ISSN 1347-7048

つくば生物ジャーナル
生物学類

Tsukuba Journal of Biology
Vol.23 No.1 January 2024
www.biol.tsukuba.ac.jp/tjb

つくば生物ジャーナル
Tsukuba Journal of Biology
Vol.23 No.1 January 2024
www.biol.tsukuba.ac.jp/tjb

令和 5 年度

生物学類卒業研究発表会要旨集
令和 6 年 2 月 19 日

筑波大学
生物学類

第一会場（2B411）
9:40-

小西 陽巳
チョウ媒植物の花の向きが受粉効率に及ぼす影響 〜折り紙花による室内実験

2

9:55-

大西 礼
花は特殊化の産物か？：送粉シンドロームを多様な訪花動物への適応として捉えなおす

3

10:10-

竹内 希海
せっかち派 vs. 慎重派：マルハナバチの採餌戦術は学習能力の個体差で説明できるか？

4

10:25-

野口 隼人
チョウ目幼虫が摂取した農業用殺菌剤ベノミルは寄生バチの寄生を失敗させる：では寄生バエは？

5

10:40-

時村 飛鳥
屋外圃場において殺菌剤ベノミルがモンシロチョウに寄生するアオムシコマユバチに与える影響

6

休憩（15 分）

11:10-

田中 優希奈
異なる植物群集における植物－送粉者ネットワークの時間的変化の比較

7

11:25-

大木 雅
モモ農園の害虫ハダニ類に対するトリコデルマ属菌の殺ダニ効果

8

11:40-

新藤 啓太
社会性ハダニにおける公共トイレの究極要因を探る

9

11:55-

田原 真夢
社会性ハダニはなぜ天敵の卵を転がすのか？

10

12:10-

谷野 彩奈
ハーレムをつくるハダニの雄は兄弟を殺さない？

11

昼食（50 分）

13:15-

藤原 快稜
日本産ハエ目昆虫に寄生する Stigmatomyces 属

12

13:30-

飯田 和生
タカハシショウジョウバエの分布北上：在来近縁種キハダショウジョウバエとの混棲状況

13

13:45-

鍋倉 快晴
ノハラカオジロショウジョウバエ交尾器形態の地理的変

14

14:00-

佐久間 陽平ミミズたちはどう生きるか15

14:15-

稲垣 実香
立つ鳥の跡を用いたリザバーコンピューティング

16

休憩（15 分）

14:45-

中山 友萌香
寄生蜂 Asobara japonica の感染に対する宿主ショウジョウバエ 10 種の応答性の比較

17

15:00-

皿海 琉
トネリコ類立枯病菌の胞子発芽を抑制する Aureobasidium pullulans のセイヨウトネリコ生葉上での挙動

18

15:15-

氷見 和裕
北茨城のスズタケに寄生する Puccinia 属サビキンの多様性調査

19

15:30-

浮田 桃子
東南アジア・オーストラレーシアに分布するブドウ葉さび病菌の分類学的検討

20

15:45-

黒﨑 裕貴
日本産シジミタケ属の系統的および形態的多様性について

21

16:00-

寺嶋 悠人
歴史の古い草原は根茎根系量が多いか？―新しい草原、森林との比較

22

第二会場（2B412）
9:40-

高井 大樹
アサガオの開花時刻制御遺伝子の探索と機能解析

23

9:55-

平井 唯子
トマトを用いた細菌性食中毒に対する食べる３価ワクチンの開発

24

10:10-

安納 萌香
ベタレイン生合成経路遺伝子の導入による黄花アサガオの改良

25

10:25-

新田 佳奈美アイスプラント由来 RNA binding protein による環境ストレス耐性ジャガイモの開発

26

10:40-

大森 圭悟
耐塩性遺伝子マングリンを導入したジャガイモのストレス耐性と生産量についての評価

27

休憩（15 分）

11:10-

高橋 陽菜
近縁野生種を用いた乾燥耐性を持つ育種系統の樹立

28

11:25-

深谷 夢夏
窒素固定に応答してシュートで発現する miRNA の同定と機能解析

29

11:40-

落合 美智
硝酸に応答した根粒形成の抑制制御に関わる硝酸トランスポーター遺伝子の解析

30

11:55-岡 佳穂
植物一過的タンパク質発現システムを用いた診断薬の生産可能性について

31

12:10-

五十嵐 咲季In planta ゲノム編集法による青臭みを抑えたダイズの作出

32

昼食（50 分）

13:15-

小寺 柚衣花古茅由来のバイオ炭「茅炭」の炭素貯留及び土壌改良への応用に向けた性質評価

33

13:30-

植田 時
中立論 vs ニッチ理論〜ササ優占型ブナ成熟林におけるギャップサイズが林床植生に及ぼす影響〜

34

13:45-

加藤 智也
伊豆諸島の森林におけるセルロース分解性真菌類の多様性と地理的分布35

14:00-

篠沢 俊介
葉レベルの炭素収支からみる植物病原菌 Rhytisma filamentosum がイヌコリヤナギ個体に与える影響

36

14:15-

舩橋 美月
筑波大学構内における鳥類相の解明：1970 年代から 2023 年の比較から

37

休憩（15 分）

14:45-須賀 文香
魚の粘液が誘発するプルテウス幼生のクローニングの再現

38

15:00-

佐藤 紘歌
分子動力学計算で解明する TGF-β受容体の多量体形成メカニズム39

15:15-

森 凛太郎
二酸化炭素によるニホンウナギ精子の運動停止反応40

15:30-

朝賀 伸一
サンゴの共生・白化に関連する褐虫藻の運動調節の研究

41

15:45-

福澤 航生
伊豆半島沖の砂泥底におけるメイオベントス群集：水深が異なる５地点の比較

42

第三会場（2C404）
9:40-

佐渡友 光一ミトコンドリア病モデルマウスを用いた生体内におけるオートファジーの重要性の検証

43

9:55-

齊藤 さくらがんの悪性化に寄与しうる新規ミトコンドリア DNA 突然変異の探索

44

10:10-

日比 保乃郁マウス培養細胞を用いた病原性突然変異型ミトコンドリア DNA の濃縮の試み

45

10:25-

佐々木 悠馬
マウス卵母細胞から変異型ミトコンドリア DNA が消失する機構の検証

46

10:40-

青木 祐人
腸内細菌由来機能未知酵素に関する研究47

休憩（15 分）

11:10-

神谷 沙羅
発達期大脳皮質における IL-17 受容体の発現と ASD モデルにおけるその変化

48

11:25-

赤羽 勇唱
炎症老化に応答した内在性レトロウイルスの発現動態の解析

49

11:40-

沼尻 紘征高タンパク質食摂取が筋損傷からの再生に及ぼす影響50

11:55-

古川 愛海
機械学習によるメダカの遺伝子発現量の予測

51

12:10-

矢内 果穂
Sleepy / Dreamless ダブルヘテロ変異マウスの睡眠覚醒と脳波52

昼食（50 分）

13:15-

森橋 美月
哺乳動物の受精後刷り込みメチル化は種や遺伝子座をこえて保存されているか

53

13:30-

山下 直輝
老化因子が血管周囲のミクログリアに与える影響

54

13:45-

宇野 めぐみ脳室周辺のグリア細胞による脳実質の恒常性制御

55

14:00-

上田 健太郎非定型カドヘリン Fat3 はプリン代謝と連携してミクログリアを制御する

56

14:15-

林 良祐
キイロショウジョウバエのメス生殖幹細胞に対する腸内細菌の影響

57

休憩（15 分）

14:45-

神村 和音
ゴマ由来生理活性物質の微生物代謝に関する研究

58

15:00-

山本 一茶
腸内細菌による植物由来生理活性物質の分解に関する研究

59

15:15-

坂井 康平
抗真菌化合物の生合成に関する研究60

15:30-

小島 優音
二枚貝における２枚目の貝殻獲得をもたらした分子機構の解明

61

15:45-

原田 理帆
ヌタウナギから探る大脳皮質の進化的起源

62

第四会場（2C410）
9:40-

武 彩海
“新生”西之島から最初に発見された藻類：その同定と侵入種としての特性

63

9:55-

栁澤 花帆
霞ヶ浦の原生生物相：形態観察と環境 DNA 解析からのアプローチ64

10:10-

大沼 万優子筑波大学構内の淡水環境におけるウアブ系統群細菌の探索

65

10:25-

吉田 伊吹
DNA メタバーコーディングによる底生ワムシの食性解析

66

10:40-

豊島 克己
クロララクニオン藻の凍結保存法の開発

67

休憩（15 分）

11:10-

藤代 彩花
光合成関連遺伝子から探る緑色渦鞭毛藻 TGD 株の共生藻痕跡核ゲノムの特徴

68

11:25-

児玉 悠佑
北極海で採集された円石藻 Emiliania huxleyi NIES-3366 株のゲノム情報の高精度化

69

11:40-

白吉 瑞綺
シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 の Mg2+輸送体ホモログの機能解析

70

11:55-

竹森 友哉
大腸菌の様々な DNA 損傷修復系の欠損変異株に対する変異原の影響

71

12:10-

山木 佳奈子繊毛虫テトラヒメナの細胞質分裂変異株に関する研究

72

昼食（50 分）

13:15-

山口 幸大
高濃度鉄存在下における単細胞性紅藻 Galdieria sulphuraria の細胞表層の構造変化

73

13:30-

Belitz Alisa Marie
Role of chlororespiration in the high CO2 tolerance of unicellular red alga Galdieria sulphuraria

74

13:45-

窪田 燿
海洋細菌は揮発性有機化合物の生産者となりうるか75

14:00-

助川 太一
海洋細菌 Paracoccus sp.由来の溶存態有機物の定性評価

76

14:15-

上安 欣語
染色体置換系統を用いた貧栄養下におけるイネ祖先種の生育と元素蓄積の解析

77

休憩（15 分）

14:45-

吉田 文哉
イネの根の細胞壁におけるストロンチウム応答機構に関する研究

78

15:00-

藤井 智代
細胞壁改変イネを用いた塩ストレス応答の解析

79

15:15-

佐野 舞桜
塩ストレス条件のトマト成熟過程におけるペクチン分解に伴うアスコルビン酸合成機構に関する研究80

令和 5 年度卒業研究発表会準備委員会
生物学類
氷見

和裕

上西

慧莉紗

及川

知穂

加藤

緑

滝

大斗

成田

紗由美

寳﨑

文音

古橋

夢摘

松浦

由直

松永

啓汰

安田

千七

山野

虎太郎

吉本

賢一郎

平井

唯子

表紙画

表紙画の解説：テーマ：「混」
水の中に数色の絵の具を落とすとそれぞれの色はやがて混ざり合い一様になります。一見するとそれは一色の色水ですが、複数の絵の具から構成されている
事実は変わりません。様々な分野の研究から形成される科学も似ているなぁと
最近感じます。

表紙画作成にあたりご尽力いただきました吉本賢一郎くんをはじめ、卒業研究発表会準備委員の皆様にこの場を借りて厚く御礼申し上げます。

つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024)

23, 1Ⓒ2024 筑波大学生物学類

令和 5 年度卒業研究発表会要旨の巻頭にあたって氷見

和裕（筑波大学 生物学類 4 年）

僕は、昨年度の卒業研究発表準備委員会で、総括を務めました。
すると、いつの間にか今年度の卒業研究発表準備委員会の代表になっていました。なんと、3 年生の時に代表を務めると自動的に4 年生で代表になる、という仕組みだそうです。それを知ったときは、本当にびっくりしました。きっと去年も言われたのだと思いますが、まったく記憶に残っていませんでした。でも代表として、僕が巻頭言を書きます。ちなみに、つくば生物ジャーナル１
月号の巻頭に書く、卒業研究ではない文章を、準備委員会では「巻頭言」と呼んでいます。
僕が筑波大学に入学した 2020 年度は、ちょうどコロナ禍が開始した直後でした。当時の世の中は、新型コロナウイルスの出現により大パニックになっていました。その影響で、残念なことに僕の高校と塾の卒業祝賀会が消滅してしまいました。
入学後の筑波大学では、多くの授業がオンライン化し、例えば生物学類の基
礎生物学実験の名物「ザ・タンポポ」が、送られてきたデータを使ってグラフを描くだけの授業になりました。
僕たちはオンライ
ン授業に備えてノートパソコンを購入し、Zoom や Microsoft
Teams の使い方を学びました。なおこのとき僕は、せっかくだからとゲーミングPC を購入し、PC ゲームに本格参入しました。
それはともかくとして、筑波大学の学園祭である雙峰祭が消滅してしまったそぽ！悲しいそぽ…（そぽたんの声）。
2 年次（2021 年度）になっても、コロナは終わりませんでした。せっかく生物学類の専門科目・実験・実習を選択できるようになったのに、コロナ禍のせいで、実習内容が縮小してしまいま
した。例えば植物分類学臨海実習では、本来下田臨海実験センターに宿泊するはずなのに、その年は筑波大学日帰り×5 日間に変わってしまったのです。でも 3 年次（2022 年度）になると、ようやく対面授業が増えてきました。
この年に履修した菌類分類学
野外実習では、
例年通り菅平高原実験センターに宿泊できました。
そして 4 年次（2023 年度）になると、ついに雙峰祭も完全復活
して、活気を取り戻したそぽ！雙峰祭の日には、筑波大学の屋内も野外も、人々であふれかえっていたそぽ。僕は、お客様にそぽたん体験（塗り絵、プラバン、クイズ）を提供する企画団体「そぽっちゃ」の一員になりました。本来なら、1 年生の時からこうして雙峰祭に参加できたはずなのに、コロナ禍のせいでなかなか参加できなかったと思うと悲しいです。
このように、僕たちの世代はこの 4 年間のほとんどの期間、
コロナ禍と戦い続けてきました。しかし！その戦いの末、何とか卒業研究にまでたどり着くことができました。発表会では、専門分野が多岐にわたるため、中にはまったく理解できない研究もあるかもしれません。それでも、せめて自分が興味のある研究だけでも、見て、聞いて、そしてどしどし質問してください。質問を受けることは、僕たち 4 年生にとって、とても勉強になります。
また、今年度の卒業研究発表会が終わった後は、ついに慰労会が解禁します。慰労会とは、卒業していく 4 年生達をねぎらいな
がら、ごちそうを食べる会です。コロナ禍で一時期消滅していましたが、今年度、ようやく帰ってきました。卒業研究発表会が終わったら、ぜひ慰労会で歓談しましょう。
Communicated by Kazuharu Ohashi, Received December 26, 2023.

いらすとや よりそぽたん
雙峰祭は大学生活の大事な 1 ページそぽ。そぽも生物学類の魂であるキャンベル生物学を読んでみるそぽ。

1

つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 2Ⓒ2024 筑波大学生物学類

チョウ媒植物の花の向きが受粉効率に及ぼす影響 〜折り紙花による室内実験小西 陽巳（筑波大学 生物学類）

指導教員：大橋【背景と目的】
被子植物の花が咲く向きは、同じ分類群内でもしばしば高い多様性を示す。このことから、花の向きには、それぞれの種が暮らす環境において何らかの適応的意義があるのではないか、と推察されてきた。しかし上向きの花、下向きの花には、それぞれ長所と短所がある。例えば下向きの花は、花粉や花蜜を紫外線や雨などの影響から護ることができる反面、ポリネーター（花粉媒介動物）には気づかれにくかったり、止まりにくく嫌われたりするだろう。実際多くの先行研究は、下向きの花が、これらの短所を補うような形質をあわせもつことを示唆している。しかし、下向きの花が抱える問題は、他にもあるかもしれない。例えば、訪れた
ポリネーターが止まる位置や姿勢を変えた場合、葯や柱頭に触れる機会が減ってしまう可能性もある。下向きの花がもつ形質の中には、こうした受粉効率の低下を防ぐ効果をつうじて進化したものもあるかもしれない。
本研究では、花の向きの多様性が高い分類群の１つ、ユリ科において、上〜横向きの花にはラッパ型の花冠をもつものが多いのに対し、下向きの花にはラッパ型が少ない点に注目した。これは、下向きとラッパ型の花冠という組合せが、ポリネーターによる受粉に何らかの不都合を生じるためかもしれない。そこで、大型の花をもつユリ科植物の主要なポリネーターであるアゲハチョウ類（以下、アゲハ）と折り紙花を用いた室内実験系を確立し、上記の可能性を検証した。

一晴（筑波大学 生命環境系）

試行が１回終了する度に、テスト個体が止まった人工花の柱頭の両面テープをすべて回収し、付着した鱗粉の数（アゲハが柱頭に触れた頻度の指標）を、実体顕微鏡下で計数した。以上のデータをもとに、上向きの花と下向きの花で、(1) 訪花頻度、(2) アゲハ
が吸蜜時に止まった花冠上の位置、(3) 柱頭（両面テープ）に付着したアゲハの鱗粉数に違いがみられるかどうかを、一般化線形混合モデル（GLMM）を用いて検討した。
【結果】
まず、下向きの花は、上向きよりもアゲハ 1 個体あたりの訪花頻度が有意に低かった（上向き: モデル調整済み平均 ± SE = 4.88
± 0.65, 下向き: 1.81 ± 0.36, P < 0.001,Type II Wald-chisquaretest）。次に、アゲハの花冠への着地は、上向きの花では内側に多
く下向きの花では外側に多い、という有意な差が見られた（図 1a）。
最後に、１回の訪花で柱頭に付着する鱗粉の数は、下向きの花の方が上向きより少ない、という有意な差が見られた（図 1b）。
【考察】
従来言われてきたのと同様、下向きの花は、上向きにくらべて訪花が少なかった。さらに、訪れたアゲハは、花冠の開口部から内側に潜るより、外側に止まったまま花冠の隙間から長い口吻を伸ばして吸蜜するケースが多かった。1 回の訪花で柱頭に付着する鱗粉数が下向きの花で有意に少なかったことから、これは、柱頭に触れずに蜜だけ取る「蜜泥棒」的な行動と言える。つまり、上向きの花は花冠がアゲハの飛来する上空に開いており、容易に内側に止まれるのに対し、下向きの花は花冠の開口部が地面を向いており、ぶら下がりが苦手なアゲハには利用しづらい。しかし、ラッパ型の花冠には隙間があるため、外側（上部）に止まったま
ま蜜だけ飲むことができてしまうのである。このように本研究は、ユリ科の花に下向きでラッパ型の花冠をもつ種が少ないのは、チ
ョウ類の蜜泥棒によって受粉効率が低下してしまうためである可能性を初めて示した。下向きの花に多い、隙間のない筒型の花冠、あるいは花弁が著しく反り返った花冠は、紫外線や雨から花粉を護りつつ、長い口吻をもつチョウ類による蜜泥棒をも防ぐことのできる、適応的な形質の組合せなのかもしれない。今後は、これらの形質の組合せが、蜜泥棒の頻度や花粉の受け渡しに及ぼす影響を、今回確立した室内実験系を用いて調べていく予定である。

【材料と方法】
人工花は、以下の方法で作成した。まず、アゲハが好む橙色の折り紙（15 cm 四方）で「花冠」を折った。次に「蜜腺」として、
1.5 mL マイクロチューブに紙粘土を詰め、その上に蜜（10 %シ
ョ糖水溶液＋少量のユリ精油）を含ませた脱脂綿を入れた。さらに、ソフトワイヤー（花糸）と先端部の両面テープ（柱頭）からなる「雌しべ」を、チューブ底の紙粘土に挿して固定した。最後に 20 個の人工花（上向きと下向きが 10 個ずつ）を、8 本の「株」（木製の支柱，高さ約 30 cm）の上端に、2 個または 4 個ずつ針
金とテープで固定した。これらの株を、2 m 四方のケージ内にほぼ 40 cm 間隔で無作為に並べた。実験には、野外で採取したアゲ
ハ類の卵または幼虫を飼育、羽化させた採餌未経験の成虫を用いた（ナミアゲハ 15［雄 9，雌 6］個体，クロアゲハ雌 1 個体）。
羽化後、数日間は直接脱脂綿で蜜を与えた。

(a)

(b)
図 1 (a) アゲハの正当訪花

トレーニング 20 個の株を並べたケージ内にアゲハ 1〜数個体を放し、自由に飛翔させた。1 時間内に 2 回以上、人工花へ訪れて吸蜜した個体を、トレーニング完了個体としてテストに用いた。

率（吸蜜訪花のうち花冠の内側に止まった割合）と、(b)1 回の訪花で付着した鱗粉

テスト トレーニング完了から 1 日後のアゲハを 1 個体ずつケージに放した。１回の試行につき、テスト個体が止まった花（# 1〜20）、止まった位置（花冠の内側／外側）、吸蜜行動 (口吻伸展)の有無を記録した。10 回の訪花が観察されるか、あるいはケージ内に個体を入れてから 3 時間が経過した時点で、試行を終了した。

2の数（柱頭に身体が触れた回数，
つまり受粉機会の指標）。
点と誤差棒は GLMM に基づくモデル調整済み平均の推定値とその 95%信頼区間。

つくば生物ジャーナル Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 3Ⓒ2024 筑波大学生物学類

花は特殊化の産物か？：送粉シンドロームを多様な訪花動物への適応として捉えなおす
大西 礼（筑波大学 生物学類）

指導教員：大橋 一晴（筑波大学 生命環境系）【背景】
動物に花粉を運んでもらう多くの植物は、主要な訪花動物に対する適応的な花の形質セット＝送粉シンドロームをもつと考えられてきた。このアイデアは、多様な訪花動物に対する同時適応はトレードオフによって妨げられるため、異なる形の花は、それぞれ別の訪花動物の形態や行動に対する「特殊化」の結果生じた、との仮定に基づいている。しかしながら、現実の植物は多様な動物によって送受粉されている。この矛盾を解決するには、送粉シ
ンドロームを、特定の訪花者に対する特殊化ではなく、特定の訪花者の組合せつまり「訪花者相」への同時適応として捉え直す必要があるのかもしれない（Ohashi et al. 2021, Biol. Rev.）。
そこで本研究では、これまでの特殊化の枠組みではうまく説明できなかった送粉シンドロームを、複数タイプの動物からなる訪
花者相と花の形質セットの対応関係として再定義することを目的としたデータ解析をおこなった。植物群集内の花を訪れる動物を網羅的に調べた先行研究のデータセットに、ネットワーク解析、
機械学習、多変量解析という３つの手法を統合的に適用し、花と動物の対応関係に隠された進化的な結びつきを定量的に探った。

よる訪花者相の分類では、３つの群（ハナバチ−チョウ、甲虫−ガ、各種ハエ類）が識別された。
最も多く訪れた動物を予測する Random Forest モデルの精度はさほど低くないものの、実質上ハナバチとそれ以外の動物を分けることしかできず、統計的には有意でなかった（平均正答率＝53.9%, P = 0.34, モンテカルロ無作為化検定）。一方、訪花者相を予測するモデルの精度は有意に高かった（60.4%, P = 0.024）。
NMDS では、3 つの訪花者相ごとに、花の形質セットに違いがみられた（図 1）。これらの違いを pairwise-PERMANOVA によって検定したところ、いずれの群間の違いについても、有意水準
5%で帰無仮説が棄却された。まず、ハナバチ−チョウ媒花には、大まかに 2 つのタイプが認められた：1 つは大きく筒状で左右対称性をもち、葯が花冠に隠れ、蜜標をもつタイプ、もう 1 つは小さく浅い、葯が突出した花が密集するタイプである。一方、各種
ハエ類媒花も小さく浅い、葯が突出した花を密集させる傾向があり、白い花をもつ種がやや多めに存在する点以外は、ハナバチ−チ
ョウ媒花の２つ目のタイプとあまり変わらなかった。また、甲虫・ガ媒花は最もせまい範囲に分布し、白色、皿型の小さな放射対称
花を密集させる傾向が強かった。
以上は日本のデータについての結果である。モーリシャスの予備解析でも同様の結果が得られており、詳細は発表会で報告する。

【方法】
解析には、 日本（京都府芦生）とモーリシャス（Black River
峡谷自然公園）の植物群集で、それぞれ 93 種、74 種の花を訪れた動物の種類と訪花数を記録した先行研究のデータを用いた。また、各植物種の花の形質情報（筒状度、対称性、大きさ、向き、密集度、葯の突出度、色、蜜標の有無の８つ）を、文献の記述や写真から抽出した。
はじめに、各群集内の植物種を、最も多く訪れた訪花者のタイプでいくつかの群に分けた。次に、二部ネットワーク解析で用いられるモジュール化の手法により、植物種を、結びつきの強い訪花者相に基づいていくつかの群に分けた。
「送粉シンドロームは特定の訪花者相への適応」という考えが正しければ、各種の花の形
質は、最も多く訪れた訪花者よりも、最も結びつきの強い訪花者相との対応関係が強いはずである。そこで次に、機械学習アルゴ
リズム Random Forest を用いたモデル構築をおこなった。そして、８つの花の形質情報を予測子としたとき、各植物種について
２種の応答変数 (1) 最も多く訪れた動物、あるいは (2) 強く結びついた訪花者相のどちらをより正確に予測できるかを、予測精度とその検定によって確かめた。
最後に、結びつきの強い訪花者相ごとにどのような花の形質
セット（シンドローム）が共有されているかを明らかにするため、
非計量多次元尺度法（NMDS）および環境傾度分析を用いて、花の形質セットの類似度に基づく 2 次元プロットを描き、プロット
上の位置ごとの花の形質分布について調べた。

【考察】
主要な訪花者より訪花者「相」の方が、花の形質セットから正しく予測できるという Random Forest の結果は「送粉シンドロームは特定の訪花者への特殊化ではなく、特定の訪花者相への同時適応の産物ではないか」との予測を支持する。また NMDS の結果から、それぞれの訪花者相に対応するシンドロームの存在も示された。これらの形質の組み合わせは、長い口吻をもつハナバ
チやチョウが訪れる花で筒状形が多い、甲虫やガが訪れる花は白色が多いなど、いずれも自然に納得できるものが多い。一方で、モデルの予測力は 60%強にとどまり、一部のハナバチ−チョウ媒
花はハエ媒花と区別がつかないなど、シンドローム間における形質の重複も認められた。今後は、花香の強さなどの形質を加える
ことで重複を減らすと共に、複数の訪花者への同時適応で潜在的な問題となるはずのトレードオフが、これらの「多媒シンドロー
ム」でどのように回避されているのか、さらに調べてゆく必要がある。
図1 花の形質と訪花者相の関係。各点は植物種を示す（白：ハナバチ−チョウ相、灰色：甲虫−ガ相、黒：各種ハエ類相）。形質が似た植物種ほど点が近い。
円は各相に含まれる種のおおまかな形質セットの分布を示す。
矢印は花の各形質の傾向を示しており、矢印の先端へ向かうほど、その傾向が強い。

【結果】最も多く訪れた動物には、6 つの群（ハナバチ、ハエ、甲虫、カ
リバチ、アリ、カメムシ）が認められた。また、モジュール化に3

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 4Ⓒ2024 筑波大学生物学類

せっかち派 vs. 慎重派：マルハナバチの採餌戦術は学習能力の個体差で説明できるか？
竹内 希海（筑波大学 生物学類）

指導教員：大橋【背景と目的】
ヒトを含む多くの動物の意思決定では、速度と精度との間にしばしば負の相関関係が認められる。この「速度と精度のトレードオ
フ」は、訪花昆虫でも観察される。例えばマルハナバチでは、報酬花と無報酬花の色を学習した後の採餌において、採餌速度と報酬花を正しく選ぶ精度との間に、個体レベルで負の相関がみられる（Chittka et al. 2003, Nature）。つまり個体は速度と精度の両方を同時に高めるよりも、精度を犠牲にして速度を高める「せっかち派」から、速度を犠牲にして精度を高める「慎重派」まで、様々な戦術にわかれる。この関係は、たしかに速度と精度のトレードオフの存在を示唆する。しかし一方で、同一の採餌環境で、こうした採餌戦術のばらつきが生じる理由はよくわからない。
この疑問に対し本研究では、学習能力の個体差が採餌戦術のばらつきを生み出す、という仮説を立てた。例えば、学習能力の高い個体は、学習時間が短くても十分に正答率を高め「慎重派」になりやすい一方、学習能力が低い個体は。短い学習時間では正答率を十分に高めることができず、やむなく速度を上げて埋め合わせる「せっかち派」になりやすいのではないか。この考えが正しけ
れば、学習に十分な時間さえ与えれば、どの個体もゆっくり正確に報酬花を選ぶ「慎重派」になり、戦術の個体差は小さくなるはずである。この予測を検証するため、報酬花と無報酬花の色の識
別しやすさ（＝学習に要する時間）が異なる課題をクロマルハナ
バチに与え、色が識別しやすいときほど個体の採餌戦術が慎重派に収束するかどうかを確かめる室内実験をおこなった。

一晴（筑波大学 生命環境系）

らの動画から、トレーニングで学習にかかった時間（訪花回数）と、テストで最初に訪れた 3️1 回の訪花中における正答率、および意思決定にかかる反応時間（花間移動時間の中央値）を求めた。

【材料と方法】
実験は、クロマルハナバチのワーカー個体を用いて、室内に建てたケージ（幅 200×奥行き 350×高さ 200 cm）内でおこなった。
１回の試行は、トレーニングとテストの 2 段階で構成される。トレーニングでは、任意に選んだ１個体のハチに報酬の有無と色を連結学習させ、同時に各個体の学習能力（学習にかかる時間）も測定した。まず、色の見分けにくさのレベルが異なる 3 種類の色
ペア（類似度：高・中・低）から任意に１つを選び、一方の色には
報酬＝蜜（10 µL の 30%スクロース溶液）を、他方の色には水を添加した。そして、報酬花と無報酬花を 18 個ずつ、6×6 の格子状にランダムな位置関係で並べ、1 個体ずつ採餌経験を積ませた。
採餌中は観察者もケージ内に留まり、ハチが各報酬花から吸蜜して去る度に分注ピペットで蜜を再補充した。そして、個体が 100%の正答率で報酬花を訪れる採餌飛行が 2 回連続するか、75 %以上の正答率で報酬花を訪れる採餌飛行が 5 回連続したら「学習成立」
としてトレーニングを終了した。また、学習が成立しないまま累積採餌飛行が 12 回に達した場合にも、同様に終了した。
続いて、トレーニングが済んだ個体について、上記と同じ 36 個の花を用い、意思決定の速度と精度を測るテストをおこなった。
ただし、記憶の強化または減退を防ぐため、どの花にも報酬や水は添加せず、採餌飛行は 1 個体につき 1 回のみおこなった。各試
行中のハチによる訪花は、すべてビデオカメラで記録した。これ

4【結果と考察】
まず、報酬花と無報酬花の色が容易に識別できる条件（低・中類似度）では、すべての個体で学習が成立した。また高類似度でも、12 個体中 8 個体で学習が成立した。ただしどの条件でも、学習にかかる時間には著しい個体差がみられた。
次に、高類似度におけるテストでは、先行研究と同様、正答率
よりも反応速度を優先する個体（せっかち派）から反応速度より正答率を優先する個体（慎重派）まで、戦術の個体差がみられた（図 1）。対照的に、低・中類似度におけるテストでは、予測通りすべての個体が正答率 90%以上に達し、戦術の個体差は消失した。これは、課題の難易度に対して十分な学習時間さえ与えられれば、いずれの個体も「慎重派」に収束することを意味する。
先行研究でみられた戦術の個体差は、学習が不十分な個体が「せっかち派」という代替戦術を採用するために現れる、一時的な現象なのかもしれない。ただしこれは、どんな個体も学習すれば、
慎重で時間をかける採餌をおこなうようになる、という単純な話ではない。なぜなら、正答率がほぼ 100%の個体の間にも、反応時間に著しいばらつきがみられたからである（図１）。
本研究は、速度と精度のトレードオフの証拠として示されてきた動物の採餌戦術の個体差が、部分的には、学習の成立度の違いで説明できる可能性を初めて示した。また十分な学習が成立した個体の間にも「精度とのトレードオフでは説明できない」反応速度のばらつきが残る、という興味深い現象を発見した。今後は、反応速度＝情報と記憶を照合する能力の個体差が、学習時間＝情報をすばやく記憶する能力の個体差とどのような関係にあるのかを探ってゆく予定である。

図1. テストにおける各個体の反応時間（中央値）と正答率。各点が個体のデータをあらわす。点の塗りつぶしの濃さは、用いた報酬花と無報酬
花の色の類似度をあらわす（黒は高、グレーは中、白は低）。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 5Ⓒ2024 筑波大学生物学類

チョウ目幼虫が摂取した農業用殺菌剤ベノミルは寄生バチの寄生を失敗させる：では寄生バエは？
野口 隼人（筑波大学 生物学類）

指導教員：藏滿司夢（筑波大学 生命環境系）

導入
バエの卵は寄主の餌植物上に産卵され、寄主の採餌に伴い経口摂近年、世界的な昆虫類の個体数の急激な減少が関心を集めており、 取される。その後すぐに孵化し、幼虫期間を約 16 日、蛹期間を約
化学合成農薬をはじめとする化学薬品の環境中への導入が原因の15 日経て羽化する[7]。本研究では寄主としてアワヨトウ
一つとして指摘されている。化学殺虫剤はもちろんのこと、本来（Mythimna separata）（チョウ目：ヤガ科）の 6 齢幼虫を使用
昆虫を標的としていない除草剤や殺菌剤が昆虫に影響を与えるとし、ブランコヤドリバエは寄主 1 頭あたり 2 個、カイコノクロウ
いう事例も複数報告されており、様々な生態系サービスを提供す
ジバエは寄主 1 頭あたり 6 個の卵を寄生させた[8]。
る有益な種を含む非標的昆虫を化学農薬が減少させているという
寄生後の寄主はベノミルを 0.025％添加した人工飼料、または懸念が高まっている[1], [2]。
同量の蒸留水を添加した人工飼料（コントロール）を与えて個別
捕食寄生性昆虫は害虫種の個体数を抑制させる有益な昆虫の一つ飼育した。その後、寄生成功率、寄主の生存率、寄主やヤドリバである。一部の国と地域では既に害虫管理に生物的防除剤として
エの奇形率を比較した。
導入されており、人工的に導入・繁殖させた個体群を利用するだ
けでなく、持続可能な手法として農業土着天敵を活用する保全的結果・考察
生物防除も実施されている。一方で、そのような農地においてもブランコヤドリバエではベノミルによる有意な悪影響を確認でき
農薬が併用され続けており、農薬の使用に伴う生物的防除の効率ず、ベノミル処理群での寄生成功率（87.x%）がコントロール群のの低下や生態系への影響が懸念されている[1], [2]。
それ（60.x%）と比べて高くなる傾向が見られた。一方で、カイコ
捕食寄生性昆虫の中で最多の種数を誇る分類群はハチ目である。 ノクロウジバエではコントロール群において寄主の約 26.x%で寄先行研究によって、捕食寄生性の寄生蜂アオムシコマユバチ
生が成功したが、ベノミル処理群では寄生がすべて失敗するとい（Cotesia glomerata）（ハチ目：コマユバチ科）が寄生している
う結果になった。後者は、ハチ目捕食寄生昆虫での先行研究に続モンシロチョウ（Pieris rapae）（チョウ目：シロチョウ科）の幼き、ハエ目捕食寄生者においてもベノミルの存在下で寄生が失敗虫にベンゾイミダゾール系殺菌剤ベノミルを経口摂取させることする事例があることを示す初めての発見である。2 種のヤドリバで寄生が失敗する、という現象が報告されている[3], [4]。ベノミ
エで異なる結果が得られた理由は不明確なものの、寄生期間や寄ルとその代謝物カルベンダジムは広域殺菌剤であり、無脊椎動物
生組織など両者の寄生様式の差異に由来する可能性が考えられる。
や哺乳類に対する悪影響が懸念されてるため欧米諸国では使用がブランコヤドリバエでベノミル存在時に寄生成功率が増加した理禁止されているが、今でも日本を含む多くの国で様々な作物の植由については、ベノミルが寄主の免疫機能に影響を与えた可能性
物真菌病を防除するために広く使用されている[5]。この研究では、 などが考えられるが、今後の更なる検証が必要である。
カルベンダジムが細胞の微小管形成を抑制することで寄生蜂の胚発生を阻害した可能性や、宿主体内で寄生蜂の卵や胚が宿主の免疫を回避するための化学的機構をベノミルが阻害した可能性が指参考文献
摘されている。また、同様の現象は他のいくつかの寄生蜂類でも1. Sánchez-Bayoa & Wyckhuysb (2019). Biol. Conserv. 232, 8-27
検出されている。
2 David et al. (2021). PNAS. 118 (2) e2023989118
殺菌剤は昆虫に対する毒性の評価例が少なく、特に寄主体内にい3. Arakawa (2020). Jpn. J. Appl. Entomol. Zool. 64, 5-12る捕食寄生者に対する影響はほとんど評価されていない。有用天
4. Arakawa (2021). Jpn. J. Appl. Entomol. Zool. 64, 13-18
敵としての捕食寄生者の役割とベノミルの汎用性の高さを鑑みる
5. Pearson, & Miller (2014). Encyclopedia of Toxicology,と、捕食寄生性昆虫に対するベノミルの影響評価は、生態系の保third ed. pp. 411–412.
全と農業の効率の改善という 2 つの観点で大きな意義があるもの
6. Nakamura (1994). Appl. Entomol. Zool. 29 (2), 133–140といえる。
7. Biliotti & Chenon (1971) Ann. Zool. Ecol. Anim 3 (3), 361-371
本研究では、これまでに寄生蜂の寄生を失敗させる効果が知ら
8. Nakamura (2018). Biocontrol Sci Technol. 28, 509-520
れているベノミルについて、寄生蜂と並んで重要な捕食寄生者であるハエ目のヤドリバエ科 2 種を対象に、その寄生に対するベノミルの影響を評価した。
研究方法異なる寄生様式を持つ 2 種の捕食寄生性ヤドリバエ科昆虫、ブランコヤドリバエ（Exorcist japonica）とカイコノクロウジバエ（Pales pavida）を対象とした。ブランコヤドリバエの卵は宿主の表皮に直接産卵され、約 4 日後に孵化し、幼虫期間を約 8～9日、蛹期間を約 8 日経て羽化する[6]。一方で、カイコノクロウジ

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 6Ⓒ2024 筑波大学生物学類

屋外圃場において殺菌剤ベノミルがモンシロチョウに寄生するアオムシコマユバチに与える影響
時村 飛鳥（筑波大学 生物学類）

指導教員：藏滿【背景・目的】
捕食寄生性昆虫の一種である寄生蜂類は，幼虫期を寄主の体内外に寄生することによって過ごし，一連の成長が完了すると最終的に寄主を食い殺して蛹化・羽化し成虫となる。寄生蜂類は鱗翅目や半翅目等の昆虫を主な寄主とし，それら寄主のうちには農業
害虫とみなされる種も多く存在する。そのため，寄生蜂類は農業生態系における害虫の天敵として，害虫個体数の抑制，ひいては農業被害の抑制に重要な役割を果たす益虫とされている。近年は，農業現場において様々な手法を総合的に用いて病害虫の防除を実施する IPM（Integrated Pest Management）が世界的に推進されており，生物的防除としての寄生蜂類の役割はより重要視され，寄生蜂類の積極的な保護・利用が進んでいる。
しかしながら，農業現場における化学農薬の使用が寄生蜂類に負の影響を及ぼしているとする報告は多い。新川ら（2020）は屋
内飼育実験にて，植物用殺菌剤として広く使用されるベンズイミ
ダゾール系殺菌剤ベノミルを含む飼料を寄生蜂アオムシコマユバ
チによる産卵を受けたモンシロチョウ幼虫が経口摂取すると，寄主体内の寄生蜂が死亡することによって寄生が 100％失敗し，一方の寄主はなんら影響を受けることなく成虫まで正常に発達することを報告した。もしこの現象が実際の圃場でも発生しているな
らば，ベノミルの使用によって寄生蜂類の個体数が減少し，農業における経済的損失を発生させている恐れがある。しかしながら，
新川ら（2020）による検証は屋内飼育実験に留まっており，屋外
圃場における検証はなされていない。
そこで本研究では，慣行農法においてベノミルがアオムシコマ
ユバチに与える影響を，キャベツ圃場での屋外試験により検証した。
【材料・方法】
実験には主たる有効成分としてベノミルを含む「ベンレート水和剤」を使用し，散布時期・回数・方法は全てキャベツに対する規定通りに適用した。圃場内に，規定濃度とその 1/10, 1/100 の濃度のベノミルを散布した処理区と，ベノミルを含まない薬液を散布する非処理区の 4 処理区を配置し，キャベツを栽培する実験を
夏栽培と秋栽培の全 2 回実施した。各実験期間において，栽培中期に防虫ネットを外してから 3 日後に各処理区からランダムに選択した株上のモンシロチョウ卵を計数した。また定期的に，各処理区からランダムに選択した株上の鱗翅目幼虫を全て採集した。
採集した鱗翅目幼虫は，種同定ののち，各個体が得られた処理区と同様の処理を施した区画のキャベツを給餌して個別飼育し，寄主生存率・寄生蜂出現率・寄主１個体あたりの寄生蜂出現数を調査した。なお個別飼育した鱗翅目幼虫から出現した寄生蜂も同様に種同定した。

司夢（筑波大学 生命環境系）

与えないことが示された。
個別飼育の結果，モンシロチョウからアオムシコマユバチが出現した例は夏栽培において採集された個体群のみでみられた。そこで，夏栽培において採集されたモンシロチョウ幼虫の飼育結果を分析したところ，モンシロチョウの生存率には有意差がみられず，ベノミルはモンシロチョウの生存率に影響を与えないことが示された。一方でアオムシコマユバチの出現率において，ベノミ
ル非処理区と比較して規定濃度とその 1/10 濃度処理区では寄生蜂出現率が低下する傾向がみられた。
またベノミル散布濃度ごとの寄主１個体あたりのアオムシコマ
ユバチ出現数について比較すると，規定濃度の 1/10, 1/100 の濃度の処理区に対して規定濃度処理区において寄主 1 個体あたり寄生蜂出現数が有意に少なく，ベノミル高濃度処理によって寄主 1 個
体から出現するアオムシコマユバチの個体数が減少することが示
された。
【考察】
実験結果から，屋外圃場におけるベノミルの散布はモンシロチ
ョウに対して影響を与えない一方で，アオムシコマユバチに致死的な影響を与えることが示唆された。このことから，圃場におけるベノミルの使用は，農業生態系中の寄生蜂個体数を減少させるとともに，アオムシコマユバチによるモンシロチョウ個体数の抑制効果に負の影響を与えていることが示唆される。
その一方で，本研究における屋外試験の結果と新川ら（2020）
により行われた屋内飼育実験の結果を比較すると，屋外試験では屋内飼育実験ほど大きな影響はみられなかった。これは，散布された薬剤が長期間屋外環境に晒されたことにより，太陽光や雨水
あるいは散水によって経時的に分解・流失したことで影響が弱まった可能性がある。
【今後の展望】
現時点では，ベノミルの影響はモンシロチョウーアオムシコマ
ユバチ系に対するものしか検証されていない。しかし，ベノミル
はその他寄生蜂や寄生バエに対しても致死的な影響を与える可能性がある。今後はキャベツ以外の作物での評価を検討し，その他の寄主―捕食寄生者系に対するベノミルの影響を検証する必要がある。
また今回の実験期間を通してキャベツに植物病原菌由来の病気が発生することはなかった。寄生蜂類の保全と農業生産性を両立するためには寄生蜂類に負の影響を与えないベノミルの濃度等使用方法や代替薬剤を検討しなければならないが，そのためにはベノミルの殺菌剤としての有効性を評価する必要があり，その検証は今後の課題である。

【結果】
株あたりモンシロチョウ産卵数には，ベノミル散布濃度による差は見られず，ベノミルはモンシロチョウの産卵選好性に影響を【参考文献】
１．新川（2020）応動昆 64: 5-126

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 7Ⓒ2024 筑波大学生物学類

異なる植物群集における植物－送粉者ネットワークの時間的変化の比較
田中 優希奈（筑波大学 生物学類）

指導教員：横井智之（筑波大学 生命環境系）【背景】
ワークの非類似性（OS）と送粉者と開花植物の種組成の変化によ
野生送粉者は、農耕地と自然生態系における送粉サービスに大るネットワークの非類似性（ST）を季節間で計算すると、どちらきな役割を果たしている。しかし、近年、野生送粉者の減少が報の調査地でも ST のほうが高かった。
告されている。また、送粉者の多様性が高いことは、攪乱に対す
各調査日に採集した送粉者の Shannon-Wiener の多様度指数
る送粉サービスの回復力において重要である。そのため、従来通
は、駐車場裏が 1.12±0.50、実験林が 1.31±0.40 という結果にりの送粉サービスを維持するためには、送粉者の個体数だけでななった。実験林では開花植物種数が多いほど多様度が高くなった
く、種多様性についても把握する必要がある。
が、駐車場裏ではその傾向はみられなかった。
送粉系の保全には、送粉者と開花植物の関連性を知ることも重要である。異なる植物群集間で送粉者群集を比較することは、送【考察】
粉者と開花植物の関連性の理解につながる。しかし植物群集によ
夏季は開花植物種数が少ないため、訪花昆虫の個体数とその多る植物―送粉者ネットワークの違いを比較した研究は少ない。
様性は減少していると考えられる。 ネットワーク解析により、筑ハナバチ類とハナアブ類は餌資源として花粉や花蜜を利用する、 波大学内の送粉者ネットワークの変化は草地でも林床でも訪花昆
代表的な送粉者である。筑波大学キャンパス内には、年間を通じ
虫と植物の種組成の変化により起こっていることがわかった。両て多様な開花植物が生育しており、これらの昆虫類も多く訪花し調査地の植物相はある程度類似していたが、訪花昆虫の多様性はている。本キャンパスでは植物をはじめとした生物相に関する調実験林のほうが高くなった。その要因としては開花植物種数の違査が行なわれたことはあったが、植物と送粉者の多様性に関するいが考えられる。駐車場裏では訪花昆虫の多様度と開花植物種数
報告はほとんどない。
に相関がみられなかったことから、送粉者の多様性には開花植物
本研究では、キャンパス内の異なる植物群集における送粉者の種数以外にも、多くの送粉者が訪花する植物の存在など他の要因
個体数や多様性の通年変化、および調査地間での植物―送粉者ネも影響している可能性がある。
ットワークの違いを明らかにすることを目的とした。
【方法】
2023 年４月から 10 月にかけて、筑波大学内の草地（駐車場裏）と筑波大学実験植物園の林床（実験林）にマレーゼトラップとファネルトラップ、パントラップ（白と黄、青）を設置した。トラ
ップ内のサンプルは２週間に一度回収した。サンプル回収日に、それぞれの調査地内で 30 分間のルートセンサスを行なった。ルー
トセンサスではルート上の開花植物種を記録し、訪花中の昆虫を採集した。採集したサンプルは分類群ごとに分類し、ハナバチ類
については属まで同定した。季節ごとの比較では４月から６月を春、７月から８月を夏、９月から 10 月を秋と定義した。

図１ 筑波大（草地）の植物―送粉者ネットワーク【結果】
駐車場裏で112 個体、実験林で156個体のサンプルが得られた。
最も多かったのはコハナバチ属で、年間を通して採集された。両調査地で４月から７月上旬にかけて訪花昆虫の個体数が多く、７月以降は個体数が減少する傾向があった。季節ごとに比較すると、駐車場裏では春はヒゲナガハナバチ属、夏はコハナバチ属、秋はハナアブの割合が最も多かった。実験林ではどの季節でもコハナ
バチ属の割合が最も多かった。トラップではハキリバチ属やキマ
ダラハナバチ属など、ルートセンサスで採集できなかった種も採集された。
年間の開花植物種数の合計は駐車場裏で 26 種、実験林で 52 種だった。調査地間の植物相の Jaccard 係数は 0.73 だった。駐車場
裏では幅広い分類群の昆虫がムラサキツメクサに訪花していた（図１）。林床においては、ハナアブ類とコハナバチ属は幅広い植物種に訪花する傾向が見られた（図２）。再配線によるネット

7

図２ 筑波大（林床）の植物―送粉者ネットワーク

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 8Ⓒ2024 筑波大学生物学類

モモ農園の害虫ハダニ類に対するトリコデルマ属菌の殺ダニ効果
大木 雅（筑波大学 生物学類）

指導教員：佐藤【背景・目的】近年、病原菌や捕食者といった天敵を用いて、病害虫の防除を行う生物的防除が重要視されている。この他にも、防虫ネットやトラップを用いた物理的防除、栽培法や品種改良による耕種的防除などを総合的に組み合わせた「総合的病害虫管理（Integrated
Pest Management; IPM）」が世界的に推進されている。

扇状地が多い甲府盆地をもつ山梨県は、モモの生産量が日本一である。モモを生産する上での一番の難点は病害虫のつきやすさにある。そのため、多くのモモ生産者は定期的な薬剤散布や果実の袋掛けにより病害虫防除を行っている。その一方で、化学農薬の使用を 80％以上削減しているにも関わらず、高品質のモモ生産に成功している生産者がいる。モモの害虫として
ナミハダニ黄緑型 Tetranychus urticae Green form (以降、ナミ)とカンザワハダニ Tetranychus kanzawai（以降、
カンザワ）
がいるが、これらハダニは葉の裏に寄生し、葉の組織から汁を吸うため、加害された部分は白っぽくかすり状になる。また、繁殖力が高いため大量に発生しやすく、葉を変色させ、最終的には葉を枯らせてしまう。しかし、この農園では、雑草が生い茂ることで、これらハダニを中心とした害虫はモモの木よりも雑草に留まり、モモの木に上がってきても温存された天敵に食べられるため、大発生しないと考えられている。また、土壌からはトリコデルマ属菌 Trichoderma が優占種として検出されている。この菌は、拮抗作用による病原菌排除や、植物における成長促進ならびに全身獲得抵抗性の誘導に寄与することか
ら有用微生物として注目されている。さらには、近年の研究により、ダニ類を含む害虫を殺す効果も期待されている。
そこで本研究では、害虫ハダニ類のナミとカンザワに対する
3 種のトリコデルマ属菌の殺ダニ効果を明らかにすることを目的とした。
【材料・方法】
ナミ、カンザワは 2022 年 6 月に上述のモモ農園から採集し、室内でインゲンマメ Phaseolus vulgaris の葉を用いて継代飼育した個体群を使用した。飼育と下記実験は 25℃、60～100％R.H.、
長日（15L9D）条件下で行った。
トリコデルマ属菌として、同じく上述のモモ農園から単離培養されたハージナム T. harzianum（以降、Th）、ハマタム T.
hamatum（以降、Tm）、ヴィレンス T. virens（以降、Tv）の 3
種の株を用いた。また、ポジティブコントロールとして生物農薬として市販されているボーベリア・バシアーナ Beauveria
bassiana（アリスタ ライフサイエンス株式会社、以降、PC）、
ネガティブコントロールとして蒸留水(以降、NC）を用意した。
NC 以外の溶液は全て 1.0×10⁷ cells/ml に調整した。
実験は以下の手順で行った。①日齢をそろえるため、実験処理の 3 日前に、脱皮して雌成虫になる直前のステージである第 3 静止期雌を集めた。②ガラスシャーレ（φ90 mm、高さ 22 mm）に菌液を入れ、ピンセットを使って直径 25 mm のインゲンマメリ

8

幸恵（筑波大学 生命環境系）

ーフディスクを約 30 秒浸し、濡れたコットンを敷いた別の昆虫飼育用プラスチックシャーレ（φ55 mm、高さ 17 mm）に移した。③葉の表面が乾いた後、脱皮後 1〜3 日の未交尾雌を 8 匹導入し、④10 日間ダニの生死を確認して記録した。ナミ、カンザワ
に対して、NC、PC、Th、Tm、Tv の 5 処理を行った。各処理区、ナミでは 8、8、8、6、8 シャーレずつ、カンザワでは 8、10、12、12、14 シャーレずつ実験を行った。
解析には統計ソフト R（version4.3.1）を使用した。コックスハ
ザード混合モデルを用いて、シャーレをランダム効果としてハダ
ニの生存日数を処理区間および種間で比較した。
【結果・考察】PC 処理区は NC 処理区に比べて、有意ではないものの生存率が低い傾向がみられた（p=0.18）。
また、一般的には、カンザワよりもナミの方で薬剤抵抗性の発達がみられ、防除が難しい種であると言われているが、全処理区において、カンザワに比べてナミの方が生存率が低かった（p <0.001；図）。
ナミ、カンザワの双方で、有意ではないものの、NC 処理区よりも Th 処理区の生存率が高い傾向がみられた（p = 0.50；図）。先行研究では Th には殺ダニ効果があると報告されている。そのため、同じ菌種でも株によってダニや害虫に対する効果が異なる可能性が考えられた。
また、こちらも有意ではないものの、ナミでは Tm 処理区が、カンザワでは Tv 処理区が PC 処理区、すなわち、生物農薬として市販されているボーベリア・バシアーナと同程度に低い生存率がみられた。そのため、ハマタムとヴィレンスは、 殺ダニ効果が期待できるかもしれない。
今後は、試行回数を増やし、トリコデルマ属菌の殺ダニ効果を明確にしていきたい。

