ 食 品 産 業
技術総合研究機構
中央農業研究センター

1,900

Ⅰａ

食肉の品質加工（９件）

ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）

Ⅰｂ

Ｈ30～

食肉の食品的価値（５件）

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明（Ⅲ）

和牛肉のおいしさを「見える化」する（Ⅱ）
輸入牛肉との比較

Ｈ29～

Ｈ30～

© The Ito Foundation

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線
維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究（Ⅲ）

林利哉

名城大学農学部

900

食品添加物の安全性に関する消費者の意識に関する研
究

堀江

正一

大 妻 女 子 大 学
家政学部食物学科

1,470

食材の低温貯蔵履歴が大腸菌O157：H7の凍結損傷回
復ならびに低温加熱耐性に及ぼす影響

本城賢一

九州大学大学院
農 学 研 究 院

1,900

ソーセージに混入する非金属異物の検出技術に関する
研究

河野

俊夫

高 知 大 学教 育 研 究 部 自 然
科学系農学部門

1,900

牛の新規遺伝的不良形質の分子基盤および生産性への
影響

大和

修

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,300

沖縄県の島々の黒毛和種集団の多様性，近交度のゲノム視点からの評価

佐々木慎二

琉球大学農学部

1,550

牛の小型ピロプラズマ病に対する感染抵抗性遺伝子の
同定

平山

博樹

東 京 農 業 大 学
生 物 産 業 学 部

1,700

青谷

大希

秋田県畜産試験場

1,000

豚の暑熱ストレス耐性マーカーの開発佐藤周史

千 葉 科 学 大 学
危 機 管 理 学 部
動物危機管理学科

1,700

牛の暑熱ストレス耐性を担うHSP70.1遺伝子多型に Ｈ30～
関する研究（Ⅱ）

森美幸

福岡県農林業総合試験場生産環境部

1,250

肉用地鶏の増産を目指した雌系名古屋種の産卵率および卵殻強度に関する遺伝子座の効率的な探索（Ⅱ）

後藤達彦

帯 広 畜 産 大 学

1,000

OPU-IVPを活用したステーション型牛胚生産システ
ムの構築

及川

俊徳

宮城県畜産試験場
酪 農 肉 牛 部

1,600

牛の子宮疾患や機能診断に資する子宮内バイオマー
カーの検索

田中

知己

東 京 農 工 大 学
農 学 部 獣 医 臨 床
繁 殖 学 研 究 室

1,300

1,300

Ⅰｃ

Ⅱａ

食品安全（３件）

遺伝育種（７件）

地鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺伝的多型の
探索（Ⅱ）

Ⅱｂ

Ｈ29～

Ｈ29～

Ｈ30～

繁殖（15件）豚における体表温と行動の変化に基づく分娩予測の試
み

檜垣

彰吾

国立研究開発法人
農 業 ・ 食 品 産 業
技術総合研究機構
動物衛生研究部門

牛体外受精胚の染色体異常予測技術の開発

杉村智史

東 京 農 工 大 学
大学院農学研究院

1,600

木崎景一郎

岩手大学農学部

1,600

暑熱ストレスによる牛子宮内膜内分泌機能攪乱への温度感受性チャンネルの関与

木村康二

岡 山 大 学 大 学 院
環境生命科学研究科

1,500

黒毛和種体外受精卵のゲノム選抜技術確立に向けた割球分離卵凍結保存法の開発藤井貴志

北海道立総合研究機構畜産試験場

1,200

卵胞由来生理活性ペプチドによる牛の卵巣機能調節メカニズムの解明松田二子

東京大学大学院
農学生命科学研究科

1,600

移植可能な牛伸長胚培養系評価法の検討

細江実佐

国立研究開発法人
農 業 ・ 食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,600

牛の早期妊娠診断を目指した血中マイクロRNA定量に関する基礎的研究（Ⅱ）

Ｈ30～© The Ito Foundation

武田久美子

国立研究開発法人
農 業 ・ 食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,500

分娩後の空胎期間短縮をもたらす新規卵巣機能賦活化技術の開発研究山村崇

国立研究開発法人
農 業 ・ 食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,500

ホルモンおよび成長因子の複合添加培地を用いた賦活培養による牛体外受精由来胚の着床能力向上に関する
研究

高﨑

久子

栃木県畜産酪農研 究 セ ン タ ー

900

分娩後のプロスタグランジン製剤投与が牛子宮修復の促進およびその後の繁殖機能に及ぼす影響伊賀浩輔

国立研究開発法人
農 業 ・ 食 品 産 業
技術総合研究機構
東北農業研究センター

1,200

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解
明（Ⅲ）

Ｈ29～

繁殖雌牛における栄養コントロールが過剰排卵処置の反応性および回収胚数に与える影響（Ⅱ）

Ｈ30～

林

武司

福岡県農林業総合
試
験
場

1,200

黒毛和種凍結精子の低運動持続性に関する実態調査
（Ⅱ）

Ｈ30～

星野洋一郎

京 都 大 学 大 学 院
農学研究科附属牧場

1,400

Ｈ29～

佐藤

繁

岩手大学農学部

1,600

消化管寄生性コクシジウム，Eimeria krijgsmanniに Ｈ30～
おける発育休止期の解析（Ⅱ）

松尾智英

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,300

畜産動物用アジュバントの開発

後藤康之

東 京 大 学 大 学 院農学生命科学研究科

1,600

豚インフルエンザウイルス国内分離株の抗原性解析

小澤真

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,600

石原加奈子

東 京 農 工 大 学
農 学 研 究 院

1,300

牛呼吸器病症候群（BRDC）発症機序の解明

帆保誠二

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,600

天然化合物による牛白血病ウイルス感染制御を目指した基礎的研究紙透伸治

麻布大学獣医学部

1,600

市居

修

北海道大学大学院
獣 医 学 研 究 院

800

豚赤痢菌の全ゲノム系統解析および薬剤耐性機序の解
明

岩田

剛敏

国立研究開発法人
農 業 ・ 食 品 産 業
技術総合研究機構
動物衛生研究部門

1,200

豚高親和性乳酸菌を用いた新規経口ワクチンの開発

大松勉

東 京 農 工 大 学
農学部附属国際家畜
感染症防疫研究
教 育 セ ン タ ー

1,600

森本

素子

宮 城 大 学
食 産 業 学 群

1,200

吉田

彩子

宮崎大学農学部

1,600

塩川

舞

日本獣医生命科学
大 学 獣 医 学 部

900

高島

康弘

岐 阜 大 学
応用生物科学部

1,600

Ⅲ

動物衛生（19件）

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症
予知と制御（Ⅲ）

食肉の薬剤耐性菌による汚染菌数の測定法の開発・評価（Ⅱ）

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索（Ⅲ）―より効果的なワクチン接種部位を求めて―

Ｈ30～

Ｈ29～

牛の消化管内寄生虫の浸潤度と駆虫プログラムの実施状況調査（Ⅱ）

Ｈ30～

鶏を対象としたトキソプラズマ症の抗体検査法の開発－

牛ウイルス性下痢ウイルスの準種ＥＮＤ は弱毒性ワ
クチンになるか？
―より効果的に免疫を誘導するための可能性の追求―
筋肉中の虫体数を予測できるトキソプラズマ感染豚の検出法（Ⅱ）

