タンパク質同定システム

MASCOT Server
チュートリアルプロテオミクスとともに・・・

マトリックスサイエンス株式会社
電子メール：support-jp@matrixscience.com
電話：03-5807-7895

ファクシミリ：03-5807-7896
住所：〒101-0021 東京都千代田区外神田 6-10-12 KN ビル 3 階

MASCOT Server : チュートリアル 1

タンパク質同定システム MASCOT Server
もくじ
1. 起動方法
1-1. MASCOT Server へのアクセス・・・・・・・・・・ 2

2. PMF (Peptide Mass Fingerprint) 検索
2-1. 検索パラメータ設定画面へのアクセス
2-2. 検索パラメータの種類
2-3. 検索パラメータの設定
2-4. MASCOT検索の実行
2-5. 検索結果レポートの見方
2-6. 検索条件の変更と再検索
2-7. 検索ログ
2-8. データベース管理画面
2-9. 検索パラメータのデフォルト値の設定
2-10. ヘルプへのアクセス
2-11. MASCOT ファミリーに関する最新情報

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

3
4
5
5
7
11
11
12
13
14
15

3. MIS (MS/MS Ion Search) 検索
3-1. 検索パラメータ設定画面へのアクセス・・・・・・・・・・ 16
3-2. 検索パラメータの種類
・・・・・・・・・・ 17
3-3. 検索パラメータの設定
・・・・・・・・・・ 18
3-4. MASCOT 検索の実行・・・・・・・・・・ 18
3-5. 検索結果レポートの見方・・・・・・・・・・ 19
3-6. 検索条件の変更と再検索
・・・・・・・・・・ 21
3-7. Error Tolerant Search・・・・・・・・・・ 21(非特異的なペプチドの切断＋1 塩基置換＋全ての翻訳後修飾を考慮した再検索)

4. LCQ_DTA Shell (Xcalibur RAWファイルに対する検索)4-1. 環境設定
4-2. DTA ファイルへの変換と MASCOT 検索の実行・・・・・・・・・・ 24
・・・・・・・・・・ 24

5. 付録
5-1. 蛋白質同定のコツその１
5-2. 蛋白質同定のコツその２・・・・・・・・・・ 27
・・・・・・・・・・ 29

MASCOT Server : チュートリアル 2

蛋白質同定システム MASCOT Server
1. 起動方法
MASCOT Server は Webサーバ上のアプリケーションです。従いまして、MASCOT Server がインストールされているコンピュータとネットワークで接続されているコンピュータから、Webブラウザを使ってアクセスすることができます。
1-1. MASCOT Server へのアクセス
Webブラウザを起動し、アドレス入力欄にMASCOT Server 名を含む次のURLを入力してください。
http://MASCOT_Server名/mascot/
MASCOT Server に接続され、次のトップページが表示されます。MASCOT Server はひとつの独立したWebサイトになっており、トップページから MASCOT Server が持つ様々なリソースにアクセスすることができます。

MASCOT Server に関連したヘルプ情報にリンクしています。
現在ログインしているユーザを示します。
（セキュリティ機能が有効な時のみ）
MASCOT Server サイト内をキーワード検索することができます。
次の MASCOT 検索モード選択画面にリンクしています。
1. Peptide Mass Fingerprint
2. Sequence Query
3. MS/MS Ion Search
MASCOT Server を利用する上で必要なブラウザの機能（Java Script、Table、ファイルの読込、Cookie）をチェックすることができます。
セキュリティ機能が有効な時、ログイン、ログアウト、パスワードの変更、登録内容の変更、現在のセッショ
ン情報の確認、ユーザの権限の設定などを行う画面にリンクしています。

MASCOT Server が利用する配列データベースの管理画
面にリンクしています。
MASCOT 検索のログ画面にリンクしています。
MASCOT Server が利用する配列データベースを追加するための設定ユーザインターフェースにリンクしています。
MASCOT Daemon のインストールおよびアップグレードを行うためページにへリンクしています。

Acrobat Reader が イ ン ス ト ー ル さ れ て い る 場 合 は「Setup & Installation」マニュアルが表示されます。
Acrobat Reader がインストールされている場合はリリースノートが表示されます。

MASCOT Server : チュートリアル 3

蛋白質同定システム MASCOT Server
2. PMF (Peptide Mass Fingerprint) 検索
MASCOT Server version 2.1のCDROMに含まれているサンプル質量データを使用して、MASCOT検索の方法およびMASCOT検索結果の見方について紹介します。
1-1. 検索パラメータ設定画面へのアクセス
Webブラウザを起動し、アドレス入力欄にMASCOT Server名を含む次のURLを入力してください。
http://MASCOT_Server名/mascot/
MASCOT Server に接続されトップページが表示されます。トップページ画面の Welcome の次の行にある Mascotのリンク、またはページ最上段の HOME | MASCOT | HELP の中の MASCOT のリンクをクリックしてください。
MASCOT Server の検索モード選択画面（Mascot Search 画面）が表示されます。

各検索モード（Peptide Mass Fingerprint、Sequence
Query、MS/MS Ion Search）にリンクしています。

LCQ_DTA プログラムのユーザインターフェースにリンクしています。

検索パラメータのデフォルト値を設定するためのユー
ザインターフェースにリンクしています。

MASCOT Server は次の３つの検索モードをサポートしています。
（１） Peptide Mass Fingerprint （MSデータを使って蛋白質を同定することができます）（２） Sequence Query （配列タグ情報を利用して蛋白質を同定することができます）（３） MS/MS Ion Search （MS/MSデータを使って蛋白質を同定することができます）
一番上の行にある [ Peptide Mass Fingerprint ] のリンクをクリックしてください。Peptide Mass Fingerprint 検索のパ
ラメータ設定画面が表示されます。

MASCOT Server : チュートリアル 4

検索そのものに関係するパラメータは、
1. Database（検索するデータベース）
2. Taxonomy（生物分類)
3. Enzyme（消化酵素）
4. Fixed / Variable modifications（翻訳後修飾）
5. Allow up to（missed cleavages）
6. Peptide tol +/-（ペプチドの質量誤差範囲）
7. Mass values（ペプチドの電荷数）
8. Monoisotopic/Averageなどです。詳しくは次の検索パラメータの種類を参照してください。
なお、各検索パラメータ項目はヘルプにリンクしており、その項目の意味や使い方を参照することができます。

