令和４年度

食肉に関する
助成研究調査成果報告書

公益財団法人

伊藤記念財団

VOL. 41

「伊藤記念財団」設立趣意書
私，伊藤傳三は，昭和３年食肉加工業を創業して以来五十有余年の永きにわた
り食肉加工品の製造販売に従事して参ったところであります。
この間，昭和47年からは日本ハム・ソーセージ工業協同組合理事長，社団法人
日本食肉加工協会理事長，加えて，ハンバーグ・ハンバーガー協会理事長等の重責を担わせていただく等，業界団体の役員を勤めさせていただいてきたところであります。
こうした中で昭和55年，はからずも勲二等瑞宝章受章という身にあまる栄誉に浴したのでありますが，受章に際し私自身の過ぎ来し方を振り返り，食肉及び食
肉加工業界の行く末に思いを致し，２つの事柄を決意致しました。
第１は，食肉加工団体の指導体制の若返りであり，第２は，食肉加工業の基礎的研究の充実であります。
諸情勢が激しく変わりつつある中で食肉加工業界をさらに大きく発展させるには，新しいリーダーの登場が望ましいことは論をまちません。また，食肉加工品については，これまでも日本独自の技術開発は行われてきましたものの，いずれも企業内技術であると言っても過言でなく，大学等における基礎的研究の不足が将来の日本の食肉加工業の発展を遅らせるおそれがあり，この現状を打破する必要があると考えたところであります。
以上のような基本的考えの下に私は，食肉関係団体等の役員を辞すると共に，
食肉及び食肉加工に関する基礎的かつ広汎な研究を行い，あるいは助長するための財団の設立を発起するものであります。
昭和56年６月
設立発起人© The Ito Foundation

伊

藤

傳

三

Philosophy Behind the Establishment of
the Ito Foundation
Approximately half of a century has passed since I established a meat
packing corporation for commercial products in 1928. While involved in thisbusiness, I have had occasion to serve as chairman of the boards of trustees
of several organizations related to the meat industry, such as the HamSausage Industrial Association of Japan in 1972, the Meat Packing Industrial
Association of Japan, and the Hamburg-Hamburger Association of Japan.
In 1980, unexpectedly, I was highly honored to receive the Order of the
Sacred Treasure, Gold and Silver Star from the emperor in acknowledgement of my contributions to the meat industry and improved human nutrition
during my career. This illustrious award provided a strong impetus for me toact on my long-standing concern for the future of meat packing industries.
My commitment to the establishment of a new research foundation for thepromotion of meat science was based on two fundamental philosophies : first,
leadership of the Association of the Meat Packing Industry should be transferred to people with novel ideas and, second, an advanced system for basic
research should be established in meat industries. Clearly, fresh leadership isneeded in changing situations for intensive development in the meat packing
industry. Although some technical product developments have been achievedin certain individual corporations, the lack of basic research in meat scienceat universities and other research organizations certainly will impede future
development of Japanese meat packing industries. It is urgent to end the stagnation in the meat industry through research support.
On the basis of these philosophies, I myself will resign from any official
positions in meat-related associations and will establish a new researchfoundation to support and promote basic and applied research in meat
science.
Denzo Ito, Founder
June© The Ito Foundation

1981

事 業 の あ ら ま し（目

的）本財団は，食肉に関する研究及び調査を行い，もって畜産業及び食品産業の振興と国民食生活の安定に資することを目的とする。
（事業）

本財団は，上述の目的を達成するため，次の事業を行う。
⑴

食肉の生産，処理，加工等に関する基礎的研究及び調査⑵

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査を行う大学等の研究機関に対する助成⑶ 食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査に優れた業績が認められる研究者の表
彰⑷

食肉の生産，処理，加工等に関する情報の普及及び広報© The Ito Foundation

（事業実績）年度
昭和57年度
58
59
60
61
62
63
平成元年度
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
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18
19
20
21
22
23
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25
26
27
28
29
30
31（令和元年度）
2
3
4

第１回
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41

研究調査助成48件 60,000千円
52
54,40060
49,80062
48,00070
53,00079
58,90095
70,50086
74,25079
60,00070
50,00086
60,00081
60,00081
60,00082
65,00081
69,10078
59,00082
60,00067
47,00057
41,00053
37,00058
40,00055
41,00055
48,00056
48,00011
10,00012
10,00015
16,90011
10,000
11
10,40012
12,00013
13,00038
37,00058
54,80069
66,00071
69,00074
75,00084 101,200
74 105,000
79 105,000
80 110,000
79 120,000

伊藤記念財団賞授賞

第１回
２
３
４
５
６
７
8

© The Ito Foundation

4名（8,000千円）
3名（6,000千円）
2名（4,000千円）
3名（6,000千円）
3名（6,000千円）
2名（4,000千円）
3名（6,000千円）
3名（6,000千円）

学会等助成事業

3団体（3,700千円）
2団体（2,500千円）
3団体（3,795千円）
3団体（4,990千円）
3団体（4,500千円）
3団体（6,000千円）
4団体（8,500千円）

ご

挨

拶

当伊藤記念財団は，伊藤ハム株式会社の創業者故伊藤傳三による巻頭の「設立趣意書」に掲げた趣意をもって，昭和56年７月３日に財団法人として農林水産大臣から設立を許可され、平成24年４月１日に公益財団法人伊藤記念財団に移行登記したものであり，事業の内容は，「事業のあらまし」にあるとおりであります。
おかげ様で当財団は，平成24年度からは公益財団法人として活動することとなり，その活動は本年で41年となります。この間，当財団の研究調査助成事業の存在が畜産関係の方々の間に浸透いたし，事業内容も逐次充実して参りつつあります。
これは，ひとえに関係各位のご指導ご鞭撻の賜と深く感謝申し上げるとともに，今後とも，
食肉加工等の基礎的研究の充実を希う創設者の意志にそって，益々食肉産業ひいては畜産業の振興及び国民食生活の安定のために役立つべく，更に努力を重ねて参りたいと存じております。
本書は，41回（令和４年度）助成事業における79件の研究調査助成対象研究者の皆様からいただいた研究成果報告とともに，第８回となります伊藤記念財団賞授賞事業の受賞者とその業
績概要と学会等事業助成の概要をとりまとめたものでありますが，以上の目的にしたがって，
食肉産業の基礎的研究等に携わる諸氏の研究の一助ともなれば幸甚でございます。
令和５年11月

理事長

伊

藤

功

一

Dear Sir：
I am very pleased to send you and your organization a complimentary copy of theresearch reports of the Ito Foundation. This research foundation was founded by the late
Mr.Denzo Ito to advance research in meat science. The research reports are publishedannually. Unfortunately, the articles are largely in Japanease ; however, in the future wehope to contribute to the international development of meat science. Any constructive
suggestions or critiques from others involved in meat-related research would be accepted
gratefully.
You will find out philosophy behind the establishment of the Ito Foundation describedby Mr.Denzo Ito, in the research report of the Ito Foundation, Vol.41 enclosed here. We
appreciate any interest you may have in our research efforts.
It is my great pleasure to publish this report as the chief director.
Sincerely yours,
Nov. 2023
Koichi Ito
The chief director
The Ito Foundation© The Ito Foundation

i

研究助成事業目次

調味液浸透肉の電子レンジ加熱硬化特性とその食感品質に関する研究河野俊夫（高知大学教育研究部自然科学系農学部門）

3

加圧 CO２環境下での酵素加水分解を利用したポークミートエキスの製造法の開発野間誠司（佐賀大学農学部）

9

食用ブドウ球菌による ZnPP 形成と食肉製品の色調改善効果に関する研究若松純

一（北海道大学大学院農学研究院）

13

生理的に調節しうる濃度のカルノシンの添加は，鶏肉の匂いを改善するか？
渡邊
佐々木

源哉・石田

翔太・赤田

花林・本山

三知代・中島郁世・

啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

19

工業型畜産の課題解決に向けた培養肉の生産技術開発
岡村大治（近畿大学農学部）

24

乾燥熟成牛肉より分離された真菌の生理特性およびその利用に関する研究
中川

麻衣・小室

春菜・中島

誠人・猪口

由美・高鳥

浩介＊

（一般社団法人食肉科学技術研究所，＊NPO法人カビ相談センター）

29

ポークソーセージにおけるタンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）
西村

敏英・山口

千里（女子栄養大学栄養学部）

35

黒毛和種牛肉の香り特性の改善に関わる脂質過酸化反応系の解析―コールドチェーン物流の転換に向けた科学的アプローチ―上田修司（神戸大学大学院農学研究科）

43

英輝（名古屋大学大学院工学研究科）

50

久美子・六車三治男（南九州大学健康栄養学部）

57

畜産副生物から作成された再生医療部材の引張強度の解明
神田

食肉加水分解物の栄養機能について（Ⅱ）
竹之山

愼一・川北

豚のオス臭を形成する臭気成分の分析とそれを記述する用語の同定
河原聡（宮崎大学農学部）

67

久（九州大学大学院農学研究院）

73

細菌のファージ感受性増大およびスーパーファージ作製に関する研究宮本敬

近赤外光と偏光，AI を組み合わせた食肉中の虫および異物検知技術の開発（Ⅱ）
山

口堅三（徳島大学ポストLEDフォトニクス研究所）© The Ito Foundation80

ii
高酸素ガス置換包装が食中毒菌の生存性に与える影響の検証岡田彩加（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

86

ウシ複合脊椎形成不全症の病態解析とウシの骨格成長に重要な糖鎖の同定（Ⅱ）
古市

達哉（岩手大学農学部共同獣医学科実験動物学研究室）

91

早産を伴う子牛死亡に関連する遺伝的要因の解明（Ⅱ）
貴１・小澤

平野

昌起２・佐々木慎二３（１東京農業大学農学部，２岐阜県畜産研究所飛騨牛研究部，３琉球大学農学部）

98

近交度の高い金華豚集団の遺伝的多様性に関する評価
塩谷

聡子・大竹

正剛・寺田

圭

（静岡県畜産技術研究所中小家畜研究センター）105

表型値間因果構造を利用した豚繁殖形質の正確な同時改良手法開発


岡

村

俊

宏（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

111

黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立（Ⅱ）
則章１・上本庄司

吉伸２（１山形県農業総合研究センター畜産研究所，２東北大学大学院農学研究科）

116

新たに見つかった黒毛和種牛の筋ジストロフィーの病態解明と遺伝的統御法の確立
保田昌

宏１，２（１宮崎大学大学院医学獣医学総合研究科，２宮崎大学農学部）

123

鶏の暑熱耐性を担う CCKAR および HSP70 遺伝子多型に関する研究福原

絵里子・平川達也・森美幸（福岡県農林業総合試験場）

127

黒毛和種における体型評価部位「肋付き」の客観的評価手法の開発（Ⅱ）
鈴木洋美（（地独）北海道立総合研究機構畜産試験場）

132

多機能尾部センサを用いた重種馬の分娩予知
孝弘１・吉岡滄木

耕治２・檜垣彰吾３（１帯広畜産大学グローバルアグロメディシン研究センター，２麻布大学，
３

国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構）

138

哺乳期の栄養環境が繁殖機能に与える影響髙橋秀之（九州大学農学部附属農場）

144

黒毛和種における不明瞭な発情発生メカニズムの黄体退行の観点からの解明（Ⅱ）
法上

拓生・堀畑

慶

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センター）

149

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の確立（Ⅲ）
久保田

海雄・三輪

雅史・阪谷

美樹

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

154

生殖巣始原生殖細胞を用いた新規家禽遺伝資源保存法の開発（Ⅱ）
中

島

友

紀

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）© The Ito Foundation

159

iii
ホルスタイン種牛の妊娠期における卵巣予備能維持機構
敬祐１・窪

古山


友瑛２

（１大阪公立大学大学院獣医学研究科，２北海道立総合研究機構酪農試験場）

165

抗酸化物質を利用したウシ体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した
新規 OPU-IVF-ET による子牛生産システムの開発（Ⅲ）
武裕１，２・美濃輪

日巻


駿斗２

（１岐阜大学応用生物科学部，２岐阜大学自然科学技術研究科）

172

ウシ初期黄体における PG 抵抗性の解明―低酸素環境による抗アポトーシス機構―（Ⅲ）


西村

亮・菱沼

貢（鳥取大学農学部共同獣医学科獣医繁殖学）

178

牛黄体血流の多寡は子宮内膜機能の局所調節に関与するのか？（Ⅱ）


金澤

朋美・木崎

景一郎（岩手大学農学部共同獣医学科）

182

小胞体ストレス制御によるウシ体外生産胚の耐凍性向上に関する研究


山

中

賢

一（佐賀大学農学部）

187（１日本大学生物資源科学部獣医学科獣医臨床繁殖学研究室，２静岡県畜産技術研究所）

192

乳牛のルーメン内環境が肝臓の炎症を介して繁殖機能に及ぼす影響
忠利１・閏間大滝英之２

豚胚品質の客観的評価法の確立に関する研究


平山

祐理・江川

紗智子（独立行政法人家畜改良センター）

199

機能性脂肪酸を活用した黄体機能強化による乳牛繁殖成績改善技術の確立（Ⅱ）
山口

昇一郎・藤井英之・成瀬

講平１・山田

豊１・太田

剛

１

（福岡県農林業総合試験場， 油化産業株式会社）

205

排卵後早期の卵巣形態と性ステロイドホルモンバランスがウシ子宮の免疫機能に及ぼす影響


松

井

基

純（帯広畜産大学獣医学研究部門）

211

黒毛和種雌牛の繁殖成績を改善するための栄養状態の最適化検討（Ⅱ）
鍋西久（北里大学獣医学部）

217

南西諸島地域における肉用ヤギの消化管内部寄生線虫感染症に関する実態調査


波

平

知

之（琉球大学農学部附属亜熱帯フィールド科学教育研究センター）

224

遺伝性心筋症による豚の突然死の病態解明と生前検査法の確立


相原

尚之・志賀

崇徳（麻布大学獣医学部）

230

牛伝染性リンパ腫ウイルス由来の非翻訳性 RNA と結合する宿主たんぱく質の同定（Ⅲ）
安


藤

清

彦

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

237

豚熱ウイルス受容体候補タンパク質の網羅的探索
池田


圭吾・岩丸

祥史

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）© The Ito Foundation

243

iv
Clostridium novyi sensu lato の新しい鑑別法の開発へ向けた国内家畜由来株のゲノム解析
髙松

大輔・馬田

貴史

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

249

ブタ呼吸器複合感染症の原因ウイルスを解析する新たな in vitro モデルの確立
宮澤光太郎・熊谷飛鳥（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

256

牛呼吸器病症候群（BRDC）の悪化におけるバイオフィルム形成の関与
帆保誠二（鹿児島大学共同獣医学部）

263

畜産農場に生息するハツカネズミの免疫関連遺伝子の多様性と病原体媒介能力
高島康弘・ニコライシャマエフ（岐阜大学応用生物科学部）

269

牛マイコプラズマによる気管傷害と細胞内侵入過程の解明
平野佑気（（地独）北海道立総合研究機構畜産試験場）

274

黒毛和種牛における血液中のビタミン D の状況把握と牛におけるビタミン D の免疫賦活作用および抗炎症作用の検討
乙丸

孝之介１・津川尚子２・井尻萌１（１鹿児島大学共同獣医学部，２大阪樟蔭女子大学健康栄養学部）

280

牛呼吸器病ウイルスの鼻咽頭関連リンパ組織におけるウイルス増殖と病態解析平井卓哉（宮崎大学農学部）

286

介（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

293

イノシシにおける豚コロナウイルスの感染実態調査（Ⅱ）
中川敬ウシ RS ウイルス研究に最適な細胞株の樹立齊藤暁（宮崎大学農学部）299

智法（東北大学大学院農学研究科）

304

ライフサイクルに応じたパイエル板の機能解明と制御因子の探索
古川

睦実・野地

サルモネラ鶏卵汚染・介卵感染に寄与する鶏卵巣での菌・宿主細胞間相互作用の解明（Ⅱ）
岡村雅史（帯広畜産大学獣医学研究部門）

308

地方病性牛伝染リンパ腫発症牛におけるゲノムワイドな DNA メチル化解析
前澤誠希（東京大学大学院農学生命科学研究科）

315

ブタにおける医薬品の適正使用に向けた薬物代謝酵素の解析
宇野泰広１・山崎浩史２（１鹿児島大学共同獣医学部，２昭和薬科大学薬学部）

320

飼料費低減に向けた低硝酸態窒素と高粗タンパク質を両立する夏季牧草の窒素管理技術
林

征幸・金子

真

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センター）327

筋肉タンパク質合成・分解を制御する植物性成分による畜肉生産の向上研究佐藤隆一郎（東京大学大学院農学生命科学研究科）© The Ito Foundation

335

v
母体の乳生産性向上による効率的な肥育を目指す基礎的研究（Ⅱ）


津

上

優

作（広島大学大学院統合生命科学研究科）

341

寒地型多年生牧草採草地が１年生イネ科草種（自生イタリアンライグラス－イヌビエ・メヒシバ）
交代植生に遷移する気候・土壌要因の解明と飼料価値の評価（Ⅱ）
池


田

堅太郎

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センター）347

骨格筋の成長と炎症予防（抑制）を目的とした PGC-1 αアイソフォームの発現制御に関する研究

隆興１・西本實安和樹２（１神戸大学大学院農学研究科，２神戸大学農学部）353

畜産動物の脂肪酸味覚受容体の機能解析


吉

田

悠

太（茨城大学農学部食生命科学科）

359

衛星コンステレーション画像の時系列深層学習による低コストな飼料用トウモロコシ収量予測手法の開発
小花和


宏之・根本

英子

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構北海道農業研究センター）

364

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証（Ⅲ）
完１・小林

西本


寿美２・大津

晴彦２（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

１

食品研究部門，２畜産研究部門）

370

暖地で冬期に高品質な粗飼料を生産するイタリアンライグラス夏播き栽培技術の開発
加藤


直樹・望月

賢太

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センター）377

和牛向け稲発酵粗飼料および発酵完全混合飼料を厳冬期でも高品質調製するための新規乳酸菌の添加効果の検証
遠野雅徳１・西川明宏２・福馬

敬紘２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，
２



広島県立総合技術研究所畜産技術センター）383

生時低体重でも生後発育回復できる子豚は何が違うのか？－血液指標の探索－
中島


郁世・谷口

雅章・芦原

茜・渡邊

源哉・本山

三知代・佐々木（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

啓介
392

⼦牛用疑似グルーミング装置利⽤モニタリングによる健康状態評価⼿法の開発（Ⅱ）
矢用

健一１・野上大史２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，２九州大学）

397

ニワトリヒナに備わる抗炎症能力の解明～抗酸化能に注目して～


橘

哲也・牧野

良輔（愛媛大学大学院農学研究科）

404

沖縄アグー豚育成豚における飼料中のタンパク質水準の違いが増体および背脂肪厚の発達に及ぼす影響普照

恭多１・伊村嘉美２（１沖縄県農林水産部畜産研究センター，２琉球大学農学部亜熱帯地域農学科）© The Ito Foundation

411

vi
睡眠様姿勢―肉用牛の生産性およびウェルフェアの新たな行動指標の検討（Ⅱ）


深澤

充・盧

尚健（東北大学大学院農学研究科）

418

暑熱ストレス下におけるニワトリ筋タンパク質分解に対する L- シトルリンの新規機能の解明


スルチョードリビシュワジット（九州大学基幹教育院）

424

子牛における乳糖不耐症に関する研究

福森理加（酪農学園大学獣医学群）

430

暖地型牧草・芝草におけるゲノム編集による冬期常緑性新規育種素材の開発


権

藤

崇

裕（宮崎大学フロンティア科学総合研究センター）441

南九州における暖地型牧草の新規調製 “霜熟” の開発―晩夏播きパールミレット霜枯れ草の収量，サイレージ品質と選好性―


石井

康之・石垣

元気・井戸田幸子（宮崎大学農学部）449

浩一（愛知県農業総合試験場）455

高品質な豚肉生産のためのエゴマ搾り粕の利用に関する研究


田島

茂行・内倉

健造・長江

杏介・豊島

ルーメン細菌叢制御を目指した子ウシ唾液抗体の分泌機能の解明鈴木裕（北海道大学大学院農学研究院）

461

多機能性因子の合成を介した筋衛星細胞による自律的な筋肥大誘導機構の解釈を利用した
新プラットフォームの形成
鈴木


貴弘・前野
室田

岳大・今給黎

大輝・中村

耀・川崎

真子・辰巳

佑華・中田

后紀・

隆一（九州大学大学院農学研究院）

467

陸（電気通信大学大学院情報理工学研究科）

475

食肉の複素誘電応答に基づく肉質評価技術の開発


村

松

大

プラズマを用いた食中毒誘発因子の分解・不活化技術の開発


作

道

章

一（岡山理科大学獣医学部獣医学科）

482

国産ジビエの衛生管理に資する迅速簡便検査法の開発
山﨑朗子１・鎌田洋一２・中曽譲３・彦野

弘一４・峯岸恭孝５（１岩手大学農学部共同獣医学科，２千里金蘭大学，
３



株式会社ファスマック，４帝京科学大学，５株式会社ニッポンジーン）

487

鶏肉・鶏卵の生産性向上を目指した安全なワクモ防除法の開発
辻尚利１・川田

逸人１・小田憲司２（１北里大学医学部，２一般社団法人生物科学安全研究所）

495

反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索（Ⅲ）
青山真人１ ・蕪山

由己人２（１宇都宮大学農学部生物資源科学科，２宇都宮大学農学部応用生命化学科）© The Ito Foundation

502

vii

CONTENTS
Study on the heat hardening characteristics of seasoned meat by microwave cooking and its
textureToshio Kawano（Natural Science Cluster, Kochi University）

3

Development of preparation method for pork meat broth by enzymatic hydrolysis underpressurized CO２ environment
Seiji Noma
（Faculty of Agriculture, Saga University） 

9Studies on the formation of ZnPP by edible Staphylococcus and their color improving effects ofmeat products
Jun-ichi Wakamatsu（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University） 

13

Does the supplementation of carnosine at concentrations that can vary in vivo improve the odorof chicken?
Genya Watanabe, Shota Ishida, Karin Akada, Michiyo Motoyama, Ikuyo Nakajima and Keisuke
Sasaki（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

19

Development of cultured meat technology to solve the problems in industrial livestock
production
Daiji Okamura（Graduate School of Agriculture, Kindai University） 

24Studies on physiological characteristics of fungi isolated from dry aged beef and its utilization
Mai Nakagawa, Haruna Komuro, Yoshito Nakashima, Yumi Inoguchi and Kosuke Takatori＊（Japan Meat Science & Technology Institute, ＊Center for Fungal Consultation Japan） 

29

Clarification of the mechanism for holding aroma compounds by proteins in pork sausages（Ⅱ）
Toshihide Nishimura and Chisato Yamaguchi（Faculty of Nutrition Science, Kagawa Nutrition University） 

35

Analysis of the enzymatic reaction system of lipid oxidase involved in the improvements ofaroma characteristics of Japanese Black cattle beef
Shuji Ueda
（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University） © The Ito Foundation

43

viii
Tensile strength of regenerative medicine components created from livestock by-products
Hideki Kanda（Graduate School of Engineering, Nagoya University） 

50

Nutritional function of meat hydrolysates（Ⅱ）
Shinichi Takenoyama, Kumiko Kawakita and Michio Muguruma（Faculty of Health and Nutrition, Minami Kyushu University） 

57

Analysis of volatile components that form the scent of male pigs and identification of terms that
describe them
Satoshi Kawahara（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki） 

67

Studies on phage sensitivity improvement and superphage construction
Takahisa Miyamoto（Faculty of Agriculture, Kyushu University） 73

Detecting foreign object in meat using near-infrared light with polarization and artificial
intelligence（II）
Kenzo Yamaguchi（Institute of Post-LED Photonics, Tokushima University） 

80

Evaluation of the effect of high-oxygen modified atmosphere packaging on the survival of foodpoisoning bacteria
Ayaka Okada（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu
University） 86Pathophysiology analysis of bovine complex vertebral malformation and identification of sugar
chains important for bovine skeletal growth（II）
Tatsuya Furuichi（Laboratory of Laboratory Animal Science and Medicine, Co-Department of Veterinary Medicine,
Faculty of Agriculture, Iwate University） 

91

Genetic factor associated with calf mortality with preterm birth（Ⅱ）
Takashi Hirano１, Masaki Ozawa２ and Shinji Sasaki３（１Tokyo University of Agriculture, Faculty of Agriculture, ２Gifu Prefectural Livestock Research Institute,
Hida Beef Cattle Research Department, ３Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus） 

98

Evaluation of genetic diversity in a highly inbred Jinhua pig population
Satoko Enya, Masayoshi Otake and Kei Terada（Shizuoka Prefectural Research Institute of Animal Industry Swine & Poultry Research Center） © The Ito Foundation

105

ix
A new method for aggregated breeding value considering causal structure
Toshihiro Okamura（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

111

Establishment of breeding improvement method for “sweet smell” in Japanese Black beef（II）
１

Noriaki Shoji and ２Yoshinobu Uemoto（１Livestock Research Institute, Yamagata Integrated Agricultural Research Center, ２Graduate School of

Agricultural Science, Tohoku University） 

116

Establishment of genetic control method and pathophysiological analysis of newly discovered
muscular dystrophy in Japanese Black cattle
Masahiro Yasuda１，２（ １Graduate School of Medicine and Veterinary Medicine, University of Miyazaki, ２Faculty ofAgriculture, University of Miyazaki） 

123

The study of polymorphism in the chicken CCKAR and HSP70 gene associated withthermotolerance
Eriko Fukuhara, Tatsuya Hirakawa and Miyuki Mori
（Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center） 

127

Research for objective evaluation of forerib conformation of Japanese Beef Cattle（Ⅱ）
Hiromi Suzuki（Hokkaido Research Organization, Animal Research Center） 132Prediction of foaling in heavy horses using multifunctional tail sensors
Takahiro Aoki１, Koji Yoshioka２ and Shogo Higaki３（１Research Center for Global Agromedicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine,
Azabu University, ３National Institute of Animal Health, National Agriculture and Food Research

２

Organization） 138

Effects of nutritional environment during nursing period on reproductive function
Hideyuki Takahashi（Kuju Agricultural Research Center, Kyushu University） 

144

Elucidation of mechanisms for silent heat from luteal regression in Japanese Black Cows（II）
Takuo Hojo and Kei Horihata（Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, NARO）

149

Identification of a molecular marker for the uterine involution to affirm the female fertility（Ⅲ）
Kaiyu Kubota, Masafumi Miwa and Miki Sakatani（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

154

Developing new method of conservation of poultry genetic resources using gonadal primordial
germ cells（Ⅱ）
Yuki Nakajima（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） © The Ito Foundation

159

x
The mechanism for keeping the ovarian reserve level during the pregnancy period in Holstein
cows
Keisuke Koyama１ and Tomoaki Kubo２（１Graduate school of veterinary science, Osaka Metropolitan University, ２Dairy research center,
Hokkaido research organization） 165

Improvement of bovine in vitro fertilized embryo production technology using antioxidants anddevelopment of calf production system by new OPU-IVF-ET method（Ⅲ）
Takehiro Himaki１，２ and Hayato Minowa２（１Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University, ２Graduate School of Natural Science andTechnology, Gifu University） 

172

The mechanisms of PG-resistance in bovine early corpus luteum－hypoxia-induced anti-apoptotic
mechanism－（Ⅲ）
Ryo Nishimura and Mitsugu Hishinuma（Laboratory of Theriogenology, Joint Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture,
Tottori University） 178

Is bovine blood flow involved in the local regulation of endometrial functions?（Ⅱ）
Tomomi Kanazawa and Keiichiro Kizaki（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University）

182

Study on improvement of cryo-tolerance by controlling endoplasmic reticulum stress in bovine
embryos produced in vitro
Ken-ichi Yamanaka（Faculty of Agriculture, Saga University） 

187

Effect of intraruminal environment in dairy cows on reproductive function through liver
inflammation
Tadatoshi Ohtaki１ and Hideyuki Uruma２（１Laboratory of Theriogenology, Department of Veterinary Medicine, College of Bioresource Sciences,
Nihon University, ２Shizuoka Prefectural Research Institute） 192

Research on establishment of evaluation method for porcine embryo quality
Yuri Hirayama and Sachiko Egawa（National Livestock Breeding Center） 

199

Functional fatty acid diet improves the reproductive performance of dairy cows by boosting
their luteal function（Ⅱ）
Shoichiro Yamaguchi, Hideyuki Fujii, Kohei Naruse１, Yutaka Yamada１and Takeshi Ohta
（Fukuoka Agricultural Research Center, １Yuka Sangyo Co., Ltd.） © The Ito Foundation

205

xi
Effects of ovarian morphology and sex steroid hormone balance during early stage after
ovulation on bovine uterine immune function
Motozumi Matsui（Department of Veterinary Medicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）  211

Optimizing nutritional status to improve the reproductive performance of Japanese Black cows
（II）
Hisashi Nabenishi（Department of Animal Science, School of Veterinary Medicine, Kitasato University） 

217

Investigation of gastrointestinal parasites infection of meat goats in south-western islands,
Japan
Tomoyuki Namihira（Subtropical Field Science Center, Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus） 

224

Pathogenesis of sudden death in pigs due to genetic cardiomyopathy and establishment ofantemortem diagnostic method
Naoyuki Aihara and Takanori Shiga（School of Veterinary Medicine, Azabu University） 230

Identification of host-derived proteins interacting with BLV non-coding RNA（Ⅲ）
Kiyohiko Andoh（National Institute of Animal Health, NARO） 

237

Comprehensive analysis of candidate receptors for Classical Swine Fever virus
Keigo Ikeda and Yoshifumi Iwamaru（National Institute of Animal Health, NARO） 

243

Genome analysis of Clostridium novyi sensu lato strains isolated from livestock in Japan fordevelopment of novel identification methods
Daisuke Takamatsu and Takashi Mada
（National Institute of Animal Health, NARO） 

249

Establishment of a novel in vitro model for investigating viruses associated with the porcine
respiratory disease complex（PRDC）
Kohtaro Miyazawa and Asuka Kumagai（National Institute of Animal Health, NARO） 

256

Involvement of biofilm formation in exacerbation of bovine respiratory disease syndrome（BRDC）
Seiji Hobo
（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University） © The Ito Foundation

263

xii
Diversity of immune-related genes and pathogen vector capacity in wild mice inhabiting
livestock farms
Yasuhiro Takashima and Nikolai Shamaev（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University） 

269

Tracheal injury and intracellular invasion process by bovine Mycoplasma
Yuki Hirano（Animal Research Center, Hokkaido Research Organization） 

274

Understanding the status of vitamin D in blood in Japanese Black cattle, the effects of vitamin D
on the immunostimulatory and anti-inflammatory in cattle
Konosuke Otomaru１, Naoko Tsugawa２ and Moe Ijiri１（１Kagoshima University, Joint Faculty of Veterinary Medicine, ２Osaka Shoin Women’s University,
Department of Health and Nutrition） 

280

Pathological analysis and replication of bovine respiratory viruses in nasopharyngeal-associatedlymphoid tissue
Takuya Hirai（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki） 

286

Epidemiological survey of porcine coronavirus-infection in Japanese wild boars（Ⅱ）
Keisuke Nakagawa（Joint Department of Veterinary Medicine Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University） 

293

Generation of a cell line suitable for research of bovine RS virus
Akatsuki Saito（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki） 

299

Investigation of Peyer’s patch function according to life cycle and exploration of its regular
Mutsumi Furukawa and Tomonori Nochi（Graduate school of Agricultural Science, Tohoku University） 304

Elucidation of the interaction between Salmonella and host cells in avian ovary that underlies
egg contamination and transovarian infection（Ⅱ）
Masashi Okamura（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine） 

308

Genome wide analysis of DNA methylation states in cattle with enzootic bovine luekosis
Masaki Maezawa（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo） 

315

Analysis of drug-metabolizing enzymes toward appropriate use of drug in pigs
Yasuhiro Uno１ and Hiroshi Yamazaki２（１Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, ２Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Showa Pharmaceutical University） 320© The Ito Foundation

xiii
Nitrogen management technology for an annual summer grass that achieves both low nitrate
nitrogen and high crude protein to reduce feed costs
Masayuki Hayashi and Makoto Kaneko（Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, NARO） 

327

Studies on increased livestock production through regulation of protein synthesis anddegradation by plant factors
Ryuichiro Sato
（Graduate Scholl of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo） 

335

Efficient fattening by improving maternal milk production（Ⅱ）
Yusaku Tsugami（Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University） 

341

Climate and soil factors of succession from temperate perennial grassland to annual grasslandand evaluation of the feeding value（Ⅱ）
Kentaro Ikeda（Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, NARO） 

347

Study on regulation of PGC-1α isoforms expression for skeletal muscle growth andinflammation inhibition/prevention
Takaoki Saneyasu１ and Kazuki Nishimoto２（１Graduate school of Agricultural Science, Kobe University,
Faculty of Agriculture, Kobe University） 

２353

A study on fatty acid taste sensing in livestock animals
Yuta Yoshida（Department of Food and Life Sciences, College of Agriculture, Ibaraki University） 

359

Development of low-cost yield prediction method in corn by time-series deep learning of satellite
constellation images
Hiroyuki Obanawa and Eiko Nemoto（Hokkaido Agricultural Research Center, NARO） 

364

Verification of the effect of feed supplemented with mass-producible oligosaccharides on the
improvement of intestinal flora in livestock（Ⅲ）
Mamoru Nishimoto１, Hisami Kobayashi２ and Haruhiko Ohtsu２（１Food Research Institute, ２Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

370

Establishment of Italian ryegrass summer sowing cultivation which produces high-quality forage
in winter in warm regions Japan
Naoki Kato and Kenta Mochizuki（Kyushu-Okinawa Agricultural Research Center, NARO） © The Ito Foundation

377

xiv
Validation of effects of novel lactic acid bacteria additives on winter-preparation of wellfermented rice whole crop silages and total mixed rations for Japanese beef cattle
Masanori Tohno１, Akihiro Nishikawa２ and Takahiro Fukuma２（ １Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, ２Livestock Technology Research Center,
Hiroshima Prefectural Technology Research Institute） 

383

What makes low birth weight piglets recover their growth after birth? －Blood profiles－
Ikuyo Nakajima, Masaaki Taniguchi, Akane Ashihara, Genya Watanabe, Michiyo Motoyama and
Keisuke Sasaki（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

392

Development of health check system by monitoring usage frequency of mechanical grooming
brush for calves（Ⅱ）
Ken-ichi Yayou１ and Hirofumi Nogami２（１Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, ２Kyusyu University） 

397

Studies on unique anti-inflammatory ability of chickens : role of anti-oxidant ability
Tetsuya Tachibana and Ryosuke Makino（Graduate School of Agriculture, Ehime University） 

404

Effects of diets with different CP levels on body weight gain, back fat thickness in Okinawa Agu
feeder pigs
Kyota Fusho１ and Yoshimi Imura２（１Okinawa Prefectural Livestock and Grassland Research Center, ２University of the Ryukyus, Facultyof Agriculture, Department of Subtropical Agro-Production Sciences） 

411

Sleep-like posture : Evaluation as a new behavioural indicator of beef cattle productivity andwelfare（Ⅱ）
Michiru Fukasawa and Sanggun Roh（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University） 

418

Elucidation of the novel function of L-citrulline to protect muscle protein breakdown under heatstressSur Chowdhury Vishwajit（Graduate School of Bioresource and Bioenvironmental Science, Kyushu University） 

424

The study on lactose intolerance in calves
Rika Fukumori（School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University） 

430

Development of new breeding materials for winter evergreen by genome editing in warm-season
forage and turf grasses
Takahiro Gondo（Frontier Science Research Center, University of Miyazaki） © The Ito Foundation

441

xv
Frost-matured silage-processing of tropical grasses in southern Kyushu -Yield, silage quality andpreference of late-summer sown pearl millet foggageYasuyuki Ishii, Genki Ishigaki and Sachiko Idota（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki） 

449

The study of utilizing perilla meal（Perilla frutescens）for producing high quality pork
Shigeyuki Tajima, Kenzo Uchikura, Kosuke Nagae and Koichi Toyoshima（Aichi Agricultural Research Center） 

455

Capacity of salivary immunoglobulin secretion and its development associated with the growthof calves
Yutaka Suzuki（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University） 

461

The novel platform for the autonomous regulatory system of myogenic hypertrophy by multifunctional modulators synthesized in satellite cells
Takahiro Suzuki, Takahiro Maeno, Hikaru Imakyure, Yuka Kawasaki, Minori Nakada, Daiki
Murota, Mako Nakamura and Ryuichi Tatsumi（Research Faculty of Agriculture, Graduate School of Agriculture, Kyushu University） 

467

Meat quality evaluation based on complex dielectric response
Dairoku Muramatsu（Graduate School of Informatics and Engineering, The University of Electro-Communications） 

475

Development of plasma technology for degrading and inactivating the causative agents offoodborne disease
Akikazu Sakudo（School of Veterinary Medicine, Okayama University of Science） 

482

Development of rapid detection methods for game meat hygiene
Akiko Yamazaki１, Yoichi Kamata２, Yuzuru Nakaso３, Koichi Hikono４ and Yasutaka Minegishi５（ １Cooperative Department of Veterinary Medicine, Iwate University, ２Senri Kinran University,
Fasmac Co., Ltd., ４Teikyo University of Science, ５NIPPON GENE Co., Ltd.） ３487

Construction of a protective system against poultry red mite, Dermanyssus gallinae, for the
improvement and development of the poultry industry
Naotoshi Tsuji１, Hayato Kawada１ and Kenji Oda２
（１Kitasato University School of Medicine, ２Research Institute for Animal Science in Biochemistry and
Toxicology（RIAS）） 

495

Investigation of the physiological markers indicating ‘nausea’ in domestic ruminants（Ⅲ）
Masato Aoyama１ and Yukihito Kabuyama２（ １Department of Agrobiology and Bioresources, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University,
Department of Applied Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University） 

２© The Ito Foundation

502

xvi

伊藤記念財団賞
目山田

知哉（農研機構西日本農業研究センター

次上級研究員）

肥育牛におけるアディポジェネシス制御機構の解明に関する研究 鍋西久（北里大学獣医学部動物資源科学科

515

准教授）

家畜に及ぼす熱環境の影響評価と対策技術の開発ならびに畜産分野への ICT 導入に関する研究 

竹之山

愼

一（南九州大学健康栄養学部

516

教授）

機能性に基づいた食肉の付加価値向上および持続可能な食肉生産に関する研究 © The Ito Foundation

517

xvii

学会等事業助成目次

令和４年度学会等事業助成実施報告書
市民公開講座『ジビエにおける食品衛生上の問題点―寄生虫汚染を中心に―』に関する開催報告
公益社団法人日本獣医学会

日本食肉科学会代表理事

猪熊壽（東京大学） 521

坂田亮一（麻布大学名誉教授・明治大学客員研究員） 525

令和４年度事業助成実施報告

日本食肉科学会

前理事長

令和４年度事業実施報告書
日本畜産学会第 130 回大会 公開シンポジウム「未来をになう Animal Science の発展と展開」
公益社団法人日本畜産学会

理事長

小澤壯行（日本獣医生命科学大学） 529

獣医学教育シンポジウム〈獣医学教育環境の更なる整備充実に向けて〉に関する開催報告
非営利活動法人獣医系大学間獣医学教育支援機構

理事長© The Ito Foundation

髙井伸二 

531

研究助成事業© The Ito Foundation

3

調味液浸透肉の電子レンジ加熱硬化特性とその食感品質に関する研究
Study on the heat hardening characteristics of seasoned meat by
microwave cooking and its texture

河

野

俊

夫

（高知大学教育研究部自然科学系農学部門）

Toshio Kawano（Natural Science Cluster, Kochi University）

Aiming to improve the elastic quality of seasoned chicken after microwave heating, weinvestigated a new quality prediction model that combines optical sensing technology and amathematical model. The thermal properties of raw chicken and seasoning-soaked chicken
were measured using DSC, and their specific heats and two endothermic peak temperatures
were identified. The specific heat of raw chicken was 4.351（J/g/K）at 40℃ to 4.436（J/g/K）at
80℃ , and that of chicken immersed in the undiluted seasoning solution ranged from 3.985 to
4.069（J/g/K）. In addition, we measured the change in elasticity of the chicken meat sample
with a microwave oven at 200 W using a rheometer, and obtained the temperature dependence
equation of the compression energy E. Furthermore, we measured the near-infrared
reflectance spectrum of the surface of chicken heated in a microwave oven and extracted
wavenumbers suitable for monitoring changes in the composition near the surface by principal
component analysis. Based on these results, we investigated two models for estimating theelastic properties of chicken samples after microwave heating. One of them is a model thatnumerically analyzes the heat conduction equation to find the temperature distribution anduses the relational expression between compression energy and temperature. Another model isa model that estimates compression energy using a neural network instead of a heat
conduction equation. As a result of comparing the two estimation models, the estimation modelusing a neural network obtained better accuracy at present.

１．目

グラム（加熱プログラム）が用意されており，加的

熱対象の質量や温度，庫内温度などをもとにその電子レンジによる温めで，「できたてそのまま」

加熱時間が制御されている。しかし，加熱対象のの食感が味わえるチキンステーキのような肉加工

温度変化のみで肉加工品の仕上がりを判断する品は，現代の働き世代にとっては，栄養価が高くと，食品自体の温度は制御可能だが，電子レンジ

短時間に摂食できる点で評価が高い。流通する電

加熱後の食感品質までは考慮されていないため，

子レンジの多くは，加熱対象に合わせた調理プロ「全体的に熱は通ったが，弾力がなくなった」と© The Ito Foundation

4

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

いう仕上がりになる場合も多い。

2 . 3 電子レンジ加熱による鶏肉試料の弾力変そこで本研究では，ステーキ風の味付けを調味化測定液で行った鶏肉を電子レンジで加熱調理する場合

鶏肉試料（生鶏肉および調味液浸漬鶏肉）は約の調理後の弾力品質を高めることを目的に，光セ1.5cm角に裁断・成形した。質量後，試料は電子ンシングや数理モデルを組み合わせた新しい調理

レンジを用いて200Ｗで加熱し，40℃から80℃ま

品質予測モデルについて検討した。

での各温度に到達した時点で取り出して，レオ

２．方
2.1

メーター（島津製作所，EZ-Test）上で，ディス法

ク型プランジャー（押圧面直径８mm）による２

供試材料

回咀嚼試験を行った。電子レンジ内での鶏肉の温実験に供試した鶏肉は「高知県産すだち鶏肉」

度測定は，供試試料の中央部に蛍光式ファイバーである。まず試料鶏肉３ｇ～５ｇをとり，これをを挿入後，蛍光式ファイバー温度計（安立計器，

135℃-２時間常圧乾燥法

を用いて含水率を測定

FL-2000）で行った。咀嚼試験は，プランジャー

し た 。供 試 鶏 肉 の 含 水 率 は 乾 量 基 準 で 平 均の降下速度50mm/min.，深さ７mmまでの反力計

353.8％,d.b.（湿量基準で77.9％,w.b.），標準偏差は測を２回の咀嚼往復運動で行った。

１）

15.6％,d.b.（同0.7％,w.b.）であった。また，鶏肉

2.4の調味液には市販のもの（キッコーマン，「てり生の鶏肉試料30個について，その質量を計測す

やきのたれ」）を利用した。生の鶏肉のほか，調るとともに，電子レンジで常温から80℃まで200

味液浸漬試料として，鶏肉を調味液の原液，水にＷで加熱した場合の温度変化を，前出の蛍光式

よる２倍希釈液，同４倍希釈液でそれぞれ１日浸ファイバー温度計で計測し，比熱×質量×温度差

漬したものを用意した。

で計算される熱量を所要時間で除して電子レンジ

2 . 2 示差熱分析装置（DSC）による鶏肉およ

利用電子レンジの実質加熱Ｗ数の推定の実質加熱Ｗ数を推定した。
2 . 5 電子レンジ加熱による表面成分変化の光

び調味液浸漬鶏肉の熱特性の測定

モニタリング測定

生の鶏肉および調味液浸漬鶏肉（原液浸漬，２倍希釈液浸漬，４倍希釈液浸漬）の試料からそれ

電子レンジ加熱前後における表面近傍の成分変

ぞれ30mg～40mg程度をとり，シールセルに封入化を間接的に知る指標として，加熱前後の試料表

し て ，示 差 熱 分 析 装 置（島 津 製 作 所 ，DSC-60

面での近赤外反射スペクトルをNIR顕微分光計

Plus）で熱特性を測定した。DSCによるイカと牛（本体：日本分光，FT/IR4100＋InGaAs型高感度

肉のタンパク質の熱特性の測定事例 によると，検出器，顕微部：IRT-1000）で測定した。測定タンパク質の熱変性温度をはっきりとさせるため範囲は，波数10,000cm－１～4,000cm－１ で，標準白には，昇温速度は５℃/min. 未満であるのがよい

板をバックグラウンドとした。

２）ことが示唆されていたことから，本研究では，
DSC測定の際の昇温速度は３℃/min. とし，室温３．結果と考察から80℃までの加熱過程での熱特性を測定した。

3.1

参考値として，生鶏肉をフリーズドライした試料

Fig.１は，示差熱分析装置（DSC）を用いて，についてもDSCによる熱特性を測定した。

生鶏肉および調味液浸漬鶏肉の熱特性

生の鶏肉，フリーズドライした鶏肉，および調味料原液，２倍希釈液，４倍希釈液に浸漬した鶏肉© The Ito Foundation

5

調味液浸透肉の電子レンジ加熱硬化特性とその食感品質に関する研究
1.0
Freeze－Dried（4.7mg）

－1.0
－2.0

Raw（28.3mg）－3.0

In two－folddiluted（34.0mg）

In four－folddiluted（35.4mg）－4.0

In undiluted（46.1mg）

（B）

（A）

－5.0

Endothermic

DSC Output （mW）

0.0

－6.0
－7.0
－8.0
－9.0

20

30

40

50
60
Temperature（℃）

70

80

90

Fig. 1 Thermal properties of the samples measured with DSC

それぞれの40℃から80℃までの昇温時熱特性である。生の鶏肉，調味料に浸漬した鶏肉のいずれの3 . 2 電子レンジ加熱による鶏肉試料の弾力変化

試料についても，Fig.１の（Ａ）と（Ｂ）で示す

１回目と２回目の咀嚼圧縮エネルギー，弾力

とおり２点で吸熱ピークがあり，これが鶏肉タン性，凝集性，咀嚼性，ガム性を示す指標が得られ

パ ク 質 の 熱 変 性 域 で あ る 。低 温 側 の 熱 変 性 域

た。鶏肉の弾力品質を示すこれらの物理特性のう（Ａ）はCa.50.9℃から始まってCa.55℃でピークにち，電子レンジ加熱による温度変化と相関性が高達し，Ca.58.2℃で終了している。高温側の熱変かったのは，咀嚼試験の第１ピーク面積から求め性域（Ｂ）は，調味液浸漬の有無と調味液の濃度られる圧縮エネルギー（記号Ｅとする）であった。

により変化があり，生の鶏肉ではタンパク質の熱

Fig.２は，生の鶏肉と原液浸漬鶏肉について，

変性ピーク温度がCa.77.3℃であるのに対して，200Ｗで電子レンジ加熱し，各温度で取り出した調味液の濃度が濃くなるにしたがって熱変性の試料の圧縮エネルギーＥを，そのときの温度に対

ピ ー ク 温 度 は 低 温 域 へ と 下 降 し ，原 液 で はしてプロットしたものである。原液浸漬試料のCa.73.4℃と，生の鶏肉のそれに比較して3.9℃も50℃のみ，脂の多いサンプルによるイレギュラー

低くなり，電子レンジ加熱においても，生肉よりな測定値の影響で平均値が外れているが，生の鶏も調味液浸漬試料のほうがより低温で肉質が白く肉も原液浸漬鶏肉のどちらも，圧縮エネルギーＥ

なる観測結果と符合している。比熱を算出した結は，温度に比例して高くなる傾向を示した。温度

果，生鶏肉の比熱は40℃の4.351（J/g/K）から

測定は試料中心部であり全体平均の温度ではな

80℃の4.436（J/g/K），フリーズドライした鶏肉

く，中心と周辺とで温度が異なることから，ここ（乾 物）が 同 2.217～2.269（J/g/K），調 味 料 原 液で得たFig.２中にある測定点を回帰した直線は，に 浸 漬 し た 鶏 肉 は 同 3.985～4.069（J/g/K）で実際には温度の低い側へ平行移動したものになるあった。これは食肉比熱の測定事例ものと推測する。

の結果と同

３）

程度であった。

© The Ito Foundation

6

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Compression energy per unit lengthof the sample（J/m）

1.4
Raw

1.2

In undiluted

1.0
２
＋p
１T
p
E＝

0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

30

40

50

60

70

80

90

Temperature（℃）
Fig. 2 Compression energy estimated from viscoelasticity test（Depth 7mm）

20

Before Heating

10
5

qu

id

0

g

Li

－5

on

in

PC3 Axis （21.79%）

15

Se

as

Microwaved

－10
－15
－15

－10

－5

0

5

10

15

20

PC2 Axis （25.03%）
Fig. 3 PCA Scatter Plots of the samples on the PC1 vs PC3 plane3 . 3 電子レンジ加熱による内成分変化の光モ

クトルの影響が大きく，調味液の濃度によらず，どれも同じ集団（データ・クラウド）を形成しニタリング計測結果
Fig.３は，電子レンジ加熱前後の鶏肉試料表面，

た。一方，電子レンジ加熱後の試料は，タンパクおよび調味液原液に対して測定した近赤外スペク

質の熱変性を受けて異なる集団へと推移していトルを主成分分析（PCA）した結果のうち，分る。そこで，加熱前と加熱後とにスペクトルを分布傾向のはっきりした主成分第２軸と第３軸平面

割し，それぞれについて改めて主成分分析して，でのスペクトルデータの散布図である。解析には

加熱前と加熱後のスペクトルを特徴づける主成分

VEKTOR DIREKTOR Ver.1.1（KAX Group,軸を求め，それらの主成分軸を形成する波数のうAustralia）を用いた。加熱前の鶏肉試料は，調ち，その係数の絶対値が大きく，影響力のある波

味液原液自体のスペクトルよりも鶏肉自体のスペ数として，加熱前の試料については6,025cm－１と© The Ito Foundation

調味液浸透肉の電子レンジ加熱硬化特性とその食感品質に関する研究
Estimated Energy E
distribution

2D Temp. distribution in chicken
meat estimated with FEM model

Energy E

Average E value
Estimation

7

Temp.

Average E value
Estimation

Four ref. signals
at selected wave
lengths

FF-type NN Estimator

Chicken meat

FEM-based estimation model・Density
・Mass・Physical & thermal
Properties

Eﬀective microwave heating energy

Ref. spectrum
Ref. signal(A)

Wave Len.

(B)

Neural-network-based estimation modelFig. 4 Two types of trial estimation models for E values of chicken meat

7,066cm－１，電子レンジ加熱後の試料については学習させて平均の圧縮エネルギーＥを推定する

5,410cm －１ と7,341cm －１ を抽出し，次に述べる電200 Ｗ 加 熱 モ デ ル で あ る 。 モ デ ル 構 築 に は子レンジ加熱後の鶏肉の弾力指標となる圧縮エネ

MATLABのDeep Learning Toolboxを用い，中ルギーを推定するモデルに用いることとした。

間層のパーセプトロン数は入力端子の２倍，学習3 . 4 電子レンジ加熱後の弾力指標推定モデル

データは120組で，このうち40％を学習用，40％をモデル検証用，残り20％をモデル確認用のデーの検討
電子レンジの実質的な投入加熱Ｗ数や鶏肉自体の物性などを条件に，加熱後の調味済み鶏肉の弾

タとし，組み合わせを順次変えて推定モデルの精度を確認した。

力指標としての圧縮エネルギーＥ（初回の咀嚼に計算の結果，（Ａ）のモデルよりも（Ｂ）のモ

要するエネルギー）を推定するモデルについて検デルのほうが良い推定精度を得た。実測に対する討した。Fig.４は，検討した二つの推定モデルのその相対誤差は42.7％であった。120組のデータ

流れを示す模式図である。（Ａ）は，鶏肉の比熱による巡回学習であることから，より多くの教師

そのほかの物性をもとに，熱伝導方程式にもとづ

データを取得・学習させることで，さらに信頼性

いて温度分布を有限要素法（FEM）によって推のある推定モデルになるものと考える。

定し，その中心断面における温度分布から，圧縮エネルギーＥの平均を推定するモデルである。断４．要約

面２次元分布の計算には，汎用FEM計算ソフト

電子レンジ加熱後の調味済み鶏肉の弾力品質をのCOMSOL Ver.6.1を用いた。（Ｂ）は，熱伝導向上させることを目的に，光センシング技術と数方程式を介せずに，前項で求めた①電子レンジ加理モデルを組み合わせた新しい品質予測モデルに熱の前後での表面成分の変化を特徴づける４波数

ついて検討した。生の鶏肉および調味液に浸漬しでの調味済み試料表面の反射スペクトルおよび鶏た鶏肉の熱特性を，DSCを用いて測定し，それら肉の物性と，②圧縮エネルギーとの組み合わせをの比熱と，二つの吸熱ピーク温度を同定した。生フィードフォワード型ニューラルネットワークに

鶏肉の比熱は40℃の4.351（J/g/K）から80℃の© The Ito Foundation

8

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

4.436（J/g/K），調 味 料 原 液 に 浸 漬 し た 鶏 肉 はのモデルは，熱伝導方程式ではなく，ニューラル

3.985～4.069（J/g/K）であった。また，鶏肉試

ネットワークを用いて圧縮エネルギーを推定する料を200Ｗで電子レンジ加熱した際の，試料の弾モデルである。二つの推定モデルを比較した結力変化をレオメーターによって測定し，圧縮エネ

果，ニューラルネットワークを用いた推定モデル

ルギーＥの温度依存性を示す方程式を求めた。さのほうが現時点では良い精度を得た。

らには，電子レンジで加熱した鶏肉表面の近赤外
反射スペクトルを測定し，主成分分析によって，表面近傍の成分変化をモニタリングするのに適した波数を抽出した。これらの結果をもとに，電子レンジ加熱後の鶏肉試料の弾力特性を推定する二つのモデルを検討した。その一つは，熱伝導方程式を数値解析して温度分布を求め，圧縮エネル
ギーと温度との関係式を用いるモデル。もう一つ

文献１）
 前田安彦，金子憲太郎，宇田靖：改訂 わかりやすい基礎食品分析法，アイ・ケイコーポレーション，
p.39, 2006.
２）
 山口達彦，赤﨑哲也，中村文雄：示差走査熱量分
析計（DSC）による肉たんぱく質の熱変性の測定，
関税中央分析所，第43号，p.5～p.8, 2003.
 宮原晃義，谷口慎，森地敏樹：食肉の比熱に及ぼ３）す 脂 肪 含 量 の 影 響 ， 日 本 畜 産 学 会 誌 ， 70（9）,J184-J188, 1999.

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9

加圧CO2環境下での酵素加水分解を利用した
ポークミートエキスの製造法の開発
Development of preparation method for pork meat broth by enzymatichydrolysis under pressurized CO2 environment

野

間

誠

司

（佐賀大学農学部）

Seiji Noma
（Faculty of Agriculture, Saga University）

Pork hydrolysate（PH）is frequently used to improve and enhance the flavor of processed
foods including seasonings. Protease digestion of pork is one of its production methods, and it issuperior method to control the flavor of PH. However, the enzymatic reaction temperature issuitable for microbial growth, resulting in spoilage if the degradation reaction takes a long time.
The short reaction time gives peptides, causing bitterness. We applied a pressurized carbon. The pCO 2
dioxide（pCO2）treatment for hydrolyzing pork meat with acid protease（AP）
treatment generates an acidic environment and it has bactericidal/bacteriostatic effects.
Among the five commercial APs tested, Kokulase-P showed the highest activity under pCO2,
and hydrolysis of pork by Kokulase-P under pCO2 occurred in a time-dependent manner. The
total free amino acid content for pCO2 PH was approximately 1.4 times higher than that for
conventional PH. The water activity of PH prepared under conventional method, hydrolyzation
under atmospheric pressure, was 0.96, while that under pCO2 was 0.94. The number ofmesophilic bacteria in the PH prepared under pCO2 was approximately 1/10 of that prepared
under atmospheric pressure. The lipids were dispersed in the meat fiber matrix as small
droplets in both conventional and pCO2 PH. However, in pCO2 PH, a larger number of smaller
lipid droplets were observed than in conventional PH. Both conventional and pCO2 PHs hadboiled pork-like odor, but a clear rancid odor（pungent odor）was observed in conventional
PH. These results suggest that PH hydrolyzation by AP under pCO2 is expected to be a new
method for production of high-quality PH.

１．目

きる優れた方法である。しかし，酵素反応温度に的おいては多くの微生物が増殖可能であるため，分

豚肉エキスは，調味料をはじめとする加工食品

解反応が長時間に及ぶと腐敗が生じる。一方で，の風味改善・増強に利用される。その製造法のひ短時間では分解され残ったペプチドによる苦味がとつであるプロテアーゼ分解は，使用するプロテ生じる。したがって，腐敗なくアミノ酸濃度を向アーゼの作用様式や反応温度により風味を制御で上可能なプロテアーゼ分解技術が望まれる。

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10

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

著者は，課題の解決手段として「加圧二酸化炭会社），コクラーゼ－Ｐ（三菱ケミカル株式会

素（pCO2）下で酸性プロテアーゼ（AP）処理に社），プロテアーゼYP-SS（ヤクルト薬品工業株

よって分解する技術」を考案した。豚肉を浸漬し式会社），パンチダーゼNP-2（ヤクルト薬品工業

たAP溶液にCO2 を加圧溶解すると一時的に酸性株式会社），オリエンターゼAY（エイチビィア（最大でpH3.2まで低下）・嫌気環境が生じるた

イ株式会社）を使用した。基質として，ブレン

め，微生物の殺菌や増殖抑制が可能である。またダー（ブレンダープロ，ラボネクスト）によりミ

APの使用により，pCO2下の酸性条件下で加水分ンチにした市販の豚コマ切れ肉を使用した。大気解が進む。同時に，豚肉に多く含まれる不飽和脂圧 下 で の 反 応 に お い て は ， AP を 0.1 ％ 含 む

肪酸の酸化も抑制できる。さらに，アミノ酸と相McIlvaine緩衝液（pH3.5）と基質を１：１で混合加・相乗的にうま味を担うイノシン酸（IMP）のした。pCO2処理下での反応においては，APを0.1％

分解抑制も期待できる。

含む脱イオン水と基質を１：１で混合した。これ

CO2は安全かつ安価な食品添加物であるが，現らを45℃，１時間反応させた。沸騰水中で加熱後，在の用途は超臨界CO2を溶媒とした抽出や炭酸飲

エタノールを添加しタンパク質を除去した上清に料の製造に限られる。これらは，CO2の官能特性ついてホルモール態窒素量を調べることで加水分変化，超臨界流体の特徴的な物質溶解性を利用し解の程度を評価した。

ており，いずれも一時的酸性化作用の利用を志向

2.2

pCO2処理してはいない。また，食品以外の分野では，超臨耐圧容器に試料を入れ，CO2をボンベ圧を利用

界クロマトグラフィーや抽出，植物工場での生育

して加圧導入した。処理圧力は１，
３，
５MPaと

促進，炭酸ガスレーザー等に使用されているが，した。

これらもまた酸性化作用を活用したものではな

2.3

い。本研究では，これまでほとんど着目されていpCO2 処理（１，３，５MPa，45℃，24時間）おない「pCO2 の一時的な酸性化・嫌気化作用」をよび大気圧下（45℃，24時間）で調製した肉エキ利用する。これらの一時的作用は，中和処理工程

スを粗ろ過後，水分活性を測定した（MD-AW1，を要しないため，酵素反応プロセスのグリーン化アズワン）。

水分活性の測定に寄与するとともに，水分活性などの調整次第

2.4

で，使用するAPの除去や失活処理を行わなくて調製した肉エキスを粗ろ過後，0.85％ NaCl溶も十分な製品安定性を示す「熱履歴の少ない」新液で段階希釈し，Tryptic soy agarに塗布した。

しい肉エキス製品の開発を期待させる。

30℃，48時間培養後，生じたコロニー数に希釈倍

本研究では，pCO2下でのAP分解を基盤とする

中温細菌数評価率を乗じたものを中温細菌数（CFU/ml）とした。

高アミノ酸濃度・高品質ポークミートエキス製造

2.5

技術の開発を目指し，pCO2下でのAP分解による調製した肉エキスをナイルレッドで染色し，
LASX CM電動顕微鏡（Leica）で観察すること

エキスの調製を行った。
２．方
2.1

脂質の存在状態の観察

で脂質の存在状態を調べた。

法2 . 6 ATP分解物，アミン類，遊離アミノ酸分析

酸性プロテアーゼ（AP）の選抜APとしてスミチームAP（新日本化学工業株式

ATP分解物は，肉エキスから脱脂・除タンパ© The Ito Foundation

加圧CO2環境下での酵素加水分解を利用したポークミートエキスの製造法の開発

11

ク 質 ，HPLC に て 分 析 し た 。カ ラ ム に は Inert

がおおむね終了していると推察された。以上の結Sustain AQ-C18（ジーエルサイエンス，東京），

果より，使用酵素をコクラーゼＰとし，pCO2 下

溶離液として50mM K2HPO4 （pH7.0）を用い，での豚コマ切れ肉の加水分解特性を，従来法（大流速1.0ml/min，40℃でイソクラテック分離を行

気圧下での加水分解）と比較した。
まず，調製後の加水分解物をろ過した後（肉エい，260nmで検出した。
アミン類および遊離アミノ酸分析は，既報の方法にしたがって行った１）。

キス），収量を調べた結果，pCO2，大気圧のいずれも62-66ml程度であり，両者間に顕著な違いは認められなかった。したがって，加水分解による３．結果と考察タンパク質の可溶化の程度は類似していると推察

一般に酵素はpCO2 耐性が微生物よりも高く，された。次に肉エキスの水分活性を測定した結容易には失活しないものもある２）。過去の研究の果，従来法肉エキスでは0.96，pCO2肉エキスでは多くで失活には超臨界状態のCO2が必要であるこ0.94であった。この結果は，pCO2下ではタンパクとが報告されている。したがって，pCO2 下で酵質の低分子化が進んでいることを示唆している。

素分解を行うことが可能であると期待される。ま

pCO2 肉エキス総遊離アミノ酸量は従来法エキス

ず，使用する酸性プロテアーゼを選択するためにの約1.4倍であった。水分活性は細菌の増殖の可大気圧下で各プロテアーゼによる豚コマ切れ肉の否に関係する。水分活性0.96以上では代表的な食加水分解を行い，ホルモール態窒素を求めて活性品関連細菌はほぼ増殖可能であるが，0.94ではそを比較した。活性の高さは同じ重量％濃度においの種類はある程度限られる３）。したがって，pCO2て，オリエンターゼAY＞プロテアーゼYP-SS＞

では従来法と比較して細菌の増殖が一定程度抑制

コクラーゼＰ＞スミチームAP＞パンチダーゼされると推察された。実際に，調製した肉エキス

NP-2の順になった。これらの中から，活性が高中の中温細菌数を調べた結果，pCO2 肉エキス中かった３種類を選抜し，１，
３，５MPaのpCO2 下では従来法肉エキス中の1/10程度であった。過去

での活性を同様に調べた。その結果，大気圧下との研究において，pCO2下では，CO2分子が細菌細は異なり，活性はコクラーゼＰ＞オリエンターゼ

胞内に入り，細胞内で解離してプロトンを生じ，

AY＞プロテアーゼYP-SSの順となった。このと細胞内を酸性化することで殺菌／静菌効果を発揮

き，コクラーゼＰの活性は大気圧下の半分程度にすることが示されている ４）。この現象もまた，低下していたが，オリエンターゼAYやプロテ

pCO2 下での中温細菌数の減少に寄与していたと

アーゼYP-SSはいずれも10％程度まで低下して推察される。

い た 。し た が っ て ，使 用 し た 酵 素 は い ず れ もATPは豚をと殺後，速やかに分解されるが，pCO2 処理に対して安定性が高いとは言えなかっその分解中間生成物にイノシン酸がある。イノシ

たが，コクラーゼＰの活性が最も残存した結果，ン酸はそれ自体でも旨味を有しているが，グルタ

pCO2 下での活性が高い結果になったと推察され

ミン酸と共存するとそれぞれ単独の場合と比較しる。pCO2 下でのコクラーゼＰによる加水分解はて旨味が最大７倍に増加することが明らかになっ８時間から24時間まで時間の延長に伴い増加したている。そこでATP分解物を定量した。しかし，が，８-16時間と比較して，16-24時間の加水分解

いずれもヒポキサンチンまで分解されていた。イ率の増加の程度は小さく，24時間前後で加水分解

ノシン酸はと殺１日後に最大値を示し，その後減© The Ito Foundation

12

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

少すると報告されている５）。また，一般的に，豚菌数が少なく，酸敗臭が抑制され，総遊離アミノがと殺されてから市場に出回るまで３－５日とさ酸量が約1.4倍に増加したエキスを調製できた。

れている。今後，と殺後まもない豚肉を使用して今後，使用する材料の鮮度の検討，塩酸分解によpCO2 下でイノシン酸が残存しやすいのかを判断り調製した肉エキスとの比較などを行い，より実する必要がある。

用的な技術に近づけていく必要がある。

pCO2 下，従来法で肉エキス中の脂質をナイル
レッドで染色し，顕微鏡で観察した。いずれのエ謝

辞キスにおいても，脂質は小滴となって肉繊維のマ

本研究の遂行にあたり，多大なご支援をいただ

トリックス内に散開していることが明らかになっきました公益財団法人伊藤記念財団様に深謝いた

た。しかし，pCO2 肉エキスでは，従来法肉エキ

します。プロテアーゼのサンプルをご恵与いただ

スと比較してサイズの小さい脂質小滴がより多くきました新日本化学工業株式会社様，三菱ケミカ

観察された。理由として，pCO2 処理後の除圧時ル株式会社様，ヤクルト薬品工業株式会社様，エにCO2ガスとともに脂質の一部が除かれた，pCO2

イチビィアイ株式会社様に心よりお礼申し上げま

処理中に溶解せずにガスとして存在したCO2が作す。顕微鏡観察は佐賀大学総合分析実験センター

り出す微小な疎水性領域に脂質が存在したなどのにて実施しました。感謝申し上げます。

可能性が考えられるが，今後，分析を行う必要がある。
最後に，調製した肉エキスのにおいの印象を評価した。その結果，いずれも豚肉を茹でたにおいがしたが，大気圧では明確な酸敗臭（刺激臭）が認められた。pCO2 エキスでも弱いながら酸敗臭（刺激臭）がしたが，処理圧力の上昇に伴って弱くなった。これらの結果から，pCO2 下では脂質の酸化が低減すると考えられた。
４．要

約

本研究では，pCO2下でのAP処理による豚コマ
切れ肉エキスの調製を試みた。その結果，中温細文
献１） Noma, S., Koyanagi, L., Kawano, S., Hayashi, N.：
Food Science and Technology Research, 26, 195～
204, 2020.
２）
 Damar, S., Balaban, M. O.：Journal of Food
Science, 71, R1-R11, 2015.
３）
 FDA, http://www.triphasepharmasolutions.com/
Private/USP%201112%20APPLICATION%20
OF%20WATER%20ACTIVITY%20
DETERMINATION%20TO%20NONSTERILE%20
PHARMACEUTICAL%20PRODUCTS.pdf 2023 年
４月16日
 Garcia-Gonzalez, L., Geeraerd, A. H., Spilimbergo,
４）S., Elst, K., Van Ginneken, L., Debevere, J., Van
Impe, J. F., Devlieghere, F.：International Journalof Food Microbiology, 117, 1～28, 2007.
 堀内篤，知久幹夫，河原崎達雄，赤松裕久，鈴木５）
清一，樫尾進：日本養豚学会誌，39, 200～208, 2002.

© The Ito Foundation

13

食用ブドウ球菌によるZnPP形成と食肉製品の色調改善効果に関する研究
Studies on the formation of ZnPP by edible Staphylococcus and their color
improving effects of meat products

若

松

純

一

（北海道大学大学院農学研究院）

Jun-ichi Wakamatsu（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

The color-improving effect of coagulase-negative Staphylococci（CNS）, which are widelyused as starter cultures for fermented meat products, was thought to be the promotion of
nitrosylmyoglobin（NOMb）formation due to the nitrate-reducing properties of CNS. However,when dry sausage with a commercial starter culture containing CNS was produced without
the addition of nitrite/nitrate in our preliminary study, the formation and accumulation of zinc
protoporphyrin IX（ZnPP）was observed instead of NOMb. Therefore, this study was designed
to clarify that the color improvement of nitrite/nitrate-free meat products by the addition of
CNS was due to ZnPP. In a sterile model experimental system using pork homogenate, theaddition of CNS did not significantly promote ZnPP formation under anaerobic conditions, but
all CNS except the MV strain showed a high promotion of ZnPP formation under aerobic
conditions. In terms of growth characteristics, the growth of all CNS was suppressed as themedium pH decreased and as the temperature decreased. The surface and interior color of the
CNS-added dry sausage was reddish, similar to that of the nitrite/nitrate-added dry sausage.
In the acetone extract of the interior of the CNS-added dry sausages, the absorption spectra of
ZnPP were observed, but those of nitrosyl heme were not observed. On the other hand, notonly ZnPP but also nitrosyl heme peaks were observed in that of the peripheral part of the
MV-added dry sausage. These results suggested that the color of CNS-added meat products is
improved in case of most CNS by forming ZnPP instead of nitrosyl heme but in case of the MV
strain by forming nitrosyl heme as well as ZnPP.

１．目

硝酸塩を添加していないドライソーセージにおい的ても確認されている３）。このため，鮮やかな赤色

亜鉛プロトプロトポルフィリンⅨ（ZnPP）はを示すZnPPを発色剤無添加の食肉製品中で多量

パルマハム等の発色剤無添加の乾塩漬食肉製品にに形成させることができれば，発色剤を使用しな

特異的に豊富に存在する赤色色素である １，２）。

くても食肉製品の色調を改善することができ，発ZnPPの形成は，パルマハムだけでなく硝酸／亜色剤に代わる色調改善方法の一つになる可能性が© The Ito Foundation

14

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ある。

CNSを添加した食肉製品の色調改善はNOMbに

我々はZnPPを形成する微生物による発色剤無添加の食肉製品における色調改善技術に注目してよるものではなく，実はZnPPである可能性が浮上した。

きた。通常，骨格筋内部は無菌的な状態であり，

しかしながら，市販スターターカルチャーに配

パルマハムのような乾塩漬生ハムの内部において合されたCNSのうちどれがZnPP形成に影響したも微生物はほとんど存在しない 。そのため，パかは不明である。また，他のCNSに関してもパル

ルマハムにおけるZnPPの形成は肉内在性の働き

マハムと同様のミオグロビン誘導体の形成に関与によるもので微生物は関与しないと考えられてき

し て い る と 報 告 さ れ て い る も の の 10），そ の 後た５）。一方，我々はこれまでに高いZnPP形成能

ZnPP形成能は確認されていない。そこで本研究を持つ微生物を複数種確認している。このこの目的を，CNS添加による発色剤無添加の食肉製とからZnPP形成能の高い微生物をスターターカ品の色調改善が，NOMB形成とは異なりZnPP形

ルチャーとして発色剤無添加の食肉製品に接種成によるものであることを明らかにすることとし

し，ZnPPを多量に形成させることができれば，

た。

４）

６～８）

発色剤無添加でも色調の好ましい製品を作れると考えられる。
食肉製品のスターターカルチャーとして用いら

２．方
2.1

法

使用細菌

れる細菌群の一つとして，食用のブドウ球菌を含

市販スターターカルチャーより分離・同定（16S

む コ ア グ ラ ー ゼ 陰 性 Staphylococcus 属 細 菌

rRNA全長配列より）した菌株２種（MV，SC４（Coagulase-Negative Staphylococci：CNS）が株とする）と，独立行政法人製品評価技術基盤機あげられる。CNSは食肉製品において，特有の発構バイオテクノロジーセンターから購入した

酵臭や風味を付加することや，色調を改善するこCNSとが報告されており ，ヨーロッパでは古くからを実験に供した。また，ZnPP形成のポジティブ

スターターカルチャーとして広く利用されてきコントロールとして，Lactococcus lactis subsp.

た。CNSによる食肉製品の色調改善はニトロシル

cremoris GB（A）-1株７）を用いた。

９）

ミオグロビン（NOMb）の形成促進によるもの
で，CNSの硝酸還元性や，一酸化窒素合成酵素

５株（SC2，SC3，SE，SH，SX株とする）

2 . 2 無菌ZnPP形成モデル実験系によるZnPP
形成促進能の評価（NOS）によるものと考えられていた。しかし，Kauserらの方法７）を一部改変して行った。無予備実験において，CNSが配合された市販のス

菌的に豚最長筋の内部を切り出し，滅菌水を加えターターカルチャーを添加した発色剤無添加のドてホモジナイズして分注し，分離菌株ならびに分

ライソーセージを製造したところ，製品全体で鮮譲菌株を添加した（終濃度：肉20％（w/w），細やかな赤色が見られ，ZnPPの自家蛍光が観察さ菌1.0×10 6 cells/ml）。その後，25℃の暗所で嫌気れた。この他にもZnPPの存在が明らかになる以的または好気的に５日間インキュベートした。終前であるが，パルマハムから分離したCNSである

濃度75％アセトンでZnPPを抽出して蛍光光度

S. lentusやS. carnosusを添加した発色剤無添加の（Ex/Em：420/590nm）を測定してZnPP形成量

サラミは好ましい赤色を呈し，パルマハムと同一とみなした。無菌操作の確認として，抗生物質添の赤色色素が形成されていた 。以上のことから，

加区をネガティブコントロールとした。

10）© The Ito Foundation食用ブドウ球菌によるZnPP形成と食肉製品の色調改善効果に関する研究

2 . 3 培養温度および培地のpHがCNSの生育に
及ぼす影響

15

SX株添加区は無添加区よりZnPP形成量が有意に多く，GB（A）-1株添加区と同等であった（Fig.

あらかじめ培養した各種CNSを菌数測定後，滅1B）。しかし，MV株添加区では，無添加区より

菌生理食塩水で希釈し，1.0×10 /mlとなるよう

ZnPPがやや多く形成されたが，有意な差は見ら各pH（4.0から7.0）に調整したTryptic Soy Broth

れず，他のCNS添加区と比較するとZnPP形成量（TSB）培地に接種し，４，10，15，20，25℃では有意に少なかった。以上のことから，豚肉ホモ24時間，静置培養後に濁度（OD 660）を測定しジネートによるZnPP形成評価試験において，嫌た。なお，菌を添加していない各pHの培地をブ

気的条件下ではCNSによる著しいZnPP形成促進

ランクとした。

能はないが，好気的条件下ではMV株以外のCNS

6

CNS添加ドライソーセージの製造と分析においてZnPP形成促進能があることが示された。

CNS添加ドライソーセージの製造では，３％

3 . 2 さまざまな培養温度および培地のpHが2.4

NaClおよび１％グルコースを添加した豚ウデ筋

CNSの生育に及ぼす影響のひき肉に分離菌株と分譲菌株を1.0×10 cells/g

スターターカルチャーとしてCNSを発酵食肉となるよう添加し，35日間乾燥熟成を行った。無製品に添加するにあたり，熟成温度や製品中の添加区にはCNSの代わりに純水を加え，発色剤添pH変化がCNSの生育に影響を与える可能性があ

加区には亜硝酸ナトリウム溶液を終濃度200ppm

る。そこで，培養温度や培地のpHがCNSの生育となるように添加した。熟成後ドライソーセージに与える影響を検討した。pH4.0～7.0に調整したの表面明視野像ならびに断面のZnPP自家蛍光像

TSB培地（未調整pH7.3±0.2）に各種CNSを接種の撮影，外側３mm部分と内部の75％アセトン抽

し，10～30℃で24時間静置培養を行い，濁度によ

出物における吸収スペクトルを測定した。

り生育を評価した。いずれのCNSにおいても培地

6のpHが低下するほど，また温度が低下するほど

３．結果と考察3.1

濁度が小さくなり生育が抑制された。特にpH4.5
以下または培養温度10℃以下ではいずれの株におCNSのZnPP形成能の評価

無菌ZnPP形成モデル実験系を用いて，各種

いても濁度が低く，生育が著しく抑制された。大CNSのZnPP形成促進能を網羅的に評価した。市部分のCNSは20℃以上で増殖したが，MV株とSX

販スターターカルチャーより分離，同定した２株では15℃でも広いpHで増殖した。

株，分譲菌株５株を最長筋ホモジネートに添加し，５日間，嫌気的または好気的にインキュベー

3 . 3 CNS 添 加 ド ラ イ ソ ー セ ー ジ に お け る
ZnPP形成と色調改善効果

トし，ZnPP形成量を測定した。嫌気的条件下で3 . 3 . 1 表面および断面における色調

は，ポジティブコントロールのGB
（A）
-1株添加

ドライソーセージ表面における色調について

区は，細菌の無添加区やネガティブコントロール

は，乾燥熟成35日目においては，いずれのCNS添の抗生物質添加区と比べて有意にZnPP形成量が加区でも，発色剤区と同等あるいはそれ以上の赤高かったが，CNS添加区は無添加区や抗生物質添みが観察された。次に，断面における色調につい加区と同等であり，食肉内在性のZnPP形成を促ては，乾燥熟成35日目において，CNS添加区の内

進しないことが示唆された（Fig. 1A）。一方，好部は発色剤区のように鮮やかな色調を呈した。

気的条件下では，SC4，SC2，SC3，SE，SH，© The Ito Foundation

令和４年度Fluorescence intensity（Ex/Em：420/590 nm）

B

150

a

100

bc
bc

bc

bc

ab

ab

bc

c

50

c

0
150

a

a

a

a

a

a

a

SX

A

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

SH

16

100

b

50
b

b

SE

3

2

SC

4

SC

V

SC

M

-1

s

A)

G

B(

tic

io

tib

An

C

on

tro

l

0

Fig. 1 Effect of CNS on the formation of ZnPP in sterile pork homogenateVarious CNSs were added into sterile pork homogenate and then they were incubated at 25℃ and for 5 days under anaerobic（A）and aerobic（B）conditions. After extraction with 75％ acetone, the fluorescence intensity of these extracts were
measured. Bars: SEM（n=3）.abc：p＜0.05

3 . 3 . 2 断面におけるZnPP自家蛍光分に分け，それぞれのアセトン抽出物における吸乾燥熟成中のドライソーセージの断面における収スペクトルを測定した（Fig.２）。

ZnPP自家蛍光については，これまでの報告６～８）

内側部分について，発色剤区ではニトロシルヘと同様に，発色剤区ではZnPPによる自家蛍光は

ム特有の395nmの吸収ピークが観察され，ZnPP

全期間で観察されなかった。発色剤区を除くすべ

特有の417nmの吸収ピークは確認されなかったての試験区では，乾燥熟成14日目以降から強い（Fig. 2A）。一方で，無添加区およびCNS（MV，ZnPP自家蛍光が見られるようになり，14日目に

SC4，SC2，SC3，SE，SH，SX株）添加区では

おいてはSX株添加区で最も強い蛍光が断面全体

ZnPP特有の417nmの吸収ピークは観察されたが，で観察された。乾燥熟成35日目では，ほとんどのニトロシルヘムの吸収スペクトルは確認されな

CNS添加区では断面全体で無添加区よりやや強かった。いずれの可視部のＱ帯についても，ニト

いZnPP自家蛍光が見られたが，MV株添加区でロシルヘムまたはZnPP特有のスペクトルを示し

は，外側部分に蛍光の弱い部分が輪状に存在した。

た。

3 . 3 . 3 乾燥熟成35日目におけるアセトン抽出

外側部分についても，発色剤区ではニトロシル
ヘ ム 特 有 の 395nm の 吸 収 ピ ー ク が 観 察 さ れ ，物の吸収スペクトル
CNSによって形成された色素について乾燥熟

ZnPP固有の417nmの吸収ピークは確認されな成35日目のドライソーセージを内側部分と外側部

かった（Fig. 2B）。また，無添加区およびMV株© The Ito Foundation食用ブドウ球菌によるZnPP形成と食肉製品の色調改善効果に関する研究
A

17

0.5
Nitrite

Abs

0.4
0.3

MV

0.2
0.1
0
350
B

400

0.4

500

550

600

650

700

500

550

600

650

700

Nitrite

0.3
Abs

450

MV

0.2
0.1
0
350

400

450

Wavelength（nm）
Control

Nitrite

MV

SC4
SE

SC2
SH

SC3
SX

Fig. 2 Absorbance spectra of acetone extract of the interior（A）and peripheral（B）parts of dry sausages
The interior（A）and peripheral（B）parts excised from CNS-added dry sausages were extracted with 75％ acetone and theabsorbance spectra of the extracts were observed.

以外のCNS（SC4，SC2，SC3，SE，SH，SX株）含む製品全体の色調を改善することが明らかに添加区ではZnPP特有の417nmの吸収ピークが観な っ た 。一 方 ，MV 株 で は 好 気 的 条 件 下 で ，察されたが，ニトロシルヘムの吸収スペクトルは

ZnPPだけでなくニトロシルヘムの形成すること確認されなかった。一方，MV株添加区では，により，製品表面の色調を改善することが明らか

ZnPPで特徴的な417nm付近と，ニトロシルヘムになった。これまでの結果６，７）と同様に，発色剤のスペクトルで特徴的な395nm付近の２つのピーの添加はZnPPの形成を阻害することが示され，クが観察され，ZnPPおよびニトロシルヘム両方

これは硝酸塩，亜硝酸塩から発生する一酸化窒素の形成が示された。いずれの可視部のＱ帯についの作用によることが知られているが，MV株ではても，ニトロシルヘムおよびZnPP特有のスペク

ZnPPとニトロシルヘムの両方を産生することにトルを示していた。

より色調改善効果をもたらした。この原因を明ら

豚肉ホモジネートを用いたモデル実験系，ならかにすることができなかったが，ZnPPとニトロ

びにドライソーセージの結果より，CNSはニトロ

シルヘムの両面からの色調改善効果はより高い色

シルヘムを形成するのではなく，好気的条件下で調改善効果になる可能性があるだろう。

ZnPPの形成を促進することにより，表層部分を© The Ito Foundation

18
４．要

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ジの内部のアセトン抽出物ではZnPPの吸収スペ

約

クトルは認められたが，ニトロシルヘムのものは乾燥食肉製品のスターターカルチャーとして広観察されなかった。一方，MV添加区の外部ではく利用されるコアグラーゼ陰性Staphylococcus属

ZnPPだけでなくニトロシルヘムのピークも確認

細菌（CNS）による色調改善効果は，CNSが持つされた。以上より，スターターカルチャーとして

硝酸還元性によりニトロシルミオグロビン

CNS 添 加 し た 食 肉 製 品 に お い て ，MV 株 で は（NOMb）が形成促進されることであるとされて

ZnPP以外にニトロシルヘムを形成するが，多くいた。しかし，CNSが配合されたスターターカルのCNSではZnPPを形成することで製品表面の色

チャーを添加した発色剤無添加のサラミを製造し調を改善することが明らかとなった。

たところ，NOMbではなく赤色色素である亜鉛プ
ロトポルフィリンⅨ（ZnPP）の形成・蓄積が見られた。そこで本研究では，CNS添加による発色剤無添加の食肉製品の色調改善がZnPPによることを明らかにすることとした。豚肉ホモジネートを用いた無菌ZnPPモデル実験系では嫌気的条件
下でCNSは顕著なZnPP形成促進効果は見られなかったが，好気的条件下ではMV株を除くすべてのCNSで，高いZnPP形成促進効果が見られた。
生育特性では，いずれのCNSにおいても培地のpHが低下するほど，また温度が低下するほど生育が抑制された。特にpH4.5以下または培養温度10℃以上ではいずれの株においても生育が著しく抑制された。CNS添加ドライソーセージの表面の色調は発色剤添加区と同等の赤みを呈し，発色剤添加区と同等であった。CNS添加ドライソーセー

文献１） Wakamatsu, J., Nishimura, T., Hattori, A.：Meat
Sci., 67, 95～100, 2004.
 Wakamatsu, J.：Meat Sci., 192, 108905, 2022.
２）
３）
 De Maere, H., Chollet, S., De Brabanter, J.,
Michiels, C., Pealinck, H., Fraeye, I.：Meat Sci., 135,
46～53, 2018.
 Toldrá, F.：Meat Sci., 49, S101-S110, 1998.
４）
 Wakamatsu, J., Okui, J., Ikeda, Y., Nishimura, T.,
５）
Hattori, A.：Meat Sci., 68, 313～317, 2004.
６）
 Asaduzzaman, M., Ohya, M., Kumura, H.,
Hayakawa, T., Wakamatsu, J.：Meat Sci., 165,
108109, 2020.
７）
 Kauser-Ul-Alam, M., Toba, Y., Hioki, S.,
Hayakawa, T., Kumura, H., Wakamatsu, J.：Foods,
9, 1583, 2020.
 Wakamatsu, J. I., Kawazoe, H., Ohya, M.,
８）
Hayakawa, T., Kumura, H.：Meat Sci., 161, 107966,
2020.
９）
 Leroy, F., Verluyten, J., De Vuyst, L.：Int. J.
Food Microbiol., 106, 270～285, 2006.
 Morita, H., Niu, J., Sakata, R., Nagata, Y.：J. Food10）
Sci., 61, 1021～1023, 1996.

© The Ito Foundation

19

生理的に調節しうる濃度のカルノシンの添加は，鶏肉の匂いを改善するか？
Does the supplementation of carnosine at concentrations that can vary invivo improve the odor of chicken?

渡邊

源哉・石田

翔太・赤田

花林・本山

三知代・中島郁世・佐々木啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Genya Watanabe, Shota Ishida, Karin Akada, Michiyo Motoyama, Ikuyo Nakajima and Keisuke Sasaki（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

Odor is an important quality factor that directly affects the willingness to eat meat, and“oily odor” caused by lipid oxidation is a typical unpleasant odor of meat. Carnosine（Car）is anantioxidant peptide abundant in meat, but it is not known whether the supplementation of Car
in a physiologically adjustable concentration would inhibit the 2-thiobarbituric acid reactive
substances（TBARS）which is indicator of lipid oxidation and the unpleasant odor derived
from meat oxidation. Therefore, in this study, we demonstrated whether the supplementationof Car to chicken meat in a physiologically adjustable concentration affects meat qualityrelated factors such as TBARS and sensory odor after heating.
We analyzed the meat quality and odor of chicken meat containing without Car
supplementation and meat with 1.0（Car 1.0）, 2.5（Car 2.5）or 15（Car 15）mg/g meat of Car
supplementation. Of these, Car 1.0 and Car 2.5 are physiologically adjustable Car levels, andCar 15 is above physiologically adjustable level. Our results of analysis of variance showed that
Car supplementation significantly affected TBARS of cooked sample, pH, L＊ which is indicatorof lightness, and cooking loss. The results of multiple comparisons showed that the Car 15
significantly suppressed TBARS compared to chicken meat without Car supplementation. On
the other hand, there was no significant difference in TBARS between chicken meat without
Car supplementation and chicken meat with Car supplementation at physiologically adjustablelevels. Sensory evaluation showed that the intensity of “oily odor” in Car 15 tended to lower
than that of without Car supplementation group. However, there was no significant difference
in sensory odor between chicken meat without Car supplementation and chicken meat with
Car supplementation at physiologically adjustable levels.
In conclusion, we found that the supplementation of Car at physiologically adjustableconcentrations did not improve lipid oxidation and odor of chicken meat.

１．目

質評価要素であり，保存中の脂質の酸化によって的生じる「酸化臭」は食肉の代表的な不快臭であ「匂い」は食肉の喫食意欲に直結する重要な品る。こうした背景から，食肉の酸化抑制を目的と© The Ito Foundation

20

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

して，さまざまな抗酸化物質が利用されてきた。

meat（Car 15区）を添加した試料を調製し，生一方，食肉は本来，抗酸化機能を有するペプチド

理的濃度以上にCarを添加した試験区とした。こであるカルノシン（Car）を多く含有している。

れ ら の サ ン プ ル を 直 径 3.5cm × 高 さ 1.0cm の パ

脂質酸化とCarの関係はすでにいくつか報告があティに成形して食品用のドリップ吸水紙を敷いた

り，鶏肉のパティに対してCarを添加すると，脂秤量皿に乗せ，酸素透過性ラップで包装し，４℃

質過酸化の指標となるチオバルビツール酸反応性に設定した冷蔵庫において白色蛍光灯下で１，３

物質（TBARS）が抑制されることが知られていもしくは７日間保存した。肉質分析は各保存期間

る 。よって，食肉中のCar含量の違いは，脂質終了直後に実施した。官能評価に用いるサンプル

酸化の抑制を介して食肉の酸化臭を抑制する可能は，保存試験を終えた後に速やかに真空包装し，性がある。他方，これまでの食肉へのCarの添加

官能評価の前日まで－30℃で保存した。上記の試実験においては，添加量が動物の骨格筋中の生理

験は２回反復して行った。

１）

的濃度以上であり，動物の飼養条件等により生理

2.2

肉質分析

的に調節可能な濃度の範囲内でCarが変動した場

保存試験を終えたサンプルを180℃に設定した合に，TBARSの生成の抑制や酸化臭等の匂いのスチームコンベクションオーブンで５分間「焼違いが生じるか解明されていない。

き」調理し，加熱前と加熱後の重量の差と加熱前

そこで本研究では，脂質の酸化速度が速く，酸のサンプルの重量の比から加熱損失を算出した。

化臭が発生しやすいとされる鶏肉を対象とし，ニ続いて，加熱前サンプルと前述の加熱後サンプル

ワトリの骨格筋の生理的な濃度の範囲内でCarをのそれぞれについてMitsumotoら（1993）の方

添加，保存し，加熱後の匂いに違いがあるか解明

法４）を一部改変し，比色定量法によりTBARSをすることを目的とした。

測定した。

２．方
2.1

保存試験を終えたサンプルに突き刺し測定用

法

pHガラス電極を差し込み，pHを測定した。測定

鶏肉サンプルの調製は測定箇所を変えて３回実施し，平均値を測定値

市販のブロイラーの丸鶏４羽分よりムネ肉およとした。

びモモ肉を採取し，それぞれをひき肉に調製し保存試験を終えたサンプル表面の色を色彩色差た 。ブ ロ イ ラ ー の ム ネ 肉 に Car は 1.5-2.5mg/g計で測定した。測定条件は，測定径８mm，観察

meat程度含まれ２，３），ムネ肉のCarの含量はCarの光源Ｄ65および10°視野とし，L＊値，a＊値および基質であるヒスチジンの飼料添加により「１mg/b＊ 値を測定箇所を変えて３回測定し，平均値を

g meat」程度２），飼料中のヒスチジン：リジン比

それぞれの測定値とした。

の調節により「2.5mg/g meat」程度

３）

増加する

2.3

匂いの官能評価

ことが報告されている。そこで，生理的に調節し2 . 1において調製した凍結サンプルを評価前日

うる濃度の範囲でCarを添加した試験区として，に４℃に設定した冷蔵庫で一晩解凍し，180℃に

前述のひき肉にCarを1.0mg/g meat（Car 1.0区）

設定したオーブンで５分間加熱した。加熱後のサおよび2.5mg/g meat（Car 2.5区）添加した試料

ンプルを一辺１cmの立方体に調製して共栓付三をそれぞれ調製した。また，既報１）において鶏肉

角フラスコに入れ，栓をした状態で評価開始までのTBARSの抑制が報告されているCar 15mg/g

40℃で保存した。評価は12名の分析型パネルを用© The Ito Foundation

21

生理的に調節しうる濃度のカルノシンの添加は，鶏肉の匂いを改善するか？

いて，気温22℃，湿度50％となるように設定した

保存期間の交互作用，カルノシン添加量と部位の評価室の個別ブースにおいて，赤色照明下で実施

交互作用，保存期間と部位の交互作用，カルノシ

した。パネリストは栓を開けて匂いを嗅ぎ，「脂ンと保存期間と部位の交互作用を固定効果とした

臭い・酸化臭」，「腐敗臭・アミン臭」，「生臭い」

混合モデルで分析した。匂いの官能評価の結果

および「鶏肉らしいにおい」の４項目について，は，パネリストの個人差を変量効果，カルノシン

150mmのラインスケールを用いて回答した。評

添加量，保存期間，部位，サンプルの評価順序，

価は40℃に設定したシリコンラバーヒーターでフ官能評価実施セッション，カルノシン添加量と熟ラスコを温めながら実施させた。サンプルの評価

成の交互作用，カルノシン添加量と部位の交互作

順序はラテン方格法を用いて無作為化した。な

用，保存期間と部位の交互作用，カルノシンと保お，本研究においては，サンプルが24種類と多く存期間と部位の交互作用を固定効果とした混合モ

負荷が大きいことから，２回のセッションに分けデ ル で 分 析 し た 。上 記 の 分 析 は い ず れ も Ｒ のて評価を実施した。

lmerTestパッケージのlmer関数を用いて行った６）。

2.4

加熱サンプルの揮発成分分析

カルノシン添加量，保存期間および部位ごとの測

匂いの官能評価に用いた加熱後サンプルの一部

定値の最小二乗平均値はemmeansパッケージにを用いて揮発成分分析を行った。具体的には，加含まれるemmeans関数により計算し７），差の検定

熱後サンプル１ｇを内蓋付きバイアルに秤量し，はmultcompパッケージに含まれるcld関数を用い内部標準として2-ヘプタノンを添加した。これをたSidakの補正により実施した８）。

60℃で５分間予備加熱した後，固相マイクロ抽出
ファイバーを用いて，10分間，ヘッドスペースの３．結果と考察揮 発 成 分 を 濃 縮 し た 。濃 縮 し た 揮 発 成 分 は

3.1

Mariuttiら（2009）の分析条件を用いて，ガス

肉質分析の分散分析の結果をTable１に示す。

クロマトグラフ質量分析計によりScanモードでCarの添加量は，加熱後サンプルのTBARSに有分析し，得られたピークはマススペクトルライブ

意に影響を及ぼした。差の検定から，Car無添加

ラリーを用いてアノテーションを行った。

区とCar 1.0区に対してCar 15区の加熱後サンプ

2.5

５）

肉質分析

ルのTBARSが有意に低下したが，Car無添加区

統計解析

肉質分析の結果は，反復を変量効果，カルノシと Car 1.0 区 お よ び Car 2.5 区 の 間 に 有 意 差 は な

ン添加量，保存期間，部位，カルノシン添加量とかった（データ示さず）。よって，Carの添加はTable 1 Results of analysis of variance for physicochemical analysis in chicken meat
pH

L＊

a＊

b＊

Cooking loss

Carnosine

＊＊＊

＊＊＊

N.S

N.S

＊

N.S

＊

Storage days
Part
Carnosine×Storage days
Carnosine×Part
Storage days×Part
Carnosine×Storage days×Part

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊

†

＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

N.S

N.S
N.S
N.S
N.S

N.S

N.S
N.S
N.S
N.S

＊

N.S

†
N.S
N.S

＊

N.S
N.S
N.S
N.S

＊

N.S
N.S

＊＊＊

N.S
N.S

＊＊＊p<0.001；＊＊p<0.01；＊p<0.05；†p<0.10；N.S.: p>0.10© The Ito Foundation

TBARS（raw） TBARS（cooked）

N.S
N.S

22

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

生理的な濃度の範囲内においてはTBARSに影響から，Car添加の肉質特性への影響はムネ肉とモしないと考えられた。また，pH，L 値および加モ肉の間に大きな違いはないと考えられた。

＊

熱損失に対してCarの添加量が有意に影響を及ぼ3.2

した。このうち，pHはCarの添加量の増加に伴い匂いの官能評価の分散分析の結果をTable２に段階的に上昇し，L 値は逆に段階的に低下した示す。Carの添加量は，「脂臭い・酸化臭」のみ（データ示さず）。一般的に食肉のpHとL 値にはに有意に影響した。差の検定においては，Car 15

負の相関があるとされることから，Carの添加に区の「脂臭い・酸化臭」がCar 2.5区に対して有よりpHの上昇が生じ，L 値の低下を引き起こし

意に低く，Carの添加により酸化臭が抑制できるたものと考えられた。

可能性が示唆された（データ示さず）。他方で，

＊

＊

＊

匂いの官能評価

保存期間は，加熱前サンプルのTBARS以外のCar無添加区とCar 1.0区およびCar 2.5区の間に有すべての分析項目において有意に影響を及ぼし意な違いはなく（データ示さず），生理的な濃度た。一方，Car添加量と保存期間の交互作用は加の範囲内におけるCarの添加は，匂いに影響を及

熱損失以外では認められず，特定の保存期間におぼさないと考えられた。
保存期間もまた「脂臭い・酸化臭」に有意に影いてCarが肉質に特異的に影響することはないと響した。一方，すべての匂いにおいて，Car添加考えられた。
部位の違いはすべての分析項目に有意な違いを

量と保存期間に有意な交互作用はなく，特定の保もたらした。また，pH，a 値および加熱前サン

存期間においてCarが匂いに特異的に影響するこ

プルのTBARSにCar添加量と部位の有意な交互とはないと考えられた。

＊

作用が認められた。差の検定の結果から，これら部位はいずれの匂いにおいても有意な影響はなの項目はムネ肉においてはCarの添加による濃度

く，カルノシン添加量との交互作用も認められな依存的な増加もしくは低下が認められたのに対しかった。よって，Carが匂いに及ぼす影響はムネて，モモ肉では部分的に濃度依存的に変動してい肉とモモ肉の間で違いはないと考えられた。

ないことが理由と考えられた（データ示さず）。

3.3

加熱サンプルの揮発成分分析

他方，Carの添加により各分析項目の値が増加す

揮発成分分析の結果，エタノール，ペンタナー

るか減少するかはムネ肉とモモ肉で一致したこと

ル，ヘキサナール，ノナナール，7-オクテン-4-

Table 2 Results of analysis of variance for odor sensory evaluation in cooked chicken meat
Descriptors
Oily

Amine

Fishy

Chicken like

Carnosine＊

Storage days
Part

＊＊＊

N.S.
N.S.
N.S.

N.S.
†
N.S.

N.S.
N.S.
N.S.

Testing order＊＊＊＊

SessionCarnosine×Storage days
Carnosine×Part
Storage days×Part
Carnosine×Storage days×Part

＊

N.S.
N.S.
N.S.
N.S.
N.S.

N.S.
N.S.
N.S.
N.S.
N.S.
N.S.

N.S.
N.S.
N.S.
N.S.
N.S.

N.S.

†
N.S.
N.S.
N.S.

＊＊＊：p<0.001；＊＊：p<0.01；＊：p<0.05；†p<0.10；N.S.: p>0.10© The Ito Foundation

＊＊

23

生理的に調節しうる濃度のカルノシンの添加は，鶏肉の匂いを改善するか？
Hexanal(a)

14000000

14000000

12000000

12000000

10000000
8000000

2-Heptanone(internal standard)

6000000

6000000
4000000
2000000

10

20
Minute30

2-Heptanone(internal standard)

8000000

2000000

0

Hexanal

10000000

40000000(b)16000000

Intensity

Intensity

16000000

40

0

0

10

20
Minute30

40Fig. 1 Chromatograms of volatile component analysis in chicken thigh meat.（a）without Car supplementation, thighmeat, 1 day,（b）Car 15 mg/g meat supplementation, thigh meat, 1 day.

オン，1-ヘキサノール-2エチル，ベンズアルデヒた。結果として，生理的な濃度以上のCar添加にド，ジヒドロ-2（3H）-フラノンおよびプロパン酸

より，無添加区に比較してTBARSが抑制される-2-メチル-3-ヒドロキシ-2, 2, 4-トリメチルペン

とともに，「脂臭い・酸化臭」が抑制される傾向

チルエステルがサンプルに共通して検出された。

を示したが，Car無添加区と生理的に調節可能な

Fig.１にCar無添加，保存期間１日のモモ肉のク濃度のCarを添加した試験区のTBARSおよび匂ロマトグラムとCar 15区，保存期間１日のモモ肉

いの強度に有意な違いはなかった。よって，生理のクロマトグラムを示す。両者の揮発成分のピー的に調節可能な濃度の範囲においては，Carの添

ク面積を内部標準の面積で補正して比較すると，

加は匂いを改善しないことが明らかとなった。

Car無添加に比較して，Car 15区でヘキサナール
等の揮発成分が低下していた（データ示さず）。
しかし，本研究では揮発成分の反復分析を実施できなかったことから，今後，測定を反復してCar
添加による揮発成分の違いと匂いの評価結果の関係について解析する必要がある。
４．要

約

Carは食肉に多く含まれる抗酸化ペプチドであるが，生理的に調節可能な濃度の範囲におけるCarの添加がTBARSの生成や不快な匂いを抑制
するかは不明であった。そこで本研究では鶏肉に対して生理的に調節可能な濃度の範囲でCarを添加して保存試験を行い，TBARS等の肉質関連因子の分析および加熱後の匂いの官能評価を実施し

文献１）
 O’Neill, L. M., Galvin, K., Morrissey, P. A.,
Buckley, D. J.：Meat Sci, 52, 89～94, 2001.
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Fujimura, S.：Anim Sci J, 86, 541～546, 2015.
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Cassens, R. G.：J Anim Sci, 71, 1812～1816, 1993.
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Herve, M., Jung, M., Love, J., Miguez, F., Riebl, H.,
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８）
 Hothorn, T., Bretz, F., Westfall, P.：Biom J, 50,
346～363, 2008.

© The Ito Foundation

24

工業型畜産の課題解決に向けた培養肉の生産技術開発
Development of cultured meat technology to solve the problems inindustrial livestock production

岡

村

大

治

（近畿大学農学部）

Daiji Okamura（Graduate School of Agriculture, Kindai University）

To produce muscle fibers for cultured meat on a large scale, it is important to expand
myoblasts in a serum-reduced or serum-free medium to avoid cost, ethical, and environmental
issues. Myoblasts such as C2C12 cells differentiate quickly into myotubes and lose their ability
to proliferate when the serum-rich medium is replaced with a serum-reduced medium. This
study demonstrates that Methyl-β-cyclodextrin（MβCD）, a starch-derived agent that
depletes cholesterol, can inhibit further differentiation of myoblasts at the MyoD-positive stage
by reducing plasma membrane cholesterol on C2C12 cells and primary cultured chick muscle
cells. Furthermore, MβCD efficiently blocks cholesterol-dependent apoptotic cell death ofmyoblasts, which is one of the mechanisms by which it inhibits the differentiation of C2C12
myoblast cells, as dead cells of myoblast are necessary for the fusion of adjacent myoblasts
during the differentiation process into myotubes. Importantly, MβCD maintains theproliferative capacity of myoblasts only under differentiation conditions with a serum-reduced
medium, suggesting that its mitogenic effect is due to its inhibitory effect on myoblast
differentiation into myotube. In conclusion, this study provides significant insights into ensuring
the proliferative capacity of myoblasts in a future serum-free condition for cultured meatproduction.

１．目

り，持続可能な開発目標（SDGs）を達成するう

的えでいくつかの課題に直面している。その課題と本研究は「培養肉」実現に向け，高価なウシ血は，水や穀物の過剰消費，飼育スペース確保のた清や成長因子と呼ばれるタンパク質の添加に依存

めの森林伐採，家畜の排泄物による水質汚染など

せず，筋肉細胞を増幅する培養システムを構築すである。また，家畜の排泄物や牛のげっぷのメタることを目指すものである。また以下の研究内容は，

ン発酵による大量のメタンガスの放出は，地球温国際科学誌「Frontiers in Cell and Developmental

暖化に悪影響を及ぼすとされている。これらの課

Biology」に掲載受理されたものである１）。

題に対し，特に今後予想される人口増加を考慮

現在の食肉システムは工業的畜産に依存しておし，持続可能な食肉生産システムの確立が急務と© The Ito Foundation

工業型畜産の課題解決に向けた培養肉の生産技術開発なっている。植物性タンパク質を原料とする「グ25MβCDを３mMになるように加えた。

リーンミート」や，家畜の筋肉細胞を培養・組織

2.2

化した「培養肉」は，その解決策として期待され10日齢のニワトリ胚を材料にし，大腿骨を外科ている。しかし，培養肉は工業的畜産が抱える問的に除去し分離した大腿筋組織を２mg/mlのコ

題を解決する可能性があるにもかかわらず，社会ラゲナーゼⅡ型で37℃，40～60分間，細胞の剥離実装の面でいくつかの課題を抱えている。

に応じて10～15分ごとにピペットしながら消化さ

ニワトリ胚性筋芽細胞細胞の初代培養

筋肉細胞やがん細胞などの動物細胞を培養液中せた。解離した筋芽細胞を40μmのセルストレー

で効率よく増殖させるためには，ウシ胎児血清やナーに通して単細胞懸濁し，DF10培地で播種。

組み換えタンパク質を培養液に補充する必要があ

翌日，MβCDを添加したDH2培地に変更して分り，コストがかかるという課題が残されている。

化誘導をかけた。

培養肉生産の目的は，家畜への依存を減らし，家2.3

畜による環境破壊を軽減することであるが，その筋管細胞の分化状態を検出するため，筋管細胞生産にウシ胎児血清を使用することは，この目的

特異的なタンパク質MHC（Myosin Heavy Chain）と矛盾している。筋細胞の増殖を促進するために対する抗体（R&D Systems，MAB4470）を用に，FGF-2，EGF，IGF-1などの成長因子を加えいて，蛍光免疫染色を行った。また，筋肉細胞のた無血清培地が開発されているが，培養肉を大規増殖やアポトーシス状態を検出するため，抗リン模に生産するには，無血清や低血清条件だけでな

酸 化 ヒ ス ト ン H3 抗 体（C-2）（Santa Cruz, sc-

く，コストの主要因である成長因子に依存しない

374669）と抗活性型カスパーゼ３抗体（Asp175）

培養技術が必要である。現在までに，この目的を（5A1E）（Cell Signaling Technology, #9664） を達成した技術報告はない。

用い，観察は蛍光顕微鏡BZ-X710（キーエンス）

本研究では上記課題の解決を目的として，デン
プン由来の環状オリゴ糖であるメチルβシクロデ
キストリン（以下，ＭβCD）に着目し，C2C12筋芽細胞の低血清培地での分化抑制と増殖促進効
果について詳細な解析を行った。
２．方
2.1

蛍光免疫染色で行った。
３．結果と考察
筋芽細胞の分化を抑制するために，MβCDを候補成分として検証した。MβCDは食品添加物
でありながら，細胞のコレステロール除去効果が法

非常に大きい物質として知られている。低血清条

C2C12細胞の増殖および分化誘導

件下で培養するC2C12細胞にMβCDを添加する

不死化マウス筋芽細胞株であるC2C12細胞をと，分化した筋管の特徴である伸長細胞の出現が10％ウシ胎児血清およびDMEM培地からなる

著しく減少した。MβCDが筋管細胞への分化に「DF10」培地で増殖培養をした。C2C12細胞は低与える影響を調べるため，主要な分化マーカーで血清条件下において筋管細胞へ分化誘導できる。

あるMHCタンパクの発現を評価したところ，

分化誘導のために，まずはDF10培地で播種し，MβCDを含む条件で培養した細胞ではMHC陽性

播種から２-３日後，細胞のコンフルエントが90-

細胞数が著しく減少し，さらにはMHC陽性細胞

100％に達した時点で培地を２％ウマ血清含有においてもその核数が有意に減少していた。低血DMEM 培 地 の「DH2」培 地 に 変 更 し た 。適 宜

清条件下でMβCDはC2C12細胞の筋管分化を効© The Ito Foundation

26

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

果的に阻害することが示された（Fig.１）。

証した。これらの結果は，MβCDがアポトーシ

アポトーシス細胞死は，隣接する細胞との接触

ス細胞死を効果的に遮断し，コレステロールがそ依存的なシグナル伝達を通じて，分化した筋芽細れを有意に回復させることを示唆していた。さら胞同士の融合を促す役割を果たすことが報告されに，コレステロール単独では，活性型カスパーゼている 。MβCDを用いた筋管分化の観察では，３陽性細胞が有意に誘導された。このように，

低血清培地条件下で起こる筋芽細胞の細胞死が，MβCDによるコレステロールの枯渇によって引

MβCD含有条件下では著しく減少していること

き起こされるC2C12筋芽細胞の分化過程におけるを発見した。このことから，MβCDによる細胞

アポトーシス細胞死の遮断は，アポトーシスによ内コレステロールの枯渇は，コレステロール依存る死細胞が筋芽細胞融合を誘導することによって性のアポトーシス細胞死の誘導を強力にブロック

隣接する筋芽細胞の筋管への分化を促すため，し，筋芽細胞の融合を障害し，結果として筋管分MβCDがC2C12細胞の筋管分化を阻害するメカ化を阻害する可能性があると考えた。我々は，ア

ニズムの一つと考えられる（Fig.１）。

２）

ポトーシスマーカーである活性型カスパーゼ３タ

RNAシーケンス解析により，MβCDを投与しンパクを検出することでアポトーシス細胞死を検た細胞では，コントロールと比較して細胞周期関Culture medium condition

Level of membrane cholesterol

10% FBS（DF10）

2% Horse Serum（DH2）
Arrest ofproliferation

FusionMyotube（di-nucleated）+ MβCD

Inhibition of
diﬀerentiation

Myotube（multi-nucleated）
Proliferation

Myoblast

MβCD

Myoblast

Apoptosis

Cholesterol
Fig. 1 Schematic illustrating summarizing that inhibition of myoblast differentiation into myotube with MβCD ensuresproliferation of myogenic cells in serum-reduced culture conditions.
MβCD is a potent inhibitor of myoblast differentiation into myotubes by reducing cellular cholesterol levels inmyoblasts. This enables the continuous proliferation of myoblasts even under serum-depleted conditions. Bylowering cellular cholesterol levels, MβCD inhibits apoptotic cell death, which is necessary for myogenic
differentiation, and this is one of the effective mechanisms by which MβCD functions as a myoblast differentiation
inhibitor under serum-reduced conditions.

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工業型畜産の課題解決に向けた培養肉の生産技術開発

27

連遺伝子の発現が高いことが確認された。そこにより筋細胞の分化を抑制し，増殖能を維持でき

で ，低 血 清 条 件 下 で の 細 胞 増 殖 能 力 に 対 す るることを示した本研究の結果は，筋芽細胞が分化

MβCDの効果を調べた。低血清条件下で３日間して増殖を停止してしまう無血清および低血清条細胞を増殖させたところ，細胞数の相対値だけで件下での培養肉生産において重要な洞察を与えなく，有糸分裂マーカーであるリン酸化ヒストンる。この結果は培養肉実現への第一歩としてでは

H3陽性細胞の頻度が，MβCD処理条件ではコンあるが，食品添加物を用いて筋芽細胞の分化を抑トロールと比較して有意に増加することが確認さ制することが，ウシ血清に依存しない筋肉細胞のれた。C2C12筋芽細胞に対するMβCDの増殖促

増殖技術実現への有効なアプローチとなり得ると進効果は低血清条件下でのみ観察され，高血清条

いう我々の主張を強く支持するものである。

件下では観察されなかったことから，C2C12筋芽細胞に対するMβCDの増殖促進効果は，筋芽細４．要

約胞の細胞増殖を直接促進するのではなく，筋管へ

培養肉用の筋繊維を大規模に生産するためにの分化に対する抑制効果によるものであることをは，コストや倫理的，環境的な問題を回避するた

強く支持している（Fig.１）。

めに，筋芽細胞を血清低減培地または無血清培地

培養肉生産におけるMβCDの有効性を検証すで増殖させることが重要である。C2C12細胞などるためには，畜産動物におけるMβCDの効果をの筋芽細胞は，血清の多い培地を血清の少ない培

調べることが重要である。これまでの研究でニワ地に交換すると，筋管に速やかに分化し，増殖能

トリ筋芽細胞の初代培養細胞をMβCDで30分間力を失う。本研究では，コレステロールを奪うデ短期処理すると，筋芽細胞の増殖が促進されるこンプン由来の薬剤であるメチルβシクロデキストとが示されているが ，その増殖や分化抑制など

リ ン （Methyl-β-cyclodextrin/MβCD） が ，の長期的な効果については確立されていない。そC2C12細胞やニワトリ初代培養筋肉細胞の細胞膜

こで我々はニワトリ筋芽細胞の初代培養を用いコレステロールを減少させ，筋芽細胞のさらなるて ，前 述 の C2C12 筋 芽 細 胞 で 見 ら れ た よ う な

分化を抑制することを実証した。さらに，MβCD

MβCDの分化抑制効果と増殖促進を評価した。

は，コレステロール依存性の筋芽細胞のアポトー

ニワトリ大腿筋細胞は，10日齢のニワトリ胚からシス細胞死を効率的にブロックする。これは，採取し，低血清条件下で筋管の分化と細胞増殖に

C2C12筋芽細胞の分化を阻害するメカニズムの一

対するMβCDの効果を評価したところ，MβCDつであり，筋芽細胞の死細胞は，筋管への分化過の添加によりMHC陽性筋管の成熟が阻害され，程で隣接する筋芽細胞の融合に必要であるため，細胞あたりの核の数が著しく減少した。さらにリMβCDは筋管への分化を阻害する。重要なこと

ン酸化ヒストンH3陽性細胞の増加によって，筋は，MβCDが筋芽細胞の増殖能を維持するのは，芽細胞の増殖促進効果も実証されたことから，

血清低減培地を用いた分化条件下のみであること

MβCDは動物種を越えて，筋肉細胞の分化抑制とで，その分裂促進作用は，筋芽細胞の筋管への分増殖促進効果を発揮することが分かった（Fig.１）。

化を抑制する作用に起因することが示唆された。

無血清培地を用いた安全で費用対効果の高い筋

以上のことから，本研究は，将来の培養肉製造に

肉細胞の培養法の確立は，培養肉の将来的な商業おける無血清条件下での筋芽細胞の増殖能の確保

的・社会的確立に不可欠である。ＭβCDの使用について，重要な知見を与えるものである。

３）© The Ito Foundation

28

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

文献１） Katayama, T., Chigi, Y., Okamura, D.：The
ensured proliferative capacity of myoblast inserum-reduced conditions with Methyl-β-cyclodextrin, Front. Cell Dev. Biol., in press.
２） Hochreiter-Hufford, A. E., Lee, C. S., Kinchen, J.
M., Sokolowski, J. D., Arandjelovic, S., Call, J. A., etal.：Phosphatidylserine receptor BAI1 andapoptotic cells as new promoters of myoblast
fusion, Nature, 497（7448）,263～267, 2013.
３） Portilho, D. M., Soares, C. P., Morrot, A., Thiago, L.
S., Butler-Browne, G., Savino, W., et al.：Cholesterol
depletion by methyl-β-cyclodextrin enhances cellproliferation and increases the number of desminpositive cells in myoblast cultures, Eur J
Pharmacol, 694（1-3）,1～12, 2012.

© The Ito Foundation

29

乾燥熟成牛肉より分離された真菌の生理特性およびその利用に関する研究
Studies on physiological characteristics of fungi isolated from dry aged
beef and its utilization

中川

麻衣・小室

春菜・中島

誠人・猪口

由美・高鳥

浩介＊

（一般社団法人食肉科学技術研究所，＊NPO法人カビ相談センター）

Mai Nakagawa, Haruna Komuro, Yoshito Nakashima, Yumi Inoguchi and Kosuke Takatori＊（Japan Meat Science & Technology Institute, ＊Center for Fungal Consultation Japan）

In this study, it was to determine how the physiological characteristics of fungi affecting
the aroma of dry-aged beef affect the conditions under which the aroma develops, and how
these characteristics can be used as indicators during production.
Thamnidium elegans and Mucor strictus were found to develop even in vacuum packaging
with low oxygen content. To inhibit the growth of these fungi after shipment, temperature
control at around 0℃ in combination with oxygen absorbers and packaging materials with low
oxygen permeability were found to be effective for long-term storage.
In tests to confirm protein assimilation capacity, it showed higher protein assimilation
capacity compared to lipids. However, the nut odor produced by M. strictus did not occur inthe protein-assimilatory medium, but in the lipid-assimilatory medium, where growth was
slower. This suggests that not only the presence of the fungus but also the substrate andnutrient source on which the fungus grows are strongly related to the generation of the aroma.
In summary, our results suggest that dry aging imparts an aging aroma to meat throughthe combined involvement of two species of fungi, which prevent the invasion of othermicroorganisms, while M. strictus degrades lipids. The study also found that unexpected
invasion of fungi during distribution could be controlled by a combination of temperature
control and packaging. If the propagation of fungi could be adjusted by fine-tuning thetemperature conditions, it would be possible to shorten the ripening period and consider theintensity of the aroma.

１．目

成の方法によって食肉の呈味や香味に多様性がも的たらされることから冷蔵庫内の温度・湿度を一定

食肉の熟成による効果として，軟化，呈味の向に保ち，さらに庫内の空気を循環させた条件下で上，独特の香りの発現などがあり，これらは食肉

食肉を熟成させる乾燥熟成（ドライエイジング）

内在性の酵素による遊離のアミノ酸やペプチドのと呼ばれる熟成方法が国内でも盛んとなってい増加の寄与が明らかにされているる。乾燥熟成環境下では真菌を利用することがあ

。また，熟

１，２）

© The Ito Foundation

30

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

り，この手法によって生成される熟成香の分析にス ト ロ ー ス 寒 天 培 地（以 下「PDA 培 地」と すついての報告 が中心であり，真菌が熟成にどのる）に 塗 抹 し た 。得 ら れ た コ ロ ニ ー を 新 た なように影響を与えているかについての報告はこれ

PDA 培 地 に 接 種 し 培 養 す る 操 作 を 繰 り 返 し ，まで少なかった。そこで我々は経験則的に行われThamnidium elegansとMucor strictusの２種を分てきた熟成中の真菌利用には熟成香の生成となん離し試験に供した。

３）

らかの明確な因果関係があると考え，乾燥熟成の2.2

包装条件比較試験

手法を用いた熟成肉から得られるナッツ臭と称さ脱酸素剤は冷蔵条件下で使用できるエージレス

れる特有の芳香と真菌の関係について調査を行っ

S100タイプ（三菱瓦斯化学株式会社製造），フィた。その結果，平成31年度（2019年度）食肉に関

ルム袋はエスラップAL 150mm×250mm（スターする助成研究において，熟成肉に付着した真菌がプラスチック工業株式会社製造）を用いた。

香気を産生し熟成肉に特有の芳香を付与している

PDA培地，Cz寒天培地にCaCl2・H2Ｏとクロラ可能性が高いことを確認した。この特有の芳香はムフェニコール（50ppm）を添加し加圧滅菌後，一般的な真菌の発育至適環境下にない時に出現す

Tween20を添加し平板としたものを「リパーゼる点が大きな特徴であり，乾燥熟成肉特有の熟成

産生用培地」，寒天培地にSkim Milkとクロラム

香の発生機序および真菌の香気生成に関するメカフェニコール（50ppm）を添加し加圧滅菌後平ニズムの一端を明らかにすることができた 。し板にしたものを「プロテアーゼ産生用培地」とかしながら，その発生機序の全容解明には至らな

し，それぞれの培地に2.1で得られた２種の真菌かった。本研究の目的は，熟成肉特有の香気生成を接種した後，次の１）～４）に示す包装条件とに関与している可能性が高い真菌の生理特性を調

異なる温度条件（０℃，４℃，10℃）で20日間ま査し，香気の発生機序を解明することにある。

で培養を行った。

４）

また，乾燥熟成牛肉（ドライエイジングビー
フ）を取り扱う場合に意図せず環境に真菌を飛散

１）含気包装（空気）フィルム袋にシーラーを用いて簡易的に包装しさせる恐れがあるため，トリミング後の乾燥熟成た。

牛肉や，それ以外の製品を汚染するリスクがあ

２）真空包装（低酸素包装）

る。そのため，これまで乾燥熟成法の前提条件とフィルム袋に真空機を用いて80％設定で包装しされていた温度条件の他に酸素濃度の違いによるた。

発育条件についても検討することとした。本研究

３）脱酸素剤パック

では発育環境条件の調査に加えて，発育する基質の栄養源等による香気産生の違いを確認し，真菌

脱酸素剤とともにフィルム袋に密閉した。
４）対照（包装なし）の香気生成条件を特定して，熟成適期の指標を提2.3

示しようとするものである。

牛脂身部分をオートクレーブ滅菌（121℃15分）

２．方
2.1

資化性試験

し，得られた油脂溶解液を60℃のインキュベータ

法に１時間ほど入れ水分を蒸発させたものをPDA培地に重層し脂質資化用培地，また牛赤身肉を供試菌株

乾燥熟成牛肉に発育していた真菌を採取しクロ100℃で60分加熱後の抽出液を10％濃度でPDA培

ラ ム フ ェ ニ コ ー ル（50ppm）添 加 ポ テ ト デ キ

地に添加したものをたんぱく質資化用培地とし© The Ito Foundation

31

乾燥熟成牛肉より分離された真菌の生理特性およびその利用に関する研究た。対照はPDA培地とした。それぞれの培地に2.1た真菌の性状確認と形態観察を行い生理学的性質で得られた２種の真菌を接種した後，４℃で40日

よりT. elegansとM. strictusと同定した。２種の間まで培養を行い５日ごとに経過を確認した。

真菌は多くの真菌が発育至適温度帯とする25℃では発育せず20℃以下が発育至適温度帯であった。

３．結果と考察
3.1

3.2

供試菌株の分離

包装条件比較試験

結果をTable１，Fig.１，Fig.２に示す。PDA培

乾燥熟成牛肉より得られた真菌をPDA培地に地における０℃，５日間の条件では，すべての包接種し培養する操作を繰り返し分離した。得られ装形態で発育が見られなかったが，４℃およびTable１ Changes in growth during incubation,
PDA
0℃

4℃

Proteolytic activity
10℃

0℃

5d 20d 5d 20d 5d 20dMucor strictus

Thamnidium
elegans

Air packaging

4℃

Lipolytic activity

10℃

5d 20d 5d 20d 5d 20d

0℃

4℃

10℃

5d 20d 5d 20d 5d 20d-+± ++ + ++

-

±

-

+

-

++

-

±

-

+

-

+

Vacuum packaging（Low oxgen concentration） -+± ++ + ++

-

±

-

+

-

++

-

±

-

+

-

+

Oxygen absorber
Non-packaging-- - - - ++ + ++ + +++ ++ + ++ + ++

-

±

-

+

-

+

Air packaging

-

+

-

++ + ++

-

+

-

+

-

++

-

±

-

±

-

±

Vacuum packaging（Low oxgen concentration）
Oxygen absorber
Non-packaging
-

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+ ++ + ++ + ++

-

±

-

+

-

+

-

++

- - + - +++ + ++ + ++－，no growth；±，slightly growth；+，growth；++，well growthFig. 1 PDA after 20 days of Mucor, I ncubation temperature （A）0 ℃ ,（B）4 ℃ and（C）10℃ Packing （1） Oxygen absorber, （2） Vacuum（Low oxygen）and（3）Air

Fig. 2 Proteolytic activity and lipase activity after 20days of Mucor,Incubation temperature （A）0 ℃ ,（B）4 ℃ ,（C）10℃

© The Ito Foundation

32

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

10℃，５日間では真空包装でわずかに発育，含気んでいった。しかしながら，リパーゼ培地上では

包装では発育しており，対照としたPDA培地で含気包装においてもコロニーの発育が悪く，酵素の発育速度と差がなかった。

反応も弱かったため酸素量に加えて低温環境下もまた，脱酸素剤を用いた包装条件下では，T.

発育阻害に有効と言える。M. strictusにおいてもelegansは長期間の培養で発育が確認された。しプロテアーゼ培地と比較するとリパーゼ培地ではかしながらM. strictusでは20日経過後まで発育が発育が遅い結果となった。これらのことにより低抑制された。この結果から，熟成肉より分離され温環境下において酸素を遮断することで食肉中でた低温性真菌は，短期間であれば低温環境下で酸の真菌の発育を阻害するとともに，乾燥熟成牛肉

素を遮断することにより発育を抑制でき，脱酸素の品質特性に影響し得る酵素反応も著しく低下す剤を用いることでさらに長い期間発育を抑制できることが推定された。

ることが示された。今回の結果より，真菌の発育3.3を抑制するためには酸素透過率の低い包材に加え資化性とは，微生物がある物質を栄養源としてて脱酸素剤を用いることが重要であった。加えて利用し，発育できる性質を指す。本研究では乾燥

保管温度を可能な限り０℃付近までの低温とする

熟成の原料肉に用いられることの多い牛肉を使用ことで真菌の発育をさらに制御することが可能とし，基質培地に栄養源として赤身部分と脂質部分なる。

をそれぞれ添加し，真菌の発育の違いを確認し多くの真菌は酸素要求度が高いと報告されてい資化性試験た。結果をTable２に示す。

るが ，今回得られた結果からも２種の真菌は酸T. elegansを接種したたんぱく質資化用培地は素環境下でよく発育することが確認された。また，

４℃，５日培養後にコロニーを形成し始め10日培

今回対象とした真菌は低温環境下で発育するとい

養後には発育が明確に確認できた。対照のPDA

う特性上，一般的な真菌が発育し難いと思われる培地と比較すると発育速度がかなり速いことが示環境下でも発育が確認された。温度条件が低いほされた。一方，脂質資化用培地は，５日培養後にど真菌の発育には時間を要するため，熟成肉をト

コロニーの形成は確認できたものの15～20日を経リミング処理後はできるだけ短期間で喫食するこ過するまで発育が弱く，PDA培地と同等の発育とが意図せぬ真菌発育を防ぐためには重要であっ速度でコロニーを形成していった。M. strictusも，た。

両培地において同様の発育速度で成長したことか

５）

食品衛生法で食肉の温度管理は10℃以下とされら，２種の真菌が好む基質と発育速度はかなり似ているため，一般的な流通条件では食肉に好低温ていることが示された。また，２種の真菌ともに性真菌の胞子が付着した場合，酸素が存在する包脂質よりたんぱく質を資化する活性が非常に強い装形態では発育可能な環境にあると考えられる。

結果であった。

乾燥熟成牛肉以外の製品であっても低温流通を必T. elegansは各条件下において熟成香特有の須とする食肉においては温度条件と包装条件が真ナッツ臭の出現は確認できなかったが，M. strictus

菌の発育に大きく影響することが示唆された。

は，脂質資化用培地において，15日目を経過後

また「リパーゼ産生用培地」，「プロテアーゼ産

ナッツ臭が発現しはじめ，20日経過時には強い生用培地」においてT. elegansを接種したプロテ

ナッツ臭を確認することができた。この結果か

アーゼ培地はPDA培地と同様の速さで発育が進ら，M. strictusは発育基質にはたんぱく質を好む© The Ito Foundation

乾燥熟成牛肉より分離された真菌の生理特性およびその利用に関する研究

33

Table２ Growth comparison of Mucor and Thamnidium. （incubation at 4℃）
Thamnidium elegans
Lipid
ProteinControl

5

10

15

20

30

40

Colony

±

+

++

++

++

++

Nytty flavor
Colony

+

+

++

++

++

++

Nytty flavor

-

-

-

-

-

-

Colony

+

+

++

++

++

++

Nytty flavor

-

-

-

-

-

-

5

10

Colony

±

+

+

+

+

+

Nytty flavor
ColonyNytty flavor
ColonyNytty flavor

±
+
-

+
+
-

±
++
++
-

++
++
++
+

+
++
++
+

+
++
++
+

Mucor strictus
Lipid
ProteinControlpreserved period（day）

preserved period（day）
15

20

30

40

－，no growth；±，slightly growth；+，growth；++，well growthが，ナッツ臭の形成には脂質を利用している可能を向上させていくと同時に，真菌は脂質を利用し性が示唆された。さらに，脂質を基質とした場合，独特なナッツ臭を肉に付与することが，熟成肉に発育速度が遅くなることは，熟成日数が長期に必

赤身肉が適しているとされる理由と考えられた。

要なことと関連していると考えられた。このナッ一方の脂質添加培地は真菌が脂質を利用し十分

ツ臭はM. strictusを接種したたんぱく質資化用培に発育するまでに要する日数が乾燥熟成牛肉の熟地では20日経過時も確認することができず，脂質

成香出現の日数４）と一致しており，M. strictusを資化用培地においてのみ発現したところが興味深

培養した場合，あるいは熟成肉に利用した場合のい結果となった。また，これまでに真菌を利用せナッツ臭を呈する時間とも一致していた。また，ず熟成した乾燥熟成牛肉でナッツ臭が出現しな

シャーレ上ではナッツ臭が20日後に強く現れて以かった報告 と一致した結果が得られた。

降，40日経過までの期間徐々に香りが弱くなって６）

通常乾燥熟成牛肉の製造には赤身肉が適していいくことも確認されたが，実際の熟成肉中では食ると言われているが，今回得られた結果による

肉中の栄養源を利用してM. strictusが発育してと，たんぱく添加培地では真菌の発育は速かった

ナッツ臭を形成するサイクルができており，一定が，乾燥熟成牛肉独特の熟成香と呼ばれるナッツ

期間熟成香を保持しているのではないかと考えら臭は出現しなかった。これよりたんぱく質資化にれた。乾燥熟成牛肉における独特の芳香は製品においては香り以外の肉質や呈味性などに対して強付加価値を与える一方で，嗜好的に好まないといく影響し，低温環境での成長が速いという特性にう意見も聞かれるため，熟成期間に応じて香りのよって，他の真菌の発育を阻害している可能性を

強弱のコントロールを可能にすることも期待でき見出した。乾燥熟成牛肉の製造では，真菌の高いる結果が得られた。

たんぱく質資化性を利用することで肉表面を真菌でカバーし微生物汚染を防ぎながら肉質や呈味性© The Ito Foundation

34
４．要

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

きく影響していることを示しており，ナッツ臭の

約

発現には，脂質が基質となっている可能性が示唆

本研究では，乾燥熟成牛肉の熟成香に影響を与された。また，利用するM. strictusの性質をコンえる真菌の生理特性が熟成香の発現条件にどのよ

トロールすることでナッツ臭は抑えながら肉質のうに影響し生産時における指標となるかを目的とみを向上させるような熟成方法の検討が期待できして調査した。

る結果が得られた。

異なる包装条件による真菌の発育特性の結果か

以上より，乾燥熟成では２種の真菌が複合的にら，本研究により分離されたT. elegansおよびM.

関与し，他の微生物の侵入を結果的に防ぎながらstrictusは，酸素要求性は高いが，真空包装のわ

肉質を向上させると同時にM. strictusが脂質を分ずかな酸素しかない環境下でも発育をすることが解することにより熟成香が付与されていると推定確認された。これらの真菌の発育を出荷後の長期された。また，流通時の予期せぬ真菌発生に対し間の保管においてコントロールするためには０℃ても温度管理と包装形態を組み合わせることによ付近での温度管理と酸素除去剤や酸素透過率の低りコントロールが可能であることが明らかになっい包材を組み合わせることが有効であった。また。さらに今回の研究成果として，温度条件を設た，酵素基質培地においては低温環境下で発育が定することにより真菌の発育を調整することがで抑制されるとともに酵素反応が抑制され，特にリきれば芳香の強弱を制御することや，熟成期間のパーゼ反応において顕著であった。つまり，乾燥短縮も可能な結果が得られた。

熟成牛肉より分離された真菌は，０℃前後の低温環境下でも発育は可能であるが，同時に熟成香に影響を与える酵素的作用が抑制されることが推定された。
資化性試験においては２種の真菌ともに脂質と比較するとたんぱく質を資化する活性が強い結果であった。しかしながら，M. strictusが産生する
乾燥熟成牛肉特有のナッツ臭はたんぱく質資化性培地では発現せず，発育の遅かった脂質資化性培地で発現した。この結果は，芳香の発生要因は真菌の存在のみでなく，発育する基質や栄養源が大文
献１）
 西 村 敏 英：日 本 味 と 匂 学 会 誌 , 8（2）,161～168,2001.
 市村さやか，高橋真佐郎，中村幸信，吉田由香，
２）
猪口由美，服部昭仁：平成30年度食肉に関する助成
研究調査成果報告書, 37, 54～63, 2019.
３）
 小林正人，佐々木整輝：平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書, 33, 39～45, 2015.
 中川麻衣，小室春菜，中島誠人，猪口由美，高鳥４）
浩介：平成31年度（令和元年度）食肉に関する助成
研究調査成果報告書, 38, 20～25, 2020.
 石 谷 孝 佑：日 本 食 品 工 業 学 会 誌 , 28（4）,53～66,
５）
1981.
６）
 河原聡：平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書, 36, 68～73, 2018.

© The Ito Foundation

35

ポークソーセージにおけるタンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）
Clarification of the mechanism for holding aroma compounds by proteinsin pork sausages（Ⅱ）

西

村

敏

英・山

口

千

里

（女子栄養大学栄養学部）

Toshihide Nishimura and Chisato Yamaguchi（Faculty of Nutrition Science, Kagawa Nutrition University）

It is well known that pork sausage is very popular as one of delicious foods. Recently, it
has been shown that lipids in pork sausage gives us Koku attributes such as complexity andlastingness in the flavor sensation. This lastingness is thought to be caused by binding
property of aroma compounds with meat proteins as well as lipids in pork sausages. However,
it is not clear that the mechanisms for binding aroma compounds with meat proteins.
The present research was carried out to clarify which protein in pork sausages
contributed to hold 7 kinds of aroma compounds possessing different log P value. At first,
sarcoplasmic proteins and myofibrillar proteins were prepared from pork meat. Then, theholding capacity of aroma compounds by each protein fraction of pork meat was evaluated by
the measurement of amounts of aroma compounds released from the mixture containing eachprotein fraction after heating. D-limonene（log P ; 4.57）, methyl propyl disulfide（log P ; 2.95）,
nonanal （log P ; 3.27） and caryophyllene （log P ; 6.30） were held by sarcoplasmic andmyofibrillar proteins as well as casing, while guaiacol（log P ; 1.32）, m-cresol（log P ; 1.96）andeugenol（log P ; 2.49）were not held by each protein of pork.
Tri acyl glycerol extracted by acetone from pork fat was also shown to hold D-limonene
and caryophyllene tightly and also held methyl propyl disulfide and nonanal, while guaiacol,m-cresol, and eugenol were not held by tri acyl glycerol.
These results in this research suggested that aroma compounds possessing log P morethan 3 were able to be held by meat proteins as well as lipids.

１．目であるポークソーセージのおいしさに関して，コ的クに焦点を当て，ポークソーセージのコクの形成

著者らは，食べ物のコクに関する客観的評価系の確立を目指し，コクを３つの要素（複雑さ，広と増強に関わるメカニズムの解明を進めている10，11）。

がり，持続性）で構築し，それぞれの「見える化」

先の研究（伊藤記念財団からの助成研究）12～18）を試みている１～９）。また，美味な食肉製品の１つにおいて，ポークソーセージのコクは，うま味物© The Ito Foundation

36

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

質や脂質の添加により増強されていることを，官本年度は，まず，食肉製品に含まれる筋漿タン

能評価により明らかにした。また，ポークソー

パク質と筋原線維タンパク質を調製し，これらにセージの香りの特徴に関わる香気成分として，対する香気成分の保持効果を検討した。また，豚

β-ピネン，3-カレン，D-リモネンを含む16成分

脂を分画し，各脂質画分への香気成分の保持効果を同定し，それぞれの成分の香気的な特徴を明らを検討した。

かにした。ソーセージ中の脂質と結合している香気成分は，咀嚼中に口腔内の唾液により放出され

２．実験方法ることも示した。同定された16の香気成分が，

2.1

ソーセージに含まれる脂質によって保持されるか

2.1.1

否かを検討し，これらの香気成分の中で，脂質にメチルプロピルジスルフィドは富士フイルム和保持されるものとそうでないものに分かれること

光純薬（株）から，ジクロロメタンは関東化学（株）

が明らかとなった。香気成分は，中性脂肪であるから，D-リモネン，ノナナール，カリオフィレン，

トリオレインにはほとんど結合しないが，コレス

グアヤコール，m-クレゾール，オイゲノール，

テロールやリン脂質に保持されやすいことも判明

ジメチルフタレート（内部標準物質），特級クロした。香気成分の脂質への保持のされやすさは，

ロホルムは東京化成工業（株）から購入した。使用

香気成分の有する特性，特にlog P（分配係数）

した７つの香気成分のlog PをTable１に示した。

に依存している可能性が示唆された。しかし，そ2 . 1 . 2 筋肉タンパク質の分画と各タンパク質のメカニズムは十分に解明されておらず，さらなる解析が必要である。また，ソーセージの成分で，タンパク質による香気成分の保持効果
試薬

画分の調製19）
市販の豚ロース肉の脂肪や筋を取り除いた後，脂質以外では，乳タンパク質や大豆タンパク質にミンサーでひき肉にした。

も香気成分の保持効果があると言われている。し①筋肉に含まれるタンパク質の分画

かし，食肉製品に存在するタンパク質の香気成分

10gのひき肉に60mlの超純水を加えて，ホモジ保持効果に関する研究はこれまでまったくなされナイズした。これを10000rpmで20分間遠心分離ていなかったので，昨年度，食肉製品のケーシン

し，上清と沈殿をそれぞれ回収した。上清を筋漿グに着目し，ケーシングに対する香気成分の結合

タンパク質画分，沈殿を筋原線維タンパク質含有性を調べ，メチルプロピルジスルフィドとノナ画分とした。残ったひき肉はすべて－80℃で保管

ナールが結合することを明らかにした。

した。

Table１ Log P of volatile compounds used in this research
Name of volatile compound

Log P

①

D-Limonene

4.57

②

Methyl propyl disulfide

2.95

③

Nonanal

3.27④

Caryophyllene

6.30

⑤

Guaiacol1.32⑥

m-Cresol

1.96⑦

Eugenol

2.49© The Ito Foundation

ポークソーセージにおけるタンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）

37た。

②筋漿タンパク質画分の調製①の上清画分を用い，低分子画分を除去するた

4.5時間加熱した混合溶液を氷中で冷やした後，め，超純水を用いて透析した。上清の溶液を分子

蒸留水で10mlにメスアップした。メスアップ後量10000カットオフの透析膜に入れた後，このの混合溶液をモノトラップ捕集ビンに移し，モノチューブを上清容量の40倍容量の超純水中に入トラップ１枚を取り付けた後，40℃で20分間加熱れ，4℃で透析した。この操作を３回繰り返し，した。モノトラップを抽出ビンに移した後，抽出

遊 離 ア ミ ノ 酸 等 の 低 分 子 を 除 去 し た 。こ れ を溶媒としてジクロロメタン1mlと内部標準物質－80℃で保管した。

（原液の1000倍希釈）20μlを加えて５分間超音波③筋原線維タンパク質画分の調製処理をして，香気物質を抽出した。これをGC/①の沈殿を超純水35mlで懸濁し，10000rpmで遠心分離した。上澄みを捨て，さらに同じ操作をMSの分析試料とした。
2 . 1 . 4 GC/MSによる香気成分の比較ならびに同定

２回繰り返した。２回洗浄後の沈殿を30mlの超純水で懸濁し，均一な状態にして－80℃で保管しモノトラップから得られた香気成分を，以下の条件で分析した。

た。

GC/MSは，GCMS-QP2010（島津製作所（株））④凍結乾燥
各試料を凍結乾燥するため，－80℃で保管してで，カラムはTC-wax（長さ60m×内径0.25mm i.d.,

いたひき肉，②筋漿タンパク質画分と③筋原線維

膜厚0.25μm，使用温度上限260℃）（GL Sciences

タンパク質画分の凍結試料を凍結乾燥機で乾燥し（株））を使用した。

た。その結果，肉タンパク質2.4g，筋漿タンパク
質画分0.27g，筋原線維画分1.36gが得られた。
2 . 1 . 3 各タンパク質画分による香気成分の保GC/MSの昇温条件は，40℃（10min）→（5℃/min）→240℃（20min）で，合計70分間のプログ
ラムを用いた。検出器には，MS（250℃）を使用した。注入量は，2μl（スプリットレス）で，内持特性の測定2 . 1 . 2で得られた筋漿タンパク質，筋原線維タ

部標準物質としてジメチルフタレートを用いた。

ンパク質と，豚ひき肉乾燥物，羊腸ケーシングのキャリアガスの流量は，1.75ml/minで分析した。

４種類のタンパク質を用いて，香気成分の結合性

また，各成分の量的な変化は，サンプルに添加しを調べた。用いた香気成分は，メチルプロピルジ

た内部標準物質で補正した後，比較した。

スルフィド，D-リモネン，ノナナール，カリオ

2 . 2 豚脂に含まれる各脂質による香気成分のフィレン，グアヤコール，m-クレゾール，オイ

保持特性

ゲノールの７種類である。内部標準物質として，

2 . 2 . 1 試薬

ジメチルフタレートを使用した。

特級メタノールは富士フイルム和光純薬（株）か試験管に各タンパク質画分0.05gを精秤した。
これに，氷水中で，ジクロロメタンで４倍希釈しら，特級クロロホルムと特級アセトンは東京化成工業（株）から購入した。

た香気成分を20μl添加した。この混合物を氷中

2.2.2

で10分間静置した後，10mlの冷やした蒸留水を豚脂10gを細切した後，100mlのアセトンを添加えた。次に，これを90℃で4.5時間加熱した。

加し，ホモジナイズした。これをろ過し，可溶画混合溶液が90℃に達してから，加熱時間を計測し分と不溶画分に分けた。不溶画分に10倍量のジエ© The Ito Foundation

脂質の溶媒分画20）

38

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 2 Amount of each lipid fraction recovered by solvent fractionation
Fraction（compound extracted by each solvent）

画分の回収量（g）

Acetone fraction（mainly tri-acyl glycerol）

6.60

Diethyl ether fraction（mainly phospholipid）

1.01

Chloroform/ether fraction（mainly sphingolipid）

trace

チルエーテルを加えて，十分に撹拌し，ジエチル

ヤコール，m-クレゾールならびにオイゲノール

エーテル可溶画分と不溶画分に分けた。次に，ジの放出量は，いずれのタンパク質でも，タンパクエチルエーテル不溶画分に，約10倍量のクロロホ

質無添加の場合の放出量と変わらず，これらの物

ルム：メタノール（2：1）混合液を加え，可溶画質はタンパク質と結合しないことが明らかとなっ分と不溶画分に分けた。このように分画した中た（Fig.１，２）。一方，D-リモネン，メチルプロ

で，アセトン可溶画分を中性脂肪画分，ジエチル

ピルジスルフィド，ノナナールおよびカリオフィ

エーテル画分をリン脂質画分とした。クロロホル

レンの放出量は，いずれのタンパク質を添加した

ム：メタノール（2：1）画分をリン脂質・糖脂質

画分でも多く，これらの香気成分は，各タンパク画分とした。

質と結合性が強く，保持されていることが明らか

各画分の溶媒を留去した後，重量を測定した結となった。
リモネンは，筋漿タンパク質との結合性が高果，Table２にように回収された。
2 . 2 . 3 香気成分の脂質との結合性（モノトく，メチルプロピルジスルフィドとノナナールはラップ（シリカモノリス捕集剤）による筋原線維タンパク質との結合性が高いことが判明捕集）した。カリオフィレンの結合性は，両者で違いが試験管に0.05gの分画した脂質を精秤した後，認められなかった。また，両方のタンパク質を含氷水中で，ジクロロメタンで４倍希釈した香気成

む肉タンパク質は，これら４つの香気成分に対し分を20μl添加した。この混合物を氷中で10分間て強い結合性を示した。

静置した後，10mlの冷やした蒸留水を加えた。

今回，実験で用いた７つの化合物と各タンパク

次に，これを90℃の温浴中で4.5時間加熱した。

質画分の結合性を，香気成分のlog Pから見てみこれ以降の作業は，2 . 1 . 3と同様に行った。

ると，各タンパク質と結合した４つの香気成分の2 . 2 . 4 GC/MSによる香気成分の比較ならびlog Pは，2.95～6.30のものであった。一方，結合性の認められなかったグアヤコール，m-クレゾーに同定
モノトラップ（Mono Trap）から得られた香ルならびにオイゲノールのlog Pは，1.32～2.49で，気成分を，2 . 1 . 4と同様の方法で分析し，香気成

他の４成分より低い値であった。Log Pが2.5付近分を同定した。

で，タンパク質との結合性に違いが生じると推定された。また，香気物質は，タンパク質と疎水結

３．結果と考察合で結合していると考えられるが，そのメカニズ

3 . 1 香気成分の筋漿タンパク質画分，筋原線

ムは証明されているわけではないので，香気成分

維タンパク質画分，肉タンパク質との結合性保持のメカニズムを解明するのは，興味深い課題

各試料と香気成分の混合物を加熱した後のグアである。

© The Ito Foundation

ポークソーセージにおけるタンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）

①②

④

⑤

⑥⑦ ⑧

Meat proteins

Peak intensity③

39

Myoﬁbrillar proteinsSarcoplasmic proteinsWithout proteins

20

30

40
50
Retention time（min）

60

Fig. 1 Chromatogram of aroma compounds released from the mixture containing each protein after heating（①D-Limonene, ②Methyl propyl disulfide, ③Nonanal, ④Caryophyllene, ⑤Guaiacol, ⑥m-Cresol, ⑦Eugenol, ⑧Internal
standard）

5

Peak area ( x 107)

4
3
2
1

l

l

ge
Eu
⑦

re
-C
m
⑥

no

so

ol
Gu

⑤

hy
op
④

Ca

ry

ai

lle

ac

ne

l
na
na
No
③

②

①

D-

Li

m

on

en
e
M
e
di th
su yl
lﬁd pre opyl0Without proteinsSarcoplasmic
proteins

Myoﬁbrillar
proteins

Meat proteinsFig. 2 Amounts of aroma compounds released from the mixture containing each protein after heating

3.2

香気成分のケーシングとの結合性

ル，m-クレゾールならびにオイゲノールの放出

前年度は，メチルプロピルジスルフィド，ノナ

量は，ケーシング無添加の場合の放出量と変わら

ナール，グアヤコールを用いて，ケーシングとのず，これらの物質は，他のタンパク質と同様，結結合性を調べた。今年度は，これらに加えて，合しないことが明らかとなった。一方，D-リモ

D-リモネン，カリオフィレン，m-クレゾールな

ネン，メチルプロピルジスルフィド，ノナナール

らびにオイゲノールのケーシングとの結合性を調およびカリオフィレンの放出量は，ケーシングをべた。その結果，Fig.３に示すように，グアヤコー

添加した画分で多く，これらの香気成分は，各タ© The Ito Foundation

40

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

14
Without casing

Peak area ( x 107)12

With casing

10
8
6
4
2

l
no
Eu
⑦

-C
m
⑥

ge

so
re

ac

⑤

Gu

ai

lle
hy
op

④

Ca

ry

l

ol

ne

l
na
na
No
③

②

①

D-

Li

m

on

en
e
M
e
di th
su yl
lﬁd pre opy
l0Fig. 3 Amounts of aroma compounds released from casing after heating

ンパク質と結合性が強く，保持されていることがlog Pは，それぞれ1.32，1.96，2.49で，３よりも明らかとなった。グアヤコール，メチルプロピル

小さかった。

ジスルフィド，ノナナールのケーシングとの結合

一方，アセトン画分の中性脂肪には，D-リモ

性は，前年度と同様の結果となった。以上の結果

ネンとカリオフィレンが強く結合することが明らから，3 . 1で明らかとなった肉に含まれるタンパかとなった。この成分はコレステロールに結合す

ク質との結合性と同様に，log Pが2.95～6.30の香るとの結果が，すでに得られているが，中性脂肪

気成分が，主にコラーゲンやエラスチンからなるに保持されるという結果はまだ得られていない。

ケーシングと結合できることが判明した。

今回分画されたアセトン画分に，コレステロール

3 . 3 豚脂に含まれる各脂質による香気成分の保持特性が含まれていないかを検討する必要がある。また，メチルプロピルジスルフィド，ノナナールも各画分の脂質0.05gに，ソーセージで検出された６種類の香気成分，D-リモネン，ノナナール，

アセトン画分の中性脂肪と結合する可能性が示唆された。

カリオフィレン，グアヤコール，m-クレゾール，

さらに，エーテル画分には，リモネンとカリオ

オイゲノールならびにメチルプロピルジスルフィ

フィレンが結合することが明らかとなった。このドの計７種類の香気成分を添加し，保持効果を調画分には，リン脂質が含まれていると考えられべた（Fig.４）。

る。リン脂質は，これまでの研究から，多種の香

各香気成分の脂質への結合性は，脂質画分に気成分が保持されることが明らかとなっているのよって異なっていた。グアヤコール，m-クレゾー

で，今回のエーテル画分には，リン脂質が含まれ

ル，オイゲノールは，脂質画分の添加でも少量保ている可能性があると考えられる。以上の結果か持されることが明らかとなったが，脂質がなくてら，D-リモネン，メチルプロピルジスルフィド，

も香気成分が溶液中に残存していたことから，水

ノナナール，カリオフィレンは，アセトン画分に溶性の香気成分であると推定された。これらの含まれる中性脂肪と結合することが示唆された。

© The Ito Foundation

ポークソーセージにおけるタンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）

41

Peak area ( x 106)

3

2

1

ge
Eu
⑦

⑥

m

-C

re

no

so

l

l

ol
Gu

⑤

hy
op
④

Ca

ry

ai

lle

ac

l
na
na
No
③

M
di ethsu yllﬁd pr
e opy

l

e
②

en
on
m
Li
D①

ne

0

Without lipids

Acetone fraction

Ether fraction

Fig. 4 Amounts of aroma compounds released from lipids in pork after heating

これら４成分のlog Pは，それぞれ4.57，2.95，3.27，

は，筋漿タンパク質，筋原線維タンパク質，肉タ6.30で，いずれも３かそれより大きい値を示した。

ンパク質と結合性が強く，保持されることが明ら

このことが，これらの香気成分が脂質に保持されかとなった。これらの香気成分は，ケーシングとる１つの理由であると推察された。これらの香気の結合性でも，同様の結果となった。各タンパク

成分は，肉のタンパク質とも結合性を有すること

質と結合した４つの香気成分のlog Pは，2.95～

が明らかとなっていることから，log Pが３以上

6.30であった。一方，結合性の認められなかったの香気成分は，タンパク質や脂質に結合できる可グアヤコール，m-クレゾールならびにオイゲノー

能性が推察された。今後は，log Pを考慮して，

ルのlog Pは1.32～2.49で，他の４成分より低い値

タンパク質や脂質への結合性を推定できると考えであった。Log Pが３付近で，タンパク質との結られる。

合性に違いが生じると推定された。また，香気物

４．要

質は，タンパク質と疎水結合で結合していると考約えられるが，そのメカニズムは証明されているわ

ポークソーセージは，美味な食品の１つであり，コクのある食品である。これまで，ポークソー

けではないので，今後に解明すべき興味深い課題である。

セージに添加される脂肪が，ソーセージの特徴を脂質からアセトンで抽出された中性脂肪は，示す香気成分を保持し，味わいの広がりや持続性

D-リモネンとカリオフィレンが強く結合するこを強めて，ソーセージのコクを増強することを明とが明らかとなった。また，メチルプロピルジス

らかとしてきた。

ルフィド，ノナナールもアセトン画分の中性脂肪

本研究では，ソーセージの原料である食肉タンと結合する可能性が示唆された。これら４成分のパク質に着目して，香気成分の保持能力を検討しlog Pは，それぞれ4.57，2.95，3.27，6.30で，いずた。その結果，D-リモネン，メチルプロピルジ

れも３かそれより大きい値を示した。

スルフィド，ノナナールおよびカリオフィレン

以上の結果から，log Pが３以上の香気成分は，© The Ito Foundation

42

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

タンパク質や脂質に結合できる可能性が推察された。
文献１） Nishimura, T. ； Definition of “Koku” Involved inFood Palatability （Koku in Food Science andPhysiology, Eds. Nishimura, T. & Kuroda, M.）,
1-16, Springer Nature, Singapore, 2019.
２） 西 村 敏 英：食 品 の コ ク と そ の 生 成 メ カ ニ ズ ム（「食品のコクとは何か」，西村敏英・黒田素央編著），
1-21，恒星社厚生閣, 2021.
３） 西村敏英：食肉のおいしさとそれを引き出すコクとは！，JATAFFジャーナル，3（12）,29～35, 2015.
４） 西村敏英：食品のおいしさを改善するコク増強物
質のチョイ足し技術，月刊フードケミカル，2017-9,
23～27, 2017.
５） 西村敏英：コクの要素と寄与成分を活かした食品
開発，食品と開発，53（6）,20～23, 2018.
６） 西村敏英：食品のコクとおいしさへの活用，醤油の研究と技術，45（3）,161～168, 2019.
７） Nishimura, T., Goto, S., Miura, K., Takakura, Y.,
Egusa, S. A., Wakabayashi, H. : “Umami compounds
enhance the intensity of retronasal sensation ofaromas from model chicken soups”, Food
Chemistry, 196, 577～583, 2016.
８） Nishimura, T., Egusa, S. A., Nagao, A., Odahara,
T., Sugise, T., Mizoguchi, N., Nosho, Y. :“Phytosterols in onion contribute to a sensation of
lingering of aroma, a koku attribute”, Food
Chemistry, 192, 724～728, 2016.
９） 西村敏英：食肉のおいしさを引き出すうま味物質の役割，食肉の科学，57（2）,177～180, 2016.
10） Nishimura, T., Saiga, A.：Umami Compounds
and Fats Involved in Koku Attribute of Pork
Sausages（Koku in Food Science and Physiology,
Eds. Nishimura, T. & Kuroda, M.）, 47-58, Springer
Nature, Singapore, 2019.

11） 西村敏英：食肉・食肉製品のコクとおいしさ（食品 の コ ク と は 何 か ，西 村 敏 英・黒 田 素 央 編 著），
161-172，恒星社厚生閣，2021.
 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの『こく』12）とその寄与因子の解明，平成26年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書, Vol.33, 101～108, 2015.
13） 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明（その２），平成27年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書, Vol.34, 72～80,
2016.
14）
 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明（その３），平成28年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書, Vol.35, 31～39,
2017.
15）
 西村敏英；ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂質の役割，平成29年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書, Vol.36, 59～67, 2018.
 西村敏英，力石麗奈：ポークソーセージにおける
16）脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ），
平成31年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書,
Vol.38, 33～41, 2020.
 西村敏英，山口千里：ポークソーセージにおける
17）脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅲ）」，令和２年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書, Vol.39, 25～33, 2021.
 西村敏英，山口千里：ポークソーセージにおける18）
タンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明，令和３年度 食肉に関する助成研究調査成果報
告書, Vol.40, 41～48, 2022.
19） Yan, R., Okitani, A., Fujimaki, M.：Effect of
Trypsin Treatment on the ATPase Activity of
Myofibrils from the Stored Rabbit Muscle,
Agricultural Biological Chemistry, 36（12）, 2087～
2095, 1972.
20） 生物化学実験法９ 脂質・酸化脂質分析法入門（宮澤陽夫・藤野泰郎編著），74-83，（株）学会出版センター，2000.

