平成25年度

食肉に関する
助成研究調査成果報告書

公益財団法人

伊藤記念財団

VOL. 32

「伊藤記念財団」設立趣意書
私，伊藤傳三は，昭和３年食肉加工業を創業して以来五十有余年の永きにわた
り食肉加工品の製造販売に従事して参ったところであります。
この間，昭和47年からは日本ハム・ソーセージ工業協同組合理事長，社団法人
日本食肉加工協会理事長，加えて，ハンバーグ・ハンバーガー協会理事長等の重責を担わせていただく等，業界団体の役員を勤めさせていただいてきたところであります。
こうした中で昭和55年，はからずも勲二等瑞宝章受章という身にあまる栄誉に浴したのでありますが，受章に際し私自身の過ぎ来し方を振り返り，食肉及び食
肉加工業界の行く末に思いを致し，２つの事柄を決意致しました。
第１は，食肉加工団体の指導体制の若返りであり，第２は，食肉加工業の基礎的研究の充実であります。
諸情勢が激しく変わりつつある中で食肉加工業界をさらに大きく発展させるには，新しいリーダーの登場が望ましいことは論をまちません。また，食肉加工品については，これまでも日本独自の技術開発は行われてきましたものの，いずれも企業内技術であると言っても過言でなく，大学等における基礎的研究の不足が将来の日本の食肉加工業の発展を遅らせるおそれがあり，この現状を打破する必要があると考えたところであります。
以上のような基本的考えの下に私は，食肉関係団体等の役員を辞すると共に，
食肉及び食肉加工に関する基礎的かつ広汎な研究を行い，あるいは助長するための財団の設立を発起するものであります。
昭和56年６月
設立発起人© The Ito Foundation

伊

藤

傳

三

Philosophy Behind the Establishment of
the Ito Foundation
Approximately half of a century has passed since I established a meat
packing corporation for commercial products in 1928. While involved in thisbusiness, I have had occasion to serve as chairman of the boards of trustees
of several organizations related to the meat industry, such as the HamSausage Industrial Association of Japan in 1972, the Meat Packing Industrial
Association of Japan, and the Hamburg-Hamburger Association of Japan.
In 1980, unexpectedly, I was highly honored to receive the Order of the
Sacred Treasure, Gold and Silver Star from the emperor in acknowledgement of my contributions to the meat industry and improved human nutrition
during my career. This illustrious award provided a strong impetus for me toact on my long-standing concern for the future of meat packing industries.
My commitment to the establishment of a new research foundation for thepromotion of meat science was based on two fundamental philosophies : first,
leadership of the Association of the Meat Packing Industry should be transferred to people with novel ideas and, second, an advanced system for basic
research should be established in meat industries. Clearly, fresh leadership isneeded in changing situations for intensive development in the meat packing
industry. Although some technical product developments have been achievedin certain individual corporations, the lack of basic research in meat scienceat universities and other research organizations certainly will impede future
development of Japanese meat packing industries. It is urgent to end the stagnation in the meat industry through research support.
On the basis of these philosophies, I myself will resign from any official
positions in meat-related associations and will establish a new researchfoundation to support and promote basic and applied research in meat
science.
Denzo Ito, Founder
June© The Ito Foundation

1981

事 業 の あ ら ま し（目

的）本財団は，食肉に関する研究及び調査を行い，もって畜産業及び食品産業の振興と国民食生活の安定に資することを目的とする。
（事業）

本財団は，上述の目的を達成するため，次の事業を行う。
⑴

食肉の生産，処理，加工等に関する基礎的研究及び調査。

⑵

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査を行う大学等の研究機関に対する助成。

⑶

食肉の生産，処理，加工等に関する情報の普及及び広報。
（事業実績）
回
第１回
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32

年度
昭和57年度
58
59
60
61
62
63
平成元年度
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25

© The Ito Foundation

研究調査助成48件 60,000千円
52
54,40060
49,80062
48,00070
53,00079
58,90095
70,50086
74,25079
60,00070
50,00086
60,00081
60,00081
60,00082
65,00081
69,10078
59,00082
60,00067
47,00057
41,00053
37,00058
40,00055
41,00055
48,00056
48,00011
10,00012
10,00015
16,90011
10,000
11
10,40012
12,00013
13,00038
37,000ご挨拶

当伊藤記念財団は，伊藤ハム株式会社の創業者故伊藤傳三による巻頭の「設立趣意書」に掲げた趣意をもって，昭和56年７月３日に財団法人として農林水産大臣から設立を許可され、平成24年４月１日に公益財団法人伊藤記念財団に移行登記したものであり，事業の内容は，「事業のあらまし」にあるとおりであります。
おかげ様で当財団は，平成24年度からは公益財団法人として活動することとなり，その活動は本年で33年となります。この間，当財団の研究調査助成事業の存在が畜産関係の方々の間に浸透いたし，事業内容も逐次充実して参りつつあります。
これは，ひとえに関係各位のご指導ご鞭撻の賜と深く感謝申し上げるとともに，今後とも，
食肉加工等の基礎的研究の充実を希う創設者の意志にそって，益々食肉産業ひいては畜産業の振興及び国民食生活の安定のために役立つべく，更に努力を重ねて参りたいと存じております。
本書は，第32回（平成25年度）助成事業における38件の研究調査助成対象研究者の皆様からいただいた研究成果報告をとりまとめたものでありますが，以上の目的にしたがって，食肉産業の基礎的研究等に携わる諸氏の研究の一助ともなれば幸甚でございます。
平成26年11月

理事長

伊

藤

功

一

Dear Sir：
I am very pleased to send you and your organization a complimentary copy of theresearch reports of the Ito Foundation. This research foundation was founded by the late
Mr.Denzo Ito to advance research in meat science. The research reports are publishedannually. Unfortunately, the articles are largely in Japanease ; however, in the future wehope to contribute to the international development of meat science. Any constructive
suggestions or critiques from others involved in meat-related research would be accepted
gratefully.
You will find out philosophy behind the establishment of the Ito Foundation describedby Mr.Denzo Ito, in the research report of the Ito Foundation, Vol.32 enclosed here. We
appreciate any interest you may have in our research efforts.
It is my great pleasure to publish this report as the chief director.
Sincerely yours,
Nov. 2014
Koichi Ito
The chief director
The Ito Foundation© The Ito Foundation

i

目

次

発酵食肉製品由来の機能性ペプチドに関する研究


津

田

治

敏（九州栄養福祉大学食物栄養学部）

1

食肉内部への食中毒菌の侵入に影響を与える因子の解明と電解水処理による殺菌法の確立


島村

裕子・増田

修一（静岡県立大学食品栄養科学部）

7

食肉製品の客観的嗜好性評価に関する研究（第２報）
芳賀

聖一・林

利哉・山口

幸彦＊

恭平・小川

（名城大学農学部，*名城大学農学部附属農場）

14

生活習慣病予防効果を有する食肉素材の創出を目指した加工技術の確立
好田正（東京農工大学大学院農学研究院）

19

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究（第３報）
山之上

稔・西田

昌弘・上田

修司・井原

一高・豊田

淨彦

（神戸大学大学院農学研究科）

27

味覚センサを用いた和牛の味の数値化と可視化に関する研究
都

甲

潔・田原

祐助

（九州大学大学院システム情報科学研究院）

34

牛肉に関する健康指標の策定と赤身牛肉の消費者ニーズ調査


広

岡

博

之（京都大学大学院農学研究科）

39

博（神戸大学大学院農学研究科）

47

豚血液由来抗肥満素材による内臓脂肪蓄積抑制機構の解明
上曽山

食肉の給与が海馬のタンパク質リン酸化および遺伝子発現におよぼす影響


豊

田

岡

本

淳（茨城大学農学部）

53

晴（鳥取大学農学部）

57

畜産副産物の中性脂肪改善効果について芳

血糖値と血中アミノ酸，オメガ３脂肪酸，血栓因子の関連に関する研究
田中

明・蒲池

桂子・中嶋

克行＊・高田明和＊＊（女子栄養大学栄養クリニック，＊群馬大学大学院保健学科，＊＊© The Ito Foundation

浜松医科大学医学部）

62

ii
冠動脈疾患患者における血中アミノ酸・脂肪酸組成と動脈硬化惹起性リポ蛋白および血栓因子の関連に関する研究
木庭

新治・小林

洋一・横田

裕哉・田中

明１

中嶋

克行２・高田明和３（昭和大学医学部，１女子栄養大学栄養クリニック，
２

群馬大学大学院保健学科，３浜松医科大学医学部）

66

食肉類の摂取と血中アミノ酸，オメガ３脂肪酸及び血栓因子の関連に関する研究高尾

哲也１・小川睦美１・中嶋克行２・高田明和３（１昭和女子大学生活科学部，２群馬大学大学院保健学研究科，
３

NPO法人「食と健康プロジェクト」）

71

畜産物由来ヘム鉄摂取について食事調査における研究―発育期スポーツ選手の体組成に対する効果―



坂

元

美

子（神戸女子大学健康福祉学部）

78

牛肉の質に関連する新たな脂肪酸合成経路の探索とバイオマーカーの同定溝口康（明治大学農学部）

84

真一・廣田

翔平（信州大学農学部）

90

牛肉の風味に関与する遺伝子の機能解析
米倉

コレシストキニンＡ受容体遺伝子を指標とした効率的な地鶏生産に関する研究
力丸

宗弘・高橋

武＊

大希・大久保

（秋田県畜産試験場，＊茨城大学農学部）

96

天然記念物「黒柏鶏」の遺伝的特徴を活用した地鶏「長州黒かしわ」の DNA 識別の可能性の検討
関谷

正男１・奥村友美２・都築政起３（１山口県農林総合技術センター，２独立行政法人家畜改良センター，
３

広島大学大学院生物圏科学研究科）

103

ブタ精子核クロマチンの構造安定性を司る鍵分子の特定とそれを指標とした新たな精子受精能評価法の確立
高坂

哲也・井川

彰・皆川

至・柴田

昌利＊

（静岡大学大学院農学研究科，＊静岡県畜産技術研究所中小家畜研究センター）108

アポトーシス阻害因子の人為制御による家畜の潜在的卵子救命法の創出眞鍋昇（東京大学大学院農学生命科学研究科附属牧場）

115

かごしま黒豚における授乳中発情の誘起試験
野口

倫子・生駒

エレナ＊・帆保誠二＊（鹿児島大学共同獣医学部， 鹿児島県農業開発総合センター畜産試験場）

120

新規繁殖制御中枢刺激剤が黒毛和種の卵胞発育に与える効果についての研究
松田

二子・大蔵

聡

（名古屋大学大学院生命農学研究科）© The Ito Foundation

125

iii
ウシ胚盤胞のマウス子宮内あるいは体外培養における休眠誘導の可能性
山田雅保（京都大学大学院農学研究科）

131

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発
ツェンコヴァ

ルミアナ・竹村豪・ジョージバザール（神戸大学大学院農学研究科）

136

リソソーム酵素活性制御による高温ストレス下でのウシ胚発生改善に関する研究
山中

賢一・阪谷

美樹＊

（佐賀大学農学部，＊九州沖縄農業研究センター）142

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発
久米

新一・王

蒙東・谷口

康晴

（京都大学大学院農学研究科）

148

乳肉および反芻家畜体内の抗酸化能を高めうる新飼料の機能評価小林泰男（北海道大学大学院農学研究院）

154

食肉におけるカルノシン関連ジペプチド増量法確立のための基礎研究友永省三（京都大学大学院農学研究科）

159

地鶏生産における初期栄養操作による免疫能向上に関する研究
太田

能之・白石

純一・西川

薫＊

（日本獣医生命科学大学応用生命科学部，＊三重県畜産研究所）

163

胎仔期のタウリン供給強化によるブタの筋形成促進
勝俣

昌也・石田

藍子

（独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産草地研究所）

170

肉質を変化させる天然物の探索内田隆

史（東北大学大学院農学研究科）

176

完全自給粗飼料給与における放牧と未放牧が日本短角種の肉質に与える影響
小笠原

英毅・岡山

和代＊

（北里大学獣医学部附属フィールドサイエンスセンター，＊

北里大学保健衛生専門学院管理栄養科）

180

畜肉生産性向上を目指した分岐鎖アミノ酸強化飼料用ダイズの開発
湯淺

高志・松尾

光弘・井上

眞理＊

（宮崎大学農学部，＊九州大学大学院農学研究院）

188

被災地産肉現場の風評被害対策を目的とした放牧地空間放射線量の自動測定システムの実証研究
平田

統一・桃田

優子・齊藤

博之＊

（岩手大学農学部，＊株式会社サイエンススタッフ）

196

腫瘍関連遺伝子発現動態解析による非典型的牛白血病の発症診断法の開発
猪熊© The Ito Foundation

壽（帯広畜産大学畜産学部）

203

iv
飼養環境下の牛群におけるマイコトキシン浸潤動態の検証―尿中ステリグマトシスチン濃度測定法の確立とその臨床応用―髙木

誠一＊・國師

光博・宇野

恵美子＊

＊

（鹿児島大学共同獣医学部， 鹿児島大学共同水産学部）

209

肺炎原因菌の特定を目的とした気管支肺胞洗浄法の牛医療への応用
帆保

誠二・野口

倫子・安藤

貴朗

（鹿児島大学共同獣医学部）

215

乳牛の病原微生物感染における卵巣機能障害の発症機序の解明
清水隆（帯広畜産大学畜産衛生学研究部門）© The Ito Foundation

222

v

CONTENTS
Functional peptides derived from fermented meat products
Harutoshi Tsuda（Faculty of Nutrition, Kyushu Nutrition Welfare University）

1

Elucidating the factors influencing the invasion to the meat inside by food poisoning bacteria
and antimicrobiological effect and application of electrolyzed water
Yuko Shimamura and Shuichi Masuda（School of Food and Nutritional Sciences, University of Shizuoka） 

7Research on the objective evaluation for palatability of meat products（Ⅱ）
Seiichi Haga, Toshiya Hayashi, Kyohei Yamaguchi and Yukihiko Ogawa ＊（Faculty of Agriculture, Meijo University, ＊ Experimental Farm, Meijo University） 

14

Establishment of processing methods for producing meat products with anti-lifestyle-relateddiseaseTadashi Yoshida（Institute of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

19

Intramuscular free fatty acids related to beef eating quality, PartⅢ
Minoru Yamanoue, Masahiro Nishida, Syuji Ueda, Ikko Ihara and Kiyohiko Toyoda（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

27

A study on quantification and visualization for taste of wagyu beef using a taste sensor
Kiyoshi Toko and Yusuke Tahara（Graduate School of Information Science and Electrical Engineering, Kyushu University）

34

Development of healthy beef index and consumer needs survey for lean beef
Hiroyuki Hirooka（Graduate School of Agriculture, Kyoto University） 39Anti-obese action of a porcine blood-derived food ingredient
Hiroshi Kamisoyama（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University） 

47

Effects of meat supplementation on hippocampal protein phosphorylation and gene expression
Atsushi Toyoda（College of Agriculture, Ibaraki University）

53

Effect of livestock by-product on serum triglyceride level
Yoshiharu Okamoto（Faculty of Agriculture, Tottori University）

© The Ito Foundation

57

vi
Studies on relationship between blood glucose level and plasma aminoacids, omega 3 fatty acids
and thrombotic factors
Akira Tanaka, Keiko Kamachi, Katsuyuki Nakajima ＊ , Akikazu Takada ＊＊（Nutrition Clinic, Kagawa Nutrition University, ＊ Gunma University Graduate School of Health
Sciences Postgraduate School of Medicine,＊＊

Hamamatsu University School of Medicine）

62

Studies on relationship between the composition of blood amino acids and fatty acids andatherogenic lipoproteins and/or thrombotic factors in patients with coronary artery diseases
Shinji Koba, Youichi Kobayashi, Yuuya Yokota, １Akira Tanaka, ２Katsuyuki Nakajima,
３

Akikazu Takada
１

２（Showa University School of Medicine, Kagawa Nutrition University, Gunma University Graduate School
３of Health Sience Postgraduate School of Medicine, Hamamatsu University School of Medicine）

66

Studies on relationship between meat intake level and plasma aminoacids, omega3 fatty acids
and thrombotic factors
Tetsuya Takao １, Mutsumi Ogawa １, Katsuyuki Nakajima ２ and Akikazu Takada ３（１Faculty of Life Sciences, Showa Woman's University, ２Graduate School of Health Sciences Gunma
University，３NPO“Food and Health Project”）

71

Study of the porcine blood heme-iron intake and the nutrition ingestion condition― Effect of the heme-iron on the body composition for the growth phase sport player ―Yoshiko Sakamoto（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Women's University） 

78

Development of a biomarker of new pathway for the synthesis of fatty acid in bovine
intramuscular adipocytes
Yasushi Mizoguchi（School of Agriculture, Meiji University） 

84Functional analysis of beef flavor-related genes
Shinichi Yonekura and Shohei Hirota（Faculty of Agriculture, Shinshu University） 90

Study on the effective chicken production by selection for Cholecystokinin type-A receptor gene
Kazuhiro Rikimaru, Daiki Takahashi, Takeshi Ohkubo ＊（Akita Prefectural Livestock Experiment Station, ＊ College of Agriculture, Ibaraki University） 

96Possibility of DNA discrimination of a meat-type brand chicken“Chosyu-Kurokashiwa”
created from the Kurokashiwa Chicken, a national natural treasure of Japan
Masao Sekiya １,Yumi Okumura ２, and Masaoki Tsuzuki ３（１Yamaguchi Prefectural Agriculture and Forestry General Technology Center, Livestock Technology
Research Department，２National Livestock Breeding Center，３Graduate School of Biosphere

Science, Hiroshima University） 

103© The Ito Foundation

vii
Identification of a key molecule responsible for the structural stability of sperm nuclear
chromatin and its application to the assessment of fertility potential of boar sires
Tetsuya Kohsaka, Akira Igawa, Itaru Minagawa, Masatoshi Shibata ＊（Laboratory of Animal Reproduction & Physiology, Graduate School of Agriculture,
Shizuoka University, ＊ Shizuoka Swine and Poultry Experimental Station） 108

Rescue of potential oocytes in livestock ovaries by artificial control of apoptosis inhibitor
Noboru Manabe（Animal Resource Science Center, The University of Tokyo） 

115

Control of lactational estrus in the Kagoshima Berkshire
Michiko Noguchi, Erena Ikoma ＊ and Seiji Hobo
（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, ＊ Livestock Research Institute,Kagoshima Prefectural Institute for Agricultural Development） 

120

The effect of a novel reproductive center stimulant to follicle development of Japanese Black
beef cows
Fuko Matsuda and Satoshi Ohkura（Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University） 

125Studies on the induction of embryonic diapause of bovine blastocysts in pseudo-pregnant
mouse uteri, in which diapause conditions are created, or under in vitro culture conditions
Masayasu Yamada（Laboratory of Reproductive Biology, Graduate School of Agriculture, Kyoto University） 

131

Development of rapid and non-destructive diagnostic system for cow's estrus and pregnancy
Roumiana Tsenkova, Go Takemura, George Bazar（Biomeasurement Laboratory, Kobe University Graduate School of Agricultural Science） 

136

Study on improvement of bovine embryonic development under heat stress by regulation oflysosomal enzyme activities
Ken-ichi Yamanaka and Miki Sakatani ＊（Faculty of Agriculture, Saga University, ＊ National Agricultural Research Center for Kyushu Okinawa
Region） 

142Effects of functional components in grass on enhancing immunoglobulin in colostrum
Shinichi Kume, Mengdong Wang and Yasuharu Taniguchi（Graduate School of Agriculture, Kyoto University） 

148

Evaluation of a new functional feed to possibly enhance anti-oxidant activity of milk, meatand other tissues of ruminantYasuo Kobayashi（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University） © The Ito Foundation

154

viii
Basic study for the establishment of the method to increase carnosine-related dipeptide
levels in meats
Shozo Tomonaga（Graduate School of Agriculture, Kyoto University

）

159

Study on improvement of immunity by early nutritional development in Japanese nativechicken production
Yoshiyuki Ohta, Jun-ichi Shiraishi and Kaoru Nishikawa ＊（Faculty of Applied Bioscience, Nippon Veterinary and Animal Science University，＊

Animal Science Laboratory Mie-prefecture） 163

Promotion of myogenesis by administration of taurine during the fetal stage in the pig
Masaya Katsumata and Aiko Ishida（NARO Institute of Livestock and Grassland Science） 

170

Screening for natural product that changes the meat characteristics
Takafumi Uchida（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University） 

176

Effect of grazing on meat quality of Japanese Shorthorn under complete grass-fed beef
production system
Hideki Ogasawara and Kazuyo Okayama ＊（Field Science Center, School of Veterinary Medicine, Kitasato University, ＊ Department of 
Applied Clinical Dietetics, Kitasato Junior College of Health and Hygienic Sciences） 

180

Improvement of branched chain amino acid contents in soybean for high quality meat production
Takashi Yuasa, Mitsuhiro Matsuo, Mari Iwaya-Inoue ＊（Faculty of Agriculture，University of Miyazaki; ＊ Faculty of Agriculture, Kyushu University） 188

An empirical study of the automatic measurement system of the grazing land space dose ofradiation for opposing the damage caused by rumors of a stricken area
Toh-ichi Hirata, Yuko Momota and Hiroyuki Saito ＊（Faculty of Agriculture, Iwate University, ＊ Science Staff Co. ltd．
）

196

Development of diagnostic methods for atypical bovine leukosis by analysis of tumor-related
gene expressions
Hisashi Inokuma（Faculty of Animal Husbandry, Obihiro University of Agriculture & Veterinary Medicine） 203

Field application of urinary sterigmatocystin concentration measurements for monitoring
natural feed contamination in cattle herds
Mitsuhiro Takagi, Seiichi Uno ＊ and Emiko Kokushi ＊（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University,
University） ＊Faculty of Fisheries, Kagoshima

209© The Ito Foundation

ix
Application of bronchoalveolar lavage to specify offending bacteria of pneumonia to cow
medical treatment
Seiji Hobo, Michiko Noguchi and Takaaki Andou（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University

）

215

Mechanisms of ovarian dysfunction by bacterial infection in dairy cow
Takashi Shimizu（Graduate School of Animal and Food Hygiene, Obihiro University of Agriculture and Veterinary
Medicine） 222© The Ito Foundation

© The Ito Foundation

1

発酵食肉製品由来の機能性ペプチドに関する研究
Functional peptides derived from fermented meat products

津

田

治

敏

（九州栄養福祉大学食物栄養学部）

Harutoshi Tsuda（Faculty of Nutrition, Kyushu Nutrition Welfare University）

The purpose of this study was to select a lactic acid bacterial strain for use as a starter
culture for producing fermented meat products and for evaluating a functionality of thefermented meat products. Lactobacillus plantarum JAB2001 was isolated from Japanesetraditional fermented food, funazushi. This strain was capable of growth in a ground beef patty,
and pH of the fermented patty reached 4.8 after 48 h incubation at 25°C. The extract of thefermented meat patty showed an inhibitory activity against angiotensin I-converting enzyme（ACE）．The peptide that inhibited ACE was purified from the fermented meat patty byreverse-phase HPLC and a size-exclusion HPLC．

１．目などのいくつかの保存法を駆使した加工食品であ的る。一般に，発酵食肉中の環境は菌の生育にとっ乳酸菌は多くの発酵食品に用いられる細菌の一て厳しく，低 水 分 活 性 ，高 塩 濃 度 お よ び 低 pHつであり，特に乳製品への利用がよく知られていなどが重要な生育抑制因子として考えられている。プロバイオティクスという概念は1989年，

る ７）。このような環境が一般細菌の生育を抑制しFuller １）に よ っ て 提 唱 さ れ ，2002 年 に は FAO/

保存性の向上に寄与している。発酵食肉製品のスWHOによって「食品として適切な量を摂取しターターに利用されている乳酸菌はこうした環境

た場合に宿主に有益な影響をおよぼす生きた細でも生育できる菌株であり，食肉から分離された菌」と定義された。このプロバイオティクス細菌

乳酸菌であることが多い。その他の発酵食品由来の代表が乳酸菌であり，乳酸菌を多く含む食品との菌の利用も検討されている８～10）が，その場合，してヨーグルトなどの発酵乳製品がある。

何らかの付加価値が最終製品にもたらされること

２）

近年，プロバイオティクス乳酸菌の運び手食品が期待される。すなわち，プロバイオティクス乳として発酵食肉製品が注目されている３～６）。発酵酸菌などを応用することによって発酵食肉製品に

食肉製品はヨーロッパ各地で発達し，食塩や亜硝保健効果を付与することが検討されている。しか酸塩の添加，原料や環境に由来する微生物の利用しながら，そのような菌株が食肉中で良好な生育© The Ito Foundation

2

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

ら生育度（％）を求めた。またoxgallの最小生育を示すとは限らない。
発酵食肉製品以外にも環境因子として低水分活阻止濃度を求めた。

性，高塩濃度および低pHを有する発酵食品があ2.3る。我が国で伝統的に製造されている熟れ鮨（ナ

人工胃液耐性試験は，人工胃液耐性試験増殖用レズシ）である。熟れ鮨は乳酸菌を利用した発酵培地（市販牛乳98ｇ，脱脂粉乳（雪印）1.5ｇ，食品であり，特に琵琶湖周辺で製造されている酵母エキス0.5ｇ）を用いて37℃，24時間培養し「鮒ずし」は，我が国に現存する熟れ鮨の中ではた培養液，市販牛乳および4.0％ペプシン（シグ最も古い形態を残していると考えられている 。

マ）溶液を，それぞれ25，74および１の割合で混製造方法は，桶に飯，フナ，飯，フナの順に入れ合し，塩酸を用いてpHを2.5に調整したものを人積み上げた後，竹の皮で蓋をし，重石をする。１

工胃液混合物とした。人工胃液混合物を37℃に保～２日間はそのままにし，次に水を表面まで張

持し，０，
１，
２および３時間後の生菌数をMRS

り，１～２年間漬込み発酵させたものである。発寒天培地を用いて測定した。

11）

人工胃液耐性試験16）

酵食肉製品と同様に，環境因子として低水分活

2.4

人工腸液耐性試験16）性，高塩濃度および低pHなどが挙げられる12，13）。

人工腸液基礎培地（市販牛乳97.6ｇ，脱脂粉乳

このように発酵食肉製品と鮒ずしは微生物の生育1.5ｇ，酵母エキス0.5ｇ，ウシ胆汁沫0.4ｇ），10％

環境に共通点を持つが，鮒ずし由来の乳酸菌を利ト リ プ シ ン（和 光 純 薬）溶 液 お よ び pH4.0 で用した発酵食肉製品の検討はこれまでほとんどさ

37℃，１時間培養後の人工胃液混合物をそれぞれれていない。

96，１および３の割合で混合したものを人工腸液

本研究では鮒ずし由来の乳酸菌を利用した発酵混合物とした。嫌気ジャー（BBL）を用いて人工食肉製品およびその機能性について検討した。す腸液混合物を37℃で嫌気的に保持し，０，６，12

なわち，発酵食肉製品中での乳酸菌の生育性，ヒおよび24時間後の生菌数を測定した。

トの各種消化液に対する耐性および発酵食肉製品

2.5のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。

発 酵 食 肉 の 調 製 は 中 江 ら 17） を 参 考 に し た

２．方

食肉の発酵

（Table １）。牛すね肉，豚背脂肪およびタマネギ

法は４mmのミンチにして用いた。菌体懸濁液は，菌株をMRS液体培地で継代培養したのち遠心分

2 . 1 使用菌株
試 験 に は Lactobacillus plantarum JAB2001 を用いた。この菌株は琵琶湖周辺の伝統的乳酸発酵
食品「鮒ずし」を分離源とするものであり，生理

Table１ Component of fermented meat
Component

Ratio（％）

学的諸性質および16S rDNAの解析結果から菌種

Beef shankを同定したものである14）。

Porcine backfat

15

Common salt

2.0

Potassium nitrate

0.05

Glucose

0.5

White pepper

0.2

MRS液体培地にそれぞれ接種し37℃で６時間培

Onion

9

養後の濁度を620nmで測定し，両者の濁度の比か

Cell suspension

1.0

2.2

胆汁酸耐性の測定

WalkerとGillilandの方法を参考にして行った15）。
MRS液体培地およびoxgall（Difco）を0.3％含む© The Ito Foundation

72.3

3

発酵食肉製品由来の機能性ペプチドに関する研究

離（1,000×Ｇ，10分）して集菌・菌体洗浄を繰

阻害活性（％）＝（Ec－Es)／(Ec－Eb）×100

り返したのち等量の水に懸濁したものを用いた。

Es，EcおよびEbはそれぞれ試料，対照および調製食肉に菌体懸濁液を１％加え25℃，約80％
RHで48時間培養したものを発酵食肉とした。

ブランクのOD228を示す。
2.7

ACE阻害ペプチドの粗精製

発酵食肉３ｇを30mlの滅菌蒸留水に懸濁し，

発酵食肉100ｇを500mLの水に懸濁し70℃で30pHを測定した。また，生菌数はこの懸濁液を分間の加熱処理後，遠心分離（10,000×Ｇ，20分）

MRS寒天培地（pH5.4）に塗抹し，48時間30℃でした。回収した上澄液のpHを8.3に調整したのち，培養後に形成した集落を計数して求めた。

1.5Ｌの冷エタノールを徐々に加え生成した沈殿

2.6

ACE阻害活性の測定物を除去したものをエバポレーターで約300mLまACE阻害活性はCushmanとCheungの方法

18）を参考に以下の方法で測定した。アンギオテンシン

で濃縮した。濃縮液を凍結乾燥し，得られた粉末を10mLの水に溶解したものを試料とした。

変換酵素（ウサギ肺製，SIGMA）1 unitを２mL

試料を逆相液体クロマトグラフィー（Ｌ- 6200の50％グリセロールに溶解せしめ冷凍保存し，使シ ス テ ム ，HITACHI）に 供 し た 。カ ラ ム は

用時にはほう酸緩衝液（pH8.3，300mM NaCl，

TSKgel ODS-100V（東ソー）を用い，流速1.020μM ZnCl２）で５倍希釈した。馬尿酸―ヒスチ

mL/min，吸光波長215nmで測定した。移動相にジルロイシン（SIGMA）53.688mgを上記ほう酸は0.05％

緩衝液10mLに溶解せしめたものを基質溶液としトニトリル溶液でグラジエントをかけた。５分毎冷凍保存した。発酵食肉を５倍量の水に懸濁しに分画し，集めた画分を凍結乾燥したのち水に溶

70℃で30分間の加熱処理後，遠心分離（10,000×

解し，ACE阻害活性を測定した。ACE阻害活性

Ｇ，20分）し，回収した上澄液のpHを8.3に調整を示した画分を上記の条件で再び分画した。

したのち，再度遠心分離して得られた上澄液を試ACE阻害活性を示した画分は，同HPLCシステム料とした。

と サ イ ズ 排 除 カ ラ ム （Superdex Peptide HR

TFA水溶液を用い，0.05％

TFAアセ

試料50μＬおよびACE溶液25μＬを混和し，10/300 GL）を用いて分画し，ACE阻害活性を示

37℃の水浴で10分間反応させたのち，基質溶液50

す画分を再び上記の逆相液体クロマトグラフィー

μＬを加え，37℃の水浴で60分間反応させた。そに供し，同条件で分画した。

の後，反応溶液に反応停止液として0.5N HClを
125μＬ加えたのち，酢酸エチル

700μＬを加え３．結果と考察撹拌した。遠心分離（1,200×Ｇ，５分）し，上3.1

各種消化液に対する耐性層部（酢酸エチル層）500μＬを試験管にとり，Lactobacillus plantarum JAB2001 は oxgall を

濃縮遠心機に20分間かけた。乾固物に1.0mLの蒸0.3％含む培地における生育率が41％と高い値を留水を加え，この溶液の紫外部吸光度（228nm）示した。また，本菌株のoxgallに対する最小生育を測定し，溶液中の遊離馬尿酸量を測定した。対阻止濃度は20％であった。

照には試料の代わりに未発酵調製肉抽出液あるい

消化管を生きて通過することが求められるプロは蒸留水を用いた。ブランクには対照にあらかじ

バイオティクス乳酸菌にとって，胆汁酸に耐性をめ0.5N HCl

125μＬを加えたものを用いた。

有する事は必要不可欠である。胆汁酸は十二指腸阻害活性（％）は以下の計算式で求めた。

において分泌され，界面活性効果を有するため細© The Ito Foundation

4

Viable cell counts（log cfu/ml）

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

9.0
gastric juice pH2.5

intestinal juice

8.0
7.0
6.0
5.0

0

1

time（h）

2

3

Figure 1 Viable cell counts of L. plantarum JAB2001 in simulated gastric juice (pH2.5) and intestinal juice．

7

9
8

6
viable cell counts

7

pH

pH

Viable cell counts（log cfu/g）

10

6

5

5
4

0

1

2

3

4
5
time（h）

6

7

8

4

Figure 2 pH values and viable cell counts of L. plantarum JAB2001 in the fermented meat patty．

菌の細胞膜を構成する脂質を分解し，殺菌作用をこのことから，pH2.5に調整した人工胃液中で３示す。胆汁酸の濃度は食後一時間程度は約２％程

時間後まで菌数を維持できた本菌株は，経口接種

度であるが，その後0.3％程度まで低下する 。本後生きて消化管を通過し，腸液中で生育すること

菌株はoxgallが20％でも生育できるため，生きてができると考えられる。

19）

3.2

腸管を通過する可能性が高い。

食肉の発酵試験

人工胃液および人工腸液に対する耐性試験の結食肉を本菌株で発酵した時のpHおよび生菌数果を示した。本菌株はpH2.5に調整した人工胃液を測定した。食肉のpHは48時間発酵後に4.8程度に３時間晒されても菌数の減少は見られなかっまで減少しその後ほぼ一定を保った。このときのた。また，人工腸液中では生育性を示し，菌数は

生菌数は約９log cfu/gであった。生菌数測定の増加した（Figure １）。

為に用いた平板培地上の集落を無作為に釣菌し単胃液のpHは通常時は約１程度であるが，食後に離したのち，それぞれの生理学的諸性質を調べたは約３程度にまで上昇する。また，食事成分が胃結果，いずれもL. plantarum JAB2001と同等でを通過するには２～４時間程度かかるとされる 。

あった。また，培養時間が進むにつれ平板状に形

20）© The Ito Foundation

発酵食肉製品由来の機能性ペプチドに関する研究
Table 2 ACE inhibitory activities of 7 fractions after

reverse-phase HPLC, size-exclusion HPLC andreverse-phase HPLC5チドの分子量は，サイズ排除HPLCの結果から
300－1,000と推測された。また，現在アミノ酸配列を解析しており，３残基目までの配列がGlu-

Fraction＊

ACE Inhibitory activity（％）

１

ND＊

Lys-Glnである結果を得ている。ちなみに３残基

２ND目までの配列でペプチド合成したものではACE

３ND

阻害活性が見られなかった。

４

ND

５

ND

６

ND

７

61.2

本研究では鮒ずし由来乳酸菌を応用した機能性

８

ND

発酵食肉製品について検討した。Lactobacillus

４．要＊：Not Determined（less than ５％ ACE inhibitory activity）

約

plantarum JAB2001は牛挽肉のパティ中で生育することができ，25℃で36時間培養したときのpH状の異なる集落が現れたが，これらは食肉由来のは5.0であった。本菌株は各種消化液に対して耐乳酸菌と考えられた（Figure ２）。

性を示したため，この菌株で調製した発酵食肉製

発酵食肉製品における乳酸菌の主な働きの一つ

品を経口摂取した場合，生きて腸内に届き宿主には乳酸の生成である。酸度は肉の硬さや色調に大有益な影響を与えることが期待できる。また，こきな影響をおよぼす。すなわち，筋タンパクの結の発酵食肉製品の抽出液はACE阻害活性を示し

着やニトロソミオグロビンの発色は低pHで進む

たため，HPLCを用いて阻害ペプチドを単離精製とされる４）。ただし，酸度が高すぎる場合には肉を試みた。このペプチドの詳細なアミノ酸配列はのテクスチャーはむしろ悪化し，色調も劣化して不明であるが，おそらく修飾アミノ酸を含んでいくる。そのため，最適なpHはおおよそ5.0付近とると考えられた。今後はこのペプチドのアミノ酸考えられる。実際，種々の発酵食肉製品を官能評

配列をより詳細に解析していく予定である。

価した際にpH5.0の製品が最も評価が高いという報告がある21）。本菌株を用いた場合，およそ36時
間でpH5.0に達することができた。これはイタリア
ンサラミなどの発酵食肉製品と同等の発酵時間21）であるため，本菌株は発酵食肉製品への応用性が高いと考えられる。
3.3

ACE阻害ペプチドの精製

JAB2001株で調製した発酵食肉製品の抽出液を逆相HPLCに供し，高いACE阻害活性を示した画
分をサイズ排除カラムに供試し，最後に再び逆相
HPLCに供し，高いACE阻害活性を示した画分をアミノ酸配列解析に供した（Table ２）。その結果，画分７において最も高いACE阻害活性が確認できた。この画分７に含まれるACE阻害ペプ

文 献
１）
 Fuller R. ： Probiotics in man and animals. J.
Appl. Bacteriol．，66，365～378，1989．
２）
 FAO/WHO. Guidelines for the evaluation ofprobiotics in food. Report of a joint FAO/WHO
working group on drafting guidelines for theevaluation of probiotics in food. London, Ontario,
Canada，2002．
３）
 Pennacchia C., Vaughan E. E. and Villani F. ：Potential probiotic Lactobacillus strains fromfermented sausages: Further investigations on
their probiotic properties. Meat Sci ．， 73 ， 90 ～
101，2006．
４）
 Ammor M. S. and Mayo B.：Selection criteria for
lactic acid bacteria to be used as functional starter
cultures in dry sausage production: An update.
Meat Sci．，76，138～146，2007．
５）
 Ruiz-Moyano S., Martin A., Benito M. J., Nevado F.
P. and Cordoba M. G.：Screening of lactic acid

© The Ito Foundation

6

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

bacteria and bifidobacteria for potential probiotic
use in Iberian dry fermented sausages. Meat Sci．，
80，715～721，2008．
６） De Vuyst L., Falony G. and Leroy F. ： Probiotics
in fermented sausages. Meat Sci ．， 80 ， 75 ～ 78 ，
2008．
７） 森田英利：発酵食肉製品における細菌の有用性，
食肉の科学，38，189～203，1997．
８） Sameshima T., Magome C., Takeshita K., Arihara
K . , I t o h M . K o n d o Y . ：E f f e c t o f i n t e s t i n a l
Lactobacillus starter cultures on the behavior of
Staphylococcus aureus in fermented sausage. Int. J.
Food Microbiol．，41，１～７，1998．
９） Erkkilä S., Suihko M. L., Eerola S., Petäjä E.
Mattila-Sandholm T.：Dry sausage fermented by
Lactobacillus rhamnosus strains. Int. J. Food
Microbiol．，64，205～210，2001．
10） Pidcock K., Heard G. M. and Henriksson A.：
Application of nontraditional meat starter culturesin production of Hungarian salami. Int. J. Food
Microbiol．，76，75～81，2002．
11） 藤井建夫，西 忠嗣，奥積昌世：ふなずしの化学成分と微生物相，山脇学園短期大学紀要，46，90～
103，2008．
12） Kubo K.M., Ogawa Y. and Horikoshi M.：The
effects of free amino acids, nucleic compounds, andvolatile constituents of funazushi（fermented sushi
of crucian carp（Cyprinus auratus））on preference.
J. Sci. Food Agric．，88，1259～1265，2008．
13） An C., Takahashi H., Kimura B. and Kuda T.：
Comparison of PCR-DGGE and PCR-SSCP analysis
for bacterial flora of Japanese traditional fermented
fish products, aji-narezushi and iwashi-nukazuke. J.
Sci. Food Agric．，90，1796～1801，2010．
14） Tsuda H., Kubota K., Matsumoto T. Ishimi Y. ：Isolation and identification of lactic acid bacteria in
traditional fermented sushi, Funazushi, from Japan.
Food Sci. Technol. Res．，18，77～82，2012．
15）
 Walker D. K. Gilliland S. E.：Relationships among
bile tolerance, bile salt deconjugation, andassimilation of cholesterol by Lactobacillus
acidophilus. J. Dairy Sci．，76，956～961，1993．
16）
 Takiguchi R., Mochizuki E., Suzuki Y., NakajimaI., Benno Y.：Inhibitory effects of Lactobacillus
acidophilus SBT2062 and Bifidobacterium longum
SBT2928 on harmful intestinal bacteria. J. Intest.
Microbiol．，11，11～17，1997．
17） 中江利孝，片岡 啓，宮本 拓：発酵ひき肉製品の製造と生化学的性状に関する研究，食肉に関する助成研究調査成果報告書，５，298～304，1986．
18）
 Cushman D. W. and Cheung H. S.：
Spectrophotometric assay and properties of theangiotensin-converting enzyme of rabbit lung.
Biochem. Pharmacol．，20，1637～1648，1971．
19）
 Noriega L., Gueimonde, M., Sanchez, B., Margolles
A., Reyes-Gavilan, C. G.：Effect of the adaptation tohigh bile salts concentrations on glycosidic activity,
survival at low pH and cross-resistance to bile salts
in Bifidobacterium. Int. J. Food Microbiol．，92，79～86，2004．
20）
 Pennacchia C., Ercolini D., Blaiotta G., Pepe O.,
Mauriello G. Villani F.：Selection of Lactobacillus
strains from fermented sausages for their potential
use as probiotics. Meat Sci．，67，309～317，2004．
21）
 沼田正寛：発酵食肉製品，食肉の科学，35，171～180，1994．

© The Ito Foundation

7

食肉内部への食中毒菌の侵入に影響を与える因子の解明と電解水処理による殺菌法の確立
Elucidating the factors influencing the invasion to the meat insideby food poisoning bacteria and antimicrobiological effect andapplication of electrolyzed water

島

村

裕

子・増

田

修

一

（静岡県立大学食品栄養科学部）

Yuko Shimamura and Shuichi Masuda（School of Food and Nutritional Sciences, University of Shizuoka）

Elucidating the factors influencing the invasion of food poisoning bacteria to the meat
inside by and anticmicrobial effect of combination treatment with alkaline electrolyzed water（AlEW）and strong acidic electrolyzed water（StAEW）on fresh chicken breast meat and beefliver were evaluated in this study. When bacteria attached to the upper surface site of themeat for 1h at room temperature, bacteria invaded internal １㎝ regardless of fiber direction of
the meat. Similarly, when bacteria attached to the lower or side surface site of the meat,bacteria invaded internal １cm regardless of fiber direction of the meat. Although in the beefliver samples with the thin skin, bacteria did not invade in more than １ ㎝，bacteria could
invade liver without the thin skin from the upper surface site to ２㎝．These results suggested
that the invasion of bacteria is involved in not only the structure of the meat but also thegravity and gravy of the meat. Next, meat samples（each of 1 ～ 10 g）were experimentally
inoculated with bacteria, and subjected to dipping combination treatment（20℃ for 3 min）with
AlEW and StAEW. Dipping combination treatment with alkaline and acidic electrolyzed watersignificantly reduced the pathogens compared to untreated controls. The reduction of about 1
log CFU/g was achieved by combination treatment. From these results, combination
treatments extended the shelf life of chicken meat and beef at 4℃ with marginal changes of
sensory quality. In the future, we should find more effective washing methods to control
microbial pathogens in meat．

１．目

らず，大量の食肉に適応できる殺菌技術の確立は的緊急課題となっている。野菜類の微生物制御に関2011 年 ，ユ ッ ケ で 起 き た 腸 管 出 血 性 大 腸 菌して，2002年に微酸性電解水が食品添加物に認定

Ｏ-111による集団食中毒事件を機に，消費者の食されており，微生物制御に使用されている１）。し肉の安全性に対する不安が高まっている。食肉にかし，酸性電解水は材料中の有機物の存在により関しては，現在も有効な殺菌方法が確立されてお殺菌効果が弱まる，また洗浄に使用する装置の金© The Ito Foundation

8

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

属が腐食する等の問題点があることから，食肉に１時間放置した。放置後，汚染面表面，①表面か対して酸性電解水を使用した具体的な洗浄・殺菌

ら１cm，②表面から１～２cm，③表面から２～技術に関する研究はほとんど行われていない。ま４cm，④表面から４～６cmに切り分け，各々のた，食肉の食中毒菌における汚染において，食中部位の菌数を測定した。

毒菌が単に表面に付着しているだけでなく，食肉

2.2

内部にまで侵入した場合，洗浄や表面の加熱のみ

電解水を用いた洗浄・殺菌方法の最適条
件の検討では，除去・除菌できない可能性がある。そのた

牛レバー，鶏むね肉各10 ｇに各種食中毒菌をめ，食肉内部への食中毒菌の侵入に影響を与える

10 ～10４CFU/gとなるように接種し，100 mLの因子について明らかにすることは，汚染防御を考

アルカリ性電解水（ガイアウォーター（株）；ガ

える上で重要である。影響する因子としては，食イア，pH11.5，20±５℃）に３分間浸漬して表面中毒菌の濃度，菌株の種類，食肉の種類や鮮度，の有機物を除去した。次いで100 mLの酸性電解水

温度などが考えられるが，これらに関する知見は（ガイアウォーター（株）；ACC14±1.5 mg/Ｌ，少ない。また，食肉に対する微生物の付着機構とORP＝960±５mV，pH2.5，20±５℃）で中和後，しては，食肉に含まれる細胞外マトリックスタン

さらに100 mLの酸性電解水に３分間浸漬して殺菌

パク質（コラーゲン，フィブロネクチン，ラミニン

処理を行い，100 mLのアルカリ性電解水で中和処等）に微生物が付着することが報告されている理を行った。殺菌処理後，菌を接種した食肉の菌が，実際の食肉を用いた研究報告は少なく，いま数を測定した。

２，３）

３

だ不明な点が多い。そこで，本研究では，食中毒

2.3

菌の侵入に影響を与える因子の解明，アルカリ菌未接種の食肉（鶏むね肉，牛もも肉，牛レ性・酸性電解水併用処理を用いた食肉の新規殺菌バー）を2.1と同様に電解水で処理して４℃で０法の確立，電解水併用処理後の食肉の品質評価の～７日間保存し，各種機器分析および官能検査を３項目について検討し，効果的な食肉の殺菌方法

用いて品質を評価した。電解水と同様の処理を滅を見出すとともに，と畜後の枝肉の殺菌に適応で菌水で行った生肉をコントロールとした。

きる新規技術の確立を目的とした。

（１） 肉色の測定

2.1

肉色の色差の測定は，色差計CR-300（ミノル法

２．方

各種機器分析による食肉の評価タ）を使用した。

食肉内部への食中毒菌の侵入に影響を与（２） pH測定
各生肉サンプル５ｇに滅菌水45 mLを加え，ミえる因子の解明
切断面の繊維の方向が垂直または平行の鶏むね

キサーで１分間ホモジナイズした。ホモジナイズ

肉，および薄皮あり，またはなしの牛レバー（縦後，2,000×gで20分間遠心分離し，上清の溶液の３cm×横３cm×高さ６cm）の上部表面，側部pHをpHメーター（pH METER F-21; HORIBA）

表 面 ， 下 部 表 面 （表 面 積 ９ cm ） ににより測定した。

Staphylococcus aureus C-29， Salmonella（３） 食肉中の脂質酸化度の測定

enteritidis NBRC3313 お よ び Escherichia coli

各生肉サンプル10ｇに10％（w/v）トリクロロ

JCM2449を各々浸み込ませたペーパーディスク

酢酸溶液20 mLを加えミキサーで１分間ホモジナ（10 ～10 CFU/100μL）を置き，室温で５分，イズし，2,300×g，30分間，５℃で遠心分離を行

２

３

４

© The Ito Foundation

9

食肉内部への食中毒菌の侵入に影響を与える因子の解明と電解水処理による殺菌法の確立

い，上清をろ過した。ろ液から２mL採取して20処理肉（対照区）があることを説明した。それぞmMチオバルビツール酸溶液２mLを加え，混合れの食肉を対照区と区別して，各評価項目についした後，97℃の温浴中で20分間加温した。室温でて，優れているか，もしくは劣っているかを５段冷却した後，分光光度計を用いて波長532 nmで階評価でアンケート用紙に従い選択してもらっ測定した。

た。評価項目は，鮮度，硬さ，腐敗度，臭気，総（４） 遊離アミノ酸組成分析

合評価の５項目で，未処理肉（対照区）と比較し各生肉サンプル10ｇに２％スルホサリチル酸て，とても良い（とても硬い）：５点，良い（硬40 mLを加え，１分間ホモジナイズし，3,000×gい）：４点，普通：３点，悪い（柔らかい）：２点，で10分間遠心分離を行い，中間層をさらに10,000

とても悪い（とても柔らかい）：１点とした。コ×gで遠心分離して得られる透明層を試料とした。

ントロールは各項目一律３点と指定して，評価し分析はAmino Acid Analyzer L―8900（日立ハイてもらった。サンプルを評価する順序はパネルにテクノロジーズ）を用い，カラムは＃2622SC-PF一任した。

（φ4.6 mmｘ80 mm；日立ハイテクノロジーズ）

2.5で分析した。

データは各群の平均値および標準偏差を算出

2.4

官能検査による食肉の評価

統計処理

し，両群間で等分散性の検定（Ｆ検定）を行い，各生肉サンプルについて，９名をパネルとした等分散の場合はStudentのＴ検定，不等分散の場

２点嗜好試験法（両側検定）による官能検査を

合はAspin-Welchの検定により統計学的有意差検行った。パネルの内訳は20代男性１名，20代女性定を行った。なお，有意水準は５％とし，片側検５名，30代女性１名，40代女性１名および40代男

定で実施した。

性１名である。各パネルには，電解水処理肉と未Table 1 Elucidating the factors influencing the invasion of food poisoning bacteria to the chicken breast meat inside．
Verticaldirection

５min

１ｈ

Horizontal
direction

５min

１ｈ

Bacterial
strains

ControlSurface

Surface～１cm

１cm～２cm

２cm～４cm

４cm～６cm

S. aureus

9.0ｘ10５±119.0

5.9ｘ10３±175.4

7.0ｘ10２±11.4

＞10

＞10

＞10

Sa. Enteritidis

6.1ｘ10５±233.5

3.4ｘ10３±189.0

3.2ｘ10３±88.6

＞10

＞10

＞10

E. coli

8.2ｘ10５±83.0

3.7ｘ10３±73.6

3.6ｘ10３±19.0

＞10

＞10

＞10

S. aureus

2.7ｘ10５±44.8

1.9ｘ10３±72.55.2ｘ10２±12.6

＞10

＞10

＞10

Sa. Enteritidis

6.7ｘ10５±177.0

3.3ｘ10３±142.7

5.0ｘ10３±227.1

＞10

＞10

＞10

E. coli

1.1ｘ10６±155.5

3.5ｘ10３±131.4

5.2ｘ10３±166.2

＞10

＞10

＞10

Bacterial
strains

ControlSurface

Surface～１cm

１cm～２cm

２cm～４cm

４cm～６cm

S. aureus

9.0ｘ10５±119.0

6.1ｘ10３±116.7

8.4ｘ10２±29.5

＞10

＞10

＞10

Sa. Enteritidis

6.1ｘ10５±233.5

3.0ｘ10３±225.0

3.2ｘ10３±102.7

＞10

＞10

＞10

E. coli

8.7ｘ10５±10.0

8.2ｘ10３±83.0

3.5ｘ10３±136.2

＞10

＞10

＞10

S. aureus

2.9ｘ10５±41.3

1.2ｘ10３±10.6

1.2ｘ10３±98.7

＞10

＞10

＞10

Sa. Enteritidis

5.1ｘ10５±64.42.2ｘ10３±42.52.2ｘ10３±94.8

＞10

＞10

＞10

E. coli

1.5ｘ10６±298.2

9.2ｘ10３±145.7

5.2ｘ10３±69.9

＞10

＞10

＞10

Values represent the mean ± SD for six independent experiments．

© The Ito Foundation

10

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 2 Elucidating the factors influencing the invasion of food poisoning bacteria to the beef liver inside．
Verticaldirection

５min

１ｈ

Horizontal
direction

５min

１ｈ

Bacterial
strains

ControlSurface

Surface～１cm

１cm～２cm

２cm～４cm

４cm～６cm

S. aureus

5.7ｘ10５±49.2

4.8ｘ10３±239.3

5.4ｘ10２±7.9

＞10

＞10

＞10

Sa. Enteritidis

3.5ｘ10５±181.6

3.3ｘ10３±64.3

9.2ｘ10２±14.9

＞10

＞10

＞10

E. coli

6.9ｘ10５±178.0

5.8ｘ10３±169.1

1.7ｘ10３±143.7

＞10

＞10

＞10

S. aureus

7.5ｘ10５±486.5

7.0ｘ10３±358.4

3.2ｘ10２±11.4

＞10

＞10

＞10

Sa. Enteritidis

7.4ｘ10５±543.5

2.1ｘ10３±46.9

2.1ｘ10２±22.3

＞10

＞10

＞10

E. coli

1.1ｘ10６±480.7

7.5ｘ10３±342.0

6.9ｘ10２±13.8

＞10

＞10

＞10

Bacterial
strains

ControlSurface

Surface～１cm

１cm～２cm

２cm～４cm

４cm～６cm

S. aureus

5.7ｘ10５±49.2

5.0ｘ10３±266.8

5.8ｘ10２±9.6

＞10

＞10

＞10

Sa. Enteritidis

3.5ｘ10５±181.6

3.0ｘ10３±123.0

1.3ｘ10３±20.5

＞10

＞10

＞10

E. coli

6.9ｘ10５±178.0

3.8ｘ10３±215.4

5.1ｘ10３±35.5

1.3ｘ10３±56.3

＞10

＞10

S. aureus

6.5ｘ10５±293.6

3.7ｘ10３±319.8

1.5ｘ10３±40.7

1.3ｘ10２±1.5.3

＞10

＞10

Sa. Enteritidis

8.3ｘ10５±450.7

2.6ｘ10３±143.3

3.3ｘ10３±263.7

7.1ｘ10２±16.5

＞10

＞10

E. coli

9.9ｘ10５±593.8

4.4ｘ10３±194.5

2.2ｘ10３±139.1

1.5ｘ10２±2.94

＞10

＞10

Values represent the mean ± SD for six independent experiments．

100
90

Residual bacterial cells (%)

80
70
＊

60
50

＊

＊

40
＊

30

＊

20

＊

＊

＊＊

10
0

＊

＊
＊

Control

Chicken breast 1g

S. aureus

Chicken breast 5g

Beef liver 1g

＊

＊

＊

Sa. Enteritidis

Chicken breast 10g＊＊

E. coli
Beef liver 5g

Beef liver 10g

Fig.1 Effect of combination treatment with alkaline and acidic electrolyzed water on sterilization and quality of meat.

Values represent the mean ± SD for six independent experiments．＊represents p＜0.05, compared to control．

線維が平行または垂直に走っている鶏むね肉の３．結果と考察3.1

上部表面に菌を付着させた場合，５分または１時

食肉内部への食中毒菌の侵入に影響を与える因子の解明

間ともに内部１㎝までの侵入に留まった（Table１）。牛レバーでは，薄皮が付いた面に菌を付着© The Ito Foundation

11

食肉内部への食中毒菌の侵入に影響を与える因子の解明と電解水処理による殺菌法の確立

3.2

させた場合，すべての付着時間において，菌は表

電解水を用いた洗浄・殺菌方法の最適条
件の検討

面～１cmまでの断片に留まった。一方，薄皮が付いていない面に菌を付着させた場合，５分間で電解水併用処理により，各食肉ともに101CFU/

は菌は１cmまでの断片に留まったが，１時間でgオーダーの菌数減少が認められ，平均菌減少率

は，上部表面～２cmまで内部に侵入した（Table

は約７～８割程度を示し，電解水併用処理は効果

２）。また，食肉の下部または側部表面に菌を付的な殺菌方法であることが明らかとなった（Fig．

着させた場合，いずれの試料においても菌付着面１）。しかし，電解水併用処理を行った食肉でも，から内部１cmまでの断片に菌が留まった。食肉

３～４log CFU/gの菌が残存しており，肉の表面の下部または側部表面に菌を付着させた場合，線に存在する脂肪やタンパク質等の有機物が殺菌効

維の方向に関係なく，１cmまでの断片に留まっ果に影響していると考えられた。また，食中毒菌たことから，菌の侵入は，線維の方向だけでなく，の種類の違いによる影響は認められなかった。今

重力や肉汁等の物理的要因も関与していることが後，さらに電解水併用処理における攪拌方法や温示唆された。

度を変更し，より効果的な殺菌方法を検討してい

（B）

7

6.5

6.5

6

6

pH value

pH value

（A）

7

5.5
5

Control

4.5425Strage day（d）

5

4

7

（C）

5

5

Control

4

EW treatment

3
2
1
0

0

2
5
Storage day（d）

7

（D）

TBARS

TBARS

4

Control
EW treatment

4.5

EW treatment
0

5.5

Control
EW treatment

3
2
1

0

2

5

7

0

Storage day（d）

0

2

5

7

Strage day（d）

Fig.2 Changes in pH of treated and untreated chicken breast meat（A）and beef liver（B）samples during storage at

refrigeration temperature（4℃）．Changes in TBARS of treated and untreated chicken breast meat（C）and beefliver（D）samples during storage at refrigeration temperature（4℃）．Electrolyzed water（EW）treatment
solutions were alkaline electrolyzed water and strong acidic electrolyzed water. Values represent the mean ± SD
for six independent experiments．＊represents p＜0.05, compared to control．

© The Ito Foundation

12

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

く必要がある。
3.3

について検討し，効果的な食肉の殺菌方法を見出

各種機器分析による食肉の評価

すとともに，と畜後の枝肉の殺菌に適応できる新

色差計を用いた肉色の測定では，電解水併用処規技術の確立を目的とした。

理後の鶏むね肉でＬ 値が有意に高くなったが，食肉の上部表面に菌を付着させ，１時間放置しその他の肉においては，有意差は認められなかった場合，食肉の線維の方向（平行，垂直）に関係た 。電 解 水 併 用 処 理 後 の 各 食 肉 の pH（Fig. ２なく，内部１cm以上侵入しなかった。また，薄（Ａ），（Ｂ）），脂 質 酸 化 度（Fig. ２（Ｃ），（Ｄ））

皮ありの牛レバーでは内部１cm以上侵入しなおよび遊離アミノ酸含有量に有意差は認められなかったのに対し，薄皮なしの牛レバーでは，上部かった。電解水併用処理後の各食肉の硬さは，有表面～２cmまで内部に侵入した。さらに，食肉

意に硬いと評価されたが，鮮度，臭気，総合評価の下部または側部表面に菌を付着させた場合，線等に有意差は認められなかった（Table ３）。以維の方向に関係なく，内部１cmまでの侵入に留上の結果より，電解水併用処理により，表面に付まったことから，菌の侵入は食肉の構造だけでな着した食中毒菌を殺菌可能であり，食肉の品質劣く，重力や肉汁等の物理的要因も関与しているこ化は認められないことを明らかにした。

とが示唆された。アルカリ性および酸性電解水併＊用処理による食肉の殺菌効果を検討したところ，

約

４．要すべての試料で１log CFU/g以上の菌数減少が認

食肉の安全性を確保し，チルドパックされた食められた。さらに，電解水併用処理後の食肉の品

肉のシェルフライフを延長するためには，微生物質を評価したところ，いずれの項目においても食の制御が不可欠である。本研究では，食中毒菌の肉の劣化は認められず，電解水併用処理は，食肉侵入に影響を与える因子の解明，アルカリ性・酸の殺菌に実用可能であることが明らかとなった。

性電解水併用処理を用いた食肉の新規殺菌法の確

本研究では，食中毒菌の食肉への付着・侵入機構

立，電解水併用処理後の食肉の品質評価の３項目を明らかにすることで，アルカリ性および酸性電

Table 3 Sensory evaluation of chicken breast meat and beef liver treated with electrolyzed water（EW）during storage

at 4℃．
Chicken breast meat

Sensory
attributes
Freshness

Texture

Decay

Odor

Overall

Beef liver

０day

２days

５days

７days

０day

２days

５days

７days

Control2.9±0.4

2.9±1.1

3.0±0.7

2.9±0.3

3.0±0.3

3.0±0.7

3.0±1.0

3.2±0.5

EW treatment

3.0±0.9

2.9±0.8

2.9±0.7

2.6±0.8

3.0±0.0

3.0±0.8

3.0±0.9

2.7±0.8

Control2.9±0.9

2.8±0.7

3.1±0.9

3.2±0.7

2.9±0.5

2.9±0.7

2.9±0.7

3.0±0.5

EW treatment

3.5±1.1

3.4±1.0＊

3.6±0.8＊

3.5±1.0

3.5±0.8＊

3.5±0.8＊

3.8±0.8＊

3.5±0.7＊

Control

3.0±0.0

3.1±0.8

3.0±0.5

2.9±0.4

3.0±0.0

3.1±0.8

3.1±0.9

3.3±0.7

EW treatment

3.3±0.6

3.1±0.6

3.0±0.6

2.8±0.8＊

3.1±0.2

3.3±0.8

2.6±0.7

2.9±0.8

Control

3.0±0.5

3.0±0.5

2.9±0.7

2.9±0.4

3.0±0.8

2.9±0.4

3.0±0.8

3.1±0.3

EW treatment

2.9±0.6

3.0±0.4

2.8±0.4

2.7±0.6

2.9±0.8

2.8±0.6

2.8±0.6

2.9±0.5

Control

3.0±0.5

3.0±0.8

3.0±0.6

3.0±0.5

3.0±0.3

3.0±0.7

3.0±0.9

3.2±0.5

3.2±0.8

2.9±0.7＊

3.0±0.7

3.0±0.6

3.2±0.9

2.9±0.6

2.9±0.9

EW treatment

3.2±0.9

Sensory attributes（scores）reported as mean ± standard deviation, n＝２×３．＊represents p＜0.05, compared to control.
Sensory scores were based on 5-point descriptive scale, where１＝poor，２＝fair，３＝good，４＝very good, and ５＝excellent．

© The Ito Foundation

食肉内部への食中毒菌の侵入に影響を与える因子の解明と電解水処理による殺菌法の確立

解水併用処理を用いた効果的な微生物制御法を見出すとともに，その有効性を明らかにした。今後，電解水併用処理を用いた更なる殺菌効果の向上を検討することで，と畜後の枝肉に適応できる実用スケールの殺菌・洗浄装置が開発されることが期
待される。

13

文 献
１）
 Rahman SM, Ding T, Oh DH.：Effectiveness of
low concentration electrolyzed water to inactivate
foodborne pathogens under different environmental
conditions. Int. J. Food Microbiol．，139，147～153，2010．
２）
 Zulfakar SS, White JD, Ross T, Tamplin ML.：
Bacterial attachment to immobilized extracellularmatrix proteins in vitro. Int. J. Food Microbiol．，
157，210～217，2012．
３）
 Zulfakar SS, White JD, Ross T, Tamplin ML：
Cultured C2C12 cell lines as a model for assessmentof bacterial attachment to bovine primary muscle
cells. Meat science，94，215～219，2013．

© The Ito Foundation

14

食肉製品の客観的嗜好性評価に関する研究（第２報）
Research on the objective evaluation for palatability of meat products（Ⅱ）

芳賀

聖一・林

利哉・山口

恭平・小川

幸彦＊

（名城大学農学部，＊名城大学農学部附属農場）

Seiichi Haga, Toshiya Hayashi, Kyohei Yamaguchi and Yukihiko Ogawa＊（Faculty of Agriculture, Meijo University, ＊Experimental Farm, Meijo University）

Evaluation of texture is essential criteria in developing and improving food products.
Sensory evaluation and instrumental measurements are normally used in research for foodpalatability. However, understanding of the relationship between instrumental analysis andsensory analysis is inadequate. In the previous study, we tried to elucidate the correlation
between sensory and instrumental parameters obtained from several kinds of model porksausages, and established texture prediction formula which can speculate palatability from theobjective values resulting in instrumental measurements by using multiple regression analysis
over the whole parameters. If the formula can express organoleptic evaluation value, it will bevery useful for not only food texture research but also food manufacturer．
In the present study, we tried to verify the usefulness of the prediction equation by using
instrumental parameters obtained from several kinds of model pork sausages with lactic acidfermentation（2 strains of Lactobacillus sakei）and/or with additive（20％ pork fat）．
The effects of fermentation on the cohesiveness and cooking loss of model pork sausage
were analyzed. As a result, both fermented model sausages had significantly lower
cohesiveness compared with control sausage（p ＜ 0.05），and cooking loss of fermented
sausages was considerably and significantly higher than those of control sausage（p ＜ 0.05）．
The cooking loss was markedly improved by adding fat（20％）to the fermented

sausages. Then we tried to estimate the palatability from the objective values by using the
texture prediction formula. Subsequently, the organoleptic evaluation values of the fermented
sausages with 20％ fat were estimated as higher than that of fermented sausages without fat．
Therefore, it is supported that this formula can presume organoleptic evaluation value
from objective data obtained from instrumental measurements．

１．目

について多面的に追究してきた１～３）。その結果，的様々な食肉製品が有する特徴的な機能特性が，そ著者らはこれまで，食肉加工に関わる様々な加の組織構造に支配されていることに加え，食感に工技術，すなわち乳酸発酵，レトルト加熱，凍結

関わる種々の物性値が構造に基づく視覚的情報に処理等の有用技術が食肉の加工特性に及ぼす影響

よって客観的かつ定量的に説明可能であること等© The Ito Foundation

食肉製品の客観的嗜好性評価に関する研究（第２報）

を見出している１，２）。

15塩漬した。低温発酵処理区においてはこの塩漬剤

一般に食品のおいしさ評価は官能評価によって添加の際に各乳酸菌スターターを添加し，低温下行われているが，あくまで個人差を伴う主観的な（４℃）にて５日間塩漬および発酵させた。塩漬評価であるため，より客観性を有する評価の確立

後，スタッファーにて充填（ポリ塩化ビニリデンが求められている 。特に食感は，食肉製品におケーシング，折径：40mm）を行い，75℃恒温槽

いて重要な特性の一つであるが，一方で客観的評

で中心部温度が63℃に達してから30分間加熱し，価がより困難な特性でもある。食感は食品がもつ

加熱後直ちに氷冷した。なお，発酵区については物性と関連深いとされており，機器測定による客当研究室で保有する低温増殖性乳酸菌

観的物性値で，主観的な官能評価値を表現するこ

Lactobacillus sakei D-1001，No．２（以下，それとができれば，官能評価に頼らずとも嗜好性を推

ぞ れ Ｄ -1001 ，No ．２ と 略 す）を そ れ ぞ れ 10 ６定できる極めて有益な手段となりえる。著者らは

CFU/g肉となるように接種した。

４）

前報 にて報告した通り，機器測定による物性値

また，物性改良の目的で，カッティング時間をと，人による官能評価特性との関連性を明らかに200秒とした以外は同じ要領で20％脂肪添加ソーするため，低温乳酸発酵処理を含む種々の加工処

セージを作製し，さらに同乳酸菌株による20％脂理を施した十数種類のモデルソーセージを作製

肪を含む発酵ソーセージも作製した。

５）

し，これらの物性測定および官能評価を実際に行

2.2モデルソーセージの機器測定と官能評価

い，両者の相関性について詳細に検討した上で，物性測定はレオナー（RE2-33005S，株式会社

重回帰分析により機器測定で得られた物性値か山電）を用いてテクスチャー測定を行い，凝集性ら，人による官能評価値を推定しうる有意な推定を求めた。またこれに加えて，加熱損失率（クッ

式を作成するに至っている。

キングロス）も測定した。

そこで本研究では，前報にて見出した推定式の官能評価は前報５）記載の通り，本学学生を対象

有用性を検証するため，保水性等の低下を示す発に嗜好型官能評価を実施した。評価項目は，「断酵モデルソーセージと，物性改良材としての脂肪面の色調」，「断面のきめ」，「断面の光沢」，「歯ごを添加した高脂肪モデルソーセージを作製し，機たえ」，「ジューシーさ」および「総合評価」の６器を用いた客観的評価と，その数値と推定式を活項目とし，評価方法は基準試料（control）と比用した官能評価推定値を求め，比較検討を行った。

べてそれぞれ「好き」か「嫌い」かの，嗜好型で

２．方
2.1

評価する７点尺度法を用いた。評価基準は基準試

法

料（control）を「０」とし，「－３」から「＋３」モデルソーセージの調製の７段階で実施した。

と殺後３日以内の豚モモ肉の脂肪および結合組織をできるだけ取り除き，約３cm角のブロック
肉に細切した。これに塩漬剤（2.0％
トリポリリン酸Na，0.02％

NaCl，0.3％

NaNO ２ ，0.05％

KNO３，0.05％アスコルビン酸Na），2.0％グルコー

2.3

データの標準数値化と統計解析

前報記載の通り，controlの値を常に「50」として，各処理区における測定値を「０～100」で表すことで官能評価値，機器測定値のすべてを標準数値化した。

スの添加および加水（砕氷：５％）を行い，60秒

標準数値化した数値を用いて，官能評価値と客間カッティングした後，低温下（４℃）で３日間

観的評価値間の単相関分析を行い，単相関係数の© The Ito Foundation

16

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 1 Comparison in the instrumental parameters of various model pork sausages．
control

Ｄ-1001

No.２

20％ fat＆
Ｄ-1001

20％ fat20％ fat＆No.２

cohesiveness

0.38±0.02ａ

0.14±0.08ｂ

0.17±0.10ｂ0.37±0.02ａ

0.37±0.06ａ

0.38±0.05

ａcooking loss（％）

2.79±1.40ａ10.5±1.78ｂ13.2±5.10ｂ1.29±0.78ｃ3.70±1.50ｄ4.93±0.86ｅValues in same row with the same letters are not significantly different（p＜0.05）．
control：75℃-heated sausage, D-1001 and No.2: fermented sausages with Lactobacillus sakei D-1001and No.2, respectively，
20％ fat: high fat sausage

値が高いものを選択し，変数増加型による重回帰

集性についてみてみると，Ｄ-1001，No．２のい分析を行うことで重回帰式を求めた。得られた回

ずれの低温増殖性乳酸菌株を接種した場合も有意帰式を用いて主観的評価の推定を試みた。なお，に値が低下し，一方の加熱損失率も同様に有意な統計処理には，Excel多変量解析（Ver．3.0，株

値の上昇がみられ（ｐ＜0.05），発酵によるモデ

式会社エスミ）を用いた 。

ルソーセージの客観的品質低下が示された。次５）に，物性改良目的で添加した脂肪の影響をみてみ

３．結果と考察

ると，20％脂肪を添加することによって，非発酵

前報において，人による「断面のきめ」，「歯ご

ソーセージでは凝集性に有意な変化はみられな

たえ」，「ジューシーさ」，「総合評価」等の官能評

か っ た が ，加 熱 損 失 率 が 有 意 に 低 下 し（ｐ ＜価値と，テクスチャー測定や保水性等の機器によ

0.05），脂肪添加による水分保持性の改善がみらる客観的評価値の間に高い相関性があること，まれた。一方の著しい物性低下がみられた発酵区でたそれをもとにした重回帰分析により，「断面のは，いずれの菌株を接種した場合も脂肪添加に

きめ」，「歯ごたえ」，「ジューシーさ」および「総よって，凝集性はcontrolに匹敵する値を示し，合評価」の４項目において有意性のある重回帰式

かつ加熱損失率においては，controlのそれにはを得ることができ，さらにこの推定式により，官及ばないものの，脂肪を添加していない発酵ソー能評価値を機器測定値から推定できる可能性を併セージと比較して，有意（ｐ＜0.05）かつ著しいせて報告した 。そこで本研究では，本推定式の改善がみられた。

５）

有用性を検証するため，現象として保水性，結着

このような発酵や脂肪添加によってもたらされ性等の顕著な嗜好性低下がみられる発酵モデル

るモデルソーセージの物性変化が，官能評価値にソーセージと，物性改良を意図した脂肪添加モデ

どう反映されるかについて，前報にて確立した推ル ソ ー セ ー ジ を 作 製 し ，水 分 保 持 性 や テ ク ス

定式を用いて検証を行った。今回は，「歯ごたえ」

チャー測定等によって得られる客観的物性評価値と「総合評価」を推定する以下の２式を用い，得を求めるとともに，そこで得られた数値を用いてられた推定値をFig．１にまとめた。

官能評価値の推定を行った。

「歯ごたえ」

発酵を施すことにより，客観的評価値の中でも特 に 著 し い 変 化 が み ら れ た 凝 集 性

ｙ＝－0.21Ｘ４＋0.20Ｘ２＋33.6＊＊（寄与率：86.1％）（cohesiveness）と加熱損失率（cooking loss）に「総合評価」

ついてまとめたものをTable １に示した。まず凝ｙ＝0.25Ｘ５＋0.04Ｘ３＋0.13Ｘ１＋32.7＊＊© The Ito Foundation

17

食肉製品の客観的嗜好性評価に関する研究（第２報）

Estimated value

3(A) Elasticity
y＝－0.21X4＋0.20X2＋33.57**

0

fa
t

fa
t
&
N
o.
2

D

-1

00

1

&

20

20

20

%

%

fa
t
%

o.
2
N

1
00
-1
D

co
nt
ro
l

-3

Estimated value

3(B) Total preference
y＝0.25X5＋0.04X3＋0.13X1＋32.73**

0

%
&
2

o.
N

D

-1

00

1

&

20

20

20

%

fa

fa

t

t

t
fa
%

2
o.
N

1
00
-1
D

co

nt

ro

l

-3

Fig.1 Comparison in the estimated organoleptic evaluation values of various sausages calculated from texture
prediction formula for Elasticity（A）and Total preference（B）．
control：75℃-heated sausage
D-1001 and No.2：fermented sausages with Lactobacillus sakei D-1001and No.2, respectively
20％ fat: high fat sausage
［Ｘ１］：Cohesiveness，［Ｘ２］：Gumminess，［Ｘ３］：Retarded viscosity η１，［Ｘ４］：Cooking loss，［Ｘ５］：pH，［＊＊］：ｐ＜0.01（寄与率：81.9％）
Ｘ１：凝集性

たが，20％脂肪を添加することによって，control

Ｘ２：ガム性応力

Ｘ３：遅延粘性率η１に匹敵する官能評価値を示すことが明らかとな

Ｘ４：加熱損失率

Ｘ５：pHり，脂肪添加によって発酵ソーセージの嗜好性が向上する可能性が示唆された。この「総合評価」

その結果，Fig.１（Ａ）に示した「歯ごたえ」

を説明する重回帰式に，発酵や脂肪添加の影響をに関しては，いずれの菌株を接種した場合も発酵強く受ける加熱損失率が選択されていないにもかによって官能評価推定値の低下がみられ，これにかわらず，両者間に対応がみられたことは，この脂肪を添加しても特に大きな変化はみられなかっ「総合評価」の推定式が，嗜好性を総合的に推定た。一方，「総合評価」では，発酵のみの場合は，できていることを意味するものと考える。

「歯ごたえ」同様，著しい評価値の低下がみられ

以上のように本研究において，客観的機器測定© The Ito Foundation

18

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

値から主観的な官能評価値を推測することが可能

そこで本研究では，保水性低下等の明らかな品であることが示された。さらには食感改良材とし質低下を示す発酵処理や，物性改良効果が期待でての脂肪添加の影響も官能評価推定値に反映されきる脂肪添加処理を施したモデルソーセージを作ることが分かり，本推定式の有用性がさらに支持製し，機器を用いた客観的評価と，その数値と推される結果となった。しかしながら著者らは機器定式を活用した官能評価推定値を求め比較検討を測定値からの嗜好性の推定にとどまらず，むしろ行った。その結果，発酵処理を施すことにより，構造面からのアプローチも極めて重要であると考

加熱損失率は有意に低下し，官能評価推定値（総えている。今後引き続き検討を続け，食品の嗜好合評価）も同様に低下した。これに20％脂肪を添性研究や，実際の商品開発に資する客観的嗜好性

加することにより，加熱損失率と官能評価推定値

評価法の確立に努めたい。

のいずれも大幅な改善がみられ，客観的数値をも４．要とに嗜好性を推定する本推定式の有用性が示唆さ約れた。

おいしさ評価は一般に人による官能評価によって行われており，極めて有効な方法ではあるが，あくまでも主観に基づくため，労力を要するとともに客観性に欠けるという問題がある。特に食感は，客観的評価がより困難な特性でもある。そこ
で昨年度著者らは，客観的評価値である機器による物性測定値と，主観的評価値である人による官能評価を用いた両者間の相関分析，さらに重回帰分析を行うことにより官能評価値の推定式を見出

文 献
１）
 芳賀聖一，岩切鉄矢，水野達也：名城大学農学部
学術報告，37，89～94，2001．
２）
 藤田利宗，林 利哉，芳賀聖一：日本食品科学工学会誌，53（８），423～429，2006．
３）
 西崎あや，林 利哉，小川幸彦，芳賀聖一：食肉の科学，47（１），156～160，2007．
４）
 Mullenet, J-F ： J. Sensory Stud ．，13 ，77 ～ 93 ，
1998．
５）
 芳賀聖一，林 利哉，山口恭平，西崎あや，小川幸彦：食肉に関する助成研究調査成果報告書（伊藤記念財団），31，36～41，2013．

した。

© The Ito Foundation

19

生活習慣病予防効果を有する食肉素材の創出を目指した加工技術の確立
Establishment of processing methods for producing meat products with
anti-lifestyle-related disease

好

田

正

（東京農工大学大学院農学研究院）

Tadashi Yoshida（Institute of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

The number of the patients of life style-related diseases is increasing for recent decades.
Recent studies revealed that the chronic inflammation occurred around adipose tissue would
play a crucial role in the induction of life style-related diseases. We in this study aimed atdemonstrating the anti-inflammatory and anti-life style related-disease activity of food factors,
focusing on the glycogen derived from meats. It has been reported, in the previous study, thatthe immune regulating activity of glycogen depended on the molecular weight of the glycogen.
We therefore used the glycogen after treating with sulfuric acid for modulating its molecularweight．
Our results obtained from this study showed that sulfuric acid-treated glycogen, preparedfrom several origins of meat products, inhibited the production of inflammatory cytokine fromin vitro cultured murine splenocytes. The activity strongly depended on the period of acidtreatment and the origin of meat, suggesting that the activity depended on the molecularweight. The swine liver glycogen that had been treated with sulfuric acid for 2 days showed
the strongest activity tested. The activity also depended the stimulation which induced asimilar situation with inflammation in vitro. The glycogen inhibited the inflammation inducedby concanavalin A but did not inhibit it induced by lipopolysaccharide. The swine liver
glycogen treated for 2 days also inhibited inflammatory cytokine production when it was orally
administered to arteriosclerosis model mice. This result suggests that acid treatment of meat
glycogen might be a useful method for preparing an anti-life style-related disease foodmaterial．
Unfortunately, we in this study did not show that the anti-inflammatory effect of the swine
fillet and liver that had been directly treated with acid. A further study to increase thecontent of glycogen in those organs is required for development of anti-life style-related meatproducts．

© The Ito Foundation

20
１．目

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

非常に栄養価が高く，我が国の食卓に欠かすこと的のできない食材である。また，嗜好的な側面から本研究では，食肉中に含まれるグリコーゲンのも若者を中心に肉料理を好む者は多い。一方で，機能に着目し，抗生活習慣病効果を付与する加工

食肉製品の摂りすぎは肥満や生活習慣病の原因と技術の確立を通して，食肉の需要拡大と付加価値なるという考え方が広く浸透しており，これらのの創出を実現することを目的とした。

既成概念とは反対に抗生活習慣病効果をもつ食肉

近年，生活習慣病の患者数は増加の一途を辿

素材というこれまでになかった付加価値の創出はり，大きな社会問題となっている。食生活の欧米

社会に大きなインパクトを与えることが期待され化やライフスタイルの変化による運動不足が一因る。

と考えられているが，それらの要因が将来的に解決される可能性は低く，新たな対応策が望まれて２．方法いる。また，以前はまったく無関係であると考え2.1

られていた持続的な炎症が生活習慣病の引き金とBALB/cマウス（メス，６週齢）は日本クレア

なっていることが明らかとなってきた 。そのた（東京）より購入した。アポリポプロテインＥ欠め，抗炎症作用をもつ薬剤による予防法の確立に

損マウス（ApoE KO）はジャクソン研究所より期待が寄せられているが ，副作用が認められる

購入し，本学において繁殖させ７～８週齢のオス等の問題に加え，薬剤を発症前から長期にわたっまたはメスを実験に用いた。全てのマウスは東京て予防的に摂取し続ける事への抵抗感もある。そ農工大学実験動物飼育管理ガイドラインに従って

こで，食品のもつ抗炎症作用を利用して日々の食取り扱った。

１）

２）

マウス

事を通して炎症を持続的に抑制することによって

2.2

グリコーゲンの硫酸処理

生活習慣病の予防が可能であることを実証するこ

ウシ肝臓由来グリコーゲンはシグマアルドリッとができれば，活性の強い抗炎症薬を用いるより

チ（東京）より購入した。市販の豚およびトリのも，安全かつ効果的で国民にも広く受け入れられ肝臓からグリコーゲンを抽出した。肝臓は乳鉢でる方策となることが期待される。

すりつぶした後に，沸騰水中で30分間攪拌加熱し

過去の研究において，グリコーゲンに類似したた。700×gで10分間遠心した後，上清を回収し構造を持つ植物性の天然多糖である澱粉が分子量５％濃度となるようにトリクロロ酢酸（和光純に依存して免疫調節活性を有することを見いだし薬，大阪）を添加して４℃で１晩静置した。700た 。しかも，澱粉由来の活性因子は感染状況下×gで10分間遠心した後，上清を回収し，３倍量では免疫応答を促進し，平常状況下では免疫応答のエタノール（和光純薬）を添加した。700×gでを抑制することが明らかとなった。これらの結果

10分間遠心した後，沈殿を回収し，純水に溶解し，は，牛や豚など食肉として広く利用されている動再び３倍量のエタノールを添加した。遠心後に得物に含まれるグリコーゲンの分子量を最適化する

られた沈殿を抽出グリコーゲンとして用いた。得ような加工方法を確立することで，抗炎症活性をられたグリコーゲンを純水に溶解し，フェノール

もつ新たな食品素材を創出することができる可能

硫酸法により全糖量を求めた。

３）

各グリコーゲンを純水で希釈し（10～100mg/性を示している。
食肉はタンパク質や脂質，ミネラルを多く含みml），17％濃度となるように硫酸（和光純薬）を© The Ito Foundation

生活習慣病予防効果を有する食肉素材の創出を目指した加工技術の確立

21

添加した。37℃で０，１，
２，４日間処理した後，それぞれ11Ｂ11およびR4-6A2（BD Pharmingen,

６M NaOHで中和した。

CA）を 用 い た 。二 次 抗 体 に は そ れ ぞ れ BVD6-

2.3

食肉の硫酸処理

24G お よ び XMG1.2 （BD Pharmingen） を 用 い

市販の豚ヒレ肉および肝臓を冷凍した後，薄くた 。 TNF- α 産 生 量 は Mouse TNF- α ELISA

スライスして17％硫酸溶液に浸漬した。液量は試MAX Deluxe（Biolegend, CA）を用いて測定した。

料が十分浸かる程度とした。37℃で２日間処理
し，NaOHで中和した。700×gで10分間遠心した
後，沈殿を回収し60℃で３日間乾燥させた。
2.4

細胞培養

３．結果と考察3.1

硫酸処理グリコーゲンは脾臓細胞からのサイトカイン産生を抑制した

BALB/c ま た は ApoE KO マ ウ ス の 脾 臓 細 胞

過去の報告により，グリコーゲンが免疫調節活（５x10６ cells/ml）を各グリコーゲン試料の存在性を有すること４，５），およびその活性は分子量に下で，コンカナバリンA（Con A；シグマアルド

強く依存することが明らかにされている６）。また，

リッチ）５μｇ/mlまたは大腸菌由来リポ多糖

我々の研究によってグリコーゲンに類似した構造（LPS；シグマアルドリッチ）１μｇ/mlによってをもつ植物性多糖である澱粉も分子量に依存して刺激した。２日後の培養上清中に含まれるIL-４，

免疫調節活性を発揮することが明らかとなった３）。

IFN-γ，TNF-α産生量を測定した。上清回収後

そ こ で ，本 研 究 で は 食 肉 よ り グ リ コ ー ゲ ン をに各ウェル中の生細胞数をトリパンブルー染色に抽出し，グリコーゲンの分子量を変化させるためより測定した。

に硫酸処理を行った。豚ヒレ肉と肝臓，およびト

2.5

高脂肪食およびグリコーゲンの摂取

リ胸肉と肝臓からグリコーゲンを抽出したが，いApoE KOマウスに高脂肪食（High Fat Diet

ずれも肝臓からのみグリコーゲンを得ることがで

32；日本クレア）を４週間自由摂食させた。そのきた。得られた豚およびトリの肝臓由来グリコー

間，豚肝臓より抽出して２日間硫酸処理したグリ

ゲン，および購入したウシ肝臓由来グリコーゲン

コーゲンを0.5％濃度となるように飲水に溶解しを図中に示した日数硫酸処理し，BALB/cマウスて自由摂取させた群を設けた。また，２日間硫酸の脾臓細胞に添加した。細胞をCon A存在下で培処理した豚ヒレ肉および肝臓を10％濃度となるよ

養したところ，サイトカイン産生がグリコーゲン

うに餌に添加した群も設けた。

の添加により抑制されることが示された（Fig.