検索パラメータの各項目はヘルプ書類にリンクされていますので、その使い方や意味をオンラインで参照することができます。

2-2. 検索パラメータの種類
Peptide Mass Fingerprint 検索では、次の検索パラメータを入力または選択することができます。
質量データは [ Query ] ウインドウに数値を入力しますが、質量データをファイルでお持ちの場合は [ Data file ] の[ 参照 ] から指定して読み込むことができます。翻訳後修飾パラメータは最大9個まで同時選択することができます。複数のパラメータを選択する場合および選択したパラメータを解除する場合はキーボードの [ Ctrl ] ボタンを押しながらマウスでクリックしてください。
なお、各検索パラメータ項目は MASCOT Server のWeb内にあるヘルプ書類にリンクしており、その項目に関する意
味や使い方を参照することができます。
検索パラメータYour nameEmail
Search title

Database
Taxonomy
EnzymeAllowed up to [1-9] missedcleavages
Fixed modifications
Variable modifications

Protein mass

Peptide tol. +/-値と内容
名前（ユーザ名）を入力してください。
Emailアドレスを入力してください。
検索タイトルを入力してください。後日、この検索結果にアクセスしやすくするためにできるだけ詳しい内容を入力することをお勧めします。
複数のデータベースがセットアップされている場合は、検索したいデータベースを選択します。
検索対象とする生物種を選択します。
蛋白質を消化するために使用した消化酵素を選択します。必要であればユーザ定義の消化酵素も定義することができます。
未消化のペプチドの状態を指定します。完全に消化されていると考えられる場合は"0"（ゼロ）を選択してください。
翻訳後修飾を選択します。指定したすべての（Fixされた）アミノ酸に対して翻訳後修飾を考慮し検索します。
翻訳後修飾を選択します。指定したアミノ酸に対して
翻訳後修飾を考慮する場合としない場合の２通りの（Variableな）検索を行います。
検索範囲ウインドウを指定します。たとえば、"30"を指定した場合は30KDaの範囲にある連続したアミノ酸配列を対象として検索を行います。
ペプチド質量の許容誤差をDa、mmu、%、ppmの単位で指定します。1.0 Daを指定した場合は（ペプチド質量-1.0）Daから（ペプチド質量+1.0）Daの範囲でヒットするペプチドを検索します。

設定例
usami
support-jp@matrixscience.com
sample1, spot67, Trypsin, 50fm,
2457-9001-125-afd
MSDB
All entries
Trypsin2

Carboxymethyl (C)Acetyl (K)Oxidation (M)30

1DaMASCOT Server : チュートリアル 5

Mass values
Monoisotopic/Average
Data file
Query

Overview
Report topペプチドの電荷状態（MH+, Mr, M-H-）を指定します。
質量データの種類（MonoisotopicまたはAverage）を指定します。
読み込みたい質量データファイルを[ファイルの選択]
ダイアログを通じて指定します。
質量データを入力します。
PMF検索で使用する質量データは、ノイズがカットされたモノアイソトピック質量です。質量データからこれらの値を抽出するには、各装置の解析ソフトウエアや、
Mascot Distillerなどを利用してください。

チェックボックスをチェックすることにより、検索結果ページに"Overview Table"を表示します。
検索によりヒットした蛋白質の表示数を選択します。

MH+
Monoisotopic
データファイルを指定
1137.81209.41704.01862.01998.02037.02485.22923.63031.8
ボックスをチェック20

2-3. 検索パラメータの設定
つぎの検索パラメータを設定してください。
検索パラメータYour name
Search title
Database
Taxonomy
EnzymeAllowed up to [1-9] missed cleavages
Peptide tol. +/Mass values
Monoisotopic/Average
Query

Overview
Report top

設定値
任意
PMF test search # 1
MSDB
All entries
Trypsin1
0.5 DaMH+
Monoisotopic
1137.81209.41704.01862.01998.02037.02485.22923.63031.8
ボックスをチェック
10

摘要
ユーザ名をアルファベットで入力

質量データを数値入力する代わりに、[ Data file ] の[ 参照 ] からMASCOT Server 2.1のCDROMの中の
mskkフォルダにある “pmfSample.asc”ファイル（中身は、1137.8、12.19.4、1704.0、1862.1、1998.0、2.137.0、2485.2、2923.6、3031.8の質量データです）を読み込むことができます。

2-4. MASCOT 検索の実行
画面左下にある[ Start Search ... ]ボタンを押してください。MASCOT検索が始まり、検索の進捗状況が表示され、検索が終了すると検索結果レポート画面が表示されます。

MASCOT Server : チュートリアル 6

検索パラメータの設定と質量データの入力または質量データを含むファイルの指定が完了したら、[ Start Search … ] ボタンを押してください。MASCOT 検索が始まり、検索の進捗状況が表示され、検索が終了すると検索結果レポートが表示されます。

検索時間（検索に要する時間）は、検索に使用したデータベースのサイズ（データベースを構成するタンパ
ク質エントリ数）、missed cleavages の設定値、Fixed / Variable modifications の設定値、Peptide tol +/の設定値などにより異なります。これらの設定値が大きくなるほど検索空間が広がるために、一般的には、検索時間は長くなります。

MASCOT Server : チュートリアル 7

2-5. 検索結果レポートの見方
MASCOT検索が終了すると、次の Mascot Search Results 画面が表示されます。Mascot Search Results 画面
は（１） Concise Protein Summary Report、（２） Protein Summary Report、 （３）Export Search Resultsの３つの画面から構成されています。 最初に表示されるのは（１）の Concise Protein Summary Report 画面です。
(1) Concise Protein Summary Report 画面

検索したデータベース（この場合は MSDB）のサイズ（蛋白質のエントリ数＝2,011,572 件）です。
トップスコアを持つ蛋白質情報が表示されます。
統計的に有意な閾値スコア（有意水準を 5%として、この場合は76）とスコアの計算式（P=1/2011572*0.05）を示しています。
閾値 76 のライン

有意なヒットが１件存在することを示しています。

Concise Protein Summary と Protein Summary 画面を切り替えることができます。
閾値を決める有意水準を変更することができます。

(2) Protein Summary Report 画面ヒットした蛋白質がスコア順に表示されます。なお、有意なス
コアは太い赤文字で表示されます。Accession 番号は詳細情報を表示する Protein View 画面にリンクしています。

MASCOT Server : チュートリアル 8（１）の Concise Protein Summary Report 画面では、ヒットした蛋白質をスコア順に表示しますが、トッ
プスコアを持つ蛋白質に帰属する質量データのうち、すべてまたは一部分の質量データを持つ蛋白質をひとつのグループにまとめて表示します。たとえば、第１グループの有意なスコア 93 を持つ Q6W897_HUMAN は（1136.79、1208.39、1702.99、1860.99、2035.99、2484.19、2922.59）の質量データが帰属しますが、スコア
38 を持つ Q72N89_LEPIC は Q6W897_HUMAN に帰属する質量データの一部分に当たる（1136.79、1860.99、2484.19）の質量データが帰属しています。
1.