Ｈ30～© The Ito Foundation

目堅

博久

宮 崎 大 学
テニュアトラック推 進 機 構

1,100

Ｈ30～

岡林

環樹

宮崎大学農学部

1,600

反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索 Ｈ30～
（Ⅱ）

青山

真人

宇都宮大学農学部

1,600

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析（Ⅲ）

Ｈ29～

黒木

香澄

東 京 大 学
日本学術振興会

1,600

アフリカ豚コレラの侵入リスク評価に関する疫学研究
（Ⅱ）

Ｈ30～

杉浦

勝明

東 京 大 学 大 学 院農学生命科学研究科

1,600

牛におけるPTH/PTHrP受容体シグナルの肥満とインスリン抵抗性への関与

恩田賢

麻布大学獣医学部

1,400

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究―飼養成績と免疫能に及ぼす影響―

勝俣昌也

麻布大学獣医学部

1,400

暑熱ストレスによる筋成長阻害のブレークスルー：筋幹細胞の活性化・増殖因子HGFのニトロ化（不活化）の関与の検証辰巳

隆一

九州大学大学院
農 学 研 究 院

1,900

米倉

真一

信州大学農学部

1,600

黒毛和種繁殖雌牛の放牧行動における群内個体差は生産成績と関連するか？

安在弘樹

宮崎大学農学部

900

茎葉多収型飼料用イネの茎部に蓄積する炭水化物の栄養的意義と生産現場との技術的連携近藤誠

三重大学大学院
生物資源学研究科

1,200

養鶏における個体管理と清掃ロボット導入によるIoT Ｈ30～
型食肉生産技術の開発（Ⅱ）

堀口健一

山形大学農学部

1,300

成熟後の効率的な筋肥大の誘導に寄与する筋幹細胞の
探索（Ⅱ）

鈴木

貴弘

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,600

ルーメン内繊維消化ダイナミクスに着目した採食可能量の予測モデルの開発

谷川珠子

北海道立総合研究機構酪農試験場

1,600

異なる月齢時の輸送が子牛の福祉性および生産性に与
える影響

戸澤あきつ

帝 京 科 学 大 学
生 命 環 境 学 部

600

鶏肉中のイミダゾールジペプチド含量を増やす飼養方法とその活用に関する研究

久恒

辰博

東京大学大学院
新領域創成科学
研
究
科

1,800

中島

郁世

国立研究開発法人
農 業 ・ 食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,500

黒毛和種育成牛のアミノ酸要求量に関する研究

寺田

文典

東北大学大学院
農 学 研 究 科

500

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可
能性

松﨑

正敏

弘 前 大 学
農学生命科学部

1,500

鶏の飼養管理における労力低減のための距離センサによる体重推定に関する研究

阿野

裕司

山
口
県
産業技術センター

1,800

哺育期子牛の消化管機能を強化するための管理技術の
開発

福森

理加

酪 農 学 園 大 学
獣 医 学 群

1,900

網羅的ジェノタイピングによる新規牛白血病抵抗性遺伝子の同定
豚腸管細胞モデルを用いた豚サーコウイルス関連疾病の重症化機序解明（Ⅱ）Ⅳ

家畜飼養，飼料など（16件）

骨格筋肥大を促進する植物由来成分の探索（Ⅱ）―質的向上も目指して―豚の未熟産子（ひね豚）の発育遅延をもたらす生理的要因の解明（Ⅱ）

合

計

Ｈ30～

Ｈ30～

Ｈ30～

74件

105,000© The Ito Foundation

伊藤記念財団賞© The Ito Foundation

431

佐々木

啓介

農研機構畜産研究部門畜産物研究領域

ユニット長〔業績の課題名〕

食肉の官能特性評価と消費者受容に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
消費者が食肉を受容し購入し続けるためには，消費者自身のニーズや品質表示から購入の可否を決定する「食べる前の受容」と，実際に喫食して味，匂いおよび食感，すなわち官能特性を感知し，好まし