高脂肪食の開始４週間後に採血して血清を得

１）。最も効果の高い処理日数はグリコーゲンのた。得られた血清中のコレステロール濃度をコレ由来により異なっていた。この結果は，由来によステロールＥ-テストワコー（和光純薬）を用いりグリコーゲンの分子量もしくは硫酸による分解て測定した。また，脾臓細胞を２日間培養し，上のされやすさが異なっていることを示唆している

清中のTNF-α産生量を測定した。さらに，腹部と考えられる。また，各サイトカイン（IFN-γ，大動脈の組織切片を作成し（札幌総合病理研究

IL-４，TNF-α）に対する抑制効果は同様な傾向

所，札幌），HE染色像を観察した。

を示した。IFN-γはTh１型，IL-４はTh２型，

2.6

サイトカインELISA

TNF-αは炎症性サイトカインとして知られてお上清中のIL-４およびIFN-γ産生量をサンドり，これらすべてが同様に抑制されたことから，

イッチELISAによって測定した。一次抗体にはグリコーゲンが免疫応答のバランスを変化させず© The Ito Foundation

22

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

0d

2dIL-4 production(pg/ml)

3
2.5
2
1.5
1
0.5

IFN-γ production(ng/ml)

0
14
12
10
8
6
4
2

TNF-α production(pg/ml)

0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
－
Cont

1d

4d

Bovine

0d

1d

2d

Swine

4d

0d

1d

2d

4d

Chicken

Con A

Fig.1 Effect of acid-treated glycogen on cytokine productions from BALB/c splenocytes. Splenocytes from BALB/cmice were stimulated with Con A in vitro in the presence of acid-treated glycogens. The supernatant was collectedfrom each well 2 days after stimulation, and the cytokine productions in each supernatant were measured by
ELISA．

に応答の強度を全体的に低下させることが示されることが示された（Fig. 2a）。一方で，Con Aのた。

代わりにLPSで刺激した脾臓細胞からのTNF-α

次に，動脈硬化のモデルマウスであるApoE

産生は抑制しなかった（Fig. 2b）。我々は以前のKOマウスの脾臓細胞を用いて，BALB/cマウス

研究により，硫酸処理した澱粉が刺激の種類に依で得られた結果を検証した。その結果，BALB/c

存して，炎症に対して抑制的に働く場合と促進的マウスの場合と同様に，グリコーゲンがCon A刺に働く場合があることを示しており３），本研究に激した脾臓細胞からのサイトカイン産生を抑制す

よってグリコーゲンでも同様な結果が得られたと© The Ito Foundation

23

生活習慣病予防効果を有する食肉素材の創出を目指した加工技術の確立
(b)
500
400
300
200
100
0

(c)
30
Cell count(x105/well)

12
9
5
3
0
70
60
50
40
30
20
10
0

25
20
15
10
5
0
Cont

Cont

-

0d 1d 2d 4d 0d 2d 0d 1dBovineSwine Chicken
Con A

Cell count(x105/well)

TNF-α production(pg/ml)

IFN-γ production(ng/ml)

IL-4 production(pg/ml)

TNF-α production(ｐg/ml)

(a)
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
15

-

BovineSwine Chicken
LPS

16
14
12
10
8
6
4
2
0
Cont

0d 1d 2d 4d 0d 2d 0d 1d-

0d 1d 2d 4d 0d 2d 0d 1dBovineSwine Chicken
Con A

Fig.2 Effect of acid-treated glycogen on cytokine productions from ApoE KO splenocytes. Splenocytes from ApoE KO

mice were stimulated with ConA（a, c）or LPS（b, c）in vitro in the presence of acid-treated glycogens.（a, b）The
supernatant was collected from each well 2 days after stimulation, and the cytokine productions in eachsupernatant were measured by ELISA.（c）The cell number in each well was counted 2 days after stimulation．

考えている。しかしながら，グリコーゲンはLPS

時に，豚肝臓由来グリコーゲンを２日間硫酸処理

存在下においても炎症を促進するような効果は認した標品を経口的に摂取させることにより（各群められなかった。

２頭），炎症および動脈硬化への影響を検証した。

また，Con AおよびLPS刺激脾臓細胞のいずれ

摂取開始から４週間後に脾臓細胞を培養し上清中においても，グリコーゲンの添加による生細胞数のTNF-α産生量を測定した結果，高脂肪食摂取への影響は認められなかった（Fig. 2c）。

によって増加した産生量が，グリコーゲンの摂取

3.2

硫酸処理グリコーゲンは動脈硬化モデル
マウスにおける炎症を抑制したによって低下することが明らかとなった（Fig.
3a）
。この結果は，高脂肪食摂取によって誘導さ

上記の結果より，硫酸処理グリコーゲンが慢性れる炎症反応は，in vitroでLPS刺激によって誘炎症を抑制し生活習慣病の発症を予防する可能性

導される炎症反応とは異なり，Con Aによって誘が示唆されたので，実際に動脈硬化モデルマウス

導された炎症と同様にグリコーゲンによって抑制であるApoE KOマウスに高脂肪食を与えると同され得ることを示している。また，同じマウスよ© The Ito Foundation

24

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

25

1200
Cholesterol(mg/dL)

（c）
1400

TNF-α production(pg/ml)

（a）
30

20
15
10
5

1000
800
600
400
200

0
Cont

-

0

Swine-2d

ContHigh Fat Diet-

Swine-2dHigh Fat Diet

（b）

－

Cont

Swine-2dHigh Fat Diet

Fig.3 Effect of acid-treated swine glycogen on high fat diet induced inflammation. ApoE KO mice were orally

administered with high fat diet and acid-treated swine glycogen.（a）Splenocytes from the mice were cultured for 2days, and the TNF-α production in each supernatant was measured by ELISA.（b）Histological analysis ofabdominal aorta obtained from ApoE KO mice that had been fed high fat diet and glycogen for 4 weeks was
performed.（c）Total cholesterol concentration in the sera of ApoE KO mice that had been fed high fat diet andglycogen for 4 weeks was measured．

り作製した腹部大動脈切片の組織像を観察するの組織像のいずれにおいても硫酸処理肉の影響はと，高脂肪食の摂取によっても血管の炎症像は観認められなかった（Fig. 4a, b）。豚ヒレ肉および

察できなかった（Fig. 3b）。さらに，高脂肪食群

肝臓を投与した群におけるグリコーゲンの推定摂にグリコーゲンを摂取させても血管の組織像に影取量を計算すると，最大でもそれぞれ約40 mgお響は認められなかった（Fig. 3b）。なお，解剖直

よび100 mg／マウス・４週間となり，飲水に溶前の血清中の総コレステロール濃度には各群で差解してグリコーゲンを摂取させた実験の約500 mg

異は認められなかった（Fig. 3c）。

／マウス・４週間と比較すると少ない摂取量とな

次に，豚ヒレ肉および肝臓を直接硫酸処理し，るため，抗炎症効果が認められなかったと考えら

餌に添加することで炎症および動脈硬化への影響れる。なお，豚ヒレ肉および肝臓を硫酸処理するを上記と同様に観察した（各群３頭）。その結果，

過程で，含まれていたグリコーゲンの一部は上清

脾臓細胞からのTNF-α産生量および腹部大動脈中に溶出して失われたと考えられるので，実際の© The Ito Foundation

生活習慣病予防効果を有する食肉素材の創出を目指した加工技術の確立
（a）

25

30

TNF-α production(pg/ml)

25
20
15
10
5
0

-

Cont

FilletLiver

High Fat Diet

（b）

Cont

－

FilletLiver

High Fat Diet
Fig.4 Effect of acid-treated swine meats on high fat diet induced inflammation. ApoE KO mice were orally administeredwith high fat diet and acid-treated swine fillet or liver.（a）Splenocytes from the mice were cultured for 2 days, andthe TNF-α production in each supernatant was measured by ELISA.（b）Histological analysis of abdominal aorta
obtained from ApoE KO mice that had been fed high fat diet and acid-treated meats for 4 weeks was performed．

摂取量はさらに少なくなっていたと推察される。

たが，このような機能を持った食品を日々の食事

本研究の結果より，食肉由来グリコーゲンを硫を通して持続的に摂取すれば生活習慣病だけでな酸処理することで抗炎症作用を持った食品素材をく，アレルギーやガンの発症や症状を抑制するこ

創出することが可能であることを示した。動脈硬とが可能になると期待される。本研究では食肉を化に対する影響を直接実証することはできなかっ

直接硫酸処理した場合の抗炎症効果を実証するこ© The Ito Foundation

26

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）ともできなかったが，食肉中により多くのグリて異なっていた。さらに，硫酸処理グリコーゲン

コーゲンを蓄積させる技術の開発や，廃棄肉等かの抗炎症効果は，炎症を惹起する刺激の種類にら分離したグリコーゲンを硫酸処理して食肉に添よって異なることも示された。

加する等により，食肉に新たな機能性や付加価値

豚肝臓由来グリコーゲンを２日間硫酸処理したを付与することに繋がる研究成果であると考えて標品を動脈硬化モデルマウスに摂取させることいる。

で，炎症反応が抑制されることが示された。この

４．要ような効果は，豚ヒレ肉や肝臓を直接硫酸処理し約た加工肉を摂取させた場合には認められなかった

近年，我が国における生活習慣病患者の数は増が，今後の研究により食肉中のグリコーゲン含量

加の一途をたどっており，早急な対策が必要であを増加させることができれば，抗生活習慣病効果

る。生活習慣病の多くは肥満そのものが原因とを有する食肉素材の開発に繋がる成果であると期なって発症するわけではなく，肥満に伴って生じ待される。

る持続的な炎症反応が重要な役割を担っていることが明らかとなってきた。すなわち，抗炎症効果を有する食品素材を日常的に摂取することによって生活習慣病を予防することが可能であると考えられる。そこで本研究では，食肉中に含まれるグ
リコーゲンの機能に着目し，抗生活習慣病効果を付与する加工技術を確立し，付加価値の創出と食肉の需要拡大を実現することを目的とした。
本研究の結果より，食肉由来グリコーゲンを硫酸処理することによって，グリコーゲンに抗炎症作用を付与することが可能であることが明らかと

文 献
１） Alemany, M. Nutr. Res．33，１～11，2013．
２）
 Harris, RE., Beebe-Donk, J., Doss, H. and Burr
Doss, D. Oncol. Rep．，13，559～583，2005．
３）
 Yoshida, T., Takahashi, K. and Hattori, M. Food
Chemistry，133，1494～1500，2012．
４）
 Takaya, Y., Uchisawa, H., Ichinohe, H., Sasaki, J.,
Ishida, K. and Matsue, H. Marine Biotechnology，
６，
208～213，1998．
５）
 Ryoyama, K., Kidachi, Y., Yamaguchi, H., Kajiura,
H. and Takata, H. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68,
2332～2340, 2004．
６）
 Kakutani, R., Adachi, Y., Kajiura, H., Takata, H.,
Kuriki, T. and Ohno, N. Carbohydrate Research，
342，
2371～2379, 2007．

なった。また，付与される抗炎症効果の程度は，グリコーゲンの由来および硫酸処理の時間によっ© The Ito Foundation

27

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究（第３報）
Intramuscular free fatty acids related to beef eating quality, PartⅢ

山之上

稔・西田

昌弘・上田

修司・井原

一高・豊田

淨彦

（神戸大学大学院農学研究科）

Minoru Yamanoue, Masahiro Nishida, Syuji Ueda, Ikko Ihara and Kiyohiko Toyoda（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

The aims of this study were to analyze the amounts and fatty acid composition of freefatty acid（FFA）and taste-traits in water-soluble extract（broth）from Holstein beef after
postmortem aging and cooking, and to prove the influence of FFA on beef eating quality bycomparing to those results from Japanese Black Wagyu beef. Sample beef slices were takenfrom carcass cross-section between the sixth and seventh ribs of the Holstein cattle and stored
at ４℃ antiseptically. At 7-, 14- and 21-days postmortem, water-soluble extract was preparedfrom raw and cooked beef samples. The amounts of triacylglycerol（TG）and FFA were
measured and the fatty acid composition was determined by GC analysis. As the results, theamounts of TG and FFA in water-soluble extract were not changed significantly during
postmortem aging, and cooking caused no significant change in those amounts. Fatty acidcomposition of FFA was markedly different from that of TG and the ratio was in the order ofpalmitic acid ＞ stearic acid ＞ oleic acid. The ratio of oleic acid was gradually increased in FFA
during postmortem aging of Holstein beef. On the other hand, taste-traits of water-soluble
extract measured by an electric sensing system showed that sourness was markedly decreased
at 21-days postmortem and acidic bitterness was increased during storage. The value of umami
of cooked beef samples at 21-days postmortem was increased slightly but much less than thevalue of Japanese Black Wagyu beef. It is suggested that better eating quality of JapaneseBlack Wagyu beef is possible to relate to intramuscular free fatty acid．

１．目

大きく，脂肪交雑として筋内脂肪量が多いことが的重要視されてきたが，近年では脂肪を構成する脂今日一般に市販されている牛肉は，低温で一定期間の熟成を経て利用されている。熟成の進行に肪酸が牛肉のテクスチャーや風味を左右することが示され，注目されている２～４）。

伴い軟化，多汁性の回復，風味の向上などの肉質

我々は牛肉のおいしさへの筋内脂肪の影響を明に影響を与える諸要素の改善が起こり１），牛肉はらかにするため，主要な肉牛である黒毛和種牛のおいしくなる。牛肉のおいしさには脂肪の影響もロース部を材料に，平成23年度にクロロホルムと© The Ito Foundation

28

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

メタノールの混液で抽出した総脂質と，総脂質かテスク社もしくは和光純薬工業株式会社の特級試ら分画した牛肉の中性脂肪の大半を占めるトリア薬を用いた。脂肪酸メチルエステル標準品はシグ

シルグリセロール（TG）や食味との関連が示唆

マ―アルドリッチ社から購入した。牛肉試料は，されている遊離脂肪酸（FFA）について，熟成

伊藤ハム（株）四国センターから購入したホルスおよび加熱に伴う脂質量と脂肪酸組成の変化を調

タイン種枝肉の第６～７肋骨間のロース部を用いべた 。また平成24年度に牛肉中の遊離脂肪酸とた。

咀嚼時の食味性との関係を明らかにするために，

2.2

黒毛和種牛肉の摂取時の咀嚼中に口腔内に滲出

ロース部の牛肉を４℃で保存し，と畜後７日

し，呈味物質が溶存する水溶性画分（肉汁）中の目，14日目，および21日目にロース芯から牛肉片

脂質量や脂肪酸組成が熟成および加熱調理でどのを無作為に採取して熟成および未加熱試料としように変化するかを調べ，さらに肉汁の呈味性のた。一方，同期間熟成した牛肉ロース芯を４cm

変化を客観的測定手法である味覚センサーを用い×５cmの大きさで厚さ１cmの肉片に整形し，て調べた 。その結果，熟成中に筋内の遊離脂肪

120℃に加熱したホットプレートで内部温度が65

酸量が有意に増加し，加熱処理でも変化しないこ～70℃になるように表裏を各130秒間加熱後に試とを明らかにして５），肉汁中でも遊離脂肪酸量が料を採取し，加熱試料とした。

５）６）

熟成および加熱処理

増加することを確かめた 。また熟成に伴い肉汁2.3の酸味が顕著に減少し旨味および苦味雑味が増加

未加熱および加熱牛肉の各４ｇに10mlの蒸留

し，これらの呈味性は加熱処理でも変わらないこ

水を加えて，10,000 rpmで２分間ホモジナイズしとを示した。さらにホルスタイン種牛肉に比べてた。蒸留水を加えてメスシリンダーで15 mlに定黒毛和種牛肉のおいしさが優れているという官能容にし，よく混合して均質にした後，5,000 rpm

試験結果を得ている。これらの結果から，熟成中

で20分間の遠心分離を行った。遠心分離後，ろ過に増加する筋内の遊離脂肪酸が脂肪由来の牛肉のした上清を10 mlに定容にして肉汁試料とした。

６）

2.4

食味性に関与する可能性を考えている。

肉汁試料の調製

肉汁試料中のTGおよびFFA量の測定

本研究では，両年度で調べた黒毛和種牛肉に比

肉汁試料中のTG量は，トリグリセリドＥ―テス

べて食味性の劣るホルスタイン種牛肉の熟成およ

トワコーTG測定キット（和光純薬工業）を用い

び加熱前後で，肉汁中のTGとFFAの量および組て測定した。測定方法は指示書に従い，トリオレ

成の変動を調べ，また肉汁の呈味性分析を行っイン酸を標準として波長600 nmの吸光度から検た。これらのホルスタイン牛肉肉汁で得られる結量 線 を 作 成 し た 。ま た FFA 量 は Free Fat Acid

果と前年度までに黒毛和種牛肉で得られた結果をQuantification Kit（Bio Vision）を用いて測定し比較解析することで，黒毛和種牛肉の筋内遊離脂た。測定方法はBio Vision社の指示書に従い，一肪酸変化と優れた食味性を明確にし，牛肉のおい部希釈した試薬を使用した。パルミチン酸を標準しさと筋内遊離脂肪酸との関連性を検証した。

に，波長570 nmの吸光度から検量線を作成した。

２．方
2.1

2.5

法

肉汁試料中のTGおよびFFAの分画

肉汁試料中のTGおよびFFAの分画は，前報６）試薬および牛肉試料の方法に準じてスケールダウンして行った。肉汁

試薬は特に表記してあるものを除き，ナカライ

試料を除タンパク質後シリカゲルカラムで分離し© The Ito Foundation

29

500
400
300
200
100
0

7

14

21

Amounts of FFA（mg/100 g of beef）

Amounts of TG（mg/100 g of beef）

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究（第３報）

10
8
6
4
2
0

Postmortem Time（days）

7

14

21

Postmortem Time（days）

Fig.1 Effects of postmortem aging and cooking（■ , raw;

Fig.2 Effects of postmortem aging and cooking（■, raw;□，cooked）on the amounts of TG in Holstein beefbroth（n＝８）．

□，cooked）on the amounts of FFA in Holstein beefbroth（n＝６）．

た 。分 画 し た 脂 質 ク ラ ス を 薄 層 ク ロ マ ト グ ラには342.4 mg，21日目には250.3 mgとなり，加熱フィー法で展開し，精製度を確認した。

牛肉からの肉汁では熟成７日目に253.5 mg，14日

2.6

脂肪酸組成の測定

目に252.3 mg，21日目に235.9 mgといくらかの増分画したTGおよびFFAから三フッ化ホウ素―

減はあるものの熟成中の有意な変化を示さなかっメタノール法で脂肪酸メチルエステル（FAME）

た。また前年度に行った黒毛和種牛肉肉汁中のを調製した。乾固したFAMEをヘキサンに溶解

TGの定量値６）に比べていずれも低値であった。

し，過去に示した方法５）と同様にガスクロマトグ

さらに未加熱と加熱の両牛肉試料間におけるTG

ラフ（GC）（島津量に有意差はなく，加熱の影響は認められなかっGC-2014）で脂肪酸組成分析

た。

を行った。
2.7

一方，Fig.２に示すように，肉汁中のFFA量は

呈味性評価

肉汁試料からタンパク質を除去後，呈味性を味

未加熱試料で熟成７日目は100ｇ牛肉当たり2.9

覚センサー（INSENT）で分析した。使用したセ

mg，14日目には2.9 mg，21日目には3.1 mgであっンサーはAAE，CT0，CA0，C00およびAE１でた。加熱試料では熟成７日目に1.6 mg，14日目はあり，それぞれ旨味，塩味，酸味，苦味雑味，渋1.3 mg，21日目には1.8 mgとほぼ一定で，ホルス味の程度を検出する。

タイン種牛肉肉汁中のFFA量は熟成および加熱処理で大きな変化を示さなかった。これらの結果

３．結果と考察は，前年度に行った黒毛和種牛肉肉汁中のFFA

ホルスタイン種牛肉を入手後４℃で熟成し，７の定量値６）に比べていずれも低値であった。また日目，14日目，および21日目に肉汁試料を調製し，黒毛和種牛肉では肉汁中のFFA量は熟成21日間

TGおよびFFAを定量した。Fig.１に示すように，に増加したが，ホルスタイン種牛肉肉汁のFFA

未加熱牛肉からの肉汁中のTG量は熟成７日目に量は熟成期間を通じてほぼ一定で，黒毛和種牛肉

100ｇ牛肉当たり295.2 mgであったのが，14日目と異なっていた。加熱処理は，肉汁中のTG量変© The Ito Foundation

30

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

60

Composition（％）

50
40
30
20
10
0

C14：0

C14：1

C16：0

C16：1

C17：0

C17：1

C18：0

C18：1

C18：2

Fatty Acid
Fig.3 Effects of postmortem aging and cooking on fatty acid composition of TG in Holstein beef broth（n＝１～２）．

Beef broths were prepared from raw（closed box）and cooked（open box）samples at appropriate postmortemdays（7-days, ■and□ ; 14-days, ■and■ ; 21-days, and ）．

化と同様にFFA量に影響を及ぼさなかった。

多くを占め，TGの脂肪酸組成で同定されたリノー

調製した肉汁試料をシリカゲルカラムで分離

ル酸は，FFAでは検出されなかった。肉汁におし，分画したTGおよびFFAをメチルエステル化

いてTGの脂肪酸組成（Fig.３）がFFAの脂肪酸

後，GCでそれらの脂肪酸組成を分析した。Fig．

組成に反映している訳ではなく，また熟成中にス３に示すように，ホルスタイン種牛肉肉汁中のテアリン酸割合が減少しオレイン酸割合が増加す

TGで一番多く含まれている脂肪酸は，未加熱牛る傾向にあり，熟成７日から21日目にオレイン酸

肉と加熱牛肉共にオレイン酸（Ｃ18：１）で，次割合は約10％から約20％へと増加した。ホルスタ

いでパルミチン酸（Ｃ16：０）とリノール酸（Ｃ

イン種牛肉肉汁では，熟成および加熱処理による

18：２）であり，それぞれ約35％，約28％，約

TG量の変化は認められず（Fig.１），オレイン酸14％であった。熟成および加熱における影響は認の相対的な増加は熟成および加熱中のリパーゼ等

められなかった。ホルスタイン種牛肉における肉の作用によるTGからの遊離に原因があるとは考

汁TGの脂肪酸組成変化は黒毛和種牛肉肉汁におえにくい。牛肉中のリン脂質分解やステアリン酸

ける結果と類似していたが，オレイン酸割合が黒からオレイン酸への合成を促すステアロイルCoA

毛和種牛肉肉汁の約49％６）に比べて低い値であっ不飽和酵素７）の作用など，牛肉中の酵素による可た。

能性が考えられるが，今後この理由についての検一方，ホルスタイン種牛肉肉汁中のFFAでは，討が必要である。

一番多く含まれている脂肪酸はパルミチン酸であ

Fig.５に，ホルスタイン種牛肉肉汁試料の呈味

り，次いでステアリン酸（Ｃ18：０）とオレイン

性分析を行った結果を示す。熟成７日の未加熱牛酸であった（Fig.４）。TGと異なり飽和脂肪酸が肉から調製した肉汁における分析値に比較したと© The Ito Foundation

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究（第３報）

31

60

Composition（％）

50

40

30

20

10

0

C14：0

C16：0

C18：0

C18：1

Fatty Acid
Fig.4 Effects of postmortem aging and cooking on fatty acid composition of FFA in Holstein beef broth（n＝１～２）．

Beef broths were prepared from raw（closed box）and cooked（open box）samples at appropriate postmortemdays（7-days, ■and□ ; 14-days, ■and■ ; 21-days, and ）．

Sourness
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7

Richness

Acidicbitterness

Bitterness

Astringene

Saltiness

Umami

Fig.5 Effects of postmortem aging and cooking on the taste-traits of Holstein beef broth．

Beef brothwas prepared from raw（solid line）and cooked（broken line）samples at appropriate postmortem time; 14-days,; 21-days,）．
（7-days,© The Ito Foundation

32

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

き，熟成21日目に未加熱と加熱牛肉の両試料で酸遊離脂肪酸の寄与を明らかにするうえで重要と考

味値が顕著に低下し，味に深みを与える苦味雑味

えられる。

値が上昇した。また熟成21日目の加熱牛肉試料で旨味値が上昇した。これらの結果は黒毛和種牛肉

４．要

約

肉汁における呈味性変化の結果６）と同様であった

牛肉のおいしさへの筋内脂肪の影響を，牛肉中が，旨味値の上昇の程度は黒毛和種牛肉肉汁におの遊離脂肪酸と咀嚼時の食味性との関係から明らける結果よりも少なかった。牛肉の酸味は死後にかにするために，前年度に行った黒毛和種牛肉か蓄積する乳酸量に関連するが，豚肉では熟成にらホルスタイン種牛肉に材料を変えて熟成および伴い増加するペプチドによって酸味が抑制され加熱調理で肉汁中の筋内脂肪量や脂肪酸組成が，ると報告されており，牛肉の熟成中にも同様の

また肉汁の呈味性がどのように変化するか調べた。

ペプチド増加は起る10）ので，ペプチド増加によるホルスタイン種牛肉の第６～第７肋骨間ロース

酸味のマスキング効果が生じたのかもしれない。

部を４℃で保存し，と畜後７，14，および21日目

一方，FFA量は苦味と関連すると報告されてにロース芯から筋肉片を採取した。未加熱およびいるが，熟成中にホルスタイン種牛肉肉汁中の加熱処理後，水溶性画分を調製し，肉汁試料としFFA量に増加は認められず（Fig.２），苦味値がてトリアシルグリセロール（TG）および遊離脂変化しない一方で，苦味雑味値の熟成21日目の増肪酸（FFA）を定量した。その結果，熟成中に加が認められた。黒毛和種牛肉肉汁の結果では熟TG量およびFFA量に有意な変化は認められず，

成中にFFA量が増加し，苦味雑味値の上昇が認

加熱試料でも同様であった。それらの脂肪酸組成

められたことから，FFAと苦味雑味値との関連を調べたところ，TGではオレイン酸割合が高かっ性については明確ではなかった。

たが，FFAではパルミチン酸割合が高く，熟成

８）

９）

８）

前年度に行った４℃で21日間熟成させた黒毛和によりステアリン酸割合の減少とオレイン酸割合

種牛肉とホルスタイン種牛肉を加熱調理後の官能の増加が認められた。また肉汁試料の呈味性を機

検査６）では，黒毛和種牛肉の食味性がホルスタイ

器分析したところ，熟成に伴い未加熱と加熱の両ン種牛肉に比べて有意に好ましい結果が得られて試料で味に深みを与える苦味雑味値が上昇した。

いる。今年度のホルスタイン種牛肉における呈味

さらに熟成21日目には両試料で酸味値が顕著に低性分析結果でも黒毛和種牛肉の旨味の優位性を示

下し，加熱試料で旨味値が上昇した。

す結果が得られた。熟成に伴う黒毛和種牛肉肉汁

前年度までの黒毛和種牛肉における結果と今年中のFFA量およびオレイン酸割合の増加が，ホ度得られたホルスタイン種牛肉における結果か

ルスタイン種牛肉肉汁中のそれらに比べて高く，ら，黒毛和種牛肉の食味性の良さには熟成中に増

口中の舌上における味の認識への長鎖脂肪酸の影

加する筋内遊離脂肪酸量と遊離脂肪酸のオレイン

響11，12）の可能性を示している。前年度から今年度

酸割合の寄与が示唆された。

にかけて明らかになった黒毛和種牛肉肉汁中のFFA量およびオレイン酸割合の熟成および加熱に伴う増加が，ホルスタイン種牛肉肉汁におけるそれらの増加よりも顕著である理由を解明することが，黒毛和種牛肉の食味性の良さに対する筋内

文 献
１）
 Muchenje, V., Dzama, K., Chimonyo, M., Strydom,
P.E., Hugo, A. Raats, J.G.：Food Chem．
，112，279～
289，2009．
２）
 Westerling, D.B., Hedrick, H. B.：J. Anim. Sci．，© The Ito Foundation

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究（第３報）
48，1343～1348，1979．
３） Melton, S. L., Amiri, M., Davis, G. W. Backus, W.
R.：J. Anim. Sci．，55，77～87，1982．
４） Mandell, I. B., Buchanan-Smith, J. G. Cambell, C.
P.：J. Anim. Sci．，76，2619～2630，1998．
５） 山之上 稔，矢野恵子，上田修司，井原一高，豊田淨彦：平成23年度食肉に関する助成研究調査成果
報告書，Vol．30，68～75，2012．
６） 山之上 稔，大和彩弥香，上田修司，井原一高，
豊田淨彦：平成24年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol．31，42～48，2013．
７） T a n i g u c h i , M . , M a n n e n , H . , O y a m a , K . ,Shimakura, Y., Oka, A., Watanabe, H., Kojima, T.,
Komatsu, M., Harper, G.S. and Tsuji, S.：Livest.
Prod. Sci．，87，215～220，2004．

33

８）
 Chikuni, K., Oe, M., Sasaki, K., Shibata, M.,
Nakajima, I., Ojima, K. Muroya, S.：Anim. Sci. J．，
81，600～605，2010．
９）
 Okumura, T., Ryoji, Yamada, R. Nishimura, T.：
Biosci. Biotechnol. Biochem ．，68 ，1657 ～ 1662 ，
2004．
10）
 Muroya, S., Ohnishi-Kameyama, M., Oe, M.,
Nakajima, I. Chikuni, K. ： Meat Sci ．， 75 ， 506 ～
514，2007．
11）
 Matsumura, S., Mizushige, T., Yoneda, T.,
Iwanaga, T., Tsuzuki, S., Inoue, K. Fushiki, T.：
Biomed. Res．，28，49～55，2007．
12）
 Galindo, M. M., Voigt, N., Stein, J., Lengerich, J.,
Raguse, J-D., Hofmann, T., Meyerhof, W. Behrens,
M.,：Chem Senses，37，123～139，2012．

© The Ito Foundation

34

味覚センサを用いた和牛の味の数値化と可視化に関する研究
A study on quantification and visualization for taste of wagyu beef using
a taste sensor

都

甲

潔・田

原

祐

助

（九州大学大学院システム情報科学研究院）

Kiyoshi Toko and Yusuke Tahara（Graduate School of Information Science and Electrical Engineering, Kyushu University）

The project aim in this study is to establish an objective evaluation technique ofquantification and visualization for taste of wagyu using the taste sensor. The taste sensor（orcommercially-available Taste Sensing System）comprising lipid/polymer membranes that canevaluate various qualities of taste has been used in food production andquality-control
applications. However, the evaluation of beef has been made by removing beef tallow so far,because beef tallow had interference with the functions of the lipid/polymer membranes acting
as the receptor part of taste sensor. We evaluated characteristics of the taste sensor
membranes at 50 ℃（dissolution temperature of beef tallow）and the interaction between beef
tallow and the taste sensor membranes, and tried to quantify the taste of beef. The
experimental results showed that（ⅰ）the taste sensor enables the taste evaluations at 50℃
which corresponds to the dissolution temperature of beef tallow,（ⅱ）saltiness, sourness andumami sensor electrodes can be useful to evaluate tastes of beef samples including beef tallow,（ⅲ）the umami intensity of wagyu using the umami sensor shows A3 ＞ A5 ＞ A ２．
In conclusion, the obtained data suggest the feasibility of the evaluation technique ofquantification and visualization for taste of wagyu using the taste sensor. The next step is toevaluate the relationship between the sensor responses and sensory test．

１．目「味」に関する情報は，舌の味細胞に存在する的受容体やイオンチャネルで味物質が受容された後

本研究は，味覚センサ

を応用して，和牛のに，神経伝達物質の放出によって味神経に伝えら「味」を客観的に数値化，可視化する評価技術のれ，最終的に中枢組織である脳の味覚野に到達す構築を目的としている。一般的に牛肉の食味は，る。これら生理学的な観点から，味は五基本味と

「味」
，
「食感」
，
「香り」等の総合的な要素から成る呼ばれる，酸味，塩味，うま味，苦味，甘味からと考えられている。本研究では，これらの要素の構成されている。渋味も，味細胞及び物理刺激で１つである「味」に着目し，味覚センサを用いた感じる広義の味として食品の味を構成する重要な和牛の「味」の数値化と可視化技術の構築を行う。

味として知られている。

１，
２）© The Ito Foundation

味覚センサを用いた和牛の味の数値化と可視化に関する研究

35

Figure 1. Taste sensor（TS-5000Z, Intelligent Sensor Technology, Inc．
）

一方，食品化学において，牛肉は，甘味，うまジューシーさ，滑らかさ，柔らかさなどの食感に味，コク等の好まれる味質の他に，苦味，渋味（収影響するといわれており，近年では脂肪交雑が高斂味）といった味質及び「ぱさつき」，「しつこまっている４）。従って，脂肪は牛肉のおいしさにさ」といった好まれない要素がある。本研究でおいて重要な要素を占める。近年，味覚センサは，は，これらの要素を含む味を客観的に評価するた

油脂に関しても応答を示し，高い耐久性を有する

めに，味覚センサを用いて，和牛の「味」を客観までに至った。従って，本研究は，和牛の味に重的に数値化及び可視化する手法の確立を目指す。

要な役割を担う脂肪に関しても脱脂する事無く評以前から，官能評価と呈味成分分析の結果が一致

価可能な技術の構築を目指すものである。

しない事は深刻な問題点とされており，そこで本研究では味覚センサを用いる事でこの問題点の解

２．方
2.1

決を試みる。

法

50℃での味覚センサ性能評価

我々が開発した味覚センサ（Fig.１）は，「味」

味覚センサの味受容部は，脂質，高分子，可塑を数値化できる世界初の装置として知られてい剤を混合した脂質高分子膜を用いているが，油脂る。味覚センサの脂質高分子膜は，味物質の受容のような疎水性の高い物質に対して吸着し，脂質部として用いられ，脂質，可塑剤，高分子から構

高分子膜を汚染してしまうといった問題があっ成されている。この脂質高分子膜は，生体の舌のた。そのため肉類の分析は，濾過や遠心分離を細胞を被う生体膜を模倣したものである。味覚セ

行って油脂を取り除いたサンプルを測定対象としンサはこれまでに，ビール，日本酒，お米，肉類，ていた。本研究は，和牛の「味」を対象としてお野菜，果物等種々の食品の味の数値化に成功しり，和牛の「味」に重要な役割を持つ油脂を含有ているが，肉類に関しては，脂肪がセンサ応答のした状態で評価する事が望ましい。油脂全体に占

感度と脂質高分子膜の耐久性に悪影響を及ぼすた

める個体脂の割合を百分率で示した個体脂指数

めに，肉の味に重要とされる脂肪を除去して評価（SFI）によると牛肉油脂において，約50℃以上を行っているのが現状である。脂肪は，牛肉ので大部分が溶解する５）。従って，味覚センサでの３）© The Ito Foundation

36

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 1 Basic samples used in the taste experiments．
試

薬

組

成

基準液

30 mM KCl, 0.3 mM tartaric acid

塩味サンプル

300 mM KCl , 0.3 mM tartaric acid

酸味サンプル

30 mM KCl, 3 mM tartaric acid

旨味サンプル

30 mM KCl, 0.3 mM tartaric acid，10 mM monosodium glutamate

苦味サンプル

30 mM KCl, 0.3 mM tartaric acid，0.01 vol％ iso-alpha acid

渋味サンプル

30 mM KCl, 0.3 mM tartaric acid，0.05 wt％ tannic acid

洗浄液

100 mM KCl, 10 mM KOH，30％ EtOH

測定を50℃で行う事が可能か否かを評価した。測牛サーロイン）を用いた。サンプル調整は，以下

定には，味覚センサ（味認識装置TS-5000Z，（株）の通り行った。①牛肉を厚さ１cm×４cm×５cm

インテリジェントセンサーテクノロジー）及び，に切断後，室温で１時間解凍した。②フライパン

センサ電極として塩味，酸味，うま味，苦味，渋で牛肉表面を60秒，裏面を90秒加熱した。③処理

味センサ（（株）インテリジェントセンサーテク

した牛肉及び等量の味覚センサ基準液をフードプ

ノロジー）を使用した。測定サンプルは，ヒトのロセッサーで１分間ミキシングして混合した。④

官能閾値の約10倍の味強度を有する各基本五味サ

ガーゼを用いて固形分を除去した。⑤得られたサンプル溶液（（株）インテリジェントセンサーテ

ンプル溶液を５，10，100，1000倍に基準液で希クノロジー）を用いた 。用いた基本五味サンプ

釈し，これらを測定用サンプル溶液とした。味覚

ル，基準液，洗浄液をTable １に示した。温度管

センサの測定は50℃で行い，測定ごとに新しいエ理を行うために恒温槽で50℃に調節した水を，測

タノール含有洗浄液を交換し，センサ電極がサン定するサンプル溶液のビーカー周りに循環させ

プル溶液に挿入される時以外はサンプル溶液の蒸た。また，測定中のサンプル溶液の蒸発を防ぐた

発を防ぐために蓋をした。

６）

めに，センサ電極がサンプル溶液に挿入される時（電位計測）以外は蓋をした。
2.2

味覚センサの牛肉油脂に対する影響

３．結果と考察
3.1

50℃での味覚センサ性能評価

油脂を含んだ状態で牛肉を評価するためには，

センサ電極の各味サンプル溶液に対するセンサ

油脂を含んだ基本五味サンプルに対する味覚セン

応答をFig. ２に示した。塩味センサ及び酸味セン

サのセンサ応答や耐久性を確認する必要がある。

サを用いた塩味及び酸味サンプルの測定では，常そ こ で ，基 本 五 味 サ ン プ ル に ，牛 肉 油 脂 を温での測定と比較してセンサ応答は増加したが，10wt％になるように混合し，50℃条件下で味覚標準偏差から考察すると再現性の高い測定結果をセンサの測定を行った。味覚センサの測定で使用得ることができたといえる。うま味センサを用いするエタノール含有洗浄液は，測定回数の増加とたうま味サンプルの測定では，常温での測定と比共に油脂で汚染されることが考えられるため，測較して増加したものの，再現性の高い測定結果を定ごとに新しい洗浄液に交換した。

得ることができたといえる。苦味センサを用いた

2.3

苦味サンプルの測定では，常温での測定と同程度

味覚センサを用いた牛肉の測定

牛肉の測定には，肉質等級Ａ２，Ａ３，Ａ５（和のセンサ応答及び高い再現性が得られた。渋味セ© The Ito Foundation

味覚センサを用いた和牛の味の数値化と可視化に関する研究

37；常温測定， ；50℃測定， ；牛脂 10wt％＋50℃測定

60

塩味

酸味

うま味

苦味

渋味

40

Sensor response(mV）20
うま味センサ 苦味センサ 渋味センサ

塩味センサ

0

酸味センサ

-20
-40
-60
-80
-100

Figure 2

Sensor responses of sensor electrodes to each taste substance．

ンサを用いた渋味サンプルの測定では，常温でのののセンサ応答は約12％低下した。苦味センサを測定と比較してセンサ応答が半減した。以上によ用いた苦味サンプル＋牛肉油脂では，標準偏差はり，味覚センサの50℃での使用は，渋味センサを高く（変動係数15％）センサ応答は約34％低下し除いて十分に使用可能なセンサ性能を有する事がた。標準偏差が高かった理由としては，苦味セン

示され，油脂を溶解した状態での測定が可能であサの脂質高分子膜の疎水性成分と油脂の疎水性度る事が示唆された。また，渋味センサに関しては，との相互作用による影響が考えられる。渋味セン

センサ応答が半減したものの，温度補正を行う事

サを用いた渋味サンプル＋牛肉油脂では，標準偏で使用できると考えられる。

差は低く，センサ応答は約22％低下した。従って，

3.2

味覚センサの牛肉油脂に対する影響

酸味センサと旨味センサは，センサ応答が減少し牛肉油脂が味覚センサに与える影響を評価する

たものの，標準偏差からセンサは安定しているとため，基本五味サンプルに牛肉油脂10wt％を添

いえ，油脂を含む測定サンプルを測定可能である

加し，50℃条件下での測定を行い，油脂を含まなことが示唆された。また，本測定の終了後，油脂

い50℃での測定と比較した（Fig.２）。塩味センを含まない基本五味サンプルで測定を行った結サを用いた塩味サンプル＋牛肉油脂の測定では，果，渋味センサ以外のセンサにおいて，センサ応

センサ応答や安定性に影響を与えないことが分答が回復したことから，油脂に対するセンサの耐かった。よって，塩味センサは，油脂に影響を受

久性を確認でき，繰り返し使用可能であることがけないといえる。酸味センサを用いた酸味サンプ

分かった。

ル＋牛肉油脂では，標準偏差は低いもののセンサ

3.3

応答は約35％低下した。うま味センサを用いたうサンプル調整した各肉質等級を基準液で希釈

ま味サンプル＋牛肉油脂では，標準偏差は低いも（５，10，100，1000倍）し，味覚センサの測定を© The Ito Foundation

味覚センサを用いた牛肉の測定

38

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Sensor response（mV）

-60

４．要

約

本研究は味覚センサを利用して，和牛の「味」-40を客観的に数値化，可視化する評価技術の構築を目的とし，50℃での味覚センサ性能評価，味覚セ-20を用いた牛肉の測定を実施した結果，下記３点が0

Figure 3

ンサの牛肉油脂に対する影響の確認，味覚センサ

Ａ２

Ａ３

Ａ５

Sensor response of umami sensor to wagyu．

明らかとなった。
①油脂が溶解する50℃条件において，味覚センサを使用することが可能であること，行った結果，５，10倍に希釈したサンプルではセ②牛肉油脂を含むサンプルの測定において，塩ンサ応答が飽和しており，100倍希釈したサンプ

味，酸味，うま味センサを使用することが可能でルにおいて，味覚センサの測定範囲内の応答電位あること，におさまった。従って，味覚センサを用いた牛肉③味覚センサの測定において，うま味強度は，Ａサンプルの評価は，100倍程度希釈する必要があ

３＞Ａ５＞Ａ２という関係を有する。
従って，本研究により味覚センサを用いた和牛る事が分かった。
塩味，酸味，苦味，渋味センサは，肉質等級にの「味」の数値化と可視化技術の構築の実現可能

よらず数mV程度しかセンサ応答が得られなかっ性が示された。今後は，牛肉測定のための苦味及た。今後，官能検査を実施し，各味質強度を確認

び渋味センサのセンサ性能の向上を行う必要があする必要がある。うま味センサのセンサ応答をると共に，官能検査を実施し，味覚センサとヒト

Fig.３に示した。Ａ２，Ａ３，Ａ５のうま味センの官能の相関を確認する予定である。

サの応答（平均値±標準偏差）はそれぞれ－40.0±1.1mV，－49.1±1.7mV，－44.5±0.96mVであった。従って，うま味強度は，Ａ３＞Ａ５＞Ａ２という関係であることが示され，牛肉の味評価にお謝辞
本研究で用いた和牛は，伊藤ハム株式会社様からご提供頂いた。ここに謝意を表す。

いてうま味センサが有望なセンサとして用いられることが示唆された。今後は，本結果を確認するために官能検査を実施する必要があると考えられる。また，酸味センサは，サンプルのpHが中性領域において，うま味センサとよく似た結果が得られることが分かっているが，本測定サンプルにおいても，うま味センサと同様のセンサ応答を示した。これは，牛肉に酸味を感じないというヒトの官能から容易に想像できることであると考えら
れる。

文 献
１）
 K. Toko: Biomimetic Sensor Technology,
Cambridge University Press, UK，2000．
２）
 Y. Tahara, K. Toko: IEEE Sensors Journal ， 13（８），3001～3011，2013．
３）
 K. Toko（ed）: Biochemical Sensors, Pan Stanford
Publishing, Singapore，2013．
４）
 沖谷 明紘：栄養学雑誌，60（３），119～129，2002．
５）
 兼松 弘，木下葉子，新谷 勛，松本太郎：油化学，28（５），344～347，1979．
６）
 Y. Kobayashi, M. Habara, H. Ikezaki, T. Chen, Y.
Naito, K. Toko: Sensors ，10（４），3411 ～ 3443 ，
2010．

© The Ito Foundation

39

牛肉に関する健康指標の策定と赤身牛肉の消費者ニーズ調査
Development of healthy beef index and consumer needs survey for lean
beef

広

岡

博

之

（京都大学大学院農学研究科）

Hiroyuki Hirooka（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

Three types of approaches（carcass data analysis, data analysis of fatty acid profiles andhealthy beef indexes, and internet questionnaire-based study）were conducted to investigate
the characteristics and consumers' needs of lean beef. Carcass and fatty acid data of ten grassfed Japanese Brown steers were used as an example of lean beef. The results from carcass
data analysis showed that grass-fed steers produced smaller carcass weight and rib eye area,
thinner rib-thickness, lower beef marbling standard number（BMS number）than concentratefed steers of the same breed kept in conventional farm conditions. About 100 yen cheapercarcass unit price of the grass-fed were predicted from the multiple regression equation
derived from carcass data of concentrate-fed steers. Moreover, the dark red meat and yellow
fat colors of grass-fed steers may lead to further discount of the price. For fatty acid profiles
and healthy beef indexes, grass-fed Japanese Brown steers had a lower n-6 to n-3 fat ration andhigher conjugated linoleic acid（CLA）content when compared with other breeds（JapaneseBlack, Holstein and their crossbreds raised in conventional systems, indicating that beef fromgrass-fed Japanese Brown steers may have positive impact on human health for the two
indicators. In contrast, the atherogenicity index and thrombogenicity index of grass-fed
Japanese Brown steers were significantly lower than those of Japanese Black steers, whichindicated that there was no advantage of beef from grass-fed Japanese Brown steers on humanhealth for the two indexes. These results revealed diverse impacts of beef from various breeds
and production systems on human health. Finally, it was shown from internet questionnairebased study that consumers in Kumamoto Prefecture（520 respondents）were willing to pay
about 1.55 times for purchasing Japanese Brown lean beef as high as beef which they purchase
everyday. Further, the payments were influenced by age and classification by perceptions onbeef（Japanese Brown oriented, social factor oriented and health oriented）of respondents．

１．目が増大し，その多くが食生活に関係していると考的えられている。牛肉をはじめとする畜産物は，戦近年，わが国では，成人病に対する医療コスト

後，貴重な蛋白源として日本人の栄養向上に大き© The Ito Foundation

40

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

く貢献してきたが，最近では，牛肉は相対的に脂肪分が多く，カロリーが高いため，健康に悪い食品と評価されがちである。
熊本県では，大陸からたびたび輸入された韓牛（朝鮮牛）が在来牛として古くから飼養されていたが，これらの在来牛は一般に，粗飼料利用性にどを調べることを目的とした。
２．方法

本研究では，以下の３つのアプローチを用いて褐毛和種放牧肥育の可能性を検討した。
2.1

優れ，温厚な性質で役牛としては適していたが，褐毛和種放牧肥育牛の枝肉形質と市場価値

体格は小さく後駆が貧弱であった 。そこで明治

熊本県阿蘇にある熊本県農業研究センター畜産

中期から大正にかけてシンメンタール種との交配

草地研究所において配合飼料給与のもとで通年放による改良が行われ，その後，褐毛和種は1944年

牧され，冬場（11月から３月）に乾草を給与されに品種として公式に成立してから現在までも定期た褐毛和種放牧肥育去勢牛10頭の枝肉成績を用い的に改良目標の改定を重ねながら，産肉能力の改た。本研究では，このような放牧肥育牛の枝肉成良が推進されてきた 。

績の特徴を明らかにするために，フィールド後代

１）

２）

これまでわが国では脂肪交雑を重視した黒毛和

検定用に濃厚飼料中心に舎飼い肥育された294頭

種中心の肥育が行われ，枝肉市場では脂肪交雑のの褐毛和種去勢牛の枝肉形質（BMSナンバー，

優れた黒毛和種の枝肉は高価で取り引きされてき枝肉重量，ロース芯面積，バラの厚さ，皮下脂肪たが，そのような枝肉市場において，褐毛和種の厚および肉色，脂肪色など）との比較を行った。

枝肉は，脂肪交雑が劣るため低く評価され，生産

草地畜産研究所で飼育された褐毛和種放牧肥育牛

農家の収益は少なく，近年，褐毛和種の飼養頭数の枝肉価格は，枝肉市場では得られなかったのは大幅に減少してきている。しかし，今後，褐毛

で，褐毛和種のフィールド検定成績から枝肉形質

和種のような品種に関しては，いたずらに脂肪交から枝肉単価を予測する重回帰式を求め，褐毛和

雑の向上を期待するよりは，優れた放牧適性を活種放牧肥育去勢牛の枝肉形質を用いて枝肉単価をかして放牧主体の新しい肥育生産体系を構築し，求めた。

赤身牛肉生産をめざす選択肢もあるのではないか

2.2と考えられる。さらに，もしそのような牛肉が人

2.1で用いた放牧肥育されている褐毛和種去勢の健康にプラスの影響があると科学的に証明でき

牛10頭の枝肉から得たロース部位を磨砕し，ソッ

れば，ヘルシーな牛肉を望む消費者のニーズに応

クスレー法によりエーテル抽出した後に，0.5Ｎえることができ，新たな市場が生まれることも期

水酸化ナトリウムーメタノール溶液でケン化後，待できる。

B-Fメタノール溶液でメチルエステル化し，その脂肪酸組成とヘルシー指標

そこで，本研究では，第１に放牧肥育で生産さ後，ガスクロマトグラフにより分析した。得られれた褐毛和種牛肉の枝肉市場での評価の可能性をた脂肪酸組成から，特にオレイン酸（Ｃ18：１），

検討し，第２に褐毛和種放牧肥育牛肉の脂肪酸組

αリノレイン酸（Ｃ18：３），オメガバランス

成およびヘルシー牛肉の指標を他の品種と比較（ｎ-６系脂肪酸／ｎ-３系脂肪酸；ここではリ

し，第３に，インターネットアンケートを褐毛和

ノール酸とリノレン酸の比），共役リノール酸種の産地である熊本県で実施し，消費者の赤身牛（CLA），アテローム生成指標，血栓形成指標に肉に対するニーズと褐毛和種牛肉へ支払意思額な

注目し，これらの数値を算出して，すでに我々が© The Ito Foundation

牛肉に関する健康指標の策定と赤身牛肉の消費者ニーズ調査

41

アテローム生成指標 AIND＝（４×ミリンスチン酸（Ｃ14：０）＋パルミチン酸（Ｃ16：０））÷（多価不飽
和脂肪酸合計＋１価不飽和脂肪酸合計），血栓形成指標 TIND＝（ミリンスチン酸（Ｃ14：０）＋パルミチン酸（Ｃ16：０）＋ステアリン酸（Ｃ18：０））÷（0.5×（１価不飽和脂肪酸合計＋ｎ－６系多価不飽和脂肪酸＋３×（ｎ－３系多価不飽和脂肪酸合計＋オメガバランス））

脂肪酸組成データベースとして収集・蓄積していになるようランダムに抽出した。本研究では褐毛る黒毛和種，ホルスタイン種，交雑種の数値（広和種の認知度と普段の牛肉の購買価格，放牧赤身岡，未発表）と比較し，褐毛和種放牧肥育牛の脂肉や褐毛和種牛肉へ支払意思額を聞き，さらに褐

肪酸組成と健康指標に関する特徴を明らかにし

毛和種牛肉を食した経験を持つ消費者には褐毛和た。なお，アテローム生成指標と血栓形成指標は

種牛肉に対する印象を聞いた。
赤身牛肉や褐毛和種牛肉に対する消費者の価値

上記の式によって求めた 。
３）

2.3

観は，以下に示すプレミアム指数によって数値化

消費者ニーズ調査

調査はインターネットアンケート会社のマクロした。すなわち，まず普段購買している牛肉の値ミルに依頼し，熊本県に在住の男女を対象に，段（購買価格）について，98円から2000円以上ま2013年11月14日から2013年11月18日にかけてインでの16段階（100ｇ当たり金額）で回答を得た後，ターネットアンケートを実施し，20歳以上の男女分析対象とする放牧赤身肉や褐毛和種の牛肉の購520人を性別，年齢層（20歳代，30歳代，40歳代，買に対する支払意思額を聞き取るために，以下の50歳代，60歳以上）別に，できる限り均等な人数

ような簡単な説明を行なった。

放牧赤身肉に関する支払意思●普段購入する牛肉100ｇあたりの金額に追加で□

日本では従来，牛肉は霜降りが多いほど美味しく，

円，高くても購入する（半角数字）

高級である，とされてきました。そのため，現在の牛肉生産では出荷前に牛に多量の脂肪をつけるため，

褐毛和種に関する支払意思

とうもろこしなどの穀物の飼料を給与するのが一般

褐毛和種（あか牛とも呼ばれる）という品種の牛的です。しかし近年では，脂肪分の多い牛肉を食べが，熊本県を中心に飼養されています。褐毛和種はることによる健康への影響から，霜降り重視の牛肉

放牧に適し，性格がおとなしく飼育しやすいという生産が見直され，赤身肉本来の美味しさが味わえる特性を持っています。また，肉質は赤身が多く，適牛肉の生産に注目が集まっています。また，多量の度な脂肪分も含み，赤身肉本来のうま味とやわらか

穀物飼料給与による牛への影響や飼料の生産にかかさ，ヘルシーさを兼ね備えています。

る費用の問題から，放し飼い（放牧）の環境下で牧

上記のような特徴を持つ褐毛和種牛肉が販売され草を自由に食べさせる牛肉生産をする農家が増えてた場合，いくらまでなら普段購入する牛肉より高くいます。

ても購入しますか。

上記のような牛肉が販売された場合，いくらまで100ｇあたり追加の金額（税込）をお答えください。

なら普段購入する牛肉より高くても購入しますか。

※購入されない場合は『０円』とお答えください。

100ｇあたり追加の金額（税込）をお答えください。

【必須入力】※購入されない場合は『０円』とお答えください。

●

普段購入する牛肉100ｇあたりの金額に追加で□© The Ito Foundation

円，高くても購入する（半角数字）

42

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

このような放牧赤身肉や褐毛和種牛肉に対して，いくらまでなら普段購買している牛肉よりTable 1 Comparison of carcass traits between grass-fed

and concentrate-fed Japanese Brown steers

高くても購入するか（支払意思額）を自由回答

Grass-fed

Concentratefed（100ｇ当たり金額））で質問し，広岡４）の手法に

Number of animal

10

294

基づき，以下の式から褐毛和種のプレミアム指数

Slaughter age (month）

27.1

25.3

Carcass weight（kg）

427.0±28.4

470.0±41.8

BMS number

2.2±0.4

3.2±0.9

Rib-eye-area（cm２）42.3±5.6

50.0±6.8

Rib thickness（cm）

6.6±0.5

7.1±0.7

ここで，たとえばプレミアム指数が1.4というFat thickness（cm）

2.2±0.2

2.7±0.8

ことは，消費者は40％までそのような牛肉を高くMeat color（BCS）

5.2±0.6

3.9±0.5を算出した。
プレミアム指数＝（購買価格＋支払意思額）／購買価格

購買してもよいという意思を持っていることを表している。
次に褐毛和種を食した経験のある消費者（361

Fat color（BFS）

6.0±0.7

2.8±0.4

Carcass unit price（yen/kg）

1058±67ａ

1159±184a:Predicted from the multiple regression equation名）に，褐毛和種牛肉の印象に関する８種の質問

育牛とフィールド後代検定用の慣行肥育去勢牛の（「ジューシーで柔らかい」，「適度な歯ごたえがあ

枝肉形質を比較したものである。放牧肥育牛は，る」，「コクのある味わいがある」，「赤身肉本来の出荷月齢が進んでいるにもかかわらず，枝肉重量

旨さが味わえる」，「脂肪が少なく，さっぱりしてやロース芯面積が小さく，バラが薄く，BMSナいる」，「ヘルシーである」，「価格が高い」，「なか

ンバーも低いことが示された。また，放牧肥育牛

なか手に入らない」）を行い，各質問項目に関しの枝肉単価は求められていないため，慣行肥育牛て６段階の評価（「非常にそう思う」から「まっの枝肉成績から求められた重回帰式（下記に示

たくそう思わない」まで）の回答を得た後に，そす）から，枝肉単価を予測したところ，1058円とれらの数値を主成分分析し，主成分スコアーを算なり，慣行肥育牛よりも100円程度安価になると出した。

考えられた。なお，下式でCWTは枝肉重量（㎏），

最後に，日頃の牛肉購買価格と赤身肉プレミア

REAはロース芯面積（cm ２），RTはバラの厚さ

ム指数，褐毛和種プレミアム指数に関与する要因（cm），SFTは皮下脂肪厚（cm），BMSはBMSナを特定するために，最小２乗分散分析を行った。

ンバーを示し，回帰係数のアスターはその係数が最小２乗分散分析においては，性別と年齢層を母ゼロであるかどうかの検定結果である。

数効果，個々の主成分因子を共変量として取り上

3.2

げた。

Table２は，放牧肥育褐毛和種去勢牛の脂肪酸組成および健康指標について，同じ大規模企業体

３．結果と考察3.1

農家で濃厚飼料主体で舎飼い飼養された黒毛和褐毛和種放牧肥育牛の枝肉形質と市場価
値

種，ホルスタイン種およびそれらの交雑種の数値と比較した結果である。特に人間の健康と関連性

Table１は，本研究で用いた褐毛和種の放牧肥
重回帰式

脂肪酸組成

が高いと考えられている項目に関して検討する

枝肉単価（円／㎏）＝966.7－1.13＊＊CWT＋3.90＊REA＋32.66＊＊RT－36.16SFT＋123.95＊＊BMS© The Ito Foundation

43

牛肉に関する健康指標の策定と赤身牛肉の消費者ニーズ調査

Table 2 Comparison of fatty acid composition and healthy beef indicators of grass-fed Japanese Brown steers withsteers of other breeds under conventional fattening systems
Holstein

Ｆ１

Japanese Black

Grass-fed Japanese
Brown

Number of animal

20

９

９

10

Slaughter Age（days）

647.4

747.3

914.2

828.9

Carcass weight（kg）

451.4

492.4

518.1

427

Myristic

Ｃ14：０

2.83ab

3.20ａ

2.29ｂ

2.52ｂ

Pentadecanole

Ｃ15：０

1.05ｂ

1.35ａ

1.11ａ

0.27ｃ

Palmitic

Ｃ16：０

27.55ａ27.83ａ23.78ｂ

26.72ａPalmitoleic

Ｃ16：１

3.22ｂ

3.69ａ

3.84ａ

2.83ｂ

Margaric

Ｃ17：０

0.81ｂ

0.76ｂ

0.73ｂ

0.75ｂ

Margaoleic

Ｃ17：１

0.64ｂ

0.62ｂ

0.86ａ

0.49ｃ

Stearic

Ｃ18：０

11.94ｂ

9.83ｃ

9.41ｃ

14.34ａ

Oleic

Ｃ18：１

44.66ｂ

46.15ｂ

51.49ａ44.22ｂElaidic

t9-C18：１

0.22ａ

0.18ab0.17ｂ0.21abTrans-vaccenic

t11-C18：１

0.80ｂ

0.68bc

0.55ｃ

1.10ａ

Linoleic

Ｃ18：２

2.07ａ

1.85ab

1.77abc

1.40ｃ

Linolenic

Ｃ18：３

0.13ｂ

0.09ｃ

0.10bc

0.27ａ

Arachidic

Ｃ20：０

0.061ｂ

0.057ｂ

0.056ｂ0.101ａIcocenoic

Ｃ20：１

0.15ｃ

0.26ｂ

0.37ａ

0.19bcSaturated fatty acid

SFA

45.46ａ44.24ａ38.59ｂ46.40ａMonounsaturated fatty acid

MUFA

50.91ｂ52.27ｂ57.88ａ49.73ｂPolyunsaturated fatty acid

PUFA

2.87

2.62

2.62

2.90

Omega balancen-6:n-３

17.18ａ20.63ａ17.76ａ5.32ｂConjugated linoleic acidCLA

0.344ｂ0.386ｂ

0.384ｂ

0.865ａAtherogenicity index

AIND

0.735ａ0.677ｂ

0.565ｃ0.702ab

TIND

1.574ａ1.499ａ1.181ｂ

1.648ａFat content

7.8ｃ

17.0ｂ

34.2ａ

10.4ｃ

Melting point

35.6ａ

33.1ｂ

27.6ｃ

37.4ａ

Thrombogenicity index

Comparisons within a row with different superscripts are significantly different at p＜0.05と ，褐 毛 和 種 放 牧 肥 育 牛 は 共 役 リ ノ ー ル 酸

していた。海外の報告を見ると，Daleyら６）は，（CLA）の割合が高く，オメガバランスの数値が本研究結果と同様に放牧牛は舎飼い牛と比べて共低いことから，これらの指標については，人間の役リノール酸の割合が高く，オメガバランスが低健康に対してプラスの影響のあることが示唆されいと報告している。また，最近，Bjorklundら７）は，た。最近，放牧牛と慣行飼育牛の脂肪酸組成を比

乳用種において放牧肥育牛と有機肥育牛，慣行舎較した研究が国内外でいくつか報告されている飼い肥育牛の牛肉の脂肪酸組成を比較し，放牧肥が，中村ら

育牛のオメガバランスは舎飼い肥育牛や有機肥育は，褐毛和種肥育牛のオメガバラン

５）

スは慣行肥育牛と比べて大幅に低いと報告しており，本研究の結果は，中村らの結果とよく一致

５）

牛よりもかなり低いと報告している。
他方，褐毛和種放牧肥育牛のアテローム生成指© The Ito Foundation

44

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 3 Eigenvectors obtained from principal component

analysis for consumers' perception on Japanese
Brown beef者が褐毛和種を食べた経験を持っていたが，20代では約60％にとどまっていた。
褐毛和種牛肉を食した経験のある消費者を対象

Question

PC１

PC２

PC３

Juiciness and tenderness

0.36

0.10

－0.62

に，食した牛肉に対する印象を主成分分析した結Resilient

0.39

－0.05

－0.13

果を示したものがTable３である。第１主成分はRich taste

0.42

－0.02

－0.27

いずれの項目とも正の相関があるため，「褐毛和Delicious lean

0.42

－0.12

－0.08

Flinty

0.40

－0.28

0.36

種高評価因子」と名付けた。すなわち，この主成Healthy

0.37

－0.24

0.53

Expensive

0.22

0.68

0.10

が高いと考えた。なお，「高価格」と「入手困難」

Difficult to obtain

0.16

0.68

0.32

の２項目はどちらかといえば負のイメージに見えProportion

0.52

0.17

0.08

るが，高価格でしかも入手困難とする印象は，希Cumulative proportion

0.52

0.69

0.77

少性を表す意識と考えれば，褐毛和種牛肉を高く分のスコアーが大きいほど褐毛和種に関する評価

評価していると考えることも可能である。次に，数と血栓形成指数は，ホルスタイン種と同程度

第２主成分は「高価格」と「入手困難」と正の相で，黒毛和種と比べて数値が高かった。一般に，関を持っており，褐毛和種牛肉の味に関する印象

アテローム生成指数と血栓形成指数は数値が高い

ではなく，いずれも社会的要因と関連するものなほどこれらの疾病に罹患しやすいと考えられていので，「社会的要因重視因子」と名付けた。第３るため，褐毛和種放牧肥育牛の牛肉は，黒毛和種の主成分は，ヘルシーさとのみ強く関連していたの牛肉と比べて健康面で劣ると推察された。このため，「健康重視因子」と名付けた。これら３種ような結果が得られたのは，これらの指数の大きの主成分スコアーによって全体のばらつきが76％

さは計算式の分母の不飽和脂肪酸の割合，特にオ説明されたため，本研究ではこの３主成分スコ

レイン酸割合に大きく依存しており，オレイン酸

アーのみを取り上げて後の分析に利用した。

の割合が高かった黒毛和種の牛肉はこれらの指数が低くなったためと考えられた。
3.3

Table４は，購買価格，放牧赤身牛肉と褐毛和
種牛肉のプレミアム指数に対する性別，年齢層おアンケート調査結果

よび３種の主成分スコアーの影響を調べた結果で牛肉の購買価格，放牧赤身肉プレミアム指数，ある。いずれの項目に対しても年齢層の効果は有褐毛和種牛肉プレミアム指数の平均値はそれぞ意で，年齢が上がるにつれて，牛肉の購買価格はれ，362円，1.47，1.55で，熊本県の消費者は放牧

上昇し，その一方で，いずれのプレミアム指数も赤身牛肉および褐毛和種牛肉を日頃購買している低下した。牛肉の購買価格が増加したのは，年齢

牛肉よりもそれぞれ，約47％および55％高く購買が上がるにつれて所得が向上し，高い牛肉を購買してもよいと考えていることが明かとなった。

する割合が増えたためと考えられ，またプレミア

また，熊本県の消費者520名のうち，褐毛和種

ム指数の低下は高齢層ほど日頃高価な牛肉を購買

牛肉を食した経験のある消費者は361名で，全体しているため，褐毛和種牛肉への支払意思額が相の69％であった。年代別にみると，50代までは，対的に低くなって，結果としてプレミアム指数が

年齢が上がるにつれて褐毛和種の牛肉を食した経低下したものと考えられた。

験のある消費者が増加し，50代では約80％の消費

主成分成分スコアーの影響に関しては，第１主© The Ito Foundation

45

牛肉に関する健康指標の策定と赤身牛肉の消費者ニーズ調査

Table 4 Least squares means by the effects on purchased price of beef, premium index ＋ for lean beef and premiumindex for Japanese Brown beef
Purchased price
GenderPremium index for lean beef

Premium index for Japanese
Brown beef

1.51

1.62

＊

Male

405.1ａFemale352.9ｂ

1.46

1.51

Age group

＊＊

＊＊

＊＊

20ｓ

327.6ｃ

1.65ａ

1.65ａ

30ｓ

313.7ｃ

1.54ab

1.54ab40ｓ353.0bc

1.49abc

1.49abc

50ｓ

404.7ｂ

1.33ｃ

1.33ｃ

60s and/or over

495.1ａ1.41bc1.41bc1.7

0.028

0.043＊＊－28.1＊＊

0.107＊＊

0.072＊＊－5.7－0.092＊－0.134＊＊

Regression coefficient for principle component
Japanese brown oriented
Social factor oriented
Health oriented＋；Premium index was obtained as（everyday beef purchased price＋willing-to-pay value）/everyday beef purchased price＊：ｐ＜0.05，＊＊；ｐ＜0.01

abc；Comparisons within a row with different superscripts are significantly different at p＜0.05

成分の褐毛和種高評価因子の影響は褐毛和種プレ今後，褐毛和種放牧肥育牛の牛肉の販売には，品ミアム指数のみにおいて有意であった。このこと

質のさらなる向上と緻密な経営戦略，消費者へのから，褐毛和種牛肉を高く評価する消費者ほど褐

十分な情報伝達の必要なことが示唆された。

毛和種の牛肉を高く購買してもよいと考えていることがうかがえた。第２主成分である社会的要因

４．要約

重視因子に関しては，いずれの項目に対しても有本研究では，褐毛和種放牧肥育の牛肉の市場価意に影響し，価格や入手の困難さなどの社会的要値と人間の健康影響および消費者ニーズを調べる

因を重視する消費者ほど，牛肉を安価で購買し，ために，褐毛和種の放牧肥育牛と慣行肥育牛の枝放牧赤身牛肉や褐毛和種牛肉に対する支払意思の肉成績の比較，脂肪酸組成に関する他品種との比高いことが示された。第３主成分の健康重視因子

較およびインターネットアンケート調査データのは，放牧赤身肉と褐毛和種のいずれのプレミアム

分析の３つのアプローチを実施した。分析対象と指数もマイナスの影響を及ぼすことが示された。

して10頭の褐毛和種放牧肥育去勢牛の枝肉成績とこの結果は予想外で，そもそも，放牧赤身牛肉や脂肪酸組成のデータを用いた。枝肉成績の比較結

褐毛和種の牛肉は人間の健康に良いことを一つの果から，慣行肥育牛の枝肉成績と比べて，放牧肥利点として販売しようと考えられていたが，これ

育牛は枝肉重量とロース芯面積が小さく，バラはらの牛肉に対する消費者の意識は，むしろ高付加

薄く，BMSナンバーが低く，さらに放牧肥育牛

価値のある牛肉と認識していることが明らかとの枝肉単価を重回帰式によって枝肉形質から求めなった。この結果は，われわれ畜産関係者が考えたところ，慣行肥育牛よりも100円程度安価になていることと消費者の意識の乖離を示すもので，ると予測された。しかも，褐毛和種放牧肥育牛の© The Ito Foundation

46

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

牛肉は，肉色が濃く，脂肪色が黄色であるため，謝辞

現実にはさらに安価になる可能性も考えられた。

本研究を進めるに当たり，熊本県農業研究センター

脂肪酸組成と健康指標に関しては，放牧肥育牛は畜産草地研究所の家入誠二所長と堺久弥氏に貴重なオメガバランス（ｎ-６系脂肪酸とｎ-３系脂肪酸

枝肉成績のデータを使わせていただいた。ここに感の比）が低く，共役リノール酸割合が高いことか謝する。

ら，これらの指標に関しては人の健康にプラスの影響があると推察されたが，他方，アテローム生成指数や血栓形成指数に関しては，黒毛和種の牛肉と比べて数値が有意に高く，人の健康に対する評価は黒毛和種より劣ることが示唆された。インターネットアンケートの結果，熊本県の消費者は
褐毛和種の牛肉に対して，日頃購買している牛肉
よりも1.5倍以上高く購買してもよいと考えており，高価でなかなか手に入らない希少性を評価していることがうかがえた。

参考文献
１）
 古賀脩，岡本悟：畜産の研究，39，116～128．
1985．
２）
 住尾善彦：動物遺伝育種研究，35，141～146．
2007．
３）
 Ulbricht TLV, Southgate DAT ： Lancet ， 338 ，985～992．1991．
４） 広岡博之：畜産の情報，276，57～62．2012．
５） 中村好徳，金子真，林義明，莟博之，山田明史：
日本暖地畜産学会報，55（２），179～192．2012．
６） Bjorklund EA, Heins BJ, DiCostanzo A, ChesterJones H ： Journal of Dairy Science ， 97 ， 1828 ～1834．2014．
７）
 Daley CA, Abbott A, Doyle PS, Nader GA,
Larson S：Nutrition Journal，９，10．2010．

© The Ito Foundation

47

豚血液由来抗肥満素材による内臓脂肪蓄積抑制機構の解明
Anti-obese action of a porcine blood-derived food ingredient

上 曽 山

博

（神戸大学大学院農学研究科）

Hiroshi Kamisoyama（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

It is well known that edible meat products and by-products are notable sources of
essential nutrients such as protein, minerals, and vitamins. However, there is little attention to
the biological functions of these products. In Japan, blood is not usually used as a food material,
and therefore, has been wasted as a by-product. In the present study, we have investigated theeffects of dietary heme iron on the lipid metabolism in high-fat diet-induced obese mice. Dietaryheme iron tended to increase the relative weight of gastrocnemius muscle and decrease therelative weight of perirenal adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. The plasma
levels of triglyceride and nonesterified fatty acid were not affected by heme iron. Dietary heme
iron significantly increased the levels of the mRNA of carnitine palmitoyltransferase-1b anduncoupling protein 2 in the soleus muscle. These results suggest that the natural ingredientheme iron promotes fatty acid oxidation in the muscle, which in turn, results in the decrease of
abdominal fat in the high-fat diet-induced obese mice．

１．目の「抗肥満」の重要性は更に高まると判断される。

的

欧米では，家畜の畜産副生物を食品として活用

高齢化社会を迎えつつある我が国においては，する文化が根付いている。例えば，血液はブラッ

ごく近い将来，介護医療に要する費用の急激な増ドソーセージとして食される。我が国において加は避け得ないと言われているが，その介護医療

も，畜産副生物のうち，消化管や肝臓等の可食臓が必要となる疾患の主因とされている動脈硬化を器は食用として，その他の非可食臓器類について引き起こすメタボリックシンドロームの原因となは飼料・肥料用として，それぞれ有効に利用される肥満の効果的な予防法は未だ見出されていなているが，保存や流通に費用が掛かる血液についい。また，2011年のWHOの発表によれば，我がては，我が国においては食文化がないこともあ

国における60歳以上の高齢者の割合は人口の30％り，多額の費用を掛けて廃棄（或いは，環境へ流（世界最高）を占める。それ故，今後は，介護医出）されている。それ故，血液の有効利用法の開療に繋がるメタボリックシンドローム予防のため発が極めて重要な課題となっている。鉄分補給用© The Ito Foundation

48

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）の食品素材として用いられてきた豚の血球画分をTable 1 Composition of experimental diets（g/100g diet）

酵素分解して得られる水溶性ヘム鉄の給与は，高Control

Heme iron

Casein21

18

L-Cystein

0.39

0.39

Corn starch

20.94

20.94

Sucrose8.9

8.9

ヘム鉄は，鉄分補給用途に加え，抗肥満用途の食

脂肪食肥満マウスの精巣上体周囲脂肪組織重量を減少させる傾向を示す１）。また，その効果は，３％という低い添加率で認められることから，水溶性

Soybean oil

22

品素材としても利用できる可能性があると判断さ

Beef tallow

32.9

32.9

れた。しかしながら，その詳細な作用機構についCellulose

6.5

6.5

Mineral mixture１）

1.3

1.3

Vitamin mixture２）

1.7

1.7

CaHPO４・２Ｈ２Ｏ

0.71

0.71

としての利用法拡大のための一環として，水溶性ては明らかにされていない。
本研究では，畜産副生物である血液の食品素材

CaCO３

2.1

2.1

ヘム鉄の内臓脂肪蓄積抑制機構を明らかにするこ

Potasium citrate

1.3

1.3

とを目的とした。

Choline-tartrate

0.26

0.26

Heme iron03１）AIN-93G Mineral mixture (Japan SLC, INC., Shizuoka, Japan）
２）AIN-93G Vitamin mixture (Japan SLC, INC., Shizuoka, Japan）

２．方法

水溶性ヘム鉄を０或いは３％含む高脂肪食飼料（Table １）を５週齢のICRマウス（日本エスエル

Table 2 Primers used for quantitative RT-PCR
RPS17

Forward5’- CCG GGT CAT CAT CGA GAA GT -3’

Reverse5’- GCG CTT GTT GGT GTG GAA GT -3’

Forward5’- GAS AGC TTG GCA CAG TGC AA -3’

Reverse5’- CAC CCA TGG ATC ACC ACA AA -3’

Forward5’- GAA CCC CAA CAT CCC CAA AC -3’

Reverse5’- TCC TGG CAT TCT CCT GGA AT -3’

ATGL

Forward5’- CCT CAG GAC AGC TCC ACC AA -3’

Reverse5’- TTG AAC TGG ATG CTG GTG TTG -3’

UCP1

Forward5’- TGT TCA TTG GGC AGC CTA CA -3’

Reverse5’- TGG CTC TGG GCT TGC ATT -3’

CPT-1bForward5’- GTG CAA GCA GCC CGT CTA G -3’

Reverse5’- TTG CGG CGA TAC ATG ATC AT -3’

UCP2

Forward5’- TGA TGT GGT CAA GAC GAG ATA CAT G -3’

Reverse5’- CAG TGA CCT GCG CTG TGG TA -3’

UCP3

Forward5’- TTT TGC GGA CCT CCT CAC TT -3’

Reverse5’- TGG ATC TGC AGA CGC ACC TT -3’

HSL

Forward5’- GGC GAA AAG GCA AGA TCA AA -3’

Reverse5’- CAT CGT GCG TAA ATC CAT GCT -3'

Forward5’- GAT GGA CGG TAA CGC GAA TG -3'

Reverse5’- TAC AGG GCG GCC ACA AGT -3’

FAS

CPT-1aLPL© The Ito Foundation

豚血液由来抗肥満素材による内臓脂肪蓄積抑制機構の解明

49

シー株式会社）に４週間給与した。試験飼料給与

与による有意な差は認められなかった（Fig.２）。

期間中は，摂食量を毎日測定し，体重を毎週測定

褐色脂肪組織における脂肪酸酸化関連遺伝子であした。24時間絶食後，イソフルラン麻酔下で腹部る脱共役タンパク質（UCP）１のmRNA量にも大静脈より採血し，血漿を分離後，市販のキット有意な差は認められなかった（Fig.２）。

トリ

精巣上体周囲脂肪組織における脂肪分解関連遺グリセライド：和光純薬工業株式会社）を用いて伝子である脂肪組織TGリパーゼ（ATGL），およ

ト リ グ リ セ リ ド （TG） お よ び 遊 離 脂 肪 酸

び，脂肪酸の脂肪組織への取り込みの律速酵素で（NEFA）の血中濃度を測定した。また，肝臓重あるリポタンパク質リパーゼ（LPL）のmRNA

量，腹部脂肪（精巣上体周囲脂肪および腎周囲脂量にはヘム鉄給与による有意な差は認められな肪）重量，褐色脂肪組織重量，腓腹筋重量およびかったが，ホルモン感受性リパーゼ（HSL）のそ

ヒラメ筋重量を測定した。さらに，脂質代謝関連

れには増加傾向が認められた（Fig.２）。

（ラボアッセイTM

NEFA，ラボアッセイ

TM

臓器組織として肝臓，脂肪組織，筋肉および褐色

ヒラメ筋においては脂肪酸酸化の律速酵素であ

脂肪組織からセパゾール RNA I（ナカライテス

るCPT-1b，および，脂肪酸酸化関連遺伝子であク株式会社）を用いて総RNAを抽出し，脂肪合るUCP２のmRNA量に水溶性ヘム鉄給与による成 あ る い は 分 解 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 7300 Real

有意な増加が認められ，骨格筋に特異的なUCP

Time PCR System（アプライドバイオシステム

であるUCP３にも増加傾向が認められた（Fig.