Q6W897_HUMAN

Mass: 57382

Score: 93

Expect: 0.001

Queries matched: 7

Mass: 57411

Score: 93

Expect: 0.001

Queries matched: 7

Mass: 23825

Score: 38

Expect: 3e+002

Queries matched: 3

Mass: 24272

Score: 38

Expect: 3e+002

Queries matched: 3

HSD-34.- Homo sapiens (Human).
Q86WT6_HUMAN
RNF36 protein.- Homo sapiens (Human).
・
・
(省略)
・
・
Q83B90_COXBU
IcmJ protein.- Coxiella burnetii.
Q72N89_LEPIC

Flagellin protein.- Leptospira interrogans (serogroup Icterohaemorrhagiae / serovar Copenhageni).
-------------------------------------------------------------------------------2.

AAL82101

Mass: 34383

Score: 51

Expect: 17

Queries matched: 4

Score: 51

Expect: 18

Queries matched: 4

Score: 38

Expect: 3.3e+002

AE010291 NID: - Pyrococcus furiosus DSM 3638
AAL821011

Mass: 34583

AE009950 NID: - Pyrococcus furiosus DSM 3638
Q74A00_GEOSL

Mass: 29253

Queries matched: 3

ISGsu5, transposase.- Geobacter sulfurreducens.
-------------------------------------------------------------------------------3.

Q6RUD2_SIVCZ

Mass: 16695

Score: 48

Expect: 29

Queries matched: 3

Envelope glycoprotein (Fragment).- Chimpanzee immunodeficiency virus (SIV(cpz)) (CIV).
-------------------------------------------------------------------------------・
・
(省略)
・
・
-------------------------------------------------------------------------------16.

Q6DBN8_ARATH

Mass: 40326

Score: 38

Expect: 3.3e+002

At5g23610.- Arabidopsis thaliana (Mouse-ear cress).
--------------------------------------------------------------------------------

ページの最後にはこの検索で使用した検索パラメータが表示されます。
Search Parameters
Type of search: Peptide Mass Fingerprint

Enzyme: Trypsin

Mass values: Monoisotopic

Protein Mass

: Unrestricted

Peptide Mass Tolerance : ± 0.5 Da
Peptide Charge State: 1+

Max Missed Cleavages: 1

Queries matched: 3

MASCOT Server : チュートリアル 9

Number of queries: 9（２）の Protein Summary Report 画面では、ヒットした蛋白質をスコア順に表示します。また、ヒットした各々の蛋白質に関して、帰属している質量データ（Observed / Mr(expt)）とその理論値（Mr(calc)）および差分（Delta）、質量データに対応するペプチドのアミノ酸配列（Peptide）と蛋白質内の位置（Start / End）、
未消化状態数（Miss）などの情報を表示します。Concise Prptein Summary Report の時のように、グループにまとめません。
Accession

Mass

1.

Q6W897_HUMAN

57382

93

Score

HSD-34.- Homo sapiens (Human).

2.

Q86WT6_HUMAN

57411

93

RNF36 protein.- Homo sapiens (Human).

3.

Q8WY16_HUMAN

32047

83

TRIMLESS beta.- Homo sapiens (Human).

4.

Q8WY17_HUMAN

34011

83

TRIMLESS alpha.- Homo sapiens (Human).

5.

Q8IYY3_HUMAN

39229

79

Ring finger protein 36, isoform b.- Homo sapiens (Human).

6.

Q8QHA5_XENLA

119656 54

Helicase.- Xenopus laevis (African clawed frog).

7.

AAL82101

34383

AE010291 NID: - Pyrococcus furiosus DSM 3638

51

Description

8.

AAL821011

34583

51

AE009950 NID: - Pyrococcus furiosus DSM 3638

9.

Q6RUD2_SIVCZ

16695

48

Envelope glycoprotein (Fragment).- Chimpanzee immunodeficiency virus (SIV(

10. Q8HRQ8_9ROSI

38256

46

NADH dehydrogenase subunit F (Fragment).- Morisonia americana.

Results List
1.

Q6W897_HUMAN

Mass: 57382

Score: 93

Expect: 0.001

Queries matched: 7

HSD-34.- Homo sapiens (Human).
Observed

Mr(expt)

Mr(calc)

Delta

Start

End

Miss

Peptide1137.801136.791136.58

0.21

361

-

371

0

R.FDSSVAVLGSR.G

1209.40

1208.391208.59

-0.19

378

-

386

0

K.WYWEVEVAK.K

1704.00

1702.99

1702.85

0.14

403

-

417

0

K.GSCPLTPEQGFWLLR.L

1862.00

1860.99

1860.98

0.01

426

-

442

0

K.ALDLPSFSLTLTNNLDK.V

2037.00

2035.992035.99

0.00

443

-

460

0

K.VGIYLDYEGGQLSFYNAK.T

2485.202484.192484.05

0.14

50

-

70

0

R.DPLMLSCGHNFCEACIQDFWR.L

2923.60

2922.592922.44

0.15

261

-

285

1

K.TEQQNSFDFLKDITTLLHSLEQGMK.V

No match to: 1998.00, 3031.80

タンパク質のアクセッション番号（そのタンパク質のユニークなID）のリンクをクリックすると Protein
View 画面が表示されます。Protein View 画面では、そのタンパク質の詳細情報（全体アミノ酸配列と質量データがカバーしているアミノ酸配列部分、等電点理論値、アノテーション情報、NCBIサイトへのリンクなど）を表示します。
Protein View
Match to: Q6W897_HUMAN Score: 93 Expect: 0.001
HSD-34.- Homo sapiens (Human).
Found in search of C:\Inetpub\mascot\mskk\pmfSample.asc
Nominal mass (Mr): 57382; Calculated pI value: 6.04
NCBI BLAST search of Q6W897_HUMAN against nr
Unformatted sequence string for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Links to retrieve other entries containing this sequence from NCBI Entrez:
AAQ75551 from Homo sapiens
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P

MASCOT Server : チュートリアル 10

Number of mass values searched: 9Number of mass values matched: 7
Sequence Coverage: 23%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MEVSTNPSSN IDPGNYVEMN DSITHLPSKV VIQDITMELH CPLCNDWFRD
51 PLMLSCGHNF CEACIQDFWR LQAKETFCPE CKMLCQYNNC TFNPVLDKLV
101 EKIKKLPLLK GHPQCPEHGE NLKLFSKPDG KLICFQCKDA RLSVGQSKEF
151 LQISDAVHFF MEELAIQQGQ LETTLKELQT LRNMQKEAIA AHKENKLHLQ
200 QHVSMEFLKL HQFLHSKEKD ILTELREEGK ALNEEMELNL SQLQEQCLLA251 KDMLVSIQAK TEQQNSFDFL KDITTLLHSL EQGMKVLATR ELISRKLNLG
301 QYKGPIQYMV WREMQDTLCP GLSPLTLDPK TAHPNLVLSK SQTSVWHGDI
351 KKIMPDDPER FDSSVAVLGS RGFTSGKWYW EVEVAKKTKW TVGVVRESII
401 RKGSCPLTPE QGFWLLRLRN QTDLKALDLP SFSLTLTNNL DKVGIYLDYE
451 GGQLSFYNAK TMTHIYTFSN TFMEKLYPYF CPCLNDGGEN KEPLHILHPQ
501
Start - End