図．各処理区におけるナミとカンザワの 10 日間の生存率

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 9Ⓒ2024 筑波大学生物学類

社会性ハダニにおける公共トイレの究極要因を探る
新藤 啓太（筑波大学 生物学類）

指導教員：佐藤幸恵（筑波大学 生命環境系）

出液、対照区では溶媒であるジエチルエーテルに浸した 1mm 四方の濾紙片を巣の中央上に置いた。④3 日後に濾紙片を除去し、濾紙片下のトイレの有無、産子数（卵と未成熟虫の数）、雌成虫と子（卵と未成熟虫）の生死、増築の有無を記録した。増築が見られた場合は③の操作を増築部分に対して行った。⑤5、7、10、
12、14 日目にも④の操作を行った。
この操作を、雌 5 匹、7 匹ともに 3 回に分けて実施し、合計して雌 5 匹では各処理区 28 巣ずつ、雌 7 匹では 26 巣ずつ行った。
解析 解析には R（version 4.3.2）を使用した。一般化線形混合モ
デルを用いて、14 日間の雌 1 匹当たりの産子数、雌成虫と子（卵と未成熟虫）の生存率、増築回数を処理区間で比較した。

【背景・目的】動物にとって、体内の老廃物の除去を目的とする排泄は非常に重要な行動である。しかし、排泄物である糞は病原体の温床であり、またそのにおいで捕食者や寄生者を誘引する可能性もあるため、動物の生存に悪影響を与え得る。特に巣を作り、そこで定住的に集団生活を送る社会性動物では、限られた生活空間への大量の糞の蓄積、病気の潜在的な広がりやすさなどの理由から、糞の影響はより大きいと言える。そこで社会性動物では、糞の蓄積や糞との接触を防ぐために様々な排泄物管理行動が進化してきた。
その一例が、ダニ目ハダニ科に属するケナガスゴモリハダニ
Stigmaeopsis longus（以降、ケナガスゴモリ）である。体長 1mm未満の本種はササ寄生性で、葉裏の主脈沿いに糸を張ってトンネ
ル状の巣を形成し、そこで集団生活を送る。巣は入り口方向に増築を繰り返すことで大きくなり、集団は最大で数百、数千匹にもなるため大量の糞の処理が課題となるが、本種は巣の外（入り口付近）の１か所に「公共トイレ」を定め、そこでのみ排泄するという行動が見られる。本種は目が見えないが、トイレの場所の認
識は次のようにして行われることが分かっている。①トイレがまだ無い場合、触覚刺激を利用して巣の入り口を探す。②トイレが既にある場合、糞に含まれるササの葉由来の揮発性物質（エーテ
ル可溶性）を感知して、トイレの場所を把握する。
このように本種の排泄行動の至近メカニズムは解明されているが、この行動が果たして病気の予防、巣内スペースの活用などにどのくらい有効であるかは明らかにされていない。そこで本研究では、本種の排泄行動の究極要因を探るため、トイレの場所や数を変更した場合の産子数や生存率、巣の増築回数を調査した。

【結果・考察】対照区では濾紙片下への排泄はほとんど見られなかったが、操作区では 80%以上の確率（雌 5 匹：84.7%、雌 7 匹：82.9%）で濾紙片下にトイレが形成された。その結果、操作区のトイレの数は有意に多かった（P<0.001）。
産子数は、雌5 匹と雌7 匹で一定した傾向が見られず（P<0.01）
操作区でトイレの数が増えたからといって産子数が減少する現象は見られなかった。雌成虫及び子（卵と未成熟虫）の生存率においても、雌 5 匹と雌 7 匹で一定した傾向は見られず（P<0.01）、
操作区で生存率が低下するといった現象は見られなかった。一方、雌の数に関わらず、操作区では増築回数が有意に多かった（P<0.001、図 1）。つまり本種は、操作によりトイレを巣内に過剰に形成させられても、病気やスペースの減少といった影響を巣の増築により緩和していたのではないかと考えられる。そのため、今後はより小さい葉を使うなどして増築ができない状況をつくり、同様の実験を行うことにより、本種の特殊な排泄行動の適応的意義を検証したい。また、トイレの場所や個数が、捕食者の餌種の巣探索効率に影響を与えるのかについても探っていきたい。

【材料・方法】
材料 ケナガスゴモリは 2020 年 8 月に筑波大学山岳科学センタ
ー筑波実験林で採集され、室内で継代飼育したものを使用した。
飼育はクマザサ Sasa veitchii（同実験林で採集）を長方形に切り取り、水に浸した綿の上に広げ、その葉上で飼育するリーフディ
スク法により行った。飼育及び下記実験は、25℃、40～80%RH、
15L9D の条件下で実施した。
方法(1)揮発性物質の抽出
トイレの場所を操作するため、トイレの場所認識に利用される
エーテル可溶性揮発性物質の抽出を、先行研究に倣って行った。
筑波実験林でクマザサの葉 200g を採集し、水洗いして乾かした
後 1cm 四方に切断し、ジエチルエーテル 2L に浸漬して室温で 24
時間放置した。その後濾過を行い、エバポレーターで 100ml に濃縮した。最終的に、2g 生葉相当量／ml の抽出液を得た。
(2)トイレの場所操作実験
以下の手順で行った。①クマザサの葉を 3×1cm に切り取り、水に浸した綿の上に広げて実験アリーナを作成した。②実験アリーナにケナガスゴモリの既交尾雌成虫（2～4 日齢）を 5 匹または7 匹導入し、1 つの巣を作らせた。③6 時間後、操作区では(1)の抽図 1 14 日間の増築回数

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C：対照区、T：操作区

つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 10Ⓒ2024 筑波大学生物学類

社会性ハダニはなぜ天敵の卵を転がすのか？
田原 真夢（筑波大学 生物学類）

指導教員：佐藤【背景】
自然界では、食べるものである捕食者と、食べられるものである被食者との間で捕食-被食の関係性が成り立っており、この関係性が複雑に絡み合って食物網が出来ている。一般的に、被食者は捕食者から逃げる、もしくはその他の回避行動を行うが、中には捕食者に対して反撃を行う被食者も存在し、そのような生物としてスゴモリハダニ類の一部の種が知られている。
スゴモリハダニ属はダニ目ハダニ科に属する体長 1 mm 未満の植食性節足動物である。本属はササ・タケ類やススキなどのイネ科植物に寄生し、これら寄主植物の葉の裏に糸を張って巣をつく
り、集団で共同営巣を行うという特徴がある。この巣網は天敵に対する防衛としての機能を持つことが分かっている。スゴモリハ
ダ ニ属 の天敵 とし て捕食性 ダニ である タケ カブリダ ニ
Typhlodromus bumbusae（以下タケカブリ）が知られているが、このタケカブリはスゴモリハダニ属の作った巣網を突破し、巣内に侵入することが出来る。巣の内部に侵入したタケカブリの雌成虫は、主にスゴモリハダニ属の卵などを捕食し、自身の卵も産み落とす。しかし、孵化したタケカブリの幼虫はスゴモリハダニ属
によって体液を吸い取られ、殺されてしまうことがあるほか、ス
ゴモリハダニ属の一部の種では、天敵を巣内から追い出す行動も見られる。また、本属の 1 種であるケナガスゴモリハダニ
Stigmaeopsis longus（以下ケナガスゴモリ）の成虫では、巣内に産み落とされたタケカブリの卵を転がし、巣の出入り口や巣の外へ移動させる行動（以下卵転がし行動）が観察されている。しかし、この卵転がし行動の詳細や適応的意義は分かっていない。そこで、私はケナガスゴモリを対象に、卵を転がす頻度や卵の移動場所などこの行動の詳細を調査するとともに、卵を転がす前後のケナガスゴモリの行動を観察し、卵転がし行動の適応的意義を検討した。
【材料・方法】
ケナガスゴモリは、水で湿らせたコットン上に寄主植物である
クマザサ Sasa veitchii（筑波大学実験林より採集）の葉を長方形に切り取って広げ、その上で飼育した。タケカブリは、飼育したケナガスゴモリを餌として飼育した。飼育と実験は 25℃、60～
100％R.H.、長日条件(15L : 9D)の条件下で行った。
2 × 3 cm に切り取ったササ葉片にケナガスゴモリの雌成虫を 10匹導入し、3 日間巣を作らせ、産卵させた。このとき、巣が 2 つ以上作られていた場合はその都度昆虫針を用いて壊した。その後、タケカブリの雌成虫を 1 匹導入した。この雌が産卵したことを確認し、産卵場所を写真によって記録した後、タケカブリを除去した。このとき、巣内に産み落とされた捕食者の卵の数によってケ
ナガスゴモリの行動が変わる可能性を考慮し、各シャーレにおけるタケカブリの卵の数は 1、2、3 個のいずれかにした。タケカブ
リは約 8 時間で 1 つの卵を産むため、設定したい卵の数に合わせて、タケカブリの導入時間を 8～24 時間で調整した。ここまでの操作を行った後、以下の 2 つの実験を行った。

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幸恵（筑波大学 生命環境系）① 卵転がし行動の詳細を実験によって把握するために、タケカブリの卵が孵化するまでの間（約 2～3 日）、24 時間ごとに卵の場所を確認した。写真で記録した卵の場所から、卵 2 つ
分以上動いていたら卵転がし行動があったと判定した。
② 卵転がし行動の適応的意義を検討するために、タケカブリの卵が孵化するまでの間、卵を転がす前後のハダニの行動を観察した。観察には顕微鏡カメラを使用し、タイムラプスで記録した。
【結果・考察】タケカブリの産卵場所及び卵の移動先について、巣の入口付近（Entrance）、巣の端（Edge）、そのどちらでもない巣内葉面（Other）、天井の巣網（Nest ceiling）の 4 つに分類した。卵の移動の有無は産卵数の影響を受けなかったが（binomial GLM,
P=0.420）、産卵場所の影響を有意に受け(binomial GLM, P＜
0.001 ; 図)、巣の天井や端より も葉面に産み落とされた場合に多く動かされた(Tukey’s test, Other vs. Nest ceiling : P＜0.001,
Other vs. Edge : P＜0.05)。また、卵の移動先は産卵数により有意に異なっていたが（多項解析, P<0.05）、産卵場所による有意な影響は見られなかった（多項解析,P=0.316）。
行動観察から、ケナガスゴモリは巣内を歩き回る際にぶつかることでタケカブリの卵を認識し、第 1 脚で「触る」「転がす」な
どの行動を始めることが分かり、出入口の場所を確かめながらその方向へ動かす様子も確認できた。天井に産み付けられた卵に対しても、ぶつかった際に体の前半分を持ち上げてつつく様子が見られた。このことから、ケナガスゴモリは接触によりケカブリの卵を認識しており、活動拠点である巣内葉面の卵に気づきやすいと考えられる。
さらに、天敵の卵にぶつかるとその卵を触るが、すぐにその場を離れ、卵転がし行動には至らない個体も多かった。同種卵に対してこのような行動は見られないため、異物であるという認識をしていると考えられるが、タケカブリの卵を単なる異物としてではなく天敵の卵であると認識できているのかは未だ不明である。
今後は別種のハダニの卵に対しても卵転がし行動を行うのか調べ
るとともに、他のスゴモリハダニ種においても同様の行動が見られるか、調査を行いたい。

図 産卵場所と卵の移動の有無
数値は試行回数を示す。

つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 11Ⓒ2024 筑波大学生物学類

ハーレムをつくるハダニの雄は兄弟を殺さない？
谷野 彩奈（筑波大学 生物学類）

指導教員：八畑【背景・目的】
自然界では雌をめぐる雄間闘争がよくみられるが、その多くが殺し合いまで発展しない。それは、殺し合い行動には大きなリス
クとコストが伴い、進化する条件が限られているためだと考えられている。しかし、一部の動物では致死的雄間闘争がみられている。その進化の説明の一つに非血縁者を殺して血縁者の適応度を上げるといった血縁選択説があげられる。
ススキスゴモリハダニ種群（Stigmaeopsis miscanthi species
group）は致死的雄間闘争を行い、ハーレムを形成することが知られている。本ハダニ種群における致死的雄間闘争の進化を血縁選択説で説明するならば、非血縁者を選択的に殺すべく、血縁者と非血縁者を識別する能力が求められる。しかし先行研究では、雄が非血縁者を率先して殺害する行動は観察されなかった。一方、近年の研究により、実際の遺伝的な血縁度ではなく、ともに過ごしたかどうかの関係性に基づいて血縁認識する行動がダニ類ではみられている。本ハダニ種群の雄においても、ともに過ごした関係性により血縁認識している可能性は十分に考えられる。
そこで本研究では、遺伝的な血縁関係に加えてともに過ごした
関係性も操作し、それらが致死的雄間闘争に与える影響を調査して、血縁認識能力を再検証することを目的として実験を行った。
【材料】
ススキスゴモリハダニ種群は、クモ綱ダニ目ハダニ科に属する
体長 1mm 未満の植物寄生性節足動物であり、ススキの葉の裏に巣網を張って集団で共同営巣を行う。また、産雄単為生殖を行い、未受精卵からは雄が生まれ、受精卵からは雌が生まれる。
本研究では、本ハダニ種群の中でも最も激しい致死的雄間闘争がみられるススキスゴモリハダニ HG 型を用いた。2022 年 7 月と 2023 年 8 月に沖縄県本島の金城ダムにて採集し、室内にてリーフディスク法で継代飼育した個体群を使用した。飼育と下記実験は 25°C、50~70%r.h.、15L9D の条件下で行った。
【方法】
実験は以下の手順で行った。
①ススキの葉を 2×1cm に切り取り、水に浸した綿で囲んでアリーナを作り、そこに未交尾雌 1 匹を導入し、巣網を張らせ産卵させる。
②未交尾雌の生んだ未受精卵から雄の幼虫が孵化したら、別のア
リーナに雌 1 匹に巣網を張らせ、雌を追い出し、そこに 2 匹幼虫を移動させる。その際、同じ母親から生まれた遺伝的血縁関係のあるペアと、異なる母親から生まれた遺伝的血縁関係のないペアを作る。
③幼虫から成虫雄になるまで飼育し、毎日成長ステージを記録する。
④別のアリーナにあらかじめ 1 匹の雌に巣網を張らせ、卵を 3 個以上産ませて雌を除去する。そこに③の成虫雄を 2 匹ずつ移動させる。その際、遺伝的血縁関係の有無とともに過ごした関係性の有無に基づいて、図１のとおり 4 つの条件区に分ける。

謙介（筑波大学 生命環境系）

図 1. 闘争実験の条件区
ハダニ内の網掛けは血縁度を、家はともに過ごした関係性を表す。

⑤④の成虫雄 2 匹を 5 日間毎日観察し、生存を記録する。
雄が死亡した場合の死因が致死的雄間闘争であるかどうかの判
断は、本種の致死的雄間闘争が共食い行動であることから、先行研究にならって死体の体液がなくなり干からびた状態であるかどうかを基準とした。①から⑤の操作を 1 シリーズとし、4 シリー
ズに分けて行った。
解析には統計解析ソフト R（version 4.3.0）を使用した。一般化
線形混合モデルを用いて、致死的雄間闘争の起こる確率に、遺伝的血縁関係、ともに過ごした関係性、それらの交互作用が与える影響をみた。混合効果には実験シリーズの違いを組み入れた。
【結果・考察】遺伝的血縁関係の有無によって致死的雄間闘争の起こる確率は有意に異なることから（P<0.05）、血縁を認識していることが確かめられた。しかし、遺伝的非血縁者ではなく血縁者を殺す傾向がみられ、血縁選択説の予想とも、遺伝的血縁関係は影響しないとした先行研究の結果とも異なるものであった（図 2）。このような結果が得られた理由の一つに、発育環境や雄間闘争時の日齢といった、先行研究との条件の違いがあるかもしれない。一方、ともに過ごした関係性の有無については有意な差がみられなかった（P=0.45; 図 2）。
これらのことより、今後は致死的雄間闘争における発育環境や日齢、第三者の存在の影響に焦点を当て、致死的雄間闘争が起こりやすい条件について詳細な調査を行っていく必要がある。

図 2. 雄間闘争の殺害頻度11つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 12Ⓒ2024 筑波大学生物学類

日本産ハエ目昆虫に寄生する Stigmatomyces 属
藤原 快稜（筑波大学 生物学類）

指導教員：澤村【背景・目的】
子嚢菌門に分類される絶対寄生菌のラブルベニアは節足動物の体表のみから見つかっている。
このうち Stigmatomyces 属は主としてハエ目昆虫に寄生し、これまでに世界で約 200 種記載されている。しかし、2023 年に 3 種が報告されるまで、Stigmatomyces
属は日本では知られていなかった[1]。ラブルベニアと宿主の対応関係は重要であるが、日本では未解明である。そこで本研究では、野外で採集された日本産ハエ目昆虫を調査することにより、新たなラブルベニアやその宿主を見出した。

京一（筑波大学 生命環境系）

表1 ラブルベニア感染が見つかったハエ目昆虫
宿主

和名

ラブルベニア採集日

採集地

D. suzukii

オウトウショウジョウバエ

St. majewskii

多数

日本各地

Sd. subtilis

ススバネショウジョウバエ

St. scaptodrosophilae

2022/4/6

京都府京都市Sd. coracina

クロツヤショウジョウバエ

2022/5/20 京都府京都市

O. circularis

ミナミカマバエ

D. rufa

ムナスジショウジョウバエ

St. scaptodrosophilae
St. gracilis （図1）
St.dubius （図2）
St. majewskii

Sc. graminum

ナミヒメショウジョウバエ

St. scaptomyzae

2022/11/12 東京都八王子市

D. sternopleuralis マガタマショウジョウバエ

St. majewskii ? （図3）2023/6/3

D. annulipes

ダンダラショウジョウバエ

St. majewskii ? （図4）2023/9/13 長野県上田市

C. nipponica

ヤマトオオフンコバエ

Stigmatomyces sp. ?（図5）2023/10/22 岐阜県揖斐郡D. angularis

ヒメホシショウジョウバエ

St. majewskii ?（図6A,B） 2023/11/5 京都府京都市

カクホシショウジョウバエ
D. unispina
St. majewskii ?（図7）C. = Crumomyia, D. = Drosophila, O. = Ochthera, Sc. = Scaptomyza,
Sd. = Scaptodrosophila, St. = Stigmatomyces2022/9/20 岐阜県羽島市
2022/10/22 京都府京都市
埼玉県狭山市

2023/11/6 京都府京都市

今回初出のものには行全体を灰色で示した。

【材料・方法】
ショウジョウバエを中心とするハエ目昆虫はバナナトラップやスウィーピングによって日本各地で採集されたものを用いた。採集個体は 70 %エタノール中に保存またはトリエチルアミンで麻酔したのち、実体顕微鏡を用いて観察し、ラブルベニア感染の有無および感染部位を特定した。ラブルベニアは実体顕微鏡下で、ピンセットを用いて PBS 溶液に浸した宿主の体表から外し、99.9 %乳酸に浸してプレパラートを作製した。その後、光学顕微
鏡や位相差顕微鏡を用いて、ラブルベニアの形態を観察し、種同定を試みた。
【結果・考察】本研究では新たに 6 種のハエ目昆虫からラブルベニアの感染個体を発見することができた（表 1）。
形態的な特徴により（詳細は発表会にて）、D. sternopleuralis
および D. annulipes、D. angularis、D. unispina より見つかったものは St. majewskii に同定した。ただし、St. majewskii とそれに近縁な St. entomophilus の区別点は軽微であり、D. angularis
および D. unispina より見つかったものは後者の可能性もある。
St. majewskii と St. entomophilus はともに Drosophila 属に感染するが、前者は Sophophora 亜属に、後者は Drosophila 亜属の種に特化しているとされてきた[2]。本研究では、St. majewskii の宿主特異性が弱く、Drosophila 亜属の種にも感染し得ることを示唆した。ただし、宿主が異なる St. majewskii は形態上区別ができないだけで、隠蔽種となっている可能性もある。
また、形態的な特徴により（詳細は発表会にて）、O. circularisより見つかったものは、St. dubius と St. gracilis に同定した。これら 2 種はパプアニューギニアのニューブリテン島で採集された
O. mantis（文献[3][4]によると、O. circularis の可能性あり）の同一個体から記載されたものである[5]。基産地から遠く離れた日本
からも O. circularis の同一個体からこれら 2 種が見つかったことは興味深い。ただし、他のラブルベニアでも知られているように[6]、2 種間で感染部位に違いが見られる可能性もある。
今後は日本産ハエ目昆虫に寄生するラブルベニアについて、その詳細を明らかにするとともに、感染実験を通してそのメカニズ
ムや相互作用について明らかにしていきたい。

【謝辞】
本研究を実施するにあたり、大宮悠様、小沼萌博士、川村康平
様、神崎菜摘博士、澤村京一博士、出川洋介博士、山﨑いずみ様、
李知彦様にお世話になった。
【引用文献】[1] Yamazaki I et al. （2023）Fly 17: 2234265.
[2] Haelewaters D, De Kesel A（2020）MycoKeys 71: 23-83.
[3] Huldén L（1983）Karstenia 23: 31-136.
[4] Clausen P J（1977）Trans Amer Ent Soc 103: 451-530.
[5] Thaxter R（1901）Proc Amer Acad Arts & Sci 36: 397-414.
[6] Sundberg H et al. （2018）Fungal Syst Evol 1: 217-228.

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つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 13Ⓒ2024 筑波大学生物学類

タカハシショウジョウバエの分布北上：在来近縁種キハダショウジョウバエとの混棲状況
飯田 和生（筑波大学 生物学類）

指導教員：澤村

はじめに
ショウジョウバエ属（Drosophila）キイロショウジョウバエ群（melanogaster group）のうち、タカハシショウジョウバエ亜群（takahashii subgroup）には国内ではタカハシショウジョウバエ（D. takahashii）とキハダショウジョウバエ（D. lutescens）の 2種が生息している。これら 2 種は実験室内での交配により妊性のある雑種メスと不妊の雑種オスが作製できる（竹下ら, 2023）。
1980 年代の報告では、国内では D. lutescens が北海道から奄美大島までの広域分布種で、D. takahashii は九州や四国の南部を北限とする南方系の種であった（Kimura, 1982; Fukatami, 1984）
が、近年では D. takahashii の分布が北上しており、D. lutescensとの混棲域が拡大している（新井健太・小沼萌, 未発表）。一般的に、近縁種間においては同様の資源をめぐる競争排除や繁殖干渉、雑種形成などにより、片方の種が淘汰されて共存できない場合があるとされる。しかし、D. takahashii と D. lutescens は同所的に安定して共存していることから、野外において 2 種が何らかの仕組みでそれらの問題を回避している可能性がある。本研究では、
D. takahashii の現時点での分布の北限と 2 種の混棲状況を調査することを目的とした。
材料と方法（1）野外採集2023 年 4〜11 月の期間に、東京都、千葉県、茨城県内の合計16 地点で野外採集を行なった（図 1）。採集方法は基本的にドライイーストで発酵させたバナナを用いたトラップ採集とした。トラップは主に落葉広葉樹で構成された雑木林の林内または林縁部の直射日光が当たらない場所に仕掛け、1〜20 日後に回収した。
また、一部の調査地ではヤマボウシなどの果実に群がるショウジ
ョウバエ類を視認できたため、捕虫網を用いた採集も行なった。
採集で得られたショウジョウバエ類は 70％エタノール内に浸けて保存した。

京一（筑波大学 生命環境系）（2）種同定
まず、実体顕微鏡下で性櫛（sex-comb）などの外部形態の特徴をもとにショウジョウバエ類から takahashii subgroup の雄を選別した。D. takahashii と D. lutescens は外見での区別は困難だが、雄交尾器内の 1 対の穂のような形をした構造をもとに同定することができる（Okada, 1954, 1955, 図 2）。前者では aedeagal
sheath の基部がそのように見えるが、後者では ventral
postgonite と呼ばれる構造が長く伸びている（竹下ら, 2023）。交尾器を観察するため、雄成虫を 1N の KOH 溶液（100℃、10 分
間）に入れた後、グリセリン内で解剖して交尾器を摘出し、光学顕微鏡下で観察した。

図 2 D. takahashii の aedeagal sheath の基部（左）と D. lutescensの ventral postgonite（右）の比較
結果と考察
東京都と千葉県内の 9 つの調査地点において D. takahashii が得られ、うち 7 地点では D. lutescens と混棲していた。茨城県内で採集したショウジョウバエ類については現在同定中のため、詳細な結果と考察については発表会で紹介予定である。
謝辞
実験指導および野外採集に協力していただいた研究室の皆様方、卒業生の新井健太博士と小沼萌博士に感謝申し上げます。
引用文献
Fukatami, A. (1984) Cold temperature resistance in Drosophila
lutescens and D. takahashii. Japanese Journal of Genetics 59,
61-70.
Kimura, M. T. (1982) Cold hardiness and preimaginal period in
two closely related species, Drosophila takahashii and D.
lutescens. Kontyu 50, 638-648.
Okada, T. (1954) Comparative morphology of the Drosophilid
flies. I. Phallic organs of the melanogaster group. Kontyu 22,
36-46.
Okada, T. (1955) Drosophila. In Kihara, H. (Ed). Fauna andFlora of Nepal Himalaya. Vol. 1. Fauna and Flora ResearchSociety, Kyoto University, pp.387-391.
竹下瑛人, 大宮悠, 小沼萌, 澤村京一 (2023). タカハシショウジ
ョウバエ亜群の近縁2種における交尾器形態および機能の比較.
昆虫 DNA 研究会ニュースレター 39, 24-26.

図 1 調査地点の概要（国土地理院標準地図をもとに作成）
野外採集は筑波大学構内・周辺、つくばエクスプレス（TX）南流山駅〜万博記
念公園駅の各駅周辺（9 箇所）、JR 武蔵野線新八柱駅、市川大野駅、船橋法典駅の各駅周辺（3 箇所）、北総鉄
道の松飛台駅と大町駅周辺（2 箇所）、葛西臨海公園の合計 16 地点で行なった。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 14Ⓒ2024 筑波大学生物学類

ノハラカオジロショウジョウバエ交尾器形態の地理的変異
鍋倉 快晴（筑波大学 生物学類）

指導教員：澤村【背景と目的】
分布の重複する 2 種の生物のある形質が、異所性の個体群では似た特徴を示すが、同所性の個体群では異なる特徴を示す場合、この形質の地理的変異パターンは形質置換と呼ばれる。繁殖に関わる形質の分化を指す生殖的形質置換と隔離の強化が相互作用することで種分化が起こる場合がある。昆虫の交尾器形態は、生殖的隔離に関わる形質であり、特に進化速度が速い。
日本に生息するショウジョウバエ属 (Drosophila) のカオジロ
ショウジョウバエ類の 1 種であるノハラカオジロショウジョウバエ (D. triauraria) は、近縁種であるカオジロショウジョウバエ(D. auraria) と分布が広く重なっている (Kimura, 1987) 。ノハ
ラカオジロショウジョウバエのオス交尾器には、カオジロショウ
ジョウバエと同所的に生息する九州以北の個体群と、カオジロシ
ョウジョウバエが生息していない南西諸島の個体群との間で形態的差異が見られることが知られている (Onuma et al., 2022) 。これは、ノハラカオジロショウジョウバエのオス交尾器で形質置換が起こったことを示唆している可能性がある。
また、カオジロショウジョウバエ類のメス交尾器には、オス交尾器に対応した構造が見られることが知られており、メス交尾器の形態も種特異的な多様性を示す。交尾の際にオスの交尾器がメ
ス交尾器に付ける傷である交尾時創傷の位置も種特異的である(Onuma et al., 2022) 。しかし、オス交尾器の形態が異なる本土個体群と南西諸島個体群の間で、メス交尾器の形態の比較は行われていない。
そこで、本研究では、先行研究で示されたノハラカオジロショ
ウジョウバエのオス交尾器の地理的変異を再確認すること、メス
交尾器に何らかの地理的変異が見られるのかの 2 点を明らかにすることを目的とした。

京一（筑波大学 生命環境系）【結果と考察】観察の結果、ノハラカオジロショウジョウバエのオス交尾器には先行研究 (Onuma et al., 2022) で報告されていたような地理的変異が見られた（図１）。エデアグス先端の形状（図３-a ①）とエデアグスの突起（図３-a ②）に差が見られた。
メス交尾器の生殖管には全ての系統で襞状構造と交尾時創傷が見られ、系統間に差は見られなかった（図２）。オスのエデアグ
スの突起の大小に関わらず、メス生殖管には傷が付くことが示された。先行研究で明らかにされた T544 の生殖管内の構造が図３b である。生殖管内の構造の位置関係が不明である南西諸島産の2 系統でも、生殖管を圧迫して反転させる手法を用いて立体的な観察を行う必要がある。

図１. カオジロショウジョウバエとノハラカオジロショウジョウ
バエ 3 系統のオス交尾器

図２. ノハラカオジロショウジョウバエのメス生殖管に見られた襞状構造と交尾時創傷【材料と方法】（１）使用した系統
ノハラカオジロショウジョウバエの 3 系統を使用した。同所性である九州以北産の系統として、茨城県つくば市由来の T544 の
1 系統、異所性である南西諸島産の系統として、屋久島由来の
YKS-MTK、沖縄本島由来の OKNG12-6 の 2 系統を使用した。
（２）オス交尾器の観察
ノハラカオジロショウジョウバエのオスを 1N KOH 中で 10 分
間 100 ℃で加熱した。これをグリセリン中で解剖し、取り出した交尾器を顕微鏡下で観察した。
（３）メス交尾器の観察
ノハラカオジロショウジョウバエを雌雄 30 匹ずつ飼育ビンに入れた。1 週間後にメスを麻酔して取り出し、実体顕微鏡下で解剖して交尾器を取り出した。摘出した交尾器をスライドガラスに置き、PBS で封入してプレパラートを作製し、交尾器の構造と交尾時創傷の位置を顕微鏡下で観察した。また、雌雄 1 匹ずつで交尾させたメスをバイアル内で飼育し、1 週間後に同様の手法で観察した。

図３. ノハラカオジロショウジョウバエ雌雄交尾器の模式図【謝辞】
本研究を行うにあたり、貴重な情報をいただいた木村正人博士（北海道大学）、和多田正義博士（愛媛大学）、ご指導いただいた小沼萌博士（当研究室卒業生）、系統を提供していただいた
KORIN-FLY の皆様に厚くお礼申し上げます。
【引用文献】
1) Kimura, M. T., 1987. Kontyu 55: 429- 436.
2) Onuma, M. et al., 2022. Biol. J. Linn. Soc. 135: 195- 207.

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 15Ⓒ2024 筑波大学生物学類

ミミズたちはどう生きるか佐久間

陽平（筑波大学 生物学類）

指導教員：徳永【背景・目的】
陸棲ミミズ類は土壌生態系を代表する生物である。同時的雌雄同体であることがわかっているが生殖方式については未解明な部分が多い。
同時的雌雄同体の成体は雌雄両方の生殖器官をもつが繁殖は二個体で有性生殖を行い、単為生殖や自家受精を行わないことが一般に知られている。ツリミミズ科のシマミミズ(Eisenia fetida 以下
Ef)、
アンドレツリミミズ(E.andrei 以下 Ea)はどちらも同時的雌
雄同体度物であるが通常の二個体での交尾に加えて一個体だけでの繁殖が報告されている[1]。2 種は生息地が重なる地域もあり、実験条件下で交雑も確認されておりそれらの子孫には不完全ながら妊性が見られる[2]。また交雑種はアンドレツリミミズに近い特徴をもっていた。
本研究では 2 種にみられる一個体での繁殖が生態学的にどのような意味をもつのか飼育観察に基づいた遺伝学的なモデルにより考察した。2 種がどのような繁殖戦略を用いているのかを明らかにすることを目的とした。
【方法】
2 種の飼育観察に戻づいた遺伝学的モデルの作成とそれに基づく R でのシミュレーションを行った。
はじめにモデル作成のために繁殖方法及び 2 種の生態について整理する。Ef、Ea の繁殖方法には一個体だけでの繁殖(以下、自家受精と仮定する)、と種内(種間)交尾があり繁殖方法は個体ごとにそれぞれの戦略に基づき決められるものとする。交雑種が実験条件下で確認されたことから他個体が Ef、Ea のどちらなのかは判別ができていないものとする。以上の仮定のもとパラメータを次のように設定した。

Nt
Ft,At
Xf,Xa
Mf,Ma
Sf,Sa
Hf,Ha

幸彦（筑波大学 生命環境系）

𝐴𝑡+1 = 𝐴𝑡 + 𝐴𝑡 (𝑅𝑎 − 1) (1 −𝑁𝑡
) … (2)
𝐾(1),(2) をもとに R を用いて他の個体群から個体が移入しない
場合と個体が移入する場合にわけてシミュレーションを行った。
繁殖戦略はその条件下で最適なものに毎世代、変更するものとし交雑について Ef は子孫を残さず、Ea のみ子孫を残すものとした。
【結果】
個体群の平衡条件は次のようになる。
𝑅𝑓 = 𝑅𝑎 = 1 … (3) または𝑁𝑡 = 𝐾(3)の値は観察されているミミズの繁殖成績の範疇で取りうる値であった。ただし安定性解析の結果、2 種が安定して共存することはなくどちらか一種のみになるとわかった。図 1 より平衡点からどちらかにずれるとそちら側に傾くことがわかる。
R によるシミュレーションでは移入しない場合には最終的にどちらか一方の種が残った。移入する場合には F0 が A0 に対して十分大きい場合に Ea:Ef の割合が安定した。そのとき、Xf は 1、Xa
は 0 の値で安定した。つまり Ef は自家受精を行わず交尾のみを行い反対にEaは交尾を行わず自家受精のみを行うようになった。
【考察】
平衡条件の結果と R によるシミュレーションの結果より Ea とEf の2 種が閉鎖的な条件で共存しつづけることは難しいと考えられる。ただし移入を含めたシミュレーションでは一定の比で安定したことから 2 種の生息地の境界では Ea が自家受精のみの繁殖戦略を取り交雑を避けることによって共存することが考えられる。
これは割合が低い Ea が交雑を避け、自家受精を選択するために生じている。自家受精について異なる報告[1][2]は実験に用いた個体の生息環境で 2 種の比率が異なるためであると推察できる。

時間 t における全個体数
時間 t における Ef,Ea の個体数
Ea,Ef の交尾を選択する割合(繁殖戦略)
Ea,Ef の種内交尾による産卵数
Ea,Ef の自家受精による産卵数
Ea,Ef の種間交尾による産卵数【参考文献】[1]Domínguez,J., et al.(2003). Pedobiologia,47,530-534.
[2]Plytycz,B., et al.(2018). PLOS ONE,Sep 21;13(9):e0204469.

これらのパラメータを用いて Ef,Ea それぞれの一個体が一度の交尾によって残す卵の数 R は次のように表すことができる。
𝐹𝑡 𝑋𝑓
𝐴𝑡 𝑋𝑎
𝑅𝑓 = (1 − 𝑋𝑓 )𝑆𝑓 + 𝑋𝑓 (𝑀𝑓 +𝐻)
𝐹𝑡 𝑋𝑓 + 𝐴𝑡 𝑋𝑎
𝐹𝑡 𝑋𝑓 + 𝐴𝑡 𝑋𝑎 𝑓
𝐹𝑡 𝑋𝑓
𝐴𝑡 𝑋𝑎
𝑅𝑎 = (1 − 𝑋𝑎 )𝑆𝑎 + 𝑋𝑎 (𝐻 +𝑀)
𝐹𝑡 𝑋𝑓 + 𝐴𝑡 𝑋𝑎 𝑓 𝐹𝑡 𝑋𝑓 + 𝐴𝑡 𝑋𝑎 𝑓
これらに環境収容力による密度効果を加え、世代ごとの個体数の関係性を R を用いて次のように表すことができる。
𝑁𝑡
𝐹𝑡+1 = 𝐹𝑡 + 𝐹𝑡 (𝑅𝑓 − 1) (1 − ) … (1)𝐾

図 1 Rf/Ra と Ft の割合の関係性15つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 16Ⓒ2024 筑波大学生物学類

立つ鳥の跡を用いたリザバーコンピューティング
稲垣 実香（筑波大学 生物学類）

指導教員：徳永幸彦（筑波大学 生命環境系）

きる(図 2)。ネットワークの中心性を計算する際、そのネットワークは正方行列で表現される必要がある。しかし、先の行列は必ずしも正方行列ではなく、そのままでは中心性を計算することができない。そのため、今回はこの行列とその転置行列を用いて、コロニー同士のつながりを表す
正方行列とねぐら同士のつながり
図 1：二部グラフを表す正方行列を作り、それぞれについて中心性ベクトルを算出した。本研究では、これらの中心性ベクトルがコロニーとねぐらにおける実際の個体数を表すと仮定し、それぞれの中心性ベクトルと
図 2：つながり行列 個体数データの相関が最も高くなるようなコロニーとねぐらのつながり(図 2)を遺伝的アルゴリズムにより求めた。遺伝的アルゴリズムは、生物の適応進化のメカニズムを応用した探索アルゴリズムである。本研究では、0/1 を「遺伝子」、つながり行列(図 2)を「個体」と捉え、進化プロセス（組み換えや突然変異）を繰り返すことにより、個体数データとの相関が最も高くなるつながり行列を選択した。
(B) 次に、(A)で作ったネットワークから、年をまたいだねぐ
ら間のつながりを表すネットワークを作り、これをリザバーとして用いた RC を作成した。本研究で用いた RC は、入力層(Win)、
リザバー層(W)、リザバー間のデータ受け渡しを担う中間層(Winner)、出力層(Wout)から成る(図 3）。このような RC を各
中心性指標について作り、いくつかの問題(時系列予測問題、時系
列分類問題)を解かせることで、リザバーとしての性能を比較した。

【背景・目的】
サギは、繁殖期にコロニー、繁殖期以外にねぐらという、複数の種から成る集合を作る。茨城県では、コロニーは主にアオサギ(Ardea cinera)、ダイサギ(Ardea alba)、チュウサギ(Egrettaintermeddia) 、 コ サ ギ (E.garzetta) 、 ゴ イ サ ギ (Nycticorax
nycticorax)、アマサギ(Bubulcus ibis)により構成され、ねぐらは主に渡りを行うチュウサギ、アマサギを除く 4 種で構成される。
本研究では、(A)サギの流動が距離と中心性によって決まっていると仮定し、複数の中心性指標を用いてサギの移動を表すネット
ワークを作った。また、(B)どの中心性指標がサギの動態を表すう
えで最も適しているか調べるために、それぞれのネットワークのリザバーとしての性能を比較した。
ネットワークの中心性とは、ネットワークを構成する各ノード(頂点)が、どれだけ中心的な役割を果たすかを表す指標であり、ネットワーク分析の研究では、注目している性質ごとに異なる中心性指標が用いられている。本研究で用いた中心性指標と、それぞれのノードの評価方法について表 1 に示す。
表 1：７つの中心性指標の、ノードの評価方法

リザバーコンピューティング(RC)は、時系列データの処理に適した機械学習技術である。一般的な RC は、時系列データを受け取りリザバーに入力する入力層、教師あり学習による学習を行う
出力層、リザバー層から成る。リザバーとは、入力信号系列に駆動される力学系である。リザバーとして適した力学系の特性として、同一入力に対して同一の出力を返すこと、短期記憶容量が大きいこと、データを非線形変換できることがある(犬伏・吉村,
2019)。近年、生物の作るネットワークが高い計算能力を持つリザバーになっていることが報告されている。そこで、本研究では、リザバーとして高い性能を発揮するネットワークほど実際の生物
ネットワークをよく表現しているのではないかと考え、(A)で作った各中心性指標に基づくネットワークについてリザバーとしての性能を比較することで、サギの動態を表すうえで最も適した中心性指標を推測した。
【材料・方法】
本研究では、2001 年から 2012 年までの、コロニーにおけるサギの個体数、ねぐらにおけるサギの個体数、それぞれのコロニー、ねぐらの座標を調べたデータを使わせていただいた。
(A) まず、上記の中心性指標と実際のデータを用いて、2001 年から 2012 年までの各年におけるコロニー、ねぐらにおけるサギの個体数を最もよく表現できるような、コロニー・ねぐら間のつながりを表すネットワークを作った。コロニーとねぐらのつながり
は、二部グラフとして表現することができる(図 1)。二部グラフ
は、つながりがある部分を 1、ない部分を 0 とした行列で表現で

図 3：本研究で用いた RC の構造(Chouikhi et al., 2018 を改変)
【結果、考察】サギのリザバーは、NARMA モデルや簡単な時系列分類問題で高い精度を発揮したが、カオスモデルや複雑な時系列分類問題では精度が低くなった。詳しくは発表会にて報告する。
【参考文献】
1. 犬伏正信・吉村和之, 2019, 「リザバーコンピューティングに適した力学系の特性と構造」『電子情報通信学会誌』102(2):114-20．
2．Chouikhi et al. 2018, Genesis of Basic and Multi-Layer Echo
State Network Recurrent Autoencoders for Efficient Data
Representations, arXiv:1804.08996v2

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 17Ⓒ2024 筑波大学生物学類

寄生蜂 Asobara japonica の感染に対する宿主ショウジョウバエ 10 種の応答性の比較中山友萌香（筑波大学 生物学類）

指導教員：上山【背景・目的】
寄生蜂は、宿主となる植物や節足動物に卵を産み付け、栄養を搾取することによって成長するハチ目の昆虫である。寄生蜂は種ごとに特異的な宿主を有し、宿主とすることができる種の範囲（宿主範囲）が大きく異なる。宿主範囲の特徴から、広範囲の種に寄生ができる寄生蜂は generalist、ある限られた宿主種にのみ寄生する寄生蜂は specialist と呼ばれる¹。この寄生蜂が宿主範囲を決定するメカニズムについては不明な点が多い。
寄生蜂の一種である Asobara japonica（以下、A. japonica）はショウジョウバエ属の幅広い種を宿主とする generalist 的な寄生蜂である²。A. japonica は宿主幼虫の体内に毒と卵を注入し（感染）、宿主体内で孵化する。A. japonica の幼虫は宿主体内で成長し、やがて宿主が蛹に達すると蛹の内部で宿主を食い殺し、宿主の蛹から A. japonica の成虫が羽化する。所属研究室の先行研究において、A. japonica の感染時に注入される毒が Drosophilamelanogaster（以下、D. mel）幼虫の成虫原基（成虫の前駆組織）で細胞死と細胞分裂の停止を誘導し、宿主の成長を制御し寄生を成功させることが見出された（島田ら、未発表）。この A. japonicaの寄生戦略は D. mel 以外の宿主種に対しても共通しているのか、あるいは宿主種ごとに細分化された異なる寄生戦略を持つのだろうか。この疑問を明らかにするため、本研究では A. japonica 感染
後の成虫原基の細胞死および細胞分裂活性を宿主ショウジョウバ
エ 10 種で比較した。
【方法】
実験１. 寄生成功率の計測
A. japonica を 10 種のショウジョウバエ（Drosophila simulans,melanogaster, yakuba, erecta, suzukii, ananassea,
pseudoobscura, willistoni, mojavensis, virilis）の 3 齢幼虫に感染させた。その後、感染個体から羽化した A. japonica もしくはショ
ウジョウバエの成虫の個体数と蛹または幼虫で死亡した個体数を計測した。
実験２. 感染後の翅原基の細胞死および細胞分裂活性の比較
A. japonica の感染４時間後に、成虫原基の一つである翅原基を宿主幼虫から解剖し、固定した。細胞死により断片化した DNA の末端を標識する TUNEL (Roche) 染色と、アポトーシス実行因子である切断型 death caspase (cDcp1, Cell Signalling Technology)
特異的抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。加えて、細胞分
裂期の細胞を標識する pH3 (Cell Signalling Technology) 特異的抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。D. moj においては感染
6 時間後と 8 時間後の翅原基も同様の方法で染色を行った。その後、共焦点レーザー顕微鏡（Carl Zeiss, LSM700）でこれらのシ
グナルの観察と撮影を行った。
【結果・考察】
実験１：今回観察したショウジョウバエ（ハエ）10 種すべてにおいて、A. japonica の感染を受けた個体から A. japonica 成虫が羽化した。ハエ成虫が羽化した割合は観察した個体の 1％以下であった。従って、A. japonica は D. sim, mel, yak, ere, suz, ana,

拓己（筑波大学 生存ダイナミクス研究センター）

pse, wil, moj, vir の幼虫に対して寄生を成立できることが示された。また、D. moj においては他の宿主種と比較して寄生成功率が低く、A. japonica 成虫が羽化した割合は感染個体の 20％以下であった。
実験２：感染 4 時間後の D. sim, mel, yak, ere, suz, ana, pse,wil, moj, vir の翅原基において、非感染個体の翅原基と比較してTUNEL 陽性細胞数と cDcp1 の蛍光面積が顕著に増加し、pH3 陽性細胞数が顕著に減少していた。これに対し、D. moj の翅原基では感染 4 時間後、TUNEL 陽性細胞数と cDcp1 の蛍光面積は顕著に増加していたものの、pH3 陽性細胞数の減少はみられなかった。
しかし感染 6 時間後と 8 時間後の翅原基を観察すると、pH3 陽性
細胞数は非感染個体の翅原基と比較して顕著に減少していた。よって、本研究で観察した D. sim, mel, yak, ere, suz, ana, pse, wil,moj, vir は、A. japonica の感染を受けると翅原基の細胞死と細胞分裂の停止が誘導されることが示された。また、D. moj では他の9 種よりも A. japonica 感染後に細胞分裂の停止が起こるまでにかかる時間が長いことが示された。
本研究から、A. japonica は宿主成虫原基に対する細胞死と細胞分裂の停止の誘導を D. mel 以外の複数の宿主種で共通して引き起こすことが分かった。また、D. moj で観察されたように、寄生が可能な宿主種同士であっても細胞分裂が停止し始める時間には種ごとに差異があることが示唆された。D. moj の寄生成功率が低かったことから、宿主成虫原基で細胞分裂の停止が誘導されるまでのスピードが寄生成功率に影響する可能性が示唆された。
【今後の展望】
宿主成虫原基の細胞死および細胞分裂活性を観察し、寄生蜂 A.
japonica が複数の宿主種に対し共通する生理反応を誘導することを示した。所属研究室の先行研究において、D. mel を宿主とした時、翅原基の細胞死と細胞分裂の停止の誘導に必須である２つの毒タンパク質が同定されている（上山ら、未発表）。この毒タン
パク質遺伝子を RNA 干渉法によりノックダウンした A. japonicaを作成し、細胞死と細胞分裂停止の誘導の有無を観察することで、同定された二つの毒タンパク質が D. mel 以外の宿主種の成虫原基に対する細胞死と細胞分裂の停止においても必須の役割を担うのかを検討することができる。この解析により、A. japonica と異なる複数の宿主種に対する寄生戦略の共通性と多様性の理解を分
子レベルまで深めることが期待できる。
【参考文献】
1） Schlenke, T.A., Morales, J., Govind, S. and Clark, A.G.
(2007). PLoS Pathogens, 3, e158.
2） Ideo, S., Watada, M., Mitsui, H. and Kimura, M.T. (2008).
Entomol. Sci. 11, 1–6.