© The Ito Foundation

43

黒毛和種牛肉の香り特性の改善に関わる脂質過酸化
反応系の解析
―コールドチェーン物流の転換に向けた科学的アプローチ―
Analysis of the enzymatic reaction system of lipid oxidase involved in the
improvements of aroma characteristics of Japanese Black cattle beef

上

田

修

司

（神戸大学大学院農学研究科）

Shuji Ueda
（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

Meat is usually exported in vacuum-packed block pieces. However, this method has
disadvantages, such as low transportation efficiency and drip losses. The cold chain fromproduction to consumption needs to be improved to reduce food waste in meat production.
Japanese Black cattle beef accounts for approximately 50％ of Japan’s livestock exports. The
Wagyu aroma of Japanese Black cattle beef is composed of volatile compounds produced by
the Maillard reaction. Lactones produced by lipid oxidation contribute notably to the sweet
aroma of Wagyu beef. In this study, we propose a new film packaging that achieves botharoma and quality to enhance the value of Japanese Black cattle in the premium market. We
also analyze enzymatic lipid oxidation of unsaturated fatty acids in Japanese Black cattle beef
during cold storage and propose a new cold chain for fresh meat based on the results. Skinpack packaging of Japanese Black cattle beef resulted in significant changes in meat color
depending on the oxygen barrier performance of the film material. Especially in long-term
storage, the oxygen barrier film was suggested to reduce flavor loss and drip loss of meat
effectively. The effect of cold storage of vacuum-packed Japanese Black cattle beef on Wagyu
aroma was examined by forming lactone precursors（hydroxy fatty acids）.Hydroxy fatty acids
were analyzed by LC-MS, and 9S-HODE, 13S-HODE, and 13-KODE derived from linoleic acid
were detected in beef at 6 and 21 days after slaughter. Comparing “basic film” and “oxygen
barrier film” used for vacuum packaging showed no significant differences in hydroxy fatty
acids. We propose a new cold chain using oxygen barrier film packaging for fresh meat basedon our results．

１．目

揃いなブロック肉を箱詰めするため，梱包時に不的要なスペースができやすく，輸送時の積載効率の食肉の輸出は，真空包装したブロック肉の状態

低下につながっている。また，ブロック肉は，解で配送されている。しかし，この配送方法は，不凍時に大量のドリップが出るなど，デメリットが© The Ito Foundation

44

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

指摘されている。食肉製造における食品廃棄の削減は，経済的な理由，環境への配慮から重要性が

２．方法

高まっている。サプライチェーン（生産，加工，2.1

輸送，消費段階）の効率的な管理への改善が求め同一個体の黒毛和種のロース，モモ肉より，「とられている 。

牛肉のスキンパック包装食肉の調製

畜日６日目」と，さらに冷蔵保存した「と畜日28

１）

我が国の畜産物の輸出実績は，黒毛和種牛肉の日目」を準備し，厚さ５mmに柵切り後，連続式

輸 出 が 520 億 円（2022 年 度 実 績）で ，全 体 の 約

大型包装機であるMULTIVACシステム（東京食50％を占める。近年，食肉現場では，黒毛和種牛品機械株式会社）を用いて，スキンパック包装を肉の香りに対する関心が高まっている。食肉産業

試作した。フィルムには，ノンバリア性フィルムの振興において，黒毛和種牛肉の品質を落とさ（CEL-9030D），酸 素 ハ イ バ リ ア 性 フ ィ ル ム

ず，海外輸送が可能な包装形態の検討は重要な課（CEL-9830C）を用いた。
2.2

題である。

画像解析と食味試験

牛肉の香りは，何百もの揮発性化合物からなる

食肉の画像解析では，シュナイダー・クロイツ

複雑な混合臭である 。香り成分は，有機酸，脂

ナッハ製レンズを搭載したハイパースペクトロカ

肪酸，糖類のメイラード反応とストレッカー分解

メ ラ（IMEC 社 製 ； Snapscan, VNIR

によって生成する。黒毛和種牛肉の調理時に生じ1050）を用いて，可視光波長領域（470～900nm）

る甘い香りは，霜降りと並ぶ黒毛和種牛肉の特徴を画像撮影した。食味試験は，家畜改良センター

として珍重されている。この香り成分は，環状エ編集の「食肉の官能評価ガイドライン」に従って

ステル化合物のラクトンが主体である３）。

行った。

２）

我々は，黒毛和種牛肉を匂い嗅ぎガスクロマト

2.3#B150U-

酸素バリアフィルム包装食肉の調製グラフィーで分析し，甘い香りの成分の同定をと畜６日目の黒毛和種のロースを調達し，酸素行った 。その結果，γ-ヘキサラクトンを同定し，ハイバリアフィルム（酸素透過度：6cm３/m２ ・FDファクターで算出される香気寄与度の高さな

24時間・atm，水蒸気透過度：7g/m２・24時間），

どを鑑み，牛肉の鼻先に感じるナッツのような香または通常フィルム（酸素透過度：49cm３/ｍ２・気に寄与すると推察している。

24時間・atm，水蒸気透過度：7g/m２ ・24時間）

４）

本研究課題では，近年，コールドチェーンで注で真空包装し，と畜21日目まで冷蔵（４℃）保管

目されているスキンパック包装について，使用す

後，急速凍結し，分析まで－80℃で保管した。

るフィルムの違いによる黒毛和種牛肉の肉色への影響について検討を行った。さらに，黒毛和種の2 . 4 ヒドロキシ脂肪酸のLC-MS/MSによる分析

香り成分であるラクトンの材料に着目し，低温保酸化脂肪酸は，ロース芯より回収した牛肉粉末

存中に生じる脂質過酸化物の経時的変化を解析しから脂質画分をメタノール抽出し，HLBカラムた。これらの結果を基に，本研究課題の成果としで固相抽出した。ヒドロキシ脂肪酸は，XBridgeて，生鮮食肉の加工に最適な酸素バリアフィルム

C18カラム（日本ウォーターズ株式会社）を備え包装の新たな工程を提案する。

た高速液体クロマトグラフィーNexeraLC-30ADシステム（株式会社島津製作所）で分離し，トリ
プル四重極質量分析計LC-MS-8040（島津製作© The Ito Foundation

黒毛和種牛肉の香り特性の改善に関わる脂質過酸化反応系の解析45所） で 分 析 し た 。 内 部 標 準 に は ， 12，13 ―色調変化と考えられる５）。「と畜28日目」の牛肉

diHOME-d４，13S-HODE-d４，13―KODE-d３，

は，「と畜６日目」に比べて，ロースとモモ肉で

12，13―EpOME-d４（ケイマンケミカルズ社）をともに鮮紅色が減少した（Fig.１）。

使用した。データ分析は，LabSolutionsソフトウェ

スキンパック開封後の肉色変化では，ノンバリア（島津製作所）を使用した。統計解析は，エク

ア包装は，冷蔵保管期間が長くなるにつれて，鮮セル統計（ベルカーブ株式会社）を使用した。

紅色から暗褐色に変わり，包装開封後の肉色の変化は軽微であった。酸素バリア性フィルムでは，

３．結果と考察

包装開封後の暗赤色から鮮紅色に変化が観察され

3 . 1 スキンパック包装による黒毛和種牛肉の肉色への影響た。酸素バリア性フィルムの鮮紅色への変化は，「と畜28日目」に比べて，「と畜６日目」でより顕

コールドチェーンの適切な加工時期を検討する著であった。肉色の計測には，ハイパースペクト

ため，黒毛和種牛肉のロース，モモ肉を「と畜後

ロカメラを使用した６）。「と畜28日目」のロース

６日目」と「と畜後28日目」でスキンパック包装とモモ肉のスキンパック包装食肉の開封後の肉色した。スキンパック包装は，フタとなるフィルムの変化の様子を，ハイパースペクトロカメラで捉と底材の台紙で構成される。本研究では，台紙はえた画像で示す（Fig.２）。脂肪組織の偏在が見トレーパックを使用し，フィルムはノンバリアとられる黒毛和種牛肉の場合，従来のRGBカメラ

酸素バリア性フィルムを用いて比較した。

では霜降りの割合の影響を大きく受ける。ハイ

ノンバリア包装した牛肉の肉色は，「と畜６日パースペクトロカメラは，ピクセル単位で分光目」のロースとモモ肉でともに，カット直後に見データを取ることが可能なため，赤身，霜降り，られる鮮紅色を示した。一方，酸素バリア性フィ

皮下脂肪の組織ごとの肉色の比較が可能となった。

ルムでは，包装後に肉色の暗赤色化が観察され3.2た。この肉色変化は，牛肉内の酸素の低下による

スキンパック包装した黒毛和種牛肉を食味した

ミオグロビンの酸化型から還元型への遷移による結果，ノンバリア，酸素バリア性フィルム包装し

Round

Loin

Round

Oxygen barrier

Non-barrier

Loin

スキンパック包装による肉質への影響

6th day after slaughter
Fig. 128th day after slaughter

Effects of different oxygen barrier performance of meat packaging films on meat quality．
Japanese Black cattle beef prepared at “6 days after slaughter” and “28 days after slaughter” were vacuum-packed in skinpacks. Comparison of appearance shows that the non-barrier film exhibits a bright, fresh red color. The high-barrier film
packaging shows dark red meat color due to reduction reaction by myoglobin．

© The Ito Foundation

46

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）
Round

Oxygen barrier

Non-barrier

Loin

Fig. 2 Image analysis with hyperspectral camera. The picture shows a pseudo-color image of meat color after opening the“28thday after slaughter” skin pack packaging. Muscle tissue is shown in red, and is classified into dark red and light red according
to differences in meat color. The oxygen high-barrier film clearly shows a brighter flesh color after opening than the nonbarrier film．

Hydroxy fatty acid
O
H3C

OH
OH

γ-Hexalactone
H3C

O

O

Fig. 3 Condensation reaction of dehydration by heating and cooking. Hydroxy fatty acids are degraded to 4-hydroxyhexanoic acid,followed by cyclization reactions to γ-hexalactone．

た牛肉で，食味に影響するような，色沢，外観，定される。これまでの研究では，多価不飽和脂肪

ドリップ，臭いの違いは観察されなかった。しか酸のリノール酸とγ―ヘキサラクトンの相関が認し，ノンバリアでは，解凍後２日間の冷蔵保管にめられた７）。ラクトンの複素環は，ヒドロキシ脂

より，肉の旨味の低下，ドリップの流出，多汁性

肪酸のヒドロキシ基（―OH）とカルボキシル基の低下，苦味の増加が感じられた。特に，モモ肉

８，９）（―COOH）が脱水縮合して生じる（Fig.３）。

では，その味覚の差は顕著であった。一方，酸素

我々は，前駆物質の探索を通して，リノール酸のバリア性フィルムでは，ノンバリアに比べ，ド酸化脂質であるヒドロキシ脂肪酸の9S-hydroxy-

リップの流出がほとんどなく，旨味の低下は感じ

10E, 12Z-octadecadienoic acid（9S-HODE）とられなかった。

13-hydroxy-9Z, 11E-octadecadienoic acid

肉の旨味は，低温保存中に生じるタンパク質分（13S-HODE）が，ラクトンの形成過程の中間体

解物のグルタミン酸，核酸分解物のイノシン酸な10）であることを示した（Fig. 4A）。このヒドロキ

どが深く関係する。また，タンパク質の酸化によ

シ脂肪酸の生合成は，不飽和脂肪酸のシス型二重る凝集がドリップの流出を増加させると考えられ結合の酸化反応である。

る。フィルムの酸素バリア性能の違いが，牛肉の肉色と食味性に影響することが示唆された。
3 . 3 スキンパック包装による黒毛和種牛肉の肉色への影響本研究課題では，ヒドロキシ脂肪酸を香りの指標と捉え，酸素バリア性の異なるフィルムで真空包装した黒毛和種牛肉の低温保存中の経時的変化を解析した。ヒドロキシ脂肪酸の測定は，トリプ

牛肉のラクトンの生合成は，脂肪酸が材料と推ル 四 重 極 質 量 分 析 計 を 使 用 し た 。そ の 結 果 ，© The Ito Foundation

47

黒毛和種牛肉の香り特性の改善に関わる脂質過酸化反応系の解析
A

H3 C

CO2H

9

linoleic acid
Lipoxygenace
OOH
H3C

CO2H

H3C

CO2H

9

HOO 13

9-HpODE

13-HpODE
glutathione peroxidase

OH
H3C

CO2H

H3C

CO2H

9

HO 13

9S-HODE

13S-HODE
hydroxyl fatty acid dehydrogenate

O
H3C

CO2H

H3C

CO2H

9

O 13

9-KODE

13-KODEB

Concentration（pg/mg beef）

300

6 DaysHigh 21 Days

Basic 21 Days

250
200
150
100
50

E

E

M
O
-d
iH

12

,1
3

H
O
-d
i

9,
10

Ep
O

M

E
M

E
3-

12

,1

-E
pO
9,
10

13

-K

O

D

M

E

E
D
KO

O
H
S-

9-

E
D

E
13

9S

-H
O

D

D
-H
pO

13

9-

H

pO

D

E

E

0

Fig. 4 Quantitation of oxidative metabolites of linoleic acid.（A）Schematic diagram of lipid oxidation of linoleic acid.（B）Composition of oxidized linoleic acid in beef tallow. The graph shows the mean values obtained from three analyses of
independently prepared samples. Data represent the mean ± standard error（ｎ＝３）. Bonferroni test showed no significant
differences between samples（6 Days vs High 21Days vs Basic 21Days）．

9S-HODE, 13S-HODE に 加 え ，13S-HODE が ケ

High 21 Days），またはローバリア性の通常フィトン化した13―oxo-9Z, 11E-octadecadienoic acid

ルム（表記；Basic 21 Days）で15日間低温保存（13-KODE）が 検 出 さ れ た（Fig. 4B）。「と 畜 ６した食肉間で，酸化脂肪酸の生成量に有意差は認日目」と比べ，酸素ハイバリアフィルム（表記；

められなかった。リノール酸の13位のヒドロペル© The Ito Foundation

48

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Days of cold postmortem aging of meat
Slaughter

Carcass

6 days～21st day

Meat
block

Retail cutmeat～28th day•••Consumer
Retailer
Restaurants

Retail cut
meat
Conventional cold chain
New cold chain shown in this study
Fig. 5A new cold chain flow for Japanese Black cattle beef．
This study proposes a cold chain in which carcasses are cut into portions, followed rapidly by retail cutting and vacuum
packaging. This method promotes enzymatic lipid oxidation on the surface of beef by cutting early after slaughter. In addition,
packaging with oxygen barrier film is expected to retain freshness and reduce deterioration of meat quality．

オキシド化は，酵素的にはアラキドン酸リポキシ

態で輸出される。しかし，この包装形態は，広く

ゲナーゼ15に限られた反応である 。今回の条件

汎用されているが，輸送効率の低さ，解凍時のドは，日本式の熟成であるウェットエイジングに相リップロスなどのデメリットが存在する。食肉分当する。黒毛和種牛肉は，他の品種に比べて脂質野における食品廃棄を減らすには，生産から消費含 量 が 高 く ，13-KODE は「と 畜 ６ 日 目」で 約者に至るコールドチェーンの改善が必要である。

150pg/mg程度存在することが示された。本研究

黒毛和種牛肉は，日本の畜産物輸出の約５割を占課題の申請時は，低温保存中の脂質酸化を期待しめ，我が国の畜産振興における期待は大きい。黒ていたが，研究により，「と畜６日目」ですでに

毛和種牛肉の特徴である甘い香りは，酸化脂質の十分な脂質酸化が進んでいることが示唆された。

縮合反応によって生じるラクトンが寄与する。

10）

これらの結果を基に，生肉の酸素バリアフィル

本研究課題では，黒毛和種牛肉のプレミアム市

ム包装を用いた新しいコールドチェーンとして，場での価値を，さらに高めるため，香りと品質を枝肉からブロック肉を切り分けた後，速やかにリ両立させる新しい流通形態を提案するため，以下

テールカットと真空包装を行う生鮮食肉の加工にの研究を行った。まず，現在，海外を中心に新し最適な酸素バリアフィルム包装の新たな工程を提い包装形態として注目されているスキンパック包案する（Fig.５）。この工程では，と殺後早期に装を黒毛和種牛肉に導入し，肉色，味覚，ドリッ

カットすることで，牛肉表面の酵素による脂質のプに対する効果を検討した。その結果，スキン

酸化を促進することで香りの向上に加え，酸素バ

パック包装のフィルム素材によって，影響が確認

リア性フィルムで包装することで，食肉の鮮度保された。酸素バリア性能の高いフィルムでは，ミ

持や肉質の劣化を抑制することが期待される。

オグロビンによる還元により，肉色の低下が認め

４．要られたが，長期保存においては，酸素バリアフィ

約

ルム包装食肉で，食肉の旨味ロス，ドリップロス

牛肉は，通常，真空包装されたブロック肉の状の低減に有効であることが示唆された。

© The Ito Foundation

黒毛和種牛肉の香り特性の改善に関わる脂質過酸化反応系の解析

次に，真空包装した黒毛和種牛肉の低温保存が香りに与える影響について，ラクトン前駆体（ヒドロキシ脂肪酸）の生成により検討した。その結果，と殺後６日および21日の牛肉からリノール酸
由来のヒドロキシ脂肪酸の派生物である
9S-HODE，13S-HODE，13-KODEが検出された。
真空包装素材に用いる通常フィルムと酸素バリア性フィルムを比較したところ，ヒドロキシ脂肪酸に有意差は見られなかった。
今回の結果を踏まえ，生肉の酸素バリアフィル
ム包装を用いた新しいコールドチェーンとして，枝肉からブロック肉を切り分けた後，速やかにリテールカットと真空包装を行う工程を提案する。
文
献１） Karwowska, M., Łaba, S., Szczepański, K.：Food
Loss and Waste in Meat Sector-Why theConsumption Stage Generates the Most Losses?,
Sustainability, vol. 13, 2021．
２） Kaczmarska, K., Taylor, M., Piyasiri, U., Frank,
D.：Flavor and Metabolite Profiles of Meat, Meat
Substitutes, and Traditional Plant-Based HighProtein Food Products Available in Australia,
Foods（Basel, Switzerland）, 10（4），801，2021．
３） Matsuishi, M., Fujimori, M., Okitani, A.：Wagyu
beef aroma in Wagyu（Japanese Black cattle）beef
preferred by the Japanese over imported beef,
Nihon Chikusan Gakkaiho, 72（6），498～504，2001．
４） Ueda, S., Yamanoue, M., Sira,i Y., Iwamoto, E.：
Exploring the Characteristic Aroma of Beef from49

Japanese Black Cattle （Japanese Wagyu） via
Sensory Evaluation and Gas ChromatographyOlfactometry, Metabolites, vol. 11，2021．
５） Ramanathan, R., Suman, S. P., Faustman, C.：
Biomolecular Interactions Governing Fresh Meat
Color in Post-mortem Skeletal Muscle: A Review, J
Agric Food Chem, 68（46），12779～12787，2020
６） Dixit, Y., Hitchman, S., Hicks, T. M., Lim, P.,
Wong, C. K., Holibar, L., Gordon, K. C., Loeffen, M.,
Farouk, M. M., Craigie, C. R. et al.：Non-invasive
spectroscopic and imaging systems for predictionof beef quality in a meat processing pilot plant,
Meat Science, 181，108410，2021．
７） Ueda, S., Sasaki, R., Nakabayashi, R., Yamanoue,
M., Sirai, Y., Iwamoto, E.：Exploring the Lipids
Involved in the Formation of Characteristic
Lactones in Japanese Black Cattle, Metabolites,
11（4），203，2021．
８） Davis, K. E., Hickey, L. D., Goodpaster, J. V.：
Detection of ɣ-hydroxybutyric acid（GHB）andɣ-butyrolactone（GBL）in alcoholic beverages via
total vaporization solid-phase microextraction（TV-SPME） and gas chromatography-mass
spectrometry, J Forensic Sci, 66（3）,846～853, 2021．
９） Kang, W. R., Seo, M. J., An, J. U., Shin, K. C., Oh, D.
K.：Production of δ-decalactone from linoleic acidv i a 1 3 - h y d r o x y - 9（Z）- o c t a d e c e n o i c a c i dintermediate by one-pot reaction using linoleate
13-hydratase and whole Yarrowia lipolytica cells,
Biotechnol Lett, 38（5），817～823，2016．
10） Ueda, S., Hosoda, M., Kasamatsu, K., Horiuchi, M.,
Nakabayashi, R., Kang, B., Shinohara, M., Nakanishi,
H., Ohto-Nakanishi, T., Yamanoue, M., et al.：Production of Hydroxy Fatty Acids, Precursors of&gamma ; -Hexalactone, Contributes to theCharacteristic Sweet Aroma of Beef, Metabolites,
vol. 12，2022．

© The Ito Foundation

50

畜産副生物から作成された再生医療部材の引張強度の解明
Tensile strength of regenerative medicine components created fromlivestock by-products

神

田

英

輝

（名古屋大学大学院工学研究科）

Hideki Kanda（Graduate School of Engineering, Nagoya University）

In our previous FY2020 funded research report, we proposed a method for decellularizing
porcine and ostrich arteries using liquefied dimethyl ether（DME）instead of conventional
sodium dodecyl sulfate（SDS）to remove lipids, followed by DNA fragmentation with DNase. In
this study, the physical properties of porcine aorta and ostrich carotid artery decellularizedusing the combined DME and DNase method were evaluated by tensile strength testing.
Porcine aorta decellularized by the conventional SDS method was found to be threedimensionally swollen, very easy to fracture, and lacking in strength. On the other hand, theDME-treated samples were found to have lower elasticity, but the maximum stress required
for rupture was greater than that of the original aorta. This decrease in elasticity may be
attributed to the appearance of transient C＝N bonds due to the Schiff base reaction that
occurs during lipid removal by liquefied DME. To circumvent this problem, we used ostrich
carotid tissue, in which the Schiff base reaction does not occur, in a treatment method
combining DME and DNase, and found that decellularized tissue could be prepared thatretained its elasticity．

１．目

る１～12）。脱細胞化組織は，生体適合性と再生特性

的が他の非天然型人工組織より優れているため，広大動脈瘤，大動脈弁狭窄症，動脈硬化症は世界

く受け入れられている。再生医療において脱細胞的な死因の上位にあり，そのため動脈移植は主要化組織が大きな役割を果たすためには，脱細胞化

な分野となっている。しかし，動脈は生存に関わ組織の基本的な特性を解明する必要がある。特る重要な部位であるため，慢性的にドナーが不足に，機械的特性を理解することは，脱細胞化組織

しているのが現状である。そのため，人工血管をが血管の代わりとなることを可能にするために非使用することが多いものの，現在使用されている常に重要である。本研究では，従来法と新しい方人工血管にはかなりの限界がある。そこで，さま法で作製したブタ大動脈とダチョウ頸動脈の脱細ざまな組織や臓器のための新しいバイオマテリア

胞化組織の機械的特性を比較した。従来法はドデル と し て ，脱 細 胞 化 組 織 が 広 く 研 究 さ れ て い

シル硫酸ナトリウム（SDS）とDNase処理であ© The Ito Foundation

畜産副生物から作成された再生医療部材の引張強度の解明

51

り ，新 法 は 液 化 ジ メ チ ル エ ー テ ル（DME）と点は－24.8℃である17）。沸点が非常に低いため，

DNase処理である。

脂質を除去した組織内にDMEが残留することは最も単純でよく使われている脱細胞化法は，ない13，14）。また，水溶性であるため 18，19），乾燥のSDSによる脂質除去とDNaseによるDNA断片化

前処理を必要とせず，湿潤組織から容易に脂質をを組み合わせたものである。SDSは強力な洗抽出することが可能である。しかし，DMEは水浄剤であり，組織から脂質を効果的に除去すること部分混合するので18，19），組織から脂質を抽出すとができる。そのため，SDS処理後にDNase処理

る際に水も抽出される13，14）。

１～12）を施すと，DNAを効率的に断片化することがでこれまでの研究で，ブタ大動脈の場合には，液きる。しかし，SDSは食器洗いによる肌荒れの経

化DME処理後のブタ大動脈のコラーゲン線維は，

験のように組織に残留すると炎症を起こす物質で液化DMEによる脂質抽出工程の際の水分の除去あるため，脱細胞化組織から十分に除去する必要による脱水反応によりＣ＝Ｎ架橋構造が発生するがある。また，フィブロネクチン，グリコサミノ

ことが明らかになっている。液化DMEによる脂グリカン，プロテオグリカン，細胞外マトリック

質抽出工程でのシッフ塩基反応によって生じたＣスの調節因子や分泌因子は，SDSによる脱細胞化＝Ｎ架橋構造はDNase溶液で処理すると消失し，の際に失われやすい11）。

フーリエ変換赤外スペクトルは液化DME処理前

SDSを用いて脂質を除去することのこれらの問のオリジナルのブタ大動脈と実質的に同じになで，る13）。一方で，ダチョウ頸動脈の場合には脱水反SDSの代わりに液化DMEを溶媒として用いて組応によるＣ＝Ｎ架橋構造は発生しない14）。ブタ大織から脂質を除去する方法を提案した。その後の動脈に見られたような一時的な架橋構造の履歴

DNA分解工程にDNaseを併用することで動脈をが，脱細胞化組織の力学的変化をもたらすかどう

脱細胞化できる。この方法では，液化DMEを用かは不明である。そこで本研究では，従来のSDS

いた脂質除去を１時間，DNaseを用いたDNA分とDNase処理で作製したブタ大動脈とダチョウ頸解を３日間行った後，以下の三点の脱細胞化の成動脈の脱細胞化組織と，液化DMEとDNase処理

功の条件を満たした。１）ヘマトキシリン・で作製した脱細胞化組織の引張強度を測定し，脱エオジン染色した脱細胞組織の顕微鏡検査で細胞細胞化組織の破断・変形のしやすさを検討した。

題点を解決するために，我々は以前の報告

13，14）

15，16）

核 が 観 察 さ れ な い 。２）脱 細 胞 組 織 中 の 残 留
DNAが50ng/mg-dry以下。３）脱細胞組織中の２．方法

脱細胞化プロトコルは，１）液化DMEによる残留DNA断片が200bp以下。
液化DME処理は３つのステップを含む。簡単

脂質抽出，２）DNase処理，および，３）洗浄のに言えば，まず加圧下で液化DMEを用いて動脈

３つのステップで構成される。従来の方法との違から脂質を抽出する。次に，脂質を除去した動脈

いは，SDSの代わりにDMEを使用する最初のスにDNase溶液を用いてDNAを断片化する。最後

テップである。ステップ２と３は従来のSDS法とに動脈を水とエタノールで洗浄し，DNA断片を同じである。実験サンプルにはブタ大動脈（東京

除 去 す る 。こ の 手 順 は ，SDS の 代 わ り に 液 化

芝浦臓器，東京）とダチョウ頸動脈（小山ダチョ

DMEを使用する以外は，従来のSDS法と同じでウ園）を用いた。

ある。DMEは無毒な弱極性エーテルで，沸

13，14）© The Ito Foundation

52

令和４年度

2.1

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

れた組織を得た。

DME法

液化DME処理は，脱細胞化に関する先行研究

2.3

引張強度試験

の手順に従って行った13，14）。円筒カラムにサンプ

テンシロン万能試験機（SL-600，今田製作所，

ル を 充 填 し ，液 化 DME（Spray Work Air Can豊橋市）を用いて，オリジナルのサンプルと脱細420D, Tamiya, Shizuoka, Japan）を10（±１）
ml/

胞化サンプルの引張強度を調べた20）。各サンプル

minの流速で１時間注入した。その後，大動脈をは５mm/minの速度でひずみを与え７回の測定を

0.2 ％DNase 溶 液 （Roche Diagnostic, Tokyo,

行い，最も破断しやすいものと最も破断しにくい

Japan）中で４℃で７日間振盪した。これは，先結果を除外した，中間の５回の試験で得られた応の研究で基準を満たすために必要だった３日間の力曲線を平均化した。

条件よりもはるかに長く，脱細胞化を確実にする

３．

結果と考察

大動脈を80/20（v/v）エタノール／食塩水で３3.1

ブタ大動脈21）

日間洗浄した。

Fig.１は，DME法とSDS法から得られたブタ大ために行われたものである。DNase処理後，ブタ

2.2

SDS法

動脈の脱細胞化組織の外観を示したものである。

比較対象系として従来のSDS法では，サンプル比較のため，元のブタ大動脈組織の大きさも同じを0.1％エチレンジアミン四酢酸（ニッポンジー

縮尺で示した。SDS由来の脱細胞化組織は３方向ン株式会社，東京，日本）および0.1％SDSを含に15％膨潤しているのに対し，DME由来の脱細む10mMトリス-（ヒドロキシメチル）-アミノメ

胞化組織は元のサイズから７％縮小している。こタン緩衝液で室温で24時間洗浄し，リン酸緩衝食のことは，DME由来のブタ大動脈の脱細胞化組

塩水で３回洗浄した。その後，DME処理と同様

織にはタンパク質繊維が密に詰まっているのに対にDNase溶液で処理し洗浄することで脱細胞化さし13），SDS由来の組織にはタンパク質繊維の間に

（a）

（b）

R12.5

12.5
12.5

R8

20 25

75

25

4
12.5

10 mm

Fig.１ （a）Appearance of porcine aortas following decellularization.（b）Dimensions of the dumbbell-shaped die-cut（reproducedby the authors from the sales company literature21）．

© The Ito Foundation

53

畜産副生物から作成された再生医療部材の引張強度の解明

大きな隙間が見られるという先行研究の結果と一る25）。また，先述のようにSDS法では３次元的な致した６）。ここで，動脈は３層構造であることが膨張により，応力面の単位面積あたりの繊維数は先行研究により報告されている。最外層は，らせ

２１/（1.15）＝0.76倍に減少している。ここでFig.２

ん状に配列したコラーゲン繊維の太い束を主成分に示すように，SDSで脱細胞化したブタ大動脈のとする緩い結合組織に囲まれている。中層は平滑

最大応力は元の約40％であることも考慮すると，筋細胞，弾性線維とコラーゲン線維のネットワー

繊維１本あたりの強度は約52.6％（＝0.4/0.76）に

ク，および中層を円周方向に等方性の繊維補強ユ減少したことも分かる。

ニットに分離する弾性ラメラからなる。内層は主

これまでの研究で，血管の引張試験は応力の強に単層の内皮細胞，薄い基底膜，コラーゲン繊維

さによって３つの段階があることが知られていの内皮下層からなる。また，繊維は外層ではる。Fig.３のように，応力が小さい初期段階では，軸方向に近く，中層では円周方向に，内層ではこエラスチンに応力がかかり，コラーゲンにはほとの二つの方向の中間にあるので ，つまり全体とんど応力がかからない。応力が大きい後期段階でして血管を構成する繊維に大きな異方性は見られは，主にコラーゲンに応力がかかり，エラスチン

ず，SDS法で三次元的に等方的に拡張したことはに応力がかかりにくくなる。過渡期は初期と後期構造と整合する。

の中間で，まだエラスチンにかかる応力がコラー

22，23）

24）

ゲンよりも大きいが，応力の増分のほとんどはコ

Fig.２より，縦方向では，SDSまたは液化DME

ラーゲンにかかる20）。

で処理した脱細胞化組織は，同じ応力下で元のブタ大動脈より硬いことが分かった。DME処理でFig.３に示したような先行研究の知見に基づきは，破断に必要な最大応力が元のブタ大動脈に比Fig.２を考察すると，次のようなことが考えられ

べて増加し，強度は低下していない。しかし，る。まず，液化DMEによる脱細胞化のため，コSDSを使用すると，非常に弱い応力でも容易に破ラーゲンは弾性を失い，わずかな伸長でも大きな断した。このように，SDSによる脱細胞化が組織

応力がかかるようになる。この弾力性の低下は，の微細構造を変化させ，強い脂質の剥離効果と引DME処理時にシッフ塩基反応によるＣ＝Ｎ結合

き換えに細胞外マトリックスの生体力学的完全性が一時的に出現し，隣接するコラーゲン線維とのを損なうことを示した既往研究の知見と一致す

距離が短くなるためと考えられる。これにより，Stress（N/mm2）

0.6

Liqueﬁed DME

0.4

Original
SDS

0.2

0

0

10

20

30

40

50

Strain（%）
Fig. 2 Average strain-stress curves of porcine aortas in the longitudinal direction. Untreated refers to the aorta prior to
decellularization treatment. DME：dimethyl ether；SDS：sodium dodecyl sulphate21）．

© The Ito Foundation

54

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

StressCollagen

Elastin

Strain
Early phaseFig. 3

Transition phase

Later phase

Stress response properties of collagen and elastin when elongated21）.

10mm
SDS
Fig. 4DME

Photographs of ostrich carotid artery samples after decellularization and before die-cutting26）．

コラーゲン繊維のＣ＝Ｎ結合が発生していない部

3.2

位でも，隣接するコラーゲン繊維との分子間力がFig.４は，DMEとSDSを用いて得られたダチョ

強くなる位置に変化する可能性もある。また，

ウ頸動脈の脱細胞化組織である。SDS処理した組

DNase溶液処理によりＣ＝Ｎ結合が解消された後織は，長さ約6.5cm，幅約1.8cmで，元の組織とも，この位置変化が残っている場合がある。これ比較して長さ，幅ともに18～20％拡大した。一方，により，コラーゲン線維を引っ張ったときの動き

DME処理した組織は長さが約5.2cmとなり，元のが小さくなり，弾力性が損なわれる。また，コラー

組織から５％縮んだ。幅はほとんど変化しなかっ

ゲン繊維間の分子間力が増大することで，破断直たので，有意差は測定できなかった。これは，ブ前の最大応力が増大する。しかし，弾力性が失わタ大動脈で観察されたサイズ変化と同様であれるのは，血圧が上昇する動脈硬化と同様の現象

る 13）。これは，既往の研究で，DMEで処置されである。液状化DME処理後にシッフ塩基反応がたダチョウ頸動脈の脱細胞化組織を顕微鏡観察し起きないような動物由来の血管を使用すれば，柔たところタンパク質繊維で密に詰まっていたこと

軟性低下の問題は解決される可能性がある。

とも一致する14）。

© The Ito Foundation

ダチョウ頸動脈26）

55

畜産副生物から作成された再生医療部材の引張強度の解明
5Liqueﬁed DME

Stress（N/mm2）

43

Original

2
1
0

SDS
0

5

10

15

20

25

30

35

40

Strain（%）
Fig. 5

Average strain-stress curves of the ostrich carotid artery samples26）．

Fig.５は，長軸方向に切断したダチョウ頸動脈
組織の引っ張り強度試験の結果である。SDS処理

脱細胞化組織の柔軟性と強度を，脱細胞化前の元の組織のまま維持できる可能性がある。

した組織は，引張試験の途中までは元の組織やDMEで脱細胞化した組織と同様の応力応答を示したが，DME処理した組織が耐えた最大応力の半分で簡単に破断した。一方でDMEで処理した脱細胞化組織は，同じ応力下で元のダチョウ頸動
脈とほぼ同じ伸びを示し，すなわちブタの大動脈で見られるような動脈硬化様の変化を示さなかった。このことから，先述の推論，すなわちDME処理によるシッフ塩基反応がコラーゲン繊維の柔軟性を損なうメカニズムの妥当性が補強された。
４．要約

DMEによる脂質抽出とDNaseによるDNA断片化の組み合わせによる脱細胞化処理では，シッフ
塩基反応の発生の有無が脱細胞化組織の応力応答の変化に影響を与える可能性が示唆された。特にシッフ塩基反応が生じないダチョウ頸動脈では，脱細胞化組織の柔軟性と強度の両方が元のダチョ
ウ頸動脈とほぼ同じであり，きわめて力学特性に優れた脱細胞化組織が得られることが判明した。
将来的に，ダチョウ頸動脈にシッフ塩基反応が生じない理由を解明できれば，ブタ組織においても文
献１）
 White, J. K., Agnihotri, A. K., Titus, J. S., et al.：A stentless trileaflet valve from a sheet of
decellularized porcine small intestinal submucosa,
Ann Thorac Surg, 80，704～707，2005．
２）
 Korossis, S. A., Wilcox, H. E., Watterson, K. G., eta l . ：I n - v i t r o a s s e s s m e n t o f t h e f u n c t i o n a lperformance of the decellularized intact porcine
aortic root, J Heart Valve Dis, 14，408～421，2005．
３）
 Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S.
F.：Decellularization of tissues and organs,
Biomaterials, 27，3675～3683，2006．
４） Prasertsung, I., Kanokpanont, S., Bunaprasert, T.,et al.：Development of acellular dermis from
porcine skin using periodic pressurized technique,
J Biomed Mater Res Part B Appl Biomater, 85B,
210～219，2008．
５） Rosario, D. J., Reilly, G. C., Salah, E. A., et al.：Decellularization and sterilization of porcine
urinary bladder matrix for tissue engineering in
the lower urinary tract, Regen Med, 3, 145～156,
2008．
６） Funamoto, S., Nam, K., Kimura, T., et al.：The
use of high-hydrostatic pressure treatment todecellularize blood vessels, Biomaterials, 31, 3590～
3595，2010．
７） Flynn, L. E.：The use of decellularized adipose
tissue to provide an inductive microenvironment
for the adipogenic differentiation of humanadiposederived stem cells, Biomaterials, 31, 4715～
4724，2010．
８） Kajbafzadeh, A. M., Sabetkish, S., Heidari, R., et© The Ito Foundation

56

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

a l . ：T i s s u e - e n g i n e e r e d c h o l e c y s t - d e r i v e d
extracellular matrix: a biomaterial for in vivo
autologous bladder muscular wall regeneration,
Pediatr Surg Int, 30, 371～380，2014．
９） Wolinsky, H., Glagov, S.：Structural basis for thestatic mechanical properties of the aortic media,
Circ Res, 14，400～413，1964．
10） Hashimoto, Y., Funamoto, S., Sasaki, S., et al.：Preparation and characterization of decellularized
cornea using high hydrostatic pressurization forcorneal tissue engineering, Biomaterials, 31, 3941～
3948，2010．
11） Moffat, D., Ye, K., Jin, S.：Decellularization for
the retention of tissue niches, J Tissue Eng, doi：
10.1177/20417314221101151，2022．
12） Xing, Q., Yates, K., Tahtinen, M., et al.：Decellularization of fibroblast cell sheets for natural
extracellular matrix scaffold preparation, Tissue
Eng Part C Methods，21，77～87，2015．
13） Kanda, H., Ando, D., Hoshino, R., et al.：Surfactant-free decellularization of porcine aortic
tissue by subcritical dimethyl ether, ACS Omega,
6，13417～13425，2021．
14） Kanda, H., Ando, D., Oya, K., et al.：Surfactantfree preparation of an ostrich carotid artery
scaffold using liquefied dimethyl ether and DNase,
Arab J Chem, 14，103280，2021．
15） Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Hessel, N., etal.：Development of decellularized scaffolds forstem cell-driven tissue engineering, J Tissue Eng
Regen Med, 11，942～965，2017．
16） Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F.：
An overview of tissue and whole organ
decellularization processes, Biomaterials, 32, 3233～
3243，2011．
 Wu, J., Zhou, Y., Lemmon, E. W.：An equation of
17）
state for the thermodynamic properties of dimethyl
ether, J Phys Chem Ref Data，40，023104，2011．

18）
 Holldorff, H., Knapp, H.：Binary vapor-liquidliquid equilibrium of dimethyl ether-water andmutual solubilities of methyl chloride and water:
experimental results and data reduction, Fluid
Phase Equilib，44，195～209，1988．
19）
 Tallon, S., Fenton, K.：The solubility of water in
mixtures of dimethyl ether and carbon dioxide,
Fluid Phase Equilib，298，60～66，2010．
 Wu, P., Nakamura, N., Kimura, T., et al.：20）
Decellularized porcine aortic intima-media as apotential cardiovascular biomaterial, Interact
Cardiovasc Thorac Surg，21，189～194，2015．
 Kanda, H., Oya, K., Irisawa, T., Wahyudiono,
21）
Goto, M.：Tensile strength of porcine aorta
decellularized with liquefied dimethyl ether anddNase, ACS Omega，7，34449～34453，2022．
22） Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A.：Elastin
and collagen fibre microstructure of the humanaorta in ageing and disease: a review, J R Soc
Interface，10，20121004，2013．
23） Gasser, T. C., Ogden, R. W., Holzapfel, G. A.：
Hyperelastic modelling of arterial layers with
distributed collagen fibre orientations, J R Soc
Interface，3，15～35，2006．
24） Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., etal.：Determination of the layer-specific distributed
collagen fibre orientations in human thoracic andabdominal aortas and common iliac arteries, J R
Soc Interface，9，1275～1286，2012．
25） Xu, H., Xu, B., Yang, Q., et al.：Comparison of
decellularization protocols for preparing a
decellularized porcine annulus fibrosus scaffold,
PLoS One, 9, e86723，2014．
26） Kanda, H., Oya, K., Irisawa, T., et al.：Tensile
strength of ostrich carotid artery decellularizedwith liquefied dimethyl ether and DNase: An effort
in addressing religious and cultural concerns, Arab
J Chem，16，104578，2023．

© The Ito Foundation

57

食肉加水分解物の栄養機能について（Ⅱ）
Nutritional function of meat hydrolysates（Ⅱ）

竹之山

愼一・川北

久美子・六車三治男（南九州大学健康栄養学部）

Shinichi Takenoyama, Kumiko Kawakita and Michio Muguruma（Faculty of Health and Nutrition, Minami Kyushu University）

The objective of this research was to produce the drinkable meat powders and pellets.
The hydrolysate of chicken breast meat was prepared by digestion with food grade enzyme
protamex. In the previous study, we found that the hydrolysate of chicken breast meat showed
the high DPPH inhibition activity and high ACE inhibitory activity, and contained essential
amino acids and functional peptides such as BCAA. In this study, we conducted to discover
new physiological function of this hydrolysate. Dipeptidyl peptidase Ⅳ（DPP-Ⅳ）inhibitors are
expected to be categorized in a new type of antidiabetic drugs. The hydrolysate of chicken
meat pellet（CMP）showed the high DPP-Ⅳ inhibitory activity. Furthermore, the effects of
CMP on grip strength and anti-fatigue of young adults were investigated. CMP administration
significantly increased the grip strength and reduced the fatigue after exercise. Based on theirremarkable antioxidant activity, ACE inhibitory activity, DPP-Ⅳ inhibitory activity, grip
strength enhancing effect and anti-fatigue effect, we suggest that the CMP may have potential
applications as a functional food．
Functional peptide powder and pellet derived from chicken meat with excellent
digestibility and absorbability have been developed. CMP with a high protein score is now
easily available to the elderly, toddlers, undernourished people, people with masticatory andswallowing disorders and athletes anytime, anywhere.

１．目

本人の食事摂取基準（2020年版）では，サルコペ

的ニアおよびフレイルの発症予防を目的とした場

近年，高齢者はさまざまな理由で低栄養から筋合，高齢者（65歳以上）では少なくとも１g/kg

肉量・筋力の低下（サルコペニア）や虚弱（フレ

体重／日以上のタンパク質を摂取することが望まイル）になる問題が認識されている 。高齢者のしいと記述されている５）。タンパク質を食品としサルコペニアやフレイルの予防に，運動とともにて摂取する場合，必須アミノ酸組成がヒトの必要適切なタンパク質（アミノ酸）の摂取が重要であとするアミノ酸バランスに近く，十分に消化されることは，筋量，筋力，運動機能などを指標としるものであれば栄養価の高いタンパク質と言えた数多くの研究から明らかとなっているる。食肉は良質なタンパク質を多く含んでおり，

１）

。日

２～４）

© The Ito Foundation

58

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

健康や長寿には不可欠な食品である６）。

プチドを豊富に含むCMPを摂取した時の，運動

われわれは，2003年以来，食肉由来の血圧降下

負荷時の筋肉量・筋力増加効果や抗疲労効果につ作用を有するペプチドを単離・精製し，それらのいて検討した。得られた研究結果を報告する。

作用機作を明らかにしてきた。食肉の消化酵素分
解ペプチドにACE阻害活性があり，動物実験に

２．方法

おいて血圧降下作用や抗酸化作用を示す結果を得

2 . 1 各種食肉加水分解物や鶏肉加水分解物錠ており７～11），それらの研究を取りまとめ総説とし剤（CMP）を用いたジペプチジルペプチて報告している 。さらに，調理加工した食肉・ダーゼⅣ（DPP-Ⅳ）阻害活性の測定

12）

食肉製品を摂取した際にも，生の対照肉に比較し2.1.1てACE阻害活性や抗酸化活性を有する機能性ペ

和牛肩赤身肉，国産豚ロース肉，国産鶏むね肉

プチドの産生の程度が増加することを明らかにしを実験材料として使用した。なお，実験の目的にた 。また，高い血圧上昇抑制効果や抗酸化活性

合う新鮮な実験材料は，食肉専門店から購入した。

13）

実験材料

を有し筋肉で代謝される分岐鎖アミノ酸

2.1.2（BCAA）も豊富に含み，スポーツ栄養の分野に

食肉タンパク質の高度加水分解のため，ノボザも貢献できる鰹節菌で発酵した新規和風生ハムを

イム社の食品グレードのタンパク質分解酵素のプ完成させた 。そのような良質なタンパク質を持

ロタメックス（エンド型プロテアーゼ）を使用しつ食肉を「食べる食肉から飲む食肉」へと変換すた。各原料のミンチ肉に加水（３倍量の蒸留水添ることにより，いつどこでも気軽に摂取でき，し加）し，酵素を適量添加して撹拌しながら50℃でかも栄養価が高く生活習慣病予防効果も有する食

90分間反応させた。経時的（０，10，30および90

品素材を開発することを目的として，伊藤記念財

分後）に反応液を採取し100℃で２分間加熱して団令和３年度研究助成により研究・開発を行っ

酵素を失活させた。それらの加水分解物を冷却た。その結果，食肉（鶏むね肉）由来の高い抗酸後，ガーゼでろ過して得られたろ液を遠心分離作用や血圧降下作用を有しBCAAも豊富に含有す（5,000g，15分）し，その上清画分を液状化加水る機能性食肉加水分解物飲料，粉末や錠剤を開発

分解物（ミートドリンク）とした。鶏むね肉のプ

す る こ と が で き ，得 ら れ た 研 究 成 果 を 報 告 しロタメックス処理により作製された液状のチキン

15，16）

た

ミートドリンクの紛末化と錠剤化は，マルナカ

そこで本年度の研究では，食肉加水分解物に含フードにより行われた。なお，食肉加水分解物のまれる新たな生理機能の検索と鶏肉加水分解物錠

栄養機能解析のため，それらの試料を溶解し0.45

剤（CMP）を用いたヒトによる試験を実施した。

μｍメンブレンフィルター（アドバンティック東新たな生理機能検索として，各種食肉加水分解物

洋株式会社）でろ過したろ液を実験に用いた。

14）。

食肉の酵素処理やCMPを用いて血糖上昇抑制に関与するジペプ

2.1.3

チジルペプチダーゼⅣ（DPP-Ⅳ）阻害活性を測タンパク質の定量はBiuret法17）により行った。

定し，食肉加水分解物の血糖上昇抑制効果につい

すなわち，タンパク質溶液に対し，４倍量のBiuretて比較検討した。さらに若年女性を対象としたヒ試薬を加えて常温で30分間反応させた。反応液をトによる試験では，筋肉タンパク質合成に関与す

島 津 製 作 所（株）製 UV-VIS Spectrophotometer

るBCAAや抗疲労効果を有するイミダゾールジペ

1240型分光光度計（吸光度：540nm）にて測定し© The Ito Foundation

タンパク質の定量

食肉加水分解物の栄養機能について（Ⅱ）

た。また，分解物であるペプチドについてはUV
法59

2 . 2 CMPのヒトに対する筋肉量・筋力増加効
果や抗疲労効果解析を適用し，測定を行った。

18）

2 . 1 . 4 ジペプチジルペプチダーゼⅣ（DPP-

2.2.1

対象者

対象は健康な21歳女子大学生５名とした。本研Ⅳ）阻害活性の測定の方法に準究はヘルシンキ宣言の精神に則り，南九州大学倫

じて，
DPP-Ⅳ Inhibitor Screening Kit（Bio Vision

理委員会の承認を得るとともに，対象者に対し研社製，Ｋ780-100，MA，USA.）を用いて測定した。

究の説明を行い書面による同意を得られた学生に

2.1.2 の と お り 調 製 し た 各 種 食 肉 加 水 分 解 物 を実施した。

DPP-Ⅳ Assay Bufferにて10倍希釈し，供試試料

2.2.2とした。一方，鶏肉加水分解物錠剤（CMP）は

今回ヒトに対する試験に用いたCMPの栄養成

含有されるタンパク質量を勘案して，蒸留水で溶分（10粒（2.8g）当たり）は，熱量10.4kcal，タ

解したCMP溶液をDPP-Ⅳ Assay Bufferにて５，ンパク質が2.0g，脂質が0.1g，炭水化物が0.2ｇ，10，20倍に希釈し分析に供した。

食塩相当量が0.1gであった。日本人の体重分布か

DPP-Ⅳ阻害活性の測定は，関ら

19）

試験食

まず，DPP-ⅣEnzymeをDPP-Ⅳ Assay Buffer

らすると，その平均は男性70kg，女性55kgであを用いて所定の濃度に調整後，各ウエルに50μlる。１g/kg体重／日以上のタンパク質の摂取がずつ分注し，さらに各試料25μlを各ウエルに添

筋肉量の低下を予防することを考慮すると20），平

加して37℃で10分間反応させた。次に，合成基質

均で62.5gのタンパク質摂取が必要となる。今回（H-Gly-Pro-7- ア ミ ノ -4- メ チ ル ク マ リ ン）をのヒトを対象とした場合には平均体重が約52㎏で

DPP-Ⅳ Assay Bufferで所定の濃度に溶解して25あり，１日のタンパク質の摂取量が約52gとなり，μlを添加し，反応を開始した。蛍光プレートリー

約８％の量にあたる４gのタンパク質が摂取でき

ダ ー （Thermo Scientific Multiskan Microplateるよう設定した。

Spectrophotometer ，Finland）を 用 い て 励 起 波

2.2.3

長360nm，蛍光波長460nmで蛍光強度を30分間測コントロール期間を２週間（CMPの摂取はな定した。その間，検量線が認められる範囲で，任く通常の生活を行う），コントロール期間終了後，意の反応時間（T1，T2）に対応する蛍光強度

摂取期間を４週間とした（CMPは１日20粒摂取（RFU1，RFU2）を選択し，その差から単位時間

し，運動負荷した生活を行う）。CMP摂取は，平に対する傾きを算出し，以下の式にて，DPP-Ⅳ

日は朝食後と午後３時頃に運動負荷後に各10粒，阻害率（％）を算出した。なお，Sitagliptinを標

１日合計20粒摂取した。休日は同時間の摂取のみ準物質としてpositive control（PC）とし，DPP-とした。運動負荷については階段上り下り（大学Ⅳ Assay Bufferをnegative control（NC）として

内階段１～７階700歩程度２往復）と，ハンドグ算出した。得られたDPP-Ⅳの50％阻害活性が認

リップを握って手の開閉を両手それぞれ10回×３められる試料濃度をIC50値とした。

セットを行うよう指示した。また，摂取期間中は

阻害率
（％）＝
（（NCの傾き－各種加水分解物また は PC の 傾 き）
／ NC の 傾 き）
ｘ

試験プロトコール

１日8,300歩を目標に歩くよう推奨した。休日は各自で同様の運動を行うよう指示した。

100© The Ito Foundation

60

令和４年度

2.2.4

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

測定項目で評価した。

１ ） 体組成，握力

2.3

摂取開始前，摂取２週間後，摂取４週間後の体それぞれの値は平均値±標準偏差で表した。

組成はOMRON HBF-702T（オムロンヘルスケ

2.1.4の試験結果の解析については，一元配置分散ア株式会社）で計測した。握力はSMEDLEY’S

分析による多重比較を行い，５％未満の水準でサ

HAND DYNAMO METER（YAGAMI）を 使 用

ン プ ル の 効 果 が 有 意 で あ っ た 場 合（p<0.05）,

して，文部科学省

Tukey法による多重比較検定を行った。

新体力テスト実施要項（20歳～64歳対象）の握力測定方法に準じて測定した。
記録はkg単位とし，kg未満は切り捨て，左右それぞれ良いほうの記録を採用した。

３．結果と考察3 . 1 各種食肉加水分解物および鶏肉加水分解２ ） 活動量物錠剤がDPP-Ⅳ阻害活性に及ぼす影響

活動量はOMRON HJA-405T（オムロンヘルス
ケア株式会社）で計測した。
2.2.5

統計解析

用不足により血糖値が上がる病態である。とくにアンケート調査

２型糖尿病は，膵β細胞からのインスリン分泌障

主観的疲労感は摂取開始前と摂取４週間後に，
Chalder Fatigue Scale

糖尿病は，血糖値を低下させるインスリンの作害により発症し進展する疾患であり，膵β細胞のの質問項目を参考に疲労機能低下は２型糖尿病の発症に直結すると考えらの度合いを数値化した。質問項目は，１．疲れにれている。インスリン分泌を増強させるホルモン関して問題がありますか？

２．もっと休養が必のインクレチン（代表的なインクレチン：グルカ

３．眠気またはだるさを感じます

ゴン様ペプチド-1（GLP-1））を分解するDPP-Ⅳ

20）

要ですか？

５．

を阻害することでインスリンのコントロールが可

問題なく何かを始めても，それを続けているうち能となり，DPP-Ⅳ阻害薬が経口投与の可能な血に体が弱ってきますか？

６．行動力に欠けてい糖低下薬として開発されている 21，22）。DPP-Ⅳ阻

７．以前より筋力が衰えていますか？

害薬はDPP-Ⅳの基質と類似した構造を持つペプか？

４．何かを始めるのが困難ですか？

ますか？

８．身体が弱っていると感じますか？

９．集中

チ ド 型 と 非 ペ プ チ ド 型 が あ る が ，食 品 由 来 の10．物事を明確に考え

DPP-Ⅳ阻害はペプチド型と考えられる。そこで，るのが大変ですか？

11．話しているときに言い

各種食肉の加水分解に伴うDPP-Ⅳ阻害活性の発間違いをしますか？

12．的確な言葉を探すのに現様式を検索した。また，CMPのDPP-Ⅳ阻害活

するのに苦労しますか？

以前より苦労しますか？
か？

13．記憶力はどうです

14．以前は関心があったことに興味を持て

なくなりましたか？

性も比較検討した。
Fig.１に各種食肉を０～90分間プロタメックスの14項目とした。回答は質で処理することにより得られた加水分解物をそれ

問項目１を（ない，やや当てはまる，ある），13

ぞれ，和牛肩赤身肉（BM Hydrolysate），国産豚を（良い，やや悪い，悪い），それ以外の質問項

ロ ー ス 肉 （PM Hydrolysate）， 国 産 鶏 む ね 肉

目を（いいえ，やや当てはまる，はい）とし，そ（CM Hydrolysate）とし，それらのDPP-Ⅳ阻害

れぞれ３段階の得点を０～２点として集計した。

活性を示した。その結果，酵素による加水分解前

質問項目１～８を身体的疲労感，９～14を精神的のすべての生肉のコントロールではDPP-Ⅳ阻害

疲労感，１～14を総合的疲労感として合計スコア

活性は認められなかった。酵素により加水分解す© The Ito Foundation

61

食肉加水分解物の栄養機能について（Ⅱ）

DPP-Ⅳ inhibitory activity（%）

100
80
60
40
20
0

n

pti

gli

a
Sit

0

n

mi

10

n

mi

30

n

mi

90

n

mi

0

n

mi

10

n

mi

30

n

mi

90

PM Hydrolysate

BM Hydrolysate

n

mi

0

n

mi

10

n

mi

30

n

mi

90

n

mi

CM Hydrolysate

Fig.１ DPP-Ⅳ inhibitory activity of hydrolysates of beef, pork and chicken breast meat treated with protamex for 0, 10, 30 and 90
minutes. The times in the graph mean reaction time with enzyme. Associated graph shows the values of DPP-Ⅳ inhibition
percentage. Sitagliptin was used as a positive control（PC）as a standard substance, and DPP-Ⅳ assay buffer was used as anegative control（NC）.BM：beef meat, PM；pork meat, CM：chicken meat．

ると，加水分解処理時間に依存してDPP-Ⅳ阻害

度依存的にDPP-Ⅳ阻害活性が増加することも明

活性率は約40～70％へと増加した。加水分解の伸らかとなった。食品由来DPP-Ⅳ阻害ペプチドと長により経時的にDPP-Ⅳ阻害活性は高くなる傾しての効果的な濃度を検討することも今後の課題

向が認められ，タンパク質の低分子化が進み低分である。また，CM Hydrolysateの90min分解物

子量のペプチドが生成され，90分間の加水分解にとCMP×10が同等の約60％以上の阻害率を示しより70％の高いDPP-Ⅳ阻害活性を示すことが明た。CMPのタンパク質含量を勘案して溶解した

らかになった。90分間加水分解した牛肉，豚肉おことから，この両者はほぼ同様のタンパク質含量

よび鶏肉のDPP-Ⅳ阻害IC50 値はそれぞれ3.2mg/の条件下での測定結果である。CMPのDPP-Ⅳ阻

ml，3.4mg/ml，3.9mg/mlであった。食肉の種類

害IC50値は3.3mg/mlであった。これらのことは，による阻害活性の有意な相違は認められず３種の加水分解後噴霧乾燥させ，さらに錠剤化されても食肉においてほぼ同様に加水分解の時間とともに

DPP-Ⅳ阻害活性は保持されることが明確になっDPP-Ⅳ阻害活性が増加した。このことから，牛た。

肉，豚肉および鶏肉の加水分解物中の低分子量ペわれわれも，肝臓水解物がメタボリックシンド

プチドの増加に比例してDPP-Ⅳ阻害活性が発現

ロームモデル動物であるSHR-cpラットにおいてされることが明らかになった。

糖負荷後の血糖上昇の亢進を抑制する効果を認

CMP水溶液を調製し，前述の食肉加水分解物

め，肝臓水解物がインスリン抵抗性を改善する可と同様にDPP-Ⅳ阻害活性を測定した結果をFig.

能性を報告した23）。また，食事として摂取した食２に示した。その結果，濃度の低い20倍希釈溶液

品ペプチドによる血糖の制御の可能性も示唆されがDPP-Ⅳ阻害活性が低く，濃度の高い５倍希釈ている 24）。近年，DPP-Ⅳ阻害薬と同様の働きを溶液が80％以上のDPP-Ⅳ阻害活性率を示し，濃示す低分子ペプチドが発酵食品の納豆25）から見い© The Ito Foundation

62

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

DPP-Ⅳ inhibitory activity（%）

100
80
60
40
20
0

tin

lip

ag
Sit

BM

n

mi

90

n

mi

90

PM

CM

n

mi

90

20

P×

CM

Meat Hydrolysate

10

P×

CM

5

P×

CM

Hydrolyzed Pellet

Fig. 2 DPP-Ⅳ inhibitory activity of hydrolysates of beef, pork and chicken breast meat treated with protamex for 90 minutes andhydrolyzed chicken meat pellet（CMP）. The numerical value of CMP in the graph is the dilution ratio. Associated graphshows the values of DPP-Ⅳ inhibition percentage. Sitagliptin was used as a positive control（PC）as a standard substance,
and DPP-Ⅳ assay buffer was used as a negative control（NC）.BM：beef meat, PM；pork meat, CM：chicken meat．

だされ，そのIC50値は5.35±0.27mg/mlであると報労感の合計スコアは，摂取開始前が6.2±2.0，4.8

告 さ れ て い る 。ま た 最 近 ，食 品 の ソ バ か ら も±2.3，11.0±3.6，摂取４週間後が2.6±1.9，1.8±

DPP-Ⅳ阻害ペプチドが報告されている 。CMP

0.4，4.4±2.2であった。対象者の摂取開始前，摂に含有される高いDPP-Ⅳ阻害活性を有するペプ

取４週間後の総合的疲労感の合計スコアの変化を

チドの分画を行い，さらにはそれらのペプチドのFig.４に示す。摂取開始前と比べて摂取４週間後

精製や同定が今後の重要な課題である。

に体組成や筋肉量に変化は認められなかった。一26）

3 . 2 鶏肉加水分解物錠剤のヒトに対する筋肉

方，摂取開始前と比べて摂取４週間後に筋力（握量・筋力増加効果や抗疲労効果に及ぼす影力）の増加および疲労の軽減傾向が認められた。
本研究では，イミダゾールジペプチドやBCAA

響
若年女性を対象としたヒトによる試験では，筋を豊富に含むCMPを１日20粒（ペプチド４g）４

肉タンパク質合成に関与するBCAAや抗疲労効果

週間摂取し，運動負荷時の抗疲労効果や筋肉量増を有するイミダゾールジペプチドを豊富に含む

加効果等を明らかにすることを目的とした。運動

CMPを摂取した時の，運動負荷時の筋肉量・筋負荷は大学内での階段の上り下りとハンドグリッ

力増加効果や抗疲労効果について検討した。

プを使用しての握力強化運動とし，１日8,300歩

体 組 成 と 握 力 に つ い て ，対 象 者 の デ ー タ をを目標に歩くことを推奨した。CMP摂取量と運

Table１，摂取開始前，摂取４週間後の握力の変動負荷量については，日頃の栄養補助食品として化をFig.３に示す。活動量について，通常生活をの活用を考慮し，日常生活で気軽に取り入れるこ行うコントロール期間（２週間）および摂取期間とができ，かつ継続可能な量とした。

（４週間）の歩数はそれぞれ4677±1155歩，6996

その結果，摂取４週間後に握力の増加および疲±2493歩であった。疲労度に関するアンケートに労の軽減傾向が認められた。握力はハンドグリッ

ついて，身体的疲労感，精神的疲労感，総合的疲

プを握って手の開閉を両手それぞれ10回×３セッ© The Ito Foundation

63

食肉加水分解物の栄養機能について（Ⅱ）
Table 1 Changes in body composition, activity and grip strength before and after intake CMP.

Body weight
Body fat percentage

Grip strength

Before２weeks

４weekskg

52.1±3.852.3±3.652.1±3.8％24.7±3.525.3±2.724.9±3.1

kg/m２

21.3±2.3

21.3±2.2

21.2±2.2％

27.9±1.827.7±1.527.9±1.7Arms％

31.7±2.3

31.4±1.931.6±2.1

Trunk％

23.0±1.822.7±1.522.9±1.7

BMI
Body composition

Unit

Body muscle percentage
Body muscle percentage

Legs

％

40.3±1.539.9±1.0

40.2±1.6

Right hand

kg

30±７

31±７

34±６

Left hand

kg

30±４

28±５

31±６

CMP：hydrolyzed chicken meat pellet, BMI：Body Mass Index , Before：before intake CMP, 2 weeks：two weeks after intake

45

45

40

40

35

35

Grip strength
Left hand（kg）

Grip strength
Right hand（kg）

CMP, 4 weeks：four weeks after intake CMP. Values are means±SD．

30
25
20
15

30
25
20
15

10

10

5

5

0

Before2 weeks

0

4 weeks

Before2 weeks

4 weeks

Fig. 3 Comparison of grip strength and CMP intake pre- and post-intervention. CMP：hydrolyzed chicken meat pellet, Before：
before intake CMP, 2 weeks：two weeks after intake CMP, 4 weeks：four weeks after intake CMP. Individual data are
indicated by dotted lines. Mean values are indicated by solid lines. Error bars indicate standard deviation（ｎ＝５）．

トを毎日行ったため，両手ともに５名中４名に増より作製された液状のチキンミートドリンクを粉加が認められ，とくに利き腕の右手に増加が認め

末化し錠剤化したものであり，先行研究においてら れ た ．疲 労 度 に つ い て は ，主 観 的 疲 労 感

内因性抗酸化物質としての機能を有するカルノシ

は Chalder Fatigue Scale を 用 い て 検 討 し た。

ンが35mg/100g，アンセリンが102mg/100gと高Chalder Fatigue Scale は ，身 体 的 疲 労 感（８ 項

濃度に含まれることが分かっている。また加水分

目）と精神的疲労感（６項目）および総合的疲労解物錠剤10粒当たり，約2,000mgのペプチドやア感（14項目）で判断される。CMP摂取４週間後

ミノ酸が含まれており，うち遊離アミノ酸や遊離には５名中全員に身体的疲労感と精神的疲労感おイミダゾールジペプチドとして存在する成分が約よび総合的疲労感の低下が認められた。今回摂取

７mg，残りの1,993mgが固体状のほぼ同様の組

したCMPは，鶏むね肉のプロタメックス処理に成のペプチドやアミノ酸として存在すると想定さ© The Ito Foundation

64

General fatigue level score

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

16錠中アンセリン換算で0.12g相当）７日間摂取さ14せた時の運動能力，視力，疲労感に及ぼす影響に12

ついて検証した試験では，アンセリンとクレアチ

10ニンの相乗効果で運動機能の向上に寄与した可能8性を示唆している。また，眼精疲労や運動後のだ

6

るさ感といった疲労感などの低下も認めていた。

4

アンセリンやカルノシンなどのイミダゾールペ

2プチドには抗疲労効果や抗酸化作用，血糖値調節0

Before作用などさまざまな生理機能が認められている。

4 weeks

Fig. 4 Change in general fatigue level score from baseline tothe post of the 4 weeks intervention period．
CMP：hydrolyzed chicken meat pellet , Before ： before
intake CMP, 4 weeks ： four weeks after intake CMP.
Individual data are indicated by dotted lines. Mean values areindicated by solid lines. Error bars indicate standard deviation（ｎ＝５）．

今回使用したCMPは鶏むね肉のプロタメックス
処理により，高分子量のタンパク質が，分解後は約6,800から240までの分子量のペプチドやアミノ酸にまで低分子化されたものであるため15），20粒（ペプチド４g）が摂取後効率よく吸収され，これらが疲労の軽減傾向に寄与した可能性が考えられた。

れ，高い抗酸化活性やACE阻害活性を発現する

委縮した筋肉の回復において，ホエイペプチド

多くのペプチドを含んでいる可能性が示唆されては，ホエイタンパク質と比較し，より優れた効果

いる15，16）。

を示すことが認められている29）。鶏肉抽出物の摂杉山ら27）のスポーツサプリメントとしての卵白

取は，中高年の筋力の向上に効果があることも報

ペプチドの抗疲労効果を検証した試験では，大学告されている30）。また，ロイシン高含有アミノ酸駅伝チームの強化合宿（９日間）期間中に卵白ペ混合物が，運動後の筋合成促進作用および筋肉痛

プチドを7.5g／日摂取したところ，厳しいトレー軽減作用を有するとの報告がある31）。鶏むね肉加

ニングによる心筋や骨格筋あるいは内臓組織への水分解物に豊富に含まれているイミダゾールジペ

ダメージの軽減や疲労度の軽減傾向が認められてプチドは，抗酸化作用，緩衝作用，抗疲労作用のおり，卵白ペプチドの強い抗酸化力との関連を示

ほか記憶機能改善効果32）や高齢者において摂取量唆している。また，吸収速度においてペプチドのが減少するイミダゾールジペプチド顆粒状の食品

ほうがタンパク質よりも有効であるため，激しいを介して補うことにより，加齢により低下する記トレーニング後の消化吸収能が低下しているアス

憶機能を改善できることも報告されている33）。本

リートのための成分栄養食としては，タンパク質研究で開発したCMPは，BCAAやイミダゾール

よりもペプチド態のものを用いたほうが良いとしジペプチドなど吸収性に優れた良質なペプチドやている。

アミノ酸を豊富に含有することから，上記のよう

また，寺沢らの大学陸上競技部の中・長距離

28）

なさまざまな効果も期待される。

種目を専門とする健常な男子大学生９名に対し

本研究では，抗酸化作用や血圧降下作用のほかて，サケ肉を原料として調製されたアンセリンを血糖調節作用を有する機能性ペプチドが豊富に含豊富に含むアンセリン含有エキスを１日９錠（９まれていることが確認された。さらに，ヒトに対© The Ito Foundation

食肉加水分解物の栄養機能について（Ⅱ）

65

する試験でCMP摂取による筋力増強効果や抗疲摂取前と比べて摂取４週間後に筋力（握力）の増労効果も明らかになった。今後，CMPに含まれ加および疲労の軽減効果が認められた。CMPにる抗酸化ペプチド，ACE阻害ペプチドやDPP-Ⅳ

は，BCAAや抗疲労効果を有するイミダゾールジ阻害ペプチドの精製と同定を行う必要がある。さペプチドが豊富に含まれており，１日20粒（ペプ

らにヒトによるCMP摂取試験で，血糖上昇抑制

チド４g）の摂取で効率よく吸収され，これらが効果を明らかにすることが今後の検討課題である。

疲労の軽減傾向に寄与した可能性が示唆された。
本製品はペプチドで，タンパク質含量が調整さ

約

４．要れ，消化と吸収性に優れており，さらに多くの生

本年度の研究では，食肉加水分解物に含まれる

理機能を有する食肉由来の機能性タンパク質錠剤

新たな生理機能の検索と鶏肉加水分解物錠剤が開発された。これにより，プロテインスコアの（CMP）を用いたヒトによる試験を実施した。新

高い食肉タンパク質を，高齢者，幼児，低栄養者，

たな生理機能検索として，各種食肉加水分解物や咀嚼・嚥下障害者そしてアスリートがいつどこでCMPを用いて血糖上昇抑制に関与するジペプチ

も手軽に利用できるようになった。

ジルペプチダーゼⅣ（DPP-Ⅳ）阻害活性を測定
し，食肉加水分解物の血糖上昇抑制効果について比較検討した。さらに，若年女性を対象としたヒトによる試験で，筋肉タンパク質合成に関与する
BCAAや抗疲労効果を有するイミダゾールジペプ
チドを豊富に含むCMPを摂取した時の，運動負荷時の筋肉量・筋力増加効果や抗疲労効果について検討した。
牛肉，豚肉，鶏肉を90分間食品用の酵素プロタ
メックスで処理することにより得られた加水分解
物はいずれも約70％の高いDPP-Ⅳ阻害活性を示した。牛肉，豚肉および鶏肉のDPP-Ⅳ阻害IC50
値はそれぞれ3.2mg/ml，3.4mg/ml，3.9mg/mlであった。CMP水溶液も濃度依存的にDPP-Ⅳ阻害
活性が増加し，５倍希釈溶液が80％以上の高い
DPP-Ⅳ阻害活性を示した。CMPのDPP-Ⅳ阻害
IC50値は3.3mg/mlを示し，加水分解後噴霧乾燥させ，さらに錠剤化されてもDPP-Ⅳ阻害活性は保持されることが明確になった。若年女性を対象としたヒトによる試験でCMPを摂取した時の運動
負荷時の筋肉量・筋力増加効果や抗疲労効果について検討した結果，摂取前と比べて摂取４週間後に体組成や筋肉量に変化は認められなかったが，

文
献１）
 葛谷雅文：日本内科学会雑誌，104，2602～2607,
2015．
２） Cruz-jentroft, A. J., Sayer, A. A.：Lancet, 293,2636～2646，2019．
３） Hoogendijk, E. O., Afilalo, J., Ensrud, K. E., Kowal,
P., Onder, G., Fried, L. P.：Lancet, 394, 1365～
1375，2019．
 藤田倶子，菱田知代，丸山加寿子：日本看護科学
４）
会誌，40，422～429，2020．
５） 厚 生 労 働 省：「日 本 人 の 食 事 摂 取 基 準（2020 年版）」策定検討会報告書，2019．
 六車三治男：食肉の保健的機能性，健康あれこれ
６）
栄養ふむふむ，南九州大学健康栄養学部開設10周年記念コラム集（南九州大学健康栄養学部編著），pp.
62～65，鉱脈社，宮崎，2015．
 Katayama, K., Tomatsu, M., Fuchu, H., Sugiyama,
７）
M., Kawahara, S., Yamauchi, K., Kawamura, Y.,
Muguruma, M.：Animal Science Journal, 74, 53～
58，2003．
 Katayama, K., Tomatsu, M., Kawahara, S.,
８）
Yamauchi, K., Fuchu, H., Sugiyama, M., Kawamura,Y., Muguruma, M.：Journal Agriculture and Food
Chemistry, 52, 771～775，2004．
 Katayama, K., Jamhari., Mori, T., Kawahara, S.,
９）
Miake, K., Kodama, Y., Sugiyama, M., Kawamura,Y., Nakayama, M., Maruyama, M., Muguruma, M.：
Journal of Food Science，72，702～706，2007．
10）
 Katayama, K., Anggraeni, H. E., Mori, T.,
Ahhmed, A. M., Kawahara, S., Sugiyama, M.,
Nakashima, T., Maruyama, M., Muguruma, M.：
Journal of Agriculture and Food Chemistry, 56, 355～360，2008．

© The Ito Foundation

66

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

 Muguruma, M., Ahhmed, A. M., Katayama, K.,
11）
Kawahara, S., Maruyama, M., Nakamura, T.：Food
Chemistry，114，516～522，2009．
 六車三治男：日本暖地畜産学会報，55，85～91，
12）
2012．
13）
 六車三治男，川北久美子，竹之山愼一：南九州大学研究報告，51，9～15，2021．
14）
 六車三治男，川越聖人，木本早紀，川北久美子，竹之山愼一，中村豊郎：日本暖地畜産学会報，65，
85～92，2022．
15）
 竹之山愼一，川北久美子，六車三治男：令和３年
度食肉に関する助成調査報告書，（公財）伊藤記念財団，40，49～57，2022．
 Takenoyama, S., Yamauchi, M., Kawakita, K.,
16）
Nakamura, T., Muguruma, M.：Japanese Journal ofMeat Science and Technology, Vol.63, Special Issue,
p298，2022．
 Gornal, A. G., Baradawill, C. J., David, M. M.：
17）
Journal of Biological Chemistry, 177, 751～766,
1949．
18）
 Murphy, J. B., Kies, M.W.：Biochimica etBiophysica Acta，45，382～384，1960．
 関英治，小塚美由記，米田（和田）実央，村尾咲
19）
音，山根拓也，荒川義人，大久保岩男，藤原佳史：
日本補完代替医療学会誌，15，21～28，2018．
20）
 Chalder, T., Berelowitz, G., Pawlikowska, T.,
Watts, L., Wessely, S., Wright, D., Wallace, E. P.：
Journal of Psychosomatic Research, 37（2）,147～
153，1993．

21）
 Holst, J. J., Deacon, C. F.：Diabetes, 47, 1663～
1670，1998．
22）
 Drucker, D J.：Current Pharmaceutical Design,
7, 1399～1412，2001．
 井上尚典，日髙修二，三浦直良，山田耕太郎，深23）
堀勝博，丸山眞杉，河原聡，太田一良，六車三治男：
YAKUGAKU ZASSHI，133，117～123，2013．
 比良徹：化学と生物，55，296～298，2017．
24）
 Sato, K., Miyasaka, S., Tsuji, A., Tachi, H.：Food
25）
Chemistry，261，51～56，2018．
26）
 星野弘二，徳岡昌文，小山翔大，井上博文，高橋
公 咲：日 本 食 品 化 学 学 会 誌 ，29（3），156～163 ，
2022．
 杉山喜一，栗城大輔，松岡亮輔，増田泰伸，久能27）
昌朗，大後栄治：日本食品科学工学会誌，67（8），245～256，2020．
28）寺沢なお子，棟田裕一，高橋義宣，小尾麻菜，椎名康彦：日本水産学会誌，80（4），601～609，2014．
29） 小林敏也：Milk Science，61，277～280，2012．
30）
 佐藤三佳子，松前公彦，高畑能久，森松文毅，佐藤雄二：日本食品科学工学会誌，59，182～185，
2012．
 Kato, H., Miura, K., Nakano, S., Suzuki, K., Bannai,
31）
M., Inoue, Y.：Amino Acid, 48, 2145～2155，2012．
32）
 片倉善範：化学と生物，57，596～600，2019．
33） 久恒辰博：化学と生物，54，892～900，2016．

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67

豚のオス臭を形成する臭気成分の分析とそれを記述する用語の同定
Analysis of volatile components that form the scent of male pigs andidentification of terms that describe them

河

原

聡

（宮崎大学農学部）

Satoshi Kawahara（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Pork obtained from uncastrated male pigs was subjected to chemical analysis of maleodor-related substances, volatile component analysis, and extracting terminology related toodor by panel test. Based on these results, we aimed to clarify the characteristics of odors
emitted from male pigs and their perception by humans．
As a result of the quantification of tryptophan metabolites such as indole in subcutaneousfat, male pork contained higher concentrations of tryptophan metabolites than castrated pork.
However, their concentrations were below the detection threshold in meat. Esters werecharacteristically detected in raw male pork when analyzing volatile compounds related tomeat aroma. Alcohols and alkanes caused by lipid oxidation were detected in the cooked meat.
However, we could not confirm the relationship between the proportion of these substances
and the sex of pigs. From the panel test results, it was suggested that the heated male pork
has a weak pork-like flavor and a high frequency of sour flavor. However, it was alsosuggested that it is difficult to distinguish between male pork and castrated pork due to thesmell of raw meat. In addition, it was confirmed that male pork is less palatable than castrated
pork. From the above results, it was considered that quality control of the taste part isessential when male pork is used as a raw material for meat products．

１．目

臭はトリプトファンの代謝物であるスカトールや的インドール，あるいはステロイド代謝物であるア

食肉・食肉製品から発生するオフフレーバーはンドロステノンが原因であると報告されてい製品の食味を著しく低下させる要因となる。なかる１）。一方，獣臭を検知された食肉・食肉製品中

でも「獣臭」と表現されるオフフレーバーの発生からは必ずしもこれらの物質が多量，すなわちヒは消費者にも容易に知覚され，製品の商品価値をトの知覚閾値を超える量ほどに検出されないこと

大きく損なう一因であると考えられる。

もあり，食肉製造における品質管理を難しくして「獣臭」は，その用語が連想させるイメージかいると推測される。

ら「オス臭」と関連付けられることが多い。オス

近年，とくにヨーロッパにおいて，動物福祉へ© The Ito Foundation

68

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）の配慮から外科的去勢を避ける傾向があり，自己

ち，HPLC分析に供した。HPLCは島津社製（LC-

免疫により性成熟を阻害する免疫去勢が代替法と10A）を用いて，分析条件は以下のとおりとした。

して普及し始めている。しかし，免疫去勢法は去カラム：ODS Hypersil® （Thermo 社， 150 ×

勢の成否に個体差があり，去勢が不十分な個体に由来する食肉にはオス肉の特徴が残ってしまうこ

4.6mmID，粒径５μm）
移動層：0.1％酢酸水溶液：テトラヒドロフラとが課題である。

ン＝65：35（v：v）

そこで本研究では，無去勢のオス豚から得た豚

流速：１ml/min

肉についてオス臭関連物質の化学分析，揮発性成

分離温度：40℃

分分析および官能検査による臭気に関する用語抽

検出：蛍光検出器（励起波長：285nm，蛍光波出を行い，オス豚から発生する香気およびヒトに

長：340nm）

よる認知の特性を明確にすることを目標として実

定量：内部標準法

施することとした。

2.3

２．方
2.1

揮発性物質の分析

試 料 か ら の 揮 発 性 物 質 は MonoTrap® （GL法

Sciences社製，DCC18）を用いたヘッドスペース材料

法 お よ び solvent-assisted flavor evaporation

本試験は宮崎大学動物実験規則を遵守して行わ（SAFE）法３）により回収した。これらの方法でれた。供試動物は，宮崎大学農学部附属フィール

回 収 し た 揮 発 性 物 質 は GC-MS（Agilent 7890B

ド科学教育研究センター住吉フィールドで生産さ

GC，5977ＡシリーズGC/MSD）により分析した。

れたLWD種非去勢雄豚４頭および去勢豚４頭を分析条件は以下のとおりとし，炭素数８から20の用いた。供試豚は２腹から体重の近い個体を選抜

飽和炭化水素を標準物質として算出したKovats

し，平均体重が等しくなるように配置した。これ

RIおよびマススペクトルのHit率に基づきピーク

らの供試豚は，おがこ式豚舎で自家配合飼料を飽の同定を行った。

食給与，自由飲水で群飼育し，体重約105kgで出

カラム：DB-WAX®（Agilent Technology社，荷した。分析および官能評価には，各と体右半丸60ｍ×0.25mmID，膜厚0.25mm）から採取したロース肉を供し，使用まで－60℃でキャリアガス：ヘリウム

冷凍保存した。

線速度：30cm/min

2.2

トリプトファン代謝物の定量

カラム温度：40℃，５min→４℃/minで240℃

ロース肉周囲より採取した皮下脂肪の内層部分まで昇温→240℃，20min保持に つ い て ，イ ン ド ー ル お よ び ス カ ト ー ル を

気化室温度：240℃

Hansen-Møller（1994）の手法

検出器温度：250℃

２）に準じて測定した。細断した脂肪組織１gをテフロン・ホモジナ

試料導入：スプリットレス

イザー（バイオマッシャーSP，ニッピ社製）に

2 . 4 官能評価用語の抽出とCATA法による官精秤し，内部標準（2-methyindole）のメタノー

能評価

ル溶液を３ml加え，ホモジネートを調製した。

官能評価用語の抽出は，大学生285名を対象とホモジネートを250×g，４℃で５分間遠心分離するアンケートにより行った。具体的には，日本

し，その上清を0.45μmフィルターで濾過したの

工業規格に収載されている官能評価分析用語およ© The Ito Foundation

豚のオス臭を形成する臭気成分の分析とそれを記述する用語の同定

69

び学術論文で使用されている官能評価用語から香引き続きアンケートにて回答した。喫食順によるりに関する形容詞を100語選び，「肉の香り」を表

回答のバイアスを除くため，２種類の試料はラン現する用語として相応しいと考える用語をすべてダムに提供した。

回答させた。アンケートの集計結果に基づいて15

３．結果と考察語を選定し，本研究における「香りの記述子」とした。

皮下脂肪内層のインドールおよびスカトールを官 能 評 価 は Check-All-That-Apply（CATA）

Table１に示す。インドール，スカトールともに

法 により，去勢豚肉とオス豚肉の組み合わせを

オス豚肉で高値を示す傾向が認められ，インドー

１セットとして同一日に実施し，これを４セット

ルでは統計学的な有意性（p＜0.05）が認められ行った。事前に市販のキット（Open Essence，

た。インドールおよびスカトールの平均的な検知

富士フイルム和光純薬社）を用いて嗅覚同定力を閾値は鼻先香で1000ng/g肉，口中香で250ng/g肉確認した大学生25名（男性12名，女性13名）によと報告されている５）。このことを踏まえると，本り実施した。厚さ５mmに切り分け，個包装にし研究で用いたオス豚肉は，香りや風味が劣化する

た後に，85℃に設定した水浴中で60分加熱した後レベルのインドールおよびスカトールを含有してに流水で粗熱をとり，60℃の恒温器中で保温したはいなかった。

４）

肉試料をパネルに提示した。パネルは，包装を開去勢豚肉およびオス豚肉で検出された揮発性成封してただちに鼻先香を嗅ぎアンケートに答え，分の要約をTable２からTable４に示す。生肉のさらに肉を咀嚼・嚥下する間に感知した口中香をヘッドスペース分析において検知された主な化合

Table 1 Indole and skatole content in adipose tissue
Male

Castrated

p value＊(ng/g lipid)
Indole63.9 ± 12.5

38.0 ± 11.3

0.022

Skatole87.1 ± 55.9

43.5 ± 14.9

0.218

Data was shown as average ± standard deviation.
＊ Result of Welch’s t-test

Table 2 Summary of olthonasal aromatic compounds from raw meat （% of totalcompounds determined）

Aromatic hydrocarbones

MaleCastrated

p values＊

4.52 ± 1.10

3.73 ± 1.25

0.382

Aldehydes

2.33 ± 0.47

2.57 ± 0.44

0.492

Ketones

5.53 ± 1.97

4.02 ± 0.86

0.230

Alkanes

15.1 ± 2.6

14.7 ± 2.2

0.818

Alcohols

25.7 ± 4.6

19.0 ± 5.5

0.111

Esters

0.670 ± 0.410

1.69 ± 0.38

0.022

Others46.1 ± 8.5

54.7 ± 8.8

0.209

Data was shown as average ± standard deviation.
＊ Result of Welch’s t-test© The Ito Foundation

70

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 3 Summary of orthonasal aromatic compounds from cooked meat（% of totalcompounds determined）

Male

Castrated

p values＊

Aromatic hydrocarbones

7.52 ± 2.54

5.48 ± 2.08

0.262

Aldehydes

7.47 ± 6.36

6.75 ± 5.56

0.870

Ketones

7.66 ± 2.70

5.58 ± 1.95

0.262

Alkanes

16.7 ± 6.1

14.1 ± 5.7

0.561

Alcohols

12.0 ± 4.9

7.35 ± 4.50

0.207

Esters1.68 ± 0.69

0.956 ± 0.559

0.187

Others46.9 ± 14.2

60.0 ± 11.6

0.207

Data was shown as average ± standard deviation.
＊ Result of Welch’s t-test

Table 4 Summary of retronasal aromatic compounds from cooked meat（% of totalcompounds determined）

Aromatic hydrocarbones

MaleCastrated

p values＊

12.7 ± 11.4

4.85 ± 1.60

0.261

Aldehydes

1.60 ± 0.66

1.65 ± 1.48

0.950

Ketones

2.07 ± 1.64

2.71 ± 1.84

0.619

Alkanes35.8 ± 15.1

35.9 ± 20.5

0.990

Alcohols

1.07 ± 0.03

14.8 ± 21.4

0.381

Esters

0.408 ± 0.224

0.815¶－

Others47.1 ± 5.43

43.5 ± 20.3

0.753

Data was shown as average ± standard deviation.
＊ Result of Welch’s t-test¶ The standard deviation could not be calculated because it was detected in only one sample.

物はアルコール類であり，ついでアルカン類の割

nonadecaneがオス豚肉に高い割合で検出された。

合が高かった。また，エステル類の割合は低かっ

アルコール類やアルカン類は加熱により発生する

たものの，有意差が認められた（Table２）。検出

典型的な脂質酸化物である。しかしながら，溶媒された主要な化合物はisopropyl myristateであっ抽出した試料については，試料のばらつきが大きた。エステル類の多くは特徴的な芳香をもつ。今く，性別間の際を議論するのは困難であると考え後，未加熱肉中のエステル類とオス豚肉の獣臭とられた。この点については，溶媒抽出からSAFEの関連性を検討する必要があると考えられた。

法による分析試料精製のプロセスを最適化する必

加熱肉のヘッドスペース分析においても，アル要がある。

コール類およびアルカン類が主要な化合物と同定

オス豚肉および去勢豚肉各４検体およびされた（Table３）。これらの中では，オス豚肉にCATA法による官能評価において典型的に検知

おいて1-heptanolおよび1-nonanolなどが比較的された記述子はmeaty（豚肉らしい），roasty（香高い割合で検出された。一方，肉試料から溶媒抽ばしい），sweet（甘い），sour（酸っぱい），blood-

出した揮発性成分については，主にアルカン類がlike（血液のような），gamey（野生獣のような），検出された（Table４）。アルカン類の中では，

fatty（脂っぽい）の７項目だった（Fig.１）。オ© The Ito Foundation

71

豚のオス臭を形成する臭気成分の分析とそれを記述する用語の同定
Male

Number of panels

50

Castrated

orthonasal

retronasal

50

40

40

30

30

20

20

10

10

0

Raw maet

Cooked meat

During
Masticating

meatyroastysweet

blood-like

gamey

fatty

After swallowing

0

orthonasal

Raw maetsour

retronasal

Cooked meat

During
Masticating

meatyroastysweet

blood-like

gamey

fatty

After swallowing
sour

Fig.１ Number of panels that selected each descriptor related to odors that are characteristically recognized in sensory evaluation

ス豚肉は，鼻先香と口中香のいずれについても，好まれる傾向が認められたことから，オス豚肉を豚肉らしい香気が弱く，酸性の刺激臭を感じる頻

食肉製品原料などに使用する場合，食味部分の品度が高いようであった。また，加熱した際に野生質管理が重要であると考えられた。

獣のような風味を感じる頻度が高くなるなどの特徴も認められたが，いずれの記述子の選択頻度に

４．要約

ついても，オス豚と去勢豚の間で統計学的に有意無去勢のオス豚から得た豚肉についてオス臭関な差異は認められなかった。一方で，同時に調査

連物質の化学分析，揮発性成分分析および官能検した嗜好性の評価に関して，口中香についてオス

査による臭気に関する用語抽出を行った。これら

豚肉に比較して去勢豚肉が有意に好ましいと評価の結果から，オス豚から発生する香気およびヒトされた（ｔ検定における有意確率は鼻先香p＝による認知の特性を明確にすることを目標とした。

0.449，口中香p＝0.003）。このことは，パネルが皮下脂肪のトリプトファン代謝物を定量した結オス豚肉と去勢豚肉の風味の違いを検知している

果，去勢豚肉と比較してオス豚肉はインドールなことを示唆している。以上のことは，今回の検討

どのトリプトファン代謝物を高い濃度で含有してにおいてオス豚肉（あるいは去勢豚肉）の香りをいた。しかし，それらの濃度は食肉における検知

表現する適切な記述子を選定できなかったと考え

閾値より低かった。食肉の香気に関連する揮発性るのが妥当であり，さらなる検討が必要である。

化合物を分析すると，生のオス豚肉からはエステ

以上の結果から，オス豚肉と去勢豚肉から発生

ル類が特徴的に検出された。加熱肉では脂質酸化する揮発性化合物には差異があり，少なくとも両に起因するアルコール類やアルカン類が検出され者を同時に喫食した場合には，消費者はそれらのた。しかし，それらの含有割合について去勢との異なる風味を検知できることが示唆された。食味

関連性は確認できなかった。官能検査の結果から性の観点からは，オス豚肉より去勢豚肉のほうがは，加熱したオス豚肉において豚肉らしい香りが© The Ito Foundation

72

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

弱く，酸っぱい香りを感じる頻度が高いことが示唆された。しかし，生肉の臭いによりオス豚肉か去勢豚肉かを判別は難しいこともあわせて示唆された。また，去勢豚肉と比較して，オス豚肉は嗜好性が低いことが確認された。以上の結果から，
オス豚肉を食肉製品原料などに使用する場合，食味部分の品質管理が重要であると考えられた。
文献１） Briyne, N. D., Berg, C., Blaha, T., Temple, D.：Pig
castration: will the EU manage to ban pig
castration by 2018?, Porcine Health Management,
2：29，1～11，2016．

２）
 Hansen-Møller, J.：Rapid high-performanceliquid chromatographic method for simultaneous
determination of androstenone, skatole and indole
in back fat from pigs, Journal of Chromatography B,
661，210～230，1994．
３）
 Engel, W., Bahr, W., Schieberle, P.：Solventassisted flavour evaporation - a new and versatiletechnique for the careful and direct isolation ofaroma compounds from complex food matrices,
European Journal Food Research and Technology,
209，237～241，1999．
４） 今村美穂：記述型の官能評価／製品開発におけるQDA法の活用，化学と生物，50，818～824，2012.
 宮崎大学：免疫去勢による国産豚国際競争力強化
５）
事業実績報告書，2021．
URL：https://www.miyazaki-u.ac.jp/ags/bunner/
e797a8f3ca125e048d48299f9881dee93c12f005.pdf© The Ito Foundation

73

細菌のファージ感受性増大およびスーパーファージ
作製に関する研究
Studies on phage sensitivity improvement and superphage construction

宮

本

敬

久

（九州大学大学院農学研究院）

Takahisa Miyamoto（Faculty of Agriculture, Kyushu University）

To investigate the involvement of dnaK gene product on the phage resistance ofEscherichia coli BW25113, myricetin and quercetin which have been reported to interact to
DnaK, were used. After pretreatment for 6 h with

500μM myricetin, the viable counts of E.

coli was 1.0 log lower than that of control after phage S127 BCL3 addition. Moreover, theregrowth of the phage resistant cells of E. coli was retarded only in the cells pretreated withmyricetin. The viable counts were 1.18 and 2.1 log lower than that of the cells without
myricetin at 9 and 12 h, respectively. Furthermore, the cells pretreated with 500μM quercetin
showed the highest susceptibility to phage, and viable counts at 9, 12 and 15 h were 1.4, 1.4 and2.7 log lower than those of the cells without quercetin, respectively．
To investigate the involvement of priA gene product on the phage resistance of E. coli
BW25113, kanamycin, and chloramphenicol, which have been reported to inhibit the function of
PriA were used. The combined use of phage S127 BCL3 and chloramphenicol at 2 or ５μM
increased the phage susceptibility of E. coli and retarded the regrowth of the phage-resistantcells. Kanamycin showed the similar effects. The combined effect of the phage andchloramphenicol was confirmed on E.coli O157 : H ７．
For the preparation of multi-tailed fiber phages, the tail fiber genes of phage ECP52 will
be isolated and transformed into phage T4 genome by a genome editing system using
CRISPR-Cas9. The receptors for ECP52 in E. coli were examined. As a result of comparing
the infectivity against 11 types of outer membrane protein gene-deletion andlipopolysaccharide synthesis gene-deletion mutants, the infectivity of the phage against
ΔompR and ΔwaaC and ΔompF mutants was lower than that against BW25113. This suggeststhat OmpR, WaaC and OmpF proteins are important for infection by the phage ECP52．

１．目が多く，特に腸管出血性大腸菌，サルモネラやカ的ン ピ ロ バ ク タ ー を 原 因 と す る 食 中 毒 は ，飲 食

腸管出血性大腸菌やサルモネラ等の食中毒細菌

チェーン店の食事や焼き肉，ユッケ，焼き鳥，鳥による健康危害（食中毒）が国民に不安を与えて刺しなどのような食肉や加工品を原因として発生いる。これらの食中毒は，食肉を原因とすること

し て い る 。さ ら に ，Extended Spectrum Beta-© The Ito Foundation

74

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Lactamase（ESBL）-産生大腸菌，牛の乳房炎の性により一本鎖領域を出現させると，そこに複製原因菌である黄色ブドウ球菌の多剤耐性化など，装置を再動員する３）。カナマイシンおよびクロラ

広範な抗生物質に耐性な食中毒細菌（人畜共通感

ムフェニコールはタンパク質合成阻害剤であり，染症の細菌）の割合も増えてきており，感染者のそれぞれリボソームサブユニット30Ｓ，50Ｓの阻治療において大きな問題となっている。これは家害が主な作用点であるが，PriAとSSBの結合を阻畜の飼育においても大きな問題である。この解決

害することも報告されている４）。さらに，本研究にバクテリオファージ（以降ファージ）の利用が室ですでに単離している複数種の細菌に感染でき期待されており，欧米ではすでに食中毒細菌を溶るファージについて，細菌のファージレセプター

菌するファージが食品に使用されている。さらにを認識するスパイクタンパク質の遺伝子を同定

利用拡大のためには，ファージに感染した細菌がし，ファージに導入する。これにより，複数の耐性化する「ファージ耐性化」を克服する必要がファージレセプターを認識できるスーパーファーある。

ジの構築を試みる。本研究により，ファージ耐性

著者らは，過去の本財団助成研究において，約化の抑制法が開発され，さらに広範囲の食中毒細4000株の大腸菌の遺伝子欠損株ライブラリーにつ菌種に感染して溶菌するスーパーファージ作製のいてファージ感受性を調べてファージ感受性の向可能性が示されると，将来，Ready-to-eat食品

上および耐性化に関与する遺伝子を10種同定してならびに食肉製品の安全性向上に大きく貢献するいる。本申請研究では，これらの遺伝子のうち，だけでなく，抗生物質に依存しない人畜共通感染

dnaKおよびpriA遺伝子産物の機能阻害に基づい症の治療法開発など畜産業への貢献も期待される。

た細菌のファージ感受性増強について検討した。
dnaKは，分子シャペロンとして機能するDnaKをコードする遺伝子である。DnaKはDnaJおよびGrpEとともにタンパク質のフォールディング，

２．方法

2 . 1 dnaKおよびpriA遺伝子産物の阻害物質とファージの併用効果

またはさまざまなストレスによって生じる変性タ

ミリセチンとファージの併用効果について検討

ンパク質や凝集タンパク質のリフォールディングした。まず，E. coli BW25113懸濁液に種々の濃機能を有することが報告されている 。In vitro

度のミリセチン溶液を添加して37℃で培養し，培において，植物ポリフェノールのミリセチンは大養開始６時間目にファージS127 BCL３を接種し腸菌のDnaKの機能を阻害することが報告されてて培養を続け，ファージ接種後，経時的に生菌数いる ことから，ミリセチンとファージの併用効測定を行って効果を検討した。

１）

２）

果について調べた。また，PriAは停止した複製

ま た ，E. coli BW25113 菌 液 に フ ァ ー ジ S127

フォークを認識し，解離した複製装置を再構築しBCL３とPriA阻害物質を同時に添加し，０，３，て複製を再開させるタンパク質である。PriAは

６，
９，24時間目に培養液中の生菌数を測定して3’OH基が露出した二本鎖DNAを持つ複製フォー

その効果を評価した。抗生物質は最小生育阻止濃ク や ， ラ ギ ン グ 鎖 が Single-Stranded DNA

度ならびにその半量程度で添加した。

Binding Protein（SSB）でコーティングされた一さらに，タンパク質合成阻害剤であるがPriA

本鎖DNAを持つ複製フォークなどを認識し，そとの相互作用を示さないテトラサイクリンについの後必要に応じてPriAのATPase／ヘリカーゼ活ても対照として同様に実験を行った。

© The Ito Foundation

細菌のファージ感受性増大およびスーパーファージ作製に関する研究

75

2 . 2 ファージレセプターの同定（マルチレセプ

た結果，Fig.１に示すようにミリセチンで６時間

ター認識スーパーファージ作製の基礎検討）

前処理した大腸菌にファージを添加した場合の生E. coli BW25113培養液と1.0×10９PFU/mlとな

菌数は6.9log CFU/mlと，親株と比べて生菌数はるように調整したECP52ファージ（研究室保有

1.5log低かった。また，終濃度500μＭのミリセチ

ファージ）溶液を100μlずつLB液体培地５mlに添ン で ６ 時 間 処 理 し た 菌 体 の 生 菌 数 は 約９log

加して37℃で一晩振とう培養した。この培養上清

CFU/mlであった。MOIが約0.1という低い値であをECP52ファージ溶液として試験に用いた。E.

るが，ミリセチンとの併用により，未処理に比べcoli BL21 （DH3）， BW25113， ΔompA， Δてファージ接種により生菌数を２log減少させる

ompC，ΔompF，ΔompG，ΔompL，ΔompN，ことができた。ミリセチンによる最適処理濃度にΔompR， ΔompT， ΔOmpX， ΔwaaC，

つ い て 検 討 し た 結 果（Fig. １），フ ァ ー ジ 接 種

ΔrfaG，ΔrfaLをそれぞれ含む軟寒天を重層した

10，12時間後，親株の生菌数はそれぞれ8.1およLB寒天培地にECP52ファージ溶液をスポットしび5.3log CFU/mlであった。一方，ファージ接種て37℃で一晩培養後，形成されたプラーク数を測

10，12時間後，終濃度500μＭのミリセチンで６定した。ファージ調製に用いた宿主に対するプ

時間処理した大腸菌の生菌数はそれぞれ6.4およラ ー ク 形 成 能 力 EOP（Efficiency of plating）を

び4.3log CFU/mlであった。ミリセチンで処理す基準（EOP＝１）として，それぞれの株に対することで，ファージ接種10，12時間後の生菌数は，るEOPを算出した。

親株と比べてそれぞれ1.5および1.0log減少した。
終濃度500μＭのミリセチンで処理した大腸菌

３．結果と考察はdnaK欠損株と同様の性質を示すことが知られ

3 . 1 dnaK遺伝子産物の阻害物質とファージの併用効果ている５）。In vivoにおいて，dnaK欠損株では細菌の集合体であるバイオフィルムが形成されず，

ミリセチンによる最適処理時間について検討しバイオフィルム形成に必要なカーリせん毛の合成

Viable counts（log CFU/ml）

10
9
8
7
6
5
4
3
2

0

4

8

12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60
Incubation time（h）

Fig. 1 Effect of pre-treatment（6 h）of myricetin on phage susceptibility of E. coli BW25113
E. coli BW25113 was pretreated with myricetin at 0μM （○）， 200μM （△）， and 500μM （□）for 6 h. Phage S127 BCL3
was added to the culture containing myricetin at 0μM（●），200μM（▲），and 500μM（■）at MOI≒0.5．The values are
the mean±S.D. for three separate experiments.

© The Ito Foundation

76

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）が抑制される。ミリセチンで処理した大腸菌はミ５μＭではファージ単独処理と比較して1.1log低リセチン濃度依存的にバイオフィルムの形成が抑かった。

制され，終濃度300μＭのミリセチンで処理する

クロラムフェニコールでは，同時処理（Fig.

とカーリせん毛合成が抑制される。また，DnaK2B）６時間目における生菌数が終濃度２μＭでは熱ショックタンパク質として知られている 。

1.6log，終濃度５μＭで1.7log低く，９時間目におこのことから，大腸菌は44℃のような最適温度よける生菌数は終濃度２μＭで2.3log，終濃度５μり も 高 い 温 度 に 対 す る 耐 性 が あ る 。し か し ，Ｍで3.3log低かった。しかしファージ添加24時間

dnaK欠損株は44℃では生育できない。さらに，後には，いずれの濃度でもファージ単独処理と同抗生物質の一種であるバンコマイシンはグラム陽程度にまで生菌数は増加した。終濃度５μＭの場性細菌に抗菌作用を示すが，グラム陰性細菌には合は，ファージ添加３時間目から９時間目にかけ抗菌作用を示さない。これはグラム陰性細菌の外て生菌数が検出下限未満となった。またいずれの膜がバンコマイシンの菌体内への透過を阻止する濃度でも，ファージ添加24時間後においても生菌ためである。しかし，dnaK欠損株は50μg/ml以数はファージ単独処理より低いままであった。し

上の濃度のバンコマイシンで処理すると，感受性

かし，テトラサイクリンとファージとの併用処理を示す。一方，終濃度500μＭのミリセチンで処では，ファージの溶菌活性の増大および耐性菌の理した大腸菌も同様に44℃で生育できず，バンコ

増殖抑制は認められなかった（Fig. 2C）。PriAは

マイシン感受性を示す。したがって，終濃度500

ファージ耐性化機構であるCRISPR-Casシステム

μＭのミリセチン処理菌体はdnaK欠損株と同様のadaptationフェーズ（prime型）にも関与し，の性質を示していると推定される。dnaK欠損株

Cascade-crRNA複合体とDNAの結合により生じ

においてファージ感受性が高くなった原因についるＲループと呼ばれる構造をRecGとともに認識ては，さらにdnaK欠損株の表現型を調べて考察し，その構造を取り除く。それによりssDNA領する必要があると考えられる。

域が露出することでCas1-Cas２複合体がDNAに

６）

3 . 2 priA遺伝子産物の阻害物質とファージの近づき，複数回DNAを切断することでスペーサーを獲得する７，８）。これより，PriAの機能を阻害す

併用効果
PriA 阻 害 の 可 能 性 が 報 告 さ れ て い る 物 質 とることはCRISPR-Casシステムのスペーサーの獲

ファージの併用によるファージの殺菌効果の増大得を阻害することにつながり，その結果として耐および耐性菌集団の増殖抑制の可能性について検性菌の出現を抑制した可能性も考えられる。

討した。

3 . 3 E. coli BW25113 野 生 株 由 来 の ECP52 にカナマイシンとの同時処理（Fig. 2A）では，

よるプラーク感染効率（EOP）の評価

ファージ＋カナマイシン添加後６時間目におけるマルチレセプター認識スーパーファージ作製の生菌数がファージ単独処理に比べて，カナマイシ

基礎的検討として，ファージECP52が宿主に吸着

ン終濃度２μＭで0.7log，終濃度５μＭで1.4log低する際に関連があると予想される外膜タンパク質

かった。９時間目における生菌数は終濃度２μＭ

やリポ多糖と感染効率との関係性について検討しで0.5log，終濃度５μＭで1.8log低かった。終濃度

た。E. coli BW25113野生株を宿主としてECP52

２μＭでは24時間後に生菌数はコントロールと同を調製し，11種類の外膜タンパク遺伝子欠損株と程度まで増加した（≒10 CFU/ml）が，終濃度リポ多糖合成遺伝子欠損株に対するEOPを比較

９© The Ito Foundation

Viable counts（log CFU/ml）

細菌のファージ感受性増大およびスーパーファージ作製に関する研究（A）Kanamycin

10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

Viabl counts（log CFU/ml）

77

3

6

9
12
15
Incubation time（h）

18

21

24

（B）Chloramphenicol

10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

3

6

9

12

15

18

21

24

Viable counts（log CFU/ml）

Incubation time（h）（C）Tetracycline

10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

3

6

9

12

15

18

21

24

Incubation time（h）
Fig. 2 Effect of PriA inhibitors on phage susceptibility of E. coli BW25113

E. coli BW25113 was incubated with（filled symbols）and without（open symbols）phage S127 BCL3（MOI＝１）（A）in the presence of Kanamycin at０ （○ ， ●）， ２ （△ ， ▲）and５ （□ ， ■） μM,（B）in the presence ofChloramphenicol at０（○，●），２（△，▲）and５（□，■）μM, and（C）in the presence of Tetracycline at０（○，●），0.5（△，▲）and１（□，■）μM. Values are means±SD for 3 separate experiments

した。その結果，Fig.３に示すように外膜タンパ

ECP52が感染する際にOmpRとWaaCが重要であク遺伝子ΔompRとLPS合成酵素遺伝子ΔwaaCにり，OmpFも関与していることが示唆された。こ

お い て ，EOP は 野 生 株 と 比 較 し て ４ 桁 ほ ど ，の結果からECP52は吸着の際にLPSのinner coreΔompFにおいて２桁ほど低下した。以上から，領域を主たる標的とし，外膜タンパクのOmpFも© The Ito Foundation

78

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

10Relative EOP

1
0.1
0.01
0.001
0.0001

Δ

W
T
om
pA
Δ
om
pC
Δ
om
p
Δ F
om
pG
Δ
om
pL
Δ
om
p
Δ N
om
p
Δ R
om
Δ pT
om
pW
Δ
om
p
Δ X
w
aa
C
Δ
rfa
G
Δ
rfa
L
BL
21

0.00001

Host strain
Fig. 3 Eficiency of plating for E. coli phage ECP52 against various E. coli mutants

吸着の際に利用していることが示唆された。

リセチン（500μＭ）で６ｈ前処理した後，大腸

OmpCとOmpFは膜貫通タンパクで，外膜中に親菌ファージS127BCL3を添加したところ，未処理

水性低分子物質に対する透過孔を形成していに比べてファージ添加後10，12ｈの生菌数がそれる９）。OmpCは高い浸透圧のときに働き，OmpF

ぞれ約1.5，1.0log CFU/ml低かった。PriAの機能は低い浸透圧のときに働く。また，OmpRは，浸阻害の可能性が報告されているクロラムフェニ

透圧制御や正の転写調節因子として環境の変化を

コ ー ル ，カ ナ マ イ シ ン に つ い て フ ァ ー ジ

感知するセンサータンパク質から情報を受け取っ

S127BCL3とともに大腸菌BW25113株に混合してて 機 能 遺 伝 子 の 発 現 を 調 節 す る 10）。こ れ よ り

継時的に生菌数を測定した。その結果，これらのΔompRでは下流のompFなどの発現量が減少し併用処理により，培養３時間後には生菌数が検出たことで，ECP52の吸着が阻害され，EOPの低

限界未満まで低下した。さらに培養９時間後の生

下につながったと考えられる。

菌数は，ファージ単独処理に比べて，２μmol/l

４．要のクロラムフェニコールの併用では1.8log，２μ約mol/lのカナマイシンとの併用では0.8log低かっ

溶菌ファージを用いた細菌制御法確立のためにた。これらの物質とファージの併用により，医療は，細菌のファージ耐性化を克服する必要があ

や畜産，食品などさまざまな分野においてファーる。これまでの研究で細菌のファージ耐性化，感ジの利用拡大が期待される。さらに，テールファ受性に関与する遺伝子を10種同定している。本申イバー遺伝子を複数持つ大腸菌ファージECP52に

請研究では，これらの遺伝子のうち，dnaKおよ

ついて，大腸菌欠損株への感染効率を比較した。

びpriA遺伝子産物の機能阻害に基づいた細菌のその結果，外膜タンパク遺伝子ompR欠損株とリファージ感受性増強について検討した。まず，

ポ多糖合成酵素遺伝子waaC欠損株において，DnaKの機能を阻害することが報告されているミ

EOPは野生株と比較して４桁ほど，ompF欠損株© The Ito Foundation

細菌のファージ感受性増大およびスーパーファージ作製に関する研究に お い て ２ 桁 ほ ど 低 下 し た 。こ の こ と か ら ，ECP52が感染する際にOmpRとWaaCが重要であり，OmpFも関与していることが示唆された。
文献１） Mayer, M. P., Bukau, B.：Hsp70 chaperones:
cellular functions and molecular mechanism,
Cellular and molecular life sciences, 62（6）, 670～
684，2005．
２） Chang, L., Miyata, Y., Ung, P. M., Bertelsen, E. B.,
McQuade, T. J., Carlson, H. A., Gestwicki J. E.：
Chemical screens against a reconstituted
multiprotein complex: myricetin blocks DnaJ
regulation of DnaK through an allostericmechanism, Chemistry & biology, 18（2）， 210～
221，2011．
３） Windgassen, T. A., Wessel, S. R., Bhattacharyya,
B., Keckc, J. L.：Mechanisms of bacterial DNA
replication restart, Nucleic Acids Research．46（2），504～519，2018．
４） Liu, S., Alnammi, M., Ericksen, S. S., Voter, A. F.,
Ananiev, G. E., Keck, J. L., Hoffmann, F. M.,
Wildman, S. A., Gitter, A.：Practical model selection
for prospective virtual screening, Journal ofChemical Information and Modeling, 59（1）, 282～
293，2019．
５） Arita-Morioka, K. I., Yamanaka, K., Mizunoe, Y.,
Ogura, T., Sugimoto, S.：Novel strategy for biofilm

79

inhibition by using small molecules targeting
molecular chaperone DnaK, Antimicrobial agentsand chemotherapy, 59（1），633～641，2015．
６） Bertelsen, E. B., Chang, L., Gest, J. E., Zuiderweg,
E. R.：Solution conformation of wild-type E. coli
Hsp70（DnaK）chaperone complexed with ADP
and substrate, Proceedings of the National Academyof Sciences, 106（21），8471～8476，2009．
７） Fineran, P. C., Gerritzen, M. J. H., Suárez-Diez, M.,
Künne, T., Boekhorst, J., Hijum, S. A. F. T., Staals, R.
H. J., Brouns, S. J.：Degenerate target sites mediate
rapid primed CRISPR adaptation, Proceedings of
the National Academy of Sciences, 111（16）,e1629-e1638．
８） Ivančić-Baće, I., Cass, S. D., Wearne, S. J., Bolt,
E.L.：Different genome stability proteins underpin
primed and naïve adaptation in E. coli CRISPRCas immunity, Nucleic Acids Research, 43（22）,10821～10830，2015．
９） Pienaar, J. A., Tobias, A. S., Barnard, G.：The
viable but non-culturable state in pathogenic
Escherichia coli : A general review, AOSIS, African
Journal of Laboratory Medicine, 1～9，2016．
10） K o ndo , H ., N a ka ga w a , A ., N i s hi hi r a , J .：Escherichia coli positive regulator OmpR has alarge loop structure at the putative RNA
polymerase interaction site, Nature PublishingGroup，29～31，1997．

© The Ito Foundation

80

近赤外光と偏光，AIを組み合わせた食肉中の虫および異物検知技術の開発（Ⅱ）
Detecting foreign object in meat using near-infrared light with polarization
and artificial intelligence（Ⅱ）

山

口

堅

三

（徳島大学ポストLEDフォトニクス研究所）

Kenzo Yamaguchi（Institute of Post-LED Photonics, Tokushima University）

We successfully detected organic foreign objects in ham using a combination of nearinfrared light and polarization-based near-infrared imaging. This method demonstrated thesuperiority of polarization in reducing stray light noise and accurately locating the foreign
objects compared to a non-polarization-based reference sample inspection. Firstly, weevaluated a near-infrared imaging method at a wavelength of 850 nm using cartilage toaccommodate the diversity of foreign objects and explored techniques to enhance the reliabilityof the inspection. Additionally, we addressed the issue of noise by applying filtering techniques,
which improved the detection accuracy by removing unwanted noise from the images. We also
investigated light imaging methods at different wavelengths to capture detailed information
about the properties, light absorption, and scattering behavior of the foreign objects, leading toan increased detection rate. Furthermore, we reevaluated the polarization degree and camera
installation angles, which improved the accuracy of imaging and analysis, resulting in highquality foreign object detection images. Finally, we focused on constructing a dataset suitable
for machine learning, collecting imaging data and analysis results, and using them to train
machine learning algorithms, thus achieving automation and efficiency in foreign object
detection．

例が85件（全体の５％）報告されている。異物の的

１．目

種類別では，ゴキブリやハエなどの昆虫が最も多食品中に異物が混入する問題は，ソーシャル

く，次いでカッターや針金などの金属片，さらにネットワーキングサービスを通じて迅速に広まは毛髪や爪といった人由来のものが続く。注目すり，メディアで取り上げられている。2014年度にべきは，これらの異物の大半が有機物であり，な

国民生活センターへの相談内容を参考にすると，

かにはプラスチックや紙，骨，小動物の死骸や羽，報告された1,852件の異物混入事例のうち，食品糞なども含まれていたことである。

の種類別では調理食品が最も多く，穀物や菓子類

現在，食品製造現場では金属検出機やＸ線検査へと続く 。その中でも，肉に関する異物混入事機が導入されているが，これらは金属や石などの１）© The Ito Foundation

近赤外光と偏光，AIを組み合わせた食肉中の虫および異物検知技術の開発（Ⅱ）

無機物を検出することに特化しており，虫や毛髪

81

する。

などの有機物や小骨の検知には十分ではない。そ伊藤記念財団令和３年度研究助成において実施のため，検査員の目視検査による手作業で最終確した近赤外光異物検知法を用いて，ロースハムに認を行っているが，異物の完全な除去には至って混入した異物（天然ゴムラテックス製の手袋片）

いない。

を撮像し，その後の画像解析により，目視では確

本研究では，食品中の有機異物を検知する光技認できない異物を検知することに成功した。ま術の開発を目的とした。独自に開発した異物検知ず，偏光Pにより，試料と異物の光吸収の差から技術として，近赤外領域の光源とその波長感度を

透過光量が変化し，赤身と脂身，そして異物を確持つカメラとの間に，２枚の偏光子を試料の前後認した。また，肉厚などによる光学的不均一も鮮に配置した光学系を用いて，食品中の有機異物を明に撮像された。次に，偏光Cでは，本来透過し検知する（Fig.１参照）２）。Fig.１に異物検知画像

ないはずの光が試料を介して偏光を解消し，偏光を得るシステムを示した。ここで，２枚の偏光子

子Aを透過する偏光成分（散乱光）を撮像した。

の透過軸を平行（parallel以下，P）と直交（cross

これにより，透過光量が少なくても画像Pと異な

以下，C）ニコルのそれぞれに配置した。偏光Pる試料の情報を得たと考える。最後に，画像Pとでは，試料からの正透過光と異物による光散乱の画像Cの差分を演算処理することで，ノイズ成分

影響を受け，その一部の散乱光が第２の偏光子を取り除き，異物のみを抽出した異物検知画像を（analyzer以下，A）を透過する。一方，偏光Cで得た（Fig.１参照）。以上の結果から，光制御とは，試料からの正透過光はAで除去され，原理上画像処理を組み合わせることで食肉中の有機異物

その透過光は０となる。しかし，先と同様に，異を検知することに成功した。

物による光散乱の影響を受けた光のみがAを透過

検知像

P

カメラ
／レンズ

C

透過軸を90°回転

第2偏光子
（A）

試料台
(食品)
透過軸を固定

第1偏光子

光源

検査光
透過軸

Fig. 1

独自開発した近赤外光異物検知法と，ロースハム中のゴム手袋片の検知© The Ito Foundation

82
２．方

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

い。偏光Pにより，試料と異物の光吸収差から透法

過光量の変化を観察し，赤身と脂身，異物をそれ

先の近赤外光異物検知法では，ハムの肉厚や脂ぞれ確認した。また，肉厚による光学的な不均一

身などの要素や異物の多様性による判定条件の不も明確に撮像された。偏光Cでは，通常は透過し確実性が課題となっていた。そこで本研究では，ない光が試料を介して偏光を解消し，偏光子Aを

これらを改良し，より高精度な検査を実現した。

透過する散乱光成分を撮像した。これより，少な

具体的には，異物の多様性を対応するために，直い透過光量でも画像Pと異なる試料情報を得るこ

径 5.8mm ，厚 さ 2.9mm の 軟 骨 を 使 用 し ，波 長とができた。その後，画像Pと画像Cを差分演算

850nmにおける近赤外光異物検知法を評価した。

処理することで，ノイズ成分を取り除き，異物の次に，ノイズの問題に対処するために，フィルタみを抽出した異物検知画像を生成した。以上の結処理の適用を検討した。また，波長940nmと波長

果から，近赤外光異物検知法を用いて食肉中の軟630nmの異なる波長におけるノイズの除去も検証

骨を検知することに成功した。

した。さらに，本技術の中核となる要素の偏光度

一方，先の近赤外光異物検知法では，ハムの輪

やカメラの設置角度を再評価し，最適な条件を模郭や内部にノイズが残ることを確認した。これら索した。最後に，機械学習に適したデータセットのノイズを除去するために，さまざまなフィルタを構築した。

処理を検討した。具体的には，２値化をはじめ，
Ｐタイル法や判別分析法，移動平均フィルタ，ガ

３．結果と考察

ウシアンフィルタ，ディアンフィルタ，ソーベル

波長850nmの近赤外光異物検知法によるロース

フィルタ，Cannyエッジ検出，細線化，ガンマ補ハム中の異物（軟骨）の撮像および解析結果を正，アンシャープマスキング，バイラテラルフィ

Fig.２に示す。目視画像より，軟骨は確認できな

ルタ，膨張，収縮，オープニング，クロージング，

ハムに混入した軟骨＠850 nm（異物検知）
軟骨の検知にも成功（フィルタ処理なし）

異物：軟骨

目視

P

C

検知像

異物検知×フィルタ処理
脂身や筋繊維の画像情報を平坦化
フィルタ処理目視

Fig. 2

PC

検知像

ロースハム中の軟骨の検知と，フィルタ処理が与える異物検知© The Ito Foundation

近赤外光と偏光，AIを組み合わせた食肉中の虫および異物検知技術の開発（Ⅱ）

83

異物検知＠940 nm
ハム輪郭のノイズを減少

異物：軟骨

目視

P

C

検知像

異物検知＠630 nm
PとCの輝度値が類似し、ハムのノイズを減少

目視PFig. 3C

検知像波長が与える異物検知

トップハット，ブラックハット（ボトムハット），

850nmと比べて，露光時間が半分になったが，偏ラベリング，色変換（色相抽出），疑似カラーな

光Pと偏光Cにおける異物の輝度値が同程度に現どがあげられる。これらのフィルタ処理を検討しれた。このことから，光吸収による影響が偏光よた中でも，メディアン（または中央値）フィルタ

りも支配的となり，ハム内部のノイズが大幅に減

が，周辺画素値の大小比較を行い，中央値の画素

少し，異物の検知に至ったと考えられる。

に変換する特性から，本研究における強いノイズ

さらに，今後の技術開発を進めていくうえで中に対して最適なフィルタ処理であることが分かっ心となる偏光度やカメラの設置角度を再評価し，た（Fig.２参照）。

最適な条件を模索した（Fig.４参照）。上段の図

次 に ，波 長 850nm 以 外 の 波 長 ，具 体 的 に はでは，10°ごとに異なる偏光画像を撮影し，これ940nmと波長630nmによる近赤外光異物検知法を

らの画像を組み合わせた適切な演算処理について検討した（Fig.３参照）。この場合も，異物としの検討を進めている。また，下段の図では，これて軟骨を使用した。上段の図から分かるように，

までは透過と反射に焦点を当ててきたが，散乱も波長940nmではロースハム中の軟骨を検知するこ考慮したカメラの適切な設置角度に関しても同時とに成功した。ただし，波長850nmと同じ光パに検討している。検知画像から明らかなように，

ワーで入射しても，波長940nmでは露光時間が約

視点の角度が検査結果に大きな影響を与えること２倍になったが，ハムの輪郭ノイズが少なくなっを確認した。

た。これは，波長940nmにおけるハムの吸光度が最後に，得られた検査画像を用い，機械学習に小さく，偏光度が大きく現れたことにある 。ま適した学習データの構築を進めている。学習デー

た，輝度値分布からも，ノイズが小さいことが確タの構築には，異物を含むさまざまな食品の画像認された。下段の図では，波長630nmにおいてもを収集した。例えば，ロースハムやその他の肉製

ロースハム中の軟骨を検知した。この場合，波長品，野菜，果物などを含む。なお，これらの画像

２）© The Ito Foundation

84

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

偏光度
各偏光画像の演算処理

無偏光

0

10

20

30

40

50

60

70

80

偏光角度（°）

カメラ設置
見る角度もポイントに

異物
P

異物

検知像

Fig. 4P

検知像

その他の検査条件の検討

は，異物の存在や位置，異物と周囲の食品の光学的特性などを捉えるために撮影した。収集した画

４．要

約

像は，事前に画像処理を行い，必要な前処理を施

近赤外光と偏光を組み合わせた近赤外光異物検した。これには，リサイズ，正規化，データの水知法を使用し，ロースハム中の有機異物を成功裏増し（オーグメンテーション）などを含む。これに検知した。本手法は，偏光を用いない対照試料により，学習データの多様性と汎化能力を向上さに比べて迷光ノイズを低減し，異物の位置を特定せた。その後，VGG16である畳み込みニューラ

することができる一方，異物の多様性に応えるた

ルネットワークモデルを適用した。VGG16は，め，軟骨を使用した波長850nmの近赤外光異物検

異物検知のタスクにおいて優れた性能を発揮する

知法を評価し，その信頼性の向上を探求した。そことが知られている。このモデルを事前学習済み

して，フィルタ処理を適用したノイズの問題に対の重みで初期化し，学習データを用い，ネット

処し，異物の検出精度を向上させた。さらに，異ワーク学習を行った。一方で，学習済みのCNN

なる波長による光異物検知法も検討し，異物の特モデルを使用し，異物検知のための予測も行って性と光の吸収・散乱の挙動を詳細に捉えることでいる。新しい画像を入力として与えると，モデル検出率を向上させることができた。この他にも，は異物の存在やその特徴を識別し，異常な部分を偏光度とカメラの設置角度の再評価により，異物検出することができる。このような機械学習の手の撮像と解析の精度を向上させ，高品質な異物検法により，異物の検知精度を向上し，人間の目視知画像を得ることができた。最後に，機械学習にでは見つけることが難しい微細な異物も検出でき

適した学習データの構築に取り組み，異物の撮像るようになってきている。今後は，検査の自動化

データと解析結果を収集して機械学習アルゴリズや効率化に貢献する一方で，食品の品質と安全性

ムの学習に使用し，異物検知の自動化と効率化をの向上にも寄与していきたい。

実現した。なお，これらの研究成果は，雑誌３報© The Ito Foundation

近赤外光と偏光，AIを組み合わせた食肉中の虫および異物検知技術の開発（Ⅱ）と発表４件（うち１件は展示を含む）
，受賞１件
である

。

３～10）

文
献
１） h t t p s : / / w w w . k o k u s e n . g o . j p / n e w s / d a t a /n-20150126_1.html
２） 山口堅三：近赤外光と偏光，AIを組み合わせた食
肉 中 の 虫 お よ び 異 物 検 知 技 術 の 開 発 ，第 40 巻 ，pp.82-86，2022．
３） 宮本遼二，大津朋也，釜野勝，獅々堀正幹，山口
堅三：偏光で見る食品中の有機異物検査，ふーま，
第156号，pp.24-27（2023年２月）
４） 山口堅三，大津朋也，釜野勝，獅々堀正幹：近赤
外光と偏光，画像解析が織りなす食品の異物検査，
明日の食品産業，第531号，pp.31-38（2022年11月）
５） 山口堅三，大津朋也，獅々堀正幹，釜野勝：近赤85

外光と偏光による食品の異物検知とその可視化，クリーンテクノロジー，第32巻第６号，pp.54-58（2022年６月）６） 山口堅三：近赤外光による食品異物検査について～見えない光で見つけだす～，食品技術士センター
講演会（2023年３月）
７） 山口堅三：人の目に代わる光技術，食品機械関連
技術パネルディスカッション（2023年３月）
８） 山口堅三：食品ロスゼロ社会を目指す光異物検査技術，FOOMA JAPAN2022国際食品工業展（2022年６月）９） 山口堅三：光で変える新しい異物検査法～安全・安心・安定して提供する食を目指して～，FOOMA
JAPAN2022国際食品工業展（2022年６月）
10） FOOMAアカデミックプラザ賞準グランプリ，一般社団法人日本食品機械工業会（2022年６月）© The Ito Foundation

86

高酸素ガス置換包装が食中毒菌の生存性に与える影響の検証
Evaluation of the effect of high-oxygen modified atmosphere packaging on
the survival of food poisoning bacteria

岡

田

彩

加

（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

Ayaka Okada（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

In recent years, high-oxygen modified atmosphere packaging（high O２MAP）, in whichmeat is packaged under high oxygen concentration（80 ％oxygen concentration and20 ％carbon dioxide concentration）to maintain meat quality, has been reported to extend the shelf
life of meat. High O２MAP was known to inhibit the growth of mesophilic bacteria andEnterobacteriaceae. This study focused on Campylobacter spp., which are the most common
bacteria implicated in incidents of food poisoning reported since 2003 in Japan, and aimed toinvestigate the effect of high O２MAP on Campylobacter spp. In this study, a simple method tocreate a high O２MAP in the laboratory without the use of large equipment was established.
The viability of Campylobacter spp. in a high O２MAP environment was investigated using theestablished method. The viability of Campylobacter spp. was suppressed under high O２MAP
conditions more than under atmospheric conditions, indicating the usefulness of high O２MAP.
Further validation using lower concentrations of Campylobacter spp. is needed．

１．目への効果を調査することを目的とした。

的

カンピロバクターは他の食中毒菌とは異なり，近年，食肉の品質保持のために高酸素濃度（酸食肉上で増殖しない性質を持つため，増殖性では

素濃度80％，二酸化炭素濃度20％）で包装するガ

なく，生存性を確認することが必要となる。しかス置換包装（以下，高O２MAP）が使用され，一し，カンピロバクターは生存に不利な環境になる

般細菌や腸内細菌科菌群の増殖を抑制し，食肉のと，生きているが培養不能な状態，Viable but

消費期限を延長することが報告されている１）。著

non culturable（VBNC）状態となることが知ら者は一般細菌などのいわゆる衛生指標菌ではなれる。高O２MAPではカンピロバクターはVBNC

く，食中毒菌への効果はあるのかという疑問を状態となっている可能性が高く，一般的に用いら持った。そこで本研究では，近年の細菌性食中毒

れる培養法では正確な調査が困難である。著者は発生件数の中で第１位の病原体であるカンピロバ

すでに食肉上のVBNC状態のカンピロバクターもクターに着目し，高O２MAPのカンピロバクター

含めた生きたカンピロバクターを検出する手法を© The Ito Foundation

高酸素ガス置換包装が食中毒菌の生存性に与える影響の検証

確立しており２），本研究ではVBNC状態のカンピ
ロバクターも含め，カンピロバクターの生存性における高O２MAPの効果を検証することを目指す。

２．方
2.1

87

法

高O２MAP環境の作出

しかし，食鳥肉はすべてカンピロバクターに汚当初予定していたデシケーターと真空ポンプを染されているわけではなく，さらに，汚染されて用いた手法では難しかったため，以下の手法によいてもパックごとに汚染菌数が大幅に異なるたり，高O２MAP環境を作出した。概要をFig.１にめ，自然に付着したカンピロバクターで実験を行示す。

うことができない。また，カンピロバクターは

耐ガス透過性の高い，１lサンプリングバッグ

BSL２の病原体であるため，増菌培養したものを（Smart Bag PA CEK-1, GL Sciences, Tokyo,

使用する際は安全キャビネットなどが備えられたJapan）を使用した。サンプリングバッグは２口

適切な実験室で作業を行う必要があるため，実際タイプであり，それぞれ，ミニバルブ付スリーブの食肉工場で使用される高O２MAP用の機器を使

φ6，Ｍ6コネクターを接続したものを使用した。

用することができない。本研究課題では，実験室

サンプリングバッグの片側をハサミで切り開き，

内で高O２MAP環境を作出する手法を確立すると鶏肉を入れるための入口とした。鶏肉を設置した

ともに，作出した環境下における鶏肉上のカンピ

後，シーラー（NL-202JC-5，石崎電機製作所，

ロバクター生存性の評価を行うことを目的とした。

Tokyo，Japan）でサンプリングバッグを接着して密閉した。ミニバルブ付スリーブにシリコンホースを接続してサクションポンプ（SP30, Air
Liquide Medical Systems, Italy）によってサンプ

A

B

C

Fig.１ Schematic of the experiments. A sampling bag（A）. A piece of meat was set inside the sampling bag with one side cut（B）.
The sampling bag with meat was sealed and connected to a suction pump at arrows（C）．

© The Ito Foundation

88

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

リングバッグ中の空気を吸引した。吸引後，混合したプレストン培地の原液を３本の空の試験管にガス（80％酸素，20％二酸化炭素）（三光堂，各10mlずつ分注し，さらに試液１mlおよび0.1ml

Gifu，Japan）をミニバルブ付スリーブから直接を各々プレストン培地が10ml入った試験管３本

サンプリングバッグに充填した。Ｍ6コネクターずつに接種した。42℃で24時間，微好気条件で培か ら ガ ス 濃 度 測 定 器 （CheckPointO２ /CO２，

養し，プレストン培地から１白金耳分の検体をDansensor, Ringsted, Denmark）により，酸素濃mCCDA培地に塗布し，42℃で48時間，微好気条

度および二酸化炭素濃度を測定した。また，４℃

件で培養した。コロニーが認められたものについで10日間静置した後のガス濃度についても測定してはコロニーPCRにより，カンピロバクター陽性

た。

であることを確認した。カンピロバクター陽性と鶏肉上のカンピロバクター生存性の検証なった試験管数から最確数表３）よりMPN値を求

2 . 2 . 1 擬似汚染鶏肉の準備および高O２MAP

め，さらに得られた値を10倍して100g当たりの2.2

カンピロバクター汚染菌数を求めた。

環境への設置カンピロバクター陰性であることをPCR法にて

2.2.3

PMA-qPCR法

確認した市販鶏肉に実験的に増菌培養したカンピすでに確立済みの手法を用いて実施した１）。市

ロバクターを塗布することで擬似汚染鶏肉を作出

販鶏肉25gをストマッカー袋に入れ，PBS 10mlをし た 。す な わ ち ，C. jejuni NCTC11168 株 を －添加し，手で揉み込むように表面をリンスした。

80 ℃ に 保 存 し た グ リ セ ロ ー ル ス ト ッ ク よ りフィルターを通して懸濁液を回収し，リンス液とmCCDA培地に塗布し，37℃で48時間，微好気培した。リンス液を800×g，４℃で10分間遠心し，養した。コロニーの一部をミューラーヒントン寒不純物を除去した。上清を8,000×g，４℃で10分

天培地に塗抹し，37℃で18±２時間，微好気条件

間遠心し，ペレットをPBSで懸濁し，160μlとしで培養した。寒天培地から滅菌綿棒で菌体を掻きたものをサンプルとした。160μlのサンプルに取り，PBSに懸濁し，OD600を1.0に調整し，5.0

PMA Enhancer を 40 μl ，PMAxx を 終 濃 度 が 25

×10８～１×10９CFU/mlの生菌サンプルとした。

μMとなるように加え，37℃で10分間インキュ

これらを階段希釈することで5.0×10 ～１×10

５ベートし，PMAxx活性化のためLED Crosslinker

CFU/mlの菌液とし，鶏肉25gあたりに100μlずつ12（Takara, Shiga, Japan）を用いて15分間光照

そ れ ぞ れ の 菌 液 を 塗 布 し 5.0 × 10 ～ １ × 10

４射を行った。PMA処理を繰り返し実施するため，

CFU/25gの擬似汚染鶏肉とした。計測する日数

8,000×g，４℃で10分間遠心操作を行い，160μl分の培養法，PMA-qPCR法で測定するのに必要の PBS で 懸 濁 し ，再 度 上 記 の 操 作 を 行 っ た 。

な分をそれぞれ別のサンプリングバッグに準備しDNA抽出は200μlの懸濁液からDNeasy Blood &た。

Tissue Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて

４

３

2.2.2

行い，100μlのバッファーで溶出した。鶏肉に塗培養法（MPN法）

NIHSJ-02法に準じて実施した。すなわち，検布する際に作出したカンピロバクターの階段希釈

体（市販鶏肉25ｇ）にプレストン培地（OXOID,

液を用いて同様にPMA処理，DNA抽出を行い，

Hampshire, UK）を225ml加えたものをストマッ

検量線作製用のサンプルとした。

カー処理し試料液を作製し，MPN法により菌数qPCR 法 は GoTaq Probe qPCR Master Mixを算出した。すなわち，鶏肉をストマッカー処理（Promega, Madison, WI, USA），フォワードプラ© The Ito Foundation

89

高酸素ガス置換包装が食中毒菌の生存性に与える影響の検証

CAT AT-3’），リバースプライマーcampR2（5’GGC TTC ATG CTC TCG AGT T-3’），プ ロ ーブ （5’-FAM- CAG AGA ACA ATC CGA ACT
GGG ACA-BHQ1-3’）を使用し，マニュアルに従い実施した。コントロールサンプルを用いて作

10000
Bacterial count（log）

イ マ ー campF2 （5’-CAC GTG CTA CAA TGG

1000
100

1

出した検量線から，カンピロバクターのコピー数を算出した。

大気
1

2

3
Days

4

5

Fig.2 Quantitative change of inoculated Campylobacter spp.
counts in packed broiler whole legs of trials 1-5 days．

３．結果と考察3.1

高O2MAP10

高O２MAP環境の作出

デシケーターと真空ポンプを使用する手法で培養法では菌数が少ないため，MPN法を用いは，一度完全な真空にする必要があるが難しく，たが，すべてのサンプルにおいて10ml，１ml，

窒素濃度を０にすることができなかったため，

0.1mlの増菌培養液を塗抹したmCCDA培地でカ

２．方法に示すように，サンプリングバッグを用

ンピロバクター陽性となり，1100MPN/100g以上いた手法で高O２MAP環境の作出を実施した。ガと算出された。そのため，菌数の減少を確認する

ス置換直後のガス濃度についてはO２ が78.8％，

ことはできなかった。今後，より低濃度の菌数をCO２が18.8％であった。また，10日後のガス濃度塗布することで検証を実施する必要があると考えはO２が77.1％，CO２が15.6％であり，日数が経つられる。

ごとにO２，CO２濃度の低下が認められるものの，培養法と同時にPMA-qPCR法による検証も実施し，算出したカンピロバクターコピー数の推移

高い濃度を維持することが可能であった。
3 . 2 鶏肉上のカンピロバクターの生存性の検をグラフに示した（Fig.２）。大気環境で保存した４日目の鶏肉に関して，手技のミスからDNA

証
鶏肉に塗布したカンピロバクターの生存性を培抽出を実施できなかったためデータから除いて示養法およびPMA-qPCR法により検証した。実施した。大気環境で保存した鶏肉に関しては４℃に前にガス濃度が維持されているかを確認し，以下設置してから５日目においても10分の１程度の生の値であった。ガス置換２日目ではO２が78.1％，

菌数を維持していた。一方，高O２MAP環境下でCO２ が 18.1 ％（培 養 法），O２ が 77.7 ％，CO２ が保存した鶏肉においては４℃に設置した翌日には18.3％（PMA-qPCR法），ガス置換３日目ではO２

10分の１程度まで減少し，設置４日目においてはが79.4％，CO２が18.4％（培養法），O２が77.6％，

検出限界以下となった。2023年に実験的にカンピ

CO２ が18.1％（PMA-qPCR法），ガス置換４日目

ロバクターを塗布した鶏肉における高O２MAP環

ではO２ が77.6％，CO２ が18.1％（培養法），O２ が境の影響を検証した論文が報告された４）が，６日

78.6％，CO２ が18.2％（PMA-qPCR法），ガス置

後においてもカンピロバクターが検出されてお換 ５ 日 目 で は O２ が 76.6 ％，CO２ が 17.8 ％（培 養り，本研究報告と一致しなかった。この論文では

法），O２が78.4％，CO２が18.2％（PMA-qPCR法）

１×10５CFU/gというかなり高濃度の菌が塗布さであった。

れていたことが要因であると考えられる。そのた© The Ito Foundation

90

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

め，最初に鶏肉に塗布する菌量の設定はかなり重要であることが示唆された。
本研究により，高O２MAP環境におけるカンピ
ロバクターの生存性は大気環境よりも抑制される
こ と が 示 唆 さ れ た 。今 回 は 5.0 × 10 ３～ １ × 10 ４
CFU/25 g程度の菌数を塗布したが，実際の鶏肉上の菌数はより低いと考えられるため５），今後，より低濃度の菌数での検証が必要であると考えら
れる。
４．要

約

本研究において実験室内で大型の機器を用いることなく，簡便に高O２MAP環境を作出する方法を確立できた。確立した手法を用いて高O２MAP
環境におけるカンピロバクターの生存性を検証したところ，大気環境よりも抑制されることが示唆され，高O２MAP包装の有用性が示された。今後，

文
献１） 原理洋，加藤千晶，野市哲也，菊池貴子，梅津準士，
富田昌俊，森田幸雄：高濃度酸素ガス置換包装された食肉の衛生指標菌の動向および官能検査結果，日本食品微生物学会雑誌，38，88～92，2021．
２）
 Okada, A., Tsuchida, M., Rahman, M. M.,
I n o s h i m a , Y . ：T w o - r o u n d t r e a t m e n t w i t hpropidium monoazide completely inhibits thedetection of dead Campylobacter spp. cells by
quantitative PCR, Frontiers in Microbiology, 13,
801961，2022．
 De Man：MPN Tables: Corrected, Europian
３）
Journal of Applied Microbiology and Biotechnology,
17, 301～305，1983．
４）
 Beterams, A., Tolksdorf, T., Martin, A., Stingl, K.,
Bandick, N., Reich, F.：Change of Campylobacter,
Escherichia coli and Salmonella counts in packaged
broiler breast meat stored under modified
atmosphere and vacuum conditions at 4 and 10 ℃
based on cultural and molecular biologicalquantification, Food Control，145，109337，2023．
 Duqué, B., Daviaud, S., Guillou, S., Haddad, N.,
５）
Membré, J. M.：Quantification of Campylobacter
jejuni contamination on chicken carcasses inFrance, Food Research International, 106, 1077～
1085，2018．

より詳細な検証を実施する必要がある。

© The Ito Foundation

91

ウシ複合脊椎形成不全症の病態解析とウシの骨格成長に重要な糖鎖の同定（Ⅱ）
Pathophysiology analysis of bovine complex vertebral malformation andidentification of sugar chains important for bovine skeletal growth（II）

古

市

達

哉

（岩手大学農学部共同獣医学科実験動物学研究室）

Tatsuya Furuichi（Laboratory of Laboratory Animal Science and Medicine, Co-Department of Veterinary Medicine,
Faculty of Agriculture, Iwate University）

Complex vertebral malformation（CVM）is an autosomal recessive severe skeletal
dysplasia in Holstein cattle. CVM consists of a range of complex anomalies of the vertebral
column and limbs, dysmorphic craniofacial features, cardiac anomalies, and spontaneousabortion or perinatal death. Bovine SLC35A3 gene has been identified as a CVM-causative
gene. SLC35A3 has been reported to be a UDP-N-GlcNAc transporter located in the Golgi
membrane; however, the pathogenic mechanisms of CVM have been largely unspecified. To
address this issue, we generated a Slc35a3 knockout（KO）mouse strain and showed theusefulness of this mutant strain as an animal model for CVM in the last year. In this year, we
showed that Slc35a3 mRNA was expressed in the presomitic mesoderm of wild-type mouseembryos, suggesting that SLC35A3 transports the UDP-GlcNAc used for the sugar
modification of Notch receptors, which is an essential step in somite formation. To understandthe pathogenic basis for chondrodysplasia in Slc35a3 KO mice, we performed detailed
histological analyses of this mutant strain. In the cartilage of Slc35a3 KO embryos, theextracellular matrix space was severely reduced, and many flat proliferative chondrocytes
were reshaped. Similar histological abnormalities have been reported in the two mutants
accompanied by impaired glycosaminoglycan（GAG）biosynthesis. Conversely, chondrocyte
proliferation, apoptosis and differentiation were not affected in Slc35a3 KO mice. These results
and findings suggest that the chondrodysplasia phenotypes in Slc35a3 KO mice should becaused mainly by abnormalities in extracellular matrix quality and the impaired GAG
biosynthesis contributes to the chondrodysplasia phenotypes. To elucidate the pathogenic
mechanisms of CVM, we are going to perform the multiple analyses of Slc35a3 KO mice,
including detailed sugar chain and comprehensive gene expression analyses．

１．目

ン種における周産期致死性の常染色体潜性遺伝病

的である１）。CVM発症個体は，椎骨や肋骨の欠損・

複合脊椎形成不全症（CVM）は，ホルスタイ

癒合，頚椎や胸椎の短縮，側弯など重度の脊椎形© The Ito Foundation

92

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

成不全を示し，その約８割が妊娠260日までに死CVM個体ではどのような種類の糖鎖合成が影響流産する。CVM家系の連鎖解析から，CVMの原を受けているのか，そしてCVMの発症機序はほ因遺伝子は糖ヌクレオチド輸送体をコードする

とんど解明されていない。これらを解明するため

SLC35A3 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る

２）にはCVM発症個体のサンプルが必要であるが，SLC35A3はゴルジ体膜上に発現し，UDP-N-ア

CVMの発症頻度は著しく低く，十分なサンプル

セチルグルコサミン（GlcNAc）を細胞質からゴ数の確保は困難である。またCVM個体は周産期

ルジ体内腔へ輸送する糖ヌクレオチド輸送体であ致死であるため，糖鎖解析をはじめとする生化学

る。糖鎖は末端に単糖が付加されることで形成さ解析が可能となる新鮮なサンプルの入手も困難でれ，この反応は糖転移酵素によって触媒される。

ある。したがって，SLC35A３の機能を欠損する

糖転移酵素は糖ヌクレオチド（糖供与体）を基質

モデル動物が必要である。私たちは令和３年度伊として用い，糖ヌクレオチドの単糖を新しく合成

藤 記 念 財 団 の 研 究 所 助 成 を 受 け ， Slc35a3される糖鎖の末端に付加する反応を触媒する。すknockout（KO）マ ウ ス を 作 製 し ，同 マ ウ ス のなわち，糖ヌクレオチド輸送体は，糖転移酵素のCVM モ デ ル 動 物 と し て の 有 用 性 を 報 告 し た

基質として用いられる糖ヌクレオチドを細胞質か（Fig.１）４）。本研究では同マウスの詳細な形態学

ら糖鎖合成の場である小胞体あるいはゴルジ体の的，組織学的解析を行い，SLC35A3機能欠損に内腔へ輸送する役割を担っている 。したがって，

よる脊椎形成不全，軟骨形成不全のメカニズムに

CVMはSLC35A3の機能不全によって起こる糖鎖ついて検討した。

３）の合成不全が原因で発症すると推測されるが，WT

Slc35a3 KO

WTFig. 1

WT

Slc35a3 KO

Slc35a3 KO

Slc35a3 KO mouse strain is a useful animal model for CVM．

（A）Gross appearance of wild-type（WT）and Slc35a3 KO littermate embryos at E18.5.（B）Whole skeleton stained with
Alizarin red and Alcian blue of WT and Slc35a3 KO littermate embryos at E18.5.（C）Dorsal view of spine and ribs. Slc35a3
KO mice exhibited vertebral malformation, including misshaped vertebrae, fusion of vertebral bodies, and fusion andbifurcation of rib．

© The Ito Foundation

ウシ複合脊椎形成不全症の病態解析とウシの骨格成長に重要な糖鎖の同定（Ⅱ）

２．方

93

TUNEL 染 色 に は ， in situ Apoptosis Detection

法

Kit（TaKaRa）を使用した。ISHはGenostaff社の胎生9.25日の野生型マウス胚を用いてホールマ

方法に準じて行った５）。SLC35A3欠損の軟骨細胞

ウントin situハイブリダイゼーション（WISH）

増殖への影響を検討するために，BrdUラベル実を行い，体節形成時期におけるSlc35a3 mRNAの験を行った。妊娠18.5日目のメスマウスにBrdU

発現を調べた。マウス胚を４％ PFA/PBSで４℃

溶液（２mg/ml）を100mg/kg用量で腹腔内投与で一晩固定し，脱水した。0.1％ Tween 20を含む

し，その３時間後に安楽殺し，胎子を提出した。

PBS（PBST）
で胚を再水和し，20mg/mlのProtein

提出した胎子は安楽殺した後に後肢を摘出し，パKを含むPBST中で８分間処理した。４％ PFA/

ラフィン切片を作製した。抗BrdU抗体染色には，0.2％グルタルアルデヒドで再固定した後，胚をe B i o s c i e n c e TM B r d U K i t f o r I H C / I C C

DIG標識RNAプローブと66℃で一晩ハイブリダ

Colorimetric（Invirtogen）を使用した。

イズさせた。洗浄後，0.1％ Tween 20を含むTris

本研究で実施した動物実験は，岩手大学動物実

緩衝生理食塩水（TBST）で１：2000に希釈した

験等管理規則に従い，本学動物実験委員会の承認

アルカリホスファターゼと結合した抗DIG抗体と（承認番号：A202047）を得て行った。

ともに胚を室温で３時間インキュベートした。

３．結果と考察

TBST洗浄後，BM Purple（Roche Life Science）
を使用して，アルカリホスファターゼ活性を可視化した。

WISHの結果，Slc35a3アンチセンスプローブの陽性シグナルは胚の体幹部位で検出され，未分

私たちの研究室で系統維持しているSlc35a3

節中胚葉が存在する尾部に近づくにつれて強く

hetero KOマウスの雌雄を交配させ，帝王切開になった（Fig. 2A）。尾部の拡大画像では，未分節

よ っ て 胎 生 18.5 日 の Slc35a3 KO お よ び コ ン ト

中胚葉と神経上皮に陽性シグナルが検出された

ロール（野生型＋Slc35a3 hetero KO）マウス胚（Fig. 2B）
。コントロールのセンスブロープを用を摘出し，成長板軟骨の組織切片を作製した。こいたWISHでは陽性シグナルは観察されず（Fig.

れらの切片を用いHE染色，TUNEL染色，in situ2C），アンチセンスプローブを用いて認められた

ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン（ISH）を 行 っ た 。

陽性シグナルは非特異的な反応ではなく，

Antisense probe
A

B

Sense probe
C

NE
PSM

Fig. 2 Slc35a3 mRNA was expressed in the presomitic mesoderm during somite formation. Whole-mount in situ hybridization
images of wild-type mouse embryos at E9.25 produced using the antisense（A, B）and the sense（C）probes against Slc35a3
mRNA. Lateral side view（A）, and the magnified images of the tail region（B, C）. NE： neuroepithelium, PSM： presomatic
mesoderm. Scale bars：500μm．

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94

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Slc35a3 mRNAを検出した結果であることが示さ層では，軟骨細胞外マトリックス（ECM）領域れた。脊椎は胎生期に未分節中胚葉が周期的にくが著明に減少しており，それに伴って細胞密度はびれ切れることで形成される体節に由来する。体上昇していた（Fig. 3A，B）。KOマウスの扁平増節形成にはNotchシグナルが重要な役割を担って殖軟骨細胞の多くは，立方状に変形していた。

お り ，Notch 受 容 体 上 の O- フ コ ー ス 残 基 に

次に，KOマウスの軟骨細胞の増殖能をBrdU取GlcNAc を 付 加 す る 糖 転 移 酵 素 を コ ー ド す る

込み実験で調べた。安楽死させたBrdUラベル胎LFNG遺伝子の変異は，ヒトとマウスで重度の脊子の後肢のパラフィン切片を作製し，抗BrdU染

椎形成不全を引き起こす 。WISHによって，色を行った。コントロールおよびKOマウスの球

Slc35a3 mRNAは体節形成期の未分節中胚葉で発状および扁平増殖軟骨細胞層にBrdU染色陽性細現 し て い る こ と が 明 ら か と な り ，SLC35A3 は胞が認められた（Fig. 4A）。BrdU陽性細胞の割

LFNGの基質として用いられるUDP-GlcNAcを輸合を計測した結果，球状および扁平増殖軟骨細層送することで体節形成に関わっていることが強くの両方で，コントロールとKOマウスの間に有意示唆された。

差はなかった（Fig. 4B）。したがって，Slc35a3

６）

胎生18.5日胚の組織切片のHE染色像を観察しKOマウス軟骨細胞の増殖能に大きな異常は起きた。成長板は，端から球状増殖軟骨細胞，扁平増ていないことが示された。次に，Slc35a3 KOマ

殖軟骨細胞，肥大軟骨細胞から形成される細胞層

ウスの軟骨細胞のアポトーシス頻度をTUNEL染が観察される（Fig. 3A）。Slc35a3 KOマウスの色によって調べた。コントロールおよびKOマウ

成長板の高さは，野生型マウスと比べ有意に短縮

スの肥大軟骨細胞層の下部に，TUNEL陽性細胞していたが，３層の区別は可能であった（Fig.

が認められた（Fig. 4C）。TUNEL陽性細胞の割

3A）。KOマウスの球状および扁平増殖軟骨細胞合を計測した結果，コントロールとKOマウスのA

Wild-type

Slc35a3 KO

a

B

d
C

RC

b

e

FC

c

f

Cells/10,000 µm2

150p = 0.0064

100
50
0

Ctrl Slc35a3 KO

HC

Fig. 3 Cartilaginous extracellular matrix space was severely reduced in Slc35a3 KO mice. Humerus and lumbar vertebrae sectionsof Control（Ctrl, wild-type＋Slc35a3 hetero KO）and Slc35a3 KO littermate embryos at E18.5 were stained using hematoxylin
and eosin（HE）solution.（A）High magnification images of the round chondrocyte（RC）, flat chondrocyte（FC）, andhypertrophic chondrocyte（HC）zones in the growth plates. Scale bars, 50μm.（B）Cells were counted in the roundchondrocyte zone of HE-stained sections within the squares（100×100μｍ）．

© The Ito Foundation

ウシ複合脊椎形成不全症の病態解析とウシの骨格成長に重要な糖鎖の同定（Ⅱ）
A

Wild-type

Slc35a3 KO

RC

RC

FC

C

Wild-type-type

RC

10
0

D

N.S.

30

% of BrdU+ cells

20

Slc35a3 KO

FC

N.S.

30

% of BrdU+ cells

FC

Ctrl Slc35a3 KO% of TUNEL+ cells

B

95

20
10
0

Ctrl Slc35a3 KO

20

N.S.

15
10
5
0

Ctrl Slc35a3 KO

Fig. 4 Chondrocyte proliferation in Slc35a3 KO mice．
（A）BrdU staining of the tibia sections from the BrdU-treated embryos at E18.5. RC, round chondrocyte zone; FC, flatchondrocyte zone.（B）Frequency of BrdU-positive cells in the RC and FC zones.（C）TUNEL staining of the hypertrophic
chondrocyte zone in the tibia sections at E18.5.（D）Frequency of TUNEL-positive cells in the hypertrophic chondrocyte zone.
Scale bars，200μm（A）and

100μm（C）．

間に有意差は認められなかった（Fig. 4D）。したCol2a1アンチセンスプローブを用いた染色では，がって，Slc35a3 KOマウスの軟骨細胞におけるコントロールおよびKOマウスの増殖軟骨細胞層

アポトーシス頻度に大きな異常は起きていないこに陽性シグナルが検出され，Col10a1アンチセンとが示された。

スプローブを用いた染色では，肥大軟骨細胞層に最後にSlc35a3 KOマウスの軟骨細胞分化能を陽性シグナルが認められた（Fig. 5A）。KOマウ

調 べ る た め に ，Ⅱ 型 コ ラ ー ゲ ン を コ ー ド す るスにおけるCol2a1陽性細胞層およびCol10a1陽性

Col2a1とＸ型コラーゲンをコードするCol10a1の細胞層の高さは，コントロールマウスと比べて有アンチセンスRNAプローブを用い，ISHを行った。

意に短縮していた（Fig. 5B）。しかし，KOマウ

Ⅱ型コラーゲンとＸ型コラーゲンはともに軟骨特スにおける（Col2a1陽性細胞層の高さ）/（成長板

異的に発現し，Ⅱ型コラーゲンは増殖軟骨細胞，の高さ）の比，および（Col10a1陽性細胞層の高Ｘ型コラーゲンは肥大軟骨細胞が産生する。

さ）/（成長板の高さ）の比は，コントロールマウ© The Ito Foundation

96

令和４年度
A

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）
Slc35a3 KO

p < 0.0001

800
700
600
500

Ctrl Slc35a3 KO

150

p = 0.0021

140
130
120
110
100

Ctrl Slc35a3 KO

90

N.S.

88
86
84
82
80

Ctrl Slc35a3 KO

relative Col10a1 zone
(%)

900

relative Col2a1 zone(%)

height of Col2a1 zone (µm)

Bheight of Col10a1 zone (µm)

Col10a1

Col2a1HE

Wild-type

N.S.