Observed

50 - 702485.20

Mr(expt) Mr(calc)
2484.192484.05

Delta
0.14

Miss Sequence
0

R.DPLMLSCGHNFCEACIQDFWR.L

261 - 285

2923.60

2922.592922.440.15

1K.TEQQNSFDFLKDITTLLHSLEQGMK.V

361 - 371

1137.801136.791136.58

0.21

0R.FDSSVAVLGSR.G

378 - 386

1209.40

1208.391208.59-0.19

0K.WYWEVEVAK.K

403 - 417

1704.00

1702.99

1702.85

0.14

0K.GSCPLTPEQGFWLLR.L

426 - 442

1862.00

1860.99

1860.98

0.01

0K.ALDLPSFSLTLTNNLDK.V

443 - 460

2037.00

2035.992035.99

0.00

0K.VGIYLDYEGGQLSFYNAK.T

また、質量データとその理論との質量誤差グラフは、質量分析計固有のキャリブレーションカーブ（質量校正曲線）に対応しますので、この質量誤差グラフと実際のキャリブレーションカーブが大きく異なる場合は、質量データや検索条件を吟味する必要があります。

（３）の Export Search Results を選択すると検索結果をXMLまたはCSV形式のファイルに出力するための設定
画面が表示されますので、出力項目を指定して[ Export search results ]ボタンを押してください。

MASCOT Server : チュートリアル 11

2-6. 検索条件の変更と再検索（１）の Concise Protein Summary Report 画面の [ Re-Search All ] または [ Search Unmatched ] ボタン、
あるいは、（２）の Protein Summary Report 画面の [ Search Selected ] ボタンを押すことにより、PMF検索
パラメータ設定画面に戻りますので、パラメータ設定を変更して再検索することができます。

2-7. 検索ログ
MASCOT Serverのトップページの [ Search Log ] リンクをクリックするか、URLとして
http://MASCOT_Server名/mascot/x-cgi/ms-review.exeを指定すると、MASCOT検索ログのリスト画面が表示されます。
画面中の [ Job# ] はMASCOT Server が MASCOT検索毎に付与する固有IDで、Mascot Search Results の Concise
Protein Summary Report 画面にリンクしています。
ラジオボタン（○）は、昇順に並べ替える際に選択し、[ Sort / filter ] ボタンを押してください。
チェックボックス（□）は、チェックされたタイトルの内容を表示させる際に選択してください。
チェックボックスの下にある枠は文字列検索の入力ウインドウになっています。検索したい文字列を入力し、[ Sort / filter ] ボタンを押してください。入力文字列にヒットしたMASCOT検索結果がリスト表示されます。

8. データベース管理画面
MASCOT Serverのトップページの [Database Status] リンクをクリックするか、URLとして、

MASCOT Server : チュートリアル 12

http://MASCOT_Server名/mascot/x-cgi/ms-status.exeを指定すると、MASCOT search status page が表示されます。
この画面では、MASCOT Server に登録したデータベースの状態を表示する他、検索ログへのリンク、MASCOT
検索ジョブ等が実行された際に記録されるエラーログへのリンクがあります。また、データベースの内容（残基数、エントリ数、最も大きなエントリの残基数、残基の出現数、各生物種に含まれるエントリ数など）や、（入力間違いによるスペルミスや生物種辞書に登録されていないことなどが原因の）不明な生物種、MASCOT
Serverのバージョン、ライセンス情報、現在進行中の検索数、エラーログへのリンクを含め、様々な情報も確認することができます。

2-9. 検索パラメータのデフォルト値の設定
Mascot Search 画面の [ Search Form Defaults ] リンクをクリックするか、URLとして、

MASCOT Server : チュートリアル 13

http://MASCOT_Server名/mascot/search_form_select.htmlを指定すると Set Mascot search form defaults 画面が表示されます。
この画面では、検索パラメータの初期値（デフォルト値）を指定することができます。ここで指定された値
は、検索パラメータ設定画面中でパラメータ初期値として表示されます。
初期値として設定したい検索パラメータを指定し、[ Save defaults as cookie … ]ボタンを押してください。
「Your search form defaults have been saved as cookie」のメッセージが表示され、パラメータ初期値が設定されます。
なお、この設定はCookieを利用しているため、Webブラウザ毎の設定値になります（異なるログオンユーザや異なるPC上で起動したWebブラウザでは反映されません）。

2-10. ヘルプへのアクセス
各画面の上方にある HOME | MASCOT | HELP の中の HELP リンクをクリックするか、 URLとして、
http://MASCOT_Server名/mascot/help_index.html

MASCOT Server : チュートリアル 14を指定すると つぎのような Help Topic Index 画面が表示されます。各々のタイトルはリンクされていますので、関係するリンクをクリックしてください。
MASCOT Server – General ： ASMSなどで発表したプレゼンテーション資料などを参照することができます。
Mascot search overview
A History of Mascot and Mowse
ASMS 2001 User Meeting presentations
ASMS 2002 User Meeting presentations
ASMS 2003 User Meeting presentations
ASMS 2004 User Meeting presentations
Mascot FAQ's
Using Mascot ： MASCOTの使い方に関してまとめてあります。
Search parameter reference
Error tolerant search
Data file format
Scoring algorithm
Results format
Result Interpretation
Sharing result reports
Exporting result reports
Mascot System Administration ： DBのセットアップ方法をまとめてあります。
Sequence database setup
Instrument Specific Tips ： 質量分析計のデータ処理システムとMASCOTの連携方法をまとめてあります。
Applied Biosystems | MDS Sciex Analyst
Micromass Masslynx
Thermo Finnigan Xcalibur
Protein Identification ： 蛋白質同定の原理などをまとめてあります。
Peptide Mass Fingerprint
Sequence Query
MS/MS Ion Search
Bibliography
Protein chemistry ： 蛋白質同定に関連する蛋白質科学に関してまとめてあります。
Post translational modifications
Enzymes
Autolysis
Sequence databases
Nucleic acid translation
Amino acid reference
Contaminants
BLAST & FastA
Bibliography

MASCOT Server : チュートリアル 15

Mass spectrometry ： MASCOTの使い方に関してまとめてあります。
MS/MS fragmentation
Accuracy & resolution
Quadrupole Ion Trap MS
Bibliography
Miscellaneous ： その他の関連事項についてまとめてあります。
Mascot brochure (PDF 1.8 Mb)
Privacy FAQ
Browser Check
Useful links