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 18Ⓒ2024 筑波大学生物学類

トネリコ類立枯病菌の胞子発芽を抑制する Aureobasidium pullulans のセイヨウトネリコ生葉上での挙動
皿海琉（筑波大学 生物学類）

指導教員：岡根泉（筑波大学 生命環境系）

SEM による観察では時間が経つにつれて A. pullulans の酵母状細胞の出芽増殖と菌糸状の増殖の様子が確認された。また、酵母状細胞で増殖し小葉上でバイオフィルム状に定着していることを示唆させる様子も観察された（図 3）。

【背景と目的】近年、ヨーロッパにおいて“Ash dieback”というトネリコ属植
物に立枯れ症状を引き起こす樹木病害が広く発生しており問題となっている。
この“Ash dieback”の原因菌である Hymenoscyphus fraxineusに感染しても“Ash dieback”が発病しない北海道大学札幌キャンパス内で生育するセイヨウトネリコの個体について内生菌相の調査が行われ Aureobasidium pullulans が分離された。この A.
pullulans は、H. fraxineus の子嚢胞子の発芽を抑制することが報
告されており生物防除剤としての活用が期待されている。
本研究では、セイヨウトネリコ上での A. pullulans の挙動を明らかにすることを目的として、本菌をセイヨウトネリコ生葉に接種および再分離試験を行うことで、本菌の宿主組織内外での定着の状態と、生葉上での挙動をズーム式顕微鏡（実体顕微鏡）と卓上顕微鏡 Miniscope（簡易 SEM）で観察した。

【まとめ】

Aureobasidium pullulans はセイヨウトネリコ生葉上で少なくとも 3〜4 週間生存する可能性が強く示唆された。葉面上では菌糸を伸長させ、また、バイオフィルム状に定着する様子が観察されたことにより、葉面上で菌糸状細胞や酵母状細胞など様々な形態で生存している可能性が示唆された。本菌はセイヨウトネリコから内生的に分離されたものであるが、今回の条件では内生菌として分離されなかった。葉表面上の定着形態によっては葉組織内に定着する可能性があるため、今後の調査が必要である。

【材料と方法】（1）供試植物および供試菌株
供試植物として北海道大学で採取、移送され本研究室で維持してきたセイヨウトネリコの若木を使用した。供試菌株として市村（2021）によって北海道大学に生育するセイヨウトネリコ生葉から内生として分離された A. pullulans No.5029 を供試した。
（2）Aureobasidium pullulans の再分離試験
Aureobasidium pullulans の懸濁液を接種したセイヨウトネリ
コの小葉（図１）を 3 日、1 週間、2 週間、3 週間、4 週間後に採取し、無処理葉の葉面を寒天培地上に押しつけた後、剥がすこと
で葉面菌の分離を試みた。その後、本葉を表面殺菌した後に切り出した葉片を寒天培地上において培養し、伸長してきた菌体をさらに分離培養して A. pullulans の生息を確認した。
（3）Aureobasidium pullulans の継時的観察
14×10 cm の角形プラスチックシャーレ内で40ppm のジベレリ
ン溶液を与えながらで維持したセイヨウトネリコの小葉の切り葉上に（図 2）、A. pullulans 懸濁液を滴下し、1 週間継時的に実体顕微鏡または簡易 SEM で A. pullulans の細胞を観察した。

図１ セイヨウトネリコへの A.
pullulans の接種方法

図２ 角形シャーレにおける切り葉の維持方法【結果および考察】（1）A. pullulans の再分離試験
接種後3日〜4週間後の表面殺菌をしていない小葉の葉面からは
A. pullulans が分離された。一方で、表面殺菌後の小葉からは A.
pullulans は分離されなかった。今回の条件では A. pullulans はセイヨウトネリコから内生菌としては分離されなかったが、葉面上で 3〜4 週間ほど生存できることが確認された。
（2）A. pullulans の継時的観察
実体顕微鏡による観察では時間が経過しても A. pullulans の細胞は生葉上で増殖する様子は観察されなかった。一方で、簡易

図３ 簡易SEM による葉面上のA. pullulans の観察画像
A：接種後 1 日目の細胞の様子
B：接種後 5 日目の増殖の様子
C：接種後 3 日目のバイオフィルム状に増殖する様子

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 19Ⓒ2024 筑波大学生物学類

北茨城のスズタケに寄生する Puccinia 属サビキンの多様性調査
氷見 和裕（筑波大学 生物学類）

指導教員：岡根【背景と目的】サ ビ キ ン は 担 子 菌 門 (Basidiomycota) サ ビ キ ン 綱(Pucciniomycetes)サビキン目(Pucciniales)に属する植物絶対寄生菌である。これまでにサビキンは世界で 14 科 166 属 7798 種が報告され、日本で 800 種が報告されている。サビキンは 1 種が最大で 4 つの形態的、機能的に異なる胞子世代と 5 種類の胞子(精子、さび胞子、夏胞子、冬胞子、担子胞子)を形成する。また、生活環を全うするのに系統的に異なる 2 種類の植物を必要とする異種寄生種と、1 種の植物で全うできる同種寄生種が存在する。
Puccinia 属サビキンの中にはタケ・ササ類を夏胞子・冬胞子世
代宿主とするものがおり、スズタケ(Sasamorpha borealis)に寄生することが報告されているのは P. aduncata、P. hikawaensis、P.
longicornis、P. mitriformis、P.sasae、P. sasicola、P. suzutakeの 7 種である。筑波大学植物寄生菌学研究室は茨城県の菌類相調
査プロジェクトに参加しており、その中で北茨城のスズタケには少なくとも 2 種の Puccinia 属サビキンの夏胞子・冬胞子世代が寄生していることを発見した。1 種は形態学的に P. suzutake と同定される種、もう 1 種は冬胞子の先端が長く湾曲し周辺のウツギ
上のサビキン(Aecidium)と分子系統学的に一致する種(Puccinia
sp. 1)である。本研究では、北茨城のスズタケに寄生する Puccinia
属サビキンの種の多様性を解明することを目的として、分子系統
解析、形態観察、接種試験による分類および生態学的検討を試みた。
【材料と方法】(1)分子系統解析…Rust2inv と LR6 をプライマーに用いた PCRで、2023 年に北茨城市花園渓谷で採取したスズタケに寄生する
Puccinia 属サビキン 11 点の 5.8S rDNA－ITS2－28S rDNA 領域の約1400 bp を増幅し塩基配列を決定した。
それらにGenBankに登録されている ITS2 と 28S rDNA D1/D2 領域を含む 23 の塩基配列データを加え近隣結合法で分子系統解析を行った。
(2)形態観察…2023 年に北茨城市花園渓谷で採取したスズタケに寄生する Puccinia 属サビキン 16 点の冬胞子の形態を光学顕微鏡で観察するとともに各部位の形態測定を行った。
(3)接種試験…Puccinia sp. 1 の担子胞子をウツギ、
ヤマアジサイ、
コサジサイに接種し、精子・さび胞子世代の形成の有無を観察した。その後ウツギに発生したさび胞子をスズタケに接種し、夏胞子・冬胞子世代の形成の有無を観察した。
【結果】(表も参照)(1)分子系統解析…2023 年に北茨城市花園渓谷で採取したスズタケに寄生する Puccinia 属サビキン 11 点は、2 つのクレードに分かれ、それぞれ Puccinia sp. 1 と P. suzutake の標本が含まれた。
(2)形態観察 …2023 年に北茨城市花園渓谷で採取したスズタケに寄生する Puccinia 属サビキン 16 点の冬胞子の形態は次の 3 タイプに分かれた：①先端が突出せず、短く丸い P. hikawaensis 型、②先端が突出し、細長く湾曲する Puccinia sp. 1 型、③先端がまっすぐ突出する P. kusanoi, P. longicornis, P. suzutake 型(図 2)。

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泉（筑波大学 生命環境系）(3)接種試験 …ウツギ上に接種 12 日後に精子器、接種 27 日後にさび胞子堆の形成を認めた。ヤマアジサイとコアジサイにはいずれの発生も認められなかった。なお、スズタケへのさび胞子接種の結果については、これまで夏胞子堆および冬胞子堆の発生は確認されていない(2024 年 1 月 19 日現在)。
【まとめ】
これまでに北茨城では P. suzutake と Puccinia sp.1 が報告されていた。しかし、今回の分子系統解析と形態観察から、北茨城のスズタケには P. hikawaensis, P. suzutake, Puccinia sp.1 の 3
種の Puccinia 属サビキンが寄生していることが明らかになった。
夏胞子・冬胞子世代でタケ・ササ類の植物に寄生する Puccinia
属サビキンのうち、精子・さび胞子世代でウツギに寄生する種は
P. kusanoi と P. longicornis の 2 種のみである。Puccinia. sp 1 はウツギに寄生するが、分子系統学的に P. kusanoi および P.
longicornis と異なる。Puccinia. sp 1 の冬胞子は、どのタケ・サ
サ類寄生 Puccinia 属サビキンとも形態が異なることから未記載種であると示唆された。
表 分子系統解析と冬胞子の形態に基づく同定結果
標本番号
分子系統解析
冬胞子の形態
TSH-R25489
P. hikawaensis－*
TSH-R25783
P. hikawaensis－
TSH-R26180
P. suzutake－
TSH-R26183
P. suzutake－
TSH-R26534
Puccinia sp. 1－
HK-20230430-01
Puccinia sp. 1
Puccinia sp. 1
HK-20230430-02
Puccinia sp. 1
Puccinia sp. 1
HK-20230430-04
Puccinia sp. 1
Puccinia sp. 1
HK-20230430-06
P. suzutake
P. suzutake
HK-20230430-07
Puccinia sp. 1
Puccinia sp. 1
HK-20230430-08
P. suzutake
P. suzutake
HK-20230430-09
P. suzutake
P. suzutake
HK-20230430-12
P. suzutake
P. suzutake
HK-20230430-15
Puccinia sp. 1
Puccinia sp. 1
HK-20230605-02
Puccinia sp. 1
Puccinia sp. 1
HK-20230605-14
Puccinia sp. 1－
HK-20230627-18
Puccinia sp. 1－* －：未供試①②③

図 2023 年に北茨城市花園渓谷で採取したスズタケに寄生する
Puccinia 属サビキン 16 点の冬胞子の 3 タイプの形態

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 20Ⓒ2024 筑波大学生物学類

東南アジア・オーストラレーシアに分布するブドウ葉さび病菌の分類学的検討
浮田 桃子（筑波大学 生物学類）

指導教員：岡根【背景・目的】サビキンは担子菌門サビキン亜門サビキン綱サビキン目を構成する絶対寄生菌である。サビキンは 1 種が最大で 4 つの形態的、機能的に異なる胞子世代と 5 種類の胞子（精子、さび胞子、夏胞子、冬胞子、担子胞子）を有する。サビキンはシダ類、裸子植物、被子植物等の絶対寄生菌であり、その中には経済的に重要な作物や樹木に病気を引き起こすものもある。そのため、植物病原菌としてのサビキンの防除を念頭に置いた、宿主範囲や生活環を中心とした研究も行われている。
サビキンの宿主植物の一つにブドウがある。ブドウ葉さび病は
商業用ブドウ園でしばしば深刻化し、重度の感染では果実の収穫
前または収穫時に落葉を引き起こし、果実の収量と品質を大幅に低下させる。rDNA ITS2 及び LSU D1/D2 領域に基づいた分子系
統解析では、東南アジア・オーストラレーシアに分布するブドウ
葉さび病菌 Neophysopella tropicalis は 3 つのサブグループからなる。それらはタイ・ベトナム、マレーシア・インドネシア、東ティモール・オーストラリアの 3 つの地域に対応する（図 1）。
一方 N. tropicalis の形態形質に関しては、Pota et al.（2014）
では、異なる地域個体群間での有意差は見られなかった。さらに、
N. tropicalis の夏胞子表面についての詳細な観察はまだ行われていない。
本研究では、東南アジア・オーストラレーシアに分布するブド
ウ葉さび病菌の分類学的検討を行うことを目的とした。そこで光学顕微鏡と走査型電子顕微鏡を用いた形態観察を試みた。

泉（筑波大学 生命環境系）

夏胞子の表面構造の観察
試料台に貼ったカーボンテープ上に標本の葉から切り取った 5mm 角葉片と、メスでかきとった夏胞子を貼り付けた。次に、イオンスパッターを用いて白金パラジウムコーティングし、走査型電子顕微鏡を用いて観察を行った。各標本につき任意に 20 個以上の夏胞子を選び、表面 25 µm2 あたりの刺の数を数えた。それを基にした刺の分布密度を用いて Tukey の多重比較検定を行った。
【結果・考察】夏胞子堆を構成する糸状体は円筒状で湾曲していた（図 2）。夏胞子の形状は楕円形、倒卵形であり、どの標本においても夏胞子表面の刺は一様に分布していた（図 3）。

20 µm

図 2. Neophysopella tropicalis の夏胞子堆を構成する糸状体（TSH-R57597）

2 µm

図 1.

rDNA ITS2 及 び LSU D1/D2 領 域 に 基 づ い た
Neophysopella tropicalis の ML 系統樹【材料・方法】
筑波大学植物寄生菌学研究室標本庫（TSH）所蔵の東南アジア・
オーストラレーシア産の N. tropicalis の乾燥標本を形態観察において 12 点供試した。
糸状体と夏胞子の形態観察及び形態測定
メスで標本から夏胞子堆をかきとりスライドガラス上の乳酸に懸濁し、カバーガラスで封入し、光学顕微鏡を用いて観察した。
測定した項目は、糸状体の高さ、背側長さ、幅、背側及び先端の壁厚、夏胞子の長径、短径、壁厚である。各標本につき任意に 20個の糸状体と夏胞子を選び測定した。そして、その測定値を用いて Tukey の多重比較検定を行った。

20

図 3. Neophysopella tropicalis の夏胞子の走査型電子顕微鏡写真（TSH-R56745）
糸状体の高さ、背側長さ、背側及び先端の壁厚、夏胞子の短径、壁厚、刺の分布密度においては、標本間で有意差がみられた。有意差のない標本を同一集団としてまとめ、有意差のある各標本同士は異なる集団としてグループ分けした上で比較した。その結果、いずれの形態形質によるグループ分けにおいても 3 つの地域個体群と対応するものはなかった。また、同一集団としてグループ分
けされた標本は計測した形態形質によって異なり、複数の形態形
質の違いを反映したグループは形成されなかった。よって本研究では、N. tropicalis の各地域個体群を識別できる有効な分類指標となる形態形質は見出されなかった。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 21Ⓒ2024 筑波大学生物学類

日本産シジミタケ属の系統的および形態的多様性について
黒﨑 裕貴（筑波大学 生物学類）

指導教員：出川【背景】
シジミタケ属 (Resupinatus) は担子菌門ハラタケ目に分類される腐生菌であり、巨視的な子実体 (キノコ) を形成する。ハラタ
ケ目では、子実体の形態は傘と柄を有するハラタケ型や、柄が発達しないヒラタケ型、椀型で子実層托が平滑なキフェロイド型など、いくつかの型にタイプ分けされており、属や科内で共通することが多い。しかし、シジミタケ属にはヒラタケ型やキフェロイ
ド型など全く異なる形状の子実体を形成する種が含まれており、さらに他の属との肉眼的な識別が簡単なため野外での材料収集も容易であることから、属内での形態進化を考察するうえで適した材料であると考えられる。
属内の形態進化を考察するには、属内全体の多様性と系統関係の解明が不可欠である。現在、シジミタケ属には 33 種が知られて
おり (He et al., 2019)、欧米やオセアニアから多くの種が報告されてきた。一方、日本での分布はヒラタケ型の 5 種のみが報告されており (勝本, 2010)、キフェロイド型の種は含まれていない。
また、菌類では 1990 年代以降の分子系統解析を加味した分類学的再検討により、日本産の材料が欧米産とは別種である事例が相次いで報告されている。日本産のシジミタケ属では分子系統解析の伴った研究が行われておらず、さらに網羅的な収集やその形態評価も行われていない事から、潜在的な多様性が正確に評価されていない可能性がある。
そこで本研究では日本に分布するシジミタケ属の種レベルの多様性を把握することを目的に、日本のシジミタケ属の試料を広く収集し形態観察を行うとともに、分子系統解析によって属内での系統関係を明らかにした。
【方法】
日本各地 17 地点からシジミタケ属の 48 標本を採集した。これらの子実体または分離株、および国立科学博物館の菌類標本庫にシジミタケ属として登録のある標本 24 点から DNA を抽出し、菌類のバーコード領域である核リボソームDNAのITS領域をPCRで増幅後、配列を取得した。取得した配列と GenBank に登録されているシジミタケ属菌の配列、McDonald (2015) で使用された
未公開配列から、IQ-TREE を用いて最尤系統樹を作成した。また
子実体の形態観察を行い、既知種との比較を行った。肉眼的特徴
は採集時の子実体、顕微鏡的特徴は乾燥標本に基づいて観察した。
【結果と考察】系統解析の結果、日本産 63 標本由来の配列と GenBank 上の日本産の 3 配列は、末端で強く支持される 5 クレード (Ⅰ – Ⅳ、Ⅶ) と 1 配列のみからなる 2 クレード (Ⅴ、Ⅵ) に分けられた。ク
レードⅠ – ⅣおよびⅦに含まれる日本産の配列は 34 配列 (Ⅲ)、23 配列 (Ⅰ)、3 配列 (Ⅳ、Ⅶ)、１配列 (Ⅱ)であった。クレードⅠ、
Ⅱにはそれぞれ日本から既報告である R. applicatus (シジミタケ)と R. striatulus (ヒメシジミタケ) のタイプ標本由来の配列が含まれた。クレードⅢは最も多くの日本産の配列を含むとともに、タイプ標本由来ではない中国やアメリカ由来などの配列も含まれた。また、国立科学博物館に R. applicatus として登録されている

21

洋介（筑波大学 生命環境系）

標本 21 点のうち、ITS 領域を取得できたほぼすべての標本は本クレードに含まれた。クレードⅣ – Ⅵはタイプ標本由来の配列を含まず、日本産の配列のみが含まれた。クレードⅦにはタイプ標
本由来でない複数種の種名が認められた。また、既報告種である
R. dealbatus (ヒメカワキタケ) と R. merulioides は標本が入手できず、R. trichotis (クロゲシジミタケ) は標本から ITS 領域を取得できなかったため、本研究では検討できなかった。
形態観察の結果、クレードⅠ – Ⅲ、Ⅵ、Ⅶの子実体はヒラタケ型であり、クレードⅣ – Ⅴはキフェロイド型であった。7 クレード中、最も多くの標本数を得られ、未記載種であると考えられる
クレードⅢについて以下に詳述する。
主な特徴: 子実体はヒラタケ型または殻斗型で基物に背着から側生し、暗灰色で基部に白色から黒色の毛を有し、縁はヒダが透け
条線様をなす。担子胞子は楕円形から長楕円形で表面は平滑、5.0– 6.4 × 2.8 – 3.8 µm (平均 5.4 × 3.4 µm, n = 30）、シスチジ
アは円筒形や便腹型など、厚壁で被覆物を伴うことが多い。PDAと素寒天培地上で 無性世代や hour - glass 細胞は確認されない。
落枝や倒木上、5 – 11 月に採集。日本、中国、アメリカなど。
シジミタケ属内では、ヒラタケ型でかつ厚壁のシスチジアを持
つ種は R. niger しか知られないが、クレードⅢと同種とは胞子サ
イズやその他の構造が異なり明瞭に区別できる。さらに ITS 領域に基づく系統解析の結果も踏まえると、クレードⅢは未記載種であると考えられ、今後新種記載を行う予定である。
国立科学博物館に R. applicatus として登録されている標本の多くはクレードⅢに含まれたが、両者は胞子やその他の構造から明瞭に区別できる。このような形態的な差異が明瞭である場合にも混同が生じており、国内における本属の多様性は過小評価されていることが示唆された。さらに 60 点の標本ですら 5 つの未知クレード (Ⅲ – Ⅶ) が見いだされた。これは国内での既報告種数に匹敵し、これまで報告のないキフェロイド型や未記載種も含まれたことから、国内に分布するシジミタケ属の種数はより多いと考えられる。
本研究により、日本に分布するシジミタケ属は、これまで知られていたよりもはるかに多様性が高いことが示唆された。今後、未知系統であるクレードⅣ – Ⅶについて形態学的に検討するとともに、国内からさらなる網羅的な材料収集を行うことで、日本におけるシジミタケ属の多様性解明を目指したい。
【引用文献】He, MQ. et al. (2019) Notes, outline and divergence times ofBasidiomycota, Fungal Diversity, 99, 105–367.
勝本謙 (2010) 日本産菌類集覧, 1177pp. 日本菌学会関東支部.
McDonald, J. V. (2015) Morphological and Molecular
Systematics of Resupinatus (Basidiomycota), Electronic Thesis
and Dissertation Repository, 3135, 299pp. The University ofWestern Ontario.

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 22Ⓒ2024 筑波大学生物学類

歴史の古い草原は根茎根系量が多いか？―新しい草原、森林との比較
寺嶋 悠人（筑波大学 生物学類）

指導教員：田中【背景・目的】自然攪乱の抑制や人為管理の減少などにより、世界でも日本でも草原が近年急速に減少している。絶滅危惧の動植物の 3～
4 割は草原性である。草原がこれほど減少したことは歴史上初めてであり、草原とともに社会が何を失ってしまうのか未知である。
これまでに、草原の継続期間とともに植物やチョウ類 1、・微生物 2 の多様性が高い分かっている。
また歴史の古い草原は、生物多様性だけでなく、様々な生態系サービスが高い可能性がある。歴史の古い草原には根系が大きい植物種が多い 3。そこで私は、歴史の古い草原は斜面防災の機能が高い可能性があることに着目した。本研究は、斜面防災機能と関連が深い根系量が歴史の古い草原で多いのかを、同一地域の新しい草原や森林との比較によって検証した。

健太（筑波大学 生命環境系）

る。植物の群集生態学においては、遷移の進行とともに地下部への投資の大きい K 淘汰種が増えると考えられている。こうした生態学的機構によって根量の時間的変化を説明できる。
現在、草原への植林を進める世界的キャンペーンが存在しているが、こうした取組は生物多様性保全に逆行すると、近年厳しく批判され始めている。今回の成果から、歴史の古い草原を森林化させることは生物多様性のみならず生態系機能を低下させる可能性があることを問題提起したい。

【方法】
長野県・菅平高原に存在するスキー場周辺で、少なくとも300 年以上継続している古い草原と、古い草原の管理放棄ある
いは植林によって成立した林齢 40～90 年ほどの森林、そうした森林を伐採してから 50～70 年が経過した新しい草原、という 3 つの植生に対して、各 8 地点を調査地とした。7 月～11 月
にかけて、各地点で 20m のトランセクトを設け、直径 5~8 ㎝・深さ最大 30 ㎝の土壌コア試料を約 5m 間隔で 5～6 本採取した（合計 24 地点・140 コア）。採取した土壌コアを深さ 5 ㎝ごとに切り出して根系の乾重量を計測した。

図 1 歴史の古い草原の体積あたり根乾重は、新しい草原や森林と比べて多い傾向がある。森林・新草原・古草原について各 5・2・
4 地点、11・5・14 コアのデータに基づく。
森林

新草原

古草原

【結果・考察】土壌深ごとの平均根重量を全深度で合計すると、古草原・新草原・森林の値がそれぞれ 10.0・3.2・4.7 mg/cm3 であり、古草原は新草原や森林と比べて根量が多い傾向があり、新草原と森林は近い水準だった。深度ごとに見ると、土壌深 15 cm までの浅層の根量は古草原＞新草原＞森林という傾向があり、土壌
深 15～30cm の深層では古草原と森林の根量が同水準で、新草原の根量が少ない傾向があった（図 1・図 2）。
これらの結果から、継続期間の長い古い草原は豊かな根茎が発達しているのに対して、そこが森林化したり、再草原化してからの継続期間が短い場合には、根量が少なくなると考えられる。今回の調査では、樹木の太い根に土壌コアが採集器が当たると採集そのものができず、樹木幹の直下または周辺の根量を評価できていない可能性がある。しかし、幹と幹の中間付近の 図 2 根乾重は試料ごとに大きくばらつくものの、深度ごとの根乾
根量が少ない場所が斜面崩壊の弱点になると考えられており 4、 重は植生間で異なる傾向がある。
そうした場所の根量が斜面崩壊抑止機能の指標となる。そのため、今回評価した根量の違いは、古草原の斜面崩壊抑止機能が 【参考文献】
1
井上ほか. (2021) 保全生態学研究 26: 1-10森林や新草原よりも高いことを示唆している。
2
Honnay et al. (2017) Biol. Cons. 212: 196–208
古草原の根量が新草原よりも多くなる機構として、草原を構 3
Inoue, T. (2023). Doctoral dissertation, Univ. Tsukuba
成する植物種の組成が草原の継続期間とともに変化し、歴史の 4 北原 (2010)水利科学 53.6: 11-37
古い草原には根系が大きい植物種が多くなる 3ことが考えられ
22

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 23Ⓒ2024 筑波大学生物学類

アサガオの開花時刻制御遺伝子の探索と機能解析
高井 大樹（筑波大学 生物学類）

指導教員：小野道之（筑波大学 生命環境系）

として緑色蛍光タンパク質の一種である ZsGreen とカナマイシ
ン耐性遺伝子 NPTⅡを含む。
(2) 組換え EVF1 の導入
先行研究で作成された組換え EVF1 導入ベクターを用いて，アグロバクテリウム法を用いて Violet の EC (Embryogenic cell)を形質転換し，選択培養を行った。
(3) QTL-seq に向けた育成先行研究で得られた第 4 染色体の QTL は極めて広く，この原因として内部に動原体を含み組換えが抑制された可能性がある。
より詳細な解析のために EB とメキシコ原産の系統である
Mexico 及びギニア原産の Africa を用いた QTL-seq を行うことにし，解析に向けて交配を行った。
(4) DFOT1 ホモログの探索
NCBI BLAST アルゴリズム及びアサガオのゲノムデータベースである Asagao genome project (http://viewer.shigen.info/
asagao/)，タンパク質立体構造予測を行う AlphaFold2 簡易版(https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb)を用いて DFOT1 の相同遺伝子を探索した。

【背景・目的】
植物の中には一日のうち一定の時刻に開花する種が多数知られている。この開花時刻の決定には植物自身の遺伝的要因のほか，
光周期や温度といった環境要因，植物の成長や加齢といった内的要因が複雑に絡んでいると考えられている。
植物が繁殖のために行う開花という現象は農業においては収量に直結する問題である。実際，イネ科植物においては熱ストレスを受けて花粉管や葯の発達阻害が発生し不稔となる障害が知られており(Callens, et al. 2023)，開花時刻をずらすことで高温障害を回避する研究が行われているが，開花の詳細なメカニズムは殆ど解明されていない。
本研究の材料であるアサガオ Ipomoea nil は，日本産のモデル系統においては光シグナルを受けて暗期の開始後 10-12 時間
後，朝方に開花するという暗期の開始に依存的な開花を示し，この開花時刻制御は約 24 時間周期の概日リズムの影響を受けていることが知られている。また，小野研究室は開花時刻に関する変異体系統である Evening Blue (EB)を保有しており，EB はViolet や TKS といった日本産系統と異なり，明期の開始 12 時
間前後，つまり夕方から夜に開花するという明期の開始に依存的な開花を示すことが先行研究で明らかになっている。
EB と Violet を用いて先行研究で行われた QTL (Quantitative
Trait Locus)解析により，アサガオの開花時刻を決定する QTL
は第 3, 4 染色体にあることが判明しており，詳細な解析により得た開花時刻決定遺伝子の候補は EVF1 (evening-flower 1)と命名されている。
本研究では，この EVF1 をゲノム編集技術によりノックアウ
トし，その後 Violet と EB の EVF1 をそれぞれ導入すること
で，EVF1 の開花時刻制御における機能を解析する。
また，イネにおいて開花時刻を制御する遺伝子として近年同定された DFOT1 (diurnal flower-opening time 1, Wang, et al.
2022)のホモログをアサガオにおいて探索し，先行研究で同定された QTL との関連を調査した。

【結果・考察】詳細は発表会にて報告する。
【展望】
形質転換体の育成を継続し，evf1 ヌルセグリガントを得た後に，交配により組換え EVF1 を導入し，開花時刻を計測する。
また，DFOT1 ホモログのノックアウトを行い開花時刻を計測して機能解析を試みる。
以上のような実験から，植物に普遍的にみられる開花制御のメ
カニズムの解明を目指す。
【参考文献】
・ Callens C, Fernandez-Goméz J, Tucker MR, Zhang D,
Wilson ZA. Heat stress responses vary during floret
development in European spring barley cultivars. Front Plant
Sci. 2023;13:918730. doi:10.3389/fpls.2022.918730
・ Wang M, Zhu X, Peng G, et al. Methylesterification of cellwall pectin controls the diurnal flower-opening times in rice.
Mol Plant. 2022;15(6):956-972. doi:10.1016/j.molp.2022.04.004【材料と方法】(1) EVF1 のノックアウト
EVF1 のノックアウトには CRISPR-Cas9 を用いた。先行研究で設計された gRNA では large deletion が期待できないこと，
ベクター作成に難航したことから，オンラインツール
CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp/)を用いて gRNA を再設計
し，TaKaRa DNA Ligation Kit <Mighty Mix>を用いてエント
リーベクターにクローニングした。これらと ZsGreen を導入したエントリーベクターを用いて Overlap-Extention PCR により
gRNA 発現カセットの全長フラグメントを作成し，Invitrogen™
LR Clonase™ II Plus enzyme mix を用いて LR 反応を実行しデスティネーションベクターにクローニングした。このノックアウ
トベクターは Cas9，3 つの gRNA 発現カセット，選択マーカー【謝辞】
本研究に際し，系統 Evening Blue を提供して頂いた故 米田
芳秋先生（静岡大学名誉教授）に感謝と哀悼の意を表すると共に，中村信雄先生（函館白百合学園中学高等学校），情報提供を頂いた遠藤真咲先生（農研機構），土屋亨先生（三重大学准教授）に厚く御礼申し上げます。

23

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 24Ⓒ2024 筑波大学生物学類

トマトを用いた細菌性食中毒に対する食べる３価ワクチンの開発
平井 唯子（筑波大学 生物学類）

指導教員：小野【背景・目的】「食べるワクチン」は本学の令和５年度「幸多き人生 100 年時
代を創る『知』活用プログラム」 に採用された研究プロジェクトの１つである。食用植物のゲノムにウイルスや細菌の抗原遺伝子を導入し、 抗原タンパク質を可食部に蓄積させることで、その食物の摂取と共に粘膜免疫と全身免疫の両方を誘導しようというこの研究は、 従来のワクチンよりも低コストで安全性の高いワクチンを実現することが可能であるとして多くの注目が寄せられている。特に途上国では製造・輸送・保存のコストや専門の医療従事者の不足などから、現行のワクチンが行き届いておらず、食中毒をはじめとした感染症が蔓延している現状がある。これに対して、収穫後の加工工程が最小限で、保存に極度の低温を必要とせず、摂取が容易である食べるワクチンは非常に有効な解決策になると考えられる。さらに、栄養価の高い植物を発現宿主に用いること
で、紛争地域の難民キャンプや災害による被災地などで、栄養とワクチンの同時提供を可能にすることも期待されている。
コレラ毒素（CT）、2 型ベロ毒素（VT2）、エンテロトキシン（CPE）の３種は、それぞれ細菌性食中毒の原因となるコレラ菌（Vibrio cholerae）、腸管出血性大腸菌（Enterohemorrhagic
Escherichia coli）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）が産生する毒素である。これらは毒性を持つ病原性部位と、それ自体は毒性を持たず毒素の細胞内侵入などに役立つ非病原性部位の2 つの部位に分けることができる。先行研究において 3 種の毒素の非病原性部位であるコレラ毒素Ｂサブユニット（CTB）、2 型
ベロ毒素 B サブユニット（VT2B）、エンテロトキシン C 末端領域（C-CPE）のうちの 2 つを組み合わせた CTB:C-CPE とVT2B:C-CPE の二価ワクチンが作製され、マウスに対し免疫原性を持つことが報告された 1, 2。そこで本研究では CTB、VT2B、CCPE の 3 つの遺伝子を融合し（以下 CVC）、細菌性食中毒に対する三価の食べるワクチンを開発することを試みた。
【材料】
ナス科のモデル植物で矮性のトマトである、マイクロトム(Lycopersicon esculentum)をワクチンの発現系として使用した。
【方法】（１）導入ベクターのコンストラクト
トマト果実特異的に発現する E8 プロモーターの下流に植物にコドン最適化した CVC 遺伝子を組み込んだ T-DNA 配列を
MultiSite Gateway Intermediary Vector の pK7m24GW に導入した（pE8::CVC）。また、この T-DNA 配列には選抜用にカナマ
イシン耐性遺伝子（NPTⅡ）及び緑色蛍光タンパク質遺伝子（ZsGreen）を組み込み、これらのプロモーターにはそれぞれ
NOS プロモーター及び CaMV35S プロモーターを用いた。

道之（筑波大学 生命環境系）

マイクロトムの種子を MS 固形培地に無菌播種し、播種後 7～
10 日目の子葉切片を得た。この子葉切片を前述のベクターを持つ
アグロバクテリウム懸濁液に 10~20 分浸漬した後、共存培地（MS＋40 µM アセトシリンゴン＋1.5 mg/l ゼアチン）上で 2 日間暗条件に置き、形質転換を行った。形質転換後の子葉切片はカルス誘導培地（MS＋1.5 mg/l ゼアチン＋100 mg/l カナマイシン）に植
え、25℃, 16L /8D で 4 週以上培養した後、形成されたカルスから得たシュートを切り離して、シュート誘導培地（MS＋1.0 mg/l ゼ
アチン＋100 mg/l カナマイシン）に移した。この時、青色光で蛍光観察を行い ZsGreen の蛍光がみられるシュートのみを選抜した。長さが 1~2 cm まで達したシュートを発根培地（1/2MS＋50
mg/l カナマイシン）に移し、2 回に分けて発根選抜を行って形質転換体を得た。馴化した形質転換体を P1P 栽培室で結実させ、赤い果実（stage Orange to Deep orange～Red Ripe）をサンプリン
グし、採種の後、分析に使用するまで-80℃で凍結保存した。
（３）CVC 発現量解析
果実からタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングで抗
CTB 抗体を用いて CVC の発現量を解析した。タンパク抽出には2×IM buffer や CHAPS buffer など複数のバッファーを用い、抽出条件の検討も併せて行った。
【結果・考察】感染させた約 400 片の子葉切片から 13 系統 25 個体の形質転換体を得た。果実からタンパク質を抽出して、抗 CTB 抗体を用いてウェスタンブロッティングを行っているが、現在のところ目的の40.2 kDa 付近にCVC タンパク質と思われるバンドは確認できていない。
CVC タンパク質の発現が検出できていないことについては、①
CVC の転写が行われていない、または転写レベルが極めて低い、②CVC は発現しているが抽出方法に問題がある、③トマトのプロ
テアーゼ活性によって、CVC タンパク質が発現後直ちに分解されている、などの可能性が考えられる。②について、CTB は多量体を形成し膜脂質に結合する性質を持つため、抽出の際に可溶化しにくく沈殿していることが考えられる。バッファー組成や pH な
ど、抽出条件の更なる検討を行っていく。①・③については、コンストラクトを改良した新規ベクターの作成を現在行っているほか、今後、小胞体移行シグナル（KDEL）などを CVC 遺伝子に付加して細胞内局在を変える実験を行うことなどを検討している。
詳細については発表会で報告する。
【参考文献】
1） Suzuki et al. 2018. Front. Immunol, 9: article 2320
2） Hosomi et al. 2018. Inter. Immunol, 31(2): 91–100（２）アグロバクテリウム法によるマイクロトムへの目的遺伝子の導入と組織培養・個体再生24つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 25Ⓒ2024 筑波大学生物学類

ベタレイン生合成経路遺伝子の導入による黄花アサガオの改良
安納 萌香（筑波大学 生物学類）

指導教員：小野道之（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】
生合成遺伝子として、BvADHα、BvCYP76AD6、BvDOD、
花卉植物は永らく、より美しい花、より珍しい花を目指した色
MjDOD を使用した。また、形質転換体選抜のためにカナマイシ
彩豊かな花々の作出が行われてきた。近年では遺伝子組換え技術
ン耐性遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子(ZsGreen)を用いた。
による品種改良も盛んに行われており、モデル花卉植物の一つとしてアサガオ(Ipomoea nil )が使用されている。アサガオは日本独【方法】
自に発展した園芸植物であり、江戸時代から多様な花色や模様、
1. ベクターコンストラクトの改良と形質転換形をしたアサガオがつくられ現代まで保存されてきた、鑑賞的価
BvADHα 、 BvCYP76AD6 、 BvDOD 、 AmVT-MjDOD 、
値の高い花である。一方で、江戸時代の図版には残されているがZsGreen を CaMV35S プロモーターで恒常的に発現させるベク
現存しないものもある。中でも黄花のアサガオは「幻のアサガオ」
ターを設計した。それぞれ In-Fusion Cloning で各モジュールベと呼ばれ育種家・愛好家の夢となっている。本研究最大の目標は、クターを作成し、Golden Gate Cloning で Binary Vector に組み
遺伝子組換え技術を用いた幻の黄花アサガオの再現である。
込んだ。アグロバクテリウムに形質転換し、アサガオの未熟胚由植物色素であるフラボノイド、カロテノイド、ベタレインの 3 種
来の胚性カルスに形質転換した。
は黄色の化合物を含む。アサガオはフラボノイドの一種であるア
ントシアニンを花弁で合成することで、赤や青、紫色を呈してい2. 一過性発現による改良ベクター有効性の検証る。先行研究において、フラボノイドの一種であるオーロンやカ
改良ベクターをアグロバクテリウムに形質転換し、アグロイン
ロテノイドの蓄積による黄花アサガオの作出が行われたが、それフィルトレーション法によりベンサミアナタバコ（Nicotiana
らは淡黄色に留まっている。ベタレインは他 2 種の色素とは異な
benthamiana）の葉へ導入した。また、Particle Gun によりタマってアサガオが合成していない色素であり、ベタレインを用いたネギ（Allium cepa）の鱗葉表皮細胞へ導入し、顕微鏡下で蛍光観
黄花アサガオは作出されていない。そこで本研究室では、ベタレ
察を行なった。
イン生合成遺伝子導入による黄花アサガオの作出が試みられてきた。ベタレインは黄色のベタキサンチンと赤色のベタシアニンに
3. 交配による生育障害を回避した濃色化大別される。これまでにベタキサンチン生合成経路遺伝子の導入
35S 黄花系統と花弁特異的黄花系統、薄色系のアサガオ品種とにより、明瞭な黄色を呈するが重篤な生育障害が生じる 35S 黄花の交配を行なった。
系統（異所的過剰発現する CaMV35S プロモーターを使用）と、淡黄色に留まるが生育障害のない花弁特異的黄花系統（花弁特異【結果・考察】的発現プロモーターを使用）が得られている。生育障害は L1. 黄花ベクターの改良
DOPA の意図しない代謝に伴う活性酸素種の発生によるもの、淡改良ベクターを完成し、形質転換を進めている。
黄色はベタキサンチンの合成量が少ないためであり、共に LDOPA か ら Betalamic acid へ の 代 謝 を 行 う DOPA 4,52. 一過性発現による改良ベクター有効性の検証
dioxygenase (DOD)の活性が弱いことが原因であると推察された。 詳細は発表会にて報告する。
そこで本研究では、より強い DOD 活性を持つ DOD(A)を導入する（Sheehan et al., 2019）などのベクターコンストラクトの改良
3. 交配による生育障害を回避した濃色化を行うこと、生育障害を生じない濃黄色を呈する形質転換体の作
現在、交配により得られた種子を播種して F1 を栽培中。
出を目指した。
【展望】【材料】
改良ベクターを導入した形質転換体の作出、花弁で合成されたベ
植物材料として、AK77、35S 黄花系統、花弁特異的黄花系統を用
タキサンチンの構造決定を行う。また、交配によって得られた系
いた。AK77 は、アントシアニン合成に関わる酵素 DFR-B
統の生育障害の有無と花色を確認する。
(dihydroflavonol 4-reductase)変異体で白花のアサガオ系統。35S
黄花系統は、AK77 を背景にビート（Beta vulgaris）由来の【謝辞】
BvCYP76AD6 およびオシロイバナ（Mirabilis jalapa）由来の cDNA の提供を頂いた Samuel F. Brockington 博士（ケンブリッ
MjDOD (DOPA 4,5-dioxygenase)を CaMV35S プロモーターで ジ大学）、L C-MS/MS による L-DOPA 定量を行なっていただい発現させた形質転換体系統。花弁特異的黄花系統は、AK77 を背た朝比奈雅志教授 (帝京大学)に深く御礼を申し上げます。
景 に ビ ー ト由 来 の BvADHα (alcohol dehydrogenase ） 、
BvCYP76AD6 を CaMV35S プロモーターで発現させ BvDOD(DOPA 4,5-dixygenase)を花弁特異的プロモーターで発現させた形質転換体系統である。導入ベクターの改良にはベタキサンチン25つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 26Ⓒ2024 筑波大学生物学類

アイスプラント由来 RNA binding protein による環境ストレス耐性ジャガイモの開発
新田 佳奈美（筑波大学 生物学類）

指導教員：菊池彰（筑波大学 生命環境系）【導入】
影響を与えず、かつ形質転換体と非形質転換体の区別がより容易
塩害などの環境ストレスによって農作物はダメージを受け、そになるカナマイシン濃度の検討をカナマイシン耐性系統の葉切片の収量が低下する。食料と飼料の 40％を生産している灌漑農地のを用いて行っている。
*1
50％が塩によるダメージを受けており 、世界人口の増加によって起こる食料問題解決にあたって重大な課題であると考えられる。 ＜２＞ コンストラクトの作成と遺伝子導入
ジャガイモ（Solanum tuberosum L.）は世界 4 大作物にも数え
カナマイシン選抜では再分化体が得られてもエスケープが多い
られる主要な作物であるが、他の作物より根の分布が浅く、地下ことから、エスケープ出現の可能性が低いグルホシネートを有効に可食部である塊茎が出来るという特徴から、土壌の環境条件の成分とする除草剤Basta を選抜マーカーとする新しいコンストラ
影響を受けやすい。そこで、塩ストレス耐性を持つジャガイモのクトを用いることとした。これに合わせ、アグロバクテリウムの作出に需要があると考えられる。
菌株を LBA4404 株から同じナス科のトマト （ Solanum
本研究では、塩生植物であるアイスプラント
lycopersicum）で形質転換効率が高い AGL1 株に変更した。
（Mesembryanthemum crystallinum ）から単離された RNA
binding protein 遺伝子を、ジャガイモに導入し、環境ストレス耐 【方法】
性を向上させることを目的としている。
1. 全身高発現性の pGWB602、GFP 融合型全身高発現性の
pGWB605 にそれぞれ McRBP を導入し、シークエンス解析【材料】
によって遺伝子の導入を確認した。
ジャガイモ：Solanum tuberosum L. cv. Desiree
2. エレクトロポレーションによりベクターをアグロバクテリウ
古くから研究材料として使用され、耐塩性が比較的高いオランムに導入し、コロニーPCR によってコンストラクトを保有す
ダ由来の品種である*2。Murashige and Skoog (MS) 固形培地上
るアグロバクテリウムを得た。
で継代培養 (25℃、16 時間明期、8 時間暗期)し、維持している。
3. ジャガイモの葉切片に得られたアグロバクテリウムAGL1株
導入遺伝子：RNA binding protein (McRBP)を感染させ、植物ホルモンを加えた MS 固形培地でカルス誘
東京農工大学山田研究室において大腸菌の耐塩性スクリーニン
導、再分化誘導を行った。
グにより単離されたアイスプラント由来の遺伝子である。
RNA シ
4. 得られた再分化体は選抜マーカーであるBasta で選抜を行っャペロンとしての機能が考えられており、RNA の転写を安定さた。
*3せ、塩耐性を付与すると考えられている 。
【結果・考察】＜１＞ アグロバクテリウム法による遺伝子導入
Basta を選抜マーカーとするコンストラクトの作成に成功した。
【方法】
このコンストラクトを保有するアグロバクテリウムAGL1株を用
1. ジャガイモの葉切片に McRBP を保有するアグロバクテリ
いてジャガイモの葉切片に感染させたところ、再分化体が得られ
ウム LBA4404 株を感染させ、植物ホルモンを加えた MSている。現在、Basta を培地に加えて選抜を進め、耐性系統の取固形培地でカルス誘導、再分化誘導を行った。
得を進めている。今後、アグロバクテリウムの除去が完了した段2. 得られた再分化体は選抜マーカーであるカナマイシンで選階で、導入遺伝子の存在を確認し、形質転換体か否かの判定を行抜を行った。
う予定である。
3. 植物ホルモンを加えていない培地に再分化体を移植し、発根した個体について、アグロバクテリウムの除去確認試験
【展望】
を行った。
今後も感染を継続し、形質転換体の取得を目指す。形質転換体
4. 除去確認した再分化体から簡易抽出した DNA を用いてが得られた際には、in vitro での耐塩性評価を行い、選抜系統を得
PCR を行い、形質転換体であるかの確認を行った。
る。選抜系統については実際の生育環境により近い環境の栽培室
や特定網室において耐塩性評価を行いたい。また、発現量評価や、【結果・考察】GFP 融合 McRBP の局在評価、ストレス環境下での生理的評価をジャガイモの葉切片へアグロバクテリウムを感染させ、複数の行い、機能の一端を明らかにしたい。
再分化体を得た。
アグロバクテリウム除去確認後の再分化体DNAにおいて、PCR を行ったが McRBP のバンドは確認されなかっ【参考文献】
た。再分化体のうち、発根が良い個体について検証を行うとカナ
1. Breeding Science 65: 85–102 (2015)
マイシン耐性遺伝子のみが導入されていた。現在までに得られた
2. ジャガイモ事典：財団法人いも類振興会(2012)
再分化体は形質転換体ではないエスケープまたは、カナマイシン
3. Plant Biotechnology Journal17: 801–811 (2019)
耐性遺伝子のみ導入されたものであった。そのため、再分化に悪26

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 27Ⓒ2024 筑波大学生物学類

耐塩性遺伝子マングリンを導入したジャガイモのストレス耐性と生産量についての評価
大森 圭悟（筑波大学 生物学類）

指導教員：菊池彰（筑波大学 生命環境系）

2. 成長・生産量評価：NT と組換え体について、約 1 ヶ月間の順
化後、特定網室に移動し、0 、50、150 mM NaCl の灌水処理区に分けて、13 週間の栽培評価を行った(2023.11.01 ~ 2024.01.31)。
評価項目は、成長量、光合成量子収量(QY)、葉緑素量の指標となる SPAD 値、生産量の 4 つである。前者 3 項目は 1 週間毎に計測を行い、QY は FluorPen 100 を、SPAD 値は葉緑素計 SPAD502 を使用した。生産量は栽培終了後、地上部の乾燥重量、塊茎の個数、塊茎重量、塊茎比重を測定することで評価を行った。

【背景と目的】
過剰な塩を含む土壌で植物を生育させると、吸収された塩による浸透圧ストレスやイオンの恒常性の崩壊を引き起こし、その生育が著しく抑制される。近年、地球規模の気候変動や不適切な灌漑によって、世界中で塩害地が拡大しているが、これは作物の耕作に利用可能な農地が減少しているとも言い換えられる。その一方で、現在、増え続ける世界人口に伴う食料需要の増加が発生しており、その需要を賄うための作物生産量の向上が必要とされている。
これらの背景から、対策の一つとして、主要作物の耐塩性を強化することが考えられている。本研究で扱うジャガイモ(Solanum tuberosum L.) は、世界中で広く栽培されている重要作物であるが、可食部が土中の塊茎であるため土壌からの塩スト
レスに曝されやすい。本研究では、耐塩性遺伝子「マングリン」
を導入した新規系統の作出を目指すとともに、既存の組換え体を用いて、塩ストレス条件下での成長性と生産量、葉における活性酸素量を可視化し、マングリン導入系統の耐塩性評価を試みた。
【材料】
・ジャガイモ：本研究では、古くから研究材料として使用され*1、耐塩性が比較的高いオランダ由来の品種 Desiree を用いた。また、使用したマングリン遺伝子組換え系統(114-1、144-6)は先行研究
により Desiree を用いて作出された。非組換え体(NT)を含む系統
は Murashige snd Skoog (MS) 固形培地上で継代培養 (25℃、16
時間明期、8 時間暗期)し維持している。
・導入遺伝子：マングリン遺伝子は熱帯および亜熱帯地域の河口汽水域で生育する塩生植物であるマングローブの一種、オバナヒ
ルギ (Bruguiera sexangula) から単離された耐塩性遺伝子である*2。マングリンタンパク質は葉緑体に局在し、分子シャペロン様の活性を持つことやマングリン遺伝子の導入によってタバコ(Nicotiana tabacum)やユーカリ(Eucalyptus camaldulensis)で耐塩性が向上したことが報告されている*3。

3. 生理的耐性評価：通常、環境ストレスに曝された植物では体内の活性酸素(ROS)を除去しきれなくなり酸化障害を被るが、マン
グリン導入系統では ROS による障害の抑制が期待される。そこ
で、ROS の 1 種である H2O2 により酸化重合し、茶褐色の沈殿を生じる 3，3’-ジアミノベンジジン（DAB）を用いた染色を行い、組換え体の環境ストレス耐性を評価した。
継代後４週間の植物体の茎頂側から数えて 3 番目の葉をシャーレに乗せ、チャンバー内で 2 週間、低温下で光ストレスを与えた（10℃、150μmol/m2/s）。ストレス期間終了後、取り出した葉に対して、10 mM MES バッファー(pH 6.5)を含む 1 mg/ml DABを用いた 5 分おき 3 回の真空浸潤を行い、暗所で一晩浸した。その後、70℃の 90%エタノールで 3 時間インキュベートして反応を停止させ、70%エタノール中で観察、撮影を行った。さらに、撮影した写真を解析し、染色度合いを数値化した。
【結果と考察】1. 組換え体作出：これまでに約 200 枚の葉切片に対し感染作業を行い、十数個体の再分化体を得ることができたが、いずれも除草剤を含む培地での発根が見られなかったことから組換え体ではな
いと考えられる。今後も新たな組換え体の獲得を目指すとともに、形質転換に用いるアグロバクテリウム株をより感染効率の高い株に変更することを検討している。
2. 成長・生産量評価：栽培 11 週目までの経過として、114-1、1446 はNT と比較して塩ストレス下において有意に成長量が大きく、150 mM の塩ストレス下において有意に高い SPAD 値を維持している。また、葉の健全度の指標となる QY については系統間での差は見られていない。最終的な生育状況や収量については、栽
培終了後に測定結果をまとめ、発表会にて報告する。

【方法】
1. 組換え体作出：継代後 3~5 週間後の植物体の葉を用いて、アグロバクテリウム法によりジャガイモにマングリン遺伝子を導入した。アグロバクテリウムを感染させた外植片を、植物ホルモンを加えた MS 固形培地の上で培養し、カルスの形成と再分化体の形成を誘導した。導入した遺伝子にはマングリン遺伝子の他に除草剤（グルホシネート）に対する耐性遺伝子も含まれており、適当な時期に再分化誘導用の培地に除草剤を加えることで、除草剤耐性をもつ組換え体のみ再分化体を誘導した。さらに、得られた再分化体を除草剤が含まれる MS 固形培地上で培養し、発根が確認できた個体を組換え体候補系統とした。

3. 生理的耐性評価：現在評価中であるため、詳細は発表会にて報告する。
【参考文献】*1 ジャガイモ辞典：財団法人いも類振興会 (2012)*2 Plant Cell Physiology 43: 903-910 (2002)*3 Journal of Plant Research 126: 141-150 (2013)27

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 28Ⓒ2024 筑波大学生物学類

近縁野生種を用いた乾燥耐性を持つ育種系統の樹立
高橋 陽菜（筑波大学 生物学類）

指導教員：菊池【導入】
昨今地球温暖化によって乾燥化が問題となっており、農作物の生育にも大きな影響を与えると考えられる。
世界四大作物であるジャガイモ(Solanum tuberosum)は、主食としてヒトの食生活を長きにわたり支えてきた植物である。その重要性からより安定した供給が必要とされている。その収量を安定させるためには乾燥ストレスに対しての耐性を持つことが重要である。
乾燥耐性を付与するために乾燥に強い野生種との交配をおこなうという方法がある。現在栽培されている品種も、近縁種との交配によって得られているものであるため、同様に近縁野生種との交配を通してその有利な性質である乾燥耐性を導入することで有用性が高まると考えられる。
本研究では、ポリエチレングリコール(Polyethyleneglycol、PEG8000)を用いて乾燥ストレスを模擬し、選抜を行うことで、乾燥耐性を獲得したジャガイモ育種系統を樹立することを目的とする。

彰（筑波大学 生命環境系）

親の野生種系統によって乾燥耐性の強度が異なると考えられた
ため、先行研究で行っていた予備試験の結果から、11TA 系統を親に持つものは 100 g/L、31TA、27TA 系統を親に持つものは120g/L の PEG 濃度とした。ジャガイモの生育に影響を与えない
濃度は PEG に換算して約 37~52 g/L であることから、実験に使用した PEG 濃度はその 2~3 倍の濃度であり、ジャガイモにとって水を吸収しにくい疑似的な乾燥条件である。
3.回復処理PEG 溶液を抜き、共洗いの後に液体 MS 培地を同量与えた。液
体 MS 培地で 3 日間振盪培養した。
4.計測・解析
茎頂部分の上部についている葉から下に向かって全ての葉のダ
メージにスコアをつけた。ダメージがないものを 3、半分以上緑だが葉が丸まっているものを 2、半分以上枯れているものを 1、完
全に枯死したものを 0 とした。全葉のスコアを使い、系統ごとの平均スコアを算出した。
ここで生育不良であったもの、カルス化してしまったもの、茎から枯死してしまったものなど、スコアをつけられないものを含む系統は再試験を実施した。

【材料】
・ジャガイモ：栽培種と近縁野生種を掛け合わせた F1 世代を用いた。
本研究での近縁野生種とは 11TA(S. chillonanum)、31TA(S.
okadae)、27TA(S. jamesii)である。また、野生種は二倍体であり栽培系統は四倍体であるため、そのままでは交雑はできない。そのため野生種の倍加と栽培系統との交雑を長崎県農林技術開発センターに依頼し、得られた F1 世代を研究材料とした。先行研究
で種子の乾燥耐性スクリーニングを行い、選抜された 88 系統を今回の研究に用いている。それらは 25℃、16 時間明期、8 時間暗期の条件下で固形 Murashige and Skoog（MS）培地を使用して継代培養により維持している。

【結果、考察】1.親系統野生種に関する傾向について
88 系統の試験結果から平均スコア 2.0 以上の 16 系統をより強い乾燥耐性を持つものとして選抜した。そのうち親系統が 11TAのものが 11 系統、31TA のものが 5 系統となった。試験を行ったのは 11TA 由来が 34 系統、31TA 由来が 53 系統、27TA 由来が1 系統であることから、1 系統のみである 27TA を除いて、それぞれ選抜されたのは上位 32.4 %、9.3%であった。これは 11TA 由来の方が、ストレスを与える際の PEG 濃度を低くしていたからだと考えられる。

・PEG8000：平均分子量が 8000 のポリエチレングリコールである。これを液体 MS 培地に溶かした PEG 溶液を培地として用いると植物体内に水が吸収されにくくなるため、それをジャガイモに対する乾燥ストレスとみなし実験に使用した。

2.評価方法について
また、評価方法に全葉を用いたのは 88 系統のジャガイモの生育の多様性におけるダメージを適切に評価するためである。親系
統が異なるため根、茎、葉の伸び方や長さ、葉のつき方や枚数も様々であった。そのため、全ての葉を包括的に評価することによって系統の差をなるべく平均化できると考えた。

【方法】
1.植物体の調整試験管で培養していたジャガイモから頂芽または腋芽をカットし、ボトル(直径 5.8 cm、高さ 11.0 cm のマヨネーズ瓶)に移した。
ボトルには液体 MS 培地を使用した。一系統につき 3 ボトル、一つのボトルに 3 つの頂芽または腋芽を入れた。シェーカーで 3~4
週間振盪培養し、植物体がボトルの上部にまで到達する程度の大きさにした。

【展望】
本研究ではボトル、MS 培地を用いていたため今後はポット、土壌を用いてよりジャガイモの植物体を大きく生育させ、実際の栽培環境に近い条件で形質評価を行っていきたい。培地条件が土壌になることから、適切な評価のために植物体に与えるストレスの条件、方法を検討していく。