18
16
14
12
10
8

Ctrl Slc35a3 KO

Fig. 5 Chondrocyte differentiation in Slc35a3 KO mice．
（A）HE staining and in situ hybridization（ISH）images, produced using Col2a1 and Col10a1 probes of the tibia sections at
E18.5. Scale bars ，200 μm.（B）Heights of Col2a1- and Col10a1-expressing zones（upper graphs）,and the relative heights ofCol2a1- and Col10a1-expressing zones normalized by the total heights of the growth plate（lower graphs）in the ISH images.
Data are shown as the means ± standard deviation ; n ＝ 4. p values were calculated using Student’s t-test. Ctrl, control（wildtype＋Slc35a1 hetero KO）; N.S., not significant．

ス と 比 べ て 有 意 差 は な か っ た 。し た が っ て ，た ７）。したがって，Slc35a3 KOマウスの軟骨形

Slc35a3 KOマウスにおける軟骨細胞分化に大き成不全には，GAGの産生異常が関与しているこな異常は起きていないことが示された。

とが示唆された。これらのマウスに共通して軟骨

Slc35a3 KOマウスの球状および扁平増殖軟骨におけるECMの減少と扁平軟骨細胞の変形が観細胞層ではECM領域が著明に減少し，それに伴っ察 さ れ る こ と か ら ，軟 骨 組 織 に お け る GAG はて細胞密度は上昇した。一方，KOマウスの軟骨

ECMのスペース確保と扁平軟骨細胞の形態維持細胞における増殖能，分化能，そしてアポトーシに関与しているのかもしれない。

ス頻度に異常は見られなかった。軟骨基質に最も今後はSLC35A3の生体内機能，そしてCVMの豊富に存在している糖鎖はグルコサミノグリカン

病態機序の全容解明を目指し，Slc35a3 KOマウ

（GAG）の１種であるコンドロイチン硫酸であスを用いて詳細な糖鎖解析，そして体節形成時期

り，Slc35a3 KOマウスに認められた軟骨組織異における網羅的な遺伝子発現解析などを行う予定

常は過去に報告されているGAG産生異常を伴うである。一方，糖ヌクレオチドは主に細胞内に存

変異マウスに観察されている異常と類似してい在しているが，細胞外では唯一，乳中に検出され© The Ito Foundation

ウシ複合脊椎形成不全症の病態解析とウシの骨格成長に重要な糖鎖の同定（Ⅱ）

97ており，ウシとヤギの初乳中にはSLC35A3によっ

軟骨に最も豊富に存在している糖鎖はGAGのて輸送されるUDP-GlcNAcが検出されている。

１種であるコンドロイチン硫酸であり，Slc35a3

したがって，糖ヌクレオチドは家畜の育児用調整

KOマウスに認められた軟骨組織異常は過去に報

乳や家畜飼料素材への機能性添加物として利用で告されているGAG産生異常を伴う変異マウスにきる可能性が指摘されており ，本研究は家畜飼観察されている異常と類似していた。したがっ料学の方面にも発展させていきたいと考えている。

て，Slc35a3 KOマウスの軟骨形成不全にはGAG

８）

４．要

の産生異常が関与していることが示唆された。今約後はSLC35A3の生体内機能，そしてCVMの病態

CVMはホルスタイン種における周産期致死性機序の全容解明を目指し，Slc35a3 KOマウスをの常染色体潜性遺伝病であり，糖ヌクレオチド輸

用いて詳細な糖鎖解析，そして体節形成時期にお送体をコードするSLC35A3がCVMの原因遺伝子

ける網羅的な遺伝子発現解析などを行う予定であとして報告されている。私たちは令和３年度伊藤る。

記念財団の研究助成を受け，Slc35a3 KOマウスを作製し，同マウスのCVMモデル動物としての有用性を報告した。本研究では同マウスの詳細な形態学的，組織学的解析を行い，SLC35A3機能欠損による脊椎形成不全，軟骨形成不全のメカニズムについて検討した。
胎生9.25日の野生型マウス胚を用いてWISH解析を行い，体節形成時期におけるSlc35a3 mRNAの発現を調べた。その結果，Slc35a3 mRNAは体節形成期の未分節中胚葉で発現していることが明らかとなり，SLC35A3によって輸送されるUDPGlcNAcは体節形成を調節している可能性が示された。成長板組織切片のHE染色により，Slc35a3
KOマウスの球状および扁平増殖軟骨細胞層ではECM領域が著明に減少し，それに伴って細胞密度は上昇していた。抗BrdU抗体染色，TUNEL
染 色 ，軟 骨 細 胞 分 化 マ ー カ ー の ISH の 結 果 ，Slc35a3 KOマウスの軟骨細胞における増殖能，分化能，そしてアポトーシス頻度に異常はみられ
なかった。

文
献
１）
 Ghanem, M. E., Akita, M., Suzuki, T., Kasuga, A.,
Nishibori, M.：Anim Reprod Sci, 103, 348～354,2008．
２）
 Thomsen,B., Horn, P., Panitz, F., Bendixen, E.,
Petersen, A. H., Holm, L. E., Nielsen, V. H.,
Agerholm, J. S., Arnbjerg, J., Bendixen, C.：
Genome Res，16，97～105，2006．
 Hadley, B., Litfin, T., Day, C. J., Haselhorst, T.,
３）
Zhou, Y., Tiralongo, J.：Comput Struct Biotechnol J，17，1123～1134，2019．
 古市達哉：令和３年度 伊藤記念財団・食肉に関４）する助成研究調査結果報告書，VOL.40, p99～103，2022．
５）
 Kodama, K., Takahashi, H., Oiji, N., Nakano, K.,
Okamura, T., Niimi,K, Takahashi, E., Guo, L.,
Ikegawa, S., Furuichi, T.：CANT1 deficiency in amouse model of Desbuquois dysplasia impairs
glycosaminoglycan synthesis and chondrocyte
differentiation in growth plate cartilage, FEBS
Open Bio，10，1096～103，2020．
 Stanley, P., Okajima, T.：Roles of glycosylation in
６）
Notch signaling, Curr Top Dev Biol, 92, 131～164，2010．
 Mizumoto, S., Yamada, S.：Congenital Disorders
７）of Deficiency in Glycosaminoglycan Biosynthesis,
Front Genet，12，717535，2021．
８） 浦本匡：科学研究費助成事業 研究成果報告（16Ｋ08003）．

© The Ito Foundation

98

早産を伴う子牛死亡に関連する遺伝的要因の解明（Ⅱ）
Genetic factor associated with calf mortality with preterm birth（Ⅱ）

平野

貴１，小澤

昌起２，佐々木慎二３（１東京農業大学農学部，２岐阜県畜産研究所飛騨牛研究部，３琉球大学農学部）

Takashi Hirano１，Masaki Ozawa２ and Shinji Sasaki３（１Tokyo University of Agriculture, Faculty of Agriculture,
２Gifu Prefectural Livestock Research Institute, Hida Beef Cattle Research Department,
３Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus）

Weak calf syndrome（WCS）is thought to account for approximately 60％ of all neonatal
deaths in Japanese Black cattle. IARS disorder is a recessive genetic disease in Japanese Black
cattle, caused by the IARS c.235G>C（p.Val79Leu）mutation, which was identified as one of thecausative mutations of WCS. However, it was shown that there was WCS, which could not be
accounted for by the IARS mutation. Therefore, to identify other causative mutations for WCS,
we are performing analysis. So far, we have mapped the WCS to candidate region-1 and 2,
with a paternal half-sib family using WCS affected offspring of Bull A, which was not carrier
for the IARS mutation. In these two regions, causative genes for the same human genetic renal
disease were locating, and mutations of Gene-1 located in candidate region-1 were firstsearched. We detected five non-synonymous SNPs, and reconstructed haplotypes includingthese SNPs in the Bull A family. However, it was not shown that the Gene-1 SNPs were linked
to WCS. Furthermore, we searched for mutations in related genes located in the candidate
region-2, and we did not detect any mutations that might affect gene function. Therefore, we
considered that these genes were not causative genes for WCS.
Gene-9 is locating in a part locating SNPs more deviated from Hardy-Weinberg
equilibrium（HWE）in the candidate region-1. We searched mutations for Gene-9 and detected
6 polymorphisms. Five of these polymorphisms, located in or around exon 5, indicated to linkwith WCS. Furthermore, using two of 5 polymorphisms, genotype and allele frequency wereanalyzed in the normal cattle population, and it was shown that these polymorphisms did not
follow the HWE. These results suggested that Gene-9 was a candidate gene, should be further
analysis.

１．目

し，発症の原因を臨床的に特定できないものの総的称である。また，子牛死亡の主要な原因であり，虚弱子牛症候群（WCS：Weak Calf Syndrome）

黒毛和種における新生子死亡の約60％を占めるとは，吸乳欲の減退や起立困難などの虚弱症状を示考えられている。WCSの発症には，さまざまな© The Ito Foundation

早産を伴う子牛死亡に関連する遺伝的要因の解明（Ⅱ）

99

要因が関係していると考えられているが，発症率

部位にヒト遺伝性腎疾患の原因遺伝子（Gene-1）

が父方と母方の家系によって異なることから，遺が位置していた。さらに，候補領域-2に同じヒト伝的要因が関係するものも存在すると考えられて遺伝性腎疾患の原因遺伝子や関連すると思われるいる 。

遺伝子が存在したため，まずGene-1の変異を探１）

IARS異常症は，イソロイシルtRNA合成酵素

索したところ，タンパク機能に影響すると予測さ（IARS：isoleucyl-tRNA synthetase）遺伝子の塩れた４種を含む５種の非同義置換（c.284C>T，

基 置 換（c.235G>C）に 伴 う ア ミ ノ 酸 置 換（p.

c.292C>A， c.1039C>T， c.1084C>TおよびVal79Leu）が原因で発症する黒毛和種でみられ

c.2848A>T）が検出された４）。そこで，Gene-1をる常染色体劣性の遺伝的不良形質である。この候補遺伝子として，さらに詳細な解析を行うととIARS変異はWCSの原因の一つとして同定されもに，候補領域-2に位置する候補遺伝子の変異探た２）。しかし，このIARS変異を保有せず，IARS

索を試みた。

異常症とは異なる原因で死亡するWCS発症個体が確認されている。そのため，黒毛和種の子牛死

２．材料および方法

亡発生を低減させるために，新たな子牛死亡の原

2.1因遺伝子変異を特定し，交配のコントロールを可検出したSNPを含むハプロタイプを再構成し，能にするDNA診断法を開発する必要がある。

供試個体

精査するために，マッピングに用いた種雄牛Ａと我々は，新たな子牛死亡の原因となる遺伝子変

その発症産子（５頭）および正常産子（23頭）か

異を探索するために，生後20日以内に死亡した黒らなる父方半きょうだい家系（マッピング用家

毛和種子牛のサンプルを大規模に収集した。その系）のゲノムDNAを用いた。

うち，IARS c.235G>Cを保有しない特定種雄牛

候補原因遺伝子の変異を探索するために，マッ（種雄牛Ａ）の産子でWCSと診断され，しかも早ピング用家系から，変異探索用個体として種雄牛産を伴う個体を用いてホモ接合マッピングを行っ

Ａ，発症産子２頭および正常産子１頭を選抜し，た。さらに，この集団を父方半きょうだい家系とこれらのゲノムDNAを用いた。

して使用して連鎖解析を試みた。その結果，ホモ検出したSNPの正常牛集団におけるアレル頻度

接合マッピングと連鎖解析でそれぞれ異なる染色を調べるために，2003～2008年の期間に東京都中体領域を１ヶ所ずつ検出した（候補領域-1と2）。

央卸売市場食肉市場および大阪市中央卸売市場南このことから，このWCSはホモ接合マッピング

港市場で腎周囲脂肪組織が収集されたサンプルかにより検出された候補領域-1に位置する原因遺伝

ら月齢が23～39ヶ月，枝肉重量が300～700kgで子変異をホモで保有するとともに連鎖解析によっある肥育去勢牛20,493頭から同一種雄牛の産子がて検出された候補領域-2に位置する原因遺伝子変３頭を超えないように選抜した1,235頭のうち，異をヘテロまたはホモで保有することにより発症

356頭のゲノムDNAを用いた。

すると考え，黒毛和種多様体データベースよりこ

2.2

れら候補領域に位置するSNPを抽出し ，遺伝子

Gene-1の5 SNPsの型判定は，これらSNPsをカ

３）

SNP型判定および変異探索

バーする３種のプライマーセットを用いた（Fig.

変異を探索した。
多様体データベースに基づき検出した候補領

1a）。また，Gene-9の変異探索は各エクソンをカ

域-1内のアレル頻度に偏りがあるSNPが集中する

バーするようにイントロン領域に配置したプライ© The Ito Foundation

R

381 bp© The Ito Foundation

15
16

476 bp3

381 bp378 bp18

505 bp17

340 bp19

380 bpsF1

21447 bp20

645c.391-74delA ▲▲ c.450+7_14delinsAAC
c.391-73C>A ▲▲ c.450+24G>A
c.437A>G ▲357 bp
sF

sR1
2 3

7

427 bp925

10363 bp11

360 bp12

376 bpBoxes, filled triangles, and arrowheads indicate exons, detected polymorphisms, and primers, respectively. Shaded box （■） indicates UTR．

1,717 bp

8332 bp20
21▲ c.2848A>T

987 bp394 bpsR2ａ）Gene-1 primers for SNP typing．ｂ）Gene-9 primers for SNP search．

Fig. 1 Primers for PCR and sequencing, and SNP position．

14329 bp 363 bp

2▲ c.127+4G>A

748 bpExon 1F▲ c.1039C>T▲ c.1084C>T5

4

3▲ c.284C>T▲ c.292C>A

462 bp566 bpFR

13

362 bp

令和４年度

b)Exon 1a)100
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

マーセットを用いた（Fig. 1b）。候補領域-2に位マーの設計は，ゲノム配列（ARS-UCD1.2）に基置する候補遺伝子の変異探索も同様に各エクソンづいて行った。これらプライマーセット用いて，をカバーするプライマーセットをイントロン領域

それぞれマッピング用家系，正常牛集団および変に 配 置 し て 行 っ た（data not shown）。プ ラ イ

異探索用個体のゲノムDNAをテンプレートとし

早産を伴う子牛死亡に関連する遺伝的要因の解明（Ⅱ）てPCRし，得られた増幅産物をダイレクトシーケ

101に位置する遺伝子の変異を探索した。

ンスすることでSNP型判定または変異探索を行っ

3 . 2 候補領域-1に位置するGene-9の解析

た。変異探索によって検出された変異でアミノ酸

Gene-1は，候補領域-1内でハーディ・ワイン

置換を伴うものについて，アミノ酸置換のタン

ベルグ平衡（HWE）に従わないSNPが集中する

パ ク 質 機 能 へ の 影 響 を PolyPhen-2 （http://部位に位置する。その部位内でGene-1に隣接し，genetics. bwh. harvard.edu/pph2/）で予測した。

より強くHWEに従わないSNPが集中する部位に位置するGene-9の変異を探索した（Fig.３）。

３．結果と考察

Gene-9は21種のエクソンからなる遺伝子であ3 . 1 Gene-1 SNPのハプロタイプ解析およびる。これらエクソンをカバーする各プライマー
セットを用いて変異を探索したところ，種雄牛Ａ

候補領域-2の変異探索
Gene-1の変異探索により検出された非同義置

がヘテロであり，発症産子がリスク型ホモを示

換の5 SNPs（c.284C>T，c.292C>A，c.1039C>T，し，正常産子がリスク型ホモを示さない多型が６c.1084C>Tおよびc.2848A>T）について，マッピ

種検出された（c.127＋４G>A，c.391-74delA，

ング用家系の型判定を行い，ハプロタイプを再構

c.391-73C>A， c.437A>G， c.450

成した。BovineSNP50（illumina）によるマッピ

7_14delinsAAC，c.450＋24G>A）。これらのうち，ングで再構成したハプロタイプは，発症産子５頭

c.437A>Gはエクソン領域に位置する非同義置換

すべてリスク型ハプロタイプホモであり，正常産（p.K146R）であったが，タンパク機能への影響

子23頭の18頭がヘテロであり，５頭がリスク型ホは無害であると予測された。また，これらの５多モであった。しかし，Gene-1の5 SNPsを加えて型はexon 5内および周辺に位置していた（Fig.

ハプロタイプを再構成したところ，この5 SNPs

1b）。

によるハプロタイプは正常産子の13頭がリスク型＋

これら６多型についてマッピング用家系を型判定し，ハプロタイプを再構成したところ，c.127

ホモであると思われた（Fig.２）。
Gene-1はヒト遺伝性腎疾患の原因遺伝子であ＋４G>A以外のexon 5周辺に位置する５多型はり，候補領域-2にも同じヒト遺伝性腎疾患の原因

完全に連鎖していた。また，これら５多型による遺伝子（Gene-2）が存在したため候補遺伝子とハプロタイプは，発症産子５頭すべてリスク型ホ

考えて解析した。そこで，候補領域-2に位置する

モであり，BovineSNP50によるマッピングでリ

Gene-2を含めた当該ヒト遺伝性腎疾患のその他

スク型ホモを示した正常産子５頭を含む６頭がリ原因遺伝子や腎臓で発現し，関連すると考えられ

スク型ホモであることから，Gene-1のSNPsとはた７種の遺伝子について変異を探索した。しか異なり，候補領域-1のリスクハプロタイプと連鎖し，種雄牛Ａがヘテロを示す非同義置換などの遺し，WCSと連鎖していると思われた（Fig.２）。

伝子機能に影響すると思われる変異は検出されな

そこで，Gene-9の連鎖している５多型のうちｃ．

かった。

450＋7_14delinsAACとc.450＋24G>Aの型判定を

こ れ ら の こ と か ら ，候 補 領 域 -1 に 位 置 す る

正常牛356頭について行い，２多型による遺伝子

Gene-1および候補領域-2に位置する７遺伝子は型とアレル頻度を調べた。その結果，ノンリスク

原因遺伝子ではないと考え，改めて，候補領域-1型ホモが105頭（0.295），ヘテロが194頭（0.545），

内でアレル頻度に偏りがあるSNPが集中する部位

リスク型ホモが57頭（0.160）であり，これらは© The Ito FoundationAffected

Normal

HWEに従っていなかった（ｐ＜0.05）。

© The Ito Foundation

Gene-9

A
A
G
1
T
C
T
1
2
3
2
3
1
1
3
2
1
1
1
3
3
1
0
0
0
0
0
0

A
A
G
1
T
C
T
1
1
3
2
2
3
3
1
1
3
3
2
1
1
3
0
0
0
0
0
0

C21
p m
1 1
1 1
1 1
1 3
1 1
3 3
1 3
3 3

C07
C11
p m p m3 3 1 31 1 2 11 1 3 1
1 3 3 11 1 1 13 1 3 13 1 3 11 1 1 1A A A A
delA - delA C A C A
G A G AAAC - AAC A G A G
4 4 4 4T A T TC T C TT C T CA C A CT C T C1 3 1 31 2 1 23 1 3 11 2 1 23 2 3 21 3 1 31 3 1 33 3 3 12 2 2 11 3 1 11 3 1 11 2 1 23 1 0 03 3 1 1
1 3 3 33 1 1 13 1 1 11 2 2 11 2 2 21 2 2 11 1 3 1

C01
p m
3 1
1 2
1 3
1 3
3 1
1 3
1 3
3 1
G A
- delA
A C
A G
- AAC
G A
1 4
A T
T C
C T
C A
C T
3 1
2 1
1 3
2 1
2 3
3 1
3 1
1 3
1 2
3 1
3 1
2 1
1 3
1 3
3 1
1 3
1 3
2 1
2 1
2 1
3 1

C23
p m
3 1
1 2
1 3
1 3
3 1
1 3
1 3
3 1
G A
- delA
A C
A G
- AAC
G A
1 4
A T
T C
T T
C A
C T
3 1
2 1
1 3
2 1
2 3
3 1
3 1
1 3
1 2
3 1
3 1
2 1
1 3
1 3
3 1
1 3
1 3
2 1
2 1
2 1
3 1

C02
p m
3 3
1 1
1 1
1 1
3 3
1 3
1 3
3 1
G A
- delA
A C
A G
- AAC
G A
1 4
A T
T C
C T
C A
C T
3 1
2 1
1 3
2 1
2 3
3 1
3 1
1 3
1 2
3 1
3 1
2 1
1 3
1 3
3 1
1 3
1 3
2 1
2 1
2 1
3 1

C08
p m
3 3
1 1
1 1
1 1
3 3
1 1
1 3
3 1
G A
- delA
A C
A G
- AAC
G A
1 4
A T
T C
C T
C A
C T
3 1
2 1
1 3
2 1
2 3
3 1
3 1
1 3
1 2
3 1
3 1
2 1
1 3
1 3
3 1
1 3
1 3
2 1
2 1
2 1
3 1

T
C
C
C
3
2
1
2
2
3
3
1
1
3
3
2
1
1
3
1
1
1
1
1
1

C
T
A
T
1
1
3
1
3
3
3
3
1
3
1
1
3
1
1
1
1
1
1
2
3

C09
p m
3 3
1 1
1 1
1 1
3 3
1 1
1 3
3 3
G G
- delA
A C
A G
- AAC
G A
1 4

3
2
1
2
2
3
3
1
1
3
3
2
1
1
3
1
1
2
2
2
3

1
1
3
1
2
3
3
3
1
1
3
2
3
1
3
1
1
1
2
1
1

C05
p m
3 3
1 1
1 3
1 1
3 1
1 1
1 3
3 1
G A
- delA
A C
A G
- AAC
G A
1 4
A T
T C
C T

C14
p m
3 1
1 1
1 1
1 3
3 1
1 3
1 1
3 3
G A
- delA
A C
A G
- AAC
G A
1 1
A A
T T
C C
C C
C C
3 3
2 2
1 3
2 2
2 3
3 3
3 3
1 3
1 2
3 1
3 3
0 0
3 3
3 1
1 1
3 1
3 3
1 1
1 2
1 1
1 1

C10
p m
3 3
1 1
1 1
1 1
3 1
1 1
1 1
3 1
G A
- A A
A A
- G G
1 4
A A
T T
C C
C C
C C
3 3
2 2
1 1
2 2
2 2
3 3
3 3
1 3
1 2
3 3
3 3
2 2
1 1
1 3
3 3
1 1
1 1
2 2
2 2
2 2
3 1

“R” and“nR”, respectively. In offspring, paternal and maternal haplotypes are indicated by

The risk allele is shown in black. Unclear haplotypes are shown in gray．

haplotype are indicated by“p” and“m”, respectively.

Fig. 2 Genotypes of affected and normal cattle on the candidate region-1. Top boxes indicate each individual. In Bull-A, risk-haplotype and non-risk-

Bull A A06
A08
A10
A12
A15
C06
C15
C19
C20
C16
C03
C04
C17
C12
C18
C13
C22
nR R p m p m p m p m p m p m p m p m p m p m p m p m p m p m p m p m p m
SNP-1 3 1 1 1 1 3 1 1 1 3 1 1 1 1 3 1 1 3 1 3 1 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 3 1
SNP-2 1 2 2 2 2 1 2 2 2 1 2 1 2 2 1 2 2 1 2 1 2 1 1 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 1 1 2
SNP-3 1 3 3 3 3 1 3 3 3 1 3 1 3 3 1 3 3 1 3 1 3 1 3 1 3 3 3 1 3 3 3 3 3 1 3 1
SNP-4 1 3 3 3 3 1 3 3 3 1 3 3 3 1 1 3 3 1 3 1 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3
SNP-5 3 1 1 1 1 3 1 1 1 3 1 1 1 3 3 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 1 1 3 1 3 1 3 1 3
SNP-6 1 3 3 3 3 1 3 3 3 1 3 3 3 1 3 3 3 1 3 1 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1
SNP-7 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 3
SNP-8 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1
c.127+4G>A G A A A A A A A A A A A A G A A A A A A A A A G A A A G A A A A A A A G
c.391-74delA - dalA dalA dalA dalAdalA dalA dalA dalA dalA dalA dalA delA delA delA delA delA delA delA delA delA delA delAdelA delA - delA - delA - delA - delA - delA c. 391-73C>A A C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C A C A C A C A C A C A
c.437A>G A G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G A G A G A G A G A G A
c.450+7_14delinsAAC - AAC AACAAC AACAAC AACAAC AACAAC AACAAC AACAAC AACAAC AACAAC AACAAC AACAAC AACAAC AAC - AAC - AAC - AAC - AAC - AAC c.450+24G>A G A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A G A G A G A G A G A G
SNP-9 1 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 4c.2848A>T A T T T T T T T T T T T T T T T T T T T
T T T T T T T T
T T T Tc.1084C>T T C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C
c.1039C>T C T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T
c.292C>A C A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
c.284C>T C T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T
SNP-10 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
SNP-11 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 2
SNP-12 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
SNP-13 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
SNP-14 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2
SNP-15 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 1
SNP-16 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3
SNP-17 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1
SNP-18 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 1
SNP-19 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 1
SNP-20 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 3 1 3 1 3
SNP-21 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 2
SNP-22 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0 0 3 1 0 0 3 1
SNP-23 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 1 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 0 0 3 1 0 0 3 3
SNP-24 3 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 3 1 3 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 0 0 1 3 3 1 1 1
SNP-25 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 1 0 0 3 3 3 3 3 1 3 1 3 1 0 0 3 1 1 3 3 1
SNP-26 1 3 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 1 3 1 0 0 3 3 3 3 3 3 3 1 3 1 0 0 3 1 1 3 3 3
SNP-27 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 2 0 0 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 0 0 1 2 2 2 1 1
SNP-28 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 0 0 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 0 0 1 2 2 2 1 2
SNP-29 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 2 0 0 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 2 1 1 2 2 2 1 1
SNP-30 3 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 3 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 3 3 3 1 1

令和４年度

Gene-1

102
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

団における頻度調査および遺伝子上流の変異探索

これらのことから，Gene-9を候補遺伝子としを行う必要があると思われた。さらに，候補領て，exon 5周辺で検出された変異の遺伝子機能へ

域-2からGene-9と相互作用する遺伝子など関連の影響を調べるとともに，さらに多くの正常牛集する遺伝子の探索も行う必要があると思われた。

４．要

約

© The Ito Foundation

Log（1/p）0500,000

1,000,000

1,500,000

Gene-92,500,000

3,000,000

3,500,000

候補領域-1上の相対的位置（nt）

2,000,000

Gene-1

Open circle indicate p-value detected with χ２ test of each SNPs. Arrow indicates gene and its direction.

Fig. 3 Distribution of p-values for each SNP deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium in candidate region-1.

0

1

2

3

4

5

6

7

4,000,000

4,500,000

5,000,000

早産を伴う子牛死亡に関連する遺伝的要因の解明（Ⅱ）

103

IARS異常症はWCSの原因遺伝子変異の一つとして同定されたIARS c.235G>C（p.Val79Leu）変異

虚弱子牛症候群（WCS）は，黒毛和種の新生による黒毛和種の劣性遺伝的不良形質である。し子 死 亡 の 約 60 ％ を 占 め る と 考 え ら れ て い る 。

かし，IARS変異によらないWCSの発症が確認さ

104

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

れていることから，新たなWCSの原因遺伝子変

牛集団における遺伝子型頻度を調べたところ，

異を特定するために解析を進めている。これまで

HWEに従っていないことが分かった。これらのに，種雄牛Ａの産子で発症するWCSを候補領ことから，Gene-9を候補遺伝子として，さらに域-1と2にマッピングした。これら領域には同じ

詳細な解析を行う必要があると思われた。

ヒト遺伝性腎疾患の原因遺伝子が存在することから，まず候補領域-1に位置するGene-1の変異を探索し，５種の非同義置換を検出した。そこで，
これら5 SNPsを含むハプロタイプをマッピング
用 家 系 で 再 構 成 し た と こ ろ ，Gene-1 SNPs は
WCSと連鎖しないことが示された。さらに，候補領域-2に位置する関連遺伝子の変異を探索したが，遺伝子機能に影響すると思われる変異は検出されなかったことから，これら遺伝子は原因遺伝
子ではないと考えた。
改めて候補領域-1内で，特にアレル頻度に偏りのある領域に位置するGene-9の変異を探索したと こ ろ ，６ 種 の 多 型 が 検 出 さ れ た 。こ の う ち
exon 5および周辺に位置する５多型はWCSと連鎖すると思われ，さらに，これらの２多型で正常

文献１）
 Ogata, Y., Nakao, T., Takahashi, K., Abe, H.,
Misawa, T., Urushiyama, Y., Sakai, J.：Intrauterine
growth retardation as a cause of perinatal
mortality in Japanese black beef calves, J. Vet.
Med. A., 46, 327～334，1999．
２）
 Hirano, T., Kobayashi, N., Matsuhashi, T.,
Watanabe, D., Watanabe, T., Takasuga, A.,
Sugimoto, M., Sugimoto, Y.：Mapping and exome
sequencing identifies a mutation in the IARS geneas the cause of hereditary perinatal weak calf
syndrome, PLoS ONE, 21, e64036，2013．
 佐々木慎二，鈴木穣，森元学，秋山敬孝，福島護之，
３）
北村夕貴，田淵一郎，有島太一，長谷川清寿，高山恵，
黒木一仁，渡邊学，菅野純夫，杉本喜憲：黒毛和種の生産阻害因子解明のための多様体データベースの構築，日本畜産学会第122回大会講演要旨，2017．
 平野貴，村木英二，佐々木慎二：早産を伴う子牛
４）死亡に関連する遺伝的要因の解明，令和３年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，40，93～98，
2022．

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105

近交度の高い金華豚集団の遺伝的多様性に関する評価
Evaluation of genetic diversity in a highly inbred Jinhua pig population

塩谷

聡子・大竹

正剛・寺田

圭

（静岡県畜産技術研究所中小家畜研究センター）

Satoko Enya, Masayoshi Otake and Kei Terada（Shizuoka Prefectural Research Institute of Animal Industry Swine & Poultry Research Center）

In this study, we evaluated inbreeding effects on the reproductive traits of Jinhua pigs
and inbred minipigs maintained in the Shizuoka Prefectural Research Institute of AnimalIndustry Swine & Poultry Research Center. We collected pedigree information from Jinhua
pigs and inbred minipigs, as well as DNA samples from 21 and 289 pigs, respectively, whichwere used to obtain the SNP information. DNA samples were used to obtain the SNP
information. We calculated the inbreeding coefficients, and the genomic ones were calculated
from runs of homozygosity（ROH）according to Sus Scrofa 11.1 genome map. Moreover, weinvestigated the relationships between genomic inbreeding coefficients and the number of total
and live litter sizes. The average inbreeding coefficients for Jinhua pigs based on pedigree
information increased from 0 in 1996-1997 to 0.27 in the current sows born during 2015-2021.
The average genomic inbreeding coefficients were 0.25 and 0.34, respectively, indicating an
increase in genomic inbreeding coefficients. The correlation coefficient between the inbreeding
coefficients from ROH and pedigree information was 0.93. The relationship between theinbreeding coefficient and reproductive performances in the minipig lines showed that a 10％
increase in the inbreeding coefficient led to a decrease of 0.53 and 0.66 in total litter and live
birth sizes, respectively. These results indicated that the increase in the inbreeding coefficient
could affect reproductive performance in pigs; therefore, excessive inbreeding increases should
be monitored in the maintenance of the Jinhua population.

１．目

念される１）。静岡県畜産技術研究所中小家畜研究的センター（以下，「当センター」という）におい

一般に，ブタの集団の維持には，15％未満の近てもアジア系希少品種である金華豚を30年以上に交係数が望ましいとされている。しかし，現在国

わたり維持しており２），同様の問題に直面しつつ内で維持しているアグーなどのアジア系の希少品ある。これら希少品種の今後の集団の維持には，種はすでに高い近交度であり，新しい血縁を導入

近交退化を回避するため，ゲノム上のホモ化の程することができないため，今後さらに近交度が高度と繁殖性など形質との関連性を明らかにする必まることで集団の維持管理が難しくなることが懸要があると考えられる。

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106

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

また，当センターでは，ゲノムの斉一性を高め

イナーアリルの頻度が0.01以下の基準に従うSNP

たミニブタの系統を作出すべく，計画的に兄妹交を削除し，さらに，豚ゲノムマップ（Sus scrofa

配を重ねた近交系ミニブタを研究開発している。

11.1）において常染色体にあるSNPのみを解析に基礎個体群の一部には，ベトナムポットベリーが利用した。基準に準じたSNPは，Beagle 5.4を使使われており ，金華豚とミニブタは同じアジア

いインピュートし，ゲノム上のホモ化領域のサイ系ブタという共通点がある 。近交系ミニブタをズ（ROH）を計算した。個体ごとにROHの長さモデルとした急激な近交度上昇に伴い発生する形の合計を計算し，SNPの配置したゲノム領域の長質の異常は，国内で血縁導入ができない金華豚やさの商により近交係数（FROH）を計算した。ROH

アグーなどの集団で近い将来予想される，高い近由来の近交係数はPLINK v 1.9６，７）を用いて，各交度に伴い発生する問題の解決に応用できる可能個体について推定した。連鎖不平衡（LD）に起性があり，アジア系遺伝資源豚集団の遺伝管理手

因 し て ゲ ノ ム 全 体 に 出 現 す る 短 い ROH や 共 通法を検討するための一つのモデルにできると考えROHを除くため，ROHの最小長を1Mbに設定している。

た８）。以下のPLINKパラメータと閾値６）を適用し３）

４）

そこで本研究では，近交度が高まりつつある金てROHを定義した。１）ゲノム上の50個のSNP

華豚集団と計画的に近交度を高めた近交系ミニブのスライディングウィンドウ，２）ホモ接合体のタ集団のSNP情報から，各個体内で連続する比較

重複ウィンドウの割合が0.05，３）ROHに含まれ的広いホモ接合領域（Runs of Homozygosity：

る連続したSNPの最小数が50，４）ROHの最小ROH）から推定した近交係数を算出し，金華豚長が1Mb，５）連続したホモ接合体SNP間の最大の遺伝的保全をゲノム多様性の観点から検証する。

ギャップが1000kb，６）100kbあたり1SNP以上

２．方の密度，７）最大5SNPの欠損と最大１ヘテロ接法

合 遺 伝 子 タ イ プ を 許 容 し た 。各 個 体 に つ い て

本研究では，金華豚とミニブタをそれぞれ21頭

ROH長を計算するとともに，ROHの領域数と平および289頭を利用した。金華豚は，1996年から

均ROH長を計算し，染色体長に占めるROH長の1997年に生まれ種豚として用いられた個体から調割合を算出し，ROH由来の近交係数（FROH）とし査可能だった個体と2015年から2021年に生まれ現た。

在種豚として飼育されている個体を用いた。ミニ

繁殖成績調査と解析には，当センターにおけるブタ集団についてはＡからＤの基礎（G0）の両分娩記録を用いた。調査項目は，総産子数（生存親が異なる４つの系統を作り出した。ミニブタ集

産子数＋死産頭数），生存産子数とした。

団は離散世代として，各世代繁殖性の高い兄妹ペアなどを選抜した。それぞれの集団において記録した血統情報よりCoeFR ５）プログラムを用いて近交係数（FPED）を計算した。

３．結果と考察FPEDについて，金華豚においては，1996年から1997年に生まれた４頭は平均0.00，2015年からすべての個体よりDNAサンプルを採取し，2021年に生まれた17頭は平均0.27だった。ミニブ

Porciene 60k BeadChip V2とV3（Illumina）によタＡからＤの４つの系統においては，それぞれ第り SNP の 情 報 を 取 得 し た 。得 ら れ た SNP か ら

１世代（IB1）は平均0.06，0.25，0.13，0.13，最PLINK v 1.9

も進んだ世代（IB7，IB6，IB6，IB4）は平均0.75，

６，７）を用いてコール率が0.9以下，マ© The Ito Foundation

107

近交度の高い金華豚集団の遺伝的多様性に関する評価
Table 1 FPED and FROH in Jinhua and in minipig

Jinhuaminipig

A

B

C

D

FROH

FPED

N

Average

Average

Min

Max

SD

1996-1997

4

0.00

0.25

0.12

0.45

0.13

2015-2021

17

0.27

0.34

0.24

0.42

0.05

G0

2

0.09

0.27

0.25

0.29

0.02

IB1

14

0.06

0.31

0.28

0.34

0.02

IB2

30

0.31

0.42

0.32

0.53

0.05

IB3

35

0.39

0.47

0.35

0.57

0.05

IB4

18

0.54

0.57

0.49

0.63

0.05

IB5

17

0.62

0.61

0.57

0.68

0.03

IB6

26

0.70

0.68

0.60

0.75

0.04

IB7

7

0.75

0.73

0.70

0.79

0.03

G0

2

0.16

0.34

0.31

0.38

0.04

IB1

9

0.25

0.40

0.35

0.46

0.03

IB2

20

0.41

0.53

0.42

0.65

0.06

IB3

21

0.52

0.58

0.50

0.63

0.04

IB4

19

0.56

0.59

0.54

0.66

0.03

IB5

24

0.66

0.66

0.58

0.72

0.03

IB6

5

0.72

0.67

0.65

0.69

0.02

IB1

2

0.13

0.26

0.24

0.27

0.01

IB2

2

0.34

0.43

0.42

0.44

0.01

IB3

2

0.40

0.46

0.44

0.47

0.02

IB4

4

0.56

0.56

0.52

0.60

0.03

IB5

5

0.63

0.66

0.63

0.68

0.02

IB6

3

0.71

0.71

0.66

0.75

0.04

IB1

2

0.13

0.28

0.24

0.31

0.03

IB2

3

0.34

0.43

0.40

0.45

0.02

IB3

3

0.45

0.48

0.44

0.50

0.03

IB4

4

0.51

0.59

0.55

0.63

0.03

0.72，0.71，0.51であった（Table１）。

以下だった37頭に着目した場合，相関係数が0.13

FROHについて，金華豚においては，1996年からとほとんど相関は認められなかった。また，調査

1997年に生まれた４頭は平均0.25，2015年からを行った310頭中，76.5％にあたる237頭の個体で，2021年に生まれた17頭は平均0.34だった。ミニブ

FPED はFROH よりも小さかった。この結果は，FPED

タＡからＤの４つの系統においては，それぞれはFROH の値より小さいとの既報 ９）と同様であっ

IB1は平均0.31，0.40，0.26，0.28，最も進んだ世た。特に，FPEDが0.2以下の場合，すべての個体に代（IB7，IB6，IB6，IB4）は平均0.73，0.67，0.71，

おいてFPED がFROH よりも小さかった。FPED は基礎0.59であった（Table１）。

集団の近交係数を０として各個体について基礎個

金華豚とミニブタ，合わせて310頭の個体につ体の一つのアリルがホモ化している確率を表して

いて，FROH とFPED の相関係数は0.93であり，高いいるが，FROH では基礎集団の概念はないため，正の相関が認められた。しかしながら，FPEDが0.2

FROHが低い個体についてFPEDとの比較は留意を要© The Ito Foundation

108

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 2 Breeding performance of Jinhua and minipig
Average
FROH
Jinhuaminipig

A

B

C

D

N

Litter size

Min

Max

No. of live
pigletMin

Max

1996-1997

0.25

34

9.7

3

17

8.7

3

14

2015-2021

0.34

44

9.1

1

17

7.7

0

15

G0

0.27

4

6.8

5

8

6.3

4

8

IB1

0.31

7

4.9

4

6

3.6

1

6

IB2

0.42

9

4.3

2

6

3.4

0

6

IB3

0.47

13

3.9

2

10

2.1

0

8

IB4

0.57

8

4.2

2

7

3.4

2

7

IB5

0.61

21

3.8

2

9

2.6

0

7

IB6

0.68

11

3.3

1

5

2.5

0

4
6

G0

0.34

9

4.6

3

6

4.3

2

IB1

0.40

5

3.7

2

7

3.0

0

6

IB2

0.53

10

3.0

2

4

1.8

0

3

IB3

0.58

8

2.4

1

5

2.3

1

5

IB4

0.59

17

2.7

1

5

2.5

0

5

IB5

0.66

10

2.8

1

4

0.7

0

3
4

IB1

0.26

1

4

4

4

4

4

IB2

0.43

1

2

2

2

2

2

2

IB3

0.46

2

4.0

3

5

4.0

3

5

IB4

0.56

4

4.2

2

6

4.2

2

6

IB5

0.66

4

3.0

3

5

1.5

0

4

IB6

0.71

3

2.8

2

3

2.5

1

3

IB1

0.28

3

5.7

4

7

5.3

4

6

IB2

0.43

6

4.1

3

5

3.6

0

5

IB3

0.48

4

3.2

3

4

2.5

2

4

する。また，今回の解析では，SNPチップによる存産子数ともに１％有意水準で，FROHの上昇に伴データかつ1Mb以下のROHは解析に含めなかっい繁殖成績が低下し，回帰係数から親世代のFROHたため，過去に起こった近交に伴う多様性の低下が10％上昇すると総産子数および生存産子数がそについては，詳細には把握できないと考えられる

れぞれ0.53および0.66頭減少することが推定されが，本解析において導入した基礎個体においてもた（Table３）。総産子数に対して，母親の近交係

ROHが存在しており，FPEDで把握できない多様性

数上昇の影響は大きいと報告されている。當眞

の低下については，FROHではある程度評価できる

ら１）は，沖縄アグー豚において母親の近交係数が可能性があると考えられた。

10％上昇すると総産子数が0.59頭減少することを

金華豚およびミニブタの各世代の雌の繁殖成績
は，Table２のとおりである。近交係数上昇に伴報告している。今回推定された変化量は，0.53頭と報告値よりもわずかに低かった。

う繁殖能力の低下を予測するため，ミニブタ集団

導入から30年以上が経過した金華豚集団の遺伝のFROHと総産子数もしくは生存産子数の回帰直線管理手法の検討は当センターの喫緊の課題であっから，世代ごとの近交係数上昇に伴う繁殖能力のた。しかしながら，長期間飼育においてこれまで変化量を計算した。その結果，総産子数および生

FPED を上昇させない交配ペアを選択してきた結© The Ito Foundation

近交度の高い金華豚集団の遺伝的多様性に関する評価

109

Table 3 Trend of the effects of FROH in minipigs
the amount of change
Litter size

-0.53＊

No. of live piglet-0.66＊The values in the table represent the amount of change as FROH increases by 10%.
＊p<0.01

果，FPED が平均0.27で維持できており，ゲノム情を調査した。FPED（血統情報による近交係数）に報を用いた近交係数であるFROH においても平均

よる金華豚の平均近交係数は，1996から1997年に0.34であった。加えて，FPED は上昇しているが，生まれ種豚として用いられた個体のうち調査した

生まれた個体の中から繁殖性の良い個体を選抜し４頭は平均0.00であったが，2015年から2021年にているため，外部からの新しい血縁の導入がない

生まれ現在種豚として利用されている集団におい場合でも，産子数等の繁殖成績の低下は顕著ではて0.27まで上昇していた。FROHでは，それぞれ0.25なかったと考えられた。一方で，今後，繁殖成績

および0.34であり，ゲノム情報においても上昇しの低下が起こる可能性は排除できないため，ゲノていることが認められた。金華豚とミニブタのム情報等を利用した遺伝的多様性の管理を実施しFPED とFROH との相関係数は0.93であった。近交系ていく必要があると考える。

ミニブタ系統において近交係数と繁殖性との関係

近交退化に加え，近年では豚熱・アフリカ豚熱を調査した結果，近交係数が10％上昇すると，総など家畜伝染病の発生による殺処分により遺伝資

産子数と生存産子数がそれぞれ0.53および0.66頭

源が失われる可能性がある。希少種ブタ集団を維の減少することが推定された。本研究において，持するには上記維持管理方法に加え，凍結精液，

近交係数の上昇は繁殖能力に影響を与える可能性

凍結卵子，凍結受精卵の保存技術の開発も必要でがあることが示され，今後，金華豚集団の維持にあると考える。

おいても過度な近交度の上昇には留意を要すると

４．要考えられた。

約

本研究では，静岡県畜産研究所中小家畜研究センターで飼育している金華豚および系統維持している近交系ミニブタについて，血統情報による近謝

辞本研究は，農林水産省農林水産技術会議事務局の荒川愛作氏の協力のもと行われた。

交度の評価をゲノムの観点から評価し，比較を行った。記録した金華豚とミニブタの血統情報を利用するとともに，それぞれから21頭と289頭のDNAサンプルを用いた。得られたDNAサンプル
からSNP情報を得るとともに，Sus Scrofa 11.1に従い，ゲノム中の連続するホモ化領域（ROH）の特定と，ROHサイズからFROH（ゲノム情報による近交係数）を計算した。加えて，総産子数と生存産子数について，得られた近交係数との関係性

文献１） 當眞嗣平，親泊元治，翁長桃子，嘉数良子，野中克冶：近交係数増加が沖縄アグー豚の繁殖成績に及ぼす影響，沖縄県畜産研究センター研究報告，第53号, 25～28, 2015.
２）
 関哲夫，堀内篤，野口博道：金華豚の特性調査について（１），静岡県中小家畜試験場研究報告，第１号, 7～15, 1988.
 Kaneko, N., Itoh, K., Sugiyama, A., Izumi, Y.：J
３）
Pharmacol Sci, 115, 112～114. 2011.
４） 當眞嗣平，島袋宏俊，親泊元治，我那覇紀子，光© The Ito Foundation

110

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

部柳子，野中克冶，奥村直彦，荒川愛作：SNPマーカーを用いたアグーの遺伝構造解析，沖縄県畜産研究センター研究報告，第51号, 17～20, 2014.
５） 佐藤正寛：大規模血統情報から近交係数を算出するプログラムの開発，日豚会誌, 37, 122～126, 2000.
６） Purcell, S., Neale, B., Todd-Brown, K., Thomas, L.,
Ferreira, M. A., Bender, D., et al.：PLINK: a tool
set for whole-genome association and populationbased linkage analyses, Am. J. Hum. Genet., 81, 559～575, doi：10.1086/519795, 2007.
７） Chang, C. C., Chow, C. C., Tellier, L. C., Vattikuti,

S., Purcell, S. M., Lee, J. J.：Second-generation
PLINK: rising to the challenge of larger and richer
datasets, Gigascience, 4, 7, doi: 10.1186/s13742-0150047-8, 2015.
８） Purfield, D. C., Berry, D. P., McParland, S.,
Bradley, D. G.：Runs of homozygosity andpopulation history in cattle, BMC Genet, 13, 70.
doi：10.1186/1471-2156-13-70, 2012.
９） 佐々木慎二：沖縄県の島々の黒毛和種集団の多様性，近交度のゲノムの視点からの評価，食肉に関する助成研究調査成果報告書, 38, 118～122, 2019.

© The Ito Foundation

111

表型値間因果構造を利用した豚繁殖形質の正確な同時改良手法開発
A new method for aggregated breeding value considering causal structure

岡

村

俊

宏

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Toshihiro Okamura（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

Simultaneous improvement of farrowing and nursing traits is necessary to improve sows.
However, conventional methods of simultaneous improvement may not be applicable dependingon the statistical model used to estimate genetic parameters and breeding value because there
are the causal relationships between these traits. Therefore, selection indices were derived
allowing genetic parameters with the statistical model considering causal relationship, andcomputer simulations were conducted to estimate aggregate breeding value using thosegenetic parameters for simultaneous improvement using the statistical model. The conventional
method of calculating the selection index using genetic parameters with a statistical model
considering causal effects mathematically showed that the expected gains of phenotypes could
deviate from the relative desired gain. However, it was also shown that the deviation could be
eliminated, and the desired improvement could be achieved by correcting the relative desired
improvement with considering causal effects. In addition, computer simulations assuming to
improve simultaneously farrowing and weaning traits in a closed population showed that thegains based on the estimated aggregate breeding value using genetic parameters with themodel considering causal relationships was biased toward weaning traits. However, this bias
could be eliminated by using the relative desired gains corrected for causal effects. This study
indicates that simultaneous improvement using genetic parameters with a model considering
caulsal relationships requires a correction to account for their causal effects in setting therelative desired gain.

１．目

だったからである。しかし，母豚に望まれる能力

的は，分娩時の産子能力だけでなく，離乳時の離乳

豚の生産頭数を増やすための改良の多くは，産頭数・総体重に表れる哺育能力も重要である。そまれてくる子豚の数（総産子数や生存産子数）をのため，母豚の改良は生存産子数に加え，離乳頭増やすことで行われてきた

数や離乳総体重も改良対象とした，両者の同時改。これは，これら

１，２）の形質が離乳頭数と比較して低労力で測定でき，従来の改良方法でも着実に育種することが可能

良が必要である。
一 方 で ，豚 ラ ン ド レ ー ス 種 お よ び 大 ヨ ー ク© The Ito Foundation

112

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

シャー種における繁殖形質間の因果構造推定にが成り立つ。
p = (I t×t－Λ)－1g + (I t×t－Λ)－1e

よって，生存産子数と離乳頭数および離乳総体重の表型値間の原因と結果の関係性，すなわち因果

ここで，

g* = (I t×t－Λ)－1g, e* = (I t×t－Λ)－1e

関係とその強さを含む因果構造の存在が示唆されている３）。これはすなわち，生存産子数増加は，と書き換えると，

離乳頭数増加と離乳総体重減少をさせ，離乳頭数
増加は離乳総体重減少をさせるという関係である。また，報告者らは，この関係をもとにして，である。

p = g* + e*

このとき，表型値と育種価の共分散 G* および離乳頭数および離乳総体重から生存産子数の影響

表型値の分散 p* は，それぞれを取り除く統計モデルを開発した。

G* = Cov( p, g*' )しかし，従来から豚の改良に用いられている同時改良のための総合育種価推定方法４，５）では，この因果関係を考慮した統計モデルより得られた推定育種価には対応できない可能性がある。それは，従来法では形質間の関係性を遺伝相関と表型相関で考慮するのに対し，因果関係を考慮した統計モデルにおいては，それらの相関に加え，表型値間の因果効果にて形質間の関係性を表すからである。
そこで本研究では，１）因果関係を考慮した統計モデルに対応した同時改良のための選抜指数を数学的に導出すること，２）豚育種集団を模したコンピューターシミュレーションを実施して，
１）が実際の改良に有用かを検証することを目的
とした。
２．方
2.1

= Cov( p, (I t×t－Λ)－1 g' )= Cov( p, g' ) (I t×t－Λ)－1'= G(I t×t－Λ)－1' G，
ただし，Cov(p, g' ) = Var( p)P* == Var( g* + e*)= Var( g*) + Var(e*)= Var((I t×t－Λ)－1 g) + Var((I t×t－Λ)－1 e)= (I t×t－Λ)－1) G0 (I t×t－Λ)'－1 +(I t×t－Λ)－1 R0 (I t×t－Λ)' －1= (I t×t－Λ)－1 P(I t×t－Λ)' －1

ただし，Var( g) = G0，Var(e) = R0，G0 + R0 = Pと表すことができる。

このとき，通常の多形質モデルから得られる遺伝的パラメーターは，G* および P* であり，因果関係を考慮した統計モデルから得られる遺伝的パ法

ラメーターは G および P である。

選抜指数の数学的導出

相対的希望改良量のベクトルを d とすると，

表型値のモデルを以下のとおりとする。

それを達成するための選抜指数はYamadaら３）の相対希望改良量を達成するための選抜指数は，通p = Λp + g + e

ここで，p, g, eはそれぞれ各個体の，t × 1 の
表型値，育種価，誤差のベクトル，Λ は因果構造を表す t × t の因果構造係数の行列とする。
この式は，(I t×t－Λ) p = g + e

常の多形質から得られる遺伝的パラメーターを用いた場合には
ただし，b1 = P*

－1I1 = b 1 p

G*(G*'P*－1G*)－1dであり，因果関係を考慮した統計モデルから得らと書き換えることができるため，一般的に次の式

れる遺伝的パラメーターを用いた場合には，© The Ito Foundation

113

表型値間因果構造を利用した豚繁殖形質の正確な同時改良手法開発

ただし，b3 = P－1G(G'P－1G)－1d*I 2 = b 2p

ただし，b2 = P－1G(G'P－1G)－1dである。このとき，I3 の選抜指数によって得られる表型値の期待改良量はである。

このとき，I1の選抜指数によって得られる表型

値の期待改良量はE(∆p) = E(∆g*)= E(∆(I t×t－Λ)－1 g)= (I t×t－Λ)－1E(∆ g)= (I t×t－Λ)－1=

G*)－1dCov( g, p' )b1(I t×t－Λ)－1G'P*－1G*(G*'P*－1=

G*'P*－1G*(G*'P*－1G*)－1d=dE(∆p) = (I t×t－Λ)－1

Cov( g, p' )b3=(I t×t－Λ)－1G'P－1G(G'P－1G)－1d*=(I t×t－Λ)－1(I t×t－Λ)d=dとなり，相対希望改良量のベクトルの方向と一致する。
2 . 2 コンピューターシミュレーションによる検証
Satohら５）では，多形質のBLUP法によって得られた推定育種価とそれらに重み付けした推定総合育種価による選抜によって，相対希望改良量の

ただし，i は標準選抜差となり，相対希望改良量のベクトルの方向と一致達成が期待されることを示している。その重み付する。一方，I2 の選抜指数によって得られる表

け値の算出方法は，総合育種価の重み付け値のベ型値の期待改良量はE(∆p) = (I t×t－Λ)－1

クトルを a とすると，
a = (G'P－1G)－1d

Cov( g, p' )b2

であり，それらと各形質の推定育種価を組み合わ=(I t×t－Λ)－1G'P－1G(G'P－1G)－1d=(I t×t－Λ)－1d

せた推定総合育種価を
Ĥ = a' ĝとして算出できる。これは国内の系統造成事業で広く利用されているものである。

となり，相対希望改良量のベクトルの方向と一致発生させる表型値は生存産子数（NBA），離乳
頭数（NW）および離乳総体重（WW）とし，基しない。
ここで，因果関係を考慮して補正した相対希望
改良量 d*を本的なパラメーターはOkamuraら３）で推定されたlandrace集団のパラメーターを用いた。集団は

d* = (I t×t－Λ)d

雄90頭，雌360頭の基礎集団から，雄１頭につきとすると，これと因果関係を考慮した統計モデル

雌４頭が交配して次世代の雄90頭，雌360頭を作から得られる遺伝的パラメーターを用いた場合にると想定し，５世代を発生させた。また，６世代

は，目には雄360頭，雌720頭の候補豚を発生させ，そI 3 = b 3p

こから雄90頭，雌360頭をⅠ～Ⅲの推定総合育種© The Ito Foundation

114

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

価で選抜し，その選抜差を改良量とした。また，

３．結果と考察１～５世代目の雌1800頭が表型値を持つと想定した。

3.1

表 型 値 と 家 系 情 報 か ら EM-REML 法 に よ り
BLUPF90+

選抜指数の数学的導出

選抜指数 I1を用いた選抜では，表型値の期待改を用いて遺伝的パラメーターを算

良量が相対希望改良量のベクトルと方向が一致し出し，そのパラメーターをもとにBLUPによる推た一方で，選抜指数 I2を用いた選抜では，表型値

６）定育種価と推定総合育種価を算出した。推定総合の期待改良量は相対希望改良量のベクトルの方向

育種価の算出に，Ⅰ）通常の多形質モデルから得とは一致しなかった。このことより，因果関係をられる遺伝的パラメーターG*およびP*と相対的考慮した統計モデルより得られる遺伝的パラメー

希望改良量d，Ⅱ）因果関係を考慮した統計モデ

ターを用いた選抜指数による改良は相対希望改良

ルから得られる遺伝的パラメーターGおよびPと量から乖離することが示唆された。また，選抜指相対的希望改良量d，Ⅲ）因果関係を考慮した統計モデルから得られる遺伝的パラメーターGおよ

数 I3を用いた選抜では，表型値の期待改良量が相びPと相対的希望改良量d*を用いて改良量を算出

より，因果関係を考慮した統計モデルから得られし，それを5000回繰り返し，その平均値を比較しる遺伝的パラメーターを用いた，相対的希望改良た。

量を達成するための選抜指数には，因果関係を考dは慮して補正相対希望改良量を用いる必要があるこ

対希望改良量のベクトルと方向が一致した。以上とが示された。
3 . 2 コンピューターシミュレーションによる検証
シミュレーションによって得られた生存産子

た だ し ，dNBA ，dNW お よ び dww は そ れ ぞ れ
NBA，NWおよびWWの希望改良量とした。

数，離乳頭数および離乳総体重の改良量およびその改良量比をTable１に示した。シミュレーショ
ンの結果，Ⅱの推定総合育種価による改良量はⅠと比較してNWおよびWWに対して1.5～２倍程度に大きく偏っていた。これは，Ⅱで用いた因果関

Table 1 Genetic gain of each trait. NBA NW and WW were number

born alive, number of weaned piglets and total weight of weaned
piglets, respectively.
Unit

NBA
NW
WW
Ratio of NW to NBA
Ratio of WW to NBA

Estimated aggregate breeding value
I

II

III

head
head
kg

0.14
0.10
1.23

0.12
0.18
1.68

0.14
0.10
1.23

kg/head

0.75
8.97

1.46
13.56

0.75
8.96

NBA, NW and WW were number born alive, number of weaning piglets andtotal weight of weaning piglets, respectively.

© The Ito Foundation

表型値間因果構造を利用した豚繁殖形質の正確な同時改良手法開発

115

係を考慮した統計モデルから得られた遺伝的パラ計モデルでも同時改良が可能な選抜指数の導出おメーターの形質間の関係性には因果効果が含まれよび推定総合育種価の算出方法についてコンていないことから，NBAの改良量によるNWおよ

ピューターシミュレーションで検証した。相対希びWWへの因果効果，およびNWの改良量による望改良量を達成するための選抜指数の算出に，因WWへの因果効果が考慮されないような推定総合

果関係を考慮したモデルを用いる場合には，因果育種価となったため，NWおよびWWへの改良量

効果を考慮して補正した相対希望改良量を用いるの偏りが生じたと考えられる。一方で，Ⅲの推定ことで，想定した相対希望改良量が得られる選抜

総合育種価による改良量はⅠとほぼ一致してい指数になることが示された。また，分娩時形質とた。Ⅲで用いた遺伝的パラメーターも，形質間の離乳形質を想定したコンピューターシミュレー

関係性には因果効果が含まれていないが，NBAションでは因果関係を考慮したモデルによる遺伝の改良量によるNWおよびWWへの因果効果，お的パラメーターを用いた推定総合育種価による改よびNWの改良量によるWWへの因果効果を相対良量は，離乳形質に大きく偏ることが示された

希望改良量の補正に用いることで，Ⅰと同様に想が，因果効果を考慮して補正した相対希望改良を定した相対希望改良量の比に近くなったと考えら

用いることで，その偏りが解消できることが示さ

れる。

れた。

以上の結果より，相対希望改良量を達成するための選抜指数および推定総合育種価の算出に，因果関係を考慮した統計モデルから得られる遺伝的パラメーターを用いる場合には，因果効果を考慮して補正した相対希望改良量を用いる必要がある
ことが示された。
４．要

約

母豚の改良には分娩時形質と哺育形質の同時改良が必要である。しかし，これらの形質間には因果関係が存在することから，遺伝的パラメーター
および育種価を推定するために用いる統計モデル
によっては，従来の同時改良方法が適用できない文
献１）
 Sorensen, D., A. Vernersen, and S. Andersen：
Genetics, 156.1, 283～295, 2000.
 Holl, Justin Wane, and O. W. Robison：Journal of２）
Animal Science, 81.3, 624～629, 2003.
３）
 Okamura, T., K. Ishii, M. Nishio, G. J. Rosa, M.
Satoh, O. Sasaki：Animal Science Journal, 91（1）,e13369, 2020.
 Yamada, Y., K. Yokouchi, and A. Nishida：
４）Japanese Journal of Genetics, 50, 33～41, 1975.
５）
 Satoh, M., C. Hicks, K. Ishii and T. Furukawa：Animal Science Journal, 71, 17～25, 2000.
 Misztal, I., S. Tsuruta, D. A. L. Lourenco, Y.
６）
Masuda, I. Aguilar, A. Legarra, Z. Vitezica. 2018.
Manual for BLUPF90 family programs. Universityof Georgia. http://nce.ads.uga.edu/wiki/doku.
php?id=documentation

可能性がある。そのため，因果関係を考慮した統© The Ito Foundation

116

黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立（Ⅱ）
Establishment of breeding improvement method for “sweet smell” inJapanese Black beef（II）

庄

司

則

章１・上

本

吉

伸２

（１山形県農業総合研究センター畜産研究所，２東北大学大学院農学研究科）

Noriaki Shoji１ and Yoshinobu Uemoto２（１Livestock Research Institute, Yamagata Integrated Agricultural Research Center,
２Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

For the “sweet aroma” characteristic of Japanese black beef, genetic parameters related tothe precursors of aroma compounds that contribute to the “sweet aroma” evaluation value of
baked meat were estimated, and aroma compounds that contribute to the “sweet aroma”
evaluation value of boiled meat were investigated. Heritabilities of monosaccharides, free aminoacids, dipeptides, and nucleic acid-related substances, which are precursors of baked aroma,
were 0.28, 0.15, 0.15, and 0.19, respectively, and the difference in predicted breeding values
among bulls was about 30％ of the tabular value. The components significantly correlated with“sweet aroma” of boiled meat were 1-Tetradecanol, Pantolactone， γ-Crotonolactone,
1-Hexadecanol, Skatole, Acetoin, Isovaleric acid, and Butyric acid. The results of PLS analysis
with these eight components suggested that the “sweet aroma” rating could be estimated fromtheir content.

１．目の香りが弱くなった」，「甘みのある和牛肉が少な的くなった」といったような食味低下を危惧する意

黒毛和種牛肉（以下「和牛肉」とする）は脂肪見が多い。牛肉の食味には食感，味，香りの３つ交雑の多さが特長であり，これまで重点的に育種の要素があり，最近の研究から香りが最も重要で改良が進められてきた。そのため，脂肪交雑は飛あることが明らかとなっている。いくつかの品種

躍的に向上し，全国の令和４年枝肉格付におけるの牛肉の比較試験においても，和牛肉は輸入牛肉

５等級率は10年前の３倍となる60％まで高まってと比べて官能評価で明らかに甘い香りが強く，まいる。また，BMS No.の現場後代検定成績が10をた，交雑種や褐毛和種等の牛肉と比べても有意に超える種雄牛が続出していることから，全国の５甘い香りが強い。和牛肉の特長は甘く脂っぽい香

等級率はさらに高まることが予想される。脂肪交りである「和牛香」にあるということが食肉関係雑量の多い和牛肉生産が拡大する一方で，食肉流者の間では広く知られており，これらの品種比較

通関係者には「脂肪交雑は多くなったが和牛独特をした試験成績からも和牛肉の特長は和牛香であ© The Ito Foundation

黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立（Ⅱ）

117

る こ と が 分 か る 。脂 肪 交 雑 量 が 強 く 影 響 す る

核酸関連物質を，メタボロミクス前処理ハンド「脂っぽさ」は現状の和牛肉では十分であると考

ブック４）の方法により抽出ならびに誘導体化し，えられることから，我々は「甘い香り」を高めて

ガスクロマトグラフ質量分析計（島津製作所製

いくことが和牛肉の食味向上のうえで非常に重要

QP2010plus

であると考える。

0.25mmID）により測定した。定量にあたっては，

前報

カ ラ ム ： DB-5 30m × 1.00 μm ×において，焼成和牛肉の「甘い香り」に

標準試薬より調製したQCサンプルをサンプル７

関与する香気成分の含有量は，生牛肉中の粗脂

検体ごとに分析し，LOWESS平滑化とSplineによ肪，単糖，遊離アミノ酸，ジペプチド，核酸関連

りQC定量値を補間し，その補間値によりサンプ

物質，遊離脂肪酸の６成分により説明できること

ルの定量値を標準化した５）。

１）から，これらの成分は「甘い香り」の前駆物質でグルコース，フルクトース，マンノース，リボーあると考えられる。また，これらの成分は熟成前

ス，アラビノースの総量を単糖含量，グルタミン，後の相関が高いことも明らかとなっている。そこ

アラニン，ロイシン，リジン，セリン，バリン，で本研究では，焼成和牛肉の「甘い香り」に寄与

フェニルアラニン，グリシン，チロシン，イソロ

する香気成分の前駆物質について遺伝的パラメー

イシン，メチオニン，トレオニン，アスパラギン，

ターを推定し，「甘い香り」前駆物質の遺伝的要プロリン，オルニチン，ヒスチジン，βアラニン，

因を明らかにする。

γアミノ酪酸，グルタミン酸，アスパラギン酸のまた，和牛肉の特長とされる「和牛香」は脂肪総量を遊離アミノ酸含量，カルノシンとアンセリ

交雑度の高い和牛肉を熟成後にスライスし，含気ンの総量をジペプチド含量，ヒポキサンチン，イ

状態で冷蔵したのち，80℃前後の煮肉調理においノシン，イノシン酸の総量を核酸関連物質含量とてより感じやすい 。和牛香にはラクトン，ケト

した。これらの成分は水溶性物質であり，サンプン，アルデヒド類など脂肪由来の香気成分の関与

ル中の粗脂肪割合の影響を大きく受ける。そこでが報告 されているものの，和牛香を構成する香粗脂肪含量を併せて測定し，粗脂肪を除いた重量

気成分の全体像には不明な点が多い。そこで煮肉当たりで補正した単糖，遊離アミノ酸，ジペプチの「甘い香り」に注目し，分析型官能評価と香気

ド，核酸関連物質含量を用いた。また，異常値を成分分析から煮肉の「甘い香り」に寄与する香気除外するため，形質ごとに平均値±３SDの範囲

成分についても明らかにする。

のみのデータを採用した。遺伝率の推定および育

２）

３）

２．方

種価の予測は，単形質アニマルモデルREML法を法

2 . 1 試験１

用い，遺伝相関の推定は２形質アニマルモデル
焼成肉における「甘い香り」前REML法を用いた。調査牛の４世代まで遡って得られた17,604頭の血縁情報を用い，母数効果とし駆物質の遺伝的要因の解明
焼成和牛肉の「甘い香り」に重要な香気成分のて農場，と畜場，と畜年，と畜月，性を，共変量前駆物質と考えられる単糖，遊離アミノ酸，ジペとしてと畜月齢への２次までの回帰を考慮した以

プチド，核酸関連物質の遺伝的パラメーターを推下のモデルにより，ASREML v4.1を用いて遺伝定するため，山形県内の市場に上場された黒毛和的パラメーターを推定した。

種の枝肉3,684検体より切開面の僧帽筋を採取しｙ＝総平均＋農場＋と畜場＋と畜年＋と畜月＋た。僧帽筋の単糖，遊離アミノ酸，ジペプチド，性＋と畜月齢（２次回帰）＋育種価＋誤差© The Ito Foundation

118

令和４年度

2 . 2 試験２

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

煮肉の「甘い香り」に寄与する

香気成分の特定
牛肉販売店より，２mm厚でスライスしたサー３．結果と考察3.1

試験１

ロイン31検体（黒毛和種15，交雑種６，乳用種４，

試料の粗脂肪含量を除いた値で補正した，枝肉

外国種６）を購入して真空パックし，官能評価な

切開面の僧帽筋の単糖，遊離アミノ酸，ジペプチ

らびに理化学分析まで－80℃にて保存した。

ド，核酸関連物質含量の平均値±標準偏差は，そ分析型官能評価は（一社）
食肉科学技術研究所にれぞれ2.86±0.75，9.37±2.24，9.39±2.35，3.55±

依頼した。最長筋を80℃の１％食塩水中で２分間

1.03mg/g除脂肪であった（Table１）。これらの形

加熱し，ただちに５名の分析型パネルに提供し質の変動係数はそれぞれ26.3，23.9，25.0，28.9％て，甘い香り，脂っぽい香り，肉様の香りを評価

であり，不飽和度の12.3％に比べて高いことから，した。１回あたりの検査数は３検体とし，全10回

より個体間差が大きい形質であると考えられた。

の官能評価においてデータを比較できるよう，同また，Table１に遺伝率 h２を示した。脂肪の口溶

一の基準肉（交雑種）を毎回食し，基準肉を０とけに影響する不飽和度の遺伝率は0.65であり，こして各検体の香りの強さを＋３（非常に強い）～れまでの報告６，７）と同程度であった。一方，単糖，－３（非常に弱い）の７段階で評価した。

遊離アミノ酸，ジペプチド，核酸関連物質含量のまた，同様に調理した最長筋を細断してエタ

遺伝率は0.28，0.15，0.15，0.19であり，不飽和度

ノールを添加し，ビーズ式破砕機（安井器械製に比べて低い遺伝率であった。Sakumaら８）は黒

マルチビーズショッカー）にて2000rpmで120秒

毛和種587頭の最長筋を用いた同様の解析を報告

間破砕した。これを30℃で一夜，香気成分を抽出しており，牛肉中の水分当たりの遊離アミノ酸，後，内部標準物質（シクロヘキサノール）と硫酸

ジペプチド，核酸関連物質含量の遺伝率は本研究ナトリウムを添加して脱水し，－10℃の遠心分離と同程度の0.12，0.18，0.22であった。また，こにより上清を得た。固相抽出（InertSep C18FF）の報告ではグルコース，フルクトース，マンノー

により上清から中性脂質を除去し，抽出液にヘキス，リボース，グリセロール，myo-イノシトー

サン・ジエチルエーテル混液を６倍量添加して糖ルの総量の遺伝率は0.08，それぞれの単糖の遺伝とアミノ酸を沈殿させ，上清を濃縮した。この濃率も0.04～0.14であり，本研究の遺伝率の方が高縮サンプルを，標準試薬より調製したQCサンプ

かった。本研究において種雄牛809頭の育種価をルとともにガスクロマトグラフ質量分析計（カラ予測し，このうち2010年生まれ以降の種雄牛119

ム ： DB-WAX UI 30m × 0.25 μm × 0.25mmID）

頭の単糖，遊離アミノ酸，ジペプチド，核酸関連で測定し，試験１と同様に定量値の標準化を行っ

物質含量の育種価の最大値―最小値間差はそれぞた。分析型パネルによる「甘い香り」評価値を目れ1.23，2.66，2.92，1.38mg/g除脂肪であった。

的変数，香気分析値を説明変数とするPLS解析を

これらの形質の遺伝率は高くはないものの，表型

The Unscrambler X（CAMO社）により実施し，

値の30％程度の育種価の種雄牛間差が認められた。

煮肉の「甘い香り」に寄与する香気成分を選定しTable２に遺伝相関を示した。核酸関連物質とた。

粗脂肪含量の遺伝相関は－0.69であった。この核酸関連物質含量は，粗脂肪含量を除いた原物当たりの値であるが，それでも粗脂肪含量と比較的高© The Ito Foundation

119

黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立（Ⅱ）
Table 1 Basic statistics and heritability
Trait

Abbreviations

N

mean

SD

CV

h２

Carcass weight

CW

3656

460.5

54.4

11.8

0.45

Crude fat

CF

3676

42.1

9.2

21.7

0.47

US/S

3645

1.96

0.24

12.3

0.65

Total sugar＊

TS

3658

2.86

0.75

26.2

0.28

Total free amino acids＊

TFAA

3638

9.37

2.24

23.9

0.15

Total peptides＊

TP

3640

9.39

2.35

25.0

0.15

Total nucleotides＊

TN

3603

3.55

1.03

28.9

0.19

Ratio between
USFA and SFA

h２：heritability estimates
SFA = sum of C14:0, C16 : 0 and C18 : 0
USFA = sum of C14 : 1, C16 : 1 and C18 : 1
Total sugar = sum of Glc, Fru, Man, Rib and Ara
Total free amino acids = sum of Gln, Ala, Leu, Lys, Ser, Val, Phe, Gly, Tyr, Ile, Met,Thr, Asn, Pro, Orn, His, β-Ala, GABA,Glu and Asp
Total peptides = Car and Ans
Total nucleotides = Hx, Ino and IMP＊ Trait values in meat excluding fat（mg/g meat excluding fat）

Table 2 Genetic correlations
TS

TFAA

TP

TN

CW

－0.26

0.25

－0.11

0.03

CF

－0.19

－0.26

－0.33

－0.69

US/S

－0.19

0.21

0.06

0.19

Abbreviations are the same as Table 1.
Table 3 Significance of non-genetic effects（p-value）
Trait

farm

slaughter
place

year

sex
month

ageinmonths
primary

secondary

CW

<.001

<.001

0.001

0.003

<.001

<.001

0.015

CF

<.001

<.001

0.002

<.001

<.001

0.526

0.754

US/S

<.001

0.902

0.159

<.001

<.001

<.001

0.602

TS

<.001

<.001

0.112

<.001

0.346

0.136

0.966

TFAA

<.001

<.001

0.024

<.001

0.130

0.110

0.003

TP

<.001

0.01

<.001

<.001

0.389

0.291

0.977

TN

<.001

<.001

<.001

<.001

<.001

0.154

0.885

Abbreviations are the same as Table 1.

い負の遺伝相関を示した。このことから現在の脂おいて有意な効果が認められた（Table３）。デー

肪交雑を重視した黒毛和種の育種改良により，牛タ数が10以上の96農場における単糖（TS），遊離肉のうま味に関与する核酸関連物質は低下していアミノ酸（TFAA），ジペプチド（TP），核酸関

くものと考えられた。

連物質（TN）含量の農場効果の最大値－最小値

非遺伝効果である農場効果は，すべての形質に間差はそれぞれ1.31，3.27，3.45，1.36mg/g除脂© The Ito Foundation

120

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

肪であり，農場の飼養管理の違いが大きいことがあった（Table５）。これらの化合物は「脂っぽい推察された。今後，農場効果と飼養管理との関連香り」とも同程度の相関関係にあった。この８化性についても調査し，飼養管理面からこれらの形

合物の煮肉含有量を説明変数，「甘い香り」評価

質の向上方策を明らかしたい。

値を目的変数としたPLS解析を実施したところ，

3.2

試験２

因子数１，決定係数はキャリブレーション0.753，

煮肉による分析型官能評価において，黒毛和種

バリデーション0.725となり，８化合物により「甘は交雑種，乳用種，外国種に比べて「甘い香り」

い香り」を説明できるものと考えられた。分析型と「脂 っ ぽ い 香 り」が 有 意 に 強 か っ た（Table

官能評価の実施にあたっては，試料の入手と調

４）
。佐久間ら

も官能評価において黒毛和種牛

製，検査員の確保等で多大な労力と費用が必要と肉は輸入牛肉に比べて「甘い香り」と「脂っぽい香なり，多検体の牛肉の「甘い香り」評価値を蓄積り」が大きく優れることを報告しており，改めてするのは困難であるが，本研究より「甘い香り」

これらの香りは黒毛和種牛肉の特徴であることが評価値を煮肉の香気成分分析値から推定できるこ確認された。煮肉の香気成分分析では半数以上のとが示唆された。次に，煮肉調理前の生肉を用い試料から検出された化合物数は63であり，このうて同様の推定が可能かどうか検討した。生肉の香

ち官能評価の「甘い香り」と有意な相関（ｐ＜0.01）

気成分を分析し，上記８化合物によるPLS解析をが 認 め ら れ た 化 合 物 は 1-Tetradecanol,

行ったところ，因子数１，決定係数はキャリブ

Pantolactone, γ-Crotonolactone, 1-Hexadecanol,

レーション0.612，バリデーション0.639であった。

Skatole, Acetoin, Isovaleric acid, Butyric acid で

このバリデーションの決定係数0.639（相関係数９）Table 4 Sensory evaluation value
Beef breeds

N

Sweet smell

Fatty smell

Meat smell

Japanese Black

15

0.97

±0.41

A

0.76

±0.59

A

－0.12

±0.43

B

Hybrid（H×JB）

6

－0.10

±0.49

B

－0.30

±0.63

B

0.40

±0.35

B

Holstein

4

－0.90

±0.41

C

－1.15

±0.33

B

1.25

±0.22

A

Foreign species

6

－2.20

±0.12

D

－2.23

±0.24

C

－0.13

±0.60

B

Significant difference between different codes（p<0.05）
Table 5 Correlation between sensory evaluation values and boiled meat aroma

content（N=31）

Sweet smell

Fatty smell

Meat smell

1-Hexadecanol

0.56

0.51

－0.31

Pantolactone

0.54

0.54

－0.49

γ-Crotonolactone

0.49

0.45

－0.17

1-Tetradecanol

0.47

0.50

0.15

Skatole

0.46

0.32

－0.30

Acetoin

－0.49

－0.52

0.11

Isovalericacid

－0.50

－0.49

－0.07

Butyricacid

－0.67

－0.69

－0.20

© The Ito Foundation

黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立（Ⅱ）
Table 6121

Aroma content of boiled and raw meat（N=31）
Content（ng/g meat）

p-value

Correlation
coefficient

49

0.938

0.448

72

0.000

0.555

1756

1630

0.154

0.979

687

729

0.785

0.992

boiledraw

1-Tetradecanol

50

Pantolactone29γ-Crotonolactone
1-Hexadecanol
Skatole

6

12

0.031

0.339

Acetoin

5718

9768

0.000

0.942

Isovaleric acid

21

44

0.000

0.763

Butyricacid

1354

2488

0.000

0.801

0.80）は，近赤外測定装置による黒毛和種枝肉筋
間脂肪のMUFA推定における相関係数0.80 10）と同

４．要

約程度であり，煮肉に比べて推定精度は低下するも和牛肉の特長である「甘い香り」について，焼のの，生肉でも「甘い香り」評価値を予測できる成肉の「甘い香り」評価値に寄与する香気成分のものと考えられた。

前駆物質に関する遺伝的パラメーターを推定する

この８化合物の含有量を煮肉と生肉で比較したとともに，煮肉の「甘い香り」評価値に寄与する

ところ，Pantolactone, Skatole, Acetoin, Isovaleric

香気成分を調査した。焼成香気の前駆物質である

acid, Butyric acidは煮肉調理により有意に減少し単糖，遊離アミノ酸，ジペプチド，核酸関連物質

た（Table６）。これらの化合物は水に溶解するが，水の遺伝率はそれぞれ0.28，0.15，0.15，0.19であり，に不溶である1-Tetradecanol, γ-Crotonolactone,

予測された育種価の種雄牛間差は表型値の30％程

1-Hexadecanolは煮肉調理による変化は認められ度であった。煮肉の「甘い香り」と有意な相関がな か っ た 。煮 肉 と 生 肉 の 含 有 量 の 相 関 係 数 は認められた成分は1-Tetradecanol, Pantolactone,

Skatoleで低かったが，それ以外は中程度から高γ-Crotonolactone, 1-Hexadecanol, Skatole,

か っ た 。前 報でγ-Crotonolactone な ら び にAcetoin, Isovaleric acid, Butyric acidであった。

Butyric acidの熟成前後の含有量の相関係数をまた，この８成分によるPLS解析の結果，これら0.90，0.87と報告しており，この際に調査したの含有量から「甘い香り」評価値を推定できるこ

1-Tetradecanol, Pantolactone, 1-Hexadecanol,とが示唆された。

１）

Skatole, Acetoin, Isovaleric acid の 相 関 係 数 は それぞれ－0.25，0.79，0.99，0.95，0.98，0.39であった。1-TetradecanolとIsovaleric acid以外は熟成前後において高い相関係数が認められたことか
ら，熟成前の生肉中の香気成分含有量より熟成後の煮肉の「甘い香り」評価値を予測できるものと考えられる。

文献１）
 中嶋宏明ら：黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立，令和３年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，VOL. 40，115～122，2022．
２）
 Matsuishi, M., et al：Wagyu Beef Aroma in
Wagyu（Japanese Black Cattle）Beef Preferred by
Japanese over Imported Beef, Anim. Sci . J., 72（6），
498～504，2001．
 松石昌典ら：和牛肉と輸入牛肉の香気成分，日本
３）
畜産学会報，75（3），409～415，2004．

© The Ito Foundation

122

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

 島 津 製 作 所， https://www.an.shimadzu.co.jp/
４）
si t es/an.shi m a d zu . co. jp /files/ck ed itor/ap l/lifescience/metabolomics/c146-2181a.pdf
 ESI友の会編：メタボロームデータの標準化方法，
５）
https://sites.google.com/site/esitomonokai/jie-xibu-wu/metaboromudetano-biao-zhun-hua-fangfa/2-lowesstosplineno-li-lun 井上慶一ら：黒毛和種肥育牛の脂肪融点，脂肪酸６）
組成および格付形質間の遺伝的関係，日本畜産学会
報，79（1），１～８，2008．
７） 横田祥子ら：黒毛和種牛肉における脂肪酸組成と枝肉形質および肉質形質との遺伝的関係，東北畜産学会報，60（3），80～85，2011．

８） S a k u m a , H . , e t a l ：E s t i m a t e s o f g e n e t i cparameters for chemical traits of meat quality inJapanese black cattle, Anim. Sci. J., 88，203～212，2017
 佐久間弘典ら：黒毛和牛の優れた風味とそれをも９）たらす遺伝子の解明，におい・かおり環境学会誌，
42（4），276～284，2011．
 神山洋ら：近赤外測定装置による黒毛和種枝肉筋
10）
間脂肪中の脂肪酸測定のためのサンプル数等条件の検討，東北農業研究，66，83～84，2013．

© The Ito Foundation

123

新たに見つかった黒毛和種牛の筋ジストロフィーの病態解明と遺伝的統御法の確立
Establishment of genetic control method and pathophysiological analysisof newly discovered muscular dystrophy in Japanese Black cattle

保

田

昌

宏１，２

（１宮崎大学大学院医学獣医学総合研究科，２宮崎大学農学部）

Masahiro Yasuda１，２（１Graduate School of Medicine and Veterinary Medicine, University of Miyazaki,
２Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Muscular dystrophy is a genetic muscle disease that causes progressive degeneration andnecrosis of muscle fibers, resulting in muscle weakness and atrophy. In this study, a newborn
Japanese Black calf present astasia after birth. As a result, several mutations were found in thedystrophin gene, and a diagnosis of dystrophin deficiency muscular dystrophy was found. By
tracing the gene carrier cows, the existence of three carrier cows was identified. These finding
suggest that differential diagnosis of this disorder is necessary if neonatal male calf presentswith astasia after birth, and a family history is suspected．

１．目

質の性状や遺伝様式などがヒトの筋ジストロ

的フィーと同一ではなく，不明な点も多いため遺伝

筋ジストロフィーは進行性に筋線維が変性・壊性筋症として扱われる傾向にあった。ウシの遺伝

死し，筋力の低下や萎縮を起こす遺伝性筋疾患で性 筋 ジ ス ト ロ フ ィ ー は Meuse-Rhine-Ysselある。ヒトでは筋を構成するタンパク質群の異常（MRY）種牛でHeat-shock 70 protein 1B遺伝子によって，Ｘ染色体連鎖性，常染色体優性または欠損による常染色体劣性遺伝性の横隔膜筋ジスト

劣性のほか，突然変異によって起こることが知らロフィーが報告されており，ホルスタイン種成牛れている。その中でもジストロフィンタンパク質における慢性第一胃鼓張症を特徴とする疾患であの異常によるDuchenne型は症状が重篤で，ヒト

る４，５）。伴性遺伝するジストロフィン欠損型筋ジの出生3,500－10,000人あたり１人が発症し，ジスストロフィーはマウス，ラット，イヌ，ネコ，ブトロフィン遺伝子座はＸ染色体上にあり，伴性遺タ，ゼブラフィッシュ，ミバエで確認されている伝するために主として男子に発症が認められが６），ウシでの報告はまだない。

る１～３）。

今回，黒毛和種繁殖農家において，新生子雄牛

これまでにもヒト以外の動物の筋ジストロが出生後起立不能を呈したため，母牛系統群の事

フィーは，イヌ，ネコ，ヒツジ，ウマなどの多種故発生状況の解析により遺伝性疾患が疑われたので認められている。しかしながら，欠損タンパクで，症例の解剖および遺伝子解析を実施した。さ© The Ito Foundation

124

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

らに関連農場を含めた遺伝子検査を行い，本疾患

子牛の臨床症状は，子牛の血縁者である母牛からの遺伝的統御を試みた。

生まれた他の５頭の雄子牛（Ａ-④，Ａ-⑧，Ａ-

２．方
2.1

⑨，Ｂ-④，Ｂ-⑤）にも確認されていた。そこで，

法本症例を安楽死させ，生後３日で剖検を実施した。

農場の概要

３．結果と考察

黒毛和種牛約30頭を使用する繁殖農家で，素牛は自家育成あるいは外部導入にて更新しており，

3.1

牛異常産三種混合ワクチンも毎年接種していた。

全身の骨格筋の淡色化（白化）が認められた

しかし子牛の事故が頻発し，奇形を伴う異常産と（Fig.３）。前肢および後肢の深部筋も白化してい出生後起立不能を呈する事故がたびたび認められた。心臓の外景には著変はなく，心房に欠損孔約た。事故子牛の母牛系統を見直したところ，母牛５mmの中隔欠損を認めた。また，第四胃幽門部

Ａの産子９頭（雄４頭，雌５頭）のうち雄３頭が粘膜の軽度びらんが認められ，肺は右後葉の一部

出生後３日から６ヵ月齢で起立不能をとなり，死が肝変化し，胸腺が矮小であった。脳，脊髄，そ亡していた（Fig.１：Ａ-④，Ａ-⑧，Ａ-⑨）。まの他の臓器には外見上の異常は認めなかった。

肉眼剖検所見た，母牛Ａの２産目および６産目の雌子牛を育成3.2

して繁殖に用いていた。２産目の母牛Ｂの４産目

岡山大学にて遺伝子解析を実施した。候補遺伝

および５産目の雄子牛が出生後起立不能を呈し死子としてジストロフィンに注目し，発症個体の毛亡していた（Fig.１：Ｂ-④，Ｂ-⑤）と６産目の根と血液を用いてジストロフィン遺伝子の塩基配

母牛Ｃの１産目の雄子牛が出生後起立不能を呈し列を次世代シークエンサーにて解析した。データ

死亡していた（Fig.１：Ｃ-①）。２産目の産子

ベースにある塩基配列と比較した結果，発症個体（解剖した症例：Ｃ-②）も雄で出生後起立不能をのジスロトフィン遺伝子領域には，ジストロフィ

呈したことから遺伝性疾患を疑った。

ンタンパクの機能に影響を及ぼすと思われるエク

2.2

子牛の概要

遺伝子解析結果

ソンの大規模欠損を含んだ突然変異カ所が３カ所

新生子雄の黒毛和種子牛（Ｃ-②）は，出生時見つかった。これらの変異が本疾患と関連がある

35kgで正常分娩であった。出生直後より起立不と思われた。その後，生存する雌牛の遺伝子検査

能で，後肢随意運動不能であった。意識，飼料摂を実施したが，ヘテロに変異を持つキャリア個体

取量，頭頸部の動きは正常であった（Fig.２）。

は母牛Ｂと母牛Ｃおよび６産目の雌牛（Ｂ-⑥）
A

1

1

2

3

B
3

4

4

5

5

6

C
1

7

8

2

9
femalemaledeath maleFig. 1

A family tree of the affected calf.

© The Ito Foundation

新たに見つかった黒毛和種牛の筋ジストロフィーの病態解明と遺伝的統御法の確立

Fig. 2A lateral aspect of the symptom appeared calf.

の３頭のみであった。

Fig. 3125

The muscles of fore-limb.

ストロフィーを発症して死亡する。本症例では，よって，本症例および母牛系統の解析，さらに母牛Ａはすでに食肉処理されていたために遺伝子

遺伝子解析結果からＸ染色体連鎖性の筋ジストロ

検査をできていない。しかしながら，母牛Ｂおよ

フィーであると考えられた。ジストロフィン遺伝

び母牛Ｃとその産子の状況をふまえると，母牛Ａ子は大きく，ヒトでは約2.5Mbにおよび79個のエに突然変異が起こり保因牛となった可能性があ

クソンをコードしている。突然変異も起こりる。また，発症雄牛が生まれると数日から数ヶ月

やすく，欠失変異，重複変異，点変異，および小で死亡廃用となる可能性が高く農場の損失が大きさな挿入や削除変異等もしばしば発生すると言わい。さらに保因雌牛は外見上正常であるために，れている 。よって，ウシにおいても突然変異に繁殖素牛として育成され，気づかないうちに疾病よるジストロフィン欠損型筋ジストロフィーの発が拡大する危険性もある。今後は遺伝子診断法を

生は散発的に起こっている可能性があり，新生子

確立し，保因雌牛の摘発と遺伝的制御を実施するの起立不能は遺伝性の筋ジストロフィーを鑑別診必要がある。

７，８）

９）

断する必要があると思われた。今回の死亡雄産子
では，出生直後より起立不能を呈し，数日から

４．要

約

数ヶ月程度で死亡していることから，ウシのジス筋ジストロフィーは進行性に筋繊維が変性・壊トロフィン欠損型筋ジストロフィーは，臨床症状

死を起こし，筋力の低下や萎縮を起こす遺伝性筋が早期に出現し，筋力低下が重篤で致死的になる疾患の総称である。今回，黒毛和種牛新生子牛がと示唆された。ジストロフィン遺伝子はＸ染色体

出生後起立不能を呈し，母牛系統群の事故状況を上に存在するために雄は一つ，雌は二つのジスト

解析し遺伝性が疑われたことから，解剖し遺伝子

ロフィン遺伝子を持っており，雌は一方の変異遺検査を行った。その結果，ジストロフィン遺伝子

伝子を受け継いだとしても，もう一方の遺伝子がに変異が認められたことからジストロフィン欠損

正常であれば発症せず保因牛となる。雄では，Ｘ型筋ジストロフィーと診断した。また，保因牛を染色体が一つなので，変異遺伝子を受け継いだ場

追跡することで，３頭の保因牛の存在を突き止合，ジストロフィンタンパクを産生できず，筋ジめ，遺伝的制御が行えた。新生子牛が出生後の起© The Ito Foundation

126

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

立不能を呈し，性別が雄であり，家族性の発症が認められた場合，ジストロフィン欠損型筋ジスト
ロフィーを鑑別する必要がある。
謝辞

遺伝子検査を実施いただきました，岡山大学大学院環境生命科学研究科

辻岳人先生に深謝いたします。また，保因牛の追跡調査にあたってご協
力いただきました，宮崎県農業共済組合の近藤弘
章先生に深謝いたします。
文献１） Gisela, G., Alexandra, P.：Muscular dystrophy:
Experimental animal models and therapeutic
approaches, Exp Ther Med，21，610，2021．
２） Sui, T., Lau, Y. S., Liu, D., Liu, T., Xu, L., Gao, Y.,
Lai, L., Li, Z., Han, R.：A novel rabbit model ofDuchenne muscular dystrophy generated by
CRISPR/Cas9, Dis. Model Mech., 11, dmm032201
10.1242/dmm．032201，2018．
３） Ryder, S., Leadley, M. R., Armstrong, N.,

Westwood, M., de Kock, S., Butt, T., Jain, M.,
Kleijnen, J.：The burden, epidemiology, costs andtreatment for Duchenne muscular dystrophy: anevidence review, Orphanet J Rare Dis, 12, 79, 2017．
４） Goedegebuujie, A. S., Hartman, W., Hoese, P. H.：
Dystrophy of the Diaphragmatic Muscles in Adult
Meuse-RhineYssel Cattle: Electromyographical andHistological Findings, Vet Pathol, 20, 32～48，1983．
５） Furuoka, H., Doi, T., Nakamura, N., Inada, I.,
Osame, T., Matsui, T.：Hereditary myopathy of thediaphragmatic muscles in Holstein-Friesian cattle,
Acta Neuropathol，90，339～346，1995．
６） Miranda, D. G., Jessica, R. T., Basma, A. A.,
Marisa, N. D., Hannah, G. R., Peter, G. A.：
Biomarkers for Duchenne muscular dystrophy:
myonecrosis, inflammation and oxidative stress, Dis
Model Mech，1，13，2020．
７） Maria, S. F., Chiara, S., Chiara, P., Alessandra, F.：
Muscular Dystrophy: From diagnosis to therapy,
Molecules，20，18168～18184，2015．
８） Wells, D. J.：Tracking progress an update on
animal models for Duchenne muscular dystrophy,
Dis Model Mech, 11（6）,dmm035774，2018．
９） Yu, X., Bao, B., Echigoya, Y., Yokota, Y.：D ys t r o phi n- de f i c i e nt l a r ge a ni m a l m o de l s :translational research and exson skipping, Am J
Transl Res，7，1314～1331，2015．

© The Ito Foundation

127

鶏の暑熱耐性を担うCCKARおよびHSP70遺伝子多型に関する研究The study of polymorphism in the chicken CCKAR and HSP70 geneassociated with thermotolerance

福原絵里子・平川達也・森美幸（福岡県農林業総合試験場）

Eriko Fukuhara, Tatsuya Hirakawa and Miyuki Mori
（Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center）

Summer heat stress reduces the productivity of chickens. The relationship between asingle nucleotide polymorphism（SNP ; AB604331, g.420 C>A）in the cholecystokinin type A
receptor（CCKAR）gene and three production traits, body weight gain, feed conversion rate,
and production index, during hot weather was investigated in Hakata-jidori and Hakataichibandori from Fukuoka prefecture. No effect of the genetic polymorphism was observed inthese traits examined. By genomic sequencing the heat shock protein 70（HSP70）gene, whichis expected to be associated with heat stress in the Shamo, Barred Plymouth Rock, Hakatajidori, and Hakata-ichibandori, 4, 7, 3, and 4 SNPs were found, respectively.

１．目

現在，比内地鶏等では発育に関連する遺伝子

的（コ レ シ ス ト キ ニ ン Ａ 受 容 体 遺 伝 子 ： 以 下

夏季の暑熱ストレスは鶏の生産性低下を引き起

CCKAR）の一塩基多型（SNP；AB604331，g.420

こし，畜産農家にとって大きな問題となっていＣ＞Ａ）において，ＡアリルがＣアリルより優れる。福岡県ではブランド肉用鶏「はかた地どり」

ることが明らかとなっており１～３），同遺伝子の発と「はかた一番どり」を生産している。「はかた育改善効果は暑熱時においても発現することが報地どり」はシャモの雄と横斑プリマスロックの雌告されている３）。

を交配したＦ１の雄と白色プリマスロックの雌を一方で，暑熱耐性に関わる熱ショックタンパク

交配させた鶏である。また，「はかた一番どり」

質（Heat shock protein：以下HSP70）は，生命は横斑プリマスロックの雄と白色プリマスロック活動を担うさまざまなタンパク質を熱変性から保の雌を交配したＦ１の雄と白色プリマスロックの護・修復する役割を持ち，これまでにHSP70遺伝

雌を交配させた鶏である。「はかた地どり」，「は子の発現量と暑熱ストレスに対する生理反応の関

かた一番どり」は，夏季の暑熱時に生産性が低下

連性が報告されている。また，HSP70遺伝子多型するため，暑熱耐性のある鶏の作出が求められては鶏種により異なり４～６），多型によってパンティいる。

ング数や飲水量が異なることが報告されている© The Ito Foundation

128

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）が６），鶏種ごとの遺伝子多型と暑熱耐性との関連

各区６羽（６羽に満たない区は全羽数）の直腸温性は明らかではない。

とパンティング数を測定した。

そこで本研究では，福岡県産ブランド肉用鶏である「はかた地どり」，「はかた一番どり」におけ

統計解析については，調査項目ごとに遺伝子型と性別の２元配置の分散分析を行った。

るCCKARの遺伝子多型と暑熱期の増体性との関2 . 2 シャモ，横斑プリマスロック，「はかた連について検討した。さらに，これらブランド肉地どり」および「はかた一番どり」におけ用鶏およびその原種鶏となるシャモと横斑プリマ

るHSP70遺伝子多型の探索

スロックを対象に，DNAシーケンスによる解析「はかた地どり」，「はかた一番どり」，シャモ，を実施し，HSP70遺伝子多型について調査した。

横斑プリマスロックが保有するHSP70遺伝子多型

２．方を推定するため，2.1で使用した「はかた地どり」，

法「はかた一番どり」の雄をそれぞれ76羽，56羽，

2 . 1 「はかた地どり」，「はかた一番どり」の福岡県農林業総合試験場で保有しているシャモと

CCKAR遺伝子多型と発育性との関連性の横斑プリマスロックの雄をそれぞれ40羽，50羽の解明

計222羽のHSP70の遺伝子型多型を調査した。2.1「はかた地どり」，「はかた一番どり」が保有すと同様に採血してDNAを抽出した後，HSP70遺るCCKAR遺伝子多型の違いによる暑熱期の発育

伝 子 の 一 部 配 列（GenBank ： accession number

性との関連性を解明するため，「はかた地どり」

J02579）を特異的プライマー（Table１）で増幅した。

雄99羽，雌97羽，「はかた一番どり」雄94羽，雌増 幅 産 物 を ExoSAP-IT Express PCR Cleanup

101羽の計391羽のCCKARの遺伝子型を調査しReagents（サ ー モ フ ィ ッ シ ャ ー サ イ エ ン テ ィた。２週齢で翼下静脈から採血した後は力丸らのフィック）で精製した後，DNAシーケンス（ユー方法に準じた。試験期間は「はかた地どり」はロフィンジェノミクス株式会社）により前から

令和４年６月１日～８月24日，「はかた一番どり」

1000塩基程度までの配列情報を取得し，GenBankは令和４年６月17日～８月18日とした。平飼鶏舎に登録されているリファレンス配列を参照し，遺に雌雄別に飼養し，遺伝子型を確認後，４週齢で伝子多型を検出した。

１）

雌雄ごとにA/A区，A/C区，C/C区に区分した。

なお，本研究は「実験動物の飼養及び保管並び飼料は以下の市販飼料を給与した。「はかた地どに苦痛の軽減に関する基準」（環境省2006）に則り」は，前期飼料（CP22.5％，ME3,130kcal）をり実施した。

３週齢まで，後期飼料（CP18％，ME3,170kcal）
を８週齢まで，仕上げ用飼料（CP18％，ME3,100

３．結果と考察kcal）を12週齢まで給与した。また，「はかた一3 . 1 「はかた地どり」，「はかた一番どり」の番どり」は，前期飼料（CP22.5％，ME3,130kcal）

CCKAR遺伝子多型と発育性との関連性のを３週齢まで，仕上げ用飼料（CP17％，ME3,150

解明kcal）を９週齢まで給与した。飼育期間中は水と「はかた地どり」におけるCCKARの遺伝子型

飼料は自由摂取とした。

は，雄ではA/A型が44羽，A/C型が43羽，C/C型

調査項目は，生体重，飼料要求率，生産指数とが12羽，雌ではA/A型が49羽，A/C型が45羽，した。また，鶏舎内で30℃を超えた１日において，C/C型が３羽であった。「はかた一番どり」にお© The Ito Foundation

129

鶏の暑熱耐性を担うCCKARおよびHSP70遺伝子多型に関する研究
Table 1 The DNA sequence of primer（forward and reverse）of HSP70 gene
HSP70-F

5’-CGATCTGGCTGCAATCTACG-3’

HSP70-R

5’-ATTTCCAGAAGCTGCACTTGG-3’

Table 2 The effect of CCKAR genotype on Hakata-jidori and Hakata-ichibandori
Body weight
（g）

SNP

SNP

Rectaltemperature（℃）

Panting
frequency（time/minite）

3289

2.43

155

42.3

166

A/C

3330

2.46

147

41.8

175

C/C

3146

2.62

140

41.8

196

NS

NS

NS

NS

NS

male

3792

2.47

176

42.2

154

female

2718

2.54

119

41.7

204

＊

NS

＊

＊

NS

A/A

2708

2.10

178

42.8

183

A/C

2867

2.08

197

42.3

170

C/C

2920

2.29

167

42.9

177

NS

NS

NS

NS

NS

Hakata-ichibandori

GenderProduction
Score

A/A

Hakata-jidori

GenderFeed/gain
ratio

male

3016

2.16

170

42.9

182

female

2647

2.15

191

42.4

172

＊

NS

NS

＊

NS

＊, p<0.05

いては，雄ではA/A型が34羽，A/C型が57羽，

江らは，CCKAR遺伝子多型の効果が認められてC/C型が３羽，雌ではA/A型が46羽，A/C型が47いる鶏種と比較すると，肉用讃岐コーチンの飼育

羽，C/C型が８羽であった。

期間が短く発育が早いため，CCKAR遺伝子多型

CCKARの遺伝子型の違いによる「はかた地どの増体効果が認められなかった可能性を指摘してり」および「はかた一番どり」の成績をTabel２

おり，本試験で供試した「はかた地どり」およびに示した。体重，飼料摂取量，生産指数，直腸温「はかた一番どり」も，飼育期間は12週齢および度およびパンティング数はいずれも遺伝子型の違

９週齢と短いことから，CCKARの増体効果が認いによる差は認められなかった。

められなかった可能性がある。

CCKAR遺伝子のA/A型は発育が優れ，比内鶏

3 . 2 シャモ，横斑プリマスロック，「はかたでは飼料要求率が優れることが報告１）されている

地どり」および「はかた一番どり」におけが，本試験での「はかた地どり」と「はかた一番

るHSP70遺伝子多型の探索どり」において，増体や飼料要求率でCCKAR遺シャモ，横斑プリマスロック，「はかた地どり」

伝子多型の効果が認められなかった。川江らは11

および「はかた一番どり」の血液から抽出した

週齢まで飼育した肉用讃岐コーチンではCCKAR

DNAの塩基配列情報から，遺伝子多型の存在箇の効果が認められなかったと報告している 。川所およびアレル頻度を調査した。

７）© The Ito Foundation

130

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 3 Genotype of HSP70-SNPs
Genotype frequency（％）
SNPs
213

220

233

323

371

448

G/A

Shamo

A/G

Hakata-jidori

Hakata-ichibandori

GG

AG

AA

GG

AG

AA

GG

AG

AA

GG

AG

AA

54.5

45.5

0

17.2

82.8

0

53.5

46.5

0

65.6

34.4

0

A/G

T/G

Barred plymouth rock

-

TT

GT

GG

83.3

16.7

0

AA

AG

GG

0

35.5

64.5

G/A

-

G/A

-

649

A/G

-

667

C/G

-

682

C/T

-

847

C/T

CC

CT

TT

82.5

17.5

0

AA

AG

GG

0

10.7

89.3

-

-

-

-

-

-

-

-

GG

AG

AA

28.6

71.4

0

-

GG

AG

AA

57.1

33.3

9.5

AA

AG

GG

AA

AG

GG

14.0

48.0

38.0

17.1

59.2

CC

CG

GG

CC

CG

10.0

52.0

38.0

63.2

31.6

CC

CT

TT

54.0

38.0

8.0

GG

AG

AA

53.1

46.9

0

-

-

-

AA

AG

GG

23.7

8.9

35.7

55.4

GG

CC

CG

GG

5.3

64.3

33.9

1.8

-

-

-

-

結果はTable３のとおり，シャモではg.213（G/色プリマスロック，「はかた一番どり」は（横斑A），g.233（T/G），g.323（A/G），g.847（C/T）

プリマスロック×白色プリマスロック）×白色プの計４カ所に多型が検出された。また，横斑プリ

リマスロックであり，いずれも横斑プリマスロッ

マスロックではg.213（G/A），g.220（A/G），g.371クが交配されていることから，共通した遺伝子多（G/A），g.448（G/A），g.649（A/G），g.667（C/型が検出されたと考えられた。

G），g.682（C/T）の計７カ所，「はかた地どり」

なお，本試験で取得できた塩基配列は前から

で は g.213（G/A），g.649（A/G），g.667（C/G）

1000塩基程度までであり，HSP70遺伝子の一部での３カ所，「はかた一番どり」ではg.213（G/A），

あるため，今後は未取得の塩基配列の遺伝子多型

g.371（G/A），g.649（A/G），g.667（C/G）の４を調査したうえで，遺伝子多型と暑熱時の発育性

カ所に多型が検出された。

との関連性を検討する必要がある。

g.213は４鶏種に共通した遺伝子多型であり，「はかた地どり」と「はかた一番どり」で検出さ４．要

約

れた遺伝子多型は横斑プリマスロックで検出され「はかた地どり」および「はかた一番どり」にた存在箇所と共通していた。「はかた地どり」のお い て ，コ レ シ ス ト キ ニ ン Ａ 受 容 体 遺 伝 子

交配方法は（シャモ×横斑プリマスロック）×白（CCKAR）の 一 塩 基 多 型（SNP ； AB604331 ，© The Ito Foundation

鶏の暑熱耐性を担うCCKARおよびHSP70遺伝子多型に関する研究

g.420

Ｃ＞Ａ）と暑熱時における増体性との関連について調査した。体重，飼料要求率，生産指数では遺伝子多型による影響は認められなかった。また，シャモ，横斑プリマスロック，「はかた地どり」および「はかた一番どり」において，HSP70遺伝子の多型の存在箇所を調査した。シャモでは４カ所，横斑プリマスロックでは７カ所，「はかた地どり」では３カ所，「はかた一番どり」
では４カ所に多型が存在することを明らかにした。
文献１） 力丸宗弘，武田尚人，大久保武，高橋大希，小松恵，
高橋秀彰：比内鶏の発育形質関連QTL解明とその検証（第４報）―コレシストキニンＡ受容体遺伝子の一塩基多型は比内鶏の発育を改善する―，秋田畜試研報，30，21～29，2016．
２） Horinouchi, S., Nakayama, H., Takahashi, H.：
Effect of a single nucleotide polymorphism in thecholecystokinin type A receptor gene on growthtraits of the Miyazaki Jitokko chicken, Journal of
Poultry Science，56，96～100，2019．

131３）
 Ishikawa, S., Asano, M., Sakai, K., Takahashi, H.：
Verification of the Effectiveness of an SNP Marker
in the Cholecystokinin Type A Receptor gene for
Improving Growth Traits in Okumino-kojidori
Chickens, Journal of Poultry Science, 57, 107～113，
2020．
４）
 Habib, H. N., Karomy, A. S., Gheni, Q. J., Saleh, W.
M. H.：Molecular detected of heat shock protein70
gene in Layer hens（Lohmann breed）, Materials
Science and Engineering，928，2020．
５）
 Tamzil, M. H., Noor, R. R., Hardjosworo, P. S.,
Manalu, W., Sumantri, C.：Polymorphism of theheat shock protein gene in kampong, Arabic andcommercial chickens, Jurnal Veteriner. 14, 317～
326, 2013．
６）
 Tamzil, M. H., Noor, R. R., Hardjosworo, P. S.,
Manalu, W., Sumantri, C.：Acute Heat StressResponses of three lines of chickens with different
heat shock protein（HSP）-70 genotypes, Journal ofpoultry science, 12，264～272，2013．
７） 川江早矢香，三谷英嗣：遺伝子マーカーを利用した讃岐コーチンの改良，香川畜試報告，55，2020．

© The Ito Foundation

132

黒毛和種における体型評価部位「肋付き」の客観的評価手法の開発（Ⅱ）
Research for objective evaluation of forerib conformation of Japanese Beef
Cattle（Ⅱ）

鈴

木

洋

美

（（地独）北海道立総合研究機構畜産試験場）

Hiromi Suzuki（Hokkaido Research Organization, Animal Research Center）

In this 2020 project, we clarified that there is a relationship between forerib angle（FA）
and body condition score（BCS）,and there is genetic relationship between FA and chest width（CW）. This study investigated the correction method for the effect of BCS on FA and thegenetic relationship with carcass traits of FA and CW, as well as when FA and CW early
assessment is possible in calf. In Study 1, the FA was measured in 129 standard registration
cows and the CW was measured in 64 cows, and the correlation with the examination results
was analyzed. In addition, a model study for genetic evaluation was conducted on 1,809 animals,
and the model considering BCS level was suitable. In Study 2, we estimated the genetic
correlation between FA scaled at the livestock market and carcass traits on in 687 fattening
cows, and found a negative relationship between carcass weight and rib thickness andmarbling score. In Study 3, FA was measured over time up to 14 months of age in 9 calves andCW was measured up to 18 months of age in 21 calves, and a correlation analysis was
performed for each month of age. It was suggested that 9 months of age is early possible
period at FA and CW assessment. From the above results, it was suggested that FA and CW
had a desirable relationship with the registry judgment score of Japanese black cattle. And
that the FA and the carcass traits had a desirable relationship for genetic improvement,suggesting that selection based on the breeding value of the FA can be expected to improve
both the registry judgment score and the carcass traits．

１．目

る。また，日本食肉格付協会の「牛枝肉取引規格」

的における枝肉切開面も同部位であるため，肋付き

黒毛和種では体型の評価の際に，牛体におけるは重要な部位といえる。しかしながら，同部位の肩甲骨後方部分と肋骨前方部分の部位は「肋付

評価は目視のみであるため要因の調査や分析が困き」とされ，肋骨と背骨の付着の形状を推定する

難で，改良項目に加えることがこれまでできなために観察される。肋骨がより開帳した形で背骨かった。

と結合していると体型的に望ましいとされてい本研究助成事業の令和２年度の調査において，© The Ito Foundation

黒毛和種における体型評価部位「肋付き」の客観的評価手法の開発（Ⅱ）

133

小型デジタル水準計を用いて肋付き角度が測定可した。母数効果は性別（２水準），出生年（５水能であることを示し，肋付き角度は栄養度の影響

準），測定日（41水準），日齢の肋付き角度に対すを含むものの，胸幅との間での遺伝的な関係が高る１次回帰とした。栄養度を考慮するため，栄養いことを明らかにした 。胸幅の測定は登録時の度指数の肋付き角度に対する１次回帰を含むモデ審査で省略されることが多いため，胸幅の遺伝評

ル（モデル１）と含まないモデル（モデル２）の価や，胸幅との間での枝肉成績との関係等は調査

２通りとし，赤池情報量基準（AIC）によって比されていない。そこで本研究では，肋付き角度に

較した。

１）

おける栄養度の影響の補正法を開発し，そのうえ
で育種価評価に向けて「肋付き角度と枝肉成績」

2 . 2 肋付き角度および胸幅における育種価評
価法の確立

および「胸幅と枝肉成績」との関係を調査した。

調査１：北海道内で2008年11月から2020年１月

また，肋付き角度および胸幅の早期評価が可能なに基本・本原登録を受けた繁殖雌牛（1,086頭）

時期を調査した。

の胸幅の記録と，この繁殖雌牛の産子である2012
年 か ら 2022 年 に と 畜 さ れ た 北 海 道 産 肥 育 牛

法

２．方（3,648頭）の枝肉成績６形質記録（枝肉重量，

肋付き角度の栄養度の補正方法の確立

ロース芯面積，バラの厚さ，皮下脂肪の厚さ，歩本調査での栄養度の指標は，登録審査において留まり基準値，脂肪交雑基準値）を対象形質としは栄養度審査成績（９段階） ，家畜市場調査にた。変量効果として，個体の直接遺伝効果，繁殖

おいては簡易な栄養度の目安として栄養度指数

農家（170水準），肥育農家（128水準），残差とし（体重／体高比）を用いた。

た。母数効果として，胸幅に対して栄養度（５水

2.1

２）

調査１：前報と同様に肋付き角度を測定した。

準），登録年月日（290水準）とした。また，回帰調査牛は，北海道内での基本・本原登録受審牛効果として登録時月齢１次回帰，登録時月齢２次（127頭）とし，分散分析により肋付き角度の栄養

回帰，近交係数１次回帰とした。枝肉成績に対し度ごとの差を調査した。これらを栄養度審査４とて母数効果は性別（２水準），と畜年（11水準），５のもの（48頭）および６と７のもの（79頭）に回帰効果はと畜時月齢２次回帰，近交係数１次回

区分し，肋付き角度と，体測値および牛体各部位帰とした。

の目視評価項目（均称や品位など）との関係につ

調査２：2019年９月から2022年11月にホクレン

いて，相関分析を行った。解析は統計解析ソフト

十勝地区家畜市場および南北海道家畜市場に出荷

R version 4.0.3

され，肋付き角度を測定した黒毛和種子牛のう３）およびRStudio version 2022.12.0

ち，と畜後の枝肉成績を持つものにおいて，肋付

Build 353（RStudio社）を用いて行った。
調査２：2019年９月から2022年11月にホクレン

き角度または胸幅，および枝肉成績６形質を対象

十勝地区家畜市場および南北海道家畜市場に出荷形質とした。変量効果は個体の直接遺伝効果，繁された黒毛和種子牛1,809頭（去勢：1,063頭，め

殖農家（肋付き角度），肥育農家（枝肉成績）とす ： 746 頭）に お い て 肋 付 き 角 度 を 測 定 し ，した。母数効果および回帰効果は肋付き角度に対airemlf90

して2.1のモデル１を用いた。

４）を用いて単形質アニマルモデル

REML法により遺伝率を推定した。変量効果は個いずれの調査においても，パラメータの推定は体の直接遺伝効果，繁殖農家（116水準），残差とPEST version 4.2.3５），VCE-6 version 6.0.2６）を用© The Ito Foundation

134

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

い，２形質アニマルモデルREML法により，肋付られた。このことから，肋付き角度は栄養度とのき角度または胸幅と枝肉成績との間での遺伝相関関係はあるものの，登録審査では栄養度に関わらを推定した。

ず肋付き角度の減少は審査得点の向上につながる

2.3

肋付き角度と胸幅の早期評価手法の確立と考えられた。一方，胸幅はいずれの区分におい北海道立総合研究機構畜産試験場で2020年以降ても栄養度と比較的強い正の関係が認められた。

に出生した黒毛和種雌子牛９頭に対し，肋付き角また，体積，前駆，均称，総得点に加え，均称や度は出生時から14カ月齢程度に至るまで，胸幅は品位などとも正の相関関係が認められた。胸幅は出生時から18カ月齢に至るまで経時的に測定し，肋付き角度より強い栄養度との関係があるもの

月齢ごとにそれぞれの順位相関係数を求めるととの，胸幅の増加は審査成績の向上につながると考もに，14カ月齢または18カ月齢と最も相関係数のえられた。

高い月齢を調査した。

調査２：分析に供した肋付き角度のデータの基
本統計量と分析結果をTable２に示した。モデル

３．結果と考察
3.1

１はモデル２と比較するとAICが小さいことか

肋付き角度の栄養度の補正方法の確立

ら，栄養度を考慮したモデル１が適していると考調査１：審査成績と肋付き角度および胸幅とのえられた。肋付き角度の遺伝率は0.38±0.09となあいだで相関分析を行い，その結果をTable１に

１）
り，令和２年度に推定した結果（0.32±0.10）と示した。肋付き角度において，栄養度４と５では同様となりつつも標準誤差は低下した。

前駆との間で弱い負の関係が認められた。栄養度

以上の結果から，登録審査においては肋付き角

６と７ではどの細目においても傾向は認められな度の栄養度の補正は不要と考えられたが，育種価かった。全体で分析を行うと，体積，前駆，中駆，評価においては栄養度の影響を排除することで，

後躯，均称，総得点において弱い負の関係が認めより正確な評価が可能と考えられた。

Table 1 Correlations between forerib angle（°），chest width（cm）and records of judged body shape classified by body

condition．

impressivness

face

quality

dairy

final
score

－0.31 －0.17 －0.15 －0.27 －0.16 －0.13
＊

0.11

－0.05

－0.1

－0.23

0.02

0.06

0.09

－0.06 －0.05

forerib angle
ｎ＝127－0.54 －0.34 －0.4 －0.28 －0.28 －0.26 －0.05 －0.07＊＊＊ ＊＊＊ ＊＊＊ ＊＊
＊＊
＊＊

0.04

0.07

－0.29
－0.08 ＊＊＊

chest width atbcs 4-5
ｎ＝26

0.68
0.64
＊＊＊ ＊＊＊

Means

Month of BW/WH bodyfore middle hindagecapacity quarter quarter quarter proportion

forerib angle
at bcs 4-5
ｎ＝48
forerib angle
at bcs 6-7
ｎ＝79－0.27 －0.23
25.0±7.5

chest width at 44.5±4.4
bcs 6-7ｎ＝36
chest widthｎ＝6218.6±3.7 －0.39 －0.13 －0.16 －0.07 －0.05＊＊＊

18.8±4.2

0.56
＊＊

0.00

feet,
hoof

0.07

0.37

0.38

0.59
＊＊

0.54

0.4
＊

0.07

0.13

0.42

0.59
＊＊

0.91
0.57
0.75
0.67
＊＊＊ ＊＊＊ ＊＊＊ ＊＊＊

0.66

0.55
＊＊＊

0.46

0.25

0.26

0.15

0.47

0.64
＊＊＊

0.88
0.64
0.75
0.67
＊＊＊ ＊＊＊ ＊＊＊ ＊＊＊

0.67
＊＊

0.6
＊＊＊

0.51
＊

0.31
＊＊

0.2

0.16

0.51
＊

0.68
＊＊＊

BW/WH； The ratio of body weight / withers height as index of body condition．

© The Ito Foundation＊＊＊

ｐ＜0.001，＊＊ｐ＜0.01，＊ｐ＜0.05

135

黒毛和種における体型評価部位「肋付き」の客観的評価手法の開発（Ⅱ）
Table 2 The comparison of Model 1 and Model２．
Analyticalmodel
Model１Model２ｎ

Means，°Day of age

1809

21.0±7.4

289.7±17.7

Ratio of farmvariance

Heritability

ResidualvarianceAIC

0.38±0.09

0.10±0.02

0.51±0.0811339

0.27±0.07

0.22±0.03

0.50±0.07

11631

Pedigree
3,690

Table 3 Basic statistics of data set at research 1 and research２．
Research

2.2
research1

Means

Month ofage

CW of standard
registered female 1,086 47.5±3.2
cattle, cm

20.1±2.8

Carcass traits ofprogeny3,64828.5±1.8

FA of calf at
market，°

687

Cattle and traits

2.2
research2ｎPedigree

REA,
cm２

RT,cm

SFT,
cm

YE, ％

BMS

8,305
500.7±66.7 63.6±14.9 8.2±1.0 2.4±0.7 73.3±11.0 2.5±1.0

20.3±7.6 288.5±20.1１

Carcass traits

Carw,
kg

2,016

28.4±1.7

502.0±57.8 67.7±12.0 8.3±0.9 2.4±0.7 75.3±1.8 2.5±1.1

FA ； Forerib angle, CW ； Chest width, Carw ； Carcass weight, REA ； Rib eye erea, RT ； Rib thickness, SFT ； Subcutaneous fat
thickness，YE；Yielt estimate
１

Age of day

Table 4 Genetic correlation and phenotypic correlation between chest width of breeding females, forerib angle of calvesand carcass traits．

FA of calves atmarket

CW of Standard registerd female cattle
Genetic correlation

Phenotipic correlation

Genetic correlation

Phenotypic correlation

Carw

0.33±0.72

0.04－0.46±0.29

－0.01

REA

0.94±0.83

0.10

0.25±0.35

－0.04

RT

0.67±0.73

0.08－0.57±0.22

－0.09

SFT

－0.21±0.85－0.02－0.31±0.30

－0.01

YE

0.31±1.02

0.04

0.30±0.35

－0.06

BMS

0.97±0.61

0.11－0.40±0.26－0.08

3 . 2 肋付き角度および胸幅における育種価評
価法の確立

調査２：Table４に，家畜市場出荷時における肋付き角度および胸幅と枝肉成績との間での遺伝

本調査で分析に供したデータセットおよび基本統計量をTable３にまとめた。

相関を標準誤差とともに示した。肋付き角度と枝肉重量，バラ厚および脂肪交雑基準値との間での調査１：Table４に，基本・本原登録時の繁殖

遺伝相関係数は負の関係が認められた。このこと

雌牛の胸幅と，その産子である肥育牛の枝肉成績から，肋付き角度とこれらの３形質は改良上望まとの間での遺伝相関を標準誤差とともに示した。

しい関係にあると考えられた。しかし，ロース芯

いずれの形質も標準誤差が大きく示され，関係は面積や皮下脂肪厚，歩留まり基準値においては標明らかにならなかった。

準誤差が大きく示された。さらに，市場出荷時に© The Ito Foundation

136

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 5 Correation coefficient of calf chest width between each age and 18mo, and calf forerib angle between each age

and 14mo．
CW

Spearman’sｎρMeans of cw,cmFA
Spearman’sｎρMeans of FA，°FA
Spearman’s

９ｎρ

Means of FA，°
Spearman’s

21

９

０mo

１mo

３mo

５mo

９mo

18mo

0.14

－0.08

0.01

－0.23

0.41

―

14.8±1.617.8±2.2

22.7±2.4

28.0±3.0

35.0±2.3

43.2±2.4

０mo

１mo

３mo

５mo

６mo

７mo

0.19

0.01

－0.08

0.33

0.59

0.06

20.7±4.724.2±8.0

28.5±7.1

36.8±5.8

38±5.337.9±4.5

８mo

９mo

10mo

11mo

12mo

13mo

0.45

0.58

0.44

0.66＊

0.61

0.41

33.1±4.935.9±4.931.4±5.1

29.1±4.528.8±3.726.5±5.7

ρ；Spearman’s rank correlation coefficient．

＊ｐ＜0.05

mo；Month after birth．

測定した胸幅と枝肉成績との間での遺伝相関を推られた（Table１）。また，胸幅は均称と品位との定することができなかった。原因として調査頭数

間で正の相関関係が認められた（Table１）。これ（528頭）の不足が考えられた。調査頭数を増加す

らの種牛性の項目は目視評価の影響が強く，改善ることで，標準誤差を低下させつつこれらの推定や改良が困難とされてきた。肋付き角度および胸が可能となると考えられる。

幅の両方を評価することでこれらの項目の改善に

3.3

牛の成長過程における肋付き角度の変動

つながり，登録審査や共進会での成績の向上に寄

Table５に，肋付き角度における各月齢と14カ与できると考えられる。実際に，2022年８月10日

月齢との間での，胸幅における各月齢と18カ月齢に開催された第12回全国和牛能力共進会鹿児島大との間での順位相関係数を，および各測定値の平会に向けた北海道代表牛選抜会において，代表牛

均値を月齢ごとに示した。肋付き角度の平均値はと非代表牛の肋付き角度の差を比較した（合計65６カ月齢で最大となり，６カ月齢（ｐ＜0.1）お頭）。審査委員は目視のみによって肋付きの良いよび９カ月齢（ｐ＜0.1），11カ月齢（ｐ＜0.05）

牛を選抜した。その結果，代表牛は非代表牛に比と，14カ月齢との間で比較的高い負の関係が示唆

べ肋付き角度は有意に小さい（ｐ＜0.05）結果とされた。胸幅は，５カ月齢と18カ月齢との間で負なった。このことから，審査委員の目視評価と肋の関係，９カ月齢と18カ月齢との間で正の関係が付き角度の評価結果はおおむね近く，共進会にお示唆された。したがって，胸幅に比べ肋付き角度

いて肋付き角度が評価指標として活用可能であるはやや早く，６カ月齢での評価が可能と考えられことが明らかとなった。

た。胸幅，肋付き角度両方において同時に評価が可能なのは９カ月齢程度と考えられた。

肋付き角度と一部の枝肉成績との間での遺伝的な好ましい関係が示唆された（Table４）。肋付き

本調査の結果，肋付き角度および胸幅はいずれ角度が小さいことは背幅の充実が見込まれることも審査成績の向上に寄与すると考えられた。肋付から枝肉の厚みにつながり，バラの厚さや枝肉のき角度は，審査標準において肉用種の特徴の項目

大きさに寄与すると推察される。背腰幅と，枝肉である体積や前駆，中駆等に加え，いわゆる種牛

重量やバラの厚さとの遺伝相関は比較的高いとさ性の項目である均称との間で弱い負の関係が認め７）れている（それぞれ0.65，0.50）。また，肋付き© The Ito Foundation

黒毛和種における体型評価部位「肋付き」の客観的評価手法の開発（Ⅱ）

137

角度と脂肪交雑基準値との間で遺伝的に負の関係

し，月齢ごとに相関分析した結果，同時に早期評が認められた（－0.40±0.26）。肋付き角度は栄養価可能な時期は９カ月齢であると考えられた。以度との関係も強いことから，筋肉内脂肪の充実度

上の結果から，肋付き角度と胸幅は審査上と望まとの関係も推察される。これまで体型測定項目としい関係にあり，さらに肋付き角度と枝肉成績と脂肪交雑との遺伝相関はおおむね0.1を超えるもは改良上望ましい関係が示唆されたことから，肋のはなかった 。したがって肋付き角度は，脂肪付き角度の育種価による選抜によって，審査成績

交雑の改良を間接的に進めることが可能な，新たおよび枝肉成績のいずれにおいても改良効果が期な評価項目としての活用が期待できる。

待できると考えられた。

７）

４．要

約

令和２年度本事業において，肋付き角度と栄養度との間で相関関係が，胸幅との間で遺伝的な関係があることを明らかにした。本研究では肋付き角度における栄養度の影響の補正法と，肋付き角度および胸幅の枝肉成績との遺伝的な関係を調査するとともに，早期評価が可能な時期を調査した。研究１では基本・本原登録受審牛129頭において肋付き角度，64頭において胸幅を測定し審査
成績との関係を相関分析した結果，いずれの形質においても審査成績と望ましい関係が認められた。また，1,809頭で遺伝評価のためのモデル検討をした結果，栄養度を考慮したモデルが適していた。研究２では肥育牛687頭において家畜市場
出荷時の肋付き角度と枝肉成績との遺伝相関を推定した結果，枝肉重量とバラの厚さおよび脂肪交
雑基準値との間で負の関係が認められた。研究３
では黒毛和種雌子牛９頭で肋付き角度を14カ月齢まで，21頭で胸幅を18カ月齢まで経時的に測定

文
献１）
 鈴木洋美：令和２年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，39，133～138，2020．
 公益社団法人全国和牛登録協会，一般社団法人全２）
国肉用牛振興基金協会：令和４年度地方審査委員認
定講習会受講者研修会テキスト，29，公益社団法人
全国和牛登録協会，2022．
 Douglas Bates, John Chambers, Peter Dalgaard,
３）
Robert Gentleman, Kurt Hornik, Ross Ihaka, Tomas
Kalibera, Michael Lawrence, Friedrich Leisch, Uwe
Ligges, Thomas Lumley, Martin Maechler, Martin
Morgan, Paul Murrell, Martyn Plummer, Brian
Ripley, Deepayan Sarkar, Duncan Temple Lang,
Luke Tierney, Simon Urbanek：R Core Team
（2020）: https://www.R-project.org/．
 Ignacy Misztal：Complex Models, More Data :４）
Simpler Programming?, Interbull Bulletin 20, 33～
42，1999．
５）
 GROENEVELD, E：PEST User’s manual.
Institute of Animal Science press, Neustadt : http://
docshare04. docshare. tips/files/24265/242659135,
2006．
６）
 GROENEVELD, E., M. K OVAC, N. M IELENZ：VCE User’s Guide and Reference Manual Version
6.0., 2010．
 公益社団法人全国和牛登録協会：これからの和牛
７）の育種と改良改訂版，106，公益社団法人全国和牛登録協会，1997．

© The Ito Foundation

138

多機能尾部センサを用いた重種馬の分娩予知
Prediction of foaling in heavy horses using multifunctional tail sensors

滄木孝弘１・吉岡耕治２・檜垣彰吾３（１帯広畜産大学グローバルアグロメディシン研究センター，２麻布大学，
３

国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構）

Takahiro Aoki１，Koji Yoshioka２ and Shogo Higaki３（１Research Center for Global Agromedicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine，２Azabu University，
３National Institute of Animal Health, National Agriculture and Food Research Organization）

It is desirable to attend to the mare at the time of foaling in order to assist fetal delivery
and prevent complications. The early detection of the onset of labor is an important issue forthe equine industry. The purpose of this study was to examine the applicability of a sensor for
foaling detection using the data of surface temperature（ST）, activity intensity, roll angle（rotation about the y-axis）and y-axis（long axis of the tail）acceleration which were collectedfrom a multimodal device attached to the ventral tail base of the mare. The data were collected
every 3 minutes in 17 pregnant mares. Roll angle differences from the reference values and themareʼs posture（standing or recumbent）confirmed by video were compared and associated.
Cohenʼs kappa coefficient was 0.99 when the threshold was set as ± 0.3

radian in roll angle

differences. This result clearly showed that the sensor data can accurately distinguish between
standing and recumbent postures. The hourly sensor data with a lower ST（LST ＜ 35.5℃），
relatively higher activity, a recumbent posture determined by the roll angle, and tail-raising（TR, decline of 200 mg or more from the reference value in y-axis acceleration）was
significantly higher during the last hour prepartum than 2-120 hours before parturition（p <0.01）. In conclusion, the sequential changes of ST and some behavioral parameters wereidentified using a multimodal device with a thermistor and tri-axial accelerometer attached to
the ventral tail base during the last 5 days of pregnancy. In the future, by increasing thenumber of cases, we would like to proceed with more detailed perinatal behavioral analysis andtry to develop the foaling prediction model．

１．目期間）は，他の家畜と比較して短く，平均15～20

的分で完了する。分娩第２期が40分を超えると，子馬の妊娠期間は約11か月だが，個体差が大き

馬の死亡率が上昇する５）。さらに，馬の難産は，

く，320日から360日のばらつきがある１，２）。また，すべての分娩の最大10％程度で発生し，母子とも馬の分娩の80％以上が夜間に起こる３，４）。馬の分に致命的な状態に陥る危険性がある６）。そのため，

娩第２期（破水してから胎子が娩出されるまでの

適切なタイミングで助産し，難産による合併症を© The Ito Foundation

多機能尾部センサを用いた重種馬の分娩予知

139防ぐためには，管理者が分娩に立ち会うことが望

7.1±2.9歳で17頭のうち14頭が経産馬，３頭が初ましい。しかし，長期にわたる夜間の分娩監視は産馬であった。センサを馬に装着してから分娩が長時間の労働を必要とし，馬の生産者にとって膨完了するまでの間，馬の様子はウェブカメラで記

大な労働時間や経費がかかることになる。このた録した。

め，分娩の予測や検知は，馬産業にとって重要な本研究のすべてのプロトコルと研究方法は帯広課題である。過去数十年にわたって，分娩の管理

畜産大学の動物実験委員会の承認を得ている（承に必要な莫大な労働力を削減する目的で，分娩の認番号：20･220, 21-25）。

時期を予測または検知するための多くの研究が行

センサは，過去の研究７）で開発された多機能尾

われてきたが，安全で，かつ確実な分娩予知方法

部センサを使用した。馬の尾根腹側の皮膚にセンは確立されていない。本研究の目的は，温度計とサの温度計が密着するように配置し，特注のシリ

３軸加速度計を搭載した多機能尾部センサを妊娠

コンベルトと面ファスナーを用いて装着した後，馬の尾根部腹側に取り付け，分娩前後の体表温や医療用伸縮テープを巻いて固定した（Fig.１）。

行動の変化を明らかにし，分娩予知を目的としたセンサは出産予定日（最終交配から335日）から

センサの有用性を検証することである。

10.7±6.0日前に装着した。センサから取得した

２．方

データは３分間隔で自動的に受信機に送信され，

法

３G/LTE経由でクラウドサーバーに保存された。

17頭の重種馬を研究の対象とした。平均年齢は1a

体表温度（20～45℃，分解能0.05℃），活動量（０1bz-axisy-axisroll
x-axis1c1dFig. 1 The sensor（Fig. 1a）was fixed to the tail using a custom-made silicone rubber belt and a hook-andloop fastener（Fig. 1b）. Fig. 1c shows the sensor attached to a PET bottle shaped like a tail. The sensor
attached to the tail was covered with an elastic medical bandage to stabilize its position（Fig. 1d）.

© The Ito Foundation

140

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）～102.3，分解能0.2），Ｙ軸加速度（－1000～＋

１時間ごとのデータの分布をグラフ化し，分娩1000mg，分解能４mg），
Y軸まわりのロール角

前１時間のデータ分布を分娩前２～120時間の（Ｙ軸に対するＸ軸とＺ軸の回転，－３～＋３

データ分布と比較した。カイ二乗検定を用い，ｐradian，分解能0.05radian）を集計した。活動量

値が0.05未満の場合に有意な差とみなした。

およびロール角はHigakiらの方法

７）に従って算出

３．結果と考察した。活動量は３分間まったく動かない場合を０として数値が大きいほど３分間の活動量が多いこ

ビデオで確認した馬の姿勢とセンサで得られたとを意味する。Ｙ軸加速度は尾の上げ下げを表し

ロール角の関係をFig.２に示した。ビデオで確認ており，それぞれの馬において記録開始後24時間した馬の姿勢を実測値，センサで得られたロールのＹ軸加速度を基準値とし，基準値からマイナス角の値を期待値として，コーエンのカッパ係数を方向への数的変化を挙尾の程度と定義した。Ｙ軸算出した。立位と横臥位を判別するための閾値をまわりのロール角は馬の体軸の傾きを表しておロール角基準値±0.3radianとした場合，コーエンり，記録開始後２時間の平均値を立位の基準値とのカッパ係数は0.99となり，高い精度で立位と横した。センサ装着後に横臥を繰り返すなど，姿勢臥位を判別できることが明らかとなった。この結が安定しない馬では，ビデオで持続的な立位が確

果から，ロール角基準値から±0.3radian変化した

認された２時間の平均値を基準値とした。

場合，馬が立位から横臥位に姿勢を変化した（横臥した）と判断した。

ビデオで確認した馬の姿勢とロール角の変化を比較し立位と横臥位（伏臥位および側臥位）を識

分娩前120時間の体表温度，活動量，ロール角

別するのに適した閾値を検証した。コーエンのおよびＹ軸加速度のデータ分布をFig.３に示しカッパ係数を算出し，1.0に最も近い時の値を閾た。体表温度を35.5℃未満，36℃未満，36.5℃未満，値とした。

および36.5℃以上に分類した。35.5℃未満を示す

Standing posture

Sternal recumbency

320

Lateral recumbency

14,000280

12,000240

10,000200

8,000

lying on the right side

lying on the left side

160

6,000

120

4,000

80

2,000

40

0

－1.8 －1.5 －1.2 －0.9 －0.6 －0.3

0

+0.3

+0.6

+0.9

+1.2

+1.5

Diﬀerences of roll angle from the reference values（radian）
Fig. 2 The relationship between the mareʼs posture determined by the video and the roll angle data

© The Ito Foundation

+1.8

0

Number of data showing recumbent posture

Number of data showing standing posture

16,000

141

多機能尾部センサを用いた重種馬の分娩予知

Ventral tail ST（% of data）

100
ST（℃）

80

36.5 ≤
60
40

36.0 ≤< 36.535.5 ≤< 36.0< 35.5

20
0
－120

－96

－72

－48

－24

0

Activity intensity（% of data）

100

< 10

60
40

10 ≤

< 20

20 ≤

< 30

30 ≤

20
0
－120

Roll angle diﬀerence（% of data）

Activity intensity

80

－96

－72

－48

－24

0

100
Roll angle diﬀerence（radian）

80< |0.3|（standing position）

60|0.3| ≤

< |0.9|（sternal recumbency）

40|0.9| ≤
200－120（lateral recumbency）

－96

－72

－48

－24

0

TR index（% of data）

100
TR index（mg）

80－100 <
60
40－200 <≤ －100－300 <≤ －200

≤－300

20
0
－120

－96

－72

－48

－24

0

Time from foaling（hours）

Fig. 3 Changes in ventral tail ST（surface temperature）, activity intensity, lying duration, and TR（tail-raising）index for 120
hours before foaling. The data was classified by level in each parameter and shown as the occurrence rate per hour．

データの割合が，分娩前２～120時間において，の腹側部筋肉内に体温センサを埋め込み，分娩前毎時平均1.8％（中央値0.9％，最小値０％，最大後の深部体温を測定した過去の研究では分娩４時値12.4％）であったのに対し，分娩前１時間では間前から深部体温の低下が始まり，分娩時に最低

平均55.9％となり有意に増加した（ｐ＜0.05）。馬

体温（36.6±0.2℃）を記録した８）。本研究では，© The Ito Foundation

142

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

分娩時の体表温度は平均33.1±1.0℃であった。体スペース（パドックや馬房）であるために群れか温の変化としては過去の研究と矛盾しない結果をら離れることができず，ストレスを感じた結果，得ることができた。しかし，体温低下の程度が大落ち着きがなくなったのかもしれない。また，陣きいことから，分娩に伴う横臥行動や挙尾行動の痛などの分娩に関連した身体的ストレスが活動量増加に伴い，センサと皮膚の密着性が低下し，外の増加に関与している可能性も考えられた。

気温によりセンサが冷却された可能性も示唆されロール角の基準値からの変化を＞|0.3|radian（横た。分娩前の体温の低下はプロジェステロン（Ｐ臥位），および|0.3|radian≧（立位）に分類した。

４）濃度の低下と関連していることが牛で報告さロール角の変化量が＞|0.3|radian（横臥位）を示れているが，馬では体温の低下とＰ４濃度の低下

すデータの割合が，分娩前２～120時間において，の相関関係は緩やかであり，分娩に伴う体温低下

毎時平均5.3％（中央値4.2％，最小値０％，最大のメカニズムについてはいまだ明らかにされてい値21.3％）であるのに対し，分娩前１時間ではない 。本研究では，分娩直前でないにも関わら40.4％となり有意に増加した（ｐ＜0.05）。馬の分ず35.5℃未満の体表温の低下が散見された。これ

娩前の行動を観察した過去の研究では分娩前30分

らのポイントにおいて，長時間の横臥行動が確認頃から横臥時間が増加することが報告されていされたことから，横臥姿勢が持続することによっる11）。胎子を娩出するための娩出力を効率的に得て尻尾が浮きあがり，センサと皮膚の密着性が低るため，娩出時には横臥姿勢になると考えられ下することでセンサの冷却を招く可能性が考えらる。実際，本研究では，すべての馬が娩出を終えれた。本研究で得られたセンサデータの変化を分た際，横臥位であった。また，陣痛による身体的娩予測や分娩検知に応用する際は，季節，地域あな不快感から横臥を繰り返している可能性も考え

るいは気候などの環境条件がセンサデータに影響

られた。

９）

する可能性があることを考慮する必要があるだろう。

Ｙ軸加速度の基準値からの変化を＜－200mg，＜－100mg，および－100mg≦に分類した。Ｙ軸

活動量を＞30（活動量が大きい），＞20，＞10，

加速度の変化量が－200mgよりも大きく変化したおよび10≧（ほとんど動いていない）に分類し（尻尾を挙上する程度が大きい）データの割合がた。活動量＞30を示すデータの割合が，分娩前２

分娩前２～120時間において，毎時平均2.1％（中～120 時 間 に お い て ，毎 時 平 均 12.1 ％（中 央 値

央値2.1％，最小値０％，最大値5.9％）であるの

12.0％，最小値5.5％，最大値21.0％）であったのに対し，分娩前１時間では42.7％となり有意に増に対し，分娩前１時間では平均31.1％となり有意加した（ｐ＜0.05）。Ｙ軸加速度の基準値からのに増加した（ｐ＜0.05）。加速度計を用いて分娩変化量は，３分間の挙尾の回数，挙尾の継続時間

前の活動量を評価した過去の研究では分娩１時間や挙尾の程度（角度）によって決まる。本研究の前に活動量の増加，さらに分娩前30分に急激な活中で，＜－200mgを示すタイムポイントを映像記

動量の増加が報告されている 。野生の馬やシマ録で確認したところ，単純に尻尾を挙上する行動

ウマでは，分娩が近くなると群れから離れ，孤立のほかに，排尿や排便，分娩時に羊膜や胎子にを求める行動が観察されている 。本研究で観察

よって尻尾が挙上されることが確認された。馬のされた分娩前１時間の活動量の増加は，分娩する

分娩前の行動変化をビデオで解析した研究では，ために群れから離れようとするも，限られた飼養

分娩前に挙尾の頻度が増加したことを報告してい

10）

11）

© The Ito Foundation

多機能尾部センサを用いた重種馬の分娩予知

143る12）。本研究において分娩前１時間にＹ軸加速度

割合を１時間ごとに集計したところ，分娩前２～の変化量が増加した原因は，単純な挙尾行動の増120時間に比べて，分娩前の最後の１時間で有意加のほかに胎子の娩出プロセスに伴う尻尾の挙上に増加した。本研究の結果より，多機能尾部センが含まれることが示唆された。

サは分娩前の馬の生理学的および行動学的な変化

本研究では，多機能尾部センサで得られた体表の特徴を明らかにした。今後は，臨床応用に向け

温度，活動量，横臥行動および挙尾行動により，て，症例数を増やすとともに，分娩の予測モデル

重種馬における分娩前の生理学的および行動学的の開発につなげていきたい。これにより，馬の分な変化を明らかにした。今後は，臨床応用に向け

娩管理に費やされる膨大な労力を削減し，馬生産て，症例数を増やすとともに，分娩の予測モデル

分野に大きく貢献できると考える。

の開発につなげていきたい。これにより，馬の分
娩管理に費やされる膨大な労力を削減し，馬生産分野に大きく貢献できると考える。
４．要約

馬の分娩事故を防ぐためには，出産に立ち会うことが望ましい。分娩の開始を早期に発見することは，馬産業にとって重要な課題である。この研究の目的は，妊娠馬の尾根部腹側に装着した多機
能尾部センサを用いて，体表温度，活動量，ロール角（Ｙ軸周りの回転），およびＹ軸（尾の長軸）
加速度のデータを収集し，分娩を検知するためのセンサの有用性を検証することである。データは17頭の妊娠牝馬から３分ごとに収集した。動画で確認した馬の姿勢（立位または伏横臥位）とロー
ル角の変化を比較した。コーエンのカッパ係数は，閾値を±0.3radianに設定した場合，0.99となり，センサデータにより，立位と伏横臥位の姿勢を正確に区別できることが示された。低体表温（35.5℃未満），高い活動量，横臥行動，および尻尾 を 挙 上 す る 行 動（Ｙ 軸 加 速 度 で 基 準 値 か ら文
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200mgよりも大きく低下）を示すセンサデータの© The Ito Foundation

144

哺乳期の栄養環境が繁殖機能に与える影響
Effects of nutritional environment during nursing period on reproductivefunction

髙

橋

秀

之

（九州大学農学部附属農場）

Hideyuki Takahashi（Kuju Agricultural Research Center, Kyushu University）

The conception rate of Japanese Black cattle has been declining year by year. Follicle
development and oocyte growth and maturation are essential for conception, and in vivo and invitro research results have reported that changes in nutritional levels during the period fromprimordial follicle to mature follicle and ovulation can affect follicle development in the earlystages. Since various nutritional metabolites and endocrine hormones are involved in follicle
development, it is thought that changes in nutritional metabolites and endocrine hormone
levels through nutritional management during the nursing period may improve reproductivefunction and contribute to improved fertility in Japanese Black cattle, but the details are
unknown. Therefore, the objective of this study was to examine the effects of nutritional
management during the nursing period on reproductive function by feeding octanoic acid,
which increases ghrelin secretion. No differences in body weight and body size were observed
between the two groups. Plasma glucose concentrations showed a significant increase in theoctanoic acid group compared to the control group, while plasma insulin concentration did not
differ between the two groups. There was no difference in plasma cholesterol concentration
between the two groups. These results indicate that feeding octanoic acid during the nursing
period may have altered nutrient allocation in the calves．

１．目

受けると考えられるが明らかとなっていない。卵的

胞発育にはさまざまな栄養代謝産物や内分泌ホル黒毛和種牛の受胎率は年々低下している。受胎

モンが関与している。

するためには卵胞発育や卵子成長成熟が必須であ

肝臓により合成されるコレステロールはウシ卵る。in vivoやin vitroの研究成果から，原始卵胞

胞発育に必須の重要な栄養素であり，卵胞液中のが成熟卵胞となり排卵に至るまでの期間，栄養水

コレステロール濃度の違いは良好胚率および妊娠準の変化は初期段階の卵胞発育に影響を与えるこ率に影響を与える２）。加えて，卵胞発育過程ではとが報告されている１）。これらの報告から受胎率

グルコースが利用される３）。これらの代謝産物にに影響する卵胞発育は哺乳期の栄養環境に影響を加え，種々のホルモンも卵胞発育に関与し，成長© The Ito Foundation

哺乳期の栄養環境が繁殖機能に与える影響

145

ホルモン（GH）は，その作用により脂肪分解が乳100g当たり1.5gのオクタン酸を代用乳に混合し亢進され脂肪分解産物のケトン体が卵胞に供給さて給与した。代用乳摂取量は，毎日個体ごとに記れる。また，インスリン様成長因子-1（IGF-1）や録した。90日齢で離乳するまでは，市販のスター

インスリンは卵胞発育・成熟・排卵に重要なホルターおよびイタリアンライグラス主体の自家製乾モンであり，これらのホルモンの濃度や作用は栄草を自由摂取させた。離乳後は，市販の配合飼料

養状態により変化する。したがって，哺乳期の栄を給与し，乾草を飽食とした。スターターおよび養管理によりGH・IGF-1・インスリン濃度を増加

配合飼料は，１日２回９：00および16：00に給与させることで繁殖機能が向上し，黒毛和種牛の受した。飼料の残は朝の給飼前に回収し計量した。

胎率向上に寄与すると考えられるが詳細は不明で

水および鉱塩®は試験期間を通して自由摂取させある。脂質代謝や糖代謝ならびにGHやインスリた。

ン分泌を亢進するホルモンとしてグレリンがあげ2.2られる。グレリンはＮ末端から３番目のセリン残体重および体格（体高，体長，胸囲および胴囲）

基にオクタン酸が修飾されており，このオクタン

測定は生後４，30，60，90，120，150，180日齢

酸修飾がグレリンの生理活性発現に必須であるに実施した。０日齢では，体重測定のみ行った。

。また，オクタン酸給与は活性型グレリンを増加

採血は２lゲージの採血針およびヘパリン入りさせる ことから，哺乳期へのオクタン酸給与はの真空採血管を用いて，生後４，30，60，120，

代謝産物や内分泌ホルモンを増加させることで卵150，180日齢において，朝の給飼前（８：30）お胞発育に寄与すると考えられるが明らかとなってよび給飼３時間後（12：00）に実施した。採取しいない。そこで本研究では，グレリン分泌を増加た血液はただちに氷上静置し，採取後１時間以内させるオクタン酸を哺乳期に給与し，哺乳期の栄に，あらかじめヘパリンナトリウムを血液１ml

養管理が繁殖機能に与える影響を検討することを当た り10IU，アプ ロチニ ンを 血液１ ml当た り目的とした。

100KIUを添加しておいた50mlチューブに血液を

４）

４）

２．方

サンプリングデカントで分注し，2,330×g，４℃，20分の条件

法

下で遠心分離した。遠心分離により得られた血漿

本研究は「九州大学大学院農学研究院，大学院

サンプルは，1.5mlチューブに１mlずつ1000μlピ

生物資源環境科学府および農学部における動物実

ペ ッ ト で 分 注 し 解 析 ま で － 80 ℃ で 保 存 し た 。

験指針に関する基準」の規則に基づいて実施した。

IGF-1解析用サンプルは，あらかじめ１mlの酢酸

2.1

バッファーを添加しておいた15mlチューブに血供試動物と飼養管理

黒毛和種繁殖メス子牛８頭を供試し，生後０日

漿１mlを加え，ボルテックスで混合後，抽出ま

齢から３日齢まで母牛の下で飼育し，自然哺乳さ

で－80℃で凍結保存した。また，90日齢では経時せた。３日齢で母子分離を行い，対照区（ｎ＝４，的採血を行った。経時的採血の前日の12：00から

生時体重＝34.1±1.7kg）とオクタン酸区（ｎ＝絶食させて，16：00に頸動脈カテーテルを装着し４，生時体重＝33.3±1.1kg）の処理区に無作為にた。翌日の11：00（－60分）より10分おきに採血割り当てた。子牛は，両処理区ともに市販の代用を行い，０分の採血が終わった直後（12：00）

乳を最大 7 l給与し90日齢まで給与した。代用乳に，代用乳を400g給与した。代用乳給与後２時

濃度は200g/lであった。オクタン酸区には，代用

間は，10分おきに10mlずつ採血を行った。採取© The Ito Foundation

146

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

し た 血 液 は ， 100IU の ヘ パ リ ン ナ ト リ ウ ム
1,000KIUのアプロチニンが添加された採血管に３．結果と考察移し，氷上静置した。その後は，経日採血と同様

オクタン酸は中鎖脂肪酸の１種であり，小腸にに2,330×g，４℃，20分の条件下で遠心分離し，て速やかに吸収され子牛の栄養源として重要な脂血漿サンプルは1.5mlチューブまたはあらかじめ肪酸である。したがって，オクタン酸は栄養素と１mlの酢酸バッファーを添加しておいた15ml

して利用はされていると考えられるが，体重およ

チューブに分注し，－80℃で凍結保存した。

び体格は両区の間に差は認められなかった。この

2.3

血漿成分解析

ことは，栄養の分配が筋肉や脂肪へは行かず，別血漿GH・IGF-1およびインスリン濃度は，時の組織にて利用された可能性を示唆する。つま間分解蛍光免疫測定法（TR-FIA）を用いて解析

り，哺乳期のオクタン酸給与により子牛の栄養分した。血漿コレステロール，遊離脂肪酸（NEFA）

配が変化した可能性がある。

およびグルコース濃度は，それぞれコレステロー

経日的な採血において，血漿グルコース濃度

ルオキシダーゼ・3,5-ジメトキシ-Ｎ-エチル-Ｎ-

は，採食前後で両区の間に差はなかった。しかし（2-ハイドロキシ-3-スルホプロピル）-アニリン

ながら，変化率においては，オクタン酸区の採食

ナトリウム（DAOS）法，アシルCoAシンセター

後 で は 120 日 齢 で 有 意 に 高 い 値 を 示 し（ｐ ＜ゼ（ACS）・アシル-CoAオキシダーゼ（ACOD）

0.05），試験期間を通して交互作用が見られた（ｐ法 ，ム タ ロ ー ゼ ・ グ ル コ ー ス オ キ シ ダ ー ゼ＜0.01）。末梢組織への血漿グルコース取り込み（GOD）法を用いた市販のキット（コレステローに関与する血漿インスリン濃度は両区の間に差はルＥ-テストワコー，NEFA C-テストワコー，グ

認められなかった。一方で，経時採血における血ルコースＣⅡ-テストワコー，富士フイルム和光

漿グルコース濃度では，オクタン酸区は対照区と純薬会社，大阪）を用いて測定を行った。

比較し，代用乳給与後110分と120分で有意な増加

2.4

統計解析

が認められた（ｐ＜0.05）が，血漿インスリン濃血漿ホルモン・代謝産物濃度は，JMP®14 Pro

度は両区の間に差は認められなかった。代用乳に（SAS Institute Inc., 東 京）を 用 い ，下 記 の モ デは長鎖脂肪酸が含まれており，長鎖脂肪酸は肝臓

ルに当てはめて解析した。

によりトリアシルグリセロールに合成され，肝臓

Yijk＝μ＋Treatmenti＋Timej＋Calf（Treatment）
k(i)や脂肪組織において，体脂肪として蓄積される。
一方で，オクタン酸は小腸にて速やかに吸収さ＋Treatment×Timeij＋eijk
Yijk は独立変数，μは全体平均，Treatmenti はれ，オクタン酸は筋たんぱく質分解を抑制し脂肪処理の固定効果，Timejは反復測定として用いた分解を促進しエネルギー産生を促す５）。したがっ時間の固定効果，Treatment×Timeij は処理と時て，オクタン酸区においては子牛の栄養状態が良間の交互作用，Calf（Treatment）
k(i) は処理区で枝好 で あ っ た と 考 え ら れ る 。そ の 結 果 と し て ，分かれさせた個体の変量効果，ならびにeijk は誤ATP産生に利用されるグルコースの消費が抑え差を示している。単純主効果検定は処理と時間のられたため，経時採血時の代用乳哺乳後に血漿グ交互作用が見られた場合に，同一の時間で処理区

ルコース濃度の増加が認められたと考えられる。

間の差異を明らかにするために行った。

負のエネルギー状態では血漿グルコース濃度が低下し，卵胞刺激ホルモン（FSH）に対する卵胞© The Ito Foundation

哺乳期の栄養環境が繁殖機能に与える影響の反応性が減少する。その結果，卵胞発育が遅延する 。したがって，哺乳期へのオクタン酸給与

147

質代謝に変化はなかったことが示唆された。

６）

は栄養状態を改善することで卵胞発育を促す可能

４．要約性が示された。また，卵胞における糖取り込みは，

黒毛和種牛の受胎率は年々低下している。受胎

主に非インスリン感受性糖輸送単体であるグルするためには卵胞発育や卵子成長・成熟が必須で

コーストランスポーター１（GLUT1）により行ある。in vivoやin vitroの研究成果から，原始卵

われる７）。経日的な採血の結果と経時採血の結果胞が成熟卵胞となり排卵に至るまでの期間，栄養から，オクタン酸給与によって代用乳給与後の血水準の変化は初期段階の卵胞発育に影響を与える

漿グルコース濃度は増加し，その増加が基礎値にことが報告されている。卵胞発育にはさまざまな戻るまでの時間はオクタン酸区で長くなる可能性

栄養代謝産物や内分泌ホルモンが関与しているこがある。つまり，血漿グルコース濃度の消失速度とから，哺乳期の栄養管理により栄養代謝産物やが 遅 延 す る こ と が 推 察 さ れ る 。こ の こ と は ，内分泌ホルモン濃度を変化させることで繁殖機能

GLUT1による長期的なグルコース取り込みが可が向上し，黒毛和種牛の受胎率向上に寄与すると能になることを意味し，卵胞へのグルコース供給考えられるが詳細は不明である。そこで本研究でが長期的に持続する可能性が示された。

は，グレリン分泌を増加させるオクタン酸を哺乳

経日的な血漿コレステロール濃度は採食前後で期に給与し，哺乳期の栄養管理が繁殖機能に与え両区間の間に差は認められなかった。血漿コレス

る影響を検討することを目的とした。体重およびテロールに関しては，変化率においても両区間に

体格は両区の間に差は認められなかった。血漿グ差は見られなかった。経時採血における血漿コレ

ルコース濃度では，オクタン酸区は対照区と比較

ステロール濃度は実測値および変化率ともに両区し，有意な増加が認められたが，血漿インスリンの間に差は認められなかった。これまでの研究よ

濃度は両区の間に差は認められなかった。血漿コ

り，繁殖メス牛へのオクタン酸給与は血漿コレス

レステロール濃度は両区の間に差は認められなテロール濃度を増加させることを明らかにしていかった。これらの結果から，哺乳期のオクタン酸

る（未発表）
が，子牛へのオクタン酸給与は，血漿給与により子牛の栄養分配が変化した可能性が示

コレステロール濃度に影響を与えなかった。栄養された。

状態が良好な場合，血漿コレステロール濃度は増加する。血漿グルコースの結果から，子牛の栄養状態は良好であった可能性があるが，血漿コレス
テロール濃度は差がなかった。変化がなかった要因は不明だが，コレステロールは卵胞に取り込まれた場合，卵胞液中のコレステロール濃度は増加する。したがって，今後，卵胞液中のコレステロー
ル濃度を測定することで，オクタン酸給与が卵胞発育に与える影響を詳細に検討する必要がある。
血漿NEFAおよびIGF-1濃度は両区の間に差はなかった。このことから，脂肪酸代謝やたんぱく

文献１）
 菅原七郎：畜産の研究，64巻，293～298，2010．
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© The Ito Foundation

148

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

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Animal Science Papers and Reports, 33, 191-212,
2015．

© The Ito Foundation

149

黒毛和種における不明瞭な発情発生メカニズムの
黄体退行の観点からの解明（Ⅱ）
Elucidation of mechanisms for silent heat from luteal regression in
Japanese Black Cows（II）

法

上

拓

生・堀

畑

慶

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センター）

Takuo Hojo and Kei Horihata（Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, NARO）

Summer heat stress（HS）affects the functions of various reproductive organs, including
the corpus luteum（CL）.Recently, HS was suggested to inhibit apoptosis of luteal steroidogenic
cells（LSCs）which contributes luteolysis in beef cattle. Although HS may inhibit apoptosis via
intracellular heat shock protein（HSP）70, the details are unclear. Therefore, in the present
study, we investigated the effects of HSP70 on the mechanisms of apoptosis by using pifithrinμ（PFT）, an inhibitor of HSP70, to clarify the influence of HS on reproductivity in beef cattle.
Isolated luteal steroidogenic cells（LSCs）from the mid CL were cultured at 38.5 or 40℃（representing HS conditions）in ５％ CO2 for 6 h. Thereafter, LSCs were treated at 38.5℃ for
12 or 48 h with cytokines（tumor necrosis factor-alpha： 2.3 nM, interferon gamma： 2.5 nM,
and Fas ligand： 5.6 nM）, which were known as stimulators of apoptosis and luteal regression
in bovine CL, and/or PFT（20μM）.We then investigated the viability, mRNA-level expressionof apoptosis-related factors（CASP8, CASP3, BAX and BCL2）in LSCs. HS downregulated
cytokines-induced cell death. However, there was no significant difference between 38.5℃ and
40℃ in LSCs which were cultured with PFT ＋ cytokines. Furthermore, although PFT
decreased cell viability, PFT tended to decrease cytokines-induced CASP3 and CASP8 mRNA
expression in LSCs. There was no significant difference in BAX and BCL2 mRNA expression
in any treatments. Overall, these results suggest that heat stress suppresses apoptosis via
HSP70 in bovine LSCs, and that PFT may be involved in cell death via CASPs-independent
pathway．

１．目

近年，気候温暖化に伴い，牛における夏季の繁的殖成績低下が大きな問題となっている。その一因

本研究は，肉用牛において夏季の高温環境下でとして夏季における発情行動（乗駕許容行動）が増加することが報告されている不明瞭な発情の発発現しない不明瞭な発情の増加が指摘されてい生メカニズムの一端を，卵巣上に形成される内分る。黒毛和種において，不明瞭な発情が冷涼期と泌器官である黄体機能の観点から明らかにするこ

比較して夏季に約30％増加すること１），また，夏とを目的とする。

季の授精頭数当たりの受胎率は低下していないに© The Ito Foundation

150

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

も関わらず，受胎頭数は他の季節と比較し夏季に単離直後にトリパンブルー染色により細胞生存率

約30％低下すること（家畜改良事業団調べ）が報が85％以上であることを確認している。

告されている。これらの報告から不明瞭な発情に本試験では高温環境条件として，予備試験によよる授精頭数の低下が，直接肉用牛における繁殖り確認した40℃，６時間の培養条件を用いた。黄

効率の低下につながることが示唆されており，こ体 細 胞 を 38.5 ℃ ま た は 40 ℃ で ６ 時 間 培 養 後 ，のような夏季における不明瞭な発情の増加は肉用

HSP70の活性阻害剤であるpifithrin-μ（PFT：20

牛生産において喫緊の課題となっている。

μＭ）を単独またはアポトーシスを刺激するため不明瞭な発情の対策を開発するためには，発生の腫瘍壊死因子（TNF：2.3nM），インターフェのメカニズムを解明する必要がある。これまで