2-11. MASCOT ファミリーに関する最新情報
弊社のWebサイトにアクセスしてください。MASCOT Serverのトップページ左上にある弊社のロゴをクリックするか、
アドレス欄に次のURLを入力してください。
http://www.matrixscience.com/[ WHAT’S NEW ]バージョンアップ情報やプレスリリース等に関する最新情報を掲載しています。
[ MASCOT ]弊社が公開しているMASCOT Serverです。時差の関係で日本では昼間の時間が比較的空いているようです。
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[ SUPPORT ]製品別の最新技術情報を入手することができます。また、製品試用版をダウンロードすることができます。

MASCOT Server : チュートリアル 16

蛋白質同定システム MASCOT Server
3. MIS (MS/MS Ion Search) 検索
MASCOT Server version 2.1のCDROMに含まれているサンプル質量データを使用して、MS/MS質量データに対するMASCOT検索の方法およびMASCOT検索結果の見方について紹介します。

3-1. 検索パラメータ設定画面へのアクセス
Webブラウザを起動し、アドレス入力欄に MASCOT Server 名を含む次のURLを入力してください。
http://MASCOT_Server名/mascot/
MASCOT Serverのトップページに接続されます。表示されたトップページ画面の Welcome の次の行にある Mascotのリンク、またはページ最上段の HOME | MASCOT |HELP の中の MASCOT のリンクをクリックしてください。
MASCOT Serverの検索モード選択画面（Mascot Search 画面）が表示されます。

各検索モード（Peptide Mass Fingerprint、Sequence
Query、MS/MS Ion Search）にリンクしています。

LCQ_DTA プログラムのユーザインターフェースにリンクしています。

検索パラメータのデフォルト値を設定するためのユー
ザインターフェースにリンクしています。

MASCOT Serverは次の３つの検索モードをサポートしています。
（１） Peptide Mass Fingerprint （MS質量データを使って蛋白質を同定することができます）（２） Sequence Query （配列タグ情報を利用して蛋白質を同定することができます）（３） MS/MS Ion Search （MS/MS質量データを使って蛋白質を同定することができます）
MS/MS Ion Search: のリンクをクリックしてください。MS/MS Ion Search検索のパラメータ設定画面が表示されます。

MASCOT Server : チュートリアル 17

検索そのものに関係するパラメータは、
1. Database（検索するデータベース）
2. Taxonomy（生物分類)
3. Enzyme（消化酵素）
4. Fixed / Variable modifications（翻訳後修飾）
5. Allow up to（missed cleavages）
6. Peptide tol +/-（ペプチドの質量誤差範囲）
7. Mass values（ペプチドの電荷数）
8. Monoisotopic/Averageなどです。詳しくは次の検索パラメータの種類を参照してください。
なお、各検索パラメータ項目はヘルプにリンクしており、その項目の意味や使い方を参照することができます。

検索パラメータの各項目はヘルプ書類にリンクされていますので、その使い方や意味をオンラインで参照することができます。

3-2. 検索パラメータの種類
MS/MS Ion Search検索では、次の検索パラメータを入力または選択することができます。
質量データは Data file 項の [ 参照 ] ボタンから指定して読み込みます。翻訳後修飾パラメータは最大9個まで同時選択することができます。複数のパラメータを選択する場合および選択したパラメータを解除する場合はキーボードの[ Ctrl ] ボタンを押しながらマウスでクリックしてください。
なお、各検索パラメータ項目はMASCOT Server のWeb内にあるヘルプ書類にリンクしており、その項目に関する意
味や使い方を参照することができます。
検索パラメータYour nameEmail
Search title

Database
Taxonomy
EnzymeAllowed up to [1-9] missedcleavages
Fixed modifications

Variable modifications

Protein mass

ICAT
Peptide tol. +/-値と内容
名前（ユーザ名）を入力してください。
Emailアドレスを入力してください。
検索タイトルを入力してください。後日、この検索結果にアクセスしやすくするためにできるだけ詳しい内容を入力することをお勧めします。
複数のデータベースがセットアップされている場合は、検索したいデータベースを選択します。
検索対象とする生物種を選択します。
蛋白質を消化するために使用した消化酵素を選択します。必要であればユーザ定義の消化酵素も定義することができます。
未消化のペプチドの状態を指定します。完全に消化されていると考えられる場合は"0"（ゼロ）を選択してください。
翻訳後修飾を選択します。指定したすべての（Fixされた）アミノ酸に対して翻訳後修飾を考慮して検索を行います。
翻訳後修飾を選択します。指定したアミノ酸に対して
翻訳後修飾を考慮する場合としない場合の２通りの（Variableな）検索を行います。
検索範囲ウインドウを指定します。例えば"30"を指定した場合は30KDaの範囲にある連続したアミノ酸配列を対象として検索を行います。
ICATによる修飾が存在する場合にチェックします。
ペプチド質量の許容誤差をDa、mmu、%、ppmの単位で指定します。1.0 Daを指定した場合は（ペプチド質量-1.0）Daから（ペプチド質量+1.0）Daの範囲でヒットするペプチドを検索します。

設定例
usami
Support-jp@matrixscience.com
sample1, spot67, Trypsin, 50fm,
2457-9001-125-afd
MSDB
All entries
Trypsin2

Carboxymethyl (C)Acetyl (K)Oxidation (M)ブランク

チェック無し1Da

MASCOT Server : チュートリアル 18

MS/MS tol. +/Peptide charge
Monoisotopic/Average
Data file
Data format
Precursor
Instrument
Overview
Report top

フラッグメントの許容誤差をDa、mmuの単位で指定します。
データファイルに電荷の値が記載されている場合は無視されます。
質量データの種類（MonoisotopicまたはAverage）を指定します。
読み込みたい質量データファイルを[ファイルの選択]
ダイアログを通じて指定します。
質量データのフォーマットを選択します。
データファイルにプリカーサ質量の値が記載されている場合は無視されます。
フラグメント開裂様式は装置によって異なるため、測定に用いた装置の種類を選択します。
チェックボックスをチェックすることにより、検索結果ページに"Overview Table"を表示します。
検索によりヒットした蛋白質の表示数を選択します。

0.5Da
2+
Monoisotopic
データファイルを指定
Mascot generic
ブランク
ESI-QUAD-TOF
チェック無し20

3-3. 検索パラメータの設定
次の検索パラメータを設定してください。
検索パラメータYour name
Search title
Database
Taxonomy
EnzymeAllowed up to [1-9] missed cleavages
Peptide tol. +/MS/MS tol. +/Peptide charge
Monoisotopic/Average
Data file
Data format
Instrument
Overview
Report top