2.乾燥ストレス処理
液体 MS 培地を抜き、共洗いの後に PEG 溶液を同量与えた。
PEG 溶液で 9 日間振盪培養した。

28

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 29Ⓒ2024 筑波大学生物学類

窒素固定に応答してシュートで発現する miRNA の同定と機能解析
深谷 夢夏（筑波大学 生物学類）

指導教員：壽崎拓哉（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】
非感染、WT 株感染、ΔNifH 株感染の 3 つの条件でミヤコグサ
硝酸やアンモニアなどの窒素栄養は生体内で同化されタンパクを 11 日間栽培し、その後、地上部全体をサンプリングして質の合成に用いられる。特に植物ではクロロフィルの構成要素とRNAseq および Small RNAseq 解析を行った。３条件のうち WT
もなり生育には欠かせないものである。ダイズやミヤコグサで知株感染でのみ発現が変化する miRNA を同定した。
られるマメ科植物は、窒素固定を行う根粒菌と共生関係を築くことで低窒素土壌下でも生育に十分な窒素栄養を得ることができる。 RT-PCR
マメ科植物と根粒菌の間でみられるこの関係を根粒共生という。
上記、解析によって同定した miRNA について、WT 株の根粒菌
植物は根粒菌から窒素栄養をもらう見返りとして、光合成で産を感染させたミヤコグサを経過ごとにサンプリングして RT-PCR
生した炭素栄養を根粒菌に与えている。このギブアンドテイクのを行い、継時的な発現パターンを調べた。
関係が植物にとって不利益に働かないよう、すなわち、窒素栄養
また、根粒菌非感染で硝酸またはアンモニアを処理した土壌で栽が必要ない状況なのに根粒菌にむやみに炭素栄養を与えることが培したミヤコグサをサンプリングして RT-PCR を行い、窒素栄養ないよう、マメ科植物は窒素栄養に応答した根粒共生の制御機構に応答した発現パターンを調べた。
を持つとされている[1]。根粒菌からの窒素栄養が必要でない状況とは、高窒素土壌下におり植物自身で十分な窒素栄養を供給でき
過剰発現体の作成
る場合や根粒菌からもらう窒素栄養が十分に足りている場合など
解析候補の miRNA について毛状根形質転換法により過剰発現があり、植物では体外と体内の窒素栄養に応答した制御が行われ体を作成した。この過剰発現体を様々な条件で栽培し、根粒形成ていると考えられる。
の様子や植物体の生育度合いなどの表現型を観察した。
移動ができない陸上植物が変動する周りの環境に応答して生育するためには、地上部と根のコミュニケーションが必要不可欠で機能喪失体の作成ある。植物体内では mRNA、転写因子や低分子ペプチドなどのシ
解析候補の miRNA について CRISPR-Cas9 システムを用いた
グナル因子が器官間を移動することで情報を共有しており、根粒
機能喪失体の作成を試みた。
形成においても遠距離シグナルによる根と葉を介した根粒共生制
御システムが知られている。根粒菌感染に応答して働くシグナル【結果・考察】因子の１つとして、
miRNAであるmiR2111が知られている［2］。
RNAseq および Small RNAseq 解析の結果、WT 株感染でのみ
miRNA の中には師管を介して全身へ輸送されるものがあり、移発現が増加する miRNA と発現が減少する miRNA をそれぞれ同動先の器官や組織で標的とする遺伝子の発現を直接制御する。
定した。そのうち１つについては、機能喪失体の作成に成功した。
miR2111 はシュートで発現して根に移動し、根粒形成抑制因子
結果の詳細は当日報告する。
TML の発現を抑制することで、根粒形成を促進している。移動性
低分子の miRNA はあらゆる生物で様々な生物学的プロセスを制【展望】御する機能が確認されており、miR2111 以外の miRNA が根粒共
今後は、同定した miRNA の詳細な機能解析を進めるとともに、生の全身的な制御に関与している可能性は高い。
miRNA が直接制御する標的遺伝子の同定を行うことで、miRNA
この研究では、体内の窒素栄養に応答してシュートで発現し、が関与する一連の制御機構を解明していきたい。さらに、miRNA
根粒共生を制御する miRNA の発見を目指した。これにより、根の移動性や器官ごとの機能を調べるために接木実験を行っていき
粒共生における新たな遠距離シグナル制御機構を解明することをたい。また、今回解析対象としなかった miRNA の中にも、未知目的とした。
の遠距離シグナル機構に関わり共生を制御するものが存在するかもしれない。今回とは異なる指標から候補を絞り、根粒共生にお【材料・方法】
ける miRNA の関与と機能を追究していきたい。
ミヤコグサ Lotus japonicus wild-type MG-20
根粒共生は低窒素環境下での植物の生育を可能にすることから、根粒菌 ・Mesorhizobium loti wild-type（以下 WT 株とする）
幅広い植物に適用することができれば農業に大きな利益をもたら
・Fix-mutant ΔNifH（以下ΔNifH 株とする）
すと考えられる。共生の制御機構に関わる因子の発見は、農業利ΔNifH 株はニトロゲナーゼが機能しないため、根粒は形成する用の実現に向けた大切な１歩だと考えている。
が窒素固定を行わない根粒菌である。植物に WT 株を感染させた
ときとΔNifH 株を感染させたときで、根粒形成に関与する因子は【参考文献】
どちらの場合も働くが、根粒菌由来の窒素栄養に応答して共生を[1] Misawa et al. The Plant Cell, 34, 1844-1862(2022)
制御する因子はWT 株を感染させた場合でのみ働くと考えられる。 [2] Okuma et al. Nature communications, 11, 5192(2020)
RNAseq 解析、Small RNAseq 解析29

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 30Ⓒ2024 筑波大学生物学類

硝酸に応答した根粒形成の抑制制御に関わる硝酸トランスポーター遺伝子の解析
落合 美智（筑波大学 生物学類）

指導教員：壽崎【背景】
マメ科植物は根粒菌と共生関係を築き、根粒を形成する。この共生関係において、根粒菌は大気中に存在する窒素を固定し、植物が利用可能な形で提供する。これに対して、植物は、根粒菌へ
光合成産物を提供する。この相利的な共生関係により、植物は土
壌の窒素源のみに依存せず、効率的に窒素栄養を獲得することができる。その一方で、土壌に硝酸などの窒素栄養が豊富に存在する環境下では、植物は土壌から直接窒素栄養を吸収できるため、根粒菌由来の窒素栄養は不要であり、光合成産物というコストのみを支払う関係となる。このような環境条件への対応として、植物では硝酸に応答して根粒形成を抑制することが知られている。
マメ科のモデル植物であるミヤコグサ (Lotus japonicus)の、硝酸に応答した根粒形成抑制には、転写因子である NIN-LIKE
PROTEIN 1 (LjNLP1)、LjNLP4 と硝酸トランスポーターの
NITRATE TRANSPORTER 2.1 (LjNRT2.1)が機能していることが、先行研究より明らかになっている (1)。まず、細胞内の硝酸イオンに応答して、LjNLP1 が活性化し、LjNRT2.1 の発現を誘導する。これによって、LjNRT2.1 が生成され、細胞膜に局在して硝酸トランスポーターとして機能することで、硝酸イオンの細胞内への取り込みが加速する。細胞内硝酸イオン濃度の上昇に応答して、LjNLP4 は細胞質基質から核へと移行し、根粒形成に関連するいくつかの遺伝子発現を制御する。このようなプロセスによって、ミヤコグサでは硝酸に応答した根粒形成の抑制が成り立っていると考えられている。その一方で、LjNLP1 は LjNRT2.1
以外の硝酸トランスポーター遺伝子の発現を制御する可能性も示
唆されており、本制御系の分子機構の全容解明には至っていない。
シロイヌナズナなど他の植物では、NRT2.1 と同じく硝酸トランスポーターである NRT3.1 が NRT2.1 と相互作用し、協調的に機能するという知見がある (2), (3)。その一方で、マメ科植物では、
NRT3.1 の機能は未解明である。このような背景のもと、本研究では所属研究室で作出された、Ljnrt3.1 ノックアウト体の選抜を行い、ミヤコグサにおける NRT3.1 遺伝子の機能解析を行った。
【方法】
・Ljnrt3.1 変異体の選抜
CRISPR-Cas9 システムによって変異が導入された T0 世代の個体をシーケンスし、Ljnrt3.1 変異体の探索を行った。そして、変異の入っている系統を継代し、T1 世代のシーケンス結果と種子形
成量の観点から、Ljnrt3.1 変異体の選抜を行った。

拓哉（筑波大学 生命環境系）

種子を滅菌処理後、一晩吸水させ、1%アガー培地に播種した。
この培地を遮光し、2 日経過後、個体を根粒菌処理と硝酸処理をしたバーミキュライトに植え替え、栽培した。硝酸条件は、KNO30 mM と 10 mM の 2 条件を設定した。そして、ポットへの植え替えから 3 週間後、根粒と地上部の表現型の観察を行った。
・トランスアクチベーションによる LjNRT3.1 発現制御における
NLP 転写因子の関与の検討
MG20 の種子を、表現型観察と同様の方法で吸水、播種し、遮光条件で 2 日経過後、KNO3 10 mM の硝酸処理のみをしたバー
ミキュライトに植え替え、根粒菌非感染条件で 2 週間栽培した。
この個体から、プロトプラストを抽出し、トランスアクチベーシ
ョンに用いた。
トランスアクチベーションは、エフェクターとして、LjNLP1、
LjNLP4 、 GFP ( 対 照 条 件 ) 、 レ ポ ー タ ー と し て
LjNRT3.1pro:NanoLUC を設計し、35Spro:GUS の結果でノーマ
ライズを行った。
【結果・考察】・Ljnrt3.1 変異体の選抜
T0 世代のシーケンスの結果、14 系統中 4 系統で変異が確認できた。これらの T1 世代のシーケンス結果と種子形成量から、変異がホモで保存されている 1065-10 と 2 種類の変異をヘテロで持つ
1065-5#3 の 2 系統を Ljnrt3.1 変異体として選抜した。
硝酸応答に関する表現型観察とトランスアクチベーションの結果については、発表会にて報告する。
【展望】

Ljnrt3.1 変異体として選抜した 1065—5#3 について、2 種類の変異をヘテロで持つ変異体であることから、次代の個体を用いて、変異がホモで固定された系統の探索を行う。また、LjNRT3.1 の誘導メカニズムについて、さらなる実験を行い、
LjNLP1、
LjNLP4と LjNRT3.1 の関係を検討したい。
これに加えて、毛状根形質転換による遺伝子の過剰発現実験などを通して、LjNRT2.1 と LjNRT3.1 の相互作用や協調的な機能の有無についても調べていきたいと考えている。
【参考文献】(1) Misawa F. et al. The Plant Cell. 34, 1844-1862, (2022).
(2) Krouk G. et al. Plant Physiology. 142, 1075-1086, (2006).
(3) Okamoto M. et al. Plant Physiology. 140, 1036-1046, (2006).

・硝酸応答に関する表現型観察
ミヤコグサの野生型系統である MG20、Ljnrt2.1 変異体、
Ljnrt3.1 変異体と根粒菌 (Mesorhizobium loti)を用いて実験を行った。

30

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 31Ⓒ2024 筑波大学生物学類

植物一過的タンパク質発現システムを用いた診断薬の生産可能性について
岡 佳穂（筑波大学 生物学類）

指導教員：三浦

1.背景・目的
診断薬には、特定のタンパク質が必要とされ、そのタンパク質には診断薬に応じて多くの種類がある。また、目的タンパク質の生産のために様々な生産方法が試みられている。
しかし、診断薬のなかには、発現に時間がかかるうえに、得られる量が少ないことから、非常に高価な診断薬が存在する。そのため、研究や医療コストの観点から、これらの生産コストの削減が望まれている。
現在、特定の目的タンパク質の生産方法として、組換えタンパ
ク質の生産がある。本研究では、上記の問題点の克服のために、
当研究室で開発された「つくばシステム」を利用した。つくばシ
ステムとは、ジェミニウイルス由来のローリングサークル型複製システムと、ダブルターミネーターを組み合わせることで、これまでに報告された植物での一過的タンパク質発現システムである
magnICON システムと比較して、より短期間で大量のタンパク質を一過的に発現させるシステムである。
組換えタンパク質の生産には、大腸菌、動物細胞、植物など多くのプラットフォームが利用されている。その中でも植物は、栽培が容易であり、植物に感染する病原体のほとんどは哺乳類に病原性を示さないといったことから、低コストかつ安全性が高い宿主として注目されている。
これらのことから本研究では、植物のベンサミアナタバコを用いて、診断薬に用いることができる医療用タンパク質を、短期間に大量に生産することを試みた。

謙治（筑波大学 生命環境系）

行い、上清と沈殿に分けた。その後に、沈殿部分のフォールディ
ングされていないタンパク質や凝集したタンパク質を除き、上清部分のみを透析チューブを用いて透析にかけ、タンパク質を精製した。続いて、TALON レジンを用いて目的タンパク質を取り出した。
(4) 目的タンパク質の四量体化
ビオチン、ストレプトアビジンを用いて目的タンパク質の四量体化を行った。詳細は発表会にて報告する。
3.結果
詳細は発表会にて報告する。
4.考察
詳細は発表会にて報告する。

2.材料・方法
材料として、ベンサミアナタバコを用いた。
(1) ベクター作製
つくばシステムに用いるプラスミドに、目的タンパク質遺伝子の発現カセット、解析及び精製に用いる His タグを組み込んだものを用いた。
(2) アグロインフィルトレーション
エレクトロポレーション法によってベクターをアグロバクテリ
ウムに導入し、カナマイシン濃度を 50 µl/ml、ゲンタマイシン濃度を 30 µl/ml、リファンプシン濃度を 5 µl/ml として、5 ml の LB培地で２日、その後 800 ml の LB 培地で一晩、適切に培養した。
この培養液の OD600 値を 0.5 に調製し、感染溶液とした。これをバキューム、もしくはシリンジを用いてベンサミアナタバコに感染させた。
(3) タンパク質精製
感染から 4 日後、植物体の葉の感染部位を切り取り液体窒素を用いて凍結させたのち、ミキサーで粉砕した。これにバッファー
を加え液状にしたのち、濾過、遠心分離によって不溶性画分を取り除いた。次いで、硫安分画を 30 ％飽和の硫安アンモニウムで31

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 32Ⓒ2024 筑波大学生物学類

In planta ゲノム編集法による青臭みを抑えたダイズの作出
五十嵐咲季（筑波大学 生物学類）

指導教員：三浦【背景・目的】ダイズ（Glycine max）は経済的価値の高い作物であり、人間の謙治（筑波大学

生命環境系）【方法】
1. アグロバクテリウムの準備
目的タンパク質をコードする遺伝子を導入したベクターを作製し、このベクターを用いてアグロバクテリウムに形質転換を行った。
2. 植物へのインフィルトレーション
播種後約 1~2 週間の野生型ダイズ植物に対し、バキュームとシリンジを用いてアグロバクテリウムの感染を行った。
3. 植物からのゲノム抽出
感染部位において新たに発生したシュートから 1 cm 四方の葉片を切り出し、ゲノム抽出に用いた。

食糧、家畜の飼料、工業用材料として世界中で広く利用されている。したがって、時間やコストを省いた新品種作出法を開発する
ことは、ダイズ生産に大きな利益をもたらす。従来は品種同士の掛け合わせにより新品種を獲得していたが、ゲノム編集技術を利用することにより大幅な効率性の向上が見込まれる。本研究で用いるゲノム編集技術は、CRISPR/Cas9 システムである。
CRISPR/Cas9 システムとは、人工ヌクレアーゼである Cas9 とDNA 配列の標的部位を特異的に認識する gRNA によって二本鎖切断 (DSB) を誘導し、切断された遺伝子の修復エラーを利用して変異を導入する技術である。
従来、ダイズのゲノム編集は組織培養により形質転換体を得る
ことで行われてきた。半分に切断したダイズ種子にアグロバクテ
リウムを感染させることで、Cas9 や gRNA 遺伝子を植物ゲノム
内に組み込む。これを植物体まで分化・再生させることで、形質転換体を高効率で獲得できる。しかし、組織培養は適用品種が限られることに加え、植物体獲得までに長い時間を要すること、滅菌環境下における頻繁な培地交換により労力やコストがかかること、カビやバクテリアなどのコンタミネーションによる植物体の枯死など、多くの課題を抱えている。そこで本研究では、より簡便かつ多様な品種に適用できるゲノム編集法として、In planta ゲ
ノム編集法を利用する。In planta ゲノム編集法とは、組織培養を行わず、植物体に直接ゲノム編集による変異を導入する方法である。本研究では、この方法と一過的タンパク質発現系「つくばシステム」を組み合わせたゲノム編集を行なっている。これにより、形質転換体を作出することなく Cas9 や gRNA の一過的発現が可能であるため、時間やコストを削減できる。また、形質転換体を用いる場合、サイレンシングなどの抑制機構がはたらくが、一過的発現によりサイレンシングサプレッサーも共発現させているため、サイレンシングを防ぐことが可能である。
本研究において変異を導入する目的遺伝子は、GmFAD2 とGmFAD6 である。これらの遺伝子は、脂肪酸であるオレイン酸からリノール酸への変換で必要となる触媒酵素をコードしている。
リノール酸は、ダイズの青臭みの原因となるヘキサナール生合成
経路の出発物質である。そこで、出発物質であるリノール酸を減少させることで、ダイズの青臭みを抑えることができる。ダイズ
は私たちの身近な食品に多く利用され、近年では代替肉の主な原材料として注目されている。代替肉や豆乳製品の開発において、ダイズ特有の青臭みを抑えることは商業的に求められている形質である。
本研究では、ダイズにおける簡便で編集効率の高いゲノム編集
方法（In planta ゲノム編集法）を確立するとともに、この方法を用いた青臭みを抑えたダイズの作出を目的としている。ダイズにおいて確立されたゲノム編集方法は、他のマメ科植物への適用が期待される。

【結果と考察】In planta 法を用いることにより、組織培養よりも約 3 ヶ月早く次世代の種子を得られることが明らかとなった。組織培養の場
合、カルスの形成や再分化など約 3 ヶ月が必要である。一方、Inplanta 法では、種を非滅菌環境下で土にまき、約 1〜2 週間育てた後にアグロバクテリウムの感染を行う。その後、約 3 ヶ月間で次世代の種子を得ることができる。しかし、ゲノム編集効率は組織培養よりも低いため、感染方法の検討が必要である。
本研究では、2 種類の成長段階の野生型ダイズ植物を対象とした。いずれの方法においても感染部位で GFP の蛍光が観察されたため、これらの方法を GmFAD2 と GmFAD6 をターゲットとした感染に適用した。播種後約 2 週間の茎頂分裂組織にアグロバ
クテリウムの感染を行なった場合、新たに発生したシュートのう
ち複数のシュートにおいてターゲット配列上に変異が見られた。
播種後約 1 週間の苗に対して子葉を 1 枚残して切断し、剥き出しになった分裂組織に感染を行なった場合も、新たに発生したシュートにおいてターゲット配列上に変異が見られており、早い成長段階における感染の方が高い編集効率を示した。これは、切断処理によりアグロバクテリウムが感染しやすい状態であることに加え、若い植物体は細胞分裂がより活発であるためだと考えられる。
一方で、苗を用いた感染の場合は、植物体が弱く感染後に枯れてしまうことが多い。これを改善するためには、真空浸潤の時間や回数を減らす、シリンジによるアグロバクテリウムの注入回数を減らすなどを検討する必要がある。また、感染後には液体肥料を与え成長を促進させるといった対処法も考えられる。
今後は、感染方法を改善しながら、苗を対象とした感染を続けることでゲノム編集効率の向上を図る。また、現在 T1 種子を獲得した段階であるため、T1 世代の変異率を調べていきたいと考えている。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 33Ⓒ2024 筑波大学生物学類

古茅由来のバイオ炭「茅炭」の炭素貯留及び土壌改良への応用に向けた性質評価
小寺 柚衣花（筑波大学 生物学類）

指導教員：廣田【背景】
茅葺き家屋では、茅と総称されるイネ科等の草本を高密度にして屋根に葺く。茅葺き屋根は数十年に一度葺き替えられ、その度に古い茅（以下、古茅）が発生する。大量に発生する古茅はかつて堆肥や敷き藁等として利用され、最終的に土に還るサイクルが維持されてきた。しかし、今日では古茅が利用されることなく廃棄されることが多い。廃棄には費用がかかり、茅葺き屋根の維持管理費増の一因にもなっている。古茅の有効利用は、茅葺きを中心とした資源の循環利用に不可欠である。
私達の研究室では、古茅の新たな利用方法として、炭素貯留や土壌改良効果が期待できるバイオ炭に着目した。様々な未利用・廃棄物バイオマスから生成されるバイオ炭の先行研究は多く（例
えば、Kalemelawa et al. 2014）、農地などの土壌への散布により炭素隔離や保水力向上など様々な効果が期待できることも報告されている（Blanco-Canqui, 2021）。
古茅を素材とするバイオ炭（以下、茅炭）には、茅の循環利用だけでなく、炭素貯留による CO2 排出量削減や土壌改良材、J-ク
レジット制度登録による収入確保などを期待する。茅炭の性質や機能の評価を行うことが、古茅の新しい利用方法の有用性を評価するうえで欠かせない。

充（筑波大学 生命環境系）【方法】
材料はススキ（茨城県と広島県）、ヨシ（宮城県）の古茅を用いた。これらを開放型、密閉型、マッフル炉の３つの炭化炉で炭化した。作成した茅炭の C 濃度、N 濃度、pH を測定した。
【結果と考察】いずれの茅炭も、C 濃度は 70-80％、N 濃度は 0.3-0.7％であった。全ての古茅において炭化前後で C、N で濃度が増加した。C
濃度の変化は 1.4-1.6 倍とあまり変わらないが、N 濃度は 1.2-2.9
倍と幅があった。C/N 比は炭化前後で増加あるいは減少したが、これは N 濃度の変化の幅が影響したと考えられる。
素材の異なる茅炭の違いは、C 濃度に有意差はないが、N 濃度
は M-茨 O が有意に低く（p＜0.01）、C/N 比も有意に高くなった（p＜0.01）。炭化条件間での茅炭の違いは、C 濃度に有意差はな
いが、N 濃度に有意差はない（p = 0.06）ものの M-茨 C が高く、C/N 比も有意に低くなった（p＜0.05）。以上から、素材や炭化方法の違いが茅炭の N 濃度に影響を与えたと考えられる。
全ての茅炭の pH は約 9-10 と強いアルカリ性であった。
17の論文から抽出した33のバイオ炭データと比較したところ、
茅炭は C の割合が草本炭の中でも高かった。その理由として、茅は地上部が枯れた状態で収穫するため、セルロース等の高分子化合物の割合が高くなっていた可能性が示唆された。

【目的】
古茅を素材とするバイオ炭「茅炭」を生成し、茅炭の性質評価を目的とする。具体的には、茅炭の化学的性質を解明するとともに、 古茅の素材の違いや炭化条件の違いが、茅炭の性質に与える
影響について検証する。

表 1 各図における茅炭の名称
名称

材料

炭化条件

M-茨O

ススキ(茨城県)

開放型

M-茨C

ススキ(茨城県)

密閉型

M-広O

ススキ(広島県)

開放型

P-宮O

ヨシ(宮城県)開放型

図 2 原料別バイオ炭の C 濃度、N 濃度、pH

木材 n=6、草本 n=18 (pH は n=16)、家畜糞尿 n=6、その他 n=3【引用文献】
・Blanco-Canqui (2021). GCB Bioenergy. 13, 291–304
・Frank et al. (2014). Wood Carbonization Research.10-2, 63-73

図 1 各古茅の C 濃度、N 濃度、C/N 比の変化33

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 34Ⓒ2024 筑波大学生物学類

中立論 vs ニッチ理論〜ササ優占型ブナ成熟林におけるギャップサイズが林床植生に及ぼす影響〜植田時（筑波大学 生物学類）

指導教員：廣田【背景および目的】
撹乱の結果生じるギャップは、森林動態の重要な原動力である。
またギャップの規模は、その後の植生を決定する主要因である。
このことから、複雑な森林動態の理解には、ギャップの規模と林床植生の関係性の把握が欠かせない。先行研究では、ギャップ面積の増加に伴って、林床植生の多様性が増加することが数多く報告されている(Eduardo et al. 2020 ほか)が、そのメカニズムについては未だ知見が不足している。本研究では環境要因に着目し、ギャップ面積の増加に伴うギャップ内の林床植生の変化メカニズ
ムの解明を目的とした。
【調査地】
本研究では、ササ優占型の成熟林である、長野県カヤノ平ブナ林(以下、カヤノ平)と、岐阜県大白川ブナ林(以下、大白川)で 2023
年 7 月〜8 月に調査を実施した。両林分ともに標高約 1400m に位置する林齢 300 年以上の落葉広葉樹林である。
【方法】
両林分において、ギャップを「樹冠高が調査地における最大樹
冠高の 1/3 以下の領域」と定義し、ドローンによって撮影した UAV
画像からその面積を算出した。カヤノ平では約 20m2〜370m2 のギャ
ップ 15 個、大白川では約 16m2〜360m2 のギャップ 5 個を調査対象とした。各ギャップ内に大きさの異なる調査区を複数個設置し、樹木実生(高さ1m 未満)と中低木(高さ1m 以上かつ胸高直径5cm 以下)の出現種数を記録し、ギャップ毎に種数―面積曲線を作成することでギャップ内の最大出現種数を推定した。同時に各ギャップにおいて、異なる高さでの相対光強度や土壌含水率、ササの最大長などの環境要因を計測し、各ギャップ内での平均値と CV(ばらつき)を算出した。
【結果】
ギャップ内の樹木実生と中低木の推定種数は、両林分でギャッ
プ面積が大きいほど有意に増加した(図１)。

充（筑波大学 生命環境系）

共分散構造解析の結果、カヤノ平におけるギャップ面積の増加は、林床の樹木実生種数の増加を直接説明しなかった。一方で、ギャップ面積増加に伴う高さ 1m 以下の相対光強度のばらつきの増加
や、リターの厚さの減少を介して、有意に樹木実生の種数を増加させていることがわかった(図２)。中低木の種数でも同様に、ギャ
ップ面積の増加は、リターの厚さの減少を介して種数を増加させていた。
*：p<0.05**：p<0.01

図 2. カヤノ平におけるギャップ面積・環境要因・樹木実生種数の関係【考察】
ギャップが大きいほど樹木実生および中低木種数が多いという結果は、先行研究と一致した(Menges et al. 2008)。ギャップが大きいほど樹木実生の種数が増加したことについては、ギャップが大きいほどササの最大長と被度のばらつきが大きくなることで、ササの下の光強度のばらつきが大きくなることが原因であると考えられた。このように、ギャップ面積の増加に伴う植物種数の増加が、ササを介した光環境の制限によるものであることを示唆した研究例はなく、今回の結果はササが優占する冷温帯広葉樹林に特有のものである可能性が高い。
近年、森林動態の決定因子として、確率的浮動が重要であるとする“中立論”を支持する声が強まっている。一方で、本研究の結果では、ギャップ面積の増加は植物種数の増加を直接説明せず、
環境要因のばらつきの増加を介して有意に説明した。このことは、環境条件に依存した競争力の種差が種構成を決定するという“ニッチ理論”を支持する結果であったと言える。
森林動態は、長い時間スケールで見ると、ランダムに生じる事象が多く、全体としては中立論で説明されうる安定した平衡状態が続くように見える。しかし、今回の結果から、少なくともササ
優占型の冷温帯広葉樹林においては、撹乱とそれに伴う遷移という短い時間スケールで見ると、ニッチ理論に基づいた非平衡状態が常に維持されていると言える。このことが空間スケールを拡大
しても適応されるのであれば、今回の結果は、森林動態における
撹乱と遷移の流れに新たな視点を提供するものであると言える。

図１. ギャップ面積と植物種数の推定値の関係【引用文献】•
Eduardo et al. (2020) Ecology•
E S. Menges et al. (2008) Journal of Vegetation Science

両林分で共通して、ギャップ面積が大きいほど高さ 1m 以下の光強度のばらつきが大きく、ササの被度と最大長のばらつきも大きかった。また、ギャップ面積が大きいほど、リターの厚さは薄くなることがわかった。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 35Ⓒ2024 筑波大学生物学類

伊豆諸島の森林におけるセルロース分解性真菌類の多様性と地理的分布
加藤 智也（筑波大学 生物学類）

指導教員：廣田【背景・目的】分解者として働く土壌菌類は、陸域生態系の根幹を成す生物群である。そのため土壌菌類の分布に関する知見は、各地域の生態系を理解する上で重要となる。一般的に菌類の分布は、定着制限
や拡散制限を受けて決定されている。
前者は、植生遷移 (Fujimaki2017) や年平均気温 (Osono et al. 2020) などの要因がある。後者
では、海洋島における地理的距離 (Hirose et al. 2022) などの要因が報告される一方で、風や海流により広範囲の拡散が可能な菌
類は、拡散制限を受けないとする報告がある (Kivlin et al. 2014)。
よって海洋島における菌類の拡散制限については、不確定な要素が多く、より多様な土壌菌類を対象とした研究が必要である。
そこで本研究では土壌中に豊富に含まれ、多様な土壌菌類が容易に分解できるセルロースに注目し、セルロース分解性真菌類の伊豆諸島における地理的分布を調べた。

充（筑波大学 生命環境系）

面積と地理的距離が、調査地の菌類多様性に与える影響を調べるために回帰分析を行ったところ、面積と有意な関係が見られた。

Fig. 1 各調査地の出現種の株数
数値は Shannon-Wiener の多様度指数 H’を示す。

【方法】
本研究は、伊豆諸島の伊豆大島 (IZ)、三宅島 (MYK)、八丈島(HCJ)と本州の南伊豆 (MIZ) の極相林を調査地とした。各調査地において、調査区 (10m×10m) を約 5m 間隔で、3 つ設置した。
調査区内では、セルロースコットンを埋設し、セルロース分解性
真菌類を採取した。また各調査区の環境調査も行った。
(1) セルロースコットンの設置から回収
コットンは、調査区内の土壌表層 0-5 cm に、約 2m 間隔で、10地点で設置した。コットンは埋設から約 2 か月後に回収し、1 枚ごと袋に入れた状態で乾燥させた。
(2) 環境調査
調査区の毎木調査、表層 0-5 cm の土壌温度、土壌水分率、土壌Fig. 2 主要種の相対出現頻度
CN 比、土壌 pH、土壌 EC の測定を行った。
【考察】(3) 菌の単離と種推定
各種の優占状況から T. spirale, T. lixii は本州由来であるのに対パンチを用いて作成したコットン片を、0.005% OT 溶液で洗浄して、T. hamatum, T.crassum は南方由来である可能性が考えらし、抗生物質入りの麦芽寒天培地上に 1 枚ずつ置いた。暗室 20℃れる。その場合、本州の MIZ を起点に定義した地理的距離だけで下で培養し、数日後に観察した。見られた菌糸を斜面培地上に単は、多様性への影響を正しく評価することはできない。
離し、菌株とした。菌株をセロファン培地上で再培養し、DNA の一方で、面積については有意な関係が認められたので、動植物抽出に用いた。抽出した DNA は PCR で増幅し、電気泳動で増幅だけではなく、菌類のような微小な生物についてもMacArthur らを確認した後に、精製キットを用いてDNAの精製を行った。
DNAの島嶼生物地理学の理論が適用されることがわかる。そのため伊シーケンス解析から得られた波形データを配列データに変換した。 豆諸島におけるセルロース分解性真菌類の分布は、拡散制限より
配列データから BLAST 検索を通じて、種の推定を行った。
も環境要因に伴う定着制限の影響を受けると考えられる。また
Trichoderma 属については、T. spirale と T.crassum の分布域の【結果】違いから、温度が定着制限として働いていることが考えられる。
種推定の結果、MIZ で 7 種、IZ で 6 種、MYK, HCJ で 4 種が単離され、すべての地点で Trichoderma 属が優占していた。多様【参考文献】
度指数は、最大値が MIZ の 1.73 で、最小値が HCJ の 1.07 であ・ D. Hirose et al. (2022). Med. Mycol. J. 63 (4), 99-107.
った。本州では多様度が高く、島嶼部では低い傾向が見られた。
・ M. Fujimaki (2017). 筑波大学大学院 修士論文.
MIZ, IZ, MYK で優占していた T. spirale が、HCJ では全く出・ R.H. MacArthur and E.O. Wilson (1967). Princeton
現しなかったことや、T.crassum が HCJ でのみ出現したことか
University press.
ら、伊豆諸島における Trichoderma 属についての地理的隔離が確・ S.N. Kivlin et al. (2014). Fungal Ecology. 12. 14-25.
認された。
・ T. Osono et al. (2020). frontiers in Microbiolory. 11.

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 36Ⓒ2024 筑波大学生物学類

葉レベルの炭素収支からみる植物病原菌 Rhytisma filamentosum がイヌコリヤナギ個体に与える影響
篠沢 俊介（筑波大学 生物学類）

指導教員：増本【背景】
葉に感染する植物病原菌は２つの効果により宿主植物の炭素収支を減少させる。
1. 病原菌が光合成を阻害することで、宿主植物の生産量（＝炭素収入）を減少させる効果
2. 病原菌の成長・繁殖のために宿主植物から炭素を吸収し、宿主の炭素支出を増加させる効果
多くの研究では光合成阻害のみを評価しているが、病原菌の生存戦略を考えると、病原菌は炭素吸収を最大化することが最適である。そのため、本研究では、「病原菌が宿主植物の炭素収入の減少、炭素支出の増加に与える影響の評価」を目的とした。
一方で、個体レベルでの宿主植物の炭素収支は、光環境や葉枚数といった環境差・個体差によって変動する。病原菌の感染はそれらの環境差・個体差による宿主の炭素収支の変動とは独立して宿主の炭素収支に影響を与えると考えられる。そのため、異なる
サイト間で、個葉レベルの炭素収支にもとづいた個体レベルの炭素収支を求め、「病原菌の感染が宿主の個体レベルの炭素収支の差に与える影響の評価」を目的とした。
【方法】
調査地：長野県菅平高原
調査対象：イヌコリヤナギとそれに特異的に感染する Rhytisma
filamentosum （Rhytisma 属菌）
s1、s2、s3 の 3 サイトにおいて 5 月から 11 月に調査を行った（以後それぞれのサイトの個体を s1、s2、s3 とする）。
葉レベルでの炭素収支を評価するために、健全葉の炭素収支（純光合成生産量）、病原菌の炭素収入への影響（光合成阻害量）、
病原菌の炭素支出への影響（病原菌の呼吸量、炭素量）の推定を行った。次に個体木レベルでの炭素収支を評価するために、感染
木の葉の総数、感染率の推定を行った。
・健全葉の純光合成生産量の推定
10、11 月に各地点の光量（PPFD）を測定し、菅平実験所のタワーを基準として年間の PPFD を求めた。5-11 月において葉面積を測定し、着葉期間の葉面積の季節変動を求めた。5-11 月に葉の光合成活性（ETR）を測定し、9 月に測定した光合成速度と ETR との相関で光合成速度の季節変動を求めた。以上の項目
により着葉期間の健全葉の純光合成生産量を推定した。
・病原菌の炭素収入への影響の推定
9-11 月の病原菌の子嚢子座の表面積を測定した。子嚢子座の表面積あたりの純光合成生産量を求め、光合成阻害量とした。
・病原菌の炭素支出への影響の推定
病原菌の呼吸量は以前の研究の近似式を用いて、子嚢子座の表
面積、気温をもとに推定した。病原菌の炭素量は表面積を測定した病原菌の重量・炭素含有量の測定により推定した。
・感染木の葉の総数、感染率の推定
リタートラップを設置し、1 個体 200 枚の葉に目印をつけ、標識再補法を用いて、葉の総数、感染率を推定した。

翔太（筑波大学 生命環境系）【結果】
着葉期間の個葉レベルでの純光合成生産量は、s1 で 75.6 mgCleaf-1、s2 で 16.8 mgC leaf-1、s3 で 86.5 mgC leaf-1 と推定された（表 1）。s1、s3 は同程度であり、s2 で明らかに純光合成生産量が小さかった要因は、PPFD と ETR の差が反映されている病原菌の炭素収入への影響は純光合成生産量に比して s1 で1.2%、s2 で 1.7%、s3 で 0.7％であった（表 1）。
炭素量は重量の約 68%と推定した。病原菌の炭素支出への影響
は純光合成生産量に比して s1 で 24%、s2 で 75％、s3 で 31％であった（表 1）。
個体レベルでの純光合成生産量は、s1 で最も大きく、5.2 kgCであった。感染率は s3 で最も高く、7.8%であったが、感染による炭素収支の減少割合は s2 で最も大きく、4.7％であった（表 2）。
【考察】
病原菌による宿主の炭素収支に与える影響は病原菌による光合成阻害量、呼吸量、炭素量の順で大きくなった（表 1）。この結果から、病原菌は炭素収入の減少より炭素支出の増加により宿主の炭素収支を減少させることが示唆された。
サイト間の個葉レベル、個体レベルの純光合成生産量を比較す
ると、どちらの場合も s2 が」最も小さかった。一方で、純光合成
生産量は個葉レベルでは s3 で最も大きかったのに対して、個体レベルでは s1 で最も大きく、評価する生物学的組織レベルで結果が異なっていた（表 1,2）。個葉レベルでは s3 の葉面積が s1 の約
1.6 倍と大きく、個体レベルでは s1 の葉の総数が s3 の約 2.4 倍であったことが、純光合成生産量の差の要因として挙げられる。
サイト間の健全木の純光合成生産量の違いに対して、病原菌の炭素収支への影響は s1 で最も小さく、s2 で最も大きかった（表2）。この結果から個体差・環境差による宿主の炭素収支の変動と病原菌の炭素収支の変動は独立しており、病原菌の感染は宿主の炭素収支の相対的な差異をさらに大きくすることが示唆された。
表１：個葉レベルの炭素収支

表 2：個体レベルの炭素収支36つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 37Ⓒ2024 筑波大学生物学類

筑波大学構内における鳥類相の解明：1970 年代から 2023 年の比較から
舩橋 美月（筑波大学 生物学類）

指導教員：庄子【背景】
人間活動による生息環境の改変や外来種の導入は鳥類の生物多様性に脅威をもたらす。生息地の喪失や分断化は種の構成や生態系機能に悪影響を与え、外来種の導入も在来種の保全において重要な課題となっている。筑波大学とその周辺の環境は開学から 50
年でつくば市の開発により大きく変化している。鳥類は生息地とその周辺の環境の影響を受けることから (Zhao et al., 2023)、筑波大学構内とその周辺の環境の変遷が鳥類に影響を与えている可能性がある。しかし、具体的な変化やその要因は不明であり、現状把握や保全・管理に必要な情報が不足している。
【目的】
本研究は、現在の筑波大学構内における鳥類相を明らかにし、50 年前と比較して環境変化と鳥類相の変遷の関連性を検証することである。
【方法】
2023 年 4 月から 7 月にかけて、筑波大学構内で早朝、夜間の鳥類調査を実施した。早朝調査では 4 月 5 月には農耕地・水域・草地・森林で計 37 地点を調査した。農耕地・水域・草地では地点から見える範囲すべて、森林は半径 10m の調査区を設け、1 地点 10分間の調査を行った。6 月以降は筑波大学構内全域をもれなく確認するために構内を 143 カ所に区画した。区画した調査エリアを
時速 2 ㎞でエリア内を移動しながら 10 分間の調査を行った。夜間調査は、7 月に 3 回に分けて学内全域を調査した。日没前 1 時
間から約 3 時間程度、時速 2 ㎞で歩きながら、鳥類の種類を記録した。種ごとの生息地データは AVONET (Tobias et al., 2022)を参考にした。開学当初 (1973-74)の筑波大学構内の鳥類相のデー
タは「筑波大学構内及びその周辺の鳥類観察目録(斎藤 et al.,1976)」を用いた。解析時、比較可能な情報を得るために、本研晶子（筑波大学 生命環境系）【考察】
湿地性鳥類の減少は湿地面積の縮小に起因している可能性が高い。特に平砂宿舎周辺の湿地が埋め立てられ、道路や建造物の建設によって湿地が失われていたことが影響していると考えられる。
外来鳥類の出現に関して、ドバトは人工環境の増加が影響しており、ソウシチョウは筑波山における分布の変化による影響が考えられている。これらの外来鳥類の影響は生態系や社会・経済に及ぶ可能性があり、モニタリングが必要とされている。
種の入れ替わりが見られたことは都市環境への適応能力の差や競争的排除の影響を受けている可能性があると考えられるが、本研究では検証できていないため今後の課題である。
最後に、本研究で見られた筑波大学での鳥類相の変化は都市緑地の保全や改善において重要であり、在来環境の植生の維持や湿地の保全、外来鳥類のモニタリングなどが今後の施策に考慮されるべきである。

究では斎藤ら (1976)の文献からは筑波大学構内で記録された鳥類に限定し渡り区分は調査期間内で主に確認できる留鳥、夏鳥、旅鳥に絞った。渡り区分は「日本と北東アジアの野鳥 (榛葉 et al., 2016)」のデータを用いた。
【結果】
鳥類調査は 4 月と 5 月で 7 回、6 月と 7 月の調査においてはそれぞれ大学全域の調査を 6 月は 12 日、7 月は 13 日に分けて大学全域の調査を 1 回行った。鳥類の出現種数は、1970 年代が 69
種、2023 年が 45 種であり、種を減少させていることがわかった。
また、外来種について、1970 年代はコジュケイのみだったのに対し、2023 年はそれに加え、ドバトとソウシチョウが確認された。
1970 年代から 2023 年に各生息地グループにおける変化より、すべての生息地グループにおいて種を減少させていたが、特に湿地性鳥類 (wetland)の種の減少が最も多かった。また、1970 年に確認された鳥類の一部が 2023 年には確認されなくなったことに加え、2023 年には 1970 年には確認されなかった鳥類が確認されるようになるといった種の入れ替えが起こっていたことがわかった(図 1)。

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図 1： 1970 年代から 2023 年にかけて起こった生息地ごとの鳥類
種数の変化。縦軸とバー内の数値は種数を表し横軸のカテゴリー
は 1970 年代と 2023 年の AVONET(Tobias et al., 2022)に記載された鳥類の生息地グループを表す。黒棒は 1970 年代に記録された鳥類種数を表し、グレー棒は 2023 年に新たに記録した鳥類種
数を表す。
【文献】
Zhao et. al. 2023. Urban Bird Community Assembly
Mechanisms and Driving Factors in University Campuses inNanjing, China.
Tobias et al. 2022. AVONET: morphological, ecological andgeographical data for all birds.
斎藤 et al. 1976. 筑波大学構内およびその周辺の鳥類観察目録(Vol. 1).
榛葉 et. al. 2016. 日本と北東アジアの野鳥つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 38Ⓒ2024 筑波大学生物学類

魚の粘液が誘発するプルテウス幼生のクローニングの再現
須賀 文香（筑波大学 生物学類）

指導教員：谷口俊介（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】※両実験とも 3 日ごとに水替え及びえさやり（Chaetoceros
生物の生存戦略の一つである個体や器官の再生が、プラナリア
calcitrans）を行った。
やイモリ、ベニクラゲといった数々の生物種で報告されている。
ヒトデやクモヒトデなどの棘皮動物の成体もまた、高い再生能力【結果】をもつ生物として多くの研究が行われてきた。一方、棘皮動物の・実験 1（シタビラメの粘液を使用）
幼生も高い再生能力を持っており、それは“クローニング”とい
各粘液濃度及びコントロール共に、3 日目及び 4 日目幼生ではう現象として報告されている。一般的に、クローニングは遺伝子
クローニングは観察されなかった。
の単離を指す分子生物学用語であるが、ここでは自分と遺伝的に・実験 2（シタビラメおよびヒラメの粘液を使用）
同一な個体、すなわちクローンが形成される無性生殖の一様式を
受精後 3 日目から中濃度のヒラメ粘液に暴露した、サンプル 1
示す言葉として用いる。棘皮動物の幼生において広く行われるク匹において、クローニングと思われる細胞塊が幼生の肛門付近
ローニングでは、幼生の体から出芽のように新しい細胞塊が形成から出芽している様子が確認できた。経過観察を行うために同される。通常、発生初期の段階ではクローニングは観察されない
じ粘液条件下で個別飼育を行ったところ、出芽した細胞塊が本が、幼生の成長に適した水温やエサ条件下で促進されることが示体から分離して遊泳している様子が観察できた。分離した細胞されている。近年、幼生の捕食者となる魚の粘液もまた、クロー塊を詳細に観察したところ、繊毛と思われる構造物と共に僅か
ニングの促進要因となりうることが、ウニの仲間であるアメリカに個体が動く様子が確認できた。しかしながら、その後のハンド
ハスノカシパンを用いた実験によって報告されている。受精後 4リングにミスをしたため、十分な経過観察ができなかった。
日目のプルテウス幼生にろ過海水で希釈した 0.01〜1.0 mg/ml 程度の粘液を暴露すると、24 時間以内にクローニングが観察されたとのことである。魚の粘液によるクローニングの促進報告はこれまでアメリカハスノカシパンのみであり、自然条件下での誘発例
もアメリカムラサキウニのみとなっている。つまり、我が国で実験材料として広く用いられているバフンウニにおける例はまだ報告されていない。
よって、今回は、魚の粘液が誘発するプルテウス幼生のクロー
ニングをバフンウニにおいて再現することを目的に実験を行った。
【方法】
・魚の粘液の採取
タモ網で魚（シタビラメおよびヒラメ）を採取し、網から滴る粘液を採取した。0.45 μm フィルターにてゴミなどを除去した後、その粘液を 1ml チューブに分注し、-20℃で冷凍保存した。
・粘液の重さ算出
使用直前に冷凍保存した粘液チューブを解凍し、ボルテッ
クスで攪拌後遠心した。粘液入りエッペンチューブと空のエッペンチューブの重さを比較することで重さを測定し、粘液 1ml あたりの重さを算出した。
・バフンウニ幼生への粘液暴露
解凍した粘液を高、中、低濃度（5.0、1.0、0.1 mg/ml）になるようにろ過海水で希釈し、24 穴シャーレに 2ml ずつ分注した。コントロールとしてはろ過海水を使用した。
実験 1：受精後 3 日目及び 4 日目の幼生を各濃度 1 穴につき5 匹ずつ分注し、15℃のインキュベーターで保存した。24 時
間ごとに 9 日間幼生の様子を観察した。
実験 2：受精後 2 日目及び 3 日目の胚を各濃度 1 穴につき、
1、5、10 匹ずつになるように分注した。15℃のインキュベー
ターで保存し、24 時間ごとに 14 日間観察を行った。

クローニングにより本体から出芽したと思われる細胞塊（矢印）【考察・今後の展望】
実験 2 の結果より、バフンウニにおいてもクローニングが誘発されること及び魚の粘液がクローニングの促進剤となりうる可能性が示唆された。今回、シタビラメの粘液からヒラメの粘液に切替えて暴露した後にクローニングが観察されたことから、魚種の違いによってクローニングの誘発が左右されるのかが今後の検討事項である。しかしながら、実験で得られたクローニング個体は
これまで 1 匹のみであり、その後同じ粘液条件下で行った実験ではまだクローニングは観察されていないため、魚種の違いを論じる段階にない。そこで、まずはクローニングの再現性を高めるた
めの条件検討を行い、その過程で魚種の違いによる粘液条件を検討事項に加えていく。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 39Ⓒ2024 筑波大学生物学類

分子動力学計算で解明する TGF-β受容体の多量体形成メカニズム佐藤 紘歌（筑波大学 生物学類）

指導教員：原田【導入】
我々の生体は数多くの細胞から成り立っている。細胞が分化・増殖することで、さまざまな機能を有する細胞が産生され、生体内の組織は正常にはたらき、生体の恒常性が維持される。しかし、細胞増殖が無秩序に繰り返されると、いわゆる「がん化」と呼ばれる状態になり、腫瘍の形成など生体へ悪影響を及ぼす。そのため、細胞増殖は厳密に制御される必要がある。
形質転換増殖因子-β (TGF-β) は、細胞増殖の抑制にはたらく分泌性のタンパク質である。TGF-βは、リガンドとして細胞膜に存在する受容体に受容され、細胞内へシグナルが伝達されることで、その役割を果たす。この一連のシグナルの伝達を TGF-βシ
グナル伝達と呼ぶ。TGF-βは TGFBRI、TGFBRII の二種類の受容体と結合することが知られている。TGF-βは二量体で活性をもち、TGFBRI :TGFBRII = 2 : 2 の四量体
(以下、受容体四量体)と六量体を形成し、細胞内へシ
図１. TGF-β/受容体多量体
グナルを伝達する。(図 1)
BAMBI は、TGF-βシグナル伝達の阻害因子の一つである。細
胞増殖の制御は、細胞増殖の促進と抑制のバランスで保たれている。TGF-βシグナル伝達を抑制し、細胞増殖を促進する因子もまた重要である。BAMBI は膜タンパク質であることから、TGF-β
シグナル伝達において、同じく膜タンパク質である受容体に作用し、受容体多量体形成を阻害することでシグナル阻害をすることが考えられている。しかし、BAMBI が TGFBRI、TGFBRII のどちらに作用しているのかといった阻害機序は未解明である。そこで、本研究では、BAMBI による受容体多量体形成の阻害機序の解明を目的とした。
TGF-β受容体の構造は、細胞内および細胞外ドメインと細胞膜中に存在する膜貫通ドメインに分けられる。生物学的実験から、
TGFBRI、TGFBRII の膜貫通ドメインを他の受容体のものに置換するとシグナル伝達効率が変化することが示された。[1] これにより、受容体四量体の形成に膜貫通ドメインが寄与することが示唆される。したがって、TGFBRI、TGFBRII、BAMBI 間の結合について検討するには、膜貫通ドメインの結合親和性を比較する必要がある。そこで本研究では、膜貫通ドメインの結合・解離プロセスを観測できる分子動力学シミュレーション (MD) を用いて、
膜貫通ドメインの結合親和性の比較および BAMBI による阻害機序の解明を進めた。
【方法】
本研究では、タンパク質の結合・解離プロセスを原子レベルで観測できる MD を使用した。MD は、原子間にはたらく力を計算しながら原子の位置と速度を更新することで、タンパク質の構造
変化 (ダイナミクス) を時系列データ (トラジェクトリ) として観測できる。また、トラジェクトリを解析することで、タンパク質のダイナミクスや構造安定性などを評価できる。

隆平（筑波大学

計算科学研究センター）

はじめに、タンパク質の立体構造予測できるプログラムである
AlphaFold 2 (AF2) を用いた。AF2 は、単量体の構造だけでなく複合体の構造も予測できる。そこで、TGFBRI と各タンパク質からなる三種類について二量体構造を予測した。
TGFBRI + { TGFBRI / TGFBRII / BAMBI }次に、生成した三種類の二量体構造を膜環境に埋め込み、MD を実施することで、膜内における安定構造を入手した。(図 2)
最後に、三種類の二量体について以下の二段階の操作を実施した。
(1) 各タンパク質間の距離を変更し、複合体が結合している状態
から、解離している状態までの構造を均一に作成した。(図 3)(2) 作成した構造すべてに短時間の MD を実施した。

図 2. 膜内における安定構造

図 3. 複数距離の構造【結果】
MD により得られたトラジェクトリの解析結果から、二量体の結合および解離状態のエネルギー差 (ΔW) を算出できる。三種の二量体についてΔW を比較し、どの二量体が優先的に結合するかを推察する。その結果、BAMBI と TGFBRII の結合親和性は小さく、BAMBI は TGFBRI と結合することが示唆された。また、TGFBRI に対する BAMBI および TGFBRII の結合親和性は同程度であることが示された。また、各二量体の膜内における安定構造を比較することで、二量体が膜貫通ドメインのαヘリックスのどの面で結合しているか調べた。その結果、TGFBRI のTGFBRII および BAMBI に対する結合面が同じであることが示された。MD および結合面の解析から導かれる結論として、
BAMBI は TGFBRI と結合し、TGFBRI-TGFBRII の結合面をブロックし結合を競合的に阻害することで、受容体四量体の形成を阻害し、シグナル伝達を阻害することが考えられる。(図 4)

図 4. BAMBI による阻害機序仮説【参考文献】
1. Onichtchouk D. et al., Nature, 401, 480-485(1999)39

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 40Ⓒ2024 筑波大学生物学類

二酸化炭素によるニホンウナギ精子の運動停止反応
森 凛太郎（筑波大学 生物学類）

指導教員：稲葉一男（筑波大学 生命環境系）

整した。Nigericin は 10 mM ストック水溶液、Ethoxzolamide(ETZ) は、
0-40 mM ストックDMSO 溶液を適宜希釈して用いた。
溶液中の DMSO の最終濃度は 0.5 %とした。
【結果】
ウナギ精子懸濁液に CO2 ガスを吹き付けた結果、運動中の精子はカレイ類精子と同様に直ちに停止した。また、CO2 噴射停止直後、すぐさま運動性が回復した。カレイ類精子が CO2 停止から回復する場合と異なり、ウナギ精子鞭毛の屈曲は鞭毛の先端から回復した。カレイ類精子は、25-100 mM の NaHCO3 で運動が抑制される。しかし、ウナギ精子を NaHCO3 溶液中で観察すると、400mM NaHCO3 でも運動は全く停止せず、曲線速度にも顕著な違いはなかった。様々な pH でのウナギ精子の運動性を評価した結果、pH 4.0-9.0 では運動性に変化がなかったが、pH 3.0 では運動性が著しく低下した。Nigericin を用いて、細胞内外の pH 差を無くしたところ、pH 6.0 以下の溶液で精子運動性が低下した。CA の阻害剤である ETZ の効果を低 pH 条件である pH 5.0 と、
通常の pHである pH 8.0 で比較したところ、pH 5.0 では精子の運動性が低下したが、pH 8.0 では運動性に変化はなかった。
【考察】
カレイ類と同様に、ウナギ精子も CO2 の噴射による運動停止反応を示した。停止効果は非常に高く、吐息を吹きかけただけでもCO2 による速度低下が観察された。しかしながら、本研究では、カレイ類精子では停止反応を示した NaHCO3 溶液で、ウナギ精子が全く停止しないという結果を得た。この結果の相違は、ウナギの運動性を確保するために使用した BSA に原因がある可能性と、CO2 による運動停止メカニズムがカレイ類とウナギで異なる可能性が考えられる。また、CO2 停止後に運動を回復させる際の波形回復を観察した結果、ウナギ精子の波形は鞭毛の先端から回復した。それに対して、カレイ類では鞭毛基部から波形が回復し、両者では全く異なる反応を示した。この特殊な回復反応は、ウナギ
精子が持つ「9+0」構造が寄与しているのではないかと考えられる。
一方、カレイ類精子と同様に、ウナギ精子も低 pH 溶液で高い運動性を持つことが示された。低 pH 条件下では、Nigericin や
ETZ の添加により運動性が低下したことから、CA が低 pH 溶液
における運動に寄与していることが示唆された。これらのことか
ら、CA はウナギ精子内の pH 維持に寄与しており、これはカレイ類と同様の性質であることが明らかにされた。
本研究では、ウナギ精子がカレイ類と同様に多量の CA を持ち、低 pH 溶液における運動維持に寄与していることが示唆された。
今後は、質量分析による CA の特定や生化学的な解析、さらに系
統的に離れたカレイ類とウナギが、いかに同じ性質を獲得したのかを明らかにしていきたい。
【参考文献】
1. Inaba et al., Cell Motility and the Cytoskeleton 55:174-187(2003).
2. Tanaka et al., Fisheries Science 70: 780-787 (2004).