ロ ン γ （IFNG ： 2.5nM） な ら び に Fas ligandに，不明瞭な発情発生のメカニズムの一つとし（FASL：5.6nM）と組み合わせて添加し，さらにて，卵巣に発現する黄体の関与が示唆されてい

38.5℃で培養を継続した。

る。黄体は妊娠の成立・維持に必須のプロジェス

2.2

テロン（Ｐ４）を分泌する内分泌器官であるが，細胞生存率に及ぼすPFTの影響を調べるため，妊娠が成立しなかった場合，次の排卵が起こるた

高温条件で培養した細胞にTNF＋IFNG＋FASL

めに黄体はＰ４分泌能が衰退するとともに（機能を添加（以後，Cytokines区）し，38.5℃でさら的黄体退行），卵巣上から消失する（構造的黄体に18時間培養した後，再度高温環境下で培養し退行）。夏季に多発する不明瞭な発情ではこの黄た。２度目の高温環境下での培養終了後38.5℃で体退行が緩慢となっていることが報告されてい18時間培養を継続し，培養終了後AlamarBlueにる。黄体退行には黄体を構成する黄体ステロイド

よって細胞生存率を調べた５）。

細胞生存率

合成細胞（以下，黄体細胞）のアポトーシスが重2.3

要な役割を果たすことが知られており，暑熱スト

高温条件で培養した細胞にPFTを単独またはレスによって増加するタンパク質であるヒート

Cytokinesと組み合わせて添加し12時間培養後，ショックプロテイン（HSP）70はある種の細胞でtotal RNAを回収し，アポトーシス誘導経路に関

アポトーシスを阻害することが知られている 。

連するタンパク質をコードするcaspase（CASP）

これまでの研究によって，ウシ黄体細胞を高温環

8, 3, BAX お よ び BCL2 mRNA 発 現 を real-time

境で培養すると細胞内のアポトーシス誘導因子のqPCR に よ り 測 定 し た 。内 部 標 準 に は β -actin発現が抑制され，アポトーシスが阻害されること（ACTB）を用いた。

２）が示唆されたが ，HSP70が関連しているかを含

遺伝子解析

３）

めた詳細なメカニズムは不明である。HSP70の活性阻害剤を用いて，高温環境が黄体細胞のアポ

2.1

Cytokines区において38.5℃培養区と比較し，40℃培養では細胞生存率が有意に高い値を示した

トーシスに及ぼす影響について検証した。
２．方

３．結果と考察が，PFTμ＋Cytokines区では培養温度間で細胞法

生存率に有意な差はなかった（Fig.１）。これまでの研究において，ウシ黄体細胞を40℃，６時間

黄体細胞の単離と培養

食肉処理場由来の肉用牛開花期黄体から環流法で培養することでHSP70をコードする遺伝子であにより ，黄体細胞を単離し，一晩前培養した。

るHSPA1 mRNA発現が増加することを確認して

４）© The Ito Foundation

151

Viablity（% of Cont）

黒毛和種における不明瞭な発情発生メカニズムの黄体退行の観点からの解明（Ⅱ）
120

a

100

ｘ

＊
b

80
60

b

y

xy

b

y

40
20
0

Cont

PFT

Cytokines

38.5℃

40℃

PFT＋Cytokines

Fig. 1 Effects of heat stress and pifithrin-μ（PFT）on viability in bovine luteal cells. The cells were cultured in the medium withor without TNF（2.5nM）＋IFNG（2.3nM）＋FASL（5.6nM）and/or PFT（20μM）under 38.5 or 40℃ for 48h. Different letters
indicate significant difference（p ＜ 0.05）,as determined by ANOVA followed by a multiple comparison with Tukey correction,
and asterisk indicates significant difference between 38.5℃ and 40℃，as determined by a paired t-test．

B

†

2.5

b

Ratio mRNA（CASP3/ACTB）

Ratio mRNA（CASP8/ACTB）

A

†

2.0

ab

1.5
1.0
0.5
0.0

a

Cont

a

PFT

Cytokines

PFT＋Cytokines

38.5℃

1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

＊
†

Cont

PFT

Cytokines

PFT＋Cytokines

40℃

Fig. 2 Effects of heat stress and PFT on expression of CASP8（A）, CASP3（B）mRNA in bovine luteal cells. The cells were
cultured in the medium with or without TNF ＋ IFNG ＋ FASL and/or PFT under 38.5 or 40 ℃ for 12h. The amount of eachmRNA is expressed relative to the amount of ACTB. Different letters indicate significant difference（p ＜ 0.05）,as determined
by ANOVA followed by a multiple comparison with Tukey correction. Asterisk and dagger indicate significant difference（p＜ 0.05）and significant trend（p ＜ 0.1）between 38.5℃ and 40℃，respectively, as determined by a paired t-test．

いる。本研究の結果は過去に行った研究結果３）や区およびPFT＋Cytokines区において高温環境下

HSP70がラットの細胞においてアポトーシスを阻ではCASP8 mRNA発現を抑制する傾向を示した

害するという報告とも一致しており ，ウシ黄体（p＜0.1：Fig. 2A）。過去の研究によってCASPs細胞において高温環境の培養で増加したHSP70が依存的なアポトーシス誘導経路においてHSP70はアポトーシスを阻害することが強く示唆された。

CASP８よりも下流のCASP９に作用することでまた，38.5℃培養区において，PFT区においてアポトーシスに影響することが報告されている

control 区 と 比 較 し 低 い 値 と な っ た こ と か ら ，が６），本研究の結果はHSP70がCASP８に直接まPFTはウシ黄体細胞において単独で細胞死を誘たはCASP８よりも上流に作用する可能性を示し導する可能性が示された。

ている。CASP８よりも上流へのHSP70の影響に

２）

アポトーシス誘導経路に関連する遺伝子発現に及ぼす高温環境の影響を調べた結果，Cytokines

ついては今後さらなる検討を予定している。
Cytokines区では40℃培養において38.5℃での© The Ito Foundation

152

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

培養と比較しCASP3 mRNA発現が有意に低い値

CASP依存的なアポトーシス誘導経路に関連すとなったが（p＜0.05），PFT＋Cytokines区ではるBCL２スーパーファミリー８）であるBAXなら40℃と比較し38.5℃でCASP3 mRNA発現は低い

びにBCL2 mRNA発現はいずれの区においても傾向はあるものの有意な差はなかった（p＜0.1：

有意な差はなかった（Fig.３）。これらの因子はFig. 2B）。CASP３は細胞内のアポトーシス誘導タンパク質として細胞内で作用することから，タ経路における最も下流に位置するアポトーシス実

ンパク質の発現を検証する必要があるが，現時点行因子である６）。40℃培養においてサイトカイン

ではタンパク質の発現解析には至っておらず，今によるCASP3 mRNA発現の上昇が抑制されたの後検証する必要がある。

は，高温環境下の暑熱ストレスによって増加した

本 研 究 の 結 果 よ り ，ウ シ 黄 体 細 胞 に お い て

HSP70がCASP３よりも上流の因子に作用し，ア

cytokines に よ っ て 刺 激 さ れ る CASP3 お よ び

ポトーシス誘導経路を阻害していることを示唆し

CASP8 mRNA発現を高温環境下での培養が抑制ており，過去の報告とも一致している 。一方で，し，アポトーシスを阻害する現象は，高温環境に細胞生存率は，PFTによって低下したことからよって発現が増加したHSP70を介して起こること（Fig.１），CASP8およびCASP3 mRNAの発現はが示唆された。このことから，生体内においても，

PFT区において増加すると予想されたが，これ

暑熱期の熱ストレスによって黄体組織内で増加しらの遺伝子発現にcontrol区とPFT区の間で有意たHSP70が黄体を構成する細胞のアポトーシスをな差はなかった（Fig. 2A, B）。このことはPFTが阻害することで緩慢な黄体退行を引き起こし，鈍CASP非依存的な経路を介して細胞死を誘導する性発情の一因となっている可能性が示された。まことを示唆している。近年，ウシ黄体細胞においた，HSP70の活性阻害剤であるPFTはCASP非依てCASP非依存的な細胞死が起こることが報告さ存的な経路を介して細胞死を誘導することが示唆れており，PFTによる細胞生存率の低下はこされた。今後はPFTが単独で誘導する細胞死にれらの細胞死によるのかもしれない。申請者ら

ついてさらに検証し，黄体退行メカニズムの詳細

は，すでにCASP非依存的な細胞死に関わる因子を解明することで鈍性発情の対策・治療法の開発の発現に及ぼすHSP70ならびにPFTの影響につの一助となることが期待される。

２）

５，
７）

いて検討を開始している。
B

3.5
3.0

Ratio mRNA（BCL2/ACTB）

Ratio mRNA（BAX/ACTB）

A

2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

Cont

PFT

Cytokines

PFT＋Cytokines

5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

Cont

PFT

Cytokines

PFT＋Cytokines

Fig. 3 Effects of heat stress and PFT on expression of BAX（A）and BCL2（B）mRNA in bovine luteal cells. The cells were
cultured in the medium with or without TNF ＋ IFNG ＋ FASL and/or PFT under 38.5 or 40℃ for 12h. The amount of eachmRNA is expressed relative to the amount of ACTB．

© The Ito Foundation

黒毛和種における不明瞭な発情発生メカニズムの黄体退行の観点からの解明（Ⅱ）

４．要

153

0.05），PFT区およびPFT＋Cytokines区では温度

約間でCASP3 mRNA発現に有意な差はなかった。

高温環境での暑熱ストレスが，黄体退行の主ないずれの区においてもBAXとBCL2 mRNA発現要因である黄体ステロイド合成細胞（LSCs）のに有意な差はなかった。以上の結果より，ウシ

アポトーシスを阻害し，不明瞭な発情の一因とな

LSCsにおいて暑熱ストレスはHSP70を介してアることが示唆されている。暑熱ストレスは細胞内ポトーシスを抑制することが示唆された。また，の Heat shock protein（HSP）70 を 介 し て ア ポ

ウシLSCsにおいてPFTは，単独で細胞死を誘導

トーシスを阻害すると考えられるが詳細は不明でし細胞率を低下させたが，サイトカインによってある。本研究はHSP70の阻害剤であるpifithrin-

刺激されるCASPs発現も抑制する傾向が見られμ（PFT）を用いて，暑熱ストレスがLSCsのアたことから，PFTはCASP非依存的な経路で細胞ポトーシス誘導機構へ及ぼす影響について検証し死に関与する可能性が示された。

た。ウシ開花期黄体よりLSCsを単離し，通常（38.5℃）または高温環境（40℃）で６時間前培養した。前培養終了後，PFT（20μＭ）を単独またはアポトーシスを誘導するcytokines（腫瘍壊死因子：2.3nM，インターフェロンγ：2.5nMおよびFas ligand：5.6nM）と組み合わせて添加し，38.5℃で培養した。48時間培養後の細胞生存率ならびに12時間培養後のアポトーシス関連因子遺伝
子（CASP3，CASP8，BAXならびにBCL2）発現を調べた。Cytokines区において高温環境が生
存 率 を 有 意 に 向 上 さ せ た が（p<0.05）, PFT ＋
Cytokines区では温度間で生存率に差はなかった。
38.5℃区においてPFTはサイトカインが刺激した
CASP8 mRNA発現を抑制する傾向を示した（p＜0.1）
。Cytokines区において高温培養によって文
献１）
 竹之内直樹，福重直輝：日本胚移植学雑誌，35，
97～108，2013
 Beere, H. M., Wolf, B. B., Cain, K., Mosser, D. D.,
２）
Mahboubi, A., Kuwana, T., Tailor, P., Morimoto, R. I.,
Cohen, G. M., Green, D. R.：Nat Cell Biol, 2, 469～
475，2000．
 法上拓生，堀畑慶：令和３年度食肉に関する助成
３）
研究調査成果報告書，40，165～170，2022．
４）
 Okuda, K., Miyamoto, A., Sauerwein, H.,
Schweigert, F. J., Schams, D.：Biol Reprod, 46, 1001
～1006，1992．
 Hojo, T., Siemieniuch, M. J., Lukasik, K.,
５）
Piotrowska-Tomala, K. K., Jonczyk, A. W., Okuda,K., Skarzynski, D. J.：Sci Rep，6，38211，2016．
 Cohen, G. M.：Biochem J，326，1，1997．
６）
 Aboelenain, M., Kawahara, M., Balboula, A. Z.,
７）
Montasser, Ael-M., Zaabel, S. M., Okuda, K.,
Takahashi, M.：J Reprod Dev, 61, 229～236，2015．
８） Antonsson, B.：Cell Tissue Res, 306, 347～361,
2001．

CASP3 mRNA 発 現 が 有 意 に 低 下 し た が（p ＜© The Ito Foundation

154

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の確立（Ⅲ）
Identification of a molecular marker for the uterine involution to affirm
the female fertility（Ⅲ）

久保田

海雄・三輪

雅史・阪谷

美樹

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Kaiyu Kubota, Masafumi Miwa and Miki Sakatani（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

Longer post-partum interval causes huge economic loss in the cattle management. Fullrecovery of the uterus from the damage by parturition, so-called “uterine involution” isnecessary to achieve the subsequent embryonic implantation into uterus for pregnancy
success. Even to date, the conventional rectal palpation with ultrasonography is the almost only
choice to evaluate the genital tract, however, it only gives a gross information, e.g. size ofuterus and loss of discharge, but not the details including the probability to become pregnant,i.e. fertility. Therefore, our purpose of the present study was to establish a quantitative andreliable molecular marker for the uterine involution to affirm the female fertility. We collected
endometrial samples from Japanese Black cows by cytobrush during the uterine involution for
RT-qPCR gene expression analyses of insulin-like growth factor 1（IGF1）and mucin 16（MUC16）. IGF1 function was evaluated by evaluating cell proliferation after treatment ofendometrial epithelial cells with IGF1 protein. Concentration of IGF1 in cervicovaginal mucus（CVM）was determined by ELISA assay, for indirect evaluation of IGF1 expression reflecting
a uterine involution. The results showed that the expression of IGF1 was high at involution
and decreased after recovery. IGF1 promoted the endometrial epithelial cell proliferation. IGF1
concentrations in CVM were not altered before and after involution. Those results suggest
IGF1 plays a role in uterine involution. However, the methods utilizing the IGF1 concentrationin CVM as a marker to evaluate uterine involution cannot work to date. On the other hands,
other potential candidate, MUC16 expression was also high after calving and decreased
gradually along with uterine involution. Therefore, MUC16 might be a next target for amolecular marker for uterine involution and fertility．

１．目

査によると，令和元年度の乳用牛空胎日数は最頻的値80日であるが平均値は160日となっており，一肉用牛・酪農経営において分娩間隔の延長は負部の牛が平均値を間延びさせている。乳用牛の初の影響を与えるため，分娩後なるべく早期に受胎産牛において，分娩後初回人工授精日数は最頻値させる必要がある。家畜改良事業団の牛群検定調70日（平均値89日）であり，経産牛や肉用種にお© The Ito Foundation

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の確立（Ⅲ）

155

いても同様な状況であると考えられ，初回人工授を採取しIGF1のタンパク量を測定することで子精は分娩後早期に実施されている。このことか

宮内膜の状態を評価可能か検討した。

ら，分娩間隔を短縮させるには一度の交配では受また，IGF1以外の候補因子も引き続き検索す

胎せずに複数回交配が必要な牛を検出・対処するる必要がある。保水や微生物に対する保護のため必要がある。受胎不成立や早期胚死滅にはさまざに細胞表面を覆う糖タンパク質ムチンの一つ

まな原因が考えられるが，同じロットの精液を用

MUC１は細胞表面の立体構造から胚の子宮内膜いた人工授精や良質な受精卵の移植においても受への着床にも関与すると考えられている。我々

胎牛と不受胎牛の両方が発生することから，母体は，子宮内膜上皮細胞におけるMUC１の発現が側要因の特定も重要である。特に子宮は，前回分

長期空胎牛で高くなることを明らかにし，性ホル

娩による損傷から回復（子宮修復）していなけれモンによる発現制御機構とともに発表した１）。同

ば胚の発育が損なわれるため受胎不成立に陥る。

じくムチンメンバーに属するMUC16は，その低現在，子宮修復の判断には超音波診断を併用した発現が妊娠早期診断の指標とされる報告があ

直腸検査が用いられるが，この方法では悪露の排り２），今回我々はMUC16について子宮修復およ

出や子宮の形状を評価することはできても子宮内び受胎性のマーカーとなり得るか解析を行った。

膜の機能評価ひいては受胎性までは判断できない。そこで繁殖処置の実施判断や淘汰牛の選定を２．方法行うために，子宮内膜や腟粘液の分子的性状（タ2.1

ンパク質の挙動）をマーカーとして活用し，受胎本研究は国立研究開発法人農業・食品産業技術性を加味した子宮修復状態を評価することを本研

総合研究機構が設置する動物実験委員会の承認を究の目的とした。

得て実施した。

供試牛

これまでに我々は子宮修復を客観的に評価でき

子宮内膜炎や乳房炎等の外的要因が少ない黒毛

る分子マーカーの確立を目指して，分娩後子宮修和種牛を供試した。分娩後自然哺乳中の母牛計31

復期に経時的にサンプリングを行い，その分子生頭を初産・経産の区別なくランダムに供試した。

物学的機構・特徴の解明に取り組んできた。その本研究に用いた母牛は分娩前後とも臨床上異常所

結果，細胞増殖等に働くインスリン様成長因子

見がなく正常分娩と考えられた。分娩予定日約１（IGF1）の子宮内膜上皮細胞における発現が子宮週前に分娩房へ移動し，分娩後約10日間は子牛同修復時にのみ高く，子宮修復完了に伴い減少する居の元で分娩房にて管理した。分娩後約10日目にことを明らかにしてきた（Fig.１ＡおよびＢ）。

屋外コンクリートパドックへ移し，自由採食（乾本年は，IGF1の子宮修復への機能を明らかにす草），自由飲水条件下で群飼での親子飼育を分娩るために，培養子宮内膜上皮細胞をIGF1タンパ

後約90日目離乳まで継続した。本牛群の一部の牛ク質で処理し，細胞増殖を解析した。また，コロ（ｎ＝10）における10日ごとの超音波診断およびナウイルス抗原検査キットのような迅速かつ容易

２―３日ごとのプロゲステロン濃度を測定の結な判定法が牛の子宮修復にも開発されれば，生産

果，本牛群における悪露消失は41.0±1.8日目，初現場へ普及することも考えられる。IGF1は液性

回排卵は44.0±6.2日目，初回発情は53.9±5.9日目

因子として体液や粘液中に分泌され，子宮粘液はであった。

腟内に漏出することから，子宮修復前後の腟粘液

© The Ito Foundation

156

令和４年度

Relative expression

A

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）
B

IGF1

1.5
1
0.5
0

S
20

30

40

LE

50

C

Cell counts（×10000 cells）

Days post parturition

12

＊

10
8
6
4
2
0

Ctrl

IGF1

P

IGF1+P

D
Ctrl

IGF1

P

IGF1＋P

Fig. 1 IGF1 in the bovine uterine involution. A）Time-course change of the IGF1 expression in the endometrial
epithelial cells of Japanese Black cattle during the uterine involution, analyzed by RT-qPCR. Data arepresented as the mean ± standard error. B）Localization of the IGF1 expression in the endometrium at 20
days after calving, analyzed by immunohistochemistry. Arrowhead indicates IGF1 expression. Scale Bar ＝50μm. LE ; luminal endometrium. S ; stroma. C）Cell proliferation analyzed in the endometrial epithelial
cells treated with IGF1（100 ng/ml）and/or IGF1 receptor inhibitor（Picropodophyllin，１μM）for 72 hours.
Asterisk indicates statistical significance compared with control（p＜0.05）. D）Representative pictures ofcells after treatment．

2.2

遺伝子発現解析（RT-qPCR解析）

細 胞 検 体 を 採 取 し た 。そ れ ぞ れ の 検 体 よ り 総

細胞診用サイトブラシを用いて，分娩後20日目

RNAを抽出し，cDNAに逆転写後に定量的リアより50日目まで10日ごとに経時的に子宮内膜上皮

ルタイムPCR（RT-qPCR）によりIGF1および© The Ito Foundation

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の確立（Ⅲ）

157

MUC16 の 発 現 解 析 を 行 っ た 。解 析 に は 18S

現し，子宮修復完了後に減少することを明らかに

rRNAを内部標準として，ΔΔCT法を用いて相対してきた（Fig.１ＡおよびＢ）。また，シグナル的発現量を評価した。

を伝達する受容体IGF1Rは修復前後で恒常的に発2 . 3 培養細胞におけるIGF1機能評価（細胞増殖評価）

現していた。そこで，子宮修復時の子宮内膜上皮細胞に対するIGF1の機能を解明するために，培

細胞診用サイトブラシを用いて，分娩後20日目

養細胞をIGF1タンパク質で処理し細胞増殖を評の子宮体部内膜から上皮細胞を単離し，10％牛血価した。その結果，IGF1処理区では対照区と比清を含むダルベッコ改変培地／Ｆ12培地により培較して有意に細胞数が増加していた（Fig.１Ｃお養した。サブコンフルエントに到達後トリプシン

よ び Ｄ）。ま た ，IGF1R 機 能 阻 害 剤 処 理 に よ り

で回収し，20,000cell/wellの濃度で12wellプレー

IGF1の細胞増殖機能は抑制された。以上より，

トに播種，牛血清を５％に落としIGF1（100ng/

IGF1は細胞の増殖を誘導することで分娩後の子ml）お よ び IGF1R 阻 害 剤（Picropodophyllin ，宮 修 復 を 促 進 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。今 後 は１μＭ）で72時間処理後，トリプシンにて回収しIGF1の発現を制御する機構を明らかにする必要

血球計算盤により細胞数を計測した。

がある。続いて，腟粘液中のIGF1を指標として

2 . 4 腟粘液中のIGF1タンパク質定量（ELISA
アッセイ）

子宮修復を判定可能か評価するために，子宮修復前後の腟粘液中IGF1濃度を測定した。その結果，分娩後20日目，30日目，および子宮修復後（分子宮内膜の遺伝子・タンパク質発現と相反して，

娩50日目以降）の発情期において，腟鏡下で鉗子腟粘液中IGF1濃度は子宮修復前後で一定であっに挟んだ脱脂綿により外子宮口付近を拭い，腟粘

た。子宮で産生されたIGF1タンパク質が腟粘液液を採取した。検体は遠心により固形物を除去

中へ分泌されない，安定性が低く分解されてしま

し ，上 清 を 分 注 後 に 解 析 に 用 い る ま で 即 座 にう，肝臓由来のものでマスクされる等の原因があ－80℃に凍結保存した。IGF1タンパク質の定量

り，腟粘液中IGF1は子宮修復指標として不適では，R&D systems製ヒト用IGF1 Enzyme-Linked

あった。

Immuno Sorbent Assay（ELISA）キットを用いてプロトコルに従い測定した。

次に，子宮修復・受胎性指標の新候補因子としてMUC16に注目した。MUC16の発現は分娩後早期に高く，修復が進むにつれて徐々に減少してい

３．結果と考察た（Fig.２）。ムチンファミリータンパクは，バIGF1は細胞の増殖・分化を調節することでさクテリアや病原菌との接着を防ぎ細胞を護る働き

まざまな組織の成長や恒常性に貢献している。雌があり，子宮内膜では胚の接着を抑制するとも考牛の産褥期には，肝臓由来の血中IGF1濃度が上えられている。つまり，MUC16の発現が高いと昇することで排卵が起こるが，負のエネルギーバ

受胎性が低く，発現が低いと受胎性が高い可能性

ランスに陥ると血中IGF1濃度が低いため排卵しがある。そのため，今回明らかになった子宮修復ない 。ウシ子宮においては，子宮が産生する

進行とともに減少するMUC16の発現挙動は，修IGF1が妊娠初期の胚発生に関与すると報告があ復が進むと受胎性が上昇することを示唆しているる４）。我々はこれまでの研究において，分娩後子と考えられる。一方で，子宮修復完了後の発情期

宮修復時には子宮内膜上皮細胞がIGF1を高く発と黄体期におけるMUC16の発現をFig.３に示し

３）© The Ito Foundation

令和４年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

MUC16

1.5

Relative expression

Relative expression

158

1
0.5
0

20

30

40

50

Days post parturition

1.5

MUC16

1
0.5
0

EstrusFollicularFig. 3 Alteration of MUC16 expression in the bovine

Fig. 2 Time-course change of the MUC16 expression in theendometrial epithelial cells of Japanese Black cattle
during the uterine involution, analyzed by RT-qPCR.

endometrial epithelial cells during the estrous cycle,
analyzed by RT-qPCR. Data are presented as the mean
±standard error．

Data are presented as the mean±standard error．

た。MUC16は発情期に高く，黄体期に減少して修復完了後に減少した。IGF1タンパク質によるおり，子宮修復完了後も性ホルモン等により変動

処理は，子宮内膜上皮細胞の細胞増殖を誘導ししている。よって，単純に子宮修復を反映していた。残念ながら，腟粘液中のIGF1濃度は一定でる訳ではなく，今後詳細な解析が必要となる。まあった。以上から，分娩後のウシ子宮内膜ではた，上記IGF1のように腟粘液や血液等により簡IGF1が産生され，細胞増殖を促進することで子便・迅速に計測できる方法も開発する必要がある。

宮修復に貢献することが示唆された。一方，腟粘

４．要

液中IGF1を指標として子宮修復を評価すること

約

は 困 難 と 考 え ら れ た 。も う 一 つ の 候 補 因 子

牛の分娩間隔短縮を達成するために，子宮修MUC16については，その発現は子宮修復が進む

復・受胎性を客観的に評価する分子指標確立を研につれて減少した。MUC16の発現は子宮修復完究の目的とし，IGF1およびMUC16の子宮修復時

了後も変動するためさらなる解析が必要であるの子宮内膜における発現および機能を解析した。

が，腟粘液等を用いてMUC16を分子指標として疾病などの外的要因の少ない黒毛和種繁殖雌牛を子宮修復および受胎性を評価する道が拓かれた。

初産・経産の区別なくランダムに供試した。子宮修復中の分娩後20日目から子宮修復完了後の分娩後50日目まで10日ごとに細胞診用サイトブラシを用いて子宮内膜上皮細胞を採取し，RT-qPCRによりIGF1およびMUC16の発現を解析した。また，IGF1の子宮修復に対する機能を明らかにするため，培養細胞をIGF1タンパク質で処理し，細胞増殖を評価した。さらに，腟粘液中のIGF1タンパク質濃度を測定した。その結果，ウシ子宮文
献１）
 Kubota, K., Miwa, M., Hayashi, K. G., Hosoe, M.,
Sakatani, M.：J Reprod Dev，67，386～391，2021．
 Kunii, H., Kubo, T., Asaoka, N., Balboula, A. Z.,
２）
Hamaguchi, Y., Shimasaki, T., Bai, H., Kawahara, M.,
Kobayashi, H., Ogawa, H., Takahashi, M.：Biochem
Biophys Res Commun，569，179～186，2021．
 Butler, W. R.：Anim Reprod Sci, 60-61, 449～57,
３）
2000．
４）
 Hansen, P. J., Tríbulo, P.：Biol Reprod, 101, 526～
537，2019．

内膜上皮細胞のIGF1発現は子宮修復中に高く，© The Ito Foundation

159

生殖巣始原生殖細胞を用いた新規家禽遺伝資源保存法の開発（Ⅱ）Developing new method of conservation of poultry genetic resources
using gonadal primordial germ cells（Ⅱ）

中

島

友

紀

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Yuki Nakajima（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

The technology for long-term conservation of poultry genetic resources is necessary forstable production of native chicken. Cryopreservation of primordial germ cells（PGCs）,
progenitor cells of sperm and ova, has been developed as technology for long-term
conservation of poultry genetic resources. Efficient method for cryopreservation of poultry
genetic resources has been developed in my previous study using gonadal PGCs（gPGC）,
which present in embryonic gonad by cryopreservation of embryonic gonad. In the present
study, to evaluate physiological function of gPGCs cryopreserved using this method,
gametogenesis of gPGCs recovered from frozen-thaw gonad were investigated. Embryonic
gonads were removed from 7-day-old tdTomato induced chick embryo, then placed incryotube containing cryoprotectant including 10％ dimethyl sulfoxide（DMSO）and serum andcryopreserved by slow freezing and stored for more than a month in liquid N２．Recovered 200
gPGCs from frozen-thaw gonads were injected in blood vessel of 2.5-day-old recipient
embryos. Recipient embryos were hatched and raised to sexual maturity and progeny testing
was conducted by mating with White Leghorn of the opposite sex. Embryos induced tdTomato
gene were obtained from two male recipients. This result suggested that gPGCs recoveredfrom frozen-thaw gonad maintain functional ability of gametogenesis. Furthermore, to elucidate
more efficiency condition of cryopreservation of embryonic gonad, effect of cryomedia, adhesion
with mesonephros and osmotic pressure in survivability and migration into recipient gonad ofgPGCs were examined in each developmental stage. In 5-day-old embryos, no effects ofadhesion of mesonephroi with gonad and addition of trehalose in cryomedia were not observed
on viability and migratory ability into recipient gonad of gPGCs. In 9-day-old embryos, thenumber of recovered gPGCs from frozen-thaw gonad tended to increase with increasing
osmotic pressure and osmotic time, but viability of gPGCs were significantly decreased.
Further, migratory ability of gPGCs also negatively correlated with osmotic pressure andosmotic time. These results suggests that it is the most effective conditions forcryopreservation of 9-day-old embryonic gonad are immediately cryopreserved withphysiological osmotic pressure. In the present study, therefore, a new effective method ofconservation of poultry genetic resources using gPGCs maintaining differentiative ability intofunctional gamete were developed by directly cryopreservation of embryonic gonads．

© The Ito Foundation

160
１．目

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

gPGCの生理的機能の証明が不十分であることが的課題であった。そこで本研究では，新規保存法を安定的な地鶏生産のためには，種鶏となる家禽用いて凍結したニワトリ７日胚生殖巣から分離しを安定的に維持・供給する必要がある。しかし，たgPGCの生理的機能，および凍結保存する胚の現在の飼育による維持は，鳥インフルエンザ等の発生段階に適した凍結保存条件を明らかにするこ

感染症や災害等により，一度に多数の種鶏を失うとで，本法における家禽遺伝資源保存技術への有リスクがある。そのため，地鶏生産の種鶏となる

効性を評価した。

品種や系統における遺伝資源の早急な保存がきわめて重要視されている。家禽における遺伝資源の保 存 で は ，卵 や 精 子 の 源 で あ る 始 原 生 殖 細 胞（PGC）を用いた独自の方法が開発されている。

２．方法

2 . 1 凍結生殖巣から分離したgPGCの配偶子形成能の解析

ニワトリでは，2.5日胚の血液中に存在するPGC

本研究における動物実験は所属機関の動物実験（cPGC）を分離して凍結保存し，融解したcPGC

実施規程，畜産研究部門動物実験等実施要領に則を宿主胚に移植して作製した雌雄のキメラニワト

り，部門動物実験委員会の承認を得て実施した。

リを交配することで個体の再生が可能である１）。

赤色蛍光を示すtdTomato導入ニワトリの受精

しかし，cPGCの分離には特殊な器具，高価な試

卵を孵卵し，孵卵後７日目の胚を供試した。雌雄

薬や機械の導入が必須であり，それらの技術習得のtdTomato導入胚の生殖巣を50μｌのCa２＋ およには時間を要する。さらに，cPGCを使用する場

びMg２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）

合，回収できる胚の発生時期は孵卵2.5日目の数で２回洗浄し，４℃に冷却した200μｌの凍結保時間程度であり，一つの胚から採取可能なcPGC

護液（CELLBANKER 1 plus（ゼノジェンファー

の数は10～200個程度と少ない。これらの問題をマ（株））に浸漬し，－１℃／分の速度で－80℃解決するため，生殖巣で増殖したPGC（gPGC）

まで冷却後，－196℃の液体窒素内で１か月以上の利用に着目した。gPGCは一つの胚から確実に保存した。融解時には，凍結チューブを37℃で急多数のPGCの採取が可能であり，採取可能な胚発速融解し，生殖巣をただちに50μｌのPBSで２回

生期間も数日以上である。さらに，gPGCはcPGC

洗浄し，200μｌのPBS内で37℃，２時間インキュと同様に凍結保存が可能なためベーションした。20μｌのウシ胎児血清（FBS），保存する遺２，３）

伝資源の試料としての利点が多い。そこで，前年を添加し，得られた懸濁液中のgPGC

度の本助成による課題ではgPGCを用いた特別な野生型の白色レグホーン（WL）2.5日胚の背側大機器や技術を必要としない効率的かつ簡便な家禽

動脈に移植した。移植後，孵化・育成し，性成熟

遺伝資源の保存法の開発に取り組んだ。具体的にに至った後にWLと交配することで後代検定をは，従来の「細胞を分離した後に凍結保存する」

行った。得られた受精卵を５～８日間孵卵し，胚という手順を省くため，胚から採取した生殖巣をにおける赤色蛍光標識の検出により移植された凍直接凍結保存し，融解後のgPGCの分離効率を評

結gPGCの配偶子形成能の有無を判定した。

価することで新たな保存法の有効性を示した。しかし，前年度では７日胚以外では保存効率が著し
く 低 い こ と ，融 解 後 の 生 殖 巣 か ら 分 離 さ れ た

200個を

2 . 2 胚の発生段階に適した生殖巣凍結条件の改良
赤色蛍光を示すtdTomato導入ニワトリの受精© The Ito Foundation

161

生殖巣始原生殖細胞を用いた新規家禽遺伝資源保存法の開発（Ⅱ）

卵を孵卵し，孵卵後５日および９日の胚を供試し

レハロース，10％FBS，５％DMSO添加DMEM

た。tdTomato陽性を示す雌雄の胚から左側生殖（以 下 ，TRE ５），③ ３ ％ ト レ ハ ロ ー ス ，10 ％巣を採取し，2.1と同様の手順で凍結保存した。

FBS ，10 ％ DMSO 添 加 DMEM（以 下 ，TRE10）

詳細な凍結保護液および凍結保護条件は下記2.2.1の計３種類を使用し，それぞれの凍結保護効果を

および2.2.2に記した。

検証した。

融解時には，凍結チューブを37℃のウォーター2.2.2

９日胚生殖巣の凍結保存条件の検討

バス内に入れて急速融解し，ただちに50μｌの凍結保護液は，①260mOsm/l（以下，Ｌ），②

PBSで２回洗浄し，100～200μｌのPBSに浸漬し330mOsm/l（以下，Ctrl），③400mOsm/l（以下，て，37℃，２時間インキュベーションした。得らＭ），④560mOsm/l（以下，Ｈ）の４種の浸透圧れた細胞懸濁液10μｌのトリパンブルー染色を行に調整したDMEMに10％FBSおよび10％DMSO

い，分離された生存gPGC数，死gPGC数，体細を添加し，凍結保存に供した。生殖巣の凍結保護

胞数をそれぞれ測定した。総gPGC数に対する生液への浸漬後，冷却前に０，15および30分間，４℃

存gPGC数の百分率を生存率，分離した総細胞数下に静置した後に上法により凍結保存した。これ

に対するgPGC数の百分率を純度として算出した。

らの凍結保護液の浸透圧および浸透時間による凍

次に，分離したgPGCの宿主胚生殖巣への移住

結保護効果を検証した。

能を解析するため，分離したgPGC 50個をWL2.5

３．結果と考察

日胚の血管内に移植した。移植５日後，WLの生殖巣に存在するtdTomato陽性gPGC数を測定し

3 . 1 凍結生殖巣から分離したgPGCの配偶子た。

形成能の解析

2.2.1

５日胚生殖巣の凍結保存条件の検討

凍結生殖巣から取り出したgPGCを移植した６

前年度において，５日胚では生殖巣組織の著し羽（雄３羽，雌３羽）の宿主が性成熟に至った。

い損傷が認められたことから，生殖巣を保存する

WLとの交配を行った結果，２羽の雄の宿主に由際，中腎と生殖巣が接着した状態および中腎から来する受精卵から得られた胚の中にtdTomato陽

完全に分離した状態の２通りの方法で凍結保護効

性胚が確認された（Table１）。このことから，本果を検証した。また，凍結保護液には，①10％ウ法を用いることで機能的配偶子形成能を保持した

シ胎児血清（FBS），10％DMSO添加イーグル最

gPGCを凍結保存できることが明らかになった。

小必須培地（DMEM）（以下，Ctrl），②３％ト

gPGCを分離した後に凍結保存する従来法におけTable 1 Progeny testing of recipient after transferring 200 gPGCs recovered from cryopreserved gonad of 7-day-old
tdTomato embryo into White Leghorn
ID

Recipient sex

Incubated eggs

Fertilized egg

Detectable

tdTomato-positive

M1

male

123

101

92

1

M2

male

118

107

104

2

M3

male

127

97

97

0

F1

female

76

69

58

0

F2

female

66

64

64

0

F3

female

44

38

37

0

© The Ito Foundation

162

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）
120
Number of tdTomato+ gPGCs

Number of gPGCs

5000
4000
3000
2000

a

1000

ab

b

0

Ctrl
Mesonephroi +

TRE5

100
80
60
ab

40
20
0

TRE10
Mesonephroi －

a
ab

b
Ctrl
Mesonephroi +Fig. 1 Number of survival gPGCs recovered from frozen-

thaw gonads of 5-day-old chick embryo.（means±95％ CI）.

Notations；Ctrl：control, TRE5：3％ trehalose and 5％ dimethyl
sulfoxide（DMSO）, TRE10：3％ trehalose and 10％ DMSO
ab：number of gPGCs with different letters are significantly
different at p<0.05 among cryoprotectant．

TRE5

ab
ab
TRE10
Mesonephroi －Fig. 2 The number of tdTomato-positive gPGCs in the

gonad of recipient embryos at 5 days after transfer（means±95％ CI）．

Notations；Ctrl：control, TRE5：3％ trehalose and 5％ dimethyl
sulfoxide（DMSO）,TRE10：3％ trehalose and 10％ DMSO
ab：number of tdTomato positive gPGCs with different letters
are significantly different at p<0.05 among cryopreservation
condition．

る，得られた後代におけるドナー由来後代の比率

TRE５中腎ありの場合に最も高かったが，Ctrl中は１～２％であり３），本法を用いた場合のドナー

腎なしおよびTRE10中腎なしと同等であり，そ由来後代の比率と同等であった。先行研究におけれぞれの条件の間に有意差は認められなかった

る凍結保存をしていない場合のドナー由来後代の（Fig.２）。また，中腎の有無と凍結保護液の間に比率は約７～60％であることから ，凍結保存操

交互作用は認められなかった。以上より，５日胚

作自体がgPGCの生理的機能性に影響している可の生殖巣の凍結保護液はCtrlが最も効率的である能性が考えられる。今後は，凍結保存法の改善やと考えられる。凍結時に生殖巣と中腎が接着して融解後に分離されたgPGCの回復培養等の検討がいる場合，凍結保存までの操作の大幅な時間短縮必要である。

が可能であり，融解後に凍結チューブから生殖巣

３）3 . 2 胚の発生段階に適した生殖巣凍結条件の

gPGCの分離には生殖巣の中腎からの分離操作が

改良
3.2.1

を回収する際にも操作性が高かった。しかし，５日胚生殖巣の凍結保存条件の検討

凍結時の生殖巣の中腎との接着の有無は，分離必須であるため，最終的にgPGCを分離するまでに要する時間は同等であると考えられる。

された総gPGC数，生存gPGC数，生存率および

3.2.2

純度それぞれにおいて有意な差異は認められな雌における生存率および生存gPGC数は，Ctrl

かった。生殖巣から分離された生存gPGC数につでは15～30％程度および1.2×10４個以上であった

いて，Ctrlが最も多く，Ctrlに対しTRE５では有のに対し，Ｌ，ＭおよびＨでは10％程度以下およ

意に少なかった（ｐ＜0.05，Fig.１）。また，純度び1.0×10 ３～1.0×10 ４ 個以下となり，浸透圧がについてもCtrlで有意に高くなった（ｐ＜0.05）。

gPGCの生存性に影響することが示唆された。純これらより，生存gPGCを効率的に分離するため

度は，Ctrl，Ｌでは浸透時間の経過に伴う有意差には，Ctrlの凍結保護溶液が最も適していることは認められなかったが，Ｍの場合は浸透時間30分が示唆された。一方，分離したgPGCを宿主胚にの際に有意に低くなり，反対にＨでは時間ととも移植した場合における生殖巣への移住能は，に上昇した（ｐ＜0.05）。浸透時間を長くするこ© The Ito Foundation

９日胚生殖巣の凍結保存条件の検討

163

生殖巣始原生殖細胞を用いた新規家禽遺伝資源保存法の開発（Ⅱ）

Number of survival gPGCs

60000
50000
40000

a

30000
ab

20000

b

10000
0

L

Ctrl

M

H

L

Ctrl

Female

M

H

Male
0min

15min

30min

Fig. 3 Number of survival gPGCs recovered from frozen-thaw gonads of 9-day-old chickembryo.（means±95％ CI）.

Notations；L：260mOsm/l, Ctrl：control（330mOsm/l）,M：400mOsm/l, H：560mOsm/l
０min, 15min, 30min ; Penetration time before cryopreservation.
ab：number of gPGCs with different letters are significantly different at p<0.05 among same
cryoprotectant．

Number of tdTomato+ gPGCs

100

80

60

40

20

0

L

Ctrl

M

H

L

Female

Ctrl

M

H

Male
0min

15min

30min

Fig. 4 The number of tdTomato-positive gPGCs in the gonad of recipient embryos at

9 days after transfer（means±95％ CI）．

Notations；L：260mOsm/l, Ctrl：control（330mOsm/l）,M：400mOsm/l, H：560mOsm/l
０min, 15min, 30min ; Penetration time before cryopreservation.

とで分離可能なgPGC数は増加する一方，移植後適していると考えられる。

の移住能が著しく低下することが示された（Fig.

雄において，生存gPGC数は，浸透圧の上昇お３および４）。これらのことから，雌においては，

よび浸透時間に伴い増加する傾向が認められた

生理的浸透圧であるCtrlに短時間浸透する条件が（Fig.３）。生存率については，Ctrl，Ｌでは浸透© The Ito Foundation

164

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

時間の経過に伴う有意差は認められなかったが，殖巣を10％ジメチルスルホキシド（DMSO）おＭでは浸透時間の経過とともに上昇し，反対にＨ

よび血清を添加した凍結保護液内で緩慢凍結法をの場合は浸透時間の経過とともに低くなった（ｐ用いて凍結保存した。融解した生殖巣から分離し＜0.05）。しかし，宿主胚に移植した場合の生殖たgPGCを宿主胚の血管内に移植し，孵化，育成

巣への移住能は，浸透時間および浸透圧に負の相し，性成熟に至った宿主を野生型のニワトリと交関を示した（Fig.４）。これらのことから，雄で配した。その結果，２羽の雄宿主に由来する胚かは260～400mOsm/lの浸透圧の凍結保護液でただらtdTomatoが検出され，移植されたgPGCが機能

ちに凍結保存する条件が最も適していることが示的な配偶子形成能を維持していることが示され唆され，雌雄では異なる傾向が認められた。

た。次に，５および９日胚における最適な凍結保本研究では，雌雄の５および９日胚いずれにお存条件を明らかにするため，５日胚では中腎とのいても，前年度の凍結保護液を用いた移住能より接着の有無および凍結保護液，９日胚では浸透圧約1.9倍および約3.5倍の高い効率で，生理的機能

および冷却前の浸透時間による保存時の細胞の生性を維持したgPGCの保存が可能であることが示

存性および宿主胚に移植後の生殖巣への移住能へされた。以上より，本研究では５および９日胚その効果をそれぞれ検討した。その結果，５日胚でれぞれにおける生殖巣の凍結保存条件の改良に成は中腎の接着およびトレハロース添加による功した。しかし，従来のgPGCを生殖巣から分離

gPGCの生存性および移住能への影響は認められした後に凍結する方法に対し，５日胚の場合，融なかった。また，９日胚では浸透圧の上昇および解後のgPGCの移住能は低かった。したがって，

浸透時間の増加に伴い，分離可能なgPGCは増加

融解後の凍結による細胞のダメージを回復するたする傾向が認められたが，生存性が著しく低下

めの回復培養や培養によるgPGCの増殖の検討がし，移住能についても，浸透圧および浸透時間に今後，必要であると考える。

負の相関を示した。これらより，９日胚では生理４．要的浸透圧の凍結保護液でただちに凍結保存を行う

約

条件が最も適していることが明らかになった。以安定的な地鶏生産のためには，家禽遺伝資源を上より，本研究で機能的配偶子への分化能を維持

長期保存する技術が必要である。家禽遺伝資源のしたgPGCによる効率的な家禽遺伝資源の新規保長期保存法として，精子や卵の源である始原生殖存法が開発された。

細胞（PGC）の凍結保存技術が開発されている。
そこで，前年度に生殖巣に存在するPGC（gPGC）の簡便かつ短時間で効率的な家禽の遺伝資源保存法を開発した。本研究では，本法により保存した
gPGCの生理的機能性を評価するため，凍結生殖巣から分離したgPGCの配偶子形成能と，より効率的な凍結保存条件を明らかにすることを目的と文献１）
 Naito, M., Tajima, A., Tagami, T., Yasuda, Y.,
Kuwana, T.：Journal of Reproduction and Fertility，
102，321～325，1994．
２）
 Tajima, A., Naito, M., Yasuda, Y., Kuwana, T.：
Journal of Experimental Zoology，280，265～267，
1998．
 Nakajima, Y., Asano, A., Tajima, T.：British
３）
Poultry Science，63，46～53，2022．

した。まず，tdTomato導入ニワトリ７日胚の生© The Ito Foundation

165

ホルスタイン種牛の妊娠期における卵巣予備能維持機構
The mechanism for keeping the ovarian reserve level during the
pregnancy period in Holstein cows

古

山

敬

祐１・窪

友

瑛２

（１大阪公立大学大学院獣医学研究科，２北海道立総合研究機構酪農試験場）

Keisuke Koyama１ and Tomoaki Kubo２（１Graduate school of veterinary science, Osaka Metropolitan University，
２Dairy research center, Hokkaido research organization）

Cows with high ovarian reserve have high fertility. Using the number of antral follicles as
an index for ovarian reserve, a similar value is observed following one parity. During
pregnancy of nine months, follicular growth and regression occur repeatedly. It is speculated
that a mechanism exists to maintain ovarian reserve during pregnancy. However, thismechanism remains unclear. Anti-Müllerian hormone（AMH）functions by suppressing themobilization of primordial follicles. During pregnancy, blood AMH concentrations ofprimiparous Holstein cows increase during pregnancy, suggesting a potential role of high bloodconcentrations of AMH in maintaining ovarian reserve during pregnancy. In this study, we
analyzed the changes in the blood concentration of AMH during the pregnancy period ofHolstein cows, as well as the effect of nutritional status and heat stress on AMH concentrations,in order to clarify the mechanisms involved in maintaining ovarian reserve during pregnancy.
The results demonstrate that the concentration of AMH in the blood of primiparous cows washigher at the fifth and seventh months of pregnancy than before pregnancy. In contrast, in
multiparous cows, the concentration was lower in the second and third months of pregnancy
than before pregnancy. Furthermore, a positive correlation was observed between the rate ofchange in the blood concentration of AMH from before pregnancy to the ninth months ofpregnancy and the rate of change from before pregnancy to the fifth and seventh months ofpregnancy in primiparous cows. These findings suggest that the blood dynamics of AMH
during pregnancy differ between primiparous and multiparous cows. In addition, it wassuggested that the blood concentration of AMH may be involved in the mechanism of
maintaining ovarian reserve during the pregnancy period in primiparous cows．

１．目

いる。卵巣予備能の指標となる直径３mm以上の的卵胞数（AFC）の多いウシの受胎性は高い１）。こ

卵巣内に存在する正常卵胞の総数は卵巣予備能のAFCは，同一個体であれば，産次を１つ重ねと呼ばれ，卵巣機能の評価指標として活用されてても同様の数値を示す２）。一方，産次を１つ重ね© The Ito Foundation

166

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

るとAFCの低下する個体が一定数いる３）。しか

年７月に分娩を迎えたホルスタイン種泌乳牛17おし，この産次経過に伴うAFCの変化，すなわちよび28頭（産次2.6±1.6および2.5±1.2，平均±標

卵巣予備能の変化がどのような因子の影響を受け準偏差）をそれぞれ供試した。

るのかは不明である。また，産次を１つ重ねるた本研究における動物実験は大阪公立大学動物実

めには，卵胞が発育と退行を繰り返す９か月間と験委員会の審査承認を得て実施した（動物実験いう妊娠期間を経る必要があり ，妊娠間中に卵

22-141号）。

４）

巣予備能を維持する機構があると推察される。し2 . 2 血液の採取，ボディコンディションスコ
ア（BCS）の記録および牛舎内温湿度の測定

かし，その機構については不明である。
抗ミューラー管ホルモン（AMH）には，原始分娩後２か月目（非妊娠期）ならびに妊娠２，卵胞からの動員を抑える働きがある 。１産次の３，
５，７および９か月目に尾静脈から採血を行

ホルスタイン種雌ウシの血中AMH濃度は，妊娠

い，BCSを記録した。採取した血液から血清を分後に増加する 。このことから，妊娠中に高く維

取 し ，－ 30 ℃ で 保 存 し た 。牛 舎 内 に 温 湿 度 計

持された血中AMH濃度が卵巣予備能維持機構と（RTR-507，ティアンドデイ，長野）を設置し，関与している可能性がある。しかし，ホルスタイ

１時間ごとに温湿度を測定した。

５）６）ン種雌ウシの妊娠期における血中AMH濃度の推2 . 3 血中AMH濃度および血液生化学値の測定移を調べた報告は一報しかなく ，その値と卵巣６）

予備能維持機構との関連性を調べた報告はない。

凍結保存した血清を融解後，市販のAMH測定

ホルスタイン種雌ウシにおいて，血中AMHと用酵素免疫測定法キット（AL-114，Ansh Labs，

遊離脂肪酸（NEFA）濃度との間には負の相関がTX，USA）を用いて，血中AMH濃度を測定した。

ある 。エネルギー不足の際に体脂肪が分解され同様に凍結保存した血清を融解後，生化学自動分生成されるNFFA

は胞状卵胞の発育を阻害する

析装置（自動分析装置3100，日立ハイテク，東京）

ことで ，卵胞からのAMH分泌を阻害すると考を用いて，３項目（NEFA，T-chol：総コレステ

えられる。一方，肉用牛においては，暑熱ストレ

ロール，BHB：β-ヒドロキシ酪酸）を測定した。

６）

７）

８）

スにより血中AMH濃度が低下する 。すなわち，

2.4

栄養状態および暑熱ストレスが妊娠期間中の血中

妊娠２，３および５か月目に7.5MHzのリニアプ

AMH濃度に影響を及ぼす可能性が考えられる。

ロ ー ブ を 装 着 し た 超 音 波 画 像 診 断 装 置（HS-本研究では，妊娠期における卵巣予備能維持機

1600V，本多電子，愛知）で卵巣を経直腸的に検構を明らかにすることを目的として，ホルスタイ

査し，胞状卵胞数として直径２mm以上の卵胞数

ン種雌ウシの妊娠期における血中AMH濃度の推を個体ごとにカウントした。

９）

胞状卵胞数の測定

移およびその値に栄養状態および暑熱ストレスが2.5

及ぼす影響の解析を行った。

実験１として，妊娠期における血中AMH濃度

２．方
2.1

実験計画

の推移を明らかにするために，血中AMH濃度を法測定した計45頭分のデータ（計212サンプル）を解析に供した。

供試動物

北海道立総合研究機構酪農試験場および大阪府

実験２として，妊娠期における胞状卵胞数およ

内民間酪農場１戸で飼養され，2021年８月～2022

び胞状卵胞数あたりの血中AMH濃度の推移を明© The Ito Foundation

ホルスタイン種牛の妊娠期における卵巣予備能維持機構

167

らかにするために，血中AMH濃度および胞状卵

目的変数とし，月数，産次（１産次もしくは２産胞数を測定した計37頭分のデータ（計91サンプ

次以上）およびそれらの交互作用を説明変数としル）を解析に供した。

た線形混合モデル（変量効果：ウシ個体）を用い実験１において，１産次のウシでは妊娠５およた。分散分析後の多重比較は，産次ごとにTukey

び７か月目での血中AMH濃度の上昇，２産次以の補正を用いて行った。目的変数の正規性を確保上のウシでは妊娠２および３か月目での血中するために，血中AMH濃度および胞状卵胞数あ

AMH濃度の低下がみられたため，実験３では，たりの血中AMH濃度はBox-Cox変換後に解析に妊娠前から妊娠９か月目までの血中AMH濃度の供した。

変化割合と１産次のウシにおける妊娠前から妊娠

妊娠前から妊娠９か月目までの血中AMH濃度

５および７か月目までもしくは２産次以上のウシの変化割合と１産次のウシにおける妊娠前から妊における妊娠前から妊娠２および３か月目までの

娠５および７か月目（妊娠５および７か月目の血

血中AMH濃度の変化割合との関連性を解析した。

中AMH濃度のうちの最大値を抽出）もしくは２

実験４として，栄養状態の指標となるBCSなら産次以上のウシにおける妊娠前から妊娠２およびびに血中NEFA，T-cholおよびBHB濃度と１産３か月目（妊娠２および３か月目の血中AMH濃次のウシにおける妊娠前から妊娠５および７か月

度うちの最低値を抽出）までの血中AMH濃度の目もしくは２産次以上のウシにおける妊娠前から変化割合との関連性を解析するために，ピアソン

妊娠２および３か月目までの血中AMH濃度の変の相関分析を行った。また，BCSならびに血中化割合との関連性を解析した。

NEFA，T-cholおよびBHB濃度と１産次のウシ

実験５として，２産次以上のウシにおける妊娠における妊娠前から妊娠５および７か月目もしく

２および３か月目での血中AMH濃度の低下と暑は２産次以上のウシにおける妊娠前から妊娠２お熱ストレスとの関連性を解析した。１時間ごとのよび３か月目までの血中AMH濃度の変化割合と温湿度から温湿度指数（THI）を計算した（温度の関連性も同様に解析した。

×1.8－（１－湿度÷100）
×（温度－14.3）＋32）10）。

２産次以上のウシにおける暑熱ストレスが妊娠

１日の平均THIを算出し，その値が72以上であっ前から妊娠２および３か月目までの血中AMH濃た日にちを暑熱日とした 。サンプリングを行っ

度の変化割合に及ぼす影響はウィルコクソンの順

た日にちが暑熱日であった個体を「暑熱ストレス位和検定により解析した。

11）あり」として定義した。また，１産次のウシで妊娠５および７か月目のサンプリング日が暑熱日で実験１の解析では，月数（ｐ＜0.01）および月あった個体は存在しなかった。
2.6

３．結果と考察

数と産次との交互作用（ｐ＜0.01）が認められ

統計解析

すべての統計解析は，Ｒソフトウェア（ver.4.2.1）

た。産次ごとの多重比較の結果はFig.１に示した。

を使用して実施した 。ｐ＜0.05を統計的に有意

１産次のウシでは，妊娠前に比べて妊娠５およびであるとした。

７か月目において血中AMH濃度は高くなった

12）

妊娠期における血中AMH濃度および胞状卵胞（ｐ＜0.05）。一方，２産次以上のウシでは，妊娠数の解析を行うために，血中AMH濃度，胞状卵

前に比べて妊娠２および３か月目において血中胞数または胞状卵胞数あたりの血中AMH濃度を

AMH濃度は低くなった（ｐ＜0.05）。１産次のウ© The Ito Foundation

168

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）ⅰ）primiparous

blood AMH concentration（pg/ml）

1500ⅱ）multiparous

a, b, c : p＜0.05

a, b : p＜0.05

a

abc
ab
1000

bc

ab

a
bc

ab

ab
b

c

b

500

0

（11） （14）（14） （8） （8） （11）（33） （25）（25）（23）（20）（20）2
beforepregnant2
beforepregnant

3

5

7

month of pregnancy

9

3

5

7

9

month of pregnancy

Fig. 1 Blood concentrations of anti-Müllerian hormone（AMH）in i）primiparous and ii）multiparous（secondor greater parity）cows before and during pregnancy. The total number of enrolled cows at each time
point is indicated in parentheses．

シにおける妊娠中の血中AMH動態は過去の報告た。１産次における妊娠中に血中AMH濃度上昇と同様であった 。本研究により１と２産次以上は，妊娠末期の血中AMH濃度に関連することがのウシでは，妊娠中の血中AMH動態が異なるこ示唆され，妊娠期間中の卵巣予備能維持機構に血とが初めて明らかとなった。

中AMH濃度が関与している可能性が示された。

６）

妊娠期間中の胞状卵胞数および胞状卵胞数あた

本研究では，研究期間に限りがあり，個体ごとにりの血中AMH濃度の推移をFig.２に示した。両おける産次間での卵巣予備能変化の指標として，者において，月数および産次の影響はみられな

妊娠前から妊娠９ヶ月目の血中AMH濃度の変化

かった。一方，胞状卵胞数あたりの血中AMH濃割合を使用せざるを得なかった。今後は，産次を度は，産次による効果のある傾向がみられた（ｐ１つ重ねる前後の非妊娠期での血中AMH濃度の＝0.09）。卵胞からのAMH分泌能が産次により異変化割合を個体ごとにおける産次間での卵巣予備なる可能性を示している。

能変化の指標として用いたうえで，妊娠中の血中

実験３の解析結果をFig.３に示した。１産次のウシにおいて，妊娠前から妊娠９か月目までの血AMH濃度の上昇との関連性を解析する必要がある。

中AMH濃度の変化割合と妊娠前から妊娠５およ

１産次のウシにおける実験４の解析結果をFig.

び７か月目までの変化割合との間の正の相関がみ４に示した。各項目と妊娠前から妊娠５および７

られた（ｒ＝0.850，ｐ＜0.01）。一方，２産次以か月目までの血中AMH濃度の変化割合との間に上のウシの解析では有意な相関はみられなかっ

有意な関連はみられなかったが，血中BHB濃度© The Ito Foundation

169

ホルスタイン種牛の妊娠期における卵巣予備能維持機構
parity : p=0.09
month : ns
interaction : ns

parity : nsmonth : ns
interaction : ns
50

100
rate of blood AMH concentration
based on AFC（pg/ml）

primiparous
multiparous

40

AFC

30

20

10

0

3
month of pregnancy

75

50

25

0

（12）
（20） （12）（20） （9）（18）
2primiparous
multiparous（12）（20） （12）（20） （9）
（18）

5

2

3
5
month of pregnancy

Fig. 2 Antral follicle count（AFC）and the rate of blood concentrations of anti-Müllerian hormone（AMH）
based on AFC in primiparous and multiparous（second or greater parity）cows during pregnancy. The
total number of enrolled cows at each time point is indicated in parentheses. The notation “ns” indicatesthat the p-value is greater than 0.1．

ⅰ）primiparous

rate of blood AMH concentration frompre-pregnancy to 9th month of pregnancy

5ⅱ）multiparous

r=0.850（p＜0.01）

r=0.036（p＝0.912）

4

3

2

1

0
0

2

4

6

rate of maximal blood AMH
concentration during the 5th and 7thmonths of pregnancy based on
pre-pregnancy blood AMH concentration

0

0.25

0.5

0.75

1

rate of minimal blood AMH concentration
during the 2nd and 3rd months ofpregnancy based on pre-pregnancy
blood AMH concentration

Fig. 3 Relationship between the rate of maximal blood concentration of anti-Müllerian hormone（AMH）
during the fifth and seventh months of pregnancy in i）primiparous cows or the rate of minimal
blood AMH concentration during the second and third months of pregnancy in ii）multiparous
cows（second or greater parity）, and the rate of blood AMH concentration from pre-pregnancy
to the ninth month of pregnancy．

© The Ito Foundation

170

令和４年度

rate of maximal blood AMH concentration during the
5th and 7th months of pregnancy based on
pre-pregnancy blood AMH concentration

6

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

r=0.146（p=0.731）

r=－0.203（p=0.630）

4
2
0
2.5
6

3

BCS

3.5

4

0

200
400
NEFA（µEq/l）

r=0.387（p=0.343）

600

r=－0.647（p=0.083）

4
2
0
50

100

150

200

250

400

500

T-chol（mg/dl）

600

700

BHB（µM）

Fig. 4 Relationship between the rate of maximal blood concentration of anti-Müllerian hormone（AMH）
during the fifth and seventh months of pregnancy based on pre-pregnancy blood AMH
concentration in primiparous cows and body condition score（BCS）or blood concentrations ofcertain biochemical indicators, including non-esterified fatty acid（NEFA）, total cholesterol（T-chol）or beta-hydroxybutyrate（BHB）,at the time of AMH detection．

との間には負の相関のある傾向がみられた（ｒ＝２および３か月目までの変化割合に影響を及ぼさ－0.647，ｐ＝0.083）。エネルギー不足により体脂なかった。

肪動員が進み，肝臓からBHBが多く産生された以上のことから，１と２産次以上のウシでは，個体では，妊娠中の血中AMH濃度の上昇がみら

妊娠中の血中AMH動態が異なることが明らかとれにくくなる可能性を示している。２産次以上のなった。また，１産次においては，妊娠期間中のウシにおける各項目と血中AMH濃度の変化割合

卵巣予備能維持機構に血中AMH濃度が関与してとの間には有意な関連はみられなかった（データいる可能性が示された。

略）。また，本研究で血中BHB濃度の測定が行われたのは分娩後218日目以降であり，測定された

４．要約

血中BHB濃度と分娩後早期の負のエネルギーバ

本研究では，妊娠期における卵巣予備能維持機

ランス（NEB）の大きさとの関連性は弱いと考構を明らかにすることを目的として，ホルスタイ

え ら れ る 。分 娩 後 早 期 の NEB が 妊 娠 中 の 血 中

ン種雌ウシの妊娠期における血中抗ミューラー管

AMH濃度に及ぼす影響については，今後検証すホルモン（AMH）濃度の推移およびその値に栄べきである。

養状態および暑熱ストレスが及ぼす影響の解析を

実験５の解析結果をFig.５に示した。２産次以行った。結果，１産次のウシでは，妊娠前に比べ上のウシにおける暑熱ストレスは妊娠前から妊娠て妊娠５および７か月目において血中AMH濃度© The Ito Foundation

rate of minimal blood AMH concentration during the
2nd and 3rd months of pregnancy based on
pre-pregnancy blood AMH concentration

ホルスタイン種牛の妊娠期における卵巣予備能維持機構

171

2.5

2

1.5

1

0.5

0
with
heat stresswithout
heat stressFig. 5 Effect of heat stress on the rate of minimal blood anti-Müllerian hormone（AMH）concentration during the second and third months of pregnancy inmultiparous cows（second or greater parity）．

は高くなり，２産次以上のウシでは，妊娠前に比べて妊娠２および３か月目において血中AMH濃度は低くなった。また，１産次のウシにおいて妊
娠前から妊娠９か月目までの血中AMH濃度の変化割合と妊娠前から妊娠５および７か月目までの変化割合との間に正の相関がみられた。この妊娠前から妊娠５および７か月目までの変化割合と血中β-ヒドロキシ酪酸濃度との間には負の相関のある傾向がみられた。以上のことから，１と２産次以上のウシでは，妊娠中の血中AMH動態が異なることが明らかとなった。また，１産次においては，妊娠期間中の卵巣予備能維持機構に血中
AMH濃度が関与している可能性が示された。
文献１） Mossa, F., Walsh, S. W., Butler, S. T., Berry, D. P.,
Carter, F., Lonergan, P., Smith, G. W., Ireland, J. J.,
Evans, A. C. O. O.：J Dairy Sci, 95, 2355～2361,
2012．
２） Burns, D. S., Jimenez-Krassel, F., Ireland, J. L. H.,
Knight, P. G., Ireland, J. J.：Biol Reprod, 73, 54～62,

2005．
３） Koyama, K., Koyama, T., Sugimoto, M.：J Reprod
Dev, 64, 535～539, 2018．
４） Ginther, O. J., Kot, K., Kulick, L. J., Martin, S.,
Wiltbank, M. C.：J Reprod Fertil, 108, 271～279,
1996．
５） Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J.
E.：Mol Reprod Dev, 71, 480～488, 2005．
６） Monniaux, D., Drouilhet, L., Rico, C., Estienne, A.,
Jarrier, P., Touzé, J.-L., Sapa, J., Phocas, F., Dupont,J., Dalbiès-Tran, R., Fabre, S.：Reprod Fertil Dev,
25, １～16, 2013．
７） Herdt, T. H.：Vet Clin North Am Food Anim
Pract, 16, 2000．
８） Ferst, J. G., Missio, D., Bertolin, K., Gasperin, B. G.,
Leivas, F. G., Bordignon, V., Gonçalves, P. B.,
Ferreira, R.：Anim Reprod Sci, 219, 106536, 2020．
９） Torres-Simental, J. F., Peña-Calderón, C.,
Avendaño-Reyes, L., Correa-Calderón, A., MacíasCruz, U., Rodríguez-Borbón, A., Leyva-Corona, J. C.,
Rivera-Acuña, F., Thomas, M. G., Luna-Nevárez,P.：Livest Sci, 250, 104590, 2021．
10） Gernand, E., König, S., Kipp, C.：J Dairy Sci, 102,
6660～6671, 2019．
11） Armstrong, D. V.：J Dairy Sci, 77, 2044～2050,
1994．
12） R Core Team.：R: A language and environment
for statistical computing. Vienna, Austria: R
Foundation for Statistical Computing；2022．

© The Ito Foundation

172

抗酸化物質を利用したウシ体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発（Ⅲ）
Improvement of bovine in vitro fertilized embryo production technology
using antioxidants and development of calf production system by new
OPU-IVF-ET method（Ⅲ）

日

巻

武

裕１，２・美濃輪駿斗２（１岐阜大学応用生物科学部，２岐阜大学自然科学技術研究科）

Takehiro Himaki１，２ and Hayato Minowa２（１Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University，
２Graduate School of Natural Science and Technology, Gifu University）

One of the factors that affecting in vitro embryo production efficiency is oxidative stress.
The purpose of this study was to investigate the effect of α-lipoic acid（ALA）treatment
during in vitro maturation culture of bovine oocytes, a strong antioxidant, on the gene
expression status of blastocyst-stage embryos derived from in vitro fertilization（IVF）.
Oocytes collected from slaughterhouse were cultured in maturation medium supplemented
with 0 or

50μM ALA for 22 h. After that, in vitro fertilized embryos were produced by ageneral method and cultured to the blastocyst stage. Then, total RNA was extracted fromblastocysts and performed reverse transcription real-time quantitative PCR analysis. As aresult, the anti-apoptosis-related genes BCL2, BIRC5, and GPX1 showed significantly higher
expression levels in the

50μM ALA-treated group compared to the control group（p < 0.05）.

On the other hand, no difference was observed in BAX, that of the gene promotes apoptosis
and SOD2, which acts as an antioxidant. Regarding genes related to developmental potential,
GLUT1 showed a significantly higher expression level in the

50μM ALA-treated groupcompared to the control group（p < 0.05）. In addition, CDX2, SOX2, and OCT4 tended to behigher in the

50μM ALA-treated group than in the control group. In conclusion, in this studyof molecular biological analysis demonstrated that treatment with

50μM ALA during in vitro

maturation indicates an antioxidant effect in bovine in vitro fertilized embryo production and iseffective in improving the developmental potential and quality of the embryos．

１．目

持している状況にある。このような多頭飼養形態的の弊害として，農家の観察が十分に行き届かず授

国内における畜産業は，高齢化に伴う畜産農家

精適期を逃してしまい，人工授精による受胎率が戸数の減少等に伴い，特にウシにおいては，各農低下していることが問題となっている。したがっ家が飼養頭数を増やすことで国産牛肉生産量を維て，これまでの和牛生産を一新する効率的な増産© The Ito Foundation

173

抗酸化物質を利用したウシ体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発（Ⅲ）

体制の確立が急務である。一方で，海外に目を向離し，人工授精用凍結―融解精液を用いてIVFをけると，欧米を中心に経腟採卵（OPU）―体外行った。媒精から６時間後に余分な精子および卵受精（IVF）―受精卵移植（ET）システムによ丘細胞を完全に剥離し，マルチガスインキュベー

る子牛生産が21世紀に入って急増している 。国ターにて38.5℃，５％CO２，
５％Ｏ２ ，90％Ｎ２ ，内においても，近年，本システムによる子牛生産

飽和湿度条件下でそれぞれ体外発生培養に供しは増加傾向を示しているものの海外ほど顕著な増た。なお，媒精２日後までは0.3％BSA添加CR1aa

加は認められていない。その要因には，人工授精で培養し，以降は，10％FBS添加CR1aaで培養しに比べて費用が高いことやIVF卵移植による受胎た。各処理区において，媒精から７日後に得られ率が低いこと，過大子が生まれやすく難産によるた胚盤胞期胚を遺伝子発現解析に用いた。

１）

母体への影響を危惧することなどがあげられる。

2 . 2 ALA処理が胚盤胞期胚における各種遺伝

これらの問題を解決するためには，体内発生能が子の発現状況に及ぼす影響の評価

良好な高品質な受精卵を効率的に生産する技術の

胚盤胞期胚からの総RNA抽出はダイレクト開発が重要である。そこで著者らは，これまでに，法 で行った。各処理区10個の胚盤胞期胚を１群IVF卵生産において問題視されている酸化ストレとし，RNase Inhibitorならびにジチオスレイトースに着目し，強力な新規抗酸化物質であるα-リ

ル を 添 加 し た RNA 保 存 液 と と も に マ イ ク ロ

ポ酸（ALA）処理の有効性を明らかにした。そチューブに加えた。その後，速やかにマイクロの結果，効率的かつ高品質なIVF卵の生産法を確

チューブを液体窒素中に浸漬することで，細胞を立した 。さらに，ALA処理による受精卵の発生

急速凍結破壊し，総RNA抽出液を作製した。総能や品質改善効果を成熟卵子の細胞質成熟状況やRNA抽出液は，使用するまで－80℃バイオフリー

品質の面から解明し，ETによる正常な子牛の生

ザ ー で 凍 結 保 存 し た 。逆 転 写（RT）反 応 に は産にも初めて成功した 。

Q u a n t A c c u r a c y ® ，R T - R a m D A ® c D N A

２）

３）

４）

そこで本研究では，ALA処理が，作出したIVF

Synthesis Kit（TOYOBO）を用いた。0.2mlの８卵における発生能や品質に関わる遺伝子の発現状

連 チ ュ ー ブ に ，１ つ の チ ュ ー ブ あ た り Lysis

況に及ぼす影響について，分子生物学的側面から

Buffer詳細に解明することを目的とした。

Inhibitor

２．方

2.0μl，Lysis Enhancer

0.45μl，RNase

0.05μl，Nuclease free water

0.5μl，

総RNA抽出液2.0μlを加え（計5.0μl），TaKaRa

法

PCR Thermal Cycler DiceTM Touch （Takara

2 . 1 ALA処理によって体外成熟培養した卵子に由来するIVF卵の生産

Bio）にて熱変性反応［熱変性（75℃・90秒），冷却（４℃）］を行った。熱変性反応後，１つの食肉処理場由来卵巣から卵丘細胞―卵母細胞複チ ュ ー ブ あ た り RT-RamDA® Buffer 1.2 μl ，合体（COCs）を採取した。COCsは，10％FBS

gDNA Remover 0.45 μl ，RT-RamDA® Enzyme

添加HEPES-M199を基礎培地として，ALAを０

Mix 0.5 μl ， RT-RamDA® Primer Mix 0.5 μl ，または50μＭ添加した成熟培地微小滴中で，CO２

Nuclease free water 1.35 μl を 加 え（計 9.0 μl），

インキュベーターにて38.5℃，５％CO ２ ，95％

RT-RamDA® 反応［プライミング１（25℃・10

air，飽和湿度条件下でそれぞれ22時間培養した。

分），プライミング２（30℃・10分），逆転写およその後，豊潤化した卵丘細胞を２～３層程度に剥び増幅（37℃・30分および50℃・５分），不活化© The Ito Foundation

174

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）（98℃・５分），冷却（４℃）］を行い，cDNAを

Ct値を求め，相対的な遺伝子発現は２－ΔΔCt の計合成した。RT産物は使用するまで－20℃バイオ

算式によって算出した。なお，各遺伝子のPCR反フリーザーで凍結保存した。定量PCR反応には，応の特異性を評価するために，PCR産物は電気泳

THUNDERBIRD®

Next SYBR®

qPCR Mix

動して，各遺伝子の増幅産物長を確認した（Fig.

（TOYOBO）を 用 い た 。0.1ml の ８ 連 チ ュ ー ブ

１）。

（NIPPON Genetics）に，１つのチューブあたり

2.3

滅菌蒸留水3.0μl，各遺伝子のプライマーミック

得られたデータの統計解析は，４Stepエクセル

®

®

統計解析

ス 1.2 μl ，THUNDERBIRD Next SYBR qPCR

統計（オーエムエス出版）を用いて，スチューデ

Mix 5.0 μl ，RT 産 物 0.8 μl を 加 え（計 10 μl），

ントのｔ検定を行った。

TM

StepOnePlus リアルタイムPCRシステム（Applied
Biosystems）にて，以下の条件でPCR反応を行っ３．結果と考察た。すなわち，Pre-incubation（95℃・２分）の後，本研究では，体外成熟培養過程における50μＭ

熱変性（95℃・10秒），アニーリング（55℃・15のALA処理がIVFに由来する胚盤胞期胚の遺伝秒），伸長反応（72℃・30秒）の条件で40サイク子発現状況に及ぼす影響を評価した。その結果，ル行った。評価対象として検討した遺伝子のオリ

ア ポ ト ー シ ス 抑 制 遺 伝 子 で あ る BCL2 お よ び

ゴヌクレオチドプライマーの配列はTable１に示

BIRC5，抗酸化関連遺伝子であるGPX1，発生TMした。PCR終了後，データの解析はStepOne

能促進遺伝子であるGLUT1において対照区と比Software（Applied Biosystems, Ver. 2.3）を用い較して有意（p＜0.05）に高い発現量が示された。

てΔΔCt法で行った。ハウスキーピング遺伝子

また，細胞分化関連遺伝子であるCDX2，SOX2であるβ-actinで正規化することでΔCt値，ΔΔ

およびOCT4においても有意な差はみられなかっ

Table 1 Sequence of the primers for gene expression analysis by real-time RT PCR.
Gene

Primer sequence（5ʼ-3ʼ）Product size（bp）

Accession No.

BAX

Forward：TCTGACGGCAACTTCAACTG
Reverse：TCGAAGGAAGTCCAATGTCC
Forward：GTCAACCGGGAGATGTCG
Reverse：GACAGCCAGGAGAAATCAAACA
Forward：CCTGGCAGCTCTACCTCAAG
Reverse：GAAAGCACAACCGGATGAAT
Forward：GGACTACACCCAGATGAATGAC
Reverse：TACTTCAGGCAATTCAGGATCTC
Forward：GACGCTTACAGATTGCTGCTTGT

135

NM_173894

163

NM_001166486.1

233

AY606044

132

NM_174076.3

127

NM_201527.2

140

NM_001206299

113

NM_001105463

145

NM_174580

258

M60448.1

178

NM_173979.3

BCL2
BIRC5
GPX1
SOD2
CDX2
SOX2
OCT4
GLUT1
β-actin

Reverse：TCGGGCCTGACATTTTTATACTG
Forward：GCCACCATGTACGTGAGCTAC
Reverse：ACATGGTATCCGCCGTAGTC
Forward：ATGATGGAGACGGAGCTGAA
Reverse：GGGCTGTTCTTCTGGTTGC
Forward：AGGTGTTCAGCCAAACGACTAT
Reverse：GTCTCTGCCTTGCATATCTCCT
Forward：CAGGAGATGAAGGAGGAGAGC
Reverse：CACAAAATAGCGACACGACAGT
Forward：CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT
Reverse：GGGCAGTGATCTCTTTCTGC© The Ito Foundation

抗酸化物質を利用したウシ体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発（Ⅲ）

M

BAX

BCL2

BIRC5

GPX1

OCT4

SOX2

SOD2

GLUT1

CDX2

175

β-actin

200 bp100 bpFig. 1 Electrophoretic images of PCR products of various genes. M indicates a

100 bp DNA marker．

6

a

0 µM

5

50 µM

a

4
3
2

b

1

a

a
b

b

BIRC5

GPX1

b

0
BAX

BCL2

SOD2

CDX2

SOX2

OCT4

GLUT1

Fig. 2 Effect of α-lipoic acid treatment during in vitro maturation on the expression ofvarious genes in blastocysts．
Data are mean±SEM values．
a-b Different superscripts indicate a significant difference（p＜0.05）．

たが，50μM ALA処理区において増加する傾向として作用するメラトニンを添加した先行研究でがみられた（Fig. ２）。

は，BAXに有意な差はみられなかったものの，通常，抗アポトーシスタンパク質として作用す

BCL2において有意な発現量の増加が認められ，るBCL2やBCL-XLなどは，アポトーシスを促進

胚盤胞形成率の有意な改善が報告されている７）。

させるBAXやBAKに結合することによって活性

そして，本研究結果は，遺伝子発現状況や胚盤胞を阻害し，アポトーシスを抑制する５）。一方で，形成率において有意な改善が認められた先行研究

アポトーシス阻害タンパク質の一種であるBIRC5の結果７）と一致した。したがって，酸化ストレス

は，BCL2やBCL-XLとは作用機序が異なり，カの要因となる活性酸素種（ROS）の分解が促進

スパーゼを認識して結合することで，カスパーゼ

され，アポトーシスの発生を抑制したことが考えの活性を阻害し６），アポトーシスを引き起こすカ

られ，ALA処理においても同様の抗酸化作用がスパーゼカスケードを抑制する。同じく抗酸化剤

機能した可能性が示唆された。一方で，GPX1と© The Ito Foundation

176

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

SOD2に関しては，どちらもROSを分解する酵素

おり，その下方制御は，受精卵における細胞数のの発現に関与し，酸化ストレスの軽減に関連して減少をもたらすことを示している13）。したがって，

いる８）。本研究では，GPX1においてのみ有意な本研究においてGLUT1の発現量の有意な増加増加が認められた。したがって，成熟培養過程では，50μＭのALA処理によって，胚盤胞形成率

生じたROSの分解に寄与し，さらには，発生培養が有意に増加した結果２）と一致し，胚盤胞期胚の過程で生じた酸化ストレスについても軽減した可

総細胞数の増加に寄与したことが明らかとなった。

能 性 が 高 い 。我 々 は ，成 熟 培 養 過 程 に お け る

ウシ受精卵において，内部細胞塊（ICM）に分

ALA処理が，胚盤胞期胚における総細胞数の増化するためにはSOX2やNANOGといった細胞分加に影響を及ぼすことやアポトーシス細胞割合が化関連遺伝子が関与しており，栄養外胚葉（TE）

減少傾向を示すことを明らかにしている 。したへの分化にはCDX2が関与している 14）。また，

がって，アポトーシス抑制遺伝子であるBCL2，

OCT4に関しては，ウシIVF卵ではICMとTEの

BIRC5ならびにGPX1の発現量が有意な増加をどちらからも発現する細胞分化関連遺伝子であ示したことは，これまでの定性的な蛍光観察結果

る14）。したがって，50μＭのALA処理によって，と一致する結果となった。一方で，これまでに胚これらの遺伝子の発現量が増加傾向を示したこと

盤胞期胚におけるSOD2の発現量は，ミトコンド

は，ICMとTEの両細胞数の増加に寄与した可能

リア活性と相関があり ，受精卵の品質とも関連性を示している。加えて，体内受精卵はIVF卵と性があることが示されている。そして，我々は，比較して，SOX2とOCT4の発現量が多いことがこれまでに50μＭのALA処理によって，ミトコ

報告されている15，16），特に，ウシでは，形態的にンドリア活性が有意に増加することを明らかにし品質の良い胚盤胞は品質の悪い胚盤胞と比較してた 。しかし，本研究では，SOD2の発現量とミGPX1やBCL2，SOX2などの発現量が高いこと

トコンドリア活性に明確な相関はみられなかっが示されており10，17），本研究結果より，50μＭのた。その理由は明らかではないが，今後，改めてALA処理によって得られた胚盤胞の品質が向上

検討すべき課題であると考える。

していることが示された。さらに，SOX2および

２）

９）

10）

３）

哺乳動物細胞では，原形質膜を通過するグル

OCT4の発現量が増加傾向を示したことから，培コース輸送は２通り存在し，そのうちの一つが促

養環境がより改善され，体内受精卵により近い品

進的グルコース輸送を介した受動的なエネルギー

質のIVF卵を作出できたと考えられる。

非 依 存 性 輸 送 で あ る 。哺 乳 動 物 の 胚 で は ，GLUT1遺伝子は最も広範囲に分布するGLUTア

４．要約

イソフォームであり，胚の収縮後は，主要なエネ

本研究では，強力な抗酸化物質であるα-リポ

ルギー基質となり，GLUT1～３などの促進的グ酸（ALA）処理によるウシ体外受精（IVF）卵

ルコース輸送体を介して取り込みが調節される。

生産技術の高度化を目的として，IVFに由来する

特に，受精卵における細胞内グルコースの取り込

胚盤胞期胚の品質改善効果を分子生物学的に解析

みはGLUT1によって媒介され，その発現は着床した。

前の全期間にわたって確認されている。また，その結果，体外成熟培養過程における50μＭのPantaleonらは，初期胚発生に重要な調節因子とALA処理によって，胚盤胞期胚における抗アポ

してのグルコース輸送体の重要性を明らかにしてトーシス関連遺伝子であるBCL2，BIRC5および

11，12）© The Ito Foundation

抗酸化物質を利用したウシ体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発（Ⅲ）

GPX1遺伝子の発現量が有意に増加した。一方
で，アポトーシス促進遺伝子であるBAXや抗酸化ストレス作用を有するSOD2遺伝子に差はみられ な か っ た 。ま た ，発 生 能 関 連 遺 伝 子 で あ る
GLUT1は，50μＭのALA処理によって有意に増加し，CDX2，SOX2およびOCT4遺伝子においても，差はみられなかったものの対照区と比較して増加する傾向を示した。
結論として，本研究は，ALA処理によるウシ
IVF卵生産効率および品質の改善効果を分子生物学的に解明でき，ウシIVF卵生産技術の高度化に向けて新たな知見を提供する。本研究で得られた新知見は，抗酸化剤としてのALAを用いたウシ
IVF卵生産研究の基盤となり，畜産現場における効率的かつ発展的な産子生産システムの確立に大いに貢献することが期待される。
文
献１） IETS Data Retrieval Committee Reports.：
Embryo Technology Newsletter，39，n. 4，2021．
２） 日巻武裕，草薙志穂，多治見弘史：公益財団法人
伊藤記念財団 令和２年度食肉に関する助成研究調
査成果報告書，39，167～173，2021．
３） 日巻武裕，中川裕喜，多治見弘史：公益財団法人
伊藤記念財団 令和３年度食肉に関する助成研究調
査成果報告書，40，217～223，2022．
４） Klebe, R. J., Grant, G. M., Grant, A. M., Garcia, M. A.,
Giambernardi, T. A., Taylor, G. P.：Biotechniques,177

21，1094～1100，1996．
５） Peña-Blanco, A., García-Sáez, A. J.：FEBS J，
285，416～431，2018．
６） Kawamura, K., Sato, N., Fukuda, J., Kodama, H.,
Kumagi, J., Tanikawa, H., Shimizu, Y., Tanaka, T.：
Dev Biol，156，331～341，2003．
７） Pang, Y., Zhao, S., Sun, Y., Jiang, X., Hao, H., Du,
W., Zhu, H.：Anim Sci J，89，648～660，2018．
８） Guérin, P., El Mouatassim, S., Ménézo, Y.：HumReprod Update，７，175～189，2001．
９） Rizos, D., Lonergan, P., Boland, M. P., ArroyoGarcía, R., Pintado, B., de la Fuente, J., GutiérrezAdán, A.：Biol Reprod，66，589～595，2002．
10） Cebrian-Serrano, A., Salvador, I., García-Roselló,
E., Pericuesta, E., Pérez-Cerezales, S., GutierrezAdán, A., Coy, P., Silvestre, M. A.：Reprod Domest
Anim，48，331～338，2013．
11） L e q u a r r e , A . S . , G r i s a r t , B . , M o r e a u , B . ,Schuurbiers, N., Massip, A., Dessy, F.：Mol Reprod
Dev，48，216～226，1997．
12） Bertolini, M., Beam, S. W., Shim, H., Bertolini, L. R.,
Moyer, A. L., Famula, T. R., Anderson, G. B.：Mol
Reprod Dev，63，318～328，2002．
13） Pantaleon, M., Ryan, J. P., Gil, M., Kaye, P. L.：
Biol Reprod，64，1247～1254，2001．
14） Ozawa, M., Sakatani, M., Yao, J., Shanker, S., Yu,
F., Yamashita, R., Wakabayashi, S., Nakai, K., Dobbs,
K. B., Sudano, M. J., Farmerie, W. G., Hansen, P. J.：
BMC Dev Biol，12，33，2012．
15） Magnani, L., Cabot, R. A.：Mol Reprod Dev，75，
1726～1735，2008．
16） Purpera, M. N., Giraldo, A. M., Ballard, C. B.,
Hylan, D., Godke, R. A., Bondioli, K. R.：Mol Reprod
Dev，76，783～793，2009．
17） Velásquez, A. E., Veraguas, D., Cabezas, J.,
Manríquez, J., Castro, F. O., Rodríguez-Alvarez, L.
L.：Zygote，27，398～404，2019．

© The Ito Foundation

178

ウシ初期黄体におけるPG抵抗性の解明―低酸素環境による抗アポトーシス機構―（Ⅲ）
The mechanisms of PG-resistance in bovine early corpus luteum－hypoxia-induced anti-apoptotic mechanism－（Ⅲ）

西

村

亮・菱

沼

貢

（鳥取大学農学部共同獣医学科獣医繁殖学）

Ryo Nishimura and Mitsugu Hishinuma（Laboratory of Theriogenology, Joint Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Tottori University）

In cattle, prostaglandin F2α（PG）is one of the most important drugs for estrous
synchronization, because injection of PG induces luteal regression. However, the early-stage
corpus luteum（CL）during almost five days after ovulation does not regress by PG injection（PG resistance）. The precise mechanisms of PG resistance are still unclear. It is necessary toinvestigate the mechanisms of the formation of CL for clarify the PG resistance, because PG
resistance is limited during CL formation. The present study is conducted to examine theeffects of hypoxia on the mRNA expressions in the luteal cells isolated just after ovulation（Day0 luteal cells）by RNA-Seq analysis. The effect of the stimulation of luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor（LH/CGR）is also examined, because LH is related toluteinization. RNA-Seq analysis revealed that hypoxia induces signals for inflammation（cytokines and activation of leukocytes）, assembly and movement of cells as well as
angiogenesis in Day 0 luteal cells. The crosstalk between the signals from hypoxia and from
LH/CGR was not found in the present study. Further studies investigating the roles of thesehypoxia-induced signals in luteal formation is needed to reveal the mechanisms of PG
resistance in cattle．

１．目の活性化を介してさまざまな遺伝子発現を誘導す的ることで低酸素環境へ適応することが知られてい黄体は，哺乳動物の卵巣において排卵後の卵胞る ２）。これまで我々はウシの初期黄体においてから形成され，妊娠の成立および維持に必須であHIF1の機能することを明らかにし １，３），HIF1のるプロジェステロンを合成・分泌する一過性の内制御下にある血管新生因子VEGF１），糖輸送担体

分泌器官である。ウシ卵巣動脈の血流量は黄体退

GLUT1４）およびアポトーシスとオートファジー

行期から減少し，排卵後の黄体初期においても低の制御に関わるBNIP3５）が黄体の形成に関係する

く，初期黄体細胞は低酸素環境に曝されている１）。

ことを示してきた。しかし，排卵後黄体細胞に分低酸素環境に曝された細胞の多くは低酸素誘導性化しつつある卵胞の顆粒層細胞と卵胞内膜細胞が転 写 因 子 （Hypoxia-inducible factor 1 ； HIF1）

最も低酸素環境に晒され，細胞内で低酸素環境に© The Ito Foundation

ウシ初期黄体におけるPG抵抗性の解明―低酸素環境による抗アポトーシス機構―（Ⅲ）

179

起因するシグナルが最も活性化すると考えられるU/ml）を添加し，我々の既報と同様に１），通常

排卵直後における状況の解析は未然であった。

の培養環境（20％ Ｏ２，５％ CO２ ，75％ Ｎ２）お本研究では，ウシ初期黄体におけるPG抵抗性を解明する一環として，ウシの黄体形成における低酸素環境の関わりをより詳細に明らかにする目

よび低酸素環境（３％ Ｏ２，５％ CO２，92％ Ｎ２）
において６時間培養した。
2 . 3 total RNA の 抽 出 と RNA-seq ラ イ ブ ラ

的で，これまでに報告のない排卵直後の黄体細胞リーの作成（Day ０黄体細胞）の単離を試みた。さらに，こ2.2において６時間培養したDay ０黄体細胞にのDay ０黄体細胞を用いて，１）低酸素環境おQIAzoI Lysis Reagent（#79306，QIAGEN, Inc.）

よび，２）排卵や黄体化に関わると考えられる黄と ス テ ン レ ス 球（Ф ５ mm ； #AB68220W03 ，体形成ホルモン受容体（LH/CGR）刺激の影響にTAITEC，Inc.）を加え，ビーズ破砕機（μT-12,

ついて，相互作用も含めて網羅的に調べた。

TAITEC, Inc.）にてホモジェネート（3,200rpm,

２．方
2.1

30 sec.）した。その後，RNeasy Plus Universal kit

法（#73404，QIAGEN, Inc.）を用いてtotal RNAをウシ卵巣の採取抽出した。total RNA（100 ng）から，NEBNext

と畜場においてと畜直後のウシより排卵直後のPoly（A）mRNA Magnetic Isolation Module

初期黄体（Day ０黄体）を有する卵巣（Fig. １）（#E7490, New England BioLabs（NEB）, Inc.）

を選抜し，氷冷した生理食塩水に浸漬し，研究室と NEBNext Ultra Ⅱ RNA Library Prep kit forに運搬した。

Illumina（#E7770, NEB, Inc.）を用いてpoly（A）

2 . 2 Day ０黄体細胞の遺伝子発現に及ぼす低RNAの抽出と断片化を行った。

酸素環境およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモ

2.4

ン（hCG）の影響

デ ー タ 解 析 に は CLC Genomics Workbench

Day ０黄体を有するウシ卵巣において，卵巣動

RNA-Seq

解析（GWB）22.0.1 を 用 い ， 発 現 解 析 に は GWB の脈に組織融解液（collagenase type 1，3,300 unit/

RNA-Seq Analysis

ml，38℃，40 min.）を還流させることによって，ンス配列へのマッピングとタグカウントを行っ

Day ０黄体細胞を単離した。単離した細胞を培た。リファレンス配列ならびにゲノムアノテー

養プレートに播種して12時間培養後，hCG（1.0

ションは，GWBの機能によりEnsemblからダウン

2.6ツールを用いてリファレロードしたBos taurus（Hereford）ARS-UCDI. 2.97を用いた（http://ftp.ensembl.org/pub/release-97/
fasta/bos_taurus/dna/Bos_taurus. ARSUCD1.2.dna.primary_assembly. l.fa.gz）。
３．結果と考察本研究では，ウシ初期黄体におけるPG抵抗性

Day 0 CLを解明する一環として，ウシの黄体形成における

10 mm
Fig. 1 Bovine ovary with ovulated follicle（Day 0 corpus

luteum［CL］）

低酸素環境の関わりをより詳細に調べることとした。そのため，これまでにいずれの動物種におい© The Ito Foundation

180

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）ても報告のない排卵直後の黄体細胞の単離をウシ

り ，VEGF を 中 心 と し た 血 管 新 生 シ グ ナ ル ，の卵巣において試み，例数は少ないながら成功し

GLUT1による糖輸送，細胞死とオートファジー

た。この細胞を培養し，低酸素環境およびLH/を調節するBNIP3の関与することを示してきた。

CGRシグナルの影響についてRNA-Seqを用いて本研究の網羅解析において，既報のシグナル以外

網羅的に調べた。

に，低酸素刺激によって，炎症反応，細胞の組み

申請者らはこれまで，ウシの黄体形成において立て，走化性などのシグナルが増強されることが低酸素環境が重要な役割を果たすことを示してお示唆された（Fig. ２）。本研究では，新たに単離

Fig. 2 Hypoxia-related signal in bovine luteal cells just after ovulation© The Ito Foundation

ウシ初期黄体におけるPG抵抗性の解明―低酸素環境による抗アポトーシス機構―（Ⅲ）

181に成功したDay ０黄体細胞を用いて，新たな低およびLH/CGRシグナルの影響についてRNA-

酸素誘導性シグナルを見出した。今後，これらのSeqを用いて網羅的に調べた結果，著者らがこれシグナルと既報のシグナルについてタンパク質レ

までにウシの黄体形成に関与することを示してき

ベルで解析し，さらに，成熟した黄体細胞におけたVEGFを中心とした血管新生，GLUT1によるる反応と比較することによって，排卵直後の黄体

糖 輸 送 ，細 胞 死 と オ ー ト フ ァ ジ ー を 調 節 す る

形成機構がより明確にできると考えられる。引きBNIP3等のシグナル以外に，炎症反応，細胞の組続き，本研究で見出されたシグナルの黄体形成にみ立て，走化性などのシグナルが低酸素環境によおける役割をさらに詳細に解析し，それぞれの生り増強されることが示唆された。一方，低酸素環

理的役割を明確にすることで，初期黄体のPG抵境シグナルとLH/CGRシグナルの相互作用は認め

抗性の機構が明らかになると考えられる。

られなかった。今後，さらにDay ０黄体細胞に本研究においては，低酸素シグナルとLH/CGR

おける検討を重ね，タンパク質レベルでの解析を

シグナルの明確な相互作用は認められなかった。

進めることで，本研究で見出されたシグナルの黄引き続きDay ０黄体細胞の解析を進め，双方の体形成における生理的役割を明確にし，それらのシグナルが独立して黄体形成に寄与するか，ある

シグナルと初期黄体のPG抵抗性との関わりを解いは部分的な相互作用を発揮するかについて継続明する。

して検討する必要がある。
４．要

約

本研究では，ウシ初期黄体におけるPG抵抗性を解明する一環として，ウシの黄体形成における低酸素環境の関わりをより詳細に調べた。具体的には，これまでにいずれの動物種においても報告のない排卵直後の黄体細胞（Day ０黄体細胞）の単離をウシの卵巣において試み，例数は少ないながら成功した。この細胞を培養し，低酸素環境

文献１）
 Nishimura, R., Okuda, K.：J Reprod Dev，56，110～116，2010．
２） Wenger, R. H.：Faseb J，16，1151～1162，2002．
３） Nishimura, R., Okuda, K.：J Reprod Dev，66，307～310，2020．
４） Nishimura, R., Hasegawa, H., Yamashita, M., Ito,
N., Okamoto, Y., Takeuchi, T., Kubo, T., Iga, K.,
Kimura, K., Hishinuma, M., Okuda, K.：J Vet Med
Sci，79，1878～1883，2017．
５） Nishimura, R., Okuda, K., Gunji, Y., Khalid, A. M.,
Yamano, Y., Yamashita, Y., Hishinuma, M.：J Vet
Med Sci，80，368～374，2018．

© The Ito Foundation

182

牛黄体血流の多寡は子宮内膜機能の局所調節に関与するのか？（Ⅱ）
Is bovine blood flow involved in the local regulation of endometrial
functions？（Ⅱ）

金

澤

朋

美・木

崎

景一郎

（岩手大学農学部共同獣医学科）

Tomomi Kanazawa and Keiichiro Kizaki（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University）

Luteal vascularity is essential for progesterone（P４）biosynthesis from corpus luteum, andinfluences fertility in cattle. However, no studies have investigated the mechanism that luteal
vascularity controls fertility. The aim of this study was to clarify influences of luteal vascularity
on endometrial functions. Ultrasound examinations were performed on 8 Japanese Black cattle
to evaluated maximum diameter of corpus luteum（CL）, CL area, CL tissue area, and bloodflow area（BFA）on Day 7（Day ０＝the day of estrus）. After ultrasound examination, endometrial
biopsy samples and blood samples were collected from these cattle. We investigated the CCN1,
CCN2, and CCN3 mRNA expressions in endometrial tissue. Plasma and endometrial P４
concentrations were measured by enzyme immunoassay analysis. No differences in CL area,
CL tissue area, and plasma and endometrial P４ concentrations were observed between high
（HV；n＝４）and low vascularity（LV；n＝４）groups. BFA was greater in HV group than in
LV group. There was no significant difference in CCN1 mRNA expressions between the HV
and LV groups. CCN2 was not detected in these groups. In HV group, CCN3 mRNA
expressions were higher than those of LV group. Collectively, these results indicate that highvascularity of the CL increase endometrial CCN3 expressions on Day 7 without increased
plasma and endometrial P４ concentrations, and thereby may influence fertility．

１．目

プラ法が牛の繁殖領域に応用されたことで黄体血的流の観察が容易となり，新たな黄体機能評価法と近年，牛の繁殖成績の低下は深刻な問題であして注目されている。これまで，胚移植（ET）

り，受胎性に関わる要因の探索ならびに受胎性向時とET後７日（発情後７および14日）において上に資する技術の開発は急務である。牛の妊娠成受胎牛の黄体血流は不受胎牛と比較して多く，黄立には，卵巣に機能的な黄体が存在し，妊娠維持

体血流が受胎性に関与していることが明らかにに必要なプロジェステロン（P４）が高い濃度でなっている１）。しかし，受胎牛と不受胎牛では末維持され，胚の正常な発育と着床に適した子宮内梢血中P４濃度の推移に差がなく１），黄体血流の多環境の構築が必要不可欠である。近年，超音波ド寡が受胎性に影響を及ぼすメカニズムは解明され© The Ito Foundation

牛黄体血流の多寡は子宮内膜機能の局所調節に関与するのか？（Ⅱ）

ていない。

183

供試した。発情日をDay ０とし，Day ７に卵巣

令和３年度の伊藤記念財団助成研究によって，発情後７日に黄体血流の多い牛群は少ない牛群に比較して子宮内膜組織において248遺伝子が高発
現，138遺伝子が低発現であり，それらの遺伝子の超音波検査を行い，同時に黄体側子宮角の子宮内膜組織および血液を採取した。
なお，本研究は岩手大学動物実験委員会の承認を受けて行った（承認番号A202044）。

は細胞接着，細胞外マトリックス構築および白血2.2球のアポトーシス制御に関する遺伝子群であるこDay ７ に 超 音 波 画 像 診 断 装 置（MyLab Oneとが明らかとなった。

超音波検査による黄体血流量の測定

Vet，Esaote SpA）を用いて卵巣の観察を行った。

本研究では，これらの発現変動遺伝子のうちはじめにＢ-モードを用いて黄体の静止画を３回CCNファミリーに着目した。CCNファミリーは，

記録し，次にカラーフローマッピングモードを用

Cysteine-rich 61 （CRY61：CCN1）， Connective

いて黄体のドプラ画像を３回記録した。画像解析

tissue growth factor （CTGF：CCN2） お よ び

ソフト（Image J, Wayne Rasband（NIH））によ

Nephroblastoma overexpressed（NOV：CCN3）

り，最大直径，黄体面積（最大直径での断面積），の頭文字から命名されたタンパク質ファミリーで黄体内腔面積（内腔が存在した場合；最大直径であり，現在６つのメンバーから構成されている２）。

の黄体内腔の断面積），黄体組織面積（黄体面積

その多くは細胞外マトリックスに存在し，さまざと 黄 体 内 腔 面 積 の 差）お よ び 黄 体 血 流 面 積

まな受容体や成長因子と相互作用し細胞の分化，（BFA）を算出し，３回の平均値をデータとして遊走，増殖および接着を制御していると考えられ使用した。また，BFAに基づき供試牛を血流のている２）。これまで，さまざまな動物種について多い群（HV，ｎ＝４）と少ない群（LV，ｎ＝４）

生殖器におけるCCNファミリーの発現分布，作に分類した。

用ならびに疾患との関連性について検討されてい2.3

る。特に，CCN1-３は子宮内膜の血管新生作

子宮内膜組織採取前に頸部静脈よりヘパリン加用５），胚の子宮内膜への接着６）や胎盤形成５）など

真空採血を用いて採血を行った。血液を遠心分離への関与が報告されており，受胎性と関連してい後，血漿を採取しP４ の測定まで－35℃で保存しる可能性がある。昨年度の研究から黄体血流量のた。キシラジン製剤（セデラック２％注射液，日多寡がCCNファミリーの遺伝子発現に影響を与本全薬工業（株））0.05mg/kgを用いて鎮静後，えることが推察されたが，これまで黄体血流量と２％リドカイン（キシロカイン注射液２％，アスの関連性を検討した報告はない。

ペンジャパン（株））により尾椎硬膜外麻酔を

３，
４）

子宮内膜組織および血液の採取

そこで本研究では，CCNファミリーについて行った。滅菌済み子宮内膜採取器（富士平工業

リアルタイムRT-PCR法によりmRNA発現量を（株））を用いて，黄体側子宮角先端の子宮内膜組定量化し，黄体血流の多寡がCCNファミリーの織を採取した。採取した子宮内膜組織は液体窒素

遺伝子発現に与える影響を検討した。

に て 凍 結 し ，P４ の 測 定 お よ び RNA 抽 出 ま で

２．方
2.1

－80℃で保存した。内膜組織採取後，トラネキサ

法

ム酸製剤（トラムリン，日本全薬工業（株））を供試材料

10mg/kg，サリチル酸ナトリウム製剤（ザルソ

健康で発情周期が正常な黒毛和種経産牛８頭をブロガ糖注NZ，日本全薬工業（株））を6.5mg/© The Ito Foundation

184

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 1 Primers used in real-time RT-PCR．
GeneSequence of primers（5’→3’）

CCN1

ForwardTGTGGACAGCCGGTGTACAG

ReverseGGACTTCTTGGTCTTGCTGCATForward

TCCCACGGAGGGTCAAACT

Reverse

CATCACGGGACACCCATTC

Forward

GTAGCGATGGCCGATGCT

ReverseTGGAACTCCACCTGGATGGT

CCN2
CCN3

Table 2 Features of the corpus luteum（CL）in the high（HV）and low（LV）

vascularity groups on Day ７．

Item
CL maximum diameter（mm）
CL area（mm２）
CL tissue area（mm２）
BFA（mm２）

HV（ｎ＝４）

LV（ｎ＝４）23.5±1.1

24.1±1.1

p value
0.81

357.98±24.30

378.88±23.77

0.58

336.89±37.85
88.01±12.30

366.45±18.42
38.75±2.73

＜0.01

0.80

Abbreviation：BFA, blood flow area. All data are represented as the mean±SEM．

kg静脈内投与した。
2.4

３．結果と考察

P４濃度の測定

血漿および子宮内膜組織中P４ 濃度を酵素免疫

3.1

各群の黄体の形態および血流量の比較

BFAに基づき分類したHV群およびLV群につ測定法により測定した。
total RNAの抽出およびcDNA合成

いて，黄体の最大直径，黄体面積，黄体組織面積

子宮内膜バイオプシー試料からRNeasy mini

およびBFAの比較を行った（Table２）。黄体の最Kit（Qiagen，74106）を使用してtotal RNAを抽出

大直径，面積および組織面積は２群間で差が認めした。分光光度計で濃度を測定し，total RNA1μg

られなかった。また，BFAは，HV群（88.01±

からHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription

12.30mm２）とLV群（38.75±2.73mm２）で有意なKit（Thermo Fisher Scientific，4374967）を用い差が認められた（ｐ＜0.01）。これらの結果は昨てcDNAを合成した。

年度と同様であり，両群ともに黒毛和種牛のDay

2.5

2.6

リアルタイムRT-PCR

７の黄体として適正なサイズであった。したがっ2 . 5において作成したcDNAを鋳型としてリアて，供試牛の血流量の差は黄体サイズを反映して

ルタイムPCRを行い，子宮内膜組織中のCCN1，いるものではないと考えられる。また，ET時

CCN2およびCCN3のmRNA発現量を測定した。

（Day ７）のBFAが43.0mm２以下の牛は受胎性がGAPDHの発現量を内部標準として補正し，比較

低い１）ことから，本研究のLV群はHV群に比較しCt値法によりmRNAの発現量を算出した。本研て受胎性が低い牛群であると考えられた。

究で使用した特異的プライマーをTable１に示した。

3 . 2 黄体血流量が血漿および子宮内膜組織中
P４濃度に及ぼす影響
各群の血漿および黄体側子宮角先端の子宮内膜
組織中P４ 濃度をTable３に示した。血漿・子宮内膜組織中P４濃度ともにHV群とLV群で差は認めら© The Ito Foundation

牛黄体血流の多寡は子宮内膜機能の局所調節に関与するのか？（Ⅱ）

185

Table 3 Plasma and endometrial progesterone（P４）concentrations

on Day ７．

P４ concentrations
Group

Plasma（ng/ml）

Endometrium（ng/g）

HV（ｎ＝４）2.52±0.20

7.87±1.22

LV（ｎ＝４）2.66±0.31

6.85±0.57

All data are represented as the mean±SEM．

0.5

0.0

＊＊＊

1.5

Gene expression（CCN3/GAPDH）

Gene expression（CCN1/GAPDH）

1.0

LV（n = 4）

HV（n = 4）

Fig. 1 CCN1 mRNA expression in the endometrium of

the high（HV, open bar；ｎ＝４）and low（LV, black
bar；ｎ＝４）vascularity groups on Day 7（Day ０＝
estrus）．
Data are represented as the mean±SEM．

1.0

0.5

0.0

LV（n = 4）

HV（n = 4）

Fig. 2 CCN3 mRNA expression in the endometrium of

the high（HV, open bar；ｎ＝４）and low（LV, black
bar；ｎ＝４）vascularity groups on Day 7（Day ０＝
estrus）．
＊＊＊
Data are represented as the mean ± SEM．
p＜0.001

れなかった。これらの結果も昨年度と同様であられ，その発現量は黄体血流の多寡による影響をり，黄体血流量による受胎性制御機構には血漿お受けないと考えられた。

よび子宮内膜組織中P４ 濃度は関与していないこ

CCN2 mRNAは両群ともに発現量が低く，検出されなかった。CCN2は，牛において子宮内膜とが推察された。
3 . 3 黄体血流量の多寡が子宮内膜組織中ののリモデリングや細胞接着に関与し，妊娠18日に

CCN1，CCN2およびCCN3のmRNA発現に増加することが報告されている９）。また，発情後与える影響

５および７日では子宮内膜組織における発現量がCCN1 mRNA発現は，両群間で差が認められ低いが13および16日に増加し，胚の伸長や着床をなかった（Fig. １）。CCN1は，子宮内膜の血管促進することが示唆されている３）。また，発情後新生５），胚の着床，胎子の脳や軟骨形成および血３日から血中P４ 濃度を増加させると発情後７日

管新生などの胚発生に関与し ，CCN1欠損マウのCCN2 mRNA発現量が増加することも明らか

スでは胎盤の血管形成異常や胚死滅を招くと報告となっている３）。本研究では，子宮内膜での発現されている８）。これまで牛の子宮内膜組織におけ量が低い時期に子宮内膜組織を採取したこと，血るCCN1の発現動態に関する報告はないが，本研漿中および子宮内膜組織中P４ 濃度に両群間で差究の結果より牛の子宮内膜においても発現が認めがなかったことから，HV群・LV群ともに発現量７）© The Ito Foundation

186

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）が低く検出されなかったと考えられた。

のmRNA発現量には差が認められなかったが，CCN3 mRNA発現は，LV群に比較してHV群にCCN3 mRNA発現はLV群に比較してHV群におい

お い て 有 意 に 高 か っ た（Fig. ２ ； ｐ ＜ 0.01）。

て有意に高いことが明らかとなった。HV群は受CCN3はヒトにおいて胎盤形成に関与し ，発現

胎性が高くLV群は受胎性が低い牛群であること

量の低下が妊娠高血圧症，過剰が癒着胎盤の原因から，黄体血流量の多寡は子宮内膜組織のCCN3となると考えられている 。また，ヒトやラット

mRNA発現に重要な役割を果たし，その結果とにおいて血管内皮細胞に作用し血管新生を促進す

して受胎性に影響を与えている可能性がある。

10）

11）

ることが知られている。したがって，受胎性12，13）の高いHV群では，CCN3発現量が高く子宮内膜組織での血管新生が十分に行われ，胚の生存や発育に適した子宮内環境の構築している可能性があると推察した。
以上の結果より，黄体血流量の多寡は子宮内膜組織におけるCCN3 mRNA発現に影響を与えることが明らかとなった。これまで牛の子宮内膜組織のCCN3と受胎性に関する報告はなく，今後サ
ンプル数を増やし解析を進め，CCN3の生理的意義を明らかにする。同時に，他の遺伝子の発現解析を進め，黄体血流による受胎性制御機構を解明
する。
４．要

約

本研究では，黄体血流の多寡が子宮内膜の局所的な機能調節に関与しているか否かを明らかにすることを目的として，黄体血流量，血漿・子宮内膜組織中P４ 濃度および令和３年度の伊藤記念財
団助成研究において発現変動遺伝子として抽出されたCCNファミリーについて解析を行った。発情後７日の血液および黄体側子宮角先端の子宮内膜組織を採取した。黄体血流の多い群（HV群）と少ない群（LV群）について，血漿・子宮内膜
組織中P４濃度およびCCNファミリー（CCN1-３）のmRNA発現量を比較した。その結果，HV群とLV群では血漿および子宮内膜組織中P４濃度に差文
献１）
 Kanazawa, T., Seki, M., Ishiyama, K., Kubo, T.,
Kaneda, Y., Sakaguchi, M., Izaike, Y., Takahashi,
T.：Theriogenology，86，1436～1444，2016．
２）
 Leask, A., Abraham, D. J.：J Cell Sci，119，4803～4810，2006．
３） Forde, N., Spencer, T. E., Bazer, F. W., Song, G.,
Roche, J. F., Lonergan, P.：Physiol Genomics，41，53～62，2010．
４） Abudukeyoumu, A., Li, M. Q., Xie, F.：Am J
Reprod Immunol，84（2），e13262，2020．
５） Winterhager, E., Gellhaus, A.：Cell Mol Life Sci，
71，2299～2311，2014．
６） Yu, H. N., Li, X. M., Kong, L. L., Ren, J., Wu, H.,
Bu, L. G., Ding, N. Z., Ni, H.：Theriogenology，153，
85～90，2020．
７） Yang, R., Chen, Y., Chen, D.：Mol Med Rep，17（1），
３～10，2018．
８） Mo, F. E., Muntean, A. G., Chen, C. C., Stolz, D. B.,
Watkins, S. C., Lau, L. F.：Mol Cell Biol，22（24），8709～8720，2002．
９） Klein, C., Bauersachs, S., Ulbrich, S. E., Einspanier,R., Meyer, H. H., Schmidt, S. E., Reichenbach, H. D.,
Vermehren, M., Sinowatz, F., Blum, H., Wolf, E.：
Biol Reprod，74，253～264，2006．
10） Adu-Gyamfi, E. A., Ding, Y. B., Wang, Y. X.：Biol
Reprod，102（1），18～26，2020．
11） Duan, L., Schimmelmann, M., Wu, Y., Reisch, B.,
Faas, M., Kimmig, R., Winterhager, E., Köninger, A.,
Gellhaus, A.：Front Endocrinol，11，597549，2020．
12） Lin, C. G., Leu, S. J., Chen, N., Tebeau, C. M., Lin, S.
X., Yeung, C. Y., Lau, L. F.：J Biol Chem，278（26），24200～24208，2003．
13） Henort, P., Moisan, F., Laurent, P., Manicki, P.,
Kaulanjan-Checkmodine, P., Jolivel, V., Rezvani, H.
R., Leroy, V., Picard, F., Boulon, C., Schaeverbeke,
T., Seneschal, J., Lazaro, E., Taïeb, A., Truchetet, M.
E., Cario, M.：J Invest Dermatol，140（7），1427～1434，
2020．

が認められなかった。また，CCN1およびCCN2© The Ito Foundation

187

小胞体ストレス制御によるウシ体外生産胚の耐凍性向上に関する研究
Study on improvement of cryo-tolerance by controlling endoplasmic
reticulum stress in bovine embryos produced in vitro

山

中

賢

一

（佐賀大学農学部）

Ken-ichi Yamanaka（Faculty of Agriculture, Saga University）

In this study, we examined whether the use of embryos produced by endoplasmic
reticulum（ER）stress-suppression during in vitro maturation（IVM）and in vitro culture（IVC） in the slow freezing method can improve their viability after thawing.
Tauroursodeoxycholic acid（TUDCA）, a selective inhibitor of ER stress inhibitor, wassupplemented during IVM, and IVC following in vitro fertilization（IVF）for 24（IVM＋24h）or
48h（IVM＋48h）. The number of embryo developed to blastocyst stage was significantly
higher in the IVM＋24h group than in the control group. Moreover, the number of blastocysts
classified as code1 by IETS criteria was significantly higher in the IVM＋24h group than in thecontrol group, indicating that ER stress suppression improves embryo quality as well as
development to the blastocyst stage. Next, survivability and hatchability at 24 hours afterthawing were examined. Survivability was significantly higher in both the IVM＋24h and IVM＋48h groups than in the control group, while hatchability was not significantly different amonggroups. In addition, apoptosis index of blastocysts was significantly lower in both the IVM＋
24h and IVM＋48h groups than in the control group. These results indicate that suppression of
ER stress can improve the productivity of high-quality embryos with high freezing tolerance,
and is expected to contribute to efficient calf production using in vitro produced embryos．

１．目とや世代間隔の短縮につながり，育種改良の迅速的化を図ることができる２）。そのため，近年では体体外受精胚の移植による子牛生産は任意の雌雄

外受精胚の移植件数が体内生産胚のそれを上回

個体から優良形質を受け継いだ子牛のより効率的

り，世界で移植されたウシ胚のうち約80％を占め

１）

な増産，牛群の遺伝的改良に大きく貢献できる 。

ることが報告されている３）。一方，体外受精胚は加えて，現在，現場レベルでの活用が広まりつつ

体内生産胚と比較して移植後の受胎率が低いことあるゲノム育種価の利用促進にも大いに貢献すが知られている。加えて，飼育頭数の限られた我る。つまり，移植前に体外受精胚においてゲノが国の畜産現場では，移植に適した時期のレシピ

ミック評価を実施することで，選抜圧を高めるこ

エント牛の選択が困難であるため，胚の凍結保存© The Ito Foundation

188

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）が不可欠の技術として利用されている。しかしな

μg/mlゲンタマイシン（ナカライテクス）を加えがら，体外受精胚は体内生産胚と比較して耐凍性た培地中で38.5℃，５％CO２，加湿条件下で22時が低く，凍結胚を移植した場合の受胎率は体内生

間体外成熟培養を行った。体外成熟後，COCsは産胚と比較すると10％程度低く，体外受精胚の凍

IVF100（機能性ペプチド研究所）で洗浄後，媒結融解後の生存性や品質を向上させることが長年精まで38.5℃，５％CO２，加湿条件下で静置した。

の課題として残されている 。

一方，精液は人工授精用凍結精液を融解後，90％

４）

これまでの研究において，我々は小胞体ストレ（v/v）パーコール溶液（GE Healthcare）を用いスの抑制・誘導実験を通じて，小胞体ストレスがて800×g，10分間の遠心処理を行った。上清を除体外生産胚における過剰な活性酸素種の産生を引去した後，IVF100で希釈し，600×g，５分間のき起こすことで，不適切なレドックス状態を生み遠心処理により洗浄した。遠心洗浄後，上清を除出し，結果的にアポトーシスを誘導し，生存性低去 し 精 子 濃 度 が ５ × 10 ６ 個 ／ ml に な る よ う に下の原因となっていることを明らかにした５，６）。

IVF100で調製し，38.5℃，５％CO２，加湿条件下

加えて，小胞体ストレスを抑制することによっで４時間媒精を行った。媒精後，ピペッティングて，体外生産胚の体外発生率のみならず，ガラスにより卵丘細胞および精子を完全に取り除くこと

化保存後の生存性も向上できることを報告しで裸化を行った。裸化後，受精胚を５％FBSを添た 。一方，現在，ウシ胚の保存は主に緩慢凍結加したCR1aa培地で洗浄し，38.5℃，５％CO２ ，法およびガラス化保存法によって行われている

５％O２，加湿条件下で８日間体外発生培養を行っが，両者を比較した場合，保存後の生存性としてた。

はガラス化保存法が優れていることが多くの研究

2.2

チームによって報告されている 。しかしながら，発生培養後，７または８日に胚盤胞期まで発生

畜産現場での利用を考慮すると，移植用ストロー

した胚のうち，International Embryo Technologyに封入した状態で胚を凍結する緩慢凍結法のほう

Society マ ニ ュ ア ル ８）で 定 め ら れ て い る 基 準 にが融解後そのまま移植を行えるため，実用性が高従ってCode1および２と評価した胚を実験に供しく，ウシ胚の凍結では主流となっている。

た。緩慢凍結は家畜改良センターのマニュアル９）６）７）

胚の緩慢凍結そこで本研究では，これまでの我々の知見を活に従い行った。胚を基礎液で洗浄後，凍結保存液

かして，小胞体ストレス抑制処理を行った胚を緩へ移し，１～２分後にストローへ吸引した。凍結

慢凍結法に用いることにより，融解後の生存性を保存液に移してから約15分後に－７℃のプログラ向上させられるのか？について検証を行った。

ムフリーザー（YT Freezer 80；ヤマネテック）

２．方
2.1

へ投入した。２分後に植氷を行い，その温度で13法分間保持した後，－0.3℃／分の速度で－30℃ま

体外受精胚の作製で冷却し，液体窒素中に投入し凍結した。凍結保

食肉処理場由来卵巣より，吸引採取法により卵存後の融解は，液体窒素から取り出したストロー

丘 卵 母 細 胞 複 合 体（COCs）を 採 取 し ，Ｍ 199

を大気中に10秒間保持し，30℃の温湯中で行い，

培 地（Thermo Fisher Scientific）に ５ ％ ウ シ 胎取り出した胚を基礎液に移し10分間平衡後，20％

子 血 清（FBS；Thermo Fisher Scientific），0.02（v/v）FBSおよび0.1mM βMEを添加したＭ199

IU/ml FSH（アントリン；共立製薬）および10培地で38.5℃，５％CO２，５％O２ ，加湿条件下で© The Ito Foundation

189

小胞体ストレス制御によるウシ体外生産胚の耐凍性向上に関する研究

回復培養を行った。回復培養24時間後に胚を観察

は解析の前にアークサイン変換を行った。p＜0.05

し，生存率および孵化率をそれぞれ算出した。

の場合を統計的に有意な差が認められると判断し

2 . 3 胚盤胞期胚の細胞数およびアポトーシス

た。

細胞の検出

３．結果と考察回復培養24時間後の生存胚におけるアポトーシ
ス 細 胞 を TUNEL ア ッ セ イ キ ッ ト（In situ Cell

これまでの我々の研究において，体外成熟また

Death Detection Kit ； Roche）を 用 い て 検 出 しは体外発生培養中に小胞体ストレスの抑制剤であた。４％パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich）

るTUDCAを添加することにより，ウシIVF胚のを添加したPBS（－）溶液（pH7.4）で30分間固体外発生能が向上することが明らかになってい定した。0.05％ポリビニルピロリドン（PVP；る５，６）。しかしながら，体外成熟および体外発生

Sigma-Aldrich） を 添 加 し た PBS （－） 溶 液の両期間を通じてTUDCAを添加した場合の効果（PVP-PBS） で 洗 浄 後 ， 0.5 ％ TritonX-100

については検証が行われていない。そこで本研究（Sigma-Aldrich）を加えたPVP-PBSで20分間透で は ，ま ず 体 外 成 熟 か ら 体 外 発 生 を 通 し て過処理を行った。PVP-PBSで洗浄後，断片化しTUDCAを添加し，体外発生能の評価を行った。

た DNA 末 端 を フ ル オ レ セ イ ン -130dUTP に て予備実験の結果をもとに，100μＭのTUDCAを

38.5℃で60分間標識した。PVP-PBSで３回洗浄添加した培地で成熟を行った後，体外受精で得ら後，スライドグラスにDAPIを含む蛍光褪色防止液

れた胚を10μＭのTUDCAを添加した培地で24（Vectashield with DAPI；Vector Laboratories）（IVM＋24h区）または48時間（IVM＋48h区）発とともにマウントした。蛍光顕微鏡（EVOS-FL；

生培養を行った。その後，TUDCAを含まない培Thermo Fisher Scientific）を用いてTUNEL陽性

地で培養を継続し，発生培養後２および８日で分細胞をアポトーシス細胞として計測し，総細胞数

割数，胚盤胞期への発生数を計測した。その結果，に対する割合をアポトーシス発生率として算出し分割数はいずれの区間でも差は見られなかった

た。

が，胚盤胞期への発生数はIVM＋24h区がControl

2.4

統計解析

区と比較して有意に高かった（p＜0.05；Table

体外発生率，融解後の生存率および孵化率はカ１）。また，統計的な有意な差は認められなかっイ二乗検定，胚盤胞期胚の細胞数およびアポトー

た が ，IVM ＋ 48h 区 の 胚 盤 胞 期 へ の 発 生 数 も

シス率は一元配置分散分析の後，Tukey-Kramer

Control区と比較して高い傾向が見られた（p＝法により試験区間の差の解析を行った。％データ

0.067；Table１）。さらに，胚盤胞期への発生したTable１ In vitro development of bovine embryos supplemented with and without TUDCA during IVM and IVC
Group＊

No. of embryos

No. of ≥ 2-cell embryos（％）

No. of blastocysts（％）

No. of IETS code 1
blastocysts（％）

Control211

175（85.6）63（34.3）ａａ
48（22.7）

IVM＋24h115

95（83.8）51（45.9）ｂｂ
39（33.9）

79（87.3）

37（41.6）abab
30（33.0）

IVM＋48h91＊ER inhibitor；TUDCA, was supplemented during IVM, and IVC following IVF for 24（IVM＋24h）or 48h（IVM＋48h）．
ａ，ｂValues with different superscripts within the same column are significantly different（p＜0.05）．

TUDCA, Tauroursodeoxycholic acid；IVM, in vitro maturation；IVF, in vitro fertilization；IVC, in vitro culture．

© The Ito Foundation

190

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

胚のグレードを調べた結果，IETS基準でCode1

べた結果，生存率は，IVM＋24h区およびIVM＋に分類される胚盤胞期胚への発生数がIVM＋24h

48h区ともにControl区と比較して有意に高かった区がControl区と比較して有意に高かった（p＜（p＜0.01；Table２）。一方で，孵化率はいずれの0.05；Table１）。また，胚盤胞期胚への発生数と区間においても有意な差は見られなかった。ま同様に，統計的な有意な差は認められなかった

た，凍結融解後24時間で生存していた胚の総細胞が，IVM＋48h区におけるCode1に分類される胚およびアポトーシス発生率を調べた結果，総細胞

盤胞期胚数もControl区と比較して高い傾向が見数に関してはいずれの区間においても有意な差はられた（p＝0.063；Table１）。これらの結果は，見られなかったが（Fig.１），アポトーシス発生

小胞体ストレス抑制によって胚盤胞期への発生の率 は IVM ＋ 24h 区 お よ び IVM ＋ 48h 区 と も にみならず胚の品質も向上できることを示していControl区と比較して有意に低かった（p＜0.01；

る。畜産現場においては，通常Code1の胚が凍結

Fig.２）。

保存に用いられるため，小胞体ストレス抑制は凍

胚の凍結保存では，活性酸素の過剰産生が引き結可能胚の生産効率の向上にも寄与すると考えら起こされ，これによりアポトーシスが誘導されるれる。体外培養中に産生される活性酸素種は小胞ことが知られており，このアポトーシスを抑制す

体ストレスを引き起こすとともに，その小胞体スることが凍結胚の発生能向上に重要であると考えトレス自体が活性酸素種の産生を促す 。また，られている12）。これらの知見とともに前述したよ

体外成熟中の卵丘細胞は小胞体ストレスへの感受

うに小胞体ストレスは活性酸素種の産生を促進す

性 が 高 く ，卵 母 細 胞 の 発 生 能 を 低 下 さ せ る こ

ることが知られているため，小胞体ストレスを抑と11），体外発生培養の初期の胚で活性酸素種が増制した胚では活性酸素種の産生も抑えられた結

加すること

果，凍結胚におけるアポトーシス発生率が減少す10）が報告されている。今回，体外成熟６）または体外発生単独でTUDCAを添加する区を設けていないため，直接的な比較はできないが，これらの知見と今回の結果をあわせると，体外成熟

るとともに生存率も向上したと考えられた。
４．要約および体外発生初期の両方で小胞体ストレスを抑本研究では，体外成熟および体外発生培養時に制することが体外受精胚の発生能向上により効果

小胞体ストレスを抑制することにより，胚盤胞期的である可能性が示された。

への発生および凍結可能胚の生産効率が向上する

凍結融解後24時間での生存率および孵化率を調ことを示した。また，この培養条件で得られた胚

Table２ Viability and hatchability following cryopreservation by slow-freezing of bovine blastocysts supplemented withand without TUDCA during IVM and IVC
Group

No. of blastocysts

No. of survived（％）

No. of hatching and hatched（％）

Control76ａ36（47.4）

15（19.7）

IVM＋24h35ｂ26（74.3）９（25.7）29ｂ24（82.8）６（20.7）

IVM＋48h＊ER inhibitor；TUDCA, was supplemented during IVM, and IVC following IVF for 24（IVM＋24h）or 48h（IVM＋48h）．
ａ，ｂValues with different superscripts within the same column are significantly different（p＜0.01）．

TUDCA, Tauroursodeoxycholic acid；IVM, in vitro maturation；IVF, in vitro fertilization；IVC, in vitro culture．

© The Ito Foundation

191

小胞体ストレス制御によるウシ体外生産胚の耐凍性向上に関する研究
10

8
Apoptotic index（%）

Cell No.

100

50

a

6

b

b

4

2

0

Control

IVM+24h

IVM+48hFig. 1 Total cell numbers of bovine blastocyst after

post-thaw cultureD ata are shown the mean±standard error. ER
inhibitor；TUDCA, was supplemented during IVM,
and IVC following IVF for 24（IVM＋24h）or 48h（IVM＋48h）．

盤胞期胚を緩慢凍結に用いることで融解後の生存率が向上するとともに，アポトーシス発生率が低下することが示された。これらの結果から，体外培養時の小胞体ストレス抑制は高い耐凍性を有した高品質な胚の生産性を向上させることができ，
体外受精胚による効率的な子牛生産に寄与することが期待される。
文
献１） Ferre, L. B., Kjelland, M. E., Strobech, L. B.,
Hyttel, P., Mermillod, P., Ross, P. J.：Animal, 14,991～1004, 2020．
２） Ponsart, C., Le Bourhis, D., Knijn, H., Fritz, S.,
Guyader-Joly, C., Otter, T., Lacaze, S., Charreaux,F., Schibler, L., Dupassieux, D., Mullaart, E.：
Reprod Fertil Dev, 26, 12～21, 2013．
３） International Embryo Technology Society. Data
Retrieval Report 2021 Statistics of embryo
production and transfer in domestic farm animals,
https://www.iets.org/Portals/0/Documents/
Public/Committees/DRC/IETS_Data_Retrieval_
Report_2021.pdf

0Control

IVM+24h

IVM+48hFig. 2 Apoptotic indexes of bovine blastocyst after post-

thaw cultureD ata are shown the mean±standard error. ER

inhibitor；TUDCA, was supplemented during IVM,
and IVC following IVF for 24（IVM±24h）or 48h（IVM±48h）. ａ，ｂdifferent letters denote significant
differences（p＜0.01）．

４） Valente, R. S., Marsico, T. V., Sudano, M. J.：
Anim Reprod Sci, 239, 106970, 2022．
５） Khatun, H., Wada, Y., Konno, T., Tatemoto, H.,
Yamanaka, K. I.：Reproduction, 159, 361～370,
2020．
６） Khatun, H., Ihara, Y., Takakura, K., Egashira, J.,
Wada, Y., Konno, T., Tatemoto, H., Yamanaka, K.
I.：Theriogenology, 142, 131～137, 2020．
７） Saragusty, J., Arav, A.：Reproduction, 141, １～
19, 2011．
８） Robertson, I., Nelson, R. E.：Manual of theInternational Embryo Transfer Society, Fourth
edition: 86-105, International Embryo Transfer
Society, Savoy, IL, 2010．
９） 小林修司：ウシ生体卵子吸引・体外受精マニュア
ル, 第２版, 19～25, 2009．
10） Yoon, S. B., Choi, S. A., Sim, B. W., Kim, J. S.,
Mun, S. E., Jeong, P. S., Yang, H. J., Lee, Y., Park, Y.
H., Song, B. S., Kim, Y. H., Jeong, K. J., Huh, J. W.,
Lee, S. R., Kim, S. U., Chang, K. T.：Biol Reprod, 90,
104, 2014．
11） Wu, L. L., Russell, D. L., Norman, R. J., Robker, R.
L.：Mol Endocrinol, 26, 562～573, 2012．
12） Vining, L. M., Zak, L. J., Harvey, S. C., Harvey, K.
E.：Theriogenology, 173, 93～101, 2021．

© The Ito Foundation

192

乳牛のルーメン内環境が肝臓の炎症を介して繁殖機能に及ぼす影響Effect of intraruminal environment in dairy cows on reproductive function
through liver inflammation

大

滝

忠

利１・閏

間

英

之２

（１日本大学生物資源科学部獣医学科獣医臨床繁殖学研究室，２静岡県畜産技術研究所）

Tadatoshi Ohtaki１ and Hideyuki Uruma２（１Laboratory of Theriogenology, Department of Veterinary Medicine, College of Bioresource Sciences, Nihon University，
２Shizuoka Prefectural Research Institute）

Measurements of ruminal pH, LPS, and a comprehensive analysis of bacterial flora werecarried out to investigate the effects of the rumen environment on reproductive function via
liver inflammation. A high pH group with a ruminal pH of 6.4 or higher and a low pH groupwith a ruminal pH of less than 6.4 at 4 weeks postpartum were compared. Compared to thehigh pH group, the low pH group showed significantly lower ALB and T-Cho values andsignificantly higher GGT concentrations. In addition, Hp and SAA concentrations weresignificantly higher in the low pH group. The incidence of endometritis at 4 weeks postpartum
was 0％（0/5）in the high pH group and 33％（1/3）in the low pH group. No clear differenceswere observed in the ruminal microflora. It was suggested that even under normal rearing
conditions, rumen and liver inflammation and accompanying deterioration of liver function may
occur in animals with decreased ruminal pH．

１．目

多量に移行する４）。血液中のLPSは肝臓により解的毒されるため５），LPSによる肝機能への関与は重

乳牛への濃厚飼料の多給はルーメン内の揮発性要である。濃厚飼料の多給によるルーメン内LPS

脂肪酸産生量の増加を引き起こし，その結果，濃度上昇は急性期たんぱく質（血清アミロイド

ルーメン内pHが低下することで亜急性ルーメン

Ａ：SAA，ハプトグロビン：Hp）やアスパラギ

ア シ ド ー シ ス（SARA）を 引 き 起 こ す 。こ のン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）の上昇

SARAに伴いグラム陰性菌が死滅することでエンなど肝機能に悪影響を及ぼす６）。

ドトキシ（リポポリサッカライド：LPS）がルー

一方，ルーメン内には多種多様な細菌が常在

メン液に多量に放出される 。ルーメンLPSは主し，代謝物質等の交換などで互いに影響しあうこに第一胃壁から吸収され，門脈を経由して肝臓にとでルーメン内細菌叢を形成し，それぞれの細菌到達する２～４）。また，第一胃壁や下部消化管の粘種が特徴的な生化学性状を持つことで生態的地位

膜バリアに損傷があるとルーメン内LPSが血中にを確保し，その総体としてルーメンが機能してい１）© The Ito Foundation乳牛のルーメン内環境が肝臓の炎症を介して繁殖機能に及ぼす影響

193

る７～９）。これらの細菌にはそれぞれの至適pHがTable１ Ingredients and nutrient composition of diets

あり ，濃厚飼料の多給によるルーメン内pH低

Item

10）

下時には著しい細菌叢の変化が認められる11）。また，乳量の多い牛は少ない牛に比べて特徴的なルーメン内細菌叢を保有すること ，ルーメン内
12）

細菌叢と飼料効率との間に相関が認められること 13～16）が報告されており，生産性向上に対する
ルーメン環境の重要性が注目されてきている。しかし，乳牛におけるこれらルーメン内細菌叢と繁殖機能との関連は明らかとなっていない。
そこで本研究では，ルーメン内pHおよびLPSの測定と細菌叢の網羅的解析を実施し，ルーメン
内環境が肝臓の炎症を介して繁殖機能に及ぼす影% of DM

Ingredient
FSK mash（Compound feed）

11.5

Corn silage

4.0

Italian ryegrass silage

3.6

Sorghum silage

0.7

Oats hay

1.2

Timothy hay

1.2

Alfalfa hay

0.5

Biophos M１）

0.2

Baking soda

0.2

Nutritional composision
TDN

60.0

CP

13.0

NDF

36.0

NFC

32.0

１）Biophos M ingredients : P, Ca, Mg

響を解明することを目的とした。
２．方
2.1た。子宮内膜細胞診は，サイトブラシ（メトリブ法

ラシセット牛用，富士平工業（株），東京，日本）

供試動物と給与飼料を用いて子宮内膜を採取後，スライドガラスに塗２産以上（２-５産）のホルスタイン種乳牛８抹し，ディフクイック（シスメックス（株），兵頭を使用した。試験期間は分娩後３日から８週と庫，日本）染色を行った。サイトブラシによってした。供試牛は，フリーストールで飼養され，給採取された子宮内膜上皮細胞と多形核白血球数

餌 は 10 時 と 15 時 に TMR（Total Mixed Ration）（PMN）からPMNのパーセント（PMN％）を求により行った飼料乾物中の組成および養分含量をめた。

Table１に示した。すべての実験は静岡県畜産技2.3

術研究所大動物分野における動物実験実施規程に

2.3.1

基づき実施した。

ルーメン液はpHを測定し，ルーメン液中LPS

2.2

サンプリング測定項目
ルーメンpHおよびLPS

濃度は，LAL阻害を不活化するためにサンプル

ルーメン液は，分娩後３日，４週，８週に，朝を proteinase K （Limulus Amebocyte Lysate ，の給餌前10時にルーメンカテーテル（ルミナ：富ロ ン ザ ジ ャ パ ン（株），東 京）に よ る 前 処 理 を

士平工業（株），東京，日本）を用いて経口的に行った 18）後に，エンドスペシーⓇES-50M（生化採取した。小野寺 17）の方法に従い採取瓶に吸引学工業，東京）を用いて測定した。

後，採取液を４重ガーゼで50mlの保存容器に濾

2 . 3 . 2 血液生化学性状，IGF-1，Hp，SAA，
TNF-αおよびIL-6

過した。また，分娩後１，２，３，４および８週に血液を採取し，採血後速やかに血清を遠心分離し血液生化学性状として，アルブミン（ALB），

た。各サンプルは即日検査を必要とするもの以外

総たんぱく質（TP），血中尿素窒素（BUN），非は処理後分析に供するまで－30℃で保存した。まエステル化脂肪酸（FFA），総コレステロール

た，分娩後４週において子宮内膜細胞診を実施し（T-Cho），AST，γ-グルタミントランスペプチ© The Ito Foundation

194

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ダ ー ゼ（GGT）を 測 定 し た 。Hp 濃 度 は ，中 村

内膜炎牛が１頭のみであり，ルーメン内LPS濃度

らのヘモクグロビン結合アッセイにより測定しの各個体による差が認められなかった。このことた。また，市販のキットを使用してインスリン様から，分娩後４週におけるルーメンpHが6.4以上

成長因子（IGF-1，IGF-1 Human ELISA kitの高pH群（n＝5）と6.4未満の低pH群（n＝3）にQuantikine ，R&D systems Inc., U.S.A），SAAて群分けを行い，解析した。

19）®

（ M u l t i s p e c i e s S A A E L I S A k i t ，T r i d e l t a

まず，ルーメン内pH，LPSの推移をFig.１に示Development Ltd., Poland）），TNF-α（ELISAした。ルーメン内LPS濃度は，低pH群で高値をKit for Tumor Necrosis Factor Alpha，Cloud-

示したが，有意な差は認められなかった。次に，Clone，中国）およびIL-6（IL-6 Bovine Uncoated

各群の分娩後の血液生化学性状とIGF-１濃度の

ELISA Kit，Invitrogen，U.S.A）を測定した。

推移をFig.２に示した。TP濃度は低pH群で有意2.3.3に高値を示し（p＜0.01），ALB濃度は低pH群で細菌叢解析

分娩後４および８週のルーメン液をDNA抽出

有意に低値を示した（p＜0.05）。BUN濃度は低キット（QIAamp DNA Stool Mini Kit, Qiagen,

pH群で有意に低値を示した（p＜0.01）。T-ChoHilden, Germany）を用いてDNAを抽出した。抽濃度は低pH群で有意に低値を示した（p＜0.01）。

出したDNA溶液について，16S rRNAのV3-V４

GGT 濃 度 は 低 pH 群 で 有 意 に 高 値 を 示 し（p ＜領域を増幅し，Miseq（Illumina, San Diego, Ca,

0.05），週 と 群 で 交 互 作 用 が 認 め ら れ た（p ＜USA）による高速シーケンシングを実施した。

0.05）。それ以外の血液生化学性状については，解析したシーケンスデータは，16S rRNA遺伝子

明らかな差は認められなかった。IGF-１濃度はの 塩 基 配 列 を 決 定 し ， EzBioCloud （https://

低pH群で有意に高値を示し（p＜0.05），週と群

www. ezbiocloud.net/）を用いて各菌種の基準株で交互作用が認められた（p＜0.05）。
急性期たんぱく質および炎症性サイトカインのの配列と比較した。得られたOTUに対し，細菌推移をFig.３に示した。Hp濃度は低pH群で有意

種の多様性の解析を行った。

に高値を示した（p＜0.01）。SAA濃度は低pH群

３．結果と考察で有意に高値を示し（p＜0.01），週と群で交互作
用が認められた（p＜0.05）。TNF-αおよびIL-６

分娩後４週における子宮内膜細胞診にて，子宮High pH（n=5）

Low pH（n=3）

4 10４

7
LPS（EU/ml）

pH

6.8
6.6
6.4
6.2
6

0

2

4

6

8

3.5 10４
3 10４
2.5 10４
2 10４
0

2

4
分娩後週数

分娩後週数
Fig. 1 Postpartum changes in ruminal pH and LPS.
Error bars indicate SEM.

© The Ito Foundation

6

8

195

乳牛のルーメン内環境が肝臓の炎症を介して繁殖機能に及ぼす影響
High pH（n=5）

Low pH（n=3）

ALB（g/dl）

7.6
7.4
7.2
7
G : p<0.01
PW : p<0.01

6.8

BUN（mg/dl）

6.6
14
13
12
11
10
9
8
7
6

0

2

4

6

8

G : p<0.01
PW : p<0.01
0

2

4

6

T-Cho（mg/dl）

TP（g/dl）

7.8

30
25
20
15
10

0

2

4

6

8

0

2

4

6

80
70
60
50
40
30
20
10
0

8

G : p<0.01
PW : p<0.01
0

IGF-1（ng/ml）

GGT（IU/l）

G : p<0.05
PW : p<0.05
G×PW : p<0.05

G : p<0.05
PW : p<0.01

220
200
180
160
140
120
100
80
60

8

40
35

3.6
3.5
3.4
3.3
3.2
3.1
3
2.9
2.8

2

4

6

8

G : p<0.05
PW : p<0.01
G×PW : p<0.05
0

分娩後週数

2

4

6

8

分娩後週数

Fig. 2 Changes in postpartum blood biochemistry and IGF-1 concentration in high（n＝5；open circle）and low pH

groups（n＝3；filled circle）.Error bars indicate SEM.

濃度には明らかな差は認められなかった。

α多様性においては，低pH群の分娩後４週と８Dubucら 20）の報告に従い，PMN％が６％を超

週のSimpson indexにのみ差がある傾向が認めらえるものを子宮内膜炎と診断した時，分娩後４週れた（p＝0.05）。すなわち，低pH群でのみ分娩における子宮内膜炎の発症は，高pH群で０％後の経過に伴い，主要な種類の細菌の均等度が低（0/5），低pH群で33％（1/3）であった。

下していた。

分娩後４週および８週の細菌属構成比をFig.４

分娩後４週および８週のルーメン性状と血液生に示した。属レベルではPrevotella属が共通して化学性状および急性期たんぱく質，炎症性サイト

多くを占有した。分娩後４週および８週それぞれカインの相関を調べたところ，分娩後４週においの時期で，低pH群と高pH群との間にα多様性て，ルーメン内LPS濃度とALB濃度に有意な負の（OTU 数 ， Chao1 ， Shannon index ， Simpson

相関が認められた（ρ＝－0.74，p＜0.05）。また，

index）に有意な差は認められなかった。一方，分娩後８週では，ルーメンpHとASTとの間に有© The Ito Foundation

196

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）
High pH（ n=5）

80
70
60
50
40
30
20
10
0

G : p<0.05
PW : p<0.01

0

2

4

6

SAA（μg/ml）

800
700
600
500
400
300
200
100
0

8

IL-6（pg/ml）

TNF-α（pg/ml）

Hp（μg/ml）

Low pH（ n=3）

0

2

4

6

8

160
140
120
100
80
60
40
20
0

1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0

G : p<0.01
PW : p<0.01
G×PW : p<0.05

0

2

4

6

8

0

2

4

6

8

分娩後週数

分娩後週数

Fig. 3 Changes in postpartum acute phase protein and inflammatory cytokine concentration in high（n＝5；open

circle）and low pH groups（n＝3；filled circle）.Error bars indicate SEM.

低pH群8W

低pH群４W

高pH群8W

高pH群４W

0%［Genus］

10%20%

Prevotella
Mitsuokella
Succiniclasticum
Sporobacter
Acholeplasmataceae_uc
AY244965_g
Unclassiﬁed in higher taxonomic rank

30%

40%

50%

占有率（%）

Prevotellaceae_uc
Fibrobacter
Butyrivibrio
GU303877_g
Ruminococcus_g2
EF445219_g
ETC(under 1% in average)

60%

70%

80%

HM008751_g
Treponema
FR888536_g
AB185751_g
HQ716072_g
PAC001207_g

Fig. 4 Occupancy of the ruminal bacterial genus in high and low pH groups.

© The Ito Foundation

90%

100%

乳牛のルーメン内環境が肝臓の炎症を介して繁殖機能に及ぼす影響197

意な負の相関（ρ＝－0.72，p＜0.05）が認められ確な関係性を示すことができなかった。今後は，た。

供試頭数を増やすとともに，採取された肝臓およ

本研究では，低pH群において血中ALB濃度のび子宮内膜組織を用いて，炎症性サイトカイン発低下が認められた。ALBは，肝臓で合成される

現のリアルタイムPCRを実施し，さらに精査を行

血漿たんぱく質の一種であり，牛での半減期がう予定である。

16.5日と比較的長いことからたんぱく質代謝における慢性的な指標とされる21）。一般に，ALBの減４．要

約

少は食餌性たんぱく質欠乏時に低ALB血症に先ルーメン内pHおよびLPSの測定とルーメン内

行し ，ALBレベルが比較的低いことは，利用可

細菌叢の網羅的解析を実施し，ルーメン内環境が能な総たんぱく質が低いことを示している 。こ肝臓の炎症を介して繁殖機能に及ぼす影響を検討

れにより，病気の発作に対する反応が悪くなり，した。分娩後４週におけるルーメンpHが6.4以上

子宮内膜炎，乳房炎，およびその他の病気が牛にの高pH群とそれ未満の低pH群で比較をしたとこ発生する可能性がある。さらに，ALBは反応がろ，高pH群に比べ低pH群では，ALB，T-Choが遅い負の急性期たんぱく質であり，そのレベルは有意に低値を示し，GGT濃度有意に高値を示し

炎症中に減少することが知られている23，24）。炎症

た。また，HpとSAA濃度は低pH群で有意に高値の過程では体液とたんぱく質は組織液に移行してを示した。分娩後４週における子宮内膜炎の発症

浮腫を誘発し，これがALB減少の一因となるとは，高pH群で０％（0/5），低pH群で33％（1/3）

されている 。また，低pH群では，急性期たんであった。ルーメン内細菌叢については明らかなぱく質であるHpとSAAが高く，肝機能の生化学差は認められなかった。一般的な飼養環境下で的指標であるT-Chol，ALBが低く，GGTが高かっあっても，ルーメン内pHが低下する個体では，た。

ルーメンおよび肝臓の炎症やこれに伴う肝機能低

21）

22）

21）

濃厚飼料の多給は，急性期たんぱく質（SAA，Hp）の上昇などルーメン壁や肝臓の炎症を引き下が引き起こされる可能性があることが示唆された。

起こすとともに，ASTの上昇など肝機能に悪影響を及ぼすことが報告されている６，25）。SARAの定義はルーメン液pHがおおよそ5.6以下となる時間が少なくとも１日に３時間以上継続する状態25）とされ，本試験では採取時のpHが5.9前後の個体が存在し，SARAとなっている可能性は否定できない。一般的な飼養環境下であっても，ルーメン
内pHが低下する個体では，ルーメンおよび肝臓の炎症やこれに伴う肝機能低下が引き起こされる可能性があることが示唆された。
今回，供試頭数が少なく，子宮内膜炎を発症した牛が１頭のみであり，ルーメン内環境が肝臓の炎症を介して繁殖機能に及ぼす影響について，明文献１） Nagaraja, T.G., Bartley, E. E., Fina, L. R.,
Anthony, H. D., Bechtle, R. M.：J. Anim. Sci., 47,
226～234, 1978.
２）
 Gozho, G. N., Krause, D. O., Plaizier, J. C.：J.
Dairy Sci., 90, 856～866, 2007.
３）
 Khafipour, E., Krause, D. O., Plaizier, J. C.：J.
Dairy Sci., 92, 1060～1070, 2009.
 Khafipour, E., Krause, D. O., Plaizier, J. C. A.：J.
４）
Dairy Sci., 92, 1712～1724, 2009.
５）
 Battaglia, D. F., Bowen, J. M., Krasa, H. B., Thrun,
L. A., Viguie, C., Karsch, F. J.：Endocrinology, 138,4273～4281, 1997.
６）
 Ohtaki, T., Ogata, K., Kajikawa, H., Sumiyoshi, T.,
Asano, S., Tsumagari, S., Horikita, T.：J. Vet. Med.
Sci., 82, 971～977, 2020.
 McSweeney, C., Mackie, R.：Microorganisms and７）ruminant digestion: state of knowledge, trends and© The Ito Foundation

198

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

future prospects, Background study paper No. 61.
Food and Agriculture Organization of the United
Nations（FAO）,2012.
８） Nyonyo, T., Shinkai, T., Tajima, A., Mitsumori,
M.：Effect of media composition, including gelling
agents, on isolation of previously uncultured rumen
bacteria, Lett. Appl. Microl., 56, 63～70, 2013.
９） 三森眞琴, 湊一：新ルーメンの世界（板橋久雄編）.
p.43～86，農山漁村文化協会, 東京, 2004.
10） Creevey, C. J., Kelly, W. J., Henderson, G., Leahy,
S. C.：Biotechnol., 7, 467～479, 2014.
11） Nagata, R., Kim, Y. H., Ohkubo, A., Kushibiki, S.,
Ichijo, T., Sato, S.：J. Dairy Sci., 101, 4424～4436,
2018.
12） Tong, J., Zhang, H., Yang, D., Zhang, Y., Xiong, B.,
Jiang, L.：PLoS One, 13（11）,e0198225, 2018.
13） Carberry, C. A., Kenny, D. A., Han, S., McCabe, M.
S., Waters. S. M.：Appl. Environ. Microbiol., 78,
4949～4958, 2012.
14） Guan, L. L., Nkrumah. J. D., Basarab, J. A., Moore,
S. S.：FEMS Microbiol. Lett., 288, 85～91, 2008.
15）Myer, P. R., Smith, T. P. L., Wells, J. E., Kuehn, L. A.,
Freetly, H. C.：PLoS One, 10（6）,e0129174, 2015.
16） Rius, A. G., Kittelmann, S., Macdonald, K. A.,

Waghorn, G. C., Janssen, H., Sikkema, E.：J. Dairy
Sci., 95, 5024～5034, 2012.
17） 小野寺良次：新編動物栄養試験法（石橋晃監修）,
p.407～416, 養賢堂, 東京, 2001.
18） Petsch, D., Deckwer, W. D., Anspach, F. B.：
Anal. Biochem., 259, 42～47, 1998.
19） 中村正明, 小山毅, 松井義貴, 平井綱雄, 南橋昭, 中田健, 横田博, 宮本亨：日獣会誌, 65, 628～688, 2012.
20） Dubuc, J., Duffield, T. F., Leslie, K. E., Walton, J. S.,
LeBlanc, S. J.：J. Dairy Sci., 93, 5225～5233, 2010.
21） 久保周一郎：獣医臨床生化学 第四版（久保周一郎, 友田勇 監訳）p.153～157, 近代出版, 東京, 1991.
22） Van Sun, R. J.：Am. Assoc. Bov. Pract., 37, 212～
213, 2004.
23） Bertoni, G., Trevisi, E., Han, X., Bionaz, M.：J.
Dairy Sci., 91, 3300～3310, 2008.
24） Madoz, L. V., Giuliodori, M. J., Migliorisi, A. L.,
Jaureguiberry, M., de la Sota, R. L.：J. Dairy Sci.,
97, 195～201, 2014.
25） Gozho, G. N., Plaizier, J. C., Krause, D. O.,
Kennedy, A. D., Wittenberg, K. M.：J. Dairy Sci.,
88, 1399～1403, 2005.

© The Ito Foundation

199

豚胚品質の客観的評価法の確立に関する研究
Research on establishment of evaluation method for porcine embryo
quality

平

山

祐

理・江

川

紗智子

（独立行政法人家畜改良センター）

Yuri Hirayama and Sachiko Egawa（National Livestock Breeding Center）

In this study, we observed the developmental kinetics of porcine embryos at theblastocyst stage before vitrification using a time-lapse imaging device and explored thefeatures that affect the viability of embryos after vitrification-warming. Our aim was todevelop a system that automatically detects viability-indicating features in order to objectively
evaluate the quality of embryos．
In-vivo-derived porcine embryos were observed at 30-minute intervals in individual
culture using a time-lapse imaging device（Mil-Cell, Sumitomo Electric Industries, Ltd.）. To
4ptimal imaging time, three experimental groups were compared: imaging for 22 to 24 hours（Day 5.0）, 14 to 16 hours（Day 5.5）, and 4 to 6 hours（Day 6.0）. The highest survival rate
（26.7％）was achieved in the Day 6.0 group. The group culture under the same conditions
resulted in a survival rate of 46.7％, indicating that group culture is necessary even with ashort in vitro culture. In Day 6.0 time-lapse images, changes in contraction frequency andstrength, blastomere, and embryo volume（The area consist in blastomere and blastocoel）
were observed, which did not correlate with viability or the number of viable cells. On theother hand, embryos with a viable cell count of 70 or more tended to show greater volume
change（p＝0.08）than embryos with a viable cell count of less than 70, indicating thepossibility of predicting embryo quality by measuring volume change. Therefore, we usedembryo volume change as an index for embryo quality assessment．
For the automatic measurement of the embryo volume, Mask-R-CNN was used to detect
the embryo volume area. A rectangle was computed from the detected area. Then, wedeveloped an AI model that can calculate the embryo volume by calculating the diameter ofthe embryo from the width of the rectangle．

１．目

カ豚熱が国内外を脅かしている。これらの伝染性的疾病の侵入による遺伝資源の消失は養豚業界に

近年の養豚業界を取り巻く状況は，国内での豚とって大きな損害であり，喫緊に対応すべき課題

熱の猛威に加え，近隣諸国で発生しているアフリとなっている。この対策として，希少・貴重な遺© The Ito Foundation

200

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

伝資源を伝染性疾患への感染リスクの高い生体で２．方はなく，子豚生産可能な状態であらかじめ超低温法

保存しておくことの重要性が再認識されてきた。

本実験は，独立行政法人家畜改良センター動物

現在，ブタ胚の超低温保存（ガラス化保存）技術

実験実施規程に従って計画し，動物実験委員会のや生産現場での胚移植を可能とする非外科移植法

審査・了承を得て行った（承認番号：4-6）。

の開発が進み，こういった養豚産業の課題に胚移植で対応することが可能になりつつある。

採取した胚を経時的に短時間観察することで，ガラス化加温後の胚の生存性評価を可能にすべ

一方，胚の流通の基盤となる胚の品質評価基準

く，指標の探索・選定の後に，選定した指標の自は，国際胚技術学会（IETS）により示されてい動検知を行った。撮影には，胚を２方向から撮影

る胚の形態を目視により評価する方法であり，術可 能 か つ 安 価 な タ イ ム ラ プ ス 撮 影 装 置（Mil-者の熟練が求められる。ブタ胚の流通には，輸送

Cell，住友電気工業株式会社製）を用いた（Fig.