設定値
任意
MIS test search # 1
MSDB
All entries
Trypsin1
1.0 Da0.6
1+
Monoisotopic[参照]ボタンを押して
msmsSample-0.mgfを選択
Mascot genericDefault
ボックスをチェック
20

摘要
ユーザ名をアルファベットで入力してください。

デフォルト値
デフォルト値

デフォルト値
デフォルト値
Version 2.1のCDROMのmskkフォルダにあります。５つのMS/MSデータから構成されています。
デフォルト値
デフォルト値

3-4. MASCOT 検索の実行
画面左下にある[ Start Search ... ]ボタンを押してください。MASCOT検索が始まり、検索の進捗状況が表示され、検索が終了すると検索結果レポート画面が表示されます。MS/MS Ion Searchでは2段階の検索が行われます。最初に「Peptide tol +/-」で指定された質量誤差範囲に含まれるペプチドを検索します。この段階で、ヒットしたペプチドのアミノ酸配列がわかりますので、フラグメントイオンの質量データがアミノ酸配列に一致するかどうかを検索します。

MASCOT Server : チュートリアル 19

検索パラメータの設定と質量データファイルの指定が完了したら、[Start Search …] ボタンを押してください。MASCOT 検索が始まり、検索の進捗状況が表示され、検索が終了すると検索結果レポートが表示されます。

3-5. 検索結果レポートの見方
MASCOT検索が終了すると、Mascot Search Results 画面が表示されます。 [ Query ] 番号は Peptide View 画面に、ヒットした蛋白質のアクセッション番号は Protein View 画面リンクしています。
Peptide Summary 画面にはヒットした蛋白質のスコアの状況を示すグラフに続いて、ヒットしたペプチドとそれが帰属する蛋白質がスコア順に表示されます。
蛋白質のスコアはペプチドのスコアの積算値として表示されます。スコアは統計的な意味を持ち、ヒットしたペプチド（すなわちそれが帰属する蛋白質）が有意かどうかを判定するための数値として、デフォルトでは5%の出現率をもって有意性を判断するための閾値としています。閾値以上のスコア（5%以下の出現率）を持つペプチドあるいは蛋白質が統計的に有意であり、また逆に、5%以上の出現率を持つペプチドあるいは蛋白質は統計的に有意ではない（ランダムヒットである）、という読み方をします。蛋白質のスコア状況グラフを参照することにより、有意にヒットしている蛋白質の存在を直感的に把握することができます。
Peptide View 画面を参照することにより、ヒットした各々のペプチドに関して、そのフラグメントとアミノ酸配列の一致状
況を確認することができます。

MASCOT Server : チュートリアル 20< (1) Peptide Summary Report 画面 >検索したデータベース（この場合は MSDB）のサイズ（蛋白質のエントリ数＝1,942,918 件）です。

有意なスコアを持つ蛋白質情報が表示されます。

統計的に有意な閾値スコア（有意水準を 5%として、この場合は48）を示しています。
閾値 48 のライン
有意なヒットが 3 件存在することを示しています。

有意水準やペプチドのスコアを変更して再表示することができます。

< (2) Peptide View 画面 >フラグメントイオンのアサイン状況と質量誤差（Error graph）
を確認することができます。質量誤差グラフは質量分析計の質
量誤差特性を表していると考えられますので、高いスコアでヒットした蛋白質でも、質量分析計の質量特性から外れている場
合は注意が必要です。

ヒットした蛋白質がスコア順に表示されます。Accession 番号は蛋白質の詳細情報を表示する Protein View 画面にリンクしています。また、[Query]番号の上にマウスカーソルを合わせると右のようなポップアップ画面が表示され、このQuery にヒットしている蛋白質一覧を見ることができます。また、[Query]番号はPeptide View 画面にリンクしています。

蛋白質のアクセッション番号は Protein View 画面にリンクしています。Protein View 画面では、蛋白質の詳細情報（全体アミノ酸配列、質量データがカバーしているアミノ酸配列部分、等電点理論値、質量誤差グラフ、アノテーション情報、NCBIサイトのBLAST検索やTaxonomy Browserへのリンクなど）を表示する他、Peptide View 画面へのリンクも張られています。

MASCOT Server : チュートリアル 21

3-6. 検索条件の変更と再検索
Peptide Summary Report 画面の [Search Selected] ボタンを押すことにより、MS/MS Ion Searchの検索パラメータ設
定画面に戻りますので、パラメータ設定を変更して再検索することができます。

3-7. Error Tolerant Search(非特異的なペプチドの切断＋1 塩基置換＋全ての翻訳後修飾を考慮した再検索)
複数のMS/MSデータで構成された質量データに対してMASCOT検索を実行した場合、ヒットした蛋白質に帰属しな
いMS/MSデータは “Peptide matches not assigned to protein hits” としてリスト表示されます。

リスト表示されたMS/MSデータが、MASCOT検索によってヒットした蛋白質に帰属しない理由としては、(1) ペプチド処理に用いた消化酵素以外の非特異的な切断が起きた(2) サンプル蛋白質にSNPs など1塩基置換・欠失・挿入が起きていて、DBに登録されている配列と異なる(3) 検索時に指定しなかった翻訳後修飾を持っている(4) スペクトルが不十分で、検索に十分なマッチングが得られない(5) サンプルがまったく新規のタンパク質由来のペプチドで、マッチングが得られないが上げられますが、MASCOT Serverでは、選択したヒット蛋白質に対して、(1)、(2)、(3) を考慮した再検索、 Error
Tolerant Search を実行することができます。

MASCOT Server : チュートリアル 22【Error Tolerant Search の実行】
Mascot Search Results 画面を Peptide Summary 表示にした後、Error tolerant のチェックボックスをチェックしてくだ
さい。Error Tolerant Search が有効になります。ヒット蛋白質名の下にある、□ Check to include this hit in error tolerant search or archive reportのチェックボックスをチェックし、Error Tolerant Search を実行したい蛋白質を選択してください。複数の蛋白質を選択することができます。[Search Selected] ボタンを押してください。 Error Tolerant Search 画面に切り替わります。

検索パラメータ設定画面と同様な画面が表示されれますが、Databaseやmodificationsなどの検索条件は変更せずに、[Start Search…]ボタンを押してくだ
さい。Error Tolerant Search が開始されます。

MASCOT Server : チュートリアル 231塩基置換によるアミノ酸の変化、MASCOTの設定ファイルに含まれる翻訳後修飾、非特異的な切断を考慮した
Error Tolerant Search の結果が表示されます。各MS/MSデータに対するヒット情報を示す行の後半に示されている青色の数値はデータベース中のアミノ酸配列に対する質量差を表しています。また、青色数値の上にマウスカーソルを合わせると、詳細情報がポップアップ表示されます。