【背景・目的】魚類の精子は、様々な受精環境に適応し、多様な進化を遂げてきた。
特にカレイ類では、
精子懸濁液に対してCO2を噴射すると、すぐさま精子が停止するという特異な反応が知られている 1)。この反応は、精子に多量に含まれる炭酸脱水酵素 (CA) によって引き起こされる。CA は CO2 + H2O ⇄ HCO3- + H+の反応を触媒し、細胞内 pH の維持に重要な役割を果たしている。カレイ類精子では CA が高発現しており、CO2 噴射により産生された HCO3-が軸糸の運動を抑制すると考えられている。また、カレイ類は低 pH 溶
液でも十分な精子運動が確認されており、CA との関連が示唆される。先行研究により、ウナギ精子における NaHCO3 溶液中での運動抑制が報告されている 2)。しかしながら、カレイ類精子と同様に CA による精子運動停止メカニズムが存在するのか否か、その詳細や意義は明らかになっていない。また、ウナギ精子の軸糸構造は「9+0」構造であり、多くの生物が持つ「9+2」構造とは異なる。すなわち、ウナギ精子の軸糸は中心対微小管、ラジアルス
ポーク、外腕ダイニンを欠いた構造しており、最も単純な軸糸構造を持つ生物だと考えられている。
本研究では、ニホンウナギ精子の CO2 による運動停止反応を詳細に調べることで、精子鞭毛軸糸の CO2 および HCO3-による運動
調節メカニズムの解明を目的とした。
【材料】
ニホンウナギ (Anguilla japonica) (雄)FRP 製 500 L 水槽を用いて、水温 20 ℃、全暗条件にて飼育した。雄ウナギの性成熟は、ウナギ組換え LH (0.5 mg/ml, Repro
Master rLH, アークリソース社) 200 µl を週 1 回、10 週間注射して促した。成熟したウナギを 2-フェノキシエタノールで麻酔し、腹部圧迫により精子を採取した。
【方法】
CO2 噴射時の精子鞭毛波形解析
BSA コートしたスライドガラス上に NaCl 溶液を置き、少量の精子を滴下し、運動を活性化させた。その後、CO2 ボンベに接続したチューブを介して CO2 ガスを精子に噴射し、その様子を位相差顕微鏡で 10 倍の対物レンズを用いて観察し、高速カメラ(HAS-U2) により 1000 fps で記録した。
精子運動率、遊泳速度の測定
BSA コートしたスライドガラス上に各溶液を 20 µl 置き、50 倍希釈した精子 1 µl を滴下した。位相差顕微鏡で 10 倍の対物レン
ズを用いて観察を行い、精子運動解析ソフトウェア SMAS により
精子運動率、遊泳速度を測定した。
実験溶液の組成
精子運動の活性化には、NaCl 溶液 (450 mM NaCl, 0.5% BSA,
10 mM Hepes-NaOH, pH 8.0) を用いた。HCO3-の影響は、運動活性化溶液に25-400 mM になるようにNaHCO3 を加えた溶液を用いて調べた。NaCl と NaHCO3 の総濃度は 450 mM とした。
pH の影響については、溶液の pH を pH 3.0-9.0 の範囲で変化させた。pH 3.0, 4.0 は K-acetate、pH 5.0, 6.0 は MES を用いて調40

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 41Ⓒ2024 筑波大学生物学類

サンゴの共生・白化に関連する褐虫藻の運動調節の研究
朝賀 伸一（筑波大学 生物学類）

指導教員：稲葉一男（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】く、暗期に向けて運動率は下がった。C. goreaui では、遊泳細胞
古生代から続くサンゴ-褐虫藻間の相利共生関係は、豊かな生が観察されなかった。
物多様性を生み出すサンゴ礁生態系を支えている。褐虫藻は渦鞭運動軌跡を解析した結果、運動率が低い時間帯では直進・らせ毛藻類に属し、横鞭毛と縦鞭毛という 2 本の鞭毛を持つが、遊泳ん運動を示す褐虫藻が多かった。また、運動率が高くなるにつれにおいて横鞭毛は推進力、縦鞭毛は舵取りの役割を果たしているて、回転運動を示す褐虫藻が増加した。以上の結果から、褐虫藻
と考えられている。また、褐虫藻は鞭毛がある遊泳細胞と鞭毛のの運動率は種によって異なること、運動軌跡は光周期の時間帯にない球形細胞という２つの形態をとり、共生前後で変化する。
よって変化することがわかった。
サンゴの白化は、温暖化や強光により光合成系が破壊された褐
次に、直進・らせん運動と回転運動を起こす機構を明らかにす虫藻がサンゴから排出されることが原因で起こる。白化によりサるために、B. minutum を用いて鞭毛運動の観察を行った。本研
ンゴの増殖が抑えられ、サンゴ礁が縮小する結果、サンゴ礁域に究では、褐虫藻が持つ 2 本の鞭毛のうち、横鞭毛を明確に記録す
住む多様な海洋生物種の生息地が奪われることになる。白化時のることができなかったため、縦鞭毛の波形解析を行った。褐虫藻
サンゴが緑色蛍光を発するという報告や、緑色蛍光に褐虫藻が誘が回転運動から直進運動に転換する際の縦鞭毛の波形を観察・解引されるという報告 1)から、褐虫藻の走光性はサンゴの共生や白析した結果、回転運動では非対称波を描き、直進運動では対称波化に密接に関わっていると考えられる。しかし、その運動調節機を描くことがわかった。さらに、機械刺激を受容した直後、鞭毛構の詳細は明らかにされていない。
の打頻度が変化する様子を記録することができた。これらの鞭毛本研究では、走光性を示す褐虫藻の鞭毛波形の変化を解析し、波形の変化は、運動軌跡の調節に深く関係していると考えられる。
褐虫藻の運動調節機構を明らかにすることを目的とした。
さらに、B. minutum を用いて青色光に対する走光性を解析し【材料】たところ、直進・らせん運動を示していた褐虫藻が、明期開始後・褐虫藻
の時間にかかわらず、負の走光性を示すことがわかった。
Breviolum minutum 、 Breviolum psygmophilum 、 Cladocopium 【考察・今後の展望】
goreaui の遊泳細胞の増加に伴い、回転運動を示す細胞が増えたことは、３種の株を IMK 培地中、23℃で維持した。冷白色蛍光灯を用い、 褐虫藻の運動変化が光周期の時間帯だけでなく、細胞の運動率に
14 時間明期：10 時間暗期（8:00 点灯, 22:00 消灯）で照明した。
依存する可能性を示す。本研究では、回転運動が培養容器の底で【実験方法】
観察された。自然界においても、遊泳性の褐虫藻は海中よりもサ褐虫藻の 24 時間観察と解析
ンゴが生息している海底に多く存在するといわれている。サンゴ培養フラスコ内の褐虫藻を赤色LED光照射の下、4倍の対物レの共生効率は、褐虫藻の密度が高いほど大きくなることから、サンズを用いて位相差顕微鏡で24時間観察し、15分毎に30秒の動ンゴの緑色蛍光 1)により誘引された褐虫藻が、回転運動によって画をカメラ（iDS,UI3240CP）により撮影した。撮影した動画をサンゴ表面に留まることで、共生効率を高めている可能性がある。
画像解析ソフト ImageJ で解析し、運動率・運動軌跡を求めた。
本研究では、光照射開始 4 時間後から遊泳細胞が観察された。
鞭毛運動の観察と解析
光照射開始前の細胞分裂のピーク直後に遊泳細胞が現れるという
褐虫藻 B. minutum を赤色LED光照射の下、10倍の対物レンズ
報告や 2)、12時間/12時間の明暗周期のうち、褐虫藻の走光性活性を用いて位相差顕微鏡および微分干渉顕微鏡で観察し、ハイスピが明期開始 4 時間後に最も高いという報告 1)がある。したがって、ードカメラ（DITECT,HAS-U2）により 1 秒間に 100 フレーム撮
褐虫藻の鞭毛形成、運動性の獲得、および運動調節は、細胞分裂影した。観察は BSA コートしたスライドガラスチャンバーで行や光受容の機構と深く関わっている可能性が示唆される。
った。
本研究から、運動軌跡の変化に伴い縦鞭毛の対称性が変化する
青色光への走光性の観察と解析ことがわかった。褐虫藻の横鞭毛には、Ca2+により鞭毛の収縮や褐虫藻 B. minutum を赤色 LED 光照射の下、4 倍の対物レンズ
運動性を変化させるセントリンというタンパク質が存在する。運を用いて位相差顕微鏡で 9:00、13:00、17:00 に観察し、ハイスピ
動調節の機構を明らかにするためには、縦鞭毛 Ca2+調節を解析すードカメラ(HAS-U2)により 1秒間に 100 フレーム撮影した。青色るとともに、横鞭毛が褐虫藻の運動調節にどのように関わるのか
光は 5mm 青色 LED(465-475nm)を 50ml 角フラスコの横から照射を明らかにする必要がある。さらに本研究では、褐虫藻が青色光した。
への走光性を示すことがわかった。褐虫藻の鞭毛運動を制御する【結果】
因子が、周囲の環境変化に応答する可能性が考えられる。褐虫藻
褐虫藻の運動性を 24 時間観察した結果、B. minutum では、明の光受容機構を明らかにすると同時に、今後はサンゴ由来の物質
期開始から数時間後に遊泳細胞が観察されはじめ、13:00 からに対する走化性の有無についても検証したい。
14:00 の間で最大運動率が計測された。また、14:00 以降は暗期に【参考文献】
向けて運動率が下がった。B. psygmophilum の運動性は低かった
1. Aihara et al., PNAS, 116: 2118-2123 (2019).
が、B. minutum と同様に 13:00 から 14:00 の間で運動率が最も高
2. Yamashita et al., Galaxea, JCRS, 18: 13-19 (2016).

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 42Ⓒ2024 筑波大学生物学類

伊豆半島沖の砂泥底におけるメイオベントス群集：水深が異なる５地点の比較
福澤 航生（筑波大学 生物学類）

指導教員：中野【背景および目的】
メイオベントス(meiobenthos) もしくはメイオファウナ(meiofauna)とは約 1 mm の篩を通り抜け、32-63 µm の篩に残る小型の底生動物を指す。メイオベントスはあらゆる水圏に分布し、その活動は直接的もしくは間接的に堆積物の特性を変化させている。海洋生態系をより深く理解するためには、どのような特性の海底にどのようなメイオベントス群集が形成されているかを正確に把握し、評価することが重要である。しかし、日本近海においてメイオベントス群集を水深ごとに比較した研究は少なく、伊豆半島沖のメイオベントス群集を対象とした研究はほとんどない。
以上の背景から本研究では、伊豆半島沖の砂泥底において水深の異なる５つの地点で底質のサンプリングを行い、メイオベントスの群集組成を明らかにすることを目的とした。
【材料と方法】
1) 底質のサンプリング
2023 年 11 月 6 日、
静岡県下田市白浜沖水深 40m、
60m、
80m、
100m、120m の砂泥底 5 地点から、それぞれ 3 回ずつ計 15 回、底質のサンプリングを実施した。底質は船上からスミスマッキン
タイヤ採泥器を投下し採取され、サンプリング毎に 1 L の底質サンプルを標本瓶にて持ち帰った。
2) メイオベントスの抽出
基本的に山崎ほか(2019)に従って実施した。具体的には、底質サンプルを 1.18 mm の篩で水道水を用いて洗浄して大型動物を除去し、篩を通過した堆積物を保持した。この堆積物を 50 µm のプランクトンネットで水道水を用いて洗浄し、篩に残った堆積物を保持した。その後、堆積物からガラスコロイド溶液を用いた密度分離法によってメイオベントスを抽出した。抽出したメイオベ
ントスは 70 %エタノール溶液で固定し、保存した。
3) ソーティングと計数固定したメイオベントスを実体顕微鏡下で観察し、SchmidtRhaesa (2020)を参考に形態に基づいて分類し、撮影を行った。そして、高次分類群ごとに計数を行った。個体数データに対しては平方根変換を適用した。
4) 調査地点ごとの比較
調査地点ごとのメイオベントス群集を相互比較するために、
nMDS および階層的クラスター分析を実行した。これには BrayCurtis 指数が用いられた。またクラスター分析には Ward 法が用いられ、クラスターの数はシルエット分析に基づいて決定した。
【結果】
1) ソーティング
15 個のサンプルからは合計 20,042 個体のメイオベントスが抽出された。実体顕微鏡下で観察した結果、以下の表１および図１に示した 15 のグループに分類された。
Nematoda A

Nematoda B

Copepoda A

Copepoda D

Halacaroidea A

Amphipoda A Isopoda A

Copepoda B

Priapulida A

Echinodermata A Cnidaria A

Copepoda C
Tanaidacea A

Oligochaeta A Kinorhyncha A

表１：メイオベントスの分類結果

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裕昭（筑波大学 生命環境系）
図 1：
分類され
た 15 グル
ープ。並び
順は表 1
に従う。
スケール
バー：200µm。

2) 分類群ごとの計数
メイオベントスを分類群ごとに計数した結果、全体としてNematoda A(計 17,361 個体)が優占することがわかった。また、
水深 40m では全体のメイオベントスに対して Copepoda A や、
Isopoda A といったグループの占める割合が水深60m 以深と比較すると大きいことが判明した。逆に水深 60m 以深ではそれらのグループの占める割合は小さく、Nematoda B (全個体を水深 60m
以深で採集)や、Priapulida A (全個体を水深 80m 以深で採集)などといった水深 40m では見られないグループが観察された。その他のグループの計数結果を含む詳細は発表会にて報告する。
3) 調査地点ごとの比較
地点ごとの群集組成がその類似度によって複数のグループに分割されるか確認するために、nMDS および階層的クラスター分析を実行した。その結果、図 2 のような樹形図が得られた。この図においてシルエット分析を行い、シルエット値が最大となる 2 分
割とするのが適切であると判断した。40m の全地点が含むグルー
プを G1、60m 以深の全地点を含むグループを G2 とした。
図 2：クラスター分析で得られた樹形図。水深 40m の 3 地点を含むG1と水深60m以深の 12 地点を含む G2 が示されている。

【考察】
下田市白浜沖水深 40m~120m の海底では全体的に Nematoda
A が優占していた。また、水深 40m では Copepoda A や Isopoda
A が比較的大きな割合を占める一方で、水深 60m 以深ではその割合が小さくなり、Priapulida A などが出現することが明らかになった。この結果から、メイオベントス群集が水深 40m-60m を境に大きく変わることを見出すことができた。このような変化が見られた背景には水温や底質粒度などの違いが存在する可能性があり、今後の研究では生物相と環境条件との関係を調べていきたい。
【参考文献】
Schmidt-Rhaesa, A., (2020). Guide to the Identification ofMarine Meiofauna. Verlag Dr. Freiderich Pfeil, München.
山崎博史ほか (2019).タクサ: 日本動物分類学会誌, 46, 40-53.

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 43Ⓒ2024 筑波大学生物学類

ミトコンドリア病モデルマウスを用いた生体内におけるオートファジーの重要性の検証
佐渡友光一（筑波大学 生物学類）

指導教員：中田

和人（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】【材料】
ミトコンドリアは細胞小器官の一つであり、内膜に存在する呼5-7 か月齢の mito-miceから摘出した高率を許容し腎不全を
吸酵素複合体による酸化的リン酸化を介して、生体内で必要とさ発症する腎臓、高率を許容し心伝導障害を発症する心臓、高率れる ATP の大部分を産生することが知られている。哺乳類におを許容せず目立った病態を発症しない肝臓を用いた。
いて、ミトコンドリアには独自のゲノムであるミトコンドリア
DNA (mtDNA) が 1 細胞当たり数百から数千コピー存在してい【方法】
る。哺乳類の mtDNA には、呼吸酵素複合体を構成するサブユニ
摘出した各臓器の率を定量することで、率が 0% (wt) 、ットのうち、13 種類の構造遺伝子とそれらの翻訳に必要な 2 種
0~25% (low) 、25~50% (middle) 、50~75% (high) 、75~100%類のrRNA 遺伝子と22 種類のtRNA 遺伝子がコードされている。 (super high) の 5 群に分類した。さらに、各群におけるオートフ
このmtDNA に病原性の突然変異が一定の割合で蓄積するとミト
ァジー関連タンパク質 (LC3、p62) 、及びマイトファジー関連タ
コンドリアの呼吸機能が低下し、ミトコンドリア病と称される多ンパク質 (BNIP3、Nix、PINK1、Parkin)の発現量をウエスタン
様な疾患群が引き起こされる。ミトコンドリア病を引き起こす病
ブロッティングにより定量し比較解析した。
原性の変異のひとつに、mtDNA の全長の 3 分の 1 を欠失する大規模欠失突然変異がある。ヒトにおいて、大規模欠失突然変異型【結果・考察】mtDNA (mtDNA) の 蓄 積 は CPEO (Chronic progressive
詳細な結果と考察については発表会にて報告する。
external ophthalmoplegia) や KSS (Kearns-Sayre syndrome)と呼ばれるミトコンドリア病を引き起こすことが知られている。
所属研究室では、ヒトmtDNA とほぼ同じ位置が欠失したmtDNA を全身の細胞に様々な割合で蓄積するミトコンドリア
病モデルマウス (mito-mice) の樹立に成功している。mitomiceでは、各組織・各臓器でmtDNA が 70～80％以上蓄積するとミトコンドリア呼吸機能の低下 (ATP 産生不全) が誘導され、低体重、高乳酸血症、貧血、腎不全、心伝導障害といったミトコ
ンドリア病様の病状を呈する。また、mito-miceでは同一個体であってもmtDNA の含有率（率）が異なり、臓器特異的な病態を示すことが判明している。mito-miceにおいて、腎臓や心臓では率が 85%以上を示し重篤な腎不全や心伝導障害を示す個体であっても、肝臓では率が 60%を超えず目立った病態を示さない。
このように、臓器間で率の蓄積の差異が病態の臓器特異性を生み出す一因となっていることが考えられる。しかし、現状臓器間のmtDNA の蓄積の差異を生み出す具体的な機構は明らかになっていない。
近年、機能不全のミトコンドリアがオートファジーによって選択的に排除されるミトコンドリアオートファジー (マイトファジー) が注目されている。マイトファジーは、ミトコンドリアの品質管理に寄与し、細胞内の恒常性を維持するうえで重要であることが示唆されている。このことから、mito-miceにおける臓器間の率の蓄積やその最大値を制御する機構として、
オートファジーや
マイトファジーが考えられる。
そこで本研究では、mtDNA を様々な割合で蓄積する mitomiceを用いて臓器ごとのmtDNA とオートファジー活性の相関関係を検証することで、臓器間におけるmtDNA の蓄積の差異にオートファジー及びマイトファジーの活性が寄与する可能性を
検証した。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 44Ⓒ2024 筑波大学生物学類

がんの悪性化に寄与しうる新規ミトコンドリア DNA 突然変異の探索
齊藤 さくら（筑波大学 生物学類）

指導教員：中田

和人（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】て B6 系統のマウス由来の mtDNA を有する P29mtB6 を解析対
細胞小器官のひとつであるミトコンドリアは、呼吸酵素複合体
象サンプルとした。Clone5 については、先行研究において転移能を介した酸化的リン酸化によって ATP を産生しており、独自の及び造腫瘍性が高いことが明らかとなったため、がんの悪性化に
ゲノム、ミトコンドリア DNA (mtDNA) を有する。mtDNA は細大きく関与する変異を有することが期待でき、これらの変異は腫胞あたり数百～数千コピー存在し、呼吸酵素複合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、
瘍形成後や転移後に濃縮することが予想される。このことを検証
Ⅴのサブユニットと、これらの翻訳に必要な tRNA や rRNA をコするため、P29mt+/+-5 の尾静脈注射によって肺転移を誘導し、そードしている。
の後肺結節から回収したP29mt+/+-5ivを転移後サンプルとした。
一部の発がん性化学物質が核 DNA よりも mtDNA に結合しやさらに P29mt+/+-5 の背部皮下注射によって腫瘍形成を誘導し、すいとの報告等から、mtDNA に突然変異が蓄積することが、がそこから回収した P29mt+/+-5sc を腫瘍形成後サンプルとした。
ん化の原因のひとつであるとする「がんミトコンドリア原因説」
これらのサンプルについて次世代シーケンサーによるmtDNA のが提唱されている。しかし mtDNA は完全に母性遺伝するのに対塩基配列解析を行うことによって、がん細胞の悪性化に寄与しう
し、がんは一般的に母性遺伝しない等の報告から、この説に対する新規 mtDNA 変異の同定を試みた。
る異論も多く存在する。そこでこの説を検証するために、所属研究室の先行研究において、正常細胞とがん細胞との間で mtDNA【結果・考察】を相互に置換したサイブリッド（cytoplasmic hybrid; 細胞質雑種）
上記 5 種のサンプルについて解析を行った結果、変異含有率の作製が行われた。得られたサイブリッドの性質が評価された結50％以上の点突然変異を、呼吸酵素複合体や rRNA、tRNA 上な果、mtDNA の由来に関係なく、がん細胞由来の核 DNA を有す
ど計 24 箇所見出した。そのうち Clone1 (P29mt+/+-1) およびる細胞のみが造腫瘍性を示すことが明らかとなった。つまりこのClone5 (P29mt+/+-5、P29mt+/+-5iv、P29mt+/+-5sc1、P29mt+/+実験により、用いた細胞におけるがん化の原因は mtDNA 変異で
5sc2、P29mt+/+-5sc3) に共通する変異が 12 個、Clone1 に特異はなく核DNAにあることが示唆された。
しかしmtDNA変異が、的な変異が 7 個、Clone5 に特異的な変異が 5 個存在した。さらにがんの悪性化へ関与している可能性が考えられたため、C57BL/6
Clone5 に特異的な変異については、転移後や腫瘍形成後に変異含(B6) 系統マウスのルイス肺がん由来細胞株である低転移性がん
有率が濃縮するという傾向が確認されたことから、特にこれらの細胞 P29 および高転移性がん細胞 A11 との間で mtDNA を置換
変異はがんの悪性化に直接寄与しているのではないかと考えられした実験が行われた。この実験では、A11 由来の mtDNA を有する。その他、結果の詳細は発表会にて報告する。
るサイブリッドは高転移性を示し、P29 由来の mtDNA を有する
サイブリッドは低転移性を示した。そこで両者の mtDNA 配列の【展望】比較が行われた結果、mtDNA の点突然変異が、がん細胞の転移
本研究では、がんの悪性化に寄与する可能性がある新規能を誘導しうるという、mtDNA 誘導性がん転移が提唱された。
mtDNA 点突然変異を複数見出したが、現時点ではサイブリッド
この先行研究でがん転移を誘導しうると報告されたのは、マウスを作製した際に、核 DNA にサイブリッドクローンおよび腫瘍のmtDNA の G13997A 変異であったが、他にもがん細胞の性質に特性に影響を及ぼす突然変異が偶発的に起きた可能性を完全に排影響を及ぼすmtDNA 突然変異が存在する可能性は十分に考えら除することができない。そこで今後は、サイブリッドクローンのれる。そこで、mtDNA mutator mice の+/mut マウスを代々かけ腫瘍形成能や転移能が、核 DNA 変異と mtDNA 変異のどちらに合わせて得た、生殖細胞系列にランダムな mtDNA 突然変異が蓄よって誘導されたものであるかを明らかにすることを目的として、
0積している+/+マウスの血小板をマウス 細胞に融合させて得た脱核融合およびサイブリッド作製を行う予定である。具体的には、
サイブリッドクローンを用いて、造腫瘍性と転移能が評価された。 サイブリッド P29mt+/+を脱核した細胞質体と、非転移性マウス
その結果、得られたサイブリッドクローンは、同一個体に由来す
繊維肉腫 B82 の mtDNA を除去した0B82 を融合し、B82mt+/+
る mtDNA を有しているにも関わらず、造腫瘍性や転移能においを作製する。このサイブリッドを用いた検証実験やマウス生体にて大きく異なる性質を示した。
おける造腫瘍試験等を行うことによって、確認された点突然変異
そこで本研究では、がんの悪性化に関与する新規 mtDNA 突然の性質を評価していきたいと考えている。
変異を同定することを目的として、先行研究で得られたクローンの中で、特に造腫瘍性や転移能が著しく高いクローンを中心に、次世代シーケンサーによる mtDNA の塩基配列解析を行った。
【材料・方法】
先行研究で樹立されたサイブリッドクローンのうち、低度の造腫瘍性及び転移能を示した Clone1 (P29mt+/+-1) 、高度の造腫瘍性及び転移能を示した Clone5 (P29mt+/+-5) 、コントロールとし

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 45Ⓒ2024 筑波大学生物学類

マウス培養細胞を用いた病原性突然変異型ミトコンドリア DNA の濃縮の試み
日比 保乃郁（筑波大学 生物学類）

指導教員：中田

和人（筑波大学 生命環境系）

究ではこの Cybrid を出発材料として A2689G 変異を有する
mtDNA を濃縮しようと考えた。
A2689G 変異を有する mtDNA を濃縮するために、mtDNA 複製阻害剤であるエチジウムブロマイド（EtBr）を用いた。Cybrid
を 2.5 μM の EtBr を添加した培地で 5 日間培養すると、mtDNA
コピー数が減少し、その後、通常培地で5 日間培養すると、
mtDNA
コピー数が回復する。このような mtDNA コピー数の減少と回復によるボトルネック効果を利用して、A2689G 変異を有する
mtDNA の割合が増加したクローンを単離しようと考えた。
mtDNA コピー数を回復させた後、シングルセルクローニングを行い、単離したクローンに含まれる A2689G 変異を有する
mtDNA の割合を PCR-RFLP（Restriction Fragment Length
Polymorphism）によって解析した。
さらに本研究では、よりわずかな A2689G 変異を有する
mtDNA の濃縮状態を検出するために dPCR の活用を検討した。
dPCR の条件検討では、野生型と A2689G 変異のオリゴ DNA を用いて検出感度を検証した。

【背景・目的】ミトコンドリアは脂質二重膜構造を有する細胞小器官であり、内膜に存在する呼吸酵素複合体によって ATP を産生する。哺乳類のミトコンドリアには核 DNA とは異なる独自の環状二本鎖構
造の DNA（mtDNA）が、細胞あたり数百から数千コピー含有されている。この mtDNA に病原性突然変異が生じ、そのような変異型 mtDNA が細胞や組織に高い割合で蓄積すると、ミトコンド
リア呼吸機能（ミトコンドリアにおける ATP 産生）が低下し、ミトコンドリア病と呼ばれる全身性の代謝疾患が発症する。
ミトコンドリア病の症例の中でも MELAS （Mitochondrial
myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like
episodes）は最も罹患率が高い病型である。MELAS の症例ではmtDNA にコードされた tRNALeu(UUR)遺伝子領域に点突然変異が高頻度に生じていることが知られており、特に同遺伝子領域のA3243G 変異が MELAS の症例の約 80%で見出されている。近年、この A3243G 変異が糖尿病や難聴の症例でも見出されたことを受け、A3243G 変異による多様な発症機構の存在が注目されている。しかし、A3243G 変異を含有する病態モデルマウスが樹立されていないことから、有効な治療法の探索はもとより、A3243G
変異による多様な発症機構の理解は遅れている。
そこで本研究では、ヒト A3243G 変異と相同なマウス A2689G
変異を有する、病態モデルマウスの作製を最終目的とした。核DNA と異なり、mtDNA にコードされた遺伝子の改変は極めて困難であり、CRISPR-Cas9 をはじめとした各種遺伝子改変手法をもってしても、未だに病態モデルマウスの作出には活用できていない。そこで本研究では、体細胞突然変異によって生じたわず
かな変異型 mtDNA を濃縮し、その細胞質体をマウス ES 細胞に導入する細胞生物学的な手法を活用することにした。

【結果】
これまでに（2024 年 1 月現在）、計 1,293 クローンを単離し、PCR-RFLP（検出感度 1.0％程度）を行ったが、A2689G 変異を有する mtDNA の濃縮は確認できていない。
dPCR における A2689G 変異を有する mtDNA の検出のための実験では、少なくとも 0.3％程度まで検出感度を向上させることに成功した。
【考察・展望】
所属研究室における別の変異型 mtDNA の濃縮研究において、
1,728 クローンの単離を介して変異型 mtDNA の含有率を0.4％
から 95％以上に濃縮することに成功している。本研究のように、極めて低含有率の変異型mtDNA（A2689G変異を有するmtDNAの含有率は 0.0104％）を濃縮させるためには、より多くのクローンの単離が必要であると考えられる。そこで今後は、クローン数を増やし、かつ、各クローンに含まれる A2689G 変異の含有率の解析に dPCR を用いることで、今までは検出できなかったよりわ
ずかな A2689G 変異を有する mtDNA の濃縮状態を検出し、A2689G 変異を有する mtDNA を多含する Cybrid の樹立を成功させたいと考えている。

【材料・方法】
A2689G 変異を有する病態モデルマウスの作製計画は以下の通りである。まず、A2689G 変異を高い割合で含有する培養細胞を脱核して得た細胞質体と、mtDNA を欠損させたマウス ES 細胞を融合させる。A2689G 変異を有する mtDNA をミトコンドリアごと導入したマウス ES 細胞を、マウス初期胚に移植してキメラ
マウスを作製する。雌のキメラマウスを野生型の雄と交配させ、全身に A2689G 変異を有する病態モデルマウスを誕生させる。
本研究では、この作製計画の出発材料である A2689G 変異を高い割合で含有する細胞の樹立を目指して、所属研究室の先行研究において作製された mutator mice の血小板と mtDNA 欠損培養
細胞を融合させた細胞質雑種（Cytoplasmic hybrid; Cybrid）を用いることにした。mutator mice とは mtDNA 複製酵素である
DNA Polymerase （PolG）の校正機能を欠損させたマウスであり、加齢に伴って mtDNA にランダムに突然変異が生じることが知られている。先行研究で樹立された Cybrid には A2689G 変異を有する mtDNA が 0.0104％の割合で含有されていたため、本研

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 46Ⓒ2024 筑波大学生物学類

マウス卵母細胞から変異型ミトコンドリア DNA が消失する機構の検証
佐々木悠馬（筑波大学 生物学類）

指導教員：石川【背景・目的】
細胞内小器官の一つであるミトコンドリアは、内部にミトコン
ドリア DNA、通称 mtDNA と呼ばれる核 DNA とは異なる独自の DNA を有している。哺乳類では、mtDNA は体細胞で数百～数千コピー、成熟した卵で十万コピーほど存在するといわれている。また、mtDNA はミトコンドリアの呼吸機能に関係する遺伝子をコードしているため、病原性突然変異が生じた mtDNA が蓄積した場合、ミトコンドリアの呼吸機能が低下し、ミトコンドリ
ア病を発症することが知られている。
ミトコンドリア病の原因となる病原性突然変異の一種として、大規模欠失型突然変異がある。この欠失によって mtDNA 全長の約 1/3 が抜け落ちて短くなった mtDNA をmtDNA と呼んでいる。所属研究室では、ヒトのmtDNA とほぼ同じ領域を欠失した
マウスmtDNA を有するミトコンドリア病モデルマウスの樹立に成功しており、このマウスを Mito-miceと呼んでいる。Mitomiceは野生型 mtDNA とmtDNA の両方を有しており、
mtDNA の割合はマウスの個体ごとだけでなく、単一個体の臓器や細胞ごとにも異なる。
Mito-miceでは、mtDNA が母親から仔へ遺伝するため、系統維持することが可能である。雌のmtDNA の割合が低すぎると、mtDNA はほとんど次世代に受け継がれず、高すぎると不妊になる。そのため、mtDNA の割合が 10～30%程度の雌を野生型の雄と交配させることで Mito-miceの系統維持を行なっている。この系統維持を通じ、「母親が若齢のときには、mtDNA を
様々な割合で有する仔が得られるのに対して、母親が加齢すると、
mtDNA が仔に伝わらなくなる」という現象が明らかになっている。
そこで、本研究では、「いつmtDNA が消失するのか」を検証した。この問いに関しては、「仔にmtDNA が伝わらなくなる月
齢はいつか (個体レベル) 」と、「mtDNA が消失する卵胞のス
テージはいつか (細胞レベル) 」という 2 つの意味合いがある。個体レベルの「いつ」に関して、先行研究により、「母親が 6 ヶ月
齢を超えると、仔にmtDNA がほとんど伝達されない」ということが明らかになっている。細胞レベルのいつに関して、卵がmtDNA を含んでいる場合、①卵が排卵されない②受精できない③発生過程で致死に至るという 3 つの仮説が立てられるが、「母親が加齢しても、産仔数の減少はみられない」ため、②と③の仮説は棄却される。したがって、①の仮説を検証するため、排卵に至るまでの卵の形成過程に焦点を当てて解析した。
【方法】
・卵巣を用いた組織学的解析
野生型マウスと 10～30%の割合でmtDNA を有する Mitomiceの雌から、ヶ月、ヶ月、ヶ月時点で卵巣を採取し、連続切片を作製した。それらの切片に対してヘマトキシリン・エオシ
ン (HE) 染色を行い、卵巣の中心付近 260 µm の範囲に含まれる
原始卵胞、一次卵胞、二次卵胞、胞状卵胞の数をカウントした。

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香（筑波大学 生命環境系）

・単一卵母細胞におけるmtDNA の定量
生殖系列の細胞のみが GFP 陽性になる Stella-GFP マウスを、
京都大学の斎藤通紀教授より提供して頂き、Mito-miceの雌と交配させた。得られた産仔のうち、10～30%の割合でmtDNA を有する雌に対して、様々な月齢で過排卵処理を行い、排卵した卵と、卵巣中に含まれる様々な発達段階の GFP 陽性卵母細胞を、顕微
鏡下ハンドピックにより採取した。採取した卵と卵母細胞に含まれるmtDNA の割合を定量した。
【結果・考察】詳細な結果と考察については発表会にて報告する予定である。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 47Ⓒ2024 筑波大学生物学類

腸内細菌由来機能未知酵素に関する研究青木 祐人（筑波大学 生物学類）

指導教員：熊野匠人（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】【結果・考察】
近年、腸内細菌が宿主の健康に対して大きな影響を与えること
SDS-PAGEでは、無細胞抽出液において目的遺伝子に由来すが明らかになってきている。その一つの要因は、食物に含まれるるタンパク質の明瞭なバンドは確認されなかった。また、HPLC
化合物を腸内細菌が代謝し、その代謝産物が宿主に対して生理活の結果、無細胞抽出液、休止菌体どちらの反応についても C1 の性を示すことである。したがって、腸内細菌がもつ代謝酵素機能減少は確認されなかった。可溶性画分の発現量増加を目的に、金の解明は、医療や製薬などの分野において重要な意義をもつと考属イオンの添加やエタノールの添加を行ったが、発現量は増加し
えている。
なかった。
カテキンはフラボノイドの一種であり、お茶、リンゴ、プラム、これらの結果から、宿主として大腸菌は目的遺伝子の発現に適
ココア、赤ワインなどの様々な食用植物に含まれており、血圧上していないことが示唆された。今回用いた腸内細菌はグラム陽性昇の抑制や、血中コレステロールおよび血糖値の調節、抗酸化作菌であり、さらにゲノム DNA が GC リッチである[1][2]。一方、大用などヒトの健康に関わる様々な活性を示すことが知られている。 腸菌はグラム陰性菌であり、GC 含量も異なることから、腸内細カテキンの腸内細菌による分解・代謝に関する報告はいくつか存
菌 の遺伝子を発現する宿主として、大腸菌は不適切である可能
在するものの、代謝酵素についての報告はほとんどなされていな性が考えられた。そのため、今後はグラム陽性で GC リッチな放い。
線菌を宿主にして酵素発現を試みる。
本研究室では、腸内細菌由来のカテキン代謝酵素の新規発見と当研究室で開発された大腸菌 – 放線菌シャトルベクターを用い機能解明のため、ヒト腸内細菌を対象に、候補となる遺伝子の絞ることで、プラスミド構築までを操作および培養が比較的容易な
り込みおよび同定を行ってきた。これまでに、(+) - カテキンから大腸菌で行い、酵素発現のステップを放線菌で行う予定である。
代謝産物 C1 が代謝されること、C1 から代謝産物 C2 が生成されることされることが明らかになっているが、C1 から C2 の反応を【参考】触媒する酵素は未だ特定されていない。
[1] 江崎孝行. (2006). 腸内に生息する細菌の系統. 腸内細菌学雑誌
本研究では、カテキン代謝産物 C1 を代謝する酵素の同定を目
20: 237–244.
的として、候補遺伝子 X の異種発現と機能解析を試みた。
[2] 藤澤倫彦. (2016). ヒト腸内グラム陽性細菌の分類の現状. 腸内細菌学雑誌 30: 177-190.
【方法】
腸内細菌からの DNA 抽出
脱酸素剤で嫌気状態を保った密閉容器内で、GAM 培地で満たしたねじ口試験管に 腸内細菌を植菌し 37℃ で 2 日間培養した。
培養した菌体を遠心分離し、キットを用いて DNA を抽出した。
目的遺伝子のクローニング
目的領域のプライマーを作成し、2ステップPCRでクローニン
グした。PCR溶液をアガロースゲル電気泳動し、目的バンドの切り出しおよびゲル抽出を行った。得られたインサートを NdeI と
XhoIによって制限酵素処理した大腸菌発現用プラスミドにクローニングした。
大腸菌での目的遺伝子の発現構築したプラスミドを大腸菌コンピテントセルに形質転換し、培養した。集菌した菌体を破砕し、遠心して無細胞抽出液を得た。
それを SDS-PAGE に供した。
C1 との反応
無細胞抽出液と休止菌体液（培養後の菌体を緩衝液で懸濁したもの）それぞれに C1 を添加し、37 ℃で一晩インキュベートした
のち、反応溶液を高速液体クロマトグラフィ（HPLC）に供した。

47

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 48Ⓒ2024 筑波大学生物学類

発達期大脳皮質における IL-17 受容体の発現と ASD モデルにおけるその変化
神谷 沙羅（筑波大学 生物学類）

指導教員：武井陽介（筑波大学 医学医療系）

二つのプローブを混ぜて脳切片と反応させた。抗 DIG 抗体とNBT/BCIP でシグナルを検出した。
(3) 免疫組織化学染色
IL17 受容体を発現する細胞種を同定するために、NeuN(ニューロン), GFAP(アストロサイト), IBA1(ミクログリア/マクロファー
ジ)の抗体染色と ISH の蛍光二重染色を行った。mRNA のシグナ
ルは FastRed(赤色)で検出し、各細胞マーカーを Alexa488 標識抗体(緑色)で検出した。
(4) 画像取得と統計解析
医学共通機器室に設置されているオールインワン型顕微鏡
BZX-980 (keyence)で写真撮影し、Photoshop (Adobe)を用いて画像処理を行った。JMP (SAS institute)で統計解析を行った。

【背景・目的】
精神疾患の原因と病態に免疫系の変調が関与しているという知見が集まっている。特にヘルパーT 細胞 17(Th17 細胞)による免疫反応は、自閉スペクトラム症(ASD, 自閉症)、統合失調症、うつ病などの精神疾患の病態に関与することが多くの臨床研究から示唆されている。これらの疾患患者の大脳皮質ではニューロンの配列や層構造の異常、シナプス密度・形態変化などが認められ、その機能異常の基盤となっていると考えられる。しかし、免疫反応がどのような過程で神経系に器質的変化を引き起こすのか不明な点が多く、Th17 細胞の寄与については理解が十分に進んでいない。
炎症性サイトカインのインターロイキン(interleukin; IL-)17A産生細胞である Th17 細胞は、腸管の粘膜固有層に多く存在しており、細菌や真菌の感染に対する防御反応、関節リウマチや多発性硬化症などの炎症性自己免疫疾患に関与する。IL-17A は、IL17RA と IL-17RC のヘテロ二量体からなる受容体に結合し、NFκB、MAPK、C/EBP を含む下流経路を活性化させ、標的細胞の炎症応答を誘導する。
自閉症は、コミュニケーションの障害や常同的行動パターンが見られ、3 歳までに発症する発達障害である。自閉症の環境要因のひとつに母体免疫活性化 (maternal immune activation; MIA)がある。MIA は細菌・ウイルス感染によって母体免疫が一過性に活性化される現象である。MIA により母体内で誘導された IL17A が胎盤を通過し、胎仔脳に作用して ASD 病態を引き起こす可能性が示されている。また自閉症患者では血中 IL-17A 濃度が上昇しており、IL-17A レベルと重症度が相関することが報告されている。しかし、血中 IL-17A の慢性的高値が中枢神経系に対してどのような影響を与えるかは不明である。中枢神経系におけるIL-17A とその受容体の分布は複数の研究グループから報告されているが、一貫性がなく、現在も議論が続いている。本研究では、①発達期におけるマウス脳の Il17ra とIl17rc のmRNA 発現を insitu hybridization(ISH)により調査し、②それぞれの分子を発現している細胞種を検討した。さらに③MIA 自閉症モデルの中枢神経系で両者の発現・分布の変化が観察されるのか検討を行った。
【実験方法】(1) 動物と脳切片作製
本実験には、生後(Postnatal day; P)0, 7, 14, 21, 28, 35 日目、成体の C57BL/6J マウス Mus musculus を用いた。所属研究室の先行研究に従い、MIA 自閉症モデルは、妊娠 12.5 日目の雌マウスに 20 mg/kg のポリイノシン酸-ポリシチジル酸［poly(I:C)］を投与し、生まれた仔を自閉症モデルとした。コントロール群にはPBS を投与した。
マウスを開胸し、1×PBS で脱血後、4% PFA/0.1MPB で灌流固定した。抜脳後、4% PFA/0.1MPB 中で一晩浸漬固定した。スラ
イディングミクロトームを使用して脳切片を作製した。
(2) in situ hybridization (ISH)
浮遊法で ISH を行った。Il17ra と Il17rc の CDS 内に 2 個ずつ(5’側と 3’側)RNA プローブを設計した。シグナルを増強するため、48【結果と考察】P0, P7, P14, P21(離乳期), P28, P35, 成体の脳で Il17ra とIl17rc mRNA の発現を調査した。P7 以降は、Il17ra は大脳皮質
V-VI 層、特に VIa, VIb 層に強く発現していた。調査した発達段階の中では P14 で ISH シグナルが最も強く、成体にかけて低下していた。一方、Il17rc は調査したすべての発達段階において IIVI 層に分布していた。
Il17rc は新生仔期(P0～P7)で発現が高く、成体にかけてシグナルが低下する傾向を示した。l17ra, Il17rc ともに明確な領野特異性は示さず、大脳皮質全体に分布していることが確認された。
IL17 受容体を発現する細胞種を同定するために、各種細胞マー
カーとの二重染色を行った。Il17ra は NeuN 陽性の第 VI 層ニューロンの約 60％に発現していることがわかった。Iba1 陽性ミク
ログリアやGFAP陽性アストロサイトの一部の集団にも発現が観察された。Il17rc は、中枢神経系に広く分布していることや、
IL17RA 以外の複数種の IL17 受容体とも複合体を形成するという報告を合わせて考えると、細胞種特異性は低く、多様な IL17 シ
グナル経路に関与するのかもしれない。現在、Il17ra が皮質-視床
投射ニューロンに特異的に発現しているのか検討するとともに、
Il17ra と Il17rc の double ISH を実施し、両者を共発現する細胞の同定を行っている。
MIA 自閉症モデルマウスでは、コントロール群と比較して、
Il17rc の発現レベルおよびその分布パターンに大きな変化は認められなかった。一方、Il17ra は P14 で顕著な発現低下が観察された。Il17ra は、生後の神経回路再編成が盛んな新生仔期から乳児期にかけて発現が強く、成体にかけて発現レベルが低下することと、自閉症モデルで乳児期に Il17ra の発現低下が顕著であることから、自閉症の顕在化に関与している可能性がある。
本研究では、予想に反して IL-17A 受容体がニューロンに発現していることが明らかになり、IL-17A とその受容体の中枢神経系
における機能を理解する最初の手がかりを得ることができた。今後は、IL-17A が大脳皮質形態形成にどのような影響を与えるかを直接調べるため、胎仔側脳室に IL-17A を投与する実験を計画している。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 49Ⓒ2024 筑波大学生物学類

炎症老化に応答した内在性レトロウイルスの発現動態の解析
指導教員：川口【方法】
1. マウス由来培養細胞を用いた ERV の発現制御機構の解析
DNA のメチル化による ERV の発現制御機構を明らかにする
ため、NIH/3T3 細胞（マウス胎児由来線維芽細胞）、および
RAW264 細胞（マウス腹水由来マクロファージ）に DNA メチル化阻害剤である 5-Aza-2’-deoxycytidine（5AzadC）を添加し、ERV の発現量を RT-qPCR 法により定量した。今回は先行研究に基づき、6 種類の ERV（MMERVK10D3, RLTR10D2, MERVL,ERVB5_1-I, ERVB5_1-ltr, MurERV4 ） を 解 析 対 象 と し た（Scheller M., et al., Nature Cancer, 2021）。

た。

RNA-seq 解析による ERV 発現量の比較
加齢に伴う ERV 発現量の変化を調べるため、28 週齢および 63
週齢の野生型マウスより末梢血単核細胞（PBMC；Peripheral
blood mononuclear cells）を分離し、total RNA を抽出して RNAseq 解析を行なった。また、DNA の脱メチル化に関わる Tet2 遺伝子を血球細胞特異的に欠損したマウス（Vav1 cre/Tet2 flox マウス；筑波大・坂田麻実子教授との共同研究）から分離した PBMCにおいても同様の解析を行なった。

RLTR10D2

10
1

1

0.1

0.1
1

2

3

2

3

1

0.1

1

3

4

1

5AzadC

4

10

1

0.1

0.1
2

3

ERVB5_1-Itr

10

Relative expression

Relative expression

1

2

5AzadCRLTR10D2

10

1

1

4

5AzadCMMERVK10D3

10

0.1
1

4

5AzadC

5AzadC

MERVL

10Relative expression

100

Relative expression

Relative expression

NIH/3T3 cells

MMERVK10D3

2

3

1

4

2

3

4

5AzadC図 1. 5AzadC 処理による ERV 発現量の変化
実験の結果、MMERVK10D3 および RLTR10D2 は、線維芽細胞だけでなくマクロファージでも検出され、5AzadC の濃度依存的に発現量が増加した。よって、これらの ERV は免疫細胞を含む多くの細胞種において、DNA メチル化による発現抑制を受けている可能性が示唆された。一方、MERVL は線維芽細胞特異的に、ERVB5_1-ltr はマクロファージ特異的に検出され、5AzadC
処理によって発現量に顕著な差が見られなかった。よって、これらの ERV では DNA メチル化による発現抑制の影響が小さいと考えられた。
2.

2.