いかどうかを判断する「食べた時の受容」の両面で食肉が受容され続けることが必要である。そこで食肉の「食べる前の受容」「食べた時の受容」を評価解明し，国産食肉の高付加価値化に貢献するため以下の研究を行い，それぞれ成果をあげた。
（１）食肉の官能特性評価指標に関する業績
食肉の「食べた時の受容」に直接影響する官能特性を，分析型官能評価を用いて解析し，エコフィー
ドや飼料用米等の新規飼料資源を活用して生産した豚肉について，慣行品との識別性やその違いを表す
指標を明らかにした。また，消費者が感じる牛肉の「やわらかさ」には「かみ切りやすさ」「変形しやすさ」の異なる２つの要素が含まれ，これらを分けて評価する必要があることや，「地鶏肉らしい食感」
において「弾力性」が有用な指標であることを見いだした。
（２）食肉に対する消費者ニーズ・消費者嗜好に関する業績
一般消費者を対象としたアンケートから，「食べる前の受容」としては牛肉に対するニーズが類型化できること，豚肉への「飼料用米利用」表示に対して消費者に割増価格を支払う意思があること，「エコフィード」利用型豚肉に対する消費者イメージの多様性を解明した。また「食べた時の受容」に関しては，嗜好型官能評価を用い，牛肉に対する一般消費者の嗜好性は「和牛嗜好群」「国産乳用種牛肉嗜好群」などに類型化できることを解明した。これらの結果から，食肉の高付加価値化においては，販売対象とすべき消費者群を適切に選択することが有効であることを示した。
（３）食肉の官能評価実施条件に必要な情報整備やその普及に関する業績
食肉の官能評価においてはその目的によって適切なサンプル調整方法や評価用語を選択する必要がある。そこで食肉の湿熱調理レシピを収集し解析することで，加熱時間や塩濃度等について標準的な条件を示すとともに，一般消費者および調理従事者に対するアンケート調査から，食肉における官能評価用
語選択に活用可能な「食肉の官能評価候補用語集（農研機構式）」を確立した。また，食肉官能評価技
術について，平成24年から７年間にわたり，毎年「食肉の官能評価ワークショップ」を開催し，公設試
験研究機関への普及に努めた。

© The Ito Foundation

432

中 島

郁 世

農研機構畜産研究部門畜産物研究領域

上級研究員〔業績の課題名〕

肉用家畜における脂肪組織の形成・制御機構に関する研究― in vitro から in vivo まで ―〔業績の概要（受賞理由）〕
食肉は主に筋肉，脂肪および結合組織からなる。中でも脂肪はエネルギー源として重要な栄養素であるだけでなく，その量や質は喫食時の官能特性に影響する。また枝肉取引規格において，牛では筋肉内脂防の沈着量，すなわち脂肪交雑が，豚では皮下脂肪の被履量が主要な格付項目となっている。したがって，肉用家畜を高付加価値化するためには生産段階で脂肪組織の量と質を適切に制御する技術が必要となる。受賞者はこれまで，肉用家畜の脂肪組織形成およびその制御機構を解明すべく培養細胞から個体レベルに至る幅広い視点から取り組み，顕著な業績をあげてきた。研究成果は以下の３つに大別される。
（１）牛筋肉内脂肪組織の形成とコラーゲンの役割
黒毛和種牛の筋肉内結合組織に筋肉内脂肪組織が沈着する際，脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化に伴いコラーゲンをはじめとする細胞外マトリックス成分を細胞自ら積極的に産生・分泌し，脂肪前駆細胞時とは異なる細胞外環境を新たに再構築すること，この脂肪細胞自身によるコラーゲン産生が脂肪蓄積に必須であること，また脂肪細胞分化にⅤ型およびⅥ型コラーゲンの添加が効果的であることを明らかにした。
（２）豚皮下脂肪細胞株の樹立とマウス脂肪細胞株との分化特性の違い
豚の培養脂肪細胞モデルとして，クローニングにより豚胎児皮下組織由来の脂肪前駆細胞株PSPAを樹立した。このPSPAは，分化培地に対する応答性，蓄積した脂肪の脂肪酸組成，分化に伴う遺伝子発
現が，培養脂肪細胞モデルとして汎用されているマウス由来３T3-L１と異なっており，PSPAの樹立によって，豚とマウスの脂肪細胞で動物種間差が存在することを世界で初めて証明した。
（３）品種間比較による豚皮下脂肪組織の発達とアディポネクチン
遺伝的に背脂肪厚が異なる西洋系品種と中国系品種の豚を比較した結果，中国系品種の厚脂の要因が脂肪細胞の肥大であることを突き止めた。この中国系品種に見られる脂肪細胞の肥大化は，皮下脂肪組織における脂肪蓄積・分解能に起因するものでなく，全身のエネルギーバランスによる制御を受けている可能性をアディポネクチン遺伝子の発現量および血液性状の違いから示した。