MASCOT Server : チュートリアル 24

蛋白質同定システム MASCOT Server
4. LCQ_DTA Shell（Xcalibur RAW ファイルに対する検索）
サーモエレクトロン社は、Xcaliburが出力する質量データファイルである*.RAW (バイナリ形式)
を*.DTA ファイル(テキスト形式)に変換するためのプログラム “extract_msn.exe( LCQ_DTA.EXE ) ” を提供しています。*.DTAファイルを使ってMASCOT検索を実行することもできますが、MASCOT Serverはextract_msn.exe ( LCQ_DTA.EXE) プログラムのインターフェースである“LCQ_DTA Shell” を内蔵しており、次のような流れで*.RAWファイルから直接MASCOT検索を実行することができます。
(1) LCQ DTA Shellユーザインターフェースの表示(2) *.RAWファイルの指定(3) LCQ_DTA.EXEプログラムの条件設定(4) RAW → DTAへの変換実行(5) *.DTAファイル生成 <中間ファイルとして存在>(6) MASCOT ServerのMS/MS Ion Search検索設定画面の[Data file]欄への自動入力(7) MASCOT検索実行(8) MASCOT検索結果画面の表示
4-1. 環境設定
MASCOT ServerをインストールしたPCに次のフォルダを作成してください。
C:\LCQ\system\programs
C:\temp
BioWorksのCDROMまたはBioworksがインストールされているPCから次のファイルを検索し、MASCOT Serverを
インストールしたPCの “C:\LCQ\system\programs”フォルダにコピーしてください。
extract_msn.exe（*注）Fregistry.dll
Fileio.dll（*注）存在しない場合は 同じフォルダ内のLCQ_DTA.EXEを使用してください。
LCQ_DTA.EXEプログラムにはいくつかのバージョンが存在し、上記の２つのファイルだけでは動作しない場
合があります。この場合は、 “Fglobal.dll”、“Fcontrol2.dll” 、“MFC42U.dll” を検索し、MASCOT Server
をインストールしたPCの “C:\LCQ\system\programs”フォルダにコピーしてください。

4-2. DTA ファイルへの変換と MASCOT 検索の実行
Webブラウザを起動し、アドレス入力欄にMASCOT Server名を含む次のURLを入力してください。
http://MASCOT_Server名/mascot/
MASCOT Serverのトップページに接続されます。表示されたトップページ画面の Welcome の次の行にある
Mascot のリンク、またはページ最上段の HOME | MASCOT |HELP の中の MASCOT のリンクをクリックしてくだMASCOT Server : チュートリアル 25

さい。MASCOT Serverの検索モード選択画面（Mascot Search画面）が表示されます。

LCQ_DTA プログラムのユーザインターフェース画面にリンクしています。

LCQ_DTAのリンクをクリックしてください。LCQ_DTA.EXEプログラムを動作させるために必要な変換パラメー
タ値を入力できるユーザインターフェース（LCQ DTA Shell画面）が表示されます。

LCQ Raw File項の[参照]ボタンを押し、RAWファイルデータを選択してください。次に、LCQあるいはLTQの測定条件に応じて、RAWファイルからDTAファイルへの最適な変換パラメータ値を設定してください。「Min. Scan
/ Group」のデフォルト値は2ですが、測定条件によっては1を設定しないとLCQ_DTA.EXEプログラムがエラーを返すことがあります。
LCQ_DTA.EXEプログラムの変換パラメータ設定に関しては、

MASCOT Server : チュートリアル 26

http:// MASCOT_Server名/mascot/help/instruments_xcalibur.htmlに若干の説明がありますが、詳しい内容に関しましては、LCQ_DTA.EXEプログラムの供給元であるサーモエレ
クトロン株式会社にお問い合わせください。
変換パラメータ値の設定が終わりましたら、画面の最下段にある [Generate .DTA Files] ボタンを押してください。RAWファイルがDTAファイルに変換され、MS/MS Ion Search画面に切り替わりますので、検索パラメー
タを設定し、[Start Search ...]ボタンを押してMASCOT検索を実行してください。

RAW ファイル名と変換された Scan 範囲に関する情報が自動的に挿入されます。

LCQ_DTA.EXE プログラムで変換された DTA ファイルが自動的に読み込まれます。

なお、LCQ_DTA.EXEプログラムはモノアイソトピックなピークを検出するためのソフトウエアではありません。
RAWファイルのプロファイルがそのままDTAファイルとして作成されることにご注意ください。

MASCOT Server : チュートリアル 27

蛋白質同定システム MASCOT Server
5. 付録
5-1. 蛋白質同定のコツその１
5-1-1. はじめに質量分析計を利用して、試料に含まれるペプチドに由来するイオンの質量を測定し、NCBInr等の配列データ
ベースに対して測定データに一致する配列を検索することにより、試料に含まれる蛋白質やペプチドの有力候補を特定することができる。
通常、検索作業は「検索エンジン」と呼ばれるソフトウエアを利用する。「消化酵素」、「生物種」、「質量誤差範囲」などの検索条件の下で、アミノ酸配列や塩基配列の情報を含む配列データベースの中から測定データである質量値に一致する配列、すなわちその配列を含む蛋白質群を探し出す。配列に一致する質量値の数が多くなるほど、それらを同時に満足する候補蛋白質は絞られ、統計的な明確さをもって蛋白質を同定することができる。
検索エンジンは機能が単純であるため、検索結果は質量データや検索条件に強く影響される。ここでは弊社が提供している蛋白質同定ソフトウエアツールを例にして、蛋白質同定をより確実に行うためのコツを紹介する。
なお、蛋白質同定精度をより高めるためには、質量分析計の生データからのモノアイソトピックなピークの同定、配列データベース内に存在する質量データに一致する蛋白質の同定、プロテオーム実験プロセスから発生する様々なデータやアノテーション情報を加味したデータマイニングによる同定を組み合わせることがより重要である。

5-1-2. 翻訳後修飾は控えめにMASCOT検索では同時に最大9個の翻訳後修飾を指定することができるが、翻訳後修飾設定数の増加は検索空間の増大を意味し、ひとつの質量データに一致する配列数は増加するため、相対的にスコアは低下し、検索時間は増加する。「Oxdation (M)」の条件では10秒程度で有意なヒットが得られる質量データセットでも、翻訳後
修飾設定数を9個にして検索すると、有意なヒットは得られず、検索時間も100秒以上を要する。したがって、
翻訳後修飾は必要最低限の設定数でMASCOT検索を実行することが望ましい。