敦史（筑波大学 医学医療系）

β-Actin 遺伝子を内在性コントロールとして用い、データを補正しRelative expression【背景・目的】
炎症老化とは、DNA の損傷など、加齢に伴う様々なストレスを受けた細胞の形質が変化することによって、個体レベルで慢性的な炎症が引き起こされる現象である。老化形質を示す細胞からは、IL-6 や TNF-α などの炎症性サイトカインをはじめとする種々の炎症応答関連物質が分泌されており、この現象は細胞老化関連分
泌形質（SASP；Senescence-associated secretory phenotype）と呼ばれている。SASP による炎症性サイトカインの分泌は様々な加齢性疾患の発症に関連することから、加齢に応答した SASP 関連遺伝子の発現制御機構を理解することは、老化形質の進行を抑制する上で非常に重要である。
近年、加齢に応答してクロマチン動態や DNA 修飾によるエピ
ジェネティックな転写制御が変化することにより、正常な細胞ではサイレンシングされている内在性レトロウイルス（ERV；
Endogenous retrovirus）の異常な発現が報告されている。ERV はレトロトランスポゾンの一種であり、太古のレトロウイルス感染の痕跡であると考えられている。ERV の異常発現は、自然免疫系を活性化することで炎症老化を誘導する可能性が示唆されている
ものの、その詳細なメカニズムは明らかではない。本研究では、ERV の発現制御に関わるエピジェネティックな要因として DNAのメチル化に焦点を当て、炎症老化に応答した ERV 発現動態の解析を目的とした。

RAW264 cells

赤羽 勇唱（筑波大学 生物学類）

RNA-seq 解析による ERV 発現量の比較
現在解析を進めており、詳細は発表会にて報告する予定である。

【展望】
今後、RNA-seq 解析により得られたデータから、発現量の変化に基づいて ERV のクラスタリングを行う予定である。応答性の異なる各クラスターに対し、メチローム解析をはじめとしたエピ
ゲノム解析を行うことで、炎症老化における ERV の発現制御機構を明らかにしていきたい。また、老化した個体の血球細胞ではTet2 遺伝子変異が頻繁に見られ、cGAS-STING 経路を介した慢性炎症を惹起することで加齢性疾患が誘導されることが報告されている（Xie J., et al., Leukemia, 2023）。cGAS-STING 経路は
細胞内二本鎖 DNA を認識することで炎症を惹起すると考えられているが、Tet2 遺伝子の変異により本経路が活性化されるメカニ
ズムは明らかになっていない。したがって、ERV 発現の活性化に応答して cGAS-STING 経路が活性化される可能性についても検討していく予定である。

【結果・考察】1. マウス由来培養細胞を用いた ERV の発現制御機構の解析
本実験では、5AzadC を異なる濃度（0, 30, 100, 300 nM）でNIH/3T3 細胞および RAW264 細胞に添加し、ERV 由来 mRNAの相対的な発現量を RT-qPCR 法により定量した（図 1）。また、

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 50Ⓒ2024 筑波大学生物学類

高タンパク質食摂取が筋損傷からの再生に及ぼす影響
沼尻 紘征（筑波大学 生物学類）

指導教員：武政【背景・目的】アスリートが受ける代表的な骨格筋の損傷として、肉離れがよく知られている。肉離れからの回復期間は通常の運動やトレーニングを行うことができず、期間が長引くほど脱トレーニング期間が長期化し、パフォーマンス低下を招くため、回復期間を短くすることはアスリートに限らず重要な課題である。
筋力トレーニングに対する栄養的介入として、タンパク質の積
極的な摂取が一般的に推奨されている。トレーニング後のタンパ
ク質摂取は筋タンパク合成の促進、筋力向上、ミトコンドリアタ
ンパク質生合成の促進など、骨格筋に対してポジティブな効果が報告されている（Camera, 2022）。筋損傷時は運動を継続することが困難なため、長期の不活動により筋萎縮や筋力低下が進んでしまうことになるが、タンパク質摂取は、筋タンパク質合成の促進により筋萎縮を抑制し、筋に対しポジティブな効果をもたらす
ことが報告されている(Fujita,2015)。
筋損傷において、損傷した筋組織を結合組織が修復する過剰な筋線維化は問題であり、これにより再損傷を起こしやすい瘢痕組
織が残存してしまう。低タンパク食を継続摂取したマウスにコラーゲンペプチドを経口摂取させた実験では、組織内コラーゲン量が増加することが報告されている（Ito et al., 2013）。筋線維化に関与する組織はコラーゲン線維が主に占めているが、タンパク質の摂取量増加によって血漿アミノ酸濃度が上昇することが分かっており（Trommelen et al,2023）、これが筋の線維化に関与すると私は予想した。高タンパク質食（High protein diet:以下 HPD）に よ っ て Mechanistic Target Of Rapamycin Complex 1（mTORC1)シグナル経路が活性化することが報告されているが（Miyatake et al,. 2020）、mTOR 活性化は線維芽細胞の肥大や分化促進にも寄与すると報告されている。また mTORC1 の阻害剤であるラパマイシンによる mTOR 阻害は線維芽細胞の増殖抑制を引き起こす（Alexander et al,. 2015）。以上の点から、HPD
は、筋損傷回復にネガティブな効果をもたらす効果があることが予想できる。
以上のことから、私は、HPD が筋損傷時の線維化を促進し、回復を遅延させることになると仮説を立てた。そこで、本実験では HPD が筋損傷からの再生に及ぼす影響について検討することを目的とする。
【方法】
7 週齢 C57BL/6 雄マウスを用いた。本実験では筋損傷モデルとして、前脛骨筋への Cardiotoxin（CTX）注射を用いた。CON（通常餌）群、HPD 群、CTX+通常餌群、CTX+HPD 群に分けた（各群 n=6）。1 週間の馴化飼育後、マウス左足前脛骨筋に CTX(10μM)を 50μL、右足に PBS を 50μL 注射した。HPD 群は餌をHPD（オリエンタル酵母：表 1）に変更した。4、7、14 日後に前脛骨筋を摘出した。摘出した筋サンプルは筋湿重量測定後、OCT
コンパウンドで覆い、液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結させ、切片作成まで-80℃で保存した。

50

徹（筑波大学 体育系）

保存したサンプルは、クリオスタットを用いて厚さ 10μm の切片を作成した。作成後、HE 染色を行った。切片を風乾させ、ヘマ
トキシリン溶液で 10 分染色した後、水道水で洗浄し、エオシン溶液で 30 秒染色し、水道水で洗浄後、100%エタノールで脱水した。
【結果・考察】マウスのタンパク質総摂取量は、損傷後 4、7、14 日において、HPD 群が通常餌群と比較して有意に高値を示した。
前脛骨筋の筋湿重量は損傷後 4、7 日後において、PBS 注射群と比較して CTX 群で優位に低下していたが、通常餌群と HPD 群間で有意差は確認できなかった。
現在解析中の結果と考察については発表会で報告する。
表 1 通常餌、HPD の成分組成
成分

通常餌

HPD

水分(%)

8.1

9

粗タンパク質(%)

23.2

50

粗脂肪(%)

4.9

7

粗繊維(%)

5.9

5

粗灰分(%)

3.3

3.6

代謝エネルギー(kcal/100g)

355.7

364.6

A
＊

＊

＊

＊

B

C

図 1 筋損傷後の筋湿重量の変化
A：損傷 4 日後 B：損傷 7 日後 C：損傷 14 日後

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 51Ⓒ2024 筑波大学生物学類

機械学習によるメダカの遺伝子発現量の予測古川

愛海（筑波大学 生物学類）

指導教員：尾崎遼（筑波大学

医学医療系）【背景・目的】評価を行なった。ハイパーパラメータは、n_estimators,
遺伝子が生体内において適切に機能を発現するために、時空間的
random_state, max_depth の 3 点について手動で調整した。結果な転写制御は不可欠である。特に真核生物においては、プロモーの評価には、テストデータにおける実際の発現量の値と予測値のターやエンハンサーなどの転写制御領域によって遺伝子発現調節
差の 2 乗である平均二乗誤差(MSE)と、実際の発現量の値と予測が行われる。遺伝子の転写制御領域と遺伝子発現に関する分野は値の相関係数を利用した。MSE が低く、相関係数が高い予測が精
情報科学を用いた研究がされており、深層学習や機械学習を用い度の高い予測であると言える。
た転写制御領域の予測モデルや、転写因子結合モチーフの研究開【結果・考察】発が行われている。転写制御の先行研究は、ヒトやマウスなどの入力処理とモデルの組み合わせにおいて、最も正確に予測できたモデル生物に対しては盛んに行われている[1]のに対し、非モデルのは GENA-LM のベクトル表現と RF の組み合わせであった。
生物においてそのような研究はほとんど行われておらず、ゲノム
ステージ 11 のサンプルに関して相関係数 0.55、MSE 0.024 とい
配列やオミクスデータに関するデータベースが整備されていない。 う精度で予測が可能であった。また、1 つの遺伝子配列入力から 2
そこで、非モデル生物のゲノム配列から転写制御領域を予測する
つのサンプルの発現量を予測するモデル(multiple-output model)
モデルの構築を見据え、本研究では、非モデル生物の１種であるで最も精度が高くなった。
メダカの転写制御領域から遺伝子発現量を予測するモデルをメダ最も精度が高かったモデルを用い、野生型の転写制御配列に一塩カの転写制御領域の遺伝子配列から遺伝子発現量を予測する機械
基置換を入れた変異配列を入力とした際に遺伝子量の予測がどの学習モデルを構築することを目的とした。
ように変化するかを調べる in silico mutagenesis 実験を、ステー【材料】
ジ11 で特異的に発現している上位100 遺伝子に対して実施した。
メダカの転写制御領域配列(入力値)
その結果、特に、G や C に置換した際に発現量が上昇するというメダカ(oryzias latipes)の転写開始点の上流 1000bp と下流傾向が見られた。
1000bp の合計 2000bp の塩基配列を転写制御領域の配列とし、遺さらに転写開始点の付近では配列に変異が加わると発現量が下伝子ごとに USCS Table Browser からダウンロードした。
がるという既存知識から、特に転写開始点の付近において変異をメダカの遺伝子発現量(予測値)
加えた配列からの予測値が元の配列からの予測値よりも低下する
メダカの胚発生のステージごとの RNAseq データを用いた[2]。デという仮説を立てた。しかし、予想に反して変異を加えた配列のータの分散を減らすために、全てのデータに 1 を足し、10 で対数予測値の変化は転写開始点からの位置と関係ないということがわをとったステージ 11 とステージ 40 の数値を実験に用いた。
かった(図 1)。
対象とした遺伝子
転写制御領域と発現量のデータの両者が揃っている遺伝子を用いた。また、対象遺伝子から Y 染色体およびミトコンドリアゲノムの遺伝子を除いた。さらに、適切な予測の検証を行うために、全てのサンプルでの発現量が 0 である遺伝子は除いた。最終的に11203 の遺伝子を対照とした。
【方法】
データセットの作成
対象の遺伝子データのうち、8 割を訓練データ、2 割をテストデー
タとした。リーキング（テストデータの情報が訓練データに不適切に含まれること）を防ぐために、訓練データセットの遺伝子の図 1 変異を加えた塩基の位置(x 軸の 0 が TSS)と変異による予中で、テストデータセットの遺伝子領域に重なるものは除いた。
測値変化の関係
その上で、全ての遺伝子において発現量から対象サンプルの訓練【展望】
データの平均値を引いた数値を実験用の遺伝子発現量とした。
変異に対する予測値の変化を求め、転写制御配列の中で遺伝子発また、下記で用いるモデルには塩基配列をそのまま入力できない
現量予測に対して影響力の高い部分配列を同定したい。そのようため、転写制御配列を長さ 3,4,5 の部分配列の数である 3,4,5-mer
な部分配列は転写調節領域である可能性が高いため、その部位をのカウントデータ、または、遺伝子配列のベクトル化処理である
予測するモデルを作ることによって、メダカの転写調節領域を予GENA-LM[3]による 1024 次元の数値ベクトルに変換した。
測することができるのではないかと期待される。
機械学習モデルによる計算機実験【参考文献】
機械学習モデルには、
random forest（RF）と XG boost を用いた。
[1]Eraslan et l., Net Rev Genet 20, 389-403, 2019
訓練データで発現量の予測を行うことでモデルの訓練を行い、訓[2] Li Y et al., Genome Res, 30(6) 924-937,2020
練を行ったモデルでテストデータの予測を行い、モデルの精度の[3]Veniamin F et al., bio Rxis, 544592, 2023

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 52Ⓒ2024 筑波大学生物学類

Sleepy / Dreamless ダブルヘテロ変異マウスの睡眠覚醒と脳波
矢内果穂（筑波大学 生物学類）

指導教員：柳沢正史（筑波大学

国際統合睡眠医科学研究機構）【背景と目的】
睡眠は、生存に不可欠な行動として、高等動物に広く保存されている現象である。しかし、睡眠のメカニズムに関しては、未だ不明な部分も多い。
マウスの睡眠は、脳波（electroencephalogram; EEG）の状態
によってレム（Rapid Eye Movement: REM）睡眠とノンレム（non-REM）睡眠という 2 つの睡眠段階がある。レム睡眠は覚醒時に似た高周波な脳波状態を特徴として持つ。ノンレム睡眠は0.5~4 Hz の高振幅、低周波の脳波によって特徴づけられる。いずれの睡眠段階においても、筋電は消失する。また、ノンレム睡眠時に見られるデルタ波のパワースペクトル（デルタパワー）の大
きさは、睡眠要求を示す指標として有効とされている。
これまで、我々の研究室では、マウスを用いた大規模な睡眠遺伝子のスクリーニングを実施しており、これまでに睡眠制御に関わる遺伝子として Sleepy（Slp）変異 Sik3 と Dreamless（Drl）
変異 Nalcn を新たに同定した。
キナーゼタンパク質である SIK3 をコードしている Ski3 遺伝
子に Slp 変異が生じているマウス個体では、覚醒時間の減少と、ノンレム睡眠時間の増加が見られるとともに、ノンレム睡眠時のデルタ波成分の増加も認められた。
電位依存的非選択的陽イオンチャネル NALCN をコードしている Nalcn 遺伝子に Drl 変異が生じているマウス個体では、レム睡眠時間の減少と、レム睡眠のエピソード継続時間の減少が見られた。
ノンレム睡眠とレム睡眠の、相互影響については、検討が無く、それらの関係性は解明されていない。そこで本研究では、ノンレ
ム睡眠に量的変化を起こす Slp 変異とレム睡眠に質的変化を生じさせる Drl 変異を同時に持ったマウスの睡眠を調べることで、レム睡眠とノンレム睡眠の相互の関係の理解の一助となる知見が得られると考えられた。

抽出した 2 について、4 秒ごとのエポックで区切る方法での解析も行った。
（3）ビデオ撮影
解析後、Sleepy / Dreamless ダブルヘテロ変異マウスの 1 個体
において、脳波・筋電の再測定を行った。その際、測定に並行して無人のビデオ撮影を行い、マウスの行動を観察した。

【方法】（1）Sleepy / Dreamless ダブルヘテロ変異マウスの作成
Slp ホモ変異個体の卵と Drl ヘテロ変異個体の精子を用いて、IVF（体外受精）を行った。得られた仔から Slp ヘテロ変異個体の雌と雄、Sleepy / Dreamless ダブルヘテロ変異個体の雄と雌から 10 匹の計 40 匹を実験材料に選んだ。
生後 8～11 週目に、マウスの頭部に脳波測定及び筋電測定用の電極を外科手術により取り付けた。2 週間以上の回復期間の後に睡眠測定を行った。睡眠測定では、生理的な睡眠状態と、6 時間の断眠後に、脳波・筋電をベースとして、睡眠の記録を行った。
（2）Sleepy / Dreamless ダブルヘテロ変異マウスの睡眠の解析
マウスは自由飲水・採餌下で 12h ごとの明暗サイクルのもと飼育された。睡眠測定は 48h 実施した。記録された脳波と筋電は 20
秒ごとのエポックで区切り、脳波成分と筋電位の情報から覚醒、
ノンレム睡眠、レム睡眠の 3 つの状態のいずれか判定を行った。
なお、Sleepy / Dreamless ダブルヘテロ変異マウスに対しては、【考察・展望】【結果】
Slp ヘテロ変異マウスに比べて、Sleepy / Dreamless ダブルヘ
テロ変異マウスでは、レム睡眠のエピソード継続時間が優位に減少していることが確認された。
Sleepy / Dreamless ダブルヘテロ変異マウスにおいて、覚醒中に 2 秒前後、5~6 Hz ほどの脳波が発現する脳波が頻発していることが、解析中に偶然発見された。その脳波の際、筋電は消失していた。（図 1）
撮影されたビデオと、同時期の脳波・筋電を照合したところ、
図 1 様の脳波・筋電で筋電が消失しているエポックでは、マウスの動きは止まっていることが明らかになった。この活動停止中、確認できたエポックにおいて目は開かれたままであることが確認できた。

図 1 Sleepy / Dreamless ダブルヘテロ変異マウスで特に頻発して見られる脳波と筋電Sleepy / Dreamless ダブルヘテロ変異マウスの睡眠は、Slp 変
異個体と Drl 変異個体の双方の睡眠の特徴を示すことが明らかになった。。
図 1 様の脳波・筋電にはてんかん患者に見られる欠神発作との共通点がいくつか見られる。よって図 1 に示される現象はてんかんに類似した状態である可能性が考えられる．今後、てんかんの治療に用いられる薬剤の 1 つであるパルプロ酸ナトリウムをSleepy / Dreamless ダブルヘテロ変異マウスに投与し、図 1 様の脳波・筋電の発生回数の変化を調べることを計画している。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 53Ⓒ2024 筑波大学生物学類

哺乳動物の受精後刷り込みメチル化は種や遺伝子座をこえて保存されているか
森橋 美月（筑波大学 生物学類）

指導教員：谷本【背景】
ヒトを含む哺乳動物は、父親と母親からそれぞれ 1 セットずつゲノムを受け継ぎ、両アレルの遺伝子は仔で等しく発現する。しかし、一部の遺伝子は例外的に、由来する親の性に依存した片側アレル性の発現を示し、同現象は「ゲノム刷り込み」と呼ばれる。
どちらの親由来の遺伝子が発現するかは、遺伝子周辺の刷り込み制御領域（Imprinting control region; ICR）における DNA メチ
ル化状態が両親由来で異なることで制御され、ヒトやマウスでは、
母由来で高メチル化である ICR は 20 個程度、父由来で高メチル化である ICR は、H19-ICR、IG-DMR、Rasgrf1 の 3 つのみが知られる。刷り込み発現は胎児の成長を促進、または抑制する遺伝子によくみられるため、哺乳動物の正常な発生や成長に必須である。
受精後の初期発生胚は、ゲノム全体が DNA 脱メチル化されることで分化多能性を獲得する。しかし ICR では、一方の配偶子のみで獲得した DNA メチル化が、ゲノム全体の脱メチル化に抵抗して維持される。所属研究室では、H19-ICR が精子でのみメチル化を獲得し、それが受精後も維持されるメカニズムを理解するために、マウス H19-ICR の DNA 配列をもつトランスジェニック
マウス（TgM）を作製した（図 1A）。その結果、予想外に、同配列は精子ではメチル化されず、受精後の初期胚でメチル化された（図 1B）。この現象は、内在 H19-ICR の挙動とは異なっており、新たに「受精後刷り込みメチル化」と名付けられた。
H19-ICR 配列内で受精後刷り込みメチル化に必要なDNA配列を同定するためには、同配列を、共通の機能をもつ他の DNA 配列と比較することが有益だと考えられた。そこで、このような候補として、マウス H19-ICR に相同性が高いラット H19-ICR 配列、および、H19-ICR と同様、父由来で高メチル化となるマウス
IG-DMR について、それぞれ TgM を作製した（図 1A）。その結果、ラット H19-ICR 配列（2,809 bp）は、マウスで同定した受精
後刷り込みメチル化に必要とされる 118 bp 配列と相同な配列（113 bp）を含むにも関わらず、受精後刷り込みメチル化が起こらなかった。一方、父由来アレルでの高メチル化維持に必要なことが報告された 216 bp のリピート配列を含むマウス IG-DMR 配列（2,674 bp）は、受精後に父由来アレルでのみ高メチル化された。ところが、同配列は胚盤胞期以降、低メチル化であるべき母由来アレルで高メチル化されてしまった。これらの結果より、両配列には、完全な受精後刷り込みメチル化に必要な配列が含まれていないことが考えられた。
そこで私の卒業研究では、以前の DNA 断片よりも塩基配列を伸長した新しい断片を用いて TgM を作製し、受精後刷り込みメ
チル化に必要な制御配列を同定することを目的とした（図 1A）。
まずラット H19-ICR 配列は、その後の研究から、新たにマウス
H19-ICR の受精後刷り込みメチル化に重要と考えられた配列を含むように伸長した。一方、マウス IG-DMR については、他研究グループによって最近報告された、母由来アレルでの低メチル化の維持に必要な配列を含めた。

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啓司（筑波大学 生命環境系）【方法】
新たに作製した各配列は、巨大な酵母人工染色体（Yeast
Artificial Chromosome; YAC）の内部に挿入した。YAC への挿入には Tg を位置効果から保護する目的がある。位置効果とは、Tgがゲノム上に挿入された位置の違いによって、その活性や機能が変化する現象である。本研究では、研究対象の断片と、YAC 外側のマウスゲノム配列との距離が十分に離れることで、各配列が周囲のゲノムからの影響を受けにくくなることを期待した。また、両配列は異なる 2 種類の loxP 配列（loxP5171 及び loxP2272）で交互に挟まれるように連結した上で、YAC に挿入した。酵母より
YAC-DNA を精製した後、顕微注入法によりマウス受精卵に導入した。得られた仔マウスのうち、Tg を 1 コピーもつ個体を定量
PCR により同定した。その後、同 YAC-TgM と、卵でのみ Cre
酵素を発現する Zp3-Cre TgM との交配により、マウス生体内での Cre-loxP 組換え反応を誘導した。その結果、次世代で、ラット
H19-ICR 配列、または、マウス IG-DMR 配列どちらか一方のみをもつマウスが得られた。今後、これらの Tg を父由来、あるいは、母由来で受け継ぐマウスについて、bisulfite sequencing 法とメチル化感受性定量的 PCR 法を用いることで、そのメチル化状態を調べる計画である。
【結果・展望】
現在までに、ラット H19-ICR、あるいは、マウス IG-DMR 配列をもつ TgM がそれぞれ 3 系統ずつ得られており、今後、父、または母から受け継がれた Tg のメチル化状態を調べる。
ラット H19-ICR Tg で受精後刷り込みメチル化が起こる場合、伸長した配列内に重要な領域が含まれる可能性がある。また、マウス IG-DMR Tg で母由来の低メチル化状態が胚盤胞期以降も維持される場合、他研究グループが報告した配列が重要である可能性がある。種間での H19-ICR 同士の比較や、異なる遺伝子座（H19-ICR と IG-DMR）間の比較をすることで、受精後刷り込
みメチル化に必要な配列の探索をおこなう。

A. mouse Igf2-H19 gene locus
Igf2

rat Igf2-H19 gene locus

H19-ICR H19

H19-ICR H19

Igf2

2,809 bp

2,869 bp
118 bp3,549 bp
113 bpmouse Dlk1-Dio3 gene locus: Sox-Oct
Dlk1

IG-DMR

Gtl2

Rtl1

Rian

Mirg

Dio3

: CTCF

2,674 bp
repeat配列（ 216 bp）
4,670 bp

B.

paternal

精子
受精

卵

着床

maternal

図 1 A. TgM 作製に用いた DNA 断片
B. マウス Tg H19-ICR でみられた受精後刷り込みメチル化

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 54Ⓒ2024 筑波大学生物学類

老化因子が血管周囲のミクログリアに与える影響山下

直輝（筑波大学 生物学類）

指導教員：鶴田 文憲（筑波大学 生命環境系）【背景と目的】ヒトやマウスの脳では老化に伴って認知機能が低下することが知られており、その主な要因として神経炎症の亢進が挙げられる。
神経炎症は脳内の免疫担当細胞であるミクログリアによって媒介されており、老化した脳ではミクログリアの活動が過剰になることで炎症が亢進している。先行研究では炎症に関わる老化促進因子として β2-microglobulin (B2m) が同定されている。B2m は
MHC クラスⅠ分子のサブユニットとしてほとんどの有核細胞表面に発現し、その一部は細胞外へ遊離している。脳内においてB2m はミクログリアで多く発現しており、発現量は加齢とともに上昇する。また血中および脳脊髄液中の B2m 濃度が加齢に伴って上昇すると認知機能の低下が起こることが報告されている。しかし、ミクログリアの B2m 発現上昇と、ミクログリア周囲環境の B2m 濃度上昇のどちらが炎症の制御に重要であるかは明らかでない。そこで本研究では、B2m がミクログリアを制御し、老化
表現型を引き起こす分子メカニズムの解明を目的とした。

(TOYOBO) を用いて Fast Real-Time PCR System (Applied
Biosystems, 7900HT) で反応させ、5S をインターナルコントロールとして IL-1β の mRNA の発現を定量した。
(5) 免疫細胞染色
カバーガラスに BV2 細胞を播種して遺伝子導入を行い、24 時
間培養を行った後、PBS で洗浄してから 4%PFA/PBS に置換し、氷上で 10 分間固定した。PBS で洗浄した後、5%BSA /0.25% Triton X-100 / PBS を添加して室温で 30 分間透過処理とブロッキングを行った。一次抗体として、抗 GFP 抗体(1:1000,Abcam)、抗 RFP 抗体 (1:1000, Rockland) を用いて室温で 2 時間反応させた。PBS で洗浄した後、蛍光色素が結合した２次抗体を 30 分間反応させて染色した。核の染色には 1.0µg/mL DAPI (Dojindo) を用いた。得られたサンプルは蛍光顕微
鏡 (Keyence, BIOREVO BZ-9000) を用いて観察した。得られた画像から、ImageJ を用いて共局在指数 (Pearson’s value) を算出した。

【実験方法】(1) プラスミド作製
B2m をマウス (C57BL/6) 脳 cDNA ライブラリからクローニ
ングして、pCS4 ベクター (pCS4-mCherry) の BglII の制限酵
素サイトに組み込んだ。
(2) 遺伝子導入
ヒト胎児腎細胞 (HEK293T) とマウスのミクログリア細胞株(BV2) を用いて実験を行った。HEK293T は DMEM、BV2 はDMEM/F12 を培地として用いた。リポフェクション法により
B2m-mCherry を細胞に遺伝子導入した。トランスフェクショ
ン試薬には 1.0 mg/mL Polyethylenimine MAX (Polysciences)を用いた。
(3) ウエスタンブロッティング
サンプルとして培養上清と細胞抽出液を回収した。培養上清は、条件培地から 100µL 回収して 3000g で 5 分間遠心を行い、
上清 90μL を回収した。細胞抽出液では、細胞を冷却した PBSで洗浄した後、Lysis Buffer を用いて細胞を溶解した。回収したサンプルに Sample buffer を添加し、3 分間ボイルを行った。サンプルはアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、Transfer
buffer を用いて PVDF 膜へ 100V で 60 分間の転写を行った。
PVDF 膜は、5%スキムミルク/ TBS-T でブロッキングした後、5% BSA/TBS-T に希釈した一次抗体を 4℃で一晩反応させた。
一次抗体には、抗 RFP 抗体 (1:1000, Rockland)を用いた。その後、TBS-T で洗浄し、5% スキムミルク/TBS-T に 1/20000 で希釈した二次抗体を 1 時間反応させた。PVDF 膜を TBS-T で洗浄し、ケミルミワン Super (nacalai tesque) で検出した。
(4) RT-qPCR
total-RNA は IsogenⅡ (Nippongene) を用いて抽出し、Revertra Ace (TOYOBO) と Random primer (TOYOBO) を用いて逆転写を行った。Thunderbird SYBR qPCR Mix【結果・考察】まず、B2m と mCherry が融合したプラスミドを構築してHEK293T 細胞に導入し、ウエスタンブロッティングを行った。
その結果、細胞だけでなく培養上清でも B2m が検出できた。以上の結果から、B2m が細胞外へ放出されていることが示唆された。
次に、細胞外へ遊離した B2m がミクログリアを活性化するか検証するため、B2m を含んだ培養上清を BV2 細胞に添加して炎症反応が引き起こされるか解析した。B2m を加えてから 3 時間後に qPCR を行った結果、IL-1β の mRNA 発現量がコントロールと比較して有意に増加していた。この結果から、細胞外に遊離したB2m がミクログリアの炎症反応を促進することが示唆された。
また、B2m の発現上昇がミクログリアの炎症反応を制御するか検証した。BV2 細胞に B2m を過剰発現させ、他の細胞小器官とともに免疫細胞染色を行って観察した。その結果、各細胞小器官と B2m の共局在指数を算出して比較したところ、リソソームのマーカーである LAMP１と顕著な共局在が観察された。マクロファージの研究では、B2m がリソソームに蓄積すると炎症反応が誘導されることが明らかにされており、ミクログリアでも同様の現象が起こっている可能性が考えられる。
以上の結果から、加齢に伴う B2m 濃度の上昇がミクログリアの炎症反応を促進する可能性が示唆された。今後は、外因性B2m がどのような経路でミクログリアの炎症反応を促進しているのかを明らかにしていく。また、ミクログリアで発現上昇した
B2m がリソソームに蓄積する可能性が示唆された。今後、内因性 B2m がリソソームに蓄積することで炎症の制御に関与しているか検証していく予定である。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 55Ⓒ2024 筑波大学生物学類

脳室周辺のグリア細胞による脳実質の恒常性制御
宇野 めぐみ（筑波大学 生物学類）

指導教員：鶴田文憲（筑波大学 生命環境系）

mm, ML: +1.0 mm, DV: −2.5 mm の位置に挿入した。その後エバンスブルーを 0.2 µL/min で 1 µL 投与した。注入後、ハミルト
ンシリンジは逆流を防ぐために 5 分間静置した。注入後 24 時間
後に灌流固定を行い、サンプルを作成した。

【背景と目的】
哺乳動物は、体温を一定の温度域に維持するために環境の変化に応じて体温制御を行っている。この体温制御機構は、脳の視床下部に存在する神経細胞によって制御されている。これまで当研究室では、体温制御に関わる候補因子として、RNA binding motif
protein3 (RBM3) に着目してきた。RBM3 は低温応答性の RNA
結合タンパク質で、脳内では視床下部で強く発現することを見出している。また、この RBM3 を全身で欠損させた RBM3 ノック
アウト (KO) マウスでは、低温刺激に対して体温が維持できなくなることから、RBM3 は体温を一定に留めておく制御因子である
ことが示唆されている。しかしながら、脳内における RBM3 発現制御機構の詳細は明らかになっていない。
先行研究から、哺乳動物における RBM3 の発現は周期性を持
ち、体温が低下する睡眠時に発現が上昇することが報告されている。興味深いことに、近年、睡眠時の哺乳動物の脳内では、脳と脊髄を循環する組織液である脳脊髄液 (CSF) の流量が増加する
ことも報告されている。また CSF は様々な成長因子や栄養因子を含み、脳の恒常性維持に重要である。例えば、IGF1 などの成長因
子は、脳室壁の表面に存在する上衣細胞に取り込まれ、突起の先端に輸送される。上衣細胞は周辺のアストロサイトと相互作用することから、CSF から取り込まれた因子がアストロサイトを制御し、脳室近傍の神経細胞の機能を調節している可能性が考えられた。そこで本研究では、脳室の CSF 流入に伴う上衣細胞とアストロサイト間の連絡が、神経細胞における RBM3 発現を制御するか解明することを目的とした。
【方法】（１）免疫組織染色
アストロサイトの解析は、アストロサイトを GFP で蛍光標識させた遺伝子改変マウス (ALDH1L1-GFP マウス) を使用した。
P20 の ALDH1L1-GFP マウスを灌流し、脳を摘出した後に 4 ％PFA/PBS 溶液を用いて一晩浸透固定した。その後 30 %スクロー
ス/PBS 溶液で置換し、30 %スクロース/OCT compound (1:1) で包埋した。その後クライオスタットを用いて厚さ 30 µm の冠状断面の切片を作製した。作製した凍結切片は、5 %BSA/0.25 %Triton
X-100/PBS 溶液を用いて室温で 1 時間処理した。染色は、アストロサイトを検出するため抗 GFP 抗体 (1:500) を、核を染色するために DAPI (1:1000) および Hoechst33342 (1:1000) を用いた。
染色画像は共焦点レーザー顕微鏡 (ZEISS, LSM710) で Z-stack
画像を 1 µm 間隔で 30 枚撮影した。
（２）エバンスブルーの局所投与
P20 の野生型 (WT) マウスおよび RBM3 KO マウスに、CSF
中のアルブミンを染色するエバンスブルーを局所投与した。はじめにイソフルランで麻酔し、脳定位固定装置 (Narishige, IMS-20、Narishige, SR-AM) に固定した。側脳室に注入するために、5 µL
ハミルトンシリンジ (Hamilton, 75N) をブレグマから AP: +0.5

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【結果】
はじめに、視床下部に位置する第三脳室周辺のアストロサイトの発現を観察するため、ALDH1L1-GFP マウスの免疫組織染色を行った。この際 E18 と P20 という異なる発達段階のマウスを用いて、神経細胞やグリア細胞の分化が未完成な胎児期と、分化が完了した成熟期について比較実験を行った。その結果、E18 では ALDH1L1 陽性細胞は第三脳室周辺の上部で多く、下部ではほとんど観察されなかった。一方 P20 では一様な分布が観察された。このことから、成熟期と比べて胎児期ではアストロサイトが第三脳室周辺において特徴的な分布パターンを示すことが分かった。
次に、このような分布パターンと CSF の脳実質への流入場所に関係があるかを検証するため、P20 の WT マウスにおいてエバン
スブルーの局所投与を行った。その結果、エバンスブルーの脳実質への流入場所は各脳室で一様に観察された。P20 の ALDH1L1GFP マウスでは ALDH1L1 陽性細胞が一様に分布していることから、アストロサイトの分布と CSF の流入場所が一致していることが示された。
次に、CSF の脳実質への流入量が RBM3 の発現の有無によって変化するかを検証するために、WT マウスと RBM3 KO マウス
を用いて同様の実験を行った。その結果、RBM3 KO マウスの流入量は WT マウスと比べて減少していた。このことから、RBM3
KO マウスでは CSF の脳実質への流入効率が低下している可能性が考えられた。
【展望】
本研究では、ALDH1L1-GFP マウスを用いて発達段階における第三脳室周辺のアストロサイトの異なる分布パターンを示した。
今後は、P20 の WT マウスにおける脳室周辺の上衣細胞や神経細胞の発現を観察するために、免疫組織染色を行いたいと考えている。また、TGFβや IGF1 などの成長因子を導入した AAV を作成し各脳室に導入することで、上衣細胞とアストロサイト間の成長因子の連絡を観察したいと考えている。また、RBM3 KO マウ
スではCSF の流入量がWT マウスに比べて少なかったことから、CSF 中の成長因子の透過性が低下している可能性が考えられる。
RBM3 は神経新生に働くことから、RBM3 KO マウスでも上記の実験を行うことで、CSF の流入に伴う成長因子の神経細胞への影
響は、神経新生に関与するか明らかにしたいと考えている。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 56Ⓒ2024 筑波大学生物学類

非定型カドヘリン Fat3 はプリン代謝と連携してミクログリアを制御する
上田 健太郎（筑波大学 生物学類）

指導教員：鶴田 文憲（筑波大学 生命環境系）【背景と目的】脳は、多くの神経細胞とグリア細胞によって構成されている。
グリア細胞はオリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログ
リアの 3 つに大別される。中でもミクログリアは、脳内における免疫機能を担う常在型マクロファージとして知られている。近年、
ミクログリアはシナプスの形成や刈り込み、神経細胞のアポトー
シス誘導など、脳の発達に重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。脳の発達過程においてミクログリアは著しく増殖し、その形態や機能を変化させていく。そして、互いに重なり合わないようにテリトリーを形成し、脳の恒常性維持に寄与している。これまで、所属研究室では、ミクログリア様細胞 BV2 において、プリン代謝産物であるヒポキサンチン刺激が細胞突起を安定化させることを発見し、その制御因子として非定型カドヘリン
タンパク質 Fat3 を同定している。また、Fat3 ノックアウトマウ
スでは、ミクログリアの細胞突起が過剰形成されることも見出している。しかし、Fat3 がプリン代謝を介して成体ミクログリアを制御する分子メカニズムは不明であった。本研究では、Fat3 がプリン代謝と連携して、成体ミクログリアの状態変化に寄与する分子メカニズムを明らかにすることを目的とした。
【方法】
1. 免疫組織染色野生型 (WT) マウスと Fat3 の C 末端に HA タグを挿入した
Fat3-HA マウスをそれぞれ PBS で灌流し、脳を摘出した後に、
4 % PFA/PBS 溶液で浸透固定した。その後、30 % Sucrose/PBS
溶液で置換し、凍結サンプルを作製した。凍結させた脳を、クライオスタットを用いて厚さ 50 µm の凍結切片を作製した。作製した切片に 5 % BSA/0.25 % Triton X-100/PBS 溶液を添加し、室温で 4 時間、透過処理を行った。その後、抗 IBA1 抗体 (1:200) と抗 HA 抗体 (1:500) を用い、4 ℃で一晩反応させた。一次抗体反応後、蛍光色素が結合した二次抗体と核を染色する Hoechst(1:1000) を添加した。
染色画像は、
共焦点レーザー顕微鏡 (ZEISS,LSM710) を用いて取得した。
2.

共免疫沈降 (Co-IP)
HEK293T 細胞に Flag-Fat3 ICD と HA-HPRT の発現プラス
ミドを導入した。導入後、48 時間後に細胞を回収し、Lysis buffer(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.5 % NP-40, 1 mM EDTA, 1
mM DTT) で溶解した。その後、十分に洗浄した Flag ビーズを加え、4 ℃で 3 時間混和した。混和後、Flag ビーズを Lysis buffer
で洗浄し、タンパク質をウエスタンブロットで検出した。

抗体 (1:1000)、抗 Flag 抗体 (1:1000) を用いて 4 ℃で一晩反応させた。
一次抗体反応後、
TBS-T で洗浄し、5 %スキムミルク/TBST で希釈した二次抗体を室温で 1 時間反応させた。二次抗体反応
後、化学発光検出試薬を用いて検出した。
【結果・考察】Fat3 の細胞内ドメインは切断される
はじめに、Fat3-HA マウスを用いて、ミクログリアマーカーである IBA1 と HA の免疫組織染色を行った。その結果、Fat3 の C
末端はミクログリアの核近傍に局在していた。以上の結果から、脳内において Fat3 はミクログリア内で発現しており、細胞膜ではなく、切断されることで核近傍に局在する可能性が示唆された。
先行研究では、特定の膜タンパク質は切断されて断片化し、その断片が本来の機能とは異なる機能を持つことが報告されている。
そこで、Fat3 も細胞内ドメイン (ICD) が切断されることで核近傍への局在が見られるのではないかと仮説を立てた。Fat3 ICD が切断されているかを検証するために、Fat3-HA マウス脳のウエス
タンブロットを行った。その結果、Fat3 の完全長のバンドだけでなく、さらに分子量の小さいバンドが 3 つ検出された。最も分子量が小さいバンドは ICD よりも小さく、HA が ICD 側 (C 末端側) に存在していることから、Fat3 ICD は切断されることが推察された。
Fat3 ICD は HPRT と相互作用する
タンパク質間相互作用のデータベースにおいて、膜タンパク質である Fat3 が細胞質に存在している Hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase (HPRT) と相互作用することが報告されている。HPRT はプリン代謝においてヒポキサンチン代謝反応を触媒する酵素である。また、所属研究室の先行研究で、ヒポ
キサンチン刺激によって Fat3 の発現量が上昇することを見出している。そこで、Fat3 は切断され、ICD は HPRT と相互作用すると仮説を立てた。これを検証するため、Co-IP を行ったところ、
HA 抗体でブロットした Co-IP サンプルで HPRT のバンドが検出された。このことから、Fat3 ICD と HPRT が相互作用していることが示唆された。
本研究では、Fat3 がマウス脳内で切断され、断片化されることを見出した。さらに、Fat3 ICD がプリン代謝関連酵素である
HPRT と相互作用することを見出した。これらの結果は、Fat3 断
片が HPRT と複合体を形成し、ミクログリアの状態変化に寄与していることを示唆するものである。
【展望】
今後は、成体ミクログリアのテリトリー形成において、Fat3 の断片化がどのように関わるかについて検証を進めていく。また、以上の現象がプリン代謝を介して成体ミクログリアの維持に関与しているかについて明らかにしていく。

3.

ウエスタンブロット
SDS-PAGE により、作製したサンプル中のタンパク質を分離し、PVDF 膜に転写した。その後、PVDF 膜を 5 %スキムミルク/TBS-T を用いて blocking し、5 % BSA/TBS-T で希釈した抗 HA

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 57Ⓒ2024 筑波大学生物学類

キイロショウジョウバエのメス生殖幹細胞に対する腸内細菌の影響
林

良祐（筑波大学 生物学類）

指導教員：丹羽【背景・目的】
卵形成は、多くの生物にとって子孫を残すために重要な過程である。卵形成の活性は、季節や個体の栄養状態といった様々な外的・内的要因によって制御され、生物の生存と生殖のバランスを調節している。卵形成の制御機構の詳細を知ることは、生物の生存戦略を深く理解する上で重要である。その一方で、卵形成の制御に関わる分子経路や、経路同士の相互関係については未解明の部分も少なくない。
本研究ではキイロショウジョウバエ Drosophila melanogaster（以下、ショウジョウバエ）の卵巣に存在し、卵形成に必須である生殖幹細胞（germline stem cell：GSC）に着目した。そして、GSC 制御に影響する新規因子の特定を試みた。ショウジョウバエのメス成虫において、GSC は卵巣を構成する管状の構造（卵巣小管）の頭部側先端付近に存在し、非対称分裂によって将来卵に発達する娘細胞を産み出す。GSC の分裂頻度は、栄養状態によって変化する [1]。また、交尾後に生じる GSC の増加は、腸由来のペプ
チドホルモンの作用を介する[2]。これらの報告から、私は GSC 制
御に際して、腸のはたらきが重要であると考えた。他方、ショウ
ジョウバエの腸内には宿主に様々な影響を与える腸内細菌が共生している。以上のことから、私は腸内細菌が宿主の GSC 制御に与える影響を明らかにしようと試みた。
【方法】（1）実験個体の飼育と腸内細菌の除去
ショウジョウバエの飼育に用いる餌に、抗生物質の amoxicillin（終濃度 100 μg/ml）および gentamicin（終濃度 50 μg/ml）の混合溶液を加えた。抗生物質添加あるいは未添加の餌を含むバイ
アルに、実験対象系統の未交尾のメス成虫 10～15 匹を移して、25℃で 4～7 日間飼育した。飼育期間の終了後にこれらのメス成虫を解剖して、卵巣を取り出し、GSC 数の計測や比較に用いた。
（2）卵巣の免疫組織化学染色
各処理区で飼育したメス成虫の GSC 数を計測・比較するために、卵巣の免疫組織化学染色を行った。まず、1 xPBS 中でショウジョウバエを解剖し、取り出した卵巣を 4%パラホルムアルデヒ
ド in 1 xPBS に加えて固定した。次に、1 次抗体として抗 Hts 抗体、抗 Lamin-C 抗体、および抗 pMad 抗体を用いて、1 次抗体反応を行った。さらに、Alexa 蛍光標識 2 次抗体を用いて 2 次抗体反応を行い、卵巣小管の頭部側先端の構造を可視化した。

隆介（筑波大学 生存ダイナミクス研究センター）
GSC を数え上げ、各処理区における GSC の平均個数を算出した。
そして、ウィルコクソンの順位和検定によって処理区ごとの GSC
数の比較を行った。
【結果・考察】まず、ショウジョウバエを用いた実験においてコントロール系
統としてよく利用される w1118 について、実験を行った。一貫して抗生物質非処理の餌で飼育した群（conventional：conv.）、幼虫期 から 解剖直 前ま で抗生物 質処 理した 餌で 飼育した 群（Antibiotics from Larva：ABL）、および幼虫期～蛹期は抗生物
質非処理の餌で飼育し、羽化直後から 20 時間以内に抗生物質処理した餌に移して飼育した群（Antibiotics from Adult：ABA）における GSC 数を比較した。その結果、conv.群に対し、ABL、ABA
両群で GSC 数が有意に増加することが分かった。他方、ABL 群と ABA 群の間に GSC 数の有意な差は無かった。以上から、ショウジョウバエのメス成虫から腸内細菌を除去すると、何らかの経路を介して GSC が増加する、裏を返せば通常の餌による飼育条
件下では、腸内細菌の存在が GSC を減少させる方向に影響していることが示された。また、成虫期以降のみの抗生物質処理でもGSC 数に影響することが分かったため、以降は conv.群と ABA群の比較を中心とした。
続いて、ABA 群における GSC 増加の原因となる宿主側因子の特定を目指し、交尾後の GSC 増加に必須である NPF（ペプチドホルモン）と OA（神経伝達物質）の受容体遺伝子変異系統について実験を行った。これらの分子が ABA 群における GSC 増加に関わっていれば、そのシグナルが機能しない系統では ABA 群における GSC 増加はキャンセルされる、という仮説のもと実験を行った結果、これらの系統においても ABA 群における GSC 増加は一貫して観察できた。したがって、交尾後の GSC 増加に関わるこれらの因子が、GSC に対する腸内細菌の影響の制御にも関わる可能性は低いと結論づけられる。
【展望】
現在、ショウジョウバエの神経ペプチド遺伝子変異系統を対象
として、ABA 群における GSC 増加がキャンセルされる系統をとらえることを目的としたスクリーニングを進めている。一方で、ショウジョウバエの卵巣に共生する細胞内共生細菌である
Wolbachia pipientis や、その感染除去に用いられる抗生物質のテ
トラサイクリンといった要因がショウジョウバエに与える影響を排せずにいる。そのため、今後はこれらの因子の影響を一つ一つ理解できる実験系の構築を目指したい。

（3）GSC 数の計測と比較
GSC 数の計測は、免疫組織化学染色を行ったサンプルを、蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Axioplan2）下で観察することで行った。抗 Hts
抗体、抗 Lamin-C 抗体、および抗 pMad 抗体は、それぞれ、生殖細胞特異的な細胞内構造体（スぺクトロソーム）、GSC に隣接する体細胞の一種（キャップ細胞）、GSC の維持にはたらくシグ
ナル経路中のタンパク質に結合する抗体である。これらの 1 次抗体に対応した 2 次抗体の蛍光を利用して、卵巣小管 1 本ごとに【参考文献】[1] Lafever and Drummond-Barbosa (2005) Science, 309, 10711073.
[2] Ameku et al. (2018) PLoS Biol., 16, e2005004.

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 58Ⓒ2024 筑波大学生物学類

ゴマ由来生理活性物質の微生物代謝に関する研究
神村 和音（筑波大学 生物学類）

指導教員：小林

目的・背景
セサミンは抗酸化作用や血中コレステロール低下作用、脂質低下作用などの様々な生理活性作用を持つことで知られ、近年は機能性食品やサプリメントといった利用により注目を集めている。
しかし、その代謝に関してヒトやマウスにおいては報告があるものの、微生物によるセサミン代謝や酵素が同定された例は無かった。よって本研究室で微生物におけるセサミン代謝酵素の同定と精製が行われたところ、
SesA という新規酵素によってセサミンがセサミンモノカテコール、ジカテコールへと変換されることが明らかとなった。さらにその後の研究によって、SesA 近傍遺伝子
ORF2, ORF3, ORFX, ORFXX によりセサミンジカテコールから段階的に化合物Ｄへと移行する一連の代謝経路が提案された。しかし、その中で化合物 A, 化合物 B から化合物 C への変換のために必要となる酵素、ORFX の詳細な働きについてはいまだ不明のままであった。そこで本研究では ORFX の諸性質解明を目的とした。

達彦（筑波大学 生命環境系）

ク質の発現や精製の程度を確認した。最終的に精製に成功した酵素 ORF2, ORF3 を用いて同様のアッセイを行ったところ、セサ
ミンジカテコールから化合物 A, 化合物 B への移行速度が飛躍的に上昇したことが明らかとなった。しかし、それから一か月半ほど経過した後に同じ組成でアッセイを行った場合、反応速度は約半分ほどに低下してしまった。このことから、ORF2, ORF3 といった酵素は時間経過により比較的短時間で活性が低下してしまう可能性が示唆された。今後はこれらの酵素の再精製を行うとともに、活性を残したまま長期間保存する方法についても探っていきたい。また、これまで先行研究から得られた知見と反し、ジカテコールからの代謝において化合物Ｄが観察できていなかったため、
ORFXX の精製が不完全であると予想していた。しかし新たに精製した ORFXX を用いた場合であっても同様に化合物 D は確認できなかった。いまだに先行研究で提案されたジカテコールから化合物 D までの経路の観察ができていないため、これを目標としつつ、pH 依存性や温度依存性、反応産物の同定といった ORFXの諸性質解明を進めていきたい。

方法・結果
ORFX 諸性質解明のため、まず ORFX 反応の基質である化合
物 A, 化合物 B を大量に得ることを目的とした。化合物 A, B は安
定性に欠け、研究室で長期間保存することは難しい。そのため、より安定なセサミンジカテコールから、ORF2, ORF3 が触媒する反応によって化合物 A, 化合物 B を手に入れることを考えた。
そのために反応液の組成と反応条件を検討し、効率的に化合物Ａ,
化合物 B を得る方法を調査した。結果的に、前任者が考案した組
成では、セサミンジカテコールが過剰であったことが明らかとなった。前任者の組成に対してセサミンジカテコールを 1/10 量にしても、反応生成物量に大幅な差は見られなかった。よって、基質量をより削減できる効率的な組成であるとして、今後はセサミン
ジカテコール量を従来の 1/10 の量に変更してアッセイを行っていくこととした。また、反応液中の ORF2 の量を大幅に増やすことによって、単位時間中の基質から反応産物への変換がより活発になるのではないかと考えた。実際に ORF2 を 10 倍量添加することにより、反応時間中の基質減少速度および反応産物生成速度の大幅な増加という結果を得ることができた。しかし、その後の実験により 2 ステップ反応として働く ORF2 と ORF3 のバラン
スが乱れることにより、かえって非効率的な組成であったことが明らかとなった。さらに、その後の実験により、従来の組成においても ORF2 が過剰であったことが判明したため、ORF2 は従来の組成に対して 1/5 量添加することとした。
これまでの実験では前任者が精製し、-80℃保存されていた酵素を用いて実験を行っていた。酵素が残り少なくなっていたので、自分でも ORF2, ORF3, ORFXX の精製を行った。各酵素遺伝子がクローニングされた発現用プラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、培養した後に菌体を破砕して、遠心分離して得た無細胞抽出液を、2 種類のカラムに供し分画した。各過程において得られたフラクションを SDS-PAGE に供することにより、目的タンパ

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 59Ⓒ2024 筑波大学生物学類

腸内細菌による植物由来生理活性物質の分解に関する研究
山本 一茶（筑波大学 生物学類）

指導教員：小林【背景・目的】
カテキンはフラボノイド化合物の一種であり、緑茶などに多く含まれている。カテキンには抗酸化作用、抗腫瘍作用、抗菌作用などの生理活性があることが知られており、あらゆる疾患の予防に役立っている。経口摂取されたカテキンは、小腸ではほとんど吸収されず、大腸へと運ばれる。運ばれたカテキンは大腸内に生息する腸内細菌によって代謝される。腸内細菌によって産生される代謝産物の一部にも抗酸化作用や認知症予防といった生理活性が認められているものもあるため、カテキンを摂取することでもたらされる健康効果の発揮にはカテキンそのものだけでなく、その腸内細菌由来代謝産物も大きな貢献を果たしている可能性が考えられる。
先行研究により、カテキンは A 細菌によってカテキンの環が開いた C-1 および C-2 へと変換され、その後 B 細菌によりそれぞれ
吉草酸やラクトンへと変換されることが明らかになっている。また、当研究室の先行研究により、C-1, C-2 から吉草酸、ラクトンに変換されるまでの経路を解析するとともに、2 つの中間産物（C1-A, C-1-B / C-2-A, C-2-B）を同定している。
そこで私は B 細菌により起こる反応の中でも、C-1-A / C-2-A からそれぞれ C-1-B / C-2-B へ加水分解される反応に着目した。この反応は酵素 X も酵素 Y も触媒可能である。本研究ではこれらの酵素の諸性質解明を目的とした。

達彦（筑波大学 生命環境系）

基質の調製
分取したものを LC-MS を用いて分析したところ、目的化合物のみが大きなピークとして見られ、精製することができた。
キネティックパラメーターの測定得られた Km, kcat の値から触媒効率を求めたところ、基質が C1-A のときは酵素 X の方が触媒効率が高かった。一方、基質が C2-A のときは酵素 Y の方が触媒効率が高かった。このことより、腸内では酵素 X が C-1-A を生理的に代謝し、酵素 Y が C-2-A を生理的に代謝していることが示唆された。
今後は酵素 X、
酵素 Y の詳細な生化学的解析を行う予定である。

【方法】
酵素精製
目的遺伝子を導入した大腸菌を培養後、細胞破砕を行い、無細胞抽出液を調製した。その後、His trap カラムを用いて目的酵素を精製した。
基質の調製
反応液に C-1 および C-2 と反応に必要な酵素と補酵素を加え、C-1-A および C-2-A を生成した。その後、HPLC を用いて反応液の中から C-1-A および C-2-A のみを分取した。
キネティックパラメーターの測定
さまざまな濃度の基質(C-1-A または C-2-A)と一定量の酵素を反応させることでできる生成物(C-1-B またはC-2-B)をLC-MS で検出し、そこから得られるピーク面積から生成物量を求めた。求めた値から SV plot を作成し、Km, Vmax, kcat 等を算出した。
【結果・考察】酵素精製
SDS-PAGE を行ったところ目的酵素の分子量付近に濃いバンドが見られ、精製に成功した。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 60Ⓒ2024 筑波大学生物学類

抗真菌化合物の生合成に関する研究
坂井 康平（筑波大学 生物学類）

指導教員：小林達彦（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】続いて、基質であるピエリシジン B1 とピエリシジン B5
私は Kitasatospora 属の放線菌が生産するピエリシジン
は分取と並行して、ピエリシジン B1 N オキシドとピエリ
B1 N オキシドとピエリシジン B5 N オキシドという抗真菌
シジン B5 N オキシドから還元し獲得することができない化合物の生合成に関する研究を行っている。ピエリシジンかを検討した。結果として、(pinB)2 と呼ばれる還元剤を類は殺虫作用をもつ化合物として発見された。その構造は、 用いることで比較的温和な条件でピエリシジン B1 N オキ
窒素を含む複素環に炭素鎖がついたような形をしている。
シドとピエリシジン B5 N オキシドをピエリシジン B1 とまた、N オキシドという窒素に酸素が付加されている構造
ピエリシジン B5 へと還元することに成功した。
も有している。ピエリシジン類で N オキシドの構造をもつ
ものはピエリシジン B1 N オキシドとピエリシジン B5 N
今後は調製した基質を用いて目的酵素の精製を行いたいとオキシドの 2 種のみが確認されているが、ピエリシジンの考えている。
N オキシド化酵素は未同定でその発見には新規性があると考えた。
よって、本研究室でスクリーニングされ単離・同定された
ピエリシジン B1 N オキシドとピエリシジン B5 N オキシ
ド を合成する Kitasatospora 属放線菌の 1 株に注目し、本株が持っていると考えているピエリシジン B1 とピエリシ
ジン B5 を N オキシド化する酵素の同定を目的とした。
【方法・結果】
まず、研究対象としている Kitasatospora 属の放線菌株がピエリシジン B1 を基質にピエリシジン B1 N オキシドを合成していることを休止菌体を用いて検証した。標品として購入したピエリシジン B1 に本株の休止菌体を添加し Nオキシド化が進行するかを検討した。反応溶液を LC/MS
を用いた質量分析法にかけることで、反応前には見られなかったピエリシジン B1 N オキシドが反応後に見られるようになった。この結果から、本株によって、ピエリシジン
B1 を基質としてピエリシジン B1 N オキシドが生産されている可能性が示唆された。
また、基質であるピエリシジン B1 とピエリシジン B5 の大量精製および反応生成物であるピエリシジン B1 N オキシドとピエリ
シジン B5 N オキシドの定量のための検量線を作成しようと考えた。そのため、液体クロマトグラフィーを用いて基質と反応生成物を分取する方法について検討した。分取を試みるサンプルとしては菌体培養上清を選択した。液体クロマトグラフィーの条件検討も併せて行った結果、80% メタノール 20%/0.05% ギ酸のアイソ
クラティックメソッドが充分分取したい化合物のピークを分離できており、このメソッドが適切であると判断した。結果的には、No.42 株培養上清を酢酸エチルで化合物抽出し、そこから反応生成物であるピエリシジン B1 N オキシドとピエリシジン B5N オキ
シドの分取に成功した。一方で、同サンプルから基質であるピエリシジンB1 およびピエリシジン B5は分取することができなかった。液体クロマトグラフィーでは基質を高い強度で検出することができず、単一なピークになっていなかったためである。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 61Ⓒ2024 筑波大学生物学類