ズジャパン株式会社）およびTHUNDERBIRD

２）
。

Ⓡ

Ⓡ

SYBR qPCR Mix（東洋紡績株式会社）を用いたⓇ

リアルタイムPCRにより解析した。リアルタイム

４．考察

PCRに用いたプライマーはTable２に示した。統

本実験において，ヘム鉄の給与はマウスの体重計解析はスチューデントの t 検定により行った。

当りの腎周囲脂肪組織重量を減少させる傾向を示３．結した。以前の実験においては，ヘム鉄の給与によ果りマウスの精巣上体周囲脂肪組織重量が減少する

ヘム鉄の給与はマウスの体重，摂食量，肝臓重傾向を示した１）。この相違の原因については不明

量，褐色脂肪組織重量，精巣上体周囲脂肪組織重であるが，本実験においても体重当りの精巣上体量には影響を及ぼさなかったが，腎周囲脂肪組織

周囲脂肪組織重量はヘム鉄給与群において対照群

重量を減少させ，腓腹筋重量を増加させる傾向を

より低い値を示しており，以前の実験においても示した（Fig.１）。血中のTG濃度（対照群72.4±

体重当りの腎周囲脂肪組織重量はヘム鉄給与群に7.6㎎/100mlに対し，ヘム鉄給与群61.0±6.41㎎

おいて対照群より低い値を示している。これらの/100ml）およびNEFA濃度（対照群0.50±0.05μことから，ヘム鉄はマウスの内臓脂肪蓄積抑制作

Eq/100ml に 対 し ，ヘ ム 鉄 給 与 群 0.47 ± 0.09 μ用を有する可能性が示された。

Eq/100ml）には有意な差は認められなかった。

水 溶 性 ヘ ム 鉄 添 加 区 に お い て ，ヒ ラ メ 筋 の肝臓において，脂肪酸合成の律速酵素である脂CPT-1bおよびUCP２のmRNA量が有意に増加

肪酸合成酵素（FAS），および，脂肪酸酸化の律

し，UCP３のmRNA量も増加する傾向を示した。

速酵素であるカルミチンパルミトイルトランス

CPT-1bはミトコンドリアにおける脂肪酸のβ酸

フェラーゼ（CPT）-1aのmRNA量には，ヘム鉄給化の律速酵素として知られている２）。また，UCP© The Ito Foundation

50

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

10
Control

0.1

0Control

5
4
3
2
1
0

Control

Heme iron

0.04
0.03
0.02
0.01

Control0

Heme iron

6

Control

Heme iron

2

5
4
3
2
1
0

Heme iron

Ｐ＝0.0650

0Heme iron

0.2

Liver（g/BW）

20

Perirenal fat（g/BW）

30

0.05

100

Epididymal fat（g/BW）

Brown adipose tissue（g/BW）

Food intake（g）

40

0

Gastrocnemius muscle（g/BW）

150

Soleus muscle（mg/BW）

Body weight（g）

50

Control

Heme ironControl

Heme iron

1.5

Ｐ＝0.105

1
0.5
0Control

Heme iron

0.3

0.2

0.1

0

Fig. 1 Effect of heme iron on body weight, food intake, and the relative weight of liver, brown adipose tissue, adipose

tissues, and muscles in high-fat diet-induced obese mice. Data represent the mean ±group．

SEM for eight mice in each

２およびUCP３は脂肪酸β酸化の亢進時にそのウスの腓腹筋重量が増加する傾向を示した。それ発現が促進されることが報告されている 。これ

故，ヘム鉄給与群においてはマウスの運動量が増らの知見と我々の結果から，水溶性ヘム鉄の給与加していた可能性があり，このことが，ヘム鉄給により，骨格筋における脂肪酸β酸化が亢進した

与群における腎周囲脂肪組織重量の減少に関与しことが示唆された。

ている可能性もある。今後，ヘム鉄給与が，マウ

３）今回，水溶性ヘム鉄の給与により，骨格筋における脂肪酸β酸化が亢進したことが示唆された

スの運動量に及ぼす影響について調べる必要があろう。

が，一般に，骨格筋におけるβ酸化は運動時や絶ヘム鉄給与は，精巣上体周囲脂肪組織における食時に促進することが知られている。更に，本実HSLのmRNA量を増加させる傾向を示したが，験においては，ヘム鉄給与により，体重当りのマ

血中遊離脂肪酸濃度には有意な変化が認められな© The Ito Foundation

51

0.5

Control

Heme ironMuscle CPT1b(Arbitrary unit）

White adipose tissue
HSL(Arbitrary unit）

1

0

Control

0.4
0.2
0Control＊＊
1

Control

Heme iron

Heme iron

0.8
0.4

Control

＊

0.4
0.3
0.2
0.1
0

Control

Heme iron

5
4
3
2
1
0

Control

Heme ironControl

Heme iron

1.5
1
0.5
0

Heme iron

0.5

6

2

Ｐ＝0.091.2

0Heme iron

2

0

0.6

1.6

Muscle UCP2(Arbitrary unit）

White adipose tissue
ATGL(Arbitrary unit）

2

0.8

White adipose tissue
LPL(Arbitrary unit）

0

BATUCP1(Arbitrary unit）

1

1

Muscle UCP3(Arbitrary unit）

1.5

Hepatic CPT1a(Arbitrary unit）

Hepatic FAS（Arbitrary unit）

豚血液由来抗肥満素材による内臓脂肪蓄積抑制機構の解明

Ｐ＝0.06

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

Control

Heme ironFig. 2 Effect of heme iron on the mRNA levels of lipid metabolism-related genes of high-fat diet induced obese mice

Data represent the mean ± SEM for eight mice in each group．＊and＊＊ ，significant with respect to control group（P＜0.05 and 0.01, respectively）．

かったことから，脂肪組織における脂肪分解には影響がなかったことが示唆される。HSLによる脂５．要約

肪の分解は，HSLのリン酸化による活性化，およ本研究では，畜産副生物の利用法開発のためのび，脂肪細胞の脂肪滴にHSLが接することを妨げ一環として，ヘム鉄の抗肥満作用について調べるペリリピンのリン酸化による脂肪滴からの遊離た。ヘム鉄がマウスの脂質代謝に及ぼす影響につによっても制御される 。それ故，HSLのmRNAいて調べた結果，ヘム鉄の給与は，マウスの体重量は増加したものの，その酵素活性や脂肪滴への当りの腓腹筋重量を増加させ，腎周囲脂肪組織重接触が進まなかったため，脂肪分解が促進されな量を減少させることが明らかになった。また，水かったのかもしれない。

溶性ヘム鉄の給与は，ヒラメ筋におけるCPT-

４）© The Ito Foundation

52

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

1b，およびUCP２のmRNA量を有意に増加させることが明らかになった。これらの結果から，水
溶性ヘム鉄は，骨格筋における脂肪酸酸化を亢進させ，その結果として，内臓脂肪蓄積を抑制する可能性が示された。
文献１） 上曽山博：公益財団法人 伊藤記念財団．食肉に関 す る 助 成 研 究 調 査 成 果 報 告 書 ，31 ，６ ～ ７ ，
2013．

２）
 H o u t e n S M , W a n d e r s R J A ：A g e n e r a l
introduction to the biochemistry of mitochondrial
fatty acid b-oxidation. J. Inherit Metab Dis．33，469～477，2010．
３）
 Samec S, Seydoux J, Dulloo AG.：Role of UCP
homologues in skeletal muscles and brown adipose
tissues: mediators of thermogenesis or regulators oflipids as fuel substrate. FASEB J 12，715～724，
1998．
４）
 Zimmermann R, Lass A, Haemmerle G, Zechner
R.：Fate of fat: The role of adipose triglyceridelipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta 1791，494～500，2009．

© The Ito Foundation

53

食肉の給与が海馬のタンパク質リン酸化および遺伝子発現におよぼす影響
Effects of meat supplementation on hippocampal protein phosphorylationand gene expression

豊

田

淳

（茨城大学農学部）

Atsushi Toyoda（College of Agriculture, Ibaraki University）

Recently, the number of patients suffering from diseases related to brain dysfunction suchas depression and dementia has been increased in Japan. In this study, we aimed to elucidate
the chronic effects of meat-containing diet on the molecular function in the brain. Particularly,
we focused on the hippocampus which is related to learning ability and mental disorders, andwe observed the chronic meat containing diet-induced molecular events in the rat hippocampus
comprehensively. Wistar male rats were fed the dried beef-containing AIN93G-based diet（10g/kg of diet and 100 g/kg of diet）for 4 weeks. Body weight and feed intake were measured,and no difference between the groups was observed. Also, using the antibody microarrays（KINEXTM ANTIBODY MICROARRAY, KINEXUS, Canada），the hippocampal protein
expression and their phosphorylation were observed. We found that 29 hippocampal protein
expression or phosphorylation were changed with chronic feeding of dried beef meat-containeddiet（100 g/kg of diet）． Especially, phosphorylation of the tyrosine residue（Y13）of cyclindependent protein-serine kinase 6（CDK6）was enhanced. Conversely, dephosphorylation of thethreonine residue（T202）of extracellular regulated protein-serine kinase 1（Erk1, p44 MAP
kinase）and extracellular regulated protein-serine kinase 2（Erk2, p42 MAP kinase）was
remarkably induced with chronic supplementation of beef meat-contained diet（100g/kg ofdiet），In the future studies, hippocampal events involving gene expression and cell morphology
should be elucidated．

１．目

雇用環境など社会的ストレスの増加によって，認的知症，うつ病などの中枢神経系疾患の患者数が増

本研究の目的は，食肉，特に牛肉の摂取が，記加している。このような現状に加え，東日本大震

憶・学習や精神疾患と関係する脳の海馬における災やその後に起こった福島第一原発事故によるう

影響を，タンパク質，遺伝子レベルで網羅的に解つ病やPTSD患者の増加が懸念されている。これ明することである。

らの疾患への抗うつ剤などの薬剤治療は，長期間近年の日本では，急激な高齢化の進行，また，

にわたることが一般的で，また，重大な副作用© The Ito Foundation

54

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）（自殺企図のリスク増加，攻撃性の増加）の報告で行われた疫学調査によって明らかになっていもされていることから，発症後の治療のみならる６）。以上より，私共は食肉成分にはうつ病など

ず，予防対策にも早急に取り組むべきといえる。

の中枢神経系疾患に対して予防的な効果を期待で

私共は，日々の食生活を通して，これらの中枢きるのではないかと考えた。本研究では，実際に神経系の失調で発症する疾患（神経疾患，精神疾

長期間食肉を経口摂取した場合，摂取しない場合患）等を予防できないかと考え，食物由来成分でと比較して脳内ではどのような分子機構の変化が中枢神経系の機能を改善させる可能性のある因子生じるのか，実験動物（ラット）を用いて詳細にを探索している 。現在までにもいくつかの農産

解析することにした。

１）

物および食物由来の機能性因子について，動物実

脳の海馬は，記憶や学習に重要な役割を担って験を中心に研究を行ってきたが ，今回は食肉におり，てんかんやアルツハイマー型認知症，うつ含まれる成分が中枢神経系の機能へどのような影病，統合失調症などさまざまな中枢神経系疾患に響を与えるか，生化学的に解析を行うことにした。

深く関与すると考えられている７）。本研究では，食肉には必須アミノ酸がバランスよく含まれて牛肉の摂取による脳への影響を海馬に絞って解析

おり，それらは脳内で神経伝達物質であるセロトすることで，中枢神経系疾患に対してどのようなニンやノルアドレナリン等の原料となる３）。例え効果を持つのか，分子レベルで解明することにしば，中枢のセロトニン神経系のシナプス伝達失調た。そこで，牛肉を混合した飼料を慢性的に摂取が，うつ病の原因になりうることがわかっている

させたときのラット海馬におけるタンパク質発現（モノアミン仮説） 。また，ノルアドレナリンは，レベルやリン酸化レベルの変動について，抗体マ

不安障害やうつ病などいくつかの精神疾患との関イクロアレイを用いて網羅的解析を実施した。

２）

４）連が指摘されている。最近では，海馬における脳由来神経成長因子（Brain-derived neurotrophic

２．方法

factor, BDNF）の発現低下が，うつ病の原因のひ

2.1

とつであるとする仮説も出てきている（BDNF仮

真空包装下において，－30℃で凍結保存した牛説） 。このように，うつ病は，様々な生物学的肉（大腿二頭筋）を４℃の冷蔵庫内で解凍した。

原因により発症することが分かってきており，ま半解凍の肉をナイフで裁断後，ミンチ器にて粉砕た，症状も多様であることから，創薬は困難を極し，再度真空包装し，－20℃で凍結後，凍結乾燥

めていると言われている。抗うつ剤が全く奏効しし た 。こ の 牛 肉 乾 燥 粉 末 を 精 製 粉 末 飼 料

ない難治性うつ病も知られている。このことから（AIN93G，オリエンタル酵母工業）へ添加しても，うつ病になりにくい生活習慣を心がけて，う牛肉含有飼料とした。５週齢で動物飼育室へ導入

つ病を予防する観点がより重要になってきているした９頭のラット（ウィスター，オス，チャールと言える。膨張する医療費の抑制という観点からズリバー）は，予備飼育期間１週間を経て，上記も予防医療に力点を置くべき時代である。食生活の牛肉含有飼料の給与を開始した。対照群と牛肉の改善でうつ病を予防できたとする研究は，ほと

給与群①（10ｇ/kg

んど知られていないが，最近，赤身を多く含む牛

ｇ/kg

肉は，適正量を摂取することでうつ病や不安障害

は，４週間（28日間）続けて行い，対照群にはに対するリスクを減らすことが，オーストラリア

AIN93Gのみを給与した。給与期間中は，摂食量５）© The Ito Foundation

４週間の牛肉含有飼料の給与試験diet），牛肉給与群②（100diet）の３群に分けた。試験飼料の給与

55

食肉の給与が海馬のタンパク質リン酸化および遺伝子発現におよぼす影響

を毎日，体重を週一回測定した。なお，動物試験

197.6±8.4ｇ，218.8±5.4ｇ，208.5±13.2ｇであり，については，すべて茨城大学農学部動物実験委員

各群間で有意な差はなかった。これらの結果か

会規則に沿って行った。予備飼育の時期からラッら，本研究で調製した牛肉（大腿二頭筋）の乾燥

トを個別ケージに収容し，単飼した。水と飼料は

粉末は，10％程度精製飼料に添加しても，ラット

自由摂取とし，室温22±１℃，湿度45±５％，12の摂食量にはほとんど影響を与えず，また，増体

時間の明暗サイクル（６時点灯，18時消灯）の環にも影響を与えないことが明らかとなった。
3.2

境下で飼育した。
2.2

給与試験後の海馬におけるタンパク質発

牛肉含有飼料の給与が海馬のタンパク質
発現およびリン酸化量の変化におよぼす影響

４週間の牛肉含有飼料の給与が，ラットの海馬

現量およびリン酸化量変化の解析
2.1の給与試験後，ラットを断頭し，脳より海におけるタンパク質の発現量およびリン酸化量の馬を摘出して，ただちに液体窒素で凍結した。凍変 化 に お よ ぼ す 影 響 を ，抗 体 マ イ ク ロ ア レ イ

結後，－80℃で保存した。海馬の一部を用いてタ（KINEXTM ANTIBODY MICROARRAY ， カ ナ

ンパク質抽出液を下記のマイクロアレイ解析法でダKINEXUS社）を用いて解析した。その結果，指定されている緩衝液で調製した。膜タンパク，牛肉含有飼料（100ｇ/kg diet）の給与で，発現細胞内キナーゼ，細胞内骨格タンパク，ストレス量，またはリン酸化量が顕著に変化した海馬のタタンパク，転写因子等，さまざまなタンパクの発

ンパク質が29個検出されたが，19個は増加し，10現量およびリン酸化量を，抗体マイクロアレイ個は減少した。特に，Cyclin-dependent protein-（KINEXTM ANTIBODY MICROARRAY，カナダ

serine kinase 6（CDK６）の13番目のチロシン残KINEXUS社）を用いて網羅的に解析を行った８）。

基（Ｙ13）のリン酸化が亢進していた。逆に，なお，今回は対照群（ｎ＝３）と牛肉給与群②

Extra-cellular regulated protein-serine kinase（100ｇ/kgdiet）（ｎ＝３）のタンパク質抽出液

1（p44―MAP kinase），およびExtracellular regu-

をそれぞれの群でプールしてアレイに供し，比較

lated protein-serine kinase 2（p42 MAP kinase）

することにした。

の202番目のスレオニン残基（Ｔ202）の脱リン酸化が顕著であった。対照群（０ｇ/kg diet）お３．結果と考察
3.1

よび牛肉給与群（100ｇ/kg

牛肉含有飼料の給与がラットの体重と摂diet），それぞれ３

頭ずつのサンプルを混合し平均化したサンプルの比較のため，統計的な評価は不可能であるが，牛食量におよぼす影響
４週間の牛肉含有飼料の給与が，ラットの体重

肉の慢性的な経口摂取で，海馬のシグナル伝達系と摂食量におよぼす影響について調べた。対照が修飾される可能性は示唆された。CDK６は酵

群，牛肉給与群①（10ｇ/kg

diet），牛肉給与群母Saccharomyces cerevisiaeのCDC28のホモログ②（100ｇ/kg diet）の３群の一日の平均摂食量であり，細胞周期の制御に関わるタンパク質であ（±標準誤差）は，それぞれ25.2±0.3ｇ，26.7±0.2る９）。また，CDK６はCyclin Dと結合することに

ｇ，24.0±0.3ｇであり，各群間で統計的に有意なより，腫瘍抑制タンパク質RBをリン酸化し，細胞差はなかった。また，対照群，牛肉給与群①（10周期を進めることが知られている10）。海馬におけ

ｇ/kg

diet）

るCDK６の機能についてはほとんど知られていの３群の平均増体重（±標準誤差）は，それぞれないが，最近の研究では，CDK６が海馬歯状回

diet），牛肉給与群②（100ｇ/kg© The Ito Foundation

56

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）の神経細胞新生に関与することが明らかとなってが顕著に増減した海馬のタンパク質が29個検出さいる 。海馬の神経細胞新生は，記憶・学習能力

れ ，19 個 は 増 加 し ，10 個 は 減 少 し た 。Cyclin-や，精神疾患発症とも関係していると言われておdependent protein-serine kinase 6 （CDK ６） のり ，今後は，牛肉の摂取が，海馬神経細胞新生

13番目のチロシン残基のリン酸化が亢進していやそれに関与する遺伝子発現におよぼす影響が研た 。 逆 に Extracellular regulated protein-serine

究の焦点になる。また，海馬のMAPキナーゼカ

kinase 1（p44 MAP kinase）およびExtracellular

スケードについても，様々な高次機能，精神疾患

regulated protein-serine kinase 2（p42 MAPに関与することが知られているので，牛肉給与しkinase）の202番目のスレオニン残基の脱リン酸たラットやマウスの行動解析や網羅的遺伝子発現化が顕著であった。今後，これらの分子の変動と解析などを通して，今後，牛肉給与が高次脳機能

海馬神経細胞の新生，高次機能等との関連についへあたえる影響等を精査する必要がある。

て，精査する必要がある。

11）

12）

４．考

察

近年の日本では，急激な高齢化の進行や社会的ストレスの増加によって，うつ病や認知症などの中枢神経系疾患の患者数が増加している。本研究では，食肉の摂取が脳にどのような影響をもたらしているのか解明することを目的とした。特に，記憶・学習機能や精神疾患発症に関係する海馬に着目し，食肉の摂取が脳の海馬における神経活動へ与える影響を分子レベルで網羅的に解明することにした。今年度は，抗体マイクロアレイを用いて，４週間の牛肉含有飼料の給与が，ラットの体重と摂食量，海馬のタンパク質発現およびリン酸
化量におよぼす影響について調べた。その結果，４週間の牛肉含有飼料の給与（10ｇ/kg
よび100ｇ/kg

dietおdiet）は，ラットの摂食量，増体文献１）
 茨 城 大 学 農 医 連 携 プ ロ ジ ェ ク ト http://iucamibaraki.wix.com/iucam２）
 Iio W, et al. ： Amino Acids ，43 ，2037 ～ 2046 ，
2012．
３）
 Nagasawa M, et al.：Animal Science Journal，
83，493～498，2012．
４）
 Berton O, et al.：Nature Reviews Neuroscience，7，137～151，2006．
５） Tsankova NM, et al. ： Nature Neuroscience ，9 ，
519～525，2006．
６） J a c k a F N , e t a l . ：P s y c o t h e r a p y a n d
Psychosomatics，81，196～198，2012．
７） Nestler EJ, et al.：Neuron，34，13～25，2002．
８） KINEXUS社http://www.kinexus.ca/
９） Meyerson M, et al.：EMBO Journal，11，2909～
2917，1992．
10）
 Elizabeth A, et al.：Nature Reviews Cancer，
11，558～572，2011．
11）
 Beukelaers P, et al.：Stem Cells，29，713～724，
2011．
12）
 Yamasaki N, et al.：Molecular Brain， 1， 6，
2008．

には影響を与えなかった。また，牛肉含有飼料の給与（100ｇ/kg

diet）で，発現量，リン酸化量© The Ito Foundation

57

畜産副産物の中性脂肪改善効果について
Effect of livestock by-product on serum triglyceride level

岡

本

芳

晴

（鳥取大学農学部）

Yoshiharu Okamoto（Faculty of Agriculture, Tottori University）

We examined effects of degradation product from porcine liver（Liver Hi ®）on the
improvement of triglyceride and cholesterol using high fat diet fed mouse model. C57BL/6
mice（male, 6 weeks old）were fed high fat diet for 28 days. Mice had been drank diluted
water with or without Liver Hi ® ad libitum during the experimental period. After theexperimental period, blood, liver and epididymal fat tissue were taken. Serum blood chemistries
including triglyceride and cholesterol were measured. Intakes of Liver Hi® did not influence
the changes of body weight and the weight of liver and epididymal fat tissue. Intakes of LiverHi® decreased the level of low density lipoprotein cholesterol. However, intakes of Liver Hi® did
not influence other parameters. Furthermore, intakes of Liver Hi ® suppressed liver
steatohepatitis. These results indicate that Liver Hi® has a potency as a new functional food forthe patients of hypercholesterolemia．

１．目

肪食負荷モデルにて検討することである。

的

平成19年の国民健康・栄養調査によると，メタ２．方法

ボリックシンドローム患者数は予備軍を含めおよマウス（C57BL／６，雄，６週齡，体重17～20ｇ）

そ2,000万人と推定されている 。メタボリックシ

は，日本クレア株式会社（東京）より購入し，１

ンドロームは，腹部肥満，糖尿病，脂質異常症お週間馴化したものを使用した。なお動物実験は，

よび高血圧のうち複数を持ち合わせている病態で鳥取大学動物実験委員会の審査・承認のもと，上ある１）。これらの疾患はいずれも代謝異常そのも記委員会の動物実験指針に従い実施した。

１）のあるいはそれに続発するものであり，脂質代謝
恒常性の重要性が唱えられている 。

豚肝臓分解物（レバーHi）は，ILS株式会社（茨城）より提供を受けた。豚肝臓抽出物は，国２）

その中で，脂質代謝制御における食品の役割は産レバーを酵素分解した水溶性ペプチド粉末で，極めて重要であると考えられる。本試験の目的

分子量3,000以下のペプチドである。実験用飼料

は，豚肝臓抽出物の脂質代謝に与える影響を高脂は，通常食としてCE-２，高脂肪食としてHigh© The Ito Foundation

58

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 1 Effects of the degradation product from porcine liver on body weight change and organ weights
ND

HFD

HFD＋Ｌ２％

HFD＋Ｌ５％Initial body weight（g）

21.3±1.1

21.7±1.0

21.8±1.2

21.3±1.2

Final body weight（g）

23.1±1.3

25.9±1.1

25.6±1.2

25.4±1.1

Liver weight（g）

1.0±0.1

1.1±0.1

1.1±0.1

1.2±0.2

Epididymal fat tissue weight（g）

0.3±0.0

0.8±0.3

0.8±0.3

0.8±0.1

Data represent the mean±SD in each group（ｎ＝５～６）．

Table.2 Effects of the degradation product from porcine liver on blood biochemistry
ND

HFD

HFD＋Ｌ２％

HFD＋Ｌ５％Glu

55.6±5.4

115.0±32.4

109.0±50.1

118.0±52.4

TP

5.0±0.3

5.0±0.2

5.4±0.4

4.9±0.2ALB

2.7±0.3

2.6±0.2

2.7±0.3

2.5±0.2AST

58.3±5.6

138.0±133.0

115.0±67.0

72.0±42.1

ALT

27.5±9.8

101.0±129.082.2±92.2

31.8±35.6

ALP

405.0±29.0

347.0±26.5＊

326.0±37.4＊

300.0±26.2＊＊

T-Bil

0.6±0.0

0.5±0.1

0.6±0.1

0.6±0.1

BUN

25.7±1.925.8±4.6

26.5±5.2

28.4±4.5Cre

0.2±0.0

0.4±0.2

0.3±0.3

0.2±0.0

Data represent the mean±SE in each group (n＝５）．＊＊：ｐ＜0.01，＊：ｐ＜0.05 compared with the ND group．

Fat Diet32をそれぞれ日本クレア株式会社より購（Lipo Search，スカイライト・バイオテック株式

入し，自由採食とした。飲料水は，水道水あるい

会社，東京）を実施した。血液生化学検査では，は水道水にレバーHiを溶解したものを使用した。

血糖値（Glu：mg/dl），総タンパク質（TP：ｇ/

マウスは通常食（ND）群（ｎ＝６）
，高脂肪食

dl）
，アルブミン（ALB：ｇ/dl），アラニンアミ（HFD）群（ｎ＝５），高脂肪食＋２％豚肝臓抽ノ基転移酵素（ALT：U/l），アスパラギン酸ア

出物飲水（HFD＋Ｌ２％）群（ｎ＝５）および

ミノ基転移酵素（AST：U/l），アルカリホスファ

高 脂 肪 食 ＋ ５ ％ 豚 肝 臓 抽 出 物 飲 水（HFD ＋ Ｌ

タ ー ゼ（ALP ： U/l），総 ビ リ ル ビ ン（T-Bil ：５％）群（ｎ＝５）の４群を設定した。マウスにmg/dl），尿素窒素（BUN：mg/dl），クレアチニ

は28日間各飼料および飲料水を投与した。29日目

ン（Cre：mg/dl）を測定した。

に12時間絶食のもと５％イソフルレン（インター

結果は，平均値±標準偏差で示した。有意差検

ベット，東京）吸入下で，腹部大静脈より採血を

定 は ，一 元 配 置 分 散 分 析 の 後 Tukey Kramer's

実施し，その後頚椎脱臼により安楽死処分した。

testにて行った。危険率５％未満を有意差ありと

その後，肝臓と精巣周囲脂肪組織を摘出し重量のした。

測定を行った。肝臓組織の一部は，ズダンⅢ染色を実施し，組織学的検索を行った。
血液は500×ｇ，３．結果と考察

４℃で15分間遠心分離し，血清を得た。得られた

3.1

血清で血液生化学検査および血中脂質（コレステ

体重変化ならびに臓器重量の結果をTable１にロールおよび中性脂肪）プロファイリング検査示した。28日目において，HFD群，HFD＋Ｌ２％© The Ito Foundation

体重変化ならびに臓器重量59

畜産副産物の中性脂肪改善効果について
Serum cholesterol levels
180.00＊＊：ｐ＜0.01＊：ｐ＜0.05＊＊

160.00ND
HFD
HFD＋L2％
HFD＋L5％140.00120.00100.00
80.00

＊

60.00
40.00
＊＊

20.00
0.00

Total

CM

VLDL

LDL

HDL

Fig.1 E ffects of the degradation product from porcine liver on cholesterol concentration in blood（ｎ＝３）＊＊：ｐ＜0.01，＊：ｐ＜0.05 compared with the ND or HFD group．

群およびHFD＋Ｌ５％群で体重に差異は認めらが上昇することが報告されているがその具体的なれなかった。同様に肝臓および精巣周囲脂肪組織

機序は不明である３）。この点に関しては，今後詳

重量も，HFD群，HFD＋Ｌ２％群およびHFD＋

細な検討が期待される。

Ｌ５％群での差異は認められなかった。

3.3

以上より，レバーHiの投与により肝臓，末梢組
織への脂肪蓄積量の変化は起こらないことが明らかとなった。
3.2

血清コレステロールおよび脂質プロファ
イリング

血清コレステロールプロファイルの結果をFig.1に示した。高脂肪食の投与により，HFD，血液生化学検査

HFD＋Ｌ２％およびHFD＋Ｌ５％群の総コレス

血液生化学検査の結果をTable２に示した。

テロール濃度は上昇した（ｐ＜0.05）。そのうちHFD群においてGlu，ASTおよびALTはND群と超 低 比 重 リ ポ 蛋 白（VLDL），低 比 重 リ ポ 蛋 白

比較して上昇傾向が確認された。HFD＋Ｌ２％（LDL）および高比重リポ蛋白（HDL）は高脂肪およびHFD＋Ｌ５％群において，ASTはHFD群食投与により，血清中の濃度上昇が確認された。

と比較して低値を示す傾向が見られた。HFD，

VLDLおよびHDL濃度は，レバーHi投与による変

HFD＋Ｌ２％およびHFD＋Ｌ５％群において，化は確認されなかった。血清LDL濃度は，レバー

ALPはND群と比較して有意に低値を示した（ｐHi投与によりHFD群よりも低値を示した。特に＜0.01：HFD＋Ｌ２％およびHFD＋Ｌ５％群，

HFD＋Ｌ５％群において，HFD群と比較して有ｐ＜0.05：HFD群）。そのほかの項目に関しては，

意に低値を示した（ｐ＜0.05）。カイロミクロン

４群間に差異は認められなかった。

（CM）には変化が確認されなかった。

これまでにも，高脂肪食負荷により血清中ALP

血清中性脂肪プロファイルの結果をFig.２に示© The Ito Foundation

60

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）
Serum tryglyceride levels

100.00
90.00
80.00

ND
HFD
HFD＋L2％
HFD＋L5％

70.00
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00

Total

CM

VLDL

LDL

HDL

Fig.2 Effects of the degradation product from porcine liver on triglyceride levels in blood（ｎ＝３）

した。HFD＋Ｌ２％およびHFD＋Ｌ５％群におあるHDL受容体により取り込まれる。肝臓に取いて，血清総中性脂肪およびVLDL濃度がND群り込まれたコレステロールは胆汁酸に変換される

およびHFD群と比較し，上昇傾向を示した。しか，コレステロールのまま胆汁中に分泌される。

かし，有意差は確認されなかった。LDL，HDL

したがって，今回の結果からレバーHi摂取によりおよびCM濃度は４群間において差異は認められ末梢組織での取り込みの増加，肝臓での取り込みなかった。

の増加，肝臓での胆汁酸への変換・分泌促進のい

生体内におけるコレステロール代謝は，以下のとおりである。体内のコレステロール代謝は

４，５）食事，遺伝的要因，コレステロールの吸収，ステ

ずれかが活発となり，LDL減少がみられたと考えられる。しかしながら，作用機序解明は未だ不十分であり，今後さらなる検討が必要である。

ロールの合成と排泄により制御されている。食品

3.4

中に含まれるコレステロールは，小腸から吸収さズダンⅢ染色像（光学顕微鏡鏡検下400倍）をれ肝臓に運ばれる。肝臓からはVLDLが血中に分Fig.３に示した。ND群において，脂肪滴はほと

泌され，血中でLDLにまで代謝される。その後，んど観察されなかった（Fig. 3a）。HFD群では大LDLは各組織の細胞膜表面に存在するLDL受容

小多様な脂肪滴（矢印）および，肝細胞の空胞変体により細胞の中に取り込まれて末梢組織へと供性，脂肪変性（矢頭）が確認された（Fig. 3b）。

給され，この機構はフィードバック制御により支HFD＋Ｌ２％およびHFD＋Ｌ５％群では，脂肪配されている。一方，HDLは過剰なコレステロー

滴は観察されるもののその大きさはHFD群と比ルを末梢組織から肝臓へ輸送し，胆汁酸として排較して小さかった。また，空胞変性，脂肪変性の泄する機能がある。LDLは，抹消組織と肝臓にあ程度は軽度であった（Fig. 3cおよびｄ）。

るLDL受容体により取り込まれ，HDLは肝臓に

組織学的観察近年，生活習慣をはじめとする様々な要素が原© The Ito Foundation

畜産副産物の中性脂肪改善効果について

a

b

c

d

61

Fig.3 Histopathological findings of the liver
The tissue sections of the colon were stained with Sudan three stain. Data presented are for 1 mouse each from

ND（a），HFD（b），HFD＋Ｌ２％（c）and HFD＋Ｌ５％（d）groups. Bar＝200μｍ．

因となる非アルコール性肝障害が問題となってい品となりうることを示唆している。しかしながる 。高脂肪食の摂取もその原因の１つと考えら

ら，その作用機序は未だ不明な点が多く今後の検れており ，今回HFD群では確認された脂肪滴お討が必要である。

６）

７）

よび，肝細胞の空胞変性，脂肪変性が確認された。
その一方で，レバーHi投与群では，脂肪滴の大きさが小さく空胞変性，脂肪変性は軽度であった。
これらの結果は，レバーHiの投与により肝臓での脂肪蓄積の減少が起こったと考えられる。
４．要

約

本研究では，高脂肪食摂取モデルを用いて豚肝臓加水分解産物の中性脂肪改善効果の検討を行った。豚肝臓加水分解産物摂取により，LDLコレス
テロール濃度の減少および肝臓での脂肪滴減少，空胞変性・脂肪変性の減少が確認された。これらの結果は，豚肝臓加水分解産物が中性脂肪特にLDLコレステロール値の改善に有効な機能性食

参考文献
１）
 平成19年国民健康・栄養調査報告，厚生労働省，
2008．
２）
 佐藤隆一郎：日本栄養・食料学会誌，66，279～
285，2013．
３）
 Matsunaga S，Azuma K，Watanabe M，Tsuka T，Imagawa T ， Osaki T ， Okamoto Y,: Exp.Ther.
Med.，7，379～382，2013．
４）
 佐藤隆一郎：日本栄養・食料学会誌，56，127～
133，2003．
５）
 福田伊津子，小土井理恵，久保麻友子，岡本隆志，
藤田 剛，芦田 均：生物工学会誌，87，129～
134，2009．
６）
 Browning JD ， Szczepaniak LS ， Dobbins R ，
Nuremberg P ， Horton JD ， Cohen JC ， Grundy
SM，Hobbs HH：Hepatology，40，1387～1395，
2004．
７）
 Donnelly KL ， Smith CI ， Schwarzenberg SJ ，
Jessurun J，Boldt MD，Parks EJ：J Clin. Invest，
115，1343～1351，2005．

© The Ito Foundation

62

血糖値と血中アミノ酸，オメガ３脂肪酸，血栓因子の関連に関する研究
Studies on relationship between blood glucose level and plasmaaminoacids, omega 3 fatty acids and thrombotic factors

田中

明・蒲池

桂子・中嶋

克行＊・高田明和＊＊（女子栄養大学栄養クリニック，＊群馬大学大学院保健学科，＊＊浜松医科大学医学部）

Akira Tanaka・Keiko Kamachi・Katsuyuki Nakajima＊・Akikazu Takada＊＊（Nutrition Clinic, Kagawa Nutrition University，＊Gunma University Graduate School of Health Sciences Postgraduate School of Medicine，＊＊Hamamatsu University School of Medicine）

The purpose of this study is to clarify the relationship between glucose intolerance, serum
remnant lipoprotein cholesterol（RLP-C）levels and plasma amino acids levels. Leucine,isoleucine and tryptophan are reported to decrease serum glucose levels. And nateglinide,inducing substance of amino acid is used as the oral hypoglycemic agent. The increase ofserum RLP-C levels is the atherosclerotic risk factor．
Hemoglobin A1c（HbA1c）value is used as the marker of glucose intolerance in the study．
Plasma amino acid levels, HbA1c values and serum RLP-C levels were measured in 17
subjects (2 men and 15 women), who consulted Nutrition Clinic. HbA1c valued between 5.2 and
7.1％（Table １）．
Only plasma tyrosine value showed a significant positive correlation with HbA1c value（r＝0.5501，ｐ＝0.0271，Table 2）．Tyrosine is the precursor of catecholamine and thyroid
hormone, which increases serum glucose levels. This may explain the relationship between
plasma tyrosine value and HbA1c value. However, there was not a significant correlation
between plasma leucine, isoleucine and tryptophan values and HbA1c value．
Plasma valine and leucine values showed a negative correlation with HbA1c value（r ＝－ 0.4978，ｐ＝ 0.0497；ｒ＝－ 0.4330，ｐ＝ 0.0939，respectively）． The branched chain aminoacids, valine and leucine, are reported to decrease serum glucose levels and improve the insulin
resistance. Serum RLP-C levels are increased in the insulin resistance state. This may explain
the negative relationship between the branched chain amino acids and RLP- C．
The subjects investigated in the study were small. However, The study showed therelationship between a part of amino acids（tyrosine and branched chain amino acids）andglucose intolerance, RLP- C．

１．目の関連を明らかにすることである。耐糖能障害の的指標はHbA1c値を用い，アミノグラムにより各

本研究の目的は，耐糖能障害と血中アミノ酸とアミノ酸レベルを測定した。

© The Ito Foundation

63

血糖値と血中アミノ酸，オメガ３脂肪酸，血栓因子の関連に関する研究
表１ 研究の対象
症例

性別

年齢
（歳）

BMI

HbA1c
（％）

LDL-C
（mg/dl）

HDL-C（mg/dl）

RLP-C（mg/dl）

１

女性

51

27.2

5.6

197

55

4.5

２

女性

58

29.1

5.7

183

55

4.6

３

女性

35

33.9

5.9

138

50

6.8

４

女性

34

28.4

5.4

90

60

2.8

５

女性

56

30.2

5.9

143

49

5.5

６

女性

54

23.6

5.2

129

71

2.4

７

女性

58

31.0

6.0

122

85

4.3

８

女性

65

28.1

7.1

131

59

3.5

９

女性

50

27.5

5.4

176

66

5.0

10

女性

55

28.0

5.4

127

56

3.0

11

女性

60

25.8

5.7

161

63

4.0

12

女性

57

27.7

5.9

107

65

3.7

13

女性

57

45.7

6.7

87

39

2.7

14

女性

50

20.8

5.3

113

77

3.5

15

女性

54

29.1

5.9

131

51

13.5

16

男性

51

24.4

6.4

105

84

3.7

17

男性

47

26.0

6.5

98

45

87.7

アミノ酸は血糖値を下げる可能性が指摘されている。実際，イソロイシン，ロイシン，トリプト

た。
２．方

法

制して血糖値を下げる可能性が指摘され，トリプ

2.1

象

トファンは血糖上昇抑制作用が報告されてい女子栄養大学栄養クリニックを受診した17例のファンなどのアミノ酸は視床下部の摂食中枢を抑る

対。また，糖尿病患者では血中アミノ酸，特患者（男性２例，女性15例）を対象とした。年齢に分岐鎖アミノ酸が低値であることが指摘されて34～65歳，BMI20.8～45.7，HbA1c（NGSP値）5.2

いる。さらに，アミノ酸誘導物であるナテグリニ～7.1％，LDLコレステロール値87～197mg/dl，

ドは経口血糖低下薬として使用されている。

HDLコレステロール39～84mg/dl，RLPコレステ

１～４）

このようにアミノ酸代謝は糖尿病の病態と強くロール2.4～87.7mg/dlであった（表１）。

関連していることが考えられ，アミノグラムによ

2.2

方

法

り，すべての血中アミノ酸レベルと耐糖能低下状

アミノグラムにより，39種類の血中アミノ酸レ態との関連を検討した本研究の結果は，アミノ酸ベルを測定した。血清脂肪酸はアラキドン酸，による糖尿病診断および治療に役立つ可能性があ

EPA，DHA値，血中脂質はLDLコレステロールる。

（LDL- C），HDLコレステロール（HDL- C），レム

今回は，血中アミノ酸レベルと血中レムナント

ナントコレステロール（RLP- C）を測定した。耐リポ蛋白（RLP）コレステロール値との関連，お糖能障害の指標としてはHbA1c（NGSP）値を用

よび耐糖能障害と血中脂肪酸値との関連も検討しいた。

© The Ito Foundation

64

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

表２ HbA1c値（％）と各血中アミノ酸量（nmol/ml）の関連

ファンはHbA1c値との関連を認めなかった。
3.2

アミノ酸

HbA1c（NGSP）値

血中RLP- C値と各血中アミノ酸量との関
連

スピアマン相関係数

Ｐ値

グルタミン酸

ｒ＝0.5257

ｐ＝0.0553＋

アラニン

ｒ＝0.4638

ｐ＝0.0801＋

ミン酸（ｒ＝0.6834，ｐ＝0.0035），バリン（ｒ＝イソロイシンｒ＝0.2734

ｐ＝0.2433－0.4978，ｐ＝0.0497）であった。その他，相関

ロイシン

ｒ＝0.2783

ｐ＝0.3173

傾向を認めたのは，ロイシン（ｒ＝－0.4330，ｐ

チロシン

ｒ＝0.5501

ｐ＝0.0271＊

トリプトファン

ｒ＝0.0458

ｐ＝0.9667＝0.0939）であった。

＊ｐ＜0.05＋ｐ＜0.10

血中RLP- C値と有意相関を認めたのは，グルタ

血中RLP- Cの上昇は動脈硬化進展の危険因子として知られている６）。また，血中RLP- C値は，糖尿病，メタボリックシンドローム，インスリン抵

HbA1c 値 と 各 血 中 ア ミ ノ 酸 値 と の 相 関 ，

抗性の病態で上昇することが指摘されている７）。

HbA1c値と血中脂肪酸値との相関，血中RLP- C

今回，血中RLP- C値と分岐鎖アミノ酸であるバリ値と各血中アミノ酸値との関連はスピアマンの相ン，ロイシンと負の有意相関あるいは相関傾向を関係数で検討した。

認めた。分岐鎖アミノ酸は，視床下部の摂食中枢を抑制して血糖値を下げる可能性が指摘され，糖３．結果と考察尿病患者では血中アミノ酸，特に分岐鎖アミノ酸

3 . 1 HbA1c 値 （％ ） と 各 血 中 ア ミ ノ 酸 量（nmol/ml）の関連（表２）が低値であることが指摘されている１～４）。今回の結果から，高RLP- C血症ではインスリン抵抗性，

HbA1c値と有意相関を認めたのはチロシンのみであった。その他，相関傾向を認めたのはグル
タミン酸，アラニンであった。イソロイシン，ロイシン，トリプトファンは関連を認めなかった。

耐糖能障害の増悪を介して血中分岐鎖アミノ酸量が低下していることが推定された。
3.3

HbA1c 値 と 各 血 清 脂 肪 酸（ア ラ キ ド ン
酸，EPA，DHA）の相関

チロシンは，フェニルアラニンから合成される

HbA1c値とアラキドン酸，EPA，DHAとの相アミノ酸で，芳香族アミノ酸に分類される。チロ

関は，それぞれ，ｒ＝0.3249（ｐ＝0.2032），ｒ＝シンは，甲状腺ホルモン（サイロキシン，トリ

0.0173（ｐ ＝ 0.9474），ｒ ＝ 0.1113（ｐ ＝ 0.6706）

ヨードサイロニン）やメラニン色素，カテコールといずれも有意な関連を認めなかった。

アミン（ドーパミン，ノルエピネフリン，エピネ
フリン）の前駆物質であり，チロシン投与により４．要

約

血中ノルエピネフリンおよびドーパミン値が増加

女子栄養大学栄養クリニックを受診した17例をすることが報告されている５）。甲状腺ホルモン，

対象に，アミノグラム分析による血中各アミノ酸

カテコールアミンは血糖上昇作用があり，HbA1c

量と耐糖能障害および血中レムナント値との関連

値と血中チロシン値との正相関の原因となる可能を検討した。耐糖能障害の指標であるHbA1c値性が考えられる。

は血糖上昇作用のある甲状腺ホルモンおよびカテ

しかし，今回の検討では，血糖低下作用の指摘

コールアミンの前駆物質であるチロシンと有意正されているイソロイシン，ロイシン，トリプト相関を認めた。また，血中RLP- C値は血糖低下作© The Ito Foundation

血糖値と血中アミノ酸，オメガ３脂肪酸，血栓因子の関連に関する研究用のある分岐鎖アミノ酸値と負の有意相関を認めた。今回の研究は少数例での検討であったが，チ
ロシンおよび分岐鎖アミノ酸など一部のアミノ酸と耐糖能障害およびレムナント代謝との強い関連性が推定された。
文献１） Doi M, Yamaoka I, Fukunaga T : Biochem &Biophys Res Commun，312，1111～1117，2003．

65２）
 吉沢文昭，渡辺陽介，土居雅子：必須アミノ酸研
究，175，1～7，2006．
３）
 吉沢文昭：アミノ酸研究，1，9～17，2008．
４）
 Ikehara O, Kawasaki N, maezono K: Biologicaland Pharmaceutical Bulletin，31，469～472，2008．
５） http://ja.wikipedia.org/woki/チロシン
６）
 Akira Tanaka. : Postprandial Hyperlipidemia andAtherosclerosis. J Atheroscler Thromb, 11 ，322 ～
329，2004．
７）
 Masumi Ai, Akira Tanaka, Keiko Ogita, Masaaki
Sekine, Fujie Numano, Fujio Numano, Gerald M
Reaven : J Am Coll Cardiol ， 38 ， 1628 ～ 1632 ，
2001．

© The Ito Foundation

66

冠動脈疾患患者における血中アミノ酸・脂肪酸組成と動脈硬化惹起性リポ蛋白および血栓因子の関連に関する研究
Studies on relationship between the composition of blood amino acids andfatty acids and atherogenic lipoproteins and/or thrombotic factors inpatients with coronary artery diseases

木庭

新治・小林

洋一・横田

裕哉・田中

明１・中嶋

克行２・高田明和３（昭和大学医学部，１女子栄養大学栄養クリニック，２群馬大学大学院保健学科，３浜松医科大学医学部）

Shinji Koba, Youichi Kobayashi, Yuuya Yokota, 1Akira Tanaka, 2Katsuyuki Nakajima, 3Akikazu Takada（Showa University School of Medicine, 1Kagawa Nutrition University，2Gunma University Graduate School of Health Sciences
Postgraduate School of Medicine, 3Hamamatsu University School of Medicine）

Background: Metabolic dyslipidemia is a main feature of coronary artery disease（CAD）．
Atherogenic lipoproteins such as small dense LDL, oxidative stress, and thrombotic factors
play an important role in the development of acute coronary syndrome（ACS）．Recent studies
suggest that some amino acids and fatty acids regulate key metabolic pathways. The aim of
the present study is to examine relationship atherogenic lipids including remnant-like particlecholesterol（RLP-C）and malondialdehyde-modified LDL（MDA-LDL），and composition of fatty
acids and amino acids in patients with ACS．
Methods and Results: The blood samples were obtained by venipuncture on admission.
Plasma fatty acids were measured using gas-chromatography and plasma amino acids were by
Liquid Chromatograph Mass Spectometer. Thirty％ of 121 patients with ACS had prior historyof CAD and 72％ and 27％ had hypertension and diabetes, respectively. Compared to normal
range, ACS patients had higher levels of taurine，asparatic acid，glutamic acid，alanine，
cystine，phenylalanine，β-alanine，and ornitine, and lower levels of asparagine，glutamine，
tryptophan，and arginine. Diabetic patients had further lower tryptophan levels, which
supported previous experimental reports. On the other hand, non-diabetic patients had further
lower arginine, a precursor of nitric oxide. Correlation coefficients between glucose-related
factors or atherogenic lipids and cmposition of amino acids or fatty acids showed that glutamic
acids were significantly positively associated with non-HDL-cholesterol and MDA-LDL, which
supported that glutamic acids induced dyslipemia and oxidative stress. Not eicosapentaenoic
acid but arachidonic acid, dehomo- γ linoleic acid, and docosahexaenoic acid were significantly
associated with non-HDL-cholesterol, MDA-LDL and RLP-C. No amino acids related to HbA1c
and glucose levels on admission．
Conclusion: These suggest that amino acids have important functions in both nutrition andhealth, and affect diabetes or dyslipidemia related metabolic disorders and atherosclerosis.
Further studies are required to compare these results with healthy subjects．

© The Ito Foundation

冠動脈疾患患者における血中アミノ酸・脂肪酸組成と動脈硬化惹起性リポ蛋白および血栓因子の関連に関する研究

１．目

67

アミノ酸組成，脂肪酸組成，動脈硬化惹起性リポ的蛋白を測定し，その相互関連を評価した。

冠動脈疾患では代謝性脂質異常症を呈する例が法

２．方多く，その主因である動脈硬化惹起性リポ蛋白がレムナントリポ蛋白やsmall dense LDLである。

急性冠症候群で入院時に静脈血を採取し，血清これらの動脈硬化惹起性リポ蛋白と酸化ストレスと血漿を分離した。血漿中の脂肪酸４分画をガスや血栓因子との関連が注目されている。代謝性脂クロマトグラフィーで，アミノ酸39種類を高速液質異常症の予防・治療には食事・運動など生活習

体クロマトグラフィー質量分析計で測定した。血慣の改善が必須である。しかし，脂肪制限食，炭清レムナント様リポ蛋白コレステロールは免疫吸

水化物制限食，蛋白制限食の効果について，未だ着法で，small dense LDLコレステロールおよび

議論の余地がある。アミノ酸組成が糖脂質代謝に

LDLコレステロールはホモジニアス法で測定し影響することが指摘されており ，様々なアミノた。群間分析は分散分析で，２変量間の相関は酸を含む食肉を制限するべきか否かに関しても不Spearmanの順位相関で解析した。

１）

明な点が多い。本研究では急性冠症候群発症時の表１ 臨床背景
全例

背景

年齢，歳
BMI，kg/㎡
心筋梗塞の既往
冠動脈血行再建術の既往
血液透析実施例
悪性疾患の既往

121例

男性

101例

女性

20例

危険因子
血液
蛋白
糖脂質

68.6±13.6
23.8±4.1
18
34
5
15

67.3±13.924.1±4.3
18
29
3
11

75.4±8.6
22.6±3.1
0
5
2
4

高血圧
糖尿病
喫煙 以前／現在
脂質低下薬服用
糖尿病治療薬服用

87
31
42/43
36
19

69
24
42/41
30
15

18
7
0/2
6
4

総蛋白，g/dl
アルブミン，g/dl

7.1±0.7
4.0±0.6

7.0±0.7
4.1±0.6

7.3±0.8
3.9±0.7

HbA1c，％
Total cholesterol, mg/dl
Triglyceride, mg/dl
HDL cholesterol, mg/dl
LDL cholesterol, mg/dl
Non-HDL cholesterol, mg/dl
アポリポ蛋白A1, mg/dl
アポリポ蛋白B, mg/dl
Small dense LDL-C, mg/dl
RLP-C, mg/dl
MDA-LDL, U/l
ジホモ-γ-リノレン酸，μg/ml

6.18±1.22
188.2±45.5131.8±97.3
45.9±12.2
117.8±38.7142.3±43.9123.6±24.2
97.3±27.4
33.1±20.5
5.93±4.79
153.5±71.6
37.9±14.9

6.15±1.26
187.4±43.7132.9±97.3
45.0±11.1
118.5±38.6
142.4±43.4
122.2±22.8
97.4±27.3
33.4±20.5
6.15±5.12
154.7±72.7
38.3±14.9

6.28±1.01
192.1±54.7
126.5±99.5
50.3±16.4
114.3±40.0
141.9±47.6131.0±29.8
96.6±28.2
31.7±21.2
4.83±2.21
147.4±66.9
35.9±15.4

アラキドン酸，μg/ml
エイコサペンタエン酸，μg/ml
ドコサヘキサエン酸，μg/ml

179.6±52.2
68.0±38.5
133.6±51.2

178.8±52.8
59.3±36.7
127.2±45.5

183.6±50.0
81.8±42.7
165.8±66.0

平均値±標準偏差 Small dense LDL- C＝small dense LDL-cholesterol, RLP-C＝remnant-like particle-cholesterol,
MDA-LDL＝Malondialdehyde-modified LDL© The Ito Foundation

68

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

表２ 異常値を示したアミノ酸と糖尿病の有無による比較
平均±標準偏差

最小値

最大値

基準値

非糖尿病
（ｎ＝90）

糖尿病（ｎ＝31）

Taurine108.8±48.4

32.4

271.1

39.5－93.2

107.3±46.7

113.1±53.5

Aspartic acid13.2±15.5

2.3

71.0

2.4以下

12.6±14.7

15.1±17.7

Asparagine

44.7±12.7

24.8

99.9

44.7－96.8

44.8±13.3

44.2±10.7

Glutamic acid

102.4±46.2

33.0

264.0

12.6－62.5

98.8±43.6

112.9±52.2

Glutamine

497.8±115.6

112.2

838.7

422.1－703.8

502.4±123.1

484.3±90.8

Alanine418.3±141.7

162.9

1226

208.7－522.7

417.9±147.8

419.±124.7

Cystine24.8±13.5

6.0

111.1

13.7－28.3

24.0±13.0

26.9±14.9

Phenylalanine

71.4±20.8

41.3

174.8

42.6－75.7

70.8±21.573.3±18.5β-alanine40.4±169.2

3.0

1200

（－）

21.4±138.9

90.8±226.5

Tryptophan

41.4±11.4

8.8

73.6

37.0－74.942.5±11.6

37.2±10.1＊

Ornitine

102.7±34.5

43.4

239.8

31.3－104.7

105.0±36.8

96.1±25.9

Arginine

51.9±24.6

5.0

126.6

53.6－133.649.1±23.6

60.0±26.2＊＊ｐ＜0.05 vs非糖尿病群

でTryptophanが低値で特に糖尿病例でより低値３．結果と考察を示したことは，過去の実験的研究結果を支持し177人の血漿，血清で測定を行ったが，急性冠た。一酸化窒素の前駆体のArginineは，急性冠症

症候群を否定された症例，重複症例，ω３系脂肪

候群で低値を示したが，非糖尿病例でより低値で酸製剤服用者を除いた121人（男性101人）で解析あった。

した。患者背景を表１に示す。

3.2

年齢の脂肪酸，アミノ酸に及ぼす影響

約30％は冠動脈疾患の既往を有し，高血圧は年齢と有意な負相関をジホモ-γ-リノレン酸

72 ％，糖 尿 病 は 26 ％ で 合 併 し て い た 。Small（相関係数ρ－0.293，ｐ＝0.001），アラキドン酸

dense LDL cholesterolとMDA-LDLは過去の自験（ρ－0.212，ｐ＝0.02），Glutamic acid（ρ－0.23，

例や他の報告の一般健康人よりも有意に高値で

ｐ＝0.011），に，有意な正相関を，ドコサヘキサ

あった。

エン酸（ρ0.224，ｐ＝0.013），Citrulline（ρ0.278，

3.1

ｐ ＝ 0.002）， Cystine （ρ 0.283 ， ｐ ＝ 0.002），

アミノ酸と糖尿病の影響

基準値と比較し異常値を示すアミノ酸と糖尿病

Phenylalanine（ρ0.284，ｐ＝0.002）に認めた。

の有無による比較を表２に示す。

3.3

急性冠症候群患者ではTaurine，Asparatic acid，

発症前に糖尿病治療薬を服用していなかった

Glutamic acid，Alanine，Cystine，phenylalanine，

102 例 に お い て ，入 院 時 の 血 清 グ ル コ ー ス ，

β - alanine， Ornitine 高 値 で， Asparagine，

HbA1c に 関 連 す る 脂 肪 酸・ア ミ ノ 酸 は 認 め な

Glutamine，Tryptophan，Arginineが低値を示し，かった。

糖尿病ではTryptophanがより低値，Arginineは3.4

糖代謝マーカーとの関連因子

脈硬化惹起性脂質マーカー（non-HDL-

非糖尿病例でより低値を示した。Tryptophanがcholesterol, RLP- C, MDA-LDL）と の 関 連

膵臓のβ細胞機能を保護し，血糖低下作用を有す因子ることが報告されている。急性冠症候群患者

２～４）

全例および発症前に脂質低下薬を服用していな© The Ito Foundation

69

冠動脈疾患患者における血中アミノ酸・脂肪酸組成と動脈硬化惹起性リポ蛋白および血栓因子の関連に関する研究
表３ 動脈硬化惹起性脂質マーカーと脂肪酸・アミノ酸との相関（Spearmanの順位相関係数）
Non-HDL cholesterol

MDA-LDL

RLP-C

全例

未薬物

全例

未薬物

全例

未薬物

総蛋白

0.220**

0.229＊

0.254＊＊

0.226＊

0.228＊

NS

アミノ酸

NS

NS

NS

NS

0.204＊

NS
0.339＊＊＊
NS

分枝アミノ酸

NS

NS

NS

NS

0.252＊＊

Glutamic acid

0.233＊

0.378＊＊＊＊

0.213＊

0.292＊＊NSNS

Alanine

NS

NS

NS

NS

0.231＊

Valine

NS

NS

NS

NS

0.271**

0.284＊＊

Isoleucine

NS

NS

NS

NS

0.217＊

0.406＊＊＊＊

Leucine

NS

NS

NS

NS

0.213＊

0.242＊

ジホモ-γ-リノレン酸

0.598＊＊＊＊

0.539＊＊＊＊

0.615＊＊＊＊

0.574＊＊＊＊

0.657＊＊＊＊

0.583＊＊＊＊

アラキドン酸0.555＊＊＊＊

0.523＊＊＊＊

0.495＊＊＊＊

0.433＊＊＊＊

0.599＊＊＊＊

0.591＊＊＊＊

エイコサペンタエン酸

NS

NS

NS

NS

NS

NS

ドコサヘキサエン酸

0.355＊＊＊＊

0.265＊

0.287＊＊＊

NS

0.246**

NS＊ｐ＜0.05，＊＊ｐ＜0.01，＊＊＊ｐ＜0.001，＊＊＊＊ｐ＜0.0001

かった85例で，動脈硬化惹起性リポ蛋白のコレスる。近年，アミノ酸組成・脂肪酸組成の動脈硬化

テロールの指標であるnon-HDL-cholesterol，血性糖脂質代謝への影響が指摘されている。急性冠

栓 と 関 連 す る RLP-C ，酸 化 LDL の 指 標 で あ る症候群発症時のアミン酸組成，脂肪酸組成，動脈

MDA-LDLに影響する脂肪酸・アミノ酸を検討

硬化惹起性リポ蛋白を測定し，その関連を評価しし，結果を表３に示す。

た。

グルタミン酸が，脂質異常と酸化ストレスを惹起することが報告されている

急性冠症候群による入院時に静脈血を採取し，。グルタミン酸

血清と血漿を分離した。血漿中の脂肪酸４分画をが酸化LDLであるMDA-LDLと正相関を示した

ガスクロマトグラフィーで，アミノ酸39種類を高こと，過去の実験的研究結果を支持した。脂質速液体クロマトグラフィー質量分析計で測定しマーカーとエイコサペンタエン酸以外の不飽和脂た。血清レムナント様リポ蛋白コレステロールは

肪酸特にジホモ-γ-リノレン酸，アラキドン酸が免疫吸着法で，small dense LDLコレステロール

正相関を示したことは，ω３系とω６系の脂肪酸

およびLDLコレステロールはホモジニアス法での違いを示唆した。

測定した。群間分析は分散分析で，２変量間の相５～８）

本研究結果は急性冠症候群患者における断面調
査であり，今後，健康人との比較や血栓因子との関連を検討する予定である。
４．要関はSpearmanの順位相関で解析した。
121人（男性101人）で解析した。約30％は冠動脈疾患の既往を有し，高血圧は72％，糖尿病は26％で合併していた。基準値と比較し，急性冠症候

約群 患 者 で は Taurine，Asparatic acid，Glutamic

動脈硬化惹起性リポ蛋白（レムナントリポ蛋白

acid，Alanine，Cystine，phenylalanine，β-alanine，やsmall dense LDLなど），酸化ストレスや血栓Ornitine 高 値 で， Asparagine， Glutamine，因子は冠動脈疾患，急性冠症候群の発症と関連す

Tryptophan，Arginineが低値を示し，糖尿病では© The Ito Foundation

70

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Tryptophanがより低値，Arginineは非糖尿病例
でより低値を示した。発症前に糖尿病治療薬を服用していなかった102例において，入院時の血清
グルコース，HbA1cに関連する脂肪酸・アミノ酸は認めなかった。
全例および発症前に脂質低下薬を服用していな
かった85例で脂質値と関連する因子を検討した。
Glutamic acid が non-HDL-cholesterol と MDALDLと有意な正相関を示した。エイコサペンタエ
ン酸以外の，ジホモ-γ-リノレン酸，アラキドン
酸 と ド コ サ ヘ キ サ エ ン 酸 は ， non-HDLcholesterol，MDA-LDL，RLP-Cのいずれとも正相関を示した。
以上より，アミノ酸は栄養および健康面に重要な機能を有し，糖脂質代謝や動脈硬化に影響を及
ぼす。

文
献
１）
 Wu G Amino acids: metabolism, functions, andnutrition. Amino Acids.，37（１）：１～17，2009．
２）
 Marshall S, et al: Amino acid regulation of insulin
action in isolated adipocytes. J Biol Chem ； 264 ，2037～2042，1989．
３）
 Traxinger RR, et al: Role of amino acids inmodulating glucose-induced desensitization of the
glucose transporter system. J Biol Chem ，； 264 ，20910～20916，1989．
４）
 Inubushi T, et al: L-tryptophan suppresses rise inblood glucose and preserves insulin secretion in
type-2 diabetes mellitus rats. J Nutr Sci Vitaminol（Tokyo），；58（６），415～422，2012．
５）
 Park CH, et al: Glutamate and aspartate impair
memory retention and damage hypothalamic
neurons in adult mice. Toxicol Lett ，；115 ，117 ～125，2000．
６） Singh P, et al: Prolonged glutamate excitotoxicity:
Effects on mitochondrial antioxidants andantioxidant enzymes. Mol Cell Biochem，；243，139～145，2003．
７）
 Gobatto CA,et al: The monosodium glutamate(MSG) obese rat as a model for the study of exercise
in obesity. Res Commun Mol Pathol Pharmacol，；
111，89～101，2002．
８）
 Kumar P, et al: Protective effect of Trigonella
foenum-graecum Linn. on monosodium glutamateinduced dyslipidemia and oxidative stress in rats.
Indian J Pharmacol，；45（２），136～140，2013．

© The Ito Foundation

71

食肉類の摂取と血中アミノ酸，オメガ３脂肪酸
及び血栓因子の関連に関する研究
Studies on relationship between meat intake level and plasma aminoacids,
omega3 fatty acids and thrombotic factors

高尾

哲也１・小川睦美１・中嶋克行２・高田明和３（１昭和女子大学生活科学部，２群馬大学大学院保健学研究科，３NPO法人「食と健康プロジェクト」）

Tetsuya Takao１, Mutsumi Ogawa１, Katsuyuki Nakajima２ and Akikazu Takada３（１Faculty of Life Sciences, Showa Woman's University, ２Graduate School of Health Sciences, Gunma University，
３NPO“Food and Health Project”）

The subjects, they were over 50 years old, male, not disease, not on medication and no
dietary restrictions, were tested for food intake level, blood lipids level, remnants, insulin andamino acids. The average age of the subjects was 62.8 ± 10.2 years old and BMI of the subjects
was 24.2 ± 2.6kg/㎡ . The average energy intake of subjects was 2020.3 ± 261.8kcal/day,average protein intake ratio was 17.7 ± 2.6 ％，average lipid intake ratio was 27.3 ± 3.9 ％，average carbohydrate intake ratio was 46.7 ± 6.9％．Lipid intake ratio of subjects was slightly
greater than guideline level and carbohydrate ratio was somewhat less tendency. The averagemeat intake ratio of subjects was 180.7 ± 70.0kcal/day and seafood intake ratio was 134.3 ±29.7kcal/day. Meat intake of subjects was significantly higher than seafood intake. The average
blood HDL-cholesterol level of subjects was 55.8 ± 13.4mg/dl, LDL-cholesterol was117.8 ±
32.4mg/dl, total-cholesterol was 197.9 ± 33.6mg/dl, triglyceride was 128.0 ± 88.8mg/dl. Blood
RLP-cholesterol level that is the important factor as thrombus was 8.5 ± 11.2mg/dl. Identically,
blood RLP-triglyceride was half of subjects were less than 15mg/dl. The blood EPA and DHA
level, that are ω -3 fatty acid, of subject were 79.8 ± 41.0 μg/ml and 151.4 ± 54.8 μg/m. The
blood dihomo- γ -linolenic acid and arachidonic acid, that are ω -6 fatty acid, of subject
were 35.8 ± 8.5 μg/ml and 187.5 ± 31.4 μg/ml. The insulin level of subjects was 6.5 ± 3.1 μIU/
ml. The blood total amino acids level of subjects was 2870.4 ± 273.7 nmole/ml, each amino acids
were 0 to 637.2 nmole/ml. The fasting blood glucose level of subjects was 105 ± 17.2mg/dl.
There was no strong correlation between the protein intake ratio, meat intake ratio and blood
lipids, remnants, insulin and amino acids. From these result, it was suggested that normal meatintake dose not affect blood lipids, remnants, insulin and amino acids．

１．目

栄養素の摂取と血液性状の状態を定量的に測定的し，関連性を解析した研究例は少ない。食事中に食事やその中に含まれる成分は人の健康に様々含まれるたんぱく質は，同一エネルギー量であれな影響を与えていると考えられている。しかし日ば，炭水化物と比較して血糖値の上昇を抑制する

本の壮・高齢者の通常の生活の中での食事内容や事は広く知られている。さらに，摂取たんぱく質© The Ito Foundation

72

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）を構成しする分岐アミノ酸の一種であるイソロイ

2.3

シン，ロイシン，トリプトファンなどのアミノ酸

感情の状況を，アンケート記入型の気分プロは視床下部の摂食中枢を抑制して血糖値を下げる

フィール検査方法の一つである日本語版POMS短可能性が指摘されている。また，最近，血中アミ縮版を用いて測定した。POMS短縮版は30問の設ノ酸およびアミノ酸関連物質を測定するアミノグ

問からなる５段階で回答するアンケート形式の質

ラムが開発され，これにより食事摂取とアミノ酸問用紙で，緊張，抑うつ，怒り，活気，疲労，混関連物質との関連を解析する事が容易となりつつ乱の６つの感情尺度から気分や感情の状態を測定ある。さらに，血糖値と血栓危険因子であるレム

する事が可能である。

感情の状況調査

ナント，DHA，EPAなどのω-３脂肪酸との関連2.4も指摘されている。そこで本研究では，被験者の10時間以上絶食後，被験者の血液を腕静脈より

食事内容の状況を，たんぱく質や炭水化物，脂質の採血により採取した。その後血漿を遠心分離にの摂取状況も把握できる半定量的食事摂取頻度調より分画，取得し，測定までの間－80℃に保存し査票を用いて測定し，血中の脂質類やω-３脂肪た。保存後，以下に示した項目を株式会社エス・酸，血栓因子であるのレムナント，アミノ酸等を

アール・エルに委託して測定を行った。

測定した。これらの測定結果を用いて，食事摂取の内容と血液性状との関連性を検討した。
２．方
2.1

血中脂質類およびアミノ酸類の測定

血中脂質類として，HDL-コレステロール，
LDL-コレステロール，総コレステロール，トリ
グリセリド，RLP-コレステロール，RLP-トリグ法

リセリド，ジホモ-γ-リノレン酸，アラキドン酸，

被験者

EPA，DHAを測定した。同時にインスリンの測

投薬等による治療及び食事制限を行っていない定を行った。血中アミノ酸類として，Taurine,

人を健常者とし，このうち50才以上の男性を本研

Aspartic acid, Hydroxyproline, Treonine,

究の被験者とした。被験者の募集は昭和女子大学

Treonine, Serine, Asparagine, Glutamic acid,

及びNPO法人「食と健康プロジェクト」により

Glutamine, Sarcosine,行った。被験者の年齢，身長，体重はアンケート

Proline, Glycine, Alanine, Citrulline,により把握した。

-Aminobutyric acid, Valine, Cystine,

本研究は昭和女子大学ヒト臨床試験倫理委員会に申請し承認を受けた。
2.2

α-Aminoadipic acid,

Cystathionine, Methionine, Isoleucine, Leucine,
Tyrosine, Phenylalanine,

食事摂取調査αα-Aminoβ-hydroxybutyric acid, β -Alanine, β -Amino-iso-

被験者の食事摂取状況を１ヶ月思い出し法によb u t y r i c a c i d , γ- A m i n o b u t y r i c a c i d ,る半定量的食事調査票（FFQ） により把握しMonoethanolamine, Homocystine, Histidine,

た。調査票により，推定摂取エネルギー量（エネ3-Methylhistidine, 1-Methylhistidine, Carnosine,

ルギー量，kcal／日），推定摂取たんぱく質比率

Anserine, Tryptophan, Hydroxylysine,（たんぱく質比率，％），推定脂質比率（脂質比

Ornithine, Lysine, Arginineの測定を行った。こ率，％），推定炭水化物比率（炭水化物比率，％），

れらの測定結果より，総アミノ酸量，必須アミノ

推定肉類摂取量（肉類量，kcal／日），推定魚介

酸量（EAA），非必須アミノ酸量（NEAA），分

類摂取量（魚介類量，kcal／日）等を算出した。

岐鎖アミノ酸量（BCAA）を算出した。

１）© The Ito Foundation

食肉類の摂取と血中アミノ酸，オメガ３脂肪酸及び血栓因子の関連に関する研究

73

400
350
I
n
t
a
k
e
R
a
t
i
o
K
c
a
l
d
a
y
）

300
250
Meat
Ｒ＝0.300(/

meat intake
seafood intake

200

Seafood
Ｒ＝0.266

150
100
50
０
45

50

55

60
65
Age (years）

70

75

80

Fig.1 Relationship between age and meat and seafood intake ratio．

2.5

血糖値

んぱく質比率17.7±2.6％，脂質比率27.3±3.9％，

血糖値は，10時間以上絶食後，ハンディータイ

炭水化物比率46.7±6.9％であった。この事から，

プの血糖度計（メディセーフミニGR-102，テル

日本人の食事摂取基準（2010年度版）による脂質

モ社製）を用いて，被験者自身が測定した。

の摂取比率が目標量である20％以上25％未満２）に比べやや高く，炭水化物の摂取比率が目標量であ

３．結果と考察3.1

る50％以上70％未満２）に比べてやや低い値であっ

被験者

た。

本研究では28名が応募し，26名を被験者とし肉類量は180.7±70.0kcal／日，魚介類量は134.3

た。被験者の平均年齢は62.8±10.2歳で，50～59±29.7kcal／日であり，被験者における肉類の摂歳は11名，60～69歳は７名，70歳以上は８名で，取量は魚介類の摂取量に比べて有意に高かった。

最高齢の被験者は79歳であった。被験者の身長は被験者の年齢とエネルギー量とに弱い正の相関169.4±7.4cm，体重は69.2±9.3kg，BMIは24.1±（0.356）を，たんぱく質比率との間に弱い正の相2.6kg/㎡であった。2013年における日本人の60～

関（0.320）を認めた。また，年齢と肉類量とに64歳の平均身長は167.2cm，平均体重は65.3kg，

弱い正の相関（0.300）を，魚介とに弱い正の相23.3kg/㎡である事から ，本研究の被験者は，

関（0.266）を認めた（Fig.１）。

２）

日本人の平均的な体格に含まれると考えられた。
3.2

3.3

感情の状況調査

感情尺度と年齢，BMI等や肉類の摂取量や魚介

食事摂取調査被験者のエネルギー量は2020.3±261.8kcal／日で あ っ た 。身 体 活 動 レ ベ ル の 低 い 基 準 体 重類の摂取量といった，食事摂取の状態との間に相関は認められなかった。

65.0kg ， 50 ～ 69 歳 男 性 の エ ネ ル ギ ー 代 謝 量

3.4

2,100kcal／日

被験者のHDL-コレステロールは55.8±13.4mg/に比べ，やや低い値であった。た３）© The Ito Foundation

血中脂質類，アミノ酸類および血糖値

74

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

700
600
Ｒ＝0.463

C
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n
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n
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r
a
t
i
o
n
n
m
o
l
m
l
）

(

/

500
400

Glutamine
ProlineCitrulline

300
200
Ｒ＝0.526100
０45

Ｒ＝0.614
50

55

60
65
Age (years）

70

75

80

Fig.2 Relationship between age and blood amino acid level．

dl，LDL-コレステロールは117.8±32.4mg/dl，ト

被験者のインスリンは6.5±3.1μIU/mlであっリグリセリドは128.0±88.8mg/dl，総コレステ

た。糖負荷を行わない際の基準値は1.84～12.2μロールは197.9±33.6mg/dlであった。HDL-コレ

IU/mlであることから被験者群は基準内であるとステロールは40mg/dl以上，LDL-コレステロー

考えられた。被験者のうち１名がインスリン基準

ルは120mg/dl未満，トリグリセリドは150mg/dl

値を上回った。

未満，総コレステロールは200mg/dl未満が正常

被 験 者 の 血 中 ア ミ ノ 酸 量 は Taurine79.7 ±値とされている事から４），被験者はLDL-コレステ

13.1nmole/ml ，Aspartic acid3.9 ± 0.6nmole/ml ，ロール及び総コレステロールで正常の上限に近い

Hydroxyproline13.9±3.9nmole/ml，Treonine126.2値を示していた。

± 25nmole/ml ， Serine100.9 ± 15.9nmole/ml ，血栓因子のレムナントとして重要であるRLP-

Asparagine44.8±6.0nmole/ml，Glutamic acid56.5

コレステロールは8.5±11.2mg/dlであった，同様±18.9nmole/ml， Glutamine543.9 ± 62.6nmole/の RLP- ト リ グ リ セ リ ド で は 被 験 者 の 半 数 で

ml，Proline181.0±62.7nmole/ml，Glycine207.3±

15mg/dl以下であった。RPL-コレステロールの基

29.9nmole/ml ， Alanine384.5 ± 89.6nmole/ml ，準値は7.5mg/dl以下である事から，被験者群は基Citrulline27.2 ± 7.7nmole/ml， α-Aminobutyric

準値を超える値を示していた。被験者のうち基準

acid24.3±6.2nmole/ml，Valine238.8±33.7nmole/

値を超えたのは30.8％に当たる８名であった。

ml ，Cystine21.8 ± 6.2nmole/ml，Methionine27.9ω-３脂肪酸であるEPAは79.8±41.0μg/ml，±4.4nmole/ml，Isoleucine69.8±15.7nmole/ml，

DHAは151.4±54.8μg/mであった。ω-６脂肪酸

Leucine131.8 ± 20.5nmole/ml ， Tyrosine65.1 ±であるジホモ-γ-リノレン酸は35.8±8.5μg/ml，

11.8nmole/ml， Phenylalanine60.3 ± 6.9nmole/

アラキドン酸は187.5±31.4μg/mlであった。

ml，β-Alanine6.8±0.7nmole/ml，β-Amino-iso-© The Ito Foundation

食肉類の摂取と血中アミノ酸，オメガ３脂肪酸及び血栓因子の関連に関する研究

75

100

80
C
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n
c
e
n
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r
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t
i
o
n
（
m
g
d
l
）

/
60
Ｒ＝0.539
40

20

０
50

100

150
200
250
300
350
Meat intake ratio (kcal/day）

400

Fig.3 Relationship between meat intake ratio and blood HDL-Cholesterol level．

butyric

a c i d 1 . 9 ±2 . 5 n m o l e / m l ，リン，アミノ酸等との関係を検討した。その結果，

M o n o e t h a n o l a m i n e 8 . 2 ±1 . 1 n m o l e / m l ，

年齢と脂質類，レムナント，アミノ酸等との間にHistidine84.2±9.3nmole/ml，3-Methylhistidine1.4

相関は認められなかった。年齢とアミノ酸類では±2.2nmole/ml，1-Methylhistidine6.9±9.7nmole/

Glutamine と に や や 強 い 正 の 相 関（0.463）を ，

m l , T r y p t o p h a n 6 0 . 5 ±9 . 1 n m o l e / m l ，Proline と に や や 強 い 負 の 相 関 （0.526） を ，

Ornithine59.4 ± 13.5nmole/ml ， Lysine193.0 ±Citrullineとにやや強い正の相関（0.614）を認め

23.3nmole/ml ， Arginine94.6 ± 20.2nmole/ml でた（Fig.２）。

あった。Sarcosine及びα-Aminoadipic acidはトたんぱく質比率と脂質類ではDHAとの間に弱レ ー ス と し て 検 出 さ れ た 。Cystathionine ，αい正の相関（0.277）を認めた。その他の脂質類-Aminoβ-hydroxybutyric acid, γ -Aminobutyricやレムナントとたんぱく質比率の間には相関を認

acid ， Homocystine ， Carnosine ， Anserine ，めなかった。たんぱく質比率とTryptophanとにHydroxylysineは検出されなかった。総アミノ酸

やや強い負の相関（0.414）を認めた。それ以外

量 は 2870.4 ± 273.7nmole/ml ， EAA992.3 ±に強い相関を示すアミノ酸類は認めらなかった。

98.6nmole/ml ，NEAA1878.1 ± 213.3nmole/ml ，

肉類量と脂質類では，HDL-コレステロールとBCAA440.3±676.2nmole/mlであった。

の 間 に や や 強 い 負 の 相 関 性（0.539）を 認 め た

被験者の空腹時血糖値は105±17.2mg/dlであっ（Fig.３）。HDL-コレステロールが基準値の40mg/

た 。糖 尿 病 の 診 断 基 準 で あ る 空 腹 時 血 糖 値dl４）を下回る被験者は２名であった（Fig.３）。こ126mg/dl５）を超える被験者は３名であり，２名れらの被験者のエネルギー量は各々2581kcal／日は50歳代，１名は70歳代であった。

および2262kcal／日であり，たんぱく質比率は

年齢や食事状況と脂質類，レムナント，インス

21％および24％，脂質比率は34％及び30％と被験© The Ito Foundation

76

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

120

100

/

C
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）

(

80

60

Ｒ＝0.513

40

20

０
50

100

150
200
250
300
350
Meat intake ratio (kcal/day）

400

Fig.4 Relationship between meate intake ratio and blood taurine level．

者群の中でも高い値であった。これに対し，炭水間にやや強い正の相関を認めたが，肉類の摂取量

化物比率は41％および43％であった。エネルギー

ばかりでなく，摂取エネルギー量や脂質量等も影量に占める肉類量は13.9％および12.6％となり，響を与えていると推察され，今後被験者数を増やこの２名を含まない被験者の平均8.4±2.5％に比して検討する必要があると考えられる。

べて高い値となっていた。肉類量とEPAとの間

以上の様な事から，50歳代以上の年齢の男性にに弱い負の相関（0.340）を認めた。その他の脂おいて，食事中のたんぱく質比率や肉類の摂取量

質類やレムナントと間には相関を認めなかった。

は血中脂質類や血栓因子，インスリン，アミノ酸

肉類量とインスリンとの間に弱い正の相関に大きな影響を与えないと推察された。しかし被（0.253）を認めた。肉類量とアミノ酸類では，

験者数が少ない事から，今後被験者を増やすと共Taurineとにやや強い負の相関（0.513）を認めたに，肉類から摂取されて血中に存在するトランス（Fig.４）。それ以外に強い相関を示すアミノ酸類

脂肪酸の測定や，糖尿病や循環器疾患患者との比は認めらなかった。

較を行う事により，食肉類の摂取が健康に与える魚介類量とDHAとの間にやや強い正の相関（0.470）を，同様にEPAとの間にやや強い正の相関（0.400）を認めた。魚介類量とその他の脂質影響をより明確に推察できると考えられる。
４．考察

類，レムナントおよびインスリンとの間に相関を健康な50歳以上の男性26名を被験者として，食認めなかった。魚介類量とHistidineとにやや強い事摂取状況と血中の脂質類，ω-３脂肪酸，ω-６

負の相関（0.402）を認めた。それ以外に強い相脂肪酸，血栓因子であるのレムナント，アミノ酸関を示すアミノ酸類は認めらなかった。

等の関係を検討した。被験者の年齢は62.8±10.2

肉類の摂取量と血中HDL-コレステロールとの

歳，BMIは24.1±2.6kg/㎡であった。被験者の推© The Ito Foundation

食肉類の摂取と血中アミノ酸，オメガ３脂肪酸及び血栓因子の関連に関する研究

77

定エネルギー摂取量は2020.3±261.8kcal／日，推μIU/mlであった。糖負荷を行わない際のインス

定たんぱく質摂取比率17.7±2.6％，推定脂質摂取

リン基準値は1.84～12.2μIU/mlであることから

比率27.3±3.9％，推定炭水化物摂取比率46.7±

被験者群は基準内であると考えられた。総アミノ6.9％であり，脂質摂取比率がやや多く，炭水化

酸量は2870.4±273.7nmole/mlであり，各々のア

物摂取比率はやや少なかった。被験者における肉ミノ酸は０～637.2nmole/mlであった。空腹時血類摂取量は180.7±70.0kcal／日，魚介類摂取量は

糖値は105±17.2mg/dlであった。以上のような事

134.3±29.7kcal／日であり，肉類の摂取は魚介類から，食事中のたんぱく質比率や肉類の摂取量の摂取に比べて有意に高かった。被験者のHDL-は，通常の摂取量であれば血中脂質類や血栓因

コレステロールは55.8±13.4mg/dl，LDL-コレス

子，インスリン，血中アミノ酸に大きな影響を与

テロールは117.8±32.4mg/dl，総コレステロールえないと推察された。

は197.9±33.6mg/dl，トリグリセリドは128.0±
88.8mg/dlであった。血栓因子のレムナントリポ
蛋白として重要であるRLP-コレステロールは8.5±11.2mg/dl，RLP-トリグリセリドは被験者の半数で15mg/dl以下であった。ω-３脂肪酸である
EPAは79.8±μg/ml，DHAは151.4±54.8μｇ/ｍであった。ω-６脂肪酸であるジホモ-γ-リノレン酸は35.8±8.5μg/ml，アラキドン酸は187.5±31.4μg/mlであった。被験者のインスリンは6.5±3.1

文献１）
 丹後俊郎ら：，日本公衆衛生学会誌，47，230～
244，2000．
２） 文部科学省：学校保健統計調査・運動能力調査３）
 厚生労働省：日本人の食事摂取基準2010年度版，
ｐ45～117，第一出版，東京，2009．
４）
 日本動脈硬化学会：動脈硬化性疾患予防ガイドラ
イン2007年版，ｐ６，日本動脈硬化学会，東京，
2007．
５） 岩本安彦ら：糖尿病最新の治療，2013～2015，ｐ
47，南江堂，東京，2013．

© The Ito Foundation

78

畜産物由来ヘム鉄摂取について食事調査における研究―発育期スポーツ選手の体組成に対する効果―
Study of the porcine blood heme-iron intake and the nutrition ingestion
condition―Effect of the heme-iron on the body composition for the growth phasesport player―

坂

元

美

子

（神戸女子大学健康福祉学部）

Yoshiko Sakamoto（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Women's University）

We have demonstrated that if total energies and various nutrient intakes from the food
did not satisfy the reference value, the blood hemoglobin level was decreased. In order tomaintain the blood hemoglobin values for the growing athletes, they needed to intake not only
the heme iron but also nutrients in regard to hemoglobin metabolism. About the changes inblood hemoglobin values before and after intakes of heme iron supplements, if the totalenergies from the food of the athletes were deficient, we howed no difference in the effect of
the intakes heme iron supplements. On the other hand, if total energies and various nutrient
intakes from the food is satisfied and blood hemoglobin level is high, hemoglobin values aremaintain or increase depending on the heme iron supplements. We got an indication thatregarding the changes in body composition of before and after intake of heme ironsupplements, when the athletes implement the suitable nutrient intake, adequate training
philosophy, and the supplementation of heme iron, they can increase skeletal muscle mass andprotein level, and they can decrease the amount of body fat．

１．目ていない。適切な食事量と栄養摂取ができていな的い場合，健全な精神と肉体を育てることは不可能

発育期におけるスポーツ選手は，身体発育に必になるばかりではなく，成長障害，疲労骨折，鉄

要な食事量に加え，トレーニング等による身体活

欠乏性貧血，摂食障害など様々な障害の要因にな

動量の増加に見合ったより多くの食事量を必要とる２）。特に，激しい運動が原因でおこる貧血はス

するが，選手自身の，必要なエネルギー摂取量やポーツ貧血と呼ばれている３）。スポーツ選手の貧

栄養素の充足に対する認識は非常に薄く，日本人

血は，貧血症状と同時に競技能力の低下をもたらの食事摂取基準１）にも，ビタミン，ミネラル等のす２）。通常は貧血の指標が正常値であっても，激栄養素のスポーツ選手への適切な摂取量は示され

しい運動などで急激に赤血球やヘモグロビンが減© The Ito Foundation

畜産物由来ヘム鉄摂取について食事調査における研究79

少し，貧血の症状を呈することもあり４），適切な試合数が増加し，疲労が蓄積しやすい７月に，栄養素の摂取と基礎体力に見合ったトレーニング

研究の目的と内容を説明し，同意を得た上で，食メニューの作成が必要と考えられる。そこで，本事調査を行い，食事調査と同日の３日間カロリー

研究は，持久的能力が必要なスポーツであるサッカウンターを装着しエネルギー消費量を測定す

カー選手の血中ヘモグロビン値と体組成を測定る。同時に対象選手の身体計測，ヘモグロビン値

し，消費エネルギーや運動強度に見合った栄養素測定を行う。７月より畜産物由来ヘム鉄3.5㎎／

摂取がなされているかについて栄養調査を行い，日を，トップチームの25名と新入生の13名に３ヶ貧血予防やスポーツ選手の理想的な体組成と栄養

月間摂取させ，サプリメントを摂取していない新摂取状況との関連を検討することおよび，発育期入生９名とともに約４週間ごとに計４回，血中ヘスポーツ選手の畜産物由来ヘム鉄摂取の必要性を

モグロビン値測定と身体計測を行った。新入生の検討することを目的とする。

サプリメント摂取群と非摂取群の抽出は，名簿よ

２．方り無作為抽出で行った。

法

本研究は，神戸女子大学ヒト倫理審査委員会

調査対象は，京都府の高校サッカー部に所属（承認番号Ｈ25－14）の倫理審査承認のうえ，対し，３ヶ月間全ての測定を行うことのできた男子

象者とその保護者に対して，説明書を研究者が配

部員トップチーム25名と新入生22名。対象チーム

布し説明したのち，被験者は20才未満のため対象

は，地区大会では常に上位におり，全国大会を目者とその保護者，サッカー部の監督および学校長

標としている比較的高レベルのチームである。

に書面により同意を得たうえで行った。

2.1

栄養摂取状況調査

対象者の保護者に，連続した３日間の食事内容を評量法で測定してもらい，自記式記入法で調査用紙に記入してもらう。エネルギー・栄養素摂取
量は栄養計算ソフトエクセル栄養君Ver.５（健帛社）を用いて算出する。
2.2

３．結果と考察3.1

エネルギー・栄養摂取状況と血中ヘモグ
ロビン値

トップチーム（以下１群），新入生サプリメン
ト摂取群（以下２群），新入生サプリメント非摂スポーツ貧血調査

非侵襲式血中ヘモグロビン量測定装置

取群（以下３群）について，各群のエネルギー消アスト

費量，エネルギー・栄養素摂取量と血中ヘモグロ

リムSU（シスメックス社製）を用いて血中ヘモビンの３ヵ月後の変化をTable１に示した。エネ

グロビン値を測定する。

ルギー・栄養素摂取量についてそれぞれの基準値

2.3

エネルギー消費量調査と し て ，エ ネ ル ギ ー は 日 本 人 の 食 事 摂 取 基 準

カロリーカウンターHJA-307IT（オムロン社製）を用いて，エネルギー消費量を測定する。
2.4

１）（2010年版）の対象者と同年代の男性，身体活動

レベル３とし，たんぱく質，脂質，炭水化物は基

身体計測

準エネルギー値からP：F：C＝15：25：60のエネ

身長はSECA213（SECA社製）を用いて，体組

ルギー比率で算出した。その他の栄養素は，日本

成はボディーコンポジションアナライザー

人の食事摂取基準（2010年版）において推奨量がInBody720（株式会社バイオスペース社製）を用設定されているものは推奨量を，設定されていな

いて測定する。

いもの（カリウム，リン，マンガン，ビタミンＤ，© The Ito Foundation

80

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

table.1 The energy consumption, energy intake,nutritional intake and changes in blood hemoglobin concentration before

and after ingestion of the target person
Energyconsumption

EnergyintakeProtein

Fat

Carbohydrate potassium

Calcium

Magnesium

Iron

Zinc

Copperselenium

kcal

kcal

ｇ

ｇ

ｇ

mg

mg

mg

mg

mg

mg

mg

group1（n＝25）

2707

2676

92.3

78.7

386.4

2838

559

281

8.7

11.6

1.41

77

SD（±）

307

536

13.7

16.7

96.9

654

240

67

2.2

2.4

0.32

19

group2（n＝11）

2464

2995

109.4

94.2

410.5

3095

588

318

9.3

13.8

1.80

101

SD（±）

228

558

29.8

27.6

80.5

829

220

84

2.4

3.5

0.72

37

group3
（n＝９）

2342

2415

85.0

80.0

327.5

2335

560

243

7.8

10.7

1.40

72

SD（±）

372

806

37.0

48.2

73.0

938

575

79

2.6

4.7

0.52

28

Reference

3100

3100

116.2

86.1

465.0

2700

800

350

9.5

13.0

0.90

35

Folic acid

VitaminC

HGB preHGB post

VitaminA

VitaminE VitaminB１ VitaminB２

NiacinVitaminB６ VitaminB12

μgRE

mg

mg

mg

mg

mg

μｇ

μｇ

mg

g/dl

g/dl

group1（n＝25）

650

21.2

1.42

1.45

37.80

1.53

7.0

327

148

14.6

14.4

SD（±）

282

5.9

0.39

0.35

6.80

0.39

3.4

82

139

1.0

1.1

group2（n＝11）

688

9.5

1.70

1.68

23.73

1.71

8.2

380

134

14.9

15.3

SD（±）

176

1.7

0.83

0.44

9.79

0.58

4.1

110

57

0.9

1.3

group3
（n＝９）

481

18.8

1.20

1.31

34.00

1.50

5.9

268

106

14.8

14.5

SD（±）

270

7.4

0.67

0.65

16.00

1.01

3.4

72

61

0.8

0.8

Reference

900

8.0

1.50

1.70

16.00

1.40

2.4

240

100

14.0

14.0

ビタミンＥ，ビタミンＫ，パントテン酸）は目安

ロビンの増加の可能性も考察したが，以上の結果の量とした。

から，成長期スポーツ選手が血中ヘモグロビン値

エネルギー充足していたのは２群と３群であっを維持するためには，ヘム鉄の摂取のみならず，たが基準値は満たしていなかった。ビタミンＥ，

ヘモグロビン代謝に関与する栄養素の基準値を満

ナイアシン，ビタミンＣを除く栄養素摂取量におたす摂取が必要であることが考えられる。また，

いて２群が多く摂取していた。銅，セレン，ナイ

スポーツをすることによって増加するエネルギー

アシン，ビタミンＢ６，ビタミンＢ12，葉酸，ビ消費量に見合ったエネルギー・栄養素量の摂取がタミンＣについては３群とも，カリウムは１群と必要であることが示唆された。

２群が基準値を満たしていた。たんぱく質，炭水化物，カルシウム，マグネシウム，鉄，ビタミン3.2

サプリメント摂取前後の血中ヘモグロビ
ン値の変化

Ａ，ビタミンＢ２については３群とも基準値を満

トップチームのサプリメント摂取前の血中ヘモたしていなかった。それ以外の栄養素について

グロビン値がスポーツ選手の基準値である14g/dlは，２群のみが基準値を満たしていた。血中ヘモ以上の選手（以下１-ａ群），トップチームのサプ

グロビン値は，２群のみが上昇していた。前年度

リメント摂取前の血中ヘモグロビン値が14g/dl未の報告書において，１ヶ月間のみの摂取で，72名満の選手（以下１-ｂ群），新入生サプリメント摂中51名の選手が，血中ヘモグロビンが低下してお取前の血中ヘモグロビン値が14g/dl以上の選手

り，ヘム鉄サプリメントの継続摂取で血中ヘモグ（以下２-ａ群），新入生サプリメント摂取前の血© The Ito Foundation

81

畜産物由来ヘム鉄摂取について食事調査における研究

table.2 The energy consumption, energy intake,nutritional intake and changes in blood hemoglobin concentration before

and after ingestion of the target person
Energyconsumption

EnergyintakeProtein

Fat

Carbohydrate potassium

Calcium

Magnesium

Iron

Zinc

Copperselenium

kcal

kcal

ｇ

ｇ

ｇ

mg

mg

mg

mg

mg

mg

mg

group１-a（n＝19）

2744

2668

91.2

79.4

383.5

2824

550

278

8.5

11.7

1.40

74

SD（±）

264

493

14.7

17.6

83.7

653

254

67

2.0

2.5

0.31

16

group１-b
（n＝６）

2590

2700

96.0

76.5

395.6

2881

586

290

9.4

11.5

1.43

88

SD（±）

371

617

7.2

11.1

123.3

602

161

59

2.5

1.8

0.33

21

group２-a
（n＝９）

2500

3065

110.1

93.6

428.2

3134

594

326

9.5

14.3

1.91

100

SD（±）

235

582

32.6

29.1

78.6

879

241

90

2.6

3.7

0.75

40

group２-b
（n＝２）

2303

2681

106.3

96.8

330.6

2917

564

281

8.6

11.9

1.30

106

SD（±）

59

259

8.5

19.2

10.1

508

59

30

0.3

1.6

0.14

17

group３-a
（n＝７）

2377

2282

81.1

71.2

318.3

2453

598

247

7.5

10.0

1.39

70

SD（±）

167

646

37.0

37.6

61.2

871

606

81

2.5

4.5

0.53

29

group３-b
（n＝２）

1855

2880

98.3

110.8

359.8

2826

427

229

8.5

13.2

1.24

79

SD（±）

294

927

21.4

55.7

83.1

809

113

44

2.4

2.7

0.29

8

3100

116.2

86.1

2700

800

35

Reference

3100
VitaminA

VitaminE VitaminB1 VitaminB2

465.0
NiacinVitaminB6 VitaminB12

350

9.5

13.0

0.90

Folic acid

VitaminC

HGB preHGB post

μgRE

mg

mg

mg

mg

mg

μｇ

μｇ

mg

g/dl

g/dl

group１-a（n＝19）

656

7.6

1.42

1.46

20.1

1.53

6.7

332

166

15.1

14.5

SD（±）

255

1.8

0.41

0.38

5.1

0.39

3.5

84

151

0.5

1.0

group１-b
（n＝６）

630

7.7

1.42

1.44

22.3

1.53

7.7

313

91

13.1

13.9

SD（±）

335

1.0

0.27

0.15

2.5

0.34

2.6

70

32

0.3

1.0

group２-a
（n＝９）

680

9.7

1.76

1.70

24.1

1.76

8.8

383

139

15.2

15.4

SD（±）

192

1.8

0.90

0.49

10.6

0.61

4.3

115

59

0.7

1.2

group２-b
（n＝２）

729

8.5

1.48

1.58

22.3

1.50

5.2

363

110

13.6

15.0

SD（±）

45

0.5

0.28

0.05

4.8

0.42

0.8

83

33

0.0

1.7

group３-a
（n＝７）

440

6.5

1.20

1.19

18.1

1.24

5.7

254

92

15.1

14.8

SD（±）

276

2.5

0.71

0.56

9.6

0.54

3.5

63

40

0.5

0.6

group３-b
（n＝２）

623

8.1

1.22

1.75

21.8

2.49

6.5

320

154

13.7

13.5

SD（±）

27

2.8

0.05

0.61

4.1

1.34

1.7

57

78

0.2

0.4

Reference

900

8.0

1.50

1.70

16.0

1.40

2.4

240

100

14.0

14.0

中ヘモグロビン値が14g/dl未満の選手（以下２-

取量と血中ヘモグロビンの３ヵ月後の変化をｂ群），新入生血中ヘモグロビン値が14g/dl以上

Table２に示した。

の選手（以下３-ａ群），新入生血中ヘモグロビン

エネルギーが充足しており，基準値をほぼ満た

値が14g/dl未満の選手（以下３-ｂ群）についてしているのは２-ａ群だけであったが，１-ｂ群，各群のエネルギー消費量，エネルギー・栄養素摂２-ｂ群，３-ｂ群はエネルギーが充足していた。

© The Ito Foundation

82

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

table.3 The blood hemoglobin concentration and physical situation of the target person
HGB：g/dl（SD）

Height：cm（SD）

Body weight：kg（SD）

Intracellularwater
content：ℓ（SD）

Extracellularwater
content：ℓ（SD）

Skeletalmusclemass：kg（SD）

14.6（1.0）

171.9（5.8）

60.9（5.8）

24.7（3.8）

14.8（1.3）

31.0（2.8）

post

14.4（1.1）

172.7（6.0）

60.9（6.4）

25.8（2.4）

14.9（1.5）

31.6（3.2）

group2（n＝12）

pre14.9（1.0）

170.0（5.9）

56.9（4.4）

23.8（1.8）

14.2（1.0）

29.1（2.3）

post

15.1（1.4）

171.5（6.1）

57.8（4.9）

24.4（2.2）

14.4（1.2）

29.9（2.7）

group3（n＝９）

pre

14.8（0.8）

166.3（5.1）

53.9（5.8）

22.2（2.4）

13.1（1.5）

26.9（3.1）

post

14.5（0.8）

167.7（5.3）

54.5（6.0）

22.5（2.4）

13.2（1.6）

27.3（3.1）

Amount ofbody fat：kg（SD）

BMI（SD）

Body fatpercentage：％（SD）

Amount ofprotein：kg（SD）

Mineralcontent：kg（SD）

5.4（1.9）

20.4（1.5）

8.9（2.7）

10.9（0.9）

3.72（0.33）

group1（n＝20）

group1（n＝20）

pre

pre
post

4.8（1.7）

20.2（1.7）

7.8（2.3）

11.1（1.0）

3.75（0.40）

group2（n＝12）

pre5.1（1.6）

20.0（1.2）

8.9（2.5）

10.3（0.7）

3.51（0.2）

post

4.9（1.5）

19.6（1.2）

8.5（2.5）

10.6（0.9）

3.59（0.30）

group3（n＝９）

pre

5.8（2.1）

19.4（1.4）

10.6（3.4）

9.6（1.0）

3.25（0.36）

post

5.8（2.1）

19.3（1.3）

10.5（3.4）

9.7（1.0）

3.31（0.37）

たんぱく質，炭水化物は全ての群で摂取量が基準

取ができていれば，ヘム鉄サプリメントを摂取す

値を下回っていたが，どちらも２-ａ群が最も基ることで維持または，さらに増加させることも可準値に近い摂取量であった。脂質は２-ａ群，２-能であると考える。

ｂ群，３-ｂ群で基準値を満たしており，３-ｂ群

3.3

サプリメント摂取前後の体成分の変化が最も多かった。カルシウム，マグネシウム，ビ体成分測定が７月と10月の２回行うことの出来

タミンＡは全ての群で基準値を満たしていなかったトップチームの選手18名（以下１群），新入生

た。脂質，カルシウム，セレン，ビタミンＡ，ビサプリメント摂取群13名（以下２群），新入生サ

タミンＢ２，ビタミンＢ６，ビタミンＣ以外の栄プリメント非摂取群９名（以下３群）について，

養素は全て２-ａ群が最も摂取量が多かった。１-

血中ヘモグロビン値と体組成の変化をTable３に

ａ群，３-ａ群，３-ｂ群で血中ヘモグロビン値が示した。

減少し，１-ｂ群，２-ａ群，２-ｂ群は上昇した。

１群は体重の増加は見られなかったが，骨格筋以上の結果から，エネルギー充足に見合う栄養摂量が増加し，体脂肪量が減少した。２群と３群と取ができていなければ，ヘム鉄サプリメントを摂もに体重，骨格筋量の増加は見られるが，体脂肪取しても血中ヘモグロビンの上昇に効果的に働か量は，２群で減少し，３群では大きな変化は見らないことが示唆された。３-ｂ群は，エネルギーれなかった。また，体たんぱく質量は１群と２群は充足しているが，脂質からのエネルギー摂取量で増加したが３群では大きな変化は見られなかっが多いことから，エネルギー源栄養素として，たた。３群間の検定について，一元配置分散分析