© The Ito Foundation

433

永 野

昌 志

北里大学獣医学部動物資源科学科

教授〔業績の課題名〕

牛卵子の体外発育培養系の開発と卵胞発育機構研究：臨床現場における牛胚生産への応用〔業績の概要（受賞理由）〕
牛の体外胚生産技術は，と体卵巣内の小卵胞内から採取された卵子あるいは超音波ガイド下で卵巣内の小卵胞を確認しながら経腟的に採取された卵子を体外で成熟培養し，体外受精を行ったのち，非外科的に移植可能な胚盤胞まで発育させる技術であり，世界中で商業的に行われるほど一般的なものとなっている。しかし，これらの卵子を用いた移植可能胚の作出効率は30～50％程度であり，体内で成熟した卵子より低いことが知られている。牛は１回の発情周期中に１個の卵子を排卵する動物であることから，体外胚生産で利用する卵子の大部分は退行する運命にあることが，体外成熟卵子の発生能が低い原因であると考えられる。卵子が体内で発生能を獲得あるいは失う過程について検討するとともに，体外で卵子を発育させることで卵子の発生能獲得機構について研究し，発生能の高い卵子を産生できる培養系の開発および生体内から発生能の高い卵子を採取する方法について検討を行っている。
近年は，卵子固有の発生能に影響を与える要因として，牛卵巣内の胞状卵胞数に注目した研究を行っている。すなわち，たくさんの胞状卵胞を有する牛の繁殖性が，少ない牛に比べて高くなる要因の一つとして，顆粒層細胞のエストラジオール産生能は卵胞数が多いほど高くその卵胞内で発育する卵子の発生能も高いことを明らかにした。現在は，牛ごとに固有の卵胞数が変化する理由について北里大学附属
八雲牧場の日本短角種牛を用いて研究を始めている。また，牛精子が受精能を獲得する機構や近年世界的に広く使用されている性選別精子の性状について精子自身の検査や体外受精技術を用いて詳細に解析している。これらは牛の卵子および精子品質の改善につながる業績であり，食肉生産と供給を安定的に行うことに寄与すると考えられる。

© The Ito Foundation

学会等事業助成© The Ito Foundation

437

シンポジウム「食鳥肉検査における日本とアジア諸国の HACCP の現状」に関する開催報告
公益社団法人日本獣医学会

代表理事

久和

茂（東京大学）〔日時〕令和２年２月15日（土）13：00－17：00〔場所〕国立大学法人東京大学

弥生講堂

HACCP（Hazard Analysis and Critical Control Point）とは，食品等事業者自らが食中毒菌汚染や異物混入等の危害要因（ハザード）を把握しうえで，原材料の入荷から製品の出荷に至る全工程の中で，それらの危害要因を除去または低減させるために特に重要な工程を管理し，製品の安全性を確保しよう
する衛生管理の手法である。本シンポジウムでは，わが国および近隣アジア諸国における食鳥肉検査におけるHACCPの現状を報告していただき，課題と今後の方向性について意見を交換した。一般市民も自由に参加できるように参加費無料の公開シンポジウムとして開催したが，あいにくわが国においても新型コロナウイルス感染症の発生が報告されはじめ，参加者は30-40名と多くはなかった。しかしながら，関東近県で食肉衛生の実務者の参加もあり，活発な意見が交わされた。以下に本シンポジウムのプ
ログラムと各講演の概要を報告する。
〔プログラム〕
座長：森田幸雄（東京家政大学），苅和宏明（北海道大学）
開会挨拶

久和

茂（日本獣医学会理事長）

１．「タイの食鳥，魚介類輸出企業のHACCPの状況」“HACCP system of food product company exporting poultry and seafood in Thailand”
Dr. Sumalee Boomar, DVM., Ph.D. Walailak University, Thailand.
２．「フィリピンにおける食肉検査システム確立の歴史―食肉関連施設（食鳥処理場，と畜場，食肉加工工場，食肉用冷蔵庫）へのHACCPシステム導入の経緯―」“A Brief History on the Development of Meat Inspection System in the Philippines leading to
Implementation of HACCP system in Meat Establishments（Poultry and Pig Slaughterhouses, Meat
Processing Plants, Meat Cutting Plants and Cold Storage Warehouses）”
Dr. Clarita M. Sangcal, DVM. Chief Meat Control Officer, Meat Import Export Division, National
Meat Inspection Service, Philippines.
３．「重要管理点（CCP）としての精肉のガス置換包装」
森田幸雄（東京家政大学）
４．「わが国におけると畜場HACCPシステム妥当性検証：その意義と検証法開発」
鎌田洋一（甲子園大学）
総合討論
閉会挨拶