二枚貝における２枚目の貝殻獲得をもたらした分子機構の解明
小島 優音（筑波大学 生物学類）

指導教員：守野

孔明（筑波大学 生命環境系）【導入】(A/B) で発現していた。
軟体動物門は非常に多くの生物群を網羅する巨大な動物群であ
次に二枚貝の初期と後期での領域の対応関係を検証するためにり、その外部形態は多様性に富んでいる。中でも二枚貝は２枚の上記遺伝子の 16hpf 胚の発現パターンの観察を行った。初期に外貝殻を持ち、それらで柔らかい軟体部を覆うことで外敵から身を側で特異的に発現した遺伝子群 (CS, Dpp GATA1/2/3) はいずれ
守り、繁栄してきた。二枚貝と比較的近縁で祖先形質である一枚も貝殻腺を縁取る領域 (ⅲ) での発現が見られ、CS, Dpp についの貝殻を持つ腹足類を比較すると、内部形態や発生初期の卵割パては蝶番領域 (ⅰ) での発現も観察された。
また内側に特異的に発ターン、割球運命などは似通っているが、貝殻の枚数は幼生の頃現した遺伝子群のうち、Hox1, Tyr も貝殻腺を縁取る領域 (ⅲ) でから既に違いが見られる。特に幼生期に背側に出現する貝殻腺領の発現が見られた。一方で MIST は貝殻腺内部の一部 (ⅱ) のみ
域の形態は大きく異なり、腹足類は楕円状である一方で、二枚貝で発現が観察された。En2, Hox4 は貝殻腺での発現が見られなかはダンベル状であり、また、その正中線上にミネラリゼーションった。
が起こらないと考えられる蝶番領域が存在する。このような貝殻腺形態、ひいては貝殻の形態の違いをもたらした分子発生プロセスの改変を解明するためには両者の貝殻腺の分子発生機構の丹念な比較が重要になってくる。二枚貝及び腹足類初期においては、
貝殻腺領域は少なくとも３つの細胞領域に分かれることが知られている (Liu et al., 2020 , Phuangphong et al., in prep; 図 1) 。
しかし、腹足類・二枚貝類間におけるそれらの領域の対応関係は不明である。また、二枚貝の３つの細胞領域が貝殻形成後期におけるダンベル状の貝殻腺のどの領域を構成するのかも不明である。 図１ 腹足類初期及び二枚貝初期・後期における貝殻腺の形態
本研究では、二枚貝・腹足類の貝殻腺形成初期における領域の比較、及び二枚貝における貝殻形成初期と後期における領域の対応
Hox1
Hox4
MIST
En2
GATA1/2/3
Dpp
Tyr
CS
A/B
○
○
○
○
×
×
○
×
関係の検証を目的とし、二枚貝における貝殻腺で発現する遺伝子
C
×
×
×
×
○
○
×
○
ⅰ
×
×
×
×
×
○
×
○
群の発現パターンを観察し、その結果を腹足類の既知の細胞領域
ⅱ
×
×
○
×
○
×
×
×
ⅲ
○
×
×
×
○
○
○
○
及び二枚貝の貝殻形成初期と後期間で比較した。
表１
二枚貝初期・後期における各遺伝子の発現パターン【材料と方法】【考察】
軟体動物二枚貝のムラサキインコガイ Mytilisepta virgata を茨
本研究の結果から、腹足類・二枚貝類の初期の貝殻腺領域にお城県平磯海岸で採集し、人工授精を行なった。受精によって得らいて、いずれもCS は外側の領域、Hox1, Hox4, MIST, Tyr は内れた胚は、貝殻形成の初期（12hpf）及び後期（16hpf）で固定し側の領域で発現していることが明らかとなった。このことは腹足た。これらの固定胚を用いて貝殻腺細胞で発現することが知られ類と二枚貝の発生初期の貝殻腺の内側 (A/B) と 外側 (C) の領る遺伝子群の in situ hybridization を行ない、それぞれの遺伝子域には対応関係があることを示唆する。ただし内側領域に含まれの発現パターンを観察した。具体的には転写因子として Hox1,
る２つの領域 (A/B) が両者で対応しているかどうかについては
Hox4, MIST, Engrailed2 (En2) , GATA1/2/3、シグナル分子とし不明であり、より多数のマーカー遺伝子の発現を観察する必要がて Dpp, ミネラリゼーションに関わる遺伝子として CS,ある。今後、この対応関係を基盤して、二枚貝と腹足類の貝殻腺Tyrosinase (Tyr) の発現を観察した。
発生プロセスの相違点を解明していく。
【結果】
また、二枚貝の発生後期においては初期の発現パターンに関わまず、腹足類・二枚貝類間の初期の領域を比較するために上記
らず多くの遺伝子が貝殻腺を縁取る領域での発現を示した。しか遺伝子の初期における発現パターンを観察した。先行研究においしこれらの発現が同所的なのか、いずれかの遺伝子が貝殻腺周て二枚貝類マガキの貝殻腺領域では En2 が内側領域 (A/B) のマ
縁のより外側/内側で発現しているかは不明である。今後二重ーカー、GATA1/2/3 及び Dpp が外側領域 (C) のマーカーとなっ
染色等の手法を用いてより詳細な観察を行い、発現領域の区別をており、ムラサキインコガイにおいてもこれらのマーカー遺伝子行う。また、近年公開されたマガキのシングルセル RNA-seq デーの発現パターンを観察した結果、先行研究と同様にそれぞれ内側タの解析も組みわせることでより正確な領域分けと領域ごとの分(A/B) /外側 (C) の領域で発現していることが確認できた。続い
子的特徴付けを行っていくことで、貝殻腺のそれぞれの領域、特て、上記遺伝子の発現を指標とし、腹足類の貝殻腺において内側に蝶番がどのような遺伝子発現によって特徴付けられるかを解明(A/B)で発現する Hox1, Hox4, MIST, Tyr 及び外側 (C) で発現することを目指す。
する CS が二枚貝では内側/外側のどちらで発現しているのかを検【引用文献】
証した。その結果、腹足類で外側の発現を示す CS は二枚貝でも1. Liu et al. (2020) Dev Genes Evol. Jan; 230(1), 39-45
外側(C)で発現し、腹足類で内側の発現を示す遺伝子群は内側

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 62Ⓒ2024 筑波大学生物学類

ヌタウナギから探る大脳皮質の進化的起源
原田 理帆（筑波大学 生物学類）

指導教員：鈴木【背景と目的】
脊椎動物の脳進化において層構造の獲得は、機能のモジュール化と神経回路の配線整理を実現し、情報処理能力の効率化に貢献した。とりわけ哺乳類で顕著に発達している終脳背側の層構造、
すなわち大脳皮質は、高度な知性の基盤であると考えられている。
大脳皮質の進化的起源に関しては、独立進化説と共通起源説というふたつの仮説が提起されている。以前は、終脳に層構造を有する脊椎動物は羊膜類（＝哺乳類と爬虫類）と、現生脊椎動物のなかで最初期に分岐した動物群である円口類のヌタウナギしか知られていなかったため、独立進化説が支配的であった。しかし最近、ヌタウナギの姉妹群であるヤツメウナギの終脳外套にも層構造が存在すると報告された[1]。このような背景から、羊膜類と円口類の共通祖先、すなわちすべての脊椎動物の共通祖先で大脳皮質が獲得されたとする共通起源説がにわかに浮上したのである。
大脳皮質の進化的起源を明らかにするためには、円口類の終脳外套が羊膜類の大脳皮質と相同であるかを検証し、独立進化説と共通起源説の対立を解消する必要がある。
脊椎動物の祖先的な特徴を多く残すと考えられている円口類の脳研究は、ヤツメウナギを中心に進められている。しかし、ヤツメウナギは派生的な形質も多く有することから、脊椎動物の祖先状態を推定するためには、ヌタウナギとの比較が必要である。しかしながら、ヌタウナギの脳研究は組織学的知見にとどまっており、遺伝学的なアプローチは行われていない。
そこで本研究では、ヌタウナギの終脳外套における神経伝達物
質マーカー遺伝子と哺乳類の大脳皮質の層特異的マーカー遺伝子の発現解析を実施した。
【方法】
Nissl 染色ヌタウナギ(Eptatretus burgeri)成体の脳切片を Cresyl Violet
溶液で染色し、細胞体の密度や分布様式を観察した。
切片 in situ hybridization 法
神経伝達物質マーカー遺伝子（VGluT と GAD）と哺乳類の大脳皮質の層特異的マーカー遺伝子（Rorβ と FoxP2A）について、
切片 in situ hybridization を行い、ヌタウナギ成体の脳切片でmRNA を検出した。
【結果】
大脳皮質の組織学的観察
Nissl 染色により、5 層構造のヌタウナギの終脳外套の第 2 層と第 4 層は大きな細胞体の密集する細胞層、第 3 層は小さな細胞体の散在する層であった。これは先行研究と一致していた。
神経伝達物質マーカー遺伝子の発現解析
第 2 層と第 4 層にグルタミン酸作動性ニューロンのマーカー遺伝子である VGluT、第 3 層に GABA 作動性ニューロンのマーカー遺伝子である GAD が発現していた。

大地（筑波大学 生命環境系）

層特異的マーカー遺伝子の発現解析
6 層からなる哺乳類の大脳皮質において、Rorβ は視床から入力を受ける第 IV 層のマーカー遺伝子、FoxP2A は視床や脊髄へ出力する第 V/VI 層のマーカー遺伝子である。ヌタウナギの第 2 層と第 4 層では、その両方が発現していた（図 1）。
【考察と展望】
脊椎動物の中枢神経系は主に、グルタミン酸作動性投射ニューロンと GABA 作動性介在ニューロンから構成される。羊膜類とヤツメウナギの終脳の層構造は、VGluT 陽性の大きな細胞体の密集する層と、GAD 陽性の小さな細胞体の散在する層から構成される
ことが知られている。本研究におけるヌタウナギの VGluT、GADの分布は、このような羊膜類とヤツメウナギでの分布と類似している。
ヌタウナギでは、哺乳類の第 IV 層および第 V/VI 層のマーカー遺伝子が第 2 層と第 4 層で発現していた。また、羊膜類の共通祖
先の大脳皮質は 3 層構造で、第 2 層に哺乳類の第 II〜VI 層に対応するニューロンが混在していた可能性が指摘されている[2]。上述の神経伝達物質マーカー遺伝子の発現結果と合わせると、本研究による遺伝子発現解析は、共通起源説を支持している。
以上から、次のような大脳皮質の進化シナリオが考えられる。
脊椎動物の共通祖先は 3 層の大脳皮質を有しており、その第 2 層には、さまざまな機能をもったニューロンが混在していた。円口類において、ヤツメウナギは祖先的な 3 層構造を保持したが、他
方ヌタウナギではそのような第 2 層から新たに第 4 層が出現し、5 層構造の大脳皮質が獲得された。羊膜類においては、爬虫類は 3層構造を保持し、哺乳類では一部が大脳新皮質として 6 層に拡大したのである。
今後は、各層の詳細な機能を調べるために、軸索トレースや電気生理学的解析を実施する予定である。加えて、ヤツメウナギの大脳皮質においても層特異的マーカー遺伝子の発現解析を実施し、本研究成果との比較から大脳皮質の進化的起源の解明を目指す。

図 1：ヌタウナギにおける層特異的マーカー遺伝子の発現分布【引用文献】[1] Suryanarayana et al. (2017) Current Biology 27, 3264-3277.
[2] Tosches et al. (2018) Science 360, 881-888.

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 63Ⓒ2024 筑波大学生物学類“新生”西之島から最初に発見された藻類：その同定と侵入種としての特性
武 彩海（筑波大学 生物学類）

指導教員：石田健一郎（筑波大学 生命環境系）

M. thermotolerans の記載論文 Krivina et al. (2023) を参考にして ITS 領域の二次構造を構築した結果、Handa-4259-d 株と M.
thermotolerans の間には種の区別に用いられる CBC（二次構造において結合している 2 つの塩基の両方が変化すること）はなかったため、
Handa-4259-d株はM. thermotolerans だと同定した。
＜乾燥耐性＞
1 日以上乾燥させたサンプルでは、28 日間培養しても最大で初期細胞密度の 2.96 倍の増殖に留まり、対照区（乾燥なし）の 18.51
倍と比較して明確な増殖はなかった。自家蛍光は全てのサンプルで観察できた。
＜塩耐性＞
対照区（0％海水）と比較すると増殖率は低いが、全ての海水濃度で Handa-4259-d 株の増殖がみられ、海水とほぼ同じ塩濃度の培地でも、21 日間で初期細胞密度の 9.67 倍にまで増殖した。

【背景】
西之島は、小笠原諸島の火山島である。陸地から遠く離れた無人島（父島からおよそ 130 ㎞）で、2019 年末からの火山活動により、島全体が溶岩や火山灰に覆われ、生物相がリセットされた。
この“新生”西之島は、生態系の一次遷移を観察するのに適した島として、無人探査を中心としたモニタリングが継続的に行われている。このような島での生態系の遷移について、藻類に注目した研究はほとんど行われていない。
2022 年、“新生”西之島で初めて光合成生物のコロニーが発見された。コロニーは降雨時に水流が生じると思われる火山灰表面に生息しており、採取後に培養株（Handa-4259-d 株）として確立された。本研究では、Handa-4259-d 株の同定を行うとともに、侵入種としての特徴を明らかにすることを目的とした。

【方法】
＜同定＞
淡水培地 AF-6 で培養した Handa-4259-d 株から DNA を抽出し、18SrRNA 遺伝子を PCR で増幅して塩基配列を取得した。
BLAST 検索の結果、緑藻 Micractinium の一種だと判明したた
め、Micractinium の同定に用いられる ITS1-5.8S-ITS2 領域の塩基配列から最尤系統樹を作成した。系統樹は IQtree（SYM+I+G4モデル）を使用して作成した。
また、ITS 領域の二次構造も Micractinium 内の種の同定に用いられるため、ITS1,2 領域の二次構造を構築した。
＜乾燥耐性＞
ろ紙に細胞懸濁液を撒き、シャーレ内で 1、3、5、7 日間乾燥させてから液体培地を入れたチューブ内で濾紙を洗い、細胞を培地に懸濁した。その後 20℃、124 µmol photons / m-2 / s-1 に静置し、培地に細胞を入れた直後と、7、28 日間培養した後に細胞数を計測した。細胞数を計測する際には 2.5%グルタルアルデヒドで固定した。また、乾燥後液体培地で 7 日間培養したものを 2.5%グルタ
ルアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡を用いて葉緑体の自家蛍光を
観察した。
＜塩耐性＞
淡 水 培 地 AF-6 を 構 成 す る 水 の 部 分 を 、 そ れ ぞ れ
0,10,25,50,75,100% ろ過海水に置き換えた培地を用いた。6 穴プ
レートの穴にそれぞれの培地を入れ、2.0×10６個 / mL の濃度になるように細胞を加えた。20℃、24 µmol photons / m-2 / s-1 で28 日間静置培養し、7 日間ごとに細胞数を計測した。細胞数を計測する際にはグルタルアルデヒドで固定した。

【結果】
＜同定＞
ITS1-5.8S-ITS2 領域の系統樹を作成した結果、Handa-4259-d
株は緑藻 Micractinium thermotolerans のクレードに位置した。

63【考察と展望】
本研究の分子系統解析および ITS 領域の二次構造比較により、Handa-4259-d 株は最近新種記載された M. thermotolerans と同定された。これは、“新生”西之島において初期に侵入し生育した藻類の一つとして初めて同定されたものである。
“新生”西之島のような一次遷移初期に生物が侵入し定着するた
めには、ある程度厳しい環境への適応あるいは耐性が必要だと考えられる。M. thermotolerans はこれまでに温泉と砂漠で存在が確認されており、実験により熱耐性があることが報告されている（Krivina et al. 2023）。これは、太陽の光を遮るものがない一次遷移初期の環境で生き延びるのに適した性質だと考えられる。
また、塩耐性については、今回 Handa-4259-d 株が 100%海水濃度の培地でもある程度増殖することが示されたことから、本藻は海水を介して、あるいは海水に晒される状態で“新生”西之島に侵入することが可能だと考えられる。したがって、 M.
thermotolerans は少なくとも、熱耐性と塩耐性の面で、“新生”
西之島の一次遷移初期の侵入者として適した性質を有していると考えられる。
本研究ではもう一つ乾燥耐性についても検証を試みたが、葉緑体の自家蛍光は観察できたものの細胞の増殖は確認できなかった。
これは、今回細胞を急激に乾燥させすぎたことが原因の可能性がある。
今後は、乾燥耐性について、より緩やかに乾燥させて再検証す
ることに加えて、Handa-4259-d 株が西之島に定着するために重要であると考えられる他の特性についても検証していきたい。例
えば、火山灰の上にコロニーを形成したことから低 pH への耐性、火山島であることから硫化水素や重金属への耐性などを調べ、Handa-4259-d 株の一次遷移における初期侵入種としての特性をさらに詳しく解明していきたい。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 64Ⓒ2024 筑波大学生物学類

霞ヶ浦の原生生物相：形態観察と環境 DNA 解析からのアプローチ
栁澤 花帆（筑波大学 生物学類）

指導教員：石田【背景・目的】
原生生物は真核生物の系統的多様性のほとんどを占める生物群であり、土壌、海洋、湖沼といった地球上のあらゆる環境に存在する。水圏生態系においては重要な一次生産者、一次消費者、分解者として、微生物ループの一翼を担っているほか、主に底生性・付着性の原生生物は魚類や甲殻類などの直接的な餌として、生態系内の栄養循環に大きく貢献している。そのため原生生物相を把握することは、その環境における生態系全体のより深い理解のために重要である。原生生物相の詳しい解析は、深海や南極、海洋といった環境での報告が多く、陸域のいわゆる身近な普通の環境（普遍環境）では、多くの生物群を網羅した詳しい解析の知見は少ない。霞ヶ浦は日本第 2 位の面積を有する平均水深が 4m の海跡湖で、淡水の普遍環境を代表する湖の一つと言える。1976 年から国立環境研究所(NIES)により霞ヶ浦内の 10 地点で水質や生物群集の長期モニタリングが実施されている。しかし原生生物相の調査はその内 2 地点で光学顕微鏡による目視による同定しか行われておらず、DNA レベルの詳しい解析の報告はない。またサンプ
リングでは表層水を採集するのみであるため、底生性・付着性の原生生物については調査が不十分であると言える。
本研究では顕微鏡下での形態観察の他、環境 DNA 解析を用いて底生性・付着性も含めた原生生物相を調査し、霞ヶ浦の生態系理解のための基盤をさらに充実させることを目的とした。
【方法】○ 調査地及びサンプリング方法
調査地として NIES で原生生物相の調査が行われていない霞ヶ浦西岸の古渡地区を選択し、古渡地区の松川、古渡橋、鳩崎の 3地点において 2023 年 5 月から 12 月にかけて毎月 1 回サンプリングを行った。各地点で表層水、湖底の泥、湖岸の人工物への付
着藻類、水面に浮遊する枝や葉及びその付着藻類を採集し、プラ
ンクトンネットを用いた採集も行った。持ち帰ったサンプルを
AF-6 培地で粗培養し、顕微鏡下で形態観察を行った。プランクト
ンネットのサンプルは培養せず直接観察した。また古渡橋で採集した表層水サンプルと泥サンプルは、
形態観察に加えて環境 DNA
解析にも使用した。
○ 形態観察顕微鏡 AXIO ImergerA2 (ZEISS)と CKX31 (OLYMPUS)を用
いてサンプルの観察を行った。観察できた細胞は全て AXIO
ImergerA2 の顕微鏡カメラ DP73 (OLYMPUS)で写真記録した。
○ 環境 DNA の抽出
環境 DNA 解析には 6 月から 10 月の水サンプルと、7 月から10 月の泥サンプルを用いた。採集当日中に表層水サンプル約 1L
を GF/F filter (Whatman)で濾過し、泥サンプルと共に-80℃で保存した。表層水サンプルは Dneasy®Plant Mini Kit (QIAGEN)を用いてフィルターから DNA を抽出し、泥サンプルは FastDNA™
SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals)を用いてDNA抽出を行った。
抽出 DNA は冷凍保存し、18SrRNA 遺伝子の V8 領域を標的としたプライマーを用いた PCR 増幅断片のライブラリー作成、及び64

健一郎（筑波大学 生命環境系）

MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina)を用いた 18S アンプリコンシー
ケンシング解析を株式会社生物技研に依頼した。
○ 環境 DNA の解析
微生物相解析プラットフォームである QIIME2 (ver.2022.11.1)を用いて分類群推定を行った。ペアエンドのクオリティを確認した後、DADA2 プラグインにてシーケンスエラーの修正及びForward 配列と Reverse 配列のマージ、Amplicon Sequence
Variant (ASV)へのグルーピングを行った。得られた ASV 配列は
SILVA（ver. 138.1）を参照し、単純ベイズ分類器を利用して各分類群へ割り当てた。その後、得られた ASV 配列の分類をより正確なものにするため、BLAST 検索で確認、修正を行った。
【結果・考察】○ 形態観察これまでに 11 門 107 属を観察した。最も多くの属が見られたのは緑藻植物門であり、34 属を観察した。その他観察できたもの
は不等毛藻32 属、
シアノバクテリア13 属、ユーグレノゾア9 属、ストレプト植物 6 属、繊毛虫 4 属、クリプト藻 2 属、コアノゾア
1 属、太陽虫 1 属、アメーボゾア 1 属であった。緑藻植物門は主に5 月の水サンプルで多く見られ、特に Gonium 属と Lobomonas
属は 5 月サンプルでのみ観察されたほか、珪藻は水サンプルと泥サンプルで共通して見られたが、Placoneis 属など泥サンプル及び付着物サンプルでのみ観察されるものもあるなど、季節間、サンプル間で出現原生生物の明確な違いが確認された。
○ 環境 DNA 解析
合計 482,154 リードから 2305 の ASV を得ることができ、65
門 298 属の配列を検出できた。原生生物相においては、水サンプ
ル全体では不等毛藻が最も優勢であり、その内 8 月は不等毛藻が全体のリード数の 50%以上を占めていた。泥サンプルでは繊毛虫が最も優勢であったが、クリプト藻の配列は水サンプルと比較してほとんど検出されなかった。データの詳細は卒業研究発表会にて報告する。
これらをもとに発表会では、形態観察と環境 DNA 解析で得られたデータを統合し霞ヶ浦の原生生物相について、NIES の霞ヶ浦データや他の普遍環境における原生生物相との比較も含めて考察する。

図 6-10 月環境水及び 7-10 月泥における門レベルでの原生生物
リード数占有率(上位分類群のみ抜粋)

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 65Ⓒ2024 筑波大学生物学類

筑波大学構内の淡水環境におけるウアブ系統群細菌の探索
大沼 万優子（筑波大学 生物学類）

指導教員：石田健一郎（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】認した。先行研究において兵太郎池での存在が確認されていたク
生物進化の歴史の中で最も注目すべき出来事の一つは、真核生
レード９では、今回兵太郎池の堆積物サンプルから配列の増幅が物の誕生である。真核生物と原核生物の間には、細胞やゲノムの確認できず、淡水性ウアブ系統群細菌の数が減少したか、または複雑さという点で大きな差が存在する。一説には、真核生物の祖
現在は生息していないことが考えられる。松美池で検出されたク
先が食作用によってα-プロテオバクテリアを取り込み、ミトコン
レード３、クレード４、クレード５については、新規のプライマ
ドリアとしたことが、真核生物誕生の原動力であるとされている。 ーを作成し PCR を行ったが、こちらも松美池の堆積物サンプル
しかし、原核生物が真核生物に似た食作用を示したという例は近から配列の増幅は確認できなかった。クレード９と同様に、それ年まで報告されていなかった。
らに含まれる細菌の生息数が減少したか、または消失してしまっ
Ca. Uabimicrobium amorphum (以下ウアブ) は 2019 年にパ た可能性が考えられる。
ラオ共和国の海水中から単離された細菌で、他の細菌や小さな真PCR により淡水性ウアブ系統群細菌の存在が確認できたクレ
核生物を取り込む貪食様行動を示すことが報告されている。ウアード６に関して、計 14 回の FISH を行いその蛍光の様子を観察
ブは、真核生物の食作用関連遺伝子に相同な遺伝子はほとんど持した。その結果、新たに４例の蛍光像を得ることができた（Fig.1）。
たないことから、この貪食様行動は真核生物とは独立に獲得され得られた蛍光から、細胞の大きさは 4–8 μm 程度と考えられ、たことが示唆されている。そのため、ウアブは原核生物における
これは 4–5 μm のウアブよりやや大きい。また DAPI 染色による食作用の進化を知る上で重要な生物だと考えられている。環境
蛍光は、細胞内に複数の局在が見られるウアブとは異なり、細胞DNA 解析からは、ウアブに近縁な細菌は海水中だけでなく、
淡水、 内全体に観察された。これにより、淡水性ウアブ系統群細菌は、土壌等の様々な環境に普遍的に存在していることがわかっている。 ウアブのように細胞内に仕切られた核様体構造を持たないことがウアブ近縁系統に含まれる細菌の多様性を明らかにすることは、示唆される。
ウアブが貪食様行動を得るに至った進化の過程を明らかにする上で重要である。
先行研究による大学構内の淡水環境の環境 DNA 解析から、９つのウアブに近縁なクレードの存在が明らかになった。それら淡水性ウアブ系統群うちの一つ、天の川で検出されたクレード 6 に関しては、蛍光 in situ hybridization (FISH) による蛍光像の観察にも成功している。しかし、観察例が少なく形態的特徴を把握す
るには未だ不十分である。
Fig 1. 天の川から採取した堆積物サンプルの蛍光顕微鏡写真。
本研究では、淡水性ウアブ系統群に含まれる細菌の形態的特徴を明らかにすることを目的として、クレード 6 を含めた複数のク
A は明視野像、B は特異的プローブによる蛍光像、C は DAPI 染
レードに対して PCR による各クレードに特異的な配列の検出及色による蛍光像。
び、FISH による細胞の可視化を行った。
【今後の展望】
本研究から、淡水性ウアブ系統群細菌はウアブと異なる形態的特徴を持つことがわかった。今後は、得られた形態情報や蛍光シグナルを元に細胞を単離し、ゲノムシーケンスを行う予定である。
得られたゲノム情報から、淡水性ウアブ系統群細菌の生態や代謝が明らかになることが期待される。また、代謝経路の推定によって培養条件の最適化を行うことで、クレード６の培養株確立を行っていく予定である。
クレード６以外においても、FISH による蛍光の観察やゲノム解析を行うことで、ウアブに近縁な系統の多様性や貪食様行動の獲得過程の解明につながることが期待される。

【方法】
筑波大学構内の淡水環境 (天の川、兵太郎池、松美池) において、堆積物サンプルを収集し、FastDNA Spin Kit For Soil を用いてその DNA を抽出した。抽出した DNA に対して、特異的プライマーを用いた PCR を行い、サンプル中に淡水性ウアブ系統
群細菌が存在しているかを確認した。淡水性ウアブ系統群細菌の存在を確認できたサンプルに対して FISH による染色を行い、蛍光顕微鏡でその蛍光の様子を観察した。

【結果と考察】淡水性ウアブ系統群に特異的なプライマーを用いたPCR の結果、クレード６は天の川の堆積物サンプルから特異的配列の増幅を確認することができた。これにより、先行研究と同様に、天の川では安定して淡水性ウアブ系統群細菌が生息していることを確

65つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 66Ⓒ2024 筑波大学生物学類

DNA メタバーコーディングによる底生ワムシの食性解析
吉田 伊吹（筑波大学 生物学類）

指導教員：中山【背景・目的】
水圏の底生環境は様々な生態系機能を有していると考えられており、その一つが上層水と下層水間の栄養循環である。これは非生物的なプロセスの他、底生生物による生物的なプロセスが関わっているとされ、特にデトリタスや細菌、原生生物、藻類、メイ
オ/マクロベントスを含む食物網を介した栄養循環が考えられている（Covich et al., 1999）。従って底生生物の食性を調査することは底生環境の生態系機能を評価する上で重要である。
ワムシは体長 1 mm 以下の微小な動物であり、プランクトン性の種と底生性の種が含まれる。淡水環境中の存在量も多く、細菌や細菌食性原生生物からなる microbial loop と、より大型の動物による食物綱間のエネルギー流を仲介する役割があるとされるなど（Moore et al., 2019; Schmid-Araya and Schmid, 2000）、水圏の生態系において重要な役割をもつと考えられる。しかし、現在のワムシに関する知見の多くはプランクトン性ワムシに関する研究によって得られたものであり（Ricci and Balsamo, 2000）、食性研究においても底生ワムシに関しては十分でない（Gilbert, 2022）。最近、
プランクトン性ワムシの広範な食性を調査するためにDNA メ
タバーコーディングが用いられるようになったが（Novotny et al.,2021 など）、底生ワムシではほとんど行われていない。
本研究では霞ヶ浦における 4 グループの底生ワムシの餌生物の種類を、DNA メタバーコーディングを用いて検出し、基礎的知見を得ることを目的とした。その結果から、底生ワムシの食性ニッ
チや底生環境での役割の理解を目指した。
【方法】
1) サンプリング
サンプリングは 6 月から 9 月の各月に 1 回ずつ、霞ヶ浦南の古渡橋と、6・7 月は鳩崎第一揚排水管、8・9 月は鳩崎第三揚排水管付近で行った。底生生物の採集は、まず鋤簾を用いて沿岸の河床の上層数 cm を、採集容器（135 × 155 × 210 mm）に深さ 5cm 程度採集した。そしてポンプで河床水を約 2L 注いで良く攪拌した後、上清をふるい（53 µm）にかけ、再び採集容器に河床水を入れた。これを 5 回繰り返した後、ふるいを河床水で洗い、45 mlの濃縮液を得た。濃縮液はその場でエタノール（終濃度 70 %）で固定し、クーラーボックスで実験室へ持ち帰り、4℃で保存した。
2) ワムシの選別と DNA メタバーコーディング
実験にはヒルガタワムシ 2 種と Lecane spp.、Monostyla spp.
を用いた。サンプルは光学顕微鏡下で選別し、個体をエタノール
で 5 回洗った。6 月のサンプルはサンプル間のばらつきの確認とワムシ間の比較のため、各種 9-14 個体をそれぞれマイクロチュー
ブに入れ、これを 3 回行った。7-9 月のサンプルは季節を経た全体の傾向を確認するため、各種 9-100 個体をそれぞれマイクロチ
ューブに入れ、これを 1 回行った。
DNA は DNeasy blood & tissue kit（Qiagen）で製造元のプロ
トコルによって抽出した。また、環境中の潜在的な餌生物の確認のため、古渡橋同所の表層水からの抽出 DNA を同研究室の柳沢氏より提供してもらった。ワムシを標的としたブロッキングプラ

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剛（筑波大学 生命環境系）

イマーの作成、及びこれらの抽出 DNA の 18S rRNA V8 領域を標的とした MiSeq によるシーケンシング解析を依頼した。
ヒルガタワムシ 2 種は固定した状態では種同定できないため、抽出 DNA の COI 領域を PCR で増幅して TA クローニングを行
い、Seq-studio でシーケンシングした。その後ヒルガタワムシのデータセット（Fontaneto et al., 2007）を用いて最尤法系統樹を作成し、Rotaria cf. neptunia と Rotaria cf. rotatoria と同定した。
3) データの解析
配列データは QIIME2 パイプライン（Bolyen et al., 2019）を用いて解析した。配列は DADA2 プラグインを用いてノイズ除去
し、Amplicon Sequence Variant（ASV）を取得した。そしてfeature-classifier プラグインを用い、Silva 18S データベース（Pruesse et al., 2007）を参照して単純ベイズ分類器により ASV
配列の分類群への割り当てを行った。また、ワムシサンプルにおいて、Eukaryote など分類学的解像度が低いものは NCBI ヌクレ
オチドデータベースを用いた Blast 検索によって手動で確認した。
データの可視化前に、ワムシの配列は除去した。
【結果・考察】合計 1,062,079 配列から 1,374ASV が生成され、532 の Taxaが割り当てられた。その内、環境水からは 389、ワムシサンプル
からは 227 の Taxa が割り当てられた。
6 月のワムシサンプルからは、輪形動物門と未分類の真核生物を除き 28 門 60 綱が検出された。
全体的に、緑藻綱や黄金色藻綱、クリプト藻綱といった藻類も 5 %前後のリードが検出されたが、上位に多く検出されたのはユスリカのようなデトリタス由来と考えられるものと真菌、及びケルコゾアや繊毛虫、アーケアメーバ、
襟鞭毛虫、パーキンサス類といった原生生物であった。7 月以降についても、概ね同じ傾向にあった。従って、これらの底生ワム
シは底生環境において腐食連鎖的な食物網へより関与している可能性が示唆された。
卒業研究発表では検出された種について生態的な面も含め詳しく考察するとともに、ワムシ間の餌の重複についてβ多様性解析を行った結果と合わせて底生ワムシ間の食性の相違も考察する予定である。

図 1:6 月の各ワムシサンプルから検出された綱レベルの 18SrRNA リードの占有率。各グラフにおける上位 5 綱を示す。

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 67Ⓒ2024 筑波大学生物学類

クロララクニオン藻の凍結保存法の開発
豊島 克己（筑波大学 生物学類）

指導教員：平川泰久（筑波大学 生命環境系）【背景と目的】【結果】
微細藻類の培養株の多くは、定期的に植え継ぐことで維持されL. globosa においては、10% DMSO のもと急速冷凍法で凍結ている。しかし継代培養には管理のための労力やコンタミネーシ
した場合で解凍後の生存が確認された。解凍後 6 から 8 日目に顕ョンなどのリスクが伴う。
微鏡で観察したところ、10% DMSO を用いて凍結を行った細胞
微細藻類の株保存施設などでは、液体窒素を用いた凍結保存もは緑色を維持しており、遊走細胞も確認された。他の条件で凍結行われている。しかし、凍結保存が難しい微細藻類もあり、継代した場合は、細胞の色素がなくなり、増殖した様子も観察されな培養のみで維持されている株も多くある。
かった。一方、A. amoebiformis では条件に関わらず解凍後の生本研究では、形態の異なる 2 種類のクロララクニオン藻を用い存は確認できず、解凍直後、損傷した細胞が多く観察された。して、凍結保存法の開発を試みた。クロララクニオン藻は海産の単かし、15%の凍結保護剤を用いた細胞では、それ以外のものと比
細胞性藻類で、アメーバ細胞、球状細胞、遊走細胞などの形態を較して、細胞形状を維持しているものが多く観察された。
持つ (図 1、2) 。当研究室では複数のクロララクニオン藻株を継代培養しているが、凍結保存株は存在していない。本藻類を凍結
有機物を添加した改良 ESM での培養実験では、いずれの培地
保存するために、冷却及び解凍時の速度または温度条件に加え、でも、完全暗条件での細胞増殖は観察されなかった。一方、通常
凍結保護剤の種類や濃度、様々な条件を検討した。また、凍結保の光条件下での培養では、ESM+B-V で、ESM を使用した場合よ存から復帰させる際に使用する栄養リッチな培地の検討も行った。 りも顕著な細胞増殖が観察された。
【材料と方法】
実験に用いた 2 種のクロララクニオン藻はそれぞれ、
Amorphochlora amoebiformis ( 図 1) がアメーバ細胞で 、Lotharella globosa (図 2) が細胞壁を持つ球状細胞である。L.
globosa は培養条件により遊走細胞へと変化する。継代培養には海水培地 ESM を使用し、22℃で 12 : 12 時間の明暗周期で行った。
i) 制御凍結法
前処理として、細胞懸濁液に最終濃度が 0、3、5、10、15%になるように凍結保護剤 (メタノールまたは DMSO) を添加して、室温で 15 分間静置した。細胞溶液の入ったチューブを凍結処理
容器 (BICELL) に入れて、冷凍庫内で-30℃まで緩慢冷却した後、液体窒素中で急速冷却した。その後、ディープフリーザーで 24 時
間以上保存した。解凍は 39℃ウォーターバスで迅速に行った。解凍後は ESM 培地で細胞を希釈し、暗めの光条件に 1 日置いて、
通常の光条件に戻して培養した。
ii) 急速冷凍法
制御凍結法と同様の前処理を行った後、細胞溶液の入ったチューブを液体窒素で急速凍結した。以降は制御凍結法と同様の操作を行った。
iii) 栄養リッチな改良培地
ESM 培地は有機物を含まない完全無機培地であるが、そこに1％から 2％のグルコースを添加した ESM+G 培地、また 4 つの有機物 (酢酸ナトリウム、グルコース、トリプトン、酵母エキス)を加えた ESM+B-V 培地を準備した。それぞれの培地で、クロララクニオン藻を通常の光条件と完全暗条件で培養し、細胞増殖を
観察した。

【考察】
凍結の際に細胞が損傷を受ける主な要因は、細胞内での氷晶形
成による物理的損傷か、溶質濃度の上昇による生理的損傷のいずれかであると考えられている。
制御凍結法では、細胞外の水分が先に凍結し、浸透圧変化に伴う水分の放出で、溶質濃度が上昇し有害となった可能性があり、2 種とも復活しなかった要因の一つと考えられる。
急速冷凍法では細胞内の水分が放出される前に凍結するため、氷晶形成による内部からの物理的な損傷が、細胞の生存を妨げると考えられている。A. amoebiformis は解凍後に細胞が破裂していたが、L. globosa は形状を維持していた。このことから、氷晶が形成されても、細胞壁によって細胞構造が維持され、解凍後も生存できる可能性が示唆された。

A. amoebiformis が ESM+B-V でより顕著な増殖を示したことから、いずれかの有機物を利用している可能性が示唆された。しかし、完全暗条件での培養はできなかったことから、光はクロラ
ラクニオン藻の増殖に必須であると考えられる。しかしながら、
ESM+B-V 培地は本藻を増殖させるのに有効な新規培地である。

図 1 Amorphchlora amoebiformis 図 2 Lotharella globosa

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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 68Ⓒ2024 筑波大学生物学類

光合成関連遺伝子から探る緑色渦鞭毛藻 TGD 株の共生藻痕跡核ゲノムの特徴
藤代 彩花（筑波大学 生物学類）

指導教員：中山【背景と目的】
葉緑体は、シアノバクテリアと真核生物の細胞内共生（一次共生）によって獲得された。また、一次共生により誕生した植物がさらに別の真核生物と細胞内共生進化を起こし、様々な系統の真核生物が光合成能力を獲得した。この真核生物同士の細胞内共生
進化は、二次共生と呼ばれる。
二次共生に由来する光合成生物では、多くの系統で共生藻の核は失われ、葉緑体のみが保持されている。一方、二次共生由来のクリプト藻とクロララクニオン藻は、葉緑体に加え、共生藻痕跡
核（ヌクレオモルフ、以降 Nm）を持つ。よって、クリプト藻やクロララクニオン藻は二次共生の中間段階にあると考えられていた。しかし、近年の研究から、これらの Nm ゲノムは進化の中間段階ではなく、既に進化が完了した状態にあるという見方も示されている。
近年、Sarai et al. (2020)1 より、Nm を持つ新たな生物として、
渦鞭毛藻 TGD 株（以降、TGD）が報告された。同研究 1 から、
TGD は緑藻（ペディノ藻）に由来する葉緑体を持ち、その Nm ゲ
ノムには、既知の Nm ゲノムからは既に消失している遺伝子を含め、未だに多くの遺伝子が存在することが示唆されている。よって、TGD の Nm ゲノムの縮小進化は現在も進行中である可能性が示唆されている。しかし、TGD の Nm ゲノムに関する知見は
主に RNA-seq データを根拠としており、Nm ゲノム配列は得られていなかった。よって、TGD の Nm ゲノムを直接調査した研究はこれまで行われておらず、本藻の Nm ゲノムの特徴や、そこにコードされる遺伝子の実態は不明なままである。
そこで本研究では、TGD の Nm ゲノム配列を探索し、得られたNm ゲノム配列からTGD のNm ゲノムコード遺伝子の特徴を調査した。具体的には、TGD の Nm ゲノム候補配列の抽出と一部遺伝子についてのアノテーションを行い、既知の Nm ゲノムや自由生活性のペディノ藻の核ゲノムと比較した。さらに、RNA エ
ディティングが TGD の Nm ゲノムから発見されたため、
TGD の
Nm ゲノムにおける RNA エディティングの調査も行った。

卓郎（筑波大学 生命環境系）

を実施し、Nm ゲノムコンティグにコードされる遺伝子を探索した。検出された Nm ゲノム遺伝子については、手動による構造アノテーションを行い、遺伝子モデルを決定し、CDS 長、イントロ
ン数、イントロン平均長を算出した。
今回アノテーションを行った Nm ゲノム遺伝子について、自由
生活性ペディノ藻 Pedinomonas minor のゲノム情報から相同遺伝子を探索した。検出された P. minor の相同配列に対してそれぞれ CDS 長、イントロン数、イントロン平均長を算出し、TGDの光合成関連遺伝子と比較した。
Nm ゲノムにおける RNA エディティングの探索
TGD の RNA-seq リードを TGD ゲノムコンティグにマッピン
グしたデータをもとに、BCFtools を用いて、TGD の転写物と Nm
ゲノムコンティグで相違が見られる座位を特定した。その後、Nm
ゲノム遺伝子について、エディティング数およびエディティング
の頻度（エディティングの数 / CDS 長）を算出した。
【結果と考察】TGD の Nm ゲノムコンティグは 28 個存在し、その総塩基長は1.80 Mbp と、クリプト藻の Nm ゲノムの総塩基長（約 0.45~0.87
Mbp）
や、
クロララクニオン藻のNm ゲノムの総塩基長（約0.33~1Mbp）を上回った。TGD の光合成関連遺伝子は、宿主核ゲノムとNm ゲノムで合わせて 109 個存在すると予想されているが、本研究では、そのうち 24 個が Nm ゲノムコンティグに存在することが示された。
TGD の Nm ゲノムコード光合成関連遺伝子と P. minor の相同配列の比較では、CDS 長において 2 つのゲノム間で大きな違いはほとんど見られなかった。一方、イントロン平均長では顕著な違いが見られ、P. minor では平均 231 bp なのに対し TGD では
平均 93 bp と、P. minor の半分以下であった。既知の Nm ゲノ
ムにおいて、クリプト藻はイントロンがほとんどなく、クロララ
クニオン藻はイントロン長が 18~23 nt であることが知られているが、今回 TGD の Nm ゲノム遺伝子に見られたイントロンはこれよりも顕著に長い。
上記の結果は、TGD では二次共生に伴い Nm ゲノムの縮退が進行しているが、既知の Nm ゲノムよりは縮退が進んでおらず、TGD が Nm ゲノム縮退の中間段階にあることを示唆する。
TGDのNmゲノムにおけるRNAエディティングの調査では、
1 つの遺伝子を除いてすべての Nm ゲノム遺伝子で RNA エディ
ティングが確認された。特に、U から C への置換と A から G への置換が多数を占め、コード領域の 100 から 1000 bp に 1 つの頻度で RNA エディティングが起きていることが示唆された。
今後は、Nm ゲノムコンティグ全体でアノテーションを行い、同様に比較解析やRNAエディティングの調査を行う予定である。

【方法】
Nm ゲノムコンティグの抽出
先行研究 1 の知見に基づいて得られた「Nm ゲノムコード遺伝子候補」の塩基配列をクエリとして、研究室内で作成されていた
TGD のゲノムアセンブリに対して相同性検索を行うことで Nm
ゲノムコンティグの抽出を行なった。相同性検索結果を精査し、identity が 90 以上かつ Bits score が 100 以上のヒットが 1 つ以上存在するコンティグを Nm ゲノムコンティグと判断した。
Nm ゲノム遺伝子のアノテーションとペディノ藻遺伝子との比較
既知のNm ゲノムからは光合成関連遺伝子が消失しているのに対し、TGD の Nm ゲノムには複数残存していることが示唆されていた 1。よって本研究では、Nm ゲノム上の光合成関連遺伝子に着目して構造アノテーションを行なった。先行研究で得られた「Nm コード光合成関連遺伝子候補」をクエリとした相同性検索【参考文献】

1. Sarai et al. (2020). Proc Natl Acad Sci USA, 117, 5364-5375
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Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 69Ⓒ2024 筑波大学生物学類

北極海で採集された円石藻 Emiliania huxleyi NIES-3366 株のゲノム情報の高精度化
児玉 悠佑（筑波大学 生物学類）

指導教員：鈴木

石根（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】
3. 新規アルケノンデサチュラーゼ遺伝子の探索
円石藻 Emiliania huxleyi は海洋に広く分布し、円石と呼ばれ今回予測された遺伝子の中から機能ドメイン検索に基づきアルる炭酸カルシウムの結晶を細胞表面に保持する微細藻類である。
ケノンデサチュラーゼ候補遺伝子を抽出し、illumina で予測されそのため E. huxleyi は有機的と無機的な 2 つの炭素固定系を通したアルケノンデサチュラーゼ遺伝子と照らし合わせた系統的解析て二酸化炭素の循環に関与し、地球環境に大きな影響を与える。
を MEGA Ⅹを用いて行った。候補遺伝子を絞るため、アルケノ
また、E. huxleyi を含む一部の藻類はアルケノンという、化石燃
ンデサチュラーゼに特徴的なヒスチジンボックスの有無、膜貫通料に代わる液体燃料としての利用が期待される長鎖不飽和炭化水
領域の予測、立体構造予測、シグナルペプチドを確認した。ヒス素を生産する。このような特徴をもつ E. huxleyi の生育挙動の理
チジンボックスの確認ではアミノ酸配列のアライメントを行った。
解や産業利用のためには、ゲノム解読による E. huxleyi の遺伝学
さらに、TMHMM、SOSUI を用いて２つ以上の膜貫通領域をも的な情報の解明が重要である。特に上述のアルケノンの合成機構
つ遺伝子を探した。加えて AlphaFold により立体構造モデルを作には未知の部分が多く、アルケノン分子の修飾に関わるデサチュ
成した。SOSUIsignal と iPSORT Prediction を用いてシグナル
ラーゼ遺伝子の同定、その発現メカニズムの解明は、アルケノン
ペプチドを検索し、アルケノンが存在しないミトコンドリアのシの産業利用のポテンシャルを高めることが期待される。
グナルペプチドが見つかった場合は候補から除外して最終的な新先行研究により北極海で採集された E. huxleyi NIES-3366 株
規アルケノンデサチュラーゼ候補遺伝子を決定した。
は、他の北極海採集株（NIES-3362, NIES-3365）とともに【結果・考察】
illumina Miseq のショートリードシーケンスによるゲノム解析が今回私が解析した PacBio のロングリードシーケンスと先行研行われている。その結果 NIES-3366 株のゲノムサイズ・予測遺伝
究の illumina ショートリードシーケンスの解析結果の比較を表
子数は、他の北極海採集株と比較して著しく増大していた。先行１に示す。N50 や BUSCO の値から、NIES-3366 株のゲノムデ研究で用いられたショートリードシーケンスは DNA 断片に繰りータの精度を高めることができた。ゲノムサイズはどちらも概ね返し配列が存在すると解析が難しく、正確性に劣る可能性がある。 同じ値を示した一方で、予測されたタンパク質コード遺伝子の数
そのため、NIES-3366 株が他の北極海採集株より長いゲノム配列
は illumina に比べて著しく減少した。PacBio のアッセンブリにを示す原因を探るには、より精度の高いゲノムデータが望ましい。 illumina で解析された scaffold および PacBio と illumina で予測
そこで本研究では、PacBio Revio/Sequel Ⅱによるロングリードシ
された遺伝子配列をマッピングした。その結果、illumina では反ーケンスを行い、NIES-3366 株のゲノム情報の高精度化を目指し
復配列で scaffold が分かれ、scaffold を跨ぐ遺伝子が別々ものとた。また、予測された遺伝子に illumina のデータで明らかになっ予測された箇所があった。このことが PacBio の方が illumina にていない新規アルケノンデサチュラーゼ遺伝子がないか探索した。 比べて予測遺伝子が減った原因の 1 つとして考えられた。
【材料・方法】
本研究では新たに２つの新規アルケノンデサチュラーゼ候補遺
1. 微細藻類の培養
伝子を見出した。1 つ目はアライメントによって E. huxleyi 北極
E. huxleyi NIES-3366 株は、Marine-art ESM 培地で 18℃、 海採集株では明らかになっていなかったΔ7 デサチュラーゼ遺伝
100 µmol photons m-2 s-1 の条件で培養し、対数増殖期の細胞を得子（FUN_000956_T1）である。さらにアルケノンデサチュラー-1-1た。抗生物質（500 µg mL アンピシリン、200 µg mL カナマイ
ゼの条件を揃えた１つの遺伝子（FUN_038130_T1）を新規アル
シン, 100 µg mL-1 スぺクチノマイシン）を培地に加えた。
ケノンデサチュラーゼ候補遺伝子として決定した。
2. DNA シーケンス
表 1PacBio と illumina によるゲノムデータ比較
CTAB 法により DNA を抽出し、ProNexBeads によって精製して、シーケンスに必要な品質と量の DNA を得た。シーケンス
PacBioilluminaには HiFi Read を用いた PacBio Revio/Sequel Ⅱによるロングリー
contig No.
937
229,924
ドシーケンスを実施した。シーケンスで得られた raw read から
genome size (Mbp)209216
アダプター配列を除去し、1,000 塩基対以下の HiFi Read を削除
protein coding gene No.
40,87478,388した後、Hifiasm を用いたアッセンブリ、Purge Haplotigs による冗長なハプロティグを除去し、Tiara による真核生物由来
N50 (bp)384,086
1,916
contig を分類した。これらの得られた contig について、
BUSCO (%)
66.7
41.2
RepeatModeler および RepeatMasker を用いて繰り返し配列の分類とマスキングをした。そして BRAKER を用いて遺伝子領域【今後の展望】
を予測した。予測された遺伝子は Funannotate を用いて、どのよ
今回ロングリードシーケンスによって明らかになったゲノムサ
うな機能をもつ遺伝子か推定する機能アノテーションを行った。
イズの妥当性について、フローサイトメトリーを用いた異なるア
ゲノムの品質確認は、配列の連続性を表す N50 値や BUSCO に
プローチによっても検証する予定である。
より解析した core gene set の含有率に基づいて評価した。

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つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 70Ⓒ2024 筑波大学生物学類

シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 の Mg2+輸送体ホモログの機能解析
白吉 瑞綺（筑波大学 生物学類）

指導教員：鈴木【背景・目的】
マグネシウムイオンは生物にとって必須なイオンのひとつであり、酵素反応の触媒や細胞内の構造的な役割を果たす他、ATP な
どの生体内で生じるアニオンの対イオンとしても機能する。シアノバクテリア等の光合成生物では、集光性色素のクロロフィルが光エネルギーを捕捉して光合成を行う。クロロフィルの中心にはマグネシウムが金属イオンとして配位している。したがって、シ
アノバクテリアにおいては、マグネシウムイオンは特に重要であり、多くのマグネシウムイオンを取り込む必要がある。しかし、シアノバクテリアではこのマグネシウムイオンの輸送機構はほとんど解明されていない(1)。また、マグネシウムイオンの輸送は光合成におけるチラコイド膜を通した電気ポテンシャルの制御にも影響を与える可能性があるが、その仕組みも不明である。そのため、このメカニズムを明らかにすることは光合成機能のより詳細な理解に貢献できる。
一般的なバクテリアではマグネシウムイオン輸送体として
CorA・MgtE・MgtA/B の 3 種が知られている(2)。CorA と MgtEは複数のマグネシウムイオン結合部位を有しており、これらの部
位へのマグネシウムイオン結合により輸送活性が低下することによって、細胞内のマグネシウムイオン濃度が制御されていると考えられている。シアノバクテリアのゲノムにもこれらのホモログが存在するが、その局在性・機能は不明である。そこで、モデル
シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 を用いてマグネシ
ウムイオンの輸送に関わると推定される CorA ホモログの遺伝子(sll0671, sll0507)、MgtE ホモログの遺伝子(slr1216)、MgtA/B の遺伝子(sll0672, slr0822, sll1614)を単独または複合でノックアウ
トした破壊株を作製し、それらの株におけるマグネシウムの要求性の変化を調査することを目指した。

石根（筑波大学 生命環境系）【結果・考察】Δslr1216 株, Δsll0671 株, Δsll0507 株, Δsll0672 株は、それぞれの薬剤に耐性があるコロニーを複数得ることに成功し、作出した株由来の DNA を鋳型に耐性遺伝子を含む領域を増幅するプライマーで PCR することで、目的の位置に薬剤耐性遺伝子が挿入されていることを確認した。
通常の BG-11 培地は、0.3 mM の MgSO4 を含む。MgSO4 を 0.3
mM Na2SO4 と様々な濃度の MgCl2 に置き換えた培地を作製し、野生型の細胞を培養したところ、0.1 mM 以下の MgCl2 を含む培地で生育が抑制されることがわかった。これまでに作製した 4 種の遺伝子欠損株について、0.1 mM MgCl2 を含む培地で培養した
ところ、3 種の候補遺伝子の変異株は野生株と同様かそれ以上に生育したが、CorA ホモログをコードする sll0507 の欠損株で生育が低下することがわかった（図）。

