学位論文内容の要旨
博士の専攻分野の名称

博士（医学）

氏名 田島一樹

学位論文題名Metformin prevents liver tumorigenesis induced by high-fat diet in C57Bl/6 Mice
（メトホルミンは高脂肪食下での肝腫瘍形成を抑制する）【背景と目的】近年、世界的な規模で肥満および糖尿病有病者数は増加の一途を辿っている。肥満や糖尿病は、心血管疾患の発生を増加させるだけでなく、種々の癌のリスクを高めることも明らかにされている。そのなかで、肝臓癌は、世界的に癌死の原因として第 3 位を占める癌であり、初期症状を呈することがなく、早期診断が困難とされており、発症予防を含めた治療の確立が求められている。近年肥満や糖尿病患者数の増加に伴い、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）・非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）有病率の急速な増加を認め、特に NASH は高率に肝硬変、肝癌に進展する病態として注目されている。しかし、肥満やNASH、肝癌との病態メカニズムを含めた直接的な関連は明らかではない。我々はこれまでに、C57BL/6J マウスに高脂肪食を長期間(60 週)負荷することで、NASH の発症及び肉眼的肝結節性病変を呈するモデルマウスを樹立し、高脂肪食誘導性の肝腫瘍形成の機序として、まず肝における脂肪蓄積が生じ、それにより惹起される炎症が重要である可能性を示した。一方、近年ビグアナイド薬であるメトホルミンは、基礎研究のみならず臨床研究においても抗腫瘍効果が示され、抗糖尿病治療薬としての役割だけでなく、抗癌薬としても期待されている。メトホルミンの抗腫瘍効果の機序として、主要な標的分子である AMP
activated protein kinase (AMPK) を介し、細胞の成長、増殖や生存を促進する mammaliantarget of rapamycin (mTOR) シグナルを抑制する機序が示唆されている。しかし、AMPK非依存的な機序なども示唆されており、一定の見解は得られていない。今回、長期高脂肪食負荷肝腫瘍モデルマウスを用いて、メトホルミンが高脂肪食下での肝腫瘍形成に及ぼす影響について検討した。
【方法と結果】
1．長期高脂肪食負荷 NASH、肝腫瘍モデルマウスにおいて、メトホルミンが、肝腫瘍形成に及ぼす影響についての検討
8 週齢の雄性 C57BL/6J マウスを普通食群、高脂肪食群、高脂肪食+メトホルミン群（以下メトホルミン群）に分け、60 週間飼育した。普通食群と比較し、高脂肪食群では高度肥満を呈し、インスリン抵抗性が認められた。一方メトホルミン群では、高脂肪食群と比較し、インスリン抵抗性の改善を認めたが、体重低下は認めず、肝内中性脂肪含量は同等であった。病理学的解析では、メトホルミン投与による肝の脂肪化の改善は認めなかったが、炎症、繊維化の抑制を認めた。肉眼的肝結節性病変は普通食群で 0%、高脂肪食群で 70%、メトホルミン群で 25%に認め、メトホルミン投与により、有意に腫瘍発症を抑制した。また、肝タンパク発現変化の解析では、メトホルミン群で AMPK リン酸化の亢進は認めたものの、mTOR、S6K リン酸化の抑制は認めなかった。
2. 高脂肪食負荷 NAFLD モデルマウスにおけるメトホルミンの追加投与が、肝腫瘍形成に及ぼす影響についての検討
8 週齢より 30 週間高脂肪食を負荷し、NAFLD を呈するた雄性 C57BL/6J マウスを、更に高脂肪食を 30 週間負荷する群(高脂肪食継続群)と、更に高脂肪食＋メトホルミンを 30 週間負荷する群(メトホルミン追加群)に分け飼育した。メトホルミン追加群は、高脂肪食継続群と比較し、体重低下は認めず、インスリン抵抗性の改善、肝内中性脂肪含量の低下は認めなかった。肉眼的肝結節性病変は高脂肪食継続群で 75%、メトホルミン追加群で 82%と、NAFLD を呈するマウスにおいて、メトホルミン投与による腫瘍発症の抑制は認めなかった。