苅和宏明（北海道大学）© The Ito Foundation

438〔講演内容〕
１．「タイの食鳥，魚介類輸出企業のHACCPの状況」：タイは冷凍鶏肉や冷凍水産物の輸出が盛んで，タイの食品会社大手であるCharoen Pokphand Foods Public Company Limited（CPF）は有名である。
CPFは豚，肉用鶏，採卵鶏，アヒル，エビ，魚などを取り扱い，30か国以上の国々へ輸出している。同社では生産現場から消費者に至るまでのフードサプライチェーンにおける衛生的リスク要因を排除し，生産・販売に関する法令を遵守するとともにコーデックスの国際的基準を適用し，消費者の健康と公正取引を行っている。
２．「フィリピンにおける食肉検査システム確立の歴史―食肉関連施設（食鳥処理場，と畜場，食肉加工工場，食肉用冷蔵庫）へのHACCPシステム導入の経緯―」：19世紀のフィリピンではスペイン王国の食肉検査システムが実施されていた。食肉検査官が動物の殺処分に立ち会い記録するだけで，病気の動物の摘発などはできなかった。20世紀初頭に米国人がやってきて，米国流の食肉検査システムが導入され，1936年には現代的な手法が法制化された。1972年10月には当時のマルコス大統領が大統領令を発令し，家畜と畜産物の生産を管理する国の食肉検査委員会を設立させた。その後も歴代のアキノ大統領，
ラモス大統領らによって食肉・水産物の衛生管理に関する法整備は進み，1998年には動物福祉法も成立した。2004年にはアロヨ大統領によって食肉検査規則が整備された。2013年には食品衛生法が承認され，食品安全の規制システムが強化され，消費者の健康と食品流通に貢献している。
３ ．「重 要 管 理 点（CCP）と し て の 精 肉 の ガ ス 置 換 包 装」：ガ ス 置 換 包 装（Modified Atmosphere
Packaging：以下，MAP）とは，食品の変質を抑制し，食品本来のもつ品質を保持することを目的として，食品の包装内の空気を除去し，二酸化炭素や窒素による不活性ガスや酸素などに置換・充填する
もので，細菌の増殖防止効果があることから，米国，欧州連合等の国々では使用が認められている。しかし，わが国では，「食品の鮮度等について消費者の判断を誤らせるおそれがある」との立場からMAPは普及していない。精肉では高濃度酸素MAP（酸素80％，二酸化炭素20％）が世界的に用いられ，ミオグロビンがオキシミオグロビンに変わり，食肉を鮮紅色にすると言われている。しかし，演者らが実施した実験では色調の変化は認められず，食肉の品質，鮮度等について消費者の判断を誤らせるおそれがあるとは言えなかった。高濃度酸素MAPは精肉の一般生菌数，大腸菌数を減少させ，ウェルシュ菌が発育しないことから，わが国での普及を推奨された。
４．
「わが国におけると畜場HACCPシステム妥当性検証：その意義と検証法開発」：平成30年６月13日，
食品衛生法のほか，と畜場法等の一部を改正する法律が公布され，令和２年６月から施行し，施行から１年間は猶予期間が設けられ，2021年６月からは完全に義務化される。と畜場は腸管内や体表に腸管出血性大腸菌，カンピロバクター，サルモネラ等を保有する家畜を食肉にする製造施設であり，米国，
EU等では，HACCPの妥当性検証法や基準が示され，義務化されている。わが国のと畜場もHACCPが義務化されるにあたり，妥当性検証法の開発が行われている。
〔その他〕
新型コロナウイルス感染症（COVID-19）対策として，参加者全員にマスクを配布し，マスクの装着をお願いした。また，会場入り口には消毒液を置き，手指の消毒を推奨した。

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平成 31（令和元）年度事業実施報告書
日本畜産学会第 126 回大会 公開シンポジウム「畜産研究の成果を獣医臨床フィールドへ」
公益社団法人日本畜産学会

理事長

柏崎直巳（麻布大学）〔日時〕2019年９月19日（木）13：00～17：15，９月20日（金）９：00～12：00〔会場〕第Ⅰ会場（ぽらんホール）〔主催〕公益社団法人日本畜産学会〔共催〕岩手大学農学部，日本家畜臨床学会〔プログラム〕
９月19日（木）Ⅰ．13：00－15：00「牛の繁殖：研究と臨床のトピック」
座長：大蔵聡（名古屋大），高橋透（岩手大）