【材料・方法】
マグネシウムイオン輸送体候補遺伝子 slr1216, sll0671, sll0507,
sll0672, slr0822, sll1614 の単独破壊株の作出
シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 の染色体上の、 図. Mg2+制限条件での細胞の増殖 0.1 mM Mg2+を含む培地でのΔ
slr1216, sll1614 遺伝子にはカナマイシン耐性遺伝子、sll0671, slr1216（●）, Δsll0671（▲）, Δsll0507（◆）, Δsll0672（■）遺伝子破sll0672 遺伝子にはクロラムフェニコール耐性遺伝子、sll0507 遺 壊株および野生型（○）の増殖曲線。培養液の 730 nm における光学伝子にはエリスロマイシン耐性遺伝子、slr0822 遺伝子にはゲン密度(OD730)の変化を図示した。
タマイシン耐性遺伝子を、それぞれ二重相同組み換えにより挿入することで変異株を作出した。それぞれの標的遺伝子のコード領【今後の展開】
域とその周辺を含む約 2~3 kbp の DNA 断片を PCR で増幅し、作製の終わっていない slr0822 と sll1614 遺伝子の欠損株を作
pMD19 ベクターにクローニングした。得られたプラスミドを鋳製する。∆sll0507 株でその他の候補遺伝子の破壊を導入する。
型に、標的遺伝子のコード領域の大部分を欠損するように逆向きに PCR を行い、得られた線状化ベクターと各耐性遺伝子を In【参考文献】
Fusion 反応により結合し、大腸菌で増幅したのち精製することで、 1. Pohland AC & Schneider D, Biol. Chem. 400, 1289-1301
耐性遺伝子を目的遺伝子の上流および下流の相同領域の間にもつ(2019)
プラスミド DNA を得た。得られたプラスミド DNA を用いて
2. Maguire ME, Front Biosci. 11, 3149-3163 (2006)
Synechocystis 細胞への形質転換を行った。

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つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 71Ⓒ2024 筑波大学生物学類

大腸菌の様々な DNA 損傷修復系の欠損変異株に対する変異原の影響
竹森 友哉（筑波大学 生物学類）

指導教員：鈴木

石根（筑波大学 生命環境系）

で培養した培養液を 1.0×108 cells mL-1 に希釈し、直径 7 cm のシャーレに 5 mL 入れて UV 照射した。それらの細胞に 0、1、5、10、30、60 分間 UV を照射し、それぞれを 105 倍あるいは 2×104
倍希釈し、50 µL ずつ 3 枚の LB 寒天プレートに植菌した。37℃
で一晩培養し形成されたコロニーを数え、未照射のプレート上で形成されたコロニー数の平均を 100 %としたときの、それぞれのプレートでのコロニー形成率を細胞生存率とし、照射時間と生存率、及び変異した遺伝子と生存率の関係を考察した。
【結果と考察】1. 遺伝子欠損変異株の作出
13 の変異株のうち、7 つの変異株のカナマイシン耐性遺伝子が抜け落ちていることが確認できた。5 つの DNA 修復系全てについて少なくとも 1 つ以上の変異株で、想定された欠損株を得ることができた。
2. UV 照射による影響
変異株と野生型の生存率を比較すると、変異株の生存率は野生株に比べて低くなった（図）。また、野生株と DNA フォトリアーゼの欠損株では照射開始直後に顕著な生存率の低下が起こり、その後一旦回復し、その後は照射時間につれて生存率は低下した。
一方でミスマッチ修復系を欠き SOS 修復の起こらない株では、照射時間が長くなるにつれて生存率が漸減した。

【背景・目的】
窒素N の安定同位体 15N で標識したプラスミドに陽子線を照射すると、非常に多くの変異が導入され、この変異の度合いは 15Nの標識率によって高まった[1]。しかし、この変異がどの様に DNAに損傷を与えているか、また大腸菌の DNA 損傷修復系で修復されているのかは不明であった。そこで、大腸菌の持つ DNA 損傷
修復系を欠損させた変異株を入手した。陽子線の効果を調べるのに先立ち、UV を照射し、それらの生存率の変化を観察した。
大腸菌には大きく分けて、塩基除去修復・ヌクレオチド除去修
復・ミスマッチ修復・相同組換え・DNA フォトリアーゼの 5 種のDNA 損傷修復系が存在する。塩基除去修復は、損傷塩基に特異的な酵素が損傷塩基を切り取ることで開始され、1 塩基分だけのDNA 合成を行い、DNA 鎖を結合して修復が完了する[2]。ヌクレ
オチド除去修復は、大きな DNA 損傷に対して働く[2]。塩基除去修
復では 1 個の損傷塩基を切り出すのに対し、ヌクレオチド除去修
復では DNA 損傷を含む 10 ヌクレオチド程度の DNA 断片が切り出される[2]。ミスマッチ修復は複製エラーの修復に関与するため、この修復系の遺伝子に欠損が生じると、自然突然変異頻度が大幅に上昇する[2]。相同組換えは、RecA タンパク質を中心に、タンパク質と一本鎖 DNA との複合体をつくり、相同鎖の対合を行う修復系である[2]。DNA フォトリアーゼは、DNA の損傷を光エネルギーを用いて修復する。これらのうち、ヌクレオチド除去修
復・ミスマッチ修復・相同組換えは、細胞内に変異が蓄積されると誘導される SOS 修復に関与する[2]。
【材料・方法】
1. 遺伝子欠損変異株の作出
国立遺伝学研究所の大腸菌のバイオリソースの Keio コレクシ
ョンの中から、DNA 修復に関連する遺伝子の欠損変異株を 13 株入手した。Keio コレクションの株では、カナマイシン耐性遺伝子の置換によって標的遺伝子が破壊されているが、将来的にカナマ
イシン耐性を持つプラスミドを 15N で標識し、大腸菌に導入するため、染色体上のカナマイシン耐性遺伝子を外す必要があった。
そこで組換え酵素遺伝子を含むプラスミド pBAD_Flp を形質転換し、アラビノースで相同組換え酵素を誘導し、カナマイシン耐性遺伝子を欠失した株を作出した。その後、温度感受性の複製起点を持つ pBAD_FLP は、37℃で培養し脱落させた。
耐性遺伝子を欠失した後の株と、耐性遺伝子を持つ Keio コレク
ション株と野生株から抽出した DNA を鋳型とし、標的遺伝子の両端から約 200 bp ずつ離れた位置に設計したプライマーを用いて PCR 反応を行って標的遺伝子領域を増幅させ、電気泳動により分離した。その結果、カナマイシン耐性遺伝子の脱落が確認できたもののうち、5 種類の修復系に関わる遺伝子の変異株を一つずつ選び、それらを以降の実験で用いた。
2. UV 照射
1.の実験で得られた 5 種の欠損変異株と、Keio コレクションの宿主株である BW25113 株に対し、クリーンベンチ内の UV 殺菌
ランプ（波長 253.7 nm, UV 照射強度 51 µW cm-2）を、LB 培地

Survival rate (%)

100

10

1

0.1
0

20

40

60

UV irrdiation time (min)図. UV 照射時間と細胞生存率の関係 UV を野生型(●), DNA
フォトリアーゼ欠損株(□), ミスマッチ修復欠損株(△)に照射した時の各株の生存率の変化【今後の展望】
今回は、変異原として UV のみを用いて実験を行ったが、将来的な 15N 標識プラスミドの導入と陽子線照射を踏まえ、培養液を真空状態に封止し、その際の生存率の変化および損傷修復系による違いを観察したいと考えている。
【参考文献】[1] Yang T, University of Tsukuba, Ph.D. thesis (2023)[2] Katarzyna H M et al. Environ Mol. Biol. 60, 368-384 (2019)71

つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 72Ⓒ2024 筑波大学生物学類

繊毛虫テトラヒメナの細胞質分裂変異株に関する研究山木 佳奈子（筑波大学 生物学類）

指導教員：中野賢太郎（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】CdaA の結合パートナーの探索
テトラヒメナは、細胞表層に規則正しく並んだ多数の繊毛を有本目的のために 2 つのアプローチを進めた。一つ目は、CdaAし、その細胞の前方側には口部装置が、後方側には細胞肛門や収eGFP 株の抽出液から CdaA-eGFP をプルダウンして結合するタ縮胞という特別な細胞構造が存在する。この生物では細胞質分裂
ンパク質を調べる方法である。二つ目は、CdaA と結合する CDK時に、娘細胞が縦に並ぶように生じる。分裂面の前側の娘細胞でを探す方法である。この方法では、テトラヒメナの各種 CDK には後方側に特有な細胞肛門や収縮胞が、分裂面の後ろ側の娘細胞
eGFP を結合した遺伝子産物を発現するコンストラクトを野生型
では前方側に特有な口部装置が正しい位置に新生される。このよ
細胞に形質転換し、この細胞からタンパク質を抽出し、GFP 抗体
うに細胞の前後方向を維持しながら、正しい位置で分裂し、適切で免疫沈降を行う。その免疫沈降物に、CdaA が結合しているかに細胞表層の構造を形成するため、テトラヒメナは精緻で特別なを調べるために、CdaA のアミノ酸配列について抗原適性が高い
仕組みをもつと考えられる。私はこの仕組みを明らかにしたい。
と考えられる配列を選択し、抗体作製を外部委託で行った。
これまでにテトラヒメナでは、細胞質分裂の異常な cda (celldivision arrest) 変異株が複数単離されている。これらの変異株は、 【結果と考察】
特定の温度で培養すると細胞分裂が停止し、変異株ごとに特徴的
cdaC 株の責任遺伝子の同定
な細胞の形態異常を示す。私は、細胞質分裂が途中まで進行する
cdaC 株は、変異原処理により単離された劣性ホモ変異株である。
が、娘細胞の分離には至らない cdaC 株について、その責任遺伝
そのゲノムには、細胞質分裂の異常とは無関係のランダムな変異子とその機能について調べることにした。また、最近同定されたが多数含まれる。そのため、野生株と交雑し、cdaC に関して優性
cdaA 株の責任遺伝子は、サイクリン様タンパク質をコードする ホモと劣性ホモの F2 世代細胞集団を取得する。それぞれの細胞(Jiang et al., 2020)。サイクリンは、サイクリン依存性キナーゼ
集団からゲノムを抽出し、次世代シーケンス (NGS) による解析
CDK と結合して、主に細胞周期を調節する因子である。これまでを行うことで、cdaC の責任遺伝子を決定する。現在、cdaC-1 株に私の所属する研究室では、テトラヒメナの CDK を同定し、そについては、cy-s の F1 の取得を行っている。cdaC-2 株についての機能解析を進めてきた (村井、2019)。そこで私は、CdaA がど
は、F2 集団の取得に成功し、米国の共同研究者に NGS 解析を依のCDKと結合して働くか明らかにするため、本研究に着手した。
頼した。
CdaA の結合パートナーの探索【材料と方法】
現在、制限酵素で処理したコンストラクトをパーティクルガン
細胞株と培養を用いてテトラヒメナB2086.2株の大核に遺伝子導入する実験をテトラヒメナ Tetrahymena thermophila の各細胞株は、行っている。また、各種 CDK に eGFP を結合した遺伝子産物をTetrahymena Stock Center より供与されたものを用いた。培養発現するコンストラクトの形質転換を準備している。一方、作製
は、SPP 培地を用いて室温または 30℃で行った。
した CdaA 抗血清の評価をウエスタンブロットにより行った。
細胞の交雑
CdaA は約 170kDa のタンパク質であるが、その位置にバンドがcdaC 株の責任遺伝子を同定するため、野生株 CU427.4 と変異 見られなかった。そのため、CdaA-eGFP 株の抽出液を用いて、
株 IA119 (cdaC-1 ) 及び IA123 (cdaC-2 ) を交雑して得た F1
GFP 抗体をポジティブコントロールとして、この抗血清の再評価を、さらに B*Ⅶ株と交雑して F2 を単離した。テトラヒメナは大を行うこととした。
核と小核を持ち、通常は大核の遺伝子のみを発現している。接合後に作られる大核と小核は、親株の小核由来のものであり、親株【今後の展望】の大核は消滅する。F0 世代には、小核のみに cycloheximide
CdaA-eGFP 株の完成が確認できたら、この細胞からタンパク(CHX) 耐性を持つ CU427.4 株 (cy-r ; CHX 耐性)と cdaC 株 (cy質を抽出し、GFP 抗体で免疫沈降を行う。そして、CdaA の共沈
s ; CHX 感受性)を用いた。これにより、F1 世代を CHX 耐性を持
降物について調べる。同様に、eGFP-CDK 株についても免疫沈降
つ細胞を選ぶことにより選択できる。F1 細胞を phenotypic
実験を行う。cdaA 株は、制限温度条件下で培養すると細胞分裂初
assortment により cy-s にし、B*Ⅶ株と掛け合わせることで期に分裂が停止するため、細胞質分裂の開始に必要な CDK やそ
uniparental cytogamy を誘導し、全ゲノムホモの F2 細胞が得らの基質が判明するかもしれない。
れる。F2 細胞集団を CHX 耐性によって選択した後、細胞ごとに一方、NGS 解析により cdaC 株の責任遺伝子の候補が同定され表現型を調べ、cdaC について優性であるか劣性であるかを確認たら、その遺伝子破壊株を作製し、細胞質分裂に支障を示すか調し、それぞれ 40 クローン程度プールした。
べる。さらに、その遺伝子産物の細胞内局在や細胞機能について
CdaA-eGFP 株の作成
調べていきたい。
CDAA の C 末端周辺領域の DNA 断片をクローニングし、その終始コドンの直前に eGFP-Neo4 カセットを挿入したコンストラ
クトを作製した。

72

つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 73Ⓒ2024 筑波大学生物学類

高濃度鉄存在下における単細胞性紅藻 Galdieria sulphuraria の細胞表層の構造変化
山口 幸大（筑波大学 生物学類）

指導教員：蓑田【背景・目的】
単細胞性紅藻 Galdieria sulphuraria が属するイデユコゴメ綱(Cyanidiophyceae) は、紅藻の進化の初期に分岐したと考えられているグループであり、世界各地の高温強酸性の環境に生息する。
そのような環境中には高濃度の金属が溶出しやすく、 G.
sulphuraria は様々な金属に対して他の多くの生物よりも高い耐性をもつが、金属耐性のメカニズムについてはほとんど分かっていない。
当研究室の先行研究から、高濃度鉄存在下において細胞の凝集が起こるとともに、α-Man 及びα-Glc を認識するレクチンである ConA-FITC により染色される構造が G. sulphuraria の細胞表層に生じることが観察された。RNA-seq 解析からは細胞表層のタンパク質修飾に関わる N-グリコシル化経路などの遺伝子群の発現上昇が確認された。N-グリコシル化はアスパラギンの窒素原子に糖鎖を転移することで、細胞表層のタンパク質の正しい立体構造の形成と機能発現に関与している。
これらの結果から、高濃度の鉄への耐性には細胞表層の構造変化が重要な役割を果たしていると考えられた。そのため、本研究では、高濃度鉄存在下において生じる細胞表層の構造変化が、G.
sulphuraria の鉄耐性に与える影響を明らかにすることを目的に研究を行った。
細胞表層の糖鎖修飾は動物細胞において細胞間相互作用などと関係していることが知られているが、植物や藻類では糖鎖修飾の役割に関する知見は限られている。本研究成果は、植物や藻類における糖鎖修飾の新たな生物学的機能の一端を明らかにすることも期待される。
【材料・方法】
培養：
G. sulphuraria は 2×Allen’s 培地（pH 2.5）で 40℃、暗所で振盪培養した。
顕微鏡観察：
0 mM または 3 mM の FeSO4 を含む培地を作製し、細胞を 24 時
間培養した。ConA-FITC により細胞を染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。

歩（筑波大学 生命環境系）

1-2. 遺伝子破壊コンストラクトの作製
RNA-seq 解析で発現が上昇していた N-グリコシル化経路の遺伝子のうち OST2（Gasu_19630）、STT3（Gasu_35460）、MOGS（Gasu_23130）、MGAT3（Gasu_38070）をコードする遺伝子を欠損させるためのコンストラクトを作製した。G. sulphurariaのゲノム DNA を鋳型として用いて、標的遺伝子とその上流と下流の約 1000 塩基対を含む 3000 塩基対程度の領域を PCR により増幅した。標的遺伝子の全部または大部分を欠損するように、ブラストサイジン耐性遺伝子（BSD）カセットと置き換えた。
1-3. PEG 法による形質転換
標的遺伝子の上流及び下流と相同な配列の間に BSD カセットを含む領域を PCR により増幅し、PEG 法による 1 倍体の形質転換を行った。これまでに数回ブラストサイジン添加培地によるス
クリーニングを行ったが、相同組換えにより標的遺伝子が欠損した遺伝子破壊株は得られていない。引き続き形質転換を行い、遺伝子破壊株のスクリーニングを試みている。遺伝子破壊株を単離でき次第、高濃度鉄存在下における表現型の解析を行う予定である。
2. 細胞表層構造の酵素処理
高濃度鉄存在下において細胞表層に形成される構造が高濃度鉄耐性に及ぼす影響を調べるために endo -1,4-β-Mannanase 処理を行った。その結果、Mannanase で細胞を処理した際に、3 mM
鉄添加 24 時間後における細胞表層の ConA-FITC の蛍光強度の減少が観察された。このことから、鉄添加 24 時間後に細胞表層に形成される構造にはマンノースからなる糖鎖が含まれており、Mannanase によって分解されたため ConA-FITC の蛍光強度の減少が見られたと考えられた。
今後、Mannanase 処理により ConA-FITC で染色される細胞
表層の構造を除いたときの、細胞内への鉄の流入や活性酸素種の発生について調べる予定である。また、G. sulphuraria のもつ糖鎖の構造についても詳細な解析を行う。
【謝辞】
本研究を進めるにあたり、1 倍体を単離して頂いた平川泰久先生（筑波大学）、BSD カセットの提供ならびに形質転換操作をご教授頂いた宮城島進也先生（国立遺伝学研究所）、山下翔大先生（国立遺伝学研究所）に深くお礼を申し上げます。

【結果・考察】1. N-グリコシル化経路の遺伝子破壊株の作製
1-1. 1 倍体の単離
G. sulphuraria の細胞を 2×Allen’s 培地（pH 0.5）に加え、96well plate に分注して数日間静置培養した。顕微鏡下で細胞をピ
ペットで吸い取り、新しい培地へ単離した。単離した細胞を培養したところ、生活環の一部において 2 倍体とは形態的に異なるオ
タマジャクシ様の細胞を生じた。先行研究（Hirooka et al. 2022）において報告されていた形態との類似性から、G. sulphuraria の1 倍体であると考えられた。

【参考文献】
1. S. Hirooka et al. 2022. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 119(41),e2210665119

73つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 74Ⓒ2024 筑波大学生物学類

Role of chlororespiration in the high CO2 tolerance of unicellular red alga Galdieria sulphuraria
Belitz Alisa Marie（筑波大学 生物学類）

指導教員：蓑田

Introduction
While CO2 is essential for photosynthesis, the growth of mostphotosynthetic organisms is inhibited when CO2 levels surpass
2-5 percent (Solovchenko and Khonzin-Goldberg 2013). A few
algal species have been reported to tolerate higher CO2 levels,
including the unicellular red alga Galdieria sulphuraria. G.
sulphuraria is isolated from acidic hot springs and has beenreported to grow in up to 100% CO2 conditions. However, themechanism of high CO2 tolerance in G. sulphuraria is unknown.

歩（筑波大学 生命環境系）

Results and discussion
1. Construction of NDA2 and PTOX knockout mutants
1.1 Isolation of haploid cells
Diploid G. sulphuraria are surrounded by a thick cell wall thatprohibits genetic modification. Cell wall-less, haploid cells of G.
sulphuraria were induced by decreasing the pH of culture media
as described by Hirooka et al (2013). Isolated cells were used fortransformation.
1.2 Genetic modification
The coding regions of the target NDA2 or PTOX genes alongwith the approximately 1 kbp upstream and downstream
regions were amplified by PCR from genomic DNA. The coding
regions were replaced by linear DNA containing a blasticidin S(BS) selectable marker. The resulting DNA was used fortransformation by homologous recombination using apolyethylene glycol (PEG)-mediated method. As selection by BS
has not yielded positive transformants, we are examining
transformation and selection conditions. After successfultransformation, we plan to evaluate the phenotype under highCO2 conditions.

In a previous study by our group, G. sulphuraria was suggested
to optimize the light-dependent reactions of photosynthesis by anovel process that prevents the overreduction of theplastoquinone pool under high CO2 conditions (Ozeki 2021).
Transcriptome analysis indicated the upregulation of a type II
NADPH dehydrogenase (NDA2) and a plastid terminal oxidase(PTOX) under high CO2 in G. sulphuraria. In green algae,
NDA2 and PTOX have been reported to be involved inchlororespiration, the reduction of oxygen using electrons fromthe plastoquinone pool, which can serve as an alternativeelectron outlet for alleviating excess reducing power (Saroussi etal. 2023). Thus, NDA2 and PTOX were identified as candidate
enzymes for optimizing electron transport in G. sulphuraria
under high CO2 conditions. This research aims to investigate therole of NDA2 and PTOX in the tolerance of G. sulphuraria to
extremely high CO2 levels.

2. Effect of PTOX inhibition
Propyl gallate (PG) is known as a PTOX inhibitor. The effective
concentration of PG for G. sulphuraria was determined due to alack of previous reports. Growth rate of cells decreased in thepresence of 1 mM PG in either air or 100% CO2 conditions. This
concentration had no immediate effect on respiration rate andwas consistent with that used in studies of PTOX using green
algae (Saroussi et al. 2023). We plan to measure the chlorophyll
fluorescence of cells with and without the addition of PG using
PAM to evaluate the effect on photosynthetic electron transport.
Results will be discussed in the oral presentation.
References
Hirooka et al. (2022), PNAS. 119(41)Ozeki (2021), University of Tsukuba Thesis
Saroussi et al. (2023), Plant Phys. 192, 789-804
Seckbach et al. (1970), Nature. 227, 744-745
Solovchenko and Khonzin-Goldberg (2013), Biotechnol Lett.
35(11), 1745-1752

Fig.1 Schematic representation of the role of NDA2 and PTOX
in the photosynthetic electron transport chain.
Materials and Methods

Culture: G. sulphuraria cells were grown at 40℃ in 2 x Allen’s
medium adjusted to pH 2.5 or pH 1 for diploid or haploid cells,
respectively. Cells were bubbled with air or 100% CO2 andexposed to continuous light (90±3 μmol photons m-2 s-1). Cell
growth was evaluated by OD750.
O2 electrode: Respiration rate of cells was measured at 40℃
using Oxytherm (Hansatech).

Acknowledgements
We would like to thank Professor Yoshihisa Hirakawa for his
assistance in isolating haploid cells and Professor Shinya
Miyagishima and Dr Shota Yamashita for their guidance on the
PEG-mediated transformation method.

74つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 75Ⓒ2024 筑波大学生物学類

海洋細菌は揮発性有機化合物の生産者となりうるか
指導教員：大森【背景と目的】
大気中には多種の揮発性有機化合物（Volatile Organic
Compounds; VOC）が、微量ながらも普遍的に分布している。ア
セトンやエタノールなどの含酸素 VOC は対流圏オゾンの生成に寄与し、ジメチルスルフィドといった含硫黄 VOC は雲凝結核の前駆体として雲の生成を促進することが知られている（Charlson
et al., 1987）。このように、VOC は大気化学および地球の気候シ
ステムに重要な役割を果たす成分である。
海洋は、大気への VOC の放出源および吸収源としての役割を担っている。海洋表層における VOC の主な生成プロセスに、微生物の代謝産物として VOC が生成される生物学的プロセスと、
溶存態有機物（Dissolved Organic Matter; DOM）が紫外線を含む太陽光によって光化学的な分解を受けることで VOC が生成される光化学的プロセスの 2 つが知られている。海洋表層におけるVOC の生成および分解プロセスは、化合物ごとに異なるメカニズ
ムで制御されていることが明らかになっている（Carpenter andNightingale, 2015）。多様な VOC の生成および分解プロセスにおいて、海洋表層に分布する海洋細菌が VOC の分解者として働くことはよく知られている（Moore et al., 2020）が、一方で海洋細菌による VOC 生成に着目した研究は非常に限られている。しかし、細菌は VOC 生成を行う代謝経路をもつため VOC 生産者としての側面が存在することが予想され、さらに有する代謝経路の多様性から、その生成能は細菌種によって異なると考えられる。
そこで、本研究では海洋の細菌種が放出する VOC が海洋大気に与える影響を議論するための基礎データを提供することを目的とし、海洋細菌 Paracoccus aquimaris に着目して生成する VOC の定性および定量評価を行った。細菌種単離株の培養実験では、単純な基質であるグルコースを与える画分と、実際の環境で細菌が利用できるものに近い基質として植物プランクトンを与える画分を設け、それぞれの条件下で生成された VOC の種類および生成量を把握した。
【方法】
1. グルコースを基質とした培養実験
静岡県下田市鍋田湾の自然海水（2022 年 5 月 10 日採水）から単離されたロドバクター科の海洋細菌 Paracoccus aquimaris を、寒天培地（BD Difco Marine Agar）に植菌して培養を行い、充分に増殖した時点で Aquil 培地に植菌して前液体培養を行った。この培養液を 1 L の Aquil 培地を入れた 6 本の培養瓶に 9 mL ずつ添加し、うち 3 本には最終濃度 834 µmol C/L となるようにグルコース溶液を加え、人工気象器を用いて 20 ℃の暗所で培養を行った。培養開始から 0、12、24、42、60、84、132 時間後に、VOC濃度の測定および試料分取を行った。
また、
Aquil培地のみのVOC
測定も同時に行い、コントロール画分とした。

裕子（筑波大学 生命環境系）

国立環境研究所から入手した珪藻 Skeletonema marinoidohrnii complex を f/2 培地（Guillard and Ryther, 1962）を用いて 20 ℃、光強度 15-20 µmol photons/m^2/s、明暗周期 10L：14D
で培養した。培養液を 1500 rpm で 5 分間遠心し、ペレットを回収したのち Aquil 培地で洗浄したものを有機物液として用意した。
1. と同様に1 L のAquil 培地を入れた6 本の培養瓶に有機物液を
28 mL ずつ加え、うち 3 本に P. aquimaris の前液体培養液を添加し、人工気象器を用いて 20 ℃の暗所で培養を行った。培養開
始から 0、1、2、3、6、10、16 日後に、VOC 濃度の測定および試料分取を行った。
3.

分析
培養試料水中の VOC 濃度は、プロトン移動反応質量分析計（PTR-ToF-MS, Ionicon）を用いて測定した。純空気を培養試料に通気して、パージした VOC を含むガス試料を PTR-ToF-MS に直接導入し、分子量 21 から 160 までの VOC を検出した。分取した試料を用いて、細胞数、グルコース濃度およびクロロフィル a濃度の測定を行った。
【結果と考察】グルコースを基質とした実験では、アセトン、アセトアルデヒ
ド濃度はグルコースの添加・非添加にかかわらず数十 nm まで増加し、細菌による生成が確認できた。ただし生成量は両画分で同程度であり、グルコース添加画分では炭素およびグルコース濃度の減少と細胞数の増加が確認できたため、生成量は細胞数や消費した炭素量によらなかった。この要因として、VOC 代謝経路の始点の一部が、今回の培地に含まれないアミノ酸やビタミンの代謝による生成物であったため、それらによって VOC 生産が制限を受け、初めに添加した培養液 9 mL ぶんの細胞内物質を利用してVOC を生成したことが考えられる。また、珪藻由来有機物を基質とした培養実験および VOC の測定、その他の測定項目についての結果に関しては、卒業研究発表会にてその詳細を報告する。
40

グルコース非添加

35

濃度（nmol/L）

窪田 燿（筑波大学 生物学類）

30

グルコース添加25

コントロール

20
15
10
5
0
0

20

40

60

80

100

培養時間（h）2.

図1. アセトンの濃度変化
エラーバーは標準誤差を示す（n=3）

珪藻由来有機物を基質とした培養実験

75

120

つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 76Ⓒ2024 筑波大学生物学類

海洋細菌 Paracoccus sp.由来の溶存態有機物の定性評価
指導教員：大森【背景と目的】海水中に溶けている有機物は溶存態有機物（Dissolved Organic
Matter: DOM）と呼ばれる。DOM は有機物のうち孔径 0.2 ~ 0.7µm のフィルターを通過する画分として定義され、フィルターに保持される画分を粒子状有機物(Particulate Organic Matter: POM)と呼ぶ。海洋 DOM の炭素量は 662 Pg C と推定されており（Hansell et al., 2009）、その炭素量は大気中の二酸化炭素量 770
Pg C、陸上植生 450 Pg C（IPCC, 2021）と匹敵するため、炭素循環における DOM の動態を理解することは重要である。
DOM を分解者は主に海洋細菌であり、細菌に対する分解性に
より DOM の挙動は大きく異なる。易分解な DOM は早いものでは数時間から数日で分解されてしまうが、分解に耐性をもつ難分
解性 DOM（Recalcitrant DOM: RDOM は数百年から数千年の間海
洋中で安定して滞留する。DOM全体の90%以上を占めるRDOM
は、多量の炭素の海洋に長期隔離する重要な役割を担う（Carlson and Hansell, 2015）。しかし、RDOMの生成および分解過程は未だ明確になっていない。
海洋細菌はDOM分解者であると同時に、RDOMの生産者としても注目されている（Jiao et al., 2010）。海洋細菌が易分解 DOMを利用し、その代謝産物として RDOM が放出されると示唆されている。そのため、海洋細菌が放出する DOM の組成や分解性の解明は、RDOM の生成過程の解明につながると期待される。
近年、蛍光 DOM（Fluorescent DOM: FDOM）を指標とした培
養実験において、細菌の種ごとに生成する DOM の組成や生成プ
ロセスが異なることが示唆された（Goto et al., 2020）。また、グルコースと藻類浸出液といった基質の違いにより細菌群集が生成するDOMの構成成分が大きく異なることが示された（Kochet al.,2014）。
細菌種ごとの DOM 循環における役割の理解が必要である。しかし、単離株を用いた実験による DOM 生成を評価した研究はわずかである。また、先行研究で用いられる基質はグルコースといった単一な基質であり、実際の環境に存在する多様な有機物とは異なる。そこで本研究では細菌の単離株培養を行い、その DOM
を定性的に評価することで細菌種の DOM 動態における役割を明らかにする。さらに、グルコースと植物プランクトン由有機物を基質とした培養実験を行い、基質の違いにより細菌から放出される DOM を比較する。

裕子（筑波大学 生命環境系）

試料はガラスシリンジで分取を行い、DAPI により染色し、落射蛍光顕微鏡で細胞数を計測した。試料の一部を粒子保持径 0.3µm のガラスフィルター（GF/75, advantec）によりろ過し、ろ液を用いて溶存態有機炭素（DOC）濃度を全有機炭素計（TOC-L、Shimadzu）で測定した。蛍光分光光度計（F7500、Hitachi）でFDOM の励起蛍光マトリクスを測定し、FDOM の成分を分離するための PARAFAC 解析を行った。有色 DOM（CDOM）は紫外
可視分光光度計（1900i、Shimadzu）で吸光度を測定し、特定の波長間の傾きから分子量の変化を推測した。グルコースを基質とした実験ではグルコース濃度、S. marinoi-dohrniicomplex を基質とした実験ではクロロフィルa濃度とPOCについて測定を行った。
【結果と考察】グルコースを添加した培養において、P. aquimaris の細胞数の増加が見られた。細胞数の変化から培養12 hから60 hを増殖期、60 h 以降を定常期と定義した。DOC 濃度が 24 h から 84 h で 679
から 473 µM C まで減少したことから増殖期に DOC が積極的に利用されたと示唆される。DOC濃度は 300 hでグルコース濃度より
217 µM C高かったことから、 P. aquimaris 由来の DOM が水中に放出されたと考えられる。
FDOM は 3 つの要素に分けられた（図 1）。その中でトリプト
ファン様 FDOM は 24 h から 124 h に大きく増加したことから、
易分解なタンパク質様 FDOM は活発な増殖に伴って生産されると考えられる。難分解 DOM の指標となる腐植様 FDOM は 84 h
から 460 h に比較的多く増加したことから、自身が出した DOMを分解することで生成されることが示唆された。CDOM の吸光
スペクトルは特定の区間の傾きの比である SR 値が増加したことから、CDOM の分子量の低分子量化が起こったと考えられる。
珪藻を基質とした培養の結果については発表で報告する。

タンパク質様FDOM蛍光強度[R.U.]

トリプトファン様【方法】
細菌種は下田沿岸海水から単離されたロドバクター科のParacoccus aquimaris を使用した。1 L の Aquil 培地（Morel et al.,1979）に植菌し、以下の 2 つの基質をそれぞれ添加し、暗所にて20℃で培養した。
基質はグルコース（最終濃度 834 µM C）と珪藻 Skeletonema
marinoi-dohrnii complex を用いた。S. marinoi-dohrnii complex は f/2培地（Gulillard and Ryther, 1962）で培養後、1,500 rpm、5分で遠心分離し Aquil培地で洗浄した。

UVC腐植様UVA腐植様

0.35

0.12

0.30

0.10

0.25

0.08

0.20

0.06

0.15

0.04

0.10

0.02

0.05
0.00

0.00
0

120 240 360 480 600 720 840 960

培養時間[h]

図１ FDOM の変化 （エラーバーは標準誤差、n = 3）76

腐植様FDOM蛍光強度[R.U.]

助川 太一（筑波大学 生物学類）

つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 77Ⓒ2024 筑波大学生物学類

染色体置換系統を用いた貧栄養下におけるイネ祖先種の生育と元素蓄積の解析
上安

欣語（筑波大学 生物学類）

指導教員：Louis Irving（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】
稲作が伝播していく過程において、栽培に向いている土地もあれば向いていない土地もあったはずであり、伝播してきたイネの栄養要求性に適した土地ではより稲作が盛んに行われたのではな
いかと考えた。そこで、イネ祖先種が持つ何らかの元素蓄積に関連する特徴がイネの栽培化に貢献した可能性を見出すことで、科学的・文化人類学的側面からもヒトと稲作の関係を認識したいと考えた。
イネの栽培化における選抜の過程では、祖先種が本来持っていた多種多様な遺伝的形質が失われていることが知られている（Bright G Adu et al. 2022）。著者らは現行品種であるコシヒカ
リと、祖先種（Oryza rufipogon）を掛け合わせ、低窒素条件への応答を調査した。その結果、祖先種はコシヒカリよりも低窒素の影響を受けにくく、低窒素耐性が高い、もしくは非応答性である
ことが明らかになった。そこで、現行イネの染色体の一部が祖先種で置換された集団を古代の農業環境を想定した貧栄養下で栽培することで、現行品種よりも栄養獲得の面で優れた特徴を見つけることを目的として卒業研究を行った。

図 1：染色体置換系統の地上部の乾燥重量。右端が T65。エラーバーは SE を表す。

地上部と地下部における元素蓄積分析した 10 元素には系統間で様々な差異が認められたが、特にCa とMg において系統9 と10 で現行品種よりも約200-300％
高濃度であるという特徴が認められた。

【材料】
日本型品種 T-65 を種子親、O. rufipogon (W1962)を花粉親として交雑 F1 を育成し、T65 にて BC4F1 まで連続戻し交配を行った
W1962IL の44 系統をイネナショナルバイオリソースプロジェク
トから入手し、実験に供した。これは、戻し交配を行い、ゲノムのほとんどが T-65 である中に、一部 O. rufipogon のゲノムが存在する染色体部分置換系統である。
【方法】
１．イネのサンプリング
イネの水耕栽培に一般的に用いられる木村氏B液の濃度を1/10まで低下させた溶液を用いて W1962IL の 44 系統と T-65 を第五葉期まで育てたのちに収穫し、地上部と地下部それぞれの長さ、新鮮重量、乾燥重量を測定した。

図2：染色体置換系統の元素濃度。右端がT65。エラーバーはSE を表す。

系統 9 と 10 では第二染色体の約 7 Mbp の領域が共通して祖先種に置換されており、この範囲に Ca と Mg の高蓄積を司る遺伝子が座乗している可能性が示された。

２．ICP-OES を用いた元素測定
各試料を硝酸分解したのち、本学の分析センターに設置されている ICP-OES(ICP-7300)を用いて、Ca, Co, Cu, Fe, K, Mg, Mn,
Na, Ni, Zn の計 10 元素について測定を行った。

【考察】
二価の陽イオンとして植物体内で利用される Ca と Mg で同様の傾向が認められた点は興味深い。着目した領域には、細胞外カルシウムの受容体ホモログや、カルシウムを介して様々なストレス耐性に関与するアネキシン、そして Mg2+あるいは Ca2+の輸送体をコードする遺伝子などが存在していた。今後の研究により祖先種の持つ有用形質が明らかになることを期待したい。

【結果】
地上部と地下部それぞれの長さ、新鮮重量、乾燥重量
地上部と地下部のいずれにおいても、長さ、新鮮重量、乾燥重
量が T65 に比べて増加あるいは減少した系統が認められたが、図1 に示す地上部の乾燥重量においては最大で T65 比 149％の重量を示した系統も認められた。

77

つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 78Ⓒ2024 筑波大学生物学類

イネの根の細胞壁におけるストロンチウム応答機構に関する研究
吉田 文哉（筑波大学 生物学類）

指導教員：岩井＜導入・目的＞ストロンチウム(Sr)はイネに取り込まれると根の伸長を阻害することが知られている。しかし、Sr 毒性のメカニズムは知られていない。その機構を知る手掛かりとして、根の細胞壁ペクチンによるアルミニウム毒性緩和が関係していると考えている。
アルミニウム(Al)は Sr と同じく非必須元素で、根の伸長阻害を引き起こすことが知られている。イネは植物の中でも Al 耐性が高いとされるが、これは根から多量のペクチンを分泌し、それが障壁となって Al の吸着を防ぐことにより、毒性を緩和することがわ
かっている。ペクチンが含まれる細胞壁は金属元素が細胞内に吸収される前に通過する最初の組織であり、重金属応答においてイオン隔離装置として機能していると言われている。Al 毒性は、Caの置換に、効果的な Sr や Ba などの元素の毒性と同じ傾向を示すとされており、Sr も Al と同様な機構が存在することが考えられる。しかし、予備実験として、Sr 処理したイネ(コシヒカリ)の根のペクチンをルテニウムレッド染色で観察したところ、他の重金属処理では見られなかった被膜状の構造が見られた。このことか
ら、Sr に対する細胞壁ペクチンの応答は、他の重金属イオンに対するものとは明らかに異なることが考えられた。このように、イネにおける Sr 毒性のメカニズムや、それに対する根の細胞壁ペクチンの応答については不明な点が多いのが現状である。そこで本研究では、細胞壁のペクチンの量や質が変化したイネを用いて Srの植物体内での挙動や毒性に対する耐性の変化を調べることで、根の細胞壁およびペクチンの Sr 毒性への応答と毒性緩和における機能を明らかにすることを目的として実験を行った。

宏暁（筑波大学 生命環境系）

＜結果＞
伸長の測定
日本晴における Sr 処理による伸長量への影響を調べるため、各濃度の SrCl2 を処理し、Sr 処理前と後の根の伸長量を測定した。
Sr の濃度が上昇するにつれ、根の伸長量は減少し、Sr 500 µM の伸長量は、Sr 0 µM の 46%程度であった。
EGCG 処理下での伸長の測定
当研究室の研究により、EGCG はイネのペクチン分泌量を増加させ、根の伸長を促進することがわかっている。そこで、EGCG 処理
下での Sr 処理による伸長量への影響を調べるため、EGCG と Sr を処理し、処理前と後の根の伸長量を測定した。
EGCG未処理区では、
実験 1 と同様に Sr 濃度が上昇するにつて、根の伸長量は減少した。EGCG 処理区においても、Sr 処理によって根の伸長量は減少したが、EGCG 未処理区と比較すると、伸長量の減少の程度は小さかった。
RR による根のペクチン染色
日本晴において、Sr 処理下での根のペクチンの様子を観察する
ために、RR 染色を行った。Sr 200 µM と Sr 500 µM では、根の先端に被膜状の構造が観察されたが、Sr 0 µM では観察されなかった。また、EGCG 処理下では、Sr 200 µM と Sr 500 µM だけでなく、
Sr 0 µM においても被膜状の構造が見られた。また被膜状の構造には、多数の細胞構造が観察された。
＜考察＞
日本晴において、Srを処理することで根の伸長量は減少したが、EGCG を加えると減少の程度が小さくなったことから、EGCG はイネの根における Sr の毒性を緩和することが分かった。また、EGCG は
ペクチンの分泌量を増加させることから、イネの根における Sr に対する応答や毒性緩和にはやはりペクチンが関与していると考えられる。さらに、根の RR 染色では、他の金属処理では見られない
被膜状の構造の再現性が確認されたことから、イネの根におけるSr に対する応答は、他の金属に対するものとは異なることが示唆された。またこの被膜状構造には細胞層が観察されたことから、根の表面構造が分離したものである可能性が高い。また、EGCG 処
理下では Sr 0 µM であっても被膜状の構造が観察されたが、これはペクチンの分泌量が増加したことによるものと考えられ、Sr 処理によるものとは異なると考えられる。

＜材料・方法＞
実験 1.伸長の測定
WT(品種:日本晴)の種子を 3 日間吸水させ、1.0 mM の CaCl2 水耕液(pH4.2)で 3 日間生育後、各濃度(0, 200, 500 µM)の SrCl2 を含んだ CaCl2 水耕液で 7 日間処理した。Sr 処理前と後に根との伸長量を測定した。
実験 2.EGCG 処理下での伸長の測定
WT の種子を 3 日間吸水させ、各濃度(0, 50 µM)のペクチンメチ
ルエステラーゼ阻害剤 EGCG を含んだ 1.0 mM CaCl2 水耕液で 3 日間生育後、各濃度(0, 50 µM)の EGCG と各濃度(0, 200, 500 µM)のSrCl2 を含む CaCl2 水耕液で 7 日間処理した。Sr 処理前と後に根の伸長量を測定した。
実験 3.ルテニウムレッド(RR)による根のペクチン染色
実験 1 および実験 2 でサンプリングした根を RR で 5 分間染色
し、脱メチル化ペクチンの観察を行なった。その後、0.1N の NaOH
で 1 分間けん化処理した後、再び 0.01％の RR で 5 分間染色し、メチル化ペクチンも含むペクチン全量の観察を行なった。

＜今後の展望＞
今後は、ペクチンによる Sr 応答について詳細に調べるためにポリガラクツロナーゼ過剰発現イネ OsPG2-FOX やペクチンメチルエ
ステラーゼ過剰発現イネ OsPME1-FOX を用いて、伸長の測定や RR染色を行う。また、Sr の植物体内での輸送や挙動を調べるため放射性ストロンチウムを用いたトレーサー実験を計画している。

78

つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 79Ⓒ2024 筑波大学生物学類

細胞壁改変イネを用いた塩ストレス応答の解析
藤井 智代（筑波大学 生物学類）

指導教員：岩井宏暁（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】・細胞壁組成の解析
植物は外界の環境から塩や乾燥といったストレスを受け、あらサンプリングした OsPG2-FOX と OsPG2-WT の中で生育が揃
ゆる生理・生化学的な反応を生じる。特に塩ストレスの場合、多っているものを選び、細胞壁を抽出した。TFA 処理によって、セくは植物の生長や成育に影響を及ぼし、塩害は現代の農業におけルロースを含む TFA 不溶画分と、ペクチンとヘミセルロースをる脅威のひとつである。塩ストレスは、Na+イオン毒性と浸透圧ス
含む TFA 可溶画分に分けた。アンスロン硫酸法、カルバゾール硫
トレスに分けることができる。植物はこれらのストレスを感知す
酸法を用いて中性糖と酸性糖の量を測定し、ガスクロマトグラフ
ると、様々な応答をすることによって、塩ストレス耐性を獲得すィーを用いて、細胞壁を構成する糖の組成を解析することによっ+る。塩ストレスにより細胞外の Na 濃度が増加すると細胞内にて、TFA 可溶画分、不溶画分に含まれる単糖の定量を行った。
+++
Na が流入し、細胞質における Na 濃度が上昇する。高濃度の Naは植物にとって有害であり、この Na+を細胞外へと排出または液【結果・考察】+胞内に隔離するため複数の Na 輸送体が活性化する。この活性に・イネの塩耐性
は、NHX 型遺伝子や SOS (Salt Overly Sensitive)遺伝子といっ
塩処理前から塩処理後の FW の増加量を比較すると、地上部とた特定の遺伝子の発現が必要であることがわかっている。特に根の両方において、OsPG2-FOX の増加量が最も大きかった。
SOS5 に関して、細胞表層に局在する GPI アンカータンパクをコードしていることが明らかにされ、細胞壁構造に重要なchitinase・細胞壁組成の解析
like protein (AtCTL1)が塩ストレスに重要であることが示される。
アンスロン硫酸法の結果、地上部においては、TFA 可溶、不可このように塩ストレス応答の一部が細胞壁構造と関係している可溶の両画分で OsPG2-FOX と OsPG2-WT の中性糖量は塩処理を能性が示唆されているが、細胞壁構造と塩ストレスとの関係はほ行うことによって増加した。根においては、TFA 可溶画分では同
とんど理解されていないのが現状である。
様に増加したが、TFA 不可溶画分では、OsPG2-WT の中性糖量
植物の細胞壁はセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、構造は減少したのに対し、OsPG2-FOX は変化しなかった。
タンパク質、糖タンパク質、リグニンなどから構成される。塩ス
カルバゾール硫酸法の結果、地上部においては、TFA 可溶画分
トレスの影響として、細胞壁中のペクチンを例に挙げると、通常と不可溶画分の両方で酸性糖量が増加したが、どちらにおいても
2++
ペクチンは Ca で架橋しているが、細胞壁中の Na が増加するこ
OsPG2-WT でより大幅に増加した。一方、根においては、TFA 可とによって、Ca2+の架橋が減少することが分かっている。また、
溶画分ではどちらの系統でもあまり変化しなかったが、TFA 不可近年の研究によって、細胞壁成分(リグニンやアラビノース)の生合
溶画分では両者で同様に減少した。
成遺伝子が塩ストレス耐性に寄与しうることが示された。
ガスクロマトグラフィーの結果については発表会にて報告する。
細胞壁組成は、生物・非生物ストレスへの応答において変化す
地上部と根で糖の変化が異なっていることから、塩ストレスにることが知られているが、その変化は種や細胞によって異なるた
対する応答は部位によって異なる可能性が高い。
め、不明な点が多い。そのため、本研究の目的は、イネにおける細胞壁組成の変化が塩ストレス耐性にどのような影響を及ぼすかについて理解することである。いくつかの細胞壁改変イネを用いて塩耐性を調べた予備実験の結果、ペクチン分解酵素である PG2の過剰発現体において塩耐性に変化があった。PG2 の過剰発現体
ではペクチン量が減少すると推測されるが、ペクチン量の変化とイネの塩ストレス耐性の関係を明らかにするために、OsPG2FOX に着目して調査を行った。
【材料・方法】
・イネの生育イネ(Oryza sativa)の日本晴、OsPG2 の過剰発現体である
OsPG2-FOX、自家交配により分離し、OsPG2 を過剰発現するコ
ンストラクトを含まないヌルセグリガント個体である OsPG2WT の種子を 3 日間吸水させた後、2 週間の水耕栽培を行った。
水耕栽培の最後の3 日間は100ｍM NaCl 条件で塩処理を行った。
イネは根と地上部に分けてサンプリングし、生重量（FW）を計測した。

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つくば生物ジャーナル

Tsukuba Journal of Biology (2024) 23, 80Ⓒ2024 筑波大学生物学類

塩ストレス条件のトマト成熟過程におけるペクチン分解に伴うアスコルビン酸合成機構に関する研究
佐野 舞桜（筑波大学 生物学類）

指導教員：岩井宏暁（筑波大学 生命環境系）【背景・目的】
植物は動物と異なり移動ができないため、多くの環境ストレスに適応しながら生活している。その中でも塩ストレスは、浸透圧
ストレスやイオン毒性を引き起こすことで植物の生育や代謝に支障をきたす。トマト果実においては、果実サイズや数の減少、果実硬度の増加といった生育・代謝阻害がおこる。一方で、グルコースやフルクトース等の糖類や、プロリン、GABA 等のアミノ酸、そして一般的にビタミン C として知られているアスコルビン酸(AsA)などの栄養成分が多く蓄積し、商品価値の高いトマト果実がつくられることも知られている。
植物において AsA は、体内の活性酸素種を取り除いてストレス応答や防御に役立つ物質である。植物の AsA 合成経路はいくつか知られており、主経路である D-マンノース/L-ガラクトース(DMan/L-Gal)経路は、植物で最初にシロイヌナズナで報告された(Wheeler et al., 1998)。さらに、緑藻類の AsA 合成経路と考えられていた D-ガラクツロン酸(D-GalA)経路が、イチゴ果実で DGalA 還元酵素遺伝子 GalUR (AKR2)が単離されたことによりその存在が証明された(Agius et al., 2003)。GalA は細胞壁多糖類であるペクチンの分解物である。つまり GalA 酸経路とはペクチン
分解物を用いた AsA 酸合成の代替経路と言える。先行研究では、
緑色のトマト果実から赤色のトマト果実に成熟すると、AsA 合成
経路は D-Man/L-Gal 経路から GalA 経路に切り替わることが示
唆されている (Badejo et al., 2011)。また、これまでに本研究室では、塩ストレス条件下でのトマト果実の前期の成熟ステージでペクチンの含有量が増加し、後期では分解が促進されることが示されている。このことから、成熟後期ではペクチン分解物である
GalA の含有量も増加すると考えられる。本研究では、塩ストレス
下の成熟後期では、GalA 経路が活性化し、AsA の合成に寄与しているのではと考え、GalA 経路関連遺伝子の発現解析と、塩ストレス条件のトマト果実中の AsA の局在を調査することにより、塩
ストレス条件のトマト成熟過程におけるペクチン分解に伴うAsA合成機構を明らかにすることを目的に実験を行った。

2.

【材料・方法】
1. トマトの水耕栽培・塩ストレス処理
トマト（ Solanum lycopersicum cv.“Micro Tom”）を Yin etal., 2010 の方法を用いて、24℃のインキュベーター内で水耕栽培した。水で濡らした濾紙に滅菌した種子を播種し、子葉が出た後ロックウールに植え替えた。塩ストレス処理は花が咲き始めた時
点から開始し、NaCl 濃度を徐々に上昇させることで馴化させ、最終的に 150 mM になるように調整した。NaCl 濃度の調節は電気伝導率測定器を用いて行った。

【今後の展望】
硝酸銀を用いたトマト果実の AsA 染色では、塩ストレス条件を与えた果実が高いレベルで特徴的に染色された。再現性を調査するためには、今後、サンプル数を増やす必要があると考えている。
今後は、塩ストレスに加え、水耕液中に GalA を処理し、その条件での AsA 量の測定や AKR の発現解析、AsA 染色を成熟ステ
ージごとに行う予定である。

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サンプリングトマト果実の成熟ステージのうち、緑色の Mature green、黄色の Breaker、オレンジ色の Turning、赤色の Red ripe の 4 ステー
ジ別にサンプリングした。
3. 硝酸銀を用いたトマト果実の AsA 染色
Badejo et.al., 2012 と N.J. Chinoy, 1969 を参考に、コントロー
ル、塩ストレス条件のトマト果実を 2-3 mm の切片にし、5%硝酸銀溶液で AsA 染色した。
4.

D-GalA 経路関連遺伝子の発現解析
コントロール、塩ストレス条件のトマト果実について、果実組
織のうち、外果皮を用いて実験した。D-GalA 還元酵素遺伝子である AKR について、データベースより検索し、RT-PCR により発現解析を行った。
【結果・考察】硝酸銀を用いたトマト果実の AsA 染色では、Mature green、Breaker、Turning、Red ripe 全てのステージで、塩ストレス条件で生育させた果実が、より高いレベルで染色された。これは塩ストレス下では AsA が多く蓄積するという先行研究の結果と一致した。また、塩ストレス条件では、組織ごとに特徴的な AsA 染色性を示した。
トマトの発現データベースより検索した D-GalA 還元酵素遺伝子である AKR の発現解析では、コントロール、塩ストレスのどちらの条件でも、Breaker や Turning ステージで発現のピークを迎え、Red ripe ステージで発現が減少していく傾向が見られた。
また、Turning ステージにおいて塩ストレス条件で発現が強くなっていた。このことから、塩ストレスを与えて成熟前期で合成が促進されたペクチンは、Turning ステージには GalA 経路の AKR
酵素と反応し、Red ripe ステージでは AsA が蓄積すると考えられる。