んぱく質と炭水化物の摂取の必要性が示唆され（Dunnett）を行った結果，危険率５％未満を有た。また，血中ヘモグロビン値が高値であっても，意とすると各群間に有意な差は見られなかったエネルギー充足に見合ったエネルギー・栄養素摂が，骨格筋（Ｐ値＝0.17）について３群よりも２© The Ito Foundation

畜産物由来ヘム鉄摂取について食事調査における研究

83

群のほうが増加傾向にあり，体脂肪量（Ｐ値＝た，スポーツをすることによって増加するエネル

0.13）と体脂肪率（Ｐ値＝0.12）において３群よ

ギー消費量に見合ったエネルギー・栄養素量の摂りも１群のほうが減少傾向にあった。また，たん取が必要であることが示唆された。

ぱく質量（Ｐ値＝0.18）は３群よりも２群のほうサプリメント摂取前後の血中ヘモグロビン値のが増加傾向であった。このことから，適切な栄養変化について，エネルギー充足に見合う栄養摂取

摂取下でトレーニングを行い，ヘム鉄サプリメンができていなければ，ヘム鉄サプリメントを摂取

トを摂取することで，より効果的に体たんぱく質

しても血中ヘモグロビンの上昇に効果的に働かなと骨格筋量を増やし，体脂肪量を減らすことが示

いことが示唆された。３-ｂ群は，エネルギーは唆された。

充足しているが，脂質からのエネルギー摂取量が今回の研究の限界点として，ヘム鉄サプリメン

多いことから，エネルギー源栄養素として，たんト摂取群と非摂取群に分け，摂取前後の変化を見

ぱく質と炭水化物の摂取の必要性が示唆された。

るために群分けをした結果，各群の人数にばらつ

また，血中ヘモグロビン値が高値であっても，エきが出てしまい，統計解析を十分に行うことがで

ネルギー充足に見合ったエネルギー・栄養素摂取きなかった。今後は，対象者数を増やし，各群の量ができていれば，ヘム鉄サプリメントを摂取す

人数を同数かつより多くなるように設定し，エネることで維持または，さらに増加することが示唆

ルギー充足と食事摂取状況と，体組成について，された。

畜産物由来ヘム鉄の継続的な摂取が，どのようにサプリメント摂取前後の体成分の変化につい効果的に働くかについて，より詳細な検討を続けて，適切な栄養摂取下で，トレーニングを行い，て行う必要があると考える

ヘム鉄サプリメントを摂取することで，より効果

４．要的に体たんぱく質と骨格筋量を増やし，体脂肪量約を減らすことが示唆された。

エネルギー・栄養摂取状況と血中ヘモグロビン
値について，３ヶ月間のヘム鉄サプリメント摂取を行ったが，エネルギー・栄養素摂取量が基準値を満たしていなければ，血中ヘモグロビン値は低下した。成長期スポーツ選手が血中ヘモグロビン
値を維持するためには，ヘム鉄の摂取のみならず，ヘモグロビン代謝に関与する栄養素の基準値

文献１）
 厚生労働省策定：日本人の食事摂取基準［2010年
版］，ｐ．118～275，第一出版社，東京，2010．
２）
 樋口満：公認アスレティックトレーナー専門科目
テキスト スポーツと栄養，財団法人日本体育協会，
48～55，財団法人日本体育協会，東京，2009．
３）
 鯉 川 な つ え：日 本 臨 床 ス ポ ー ツ 医 学 会 誌 ，16（２），216～220，2008．
４） 宮崎保：体力科学，46，529～534，1997．

を満たす摂取が必要であることが考えられる。ま© The Ito Foundation

84

牛肉の質に関連する新たな脂肪酸合成経路の探索とバイオマーカーの同定
Development of a biomarker of new pathway for the synthesis of fatty
acid in bovine intramuscular adipocytes

溝

口

康

（明治大学農学部）

Yasushi Mizoguchi（School of Agriculture, Meiji University）

Intramuscular fat deposition, known as marbling, and fatty acid composition areeconomically important factors contributing to the quality of beef. The mechanisms by which
acetic acid and glucose are involved inlipid metabolism are unclear. In this study, to understandthe molecular mechanism of bovine intramuscular adipogenesis, we examined the effect ofacetic acid and glucose on the differentiation of adipose tissue（triglyceride（TG）content andfatty acid composition）and the gene expression levels of fatty acid synthase,stearoyl-CoA
desaturase and glucose transporter 4 using a clonal bovine intramuscular preadipocyte（BIP）
cell line. The BIP cells were harvested at six day after adipogenic stimulation. The gene
expression levels were validated by quantitative real-time PCR. Lipids were extracted as TG
according to the Bligh and Dyer method, and the amount of TG was measured by enzyme
method. Treatment of the BIP cells with 100 mM acetic acid significantly increased theexpression levels of three genes, compared to 10 mM acetic acid treatment（P ＜ 0.05）． TG
content significantly increased with elevated both acetic acid and glucose concentrations（P ＜0.05）． Saturated fatty acid proportions were significantly higher in 1.0g/L D-glucose than in
4.5g/L D-glucose（P ＜ 0.05），whereas those of monounsaturated fatty acid were significantly
higher in 4.5g/L D-glucose than in 1.0g/L D-glucose（P ＜ 0.05）． These results indicate that
acetic acid and glucose is essential for fatty acid synthesis and accumulation in bovine
intramuscular adipogenesis．

１．目

生産技術の開発が求められている。おいしい牛肉

的は，脂肪交雑の要因だけではなく脂肪の質にも大ウシ脂肪交雑は筋肉組織内に脂肪が沈着する現きく影響している。脂肪酸は，大きく分けて２種象であり，枝肉評価の中で重要な形質である。脂類存在する。炭素間に二重結合を含まない飽和脂肪交雑割合の高い肉は高値で取引される。近年，

肪酸（Saturated Fatty Acid：SFA）と炭素間に消費者は牛肉に「おいしさ」
・
「安全」
・
「健康」を

二 重 結 合 を １ つ 含 む 不 飽 和 脂 肪 酸

求めるようになり，時代のニーズに対応した牛肉（Monounsaturated Fatty Acid：MUFA）である。

© The Ito Foundation牛肉の質に関連する新たな脂肪酸合成経路の探索とバイオマーカーの同定

85

牛肉の不飽和脂肪酸含量は風味・食感・うま味に濃度（０mM・10mM・100mM）に調整した。遺影響している。不飽和脂肪酸の中でもオレイン酸

伝子発現量・TG含量・脂肪酸組成解析は，分化

は風味や食感に影響を与え，オレイン酸はうま味

誘導後６日目に実施した。

に関連する 。また，各種脂肪酸の機能性成分に2.2関する研究もおこなわれている。オレイン酸は動

グアニジウム法により培養細胞の全RNAを回脈硬化の予防作用があること，飽和脂肪酸である

収し，DNaseⅠ処理で混在しているDNAを分解

ステアリン酸はLDLコレステロールの減少効果した。その後フェノール・クロロホルム処理で蛋があること，共役リノール酸は抗腫瘍作用・体脂

白質を除去し，全RNAを抽出した。cDNAは全肪の低減効果があること，多価不飽和脂肪酸であRNAを鋳型としrandom hexamerを用いて逆転るアラキドン酸は認知症予防効果があることな写 反 応 を 行 い 合 成 し ， 定 量 的 Real-Time

ど，様々な報告がある２，３）。このように牛肉の質

Polymerase Chain Reaction （RT-PCR） を 用 い

は，「おいしさの向上」・「機能性成分としての効て遺伝子発現解析を実施した。解析方法は相対定用」が期待されている。

量Taq Manプローブを用い，ΔΔCt法により数１）

遺伝子発現量の測定

動物は摂食による脂肪吸収するだけでは不十分値化した。定量で使用する内在性のコントロールであるため，体内で新規合成を行っている。反芻

には，ハウスキーピング遺伝子であるグリセルア動物であるウシは脂肪酸合成において主に揮発性

ルデヒド３－リン酸脱水素酵素（GAPDH）を用

脂肪酸（酢酸・酪酸・プロピオン酸）をエネルいた。解析対象遺伝子は，Fatty acid synthase

ギー源として用いている。グルコースが筋肉内脂（FASN）， Stearoyl-CoA desaturase （SCD），

肪細胞の脂肪合成に大きく貢献していると報告さ

Glucose transporter type 4（GLUT４）の３遺伝

れている が，ウシ脂肪細胞分化に揮発性脂肪酸

子とした。

４）

がどのような影響を与えているかについては不明

2.3

な点が多い。そこで本研究は，黒毛和種の胸最長TG抽出はBligh and Dyer法６）によって抽出し筋にある筋肉内脂肪から樹立された細胞株である

た。TG含量測定はtriglyceride E-test kit (Wako,

ウ シ 筋 肉 内 脂 肪 前 駆 細 胞 株 （Bovine

Japan）を用いた酵素法によって決定した。脂肪Intramuscular Pre-adipocyte（BIP）） の分化を

肪酸組成はガスクロマトグラフィー解析により測

脂肪交雑モデルと捉え，揮発性脂肪酸の中でも単定した。ミリスチル酸（Ｃ14：０），ミリストレ

純な構造をもつ酢酸およびグルコースの濃度依存イン酸（Ｃ14：１），パルミチン酸（Ｃ16：０），

的変化が脂肪酸合成および脂肪蓄積に関連する遺パルミトレイン酸（Ｃ16：１），ステアリン酸

伝子の発現量・トリグリセリド（TG）含量・脂（Ｃ18：０），オレイン酸（Ｃ18：１），リノール

肪酸組成への影響を調べた。

酸（Ｃ18：２），リノレン酸（Ｃ18：３），飽和脂

５）

２．方
2.1

TG含量と脂肪酸組成の測定

肪酸（SFA），一価不飽和脂肪酸（MUFA）割合

法を算出した。
2.4

細胞培養

統計解析

BIPの継代・分化誘導の方法と条件は常法に

統計解析はSASによって行った。各遺伝子の従った ５）。分化誘導培地は，低グルコース濃度mRNA発現量とTG含量における酢酸とグルコー（1.0g/l）および高グルコース濃度（4.5g/l），酢酸

スの影響はGLM法を，脂肪酸組成におけるグル© The Ito Foundation

86

平成25年度
（Ａ）

（Ｂ）
4
a

Relative mRNA level

Relative mRNA level

4

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

3
2

b

b

1
0

3
2

b

b

1
0

０mM
10mM
100mM
Acetic acid concentration

a

０mM
10mM
100mM
Acetic acid concentration

Fig.1 FASN messenger RNA expression levels by treating with 0, 10 and 100 mM acetic acid at day 6 after

adipogenic stimulation in BIP cells. These cells were cultured with 1.0（A）g/l and 4.5 g/l（B）D-glucose.
Different letters indicate significant differences（a＞b, P＜0.05）．

Table 1 Fatty acid composition by treating with 1.0g/land 4.5g/lD-glucoseat day 6 after

adipogenic stimulation in BIP cells．
Fatty acid composition

Low glucose

High glucose

Ｃ14：０

7.23±2.1

4.96±2.4

Ｃ14：１

0.41±0.47

0.23±0.1

Ｃ16：０

59.36±2.32

59.65±3.1

Ｃ16：１

0.67±0.36

1.14±0.45

Ｃ18：０

26.21±3.26ａ

16.37±2.39ｂ

Ｃ18：１

6.11±1.95ｂ

15.68±0.67ａ

Ｃ18：２

0

1.93±0.76

SFA

92.8±2.68ａ

81.0±1.70ｂ

MUFA

7.12±2.68ｂ

17.07±0.91ａ

Values within a row without a common superscript are different（P＜0.05）

コース濃度の影響はStudent’s t-testによって実施

セチルCo-AやマロニルCo-Aから炭素数16の脂肪した。結果は平均値±標準誤差で表し，P＜0.05

酸合成を触媒する７）。低・高グルコース濃度におの時に統計学的に有意であると判断した。

けるFASN遺伝子発現量（Data not shown）およびＣ16：０割合に差はなかった（Table１）。以上

３．結果と考察のことから，FASN遺伝子発現は酢酸濃度に依存

低グルコース濃度時のFASN遺伝子発現量は，酢酸濃度10mMと比較して100mMは2.2倍（P＜し，Ｃ16：０割合に影響を及ぼす可能性があると考察した。

0.05）増加した（Fig.1 A）。高グルコース濃度時

低グルコース濃度時のSCD遺伝子発現量は，酢のFASN遺伝子発現量は，酢酸濃度10mMと比較

酸 濃 度 10mM と 比 較 し て 100mM は 6.9 倍（P ＜し て 100mM は 2.9 倍 （P ＜ 0.05） 増 加 し た0.05）増加した（Fig.2 A）。高グルコース濃度時（Fig.1 B）。FASNは長鎖脂肪酸合成を調節し，アのSCD遺伝子発現量は，酢酸濃度10mMと比較し© The Ito Foundation

87

牛肉の質に関連する新たな脂肪酸合成経路の探索とバイオマーカーの同定
（Ａ）

（Ｂ）
4
a

3
2
1
0

b

b

Relative mRNA level

Relative mRNA level

4

3
2
1
0

０mM
10mM
100mM
Acetic acid concentration

a

b

b

０mM
10mM
100mM
Acetic acid concentration

Fig.2 SCD messenger RNA expression levels by treating with 0, 10 and 100 mM acetic acid at day 6 after

adipogenic stimulation in BIP cells. These cells were cultured with 1.0（A）g/l and 4.5 g/l（B）D-glucose.
Different letters indicate significant differences（a＞b, P＜0.05）．

（Ａ）

4
3
2
1
0

b

b

０mM
10mM
100mM
Acetic acid concentration

a

（Ｂ）
5

a
Relative mRNA level

Relative mRNA level

5

4
3
2
1
0

b

b

０mM
10mM
100mM
Acetic acid concentration

Fig.3 GLUT4 messenger RNA expression levels by treating with 0, 10 and 100 mM acetic acid at day 6 after

adipogenic stimulation in BIP cells.These cells were cultured with 1.0 (A) g/l and 4.5 g/l (B) D-glucose.
Different letters indicate significant differences (a＞b, P＜0.05）．

て100mMは3.3倍（P＜0.05）増加した（Fig.2 B）。

＜0.05）増加した（Fig.3 A）。高グルコース濃度

低・高グルコース濃度におけるSCD遺伝子発現

時のGLUT４遺伝子発現量は，酢酸濃度10mMと量の差はなかった（Data not shown）。しかしな

比 較 し て 100mM は 7.1 倍（P ＜ 0.05）増 加 し たがら，MUFA割合は低グルコース濃度よりも高（Fig.3 B）。GLUT４遺伝子は主に脂肪細胞や骨格グルコース濃度の方が有意（P＜0.05）に高かっ筋で特異的に発現しグルコースの取り込みに重要た（Table１）。SCDは飽和脂肪酸を一価不飽和脂な役割を担っている８，９）。通常GLUT４は細胞質

肪酸に変換する酵素である。グルコースによるに存在しているが，インスリンの刺激により，細MUFA割合の増加に関して，SCD遺伝子発現量

胞質から細胞膜へトランスローケーションし，細結果と異なることから，SCDタンパク質発現量に胞内へのグルコースの取り込みを増加させる10）。

違いがあると考察した。

インスリン刺激によるグルコース取り込みの増加

低グルコース濃度時のGLUT４遺伝子発現量は細胞全体のGLUT４量が増加するのではなく，は，酢酸濃度10mMと比較して100mMは9.0倍（PGLUT４の細胞膜へのトランスローケーションに© The Ito Foundation

88

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

160a

TG content（mg/dL）

140

b

120

c

100
80

c

c

d

60
40
20
０
０mM

10mM
Acetec acid concentration

100mM

Fig.4 Triglyceride levels by treating with 0, 10 and 100 mM acetic acid at day 6 after adipogenic stimulationin BIP cells.These cells were cultured with 1.0（white）g/l and 4.5 g/l（black）D-glucose. Different letters
indicate significant differences（a＞b＞c＞d, P＜0.05）．

よるものだと考えられている11）。黒毛和種筋肉内した。低濃度時のSFA割合は，高濃度時と比較

脂 肪 前 駆 細 胞 株（BIP）を 用 い た 研 究 で は ，して有意に増加した（P＜0.05）。一方，高濃度時

GLUT４は発現していないと報告されている 。

のMUFA割合は，低濃度時と比較して有意に増本研究において，グルコース濃度によるGLUT４

加した（P＜0.05）。これは主にＣ18：０とＣ18：

遺 伝 子 の 発 現 量 の 差 は な か っ た （Data not

１の増減によるものであると考察した。Ｃ16：０

shown）。しかしながら，酢酸はGLUT４遺伝子

割合はグルコース濃度に影響しなかった。TG含発現量を増加した（Fig.3 A，
B）。このことから，

量は酢酸濃度依存的に有意に増加した。ウシの肝GLUT４遺伝子発現はグルコースよりも酢酸に大細胞において高濃度の酢酸を投与することで，きく影響を受けると考察した。

TG含量が減少したという報告がある 12）。このこ

５）低グルコース濃度時のTG含量は，酢酸濃度０とからウシ肝細胞と筋肉内脂肪細胞の間では脂肪mMと比較して10mMでは約1.6倍（P＜0.05）に

合成メカニズムが異なることを示唆した。過去に100mMでは約1.7倍（P＜0.05）に増加した（Fig.

In vivoにおいて，グルコースは筋肉内脂肪組織４）。4.5g/L D-glucoseを与えられた時のTG含量にあるアセチルユニットの50～75％を占めているは酢酸濃度０mMと比較して10mMでは約1.2倍と報告されている４）。本研究において，グルコー（P＜0.05）に100mMでは約1.4倍（P＜0.05）に増ス濃度依存的にTGが増加したこと（Fig.４）か加した（Fig.４）。酢酸濃度を０mM・10mM・ら，BIPにおいてグルコースの代謝から脂肪酸合

100mMに固定し，グルコース濃度を低および高成が活発に起こっていると考察した。

に変化させたとき，TG含量は低濃度よりも高濃度で有意（P＜0.05）に増加した（Fig.４）
。以上

４．要

約

のことから，酢酸およびグルコースのTG含量へ

反芻動物の脂肪酸合成の主要前駆体は揮発性脂の影響は相乗効果があることを示した。脂肪酸組

肪酸であるのに対して，単胃動物はグルコースで成に与えるグルコース濃度の影響をTable１に示ある。本研究は，揮発性脂肪酸の一種である酢酸© The Ito Foundation牛肉の質に関連する新たな脂肪酸合成経路の探索とバイオマーカーの同定とグルコースがウシ筋肉内脂肪細胞分化にどのような影響を与えるかを，脂肪酸合成関連遺伝子発現およびトリグリセリド（TG）蓄積により検討し た 。 BIP を 用 い て ， 酢 酸 濃 度 （０ mM ・
10mM ・ 100mM），グ ル コ ー ス 濃 度（1.0g/l ・
4.5g/l）の２×３群に分け，脂肪細胞分化誘導を行った。分化誘導後６日後にサンプルを抽出した 。脂 肪 酸 合 成 関 連 遺 伝 子（FASN ・ SCD ・
GLUT４）の発現解析をReal Time-PCRによって実施した。TGはBligh and Dyer法を用いて抽出した。TG含量は酵素法により，脂肪酸組成はガ
スクロマトグラフィーにより測定した。FASN・SCD・GLUT４遺伝子発現量は，酢酸濃度依存的に増加し，TG含量は酢酸およびグルコース濃度依存的に増加した。グルコースは，Ｃ18：１・
MUFA割合を増加させた（P＜0.05）。以上のことから，脂肪酸合成とその関連遺伝子発現には酢酸とグルコースの両方が重要であると考察した。
文献１） 広岡博之（編集）：ウシの科学，192～197．朝倉書店，東京，2013．
２） 財団法人日本食肉消費総合センター：牛肉の魅89

力，20～36．平成21年度社団法人日本食肉協議会補助事業，東京，2009．
３）
 財団法人日本食肉消費総合センター：牛肉の魅力，38～64．平成21年度社団法人日本食肉協議会補助事業，東京，2009．
４）
 Smith SB, Crouse JD：J Nutr，114：792～800．
1984．
５）
 Aso H, Abe H, Nakajima I, Ozutumi K,
Yamaguchi T, Takamori Y, Kodama A, Hoshino F,
Takano S.：Biochem Biophys Res Commun，213：
369～375．1995．
６）
 Iverson SJ, Lang SLC, Cooper MH：Lipids，36，
1283～1287．2001．
７）
 Chakravarty B, Gu Z, Chirala SS, Wakil SJ,
Quiocho FA：Proc Natl Acad Sci USA，101，15567～15572．2004．
８）
 Abe H, Kawakita Y, Hodate K, Saito M. ： J Vet
Med Sci，63，1071～1075．2001．
９）
 Carvalho E, Schellhorn SE, Zsbolotny JM, Martin
S, Tozzo E, Peroni OD, Houseknecht KL, Mundt A,
James DE, Kahn BB：J Biol Chem ，279 ，1598 ～
1605．2004．
10） Fujimoto, M., Masuzaki, H., Yamamoto, Y.,
Norisada, N., Imori, M., Yoshimoto, M., Tomita, T.,
Tanaka, T., Okazawa, K., Fujikura, J., Chusho, H.,
Ebihara, K., Hayashi, T., Hosoda, K., Inoue, G.,
Nakao, K：Biochim Biophys Acta，1745，38～47．
2005．
11）
 Kanai F, Nishioka Y, Hayashi H, Kamohara S,
Todaka M, Ebina Y ： J Biol Chem ，268 ，14523 ～
14526．1993．
12）
 Li X, Chen H, Fuan Y, Li X, Lei L, Liu J, Yin L,
Liu G, Wang Z：PloS One, 8，e67880．2013．

© The Ito Foundation

90

牛肉の風味に関与する遺伝子の機能解析
Functional analysis of beef flavor-related genes

米

倉

真

一・廣

田

翔

平

（信州大学農学部）

Shinichi Yonekura and Shohei Hirota（Faculty of Agriculture, Shinshu University）

The fatty acid composition of adipose tissue in beef has been recognized as an important
trait because of its relationship with beef quality, including favorable beef flavor andtenderness. Previous report suggested that polymorphisms of FABP4（adipocytes-type fatty
acid binding protein）I74V might be genetic factors in part associated with palmitoleic acid,indicating that I/I homozygote exhibited 0.5 ％ higher percentage than V/V homozygote. In
this study, we explored how FABP4 could potentially affect fatty acid composition in cattle andused bovine intramuscular preadipocyes（BIP）．As BIP cells have the capacity to proliferateand differentiate into mature adipocytes, they may be useful in studying the mechanism of lipid
metabolism. Firstly, we established FABP4（I/I）or（V/V）overexpressing BIP cells andconfirmed that I/I homozygote exhibited significantly higher unsaturated fatty acidcomposition compared to V/V homozygote. FABP4 have been proposed to play a role in thetransport of lipids to specific compartments in the cell. In the next, therefore, we examined thesubcellular localization of FABP4（I/I）and（V/V）during intracellular lipid droplet formation.
Although FABP4（V/V）tended to move into the nucleus, FABP4（I/I）was mainly localized
the lipid droplet. Because FABP4 is thought to govern the transcriptional activities of theirligands by targeting them in the nucleus, we examined the stearoyl-CoA desaturase（SCD）
and liver X receptor α（LXR α）mRNA expression levels of both FABP4（I/I）and（V/V）
overexpressing BIP cells. SCD and LXR α were indetified as responsible genes associated withfatty acid composition. However, there were no difference between FABP4（I/I）and FABP4（V/V）overexpressing BIP cells. These results indicate that the difference of fatty acidcomposition may result from the difference of trafficking among FABP4 polymorphisms．

１．目の食味性に影響し，脂肪の色，光沢，脂肪酸組成

的などは枝肉評価に重要な役割を持つため，肉用牛

食肉の品質に対する消費者のニーズは多様であを改良する上で重要な因子として注目されていり，消費者を満足させるためにも肉質を自在に制る。中でも，「風味」に関係するものとして脂肪御できる技術が求められている。体脂肪の質は肉酸の質が影響しているといわれており，脂肪が融© The Ito Foundation

牛肉の風味に関与する遺伝子の機能解析

91

ける温度が下がるため不飽和脂肪酸の割合が多く

2.1

なると口の中で脂肪の風味が広がりやすくなるこ

BIPは10％FBS含有DMEMで培養する限り，脂とにつながる１）。また，不飽和脂肪酸は牛肉の熟肪細胞には分化しない。理想密度0.85×10４cells/

成期間中に芳香物質となり，「風味」に対する指cm２でBIPを培養した。コンフルエントになった

標となり，さらに，飽和脂肪酸の過剰摂取は血中細胞は分化培地（培養培地に50ng/mlインスリ

コレステロールの増加をまねくことから，不飽和ン，５mMオクタン酸，10mM酢酸，0.25mMデ

脂肪酸含有量が多いことは健康にも良いとされてキサメタゾンを無菌的に添加）に置換し，分化誘いる。肉質を向上させる技術として筋肉内脂肪中導刺激を行った。

BIPの培養・分化の不飽和脂肪酸含量を上昇させる技術が有効であ2.2

ると考えられるが，反芻動物である牛では，ルーFABP4 I/IおよびFABP4 V/VのcDNA全長を

メン内微生物により飼料中の不飽和脂肪酸は飽和

pEGFPおよびpRFPベクター（Clontech社）に導２）化されるため餌による制御が非常に困難である 。

入し，FABP４各遺伝子型の発現ベクター（GFP-

近年，分子遺伝学分野の進展と共に，FABP４

FABP4 I/I,GFP-FABP4 V/V,RFP-FABP4 I/

をはじめLXRα，SCD，SREBP―１など複数の

FABP４発現ベクターの作成

I,RFP-FABP4 V/V）を作成した。

脂肪代謝関連遺伝子の多型がウシ筋肉内脂肪中の

2.3

形質転換

不飽和脂肪酸含量の違いを生み出すことが，大規BIPへのベクター導入にはリポフェクション法。例を用いた。手法はLipofectamine 2000（invitrogen

えばFABP４にはI74Vの多型が存在し，FABP4I/

社）のプロトコルに準拠した。BIPのトランス

I型の肉はFABP4V/V型のものに比べ，不飽和脂

フェクションには８割コンフルエントの細胞を使

肪酸含量が高いことが知られている 。しかし，用し，分化誘導する細胞はトランスフェクション

これらの遺伝子多型がどの様に不飽和脂肪酸含量

した翌日，コンフルエントに達したことを確認の違いを生み出すのか，その全貌は未だ不明であし，分化培地に置換した。なお一回のトランスる。この脂肪代謝メカニズムの解明は，牛肉のさ

フェクションに用いたプラスミド量は1.0μg/

らなるおいしさ向上への重要な基礎的知見となる

dishとした。

模なウシ個体群調査から明らかとなった

３～５）

３）

こ と が 期 待 さ れ る 。よ っ て 本 研 究 で は ，ウ シ

2.4

FABP４多型に着目し，如何にして不飽和脂肪酸

分化４日目のFABP４各遺伝子型の発現細胞を含量の違いが生まれるのか，そのメカニズムを明用意し，ここから有機化学的処理を施してメチルらかにすることを目的とした。

化した脂肪酸を抽出し，ガスクロマトグラフに添

２．方

脂肪酸組成の解析加した。得られたデータは飽和脂肪酸量に対する法

不飽和脂肪酸割合で算出した。

本研究では黒毛和種牛（12カ月齢，去勢牛）の

2.5

蛍光観察

胸最長筋部位より樹立した脂肪細胞株である

分化２日目および４日目のFABP４各遺伝子型

bovine intramuscular preadipocyte （BIP） を 用の発現細胞を４％PFAで固定した。脂肪量に比いた 。この細胞にGFPまたはRFPを付加した

例して脂肪滴を緑色蛍光に染める性質を持つ

FABP4 I/I及びFABP4 V/V発現ベクターを導入

BODIPY

し，FABP４各発現細胞間の違いを検討した。

DAPIを処理した後，共焦点レーザー走査型顕微

６）© The Ito Foundation

493/503 お よ び 核 染 色 を 目 的 と し て92

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table１No.

Genes

size (bp）

Forward

Reverse

１

SCD

２

LXRα

100

tcctgttgttgtgcttcatcc

ggcataacggaataaggtggc

170

gaccgactgatgttcccaag

acagaagacacggaggagga

３

GAPDH

204

aatggaaaggccatcaccatc

gtggttcacgcccatcaca

鏡で画像を取得した。
2.6

胞に対し，有機化学的処理を加え脂肪酸を遊離

トータルRNA抽出とリアルタイムPCRし，ガスクロマトグラフィーで解析したところ，

トータルRNA抽出にはTRIzolを使用した。１飽和脂肪酸量に対する不飽和脂肪酸割合の実測値

dishに対しTRIzol 1mlを使用した。BIPの分化過は FABP4 I/I 発 現 細 胞 で は 3.4 ± 0.027 と な り ，

程０，
２，４，６，８日目とFABP４各発現細胞の分FABP4 V/V発現細胞の3.25±0.08に比べ，有意に

化２日目及び４日目からトータルRNAを抽出し，高いことが明らかとなった。

使 用 時 ま で － 80 ℃ で 冷 凍 保 存 し た 。TaKaRa

過去に234頭の黒毛和種における脂肪酸組成とPrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser

FABP４各遺伝子型との相関性を解析した研究が（Perfect Real Time）の手順に従い，cDNAを作行われている。その結果からFABP4 I/I型の個体

成 し た 。 PCR 反 応 試 薬 に は TaKaRa SYBRはFABP4 V/V型のものに比べ，脂肪組織中に一Premix ExTaq（Perfect Real Time）を用い，リ価の不飽和脂肪酸であるパルミトオレイン酸の含アルタイムPCRを行った。なお本研究で用いたプ

有量が有意に高いことが報告されている３）。今回

ライマーの塩基配列はTable１に記載した。

得られた結果はin vivoの結果に非常に近く，本研

2.7

統計学的解析

究に用いたFABP４各遺伝子型の発現細胞は，

ガスクロマトグラフィーの結果とリアルタイム

FABP４の多型が不飽和脂肪酸含量に及ぼす影響

PCRの結果には，スチューデントのＴ検定を用いをin vitroで解析するのに適したモデルであるこて有意差を求めた（ｎ＝３，ｐ＜0.05）。またリとが証明された。しかしながらFABP４の多型がアルタイムPCR (BIP分化過程における不飽和脂

オレイン酸やリノール酸等を含めた全不飽和脂肪

肪酸合成関連遺伝子の発現挙動）の結果は分化０

酸の含有量に有意差を生み出すという報告はな

日目に対する有意差（ｎ＝３，ｐ＜0.05）を求めく，in vivoとin vitroでは若干の違いがあるのかた。

もしれないと考えられる。
3.2

３．結果と考察FABP４各遺伝子型の細胞内局在の観察

FABP４は細胞内に取り込まれた脂肪酸を核や

3 . 1 FABP4 I/I及びV/V発現細胞の不飽和脂

脂肪滴に運搬する役割を担うと考えられる輸送タ
ンパク質である。本実験ではFABP４の遺伝子型

肪酸割合の比較
はじめにFABP4 I/I及びFABP4 V/Vを分化前の違いによって，核と脂肪滴への移行に変化が生のBIP細胞に導入して，FABP４各遺伝子型を発じるかを調べた。BIPにGFP及びRFPを付加した

現する過剰発現細胞をそれぞれ作成した。これら

FABP４に分化誘導刺激を加え，FABP４各発現細胞の分FABP４の各遺伝子型をBIPに過剰発現させた。

化４日目における不飽和脂肪酸割合を比較する実

その後，分化誘導刺激を行い，分化過程における験をおこなった。分化４日目のFABP４各発現細

各遺伝子型の細胞内局在を観察した。すなわち，© The Ito Foundation

各遺伝子型の発現ベクターを導入し，

93

牛肉の風味に関与する遺伝子の機能解析
GFP-FABP4I/I

DAPI

merge

GFP-FABP4V/V

DAPI

merge

Fig.1 Subcelluar localization of FABP4 in differentiating BIP cells 2 days after stimulation．
BIP cells were transfected with GFP-FABP4 I/I or GFP-FABP4 V/V. These cells were treated for 2 days withadipogenic facors and, after fixation with ４
in nucleus, FABP4 V/V was（arrow）．

％ PFA, stained with DAPI. Although FABP4 I/I was not localized

GFP お よ び RFP の 局 在 を 検 討 す る こ と に よ り

ドが存在する場合にのみ核内へと移行し，リガン

FABP４の遺伝子型の細胞内局在を知ることがでドが存在しない場合では，核内への移行が見られきる。その結果，FABP４は分化過程に関わらず，ないという報告がある７）。ウシにおいても何らか

両遺伝子型とも細胞質中に多く局在するが，一部の因子がFABP４の局在に影響を及ぼしているのが核や脂肪滴にも移行しており，その移行度合い

ではないかと思われる。

には遺伝子型の違いが関連していることが明らか

FABP４の脂肪滴への移行は，分化４日目におとなった。核への移行は，分化刺激前では両遺伝

いてFABP4 I/I型はFABP4 V/V型に比べ脂肪滴

子型ともほとんど見られないが，分化刺激後２日への移行度合いが高いことが分かった（Fig.２）。

目において核への移行が確認され，FABP4 V/V

FABP４は細胞内において脂肪酸を細胞内の各型はFABP4 I/I型に比べ移行度合いが高いことが所に運搬する輸送タンパク質である。現在までに明らかとなった（Fig.１）。

FABP４が核へ脂肪酸を運搬することが解明され

FABP４の核への移行に関し，過去にFABPsているが，脂肪滴へ脂肪酸を運搬するという知見

がPPARsのリガンドに及ぼす転写活性制御機構

は今のところ無い。しかし，FABPファミリーのを調べた研究において，COS-１細胞にトランス

働きや代謝疾患との関わりについて述べた論文でフェクションされたFABP４は，PPARrのリガン

は，FABPファミリーの働きとして，脂肪滴への© The Ito Foundation

94

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

GFP-FABP4I/I

BODIPY493/503

merge

GFP-FABP4V/V

BODIPY493/503

merge

Fig.2 Subcelluar localization of FABP4 in differentiating BIP cells 4 days after stimulation．
BIP cells were transfected with GFP-FABP4 I/I or GFP-FABP4 V/V. These cells were treated for 2 days withadipogenic facors and, after fixation with ４ ％ PFA, stained with BODIPY 493/503. Although FABP4 V/V was
not localized in lipid troplet, FABP4 I/I was（arrow）．

脂肪酸輸送に関わっている可能性が述べられてい発現挙動を解析した。その結果，LXRα，SCDる８）。FABP４も脂肪細胞において，脂肪酸を脂共に，分化２日目以降で発現量の急激な上昇が認肪滴へ運搬し，蓄積に関与しているかもしれなめられた。分化前の発現量を１とした時，LXR

い。ここから，分化４日目におけるFABP４各遺αは分化２日目で発現量（1.7±0.02）がピークに伝子型の脂肪滴移行度合いの違いが，脂肪滴へ運達し，その後４日目：1.6±0.2，６日目：1.5±0.1，

搬される不飽和脂肪酸量に差を生みだし，結果，

８日目：1.6±0.2で推移した。SCDでも分化２日

不飽和脂肪酸含量に変化が生まれた可能性が考え目で発現量（8.7±0.1）がピークとなり，その後られる。

は４日目：3.3±0.4，６日目：2.4±0.3，８日目：

3.3

3.0±0.6で推移した。そこで両遺伝子の発現量増

FABP４各発現細胞における不飽和脂肪
酸合成関連遺伝子の発現量比較

加が著しかった分化２日目および４日目に着目

FABP４の遺伝子型の違いが，不飽和脂肪酸合

し，FABP４各発現細胞における両遺伝子の発現

成関連遺伝子（LXRα，SCD）の転写に与える量を比較した。しかし分化２，４日目とも，各発影響を検討するため，各発現細胞における遺伝子

現細胞におけるLXRαとSCDの発現量に，どち発現量を比較した。はじめに両発現細胞の比較時

らも違いは認められなかった。

期検討のため，BIP分化過程における各遺伝子の本研究では分化２日目においてFABP４遺伝子© The Ito Foundation

牛肉の風味に関与する遺伝子の機能解析

95

型の違いにより核移行度合いに変化が生じた。まけるFABP４各遺伝子型の細胞内局在を観察した

たFABP４は長鎖脂肪酸と高い親和性を持って結結果，FABP4 V/V型はI/I型に比べ，核への移行

合し，脂肪滴や核内へ輸送に関与する輸送タンパ

度 合 い が 高 い こ と が 明 ら か と な っ た 。ま たクであり，核内へ運ばれた長鎖脂肪酸は転写因子

FABP4 I/I型はV/V型に比べ，脂肪滴への移行度

を介して何らかの遺伝子の転写を制御していると合いが高かった。核移行度合いに差が見られるこ考えられている 。このためFABP４遺伝子型のとから，FABP４各発現細胞間で不飽和脂肪酸合違いによる核移行度合いの差が核への脂肪酸運搬

成関連遺伝子（LXRα，SCD）の発現量に違い量の差を生み，その結果，転写因子の活性に差ががあるのか比較検討を行ったが，両細胞間に差は生じることでLXRαおよびSCDの発現量を制御認められなかった。以上から，FABP４多型は不し，不飽和脂肪酸含量の違いを生み出すと予想し飽和脂肪酸合成経路には影響を与えず，多型によたが，こうした可能性を導くことはできなかっる脂肪滴移行度合いの違いが，不飽和脂肪酸含量

た。もちろんFABP４多型がLXRαとSCD以外のの違いを生みだすと考えられた。今後，FABP４

不飽和脂肪酸合成関連遺伝子の発現に影響を与え

各遺伝子型の黒毛和種牛由来の初代脂肪細胞で検ている可能性は否定できない。しかし現時点では討する必要があると考える。

７）

FABP４多型が不飽和脂肪酸含量の違いを生み出すメカニズムには不飽和脂肪酸合成関連遺伝子は関与しないと考えられる。
４．要

約

霜降り肉のおいしさを決定する要因の一つに不飽和脂肪酸含量が関係している。ウシFABP４の持つI74V多型は脂肪酸組成に関連し，FABP4 I/I型の個体はFABP4 V/V型のものに比べ，不飽和
脂肪酸含量が高いことが明らかとなっている。本
研究はFABP４多型が生み出す不飽和脂肪酸含量の違いを分子レベルで解明することを目的とした 。本 実 験 で は ウ シ 筋 肉 内 前 駆 脂 肪 細 胞 株 に
FABP４各遺伝子型を導入した細胞モデルを用いた。本細胞モデルを用いて不飽和脂肪酸割合を調べた結果，FABP4 I/I発現細胞はFABP4 V/V発
現細胞に比べ有意に不飽和脂肪酸割合が高く，本細胞モデルの有効性が確認された。分化過程にお文
献１） Melton SL, Amiri M, Davis GW, Backus WR：
Journal of Animal Science，55，77～87，1982．
２）
 Zembayashi M, Nishimura K, Lunt DK, Smith
SB.：Journal of Animal Science，73，3325～3332，
1995．
３）
 Hoashi S, Hinenoya T, Tanaka A, Ohsaki H,
Sasazaki S,Taniguchi M, Oyama K, Mukai F,
Mannen H.：BMC genetics，84，1471～2156，2008．
４）
 Taniguchi M, Utsugi T, Oyama K, Mannen H,
Kobayashi M, Tanabe Y, Ogino A, Tsuji S.：
Mammalian Genome，14，142～148，2004．
５）
 Hoashi S, Ashida N, Ohsaki H, Utsugi T, Sasazaki
S, Taniguchi M, Oyama K, Mukai F, Mannen H.：
Mammalian Genome，39，62～70，2007．
６）
 Aso H, Abe H, Nakajima I, Ozutsumi K,
Yamaguchi T, Takamori Y, Kodama A, Hoshino FB,
Takano S.：Biochemical and Biophysical ResearchCommunication，213，369～375，1995．
７）
 Tan NS, Shaw NS, Vinckenbosch N, Liu P,
Yasmin R, Desvergne R, Walter W, Noy N.：
Molecular and Cellular Biology，22（14），5114～
5127，2002．
８）
 Furuhashi M, Hotamisligil GS.：Nature Reviews
Drug Discovery，７（６），489～503，2008．

© The Ito Foundation

96

コレシストキニンＡ受容体遺伝子を指標とした
効率的な地鶏生産に関する研究
Study on the effective chicken production by selection for Cholecystokinin
type A receptor gene

力

丸

宗

弘・高

橋

大

希・大 久 保武＊

（秋田県畜産試験場，＊茨城大学農学部）

Kazuhiro Rikimaru, Daiki Takahashi, Takeshi Ohkubo＊（Akita Prefectural Livestock Experiment Station, ＊College of Agriculture, Ibaraki University）

To examine the effects of cholecystokinin type A receptor gene（CCKAR）polymorphism（A/C）on the growth traits of Hinai-jidori chickens, the feeding trial and the analysis of themRNA expression of CCKAR gene on expression sites were conducted. Twenty individuals ofeach three genotype（A/A, A/C and C/C）were raised until 23 weeks of age. The data showedthat body weight at 23 weeks of age and average daily gain between 4 and 23 weeks of age of
A/A individuals were significantly superior to those of C/C individuals. As for feed conversion
ratio, A/A individuals were superior to A/C and C/C individuals though there was no
significant difference in the feed intake among the genotypes. Expression level of CCKAR
mRNA in the pancreas, duodenum and liver tended to be high in the A/A individuals, and thismight lead to improve digestibility of nutrients and growth. A/A individuals also tended to beheavier than C/C individuals in the field tests. These results suggest that it is possible toproducechickens which are well grown efficientlyby selection for CCKAR gene．

する遺伝子を特定するため，比内鶏のＦ２交雑家

的

１．目

系を用いて発育形質に関する量的形質遺伝子座

近年，景気の低迷から国内における地鶏の生産（QTL）解析を行い，ニワトリの食欲と関連する羽数は減少している。また，配合飼料価格の高止と予測される候補遺伝子として，満腹感を司る神

まりにより，収益が減少し，厳しい生産活動を余

経情報伝達を担うペプチドホルモンとして知られ儀なくされている。地鶏はブロイラーと比較してているコレシストキニンＡ受容体遺伝子

発育が遅いため，飼育期間が80日以上と長い日数（CCKAR）と発育形質との関連性を明らかにしを要する。地鶏の生産コストの大部分は飼料費がた１）。また，Ｆ２交雑家系におけるCCKAR遺伝子占めていることから，生産現場では，より効率的の特定の一塩基多型（SNP）（A/C）と発育形質な生産による飼育コストの削減が喫緊の課題ととの関連性について解析した結果，Ａアリルは体なっている。

重や日増体重を高める効果を持つことを明らかに

我々は，これまで，ニワトリの発育形質に影響した２）。さらに，異なるCCKAR遺伝子のSNP型© The Ito Foundation

97

コレシストキニンＡ受容体遺伝子を指標とした効率的な地鶏生産に関する研究
Table 1 PCR primers for amplification of g.420 C
receptor gene＞

A polymorphism in the cholecystokinin type A
PCR amplification
genotype

Primer set

Primers（５’→３’）

Product（bp）

Target positionＡ

Ｃ

CCKAR-Hinai１

GAATGTGTGTCTGCGTGCTT

225

g.420 C＞A

＋

―

225

g.420 C＞A―＋GGATCCACAGGTTAGCTGCgAt
CCKAR-Hinai２

GAATGTGTGTCTGCGTGCTTGGATCCACAGGTTAGCTGCgAg

The underlined bases shown in lower case represent induced mismatches. The bases shown in lower case only atthe ３’end represent the target single nucleotide polymorphism（SNPs）． The genotypes that could and could not
be amplified by PCR are shown as“＋”and “－”, respectively．

を持つ比内鶏を材料として，発育・飼料摂取量・比内地鶏各個体におけるCCKAR遺伝子のSNP

飼料要求率の比較・解析を行った結果，AA型を

２）
型判定はRikimaru et al．
の方法で行った。簡単有する個体は他の遺伝子型（AC型，CC型）個体に論述すれば，１種類のフォワードプライマー

よりも発育が優れ，飼料要求率が改善されること（５’-GAATGTGTGTCTGCGTGCTT-３’）と２種を確認した。これらの成果から，CCKAR遺伝子

類のリバースプライマー（Ａアリルプライマー：を指標とした効率的な地鶏生産の可能性が見えて５’-GGATCCACAGGTTAGCTGCgAt-３’，およきた。しかしながら，CCKAR遺伝子の特定のび Ｃ ア リ ル プ ラ イ マ ー ： ５ ’

SNP型が，なぜ，発育に良い結果を示すのか，そ-GGATCCACAGGTTAGCTGCgAg- ３ ’）を 組 みの分子機構は明らかとなっていない。

合わせて，ＡおよびＣアリルを検出するPCR反応

そこで本研究では，CCKAR遺伝子情報を用い液を調製した（Table１）。

た効率的な地鶏生産の実用化を目指すため，コ

PCR反応液は，フォワードプライマー２pM，

マーシャル鶏として流通する「比内地鶏」を用い４μｌの２×PCRミックス（EmeraldAmp：タカて，異なるCCKAR遺伝子のSNP型を持つ比内地

ラバイオ，大津，日本），DNA溶液１μｌ，滅菌

鶏を作出し，CCKAR遺伝子のSNP型が比内地鶏

蒸留水を混合し，最終容量９μｌに調整した。

の発育等に及ぼす影響を明らかにするともに，

PCRサイクルは，熱変性（98℃，10秒間），アニー

CCKAR遺伝子のmRNA発現量の比較を行い，リング（65℃，30秒間），伸長反応（72℃，30秒間）

CCKAR遺伝子のSNP型が発育形質に及ぼす分子のサイクルを30回繰り返した。PCR反応後，Ａア

機構について検討を行った。

リルおよびＣアリルを検出するPCR反応液各２μ

２．方
2.1

ｌを１×TAEバッファーを使用した2.0％アガ法

ロースゲルを用いて電気泳動を行い，臭化エチジ

供試鶏および試験設計

ウム染色して，PCR増副産物を検出した。各個体

秋田県畜産試験場で同日にふ化した比内地鶏の雌 を 発 育 試 験 に 用 い た 。下 記 に 示 し た 方 法 での遺伝子型判定は，飼育試験を開始する４週齢までに行った。

CCKAR遺伝子のSNP型を判定後，４週齢にSNP

2.3型（A/A，A/C，C/C）ごとに20羽ずつ分けた。

各SNP型の比内地鶏を４週齢から出荷時期であ2.2

遺伝子型判定飼養管理

る26週齢まで運動場が付随したパイプハウスで飼© The Ito Foundation

98

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 2 Comparison of the g.420 C ＞ A genotype of cholecystokinin type A receptor gene between the phenotypic values

for growth traits of the Hinai-jidori chickens１
Genotype
Traits

A/A

A/C

C/C

ｎ＝20

ｎ＝20

ｎ＝20

BW-4 week（g）

335.6±25.0335.6±24.8355.6±21.0

BW-10 week（g）

1,108.6±127.5

1,114.1±121.8

1,177.4±156.3

BW-14 week（g）

1,730.5±127.9

1,718.6±140.2

1,762.5±175.8

BW-18 week（g）

2,320.1±130.3

2,197.9±179.0

2,265.1±176.1

BW-23 week（g）

2,873.2±214.8ａ2,743.9±199.0ab

2,703.4±174.1ｂ

ADG 4-10 week（g/day）

18.4±3.2

18.5±2.920.0±3.8

ADG 10-14 week（g/day）

22.2±3.0

21.6±2.8

20.9±2.6

ADG 14-18 week（g/day）

21.1±3.4ａ

17.1±3.7ｂ

18.0±3.2ｂ

ADG 18-23 week（g/day）

15.8±4.4ａ

15.8±4.1ｂ

12.8±2.5ｂ

ADG 4-23 week（g/day）

19.1±1.6ａ

18.1±1.5ab

17.8±1.3ｂ

BW-4 week, BW-10 week, BW-14 week, BW-18 week, and BW-23 week: body weight measured at 4 weeks, 10 weeks, 14 weeks, 18
weeks and 23 weeks of age. ADG 4-10 week, ADG 10-14 week, ADG 14-18 week, ADG 18-23 week, and ADG 4-23 week: average
daily gain between 4 and 10 weeks, between 10 and 14 weeks, between 14 and 18 weeks, between 18-23 week, and 4 and 23 weeks
of age．
a,bMeans within a row with no common superscript differ statistically（P＜0.05)．1Values are mean ± SD．

Table 3 Comparison of the g.420 C ＞ A genotype of cholecystokinin type A receptor gene between the feed intake andfeed conversion of the Hinai-jidori chickens
TraitsGenotype
A/A

A/C

C/C

73.1

72.8

72.2

Feed intake（g/day）
４～10weeks of age
10～14weeks of age

102.4

102.9

97.4

14～18weeks of age

100.1

87.8

92.9

18～23weeks of age

135.3

135.4

127.4

４～23weeks of age

105.0

102.4

100.1

４～10weeks of age

3.97

3.93

3.60

10～14weeks of age

4.61

4.77

4.66

14～18weeks of age

4.76

5.13

5.17

18～23weeks of age

8.56

8.68

10.18

４～23weeks of age

5.50

5.65

5.62

Feed conversion

育した。飼料は以下の４つの市販飼料を給与し雛 用 飼 料（CP15 ％；ME2,800kcal/kg）；４）23

た ： １）４ 週 齢 ま で 幼 雛 用 飼 料（CP22 ％ ；週齢まで仕上げ用飼料（CP16％；ME2,900 kcal/

ME3,000kcal/kg）；２）10 週 齢 ま で 中 雛 用 飼 料kg）。飼育期間中，水と飼料は自由摂取とし，照（CP18％；ME2,850kcal/kg）；３）14週齢まで大明時間は自然日長とした。

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99

コレシストキニンＡ受容体遺伝子を指標とした効率的な地鶏生産に関する研究

測定項目

ｇ の 各 総 RNA を Oligo-dT17 プ ラ イ マ ー と（１） 発育成績

ReverTra Ace（東洋紡，大阪，日本）を用いて４週齢以降，10，14，18，23週齢に体重，飼料

42℃で45分間の逆転写反応に供した。CCKAR遺摂取量の測定を行った。４～10，10～14，14～18，

伝子のmRNA発現は，得られた逆転写産物を鋳

18～23，４～23週齢における平均日増体重は各週

型 と し ， 特 異 的 プ ラ イ マ ー， ５ ’

齢における体重，飼料要求率（４～10，10～14，-ACAACAACAGCACAGCCAAC-３’（フォワー

14～18，18～23，４～23週齢）は飼料摂取量と平ド）お よ び ５ ’-TATGAGCAGCAGGAAGGTGT-

均日増体重から算出した。

３’，を用いたリアルタイムPCRにより解析した。

（２） CCKAR遺伝子のmRNA発現量

PCRは95℃５秒，60℃30秒を１サイクルとする反CCKAR遺伝子のmRNA発現量の測定には，飼応を40サイクルとした。CCKAR遺伝子のmRNA

育試験とは別にふ化した比内地鶏の雌を用いた。

発現はβ-アクチンmRNA発現に対する相対値で４および10週齢時にSNP型ごとに10羽ずつと殺表した。

し，肝臓，膵臓，十二指腸を採材した。得られた（３） 現地調査

組織より，Trizol（インビトロジェン，カリフォ

県内で比内地鶏を生産している農家を５戸選択

ルニア，アメリカ）を用いて総RNAの抽出を行っし，出荷時に採血および体重測定を行い，比内地

た後，さらにDNase I（プロメガ，東京，日本）

鶏の発育成績とCCKAR遺伝子のSNP型との関連処理を行い，逆転写用のRNAを調製した。１μ性について調査を行った。

2.4

B)
0.0018A)

0.00160.0014
Arbitrary units

Arbitrary units

0.045
0.04
0.035
0.03
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0

0.00120.001
0.00080.00060.00040.0002

Ａ/A

Ａ/C

0

Ｃ/C

Ａ/A

Ａ/C

Ｃ/C

C)
0.00004

A）: Pancreas

Arbitrary units

0.000035

B）: Duodenum

0.00003

C）: Liver

0.000025
0.000020.000015
0.00001
0.000005
0

Ａ/A

Ａ/C

Ｃ/C

Fig. 1 Effect of the g.420 C＞A genotype of Cholecystokinin type A receptor gene on CCKAR mRNA expression in thepancreas, duodenum and liver in the Hinai-jidori chickens at 4 weeks-of-age．

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100
2.5

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

統計処理

体重が有意に（P＜0.05）優れていた。その結果，統計解析については，測定形質ごとに分散分析

A/A型個体は４～23週齢における平均日増体重を行い，有意な項目についてはTukeyの多重検定

がC/C型個体より有意に（P＜0.05）優れていた。

によりSNP型間の比較を行い，P値が0.05未満の

この結果は，飼育期間の後半における増体がSNP時に有意とした。

型によって異なることを示唆している。A/A型
個体が他のSNP型個体より増体が優れていること

３．結果と考察は，我々が以前に比内鶏を用いた結果２）とも一致

3 . 1 CCKAR遺伝子のSNP型と比内地鶏の発していた。飼料摂取量を比較すると，期間全体の飼料摂取量にほとんど差は認められなかったが，育成績の比較CCKAR遺伝子のSNP型と比内地鶏の発育成績

18～23週齢においてC/C型個体はA/A型個体やの比較をTable２に示した。18週齢まで各SNP型

A/C型個体より飼料摂取量がやや少ない傾向を示

間で体重に有意な差は認められなかったが，23週した（Table３）。また，飼料要求率はA/A型個体

齢ではA/A型個体がC/C型個体より体重が有意にが一番優れていた（Table３）。これらの結果から，（P＜0.05）重かった。14週齢までの平均日増体重

CCKAR遺伝子のSNP型は比内鶏のみでなく，コに有意な差は認められなかったが，A/A型個体

マーシャル鶏である比内地鶏の発育にも影響を及は14～18週齢においてA/C型個体およびC/C型個

ぼすことが示唆された。しかしながら，比内鶏で体，18～23週齢においてC/C型個体より平均日増

は４～14週齢の平均日増体重においてSNP型間にB)

0.6

0.00030.5

0.000250.4

0.0002

Arbitrary units

Arbitrary units

A)

0.3
0.2

C)

0.00010.000050.1
00.00015

Ａ/A

Ａ/C

Ｃ/C

0.0045

Ａ/A

Ａ/C

Ｃ/C

A）: Pancreas

0.004B）: Duodenum

0.0035
Arbitrary units0C）: Liver

0.003
0.00250.002
0.00150.001
0.0005
0

Ａ/A

Ａ/C

Ｃ/C

Fig. 2 Effect of the g.420 C＞A genotype of Cholecystokinin type A receptor gene on CCKAR mRNA expression in thepancreas, duodenum and liver in the Hinai-jidori chickens at 10 weeks-of-age．

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101

コレシストキニンＡ受容体遺伝子を指標とした効率的な地鶏生産に関する研究(g)

A FarmB Farm

(g)

3000

3000

2800

2800

2600

2600

2400

2400

2200

2200

2000

2000
Ａ/A

(g)

Ａ/C
C Farm

3000

Ｃ/C

Ａ/A

Ｃ/C

D Farm

(g)

＊

Ａ/C

3000

2800

2800

2600

2600

2400

2400

2200

2200

2000

2000
Ａ/A

(g)

Ａ/C

Ｃ/C
＊,P< 0.05

Ａ/A

Ａ/C

Ｃ/C

E Farm

3000
2800
2600
2400
2200
2000
Ａ/A

Ａ/C

Ｃ/C

Fig. 3 Comparison of the g.420 C＞A genotype of Cholecystokinin type A receptor gene between the marketing bodyweight of the Hinai-jidori chickens at the field

差が認められたのに対し，比内地鶏では４～14週

響しないとされているが３），アヒルではアミラー

齢に差は認められず，14週齢以降に差が認められゼ分泌を刺激する４）。また，CCKは十二指腸の運た。このことから，CCKAR遺伝子のSNP型はニ動を活発化させる５）。したがって，遺伝子型によワトリの発育形質に影響を及ぼすが，ニワトリのるCCKAR遺伝子のmRNA発現量の違いは，消品種や系統によって発育形質に影響を及ぼす時期

化・吸収機構に影響を与え，成長改善に作用するが異なると考えられる。

可能性があると考えられる。しかしながら，10週

3 . 2 CCKAR遺伝子のSNP型と比内地鶏の主齢では，膵臓と肝臓のmRNA発現はA/A型がC/

要発現部位におけるmRNA発現量の比較

C型に比べて高くなったが，十二指腸では逆にC/

４週齢では，膵臓，十二指腸，肝臓のいずれのC型がA/A型に比べて高い値を示した（Fig２）。

組織においても，CCKAR遺伝子のmRNA発現量

これらのことから，CCKARmRNA発現は，組織

はA/A型がC/C型に比べて高い値を示した（Fig

および時期特異的に複雑な制御を受けている可能１）。ニワトリではCCKは膵外分泌にほとんど影性が示唆された。

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102

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

3 . 3 生産現場におけるCCKAR遺伝子のSNP

く，４～23週齢の平均日増体重も有意に優れてい型と比内地鶏の出荷体重の比較

た。飼料摂取量にほとんど差は認められなかった生産現場におけるCCKAR遺伝子のSNP型と比が，飼料要求率はA/A型個体が一番優れていた。

内地鶏の出荷体重の比較をFig３に示した。Ｃ農膵臓，十二指腸，肝臓のCCKARmRNA発現は，場においてA/C型がC/C型より有意に体重が重４週齢においてはA/A型で発現量が高い傾向をかった。また，Ａ農場を除いてA/A型はC/C型よ示し，消化・吸収に影響を与えて成長を改善する

り体重が重い傾向を示した。生産現場における可能性が示唆された。生産現場においてもA/A

CCKAR遺伝子のSNP型と出荷体重については，

型はC/C型より体重が重い傾向を示した。以上の畜産試験場の結果と同様にSNP型間に有意差は認結果から，CCKAR遺伝子を指標として，効率的められなかった。この違いは，飼育密度，規模，に発育が優れる地鶏を生産できることが示唆され環境等の影響によるものかもしれない。しかしな

た。

がら，生産現場においてもA/A型はC/C型より体重が重い傾向を示したことから，CCKAR遺伝子のSNP型は比内地鶏の発育形質の改良に有効であると思われる。
以上の結果から，CCKAR遺伝子を指標として種鶏を選抜することによって，発育が優れる地鶏を効率的に生産できることが示唆された。
４．要

約

コレシストキニンＡ受容体遺伝子（CCKAR）の一塩基多型（SNP）が比内地鶏の発育等に及ぼす影響を明らかにするため，異なるSNP型を持つ
比内地鶏を作出し，発育試験および主要発現部位におけるCCKAR遺伝子のmRNAの発現量の比較を行った。４週齢時にSNP型（A/A，A/C，C/C）
ごとに20羽ずつ分け，23週齢まで飼育した。A/
A型個体はC/C型個体より23週齢体重が有意に重文
献１）
 Rikimaru K, Komatsu M, Suzuki K, Uemoto Y,
Takeda H, Takahashi H：Association between
cholecystokinin type A receptor haplotypes andgrowth traits in Japanese Hinai-dori crossbred
chickens. Mol. Bio. Rep，39，4479～4484．2012．
２）
 Rikimaru K, Takeda H, Uemoto Y,Komatsu M,
Takahashi D, Suzuki K, Takahashi H：Effect of asingle-nucleotide polymorphism in thecholecystokinin type A receptor gene on growthtraits in the Hinai-dori chickens breed. J. Poult.
Sci，50，206～211．2013．
３）
 Furuse M：Release and endogenous actions of
the gastrin/cholecystokinin (CCK) family in thechicken. J. Exp. Zool．，283，448～454．1999．
４）
 Xiao R, Cui ZJ：Mutual dependence of VIP/
PACAP and CCK receptor signaling for aphysiological role in duck exocrine pancreatic
secretion. Am. J. Physiol.Regul.Integr. Comp.
Physiol., 286，Ｒ189～198．2004．
５）
 Martinez V, Jimenez M, Goñalons E Vergara P：
Mechanism of action of CCK in avian
gastroduodenal motility: evidence for nitric oxide
involvement. Am. J. Physiol．265，Ｇ842～Ｇ850．
1993．

© The Ito Foundation

103

天然記念物「黒柏鶏」の遺伝的特徴を活用した地鶏「長州黒かしわ」のDNA識別の可能性の検討
Possibility of DNA discrimination of a meat-type brand chicken“ChosyuKurokashiwa”created from the Kurokashiwa Chicken, a national natural
treasure of Japan

関

谷

正

男１・奥

村

友

美２・都

築

政

起３

（１山口県農林総合技術センター・２独立行政法人家畜改良センター・３広島大学大学院生物圏科学研究科）

Masao Sekiya１,Yumi Okumura２, and Masaoki Tsuzuki３（１Yamaguchi Prefectural Agriculture and Forestry General Technology Center, Livestock Technology Research Department，
２National Livestock Breeding Center，３Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University）

In the present study, we genotyped 54 microsatellite markersto examine the possibility for
DNA discrimination of a meat-type brand chicken“Chosyu-Kurokashiwa”created from the
Kuro-Kashiwa breed, a National Natural Treasure of Japan. Allele sizes were compared among
two native Japanese chicken breeds［Kuro-Kashiwa（KRK）and Japanese Game（JG）］，a
foreign breed [Rhode Island Red (RIR)], and two kinds of crossbreds［F1（KRK ♂ × RIR ♀ ）and JG ♂× F1（KRK ♂× RIR ♀）♀］using 272 blood samples. As a result, the Kuro-Kashiwa
breed was revealed to have private alleles at seven loci on the Z chromosome（ABR0608,
ABR1002, MCW0258, ABR1008, ABR0376, MCW0128, and ABR0289）．Therefore, DNA
discrimination of“Chosyu-Kurokashiwa”would be possible by establishing a parent stock thathas the private alleles of the Kuro-Kashiwa．

に位置付け，平成21年から生産・販売を開始して的１．目いる（商標登録5328087号，2009）。

山口県農林総合技術センターでは，天然記念物「長州黒かしわ」は山口県初のオリジナル地鶏「黒柏鶏（くろかしわ）」をもとにロードアイラン

として関係者の期待が大きく，平成22年度には県

ドレッド（RIR），軍鶏，ホワイトプリマスロッ

内の肉用鶏の生産団体，県養鶏協会及び県で構成

ク（WPR）を交配した四元交雑鶏を閉鎖群育種する「山口黒かしわ地どり振興協議会（現・黒かし，地鶏用雄系種鶏「やまぐち黒鶏（くろどり）」

しわ地どり振興協議会）」が設立されるとともに（在来種由来血液百分率50％）を作出した（関谷

平成25年５月には山口県初の統一ブランド「やまら，2009） 。

ぐちブランド」として認証されるなど，県を挙げ

１）

山口県の養鶏専門農協では，この「やまぐち黒ての地鶏振興体制を整備し，首都圏や県内に販路鶏」をRIRに交配したものをコマーシャル地鶏とを広げている。また，平成25年度には４万羽の生し，「長州黒かしわ」と命名して最高級ブランド産体制が整備され，今後については，当面は５万© The Ito Foundation

104

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

羽，将来は８万羽を目指して関係者が一丸となっアイランドレッド（86系統：雌28羽），軍鶏（833て取り組んでいる。

系：雄16羽），黒柏鶏の雄をRIRの雌に交配させ生産羽数の増加に伴い準備しておかなければな

作出した黒柏二元交雑鶏（雌30羽），ならびに軍らない項目の一つとして，比内地鶏等の有名ブラ

鶏（833系）の雄を黒柏二元交雑鶏の雌に交配さンド地鶏で行われている，地鶏肉のDNA識別方

せ作出した黒柏三元交雑鶏の第２世代（雄40羽，法の確立が挙げられる（Rikimal and Takahashi

雌128羽）を用いた。

，2007；特許第4721053号，発明の名称：「名古２）2 . 2 DNA抽出，PCR反応，マーカータイピン

屋コーチン識別用プライマーセット，検出キット
及び名古屋コーチンの識別方法」）。

グ
供試鶏の血液からフェノールクロロホルム法「黒柏鶏」には黒柏鶏特有のマイクロサテライ

４）（Sambrook and Russell ，2001）
により抽出しトマーカー（DNAマーカー）が存在することが20ng/μｌに調整したDNAをテンプレートに用明らかになっているが（Osman et al．2006） ，い ， Osman et al ．（2006） お よ び Rikimal and「長州黒かしわ」は「黒柏鶏」の他に３つの品種

Takahashi（2007）を参考にして，Table１に示しを交配した交雑鶏であるため，「長州黒かしわ」

た54マーカーをPCR法により増幅した。

３）のDNA識別にこのマーカーの応用が可能か確か

PCRに際してはフォワードおよびリバースプラ

める必要がある。また，「やまぐち黒鶏」は，まず，

イ マ ー を そ れ ぞ れ 6.25pmol ，dNTP を 0.2mM ，「黒柏鶏」の雄を「RIR」の雌に交配して「二元MgCl ２交雑鶏」を作出し，次に，「軍鶏」の雄を「二元polymerase （Bioline, Taunton, MA, USA） を交雑鶏」の雌に交配して「三元交雑鶏」を作出

0.375Ｕとし，合計15μｌで反応させた。PCR反応

し，最後に「三元交雑鶏」の雄を「WPR」の雌

条件は，熱変性を94℃で10分，その後95℃を30秒，に交配して作出した「四元交雑鶏」を改良固定化

アニーリングを55℃で30秒，伸張反応を72℃で30したものであることから，性染色体（Ｚ染色体）

秒を35サイクル繰り返し，最後に72℃で５分間保上に黒柏鶏特有のマーカーを有している可能性が持 し た 。PCR 後 ，自 動 DNA シ ー ク エ ン サ ーある。そのため，比内地鶏のDNA識別と同様に，（ABI3130, Applied Biosystems, Foster City, CA,

Ｚ染色体上に「黒柏鶏」と他の鶏との違いを見出USA）を用いて各マーカーのタイピングを行っすことができれば「長州黒かしわ」のDNA識別た。

へ応用できる可能性がある。
以上のことから，本研究では，「長州黒かしわ」を

２

mM， BIOTaqTM HS DNA

３．結果と考察のDNA識別を可能にするため，「長州黒かしわ」

黒柏鶏30羽において観察された，３つのDNA

における黒柏鶏特有のDNAマーカーの存在の有

マ ー カ ー（LEI0092, LEI0096, MCW0330）座無について確認することを目的とした。

位におけるアリルサイズをTable２に示した。

２．方
2.1

LEI0096およびLEI0092におけるアリルサイズ

法は，Osman et al．
（2006）と異なる結果であった。

供試鶏

MCW0300で検出されたアリルサイズは，274bp

本研究では，山口県農林総合技術センター畜産または286bpであり，Osman et al．（2006）の結技術部で保有している黒柏鶏（雄30羽），ロード

果と完全に一致していなかった。これは，今回供© The Ito Foundation

天然記念物「黒柏鶏」の遺伝的特徴を活用した地鶏「長州黒かしわ」のDNA識別の可能性の検討

105

Table 1  Microsatellite markers used in the current study
marker

chr

Locus
（Mb）

bp

Forward primer（５’→３’）

Reverse primer（３’→５’）

References

LEI0096

2

200

GATCAGATTGGTTCCCTGTG

TGGGTGAAGTTTCCTCGTAG

Osman et al al．
（2006）

LEI00926210

GATCTACATTTGTGCAGTGTCTCCTTGGTCTGACTCTCCATG

Osman et al al．
（2006）MCW0330

17280

TGGACCTCATCAGTCTGACAG

AATGTTCTCATAGAGTTCCTGC

Osman et al al．
（2006）

MCW0292Z

4.2

90-130GGAGGCTCTGGGTGTTCC

CAGCAGATGGGGCTGAGAGADL0022Z

4.5

140-170

GCATCAGAGGAAGAAGGAAAGGTCAAGGAAATCATAGAAA

ABR0608

Z

8.8

218

GCAGGAAGGTTCACAGAAAGTTGGCAATAGCTTCAAAACA

MCW0331Z

12.5

213-224CAGAGCAGCTGGAGATGTAAAGAGAGGGTAAGAAATCCTGCTG

ABR1001

Z

13.0

328

TTGAGATGTTGATGTGGAAAACGCAAGAAGGTGAGGAGAACAAGGA

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR1002

Z

13.1

347

TAGGAAAGATGCCCGATAAAACAAGGGTTGGGAATGTAGTGA

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR0633

Z

13.5

266

AGTATGTTATTGCCTGTGGC

TTTGGGAGAAGGAATGTTGT

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR0588

Z

18.3

130

ATACAATCCAGCATCTCACA

CCCATTATTCGTTATTCTTACTT

Rikimaru and Takahashi．
（2007）MCW0055

Z

18.3

182-196

TTTGTAGTTACCTGGTACTGAGTTTGCATTGTCTACAGCTCCTTG

ABR0080

Z

20.6

147

TTGCCCTGGGGCAGAACACGCAACAGCTTTCGACGAGACGG

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR0112

Z

21.8

230

TACTTTTATCCTGCTTCTCA

GCTTGTAGGGTAATCCAATG

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

MCW0258

Z

21.8

139-162

TTCTTAGTCCTTGCCAGAGGCCTGCAGGAGGATGTGTCCTAG

ABR1003

Z

23.0

160

AGAGGTAGGCGATGGACCAAA

ATGCACCAAGTGACCAGGGAC

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR0620

Z

23.7

265

GCCAGCTTCAGGGAACAAAATGAAACGCAAAATCAACGGA

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ADL0273Z

25.1

135-146

GCCATACATGACAATAGAGGTGGTAGATGCTGAGAGGTGTABR1005

Z

28.4

218

GTAACACTTCACATTCAAGAGGCATAACCAGCATTTCCTTCAGCAA

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR1006

Z

28.6

188

GCATCGCATTTAGGGTAAGTAT

AGTTTCACTCACGGGAGTTTTA

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

LEI0171Z

28.7

350-376GAGTGTAGACAGTAGTGTATC

CTCAGGGCACCATTTTCACTG

ABR1007

Z

28.9

230

GTCCCTCCCCTTTGCCACAACTGCTGAAGACAGACTGCTGATAG

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR1008

Z

29.4

267

GGGCTCTTTAGGACAACTCAC

ATCAATATGAAGGCAGTTACAAGA

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR0082

Z

29.5

221

TCCTGAATTTCCAAATAAGTTTTATAATCACAGCCCAAATCAAAG

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR0089

Z

29.5

221

ATAATCACAGCCCAAATCAA

CCTGAATTTCCAAATAAGTTTTA

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR1004

Z

30.2

216

TGTACTCAACTAAGACGGGATTTGTTATGTGATGTGAAACCTGA

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR1014

Z

31.4

139

GGACAGCCAGTTGCTAGCCTTG

TGCCTGCTTGACCACAAACCAC

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR0311

Z

31.6

214

CCTAAAGCAGGAAGGCAGAATTGGAGCATTTGTGGAGAAG

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR1013

Z

31.4

138

GAACAAGGTAGAACTCGTCGGTTGCTCGGGGAAGTATCACAAC

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR0505

Z

32.1

226

TTATTTATGGCACTCCACTG

TATTCCTTGTTTTGCTTTGA

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR1012

Z

32.1

267

CACCACGATACTTTCCCTTTAAACAATCTTTTCCCCCCATAC

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ADL0201Z

32.3

130-150GCTGAGGATTCAGATAAGAC

AATGGCTGACGTTTCACAGC

ABR1011

Z

32.4

220

TATCACCTGTGACTGAGGCATT

CTTGGAGAGATTTTTTGGAAGC

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR1010

Z

32.7

268

CTGCTTCAGCCAGTCTCAGTAT

CTTTTCACAAGTTTTCCCTTTT

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR1009

Z

33.6

202

GCATTTGATTAAGTGTGCTCCAGGTAAGTGTCATGGTTGG

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR0598

Z

34.5

303

CAGGTCCTTTGCTACTTACAGTACTCCGCAGACTTTCACT

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

MCW0241Z

34.5

268-281

AACCAGTTTGTTAACATCAGC

ATTGGAGTTGGTACCATACTCLEI0229Z

35.6

200-303

CAGTTTCCAAAGGCAAGTCAGG

CGGTTAGGTTTGAAGTGCATGG

MCW0154Z

35.9

168-193GATCTGTTTTATCACACACAC

CCATTTCCTTTGTTATCAGGC

ABR1015

Z

36.6

319

CATCGCACCAACATCCACCTTTGCATAAAGCCTGCTATGACC

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR1016

Z

36.7

134

CCTTGAACAGAAAGCAGGTGG

TCGTGGAAAACATGAGATGGC

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ADL0250

Z

37.0

168

AAGCCGTACTGAGAAGCACTCAGGCACAGTAGAAAAGAAC

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

MCW0246Z

37.0

230-238

TCATAAGGCAGAGAATTCATCTTTCCATTCAGACAACAAGGC

ABR0254

Z

38.3

323

TTTGGTAACTGAGTAAATAGC

ACTTTGTAGGAAATGGACTT

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR0621

Z

40.6

372

ACTTTCCCTCTTGCTGGACTGTTGGCATGACTTTGTTGCT

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

LEI0254Z

42.5

70-110AGACCACTGGCTCCAACTCGTCTGGAACTCATCCTTCATC

ABR0376

Z

43.2

166

AGGGTATGGATGTCTTACTACACAAAGTTCCTGAATAATA

MCW0294Z

43.9

304-320ACTGAACAGAAACAGTCTTCC

CTTCTCTAGATGTCCACTACC

ABR0241

Z

48.4

102

ATACACTCGGCAAGCCAGAC

CCCGGATCAGCTCATAAAGAC

LEI0111Z

49.3

95-135CCCACAAAAGAGACACCGTGG

CCTGTTTGCCGTACACTTGGC

LEI0121

Z

50.7

280

TTGACGTCCTGGATAGATTAC

ATTATCCAGAACTAACATCAAC

LEI0144Z

51.1

255-275GATCAGTTATCAATGGCTGGC

CACTGAGGTCTTCTAGATGAG

ABR0524

Z

58.9

276

TCCTACCGAAGGCAACAGAAGGCCCACTTAGCAGATGGAGAAT

MCW0128Z

58.9

166-178

CACATCCTTCTTAGCAGTCACCTGATGAAAAATTGTCCAAGTAG

ABR0657

Z

64.6

197

CAGCAACAAACAAATACAAAAGTAAGGTATCATCAGAGGG

ABR0289

Z

64.6

274

TTCTCAAACTGTTAAGGTCCAC

AACTCCCACTCCACCACAAC

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

ABR0651

Z

78.6

193

TGGGAAAAGTCAGTAGAACATGCATTATTACATCCCATCT

Rikimaru and Takahashi．
（2007）© The Ito Foundation

Rikimaru and Takahashi．
（2007）

Rikimaru and Takahashi．
（2007）
Rikimaru and Takahashi．
（2007）
Rikimaru and Takahashi．
（2007）
Rikimaru and Takahashi．
（2007）
Rikimaru and Takahashi．
（2007）

106

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 2  Allele sizes（bp）at three autosomal microsatellite
loci in the Kurokashiwa chicken
Markerallele size（bp）（Osman et al al．2006）

LEI0096

223 or 240

244

MCW0330274 or 286

286

LEI0092

245 or 270 or 287

263

Table 3 Allele frequencies at each locus on the Z chromosome in each chicken population
Name and size ofalleles（bp）

Kuro-Kashiwa

RIR

JG

KRK♂×RIR♀

JG♂×（KRK♂×
RIR♀）♀

ABR0608
203

0

0

0.500

0

0.333

213
220
222
ABR1002
256
348
353
356
358
359
MCW0258
148
150
154
158
ABR1008
279
281
285

0
1.000
0

0.103
0
0.897

0
0
0.500

0.017
0.615
0.368

0
0.482
0.185

0
1.000
0
0
0
0

0
0
1.000
0
0
0

0
0
0.094
0.781
0
0.125

0
0.615
0.385
0
0
0

0.019
0.484
0.115
0.242
0.134
0.006

0
0
1.000
0

0
0.749
0
0.251

0.341
0.659
0
0

0.000
0.285
0.619
0.097

0.326
0.189
0.485
0

0
0
1.000

0.240
0.760
0

0
0.523
0

0.143
0.237
0.619

0
0.448

290
ABR0376156
164
168
MCW0128
160
166

0

0

0.477

0

0.436
0.116

1.000
0
0

0
0.237
0.763

0
0.400
0.600

0.600
0.149
0.251

0.419
0.266
0.315

0
0

0
0.862

0
0.281

0
0.374

0.006
0.238

0
0
1.000

0
0.138
0

0.719
0
0

0
0
0.626

0.405
0
0.351

0
0
0
0
1.000

0.683
0.172
0
0.145
0

0.397
0.061
0.542
0
0

0.328
0.008
0
0.035
0.629

0.212
0.133
0.294
0
0.361

170
172
174
ABR0289
271
273
283
287
289

RIR＝Rhode Island Red, JG＝Japanease Game, KRK＝Kuro-Kashiwa© The Ito Foundation

天然記念物「黒柏鶏」の遺伝的特徴を活用した地鶏「長州黒かしわ」のDNA識別の可能性の検討

107

試した個体はOsman et al．（2006）が調査した黒可能にするため，黒柏鶏特有のDNAマーカーの柏鶏群の子孫にあたるものの，彼らが用いた個体存在の有無について，黒柏鶏，RIR，軍鶏を比較の直系の子孫ではないためであると考えられた。

したところ，７マーカー（ABR0608, ABR1002,

黒柏鶏，軍鶏，RIRについて，Ｚ染色体上の51

MCW0258, ABR1008, ABR0376, MCW0128,のDNAマーカー座位におけるアリルサイズを比

ABR0289）座位において黒柏鶏特有のアリルが較 し た と こ ろ ，７ マ ー カ ー（ABR0608（220

確認された。今後，このアリルを保有する種鶏をbp）， ABR1002 （348 bp）， MCW0258 （154

造成することにより，「長州黒かしわ」のDNA識bp）， ABR1008 （285 bp）， ABR0376 （156

別技術が確立される可能性が示された。

bp）， MCW0128 （174 bp）， ABR0289 （289bp））において黒柏鶏特有のアリルを確認した（Table３）。また，黒柏三元交雑鶏においてこれらの黒柏鶏特有のアリルをすべて有しているのは
雄２羽，雌15羽であった。
以上の結果から，この７マーカーにおいて黒柏
鶏由来のアリルを保有する雄系種鶏「やまぐち黒鶏」を造成した場合，「長州黒かしわ」のDNAを識別できる可能性が示された。今後，他の鶏種についても同様にアリルサイズを比較し，実用性を確かめる必要がある。
４．要約

天然記念物「黒柏鶏（くろかしわ）」をもとに

引用文献
１）
 関谷正男，岡崎亮，宮本和之，野村利定，藤本和正，
福坂一利：黒柏を活用した県産オリジナル地どりの開発（第１報） ―雄系種鶏「やまぐち黒鶏」の造成と実用地どりの開発―．山口県畜産試験場研究報告
第24号，47～60．2009．
２）
 Rikimaru K, Takahashi H：A Method for
Discriminating a Japanese Brand of Chicken, theHinai-jidori, Using Microsatellite Markers. Poultry
Scence，86，1881～1886．2007．
３）
 Osman SAM,Sekino M, KuwayamaT, Kinoshita K,
NishiboriM, Yamamoto Y, Tsudzuki M.：Genetic
Variability and Relationships of Native Japanese
Chickens Based on Microsatellite DNA
Polymorphisms-Focusing on the Natural
Monuments of Japan. The Journal of Poultry
Science，43，12～22，2006．
４）
 Sambrook J, Russell DW：Molecular cloning:alaboratory manual. 3rd ed. Cold Springs Harbor
Laboratory Press. New York．2001．

開発された地鶏「長州黒かしわ」のDNA識別を© The Ito Foundation

108

ブタ精子核クロマチンの構造安定性を司る鍵分子の特定とそれを指標とした新たな精子受精能評価法の確立
Identification of a key molecule responsible for the structural stability ofsperm nuclear chromatin and its application to the assessment of fertility
potential of boar sires

高坂

哲也・井川

彰・皆川

至・柴田

昌利＊

（静岡大学大学院農学研究科・＊静岡県畜産技術研究所中小家畜研究センター）

Tetsuya Kohsaka, Akira Igawa, Itaru Minagawa, Masatoshi Shibata＊（Laboratory of Animal Reproduction & Physiology, Graduate School of Agriculture, Shizuoka University,＊Shizuoka Swine and Poultry Experimental Station）

The prediction of male fertility is an important aspect of livestock production. We recently
developed a useful procedure for diagnosing subfertilityin boars, and demonstrated that thestructural stability of sperm nuclear chromatin significantly decreased in subfertileboars
compared to fertile boars. However, it remains unknown what factor（s）actually rules thechromatin stability. Therefore, we identified the key factor（s）responsible for the stability ofsperm nuclear chromatin, and established a novel procedure for assessing the fertility potentialof boar sires using the factor. Using frozen semen from both fertile and subfertile boars, we
succeeded in defining free thiols（SH）as a key molecule which rules the stability of sperm
nuclear chromatin, and provided a clear-cut evidence that a decreased chromatin stability led
to the increase in free sperm SH content and substantially decrease in the ratio of disulfide
bonds in subfertileboars. Furthermore, we successfully established a novel method forevaluating the fertility potentialof boar sires based on free sperm SH groups. The application
to freshly ejaculated semen fromthe genetic conservation program was found to be quitesatisfactory; that is, the assessment was well reflected in conception rate, which wasextremely
lowin the semen having high levels of sperm SH content. These datasuggestthat the decreased
stability of sperm nuclear chromatin in subfertile boars compared with fertile boars is
associated with incomplete oxidation of the sperm SH groups and that the levels of free sperm
SH groups correlated most strongly and negatively with fertility potential of boar sires．

１．目

加え，疾病の蔓延防止等への有効性が認識された的こと，宅配便の利用により精液性状を良好に維持

豚の人工授精の普及率は年々高まり，平成21年

しながら全国に輸送できることなどが挙げられ，度には約44％にまで増加している１）。普及率向上

ブタ人工授精のボトムアップに拍車を掛けてきた。

の要因には，精液の保存および利用技術の改良に

しかし一方で，精子の活力や形態は正常である© The Ito Foundation

ブタ精子核クロマチンの構造安定性を司る鍵分子の特定とそれを指標とした新たな精子受精能評価法の確立

109が，受胎成績の極めて悪い精液（以下，低受胎精液と低受胎精液である。一方，新鮮射出精液は静液と呼ぶ）の事例も少なくない。これは現行の精

岡県中小家畜研究センターで系統造成中のデュ液検査（精子活力，濃度，形態検査など）では，

ロック種より手圧法で濃厚部精液を分画採取し，正常精液の範疇に入ってしまい，検出することはモデナ液で等量希釈した後，15℃に保持して実験困難である。そのため，低受胎精液の問題は受胎に供した。

率低下を加速させる深刻な雄側要因の一つであ2.2る。従って，このような精液を早期に判定できる凍結および新鮮射出精液は37℃に暖めておいた

精子塗抹標本の作製

診断技術の開発や低受胎要因の特定に期待が持た

TNE 緩 衝 液 （0.01

れてきた。

mM EDTA, pH7.4）で遠心洗浄し，同緩衝液でこれまでに，我々は上記の診断技術の開発に取M Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 1

１ｘ10７ cells/mlに懸濁後，スライドガラスに塗り組み，アクリジンオレンジ（AO）を用いてブ抹した。

タ精子核クロマチンの構造安定性を顕微鏡レベル

2.3で簡便に判定できる評価法を開発した 。すなわ

AOを用いた精子核クロマチンの構造安
定性評価

２）

ち，低受胎精液ではその構造安定性が著しく低下

精子核クロマチンの評価は高坂らの方法で行っし，受精率との間で正の相関のあることが分かった２）。すなわち，精子塗抹標本を低pH・界面活た。しかし，精子核クロマチンの構造安定性の違性剤に浸漬してDNA変性負荷処理を施した後，いが何によって決定付けられるのか，その鍵を握AO染色（Sigma, St. Louis, MO, USA）を行い，る物質の正体は不明であった。しかしもし鍵分子蛍光顕微鏡下（励起波長：460～490nm，吸収波を特定できれば，それを指標とした正確な精子受長：515nm）で観察し，精子核DNAの変性率よ精能評価法が構築でき，受胎成績の悪いブタ精子

り精子核クロマチンの構造安定性を評価した。

の生産や流通の未然防止につながるものと期待で

2.4

きる。

凍結および新鮮射出精液をTNE緩衝液で遠心精子の遊離SH基含量の測定

本 研 究 で は ，精 子 核 ク ロ マ チ ン を 構 成 す る

洗浄し，同緩衝液で精子懸濁液（精子濃度：１ｘ

DNA―プロタミン複合体やプロタミン分子内の10７ cells/ml）を調製した後，遊離SH基含量を求ジスルフィド結合（SS結合）の素材となる遊離

めた。遊離SH基の定量は２-ニトロ安息香酸法でチオール基（SH基）に焦点を当て，それらが受行った３）。

精能の良好なブタ精子における核クロマチンの構2.5

造安定性を司る鍵分子であることを立証すると共に，それを指標とした新たなブタ精子受精能評価法を確立した。
２．方
2.1

精子核における遊離SH基の分布と蛍光強度

精子核における遊離SH基の検出には，モノブ
ロ モ ビ マ ン （mBBr ； Sigma, St. Louis, MO,
USA）を用いた４）。新鮮射出精液を対象に，BTS

法（Beltsville thawing solution）５）で再懸濁した後，ブタ精液

mBBr（終濃度0.2mM）を添加して，37℃で15分

ブタ精液には，凍結および新鮮射出精液を用い間反応させた。遠心洗浄後，スライドガラスに塗た。凍結精液は当研究室で液体窒素中に保存して抹し，蛍光顕微鏡下（励起波長：395～425nm，おいたデュロックまたはランドレース種の正常精吸収波長：450nm）で精子頭部の遊離SH基の分© The Ito Foundation

110

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

布を調べた。さらに，蛍光強度はBZ－9000オー／全精子SH基より算出した。なお，全精子SH基ルインワン蛍光顕微鏡（Keyence，大阪）で測定

は還元処理を施した精子にmBBrを反応させたとした６）。

きの蛍光強度とした。

2.6

2.7

精子核におけるSS結合の算出

精子運動解析装置（CASA）を用いた精子能の解析

精子核におけるSS結合の割合は以下の式により算出した。すなわち，2.5で求めた蛍光強度を

精子運動能は新鮮射出精液を対象にCASAで解基に，SS結合（％）＝（全精子SH基－遊離SH基）析した７）。すなわち，精子を37℃に暖めておいた

80
60

*

40
20
0

*

200

Free sperm SH content（nmol / 5×106 cells）

B

C

100
Denaturation tare（%）

A

150

100

0

Fertile semen

Subfertile semen

100
SS bonds（%）

D

50

80

*

60
40
20
0

Fertilesemen

Subfertile
semen

Fig. 1 Identification of free thiols（SH）as key molecules that rule the stability of sperm nuclear chromatin in boar

frozen semen.A）Stability of the sperm nuclear chromatinas revealed by acridine orange（AO）staining.
Denaturation rate of sperm nuclear chromatin in the subfertile semen was significantly higher than that in thefertile semen, revealing a decreased structural stability of sperm nuclear chromatin in the subfertilesemen.The
data was from Kohsaka et al 2）． B）The levels of free sperm SH groups. The levels were significantly higher inthe subfertile semen than in the fertile semen. C）Distribution of the free SH groups in the spermatozoa with thepermeable mBBr. When staining intensity of free SH groups was compared between fertile and subfertile semen,
the intensity in sperm head seemed to increase in the subfertile semen compared to the fertile semen. D）
Cytochemical quantitation of disulfide bonds（SS bonds）． The ratio of SS bonds was significantly lower in thesubfertile semen than in the fertile semen. Values are the means ± SEM. Asterisks indicatesignificant difference（P＜0.01）．

© The Ito Foundation

ブタ精子核クロマチンの構造安定性を司る鍵分子の特定とそれを指標とした新たな精子受精能評価法の確立

111

受精培地m-BOで希釈した後（精子濃度：１ｘ10７
cells/ml）， ２ X-CEL チ ャ ン バ ー （Hamilton
thorne, Beverly, USA）に導入し，37℃の加温板を装着した位相差顕微鏡下でビデオ撮影を行い，A closed strain herd of Duroc boars

CASAの解析に供した。
2.8

受胎成績

Semen

雄ブタの種付け頭数当たりの受胎頭数を受胎成
績として表した。
2.9

統計処理

Evaluation of the fertility potential
based on the free sperm SH groups

測定値は平均値±標準誤差で表した。有意差の検定はGB-Statを用いて，FisherのLSD法およびｔ検定で行った。

Veriﬁcation by
conception
rate

３．結果と考察
一般に正常精子では，精巣上体で起こる精子成

Selection of boar sires
having high fertilizing ability

熟過程で核蛋白プロタミンに存在する多数の遊離
SH基が酸化されてSS結合を形成し，精子核クロ
マチンの構造安定性をもたらし，精子核の凝縮を引き起こすことが知られている８）。さらに，そのVeriﬁcation by thestability of sperm
nuclear chromatinusing AO staining

Fig. ２ Establishment of a novel method for assessing

the fertility potential of boar sires based on the
sperm free SH groups．

強固な精子核の凝縮は卵子透明帯の侵入に必要であることが以前から指摘されてきた９）。これまでべた。その結果，低受胎精液では，遊離SH基のに，我々はブタ低受胎精液において，精子核クロ存在を示す蛍光が精子核で明らかに強いことがわ

マチンの構造安定性が著しく低下していることをかった（Fig.1 C）。さらに，顕微蛍光測光解析に見出し，その要因がプロタミンのSS結合の不均よりmBBrと結合した遊離SH基の蛍光強度を測一性または減少による可能性を示唆した 。

定し，SS結合の割合を算出した結果，低受胎精２）本実験では，精子核クロマチンの構造安定性を司る鍵分子が遊離SH基ではないかと考え，正常液では精子核のSS結合の割合が著しく低下していることが明らかとなった（Fig.1 D）。

精液と低受胎精液を用いて立証した。低受胎精液

これらの結果は，何らかの要因でブタ精子の遊では，精子核DNAの変性率が有意に高く，核ク

離SH基の酸化が不完全になると，DNA―プロタ

ロマチンの構造安定性が著しく低下していること

ミン複合体やプロタミン分子内のSS結合の形成を既に明らかにしている（Fig.1 A）２）。そこで，が不十分となり，その結果，核クロマチンの構造

遊離SH基含量を調べたところ，低受胎精液では，安定性が低下し，それにより受精能不良を引き起正常精液に比べて，精子の遊離SH基含量が有意こすことを示唆する。事実ヒトでは，不妊患者のに高いことが判明した（Fig.1 B）。次に，遊離SH

精子は妊孕性のある正常なそれに比べて遊離SH基と特異的に結合する膜透過性蛍光プローブ

基含量が有意に高く，DNAの変性率も高いこと

mBBrに着目し，精子における遊離SHの分布を調が指摘されている３）。従って，本研究で得られた© The Ito Foundation

平成25年度

200

Free sperm SH content（nmol / 5×106 cells）

A

150

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）
B

*

100
50
0

20

*

15
10
5
0

100
Conception（%）

C

25
Denaturation tare（%）

112

80
60
40
20
0

els
els
lev ntlev enthe
low ont
hig ont
ith H cith H cw
w
SSnn
me ermme erm
Se f sp
Se f spooFig. ３ Free sperm SH content and nuclear chromatin stability in freshly ejaculated boar semen from a genetic

conservation program. A）Boar semen assigned to high and low levels of free sperm SH content. B）Stability ofsperm nuclear chromatin as revealed by AO staining. The chromatin stability significantly decreasedin the semen
having high levels of sperm SH content. C）Conception rate. The conception rate was extremely lowin the semen
having high levels of sperm SH content.These data suggest that the levels of free sperm SH content correlated
most strongly and negatively with fertility potential of boars. Values are the means ± SEM. Asterisks indicate
significant difference（P＜0.01）．

ブタの知見やこれまでのヒトの見解を考え合わせに対して，精子活力はCASAによる運動解析からると，精子核クロマチンの構造安定性を司る鍵分も明らかなように，運動精子率，速度，直線性，子は遊離SH基であるということができる。

頭 部 振 幅 値（ALH）な ど の 精 子 運 動 パ ラ メ ー

次に，系統造成中の雄ブタ精液を対象に，遊離

ターに差異が認められなかった（Fig.４）。このSH基を指標とする新たな精子受精能評価法の構ことから，遊離SH基を指標とする新たな精子受築を検討した（Fig.２）。まず，精子の遊離SH基

精能評価法の適応は，受精能の高いブタ精液の選含量を指標に，その含量が高い精液と低い精液の抜を可能にし，受胎成績の悪いブタ精子の生産や２群に分けた（Fig.3 A）。予想通り，SH基含量の流通の未然防止につながるものと期待できる。

高い精液では，精子核クロマチン構造安定性が有受精能の不良な精子において，なぜ遊離SH基意に低下していることが分かった（Fig.3 B）。次

からSS結合の変換がスムーズに行われないのかに，雄ブタの受胎成績のデータと照らし合わせた不明である。しかし，精子成熟過程でのプロタミ

結果，精子遊離SH基含量の高い精液では，受胎ンのSH基の酸化機構に問題があると考える。SH率が著しく低いことが判明した（Fig.3 C）。これ

基酸化との関連が推測される過酸化酵素の一つ© The Ito Foundation

ブタ精子核クロマチンの構造安定性を司る鍵分子の特定とそれを指標とした新たな精子受精能評価法の確立
Velocity
60

60
40
20
0

?m/sec%80

ALH

Linearity
3

10
8

40

4

20

2

0

Semen with high levelsof sperm SH content

2

6

?m

Motile sperm
100

113

Semen with low levelsof sperm SH content

100Fig. ４ Comparison of sperm motility characteristics between semenwith high and low levels of free sperm SH content.