講演１．
「家畜における繁殖の神経内分泌学～基礎的知見と臨床応用の可能性～」
松田二子，大蔵聡（東大院農生命，名大院生命農）

講演２．
「ウシ経膣採卵（OPU）における現場利用と今後の展開」
及川俊徳（宮城県畜産試験場）
講演３．
「黒毛和種繁殖牛の飼養管理が受精卵移植受胎率に及ぼす影響」
渡邊貴之（（独）家畜改良センター）
講演４．
「ウシ黄体血流を指標とした受胎性評価」
金澤朋美（宮城県農業共済組合）
Ⅱ．15：15－17：15「肉牛生産と疾病管理の最前線」
座長：岩本英治（兵庫県），一條俊浩（岩手大）
講演１．
「ブランドを支える試験研究」
岩本英治（兵庫県立農林水産技術総合センター）
講演２．
「尿石症の多発要因と予防，治療法の開発」
渡辺大作（北里大獣医）
講演３．
「臨床現場における素牛生産の現状と課題」
松田敬一（宮城県農業共済組合）
講演４．
「独自システムを活用した黒毛和牛一貫生産と販売戦略～外れる生産と外さない生産～」鳥山真（鳥山畜産食品株式会社）

９月20日（金）Ⅲ．９：00－11：10「乳牛の飼養管理と疾病制御」© The Ito Foundation

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座長：櫛引史郎（農研機構），佐藤繁（岩手大）

講演１．
「移行期の飼養管理」
杉野利久（広大院統合生命）講演２．
「周産期代謝障害の解析と早期診断」
石川翔（兵庫県農総セ

淡路農業技術センター）

講演３．
「離乳期子牛のSARAと粗飼料給与の重要性」
竹村恵（山形庄内家保，筑波大院生命環境）

講演４．
「コーンサイレージ給与と疾病管理」
加藤淳郎（NOSAI岩手
Ⅳ．11：20－12：00

総合討論

岩手県南基幹家畜診療所）
座長：櫛引史郎（農研機構），佐藤繁（岩手大）〔開催概要〕
本シンポジウムは，公開シンポジウムとして岩手大学農学部（総合教育研究棟）を会場に，日本家畜臨床学会との共催として実施した。日本家畜臨床学会（会長：酒井淳一）は，昭和44年に前身を東北家
畜臨床研究会として，東北地方の臨床獣医師を中心に創設された学会である。現在は北海道大動物臨床研究会，九州沖縄産業動物臨床研究会と連携し，その活動を全国に広げている。
シンポジウムテーマは，繁殖障害を中心にその解決法を提示するものとして「畜産研究の成果を獣医臨床フィールドへ」とした。近年，牛の生殖障害による肉牛，酪農生産に大きな影響が出ている。岩手
県は我が国においても有数な畜産業が盛んな地域の一つであり，この臨床上の課題を討議することは，多方面の視点から臨床へ役立つ講演であると考えた。また，岩手大学農学部共同獣医学科および動物科学科の学生の参加を無料とし，次世代の畜産業の担い手を育成，教育するシンポジウムとした。畜産業の担い手不足も問題となっているが，各種畜産研究に関連する機関における優秀な次世代の確保は，我が国の畜産の死活問題である。次世代の育成および畜産現場の問題点を認識できるよう配慮したプログ
ラム構成とした。
参加者は124名で，会員のみならず臨床にたずさわる獣医師，農場関係者の方々，そして多数の学生の参加があった。

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日本食肉研究会への平成 31 年度・令和元年度
事業助成実施報告
日本食肉研究会会長

坂田亮一（麻布大学・明治大学）

１．はじめに
標記の事業の項目として，（公財）伊藤記念財団から今回助成を受けたのは，（１）海外派遣事業の補助（国際食肉科学技術会議派遣），（２）国内における研究会でのセミナー，および（３）第68回国際食肉科学技術会議（2022年，神戸開催）運営の補助である。
ここに，昨年８月に実施された（１），今年３月に行う予定であった（２），および昨年度の（３）の組織委員会の活動まで，各項目の実施内容を順次報告するが，これらの助成を受けた「日本食肉研究会」の概要について以下に記す。
２．日本食肉研究会等の概要
本会は昭和34年（1959年）４月に発足し，食肉に関する分野について広く学界，業界，団体関係者がお互いの研鑽の場として，学術と産業の発展を目指し，活動を行ってきた。
本会では毎年，研究会大会（学術講演会）の開催，ならびに会誌として「食肉の科学」を発行している（平成３年に「肉の科学」を改称）。研究会は通常，日本畜産学会大会の開催に合わせて春に実施され，食肉および食肉加工に関連する分野のエキスパートによる特別講演，ならびに会員による研究発表を行い，活発な意見交換がなされている。「食肉の科学」の主な内容として，総説，解説，海外事情，
最近の文献紹介，研究会の発表要旨などが満載されている。
設立40周年の1999年に横浜で第45回国際食肉科学技術会議（International Congress of Meat Scienceand Technology，通称ICoMST）を開催し，会員相互一体となって運営を行った経緯がある。この国
際会議は毎夏に欧州と他の国々で交互に開催されている。その各国代表者会議での話し合いで，2022年（第68回）にわが国で再び開催する運びとなり，このICoMSTの成功に向けて国内受入組織である本研究会は重要な役割を担っている。
昨年は，研究会創設60周年という記念すべき年となり，３月30日の大会で記念式典が開催された。ヨーロッパから２名の招待講演者を迎え，会場となった麻布大学に多くの参加者が詰めかけ，盛大なセレモニーとなった（写真１）。これらの行事に関しても，日本食肉研究会
ホームページで紹介している（http://jmeatsci.org/）。
その詳細は，昨年発行した本財団助成研究報告書１）に，また同内容で第60巻「食肉の科学」第１号２）にも掲載し© The Ito Foundation