3．短期高脂肪食負荷マウスにおいて、メトホルミンが肝脂肪蓄積、脂肪細胞機能に及ぼす影響についての検討
8 週齢の雄性 C57BL/6J マウスを普通食群、高脂肪食群、高脂肪食+メトホルミン(メトホルミン群)群に分け、8 週間飼育した。普通食群と比較し、高脂肪食群では肥満を呈し、脂インスリン抵抗性を認め、肝の脂肪化、肝内中性脂肪含量の増加を認めた。一方メトホルミン群では、高脂肪食群と比較し、体重は有意に低値で経過し、インスリン抵抗性は改善傾向、血中遊離脂肪酸は低下傾向、肝の脂肪化は認めず、肝内中性脂肪含量の低下を認めた。肝遺伝子発現変化の解析では、高脂肪食群とメトホルミン群で、脂肪酸合成や脂肪酸酸化に関連する遺伝子の発現に有意な変化は認めなかった。一方、精巣上体脂肪組織においては、普通食群と比較し、高脂肪食群では、脂肪重量・体重比の増加、脂肪細胞サイズの増加、F4/80 染色で crown-like structure を認め、遺伝子発現解析では、F4/80、CD11c、TNF 、MCP-1 の有意な発現増加を認めた。一方、メトホルミン群では、高脂肪食群と比較し、脂肪重量・体重比、脂肪細胞サイズの有意な低下、F4/80、CD11c 発現の有意な低下、
TNF 、MCP-1 発現は低下傾向を認めた。
4. 長期高脂肪食負荷 NASH、肝腫瘍モデルマウスにおいて、低用量メトホルミンが、肝腫瘍形成に及ぼす影響についての検討
8 週齢の雄性 C57BL/6J マウスを、高脂肪食群、高脂肪食＋メトホルミン 50mg/kg（メトホルミン 50mg/kg 群）群、高脂肪食＋メトホルミン（150mg/kg）（メトホルミン 150mg/kg群）群の 3 群に分け、60 週間飼育した。体重は 3 群間で有意差なく経過した。高脂肪食群と比較し、メトホルミン 50mg/kg 群ではインスリン抵抗性の改善は認めなかったが、メトホルミン 150mg/kg 群では改善傾向を示した。肝重量は、高脂肪食群と比較し、メトホルミ
ン 50mg/kg 群では有意差を認めなかったが、メトホルミン 150mg/kg 群では有意に低値であった。血清 ALT 値、肝臓内中性脂肪含量は、3 群間に有意差は認めなかったが、高脂肪食継続群と比較し、メトホルミン 150mg/kg 群で低値傾向を示した。肉眼的肝結節性病変は、高脂肪食群で、75%に認めたのに対し、メトホルミン 50mg/kg 群で 58%、メトホルミン150mg/kg 群で 25%と、メトホルミン投与により腫瘍抑制傾向を認めた。
【考察】
メトホルミンは、NASH の自然発症過程を抑制することで、高脂肪食下での肝腫瘍形成を抑制していることが示唆された。一方で、メトホルミンは、既に NAFLD を呈するマウスでは、腫瘍形成を抑制せず、またメトホルミンが早期の高脂肪食下における肝臓の脂肪蓄積を抑制する機序として、脂肪細胞の炎症性変化を抑制することが関与していることが示唆された。これらの事実から、既に脂肪細胞機能不全が進行した NAFLD の病態下では、メトホルミンの抗腫瘍効果が発揮できない可能性が考えられた。以上から、高脂肪食下での肝腫瘍形成におけるメトホルミンの抗腫瘍効果は、NAFLD 発症前の早期に、脂肪細胞の炎症性変化を抑制し、脂肪細胞機能不全の進展を遅らせることで、肝臓における脂肪蓄積の抑制、その後の NASH への進展および肝腫瘍発症を抑制する可能性が考えられた。
【結語】
メトホルミンは、高脂肪食下での肝腫瘍形成を抑制した。本研究におけるメトホルミンの抗腫瘍効果の機序として、NAFLD 発症前の早期に、脂肪細胞の炎症性変化を抑制し、脂肪細胞機能不全の進展を遅らせることで、肝臓における脂肪蓄積の抑制、その後の NASHへの進展および肝腫瘍発症を抑制する可能性が示唆された。