There is no significant difference between semen groups in the motility parameters, such as the percentage ofmotile sperm, velocity（VCL；μm/s），and linearity, amplitude of lateral head distance（ALH；μm）．Values are
the means ± SEM．

に，グルタチオンペロキシダーゼ（GPx）があ

以上，本研究ではブタ精子核クロマチンの構造る。最近の研究から，精巣上体で発現するGPx1,

安定性を司る鍵分子はプロタミンのSH基である

GPx3, GPx４およびGPx５や，精子で特異的に発こと，その酸化の不具合がクロマチンの構造安定

現するGPx４が見出されてきた 。さらに，ノッ性を低下させ，精子の受精能不良を引き起こすこ

クアウトマウスによる研究より，精子で発現するとを明示した。

10）

GPx４はSH基の酸化や精子受精能への関与が指摘されている11）。現時点で，ブタ精子にGPx４が４．要約

存在するとの証拠はないが，本実験で見出したブ

本 研 究 で は ，精 子 核 ク ロ マ チ ン を 構 成 す る

タ精子核クロマチンの構造安定性の低下がプロタ

DNA―プロタミン複合体やプロタミン分子内のミンのSH基酸化の不具合によって起こり，精子SS結合の素材となる遊離SH基に焦点を当て，そ

受精能を低下させる事実を考え合わせると，GPx

れが受精能の良好なブタ精子の核クロマチンの構４はブタ精子のSH基酸化の主要な制御因子とな造安定性を司る鍵分子であることを明らかにしり得る可能性は大である。従って，今後はこのた。さらに，この知見を基に遊離SH基を指標とSH基酸化機構の早急な解明が不可欠で，それにする新たな精子受精能評価法を確立できた。本法よりSH基の酸化制御が可能となり，低受胎精液は生産現場で問題となっている受胎成績の悪いブの根本的な解決につながるものと考える。

タ精液の未然防止策に使用でき，受精能の良好な

他方，暑熱との関係にも注視しなければならな
い。すなわち，ブタは夏場の高温多湿の影響で一ブタ精液のみを選別できる革新的な検査法になり得るものと考える。

時的な造成機能の減退や精子受精能の不良による受胎率の低下を招く夏季不妊症になりやすいことが知られている２）。夏季不妊は豚肉の安定供給を脅かす深刻な問題でもある。しかし，夏季不妊に伴う受精能の不良な精子の発症メカニズムについてはよくわかっていない。そのため，今後は暑熱の影響も視野に入れたSH基酸化機構の解明に取り組む必要があるものと考える。

文献１）
 日本養豚協会：平成21年度 養豚基礎調査全国集計結果，１～33，2009．
２）
 高坂哲也，王 軍，藤井栄治，皆川至，桑原康，
番場公雄，柴田昌利：平成24年度食肉に関する助成
研究調査成果報告書，31：58～63，2013．
３）
 Zini A, Kamal KM, Phang D：Urology，58，80～
84，2001．
４）
 Huang TT, Kosower NS, Yanagimachi R：Biol
Reprod，31，797～809，1984．

© The Ito Foundation

114

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

５） Bamba K, Cran DG：J Reprod Fertil，82，509～
518，1988．
６） Minagawa I, Sagata D, Pitia AM, Kohriki H,
Shibata M, Sasada H, Hasegawa Y, Kohsaka T：J
Endocrinol，220，247～261，2014．
７） Sasaki Y, Kohsaka T, Kawarasaki T, Sasada H,
Ogine T, Bamba K, Takahara H：Int J Androl ，24，24～30，2001．
８） 高坂哲也：繁殖生物学（日本繁殖生物学会編），
初版，41～60，2013．

９）
 Bedford JM, Calvin HI：J Exp Zool，188，137～
156，1974．
10）
 Noblanc A, Kocer A, Chabory E, Vernet P, Saez F,
Cadet R, Conrad M, Drevet JR：J Androl，32，641～650，2011．
11）
 Noblanc A, Peltier M, Damon-Soubeyrand C,
Kerchkove N, Chabory E, Vernet P, Saez F, Cadet R,
Janny L, Pons-Rejraji H, Conrad M, Drevet JR,
Kocer A：PLoS One，７，ｅ38565，2012．

© The Ito Foundation

115

アポトーシス阻害因子の人為制御による家畜の潜在的卵子救命法の創出
Rescue of potential oocytes in livestock ovaries by artificial control ofapoptosis inhibitor

眞

鍋

昇

（東京大学大学院農学生命科学研究科附属牧場）

Noboru Manabe（Animal Resource Science Center, The University of Tokyo）

Many primordial follicles are present in livestock ovaris, which are discarded without
being effectively used in the slaughterhouse. The aim of the present study is to save theoocytes with excellent genetic traits in the ovaries, which are discarded without being
effectively used．
Less than 1％ of primordial follicles are developed and ovulated, and the remainders are
eliminated via atresia. The endocrinological mechanisms involved in follicular development andgrowth have been characterized, but the precise mechanisms involved in the regulation offollicule selection remain unknown. Recent our studies suggest that apoptosis in follicular
granulosa cells plays a crucial role in the oocyte selection. Notably, death ligand and receptor
systems and their intracellular signaling are the key mechanisms regulating granulosa cell
apoptosis. In this study, I revealed the mechanisms of granulosa cell apoptosis regulated bydeath ligand and receptor systems and their signaling pathways. Moreover, the roles of
apoptosis inhibitory factors（cellular FLICE-like inhibitory protein, X-linked inhibitor of
apoptosis protein and decoy receptor 3），which are useful to assess the damaged and/or
healthy oocytes and save the oocyte including the follicle, were revealed. We have developed amethod to save the oocyte with the help of these inhibitors．

１．目

研究は，卵胞とそれに内包される卵子を選択して的死滅させる分子制御機構を解明する研究の成果を

我われは20年以上にわたって哺乳類の卵子が休活用して，死滅すべき卵胞とそれに内包される卵

眠後減数分裂を再開して発育成熟する過程で子，すなわち品質が劣るものを判定して排除し，99.9％以上を選択的に死滅させてしまうことで不残りの排卵に至る卵胞に内包される高品質の卵子

都合な卵子を取り除く分子機構の解明研究を進を積極的に救命して動物発生工学や生殖医療に供め，排卵に至る健常な卵胞と閉鎖されて消滅するする技術システムを開発しようとするもので，学卵胞との判別の指標となる可能性が高い分子を挙術的に独創的であり，かつ社会に貢献する意義深げることができるようになってきている

いものである。

。本

１，２）© The Ito Foundation

116
２．方

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

産生されているのか不明であるので，ブタゲノム法のcFLIP遺伝子の５’-側の転写開始コドンから上

ア ポ ト ー シ ス 阻 害 因 子 cellular FLICE-like

流にむかって順次核酸配列を読み進め，転写制御

inhibitory protein（cFLIP）発現の調節因子探索

ドメインの解析を進め，予備的にFOXO3aなどのとその分子制御機構の解明研究を進めた。健常に転写因子が転写制御していると思われる成績を得

発育している卵胞の顆粒層細胞に高発現している

た２）。次いで上記IL6-TNFα軸がアポトーシス・

cFLIP-lが急速に消滅して卵胞閉鎖が誘導されるシグナル阻害因子cFLIPの転写をup regulateするのだが，この消滅を調節している機構は未だに未場合，あるいは未探索な因子がdown regulateす解明である。cFLIP-l mRNAをup regulateあるいる場合にどのような転写制御因子およびその複合

はdown regulateする因子の探索の最初のステッ体が働いているのか解明を進めた。

プは，ブタ顆粒層細胞が不死化したものである

次 い で ，ア ポ ト ー シ ス・シ グ ナ ル 阻 害 因 子が，形質転換はしておらず，様々な顆粒層細胞のcFLIPの発現を人為的に調節することで卵子の救特性を保持しているJC－410細胞を用い，この細命が可能か否かを確認することで，阻害因子の生胞と卵胞に対して成長因子・生存因子としてはた理作用の確認を行った。卵子の品質を評価する

らくサイトカイン，性腺刺激ホルモン，ステロイ

マーカーとして役立つのみならず，cFLIPの発現ドホルモン，アクチビン，インヒビン，フォリス

を人為的にup regulateすることで食肉処理場でタチン，増殖因子，プロスタグランディン類，血日々廃棄されている卵巣内の卵子（潜在的卵巣内管新生因子類，一酸化窒素などを添加して培養卵子）の救命に役立つと考えられる。すなわち，

し，これらのなかから候補物質の絞込を進めた。

食肉処理場で採取した家畜卵巣のうちで１次卵胞なおブタやウシなどの完全性周期動物の卵胞顆粒を豊富に含む皮質部を細切してガラス化凍結し層細胞ではTNFαが増殖・生存因子として働いた。この凍結保存した卵巣組織を融解後，重症複ていること，これがアポトーシス・シグナルを伝合免疫不全マウス腎漿膜下に異種移植し，このマ達することができずに細胞増殖シグナルを伝達す

ウスの血管内にcFLIP-l遺伝子をアデノウイルス

るTNF２型受容体のみが発現していることに起由来遺伝子導入ベクターのβ-actin enhancerと因すること，しかし齧歯類ではアポトーシス・シ

CMV promoterの下流にcFLIP-l遺伝子とEGFP遺グナルも伝達できるTNF１型受容体が発現して伝子を組み込んだものを投与することで遺伝子導いること，培養細胞を用いた実験ではTNFαが入を行い，cFLIP-lを強制発現させた。この処置

cFLIP の 発 現 を up regulate す る こ と ，そ し ての後２週間バイオハザードベンチ内でマウスを飼

TNFαの発現はinterleukin-6（IL６）によってup

育して異種移植した家畜卵巣における卵胞の発育

regulate さ れ て い る こ と 等 を 見 出 し て い る のを調べた。なおあらかじめ２週間培養することでで１，２），これらの知見を道しるべにしてアポトー

卵胞腔をもつ３次卵胞にまで発育することは確認

シス・シグナル阻害因子cFLIPの発現を支配的にしたので，実験期間を２週間とした。このように制御しているマスター因子の同定を目指した。

して２週間培養した後，腎臓から卵巣組織を回収

cFLIP-lとcFLIP-sがスプライシングバリアントでして卵胞発育ステージを判定した。引き続いて３あることを確認したが，スプライシング過程がど次卵胞から卵子を取り出して体外成熟培養に供しのように巧みな調節を受けて２種のバリアントがた。卵核胞崩壊，第一極体の放出を指標として成© The Ito Foundationアポトーシス阻害因子の人為制御による家畜の潜在的卵子救命法の創出

117

熟した卵子に体外受精を施した。このようにして

domainを介して結合すると，アダプタータンパ

卵子の発生能と受精能を評価した。受精した初期

クのdeath effector domainを介してカスパーゼ８

胚を体外で培養して２細胞，８細胞，桑実胚，胚前駆体（カスパーゼは特異性の高い蛋白分解酵素

盤胞までの発生と各ステージの胚の形態異常の判で，下流の蛋白を分解してシグナルを伝達する）

別およびハッチング能の有無を確認することで，が結合し，前駆体が分解されて活性化する。免疫発生能が正常か否か評価した。

系等の多くの細胞では活性化カスパーゼ８が下流のカスパーゼ３前駆体を直接分解するが，顆粒層３．結果と考察細胞ではカスパーゼ８がミトコンドリア外膜の透哺乳類卵巣では胎児期に第一減数分裂前期の過性を調節するBidを活性化してミトコンドリア

ディプロテン期で停止した卵母細胞が顆粒層細胞からチトクロームＣを放出させ，このチトクローに包まれた原始卵胞の状態で休眠しており，性周ムＣがApaf -１およびカスパーゼ９前駆体と結合期毎に一定数が発育する。卵胞内では顆粒層細胞してapoptosomeを形成し，ここでカスパーゼ９が卵母細胞を保育し排卵に至るが，99.9％以上がが活性化されてカスパーゼ３前駆体を分解し，活閉鎖する

性 化 し た カ ス パ ー ゼ ３ が caspase activated

。

１，
２）

重要な家畜であり完全性周期動物であるブタをDNAse（CAD）を活性化させ，活性化CADが核

用いて卵胞閉鎖過程を形態学的に精査し，極初期内に移行して遺伝子DNAを分断することでアポに誘起される顆粒層細胞のアポトーシスが閉鎖のトーシスが実行されることを明らかにした。

調節に深く係わっていることを示し，この分子制

健常卵胞顆粒層細胞ではFADDと結合してカ御機構の解明を進めた。二次卵胞以降の顆粒層細スパーゼ８前駆体との結合を阻害するcFLIPおよ

胞にはtumor necrosis factor（TNF）familyに属びとカスパーゼ９とカスパーゼ３前駆体間のシグするリガンド（TNFα，TRAIL，FasL）とTNF

ナル伝達を妨げるX-linked inhibitor of apoptosis

受容体（TNFR)familyに属する受容体［TNFR-

protein（XIAP）が発現しており，これらがアポII，TRAIL受容体（DR４，DR５，囮受容体１），

トーシスを阻止していることを示した。顆粒層細FasL受容体（Fas，囮受容体３，可溶性Fas），リ

胞由来細胞で阻害因子を過剰発現させた場合，受ガンド不明受容体（PFG－５）］が発現している

容体依存性アポトーシスが阻害され，逆にRNA

こと，TNFα/TNFR-II系は細胞増殖の亢進を

silencing法で発現を停止させると細胞は死滅し担っていることを明らかにした。これら細胞死リた。阻害因子は，TNFαとinterleukin-６によっ

ガンドと受容体は，閉鎖卵胞のみならず発育してて亢進することが分かった。加えて，リガンド・いる健常卵胞の顆粒層細胞でも発現していたの受容体結合を阻害する囮受容体が発現して細胞死

で，細胞死阻害因子が存在すると考え，その探索を防いでいることも分かった。阻害因子は卵母細を行った結果，顆粒層細胞はミトコンドリアを介胞の品質を評価する指標として有用であることもしてシグナルが伝わるII型アポトーシス細胞であ分かった。

ることが分かるとともに２種類の細胞内阻害因子の存在が判明した

凍結保存が難しいブタ卵巣組織細片を凍結保存
後融解し重症複合免疫不全マウスに移植し，この

。

３～７）

リガンドと結合した活性化受容体とアダプター

時にアポトーシス阻害因子を卵胞顆粒層細胞に過タ ン パ ク（FADD や TRADD）が 互 い の death剰発現させることで，卵胞発育を可能とすること© The Ito Foundation

118

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）ができた８～10）。さらにこの卵胞から卵母細胞を調

卵子の品質を評価し，それを調節している細胞死

製して体外受精し，受精に成功した胚の体外培養阻害因子を人工的に制御することで卵胞とその中も可能となった。いまだブラッシュアップが必要の卵子を救命する手法の開発がすすめられ，無為な諸点の改良が残るものの，概ね当初立案したプに廃棄されている卵子の有効利用の路が開かれロトコールに従えば，これまで困難であった卵巣た。これによって，雌家畜側からの高効率的育種

内潜在的卵母細胞を救命し，それを有効利用する改良が期待される。加えて，家畜のみならず，人ことが可能となったと考えられる。

間では，担癌患者の卵母細胞を救命できる基盤的哺乳類の卵巣に潜在する数十万の原始卵胞の技術が整ったこととなる。このように本研究は農１％以下が排卵に至り，残りは選択的に閉鎖す

学や医学等の広領域を介して社会に貢献することる。これら無為に死滅する卵母細胞を救命するこが期待される。

とは重要な課題であるが，アポトーシス阻害因子の卵胞顆粒層細胞における発現レベルが卵母細胞の健常性の指標となることが推察され，著しく低い場合には無理に人為的に発現を調節して救命してまで産仔生産にまで供さないことが望ましいと思われた。しかし，著しく低くない場合には，アポトーシス阻害因子の発現を人為的に調節して救命する意義があると考えられる。すなわち，食肉処理場にて廃棄されている優良な雌性遺伝子資源である潜在的卵母細胞を救命することに意義があると思われた。卵母細胞の選択的死滅に関わる多くの内分泌学的研究が行われてきているが，選択調節機構には未解明な点が多く，顆粒層細胞における細胞死リガンド・受容体系と細胞内シグナル伝達が調節の鍵であることが分かってきたことを基盤として，調節機構をより一層精査することでア ポ ト ー シ ス ・ シ グ ナ ル 阻 害 因 子 cFLIP ，
XIAP，DcR3などの制御機構を理解し，卵子品質判定の指標および卵母細胞救命の鍵因子として有効に利用できるようにしていくことやこれらを人工的に制御して卵胞とその中の卵子の救命に活用できるシステムを確立することが肝要である。
４．要

約

食肉処理場では，優れた形質の雌家畜の卵母細胞が無為に廃棄され続けている。本研究によって文
献１）
 Noboru Manabe, Fuko Matsuda-Minehata,
Yasufumi Goto, Akihisa Maeda, Yuan Cheng, Shoma
Nakagawa, Naoko Inoue, Kannika Wongpanit, HuaZi Jin, Hiroshi Gonda, Jun-You Li. ： Role of cell
death ligand and receptor system on regulation offollicular atresia in pig ovaries. Reproduction in
Domestic Animals，43，268～272，2008．
２）
 Fuko Matsuda, Naoko Inoue, Noboru Manabe,
Satoshi Ohkura. ： Follicular growth and atresia inmammalian ovaries: Regulation by survival anddeath of granulosa cells. Journal of Reproduction
and Development，58，44～50，2012．
３）
 Takafumi Sai, Yasufumi Goto, Ryousuke
Yoshioka, Akihisa Maeda, Fuko Matsuda, Miki
Sugimoto, Kannika Wongpanit, Hua-Zi Jin, Jun-You
Li, Noboru Manabe. ： Bid and Bax are involved in
granulosa cell apoptosis during follicular atresia in
porcine ovaries. The Journal of Reproduction andDevelopment，57，421～427，2011．
４）
 Takafumi Sai, Fuko Matsuda, Yasufumi Goto,
Akihisa Maeda, Miki Sugimoto, Hong-Mei Gao, Abul
Khair Mohammad Ahan Kabir, Jun-You Li. Noboru
Manabe. ： Effect of RNA interference of Bid andBax mRNAs on apoptosis in granulosa cell-derived
KGN cells. Journal of Reproduction andDevelopment，58，112～116，2012．
５）
 Katsuya Kominami, Jun Nakabayashi, Takeharu
Nagai, Yuki Tsujimura, Kumiko Chiba, Haruna
Kimura, Atsushi Miyawaki, Tatsuya Sawasaki,
Hideo Yokota, Noboru Manabe. ： The molecularmechanism of apoptosis upon caspase-8 activation:
Quantitative experimental validation of amathematical model. Biochimica et Biophysica Acta
(Molecular Cell Research) ， 1823 ， 1825 ～ 1840 ，
2012．
６）
 Katsuya Kominami, Takeharu Nagai, Tatsuya
Sawasaki, Yuki Tsujimura, Kenta Yashima,© The Ito Foundationアポトーシス阻害因子の人為制御による家畜の潜在的卵子救命法の創出
Yasuhiro Sunaga, Masateru Tsuchimochi, Jun
Nishimura, Kumiko Chiba, Jun Nakabayashi, Koji
Koyamada, Yaeta Endo, Hideo Yokota, Atsushi
Miyawaki, Noboru Manabe.：In vivo imaging of
hierarchical spatiotemporal activation of caspase-8
during apoptosis. PLoS ONE，７（11），e50218. doi: 10. 1371/journal.pone．0050218
７） Chie Suzuki, Koji Yoshioka, Manabu Yamada,Michiko Noguchi, Noboru Manabe.：Expressions oftumor necrosis factor ～ α， its receptor I, II andreceptor-associated factor 2 in the porcine corpus
luteum during the estrous cycle and earlypregnancy. Veterinary Research Communications，
38，１～10，2014．
８） Shoma Nakagawa, Naoki Maedomari, Kazuhiro
Kikuchi, Takashi Nagai, Takashi Miyano, Josef
Fulka Jr., Noboru Manabe.：Rescue of vitrified fullygrown and growing porcine oocytes by germinal
vesicle transfer. The Journal of Reproduction andDevelopment，57，335～341，2011．
９） Nguyên Viêt Linh, Kazuhiro Kikuchi, Michiko

119

Nakai, Junko Noguchi, Hiroyuki Kaneko, Thanh
Quang Dang-Nguyen, Tamas Somfai, Bui Xuan
Nguyen, Takashi Nagai, Noboru Manabe.：Fertilization ability of porcine oocytes reconstructedfrom ooplasmic fragments produced andcharacterized after serial centrifugations. The
Journal of Reproduction and Development，59，549～556，2013．
10）
 Jozsef Rátky, Istvan Egerszegi, Peter Toth,
Soukanh Keonuchan, Takashi Nagai, Kazuhiro
Kikuchi, Noburu Manabe,：Klaus-Peter Brüssow.
Saving genetic resources of native pigs in occidental
and oriental countries: Practical examples of thecharacterization and utilization of native pigs inHungary and Laos. The Journal of Reproduction
and Development，59，437～441，2013．

© The Ito Foundation

120

かごしま黒豚における授乳中発情の誘起試験
Control of lactational estrus in the Kagoshima Berkshire

野

口

倫

子・生

駒

エレナ＊・帆保誠

二（鹿児島大学共同獣医学部， 鹿児島県農業開発総合センター畜産試験場）＊

Michiko Noguchi, Erena Ikoma＊ and Seiji Hobo
（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University,＊Livestock Research Institute, Kagoshima Prefectural Institute for Agricultural Development）

During lactation, sows generally remainanestrus because reproductive hormones in sowsare inhibited during suckling. However, development of mature follicles, lactationalestrus andovulation are observed on commercial pigfarm and these could be due to management duringlactation.We investigatedfrequency oflactational estrus and effects of spraying boar-pheromone
on induction of lactational estrus during lactation in Kagoshima Berkshire of a commercial
farm.In the experiment 1, ninety-eight sows were used. Data of reproductive performance（number of piglets, intervals from weaning to estrus and fertility）and sow's body condition
during lactation (lactation length and back fat loss)were investigated. Blood samples werecollected at weaning from all animals. Follicular development, lactational estrus and lactational
ovulation were defined as progesterone and estradiol － 17 β concentrationmeasured by timeresolved fluoroimmunoassay. Intervals from weaning to estrus and fertility were significantly
different between summer（August and September）and autumn（November）seasons.
Estradiol － 17 β concentrations in November were significantly higher than from during Julyto October. Lactational estrus was observed in one sow（1.0％）during experimental period. In
the experiment 2, pigs were randomly assigned to a control（n ＝ ９）or treatment of boarpheromone from 14 days after parturition to weaning（n ＝ 10）group. Vaginal electricalresidence（VER）measurements were carried out between 14 days after parturition and 7 days
after weaning in all sows. Data and blood samples were collected as experiment 1. Lactational
estrus was not found both control and treatment groups. There was no difference in values of
VER during experimental period between groups. From these results, we determinefrequencyof lactational estrus in Kagoshima Berkshire is lowon a commercial farm at least undermanagement fromSeptember to November in Kagoshima. These results also suggest it isdifficult to induce lactational estrus by spraying boar-pheromone in Kagoshima Berkshire．

© The Ito Foundation

かごしま黒豚における授乳中発情の誘起試験

１．目

121

目撃されている。ブタの授乳中発情／排卵の原因的としては，授乳母豚の栄養状態，哺乳子ブタ頭数

養豚生産において，「年間１母豚あたりの離乳

および授乳期間などの複数の要因が考えられてお頭数」は生産性の指標として経済的に重要な指標

り，先行研究ではそれらを制御することで授乳中であり，この項目は「１分娩あたり離乳頭数」との発情誘起および交配が可能であると報告されて「年間母豚１頭あたりの分娩腹数（母豚回転率）」

いる２）。

によって決定される。中でも，分娩から次回妊娠

かごしま黒豚において，人工的に授乳中の発情までの日数は，生産性を左右する重要な因子としおよび排卵時期を制御することができれば，分娩て知られている。

から次回妊娠までの日数を減少させることが可能

かごしま黒豚は，バークシャー種を基礎としたとなり，生産性向上に大きく寄与することは明白

日本有数の銘柄豚として知られている。かごしまである。しかし，かごしま黒豚における授乳中発

黒豚は，一般的な肉用ブタよりも，筋繊維が細い，情／排卵の実態については全く調査されておら

旨味成分の含有量が高い，脂肪の融点が高いといず，授乳中の卵胞発育制御に関する知見は見当たう特徴を持つため，その肉質が全国的に評価されらない。そこで，本研究では生産現場におけるかているが，生産性が低いためその流通量は少な

ごしま黒豚の授乳中発情／排卵の現状調査を行う

い。我々は，これまでにかごしま黒豚生産農場

とともに，授乳中発情／排卵と授乳条件の関係性（Ａ農場）における生産性向上を目的とし，分娩を明らかにすることで，かごしま黒豚の生産性向から初回妊娠までの日数について調査を行ってき

上につながる技術の開発のための基礎的知見を得た。その結果，Ａ農場における授乳期間は平均31

ることを目的とした。

日であり，離乳後７日目以内に発情が認められた
ブタは，84.0％（539頭／642頭）であった。肉用
ブタでは，平均授乳期間は21日であり，離乳後７日目までに発情が認められるブタは94.5％１）とな

２．方法

2 . 1 かごしま黒豚生産農場における授乳中発
情／排卵の実態調査（試験１）ることから，かごしま黒豚の分娩から初回妊娠ま鹿児島県内のかごしま黒豚生産農場において，での日数の延長が，現実問題として生産性に大き2013年７月～2014年３月まで試験を実施した。しく影響していることを明らかにした。

かし，2013年12月より，農場においてブタ流行性

ブタの授乳期間は，子ブタの吸乳刺激により視下痢（PED）が発生したため，本研究の調査対象

床下部の性腺刺激ホルモン放出ホルモンからは除外し，2013年７～11月のデータを活用し（GnRH）分泌が抑制されることで，卵胞刺激ホた。繁殖母豚100頭（20頭／各月）について，離ルモン（FSH）および黄体ホルモン（LH）の分

乳 時 に 採 血 を 行 い ，そ の 後 性 腺 刺 激 ホ ル モ ン

泌が抑制され，排卵に至るような大卵胞の発育は（PMSG，セロトロピン，あすか製薬）を1,000 IU

抑制される。そのため，一般的に，授乳期間中に筋肉内投与した。ただし，７月および８月にそれ発情は認められず，離乳による吸乳刺激からの解ぞれ離乳後淘汰および流産が認められた個体は放により，排卵に至る大卵胞の発育および発情がデータから削除した。得られた血液は，Noguchi出現する。しかし実際には，養豚生産現場においet al.３）の方法に従い，末梢血中プロジェステロて，授乳中に発情および排卵が認められるブタがンおよびエストラジオール17β濃度の測定を行っ© The Ito Foundation

122

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

た。また，供試母豚の一般情報（生年月日，分娩

離乳頭数，生時体重および離乳時体重）の聞き取

日，産歴，授乳期間，離乳後発情発現までの日数

り調査を行った。さらに，供試母豚の分娩前，分および発情持続日数）および供試母豚から生まれ

娩後14日目および離乳時における背脂肪厚の測定

た子ブタの一般情報（総産子数，哺乳頭数，離乳を行った。

頭数，生時体重および離乳時体重）の聞き取り調

2.3

査ならびに供試母豚の分娩前および離乳時におけすべての試験において，月（試験１）あるいはる背脂肪厚の測定を行った。
なお，Noguchi et al.

統計処理

処置間（試験２）の授乳中母豚条件，離乳後繁殖の報告に従い，末梢血成績のデータおよび処置間（試験２）のVER値

中プロジェステロン濃度が１ng/ml以上かつエスの変動は，SAS（バージョン9.4）を用いて，多トラジオール17β濃度が５pg/ml以下の個体は，元配置分散分析を行い，有意差が認められた場合

授乳中に排卵がおこった黄体期であると判定しには多重比較検定を行った。なお，Ｐ値が0.05以

た。また，末梢血中プロジェステロン濃度が１下の場合に有意差があると判定した。

３）

ng/ml以下かつ末梢血中エストラジオール17β濃度が５pg/ml以上の個体は，離乳時にすでに卵胞３．結果と考察

発育が始まっている発情前期であると判定した。

かごしま黒豚生産現場における母豚の授乳条件

2 . 2 オスフェロモンによる人工的刺激が授乳と離乳後の繁殖成績について，Table１に示した。

中発情／排卵に及ぼす影響（試験２）

試験期間中におけるかごしま黒豚の総産子数，生鹿児島県畜産試験場において，繁殖母豚30頭を存産子数および授乳期間は，月間で差を認めな供試した。供試母豚は無作為に半数に分け，そのかった。分娩前から離乳時の背脂肪厚の変化につ

うち15頭に対し，分娩後14日目からオスフェロモ

いても，月間における差は認められなかった。分

ンスプレー（PheroMate,Minitube社）を１日２

娩時子ブタ体重は，月間で差を認めなかったもの

回鼻に噴霧した（処置区）。15頭のブタは処置をの，11月の離乳時子ブタ体重は８～10月の成績に行わない対照区とした。ブタにおいて，深部腟内

比べて有意に上昇した。離乳後発情回帰までの日

電気抵抗（VER）値は末梢血中プロジェステロ

数は，７月および11月に比べて，８～10月では有

ン濃度

濃度と

意に延長した。11月の離乳後受胎率は，７～９月

相関が高く，卵巣動態の把握に有用であることがに比べて有意に上昇した。夏季の暑熱ストレス

知られている。すべてのブタは，分娩後14日目かは，母豚の繁殖成績に悪影響を与える６）。本研究

ら少なくとも離乳後５日目までの間，１日１回のにおいても，８～10月のかごしま黒豚の繁殖成績

VER値測定機器（ブリードテスタ，チヨダエレ

悪化は暑熱ストレスに起因するものと推察されクトリック社）を用いてVER測定を行った。離た。本研究では，11月に採材した１頭（1.0％）

乳時には採血を行い，母豚末梢血中プロジェステ

のみ離乳時における末梢血中プロジェステロン

ロンおよびエストラジオール17β濃度の測定を（11.2 ng/ml）の上昇が観察された。末梢血中プ行った 。また，供試母豚の一般情報（生年月日，

ロジェステロン濃度は月間で差を認めなかった

分娩日，産歴，授乳期間，離乳後発情発現までのが，11月のエストラジオール17β濃度は，他の月日数および発情持続日数）および供試母豚から生の個体に比べて有意に高値を示した。また，離乳まれた子ブタの一般情報（総産子数，哺乳頭数，

時にすでに卵胞発育が始まっている個体は11月に

４，
５）

およびエストラジオール17β

４）３）© The Ito Foundation

123

かごしま黒豚における授乳中発情の誘起試験
Table 1 Reproductive performance in Kagoshima Berkshire on commercial farm from July to November in

2013．

Jul

Aug

Sep

Oct

Nov

ｎ

19

19

20

20

20

Parity4.6±0.6

4.1±0.5

4.6±0.5

4.3±0.6

4.7±0.6

Total born piglets

9.3±0.8

10.0±0.6

8.6±0.5

8.6±0.88.3±0.6

Live born piglets

7.9±0.6

7.7±0.5

7.7±0.5

7.3±0.7

7.0±0.5

Lactation length（day）

27.8±0.2

26.7±0.628.2±0.427.8±0.527.8±0.5

Back fat loss（mm）

0.6±0.6

1.5±0.5

0.9±0.7

0.5±0.7

2.7±0.7

At birth

1.76±0.08

1.75±0.03

1.62±0.06

1.64±0.06

1.62±0.04

At weaning

7.74±0.28ab

7.07±0.25ｂ

7.24±0.22ｂ

7.34±0.21ｂ

8.66±0.23ａ

Piglets weight（kg）

Progesterone at weaning（ng/ml）

0.34±0.03

0.29±0.03

0.29±0.06

0.23±0.04

1.01±0.54＊
Estradiol-17β at weaning（pg/ml）

0.53±0.10ｂ

0.85±0.08ｂ

0.99±0.11ｂ

0.79±0.13ｂ

3.48±0.99ａ

Wean to estrus interval（day）

4.03±0.07ｂ

4.84±0.18ａ

4.75±0.14ａ

4.58±0.09ａ

4.00±0.04ｂ

Fertility（％）

57.9±11.6ｃ

68.4±11.0bc

65.0±10.9ｃ

90.0±6.9ab

95.0±5.0ａａ-ｃValues with different superscripts within a low differ significantly（P＜0.05）．

Values are presented as means ± SEM．

４頭認められ，末梢血中プロジェステロン濃度お体，授乳期間および背脂肪厚の変化は，区間で差よびエストラジオール17β濃度は0.4±0.1 ng/mlを認めなかった。離乳時のプロジェステロン濃度および11.0±2.7 pg/mlであった。ブタでは，授乳およびエストラジオール17β濃度においても，区期間の子ブタ吸乳刺激により，排卵に至る卵胞の間で差は認められなかった。授乳期におけるオス

発育および卵胞発育に関わるホルモン分泌は抑制

フェロモンスプレー刺激の有無がVER値の変化

されている 。排卵に至る卵胞は，エストラジオーに及ぼす影響について，Fig.１に示した。VER値

ル17βを生産し，その発育に相関する末梢血中エは，ウシ 11），水牛 12）およびブタ４，５）において各種

ストラジオール17β濃度の上昇が観察される３）。

生殖ホルモンの変動と相関が認められるため，卵また，排卵後に形成される黄体の成長により，末巣動態および交配適期の指標として用いられてい梢血中プロジェステロン濃度は上昇する 。すな

る。特に，ブタにおいてはVER値とプロジェス

わち，授乳中の卵胞発育は，授乳子ブタ頭数 ，テロン濃度（ｒ＝0.72～0.74）およびエストラジ

オスとの接触９）および飼養形態10）などに関係する

オール17β濃度（ｒ＝－0.50）との間に有意な高ことから，少なくとも本研究で観察された飼養条

い相関が認められる４，５）ことから，VER値から黄件ではかごしま黒豚において自然に授乳中発情／体の存在と大卵胞の有無が推察できる。平均28～

排卵が起こる確率は非常に低いものと考えられ29日間の授乳を行った母豚において，離乳前１週た。一方で，11月では授乳中排卵および離乳時の間目から雄豚と接触した繁殖母豚で授乳中発情／

大卵胞の発育が始まっている個体が複数認められ排卵が認められる割合（6.3％）は，接触しなかったことから，暑熱ストレスが負荷されていない期たもの（1.5％）と比べて高い８）。本研究では，対間では授乳中発情／排卵が夏季に比べて増加する

照区および試験区（授乳期間27.7±0.3日）におい可能性も示唆された。

て，離乳前14日間のVER値に有意な変化は認め

７）

３）

８）

総産子数，生存産子数，授乳期間中の子ブタ増

られず，無処置のブタを用いた既報13）と同様に，© The Ito Foundation

124

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

310

Control（n=9）

290Value of VER（Ωcm）

Weaning

Treatment（n=10）

270
250
230
210
190

-12 -11-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6Day from weaning

Fig. 1 The mean value of vaginal electrical resistance（VER）before and after weaning

in control group（n＝９）and treatment group（n＝10）in Kagoshima Berkshire. Error
bars indicate SEM．

離乳後３日目に最低値を示し，その後上昇を認めた。以上のことから，オスフェロモンスプレーによる刺激では，生殖ホルモン分泌の刺激を誘導することができず，授乳中発情／排卵を誘発することはできないことが明らかとなった。
４．要

約

本研究では，生産現場におけるかごしま黒豚の授乳中発情／排卵の現状調査を行うとともに，オ
スフェロモンスプレーを用いた授乳中発情／排卵の誘発について検討を行った。離乳時の末梢血中
プロジェステロン濃度の上昇が認められたブタの割合は1.0％であったことから，少なくとも本研
究の飼養管理下において授乳中発情／排卵が起こる可能性は低いものと考えられる。また，分娩後14日目からオスフェロモンスプレーによる刺激を負荷した豚群においても授乳中発情／排卵は認められなかったことから，フェロモンスプレーによる卵胞発育誘導効果は得られないことが判明した。

文献１） E. Poleze, M.L. Bernardi, W.S. AmaralFilha, Ivo
Wentz, F.P. Bortolozzo ： Liv. Sci ．， 103 ， 124 ～130．2006．
２）
 M. Alonso-Spilsbury, L. Mayagoitia, M. E. Trujillo,
R.Ramírez- Necoechea, D.Mota-Rojas.J. Anim. Vet.
Adv．，３，294～305．2004．
３）
 M. Noguchi, K. Yoshioka, S.Itoh, C. Suzuki, S.
Arai, Y. Wada, Y. Hasegawa, H. Kaneko ：Reproduction，139，153～161．2010．
４）
 L. Dusza, M. OpaLka, B. Kaminska, T. Kaminski, R.
E. Ciereszko：Theriogenology，45，1491～1503．1996．
５）
 S.Yamauchi, S. Nakamura, T. Yoshimoto,
T.Nakada, K.Ashizawa, H.Tatemoto：Anim.Reprod.
Sci．，113，311～316．2009．
６）
 A.Suriyasomboon, N.Lundehei,A.Kunavongkrit,
S.Einarsson：Theriogenology，65，606～628．2006．
７） J. S. Stevenson, N. M. Cox, J. H. Britt ： Biol.
Reprod．，24，341～353．1981．
８）
 W. I. Kuller, N. M. Soede, H. M. G. van BeersSchreurs, P. Langendijk, M. A. M. Taverne, J. H. M.
Verheijden, B. Kemp：J. Anim. Sci．
，82，405～413．2004．
９） J. S. Walton：J. Anim. Sci．，62，９～15．1986．
10）
 F.Hultén, A.Wallenbeck, L.Rydhmer ： Reprod.
Dom. Anim．，41，448～454．2006．
11）
 D. Schams, E. Schallenberger, B. Hoffmann, H.
Karg：Acta.Endocrinol．，86，180～192．1977．
12）
 K.A. Gupta, G.N. Purohit：Theriogenology，56，
235～245．2001．
13）
 Ｐ．Řezáč，I. Křivánek, T. Urban, M. Borkovcová，
M. Pöschl.：Anim.Reprod. Sci．
，114，238～248．2009．

© The Ito Foundation

125

新規繁殖制御中枢刺激剤が黒毛和種の卵胞発育に与える効果についての研究
The effect of a novel reproductive center stimulant to follicle developmentof Japanese Black beef cows

松

田

二

子・大

蔵

聡

（名古屋大学大学院生命農学研究科）

Fuko Matsuda and Satoshi Ohkura（Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University）

One of the biggest problems of domestic animal husbandry is the decreasing fertility rate
in cows, which is now less than 60％ in Japan. In this study, we aimed to evaluate thepossibility of a novel inhibitor of dynorphin receptor, PF4455242, as a new drug that stimulates
reproductive center of cattle. First, we examined the effect of PF4455242 on luteinizing
hormone（LH）pulses and follicular growth in mature Japanese Black beef cows. PF4455242
was dissolved in vehicle（distilled water）and then infused via jugular catheter at theconcentration of 1 mol/㎏/h for 4 hours. As a negative control, vehicle was infused in a samemanner as PF4455242. Plasma samples were collected from these animals every 10 min
between 8 h before and 12 h after the start of infusion. At the same time, the changes infollicular diameter were monitored every 6 hours between 8 h before and 56 h after the startof infusion. In vehicle-treated cows, LH pulses occurred every 3 to 4 hours before, during andafter the infusion. In a cow treated with PF4455242, two LH pulses occurred sequentially soonafter the start of infusion. These results suggest that PF4455242 may have effect to increase
LH pulse frequency in cows. In PF4455242-treated cow, follicular diameter of 48 h after thestart of infusion increased 1.6 times compared with that of the start of infusion, but thedifference of the growth rate with vehicle treatment were not clear. Next, we performed
immunohistochemistry (IHC) to examine the localization of dynorphin in cattle hypothalamus.
Neuronal fibers in the hypothalamic arcuate nucleus were stained by IHC, indicating thatdynorphin affects the frequency of LH pulses via kisspeptin neuron that is known to locate in
the arcuate nucleus. Further study is needed to confirm the effect of PF4455242 to stimulate
cattle reproductive function and its action site．

１．目

けるウシの人工授精成功率は乳用牛で50％以下，的

肉用牛でも60％を切り，ウシの生産上最も大きな日本を含む先進国におけるウシの受胎率は年々問題となっている。受胎率低下の重要な原因のひ低下しており，それに伴う繁殖効率の低下は，畜

とつが卵胞の発育不全である。卵胞発育が十分で産農家経営の大きな負担となっている。日本におないと，卵が排卵されなかったり，未熟なまま卵© The Ito Foundation

126

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

胞が排卵してその後の発生がうまくいかなかった

視床下部の神経活動が低下し，血中LH濃度が持りする。また卵胞発育不全は，性ホルモン分泌不続的に減少した。一方，ダイノルフィン受容体阻足に伴う発情の鈍化をもたらし，人工授精のタイ

害剤（nor-BNI）を同様の手法で投与すると，神ミングを逸することで受胎率が低下する。

経活動は亢進しLHパルス頻度は上昇した２）。さ

哺乳類の卵胞発育と排卵は，視床下部から分泌らに我々は，2011年に発表された新規ダイノルされる性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）

フィン受容体阻害剤（PF4455242）を卵巣除去しと，それに続いて下垂体から分泌される卵胞刺激た雌ヤギに静脈内投与し，視床下部神経活動およホルモン（FSH）および黄体形成ホルモン（LH）

びLHパルス頻度が増加するデータを得た（未発によって調節されている。GnRH/FSH/LHのパ表）。このことから我々は，PF4455242をウシのルス状分泌は卵胞発育を促すことが知られ，パル

繁殖中枢を刺激する卵胞発育促進剤として応用でス頻度が増加すると卵胞発育が促進される。一きる可能性に着目した。

方，GnRH/LHの一過性のサージ状分泌は排卵を

本研究では，PF4455242がウシにおいてもLH誘起する。このGnRHによる卵巣機能統御システ

パルス頻度を増加させるか，さらにウシの卵胞発ムを利用したのが，現在繁殖障害の治療に用いら育を促進する作用を持つかを調べた。また，免疫れているGnRHアゴニスト（GnRH製剤）である。

組織化学によりウシ視床下部におけるダイノル

GnRH製剤は排卵誘起剤としては非常に有効であ

フィンの発現細胞の同定を試みた。さらに，ヤギ

る一方，未熟な卵胞に対しては発育ではなく排卵視床下部組織を用いてin situハイブリダイゼーを誘起してしまうため卵胞発育促進剤としての実ション法によるダイノルフィン受容体発現細胞の用は難しい現状にある。以上の理由から，卵胞発同定を試みた。

育を促進し，その結果ウシの受胎率を改善する，
新規の技術開発が切望されている。
50年以上に渡りGnRHを分泌するGnRHニュー

２．方
2.1

法

ダイノルフィン受容体阻害剤の投与

ロンが繁殖制御の最上位中枢であるとされてきた名古屋大学大学院生命農学研究科附属フィールが，2000年代に入ってGnRH分泌をさらに上位でド科学教育研究センター東郷フィールドで飼育す制御するキスペプチンニューロンが新たな繁殖制

る，体重436～471kgの黒毛和種成熟雌ウシを用御中枢として発見された 。これまでに，げっ歯

い た 。新 規 ダ イ ノ ル フ ィ ン 受 容 体 阻 害 剤

類（マウス，ラット），霊長類（ヒト，サル），家（PF4455242）を溶媒（蒸留水）に溶解し，ウシ

畜動物（ウシ，ヒツジ，ヤギ，ブタ）を含む多くへの投与に使用した。ウシにプロスタグランジンの哺乳類において，キスペプチンがGnRHの分泌

Ｆ２αを投与して黄体を退行させ，次の排卵を確を促進する因子であることが明らかとなってき認してから12日後に投与を行った。PF4455242は，た。さらに近年，我々の研究グループは，ウシと頚静脈内に留置したカテーテルを通して１μmol

同じ反芻動物に分類されるヤギをモデル動物と／kg／時間の濃度で４時間持続投与した。コン

し，キスペプチンニューロンが分泌する神経ペプ

トロールとして，溶媒（蒸留水）を同様の方法でチド・ダイノルフィンがGnRH/LHのパルス状分

投与した。

１）

泌を抑制することを発見した。卵巣除去した雌ヤ

2.2

ギの脳室内にダイノルフィンを投与したところ，

超音波画像診断装置を用いてウシの卵巣活動を© The Ito Foundation

卵胞発育の観察と血中LH濃度の測定

新規繁殖制御中枢刺激剤が黒毛和種の卵胞発育に与える効果についての研究

Plasma LH (ng/ml)

2.5

A)

#9202（vehicle）

2.5

2

2

1.5

1.5

1

1

0.5

0.5

0

0

2.5

2.5

C)

#6527
（vehicle）

2

2

1.5

1.5

1

1

0.5

0.5

0

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

0

B)

127
#6535（vehicle）

3.17
D)

#6510
（PF-4455242）-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

Fig. 1 Effect of i.v. infusion of PF4455242 on luteinizing hormone（LH）secretion in cyclic adult Japanese Black beefcow. A）－C）and D）represent plasma LH profiles of cows infused with vehicle and PF4455242, respectively. Blood
samples were taken every 10 min between 8 h before and 12 h after the start of infusion. Shaded periods represent
the infusion period. Arrowheads indicate peaks of LH pulses.

モニターし，卵胞の大きさと数を測定した。卵巣の観察は，投与開始前24時間から投与開始後56時

2 . 4 免疫染色によるウシ視床下部のダイノル
フィン検出間まで６時間間隔で行った。また血漿中LH濃度

ウシ視床下部の組織切片をPBSで数回洗浄後，を測定するため，投与前８時間から投与開始後12

0.3％Triton X－100を含むPBS（PBST）で洗浄

時間まで10分間隔で採血した。血漿中LH濃度はし，ブロッキング溶液（ロシュ）にて90分間イン

ラジオイムノアッセイ法により測定した。

キュベートした。次に切片を抗ダイノルフィン抗2.3

ウシ脳組織の採取，包埋および薄切体（１ ： 4000 ； Phoenix Pharmaceuticals）を 含

卵胞期または黄体期の黒毛和種の成熟雌ウシよむブロッキング溶液中で４℃，72時間インキュり脳組織を採取した。ウシを麻酔後，頚動脈よりベートした。PBSTで数回洗浄後，Alexa555結合

リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水（PBS）お よ び 固 定 液

抗 ウ サ ギ IgG 抗 体（１：200；ラ イ フ テ ク ノ ロ（４％パラホルムアルデヒド）を注入してかん流ジーズ）を含むブロッキング溶液中で室温，２時固定し，脳を取り出した。脳から視床下部を切り

間インキュベートした。PBSTで数回洗浄後封入

出し，固定液に浸漬した。数日間固定液に浸漬しし，蛍光顕微鏡にて観察および写真撮影を行った。

た視床下部をクリオスタットにて50μｍの厚さに薄切し，組織切片を作製した。

© The Ito Foundation

128

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Follicular diameter（mm）

16
14

#6535

12

#9202

10

#6510
#6527

8
6
4
2
0

h-32 h-24 h-16 h-8

h0

h8

h16

h24

h32

h40

h48

h56

Time after the start of PF4455242 infusion
Fig. 2 Effect of i.v. infusion of PF4455242 on follicular growth in cyclic Japanese Black beef cows. Black curve

represents the change in follicular diameter of a PF4455242-infused cow（#6510），while the other three curves
represent those of vehicle-infused cows（#6527, #6535 and #9202）．Follicular diameters were measured every 6 h
between 8 h before and 56 h after the start of infusion. Shaded period represents the infusion period.

2 . 5 In situ hybridization法（ISH）によるヤギ
視床下部のダイノルフィン受容体mRNA検出
ウシの脳組織サンプルは貴重であるため，ヤギ
脳切片を用いてダイノルフィン受容体mRNAの色を停止させ，封入後，光学顕微鏡にて観察および写真撮影を行った。
３．結果と考察

ISHを実施した。ISHは過去の報告３）に記載され

3 . 1 新 規 ダ イ ノ ル フ ィ ン 受 容 体 阻 害 剤た方法に従って実施した。ヤギの脳切片はウシと（PF4455242）がウシの血中LH濃度および同様の方法で採取・作製した。ヤギのダイノル

卵胞発育に与える影響

フィン受容体mRNA配列をもとにプローブ配列

PF4455242 を 投 与 し た １ 個 体（#6510），溶 媒を設計し，ジゴキシゲニン（DIG）ラベルした（蒸留水）を投与した３個体（#6527，#6535，

RNAプローブを作製した。切片をプロテアーゼ#9202）の血漿中LH濃度変化をFig.１に示した。

Ｋ（１μｇ/mL）にて37℃，15分間処理し，PBS

溶媒を投与した個体では，平均すると３～４時間

で洗浄後，ダイノルフィン受容体RNAプローブに１回のLHパルス（図中矢頭）がみられた。投を加えて60℃，一晩処理した。切片を洗浄後，ブ与開始前，投与中，投与終了後でパルス頻度の変ロッキング溶液を加えて37℃，１時間インキュ化は認められなかった。PF4455242投与群では，ベートしたのち，抗DIG抗体（１：1000；ロシュ）投与前と投与後には３～４時間に１回のLHパルを加えて37℃，２時間インキュベートした。切片

スがみられたが，投与中の４時間に２回のLHパを洗浄し，発色液（NBT/BCIP，ロシュ）を加ルスが検出された。１個体のみの結果であるが，えて室温，30分間発色させた。切片を洗浄して発PF4455242がLHパルス頻度を増加させる作用を© The Ito Foundation

新規繁殖制御中枢刺激剤が黒毛和種の卵胞発育に与える効果についての研究

129

Fig. 3 Localization of dynorphin in the arcuate nucleus（ARC）during follicular phase in cows. A representative

photomicrograph of dynorphin immunohistochemistry is shown. Neuronal fibers containing dynorphin weredetected in the ARC（white arrowhead）．Scale bar＝100μm.

持つ可能性が示唆された。今後，投与個体数を増や下部の弓状核とよばれる神経核に局在すること

してPF4455242の作用を精査していく必要がある。

が，ヤギを含む多くの哺乳類で明らかになってい上記の４個体における，PF4455242投与前後のる。このキスペプチンニューロンにダイノルフィ

卵 胞 直 径 の 経 時 的 変 化 を Fig. ２ に 示 し た 。

ンが共在していることもヤギ，ヒツジ等で報告さ

PF4455242を投与した個体は，投与中に卵胞直径れている２，４）。ウシにおいても弓状核にキスペプの変化はなかった。溶媒を投与した個体のうち１チンニューロンの細胞体が存在することを我々は個体では投与中に卵胞直径の変化はなく，２個体

最近見いだした（未発表）。本研究結果では，弓では投与中に卵胞直径が増加した。投与48時間後状核にダイノルフィンの神経線維の染色が観察さと投与前の卵胞直径を比較すると，PF4455242投

れ，ウシにおいても弓状核に存在するダイノル

与個体は1.5倍，溶媒投与個体はそれぞれ0.9倍，1.2

フィンがキスペプチン分泌を抑制していることが倍，1.6倍に増大していた。PF4455242は４時間の示唆された。しかし，弓状核周辺にダイノルフィ

薬剤投与中すぐに卵胞を増大させる効果はない

ン陽性の神経細胞体は検出されなかったことかが，その後の卵胞発育に促進的に作用している可ら，ウシのキスペプチンニューロンにはダイノル能性が考えられた。今後，投与個体数を増やすこ

フィンが共在せず，ダイノルフィンニューロンがとでPF4455242の卵胞発育促進効果を精査する必別に存在する可能性も考えられた。今後キスペプ

要がある。

チンとダイノルフィンの二重染色を行って，この3 . 2 ウシ視床下部におけるダイノルフィンおよびヤギ視床下部におけるダイノルフィン

点を確認する必要がある。
ダイノルフィン受容体ISHの結果，ヤギ視床下部においては非常に薄い染色しか認められなかっ受容体の局在
ウシ視床下部におけるダイノルフィン免疫染色た。海馬は強く染色されたことから実験系自体は結果の代表例をFig.３に示した。GnRH/LHパル

成功していると考えられ，視床下部におけるダイ

ス頻度を促進するキスペプチンニューロンは視床

ノルフィン受容体mRNA量は本研究で行った手© The Ito Foundation

130

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

法の検出感度以下であったと考えられる。ダイノ

するダイノルフィンがキスペプチン分泌を抑制しルフィン受容体を含むＧタンパク質共役受容体ていることが示唆された。今後さらなる実験によは，一般に発現量が少なく，また互いに相同性がりPF4455242の卵胞発育促進効果とその作用点を高く検出が難しいとされる。視床下部のダイノル明らかにしていく必要がある。

フィン受容体の検出には，より高感度の方法を用いる必要があると考えられる。ヤギで成功した手法を用いて，ウシの視床下部においてもダイノルフィン受容体の局在を明らかにしていく予定であ
る。
４．要

約

日本においてウシの受胎率は低下の一途をたどっており，ウシの繁殖機能を改善する新たな技術の開発が切望されている。我々は新規ダイノル
フィン受容体阻害剤（PF4455242）をウシの卵胞発育促進剤として応用できる可能性に着目し，以下の実験を行った。黒毛和種成熟雌ウシの頚静脈内にPF4455242（１μmol/㎏/時間）を４時間持続投与し，血中LH濃度と卵胞直径の変化を測定した。薬剤投与群でLHパルス頻度および卵胞直径が増加する傾向が認められたが，溶媒群との差は明瞭ではなかった。免疫染色により，ウシ視床下部弓状核においてダイノルフィンを含む神経線文
献１）
 Maeda K, Ohkura S, Uenoyama Y, Wakabayashi
Y , O k a Y , T s u k a m u r a H , ：O k a m u r a H .
Neurobiological mechanisms underlying GnRH
pulse generation by the hypothalamus. Brain Res，
1364，103～115，2010．
２）
 Wakabayashi Y, Nakada T, Murata K, Ohkura S,
Mogi K, Navarro VM, Clifton DK, Mori Y,
Tsukamura H, Maeda KI, Steiner RA, Okamura
H.：Neurokinin B and dynorphin A in kisspeptin
neurons of the arcuate nucleus participate ingeneration of periodic oscillation of neural activity
driving pulsatile gonadotropin-releasing hormone
secretion in the goat. J Neurosci，30，3124～3132，
2010．
３）
 Ohkura S, Takase K, Matsuyama S, Mogi K,
Ichimaru T, Wakabayashi Y, Uenoyama Y, Mori Y,
Steiner RA, Tsukamura H, Maeda KI, Okamura
H.：Gonadotrophin-releasing hormone pulse
generator activity in the hypothalamus of the goat.
J Neuroendocrinol，21，813～821，2009．
４）
 Goodman RL, Lehman MN, Smith JT, Coolen LM,
De Oliveira CV, Jafarzadehshirazi MR, Pereira A,
Iqbal J, Caraty A, Ciofi P, Clarke IJ.：Kisspeptin
neurons in the arcuate nucleus of the ewe express
both dynorphin A and neurokinin B.
Endocrinology，148，5752～5760，2007．

維の局在が認められ，ウシにおいて弓状核に存在© The Ito Foundation

131

ウシ胚盤胞のマウス子宮内あるいは体外培養における休眠誘導の可能性
Studies on the induction of embryonic diapause of bovine blastocysts inpseudo-pregnant mouse uteri, in which diapause conditions are created, or
under in vitro culture conditions

山

田

雅

保

（京都大学大学院農学研究科）

Masayasu Yamada（Laboratory of Reproductive Biology, Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

In the present experiments, we examined whether day 8 blastocysts from bovine in vitro
fertilized embryos（day 0）could enter into diapause following their transfer into mouse uteri
in which diapause conditions were created, or under in vitro culture conditions. Seven days
after transfer, diapausing bovine blastocysts were not able to recover from the mouse uteri. On
the other hand, all of bovine blastocysts cultured in KSOM medium with 0.6％ deionized BSA
and 10 mM threonine degenerated within 3 days in culture, whereas when cultured in medium
with 25 ％ or 50 ％ fetal bovine serum（FBS），it appeared that about 40 ％ or 60 ％ of theblastocysts remained alive with morphological characteristics of normal expanded blastocyst
for 5 days, irrespective of the presence or absence of threonine in the culture medium,
respectively. However, it still remains unknown wherther such bovine blastocysts in extended
period of culture have an ability to develop to term following transfer into bovine surrogate
recipients．

１．目

止し，着床せず，子宮内に浮遊した状態を維持す

的る３）。このような母体の受けるストレスによって哺乳類の齧歯目や有袋目など約100種類の動物

も，胚の休眠は引き起こされ，ストレスから解放

種では，胚盤胞の段階で休眠と呼ばれる“胚の発されると，休眠胚は，活性化されて子宮への着床

生を一時的に停止する現象”を引き起こすことがを開始する。マウスやラットでは胚盤胞の休眠を知られている。この休眠は，哺育に好ましく

実験的に引き起こすことが可能である。妊娠４日ない母体の栄養状態や気候などの環境下における目のマウスの卵巣を除去することでエストロジェ

分娩を避けるために，進化の過程で獲得されたもン分泌を遮断することによって，子宮内に到達しのと考えられている。また，授乳中の母親が妊娠た胚盤胞の着床が阻害され，そのような胚は休眠すると，胚盤胞へ発生した胚は子宮内で発生を停状態に入る。この状態は，術後毎日プロジェステ

１，
２）© The Ito Foundation

132

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

ロンを投与することで３週間以上維持することがルモン（hCG, 7. 5 IU）を投与することによって可能である 。また，エストロジェンを投与する

過排卵処理を誘起させたICR系マウスを交配し，と胚は活性化され，着床を開始するようになる５）。

膣栓が確認されたマウスの卵巣を妊娠４日目

最近，非休眠動物と考えられてきたヒツジの胚（day４，交配の翌日をday１とする）に除去し，盤胞を，卵巣除去偽妊娠マウスの子宮に移植する

その後１日毎にプロジェステロン（２mg）をと，胚は休眠状態で維持され，１週間後に子宮かday10（６日間の休眠）まで皮下投与した。あるら回収した休眠胚をヒツジ受容雌へ移植すること

いは，交配したマウスの皮下に抗エストロジェン

によって，非休眠胚盤胞の移植よりも高い割合で（fulvestrant, Sigma，投与量；50μｇ

産仔が得られることが報告された６）。ウシにおいをday３の18：00ｈとday４の８：00ｈと９：00ても同様に胚の休眠が誘導されることがNatureｈの間に投与した。いずれの方法においても，誌に紹介された７）。さらに，①単為発生胚盤胞がday10に子宮内を培養液で還流し回収された胚の子宮内で休眠維持されると，その着床後の発生能数を求め，その形態を観察した。

４）

が高くなる

８）

こと，②休眠胚盤胞にはDNA損傷を修復する能力があるに樹立される2 . 2 抗エストロジェン投与偽妊娠マウス子宮こと，そして③胚性幹細内へのマウスおよびウシ胚盤胞の移植

９）

胞が非休眠胚盤胞よりも休眠胚盤胞からより高率

100μｌ－１）

偽妊娠交配させ，膣栓の観察されたマウスの子

こと，が知られている。これら

宮内にday2.5に体外培養で２細胞期から発生したのことから，休眠による胚盤胞の質的改善と受胎胚盤胞を移植し，上記の通りに抗エストロジェン

能力の向上が大いに期待される。

を投与した。day10に子宮内を還流し，回収され10，11）

胚移植によるウシの生産において，体外受精胚

た胚の数（回収率）を求め，その形態を観察した。

や凍結保存胚などの体外操作胚の低受胎性が重大

また，ウシ屠体卵巣から採取した卵母細胞を常な問題となっている。しかし，これまでにこの問法により体外成熟・受精させ，８細胞期までBSA

題の解決に向けての研究が行われてきているが，添加修正SOFaa培地で培養し，その後５％ウシ血

必ずしも大きく進歩しているわけではないことか

清添加同培地で受精後８日目まで培養することにら，本研究では，ウシ胚盤胞の休眠をマウス子宮よって発生した胚盤胞，あるいは凍結保存胚盤胞内で，あるいは体外培養において誘導・維持するを偽妊娠マウスの子宮内にday2.5に移植し，上記ことによって，その胚質を改善し，受胎能力を高の通りに抗エストロジェンを投与した。移植後７

める新たな技術の開発を目標とし，マウス子宮内日目に子宮を還流し，回収された胚の数（回収あるいは体外培養で体外受精由来ウシ胚盤胞を休率）を求め，その形態を観察した。

眠誘導・維持できるのか，について検討した。
２．方

2.3

ウシ胚盤胞の体外培養

体外受精由来ウシ胚盤胞（受精後８日目）を①

法

0.6％脱イオン化BSA(dBSA）および10mMスレオ

2 . 1 卵巣除去あるいは抗エストロジェン投与

ニンを添加したmKSOM培地，②種々の濃度の牛によるマウス子宮内での胚盤胞の休眠誘

胎児血清（FBS，10％，25％，50％）および10mM

導・維持

スレオニンを添加したmKSOM培地，あるいは③

妊馬血清性腺刺激ホルモン（PMSG，7. 5 IU）

50mMスレオニン添加あるいは無添加50％FBS含を投与し，その48時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホ

有mKSOM培地で７日間37℃，５％ CO２気相下© The Ito Foundation

ウシ胚盤胞のマウス子宮内あるいは体外培養における休眠誘導の可能性

で培養し，胚の形態を経日的に観察した。

133（総 数 ９ 個）の み が 回 収 さ れ た だ け で あ っ た（Fig.１）。

３．結果と考察

また，36個の凍結保存ウシ胚盤胞を融解後，３妊娠マウスにおける胚盤胞の休眠の誘導・維持

匹の抗エストロジェン投与偽妊娠マウス子宮内へ方法の検討を行った。先ず，卵巣除去による方法移植した。融解後の形態から，全ての胚はＣランを検討した結果，day10に２匹の処置マウスの子ク胚と判定された。移植７日後に子宮還流をした宮を還流したところ，平均１匹当たり4.5個の遅結果，正常な胚盤胞は回収されず，ウシ胚由来と延着床胚盤胞（休眠胚）が回収された。しかし，思われる透明帯のみが３個観察された。以上の結卵巣除去がおそらく不完全であったため，残り３果から，抗エストロジェン投与マウス子宮内でウ匹のマウスでは，子宮へ着床した胎児が観察され

シ胚盤胞の休眠を誘導することはできなかった。

た。

ヒツジおよびウシ胚盤胞を卵巣除去偽妊娠マウ

次に，卵巣除去の代わりに，抗エストロジェン

ス子宮内で高い受胎能を保持した状態で休眠を維投与法について３匹のマウスを用いて検討した。

持したPtakらの報告６）を再現することはできな

day10にそのマウスの子宮内を還流したところ，かった。ただ，ウシ胚盤胞の休眠に関しては，全てのマウスから平均１匹当たり4.3個の遅延着

Nature誌のNewsで紹介されている７）だけで，具床胚盤胞が回収された。従って，遅延着床を確実

体的な結果は公表されているわけではない。我々に誘導するためにも，以降の実験には簡便な抗エは，Ptakらの方法６）通り，卵巣除去偽妊娠マウ

ストロジェン投与法を用いることにした。

スの子宮内への移植を１度だけ試みたが，正常胚次に，マウス卵管から回収した２細胞期胚を，は回収されず，ウシ胚由来と思われる透明帯のみ

0.3 ％ 脱 イ オ ン 化 BSA （dBSA） を 添 加 し たが回収されただけであった。この場合も，上述しmKSOM中で２日間培養し，胚盤胞へ発生した胚

たように，ごくわずかの卵巣組織が残っていた可を，上述の方法によって抗エストロジェンを投与能性は否定できない。

した偽妊娠交配３日後のマウスの子宮内へ移植

休眠を起こさないと考えられていた動物の胚盤（移植胚数：１匹のマウス当たり20個）した。移胞が休眠動物の子宮内へ移植すると，休眠が誘導植した胚をday10に子宮還流によって回収した。

されることは，ヒツジやウシだけではなく，過去移植した３匹のマウスから遅延着床胚盤胞が回収において休眠を起こさないフェレットの胚が，休され，平均１匹当たり6.0個の休眠胚盤胞が回収

眠を起こすミンクの子宮内で数日間生存性を維持された（平均回収率：30％）。

し，休眠が誘導されることが報告されている12）。

以上の実験から，体外培養で発生した胚盤胞の従って，今後，我々がマウス子宮内でウシ胚盤胞

子宮内移植による休眠誘導・維持を抗エストロの休眠を誘導できなかった原因を精査し，再度ジェン投与法で確実に行うことができることが明Ptakらのウシの実験結果７）を再現できるよう繰

らかとなった。そこで，体外受精後８日目に発生り返し実験を行う必要性は残されていると思われした総数48個のウシ胚盤胞を，３匹の抗エストロ

る。さらに，当初計画していたウシ胚盤胞のマウ

ジェン投与偽妊娠マウス子宮内へ移植し，その７ス胚盤胞との共移植や，マウスよりも子宮腔の容日後に子宮還流によって胚の回収を試みた。その積の大きい卵巣除去あるいは抗エストロジェン投結果，いずれの子宮からも，扁平化した変性胚

与偽妊娠ラット子宮内への移植を試みることを考© The Ito Foundation

134

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

A

B

Fig. 1 Morphological observation of bovine blastocysts transferred into pseudo-pregnant mouse uteri in which

diapause conditions were created．
A: Blastocysts before embryo transfer
B: Degenerated embryos recovered from mouse uteri 7 days after embryo transfer

63％の胚が胞胚腔を拡張した状態で維持されるこえている。
次に，我々はマウス遅延着床胚盤胞を，高い受とが観察された。また，50％血清添加培地からス胎能を維持した状態で５日間維持できる体外培養

レオニンを除去した場合，あるいはその培地に法の開発に成功していることから，ウシ胚盤胞の50mMスレオニンを添加したいずれの場合におい休眠を誘導する体外培養法の開発に着手することても，胚盤胞の形態維持効果に変化はなかった。
以上の結果から，ウシ胚盤胞の形態および生存にした。
体外受精由来ウシ胚盤胞（ｎ＝30，受精後８日

性を体外培養で５日間維持できる培養条件が明ら目）をマウス遅延着床胚盤胞の培養に有効であっかとなったが，このような遅延着床胚盤胞の内部た培地（10mMスレオニン添加0.6％

細胞塊数及び試験管内着床能の経日的推移についd-BSA含mKSOM培地）で７日間培養した。胚盤胞の形態ては現在検討中である。

を経日的に観察した結果，胚盤胞の形態は維持さ

マウス着床遅延胚盤胞の休眠誘導にスレオニン

れず，数日後には全ての胚が萎縮し変性した。

が重要な役割を演じているが，ウシ胚盤胞ではそ

そこで，d-BSAの代わりに種々の濃度（10％，のような効果はないことが示唆された。マウス遅25 ％ そ し て 50 ％ ）の ウ シ 胎 児 血 清 を 添 加 し た

延着床胚盤胞でのスレオニンの効果は，内部細胞

10mMスレオニン含有mKSOM培地で培養した結塊のミトコンドリアに局在するスレオニン脱水素

果，10％（ｎ＝30）の濃度では，３日後には全て

酵 素（TDH）に よ っ て ス レ オ ニ ン が ア セ チ ルの胚で胞胚腔は萎縮したが，25％（ｎ＝30）の濃CoAとグリシンに代謝されることで発揮される。

度では，45％の胚が培養５日目まで変性あるいは

特に，我々は，TDHによってグリシンとプロピ

逆に伸長することなく拡張胚盤胞としての形態をオ ニ ル CoA に 代 謝 さ れ る ス レ オ ニ ン の 変 異 体

維持し，さらに50％（ｎ＝30）の高濃度では，（hydroxynorvaline）を用いたマウスでの実験か© The Ito Foundation

ウシ胚盤胞のマウス子宮内あるいは体外培養における休眠誘導の可能性

135

ら，アセチルCoAの重要性を示唆している。アセ外培養を試みたところ，25％あるいは50％の高濃チルCoAは，エネルギー源として作用するだけで度のFBSを添加したmKSOM培地で培養すると約なく，ヒストンのアセチル化におけるアセチル基40～60％の胚が拡張胚盤胞の形態を５日間維持す供与体でもある。ヒストンへのアセチル基供与体

ることが分かった。しかし，このように形態を維として働くために，アセチルCoAがＬ―カルニチ

持した胚盤胞に着床能力などの機能が保持されてンによってミトコンドリアから核内へ運搬されるいるのかについては明らかとなっていない。

ことも分かっている13）。最近，マウス遅延着床胚盤胞のより長期間の形態維持，特に内部細胞塊数の維持にＬ―カルニチンが有効であることを我々は明らかにしている。また，Ｌ―カルニチンは細胞寿命の延長にも関連することから，今後ウシ胚盤胞に対するＬ―カルニチンや他の細胞寿命延長効果をもつレスベラトロールなどの種々の物質についても着目し，研究を進めていく予定である。
４．要

約

本研究では，体外受精由来ウシ胚盤胞の休眠をヒツジと同様に偽妊娠マウスの子宮内で，あるいは体外培養で誘導・維持できるのかについて検討した。その結果，マウス胚盤胞の休眠を確実に誘導・維持する抗エストロジェン投与偽妊娠マウス
子宮内に受精後８日目の胚盤胞を移植し，７日後に子宮を還流したところ，変性した胚のみが回収され，ヒツジ胚盤胞のようにマウス子宮内でウシ
胚盤胞の休眠を誘導・維持することはできないと文
献１）
 Mantalenakis SJ, Ketchel MM：J. Reprod.
Fertil．，12，391～394，1996．
２）
 Yoshinaga K, Adams C,：J. Reprod. Fertil．，12：593～595，1996．
３）
 Nichols J, Chambers I, Taga T, Smith A,：
Development，128：2333～2339，2001．
４）
 Weitlauf HM：J.Reprod.Fertil．
，39：213～224，
1974．
５）
 Hamatani T, Daikoku T, Wang H, Matsumoto H,
Carter MG, Ko MSH, et al. ： Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA，101：10326～10331，2004．
６）
 Ptak GE, Tacconi E, Czernik M, Toschi P,
Modlinski JA, Loi P：PloS One, 7: e33027，2012．
７）
 Nicholls H：Nature/News, doi：10. 1038/nature．
2012．
８） Kaufman MH, Barton SC, Surani MA,：Nature ，265：53～55，1977．
９） Surani MAH, Fishel SB,：J.Reprod.Fertil．，29：
159～172，1981．
10）
 Brook FA, Gardner RL：T, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA，94：5709～5712，1997．
11）
 Evans MJ, Kaufman MH ： Nature ， 292 ： 154 ～
156，1981．
12）
 Chang M,：J. Exp. Zool．，168：49～59，1968．
13）
 Madiraju P, Pande SV, Prentki M, Madiraju SR：
Epigenetics，４：399～403，2009．

思われた。一方，受精後８日目のウシ胚盤胞の体© The Ito Foundation

136

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発
Development of rapid and non-destructive diagnostic system for cow's
estrus and pregnancy

ツェンコヴァ

ルミアナ・竹村豪・ジョージバザール（神戸大学大学院農学研究科）

Roumiana Tsenkova, Go Takemura, George Bazar（Biomeasurement Laboratory, Kobe University Graduate School of Agricultural Science）

The purpose of this research is to develop a system which enables us to diagnose cow's
estrus non-destructively, rapidly and easily by means of near infrared spectroscopy (NIRS) and
Aquaphotomics proposed as new NIRS analytical method recently. Aquaphotomics is themethod that can measure changes of solutes in solution by observing water NIR spectra which
is changed by changes of solutes, so this method is very useful to measure changes in bio
systems．
This research examine the possibility that NIR spectra of milk and blood serum of a dairy
cow can be used to measuresexual hormone（progesterone）which changes just before estrus
period. Six cows whose estruses were induced by hormone infusionwere used and milk andserum samples’ NIR spectra were acquired and measured over the examined period. Sampling
period contained planned estrus days in the middle of it. Progesterone concentration of serum
samples wasmeasured by enzyme immunoassay which was used as conventional method tomeasure sexual hormone. With it, the important wavelength ranges which showed changes ofprogesterone were investigated. From the results of partial least square regression,1384 ～ 1397
nm, 1409 ～ 1446 nm were found to be very important ranges to show changes of progesteronein milk and serum respectively. In the future, with knowledge acquired, we will try toconstruct small and cheap NIR sensor for easy and fastestrus detection．
．

１．目

を開発している１）。この手法は生体内のホルモン的等，水溶液中の溶質の変化が及ぼす水の物理化学

本研究では近赤外分光法と同法における新たな的構造変化を近赤外線による水の吸収スペクトル分析手法であるアクアフォトミクスを用いて，牛の変化から読み取るものである。あらゆる生体のの発情・妊娠の診断を非破壊，迅速かつ簡便に行

大部分は水分で構成されるため，この手法で生体うことのできるシステムの開発を行う 。

の溶質の微量な変化を水の吸収スペクトルを通し

１）

当研究グループでは近年，近赤外分光法を発展させ，アクアフォトミクスという新たな分析手法ての計測が可能となる。
本研究ではこの手法を用いて，牛の発情・妊娠© The Ito Foundation

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発

137に関するホルモンの分泌状況から牛の発情・妊娠

し，将来的にデータ解析を行う予定である。同時時に特徴的な近赤外スペクトルパターンを明らかに従来の性ホルモン濃度測定法であるエンザイムにし，これを非破壊，迅速かつ簡便に検出する診

イムノアッセイ法（以下，EIA法）を用いて，マ断システムを開発する。将来的にはこのシステム

イクロプレートリーダー（iMark, BioRad社）でを用いて畜産農家が日々の業務の中で利用できる

血清中サンプル中のプロジェステロン濃度も測定

小型，安価かつ簡易なセンサーを開発することをし た 。さ ら に ，ポ ー タ ブ ル 近 赤 外 分 光 器

目指す。

（NIRGUN, FUNTEC社）を用い，同期間中に牛特に本稿では牛の発情について，発情時期の直の乳房および静脈の近赤外スペクトルも測定し，前に血液や生乳中でその濃度が特異的に変化する

こちらも将来的にデータ解析を行う予定である。

性ホルモンであるプロジェステロンの変化を近赤

第２回目は2013年10，11月に，第１回目の実験

外分光法およびアクアフォトミクスによって捉えとは異なる４頭の供試牛を用いて行った。内１頭ることを目的とする。

はホルモン製剤処理の行われていない黄体期の牛２．方を選び，コントロール牛とした。他の条件はほぼ法

第１回目の実験と同様であったが，血清サンプル

牛の発情時期の直前には，血中プロジェステロン

の採取を８日間に加えて，数日おきに９サンプルの濃度が大きく低下することが報告されている 。

多く採取した。また，乳房と静脈の測定に関して，また，血清中プロジェステロン濃度の変化は生乳

第１回目に用いたポータブル分光器に加えて，さ中の同濃度に反映され，高い相関関係があること

らに小型のポータブル分光器（MicroNIR, JDSUが分かっている３）。従って，本研究では発情時期

社）によっても近赤外スペクトルを採取し，将来を含む一定期間，供試牛から血液（分析には血清的にデータ解析する予定である。

２）を精製・利用した），生乳をサンプルとして採取

本稿では２度の実験で，設置型分光器XDSにし，すべてのサンプルの近赤外スペクトルを測定より得られた血清および生乳の近赤外スペクトルした。

とEIA法によって得られたプロジェステロン濃度

実験は２度行い，第１回目は2013年５，６月に，の値を用いて，プロジェステロン濃度の変化を血３頭の供試牛を用いて行った。供試牛は兵庫県立

清および生乳のスペクトルの変化から捉えるため

農林水産技術総合センター淡路農業技術センターの解析結果について報告する。解析はすべて，水で飼育されているホルスタイン牛を用い，ホルモ

分子の第一倍音に関する情報を豊富に含む波長領

ン製剤によって発情を誘起した。発情予定日を中域である1300 ～ 1600nmを用いた。また，牛毎に間に含む１ヶ月間毎日，午前と午後に生乳を採取

分けて解析を行い，牛乳に関しては乳成分が極端した。また，発情予定日を中間に含む８日間毎日に異なるという理由から，午前と午後を分けて解血清を採取した。すべてのサンプルは設置型近赤析した。

外分光器（XDS, Metrohm社）で近赤外スぺクト
ル（測定波長範囲：400 ～ 2500nm，光路長：１mm，測定方法：透過法，反復測定回数：血清６，
生乳３）を測定した。一部のサンプルは他の２種の小型分光器によっても近赤外スペクトルを測定

３．結果と考察3 . 1 EIA法による血清中プロジェステロン濃度測定
牛の体内プロジェステロン濃度は発情の直前に© The Ito Foundation

4

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

166
190
191

3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
6/1～
0

6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8 6/96/10 day

P4 concentration（ng/ml）

P4 concentration（ng/ml）

平成25年度

6

170
171
185
176

5
4
3
2
1
0

day

11
11/1
11/5
11/6
11 /8
11/11
11/12
11/13
11/14
11/15
11/16
11/17
11/18
11/20
11/23
11/26
11/28
/3
0

138

Fig. 1 Concentration of serum samples measured by EIA（Left: 1st experiment. 3 cows named 166, 190 and 191. Right : 2nd experiment. 4 cows named 170, 171, 185 and 176（no hormone treatment cow ; control cow）． The lines at 6/4, 11/5 and 11/12 are removing of hormone
preparation, insertion and removing）

Cow A
B
C
D
E
F
G

Absorbance
（-）

1.2

0.8

0.4

Cow A
B
C
D
E
F
G

2.5
2.0
1.5
1.0

1399.51499.51599.51399.51499.51599.5

Wavelength（nm）
Fig. 2 Raw NIR spectra of serum and milk samples
（Left: Raw NIR spectra of serum. Right : Raw NIR spectra of milk．）

急激に低下することが分かっている２）。ホルモン（Fig.１）。実験に用いた全７頭の牛の血清中プロ製剤による発情の誘起は，膣内留置型ホルモン製

ジェステロン濃度のレンジは4.79 ～ 0.011（ng/剤（PRIDもしくはCIDR）を挿入し，人工的に牛ml）であった。

の体内プロジェステロン濃度を高い水準に保ち，適当な期間留置した後，製剤を除去することで体内プロジェステロン濃度を人工的に急激に低下させることで行う。

3 . 2 PLS回帰分析によるプロジェステロン濃度予測とそれに寄与する波長領域
Fig.２に設置型近赤外分光器XDSにより得られた生乳および血清サンプルの近赤外スペクトルをEIA 法 に よ る 血 清 中 プ ロ ジ ェ ス テ ロ ン 濃 度示す。本項では，プロジェステロン濃度を予測す（ng/ml）を測定した結果，コントロール牛を除るために，EIA法による血清中プロジェステロン

くすべての牛で，膣内留置型ホルモン製剤の除去

濃度の測定値を目的変量とし，生乳および血清の前後でプロジェステロン濃度に大きな高低差が確

近 赤 外 ス ぺ ク ト ル を 用 い て ， Partial Least

認され，ホルモン製剤による体内プロジェステロ

Squares回帰分析（以下PLS回帰分析）による分ン濃度の操作は成功していたことが確認された析を行った。PLS回帰分析とは，主成分分析に基© The Ito Foundation

139

① ②

4

Ｒ∧２＝0.87

3

SEV＝0.43

Regression Vector（-）

Predicted progesterone concentration(ng/ml）

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発

2
1
0

Cow A
B
C
D
E
F
G

10
0
-10

1
2
3
Measured progesterone concentration(ng/ml）

1399.51499.51599.5

Wavelength（nm）

Fig.3 PLS regression Y-fit and regression vector of serum．
（Left: One example of Y-fit（Cow E）． Right : Normalized regression vectors of all cows.
The range ① is 1384～1390 nm and ② is 1409～1420 nm．）

づいた回帰分析であり，元々のデータを構成する

スペクトルからプロジェステロン濃度を予測する変量を用いて回帰を行う重回帰分析と類似してい際に寄与した波長範囲を表す回帰ベクトルから，るが，PLS回帰分析では主成分分析によって合成

1384 ～ 1390nm と 1409 ～ 1420nm の 範 囲 が プ ロ

された変量を用いて回帰を行う点で，近赤外スペ

ジェステロン濃度の予測に特に重要な波長である

クトルのような多変量データへの適用に適していと考えられた（Fig.３）。
一方，血清中のプロジェステロン濃度の変化はる。
血清におけるPLS回帰分析では，より高精度な

生乳中に良く反映され，強い相関関係にあること結果を得るために，スペクトルの前処理を行っから，生乳に関しても同様にプロジェステロン濃た。主に用いた前処理としては，スペクトルに含度を目的変量としたPLS回帰分析を行った。主な

まれるランダムノイズを低減させる効果のある平

前処理は平滑化，SNV，OSC処理であり，クロ

滑化，スペクトルに内在するピークを強調するこスバリデーションによる精度評価を行った。生乳とのできる二次微分，スペクトルのベースラインのPLS回帰分析では，２度の実験のおける計７頭

補正効果があるSNV処理，また目的変量に対しの牛で，プロジェステロンの平均回帰精度としてて回帰を行うのにより適当な変量をあらかじめ選

午前と午後でそれぞれ，決定係数Ｒ２＝0.85，0.89，

び出す前処理であるOrthogonal signal correction

バ リ デ ー シ ョ ン 誤 差 SEV ＝ 0.32 ，0.25（ng/ml）

処理（以下OSC処理）があり，これらの組み合わであった。また，回帰ベクトルから，午前ではせで最も良い精度が得られた結果を用いた。ま1390 ～ 1392nmと1424 ～ 1446nm，午後では1390

た，より信頼できる回帰精度を得るために，クロ～ 1397nmと1413 ～ 1444nmの範囲がプロジェス

スバリデーションによる精度評価を行った。

テロン濃度の予測に特に重要な波長であると考え

PLS回帰分析では，２度の実験のおける計７頭られた（Fig.４，５）。

の牛で，プロジェステロンの平均回帰精度として

3.3

決定係数Ｒ２ ＝0.78，バリデーション誤差SEV＝

上記の結果から，水の第一倍音領域である1300

0.45（ng/ml）であった。また，PLS回帰分析で～ 1600nmの範囲の近赤外スペクトルを用いるこ© The Ito Foundation

考察平成25年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）①

Ｒ∧２＝0.82
3

Regression Vector（-）

Predicted progesterone concentration(ng/ml）

140

SEV＝0.62

1

-1

②

Cow A
B
C
D
E
F
G

5
0
-5
-10

0
1
2
3
4
Measured progesterone concentration(ng/ml）

1399.51499.51599.5

Wavelength（nm）

Fig. 4 PLS regression Y-fit and regression vector of milk（am）．
 （Left: One example of Y-fit（Cow F）． Right : Normalized regression vectors of all cows.