写真１ 第60回日本食肉研究会交流会（麻布大学

にて）

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ている。
今年（2020年）は京都大学農学部で３月28日に大会を行うことになっていたが，新型コロナウイルス感染拡大により，やむなく中止となった。前回を超す演題申し込
みと協賛もあっただけに，真に残念な決断であった。この事態が一刻も早く収束することを願い，大会に代えて今秋に特別セミナー開催を企画した。
なお本研究会の会員数は，本年６月30日現在で，正会

写真２ ICoMST2019メイン会場

員（一 般）160 名（前 年 156 名），正 会 員（学 生）６ 名（前年８名）賛助会員７社（前年６社），特別会員33社（前年31社），名誉会員９名（前年10名）である。
３．今回の助成結果（１）海外派遣事業の補助
国際食肉科学技術会議派遣助成として，第65回会議に本会から会員４名が参加した。このICoMSTは毎年８月中旬に開催され，本会からは，会長，副会長あるいは常任幹事の中から１名を派遣している。その際，代表者会議に出席し，会議報告を研究会機関誌の「食肉の科学」

写真３ 日本からの参加者集合写真（Gala dinner

会場で）に掲載し，内容を会員に周知することが義務づけられている。
昨年は８月４（日）～９日（金）にドイツのポツダムで開催され，本助成により，山之上稔会員（神戸大学農学部），若松純一会員（北海道大学農学部），本山三知代会員（農研機構畜産研究部門）の３名が派遣された。
会場は，ポツダム郊外テンプリナー湖の湖畔にあるコングレスホテルで行われ（写真２），49カ国から560名を超す参加者（北米83名，南米22名，ヨーロッパ238名，アフリカ15名，オーストラリア57名，
アジア141名）があり，24題の基調講演，350題以上の一般発表があった。この会議の詳細は，昨年の「食肉の科学」第２号の【海外事情】でも報告している３）。
前回の開催地メルボルンでもデスクを会場に設置し，2022年日本開催のPRに務めた４）が，今回は日本からの参加者が18名（内学生７名）あり，ICoMST2022 in 神戸の広報活動を大いに行うことができた（写真３）。
会期中は終日，ミートサイエンスに関する多くのセッションで，テーマごとにセッションが設けられ，基調講演と一般発表（口頭およびポスター）が行われた。
以下に各セッションの概要を記す（一部省略）。
Session 1：消費者行動と倫理：食肉が消費者のwell-beingにどのように貢献するか，や食品選択や摂食拒否をもたらすプロセス等の内容。

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Session 2：品質と安全性：品質を評価するための基本的概念や食品衛生確保について。
Session 3：食肉の加工品と代替品：食肉加工品および食肉類似食品（植物由来タンパク質）の物性および新規加工技術について。
Session 4：家畜生産：食肉および家畜の生産技術（ゲノム編集，持続可能性等）について。
Session 5：最新技術：デジタル化，と畜技術，ロボッ
ト等について。
Session 6：筋生理学と筋代謝：培養肉，メタボロミク
ス等を含む筋肉生理学について。
以上の学術セッションの合間などに，協賛企業等によるIndustrial Workshopが開催された。ドイツの農家・企業の生の声も聴くことができ，同国の畜産と食肉産業への理解が深まり印象的であった。
2020年のICoMSTは米国が担当し，フロリダ州オーラ

図１ 会場で配布された要旨集

ンドで８月３日（月）～６日（木）に開催された。米国
内でも新型コロナウイルス感染の拡大にいまだ歯止めがかからないが，中止にならずバーチャル方式で実施された。この会議に伊藤記念財団の派遣事業助成により，ICoMST2022組織委員会から多数のメンバーが参加し積極的に海外の研究者との学術交流を行い，日本での会議参加のアピールを大いに実施した。
また，中国南京で昨年の10月11～13日にアジア-太平洋食肉科学技術会議Asia-Pacific Congress ofMeat Science and Technologyが行われ（図１），本研究会から有原圭三副会長（北里大学）が講演招聘を受け日本の食肉研究を紹介した。ICoMSTとの関りも深い会議と判断し，日本食肉研究会代表として坂田が派遣された。その渡航に際し，2022年の日本開催のための情報収集として，本研究助成から補填した。南京での会議内容は，本年の「食肉の科学」第１号に掲載した５）。
（２）国内における研究会でのセミナーの補助「国際的な食肉研究のトップランナーを海外から招聘し，討論重視型の食肉ワークショップを開催する」という目的で，平成28年度から外国人研究者を日本食肉研究会大会に招聘し，伊藤記念財団から助成を受けこの事業を行っている。第１回目は，2017年３月30日に神戸大学国際文化学部で開催された第58回日本食肉研究会大会の中で特別講演としてドイツからProf. Schwägele（Max-Rubner Institute,
Kulmbach副所長）を招き，食肉中の微量残留物質の基準と分析法の話題を中心にセミナーを実施した。
翌2018年は東京大学農学部本郷キャンパスで第59回日本食肉研究会大会にて，トルコ共和国からDr.
Abdulatef Ahhmed（Yıldız Technical University准教授）を招き，「Accreditation of Halal meat products
and the diversity of their protein properties」の演題で，ハラルと畜の科学的検証，ならびに食肉とし© The Ito Foundation