や移植の簡便さからガラス化保存が必須であり，

１）。

今後の胚移植の産業利用において，ガラス化保存

2.1

胚の利用を想定した客観的な胚の品質評価法の確

家畜改良センター本所で飼養している８カ月齢

立は必要不可欠である。

ブタ体内胚の採取

以上の大ヨーク種５頭およびランドレース種８

そこで本研究では，胚の発育動態を経時的に確頭，合計13頭の性成熟雌豚を供胚豚として用い

認可能なタイムラプス撮影装置を用いてガラス化た。交配用の精液は，８カ月齢以上の大ヨーク

前の胚の発育動態を観察し，ガラス化保存後の胚シャー種１頭から採取し，モデナ液で希釈後，使の生存性に影響を与える要因を探索するととも用時まで15℃で保存した。供胚豚の排卵誘起は，に，ブタ胚の客観的品質評価を行うための要因選

エストラジオールプロピオン酸エステル（オバホ

定およびそのスマート化を目指すことを目的としルモンデポー筋注５mg，あすか製薬株式会社）

た。

または，エストラジオール安息香酸エステル（動Vitriﬁcation /Warming anddilution

Observation of porcine embryos using timelapse images

Recovery of in-vivoderived embryos

Vitriﬁcation ofembryos

Individual culture

Warming and dilution of
vitriﬁed embryos

Observation from two
directions

Analysis of time-lapse images

Investigating the relationshipbetween morphologicalfeatures and embryo viability

Fig. 1 Analysis of time-lapse images for embryo viability after vitrification© The Ito Foundation

Investigation of viability
after warmingand dilution

豚胚品質の客観的評価法の確立に関する研究

201

物用オバホルモン注，あすかアニマルヘルス株式

2.4会社）を用いて偽妊娠状態とした母豚を用いる方

タイムラプス撮影装置（Mil-Cell，住友電工株

法１，２），もしくは，発情周期の12～14日目にプロ式会社）での体外培養時間の影響を調べるため，

スタグランジン製剤（プラネート，MSDアニマ

体外培養時間を22～24時間行うDay5.0区，14～16

ルヘルス株式会社）を投与する方法に準じて時間行うDay5.5区，４～６時間行うDay6.0区の３行った。採胚方法は，豚の胚移植マニュアル に試験区を設定した。また，培養容器や培養条件の準じて行った。

違いによる影響についても調査した。すべての胚３）４）

試験区の設定胚の培養およびタイムラプス撮影方法

は培養後にガラス化した後，加温・希釈して胚を採取した胚日齢に適した発育時期（桑実胚から

実体顕微鏡下で観察し，胞胚腔の再形成が確認で拡張胚盤胞）の胚のみを供試胚とし，10％子牛血

きた胚を生存胚と判定した。生存性を確認した

清（CS）を 添 加 し た ブ タ 後 期 胚 培 養 用 培 地

後，一部の胚は細胞数をカウントするため，10μ（PBM）を培養液とした。培養容器はタイムラプ

g/ml bisbenzimide（Hoechst 33342，
thermofisher）

ス撮影装置専用容器と35mmディッシュを用い

お よ び 10 μ g/ml propidium isodide （PI ，た。タイムラプス撮影装置専用容器１ウェルにつthermofisher）により生存細胞と死滅細胞に区別

き100μｌの10％CS添加PBMを培地として，１個して二重染色した７）。

2.2

ずつ個別培養もしくは共培養を行うことで，個別培養と共培養との生存性の比較を行った。さら３．結果および考察に，35mmディッシュに50μｌの10％CS添加PBM

3.1

ドロップで１個ずつ個別培養を行い，タイムラプ

胚日齢および培養容器や培養条件の異なる胚のス撮影を行わない対照区とした。胚の培養には，ガラス化加温後の生存率の結果をTable１に示し採取した胚日齢に応じて，４～24時間培養を行た。既報では，胚日齢６日目におけるガラス化保い，その期間中は30分間隔で経時的に胚を撮影し存胚を加温・希釈後，48時間共培養した場合の生た。

存率は88.9％と報告されているが５），今回，これ2.3

タイムラプス撮影に適した胚日齢の検討

胚のガラス化保存および加温方法

らの報告と同胚日齢のDay6.0区において，タイム

市販のブタガラス化保存液キット（PES-1，2，

ラプス撮影装置で個別培養した場合の生存率はおよびPVS，株式会社機能性ペプチド研究所）お26.7％で，Day5.5区およびDay5.0区における同培

よびガラス化デバイス（胚スティック，ミサワ医

養条件の生存率はそれぞれ14.3および０％であっ科工業株式会社）を用いて，胚のガラス化保存をた。また，タイムラプス撮影装置での培養におい行った。胚は培養終了後，ウェルもしくは，て，共培養した場合の生存率はDay6.0区で46.7％

ドロップごとに胚のガラス化保存を行い，１カ月と個別培養に比べて高い生存率を示した。さら以上液体窒素タンクで保管した。ガラス化保存胚に，Day5.5区を35mmディッシュで個別培養を

は加温・希釈液（PWDS，株式会社機能性ペプチ

行ったところ，55.6％の生存率であった。これら

ド研究所）で加温・希釈後，10％CS添加PBM培の結果から，タイムラプス撮影時間が長いほど胚地に移して38.5℃，５％CO２，
５％Ｏ２のインキュの生存率が低下することが判明し，さらに，本研

ベーター内で22～24時間培養した後に胚の生存性究で得られた既報より低い生存率は，個別培養おおよび細胞数の確認に供した。

よびタイムラプス撮影装置専用容器の影響がある

５，
６）© The Ito Foundation

202

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table１ Survival rates of embryos collected on different days with different culture methods
Experimental group

Survival

Day＊１

Cultureｎ（％）

method
5.0
5.5

10

０

group

８

12.5

Individual

35

14.3

Individual＊２

18

55.6

Individual

45

26.7

group

15

46.7

6.0
＊１

Individual

5.0：Collected 144 hours after hCG administration．
5.5：Collected 150 hours after hCG administration．
6.0：Collected 162 hours after hCG administration．

＊２

Embryos were cultured in 50μl droplets prepared on 35-mm Petri dishes．

Y-direction

Before contraction

X-direction

Extruded
blastomeres

Thirtyminuteslaterembryo contraction

Fig. 2 Time-lapse imagesと考えられた。胚は成長因子を放出することが知られているが ，胚日齢５および６日目まで体内
８）3 . 2 タイムラプス撮影画像による胚の品質評価を行うための要因探索と選定で発育した胚を短時間，体外培養した場合であっ胚の客観的な品質評価に向けて，胚の発育につても成長因子をお互いに受容できる共培養が必要

いて経時的に画像取得を行った。これにより，胚である可能性が示唆された。さらに，タイムラプの収縮回数やその度合い，分割球，さらに胚の体ス撮影装置専用容器は２方向からの撮影を行うた積として，透明帯の内側の割球と胞胚腔の部分

めにすり鉢状の形状をしている。そのため，胚自（以下，胚体積）の経時的観察が可能であった

身から放出された老廃物が放散されず胚の周囲に（Fig.２）。Day6.0区の胚において，これらの項目

残り，胚自身に影響を及ぼしている可能性が考えを調査したところ，45個の胚のうち，収縮回数やられる。以上のことから，胚への悪影響を最小限

収縮による胚体積の変化（培養終了時胚体積／培にしつつタイムラプス撮影装置による経時的な胚

養開始時胚体積）を確認できたのは６個，分割球の発育を観察するため，Day6.0胚を用いて胚の品については１個のみで，生存率および生存細胞数

質評価の要因探索を行うこととした。

との関係はみられなかった。収縮の確認ができな© The Ito Foundation

203

豚胚品質の客観的評価法の確立に関する研究
NormalImage A
MASK=area consisted inblastomere and blastocoel

X-direction

Y-direction

BBox＝area surrounded by lines

Image B

Image C

Sy
Zy

Sx

Zx

Estimate the diameter of Mask areafrom two directions（Zy, Zx）.

Calculate the areas of Mask from the estimateddiameters（Sy, Sx）.

Fig. 3 Automatic detection of estimated embryo volume

Embryo volume consist in blastomere and blastocoel．

かった胚が多かった理由は，培養時間が４～６時

3.3

胚体積を自動で検知するシステムの構築

間と非常に短いため，胚の収縮周期に当てはまら胚の体積を自動検知するため，領域分割のAIなかったためと考えられた。次に，生存率と胚体手法であるMask R-CNNを用いた（Fig.３）。胚積の変化との関連を調査したところ，有意差はみ

体積の算出方法は，①タイムラプス撮影装置にてられなかった。

得られた２方向からの撮影画像から胚の領域

胞胚腔の再形成が確認できた胚のうち10～24％（Mask）を検出し，Maskから矩形（BBox）を計において，内部細胞塊（ICM）の細胞の輪郭が不算，②矩形（BBox）の幅を推定し（Ａ），胚の直明瞭ですでに変性もしくは死滅しつつあると推測

径（Zx，Zy）を算出（Ｂ），③直径から胚面積されると報告されている 。ICMは将来胎仔とな（Sx，Sy）を算出（Ｃ），④Zx，Zy，SxおよびSyる細胞であり，ICMが死滅しているということはを次の式に代入し，胚体積を算出した。

産子につながらない可能性があり，そういった胚

Sy × Sx
V＝（Zｙ＋Ｚx）/２９）を生存胚と判定するリスクがある。そこで，より厳密に胚の質を判断するため，生存胚および死滅

胚体積自動検知モデルは，タイムラプス撮影画

胚について23個を染色して生存細胞数を計測し像のうち1128画像を教師データとしてAIモデル

た。この生存細胞数と体積変化との関連を調査しの学習を行うことにより構築した。テストデータたところ，生存細胞数が70以上の胚は70未満の胚112画像に対してモデル精度を求めた結果，BBoxと比べて胚体積の変化が大きい傾向があった（pは0.884，Maskは0.907で，モデルで検出した直径＝0.08）。このことから，胚体積の変化を測定すとアノテーション時の直径の平均絶対値の誤差でることで加温・希釈後の胚の品質を予測できる可あるAvg l１_lossの値が5.154であったことから，能性が示唆された。

高い精度が得られていることが示された。

© The Ito Foundation

204

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

本研究の結果，加温・希釈後の胚の品質を予測

体積変化を測定することで，胚の品質を予測できするための指標となり得る胚体積を自動検知するる可能性が示された。この結果から，胚の品質評ことが可能となった。今後，共培養条件下での胚価には胚体積変化を指標として用いることとした。

体積の自動検知方法を検討してタイムラプス撮影

次に，胚体積を自動検知する方法として，領域

時間の延長を図り，胚の収縮やその度合い，また分割のAI手法であるMask R-CNNを用いて胚の分割球の確認を指標に加えた客観的な胚の品質評

領域を検出した。検出した領域から矩形を計算

価方法の構築を目指す。

し，その矩形の幅を推定した。推定した矩形の幅

４．要から胚の直径を算出することで面積を求め，さら約に胚体積を算出できるAIモデルを構築した。

本研究では，胚の発育動態を経時的に確認可能なタイムラプス撮影装置を用いてガラス化前のブ謝辞

タ胚の発育動態を観察し，ガラス化保存後の胚の研究を遂行するにあたり，Mil-Cell容器の改良，生存性に影響を与える要因を探索するとともに，胚体積の測定およびAIによる自動検知モデル構

ブタ胚の客観的品質評価を行うための要因選定お築にご協力いただいた住友電気工業株式会社の関よびそのスマート化を目指した。外科的に採取し係職員，供試豚の飼養管理および実験を補助してたブタ体内胚をタイムラプス撮影装置を用い，個頂いた家畜改良センター企画調整部管理課の関係

別培養にて30分間隔で画像取得した。まず，最適

職員に心より感謝いたします。

な撮影時間を検討するために，撮影時間を22～24
時 間 （Day5.0 区）， 14～16 時 間 （Day5.5PM 区）
および４～６時間（Day6.0区）の３試験区を設定した結果，最も高い生存率はDay6.0区の26.7％であった。同条件にて共培養を行った結果では46.7％の生存率であり，短い体外培養時間であっても共培養が必要であることが判明した。次に，
Day6.0区におけるタイムラプス画像について胚の品質評価指標を探索したところ，胚の収縮回数やその度合い，分割球，さらに胚体積の変化を確
認可能であった。胚の収縮回数や分割球の発生について生存率および生存細胞数との関係を調べた
ところ相関はみられなかった。一方，生存細胞数が70以上の胚は，70未満の胚に比べて胚体積変化が大きい傾向（p＝0.08）があったことから，胚文
献１） Hirayama, Y., Yoshioka, K., Noguchi, M., Misumi,
K.：Animal Science Journal, 90, 1523～1529, 2019．
 Hirayama, Y., Misumi, K., Yoshioka, K., Noguchi,
２）M., Kikuchi, K.：Animal science journal, 92, e13480,
2021．
３）
 瀧下梨英，平山祐理，橋谷田豊：日本胚移植学雑誌，41, 25～30, 2019．
 独立行政法人家畜改良センター：家畜改良セン
４）
ター技術マニュアル11５）
 Misumi, K., Hirayama, Y., Egawa, S., Yamashita, S.,
Hoshi, H., Imai, K.：Journal of Reproduction andDevelopment, 59, 520～524, 2013．
６） 三角浩司，江川紗智子，御澤弘靖，平山祐理：日本養豚学会誌，58, 28～34, 2020．
 Saha, S., Suzuki, T.：Reproduction, Fertility and７）
Development, 9, 741～746, 1997．
 Stokes, P. J., Abeydeera, L. R., Leese, H. J.：
８）Developmental Biology, 284, 62～71, 2005．
９） 岩崎説雄，吉田豊，渡辺誠喜，中原達夫：日本動物生殖学会誌，36, 60～65, 1990．

© The Ito Foundation

205

機能性脂肪酸を活用した黄体機能強化による乳牛繁殖成績改善技術の確立（Ⅱ）
Functional fatty acid diet improves the reproductive performance of dairy
cows by boosting their luteal function（Ⅱ）

山口

昇一郎・藤井英之・成瀬

講平１・山田豊１・太田剛（福岡県農林業総合試験場， 油化産業株式会社）１

Shoichiro Yamaguchi, Hideyuki Fujii, Kohei Naruse１，Yutaka Yamada１ and Takeshi Ohta
（Fukuoka Agricultural Research Center，１Yuka Sangyo Co., Ltd．）

In this study, we investigated the effect of feeding a diet containing calcium salts of
α-linolenic acid fatty acids to lactating dairy cows on milk yield and fertility. The experimental
diet consisted of total mixed rations, which was mainly Italian ryegrass silage. The α-linolenicacid group was supplied with 100g of calcium salts of α-linolenic acid by oral administration
daily from 3 weeks postpartum．
As a result of examination, there was no difference in the milk yield. Blood T-cho levels
were significantly higher in the α-linolenic acid group than the control group（p＜0.05）. Therewas no significant difference in corpus luteum blood flow after the first postpartum artificial
insemination 7 days after artificial insemination, but it was significantly higher in the
α-linolenic acid group 14 days after artificial insemination（p＜0.01）. The conception ratetended to be higher in the α-linolenic acid group than in the control group; however, there
was no significant difference．
In conclusion, it was suggested that feeding a diet containing calcium salts of α-linolenicacid to lactating dairy cows from 3 weeks postpartum significantly increased the blood T-cholevel, leading to early recovery of postpartum nutritional status. In addition, it was suggested
that luteal function may be improved by improving nutritional status, and the conception rate
may be improved．

１．目の乳牛は，泌乳量の急増に伴い負のエネルギーバ

的

ランスとなっており，これが繁殖成績低下の大き近年，乳牛の受胎率が低下し，酪農現場で大きな要因となっている。酪農現場では，繁殖性向上

な問題となっている。都道府県における乳牛の平や乳量および乳脂肪向上を目的として従来からリ

均分娩間隔は，450日前後であるが，目標となる

ノール酸やパーム油脂などのバイパス脂肪酸が用

400日程度には大きく差があるのが現状であり，いられている。近年，泌乳牛にn-3系脂肪酸であ

飼料費高騰が続くなか，生産コスト低減のためにるα-リノレン酸含有脂肪酸カルシウムを給与すは，その短縮が喫緊の課題となっている。分娩後

ると分娩後初回授精日数や受胎までの日数が短く© The Ito Foundation

206

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

なることが報告された１）。同様に同じn-3系の脂厚飼料と場内産イタリアンライグラスサイレージ肪酸であるドコサヘキサエン酸（DHA）を分娩を組み合わせ給与した。

４週目からの泌乳牛に給与したところ，インター

α-リノレン酸区は，分娩後３週目からトップ

フェロン刺激遺伝子の発現を向上させ妊娠率を向ドレスでα-リノレン酸脂肪酸カルシウム（ファ上させる

インメイト，油化産業株式会社，東京）を100ｇ

２）などn-3系脂肪酸による繁殖性向上に夕方に給与した。添加後のα-リノレン酸区の関する知見が報告されている。
そこで本研究では，令和３年度の本助成研究に引き続き，泌乳初期牛にアマニ油由来のα-リノ

TMRは，TDN71.4％，CP15.5％，EE3.2％となった。

レン酸含有脂肪酸カルシウムを給与することで，卵巣および子宮回復診断は，毎週１回超音波画

乳量や乳成分および血液成分に及ぼす影響を検討

像診断装置（HS-101V，本田電子株式会社，愛知）

するとともに，性選別精液の人工授精を行って，で行い，子宮修復は子宮腔貯留物スコア３）によっ受胎率や妊娠維持に関与する黄体の血流量等に及てスコア０で回復とした。人工授精（AI）は，

ぼす影響について検討した。また，令和４年度は分娩後80日以降で黄体を確認後，プロスタグラン

福岡県内酪農家２戸で現地実証試験を実施した。

ジンＦ２α製剤（PG，動物用プロナルゴンＦ注

２．方射液，Zoetis，東京）を投与し，その48時間後に法

酢 酸 フ ェ ル チ レ リ ン（コ ン セ ラ ー ル 注 射 液 ，

供試牛は福岡県農林業総合試験場で飼養する２

MSDアニマルヘルス，東京）を200μｇ投与し，産以上のホルスタイン種経産牛24頭（α-リノレ

その24時間後に定時AIを行った。人工授精に際

ン区：11頭および対照区：13頭）を用いた。試験し て は ，主 席 卵 胞 側 の 子 宮 角 内 で 深 部 注 入 器

牛はフリーストール牛舎で飼養し，ドアフィーダ（YTガン，ヤマネテック，長野）の先端から内芯によって個体ごとに飼料摂取量を計測した。搾乳を押し出して先端チューブを子宮角深部に挿入しはミルキングパーラーで８：45と17：15の１日２た状態でホルスタイン種性選別精液を注入した。

回行った。体重は毎日測定し，乳成分は分娩後２黄体血流量（面積）は，AI７日後および14日後週間に１回乳サンプルを用いて，MILKO-SCANにカラードップラー（MyLabOne VET，メディ

FT ＋（Foss Electric, Hillererod ，Denmark）でカルタスクフォース，大阪）によって測定した。

分析した。試験期間は，分娩後３週から21週としまた，採血を行って血漿中のプロジェステロン濃た。採血は３週間に１回行い，ヘパリン入り真空度を酵素免疫測定法により測定した。

採血管を用いて10：00に採血後，冷却遠心分離

現地実証試験は，福岡県内酪農家２戸（つなぎ（3,000rpm，30分間）によって得られた血漿を検牛舎，分離給与）で行った。Ａ農家の供試頭数は，体とした。血漿中の血糖，T-cho，たんぱく質，

α-リノレン酸区が５頭および対照区６頭であり，

BUN，GOTおよびGGTは，乾式血液自動分析装

Ｂ農家では，それぞれ４頭ずつを供試し，産次お置（富士ドライケム，富士メディカルシステム，

よび分娩月に大きく偏りがないよう配置した。

東京）で分析した。すべての試験用飼料は，カッα-リノレン酸区は，朝と夕にα-リノレン酸脂肪

ターで細断した粗飼料と濃厚飼料を合わせて混合酸カルシウムを50ｇトップドレスで給与した。対飼料（TMR）に調製した。TMRの養分含量は，照区は無給与とした。人工授精は，PGによる発TDN71.0％，CP15.5％，EE3.0％となるように濃情誘起または自然発情時に行い，精液は主に性選© The Ito Foundation

207

機能性脂肪酸を活用した黄体機能強化による乳牛繁殖成績改善技術の確立（Ⅱ）

別精液を用いた。また，採血はＡ農家のみで分娩の他の血液成分については，有意差が認めらな

後15週まで実施した。

かった。血漿中総たんぱく質が高い傾向にあった

統計処理は，血液データについては，α-リノ

理由は，α-リノレン酸含有脂肪酸カルシウムに

レン酸給与の影響が想定される６週～15週に反復たんぱく質は含まれておらず，また，乳たんぱく

測定分散分析を実施し，その他のデータについて質は差がなかったため，本研究では原因の特定には，正規性の解析を行った後，Studentのｔ検定は至らなかった。

もしくはマン・ホイットニーのＵ検定を実施，受胎率については，χ二乗検定で行った。

黄体血流量（面積）については，AI７日後には有意差が認められなかったが，14日後にはαリ ノ レ ン 酸 区 が 有 意 に 多 く な っ た（ｐ ＜ 0.01）

３．結果と考察（Fig. ２）。プロジェステロン（P4）濃度には，乾物摂取量は，α-リノレン酸区が27.5kg／日

有意差は認めらなかった。Sakumotoら４）は，in

および対照区が28.0kg／日となり，有意差は認め

vitroにおいて牛子宮内膜組織をα-リノレン酸存

られなかった（Table１）。平均乳量は，α-リノ在下で培養したところ，PGE2の産生が有意に増

レン酸区が46.8kg／日および対照区が46.1kg／日

加したことを明らかにした。PGE2は黄体のP4合となり，有意差は認められなかった。飼料効率

成を促進する機能亢進作用が知られ，また血管新（乳量／乾物摂取量）では，α-リノレン酸区が1.7

生を促す作用を有することから，黄体での血管新および対照区が1.6となり飼料効率は高まる傾向

生が促進され，その結果，黄体の血流が増加したにあり，高エネルギーであるα-リノレン酸の影ものと推察された。一方，コレステロールは，ス

響があったのではないかと推察された（データ省

テロイドホルモン合成の基質になり，α-リノレ略）。乳成分（試験期間中の平均値）については，ン酸区は給与期間を通じて血中T-cho濃度が高く差はなく大きな影響は認められなかった。血液成推移したことから黄体細胞が活性化した可能性も分については，試験場と現地実証試験のデータを考えられる。黄体血流量が多くなったことから合算したものを示した（Fig. １）。血中T-cho濃

P4濃度に影響が出ることも考えられたが，差は度は，α-リノレン酸の給与期間中（６週から15認められなかった。Kanazawaら５）の報告でも黄週）について，α-リノレン酸区が有意に高くな

体血流量と末梢血のP4濃度に関係が認められなり（ｐ＜0.05），高エネルギー飼料であるα-リノ

かったことを報告しており，局所的な作用があっ

レン酸給与によって分娩後の栄養状態が早期に回たことが示唆された。

復することが明らかとなった。また，血漿中総た

試験期間中の平均ボディーコンディションスコ

んぱく質については，給与期間中について，α-ア（BCS），分娩後子宮修復日数および初回授精

リノレン酸区が高い傾向にあった（ｐ＜0.1）。そ

日数は，試験区間で差が認められなかった（Table

Table 1 Effect of feeding α-linolenic acid on dry matter intake（DMI）and lactation performance．
DMI

Milk yield

Fat

Solids not fat

Protein

MUN

kg/daykg/day

％

％

％

mg/dl

α-linolenic acid（ｎ＝11）

27.5

46.8

3.6

8.5

3.1

12.5

control（ｎ＝13）

28.0

46.1

3.7

8.6

3.2

12.9

© The Ito Foundation

208

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

α-linolenic acid（n=16）

control（n=19）

250

65

T-cho（mg/dl）

Glu（mg/dl）

70

60
55
50

150

＊

50
3

6

9

12

15

3

6

9
BUN（mg/dl）

Protein（g/dl）

12

15

12

15

18

8.5
8
7.5
7

†

6.5

16
14
12
10

6
3

6

9

12

3

15

6

9

Postpartum weeks

Postpartum weeks

100

40

95
90

GGT（U/l）

GOT（U/l）9

Postpartum weeks

Postpartum weeks

85
80
75

35
30
25
20

70
3

6

9

12

3

15

6

9

12

15

Postpartum weeks

Postpartum weeks

Fig. 1 Effect of feeding α-linolenic acid on the concentration of serum metabolites during 15 weeks postpartum．
Data are presented as the mean±SEM．＊；ｐ＜0.05，†；ｐ＜0.1

２）。分娩後の初回授精受胎率は，有意差は認めて，黄体の血管形成が高まることにより，黄体へられないもののα-リノレン酸区が高い傾向が認の栄養やP4の基質供給量を増加させ，局所循環められた。受胎率が高く推移している理由としを介して黄体側の子宮角のP4濃度を増加させるて，黄体機能が高かったことが考えられる。黄体ためと推測されている６）。また，泌乳牛にDHA

血流面積が大きい牛の受胎率が高くなる理由としを給与することによりIFN-τに関係する遺伝子© The Ito Foundation

209

機能性脂肪酸を活用した黄体機能強化による乳牛繁殖成績改善技術の確立（Ⅱ）
＊＊

8

120

control（n=12）100

6P4（ng/ml）

BFA（mm2）α-linolenic acid（n=10）

80
60

4

40

2

20
0

0
Day7

Day7

Day14

Day14

Fig. 2 Effect of feeding α-linolenic acid on changes in the blood flow area（BFA）of the CL and plasma progesterone concentration（P４）．
Data are presented as the mean±SEM．＊＊；ｐ＜0.01

Table 2 Effect of feeding α-linolenic acid on BCS and reproductive performance．
Body Condition
Score（BCS）

Postpartum uterine
recoveryFirst postpartum
insemination

Conception rate at
first insemination

day

day

％

α-linolenic acid

3.2

27

95.7

30.0

control

3.1

32

96.3

21.7

BCS and postpartum uterine recovery；α-linolenic acid（ｎ＝11）and control（ｎ＝13）．
First postpartum insemination and conception rate at first insemination；α-linolenic acid（ｎ＝20）
and control（ｎ＝23）.

発現が高くなり受胎率が高くなる２）ことも報告されている。これらのことからα-リノレン酸含有

４．要

約

脂肪酸カルシウムを泌乳牛に給与することにより

本研究では，泌乳牛へのα-リノレン酸含有脂

黄体機能が高まるとともに妊娠維持に関する機構

肪酸カルシウムの給与が乳量や繁殖性に及ぼす影が向上することによって受胎率が高くなる可能性

響を検討した。試験飼料は，イタリアンライグラが示された。

スサイレージを主体としたTMRとした。α-リノ

以上のことから，分娩３週目からの泌乳牛に

レン酸区には，α-リノレン酸含有脂肪酸カルシ

α-リノレン酸含有脂肪酸カルシウムを100ｇ／日

ウムを分娩後３週目から100ｇ／日トップドレス

給与することで，血中T-cho濃度が高く推移し，で投与した。検討の結果，乳量には有意差が認め

分娩後の栄養状態が早期に回復することが明らかられなかった。血中T-cho濃度は，α-リノレンとなった。また，栄養状態が改善することによっ酸区が対照区に比べて有意に高くなった（ｐ＜て，黄体機能が高まり，初回人工授精後の受胎率0.05）。分娩後初回人工授精後の黄体血流量は，が向上する可能性が示唆された。

人工授精７日後には差が認められなかったが，14© The Ito Foundation

210

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

日後にはα-リノレン酸区が有意に高くなった（ｐ＜0.01）。受胎率は，α-リノレン酸区が有意差はないものの高い傾向にあった。
以上のことから，分娩後３週目からの泌乳牛に
α-リノレン酸含有脂肪酸カルシウムを給与することによって血中T-cho濃度が高く推移し，分娩後の栄養状態が早期に回復することが明らかとなった。また，栄養状態が改善することによって，黄体機能が高まり，初回人工授精後の受胎率が向上する可能性が示唆された。

文献１）
 Meignan, T., Madouasse, A., Beaudeau, F., Ariza,
J. M., Lechartier, C., Bareille, N.：Theriogenology ，125，293～301，2019．
２）
 Sinedino, L. D., Honda, P. M., Souza, L. R., Lock, A.
L., Boland, M. P., Staples, C. R., Thatcher, W. W.,
Santos, J. E.：eproduction, 153（5）,707～723, 2017．
 小山毅：北海道獣医師会雑誌，56（1），10～15，
３）
2012．
４）
 Sakumoto, R., Hayashi, K. G., Iga, K.：J Reprod
Dev，68（1），62～67，2022．
 Kanazawa, T., Seki, M., Ishiyama, K., Kubo, T.,
５）
Kaneda, Y., Sakaguchi, M., Izaike, Y., Takahashi,
T.：Theriogenology，86（6），1436～1444，2016．
６） 金澤朋美：臨床獣医臨時増刊号，35，45～48，
2017．

© The Ito Foundation

211

排卵後早期の卵巣形態と性ステロイドホルモン
バランスがウシ子宮の免疫機能に及ぼす影響
Effects of ovarian morphology and sex steroid hormone balance during
early stage after ovulation on bovine uterine immune function

松

井

基

純

（帯広畜産大学獣医学研究部門）

Motozumi Matsui（Department of Veterinary Medicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

Progesterone（P4）, which is secreted from corpus luteum（CL）formed after ovulation, is
widely known as important factor in bovine pregnancy. When the function of CL is insufficient,
the secretion of estradiol（E2）from newly developing follicle increases. Therefore, the ratio of
E2 to P4（E/P ratio）in the early postovulation period（around 5-7 days）might be related tofertility in cattle. The positional relationship between CL and follicle has been reported to berelated to fertility. In this study, relationship between the E/P ratio and ovarian morphology
and the intrauterine immune function were examined. Using 24 cows, ovary observation by
ultrasonography and plasma E2 and P4 measurement were performed from 4 to 7 days after
ovulation. Single embryo transfer（ET）was performed on 7 days after ovulation. Uterine
flushing with normal saline were performed at 12 and 24 hours after ET, and leukocyte gene
expression and microRNA detection in uterine flush were analyzed. According to the timing of
the E/P ratio decline, cows were divided into early-decreasing and the late-decreasing groups.
There was no difference in the sizes of follicle and CL between two groups. The positional
relationship between CL and follicle（coexistence or non-coexistence）was not related to thetiming of the E/P ratio decline. IL-8 mRNA expression in leukocytes increased with the timeafter ET, but there was no significant difference between two groups. IL-10 mRNA expression
did not change with the time after ET or the timing of the E/P ratio decline. In microRNAdetection, miR-1246 and miR-29a, which are presumed to be involved in embryonicdevelopment and intrauterine immune function, were analyzed. No change was observed withthe time after ET or the timing of the E/P ratio decline in both microRNA. This study showedthat the morphology of follicle and CL was not involved in the timing of the E/P ratio decline.
The relationship between the timing of the E/P ratio decline and intrauterine immune function
was not clarified, but a comprehensive analysis is considered necessary in the future．

１．目成される黄体から分泌されるプロジェステロン

的（P4）の重要性は広く知られている。黄体の機能

ウシの妊娠成立（受胎）において，排卵後に形が不十分な場合，排卵後に新たに発育する卵胞か© The Ito Foundation

212

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

らのエストロジェン（エストラジオール：E2）

2.2の分泌が高まり，発情・排卵後５－７日頃に少量

排卵確認日をday １として，day ５からday ７ながら血中のエストロジェン濃度の増加が観察さまで，超音波画像診断装置（HS-1600V，本多電

れる 。これらのことから，排卵後早期（５－７子）を用いて卵巣を観察し，黄体と卵胞の最大直日頃）の黄体と卵胞の形態および機能，内分泌動

径およびそれらの位置関係を調べた。

１）

卵巣の観察

態がウシの受胎性に強く影響すると考えられる。

2.3

内分泌動態の評価

排卵後早期（５－７日頃）の内分泌動態との関連

day ５からday ７まで，血中P4およびE2濃度を調べた研究では，E2濃度とP4濃度の比（E/Pを調べた。ヘパリンナトリウム加真空採血管を用比）の低下のタイミングが，受胎性に関与するこいて尾静脈より20ml採血を行い，遠心処理によとが示されている（未公表データ）。さらに，排り血漿を分離した。ジエチルエーテルを用い，血卵後に発現する第一卵胞波の主席卵胞が，黄体の漿からP4あるいはE2を抽出し，それぞれEIA法

存在する卵巣に存在する場合（共存群），黄体の

あ る い は ELISA 法（市 販 キ ッ ト ，DetectX Ⓡ，

存在する卵巣と反対側の卵巣に存在する場合（非Serum 17β Estradiol，Enzyme Immunoassay

共存群）に比べて受胎率が低いことが報告されてKit KB30 H5）により，血漿P4濃度あるいは血漿いる２）。これらの受胎性に関与すると考えられる

E2濃度を測定した。

「E/P比の低下のタイミング」と「黄体と卵胞の2.4

受精卵の移植位置関係」が相互に関連しているかどうかは明ら

受精卵は，FSH漸減投与による過剰排卵処置を行ったホルスタイン種非泌乳牛に人工授精を行かにされていない。
性ステロイドホルモンが子宮における免疫反応

い，発情後７日目に子宮灌流法により採取した。

に作用し受胎のための子宮環境を制御しているこ得られた受精卵のうち，胚盤胞期の胚を1.5Ｍエとは，長く知られていることから，受胎性に関わチレングリコールと0.1Ｍショ糖を用いた凍結にる要因である「E/P比の低下のタイミング」とよるダイレクト移植を行った。受胚牛に対し，「黄体と卵胞の位置関係」が子宮における免疫反day ７に，受精卵注入カテーテル（YTガン，株応に作用し，受胎性に影響を及ぼしている可能性

式会社ヤマネテック）を用いて，黄体側子宮角に

がある。

移植した。

本研究では，「黄体と卵胞の位置関係」と「E/2.5

子宮内液の採取

P比の低下のタイミング」との関係および「E/P

受精卵の移植後12および24時間後に，移植を比の低下のタイミング」が子宮における免疫反応

行った子宮角の中部へYTガンを挿入し，さらにに及ぼす影響を調べた。

カテーテルを延長した。注射筒を連結し，生理食

２．方
2.1

塩液20mlを注入後，速やかに回収し，回収液は法

冷却して実験室に持ち帰った。白血球の分離は密度勾配遠心法により行い，Leuko Spin Medium

供試動物

供試牛（受胚牛）として，ホルスタイン種経産（puriSelect）を用い，回収液５mlを1,000ｇにて30

泌乳牛24頭を用いた。自然発情あるいは定時人工

分間遠心を行った。エクソソームの分離には，回収授精プログラムに基づいて，行動観察および直腸液10mlからExo-Quick-TC（System Biosciences）

検査を行い，発情および排卵を診断した。

を用いて行った。

© The Ito Foundation

排卵後早期の卵巣形態と性ステロイドホルモンバランスがウシ子宮の免疫機能に及ぼす影響

213

Table１ Primer list
Primer Name

Primer Sequence（5’-3’）

IL-８

Ｆ：CATTCCACACCTTTCCACCC
Ｒ：AGGCAGACCTCGTTTCCATT

IL-10

Ｆ：CACAGGCTGAGAACCATTGAPDH

Ｆ：GCCAAGAGGGTCATCATCTC

miR-1246

RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTGCT

Ｒ：AGGGCAGAAAGCGATGA

Ｒ：GGTCATAAGTCCCTCCACGA

Ｆ：GCGCGAATGGATTTTTGG
Ｒ：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
miR-29a

RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCGAＦ：GGCTAGCACCATCTGAA
Ｒ：GTGCAGGGTCCGAGGTＵ６Ｆ：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT
Ｒ：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT

2 . 6 子 宮 内 液 の 白 血 球 遺 伝 子 発 現 お よ び
miRNA検出

３．結果と考察

白血球あるいはエクソソームからのtotalRNA

3.1の抽出には，それぞれTrizol試薬（Invitrogen）【結果】

内分泌動態と卵巣所見の評価

あるいはmiRNeasy Micro Kit（Qiagen）を使用

これまで，授精後のday ４からday ７までの血した。抽出したtotalRNAを，M-MLV（Invitrogen）

中P4およびE2濃度を調べた結果，E/P比についを使用してcDNAに逆転写した。miRNA検出のて，受胎牛ではday ４からday ５にかけて有意なためには，特異的なstem-loop primerを用いて逆低下（E/P比が２未満）がみられるのに対し，そ転写を行った。これらのcDNAをSYBR Premixの低下が，不受胎牛ではday ５からday ６にみら

Ex Taq キット（TAKARA）を用いて，リアルれたことから（未公表データ），本研究では，E/

タイムPCRを行った。内部標準遺伝子として，白P比の２未満への低下が，day ５にみられた個体

血 球 に お け る 遺 伝 子 発 現 解 析 に は GAPDH ，を早期低下群（early decrease），day ６にみられmiRNA検出にはU6を用いた。プライマーリストた個体を低下遅延群（late decrease）と区分した。

TM

早期低下群のE/P比は，day ４は2.2±0.2（平をTable１に示した。
2.7

均±標準偏差），day ５は1.4±0.2，day ６は0.9±

統計解析

データの解析には，群間の比較にはStudent-t

0.3およびday ７は0.6±0.1であり，低下遅延群で検定を行った。これらの検定において危険率５％は，day ４は2.2±0.2，day ５は2.1±0.3，day ６未満（ｐ＜0.05）の場合を有意性あり，５％からは1.2±0.3およびday ７は0.8±0.2であった。

10％（0.05＜ｐ＜0.1）の場合を統計的傾向があると判定した。

早期低下群と低下遅延群における卵巣観察において，day ４からday ７までの，最大卵胞および黄体の直径を調べた結果，両群間に差異は認めら© The Ito Foundation

214

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）
30.0Late decrease
Early decrease

15.0
14.0

CL size（mm）

Follicle size（mm）

16.0

13.0
12.0
11.0
10.0

26.0
24.0
22.0
20.0
18.0

9.0
8.0

Late decrease
Early decrease

28.0

4

5

6

Day after ovulation

7

Fig. 1 Changes in size of follicle from day 4 to day 7

れなかった（Fig. １および２）
。

16.0

4

5

6

7

Day after ovulation

Fig. 2 Changes in size of CL from day 4 to day 7

3 . 2 子宮内液における白血球の遺伝子発現お排卵後に発現する第一卵胞波の主席卵胞が，黄体の存在する卵巣に存在する場合（共存群）と黄よびmiRNA検出【結果】

体の存在する卵巣と反対側の卵巣に存在する場合

白血球におけるIL-８の発現は，受精卵移植12（非共存群）に区分し，両群におけるE/P比の早

時間後において，早期低下群と低下遅延群との間期低下群と低下遅延群の発生状況を調べた。共存で差異は認められなかったが，24時間後におい群において早期低下群は５頭，低下遅延群は７て，早期低下群が高い傾向（ｐ＝0.08）がみられ頭，非共存群において早期低下群は６頭，低下遅た（Fig. ３）。また，両群とも，12時間後に比べ，

延群は６頭であった。黄体と卵胞の共存状態と24時間後で発現が有意に高くなった。IL-10の発E/P比の低下のタイミングとの間に関連はみられ

現は，受精卵移植12時間後において，早期低下群なかった。

が高い傾向（ｐ＝0.06））がみられたが，24時間【考察】

後 に お い て ，両 群 間 で 差 異 は み ら れ な か っ た本研究より，「黄体と卵胞の位置関係」は「E/（Fig. ４）。

P比の低下のタイミング」に影響を及ぼさないこ

miRNA検出において，miR-1246およびmiR-とが示された。これまでの研究において，共存群

29aのどちらも，受精卵移植からの時間経過（12と非共存群との間で，day ７までの，第一卵胞波

時間後 vs 24時間後）およびE/P比の低下のタイの主席卵胞および黄体の発育，血中E2およびP4

ミング（早期低下群 vs 低下遅延群）との関連

濃度に差異がないことが示されている３）。すなわ

はみられなかった。

ち，黄体と卵胞の位置関係は，排卵後早期の内分【考察】

泌動態に影響を及ぼさないため，共存群と非共存

IL-8mRNAの発現は，受精卵移植12時間後か群との間でE/P比の低下のタイミングに違いがな

ら24時間後にかけて上昇した。一般に，IL-８は，かったと考えられる。このことは，「黄体と卵胞

単球，上皮細胞，内皮細胞および活性化された好の位置関係」が受胎性に及ぼすしくみと「E/P比

中球から分泌され，好中球の走化能や食作用を刺の低下のタイミング」が受胎性に及ぼすしくみが激することが知られている３）。受精卵移植後の発異なる可能性を示していると考えられる。

現上昇は，受精卵あるいは凍結保存液に反応した
結果の可能性が考えられる。受胎性が高いと思われるE/P比の早期低下群において，有意ではない© The Ito Foundation

215

排卵後早期の卵巣形態と性ステロイドホルモンバランスがウシ子宮の免疫機能に及ぼす影響
Late decrease
Early decrease3

IL-10 mRNA Relative level

IL-8 mRNA Relative level

3.5

2.5
2
1.5
1
0.5
0

12hr

3.5

Late decrease
Early decrease

3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

24hr

12hr

24hr

Fig. 3 The mRNA expression levels of IL-８

Fig. 4 The mRNA expression levels of IL-10が発現が高い傾向がみられた。白血球が作用しや確認され，それぞれ胚発育や子宮内の免疫機能にすい環境となることは，受精卵にとって不利な状関与することが推測されている７）。本研究では，

況と考えられるが，その理由は不明である。ヒト

miR-1246およびmiR-29aのどちらも受精卵移植の月経周期において，子宮内膜の増殖期および分からの時間経過およびE/P比の低下のタイミング

泌期にIL-８が上昇することが知られており，との関連はみられなかった。これについても，受受精卵の発育や着床のための子宮環境の制御に関

精卵の個数や移植後の時間経過などによる影響もわっていると考えられる。早期低下群は低下遅延考えられるが，今後，microRNAの発現状況につ群に比べ，P4が優位となる期間が長く，P4は子いて，網羅的な解析が必要と考えられる。

４）

宮内膜や分泌腺の増殖に関与していることから，
子宮内膜におけるIL-８発現が上昇し，その子宮内膜細胞がサンプルに混入していた可能性も考え

４．要

約

本研究では，ウシの受胎性に関連すると考えら
れる排卵後早期（５－７日頃）の血中E2濃度とられる。
近年，過剰排卵処置および人工授精を行ったウ

P4濃度の比（E/P比）の低下のタイミングについ

シにおける授精後７日目の子宮灌流液が，白血球て，卵胞および黄体の形態との関連，これまで受において，抗炎症作用を有するIL-10mRNA発現

胎性との関連が報告されている黄体と卵胞の位置を刺激すること ，また，その作用は，受精卵か関係との関連および子宮内の免疫反応への影響を

ら分泌されるインターフェロン-τを介している調べた。E/P比の低下のタイミングにより，早期

こ と ６） が 報 告 さ れ て い る 。本 研 究 で は ，IL-

低下群と低下遅延群とに区分し比較した結果，両10mRNA発現は，受精卵移植後の時間経過やE/P

群で卵胞および黄体のサイズに差異はみられな比の低下のタイミングによって変化はみられな

かった。また，黄体と卵胞の位置関係（共存あるかった。本研究では，１個の受精卵を移植したこ

いは非共存）は，E/P比の低下のタイミングと関とや移植からの時間経過が短かったことなどか連はなかった。子宮内の免疫反応を調べるため

ら，過去の報告にみられた受精卵によるIL-10誘に，排卵後７日目に受精卵を移植後の子宮内液を導が観察できなかったのかもしれない。

回収し，白血球の遺伝子発現およびmicroRNA検

５）

これまで，過剰排卵処置および人工授精を行っ出を解析した。白血球におけるIL-8mRNA発現

たウシにおける授精後７日目の子宮灌流液中におは受精卵移植後の時間経過に伴い上昇したが，いて，miR-1246の増加およびmiR-29aの低下がE/P比の低下のタイミングによる有意な差異はみ© The Ito Foundation

216

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

られなかった。IL-10mRNA発現は，受精卵移植後の時間経過やE/P比の低下のタイミングによって変化はみられなかった。microRNA検出において，胚発育や子宮内の免疫機能に関与することが推測されているmiR-1246およびmiR-29aについて解析を行ったが，受精卵移植後の時間経過やE/P比の低下のタイミングによって変化はみられなかった。本研究から，卵胞および黄体の形態はE/P比の低下のタイミングに関与していないことが示された。子宮内の免疫反応について，E/P比の低下のタイミングとの関連は明らかにされなかったが，今後，網羅的な解析が必要であると考
えられた。
文
献
１） Kaneko, H., Kishi, H., Watanabe, G., Taya, K.,

Sasamoto, S., Hasegawa, Y.：J. Reprod. Dev．，41，
311～320，1995．
２） Miura, R., Haneda, S., Kayano, M., Matsui, M.：J.
Dairy Sci．，98，318～321，2015．
Mitchell, G. B., Albright, B. N., Caswell, J. L.：
Infect. Immun．，71，1643～1649，2003．
３） Gaillard, C., Barbu, H., Sorensen, M. T., Sehested,J., Callesen, H., Vestergaard, M.：J. Dairy Sci., 99，
3134～3143，2016．
４） Arici, A., Seli, E., Senturk, L. M., Gutierrez, L. S.,
Oral, E., Taylor, H. S.：J. Clin. Endocrinol. Metab．，
83，1783～1787，1998．
５） Talukder, A. K., Rashid, M. B., Takedomi, T.,
Moriyasu, S., Imakawa, K., Miyamoto, A.：Am. J.
Reprod. Immunol., 81, e13069，2019．
６） Rashid, M. B., Anup, K., Talukder, A. K., Kusama,K., Haneda, S., Takedomi, T., Yoshino, H., Moriyasu,
S., Matsui, M., Shimada, M., Imakawa, K., Miyamoto,
A.：Biochem Biophys. Res. Commun．，500，879～
884，2018．
７）
 Kusama, K., Rashid, M. B., Kowsar, R., Marey, M.
A., Talukder, A. K., Nagaoka, K., Shimada, M.,
Khatib, H., Imakawa, K., Miyamoto, A.：Front.
Genet．，12，676791，2021．

© The Ito Foundation

217

黒毛和種雌牛の繁殖成績を改善するための栄養状態の最適化検討（Ⅱ）
Optimizing nutritional status to improve the reproductive performance ofJapanese Black cows（Ⅱ）

鍋

西

久

（北里大学獣医学部）

Hisashi Nabenishi（Department of Animal Science, School of Veterinary Medicine, Kitasato University）

A total of 264 Japanese Black cows kept on commercial farms in Aomori Prefecture were
tested for seven months from three months before calving to three months after calving, andtheir nutritional status were evaluated, and blood samples were analyzed for biochemistry to
examine the relationship with reproductive performance. We also examined the relationshipbetween plasma amino acid profiles before and after calving and reproductive performance.
We found that nutritional status and nutritional transition before and after calving affected the
reproductive performance in Japanese Black cows, that reproductive performance decreased
when the rate of decline in nutritional status immediately after calving was high, and that first
AI（－）cows showed increased body fat mobilization due to energy deficiency. Regarding therelationship between plasma amino acid profiles before and after calving and reproductive
performance, first AI（－）cows had significantly lower levels of 13 amino acids, including
those important for embryo survival and development in early pregnancy, compared to first AI（＋）cows, while 3-Me His was higher than that of the initial AI（＋）group. These results
indicate that the nutritional status and nutritional transition of Japanese Black cows before andafter calving affect reproductive performance, especially that body fat and body protein
mobilization is enhanced due to energy deficiency before and after calving, and that changes inplasma amino acid profiles may be involved in early embryo viability. Since it was suggested
that energy deficiency before and after calving triggers poor reproductive performance, it isimportant to control the significant decrease in nutritional status after calving．

１．目が求められる。泌乳によって負のエネルギーバラ

的ンスに陥りやすい乳用牛においては，分娩後の低肉用牛における繁殖成績低下の要因のひとつと栄養状態が繁殖成績を悪化させるとの知見が多くして，飼養管理技術の過誤による栄養充足率の過報告されている２～４）。肉用牛においても，分娩前不足が考えられる１）。したがって，栄養状態を個後の栄養状態が繁殖成績に影響を及ぼすことが推体ごとに把握しながら適切な飼養管理を行うこと察されるが，黒毛和種繁殖雌牛における分娩前後© The Ito Foundation

218

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）の栄養状態とその後の繁殖成績との関連についての知見は少ない。

見はない。
そこで本研究では，昨年度に引き続き大規模な

我々は，昨年度の研究において大規模な代謝プ

代謝プロファイルテストにおいて分娩前後の栄養

ロファイルテストを実施し，分娩前後の栄養状態

状態推移と繁殖機能との関連を検討するとともと繁殖成績との関連について検討を行った。新たに，新たに，繁殖雌牛の血漿中遊離アミノ酸プロに得られた知見として，不受胎牛群では分娩前ファイルに着目した解析を行うことによって，繁２ヵ月ないし１ヵ月から分娩月にかけての栄養度

殖成績を改善するための飼養管理技術の精密化検低下が受胎牛群よりも顕著なこと，エネルギー不討を試みた。

足による体脂肪動員の亢進とあわせて，卵巣機能回復の遅延による空胎日数の延長を確認し，黒毛２．方法

和種繁殖雌牛の繁殖成績改善のためには，分娩後2.1における著しい栄養状態の低下を抑制する飼養管

青森県内の大規模繁殖農場で飼養されている黒理の必要性を提案した。しかしながら，妊娠末期

毛和種繁殖雌牛のうち正常に分娩した264頭を供から分娩直後にかけての栄養状態の低下（エネル

試した。分娩予定日の３ヵ月前から分娩後３ヵ月

ギー不足）がどのように繁殖機能を抑制しているまで１ヵ月ごとに計７ヵ月間採材（採血，栄養状のか，そのメカニズムは不明である。また，繁殖態の評価）を実施した。栄養状態の判定は，公益

成績を改善するための飼養管理技術の精密化につ

社団法人全国和牛登録協会の栄養度判定要領に基いては，検討の余地が残されている。

づき９段階に区分し，全期間を通してすべての供分娩前後の栄養状態と繁殖成績との関連

血液成分や乳成分を測定して健康状態を総合的試牛で同一の判定者が実施した。採取した血液かに判断する代謝プロファイルテスト（MPT）がら得られた血漿を用いてグルコース（GLU），総

主に乳用牛を対象として実施されており ，近年

コ レ ス テ ロ ー ル（TCHO），ト リ グ リ セ ロ ー ル

では肉用牛の生産現場においても普及するように（TG），総タンパク（TP），尿素窒素（BUN），ア

なってきている６）。しかしながら，血液中の一般

ルブミン（ALB），グルタミン酸ピルビン酸トラ

生化学性状だけでは把握しきれない栄養状態の詳

ンスアミラーゼ（GPT），グルタミン酸オキサロ

細を明らかにするためにはまだ研究の余地が残さ

酢酸トランスアミラーゼ（GOT）および血中P4れている。ヒトの医療分野では鍵となる代謝物と濃度を測定した。なお，血中P4濃度の測定は，してアミノ酸にフォーカスしたアミノ酸メタボロ

分娩後の個体のみに限定して実施し，分娩後の発ミクスという評価手法が注目されている。ア

情回帰の指標とした。これらの血液性状と分娩前

ミノ酸メタボロミクスは，わずかな代謝変動でさ後における栄養状態推移（トレンド），繁殖成績

えも捉えられるというユニークな利点をもつこととの関連性について評価した。

５）

７，８）

から，分野を問わずさまざまな研究へと応用されている。乳用牛においてアミノ酸は乳生産性を向2 . 2 アミノ酸プロファイルによる繁殖雌牛の栄養状態評価上させる目的で多くの知見が報告されている一方

上記農場において供試した繁殖雌牛のうち，正で，主に妊娠初期における着床前胚の生存に重要

常に分娩した39頭を供試した。分娩予定日の１ヵな物質であることが示されているものの，血液中

月前から分娩後２ヵ月まで，１ヵ月ごとに計４ヵのアミノ酸濃度と繁殖成績との関連についての知月間の採材を行った。得られた血漿を用いて血漿© The Ito Foundation

黒毛和種雌牛の繁殖成績を改善するための栄養状態の最適化検討（Ⅱ）

219

中アミノ酸濃度39項目（タウリン：Tau，アスパラ

胎しなかった）群のNEFA濃度は，初回AI（＋）

ギン酸：Asp，ヒドロキシプロリン：Hypro，スレ（初回AIで受胎した）牛群よりも有意に高く推移

オニン：Thr，セリン：Ser，アスパラギン：Asn，

し（ｐ＜0.05），分娩前１ヵ月から分娩後２ヵ月

グルタミン酸：Glu，グルタミン：Gln，サルコシン：の期間において栄養度４では，栄養度５～７と比Sarco，α-アミノアジピン酸：α-AAA，プロリン：

較してNEFA濃度が有意に高かった（ｐ＜0.05）。

Pro，グリシン：Gly，アラニン：Ala，シトルリン：

以上のことより，黒毛和種繁殖雌牛における分Cit，α-アミノ酪酸：α-ABA，バリン：Val，シス娩前後の栄養度および栄養度推移が初回交配日

チン：Cys，シスタチオニン：Cysthio，メチオニン：

数，受胎率，実空胎日数，空胎日数に影響を及ぼMet，イソロイシン：Ileu，ロイシン：Leu，チロシ

すこと，分娩直後の栄養度低下率が大きい場合にン：Tyr，フェニルアラニン：Phe，γ-アミノ-β-

繁殖成績が低下すること，さらに初回AI（－）

ヒドロキシ酪酸：γ-Aβ-HBA，β-アラニン：

牛群では，エネルギー不足による体脂肪の動員がβ-Ala，β-アミノイソ酪酸：β-AIBA，γ-アミノ

亢進していることが示された。

酪酸：γ-ABA，エタノールアミン：MEA，ホモシ
ステイン：Homocys，ヒスチジン：His，3-メチル

3 . 2 アミノ酸プロファイルによる繁殖雌牛の栄養状態評価ヒスチジン：3-Me His ，1-メチルヒスチジン：

分娩前１ヵ月から分娩後２ヵ月における初回

1-Me His ，カル ノシン：Carno ，アン セリン：

AI成績による血漿中アミノ酸プロファイルにつAns，トリプトファン：Trp，ヒドロキシリシン：

いて，全期間を通して初回AI（－）牛群が初回Hylys，オルニチン：Orni，リシン：Lys，アルギニ

AI（＋）牛群と比較して低くなる傾向が認めら

ン：Arg）を測定した。

れた。また，空胎日数ごとの分類でもアミノ酸プ

さらに，血漿中アミノ酸濃度と初回AI妊否とロファイルに差異が認められた（Fig. １）。さらの関連について，人工知能による解析を試みた。

に，Fig. ２に示した13項目のアミノ酸（Thr，Ser，Asn，Pro，Val，Met，Ileu，Leu，Tyr，

３．結果と考察

Phe，His，Trp，Lys）については，初回AI（＋）

分娩前後の栄養状態と繁殖成績との関連

牛群と比較して初回AI（－）牛群が有意に低かっ

分娩後３ヵ月間の栄養度と初回交配日数との関た（ｐ＜0.05）。これらのことは，血漿中のアミ

係では，栄養度４は栄養度５，６と比較して初回ノ酸プロファイルが受胎性に関与することを示唆

交配日数が有意に延長した（ｐ＜0.05）。分娩後するものである。乳用牛の妊娠末期には産乳に向３ヵ月間の栄養度と実空胎日数との関係においてけた活発な栄養代謝が始まり，肝臓における糖新も栄養度の低い牛では実空胎日数の延長が認めら

生，体脂肪からの脂肪酸動員，筋肉組織からのア

れ，栄養度５は栄養度７と比較して有意に延長しミノ酸動員が増大することが報告されている９）。

た（ｐ＜0.05）。また，分娩月の栄養度と初回AI

反芻動物においてアミノ酸はクエン酸回路等の代受胎率との関係においても，栄養度４：25.0％，

謝中間体の生成に深く関与し，乳生産と生命維持

栄養度５：40.6％，栄養度６：51.3％，栄養度７：に重要な栄養素である。さらにケトーシス牛，第57.1％となり，栄養度が低いほど初回AI受胎率が四胃左方変位牛においてSerやTrp，Metなどの低かった。さらに，分娩前３ヶ月から分娩後３ヵ

糖原生アミノ酸濃度の低下も報告されてい月までの期間における初回AI（－）（初回AIで受る10，11）。Val，Lue，Ileuは分枝鎖アミノ酸（BCAA）

3.1© The Ito Foundation

220
80

令和４年度
Thr（nmol/ml）

60

90

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Ser（nmol/ml）

60

40
30

20
0

300

First AI（－） First AI（+）

Val（nmol/ml）

030First AI（－） First AI（+）

Met（nmol/ml）

Asn（nmol/ml）

60

20

40

10

20

0

120

First AI（－） First AI（+）

Ileu（nmol/ml）

10

0

0

80

First AI（－） First AI（+）

Tyr（nmol/ml）

80

60

60

40

40

20

20

0

150

First AI（－） First AI（+）

00

Phe（nmol/ml）

30First AI（－） First AI（+）

His（nmol/ml）

050First AI（－） First AI（+）

Trp（nmol/ml）

40
30

40

20

20
0

Leu（nmol/ml）

60

60First AI（－） First AI（+）

150

First AI（－） First AI（+）

90

30
First AI（－） First AI（+）

0

Pro（nmol/ml）

120

60
100

80

30

90

20

200

40

10
First AI（－） First AI（+）

0First AI（－） First AI（+）

Lys（nmol/ml）

100
50
0

First AI（－） First AI（+）

Fig. 1 Plasma amino acid profile classified by first AI performance. Significant differences were observed in all

categories（ｐ＜0.05）．
First AI（＋）：Did conceive at first AI
First AI（－）：Did not conceive at first AIと呼ばれ，エネルギー代謝と関連するアミノ酸でHisが高値を示し，≦80日牛群と比較して有意差ある。これらはすべて初回AI（＋）牛群が（－）

が認められた（ｐ＜0.05）（Fig. ３）。また，空胎牛群と比較して有意に高かった。これは分娩前後日数＜80日と比較して＞161日で有意に高かったの乾物摂取量を反映していると考えられた。

（ｐ＜0.05）。乳用牛において3-Me His濃度はたん

初回AI日数が分娩後81日を超える（＞81）牛

ぱく質栄養レベルの変化や乾物摂取量の変化を反群では，体たんぱく質動員の指標である3-Me

映していると報告されている12）。したがって，体© The Ito Foundation

221

黒毛和種雌牛の繁殖成績を改善するための栄養状態の最適化検討（Ⅱ）≦80
81ー160

Lys≧161

Arg 1.4

Tau

Asp

1.2

Orni

Hypro
Thr

1

Trp

Ser

0.8

Carno

Asn

0.6
0.4

1-Me His

Glu

0.2

3-Me His

Gln

0

Pro

His

Gly

Phe
Ala

Tyr
Cit

Leu
Ileu

Met

Cys

Val

α- ABA

Fig. 2 Plasma amino acid profile classified by number of days open．

（i）

（ii）

10

10

8
a
6

4

a
6

4

2

2

0

ab

8
3-Me His（nmol/ml）

3-Me His（nmol/ml）

b

b

≦80

0

≧81

≦80

Calving to ﬁrst AI interval

81ー160≧161

Days open

Fig. 3 Comparison of 3-Me His concentrations classified by calving to first AI interval（i）, number of days open（ii）.

Statistically significant differences are indicated by different letters（p＜0.05）．

たんぱく質のアミノ酸分解，すなわち，エネル

示した。Glyについては空胎日数＜80日，81－160

ギー源の補足の結果であると推察された。

日と比較して＞161日で有意に高かった（ｐ＜

空胎日数とGly，Tau濃度との関係をFig. ４に

0.05）。Tauについては空胎日数＜80日，81－160© The Ito Foundation

222

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

（i）

（ii）
30

450
b

400

25

a

300

a

Tau（nmol/ml）

Gly（nmol/ml）

350

250
200

a
a

20
b

15

10

150
100

5

50
0

≦80

81ー160

≧161

0

≦80

81ー160≧161

Days open

Days open

Fig. 4 Comparison of Gly（i）, Tau（ii）concentrations classified by number of days open. Statistically significant

differences are indicated by different letters（p＜0.05）．

日と比較して＞161日で有意に低かった（ｐ＜Cit，Val，１-Me His，His，Tyr，３-Me His，

0.05）
。Glyは乾物摂取量が低下する分娩前に比べ，Leu，Thr，Tauの順で初回AI妊否への寄与度が乾物摂取量が増加する分娩後は低値になると報告高かった。

している 。空胎日数＞161日のGly濃度の上昇は，初期のウシ胚は利用可能なすべてのアミノ酸を分娩前後のエネルギー要求量の増大に伴うアミノ

使用するとされている。母体由来のアミノ酸は主酸不足を筋肉組織からの動員で補う結果であるとに妊娠初期における胚の生存と発達のために重要考えられた。Tauは50％以上が筋肉に存在し，カであり，アミノ酸代謝量はヒトの胚生存率の指標

ルシウムイオンの動員，浸透圧調節作用，抗酸化としても活用されている。本研究において，黒毛作用などを介して筋収縮や運動において重要な作

和種繁殖雌牛の分娩前後の血漿中アミノ酸プロ用を担っており，筋機能維持におけるTauの重要ファイルに初回AI受胎牛と不受胎牛間で有意な性が示唆されている。さらに，ウシ体外受精培地差異が認められたことから，黒毛和種繁殖雌牛にへのハイポタウリン添加により，単精子侵入率のおいて，分娩前後のアミノ酸プロファイルは分娩増加，精子侵入および前核融合速度の上昇，卵割後の栄養状態および繁殖成績と深く関連すると考速度の促進，胚盤胞への発生率の上昇が報告されえられ，分娩前後の血漿中アミノ酸プロファイルている 。したがって，低いTau濃度が受精速度を評価することは，繁殖雌牛の栄養状態を精密化の低下や胚盤胞発生率の低下を引き起こし，空胎

するうえで，有用な情報になり得ることが示唆さ

日数を延長させた可能性が考えられた。

れた。

13）

14）

血漿中アミノ酸濃度と初回AI妊否との関連に以上のことから，黒毛和種繁殖雌牛における分

つ い て ，AI（人 工 知 能）解 析 を 行 っ た と こ ろ

娩前後の栄養度および栄養度推移が繁殖成績に影© The Ito Foundation

黒毛和種雌牛の繁殖成績を改善するための栄養状態の最適化検討（Ⅱ）

223

響を及ぼすこと，特に分娩前後のエネルギー不足

響を及ぼすこと，特に分娩前後のエネルギー不足

による体脂肪，体たんぱく質の動員が亢進していによる体脂肪，体たんぱく質の動員が亢進していることが明らかとなり，さらに血漿中アミノ酸プることが明らかとなり，さらに血漿中アミノ酸プ

ロファイルの変化が初期胚の生存性に関与していロファイルの変化が初期胚の生存性に関与している可能性が推察された。分娩前後のエネルギー不る可能性が推察された。分娩前後のエネルギー不足が繁殖成績低下の引き金になっていることが示

足が繁殖成績低下の引き金になっていることが示

唆されたことから，この間の栄養状態を保つ飼料

唆されたことから，分娩後における著しい栄養度設計が重要となる。

低下を抑制する飼養管理が重要となる。

４．要約

青森県内の民間農場で飼養されている黒毛和種
繁殖雌牛264頭を供試し，分娩予定日の３ヵ月前から分娩後３ヵ月まで１ヵ月ごとに計７ヵ月間にわたって栄養度評価と採血による生化学分析，性ホルモン分析を実施し繁殖成績との関連を検討した。さらに，分娩前後の血漿中アミノ酸プロファ
イルと繁殖成績との関連についても検討した。
黒毛和種繁殖雌牛における分娩前後の栄養度および栄養度推移が初回交配日数，受胎率，実空胎
日数，空胎日数に影響を及ぼすこと，分娩直後の栄養度低下率が大きい場合に繁殖成績が低下する
こと，さらに初回AI（－）牛群では，エネルギー不足による体脂肪動員の亢進が認められた。
分娩前後の血漿中アミノ酸プロファイルと繁殖成績との関連については，初回AI（－）牛群では，妊娠初期における胚の生存と発達のために重要とされるアミノ酸を含む13項目のアミノ酸で初回AI（＋）牛群と比較して有意に低かった一方で，体たんぱく質動員の指標である３-Me Hisは高値を示した。
以上のことから，黒毛和種繁殖雌牛における分娩前後の栄養度および栄養度推移が繁殖成績に影文
献１）
 鍋西久，坂口浩平，亀樋成美，黒木幹也：肉用牛研究会報，101，６～11，2016．
 平子誠，高橋ひとみ，櫛引史郎：日本家畜臨床感２）染症研究会誌，6（3）, 2011．
３）
 坂口実，笹本良彦，鈴木貴博，高橋芳幸，山田豊：
北畜会報，45，33～40，2003．
 阿部榮，植松正巳，斎藤博水，渡辺大作：家畜臨
４）
床誌，27（2），46～50，2004．
５）
 Kida, K.：Journal of veterinary medical science ，65（6），671～677，2003．
 Watanabe, U.：Journal of Veterinary Science, 15
６）（2），283～288，2014．
７）
 Kami, K., Fujita, Y., Igarashi, S., Koike, S.,
Sugawara, S., Ikeda, S., Sato, N., Ito, M., Tanaka, M.,
Tomita, M., Soga, T.：Mitochondrion，12，644～653，2012．
 Muroya, S., Oe, M., Nakajima, I., Ojima, K.,
８）
Chikuni, K.：Meat science，98，726～735，2014．
９）
 Bell, A. W.：Journal of Animal Science，73，2804～2819，1995．
 Baird G. D., Heitzman, R. J., Hibbitt, K. G.：
10）Biochem J，128，1311～1318，1972．
11）
 Hamana, M., Ohtsuka, H., Oikawa, M., Kawamura,
S.：Journal of Veterinary Medical Science，72，1355～1358，2010．
 澤田久美子，長野京子，今村正昭，柴田幸児，西12）
野直樹：家畜衛生学雑誌，39（4），165～171，2014．
13）
 Reis, R., Figueiredo, J. B., Pacheco, M. Cowpox.：
Arquivos da Escola de Veterinaria，22，213～216，
1970．
14）
 堀登，松田達彦，石田美保，小前博文，永井卓：
Journal of Reproduction and Development ，43 ，33～40，1997．

© The Ito Foundation

224

南西諸島地域における肉用ヤギの消化管内部寄生線虫
感染症に関する実態調査
Investigation of gastrointestinal parasites infection of meat goats in southwestern islands, Japan

波

平

知

之

（琉球大学農学部附属亜熱帯フィールド科学教育研究センター）

Tomoyuki Namihira（Subtropical Field Science Center, Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus）

The gastrointestinal parasites of Haemonchus contrtus, Strongyloides papillosus andCocsidia were examined in a total of 112 meat goats raised in south-western islands, Japan（Kikai, Okinoerabu, Okinawa, Kume, Miyako, Ishigaki, Iriomote, and Yonaguni）. Eggs per gram
（EPG）of Haemonchus contrtus were higher in outdoor feeding-goat than in indoor feedinggoat, and it was also higher in group feeding-goat than in individual feeding-goat. In adthtion,
EPG was higher in the fresh forage feeding-goat than in hay and concentrated feeding-goat.
As the biochemical blood value, outdoor feeding-goat had low PVC and TCHO, and high GOT
and GGT. Fresh forage feeding-goat had low TCHO, and high GOT and GGT. The values ofCa, IP, Na, K and Cl were not significantly different with the different feeding managements.

１．目

ることが明らかになった２）。沖縄地域でのヤギの的寄生虫感染による死亡事例は報告３）されているが南西諸島地域の高温多湿の気象環境は暖地型イ

その感染経路の実態は不明で，また，我が国では

ネ科牧草の高位生産が可能なため，飼料作物の10

ヤギ用の動物医薬品も少なく，牛や豚で使用されａあたりの生産量は全国平均の約３倍１）である。

ている駆虫薬剤のヤギに対する効果を実証的に明しかしながら，肉用ヤギの飼養環境としては寄生らかにされた報告は少ない。肉用牛や乳用牛，肉虫感染のリスクが高い。そのため，当地域のヤギ

豚，鶏などの主要家畜とは異なり，我が国では肉農家は高床式畜舎の舎飼管理が主流である。琉球

用ヤギの日本飼養標準はなく，駆虫方法について

大学農学部附属亜熱帯フィールド科学教育研究セ

も必ずしも確立しているとは言い難い。

ンターでは暖地型イネ科牧草地での肉用ヤギの周本研究では，肉用ヤギの飼養が盛んな南西諸島

年放牧技術の開発を目的に2019年に肉用ヤギ（ボ地域において，ヤギの消化管内部寄生線虫感染の

ア系雑種）を導入したが，放牧による管理方式で実態調査を行い，その感染状況を地域別ならびには死亡率が30％以上と放牧試験すら実施できない

飼養管理方法の違いによる影響について検討を行状況となり，これらの死因は捻転胃虫感染症によう。すなわち，現在の最重要課題である寄生虫感© The Ito Foundation

南西諸島地域における肉用ヤギの消化管内部寄生線虫感染症に関する実態調査

225

染症を克服するための，また，家畜の増頭を可能

心法で，血液学的および生化学的血液成分（ヘモにする肉用ヤギに関する飼養管理技術の確立に向グロビン［Hb］，アルブミン［Alb］，総タンパク

けた基盤の構築を目的とする。将来的には放牧管

質［TP］，総コレステロール［TCHO］，グルタ

理を中心とする国産100％のヤギ肉生産の振興

ミン酸オキサロ酢酸トランスフェラーゼ（60頭規模の生産農家の経営確立）につなげたい。

［GOT］，γ-グルタミルトランスペプチターゼ

２．方［GGT］，アルカリホスフォターゼ［ALP］，尿素法

窒素［BUN］，カルシウム［Ca］，リン［IP］，ナ

調査期間は2022年10月上旬から2023年３月末まトリウム［Na］，カリウム［Ｋ］，塩素［Cl］）はで，ヤギ肉の生産が行われている南西諸島地域の臨床化学分析装置（富士ドライケムNX500，富士

鹿児島県喜界島（２農家），沖永良部島（１農家），

フイルム，東京）にて分析した。

沖縄本島（４農家），久米島
（１農家）
，宮古島
（４

なお，本研究での調査個体の血液採取は，協力

農家）
，石垣島
（２農家）
，西表島
（２農家）
および与

農家の同意を得て，また，琉球大学動物実験規則

那国島の８地域で調査を実施した。調査対象農家

に従い，地域の家畜保健衛生所の獣医師の協力をは約20頭以上のヤギを飼養し，JA家畜セリ市場，得て実施した。

沖縄県食肉センターならびに喜界島町営と畜場のいずれかにヤギを出荷して収入を得ている生産農家とした。調査個体は分娩歴のある雌ヤギと種雄として長期に養われている雄ヤギを調査個体とし

３．結果と考察3 . 1 調査地域における肉用ヤギの飼養管理方
法

た。なお，与那国島については20頭規模のヤギを

本調査対象農家における肉用ヤギの飼養管理方

飼養している生産農家が存在していなかったた法をTable１に示した。各地域における肉用ヤギ

め，島内の野草地で繋牧されている個体８頭を無の飼養方法は群飼と単飼に分けられ，その中で畜作為に抽出し調査した。試験期間における合計調舎内の高床管理，畜舎内のコンクリート床での平査頭数は112頭である。調査方法は農家が飼養し飼管理，屋外での平飼管理，牧草地の放牧管理おているヤギから約4-5頭を選抜し，約10g以上のよび野草地での繋留管理の５つの方法に分類され直腸糞を採取して糞便検査に供した。糞便検査はた。その比率は，畜舎内の高床管理（36％）＞野

ショ糖遠心浮遊法のウイスコンシン変法を用い

草地での繋留管理（25％）＞牧草地の放牧管理て実施し，糞便1gあたりのEPG（Eggs per gram）（18％）＞畜舎内のコンクリート床での平飼管理とOPG（Oocysts per gram）を算出した。なお，（14％）＞屋外（土）での平飼管理（７％）であっ

本検査では，羊やヤギの消化管に寄生し，病原性た。各地域におけるすべてのヤギ農家の調査は実の高い捻転胃虫（Haemonchus contortus），乳頭

施できなかったものの，地域別での飼養管理方法

糞線虫（Strongyloides papillosus）ならびにコクに特徴的な違いは認められず，ほぼ同じであっ

シジウム原虫（Coccidian）に限定して計測した。

た。群飼と単飼を比較すると，その比率（それぞまた，寄生虫感染による健康状態への影響を確認

れ50％）に違いはなく，飼養頭数の多い農家は主するため，糞便採取したヤギ個体を適正に保定に畜舎内での高床管理で，飼養頭数の少ない農家

し，頸静脈から採血（７ml）を行い，血液成分

は野草地での繋留管理が多かった。また，野草地の分析に供した。ヘマトクリット値（Ht）は遠での繁留管理では雌ヤギの分娩状況や出荷状況な４）© The Ito Foundation

226

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 1 The number of investigatied meat goat farmer in South-western islands, Japan
Feeding method

Group feeding-goat

Individual feeding-goat

Total

Ratio（%）

5

5

10

36

Concreate-floor barn

2

2

4

14

Tether-grazing

―

7

7

25

Grazing

5

―

5

18

Soil-floor in outdoor

2

―

2

7

Total

14

14

28

100

Ratio（%）

50

50

100

―

Raised-floor barn

Indoorfeeding-goat

Outdoorfeeding-goat

Table 2 The gastrointestinal parasites in meat goat in South-Western islands, Japan
RegionHaemonchus contorus
EPG（number/g）

Strongyloides papillosus
EPG（number/g）

Coccidia
OPG（number/g）

Kikai islands（n=7）

48.4±126.3

0.6±0.7

284.1±338.7

Okinoerabu islands（n=6）

417.6±525.951.2±114.5

125.9±238.0

Okinawa islands, Nakijin（n=16）1362.7±3671.0

2.3±4.9352.4±307.4

Okinawa islands, Nishihara（n=10）

164.8±259.897.2±272.0

305.2±356.2

Okinawa islands, Itoman（n=4）

670.8±649.7

4.2±8.4

544.7±112.2

Kumejima islands（n=5）

32.0±40.3

2.9±6.5

360.1±329.0

Miyako islands （n=24）

430.1±1409.5

9.5±30.7

144.6±243.8

Ishigaki islands（n=11）973.1±2013.3

18.4±44.7

3291.6±6923.6

Iriomote islands（n=21）

139.2±158.2

25.4±88.0

3.8±7.7

Yonaguni（n=8）

856.8±1253.1

2.2±5.0

24.6±48.9

Mean±standard deviation

どに応じて小規模の畜舎に移動させた飼養管理を

線虫のEPGやコクシジウム原虫のOPGは調査個行う農家が多かった。高温多湿の気象環境である体によるばらつきが認められ，飼養管理方法や飼南西諸島地域では乾燥条件を好むヤギの生理生態養しているヤギの系統などの違いによる影響と考的特徴を考慮して飼養している農家は多く，そのえられた。地域別での寄生虫感染を比較すると，結果，畜舎内の高床管理が主流となっているもの

肉用ヤギの飼養頭数が多い沖縄地域（沖縄本島，と考えられた。

宮古島，石垣島および与那国島）では捻転胃虫の3 . 2 地域別の消化管内部寄生線虫感染の実態調査

５）
EPGは治療を要する感染レベル（500個/g）に達していた。また，西表島と与那国島の調査個体

南西諸島地域における肉用ヤギの消化管内部寄

には，捻転胃虫と乳頭糞線虫のEPGが未検出の個

生線虫感染症の感染状況についてTable２に示し体も存在していたものの，コクシジウム原虫のた。鹿児島県の喜界島から沖縄県の与那国島まで

OPGは調査したすべての個体から検出された。

の地域におけるヤギの糞便から病原性の高い捻転

各地域において，ヤギの飼養管理方法は畜舎の場

胃虫卵，乳頭糞線虫卵およびコクシジウム原虫

所や飼養頭数に応じた農家独自の工夫（高床，放オーシストが検出された。捻転胃虫および乳頭糞

牧，繋留あるいはそれらの組み合わせ）が認めら© The Ito Foundation

南西諸島地域における肉用ヤギの消化管内部寄生線虫感染症に関する実態調査

227

れたが，管理技術に関した統一性は認められず，の 感 染 に 関 し て は 高 床 管 理 で あ っ て も OPG は

我が国における肉用ヤギの飼養管理技術は必ずし

2,101 個 /g の 値 を 示 し ，治 療 を 要 す る レ ベ ルも確立しているとは言い難いものと推察された。

（1,000個/g）６）に達していた。群飼の場合は高床管

本調査においては，南西諸島地域のヤギには世界理であっても寄生虫感染を蔓延させるリスクが高的に蔓延している熱帯性の捻転胃虫の存在が確認いことが推察される。これらの結果を考慮すると，された。

南西諸島地域における肉用ヤギの飼養管理方法

3 . 3 飼養管理方法の違いによる消化管内部寄は，寄生虫感染リスクを回避する観点からは高床式畜舎での単飼管理が最も適し，青草のみの飼養

生線虫感染の比較
飼養管理方法の違いによる肉用ヤギの消化管内管理よりも乾草給与が望ましいことが示唆された。

部寄生線虫の感染状況をTable３に示した。捻転

3 . 4 飼養管理方法の違いによる肉用ヤギの血胃虫のEPGが最も高く検出されたのは牧草地での液学的および生化学的血液成分

放牧管理（1,914個/g）であり，ついで野草地で飼養管理方法の違いによる肉用ヤギの血液学的の繋留管理（471個/g），屋外（土）での平飼管および生化学的血液成分をTable５に示した。寄理（294個/g）であった。放牧管理における捻転

生虫の感染レベルの高かった放牧管理は舎飼管理

胃虫のEPGは治療を要する感染レベルの約４倍程や繋留管理などに比べてHtが低い値（24.7％）を度の値となっていた。高床管理やコンクリート床示していた。一般的に捻転胃虫感染が重度の場合

での畜舎管理においては，捻転胃虫卵は検出されはHtが10％台の著しい貧血状態になる場合が多たものの，その感染レベルは低かった。

い７）。本調査時において，放牧管理のEPGは1,914

給与飼料の違いによる消化管内部寄生線虫の感個/gと高くなっていたが，Htは正常値８）の範囲

染状況をTable４に示した。乾草と濃厚飼料を給内にあり，捻転胃虫感染症による悪影響は示して与して飼養管理されているヤギは捻転胃虫感染症

いないものと推察された。なお，本研究では顕微の感染レベルは低かったものの，青草を給与して鏡での形態観察によって寄生虫卵を同定したた飼養管理されているヤギは治療を要する感染レベ

め，特に放牧個体についてはDNAを用いたPCR

ルに達していた。畜舎内の高床管理のEPG（48

検査によって捻転胃虫感染を再検査する必要があ

個/aと210個/g）と畜舎内のコンクリート床でのるものと考えられた。

平飼管理のEPG（23個/g）が他の管理方法のEPG

栄養状態を示すTCHOは青草のみを給与していと比較して著しく低い値を示していたことから，る飼養管理（放牧管理や繋留管理など）は畜舎内

高温多湿の環境下にある南西諸島地域においてで乾草と濃厚飼料を給与している飼養管理よりもは，放牧地あるいは野草地での繋留管理はヤギと低く，正常値８）を下回る値（70.5mg/dl）となっ土壌との接触が常にあり，また，青草（牧草や雑ていた。青草のみでの飼養管理では乾物摂取量を草など）を採食していることによって捻転胃虫の満たしていない可能性が示唆された。肝機能の状

経口感染が広がっているものと推察された。

態を示すGPTはいずれの管理方法ともに正常値８）

群飼と単飼の違いによる寄生虫感染状況を比較

以下の値であり，また，GGTは高床式の飼養管すると，捻転胃虫とコクシジウム原虫の感染は，理を除いて正常値８）よりも高い値となっていたが単 飼 よ り も 群 飼 に お い て ２ 倍 以 上 高 い EPG とその要因については不明である。その他の成分値

OPGの値を示していた。特にコクシジウム原虫については正常値８）の範囲内にあった。これらの© The Ito Foundation好であるものと推察された。
Group feeding

結果から，本調査で検査したヤギの健康状態を総合的に考察すると，いずれのヤギともに血液学的および生化学的血液成分の面からは健康状態は良Strongyloides papillosus
EPG（number/g）
2.0±1.3
32.4±31.0

Coccidia
OPG（number/g）
757.4±899.1
255.2±273.5

４．要© The Ito Foundation
32.6±5.911.4±1.8
3.3±0.3
7.4±0.888.8±35.485.2±37.0
67.9±27.4
262.8±358.8
14.0±7.8
9.2±0.6
5.6±1.5
148.8±1.4
5.8±1.7
111.7±2.6

32.7±0.2
11.2±0.3
3.2±0.2
7.2±0.486.2±3.779.0±8.879.3±16.1
358.2±134.9
14.3±0.4
9.2±0.0
6.6±1.4
147.8±1.3
5.2±0.7
110.0±2.4

31.0±2.0
10.0±0.7
3.9±0.1
8.7±0.3
67.7±14.2
89.7±19.4
92.0±15.7
997.3±1299.2
20.7±11.9
8.9±0.5
4.1±0.5
146.3±0.6
7.1±1.6
108.3±2.5

Soil-floor barn
（n=3）

＊The data was indicated in a text book of Livestock Physiology (In Japanease）

32.9±4.5
11.0±0.8
3.0±0.2
6.9±0.783.6±15.372.8±19.7
90.8±31.2
453.6±360.2
14.0±7.8
9.2±0.6
7.6±2.7
146.6±1.9
4.7±0.5
108.3±2.1

Mean±SDHay and concentrate feeding-goat
Raised-floor barn Concreate-floor（n=17） barn（n=12）

Mean±standard deviation

PCV（%）
Hb（g/dl）
ALB（g/dl）
TP（g/dl）
TCHO（mg/dl）
GOT（IU/l）
GGT（IU/l）
ALP（I U/l）
BUN（mg/dl）
Ca（mg/dl）
IP（mg/dl）
Na（mmol/l）K（mmol/l）
Cl（mmol/l）temTether-grazingin native plant Grazing（n=13）
Mean±SD（n=14）
30.3±5.0
24.7±5.7
28.7±3.4
10.1±2.1
9.2±1.99.7±0.5
3.3±0.6
3.3±0.6
3.3±0.5
9.0±1.1
7.4±1.88.4±0.872.8±44.6
70.9±27.870.5±2.695.5±34.0
82.7±37.5
89.3±6.4
126.9±1116.3
77.5±36.4
98.8±25.4
261.2±334.9
300.3±385.6
519.6±414.2
16.9±4.2
10.1±4.3
15.9±5.4
9.5±0.99.0±2.8
9.1±0.3
6.7±2.3
4.4±1.7
5.1±1.4
147.9±1.0147.2±2.9147.1±0.8
6.8±1.55.9±1.8
6.6±0.6
110.5±2.4111.1±2.6110.0±1.4

Fresh grass feeding-goat

Table 5 Effect of feeding methods on hematological and biochemical blood components in meat goats in South-western islands, Japan

Mean±Standard deviation

Hay and concentrate feeding-goat
Fresh forage feeding-goat

Haemonchus contorus
EPG（number/g）
79.5±87.3
893.2±889.2

22-38
8-12
2.7-3.9
5.9-7.4
80-13067-117
43-71
42-77515-33
8.5-10.2
7.5-12.3
142-155
3.5-6.7
99-110Normalrange＊

令和４年度

Feed

Individual feeding

Haemonchus
Strongyloides
Haemonchus
Strongyloides
Coccidia
Coccidia
contorus
papillosus
contorus
papillosus
OPG（number/g）
EPG（number/g） EPG（number/g）
EPG（number/g） EPG（number/g） OPG（number/g）
48
3
2101
210
3
265
23
1
248
37
1
415
―
―
―
471
35
85
1915
62
110
―
―
―
294
0
571
―
―
―
569.9±905.0
16.3±30.3
757.4±916.5
239.3±218.3
13.3±19.2
255.2±165.4

Table 4 Effect of feed on gastrointestinal nematode infection in meat goat in South-Western islands, Japan

Indoorfeeding-goat

Raised-floor barn
Concreate-floor barn
Tether-grazing
OutdoorGrazingfeeding-goat
Soil-floor in outdoor
Mean±standard deviation

Feeding methods

Table 3 Effect of feeding method on gastrointestinal nematode infection in meat goat in South-western islands, Japan228
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

約

南西諸島地域（鹿児島県喜界島，沖永良部島，

沖縄本島，久米島，宮古島，石垣島，西表島およ南西諸島地域における肉用ヤギの消化管内部寄生線虫感染症に関する実態調査

び与那国島）で飼養されている合計112頭の肉用
ヤギの糞便検査を行い，消化管内部寄生線虫感染症の実態調査を実施した。その結果，各地域のヤギの糞便から熱帯性の捻転胃虫の他，乳頭糞線虫
およびコクシジウム原虫が検出された。病原性の高い捻転胃虫のEPGを飼養管理方法の違いで比較
すると，舎飼管理に比べて屋外管理（繋留管理と放牧管理）で高く，また，単飼管理より群飼管理で捻転胃虫のEPGが高くなった。給与飼料の違い
では，乾草と濃厚飼料を給与した場合よりも青草を給与した場合にEPGが著しく高かった。血液検
査では，ヤギの健康状態への悪影響は認められなかったものの，舎飼管理より屋外管理でPCVとTCHOが低く，給与飼料の違いでは，乾草と濃厚飼料を給与するより青草給与でTCHOが低く，
GOTやGOTが高かった。Ca，IP，Na，K，Clは

229

文
献
１）
 農林水産省大臣官房統計部：農林水産統計，作物
統計調査，11，2023．［2023年４月12日引用］U RL：https://www.maff.go.jp/j/tokei/kouhyou/
sakumotu/sakkyou_kome/attach/pdf/index-13.pdf
２）
 琉球大学農学部附属亜熱帯フィールド科学教育研究センター：琉球大学農学部附属亜熱帯フィールド
科学教育研究センター年報，18号，13，2019．
 奥村尚子，豊島靖：沖縄県家畜衛生試験場年報，
３）
55，95～97，2019．
４）
 平詔享：獣医寄生虫検査マニュアル．93．文英堂
出版，東京，2016．
 Handbook for the Control of Internal Parasites of５）
Sheep & Goats-2019: University of Guelph,
Canada．（新井由里香，井上誠士，塚原洋子，元村誠（訳）：め ん 山 羊 の 内 部 寄 生 虫 防 除 ハ ン ド ブ ック），13～17，2019．
 堀井洋一郎，梅木俊樹：動薬研究，65，1～10，
６）
2009．
７）
 柄武志，中川和克，川口めぐみ，山西富野，中谷英嗣，松本容二，國吉佐知子，村上久志：日本獣医師会雑誌，59，607～611，2006．
８） 津田恒之，小原嘉昭，加藤和雄：第二次改訂増補，
家畜生理学．306．養賢堂，東京，2004．

管理方法の違いによる影響は認められなかった。

© The Ito Foundation

230

遺伝性心筋症による豚の突然死の病態解明と生前検査法の確立
Pathogenesis of sudden death in pigs due to genetic cardiomyopathy andestablishment of antemortem diagnostic method

相

原

尚

之・志

賀

崇

徳

（麻布大学獣医学部）

Naoyuki Aihara and Takanori Shiga（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

The high mortality rate of fattening pigs is an important issue that directly affects
producersʼ profitability. The authors encountered a case in which a group of male pigs died asa result of anesthesia during castration and found that the cause of death was hereditary
cardiomyopathy resulting from abnormal dystrophin expression. This study aimed to establish
an antemortem testing method for diagnosing hereditary cardiomyopathy caused by abnormal
dystrophin expression and understand the pathogenesis of genetic cardiomyopathy-driven
sudden death in pigs. In this study, pigs from two families exhibiting dystrophin expression
abnormalities were used for electrocardiographic measurements under isoflurane inhalation
anesthesia. In the family lineage exhibiting sudden death during anesthesia, mutant carriers
showed premature ventricular contraction at high isoflurane concentrations and cardiac
function abnormalities. Pathological examination revealed hemorrhage in the heart anddegenerative findings in the myocardium, whereas morphological examination confirmed
severe cardiac injury. On the contrary, the family lineage exhibiting dystrophin expression
abnormalities due to skeletal muscle degeneration during slaughter showed no abnormalities
on electrocardiogram under similar anesthesia conditions. This study established a method foranalyzing cardiac function under isoflurane anesthesia as an antemortem diagnostic method forhereditary cardiomyopathy. Examination of two mutation-carrying families revealed that theextent of effects on cardiac function varied with the mutation, indicating that cardiac function
tests are useful for assessing the risk of sudden death. Additionally, a dystrophin gene mutation
associated with swine stress syndrome like symptom, which was previously reported in the
United States, was detected in Japan. This suggests that dystrophin gene mutations are widelydistributed. Therefore, it is necessary to investigate the actual situation using the antemortem
testing method established in this study．

© The Ito Foundation

遺伝性心筋症による豚の突然死の病態解明と生前検査法の確立

１．目

的

２．方

231

法

肥育豚の高い死亡事故率は生産者の収益低下に本研究に関わる動物実験は，麻布大学動物実験直結する重要課題である。著者らは去勢時の麻酔委員会の許可を受け（承認番号：211203-１），麻により雄豚が集団で死亡する事例に遭遇し，死因

布大学動物実験指針を遵守して実施した。

がジストロフィン発現異常による心不全であるこ

2.1

動物および検査材料とを明らかにした。その同腹子からジストロフィ

ジストロフィン遺伝子異常が確認された２家系

ン発現異常による遺伝性心筋症の豚家系を作出

を実験に用いた。

し，ジストロフィン遺伝子異常の検出法と心筋症

家系１：本学で飼育するジストロフィン遺伝子異研究に有用なブタモデルを確立した（特願2021-

常の保因雌豚１頭を交配し産子を得た。産子11頭

56429）。遺伝病は現場適用可能な検査法が確立さ（３ヶ月齢，54.6～63.8kg）は，イソフルラン吸入れることにより育種選抜で排除することができ，麻酔下での心電図検査，組織学的評価，免疫組織

肥育中の突然死を未然に防ぐことで事故率低減に学的検索を実施した。その内訳は変異保因豚６頭貢献できる。本研究の目的は，ジストロフィン発と非保因豚５頭である。

現異常による遺伝性心筋症による豚の突然死の実

家系２：食肉検査時に骨格筋病変を認めた個体と態を明らかにし，その生前診断法を確立すること血縁関係を持ち，ジストロフィン発現異常が明らである。

かになった家系の雄豚５頭について，５ヶ月齢

我が国における離乳後肥育豚の事故率は5.9％（89～112kg）においてイソフルラン吸入麻酔下調査と情報 2018），事故率のでの心電図検査，組織学的評価，免疫組織学的検低減が生産者の収益性向上に直結する。肥育豚の索を実施した。その内訳は変異保因豚３頭と非保死亡原因の特定は難しく，特に出荷直前での突然因豚２頭である。

とされ（農中総研

死は離乳直後の飼料の問題（セレン・ビタミンＥ

また，食肉検査時に変性性筋病変として摘発さ欠乏）や感染症等の飼養失宜とは異なり，飼養管れた約６ヶ月齢の豚６頭を対象に，ジストロフィ

理では対応できない遺伝性素因が関与することがン遺伝子の変異部位の解析を行った。

あり，摘発には新規の検査法が必要である。ブタ

2.2

心電図検査

におけるジストロフィン異常症は，肥育中の突然心電図検査は，アルファキサロン：５mg/kg

死や肉質の悪化に関与することが明らかになった（アルファキサン Ⓡ ；Meiji Seikaファルマ株式会

遺伝性の疾患である１～４）。本研究は，出荷期の突社）およびジアゼパム：0.5mg/kg（ジアゼパム

然死に関与するジストロフィン発現異常による遺注射液５mg「タイヨー」；武田テバファーマ株式

伝性心疾患の実態を明らかにし，生産現場・育種会社）を筋肉内注射，または塩酸メデトミジン

選抜において摘発・淘汰するために必要な技術を

0.06mg/kg（ドミトール；日本全薬工業株式会構築する。

社），ミダゾラム0.2mg/kg（ドルミカム注射液

この目的の達成にあたり，この遺伝性心筋症の10mg；丸石製薬株式会社）および酒石酸ブトル

病態解析，現場で実施可能な麻酔による生前診断

ファノール0.2mg/kg（ベトルファール５mg；明法の検討を実施した。

治アニマルヘルス株式会社）を筋肉内注射して鎮静後，麻酔薬気化器によりイソフルラン（マイラ© The Ito Foundation

232

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Fig. 1 Isoflurane inhalation anesthesia method. Electrocardiography was

performed under anesthesia．

ン製薬株式会社）を吸入させた。イソフルラン濃て RNA を 抽 出 し た 。逆 転 写 反 応 は SuperScript

度を１％から４％まで徐々に上昇させ，心電図をIV First-Strand Synthesis System（invitrogen）

記録した（Fig. １）。

を 用 い ，付 属 説 明 書 に 従 い 行 っ た 。得 ら れ た

2 . 3 病理解剖学的検査および病理組織学的検
査

cDNAテンプレートとして，既報のプライマーを用いてPCRを実施した １）。PCR産物は１％アガ

心電図検査後は速やかにペントバルビタールナ

ロ ー ス ゲ ル で 電 気 泳 動 し ，目 的 の バ ン ド を

トリウムの静脈内過剰投与を行い，病理解剖に供

NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（タカラバイ

し，心臓および骨格筋を採材した。採材した材料

オ株式会社）を用いて精製し，シークエンス解析

を10％中性緩衝ホルマリンで固定後，常法に従い（ユーロフィンジェノミクス株式会社）を実施しパラフィンブロックに包埋した。ミクロトームをた 。 参 照 配 列 と し て は，National Center for

用いて３μｍに薄切し，ヘマトキシリン・エオジ

Biotechnology Informationに登録されている豚のン染色（HE染色）を実施した。

ジストロフィンmRNA（NM_001012408.1）を用

2.4

免疫組織学的検索

い た 。 検 出 さ れ た 点 変 異 は ， PolyPhen-2

免疫組織染色により，上記解析材料中のジスト（PolyPhen-2：prediction of the functional effects

ロフィン発現を評価した。抗ジストロフィン抗体

of human nsSNPs（harvard.edu））により解析し，には，Ab15277（希釈倍率500倍，polyclonal，Ｃ

スコア0.15以上を病原性がある変異として記録し末端認識抗体）およびNCL-DYS1（希釈倍率100

た。

倍，clone Dy4/6D3，Rod領域認識抗体）を用いた。二次抗体にはHRP標識ヒストファインシン
プルステインMAX-PO（MULTI）を使用した。

３．結果と考察3.1

心電図検査

反応後，3-3’ジアミノベンチジン・4HCL（DAB）

家系１：変異保因豚６頭中５頭において，イソフで発色し，ヘマトキシリンで核染色を施した。

ルラン濃度を上昇させるにつれ，心室期外収縮が2.5

遺伝学的検索みられ，１頭では心室頻拍も認められた（Fig.

採材した骨格筋はドライアイスとともに粉砕2A）。特に保因雄１頭では左軸偏位の心室期外収

し ，RNeasy Plus Micro Kit（QIAGEN）を 用 い

縮が認められるため，右心室由来と考えられた。

© The Ito Foundation

遺伝性心筋症による豚の突然死の病態解明と生前検査法の確立

233

A

B

Fig. 2 Electrocardiogram findings under isoflurane anesthesia. （A） Premature ventricular

contractions（arrowheads）were observed in a pig from family 1.（B）Cardiac arrhythmia was
not observed in a pig from family 2．

また，１頭ではイソフルラン濃度を上昇させるこの変異を保因することが明らかになったとしてとにより徐脈や体表皮膚のチアノーゼが認められも，それが生体に及ぼす機能は麻酔試験や肉質へた。非保因個体５頭において異常所見は認められの影響により評価する必要があると示唆された。

なかった。

3.2

病理解剖学的検査

家系２：変異保因雄豚３頭で試験を実施し，イソ

家系１：変異保因豚６頭中５頭において，心嚢水フルラン濃度を上昇させても異常所見は認められの増加，右心室の拡張所見が認められ，４頭ではなかった（Fig. 2B）。Ｒ波の大小や心拍数の増減

心内膜または心外膜に出血がみられた（Fig. 3A）。

が認められたものの，麻酔処置による影響の範囲

変異非保因豚５頭中１匹において右心室の拡張が内であると考えられた。変異非保因豚２頭でも異みられた。骨格筋の病変は軽度であるものの，変常は認められなかった。

異保因豚の２頭では薄筋または腹直筋に褪色およ以上より，ジストロフィン変異保因家系におけび白色線状病変がみられた（Fig. 3B）。

る心機能異常を麻酔処置により誘発することが可家系２：変異保因豚３頭中２頭に心嚢水の増量，能であることが示された。心機能異常は，正常時

右心室拡張がみられ，うち１例では左心室乳頭筋

または鎮静時には発現しておらず，イソフルラン

において心内膜に出血が観察された。非保因豚で吸入濃度を上昇させることで発現することが示さは２例中１例に心嚢水の増量と右心室の拡張がみれ，段階的にイソフルラン濃度を上昇させることられた。保因豚の１頭では薄筋において白色筋状で評価可能であることが明らかになった。また，病変が観察された。

複数のジストロフィン異常症家系豚で試験を実施したところ，心機能異常を発現したのは１家系のみであった。ジストロフィン遺伝子の変異の多様

以上のように，心電図検査結果に一致して心臓に肉眼的な病変が観察された。
3.3

病理組織学的検査

性はヒト患者でも知られていることであり，その家系１：変異保因豚において，心筋の顆粒状変性

変異が心機能，骨格筋機能に与える程度もさまざや空胞変性，好酸性の増加などの変性所見と，心まである 。豚においてもジストロフィン遺伝子

筋の核に大型化がみられ，特に右心房の心内膜側５）© The Ito Foundation

234

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Fig. 3 Gross findings of the heart and skeletal muscles of the pig carrying thedystrophin gene mutation．

Fig. 4 Histopathology and immunohistochemical staining of the heart of pigs

carrying the dystrophin gene mutation.（A）Degeneration of myocardium
and macrophage infiltration.（B）Reduced dystrophin expression in the
myocardium．

で高度であった。また，心筋線維の蛇行，太さの3.4

ジストロフィン発現解析

乱れや歪な分岐が確認され，一部で炎症細胞の浸家系１：変異保因豚は６頭すべてで，心筋および潤や軽度な線維増生もみられた（Fig. 4A）。骨格

骨格筋でジストロフィン発現が減弱し，モザイク筋には変性・再生像が軽度にみられ，筋細胞周囲状の発現を示した（Fig. 4B）。一方，非保因豚はの細胞数が増加していた。非保因豚においては，

５頭すべてで，心筋および骨格筋のジストロフィこれら所見は認められなかった。

ンの正常な発現が認められた。

家系２：心臓については好酸球もしくはリンパ球

家系２：変異保因豚３頭すべてで，心筋および骨浸潤が散見されたが，保因個体と非保因個体の間格筋でジストロフィン発現が減弱し，モザイク状に明らかな程度の差は認められなかった。骨格筋の発現を示した。発現低下は肥大・円形化した線病変はいずれも軽微であったが，保因豚において維や小径の線維といった不均一な線維径をとるもは薄筋ならびに横隔膜で大小不同や変性筋線維がのに多くみられた。いずれの領域においても発現目立ち，薄筋ではマクロファージの清掃反応が散低下領域は10％以下であり，組織変化が軽微であ見された。

ることに対応するものと考えた。非保因豚２例では正常なジストロフィン発現を認めた。

© The Ito Foundation

235

遺伝性心筋症による豚の突然死の病態解明と生前検査法の確立
Table 1

Summary of the detected mutations

Case no. Mutation type

cDNA mutation details＊

Amino acid

PolyPhen-2 score/Prediction（Hum Div）

5

missense

1773 A>G

exon 13

Glu 527 Gly

0.191/Possibly damaging

5

missense

1851 T>C

exon 14

Ile 553 Thr

0.638/Possibly damaging

4

in-frame skipping

4834_5013del（180bp）

exon 35

60AA delition-

5

missense

6050 C>Texon 41

Arg1953Trp

0.984/Probably damaging

1

missense

7529 T>C

exon51

Ser 2446 Pro

0.987/Probably damaging

3

in-frame skipping

8185_8904del（729bp）

exon 56-59

243AA delition-

6

in-frame skipping

10191_10229del（39bp）
exon 7110191_10229del, 10362_10520del（198bp） exon 71, 74

13AA delition
66AA delition-

missense

11118 G>A

Ser 3642 Asn

0.774/Possibly damaging

1, 2, 3exon 77＊Reference sequence, NM_001012408.1.

いずれの家系もジストロフィン発現減弱がみら

また，エクソン41でみられたミスセンス変異はれたが，家系１では麻酔下での心機能異常ならび米国にて報告されている変異４）と同一であった。

に心筋病変が特徴であり，家系２においては骨格

この変異は，豚ストレス症候群類似の病態を示す

筋病変，心筋病変ともに軽度であった。本疾患の変異として認識され，特定の家系でのみ維持され病変分布や機能障害の程度といった表現型には家ているものと考えられていたが，突然死や肉質に系により差があることが明らかとなった。

影響のある変異が地域を超えて分布することが示

3.5

ジストロフィン遺伝子解析

され，ジストロフィン遺伝子変異は広範囲に豚で家系１，２とは由来の異なるジストロフィン異保持されている可能性がある。突然死事例や肉質常症豚６頭（症例１～６）を解析し，病原性に関の問題を認めた際には，その上流の種豚におい与すると考えられる５つのミスセンス変異と３つて，非侵襲的な麻酔による心機能評価を実施するのエクソンスキップを持つ転写産物が検出されたことで，問題となる素因を持つ種豚を特定し，被（Table１）。

害を最小化することが可能になると考えられる。

以上のように，ブタにおけるジストロフィン遺伝子変異の多様性が明らかになった。ジストロ

４．要

約

フィン遺伝子は非常に大きい遺伝子であり，ま肥育豚の高い死亡事故率は生産者の収益低下にた，変異が多岐にわたることから，特定の部位の直結する重要課題である。著者らは去勢時の麻酔みの解析では検出できず，遺伝子全長の解析が必により雄豚が集団で死亡する事例に遭遇し，死因要となり，これは費用，時間を要する試験である。

がジストロフィン発現異常による遺伝性心不全でまた，変異が認められたとしても，それが生体にあることを明らかにした。本研究の目的は，ジス与える影響も評価できず，機能評価の点での限界

トロフィン発現異常による遺伝性心筋症の生前診もある。これを踏まえ，ジストロフィン異常症が断法を確立し，それによる豚の突然死の実態を明疑われる個体について，麻酔下での心電図測定にらかにすることである。本研究では，ジストロ

よる生前検査法は，迅速性と機能評価が可能な点

フィン異常症の２家系の豚を用い，イソフルラン

で有用であると考えられる。

吸入麻酔による心電図測定を行った。麻酔時の突© The Ito Foundation

236

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

然死から摘発された家系では，変異保因豚はイソあり，今回確立した生前検査法を活用し，その実

フルラン濃度の上昇とともに心室期外性不整脈が態を調査していく必要性が示された。

発生し，心機能異常を検出することができた。病理検査により心臓における出血や心筋の変性所見を認め，心臓への強い傷害が形態学的にも確認された。一方，骨格筋の肉質に影響があることから検出されたジストロフィン異常症家系では，同様の麻酔条件でも心電図に異常は認められなかった。本研究により，イソフルラン麻酔による心機能検査法の手法が確立した。複数の変異保因家系の検査から，心機能への影響は変異により程度に差があることが明らかになり，突然死リスクを評価するために心機能検査が有用であることが示された。また，米国で豚ストレス症候群に類似の病態を示すジストロフィン遺伝子変異として報告された変異が国内でも検出された。ジストロフィン
遺伝子変異は潜在的に広く分布している可能性が文
献１）
 Aihara, N., Kuroki, S., Inamuro, R., Kamiya, Y.,
Shiga, T., Kikuchihara, Y., Ohmori, E., Noguchi, M.,
Kamiie, J.：Veterinary Pathology ，59 ，455～458 ，
2022．
２）
 Hollinger, K., Yang, C. X., Montz, R. E.,
Nonneman, D., Ross, J. W., Selsby, J. T.：FASEB
journal : official publication of the Federation ofAmerican Societies for Experimental Biology ，28 ，1600～1609，2014．
３）
 Horiuchi, N., Aihara, N., Mizutani, H., Kousaka, S.,
Nagafuchi, T., Ochiai, M., Ochiai, K., Kobayashi, Y.,
Furuoka, H., Asai, T., Oishi, K.：The Journal of
Veterinary Medical Science / the Japanese Society of
Veterinary Science，76，243～248，2014
 Nonneman, D. J., Brown-Brandl, T., Jones, S. A.,
４）
Wiedmann, R. T., Rohrer, G. A.：BMC genomics，13，
233～233，2012５）
 Darras, B. T., Urion, D. K., Ghosh, P. S.：
GeneReviews, Dystrophinopathies, University ofWashington, Seattle，1993-2021．

© The Ito Foundation

237

牛伝染性リンパ腫ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する宿主たんぱく質の同定（Ⅲ）
Identification of host-derived proteins interacting with BLV non-coding
RNA（Ⅲ）安藤清彦（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

Kiyohiko Andoh（National Institute of Animal Health, NARO）

Bovine leukemia virus（BLV）infects bovine B-cells and causes a malignant lymphoma,
resulting in severe economic losses in livestock industry. To date, although a number of studies
have been intended to clarify molecular mechanisms of BLV pathogenesis, the detail of themechanism is still enigmatic. Recent studies revealed that BLV genome encodes some novel
long non-coding RNAs, and one of the non-coding RNA, AS1-S, is expressed in both latently
infected cells and lymphoma cells, suggesting that the AS1-S RNA might play an importantrole in BLV pathogenesis. Previously, we identified an hnRNPM as the biding partner of theAS1-S RNA. In this study, we intended to clarify molecular machinery underlying the
hnRNPM-AS1-S interaction by analyzing hnRNPM-RNA complex. The pull-down assay using
recombinant hnRNPM mutants showed that RNA recognition motif 1 and 2, located in the
N-terminal region of bovine hnRNPM, are responsible for binding AS1-S. Furthermore, an
RNA immunoprecipitation assay showed that introduction of AS1-S increased the number ofmRNA that co-immunoprecipitated with bovine hnRNPM. These results suggested that AS1-S
could alter the interaction between hnRNPM and host mRNAs, potentially interfering withcellular functions. Since most of the identified mRNAs that exhibited increased binding to
hnRNPM were correlated with cell proliferation, AS1-S may contribute to tumor progressionof BLV-infected cells．

１．目

伏期を経て致死性のリンパ腫である届出伝染病

的「牛伝染性リンパ腫」を引き起こす１）。リンパ腫

本研究の目的は，牛伝染性リンパ腫ウイルスを発症した牛は全廃棄の対象となり，畜産業に大（BLV）がコードする非翻訳性RNA AS1-Sと宿きな経済的被害を引き起こすため，その原因とな

主タンパク質hnRNPMの相互作用がもたらす細る BLV へ の 対 策 は 現 場 に お け る 大 き な 課 題 と胞機能の変化を解明することである。

なっている。しかしながら，BLVに感染した個

BLVは，レトロウイルス科に属する腫瘍ウイ

体の大半は無症状であり，リンパ腫を発症するのルスであり，ウシのＢ細胞に感染した後，長い潜はわずか数％のみであることなど，BLVの病態© The Ito Foundation

238

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

進行やリンパ腫発症機構の詳細にはいまだ不明な

そこからRNA認識モチーフ（RRM）を部分的に点が多い。

欠損させた配列をPCRで増幅した。得られた断片

BLVは，感染細胞においてたんぱく質に翻訳にHisタグ配列を付加して発現プラスミドpCAG

されない非翻訳性RNAを複数発現するが，それneoに組み込み，組換えhnRNPM発現プラスミド

らの転写産物の機能は解明されていない。こを構築した（Fig. 1a）。AS1-S RNAプローブ発現の非翻訳性RNAの一つであるAS1-Sは，他のウプラスミドについては，2020年度の伊藤記念財団

イルス因子が発現しない潜伏状態にある腫瘍細胞

助成において作出した発現プラスミドpSPT19でも恒常的に発現しているため，BLV感染症の

AS1-Sを用いた。

２，３）

病態進行において重要な役割を果たすことが示唆される

2 . 3 AS1-S RNAの合成とビオチンラベル付
加。2020-2021年度の伊藤記念財団助成に

２，
４）

おいて，我々はAS1-S RNAの結合パートナーとRiboMAX Large Scale RNA Production

して宿主由来RNA結合たんぱく質hnRNPMを同

Systems（Promega）を用いて，pSPT19 AS1-S

定するとともに（2020年度成果），AS1-S RNAのＴ７プロモーターからAS1-S RNAを合成しを強制発現した細胞では外部からの刺激に対するた 。 合 成 し た RNA 断 片 に Pierce RNA 3ʼ End

応答性やシグナル伝達等の機能にかかわる遺伝子

Biotinylation Kit（Thermo Fisher）を 用 い て ビ群が発現変動することを明らかにした（2021年度

オチンラベルを付与したものをRNAプローブと成果）。hnRNPMは，mRNAのプロセッシングやして以降の解析に供した。

自然免疫活性化など多様な機能を持ち，さまざま

2.4

な細胞機能に関与する。そのため，AS1-S RNA

構築した組換えhnRNPM発現プラスミドをポとhnRNPMとの相互作用解析は，BLVの病態解リエチレンイミン（PEI）（Polysciences）を用い

明に大きく寄与すると考えられる。

て293Ｔ細胞にトランスフェクションし，72-96時

本課題では，RNA-たんぱく質複合体解析によトランスフェクション

間後に細胞を回収して以降の解析に供した。

り ，BLV 感 染 細 胞 内 に お け る AS1-S RNA と

2.5

hnRNPM相互作用の分子機構を明らかにする。

組 換 え hnRNPM 発 現 293 Ｔ 細 胞 を RIPA バ ッ

２．方
2.1

RNA-protein pull-down assay

ファー（Thermo Fisher）で処理して調製した細法

胞 抽 出 液 を AS1-S RNA プ ロ ー ブ と 混 合 し ，Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit

細胞

AS1-S発現細胞の解析には，2020年度の伊藤記念財団助成において樹立したAS1-S RNAを持続（Thermo Fisher）を用いてRNAプローブと結合するたんぱく質をpull-downした。

発 現 す る MDBK AS1-S 細 胞 お よ び 対 照 細 胞

2.6（MDBK mock）を用いた。組換えたんぱく質のSDS-PAGEで分離したサンプルをPVDF膜に発現には，293Ｔ細胞（ATCC CRL-3216）を用転写し，５％スキムミルクでブロッキング後，抗いた。

His タ グ マ ウ ス 抗 体 ま た は 抗 beta-tubulin 抗 体

2.2ウェスタンブロット解析（MBL）で室温１時間感作した。その後，HRP標

組換えプラスミドの作出

MDBK細胞から抽出したcDNAをテンプレート

識抗マウス抗体（abcam）で室温１時間感作し，としてウシhnRNPM遺伝子をクローニングし，SuperSignal West Dura Extended Duration© The Ito Foundation

（a）

（b）
RRM3

Intact N
ΔRRM3

C

kDa

ΔRRM2&3
ΔRRM1
ΔRRM1&2

Pull down

ΔRRM1&3

mock

RRM1 RRM2

239

IntactΔRRM3
ΔRRM2&3
ΔRRM1
ΔRRM1&2
ΔRRM1&3

牛伝染性リンパ腫ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する宿主たんぱく質の同定（Ⅲ）

100 75 50 37 -IB: His tag

25 Pull down

Input
Input

100 75 50 37 -IB: His tag

25 50 -

IB: β-tubulin

Fig. 1（a） Schematic diagrams of bovine hnRNPM protein and the constructed deletion mutants. White boxes indicate

RNA recognition motifs（RRM）. All constructs were fused with a his-tag sequence and inserted into theexpression plasmid pCAG neo．
（b） Pull-down assay results using AS1-S RNA probe and recombinant hnRNPMs. Recombinant proteins wereexpressed in 293T cells and the obtained cell lysates were mixed with a biotinylated AS1-S RNA probe, andsubsequently assessed by western blotting. Arrows indicate the predicted sizes of the recombinant proteins．

Substrate（Thermo Fisher）でたんぱく質を検からRNAを精製し，SMARTer Stranded RNA-出した。

Seq Kit（Illumina）を用いてライブラリーを調製

2 . 7 RNA免疫沈降（RNA immunoprecipitation：RIP）assay

してRNA-seqを実施した（NovaSeq

6000，４

Gb，100bp paired-end）。得られたデータをウシ

Magna RIP kit（Merck）を用いて実施した。

ゲノムにマッピングして遺伝子量情報を取得した

具体的には，抗hnRNPM抗体（Santacruz）およのち，抗hnRNPM抗体とコントロール抗体でそびコントロール抗体を磁気ビーズと混合し，れぞれRIPしたサンプルに含まれるRNA量を比較

MDBK AS1-S 細 胞 お よ び MDBK mock 細 胞 をし，コントロール抗体と比較して抗hnRNPM抗RIPAバッファーで処理した細胞溶解液と混合し体で２倍以上のリードカウントが得られた遺伝子て４℃で３時間反応させた。その後，洗浄バッ

を hnRNPM 結 合 遺 伝 子 と 定 義 し た 。 MDBK

ファーで洗浄し，各抗体で免疫沈降されたたんぱ

AS1-S細胞およびMDBK mock細胞のhnRNPM

く質―RNA複合体を以降の解析に供試した。

結合遺伝子リストを比較し，MDBK AS1-S細胞

2.8のみで検出された遺伝子を用いてGO解析を実施

リアルタイムRT-PCR

RIP assayで得られたたんぱく質-RNA複合体に含まれるAS1-S RNA量をOne Step PrimeScript
RT-PCR Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa）をした。
３．結果と考察3 . 1 AS1-S RNAと結合するhnRNPM領域の用いて定量した。
2 . 9 RNA-seqおよびGene Ontology（GO）解析
RIP assayで得られたたんぱく質-RNA複合体

同定
Fig. 1aに示すとおり，ウシのhnRNPMは３つ© The Ito Foundation

240

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）のRRMを有している。そこで，これらのRRMをMDBK mock細胞では1652個，MDBK AS1-S細欠損させた組換えhnRNPMを用いてAS1-S RNA

胞においては5602個の遺伝子に由来するmRNAとのpull-down assayを実施し，AS1-S RNAとのがhnRNPMとともに共沈降された（Fig. 3a）。両結合に必要なRRMの同定を試みた。その結果，細胞におけるhnRNPM結合遺伝子リストを比較

RRM1 お よ び ２ を 有 す る 組 換 え 体（Intact ，し た 結 果 ，共 通 す る 遺 伝 子 は 995 個 ，MDBKΔRRM3）のみがAS1-S RNAと結合し，これら

AS1-S細胞に特異的に認められた遺伝子は4607個の領域がAS1-SとhnRNPMの結合に重要であるであった（Fig. 3b）。

ことが明らかとなった（Fig. 1b）。

上記試験で見出された4607個の遺伝子につい3 . 2 RIP assayによるhnRNPM-RNA複合体の解析て，GO解析により共通する機能を探索した結果，biological process（BP）にかかわるタームとし

抗hnRNPM抗体を用いてMDBK AS1-S細胞かて “cellular developmental process”，“cellら hnRNPM-RNA 複 合 体 を 回 収 し ，含 ま れ る

differentiation” が，molecular function（MF）に

AS1-S RNA量を測定した。その結果，コントロー

かかわるタームとして“receptor ligand activity”，

ル抗体と比較して抗hnRNPM抗体によるRIPで約“signaling receptor activator activity”，“signaling

６倍のAS1-S RNAが検出され，MDBK AS1-S細receptor regulator activity” が，KEGG pathway

胞内でhnRNPMとAS1-Sが複合体を形成してお解析では“pathways in cancer”，“MAPK signaling

り，その複合体がRIP assayで抽出できることがpathway”，“Ras signaling pathway”，“Rap1

確認された（Fig. ２）。

signaling pathway”などの細胞増殖や腫瘍化にか

次に，RIP assayで回収した複合体から精製しかわるタームが有意に見出された（Fig. 3c-e）。

たRNAをRNA-seqに供試し，hnRNPMと共沈降

AS1-S RNAがhnRNPMのRRM1および２と結さ れ る 全 RNA 情 報 を 取 得 し た 。そ の 結 果 ，合するという結果から，AS1-S RNAの干渉によ

Relative expression

りhnRNPMと結合するmRNAのバリエーション8

p < 0.05が減少すると予想されたが，興味深いことに，

6

AS1-S RNAとhnRNPMの相互作用はhnRNPMと4複合体を形成するmRNAのバリエーションを増加させるという結果が得られた。さらに，AS1-S

2

RNAの存在によりhnRNPMと共沈降されるようPMになったmRNAの多くは細胞増殖にかかわる機

hn
RN

co
nt

ro

l

0

能を有していたことから，AS1-SがBLV感染細胞

Fig. 2 Q u a n t i f i c a t i o n o f A S 1 - S R N A i n R N Aの増殖や腫瘍化に貢献している可能性が示唆されimmunoprecipitated samples from MDBK AS1-S
cells. RNA was purified from an RNA-protein
complex obtained by RNA immunoprecipitation,
followed by real-time RT-PCR. The result is shown
as expression levels relative to the control sample.
Data are presented as the mean±standard
deviation（ｎ＝３）, and a t-test was performed forstatistical analysis. p<0.05 was defined asstatistically significant．

た。
3.4

総括

本研究により，これまでその機能や存在意義が明らかでなかったBLV由来非翻訳性RNA AS1-Sが，宿主のRNA結合たんぱく質であるhnRNPMのRRM１および２と結合し，細胞増殖にかかわ© The Ito Foundation

241

牛伝染性リンパ腫ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する宿主たんぱく質の同定（Ⅲ）
(a)

(b)

hnRNPM Ab IP（log）

hnRNPM Ab IP（log）

MDBK AS1-S

5 5602 genes
4
3
2
1
0

0

1
2
3
5
4
Control Ab IP（log）

MDBK mock

5 1652 genes
4
3

4607

995

657

2
1
0

0

1
2
3
5
4
Control Ab IP（log）

(c)

(d)

cellular developmental processcell diﬀerentiationCount

regulation of cell
diﬀerentiation
regulation of multicellularorganismal development
positive regulation of cell
diﬀerentiation
negative regulation ofphosphorus metabolic process
negative regulation ofphosphate metabolic process
negative regulation ofphosphorylation
negative regulation ofprotein phosphorylation

Count

receptor ligand activity

15.0
17.5

40
80
120
160
p.adjust
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010

20.0

signaling receptor activator
activity

22.5
25.0
p.adjust
0.036

signaling receptor regulator
activity

0.032
0.028

growth factor activity

0.024

female gamete generation
0.05

0.10
GeneRatio

0.15

0.020

0.024
0.028
GeneRatio

0.032

(e)
Pathways in cancer
MAPK signaling pathway
Ras signaling pathway
Count
40

Rap1 signaling pathway

80

Signaling pathways
regulating pluripotency ofstem cells

120p.adjust
0.010

Growth hormone synthesis,
secretion and action

0.008
0.006

GnRH signaling pathway

0.004
0.002

Prolactin signaling pathway
VEGF signaling pathway
Fc epsilon RI signaling
pathway
0.025

0.050
0.075
GeneRatio

0.100

Fig. 3（a） Scatter plots showing sequencing reads obtained by RNA immunoprecipitation. The X and Y axes show readcounts obtained by RIP-seq from control MAb and anti-hnRNPM MAb, respectively. Genes that meet thefollowing criteria were defined as hnRNPM-binding RNAs and are shown as grey dots：read counts>10,
hnRNPM/control ratio＞2.0．
（b） Venn diagram showing the overlapping hnRNPM-binding genes in MDBK AS1-S and MDBK mock cells．
（c-e） Gene ontology（GO）analysis of the 4607 hnRNPM-binding genes only detected in MDBK AS1-S cells.
Molecular function（MF）（c）, biological process（BP）（d）and KEGG pathway enrichment analysis（e）areshown separately. The size of the bubbles indicates the “gene count”, and the color of the bubbles indicates the“adjusted p-value”. Adjusted p-value＜0.05 is defined as significant．

© The Ito Foundation

242

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

るmRNAとhnRNPMの相互作用を変化させるとRNAの結合パートナーとして宿主由来RNA結合

いう分子機構が明らかになった。本知見は，たんたんぱく質hnRNPMを同定した。そこで本研究

ぱく質にならないRNAによる細胞機能への干渉

で は ， AS1-S を 導 入 し た 細 胞 内 に お け るというBLV潜伏感染における分子機構の一端を

hnRNPM-RNA複合体の解析により，BLV感染細明らかにしたことにより，将来のBLV制御に有胞内におけるAS1-S RNAとhnRNPM相互作用の用な基盤的知見となり得る。今後は，これまでの分子機構解明を試みた。組換えhnRNPMとAS1-S

研究で見出したBLV由来非翻訳性RNAの分子メ

RNAプローブを用いたpull-down assayの結果，カニズムについて，臨床検体等を用いてBLVのhnRNPMのＮ末端側に存在するRNA認識モチー

病態との関係性をさらに詳細に解析していく予定

フ１および２がAS1-Sとの結合に重要であることである。

が 示 さ れ た 。さ ら に ，RNA 免 疫 沈 降 に よ り ，

４．要

AS1-SはhnRNPMと相互作用するmRNAのバリ

約

エーションを増大させることが明らかとなった。

牛伝染性リンパ腫ウイルス（BLV）は，ウシ

これらの結果は，AS1-S RNAがhnRNPMと宿主のＢ細胞に感染して致死性のリンパ腫を引き起こ

mRNAの相互作用を変化させることで細胞機能し，畜産業に大きな経済的被害を与える病原体でに干渉する可能性を示唆する。AS1-Sの導入によある。BLVの病態メカニズムを解明するためにり影響を受けた遺伝子の多くは細胞増殖にかかわこれまでさまざまな研究が行われてきたが，そのる機能を有していたことから，AS1-SがBLV感染

発症メカニズムの詳細はいまだ解明されていな細胞の増殖や腫瘍化に貢献している可能性が示唆い。最近の研究により，BLVは複数のウイルスされた。

由来非翻訳性RNAをコードすることが報告されており，その一つであるAS1-S RNAは，潜伏状態にある感染細胞やリンパ腫細胞において恒常的に発現することが明らかとなっている。この事実
は，AS1-S RNAがBLV感染症の病態において重要な役割を担う可能性を示唆する。2020-2021年

文献１） 農林水産省 監視伝染病発生年報２） Durkin, et al.：Retrovirology，13，33．2016．
 Safari, et al.：PLoS Pathog., 16（ 5）, e1008502.
３）
2020．
４）
，165
（12）
，2869～2876，
 Andoh, et al.： Arch. Virol．
2020．

度の伊藤記念財団助成において，我々はAS1-S© The Ito Foundation

243

豚熱ウイルス受容体候補タンパク質の網羅的探索
Comprehensive analysis of candidate receptors for Classical Swine Fever virus

池

田

圭

吾・岩

丸

祥

史

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

Keigo Ikeda and Yoshifumi Iwamaru（National Institute of Animal Health, NARO）

A unique feature of the viruses belonging to the genus pestivirus including Classical swine
fever virus（CSFV）is cell tropism in vitro for culture cells from their preferred host. However,
the receptor that determines the cell tropism of the pestiviruses is yet unclear. Recently, abiochemical labeling method termed “Enzyme-Mediated Activation of Radical Sources（EMARS）” was shown to be useful for identifying candidate molecules for virus receptors. In
this study, we aimed to comprehensive analysis of CSFV receptor candidate molecules using a
combination of EMARS reaction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LCMS/MS）analysis．
The CSFV GPE－ strain and the PPK3F cells, a porcine kidney cell line, were used in thisstudy. The recombinant E2 protein, which is crucial for CSFV entry was subjected to the
EMARS reaction. After EMARS reaction, fluorescence microscopic and western blot analysis
showed the presence of the fluorescein-labeled molecules which are predicted to be present in
the vicinity of the E2 protein. The fluorescein-labeled molecules were enriched byimmunoprecipitation using anti-fluorescein antibody-combined magnetic beads, and theobtained samples were subjected to the LC-MS/MS analysis. As a result, novel ten candidatesof the CSFV receptor proteins were finally identified. Further research is needed to clarify
whether the candidate receptor proteins are the functional CSFV receptors．

１．目

抗体を誘導する能力を有しており，特にE2タン的

パク質は，中和抗体を効率的に誘導するエンベ

豚熱ウイルス（CSFV）は，エンベロープを有

ロープタンパク質として知られている１）。

する１本鎖RNAウイルスであり，フラビウイル

ぺスチウイルスが有するユニークな特徴とし

ス科ペスチウイルス属に分類される。ペスチウイて，それぞれのウイルスに好適宿主が存在し，さル ス 属 に は ，牛 ウ イ ル ス 性 下 痢 ウ イ ル ス

らにin vitroにおいて好適宿主に応じた細胞指向（BVDV）やボーダー病ウイルス（BDV）などが性 を 有 す る と い う 点 が あ げ ら れ る 。例 え ば ，

分類されている。ぺスチウイルスが産生するタン

BVDVは反芻獣（ウシ，ヒツジ），CSFVはブタ，

パク質のうち，E2，Erns，およびNS3は宿主のBDVはヒツジの細胞に指向性を有する２，３）。また，© The Ito Foundation

244

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

BVDVのE2をCSFVやBDVのE2と入れ替えると，

ク質を精製し，得られたE2タンパク質の純度をそれぞれブタやヒツジの細胞に指向性を有するよ

ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）にて

うになる２，３）。このことから，ペスチウイルスの解析した。さらに，精製タンパク質について，

E2タンパク質が細胞指向性に重要な働きをして

HRP標識したマウス抗E2タンパク質モノクローいると考えられている。さらに，レンチウイルス

ナル抗体WH303，およびマウス抗His tagモノク

を用いてCSFVのErns，E1，およびE2を有する

ローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング

シュードタイプウイルスを作成すると，ブタの細法を実施し，還元条件下および非還元条件下にお胞に指向性を有することから，CSFVの細胞指向

けるE2タンパク質のhomo dimer形成能の有無を性を決定づける受容体の存在が示唆されてい解析した。

る 。しかしながら，CSFVを含むペスチウイル

2 . 2 E2タンパク質によるCSFVの感染阻害試験

スの細胞指向性を決定する要因は明らかにされてE2タンパク質を10倍段階希釈（10μg/m-0.01

４）μg/ml）し，単層培養したPPK3F細胞（ブタのいない。
最近，ウイルスの細胞侵入に関与する分子の同定

腎臓由来）に，希釈したE2タンパク質を加え，法として，EMARS（enzyme-mediated activation

37 ℃ で 30 分 間 静 置 し た 。そ の 後 ，多 重 感 染 度of radical sources）法が利用できることが示され（MOI）0.02となるようCSFV GPE－株を追加で加た５）。この手法により，生細胞の細胞膜上でウイ

え，37℃，30分静置した。ウイルス液およびE2

ルスの表面タンパク質と近接する分子を特異的にタンパク質を除去し，洗浄して１％カルボキシメ

蛍光標識可能である。本研究では，EMARS法にチルセルロース（CMC）加培地を加え，室温でより，CSFVの受容体候補タンパク質を網羅的に20分静置し，さらに37℃で２日間培養した。その探索することを目的とする。

後，WH303抗体を用いた免疫染色を実施した。

2.1

2 . 3 E2タンパク質を用いたEMARS反応およ法

２．方

び標識分子の分析
PPK3F 細 胞 を ，コラ ー ゲ ン コ ート し た 10cm

E2タンパク質遺伝子の発現

生ワクチンとして使用されている弱毒CSFVシ ャ ー レ で 培 養 後 ，リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水

GPE 株のE2遺伝子が組み込まれたプラスミドを（PBS）で１回洗浄し，CSFV E2タンパク質（濃使用した。このE2遺伝子は，Ｎ末端側にE1-E２

度０，50μg/ml）を加え，室温で30分反応させた。

開裂シグナルを有しており，宿主のシグナルペプ

３回洗浄した後，マウス抗His tagモノクローナ

チダーゼにより開裂してE2タンパク質となる。

ル抗体を室温で30分間反応させた。５回穏やかにまた，アフィニティー精製とEMARS反応に用い洗浄し，EMARS反応を行ったウェルでは，過酸るため，Ｃ末端側にヒスチジンタグ（His tag）

化水素（Wako，終濃度0.0075％），およびフルを付与し，E2タンパク質の膜貫通領域を欠損さ

オレセインタイラマイド（BIOTIUM，終濃度

せた。

0.5mM）を室温，暗所で10分間反応させた。反応－

上記のプラスミドを，Fugene HD transfection

後，４回洗浄し，蛍光顕微鏡下で観察した。さらreagent（Promega）を用いてHEK293T細胞にトに，反応後の細胞を，Radioimmunoprecipitation

ランスフェクションし，２日目に培養上清を回収（RIPA）バッファーで溶解し，HRP標識した抗後，HisTrap

フルオレセイン抗体を用いたウェスタンブロッ

TM

HP（Cytiva）を用いてE2タンパ© The Ito Foundation

245

豚熱ウイルス受容体候補タンパク質の網羅的探索

ティング法によりフルオレセイン標識分子を検出した。

３．結果と考察2 . 4 抗フルオレセイン抗体結合ビーズを用い

E2 タ ン パ ク 質 の 遺 伝 子 を 含 む プ ラ ス ミ ド をた免疫沈降およびフルオレセイン標識分子

HEK293T細胞にトランスフェクションし，培養の同定

上清を回収して精製後，LDS-PAGEで解析した得られたサンプルをクロロホルム・メタノール

結果，fraction 2において，E2タンパク質の単量

沈 殿 に よ り 濃 縮 後 ，200 μl の １ ％ SDS ，50mM

体（約45kDa）と同等の質量を持つタンパク質がTris-HClを加え，95℃，10分間可溶化した。次高純度で検出された（Fig. １）。さらに，精製タに SDS 濃 度 が 0.1 ％ と な る よ う NP-40 溶 解 バ ッ

ンパク質について，抗E2タンパク質抗体，およファー（20mM Tris-HCl，150 mM NaCl，５mM

び抗His tag抗体を用いたウェスタンブロッティ

EDTA，１％ IGEPALⓇ CA-630，１％グリセロー

ングを実施した結果，非還元条件下において両抗ル）で希釈した（抽出タンパク質溶液）。抗フル体によりE2 homodimers（約90kDa）と同等の質

オ レ セ イ ン 抗 体 結 合 ビ ー ズ を ，Dynabeads

TM

量を有するタンパク質が検出された（Fig. ２）。

Antibody Coupling Kit（Thermo Fisher）
を用いてこのことから，作成したE2タンパク質は，CSFV

調整し，抽出タンパク質溶液１mlを懸濁後，４℃のE2タンパク質と同様，homo dimer形成能を有で１晩撹拌した。磁石上にチューブを置き，ビーしていたと考えられる。一方，還元条件下では抗ズをNP40溶解バッファーで５回洗浄後，さらにHis tag抗体でのみE2 monomers（約45kDa）とビーズを0.5M NaCl-PBSで２回洗浄し，１％SDS，同等の質量を有するタンパク質が検出され，抗50mM Tris-HClを100μl加え，95℃，５分でフルE2タンパク質抗体では検出されなかった（Fig.

オレセイン標識分子を溶出し，液体クロマトグラ

２）。過去の報告では，抗E2タンパク質抗体はフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）をアプ
ロサイエンスに委託した。その際，検体はTCA

（kDa）

S

W

1

2

3

4

5

沈殿処理後，SDS-PAGEに供して，溶出時に混入した抗フルオレセイン抗体のバンド以外の領域
をゲルから切り出して解析された。得られたデータ
を Scaffold viewer ver version ： 5.2.2（Proteome
software）を用いて解析し，E2タンパク質を用いたEMARS反応実施検体にのみ存在するタンパ

62
49
38
28

ク質を選抜した。さらに同定されたタンパク質18を，Uniprot-KBデータベース（対象種：Human）

14

上で検索し，Subcellular locationがmembrane，

6

plasma membrane，cell membraneのいずれかに該当するものを，受容体候補タンパク質として選
抜した。

rE2
monomers（45 kDa）

Fig. 1 Coomassie Brilliant Blue staining of the purified

recombinant CSFV E2 proteins（rE2）after PAGE
analysis under the reducing conditions. Lane S isthe dialyzed culture medium of the HEK 293T cells
before purification. Lane W is the washing fraction
before protein elution. Lane 1-5 are the eluate
fractions．

© The Ito Foundation

246

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

（A）

（B）

DTT

+

DTT

ー
rE2
homodimers（90 kDa）

（kDa）
62
49

rE2
monomers（45 kDa）

38

28

+

ー
rE2
homodimers（90 kDa）

（kDa）
62
49

rE2
monomers（45 kDa）

38

28

Fig. 2 Western blot analysis of rE2. Western blot analysis was performed using themouse anti-6x His tag monoclonal antibody（A）or the mouse anti-CSFV E2
monoclonal antibody WH303（B）in the presence（＋）or absence（－）of thedithiothreitol（DTT）．

Concentration of the rE2（µg/ml）
PC

0.01

1

0.1

10

NC

GPE-

Fig. 3 Inhibition of the CSFV focus formation using rE2. Monolayer PPK3F cells were treatedwith 10-0.01μg/ml of rE2 and incubated at 37℃ for 30 min. CSFV GPE－ strain（MOI0.02）was added to each well without removing the protein and incubated at 37℃ for 30
min. rE2-contained carboxy methyl-cellulose overlay medium was added. Two days post
infection, immunostaining was conducted using HRP-conjugated mouse anti-E2 protein
monoclonal antibody WH303．

homo dimersに対する親和性が高いと考えられて反応を実施し，蛍光顕微鏡で観察した結果，E2いるため ，本データも以前の報告と一致した結タンパク質を加えた細胞においてのみ，細胞膜に果であると考えられる。

一致した蛍光が観察された（Fig. 4A）。また，細６）

次に，E2タンパク質によるCSFVの感染阻害試

胞を溶解してウェスタンブロッティングを実施し験を実施した結果，E2タンパク質が１μg/ml以た結果，E2タンパク質を用いてEMARS反応を実上の濃度で，E2タンパク質の濃度依存性に高い

施した細胞において，フルオレセイン標識分子がCSFV感染阻害効果が認められた（Fig. ３）。こ検出された（Fig. 4B）。

のことから，E2タンパク質は正常な構造を保持

次に，抗フルオレセイン抗体結合磁性ビーズをしており，EMARS反応を実施する際には，少な用いた免疫沈降反応を実施し，本検体をLC-MS/

くとも１μg/ml以上の濃度を使用すべきであるとMS解析に供した結果，E2タンパク質を用いた検考えられる。

体および陰性対照においてタンパク質1387種が同続いて，得られたE2タンパク質によるEMARS

定され，そのうちE2タンパク質を用いた検体に© The Ito Foundation

247

豚熱ウイルス受容体候補タンパク質の網羅的探索
（A）

（B）
（kDa）

PC

rE2+

rE2-

rE2+

62
49

38
rE2-

28

18

Fig. 4 Detection of the EMARS products（fluorescein-labeled proteins）. The EMARS reaction was performed in

combination of rE2 and mouse anti-6x His tag monoclonal antibody（rE2＋）．Samples of EMARS reaction without
rE2 were used as the negative control（rE2－）．（A）Fluorescent microscopic images of the fluorescein-labeledproteins. Scale bar indicated 100μm.（B）Western blot analysis of the fluorescein-labeled proteins under the
reducing condition. Fluorescein -labeled IgG was used as a positive control of the fluorescein labeled protein（PC）．

おいてのみ観察されたタンパク質は100種類で至っていない。最近，ウイルスの細胞侵入に関与あった。さらに，Uniprot-KBデータベースで検す る 分 子 の 同 定 法 と し て ，EMARS（enzyme-

索した結果，Subcellular locationがmembrane，

mediated activation of radical sources） 法 が 利

plasma membrane，cell membraneのいずれかに用できることが示された。本研究では，EMARS

該当する受容体候補タンパク質10種類を同定した法により，CSFVの受容体候補タンパク質を網羅（データ非公表）。今後は，本研究で同定された受的に探索することを目的とした。

容体候補タンパク質を，哺乳動物細胞に過発現まCSFVとしてGPE－ 株を用い，ブタの細胞株とたはノックダウンさせ，実際にCSFVの受容体としてPPK3F細胞を用いた。CSFVのE2タンパクして機能しているか否かを解析する予定である。

質を使用したEMARS反応を実施し，フルオレセ

４．要

イン標識された分子を蛍光顕微鏡およびウェスタ

約

ンブロッティングで検出した。これらの分子を免豚熱ウイルス（CSFV）をはじめとしたペスチ

疫沈降反応により精製し，得られた検体をLC-ウイルス属のウイルスが有するユニークな特徴とMS/MS解析に供した結果，最終的に10種類の新

して，in vitroにおいて好適宿主に応じた細胞指規受容体候補タンパク質を選定した。本研究で同向性を有するという点があげられる。過去の報告定された受容体候補タンパク質が，実際にCSFVから，ペスチウイルスの細胞指向性を決定する受の受容体として機能しているか否かを明らかにす

容体の存在が示唆されているが，その同定にはるためには，今後さらなる研究が必要である。

© The Ito Foundation

248

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

文献１） Bouma, A., De Smit, A. J., De Kluijver, E. P.,
Terpstra, C., Moormann, R. J. M.：Efficacy andstability of a subunit vaccine based on glycoprotein
E2 of classical swine fever virus, Vet Microbiol，66，101～114，1999．
２）
 Liang, D., Sainz, I. F., Ansari, I. H., Gil, L. H. V. G.,
V a s s i l e v , V . , D o n i s , R . O . ：T h e e n v e l o p e
glycoprotein E2 is a determinant of cell culture
tropism in ruminant pestiviruses, J Gen Virol，
84，1269～1274，2003．
 Reimann, I., Depner, K., Trapp, S., Beer, M.：An
３）
avirulent chimeric Pestivirus with altered cell
tropism protects pigs against lethal infection withclassical swine fever virus, Virology，322，143～157，
2004．

４）
 Wang, Z., Nie, Y., Wang, P., Ding, M., Deng, H.：
Characterization of classical swine fever virus
entry by using pseudotyped viruses: E1 and E2 are
sufficient to mediate viral entry, Virology，330，332～341，2004．
５）
 Kotani, N., Nakano, T., Kuwahara, R.：Host cell
membrane proteins located near SARS-CoV-2
spike protein attachment sites are identified using
proximity labeling and proteomic analysis, J Biol
Chem，298，102500，2022．
６）
 Bai, Y., Jia, R., Wei, Q., Wang, L., Sun, Y., Li, Y.,
Luo, J., Zhang, G.：Development and application ofa high-sensitivity immunochromatographic test
strip for detecting classical swine fever virus
antibodies, Transbound Emerg Dis, 69, e788-e798，
2022．

© The Ito Foundation

249

Clostridium novyi sensu latoの新しい鑑別法の開発へ向けた国内家畜由来株のゲノム解析
Genome analysis of Clostridium novyi sensu lato strains isolated from livestockin Japan for development of novel identification methods

髙

松

大

輔・馬

田

貴

史

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

Daisuke Takamatsu and Takashi Mada
（National Institute of Animal Health, NARO）

Clostridium novyi sensu lato consists of Clostridium novyi types A/B/C, Clostridium
haemolyticum, and Clostridium botulinum group III. Although a typing-PCR designed to
identify Clostridium species including C. novyi and C. haemolyticum by targeting their flagellin
genes is introduced in “the guidelines for pathological appraisal” compiled by the Ministry ofAgriculture, Forestry, and Fisheries, Japan, we recently noticed that this PCR may not be able
to distinguish C. novyi, a zoonotic pathogen, and C. haemolyticum, a livestock pathogen,precisely. Therefore, in this study, we analyzed the genomes of Japanese strains identified as C.
novyi type B or C. haemolyticum by the typing-PCR and attempted to verify the reliability of
the PCR results by comparing their genomes to those of previously reported overseas C. novyi
sensu lato strains. Consequently, classification of the domestic strains by the PCR was notconsistent with any of the genome analysis results including those of toxin gene search, ANI
analysis, and phylogenetic analysis. Moreover, some amplicons by the typing-PCR wererevealed not to be generated from the genomic regions annotated as flagellin gene by our
genome analyses. Furthermore, reported information of the overseas strains including the toxin
gene profiles was also not consistent with our results, and thus they were unable to be used as
references for species identification of C. novyi sensu lato strains. This study is the first inwhich genomes of domestic C. novyi sensu lato strains were analyzed, and the results not only
reaffirmed that the current typing-PCR is not reliable in identifying species within thebacterial group, but also suggested the need to redefine the classification of species and types
within the group. Therefore, we will attempt to redefine the species of C. novyi sensu lato byanalyzing the genomes of more strains and clarifying their differences. We will then develop anovel identification method for Clostridium species important for animal and public health．

１．目

株についてゲノム解析を行い，その情報を基にC.

的novyi sensu lato内の菌種の新しい鑑別法の開発

本研究は，国内で分離された広義のClostridiumに資する基礎データを得ることを目的としている。

novyi（Clostridium novyi sensu lato）に属する菌嫌気性菌であるClostridium属菌のうちC. novyi© The Ito Foundation

250

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

sensu latoと呼ばれるグループには，遺伝学的に酷取得した後，ゲノム解析を行った。さらに，上記似する３菌種（C. novyi［A/B/C型］，Clostridiumの病性鑑定指針内のPCR法の結果とゲノム解析結

haemolyticum ，Clostridium botulinum［グ ル ー

果を比較して，PCR法の有用性と現行の菌種分類

プⅢ］）が含まれる。それぞれ家畜に悪性水腫，の妥当性を再検討した。

細菌性血色素尿症，家畜ボツリヌス症を引き起こ
す家畜衛生上重要な菌種であるが，C. novyi A/B
型 は 人 獣 共 通 感 染 症 の 原 因 菌 で も あ り ，C.

２．方法

2 . 1 C. novyi sensu lato株の培養およびゲノム

botulinumとその毒素は感染症法で二種病原体等

DNAの抽出に指定されている公衆衛生上も重要な菌である。

Skarinらの報告２）を参考にして，C. novyiまた感染症による被害を最小限に抑えるためには，正はC. haemolyticumと思われるC. novyi sensu lato

確な病気の診断がきわめて重要であるが，これら15株を培養した後，MasterPure Gram-positiveの菌はその嫌気要求度の高さゆえ，臨床検体からDNA Purification Kit（Biosearch Technologies）の分離および継代培養をすることが難しく，正確によってゲノムDNAを抽出し，イソプロパノー

な診断の支障になっている。また，農林水産省通ルおよびエタノール沈殿により精製した。精製後知の病性鑑定指針には，Clostridium属４菌種（C.

のDNAは，濃度測定（Spectrophotometer ND-

novyi A/B型，C. haemolyticum，Clostridium

1000，NanoDrop）および電気泳動によって品質

chauvoei，Clostridium septicum）を識別するPCR確認を行った。

法 が紹介されているが，我々は病性鑑定を実施

2.2

する中で，現行のPCR法では，人獣共通感染症の2.1で得たDNAを用いて，鞭毛のFlagellin遺伝

原 因 菌 で あ る C. novyi と そ う で は な い C.

子（fliC）を標的とした現行の鑑別PCR法 １）（現haemolyticumを正確に識別できていない可能性

行PCR）を行い，15株各株が現行法でどの菌種にが高いことに気づいた。すなわち，本属菌感染症

分類されるかを確認した。また，一部の株のPCRを正確に診断し，家畜のみならず生産者や消費者

産物についてサンガーシークエンス解析を行い，の安全を確保するためには，より正確な菌種同定

配列を決定した。

１）

現行の鑑別PCR法による菌種分類法を開発する必要がある。そのためには，ゲノム2.3

解析による正確な種の識別と遺伝的な特性の理解2.1で得たDNAを用いて，次世代シーケンサーが必要だが，C. novyiおよびC. hemolyticumは既（NovaSeq6000，Illumina）からショートリード

報のゲノム情報がきわめて乏しく，NCBIデータベーのゲノム生データを取得した。15株のショートス（C. novyi：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-

リードをUnicycler v 0.5.0３）を用いてアセンブル

hub/genome/?taxon=1542/

C. haemolyticum：を行った。また，アセンブル後のゲノムデータにhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/

ついて，Prokka v 1.14.6４）を用いてアノテーショ

genome/?taxon=84025）上には，国内株由来のンを行った。

ゲノム情報は１つもない。

2.4

ゲノム生データの取得とゲノム構築

ゲノム情報を用いた菌種同定

そこで本研究では，我々が保有する国内家畜由2.3で得たアセンブル後のゲノムデータにNCBI

来 の C. novyi sensu lato 株 に つ い て DNA を 抽 出

データベース上に存在する既報のC. novyiまたはし，次世代シーケンサーを用いてゲノムデータを

C. haemolyticum株13株のゲノム配列を加えた合© The Ito Foundation

Clostridium novyi sensu latoの新しい鑑別法の開発へ向けた国内家畜由来株のゲノム解析

251

計28株のゲノムを用いて以下２つの解析を行った。

①および②）のいずれかを示した。現行PCRの報ⅰ）Average nucleotide identity 解 析 ［https://

告文献１）では，２コピーのfliCがとなり合って配

www.ezbiocloud.net/tools/ani］を 行 い ，各 株 の置していると記載がある。本研究の結果でも２つゲノム間で相同性が認められた配列の平均塩基一のFlagellin遺伝子は近接して存在していたが，そ致度（ANI）を算出した。

の配列長は，パターン①では807bpと834bp，パⅱ）BLAST＋v 2.11.0（BLASTp） を使用して，ターン②では822bpと870bpと一定ではなかった。

各 株 の ゲ ノ ム 内 に お け る C. novyi お よ び C.

また，パターン②では，２つのFlagellin遺伝子間

haemolyticumの毒素遺伝子（Table１）の有無にに 機 能 を 予 測 で き な い 遺 伝 子（hypothetical

ついて調査した。BLASTpの結果，塩基構成およgene）が１つ存在した。さらに，現行PCRの増び配列長の一致率がともに90％以上の場合に毒素

幅産物の塩基配列を決定したところ，一部のPCR

遺伝子を“保有”とした。

産物はFig. １に示すFlagellin遺伝子領域から増幅

５）

さらに，28株のうち，ⅰおよびⅱの解析でC.

されたものではないことが明らかになった（Datanovyi B型またはC. haemolyticum株と判定された

not shown）。すなわち，現行PCRは，Flagellinを株については，Roary v 3.12.0を用いてコア遺コードするfliCを標的として開発されたと報告さ伝子からSNPsを抽出し，最尤法で系統解析をれているが，少なくとも本報で用いたアノテー行った。

ション手法では“Flagellin”とは標識されない配６）列を標的としている可能性が示唆された。

３．結果と考察

3.2

ゲノム解析データを用いた菌種同定

3.2.1

3 . 1 現行PCRでの鑑別結果およびFlagellin遺

毒素遺伝子検索による菌種の分類C. novyiのA/B/C型とかつてC. novyiのＤ型と伝子領域の構造の比較
現行PCRの結果，国内株15株のうち11株がC.

呼 ば れ て い た C. haemolyticum は ，３ つ の 毒 素

novyi B型，４株がC. haemolyticumと判定された（alpha, betaおよびgamma毒素）の産生パターン（Table２）。

（または当該毒素遺伝子の保有パターン）によっ構築したゲノムのアノテーション結果より，各て上記の各型に分類される７～10）（Table１）。供試

株とも２つのFlagellin遺伝子を保有し，その２遺したC. novyi sensu lato国内株をこの毒素遺伝子

伝子の配置はFig. １に示す２パターン（パターンの保有状況に基づいて分類したところ，15株すべTable 1 Toxin production of Clostridium novyi and Clostridium haemolyticum.
Toxin

Clostridium novyi

Clostridium
haemolyticum

type A

type B

type C

Alpha-toxin

＋

＋

－

－

Beta-toxin

－

＋

－

＋

Gamma-toxin

＋

－

＋

－

Clostridium novyi are now classified into types A, B, and C, and C. haemolyticum wasalso called C. novyi（type D）previously. C. novyi type A produces alpha-toxin andgamma-toxin, while C. novyi type C produces only gamma-toxin. C. novyi type B
produces alpha-toxin and beta-toxin. C. haemolyticum produces beta-toxin, but notalpha-toxin.

© The Ito Foundation

252

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 2 Summary of the results of the current PCR for Clostridium species identification and genome analyses

performed in the present study.

Four genome analyses performed in the present study

Accession no.

Domestic
strains

Species determinedby the current
typing-PCR method

Species determined by
the toxin gene search

ANI analysis

Phylogenetic
analysis

Genetic organization of
the flagellin gene region

CNH-1

C. novyi type B

C. haemolyticum

Ⅰ

Ⅴ

①

CNH-2

C. novyi type B

C. haemolyticum

Ⅰ

Ⅴ

①

CNH-3

C. novyi type B

C. haemolyticum

Ⅰ

Ⅴ

①

CNH-4

C. novyi type B

C. haemolyticum

Ⅰ

Ⅴ

①

CNH-5

C. novyi type B

C. haemolyticum

Ⅰ

Ⅴ

①

CNH-6

C. novyi type B

C. haemolyticum

Ⅰ

Ⅴ

①

CNH-7

C. novyi type B

C. haemolyticum

Ⅰ

Ⅴ

①

CNH-8

C. novyi type B

C. haemolyticum

Ⅱ

Ⅵ

①

CNH-9

C. haemolyticum

C. haemolyticum

Ⅱ

Ⅵ

②

CNH-10C. haemolyticum

C. haemolyticum

Ⅱ

Ⅵ

②

CNH-11

C. haemolyticum

C. haemolyticum

Ⅱ

Ⅵ

②

CNH-12

C. haemolyticum

C. haemolyticum

Ⅱ

Ⅵ

②

CNH-13

C. novyi type B

C. haemolyticum

Ⅰ

Ⅴ

①

CNH-14

C. novyi type B

C. haemolyticum

Ⅰ

Ⅴ

①

CNH-15

C. novyi type B

C. haemolyticum

Ⅰ

Ⅴ

①

Species information Species determined
Genetic organization
reported previously or by the toxin gene ANI analysis Phylogenetic of the flagellin gene
analysison the web databases
searchregionNot applicable

Reportedoverseasstrains

Alias

CN-1

4540

C. novyi type A

C. novyi type C

Ⅲ①

GCF_000724445.2

CN-2

4570

C. novyi type A

C. novyi type C

Ⅳ②

GCF_000768585.1

CN-3

NCTC 538

C. novyi type A

C. novyi type A

Ⅲ①

GCF_000725865.2

CN-4

GD211209

C. novyi type A

C. novyi type A

Ⅲ①

GCF_000724405.2

CN-5

BKT29909

C. novyi type A

C. novyi type A

Ⅲ②

GCF_000724425.2

CN-7150557

C. novyi type B

C. haemolyticum

Ⅰ

Ⅴ

①

GCF_003614235.1

CN-8

NCTC 9691

C. novyi type B

C. novyi type B

Ⅱ

Ⅵ

①

GCF_000724265.2

CN-9

ATCC 27606

C. novyi type B

C. novyi type B

Ⅱ

Ⅵ

①

GCF_000724245.2

Not tested

Accession no.

CH-1

122-15

C. haemolyticum

C. haemolyticum

Ⅱ

Ⅵ

①

GCF_910822285.1

CH-2

CCUG 7970

C. haemolyticum

C. haemolyticum

Ⅰ

Ⅴ

＊

GCF_017590155.1

CH-3

KFSHRC_CH1

C. haemolyticum

C. haemolyticum

Ⅱ

Ⅵ

①

GCF_001994015.1

CH-4

NCTC 8350

C. haemolyticum

C. haemolyticum

Ⅱ

Ⅵ

②

GCF_000768575.1

CH-5

NCTC 9693

C. haemolyticum

C. haemolyticum

Ⅱ

Ⅵ

②

GCF_000724225.2

Our toxin genes search classified all domestic strains into C. haemolyticum because of the presence of beta-toxin gene and theabsence of the alpha-toxin gene. Furthermore, three reported overseas C. novyi strains （CN-1, 2, and 7）were classified into types
different from those reported previously. In other genome analyses, domestic and reported overseas strains were divided into two
or four groups. However, these results were not consistent with either the current typing-PCR results or the toxin gene search
results. ＊, Genes annotated as flagellin were not found in the genome data.

てにおいてalpha毒素遺伝子は認められず，beta毒いる既報のC. novyi計８株についても登録ゲノム

素遺伝子のみ存在したことからC. haemolyticum

情報を用いて同様に判定したところ，C. novyi Aと判定された（Table２）。データベースまたは文型３株，Ｂ型２株，Ｃ型２株，C. haemolyticum

献上の情報よりＡ型が５株，Ｂ型が３株とされて１株と判定された（Table２）。一方，データベー© The Ito Foundation

Clostridium novyi sensu latoの新しい鑑別法の開発へ向けた国内家畜由来株のゲノム解析

Table 2-①

807 bp834 bpFlagellin gene

Flagellin gene253

29-30 bp
870 bp822 bp
Table 2-②

Flagellin gene

hypothetical

Flagellin gene

1783-1820 bp

Fig. 1 Genetic maps of flagellin gene regions found in the genome of Clostridium novyi

sensu lato strains analyzed in the present study．
All C. novyi sensu lato strains had two flagellin genes, and there were two patterns ofgenetic organization in the gene region. In pattern ①，807-bp and 834-bp flagellin
genes were located side by side with a 29-30-bp intergenic region. In pattern ②，
there was a 1783-1820-bp sequence between 822-bp and 873-bp flagellin genes, and ahypothetical protein was encoded in this intergenic region．

スまたは文献上C. haemolyticumとされている既る分類結果のいずれとも一致しなかった（Table

報の５株は，すべてC. haemolyticumと判定され，

２）。

報告と一致した（Table２）。

一 方 ，現 行 PCR お よ び 毒 素 遺 伝 子 検 索 で C.

3 . 2 . 2 ANI解析および系統解析による菌種の分類

novyi A型またはＣ型と判定された５株は，いずれの株も互いに95％以上のANIを示しており同一

国内株15株と既報の株13株においてANI解析を菌種であることが示唆されたが，ANIの値により行ったところ，現行PCRおよび毒素遺伝子検索にさらに２つのグループ（Table２のANI analysis

おいてC. novyi B型またはC. haemolyticumと判の Ⅲ お よ び Ⅳ）に 分 け ら れ た（Fig. ２ お よ び

定された23株のゲノムは，いずれの株同士の比較

Table２）。また，この５株（グループⅢおよびⅣ）

においても同解析で同一菌種と判定される基準でとC. novyi B型またはC. haemolyticumと判定さある95％以上のANIを示した。さらに，これら23れた23株（グループⅠおよびⅡ）の間では，ANI

株は，互いのANIが99.00-100.00％を示す２つのが81.00-81.99％にとどまった。すなわち，ANI解グループ（Table２のANI analysisのＩおよびⅡ）

析の結果からは，現在は同一菌種とされているC.

に分けることができ，グループⅠの株とⅡの株のnovyi A/C型とC. novyi B型は別菌種であり，現

間 の ANI は 97.00-97.99 ％ で あ っ た（Fig. ２）。

在は別菌種であるC. novyi B型とC. haemolyticum

SNPs系統解析においても，この23株は２つのクが同一菌種である可能性が示唆された。

レード（Table２のPhylogenetic analysisのⅤおよ

3.3

びⅥ）に分類することができ，その分類はANI解本研究の目的は，ゲノム解析によって正確にC.

析による分類結果と一致した。しかし，ANIおよnovyi sensu lato国内株の菌種を同定し，菌種鑑

び 系 統 解 析 に よ る 分 類 は ，現 行 PCR の 結 果 ，別に用いられている現行PCRの有用性を評価する

Flagellin遺伝子領域の構造，毒素遺伝子検索によこと，そして，その有用性に疑問が生じた場合は© The Ito Foundation

総括

254

令和４年度

StrainDomestic
strains

Reportedoverseasstrains

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Classiﬁcation

Domestic
strains

Reportedoverseas strains

Ⅰ

Ⅰ

Ⅱ

Ⅱ

Ⅲ

ANI（%）

ⅣⅠ

99.00-100.00

Ⅱ

97.00-97.99

Ⅰ

95.00-95.99

Ⅱ

81.00-81.99

Ⅲ
Ⅳ

Fig. 2 Classification and average nucletotide identity（ANI）of C. novyi sensu

lato strains analyzed in the present studyD omestic strains identified as C. novyi or C. haemolyticum by thecurrent PCR were classified into two groups（Ⅰ and Ⅱ），and overseas
strains reported as C. novyi or C. haemolyticum were classified into fourgroups（Ⅰ-Ⅳ）．Within each group, the ANI values between strains
were more than 99.0％. Strains in the groups Ⅰ and Ⅱ were considered
to be the same species because of the high（over 95.0％）ANI values
between the two groups. For the same reason, strains in the group Ⅲ
and Ⅳ were also considered to be the same species. On the other hand,strains in groups Ⅰ and Ⅱ and those in groups Ⅲ and Ⅳ wereconsidered to be different species based on the low（much less than
95.0％）ANI values between the strains.

新たな菌種鑑別法の開発に利用可能な標的遺伝子を絞り込むことであった。

が生じた。
また，既報のC. novyi sensu lato海外株のゲノ

国内株15株における保有毒素遺伝子の検索でム解析結果は，報告上の情報（菌種や保有毒素遺は，現行PCRの結果と異なり，全株がalpha毒素伝子）と矛盾しており，国内株の菌種判定のためを 持 た な い C. haemolyticum と 判 定 さ れ た 。C.