①

is 1390～1392 nm and②

is 1424～1446nm．）①

Ｒ∧２＝0.82
3

Regression Vector（-）

Predicted progesterone concentration(ng/ml）

The range

SEV＝0.62

1

-1

②

Cow A
B
C
D
E
F
G

5
0
-5
-10

0
1
2
3
4
Measured progesterone concentration(ng/ml）

1399.51499.5
Wavelength（nm）1599.5

Fig. 5 PLS regression Y-fit and regression vector of milk（pm）
．

（Left
: One example of Y-fit（Cow F）．Right : Normalized regression vectors of all cows.
The range ① is 1390～1397 nm and ② is 1413～1444 nm．）とにより，牛の血清および生乳からプロジェステ
ロン濃度を測定することができる可能性が示唆さ４．要約れた。特に1384 ～ 1397nm，1409 ～ 1446nmがプ

本研究では近赤外分光法と，近年提唱されていロジェステロンの濃度変化に伴って，スペクトルる近赤外分光法における新たな分析手法であるア値が大きく変化する領域であることが分かった。

クアフォトミクスを用いて，非破壊，迅速かつ簡本研究で得られた重要な波長領域を用いて，今後

便に牛の発情診断を行うシステム開発を目的とすはプロジェステロン濃度に基づいた判別分析などる。アクアフォトミクスとは，水溶液中の溶質のも行い，将来的には必要最低限の光のみを照射す変化に伴う水分子の変化を近赤外スペクトルの変ることのできる小型，安価で簡易なセンサーの開化から読み取る手法であり，生体内の変化を診断発に着手したいと考えている。

するのに適している。本研究では牛の生乳や血清中のプロジェステロン（性ホルモン）の濃度変化© The Ito Foundation

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発

141を近赤外スペクトルによってとらえることで発情ことが分かった。今後は，得られた知見を用いての診断の可能性を検討した。従来の性ホルモン濃小型，安価で簡易なセンサーの開発を目指す。

度測定法であるEIA法によって，ホルモン製剤によって発情を誘起した計６頭の牛のプロジェステ
ロン濃度の変化を測定し，それを基にプロジェス
テロン濃度に関係する近赤外波長領域を調べた。
PLS回帰分析の結果から特に，1384 ～ 1397nm，1409 ～ 1446nmの範囲がプロジェステロン濃度の変化に伴って変化を起こす波長領域であるという

文
献１）
 R.Tsenkova ： J.Near Infrared Spectrosc ．， 17 ，
303～314，2009．
２）
 中尾敏彦，版，37，57，酪農総合研究所，札幌市，
2000．
３） J.B.Roelofs, F.J.C.M Van Eerdenburg, W.
H a z e l e g e r , N . M . S o e d e , B . K e m p ：A n i m a l
Reproduction Science，91，337～343，2006．

© The Ito Foundation

142

リソソーム酵素活性制御による高温ストレス下でのウシ胚発生改善に関する研究
Study on improvement of bovine embryonic development under heatstress by regulation of lysosomal enzyme activities

山

中

賢

一・阪

谷

美

樹＊

（佐賀大学農学部，＊九州沖縄農業研究センター）

Ken-ichi Yamanaka and Miki Sakatani＊（Faculty of Agriculture, Saga University, ＊National Agricultural Research Center for Kyushu Okinawa Region）

Previous studies have reported that cathepsin B, lysosomal cysteine protease, had anegative correlation with the quality of bovine oocytes and embryos. Cathepsin B increases inpoor-quality bovine oocytes and embryos, which is associated with low developmental
competence, than in good-quality ones. Therefore, the objective of this study was to investigate
the effects of heat stress during fertilization and subsequent embryo development on in vitro
development and cathepsin B activity of bovine embryos. The developmental rate to blastocyst
stage was significantly decreased by heat stress（40.0 ℃）during in vitro fertilization and invitro culture. Next, intracellular localization of an active form of cathepsin B was observed. The
active form of cathepsin B was significantly observed throughout cytoplasm in embryos
exposed to heat stress during in vitro fertilization and in vitro culture. On the other hand, thedevelopmental rate to blastocyst stage of embryo exposed to heat stress was significantly
improved by addition to fertilization and culture medium of cathepsin B inhibitor（E-64）．
Moreover, cathepsin B activity of heat stressed embryos was decreased by addition of E-64,
and was similar to that of control embryos. In conclusion, the present results implicate that
there is a negative correlation between the developmental competence and cathepsin B activityof bovine embryos exposed to heat stress, and also its developmental competence can be
improved by controlling cathepsin B activity．

１．目

意に高いことを明らかにした。また，このカテプ

的

シンＢの活性を阻害剤であるＥ-64により抑制す

我々は，これまで体外生産胚の高品質化を目的ることで，低品質胚において顕著に起こるアポとして，卵子および胚の品質マーカーとなる候補

トーシスを抑制できること，さらには胚の発生率

として，リソソーム内にあるシステインプロテを向上できることを明らかにした１，２）。これらのアーゼに属するカテプシンＢの活性に着目した研結果は，カテプシンＢの活性が卵子および胚の品究を行ってきた。その結果，低品質の卵子および質と負の相関があること，さらに，その活性を制胚ではカテプシンＢの酵素活性および発現量が有御することで胚の品質を向上させうることを示し© The Ito Foundation

143

リソソーム酵素活性制御による高温ストレス下でのウシ胚発生改善に関する研究ている。すなわち，これらの知見から高温環境下

実験３：の生殖細胞においても同様に細胞内のカテプシン

体外発生培養をコントロール区（Control）でＢ活性が高いレベルにあり，それが引き金となっは38.5℃，高温ストレス区（HS）およびＥ-64をて品質の低下や発生停止を起こしているのではな

0.1，0.5および１μＭの濃度で添加した区（HS＋いかということが強く予想される。

Ｅ-64）では培養後１日まで40.0℃でそれ以降はそこで，本研究では，体外モデルを用いた高温

38.5℃で行った。培養後，２日で分割率，８日で胚ストレス下での受精，胚発生に対するＥ-64添加

盤胞形成率および胚盤胞期胚の細胞数を算出した。

の効果をカテプシンＢ活性との関係とともに検証

実験４：

することを目的とした。
２．方
2.1

実験３と同様にコントロール区（Control），高
温ストレス区（HS）およびＥ-64を0.5μＭの濃度法で添加した区（HS＋Ｅ-64）を設けた。実験２と実験デザイン

同様に体外発生培養後１日目の２～８細胞期の胚実験１：を用いて活性型のカテプシンＢの局在を調べた。

体 外 受 精 を コ ン ト ロ ー ル 区（Control）で は３．結果と考察

38.5℃，高温ストレス区（HS）およびＥ-64を１，５および10μＭの濃度で添加した区（HS＋Ｅ-64）

実験１および２では体外受精時の高温ストレスでは40.0℃で行い，培養後10時間で前核形成率，が体外発生能およびカテプシンＢに及ぼす影響に２日で分割率，８日で胚盤胞形成率，胚盤胞期胚

ついて調べた。まず実験１の結果から体外受精時の細胞数およびアポトーシス陽性細胞率を算出しに高温ストレスを受けたHS区ではControl区と比た。

較して分割率および胚盤胞の形成率が有意に低下

実験２：することが明らかとなった（Table１）。本研究で

実験１と同様にコントロール区（Control），高は高温ストレス温度は40.0℃と以前の我々の研究

温ストレス区（HS）およびＥ-64を５μＭの濃度も含め多くの研究で高温ストレス温度として用いで添加した区（HS＋Ｅ-64）を設け，体外発生培られている41.0℃より低い設定であった。それに養後１日目の２～８細胞期の胚を用いて活性型のもかかわらず，顕著な発生低下が認められたこと

カテプシンＢの局在を調べた。

からウシ胚が従来想定されているよりも高温スト
レスに対して感受性が高いことが示唆される。一Table 1 Effect of E-64 on in vitro development of bovine embryos exposed to heat stress during in vitro fertilization
Treatment

No. of embryos

No．（％）of cleaved
embryos

Control

373

252（67.6）ａａ42（16.7）

130.5±5.03ab

HS（Heat Stress）

399

170（44.2）ｃｂ10（5.9）126.2±7.76ａ

HS＋Ｅ-64（１μＭ）

288

174（60.4）ａｂ14（8.0）137.5±10.45ab

HS＋Ｅ-64（５μＭ）

369

224（60.7）ａａ41（18.3）

152.0±8.11ｂ

377

194（51.5）ｂｂ18（9.3）129.0±8.77ab

HS＋Ｅ-64（10μＭ）＊of blastocysts
No．
（％）＊The percentage is the ratio of blastocysts to cleaved embryos．
ａ－ｃValues with different superscripts within same column are significantly different（P＜0.05）．

© The Ito Foundation

Mean no.±SEM of cellsin blastocysts

144

平成25年度A

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）
B

C

Bright ﬁeld

Cathepsin B
Fig. 1 Micrographs of the active form of Cathepsin B localization in bovine embryos. Intracellular localization of theactive form of Cathepsin B was detected as red fluorescent dots（white arrow）． The localization of the active
form of Cathepsin B was classified into the following three categories:（A）， there is no fluorescent dot; （B），
several fluorescent dots were partly observed;（C）fluorescent dots were observed throughout cytoplasm．

方，Ｅ-64を５μＭ添加した区では高温ストレス

結果，Control区，HS区およびHS＋E-64（5 M）

を受けても分割率，胚盤胞形成率および胚盤胞期区でそれぞれ84.0，77.4および82.8％であった。

胚の総細胞数がHS区と比較して有意に高く，しかしながら，分割率ではHS区で有意な低下がControl区と同等の成績であった（Table１）。こ

みられたことから，今回設定した受精時の高温ス

れらの結果は，Ｅ-64の添加は体外受精時の高温

トレス条件では前核形成に影響を及ぼさないが，ストレスを受けた胚の体外発生能を改善するのにその後の第一分割までの間に何らかの発生停止を有効で，さらに，５μＭが最適な添加濃度である誘起をする機構が働いていることが予想された。

ということを示している。また，胚盤胞期胚のア一方で，Ｅ-64を添加した区においてもControl区

ポトーシス陽性細胞の発生率に関しては，と同等の前核形成率が得られたこと，さらに顕微Control区，HS区およびHS＋Ｅ-64）5μＭ）区で鏡下での観察でも精子の運動性や生存性に対するそれぞれ11.7±1.0，12.6±1.6および8.3±1.1％でＥ-64の悪影響は観察されなかったため，将来的あり，各区間に有意な差はみられなかった。このには夏季の受胎率向上のためにＥ-64の効果を人理由としては，上述の通り今回の研究で用いた高工授精へ利用できる可能性が示された。

温ストレス温度が比較的低かったことが考えられ

次に実験２では体外受精時の高温ストレスが活るとともに，今後，胚盤胞期より前の発生ステー性型カテプシンＢの細胞質内局在に及ぼす影響にジにおけるアポトーシスの検証が必要と考えられついてControl区，HS区，実験１の結果から発生る。また，本実験では前核形成率について調べた率の高かったHS＋Ｅ-64（５μＭ）区について調© The Ito Foundation

145

リソソーム酵素活性制御による高温ストレス下でのウシ胚発生改善に関する研究

Table 2 Effect of E-64 on the localization of Cathepsin B of bovine embryos exposed to heat stress during in vitro

fertilization
Treatment

No. of embryo examined

Ｂ（％）

Ｃ（％）

Control30

ａ16（53.3）８（26.7）

６（20.0）HS36ｂ７（19.4）18（50.0）11（30.6）24

ａ13（54.2）

７（29.2）４（16.7）

HS＋Ｅ-64（５μＭ）
＊

Ａ（％）＊

The localization of the active form of Cathepsin B was classified into the following three categories:（A），there is no fluorescentdot;（B），several fluorescent dots were partly observed;（C）fluorescent dots were observed throughout cytoplasm．
ａ，ｂValues with different superscripts within same column are significantly different（P＜0.05）．

べた。その結果，活性型カテプシンＢの局在の違ため，実験３では，体外培養開始後１日目まで

いにより３つのグループ（Ａ：見られない

Ｂ：

40.0℃で培養する条件をHS区とすることとした。

Ｃ：細胞質全体に見らその結果，HS区では胚盤胞の形成率がControl区

れる）に分類することができた（Fig.１）。このと比較して有意に低かったのに対して，HS＋分類に従ってその割合を各区間で比較したとこ

Ｅ-64（0.5μＭ）区ではControl区と比較すると低ろ，HS区では活性型のカテプシンＢが細胞質内い傾向であったが統計的な有意差は認められなに見られないＡに分類された割合がControl区おかった（Table３）。一方，HS＋Ｅ-64（0.5μＭ）

よびHS＋Ｅ-64（５μＭ）区と比較して有意に低区はHS区と比較して胚盤胞の形成率が有意に高い結果となった（Table２）。これらのことは体外い結果であった。また，胚盤胞期胚の総細胞に関

受精時の高温ストレスが活性型カテプシンＢを増しては，Control区，HS区およびHS＋Ｅ-64（0.5

加させること，さらに，Ｅ-64の添加はそれらをμＭ）区でそれぞれ118.8±6.9，96.8±12.1および抑制することに有効であることを示している。以109.0±7.2であり，各区間に有意な差はみられな上の結果から，体外受精時に高温ストレスを受けかった。これらの結果は体外受精時の高温ストレたウシ胚における発生能とカテプシンＢ活性の間スと同様に体外発生時の高温ストレスに対してもには負の相関があることが示された。

Ｅ-64の添加が発生能低下抑制に有効であること

細胞質に一部で見られる

実験３および４では体外発生培養中の高温ストを示した。

レスが体外発生能およびカテプシンＢに及ぼす影

実験４では，体外発生１日目までの高温ストレ

響について調べた。まず実験３を行う前に体外発スが活性型カテプシンＢの細胞質内局在に及ぼす生培養のどの時期に高温ストレスを負荷すること影響について実験２同様にControl区，HS区，実が有効であるのかについて予備実験を行った。実験３の結果から発生率の高かったHS＋Ｅ-64（0.5験区として体外培養後１，２，
４および６日目までμＭ）区について調べた。その結果，HS区では40.0℃で，その後は通常の38.5℃で培養する区，

活性型のカテプシンＢが細胞質内に見られないＡ

また，これらとは逆に，培養開始時は38.5℃で培に分類された割合がControl区およびHS＋Ｅ-64

養 し ，体 外 培 養 後 １，
２，
４および６日目から（0.5μＭ）区と比較して有意に低い結果となった

40.0℃で培養する区を設け，発生率を比較した。

（Table４）。さらに，活性型のカテプシンＢが細その結果，発生培養開始後１および２日目の発生

胞質全体に見られるＣと分類された割合がHS区

ステージにある胚は他の発生ステージの胚と比較で他の区と比較して有意に高い結果であった。こして高温耐性が有意に低いという結果が得られた

れらの結果は，実験２と同様に体外発生時の高温© The Ito Foundation

146

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 3 Effect of E-64 on in vitro development of bovine embryos exposed to heat stress after fertilization
Treatment

No. of embryos

No．（％）of cleaved embryos＊of blastocysts
No．（％）

Control

130

82（63.1）ａ18（22.0）

HS(Heat Stress）

132

80（60.6）ｂ２（2.5）

HS＋Ｅ-64（0.1μＭ）

125

78（62.4）bc
３（3.8）

HS＋Ｅ-64（0.5μＭ）

128

77（60.2）

ac９（11.7）

HS＋Ｅ-64（１μＭ）

118

81（68.6）

bc
７（8.6）＊The percentage is the ratio of blastocysts to cleaved embryos．
ａ－ｃValues with different superscripts within same column are significantly different（P＜0.05）．

Table 4 Effect of E-64 on the localization of Cathepsin B of bovine embryos exposed to heat stress after fertilization
Treatment

No. of embryo examined

Ａ（％）＊

Ｂ（％）

Ｃ（％）

Control44ａ28（63.6）

13（29.5）３（6.8）ａHS36ｂ13（36.1）

12（33.3）

10（28.6）ｂ

HS＋Ｅ―64（0.5μＭ）

42

ａ26（61.9）

12（28.6）４（9.5）ａ＊The localization of the active form of Cathepsin B was classified into the following three categories:（A），there is no fluorescentdot;（B），several fluorescent dots were partly observed;（C）fluorescent dots were observed throughout cytoplasm．
ａ，ｂValues with different superscripts within same column are significantly different（P＜0.05）．

ストレスによっても活性型カテプシンＢが増加す

抑制することで，胚の発生能低下を回避することることを示しており，実験３の結果と併せることができることも示された。

でカテプシンＢと発生率との間に負の相関がある

以上，高温ストレスを受けたウシ胚における発生能とカテプシンＢ活性の間には負の相関があことを示唆している。
カテプシンＢはリソソームの細胞内組織タンパ

り，カテプシンＢ阻害剤Ｅ-64の添加によって胚ク質の分解に重要な役割を果たしており，細胞内の発生能低下を改善できると考えられる。また今の不要なタンパク質の分解・再構成を行ってい回は，カテプシンＢの活性のみに注目して実験をる。しかしながら，ストレスや環境の影響等によ行ったが，高温ストレスによる胚の発生率の低下

りリソソームから漏出することで組織細胞の機能には細胞質内で活性酸素種が関与することも報告

阻害やアポトーシスを引き起こすことが知られてされており５），今後，リソソーム酵素の活性とこいる３）。我々は近年，体外成熟過程における高温

れらとの関係についてさらなる研究が必要である

ストレスが卵丘細胞と卵母細胞の両方においてカと考えられる。

テプシンＢ活性を増加させること，さらに，受精後の胚発生能が低下することを報告している４）。

４．要約

したがって，これらの知見と今回の結果から，卵

本研究では，夏季の受胎率低下の解決法への応

成熟，受精および初期胚発生過程を通じて高温ス用を目的として，ウシ体外受精および体外発生時

トレスによってカテプシンＢ活性が異常に誘起さにおける高温ストレスが卵母細胞および受精胚のれ，不必要なタンパク質分解が起こり，最終的に発生能と負に相関があることが報告されているカ

発生能や胚の品質低下が引き起こされている可能

テプシンＢ活性と体外発生能に及ぼす影響につい性が示唆された。また，これらの活性を人為的にて明らかにすることを目的とした。体外受精時ま© The Ito Foundation

リソソーム酵素活性制御による高温ストレス下でのウシ胚発生改善に関する研究

たは体外発生時に高温ストレス（40.0℃）を付加した結果，いずれの場合でも体外発生率はコント
ロール区と比較して有意に低下した。さらに，細胞質内の活性型カテプシンＢの局在を観察した結果，高温ストレスを受けた胚で活性型のカテプシ
ンＢが増加することが明らかとなった。一方，カ
テプシンＢの阻害剤であるＥ-64を添加した場合，
高温ストレスを負荷された胚の体外発生率がコン
ト ロ ー ル と 同 等 に ま で 改 善 さ れ た 。さ ら に ，
Ｅ-64の添加により活性型カテプシンＢの増加も抑制できることが確認された。以上の結果から，
高温ストレスを受けたウシ胚における発生能とカ

147

文
献
１）
 Balboula AZ, Yamanaka K, Sakatani, Hegab AE,
Zaabel S, Takahashi M：Molecular Reproduction
and Development，77，439～448，2010．
２）
 Balboula AZ, Yamanaka K, Sakatani M, Hegab
A E , Z a a b e l S , T a k a h a s h i M ：M o l e c u l a r
Reproduction and Development，77，1031～1039，
2010．
３）
 Vancompernolle K, Van Herreweghe F, Pynaert
G, Van de Craen M, De Vos K, Totty N, Sterling A,
Fiers W, Vandenabeele P, Grooten J：FEBS
Letters，438，150～158 1998．
４）
 Balboula AZ, Yamanaka K, Sakatani M,
Kawahara M, Hegab AE, Zaabel S, Takahashi M ：Reproduction，146，407～417，2013．
５）
 Sakatani M, Kobayashi S, Takahashi M：
Molecular Reproduction and Development ， 67 ， 77
～82，2004．

テプシンＢ活性の間には負の相関があり，その活性を制御することによって胚の発生能を改善できることが明らかとなった。

© The Ito Foundation

148

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発
Effects of functional components in grass on enhancing immunoglobulin incolostrum

久

米

新

一・王

蒙

東・谷

口

康

晴

（京都大学大学院農学研究科）

Shinichi Kume, Mengdong Wang and Yasuharu Taniguchi（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

Passive immunity is critical to the survival and health of neonates, and colostrum is asource of nutrients and immune components for neonatal calves. An adequate immune system
is required to prevent diarrhea in neonates, and colostral IgG and IgA of cows provides
protection against microbial antigens. Although

β-carotene supplementation has beenenhanced the retinoic acid-mediated immune response in neonates, the exact mechanism of β-cryptoxanthin or astaxanthin for enhancing mucosal IgA production in the small intestine andmammary glands is still unclear. The present study was conducted to clarify the effects ofsupplemental β-cryptoxanthin or astaxanthin in maternal mice during pregnancy and lactation
on IgA antibody-secreting cells（ASC）and mucosal IgA induction in the intestine andmammary glands of lactating mice, and to clarify the relationships between fat-soluble vitamins
and IgG or IgA concentrations in colostrum of Japanese Black cows. Because supplemental β-cryptoxanthin increased the numbers of IgA ASC in the jejunum and the mRNA expressionsof IgA C-region in the jejunum, ileum and mammary glands of maternal mice at 14 days
postpartum, supplemental

β-cryptoxanthin may be useful for enhancing mucosal immune

induction in lactating animals. The concentrations of IgG, IgA， β-carotene, vitamin A andvitamin E in colostrum of Japanese Black cows varied widely. There were positive correlations
among fat-soluble vitamins in colostrum, and there was a positive correlation between vitamin
A and IgG in colostrum. These results suggest that the improvement of vitamin status in
Japanese Black cows is effective to increase colostral IgG concentration．

１．目

近畿産ブランド和牛のほ乳期発育改善」を実施

的し，黒毛和種子牛の発育改善と疾病予防に適した

わが国の肉用牛経営では規模拡大や生産性向上

新たな人工哺乳技術を開発した。しかし，黒毛和が急速に進んでいるものの，下痢などによる子牛

種子牛には初乳由来の免疫グロブリンG（IgG）の損耗増加は黒毛和種繁殖経営に多大な経済的損と免疫グロブリンA（IgA）が不足して，下痢の失をもたらしている。代表研究者らは，農林水産

発生するケースが多数認められたため，母乳から省の実用技術開発事業で「ホエー代用乳を用いたの免疫成分の移行を高める方法を開発して，下痢© The Ito Foundation

149

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発

a)

HO
b)
O
OH

HO
c)

O

Fig. 1 The structural formulas of β-carotene（a），β-cryptoxanthin（b) and astaxanthin（c）．

などの疾病を予防することが重要と考えられた。

中のIgGだけでなく，IgAを増やすことも重要で

飼料中には栄養素だけでなく，家畜の生理機能ある。しかし，IgGに比較すると，黒毛和種繁殖や免疫機能を高める機能性成分が含まれているた牛のIgAに関する研究は非常に少ないため，代表め，子牛の下痢予防では飼料中の機能性成分を活研究者らは母乳中のIgA産生における機能性成分

用することが効果的である。特に，安全・安心なの作用機序を詳細に解明するとともに，初乳中の牛肉生産では抗生物質などの使用量低減が求めら

IgGとIgAを同時に高める機能性成分の給与法をれるが，機能性成分を活用した下痢などの疾病予開発して，新生子牛の下痢などの疾病を予防する

防方法の開発は抗生物質の使用量低減を可能にすことが必要と考えている。

る。また，草食動物である牛は牧草中に豊富に含そこで，本研究ではまず妊娠・泌乳マウスを実まれているβ-カロテンやビタミンＥなどを有効

験モデルとして利用し，それらのマウスに機能性利用して健康を維持しているが，代表研究者らは成分を給与して，母乳中のIgA産生の作用機序を

β-カロテンによる新生子牛の下痢予防効果を見詳細に解明するとともに，機能性成分による母乳いだした 。しかし，黒毛和種繁殖牛に良質の牧中のIgGとIgAの改善効果を明らかにする。なお，

草が給与されない場合には初乳中のβ-カロテン

本研究ではβ-カロテンと同様な効果が期待されなどが不足して，子牛の下痢発生率を高めることているβ-クリプトキサンチンとアスタキサンチが危惧された。

ンを機能性成分として利用し，β-カロテンによ１）

一方，黒毛和種繁殖牛の初乳中に豊富に含まれる疾病予防効果と比較した（Fig.１）。次に，黒ている免疫成分はIgGであるが，IgAは子牛の小毛和種繁殖牛の初乳を採取して，初乳中のIgG，

腸粘膜を保護して病原菌や有害微生物の腸管から

IgA，β-カロテン，ビタミンＡとビタミンＥ含量の侵入を防ぐため，新生子牛の下痢予防では初乳を調べ，初乳中の機能性成分（β-カロテン，ビ© The Ito Foundation

150

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

タミンＡとビタミンＥ）と免疫グロブリン（IgG

京都大学附属牧場で飼養している黒毛和種繁殖とIgA）との相関関係などを明らかにして，黒毛牛９頭（平均産次：4.1産，平均妊娠期間：286日）

和種繁殖牛への機能性成分給与法の開発のためのから分娩直後に初乳を約100ｇ採取して，初乳中

基礎データを得る。

のIgG，IgA，β-カロテン，ビタミンＡおよびビ

２．方タミンＥ含量を測定し，初乳中の機能性成分（β法-カロテン，ビタミンＡとビタミンＥ）と免疫グ

2 . 1 β-クリプトキサンチンとアスタキサンチ

ロブリン（IgGとIgA）の相関関係などを調べた。
また，分娩前の母牛には日本飼養標準の繁殖牛のンの給与試験
試験は妊娠マウス（β-クリプトキサンチン給与試験：30匹，アスタキサンチン給与試験：17

TDN要求量を満たすように，フスマとイタリア
ンライグラスサイレージを給与した。

匹）を機能性成分区と対照区に割り当て，機能性

黒毛和種繁殖牛の分娩前後の体重の変動と健康成分区では交配後6.5日目から分娩後14日目まで状態，その子牛の分娩時の体重と事故・疾病など

機 能 性 成 分 を 給 与 し た 。な お ，こ の 試 験 で はの発生状況を調査した。初乳中のIgG含量とIgA

Nishiyama ら の 方 法

含量はELISA法で，また初乳中のβ-カロテン，

２，３）と 同 様 に ，胃 内 容 物 の

ビタミンＡとビタミンＥ含量は高速液体クロマト

IgAを乳由来のIgAとした。
β-クリプトキサンチンは飼料中に50ppm添加
して妊娠マウスに給与し，分娩７日後と14日後に泌乳マウスとその仔マウスを安楽死させた。なお，仔マウスは分娩２日後に雌雄各５匹ずつに間引きした。また，アスタキサンチンは飼料中にグラフ法で測定した。
３．結果と考察3 . 1 免疫グロブリン産生における機能性成分の作用機序の解明

120ppm添加して妊娠マウスに給与し，分娩14日

泌乳マウスの増体率および飼料摂取量と新生仔後に泌乳マウスとその仔マウスを安楽死させた。

マウスの増体率にはβ-クリプトキサンチン給与

なお，仔マウスは分娩７日後に雌雄各５匹ずつにによる影響は認められなかった。β-クリプトキ

間引きした。

サンチン給与で泌乳マウスの分娩14日後の空腸の妊娠マウスと新生仔マウスの体重と飼料摂取量

IgA産生細胞数が増加した（Ｐ＜0.05）が，乳腺は毎日測定し，安楽死後に泌乳マウスからは血および回腸のIgA産生細胞数にはβ-クリプトキ

清，小腸（空腸および回腸）および乳腺を，またサンチン給与による影響は認められなかった新生仔マウスからは血清，胃内容物，小腸および（Fig.2）。また，新生仔マウスの血清，胃内容物，糞を採取した。血清，胃内容物，小腸および糞の小腸および糞のIgA濃度にはβ-クリプトキサン

IgA濃度とIgG濃度はELISA法で，小腸と乳腺のチン給与による影響は認められなかった（Fig.3）

IgA産生細胞数の計測は免疫染色法で，小腸と乳が，β-クリプトキサンチン給与で分娩14日後に

腺 の IgA 産 生 に 関 連 す る 遺 伝 子 の 発 現（IgA

おける乳腺，空腸および回腸のIgAのmRNA発現

C-region）はRT-PCR法で調べた。得られたデー量が有意に増加した。

タはSASのGLMプロシジャを用いて解析した。
2 . 2 黒毛和種繁殖牛の初乳中免疫グロブリンと機能性成分の関係の解明

泌乳マウスの増体率および飼料摂取量と新生仔マウスの増体率は，アスタキサンチン給与による影響は認められなかった。２週齢の新生仔マウス© The Ito Foundation

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発
a)b)

Jejunum
16151

Mammary gland

10

＊

12

8

N
u
m
b
e
r
o
f
I
g
A
c
e
l
l
s

8

4

6
4
2
0

N
u
m
b
e
r
o
f
I
g
A
c
e
l
l
s

0
7 days7 days14 days

14 daysFig. 2 The numbers of IgA antibody-secreting cells（ASC）in the jejunum and mammary glands of maternal mice ofthe control（■）and β-cryptoxanthin（□）groups after 7 and 14 days postpartum（Mean±SE）．＊Ｐ＜0.05．
1600

600

Stomach IgA(μg/g)

Intestinal IgA(μg/g)

500
400
300
200
100

1200

800

400

0

0
7 days7 days14 days

14 daysFig. 3 IgA concentration in small intestine and stomach contents of neonatal mice of the control（■）and β-cryptoxanthin（□）groups after 7 and 14 days postpartum（Mean±SE）．

の血清中IgA濃度とIgG濃度は１週齢よりも増加

β-カロテンが不足した場合にはこれらを代替品

し（Ｐ＜0.001），またアスタキサンチン給与にとして利用することが可能である。代表研究者ら

よって２週齢の新生仔マウスの血清中IgA濃度がは泌乳マウスにβ-カロテンを給与したところ，増加した（Ｐ＜0.10）（Table１）。アスタキサンチ

回腸の腸管関連リンパ組織におけるIgA産生細胞

ン給与によって母体の乳腺におけるIgA産生細胞数が増加し，乳腺のIgA産生細胞数と乳中への数が増加した（Ｐ＜0.10）が，空腸および回腸のIgA分泌量が増加した２，３）ことから，β-カロテン

IgA産生細胞数にはアスタキサンチン給与によるには腸管免疫改善効果のあることが認められた。

影響は認められなかった。

さらに，β-カロテンは小腸のレチノイン酸受容β-クリプトキサンチンとアスタキサンチンは体を介して小腸のIgA産生細胞数と腸管からのβ-カロテンと同様にカロテノイドに分類され，IgAの分泌を増やしたことから，β-カロテンによ

野菜，果物，水産物などに含まれていることから，る腸管免疫改善効果はレチノイン酸を介した効果© The Ito Foundation

152

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 1 IgG and IgA concentrations （μg/g) in serum of maternal and neonatal mice of the control and astaxanthingroups after 7 and 14 days postpartum (Mean±SE）．
Days

Control

Astaxanthin

Ｐ

Serum IgG

14651±186752±197

NS

Serum IgA

14734±186916±198NS７

402±43319±43NS14730±95522±105NS

７

0.5±0.1

0.4±0.1NS

14

2.5±0.4

3.5±0.4†

MotherNeonateSerum IgG

Serum IgA

†P＜0.10, NS, not significant．

Table 2

Correlations between IgG, IgA and fat-soluble vitamins in colostrum of Japanese Black cows (n＝９）．
Mean

SD

Min.

Max.

ｒ
IgG

IgA

Age, months

63.4

20.0

34.0

110.6

0.51

0.04

Gestation length, days

286.4

5.4

277

294

0.39

0.49

Calf birth weight，kg

33.6

3.2

28.0

39.0

0.71＊

0.68＊

132.8

54.0

40.0

206.7

0.55

－0.06
0.07

Colostrum
β-carotene，μg/dl
Vitamin A，μg/dl

409.7

245.1

69.0

849.0

0.67＊

α-tocophelol，μg/dl

711.3

324.5

117.0

1129.00.64

0.11

IgA，mg／ml

8.8

9.6

1.3

25.6

0.62

―

IgG，mg／ml

128.7

37.7

64.9

168.8

―

―

＊P＜0.05であることが推察された４）。

3 . 2 初乳中免疫グロブリンと機能性成分の関

本研究の結果からは，β-クリプトキサンチン

係の解明を泌乳マウスに給与すると乳中へのIgA分泌量へ

黒毛和種繁殖牛の初乳中IgG，IgA，β-カロテの効果は明らかでなかったものの，泌乳後期におン，ビタミンＡおよびビタミンＥ含量の平均値±

ける空腸のIgA産生細胞数と乳腺，空腸および回

標準誤差は，それぞれ128.8±37.7mg/mL，8.8±

腸のIgAのmRNA発現量を増加させたことから，

9.6mg/mL，133±54μg/mL，410±25μg/mLおβ-クリプトキサンチンにはβ-カロテンと類似しよび711±324μg/mLであり，変動が大きかった

た腸管免疫改善効果があると考えられた。わが国（Table2）。黒毛和種繁殖牛の初乳中β-カロテンとではβ-クリプトキサンチンはみかんに豊富に含ビタミンA（P＜0.05），β-カロテンとビタミンE（Pまれているため，ミカンジュース粕などの利用に＜0.01）およびビタミンＡとビタミンE（P＜0.05）

よって牛の腸管免疫の改善が期待できる。また，

間にはそれぞれ正の相関が認められ，また初乳中

アスタキサンチンも乳を介してIgAをやや移行さのビタミンＡとIgG間にも正の相関（Ｐ＜0.05）

せる効果のあることが推察された。

が認められた。しかし，初乳中の脂溶性ビタミン© The Ito Foundation

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発

153とIgA間には有意な相関関係は認められなかった。

（１）β-クリプトキサンチン給与で空腸のIgA

黒 毛 和 種 繁 殖 牛 の 初 乳 中 の 平 均 IgG 含 量

産 生 細 胞 数 と 乳 腺 ，空 腸 お よ び 回 腸 の IgA の（123mg/mL）と 比 較 す る と ，平 均 IgA 含 量 はmRNA発現量が増加したことから，β-クリプト

4.15mg/mLと非常に低いことが報告されている

キサンチンにはβ-カロテンと類似した腸管免疫５）が，本試験でもほぼ近似した値であった。しかし，改善効果がある。

初乳中IgGとIgA含量は変動が非常に大きかった（２）黒毛和種繁殖牛の初乳中IgG，IgA，β-ため，低レベルのIgGとIgA含量の初乳を給与しカロテン，ビタミンＡおよびビタミンＥ含量は変ている場合には市販されている初乳製剤などを補動が非常に大きかったが，黒毛和種繁殖牛の初乳給することが必要と考えられた。

中脂溶性ビタミン含量間に正の有意な相関が認め

一方，本研究では初乳中のビタミンＡとIgG間られただけでなく，初乳中ビタミンＡとIgG間にに正の相関が認められたことから，黒毛和種繁殖も正の有意な相関が認められたため，繁殖牛のビ

牛のビタミン栄養を改善できると初乳中IgG含量

タミン栄養を改善できると初乳中IgG含量の増加の増加することが示唆された。しかし，本研究ですることが示唆された。

は初乳のサンプル数が少ないので，今後は例数を増やして乳中への免疫グロブリンと脂溶性ビタミ
ンの移行のメカニズムをさらに検討することが必
要である。
４．要

約

初乳中のIgGとIgAを同時に高める機能性成分の給与法を開発するために，泌乳マウスにβ-ク
リプトキサンチンとアスタキサンチンを給与して母乳中のIgA産生の作用機序を解明するとともに，黒毛和種繁殖牛の初乳中の脂溶性ビタミンと文
献１）
 Kume S, Toharmat T.：Livestock Production
Science，68，61～65．2001．
２）
 Nishiyama Y, Sugimoto M, Ikeda S, Kume S.：
British Journal of Nutrition，105, 24～30．2011．
３）
 Nishiyama Y, Yasumatsuya K, Kasai K, Sakase M,
Nishino O, Akaike M, Nagase T, Sugimoto M, Ikeda
S, Kume S. ： Livestock Science ， 137 ， 95 ～ 100 ．
2011．
４）
 Nishida K, Sugimoto M, Ikeda S, Kume S.：
British Journal of Nutrition，111，247～253．2014．
５）
 Ishikawa H, Serizawa S, Ahiko K, Asai Y, Seike
N.：Animal Science and Technology (Japan），63 ，1153～1156．1992．

免疫グロブリンの関係を調べた。その結果，© The Ito Foundation

154

乳肉および反芻家畜体内の抗酸化能を高めうる
新飼料の機能評価
Evaluation of a new functional feed to possibly enhance anti-oxidant
activity of milk, meat and other tissues of ruminant

小

林

泰

男

（北海道大学大学院農学研究院）

Yasuo Kobayashi（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

Possible improvement of antioxidant ability of cattle was assessed by feeding cashew nut
shell liquid（CNSL）that contains antioxidative phenolics such as anacardic acid. Antioxidant
ability was evaluated by superoxide dismutase（SOD）and diphenylpicrylhydrazyl（DPPH）
scavenging activities and also formation of thiobarbituric acid reactive substances（TBARS）．
No clear response to CNSL feeding was observed for antioxidant activity of rumen fluid, blood
serum, milk and feces of Holstein milking cows. Rumen microbiota and fermentation did notchange significantly. Anacardic acid was detected in the rumen at much lower level than otherphenolics（cardanol and cardol），suggesting decarboxylation of anacardic acid into cardanolthat is much less antioxidative and bactericidal. Thai native cattle and swamp buffaloes showed
clear response to CNSL feeding with increased DPPH scavenging activity and decreased
formation of TBARS in rumen fluid and blood serum. Rumen bacterial flora apparently
changed with CNSL feeding toward higher abundance of Ruminobacter amylophilus andSuccinivibrio dextrinosolvens that are known to be antioxidative. Anacardic acid was detectedin the rumen at the level reasonably high enough for exertion of antioxidative and antibacterial
actions. From these, it is assumed that CNSL feeding to cattle could improve antioxidant ability
when functional anacardic acid is stably present in the rumen. This favorable action is probably
accounted for antioxidative property of anacardic acid itself and changes of rumen microbiota
and fermentation toward the formation of antioxidative compounds. CNSL would be afunctional feed material for reduction of oxidative stress, prevention of metabolic disorder, andeven maintenance of animal productivity, if the main phenolic anacardic acid stably functions
through the gastro-intestinal tract of cattle．

１．目

績においても低下がひきおこされている。この軽的減をねらい，飼料経由で抗酸化物質を家畜体内に近年の夏季の酷暑や多頭高密度飼育といった環

送り込む手段に注目があつまっている。近年で境要因で家畜体にストレスがかかり，体内で活性は，ポリフェノール類，特定のオリゴ糖などの抗酸素が蓄積することで家畜生産のみならず繁殖成

酸化活性に着目し，家畜に給与することで血液や© The Ito Foundation

乳肉および反芻家畜体内の抗酸化能を高めうる新飼料の機能評価

155

生産物の抗酸化活性をひきあげることに成功例がか，について検討を試みることとし，この作用機ある（Aoki et al., 2010, 2013 ; Zhong et al.,2012） 。

序の把握を２つ目の目的とした。

１～３）

ただし量的確保や製造コストの面で課題も多い。
カシュー殻液（CNSL）は，カシューナッツ生
産の副産物として大量に排出される種実殻の圧搾汁であり，選択的な菌生育阻害作用を有してい

２．方法

2 . 1 実験１：ホルスタイン種泌乳牛への給与試験る。この作用をウシなどの反芻家畜に転用し（飼４頭のホルスタイン種泌乳牛（612±54㎏）を料に混合給与することで）ルーメン菌叢や発酵様

供試動物として用いた。これらにはTMR（配合

式を変え，温暖化ガスとして知られるメタンの低飼料，グラスサイレージ，コーンサイレージ，ア

減（20～30％）を導くことが可能なことが報告さ

ルファルファヘイキューブ，ビートパルプ）を給れている（Watanabe et al., 2010; Shinkai et al．，

与し，CNSLの給与には22％CNSL製剤を用いた。

2012）。すでに日本国内で「飼料」として認TMRとCNSL製剤は混合し，朝夕の２回に分けて可されているが，カシュー殻液の主成分である給与した。４頭を２グループに分け，片方は対照

フェノール類（アナカルド酸，カルドールおよび期（19日間）→CNSL給与期（19日間）の順序でカルダノール）は抗酸化活性を有することが知ら

飼養し，他方はその逆であった。各々最初の２週れている（Trevisan et al．
，2006） 。したがって，間を馴致期，そのあとの５日間を本試験期とし

CNSLを給与することで，メタンを低減させ地球た。ルーメン液，血液，乳および糞便のサンプル

環境保全に貢献する一方で，家畜の抗酸化能を改を採取し，抗酸化能の指標としてSOD（スーパー

善し健康向上に資するというもうひとつの効果がオキシド消去能），DPPHラジカル消去活性能，期待できる可能性がある。

TBARS（過酸化脂質生成能）の測定を行った。

４～５）

６）

本研究は，ウシにCNSL製剤を給与し，体液中あわせて，ルーメン液，乳および糞便に存在するの抗酸化活性への影響を評価するものである。

CNSL含有フェノール成分の濃度をHPLCにて測CNSL給与有無の条件下で，定期的にルーメン液

定した。

や血液試料を採取し，これらの抗酸化活性の変動
を複数の手法でモニタリングし，活性値を比べる

2 . 2 実験２：タイ在来牛及び沼沢水牛への給与試験

ことで，CNSL給与によりウシ体内で抗酸化能のルーメンカニューレを装着したタイ在来牛４頭向上がはかれるのか否かについて検討することを（平均体重412±20㎏）および沼沢水牛４頭（平均主目的とした。ただし，家畜体内で抗酸化活性の

体重491±44㎏）を供試した。キャッサバ，とう上昇があった場合，その理由説明（メカニズムのもろこし，大豆粕を主原料とする濃厚飼料を毎朝明示）が必要となる。そのため，CNSLの抗酸化

８時に定量給与（１日１頭当たり１kg）し，粗成分であるアナカルド酸，カルドールおよびカル

飼料として稲わらを自由採食量の90％レベルで給ダノールの存在量を定量し，消化管での消長を把与した。なお，自由採食量はあらかじめ計測した握することとした。これにより，家畜体内の抗酸値に基づいた。試験期間は６週間とし，最初の２化活性の向上が，①抗酸化成分の直接的な影響

週間を対照期，次の４週間をCNSL給与期とした。

か，②消化管微生物や発酵様式の変化を介した間対照期にはCNSLを含まない空製剤を，CNSL給接的な影響か，③あるいはその双方によるもの

与期には，CNSL製剤（CNSL22％含有）をCNSL© The Ito Foundation

156

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

が原物給与換算で４ｇ／100kg体重／日となるよ（いずれもデータ示さず）。CNSLにはアナカルド

うに給与した。適時ルーメン液と血液のサンプリ酸，カルダノール，カルドールが各60％，10％，ングを行った。実験１と同様の方法で抗酸化活性20％の含有率で存在している（Paramashivappa

ならびにフェノール成分を測定した。対照期と７）
et al．
，2001）。この値と比べ，本試験牛のルーメ

CNSL給与期のルーメン液からDNAを抽出し，真ン内のアナカルド酸比率（約15％）ははるかに低正細菌の16S rRNA遺伝子とメタン生成古細菌のい。おそらく特定のルーメン微生物がアナカルド

mcrA遺伝子を標的とするクローンライブラリを

酸を脱炭酸し，カルダノールに転換していると思作成・解析し，ルーメン菌叢構成員について調べわれる。つまり本試験で期待された抗酸化能の向た。

上や菌叢の変化がみられなかったのは，CNSLに含まれる主要フェノール成分であるアナカルド酸

３．結果と考察（抗酸化活性ならびに菌選抜効果がとりわけ高い）

泌乳牛各種サンプルの抗酸化活性において，い（Trevisan et al., 2006; Watanabe et al., 2010）４，６）

ずれもCNSL給与の影響は明確ではなかった。

がルーメンで脱炭酸され，その効力が低下したこ

CNSL含有のフェノール成分は，対照期のルーメとによると推察された。

ン 液 や 糞 便 で は 当 然 な が ら 検 出 さ れ ず ，一 方

タイ在来牛及び沼沢水牛では，CNSL給与に

CNSL給与期ではカルダノールとカルドールの含

よってルーメン液および血清の抗酸化活性が向上

量が高く，本来の主成分であるアナカルド酸の含した（DPPHフリーラジカル消去能の増加と過酸量は低かった。乳からはこれらフェノール成分は化脂質の減少，Fig．１およびFig．２；増減が明確検出されなかった（検出下限0.1ppm以下）。なお，

でないSODについてはデータ示さず）。いずれもルーメン発酵や菌叢の変化も，これまでの報告

CNSL給与４週目よりも２週目で明確である傾向

４，５）（Watanabe et al., 2010; Shinkai et al ．
， 2012）にあった。さらにルーメン細菌叢や発酵パターン

から予想されるものに反し，極めて小さかったは大きく変化した。すなわち，ルーメン内のプロ

Rumen ﬂuid

450400
DPPH（Units/ml）

CNSL period（4th wk）

b
b

300
250

b

CNSL period（2nd wk）

b

350

200

Blood serum
Control period

a

ab

ab
a

a

150
100
50
0

Thai native cattle Swamp buﬀaloes

Thai native cattle Swamp buﬀaloes

Fig. 1 Effect of cashew nut shell liquid（CNSL）feeding on diphenylpicrylhydrazyl（DPPH）scavenging activity inrumen fluid and blood serum of Thai native cattle and swamp buffaloes
a, b: Different letter shows statistical significance（P＜0.05）．

© The Ito Foundation

157

乳肉および反芻家畜体内の抗酸化能を高めうる新飼料の機能評価

MDA concentration (mM)

10
8
6

Rumen ﬂuidaabBlood serumaControl periodabb

CNSL period（2nd wk）
CNSL period（4th wk）
a

4

ab

b

2
0

Thai native cattle Swamp buﬀaloes

Thai native cattle Swamp buﬀaloes

Fig. 2 Effect of cashew nut shell liquid（CNSL）feeding on formation of thiobarbituric acid reactive substances（TBARS）

in rumen fluid and blood serum of Thai native cattle and swamp buffaloes
a, b: Different letter shows statistical significance（P＜0.05）．

ピオン酸増加や抗酸化能を持つことが知られていつの要因が複合的に作用して，体液の抗酸化活性

る Succinivibrio dextrinosolvens や Ruminobacter

向上を導いたことを示唆するものと考えられる。

amylophilus（Fulghum and Worthingto，1984）

８）がCNSL給与期に増加した。菌叢を分類門別にみ

４．要約ると変化はより顕著で，タイ在来牛および沼沢水

抗酸化活性を有するフェノール成分を含むカ

牛とも，CNSL給与によりFirmicutesが増え（39.3

シューナッツ殻液（CNSL）をウシに給与し，ウ～40.5％→61.6～70.7％），Bacteroidetesが減少しシの抗酸化活性が向上するかについて検討した。

た（47.6～49.4→21.2～25.3％）。またCNSL中のホルスタイン種泌乳牛へのCNSL給与試験では，フェノール成分においては，カルダノールとカル

ルーメン液，血清，乳および糞便の抗酸化活性向ドールの合計量は1.0～1.1ppmとわずかであり，上は見られなかった。その際，ルーメン液のフェ

アナカルド酸がルーメン内で安定的に存在していノール成分はカルドールとカルダノールの割合がた（4.6～5.1ppm）。つまり抗酸化および菌選抜効高く，最も抗酸化活性の高いアナカルド酸の割合

果の主体であるアナカルド酸はタイ在来牛およびが低かった。さらにルーメン細菌叢の変動も少な

沼沢水牛の消化管内では，ホルスタイン種泌乳牛

かった。このことからこれらのウシのルーメン内で見られたような脱炭酸はおこらず，本来の機能でアナカルド酸の脱炭酸が生じ，菌選抜能や抗酸が発揮されたと推察できた。

化能が低下していることが推察された。タイ在来以上のことから，CNSL含有の抗酸化フェノー

牛および沼沢水牛への給与試験では，ルーメン液

ル成分の主体であるアナカルド酸が分解・修飾をと血清の抗酸化活性が明確に向上した。ルーメン

うけず家畜体内に存在すれば，その直接的な抗酸内細菌叢をクローンライブラリ解析によって調べ化活性が期待できることに加え，アナカルド酸にたところ，真正細菌叢はCNSL給与により有意による消化管内菌叢と発酵の変化にともなう間接的変化した。また抗酸化活性を持つとされているな抗酸化活性向上も期待できることが示唆されルーメン細菌（Ruminobacter amylophilusおよび

た。とくに本課題研究の実験２の成果は，上記２Succinivibrio dextrinosolvens）が増加していた。

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158

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

その時，ルーメン内のフェノール成分，特にアナカルド酸は比較的安定に存在していた。これらのことから，CNSLをウシに給与し，CNSL含有の抗酸化・菌選抜効果の高いアナカルド酸が安定的に機能した場合，ウシの抗酸化活性を向上させう
ることが明らかになった。さらにこのメカニズムには，CNSL含有フェノール成分自体の抗酸化能に加えて，ルーメン細菌叢の変化が関わっていることが考えられた。抗酸化活性は酸化ストレスの軽減，疾病の予防，家畜の生産性の維持などの観点から非常に重要な働きであるため，ウシにとってCNSLはその機能性フェノール成分が消化管内で分解や転換を受けないならば，有益な飼料添加物となりうることが示唆された。
文献１） Aoki,N., Furukawa, S., Sato, K., Kurokawa, Y.,
Kanda, S., Takahashi, Y., Mitsuzumi, H., Itabashi,
H.：Supplementation of the diet of dairy cows withtrehalose results in milk with low lipid peroxideand high antioxidant content. Journal of Dairy
Science．93，4189～4195.2010．
２） Aoki, N., Sato, K., Kanda, S., Mukai, K.,Obara, Y.,
Itabashi, H.：Time course of changes in antioxidant
activity of milk from dairy cows fed a trehalosesupplemented diet. Animal Science Journal ． 84 ，
42～47．2013．

３）
 Zhong, R. Z., Yu, M., Liu, H. W., Sun, H. X., Cao, Y.,
Zhou, D. W. ： Effect of dietary Astragalus
polysaccharide and Astragalusmembranaceus root
supplementation on growth performance, rumen
fermentation, immune responses, and antioxidant
status of lambs. Animal Feed Science andTechnology．174，60～67．2012．
４）
 Watanabe, Y., Suzuki, R., Koike, S., Nagashima, K.,
Mochizuki, M., Forster, R. J. Kobayashi, Y. ： In
vitro evaluation of cashew nut shell liquid as amethane-inhibiting and propionate-enhancing agent
for ruminants. Journal of Dairy Science ． 93 ， 5258
～5267．2010．
５）
 Shinkai, T., Enishi, O., Mitsumori, M., Higuchi, K.,
Kobayashi, Y., Takenaka, A., Nagashima, K.,
Mochizuki, M., Kobayashi, Y. ： Mitigation of
methane production from cattle by feeding cashew
nut shell liquid. Journal of Dairy Science．95，5308～5316．2012．
６）
 Trevisan,M.T.S., Pfundstein, B., Haubner, R.,
Wurtele, G., Spiegelhalder, B., Bartsch, H
Owen,
R.W. ： Characterization of alkyl phenols in cashew(Anacardiumoccidentale) products and assay of
their antioxidant capacity. Food and Chemical
Toxicology．44，188～197．2006．
７）
 Paramashivappa, R., Kumar, P. P., Vithayathil, P.
J., Srinivasa, A. R. ： Novel method for isolation ofmajor phenolic constituents from cashew(Anacardiumoccidentale L.) nut shell liquid. Journalof Agricultural and Food Chemistry ． 49 ， 2548 ～
2551．2001．
８）
 Fulghum, R. S., Worthington, J. M. ： Superoxide
dismutase in ruminal bacteria. Applied andEnvironmental Microbiology．48，675～677．1984．

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159

食肉におけるカルノシン関連ジペプチド増量法
確立のための基礎研究
Basic study for the establishment of the method to increasecarnosine-related dipeptide levels in meats

友

永

省

三

（京都大学大学院農学研究科）

Shozo Tomonaga（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

We evaluated three analytical methods to quantify carnosine-related dipeptides（carnosine,
anserine and balenine），their constituent amino acids（β-alanine, histidine, 1-methylhistidine
and 3-methylhistidine）and taurine levels in meats. We found that two of three methods may
be useful to investigate the ways to increase carnosine related dipeptide levels in meats．

１．目ていることに着目して，我々は以下に述べる研究的を遂行してきた。カルノシンもしくはカルノシン

カルノシン（β-アラニル-ヒスチジン），アンセ

関連ジペプチドを高含有するニワトリムネ肉抽出リン（β-アラニル-１-メチルヒスチジン）および物の経口投与には，ラットにおける抗うつ様行動

バレニン（β-アラニル-３-メチルヒスチジン）効果６）やマウスにおける学習行動改善効果７）があは，カルノシン関連ジペプチド（もしくはイミダることを見出した。更に，ニワトリにおいてカル

ゾールジペプチド）と呼ばれ，動物の筋肉に多く

ノシンとアンセリンの構成アミノ酸であるβ-ア存在する。生体における機能として抗酸化作用

１）

ラニンの投与によるムネ肉内のカルノシンとアンなどが認められている。摂取によるセリン含量の増量を試みた結果８～10），ムネ肉のカ

血圧低下効果３），運動パフォーマンス向上効果４）

ルノシン含量がわずかに増える条件があることをおよびストレス反応緩和効果なども報告されて見出した10）。以上の研究を遂行した経験から，ニいる。植物には存在しないことから動物性食物に

ワトリムネ肉だけでなく，他の様々な畜肉でもこ特有の有効成分である。一方，国内の畜産業におれらジペプチドの増量法を確立することができれいて，「畜肉部位の余剰問題」が存在する。中でば，畜肉の付加価値向上や，それによる畜肉部位

も家禽産業ではムネ肉がモモ肉に比して嗜好性がの余剰問題解決につながりうると考えた。

や緩衝作用

２）

５）

低い結果，市場価格の低迷が問題となっている。

構成アミノ酸の投与による筋肉内カルノシン関

この鶏肉における「畜肉部位の余剰問題」の解決

連ジペプチド含量の増量法は，ニワトリ以外にもに貢献するために，ニワトリのムネ肉にモモ肉よ様々な動物種で報告されている。ブタでは，β-りも多くのカルノシン関連ジペプチドが含有されアラニンだけでなく，カルノシンのもうひとつの© The Ito Foundation

160

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

構成アミノ酸であるヒスチジンを同時摂取させるが検出可能とされている。そこで，我々が使用可

ことにより筋肉内カルノシン含量がわずかに増量

能なUHPLC-MS/MSを用いた同方法でこれら成した11）。一方で，ラットではβ-アラニンの投与で分が検出されるのか確認した。次に，本分析系に顕著に（10倍ほど）筋肉内カルノシン含量が増加

おいて先行研究では確認されていないバレニンがした 。これら先行研究はβ-アラニン単独もしく検出されるのかを確認した。更に，β-アラニン

はβ-アラニンとヒスチジンの同時投与による方の投与により組織内含量が減少する場合があるタ法であるが，最も増量に効果的な構成アミノ酸投

ウリン８～10）も検出可能であるとされていることか与の諸条件（動物種，系統，畜肉部位，投与時期，

らこれも合わせて確認した。以上を踏まえ，畜肉

投与期間および投与濃度など）の決定には至ってならびに骨格筋培養細胞における分析を試みた。

いない。更に，カルノシンやアンセリンだけでな

UHPLC-MS/MSによるEZfaast誘導体化アミノ酸

くバレニンの含量まで確認している報告は，我々分析法におけるカルノシン関連ジペプチドおよびが知る限り存在しない。我々は，構成アミノ酸に構成アミノ酸の分析検討も行った14）。最後に，カ着目してカルノシン関連ジペプチド増量を試みる

ルノシン関連ジペプチド３種類を網羅的に分析す様々な実験条件の中で，バレニン合成系の活性化ることが必要な場合には，そのコストも考慮するは起こりうると考える。なぜなら，構成アミノ酸必要があると考えた。そこで，誘導体化試薬を必のヒスチジン摂取量を増やす条件では，ヒスチジ

要 と し な い Imtakt Intrada Amino Acid カ ラ ム

ンを構成アミノ酸として有するカルノシンだけで（Imtakt）によるUHPLC-MS/MSを用いた分析系15）

なく，ヒスチジンからバレニンの構成アミノ酸でにおいて，カルノシン関連ジペプチド３種類が分ある３-メチルヒスチジンへの代謝が促進された

析できるのか検討した。

12）

結果，バレニン合成促進につながる可能性が推測されるからである。以上より，鶏肉，豚肉など様々

２．方法

な畜肉におけるカルノシン関連ジペプチドの増量

2.1

法を正確に検討するためには，各畜肉部位，品種

UHPLC-MS/MSによるAccQ-Tag誘導体化アミ及び飼養条件がカルノシン関連ジペプチド３種類ノ酸分析法13）を用いて，カルノシン，アンセリン，（カルノシン，アンセリンおよびバレニン）と全

バレニン，β-アラニン，ヒスチジン，１-メチル

構成アミノ酸（β-アラニン，ヒスチジン，１-メ

ヒスチジン，３-メチルヒスチジンおよびタウリ

チルヒスチジンおよび３-メチルヒスチジン）のンの分析が可能なのか検討した。UHPLC-MS/

含量におよぼす影響を調べることが必要であるとMSは，AQUITY TQD（Waters）を用いたが，判断した。しかしながら，そのために有用な分析

以降の実験においても同様である。定量法として系は確立されていない。

内部標準法を用いた。内部標準物質は先行研究を

実験１

近年，超高速液体クロマトグラフ―タンデム型

参考にして，Ｌ-ヒスチジン（ring 2-13C），Ｌ-グ

質量分析計（UHPLC-MS/MS）を用いた高感度，

ルタミン-2,3,3,4,4-ｄ５およびグリシン-ｄ５を採高選択かつ迅速なAccQ-Tag誘導体化アミノ酸分用 し た 。ニ ワ ト リ お よ び ブ タ の 各 筋 肉 部 位 ，析システムが報告された 。本報告では，カルノ

C2C12筋芽細胞およびC2C12筋管細胞における分シン，アンセリン，β-アラニン，ヒスチジン，

析を試みた。

13）１-メチルヒスチジンおよび３-メチルヒスチジン© The Ito Foundation食肉におけるカルノシン関連ジペプチド増量法確立のための基礎研究

2.2

実験２

161

た。骨格筋培養細胞に含まれる微量のカルノシン

UHPLC-MS/MSによるEZfaast誘導体化アミノが定量可能であることは，培養細胞を用いた増量

酸分析法14）を用いて，カルノシン，アンセリン，法の探索に使えるかもしれない。以上より，本分

バレニンおよび全構成アミノ酸群の分析を検討し

析系は筋肉内カルノシン関連ジペプチドの代謝研た。タウリンは誘導体化の特性上検出不可である

究に有用である可能性が示唆された。

ことが確かめられているので除外した。定量法と実験２において，カルノシン，アンセリン，バ

して内部標準法を検討したが，内部標準物質は分

レニン，ヒスチジン，１-メチルヒスチジンおよ析キットに添付のホモフェニルアラニン，メチオ

び３-メチルヒスチジンのピークを検出すること

ニン-ｄ３およびホモアルギニンを採用した。

ができた。しかしながら，内部標準物質すべてを2.3

検出することが出来なかったことから，畜肉内含実験３

上記２つの分析法は，誘導体化試薬を用いた分量の定量まで進むことは断念した。今回採用した

析であり，高選択・高感度分析に有用である。し

分析条件が，異なる会社のUHPLC-MS/MSによかしながら，畜肉に含まれるカルノシン関連ジペるものであったことから，機器による最適条件のプチドを網羅的に分析する場合には，誘導体化試

違いを反映している可能性を推測した。今後，分

薬の購入コストが問題となる可能性がある。カル析条件の更なる検討（特にカラムの種類変更や移ノシン関連ジペプチドは畜肉に高濃度に含まれる

動相グラジエント条件）が必要であることが示唆ため，これらジペプチド分析のみ必要な場合は誘された。

導体化なしでも分析できないか検討することにし実験３ではカルノシン，アンセリンおよびバレた。そこで，誘導体化なしのアミノ酸分析用カラム

ニンの検出を確認し，畜肉内含量分析を行うこと

15）

で ある Imtakt Intrada Amino Acid（50×３㎜ ）ができた。実験１ならびに２の分析方法に比べてを用いたUHPLC-MS/MSのカルノシン関連ジペ

誘導体化試薬を用いないことから，カルノシン関

プチド３種類の分析を検討した。

連ジペプチド含量のみに着目する場合はコストパ
フォーマンスに優れた分析系として有用であると３．結果と考察考えられた。

実験１において，先行研究における分析条件そ総括すると，畜肉のカルノシン関連ジペプチドのままで，カルノシン，アンセリン，β-アラニン，

増量を視野に入れてUHPLC-MS/MSによる分析

ヒスチジン，１-メチルヒスチジン，３-メチルヒ

系を３種類評価し，そのうちの２種類に有用性がスチジンおよびタウリンが検出可能であることを認められた。両分析系は，目的に応じた使い分け確認した。バレニンも検出されたが，隣接していが有効である。たとえば，カルノシン関連ジペプ

るアンセリンとは分離されていることを確認しチドのみを網羅的に分析する場合（たとえば，含た。ニワトリおよびブタの各筋肉部位における３

量が多い畜肉を絞込むとき）は誘導体化試薬を用

種のジペプチド，一部の構成アミノ酸群およびタいない安価な分析系を用いることや，構成アミノ

ウリンは定量可能であった。C2C12筋芽細胞では酸代謝に関連した作用機構解明や増量法の評価

３種のジペプチドは検出されなかったが，C2C12（培養細胞での検討を含む）には構成アミノ酸も筋管細胞のカルノシンは定量可能であった。両培含めた誘導体化による高感度の同時分析系の検養細胞においてタウリンは定量することができ

討，などである。今後，両分析系の更なる妥当性© The Ito Foundation

162

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

検討を踏まえ，両分析系を用いたカルノシン関連
ジペプチド増量法確立を視野に入れている。中でも，「畜肉部位の余剰問題」と関連した課題から優先的に取り組む予定である。
４．要

約

本研究では，超高速液体クロマトグラフ―タン
デム型質量分析計によるカルノシン関連ジペプチ
ド（カルノシン，アンセリンおよびバレニン），
構成アミノ酸群（ヒスチジン，１-メチルヒスチ
ジン，３-メチルヒスチジンおよびβ-アラニン）
およびタウリンの分析系を３種類検討した。そのうちの２種類の分析系において有用性が認められた。今後，両分析系の更なる妥当性検討を行った
後，畜肉におけるカルノシン関連ジペプチド増量法確立のために用いる予定である。
文
献１） Kohen R, Yamamoto Y, Cundy KC：Ames BN.
Proc Natl Acad Sci U S A．85，3175～3179．1988．
２） Abe H ： Biochemistry (Mosc) ．65 ，757 ～ 765 ，
2000．

３）
 Niijima A, Okui T, Matsumura Y, Yamano T,
Tsuruoka N, Kiso Y, Nagai K：Auton Neurosci ．
97，99～102，2002．
４）
 Maemura H, Goto K, Yoshioka T, Sato M,
Takahata T, Morimatsu F, Takamatsu K：Int J
Sport and Health Sci．４，86～94，2006．
５）
 Li YF, He RR, Tsoi B, Li XD, Li WX, Abe K,
Kurihara H：PLoS One. 7，ｅ33190，2012．
６）
 Tomonaga S, Yamane H, Onitsuka E, Yamada S,
Sato M, Takahata Y, Morimatsu F, Furuse M：
Pharmacol Biochem Behav．89，627～632，2008．
７） 友 永 省 三：栄 養 生 理 研 究 会 報 ．52 ，37 ～ 44 ，
2008．
８）
 Tomonaga S, Kaji Y, Tachibana T, Denbow DM,
Furuse M：Anim Sci J．76，249～254．2005．
９）
 Tomonaga S, Kaneko K, Kaji Y, Kido Y, Denbow
DM, Furuse M：Anim Sci J．77，79～86，2006．
10）
 Tomonaga S, Matsumoto M, Furuse M ： J Poult
Sci．49，307～311，2012．
11）
 Mei L, Cromwell GL, Crum AD, Decker EA：
Meat Sci．49，55～64．1998．
12）
 Margolis FL, Grillo M, Kawano T, Farbman AI：
J Neurochem．44，1459～1464，1985．
13）
 Salazar C, Armenta JM, Shulaev V：
Metabolites．２，398～428，2012．
14）
 https://solutions.shimadzu.co.jp/glc/
techResource/phenomenex/amino/ezfaast01.html
15） http://www.imtakt.com/TecInfo/TI734E.pdf© The Ito Foundation

163

地鶏生産における初期栄養操作による免疫能向上に関する研究Study on improvement of immunity by early nutritional development inJapanese native chicken production

太

田

能

之・白

石

純

一・西

川

薫＊

（日本獣医生命科学大学応用生命科学部・＊三重県畜産研究所）

Yoshiyuki Ohta, Jun-ichi Shiraishi and Kaoru Nishikawa＊（Faculty of Applied Bioscience, Nippon Veterinary and Animal Science University，＊Animal Science Laboratory Mie-prefecture）

In order to establish the method to produce the safety chicken meat without using
pharmacy, possibility of improvement in early immune formation using in ovo amino acidadministration was evaluated. 20, 24, and 88 Mie-special Jidori breeder eggs were incubatedunder 37.8 C and over 60％ RH condition, and assigned to 2, 2, and 4 treatment groups of each10, 12, and 22 eggs with same average weights in Experiments 1, 2, and 3, respectively．
In Experiment 1, eggs were administered

５ ％ sheep red blood cell（SRBC）into theunder shell vein on Day 17 of incubation. On Day 18, distilled water or amino acid solution
consisted of whole egg protein（WEAA）in Experiment 1, and none or WEAA solution inExperiments 2 and 3 were in ovo injected to each one group. After treatments, eggs wereincubated again, and hatched. In Experiment 3, in addition, newly hatched chicks of one
residual group were administered WEAA into the crops, and those of another group were
injected WEAA into neck subcutaneously. Chicks were fed commercial feed from half day post
hatch to 3 days of age, and then they were bled from the heart. After bleeding, they weresacrificed to collect the organs in Experiment 1. In Experiments 2 and 3, chicks were grown up
to 18 weeks of age, and they were sacrificed to collect the organs．
Because SRBC antibody titer was increased by in ovo amino acid injection in Experiment
1, immune formation of chicks might be escalated at early period．
On the other hand, body weight gains of female chickens which administered amino acidby all methods were higher than control chickens in Experiments 2 and 3（ ｐ ＜ 0.05），andthere was no difference in ratio of edible meat to other parts among all chickens．

１．目

良い安全な鶏肉の生産は輸出戦略にも重要な意味的を持ち，その中でも日本固有の地鶏を安全に高品

重要な蛋白質源である肉のみならず栄養価の高

質かつ高効率で生産することが求められる。またい卵も供給する養鶏産業において，高品質で安全

ニワトリの遺伝的形質に依存するばかりでなく，な食品を安く食卓に届けることが重要である。ま

飼育法についても日本独自の方法を確立することた，環太平洋経済連携（TPP）をにらみ，品質のが品質やブランドの差別化に繋がるものと考えら© The Ito Foundation

164

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

れる。

当てた。孵卵17日目に試験１では全種卵に５％羊

そのため，今般流行の危険性が見られるインフ

赤血球（SRBC）溶液50μＬを卵殻下静脈に投与

ルエンザ等の疾病に対しては①予防的に損失を防した。孵卵18日目に試験１ではOhtaら（1999）

ぎ，飼料原料の高騰に対しては②新飼料原料の開に基づき１区に蒸留水，もう１区に全卵組成アミ発と同時に飼料の利用性を向上させ，しかも品質

ノ酸溶液0.5mLを鈍端部よりin ovo投与し，試験と安全性を損なわないこと，さらには③付加価値

２では１区を無処理としもう１区に試験１同様のにより消費者に価格を適正と感じさせることが重アミノ酸溶液を投与し，そのまま孵卵した。試験要である。

３では１区を無処理とし，各試験と同様のアミノ

家禽の栄養研究は長年これらの問題と対峙し，酸溶液をin ovo投与し，孵化時に残りの２区にそ数々の問題を解決すると同時に今また新しい技術

れぞれ同様のアミノ酸溶液をそ嚢内に強制給餌もが求められている。近年，卵中の胚発生時およびしくは頚部皮下にワクチネーションと同様に投与

餌付け時は生産の最初の段階であり，品質の高いした。

ヒナの高い育成率を達成するために重要な時期であることが認識されるようになった。

試験１は日本獣医生命科学大学動物生産化学教室内において温度32℃で24時間照明下において３

この時期については，栄養研究はともかく未だ日間全てのヒナを同一育雛箱内で群飼した。試験に栄養管理プログラムが示されておらず，この時２および３では三重県畜産研究所内の鶏舎におい期の生理的特性を十分に引き出せていないが，近て平飼い区画内にてガスブルーダーで保温し，自年それに対する答えが示されてきている。地鶏生

由摂取自由飲水で群飼した。

産においては，抗生物質等の薬剤なしでワクチン

試験１では孵化時の体重を記録し，市販飼料をの効力を最大限に引き出して健康に育てることが餌付け後３日齢時にSRBCを投与したヒナから採必要である。Ohtaら

は胚発生期にアミノ酸の血を行い，頸椎脱臼による安楽屠殺後に肝臓，腸投与を行うことにより，アミノ酸の利用性を向上

管および卵黄嚢を採取して重量を測定した。血液させ，早期餌付けにより免疫能を向上させることは血漿分離後SRBC凝集抗体価の測定に供試し４）ができる可能性を示した 。

た。腸はメッケル憩室付近から0.1ｇ組織を採取

そこで本研究では，この技術を用いることで，し，免疫関連遺伝子発現量を定法によりリアルタ

１，２）

地鶏において免疫能を向上させ，初期免疫形成時のもっとも疾病に罹患しやすい時期における対策

試験２および試験３では孵化したヒナは直ちに飼育区画内で餌付けを行い，自由摂取自由飲水に技術を開発することを目的とした。
２．方イムPCR法にて測定した。

より２週齢時以降から可食適期の18週齢時まで毎法

週体重を測定して飼育し，体重測定後に可食部試験１，試験２および試験３それぞれ20，24お（浅胸筋，深胸筋，腿肉，肝臓，筋胃），腹腔内脂よ び 88 個 の み え 特 産 鶏 種 卵 を 通 常 環 境（温 度肪および腸管重量を測定した。試験２では腸は上37.8℃，相対湿度60％以上）で孵卵した。14日目

部（十二指腸屈曲部），中部（メッケル憩室付近）の検卵後発生が確認された種卵を平均卵重が同じ

および下部（結腸上部）から0.1ｇずつ組織を採になるように試験１，
２および３においてそれぞ

取し，免疫関連遺伝子発現量を定法によりリアル

れ２，
２および４区に10，12および22個ずつ割り

タイムPCR法にて測定した。

© The Ito Foundation

165

地鶏生産における初期栄養操作による免疫能向上に関する研究

試験飼料は試験１では産卵鶏用餌付け飼料

３．結果と考察（ME 3.10 Mcal/kg，CP22％），試験２および３で は 三 重 県 で 使 用 し て い る 市 販 前 期 用（ME

Table１に試験１の結果を示した。試験１にお3.12Mcal/kg ，CP22.5 ％ ）お よ び 後 期 用（MEいて，孵化時体重に有意な差は認められなかった

3.19Mcal/kg，CP18.5％）を用いた。

が，３日間の増体重はアミノ酸投与区が有意に高得られた結果は分散分析を行った後，Turky法

かった（Ｐ＜0.05）。各臓器重量間に有意差は認もしくはｔ検定により平均値の差の検定を行っ

められなかったが，SRBC凝集抗体価はアミノ酸た。またSRBC凝集抗体価は２倍希釈以上の凝集投与区で有意に高く，また腸管中部のIL２におい価が得られた頻度をχ二乗検定にて評価した。

て高い値を示す頻度が高くなった（Ｐ＜0.05）。

Table 1 Effects of in ovo amino acid administration at Day 18 of incubation on early performance and immune response１
in Japanese native chicken, Kumano-Jidori（Experiment １）

Injection

Control（water）

Amino acids

Initial egg weights（g）

47.4±2.747.8±2.3

Body weight of hatched chicks（g）

29.9±2.430.2±1.9

Body weight/egg weight（％）

62.9±2.4

63.2±1.5

Body weight gain（g/3 days）

7.9±2.8

10.6±2.8

Intestine weights（g）

1.54±0.17

1.66±0.18

Liver weights（g）

1.13±0.08

1.18±0.10

Yolk weights（g）

0.74±0.51

0.94±0.36

SRBC antibody titer1.22±0.44

1.90±0.32＊

TLR-２

1.17±0.19

1.54±0.22

TLR-４

1.21±0.28

1.48±0.37

CD３0.93±0.11

1.27±0.70IL-２

1.22±0.41

1.94±0.88

Intestine immune gene expression（/GAPDH）

１Values are means±SD for 10 eggs and chicks．
＊Significantly different from control（P＜0.05）．

Table 2 Statistical statements of effects of in ovo, oral, or neck subcutaneous amino acid administration at Day 18 of

incubation or 0 day post-hatch on intestinal immune gene expression in Japanese native chicken, Kumano-Jidori（Experiment ３）

Fore

Mid

Hind

IL２

CD３

TLR４

TLR２

Treat

NS

NS

NS

NS

Sex

NS

NS

NS

NS

Treat x Sex

NS

NS

NS

NS

Treat

NS

NS

NS

NS

Sex

NS

NS

0.05

NS

Treat x Sex

NS

NS

NS

NS

Treat

0.05

NS

NS

NS

Sex

NS

0.10

NS

NS

Treat x Sex

NS

NS

NS

NS

© The Ito Foundation

166

平成25年度
BW(g)
4000

3000

2000

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Control (intact)♂

in ovo amino acid ♂

♀

① Treat: P<0.001② Sex: P<0.001③ Day: P<0.001④ Treat × Sex: 0.003⑤ Treat × Day: 0.812⑥ Sex × Day: P<0.001⑦ Treat × Sex × Day: 0.998

1000

0

♀

Feed conversionration
Control： 3.61
Amino acid 3.60
3 10 14

28

42

56
70
84
Post hatch (day)

98

112
123
Means±SEM

Fig. 1 Effects of in ovo amino acid injection at Day 18 of incubation on growth performance of Japanese native chicken,

Kumano-Jidori（Experiment ２）

100

250

① Treat: P=0.052② Sex: P=0.085③Treat × Sex: P=0.076

80
60

200
150

40

100

20

50

0

♂
♀
♂
♀
Control(intact)
Amino acid
Liver weights(g)100

0① Treat: P=0.527② Sex: P=0.024③Treat × Sex: P=0.061♂
♀
♂
♀
Control(intact)
Amino acid
Abdominal fat pad(g)① Treat: P=0.052② Sex: P=0.085③Treat × Sex: P=0.076

80
60
40
20
0

♂
♀
Control(intact)♂

♀
Amino acid

Means±SEM

Edible meats(%)
Fig. 2 Effects of in ovo amino acid injection at Day 18 of incubation on carcass quality of Japanese native chicken,

Kumano-Jidori 18 weeks of age（Experiment ２）

以上のことからみえ特産鶏においてもin ovoアミ

これをもとに生産能の評価を行った試験２の結ノ酸投与により初期の免疫能を向上できると推察

果をFig.１およびFig.２に示した。体重と肝臓重された。

量において雌雄とアミノ酸投与処理の交互作用が© The Ito Foundation

167

地鶏生産における初期栄養操作による免疫能向上に関する研究
2.0

3.0

1.5

2.0

1.0
1.0

0.5
0

0
Fore

Mid

Fore

Hind

Mid

Hind

CD3(A.U.)

IL2(A.U.)
1.5

2.5
2.0

1.0

1.5
1.0

0.5

0.5
0

0
Fore

Mid

Fore

Hind

Mid

Hind

TLR2(A.U.)

TLR4(A.U.)

Fig. 3 Effects of in ovo, oral, or neck subcutaneous amino acid administration at Day 18 of incubation or 0 day post-

hatch on intestinal immune gene expression in Japanese native chicken, Kumano-Jidori 18 weeks of age（Experiment ２）認められ，オスにおいては体重や体構成に差は認なった（Ｐ＜0.05）。３日齢時には有意ではない

められなかったが，メスではin ovoアミノ酸投与

がアミノ酸投与区で高い傾向が見られたことかにより有意に体重が大きくなった。また可食部割ら，免疫形成は早くなるが，その後は遺伝子発現

合は変わらず，体構成そのものは変わらないままが低くなることが示された。単独の免疫指標の高

成長が早くなったことが示された。この傾向はブ

い低いは単に免疫能の高低に結びつかないが，そ３）

ロイラーと白色レグホン産卵鶏の関係と異なり ，の後の形質に影響する効果があると推察された。

みえ特産鶏では血糖値や糖新生，もしくはコルチ

さらに投与部位について検討した試験３におい

コステロンとエストロゲン，およびテストステロては，全てのアミノ酸投与群において15週齢までンといったステロイドホルモン分泌が特異的であ対照区より体重が高かった。食餌によるアミノ酸

る可能性が示唆され，みえ特産鶏はこの点をブロの摂取でも試験２同様の効果が期待できることがイラーと比較することにより，特性を明らかにす明らかにされた。一方で雌雄どちらにおいてもそることができると推察された。またこれらの知見の後は体重が増加せず，18週齢時の体重には差がをもとに適正な飼育が可能になると考えられた。

認められなかった。同じ区域内で飼育されている

一方，腸管の免疫関連遺伝子において18週齢時に雌雄間で15週齢以降生殖行動が観察されたこと

アミノ酸投与の影響が観察されたのは腸管後部にと，試験２が初夏に，試験３が晩秋に行われたこ

おけるIL２の発現で，対照区に比べて有意に低くとから生殖行動と季節性の２点いずれかが原因と© The Ito Foundation

168

平成25年度4000

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

intact M

in ovo M

SC M

Oral M

intact F

in ovo F

SC F

Oral F

Body weight(g)Sex: P<0.0001
Treat: P<0.0001
Day: P<0.0001
Sex × Treat: P<0.0001
Sex × Day: P<0.0001
Treat × Day: P=0.00６８
Sex × Treat × Day: P=0.９４９０

3000

2000

1000

0
2W

3W

4W

5W

6W

8W 10W 12W 14W 15W 16W 17W 18W

Fig. 4 Effects of in ovo, oral, or neck subcutaneous amino acid administration at Day 18 of incubation or 0 day post-

hatch on growth performance in Japanese native chicken, Kumano-Jidori（Experiment 4）．

考えられ，今後の検討が必要と思われた。生殖行37.8℃，湿度60％以上で孵卵し，平均卵重が同じ動については雌雄を別の区画で飼育し，季節性のになるように試験１，
２および３においてそれぞ

影響については再現性を確認する必要があると思

れ２，２および４区に10，12および22個ずつ割りわれた。しかしながら，初期アミノ酸投与がメス当てた。試験１では孵卵17日目に５％羊赤血球

のみえ特産鶏生産能を向上させることについて（SRBC）溶液50μＬを卵殻下静脈に投与した。

は，代償成長に影響されない生産能向上法である孵卵18日目に試験１では蒸留水もしくは全卵組成と推察され，地鶏飼育におおいて新たな可能性がアミノ酸溶液（WEAA）を，試験２および３で示された。

は無処理もしくはWEAAを投与して孵化させた。

４．要

さらに試験３ではそ嚢内もしくは頚部皮下に

約

WEAAを投与した。試験１では孵化後半日後に地鶏において薬剤に依存しない生産系を確立す

餌付けを行い３日齢まで飼育し，採血後に安楽屠るため，in ovoを含めた初期アミノ酸栄養改善に殺し臓器を摘出して重量を測定し，血液はSRBC

より孵化初期の免疫形成および生産能の向上が可

凝集抗体価を測定した。試験２および３では18週

能か検討した。試験１，試験２および試験３それ齢まで飼育して安楽屠殺後に可食部と腹腔内脂肪ぞれ20，24および88個のみえ特産鶏種卵を温度を採取して重量を測定した。

© The Ito Foundation

地鶏生産における初期栄養操作による免疫能向上に関する研究

試験１では３日齢時のSRBC凝集抗体価はアミノ酸投与で増加し，免疫形成が早まった可能性が示唆された。一方で試験２および３ではアミノ酸の投与法に関わらず，メスの増体が有意に高くなり（Ｐ＜0.05），可食部割合は変化しなかった。
以上の結果からみえ特産鶏への胚期から孵化直後のアミノ酸投与は免疫形成を助け，なおかつメスの生産能を向上させることが明らかになった。
文
献１） Ohta, Y., N. Tsushima, K. Koide, M. T. Kidd, T.
Ishibashi ： Effect of amino acid injection in broiler

169

breeder eggs on embryonic growth andhatchability of chicks. Poultry Science，78，1493～
1498，1999.
２）
 Ohta, Y., M. T. Kidd, T. Ishibashi：Embryo
growth and amino acid concentration profiles ofbroiler breeder eggs, embryos, and chicks after in
ovo administration of amino acids. Poultry
Science，80，1430～1436，2001.
３）
 Ohta, Y., Yoshida, T. Tsushima, N：Comparison
between broilers and layers for growth and protein
use by embryos. Poultly Science ，83 ，783 ～ 787 ，
2004．
４）
 Ohta, Y., M. Takada, K. Yamada, T. Ikeda, M.
Sugawara：Effect of timing to start feeding andkinds of feeds on growth and immune
performances of newly hatched chicks. Poultry Sci.
J. 44，J108～113，2007.