444ての機能性について特別講演が行われた。次に韓国のDr. Seon-Tea Joo （Gyeongsang National University 教授） に よ り ，「Health implication of consuming highly
marbled Hanwoo beef」の演題で，韓牛の肉質について講演があり，その脂肪酸組成から機能性に富む肉である
ことが示され，会場からも和牛との比較についてなど，活発な討論が行われた。昨年は，デンマークからDr.
Lars Hinrichsen （Danish Technological Institute 副 所長），ならびにスペインからDr. Mónica Flores（Institutode Agroquímica y Tecnología de Alimentos, Valencia）
を本助成事業の一環として招聘した。両者の講演内容の詳細は，昨年の「食肉の科学」第１号に掲載されている６）。
本年は，ロシアのDr. Irina Chernukha（VM Gorbatov
Federal Research Center）， ア メ リ カ の Dr. Andrew
Milkowski（University of Wisconsin-Madison）に 講 演を依頼し，前者は『The state of art in Russian functional

図２ 第68回国際食肉科学技術会議

神戸開催の趣意書

food science and industry』，後者は『Recent trends inmeat science in the United States』で発表を予定していたが，残念ながら実施できなかった。なお，各々の要旨は「食肉の科学」本年度１号に掲載した７）。
（３）第68回国際食肉科学技術会議運営の助成
2022年，神戸開催を目指し，組織委員会を２年前に立ち上げ，鋭意準備を行っている。昨年８月は，
上記ポツダムでの65th ICoMSTに組織委員会メンバーを派遣し，情宣活動を実施した。また，３月，６月および９月に委員会を行い，委員の意見を統合し，農水省，厚生労働省ならびに各種食肉関連団体，
学会などから後援承諾を得て，趣意書を作成した（図２）。現在，関連企業や団体に協賛金の依頼を行っている。
一方で，コロナウイルス感染拡大の中で，２年後の大会開催のための募金活動の進め方として，業界の景気状況を考慮し検討中である。
４．おわりに
伊藤記念財団からの学会・研究会など学術集団への活動助成は今年で４回目となった。これまで私ども招く側は順調に大会を開催し，外国人研究者招聘を実施することができた。
しかし，今年は予期せぬ新型コロナウイルスの拡大により，大会中止に至った。国内外いまだ終息の兆しはなく，混乱の中にある。この地球規模のパンデミックの前に，助成項目（２）以外の事業を行えたことは，今後の食肉研究会を運営する上で，次に繋がるものと考えられる。国際会議参加，食肉研究© The Ito Foundation

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会への招聘，2022年神戸での国際会議開催を見据えて諸外国のキーパーソンとの交流など，この海外派
遣とセミナーの事業助成効果は確実に上がってきたと判断する。実際，研究会でも年々会員の英語伝達
力は目に見えて向上しており，この助成による成果であると感謝する。
２年後の神戸開催が予定通りできるよう，このような混乱の中でもできる限りの準備は食肉研究会として，組織委員会を稼働させ進める方針である。また我が国での国際会議開催の機会に，研究会組織の強化を図るため，学会化を推進する所存である。
ここに，助成をいただいた（公財）伊藤記念財団の皆様に心から謝意を表し，引き続き本助成の増強
を日本食肉研究会として切に希望する次第である。
参考資料
１）
 坂田亮一：日本食肉研究会への平成30年度事業助成実施報告，平成30年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.37, 521～524, 2019．
２） 根岸晴夫，坂田亮一：研究会報告「日本食肉研究会への平成30年度伊藤記念財団事業助成実施報告」，食肉の科学，
Vol.60, No.1, 150～152, 2019.
３），
 坂田亮一，山之上稔，若松純一，本山三知代，参加者13名：海外事情「第65回国際食肉科学技術会議に出席して」
食肉の科学，Vol.60，No.2，203～217，2019．
 松石昌典，有原圭三，若松純一，竹田志郎：海外事情「第64回国際食肉科学技術会議に出席して」，食肉の科学，
４）
Vol.59，No.2，149～157，2018．
５） 有原圭三，坂田亮一：海外事情「2019アジア・太平洋食肉科学技術会議（APCoMST）に参加して」，食肉の科学，
Vol.61, No.1, 55～60, 2020.
 Monica Flores, Carmela Belloch, Lars Hinrichsen, Haiyan Wu：特 別 講 演 ，食 肉 の 科 学 ，Vol.60 ，No.1 ，130 ～６）
138，2019．
７）
 Irina Chernukha, Andrew Milkowski：Short Review, 食肉の科学, Vol.61, No.1, 3～9, 2020.

© The Ito Foundation食肉に関する助成研究調査成果報告書
Final Reports for Research Grants for Meat and Meat Products

平成31年度（令和元年度）（Vol. 38）
2020年11月

発行

編集・発行 ― 公益財団法人伊藤記念財団
THE ITO FOUNDATION
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