の基準として使用できなかった。すなわち，現行novyiのalpha毒素が脱落しやすいプラスミドやPCRの有用性を判定する以前に，C. novyi sensu

ファージに存在する場合，菌分離や継代培養の間

lato内の菌種および型の分類について再検討するに毒素遺伝子が脱落し，その結果，C. novyiだっ必要性があることが明らかとなった。

た菌株がC. haemolyticumと判定されてしまった

今後は，C. botulinumグループⅢ株を含めてよ可能性も考えられる。しかし，現行PCRによる国り多くのC. novyi sensu lato株のゲノムをさまざ内株の菌種同定結果は，ANI解析や系統解析によまな角度から解析することで株間の差異を明確にる分類結果とも一致せず，さらに，一部のPCR産し，菌種や型の分類を再定義したうえで新しい菌物はゲノム解析で見つかったFlagellin遺伝子とは種鑑別法の開発につなげていきたい。

異なる領域から増幅されていた。これらの結果か
ら，少なくともC. novyiとC. haemolyticumの鑑

４．要約別においては，FlagellinをコードしているとされClostridium novyi sensu latoには，Clostridium

るfliCを標的としている現行PCRの有用性に疑問

novyi A/B/C型，Clostridium haemolyticum，© The Ito Foundation

Clostridium novyi sensu latoの新しい鑑別法の開発へ向けた国内家畜由来株のゲノム解析

255

Clostridium botulinumグループⅢが含まれ，この種の鑑別に有用でない可能性が再認識されただけ

うちC. novyiとC. haemolyticumを含むClostridium

でなく，C. novyi sensu lato内の菌種や各菌種内属菌鑑別用のFlagellin遺伝子を標的とするPCR法

での型の分類を再定義する必要性が示唆された。

（現行PCR）が，農林水産省の病性鑑定指針に掲

今後は，基準株を含む国内外のさらに多くのC.

載され，全国の家畜疾病の診断現場で使用されてnovyi sensu lato株のゲノム解析を行い，C. novyi

いる。しかし，我々が病性鑑定を行う中で，現行

sensu lato内の遺伝的差異を明確にして菌種分類

PCRでは人獣共通感染症の原因菌であるC. novyiの再定義を試みる。そのうえで，人や家畜で問題と家畜感染症の原因菌であるC. haemolyticumをとなるClostridium属菌を正確に鑑別可能な新た鑑別できない可能性が示唆された。しかし，このな菌種同定法の開発を目指したい。

２菌種の国内株のゲノムは解析されておらず，ゲ
ノム情報を利用した現行PCRの有用性評価も行えない状況であった。そこで本研究では，現行PCR
でC. novyi B型またはC. haemolyticumと判定された国内株のゲノム配列を決定し，既報の海外株のゲノムとの比較による菌種同定と現行PCRの有用性評価を試みた。現行PCRの菌種同定結果は，毒素遺伝子検索による菌種同定結果やANIおよび系統解析による分類結果のいずれとも一致しなかった。また，現行PCRの一部の増幅産物はゲノ
ム解析で見つかったFlagellin遺伝子とは異なる領域から増幅されていた。さらに，海外株の報告上の情報（菌種や保有毒素遺伝子）も毒素遺伝子検
索結果やANI解析等のゲノム解析による分類と一致せず，国内株の菌種判定の基準としても使用できなかった。本研究は国内由来のC. novyiおよび
C. haemolyticumのゲノムを解析した初めての研究であり，現行PCRがC. novyi sensu lato内の菌文
献１） Sasaki, Y., Kojima, A., Aoki, H., Ogikubo, Y.,
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13，75～90，2002．
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10）
 Oakley, C. L., Warrack, G. H., Clarke, P. H.：JGen Microbiol．，1，91～107，1947．

© The Ito Foundation

256

ブタ呼吸器複合感染症の原因ウイルスを解析する
新たなin vitroモデルの確立
Establishment of a novel in vitro model for investigating viruses associatedwith the porcine respiratory disease complex（PRDC）

宮

澤

光太郎・熊

谷

飛

鳥

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

Kohtaro Miyazawa and Asuka Kumagai（National Institute of Animal Health, NARO）

Porcine respiratory disease complex（PRDC）is highlighted due to its huge economical
damage on swine producers. Swine influenza A virus（IAV-S）is thought to play an importantrole in PRDC in combination with other pathogens, such as porcine reproduction andrespiratory syndrome virus. Moreover, pigs are known to be susceptible to both human andavian influenza viruses suggesting the potential impact of IAV-S on the pig industry andpublic health. Therefore, it is critical to monitor epidemic IAV-S strains in pig farms. MDCK
cells have been used for the isolation of IAV-S over the years. However, passaging of human
influenza viruses in MDCK cells is known to lead the selection of variants with mutations intheir genome. Although IAV-S requires trypsin to be cultivated in MDCK cells, successful
amplification of IAV-S was reported in Caco-2 cells from human colon adenocarcinoma without
trypsin．
In this study, we focus on newly established swine intestinal epithelial cell line（SIEC1-3）
for the isolation of IAV-S because pigs are the natural host. We evaluated the susceptibility of
SIEC1-3 for the isolation of IAV-S and compared these properties with MDCK and MDCKSIAT1 cells overexpressing human α-2,6-sialyltransferase. We demonstrated that SIEC1-3
cells supported efficient replication of IAV-S without trypsin and that they could more
efficiently isolate IAV-S from swine nasal swabs than MDCK cells. Contrary to our
expectations, MDCK-SIAT1 cells showed the highest sensitivity for the isolation of IAV-S
among three cell lines. Sequence analysis revealed that 11 out of 12 isolates possessed the sameamino acid sequences irrespective of the use of different cell lines for viral isolation. Only one
isolate possessed a different amino acid at position 14 of HA and at position 291 of PB1,
respectively. Further study is required to clarify the function of these mutations. In addition,
we succeeded in obtaining eight cloned cell lines from swine lung tissue, and thecharacterization of these cell lines is still ongoing．

© The Ito Foundation

ブタ呼吸器複合感染症の原因ウイルスを解析する新たなin vitroモデルの確立

１．目

257

離効率をMDCKと比較するとともに，IAV-Sの的標的細胞である豚肺由来の上皮細胞株の作出を試豚インフルエンザは，Ａ型インフルエンザウイ
ルスによって引き起こされる豚の呼吸器疾患である。豚インフルエンザウイルス（IAV-S）は，豚
繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（PRRSV）や豚

みた。
２．方

法

2 . 1 豚小腸上皮細胞株（SIEC1-3）のIAV-S

サーコウイルス２型（PCV2）とともに，豚呼吸への感受性評価

器複合感染症（PRDC）を誘発する代表的なウイ

Lenti-SV40 Lentivirus（abm）を 用 い て 不 死ルスとして知られており，諸外国では豚の生産性化後にクローニングしたSIEC1-3のIAV-Sに対すを悪化させる経済損失の大きい疾病として認識さる感受性を調べるため，24穴セルタイトＣ-１プ

れている１）。また，豚はヒトとトリの両方のインレート（住友ベークライト）に細胞を播種し，一フルエンザウイルスに感受性を示すことが知られ晩培養する。豚鼻腔スワブからMDCKを用いてており，由来の異なる２種類のインフルエンザウ

分 離 し た IAV-S（sw/Gunma/46-6975/2019）をイルスに豚が同時に感染すると，遺伝子再集合に

吸着後，0.8μg/ml，0.4μg/mlまたは０μg/ml のより新たな性状を示すウイルスが出現し，ヒトでTPCK処理済みトリプシン（Thermo Scientific）の世界的流行（パンデミック）を引き起こす可能を含む無血清培地に置換し，４日間培養した。培性が考えられるため，公衆衛生の観点からも重要

養上清中のウイルス増殖は，体積分率0.55％モル

な疾病である。ゆえに，豚群で流行・循環する

モット赤血球を用いた赤血球凝集（HA）試験に

IAV-Sの性状を正確に把握することは非常に重より確認した。
2.2

要である。

力価測定方法の検証

我々は，慣用的に使用されているイヌ腎上皮細96穴セルタイトＣ-１プレートにMDCK，α-2.6胞株（MDCK）では，分離材料である鼻腔スワ

結合シアル酸を高発現するMDCK-SIAT1およびブからウイルスゲノムが検出されるにも関わら我々が樹立したSIEC1-3を播種し，24時間培養しず，ウイルスを分離できない事例を複数経験してて単層を形成させる。細胞を無血清培地で洗浄いる。また，MDCKで分離したヒト季節性イン

後，10倍階段希釈したウイルス液を加えて37℃でフルエンザウイルスには，変異が入ることが報告

５日間培養する（単層形成後接種法）。一方，されている２）。これらの事実から，ウイルス分離

SIEC1-3については10倍階段希釈したウイルス液に用いる細胞株の感受性の違いや本来とは異なるを96穴プレートに分注後に細胞浮遊液を各ウェル宿主に由来する細胞株での増殖によるウイルスゲに加えて37℃で５日間培養する同時接種法も実施

ノムの変異により，MDCKで分離されたIAV-S

し，HA活性を指標に50％感染量（TCID50/ml）のゲノム解析の結果は，必ずしも豚で循環していを算出して単層形成後接種法と比較した。

るIAV-Sの遺伝的背景を反映していない可能性

2 . 3 MDCK ，MDCK-SIAT1 お よ び SIEC1-3がある。これまでに，ヒト結腸癌由来細胞であるを用いた鼻腔スワブからのIAV-Sの分離

Caco-2を用いたIAV-Sの分離が報告されている

本試験にはＭ遺伝子を標的としたリアルタイム

ことから３），IAV-Sの本来の宿主である豚から樹

RT-PCRにおいて遺伝子が検出された59検体の鼻

立した小腸上皮細胞株（SIEC1-3）のウイルス分腔スワブを用いた。MDCK，MDCK-SIAT1およ© The Ito Foundation

258

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

びSIEC1-3を24穴セルタイトＣ-１プレートに播ウイルス液添加実験区の培養上清においてもHA

種し，24時間培養して単層を形成させる。細胞を活性が確認された。一方，培地へのトリプシン添

HBSSで３回洗浄し，フィルター滅菌した鼻腔ス

加の有無に関わらず，接種96時間を経ても10－５ウ

ワブ（100～120μｌ）を添加して吸着（37℃で60

イルス液添加実験区の培養上清にはHA活性は認分間）後，鼻腔スワブを除く。SIEC1-3には１

められなかった。以上の結果から，豚小腸上皮細ml/well で 無 血 清 培 地 を ， MDCK と MDCK-胞株であるSIEC1-3は，MDCKやMDCK-SIAT1

SIAT1には0.5μg/ml TPCK処理済みトリプシンと は 異 な り ，ト リ プ シ ン に 依 存 す る こ と な く

含有培地を加えて37℃で４日間培養する。ウイル

IAV-Sを増殖させることが示された。

ス増殖はHA試験により判定し，HA活性が検出されなかった場合は培養上清を50倍希釈し，別途

3 . 2 SIEC1-3を用いたIAV-Sのウイルス力価
測定系の確立準備したMDCK，MDCK-SIAT1およびSIEC1-3

SIEC1-3のIAV-Sに対する感受性をMDCKと比に接種して４日間培養後にHA試験を実施した。

較した。MDCKを用いたIAV-SのTCID50 の算出

培養上清からNucleoSpin RNA XS（タカラバイには単層形成後接種法が用いられているが，同時オ）を用いてRNAを抽出後，NEBNext Ultra II

接種法はこれに比べて簡便かつ迅速な手法である

RNA Library Prep Kit（NEB）を用いてイルミ

ため，両手法から算出されるTCID50 に違いが生

ナ用RNAライブラリー調製し，次世代シーケン

じるかを検討した。単層形成後接種法を用いて算サーMiSeqシステム（Illumina）を用いて各細胞出した力価は106.125 TCID50/ml，同時接種法を用株により分離したIAV-Sの全ウイルスゲノム配いて算出した力価は106.375 TCID50/mlであり，両列を決定した。

者に著しい差は認められなかったため，SIEC1-3

2.4

豚肺由来不死化細胞株の樹立を用いた力価測定には同時接種法を採用すること

気管および細気管支をできる限り取り除いた肺とした。SIEC1-3ではトリプシン非依存性にウイ

組 織 か ら 調 製 し た 初 代 培 養 細 胞 に Lenti-SV40

ルスを培養できるため，血清含有培地の使用が可

Lentivirusを感染させ，SV40 T-antigen遺伝子を能である。血清含有培地は，細胞の状態を良好に安定発現する細胞をピューロマイシンへの薬剤耐維持し，効率的なウイルス増殖を促す可能性が考性を指標に選択し，不死化細胞株を得る。上皮細えられるため，次いでFBS添加の影響を検証した。

胞マーカーであるサイトケラチンや間葉系細胞

Table１に示すように，sw/Gunma/46-6975/2019株

マーカーであるビメンチン等に対する抗体を用いのウイルス力価は，培地へのFBS添加の有無に関て細胞を染色し，樹立した細胞株の性状を解析しわらず106.0～106.375 TCID50/mlであり，FBS添加にた。

よる力価の上昇は認められなかった。SIEC1-3を用いて算出したsw/Gunma/35-6815/2019株の力

３．結果と考察
3.1

価は106.875 TCID50/mlであり，MDCKを用いて算SIEC1-3におけるIAV-Sの増殖

出した力価（106.968 TCID50/ml）と近似しており，

SIEC1-3では，培地へのトリプシン添加の有無

MDCK-SIAT1 を 用 い て 算 出 し た 力 価 （107.301に関わらずにウイルス接種24時間後には10倍希釈

TCID50/ml）よりは若干低い傾向を示した。以上（10－１）ウイルス液を添加した実験区で培養上清の結果から，SIEC1-3はIAV-Sに対してMDCKとにHA活性が確認された。接種96時間後には10同程度の感受性を有することが示された。また，－４© The Ito Foundation

ブタ呼吸器複合感染症の原因ウイルスを解析する新たなin vitroモデルの確立

259

Table１ Comparison of TCID50/ml of IAV-S between SIEC1-3 cellswith 1％ FBS and without serum
Attempt

Serum-free

１％FBS

１st

106.375

106.0

２nd

106.25106.125

３rd

106.0

106.375

Mean TCID50/ml

106.208

106.167

A

B

Fig. 1 IAV-S induced cytopathic effects（CPE）in SIEC1-3 cells. SIEC1-3 cells

were mock-infected（A）and infected with IAV-S（B）, respectively. Imagesof SIEC1-3 cells were taken at 72 hours post inoculation of swine nasal swab.
White arrows indicate CPEs induced by IAV-S. Black arrows indicate
floating cells as the result of IAV-S infection. They often form aggregates.
Arrow head indicates the area where infected cells were completely
detached. Scale bars：400μｍ
Table２ Virus isolation in different cell cultures from nasal swabs
MDCK

SIEC1-3

MDCK-SIAT１

Number of isolation

24／59

33／59

46／59

Isolation efficiency

40.7％

56.0％

78.0％

MDCK-SIAT1のIAV-Sに対する感受性は，他の察はMDCKに比べて容易であった。

２種類の細胞株に比べて高いことが示唆された。

各細胞株を用いた鼻腔スワブからのIAV-S分

3 . 3 SIEC1-3 ，MDCK お よ び MDCK-SIAT1

離 率 を Table ２ に 示 す 。ウ イ ル ス 分 離 効 率 は ，による鼻腔スワブからのウイルス分離の比

α-2.6 結 合 シ ア ル 酸 高 発 現 細 胞 で あ る MDCK-較

SIAT1で最も高く，ついで豚小腸上皮細胞株であ

鼻腔スワブを接種したSIEC1-3では細胞間隙がるSIEC1-3，MDCKの分離効率が最も低い結果と不明瞭かつ扁平化した細胞や剥離して凝集塊を形なった。MDCK-SIAT1とSIEC1-3で分離可能で成する細胞変性効果（CPE）が観察された（Fig.

あり，MDCKでは分離不可能だった鼻腔スワブ

1B）。一方，MDCKでは細胞の剥離といったCPEのCt値の範囲は26.345～37.286と広く，ウイルスが観察されたが，トリプシンの影響により鼻腔ス

分離の可否は，スワブ中のウイルス量だけに依存

ワブ未接種実験区でも細胞の剥離が観察され，するのではなく，細胞側の要因も関与することがCPEの判定が困難であった。MDCK-SIAT1のト示唆された。一方，MDCK-SIAT1のみでウイル

リプシン耐性はMDCKに比べて高く，CPEの観ス分離ができた13検体の鼻腔スワブのCt値は，© The Ito Foundation

260

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

45

＊
＊

40

Ct values

35

30

25

20

MDCK-SIAT1MDCKSIEC1-3 Only MDCK-SIAT1

Fig. 2 Dot plot shows the distribution of Ct values of nasal swab

samples. M gene RT-PCR was conducted to detect IAV-S in nasal
swabs. Individual dots in the column indicate Ct values of nasal
swabs from which viruses were isolated by the cell line indicatedat the bottom of each column. The left column represents Ct valuesof nasal swabs from which viruses were isolated by only MDCKSIAT1 cells. Mean Ct value of this column is significantly higher
than those of MDCK and SIEC1-3 columns.＊：The results were
determined to be significant according to Bonferroni's method. Bar:Median Ct value

他の２種類の細胞株でウイルスが分離できたスワの ア ミ ノ 酸 は SIEC1-3 分 離 株 で は ト レ オ ニ ン

ブのCt値に比べて有意に高かった（Fig. ２）。以（Ｔ）であるが，MDCKおよびMDCK-SIAT1分

上 の 結 果 か ら ， MDCK-SIAT1 は SIEC1-3 や離株ではＩであった。HAの変異はシグナルペプ

MDCKに比べてウイルス量の少ない鼻腔スワブ

チド部位であることから，機能に影響は与えないからもウイルス分離が可能なことが示された。

と推測される。一方，PB１におけるアミノ酸のMDCK，MDCK-SIAT1およびSIEC1-3で共通に違いについては，今後鼻腔スワブ中のPB1遺伝子分離されたIAV-Sのうち12株について全ゲノム配列を決定し，どちらの細胞株から分離された配列を明らかにし，その配列を比較したところ，

IAV-Sの配列と一致するか調べる必要がある。以

11株についてはアミノ酸レベルでの違いは認めら上の結果から，トリプシン非依存性にIAV-Sを分れなかった。１株については，HAの40番目のア

離可能なSIEC1-3は，CPEの判別が容易かつロッミノ酸がSIEC1-3分離株ではバリン（Ｖ）であト変更に伴うトリプシン使用濃度の検討が不要でり，MDCKおよびMDCK-SIAT1分離株ではイソあるため，利便性は高いが，MDCK-SIAT1に比ロイシン（Ｉ）であった。また，PB１の872番目

較するとウイルス量の少ない検体からの分離効率© The Ito Foundation

ブタ呼吸器複合感染症の原因ウイルスを解析する新たなin vitroモデルの確立
A

B

C

D

261

Fig. 3 Immunofluorescense staining of two different immortalized

cell lines derived from proximal lung tissue. Images（A-C）
indicate the same cell line and Image D indicates another cellline. Cells were fixed with cold methanol and acetone at －20℃
and then were stained with antibodies for vimentin（A）, Pancytokeratin（B and D）, and PCAM-1（C）. Positive cells werevisualize by goat anti-rabbit IgG conjugated with Alexa Fluor
544（A and B）and by goat anti-mouse IgG conjugated with
Alexa Fluor 488（B and D）, respectively. Nuclei were stainedwith Dapi. One cell line shown in A-C is derived frommesenchymal cell lineage and the other（D）is derived from
epithelial cell lineage. Bar：100μｍが劣ることが明らかとなった。
3.4

肺由来の上皮細胞株を樹立する。

樹立した肺由来不死化細胞株の性状解析

クローニングシリンダーを用いて最初に分離し４．要

約た細胞株について性状解析を行ったところ，間葉

近年，養豚業に大きな経済的打撃を与える要因

系細胞マーカーであるビメンチンが検出されたがとして，豚呼吸器複合感染症（PRDC）が注目さ（Fig. 3B），上皮細胞マーカーであるサイトケラ

れており，豚インフルエンザウイルス（IAV-S）

チンは発現していなかった（Fig. 3A）。また，

はPRDCの原因ウイルスの一つと考えられていPCAM―１を発現することから血管内皮細胞株

る。また，豚は鳥およびヒトのインフルエンザウ

であることが示唆された（Fig. 3C）。現在サイトイルス（IAV）に感受性を示すため，豚が保有すケラチンを発現するピューロマイシン耐性の細胞

るインフルエンザウイルスの調査は公衆衛生上も集団（Fig. 3D）から限界希釈法とクローニング重要である。IAV-Sの分離には慣習的にMDCK

シリンダーを用いて７株のクローン細胞株を得てが用いられているが，MDCKで分離されたヒトいる。今後，これらの細胞株について性状解析をの季節性IAVには変異が入ることが報告されてい進め，IAV-Sの効率的な分離培養に使用可能な豚る。また，MDCKでIAV-Sを分離する際にはト© The Ito Foundation

262

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

リプシン添加が必要であるが，ヒト結腸癌由来の

HAとPBlで１アミノ酸の違いが認められた。今上皮細胞株であるCaco-2ではトリプシン添加な後、鼻腔スワブ中のウイルスゲノム配列を明らかしにIAV-Sが分離できることが知られている。本にし，どちらの細胞株で分離されたウイルス株の研究では，IAV-Sの自然宿主である豚から新たに

アミノ酸配列と一致するかを検証する必要があ

樹立した小腸上皮細胞株（SIEC1-3）のIAV-S分る。また，現在までに８株の豚肺由来不死化細胞

離効率についてMDCKと比較検証する。

株を得ており，その性状を解析中である。

我々が樹立したSIEC1-3ではトリプシン非依
存 的 に IAV-S の 増 殖 が 可 能 で あ っ た 。ま た ，
MDCKに比べて効率的にIAV-Sを分離できた。
しかしながら，α-2.6結合シアル酸を高発現する
MDCK-SIAT1が最も効率よくIAV-Sを分離可能であった。12検体の鼻腔スワブでは，SIEC1-3とMDCK-SIAT1の両細胞株でウイルスが分離された。両細胞株から分離された12株のIAV-Sのうち11株のアミノ酸配列は完全一致したが，１株では文
献
１） Li and Robertson.：The epidemiology of swine
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substrates for isolation of swine influenza A
viruses, J Virol Methods，163，162～165，2010．

© The Ito Foundation

263

牛呼吸器病症候群（BRDC）の悪化におけるバイオフィルム形成の関与
Involvement of biofilm formation in exacerbation of bovine respiratory disease
syndrome（BRDC）

帆

保

誠

二

（鹿児島大学共同獣医学部）

Seiji Hobo
（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

In this study, 28 strains of Pasteurella multocida isolated from the bronchoalveolar lavage
fluid of cattle with bovine respiratory disease（BRDC）were used, and we investigated thedrug susceptibilities of 7 antibiotics（amoxicillin：AMPC, ampicillin：ABPC, thiamphenicol：
TP, tylosin, oxytetracycline, chlortetracycline, kanamycin）. In addition, the biofilm formation
ability of P. multocida 28 strains were investigated, and we aimed to clarify the concentrationof antibiotics that can inhibit the formation of biofilms. The minimum inhibitory concentration（MIC）for 50％ or 90％ inhibition of the growth of P. multocida of the 7 antibiotics were 0.25-16
over μg/ml, 1-16 over μg/ml, respectively. AMPC and TP were MICs that could be expected
to be clinically effective against P. multocida infection, but it was suggested that clinicalefficacy of other antibacterial agents could not be expected. The minimum bactericidal
concentration（MBC）for 50％ or 90％ killing of P. multocida for the tested antibiotics were
4-16 over μg/ml and 8-16 over μg/ml, respectively. MBC was relatively high for 7 antibiotics,
suggesting that a single dose is unlikely to kill P. multocida. From this, even antibiotics thatare expected to be effective against P. multocida cannot be expected to cure with a single
dose, so it was considered important to administration continuously for a necessary andsufficient period. On the other hand, 17 strains（60.7％）out of 28 strains of P. multocida tested
formed biofilms. The formation time was 3 strains after 48 hours, 4 strains after 72 hours, 2
strains after 120 hours, 2 strains after 144 hours, and 6 strains after 168 hours. The
concentrations of AMPC, ABPC and TP that inhibit P. multocida biofilm formation by 50％ or
90％ were all 1μg/ml and 2μg/ml, respectively. This suggests that these three antibiotics may
inhibit biofilm formation. On the other hand, the minimum biofilm eradication concentrations
that eradicate 50％ or 90％ of biofilms formed by P. multocida of the tested antibiotics were all
16μg/ml over. From this, it was thought that none of the tested antibiotics could eradicate
biofilms formed by P. multocida．

© The Ito Foundation

264
１．目

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

合は，その形成を阻害できる抗菌薬の濃度を明ら的かにすることを目的とした。

牛の肺炎は，年間約1.7万頭の牛を死廃用に至らしめる重要な感染症であり，牛呼吸器病症候群

２．材料と方法（BRDC）として捉えられている１，２）。BRDCは，

2.1

輸送や集合をはじめとしたさまざまな原因による

BRDCの重症化あるいは慢性化の病態にあると感染防御能（免疫力）の低下，ウイルス感染，細診 断 さ れ た 黒 毛 和 種 牛 か ら BALF を 採 取 し ，

菌感染を主体とした複合的な要因が絡みあって発BALFから分離されたP. multocida 28株を供試し症することが知られている

た。

。

３～７）

これまでに我々は，牛での気管支肺胞洗浄法

2.2

供試材料

BALFの採取（BAL）を確立するとともに，BRDCの病態にあビデオエンドスコープを供試牛の鼻孔から挿入ると診断された牛に対してBALを実施し，真の肺

し，気管および気管支内腔を観察した。その後，炎原因菌を特定した。その結果，Pasteurella

気管支鏡を滲出液が観察される気管支へと進め楔

multocidaおよびMycoplasma bovisがBRDCの病入した。楔入部位に滅菌生理食塩水を気管支鏡の態悪化や慢性化に強く関与していることが明らか

鉗子孔経由で注入し，即座に回収することによりとなった。これらBRDC罹患牛の一部を病理解剖

BALFを得た。

６～９）に付したところ，肺患部は膿瘍を形成し，バイオ2.3

フィルムの存在を示唆する所見が存在した。このBALF検体は，既報５～９）に準じて培養した。培養ことから，BRDCの病態悪化や慢性化は，病原性後の培地から細菌を分離し，純培養後にグラム染細菌により形成されたバイオフィルムが全身投与

色検査および細菌同定検査（飛行時間型質量分析

された抗菌薬の標的細菌への到達を阻害するた法，PCR検査あるいはLoop-Mediated Isothermal

め，十分な治療効果が得られないことが原因であ

Amplification）により，菌種を同定した。供試細ると推察された。しかし，BRDC罹患牛のBALF

菌 株 は ， Brain Heart Infusion Broth （BHIB ；から分離された細菌のバイオフィルム形成に関すBecton Dickinson and Company, U.S.A．）にて増る報告は見当たらない。このことを解決するため

菌培養後，－80℃で凍結保存した。急速解凍後のには，申請者らがBRDC罹患牛の気管支肺胞領域

供試細菌液中の生存細菌数（CFU/ml）は，滅菌への感染を証明したP. multocidaやM. bovisがバ

生理食塩水で10倍階段希釈し，５％ウマ血液含有

イオフィルムを形成するのか，さらに，これら細寒天培地で培養することにより絶対生存菌数

菌がバイオフィルムを形成する場合は，その形成（CFU/ml）として計数した。

を阻害する方法の開発が必要であると考えられた。
本研究では，BRDCの病態悪化や慢性化が認め

2.4

細菌分離・同定検査

薬剤感受性試験

最小発育阻止濃度（MIC）は，動物用抗菌剤研られる牛に対してBALを実施し，その回収液で究会が「動物用抗菌剤研究会2003年改訂標準法

ある気管支肺胞洗浄液（BALF）から分離される動物由来細菌に対する抗菌性物質の最小発育阻止

P. multocidaについて，薬剤感受性を調査すると濃度（MIC）測定法」にて定めた微量液体希釈法

ともにバイオフィルム形成能を調査した。さらに準じて測定した。使用抗菌薬は，牛臨床で一次に，P. multocidaがバイオフィルムを形成する場

選択抗菌薬として使用されている７抗菌薬（アモ© The Ito Foundation

265

牛呼吸器病症候群（BRDC）の悪化におけるバイオフィルム形成の関与

キシシリン：AMPC，アンピシリン：ABPC，チ

2.6

アンフェニコール：TP，タイロシン；TYL，オ

MBICは，バイオフィルム形成量・形成阻害

キシテトラサイクリン：OTC，クロルテトラサ

キット（Biofilm Formation Assay kit，同仁化学

イクリン：CTC，カナマイシン：KM）とした。

研究所）を用い，既報10）に準じて求めた。供試細

抗菌薬濃度は，0.125，0.25，0.5，１，
２，
４，
８お

菌株のバイオフィルム形成が50％あるいは90％阻

よび16μg/mlとし，MICを求めた。また，供試細止されたMBIC（MBIC50，MBIC90）を算出した。

バイオフィルム形成阻害濃度（MBIC）

菌 株 の 発 育 を 50 ％ あ る い は 90 ％ 阻 止 す る MIC

2.7（MIC50，MIC90）を算出した。

MBEC は ，バ イ オ フ ィ ル ム 生 存 試 験 キ ッ ト

バイオフィルム撲滅濃度（MBEC）

最小殺菌濃度（MBC）は，MIC測定後の培養（Biofilm Viability Assay Kit ，同 仁 化 学 研 究 所）

液を５％ウマ血液含有寒天培地に播種し，37℃でを使用し，既報10）に準じて求めた。なお，抗菌薬

24時間培養した後，細菌発育の有無を確認した。

濃度0.125，0.25，0.5，１，２，４，８および16μg/

発育が確認されない最小の抗菌薬濃度をMBCとmlで測定した。細菌株が形成したバイオフィルした。また，供試細菌株を50％あるいは90％殺菌

ムを50％あるいは90％撲滅する最小バイオフィル

するMBC（MBC50，MBC90）を算出した。

ム撲滅濃度（MBEC50，MBEC90）を算出した。

2.5

バイオフィルム形成試験

バイオフィルム形成試験には，市販のバイオフィ

３．結果と考察

ルム形成量・形成阻害キット（Biofilm Formation

3.1

薬剤感受性

Assay kit，同仁化学研究所，熊本）を使用し，供試した牛臨床での一次選択抗菌薬７種類のP.

既報10）に準じて試験を実施した。なお，供試細菌

multocidaに対するMIC50 ，MIC90 はそれぞれ0.25

株を含むBHIBは培養開始24時間ごとに交換し，～16μg/ml超，１～16μg/ml超，MBC50 および

24，48，72，96，120，144あるいは168時間培養

MBC90はそれぞれ４～16μg/ml超，８～16μg/ml

することによりバイオフィルム形成試験を実施し

超 で あ っ た（Table １）。供 試 抗 菌 薬 の う ち ，た。

AMPCおよびTPは，P. multocida感染症に対して臨床的な効果が期待できるMICであったが，他

Table 1 The minimum inhibitory concentration（MIC）for 50% or 90% inhibition of the growth of

P. multocida, and the minimum bactericidal concentration（MBC）for 50% or 90% killing of
P. multocida.

Antibiotics

Antimicrobial
abbreviations

MIC50

MIC90

MBC50

MBC90

Amoxicillin

AMPC

0.5

1

>16

>16

Ampicillin

ABPC

0.25

>16

>16

>16

TP

1

1

4

>16

Thiamphenicol
Tylosin

TYL

16

>16

>16

>16

Oxytetracycline

OTC

4

>16

>16

>16

Chlortetracycline

CTC

2

4

4

8

Kanamycin

KM

>16

>16

>16

>16

＊μg/ml© The Ito Foundation

266

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）の抗菌薬の臨床的な効果は期待できないことが示ら，P. multocidaの感染初期から有効な抗菌薬を唆された。また，ABPCは菌株によってMICが大適切に投与すれば，その形成を阻害できる可能性

きく異なったことから，治療対象牛もしくは当該が推察された。

農場における肺炎罹患牛のBALFから分離された

3.3

P. multocidaのMICを把握することが重要である

AMPC，ABPCおよびTPのMBIC50，MBIC90は，と考えられた。一方，MBCはいずれの抗菌薬もそれぞれ１μg/ml，２μg/mlであった（Table３）。

比較的高値であったことから，P. multocidaを抗このことから，これら３抗菌薬はバイオフィルム

菌薬１回投与のみで殺菌的に死滅させられる可能形成を阻害できる可能性が示唆された。一方，他性は低いことが示唆された。このことから，P.

の抗菌薬のMBICは高値であったことから，P.

multocidaに対して効果が期待される抗菌薬でmultocidaのバイオフィルム形成を阻害することあっても，単回投与での治癒は期待できないことは困難であると考えられた。

MBIC

から，必要十分な期間にわたって連続投与するこ3.4とが重要であると考えられた。

供試抗菌薬のMBEC50およびMBEC90は，いずれ3.2

バイオフィルム形成

MBECも16μg/ml超であった（Table３）。このことから，

供試したP. multocida 28株中17株（60.7％）でいずれの供試抗菌薬もP. multocidaがバイオフィ

バイオフィルムを形成し，その形成時間は培養開ルムを形成した後に，バイオフィルムを撲滅する

始後48時間で３株，72時間で４株，120時間で２ことは不可能であると考えられた。

株 ，144 時 間 で ２ 株 ，168 時 間 で ６ 株 で あ っ た（Table２）。本研究において，P. multocidaは比較

４．要

約

的高率にバイオフィルムを形成することが明らか

本研究では，牛呼吸器病症候群（BRDC）発症となったが，その形成には時間を要することか

牛の気管支肺胞洗浄液から分離されたPasteurella

Table 2 Biofilm formation and biofilm formation time in 28 strains of Pasteurella multocida.
Strain No.

Biofilm
formation＊

Biofilm
formation time（hour）

Strain No.

Biofilm
formation＊

Biofilm
formation time（hour）

1

＋

72

15

－

nt

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
＋
＋
－
－

144
168
168
168
nt
120
48
168
72
72
nt
nt

16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27

＋
＋
－
－
－
＋
－
－
－
－
＋
＋

72
168
nt
nt
nt
120
nt
nt
nt
nt
144
48

14

＋

168

28

＋

48

＊＋：Positive，－：Negative

nt：Not possible to measure because it does not form a biofilm.

© The Ito Foundation

267

牛呼吸器病症候群（BRDC）の悪化におけるバイオフィルム形成の関与
Table 3 The minimal biofilm inhibitory concentration（MBIC）for 50% or 90% inhibition of thebiofilm formation of P. multocida, and the minimum biofilm eradication concentration（MBEC）that eradicate 50% or 90% of biofilms formed by P. multocida.

Antibiotics

Antimicrobial
abbreviations

MBIC50

MBIC90

MBEC50

MBEC90Amoxicillin

AMPC

1

2

>16

>16

Ampicillin

ABPC

1

2

>16

>16

Thiamphenicol

TP

1

2

>16

>16

Tylosin

TYL

>16

>16

>16

>16

Oxytetracycline

OTC

8

>16

>16

>16

Chlortetracycline

CTC

4

8

>16

>16

Kanamycin

KM

>16

>16

>16

>16

＊μg/mlmultocida 28株を用いて，一次選択抗菌薬７種類

わたって連続投与することが重要であると考えら（アモキシシリン：AMPC，アンピシリン：ABPC，れた。一方，供試したP. multocida 28株中17株

チアンフェニコール：TP，タイロシン，オキシ（60.7％）でバイオフィルムを形成し，その形成

テトラサイクリン，クロルテトラサイクリン，カ

時間は培養開始後48時間で３株，72時間で４株，ナマイシン）の薬剤感受性を調査するとともに，120時間で２株，144時間で２株，168時間で６株

P. multocidaのバイオフィルム形成能を調査しであった。供試抗菌薬のうち，AMPC，ABPC，た。さらに，バイオフィルムを形成する場合は，TPのP. multocidaのバイオフィルム形成を50％

その形成を阻害できる抗菌薬濃度を明らかにする

あるいは90％阻害する濃度は，いずれも１μg/ことを目的とした。供試抗菌薬のP. multocidaの

ml，２μg/mlであった。このことから，これら発育を50％あるいは90％阻止する最小発育阻止濃３抗菌薬はバイオフィルム形成を阻害できる可能度（MIC）はそれぞれ0.25～16μg/ml超，１～16

性 が 示 唆 さ れ た 。 一 方 ， 供 試 抗 菌 薬 の P.

μg/ml超であった。供試抗菌薬が，P. multocida

multocidaが形成したバイオフィルムを50％あるを 50 ％ あ る い は 90 ％ 殺 菌 す る 最 小 殺 菌 濃 度

いは90％撲滅する最小バイオフィルム撲滅濃度は（MBC）はそれぞれ４～16μg/ml超，８～16μg/

いずれも16μg/ml超であった。このことから，供ml超であった。供試抗菌薬のうち，AMPCおよ

試抗菌薬はいずれもP. multocidaが形成したバイ

びTPは，P. multocida感染症に対して臨床的なオフィルムを撲滅することは不可能であると考え効果が期待できるMICであったが，他の抗菌薬のられた。

臨床的な効果は期待できないことが示唆された。
MBCはいずれの抗菌薬も比較的高値であったことから，P. multocidaを抗菌薬の１回投与のみで殺菌的に死滅させられる可能性は低いことが示唆された。このことから，P. multocidaに対して効果が期待される抗菌薬であっても，単回投与での治癒は期待できないことから，必要十分な期間に

文
献１） Snowder, G. D., Van Vleck, L. D., Cundiff, L. V.,
Bennett, G. L.：J. Anim. Sci., 84，1999～2008，2006.
 Portis, E., Lindeman, C., Johansen, L., Stoltman,
２）
G.：J. Vet. Diagn. Invest., 24，932～944，2012．
３）
 Angen, O., Thomse, J., Larse, L. E., Larsen, J.,
Kokotovic, B., Heegaard, P. M., Enemark, J. M.：
Vet. Microbiol., 28，165～171，2009．

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268

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）４） Maunsell, F. P., Woolums, A. R., Francoz, D.,
Rosenbusch, R. F., Step, D. L., Wilson, D. J., Janzen,
E. D.：J. Vet. Intern. Med., 25，772～783，2011．
５） 藏前哲郎，石川真悟，林淳，津曲圭太，乙丸孝之介，
帆保誠二：日獣会誌，73，31～36，2020．
６） 帆保誠二，野口倫子，安藤貴朗：公益法人伊藤記念財団平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報
告書，公益財団法人伊藤記念財団，32，215～221，2014．
７） 帆保誠二，野口倫子：公益法人伊藤記念財団平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，公益財団法人伊藤記念財団，33，189～193，2015．
８） 帆保誠二，石川真悟：平成31年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，公益財団法人伊藤記念財団，
38，260～265，2020．
９） 帆保誠二，石川真悟：令和２年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，公益財団法人伊藤記念財団，
39，287～292，2021．
10） 河野亜紀，古賀靖啓，田原和貴，帆保誠二：日獣会誌，75，e191～e198，2022．

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269

畜産農場に生息するハツカネズミの免疫関連遺伝子の多様性と病原体媒介能力
Diversity of immune-related genes and pathogen vector capacity in wild mice
inhabiting livestock farms

高

島

康

弘・ニコライシャマエフ（岐阜大学応用生物科学部）

Yasuhiro Takashima and Nikolai Shamaev（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

Toxoplasma gondii is an important zoonotic pathogen of meat origin. Mus musculus（mice）
and other rodents living around livestock farms are considered to be important intermediate
hosts for T. gondii, but almost all strains of laboratory mice（M. musculus）die when infectedwith a highly virulent strain. On the other hand, in India and Thailand, there are known toexist mice individuals that are able to retain the highly virulent strains asymptomatically, andit has been pointed out that they may be reservoirs for the highly virulent strains. Such
differences in susceptibility to highly virulent T. gondii strains among individual mice aredetermined by the amino acid sequence of a protein coded by Irgb2 gene. In this study, weinvestigated the diversity of the Irgb2 gene in mice living on livestock farms in Japan. As aresult, we found individuals with an amino acid sequence similar to that of disease-resistantindividuals reported in India and Thailand in Honshu Island, Japan. We also found genes withnew mutations that have not been reported before. Computer simulations of the affinity of theproteins encoded by these genes to a T. gondii virulence factor, ROP5B, showed that some ofthe sequences had very high values. Individuals with such sequences are likely to be
asymptomatic after infection with a highly virulent strain of T. gondii and may function as areservoir for the highly virulent strain in livestock farms in Japan．

１．目

題である。また近年，実験動物用マウスに持続感

的染しない病原体であっても，一部の野生ハツカネ

畜産農家の動物舎周辺に生息する齧歯類はさま

ズミには持続感染が成立し，野生個体を介した病

ざまな家畜感染症を媒介する。例えば農林水産省

原体媒介がありうることが報告されている１）。こ

疫学調査チームは2019年には愛知県・岐阜県におのようなことが起こるのは，野生ハツカネズミ免

いて発生した豚熱のウイルスを齧歯類が媒介した

疫関連遺伝子の多様性が非常に大きく，実験用マ可能性が高いとの見解を示しているなど，畜産農

ウスとは異なった感染感受性を持つ個体が存在す家にとって齧歯類は動物の衛生管理上の重要な問ることによる。しかし，このような研究はごく最© The Ito Foundation

270

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

近始まったばかりであり，我が国の畜産農場に生ノムDNAを精製し，得られたDNAは実験に供す

息する野生ハツカネズミの実態についてはほとん

るまで冷凍庫で保存した。
2.2

ど明らかになっていない。

Irg b2遺伝子領域の塩基配列の決定

そこで本研究では，国内の畜産農家周辺に生息得られたゲノムDNAを鋳型としてIrgb2遺伝子する野生ハツカネズミの遺伝的多様性を明らかに領域を含む配列をPCRにより増幅した。用いたプ

するとともに，重要な人獣共通感染症病原体であ

ライマーおよび増幅条件は過去の文献の報告をもるトキソプラズマをモデルとして，野生ハツカネとに２），若干の改変を加えた。得られた断片に含ズミの病原体伝播能力を免疫関連遺伝子の多様性

まれるDNAの塩基配列をダイレクトシークエンの側面から調査する。とりわけType I強毒型とスで決定し，重複する波形が現れない場合はホモされるトキソプラズマ株への感受性に注目する。

ザイゴートと判断した。重複波形を含む場合はヘ

この株はハツカネズミと同種生物である実験用マ

テロザイゴートと判断し，増幅断片をpT7Blue

ウスを系統に関わらず100％殺してしまうことか

vector（Novagen, USA）にクローニングした。

ら，ハツカネズミへの潜伏感染あるいは潜伏感染

その後，得られた複数のクローンの配列を決定し個体による家畜への媒介は起こらないものとされて２種類のアレルそれぞれの塩基配列を確定した。

てきた。ところがタイ，インドの野生マウスの一2.3部個体に由来する系統は，Type I強毒型に感染

塩基配列が確定したIrg b2遺伝子にコードされしても死亡することなく，これを保虫できる。まていると考えられるタンパク質のアミノ酸配列にたこのような耐性は，これら個体が一般的な実験

ついて，Maximum Likelihood methodに基づき用マウス系統とは異なった塩基配列のImmune-

JTT matrix-based modelを用いてMEGA Xを用

related GTPase（IRG）b2遺伝子を持つことが原いて系統樹を作成した。外群としてC57BL/6マウ

因であると報告されている 。そこで本研究では，スのIrg b10遺伝子がコードするタンパク質のア

国内農場で同様の塩基配列のIrgb2遺伝子を持つ

ミノ酸配列（NM_001135115）ならびにMicrotus

ハツカネズミ個体が生息しているかどうか調査しochrogaster の 相 同 タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸 配 列

た。

（LOC101989451）を用いた。既知の野生マウス

２）

２．方

Irgb2遺伝子の系統解析のIrg b2遺伝子の配列は過去の報告に示された配法

列を用いた２）。

2 . 1 野生ハツカネズミの捕獲およびゲノム
DNAの調整2 . 4 IRG B2とROP5Bタンパク質の結合力の推定

本州に位置するＡ県および本州以外の島に位置

IRG B2およびROP5Bのアミノ酸配列のフォー

するＢ県の家畜農場あるいはその周辺において，

マ ッ ト は http://avermitilis.ls.kitasato-u.ac.jp/

害獣駆除の一環として捕獲されたハツカネズミを

readseq.cgiを用いて以下のソフトウェアに適用

頸椎脱臼により安楽殺し実験に供した。動物を用可能な形式に変換した。変換した配列をhttp://

いるすべての実験は岐阜大学動物実験委員会の承www.iitm.ac.in/bioinfo/PPA_Pred/で供されるフ

認を得て実施した（承認番号 2021-097）。脳またリーソフトで解析しＫｄ値およびΔＧ値を得た。

は 尾 の 組 織 小 片 か ら Genomic DNA Purification
Kit（Promega, Madison, WI, USA）を 用 い て ゲ© The Ito Foundation

畜産農場に生息するハツカネズミの免疫関連遺伝子の多様性と病原体媒介能力271

3 . 2 我が国の畜産農家周辺に生息する野生ハ３．結果と考察

ツカネズミが持つIRG B2タンパク質と強毒3 . 1 我が国の畜産農家周辺に生息する野生ハツカネズミのIRG b2遺伝子の多様性

株トキソプラズマの持つROP5Bタンパク質の結合性

Ａ県およびＢ県で捕獲した12個体のハツカネズ

寄生虫が分泌するROP5Bタンパク質と宿主側ミのIrg b2遺伝子の塩基配列を決定し，それぞれのIRG b2タンパク質の親和性が高い場合，当該の遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列

細胞は強毒株トキソプラズマに耐性になることがに変換したところ10種類のアミノ酸配列が得られ知られている。そこで，本調査で新たに得られたた。既報のアミノ酸配列と完全に一致したのはこ

IRG b2 タ ン パ ク 質 と 強 毒 株 ト キ ソ プ ラ ズ マのうち２つだけであり，残りの８つは新たな配列

ROP5B 分 子 の 親 和 性 を コ ン ピ ュ ー タ ー シ ミ ュであった。このうち一つ目の配列はチェコ共和

レーションにより予測した。その結果，10配列の国，中華人民共和国内モンゴル自治区，カザフス

うち３配列において，インド産野生個体に由来す

タンから報告された個体の配列に一致した。このる強毒株耐性マウス（CIM系統）のIRG b2より

配列はＡ県の２農場から検出されたほか，Ｂ県か

さらに高い結合性を示した（Ｋｄ値およびΔＧ値

らも検出された。日本国内のみならず世界中に広のいずれの面でも同様であった）。また，高い結く分布している配列と考えられる。もう一つの配合性が予測された配列のタンパク質を組換え大腸列はCAST/EiJマウスの配列と一致した。さらに菌を用いて作成し，強毒株ROP5Bとの結合能力完全一致ではないものの，きわめて類似の配列をを免疫沈降法を用いて検証中である。すべての配持つ個体も見出された（Fig. １）。CAST/EiJマ列について検証を終えたわけではないが，これま

ウスはタイの野生マウス個体に由来する系統で，で検討した配列は，いずれも免疫沈降法において強毒株トキソプラズマに感染しても無症状で長期も強い結合性を示している。一方で低い結合性が間虫体を体内に保有することが知られている。

予測された配列では，免疫沈降でもタンパク質間このようなIRG b2アミノ酸配列は国内はもとの結合は検出できなかった。このことから今回用

よりタイ，インド以外からは世界のどこからも報いたシミュレーションの結果は信頼性の高いもの

告された事例がない。また，この配列を持つ個体と考えられる。

は強毒株トキソプラズマ株を長期間保虫し，環境以上のことから我が国にも強毒株トキソプラズ

中でリザーバーになることが知られている。以上

マに無症状で感染し，これを環境中に保持できるの結果は，環境中で強毒株トキソプラズマを温存

マウス個体が野生化で広く存在しているというこできる個体はインドやタイに限局して生息していとが再度示唆された。今後は，国内に強毒株が定る例外的な存在ではなく，我が国の畜産農場周辺

着しているのか，もし定着しているとするとどのにも広く分布していることを示唆している。この地域に分布しているのかを調査する必要がある。

ような個体で維持された強毒株が食肉家畜に感染しないよう，あるいは食肉家畜を介して人へ感染しないよう十分注意する必要がある。

４．要約

トキソプラズマは食肉由来の人獣共通感染症病
原体として重要である。畜産農場周辺に生息する
ハツカネズミ等はトキソプラズマの中間宿主とし© The Ito Foundation

272

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）
Czechll Czech Republic
W7.1 Austria
W4.1 1 Austria

72

W3.1 1 Austria
W1.1 1 Austria

98

MC27 1 France
MC5 1 France

14

SPRET Spain
W4.1 2 Austria

AL21 2 Kazahstan
37
77 AL24 2 Kazahstan
WSB USA

32

AL12 2 Kazahstan
AL24 1 Kazahstan
JH6 1 Hebei Province China

65 ● B2D Gifu Japan● B2E Gifu Japan

37
42

MT4 1 Inner Mongolia ChinaPWK Czech Republic
AL12 1 Kazahstan

72● B2C Gifu Japan
AL21 1 Kazahstan86

JYG Japan
MC22 1 France

98

W1.1 2 Austria
W3.1 2 Austria

97 D18 1 Germany
LAB B2 USA
JH4 1 Hebei Province China99

MW2 2 Inner Mongolia China● B2B Gifu Japan61

JH4 2 Hebei Province China
JH6 2 Hebei Province China
61 MT4 2 Inner Mongolia China
D18 2 Germany
MC5 2 France
MC22 2 France

96

MC27 2 France
71 ● B2I Okinawa Japan
76 ● B2J Okinawa Japan99● B2G Okinawa Japan99● B2H Okinawa Japan
YX11 Henan Province China

44 99 YX3 Henan Province China
YX5 Henan Province China● B2F Gifu Japan

63
96
64

● B2A Gifu Japan
CAST B2 Thailand
CIM B2 India

IRG B2 ortholog Microtus ochrogaster
IRG B10 C57BL/6J

0.10

Fig. 1 Phylogenetic tree of expected IRGB2 proteins from captured M. musculus.

Wild rodents derived IRGB2 protein sequences from the local areas in Gifu and Okinawa Prefectures（black circles）
in Japan and reported protein sequences from laboratory mouse or wild derived individuals are shown.

© The Ito Foundation

畜産農場に生息するハツカネズミの免疫関連遺伝子の多様性と病原体媒介能力

273て重要であるが，強毒株に感染するとほとんどす

ンパク質の結合力をコンピューターシミュレー

べての系統の実験用マウスは死亡する。一方でイションで予測したところ，一部の配列が非常に高ンドおよびタイでは，強毒株を無症状のまま保虫い値を示した。このような配列を持つ個体は，トできるハツカネズミ個体の存在が知られており，

キソプラズマ強毒株に感染しても無症状である可強毒株のリザーバーである可能性が指摘されてい能性が高く，我が国の食肉家畜農場周辺においてる。このようなハツカネズミ個体ごとの感染感受

強毒株トキソプラズマのリザーバーとして機能し性の違いはIrgb2遺伝子のアミノ酸配列によってている可能性がある。

決まる。本研究では，日本国内の畜産農場に生息するハツカネズミについてIrgb2遺伝子の多様性を調査した。その結果，インドやタイで報告された耐病性個体の配列と同様のアミノ酸配列を持つ個体が本州でも見つかった。また，これまでに報告のない新たな変異を持つ遺伝子も見つかっている。これらの遺伝子がコードするタンパク質とト

文献１） Murillo-León, M., Müller, U. B., Zimmermann, I.,et al.：Molecular mechanism for the control ofvirulent Toxoplasma gondii infections in wildderived mice, Nat Commun，10，1233，2019．
２）
 Lilue, J., Benedikt, U., Müller, U. B., et al.：Reciprocal virulence and resistance polymorphismin the relationship between Toxoplasma gondii andthe house mouse, eLife, 2, e01298，2013．

キソプラズマ病原因子のひとつであるROP5Bタ© The Ito Foundation

274

牛マイコプラズマによる気管傷害と細胞内侵入過程の解明
Tracheal injury and intracellular invasion process by bovine Mycoplasma

平

野

佑

気

（（地独）北海道立総合研究機構畜産試験場）

Yuki Hirano（Animal Research Center, Hokkaido Research Organization）

Mycoplasma bovis（M. bovis）is a major cause of bovine pneumonia, but its effect on the
respiratory tract, particularly the trachea, remains poorly understood. In this study, a threedimensional culture model of fetal bovine tracheal epithelial cells （ALI-FbTEC） wasestablished to investigate the detrimental effects of M. bovis on the trachea. Transcriptome
analysis was performed on ALI-FbTEC and monolayer-cultured fetal bovine tracheal epithelial
cells（FbTEC）using RNA-seq. A total of 4,608 genes with more than 2-fold expression
changes were identified in ALI-FbTEC. Gene ontology（GO）analysis revealed an increase in
genes related to cilia structure and ciliary movement in ALI-FbTEC, indicating its usefulness
in evaluating pathogenic cilia damage. M. bovis was then inoculated into ALI-FbTEC, andtranscriptome analysis was performed using RNA-seq. A total of 197 genes with more than
2-fold expression changes were identified in M. bovis-infected ALI-FbTEC, with GO analysis
revealing changes in genes related to the immune response. Gene set enrichment analysis
showed changes in genes related to cilia structure and ciliary movement. The threedimensional culture system of bovine fetal tracheal epithelial cells established in this study is avaluable model for investigating bovine pneumonia．

１．目における肺炎の主要な原因菌であるMycoplasma

的bovis（M. bovis）は他の病原体との複合感染によ

ウシの肺炎は腸炎とならび病傷事故数が非常にる肺炎の重篤化，慢性化の増悪因子になるとされ多く，畜産農家の生産性を阻害する大きな要因のている。複合感染の機序の一つとしてM. bovisが一つである。肺炎の予防にはワクチン接種等の対気管上皮の線毛を傷害し他の細菌やウイルスの感策が実施されているが十分に制御できていない。

染を容易にすることが示唆されているが，十分なその理由として，肺炎は細菌やウイルスなど複数

報告はなされていない。気管上皮は呼吸器に侵入の病原体の複合感染により発症することが多く，してきた病原体を線毛運動により体外に排出する感染から発症までのメカニズムが複雑であるた

重要な防御機能を有している。同じMycoplasma

め，予防や治療が困難なことがあげられる。ウシ属 菌 で あ り ， ヒ ト の 肺 炎 の 原 因 と な る M.

© The Ito Foundation

牛マイコプラズマによる気管傷害と細胞内侵入過程の解明

pneumoniaeは気管上皮の線毛運動の低下や線毛275

は試験に供試するまで－80℃で保存した。

細胞の破壊を引き起こすことが報告されていウシ胎子気管上皮細胞（Fetal bovine trachealる１）。著者らは，子牛生体を供試したM. bovis感

epithelial cell：FbTEC）は食肉処理場でと殺さ

染実験により感染子牛の気管線毛の長さおよび密れた妊娠牛から採取したウシ胎子の気管上皮から度が低下しており，M. bovisが気管上皮細胞内に分離し試験に供試した。分離したFbTECは６侵入していることを明らかにした（投稿準備中）。

ウェルプレートに播種しPneumaCult-Ex Plus培

M. bovisはウシのさまざまな細胞に侵入すること地で培養した。培養したFbTECはRNA-seqによで宿主免疫を回避していることが報告されておる網羅的遺伝子発現解析のためにRNA抽出した。

り，細胞内侵入はM. bovisにとって重要な生存戦

さらに，FbTECを12ウェルプレート用セルカル

略だといえる。そこで，M. bovisの気管線毛の傷

チャーインサート内に播種し，PneumaCult-Ex

害は気管上皮細胞へ侵入するための過程の一つな

Plus培地（STEMCELL）により培養した。インのではないかという仮説を立てた。仮説を証明す

サート上で細胞をコンフルエントまで培養後，培るためにはin vitroで生体の組織に近い機能や形

地 を PneumaCult ALI 培 地 に 変 更 し ，気 液 界 面態を再現した気管上皮細胞モデルが必要である。

（ALI：Air-liquid interface）培養による三次元

気液界面培養による三次元培養は気管上皮細胞を培養に移行した。２，
３日おきに培地を交換し，成長因子やホルモンなどの成分を含んだ培地を用

ALI培養で少なくとも21日間以上培養した。ALIい，多孔質膜の特殊な培養器材で培養することで培 養 し た FbTEC （ALI-FbTEC） に ２ × 10 ６気管上皮細胞の分化を促進し，生体に近い細胞構

CFU/20μlま たは２×10８CFU/20μlのM. bovis菌

成や極性を持った擬似組織に培養する手法であ液を接種し培養した。ALI-FbTECは経上皮電気る。三次元培養した気管上皮細胞は多列線毛円柱

抵抗値の測定および網羅的遺伝子発現解析のため上皮の形態を有し，病原体の気管線毛への傷害性のRNA抽出に供試した。

を解明するために不可欠なモデルである。

2.2

経上皮電気抵抗値の測定

牛マイコプラズマによる気管傷害と細胞内侵入

M. bovisによる細胞間結合への影響を明らかに過程を解明するために，本研究では気液界面培養

す る た め に ，M. bovis を 感 染 さ せ た FbTEC のによる三次元培養系を用いてウシ気管上皮細胞モ

経 上 皮 電 気 抵 抗 値（trans-epithelial electrical

デ ル を 構 築 し ，有 用 性 を 評 価 し た 。ま た ，M.

resistance；TEER）
を Millicell ERS-2（Millipore）

bovisをウシ気管上皮細胞モデルに感染させRNA-を用いて感染後72時間まで経時的に測定した。

seqによる網羅的遺伝子発現解析を行った。
２．方

2.3

RNA抽出

培養したFbTECからTRIzol（Thermo Fisher

法

Scientific）を使用し総RNAを抽出した。抽出した

2 . 1 菌液の調整およびウシ胎子気管上皮細胞の分離・培養RNAはTURBO DNase（Thermo Fisher Scientific）
によりゲノムDNAを除去した。RNAの濃度およM. bovis 菌 株 は 基 準 株 で あ る PG45 株

び品質はBioanalyzer（Agilent）を使用して測定（ATCC25523）を供試した。M. bovisはHayflick

した。測定後，RNA-seqによる網羅的遺伝子発液体培地に接種し，37℃48時間培養した。その後現解析に供した。

Hayflick寒天培地に接種し菌数を算出した。菌液© The Ito Foundation

276
2.4

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

RNA-seq

なかった（Fig. １）。ウシの肺炎の原因菌の一つ

RNA の 精 製 は NEBNext Poly（A）mRNAであるMannheimia haemolytica（M. haemolytica）

Magnetic Isolation Module （NEW ENGLAND

は感染後48時間程度で気管上皮細胞に対して著しBiolabs），ライブラリーの調整はNEBNext Ultra

いタイトジャンクションの破壊を引き起こすがll Directional RNA Library Prep Kit（NEW２）

ENGLAND Biolabs）を用いた。次世代シーケン

ンクションを破壊するような細胞傷害を引き起こ

サーはIllumina NovaSeq 6000（Illumina）を使用さないことが示唆された。M. bovisによる単独感した。得られたシーケンスデータはRaNA-seq

染では強い病変を示さないことも多いと報告され（https://ranaseq.eu/index.php）によりデータのている。しかし，M. haemolyticaによる病原性の前処理およびマッピングを行い，iDEP（http://

高い強毒株と病原性の低い弱毒株の比較試験におbioinformatics.sdstate.edu/idep96/）によりGene

いて，弱毒株ではTEERの減少は認められなかっontology（GO）解析およびGene set enrichment

た。M. bovisにおいても菌株の違いにより気管へ

analysis（GSEA）を実施した。

の傷害性が異なる可能性が考えられる。
3 . 2 網羅的遺伝子解析によるALI-FbTECの３．結果と考察3.1，M. bovisの感染はALI-FbTECのタイトジャ

評価

経上皮電気抵抗値の推移

RNA-seqによる網羅的遺伝子発現解析により

ALI-FbTECにM. bovis菌液を接種し，M. bovis

単層培養したFbTECとALI-FbTECのGO解析を

感染による細胞間結合への影響を明らかにするた実施した。FbTECとALI-FbTECにおいて２倍めにTEERを経時的に測定した。菌量として低菌以上の発現変動を示した遺伝子は4608個あり，量（２×10 CFU）および高菌量（２×10 CFU）

ALI-FbTECで発現増加している遺伝子は2440の２条件で測定したが，いずれの菌量においても個 ，減 少 し て い る 遺 伝 子 は 2168 個 で あ っ た 。

感染後72時間までの間にTEERの変化は認められ

ALI-FbTEC は Cilium organization や Cilium

６８

TEER（Ω/cm２）

400

mock
2×10６ CFU/insert
2×10８ CFU/insert

300

200

0

6

12

24

48

72

Hours post infection
Fig. 1 Transepithelial electrical resistance（TEER）values of M. bovis

infected and uninfected FbTEC. FbTEC were infected with
M. bovis at ２×10６CFU and ２×10８CFU per insert for 72 hours.
TEER values are expressed as mean±SEM（n＝3）．

© The Ito Foundation

277

牛マイコプラズマによる気管傷害と細胞内侵入過程の解明
Cilium organization
Cilium assembly
Cilium movement
Axoneme assembly
Microtubule-based movement
Cilium-dependent cell motility
Cilium or ﬂagellum-dependent cell motility
Microtubule bundle formation
Cilium movement involved in cell motility
Plasma membrane bounded cell projection assembly
Cell projection assembly
Sperm motility
Flagellated sperm motility
Movement of cell or subcellular component
Axonemal dynein complex assembly
0

5

10

15

20

25

30

35

7

8

－log10（p-value）
Fig. 2 Gene ontology analysis of FbTEC and ALI-FbTEC．

Humoral immune response
Antimicrobial humoral response
Antimicrobial humoral immune response mediated…
Neutrophil chemotaxis
Immune response
Response to bacterium
Neutrophil migration
Inﬂammatory response
Granulocyte chemotaxis
Cilium movement
Defense response
0

1

2

3

4

5

6

－log10（p-value）
Fig. 3 Gene ontology analysis of M. bovis infected and uninfected ALI-FbTEC．

assembly，Cilium movementなど線毛の構造物

よる網羅的遺伝子発現解析を実施した。M. bovis

や線毛運動に関する遺伝子群の増加が認められた

感染FbTECと対照のALI-FbTECにおいて２倍（Fig. ２）
。このことは，ALIによってFbTECの以上の発現変動を示した遺伝子は197個あり，M.

分化が誘導されたことが遺伝子発現レベルでも確

bovis感染ALI-FbTECで発現増加している遺伝子

認されたことを示唆しており，本研究で構築したは173個，減少している遺伝子は24個であった。

ALI-FbTECはウシの肺炎の原因となる病原体の発現が変動している遺伝子に対してGO解析を実線毛に対する影響を評価するための有用なモデル施した（Fig. ３）。M. bovis感染ALI-FbTECではであることが分かった。

Humoral immune responseやAntimicrobial

3 . 3 M. bovis感染FbTECの網羅的遺伝子発現解析

humoral response，Neutrophil chemotaxisなど
主に免疫応答に関する遺伝子群の変動が抽出され

ALI-FbTECにM. bovisを感染させRNA-seqにた。遺伝子としてはGRO1，CXCL2，CXCL3，© The Ito Foundation

４．要

S100A12など白血球の遊走を亢進に関連する遺伝

子 や Lactoferrin（LTF）
や Tracheal antimicrobial
peptide（TAP）などの抗菌ペプチド遺伝子など，り線毛の傷害を起こし線毛細胞への分化に影響を与えていることが示唆された（Table２）。また，線毛の構造だけでなくCilium movementやCiliumor flagellum-dependent cell motility な ど の 線 毛運動に関連する遺伝子の変動も抽出された。M.

bovis は 直 接 線 毛 を 傷 害 す る だ け で な く ，M.

pneumoniaeと同様に線毛運動に対しても影響を及ぼしている可能性が考えられた。

以上より，本試験で構築したウシ気管上皮細胞の三次元培養系はM. bovisの気管傷害機序を解明するための有用なモデルであることが示された。

ウシの肺炎はM. bovis以外にも多様な細菌やウイルスの感染によって引き起こされることから，M.

bovis以外の病原体の肺炎発症機序や複合感染における病態解明についても応用が可能である。

約

Mycoplasma bovis（M. bovis）はウシの肺炎の原因となる主要な病原体の一つであるが呼吸器局所，特に気管にどのような影響を及ぼしているか

十分に明らかとなっていない。本研究ではM.

bovisの気管に対する傷害性を解明するために，© The Ito Foundation

28
15
7
15

TNFSF13, LTF, SLPI, C1S, NFAM1, S100A9, TNFSF11, CXCL5, IL1A, NFKBIZ, PUM2, MYB, PGLYRP2
S100A12, S100A8, CD14, VNN1, BPIFB1, C3, CXCL8, PIGR, INHCA, TNF, CXCL2, TFRC, GRO1, CXCL3, TAP
LTF, SLPI, WASL, S100A9, CXCL5, PGLYRP2, CD14, C3, CXCL8, INHCA, TNF, CXCL2, GRO1, CXCL3, TAP
S100A9, CXCL5, S100A8, CXCL8, CXCL2, GRO1, CXCL3S100A9, TNFSF11, IL1A, NFKBIZ, PGLYRP2, S100A8, CD14, VNN1, C3, SETD4, CXCL8, TNF, CXCL2, GRO1,
CXCL3

Response to bacterium

Neutrophil migration

Inflammatory response

19
23

SPAG17, MEIG1, CCDC170, KIF19, DNAI4, EML1, DNAI3, CFAP206, CFAP43, FBXW11, CLASP1, CEP126
CLASP1, SPEF2, DEUP1, STMN3, TOGARAM1, TOGARAM2, TMEM67
LTF, SLPI, S100A9, TNFSF11, CXCL5, IL1A, NFKBIZ, PUM2, PGLYRP2, S100A12, S100A8, CD14, VNN1, BPIFB1
C3, SETD4, CXCL8, INHCA, TNF, CXCL2, GRO1, CXCL3, TAP

Microtubule cytoskeleton organization

Defense response

7
9

S100A9, CXCL5, S100A8, CXCL8, CXCL2, GRO1, CXCL3SPAG17, MEIG1, TTC29, DNAI4, DNAI3, CFAP206, ATP2B4, CFAP43, SPEF2

Granulocyte chemotaxis

Cilium movement

7

9

12

Immune response

変動が抽出されたことから，M. bovisの感染によ7formationなど線毛を構造に関連する遺伝子群のS100A9, CXCL5, S100A8, CXCL8, CXCL2, GRO1, CXCL3

Axoneme assemblyやMicrotubule bundle

Neutrophil chemotaxis

さ ら に ，GSEA に よ る パ ス ウ ェ イ 解 析 で はLTF, S100A9, CXCL5, S100A12, CXCL2, GRO1, CXCL3

唆された。

Antimicrobial humoral immune response mediated by antimicrobial peptide

FbTECにおいても同様の反応が起こることが示

LTF, SLPI, S100A9, CXCL5, S100A12, INHCA, CXCL2, GRO1, CXCL3発現が増加することが報告されており３），ALI-

Antimicrobial humoral response

細胞においてもM. bovisの感染において遺伝子のLTF, SLPI, C1S, S100A9, CXCL5, S100A12, C3, INHCA, TNF, CXCL2, GRO1, CXCL3られた（Table１）。CXCL5やTAPはウシ肺上皮

Genes

病原体の排除に関わる重要な遺伝子の変動が認め

Humoral immune response

Number of GenesCXCL5 な ど の ケ モ カ イ ン 遺 伝 子 や S100A9 ，Pathways

令和４年度

Table１ Gene ontology analysis to identification of differentially expressed gene and signaling pathways

278
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

279

牛マイコプラズマによる気管傷害と細胞内侵入過程の解明
Table２ Gene set enrichment analysis to identification of signaling pathways and normalizedenrichment scores

Pathway

NES

Number of genes

Axoneme assembly

2.459758

Microtubule bundle formation

2.390980

Cilium movement

2.382386

Cilium or flagellum-dependent cell motility

2.301

60

Cilium-dependent cell motility

2.301

60

Cilium movement involved in cell motility

2.290857

Determination of left/right symmetry

2.254

54

Cilium organization

2.2488251

Flagellated sperm motility

2.238947

Sperm motility

2.238947

Cilium assembly

2.2319228

Humoral immune response

2.2236

51

NES : Normalized enrichment scores

ウシ胎子気管上皮細胞の三次元培養モデル（ALI-関する遺伝子群が変動していた。さらに，GeneFbTEC） を 構 築 し ， RNA-seq に よ り ALI-

set enrichment analysisでは線毛の構造や繊毛運

FbTECと単層培養したウシ胎子気管上皮細胞動に関する遺伝子群が変動していた。本試験で構（FbTEC）の網羅的遺伝子発現解析を行った。

築したウシ胎子気管上皮細胞の三次元培養系はウ

ALI-FbTECで２倍以上の発現変動を示した遺伝

シの肺炎研究において有用なモデルである。

子は4608個であった。Gene ontology（GO）解析
ではALI-FbTECにおいて線毛の構造物や線毛運動に関する遺伝子群の増加が認められた。ALIFbTECは病原体の線毛に対する傷害を評価するための有用なモデルであることが分かった。さらに，ALI-FbTECにM. bovisを感染させRNA-seq
により網羅的遺伝子発現解析を行った。M. bovis
感染ALI-FbTECで２倍以上の発現変動を示した
遺伝子は197個であった。GO解析では免疫応答に文
献１）
 Chaudhry, R., Ghosh, A., Chandolia, A.：Journalof Bacteriology，96，3675～3682，2014．
 Daniel Cozens, Erin Sutherland, Miquel Lauder,２）
Geraldine Taylor, Catherine C. Berry, Robert L.
Davies：Infection and Immunity, Volume 87, No. 6，2019．
 Hui Zhang, Doukun Lu, Yiqiu Zhang, Gang Zhao,
３）
Abdul Raheem, Yingyu Chen, Xi Chen, Changmin
Hu, Huanchun Chen, Liguo Yang, Aizhen Guo：
Frontiers in Immunology, Volume13，2022．

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280

黒毛和種牛における血液中のビタミンＤの状況把握と牛におけるビタミンＤの免疫賦活作用および抗炎症作用の検討
Understanding the status of vitamin D in blood in Japanese Black cattle, theeffects of vitamin D on the immunostimulatory and anti-inflammatory in cattle

乙丸

孝之介１・津川尚子２・井尻萌１（１鹿児島大学共同獣医学部，２大阪樟蔭女子大学健康栄養学部）

Konosuke Otomaru１，Naoko Tsugawa２ and Moe Ijiri１（１Kagoshima University, Joint Faculty of Veterinary Medicine，
２Osaka Shoin Womenʼs University, Department of Health and Nutrition）

In this study, we investigated the vitamin D concentration in the blood of Japanese Blackcows, and also investigated the peripheral blood mononuclear cells isolated from cattle. Cells
were cultured in 4 categories: unstimulated without vitamin D, unstimulated with vitamin D,
LPS stimulated without vitamin D and LPS stimulated with vitamin D. The gene expression
and culture supernatant of the cells after culture were measured. AS the results, herds of cows
on shaded farms had the lowest levels of vitamin D, and levels were lower in winter than insummer. In cell culture, the β-defensins DEFB10 and LAP were significantly higher in thevitamin D supplemented group than in the non-supplemented group, regardless of thepresence or absence of LPS stimulation. Nos2 was also significantly higher in the vitamin D
supplemented group than in the non-supplemented group, regardless of the presence orabsence of LPS stimulation. On the other hand, IL-10 levels were significantly lower in thevitamin D supplemented group than in the non-supplemented group, regardless of thepresence or absence of LPS stimulation. Regarding the culture supernatant, the antioxidant
stress capacity was significantly higher in the vitamin D supplemented group than in the nonsupplemented group under LPS stimulation. The cell viability was significantly higher in thevitamin D supplemented group than in the non-supplemented group, regardless of thepresence or absence of LPS stimulation. In this study, for the first time, the clarified thevitamin D concentration of Japanese Black cows, and clarified the effects of vitamin D on the
peripheral blood mononuclear cells from Japanese Black cattle at the cellular level. In the
future, it was considered necessary to conduct further research to clarify the function andutilization of vitamin D in cattle from both in vivo and in vitro．
Keywords：Japanese Black calf, vitamin D, peripheral blood mononuclear cells．

© The Ito Foundation

黒毛和種牛における血液中のビタミンＤの状況把握と牛におけるビタミンＤの免疫賦活作用および抗炎症作用の検討

１．目

2.1

的

281

血液中のビタミンＤ濃度の調査等

飼養環境の異なる鹿児島県内の３農場（Ａ農

ビタミンＤは，脂溶性ビタミンの一種に分類さ場；わずかに太陽光のあたる農場，Ｂ農場；常時れ必須栄養素である。ビタミンＤは経口的な摂取

太陽光のあたる放牧農場，Ｃ農場；太陽光のあたによる体内への吸収と太陽光（紫外線）によってらない農場）より，2022年８月（夏季）および体内で生合成されるが，太陽光（紫外線）によっ

2023年２月（冬季）において，臨床的に健康な黒て体内で合成されるためには，直射日光を浴びる

毛和種繁殖雌牛，計140頭より採血を行い，得ら必要がある。ビタミンＤの主な作用として，血液れた血清を用いてビタミンＤ濃度を測定した。

中のカルシウム（Ca）濃度を調節する作用は

２＋

2.2

末梢血単核球に対するビタミンＤの効果

広く知られているが，近年，ビタミンＤは免疫機

牛の末梢血単核球におけるビタミンＤの添加効能の向上，抗酸化ならびに抗炎症作用など，健康果について，臨床的に健康な黒毛和種牛，18頭よ状態の維持に関与する作用が注目されている

１，２）

。

り採血を行い，血液より末梢血単核球を分離しヒトにおいては，現在世界中で大流行している新た。単核球は４条件下に区分（①無添加・無刺型コロナウイルス（COVID-19）とビタミンＤの激，②無添加・LPS刺激，③ビタミンＤ添加・無関連について，血液中のビタミンＤ濃度が低値で刺激，④ビタミンＤ添加・LPS刺激）して培養をあるほど，COVID-19への罹患率，死亡率は高い

行い，ａ）末梢血単核球を24時間培養し，末梢血ことが明らかとなっており，ビタミンＤが，単核球の炎症や免疫に関するmRNA発現量をリ

感染症の罹患率や治癒率に関連していることが明アルタイムPCRを用いて測定するとともに，培養

らかになっている。一方，牛の血液中のビタミン

上清の炎症に関するサイトカイン，抗酸化能の測

Ｄ濃度については，これまで多くは調査されてお定を行った。さらに，ｂ）末梢血単核球を上記のらず，黒毛和種牛については，ほとんど調査され４条件下において24，48，72および120時間培養ていない。そこで我々は，黒毛和種牛の飼養管理

し，末梢血単核球の細胞生存率について測定した。

３，４）

状況に応じた繁殖雌牛の血液中のビタミンＤ濃度について明らかにする。また，牛の血液より分離

３．結果と考察した末梢血単核球に活性型ビタミンＤを添加して飼養環境の異なる３農場における黒毛和種繁殖

培養，炎症マーカー，免疫や炎症に関するサイト

牛の血液中のビタミンＤ濃度について，2022年８カインなどを測定するとともに，細胞生存率も調月の調査においては，常時太陽光のあたるＢ農場

査し，ビタミンＤの牛の細胞レベルの効果を明らのビタミンＤ濃度が最も高く，ついでわずかに太かにする。

陽光のあたるＡ農場であり，太陽光のあたらない

２．方

Ｃ農場が最もビタミンＤ濃度が低かった（Fig.

法１）。また，2023年２月の調査において，わずか

本研究は，黒毛和種繁殖牛の血液中のビタミンに太陽光のあたるＡ農場のビタミンＤ濃度が最もＤ濃度調査，牛の血液から分離した末梢血単核球

高く，ついで放牧農場であるＢ農場であり，ほとに対するビタミンＤの添加効果の２つ大別して実んど太陽光のあたらないＣ農場が最もビタミンＤ施した。

濃度が低かった（Fig. １）。さらに，３農場いずれにおいても，冬季のビタミンＤ濃度は夏季と比© The Ito Foundation

282

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ng/ml

ng/ml

80

80

70

70

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10

0

Farm A（n=20）

Farm B（n=25）

Farm C（n=24）

0

Farm A（n=21）

August 2022（Summer）

Farm B（n=25）

Farm C（n=25）

February 2023（Winter）

Fig. 1 Vitamin D levels in Japanese Black cattle．
Farm A with little sunlight, farm B with constant sunlight, farm C with no sunlight※Vitamin D concentration less than 20ng/ml is a deficiency value

較し低い傾向であった。１年間の太陽光からの紫な差は認められなかったが，DEFB10およびLAP

外線量は，年間を通して変動があり，夏季に多く，については，LPS刺激の有無に関わらず，ビタミ

冬季に少ないことから，同一農場においても冬季

ンＤを添加した群は，無添加群と比較し，有意にのビタミンＤ濃度の低下の要因は，紫外線量の低高値であった（Fig. ２）。このことから，ビタミ下によるものと考えられた。また，日光のあたらンＤは，末梢血単核球に対して，抗菌ペプチドでないＣ農場のビタミンＤ濃度は，３農場中最も低あるβ-defensinの産生を促進させる可能性が示い値であり，特に冬季は欠乏値の20ng/mlをわず唆された。また，生体内に侵入した外敵を阻止す

かに上回って程度である。したがって，このようるという防御機能を担うNos2遺伝子については，な農場においては，日光浴を推奨することが望ま

LPSの刺激の有無に関わらず，ビタミンＤを添加しいが，農場構造上，野外に牛を出すことが不可した群は，無添加群と比較し，有意に高値であっ能な場合は，ビタミンＤのサプリメントなどで，た（Fig. ３）。一方，炎症を抑制するサイトカイ

ビタミンＤを補給する必要がある。しかしながンであるIL-10については，LPSの刺激の有無にら，サプリメントの補給でどのように改善される関わらず，ビタミンＤを添加した群において，無のか，日光浴と経口的なビタミンＤの摂取との関

添加群と比較し有意に低値であった（Fig. ３）。

連性などが今後の課題であると考えられた。

細胞培養上清の測定においては，炎症性のサイト

牛の末梢血単核球におけるビタミンＤの添加効

カインであるTNFについて，無刺激およびLPS刺果における培養細胞のmRNA遺伝子発現につい激のいずれにおいても，無添加群とビタミンＤ添て ，微 生 物 に 対 す る 抗 菌 ペ プ チ ド で あ る

加群に有意な差はなかった（Fig. ４）。一方，抗β-defensinの測定では，DEFB3，DEFB10およ

酸 化 能（Total antioxidant capacity）に つ い てびLAPについて測定を行ったところ，DEFB3には，LPS刺激下において，ビタミンＤを添加した

ついては，ビタミンＤの添加効果について明らか

群 は ，無 添 加 群 と 比 較 し 有 意 に 高 値 で あ っ た© The Ito Foundation

283

黒毛和種牛における血液中のビタミンＤの状況把握と牛におけるビタミンＤの免疫賦活作用および抗炎症作用の検討

400
Relative expression

Relative expression

10

DEFB10
＊＊＊

8
6
4
2
0

＊＊＊
＊＊

＊＊＊

300

LAP

Relative expression

DEFB3

200
100
20
15
10
5

＊＊＊
＊＊
＊＊
＊＊
＊＊＊＊

400
300
300
200
100
20
15
10
5

0

0

1,25
（OH）2D3 －+－+1,25（OH）2D3 －

+

－

+

1,25
（OH）2D3 －

+

－

+

LPS －

－

+

+

LPS －

－

+

+

LPS －

－

+

+

Fig. 2 1,25（OH）
2Ｄ3 treatment enhances the expression of antibacterial peptides．

 BMC were stimulated by LPS（1μg/ml）with or without 1,25
P（OH）2Ｄ3（10－8ng/ml）for 24 h. Relative
expression of the DEFBs（BNBD3, and BNBD10）and LAP was determined by qRT-PCR. Data arepresented as means ± SEM（n＝17-21）and Statistical comparison was performed using one-way
ANOVA with the Dunnettʼs T3 post hoc test．＊＊＊＊p＜0.0001，＊＊＊p＜0.001，＊＊p＜0.01

80

NOS2
＊＊＊＊
＊＊＊
＊＊＊
＊＊＊
＊＊＊＊

60
40
20

IL10
3
Relative expression

Relative expression

100

＊＊＊＊
＊

＊＊＊＊

1,25（OH）2D3－

+

－

+

LPS

－

+

+

0

2

－

1

0

1,25
（OH）2D3 －

+

－

+

1,25
（OH）2D3 －

+

－

+

LPS －

－

+

+

LPS －

－

+

+

Fig. 3 1,25（OH）
2Ｄ3 upregulates the expression of NOS2 and while downregulates

that of IL10．
PBMC were stimulated by LPS（1 μg/ml）with or without 1,25（OH）
2Ｄ3 （10－8ng/ml）for 24 h. Relative expression of CXCL8, NOS2, IL10, TNF, and IFNαA
was determined by qRT-PCR. Data are presented as means ± SEM（n＝1821）and Statistical comparison was performed using one-way ANOVA with theDunnettʼs T3 post hoc test．＊＊＊＊p＜0.0001，＊＊＊p＜0.001，＊＊p＜0.01，＊p＜0.05．

（Fig. ４）。これらの結果から，ビタミンＤの細胞および120時間後において，ビタミンＤを添加しレベルにおける免疫賦活作用，抗酸化，炎症に関た群において，無添加群と比較し有意に高値でする作用が明らかとなり，今後，ビタミンＤを活あった（Fig. ５）。このことから，ビタミンＤは用するうえでの，重要な基礎的知見になると考え

生命維持に強く関与するビタミンであり，細胞レられた。細胞生存率については，無刺激下では培ベルにおいて，ビタミンＤの充足は重要であるこ

養72および120時間後，LPS刺激下では，48，72とが明らかとなった。

© The Ito Foundation

284

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）
3600

Total antioxidant capacity（μEq / l）

50

TNFα（pg / ml）

40
30
20
10
0

VD

Cont

LPS LPS＋VD

3400

3200

3000

2800

2600

VD

Cont

LPS LPS＋VD

Fig. 4 Effects of vitamin D on TNF and total antioxidant capacity in the cell culture

supernatant．
PBMCs were incubated for 24hr with or without LPS stimulation. a）without LPS
stimulation and without vitamin D；cont, b）without LPS stimulation and withvitamin D；VD, c）with LPS stimulation and without vitamin D；LPS, d）with LPS
stimulation and with vitamin D；LPS VD．
The number of samples was 18 for each（n＝18）．Data are shown as mean ± SD.
Asterisks indicate significant difference between groups（＊：p＜0.05）．

140%
120%
＊＊

＊＊

Cell viability

100%

＊
＊＊

80%

＊＊

60%
40%
20%
0%

cont

VD

LPS LPS＋VD

24h

cont

VD

LPS LPS＋VD

cont

48h

VD

LPS LPS＋VD

72h

Fig. 5 Effects of vitamin D on cell viability cultured without and with LPS stimulation

cont

VD

LPS LPS＋VD

120ha ）without LPS stimulation and without vitamin D；cont, b）without LPS stimulation and with vitamin D；VD,c）with LPS stimulation and without vitamin D；LPS, d）with LPS stimulation and with vitamin D；LPS VD.
The number of samples was 18 for each（n＝18）．Data are shown as mean ± SD．
 sterisks indicate significant difference between the groups at same incubation timeA（＊：p＜0.05，＊＊：p＜0.01）．

© The Ito Foundation

黒毛和種牛における血液中のビタミンＤの状況把握と牛におけるビタミンＤの免疫賦活作用および抗炎症作用の検討

285

本研究では，初めて黒毛和種繁殖雌牛のビタミ化能については，LPS刺激下において，ビタミンンＤ濃度が，明らかになるとともに，黒毛和種牛

Ｄを添加した群は，無添加群と比較し有意に高値の末梢血単核球に対する細胞レベルでもビタミンであった。細胞生存率については，LPS刺激の有Ｄの作用が明らかとなった。しかしながら，不明

無に関わらず，ビタミンＤを添加した群においな点や解決すべき課題も多く残されていることかて，無添加群と比較し有意に高値であった。本研ら，今後，in vivoおよびin vitroの両面から，牛究では，初めて黒毛和種繁殖雌牛のビタミンＤ濃におけるビタミンＤの機能と活用方法を明らかに度が明らかになるとともに，牛の末梢血単核球にするさらなる研究を行う必要があると考えられた。

対する細胞レベルでのビタミンＤの作用が明らか

４．要となった。今後，in vivoおよびin vitroの両面か約

ら，牛におけるビタミンＤの機能と活用方法を明

本研究では，黒毛和種繁殖雌牛の血液中のビタらかにする研究を行う必要があると考えられた。

ミンＤ濃度を調査するとともに，牛の血液より分離した末梢血単核球を，無添加・無刺激，無添
加・LPS刺激，ビタミンＤ添加・無刺激，ビタミ
ンＤ添加・LPS刺激の４つに区分して培養，培養後の細胞の遺伝子発現，培養上清を測定するとともに，経時的な培養による細胞生存率について調査した。その結果，太陽光のあたらない農場で飼養された牛群のビタミンＤ濃度が最も低く，その濃度は夏季よりも冬季のほうが低かった。細胞培養においては，β-defensinであるDEFB10およびLAPについて，LPS刺激の有無に関わらず，ビタミンＤを添加した群は，無添加群と比較し，有意に高値であった。Nos2についても，LPSの刺激の有無に関わらず，ビタミンＤを添加した群では，無添加群と比較し，有意に高値であった。一
方，IL-10については，LPSの刺激の有無に関わ文献１） Sabetta, J. R., DePetrillo, P., Cipriani, R. J.,
Smardin, J., Burns, L. A., Landry, M. L.：Serum
25-hydroxyvitamin d and the incidence of acuteviral respiratory tract infections in healthy adults,
PLoS One, 5（6）,e11088，2010．
２）
 Khoo, A. L., Chai, L. Y., Koenen, H. J., Kullberg, B.
J., Joosten, I., van der Ven, A. J., Netea, M. G.：1,25dihydroxyvitamin D3 modulates cytokine
production induced by Candida albicans：impact of
seasonal variation of immune responses, J InfectDis，203，122～130，2011．
３） Ilie, P. C., Stefanescu, S., Smith, L.：The role ofvitamin D in the prevention of coronavirus disease2019 infection and mortality, Aging Clin Exp Res, 32,
1195～1198，2020．
４） Panagiotou, G., Tee, S. A., Ihsan, Y., Athar, W.,
Marchitelli, G., Kelly, D., Boot, C. S., Stock, N.,
Macfarlane, J., Martineau, A. R., Burns, G., Quinton,
R.：Low serum 25-hydroxyvitamin D（25［OH］D）
levels in patients hospitalized with COVID-19 areassociated with greater disease severity, Clin
Endocrinol，93，508～511，2020．

らず，ビタミンＤを添加した群において，無添加群と比較し有意に低値であった。培養上清の抗酸© The Ito Foundation

286

牛呼吸器病ウイルスの鼻咽頭関連リンパ組織におけるウイルス増殖と病態解析
Pathological analysis and replication of bovine respiratory viruses innasopharyngeal-associated lymphoid tissue

平

井

卓

哉

（宮崎大学農学部）

Takuya Hirai（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Bovine Respiratory Disease Complex（BRDC）is a highly frequent disease in beef anddairy cattle in Japan. The objectives of this study were to investigate the presence of bovine
respiratory viruses, mainly Bovine Viral Diarrhea Virus（BVDV）, in the NasopharynxAssociated Lymphoid Tissue（NALT）of cattle, to perform histopathological search for lesions
caused by Mycoplasma bovis, and to establish an inexpensive detection system to visualize thegrowth of M. bovis on tissue. PCR testing for bovine respiratory viruses detected the BVDV
gene in the NALT in 8 of 9 cases. In addition, real-time PCR results of cases in which the
BVDV gene was detected by PCR showed that BVDV was detected in the NALT tissue in thesame or higher amounts than in the pulmonary lymph nodes and spleen, suggesting that the
local immune system is suppressed by multiplication of BVDV in the NALT. M. bovis was
detected in 5 of 6 cases of bacterial isolation and identification. The lungs of the M. bovis-positive cases showed necro-suppurative bronchopneumonia typical of M. bovis on HEstained specimens, and similar lesions formations were observed in the NALT. in situ
hybridization（ISH）using a probe derived from the domain V region of 23S rRNA, which has
high sensitivity and sequence conservation, showed positive reactions in inflammatory cells andnecrotic lesions in the lungs and NALT of M. bovis-positive bovines. M. bovis positive signal at
the apical part of the NALT covering epithelium, suggesting that M. bovis invade the NALT
through M cells．

１．目

Respiratory Disease Complex ： BRDC） と い う

的

名称は広く浸透しており，一般的に「ウイルスや我が国の肉用牛および乳牛における呼吸器病のマンヘミアなどの病原体の感染または長距離輸

発生頻度は高く，2021年度の全病傷事故件数に対送，密飼い，気温の急変などによる強度のストレする呼吸器病の割合は21％であり，肉用牛ではスなどの一次的要因を受けた後，二次的要因とし35％にも達する。牛の呼吸器病について，牛呼吸て気管内に常在している細菌やマイコプラズマな器 病 症 候 群 ま た は 牛 呼 吸 器 複 合 病 （Bovine

どが異常に増殖して，肺炎症状が重篤化する呼吸© The Ito Foundation

牛呼吸器病ウイルスの鼻咽頭関連リンパ組織におけるウイルス増殖と病態解析

器病」と認識されている。

287

料として鼻咽頭ぬぐい液，NALT，肺，肺門リン

BRDCを引きおこす主要なウイルスは，牛ウイ
ル ス 性 下 痢 ウ イ ル ス （Bovine Viral Diarrhea

パ節および脾臓を採取し，RNAおよびDNAを抽出した。

Virus：BVDV），牛RSウイルス，牛伝染性鼻気No.１～No.９の鼻咽頭ぬぐい液，NALTおよび管炎ウイルス，牛パラインフルエンザウイルス３

肺のRNA抽出液を用いて，BVDV，牛RSウイル

型および牛コロナウイルスなどがある。牛のマイスおよび牛コロナウイルスのPCR検査を実施し，コプラズマ肺炎において最も問題となるのはウイルス遺伝子の検出を試みた。また，PCR検査

Mycoplasma bovisであり ，他の病原体の関与がにおいてBVDV遺伝子を検出した症例のうち，なくM. bovis単独の感染により牛マイコプラズマ

No.１～No.３のNALT，肺，肺門リンパ節および２）

肺炎を発症し，死亡した事例も報告されている 。

脾臓については，既報に従ってリアルタイムPCR

これらの病原体は経鼻的に感染するが，これまで法を実施し，BVDVのウイルス量を測定した３）。

に鼻咽頭病変の病理学的解析はほぼ実施されてい他方，No.４～No.９については，鼻咽頭ぬぐい液ない。その原因として，鼻咽頭壁を覆う鼻骨や頭および肺の細菌の分離・同定を行った。採材組織

蓋骨が標本作製の妨げとなり，病原体の抗原検出は４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝溶液でが困難であることがあげられる。加えて，ヒトや固定後，パラフィン包埋を行い，HE染色標本をマ ウ ス で は 鼻 咽 頭 関 連 リ ン パ 組 織

作製し，病組織学的検査を実施した。

１）（Nasopharynx-Associated Lymphoid Tissue ：さらに，M. bovis遺伝子をin situ hybridization

NALT）が生体防御に重要な役割を担っているに（ISH）法を用いて組織上で可視化するため，M.

も関わらず，家畜においては同組織の存在すら知bovisに特異性を有するプローブを開発した。ISHられていないため，微生物研究者によって調べら法に使用するM. bovisのプローブの検討に際してれることはない。さらに，M. bovisは重要な病原は，ヒトに対するMycoplasma pneumoniaeの遺体でありながら，組織上で抗原を検出するための伝子検査法であるマイコプラズマrRNA検出試薬

抗体が非常に高額であるため，入手は容易ではなの開発において，23S rRNAを検出ターゲットとく，普遍性のある検出系が確立されていない。

することにより高感度が期待できる４）こと，M.

本研究の目的は，牛のNALTにおけるBVDVを

bovisの耐性機構に関わる23S rRNAのドメインＶ中心とした牛呼吸器関連ウイルスの存在について

領域が配列の保存性が高い部位を有する５）ことに調べるとともに，M. bovisによる病変の病理組織

着想を得て，23S rRNAのドメインＶ領域より作学的検索を行い，鼻咽頭内におけるBRDC関連病製した。細菌検査でM. bovisが分離・同定された原体の動態を明らかにすること，ならびにM.

症例のNALTおよび肺の標本を用いてISH法を実

bovisの増殖を組織上で可視化させる低廉な検出施することにより，M. bovis感染細胞の検出とそ系を確立することである。

の細胞種の特定を試みた。

２．方法

３．結果と考察

2022年２月から2023年２月の期間で，宮崎県の

3.1

ウイルス遺伝子の検出

複数の農場より呼吸器症状などを呈して淘汰され

No.１～No.９の鼻咽頭ぬぐい液，NALTおよびた牛９頭（No.１～No.９）を剖検に供した。生材

肺について，BVDV，牛RSウイルスおよび牛コ© The Ito Foundation

288

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ロナウイルスのPCR検査を実施した結果，No.７

牛RSウイルス遺伝子，No.１からはBVDV遺伝子を 除 く 個 体 か ら BVDV 遺 伝 子 が 検 出 さ れ たと牛コロナウイルス遺伝子がともに検出された。

（Table１）。No.７からは牛RSウイルスが検出されさらに，No.８からはBVDV遺伝子および牛RSウ

た。また，No.６およびNo.９ではBVDV遺伝子とイルス遺伝子に加えて牛コロナウイルス遺伝子がTable 1 PCR of BVDV, BRSV and BCV
Sample
No.

Breed

Sex

Age
(months)

SamplesNasopharyngeal
swab

No.1

No.2

No.3

No.4

No.5

No.6

No.7

No.8

No.9

Holstein

Holstein

HolsteinJapanese
black

Japanese
black

Japanese
black

Japanese
black

Japanese
black

Japanese
black

Male

FemaleFemaleMale

FemaleFemaleMale

Female

Male

1

3

5

3

2

4

8

18

6

Virus
BVDV

BRSV

BCV

+

－

±

NALT

+

－

－

Lung

+

－

－

Nasopharyngeal
swab

+

－

－

NALT

+

－

－

Lung

+

－

－

Nasopharyngeal
swab

+

－

－

NALT

+

－

－

Lung

+

－

－

Nasopharyngeal
swab

－

－

－

NALT

±

－

－

Lung

±

－

－

Nasopharyngeal
swab

－

－

－

NALT

±

－

－

Lung

±

－

－

Nasopharyngeal
swab

－

－

－

NALT

±

±

－

Lung

±

－

－

Nasopharyngeal
swab

－

－

－

NALT

－

+

－

Lung

－

－

－

Nasopharyngeal
swab

－

－

+

NALT

±

+

+

Lung

±

－

+

Nasopharyngeal
swab

－

+

－

NALT

±

+

－

Lung

+

－

－

BVDV：Bovine viral diarrhea virus, BRSV：Bovine respiratory syncytial virus, BCV：Bovine corona virus+ : Detected, ± : Weak, － : Not detected© The Ito Foundation

289

牛呼吸器病ウイルスの鼻咽頭関連リンパ組織におけるウイルス増殖と病態解析
Table 2 Quantitative PCR of BVDV-1 and BVDV-2
BVDV-1 qPCR（copies/μl）

Sample
No.

NALT

Lung

Pulmonarylymph node

BVDV-2 qPCR（copies/μl）
SpleenNALT

Lung

Pulmonarylymph node

Spleen－2.1×10 4

8.5×10 4

1.9×10 4

6.6×10 3

No.1

－

－

<1.0×10 1

No.2

8.9×10 4

3.4×10 4

1.2×10 5

4.2×10 5

－

－

－

－

No.3

1.2×10 6

4.0×10 5

8.6×10 6

4.8×10 5

－

－

－

－

－ : Negative

検出された。No.１の牛コロナウイルスを除くすすべての個体からM. bovisが検出された。その他，

べてのウイルス検出症例において，NALTから牛No.７ではMoraxella sp., No.８ではPseudomonas

呼吸器関連ウイルス遺伝子が検出されており，

aeruginosa，No.９ではTrueperella pyogenesおよ

NALTにウイルスが存在することが示された。

びStreptococcus suisが検出された（Table３）。鼻3 . 2 リアルタイムPCR法によるBVDVのウイ
ルス量の測定咽頭ぬぐい液と肺で同種の細菌が検出されたことから，鼻咽腔内で増殖した細菌が吸気によって肺PCR検査においてBVDVが検出された症例のうち，No.１～No.３のNALT，肺，肺門リンパ節および脾臓のリアルタイムPCRを実施した（Table２）。No.１ではBVDVⅡ型が検出され，NALTにに移動し，細菌性肺炎を引き起こすことが推測された。
3 . 4 M. bovis陽性牛の病理組織学的検査およびISH法の確立

おけるウイルス量は2.1×10 copies/μlであった。

M. bovisが検出されたNo.４～No.６，No.８お

No.２およびNo.３では，いずれもBVDVⅠ型が検よびNo.９の肺の病理組織学的検査では，細気管出され，NALTにおけるウイルス量はそれぞれ8.9

支腔内に好中球を主とした炎症細胞浸潤が観察さ×10 copies/μl，1.2×10 copies/μlであった。

れた（Fig. 1A）。また，結合組織に囲繞された好NALTにおけるウイルス量は，肺，肺門リンパ節

中球およびマクロファージ浸潤を伴う壊死巣が認および脾臓のウイルス量とおおむね同程度である

められた（Fig. 1B）。NALTでは，多列繊毛上皮

一方で，No.１の肺門リンパ節および脾臓，No.２

細胞に覆われた濾胞および陰窩構造がみられの肺，No.３の肺および脾臓のウイルス量を上回（Fig. 1C），陰窩内腔には壊死細胞が観察されたる結果となった。BVDVの感受性細胞としては，（Fig. 1D）
。NALTの上皮細胞が陥入する領域に

リ ン パ 球 ，マ ク ロ フ ァ ー ジ な ど が あ げ ら れ ，

おいては，好中球およびマクロファージの浸潤おBVDVはリンパ組織内で増殖して免疫機構に影響

よび杯細胞の過形成が認められた（Fig. 1E）。まし，免疫抑制に寄与すると考えられている 。本た，リンパ濾胞の一部に凝固壊死がみられ，近傍研究では，NALT組織内に肺門リンパ節や脾臓とに出血が観察された（Fig. 1F）。気管支および細同程度あるいはそれ以上の量のBVDVが検出され気管支への好中球浸潤および特徴的な壊死巣の形たことから，BVDVがNALTで増殖することによ

成 は M. bovis 感 染 に よ る 肺 炎 の 特 徴 所 見 で あり，局所免疫機構が抑制される可能性がある。

る１）。No.４～No.６，No.８およびNo.９の肺にお

４

４

６

６）

3.3

細菌検査

いても，同様の壊死性化膿性気管支肺炎がみら

No.４～No.９の鼻咽頭ぬぐい液および肺を用いれ，典型的なM. bovis感染病変を呈していた。さて細菌の分離・同定を行った結果，No.７以外のらに，No.４～No.６，No.８およびNo.９のNALT© The Ito Foundation

290

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 3 Bacterial isolation
Bacterial isolation

SampleNo.

Samples

No.4

Mycoplasma
bovis

Pasteurella
multocida

Histophilus
somni

Mannheimia
haemolytica

OthersNasopharyngeal
swab

＋

－

－

＋

－

Lung

＋

－

－

＋

－

Nasopharyngeal
swab

＋

－

－

－

－

Lung

＋

－

－

－

－

No.6

Nasopharyngeal
swab

＋

－

－

－

－

Lung

＋

－

－

－

－

No.7

Nasopharyngeal
swab

－

－

－

－

＋a

Lung

－

－

－

－

＋a

No.8

Nasopharyngeal
swab

＋

－

－

－

＋b

Lung

＋

－

－

－

＋b

No.9

Nasopharyngeal
swab

＋

－

－

－

＋c. d

Lung

＋

－

－

－

＋c. d

No.5

＋：Positive，－：Negative
a：Moraxella sp.，b：Pseudomonas aeruginosa，c：Trueperella pyogenes，d：Streptococcus suisにおいても陰窩内腔への好中球浸潤および壊死巣が 認 め ら れ た （Fig. 2A ， 2B）。 NALT で は ，の形成がみられたことから，M. bovis感染によっ

NALT被蓋上皮の頂端部および濾胞の壊死領域のて，NALTにおいても肺と同様の病変を形成する境界においてもM. bovis陽性シグナルが観察されことが示された。

た（Fig. 2C，2D）。また，上皮細胞が陥入する領本研究において開発したM. bovisプローブの特域および陰窩腔内にM. bovis陽性シグナルを有す

異性を確認するため，RNaseによる前処理を行っる マ ク ロ フ ァ ー ジ が み ら れ た（Fig. 2E）。M.

た標本およびM. bovis以外の細菌によって形成さ

bovisはリンパ球のアポトーシス，リンパ球増殖れた化膿病変を有する標本に対してISHを行った反応の抑制，好中球の機能不全を起こすことが知と こ ろ 陰 性 と な っ た 。ま た ，ジ ゴ キ シ ゲ ニ ンられている１）。No.４～No.６，No.８およびNo.９（DIG）抗体を使用してDIGプローブおよび100倍の肺およびNALTにおいて，M. bovis陽性シグナ

量の蛍光プローブの競合試験を行った結果，陽性ルを有する炎症細胞がみられたことにより，M.

シグナルが減弱した。以上の対照実験により，本

bovisが炎症細胞に存在することが確認され，ア

プローブを用いたISH法の高い特異性が示された。

ポトーシスや増殖反応抑制ならびに機能不全など

上述のM. bovisプローブを用いたISH法を，の免疫機構の抑制をもたらすことが推察された。

No. ４～No. ６ ，No. ８ お よ び No. ９ の 肺 お よ び

NALTを覆う上皮層は特殊に分化しており，そこ

NALTの切片を用いて実施したところ，肺の細気には外来抗原の取り込みを専門に行うMicrofold

管支上皮の頂端部および炎症細胞の細胞質，肺の細胞（Ｍ細胞）が存在し，粘膜免疫システムにお壊死領域では，びまん性にM. bovis陽性シグナル

ける抗原門戸細胞として機能している。NALTの© The Ito Foundation

牛呼吸器病ウイルスの鼻咽頭関連リンパ組織におけるウイルス増殖と病態解析
1A

1B

1C

1D

1E

1F

291

Fig. 11Ａ）Lung（No.8）, a bronchiole containing inflammatory cells infiltrate, mainly

neutrophils, in its lumen. Inset; neutrophil cells. Hematoxylin and eosin（HE）.
Bar＝100μｍ．
1Ｂ）Lung（No.9）, an area of pulmonary necrosis surrounded by connective
tissue capsule infiltrated by mononuclear inflammatory cells. HE. Bar＝100μｍ．
1Ｃ）NALT（No.4）, the lymphoid follicles, crypts and the covering epithelium
can be seen. HE. Bar＝250μｍ．
1Ｄ）NALT（No.4）, the crypts showing necrotic cells in their lumen（arrows）.
HE. Bar＝250μｍ．
1Ｅ）NALT（No.5）, goblet cells hyperplasia and inflammatory cell infiltrate ofneutrophils and macrophages in the epithelial invagination are observed. HE.
Bar＝100μｍ．
1Ｆ）NALT（No.6）, a coagulative necrosis（astarisk）surrounded by haemorrhage
can be seen within the lymphoid follicle. HE. Bar＝100μｍ．

被蓋上皮の頂端部においてもM. bovis陽性シグナ

知られている。本研究は，牛のNALTにおけるルが認められたことから，M. bovisがＭ細胞を介

BVDVを中心とした牛呼吸器関連ウイルスの存在

し て 侵 入 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。さ ら に ，について調べるとともに，M. bovisによる病変のNALTの陰窩内腔および壊死巣にM. bovis陽性シ

病理組織学的検索を行うこと，ならびにM. bovis

グナルが観察されたことから，M. bovisがNALTの増殖を組織上で可視化させる低廉な検出系を確に病変を形成し，局所免疫機構の抑制に影響を与立することを目的とした。牛呼吸器関連ウイルス

えていると考えられた。

のPCR検査では，９例中８例でNALTにおいても

４．要BVDV遺伝子が検出された。リアルタイムPCR法

約では，NALT組織内に肺門リンパ節や脾臓と同程

我が国の肉用牛および乳牛における呼吸器病の度あるいはそれ以上の量のBVDVが検出されたこ

発生頻度は高く，呼吸器病としてはBRDCが広くとから，BVDVがNALTで増殖することにより，© The Ito Foundation

292

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

2A

2B

2C

2D

2E

Fig. 2
2Ａ）Lung（No.8）, M.bovis signals can be observed on the apical border of thebronchiolar epithelium（arrow heads）and in the cytoplasm of inflammatory cells.
in situ hybridization（ISH）.Bar＝100μｍ．
2Ｂ）Lung（No.8）, ISH, M.bovis positive reaction can be seen diffusely in the
necrotic areas（astarisk）.ISH. Bar＝100μｍ．
2Ｃ）NALT（No.5）, ISH, M.bovis on the apical surface of the covering epithelium（arrow heads）.ISH. Bar＝50μｍ．
2Ｄ）NALT（No.4）, ISH, M.bovis positive cells in the epithelial crypts. ISH. Bar＝250
μm. Inset; macrophages with positive cytoplasmic reaction. ISH. Bar＝250μｍ．
2Ｅ）NALT（No.6）, ISH, M.bovis positivity in the borders of the necrotic areas（arrows）of the lymphoid follicles. ISH. Bar＝250μｍ．

局所免疫機構が抑制される可能性が示唆された。
細菌分離・同定を行った症例については，１例を除 い て M. bovis が 検 出 さ れ た 。M. bovis 陽 性 となった症例の肺では，HE染色標本上でM. bovisに典型的な壊死性化膿性気管支肺炎の所見がみられ，NALTにおいても同様の病変が観察された。
高 感 度 が 期 待 で き ，配 列 の 保 存 性 が 高 い 23SrRNAのドメインＶ領域より作製したプローブを用 い た ISH 法 で は M. bovis 陽 性 牛 の 肺 お よ び
NALTの炎症細胞や壊死巣に陽性所見が得られ

文献１） 播谷亮：家畜感染症学会誌，２，85～97，2013．
 滝澤亮，首藤洋三，山田美那子，中野雅功：平成２）
23年度 大分県家畜保健衛生所ならびに畜産関係業
績発表会集録，2011．
３）
 Mohit Baxi, Dorothy McRae, Shailja Baxi, Irene
Greiser-Wilke, Stefan Vilcek, Kingsley Amoako,
Dirk Deregt：Veterinary Microbiology，116（1-3），
37～44，2006．
４） 小池新平，宇佐美佳秀：日本獣医師会雑誌，64，
45～49，2011．
 塚本悠，斎藤寿一：東ソー研究・技術報告，62，５）
99～102，2018．
６） Qi, Shuhui, Lijing Wo, Chao Sun, Juan Zhang,
Quanhai Pang, Xin Yin：Viruses，14，10，2022．

た。NALTの被蓋上皮の頂端部にM. bovis陽性シ
グナルがみられたことから，M. bovisがＭ細胞を介してNALTへ侵入する可能性が示唆された。

© The Ito Foundation

293

イノシシにおける豚コロナウイルスの感染実態調査（Ⅱ）
Epidemiological survey of porcine coronavirus-infection in Japanese wildboars（Ⅱ）

中

川

敬

介

（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

Keisuke Nakagawa（Joint Department of Veterinary Medicine Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

In Japan, infectious diseases remain to pose a threat to swine industry. Once swine
infectious diseases unfortunately spread to wild boars, it takes a long time to make themdisease-free, as shown by a recent epidemic of classical swine fever in Japan. This factindicates that wild boars may play a role as potential transmitters or reservoirs of swine
pathogens. Therefore, it is important for control of swine diseases to understand the status ofprevalence of them in wild boars. Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）, transmissible
gastroenteritis virus（TGEV）and porcine deltacoronavirus（PDCoV）cause a big economic
loss because of the high level of pathogenicity for swine. Recently, PDCoV infection in humanwas reported, suggesting that PDCoV could be a zoonotic pathogen. Thus, the porcine
coronaviruses sporadically emerge to swine and human from unknown routes. To identify thetransmission routes of them should be useful information for control of the swine coronavirus
diseases in domestic pigs and zoonotic transmission of porcine coronaviruses. Here, we
conducted molecular surveys for PEDV, TGEV and PDCoV among wild boars in Gifu
Prefecture, Japan. Additionally, we examined the prevalence of paramyxoviruses, which cause
various diseases in animals. As a result, we did not detect viral genes of porcine coronaviruses
from tonsil and spleen specimens of the wild boars by RT-PCR. Interestingly, by using pan,paramyxovirus/pneumovirus primers, we detected viral genes of canine distemper virus（CDV）
but not other paramyxoviruses. These suggest that 1）wild boars in Gifu Prefecture should notplay a role as major transmitters of the porcine coronaviruses, 2）they also should not maintainviruses belonging to paramyxoviridae/pneumoviridae with a high level of pathogenicity in
porcine, as like Nipahvirus, 3）they may play a role as transmitters of the CDV. Theseknowledges will contribute to understanding of the ecology of porcine coronaviruses and CDV.

１．目

けている。また，豚と遺伝的に近縁であるイノシ

的シに感染症が定着してしまうと，その感染症の清

昨今の豚熱の流行やアフリカ豚熱の世界的流行

浄化には長い時間と労力が必要となる。実際に本が示すように，感染症は養豚産業の脅威となり続州のイノシシに豚熱ウイルスが蔓延しており，本© The Ito Foundation

294

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ウイルスに感染したイノシシの報告は山口県から

人獣共通感染症としてのPDCoVの感染経路，自岩手県に及ぶ。すなわち，イノシシは豚の病原体

然宿主あるいは伝播動物の特定が急がれている。

を保持する可能性をもつ野生動物であり，イノシ

以上より，これら豚コロナウイルスの侵入経路

シにおける豚の感染症の流行実態を把握することならびに野生動物におけるウイルスの保有・流行は，豚への感染防止対策をとるうえできわめて重状況を明らかにすることは，公衆衛生学的ならび要な情報となるに家畜衛生学的にきわめて重要な意味をもつ。し豚流行性下痢ウイルス（PEDV）や豚伝染性胃

かしながら，日本の野生動物における，豚コロナ

腸炎ウイルス（TGEV）に代表される豚コロナウ

ウイルスの感染実態（ウイルス保有状況や感染

イルスは，特に幼豚に高い致死性を示すことか歴）を調べた研究は実施されていない。

ら，養豚業界では大きな問題となっている。例え

そこで本研究では，豚の近縁野生種であるイノ

ば，PEDVを原因とする哺乳豚の死亡は，2013-

シ シ を 対 象 と し て ，豚 コ ロ ナ ウ イ ル ス で あ る

15年のみで約10億円の経済被害をもたらした 。

PEDV，TGEVおよびPDCoVの感染実態を調査

また，TGEVの感染も，日本の豚において毎年のした。また，研究開始時に計画していたPRRSウ発生が報告されている。幸いなことに両感染症に

イルスに対する調査については，北村ら４）による対するワクチンが存在する一方，突発的に感染拡

イノシシ由来の同サンプルを用いた調査報告を受大することが知られ，その侵入経路についてはいけ計画を変更し，豚に致死的な感染症を引き起こ

まだに不明な点が多い 。

し，さらに人獣共通感染症を引き起こすニパウイ

１）

２）

また最近，ハイチにおいて豚デルタコロナウイルスなどが含まれるパラミクソウイルス科ウイル

ルス（PDCoV）が小児らに感染し，インフルエ

スとニューモウイルス科ウイルスの保有状況をンザ様症状を示した事例が報告された 。本報告

pan-paramyxovirus検出用プライマーを用いて調によりPDCoVが人に感染し得ることが示され，査することとした。これらウイルス性感染症媒介３）Collecting samples of wild boars
in Gifu Prefecture from 2018
Gifu Pref.
Wild boars play a role
as a transmitter?

・Molecular epidemiology
Virus :PEDV/TGEV/PDCoV
Paramyxoviridae/Pneumoviridae

Fig. 1 Overview of the current study
PEDV, porcine epidemic diarrhea virus ; TGEV, transmissible gastroenteritis virus ;PDCoV, porcine deltacoronavirus© The Ito Foundation

イノシシにおける豚コロナウイルスの感染実態調査（Ⅱ）

295

動物としての野生イノシシを評価し，豚コロナウを抽出した（Zymo社：Direct-zol RNA miniprep

イルス感染症およびパラミクソウイルス・ニューkit）。抽出されたRNAを逆転写酵素（Invitrogen

モウイルス感染症対策に貢献できる情報提供を目社：Superscript Ⅲ Reverse Transcriptase）を用指した。本研究の概要をFig. １に示した。

いてcDNAに変換し，これらを鋳型にリアルタイ
ム PCR を 実 施 し た 。本 リ ア ル タ イ ム PCR に は

２．材料と方法
2.1

PEDV お よ び TGEV RNA を 同 時 に 検 出 で き る

材料とそれらの取り扱い

キット（Applied Biosystems社：VetMAX PEDV/本研究では，2018年から採材された野生イノシ

TGEV Kit）を用いた。なお，本実験は添付の使

シの血清，扁桃乳剤および脾臓乳剤を使用した。

用説明書に従って実施された。なお，PDCoVにイノシシ血清は血清疫学調査に供した。なお，下対する分子疫学調査には，上述したようなリアル

痢症を引き起こす豚コロナウイルスは腸管のみなタイムPCRキットが本学の設備では応用できな

らず，脾臓など他の臓器にも分布することが分い。そこで，昨年度の申請課題であるPEDVとかっているため，扁桃乳剤および脾臓乳剤を

TGEVに対する分子疫学調査のために抽出したイ

分子疫学調査に用いた。2018年から現在までに採ノシシ由来RNAを用いて，PDCoVに対するRT-取されたこれらサンプル数はすでに合計500を超

PCRを網羅的に実施した。なお，検出を試みる豚えており（報告書作成時点

コロナウイルス遺伝子はＳ遺伝子とした。

２，５）血清1281サンプル，

扁桃乳剤551サンプル，脾臓401サンプル），申請

2 . 3 イノシシ由来検体を用いたパラミクソウ

課題後にもサンプル数は増える予定である。な

イルス・ニューモウイルスに対する分子疫

お，これらサンプルは豚熱の調査を目的に採材さ学調査れたものであり，豚熱ウイルスを含む可能性が考

上記のイノシシ扁桃乳剤と脾臓乳剤に由来する

えられた。そのため，これらのサンプルは岐阜県

cDNAおよび血清から作製したcDNAを鋳型に中央家畜保健衛生所のBSL３実験施設にて以下のTongらの報告に従い，パラミクソウイルス科ウイ

適切なウイルス不活化処置を施した後に実験に供

ルス（Respirovirus，Morbillivirus，Henipavirus，することとした。すなわち，血清サンプルは，豚Avulavirus，Rubulavirus）およびニューモウイ

熱ウイルスを不活化する目的で，0.1％v/vのβ-

ルス科ウイルスを検出可能なプライマーを用いてプロピオラクトン（FUJIFILM社）添加後，37℃

semi-nested RT-PCR を 実 施 し た ６）。 本 semi-

で２時間処理し，岐阜大学へ移動させた。さらに，

nested RT-PCRは保存性の高いＬ遺伝子を標的

扁桃乳剤および脾臓乳剤については，RNA抽出としており，パラミクソウイルス科およびニュー試薬（Invitrogen社：TRIzol Reagent）添加後にモウイルス科のウイルス遺伝子の存在をスクリー破砕したものを使用した。これらの臓器乳剤はニングする目的で実施した。Ｌ遺伝子の存在が認

フェノール乳剤であることから，これらサンプルめられたサンプルについては，増幅されたＬ遺伝

中に感染性を保持した豚熱ウイルスが残存するこ子断片の遺伝子配列を決定し，BLAST解析を実とはない。

施した。本BLAST解析の結果，最も相同率の高2 . 2 イノシシ由来検体を用いた豚コロナウイ
ルスに対する分子疫学調査

い既知のウイルス配列より，ＦおよびＨ遺伝子を増幅するためのプライマーを設計し，両ウイルス

上記のイノシシ扁桃乳剤と脾臓乳剤からRNA

遺伝子の全長をnested RT-PCRにより検出する© The Ito Foundation

296

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ことを試みた。

した可能性については否定できない。一方，豚コ
ロナウイルスのいずれの遺伝子にプローブが結合

３．結果と考察しているのか明らかにされていない。したがっ3 . 1 岐阜大学へのイノシシ由来検体の移送と保管て，プローブが結合するウイルス遺伝子は存在す
る一方，RT-PCR用のプライマーがウイルス遺伝

昨年度に引き続き，岐阜県中央家畜保健衛生所

子に結合していないため，ウイルス遺伝子が増幅のBSL３実験施設に保管されているイノシシ由来

されなかったことが考えられた。また，豚への感検体の不活化処理を実施した。上述した方法にて染実験により，PEDVは腸管の他に腎臓および脾処理した血清1281サンプル，扁桃乳剤551サンプ

臓にも分布することが明らかとされている一ル，脾臓401サンプルを岐阜大学に移送させた。

方５），TGEVとPDCoVについては豚での体内動態

これらのサンプルは岐阜県との合意の下，岐阜大の詳細が報告されていない。したがって，TGEV

学にて保管され，今後の貴重な調査試料として活とPDCoVは感染個体内におけるウイルス動態が用される予定である。

PEDVと異なる可能性が考えられた。現在，豚熱3 . 2 イノシシ由来検体からの豚コロナウイル
ス遺伝子の検出の蔓延によりサンプリングが困難であるものの，イノシシの糞便サンプルより豚コロナウイルスのVetMAX PEDV/TGEV Kitを用いて，上述し検出を試みることで，イノシシが保有する豚コロ

たサンプルのうち脾臓乳剤394サンプルおよび扁

ナウイルスの存在を明らかにできる可能性が考え

桃乳剤388サンプル中のPEDVおよびTGEV遺伝られた。

子の検出を試みた。その結果，PEDV遺伝子は脾

3 . 3 イノシシ由来検体からのパラミクソウイ

臓乳剤６サンプルにおいて陽性，扁桃乳剤53サンルス・ニューモウイルス遺伝子の検出

プルにおいて陽性を示した。一方，TGEV遺伝子

上述したサンプルのうち脾臓乳剤394サンプル

は脾臓乳剤および扁桃乳剤いずれのサンプルにおおよび扁桃乳剤388サンプル中のパラミクソウイ

いてウイルス遺伝子は検出されなかった。これら

ルス科ウイルス（Respirovirus，Morbillivirus，の結果より，PEDVが野生のイノシシの脾臓およHenipavirus，Avulavirus，Rubulavirus）および

び扁桃中に存在していることを示唆された。

ニューモウイルス科ウイルスの検出を試みた。そ次 に ，VetMAX PEDV/TGEV Kit よ り PEDVの結果，Morbillivirus遺伝子が脾臓乳剤10サンプ

遺伝子の存在が示唆されたcDNAより，PEDV Ｎ

ルおよび扁桃乳剤13サンプルにおいて陽性を示し

遺伝子およびＳ遺伝子の検出を試みたものの，両た。一方，他のパラミクソウイルス科ウイルスおよ遺伝子の増幅には至らなかった。なお，作製したびニューモウイルス科ウイルスの遺伝子は検出さすべてのcDNAよりPEDV，TGEV，PDCoVのＮれなかった。増幅されたＬ遺伝子の塩基配列情報

遺伝子およびＳ遺伝子の検出を試みたものの遺伝をBLAST解析した結果，検出されたMorbillivirus

子検出には至らなかった。

はすべて犬ジステンパーウイルス（CDV）であ

残念ながら本研究では，イノシシ由来cDNAかることが明らかとなった。CDVのＬ遺伝子が検ら豚コロナウイルス遺伝子を増幅することはでき出された全23サンプルより，Ｆ遺伝子およびＨ遺なかった。したがって，VetMAX PEDV/TGEV

伝子の検出を試みた結果，２サンプルより両遺伝

Kitが豚コロナウイルス遺伝子を非特異的に検出

子全長の増幅が確認された。現在，Ｆ遺伝子およ© The Ito Foundation

イノシシにおける豚コロナウイルスの感染実態調査（Ⅱ）

びＨ遺伝子の全長配列を決定中である。

297とが期待できる。

CDVを含めたパラミクソウイルスは樹状細胞

豚やヒトに重篤な感染症を引き起こすウイルスなどの免疫担当細胞に感染することが知られていを含むパラミクソウイルス科ウイルスおよびる 。今回の調査検体であるイノシシの脾臓と扁

ニューモウイルス科ウイルスの分子疫学調査をイ

桃といった二次リンパ組織には豊富な免疫担当細ノシシ由来検体より実施した結果，CDVを検出

胞が存在していたと考えられ，CDV感染免疫担することに成功した。また，ニパウイルスなどの当細胞よりウイルス遺伝子が検出されたことが考豚とヒトに重篤な感染症を引き起こす病原体は検えられた。また，これまでに日本の野生イノシシ

出されなかった。CDV遺伝子をイノシシから実血清からCDVの感染を支持する結果が報告され際に検出した報告はなく，今回の調査により同定ている 。その一方，日本と海外を含めたイノシ

されるCDVの遺伝子情報は，本ウイルスの宿主

シから実際にCDVウイルス遺伝子の検出がなさ域を考察するうえで重要な基盤情報になる。

７）

８）

れた報告は我々の知る限り存在しない。よって本本調査を通じて，大量のイノシシ由来血清およ

知見は，CDVの宿主域を考察するうえできわめ

び臓器乳剤を岐阜大学に保管することができた。

て重要な遺伝子情報となる可能性を秘めている。

本試料は今後，イノシシが豚コロナウイルス以外

3.4の病原体を保有・伝播させる役割をもつか否かを

今後の展望

イノシシの脾臓と扁桃を用いた本調査では調査するうえできわめて貴重な試料と言える。今PEDV，TGEVおよびPDCoVの遺伝子を増幅し後，本検体を用いて，さまざまな感染症に対する遺伝子解析することは叶わなかった。一方で本調

血清疫学および分子疫学の展開が期待できる。

査結果は，日本のイノシシにこれら豚コロナウイ
ルスが蔓延していないことを示唆している。すな

４．要

約

わち，イノシシはこれら豚コロナウイルスの伝播

本調査により，日本のイノシシは豚コロナウイ者として積極的な役割を果たしていない可能性がルスの伝播者として積極的な役割を果たしていな考えられた。また，ジビエとしてもヒトの口に運い可能性が示唆された。一方，昨年度実施したばれる食材としてのイノシシの安全性を支持する

PEDVおよびTGEVに対する血清疫学調査では，結果でもあると考えられた。

高い両ウイルスの抗体陽性率を示している。分子現 在 ，VetMAX PEDV/TGEV Kit よ り PEDV

疫学と血清疫学の調査結果の違いについては今後の遺伝子の存在が示されたサンプルより，さまざの検討課題となったものの，イノシシが積極的にまなプライマーを使ってPEDVのＳ遺伝子配列の

豚コロナウイルスを豚へ伝播する可能性は低いこ検出を試みている。また，サンプル数も増やしてとが考察された。また，日本のイノシシはニパウ調査を継続中である。日本では2013年にPEDVのイルスなどの豚やヒトへ重篤な症状を示すパラミ

大流行が発生していることから，本系統学的解析

クソウイルスを保有していない一方，CDVに一は，2013年に豚にて流行したPEDVがイノシシに定の割合で感染していることが明らかになった。

定着した可能性と，イノシシが独自のPEDVを保CDVは豚に対して重篤な病態を示すことは報告持している可能性のいずれかを示すことができる

されていないものの，本ウイルスの宿主域を考察と考えられる。いずれの結果になるとしても，イするうえできわめて重要な知見を得ることができノシシにおけるPEDVの新たな感染実態を示すこた。

© The Ito Foundation

298

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

以上，養豚家に対し「イノシシが豚コロナウイ
ルスを積極的に伝播する存在とは考えにくい」「日本のイノシシがニパウイルスなど豚に重篤な感染症を引き起こすパラミクソウイルスを保有している可能性は低い」「低率ながらイノシシがCDVを保持している」ということを示すことができた。本調査結果が，ウイルスの生態理解および今後の日本の養豚業界の豚コロナウイルス対策の一助となることを期待したい。
文献１） Sasaki, Y., Kawabata, T., Nakatake, S., Kohigashi,T., Toya, R., Uemura, R., Sueyoshi, M.：Assessmentof reproductive and growth performance of pigs oncommercial swine farms in southern Kyushu,
Japan, Anim Sci J, 91, e313492-e313499, 2020．
２） 中川敬介：豚のコロナウイルス感染症，All about
SWINE 59, 29～37, 2021．
３） Lednicky, J. A., Tagliamonte, M. S., White, S. K.,
Elbadry, M. A., Alam, M. M., Stephenson, C. J.,
Bonny, T. S., Loeb, J. C., Telisma, T., Chavannes, S.,

Ostrov, D. A., Mavian, C., Beau De Rochars, V. M.,
Salemi, M., Morris, J. G. Jr.：Independent infectionsof porcine deltacoronavirus among Haitian children,
Nature, 600, 133～137, 2021．
４） Kitamura, Y., Saito, T., Tanaka, E., Takashima,
Y.：A serological survey of porcine reproductive
and respiratory syndrome virus in wild boar in
Gifu Prefecture, Japan, J. Vet. Med. Sci., 84, 1406～
1409, 2022.
５） Park, J. E., Shin, H. J.：Porcine epidemic diarrhea
virus infects and replicates in porcine alveolar
macrophages, Virus Res, 191, 143～152, 2014．
６） Tong, S., Chern, S. W., Li, Y., Pallansch, M. A.,
Anderson, L. J.：Sensitive and Broadly Reactive
Reverse Transcription-PCR Assays To Detect
Novel Paramyxoviruses, J. Clin. Microbiol., 46,
2652～2658, 2008．
７） P a r k s , G . D . , A l e x a n d e r - M i l l e r , M . A . ：Paramyxovirus activation and inhibition of innate
immune responses, J Mol Biol, 425, 4872～4892,
2013．
８） Suzuki, J., Nishio, Y., Kameo, Y., Terada, Y.,
Kuwata, R., Shimoda, H., Suzuki, K., Maeda, K.：
Canien distemper virus infection among wildlife
before and after the epidemic, J Vet Med Sci, 77,
1457～1463, 2015．

© The Ito Foundation

299

ウシRSウイルス研究に最適な細胞株の樹立
Generation of a cell line suitable for research of bovine RS virus

齊

藤

暁

（宮崎大学農学部）

Akatsuki Saito（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Infection with bovine respiratory syncytial virus（BRSV）, a member of Pneumoviridae, isa major cause of pneumonia in calves, and it can induce secondary bacterial infections, leading
to severer symptoms. Despite its importance, isolation of BRSV from clinical samples issometimes difficult, hampering the advance of BRSV research．
While cell-surface heparan sulfate is the primary receptor for human RSV, human
CX3CR1 was identified as an important surface molecule for human RSV infection in airway
epithelial cells. Since the role of bovine CX3CR1 on the infection by BRSV remains unknown,
we aimed to test whether a bovine-derived cell line expressing bovine CX3CR1 showsincreased susceptibility to BRSV infection. To this end, we generated a cell line expressing the
CX3CR1 molecule using an HIV-1-derived lentiviral vector in Trim5 knockout MDBK cells.
We succeeded in generating a stable cell line expressing CX3CR1 and found that stable
expression of CX3CR1 enhanced susceptibility to BRSV infection. This finding suggests thatstable expression of CX3CR1 is a promising way to generate a cell line with higher
susceptibility to BRSV infection．

１．目の低下，場合によっては死亡につながるケースも的多い。ウシRSウイルスの感染制御は畜産現場で本研究では，特に子牛生産現場で大きな問題ときわめて重要な課題であるが，ウシRSウイルス

なっているウシRSウイルスの分離に最適な細胞の分離が容易ではないケースがあるという課題が株を樹立することを目的とした。ウシRSウイルある。

スはニューモウイルス科に属するRNAウイルス

ヒトRSウイルスにおいては，主要レセプター

で，特に子牛の呼吸器感染症の原因の主要なウイはヘパラン硫酸であると考えられているが１，２），ルスである。ウシRSウイルスそのものによる感呼吸器上皮細胞におけるレセプターとして染のみならず，ウイルス感染後に細菌感染症へのCX3CR1が同定されている３，４）。一方で，ウシRS感受性が亢進することで，細菌による二次感染でウイルスが同様にCX3CR1を用いるかについては

子牛の健康状態が悪化し，成長率の低下，経済性

明らかとなっていない。そこで本研究では，ウシ© The Ito Foundation

300

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

由来MDBK細胞にウシCX3CR1を持続発現させる

psPAX2-IN/HiBiTプラスミド，pMD2.Gプラス

ことで，ウシRSウイルスの基礎研究の推進，臨ミド，TransIT-293トランスフェクション試薬を

床現場でのウイルス分離効率向上を目的とした。

混和し，Lenti-X 293T細胞にトランスフェクト

手法としてCX3CR1をウシ細胞に発現させる方法した。トランスフェクションの２日後に上清を濾として長期安定発現のためHIV由来レンチウイル

過し，ウイルスベクターを回収した。

スベクターを用いることとした。ところが，ウシ

2.4

細胞ではTRIM5という抗HIV宿主因子が発現さ

2 . 3で作成したbCX3CR1発現ベクターをTrim5

れており，HIV由来レンチウイルスベクターの感

ノックアウトMDBK細胞に感染させた。細胞を染効率が著しく低下する。私たちはこれまでに，

ハイグロマイシン含有培地で６日間培養した後，

CRISPR/Cas9法でTrim5遺伝子を欠損させたウ

限界希釈法を使用して単一細胞クローン化した。

シ由来MDBK細胞を作成している ５）。本研究で各クローンは，リアタイムRT-PCRによりCx3cr1

は，Trim5欠損MDBK細胞を用いることで，ウ

mRNA発現量を測定することによってその特性

シCX3CR1発現細胞の作成とその評価に取り組んを確認した。

CX3CR1持続発現細胞の作成

2 . 5 CX3CR1持続発現細胞におけるウシRSウ

だ。
２．方
2.1

イルス感受性の評価

法

CX3CR1持続発現細胞を96ウェルプレートに播種した。一晩培養した後，細胞を２倍段階希釈しプラスミド

psPAX2（カタログ番号12260；http：//n2t.net/

たウシRSウイルス（京都微研，牛RSウイルス感

addgene:12260 ； RRID ： Addgene_12260） お よ

染症生ワクチン（シード））に感染させた。翌日

びpMD2.G（カタログ番号12259；http://n2t.net/

培地を取り除き，培地で洗浄した後，新しい培地

addgene：12259；RRID：Addgene_12259）は，を加えた。感染から４日後，上清中のウイルス量

Didier Trono博士（ローザンヌ大学）から分与ををリアルタイムRT-PCRで測定した。PCRプロト受けた。

コルは，95℃で５秒間，60℃で34秒間を40サイク

2.2

ルで設定した。

細胞培養

Lenti-X 293 T （TaKaRa ， カ タ ロ グ 番 号
Z2180N）， MDBK （Japanese Collection of

３．結果と考察Research Bioresources Cell Bank（JCRB），カタ

まず，ヒトCX3CR1配列とウシCX3CR1配列のログ番号IFO50014）は10％ウシ胎児血清および相同性を調べた。Expasy（https://web.expasy.

１×ペニシリン-ストレプトマイシン（ナカライorg/sim/）における計算では，ヒトCX3CR1とウ

テスク，カタログ番号09367-34）を添加したダルシCX3CR1のidentityは81.0％であった（Fig. １）。

ベッコ改変イーグル培地（ナカライテスク，カタ

人工合成したウシCX3CR1のcDNAをレンチウイ

ログ番号08458-16）で培養した。

ルスベクターに挿入し，シークエンスを確認し

2 . 3 ウシCX3CR1発現用ウイルスベクターのた。同プラスミドを用いてレンチウイルスベク
ターを調整し，MDBK細胞に感染させた。２日

作成
Opti-MEMに，
bCX3CR1をコードするpLVSIN-

後に細胞を回収し，ハイグロマイシンにより遺伝

CMV プ ラ ス ミ ド（pLVSIN-CMV-bCX3CR1），

子導入細胞の選択を行った。その後，限界希釈法© The Ito Foundation

301

ウシRSウイルス研究に最適な細胞株の樹立による単細胞クローニングを行った。得られた30

ン#９を用いて，ウシRSウイルス感染感受性を調クローン以上のうち，12クローンを性状評価に用べることとした。実験にはウシRSウイルスのワいた。

クチン株を用い，ウイルス液の原液を２倍，４倍，

ヒトCX3CR1に対する抗体ではウシCX3CR1を８倍と２倍段階希釈した上で細胞に感染させた。

検出できなかったため，ウシCX3CR1のmRNA発

その結果，コントロール細胞では２倍希釈のウイ

現量をリアルタイムRT-PCRで測定することによルスまでしか増幅できなかったことに対して，クり評価することにした。複数クローンの評価の結

ローン#１，クローン#６，クローン#９ではさ果，クローン#１，クローン#６，クローン#９，

らに高い倍率で希釈したウイルスについても増幅

クローン#10で有意に発現量の上昇が認められた

す る こ と が で き た（Fig. ３）。こ の こ と は ，（Fig. ２）。

CX3CR1の恒常発現がウシRSウイルス感染感受そこで，クローン#１，クローン#６，クロー性の向上につながることを示唆している。

Domain: Data
- M D Q F P E S V T
hsCX3CR1
bCx3CR1M H T T L . . . T S

E N F E Y D D L A E A C Y I G D I. . . . . Y . . . . . . D M . . .

hsCX3CR1
bCx3CR1

L L V V F A L T N S. . . . . . . I . .

K K P K S V T D I
Q R S . . I . . .

hsCX3CR1
bCx3CR1A M C K F T T A F F. T . . L I . . . .

F I
. .

hsCX3CR1
bCx3CR1

S L G V W A A A I. . . . . . . . .

V A A P Q F M F T K Q K E N E C L G D Y P E V L Q E I. . T . . . . . . R E . . . . . F . . . . . I . . . .

hsCX3CR1
bCx3CR1

F L L P L L I. . . . . . .

hsCX3CR1
bCx3CR1

M I. .

hsCX3CR1
bCx3CR1F R R Y L Y H L Y G K C L A V L C G R S V H V D F S S - - S E S Q R S R H G S V L S S N F T Y H T S [350]. . . . . . R . . R . . . . . . . C H P D . L S . . . S L . . . . . . . R E . . . . . . . . H Y . . [350]hsCX3CR1
bCx3CR1D G D A L L L L *. . . . S I . . .

L
.

M S Y
. . .

G F F G S I. . . . G .

C Y F R I
. . . . .

F L E T L K L Y. . Q . . N . .

V V F G T V F L S I. A L . . . . V V .

F Y S V I F A I G L V G N [ 50]
L . . L V . . F . . . . . [ 50]

Y L L N L A L S D L L F V A T L P F W T H Y L I. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V .

F F I
. . .

T V I
. . .

S I D R Y L A I. V . . F . . .

I Q T L F S C K N H K K A K A I
M . . . . . . . . . . . . . . .

V L A A N S M N N R T V Q H G V T I [150]. . . . . . . S . . . . . . . . . T [150]

K L I
R . .

W P V L R N V E T N F L G [200]. . . I L . T . I . . . . [200]

L L V V I V F F L F W T P Y N V [250]F . . . V . . . . . . . . . . . [250]D F F P S C D M R K D L R L A L S V T E T V A F S H C C L N P L I. . . . K . . V K R . . K . . I . . . . . I . . . . . . . . . . .

[359]
[359]

Fig. 1 Alignment between human CX3CR1（hsCX3CR1）and bovine CX3CR1（bCX3CR1）

Relative expression（fold）

4
3
2
1

C #8
X3 R1
#
C
C R1 9X3
C #1
C R1 0
X3#
コン CR 11
ト
1
ロ #1
ー
2
ル
細
胞

#7

R1

C

C

C

X3

#6

R1

C

C

X3

#5

R1

C

C

X3

#4

R1

C

C

X3

#3

R1

C

C

X3

#2

R1

X3

C

C

X3

C

R1

C

X3

C

C

X3

C

R1

#1

0

Fig. 2 Expression level of Cx3cr1 mRNA in MDBK clones© The Ito Foundation

N E K G L H N [100]. . Q . . . H [100]Y A F A G E K [300]. . . . . . . [300]

302

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

104

コントロール細胞

Copies/µl

CX3CR1 #1
CX3CR1 #6

103

CX3CR1 #9

102

101
1

2

4

8

16

32

64

ウイルス希釈（倍）Fig. 3 Stable expression of CX3CR1 enhanced susceptibility to BRSV infection

以上の結果から，ウシCX3CR1を発現させるこが同様にCX3CR1を用いるかについては明らかととで，ウシRSウイルスの分離効率向上が期待でなっていない。そこで本研究では，ウシRSウイ

きる結果が得られた。現在，ヒトRSウイルスとルス感染におけるCX3CRlの機能的意義の解明をウシRSウイルスのシュードタイプウイルス（ウ目的とした。本研究では，これまで私たちが作成

シRSウイルスのＦタンパク質，Ｇタンパク質でしたTrim5ノックアウト細胞を用いることで、効被覆されたレンチウイルスベクター）の作成を進率よくウシCX3CRlを恒常発現する細胞の樹立にめており，これらを用いることでより詳細にウシ成功した。また，ウシCX3CRl恒常発現細胞におRSウイルス感染におけるCX3CR1分子の役割をいてはウシRSウイルスへの感受性が向上する結明らかにしたいと考えている。今後も実験系の最果を得た。これらの結果から，ウシRSウイルス

適化を進め，ウシRSウイルス感染症の制御に貢制御に向け，ウシCX3CR1を持続発現させた細胞

献していきたい。

の有用性が示唆された。

４．要

約

ウシRSウイルスはニューモウイルス科に属す
るRNAウイルスで，子牛の呼吸器感染症の原因の主要なウイルスである。特に細菌による二次感染が子牛に大きな健康被害をもたらす。そのため，ウシRSウイルスの分離や研究は重要な課題
であるが，臨床検体からのウシRSウイルスの分
離は時に容易でない。ヒトRSウイルスにおいては，主要レセプターであるヘパラン硫酸に加えて，呼吸器上皮細胞におけるレセプターとして
CX3CRlが同定されている一方，ウシRSウイルス

文献１）
 Krusat, T., Streckert, H. J.：Heparin-dependentattachment of respiratory syncytial virus（RSV）tohost cells, Arch Virol，142（6），1247～54，1997．
２）
 Hallak, L. K., Collins, P. L., Knudson, W., Peeples,
M. E.：Iduronic acid-containing glycosaminoglycans
on target cells are required for efficient respiratorysyncytial virus infection, Virology ， 271（2）， 264～
275，2000．
３）
 Chirkova, T., Lin, S., Oomens, A. G. P., Gaston, K.
A., Boyoglu-Barnum, S., Meng, J., Stobart, C. C.,
Cotton, C. U., Hartert, T. V., Moore, M. L., Ziady, A.
G., Anderson, L. J.：CX3CR1 is an important surface
molecule for respiratory syncytial virus infection inhuman airway epithelial cells, J Gen Virol，96（9），2543～2556，2015．

© The Ito Foundation

ウシRSウイルス研究に最適な細胞株の樹立
４） Johnson, S. M., McNally, B. A., Ioannidis, I., Flano,E., Teng, M. N., Oomens, A. G., Walsh, E. E.,
Peeples, M. E.：Respiratory Syncytial Virus Uses
CX3CR1 as a Receptor on Primary Human Airway
Epithelial Cultures, PLoS Pathog, 11；11（ 12）,e1005318，2015．

303

５）
 Morizako, N., Butlertanaka, E. P., Tanaka, Y. L.,
Shibata, H., Okabayashi, T., Mekata, H., Saito, A.：
Generation of a bovine cell line for geneengineering using an HIV-1-based lentiviral
vector, Sci Rep，12，16952，2022．

© The Ito Foundation

304

ライフサイクルに応じたパイエル板の機能解明と制御因子の探索
Investigation of Peyerʼs patch function according to life cycle andexploration of its regular

古

川

睦

実・野

地

智

法

（東北大学大学院農学研究科）

Mutsumi Furukawa and Tomonori Nochi（Graduate school of Agricultural Science, Tohoku University）

Health management is very important in livestock production. Given that the requirementof reducing the use of antimicrobial agents due to the high risk of producing drug-resistantbacteria in the world, it is essential to improve husbandry management techniques of livestock
management that do not depend on antimicrobial agents. However, there are still many
unexplored aspects of livestock immunity, one of which is the function and maturation
mechanisms of Peyerʼs patches, which play an important intestinal immunity. Peyerʼs patches
are the secondary lymphoid tissues in which immune cells, such as B and T cells, accumulate.
Although two differently shaped Peyerʼs patches exist in the jejunum and ileum of domestic
animals, the function of the ileal Peyerʼs patches is still unclear. In this study, to investigate
how the cells constituting the Peyerʼs patches change with age, we performed histologicalanalysis to investigate the localization of immune cells and milk antibodies to determine
characteristics at each week of age. We found that the localization of immune cells and milk
antibodies changed during the early, middle, and late stages of suckling, and that weaning also
had a significant effect on immune cells. To characterize immune cells and cells constituting
the ileal Peyerʼs patches, cells were isolated from the ileal Peyerʼs patches at each week of age
and generated a cDNA library for each single cell. This study successfully established atechnique to analyze at the single-cell level how the cells constituting the ileal Peyerʼs patcheschange with the growth of piglet．

１．目ながら，家畜の免疫に関しては未解明な点が多く的残されており，その一つとして，腸管免疫の中枢

家畜生産において健康管理は非常に重要であであるパイエル板の機能および成熟機序があげらり，また，薬剤耐性菌の問題により抗菌剤の使用れる。パイエル板はＢ細胞やＴ細胞などの免疫細量の低減が求められていることから，抗菌剤に依胞が集積した免疫臓器であり，家畜の腸管には空存しない家畜の健全育成を目的とした飼養管理技

腸と回腸に形状が異なる２つのパイエル板が存在

術の向上が畜産現場において必須である。しかしするが，特に回腸パイエル板の機能については不© The Ito Foundation

ライフサイクルに応じたパイエル板の機能解明と制御因子の探索

305

明確である。申請者はこれまでに胎生期から出荷

エル板から細胞を単離した。さらに，40μｍのセ

月齢のブタを経時的に解析することにより，ライ

ルストレイナー（FALCON）によってゴミを除フサイクルによってパイエル板の形態学的特徴が去した。

大きく変化することを見出してきた。そこで本研

回腸パイエル板から単離した細胞をVia-Probe

究では，週齢に伴ってパイエル板を構成する細胞（BD Biosciences）で染色することで，死細胞ががどのように変化するかを調べるために，各時期５％以下であることを確認した。その後，細胞数のパイエル板の組織学的解析，および細胞単離かを測定し，10000cell/μlになるように調整し，らシングルセル解析までに必要な条件を検討した。

Chromium Controller（10x Genomics社）に供す

２．方
2.1

ることで，調整した細胞懸濁液が単一細胞に分か法

れた状態で，一つ一つの細胞を識別するゲルビー

組織染色

ズとPCR酵素が入ったエマルジョンを調整した。

１週齢，２週齢，３週齢，および５週齢のブタ

その後，調整したエマルジョンをインキュベー

からそれぞれ採材した回腸パイエル板を４％パラ

ションし，反応後，精製した。さらに，cDNAを

フォルムアルデヒドで一晩，固定した。固定した増幅し，得られたcDNAのサイズおよび濃度をバ

組織はエタノールで脱水し，トルエンに浸漬する

イオアナライザで確認した。加えて，得られたことで透徹を行った後，パラフィンで浸漬し，包cDNAを最適なサイズに断片化し，A-tailingや各埋した。また，パラフィンブロックをミクロトー

サンプルを識別するIndex配列を付加させ，反応ムで５μｍに薄切し，組織切片を作製した。作製

後のcDNA libraryのサイズおよび濃度をバイオした組織切片は脱パラフィンをし，免疫組織化学

アナライザで測定した。

染色に供した。一次抗体として，抗CD20抗体，
抗IgM抗体，抗IgA抗体，抗Ki67抗体，抗MHC
class Ⅱ抗体，抗S100A9抗体を用いた。染色した組織切片を蛍光顕微鏡BZ-9000（Keyence），BZ-

なお，本実験は東北大学実験委員会の実験承認を得て行った。
３．結果と考察X800（Keyence）およびデジタルカメラ付きの光

3.1

学顕微鏡BX-63-DP72システム（Olympus）を用

まず，パイエル板に最も多く存在するＢ細胞にいて撮影した。
2.2

各免疫細胞および抗体の局在

ついて，CD20（B細胞マーカー）とIgM（B細胞

細胞単離とシングルセル解析受容体）の局在を免疫組織化学染色で確認した。

１週齢，２週齢，３週齢，および５週齢のブタ

その結果，Ｂ細胞が集積している濾胞のサイズからそれぞれ回腸パイエル板を採材し，細胞単離は，週齢に伴って拡大していた。また，IgMにつを行った。具体的な手順として，採材した組織は，

いては，すべての週齢において濾胞の中心部では１cm程度に切断し１mMのEDTAで攪拌しなが発現が強く，一方で辺縁部では発現が弱いといっら25分間，37℃で処理した。その後，１-２mm

たように，濾胞内でのIgM発現の強弱による局在

程 度 ま で 細 か く 切 り ，0.5mg/ml コ ラ ゲ ナ ー ゼが生じていた。

（sigma），5 U/mlのDNase（sigma）および50μ

哺乳期間には，乳汁内に含まれる抗体が腸管管Ｍのβメルカプトエタノール（ナカライ）で攪拌腔内に流入する。次に，それらの抗体が腸管組織しながら80分間，37℃で処理することで回腸パイ内に取り込まれているのかを明らかにするため© The Ito Foundation

306

令和４年度
(a)

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）(b)

1 week(c)

2 weeks(d)

1 weekIleal Peyer’s patches

2 weeks
Villi

Fig. 1 The spots of IgA uptake changed with age in weeks．

IgA was taken up from FAEs, the epithelial cells of the ileal

Peyerʼs patches at 1 week（a）, but not at 2 weeks（b）. On theother hand, epithelial cells in the villi didnʼt take in IgA at 1
week（c）,but did at 2 weeks（d）．

に，IgAの局在を調べた。その結果，乳汁IgAはから，濾胞辺縁部の増殖細胞に刺激を与える細胞

１週齢では回腸パイエル板の濾胞随伴上皮細胞

または，増殖しているＢ細胞自体が，哺乳期間中（FAE）から，２週齢では絨毛の上皮細胞から組に変化していることが考えられた。

織内に取り込まれている様子が確認された（Fig.