© The Ito Foundation

170

胎仔期のタウリン供給強化によるブタの筋形成促進
Promotion of myogenesis by administration of taurine during the fetal
stage in the pig

勝

俣

昌

也・石

田

藍

子

（独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産草地研究所）

Masaya Katsumata and Aiko Ishida（NARO Institute of Livestock and Grassland Science）

The purpose of this experiment was to test whether adding taurine to diets of sows
throughout pregnant and lactation periods would promote myogensis of offspring. Taurine（1.5％）was added to a commercial diet for pregnant pig and to a commercial diet for lactating
pig. Sows were given the diet for pregnant pig from d1 to d105 of pregnant period andthereafter they were given the diet for lactating pig until weaning that was 28 days after
farrowing. The control sows were given the same diets without taurine on the same schedule.
Piglets were reared under the usual management of NARO Institute of Livestock andGrassland Science. Adding taurine to the diet enhanced plasma free taurine concentrations on
d25 of pregnancy（ｐ＜ 0.01）.Birth weights of piglets of the taurine given sows were lower（ｐ＜ 0.05）and weaning weights of piglets of the taurine given sows tended to be lower（ ｐ ＜0.10）than those of piglets of the control sows. Adding taurine to the sow's diets did not affectratio of type I myofiber of longissimus dorsi muscle of the 1 day old piglets. The number ofmyofiber per area of longissimus dorsimuscle of the 1 day old piglets of the taurine given sowstended to be higher（ｐ＜ 0.10）and those of the 5 weeks old piglets of the taurine given sows
were higher（ｐ＜ 0.05）as compared with the piglets of the control sows. Adding taurine tothe sow's diet did not affect mRNA expression levels of myosine heavy chain protein isoforms
in muscles of offspring. We failed to detect myogenesis promoting effects of taurine in thisexperiment．

１．目

タウリン（２-アミノエタンスルホン酸）には，

的

培養筋芽細胞が筋管に分化する過程を促進する効

ブタの筋線維は胎仔期に形成する（Foxcroftら２）
果がある（Miyazakiら2013）。タウリンのこの１）
2006）
ので，出生後に筋形成を促進するのは難機能が生体内でも発揮されれば，筋形成を促進でしくなる。したがって，ブタの筋形成を促進する

きる可能性がある。

ためには，胎仔期にアプローチするのが有効だと考えられている。

本研究は，ブタの筋線維が形成される胎仔期に，母体を介して胎仔へのタウリンの供給を強化© The Ito Foundation

胎仔期のタウリン供給強化によるブタの筋形成促進

171

し，産子の筋形成を促進できるかあきらかにする筋を採取した。また，５週齢に達した時点で，各ことを目的とした。

雌豚の産子から雄，雌１頭ずつ選び，血漿，胸最

２．方
2.1

長筋，菱形筋，大腿二頭筋を採取した。

法

2.4

妊娠雌豚の管理

サンプル分析

採取した血漿は遊離タウリン濃度を測定した。

妊娠豚８頭を対照区とタウリン給与区に，４頭

１日齢ならびに５週齢のブタの胸最長筋，菱形

ずつ割りふった。対照区には，妊娠１～105日目

筋，大腿二頭筋のミオシン重鎖（MHC）タンパ

まで市販の妊娠豚用飼料を給与し，妊娠106日目

ク質の各アイソフォームのmRNA発現量を測定から離乳までは市販の授乳豚用飼料を給与した。

した。さらに，１日齢ならびに５週齢のブタのＩ

タウリン区には，市販の妊娠豚用飼料にタウリン型筋線維の割合を免疫染色法で測定するとともを1.5％添加した飼料を妊娠１～105日目まで給与に，筋線維数を測定した。

し，妊娠106日目から離乳までは市販の授乳豚用飼料にタウリンを1.5％添加した飼料を給与した。

３．結果と考察

妊娠１～105日目までの飼料の給与量は，日本飼

Table１は血漿タウリン濃度の結果である。タ

養標準・豚（2013年版）に記載されている妊娠豚

ウリン強化飼料を給与した妊娠25日目の繁殖雌豚のエネルギー要求量の算定式にのっとって決定しの血漿タウリン濃度は，対照区の濃度の６倍の高た。妊娠106日目から分娩までは１日あたり2500

さで（Ｐ＜0.01），タウリン強化飼料の効果を確

ｇの市販の授乳豚用飼料を給与した。分娩から離認した。一方，タウリン強化飼料を給与した母豚乳までは（授乳期間中），供試した繁殖雌豚の飼から生まれた１日齢の子豚の血漿タウリン濃度の料摂取量に応じて，１日あたり最大７㎏の範囲で平均値は，差はなかったものの対照区の子豚より給与量を調節した。

も低かった。ほかの遊離アミノ酸濃度と比較する

2.2

産子の管理

と，初乳中の遊離タウリン濃度は20～250倍高い供試した繁殖雌豚の産子は，畜産草地研究所の通常の管理方法で飼育し，28日齢で離乳した。
2.3

サンプル採取（岩澤ら1995）３）。岩澤ら（1995）のこの結果は，新生子豚にとってタウリンがきわめて重要だということを示唆している。対照区の母豚であっても妊娠豚からは妊娠25日目に血漿を採取した。分

体内でのタウリン合成量と乳への移行が高くなっ娩24時間以内（１日齢）に，各雌豚の産子からている可能性があり，このことが１日齢の子豚の雄，雌１頭ずつ選び，血漿，胸最長筋，大腿二頭血漿タウリン濃度に差がなかった理由かもしれな

Table 1 Effects of taurine supplementation to sow's diet during

pregnancy and lactation periods on concentrations ofplasma free taurine of sows and offspring（nmol/ml）．
ControlTaurineSows at 25th day of pregnant period

83±22

491±22＊＊

Offspring 1 day old

163±38106±37

Offspring 5 weeks old

216±34143±33＊＊：Ｐ＜0.01© The Ito Foundation

172

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 2 Effects of taurine supplementation to sow's diet during pregnancy and lactation

periods on the number of piglets born, birth and weaning weights of piglets．
ControlTaurineSE

The number of piglets born（all）

11.3

12.0

1.9

The number of piglets born（alive）

10.0

10.8

1.5

Birth weight（kg）

1.4

1.0

0.1＊

Weaning weight（kg）

9.1

7.8

0.5†

†：Ｐ＜0.10，＊：Ｐ＜0.05
Table 3 Effects of taurine supplementation to sow's diet during pregnancy andlactation periods on the ratio of myosine heavy chain type I myofiber andthe number of myofiber in l. dorsi muscle of offspring．
ControlTaurine１day old
Ratio of type I fiber（％）

5.5±0.8

5.3±0.7

The number of myofiber（number/mm２）

1799±302

2614±262†

Ratio of type I fiber（％）

11.6±1.4

9.9±1.4

The number of myofiber（number/mm２）

971±721242±66＊

５weeks old†：Ｐ＜0.10，＊：Ｐ＜0.05い。哺乳期間中の子豚のタウリンの栄養状態を評豚（2013年版）にもとづいて妊娠豚へのエネル

価するためには，初乳と通常乳の遊離タウリン濃ギー（飼料）給与量を決定したが，可消化エネル

度を測定するとともに，２週齢や離乳時など別のギーに換算すると，畜産草地研究所の通常の管理

タイミングでも豚の血漿遊離タウリン濃度を測定

で 給 与 し て い る 量 よ り も ，１ 日 あ た り 300 ～する必要がある。また，５週齢の産子の血漿タウ

1000kcal低い給与量になった。そして，この実験

リン濃度にも差はなかった。

で得たタウリン区の生時体重は，対照区だけでな

Table２は産子数，生時体重，離乳体重の結果

く，著者らの以前の実験で得た生時体重の平均値である。産子数にはタウリン強化の影響はなかっ（1.3～1.4kg）よりも低かった。著者らの以前の実た。一方，タウリンを強化すると生時体重が小さ験では，妊娠25～50日の25日間だけ，日本飼養標

くなり（Ｐ＜0.05），離乳体重も小さくなる傾向

準・豚（2013年版）にもとづいてエネルギー給与があった（Ｐ＜0.10）。タウリンを0.05％添加した量を決定した。以上のことから，タウリンにはエ

飼料を１～42日齢までウズラに給与すると，１～

ネルギー要求量を高くする効果があるのかもしれ

21日齢までは増体がよくなり，全期間でみると飼ない。この点については，エネルギー代謝試験な料効率がよくなった（Wangら2009） 。今回の実どで確認する必要がある。

４）

験結果は，ウズラによる先行研究の結果とは相いTable３に産子の胸最長筋のＩ型筋線維の割合れないものになった。その理由については不明なと筋線維数のデータをしめした。Ｉ型筋線維の割点が多いが，タウリンの添加量が高すぎたのかも合に差はなかったが，mm２あたりの筋線維数は，しれない。また，この実験では，日本飼養標準・１日齢ではタウリン区が多い傾向にあり（Ｐ＜© The Ito Foundation

173

胎仔期のタウリン供給強化によるブタの筋形成促進

0.10），５週齢ではタウリン区が多かった（Ｐ＜最長筋，菱形筋，大腿二頭筋のミオシン重鎖タン0.05）。胸最長筋の重量や断面積は測定していな

パク質のmRNA発現量の結果である。いずれのいが，生時体重と離乳体重の結果もあわせて考え

日齢，筋肉でも，アイソフォームにかかわらず，ると，タウリン区のほうが胸最長筋は小さかった

タウリン強化飼料の母豚への給与の影響はなかっと考えるのが妥当だろう。したがって，Table３た。菱形筋のMHC2bのmRNA発現量の平均値はの結果は，筋線維数が増えたことによる結果ではタウリン区で低かったが，誤差が大きく，有意差なく，胸最長筋が小さいので個々の筋線維面積もとはならなかった。タウリン区のほうが胸最長筋

小さくなり，mm あたりの筋線維数は多くなっは小さかったと考えるのが妥当と前述した。筋肉たと説明できる。

が小さくてもミオシン重鎖タンパク質のmRNA

２

Fig.１とFig.２は１日齢の産子の胸最長筋と大発現量には差がないということであれば，ミオシ

腿二頭筋のミオシン重鎖タンパク質のmRNA発

ン重鎖タンパク質のmRNA発現量を比較しても，現量の結果で，Fig３，
４，
５は５週齢の産子の胸筋肉の大きさまでは評価できないことになる。

Relative expression

3
2.5
2
1.5

ControlTaurine

1
0.5
0
MHC1

MHC2a

MHC2b

MHC2x

Fig. 1 Effects of taurine supplementation to sow's diet during pregnancy and lactation periods on mRNA expression of

myosine heavy chain protein isoforms in l. dorsi muscle of offspring of 1 day old. Least square means ± standard
errors．

Relative expression

2
1.5
1

ControlTaurine

0.5
0
MHC1

MHC2a

MHC2b

MHC2x

Fig. 2 Effects of taurine supplementation to sow's diet during pregnancy and lactation periods on mRNA expression of

myosine heavy chain protein isoforms in biceps femoris muscle of offspring of 1 day old. Least square means ±standard errors．

© The Ito Foundation

174

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

3.5

Relative expression

3
2.5
2

Control

1.5

Taurine

1
0.5
0
MHC1

MHC2a

MHC2b

MHC2x

Fig. 3 Effects of taurine supplementation to sow's diet during pregnancy and lactation periods on mRNA expression of

myosine heavy chain protein isoforms in l. dorsi muscle of offspring at 5 weeks old．
18SRNA expression was used as internal standards. Least square means ± standard errors．

Relative expression



2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

ControlTaurine

MHC1

MHC2a

MHC2b

MHC2x

Fig. 4 Effects of taurine supplementation to sow's diet during pregnancy and lactation periods on mRNA expression of

myosine heavy chain protein isoforms in rhomboideus muscle of offspring at 5 weeks old．
18SRNA expression was used as internal standards. Least square means ± standard errors．

1.8
1.6
1.4
1.2
1

Control

0.8

Taurine

0.6
0.4
0.2
0
MHC1

MHC2a

MHC2b

MHC2x

Fig. 5 Effects of taurine supplementation to sow's diet during pregnancy and lactation periods on mRNA expression of

myosine heavy chain protein isoforms in biceps femoris muscle of offspring at 5 weeks old. 18SRNA expression
was used as internal standards. Least square means ± standard errors．

© The Ito Foundation

胎仔期のタウリン供給強化によるブタの筋形成促進

４．要

175

を強化すると生時体重が小さくなり（Ｐ＜0.05），

約

離乳体重も小さくなる傾向があった（Ｐ＜0.10）。

タウリンには筋形成を促進する機能が期待でき

産子の胸最長筋のＩ型筋線維の割合にタウリン強るので，ブタの筋線維が形成される胎仔期に，母化の影響はなかったが，mm２ あたりの筋線維数体を介して胎仔へのタウリンの供給を強化し，産は１日齢ではタウリン強化で多い傾向にあり（Ｐ子の筋形成を促進できるかあきらかにすることを＜0.10），５週齢ではタウリン強化で多くなった目的とした。市販の妊娠豚用飼料にタウリンを（Ｐ＜0.05）。１日齢と５週齢の産子の筋肉（胸最1.5％添加した飼料を妊娠１～105日目まで給与

長筋，菱形筋，大腿二頭筋）のミオシン重鎖タン

し，妊娠106日目から離乳までは市販の授乳豚用

パク質のmRNAの発現量は，日齢にかかわらず，

飼料にタウリンを1.5％添加した飼料を給与した。

どちらの筋肉でも，タウリン強化の影響はなかっ

対照区には，妊娠１～105日目までは市販の妊娠た。今回の実験では，タウリンの筋形成促進効果

豚用飼料を，妊娠106日目から離乳までは市販のを確認することはできなかった。

授乳豚用飼料を給与した。分娩後の産子は，畜産
草地研究所の通常の管理方法で飼育した。妊娠25日目の母豚の血漿遊離タウリン濃度は，タウリン
強化飼料の給与で対照区の６倍になった（Ｐ＜0.01）。しかし，タウリン強化飼料を給与した母
豚から生まれた１日齢の子豚の血漿タウリン濃度は対照区と差がなかった。母豚の飼料にタウリン

文献１） Foxcroft et al：Journal of Animal Science, 84
Suppl, E105～112，2006．
２）
 Miyazaki et al.：Advances in Experimental
Medicine and Biology，776，321～328，2013．
３）
 岩澤ら：日本養豚学会誌，32，193～199，1995．
４）
 Wang et al.：Poultry Science，88，1394～1398，
2009．

© The Ito Foundation

176

肉質を変化させる天然物の探索
Screening for natural product that changes the meat characteristics

内

田

隆

史

（東北大学大学院農学研究科）

Takafumi Uchida（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

Our goal is to produce healthy and tasty meat with low fat and high protein. We speculatethat some natural compound may help produce healthier meat. In order to identify thecompound from natural product libraries,we screened for inhibitors of the peptidyl prolyl cis/trans isomerase（PPIase），Pin1, because we found that Pin1 inhibitors might reduce thecontent of fat in meat.
Pin1 binds to phosphorylated Ser/Thr-Pro motifs in a variety of proteins and catalyzes thecis/trans isomerization of peptidyl prolyl bonds. Recently, we found that Pin1 enhances theuptake of triglycerides and the differentiation of mouse embryonic fibroblasts into adipose cells
in response to insulin stimulation, and suggested that Pin1 downregulation could be a potential
approach to the treatment of obesity-related disorders. Therefore, we designed a screen to
discover potential small molecule inhibitors of Pin１．
In this study, we focus on screening inhibitors from natural compound libraries, because
they could be added in feed. As medical drugs, natural compounds have been recognized as
evolved and privileged structures with a greater likelihood than many synthetic compounds to
exhibit specific bioactivities. For example，73 ％ of cancer therapeutics approved to date are
either natural products or their derivatives. In spite of these successes, natural resources havenot been widely screened as drugs over the past two decades, due in part to persisting
difficulties in the systematic isolation and synthesis of such molecules. However, Cyclosporin A（CsA）and FK506, which are in widespread clinical use as immunosuppressant drugs arenatural products. Their target molecules are the PPIase subfamilies, the cyclophilins and theFK506-binding proteins (FKBPs), respectively. These facts suggest that natural products
represent a good source to screen for additional PPIase inhibitors.
We have established a screening method to efficiently assay for Pin1 inhibitors and applied
the method to identify a Pin1 inhibitor from the eatable foods and plants. We found an inhibitor,
974B from seaweed. The crude extract of seaweed showed similar effect to the purified
compound 974B, which suggests that feed containing seaweed may reduce the fat in meat.
This study was supported by“The Ito Foundation”in addition to a Grant-in-Aid for Scientific
Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology of Japan,
and Science and technology research promotion program for agriculture, forestry, fisheries andfood industry.

© The Ito Foundation

177

肉質を変化させる天然物の探索

１．目

できるのではないかというアイデアを持つに至っ的た。

我が国では，“さし”の入った，とろけるよう広い意味ではPin１阻害剤を探索することからな霜降り肉が高級牛肉とされ人気も高く，最高級本研究プロジェクトはスタートしているが，本研のＡ５級の肉など庶民にはまず食べる機会もない

究課題は低脂肪の食肉の生産を行うための飼料にほど高価である。その一方で，逆に，最近の健康添加する物質を探索することを目的にしている。

食ブームもあり，脂肪分の少ない赤肉の方を好む

したがって，既に食用になっている天然物を探索人も多くなってきており，消費者の好みは多様化源とすること，また，低コストでなければならなしている。

いことなどを考慮すると大量に入手可能な天然物

国産牛である短角和牛の肉質は脂肪分が少ないが好ましいと予測される。

ヘルシーな赤肉で，赤身が多いから量を食べても本助成金を受ける前から広い意味での本研究は飽きがこなく，かむほどに肉本来の美味しさが広すでに進めており，マリンエキスからPin１活性がる。高タンパク質でヘルシーな牛肉として短角を抑制する天然物抽出物を発見していた。本研究

和牛はブランド化されつつある。我が国ではあま

報告では得られた化合物がまだ少量であること，

りなじみがないし一般的になっていないが，北米

また作用機構が不明であることから，主に分子・では脂肪分の少ない高タンパク質の赤肉が多いバ

細胞レベルの基礎的な研究を行った。

イソンの肉も人気が高く，簡単に飼育できるようになればさらに普及すると言われている。すき焼

２．方法

きには霜降り肉，ステーキには赤み肉というよう第一に，微生物培養液，植物抽出物，海藻抽出に調理方法によってそれぞれの肉質の特徴をいか物などの天然物，さらに市販されている健康食品

すことができるし，どちらもより多く消費されるからの抽出物などからPin１の酵素活性を阻害すようになっていくと予測できる．高脂肪の霜降りる化合物を精製した．化合物の精製方法は既報の肉とともに低脂肪で高品質な赤身肉を作成するこ通り，メタノール抽出およびカラムクロマトグラとが望まれる。

フィーを用いる方法で行った６）。Pin１の酵素活

我々はこれまでにPin１という酵素の研究を行ってきた．Pin１の生体での機能を，Pin１遺伝子欠損マウスをもちいて解析してきた結果，Pin１が脂肪細胞の分化に関与していることを見出し性を測定するスクリーニングシステムは我々が構築した方法を用いた４）。
第二に，細胞レベルのアッセイ系として，線維，芽細胞の脂肪細胞への分化を検出する方法を用いPin１を阻害する物質を混入した餌を与えることた．オイルレッドＯ染色で脂肪を赤色に染色したで脂肪の含有量を低下させた肉を作成することに後，その色素量を濁度測定することで脂肪量を半生かせるのではないかと考え本研究を開始した。

定量的に測定する方法を用いた１）。

１～３）

すでにプロリン異性化酵素が脂肪細胞への分化を促進することを見出していた。また，この酵素

３．結果と考察

活性を阻害することで線維芽細胞を脂肪細胞に分天然物から茶カテキンと海藻抽出物が阻害活性化させなくできることを発見していた。これらのを有することを見出した。茶カテキンのPin１阻技術を応用することで，脂肪分の少ない肉を作成

害活性に関しては米国のグループに先を越され報© The Ito Foundation

178

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

し，その脂肪細胞への分化抑制作用に関して解析OHした。我々はこれまでに，１）SiRNAによるPin
OH

O
O

OH

１の発現抑制や，２）化学合成化合物によるPin

OH
OH

１酵素活性の阻害により，インシュリン刺激による線維芽細胞の脂肪細胞への分化が抑制されるこ

O

O

OH

OH

とを示した１）。
今研究で，974 -Ｂが線維芽細胞の脂肪細胞へのO

HO

分化を抑制することを明確に示すことができた

OH（Fig.２）。細胞レベルの実験は，海藻から単離精

Fig. 1 Sea Weed Pinl Inhibitor 974-B

６）

製した化合物974 -Ｂを培養液に溶解する方法で告されてしまったが ５），海藻抽出物に関しては行ったが，マウスへの投与実験は，海藻からメタ我々が発見した974 -Ｂ（分子量が974であったこ

ノール抽出を行っただけの粗精製物を餌に添加しとから名付けた）が（Fig.１） ，マウス胎仔線維投与する方法を用いた。阻害剤添加，非添加の餌

芽細胞（NIH3T３-Ｌ１）やマウス線維芽細胞かを１週間連続投与（合計10mg）した後，体重，らの脂肪細胞への分化抑制活性も示した７）。

脂肪量を比較した。両群マウスで体重，脂肪，そ６）

本研究課題では，この海藻抽出物974 -Ｂを精製の他毒性の病理などは認められなかった（データ

974-B
0

1μM

DTMN
10μM

50μM

1μM

day0

day2

day4

day6

day8

day8
（拡大）

Fig. 2 974 -Ｂによる線維芽細胞の脂肪細胞分化抑制７）© The Ito Foundation

5μM

肉質を変化させる天然物の探索179略）。本実験方法では化合物がマウス体内に吸収下させた肉を生産できる可能性を示している。海されていない可能性が否定できない。したがっ藻またはお茶葉を大量に確保し，動物での実証試て，個体での974 -Ｂの効果を明確に検出するには験を行う意義はあると考えられる。

血管内への直接投与が必要だと考える。しかし，本研究の目的には，海藻を大量に確保し動物に餌として投与する実証試験を行うことのほうがより重要であり意義があると考えている。
また，コストだけでなく，海藻中には974 -Ｂ以
外にも脂肪を分化させる活性を有する物質があるので海藻を直接餌に混合する方が好ましいと推察している。さらに牛のルーメンには海藻そのものを投与してもセルロース分解できる微生物や酵素も存在しており海藻から化合物成分を抽出しなくても，牛肉生産には海藻そのものを混入させた餌を与えることで脂肪含有量を低下した肉を作成できる可能性がある．さらに，海藻ではなくお茶葉を餌に混合するという選択肢もありうる。お茶に含まれるエピガロカテキンガレートはPin１を海藻974 -Ｂよりも強く阻害するので５，７），より強い
脂肪低下効果が期待できる。使用済みのお茶葉が使えるなら，廃棄物を使えるのでコストも安くできる。エピガロカテキンガレートの脂肪細胞分化阻害活性についてはまだ検討していないが，今後期待できる課題である。
４．要

約

線維芽細胞を脂肪細胞に分化させることを促進
するプロリン異性化酵素Pin１の活性を阻害し，脂肪含有量の低下した肉すなわち赤身の多い肉を生産する基盤について検討した。我々は安全な天然物からPin１の阻害剤を探索し海藻成分中の974 -Ｂを発見した。この化合物は線維芽細胞の脂肪細胞への分化を阻害した。海藻成分を投与しても体重減少などの急性毒性はなかった。これらの文
献１）
 Uchida T, Furumai K, Fukuda T, Akiyama H,
Takezawa T, Asano T, Fujimori F, Uchida C：
Prolyl Isomerase Pin1 Regulates Mouse Embryonic
Fibroblast Differentiation into Adipose Cells. PLoS
One, 7（3）e31823，2012．
２）
 Nakatsu Y, Sakoda H, Kushiyama A, Zhang J,
Ono H, Fujishiro M, Kikuchi T, Fukushima T,
Yoneda M, Horike N, Ohno H, Kanna M, Tsuchiya
Y, Kamata H, Nishimura F, Isobe T, Ogihara T,
Katagiri H, Oka Y, Takahashi S, Kurihara H,
Uchida T, Asano T：Peptidyl-prolyl cis/transisomerase NIMA-interacting 1 associates with IRS1 and enhances insulin actions and adipogenesis. J
Biol Chem，286，20812～20822，2011．
３）
 Nakatsu Y, Sakoda H, Kushiyama A, Ono H,
Fujishiro M, Horike N, Yoneda M, Ohno H, Kamata
H, Nishimura F, Ogihara T, Katagiri H, Oka Y,
Fukushima T, Takahashi S, Kurihara H, Uchida T,
Asano T：Pin1 associates with and inducestranslocation of CRTC2 to the cytosol, thereby
suppressing CRE transcriptional activity. J Biol
Chem，285，33018～33027，2010．
４）
 Mori T, Itami S, Yanagi T, Tatara Y, Takamiya
M, Uchida T：Use of a Real-time Fluorescence
Monitoring System for High-Throughput Screening
for Prolyl Isomerase Inhibitors. J. Biomol Screen ，
14（４），419～424，2009．
５）
 Ursova DV, Shim JH, Kim DJ, Jung SK, Zykova
TA, Carper A, Bode AM, Dong Z：
Epigallocatechin-gallate Suppresses Tumorigenesis
by Directly Targeting Pin1. Cancer Prev Res，４，1366～1377，2001．
６）
 Yamashita YM, Kondo S, Segawa S, Lin YC,
Toyohara H, Ito H, Konoki K, Cho Y, Uchida T：
Isolation and structural determination of two novel
phlorotannins from the brown alga Ecklonia
kurome Okanura, and their radical scavenging
activities. Mar Drugs，11，165～183，2013．
７）
 Mori T, Hidaka M, Ikuji H, Yoshizawa I,
Toyohara H, Okuda T, Uchida C, Asano T, YotsuYamashita M, Uchida T：A High-Throughput
Screen for Inhibitors of the Prolyl Isomerase, Pin1,
Identifies a Seaweed Polyphenol that Reduces
Adipose Cell Differentiation. Biosci, Biotechnol
Biochem（in press）

結果は海藻成分を餌に混合することで脂肪分を低© The Ito Foundation

180

完全自給粗飼料給与における放牧と未放牧が日本
短角種の肉質に与える影響
Effect of grazing on meat quality of Japanese Shorthorn under complete
grass-fed beef production system

小 笠 原 英 毅・岡

山

和

代＊

（北里大学獣医学部附属フィールドサイエンスセンター，＊北里大学保健衛生専門学院管理栄養科）

Hideki Ogasawara and Kazuyo Okayama＊（Field Science Center, School of Veterinary Medicine, Kitasato University, ＊Department of Applied Clinical Dietetics,
Kitasato Junior College of Health and Hygienic Sciences）

To further understand the complete grass-fed beef production system, we produced thecomplete grass-fed beef in Yakumo Experimental Farm, Field Science Center of Kitasato
University and investigated the effect of grass-feeding on meat quality of Japanese Shorthorn.
We analyzed carcass quality, meat quality, distribution of muscle fiber type, nutrient
composition, fatty acid composition, and sensory evaluation of complete grass-fed beef（M.
longissimusthoracis（LT）and M. biceps femoris（BF））with three different feeding systems（GH: grazing period（Jun-Nov.2011, Jun-Nov.2012），HH: zero-grazing period, HG: grazing period（Jun-Nov.2011, Jun-Nov. 2012, Jun-Nov.2013）．
There was no significant difference in carcass quality and meat quality among the threegroups. We found that grass-feeding changed fast skeletal muscle fiber types to slow skeletal
muscle type. Furthermore the grass-feeding induced 3-hydroxybutyrate dehydrogenase in slow
skeletal muscle fiber types in the LT and the BF muscle（P ＜ 0.05）． The rate of moisture
was increased in the HG managed beef compared to the GH and HH managed beef. While HG
management resulted in the reduced rate of the intramuscular fat. We also found that the rateof the intramuscular fat were increased in the HG-managed BF muscle compared to the HGmanaged LT muscle and there were differences in fatty acid composition between the muscles.
These findings suggest that the grazing make a difference between LT and BF muscle. The
flavor and juiciness showed lower scores in of HG-managed beef compared to GH- and HHmanaged beef. However, the overall acceptability similar scores among the three groups. In
conclusion, the grass feeding-induced change of muscle fiber types didn't affect meat quality
and sensory characteristics．

１．目

生産が慣行的であるため，輸入穀物飼料の給与が的必須であり，自給粗飼料を活用した牛肉生産は未

近年，耕作放棄地の利用など放牧を取り入れただ 確 立 さ れ て い な い 。北 里 大 学 獣 医 学 部 附 属

肉牛生産方式が徐々に普及しているが，国内畜産

フィールドサイエンスセンター八雲牧場（八雲牧の生産体系は脂肪交雑を重視した牛肉と効率的な場）は，夏は放牧，冬は舎飼の自給粗飼料のみで© The Ito Foundation

完全自給粗飼料給与における放牧と未放牧が日本短角種の肉質に与える影響

Jun.2011

Nov.2011

Jun.2012

Nov.2012

181

Apr.2013

GH
HH
Jun.2013

Nov.2013

HG: housing period: grazing period

Fig. 1 Feeding systems in this study.
GH：grazing period（Jun-Nov.2011, Jun-Nov.2012）．

HH：zero-grazing.

HG：grazing period（Jun-Nov.2012, Jun-Nov.2013）．

肉牛生産（北里八雲方式）を実践しており，出荷

いしさ」への影響に着目し，北里八雲方式である

月齢は約33ヶ月で，生体重は約700㎏に達する。

放牧を主体とした自給粗飼料のみでの飼養管理とその肉質は筋肉内脂肪が少ない赤肉が主体であ未放牧（通年舎飼で飼養管理する処理）で自給粗り，筋組織を構成する筋線維型は機能性成分であ飼料のみでの飼養管理で生産された日本短角種のるカルニチンを多く含む赤色筋線維（Ⅰ型および牛肉特性を明らかにすることを目的とした。

ⅡＡ型）の構成割合が慣行肥育牛よりも多いことが明らかとなっている１，２）。
北里八雲方式では春から秋まで屋外で飼養され

２．方
2.1

法

供試牛および飼養管理るため，飼養管理上，作業の省力化，景観の保持

供試牛は2010年３月～2011年５月生まれの日本に関する優位性は明白であるが，放牧が肉牛を生

短角種雄９頭とし，３～４ヶ月齢時に除角および産する上で産肉性および牛肉の「おいしさ」にど去勢を行い，６ヶ月齢まで自然哺乳と自給粗飼料の程度，貢献するかは不明な点が多い。「おいし（夏期間：放牧草，冬期間：ロールラップおよびさ」を評価する場合，一般的には理化学的分析とグラスサイレージ）のみで飼養され，７ヶ月齢以官能評価が用いられる。また，肉質の特性を把握

降，自給粗飼料のみを飽食させた（北里八雲方するために筋線維型構成割合を算出するが，最近式）。出荷時の月齢を調整にするため，2011年６では筋線維型と食味性に高い相関を持つ報告もあ月に供試牛を３つの牛群に分け，放牧期に放牧，る３）。我々の研究で一般消費者に行った舎飼期出

舎 飼 期 に 舎 飼 さ せ 出 荷 し た 群（放 牧 ― 舎 飼 区

荷の北里八雲牛の官能調査では，「外観・食味」（grazing-housing:GH）：３頭），２ヶ月齢以降，に関しては高い評価が得られたが，慣行牛と比較

放 牧 さ せ な か っ た 未 放 牧 群（舎 飼 ― 舎 飼 区

して「柔らかさ」に関しては評価が分かれた 。

（housing-housing : HH）：３ 頭），舎 飼 期 に 舎 飼

しかしながら，北里八雲方式によって生産された

い さ せ ，放 牧 後 に 出 荷 し た 群（舎 飼 ― 放 牧 区

牛肉の「おいしさ」を厳密に評価するためには単（housing-grazing : HG）：３頭）とした（Fig.１）。

に穀物給与で生産された牛肉との比較ではなく，試験開始時の平均月齢はGH，HHおよびHG区で

北里八雲方式のキーポイントとなる放牧の影響をそれぞれ11±３，10±３，３±２ヶ月齢であった。

解析しなければならない。以上のことから，本研各区の給与飼料はGHおよびHG区では放牧期は放究では放牧による筋線維型構成割合の変動と「お牧草を，舎飼期はグラスおよびロールラップサイ

４）© The Ito Foundation

182

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

レージを自由採食させた。HH区では放牧期は採分析研究所に委託し，測定した。

草地からその都度刈り取った青刈り牧草を，生草

脂肪酸組成の分析ではデカン酸（Ｃ10：０），

重量で日量40kg／頭以上給与し，舎飼期は他のラウリン酸（Ｃ12：０），ミリスチン酸（Ｃ14：区と同様の給与飼料とした。GHおよびHH区は０），ミリストレイン酸（Ｃ14：１），ペンタデカ

2013年４月に，HG区は2013年11月に北海道畜産

ン酸（Ｃ15：０），ペンタデセン酸（Ｃ15：１），

公社十勝工場に出荷し，得られたサンプルを以下

パルミチン酸（Ｃ16：０），パルミトレイン酸の実験に用いた。

（Ｃ16：１），ペプタデカン酸（Ｃ17：０）
，ペプ

2.2

枝肉成績

タデセン酸（Ｃ17：１），ステアリン酸（Ｃ18：

公益社団法人日本食肉格付協会の発行する牛枝
肉格付明細書を基に枝肉成績を解析した。
2.3０），オレイン酸（Ｃ18：１），リノール酸（Ｃ18：２），リノレン酸（Ｃ18：３），アラキジン酸

組織化学的解析（Ｃ20：０），ベヘン酸（Ｃ22：０），リグノセリ

枝肉断面より最長筋（M. longissimus thoracis），

ン酸（Ｃ24：０）の17種類について食品分析開発

大腿二頭筋（M. biceps femoris）を採取し，ドラセンターに委託し，測定した。脂肪酸組成は各脂イアイス―アセトンにより新鮮凍結サンプルを作

肪酸のピーク面積の和を100％とし，各脂肪酸の製した。その後，10μｍの凍結切片を作製し，組面積比から算出した。

織構造の解析のため，アザン染色を行った。また，

2.5

官能評価

連続切片を作製し，myosin-slow（Ⅰ型）および⑴

パネルの選定fast（Ⅱ型）抗体を用いた免疫組織化学的染色で，官能評価の対象者となるパネルは北里大学保健

酵素化学的染色によりミトコンドリアのニコチン

衛生専門学院の学生（10～20代）を対象とし，事

アミドアデニンジヌクレオチド脱水素酵素

前に調査項目の説明を行い，同意の得られた被験（nicotinamide adenine dinucleotide

者のみに４味（甘味，塩味，酸味，うま味）の濃

dehydrogenase : NADH）活性（ⅡＡ型）および度差識別テスト６）を行い，全て識別できた学生の３ - ヒ ド ロ キ シ 酪 酸 脱 水 素 酵 素みを官能評価のパネル（33名：男性７名，女性26（3-hydroxybutyrate dehydrogenase : HBD） 活

名）とした。

性（ⅠＤ型）を染色し，光学顕微鏡（OLYMPUS,⑵

BX43）で観察した。また，１切片３ヶ所を無作

調理は北里大学保健衛生専門学院管理栄養科調為に選択し，得られた染色像より各筋組織におけ理室にて実施し，折目らの報告に従って行った７）。

るⅠ，ⅠＤ，ⅡＡ，ⅡＢ型の筋線維型構成割合を

部分肉の状態でウエットエージングを14日間行っ算出した 。

た最長筋はステーキカット（約200ｇ）し，真空

５）

2.4

調理方法

包装後，官能評価で使用するまで－30℃で保存し栄養成分および脂肪酸組成

各試験区の最長筋および大腿二頭筋は適正な条た。試験前日に２℃で24時間かけて自然解凍した

件下でのウエットエージングを14日間行った。分

ものを使用した。解凍した牛肉は，調理20分前に析に用いるサンプルは皮下脂肪を取り除き，赤身常 温 に 置 き ，２ cm 角 に 整 形 後 ，各 面 を 強 火部分のみをミンチ状にし，真空状態で分析まで－（250℃）で約１分間焼いた。中心温度計（防滴型

30℃で保存した。栄養成分分析は熱量，水分，タペン温度計CT-410WR）で肉の中心温度を測定

ンパク質，脂質，炭水化物について日本食品機能

し，52℃になるまで加熱後，紙皿に移し，味付け© The Ito Foundation

完全自給粗飼料給与における放牧と未放牧が日本短角種の肉質に与える影響
A

B

183

C

Fig.2 Histochemical analysis of M. longissimus thoracis in different feeding systems．
Azan stained section of GH（A），HH（B），HG（C）．Scale bars＝100μｍても各区に有意な差は認められなかった。また，なしで官能評価を行った。
⑶

各試験区の出荷月齢の違いを考慮し各項目を個体

官能評価

食肉の官能評価ガイドライン６）および折目らの方法に従って，官能評価を行った。項目は肉色

７）ごとに解析したが，出荷月齢に連動した枝肉成績への影響は観察されなかった。

（１：悪い→５：好ましい），風味（１：弱い→

3.2

５：強い）
，うまみ（１：弱い→５：強い），硬さ

各 区 の 最 長 筋（M. longissimus thoracis），大（１：硬い→５：柔らかい），多汁性（１：パサパ

腿二頭筋（M. biceps femoris）の組織学的解析で

サ→５：ジューシー），総合評価（１：苦手→

は，各区の組織構造に顕著な差は認められなかっ

５：好ましい）を含めた６項目を調査した。評価た（Fig.２）。両骨格筋組織の筋線維型構成割合

環境は蛍光灯下でクローズドパネル法，試料コーを算出したところ，最長筋ではHG区でⅠ型筋線

ドはＡ，Ｂ，Ｃとし，１から５の評価点で評価し維の割合が低く，ⅡＡ型筋線維の割合が高かった

た。

（ｐ＜0.05）。また，GHおよびHH区で発現が認め

2.6

組織化学的解析られなかったⅠＤ型筋線維がHG区では少数観察統計処理得られたデータは分散分析とライアンの方法でされた。大腿二頭筋では各区でⅠＤ型筋線維の発多重比較検定を行い，Welch’s t-testで有意差検現が認められ，HG区では最長筋よりも高い構成定を行った。危険率が５％未満で有意水準とした。

割合であった（Table１）。Ⅰ型筋線維の中で３-ヒ
ド ロ キ シ 酪 酸 脱 水 素 酵 素（3-hydroxybutyrate

３．結果と考察
3.1

dehydrogenase : HBD）活性の高い筋線維がⅠＤ型筋線維に分類されるため，HG区の両骨格筋に枝肉成績

完全自給飼料給与を基本とした異なる飼養管理

おけるⅠ型筋線維の構成割合の減少はⅠＤ型筋線で出荷された日本短角種の枝肉成績を解析した。

維の構成割合の増加に起因する。ⅠＤ型筋線維に供試牛の出荷月齢はGH，HHおよびHG区でそれ関する報告は少なく，我々は放牧期の骨格筋組織

ぞれ34±３，34±３および32±３ヶ月齢で，枝肉においてⅠＤ型筋線維の構成割合が増加するこ

重量ではそれぞれ398±16，374±42，361±13kgと，また，その構成割合は姿勢維持など持続的にで有意な差はなかった。皮下脂肪厚ではGH，HH

働く骨格筋組織で高いこと，さらにⅠＤ型筋線維およびHG区でそれぞれ2.2±0.5，2.5±0.1，1.7±は筋線維内に小型の脂肪滴を有することを明らか

0.6cmで，HG区で他の区よりも薄い傾向が認めらにしている２）。HG区でのⅠＤ型筋線維構成割合

れたが，ロース芯面積，バラ厚など他項目においの増加はこれまでの結果と一致した。ⅠおよびⅠ© The Ito Foundation

184

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 1. Comparison of myofibertype distribution in M. longissimus thoracis and M. biceps femoris among

different feeding systems．
M. longissimus thoracis
Feeding system

Percentage distribution
Ⅰ

ⅠＤ

ⅡＡ

ⅡＢ

GH（n＝３）29.8±7.9ａn.d

5.8±4.4ab

64.4±11.2

HH（n＝３）31.3±4.2ａn.d

3.6±1.3ａ

65.1±4.5

HG（n＝３）19.8±3.3ｂ5.2±5.910.3±4.6ｂ

64.6±6.1

M. biceps femoris
Feeding system

Percentage distribution
Ⅰ

ⅠＤ

ⅡＡ

ⅡＢ

GH（n＝３）18.5±5.5ａ

0.8±1.9ａ

14.3±4.9ａ

66.4±5.0

HH（n＝３）21.3±9.6ab

3.2±3.9ａ

8.4±2.7ｂ

67.0±11.1

HG（n＝３）11.4±2.2ｂ

13.4±2.9ｂ

19.5±8.2ａ

55.7±9.8

Values are expressed as mean±SD. n.d: not detected．
a, b, cValues of each myofiber type with same superscript are not significantly different between feeding systems（P＜0.05）．

Table 2. Nutrient composition of M. longissimusthoracis and M. biceps femorisamong different feeding systems．
M. longissimus thoracis
Feeding systemenergy（kcal/100g）

moisture（％）

fat（％）

protein（％）

carbohydrate（％）

GH（n＝３）

170.3±29.5

68.5±3.1

9.6±3.519.1±0.7

1.0±0.4

HH（n＝３）186.0±16.1

67.0±1.5

11.5±2.0

19.5±0.6

1.0±0.4

HG（n＝２）130.5±6.4

72.5±0.9

4.9±0.6

20.9±0.3

0.8±0

M. biceps femoris
Feeding systemenergy（kcal/100g）

moisture（％）

fat（％）

protein（％）

carbohydrate（％）

GH（n＝３）158.0±22.5

69.6±2.1

8.1±2.8

20.2±0.8

1.1±0.3

HH（n＝３）148.0±21.0

70.4±1.3

6.7±1.3

21.0±0.4

1.0±0.4

HG（n＝２）190.0±38.2

67.2±3.0

12.5±5.2

18.3±1.5

1.1±0.7

Ｄ型筋線維は主として脂肪酸を筋収縮エネルギー

最長筋および大腿二頭筋の栄養成分（熱量，水として利用する。放牧飼養では行動量が増加する

分，脂質，タンパク質，炭水化物）をTable２にこと，皮下脂肪厚がHG区で薄い傾向にあること示す。全ての項目で個体数の関係から有意差が認からも体内の脂肪を分解して筋組織にエネルギー

められなかったが，最長筋ではHG区で水分含量源として動員され，ⅠＤ型筋線維が増加すると推が高く，脂質含量が低いことに連動し，熱量が測された。また，最長筋と大腿二頭筋におけるⅠ

GHおよびHH区よりも低かった。一方，大腿二頭Ｄ型筋線維の構成割合の違いは大腿二頭筋が最長

筋では最長筋とは異なり，HG区で脂質含量が高筋よりも姿勢保持に関わり，運動負荷が高い骨格いことから，熱量がHG区で高かった。分析サン

筋組織であることを示唆する。

プルは皮下脂肪を除去していることから，皮下脂

3.3

栄養成分および脂肪酸組成

肪の混入は少なく，HG区における脂質含量の増© The Ito Foundation

完全自給粗飼料給与における放牧と未放牧が日本短角種の肉質に与える影響

185

Table 3. F atty acid composition of M. longissimus thoracis and M. biceps femoris．
M. longissimus thoracis

M. biceps femorisGH（n＝３）HH（n＝３）HG（n＝３）GH（n＝３）HH（n＝３）HG（n＝３）

C10：0

n.d

n.d

n.d

C12：0

n.d

n.d

n.d

C10：0

n.d

n.d

n.d

C12：0

n.d

n.d

n.d

Ｃ14：0

2.37±0.83

2.63±1.03

Ｃ14：1

0.60±0.35

0.70±0.30

2.73±0.45

C14：0

2.27±0.93

2.37±0.85

2.73±0.31

0.53±0.21

C14：1

0.77±0.55

0.73±0.21

1.13±0.42

Ｃ15：0

0.53±0.12

C15：1

n.d

0.67±0.21

0.57±0.06

C15：0

0.57±0.21

0.43±0.06

0.67±0.06

n.d

n.d

C15：1

n.d

n.d

n.d

Ｃ16：0
Ｃ16：1

29.13±2.45

29.60±3.2228.93±2.16

C16：026.93±1.78

26.73±2.3724.70±1.91

3.43±0.93

3.60±0.80

4.13±0.85

C16：1

5.13±1.81

5.03±0.50

7.30±2.78

Ｃ17：0

1.47±0.06

1.63±0.15

1.70±0.10

C17：0

1.67±0.15

1.57±0.06

1.57±0.15

C17：1

n.d

n.d

0.07±0.06

C17：1

0.10±00.13±0.06

0.10±0Ｃ18：0

14.40±1.1514.17±0.95

15.07±3.06

C18：0

11.37±1.87

10.87±0.85

10.27±2.70

Ｃ18：1

44.70±4.70

43.40±5.2241.93±4.01

C18：1

47.20±4.4247.60±5.28

47.63±2.07

Ｃ18：2

1.50±0.30

1.60±0.17

2.23±0.25

C18：2

1.90±0.36

2.20±0.30

1.97±0.15

Ｃ18：3

1.10±0.20

1.33±0.15

0.97±0.06

C18：3

0.87±0.21

1.07±0.15

0.83±0.06

Ｃ20：0

0.10±00.13±0.06

0.03±0.06

C20：0

n.d

n.d

n.d

C22：0

n.d

n.d

n.d

C22：0

n.d

n.d

n.d

Ｃ24：0

0.03±0.06

0.03±0.06

0.13±0.06

C24：0

0.10±00.10±00.13±0.06

SFA１）

46.03±3.4346.57±4.05

46.90±5.57

SFA40.67±3.37

40.07±4.04

37.83±4.65

MUFA２）

48.13±4.32

47.00±4.59

46.07±4.84

MUFA52.33±4.05

52.63±4.83

54.93±4.22

PUFA３）

2.60±0.50

2.93±0.32

3.20±0.20

PUFA

2.77±0.55

3.27±0.45

2.80±0.10

Values are expressed as mean±SD. n.d：not detected．
１）Saturated fatty acids：total of C10：0，C12：0，C14：0，C16：0，C18：0，C20：0，C22：0，C24：0．
２）Monounsaturated fatty acids： total of C16：1，C18：1．
３）Polyunsaturated fatty acids： total of C18：2 and C18：3．

加は組織学的解析で明らかとなった大腿二頭筋にはオレイン酸を含む全ての脂肪酸組成に有意な差おけるⅠＤ型筋線維内に存在する脂肪滴が影響しが認められず，放牧と自給粗飼料のみで生産するている可能性が示唆された。

北里八雲方式では給与飼料が同様であるため，出

最長筋および大腿二頭筋の脂肪酸組成をTable３

荷時期が異なることや放牧飼養（運動負荷）にに示す。各区の最長筋および大腿二頭筋の各脂肪

よっても牛肉の脂肪酸組成に与える影響は少ない

酸組成に有意な差は認めらなかった。一般的に牛と考えられた。本試験とトウモロコシサイレージ

肉はオレイン酸の割合が高く，パルミチン酸とスを給与して生産された日本短角種の半腱様筋の脂

テアリン酸の割合が少ないほど風味が良いとさ肪酸組成10）を比較すると，最長筋では飽和脂肪酸

れ，オレイン酸の割合と風味の好ましさに正の相（SFA）が高く，一価不飽和脂肪酸（MUFA）が関があることが報告されている。また，松本低かったが，半腱様筋の近部である大腿二頭筋でらは放牧飼養した黒毛和種において，オレイン酸

はSFAおよびMUFAの値に差が見られなかった。

の割合と多価不飽和脂肪酸（PUFA）が増加する

大腿二頭筋では脂肪滴を有する筋線維が多く存在ことを報告している 。しかしながら，本試験でするため，この脂肪滴の脂肪酸割合と骨格筋の部

11）

８，９）

© The Ito Foundation

186

平成25年度A

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

B

C
a

a

5

5

5

4

4

3

3

2

2

2

1

1

1

0

0

0

GH

HH

HG

b

GH

D

E

5

5

HH

3

HG

4

3

3

3

2

2

2

1

1

1

0

0

0

HH

HG

GH

HH

HH

HG

GH

HH

HG

5
ac

4

GH

GH
F

b

a

4

HG

4

Fig.3 Sensory characteristics of M. longissimus thoracis among different feeding systems．
A：meat color. B：flavor. C：umami. D：tenderness. E：juiciness. F：overall acceptability．
Data are expressed mean±SD. Data with same superscript are not significantly different between

feeding systems（P＜0.05）．

位の違いによる脂肪酸含量の相違は今後の検討課

なく，運動負荷により，筋線維が太くなり硬くな題である。

る９）。風味は筋線維の分解が進むことで強くなる

3.4

官能評価

ため７），組織学的解析では観察されなかったが，最長筋における官能評価をFig.３に示す。牛肉

運動負荷の強いHG区では風味が低下する要因にの 外 観 （Fig.3A）， 風 味 （Fig.3B），う ま みなるとも考えられた。また，多汁性においても同（Fig.3C），硬 さ（Fig.3D），多 汁 性（Fig.3E），総様の要因が考えられ，栄養成分の結果ではHH区

合評価（Fig.3F）について，パネルに評価させた。

で脂質割合が高く，HG区では低いことからも，風味ではHG区と比較して，GHおよびHH区で有筋肉内の脂質含量の多さが風味や多汁性に影響し意に高く，多汁性ではHH区と比較して，GHおよた可能性が考えられた。今回の官能評価では事前

びHG区で有意に低い評価であった。その他の項に４味の濃度差を識別できたパネルを選別したこ

目では各区に有意な差は認められなかったが，硬とから，パネルによる味覚の差は影響しないと仮さにおいてHG区で低い評価の傾向があった（つ定すると，パネルの約80％が女性であったため，

まり硬い）。一般的に牛肉の硬さは穀物給与のよ

噛む力の違いによる性差の影響も考えられた。しうな高栄養で肥育された牛の牛肉では筋間脂肪がかしながら，今回の結果では骨格筋の部位の違い

入り込み，脂肪組織は筋線維や結合組織よりも脆による検討課題は残るが，最長筋においては硬さ弱なため，柔らかくなり，放牧飼養は穀物給与とや総合評価で各区に有意な差はないことから，北比較して低栄養状態により，脂肪組織の浸潤も少里八雲方式で飼養される日本短角種では出荷時期© The Ito Foundation

完全自給粗飼料給与における放牧と未放牧が日本短角種の肉質に与える影響

187が異なり，さらに２ヶ月齢以降未放牧でも牛肉の短角種の最長筋において放牧ならびに舎飼出荷なおいしさに与える影響が小さいことが示唆された。

ど出荷時期が異なること，放牧によって筋線維型

４．要

構成割合が変動することが牛肉の「おいしさ」に約与える影響が少ないことが示唆され，放牧など自本研究は放牧など自給粗飼料給与による牛肉の給粗飼料給与による牛肉の持続的生産方式確立の持続的生産の確立と向上を目指し，出生から出荷ための基礎的知見が得られた。今後，最長筋以外に至るまで完全自給粗飼料のみで生産された日本の骨格筋で同様の試験を行い，放牧など自給粗飼

短角種の牛肉の特性解明を目的とした。

料給与によって生産される牛肉の「おいしさ」を

完全自給飼料給与を基本とする異なる飼養管理

追求する必要がある。

および出荷時期（GH区，HH区，HG区）で生産，出荷された日本短角種去勢雄，各３頭を供試牛とした。組織化学的解析では各区の最長筋および大腿二頭筋の筋線維型構成割合を算出し，最長筋ではHG区でⅠ型筋線維の割合が低く，ⅡＡ型筋線維の割合が高かった（ｐ＜0.05）。また，GHおよ
びHH区で発現が認められなかったⅠＤ型筋線維がHG区では少数観察された。大腿二頭筋では各区でⅠＤ型筋線維の発現が認められ，HG区では最長筋よりも高い構成割合であった。栄養成分ではHG区で水分含量が高く，脂質含量が低いこと
から，熱量がGHおよびHH区よりも低かった。一方，大腿二頭筋では最長筋とは異なり，脂質含量が高いことから，熱量がHG区で高かった。HG区における脂質含量の増加は組織学的解析で明らかとなった大腿二頭筋におけるⅠＤ型筋線維内に存在する脂肪滴の影響の可能性が示唆された。各区の最長筋および大腿二頭筋の各脂肪酸組成では有意な差は認めらなかったが，両骨格筋で脂肪酸組成が異なることから，骨格筋の機能性の違いが脂肪酸組成に影響を与える可能性が示唆された。官能評価では風味でHG区と比較して，GHおよびHH区で有意に高く，多汁性ではHH区と比較して，GHおよびHG区で有意に低い評価であった。
しかしながら，今回の結果では硬さや総合評価で各区に有意な差はなかった。
本研究により，北里八雲方式で飼養される日本

文
献１）
 萬田富治，畔柳正，中井淳二，東善行：日本における放牧畜産の技術的展望．栄養生理学会報，49（２），27～29，2005．
２）
 小笠原英毅，岡田海渡，小林美里，渡邊康一，麻生久，寳示戸雅之：放牧飼養が日本短角種の枝肉成績と筋線維型構成割合に及ぼす影響，日本畜産学会
第117回講演要旨，（118），2013．
３）
 渡邊康一，山口高弘：食肉とその肉製品の食品組
織学，前編「食肉の科学」，45（２），151～158，
2004．
４）
 Orime A., Yonezawa T., Ogasawara H.,
Kuroyanagi T., Manda T. ： Analysis of preference
for domestic grass-fed beef in Japanese youths.
Animal Science Jounal. 83，268～271．2012．
５） 鈴木惇，大和田修一，玉手英夫：黒毛和種とホルスタイン種の骨格筋における筋線維内脂肪滴の有無と各筋線維型の割合と太さ，日畜会報：49（４），262～269. 1978．
６） 財団法人日本食肉センター：食肉の官能評価ガイ
ドライン，独立行政法人家畜改良センター編，東京，
2005．
７）
 折目愛，小笠原英毅，岡山和代：平成22年度食肉に関する助成研究調査報告書，VOL.29. 68～74．
2010．
８） Mandall IB, Effects of forage vs grain feeding on
carcass characteristics, fatty acid composition, andbeef quality in Limousin-cross steers when time on
feed is controlled. J.Anim.Sci. 76 ， 2619 ～ 2630 ．
1998．
９） Westerling D.B., H.B. Hedrick ： Fatty acids
composition of bovine lipids as influenced by diet,sex and anatomical location and relationship tosensory characteristics. J Anim Sci. 48，1343～1348．
1979．
10）
 米内光晴，今成麻衣，柴伸弥，樋口幹人，渡邊彰：
有機認証短角牛肉の脂肪酸組成．東北畜産学会報，
60（３）．123～126．2011．
11） 農文協：最新農業技術，畜産vol.4，76，2012．

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188

畜肉生産性向上を目指した分岐鎖アミノ酸強化
飼料用ダイズの開発
Improvement of branched chain amino acid contents in soybean for highquality meat production

湯

淺

高

志・松

尾

光

弘・井

上

眞

理＊

（宮崎大学農学部，＊九州大学大学院農学研究院）

Takashi Yuasa, Mitsuhiro Matsuo, Mari Iwaya-Inoue＊（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki;＊Faculty of Agriculture, Kyushu University）

Amino acid contents in soybean seed are the most important roles in an aspect of foodnutrition. Among amino acids, branched chain amino acid (BCAA) group including leucine andisoleucine and valine, have appeared to have significant effects on cell proliferation, protein
synthesis and energy metabolism. BCAA amino transferases are the rate limiting enzymes for
BCAA synthesis. It is expected that meat production and quality are improved by feeding
meat animals with high BCAA soybean. To increase BCAA content in soybean seed with agenetic method, we focused on BCAA metabolism and BCAT genes responsible for BCAA
synthesis in soybean. It is necessary to identify BCAT genes which are expressed specificallyin developing soybean seed because multiple genes of BCAT-related enzymes are expected insoybean genome. Amino acid analysis with OPA/NAC HPLC system indicates that seed BCAA
contents transiently increased and peaked at 7 day after reproductive stage 5（RS5）and thenrapidly decrease to the end of the seed filling stage while glutamine content continuously
decreased during the seed filling stage. It suggests that high BCAA content accelerated seedcell proliferation at the early seed filling stage and then BCAA and glutamine are converted toseed storage proteins during the late seed filling stage. BLAST search for soybean BCAT
homologs in soybean genome on Phytozome ver.8 predicted at least 5 putative BCAT-related
genes. RT-PCR shows that GmBCAT3 expression level was high at the early seed filling stage
and then gradyally decreased. On the other hand, GmBCAT4 expression peaked during 14 to
28 day after RS5 and then decreased at the late seed filling stage. RT-PCR and immunoblot
with anti-BCAT antibody reveals that sugar starvation treatment on soybean seedling induced
GmBCAT3 mRNA and the protein. The present data indicates that the expression of
GmBCAT3 and GmBCAT4 are possible candidate of BCAT genes responsible for BCAA
synthesis in soybean seed and that GmBCAT3 are regulated by complicated manners alongseed developmentals stage and nutrient conditions.

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畜肉生産性向上を目指した分岐鎖アミノ酸強化飼料用ダイズの開発

１．目

189

代謝酵素の遺伝子発現をマスター調節する糖飢餓

的誘導性bZIP転写因子が報告されており，発生段

ダイズ子実のタンパク質含有率は約35%と，植階や外環境シグナルによりBCATが複雑に制御さ物としては非常に高く，栄養価の高い作物としれ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た（Dietrich et al. 2011,て，また健康維持に有効な機能性食品として近年

Kaneko et al. 2013）.

注目されてきた。タンパク質は20種類のL-アミノ

ダイズBCATはダイズの栄養機能性に重要な働酸から構成されており，生体内において各アミノきをしていることが期待されるものの，その遺伝

酸にはそれぞれ異なった多様な生理機能があるこ

子発現，細胞内局在や生化学的性質についてほととが知られている。なかでも疎水性アミノ酸のうんど報告されていない。そこでダイズのBCAA含ちロイシン，イソロイシン，バリンは分岐鎖アミ量増大に向けた遺伝的改良に必要なダイズBCAT

ノ 酸 （BCAA ： Branched-chain amino acid） と遺伝子およびアミノ酸動態に着目し，まず子実肥呼ばれ，特にエネルギー代謝や細胞増殖，翻訳・大期のダイズ子実の分岐鎖アミノ酸含量の変動

転写活性を促進する効果がある（Kimball et al.

と，ダイズのBCAT遺伝子の探索および発現レベ

2006）。ダイズの子実におけるBCAA含量を増加

ルの解析を行った。

することで食品の機能性栄養強化と飼料の畜肉生産効率増大が期待される。
BCAA合成系と分解系のどちらにも関与する重

２．方
2.1

法

栽培条件

要な酵素として，分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵

供 試 作 物 と し て ダ イ ズ（Glycine max（L.）

素 （BCAT ： Branched-chain aminotransferase）

Merr.）‘フクユタカ’を用い，九州大学貝塚圃場

がある。合成経路では最終段階でα-ケト酸をアにおいて基肥として苦土石灰と豆化成を1a当り各ミノ酸に変換する反応を，分解経路では最初の段

15kg施し，2012年７月23日に種子深度が３cmに階でそれぞれのアミノ酸をα-ケト酸へと分解すなるように２粒ずつ播種し覆土した。播種後，土る反応を触媒する。シロイヌナズナ（Arabidopsis

壌の表面が適度に湿る程度に潅水を行った。潅水

thaliana（L.）Heynh.）では，合成系BCATは葉と除草，農薬(スミチオン，マラソン)散布は適宜

緑体，分解系BCATはミトコンドリアに局在する行った。

こ と が 知 ら れ て い る （Diebold et al. 2002,

2.2

Schuster et al. 2005）。シロイヌナズナBCATは，

ソース―シンクバランスを変化させるために自6つのAtBCAT遺伝子ファミリーによってコード

然条件下で栽培したコントロール区と，処理区とされ，AtBCAT-1はミトコンドリア，AtBCAT-

して，各本葉において３枚の小葉のうち２枚を切

2,3,5は葉緑体，AtBCAT-4, 6は細胞質に局在する除した摘葉区，節ごとに莢の数が半分になるよう酵素であることが知られている（Schuster et al.

に莢を切除した摘莢区を設けた。国際的に使用さ2005）。植物におけるBCATの研究は，シロイヌ

れているダイズの生育時期の表示（Hashimoto

ナズナの他に，ホウレンソウ（Spinacia oleracea1980）に従い，処理開始は子実肥大始（Ｒ５）とL.）やトマト（Solanum lycopersicum L.）などごし，摘葉区では10月８日に，摘莢区では10月９日

く少数の植物で行われている（Binder et al. 2007,に処理を行った（Fig.１）。

Maloney et al. 2010）。近 年 ，BCAT や ア ミ ノ 酸© The Ito Foundation

摘葉，摘莢処理190

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

A
SowingJun.23

Sep.27

Oct.25

65d

29d
0

7

14

HervestNov.29, 2012
34d

21

28

35 DaysB
SowingJun.23Defoliating
Oct.8

HervestNov.12 Nov.29, 2012

76d

29d
0

C
SowingJun.237

14

21

Depodding
Oct.9

17d
28

HervestNov.13 Nov.29, 2012

77d

29d
0

35 Days

7

14

21

16d
28

35 DaysFig. 1 Treatments and sampling intervals of soybean（A）Control,（B）Defoliation,（C）Depodding.

2.3

サンプリング2H ２ O＋20mM Na ２ HPO ４）を入れ，液体状にな

子実肥大開始（Ｒ５）から子実肥大盛（Ｒ６）るまで乳棒で破砕する。破砕液を，２本のフタ付の間でサンプリングを行った。子実肥大期に入る

２mLチューブに0.4mLずつ入れ，一方をTotalア

前に，成長速度が同じ個体を選抜してラベリング

ミノ酸分析用，もう一方をFreeアミノ酸分析用した。粒長が３mm以上に達した時点を子実肥大の試料とした。0.4mLの破砕液が入ったチューブ

開始０日目として，７日おきに計６回，２個体１に，0.6mLの10M HClを加え素早くフタをし，株を１反復としてサンプリングを行った。コント

110℃に設定したインキュベーター内で12時間保

ロール区は５反復，摘葉区と摘莢区はそれぞれ３

温し完全に塩酸加水分解した。12時間後チューブ反復行った。

を取り出し，４℃，13,000rpm，15分遠心分離した。

１株内のすべての莢から種子を取り出し，粒数

浮遊物が混入しないように上清を吸い取ってフタと粒重を量った後，１粒あたりの重さの平均を算付２mLチューブに移し，10M NaOHでpH７付近

出した（Fig.２）。その平均値に近い種子をランになるように調節したものを全アミノ酸分析用とダムに選んで１ｇ前後になるように量り取り，素した。0.4mLの破砕液が入ったチューブに，0.5mL

早くアルミホイルでサンプルを覆い，液体窒素で滅菌水，100％0.1mLトリクロロ酢酸を加え素早

瞬間凍結させ－80℃で保存した。

くフタをし，－４℃で12時間冷却した。12時間後

2.4

全アミノ酸，遊離アミノ酸の調製

チューブを取り出し，４℃，13,000rpm，15分遠滅菌済みの乳鉢を氷上に置き，－80℃に保存し心分離した。上清をフタ付２mLチューブに移し，ておいたサンプルと10×サンプル重量（mL）のTotalアミノ酸試料全量の10％量の400mMリン酸

20mMリン酸バッファー（等量の20mM NaH２PO４・

バッファーを加え，Totalアミノ酸試料と等量に© The Ito Foundationcontent（mg/g fresh seed）

畜肉生産性向上を目指した分岐鎖アミノ酸強化飼料用ダイズの開発

191

Free Amino acids

7
6
5
4
3
2
1
0

0

7

14

21

28

35

Day after R5
Fig.2 Profiles of free glutamine and free BCAA contents and free BCAA contents in soybean seeds during the seedfilling stage（Control）． BCAA （Branched chain amino acids）（◆）Glutamine, （●）valine, （■）leucine , （▲）
isoleucine.

なるように滅菌水でメスアップした。このときいて検索した。ダイズBCAT候補遺伝子について

10M NaOHでpH７付近になるように調節したも

CLUSTALW （http://align.genome.jp/） を 用 いのを遊離アミノ酸分析用とした。

てアミノ酸レべルの相同性を比較し系統樹を作製2.5した。発現解析に用いたプライマーはPCR産物がアミノ酸分析

HPLC 機 器 は ， ア ミ ノ 酸 分 析 シ ス テ ム

500～600bp程度になるように設計した。プライACQUITY UPLC(Waters社）を用いた。カラム

マーは25～30塩基，Tm値60～67℃，％CGを45％はODSカラムを使用し，流速は0.25mL/minに設前後の範囲で設計した。３’-プライマーは３’-UTR

定して，OPA/NAC法によってアミノ酸分析をで 設 計 し ，特 異 性 が よ り 高 く な る よ う に し た行った。バイヤル（Waters社）にサンプル試料（Yuasa et al. 2013）。

25μL，OPA/NACの混合溶液（Ｏ-フタルアルデ

常法に従いSDS-フェノール-LiCl法によりトーヒド（OPA）とＮ-アセチルシステイン（NAC）

タルRNA抽出を行った。鋳型RNA量１μｇに５をそれぞれの濃度が16g/L，20g/Lになるように

pmolアニーリング後，ReverTra Aceキット（逆メタノールに溶解し，OPA:NAC＝１：１の割合

転写酵素）（TOYOBO製）によるcDNAを合成しで混合した溶液）50μL，0.4M

ホウ酸ナトリウ

た。cDNA，標的遺伝子の５’-プライマーと３’-プ

ムバッファー175μＬを入れ，18℃で２分間放置

ライマーとGo Taq Green Master Mix（Promega）

した後，分析機器にセットした，なお標準サンプ

およびサーマルサイクラ―（PC816，ASTEC）

ルとして各１mMスタンダードアミノ酸mixture

を 用 い て PCR 反 応 を 行 っ た 。反 応 条 件 は ，を用いた。

94℃：２分，［94℃：10秒，54～58℃：10秒，

2.6

72℃：40秒］×24～36サイクル，72℃で５分の温遺伝子発現解析AtBCAT１と相同性を持つダイズ遺伝子候補

度サイクルプログラムを使用した。増幅されたを， Phytozome v6.0（http://www.phytozome.

DNA産物をアガロース電気泳動，臭化エチジウ

net） と DFCI (http://compbio.dfci.harvard.edu/

ム 染 色 の 後 ，冷 却 CCD 微 量 光 ／ 蛍 光 分 析 器

tgi/ plant.html）の植物ゲノムデータベースを用

AlphaInnotech（ASTEC社）によりDNAシグナ© The Ito Foundation

Total BCAA

0

7 14 21 28 35
Day after R5
Total BCAA

7

20

A

14 21 28
Day after R5
Total BCAA

C

35

E

15
10
5
0

7

14 21 28
Day after R535

BCAA content（mg/g fresh seed）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0

BCAA content（mg/g fresh seed）

BCAA content（mg/g fresh seed）

14
12
10
8
6
4
2
0

BCAA content（mg/g fresh seed）

25
20
15
10
5
0

BCAA content（mg/g fresh seed）

平成25年度

0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0

BCAA content（mg/g fresh seed）

192

Free BCAA

0

7 14 21 28 35
Day after R5Free BCAA

7

0.2

B

14 21 28
Day after R5Free BCAA

D

35

F

0.15
0.1
0.05
0

7

14 21 28
Day after R5

35

Fig.3 Profiles of total BCAA contents（A,C,E）and freeBCAA contents（B,D,F）in soybean seeds during the seed fillingstage.（A,B）Control,（C,D）Defoliation,（E,F）Depodding．（●）valine，（■）leucine，（▲）isoleucine．

ルを解析した。
2.7

動をRT-PCRで分析すると共にBCATタンパク質

免疫化学的解析

レベルの変動をECL法によるイムノブロットによ

BCATの遺伝子発現に加えてダイズBCATの機能を調べるには植物内在BCATタンパク質を検出する方法が必要である。そこで高等植物のBCATのアミノ酸配列を比較した。

りAlphaInnotechを用いて解析した。
３．結果と考察3 . 1 ダイズ子実肥大期のグルタミンおよびそ の 結 果 ， BCAT タ ン パ ク 質 に お い て

BCAAの全アミノ酸，遊離アミノ酸の含量の“H2N-LANKRWVPPPGKGSLYLRP-COOH”の そ れ ぞ変動

れで良く保存された19アミノ酸から成るペプチド

転流アミノ酸の一つとされるグルタミンの含量

配列を見いだし，それらを抗原として抗ペプチド（遊離アミノ酸含量）を測定した（Fig.２）。その抗体を作成した（シグマアルドリッツ）。ダイズ

含量は子実肥大初期で最も高い値を示し，子実肥

種子発芽後７日間培養した芽生えに対して３％

大開始21日目までは急激に減少し，21日目以降あショ糖処理，
栄養飢餓＋プロテアーゼ阻害剤（ロイ

まり変化は見られなかった。いずれの処理区におペプチン，
E-64d，
キナクリン）処理を行い12，24，

いても，子実肥大に伴ってバリン，ロイシン，イ

48時間にそれぞれサンプリングして－80℃凍結保ソロイシンの全アミノ酸含量は増加し，遊離アミ存した。それらのサンプルを用いて遺伝子発現変

ノ酸含量は減少傾向にあった（Fig.３B，D，F）。

© The Ito Foundation

畜肉生産性向上を目指した分岐鎖アミノ酸強化飼料用ダイズの開発

コントロール区では，BCAAの全アミノ酸含量

193（Fig.3B，D，F）。

に着目すると，子実肥大初期ではあまり変化は見

分岐鎖アミノ酸（BCAA）は、このグルタミン

られなかったが，子実肥大開始14日目以降より増などから供給されるアミノ基と，主にショ糖由来

加が見られた（Fig. 3A）。一方，BCAAの遊離アの有機酸をもとに子実で合成される。遊離アミノ

ミノ酸含量は，子実肥大開始7日目を境に増加か

酸含量は，いずれのBCAAも子実肥大開始７日目

ら減少に転じた（Fig. 3B）。BCAAのそれぞれのを 境 に ，増 加 か ら 減 少 へ と 転 じ て い る（Fig.

アミノ酸種に着目すると全アミノ酸含量としては3B）。このことより，子実肥大開始とともに，葉どのステージにおいてもロイシンが最も多く，バやその他のソース器官から子実へと供給された転リン，イソロイシンは各ステージでほぼ同量ずつ

流アミノ酸であるグルタミン，アスパラギンやウ

含まれることがわかった（Fig. 3A）。一方，遊離レイドを材料に速やかにBCAAの合成が始まり，

アミノ酸含量ではバリンが最も多く，次いでロイ

やがてBCAAはタンパク質合成に使われるため，

シン，イソロイシンとなったが，子実肥大開始35

子実肥大開始７日目以降は遊離アミノ酸含量は減

日目には３種のBCAAの遊離アミノ酸含量に有意少していると考えられる。加えて、子実肥大開始

差はなかった（Fig. 3B）。

７日目から子実重の増加が始まり，またいずれのそれぞれの処理区間で３種のBCAAアミノ酸含BCAAにおいても子実肥大中期より顕著に全アミ量を比較すると，全アミノ酸含量はほとんど差がノ酸含量が増加していることから, この時期からなく，いずれのアミノ酸においても子実肥大開始

貯蔵物質であるタンパク質の合成を開始したので35日目ではコントロール区で最も多くなった。遊はないかと考えられる。

離アミノ酸含量では，コントロール区では０－７

3 . 2 ダイズ子実肥大に伴うGmBCAT遺伝子

dayにかけて一過的に上昇した後，徐々に低下しの発現変動たのに対し，摘葉区と摘莢区では０dayに最大値

コントロール区において，成長ステージごとにを示し，徐々に低下した。いずれのBCAAアミノ

子 実 で ４ つ の 候 補 遺 伝 子 ： GmBCAT2酸分子種においてもコントロール区で最も含量が（ G l y m a 0 4 g 0 5 1 9 0 . 1 ）， G m B C A T 3

多く，子実肥大初期（０－７day）での差が最も（ G l y m a 0 1 g 4 0 4 2 0 . 1 ）， G m B C A T 4

大 き く ，子 実 肥 大 に 伴 っ て 差 は 小 さ く な っ た（ G l y m a 0 8 g 0 6 7 5 0 . 1 ）， G m B C A T 5
Days after R5

0

7

14

21

28

35

GmB CAT2（Glyma04g051901）

Cycle
33

GmB CAT3（Glyma01g404201）

27

GmB CAT4（Glyma08g067501）

30

GmB CAT5（Glyma01g345801）

30

Actin

24

Fig.4 The expression profiles of GmBCATs in soybean seeds during the seed filling stage© The Ito Foundation

194

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）
tineva
os tin tar + tors
r
c a S
r
o
bi
nt
cr Su tarv
hi
Co
Su
S
in
24
24
24 h
0
Cycle
se

ol

A
GmBCAT3（Glyma01g40420.1）

29

Actin

24
tin
e
va rs
s
r
n
i
o
e
a
l
t
ro
os cr a St +ibito
nt
cr Su tarv
h
Co
Su
S
in

B

0

24

24

24 h

Anti-GmBCAT antibody
45kDa
Anti-GmBCAT antibody+
competitor

45kDa

Fig.5 Induction of GmBCAT3 of soybean seedlings in response to starvation treatment.（A）RT-PCR,（B） Immunoblot

with anti-BCAT antibody（ECL）（Glyma 01 g 34580.1）の発現解析を行った（Fig.

3.3

４）
。その結果，２種類の発現パターンがあるこ

子・タンパク質レベルの変動とが明らかとなった（Fig.５）．GmBCAT3は子栄養飢餓ストレス処理に応答したオートファ

実肥大初期に最も発現が高く，次第に低くなっ

ジー活性化に伴ってダイズ芽生えのBCAA特異的た。一方，残りのGmBCAT遺伝子は子実肥大開

アミノ基転移酵素（GmBCAT3）が顕著に発現

始０日目ではほとんど発現しておらず，子実肥大誘導されることが示された（Fig.５）。このこと

中期に最も発現が高くなり，その後低くなった。

よりGmBCAT3は栄養飢餓ストレス処理の違いに

BCAA含量の結果と子実での遺伝子発現パター

より転写レベル・タンパク質レベルで複雑な調節ンから，まず子実肥大初期にGmBCAT3が働き，を受けることが示唆された。ダイズ子実のBCAA

葉やその他のソース器官から転流されてくるアミ含量調節において子実肥大に伴う発生レベルの調ノ酸から盛んにBCAAを合成し，子実内のアミノ節に加えてソースからシンクへの糖転流シグナル

酸プールに蓄えられたBCAAは細胞分裂を促進すがBCAT遺伝子の発現調節に機能していることがる因子として機能しているのではないかと考えら示唆された。

れる。その後タンパク質合成が盛んになり遊離アミノ酸レベルが低下してくるとタンパク質合成が栄養飢餓処理に伴うGmBCAT3の遺伝

４．要

約

始まると考えられる子実肥大７日目以降，

分 岐 鎖 ア ミ ノ 酸 （BCAA ： Branched-chain

GmBCAT3の働きを補うため残りのGmBCATs

amino acid；バリン，ロイシン，イソロイシン）は，が働き始めると考えられる。このことは，Total

タンパク質の合成やエネルギー源として利用され

BCAA含量が子実肥大14日目以降急激に増加してるだけでなくタンパク質代謝を調節する因子としいることからも説明できる（Fig.3A）。

ても知られその機能性が注目されている。そこで© The Ito Foundation

畜肉生産性向上を目指した分岐鎖アミノ酸強化飼料用ダイズの開発

195

BCAA含量の高いダイズの作出を将来的な研究目応答して顕著に誘導された。このことよりBCAT

標として，本研究ではダイズ子実におけるBCAA

３はエネルギー供給のためのBCAA分解にも関与

合成の制御機構を解明することを目的とした。

していることが示唆された。

まず肥大に伴う子実内のBCAA含量の推移を明ら か に す る た め ア ミ ノ 酸 分 析 を 行 っ た 。ま た
BCAA合成を行う重要な酵素とされる分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素（BCAT :Branched-chainaminotransferase）について既知のシロイヌナズ
ナBCATの配列をもとにダイズでのBCATホモロ
グをコードする遺伝子を探索した。AtBCATsとの 高 い 相 同 性 が 認 め ら れ た Glyma04g05190.1（GmBCAT2）,Glyma01g40420.1 （GmBCAT3），
Glyma08g06750.1 （GmBCAT4），
Glyma01g34580.1（GmBCAT5）の４つを候補遺
伝子として選抜し，発現解析を行った。
子実のBCAA含量の推移とBCAT遺伝子発現パターンから，まず子実肥大初期にGmBCAT3が発現し，葉やその他のソース器官から転流されてくるアミノ酸から盛んにBCAAを合成していると考えられる。子実を大きくするため細胞分裂が盛んに行われる時期にかけて遊離のBCAA量を増加させていることより，BCAAが細胞分裂を促進す
るシグナルとして働いている可能性が示唆された。子実内のアミノ酸プールに蓄えられたBCAA
はタンパク質合成に使われるため，BCAA供給に
お け る GmBCAT3 の 働 き を 補 う た め 残 り のGmBCAT2，4，5が発現し，種子貯蔵タンパク質の合成が盛んになるにつれ全BCAA量が急激に増加していると考えられる。またダイズ芽生えにおけるGmBCAT3の遺伝子発現およびBCAT関文
献１） Binder S, Knill T, Schuster J．：Branched-chainaminoacid metabolism in higher plants. Physiologia
Plantrum，129：68～78，2007.
２） Diebold R, Schuster J, Däschner K, Binder S.：Thebranched-chain amino acid transaminase gene family
in Arabidopsis encodes plastid and mitochondrial
proteins. Plant Physiology, 129，540～550，2002．
３） Dietrich K, Weltmeier F, Ehlert A, Weiste C, Stahl
M, Harter K, Dröge-Laser W.：Heterodimers of the
Arabidopsis transcription factors bZIP1 and bZIP53
reprogram amino acid metabolism during low energy
stress. Plant Cell, 23, 381～395，2011．
４） Hashimoto K.：ダイズ・アズキ，転作全書，農文協，
pp．185，1980.
５） Kaneko A, Noguchi E, Ishibashi Y, Yuasa T, IwayaInoue M.：Sucrose starvation signal mediates
induction of autophagy- and amino Acid catabolismrelated genes in cowpea seedling. American Journalof Plant Sciences,４，647～653，2013.
６） Kimball S, Jefferson L.：Signaling pathways andmolecular mechanisms through which branched-chainamino acids mediate translational control of protein
synthesis. Journal of Nutrition. 136, 227S～231S，2006.
７） Maloney G, Kochevenko A, Tieman D, Tohge T,
Krieger U, Zamir D, Taylor M, Fernie A, Klee H.：
Characterization of the branched-chain amino acidaminotransferase enzyme family in tomato. Plant
Physiology, 153, 925～936，2010.
８） Schuster, J. and Binder, S.：The mitochondrial
branched-chain aminotransferase （AtBCAT-1）iscapable to initiate degradation of leucine, isoleucine
and valine in almost all tissues in Arabidopsis
thaliana. Plant Molecular Biology, 57, 241～254，2005.
９） Yuasa T, Nagasawa Y, Osanai K, Kaneko A, Tajima
D, Nang MPSH. Ishibashi Y, Iwaya-Inoue M.：
Induction of a bZIP type transcription factor andamino acid catabolism-related genes in soybean
seedling in response to starvation stress, Journal of
Botany, Volume 2013（2013），Article ID 935479，2013．

連タンパク質の解析を行ったところ，栄養飢餓に© The Ito Foundation

196

被災地産肉現場の風評被害対策を目的とした放牧地
空間放射線量の自動測定システムの実証研究
An empirical study of the automatic measurement system of the grazing
land space dose of radiation for opposing the damage caused by rumors ofa stricken area

平

田

統

一・桃

田

優

子・齊

藤

博

之＊

（岩手大学農学部，＊株式会社サイエンススタッフ）

Toh-ichi Hirata, Yuko Momota and Hiroyuki Saito＊（Faculty of Agriculture, Iwate University, ＊Science Staff Co. ltd．）

We studied methods for estimating cesium radioactivity in grass and soil, based onradiation measurements, that are more detailed, require less labor and are more automatedthan conventional methods．
１）Radiation at a height of 1 cm from the ground surface was measured at five locations（A ～ E）in Iwate Prefecture believed to have a characteristic relationship between naturalradiation from geological features and radiation from cesium. Three equipment models wereused, including a test model developed through this research, to conduct the measurements.
Furthermore, NaI scintillation spectrometers were used to measure radioactivity and the
gamma-ray energy spectrum of grass（1㎡）and soil（5cm depth, 600cm3）collected from thesetest sites. The correlation coefficients between the radiation dose rate and the grass/soil were0.71 and 0.97, respectively. This means that soil radioactivity can be estimated based on theradiation dose rate. However, natural radiation（soil types, etc.）at regions with low cesium
contamination can influence the radiation measurements. As such, the development ofequipment allowing for simple measurements of just cesium radiation was needed. This
viewpoint to the experimental model was promising．
２）We also verified the utility of a system in which range cattle were outfitted withradiation dosimeters and GPS equipment allowing for the wireless collection of measurement
data. In order to reduce physical stress for the cattle, improvements were made to the test
model configurations and durability, and continuous air radiation data was collected at grazing
lands and other sites．

１．目

地の畜産業は放牧と採草の停止や多大な風評被害的を受けた。放牧や採草の再開のためには土壌や牧

東日本大震災に継発した東京電力福島第一原子草に含まれる放射能を測定し，暫定許容量以下で力発電所事故の放射性セシウム飛散により，被災あることを確認する必要がある。現状では，牧草© The Ito Foundation

被災地産肉現場の風評被害対策を目的とした放牧地空間放射線量の自動測定システムの実証研究

197

地毎の土壌や牧草の抜き取りサンプルを特定の測Ｂ試験地は火山灰土壌で自然放射線は低いが，定機関に持ち込み，重い遮蔽ジグの中に設置されホットスポットがみつかった草地の近隣地点であたゲルマニウム半導体型検出器やシンチレーショ

る。Ｃ試験地は南部の花崗岩風化土壌で自然放射

ンスペクトロメータを用いて放射能を測定してい線が高く，セシウム汚染が比較的高い地域である。しかしこの方法では，１）まだらな放射能汚る。Ｄ試験地は沿岸部の礫質土壌地域で，自然放染に対して測定数が少なすぎる，２）測定結果を射線が比較的高いが事故由来の汚染は低いと考え得るまでに時間がかかる等の課題があった。まられた。Ｅ試験地は礫質土壌で自然放射線が高た，一度草地を除染した後に生育した牧草であっく，海越えと内陸からのセシウム汚染も認められても，含有放射能が100Bq/㎏を超える除染不十

る地域である。各試験地内で放射線量率測定およ分な例が，919圃場の内54圃場（5.9％）あった

び植生と土壌の採材のための地点を，５カ所（Ｂ１）

ことから，被災地畜産業の再生には，除染効果を試験地のみ６カ所）設定した。
2.2

簡易，即時に測定する手法が欠かせない。

放射線量率測定計

そこで本研究では，放牧の再活用など被災地の放射線量率の測定には，試作機と，ハンディ式

自給飼料生産基盤の再生，消費者の食肉に対するのサーベイメーターRadi PA－1100（堀場製作

安全・安心に貢献し，被災地の復興を加速するこ所），TCS－172Ｂ（日立アロカ株式会社）の３機とを最終目的として，１）草地の空間放射線量率

種を同時に用いた（Fig.１）。試作機は，岩手大と牧草や土壌中の放射能含量との関係を明らかに

学と株式会社サイエンススタッフ（盛岡），株式

するとともに，自然放射線の影響を検討した。ま会社チノー（東京）らが共同して開発しているも

た，２）放牧牛に放射線量計と全地球測位システ

ので，東日本大震災後の畜産業の復旧・復興に資ム（Grobal Positioning System;GPS）受信機を担するために，セシウム由来放射線量と自然放射線

荷し，測定データを無線装置で取得することによを分別測定できる小型・軽量なスペクトロメー

り，放牧地の放射線量率や個別の牛が浴びた線量ターを基本コンセプトとしており，ヨウ化セシウ

を詳細，省力的，自動的に測定するシステムの開ム シ ン チ レ ー タ ， Multi-Pixel Photon Center

発について検討することとした。

（MPPC）式放射線量計である。３機種の測定値

２．方
2.1

に差が無いことを確認しており，本報告では試作

法

機の測定値を用いた。
2.3

試験地の選定放射線量率の測定

日本地質学会のホームページ等に公表されてい測定は2013年８月および９月に実施した。１測る地質由来の自然放射線量と，緊急時迅速放射線

定地点につき３機種同時に放射線量率を時定数10

影響予測ネットワークシステム等によるシミュ

秒で10回記録した。これを地表面から１cmおよレーションデータによるセシウム汚染の関係に特び１ｍの高さで行った（Fig.１）。両者間の相関徴を持つと考えられる岩手県内の５か所の試験地を確認しており，本報告では測定値と土壌放射能（牧草地）を選定した。また，試験地測定後に測との相関係数がより高かった１cmの測定値を用定した放射線データに基づき各試験地は，Ａ試験

いた。

地は内陸部火山灰土で地質由来の自然放射線が低2.4

く，事故由来のセシウム汚染も低い地域であり，選定した各試験地内測定地点の１㎡区画内で，© The Ito Foundation

土試料採取とその処理

198

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）
3 models × time constant 10sec.,10times
×2 kinds of measurement height

Measurement of 1 cm above
ground surface
RadiPA1100

Test model
Measurement of 1 m

TCS172B

Styrene foam

Measurement of
TCS172B
Hitachi Aloka
Medical, Ltd.

RadiPA1100
HORIBA, Ltd.

Test model
CHINO Co.