5-1— 2. 質量誤差範囲グラフの有効活用
検索結果ページに表示される質量誤差グラフ（Error graph）は、配列に一致した質量データに関して実験値と理論値の誤差を表示する。質量誤差グラフは質量分析計の特性を表しているのとも考えられるので、質量誤差グラフが質量分析計の質量誤差特性から外れている場合は、有意なヒットと思われる結果についても検証する必要がある。また、「Peptide tol. +/-」や「MS/MS tol. +/-」の値を質量分析計の質量誤差特性に応じた値に変更し、再検索すると有意なヒットが得られることがある。

5-1-4. Noneを使うのも一案「enzymes」ファイルで定義した消化酵素の切断特性が反映されていないような疑惑がある場合は、「Enzyme」の中から「None」を選択し、再検索することにより有意なヒットが得られることがある。

5-1-5. 正確なピーク検出
正確なモノアイソトピック質量データを使って検索を行うことが結果の信頼度を上げると同時に検索時間の節約にもなる。また、LC-MS/MSデータの場合は、同じ質量値を持つプリカーサのMS/MSスペクトルデータを互いに積算した上でピーク検出処理を実行することにより、重複配列のヒットを減らすことができる。
MASCOT Distillerは最新のピーク検出技術を利用したモノアイソトピック同定ソフトウエアツールであり、

MASCOT Server : チュートリアル 28

蛋白質同定の信頼度、検索時間を改善する。試用版は日本語のインストレーションマニュアルと共に、次のサイトから入手できる。
http://www.matrixscience.com/distiller_support.html

5-1-6. Taxonomyフィルタ
実験対象とした生物種に含まれているはずの蛋白質がデータベースの中に存在せず、有意なヒットが得られなかった場合は、Taxonomyのエントリ数を確認し、その生物種の近傍を含めて検索してみる。2.104/6/3版のNCBInrデータベースにおけるPrimatesのエントリ数は、Primates = 126,605
Homo sapiens (human) = 116,140
Other primates = 10,680である。たとえば、チンパンジーに対する検索は「Other primates」を選択するのではなく、「Primates」
を選択して検索すると目的の蛋白質がヒットする可能性が高くなる。

5-1-7. 翻訳後修飾 ― Unimodの利用（http://unimod.org/）「mod_file」に定義されていない翻訳後修飾を使いたい場合は「Unimod」のサイトを利用すると良い（http://www.unimod.org/）。Unimodは翻訳後修飾に関するデータベースを提供しており、新規な翻訳後修飾を登録したり、他のMASCOTユーザが登録した翻訳後修飾を共有することができる。また、弊社が提供している
MASCOT検索Webサービス（http://www.matrixscience.com/search_form_select.html）ではUnimodに登録されている翻訳後修飾を毎週更新しており、最新の翻訳後修飾を利用することができる。

5-1-8. データマイニング
蛋白質の同定精度をより高めるためには、質量分析計が出力する生データに含まれるモノアイソトピックピ
ークの同定情報、ピークリストに対応する蛋白質の同定情報と共に、プロテオーム実験に関わる様々な情報やアノテーション情報を蓄積し、データマイニングすることが重要となる。弊社ではこのような環境を実現するためのデータ管理ソフトウエア「MASCOT Integra」をこの秋にリリースする予定である。

< 参考文献 >(1) Matrix Science Ltd.資料, Top 10 Tips for Successful Searching, 2003

MASCOT Server : チュートリアル 29

5-2. 蛋白質同定のコツその 2
5-2-1. はじめに昨年に引き続き、弊社が提供している蛋白質同定ソフトウエアツール MASCOT ファミリー を例にして、蛋白質同定をより確実に行うためのコツを紹介する。

5-2-2. エラー・トレラント検索：Error Tolerant Search
Error Tolerant Search は、MASCOT 検索を実行して得られたヒット蛋白質群の中で、指定した蛋白質に対して全ての酵素切断特性（Enzyme = none）、全ての翻訳後修飾および全てのポイントミューテーションを考慮した再検索機能である。
最初の MASCOT 検索で、(a) 1084.56 のプリカーサ値を持つ MS/MS データが有意なスコアで ELM1_YEAST にヒットし、(b) 748.43 および(c) 1367.63 のプロカーサ値を持つ MS/MS データは有意なスコアでヒットしなかったとする。

(b)、(c)の MS/MS データがヒットしない理由として、1. これらのデータに対応するアミノ酸配列が検索対象としたデータベースに存在しない、2. 特定のアミノ酸が翻訳後修飾されている、3. ミューテーションが存在するなどの理由が考えられるが、ELM1_YEAST に対して Error Tolerant Search を実行するとセリンとトレオニンに対するリン酸化を検出し、次の結果が得られる。

MASCOT 検索では同時に最大 9 個の翻訳後修飾を指定することができるが、翻訳後修飾設定数の増加は検索空間の増大を意味し、プリカーサ質量値に一致するペプチド数は増加するため、相対的にスコアは低下し、検索時間も長くなる。Error Tolerant Search は MS/MS データセットから特定の蛋白質を切り分けた後、その蛋白質の存在可能性をより確実なものにしたり、その蛋白質の構造を検討するための有力な検索方法である。

MASCOT Server : チュートリアル 30

5-2-3. エラー・トレラント・タグ検索：Error Tolerant Tag Search
MIS（MS/MS Ion Search）検索では、プリカーサ質量値に一致するペプチド群の中から、フラグメントイオン
質量値に一致するペプチドを検索する。すなわち、プリカーサ質量値を構成するアミノ酸の質量値と翻訳後修飾などの質量値に対する検索方法である。
一方、SQ（Sequence Query）検索の Error Tolerant Tag Search モードでは、プリカーサ質量値の情報を使わずに、指定した酵素でデータベースを「消化」して得られたペプチド群の中から、ペプチドを構成するアミノ酸の種類とフラグメントイオン質量値にマッチするペプチドを検索することができる。したがって、翻訳後修飾やミューテーションに対応する質量値が誤差（実験値と理論値の差：Delta）として表示される。
次の条件（tag および etag キーワード）を使って SQ 検索を実行すると、プリカーサ値 687.30 のペプチドは104.98 の質量誤差でヒットするため、システインがピリジルエチル化されている可能が示唆される。
TAXONOMY=. . . . . . . . . . lobe-finned fish and tetrapod clade
REPTYPE=Peptide
TOL=0.03
TOLU=%
ITOL=0.5
ITOLU=DaCHARGE=2+
INSTRUMENT=ESI-TRAP
877.4 tag(376.2, [IL][QK][IL], 730.2)
687.3 etag(782.3, NG[IL], 1066.1)

MASCOT Distiller の Tag 抽出および De novo の機能を組み合わせることにより、より現実的な検索手段となりうる。

< 参考文献 >(1) Matrix Science Ltd.資料, Mascot Search Results FAQ, 2005
(2) Matrix Science Ltd.資料, http://www.matrixscience.com/help/sq_help.html(3) 私信, 吉野健一

2005年7月

第3版

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