S100A9は好中球や単球などの自然免疫細胞が１）。一方，離乳前（３週齢）ではほとんど乳汁

発現しており，TLR4を介した内在的な自然免疫

IgAは取り込まれておらず，子の腸管免疫発達に応答を引き起こすことが知られている２）。そこで，

伴い乳汁IgAの取り込みは変化しているといえ

次に，哺乳期間から離乳後にかけて自然免疫細胞た。このことから，乳汁IgAは週齢によって異なの局在変化を調べた。その結果，S100A9陽性細る部位に働きかけることにより，免疫を発達させ胞は哺乳期間中である１～３週齢においては，濾ていることが考えられ，常乳に含まれる乳汁IgA

胞間やSED領域およびその上皮に多数存在が確には，通説である病原体の直接的な排除に加え認された。一方で，離乳後である５週齢では，て，子の免疫発達機序を制御していることが類推

S100A9陽性細胞が激減しており，これらの細胞された。

が乳汁中の因子によって制御されていることが示

１）

さらに，回腸パイエル板における細胞増殖につ唆された。

いて，Ki67をマーカーとして確認したところ，す3.2

べての週齢でKi67陽性の増殖細胞の集積が濾胞

子ブタの下痢症は離乳開始２週間以内に多発す領域でみられ，特に濾胞辺縁部でそれらの発現がるとされていることや，離乳の遅延により増体が強かった。また１週齢から５週齢のすべてにおい向上する３）ことを鑑みると，腸管免疫発達にはあて，MHC class Ⅱを強発現する細胞は，抗原提る程度の時間が必要であるといえる。また，3.1

示細胞が多く存在するとされるSED領域においより哺乳期間の前期・中期・後期および離乳後て高頻度で確認されたが，濾胞内の細胞もMHCで，回腸パイエル板を構成している免疫細胞が大class Ⅱを発現していた。しかしながら，濾胞内きく変化していることが明らかとなった。これらのMHC class Ⅱの発現の局在は週齢が進むにつの時期において，免疫細胞を含むパイエル板を構れて変化しており，３週齢以降の濾胞辺縁部では成する細胞の変化を精査することが，腸管免疫のほとんど存在が確認されなかった。これらのこと

立ち上げにおいて非常に重要であると考えられた© The Ito Foundation

シングルセル解析ライフサイクルに応じたパイエル板の機能解明と制御因子の探索

307ため，哺乳期から離乳後にかけての，パイエル板

そこで本研究では，ブタの腸管に存在する中でにおける単一細胞レベルでの変化を調べることを最大とされる免疫臓器である回腸パイエル板の発試みた。

達における変化を明確にすることを目的とした。

１週齢，２週齢，３週齢，５週齢のそれぞれのまず免疫組織学染色により，免疫細胞および乳汁

回腸パイエル板を採材し，2.2の手順で単一細胞抗体の局在を解析することで，各週齢における特ご と の cDNA を 作 製 し ，バ イ オ ア ナ ラ イ ザ で徴を捉えた。その結果，哺乳期間であっても前期，

DNAのクオリティチェックを行った。cDNA作

中期，後期では免疫細胞および乳汁抗体の局在は製後のDNA濃度は１週齢，２週齢，３週齢，５変化し，さらに離乳も免疫細胞に大きく影響する

週 齢 で そ れ ぞ れ ，79.00ng/μl ，40.26ng/μl ，ことを明らかにした。また，免疫細胞および回腸30.89ng/μl，10.40ng/μlであり，cDNA Library

パイエル板を構成する細胞のキャラクタライゼー

作 製 後 の 濃 度 は 25.05ng/μl ， 29.57ng/μl ，ションを行うために，各週齢の回腸パイエル板か30.31ng/μl，42.36ng/μlであった，また，得られら細胞を単離し，単一細胞ごとのcDNA library

たcDNAのサイズも問題なく，質・濃度ともに，を作製した。本研究により，回腸パイエル板を構

シングルセル解析に十分なDNAライブラリーを成する細胞が子の成長とともにどのように変化し得ることができた。

ていくのかをシングルセルレベルで解析するため

４．要の手技の確立に成功した。

約

家畜生産において健康管理は非常に重要である。また，薬剤耐性菌の問題からも，飼養管理技術の向上が求められている。しかしながら，家畜の免疫については明らかになっていない点が多く存在し，その１つにパイエル板の機能成熟機序が
ある。

文
献
１）
 Demers, V., Mathijssen, G., Dapra, C., Do, D.,
Medo, E.：Pediatr Res，．89（4），795～802，2021．
２） Austermann, J., Spiekermann, C., Roth, J.：Nat
Rev Rheumatol，14（9），528～541，2018．
３）
 Ming, D., Wang, W., Huang, C., Wang, Z., Shi, C.,
Ding, J., Liu, H., Wang, F.：Animals（Basel）
，11
（8）
，
2169，2021．

© The Ito Foundation

308

サルモネラ鶏卵汚染・介卵感染に寄与する鶏卵巣での菌・宿主細胞間相互作用の解明（Ⅱ）
Elucidation of the interaction between Salmonella and host cells in avian
ovary that underlies egg contamination and transovarian infection（Ⅱ）

岡

村

雅

史

（帯広畜産大学獣医学研究部門）

Masashi Okamura（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Pullorum（SP）, the causative agent ofpullorum disease in chicks, a legally contagious disease in Japan, is transmitted vertically fromasymptomatic, infected hens through ovarian infection, followed by the death of the progeny,
and then horizontal dissemination in the flock. Resultant high mortality rate finally leads tosignificant economic damage worldwide. We have focused on the granulosa membrane cells
surrounding the oocyte as a route of SP transfer to the reproductive organs and identified
OmpA as a protein on the SP outer membrane that binds to the membrane protein. In thisstudy, we generated an ompA-deficient strain（Δ ompA）and examined the involvement of
OmpA in the pathogenesis of SP systemic infection. It was found that Δ ompA has reduced
adhesion and invasiveness to LMH/2A, a cultured chicken hepatocyte-derived cell line, in vitro.
When day-old chicks were then infected with wild type（WT）and Δ ompA, the number ofbacteria in the organs decreased in the Δ ompA-infected group compared to the WT-infectedgroup at 3 days post infection. This indicates that ompA is also involved in systemic infection.
On the other hand, egg-laying hens were vaccinated with recombinant（r）OmpA andsubsequently infected with WT and monitored for egg-laying rate and egg contamination,
which was almost the same as in the non-vaccinated group. This suggests that rOmpA may
be a major contributor to systemic infection rather than vertical transmission．

１．目は重症化しやすいということが分かる。サルモネラ

的食中毒の原因食品としては依然としてSalmonella

サルモネラ食中毒の発生は，1999年の年間825

enterica血清型Enteritidis汚染鶏卵が多く，喫食件をピークとしてその後，2019年の同21件まで減時の加熱調理の徹底のみならず，採卵養鶏場にお少傾向にある。しかし，サルモネラ食中毒では死いても鶏卵汚染を防止するためのワクチン接種や亡事例が発生しており，逆に現在発生件数が増加

衛生管理の徹底をはじめとした対策が継続的に行傾向にあるカンピロバクター食中毒では死亡事例われている。我々はこれまで，2,500種類以上あがゼロである点を考慮すると，サルモネラ食中毒

るサルモネラ血清型の中でもEnteritidisが鶏の卵© The Ito Foundation

サルモネラ鶏卵汚染・介卵感染に寄与する鶏卵巣での菌・宿主細胞間相互作用の解明（Ⅱ）

309

巣・卵管に強い親和性を有することを証明し１，２），を行い，cGC膜タンパク質ビーズと相互作用した菌側

それが鶏卵汚染につながるメカニズムに寄与しての因子としてOuter membrane protein A（OmpA）

いると考えている。また，血清型Gallinarumを構を検出・同定した（未発表）。OmpAは，グラム成する生物型GallinarumとPullorumは鳥類だけ

陰性菌の間で高度に保存された菌体構造の安定維を自然宿主とし，感染するとひな白痢や家禽チフ持に関わる重要な外膜タンパク質である９～11）だけ

スと呼ばれる致死性の高い急性敗血症性疾患を引でなく，Cronobacter sakazakii，Acinetobacter

き起こす。これらはいずれもわが国では家畜伝染

baumanniiおよび腸管出血性大腸菌（EHEC）で病予防法で法定伝染病に指定される重大な感染症

は細胞への接着・侵入に関与することが報告されである。特に生物型Pullorum（以下SP）は母鶏てきた12～14）。我々は，前年度の貴財団研究助成にに全身感染後，卵巣や卵管組織に侵入し，その後より，サルモネラのOmpAが鶏顆粒膜細胞への接産出される有精卵に移行することでその中で成熟着・侵入や介卵感染に関与していることを国内外するひなにも感染（介卵感染）するため，世界中で初めて明らかにした。また，OmpAと相互作用で経済被害をもたらしている。SPによる鶏卵汚するcGC膜側のレセプターとして，複数の候補タ

染の頻度はEnteritidisよりも非常に高いため，ンパク質を見出し，このうち一つあるいは複数の

我々は，SPを用いて，前述のEnteritidisに対する因子が協働してOmpAとの相互作用に関与して市販ワクチンの鶏卵汚染防止効果を評価することいる可能性を示し，これらがサルモネラの鶏卵汚に成功したと同時に，SPの介卵感染がEnteritidis

染あるいは鶏胚への介卵感染のメカニズムに関の鶏卵汚染と共通のメカニズムによって起こる可わっているものと結論づけた（未発表）。

能性を示すことができた３）。

そこで本研究では，この介卵感染に先立って起一方で，SPの介卵感染のメカニズムについて
は，性成熟に伴う一過性の免疫能の低下が介卵感
染に関与するという報告 がなされているのみでこるSPの全身感染がいかに起こるかを明らかにすることを目的とした。

４）あり，SPが卵巣に到達した後，卵母細胞に大量

２．方法に含まれる卵黄へ移行するメカニズムについても

2.1

いまだ明らかにされていない。鶏の卵胞は，外側SP野生型（WT，2001年に千葉県で発生したひから順に，卵胞膜，基底膜，顆粒膜，透明帯の４な 白 痢 事 例 由 来 分 離 株）を 親 株 と し ，λ -red

層で包まれており，透明帯の内側に卵母細胞が存

homologous recombination法９）によりΔompA，

在する５，６）。卵巣顆粒膜細胞（chicken Granulosa

ΔspiBおよびΔinvAを作製した。spiBとinvAはCells：以下cGC）は卵母細胞に最も近い細胞であそれぞれSalmonella Pathogenicity Island（SPI）

り，SPの卵黄への移行においてなんらかの形で-２および-１に含まれ，サルモネラの細胞内増殖

通 過 す る 必 要 が あ る 。我 々 は こ れ ま で ，および細胞侵入に寄与することが知られている。

Enteritidis

2.2 in vitro培養細胞株におけるΔompAの細胞７，８）と同様にSPもcGCに接着・侵入す遺伝子欠損変異株の作製ることを見出した（未発表）。さらに，その接着・接着・侵入性評価

侵入経路解明の足掛かりとして，cGC膜タンパク

鶏肝細胞由来培養細胞株であるLMH/2A細胞質を表面にカップリングした磁気ビーズにSPのを モ デ ル と し て 使 用 し た 。細 胞 数 を 調 整 し て

外膜タンパク質を反応させるプルダウンアッセイ

Waymouth MB752/1培地で37℃，５％© The Ito Foundation

CO ２ で

310

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

24時間培養した。並行して，血清型Pullorumの抗原量375μg／羽）して免疫した。

WTおよびΔompAを培養しておき，培養細胞に2.5１細胞あたり50-100個の菌が感染するように接種

ワクチン接種鶏７羽および非接種鶏７羽から経した。３時間後に培養液を除去し，ゲンタマイシ

時的に血清を採取し，ELISAにより抗体レベルンを添加して細胞外の菌を殺菌した。さらにハンを測定した。なお，予備実験において非ワクチン

クスバッファーで洗浄後，TritonX-100処理によ接種かつ非サルモネラ感染鶏から採取した血清をり得られた細胞溶解液をDHL平板培地に塗抹しネガティブコントロール，サルモネラ感染鶏からて細胞内菌数を測定し，菌株間で比較した。

採取した血清をポジティブコントロールとして用2 . 3 初生ひなにおけるin vivoでのΔompAの病原性評価

rOmpAワクチンの有効性評価

いた。抗体レベルの上昇を確認後，SPを経口接種した（10９CFU／羽）。接種後18日間にわたり採卵鶏（ボリスブラウン）初生ひな各10羽に卵を回収し，産卵率を算出した。また，回収したWT，ΔompA，ΔspiBおよびΔinvAを経口接種

卵を無菌下で割り，卵殻，卵黄および卵白を分け（10 CFU／羽）し，３および７日後に各５羽をてプラスチックバッグへ入れた。卵殻および卵白

安楽殺後，盲腸扁桃，盲腸内容，肝臓および脾臓

にHI Brothを５ml添加し，ホモジナイズした後を採取した。PBSでこれら組織の懸濁液とその10

37℃で48hrs培養した。各サンプルの１白金耳量倍階段希釈液を作製してDHL寒天平板培地に100をDHL寒天培地に画線塗抹し37℃で培養した。

μl塗抹し，単位量あたりの生菌数を測定し，群コロニーが見られたサンプルをサルモネラ陽性と間で比較した。

して記録し，陰性サンプルについては，各0.5ml

９

なお，本実験は帯広畜産大学動物実験委員会にの 卵 培 養 液 に 4.5ml の HI Broth を 添 加 後 さ ら に
37℃で24hrs培養した。培養後再びDHL寒天培地

よる審査と承認を受けて実施された。
2 . 4 組換えOmpA（rOmpA）ワクチンの作に画線塗抹しコロニーの有無を確認した。これらの結果をプールして最終的な汚染率を算出し，産製と接種タンパク質発現用プラスミドpET29bにompAを組み込んだpET29b-ompAHisでタンパク質発
現用大腸菌BL21（DE３）を形質転換し，IPTG
存在下で培養してタンパク質を発現させた。当該
菌液を氷上で30秒，３回超音波破砕後，11,100×ｇ
で20分間遠心し，ペレット再浮遊液をHisPurTM
Ni-NTA Resin（Thermo Fisher Scientific，Waltham, MA，USA，88221）に通して溶出して卵率とともにワクチン接種鶏および非接種鶏の間で比較した。
なお，本実験は帯広畜産大学動物実験委員会による審査と承認を受けて実施された。
３．結果と考察3 . 1 in vitro培養細胞株におけるΔompAの細胞接着・侵入性評価

rOmpAを得た。これを約５-10mg/10 mlに調整

ΔompA感染LMH/2Aにおける細胞内生菌数は，し，等量の完全フロイントアジュバント（CFA，3.7±0.67 log10 CFU/mlであり，WT感染LMH/2A

Sigma-Aldrich，F5881-10ML）を５mlガラスシにおける4.42±0.53 log10 CFU/mlよりも有意に低リンジと連結針を用いてよく混和して乳化した。

かった（p＜0.01）（Fig. １）。

これをrOmpAワクチンとして，鶏（ボリスブラウン）７羽の胸筋へ筋肉内注射（各１ml，最終© The Ito Foundation

サルモネラ鶏卵汚染・介卵感染に寄与する鶏卵巣での菌・宿主細胞間相互作用の解明（Ⅱ）

3 . 2 初生ひなにおけるin vivoでのΔompAの
病原性評価

311

び脾臓いずれにおいてもWT接種群と比較して検出菌数が低く，ΔinvA接種群では盲腸扁桃，肝感染３日後（Fig. 2a-d）では，盲腸内容物における菌数は各群で違いはなかったが，ΔompA接種群およびΔspiB接種群では盲腸扁桃，肝臓およ

臓でWT接種群と比較して低い菌数であった（p＜0.01～0.05）。
感染７日後（Fig. 2e-h）には，盲腸内容物でΔ
ompA接種群およびΔspiB接種群でWT接種群と比較して検出菌数が低くなった（p＜0.01～0.05）
が，盲腸扁桃，肝臓および脾臓いずれにおいても4

ΔompA接種群ではWT接種群との間で検出菌数3に違いは見られなくなった。
3.3

2

ルで0.265±0.003，ポジティブコントロールで

ΔompA

Δ ompA. Data represent the mean numbers of
intracellular bacteria and standard errors of means（n＝6；＊＊p＜0.01）．

ン接種３日後の抗体レベルは，ワクチン非接種群
で0.217±0.086，ワクチン接種群で0.282±0.209で

b8

log10 CFU/g

6
4
2
0

WT

ΔompA ΔspiB ΔinvA

d

c
6
5
4
3
2
1
0

＊＊
＊＊
＊＊
WT

ΔompA ΔspiB ΔinvA

e
＊＊

＊＊
WT

ΔompA ΔspiB ΔinvA

＊＊

6

＊＊

4
＊＊

2
0

WT

ΔompA ΔspiB ΔinvA

glog10 CFU/g

6
5
4
3
2
1
0

＊＊

＊＊

＊＊
WT

ΔompA ΔspiB ΔinvA

f8

log10 CFU/g

6
5
4
3
2
1
0

log10 CFU/g

log10 CFU/ga1.069±0.016（p＜0.05）であった。rOmpAワクチ

log10 CFU/g

WT

Fig. 1 in vitro invasion of LMH/2A cell line by WT and

log10 CFU/grOmpAワクチンの有効性評価

測定した抗体レベルは，ネガティブコントロー

1

6
5
4
3
2
1
0

＊＊
＊＊
WT

ΔompA ΔspiB ΔinvA

h
6
5
4
3
2
1
0

＊

＊＊
WT

ΔompA ΔspiB ΔinvA

log10 CFU/g

log10 CFU/well

5

6
5
4
3
2
1
0

＊

＊

＊＊
WT

ΔompA ΔspiB ΔinvA

Fig. 2 Viable counts recovered from cecal contents（a, e）, cecal tonsils（b, f）, liver（c, g）, and spleen（d, h）of chicks

infected with wild type or mutant strains at 3（a-d）and 7 days（e-h）post infection. n=5. Infected dose = 10 8
CFU/bird. ＊p<0.05, ＊＊p<0.0l vs WT.

© The Ito Foundation

312

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

1.4

＊＊

1.2

A450

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

NC

PC

Unvac

Vac

Unvac

3 dpv

Vac

14 dpvFig. 3 Titer of anti-OmpA antibody in antisera from chickens vaccinated andunvaccinaated chickens. NC（negative controls, n＝2）and PC（positive
controls, n＝2）were obtained from uninfected chickens and chickens thatsurvived after SP infection, respectively, in a preliminary experiment.
Serum samples were obtained from chickens at 3 and 14 days post
vaccination（dpv）（n＝7 each，＊＊p＜0.01）．

Table 1 Egg production and egg infection after immunization with rOmpA and challenge with SP WTGroupsEgg infection rates（％）

Mean egg-laying rates（％）
Pre-infection[No. contaminated samples/total no. samples]

Post-infection

YolkAlbumen

Shell

Whole

0.86
[1/116] a

0.86[1/116] a

8.62[10/116]0[0/90]

1.1[1/90]

6.67[6/90]

Unvac

98.6±3.892.1±7.8

7.76[9/116]Vac

97.1±4.971.4±21.1＊

5.56[5/90]a One egg was infected in both albumen and shell.
＊p＜0.05 compared to pre-infection.

あり，統計学的に顕著な違いはなかった（p＞

有意に産卵率が低下（p＝0.011）した。また，卵0.05）。一方，ワクチン接種14日後の抗体レベルは，の汚染率は，ワクチン非接種群で8.62％であった

ワクチン非接種群で0.206±0.079，ワクチン接種のに対し，ワクチン接種群で6.67％（p＝0.399）

群で1.106±0.05であり，ワクチン接種群においてであった。また，卵の部位別の汚染率は，ワクチ

抗体レベルの有意な（p＜0.01）上昇を確認した

ン非接種群の卵白で0.86％，卵黄で7.76％，卵殻（Fig. ３）。

で 0.86 ％，ワ ク チ ン 群 の 卵 白 で ０ ％，卵 黄 で感染後の産卵率と卵の汚染率の推移をTable１

5.56％，卵殻で1.11％であった。卵の部位別汚染にまとめた。感染後18日間における産卵率はワク率においては卵殻，卵白の０％～1.11％という汚チン非接種群で92.1±7.8％，ワクチン接種群で染率に対し，卵黄の汚染率は3.64％～7.76％と高71.4±21.1％で，ワクチン接種群では産卵率低下

かった。

の抑制は見られず，ワクチン非接種群と比較して© The Ito Foundation

サルモネラ鶏卵汚染・介卵感染に寄与する鶏卵巣での菌・宿主細胞間相互作用の解明（Ⅱ）

3.4

本研究の意義と今後の展望

313

タンパク質と結合するSP側のタンパク質として，以上のことから，ΔompAはWTと比較して介OmpAを同定した。そこで本研究では，ompA欠

卵感染に直接関与しない細胞においても細胞接損株（ΔompA）を作製し，SP全身感染における着・侵入能が低下した。初生ひなを用いた感染実

OmpAの病原性への関与を検証した。ΔompAは

験では，感染３日後に盲腸扁桃，肝臓および脾臓

in vitroにおいて，鶏肝細胞由来培養細胞株であにおいてΔompAの菌数がWTのそれと比較してるLMH/2Aへの接着侵入性が低下することが明低かったことから，ompAは成鶏における卵巣へらかになった。そこで，実際に初生ひなにWTとの組織トロピズムのみならず，ひなにおける全身ΔompAで感染させると，感染３日後にはWT感

感染にも寄与していると考えられる。一方で，採染群と比較してΔompA感染群において臓器内菌

卵鶏へrOmpAをワクチンとして接種したところ，数が低下した。このことから，ompAは全身感染ワクチン接種によって産卵率の低下が見られた。

にも関与していることが明らかになった。一方

また，その後WTで攻撃して卵の汚染率を比較しで，採卵鶏にrOmpAをワクチンとして接種し，たが，大きな違いはなかった。このことから，

その後WTで感染させ，産卵率や卵の汚染をモニ

rOmpAは介卵感染防止を目的としたワクチンとタリングしたが，ワクチン非接種群とほとんど変しての利用には適さないのかもしれない。しかしわらなかった。このことから，ompAは介卵感染ながら，介卵感染に先立って全身感染が起こるこ

よりもむしろ全身感染に大きく寄与している可能とを考慮すると，今後は全身感染防止に向けたワ性がある。

クチンとして評価することが必要と考えられる。
OmpAは菌体構造の維持９～11）のみならず，病原性にも関与している 15）。なかでも宿主細胞への接
着・侵入に関する報告12～14）が多く，これは本研究でも証明することができた。ひな白痢は経口感染
後，腸管上皮から組織内への侵入が全身感染への最初のステップとなることから，これを防御後きるクチンの価値は非常に高く，今後の進展が期待
される。
４．要

約

法定伝染病であるひな白痢の原因菌Salmonella
enterica血清型Gallinarum生物型Pullorum（SP）
は，感染後耐過した無症状保菌鶏から介卵感染により垂直伝播することで後代鶏を死に至らしめ，さらには水平感染により同居ひなへ伝播し高確率で死亡させるため，世界的に経済被害が大きい。
我々はこれまでSPの生殖器への移行経路として卵母細胞を取り囲む顆粒膜細胞に着目し，その膜

文献１） Okamura, M., Kamijima, Y., Miyamoto, T., Tani,
H., Sasai, K., Baba, E.：Differences among six
Salmonella serovars in abilities to colonize
reproductive organs and to contaminate eggs inlaying hens, Avian Dis，45，61～69，2001．
２）
 Okamura, M., Miyamoto, T., Kamijima, Y., Tani,
H., Sasai, K., Baba, E.：Differences in abilities tocolonize reproductive organs and to contaminate
eggs in intravaginally inoculated hens and in vitro
adherences to vaginal explants between Salmonella
enteritidis and other Salmonella serovars, Avian
Dis，45，962～971，2001．
３）
 Okamura, M., Tachizaki, H., Kubo, T., Kikuchi, S.,
Suzuki, A., Takehara, K., Nakamura, M.：
Comparative evaluation of a bivalent killed
Salmonella vaccine to prevent egg contamination
with Salmonella enterica serovars Enteritidis,
Typhimurium, and Gallinarum biovar Pullorum,
using 4 different challenge models, Vaccine，25，4837～4844，2007．
 Wigley, P., Hulme, S. D., Powers, C., Beal, R. K.,
４）Berchieri, A. Jr., Smith, A., Barrow, P.：Infection of
the reproductive tract and eggs with Salmonella
enterica serovar pullorum in the chicken isassociated with suppression of cellular immunity at
sexual maturity, Infect. Immun，73，2986～2990，© The Ito Foundation

314

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

2005．
５） Reaven, E., Lua, Y., Nomoto, A., Temel, R.,
Williams, D. L., Van der Westhuyzen, D. R., Azhar,
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lipoprotein receptor（SR-BI）in ovarian granulosa
cells of the mouse, Biochim. Biophys. Acta．，
1436，
565～576，1999．
６） S c h n e i d e r , W . J . ：R e c e p t o r - m e d i a t e d
m ec ha ni sm s i n ov arian follicle an d oocy tedevelopment, Gen. Comp. Endocrinol．，
163，18～23，2009．
７） Thiagarajan, D., Saeed, M., Asem, E. K.：
Mechanism of transovarian transmission of
Salmonella enteritidis in laying hens, Poult. Sci．，
73，89～98，1994．
８） Thiagarajan, D., Saeed, M., Turek, J., Asem, E.
K.：In vitro Attachment and invasion of chicken
ovarian granulosa cells by Salmonella enteritidis
phage type 8, Infect. Immun．，64，5015～5021，
1996．
９） Krishnan, S., Prasadarao, N. V.：Outer membraneprotein A and OprF: versatile roles in Gramnegative bacterial infections, FEBS J．，279，919～
931，2012．
10） De Mot, R., Vanderleyden, J.：The C-terminal
sequence conservation between OmpA-related
outer membrane proteins and MotB suggests a
common function in both gram-positive and gramnegative bacteria, possibly in the interaction ofthese domains with peptidoglycan, Mol.
Microbiol．，12，333～334，1994．
11） Koebnik, R., Krämer, L.：Membrane assembly of
circularly permuted variants of the E. coli outermembrane protein OmpA, J. Mol. Biol．，
250，617～626，1995．
12） Naylor, K. L., Widziolek, M., Hunt, S., Conolly, M.,
Hicks, M., Stafford, P., Potempa, J., Craig, Murdoch.,lan Douglas, C. W., Stafford, G. P.： Role of OmpA2
surface regions of Porphyromonas gingivalis in
host-pathogen interactions with oral epithelial cells,
Microbiology Open., ６，１～11，2017．
13） Mortensen, B. L., Skaar, E. P.：The contributionof nutrient metal acquisition and metabolism toAcinetobacter baumannii survival within the host,Front. Cell Infect. Microbiol., ３，１～10，2013．
14） Prasadarao, N. V., Wass, C. A., Weiser, J. N., Stins,
M. F., Huang, S. H., Kim and K. S.：Outer
membrane protein A of Escherichia coli
contributes to invasion of brain microvascularendothelial cells, Infect. Immun., 64 ， 146～153 ，
1996．
15） Nair, M. K., Venkitanarayanan, K.：Role ofbacterial OmpA and host cytoskeleton in theinvasion of human intestinal epithelial cells byEnterobacter sakazakii, Pediatr. Res., 62，664～
669，2007．

© The Ito Foundation

315

地方病性牛伝染リンパ腫発症牛におけるゲノムワイドなDNAメチル化解析
Genome wide analysis of DNA methylation states in cattle with enzootic
bovine luekosis

前

澤

誠

希

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Masaki Maezawa（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

Enzootic bovine leukosis（EBL）is B-cell lymphoma caused by bovine leukemia virus.
DNA methylation status can influence gene expression, and hypermethylation in bonemorphogenetic protein（BMP）6 promoter region is a factor relating to the progression of EBLfrom an asymptomatic state have been reported. However, genome wide methylation status in
EBL cattle is not clear. We investigated the genome wide methylation status of the BMP-6
promoter region in 4 EBL cattle and compared to those of 4 healthy cattle. Methylation levelsof cellular developmental process genes and response to BMP in EBL cattle were significantly
higher than those in healthy cattle. These results suggested that suppression of these genes
expression by DNA methylation might contribute to represent a factor contributing to EBL
onset．

１．目

たな感染を防ぐことが難しい場合も少なくない。

的

そのため，BLV感染牛におけるEBL発症予防法

牛伝染性リンパ腫（enzootic bovine leukosis：が求められている。

EBL）は 牛 伝 染 性 リ ン パ 腫 ウ イ ル ス（bovine

エピジェネティクスとはDNA塩基配列の変化

leukemia virus：BLV）感染に起因するＢ細胞性を伴わず，細胞分裂後も娘細胞に引き継がれる遺リンパ腫である 。EBLの発生件数は増加してお伝子発現制御機構の総称である。DNAメチル化

り，リンパ球は全身を循環していることから，

はエピジェネティクスの１つであり，DNAの５’EBL発症牛由来の生産物はすべて廃棄となるた側からシトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ）の順に並

め，経済的損失は深刻なものとなっている。EBL

んだ２塩基配列（CpG）におけるシトシンの５位に対する治療法やワクチンは実用化されておら炭素原子にメチル基が付加される反応である。プ

ず，BLV感染牛と非感染牛の分離飼育といった，

ロモーター領域に位置し，CpGが高頻度で存在す

BLV感染を防ぐことが主なEBL発症予防法であるCpG islandsにおいてDNAメチル化が亢進したる。しかしながら，分離飼育する敷地不足や牛群場合，多くの転写因子が結合することができなくのBLV陽性率が非常に高いなどの理由により新なるため，遺伝子発現は抑制される２）。DNAメ

１）© The Ito Foundation

316

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

チル化状態は年齢や栄養状態などの後天的な要因

Enzymatic Sequencing：RREM法を実施した。

により変化することが報告されており ，ヒト，

すなわち，DNA 200 ngを制限酵素Msp I（Newイヌ，ネコにおいて高メチル化によるがん抑制遺England Biolabs）により断片化し，ギャップの伝子またはアポトーシス関連遺伝子の発現抑制が修復およびアダプターを付加した。次に，50～リンパ腫発症に関与していることが報告されてい1,000bpのDNA断片を回収し，変換酵素（TET2る。これまでの研究において，EBL発症牛でおよびAPOBEC）を用い非メチル化シトシンをはその他の牛に比べ骨形成タンパク質６（bone

ウラシルに変換した。DNA断片にインデックス

morphogenetic protein 6 ： BMP6）遺 伝 子 プ ロ

を付加し，Miseq（Illumina）にて次世代シーク

モーター領域のDNAメチル化が亢進しているこ

エンスを行った。得られたシークエンスデータはとを明らかにした。しかしながら，EBL発症牛にBismarkによりウシゲノムをリファレンスにマッおいてもBMP6遺伝子プロモーター領域のDNA

ピングを行い，各CpGのメチル化率を算出し，メチル化が亢進していない症例も多く，EBL発症

EBL発症牛および健常牛で比較した。メチル化率

牛におけるDNAメチル化状態の全体像は不明のに有意差（p値＜0.05）が認められ，遺伝子をコーままである。そこで本研究では，EBL発症牛におドしている領域から１kb以内に位置していた

けるDNAメチル化状態を明らかにすることを目

CpGを抽出した。加えて，抽出したCpGの近傍に的に，EBL発症牛のDNAメチル化状態をゲノムコードされている遺伝子について遺伝子オントロ

ワイドに解析し，健常牛と比較した。

ジー解析（GO解析）を実施した。

３）

４～６）

２．方

本研究は東京大学大学院農学生命科学研究科が

法

定める動物実験に関するガイドラインに従い実施

EBL発症牛４頭を供した。EBL発症牛はいずれ
もホルスタイン種乳用牛の雌であり，31，47，55
および89ヵ月齢であった。病理解剖にてリンパ節された。
３．結果と考察の腫大が認められ，病理組織学的検索によりＢ細EBL発症牛および健常牛におけるDNAメチル

胞性リンパ腫であると診断された。加えて，BLV

化率の中央値はそれぞれ51.05％および63.95％でプロウイルス量は1,000copies/10ng DNA以上であり，EBL発症牛ではゲノム全体のDNAメチルあった。対照として，食肉検査にて異常が認めら化率は有意に低下していた（Fig. １）。ゲノム全れなかった健常牛４頭を用いた。健常牛は38，

体のDNAメチル化が低下するとゲノムの不安定

56，67および80ヵ月齢であり，BLVプロウイル性が誘発され，発がんを引き起こすことが報告さ

ス 量 は 24～86copies/10ng DNA で あ っ た 。EBL

れている７）。EBLにおいてもゲノムワイドなDNA発症牛では腫瘍化リンパ節，健常牛では腸管膜リメチル化の低下は発症要因となっている可能性がンパ節からQIAampⓇDNAミニキット（Qiagen）

考えられた。

を用いてDNAを抽出し，分析まで－30℃で保管

EBL発症牛および健常牛における各CpGのメチル化率を比較したところ，EBLにおいて健常牛よした。
ゲ ノ ム ワ イ ド な DNA メ チ ル 化 解 析 に は ，りメチル化率が低値であったCpGは9,211個特定NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit（Newされた。しかしながら，遺伝子をコードしている

England Biolabs）を用いたReduced Representation

領 域 か ら １ kb 以 内 に 位 置 し て い る CpG は ，© The Ito Foundation

地方病性牛伝染リンパ腫発症牛におけるゲノムワイドなDNAメチル化解析

317

＊

100
90

Methylation rate （%）

80
70
60
50
40
30
20
10
0

EBL
cattleHealthycattleFig. 1 Genome wide methylation rate in EBL cattle and

Healthy cattle．＊indicates a significant difference（p＜0.05）,Bars represent the median．

ATP5ME近傍に位置する１つのみであった。遺本研究により，EBL発症牛は健常牛に比べ，ゲ伝子がコードされている領域外の脱DNAメチル

ノムワイドなDNAメチル化は低下することが明化により，一部の染色体増加が促進され，間接的らかとなった。加えて，発がん抑制遺伝子およびに発がん遺伝子の発現を誘発することが報告され細胞分化・活性化遺伝子のDNAメチル化亢進がている 。以上より，プロモーター領域の脱メチ認められた。したがって，EBL発症にはこれらのル化による直接的な発がん遺伝の活性化はEBL発

DNAメチル化異常が関与している可能性が示唆

生に関与している可能性は低く，遺伝子コード領された。DNAメチル化は栄養状態などの後天的域以外の脱メチル化による染色体異常が関与してな要因により変化することが知られている。今回いる可能性が示唆された。また，EBLにおいて健の研究ではEBL発症に関与するDNAメチル化異常牛よりメチル化率が高値であったCpGは4,572

常を引き起こす要因については検討できていな個特定された。そのうち，遺伝子をコードしていい。DNAメチル化異常を引き起こす要因を明らる領域から１kb以内に位置しているCpGは201個かにすることは，EBL発症を予防する飼養管理法であった。これらのメチル化CpG近傍にコードさの開発につながる可能性があり，今後の研究課題れている遺伝子のGO解析した結果，発がん抑制

である。

７）

遺伝子に関与する遺伝子群および細胞の分化・活性化に関与する遺伝子群が多く認められた（Fig.

４．要約２）。したがって，DNAメチル化による発がん抑

牛伝染性リンパ腫（EBL）は牛伝染性リンパ腫

制遺伝子および細胞分化・活性化遺伝子発現が抑ウイルス（BLV）感染によって引き起こされるB

制され，EBL発症へと至る可能性が示唆された。

細 胞 性 リ ン パ 腫 で あ り ，骨 形 成 タ ン パ ク 質 ６© The Ito Foundation

318

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

System development
Multicellular organism development
Cell development
Animal organ development
Regulation of cell activation
Anatomical structure formation involved
in morphogenesis
Cell activation
Response to BMP
Cellular biosynthetic process
Cellular response to endogenous stimulus
0

1

2

3

4

-log（P-value）
Fig. 2 Top 10 Gene Ontology term of genes with higher methylation rates in EBL

cattle than in healthy cattle．

（BMP-6）プロモーター領域の高メチル化が病態

がん抑制遺伝子および細胞分化・活性化遺伝子の進行に関与すると報告されている。しかしなが発現抑制が関与している可能性が示唆された。

ら，ゲノムワイドなメチル化状態は明らかにされていない。そこで，EBL発症牛におけるゲノムワ
イドなメチル化状態を明らかにすることを目的に，EBL発症牛と健常牛のゲノムワイドなDNA
メチル化状態を比較した。EBL発症牛４頭の腫蕩化リンパ節および健常牛４頭の正常リンパ節から抽出したDNAを用い，RREM法による解析を実施したところ，EBL発症牛ではゲノムワイドなDNAメチル化の低下が認められた。加えて，EBL発症牛では発がん抑制遺伝子および細胞分化・活性化に関与する遺伝子群近傍のDNAメチ
ル化亢進が認められた。以上の結果より，EBL発症にはゲノムワイドなDNAメチル化の低下による染色体不安定性およびDNAメチル化による発文
献１）
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Milan, M., Cascione, L., Comazzi, S., Martini, V.,
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profiling reveals common signatures oftumorigenesis and defines epigenetic prognostic
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６） Mochizuki, H., Fujiwara-Igarashi, A., Sato, M.,
Goto-Koshino, Y., Ohno, K., Tsujimoto, H.：Genetic
and epigenetic aberrations of p16 in feline primary319

neoplastic diseases and tumor cell lines of lymphoidand non-lymphoid origins, Vet. J., 219, 27～33,
2017．
７） Gaudet, F., Hodgson J. G., Eden, A., JacksonGrusby, L., Dausman, J., Gray J. W., Leonhardt, H.,
Jaenisch, R.：Induction of tumors in mice bygenomic hypomethylation, Science, 300, 489～492,
2003．

© The Ito Foundation

320

ブタにおける医薬品の適正使用に向けた薬物代謝酵素の解析
Analysis of drug-metabolizing enzymes toward appropriate use of drug in pigs

宇

野

泰

広１・山

崎

浩

史２

（１鹿児島大学共同獣医学部，２昭和薬科大学薬学部）

Yasuhiro Uno１ and Hiroshi Yamazaki２（１Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University，
２Faculty of Pharmaceutical Sciences, Showa Pharmaceutical University）

The pig is an important species in livestock and drug metabolism studies for drug
development; however, the cytochrome P450（CYP）, one of the important drug-metabolizing
enzymes, have not been fully investigated in this species. Therefore, pig CYP2C enzymes wereidentified and characterized, including CYP2C32, CYP2C33, CYP2C34, CYP2C36, CYP2C42, andCYP2C49. For these CYP2Cs, cDNAs were isolated and found to contain open reading framesof 490-494 amino acids that shared relatively high sequence identities with human CYP2Cs. Pig
CYP2C genes formed two gene clusters, one of which was located in the genomic region
corresponding to that of human CYP2C cluster, and an additional gene cluster formed by pig
CYP2C33a and CYP2C33b was located distant from the first cluster. Among the tissues
analyzed, these pig CYP2C mRNAs were preferentially expressed in liver, small intestine, and/or kidney, the drug-metabolizing organs; pig CYP2C49, CYP2C32, and CYP2C33 mRNAs werethe most abundant in liver, jejunum, and kidney, respectively. Metabolic assays showed that
pig CYP2C proteins metabolized typical human CYP2C substrates including diclofenac,
warfarin, and omeprazole. The results suggest that these pig CYP2Cs are functional enzymes
able to metabolize human CYP2C substrates in liver and small intestine, similar to humanCYP2Cs. Moreover, analysis of 14 pig CYPs including these CYP2Cs, found that CYP1A2,
CYP2A19, CYP2C36, CYP2E1, and CYP3A22 were involved in metabolism of skatole, acontributor to boar taint resulting in an unfavorable odor and taste of the pork product.
Among these CYPs, CYP1A2 and CYP3A22 were expected to contribute more to boar taint inmale pigs, considering sex-biased expression of CYPs in liver where skatole is metabolized by
CYPs. In conclusion, this study suggested the importance of pig CYPs including CYP2Cs for
drug metabolism and boar taint. Further investigation of genetic variants of pig CYPs would
help to understand the variability among individuals and strains in drug metabolism andskatole metabolism（boar taint）．

© The Ito Foundation

ブタにおける医薬品の適正使用に向けた薬物代謝酵素の解析

１．目

321

が現状である。そこで本研究では，肝臓で発現す的るすべてのCYP2Cを同定し，その発現や酵素機

動物用医薬品の安全確保のためには，ヒト用の能を解析し，ブタ薬物代謝での重要性を評価し医薬品医療機器等法での情報も適用するが，動物た。また，これらのCYP2Cを含め，薬物代謝の特有の諸問題や，ヒトと産業動物の種差の課題が主要なブタCYP（計14種）についてスカトール

ある。この問題を解決するためには産業動物にお代謝への関与を調べた。

ける薬物代謝を理解する必要があるが，ヒトと異なり産業動物における薬物代謝の研究は進んでお

２．方法らず，まだ薬物代謝酵素の同定すら十分でないの2.1が実状である。また，食肉産業では，ブタの雄臭CYP2CのcDNAをクローニングするため，ブ（boar taint）が重要な問題であり，その原因物質

タ肝臓RNAを用いて，既報 １）に従いRT-PCRをの一つであるスカトールの代謝を解明することが行った。まずRT反応により１本鎖cDNAを合成必要である。スカトールは薬物代謝酵素によってし，続いて遺伝子特異的なプライマーを用いて代謝されるが，そのメカニズムは十分に解明され

PCR を 行 い， PCR Cloning Kit （New Englandていない。

BioLabs）を用いて増幅産物をベクターにクロー

薬物代謝酵素は薬物の生体内変換反応に関わる酵素群で，チトクロムP450（CYP）等が知られcDNAの同定・解析

ニングしたのちインサートの配列を決定し，配列の解析を行った２）。

ている。ヒトではさまざまなCYP分子種が存在

2.2

し，多くの医薬品等の化学物質の生体内変換に関CYP2Cの組織発現を解析するため，既報１）に与しており，医薬品等の薬効・毒性における性差従い倫理委員会の承認を得て採取したブタの副や年齢差，個体差，人種差をもたらす要因となっ

腎，脳，心臓，回腸，空腸，腎臓，肝臓，肺，卵ている。薬物代謝酵素の個体差や人種差の大きな巣，子宮から別々にRNAを抽出し，リアルタイム

原因の一つは遺伝子多型であり，ヒトでは個別化

PCRを行った。まずReverTra Ace qPCR RT kit

医療の中で薬物代謝酵素が代謝する医薬品の一部（TOYOBO）を用いてRT反応を行い，続いて遺については投与時に遺伝子多型が調べられるまで

伝 子 特 異 的 な プ ラ イ マ ー と THUNDERBIRDになっている。なかでもヒトCYP2Cはジクロフェ

SYBR qPCR Mix Kit（TOYOBO）を用いてリア

ナク，ワルファリン，オメプラゾール等の代謝にルタイムPCRを行った２）。相対的発現レベルは，関与し，薬物代謝に重要な肝臓と小腸で高く発現

TaqMan Gene Expression Assays （Applied

する重要な酵素である。また，ヒトCYP2Cの遺

Biosystems）およびTHUNDERBIRD Probe qPCR

伝子多型が薬物代謝の個体差や人種差の重要な原

Mix（TOYOBO）を用いて定量した18S rRNAレ

因であることが知られている。

ベルで補正することにより算出した。

ヒトと同様，系統や個体によって遺伝的背景が2.3

CYP2Cの組織発現解析

CYP2Cタンパクの活性測定

異なるブタについても系統や個体の間で薬物代謝

ブタCYP2Cタンパクの酵素活性を調べるためが異なることが報告され始めている。しかし，ブに，既報１，３）に従い発現プラスミドの作製，大腸

タでは薬物代謝の理解が進んでおらず，CYPを菌でのタンパク発現，膜画分の調製を行った。まはじめとする薬物代謝酵素の同定すら不十分なのずタンパク発現を高めるために，PCR増幅により© The Ito Foundation

322

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Ｎ末の改変，ついでpCWプラスミドへのサブク

同性（64-82％）を示し，CYPに特徴的なヘム結ローニングを行った 。酵素活性の測定はジクロ合領域や基質認識部位を有していた２）。また，ヒフェナク，ワルファリン，オメプラゾール，スカトがゲノム上に１つのCYP2C遺伝子クラスター

トールを基質として既報に従って行った。組を 形 成 し て い る の に 対 し，ブ タ は 大 小 ２ つ の換えタンパク質（5.0 pmol）または肝臓ミクロ

CYP2C遺伝子クラスターを形成しており，ゲノ

ゾーム（ヒトまたはブタ，0.50 mgタンパク質／

ム上，大きな遺伝子クラスターはヒトCYP2C遺ml），NADPH生成システム，基質（10または100

伝子クラスターに対応する位置に存在していたμM），50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）を（Fig. １）。ま た，す べ て の ブ タ CYP2C が ヒ ト含む反応物を37℃で15または30分間インキュベー

CYP2Cに類似した遺伝子構造を持ち，コード領

トしたのち反応を停止し，900ｇで５分間遠心分域のエクソンを９つ有し，ほとんどのエクソンが離した後，上清を高速液体クロマトグラフィー

対応するヒトCYP2Cと同じ大きさであった２）。以（HPLC）で分析した２）。HPLC分析は，基質に応上のことから，ブタCYP2CがヒトCYP2Cとよくじて蛍光またはUV検出器を使用した。最大速度

似た塩基およびアミノ酸配列を有していることが（Vmax）とミカエリス定数（Km）はミカエリス

明らかとなった。

２）

４～７）

リアルタイムPCRにてブタCYP2C mRNA発現－メンテン式を使用して算出した。

を副腎，脳，心臓，回腸，空腸，腎臓，肝臓，肺，３．結果と考察

卵巣，子宮で調べたところ，ブタCYP2C34およ

肝 臓 RNA を 用 い た RT-PCR に よ り ブ タ

び CYP2C49 mRNA は 肝 臓， CYP2C32 お よ び

CYP2C32， CYP2C33， CYP2C34， CYP2C36，

CYP2C42 mRNA は 小 腸，CYP2C36 mRNA は 腎CYP2C42およびCYP2C49のcDNAを同定し，そ

臓，CYP2C33 mRNAは肝臓と腎臓で特に高く発の配列を解析した。これらのCYP2Cは490または現していた（Fig. ２）。また，これらのブタCYP2C

494アミノ酸残基をコードしヒトCYP2Cと高い相の 中 で， 肝 臓 で は CYP2C49 つ い で CYP2C33

Human chromosome 10
2C19

HELLS
2C18

2C9

ACMS6

2C58P

2C8

PDLIM12C

2C42 PDLIM1

CPN1

Pig chromosome 10
HELLS

2C

2C

2C34

2C36

2C32

2C

2C

2C49

2C

～4500 kb

2C33a

2C33b

CHUK

Fig. 1 Genomic structure of pig CYP2C genes. The human and pig

genomes were analyzed using BLAT and Sequence Viewer. Pig
CYP2C33 cDNA was mapped to both CYP2C33a and CYP2C33b
genes most likely due to duplication of single gene. Gray arrows
show pseudogenes, and black arrows indicate CYP2Cs with acomplete coding region. The sizes of the genes and the distances
between them are not drawn to scale．

© The Ito Foundation

323

ブタにおける医薬品の適正使用に向けた薬物代謝酵素の解析

0.5
0.0

Expression level

CYP2C42

0.5
0.0

Ad
re
na
lg
la
nd
Br
ai
n
H
ea
rt
Ile
u
Je m
ju
nu
m
Ki
dn
ey
Li
ve
r
Lu
ng
O
va
ry
U
te
ru
s

Expression level

1.0

Liver

0.0

1.0
Expression level

0.5

C
YP
2
C C4
YP 9
2
C C3
YP 3
2
C C3
YP 4
2
C C3
YP 2
2C
C
YP 42
2C
36

Expression level

1.0

0.5
0.0

CYP2C49

1.0
0.5
0.0

Jejunum

0.5

0.0
C
YP
2
C C3
YP 2
2
C C4
YP 9
2
C C4
YP 2
2
C C3
YP 4
2C
C
YP 36
2C
33

B

CYP2C36

1.0

Ad
re
na
lg
la
nd
Br
ai
n
H
ea
rt
Ile
u
Je m
ju
nu
m
Ki
dn
ey
Li
ve
r
Lu
ng
O
va
ry
U
te
ru
s

Expression level

CYP2C34

Ad
re
na
lg
la
nd
Br
ai
n
H
ea
rt
Ile
u
Je m
ju
nu
m
Ki
dn
ey
Li
ve
r
Lu
ng
O
va
ry
U
te
ru
s

Expression level

1.0

0.0

1.0
Expression level

0.0

0.5

Kidney

0.5

0.0

C
YP
2
C C3
YP 3
2C
C
YP 36
2
C C4
YP 9
2
C C4
YP 2
2
C C3
YP 4
2C
32

0.5

CYP2C33

1.0

Ad
re
na
lg
la
nd
Br
ai
n
H
ea
rt
Ile
u
Je m
ju
nu
m
Ki
dn
ey
Li
ve
r
Lu
ng
O
va
ry
U
te
ru
s

Expression level

CYP2C32

Ad
re
na
lg
la
nd
Br
ai
n
H
ea
rt
Ile
u
Je m
ju
nu
m
Ki
dn
ey
Li
ve
r
Lu
ng
O
va
ry
U
te
ru
s

1.0

Ad
re
na
lg
la
nd
Br
ai
n
H
ea
rt
Ile
u
Je m
ju
nu
m
Ki
dn
ey
Li
ve
r
Lu
ng
O
va
ry
U
te
ru
s

Expression level

A

Fig. 2 Tissue expression of pig CYP2C mRNAs. Expressions of pig CYP2C mRNAs were quantified

by real-time RT-PCR in adrenal gland, brain, heart, ileum, jejunum, kidney, liver, lung, ovary,and uterus（A）. Relative abundances of pig CYP2C mRNAs were also determined in liver,jejunum, and kidney（B）. The expression level of each mRNA was normalized to the 18S
rRNA level, and values represent the average±SD from three independent amplifications. The
most abundant expression level was arbitrarily set to 1, and all other expression levels were
adjusted accordingly．

© The Ito Foundation

324

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

CYP2C49

CYP2C42CYP2C36

2

Human

Pig

Diclofenac

CYP2C49

CYP2C420

CYP2C36

1
CYP2C34

Omeprazole

R,S-Warfarin

S-Warfarin

Diclofenac

Omeprazole

R,S-Warfarin

S-Warfarin

0

3

CYP2C33

0.1

Omeprazole

4

CYP2C19

0.2

R,S-Warfarin

5

CYP2C90.3

Pig
S-Warfarin

Recombinant protein （100 μM）
Drug oxidation（nmol/min/nmol CYP）

0.4

Diclofenac

Drug oxidation（nmol/min/mg protein）

Liver microsomes （100 μM）
0.5

Human

CYP2C34

Human
Diclofenac

B

CYP2C33Pig

CYP2C32

Omeprazole

S-Warfarin

0

CYP2C32

Human

R,S-Warfarin

Diclofenac

Omeprazole

S-Warfarin

R,S-Warfarin

0

1

CYP2C19

0.1

2

CYP2C90.2

Recombinant protein （10 μM）
Drug oxidation（nmol/min/nmol CYP）

Liver microsomes （10 μM）
0.3

Diclofenac

Drug oxidation（nmol/min/mg protein）

A

Pig
S-Warfarin

R,S-Warfarin

OmeprazoleFig. 3 Oxidation activities by liver microsomes and recombinant CYP2C proteins from humans and pigs. Diclofenac

4ʼ-hydroxylation（normal bars）, S-（ light grey bars）and R, S-warfarin（grey bars）7-hydroxylation, andomeprazole 5-hydroxylation（pink bars）activities were determined in liver microsomes（A, C）and recombinant
proteins（B, D）at substrate concentrations of 10 mM（A, B）and 100 mM（C, D）in triplicate reactions．

mRNAが，空腸ではCYP2C32ついでCYP2C49お様に，いずれのブタCYP2C組換えタンパク質もよびCYP2C42 mRNAが，腎臓ではCYP2C33ついすべての基質に対して活性を示したが，活性レベ

で CYP2C36 mRNA が 高 く 発 現 し て い た（Fig.

ル は 基 質 ご と に 異 な り， CYP2C49 つ い で２）。以上のことから，ブタCYP2CがヒトCYP2C

CYP2C36がジクロフェナクに，CYP2C36ついでと同様，薬物代謝に重要な肝臓，小腸，腎臓で高CYP2C49がワルファリンとオメプラゾールに対く発現していることが明らかとなった。

して高い活性を示した（Fig. ３）。以上のことか

ヒトCYP2C基質を用いて組換えタンパク質と肝臓ミクロゾームで酵素活性を測定したところ，ら，ブタCYP2Cが酵素機能を有し，ヒトCYP2C
基質を代謝することが明らかとなった。

ブタ肝臓ミクロゾームで４つの基質すべてに活性

ブタ肝臓ミクロゾームでスカトールからの一次がみられたが，活性レベルは基質によって大きく

酸化生成物（3-メチルオキシインドール，イン

異なり，同じ基質でもヒトと異なっていた（Fig.

ドール-3-カルビノールおよび6-ヒドロキシスカ

３）。とくに，ヒトと比べてブタではジクロフェトール）の生成を測定したところ，スカトールにナクとワルファリンに対する活性が低く，オメプ

対する酸化活性がオスでメスより低く，とくにイラゾールに対する活性が高かった（Fig. ３）。同ンドール-3-カルビノールおよび6-ヒドロキシス© The Ito Foundation

325

ブタにおける医薬品の適正使用に向けた薬物代謝酵素の解析
Recombinant protein （100 μM）

Skatole oxidation（nmol/min/nmol CYP）

12
10
8
6
4
2

7
22

46

YP
C

YP
C

3A

YP

3A

29

22

3A

2E

3A
C

YP
C

YP

YP
C

C

YP
C

1

49

YP
C

Indole-3-carbinol

YP

YP
C

3-Methyloxindole

C

42

2C

YP
C

2C

2C

36

34

33

2C

2C

2C

32

22

19

YP
C

2B

2A

YP

YP
C

C

1A

2

0

6-Hydroxyskatol

Fig. 4 Recombinant pig P450 enzymes mediated skatole oxidations. The rates

of formation of 3-methyloxindole（open bars）,indole-3-carbinol（light greybars）, and 6-hydroxyskatole（dark grey bars）were determined at a
substrate concentration of 100μM. Bars and whiskers represent the meanand standard deviation values for skatole primary metabolite formation in
triplicate determinations．

カトールの生成がオスでメスより低かった。次にか ら，CYP1A2，CYP2A19，CYP2C36，CYP2E1，

スカトール代謝へのCYPの関与を調べるために，

CYP3A22がスカトール代謝に関与することが明14種のブタCYP組換えタンパク質で調べたとこ

らかとなった。なかでもCYP2A19の関与が大きろ，CYP1A2，CYP2A19，CYP2C36，CYP2E1，

かったが，雌と異なり雄の肝臓ではCYP2A19のCYP3A22がスカトールからの代謝物生成に関与発現がかなり低く，このことが雄で雄臭が生じる

し て い た（Fig. ４）。こ れ ら ５ 種 の CYP の ス カ一因である可能性が考えられる。雄の肝臓ではトール代謝への関与を詳細に調べるために組換え

CYP1A2とCYP3A22が比較的高く発現しており，

タンパク質を用いて速度論的解析を行ったとこ

雄のスカトール代謝に重要であると推測される。

ろ，3- メ チ ル オ キ シ イ ン ド ー ル 生 成 に お け る
CYP1A2，CYP2A19およびCYP3A22のVmax値

４．要

約は，それぞれ3.5，25および4.5 min－１，見かけのKm

CYPは重要な薬物代謝酵素であるが，ブタで値はすべて＞100μＭであった。インドール-3-カ

は解析がまだ不十分であり，ブタ薬物代謝の理解

ルビノール形成におけるCYP1A2，CYP2A19おが困難になっている。本研究では，CYPのうち

よびCYP3A22のKm値はそれぞれ37μＭ，60μＭ

CYP2Cについて薬物代謝酵素としての重要性を評

および94μＭ，Vmax値はそれぞれ13 min－１，14

価するために，CYP2C32，CYP2C33，CYP2C34，

min および0.4 minであった。そして，6-ヒドロ

CYP2C36，CYP2C42，CYP2C49のcDNAを同定

キシスカトール形成におけるCYP2A19のKmおし 解 析 を 行 っ た 。い ず れ の ブ タ CYP2C も ヒ ト

よびVmax値は，それぞれ70μＭおよび16 min－１

CYP2Cと高い配列相同性を示し，ヒトCYP2Cとであり，CYP2C36，CYP2E1およびCYP3A22のKm

類似したゲノム構造を有していた。また，いずれ

値はいずれも100μＭ未満であった。以上のことのブタCYP2Cも薬物代謝に重要な肝臓，小腸ま－１－１© The Ito Foundation

326

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

たは腎臓で高く発現し，ヒトCYP2C基質に酵素活性を示した。以上の結果から，ヒトCYP2Cと同様，これらのブタCYP2Cが肝臓や小腸で薬物代謝機能を発揮することが示唆された。また，食肉産業で重要な問題であるブタの雄臭について
は，原因物質の１つであるスカトールの代謝にCYP1A2， CYP2A19， CYP2C36， CYP2E1，
CYP3A22が関与していた。このうち雄の肝臓で発現するCYP1A2とCYP3A22が雄臭に重要であると考えられ，雄臭の個体差はこれらのCYPの遺伝子多型が大きな原因の一つであると推察される。雄臭の原因となる遺伝子多型が見つかれば，それをマーカーにして個体を選別する，さらには
雄臭のない集団を構築することができるかもしれ
ない。

文
献
１）
 Uno, Y., Fujino, H., Kito, G., Kamataki, T., Nagata,
R.：Mol Pharmacol, 70, 477～486, 2006．
 Uno, Y., Morikuni, S., Shiraishi, M., Asano, A.,
２）
Kawaguchi, H., Murayama, N., Yamazaki, H.：
Xenobiotica, 52, 963～972, 2022．
３）
 Iwata, H., Fujita, K., Kushida, H., Suzuki, A.,
Konno, Y., Nakamura, K., Fujino, A., Kamataki, T.：
Biochem Pharmacol, 55, 1315～1325, 1998．
４）
 Uehara, S., Uno, Y., Inoue, T., Kawano, M.,
Shimizu, M., Toda, A., Utoh, M., Sasaki, E.,
Yamazaki, H.：Drug Metab Dispos, 43, 1408～1416,
2015．
５）
 Uehara, S., Uno, Y., Inoue, T., Kawano, M.,
Shimizu, M., Toda, A., Utoh, M., Sasaki, E.,
Yamazaki, H.：Drug Metab Dispos, 44, 911～915,
2016．
 Nakanishi, K., Uehara, S., Kusama, T., Inoue, T.,
６）
Shimura, K., Kamiya, Y., Murayama, N., Shimizu, M.,
Uno, Y., Sasaki, E., Yamazaki, H.：Biochem
Pharmacol, 152, 272～278, 2018．
 Wiercinska, P., Lou, Y., Squires, E. J.：Animal, 6,７）
834～845, 2012．

© The Ito Foundation

327

飼料費低減に向けた低硝酸態窒素と高粗タンパク質を両立する夏季牧草の窒素管理技術
Nitrogen management technology for an annual summer grass that achieves
both low nitrate nitrogen and high crude protein to reduce feed costs

林

征

幸・金

子

真

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センター）

Masayuki Hayashi and Makoto Kaneko（Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, NARO）

For warm-season grasses, it is difficult to achieve both low nitrate nitrogen and highcrude protein. To improve the balance of inorganic nitrogen supply from soil and manure andits absorption by grass, a cultivation test was conducted with manure application based on theestimation by the“estimate for inorganic nitrogen supply from upland soil”and the“estimate
for inorganic nitrogen supply from organic materials（manure）”. And then the effectiveness ofthese estimates was considered. From the results, it was suggested a necessity to consider the
residue from the previous crop and to improve the equation for estimating the inorganic
nitrogen supply from soil so that the difference in available nitrogen could be accuratelyreflected．

１．目

都府県での国産自給粗飼料，特に牧草生産は，小的さな圃場での生産が多く，圃場内や圃場間での品

輸入飼料価格は近年，中国や中東諸国との競合

質のバラツキが大きく，肉用牛では繁殖雌牛以外

や，海上運賃の高騰により高止まりし，コロナ禍

での利用が広がっていない。牛肉生産のために国での海上輸送混乱やウクライナ情勢の悪化により

産自給粗飼料を輸入粗飼料の代替として広く流通

輸入飼料の高騰や品薄のリスクがさらに高まってするには，輸入粗飼料と同等の品質安定性と高品

おり，畜産経営における飼料コスト高による利益質が必要である。

減少対策として，輸入飼料から国産飼料への切替

暖地の夏季に栽培されている暖地型牧草は，地えは喫緊の課題となっている。現在国産が可能な

力窒素および施用窒素の過剰吸収により，硝酸態

粗飼料に着目すると，国産への切替えが進まない

窒素濃度が高くなりやすく，家畜が硝酸態窒素中

原因として，国産粗飼料の品質の問題点があげら

毒を起こす危険性がある。一方，粗タンパク質含れる。輸入粗飼料は，品質のバラツキが小さく，量は冬季の寒地型牧草よりも低いとされ，粗タン商品としてグレードごとに品質も明示されておパク質を高めるためには窒素施用が不可欠であり，育成牛や肥育牛など利用範囲が広い。一方，り，低硝酸態窒素と高粗タンパク質窒素の両立が© The Ito Foundation

328

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

難しい。本研究では，近年園芸作など畑作向けに吸収パターンに見合った窒素供給量になるよう開発された「畑土壌可給態窒素（地力窒素）の見に，牧草の播種日・収穫日，堆肥の施用日・施用

える化技術１）」と「有機質資材（堆肥）窒素肥効量を決定した。

見える化技術 」を牧草生産に利用し，牧草への2.2

窒素供給パターンを推定し，牧草の窒素吸収モデ

上記2 . 1で決定した牧草播種日・収穫日，堆肥

ルと組み合わせることで，窒素の供給と吸収のバの 施 用 日・施 用 量 で 下 記 の ギ ニ ア グ ラ ス 品 種

ランスを改善する。この暖地型牧草の堆肥を主体「うーまく」の栽培試験と収穫物の分析を実施し，とした窒素施用管理技術を開発することにより，地力窒素および堆肥施用が牧草収穫物の硝酸態窒

有機質資材の利用促進による化学肥料の使用量と素濃度および粗タンパク質濃度に及ぼす影響を明

コストの削減ならびに低硝酸態窒素・高粗タンパ

らかにした。

２）

ク質の安全・高品質自給粗飼料を供給可能にする圃場：九州沖縄農業研究センター内の飼料畑圃
場

ことによる自給率向上を目的とする。
２．方

栽培試験

処理：地力窒素（少ない圃場：Ｌ圃場，多い圃

法

場：Ｈ圃場），堆肥施用日（播種直前：
Ｊ処理，播種２週間前：Ｔ処理），堆肥

2 . 1 土 壌（地 力）と 堆 肥 か ら の 窒 素 供 給 パ

施用量（なし：Ｎ処理，標準：１処理，ターンの推定による施用量の決定

２倍量：２処理）。

近年開発された「畑土壌可給態窒素（地力窒素）の見える化技術」と「有機質資材（堆肥）窒

反復：４反復の乱塊法で配置。計40プロット。
各区画５ｍ×５ｍ。

素肥効見える化技術」を利用して牧草への窒素供給パターンを推定し，牧草による窒素吸収に見調査：播種（2022年７月22日）から４週間後，６週間後，８週間後に刈取り調査（各区合った施用量を決定した。
１：2022年６月10日に，栽培試験を実施する畑

画１ｍ×１ｍ）を行い，70℃で72時間以

圃場において，対角線上の５地点で，深さ15cm

上乾燥し，乾物収量を求めた。また乾燥までの土壌を，採土管を用いて採取した。

した牧草は２mm以下に粉砕し，牧草収
穫物中の硝酸態窒素および粗タンパク質

２：採取した土壌を２mmのふるいでふるったに基づきパックテストを用を分析した。各刈取り後に刈り取った部

いてCOD（化学的酸素要求量）を測定し，可給分から深さ15cmの土を採土管で採取し，態窒素含量を計算により求めた。

風乾し，２mmのふるいでふるったのち，のち，上薗らの方法

３）

可給態窒素を分析した。

３：可給態窒素含量から地力窒素供給パターン
を計算（「畑土壌可給態窒素（地力窒素）の見え

2.3

モデルの改良る化技術」の計算式１）を利用）により求めた。

上記2 . 2の結果から推定される，地力窒素およ

４：一般的な牛糞堆肥からの堆肥窒素供給パび堆肥窒素の供給量と実測した窒素吸収量の違い

ターンを計算（「有機質資材（堆肥）窒素肥効見を明らかにし，より確実に硝酸態窒素の低減を図える化技術」の計算式

れる窒素管理モデルについて考察した。

を利用）により求めた。

２）

５：上記３と４で計算された窒素供給パターン

１：栽培圃場の堆肥施用前の土壌中可給態窒素が昨年度の暖地型牧草栽培試験における牧草窒素（アンモニア態窒素および硝酸態窒素）を分析し© The Ito Foundation

飼料費低減に向けた低硝酸態窒素と高粗タンパク質を両立する夏季牧草の窒素管理技術

た。

329

Ｌ圃場では，いずれの刈取りでもＮ処理で乾物収

２：栽培試験で施用した堆肥の可給態窒素およ

量が少ない傾向を示した。８週目には，J2処理でびADSON（酸性デタージェント可溶有機態窒素）多い傾向を示した。Ｈ圃場では，８週目にT2処を分析した。

理で少ない傾向を示した。Ｈ圃場のT2処理を除３：地力窒素および堆肥からの窒素供給パター
ンを再計算した。

き，生育期間が長くなるにつれ，乾物収量も増加した。

４：牧草の乾物収量と窒素濃度から窒素吸収量を計算した。

「うーまく」の粗タンパク質含有率は，Ｌ圃場，
Ｈ圃場ともに，４週目に22％以上と高く，６週目

５：計算された窒素供給量と窒素吸収量の差を求めた。

は15％程度，８週目は13％程度に減少した。圃場
間，処理区間で明確な違いは見られなかった。

６：地力窒素供給パターンおよび堆肥窒素供給パターンの推定式について考察した。

「うーまく」の硝酸態窒素含有率は，いずれの刈取りでも，Ｌ圃場よりもＨ圃場のほうが高かった。Ｌ圃場では，Ｎ処理では４週目が最も低く，３．結果と考察その後高くなったが，T1およびT2処理では，６

3 . 1 土 壌（地 力）と 堆 肥 か ら の 窒 素 供 給 パ
ターンの推定による施用量の決定

週目が高くなった。T2，J1およびJ2処理では，８週目が最も低い値を示した。Ｈ圃場では，いず試験に利用予定の圃場の土壌中可給態窒素含量

れの処理も８週目が最も低い値を示した。

は ， 地 力 窒 素 の 少 な い 圃 場 （Ｌ 圃 場） で は「うーまく」の窒素収量は，Ｌ圃場では処理に4.3mg/100gDS（乾土），窒素の多い圃場（Ｈ圃場）よる差は認められなかったが，Ｈ圃場では，８週では7.3mg/100gDSであった。

目にT2処理が少なかった。Ｈ圃場のT2処理を除

上記の土壌中可給態窒素含量から「畑土壌可給態窒素（地力窒素）の見える化技術」の計算式を

き，生育期間が長くなるにつれ，窒素収量も増加した。

用いて地力窒素供給パターンを，「有機質資材

土壌可給態窒素のうち，硝酸態窒素は，Ｌ圃場（堆肥）窒素肥効見える化技術」の計算式を用い

では，４週目にＮ処理，T2処理，J2処理が，T1て一般的な牛糞堆肥からの堆肥窒素供給パターン

処理とJ1処理よりも高い傾向を示した。いずれのをそれぞれ求めた（Fig. １，Fig. ２）。

処理でも４週目が最も多く，その後減少した。

上記で求めた地力窒素供給パターンおよび堆肥

T1処理およびJ1処理では６週目のほうが８週目

窒素供給パターンが，昨年度の暖地型牧草栽培試よりも高い値を示した。Ｈ圃場では，４週目はJ1

験における牧草窒素吸収パターン（Fig. １，Fig.

およびJ2処理が高い値を示した。いずれの処理も２）に見合った窒素供給量になるように，牧草の４週目が最も高い値を示し，８週目が最も低い値

播種日を７月下旬，収穫日を播種２か月後，堆肥を示した。

の施用日を播種２週間前および播種当日，堆肥施用量を０，
１，２トン／10ａに決定した。
3.2

土壌可給態窒素のうち，アンモニア態窒素は，
Ｌ圃場では，６週目にＮ処理で高い値を示した。

栽培試験

J2処理では４週目（0.84mg/100gDS）と６週目「うーまく」の乾物収量は，４週目と６週目は，（0.83mg/100gDS）が同程度であったが，他の処理

Ｌ圃場よりもＨ圃場のほうが多い傾向を示した。

では，６週目が最も高い値（0.85-1.09mg/100gDS）© The Ito Foundation

330

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

4.5
4.0

N

Nitrogen（kg/10a）3.5

Nitrogen supply（kg/10a）from soil at L Field（available N: 4.30）
Nitrogen absorption from 'Umaku'（㎏/10a）Seeding at 20th June

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
4.5

3.5

7/20-8/3

8/3-8/17

8/17-/8/31

8/31-9/14
4.5

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（1 Mg/10a）at 20th June
Nitrogen supply（kg/10a）from soil at L Field（available N: 4.30）

J1

Nitrogen absorption from 'Umaku'（㎏/10a）Seeding at 20th June

3.0

Nitrogen（kg/10a）

Nitrogen（kg/10a）

T1

4.0

7/6-7/20

2.5
2.0
1.5
1.0
0.5

4.5
T2 4.0

Nitrogen（kg/10a）

3.5

3.5

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（1 Mg/10a）at 6th June
Nitrogen supply（kg/10a）from soil at L Field（available N: 4.30）
Nitrogen absorption from 'Umaku'（㎏/10a）Seeding at 20th June

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5

7/6-7/20

7/20-8/3

8/3-8/17

8/17-/8/31

0.0

8/31-9/14

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（2 Mg/10a）at 20th June
Nitrogen supply（kg/10a）from soil at L Field（available N: 4.30）

4.5
J2

Nitrogen absorption from 'Umaku'（㎏/10a）Seeding at 20th June

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0

4.0
3.5

Nitrogen（kg/10a）

0.0

4.0

7/6-7/20

7/20-8/3

8/3-8/17

8/17-/8/31

8/31-9/14

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（2 Mg/10a）at 6th June
Nitrogen supply（kg/10a）from soil at L Field（available N: 4.30）
Nitrogen absorption from 'Umaku'（㎏/10a）Seeding at 20th June

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0

0.5

0.5

0.0

0.0

7/6-7/20

7/20-8/3

8/3-8/17

8/17-/8/31

8/31-9/14

7/6-7/20

7/20-8/3

8/3-8/17

8/17-/8/31

8/31-9/14

Fig. 1 Estimated inorganic nitrogen supply and absorption in low soil fertility field（L field）. N : No manure. T1 : 1

Mg/10 a manure application at two weeks before seeding. T2 : 2 Mg/10 a manure application at two weeks before
seeding. J1 : 1Mg/10 a manure application, just before seeding at the seeding day. J2 : 1 Mg/10 a manure
application, just before seeding at the seeding day．

を 示 し た 。 Ｈ 圃 場 で は， ４ 週 目 の T2 処 理

100gDSだった。Ｈ圃場では硝酸態窒素が1.26mg/（1.01mg/100gDS） お よ び J2 処 理 （0.96mg/

100gDS ，ア ン モ ニ ア 態 窒 素 が 6.36mg/100gDS

100gDS）
において高い値を示した。いずれの処理だった。栽培試験で施用した堆肥の可給態窒素

でも４週目が最も高い値を示し，８週目が最も低は，硝酸態窒素が0.10％DM，アンモニア態窒素

い値を示した。

が0.03％DMだった。ADSONは9.8mgN/gDMだっ

3.3

た。これらの分析結果を元に，地力窒素および堆モデルの改良栽培圃場の堆肥施用前（６月22日採取）の土壌

肥からの窒素供給パターンを再計算した結果を中 可 給 態 窒 素 は ，Ｌ 圃 場 で は 硝 酸 態 窒 素 がFig. ３とFig. ４に示した。さらに，牧草の乾物収

0.87mg/100gDS，ア ン モ ニ ア 態 窒 素 が 6.26mg/

量と窒素濃度から窒素吸収量を計算し，再計算し© The Ito Foundation

飼料費低減に向けた低硝酸態窒素と高粗タンパク質を両立する夏季牧草の窒素管理技術
4.5
4.0

N
Nitrogen（kg/10a）

3.5

331

Nitrogen supply（kg/10a）from soil at H Field（available N: 7.30）
Nitrogen absorption from 'Umaku'（㎏/10a）Seeding at 20th June

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
4.5

T1

4.0
3.5

7/6-7/20

7/20-8/3

8/3-8/17

8/17-/8/31

8/31-9/14
4.5

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（1 Mg/10a）at 20th June
Nitrogen supply（kg/10a）from soil at H Field（available N: 7.30）
Nitrogen absorption from 'Umaku'（㎏/10a）Seeding at 20th June

J1

2.0
1.5
1.0

Nitrogen supply（kg/10a）from soil at H Field（available N: 7.30）

3.5

Nitrogen absorption from 'Umaku'（㎏/10a）Seeding at 20th June

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0

0.5

0.5

0.0

0.0

7/6-7/20

7/20-8/3

8/3-8/17

8/17-/8/31

8/31-9/14

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（2 Mg/10a）at 20th June

T2

Nitrogen supply（kg/10a）from soil at H Field（available N: 7.30）
4.5

Nitrogen（kg/10a）

Nitrogen（kg/10a）

2.5

4.0

4.0

3.5

3.5

3.0
2.5
2.0
1.5

8/17-/8/31

8/31-9/14

Nitrogen absorption from 'Umaku'（㎏/10a）Seeding at 20th June

1.5

0.5
8/3-8/17

8/31-9/14

2.0

1.0

7/20-8/3

8/17-/8/31

2.5

0.5
7/6-7/20

8/3-8/17

3.0

1.0

0.0

7/20-8/3

Nitrogen supply（kg/10a）from soil at H Field（available N: 7.30）
4.5

Nitrogen absorption from 'Umaku'（㎏/10a）Seeding at 20th June

7/6-7/20

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（2 Mg/10a）at 6th June

J2

Nitrogen（kg/10a）

Nitrogen（kg/10a）3.0

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（1 Mg/10a）at 6th June

4.0

0.0

7/6-7/20

7/20-8/3

8/3-8/17

8/17-/8/31

8/31-9/14

Fig. 2 Estimated inorganic nitrogen supply and absorption in high soil fertility field（H field）. N : No manure. T1 : 1

Mg/10 a manure application at two weeks before seeding. T2 : 2 Mg/10 a manure application at two weeks before
seeding. J1 : 1 Mg/10 a manure application, just before seeding at the seeding day. J2 : 1 Mg/10 a manure
application, just before seeding at the seeding day．

た窒素供給量と計算した窒素吸収量からその差をともに堆肥施用前は６mg/100gDS以上と非常に求め，Fig. ５に示した。窒素供給量と窒素吸収量高かったものの，播種４週目にはいずれの圃場，の差は，播種から播種４週目までの間（７月23日

処理でも１mg/100gDS以下まで下がっていた。

～８月18日）にはＬ圃場のほうが正の値が大きい

一方，土壌中硝酸態窒素は，Ｌ圃場，Ｈ圃場とも傾向を示し，播種４週目から６週目までの間にはに堆肥施用前よりも播種４週目のほうが高くなっ

Ｌ圃場がＨ圃場よりも負の値が小さい傾向を示していた。これは，すき込んだ前作イタリアンライた。その一因として，Ｌ圃場のほうがＨ圃場より

グラスの分解に伴いアンモニア態窒素が放出さも牧草による吸収量が少なかったことがあげられれ，その後土壌中の硝化作用によって硝酸態窒素る。土壌中アンモニア態窒素は，Ｌ圃場，Ｈ圃場

が増えたためと考えられる。また，Ｌ圃場では，© The Ito Foundation

332

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

10.0
9.0

N
Nitrogen（kg/10a）8.0

Nitrogen supply（kg/10a）from soil at L Field（available N: 7.13）
Nitrogen absorption from 'Umaku'（kg/10a）Seeding at 20th June

7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0

7/6-7/22

7/23-8/4

8/5-8/18

8/19-9/2

9/3-9/14
10.0

10.0
Nitrogen supply（kg/10a）from manure（1 Mg/10a）at 6th June

8.0

Nitrogen supply（kg/10a）from soil at L Field（available N: 7.13）

7.0

J1

Nitrogen absorption from 'Umaku'（kg/10a）Seeding at 20th June
Nitrogen（kg/10a）

Nitrogen（kg/10a）

T1

9.0

6.0
5.0
4.0
3.0
2.0

10.0
9.0

Nitrogen（kg/10a）8.0

7/6-7/22

7/23-8/4

8/5-8/18

8/19-9/2

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（2 Mg/10a）at 6th June
Nitrogen supply（kg/10a）from soil at L Field（available N: 7.13）

Nitrogen absorption from 'Umaku'（kg/10a）Seeding at 20th June

6.0
5.0
4.0
3.0
2.0

10.0
J2

Nitrogen absorption from 'Umaku'（kg/10a）Seeding at 20th June

7.0
6.0
5.0
4.0
3.0

9.0

7/6-7/22

7/23-8/4

8/5-8/18

8/19-9/2

8.0

Nitrogen supply（kg/10a）from soil at L Field（available N: 7.13）

7.0

Nitrogen absorption from 'Umaku'（kg/10a）
Seeding at 20th June

6.0

9/3-9/14

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（2 Mg/10a）
at 20th June

5.0
4.0
3.0
2.0

2.0

1.0

1.0
0.0

Nitrogen supply（kg/10a）from soil at L Field（available N: 7.13）

7.0

0.0

9/3-9/14

Nitrogen（kg/10a）

T2

8.0

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（1 Mg/10a）at 20th June

1.0

1.0
0.0

9.0

7/6-7/22

7/23-8/4

8/5-8/18

8/19-9/2

9/3-9/14

0.0

7/6-7/22

7/23-8/4

8/5-8/18

8/19-9/2

9/3-9/14

Fig. 3 Improved inorganic nitrogen supply estimation and measured absorption in low soil fertility field（L field）. N:

No manure. T1 : 1 Mg/10 a manure application at two weeks before seeding. T2 : 2 Mg/10 a manure application at
two weeks before seeding. J1 : 1 Mg/10 a manure application, just before seeding at the seeding day. J2 : 1 Mg/10
a manure application, just before seeding at the seeding day．

播種４週目から６週目にかけてアンモニア態窒素

伴う希釈効果よりも小さい。したがって，播種４が増加する傾向を示しており，牧草中硝酸態窒素

週目から８週目の期間においても，十分な窒素供も同様の推移を示していた。したがって，前作イ

給により，牧草の生育に必要な窒素は不足していタリアンライグラスが播種後も分解に伴って主になかったと考えられた。また，Ｈ圃場のほうが播アンモニア態窒素を放出し，窒素供給源として大種４週目には牧草の乾物収量は多かったにもかかきな役割を果たしていた可能性が考えられ，窒素

わらず牧草中硝酸態窒素濃度は高かったことかの供給について，前作の残渣を考慮する必要があら，播種４週目までの窒素収支は，Ｌ圃場よりもると考えられた。

Ｈ圃場で供給過多だったと考えられるが，計算に牧草中硝酸態窒素濃度は高く，４週目以降も低より求めた窒素収支は，Ｌ圃場のほうが供給過多下しているものの，その減少幅は，収量の増加にであった。これは，供給量を予測する推定式が可© The Ito Foundation

飼料費低減に向けた低硝酸態窒素と高粗タンパク質を両立する夏季牧草の窒素管理技術
10.0

Nitrogen（kg/10a）

N

9.0
8.0

333

Nitrogen supply（kg/10a）from soil at H Field（available N: 7.62）
Nitrogen absorption from 'Umaku'（kg/10a）Seeding at 20th June

7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0

Nitrogen（kg/10a）

T1

9.0
8.0
7.0
6.0

7/6-7/22

7/23-8/4

8/5-8/18

8/19-9/2

9/3-9/14
10.0

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（1Mg/10a）at 6th June
Nitrogen supply（kg/10a）from soil at H Field（available N: 7.62）
Nitrogen absorption from 'Umaku'（kg/10a）
Seeding at 20th June

J1
Nitrogen（kg/10a）

0.0
10.0

5.0
4.0
3.0
2.0

10.0
9.0

Nitrogen（kg/10a）8.0

7/23-8/4

8/5-8/18

8/19-9/2

Nitrogen absorption from 'Umaku'（kg/10a）Seeding at 20th June

7.0
6.0
5.0
4.0
3.0

0.0

9/3-9/14

10.0

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（2 Mg/10a）at 6th June
Nitrogen supply（kg/10a）from soil at H Field（available N: 7.62）

J2 9.0

Nitrogen absorption from 'Umaku'（kg/10a）Seeding at 20th June

7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0

8.0

7/6-7/22

7/23-8/4

8/5-8/18

8/19-9/2

9/3-9/14

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（2 Mg/10a）at 20th June
Nitrogen supply（kg/10a）from soil at H Field（available N: 7.62）
Nitrogen absorption from 'Umaku'（kg/10a）Seeding at 20th June

7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0

1.0
0.0

Nitrogen supply（kg/10a）from soil at H Field（available N: 7.62）

1.0
7/6-7/22

Nitrogen（kg/10a）

T2

8.0

Nitrogen supply（kg/10a）from manure（1 Mg/10a）at 20th June

2.0

1.0
0.0

9.0

1.0
7/6-7/22

7/23-8/4

8/5-8/18

8/19-9/2

9/3-9/14

0.0

7/6-7/22

7/23-8/4

8/5-8/18

8/19-9/2

9/3-9/14

Fig. 4 Improved inorganic nitrogen supply estimation and measured absorption in high soil fertility field（H field）. N:

No manure. T1 : 1 Mg/10 a manure application at two weeks before seeding. T2 : 2 Mg/10 a manure application at
two weeks before seeding. J1 : 1 Mg/10 a manure application, just before seeding at the seeding day. J2 : 1 Mg/10
a manure application, just before seeding at the seeding day．

給態窒素の違いを正確に反映できていなかったた

それに基づく堆肥施用をした栽培試験を実施しめと考えられた。

た。実測した窒素吸収量および収穫物の硝酸態窒

４．要素濃度から，見える化技術の有効性について考察

約した。窒素の供給について，前作の残渣を考慮す

低硝酸態窒素と高粗タンパク質窒素の両立が難る必要があること，地力窒素供給パターン推定式

しい暖地型牧草について，地力窒素および施用堆については可給態窒素の違いを正確に反映できる

肥からの窒素供給が過剰にならないよう，近年畑ように改良が必要だと考えられた。

作向けに開発された「畑土壌可給態窒素（地力窒素）の見える化技術」と「有機質資材（堆肥）窒
素肥効見える化技術」を利用して供給量の推定と© The Ito Foundation

334

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Nitrogen balance（kgN/10a）Absorption : Minus, Supply : Puls）

8.0

7/6-7/22

7/23-8/4

8/19-9/2

9/3-9/14

6.0
4.0
2.0
0.0
－2.0
－4.0
－6.0
－8.0

N

T1

T2

J1

J2

N

L ﬁeld

T1

T2

J1

J2

H ﬁeldFig. 5 Inorganic nitrogen balance calculated from improved supply

estimation（Plus）and measured absorption（Minus）in low andhigh soil fertility field（L and H field）. N : No manure. T1 : 1 Mg/10
a manure application at two weeks before seeding. T2 : 2 Mg/10 amanure application at two weeks before seeding. J1 : 1 Mg/10 amanure application, just before seeding at the seeding day. J2 : 1
Mg/10 a manure application, just before seeding at the seeding
day．

文
献
１） 上薗一郎，餅田利之，有村恭平，古江広治：可給態窒素簡易判定法を活用した施肥窒素量の算定ツー
ル，日本土壌肥料学会講演要旨集，58，306，2012．
２） 古賀伸久，仁科一哉，小林創平，望月賢太，新美洋，
井原啓貴，山口典子，山根剛，草場敬：酸性デター
ジェント可溶有機態窒素含量を導入した有機質資材

窒素無機化予測モデルの構築，日本土壌肥料学雑誌，
74（2），106～114．
３） 上薗一郎，加藤直人，森泉美穂子：80℃16時間水抽出液のCOD簡易測定による畑土壌可給態窒素含量の迅速評価，日本土壌肥料学雑誌，81，252～255，
2010．

© The Ito Foundation

335

筋肉タンパク質合成・分解を制御する植物性成分による
畜肉生産の向上研究
Studies on increased livestock production through regulation of protein
synthesis and degradation by plant factors

佐

藤

隆一郎

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Ryuichiro Sato
（Graduate Scholl of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

We have discovered a novel function of the bile acid receptor TGR5 as a molecule that
regulates skeletal muscle mass, and have searched for food ingredients that enhance muscle
mass. We have also found that several plant components have TGR5 agonistic activity,
resulting in increased protein synthesis. Effective use of these ingredients is expected toincrease feed efficiency and increase muscle mass in livestock meat production. In particular,
we searched for new fragrance ingredients with TGR5 agonist activity and evaluated theiractivity．
HEK293 cells were transfected with a human TGR5 expression vector and a reporter
gene and then cultured for 24 hours. Various fragrance components（dissolved in DMSO）wereadded to the culture medium. After 5 hours, the cells were harvested and activity wasquantitatively evaluated using luciferase assay. Among 163 fragrance components，α-ionone
and nootkatone were found to have good agonist activity. Furthermore, when each derivative
compound was prepared and the agonist activity was evaluated, almost the same level ofagonist activity was found in the derivatives. GPCR agonists are usually limited compounds,
and TGR5, which binds compounds with a wide variety of structures, can be said to be a rare
GPCR. The fact that the present study also showed agonistic activity in small-moleculefragrance compounds suggests that TGR5 has pockets that bind compounds of a wide range ofstructures．
In this study, human TGR5 agonist activity was found in multiple fragrance ingredients,
but further analysis is required to determine whether these have agonistic activity towards
bovine or porcine TGR5. Human and bovine TGR5 retain 87％ amino acid homology, and thesefragrance compounds may also have agonist activity．

１．目

叫ばれている。畜肉生産による畜肉タンパク質供

的

給は，穀物生産による植物性タンパク質供給より世界的な人口増加により，十分な食料タンパク

エネルギー効率の低いことから，植物性食料の有質の供給が危ぶまれる“Global protein crisis”が用性が指摘されている。しかし，国民が豊かな食© The Ito Foundation

336

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

生活を享受するには畜肉の安定的な供給を実現すが上昇し，cAMP依存性タンパク質キナーゼを活ることは不可欠であり，その生産効率を上昇させ性化し，細胞内のCRE-binding protein（CREB）

ることが必要である。我々は骨格筋量を制御する

をリン酸化・活性化し，luciferase遺伝子発現を分子として胆汁酸受容体TGR5の新規機能を発見上昇させる。この評価系により，アゴニスト活性しを定量した（Fig. １）。

，基礎研究を基盤に筋量を増強させる食品

１，
２）

成分の探索を行ってきた。複数の植物性成分に
TGR5アゴニスト活性を認め，その結果タンパク

３．結果と考察

質合成が亢進する事実を明らかにしてきた３，４）。

163種類の香料成分についてTGR5アゴニスト

これらの成分を有効に用いることにより，畜肉生

活性を評価した。その結果，αイオノン，ヌート

産において飼料効率を上昇させ，筋量増加をもたカトンに良好なアゴニスト活性を見出した（Fig.

ら す 基 盤 研 究 を 行 っ た 。本 研 究 で は ，新 た な

2A）。TGR5の内因性リガンドである胆汁酸の中

TGR5アゴニスト活性を有する香料成分の探索をでもアゴニスト活性の高いケノデオキシコール酸

行い，その成分の活性評価を行った。

CDCAと活性の比較を行った５）。培地にそれぞれ

２．方

10，30，100μＭの化合物を添加した際に，濃度法

依存的にルシフェラーゼ活性が上昇した（Fig.

HEK293細胞にヒトTGR5発現ベクター，レポー

2B）。αイオノン，ヌートカトンともにアゴニスター遺伝子を導入した後に24時間培養し，各種香ト活性はCDCAと同等か，それ以上のレベルで料成分（DMSOに溶解）を培地に添加し，５時間

あ っ た 。ま た ，本 ア ッ セ イ 系 に お い て ，ヒ ト

後に細胞を回収し，ルシフェラーゼアッセイ法にTGR5を発現させないとルシフェラーゼ活性は検て活性を定量評価した。具体的には，HEK293は出されず，この活性が受容体を介したものである

胆汁酸受容体を発現していないことより，ヒトことを示している（Fig. 2C）。

TGR5 発 現 ベ ク タ ー を 遺 伝 子 導 入 し ，さ ら にαイオノンについてはその誘導体３種類（αメcAMP response element（CRE）配 列 を ４ 回 繰

チルイオノン，αアリルイオノン，αイロン）にり返した人工応答配列をluciferase遺伝子上流についてもTGR5アゴニスト活性を評価した（Fig.

組み込んだレポーター遺伝子を同時に細胞に導入3A）。その結果，αメチルイオノンはαイオノン

した。培地に添加した化合物がヒトTGR5に結合に比較して活性がやや低かったものの，いずれのし，アゴニストとして作用すると細胞内のcAMP誘導体もアゴニスト活性を有することが分かった

Aroma compounds

Human TGR5
HEK293 cells

cAMP
-

P

CREB
CRE CRE CRE CRE

Luciferase

Fig. 1 Scheme of TGR5 agonist assay© The Ito Foundation

337

筋肉タンパク質合成・分解を制御する植物性成分による畜肉生産の向上研究
A

O
H3C

OH

CH3

H3C

O

CH3

CH3

CH3

OH

CDCA

d

d
c

c
b
a

Nootkatone

C

d

c

b
a

b
a

140
120
100
80
60

α-Ionone

Nootkatone

Control

b b

CDCA

b

α-Ionone
Nootkatone

40
20
0

CDCA

CH2
O

α-Ionone

Relative luciferase activity

Relative luciferase activity

160
140
120
100
80
60
40
20
0

CH3

CH3

HO

B

CH3
CH3

a a a aaTGR5（－）TGR5（+）

Fig. 2 α-Ionone and nootkatone activate TGR5.（A）Structure of CDCA，α-ionone, and nootkatone.（B）TGR5 agonist activity was measured by using HEK293 cells transfected with the CRE-driven
luciferase reporter plasmid and hTGR5 expression plasmid. The concentration of each compound
is 0, 10, 30, and 100μM（n＝3）．
（C）CRE-driven luciferase activity was measured by using HEK293
cells with or without hTGR5. All compounds were treated at 100μM（n＝3））．The values arepresented as mean ± SD. The luciferase activity of the CDCA （100μM）treatment group was set
at 100. Statistical analyses were conducted using one-way ANOVA（Tukey-Kramer post hoctest）.Different letters denote statistical significance in each treatment group（p＜0.05）．

（Fig. 3B）。

CDCAと比較して小分子であり，これら化合物が同様にヌートカトンの２種類の誘導体（ジヒド

強いアゴニスト活性を有することは予想していな

ロヌートカトン，ジデヒドロヌートカトン）につかった。また，ヌートカトンについてはAMPキ

いても評価を行った（Fig. 3C）。ジヒドロヌート

ナーゼ活性化剤として機能し，マウス投与実験でカトンはやや高活性を示し，２種類の誘導体はいは持久力を上昇させることが報告されている。骨ずれもTGR5アゴニスト活性を有することが明ら格筋に対して複数の機能を有する化合物として興かになった（Fig. 3D）。

味深い。

また，αイオノンの異性体であるβイオノンに

TGR5は７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体

ついてもTGR5アゴニスト活性を評価したが，そ（GPCR）の一つであり，これまでの報告から，の 活 性 は α イ オ ノ ン に 比 べ て 低 か っ た（Fig.

小腸・大腸のＬ細胞において胆汁酸を結合すると

4A，B）。しかし，濃度依存的にルシフェラーゼ

インクレチンGLP-1分泌を促し，糖代謝改善効果

活性を上昇させることより，低活性アゴニストでを発揮することが報告されている６）。同時に，脂あることを確認した。

肪細胞においては熱産生を促し，抗肥満効果を発

上記のいずれの香料成分も内因性アゴニストの揮することも報告されている。我々は，骨格筋に© The Ito Foundation

338

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

A
H3C

O

CH3

H3C

O

CH3

CH2

CH3

H3C

O
CH3

CH3

α-Methylionone

CH3

CH3

H3C

CH3

α-Allylionone

α-IroneB
Relativeluciferase activity

c

d

120
100
b

80

b

bc

c
b

60

a

40
20
0

CDCA

α-Ionone

C

CH3
CH3

a
a

α-Methyliononeaα-Allylionone

CH3
CH3

CH3

CH2

O

O

Dihydronootkatone

Didehydronootkatone

Relativeluciferase activity

200

d

150

0

b

c

100
50

α-Irone

CH3

CH2

D

c

b

b

a

a

a

b

ab

c

a

ab

ab

b
a

CDCA

bc

b

a

Nootkatone

c

c

a

DihydronootkatoneabaDidehydronootkatone

Fig. 3 Derivatives of α-ionone and nootkatone activate TGR5.（A）Structure of α-ionone derivatives.

（B）TGR5 activation was evaluated using HEK293 cells transfected with the CRE-driven luciferase
reporter plasmid and hTGR5 expression plasmid. The concentration of CDCA，α-ionone, andtheir derivatives is 0, 10, 30, and 100μM（n＝3）．（C）Structure of nootkatone derivatives.（D）TGR5 activation was evaluated using HEK293 cells transfected with the CRE-driven luciferase
reporter plasmid and hTGR5 expression plasmid. The concentration of CDCA, nootkatone, andtheir derivatives is 0, 10, 30, and 100μM（n＝3）．The values are presented as mean ± SD. The
luciferase activity of the CDCA（100μM）treatment group was set at 100. Statistical analyses wereconducted using one-way ANOVA（Tukey-Kramer post hoc test）. Different letters denotestatistical significance in each treatment group（p＜0.05）．

おいてTGR5が筋量増強を促す作用を有すること

リンを見出し３），マスリン酸をはじめとする複数を報告してきた。

のトリテルペン類 ４，７）にもアゴニスト活性があ

さらに，TGR5に結合してアゴニスト活性を示る。通常GPCRのアゴニストは限られた化合物です食品成分の探索も行ってきた。柑橘成分のノミ

あ り ，多 岐 な 構 造 を 有 す る 化 合 物 を 結 合 す る© The Ito Foundation

筋肉タンパク質合成・分解を制御する植物性成分による畜肉生産の向上研究
A

H3C

339

O

CH3

CH3

CH3

β-Ionone

B
Relative luciferase activity

140

c

120
c

100
80

b

b

60
40
20

a

a

0
CDCA

a

a

β-IononeFig. 4 Effect of β-ionone on TGR5 activity.（A）Structureof β-ionone.（B）TGR5 agonist activity was measured
by using HEK293 cells transfected with the CREdriven luciferase reporter plasmid and hTGR5
expression plasmid. The concentrations of CDCA and
β-ionone are 0, 10, 30, and100μM （n＝3）．The
values are presented as mean ±SD. The luciferase
activity of the CDCA（100μM）treatment group was
set at 100. Statistical analyses were conducted using
one-way ANOVA（Tukey-Kramer post hoc test）.
Different letters denote statistical significance in eachtreatment group（p＜0.05）．

TGR5は稀有なGPCRといえる。本研究により，豚等のTGR5を用いたアッセイ系で活性を再評価

小分子である香料化合物にもアゴニスト活性が見することは必要と考えられる。ヒトと牛のTGR5出されたのは，TGR5が広範な構造の化合物を結は87％アミノ酸相同性を保持している。またこれ合するポケットを有することを示唆している。

までの研究から，柑橘成分ノミリンのヒトTGR5

これまでの解析から，TGR5アゴニスト活性をへの結合には，77番目のGln，80番目のArg，89有する化合物はタンパク質合成を促進し，動物実

番目のTyrが必須であることを確認している９）。

験では筋量が増強することを確認している４，８）。

牛TGR5はこの３アミノ酸をそれぞれ保持してお本研究で見出した香料化合物についても，細胞培り，ヒトTGR5同様に香料成分を結合する可能性

養実験，動物実験で筋量増強効果を検証する必要がある。ただし，香料成分は他のアミノ酸を結合がある。本研究ではヒトTGR5をHEK293細胞にに必要としていることも想定されることから，今発現させ，アゴニスト活性を有する化合物の探索

後は直接的な結合実験を実施する必要がある。

を行った。畜肉生産の向上を考えたときに，牛，© The Ito Foundation

340
４．要

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

たのは，TGR5が広範な構造の化合物を結合する

約

ポケットを有することを示唆している。

骨格筋を構成する筋管細胞表面には複数の本研究により複数の香料成分にヒトTGR5アゴ

GPCRが発現している。なかでもアドレナリン類

ニスト活性が見出されたが，これらが牛，豚等のを結合するβ２アドレナリン受容体は，リガンド

TGR5のアゴニスト活性を有するかについてはさを結合すると細胞内cAMPを上昇させ，下流のシらなる解析が必要である。ヒトと牛のTGR5はグナル伝達を介して筋量を増加させる。胆汁酸受87％アミノ酸相同性を保持しており，香料成分が

容体TGR5は全身の各組織に発現しており，骨格アゴニスト活性を有することが期待される。

筋での機能は不明であったことより我々は骨格筋にヒトTGR5を過剰発現させたトランスジェン
ニックマウスを開発した。TGR5はβ２アドレナリン受容体同様，細胞内cAMPを上昇させること
より，筋量増強効果が期待されたが，トランス
ジェニックマウスで筋量増加が確認された。以上の知見より，TGR5リガンド活性を有する化合物には筋量上昇効果が期待できることから解析を進めた。これまでに柑橘成分ノミリン，マスリン酸
をはじめとするトリテルペン類にアゴニスト活性が見出されており，本研究では香料成分にアゴニ
スト成分の探索を行った。
HEK293細胞にヒトTGR5発現ベクター，レポー
ター遺伝子を導入した後に24時間培養し，各種香料成分（DMSOに溶解）を培地に添加し，５時間後に細胞を回収し，ルシフェラーゼアッセイ法にて活性を定量評価した。163種類の香料成分から，
αイオノン，ヌートカトンに良好なアゴニスト活性を見出した。さらにそれぞれの誘導体化合物を用意し，アゴニスト活性を評価したところ，誘導体にもほぼ同程度のアゴニスト活性を見出した。
通常GPCRのアゴニストは限られた化合物であり，多岐な構造を有する化合物を結合するTGR5は稀有なGPCRといえる。本研究により，小分子である香料化合物にもアゴニスト活性が見出され

文献１）
 Sasaki, T., et al.：The exercise-inducible bile
acid receptor Tgr5 improves skeletal muscle
function in mice, J. Biol. Chem., 293，10322～10332，
2018．
２）
 S a s a k i , T . , e t a l . ：M u s c l e - s p e c i f i c T G R 5
overexpression improves glucose clearance inglucose intolerant mice, J. Biol. Chem., 296，
100131，2021．
３）
 O n o , E . , e t a l . ：A n t i - o b e s i t y a n d a n t i hyperglycemic effects of the dietary citrus limonoid
nomilin in mice fed a high-fat diet, Biochem.
Biophys. Res. Commun., 410，677～681，2011４）
 Murata, S, et al.：Maslinic acid activates
mTORC1 and human TGR5 and induces skeletal
muscle hypertrophy, Biosci. Biotechnol. Biochem.,
85，311～2321，2021．
 Sasaki, T., et al.：Identification of α-ionone,５）
nootkatone, and their derivatives as TGR5 agonists,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 653，147～152，2023．
 Thomas, C., et al.：TGR5-mediated bile acid６）
sensing controls glucose homeostasis, Cell Metab.,
10，167～177，2009．
 Sato, R.：Nomilin as an anti-obesity and anti７）
hyperglycemic agent, Vitam. Horm., 91，425～439，
2013．
８）
 H o r i b a , T . , e t a l . ：D i e t a r y o b a c u n o n esupplementation stimulates muscle hypertrophy,
and suppresses hyperglycemia and obesity throughthe TGR5 and PPARγ pathway, Biochem. Biophys.
Res. Commun., 463，846～852，2015．
９）
 Sasaki, T., et al.：Identification of key amino acidresidues in the hTGR5-nomilin interaction andconstruction of its binding model, PLoS ONE, 12,e0179226，2017．

© The Ito Foundation

341

母体の乳生産性向上による効率的な肥育を目指す
基礎的研究（Ⅱ）
Efficient fattening by improving maternal milk production（Ⅱ）

津

上

優

作

（広島大学大学院統合生命科学研究科）

Yusaku Tsugami（Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University）

Improving maternal milk production contributes to the growth of suckling offspring. In
previous study, equol enhanced milk production ability of bovine mammary epithelial cells（MECs）in vitro. Equol is a metabolite of daidzein, a soy isoflavone, which is produced byintestinal bacteria. The metabolic conversion ability of equol from daidzein depends on
intestinal bacteria, thus there are individual differences. In addition, equol is easy to be
conjugated with glucuronic or sulfuric acid in the body and its bioactivity in terminal tissue isdecreased. In this study, to avoid the conjugation and decreased bioactivity, we focused on
percutaneous absorption and directly applicated equol onto lactating udders. For in vitro
experiments, MECs were cultured and treated with equol depending on concentrations. For invivo experiments, 1 ml of 200μM equol in 70％ ethanol was topical applicated to goat uddersfor 5 days. The results showed that MECs treated with equol at 5-50μM for 3 days increased
the amount of claudin-3, which is a main component of less-permeable tight junctions duringlactation, while equol treatment decreased the amount of claudin-4, which is increasing during
inflammation and causes leakage at tight junctions. The topical application of resveratrol toudders decreased somatic cell counts in milk after days 3-5, which means equol enhanced invivo tight junction barrier. In addition, equol treatment enhanced STAT5 activity, which is atranscriptional factor for milk production, in cultured MECs and milk yield of in vivo mammary
glands. To investigate whether improving maternal milk production contributes to the growthof suckling offspring, maternal udders were sprayed by equol for 3 weeks. However, there
were no differences between groups. In conclusion, it revealed that topical application of equol
to udders enhances milk production in lactating mammary glands．

１．目

乳生産性の改善は，子豚の日増体量を向上させる

的ことが報告されている１）。先行研究ではウシ乳腺

肉牛や豚は，分娩直後から離乳前までの成長は上皮細胞を用いたin vitro乳分泌モデルにおいて母体で産生される乳によるところが大きい。分娩

イソフラボンの１つであるエクオールが乳産生促前後の母豚へのアミノ酸給与による主要乳成分

進する転写因子であるSTAT5を活性し，乳産生（乳タンパク質・乳脂肪・乳糖）の増加を介した能力を向上させることが明らかになった２）。エク© The Ito Foundation

342

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

オールは大豆に含まれるダイズインの代謝産物でクチン，１μＭデキサメタゾンを含むDMEM/あり，摂取後，腸内細菌による分解などを経て産F12）に変更し，２日間培養した。その後，エク生される。そのため，エクオールの産生能力は個

オ ー ル（Toronto Research Chemicals）を 添 加

体差が非常に大きい。また，産生されたエクオー

し，その影響を調べた。なお，溶媒コントロール

ルはグルクロン酸抱合体や硫酸抱合体の形成によとして0.05％

DMSOを使用した。

り標的組織での生理活性が低減する。前年の研究

2.2

において，ブドウに含まれるポリフェノールであ

離乳後のトカラヤギ乳房へ200μＭエクオール

るレスベラトロールを乳腺組織へ直接的に作用さを含む70％エタノールを１ml搾乳後に５日間塗せるため，塗布による経皮吸収経路に着目した。

布した。前処理として溶媒である0.2％DMSOを

分子量228であるレスベラトロールは培養モデル

含む70％エタノールを３日間塗布した。また，分においてヤギ乳腺上皮細胞の抗菌因子産生やタイ娩後７日目以降の母トカラヤギ乳房へ200μＭエ

トジャンクション（TJ）バリア機能を向上させ，クオールを含む70％エタノールをスプレーによりヤギ乳房への塗布により，生体レベルでもその効噴霧した（約1.1ml／乳房）。噴霧処理は３週間行

果が確認された。エクオールの分子量は242であい，分娩後２ヶ月で離乳した。採取した乳汁は，り，経皮吸収の分子量限界は500である３）。そこCountess II FL Automated Cell Counterで本研究では，乳腺上皮細胞の乳産生能力を向上（Thermo Fisher Scientific）を用いた乳中体細胞

しうるエクオールを乳房へ塗布し，子の増体およ

数（SCC）の測定やELISAに供試した。
2.3

び免疫機能への影響を検証した。
本研究における動物実験は，広島大学動物実験

2.1

ウェスタンブロッティング

エクオール処理した乳腺上皮細胞層を供試した。SDS-PAGE後，PVDF膜に転写した。ブロッ

委員会の承認を得て行った（no. C22-25）。
２．方

カラヤギ乳房への塗布試験

キング溶液として４％スキムミルク／PBS-T溶法

液 を 使 用 し た 。一 次 抗 体 に は ，Cell Signaling
Technologyから購入した抗pSTAT5，抗STAT5

乳腺上皮細胞の培養

泌乳期トカラヤギから乳腺を採材し，PBSで洗抗体，Thermo Fisher Scientific社から購入した

浄後，メスを用いて細切した。続いて，１mg/

抗claudin-3，抗claudin-4抗体およびGeneTex社

mlコラゲナーゼを含むDMEM/F12培地中で３時から購入した抗α-tubulin抗体を使用した。二次間振盪した。その後，トリプシン処理と密度勾配

抗 体 は ， Bio-Rad か ら 購 入 し た Horseradish

遠心を２回行い，乳腺上皮細胞塊を単離して使用

peroxidase標識した抗ウサギあるいは抗マウス時まで凍結保存した。

IgG抗体（×2500-5000）を使用した。バンドの乳腺上皮細胞塊を解凍後，24ウェルプレート上検出には，発光基質溶液であるImmobilon Forteに播種し，増殖培地（５％ウシ胎児血清，５μg/

Western HRP Substrate（Millipore）とEz-Capture

ml ITS-X，10ng/ml上皮成長因子，５mM酢酸ナ

II（ATTO）を用いた。

トリウムを含むDMEM/F12）でコンフルエント

2.4になるまで培養した。続いて，分化培地（１％ウ

競合ELISAによってIL-1β，TNF-α，INF-

シ胎児血清，５μg/ml ITS-X，１ng/ml上皮成

γ濃度を測定した。各抗体は合成ペプチドをウサ

長因子，５mM酢酸ナトリウム，１μg/mlプロラ

ギへ免疫して作製し，ペプチドへのHorseradish© The Ito Foundation

ELISA

343

母体の乳生産性向上による効率的な肥育を目指す基礎的研究（Ⅱ）

peroxidase 標 識 は Peroxidase Labeling Kit-NH2

群ではpSTAT5量がそれぞれコントロール群の２もしくはKit-SH（Dojindo Laboratories）を用い倍，2.5倍に増加していた。以上より，エクオー

た。また，サンドウィッチELISAによってIgA，

ルはヤギ乳腺上皮細胞においてもクローディン量

IgG濃度を測定した。抗goat-IgA，抗goat-IgG抗を調節し，STAT5を活性化することが判明した。

体 お よ び Horseradish peroxidase 標 識 し た 抗

続いて離乳後ヤギ乳房へのエクオール塗布が及ぼ

goat-IgA，抗goat-IgG抗体はBethyl Laboratories

す影響を調べた（Fig. ２）。乳量はエクオール塗から購入した。発色にはTMBを用いた。

布３日後と５日後において，塗布前より1.2倍に

2.5

統計解析

増加していた。また，SCCとIgG濃度は塗布３日

数値データはｎ＝５以上の平均値とし，統計分

後と５日後において有意に低下していた。

析はスチューデントのｔ検定もしくはダネット検

泌乳期の乳腺TJはクローディン-３を主体に構定を用い，p＜0.05を有意とした。また，in vitro

成され，透過性の低い強固なバリア機能を示し，実験は再現性を確かめるため，異なるヤギ由来に

一方で，乳房炎や離乳時にはクローディン-４のよる独立した培養を３回以上行った。

増加とともにバリア機能が低下する４，５）。また，
SCCには主に好中球やマクロファージなどの白血３．結果と考察球が含まれており，乳腺上皮細胞の細胞間隙を通５-50μＭ処理群においてクローディン-３量がコ

大半が血液由来であり，これも主に細胞間隙を介ントロール群の1.3倍以上に増加していた（Fig.

して乳中へ移行する６）。培養モデルにおいてエク

１）。また，50μＭ処理群ではクローディン-４量

オール処理によるクローディン-3の増加とクローが有意に減少していた。さらに，10，50μＭ処理

ディン-4の減少が確認され，in vivo実験におい

pSTAT5STAT5α-tubulin
ctrl 0.5 1

5 10 50
（μM）

＊

＊ ＊

1
0

ctrl 0.5 1 5 10 50

4

＊

3

＊

2
1
0

ctrl 0.5 1 5 10 50

STAT5（ratio）

claudin-4

pSTAT5（ratio）

claudin-3

2

claudin-4（ratio）

過して乳腺内腔へ遊走する。さらに，乳中IgGはclaudin-3（ratio）

各濃度のエクオールを３日間処理したところ，

2
1
0

＊

ctrl 0.5 1 5 10 50210

ctrl 0.5 1 5 10 50

Fig. 1 Influence of equol on claudins and STAT5 in goat mammary epithelial cells（GMECs）．
GMECs were treated with equol at each concentration for 3 days. The bands show

claudin-3, claudin-4, pSTAT5, STAT5, and α-tubulin by western blot. The graphshows the result for the densitometry analysis of the bands. Alpha-tubulin was used as
an internal control. The data are presented as the mean ± SD（n ＝ 8）．Asterisks show
a significant difference（p＜0.05 versus control）．

© The Ito Foundation

100
50

10
5
0

－2 －1 0 1 2 3 4 5

0.5

80
60
40
20
0

IL-1β（ratio）

1.5

＊
＊

1
0.5
0

－2－1 0 1 2 3 5

＊＊

0.5

100
50

－2－1 0 1 2 3 5

2
1.5
1
0.5
0

－2－1 0 1 2 3 51
0.5－2－1 0 1 2 3 5

2

1
0.5

1.5
1

＊＊

0.5
0

－2－1 0 1 2 3 5－2－1 0 1 2 3 5

400
300
200
100
0

－2－1 0 1 2 3 5

＊

6

＊

1.5

0

－2 －1 0 1 2 3 5

1.5

0－2－1 0 1 2 3 5150

0－2 －1 0 1 2 3 5

2

1

0

－2－1 0 1 2 3 4 5

TNF-α（μg/ml）

IL-1β（μg/ml）

0

1.5

IgA（ratio）

1

10

2

IFN-γ（μg/ml）

1.5

2

＊ ＊

SCC（ratio）

2

TNF-α（ratio）

milk yield（ratio）

（day）

2

20

0

－2－1 0 1 2 3 5IFN-γ（ratio）

030

IgG（mg/ml）

200
150

15

IgA（μg/ml）

250

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

IgG（ratio）

令和４年度
SCC（×105/ml）

milk yield（ml）

344

＊

4
2
0

－2 －1 0 1 2 3 5

Fig. 2 Influence of topical application of equol to lactating goat udders．

 ne ml of 200μM equol in 70％ ethanol containing 0.2％ dimethyl sulfoxide was applicated to the udderOof lactating goats on days 0-4 after milking. The upper graphs show changes in individual udders andthe lower graphs show changes in the relative values compared with the average of the pre-treated（days －2 and 0）controls. The data are presented as the mean±SD（n＝10）．Asterisks show a significant
difference（p＜0.05 versus pre-treatment）．

てSCCとIgG濃度が低下していた。そのため，エ質・乳量の向上に寄与することが期待される。

クオール塗布は乳腺TJバリア機能を強化するこ

最後に，食肉産業への発展として母体の乳産生とが判明した。IgAは乳腺上皮細胞のエンドサイ調節による子の増体および免疫機能への影響を調

トーシスを介して乳中へ分泌されるため，塗布にべた。分娩直後の初乳は常乳と大きく成分が異なよる変化が観察されなかったと考えられる。さらる。そのため，分娩後７日目以降から処理を開始に，エクオールは乳成分産生を促進する転写因子した。また，乳房への塗布作業を簡便にするためであるSTAT5の活性化とともに，塗布による乳スプレーを用いた噴霧処理に変更した。噴霧処理量の増加も認められたため，酪農生産として乳３週間後（分娩後１ヶ月：１Ｍ）および分娩後© The Ito Foundation

345

母体の乳生産性向上による効率的な肥育を目指す基礎的研究（Ⅱ）

20ctrl equol

ctrl equol

1M

2M

10
5
0

ctrl equol

ctrl equol

1M

2M

IgG（mg/ml）

4

80
60
40
20
0

ctrl equol

ctrl equol

1M

2M

30
20
10
0

ctrl equol

ctrl equol

1M

2M

1
0.5
0

ctrl equol ctrl equol
1M

IFN-γ（μg/ml）

IgA（μg/ml）

6

TNF-α（μg/ml）

IL-1β（μg/ml）

SCC（×105/ml）

A maternal milk

2M

600
400
200
0

ctrl equol ctrl equol
1M

2M

ctrl equol

ctrl equol

1M

2M

0

ctrl equol

ctrl equol

1M

2M

30
20
10
0

ctrl equol

ctrl equol

1M

2M

IgG（mg/ml）

5

80
60
40
20
0

ctrl equol

ctrl equol

1M

2M

15

IFN-γ（μg/ml）

IgA（μg/ml）

10

TNF-α（ng/ml）

IL-1β（ng/ml）

body weight（kg）

B kid blood

10
50ctrl equol

ctrl equol

1M

2M

15
10
5
0

300
200
100
0

ctrl equol ctrl equol
1M

2M

Fig. 3 Influence of equol spraying to lactating goat udders on growth of suckling offspring．

One ml of 200μM equol in 70％ ethanol containing 0.2％ dimethyl sulfoxide was applicated tothe udder of maternal goats 1 week after parturition for 3 weeks. Graphs showed each value
at a month（1M）and 2 months（2M）after birth（n=5 or 6）. Cnotrol group（ctrl）was
applicated only vehicle（70% ethanol containing 0.2% dimethyl sulfoxide）.

２ヶ月（２Ｍ）における母ヤギ乳汁と子ヤギ血液を採取し，免疫グロブリン濃度やサイトカイン濃度を測定した（Fig. ３）。離乳後ヤギ乳房へのエ極めていく必要がある。
４．要

約

クオール塗布では乳中サイトカイン濃度への変化

本研究では，母体の乳生産向上による肥育効率が認められたが，３週間の噴霧処理では乳中のの改善を目指し，乳腺上皮細胞の乳産生能力を向SCCや子の体重および各濃度に有意差は認めらな上しうるエクオールを乳房へ塗布し，子の増体おかった。今後，サンプル数を増やすとともに疾病

よび免疫機能への影響を検証した。まず，ヤギ乳発症率などを追跡し，エクオールによる効果を見

腺上皮細胞の培養モデルを用いてエクオールがタ© The Ito Foundation

346

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

イトジャンクション（TJ）と乳生産を促進する
転写因子に及ぼす影響を調べた。その結果，エクオール処理によって，泌乳期乳腺TJの主要タン
パク質であるクローディン-3量の増加と炎症時のバリア機能の低下に関与するクローディン-4量の減少が判明した。また，STAT5の活性化も促進されることが判明した。さらに，生体レベルの実験として，200μＭエクオールを含む70％エタノー
ル１mlを泌乳期ヤギ乳房へ５日間塗布した。その結果，塗布３日後には乳中体細胞数の低下や乳量の増加も認められ，エクオール塗布が生体レベ
ルでも有効であることが証明された。最後に，分娩７日後から３週間乳房へのスプレーによる噴霧処理を行い，子の増体や免疫機能への影響を調べたが，統計的な有意差は認められなかった。以上

文
献１）
 Kaiguo Gao, Xiaolu Wen, Chunyan Guo, Li Wang,
Wenjie Ban, Xuefen Yang, Zhijun Wu, Zongyong
Jiang：Journal of Animal Science, 98, skaa261，
2020．
２）
 Yusaku Tsugami, Haruka Wakasa, Manabu
Kawahara, Takanori Nishimura, Ken Kobayashi：
Animal Science Journal, 93, e13720，2022．
 Jan D. Bos, Marcus M. H. M. Meinardi：
３）
Experimental Dermatology，9，165～169，2000．
４）
 Heidi K Baumgartner, Michael C Rudolph,
Palaniappian Ramanathan, Valerie Burns, Patricia
Webb, Benjamin G Bitler, Torsten Stein, Ken
Kobayashi, Margaret C Neville：Journal of
Mammary Gland Biology and Neoplasia，22，141～
157，2017．
 Ken Kobayashi, Shoko Oyama, Atsushi Numata,５）
Md Morshedur Rahman, Haruto Kumura：PLoS
One, 8, e62187，2013．
６）
 Samantha K Wall, Lorenzo E HernandezCastellano, Amir Ahmadpour, Rupert M
Bruckmaier, Olga Wellnitz：Journal of Dairy
Science，99，7544～7553，2016．

より，乳房へのエクオール塗布は乳腺における乳産生やTJバリア機能を向上させることが分かった。

© The Ito Foundation

347

寒地型多年生牧草採草地が１年生イネ科草種（自生イタリアンライグラス―イヌビエ・メヒシバ）
交代植生に遷移する気候・土壌要因の解明と飼料価値の評価（Ⅱ）
Climate and soil factors of succession from temperate perennial grassland
to annual grassland and evaluation of the feeding value（Ⅱ）

池

田

堅太郎

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センター）

Kentaro Ikeda（Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, NARO）

In Japan, temperate perennial grasses such as timothy（Phleum pratense）, orchardgrass（Dactylis glomerata L.）, and tall fescue（Festuca arundinacea）were introduced into Japanese
grasslands1). However, recently, global warming has caused severe depression of temperate
perennial grasses. Since then, unseeded Italian ryegrass （Lolium multiflorum Lam）
（native Italian ryegrass）became dominant every year. In some cases, tropical annual grass
species goldenrod（Echinochloa crus-galli（L.））and crabgrass（Digitaria adscendens（H.B.K.）
Henr））are dominant in summer and fall（annual grass alternate vegetation）. In this study, we
surveyed areas where diploid, tetraploid, and native Italian ryegrass-dominated forage areas
and areas where annual grass alternate vegetation may be distributed. The results showedthat areas of ryegrass ecotype year-round vegetation were located at mean annual
temperatures from 7.4℃ to 8.7℃, while annual grass alternate vegetation were located at meanannual temperatures from 8.4℃ to 12.4℃. These results indicate that temperate perennial
grassland may be replacing native Italian ryegrass dominant vegetation in areas with meanannual temperatures between 7.4℃ and 12.4℃ .

１．目

しい枯死が生じている２）。替わって，播種してい的ないイタリアンライグラス（Lolium multiflorum

わが国の採草地には，これまで，栄養価が高く，Lam）（以下，自生イタリアンライグラス）が毎毎年播種する必要がない寒地型多年生牧草である

年優占する植生に変化している。また，地域にチモシー（Phleum pratense），オーチャードグラ

よっては自生イタリアンライグラスの夏期の衰退

ス （Dactylis glomerata L.），ト ー ル フ ェ ス クに 伴 い ，暖 地 型 １ 年 生 イ ネ 科 草 種（イ ヌ ビ エ（Festuca arundinacea）が導入されてきた １）。し（Echinochloa crus-galli（L.））とメヒシバ（Digitaria

かし近年の温暖化により，寒地型多年生牧草の著

adscendens（H.B.K.）Henr））が夏～秋に優占す© The Ito Foundation

348

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

る二毛作の植生（以下，１年生イネ科草種二毛作

雪期間の長さの指標として日本全土の３月の最深交代植生）となっている場合も多発している。牧

積雪深（cm）データ（国土数値情報ダウンロー

草として広く栽培されているイタリアンライグラ

ドサービス）をGIS（QGIS）により１ｍ×１km

スは収量と栄養価に優れる草種である。また，１

メッシュ地図を作成し，取得した自生イタリアン

年生イネ科草種二毛作交代植生を構成するイヌビ

ライグラス優占採草地のGPS情報を重ねることエとメヒシバは牛の嗜好性が良好なため，繁殖雌で，二倍体集団植生と四倍体集団植生，自生イタ

牛や乾乳牛等維持期の粗飼料に適している。これ

リアンライグラス単作植生と１年生イネ科草種二らの草種は年間の気温較差が大きいモンスーン気毛作交代植生の採草地が分布する可能性のある地

候帯に位置するわが国の気候条件に適応した，省域を地図化した。

力的かつ持続的に生産可能な粗飼料源として期待できる。

３．結果と考察

そこで本研究では，自生イタリアンライグラス

Fig. １には，寒地型多年生牧草を播種したが自が優占している採草地が分布している地域の気象

生イタリアンライグラス優占植生に替わってし条件を明らかにするために，二倍体と四倍体，自まった採草地を示した。九州では比較的標高の高

生イタリアンライグラスが周年で優占する採草地

い阿蘇・くじゅう・飯田高原地域に位置する寒地と１年生イネ科草種二毛作交代植生の採草地の分型多年生牧草（オーチャードグラスとトールフェ

布する可能性がある地域を調査した。

スク）の採草地で多く確認し，最も高標高に位置２．方する寒地型多年生牧草の採草地（標高991m）で法も自生イタリアンライグラス優占植生になってい二倍体集団植生と四倍体集団植生，自生イタリ

た。北関東から東北にかけては低標高地域の採草

アンライグラス単作植生と１年生イネ科草種二毛

地と水田転換畑を草地造成した採草地で多く見ら

作交代植生の採草地が分布する可能性のある地域れた。北海道南部では，低標高で海岸に近い地域

を地図上で明らかにするために，北海道南部～北の採草地で多数確認された。

関東と九州において，初夏と初秋の年２回以上，草種別の冠部被度を１m コドラート法

Fig. ２には，自生イタリアンライグラス二倍体

で６箇

集団と四倍体集団で構成される採草地の分布を示所調査した。植生調査の結果から，初夏で自生イした。寒冷地の分布は３月最深積雪深（cm）を，

タリアンライグラス（芒を有するライグラスをイ

温暖地の分布は年平均気温（℃）の平年値データ

タリアンライグラスと定義）が優占し，初秋でイをメッシュ地図に重ね合わせて表示した。寒冷地

ヌビエとメヒシバが優占する採草地を１年生イネの自生イタリアンライグラス優占採草地は３月最科草種二毛作交代植生とした。また，自生イタリ

深積雪深100cm以下の地域に分布していた。そのアンライグラスが１年を通して優占する採草地を中で，四倍体自生集団は30～100cmの地域に，二自生イタリアンライグラス単作植生とした。ま

倍体自生集団は30cm未満の地域に分布していた。

た，フローサイトメトリーにより自生イタリアン

また，九州に分布する自生イタリアンライグラス

ライグラスを二倍体集団と四倍体集団に分類し優占採草地はすべて二倍体集団であった。

２

３）た。植生調査を行った採草地はGPS情報（緯度，Fig. ３には，１年生イネ科草種二毛作交代植生

経度，標高）を取得した。年平均気温（℃）と根の採草地の位置と，位置情報から得た分布の最低© The Ito Foundation

349

寒地型多年生牧草採草地が１年生イネ科草種（自生イタリアンライグラス―イヌビエ・メヒシバ）交代植生に遷移する気候・土壌要因の解明と飼料価値の評価（Ⅱ）

Annual mean air
temperature（℃）
Below 8.0

Investigation point

8.0-9.0
9.0-10.0
10.0-11.0
11.0-12.0
12.0-13.0
13.0-14.0
14.0-15.0
15.0-16.0
16.0-17.0
17.0-18.0
Over 18.0

Fig. 1 Distribution of ecotypes Italian ryegrass populations.

Deepest snow depth
in March（cm）
0.0

Annual mean air
temperature（℃）

0.0-10.0

Below 8.0

10.0-30.0

8.0-10.0

30.0-100.0

10.0-12.0

Over 100.0

12.0-14.0● Tetraploid (4n) ecotype

14.0-16.0○ Diploid (2n) ecotype

Over 16.0

Fig. 2 Distribution of diploid and tetraploid ecotypes Italian ryegrass populations.

© The Ito Foundation

350

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Investigation point

Annual mean air
temperature（℃）
Below 8.4
Distribution
Over 12.4
Fig. 3 Distribution of Annual grass alternate vegetation.

平均気温と最高平均気温から算出した分布の可能

見ると，北海道から自生イタリアンライグラス単性がある地域を示した。１年生イネ科草種二毛作

作植生の採草地が分布していた。東北北部から北

交代植生に変化している寒地型多年生牧草の採草

海道南部の間に急激な気候変化の区分は見られな地は，年平均気温（平年値）が8.4℃～12.4℃の位い。本州の寒地型多年生牧草の採草地では，オー置に分布していた。地図上で見ると，西日本では

チャードグラスを年３回収穫する体系が定着して高標高地域の寒地型多年生牧草の採草地でも，１いる。一方，北海道南部は北海道の他の地域と同

年生イネ科草種二毛作交代植生の採草地に替わる様にチモシーを年２回収穫する体系が一般的に行可能性がある。また，北関東以北から青森にかけわれている。津軽海峡の南北で自生イタリアンラては高標高地域以外の地域では１年生イネ科草種

イグラス単作植生と１年生イネ科草種二毛作交代

二毛作交代植生に替わる可能性がある。

植生の違いが急激に生じるのは，気候条件だけでFig. ４には，自生イタリアンライグラス単作植
生の採草地の位置と，位置情報から得た分布の最なく，基幹草種と収穫体系の違いも要因の１つだと考えられる。

低平均気温と最高平均気温から算出した分布の可雪腐病に弱いイタリアンライグラスにとって，能性がある地域を示した。自生イタリアンライグ

根雪期間の長さに耐えられるか否かが，寒冷地でラス単作植生の採草地は，年平均気温（平年値）

栽培するうえで重要な課題である４）。本研究の結が7.4℃～8.7℃の位置に分布していた。地図上で果から，寒冷地における自生イタリアンライグラ© The Ito Foundation

寒地型多年生牧草採草地が１年生イネ科草種（自生イタリアンライグラス―イヌビエ・メヒシバ）交代植生に遷移する気候・土壌要因の解明と飼料価値の評価（Ⅱ）

351

Investigation point
Annual mean air
temperature（℃）
Below 7.4
Distribution
Over 8.7
Fig. 4 Distribution of Italian ryegrass ecotype year-round vegetation.

スの生育分布は根雪期間の長さにより，拡大を制海，西日本においても二毛作交代植生の採草地が限されていると考えられる。自生イタリアンライ

分布している可能性は高い。今回，明らかにしたグラスの中で，四倍体集団は３月最深積雪深30～

自生イタリアンライグラス優占採草地の分布予想

100cmの地域に分布している。自生イタリアンラ

メッシュ地図から，未確認の地域の採草地の植生

イグラスの二倍体集団と四倍体集団では，四倍体情報の収集が必要である。

集団のほうが雪腐病の抵抗性が高いため，より長い根雪期間の地域に四倍体集団が分布したと考え

４．要約る。北関東～東北の太平洋側の低標高地域に位置

わが国の採草地では寒地型多年生牧草であるチ

する採草地は１年生イネ科草種二毛作交代植生へ

モシー（Phleum pratense），オーチャードグラスと替わっており，九州における分布では，阿蘇・（Dactylis glomerata L.），トールフェスク（Festuca

くじゅう・飯田高原といった，高標高に位置する

arundinacea）が導入されてきた １）。しかし近年採草地で確認できたことから，九州における寒地の温暖化により，寒地型多年生牧草の著しい枯死型多年生牧草による粗飼料生産は温暖化が進むにが生じている２）。替わって，播種していないイタ

つれて，今後さらに難しくなると考えられる。

リ ア ン ラ イ グ ラ ス（Lolium multiflorum Lam）

今回調査できた地域は九州，東北，北海道に（以下，自生イタリアンライグラス）が毎年優占偏っているが，気象メッシュ地図から，関東，東する植生に替わっている。また，暖地型１年生イ© The Ito Foundation

352

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ネ科草種（イヌビエ（Echinochloa crus-galli（L.））

12.4℃の位置に分布していた。これらの結果から，とメヒシバ（Digitaria adscendens（H.B.K.）Henr））

年平均気温7.4℃～12.4℃の地域の寒地型多年生牧が夏～秋に優占する植生（以下，１年生イネ科草

草の採草地は自生イタリアンライグラス優占植生

種二毛作交代植生）となっている場合も確認されに替わっている可能性があることか示された。

ている。本研究では，自生イタリアンライグラスの優占する採草地が分布している地域の気象条件を明らかにするために，二倍体と四倍体，自生イ
タリアンライグラスが周年で優占する採草地と１
年生イネ科草種二毛作交代植生の採草地の分布する可能性がある地域を調査した。その結果，自生イタリアンライグラス単作植生の採草地は年平均
気温7.4℃～8.7℃の位置に，１年生イネ科草種二文
献１）
 農林水産省生産局：草地管理指標 草地の管理作業及び草地の採草利用編，40～90，日本草地種子協会，東京，2018．
２）
 樽見恵梨奈，築城幹典，森昭憲：システム農学，
34（1），７～15，2018．
３）
 日本草地学会：草地科学実験・調査法，185～221，
全国農村教育協会，東京，2004．
 田瀬和浩，小林真：日本草地学会誌，40（3），246
４）～256，1994．

毛 作 交 代 植 生 の 採 草 地 は ，年 平 均 気 温 8.4 ℃～© The Ito Foundation

353

骨格筋の成長と炎症予防（抑制）を目的とした
PGC-1αアイソフォームの発現制御に関する研究
Study on regulation of PGC-1α isoforms expression for skeletal muscle
growth and inflammation inhibition/prevention

實

安

隆

興１・西

本

和

樹２

（１神戸大学大学院農学研究科，２神戸大学農学部）

Takaoki Saneyasu１ and Kazuki Nishimoto２
２Faculty of Agriculture, Kobe University）（１Graduate school of Agricultural Science, Kobe University，Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α（PGC-1α ）contains
several isoforms. One of the isoforms, PGC-1α4, promotes muscle growth via an increase of
IGF-1 expression（Cell, 151, 1319-1331, 2012）. A previous study in hepatocytes shows that
PGC-1α1 inhibits inflammation, whereas PGC-1α4 inhibits apoptosis（Molecular Metabolism,34, 72-84, 2020）. Therefore, if gene expression of PGC-1α isoforms can be controlled and
PGC-1α isoforms have the same functions in the skeletal muscle as it does in hepatocytes,
these findings contribute to develop the method to promote muscle growth without causing
inflammation. One of the objectives of this study was to overexpress of PGC-1α1 and α4using adeno-associated virus vector in C2C12 myotubes to investigate whether PGC-1α
isoforms prevent inflammation and apoptosis in the myotubes. Another objective is to explore
culture conditions which promote gene expression of both PGC-1α1 and α4, and only PGC-1
α4, to clarify mechanisms of gene expression of PGC-1α isoforms. As a results, almost all
myotubes were infected when AAV vector was exposed to the cells at 1x10４ vg/cell. The
number of myoblasts at confluency just prior to induction of differentiation into myotubes could
be used to calculate multiplicity of infection. However, no overexpression of PGC-1α isoforms
was observed. Unlike the previous study（Cell, 151, 1319-1331, 2012.）, no significant increase of
PGC-1α4 mRNA levels was not observed in the cells treated with clenbuterol and forskolin.
Further studies are required to find suitable culture conditions．

１．目て生じる。それゆえ，根本的な原因であるむね肉

的の急速な肥大を抑制すれば異常むね肉の発生は防

近年，鶏肉生産において問題となっている異常

げる。しかしながら，生産性の観点からは別の方

むね肉は，むね肉の急速な肥大に伴う酸素や栄養法が望ましい。また，ニワトリに限らず，ウシやの不足，および酸化・小胞体ストレスの増加を起ブタにおいても筋肉の炎症は食肉としての価値を因として炎症が生じ，損傷した筋線維が再生され低下させ得る。それゆえ，骨格筋の炎症の予防やずに脂肪組織や結合組織に置き換わることによっ抑制は畜種によらず必要である。

© The Ito Foundation

354

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ

ウィルス（AAV）ベクターを用いた過剰発現系

共役因子-1α（PGC-1α）はミトコンドリアの生の構築を行った。また，PGC-1αアイソフォーム

合成やエネルギー代謝に関わる遺伝子の発現を制の遺伝子発現調節機構を明らかにするための一環

御することが知られている。PGC-1αには複数ので，先行研究１）を参考に，PGC-1αとα4の両方，

アイソフォームが存在し，PGC-1α4は従来からおよびPGC-1α4のみの遺伝子発現が促進される

知られていたアイソフォーム（PGC-1α1，一般条件を探索した。

的にPGC-1αと言われているもの）とは異なり，
IGF-1の遺伝子発現を介して筋肥大を促進するこ

２．方法とがマウスで明らかにされている１）。また，最近，

2.1

マウスの肝細胞においてPGC-1α1は炎症を，PGC-1α1（Accession No. NM_008904）とα4

PGC-1α4はアポトーシスをそれぞれ抑制するこ（JX866948）の CDS 領 域 を KAPA HiFi HotStartとが示唆されている 。したがって，PGC-1α1

PCR Kit（KAPA BIOSYSTEMS社）を用いて増とα4が骨格筋でも肝細胞と同様に働くこと，お幅後にアガロースゲル電気泳動に供し，推定されよびPGC-1αアイソフォームの遺伝子発現を制御

る増幅サイズのバンドを切り出し，FastGeneTMすることができれば，筋肥大を抑制することな

ゲル／PCR抽出キット（日本ジェネティクス株式

く，炎症やアポトーシスを予防・抑制できる可能会社）を用いて増幅産物を回収した。回収した増性が考えられる。

幅産物をAAVproⓇ Helper Free System（AAV1，

２）

１AAVベクターの作成

骨格筋におけるPGC-1αアイソフォームの遺伝

タ カ ラ バ イ オ 株 式 会 社）付 属 の pAAV-CMV

子発現はcAMP応答配列結合タンパク質やAMP

Vector に In-Fusion Ⓡ HD Cloning Kit（タ カ ラ バ

活性化プロテインキナーゼなどが関与しているこイオ株式会社）とStellarTM Competent Cells（タとが知られている３）。先行研究において，β２ア

カラバイオ株式会社）を用いてクローニングしドレナリン受容体作動薬であるクレンブテロール

た。NucleoBond Xtra Midi（タカラバイオ株式会

によってPGC-1α4のみの遺伝子発現が，アデニ社）を用いてプラスミド（pAAV Vector）を精製

ル酸シクラーゼ活性化剤であるフォルスコリンにし，PCRとシーケンス解析（株式会社ファスマッ

よって両アイソフォームの遺伝子発現がそれぞれク）にてインサートを確認した。精製したpAAV

促 進 す る こ と ，お よ び ク レ ン ブ テ ロ ー ル はVector，上記キット付属のpRC VectorとpHelper

PGC-1α1の遺伝子発現を抑制し，逆にPGC-1α4

Vector を， TransIT-293 Transfection Reagentの遺伝子発現を促進することが示されている。

（Mirus社）を用いてAAVproⓇ 293T Cell Line（タしかしながら，それらの先行研究では，両アイソ

カラバイオ株式会社）にトランスフェクション

フォームの発現調節機構の違いについては触れらし，一晩培養した。新しい培地（ベクター不含）

れておらず，アイソフォーム選択的遺伝子発現調に交換してさらに２日間培養後，AAVベクター

節機構はいまだ明らかにされていない。

をキット付属の試薬で抽出した。ウィルス力価は，

１）

４）本 研 究 で は ，骨 格 筋 研 究 で 汎 用 さ れ て い る

AAVproⓇ Titration Kit（for Real Time PCR）

C2C12筋管細胞を用いて，骨格筋においてPGC-1

Ver. ２（タカラバイオ株式会社）を用いて測定

α1とα4がそれぞれ炎症とアポトーシスを抑制しし た 。ま た ，コ ン ト ロ ー ル ベ ク タ ー と し て得るか調べることを目的に，本年度はアデノ随伴

AAV1-LacZ（タカラバイオ株式会社）を用いた。

© The Ito Foundation

骨格筋の成長と炎症予防（抑制）を目的としたPGC-1αアイソフォームの発現制御に関する研究

355

なお，AAVには種々のセロタイプが存在するが，を不含）に交換し，さらに１日培養後，細胞をC2C12細胞への感染力はAAV1以外のセロタイプ

X-gal染色に供した。

では低いことから５），本研究ではAAV1を選択し

2 . 3 AAVによるC2C12筋管細胞へのPGC-1α1とα4の過剰発現た。
2 . 2 C2C12 筋 管 細 胞 に お け る multiplicity of

2 . 2と同様の方法で筋管細胞を形成させた後，
2 . 1 で 作 製 し た AAV-LacZ ，AAV-PGC-1α1 ，

infectionの検討
FetalClone III（Cytiva），100 U/mlペニ

あるいはAAV-PGC-1α4を感染させた。翌日，シリン／100μg/mlストレプトマイシン（ナカラ新しい培地（AAVを不含）に交換し，さらに２イテスク株式会社）を含むDMEM培地（ナカラ日培養後，筋管細胞のタンパク質を抽出した。

10％

イテスク株式会社）に浮遊させた市販のC2C12

2 . 4 クレンブテロール，およびフォルスコリ

（DSファーマバイオメディカル株式会社）を12

ンがC2C12筋管細胞へのPGC-1α1とα4のウェルプレート（VIOLAMO，アズワン株式会

遺伝子発現に及ぼす影響

社）に播種（４×10 cells/ml/ウェル）し，37℃，

2 . 2と同様の方法で筋管細胞を形成させた後，５％ CO２で100％コンフルエントに達するまで培

１μＭクレンブテロール，あるいは10μＭフォル

養した。培地を除去し，PBS（－）でウェルを洗スコリンを培地に添加し，６時間培養後にRNA

浄後，トリプシン／EDTAを加えて細胞を剥離しを抽出してリアルタイムPCRに供した（ｎ＝４）。

４た。そこに10％

FetalClone IIIを含む培地を加2.5ウェスタンブロット分析

え，血球計算盤で細胞数を計測した（ｎ＝４）
。

以 前 の 報 告 と 同 様 に 行 っ た ６）。Anti-PGC-

上記と同様に12ウェルプレートで100％コンフ

1alpha（ST1202）は Calbiochem 社 より，anti-α

ルエントに達するまでC2C12を培養後，２％ウマ-tubulin（#2125），およびHRP-linked anti-mouse

血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック

IgG（#7076）はCSTジャパン株式会社よりそれ株式会社）を含むDMEM培地に交換し，筋管がぞれ購入した。ローディングコントロールとして形成されるまで培養した。筋管形成後，2.1で作

α-tubulinを用いた。

製 し た AAV-LacZ を ， multiplicity of infection

2.6（MOI）が０，0.25×10 ，0.5×10 ，あるいは１以前の報告と同様に行った６）。使用したプライ

４

４×10４ vg/cellとなるように感染させた。MOIの計

リアルタイムPCR

マーの塩基配列はTable１に示した。

算には，上記で計測した100％コンフルエント時の平均細胞数を用いた。翌日，新しい培地（AAV

Table１ Primer sequences used for real-time PCR analysis
Sense

Antisense

PGC-1α15’-ggacatgtgcagccaagactct-3’5’-cacttcaatccacccagaaagct-3’

PGC-1α45’-tcacaccaaacccacagaaa-3’

5’-ctggaagatatggcacat-3’β-actin5’-ccgggtcatcatcgagaagt-3’

5’-gcgcttgttggtgtggaagt-3’

The primer sequences of PGC-1α1 and α4 are the same as in previous studies. １），４），10）© The Ito Foundation

356

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

本研究では，先行研究８）を参考に，筋管細胞に分３．結果と考察化誘導する前の筋芽細胞数を計測し，MOIの計

AAVベクターは分裂／非分裂細胞のいずれに算に用いた。その結果，ウィルス粒子数依存的にも遺伝子導入が可能であり，特に非分裂細胞におX-gal染色される筋管細胞は増え，１×10 ４ vg/

いて長期間の目的遺伝子の発現が可能とされていcell で ほ と ん ど の 筋 管 細 胞 が X-gal 染 色 さ れ たる 。また，AAVベクターはＰ１レベルの施設（Fig. １）。し た が っ て ，C2C12 筋 管 細 胞 へ のでも取り扱いが可能であり，アデノウィルスベク

AAVベクターの導入においては，MOIの計算に

ターやレトロウィルスベクターに比べて安全で取筋管細胞への分化前の筋芽細胞数を用いることがり扱いが容易である 。しかしながら，AAVベ

でき，他の細胞への導入と同等のMOIが必要でクターを用いたC2C12筋管細胞における過剰発現あることが示された。

７）７）系の先行研究は少ない。また，筋管細胞は筋芽細

しかしながら，AAV-PGC-1α1によるPGC-1胞が融合して形成されること，特徴的な細長い形

α1の過剰発現は確認できなかった（Fig. ２）。ま態をしていること，および筋管細胞の状態では継た，AAV-PGC-1α4では想定サイズ付近にバン代できないことなどから，MOIの計算に用いる

ド様のものが観察されたが，明確な過剰発現は確

細胞数をどのように決めるか課題がある。そこで認できなかった（Fig. ２）。この原因は不明であANo treatment

0.5 x 10４0.25 x 10
1 x 10４ vg/cell
４B

No treatment

0.25 x 10４ vg/cell

0.5 x 10４ vg/cell

1 x 10４ vg/cell
100 μmFig. 1 Images of X-gal staining of C2C12 myotubes infectedwith AAV-LacZ. （A） Overview of each well. （B）
Representative microscope images. Scale bar，100μｍ．

© The Ito Foundation

骨格筋の成長と炎症予防（抑制）を目的としたPGC-1αアイソフォームの発現制御に関する研究
A
LacZ

PGC1α1PGC1α4357

Mass/kDa

100

B
50
40

C

Fig. 2 Representative images of Western blot analysis of

PGC-1α1（A）,PGC-1α4（B）,and α-tubulin（C）．

PGC-1α1/RPS17

3
2
1
0

Control

Clenbuterol

Forskolin

PGC-1α4/RPS173

p = 0.06
Relative expression

Relative expression

4

2

1

0

Control

Clenbuterol

Forskolin

Fig. 3 Relative expression of PGC-1α isoforms in C2C12 myotubes treated with clenbuteroland forskolin

るが，本研究では先行文献８，９）を参考にAAVベ

発現量クレンブテロール，およびフォルスコリン

クターをC2C12筋管細胞に暴露する時間を１日にによる有意な差は認められなかった（Fig. ３）。

したが，PGC-1αアイソフォームの過剰発現を誘先行研究の再現性が本研究で見られなかった原因

導するには短かったのかもしれない。今後，暴露は不明であるが，リアルタイムPCR分析の増幅曲

時間を２日以上に延長してその過剰発現を確認す

線の立ち上がりサイクル数から判断すると，る必要がある。

C2C12筋管細胞におけるPGC-1α4の遺伝子発現

先行研究と同様に，C2C12筋管細胞における量はPGC-1α1のそれと比べてきわめて少ないとPGC-1α1の遺伝子発現量はフォルスコリンに考えられることから，培養時間や薬剤濃度が最適

よって増加傾向を示し，クレンブテロールでは有でなかった可能性がある。また，培地中の血清の意な変化は見られなかった（Fig. ３）。しかしな

有無なども影響しているかもしれない。今後，培がら，先行研究

養条件を変更して検討する必要がある。

１）

１）と異なり，PGC-1α4の遺伝子© The Ito Foundation

358
４．要

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

約

本研究では，C2C12筋管細胞を用いて，AAV
ベクターによるPGC-1αアイソフォームの過剰発
現 系 の 構 築 と ，PGC-1α とα4 の 両 方 ，お よ び
PGC-1α4のみの遺伝子発現が促進される培養条件の探索を行った。その結果，筋管細胞に分化誘導する前のコンフルエント状態の筋芽細胞数をMOIの計算に用いて，１×10４ vg/cellでAAVベ
クターを暴露することでほとんどの筋管細胞に感染することが確認できたが，AAVベクターによるPGC-1αアイソフォームの過剰発現は確認できなかった。また，先行研究で報告されているクレ

文献１） Ruas, et al.：Cell，151，1319～1331，2012．
 Léveillé, et al.：Molecular Metabolism ，34 ，72～
２）
84，2020．
３） Popov, et al.：Acta Maturae，７，48～59，2015．
４） Martínez-Redondo, et al.：The Journal of
Biological Chemistry，291，15169～15184，2016．
５） Ellis, et al.：Virology Journal，10，74，2013．
６） Saneyasu, et al.：Growth Hormone & IGF
Research，65，101478，2022．
７） Website of Takara Bio Inc. Accessed on April 17,
2023. Available from URL：https://catalog.takarabio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=
U100007828
８） Hagstrom, et al.：Blood，95，2536～2542，2000．
９） Baek, et al.：Journal of Cachexia, Sarcopenia and
Muscle，13，1277～1288，2022．
10） Honda, et al.：Journal of Nutritional Science andVitaminology，67，217～224，2021．

ンブテロールとフォルスコリンによるPGC-1α4の発現促進を確認することはできなかった。

© The Ito Foundation

359

畜産動物の脂肪酸味覚受容体の機能解析
A study on fatty acid taste sensing in livestock animals

吉

田

悠

太

（茨城大学農学部食生命科学科）

Yuta Yoshida（Department of Food and Life Sciences, College of Agriculture, Ibaraki University）

Taste guides animals to ingest more nutritious foods and avoid toxic substances. Since
taste is related to feeding behaviors of animals, understanding of taste sense of livestock
animals will be an important step to improve feeding strategy in livestock production. Taste
substances in feeds directly interact with taste receptors expressed in the taste cells.
Therefore, analyses of taste receptors of livestock animals could visualize their taste sense. In
the present study, we focused on their fatty acid taste receptor, G protein-coupled receptor（GPR120）. We inserted the open reading frames（ORF）of GPR120 genes of omnivorous pigs,
herbivorous cows, and carnivorous cats into the mammalian expression vector. The vectors
were transiently transfected with human embryonic kidney 293T（HEK293T）cells. Then, thecells were loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo4 and measured their intracellular
calcium responses to fatty acid stimulations. Here, we found that pigGPR120 and cowGPR120
were activated by various concentrations to long-chain fatty acids（linoleic acid and oleic acid）.
On the other hand, catGPR120 had lower responses to the fatty acids, suggesting that feeding
behaviors could affect fatty acid taste sense in animals. The present study provided apossibility that long-chain fatty acids could play an important role in palatability of feeds inpigs and cows. Further analyses using the other fatty acid receptors will add ourunderstanding of taste sense in livestock animals．

１．目

理解されていない。さらに味覚は，動物の摂食行的動を制御する化学感覚であり，ウシの味覚受容特

味覚は，動物が生命維持に必要な栄養素を選択

性を明らかにすることで，反芻動物の味覚特性を的に摂取するために進化してきた化学感覚である

生かした嗜好性の高い飼料を設計するうえでの基ことから，動物の食性と味覚には密接な関係があ

礎的知見となることが期待できる。本研究では，ると考えられる。これまでにヒトやげっ歯類と畜産動物として重要な草食性・反芻動物であるウ

いった雑食性の動物の味覚に関する知見が蓄積さシ（Bos taurus）に加えて，雑食動物であるブタ

れてきたが，畜産動物として重要な草食動物かつ（Sus scrofa），な ら び に 肉 食 動 物 で あ る ネ コ

反芻動物であるウシの味覚特性については十分に（Felis catus）における味覚受容特性を比較解析© The Ito Foundation

360

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

することにした。

に，ssGPR120（NM_001204766.2），btGPR120

味物質は，口腔の舌表面に存在する味蕾に含ま（XM_005890636.2）
，ま

た

は

fcGPR120

れる味細胞膜に発現するセンサータンパク質であ（NM_001317359.1）のopen reading frame（ORF）

る味覚受容体によって受容される 。複数の味覚を挿入したコンストラクトを使用した。インサー受容体が，６種類の基本味（甘味，うま味，苦味，

ト配列を含まない空ベクター（mock）をコント

酸味，塩味，ならびに脂肪）のそれぞれに対応しロールとして用いた。

１）ていることで，我々は６種類の味覚を感じ分ける

2.3

ことができる 。本研究では，三大栄養素の一つ

リ ポ フ ェ ク シ ョ ン 法 に よ り ， ssGPR120/

である脂肪の味に着目した。脂肪酸の味は，近年

pcDNA3.1（＋），btGPR120/pcDNA3.1（＋），

基本味の１つであると認識されており ，マウス

fcGPR120/pcDNA3.1 （＋）， な ら び に mock をにおいては長鎖脂肪酸をリガンドに持つ２種類のHEK293T細胞に一過的にトランスフェクション

Ｇタンパク質共役受容体であるG protein-coupled

した。Poly-D-lysineでコーティングした96 well

receptor 40 and 120（GPR40，およびGPR120），

plateにHEK293T細胞を播種し，48時間培養したならびに脂肪酸トランスポーターであるcluster

後にカルシウムイメージング法による解析を行っ

of differentiation 36（CD36）が 脂 肪 酸 に 対 す る

た。

２）

３）

味覚反応で重要であることが示されている

。

４，５）

2.4

トランスフェクション

カルシウムイメージング

本研究では，長鎖脂肪酸に対する味覚受容体候補

蛍光カルシウム指示薬であるFluo4を，トランの一つであるGPR120の機能に着目した。本研究

スフェクションから48時間後のHEK293T細胞にでは，動物の味覚受容体タンパク質をヒトの腎臓

１時間インキュベータ内で負荷した後，カルシウ由来の培養細胞に発現させた味覚バイオセンサー

ムイメージングに供した。カルシウムイメージンを利用して，長鎖脂肪酸に対する，食性の異なる

グ測定には，マルチモードマイクロプレートリー

動物種のGPR120の応答性をカルシウムイメージダーであるFlexStation3（Molecular devices）をング法により解析した。

用いた。味刺激として，10，20，40，80，120，

２．方
2.1

および120μＭのリノール酸，ならびに20，40，

法

80，120，および160μＭのオレイン酸を用いた。
96 well plateの各ウェルに味刺激のための脂肪酸

細胞培養

ヒ ト 胎 児 腎 臓 由 来 培 養 細 胞 で あ る human

溶液を測定開始後17秒の時点で自動添加し，全体

embryonic kidney 293T細胞（HEK293T細胞）を，として90秒間蛍光強度の変化を測定した。蛍光強直径60mm dishに播種し，10％ウシ胎児由来血清

度は，２秒間隔で取得した。蛍光強度の変化は，であるfetal bovine serum（FBS）および１％

ΔF/F（蛍光強度の変化量／ベースラインの蛍光

penicillin-streptmycin （PS） を 含 む Dulbeccoʼs量）で示した。

Modified Eagle Medium（DMEM 培 地）を 用 いて，37℃，５％

CO２の条件で培養した。継代はブタ，ウシ，およびネコのGPR120をトランス

２日に１回行った。
2.2

３．結果と考察

フェクションしたHEK293T細胞の蛍光カルシウ

コンストラクト

哺 乳 類 発 現 ベ ク タ ー で あ る pcDNA3.1（＋）

ムイメージング解析の結果，ブタおよびウシの© The Ito Foundation

361

畜産動物の脂肪酸味覚受容体の機能解析

GPR120は，120μＭリノール酸の添加により，蛍光強度の変化量の最大値を比較すると，ブタとウ

光 強 度 が 増 大 し た （Fig. １）。一 方 ，ネ コ のシのGPR120の応答性に有意な差はなかったもの

GPR120は，ブタおよびウシのGPR120と比較しての，ネコのGPR120の応答性と比較して有意に高リノール酸添加による蛍光強度の変化が少なかっ

い活性が認められた（Fig. ２）。またコントローた（Fig. １）。また，空ベクターをトランスフェ

ルの細胞と比較して，ブタ，ウシ，およびネコのクションしたコントロールのHEK293T細胞はリ

GPR120 は い ず れ も 有 意 に 高 い 活 性 を 示 し た

ノール酸添加に対して蛍光強度が変化しなかった（Fig. ２）。

（Fig. １）。120μμＭリノール酸添加に対する蛍次に，ブタ，ウシ，およびネコのGPR120の長

0.9

ΔF/F

0.7
0.5
0.3
0.1
－0.1

0

10

20
Pig

30

40 50 60
Time［s］

Cow

Cat

70

80

90

Control

Fig. 1 Time-dependent activation of pig, cow, and catGPR120 by a 120μM linoleic acid stimulation

Time-dependent fluorescence changes of human embryonic kidney 293T（HEK293T）cells, which were transfectedwith omnivorous pigGPR120, herbivorous cowGPR120, carnivorous catGPR120, and control empty vector, by a 120
μM linoleic acid stimulation were shown. Horizontal line shows a timeline [s] after beginning of a measurement（0s）. Fluorescence was detected every 2 s for 90 s, and taste stimulation by 120μM linoleic acid was automatically
added at 17 s after beginning of a measurement. Values are the means of Δ F/F（change of fluorescence intensity/
fluorescence intensity at a baseline（0 s））± standard errors（n＝4）．
1

ΔF/F

0.8

a
a

0.6
0.4
b
0.2
c
0

Pig

Cow

Cat

Control

Fig. 2 Activation intensities of pig, cow, and catGPR120 by a 120μM linoleic acid stimulation

Intensities of fluorescence changes of HEK293T cells, which were transfected with omnivorous pigGPR120,

herbivorous cowGPR120, carnivorous catGPR120, and control empty vector, by a 120μM linoleic acid stimulation
were shown. Values are the means of ΔF/F（maximum amount of fluorescence intensity change/fluorescenceintensity at a baseline（0 s））± standard errors（n＝4）． Statistical analysis was performed by Welchʼs t -test with
Bonferroni correction. Bars without a common letter differ significantly（p＜0.05）．

© The Ito Foundation

362

令和４年度
A

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ΔF/F

1.2
0.9
0.6
0.3
0

10

20

40

80

120

160

Linoleic acid［µM］
Pig
B

Cow

Cat

Control

1.2

ΔF/F

0.9
0.6
0.3
0

20

40

80

120

160

Oleic acid［µM］
Pig

Cow

Cat

Control

Fig. 3 Dose-dependent activations of pig, cow, and catGPR120 by different concentrations of linoleic acid and oleic acidstimulations
 ose-dependent fluorescence changes of HEK293T cells, which were transfected with omnivorous pigGPR120,
D
herbivorous cowGPR120, carnivorous catGPR120, and control empty vector, by different concentrations of linoleicacid（A）and oleic acid（B）were shown. Values are the means of ΔF/F（maximum amount of fluorescenceintensity change/fluorescence intensity at a baseline（0 s））± standard errors（n＝4）．

鎖脂肪酸に対する濃度依存的な応答を解析した。

本研究により，食性の異なる動物種において長ブタおよびウシのGPR120は，さまざまな濃度の鎖脂肪酸受容体の機能が異なっていることが明ら

リノール酸，およびオレイン酸の添加により，蛍かとなった。雑食性のブタと草食性のウシの脂肪

光 強 度 が 増 大 し た（Fig. 3A ，B）。ま た ブ タ の酸味覚受容体は機能的であり，２種類の長鎖脂肪

GPR120は，ウシでは応答が見られない低濃度の酸に対して応答を示した。したがって，畜産動物

リノール酸，およびオレイン酸に対しても応答をであるウシやブタの飼料の嗜好性においては，長示した（Fig. 3A，B）。一方，ネコのGPR120は，鎖脂肪酸が重要な役割を果たす可能性が考えられ

ブタおよびウシと比較し，これらの長鎖脂肪酸にた。一方，肉食性のネコの脂肪酸味覚受容体は脂対 す る 応 答 性 が 低 か っ た も の の ，ま た ネ コ の肪酸刺激に対して応答性が低いことが明らかに

GPR120は，高濃度の160μＭリノール酸，ならびなったことから，ネコのペットフードにおいてに120および160μＭのオレイン酸に対してわずかは，長鎖脂肪酸はあまり嗜好性に寄与しない可能に応答を示した（Fig. 3A，B）。

性が考えられた。ただし，ネコのGPR120は160μ© The Ito Foundation

畜産動物の脂肪酸味覚受容体の機能解析

363

Ｍリノール酸および120μＭと160μＭのオレイン

クターpcDNA3.1（＋）に，ウシ，ブタ，および酸刺激によって蛍光強度の増大が見られたことか

ネコのGPR120のORFをそれぞれ挿入し，ヒト

ら，ネコのGPR120は，脂肪酸に対する応答性は胎児由来腎臓培養細胞に一過性にトランスフェク

低いものの，機能していることが示唆された。

ションし，96ウェルプレートに播種した。２日後，先行研究において，ヒトGPR120は，10μＭの蛍光カルシウム指示薬Fluo4を負荷し，マイクロさまざまな長鎖脂肪酸に対して応答を示すことがプレートリーダーFlexStation3を用いたCa ２＋ イ

報 告 さ れ て い る ６）。本 研 究 に お い て ，ブ タ のメージングに供した。蛍光強度は２秒ごとに取得

GPR120は10μＭのリノール酸溶液に応答を示し

し，90秒間測定した。測定開始後17秒時点で長鎖たが，ウシのGPR120は応答を示さなかった。ま脂肪酸溶液を培地に自動添加した。ブタ，およびた，20μＭのリノール酸および40μＭのオレイン

ウシのGPR120は，さまざまな長鎖脂肪酸に応答

酸に対する応答性は，ブタGPR120に比べてウシしたが，ネコのGPR120は，長鎖脂肪酸に対する

GPR120で低かった。これらのことから，ブタと応答性が低いことが明らかとなった。これらの結比較してウシのGPR120の脂肪酸に対する応答性

果から，長鎖脂肪酸は，畜産動物の飼料の嗜好性は低い可能性が考えられた。先行研究において，に重要な役割を果たす可能性が考えられた。まヒトGPR120のリガンドとの結合に寄与するアミ

た，ブタとウシのGPR120の長鎖脂肪酸に対するノ酸残基が報告されている 。その中で，197番

応答性に差が見られたことから，今後はアミノ酸

目のアミノ酸が，ヒトやブタではIleであるが，点変異体を用いた解析により，ブタとウシの脂肪

ウシではValであった。このIle197Valの置換がウ酸受容の差異に関与するアミノ酸残機を探索す

シのGPR120の応答性に寄与する可能性について，る。また，GPR120以外の脂肪酸受容体を用いた今後点変異を加えた受容体を用いて解析していく

解析により，畜産動物であるブタやウシの脂肪酸必要がある。今後の研究により，食性の異なる動受容機構の全容を明らかにしていくことで，嗜好物の味覚を理解していくことで，それぞれの畜産

性の高い飼料設計のためのそれぞれの畜産動物種

動物の食性に応じた嗜好性の高い飼料の開発や食の脂肪酸に対する味覚受容特性の解明が期待でき品残渣などを利用して生産されるエコフィードのる。

７）

嗜好性の向上に貢献できると考えられる。
４．要

約

味覚は，食物中の栄養素を検出するための化学感覚であり，動物の摂食行動を制御している。これまでに雑食性のヒトや齧歯類の味覚研究が進められてきたが，食性が異なる動物の味覚特性は不明な点が多い。特に本研究では，草食性かつ反芻動物であるウシの味覚受容機構に着目し，雑食性のブタ，肉食性のネコを加えて，長鎖脂肪酸の味
覚 受 容 体 で あ る G protein-coupled receptor 120

文献１）
 Chandrashekar, et al.：Nature，444，288～294，
2006．
２） Chaudhari and Roper：Nat. Rev. Neurosci., 18，
485～497，2017．
３） Running, et al.：Chem. Senses ， 40 ， 507～516，
2015．
４） Cartoni, et al.：J. Neurosci., 30，8376～8382，2010.
 Laugerette, et al.：J. Clin. Invest., 115，3177～3184，
５）2005.
６） Hudson, et al.：J. Biol. Chem., 289, 20345～20358,
2014．
７） Hudson, et al.：Mol. Pharmacol., 84 ， 710～725，
2013．

（GPR120）の機能解析を実施した。哺乳類発現ベ© The Ito Foundation

364

衛星コンステレーション画像の時系列深層学習による低コストな飼料用トウモロコシ収量予測手法の開発
Development of low-cost yield prediction method in corn by time-series
deep learning of satellite constellation images

小花和

宏

之・根

本

英

子

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構北海道農業研究センター）

Hiroyuki Obanawa and Eiko Nemoto（Hokkaido Agricultural Research Center, NARO）

We developed a new high-precision and low-cost yield prediction method of maize, which
is one of the important domestic feed crops in a meat production, using satellite constellations.
First, yield survey and drone aerial survey at two times, after sowing and before harvesting,were conducted at maize fields in three regions in Hokkaido. Three-dimensional models werecreated from the aerial images taken at two times, and a detailed plant height map was createdby calculating the vertical differences. We developed a drone-based yield prediction method by
the multi regression analysis of the variety of maize（relative maturity）, the effective
accumulated temperature, the plant heights estimated by the drone images, and the actual
yields. Next, a satellite-based yield prediction method was developed. We used the Planet
images, one of the constellation satellites with higher resolution（3 m）and shooting frequency（daily）compared to the conventional satellites. The maize yield data were generated by thedrone-based method. A large amount of the satellite imagery associated with the yield data
was generated by dividing the drone-based yield map into each pixel of the satellite imagery.
We developed a yield prediction method using satellites by the deep learning analysis of thebig datasets exceeding 58,000. The accuracy of the satellite-based yield prediction method
showed high prediction performance with an average relative error of 3.7％. The yieldprediction model will be further improved by increasing the amount of learning data（survey
year, field, and area）and quality（crop variety（RM）and weather conditions）and optimizing
the network structure and internal parameters of the deep learning model using additional
data. Satellite observation is a technology that can be deployed rapidly over a wide area at low
cost and, therefore, has strong potential to promote the realization of smart agriculture．

１．目の生育・収量が圃場ごとに大きく異なることがあ的る。トウモロコシの収穫はコントラクターなどにトウモロコシは，食肉生産における重要な飼料より地域単位で行われることが一般的であるた

作物の一つである。しかし，土壌，地形，天候，

め，収穫・調製作業にかかる人員・機械・施設の病虫害，鳥獣害等の影響により，栽培計画と実際

過不足が発生し，作業ロスにつながる。適切な収© The Ito Foundation

衛星コンステレーション画像の時系列深層学習による低コストな飼料用トウモロコシ収量予測手法の開発

365

穫・調製作業計画を策定し，人員・機械を効率的り，衛星画像のスケール（今回は３ｍ×３ｍ）でに配置するためには，収穫作業前に地域内の収量

大量のデータを取得することは実質不可能であを正確に予測できる技術が求められている。従来る。そこで本研究では，まず①実収量とドローン

は，広い圃場のごく一部の坪刈り調査結果をもと画像の解析（重回帰分析）によりドローン収量予に圃場全体の収量を予測していたが，圃場ごとの測手法を開発し，次に②ドローン予測収量と衛星

坪刈り作業は労力が大きく，またサンプリング

画像の解析（深層学習）により衛星収量予測手法

データの代表性の低さのために誤差が大きく，さを開発した。以上の２段階の開発により，ドローらに調査位置選定の妥当性および生育状況診断結ン画像を衛星画像スケールに分割することで，ド果の正確性は調査者の熟練度に依存していたたローン空撮範囲全体から大量の機械学習用データ

め，データのばらつきや技術継承の難しさが課題を生成することが可能となる。

であった。また，近年ではドローン空撮画像を用

2.2

い た 収 量 予 測 手 法 も 研 究・開 発 が 進 ん で い る

2.2.1

が ，ドローン空撮にかかるコストの高さ（撮影

実収量データは，農業・食品産業技術総合研究

可能範囲は10～50 ha／日程度）のために，広大機構（農研機構）北海道農業研究センター内（札な地域への社会実装には至っていない。一方，安幌市）の３圃場（2021年１圃場，2022年２圃場），価（あるいは無料）な衛星画像を用いた広域の収北海道立総合研究機構（道総研）畜産試験場内量予測も以前から検討されているが ，撮影間隔（新得町）の５圃場（2022年），帯広市川西地区生の長さ（＝撮影頻度の低さ）および解像度の低さ

産者の３圃場（2022年）で計測した。農研機構圃

のため，圃場レベルでの適期かつ正確な予測がで場ではトウモロコシ２列ごとにトラックスケール

きなかった。近年，高頻度・高解像度・広域撮影で収量を計測し，道総研および川西の圃場では圃が可能な衛星コンステレーション（複数衛星の協場ごとに収量を計測した。

１）

２）

使用データ
収量

調運用システム）画像が比較的安価で利用可能と2.2.2なった。これらの膨大な時系列画像情報を深層学

従来に比べて位置精度が高く安定した飛行が可習することにより，労力の大きい現地調査に頼る能なDJI Phantom4 RTKを用いて，収量を計測しことなく，広範囲な地域の収量を高精度かつ安価た上記11圃場および追加で川西地区７圃場を空撮に予測できる可能性がある 。そこで本研究では，した。圃場およびトウモロコシの３次元モデルを

衛星コンステレーションを活用した高精度・運用作成するために，オーバーラップ60％（進行方

容易（熟練技術不要）・低コストな新たな収量予向）および80％（横方向）で飛行し，重複画像を測手法を開発する。

取得した。撮影高度は30-100ｍであり，空撮画像

３）

２．方
2.1

ドローン画像の解像度は約１-３cmである。トウモロコシの植法

物高を推定するために，播種後（地表面の高さ計測用）と収穫前（トウモロコシ群表層の高さ計測

開発手順

時系列衛星画像群の機械学習によりトウモロコ用）の２時期に空撮を実施した。

シ収量を予測する場合，実収量データが大量（一2.2.3

般的には数1,000以上）に必要となる。しかし，従来に比べて解像度および撮影頻度が高いコン

坪刈り調査あるいはトラックスケール計測によステレーション衛星の一つであるPlanet衛星の画© The Ito Foundation

衛星画像

366

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

像を使用した。同衛星は2016年の打ち上げ開始か

3.2

ら順次衛星数・観測バンドの増加およびデータ品

収量を実測した11圃場に関して，ドローン推定

質・配信の安定性向上を進め，近年コンステレー

植物高から計算した空隙を含む植物体容積（ｍ３/

ション衛星の中で唯一実用レベルに到達した新た

10 ａ），10-30 ℃ 有 効 積 算 気 温（℃ ），RM（日）なセンシングデータである。Planet衛星の撮影頻の３データを説明変数，地上実測による単収（生度は１日１回以上，画像の解像度は３ｍ×３ｍで重，kg/10a）を説明変数として重回帰分析を行っある。

た。その結果，補正Ｒ２＝0.98，有意Ｆ＝0.0000016

2.2.4

栽培情報

ドローン収量予測手法開発の高い精度を持つ以下の回帰式が得られた（Fig.