1 cm
1cm

Soil ofweathered rockBase rockCesiumGeology radiation: Uranium, thorium, potassium

Fig. 1 Dosimeter and radiation measurement method

100cm3 の採土管を用いて地表面より５cm深を６放射線核種のエネルギー帯605および661.7keV

カ所採取した。生土の水分量や土密度を測定して付 近 の エ ネ ル ギ ー 帯 の ピ ー ク を セ シ ウ ム 134

解析したが，本報告では，生土放射能について述（134Cs）と137（137Cs），1460.0keVのエネルギー帯

べた。

のピークをカリウム40（40 Ｋ）とした２）。土ある

2.5

草試料採取とその処理

いは生草試料１kg中の137Csおよび134Cs由来と考えそれぞれの測定地点で１㎡の区画の草全量を，ら れ る セ シ ウ ム 由 来 放 射 能（土 あ る い は 草

ウシが食草する場合を想定し地表面から約５cm

CsBq），および 40 Ｋ由来の放射能（土あるいは草の高さで刈り取った。乾草あたりとセシウム吸収KBq）を算出した。

量も解析したが，本報告では生草放射能について

2.8

述べた。

本報告では，試作機による１cm高放射線量率

2.6と土CsBq，土KBq，草CsBq，草KBqの各項目と放射能の測定土試料はよく攪拌し，500mlマリネリ容器で測

統計処理

放射線量について基本統計量と相関係数を求めた。

定した。草試料は５cm程度に細切しよく攪拌し，

2.9

1800mlマリネリ容器で測定した。ヨウ化ナトリ

Ａ試験地の放牧地等および黒毛和種放牧牛を試

ウム（NaI）シンチレーションスペクトロメータ

験に供した。株式会社チノーが試作したGPSモ（EMF211型，EMFジャパン）を用いて，放射能ジ ュ ー ル（外 形 13 × 10 × ５ cm）付 き 放 射 線 計（Bq）とγ線エネルギースペクトルを取得した。

（外形12.5×12.5×3.5cm，地上高約50cm）を，群

2.7

エネルギースペクトルの判定

放牧牛への放射線測定機装着

れのリーダー牛の胸部に担荷し，この装置から発© The Ito Foundation

199

被災地産肉現場の風評被害対策を目的とした放牧地空間放射線量の自動測定システムの実証研究
Table1 Correlation coefficiernt of each statistics value

soil CsBq

soil CsBq

soil KBq

grass CsBq

grass KBq

Ｈ１cm

1.000

0.941

0.710

0.603

0.971

1.000

0.691

0.682

0.985

1.000

0.653

0.708

1.000

0.653

soil KBq
grass CsBq
grass KBq
Ｈ１cm

1.000

信する放射線量率とGPSの位置情報を，アーズ株

草CsBqと草汚染の主要因である土CsBq４）の間式会社がＡ試験地内に設置した920MHz無線伝送の相関係数は0.710（Table１）であり，土CsBqかシステムを用いて自動的に取得した。

ら草CsBqを正確に推定するには不十分と思われた。このような困難さの理由の１つとして，草に

３．結果と考察よる土壌セシウム吸収がカリウムと競合する４，５）

岩手県内５試験地26地点において，試作機で測ことが考えられることから，土壌成分の影響にも定した放射線量（Ｈ１cm）と草試料中のセシウ注目する必要がある。本研究において，草CsBq

ム放射能（草CsBq）の相関係数は0.708で，放射と土KBqの相関係数は0.691（Table１）であり，線量から草中セシウム濃度を正確に推定するには全体として高い相関はみられなかったが，試験地不十分であった（Table１）。他の決定要因には，

ＥではＲ＝0.881で高い相関がみられたことから，土壌から草へのCs移行係数や草種 ，傾斜，草の試験地によっては土壌中カリウム濃度が植生によ

生育状況，測定時期，土壌中カリウム濃度，天候

るセシウム吸収に影響した可能性がある。また，などが影響したと考えられる。

草種によってセシウム吸収（移行係数）が異なる３）

Radiation at a height of 1 cm from the ground surface
nSv/h

３）

400
Examination site C
Cesium contamination area
Granite weathering soil ↓300

y = 0.1757x + 132.63
R2 = 0.90573
R=0.952200
The amount of cesium radioactivity
The other 4 examination sites
Low cesium contaminatiion area
Volcanic ash soil ↓y = 0.0391x + 29.123
R2 = 0.23407
R=0.484

100

0
0

200

400

600

800

Geology origin radiation+
Radiation, such as ambientenvironment origin cesium

1000

Soil Cs (Bq/kg)
Fig.2 Relationship between radiation dose rate and cesium radioactivity© The Ito Foundation

1200

200

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

μSv/h
0.05

0.04

0.03

0.02

Cowhouse

Paddock

grazing land
0.01

Experiment day

0.00
11/22-25

11/26-29

12/3-5

12/6-8

12/11-12

Fig.3 Day by day average value of the dose of radiation measured with the experimental dosimeter

which equipped cattle

ことから，試験地の植生の相違が土CsBqと草射する線量が異なることに起因しているものと思

CsBqの関係に影響した可能性がある。放射能汚われる。岩盤由来の自然放射線の１つとしてカリ染によって利用が制限され，放置された放牧草地

ウムに着目し各試験地別にみると，礫質土壌のの 植 生 は 変 化 す る 。野 草 な ど 様 々 な 草 種 で 土

Ｃ，Ｄ，Ｅ試験地では放射線量率と土KBqの間にCsBqと草CsBqの関係を明らかにする必要があ

高 い 相 関 が あ り（そ れ ぞ れ Ｒ ＝ 0.891 ，0.797 ，り，土CsBqから草CsBqの推定は困難さを増す。

0.864），火山灰土壌のＡ，Ｂ試験地では相関がな

一方，放射線量率（Ｈ１cm）から土CsBqを推かった（それぞれＲ＝0.010，0.110）。このように，定することは十分に可能（Ｒ＝0.971，Table１）

Ｈ１cmから土CsBqを推定するにあたって土壌のであり，遮蔽治具などの工夫でさらに推定精度を種類が関係し，セシウム汚染が少ない地域で特に向上できると考えられる。セシウム汚染の強弱別

影響が大きいことに留意する必要がある。また，にみると，セシウム汚染地のＣ試験地では両者間

低～中程度汚染の４地点を個別にみると，Ｈ１に強い相関がみられ（Ｒ＝0.952）（Fig.２），回帰

cmと土CsBqの間に強い正の相関や逆相関を示す

直線は，ｙ＝0.176ｘ＋132.6と推定された。低試験地がみられるなどまちまちであり，牧草の規～中程度汚染の他の４地点を合計した回帰直線

制基準値100Bq/kg付近もしくはそれ以下の地域

は，ｙ＝0.039ｘ＋29.1と推定された（Fig.２）。仮では，放射線量率測定値へ自然放射線が影響し，にセシウム濃度０Bqの時の放射線量推定値（切土CsBqを正確に推測することは困難となる。こ片）は，Ｃ試験地で0.13μSv，他の４地点で0.03

れらのことから，風評被害の防止のために新たにμSvとなる。このように地域によって切片（放開発する放射線計は，セシウム由来放射線を分別射線量）が異なる原因は，各地域で暴露される岩測定できる簡易スペクトロメータである必要があ

盤等の自然放射線量や土壌以外の周囲環境から放り，本研究で用いた開発機はこのような機能を付© The Ito Foundation

被災地産肉現場の風評被害対策を目的とした放牧地空間放射線量の自動測定システムの実証研究
μSv/h
0.05

0.04420.04

0.03480.03100.03

0.02660.0452 0.0449

0.03280.0255conventional dosimeter

0.01

experimental dosimeter

0.02

201

0.00
Cowhouseb

Paddock

Cowhouseagrazingland

Fig.4 Comparison of the average value of the dose of radiation measured with the experimental

dosimeter which equipped cattle and the conventional（RadiPA1100）dosimeter

与できることから有効である。

置として活用し，空間放射線量から草地土壌の汚放牧牛に担荷可能な形状と取付方法，堅牢性な染（安全）レベルをモニタリングできること，そどの検証を行った。その結果，①牛体になるべくの結果に基づいて必要があれば牧草中のセシウム

ストレスを与えない薄い形状であること，天候を含量を精密分析するよう指導する２段階の草地モ

選ばない防水性を持つこと，③野外環境や牛行動

ニタリング，清浄化システムを構築できる可能性に耐えうる堅牢性をもつこと，④ある一定の放牧を示し得た。

期間に稼働し続ける電源を携帯することなどを提案し，試作に反映させた。試験期間中の牛担荷線

４．要

約

量計が記録した日平均空間放射線量をFig.３に示

空間放射線量の測定によって，土壌と牧草中のした。次に，試作機の牛担荷時での測定精度の信セシウム由来放射能を従来よりも詳細，省力的，頼性を，従来の機種での歩行測定と比較すること自動的に推定する方法について検討した。１）地で検証し，試作機は牛担荷時でも有効な精度で測質由来の自然放射線量とセシウム由来放射線量の定できることを確認した（Fig.４）。牛体姿勢の関係に特徴を持つと考えられる岩手県内の５地点

判別や牛体による放射線遮蔽率などの検証すべき（Ａ～Ｅ）の試験地で，本研究で開発中の試作機

課題と，測定指示プログラム，連続で３日間しかを含め３機種を用いて地表面から高さ１㎝の放射稼働しない電池寿命などの改善点が残されたが，線量を測定した。また同地点で採取した草（１

汚染斑が存在する広大な放牧地において簡易的な㎡）と土（５cm深，600cm3）についてNaIシン

測定システムとして有効であることを示した。

チレーションスペクトロメータで放射能とγ線エ以上の結果から，放牧牛を動くモニタリング装ネルギースペクトルを測定した。放射線量率と草© The Ito Foundation

202

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

および土の放射能との相関係数は，0.71および0.97

改善し，放牧地等で連続した空間放射線量データ

であり，放射線量率から土放射能の推定が可能でを得た。

あった。また，セシウム低汚染地域では，土壌由
来の自然放射線が放射線測定値に影響するため，セシウム由来放射線のみ簡易に測定できる本試作機が有効である可能性が示された。２）放牧牛に放射線量計とGPSを担荷し測定データを無線装置で取得するシステムの実用性を検証した。牛体ス
トレスを軽減するために試作機の形状と堅牢性を文
献１）
 岩手県：岩手県牧草地除染マニュアル，第１版，１～２，2012．
２）
 文部科学省：ゲルマニウム半導体検出器によるガ
ンマ線スペクトロメトリー，３訂，197～200，東京，
1992．
３） 山口紀子：農環研報，31，75～129，2012．
４）
 Zhu YG, Smolders E.: J.Experimental Botany，51，
1635～1645，2000．
５）
 RocaMC, Valljo VR.; J.Environ. Radioactivity，28，
141～159，1995．

© The Ito Foundation

203

腫瘍関連遺伝子発現動態解析による非典型的
牛白血病の発症診断法の開発
Development of diagnostic methods for atypical bovine leukosis byanalysis of tumor-related gene expressions

猪

熊

壽

（帯広畜産大学畜産学部）

Hisashi Inokuma（Faculty of Animal Husbandry, Obihiro University of Agriculture & Veterinary Medicine）

Bovine leukosis（BL）is one of the most commonly reported neoplastic diseases of cattle.
Clinical diagnosis of BL is generally made based on clinical and clinicopathological findings suchas enlargement of peripheral lymph nodes, increased number of lymphocytes, increased
number of atypical lymphocytes in peripheral blood, or the presence of abnormal lymphocytes
in aspirates from fine needle aspiration cytology of tumorous lymph nodes. However, theaforementioned signs and tests are not always present in or available for cases of bovine
leukosis. Thus useful biomarkers are required for accurate diagnosis of onset of bovine leukosis
in the field. This study examined the efficacy of certain genes expression as biomarkers for thedetection of clinical BL cases. The expression of several genes, including interleukin 2 receptor（IL2R），Wilms' tumor 1（WT1），thymidine kinase-1（TK1），cytochrome P450 family
1-subfamily B-polypeptide 1（CYP1B1），high B-cell lymphoma/leukemia protein（BCL2）and
immunoglobulin associated alpha-1（MB1）were evaluated as potential biomarkers for theclinical diagnosis of bovine leukosis. In this study, the gene expression in the peripheral bloodfrom a total of 37 cattle, including 13 cattle with enzootic bovine leukosis, 15 clinically healthy
cattle, and 9 cattle with other diseases were measured by quantitative reverse transcription
PCR. Although wide variations of gene expression were found in someclinical cases of enzootic
bovine leukosis, 4 and 5 among 13 enzootic bovine leukosis cattle showed higher expression of
IL2R and WT1, respectively. Expression of IL2R in peripheral bloodcells in enzootic bovine
leukosis cattle was statistically increased compared with those of other groups. These results
indicate the possible usefulness of IL2R and WT1 genes as biomarkers for the clinicaldiagnosis of enzootic bovine leukosis．

１．目

bovine leukosis: EBL）と原因不明の散発型牛白的血病の２つに分類される１）。牛白血病の臨床的診

牛白血病は最も一般的な牛の腫瘍性疾患であ

断 は ，末 梢 血 液 中 の 持 続 性 リ ン パ 球 増 多 症

り，牛白血病ウイルス（bovine leukemia virus:（persistent lymphocytosis: PL），異型リンパ球増BLV）感染による地方病型牛白血病（enzootic

加および腫大体表リンパ節中の腫瘍細胞の確認と© The Ito Foundation

204

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 1 List of primers used in this study
Gene Name

Forward primers

Reverse primers

cgccatgttcaaggtcttc

gttctgcgcatctgtgtgtt

Interleukin 2 receptor

IL2-R

Wilms tumor

WT1

ttctcgttcagaccagctca

gctgaagggcttctcacttg

TK1

ccaggttgcccagtacaagt

tctcgcagaactccacaatg

Cytochrome P450, family 1,
subfamily B, polypeptide １

CYP1B1

tgttaaccagtggtccgtga

ttgaaattgcactggtgagc

B-Cell leukemia/lymphoma２

BCL2

ctgacttctctcggcgctac

cggttcaggtactcggtcat

Immunoglobulin associatedalpha-１

MB1

ccaagtcagtgatggcaaga

gatatcagccccgaatttca

Actin-beta

ACTB

ctcttccagccttccttcct

gggcagtgatctctttctgc

１

Thymidine kinase１

いった臨床病理学的所見に基づいて行われる１）。

評価はBendixenのkeyにより判定した４）。健康牛

しかし，牛白血病発症例の中には，末梢血液中の15頭は，同一農家に飼養されるもので，BLV感

リンパ球数が増加せず，異型リンパ球もみられな

染とリンパ球数により次の３群に分けられた。①

い症例，あるいは体表リンパ節腫大が認められ

BLV抗体陰性でリンパ球増多症の無いもの５頭ず，触診上検出困難な位置に腫瘍が存在する症例（BLV－PL－），②BLV抗体陽性でリンパ球増多がある 。このような特徴的臨床所見が認められ症の無いもの５頭（BLV＋PL－），③BLV抗体陽ない症例では生前の牛白血病の確定診断が困難で性でリンパ球増多症を呈するもの５頭（BLV＋ある。人医療域では，腫瘍の診断に様々なバイオPL＋）。これら15頭の健康牛は採材から１年間観マーカーが用いられているが，牛白血病の診断

察を継続したが，いずれも牛白血病の発症はみら

マーカーは少ない 。そこで本研究では，末梢血れなかった。さらに，牛白血病以外の疾患牛９頭中の遺伝子発現に着目し，非典型的牛白血病発症

はいずれも慢性感染症の牛であり，それぞれ異な診断のためのバイオマーカーとしての有用性を検る臨床症状を呈していたが，最終的には病理解剖討した。

に供して牛白血病でないことを確認した。

２）

３）

２．方

各牛から末梢血2.5mlをRNA分離用チューブ

法

PAXgeneTM Blood RNA tubes （PreAnalytiX® ，

材料として地方病型牛白血病発症牛（EBL）13

Hornbrechtikon, Switzerland）に採取し，説明書

頭，健康牛15頭，および牛白血病以外の疾患牛９に 従 っ て 処 理 し た 後 ，total RNA を 抽 出 し た頭を用いた。EBL13頭はいずれもBLV抗体陽性（ P A X g e n e TM B l o o d R N A K i t （ Q I A G E N ,で，元気食欲不振等の臨床症状を呈し，腫大した

Hombrechikon, Switzerland））。0.5μg RNAから

体表リンパ節の生検により腫瘍化リンパ球を認め

thermo script system （Applied Biosystems,

たことからEBLと診断した。これら13頭はいずれ

Foster City, CA, U.S.A．）を用いた逆転写反応にも十勝管内の別の農家に飼養される牛であり，末よ り cDNA を 合 成 し た 。さ ら に SYBR® Green梢血リンパ球数によりさらに次の２群に分けられ

PCR Master Mix（Applied Biosystems, Foster

た。①末梢血リンパ球増多症を呈する８頭（EBL

City, CA, U.S.A．）を用い，StepOnePlus System＋BLV＋PL＋），②末梢血リンパ球増多症のない（Applied Biosystems）に よ る 定 量 的 RT-PCR を５頭（EBL＋BLV＋PL－）。なお，リンパ球数の実施した。

© The Ito Foundation

205

腫瘍関連遺伝子発現動態解析による非典型的牛白血病の発症診断法の開発
WT1
15

Other dlseases

EBL(+)BLV(+)PL(+)

EBL(+)BLV(+)PL(-)

BLV(+)PL(+)

10
5

Other dlseases

EBL(+)BLV(+)PL(+)

0
EBL(+)BLV(+)PL(-)

Other dlseases

EBL(+)BLV(+)PL(+)

2

F

15
Fold changes

40

BLV(-)PL(-)

Other dlseases

EBL(+)BLV(+)PL(+)

EBL(+)BLV(+)PL(-)

BLV(+)PL(+)

6

EBL(+)BLV(+)PL(-)

Other dlseases

EBL(+)BLV(+)PL(+)

EBL(+)BLV(+)PL(-)

BLV(+)PL(+)

BLV(+)PL(-)

BLV(-)PL(-)

08

BLV(+)PL(+)

50

2

MB1

E

BLV(+)PL(-)

100

BLV(+)PL(-)

BLV(-)PL(-)

BCL2
10

BLV(-)PL(-)

D

Fold changes

Fold changes

Other dlseases

EBL(+)BLV(+)PL(+)

EBL(+)BLV(+)PL(-)

BLV(+)PL(+)

BLV(+)PL(-)

BLV(-)PL(-)

CYP1B1
150

4

0

0

0

6

BLV(+)PL(+)

5

5

C

BLV(+)PL(-)

10

10

TK1

BLV(+)PL(-)

158

BLV(-)PL(-)

20

B
Fold changes

A
Fold changes

Fold changes

IL2-R
25

Fig. 1 Messenger RNA expression levels of some genes in peripheral blood of cattle from 6 different groups as

measured by quantitative RT-PCR.（A）interleukin 2 receptor（IL2R），（B）Wilms' tumor 1（WT1），（(C）
thymidine kinase-1（TK1），（D）cytochrome P450 family 1-subfamily B-polypeptide 1（CYP1B1），（E）high B-cell
lymphoma/leukemia protein（BCL2）and （F）immunoglobulin associated alpha-1（MB1）． Bar: median value ineach grouop．

検 索 し た 発 現 遺 伝 子 は interleukin 2 receptor（IL2R），Wilms' tumor 1（WT1）， thymidine

３．結果と考察kinase-1（TK1） ， cytochrome P450 family

結果をFig.１に示す。

1-subfamily B-polypeptide 1（CYP1B1） , high

臨床的健康牛の３群15頭はいずれも，各遺伝子

B-cell lymphoma/leukemia protein（BCL2） ，（IL2R, WT1, TK1, CYP1B1, BCL2, MB1） のimmunoglobulin associated alpha-1（MB1） で あ

発現は低値を示した。健康牛群のBLV＋PL＋グ

り，Table１に示すプライマーを用いた。なお，

ループにおけるWT1以外では，シグナル値は内在性コントロールとしてはbeta actin（ACTB）

0.278～1.753と低値であった。健康牛の結果から，遺伝子を用いた。遺伝子発現量はACTBとの比較

BLV感染およびリンパ球増多症は，末梢血におによりCt値として表した。

けるこれらの遺伝子発現に影響を与えないことが各 群 の 値 は Kruskal Wallis test に よ り 検 定 した。有意水準は0.05とした。

示唆された。
3.1

interleukin 2 receptor遺伝子（IL2R）

13頭のEBL発症牛のうち４頭（BLV＋PL＋グ© The Ito Foundation

206

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

ル ー プ ３ 頭 と BLV ＋ PL ― グ ル ー プ １ 頭）が ，割を果たしている10，11）。今回観察された結果は，

IL2R発現量において８倍以上の高いシグナル値

末梢血におけるIL2R遺伝子の過剰発現が牛白血を示した。いっぽう，13頭のEBL発症牛のうち残病発症のマーカーになりうることを示した。しかりの９頭（BLV＋PL＋グループ７頭とBLV＋PL

しながら，臨床応用にあたっては，感度が低いこ―グループ２頭）のIL2R発現量シグナル値は1.6とと，発現量のばらつきが大きいことが問題にな

未満と低値を示した。IL2R発現量は５群間で統ると思われる。この遺伝子はヒトの多くの固形癌

計的に有意な差が認められた（Ｐ＝0.018）。EBLと急性骨髄性白血病の大部分で高度に発現するこ発症牛BLV＋PL＋グループにおけるIL2R発現量とが知られている 12，13）。このことはWT1遺伝子は健康牛および他疾患群の値と比較して有意差はは牛白血病のより急性ステージにおいて末梢血でみられなかった。これらの結果は，BLV感染＋PL

過剰発現され可能性を示唆するものである。今＋の非発症牛におけるIL2発現レベルが，PLのな

後，牛白血病のステージの違いによるWT1遺伝い非感染牛と比較して低値を示したという報告

子発現量の推移を検索する必要があると考えられ５）と一致するものである。IL2Rはリンパ球表面にた。

発現しているインターロイキン２受容体であり，3.3

レトロウイルスにより直接的あるいは間接的に活TK1, CYP1B1およびBCL遺伝子の発現では，その他の遺伝子，必ずしも発症がEBL発症牛13頭のうち各１頭だけが，非常に高い

IL2R遺伝子発現の活性化につながるものではな値を示した。しかし，残りの14頭ではいずれもいことが考えられる。しかし，EBL発症牛におけEBL非発症牛と同様に低い遺伝子発現量を示し

るIL2R遺伝子の高発現は予備的研究においてもた。TK1, CYP1B1およびBCL遺伝子の発現はヒ観察されており ，また，IL2R遺伝子過剰発現

トと動物の悪性肝細胞がんにおけるバイオマー

はヒト白血病症例でも報告されている 。なお，カーとしての有用性が報告されている14～23）。予備

何頭かの発症牛においてIL2R遺伝子の発現が弱的 検 討 に お い て は ，牛 白 血 病 発 症 例 に お い てかった理由については不明であるが，発症後の経TK1遺伝子発現の高値が認められてはいるもの

過および疾病のステージが関係する可能性も考えの24），今回の結果からはこれらの遺伝子発現は牛られる。以上のことから，末梢血におけるIL2R

白血病のバイオマーカーとしては利用可能性が乏遺伝子の過剰発現は牛白血病発症のマーカーになしいと思われた。なお，MB1遺伝子のmRNAはりうるが，その特異性および感度については今後

EBL発症牛の何頭かでは比較的高い値を示した

検討の余地があると思われた。

が，健康牛でもより高値を呈するものが認められ性化されるといわれており

６，７）

８）

９）

3.2

Wilms’ tumor１遺伝子（WT1）たため，特異性に問題があると考えられた。

13頭のEBL発症牛のうち５頭（BLV＋PL＋グ

以上，EBL発症症例の遺伝子発現量は個体によル ー プ ４ 頭 と BLV ＋ PL ― グ ル ー プ １ 頭）で はり大きく差があるものの，13頭中４頭のIL2R発

WT1遺伝子の発現量が高値を示した。BLV＋PL

現量と５頭のWT1発現量が，他群の中央値と比＋グループの中央値は，他群に比べて高値を示し

較し著明に高値を示した。また，EBL群のIL2Rたが，有意差は認められなかった。WT1はジン

発現量は他群と比べて有意に高かった。これらのクフィンガー転写因子をコードする遺伝子で，結果から，IL2およびWT1の発現はEBL発症診

様々な器官における細胞の成長と分化に重要な役

断のためのバイオマーカーとして有用である可能© The Ito Foundation

腫瘍関連遺伝子発現動態解析による非典型的牛白血病の発症診断法の開発性が示唆された。ただし，臨床応用にあたっては，さらに特異性と感度について検討を重ねる必要があると思われた。
なお，本研究成果はTawfeeq, M. M., Horiuchi,N., Kobayashi, Y., Furuoka, H., Inokuma, H. ：Evaluation of gene expression as biomarkers forenzootic bovine leukosis. J. Vet. Med. Sci ．75 ：1213～1217，2013．に発表された。
４．要

約

牛白血病（BL）は最も一般的な牛の腫瘍性疾患であるが，その臨床診断は，末梢血液中のリン
パ球増多症，異型リンパ球増加および腫大体表リンパ節中の腫瘍細胞の確認といった所見に基づいて行われる。しかし，BL発症例の中には，特徴的臨床所見が認められず，生前の確定診断が困難な場合も多い。そこで本研究では，いくつかの遺伝 子 ― interleukin 2 receptor（IL2R），Wilms'tumor 1（WT1），thymidine kinase-1（TK1），
cytochrome P450 family 1-subfamily
B-polypeptide 1 （CYP1B1）， high B-cell
lymphoma/leukemia protein （BCL2），
immunoglobulin associated alpha-1（MB1）― の末梢血発現に着目し，BL診断のためのバイオマー
カーとしての有用性を検討した。
地方病型牛白血病（EBL）症例の遺伝子発現量は個体により大きく差があるものの，EBL症例13
頭中，４頭のIL2R発現量と５頭のWT1発現量が，他群の中央値と比較し著明に高値を示した。また，EBL群のIL2R発現量は他群と比べて有意に高かった。これらの結果から，IL2およびWT1の発現はEBL診断のためのバイオマーカーとして有用である可能性が示唆された。
文献１） Garry, F. ： Rebhun's Diseases of Dairy Cattle,

207

2nd ed.（Divers T. J. and Peek, S. F. eds.），pp. 624633. Saunders Elsevier, St. Louis．2008．
２）
 Tagawa, M., Shimoda, T., Togashi, Y., Watanabe,Y., Kobayashi, Y., Furuoka, H., Ishii, M., Inokuma,
H. ： J. Jpn. Vet. Med. Assoc. 61: 936 ～ 940. 2008. (inJapanese with English abstract）
３）
 Sakamoto, L., Ohbayashi, T., Matsumoto, K.,
Kobayashi, Y., Inokuma, H.：J. Vet. Diagn. Invest．
21：871～874．2009．
４）
 Bendixen, H.：J. Adv. Vet. Sci．10：129～204．
1965．
５）
 Amills, M., Ramiya, V., Norimine, J., Olmstead, C.
A., Lewin, H. A.：Virology．304：１～９．2002．
６）
 Nelson, B. H.,Willerford, D. M.：Adv. Immunol ．
70：１～81．1998．
７）
 Yodoi, J., Uchiyama, T., Maeda, M. ： Blood. 62 ：509～511．1983．
８）
 Tawfeeq, M. M., Tagawa, M., Itho, Y., Sugimoto,K., Kobayashi, Y., Inokuma, H. ： J. Vet. Med. Sci ．
74：1203～1206．2012．
９）
 Erber, W. N., Mason, D. Y. ： Am. J. Clin.
Pathol．89：645～648．1988．
10）
 Buckler, A. J., Pelletier, J., Haber, D. A., Glaser, T.,
Housman, D. E. ： Mol. Cell. Biol ． 11 ： 1707 ～
1712．1991．
11）
 Sugiyama, H.：Int. J. Hematol．73：177～187．
2001．
12）
 Greiner, J., Ringhoffer, M., Taniguchi, M., Li, L.,
Schmitt, A., Shiku, H., Döhner, H., Schmitt, M.：Int.
Cancer．108：704～711．2004．
13）
 Oji, Y., Miyoshi, S., Maeda, H., Hayashi, S.,
Tamaki, H., Nakatsuka, S., Yao, M., Takahashi, E.,
Nakano, Y., Hirabayashi, H., Shintani, Y., Oka, Y.,
Tsuboi, A., Hosen, N., Asada, M., Fujioka, T.,
Murakami, M., Kanato, K., Motomura, M., Kim, E. H.,
Kawakami, M., Ikegame, K., Ogawa, H., Aozasa, K.,
Kawase, I., Sugiyama, H.：Int. J. Cancer．100：297～303．2002．
14）
 Baron, J. M., Zwadlo-Klarwasser, G., Jugert, F.,
Hamann, W., Rübben, A., Mukhtar, H., Merk, H.
F.：Biochem. Pharmacol．56：1105～1110．1998．
15）
 Cory, S.：Annu. Rev. Immunol．13：513～543．
1995．
16）
 Dassi, C., Signorini, S., Gerthoux, P., Cazzaniga, M.,
Brambilla, P.：Clin. Chem．44：2416～2421.1998．
17）
 DiGiuseppe, J. A., LeBeau, P., Augenbraun, J.,
Borowitz, M. J. ： Am. J. Clin. Pathol ．106 ： 345 ～
351．1996．
18）
 Hallek, M., Wanders, L., Strohmeyer, S.,
Emmerich, B.：Ann. Hematol．65：１～５．1992．
19）
 Kristensen, T., Jensen, H. K., Munch-Petersen,
B.：Leuk. Res．18：861～866．1994．
20）
 Lerner, A., Epstein, P. M.：Biochem. J ．393：21～41．2006．
21）
 Shimada, T., Hayes, C. L., Yamazaki, H., Amin, S.,© The Ito Foundation

208

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Hecht, S. S., Guengerich, F. P., Sutter, T. R.：Cancer
Res．56：2979～2984.1996．
22） Zhang, L., Murray, F., Rassenti, L. Z., Pu, M.,
Kelly, C., Kanter, J. R., Greaves, A., Messer, K.,
Kipps, T. J., Insel, P. A.：Int. J. Cancer．129：1162～1169．2011．
23） Tawfeeq, M. M., Miura, S., Nakanishi, Y.,

Sugimoto, K., Kobayashi, Y., Furuoka, H., Inokuma,
H. ： Calf form bovine leukosis associated withmultiple joint swelling in a Holstein heifer. J. Vet.
Med. Sci．74：1225～1228．201224）
 Tawfeeq, M. M., Sugimoto, K., Kobayashi, Y.,
Inokuma, H.：J. Vet. Med. Sci ．74：1501 ～ 1504 ．
2012．

© The Ito Foundation

209

飼養環境下の牛群におけるマイコトキシン浸潤動態の検証― 尿中ステリグマトシスチン濃度測定法の確立とその臨床応用 ―Field application of urinary sterigmatocystin concentration measurements
for monitoring natural feed contamination in cattle herds

髙

木

光

博・宇

野

誠

一＊・國

師

恵美子＊

（鹿児島大学共同獣医学部，鹿児島大学共同水産学部＊）

Mitsuhiro Takagi, Seiichi Uno＊ and Emiko Kokushi＊（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, Faculty of Fisheries, Kagoshima University＊）This study had two primary objectives:（1）to better understand the contamination of
cattle herds with the fungal toxin sterigmatocystin（STC）by monitoring STC concentrations
in feed and urine, and (2) to evaluate the effects of interventions, such as supplementation of
feed with mycotoxin adsorbent and replacement of contaminated feed. We used female
Japanese Black cattle that received a standard ration containing rice straw. The presence of
mycotoxins in their feed was monitored, as was the excretion of mycotoxins or their
metabolites in urine as marker for absorption and systemic exposure. The experimental
protocol included two treatment groups of animals that received a commercial mycotoxin
adsorbent（MA）and a control group. Three groups of six individuals from each herd wereassessed: MA1 received mycotoxin adsorbent mixed with concentrate, MA2 received
mycotoxin adsorbent topdressed on concentrate, and the control group received no mycotoxin
adsorbent. Urine and blood samples were collected at the start of supplementation（Day 0），onthe final day of supplementation（Day 14），on the first day that the contaminated feed was
replaced（MA1）or at the start of a double volume of mycotoxin adsorbent supplementation（MA2）in Herd 1（Day 45），and on the final day of sampling（Day 60 for Herd 1 and Day 45
for Herd 2）． STC concentrations in urine were measured by tandem mass spectrometry. In
Herd 1, the STC concentrations of the feed at each sampling time were 0.15, 0.17, 0.24, and0.23mg/kg．In Herd 2, STC concentrations were 0.06 and 0.03mg/kg．STC concentrations inurine in the control group within Herd 1 that received no mycotoxin adsorbent weresignificantly higher on Day 0（190.3 pg/mg of Crea）and Day 45（897.6 pg/mg of Crea）than
were those（19.8 and 0 pg/mg of Crea）in Herd 2（ｐ＜ 0.05）． A significant decrease in STC
concentrations in urine was observed 2 weeks after feed was replaced with new straw in the
MA1 group（32.6 pg/mg of Crea）in Herd 1, but no significant effects of mycotoxin adsorbent
supplementation were observed on STC concentrations in urine during the intervention period.
Monitoring of mycotoxins in urine samples serves as a marker for the systemic exposure ofcattle to mycotoxins and allows the exposure of cattle to multiple mycotoxins to be detected.
The goal of this study was to assess the effect of supplementation with mycotoxin adsorbents．

© The Ito Foundation

210
１．目

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

群由来保存尿サンプルの測定を行い，ZEN汚染

的稲ワラにおけるSTCとの共汚染の有無を検証す

我々はこれまでに，Fusarium属真菌由来マイコトキシン（MT）で，エストロジェン類似作用を持つことから家畜に繁殖障害などを引き起こす可能性が示唆されるゼアラレノン（ZEN）に着ることで，臨床応用に向けての基礎データを得る
こと，以上２点を目的とするものである。
２．方法

目し，１）尿中ZEN濃度を指標とした飼養環境

先ず，我々が既に確立しているLC/MS/MS法

下の牛群におけるMTモニタリングシステムの構による尿中ZEN濃度測定法をベースに，尿中STC

築とその有用性 ，２）モニタリング結果を基に濃度測定法の確立を目指すこと，次にこれまでにした我が国の暫定基準値を超えるZEN自然汚染稲

我々が初めて摘発したZEN自然汚染稲ワラ（８ワラ給与を原因とするMT汚染牛群の初摘発例２），

ppm以上）が給与されていた牛群由来保存尿サ

および３）尿中ZEN濃度を指標としたMT吸着剤

ンプルを用いてSTC測定を行い，ZENとSTCと添加効果の客観的評価法の確立 などを報告しての共汚染の有無を検証することを目的とした。

１）

３）おり，バイオマーカーを用いたMTモニタリング

2 . 1 LC/MS/MS法を用いた牛尿中STC濃度測システムを確立するとともに，飼養環境下の家畜（ウシおよびブタ）におけるMT浸潤動態の検証
およびデータベースの蓄積を進めている。

定法の確立
これまでに報告の無い牛尿中STC測定の可否を検証するために，LC/MS/MS法を用いた検出

ステリグマトシスチン（STC）はAspergillus

系の確立をはかる。先ず，我々が既に尿中ZEN

versicolorやその他のAspergillus属真菌などによ濃度測定で確立している手順，手法を基本に，以り産生されるMTであり，動物やヒトに対して強下に述べる一連の実験を行った。

い毒性を持つアフラトキシンB1 (AFB１）生合成①の中間物質の１つとして知られているが，STCそ

経口摂取されたSTCが肝臓でどの程度グルクのものの長期曝露による毒性は不明であるため

ロン酸胞合されているのかを調べる目的で，尿サに，わが国では飼料，食品ともに現時点で規制値

ンプル前処理時のβ-Glucuronidase/arylsulfataseは設定されていない。A. VersicolorなどのSTC産添加の有無によるLC/MS/MS測定を行った。

尿サンプルの調整

生真菌は世界中に分布し，日本各地の土壌や穀②類，特にコメを汚染することは広く知られている

尿中ZEN濃度測定に用いたLC/MS/MSの条件

が，これまでに稲ワラを含む粗飼料が給与される

設定が，STC測定にも適応出来るか否かを検証す

牛群における生体由来サンプル（尿）濃度に基づるために，STC添加回収実験を行った。試験用尿くSTC浸潤動態についての報告は皆無である。

サンプルに各濃度のSTC標準液を添加して，従来

STC添加回収実験

以上のことから，本課題においては，１）我々用いているＣ-18カラムで固相抽出後に，ZEN測が上述の尿中ZENモニタリングにおいて既に確定用調整済み条件によるLC/MS/MS測定を行っ立している，液体クロマトグラフィー質量分析て，STCの回収率を検討した。得られた一連の実（LC/MS/MS）法を応用した尿中STC濃度測定法

験結果をもとに，溶媒濃度や流速などの最適条件を確立すること，２）１)において確立された尿を設定し，尿をサンプルとした場合のLC/MS/

中STC測定法を用いて，上述の摘発ZEN汚染牛MSによるSTC測定系の確立を行った。

© The Ito Foundation

211

飼養環境下の牛群におけるマイコトキシン浸潤動態の検証
Herd1: ZEN-contaminated herd
MA supplement;＊
MA1:Mix, ＊MA2:Top dress,
Control: No MA

Day 0

MA1: Replace with straw,
MA2: Double voume of MA,
Control: No MA＊＊＊＊

Day 16

Day 58

Day 72

Herd2: Control herd
MA supplement;＊
MA1:Mix, ＊MA2:Top dress,
Control: No MA

Day 0

Day 16

Day 50: Urine and feed sampling
Figure １ Protocol for mycotoxin adsorbent（MA）supplementation in dietary feeds and sampling of urine and feed

samples． ＊ MA1: MA was mixed with dietary concentrate． ＊ MA2: MA was topdressed on the dietaryconcentrate ． ＊ ＊ MA1: The usual straw was replaced by a new lot of straw with less contamination ． ＊ ＊ MA2:
Twice the volume of MA was topdressed on the dietary concentrate. Control: No MA was provided during theexperimental period．

2 . 2 ZEN自然汚染牛群由来の保存尿を用いた

β-Glucuronidase/arylsulfatase添加の有無や添加量を決定し，前処理を行った尿サンプルを固相抽

LC/MS/MS法による尿中STC測定
これまでに報告の無い飼養環境下の牛群におけ

出後にLC/MS/MS測定に供した。併せて，尿サるZENとSTCの共汚染の有無を検証するために，

ンプリング時に採取した給与飼料サンプルについ

我々が過去に摘発を行ったZEN自然汚染稲ワラても，LC/MS/MS法による公定法を用いてSTC

給与牛群（牛群 １），およびZEN非汚染牛群（牛濃度の測定を行った。

群 ２）の２牛群由来の保存尿サンプルを用いて，上記で確立したLC/MS/MS法による尿中STC濃度測定を行った。牛群はともに23ヶ月齢の黒毛和３．結果と考察3 . 1 LC/MS/MS法を用いた牛尿中STC濃度測

種肥育雌牛で，MT吸着剤添加群（MA１：飼料定法の確立と混合，MA２：飼料へのトップドレス）とMT①

非添加群（コントロール）の各６頭ずつの３群で尿 サ ン プ ル 前 処 理 時 の β -Glucuronidase/

ある。サンプリングに関する詳細はFig１に示し

arylsulfatase添加の有無によるLC/MS/MS測定

た。尿サンプルの調整は2.1の実験結果をもとに，を行った結果，添加無の全ての尿サンプルでは© The Ito Foundation

尿サンプルの調整

212

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 1 STC concentrations in urine（pg/mg of Crea）in cattle herds with and without natural ZEN contamination, andeffects of supplementation of mycotoxin adsorbents, as measured by liquid chromatography-tandem mass
spectrometry
Samples

Herd １（ZEN
contamination）

Herd ２（no ZEN
contamination）

Day

０

Day

16

Day

58

Day

72

STC in straw（mg/kg）

0.15

0.17

0.24

New：0.04
Old：0.21

STC in concentrate（mg/kg）

＜0.01

＜0.01

＜0.01

NT

MA１

327.3±26.2

208.9±21.6

569.4±110.7

32.6±8.4ａMA２

247.3±56.5

238.7±27.5

416.2±61.6ｃ

258.3±33.3ｂ

Control

190.3±43.2ａ

181.8±42.6

897.6±96.6a,d354.2±55.5ｂ

SamplesDay

Day

STC in urine

０

16

Day

50

STC in straw（mg/kg）

0.06

0.03

NT

STC in concentrate（mg/kg）

＜0.01

＜0.01

＜0.01

MA１

67.2±21.8

147.1±39.1

41.7±19.0MA２75.5±22.3

85.9±20.8

0Control19.8±12.6ｂ

61.5±23.2

0ｂ

STC in urine

a-b, c-d within same row: Significantly different．
NT: not tested

STCの検出は出来なかったが，添加有の同一尿サ

Day 0 (190.3 ± 43.2pg/mg Crea）と Day 45 (897.6

ンプルにおいてはSTC検出が可能であった。これ±96.6pg/mg Crea）は，牛群２のそれら（Day 0,

らの結果より，経口摂取された飼料中STCはその19.8 ± 12.6pg/mg Crea; Day 45, 0 pg/mg Crea）

大部分が肝臓でグルクロン酸胞合されていることと比較して有意に高い尿中STC濃度であった。一が初めて明らかとなった。本結果から，以降の尿方，同一牛群間におけるDays０，14，45の尿中サンプル測定時には全てのサンプルにβ-STC濃度はMA１，MA２およびコントロール群

Glucuronidase/arylsulfataseを添加した前処理をの間でDay45におけるMA２群（416.2±61.6pg/

行った。

mg Crea）とコントロール群（897.6±96.6pg/mg②

Crea）の間以外，有意差は認められなかった。

STC添加回収実験

尿中STC添加回収試験の結果，回収率は85％～

し か し ， MA １ 群 の Day 72 (32.6 ± 8.4pg/mg

120％であり，我々がZEN測定用に確立したLC/

Crea）における尿中STC濃度はMA２群（258.3

MS/MS測定系を基盤にした尿中STCのLC/MS/±33.3pg/mg Crea）とコントロール群（354.2±

MS法による測定が十分可能であることが判明し55.5pg/mg Crea）と比較して有意に低い濃度で

た。

あった。

3 . 2 ZEN自然汚染牛群由来の保存尿を用いた

給与飼料中STC濃度については，両牛群における 配 合 飼 料 中 STC 濃 度 は 測 定 検 出 限 界 値

LC/MS/MS法による尿中STC測定
各サンプリング時の両試験牛群における飼料お（0.01mg/kg）以下であったが，牛群１における

よび尿中STC濃度をTable１に示した。牛群１の給与稲ワラ中STC濃度は，各サンプリング時にお© The Ito Foundation

飼養環境下の牛群におけるマイコトキシン浸潤動態の検証

213

いて牛群２と比較して２～５倍高い濃度であっ剤の添加効果には，MTの種類による極めて大きた。以上の結果から，LC/MS/MS法による尿中な違いが存在することが初めて明らかとなった。

STC濃度測定は可能であり，給与飼料中STC濃度

今後，飼養環境下の牛群におけるSTCおよび他のを極めて良好に反映する指標であることが明らか

MTとの共浸潤に関するデータベースの蓄積を継となった。

続して，牛の健康に対するリスクファクターの詳

STCの摂取が牛の健康に与える影響についてはほとんど知られていないが，過去の報告によれ
ば，A. versicolor感染が原因と思われるSTC（８細な評価を行っていく必要がある。
４．要

約mg/kg）に汚染された飼料を給与された乳用牛我々が既に確立している液体クロマトグラ

群においては，急性症状としての血便排泄や死亡

フィー質量分析（LC/MS/MS）法を応用した尿例が報告されている。今回測定を行ったZEN汚中ゼアラレノン（ZEN）濃度測定法をベースに，

染牛群における飼料中STC濃度は，過去の報告よ新たに尿中ステリグマトシスチン（STC）濃度

りもかなり低値であったために，急性の臨床症状

測定系を確立するとともに，確立した尿中STC濃が見られなかった可能性があるものと思われた。

度測定法を用いてZEN汚染牛由来保存尿サンプ

一般的に，牛に給与される飼料には異なるタイプ

ルの測定を行った結果，牛尿中STC濃度測定が可の真菌が同時に感染し，それらの真菌が産生する能であること，牛尿中に存在する大部分のSTCは

複数のMTが同時汚染することが知られている。

グルクロン酸胞合を受けていること，および本試

食品におけるSTCとZENの同時汚染に関する最験 に お い て 牛 に 給 与 さ れ て い た 飼 料 中 ZEN と近の報告によると，アフリカでサンプリングされSTCの共汚染の存在が初めて明らかにされた。さた挽きトウモロコシ中にはSTC6μg/kgとZEN 44

らに，尿中STC濃度を指標としたマイコトキシン

μg/kgのほか，27種類の他のMTとの同時汚染が（MT）吸着剤添加効果に関して，本試験で用い報告されている。一方，我々はこれまでに牛群１た１種類の吸着剤による添加効果は認められなにおいて，Day58からDay72の２週間に渡るZEN

かったことから，用いるMT吸着剤のタイプや対非汚染稲ワラ（低STC汚染）給与期間中に，試験象とする飼料中MT種により，吸着剤添加効果は牛の便性状が改善されたことを報告している 。

大きく異なる可能性が示唆された。今後も飼養環従って，多くの要因が試験牛の便性状改善に影響

境下の牛群における，継続的なMT浸潤動態の検を与えたことが推測されるが，高濃度のZENお証，およびデータベースの蓄積を継続するとともよびSTC摂取は，牛の慢性的な下痢症状を引き起に，牛の健康に対するリスクファクターの詳細な

こす原因の１つになる可能性が示唆された。

評価を行う必要があることが示された。

２）

我々はMT吸着剤を飼料に添加することにより，添加後に尿中ZEN濃度が低下することを過去に報告している１，２）。一方，本試験では，吸着剤投与後に尿中STC濃度の低下は見られなかった。この結果より，我々が確立したLC/MS/MS法による尿中STC測定系は，客観的な吸着剤添加
効果の評価に有用な方法であること，および吸着文
献１）
 Takagi M., Uno S., Kokushi E., Shiga S., Mukai S.,
Kuriyagawa T., Takagaki K., Hasunuma H.,
Matsumoto D., Okamoto K., Shahada F., Chenga T.,
Deguchi E., Fink-Gremmels J.：J. Anim. Sci ，89 ．
287～296，2011．
２）
 H a s unum a H ., T a ka gi M ., K a w a m ur a O .,Taniguchi C., Nakamura M., Chuma T.,Uno S.,© The Ito Foundation

214

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Kokushi E., Matsumoto D., Tshering C., Deguchi E.,
Fink-Gremmels J.：J AnimSci ，90 ．1610 ～ 1616 ，
2012．
３） Fushimi Y., Takagi M., Hasunuma H., Uno S.,

Kokushi E., Watanabe U., Liu J., Marey M.,
Miyamoto A., Otoi T., Deguchi E., Fink-Gremmels
J.：World Mycotoxin J，７，367～378，2014．

© The Ito Foundation

215

肺炎原因菌の特定を目的とした気管支肺胞洗浄法の牛医療への応用
Application of bronchoalveolar lavage to specify offending bacteria of
pneumonia to cow medical treatment

帆

保

誠

二・野

口

倫

子・安

藤

貴

朗

（鹿児島大学共同獣医学部）

Seiji Hobo, Michiko Noguchi and Takaaki Andou（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

To minimize the improper use of antimicrobial agents and secure food safety, We havebeen trying to introduce the use of bronchoalveolar lavage and bronchoalveolar fluid
examination to bovine medicine. We aimed to apply the technique we developed, and its clinicaluses in equine medical treatment, to bovine medical treatment. Initially, because we needed
basic data from a healthy cow to see if it was possible to pinpoint the bacterial causes ofpneumonia, we examined a healthy cow's breeding environment and the distribution of bacteria
in the bronchoalveolar region. We also investigated the bacterial distribution in the cow's nasal
cavity. Next, we performed bronchoalveolar lavage on a cow with chronicbacterial pneumonia
and examined the lavage fluid bacteriologically.The bronchoalveolar region of the clinically
healthy cow was endoscopically normal and the fluid was aseptic. This meant that any
bacterium isolated from the bronchoalveolar fluid of the chronically ill cow was likely to be thetrue cause of her pneumonia. The principal causative bacterium was successfully isolated fromthe bronchoalveolar fluid of the sick cow; it was highly likely to have been instrumental indeterioration of the cow's pneumonia．

１．目ないこと，また病理解剖は，ほとんどの場合，救的命困難な病態に陥ってから実施されるため，急性肺炎は，動物においてもヒトと同様に死因の上期の肺炎の病態を反映していないことに起因す位に位置しており，獣医療において最も重要な感る。従来，これらの情報をもとに抗菌薬を使用し染症のひとつである。肺炎の原因菌については，てきたことから，不適切な抗菌薬が長期間に渡っ

多くの場合，鼻腔スワブあるいは病理解剖肺からて使用されることも多く，耐性菌の出現が危惧さ分離された細菌に関する情報をもとに推察されてれてきた。

きた。そのため，真の肺炎原因菌が特定されるこ気管支肺胞洗浄法は，気管支肺胞領域の様々なとは少ない。これは，鼻腔スワブから得られる情情報をダイレクトに得る手法としてヒト医療，馬医報は，多くの場合，肺炎発症領域の情報を反映し療および小動物医療において実施されている１～６）。

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216

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

特に馬医療においては，肺炎原因菌の特定に留まらず肺炎の治療を目的として気管支肺胞洗浄法が臨床応用され，良好な臨床成績をあげている５）。
しかし，馬以外の産業動物の気管支肺胞洗浄法に関する報告は極めて少ない。これは手技的に７～10）

熟練を要することや，一般的に使用される内視鏡

し，細菌学的に検索した。
２．方法

2 . 1 健常子牛の鼻腔および気管支肺胞領域ならびに飼養環境中における細菌の分布状況調査

よりも細径で長尺の気管支鏡を所有する医療機関

供試動物：臨床的に健常で気道の内視鏡検査で異が少ないことが主な原因であると考えられる。こ

常所見を認めないホルスタイン種子牛６頭（雄，のような問題点を改善し，馬以外の産業動物に対14日齢，体重：51.2±3.4kg（平均値±標準偏差）；しても気管支肺胞洗浄法を導入することが，今後

45.0～56.5kg（範囲））を供試した。

の獣医療において極めて重要であると考えられ

血液検査：試験直前に頸静脈から血液を採取し，る。馬医療における気管支肺胞洗浄法を応用した

血液自動分析装置を用いて末梢血中の白血球数，

肺炎原因菌の特定や治療法の開発は，代表研究者

赤血球数，ヘモグロビン濃度およびヘマトクリッ

が中心となって行ってきたものである

ト値を測定した。

。その

１～５）

結果，肺炎発症馬に対する診断的かつ治療的な有呼吸器検体の採取および処理：70％エタノールに効性が確認され，競走馬臨床に約20年間にわたっ浸漬した綿花を用いて鼻孔周辺を清拭した後，培て応用され続け，得られた肺炎原因菌や薬剤感受

養用綿棒を可能な限り鼻腔内深部まで挿入し，ス性の情報は，馬の臨床に広く利用されている。一ワブすることにより検体（鼻腔スワブ）を得た。

方，牛および豚医療においては，特に幼獣が肺炎

続いて，非鎮静下でビデオスコープを鼻孔から挿を発症するとその成長が著しく停滞し生産性に大入し，鼻腔および咽喉頭部を観察後，必要に応じきく影響することから，その生産現場においてもて塩酸リドカインによる気道粘膜の表面麻酔を実

肺炎発症のコントロールとともに，早期診断法お施しながら，気管および気管支内腔を観察した

よび確実な治療法の開発が急務である。

（Fig.１）。その後，気管支鏡を右中葉あるいは左そこで我々は，牛医療に気管支肺胞洗浄法を導前葉へとつながる気管支へ進め，気管支直径約入し，肺炎原因菌の特定による適切な抗菌薬の使5.5mmの気管支に楔入した。楔入部位に37℃に加用法を確立することより，抗菌薬の不適切な使用

温した滅菌生理食塩水50mLを気管支鏡の鉗子孔を低減させ，食の安全の確保に繋げることが重要から注入し，即座に回収した。同操作を計２回実であると考えた。本研究では，これまでに馬医療施し，混和したものを検体（気管支肺胞洗浄液：

において開発・臨床応用してきた気管支肺胞洗浄

BALF）とした。得られた検体は冷蔵状態で検査法に関する手法や知見を牛医療に応用することを室へ搬送し，検体採取後３時間以内に各種検査に

以下により目指した。まず，肺炎原因菌を特定す供した。また，BALFの回収率を計測するとともるためには健常牛での基礎的なデータが必要であに，白血球計算盤を用いて常法により細胞数を計るので，健常牛の鼻腔および気管支肺胞領域にお数した。

ける細菌の分布状況を明らかにするとともに，飼飼養環境中の細菌検索：エアサンプラーを用い養環境中の細菌分布についても調査した。続いて，飼養環境中の細菌分布を調査した。すなわち，て，肺炎発症牛に対して気管支肺胞洗浄を実施

エアサンプラーを用いて５％ウマ血液含有コロン© The Ito Foundation

肺炎原因菌の特定を目的とした気管支肺胞洗浄法の牛医療への応用
a）

217

b）

Fig.1 Bronchoscopic findings of the healthy cow and pneumonia affected cow．
a）healthy cowb）pneumonia affected cow

ビア寒天培地（BA培地）に直接，飼養環境中の間培養（直接培養）するとともに，マイコプラズ

空気を吹き付け，細菌の分布を調査した。

マ増菌培地に接種し微好気条件下で２日間培養

細菌分離検査：得られた検体のうち，鼻腔スワブ（増菌培養）した。その後，増菌培養液は，１白は300μＬの滅菌生理食塩水に懸濁後，細菌分離

金耳をマイコプラズマ分離用寒天培地に塗布し，検査に供した。また，BALFは遠心操作により微好気条件下で７日間培養した。培養後のマイコ100倍に濃縮した後に，沈渣分画を細菌分離検査

プラズマ分離用寒天培地は，実体顕微鏡で観察すに供した。検体は，BA培地およびマッコンキー

るとともに，培地上の目玉状のコロニーについて

寒天培地（MAC培地）に接種され，BA培地は２

TOF-MSを用いて同定した。

種類の培養法（微好気条件下：37℃，５％CO２条

な お 本 研 究 に お い て は ， Mannheimia

件下，37℃，嫌気条件下）で，MAC培地は１種

haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus

類の培養法（37℃，好気条件下）で24～48時間培

somniおよびMycoplasma属を主要分離・同定対養された。エアサンプラーにより飼養環境中の空象細菌とした。

気を吹き付けられたBA培地は，微好気条件下で24時間培養された。培養後のBA培地から主要な

2 . 2 肺炎発症牛への気管支肺胞洗浄法の応用による肺炎原因菌の特定細菌を分離し，純培養後にグラム染色検査および供試子牛：慢性化した肺炎発症牛５頭（雄２頭，細菌同定検査（飛行時間型質量分析法：Time of

雌３頭；5.0±1.0月齢（平均値±標準偏差））を供Flight Mass Spectrometry:TOF-MS）を実施し，試した。

菌種を同定した。

呼吸器検体の採取および処理ならびに細菌分離検

マイコプラズマ分離検査：マイコプラズマ分離検

査：先に示した方法と同様に気管支鏡を肺炎発症

査は，細菌分離検査と同様の検体をマイコプラズ

部位へ進め，罹患肺葉の気管支に楔入し洗浄する

マ分離用寒天培地に塗布し，微好気条件下で７日ことにより気管支肺胞洗浄液を得た。他は前述の© The Ito Foundation

218

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

Table 1 Findings of the clinical, blood and bronchoalveolar lavage fluid exermination．
Unit

Result（mean±S.D．）

Rectal temperature（℃）

39.2±0.7

Heart rate

（beats/min）

99.0±7.2

Inspection item

Respiration rate

（times/min）

29.0±3.1

White blood count in the peripheral blood（x10２/mm３）

88.7±12.7

Red blood count in the peripheral blood（x10４/mm３）

809.2±72.4

Hemoglobin concentration in the
peripheral blood（g/dL）

10.0±1.0

Hematocrit in the peripheral blood（％）

32.0±2.9

Recover rate in BALF（％）

54.0±13.3

Number of cells in BALF

（x10５/mL）

3.4±2.4

BALF：bronchoalveolar lavage fluid

Table 2

Results of bacterial isolation from nasal swab and bronchoalveolar lavage fluid in healthy cows．
Bacteria

AnimalNo.

Sample1Nasal swab

Mycoplasma bovis

P. multocida

M.
haemoritica

H. somni

OthersDirect culture

Enrichment
culture―――＞５species

―

―

2

―

―

―

＞５species

―

―

3

―

―

―

＞５species

―

―

4

―

―

―

＞５species

―

―

5

―

―

―

＞５species

―

―

―

―

―

＞５species

―

―

―

―

―

―

―

―

2

―

―

―

―

―

―

3

―

―

―

―

―

―

4

―

―

―

―

―

―

5

―

―

―

―

―

―

6

―

―

―

―

―

―

6
1

BALF

BALF：bronchoalveolar lavage fluid
P. multocida：Pasteurella multocida, M. haemoritica：Mannheimia haemolytica, H. somni：Histophilus somni―：Culture negative

とおりである。

（99.0±7.2拍／分）していたが，直腸温（39.2±
0.7℃）および呼吸数（29.0±3.1回／分）は正常

３．結果と考察範囲内であった（Table１）。心拍数の増加は，試

3 . 1 健常子牛の鼻腔および気管支肺胞領域ならびに飼養環境中における細菌の分布状況
調査

験実施者が供試子牛に触れたり，聴診を実施した
りしたことが影響したものと考えられた。
血液検査においては，いずれも測定項目も正常臨床検査において，供試子牛に呼吸器の異常所
見 は 認 め ら れ な か っ た 。心 拍 数 は 軽 度 に 増 加

範囲内であった（Table１）。
BALFの回収率は54.0±13.3％，BALF中細胞数© The Ito Foundation

219

肺炎原因菌の特定を目的とした気管支肺胞洗浄法の牛医療への応用

Table 3‌ Results of bacterial isolation from nasal swab and bronchoalveolar lavage fluid in chronic pneumonia affected

cows．
Bacteria
Animal No.

Sample1Nasal swab

Mycoplasma bovis

P. multocida

M. haemoritica

H. somni

OthersDirect culture

Enrichment
culture－－－＞５species

－

－

2

－

－

－

P. a., > 5 species

－

－

3

＋

－

－

＞５species

－

－

4

＋

－

－

＞５species

＋

＋

5

－

－

－

＞５species

－

－

1

＋

－

－

β

＋

＋

2

BALF

＋

＋

－

β

＋

＋

3

＋

－

－

An

＋

＋

4

＋

－

－

－

＋

＋

5

＋

－

－

β，An

＋

＋

BALF：bronchoalveolar lavage fluid
P. multocida : Pasteurella multocida, M. haemoritica : Mannheimia haemolytica, H. somni : Histophilus somni＋：Culture positive，－：Culture negative
P.a．
：Pseudomonus aeruginosa，β：beta-hemolytic bacterium, An : obligate anaerobic bacteriaは3.4±2.4×10５／mLであった（Table１）。BALFの回収率および細胞数については，詳細な報告が3 . 2 肺炎発症牛への気管支肺胞洗浄法の応用による肺炎原因菌の特定見当たらないため既報と比較することは困難であ細菌分離検査については，鼻腔スワブの２検体

るが，他の動物で得られた成績に近似していたこ

お よ び BALF の ５ 検 体 か ら P. multocida が ，とから正常範囲内と判断した。

BALFの１検体からM. haemolyticaが分離された細菌分離検査においては，鼻腔スワブ，BALF（Fig.1, Table３）。また，Mycoplasma bovisが鼻腔およびエアサンプラー検体のいずれの検体からもスワブの１検体およびBALFの５検体から分離さ

M. haemolytica, P. multocida, H. somni お よ び

れ た 。 M. haemolytica, P. multocida お よ び

Mycoplasma 属 菌 は ま っ た く 分 離 さ れ な か っ た

Mycoplasma bovisは，牛の肺炎の主要原因菌であ（Table２）。鼻腔スワブおよびエアサンプラー検り病態の悪化に強く関与していると考えられてい体からは，これら以外の細菌が多数分離されたることから７，10，11），本研究で分離された細菌も同が，BALFからは細菌はまったく分離されなかっ症例の病態悪化の主因となっているものと推察さた。既報では，健常な子牛においても鼻腔スワブ

れ た 。一 方 ，エ ア サ ン プ ラ ー 検 体 か ら は M.

から比較的高率にこれら４菌種が分離されている

haemolytica, P. multocida, H. somni お よ びが，本研究ではまったく分離されなかった。これ

Mycoplasma属菌は分離されなかったが，他の細は，子牛の生産牧場および本学の動物飼養環境中菌が多数分離された。飼養環境中にもこれら主要にこれら細菌が多数存在しなかったことに起因す

肺炎原因菌は存在すると考えられるが，他の菌種ると思われた。

の絶対量が多かったため分離できなかったものと思われる。今後，選択培地を用いた主要肺炎原因菌の特定も試みたい。

© The Ito Foundation

220

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

本研究で供試した肺炎発症牛すべての気管支肺肺胞領域における細菌の分布状況を明らかにする胞領域には，肺炎の主要原因菌が存在し，肺炎のとともに，飼養環境中の細菌分布についても調査悪化に強く関与しているものと考えられた。しかした。続いて，慢性化した肺炎発症牛に対して気し，鼻腔スワブからの主要原因菌の分離は一部で管支肺胞洗浄を実施し，細菌学的に検索した。そあり，肺炎原因菌が必ずしも鼻腔領域からは分離の結果，臨床的に健康で気道の内視鏡検査で異常されないことが証明された。このことは，肺炎原所見を認めない子牛の気管支肺胞領域は無菌であ因菌の特定を鼻腔スワブで行っても必ずしも肺炎ることが示された。これにより，本来無菌である原因菌を反映しないことを示しており，今後の肺気管支肺胞領域から細菌が分離された場合，真の炎原因菌特定は気管支肺胞洗浄液を用いる必要性

肺炎原因菌である可能性が高いことが推察可能とが示された。しかし，今回は慢性化した肺炎発症なった。また，慢性化した肺炎発症牛の気管支肺

牛５頭のデータであったので，今後，様々な臨床

胞領域からは，牛の主要な肺炎原因菌が分離さステージにある症例の数を増やして検討すること

れ，肺炎病態の悪化に強く関与しているものと考が重要であると考えられた。

えられた。

本研究において，臨床的に健康で気道の内視鏡検査で異常所見を認めない子牛の気管支肺胞領域
は無菌であることが示された。このことから，本来無菌である気管支肺胞領域から細菌が分離された場合，真の肺炎原因菌である可能性が高いことが推察可能となった。また，慢性化した肺炎症例
牛の気管支肺胞領域からは，牛の主要な肺炎原因菌が分離され，肺炎病態の悪化に強く関与しているものと考えられた。今後は，様々な臨床ステー
ジの肺炎発症牛の気管支肺胞領域からの細菌分離を行い，その病態との関連性を明らかにすることが重要であると考えられた。
４．要約

牛医療に気管支肺胞洗浄法を導入し，肺炎原因菌の特定による適切な抗菌薬の使用法を確立することより，抗菌薬の不適切な使用を減少させ，食の安全の確保に繋げることが重要である。本研究では，これまでに馬医療において開発・臨床応用してきた気管支肺胞洗浄法に関する手法や知見を牛医療に応用することを目指した。まず，肺炎原因菌を特定するためには健常牛での基礎的なデー
タが必要であるので，健常牛の鼻腔および気管支

文献１）
 Hobo S, Oikawa M, Kuwano A, Yoshida K,
Yoshihara T.：Effect of transportation on thecomposition of bronchoalveolar lavage fluid
obtained from horses. Am. J. Vet. Res. 58 ， 531 ～
534，1997．
２）
 Hobo S, Ogasawara Y, Kuroki Y, Akino T,
Yoshihara T.：Purification and biochemical
characterization of equine pulmonary surfactant
protein D. Am. J. Vet. Res. 60，368～372，1999．
３）
 Hobo S, Ogasawara Y, Kuroki Y, Akino T,
Yoshihara T.：Purification and biochemical
characterization of pulmonary surfactant protein Aof horses. Am. J. Vet. Res. 60，169～173，1999．
４）
 Hobo S, Yoshihara T, Oikawa M, Jones JH.：
Surfactant proteins in bronchoalveolar lavage fluidof horses: assay technique and changes following
road transport. Vet. Rec. 148，74～80，2001．
５）
 Ito S, Hobo S, Eto D, Sato H.：Bronchoalveolar
lavage for the diagnosis and treatment ofpneumonia associated with transport inthoroughbred racehorses. J. Vet. Med. Sci. 63 ，1263～1269，2001．
６）
 Ito S, Hobo S, Kasashima Y.：Bronchoalveolar
lavage fluid findings in the atelectatic regions ofanesthetized horses. J. Vet. Med. Sci. 65 ， 1011 ～
1013，2003．
７）
 Allen JW, Viel L, Bateman KG, Rosendal S,
Shewen PE, Physick-Sheard P.：The microbial
flora of the respiratory tract in feedlot calves:
associations between nasopharyngeal andbronchoalveolar lavage cultures. Can. J. Vet. Res.
55，341～６，1991．

© The Ito Foundation

肺炎原因菌の特定を目的とした気管支肺胞洗浄法の牛医療への応用
８） Angen O, Thomse J, Larse LE, Larsen J,
Kokotovic B, Heegaard PM, Enemark JM.：
Respiratory disease in calves: microbiologicalinvestigations on trans-tracheally aspirated
bronchoalveolar fluid and acute phase protein
response.Vet. Microbiol. 28，135～171，2009．
９） Suzuki K, Higuchi H, Iwano H, Lakritz J, Sera K,
Koiwa M, Taguchi K.：Analysis of trace and major
elements in bronchoalveolar lavage fluid of
Mycoplasma bronchopneumonia in calves.Biol.
Trace Elem Res. 145，166～171，2012．

22110） Subramaniam R, Herndon CN, Shanthalingam S,
Dassanayake RP, Bavananthasivam J, Potter KA,
Knowles DP, Foreyt WJ, Srikumaran S.：
Defective bacterial clearance is responsible forthe enhanced lung pathology characteristic ofMannheimia haemolytica pneumonia in bighorn
sheep.Vet. Microbiol. 153，332～338，2011．
11）
 Maunsell FP, Woolums AR, Francoz D,
Rosenbusch RF, Step DL, Wilson DJ, Janzen ED. ：Mycoplasma bovis infections in cattle. J. Vet. Intern.
Med. 25，772～783，2011．

© The Ito Foundation

222

乳牛の病原微生物感染における卵巣機能障害の発症機序の解明
Mechanisms of ovarian dysfunction by bacterial infection in dairy cow

清

水

隆

（帯広畜産大学畜産衛生学研究部門）

Takashi Shimizu（Graduate School of Animal and Food Hygiene, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

Exp. 1）Bovine ovaries were collected from a slaughterhouse, and the largest follicles wereused（＞８mm in diameter, n ＝ 38）．LPS concentration in the follicular fluid was measured
using quantitative kinetic assay. Follicular steroidogenesis was evaluated by measuring the
estradiol（E2）and progesterone（P4）concentration in follicular fluid and by analysing
transcription levels of steroidogenesis-related genes in theca and granulosa cells. LPS
concentration detected in follicular fluid ranged from 0.2 to 2.0 EU/mL. In follicles with a highlevel of LPS（＞ 0.5 EU/mL, n ＝ 15），the concentration of E2 was lower and that of P4 washigher when compared to those in follicles with a low level of LPS（<0.5 EU/mL, n ＝ 23）．
Furthermore, in follicles with a high level of LPS, transcripts of steroidogenic enzymes such as
CYP17 and P450arom were lower．
Exp. 2）Bovine theca cells expressed the LPS receptor gene complex: Toll-like receptor 4（TLR4），CD14 and MD2. LPS suppressed progesterone（P4）and androstenedione（A4）production with downregulation of steroidogenic enzyme transcripts when theca cells were
stimulated with LH. By contrast, LPS did not affect P4 or A4 production when theca cells were
stimulated with E2. P4 and A4 production in theca cells was suppressed by LPS as early as at
48 h of culture．
These findings indicate that LPS present in follicular fluid may cause ovarian dysfunction
by inhibiting follicular activity．

１．目にある卵胞構成細胞に特異的な機能であるステロ

的イドホルモン産生に及ぼすLPSの影響に焦点をあ

本研究は，子宮内膜炎牛の卵巣内の発育途上のて，乳牛の生産性の向上を目指した病原微生物感

卵胞の卵胞液中リポポリサッカライド（LPS）濃染における卵巣機能障害の発症機序の解明を目的

度およびエストラジオール（Ｅ２）やプロジェスとしている。

テロン（Ｐ４）を同時に測定することによるLPSと卵胞機能との相互連関の検証，また卵胞発育期© The Ito Foundation

223

乳牛の病原微生物感染における卵巣機能障害の発症機序の解明

これらの解析により，子宮内膜炎によるLPSとス

法

２．方テロイド産生との相関関係が明らかになるとともに，影響を受けやすい卵胞の発育段階および顆粒

2 . 1 研究課題１．子宮内膜炎の牛卵巣内卵胞層細胞への影響が明確になる。

の各発育段階別の卵胞液中LPS濃度の解析
健康な乳牛の卵巣内には様々な発育段階の卵胞2 . 2 研究課題２．卵胞発育過程の卵胞膜細胞が存在している。子宮内膜炎牛の卵巣においてものステロイド合成能におけるLPSの影響解析同様であり，発育途上の卵胞内には感染した病原我々は，これまでの研究で卵胞発育過程の卵胞微生物から放出されたLPSを含有している可能性

膜細胞において，LPSの受容体であるTLR -４，があるが，卵胞の発育ステージとLPSとの詳細なMD -２およびCD14の遺伝子が発現していること

検討はこれまでにされていない。

を明らかにした。このことは，卵胞が発育する時

そこで本研究では，食肉処理場由来の乳牛の生期にLPSが体内に存在すれば，卵胞膜細胞がLPS

殖器を利用し，子宮内膜炎（子宮内に膿が蓄積さを受容することができ，LPSが卵胞膜細胞の機能れている状態，腐敗臭のするものなど）と判断しに直接的に影響している可能性を示唆している。

た子宮に付随している卵巣を採取し，各発育段階

そこで，本研究課題では，卵胞発育過程にある卵の卵胞の卵胞液を採集する。卵胞直径算出計算式

胞を小卵胞と大卵胞とに分け，それぞれから卵胞モデルを利用し，採集した卵胞液の量からその卵膜細胞を分離・採取する。採取した卵胞膜細胞に胞の大きさを算出する。また採取した卵胞液は，下垂体から分泌される黄体形成ホルモン（LH）

LPS測定キット（Endospecy ES -24S kit, Seikagaku

を添加し，同時にLPSも添加した後，卵胞膜細胞

Biobusiness）を用いて測定すると同時に卵胞液から分泌された培地中のプロジェステロンおよび中のエストラジオールおよびプロジェステロンもアンドロジェン濃度を測定する。さらに，培養し酵素免疫法（EIA）により測定する。

た細胞からはホルモン産生に関与する酵素群の遺さらに，卵胞液採取時に同時に取れる少量の顆

伝子発現を定量解析する。これらの研究により，粒層細胞から出来る限りRNAを抽出して，ステLPSが影響を及ぼす卵胞の発育段階の時期，およロイド産生関連酵素群の遺伝子発現を解析する。

びその強度が明らかとなる。

（b）
a

60
40
20
0

b
low

high

（c）

600
400
200
0

2

b
E/P ratio

80

P4 conc.（ng/mL）

E2 conc.（ng/mL）

（a）

a

low

high

1.5

a

1
0.5
0

b
low

high

Follicular ﬂuid LPS conc.
Fig. 1 （a） Estradiol（E2）and（b）progesterone（P4）concentration and（c）the ratio of E2 and P4 production （E/P

ratio）in the follicular fluid of large follicles （＞ ８ mm diameter）from bovine ovary. Cows with a follicular fluid
LPS concentration of less than 0.5 EU/mL were categorized as ‘low’ （white bar, n ＝ 13） and those with aconcentration greater than 0.5 EU/mL were categorized as ‘high’（black bar, n ＝ 13）． All values are shown as
mean±SEM. Values with different letters（a, b）are different between groups（P＜0.05）．

© The Ito Foundation

224

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

取した子宮および卵巣を用いているため，分娩後３．結果と考察の日数が不明であり，卵巣の状態が正確に判断で

3 . 1 子宮内膜炎の牛卵巣内卵胞の各発育段階きない。従って，今後は子宮炎あるいは子宮内膜炎に罹患した乳牛の卵巣内卵胞から卵胞液を採取

別の卵胞液中LPS濃度の解析
卵胞液中のLPS濃度が高い卵胞と低い卵胞におし，LPS濃度を測定する必要があると考えている。

けるエストラジオール（Ｅ）濃度およびプロジェ

興味深いことに，本研究における高LPS卵胞は，

ステロン（Ｐ）濃度との関係をFig.１に示した。

２）
Herath et al．
の研究結果と比べ低いにも関わら卵胞液中のLPS濃度が高い卵胞では低い卵胞にず，この卵胞のエストラジオール濃度は抑制され比べ，エストラジオール濃度が低く，プロジェスていた。卵胞のエストラジオールは，それに内在テロン濃度が高かった。また，卵胞の活性状態のする顆粒層細胞という細胞によって合成させる。

指標であるE/P比については，卵胞液中のLPS濃さらに，顆粒層細胞がエストラジオールを産生す

度が低い卵胞は高い卵胞に比べ，E/P比が高かっるためには，もう一つの卵胞構成細胞である卵胞た。これらの結果は，LPSが卵胞のステロイドホ膜細胞が産生するアンドロジェンが重要な役割を

ルモン産生に影響していることを示している。

担っている。すなわち，顆粒層細胞で産生される

LPSは，大腸菌を感染させた乳牛の乳汁および血エストラジオールは，卵胞膜細胞で産生されるア

液中 ，および子宮炎牛の卵胞液にンドロジェンの量に依存するため，顆粒層細胞の検出された。本研究では，卵胞液中のLPS濃度は，機能だけでなく卵胞膜細胞の機能も重要である。

0.2～2.0EU/ml（0.02～0.2 ng/ml）の範囲で検出

このようなことから，卵胞膜細胞のアンドロジェ

された。この卵胞液中のLPS濃度は，分娩後40日

ン産生に関わるCYP17という酵素の遺伝子発現から60日の乳牛を用いたHerath et al．
，の研究を解析したところ，低LPS卵胞に比べ高LPS卵胞結果に比べ非常に低い値である。このLPS濃度のの卵胞膜細胞で有意に低かった（Fig. 2b）。また，不一致は，乳牛の分娩後日数の相異に関連していCYP17遺伝子の発現に関与する黄体形成ホルモるかもしれない。本研究では，食肉処理場から採ン（LH）の受容体（LHr）の発現も解析したと

２）

や血液中

２）

３）

（a）

（b）

3

0.2

a

CYP17/GAPDH

LHr/GAPDH

１）

2
1
0

b
low

high

a
0.1
b
0

low

high

Follicular ﬂuid LPS conc.
Fig. 2 （a）mRNA expression of LHr（a）and CYP17（b）in the theca cells of large follicles （＞ ８ mm diameter) frombovine ovaries. Cows with a follicular fluid LPS concentration of less than 0.5 EU/mL were categorized as‘low'（white bar, n ＝ 13）and those with a concentration greater than 0.5EU/mL were categorized as‘high' (black bar, n＝ 13）． All values are shown as mean ± SEM. Values with different letters（a, b）are different between groups（P＜0.05）．

© The Ito Foundation

225

（b）

（c）

0.4

0.3

a

0.3
0.2
b

0.1
0

a

0.2
b

0.1
0

high

low

0.3

P450arom/GAPDH

（a）
0.4

FSHr/GAPDH

LHr/GAPDH

乳牛の病原微生物感染における卵巣機能障害の発症機序の解明

high

low

a

0.2
0.1
0

b
high

low

Follicular ﬂuid LPS conc.
Fig. 3 mRNA expression of（a）LHr,（b）FSHr, and（c）P450arom in the granulosa cells of large follicles （＞ ８ mm

diameter）from bovine ovaries. Cows with a follicular fluid LPS concentration of less than 0.5 EU/mL werecategorized as‘low’（white bar, n ＝ 13）and those with a concentration greater than 0.5 EU/mL were categorizedas‘high’（black bar, n ＝ 13）． All values are shown as mean ± SEM. Values with different letters (a, b) are different
between groups（P＜0.05）．

a

140

80
60

b

40

b

b

20
0

100
80
60
40
20

LH + 0.1

1

0

10

A4 concentration(% of control)

100

a

60
b

b

20
0

1

1

b

10

LPS(µg/ml)

b

60

160

20

100
80
60
40
0

120
100

120

LH + 0.1110

LPS(µg/ml)

b

b

40

LH,E2 + 0.1

1

10

LPS(µg/ml)（f）20
LH + 0.1

80

0

10

140

80

40

LH + 0.1a

LPS(µg/ml)（e）

A4 concentration(% of control)

120

120
100

120

LPS(µg/ml)
（d）

（c）

160

P4 concentration(% of control)

P4 concentration(% of control)

100

（b）

A4 concentration(% of control)120

P4 concentration(% of control)

（a）

a

80
60

b

b

40

b

20
0

LH,E2 + 0.1

1

10

LPS(µg/ml)

Fig. 4 Effect of LPS on the production of progesterone（P4; a-c） and androgen（A4; d-f） in bovine theca cells fromlarge follicles（＞ 8.5mm）during term 1（white circles ，0-48h）and term 2（black triangles ，48-96h）．Theca cells
were stimulated with 2.5 ng/ml luteinizing hormone（LH; a, d），100 ng/ml estradiol（E2; b, e）or LH and E2（c, f）．
Data are expressed as the percentage of control （100 ％ ）steroid accumulation in the culture medium. All values
are means ± standard error of the mean of three independent experiments. Values with different letters（a, b) aresignificantly different between groups（P＜0.05）．

© The Ito Foundation

A4 concentration(% of control)

y

60

y

y

80
ab

b

40

b

20
0

（d）

a,x

LH + 0.1

1

LPS(µg/ml)
120
100
80
60
40

y
y

b

b
b

20
0

（e）

a,x
y

LH + 0.1

1

10

100

50

0

10

（c）

150

P4 concentration(% of control)

100

（b）

P4 concentration(% of control)

120

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

A4 concentration(% of control)

P4 concentration(% of control)（a）

平成25年度E2 + 0.1

1

LPS(µg/ml)
150

100

50

0

LH + 0.1110

LPS(µg/ml)

LPS(µg/ml)

120
100

（f）

a,x

80

y

60

y

b

40

y

b

b

20
0

10

A4 concentration(% of control)

226

LH,E2 + 0.1

1

10

LPS(µg/ml)
120
100
80
60
40
20
0

a,x

b
b
y

LH,E2+ 0.1

b

y
1

z
10

LPS(µg/ml)

Fig. 5 Effect of LPS on the production of progesterone（P4; a-c）and androgen（A4; d-f）in bovine theca cells fromsmall follicles（＜8.5mm）during term 1（white circles，0-48h）and term 2（black triangles，48-96h）． Theca cells
were stimulated with 2.5 ng/ml luteinizing hormone（LH; a, d），100 ng/ml estradiol（E2; b, e）or LH and E2（c, f）．
Data are expressed as the percentage of control （100 ％ ）steroid accumulation in the culture medium. All values
are means±standard error of the mean of three independent experiments. Values with different letters（a，b）are
different between groups（P＜0.05）

ころ，低LPS卵胞に比べ高LPS卵胞の卵胞膜細胞となった。LHは卵胞膜細胞のアンドロジェン産で有意に低かった（Fig. 2a）。さらに，顆粒層細生を刺激し，FSHは顆粒層細胞のエストラジオー

胞 の エ ス ト ラ ジオール産生に関わる

ル産生を刺激することが知られている。本研究にP450aromatase（P450arom）という酵素の遺伝

おいて，卵胞膜細胞のLH受容体および顆粒層細子発現を解析したところ，低LPS卵胞に比べ高胞のFSH受容体の発現が，高LPS卵胞で抑制されLPS 卵 胞 で 有 意 に 低 か っ た（Fig. 3c）。ま た ，ていたことから，LPSがこれらの受容体の発現を

P450arom遺伝子の発現に関与するLHrおよび卵阻害することによってステロイドホルモン産生の胞刺激ホルモン（FSH）の受容体（FSHr）の発抑制に寄与している可能性が示唆された。

現も解析したところ，両受容体ともに低LPS卵胞に比べ高LPS卵胞で有意に低かった（Fig. 3aおよ3 . 2 卵胞発育過程の卵胞膜細胞のステロイド
合成能におけるLPSの影響解析び３ｂ）。これらの結果から，LPSは卵胞の顆粒前節の研究結果から，高濃度のLPSを含有した層細胞および卵胞膜細胞のステロイドホルモン産

卵胞において，顆粒層細胞および卵胞膜細胞のス

生関連因子の遺伝子発現を抑制することが明らか

テロイドホルモン産生の機能が低下していること© The Ito Foundation

227

乳牛の病原微生物感染における卵巣機能障害の発症機序の解明
（b）
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

LH + 0.1

1

10

（c）
1.4

Viable cell numbe（×105）

1.4

Viable cell numbe（×105）

Viable cell numbe（×105）

（a）

1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

E2 + 0.110（e）Viable cell numbe（×105）

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

LH + 0.1

1

10

1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

LH,E2 + 0.1

1

10

LPS(µg/ml)
（f）

1.4

Viable cell numbe（×105）

（d）

1.2

LPS(µg/ml)

LPS(µg/ml)

Viable cell numbe（×105）

1

1.4

1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

E2 + 0.1110

LPS(µg/ml)

LPS(µg/ml)

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

LH,E2 + 0.1

1

10

LPS(µg/ml)

Fig. 6 Effect of lipopolysaccharide（LPS）on number of viable theca cells isolated from large follicles（＞ 8.5mm ； ａ -c）and small follicles（＜ 8.5mm ； ｄ -f）during term 1（white circles ，0-48h）and term 2（black triangles ，48-96h）．
Theca cells were stimulated with 2.5 ng/ml luteinizing hormone（LH; a, d），100 ng/ml estradiol（E2; b, e）or LH
and E2（c, f）． All values are means±standard error of the mean of three independent experiments．

が示された。そこで，ステロイドホルモン産生に

カニズムについては，まだよくわかっていない。

最も重要な細胞である卵胞膜細胞のアンドロジェ

本研究では，LPSが小卵胞および大卵胞から採取

ンおよびプロジェステロン産生に及ぼすLPSの直した卵胞膜細胞のステロイドホルモン産生を阻害

接的な影響を観察した結果，LPSは小卵胞および２）することが示された。一方，Herath et al．
の研大卵胞から採取した卵胞膜細胞をLH含有培地で究では，卵胞の大きさに関係なく，LPSは卵胞膜培養した場合，アンドロジェンおよびプロジェス

細胞のアンドロジェン産生を阻害しなかった。本

テロン産生を抑制することが明らかとなった研究とHerath et al．２）の研究結果との不一致は，（Fig. 4，Fig. 5）。

培地中のLH添加の有無によるものでると考えら興味深いことに，LPSは小卵胞および大卵胞かれる。LHはサイクリックAMP（cAMP）を介しら採取した卵胞膜細胞の生存には全く関係しないて，ステロイドホルモン産生に関連する酵素の遺ことが示された（Fig. 6）。これらの結果から，伝子発現（転写）に関与することが知られている４）。

LPSは細胞の生存には関与しないが，細胞の機能

Taylor&Terranova５）は，LH処理したマウス卵胞に影響することを示している。

膜細胞のアンドロジェンおよびプロジェステロン

ステロイドホルモン産生におけるLPSの阻害メ産生を抑制したことを報告した。また，この研究© The Ito Foundation

228

平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.32）

では，LPSの効果を阻害するherbimycin Aを処細胞のアンドロジェンおよびプロジェステロン産

理した卵胞膜細胞において，cAMPの増加が認め生に及ぼすLPSの直接的な影響を検討した。LPSられたことを報告している。したがって，LPSのは小卵胞および大卵胞から採取した卵胞膜細胞を抑制効果はLHによって活性化されたcAMPシグ

LH含有培地で培養した場合，アンドロジェンおナル経路に関与しているかもしれない。

よびプロジェステロン産生を抑制することが明ら本研究において，卵胞膜細胞のアンドロジェンかとなった。さらに，アンドロジェンおよびプロ

およびプロジェステロン産生は，小卵胞から採取

ジェステロン産生に関与するCYP17およびStARした卵胞膜細胞では培養48時で抑制され，大卵胞という酵素の遺伝子発現を解析したところ，両因から採取した卵胞膜細胞では培養96時で抑制され子ともにLPSにより抑制されることが明らかとることが分かった。これらの結果は，LPSに対すなった。

る感受性は大卵胞よりも小卵胞の卵胞膜細胞の方

これらの研究成果から，分娩後の子宮におけるが高いことを示している。LPSの細胞内シグナル

病原微生物の感染による繁殖障害の要因の一つに

伝達には，２つの経路が存在する。すなわち，

LPSが関与していること，またその作用メカニズ

MyD88に依存的な経路とTRIFに依存的な経路で

ムは卵胞膜細胞のアンドロジェン産生を抑制するある。MyD88依存的経路はNF-κＢの早期の活性ことが明らかとなった。これらのことから，卵胞化に関与し，TRIF依存的経路はNF-κＢ活性化

発育における卵胞膜細胞に対するLPSの影響が明の遅延にかんよすることが知られている 。した確化され，生殖内分泌学におけるLPSの意義が一がって，本研究で観察されたLPS感受性の相異は層明らかになったとともに，分娩後に高頻度に起LPSの細胞内シグナル伝達経路と関係しているか

こる子宮の炎症による卵巣機能障害の原因の一端もしれない。

が明らかとなった。本研究成果は，子宮炎および

６）

４．要

子宮内膜炎による卵巣機能障害に対する予防およ約び対処法の提案・確立につながり，乳牛の生産性

本研究では，子宮内膜炎の疾患度合と卵巣機能向上に貢献することが期待される。

との相関関係を明確化するため，生体サンプルを用いて，子宮の炎症を組織学的に評価するとともに卵巣内卵胞のLPS濃度およびステロイドホルモ
ン濃度について同一卵胞で測定を行った。子宮の炎症度合に関わらず，卵巣内卵胞には高濃度のLPSと低濃度のLPSを含有する卵胞が存在することが明らかとなった。また，高濃度LPS卵胞では，低濃度LPS卵胞に比べエストラジオール濃度が低下していること，さらにこのホルモン産生に関わる顆粒層細胞のP450aromおよび卵胞膜細胞のCYP17の遺伝子発現が低下していることが明らかとなった。これらの研究成果をもとに，ステロ

文
献１） Hakogi, E., Tamura, H., Tanaka, S., Kohata, A.,S h i m a d a , Y . , T a b u c h i , K . ：V e t e r i n a r y
Microbiology，20，267～274，1989．
２）
 Herath, S., Williams, E.J., Lilly, S.T., Gilbert, R.O.,
Dobson, H., Bryant, C.E., Sheldon, I.M.：
Reproduction，134，683～693，2007．
３）
 Mateus, L., Lopes da Costa, L., Diniz, P., Ziecik,
A.J. ： Animal Reproduction Science ， 76 ， 143 ～
154，2003．
４）
 Magoffin, D.A. ： Int J Biochem Cell Biol ， 37 ，1344～1349，2005．
５）
 Taylor, C.C., Terranova, P.F. ： Endocrinology ，136，5527～5532，1995．
６）
 Kawai, T., Akira, S.：Immunity，34，637～650，
2011．

イドホルモン産生に最も重要な細胞である卵胞膜© The Ito Foundation

平成25年度助成研究調査一覧

本年度の対象とする研究または調査：食肉および食肉製品の食品的価値，加工技術及び家畜生産技術の向上に関する研究又は調査
単位：千円
研

究

課

継続
年度

題

代 表 研 究 者
所

津田

治敏

九州栄養福祉大
学食物栄養学部

800

島村

裕子

静 岡 県 立 大 学
食品栄養科学部

1,000

芳賀

聖一

名城大学農学部

1,000

好田

正

東京農工大学大
学院農学研究院

1,000

山之上

稔

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

味覚センサを用いた和牛の味の数値化と可視化に関す
る研究

都甲

潔

九州大学大学院
システム情報科 学 研 究 院

1,000

牛肉に関する健康指標の策定と赤身牛肉の消費者ニー
ズ調査

広岡

博之

京都大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

上曽山

博

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

食肉の給与が海馬のタンパク質リン酸化および遺伝子
発現におよぼす影響豊田淳

茨城大学農学部

1,000

畜産副産物の中性脂肪改善効果について岡本芳晴

鳥取大学農学部

1,000

血糖値と血中アミノ酸，オメガ３脂肪酸，血栓因子の関連に関する研究田中明

女子栄養大学
栄養クリニック650

冠動脈疾患患者における血中アミノ酸・脂肪酸組成と動脈硬化惹起性リポ蛋白および血栓因子の関連に関す
る研究

木庭

新治

昭和大学医学部

700

食肉類の摂取と血中アミノ酸，オメガ３脂肪酸及び血栓因子の関連に関する研究高尾哲也

昭和女子大学生 活 科 学 部

1,200

坂元

美子

神戸女子大学
健康福祉学部

1,000

牛肉の質に関連する新たな脂肪酸合成経路の探索とバイオマーカーの同定溝口康

明治大学農学部

1,000

牛肉の風味に関与する遺伝子の機能解析

米倉真一

信州大学農学部

1,000

コレシストキニンＡ受容体遺伝子を指標とした効率的な地鶏生産に関する研究

力丸

宗弘

秋田県畜産試験場

850

天然記念物「黒柏鶏」の遺伝的特徴を活用した地鶏「長州黒かしわ」のDNA識別の可能性の検討

関谷正男

山口県農林総合
技術センター800

発酵食肉製品由来の機能性ペプチドに関する研究

H.24～

食肉内部への食中毒菌の侵入に影響を与える因子の解
明と電解水処理による殺菌法の確立
食肉製品の客観的嗜好性評価に関する研究（第２報）

H.22～

生活習慣病予防効果を有する食肉素材の創出を目指した加工技術の確立
牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究（第３報）豚血液由来抗肥満素材による内臓脂肪蓄積抑制機構の解明

畜産物由来ヘム鉄摂取について食事調査における研究―発育期スポーツ選手の体組成に対する効果―

H.23～

H.24～

H.24～

© The Ito Foundation

属

機

関

助成金額

代表研究者名ブタ精子核クロマチンの構造安定性を司る鍵分子の特定とそれを指標とした新たな精子受精能評価法の確立

高坂哲也

静岡大学大学院
農 学 研 究 科

1,100

アポトーシス阻害因子の人為制御による家畜の潜在的卵子救命法の創出

眞鍋昇

東京大学大学院
農学生命科学研
究科附属牧場1,000

かごしま黒豚における授乳中発情の誘起試験野口倫子

鹿 児 島 大 学
共同獣医学部900

新規繁殖制御中枢刺激剤が黒毛和種の卵胞発育に与える効果についての研究松田二子

名古屋大学大学
院生命農学研究科

1,200

ウシ胚盤胞のマウス子宮内あるいは体外培養における休眠誘導の可能性

山田雅保

京都大学大学院
農 学 研 究 科

1,100

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発

ツェンコヴァ
ルミアナ

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,100

リソソーム酵素活性制御による高温ストレス下でのウシ胚発生改善に関する研究山中賢一

佐賀大学農学部

1,100

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発

久米

新一

京都大学大学院
農 学 研 究 科

950

乳肉および反芻家畜体内の抗酸化能を高めうる新飼料
の機能評価

小林

泰男

北海道大学大学
院農学研究院

1,000

食肉におけるカルノシン関連ジペプチド増量法確立のための基礎研究友永

省三

京都大学大学院
農 学 研 究 科

750

地鶏生産における初期栄養操作による免疫能向上に関
する研究

太田

能之

日本獣医生命科
学大学応用生命
科
学
部

1,000

胎仔期のタウリン供給強化によるブタの筋形成促進

勝俣昌也（独）農 業・食 品
産業技術総合研究機構畜産草地
研
究
所

1,000

肉質を変化させる天然物の探索内田隆史

東北大学大学院
農 学 研 究 科

1,200

完全自給粗飼料給与における放牧と未放牧が日本短角種の肉質に与える影響

小笠原英毅

北里大学獣医学部 附 属 FSC

1,000

畜肉生産性向上を目指した分岐鎖アミノ酸含強化飼料
用ダイズの開発湯淺高志

宮崎大学農学部

1,000

被災地産肉現場の風評被害対策を目的とした放牧地空間放射線量の自動測定システムの実証研究

平田統一

岩手大学農学部

1,000

腫瘍関連遺伝子発現動態解析による非典型的牛白血病の発症診断法の開発

猪熊壽

帯広畜産大学
畜 産 学 部

1,000

飼養環境下の牛群におけるマイコトキシン浸潤動態の検証―尿中ステリグマトシスチン濃度測定法の確立とその臨床応用―髙木光博

鹿 児 島 大 学
共同獣医学部

500

肺炎原因菌の特定を目的とした気管支肺胞洗浄法の牛医療への応用帆保

誠二

鹿 児 島 大 学
共同獣医学部

1,000

乳牛の病原微生物感染における卵巣機能障害の発症機
序の解明

清水

隆

帯広畜産大学
畜産衛生学研究
部
門

1,100

38件

37,000合計© The Ito Foundation食肉に関する助成研究調査成果報告書
Final Reports for Research Grants for Meat and Meat Products

平成25年度（Vol. 32）
2014年11月

発行

編集・発行 ― 公益財団法人伊藤記念財団
THE ITO FOUNDATION
東京都目黒区三田 1 丁目 6 番21号

アルト伊藤ビル〒 153-8587
Alt Ito Building, 1 -6 - 21 Mita, Meguro - ku, TOKYO
153-8587 JAPANTEL：03（5720）8611
FAX：03（5720）8612
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