調査対象圃場ごとの位置，面積，トウモロコシ２）。なお，積算降水量（播種日～収穫日，mm）の品種（相対熟度：北海道統一RM），播種日，も含めて解析したが，Ｐ-値が0.80と非常に大き

収穫日，有効積算気温（播種日～収穫日）の情報

かった（＝目的変数と関係性がない）ため，説明を収集した。

変数から除外した。

３．結果と考察
3.1［ドローン推定単収］＝1.37×［ドローン推定植

植物高推定

物体容積］

播種後と収穫前の２時期の空撮画像のSfM処理

－ 4.77 ×［10-30 ℃ 有 効 積により３次元モデルを作成し，両データの鉛直差

算気温］分を計算することで，トウモロコシの植物高分布＋211.45×［RM］

図を作成した。一例をFig. １に示す。各圃場の平－12259（式１）

均植物高はそれぞれ，農研機構３圃場：1.96ｍ，1.79ｍ，1.41ｍ，道総研５圃場：1.84ｍ，2.17ｍ，2.22

今回の解析ではデータ数が11ときわめて少なｍ，2.02ｍ，1.78ｍ，川西３圃場：2.64ｍ，2.74ｍ，く，高い補正Ｒ２は過剰適合の可能性が高い。今2.31ｍであった。

後，より多くのデータを追加して再解析すること

Actual yield（kg/10a）

8,000

6,000

4,000

2,000

2.6 m
0
0

25

0

50
ｍ

0

2,000

4,000

6,000

8,000

Estimated yield with drone-based method（kg/10a）Fig. 1 Crop height map created by the drone images．

Fig. 2 Estimated yield with the drone-based method．

© The Ito Foundation

衛星コンステレーション画像の時系列深層学習による低コストな飼料用トウモロコシ収量予測手法の開発

367

で，本予測手法の信頼性および汎用性が向上する

して雲がない時系列Planet衛星画像群を取得し，と考えられる。

正規化植生指数（NDVI）を計算した。各圃場に3.3

衛星収量予測手法

おける雲なしPlanet衛星画像群の枚数は異なり，ドローンで空撮した上記18圃場を対象として，

農研機構圃場では2021年は53枚，2022年は45枚，前項で開発したドローン収量予測手法を用いて，

道総研圃場では25枚，川西地区圃場では26-27枚

Planet衛星画像の各ピクセルごと（３ｍ×３ｍ）（圃場により異なる）であった。次に，各ピクセに予測収量を算出した。ピクセル数は合計86,192

ルにPlanet_NDVI時系列データを記録した。なであった。さらに，5/1-9/30の５カ月間を対象とお，雲により欠測となった日のNDVIは前後の雲Fig. 3 Neural network architecture of the satellite-based method．

© The Ito Foundation

368

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Estimated yield with drone-based method（kg/10a）

15,00010,000

5,000

0
0

5,000

10,00015,000Estimated yield with the satellite-based method（kg/10a）Fig. 4 Estimated yield with the satellite-based method．

なしPlanet_NDVI値から線形補間した。全データ

深層学習モデルのネットワーク構造および内部パのうち７割（47,806ピクセル）を深層学習の学習

ラメータをより最適化することで，収量予測結果

データ，１割（6,827ピクセル）を検証データ，の精度・信頼性・汎用性の向上が期待される。ま

２割（13,652ピクセル）をテストデータとして，た，GRUS衛星（日本，Axelspace社，解像度2.5ｍ）

時系列Planet_NDVIデータを説明変数，ドローン

やPleiades Neo衛星（フランス，Airbus社，解像予測収量を目的変数とする深層学習処理を行っ

度1.2ｍ）など，コンステレーション衛星は今後た 。 深 層 学 習 処 理 は SONY Neural Network

引き続き種類と数が増えるため，それらの衛星

Consoleを使用し，最初に単純な３層の畳み込み

データを用いた予測精度のさらなる向上，目的やニューラルネットワーク構造で学習を開始し，同予算に応じた柔軟な選択・運用が可能になると考ソフトウェアの構造自動探索機能を用いてネットえられる。さらに，高頻度時系列植生指数の深層ワーク構造の最適化を行った。その結果，複数分

学習による収量予測手法のアイデアは，飼料用ト

岐構造を含む４層の並列畳み込みニューラルネッ

ウモロコシ以外のさまざまな作物への展開，またトワークで構成される収量予測モデルが構築され収量以外の生育・環境（生育不良，病害虫被害，た（Fig. ３）。同モデルの予測精度をテストデー

収穫適期，土壌排水・栄養価）の予測および評価

タで評価したところ，平均相対誤差は3.7％と高にも展開可能だと考えられる。

い性能が示された（Fig. ４）。
3.4

衛星観測はデータ購入費（画像の種類と枚数に今後の課題・展望より大きく異なるが，０～数百万円程度）が必要

今後，学習データの量（調査年・圃場・面積）

だが，広域・複数作物・複数目的で共同利用するおよび質（品種（RM），気象条件）を増加させ，ことでコスト分散が可能であり，また従来の現地© The Ito Foundation

衛星コンステレーション画像の時系列深層学習による低コストな飼料用トウモロコシ収量予測手法の開発

369

調査やドローン空撮と異なり現地調査にかかる労誤差3.7％と高い予測性能が得られた。今後，学力がほぼゼロに低減され，さらに手法が確立すれ

習データの量と質を増加させることで，予測手法

ば途上国を含む全世界への広域展開が容易な技術の信頼性と汎用性のさらなる向上が期待される。

である。日本のみならず全世界のスマート農業の実現を推進する強力なポテンシャルを持っている。
４．要

約

北海道内の３地域（札幌市，帯広市，新得町）

文
献１） 青木康浩：畜産技術，792，13～17，2021．
 GEOGLAM：Crop Monitor a geoglam initiative.
２）
https://cropmonitor.org/．
３）
（2）
，25～
 河野達也，長澤良太：システム農学，35
32，2019．

を対象として，コンステレーション衛星Planetの時系列画像（植生指数）の深層学習による飼料用
トウモロコシの収量予測手法を開発し，平均相対© The Ito Foundation

370

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による
家畜腸内細菌叢改善効果の検証（Ⅲ）
Verification of the effect of feed supplemented with mass-producible
oligosaccharides on the improvement of intestinal flora in livestock（Ⅲ）

西本

完１・小林

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

寿美２・大津

晴彦２

食品研究部門，２畜産研究部門）

１

Mamoru Nishimoto１, Hisami Kobayashi２ and Haruhiko Ohtsu２（１Food Research Institute, ２Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

In previous years, we had shown that ryegrass seed composition increased the bodyweight of chicks. In order to confirm the reproducibility of this effect and to verify the amountof ryegrass seed composition and its active ingredients necessary to achieve the same effect,
we conducted a feeding test using ROSS, a representative meat product, by reducing theamount of ryegrass seed composition by half and preparing an extract concentrate of that. The
results showed no significant difference on chick weight gain effect, but there was a significant
increase in organic acid production in the digestive tract contents. Since there was no
significant difference in the increase in body mass effect in the positive control, the 25％
ryegrass seed composition, it is necessary to conduct a follow-up study that takes into accountthe effects of other factors such as study design. However, the results of organic acid content
suggested the effect of improving the intestinal microflora. In addition, microflora analysis ofgastrointestinal contents collected in the fourth feeding trial in the previous year was
conducted to confirm the effect of ryegrass seed composition on the intestinal microflora. It
revealed several microorganisms whose occupancy increased or decreased characteristically inthe ryegrass seed composition area. Further research is needed to determine the relationshipbetween these microorganisms and the effect of the increase in body weight．

１．目性物質の使用を中止するよう勧告した。これを受的け欧米の先進国で抗菌性物質使用が禁止されたこ

これまで畜産業界においては，家畜の成長促進とにより，生産現場では罹患率の上昇・飼料効率や感染症予防のため，抗菌性物質の投与が日常的低下に伴う成長遅延等による生産性の低下が懸念に行われてきた。しかしながら，そのような健康されており，畜産業においては生産性向上が重要維持のための抗菌性物質の多用による弊害としな課題となっている。日本国内における現状ではて，薬剤耐性菌の頻出が公衆衛生上の問題となっそれほど厳しい規制はまだないが，近い将来，規た。そのため，2017年に世界保健機関は，成長促

制強化が予想されている。そのような課題の解決

進や感染症予防を目的とした健康な家畜への抗菌に向け，成長促進効果を有する代替資材の開発が© The Ito Foundation

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証（Ⅲ）

371

期待されており，本研究ではその一助として，牧施することで，有効成分の絞り込みを行うととも草であるライグラスの種子を活用した飼料資材のに，ロリオースのプレバイオティクスとしての可開発に向けた実証試験を行っている。近年，家畜能性を評価する。

においてもヒトと同様に腸内細菌叢の改善が健康増進に役立つことが明らかになりつつあり１），そ

２．方法のような効果を期待した飼料用プレバイオティク

2.1

スやプロバイオティクスが市販されている。実イタリアンライグラス種子は，市販の「ワセア際，酵母や乳酸菌等の生菌剤や機能性オリゴ糖をオバ」（雪印種苗株式会社）を用い，給与試験に添加した飼料が国内・海外を問わず販売されてお用いる種子組成物は既報３）に従って調製した。飼り，飼料に添加する機能性素材に関する研究分野

料は，前年までと同様にトウモロコシ，大豆粕をは非常に注目度が高いと言える。ただし，優れた主体とした，粗タンパク質含量19％，代謝エネル

機能性を有する素材であったとしても，調達コス

ギー2.9Mcal/kgを対照飼料とし，試験飼料も同様

トが見合っていなければ実用化にはたどり着けなに 粗 タ ン パ ク 質 含 量 19 ％，代 謝 エ ネ ル ギ ー

いことから，すべての機能性素材が上市されると2.9Mcal/kgのライグラス種子組成物12.5％，25％は限らない。

配合した飼料および，ロリオース抽出濃縮液添加

昨年度，一昨年度に実施したニワトリヒナへの飼料の調製

飼料を調製し試験に供した。

給与試験において，ライグラス種子より調製した

2.2

組成物にニワトリヒナ増体効果があることを見出

上記のとおり調製したライグラス種子組成物をしてきた２，３）。本効果はニワトリの出荷までの期原料としてロリオース抽出濃縮液を調製した。具間を短縮することで生産性向上に資するものであ

体的には，500ｇのライグラス種子組成物に対し，り，生産者の収益向上にもつながる。なお，本組３ｌの蒸留水を加え室温で45分撹拌後，550ｇの成物はライグラス種子を原材料としていることか

活性白土SA-1（日本活性白土社）を加えさらにら，栽培面積を拡大することで容易に生産量を増

45分撹拌し，ろ過することで一部の色素成分を除大でき，生産コストも高価ではないという利点が去した抽出液を得た。本抽出液をロータリーエバ

ある。ただし，ライグラス種子組成物における有ポレータで約135mlまで濃縮したものを抽出濃縮

効成分がいまだ同定されていないことから，本研液とし，本工程を繰り返し行うことで給与試験に

究では，このライグラス種子組成物中の有効成分

必要な試料を調製した。本抽出液の飼料への添加と目されるオリゴ糖「ロリオース」を抽出・濃縮は以下のとおり行った。18kgのトウモロコシ粉した試料を調製する。ロリオースは，1958年にラを70℃12時間乾燥させ，そこに5.4ｌの抽出濃縮

イグラス種子に存在することが報告されたもの

液を加えて乳鉢で均等になじませた。その後再びの４），その後の研究例は糖の構造解析５）や耐乾燥

18kgになるよう70℃で12時間乾燥させることで，性とは無関係 ，等の数報しかなく，生合成機構

トウモロコシ粉の水分を抽出濃縮物に置換した。

や植物体にとっての生理的役割などに関する研究

抽出濃縮物の粉末化への試みとして，凍結乾燥機

例が少ないだけではなく，そのオリゴ糖の機能性（FDU-810，東京理化器械株式会社）およびスプに関する研究例も皆無である。そのため，ロリ

レードライヤー（GB210-A，ヤマト科学株式会

オース抽出濃縮液を飼料に添加した給与試験を実社）を使用した。なお，抽出濃縮液中のロリオー

６）© The Ito Foundation

ロリオース抽出濃縮物の調製

372

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ス濃度はパルスドアンペロメトリー検出型液体ク

等量の蒸留水で希釈した。希釈液をイオン交換樹

ロマトグラフィーに試料を供試し，そのピーク面

脂（Amberlite IR120H＋，東京有機化学工業株式積を求め，以前調製したロリオース標品７）を用い会社）により処理し，20,000×gで５分間遠心分て作成した検量線から試料中のロリオース濃度を離を行い，その上澄み液を分析試料とし，高速液算出した。

体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー（有 機 酸 分 析 シ ス テ ム

2.3

Nexera，島津製作所）を用いて，カラムはイオ

第五次給与試験

本研究は前々年度からの継続研究課題であるこン排除クロマトグラフィーカラム（Shim-packとから，各給与試験の名称を通し番号で識別でき

Fast-OA，島津製作所），移動相は５mmol/l p-

るよう，前々年度の第一次・第二次給与試験，前トルエンスルホン酸水溶液，流量は0.8ml/min，

年度の第三次・第四次給与試験に続き第五次給与

温度は40℃に設定し，各種有機酸を定量した。盲試験と称することとした。また，本研究における

腸 内 容 物 の pH 値 は ガ ラ ス 電 極（9618S-10D ，

動物実験は，農研機構動物実験委員会の承認を受

HORIBA）を用いて計測した。

け，農研機構動物実験等実施規程に従って行って

2.5

腸内細菌叢解析いる。

前年度に実施した第四次給与試験における供試

ブロイラー（ROSS）初生雛128羽を供試してヒナの腸内細菌叢解析を行った。給与試験後に採給与試験を行った。これまでの試験と比較するた取 し た 盲 腸 内 容 物 を た だ ち に DNA 保 存 試 薬め，①対照区，②ライグラス12.5％区，③ライグ（DNA/RNA Shield，ザイモリサーチ社）中で懸ラス25％区においては第四次給与試験と同様の飼

濁し，－20℃で保存していた懸濁液からDNA抽料を調製し，さらに，対照飼料に抽出濃縮液を添

出 キ ッ ト（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit ，加した④抽出濃縮区を試験として設けた（ただQIAGEN社）を用いてメタゲノムDNAを調製しし，すべての飼料において酸化クロム含）。それた。得られたDNAの16S rRNA領域を増幅させ，ぞれの試験区に，１群８羽４反復の計32羽ヒナをその塩基配列を次世代シーケンサーで解析を行配置し，20日間の飼養試験を行った。飼料摂取量

い，データベースに対する相同性検索および系統は各群について試験期間中の摂取量を測定し，１

分類解析により，各微生物目の占有割合を評価し羽あたりの量を算出した。試験終了時に，すべてた。

の鳥の体重を測定し，群の体重の平均値および１羽あたりの試験期間中の飼料摂取量を用いて増体

３．結果と考察量，飼料効率を算出した。また，各区１反復あた3.1り４羽（平均的な体重３羽＋最高体重１羽）から22kgのライグラス種子組成物から，方法に記

消化管内容物として盲腸内容物を採材した。
2.4

ロリオース抽出濃縮物の調製載したとおりに5.9ｌの抽出濃縮液を調製した。
抽出液のロリオース濃度は90mMであり，243ｇ

pH値および有機酸分析

第五次給与試験終了後の採材時に回収した盲腸のロリオースが含まれていることになる。22㎏の内容物は蒸留水で５倍に希釈した後にただちに凍ライグラス種子組成物には308ｇのロリオースが結し，分析するまで－20℃で保存した。解凍後の含まれており，その回収率は79％だった。なお，

試料を攪拌後に20,000×gで５分間遠心分離し，本抽出濃縮液をトウモロコシ粉にしみ込ませるこ

上澄みを孔径0.22μｍのフィルターでろ過した後，とで調製した抽出濃縮液配合飼料には0.49％のロ© The Ito Foundation

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証（Ⅲ）

373

リオースが含まれていると見積もられ，ライグラ

が低く，ロリオース等の機能性成分量が成長促進

ス種子組成物12.5％配合飼料（0.18％），25％配合を亢進するために不十分であった可能性が考えら

飼料（0.35％）と比較しても遜色ない配合割合でれる。しかしながら，ライグラス種子組成物25％ある。さらに，本抽出濃縮液の操作性改善に向け，配合飼料は第四次給与試験においては成長促進効

凍結乾燥機およびスプレードライヤーを用いた粉果が見られていたにもかかわらず，今年度実施し末化を検討したが，凍結乾燥で得られた粉末は吸た第五次給与試験においては，増体に関してはそ

湿性が高く，操作性が悪いことから実用化には不の効果が見られなかった。この理由は不明である

向きであることが分かった。また，スプレードラ

が，ライグラス種子のロット間による機能性成分

イでは今年度の試験期間中に有効な乾燥条件を見含量の差により，配合割合が十分でなく効果が見出すには至らなかった。そのため，今回の給与試られなかった可能性も考えられる。一方，消化管

験では抽出濃縮液をトウモロコシ粉にしみ込ませ

内容物中の有機酸含量から腸内細菌叢が変化してることで飼料への配合を行った。今後，スプレーいることが示唆されており，今回の飼養期間（20ドライ条件を検証し，粉末化に向けて取り組む必日間）は増体効果を現すには少し短かった可能性

要がある。

も考えられる。今後，ロット間差を検証したライ

3.2

第五次給与試験グラス種子を試験に供する，飼養期間を延長する

第五次給与試験においては，増体量，飼料摂取等，本効果の再現性を確認する必要がある。また，

量および飼料効率に対するライグラス種子組成物

ロリオース抽出濃縮液添加飼料給与の増体量，飼12.5％配合飼料，25％配合飼料給与の効果は観察

料摂取量および飼料効率への効果を第五次給与試されず，対照飼料給与とほぼ同様の値を示した

験において初めて検討し，飼料効率は最も優れて（Table１）。ただし，消化管内容物中の有機酸含

い た も の の ，有 意 な 作 用 は 観 察 さ れ な か っ た

量については，ライグラス種子組成物12.5％配合（Table１）。また，消化管内容物中の有機酸含量

飼料，25％配合飼料給与により，対照飼料給与とについても有意な差は認められなかった。これ

比べリンゴ酸および酢酸含量に有意な差が見られは，ライグラス種子組成物に含まれる成長促進物

た。一方，ロリオース抽出濃縮液添加飼料給与区

質はロリオースのみでは十分でなく，本試験で調と対照飼料給与区では有機酸含量に差は認められ製した抽出液に含まれない成分も必要である，あな か っ た（Fig. １）。ラ イ グ ラ ス 種 子 組 成 物

るいは本効果を阻害する成分も濃縮されてしまっ

12.5％配合飼料給与は，これまで行ってきた給与

た等の可能性が考えられる。ただし，pHについ試験に比べて，ライグラス種子組成物の配合割合ては対照区と比較して有意に低下していることか

Table１ E ffect of feeding ryegrass seeds on growth performance in chicks
Control
Body weight gain

Ryegrass（12.5） Ryegrass（25）Extract

549 ± 20536 ± 15544 ± 16534 ± 18877 ± 31872 ± 9863 ± 12829 ± 26

0.626 ± 0.006

0.615 ± 0.012

0.625 ± 0.011

0.644 ± 0.002（ｇ/20 days）
Feed intake（ｇ/20 days）
Feed efficiency

Mean ± S.E. n=4, Extracts：water-extracted ryegrass seed powder concentrates.

© The Ito Foundation

374

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）
＊

ns

＊

ns

ns

pH

8
7
6
5

N

C

R1

R2

ns

0.020

ns

0.015
0.010
0.005
0.000

N

C

ns

ns

0.020
0.015
0.010
0.005
0.000

C

N

R1

R2

＊＊＊＊
ns
ns

＊＊＊

ns

0.008
0.006
0.004
0.002
0.000

C

N

R2

＊
＊

1.5
ns

ns

1.0

0.5

0.0

N

C

R1

ns

ns

0.15
0.10
0.05
0.00

N

C

R1

R2

ns
ns

ns

ns

0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00

C

N

R1

R2

ns
ns
0.010

ns

ns

ns

0.008
0.006
0.004
0.002
0.000

C

N

R2

ns

ns
ns

R1
ns

ns

0.20

ns

ns

＊＊

0.010

Propionic acid（Cecal content, % FM）

ns

Isovaleric acid（Cecal content, % FM）

Lactic acid（Cecal content, % FM）
Isobutyric acid（Cecal content, % FM）

ns
ns

R1

＊＊

ns
ns

0.025

ns

Butyric acid（Cecal content, % FM）

9＊

Acetic acid（Cecal content, % FM）

ns

Malic acid（Cecal content, % FM）

ns
＊＊

R1

R2

Fig. 1 pH and organic acid content in cecum contents．

C：Control, N：Extract Concentrates（Nousyukubutu）, R1：Ryegrass（12.5），R2：Ryegrass（25）．
ns：no significant difference, ＊：p＜0.05, ＊＊：p＜0.01, ＊＊＊：p＜0.001, ＊＊＊＊：p＜0.0001．

© The Ito Foundation

R2

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証（Ⅲ）

375

Table２ M icrobial occupancy in gastrointestinal tract contents
Order

Occupancy（%）
Control

Ryegrass（25）Ryegrass（50）FOS

Coriobacteriales

0.13

0.28

0.26

0.11

Enterobacteriales

3.88

3.27

0.92

2.79

Xanthomonadales

0.11

0.17

0.15

0.12

Bacillales

2.32

0.16

0.01

1.50

Lactobacillales

6.07

5.33

6.90

7.29

Clostridiales

79.79

84.28

84.94

81.25

Erysipelotrichales

6.84

6.34

6.72

6.11

Other

0.86

0.17

0.09

0.83

Mean, n=16, FOS：fructooligosaccharides
Samples were taken from last year’s test.

ら，なんらかの腸内細菌叢改善効果がある可能性の変化が増体効果に影響を及ぼしているのかもしが示唆された。今後，ライグラス種子からの機能れない。また，菌種レベルではライグラス種子組性成分抽出法をさらに検討し，ブロイラーの成長

成物配合区においてLactobacillus等７菌株の増加，を亢進するライグラス種子の適切な飼料原料とし

Faecalibacterium等５菌株の特徴的な減少が見らての利用法を検討する必要がある。

れたものの，いずれもuncultured bacterium，い3.3

消化管内容物中の菌叢解析

わゆる難培養微生物として分類されており，菌種

前年度の第四次給与試験では，対照区，ライグの特定までには至らなかった。今年度実施した第ラス種子組成物25％配合区，50％配合区，フラク

五次給与試験において採材した消化管内容物につトオリゴ糖（FOS）配合区の計４試験区を設定

いても，今後，解析を行うことで，ライグラス種した。このうち，ライグラス種子組成物25％配合

子組成物が与える菌叢への影響をより詳細に評価

区，50％配合区において，有意な増体効果，飼料できるようになると期待している。

効率改善効果が認められた。そこで，給与試験後以上，本研究の成果を基礎的知見とし，今後実に－20℃で保存していた消化管内容物よりゲノム証試験を重ね，ライグラス種子組成物給与によるDNAを抽出し，菌叢解析を行った。微生物目レ増体効果とロリオースによる腸内細菌叢改善効果

ベルでの菌叢割合をTable２に示す。いずれの試との関連性を明らかにすることで，ニワトリにお験区も約８割はClostridialesであり，フラクトオ

ける作用機序の解明，ならびに新たな飼料用素材

リゴ糖配合区はすべてにおいて対照区との違いはとしての実用化に取り組んでいきたい。

認められなかった。前回の菌叢解析において特徴的であったLactobacillalesについては，対照区にお４．要約

いて試験区と同程度の占有割合であったことから，

前年度までの研究で，ライグラス種子組成物が大きな違いは見られなかった。一方，ライグラス

ヒナの体重を増加させることを明らかにしてき

種子組成物50％配合区では，Enterobacteriales，

た。今回，その効果の再現性を確認するとともに，50％配合区および25％配合区ではBacillalesの割本効果を得るために必要なライグラス種子組成物

合が大幅に減少していた。このような腸内細菌叢の量，およびその中の有効成分について検証する© The Ito Foundation

376

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ための給与試験を実施した。その結果，ニワトリ
ヒナ増体効果に有意な差は認められなかったものの，消化管内容物中の有機酸生成量には有意な増加が認められた。増体効果に関しては，ポジティ
ブコントロールであるライグラス種子組成物25％
配合区においても有意差がつかなかったことから，試験設計等，他の要因による影響も考慮した
追試験を実施する必要があるが，有機酸含量の結果から，腸内細菌叢の改善効果を確認することができた。また，前年度の飼育試験で採取した消化管内容物の菌叢解析を行い，ライグラス種子組成
物の腸内細菌叢への影響も評価した結果，ライグ
ラス種子組成物区において特徴的に占有割合が増減した数種の微生物を見出すことができた。
文
献１） Kiyohara, M., Tachizawa, A., Niahimoto, M.,
Kitaoka, M., Ashida, H., Yamamoto, K.：Prebiotic
effect of lacto-N-biose I on bifidobacterial growth,
Biosci. Biotechnol. Biochem., 73（5），1175～1179，

2009．
２） 西本完，山崎信，遠野雅徳：量産可能なオリゴ糖
素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証，令和２年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，公益財団法人伊藤記念財団.，39，380～
385，2021．
３） 西本完，大津晴彦，小林寿美：量産可能なオリゴ
糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証，令和３年度食肉に関する助成研究調
査成果報告書，公益財団法人伊藤記念財団.，40，391～397，2022．
４） M a c l e o d , A . M . , M c c o r q u o d a l e , H . ：Trisaccharides of Lolium and Festuca, Nature ，182
（4638），815～816，1958．
５） Chatterton, N. J.：Loliose-a novel trisaccharide inleaves of Lolium and Festuca species, Plant
Physiology（Life Science Advance），12，113～116，
1993．
６） Amiard, V., Morvan-Bertland, A., Billard, J. P.,
Huault, C., Keller, F., PrudʼHomme, M. P.：Fructans,but not the sucrosyl-galactosides, raffinose andloliose, are affected by drought stress in perennial
ryegrass, Plant Physiol., 132（4），2218～2229，2003.
７） 西本完：イネ科牧草に含まれるα-ガラクトシド
含有オリゴ糖の特性評価およびその利活用に向けた調製技術の開発，平成30年度年報，公益財団法人飯島藤十郎記念食品科学振興財団，34，243～247，
2019．

© The Ito Foundation

377

暖地で冬期に高品質な粗飼料を生産するイタリアン
ライグラス夏播き栽培技術の開発
Establishment of Italian ryegrass summer sowing cultivation which
produces high-quality forage in winter in warm regions Japan

加

藤

直

樹・望

月

賢

太

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センター）

Naoki Kato and Kenta Mochizuki（Kyushu-Okinawa Agricultural Research Center, NARO）

The present study aimed to establish appropriate nitrogen fertilizer management
techniques for a new Italian ryegrass cropping type that is sown in September and harvested
in December or January, using “Kyushu１”, a new blast-resistant variety. We investigatedyield, crude protein（CP）content, and nitrate content under 12 test conditions, which included
two levels of cattle manure application, three levels of nitrogen fertilizer application, and twolevels of harvest time. Furthermore, we used a prediction model for nitrogen mineralization oforganic materials to predict and validate the fertilizer efficacy of cattle manure compost. The
results showed that the nitrogen mineralization amount of cattle manure compost could be
estimated using the organic material mineralization model. The predicted and the measured
values were almost the same, indicating that the prediction can be made with sufficientaccuracy for practical use. Based on the result, the nitrogen fertilizer rate suitable for the newcropping type of Italian ryegrass was found to be from 5-11 kg/10 a. In this nitrogen fertilizer
rate range, dry matter yields in this crop type were expected to exceed about 800 kg/10 a, andharvests with a CP content of about 16％ could be produced consistently. Due to the tendencyof nitrate content to increase in this cropping type, it is advisable to set the harvest time inJanuary and limit nitrogen fertilizer application．

１．目

増加を招いている。

的

この原因に，①IRを含むイネ科牧草は出穂期

暖地の基幹飼料作物であるイタリアンライグラ

以降，生育の進展とともにCP含有率が低下する

ス（以下IR）は，秋に播種し，春に収穫される

ため，収穫時期により異なるCP含有率の収穫物冬作物として栽培されており，肉用牛の繁殖雌牛が生産されやすいこと１，２），また，②CP含有率はの粗飼料として広く利用されている。本草種は粗窒素施肥量の増加により高まるが，堆肥の利用がタンパク質（以下CP）含有率の変動が大きいこ前提となる飼料生産においては，倒伏や家畜に有とが報告されており１），特にCP含有率が低い場

害な硝酸態窒素（以下，NO3-N）の蓄積を避け合には補助飼料を添加する必要があり，飼料費のるため，十分な窒素施肥が行われていないことが© The Ito Foundation

378

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

あげられる。

収量調査は播種後78日目（2022年12月９日）おこれらの課題に対し，本研究では暖地を対象よび123日目（2023年１月23日）に実施した。なに，①いもち病抵抗性IR極早生新品種「Kyushu

お，収量調査時の生育ステージはいずれも出穂始

１」を利用し ，いもち病の発生により，これま期であった。

３）

で困難とされていた９月にIRを播種し，生育の調査項目は乾物収量，倒伏程度（１-９の評点。

進展が緩慢になる冬季に収穫する新たな作型（夏無：１-甚大：９），CP含有率およびNO3-N含量

播き栽培）を確立し，収穫時期によるCP含有率とした。また，統計処理として，各水準を要因との変動を生じにくくすること，②有機質資材の窒した３元配置分散分析を実施し，有意水準を10％

素無機化予測モデルを活用した堆肥の肥効予測ととして処理の影響を評価した。

その検証を行い

2.2，IRの生育に合わせた適切な４，５）試験に供試した牛ふん堆肥の含水率，全窒素含施肥管理技術を開発することで，解決を試みたの

量，全炭素含量，無機態窒素含量，リン酸含量おで報告する。

よびカリ含量を測定した（Table１）。また，牛ふ法

２．方堆肥の肥効予測とその検証

ん堆肥を現物で３t/10 aとなるように土壌とよく2 . 1 イタリアンライグラスの栽培概要と試験混合して，底に不織布を張り付けたPET円筒容器（直径５cm×高さ16 cm）に充填し，圃場に埋区設定
供試品種にIR「Kyushu１」を用い，2022年９設してIRの収穫まで経時的に円筒内土壌の無機

月22日に播種量4.0 kg/10 a，条間30 cmで播種機

態窒素含量を測定した。試験区は牛ふん堆肥混和により条播した。試験区として，牛ふん堆肥の施区と資材無混和区の２処理を３反復設置した。ま

用量２水準（３t/10 aまたは無施用）×窒素肥料

た，充填時に20 g/lの臭化カリウム溶液を５ml添の施肥処理３水準（０，５，10 kg/10 a，すべて加してよく混合した。円筒内の臭化物イオン含量

基肥として施用）×収穫時期２水準（12月およびの減少率からNO3-Nの溶脱量を推定し，補正し１月）の計12水準を設けた。１区あたりの栽培面

た無機態窒素含量と有機質資材窒素無機化予測モ積は24ｍ ，各区２反復とした。なお，施肥処理

デルによって計算した無機化予測値を比較した。

２の呼び方として，窒素のみを施用する場合にはＮ

３．結果と考察

０区，Ｎ５区，Ｎ10区，さらに堆肥を施用した場
合にはＮ０＋Ｍ区，Ｎ５＋Ｍ区，Ｎ10＋Ｍ区と示

3.1

栽培期間中の気象条件

すこととした。また，窒素以外の肥料については，栽培期間中の気象条件をFig. １に示した。降水すべての区に基肥としてリン酸20 kg/10 a，カリ

量は平年よりもやや少なめに推移した。気温は９10 kg/10 aを施用した。

月，10月は平年並みであったものの，11月は平年

Table 1 P roperties of cattle manure compost in the experiment.
Moisture

Total N

Total C

48.6

2.4

38.4

Inorganic N１

P２O５

K２O

0.04

4.2

4.5

％
Cattle manure compost

１Inorganic nitrogen is the sum of NH4-N and NO3-N.

© The Ito Foundation

暖地で冬期に高品質な粗飼料を生産するイタリアンライグラス夏播き栽培技術の開発
120

Precipitation
Average precipitation
Air temperature

25
20

Average air temperature

80

15

60
10

40

Temperature（℃）

Precipitation（mm）

100

379

5

20
0

La

te
Ea -Se
rly p
-O
M ct
id
La Oc
te t
Ea -O
rly ct
-N
M ov
id
La No
te v
Ea -No
rly v
-D
M ec
id
La De
te c
Ea De
rly c
-J
M an
id
La Jante-J
an0Fig. 1 Air temperature and precipitation during the growing

season, Kikuchi City, Kumamoto Prefecture
Cited from the website of the Japan Meteorological Agency．

値よりも高く，12月は平年値よりも低く推移しられた（Fig. 2B）。特に堆肥を施用した区では，た。本試験では出穂始期となった12月９日に１回

窒素施肥量の増加とともに倒伏程度も増加してお目の収量調査を行い，その45日後の１月23日に２

り，Ｎ10＋Ｍ区では顕著な倒伏が見られ，12月か回目の収量調査を行ったが，生育ステージは出穂ら１月にかけての乾物収量の増加程度が他の区よ始期のままであった。一般にIRの生育下限温度

りも著しく低かった（Fig. 2A）。そのため，乾物は５℃と報告されているが ，12月から１月にか収量に与える堆肥施用の効果が，収穫時期により

けては５℃を下回る時期が多く，IRの生育が進異なる原因になったと考えられた。

６）

3.3

みにくかったためと考えられた。
3.2

粗タンパク質含有率

CP含有率は12月に収穫した場合には，いずれ

乾物収量および倒伏程度

IR の 乾 物 収 量 は 12 月 で は 517 kg/10 a か らの試験区においても約20％，45日経過後の１月に672 kg/10 a，１月では697 kg/10 aから890 kg/10

収穫した場合でも約16％であった（Fig. 2C）。まaであり，収穫時期を１月にすると，収量は高くた，12月から１月に収穫時期が遅れることで，なる傾向にあった（ｐ＜0.1，Fig. 2A）。

CP含有率は有意に低下するものの（ｐ＜0.01），

また，堆肥施用の効果と収穫時期の間には交互作用が認められており，堆肥施用の効果は収穫時

収穫時期が同じであれば他の処理間に有意な差はなかった。

期により異なったと考えられた（ｐ＜0.1，Fig.

日本標準飼料成分表２）によれば，IR生草の年

2A）。具体的には12月に収穫する場合には，堆肥内刈り（出穂前）のCP含有率が26.9％，１番草の施用により，乾物収量が増加する傾向にあった（出 穂 期）の CP含 有 率 は 13.7 ％，お よ び １ 番 草ものの，１月ではそのような効果は認められな（開花期）のCP含有率は8.3％とされている。本試かった。

験で得られたIRのCP含有率は，年内刈り（出穂この原因として，１月に収穫した場合には倒伏前）の値よりは低かったが，いずれの収穫時期が発生した試験区があったことが影響したと考えも，１番草の出穂期および開花期のCP含有率を© The Ito Foundation

令和４年度Dry matter yield（kg/10 a）

1000

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）
Dec.

A

800
600
400
200

9

Jan.

Havest time: p<0.1
Manure＊Harvest time: p<0.1
Other: no signiﬁcant diﬀerence at p < 0.1

8Degree of lodging２

380

7
6

Dec.

B

Signiﬁcant diﬀerences were foundat the p < 0.01 for all treatments
and all interactions.

5
4
3
2
1

0

N0

N5

N10

N0+M

N5+M

0

N10+M

N0

N5

１

Dec.

C

Jan.

Harvest time: p<0.01
Other: no signiﬁcant diﬀerence at p < 0.1

N0

N5

N10

N0+M

１

Treatment

N5+M

N10+M

5000

Nitrates content（mg/kg）

24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

N10

N0+M

N5+M

N10+M

Treatment１

Treatment

Crude protein content（%）

Jan.

Dec.

D

Jan.

4000
3000

Harvest time: p < 0.01
Other: no signiﬁcant diﬀerence at p < 0.1

2000
1000
0

N0

N5

N10

N0+M

Treatment１

N5+M

N10+M

Fig. 2 Dry matter yield（A）, Degree of lodging２（B）, Crude protein content（C）and Nitrates content（D）of Italianryegrass
A three-way Anova was conducted with nitrogen application, manure application, and harvest time as factors．
１Number means amount of nitrogen fertilizer application and ＋M means manure application．
２Degree of lodging is indicated by a score of 1 to 9, with 1 indicating no lodging and 9 indicating terrible lodging．

上回っていた。特に12月から１月の収量調査時ま

一般に家畜に給与可能なNO3-N含量の基準とでの間には45日経過しているが，そのような場合

して，1000 mg/kgが用いられるが，本試験ではでもCP含有率は16％程度を維持していた。冬季

いずれの処理もこの値を超えていた７）。ただし，に収穫する本作型では，収穫期のIRの生育の進

Ｎ５区，Ｎ10区，Ｎ０＋Ｍ区およびＮ５＋Ｍ区で展が緩やかであり，栄養価の安定した粗飼料を生は，１月に収穫する場合には1500 mg/kgを下回っ産しやすいと考えられた。

ており，妊娠牛への給与にあたっては乾物総量の3.4

硝酸態窒素含量

50％まで，また，妊娠牛以外には給与制限がない

12月に収穫した場合，NO3-N含量は最も高い値となっていた７）。

Ｎ 10 区 で は 4048 mg/kg ，最 も 低 い Ｎ ０ 区 で も3.5

2920 mg/kgと高かった（Fig. 2D）
。一方，１月に収牛ふん堆肥由来の無機態窒素量は施用124日後穫した場合，NO3-N含量は最も高いＮ０区でもで溶脱補正後の実測値が6.15 kg/10 a，予測値が1728 mg/kg，最も低いＮ０＋Ｍ区では1220 mg/

6.96 kg/10 aであった（Fig. ３）。試験期間全体のkgと有意に低下した（ｐ＜0.01）。なお，収穫時

予測誤差については，平均絶対誤差が0.49，平均

期以外の他の処理の影響は認められなかった。

平方二乗誤差が0.55およびIndex of Agreement© The Ito Foundation

堆肥の肥効予測とその検証

暖地で冬期に高品質な粗飼料を生産するイタリアンライグラス夏播き栽培技術の開発
10
9

381

The amount of nitrogen mineralizationfrom organic amendments

8（kgN/10 a）

7
6
5
4
3

MAE = 0.49
RMSE = 0.55
IA = 0.82

2predicted values

1measured values

0
9/11

10/31

12/20

2/8

Fig. 3 The amount of nitrogen mineralization from cattle manure compost

Measured values are corrected for nitrogen leaching caused by rainfall. The initial value indicates the amount of

inorganic nitrogen originally contained in the cattle manure compost. Bars show standard deviation of measured
values（n＝3）．MAE is mean absolute error. RMSE is root mean square error. IA is Willmottʼs Index ofAgreement. It varies between 0.0 and 1.0 where a computed value of 1.0 indicates perfect agreement between theobserved and predicted observations, and 0.0 connotes one of a variety of complete disagreements. IA is sensitive
to systematic model bias, and values > 0.6 indicate satisfactory model performance８）．

（IA）が0.82であった。IAは実測値と予測値の平特にＮ５区，Ｎ10区，Ｎ０＋Ｍ区およびＮ５＋Ｍ

均値の一致度を示す指標で，［０，１］の値を取り区では，いずれも乾物収量が800kg/10 aを超えて１で観測値と予測値が完全一致，０で完全に不一いた。これはIR夏播き栽培と同じ作型で栽培さ致を意味しており，0.6以上の値は満足のいくモ

れる飼料用麦類の乾物収量0.6から0.8t/10 aと同デル性能であることを示している。これらのこと

等以上であり９），IR夏播き栽培の収量としては多から，有機質資材無機化モデルは牛ふん堆肥の窒収であると考えられた。また，CP含有率は１月

素無機化量を実用上十分な精度で予測できることにおいても，いずれも16％前後と高く，栄養価のが示された。

高い粗飼料を生産できると考えられた（Fig. 2C）。

3 . 6 イタリアンライグラスの夏播き栽培に適した栽培管理技術

NO3-N含量については，１月に収穫する場合，乾物収量が800 kg/10 aを超えたＮ５区，Ｎ10区，本試験ではIRの夏播き栽培に適した栽培管理

Ｎ０＋Ｍ区およびＮ５＋Ｍ区では1500 mg/kgを技術を開発するため，施肥管理および収穫時期に下回っており，妊娠牛には乾物総量の50％まで，水準を設けた試験を実施した。また，本作型に適また，妊娠牛以外には給与制限がない値となっした堆肥の施用技術を開発するため，窒素無機化

た７）（Fig. 2D）。そのため，飼料設計の際に配慮

予測モデルを活用した堆肥の肥効予測とその検証が必要になるものの，IRの夏播き栽培では１月を行った。

に収穫することを前提に，Ｎ５区，Ｎ10区，Ｎ０

IRの夏播き栽培に適した栽培管理技術につい＋Ｍ区およびＮ５＋Ｍ区の施肥管理を行うことて考察すると，本作型では収穫時期を１月にするで，多収と収穫物の栄養価の確保ができると考えことで，乾物収量が高まり，NO3-N含量が大きられた。

く低下することが明らかになった（Fig. 2A，D）。

また，堆肥の肥効予測とその検証結果から，© The Ito Foundation

382

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

IR「Kyushu１」の夏播きに適した窒素施肥量をその結果，本作型では収穫時期が気温の低い冬考察すると，本試験で用いた牛ふん堆肥からは，季にあたり，IRの生育の進展が緩やかになるため，

約６kg/10 aの窒素が供給されることが示された

収穫時期の生育ステージは12月から１月にかけ（Fig. ３）。そのため，上述したＮ５区，Ｎ10区，て，ほとんど変わらないことが示された。また，

Ｎ０＋Ｍ区およびＮ５＋Ｍ区の窒素供給量は５～収穫時期を１月にすること，窒素施肥量を５～11kg/10 aと考えられ，IR「Kyushu１」の夏播き

11 kg/10 a の 範 囲 と す る こ と で ，乾 物 収 量 は栽培では，おおむね５～11 kg/10a程度の範囲と800 kg/10 a 以 上 と な る こ と ，ま た ，CP 含 有 率なるよう，化学肥料または堆肥による窒素施肥を16％程度の収穫物が得られることを明らかにし行うことが望ましいと考えられた。

た。ただし，NO3-N含量は1000 mg/kgを超えてい

なお，残された課題として，一般に窒素施肥はたことから，過剰な窒素施肥を避けるよう注意が

乾物収量やCP含有率を高めると考えられるが，必要なことが示された。また，有機質資材無機化

本試験ではその影響は明瞭ではなかった（Fig.

モデルを利用した牛ふん堆肥の窒素無機化量の推２）。この原因として窒素肥料および堆肥ともに測においては，推定値と実測値がほぼ同じであり，施用していないＮ０区の乾物収量やCP含有率が実用上十分な精度で予測できることが示された。

高かったこと，堆肥を施用した区では倒伏が発生し，収量に影響したため，窒素施肥の影響が出に
く か っ た こ と が 考 え ら れ た 。ま た 本 試 験 で は
NO3-N含量が高く，最も低い区でも1000㎎／㎏を超えていた。そのため，本作型ではNO3-N含量が高まりやすい可能性があると懸念された。
これらの課題を解決し，IRの夏播き栽培に適した栽培管理技術を開発するためには，複数年度で試験を実施し，土壌からの窒素吸収量を考慮した
うえで，結果を検討する必要があると考えられた。
４．要約

本試験では暖地を対象に，いもち病抵抗性IR
極早生新品種「Kyushu１」を利用し，いもち病の発生により，これまで困難とされていた９月にIRを播種し，生育の進展が緩慢になる冬季に収穫する新たな作型（夏播き栽培）を確立し，収穫時期によるCP含有率の変動を生じにくくすること，また，有機質資材の窒素無機化予測モデルを活用した堆肥の肥効予測とその検証を行い，IRの生育に合わせた適切な施肥管理技術を開発することを目的に試験を実施した。

文
献１） 髙橋奈津美，東政則，甲斐敬康，森徹，小畑壽，
立山松男，須﨑哲也：宮崎県畜産試験場研究報告，
29，29～31，2018．
２）
 農研機構：日本標準飼料成分表，2009年版，25～
50，中央畜産会，東京，2009．
３）
 荒川明：イタリアンライグラス「Kyushu１」の特性と九州・沖縄地域での乾物生産性，日本草地学会誌，67，35～40，2021．
４） 小林創平，古賀伸久，望月賢太：有機質資材の肥効
予測標準作業手順書―窒素編―，農研機構，茨城県
つくば 市，2023．https://www.naro.go.jp/publicity_
report/publication/laboratory/naro/sop/155020.
html
５）
 古賀伸久，仁科一哉，小林創平，望月賢太，新美洋，
井原啓貴，山口典子，山根剛，草場敬：酸性デター
ジェント可溶有機態窒素含量を導入した有機質資材
窒素無機化予測モデルの構築，日本土壌肥料科学雑誌，印刷中．
６）
 池田弘，高橋保夫：水田裏作のイタリアンライグ
ラスに対する豆科牧草混播に関する研究 第３報イタリアンライグラスとコモンベッチ混播の収量性と有効積算温度との関係について，日本作物学会紀事，
36，55～62，1967．
 農研機構：日本飼養標準肉用牛，2008年版，131
７）～138，中央畜産会，東京，2008．
 Willmott, C. J.：On the validation of models,
８）
Physical Geography，２，184～194，1981．
９） 近藤聡：夏・秋播き飼料用ムギ類の優良品種と上
手な利用法について，牧草と園芸，53（5），13～16，2005．

© The Ito Foundation

383

和牛向け稲発酵粗飼料および発酵完全混合飼料を
厳冬期でも高品質調製するための新規乳酸菌の添加効果の検証
Validation of effects of novel lactic acid bacteria additives on winterpreparation of well-fermented rice whole crop silages and total mixed
rations for Japanese beef cattle

遠野

雅徳１・西川明宏２・福馬

敬紘２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，
２

広島県立総合技術研究所畜産技術センター）

Masanori Tohno１, Akihiro Nishikawa２ and Takahiro Fukuma２（１Institute of Livestock and Grassland Science, NARO,
２Livestock Technology Research Center, Hiroshima Prefectural Technology Research Institute）

This study aimed to develop silage additives for further improving the fermentative
qualities of whole-crop rice silage（rice WCS）and fermented total mixed ration（TMR）
through the isolation of new lactic acid bacterial strains with excellent low-temperature
growth properties. Through bacterial culture tests under low-temperature environment, we
succeeded in isolating lactic acid bacterial strains, namely Pediococcus inopinatus IWT669,
IWT685, and IWT687, which were isolated from TMR prepared in a cold region. Because there
were no reports in which P. inopinatus was isolated from（fermented）feeds, this is a new
finding regarding the diversity of the growth environment of P. inopinatus. The novelty ofeach novel isolate was recognized by the fact that each isolate differed from the type strain of
P. inopinatus in terms of sugar utilization. These novel isolates were found to have superior
low-temperature growth ability compared to the conventional Lentilactobacillus buchneri
subsp. buchneri IWT192. During the fermentation process of rice WCS at low-temperature,novel isolates significantly accelerated silage fermentation in promoting lactic acid production,suggesting that they had excellent growth and viability in rice WCS. Using strain IWT685 as
an inoculant for preparation of fermented TMR, the fermentation qualities were significantly
improved, as shown by lower pH, higher lactic acid content, and reduction of the loss of the
fresh matter. In the future, by clarifying the mechanisms of improving fermentation qualities ofrice WCS and fermented TMR by P. inopinatus -based silage inoculants, it is expected thatthese novel isolates will be put to practical use as new silage additives．

© The Ito Foundation

384
１．目

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）の見立てもできることから，“匠の技”に基づく肥的育管理技術の発展や継承は，今後も重要であろ高品質な「和牛肉」の価値が世界中で認められう。一方で，上記の生産拡大に関する目標と課題ている。「農林水産物・食品の輸出拡大実行戦略との間のギャップを埋めるためには，和牛肉の価（2022年12月，農水省）」において，牛肉は「和牛値を損なわずに，新たな飼料生産・給与方法の“標として世界中で認められ，人気が高く，引き続き準化”につながる技術開発も同時に進める必要が輸出の伸びに期待」とされている。和牛の輸出拡ある。

大については，2019年の輸出実績額の297億円にそこで我々は，工場生産型の飼料製造が可能で対して，2025年の輸出目標額は約5.4倍の1,600億あり，省力的給与も実現できる発酵TMR（混合円に設定されている。本目標の達成には，和牛の飼料，Total Mixed Ration）と発酵TMR製造に生産基盤の拡大が必要不可欠であり，出荷頭数のも活用される稲発酵粗飼料（イネホールクロップ

大幅な増加が求められることは論を俟たない。

サイレージ，イネWCS）に着目している。これ

しかし，和牛の生産現場の弱体化は深刻であまでに，高品質かつ低コストでイネWCSを調製る。生産拡大が急務であるにもかかわらず，総飼する技術開発を進め（2016年度農研機構重点普及

養頭数は約1,600千頭の横ばいで推移しており，

１）
成果：高品質・低コストのイネWCS生産体系），

過去10年間に飼養戸数が約３割も減少している。

広島県内において晩秋期に調製されたイネWCS

生産者１人当たりの飼養頭数が急速に増加していを活用して和牛用TMR調製技術の開発にも取りることは明白である。担い手不足，高齢化，生産組んできた２）。これまでの知見を踏まえ，和牛の者１人で管理できるキャパシティの限界，設備投生産基盤の拡大を推進するためには，①飼料用稲資の負担増といったさまざまな困難に直面し，飼の収穫作業の分散技術や，②稲わらの代替となる養現場の急激な拡大は容易ではない。これらの問

βカロテン低減イネWCS調製技術のさらなる

題解決のため，出荷頭数を増やすだけではなく，バージョンアップが必要であると着想した。そこ

基本の飼養管理技術をより向上させ，生産費の大で本研究では，低温増殖性にさらに優れる乳酸菌半を占める飼料代の低減や，飼料生産・給与に関株の探索を通じて，イネWCSや発酵TMRのさらわる作業負担の軽減策が求められる。まさに，生なる高品質化に資するサイレージ添加用乳酸菌の産コストを抑え省力的かつ効率的な生産技術の創開発に取り組む。これにより，①飼料用稲の収穫成が必要不可欠である。

作業を晩秋期（本州で11月中旬を想定）から厳冬

現在の肥育牛管理の主流は分離給与方式であ期の初め（本州で12月中旬までを想定）まで１ヶる。穀類を中心とする濃厚飼料とβカロテン含量

月程度拡大し，収穫作業期間の“ゆとり”を生みの少ない稲わら等の粗飼料を別々に給与する本方出しながら，②飼料用稲の立毛乾燥期間の延長に式は，濃厚飼料の選び食いに起因するルーメンア

よって，イネWCS中のβカロテン含量をさらにシドーシス等の障害により，牛の体調不良等によ低減させるという新たな価値の創造を目指す。さる生産性の低下が見られることがある。分離給与

らに，発酵TMR製造時に発酵遅延や品質のバラ方式には「どんな飼料を，どの程度，どのタイミツキが発生する課題に対して，発酵TMRに特化

ングで給与したら良いか」を見定める熟練技術がしたサイレージ添加用乳酸菌の開発事例がない状求められる。だからこそ，和牛には価値があると況下で研究着手するにあたり，常温発酵TMRモ© The Ito Foundation

和牛向け稲発酵粗飼料および発酵完全混合飼料を厳冬期でも高品質調製するための新規乳酸菌の添加効果の検証

デルを用いた乳酸菌の発酵品質改善効果に関する

２．方11６）上で近隣結合法による系統樹解析を実施した。
2.3

一次検証を行うこととした。

385

新規乳酸菌株の表現型の解析

新規乳酸菌株の表現型として，発酵飼料中のス法

ターター発酵能を推定する目的から，①糖資化性

低温増殖性に優れる新規乳酸菌の分離試験および，②低温条件下における増殖性試験を低温増殖性に優れる乳酸菌の探索のため，以下実施した。糖資化性試験については，市販のAPIに詳述するとおり，新規乳酸菌株の分離を試み

50CH（シスメックス・ビオメリュー株式会社製）

た。寒冷地である岩手県内で調製されたTMRサの取扱説明書に準じた培養試験により，各種糖源

ンプル10ｇを滅菌蒸留水100mlに懸濁後，ホモジに対する新規乳酸菌株の資化能を判定した

ナイザ（ProMedia SH-II，株式会社エルメック（30℃，48時間培養）。供試菌株として，新規乳酸ス）で１分間処理し，TMRサンプルの抽出液を菌３株（IWT669株，IWT685株およびIWT687株）

調 製 し た 。本 抽 出 液 を MRS（de Man, Rogosa,とJCM 12518Ｔ株を用いた。低温条件下におけるSharpe）寒 天 培 地（Difco）に 塗 布 後 ，ア ネ ロ

増殖性試験については，MRS液体培地（Difco）

パック・ケンキ（三菱ガス化学株式会社）によるで新規乳酸菌株を前培養後，新たな同液体培地に嫌気条件下において４℃で10日間培養し，形成さ初発菌数5.0×10６ colony forming unit（CFU）/ml

れた単一コロニーを分離した。得られた各コロで接種し，４℃で21日間静置培養した。菌体の増ニー（IWT669株，IWT685株およびIWT687株）

殖については，培養終了後の培養懸濁液のOD600を３回培養純化し，使用時まで10％ジメチルスル

値を測定することにより評価した。供試乳酸菌株

ホキシドを含む保存液中にて超低温（－80℃）保と し て ， 既 報 の Lactobacillus buchneri （現管した。

Lentilactobacillus buchneri subsp. buchneri）

2.2

新規乳酸菌株の系統分類学的評価

IWT192株（畜草２号株 ７，８））および新規乳酸菌

既報３）に従って，新規乳酸菌株の16S rRNA遺３株（IWT669株，IWT685株およびIWT687株）

2.1

伝子配列を解読することにより，新規乳酸菌株の系統分類学的評価を実施した。具体的には，ユニバーサルプライマー（27Ｆおよび1492Ｒ）を用いを用いた。
2 . 4 新規乳酸菌を用いたイネWCSへの添加試
験

たPCR反応により16S rRNA遺伝子を増幅し，広島県内で栽培された飼料用稲「たちすずか」

BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

を収穫後，原料草１ｇに対して各供試乳酸菌株を（ThermoFisher Scientific） に よ る ダ イ レ ク ト

１×10５ CFU個添加し，小規模サイレージ発酵試

シークエンス法にて当該遺伝子を解読した。得ら

験法９）により５℃の温度条件下で８ヶ月間貯蔵しれ た 16S rRNA 遺 伝 子 配 列 を Basic Local

た。具体的には，パウチ袋（飛竜Ｎ-9，旭化成パッ

Alignment Search Tool（BLAST）（http://blast.

クス株式会社）に原料草を100ｇ入れ，業務用卓ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）とEzBioCloudデータ

上密封包装機（SQ-202，シャープ株式会社）を

ベース にて検索し，新規乳酸菌株の最近縁種を用いて脱気密封することでイネWCSを作製した。

推定した。新規乳酸菌株および近縁種基準株の供試乳酸菌株として，IWT192株（畜草２号株７，８））

16S rRNA遺伝子配列をClustal W５）を用いてアラおよび新規乳酸菌３株（IWT669株，IWT685株

イメント処理し，MEGA software package v．

およびIWT687株）を用いた。

４）© The Ito Foundation

386

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

イネWCS開封後の発酵品質を評価するため，

Table 1 I ngredients of experimental TMR

イネWCSサンプル10ｇに滅菌蒸留水100mlを加えItemて 十 分 に 混 合 し た 。ホ モ ジ ナ イ ザ（ProMediaCorn flake

35.1

SH-II，株式会社エルメックス）で５分間処理し

Wheat bran

28.1

Soybean meal5.9

懸濁液を得た。滅菌蒸留水を用いて本懸濁液の段
階希釈系列を作成し，乳酸菌数（CFU/g FM新鮮物）とクロストリジア菌数（CFU/g FM）を測定した。乳酸菌数については，MRS寒天培地%DM

Timothy hay

30

Salt

0.6

Calcium carbonate

0.3

DM, dry matter.

（Difco）を利用し，30℃の嫌気条件下（アネロ
パック・ケンキ，三菱ガス化学株式会社）で１週

よび炭酸カルシウムを用いた（粗濃比＝３：７，

間培養後，培地上のコロニー数を計測した。クロ

水分40％）（Table１）。これらの原料を十分に混ストリジア菌数の測定については，上記の段階希合後に各供試乳酸菌株をそれぞれ添加（原料１ｇ

釈系列を75℃で15分間加熱処理した後，クロスト

当たり１×10５ CFU個）し，25℃の温度条件下でリジア測定用培地「ニッスイ」（日水製薬株式会

30日間貯蔵した。具体的には，パウチ袋（味噌用社）を利用し，30℃の同嫌気条件下で１週間培養

ガス抜きバルブ付規格袋，有限会社ムラマツ合後，培地上のコロニー数を計測した。

成）に混合したTMR原料を260ｇ入れ，卓上型ノサンプルのpH測定と有機酸分析は以下のとおズル式脱気シーラー（Ｖ-301，富士インパルス株り実施した。上述の懸濁液をろ紙（定量濾紙No.

式会社）で密封することで発酵TMRを作製した。

5A，アドバンテック東洋株式会社）を用いてろ供試乳酸菌株として，IWT192株およびIWT685

過 処 理 し 抽 出 液 を 得 た 。 pH メ ー タ ー

株を用いた。サンプルのpH測定と有機酸分析は（SevenExcellence S400，メトラー・トレド株式

以下のとおり実施した。100ｇの発酵TMRを蒸留会社）により抽出液のpHを測定した。有機酸分

水500mlに24時間冷蔵浸漬し抽出液を得た。pH析 に つ い て は ，抽 出 液 を イ オ ン 交 換 樹 脂メーター（Ｄ-71，株式会社堀場製作所）を用い（Amberlite IR120H＋，東京有機化学工業株式会て抽出液のpHを測定し，高速液体クロマトグラ

社） を 用 い て 処 理 し ， 0.45μｍ フ ィ ル タ ーフィー（LC-2030C，株式会社島津製作所）を用（DISIC-13HP ，ア ド バンテック東洋株式会社）

いて乳酸含量（％FM），酢酸含量（％FM）およを用いてろ過処理したサンプルを用いた。HPLC

びエタノール含量（％FM）を測定した。高速液

有機酸分析システム（日本分光株式会社）によ

体クロマトグラフィーの分析条件は以下のとおり

り，乳酸含量（％FM）と酢酸含量（％FM）をである。

測定した 。試験区の反復は３とし，統計解析は

カラム：HPX-87H（BIO-RAD社）

一元配置分散分析後にTukey法による多重比較検

カラム温度：40℃定を行った。

検出器：示 差屈折検出器（RID-20A，株式

９）

会社島津製作所）

2 . 5 新規乳酸菌を用いた発酵TMRへの添加試

移動相：0.01規定硫酸験TMR原料として，トウモロコシフレーク，フスマ，大豆粕，チモシー乾草，塩化ナトリウムお送液速度：0.6ml／分
原物ロス測定は以下のとおり実施した。発酵前© The Ito Foundation

和牛向け稲発酵粗飼料および発酵完全混合飼料を厳冬期でも高品質調製するための新規乳酸菌の添加効果の検証

387

後のパウチを含めた全重量を測定し，発酵前重量

地上から複数の乳酸菌様形態をしたコロニーの形（ｇ）から発酵後重量（ｇ）を減法することによ成が認められた。得られたIWT669，IWT685おり算出した。試験区の反復は３とした。統計解析

よびIWT687各分離株の16S rRNA遺伝子配列解析

は一元配置分散分析後にTukey法による多重比較

により，これらの菌株は，Pediococcus inopinatus検定を行った。

の基準株JCM 12518 Ｔ の16S rRNA遺伝子とそれぞれ99.9％，100％，99.8％の類似度を示した。

３．結果と考察

Pediococcus属全菌種を用いた近隣結合法による

3 . 1 低温環境下よりPediococcus inopinatusに属する新規乳酸菌株の分離に成功

系統樹解析により（Fig. １），新規乳酸菌３株はP. inopinatusの基準株DSM 20285Ｔ と同一の系統

寒冷地で調製されたTMR抽出液より，低温増

樹クラスターを形成した。以上の結果から，新規

殖性乳酸菌株の分離を試みた結果，市販MRS培

乳酸菌IWT669株，IWT685株およびIWT687株は，

0.01

Pediococcus inopinatus IWT687（in this study）
99
100
76

Pediococcus inopinatus IWT669（in this study）
Pediococcus inopinatus IWT685（in this study）
Pediococcus inopinatus DSM 20285T（AJ271383）
Pediococcus damnosus DSM 20331T（AJ318414）
Pediococcus ethanolidurans Z-9T（AY956789）

100

Pediococcus siamensis MCH3-2T（AB258357）

78

Pediococcus cellicola Z-8T（AY956788）
Pediococcus parvulus NBRC 100673T（AB681216）
Pediococcus argentinicus LMG 23999T（AM709786）
Pediococcus claussenii DSM 14800T（AJ621555）
Pediococcus acidilactici JCM 8797T（LC097074）

93

Pediococcus stilesii LMG 23082T（AJ973157）
Pediococcus pentosaceus DSM 20336T（AJ305321）
Holzapfelia ﬂoricola Ryu1-2T（AB523780）

Fig. 1 Neighbor-joining tree based on 16S rRNA gene sequences, showing the phylogenetic relationships of strains

IWT669, IWT685 and IWT687（boldface type）with their related taxa. Bootstrap percentages of ＞ 70％（based on
1,000 replications）are shown at the branch points. Bar, 0.01 substitutions per nucleotide position. The sequence ofHolzapfelia floricola Ryu1-2T was used as an outgroup．

© The Ito Foundation

388

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 2 D
 ifferential characteristics among Pediococcus inopinatus IWT669, IWT685, IWT687 and JCM 12518T.
Characteristic

IWT669

IWT685

IWT687

JCM 12518T

Methyl-α-D-mannopyranoside
Amygdalin
Arbutin
D-Maltose
D-Lactose
D-Sucrose
D-Turanose
Grey shading, acid production from sugar indicated; white, no acid production from sugar indicated.

すべてP. inopinatusに属することが明らかになっ以上のように，各新規乳酸菌株と既存の基準株とた。P. inopinatusは1978年にBackによって見出では，糖資化性プロファイルが異なっており，各されたPediococcus属の菌種であり，基準株の分新規乳酸菌株の新規性を裏付ける知見であると考離源はビール酵母である 。我々の研究チームの

えられる。

10）

見識内とはなるが，P. inopinatusがTMR等の（発我々の研究チームでは，低温増殖性に優れる乳酵） 飼 料 か ら 分 離 さ れ た 事 例 は な く ， P.

酸菌として，IWT192株を既報において報告してinopinatusの生育環境の多様性に関する新知見といる７，８）。新規乳酸菌３株と従来株であるIWT192

考えられる。また，P. inopinatusの至適生育可能

株の低温増殖能を比較した結果，本研究で新たに温度は30-32℃とされており，４℃等の低温環境分離した乳酸菌３株の低温増殖能力は，IWT192

下の生育に関する報告例がないことから，新規乳株よりも優れることが明らかとなった（Fig. ２）。

酸菌株の低温増殖能はきわめてユニークであるとこのことから，新規乳酸菌３株は従来技術である考えられる。

IWT192株よりも，低温環境下でも速やかに増殖

新規乳酸菌３株の糖資化性試験の結果をTable２に示した。IWT669株は基準株JCM 12518 株
Ｔと，メチル-α-Ｄ-マンノピラノサイド，Ｄ-ラク
トース，Ｄ-スクロース，Ｄ-ツラノースの資化性

し，サイレージの発酵初期から乳酸発酵を効率的に促進できる可能性が示唆された。
3 . 2 新規乳酸菌添加によるイネWCSの発酵促
進効果が異なっており，IWT669株に顕著にＤ-ラクトー

新規乳酸菌株によるイネWCSの発酵促進効果

スとＤ-ツラノースの利用性が認められた。

を検証するため，飼料用稲「たちすずか」にサイ

IWT685 株 は ，基 準 株 JCM 12518 株 と Ｄ - ラ ク

レージ添加用乳酸菌としてこれらの菌株を添加

トースとＤ-ツラノースの資化性が異なっており，後，寒冷地貯蔵のモデル試験として５℃一定の温IWT685株に顕著にこれらの２糖の利用性が認め度条件下で貯蔵し，開封後のイネWCSの発酵品られた。IWT687株は，基準株JCM 12518 株と，質を評価した。Table３に示すように，従来技術

メチル-α-Ｄ-マンノピラノサイド，アミグダリのIWT192株だけでなく，新規乳酸菌３株を添加

ン，アルブチン，Ｄ-マルトース，Ｄ-スクロース，処理した区においても，無添加区と比べて有意なＤ-ツラノースの資化性が異なっており，IWT687

pH低下が認められた。興味深いことに，新規乳株に顕著にＤ-ツラノースの利用性が認められた。

酸菌IWT669株，IWT685株およびIWT687株は，

Ｔ

Ｔ© The Ito Foundation

和牛向け稲発酵粗飼料および発酵完全混合飼料を厳冬期でも高品質調製するための新規乳酸菌の添加効果の検証

Growth（OD600）

2.0
1.5

389

IWT192
IWT669
IWT685

1.0

IWT687

0.5
0.0

day 0

day 21

Fig. 2 Evaluation of low temperature growth ofstrains IWT192, IWT669, IWT685 and IWT687 in
MRS broth at ４ ℃ by measuring absorbance at
600 nm after 21 days culture. Error bars are
representative of the three independent
experiments．

Table 3 F ermentation products and microorganism composition of whole crop rice silage stored for 8 months at 5℃ insmall-fermentation system inoculated without and with strains IWT192, IWT669, IWT685 or IWT687.

Item

None

IWT192

IWT669

IWT685

IWT687

pH

4.39ｄ

4.32ｃ

4.02ａ

4.11ｂ

4.12ｂ

Lactic acid（% FM）

1.0ａ

1.1ａ

1.6ｃ

1.5ｂｃ

1.5ｂ

Acetic acid（% FM）

0.23ｂ

0.26ｃ

0.20ａ

0.24ｂｃ0.25ｂｃ

Lactic acid bacteria（log CFU/g FM）

8.69ａ

8.75ａ

9.49ｂ

9.59ｂ

9.46ｂ

Clostridia（log CFU/g FM）

6.25ａ

5.84ａ

5.73ｂ

5.37ａ

5.60ａ

Means of triplicate silages. Values with different letters are significantly different（p<0.05）. FM, fresh matter; cfu, colony forming unit.

IWT192株よりもpHの低下が顕著であり，低温で生存・乳酸発酵能力において，IWT192株よりもの発酵能については，新規乳酸菌３株のほうがさ

さらに優れることを示すものである。発酵飼料中らに優れることが認められた。有機酸含量を分析のタンパク質などの栄養成分の分解に関与するク

した結果，新規乳酸菌IWT669株，IWT685株おロストリジア菌数の抑制効果については，無添加

よびIWT687株区では，無添加区およびIWT192

区 と 比 較 し た 場 合 に 新 規 乳 酸 菌 IWT669 株 ，株区と比較して，乳酸含量の有意な増加が認めら

IWT685株およびIWT687株区で菌数の低減が見れた。各新規乳酸菌株添加区では，酢酸産生は無られ，特にIWT685株添加区において有意な菌数

添加区と同程度であったことから，低温での乳酸抑制効果が認められた。

発酵能力に優れるものの，酢酸産生には影響しな
いと考えられた。

3 . 3 発酵TMRへの新規乳酸菌株の添加による有益効果

さらに，各新規乳酸菌添加区において，イネ

各種原料を混合することにより，発酵環境とし

WCS貯蔵後の乳酸菌数の有意な増加が認められては複雑系となる発酵TMRの調製において，P.

た 。以 上 の 結 果 は ，新 規 乳 酸 菌 IWT669 株 ，inopinatus乳酸菌の添加効果を検証した。添加乳

IWT685株およびIWT687株は，低温での増殖・酸菌モデルとしてIWT685株を選定し，従来技術© The Ito Foundation

390

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 4 F ermentative qualities of fermented TMR stored for 30 days at 25℃ in small-fermentation

system inoculated without and with strains IWT192 or IWT685.

Item

None

IWT192

IWT685

pH

4.42ｃ

4.28ｂ

4.02ａ

Lactic acid（% FM）

3.0ａ

2.9ａ

3.8ｂ

Acetic acid % FM）

0.3ｂ

1.3ｂ

0.1ａ

Ethanol（% FM）

0.1

0.5

nd

FM loss（g）

5.63ｂ

9.70ｃ

3.47ａ

Means of triplicate silages. Values with different letters are significantly different （p<0.05）.FM, fresh matter;nd, not detected.

のIWT192株も比較対照区として供試した。Table

における評価はこれまで実施されていない。イネ４に示すとおり，IWT685株およびIWT192株の

WCSや発酵TMR等の多様なサイレージ製造にお各添加区では，無添加区と比べて有意なpH低下

いて，それぞれの飼料に最適な乳酸菌スターターが認められた。また，従来技術のIWT192株よりを選定し，有効活用することの重要性が示唆されもIWT685株のほうが有意なpH低下効果を示した。

た。IWT685株区は，無添加区およびIWT192株

以上，本研究の成果を基礎的知見とし，今後，区と比較して，有意な乳酸含量の増加が確認されP. inopinatus乳酸菌によるイネWCSや発酵TMRた。IWT192株区では，無添加区と比較して有意の 発 酵 品 質 改 善 効 果 の 詳 細 を 明 ら か に し ，P.

な乳酸含量の増加は認められなかったが，酢酸含

inopinatus乳酸菌の温度感受性や発酵促進作用の量の増加が認められた。IWT685株区の酢酸産生機序を解明することにより，新規サイレージ添加

は，無添加区およびIWT192株区と比較して，顕用乳酸菌としての実用化に取り組んでいきたい。

著な増加は認められなかった。本結果より，発酵TMRにおけるIWT685株の優れた乳酸発酵能力４．要

約が認められたものの，IWT685株添加による酢酸本研究では，低温増殖性に優れる新規乳酸菌株

産生への影響はないものと考えられた。発酵飼料の分離を通じて，イネWCSや発酵TMRのさらな中に存在する酵母がエタノールの産生に主に関与

る高品質化に向けたサイレージ添加用乳酸菌製剤

す る が ，エ タ ノ ー ル 含 量 を 測 定 し た 結 果 ，の開発に取り組むことを目的とした。低温環境下

IWT685株区では未検出であった。さらに興味深

における培養試験を通じて，寒冷地で調製された

いことに，IWT685株区では，原物ロス量が最もTMR を 分 離 源 と す る 乳 酸 菌 Pediococcus

低く，発酵による原物ロスの抑制効果が高いこと

inopinatus IWT669株，IWT685株およびIWT687が認められた。以上のことから，IWT685株は，株の分離に成功した。P. inopinatusが発酵飼料か

発酵TMRにおける乳酸発酵を促進して速やかにら分離された事例はなく，P. inopinatusの生育環

pHを低下させることにより，原物ロス量を低く境の多様性に関する新たな知見となった。各新規抑えることが明らかとなった。IWT192株はイネ乳酸菌株とP. inopinatus基準株とでは，糖資化性

WCSの発酵促進と好気的変敗防止の観点で選抜が異なっていたことから，各新規乳酸菌株の新規されてきた乳酸菌株であり性が認められた。これらの新規乳酸菌株は，従来，発酵TMRモデル

７，８）© The Ito Foundation

和牛向け稲発酵粗飼料および発酵完全混合飼料を厳冬期でも高品質調製するための新規乳酸菌の添加効果の検証

技 術 で あ る Lentilactobacillus buchneri subsp.
buchneri IWT192株よりも，優れた低温増殖能力を有することが明らかとなった。イネWCSの低温発酵条件下において，新規乳酸菌株による有意な乳酸発酵促進効果が認められ，イネWCS中において新規乳酸菌株が優れた増殖および生存能力を有することが示唆された。さらに，新規乳酸菌
IWT685株を発酵TMR製造時に添加して貯蔵することにより，有意な乳酸産生の増加とpHの低下が認められ，発酵TMRの原物ロス量を低減できることが明らかとなった。今後，P. inopinatus
乳酸菌によるイネWCSや発酵TMRの発酵品質改善効果のメカニズムを明らかにすることにより，新規サイレージ添加用乳酸菌としての実用化が期
待できる。
文
献
１） 遠野雅徳：動画で実感！標準作業書で納得！農研機構重点普及成果イネホールクロップサイレージ技術，牧草と園芸，70（1），７～11，2022．
２） 河野幸雄：極短穂イネホールクロップサイレージを用いた和牛用TMRの開発，日本草地学会誌，66（1），50～53，2020．
３） Tohno, M., Tanizawa, Y., Sawada, H., Sakamoto,M., Ohkuma, M., Kobayashi, H.：A novel species oflactic acid bacteria, Ligilactobacillus pabuli sp. nov.,

391

isolated from alfalfa silage, Int. J. Syst. Evol.
Microbiol．，72，005587，2022．
４） Yoon, S. H., Ha, S. M., Kwon, S., Lim, J., Kim, Y.,
Seo, H., Chun, J.：Introducing EzBioCloud: ataxonomically united database of 16S rRNA genesequences and whole-genome assemblies, Int. J.
Syst. Evol. Microbiol．，67（5），1613～1617，2017．
５） Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P.,
Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H.,
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Clustal W and Clustal X version 2.0, Bioinfomatics，
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K.：MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics
Analysis across Computing Platforms, Mol. Biol.
Evol．，35（6），1547～1549，2018．
７） 遠野雅徳：高糖分・高消化性イネホールクロップ
サイレージ調製に対応する乳酸菌「畜草２号」の紹介，牧草と園芸，65（4），６～11，2017．
８） Tanizawa, Y., Kobayashi, H., Nomura, M.,
Sakamoto, M., Arita, M., Nakamura, Y., Ohkuma, M.,
Tohno, M.：Lactobacillus buchneri subsp. silagei
subsp. nov., isolated from rice grain silage, Int. J.
Syst. Evol. Microbiol．，70（5），3111～3116，2020．
９） Tohno, M., Kobayashi, H., Tajima, K., Uegaki, R.：
Strain-dependent effects of inoculation of
Lactobacillus plantarum subsp. plantarum on
fermentation quality of paddy rice（Oryza sativa L.
subsp. japonica）silage, FEMS Microbiol. Lett., 337（2），112～119，2012．
10） B a c k , W . ：Z u r T a x o n o m i e d e r G a t t u n gPediococcus, Brauwissenschaft，31，237～250，1978.

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392

生時低体重でも生後発育回復できる子豚は
何が違うのか？―血液指標の探索―
What makes low birth weight piglets recover their growth after birth?
―Blood profiles―

中島

郁世・谷口

雅章・芦原

茜・渡邊

源哉・本山

三知代・佐々木啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Ikuyo Nakajima, Masaaki Taniguchi, Akane Ashihara,
Genya Watanabe, Michiyo Motoyama and Keisuke Sasaki（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

It is widely accepted that low birth weight in piglets（≤ 1.0kg）correlates with decreased
survival and lower postnatal growth rates than those born with normal body weights. When
comparing their growth after birth, some of the low birth weight piglets were grown as large
as their normal birth weight littermates. To examine what makes the difference of low birthweight piglets to recover their growth postnatally, various components of the blood were
measured in this study. Firstly, three-way crossbred female piglets originated from 16 litterswere chosen by their birth weights; one low birth weight pig and one heaviest weight pig in
the same litter（“normal pig”）. In addition, low birth weight pigs were classified into twogroups based on their body weight at 10 wk-old; body weight of 28 kg or more as “growthrecovered”, and weighing less than 28 kg as “growth retarded”. Growth recovered pigs
exhibited higher growth performance soon after birth compared to growth retarded pigs.
Average daily food intake at 7-8 weeks of age was higher in growth recovered pigs than in
growth retarded pigs, but there was no difference in feed efficiency between the two groups.
At 6, 8 and 10 wk-old of age, blood samples were collected. The difference in circulating levelsof blood proteins, IGF-I, cholesterols, fatty acids, several enzyme activities, amino acids, andtheir relatives seen between normal and growth retarded pigs, were eliminated in growthrecovered pigs. GC-MS analysis showed that there were significant differences in some specificmetabolites between growth recovered and retarded pigs at 6 wk-old. However, blood IGF-I
concentration of growth recovered pigs became similar to those of normal pigs at 10 wk-old,but it remained low at 6 and 8 wk-old which resembled growth retarded pigs, indicating thatboth nutritional status of growth recovered and retarded pigs at 6 and 8 wk-old wereinsufficient compared to normal pigs. Overall, our data strongly suggest that postnatally
growth recovered low birth weight pigs can be characterized as pigs which improved undernutritional condition．

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生時低体重でも生後発育回復できる子豚は何が違うのか？―血液指標の探索―

１．目

393

生時低体重子豚解消の技術開発に向けた基盤的知的見につながることから，本研究課題では供試材料

近年の種豚は驚異的な繁殖成績を示す多産系ハを血液に特化し，発育改善豚の血液成分・代謝物

イブリッド種が主流を占め，一腹あたりの総産子の中に発育が改善していることの指標となりうる数が著しく増加している。しかしながら，産子数

血液マーカーの探索を試みた。また，いつ頃からの増加とともに未熟産子の数も増えたことから損発育改善の兆候が血液中に認められるのか６週，耗する子豚も多く，結果的には総産子数の大幅な８週および10週で採血し，血液成分の経時的な変増加ほど離乳頭数は増加していない 。未熟産子化も明らかにする。

１）とされる生時体重１kg以下の子豚は，離乳までの死亡率が40～60％にもなる２，３）。また，生時低２．方法

体重で生まれた子豚は，たとえ死亡しなくても飼

2.1

供試豚および材料

料効率や疾病対策等の観点から効率的経営を妨げ

農研機構畜産研究部門にて生産された三元交雑

る要因となるため，淘汰すべきか否かと養豚現場

豚（LWD種）16腹から同腹の雌子豚のうち生時では対処に苦慮している。多胎動物である豚の多体重が１kg以下の未熟産子と最大の産子（正常産化を推進する以上頻出する未熟産子は，解決が豚）のペアを選出した。子豚は４週齢で離乳後，望まれる養豚業界特有の課題である。

同腹ペアを同じ豚房で10週齢まで不断給餌にて飼

我々は，Ｈ30年度およびＨ31年度研究助成課題養した。毎週齢時に体重測定を行うとともに未熟で同腹きょうだいのうち生時体重１kg以下の未産子の生後の発育の違いを評価するため，未熟産

熟産子と生時体重最大の産子（正常豚）のペアを子のうち10週齢時体重が28kgに到達した子豚を用いて，10週齢までの両者の成長を詳細に比較し「発育改善豚（改善豚）」と未達の子豚を「発育不てきた。その中で，低体重で生まれても10週齢時

良豚（不良豚）」との２群に分類した。採血は，には正常豚と遜色ない発育を示す個体（発育改善

血清用真空採血管を用いて頸静脈より６，
８およ豚）と，小さいままでいる個体（発育不良豚）の

び10週齢時のそれぞれ同時刻に実施した。血液は存在が明らかになった（Fig. １）。この現象から，

遠心分離後，上清を回収し各分析に供試するまで未熟産子であっても生後に発育改善することが十－80℃にて保管した。
2.2分可能であると考えられた。
この発育改善豚の生理学的特徴を捉えることが飼料摂取量の測定

飼料摂取量を測定するため７～８週齢時に同腹

A

B

Fig. 1 Appearance of selected female littermates at 10 wk of age. Arrows

indicate piglets born at low birth weight with（A）growth recovered
postnatally and（B）growth retarded．

© The Ito Foundation

394

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ペアをそれぞれ単飼豚房で飼養し，一週間の給餌の血清中濃度（６，８および10週齢）を測定した。

量と残飼量の記録により摂食量および飼料効率を2.7算出した。ストレス低減のため，飼養試験開始の統計解析は，統計パッケージSAS（ver9.12）

一週間前から同腹ペアのまま単飼豚房に馴致させのMIXEDプロシジャもしくはＲのlmerTestパッるとともに飼料を徐々に切り換え，相互が視認でケージを用い，生時体重および10週齢体重によるきる豚房で単飼した。

分類を主効果，きょうだいの腹を変量効果とした

2.3

血液生化学検査

統計解析

一般線型混合モデルで解析した。最小二乗平均値

血清（６，８および10週齢）を用いて，オリエ間の多重比較はTuckey-Kramerの方法で行い，ンタル酵母工業株式会社が実施する肝・胆疾患ス

p＜0.05の場合に差が有意であると判定した。週クリーニングセットに含まれる22項目に尿素窒

齢ごとの体重および増体量については統計パッ

素，遊離脂肪酸およびグルコースを加えた計25検

ケージＲのt.test関数による対応のないｔ検定に

査項目について依頼分析を行った。

て２群比較を行い，p＜0.05の場合に差が有意で2.4

血清中遊離アミノ酸濃度の測定あると判定した。

血清（６，８および10週齢）と同量の６％スル
ホサリチル酸水溶液を加えて除タンパクし，上清３．結果と考察を限外濾過膜（倉敷紡績）でろ過した後，高速ア本研究で用いた同腹ペア16組の生時体重の平均

ミノ酸自動分析計（日立Ｌ-8900）により41種類

値が正常豚で1.6kgであったのに対して，未熟産のアミノ酸を解析した。

子は0.8kgであった。未熟産子のうち生後10週齢

2.5

血清メタボローム解析

時に体重28kgに達した改善豚は７頭，未達の不血清に内部標準物質の2-isopropyl malic acidを良豚は８頭（１頭死亡のため）であり，10週齢時

添加し，Bligh-Dyar法により水溶性画分を抽出の平均体重は正常豚38.7kg，改善豚31.7kgおよびした後，その上清を乾固処理した。その後，メト

不良豚20.7kgとなった。生時から10週齢までの改キシアミン塩酸塩とN-Trimethylsilyl-N-methyl

善豚と不良豚における週別体重および一日平均増

trifluoroacetamideによる誘導体化を経て，ガスク

体量（ADG）の変化をFig. ２に示した。改善豚

ロマトグラフィー質量分析機（GCMS-QP2020，と不良豚の体重は生後１週齢から差が生じた

島津製作所）のSCANモードを用いたノンター（Fig. 2A）
。他方，ADGも生後１週齢からが改善

ゲットメタボローム解析を実施した。代謝物デー豚の方で高くなったものの３週，４週および10週

タはSmart Metabolite DatabaseおよびMS-DIAL

齢では両者に差は認められなかった（Fig. 2B）。

２ を 用 い て 同 定 し た 後 ， MetaboAnalyst5.0

生後７～８週齢時の一日平均飼料摂取量はそれぞ（https://www.metaboanalyst.ca/）を用いて統計

れの体格相応に改善豚が不良豚を２倍近く上回っ

解析ならびにエンリッチメント解析を行った。

たが，飼料効率に有意な差は認められなかった。

2 . 6 血清中インスリンおよびインスリン様成
長因子濃度の測定

生後の発育が異なる改善豚と不良豚では生理的な違いがあるかどうかを明らかにするため６，８

ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）

および10週齢時に採血し，正常豚を含む３群の血法により，インスリン（R&D Systems）および液成分を比較した。正常豚に比べ不良豚で低下しイ ン ス リ ン 様 成 長 因 子（IGF-I, R&D Systems）ていた総タンパク質，アルブミン，総コレステ© The Ito Foundation

生時低体重でも生後発育回復できる子豚は何が違うのか？―血液指標の探索―
A

60

Growth recovered pigs

Body weight（Arbitrary unit）

50

＊＊＊

Growth retarded pigs

＊＊＊

40

＊＊＊

30

＊＊＊
＊＊

20
10
0

395

＊＊

0

1

＊＊

2

＊＊

＊＊

＊＊

3

4

5

6

7

8

9

10

9

10

Age（wk）

Average daily gain
（Arbitrary unit）

B

25

Growth recovered pigs
＊

15

0

＊

＊＊

＊

10
5

＊＊

Growth retarded pigs

20

＊＊

1

＊＊

2

3

4

5

6

7

8

Age（wk）
Fig. 2 Increase of body weight（A）and average daily gain（B）from birth to 10 wk of piglets born at low

birth weight. All data were expressed relative to the initial value of growth retarded pigs（＝１）．
There was n＝７ for growth recovered pigs and n＝９ for growth retarded pigs except the data from
10 wk of age were n＝８ for growth retarded pigs since one piglets died at 10 wk-old. Values aremeans±SD. Asterisks indicate statistically significant differences between two groups（＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001）．

ロール，遊離コレステロール，エステル型コレス

によるメタボローム解析を行った。検出された

テロール，LDLコレステロール，HDLコレステ

ピーク数は最大2,084ピークであり，そのうち計ロール，ヒスチジンおよびIGF-I濃度が，改善豚

231物質を同定した。正常豚，改善豚および不良では正常豚との間に差が認められなくなった。ま豚の３群による比較解析の結果，それぞれ６週齢

た，正常豚に比べ不良豚で増加していたアラニン

で30物質，８週齢で８物質および10週齢で16物質

アミノトランスフェラーゼ，アルカリフォスファに有意差が認められた（Table１）。また，p＜0.1でターゼ，遊離脂肪酸，アラニン，２-アミノ酪酸，

差があるとされた物質についてMetaboAnalyst5.0

ヒドロキシプロリンおよび１-メチルヒスチジン

を 用 い た 機 能 解 析 の 結 果 ，Citrate cycle 等 の濃度が，改善豚では正常豚との差がなくなってい

KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes andた（データ示さず）。

Genomes）パスウェイが複数浮上した。

上述の主要成分に加え，血液中のより微細な代

血液成分によっては10週齢時よりも６週齢時の謝物を捉えるため同じ血清試料を用いてGC-MS

ほうが改善豚と不良豚の差が明確なものもあり，© The Ito Foundation

396

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 1 S ummary of differential blood metabolite profiles
Age
Measurements

6wk

8wk

10wk

Total number of peaks

1,018

2,084

1,174

Total number of metabolites identified

185

223

209

Number of differential metabolites（p＜0.05）

30

8

16

Number of differential metabolites（0.05＜p＜0.1）

15

6

18

Number of KEGG pathway（p＜0.1）

9

2

3

10週齢よりも早い段階で発育改善の見極めができすることから，発育の違いにより血液性状が異なる可能性も示唆された。しかしながら，血中タンるかどうかを明らかにするため本研究では正常

パク質の栄養状態指標であるIGF-I濃度は，改善豚，改善豚および不良豚における血液成分を比較

豚の６，８週齢時は不良豚と同様に正常豚に比べした。改善群と不良群の体重および平均日増大量て低かった。

の差は生後から現れた。生後７～８週齢時の一日以上の結果から，同じ未熟産子でも生後の発育

平均摂食量は改善豚の方が不良豚よりも高かったの違いにより血液成分が異なることが明らかにものの飼料効率に両者の差は認められなかった。

なった。不良豚が低タンパク質の状況下にあるの

生後10週齢時の血液成分は，正常豚に比べ不良豚に対し ，改善豚はその状態がほぼ解消されて10で低い総タンパク質，アルブミン，一部の必須ア

週齢時には栄養状態が好転していることが血液成

ミノ酸やコレステロール類が改善豚では解消され分からうかがわれた。一方ADGの結果（Fig. 2B）ていた。また，正常豚に比べて不良豚で高い一部

からは，栄養状態が改善される時期は出生直後との酵素類，非必須アミノ酸が改善豚では解消され離乳後の２段階あるものと推察された。今後，本ていた。血中IGF-I濃度の結果から，不良豚で観研究成果である改善豚と不良豚に差が認められた

察される低栄養状態が10週齢時の改善豚では脱却

血液成分を指標とするような未熟産子の発育改善

していることが明らかになった。GCMSメタボ技術を開発するためには，これらの物質が発育改

ローム解析結果では，６週齢時にすでに両者で差善の原因と結果のいずれであるかを明らかにしてのある代謝物が多く認められたことから，10週齢いく必要がある。

よりも早い段階で発育改善の兆候が血液中に生じ

４）

４．要

ている可能性が示唆された。

約

生時体重１kg以下で生まれる未熟産子は，死亡率が高くまた生存したとしても発育が遅いことから，これまで我々は未熟産子と正常産子を比較してきた。その中で，低体重で生まれても10週齢時には正常豚と遜色ない発育を示す個体（改善豚）と，小さいままでいる個体（不良豚）が存在

文
献１）
 Oliviero, C.：Molecular Reproduction andDevelopment, https://doi.org/10.1002mrd. 23572, 2020.
 Quiniou, N., Dagorn, J., Gaudré D.：Livestock２）
Production Science，78，63～70，2002．
３） 武田浩輝：Pig Journal，11，14～17，2008．
４）
 Xu, W., Bai, K., He, J., Su, W., Dong, L., Zhang, L.,
Wang, T.：Nutrition，32，114～121，2016．

© The Ito Foundation

397

子牛用疑似グルーミング装置利用モニタリングによる健康状態評価手法の開発（Ⅱ）
Development of health check system by monitoring usage frequency of
mechanical grooming brush for calves（Ⅱ）

矢

用

健

一１・野

上

大

史２

２
（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，九州大学）

Ken-ichi Yayou１ and Hirofumi Nogami２
２Kyusyu University）（１Institute of Livestock and Grassland Science, NARO，

Usage of automatic grooming brush for calves had a lower priority than the desire forbehavior such as eating and resting, and decreased quickly as the health condition deteriorated.
For this reason, the purpose of this study was to enable monitoring of the use of thisequipment in group raring and to use it as a health condition evaluation method．
Collar-type wireless 3-axis accelerometer terminals were attached to five heifers, and an
accelerometer was also incorporated into the grooming device to collect device operation time.
In addition, we are working on incorporating individual identification, posture, and distanceinformation from the brush by AI cameras into the judgment system. With this system, it
became possible to accurately measure the brush usage time in seconds, and it became possible
to exclude the misjudgments when the brush was not in operation. We are working to improve
the accuracy of individual identification while the brush is in operation, and by adding theimage analysis results of the video cameraʼs “individual identification, distance and posture”，
we have improved the accuracy of individual identification（identification rate of 90％ ormore）．
As for the relationship between device usage frequency and health deterioration, no signsof illness such as anorexia, diarrhea and cough were observed from birth to weaning in 7
Holstein cows. However, the average daily weight gain per week, calculated from the weights
measured every week, varied greatly depending on the individual. A significant positive
correlation was found between daily weight gain and mean frequency of device use during thesame period（r ＝ 0.43，p < 0.05）. In other words, there was a tendency for the daily weight gain
to be large during the week when the device was frequently used. By monitoring fluctuationsin the frequency of device use for each individual, it was possible to predict stagnation in body
growth and to take some countermeasures. A positive correlation trend was observed between
the frequency of device use every 24 hours and the percentage of time spent ruminating whilelying（r ＝ 0.183，p < 0.05）.The increase in rumination while lying during the period when thefrequency of equipment use increased may have affected the daily weight gain．
In the future, we would like to proceed our patent of the device usage time sensor ingroup rearing into practical use. And then our surveys should be targeting during 1 to 2 weeks© The Ito Foundation

398

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

after the transfer to a group where frequent occurrence of diarrhea and pneumonia areproblems, or early mother-child separation in Japanese black cattle for which mother-childseparation immediately after birth is not customary．

１．目

り，装置を利用することで日増体量の向上や，群的からの離脱率の低減といった効果があることを明

牛肉の国内需要の増加への対応と輸出の一層のらかにしてきている。本課題では，このシステム

拡大を目指すため，令和元年12月に，和牛の生産をさらに発展させて子牛の死廃率を２％台まで下量を平成30年度の14.9万トンから令和17年度に30げることを可能にする技術の開発を目指す。具体

万トンに増やす政策目標が「農業生産基盤強化プ

的には，採食や休息といった行動の欲求と比べてログラム」の中で設定された１）。繁殖雌牛の増頭

プライオリティが低いと考えられるグルーミングに主眼が置かれているが，出生した子牛の死廃率への欲求は，健康状態の悪化に伴っていち早く減（現在優良農家で５％程度）を下げる対策も重要少するのではないかと予想しており，採食量（哺である。特に黒毛和種はホルスタイン種に比べて乳量）の低下や，発熱の検知など，目に見える症

出生時体重が小さいことなどが原因で抗病性が低状の検出よりも早期に疾病発症の危険がある子牛いことが多く，下痢，肺炎等による成長遅延，死を発見可能と考えている。早期に発見し，早期に廃の問題は特に増頭のための早期母子分離や乳牛治療が可能となることで，子牛の死廃率を低減すへの和牛受精卵移植において大きく，早急に解決るとともに，増体のよい，強い素牛作りに貢献ですべき課題である。

きる。また，早期治療が可能となることで，治療解決には子牛の健康状態把握が肝要であるが，コストが低減できるとともに，薬剤，特に抗菌剤増頭対策のために増えつつある“母牛から早期分使用の低減によって環境に優しく安全安心な牛肉

離し哺乳ロボットで群管理するシステム”では健の生産にも貢献可能である。

康状態悪化個体は目に見える症状が出て初めて発見されるため，治療にも時間を要し，死廃率も高２．方

法くなる。“もの”のインターネット，IoTが畜産分

本研究は（国研）農研機構の動物実験規定に基野にも適用されつつあるが，採食量（哺乳量）のづき計画を立案し，同機構動物実験委員会の承認低下や，発熱の検知など，目に見える症状を検出を得たうえで行った。

することが目的であることがほとんどであり，それよりもさらに早期検出が可能な技術を新たに開2 . 1 個体識別の高精度化および首輪型センサ
端末の省電力化
2021年度の実験では，複数の育成牛に無線式３

発したいと考えた。
申請者は，母牛が子牛に対して行う舐め行動

軸加速度センサ端末を首周りに取り付け，装置使（グルーミング）の代替となる子牛用疑似グルー

用時の振動を測定している。この測定信号の特徴

ミング装置を開発した（特許第6449028号） 。子を抽出し，ブラシ使用個体・使用時間判定システ

牛はグルーミングを受けたいという体幹刺激へのムを新たに提案し，特許出願した３）。このシステ欲求が強く，多くの個体は１日20分程度，毎日一

ムでは，ブラシが使用されているときには，ブラ定の時間を装置利用に費やすことが分かっておシを使用している個体の判定は可能となってい２）© The Ito Foundation

子牛用疑似グルーミング装置利用モニタリングによる健康状態評価手法の開発（Ⅱ）

399

ID_1

ID_2

ID_3

ID_4

5 sec

Cow is using the grooming device.

Fig. 1 Measurement result of the 3 axis accelerometers attached to 4 calves（ID_1～4）.
Arrows indicate the time point when at least one axis acceleration changed. Box indicates when ID_4 calf used
the grooming device.

る。しかしながら，ブラシ使用時間を過大に，あ・グルーミング装置への加速度センサの組み込み

るいは過少に判定してしまうことが分かってき・AIカメラによる個体識別・姿勢・ブラシとのた。加えて，ブラシが使用されていないときでも，距離情報の組み込みブラシ使用個体・使用時間を判定する場合が発生

実験では，首輪型無線式３軸加速度センサ端末した。

を５頭の子牛，グルーミング装置に３軸加速度セFig. １に，４頭のウシに無線式加速度センサ端ンサを使用した。また牛舎にビデオカメラを設置

末を取り付けたときの加速度変化の結果を示しし，「個体識別・姿勢・ブラシとの距離」を判定た。ID_４のある時間帯においてブラシを使用しするデータ取得を行った。本条件にて，24時間のている。ブラシの使用開始前に加速度が急上昇す実験を３回行い，解析を行った。

る特徴的な変化が計測されており，ブラシの使い

上記は，首輪型センサ端末の省電力化にもつな

始めは明確である。一方で，使い終わりには，加がる。「個体識別・姿勢・ブラシとの距離情報」

速度の変化がほとんどなく，使い終わりが分からを活用することで，ブラシとの一定区間に入ったない。ブラシ使用時間を過大にあるいは過少に判場合のみセンサを稼働させる，立位状態のみセン

定してしまう原因となっている。またID_２におサを稼働させることが可能となる。首輪型センサ

いて，ブラシ使用時と似た加速度変化が計測され端末の稼働時間を大幅に削減することができ，省ており，誤判定の原因となった。

電力化が可能となる。

これら課題を解決し，個体識別の高精度化を実現するため，ブラシ使用個体・使用時間判定シス
テムに，以下の情報を導入した。

2 . 2 センサの精度と健康状態低下検知能力の評価
ホルスタイン種子牛７頭を生後から離乳まで，© The Ito Foundation

400

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

装置を設置した個別飼育ペンにおいて飼養し，調過少に判定してしまっていたが，グルーミング装

査した。装置利用頻度については毎朝９時に回転置に取り付けた加速度変化を用いることで，ブラ数カウンターを確認し，前日24時間の総回転数を

シ使用時間については秒単位で正確に計測できる

記録し，装置利用頻度とした。個体ごとに利用頻ようになった。加えて，ブラシが稼働していない

度のレベルが異なったため，調査全期間の平均回ときにブラシ使用個体・使用時間を判定した場合

転数を100％とした割合（装置利用頻度割合）とは除外されるため，ブラシが稼働していないときして以降の統計解析に用いた。牛の行動はビデオの誤検出は発生していない。

で連続記録し，５分間隔のスキャンサンプリング

ブラシが稼働中の個体識別の高精度化に取り組により，立位，伏臥位，立位反芻，伏臥位反芻，んでおり，「個体識別・グルーミング装置からの採食について１日あたりの行動時間割合を求め

距離・姿勢」の画像解析を行った。個体識別は子た。また，約１週間間隔で体重を測定し，日増体

牛の模様情報から判定を行っており，姿勢情報に量を求めた。記録牛の健康状態については，下痢，ついては立位と座位の判定を行っている（Fig.

咳などの疾病兆候，採食量の極端な低下などにつ２）。これまでの行動解析結果より，座位の状態

いて，野帳に記録した。

でグルーミング装置を使用していることはない。

日増体量を求めた期間について，装置利用頻度

グルーミング装置からの距離は，個体識別したと割合の平均値を計算し，日増体量とのピアソン積

きのマーカの最短距離を指定した（Fig. ３）。ウ率相関係数を求め，母相関係数の無相関の検定をシが重なり合っているときは，グルーミング装置

行った（エクセル統計 バージョン4.04）。24時間との距離が０ｍと示すこともある。画像だけのグごとの装置利用頻度割合と，各行動の時間割合にルーミング装置の判定率は現状５割程度である

ついても同様に相関の検定を行った。

が，グルーミング装置の稼働時刻を加えたブラシ
使用個体・使用時間判定システムと組み合わせる

３．結果と考察
3.1

ことで，個体識別の高精度化（識別率90％以上）

ブラシ利用時間センサの開発の可能性を見出せている。この手法については国首輪型加速度センサ端末のデータ取得率の最も高い１日において解析を行った。ビデオカメラより，５頭のウシについて以下の行動観察を行い，ブラシ使用個体・使用時間判定システムとの比較

内優先権主張出願を行う。
3 . 2 センサの利用頻度と健康状態低下との関連解明調査した７個体すべての個体において調査期間を行った。

中，食欲不振，下痢および咳といった疾病の兆候，
・ウシの位置（グルーミング装置からの距離）は認められなかった。しかし，１週間ごとに測定

姿勢（立位，座位）

した体重から求めた週あたりの平均日増体量に・グルーミング装置の使用の有無

は，個体によって大きな変動が認められた（0.017-

行動観察より，ブラシの使用回数は39回であっ1.257， 0.254-0.930， 0.464-1.767， 0.280-0.971，

た。グルーミング装置に取り付けた加速度変化か

0.463-1.214，0.257-0.786，0.271-0.80kg/day）。目ら，行動観察と同様の結果を得ることができた。

視の症状としては判別不可能であったが，日増体

また，これまでのブラシ使用個体・使用時間判定

量が大きく低下した週にはなんらかの体調の不調

システムでは，ブラシ使用時間が過大にあるいはがあったことが推察された。

© The Ito Foundation

子牛用疑似グルーミング装置利用モニタリングによる健康状態評価手法の開発（Ⅱ）

401

Grooming device

CAM01
ID_1, Standing

ID_2, Sitting

Fig. 2 An example of image analysis of individual identification and posture determination.

Grooming device

CAM02
ID_3, Distance；0.3m

ID_4, Distance；0m

Fig. 3 An example of image analysis of distance measurement from the grooming device

to calf ’s tip of the nose.

日増体量を求めた期間について，装置利用頻度のが増体に直接的な影響を及ぼすわけではないと割合の平均値を計算し，日増体量とのピアソン積

考えられるが，個体ごとの装置利用頻度の変動を率相関係数を求めたところ，両者の間には有意なモニタリングすることで，増体の停滞を予測する

正の相関が認められた（Fig. ４，ｒ＝0.43，ｐ＜ことが可能となり，なんらかの対策を講じること

0.05）。つまり，装置の利用が多い週には日増体ができるようになることが考えられた。

量も大きい傾向が認められた。装置の利用そのも24時間ごとの装置利用頻度割合と，各行動の時© The Ito Foundation

402

Weekly Average Daily Weight
Gain（kg/day）

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

1.5

1

0.5

0
50

100

150

200

Weekly average Usage/Total Average
Usage of the Device（%）

Fig. 4 The relationship between device usage and

40%

a

30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%

0

b

90%

35%

Time Ratio of Lying during 24h

Time Ratio of Lying during Rumination
durig 24hweekly daily weight gain of calves. There was asignificant correlation between the parameters（r＝0.43，ｐ＜0.05）．

100

80%
70%
60%
50%
40%

200

0

Daily Usage of the Device / Total Average Usageper Day（%）

100

200

Daily Usage of the Device / Total Average Usageper Day（%）

Fig. 5 The relationships between daily device usage corrected by average daily usage during total experimental

period and the time ratios of lying during rumination（a）and lying（b）. Daily device usage significantly
and positively correlated with the time ratio of lying during rumination（r＝0.183，p < 0.05）, and significantly
and negatively correlated with the time ratio of lying（r＝－0.192，ｐ＜0.05）．

間割合についてのピアソン積率相関係数では，伏ｐ＝0.579），非常に弱い相関傾向とはいえ，伏臥臥位反芻時間割合との間に正の相関傾向（Fig.

位反芻時間割合との間に正の相関が認められたこ

5a，ｒ＝0.183，ｐ＜0.05），伏臥位時間割合とのとは予想外であった。伏臥位反芻時間割合と伏臥間に負の相関傾向が認められた（Fig. 5b，ｒ＝

位時間割合との間には強い相関傾向が認められた－0.192，ｐ＜0.05）。装置の利用は立位で行われことから（ｒ＝－0.91，ｐ＜0.01），おそらくは伏るため，装置の利用頻度は活動性を反映すると考臥位姿勢における反芻とそれ以外の状態の割合のえられる立位の時間割合との間に正の相関がある

変化が原因で，装置利用頻度割合と伏臥位時間割と予測していたが，ほとんどなく（ｒ＝－0.042，

合との間に負の相関傾向が認められたものと考え© The Ito Foundation

子牛用疑似グルーミング装置利用モニタリングによる健康状態評価手法の開発（Ⅱ）

403

られた。装置利用頻度割合と採食時間割合との間の個体識別の高精度化に取り組んでおり，ビデオに は 相 関 が 認 め ら れ な か っ た こ と か ら（ｒ ＝カメラの「個体識別・グルーミング装置からの距－0.042，ｐ＝0.579），採食頻度の増加が装置利用

離・姿勢」の画像解析結果を加えることで，個体頻度と日増体量の正相関に影響したとは考えにく

識別の高精度化（識別率90％以上）を目指す。

いが，装置利用頻度割合が増加する期間に伏臥位装置利用頻度と健康悪化との関係については，

反芻が多くなることが日増体量に影響を及ぼした

ホルスタイン種雌子牛７頭の出生直後から離乳ま可能性が考えられた。

での間，食欲不振，下痢および咳といった疾病の例数が少なかったこともあるが，生後すぐに母兆候は認められなかった。しかし，１週間ごとに子分離し，人工哺乳で飼育することが慣行化して測定した体重から求めた週あたりの平均日増体量いるホルスタイン種であったことや，個別飼育にには，個体によって大きな変動が認められ，日増

よって社会的ストレスがなかったことなどが，健体量が大きく低下した週にはなんらかの体調の不康悪化例が少なかった原因と考えられた。生後す調があったことが推察された。日増体量と同期間

ぐの母子分離が慣行化していない黒毛和種子牛での平均装置利用頻度との間には有意な正の相関がの早期母子分離や，下痢・肺炎が多発することが認められた（ｒ＝0.43，ｐ＜0.05）。つまり，装置問題となっている群飼移行後１から２週間を対象の利用が多い週には日増体量も大きい傾向が認めとした調査例数の追加を今後行っていきたい。特られた。個体ごとの装置利用頻度の変動をモニタ許出願した群飼におけるブラシ利用時間センサをリングすることで，増体の停滞を予測することが活用し，取り組む予定である。

可能となり，なんらかの対策を講じることができ

４．要るようになることが考えられた。24時間ごとの装約

置利用頻度と，伏臥位反芻時間割合との間に正の子牛用疑似グルーミング装置の利用は，採食や相関傾向が認められた（ｒ＝0.183，ｐ＜0.05）。

休息といった行動の欲求と比べてプライオリティ

装置利用頻度割合が増加する期間に伏臥位反芻がが低く，健康状態の悪化に伴っていち早く減少す

多くなることが日増体量に影響を及ぼした可能性

ると考えた。このため，群飼における装置利用モが考えられた。

ニタリングを可能にし，健康状態評価手法とすることを目的とした。

今後，生後すぐの母子分離が慣行化していない
黒毛和種子牛での早期母子分離や，下痢・肺炎が５頭の育成牛に首輪型無線式３軸加速度センサ

多発することが問題となっている群飼移行後１か端末を取り付け，また装置稼働時刻を収集するたら２週間を対象とした調査について特許出願しためグルーミング装置にも加速度センサを組み込ん

群飼におけるブラシ利用時間センサを実用化につだ。また，AIカメラによる個体識別・姿勢・ブ

なげたうえで行っていきたい。

ラシとの距離情報も，ブラシ使用時間・判定シス
テムに組み込むことに取り組んでいる。本システ
ムにより，ブラシ使用時間については秒単位で正確に計測できるようになり，ブラシが稼働していないときにブラシ使用個体・使用時間を判定した場合は除外できるようになった。ブラシが稼働中

文
献１）
 農林水産省：農業生産基盤強化プログラム，2020.
 矢用健一：子牛の疑似グルーミング装置及び飼育２）
管理法 特許第6449028号，2018．
３）
 矢用健一，野上大史：グルーミング情報収集シス
テム，個体判別システム，データセットの生成方法，
及び，個体判別方法 特願2022-079382，2022．

© The Ito Foundation

404

ニワトリヒナに備わる抗炎症能力の解明～抗酸化能に注目して～Studies on unique anti-inflammatory ability of chickens： role of antioxidant ability

橘

哲

也・牧

野

良

輔

（愛媛大学大学院農学研究科）

Tetsuya Tachibana and Ryosuke Makino（Graduate School of Agriculture, Ehime University）

We previously found that chicks possess anti-inflammatory ability against pathogenassociated molecules（PAMPs）. This study was performed to clarify the anti-inflammatory
ability of chickens in the light of anti-oxidant ability using PAMPs and D-galactosamine（D-GalN）. Lipopolysaccharide（LPS）and zymosan were selected as the PAMPs for thepresent study. Intraperitoneal injection of either LPS, zymosan or D-GalN did not induce
hepatic injury in chicks. The combination of LPS and D-GalN induced hepatic injury while the
combination of zymosan and D-GalN had no effect. LPS and D-GalN synergistically increasedmRNA expressions of interleukin-6（IL6）, a pro-inflammatory cytokine and inducible nitricoxide synthase（iNOS）at 6 h post-injection while only iNOS was synergistically increased byzymosan and D-GalN. All these treatments did not induce lipid peroxidation in the liver.
Although LPS and zymosan alone had less effect on mRNA expressions of pro-inflammatory
cytokines including IL-6 at 6 h, these PAMPs increased them at 3 h in our preliminary
experiments. This suggests that specific bioactive molecules would suppress gene expressionof pro-inflammatory cytokiens and thereby suppress oxidative stress in chicks. Since LPS andzymosan stimulate corticosterone（CORT）release, we hypothesized that CORT suppresses thegene expression of pro-inflammatory cytokines and induces anti-oxidant effect in chicks.
Indeed, subcutaneous injection of CORT suppressed mRNA expression of pro-inflammatory
cytokines in the liver and spleen. In addition, CORT increased plasma uric acid level and antioxidant capacity. However, we were not able to confirm that endogenous CORT actuallyinduce anti-oxidant effect during LPS challenge because we could not find available antagonists
for chicken CORT receptor. Finally, we performed RNA-seq analysis to find anti-oxidants inthe liver. As the result, genes associated with the synthesis of uric acid and imidazole
dipeptides were upregulated with LPS and zymosan in the liver of chicks. These anti-oxidants
might be associated with anti-oxidant ability of chicks, in addition to CORT. In summary, wesuggested that chicks possess anti-oxidant ability by CORT, uric acid and imidazole dipeptides
under pathogenic challenge．

© The Ito Foundation

ニワトリヒナに備わる抗炎症能力の解明～抗酸化能に注目して～

１．目

的

２．方

405

法

ニワトリは世界で最も多く飼育されている家畜実験には白色レグホンオスヒナを用いた。なである。しかし，多頭羽飼育が一般的な現代の養お，本実験は愛媛大学動物実験委員会の承認を受

鶏業では，高病原性鳥インフルエンザをはじめとけたものである。

する感染症が発生すると被害も甚大化しやすい。

実験１

動物の体内に病原性微生物が侵入すると，微生物

抗炎症能の確認

肝臓の損傷に基づいたPAMPsに対する特有の分子構造（PAMPs）が免疫細胞などに発まず，ヒナにD-GalN（40mg）を腹腔内投与し，現しているパターン認識受容体に認識されることその６および24時間後に採血して血漿を得た。肝で自然免疫が活性化し，炎症性サイトカインが分臓の損傷マーカーであるアスパラギン酸アミノ基泌される１）。一方で，炎症性サイトカインが過剰転移酵素（AST），アラニンアミノ基転移酵素に放出されると，肝臓などさまざまな臓器の損傷（ALT）および乳酸脱水素酵素（LDH）の血漿中が起きて敗血症を引き起こす。

活性を調べた。

しかし，著者は細菌由来のPAMPsであるリポ

次に，ヒナを４群に分け，それぞれ生理食塩水

ポリサッカライド（LPS）をヒナに投与しても肝（対照），LPS（100μg），D-GalN（40mg），また臓の損傷マーカーが変化せず，小腸に損傷が生じはLPSとD-GalNを腹腔内投与し，投与６時間後ないことを見出した（日本畜産学会第128回大会，の血漿中AST，ALTおよびLDH活性を調べた。

2021年）。これは，ヒナが感染による炎症反応に最後に，ヒナを４群に分け，それぞれ生理食塩

対する抵抗性を有していることを示唆している。

水 （対 照）， ザ イ モ サ ン （2.5mg）， D-GalN

炎症による損傷には炎症性サイトカインと酸化ス（40mg），またはザイモサンとD-GalNを腹腔内投トレスが関与しているため，ヒナにはこれらに対与した。投与６時間後の血漿中AST，ALTおよする耐性がある可能性がある。

びLDH活性を調べた。また，投与24時間後の血そこで本研究では，ヒナに備わる炎症に対する漿中活性を測定する実験も実施した。

抵抗性のメカニズムを明らかにすることを目的と実験２し た 。本 研 究 で は ，LPS に 加 え ，真 菌 由 来 のの解明

PAMPsに対する抗炎症能のメカニズム

PAMPsであるザイモサン，および哺乳類ではヒナを４群に分け，それぞれ生理食塩水（対LPSやザイモサンによる組織損傷を促すＤ-ガラ照），LPS（100μg），D-GalN（40mg），またはLPS

クトサミン（D-GalN）をヒナに腹腔内投与したとD-GalNを腹腔内投与し，投与６時間後に肝臓後の肝臓の損傷を調べるとともに，炎症性サイトを採取し，肝臓の炎症性サイトカイン（インター

カイン，酸化ストレスおよび抗炎症性物質の変化

ロイキン-１β（IL-１β），IL-６，インターフェロを調べた。また，抗炎症性物質の一つであるコルン-γ（IFN-γ）および腫瘍壊死因子様サイトカ

チコステロン（CORT）の作用を調べるととも

イン１Ａ（TL1A））と誘導型一酸化窒素合成酵に，RNA-seq法によりヒナにおける抗酸化能に素（iNOS）の遺伝子発現量をリアルタイムPCR

関わる因子を探索した。

で調べた。また，肝臓中の抗酸化酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の活性および脂質過酸化の指標であるTBARS濃度を調べた。

© The Ito Foundation

令和４年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Control
AST

400
200

b

10

a

b

b

Karmen unit

Karmen unit

600

LPS

0

LPS + D-GalN

D-GalN

8

ALT

LDH
a

6
5

a
b

ab

b

Unit/ml

406

4
2

0

b

b

b

0

Fig.１ Effect of simultaneous intraperitoneal injection of 0.1 mg LPS and D-GalN on plasma AST, ALT and LDH

activities. Blood was collected at 6 h after the injection. The number of chicks in the control, LPS alone,
D-GalN alone, and LPS ＋ D-GalN groups were 8, 9, 7, and 9, respectively. Values are the mean ± SEM. Groups
with different letters are significantly different（p＜0.05）．

次に，ヒナを４群に分け，それぞれ生理食塩水（対照），ザイモサン（2.5mg），D-GalN（40mg），
またはザイモサンとD-GalNを腹腔内投与し，LPSの実験と同様の項目を調査した。
実験３の影響を受けた化学反応経路を特定した。
また，ヒナにザイモサンを腹腔内投与（2.5mg）
した実験もLPSと同様に実施した。
３．結果と考察

CORTの作用の解明

ヒナにCORTを皮下投与（1.2mg）し，その１および３時間後に採血し，血糖値，血漿中尿酸濃実験１

肝臓の損傷に基づいたPAMPsに対する抗炎症能の確認度および総抗酸化能を測定した。同様にCORT皮D-GalNはいずれの時間においてもすべての肝下投与１および３時間後の肝臓および脾臓内炎症

臓損傷マーカーの活性に有意な影響を与えなかっ性サイトカインおよびiNOSの遺伝子発現量をリた。本研究で用いたD-GalNの投与量は哺乳類にアルタイムPCRにて調査した。

おいて肝臓の損傷を引き起こすのに十分な量であ

次に，ヒナを２群に分け，一つの群にはRU486
を皮下投与（2.4mg）した直後にLPSを腹腔内投るため２），ヒナはD-GalNに対して耐性を有していると考えられた。

与（100μｇ）し，もう片方の群には皮下投与用

LPSの単独投与はどの肝臓損傷マーカーにも有溶媒液のみ皮下投与した直後にLPS（100μｇ）

意な影響を与えなかったことから，ヒナではLPSを腹腔内投与した。投与６時間後に採血し，血漿による肝臓の損傷が生じないことが明らかとなっ

中AST，ALTおよびLDH活性を調べた。

た（Fig.１）。一方，LPSとD-GalNの同時投与に

実験４

よってすべての肝臓損傷マーカーが有意に増加し

PAMPsによって変動する肝臓中遺伝子の網羅的探索た（Fig.１）。D-GalNによるLPSの増強作用は哺乳ヒナにLPSを腹腔内投与（100μｇ）し，その類においても報告されているため３），両者の関係

３時間後に肝臓を採取して全RNAを抽出した。

性は動物種を超えて保存されていると考えられる。

逆転写の後にライブラリを作製し，RNAseq法に

ザイモサンはいずれの肝臓損傷マーカーに影響

よりシーケンスデータを取得した。得られたデーを与えず，ザイモサンとD-GalNを同時投与してタのマッピングを行い，正規化の後に遺伝子発現

も肝臓損傷マーカーの変化が見られなかった。哺

差解析を実施した。パスウェイ解析によってLPS

乳類ではザイモサンは肝臓をはじめとするさまざ© The Ito Foundation

407

ニワトリヒナに備わる抗炎症能力の解明～抗酸化能に注目して～Control

Relative change in mRNA expression

4

LPS
40

IL-1β

D-GalNLPS + D-GalN
4

IL-6

a

20

2

2

b

0

0
4

TL1A
a

b

ab

b

0

15

iNOS
a

10

2
b

IFN-γ

b

5
b

0

ab

b

0

Fig.２ Effect of simultaneous intraperitoneal injection of LPS and D-GalN on the expression of inflammatory-

associated genes in the liver. The liver was collected at 6 h after the injection. The number of chicks in thecontrol, LPS alone, D-GalN alone, and LPS ＋ D-GalN groups was 8, 8, 8, and 6, respectively. Values are the mean
± SEM. Groups with different letters are significantly different（p＜0.05）．

まな臓器の損傷をもたらすが４），ヒナではザイモの過酸化が生じなかったことを示唆している。まサンに対する耐性を有していることが明らかとた，LPSとD-GalNの同時投与はヒナの肝臓損傷なった。

を引き起こしたため（Fig.１），この肝臓損傷に

実験２

PAMPsに対する抗炎症能のメカニズム

は酸化ストレスが関与していない可能性がある。
ザイモサンを用いた実験では，ザイモサンの単の解明
LPSの単独投与によって肝臓のTL1Aの遺伝子

独投与ではいずれの遺伝子発現量においても有意発現量が有意に増加したものの，それ以外では有な 変 化 が 見 ら れ な か っ た が ，ザ イ モ サ ン と意な変化が見られなかった（Fig.２）。D-GalNの

D-GalNの同時投与によりiNOS遺伝子発現量が有単独投与はいずれの遺伝子の発現量にも影響を与意に増加した。ザイモサンおよびザイモサンとえなかった。LPSとD-GalNの同時投与によりIL-

D-GalN の 同 時 投 与 は 肝 臓 中 SOD 活 性 お よ び

６およびiNOS遺伝子発現量が有意に増加したが，

TBARS濃度に影響を与えなかった。

LPSによるTL1A遺伝子発現量の増加はD-GalNになお，予備実験として，LPSおよびザイモサン

よ っ て 低 下 し た 。こ れ ら の こ と か ら ，LPS とをそれぞれ単独投与しその３時間後の肝臓内遺伝

D-GalNの同時投与によってのみ見られる肝臓の子 発 現 量 を 調 べ た と こ ろ ，IL- ６ ，IFN- γ ，損傷にはIL-６と一酸化窒素（NO）が関与して

TL1AおよびiNOSの遺伝子発現量が有意に増加いることが示唆された。

した。投与６時間後にはこれらの作用が見られな

なお，LPSとD-GalNの同時投与によって肝臓くなったため（Fig.１），なんらかの因子がこれ

SOD活性が有意に増加したのに対し，TBARS濃らの遺伝子発現を抑えたと考えられる。

度には変化が見られなかった（Fig.３）
。これは

実験３

SODによって活性酸素が除去された結果，脂質CORTによる抗酸化作用の解明

過去の報告と同様に５），CORTは投与１時間後© The Ito Foundation

408

令和４年度
Control

LPS

D-GalN
15

TBARS

0.6

Unit/mg proteinµM/mg protein

0.8

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

0.4
0.2
0

10

LPS + D-GalN
SOD
c

bc

a

ab

5
0

Fig.３ Effect of simultaneous intraperitoneal injection of LPS and D-GalN on

TBARS and SOD activity in the liver. The liver was collected at 6 h after the
injection. The number of chicks in the control, LPS alone, D-GalN alone, andLPS ＋ D-GalN groups was 8, 8, 8, and 6, respectively. Values are the mean
± SEM. Groups with different letters are significantly different（p＜0.05）．

から血糖値および血漿中尿酸濃度を増加させた。

していることが明らかとなった（Table１）。両

血漿総抗酸化能も有意に増加したが，これは抗酸

PAMPsによってSODおよびカタラーゼの遺伝子化能をもつ尿酸の血漿中濃度が増加したことが原

発現量が減少または減少傾向を示したが，LPSで因であると考えられる 。

はアンセリン合成酵素が，ザイモサンでは尿酸合６）

また，CORTの投与によって肝臓および脾臓に成酵素およびヘムオキシゲナーゼ１が増加していおける炎症性サイトカインおよびiNOS遺伝子発た。したがって，これらの抗酸化物質がPAMPs

現量が有意に低下したことから（Fig.４），CORTによる酸化ストレスを改善するために寄与していはヒナにおいても抗炎症作用を有することが明らると考えられた。アンセリンがイミダゾールジペかとなった。しかし，グルココルチコイド受容体

プチドであることと，尿酸合成にはグルタミン，

アンタゴニストであるRU486とLPSを同時投与しアスパラギン酸、およびグリシンに由来する窒素ても血漿中肝臓損傷マーカーの値が悪化しなかっが使われていることから，アミノ酸由来の抗酸化た。これは内因性CORTがLPSに対する耐性に関物質がPAMPsに対する抗酸化に関わっているこ

与していないことを示唆している。しかし，そのとも示唆された。

後の予備実験により，RU486がニワトリのCORT

本研究により，ヒナはLPS，ザイモサンおよび受容体にアンタゴニストとして機能していない可D-GalNによって引き起こされる肝損傷に対して能性が示されたため，別のアンタゴニストで再度抵抗性を有していることが示唆された。また，検証する必要がある。

D-GalNはLPSと相乗的に肝損傷を引き起こすが，

実験４

この作用にはIL-６やNOが関わっている可能性

PAMPsによって変動する肝臓中遺伝子を示した。さらに，CORTがヒナにおいて抗酸化の網羅的探索LPSおよびザイモサンによって発現量が変動し作用と抗炎症作用を引き起こすことを明らかにした遺伝子をそれぞれ2098個および1775個特定した。最後に，アンセリンや尿酸などアミノ酸由来

た。そのうち978個が同様の変化（増減）をしたの抗酸化物質がPAMPsに対して抗酸化作用を発ものであった。パスウェイ解析によりステロイド

揮する可能性を見出した。以上のことから，LPS

生合成やアミノ酸代謝などに関わる遺伝子が変動やザイモサンがヒナにおいて肝損傷を引きこさな© The Ito Foundation

ニワトリヒナに備わる抗炎症能力の解明～抗酸化能に注目して～Control
2

409

CORT

Liver

1

＊

＊
＊

Relative change in mRNA expression

＊
＊

0
2

Spleen

1

＊
0

IL-1β

＊

IL-6

＊

＊

IFN-γ

TL1A

＊

IL-8

iNOS

Fig.４ Effect of subcutaneous injection of CORT on mRNA expressionof cytokines and other inflammation-related bioactive molecules in
the liver and spleen of chicks at 1 h post-injection. The number ofchicks was 8 in each group at each time. Data are expressed asmeans ± SEM. Asterisks indicate significant difference from thecontrol group（p＜0.05）．

い原因として，①両PAMPsによって引き起こさリポポリサッカライド（LPS），ザイモサン，おれるIL-６やiNOSの発現がなんらかの因子で抑えよびＤ-ガラクトサミン（D-GalN）の単独腹腔内られる，②その因子の候補の一つとしてCORTが投与がヒナにおいて肝損傷を引き起こさないことある，および③アミノ酸由来の抗酸化物質によっを明らかにした。また，LPSはD-GalNと同時投て酸化ストレスの発生が防止される，の三点があ与した場合には肝損傷が生じたのに対し，ザイモることを明らかにした。

サンとD-GalNの同時投与では肝損傷が生じな

４．要かった。LPSとD-GalNの同時投与は肝臓におけ約るインターロイキン-６（IL-６）と誘導型一酸化本研究は，抗酸化能に着目してニワトリが有す

窒素合成酵素（iNOS）の遺伝子発現量を有意にる抗炎症能を解明することを目的とした。まず，増加させたのに対し，LPS単独ではこれらの遺伝© The Ito Foundation

410

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 1 Metabolic pathway affected by intraperitoneal injection of LPS and zymosan in chicks
LPS

Zymosan

Carbon metabolism

Drug metabolism - cytochrome P450

Fatty acid degradation

Steroid biosynthesis

Drug metabolism - cytochrome P450

Biosynthesis of cofactors

Tryptophan metabolism

Arginine and proline metabolism

Peroxisome

Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450

Fatty acid metabolism
Valine, leucine and isoleucine degradation

PPAR signaling pathway
Glycine, serine and threonine metabolism

Pyruvate metabolism

Carbon metabolism

Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450

Peroxisome

Drug metabolism - other enzymes

Biosynthesis of amino acids

Glyoxylate and dicarboxylate metabolism
Glycolysis/ Gluconeogenesis

Tryptophan metabolism
Drug metabolism - other enzymes

Arginine and proline metabolism
Butanoate metabolism

Glyoxylate and dicarboxylate metabolism
Apoptosis

Propanoate metabolism
PPAR signaling pathway
Citrate cycle（TCA cycle）
２-Oxocarboxylic acid metabolism
Biosynthesis of amino acids
Histidine metabolism
Steroid biosynthesis
Tyrosine metabolism
Glycine, serine and threonine metabolism
Terpenoid backbone biosynthesis
beta-Alanine metabolism
Biosynthesis of cofactors
Apoptosis
Lysine degradation

Ferroptosis
FoxO signaling pathway
Influenza A
One carbon pool by folate
Cysteine and methionine metabolism
DNA replication
Glutathione metabolism

子発現量の増加が見られなかったため，IL-６と酸合成酵素を見出した。これらのアミノ酸由来の

iNOSの発現が抑えられたことでLPSによる肝損

抗酸化物質によってPAMPsによる酸化ストレス

傷が抑えられたと考えられた。これらの遺伝子発を未然に防いでいることが示唆された。

現量を抑えた因子の一つとして，コルチコステロ
ン（CORT）の作用について調べた。その結果，
CORTに抗酸化作用があること，そしてCORTが炎症性サイトカインやiNOSの遺伝子発現を抑えることが明らかとなった。しかし，ヒナで有用な
グルココルチコイド受容体アンタゴニストを見出すことができなかったため，LPSに対する耐性に内因性CORTが関与している証拠を得ることはできなかった。最後に，LPSおよびザイモサンによって発現量が変わる肝臓内の遺伝子を網羅的に探索し，それらの中から抗酸化能に関わるものを調べたところ，それぞれアンセリン合成酵素および尿文献１）
 林隆也，中村亨，髙岡晃教：日本臨床免疫学会会
誌，34，329～348，2011．
 Yamada, J.,Sugimoto, Y.,Horisaka, K.：Journal of２）
Pharmacobio-Dynamics，８，780～784，1985．
３）
 Li, L.,Duan, C.,Zhao, Y.,Zhang, X.,Yin, H.,Wang,
T.,Huang, C.,Liu, S.,Yang, S.,Lim X.：International
Immunopharmacology，51，99～106，2017．
 Ivanovska, N.,Kalfin, R.,Lazarova, M.,Dimitrova,
４）
P.：Immunology Letters，110，126～132，2007．
５）
 Simon, J.：Diabetes & Metabolism ， 10 ， 211～
217，1984．
 Machín, M.,Simoyi, M. F.,Blemings, K. P.,Klandorf,
６）
H.：Comparative Biochemistry and Physiology.
Part B, Biochemistry & Molecular biology ， 137 ，383～390，2004．

© The Ito Foundation

411

沖縄アグー豚育成豚における飼料中のタンパク質水準の違いが増体および背脂肪厚の発達に及ぼす影響
Effects of diets with different CP levels on body weight gain, back fat
thickness in Okinawa Agu feeder pigs

普

照

恭

多１・伊

村

嘉

美２

２
（１沖縄県農林水産部畜産研究センター，
琉球大学農学部亜熱帯地域農学科）

Kyota Fusho１ and Yoshimi Imura２（１Okinawa Prefectural Livestock and Grassland Research Center，
２University of the Ryukyus, Faculty of Agriculture, Department of Subtropical Agro-Production Sciences）

This study clarified the effects of diets with different CP levels on body weight gain（BWD）, back fat thickness（BF）, and digestibility in Okinawa Agu feeder pigs. We prepared
three test diets of which were Control feed, High CP feed, and Low CP feed, respectively andfed these diets to 13-14week old Agu feeder pigs for 7 weeks. As a result, regarding bodygains, the high CP group tended to have significantly higher daily body weight gain andsignificantly lower feed conversion ratio. Regarding digestibility, the apparent digestibility was
lower in the high CP group than in the low CP group, and the DCP intake in the high CP
group was equivalent to that of the low CP group, but the BF and its increase tended to belower in the high CP group. These results suggest that feeding feed with higher CP levels thannormal feed may suppress the increase in BF without affecting the BWD of Agu feeder pigs．

１．目

り発行された飼養管理マニュアルを基に飼養管理的が行われている６）。給与飼料には，通常，一般流

沖縄アグー豚（以下アグー）は日本唯一の在来

通飼料が用いられ，その飼料設計には日本飼養標豚で，現在沖縄県内に約700頭が飼養されてい準が用いられるが，これは産肉能力が中位の豚をる 。その優れた肉質から全国的にも高く評価対象とした適温域での養分要求量を示したものでされており，沖縄県が誇るアグーブランド豚の生ある。しかし，アグーの産肉能力は一般豚と比べ産に大きく貢献している。一方，アグーの産肉能て低く，亜熱帯環境で飼育されているため，一般力，繁殖性等の経済性は西洋品種に劣り３），小型

豚とは飼料要求率が異なると予想される。また，

で発育が遅く，脂肪を蓄積しやすい特徴をあわせ脂肪がつきやすいアグーは過肥の個体が散見さ持っている 。

れ，過肥による繁殖性への悪影響が懸念されてお

１）

２）

４）

このようなことから，アグーの飼養管理は日本

り，生産現場からも新たな飼養標準や繁殖生産性

飼養標準・豚（2013年版）５）に準拠した飼料給与を安定させるための栄養度の評価指標の検討が望ではなく，沖縄県アグーブランド豚推進協議会よまれている。一方，アグーに関する研究において© The Ito Foundation

412

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

飼料給与水準についての報告は少ない。そのためた。供試豚は2022年７月に生まれた13～14週齢の近交退化などの遺伝的要因による繁殖性の低下

７）

アグー育成豚雄６頭，雌６頭の計12頭（３腹）をが報告されているアグーにおいて，適切な栄養バ用いた。試験開始前の１週間は一般流通飼料を給ランスを明らかにし，増体の改善や過肥を抑える

与して予備飼育期間とした。その後，一般流通飼可能性を検討することは，アグーの発育や繁殖能料を給与する対照区，CP含有率を増加させた飼力等の生産性向上につながると考えられる。

料を給与する高CP区，およびCP含有率を低下さ

丸 山 と 相 馬 ８）は ，肥 育 前 期（体 重 30～70kg）

せた飼料を給与する低CP区を設け，各処理区におよび後期（70～110kg）の高発育能力豚に対しそれぞれ４頭（雄２頭，雌２頭）ずつ配置し７週

さまざまな可消化養分総量（以下TDN）・粗タン

間飼育した。試験飼料は一般流通飼料をベースにパク質（以下CP）水準の飼料を給与した。その

琉球飼料株式会社に配合を依頼した。Table１に

結果，低TDN・高CPの給与によって高発育能力

供試飼料の原料割合と成分測定値を示した。飼養

豚の発育性を阻害することなく，背脂肪厚増加量

管理は，単房（１豚房：1.1ｍ×2.5ｍ＝2.75ｍ2）の抑制が可能であることを報告している。市川に１頭ずつ配置し，給与飼料は朝，夕の２回に分らけて給餌し，自由飲水とした。

９）は，LWD種60頭に対してTDN77～79％，CPが14～18％のさまざまな飼料を給与した。その結体重測定を試験開始から試験終了まで１週間隔

果，増体日量（以下DG）は育成期ではCP18％がで測定した。飼料摂取量は，給与した飼料を完食

最も優れていたが，仕上げ期ではCP水準の上昇したので給与量を摂取量として用いた。背脂肪厚

につれてDGが低下する傾向がみられた。また，をエニースキャンBF（SongKang GLC Co., Ltd，と畜成績においてCP水準が高いほど背脂肪厚が韓国）を用いて測定した。測定部位は左右のＰ２薄くなり，脂肪融点が下がる傾向にあったと報告

点（最終肋骨部の正中線から左右に約6.5cm下している。

部）とした。測定部位の被毛を剃毛し，エコー塗

これらの結果から，豚の増体と背脂肪厚につい布剤（プロゼリー，ジェクス株式会社，日本）をて，飼料中のエネルギーおよびCP水準が影響し塗布し，体表面と直角になるようにプローブをあており，アグーについても同様の影響を与えるとて測定した。測定した数値を読み取り，左右の値考えられる。また，CPの増減により増体や脂肪の平均値を背脂肪厚とした。

の蓄積をコントロールできると考えられる。そこ

糞は，試験期間の最後の３日間豚房に落ちていで本試験では，アグーに適する栄養バランスを明たものを朝夕２回に分けて採取した。供試飼料おらかにするために，CP水準の異なる３つの飼料

よび糞の生重を測定した後，60℃で１～２日間通を育成期のアグーに給与し，増体，背脂肪厚およ風乾燥した。乾燥後，重量を測定したのち１mm

び消化率に及ぼす影響について検討した。

のふるいを通るように粉砕し，その後の成分分析

２．方に供した。飼料および糞の成分を，常法に基づき，

法

CP ，粗 脂 肪（以 下 EE），可 溶 無 窒 素 物（以 下

本研究は沖縄県畜産研究センター実験等委員会

NFE），粗繊維（以下CF）および粗灰分（以下により審査され，承認を受けて沖縄県畜産研究セ

CA）を定量した。酸不溶性灰分（以下AIA）をンター内の豚舎にて行った。

2N HCL・AIA法10）によって定量し，見かけの成試験は2022年10月13日～12月７日の期間で行っ分消化率を次式により算出した。見かけの成分消© The Ito Foundation

沖縄アグー豚育成豚における飼料中のタンパク質水準の違いが増体および背脂肪厚の発達に及ぼす影響

413

Table 1 I ngredients and chemical composition of experimental diets
Type of diet

LowCP

Control

HighCP

Ingredient（％）
Grains

76.1

70.0

68.0

Oilseed meal

16.5

21.0

24.2

Brans and food processing by products

0.3

1.0

0.3

Animal origin feeds

0.9

1.0

0.9

Others

6.2

7.0

6.6

Dry Matter（％）

92.1

91.7

92.5

Analyzed composition（％）

Crude Protein（％ in DM）

15.1

16.7

17.6

Ether Extract（％ in DM）

8.0

7.0

8.0

Nitorgen free extract（％ in DM）

63.2

61.2

60.3

Crude fiber（％ in DM）

1.7

2.0

2.1

Crude ash（％ in DM）

4.1

4.8

4.5

Gross energy（Mcal/kg in DM）

4.1

4.0

4.2

化率（％）＝100－100（飼料中のAIA含有率／糞体重は低CP区が46.0kg，対照区が45.5kg，高CP

中のAIA含有率）×（糞中の成分含有率／飼料中区が46.9kgであり，高CP区が高い値を示したがの成分含有率）糞および飼料のエネルギー含有率

有意差は認められなかった。増体日量は低CP区

は，燃研式自動ボンベ熱量計を用いて総エネル

が0.46kg，対照区が0.44kg，高CP区が0.49kgであギー（以下GE）を定量した。見かけのGE消化率

り，高CP区が高い値を示し，対照区と有意差がを次式により算出した。見かけのGE消化率（％）

認められた（ｐ＜0.05）。飼料摂取量はすべての＝100－100（飼料中のAIA含有率／糞中のAIA含処理区で1.25kgであった。増体に対する飼料要求有率）×（糞中のエネルギー含有率／飼料中のエ率は低CP区で2.71，対照区で2.87，高CP区で2.56

ネルギー含有率）。以上の分析結果をもとに可消であり，高CP区が低い値を示し，対照区と有意化エネルギー（以下DE）を次式により算出した。

差が認められた（ｐ＜0.05）。試験開始時の背脂

DE＝飼料エネルギー含有率×GE消化率。

肪厚は低CP区が13.1mm，対照区が14.6mm，高

2.1

統計処理

CP区が14.9mmであった。試験終了時の背脂肪厚得られた結果について，オープンソースプログ

は低CP区で18.5mm，対照区で20mm，高CP区でラムJASPを用いて低CP区，対照区および高CP

18.1mmであった。背脂肪厚の増加量は低CP区で区間の有意差検定を行った（Tukey多重範囲検5.4mm，対照区で5.0mm，高CP区で3.3mmであっ定）。

た。しかし，これらの間に有意差は認められなかった。CP摂取量は低CP区が0.19kg，対照区が３．結果と考察

0.21kg，高CP区が0.22kgであり，高CP区で高い

Table２に増体成績および飼料要求率を示す。

値を示したが有意差は認められなかった。増体に

試験開始時の体重は低CP区が26.6kg，対照区が対するCP要求率は低CP区が0.41，対照区が0.48，

27.2kg，高CP区が26.4kgであった。試験終了時の高CP区が0.45であり，低CP区で低い値を示し，© The Ito Foundation

414

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 2 E
 ffect of experimental diets on growth parameters,back fat and diet requirements
Measurements

LowCP

Control

HighCP

Initial body weight（kg）

26.6±1.827.2±1.3

26.4±1.0

Final body weight（kg）

46.0±2.445.5±0.9

Growth performance parametersab

Daily body weight gain（kg/d）

0.46±0.02

0.44±0.03

0.49±0.02b

1.25

1.25

1.25

Daily Feed intake（kg/d）
Feed conversion ratio

46.9±0.3

2.71±0.1abaa2.87±0.18

2.56±0.11b

Back fat growth performance parameters
Initial back fat（mm）

13.1±1.3

14.6±2.5

14.9±0.9

Final back fat（mm）

18.5±3.1

20.0±3.2

18.1±1.5

Back fat gain（mm）

5.4±1.9

5.0±1.4

3.3±1.3

Diet requirements
Daily crude protein intake（kg/d）
Crude protein conversion ratio

0.19

0.21

0.22

0.41±0.02a

0.48±0.03b

0.45±0.02ab

Gross energy intake（Mcal/d）

5.14

5.03

5.20

Gross energy conversion ratio

11.16±0.44

11.55±0.74

10.67±0.48

Digestible energy intake（Mcal/d）4.68±0.04a

4.30±0.11b

4.39±0.39ab

Digestible energy conversion ratio

10.17±0.42

9.87±0.67

9.02±0.84

a, b ; p<0.05

対照区と有意差が認められた（ｐ＜0.05）。GE摂化率は低CP区が83.8％，対照区が80.4％，高CP区

取量は低CP区が5.14Mcal，対照区が5.03Mcal，が73.4％であり，低CP区で高い値を示したが有意高CP区が5.20Mcalであり，高CP区で高い値を示

差は認められなかった。EE消化率は低CP区がしたが，有意差は認められなかった。GE要求率

92.4％，対照区が86.4％，高CP区で85.1％であり，は 低 CP 区 が 11.16 ，対 照 区 が 11.55 ，高 CP 区 が低CP区で高い値を示したが有意差は認められな10.67であり，高CP区で低い値を示したが，有意かった。CF消化率は低CP区が37.6％，対照区が差は認められなかった。DE摂取量は低CP区が17.6％，高CP区が28.1％であり，低CP区で高い値

4.68Mcal，対照区が4.30Mcal，高CP区が4.39Mcalを示し，対照区と有意差が認められた（p＜0.05）。

であり，低CP区で高い値を示し，対照区と有意NFE消化率は低CP区が94.6％，対照区が90.8％，

差が認められた（ｐ＜0.05）。DE要求率は低CP区

高CP区が91.9％であり，低CP区で高い値を示し，が10.17，対照区が9.87，高CP区が9.02であり，高有意差が認められた（ｐ＜0.05）。GE消化率は低

CP区で低い値を示したが，有意差は認められなCP区が91.1％，対照区が85.4％，高CP区が84.4％

かった。

であり，低CP区で高い値を示し，有意差が認め

Table３に供試飼料の見かけの成分消化率を示られた（ｐ＜0.05）。

した。DM消化率は低CP区が91.5％，対照区がTable４に供試飼料の可消化成分含有量を示し87.6％，高CP区が86.4％であり，低CP区で高い値た 。可 消 化 CP は 低 CP 区 が 12.7 ％，対 照 区 がを示し，有意差が認められた（ｐ＜0.05）。CP消13.4％，高CP区が12.9％であり，対照区で高い値© The Ito Foundation

沖縄アグー豚育成豚における飼料中のタンパク質水準の違いが増体および背脂肪厚の発達に及ぼす影響

415

Table 3 Apparent digestibility of experimental diets
LowCP

Controla

Dry Matter（%）

91.5

87.6

Crude Protein（%）

83.8

80.4

Ether Extract（%）

92.4

86.4

37.6

a

Nitorgen free extract（%）

94.6

a

Gross energy（Mcal/kg）

91.1a

Crude fiber（%）

b

HighCP
86.4b
73.4
85.1

17.6

b

28.1ab

90.8

b

91.9b

85.4ab84.4ba, b ; p<0.05

Table 4 D igestible nutrients content of experimental diets
LowCP

Control

HighCP

Crude protein（%DM）

12.7

13.4

12.9

Ether Extract（%DM）

7.4

6.1

6.8

Crude fiber（%DM）

0.6a

0.2b

0.6a

Nitorgen free extract（%DM）

59.8

56.9

56.7

Digestible energy（Mcal/kg DM）

3.74a

3.44b

3.51a

a, b ; p<0.05を示したが，有意差は認められなかった。可消化

粗繊維の消化率は反芻家畜に比べて著しく低いこ

EEは低CP区が7.4％，対照区が6.1％，高CP区がとが知られているが，粗繊維含量の少ない濃厚飼6.8％であり，低CP区が高い値を示したが，有意料の場合，豚の消化率は他の家畜に劣るものでは差は認められなかった。可消化CFは低CP区がないとされている。今回の試験では低CP区の給0.6％，対照区が0.4％，高CP区が0.6％であり，低与飼料に含まれるCF含量が少なかったことから，

CP区および高CP区で高い値を示し，有意差が認

消化率が低下することなく，見かけのGE消化率

め ら れ た（p ＜ 0.05）。可 消 化 NFE は 低 CP 区 がが高くなったため，低CP区においてDE摂取量が59.8％，対照区が56.9％，高CP区が56.7％であり，有意に高くなったと考えられる。

低CP区で高い値を示し，有意差が認められた（ｐ高CP区の見かけの消化率は他の処理区より低＜0.05）。DEは低CP区が3.74Mcal/kg DM，対照

い傾向にあったが（Table３），これは高CP区に区 が 3.44Mcal/kg DM ， 高 CP 区 が 3.51Mcal/kg

おける糞中AIA含有率の変動が大きかったことがDMであり，低CP区で高い値を示し，有意差が認影響した可能性がある。AIAを用いた消化率測定

められた（ｐ＜0.05）。

方法は，全糞採取法や酸化クロム法と比較して，給与飼料のGE含有量はいずれの処理区でも同労力が少なく，定量法が簡便で，測定の信頼性が等の値であったのに対し，DE摂取量は低CP区で高いとされるが12，13），AIAの主体である飼料中の最も高い値を示した（Table２）。Table１に示した

ケイ酸含量や飼料の種類によっては，AIAの回収

ように，低CP区のCF含量は他の処理区よりも少率が変動する場合もあると報告されている12，14）。

なくなっている。高橋ら11）によると，豚における高CP区の飼料原料は他の処理区と比較して，ト© The Ito Foundation

416

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ウモロコシや飼料米の割合が低く，大豆粕の割合

以上のことから，通常の飼料よりCP水準を増が多くなっている（Table１）。また，豚の飼料原加させた飼料の給与によって，アグー育成豚の増料中のケイ酸含有量は低く13），含有量の少なさが体に影響を及ぼさずに，背脂肪厚増加を抑制でき

通常の分析誤差でも消化率の精度に大きく影響する可能性が示唆された。今後の検討事項として，

る

本試験結果を基に飼料原料の質的内容の変動を抑14）とされ，高CP区の飼料の質的内容が異なる

えた飼料設計を行い，飼料へのセライト添加13）やことが消化率に影響したと考えられる。
CP要求率について低CP区で有意に低い値を示

全糞採取法といったより精度の高い消化率測定法

した（Table２）。これはCP摂取量が低CP区ではを検討し，引き続きタンパク質およびエネルギー

他の処理区より低いのに対し（Table２），見かけの水準が，アグー育成豚の増体，背脂肪厚およびのCP消化率が他の処理区よりも高かったためと消化率に及ぼす影響を検証していく必要がある。

考えられる（Table３）。一方，可消化CP摂取量は高CP区と低CP区で同等の値を示したが（Table

４．要約４），実際に体内に吸収されたタンパク質量は高本研究では，アグーに適する栄養バランスを明CP区で低CP区より多くなり，タンパク質の蓄積

らかにするために，飼料中のCP水準がアグー育量は高CP区のほうが高くなった可能性がある。

成豚の増体，背脂肪厚および消化率に及ぼす影響

Table１に示したように，低CP区の飼料中CP含量を検証した。CP水準は一般流通飼料を給与するは高CP区より2.5％低いものであり，リジンやメ

対照区，CP含有率を増加させた飼料を給与する

チオニンは日本飼養標準を参考に調整してある

高CP区，およびCP含有率を低下させた飼料を給が，不足しがちなトレオニンやトリプトファンは与する低CP区の３水準を設けた。CP水準の異な添加しておらず低CP区飼料では欠乏していた場

る３つの飼料を13～14週齢のアグー育成豚に７週合も考えられる。古谷ら

は低タンパク質飼料の間給与した。その結果，増体について，高CP区

給与によって，いずれかの必須アミノ酸不足が生

はDGが有意に高く，飼料要求率が有意に低くな

じ，供試豚の背脂肪厚が厚くなったことを報告しる傾向にあった。また，消化率について高CP区ており，梶はエネルギー水準に対しタンパク質の見かけの消化率は低CP区より低く，DCP摂取

給与量が不足する場合，エネルギーが節約されて量は低CP区と同等の値を示したが，高CP区は背脂肪の蓄積に向けられることを報告している。本

脂肪厚およびその増加量が低くなる傾向にあっ

試験においても，高CP区はアグーにおけるアミた。以上のことから，通常の飼料よりCP水準を

ノ酸要求量を満たしていたが，低CP区はいずれ増加させた飼料を給与することで，アグー育成豚かの必須アミノ酸が欠乏したことが影響し，試験の増体に影響を及ぼさずに，背脂肪厚増加を抑制

終了時の背脂肪厚は低CP区で高い値を，高CP区できる可能性が示唆された。

15）

16）

で低い値を示し，背脂肪厚増加量は高CP区で最も低い値となったと考えられる（Table２）。また，
Table４に示したように，低CP区において可消化
EEやDE含有量が最も高くなっており，これも低CP区で背脂肪厚が厚くなった要因の一つとして考えられる。

文献１）
 沖縄県アグーブランド豚推進協議会ホームページ（http://okinawa-agu.com/data.html）
 當眞嗣平，翁長桃子，桃原紀子，及川卓郎：日本
２）
養豚学会誌，54，121～129，2017．
３）
 Shihei Touma, Motoharu Oyadomari：Anim Sci J,
91（1）,e13362. doi：10.1111/asj．13362．，2020．

© The Ito Foundation

沖縄アグー豚育成豚における飼料中のタンパク質水準の違いが増体および背脂肪厚の発達に及ぼす影響４） 當眞嗣平，及川卓郎：日本畜産学会報，88（2），103～113，2017．
５） 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構：
日本飼養標準・豚（2013年版），４～11，中央畜産会，
2013．
６） アグーブランド豚推進協議会：琉球在来豚アグー
飼養マニュアル，沖縄県，2008．
７） 當眞嗣平，親泊元治，翁長桃子，嘉数良子，野中克冶：沖縄県畜産研究センター試験研究報告，53，
25～28，2016．
８） 丸山健，相馬由和：茨城県畜産センター研究報告，
31，153～158，2001．
９） 市川明，水野眞樹，深津倍三：愛知県農業総合試
験場研究報告，18，319～324，1986．
10） 小牧弘，鈴木健，森本宏：日本大學農獣医學部學417

術研究報告，38，248～255，1981．
11） 高橋正也，森淳，長野錬太郎，実川義人，姫野健
太郎，森本宏：畜産試験場研究報告，18，29～36，
1968．
12） 杉 本 亘 之：日 本 畜 産 学 会 報 ，55（12），924～929,
1984.
13） 古谷修，山本朱美，伊藤稔，青木幸尚：日本養豚学会誌，38，171～176，2001.
14） 寺田文典，岩﨑和雄，田野良衛，針生程吉：畜産試験場研究報告，36，75～79，1979.
15） 古谷修，渡邉正樹，阿部博行，清水俊郎，大門博之，
佐藤圭子，今田哲雄，佐藤金一：日本養豚会誌，
34，15～21，1997.
16） 梶雄次：栄養生理研究会報，45，31～38，2001．

© The Ito Foundation

418

睡眠様姿勢―肉用牛の生産性およびウェルフェアの新たな行動指標の検討（Ⅱ）
Sleep-like posture：Evaluation as a new behavioural indicator of beef
cattle productivity and welfare（Ⅱ）

深

澤

充・盧

尚

健

（東北大学大学院農学研究科）

Michiru Fukasawa and Sanggun Roh（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

The aims of this study were（1）to clarify the relationship among the sleep-like posture（SLP）expression, growth, carcass traits, and meat quality traits in fattening cattle, and（2）toinvestigate the effects of nutritional and non-nutritional factors on the increased SLP
expression due to high concentrate feed and whether the increased expression indicates anegative welfare aspect in fattening cattle.（1）The SLP expression was stable during thefattening period. The SLP expression showed no correlation between daily gain and carcass
traits, respectively. However, the SLP expression showed negative correlations with daily gain
and carcass weight, respectively. While the SLP expression showed a positive correlation withyield estimation value.（2）To examine the negative effect of endotoxin production on SLP
expression, we investigated the SLP expression when endotoxin production was suppressed bysodium bicarbonate supplement under high concentrate feed. Sodium bicarbonate supplement
could suppress the ruminal endotoxin production. However, SLP expression was not different
from that in the control condition, it was suggested that there was no effect of endotoxin
production on SLP expression. To examine the effects of behavioral unsatisfaction on SLP
expression, we investigated the reduction of eating and ruminating time when the length ofroughage was changed. Although eating time was increased when longer roughage was fed,
there was no difference in SLP expression between roughage lengths. These results suggestthat the prolonged SLP time under high concentrate feed condition would not relate with anegative animal welfare issue．

１．目

いることが明らかになっている１）。そのため，睡的

眠は肉用牛の成長にも深く関連することが予想さ

睡眠は単純な休息ではなく，動物の成長や健康れ，その発現の適正化を図ることは家畜生産性のに深く関わる行動である。ヒトでは睡眠時には成向上につながることが期待できる。また，近年で長ホルモンや甲状腺刺激ホルモン等の物質が分泌は肉用牛においてもアニマルウェルフェア（以され，健全な心身の発達や維持に大きく寄与して下，AW）への配慮が求められている。ウシの睡© The Ito Foundation

睡眠様姿勢―肉用牛の生産性およびウェルフェアの新たな行動指標の検討（Ⅱ）

419

眠はエンリッチメント環境下で長くなることが示

よび27か月齢時に睡眠様姿勢の発現を調査した。

２）

されており ，睡眠はAWの指標となる可能性が肥育牛はペン（4.6ｍ×4.8ｍ）に10か月齢時に２考えられる。

頭ずつ導入した。それぞれの成長に合わせて稲ワ

本研究では，ウシが伏臥状態で首を曲げ，頭部

ラおよび配合飼料を給与した。ウシの睡眠様姿勢

を脇腹に乗せた状態を睡眠様姿勢として，睡眠の発現の測定は頭部に装着した加速度計を用いて２指標とした。昨年度の結果では，肥育牛において日間連続で調べ，１日の総発現時間，バウト回数

睡眠様姿勢の平均日発現時間と日増体量との間におよび平均バウト時間を得た。４回の測定値の平負の傾向が認められた。このことから，睡眠様姿

均と肥育期間の日増体量およびと畜後の枝肉形質

勢の発現はウシに対するネガティブな状況を示しとの相関を求めた。

ている可能性も考えられた 。また，と畜まで至2 . 2 配合飼料多給による睡眠様姿勢発現の増らなかったことから，枝肉や肉質形質との関係も加に対する栄養的および非栄養的要因の影評価することはできなかった。そこで本年度は，

響

３）①肥育牛の睡眠様姿勢の発現と成長および枝肉・2 . 2 . 1 配合飼料多給によるエンドトキシンの肉質形質との関係を明らかにする，とともに，②発生が睡眠様姿勢の発現に与える影響

肥育期の睡眠様姿勢の発現について，睡眠姿勢の黒毛和種肥育牛４頭（２頭×２群）供試し，重発現が，AW上問題とされる配合飼料多給に関連

曹（東洋電化工業株式会社製）給与と対照給与のしているか検討することを目的とした。①につい反転試験を行った。供試牛には１頭当たり稲ワラては，昨年度供試したウシを出荷まで追加調査

３kg／日，配合飼料10kg／日を朝夕に分けて給し，枝肉や肉質形質との相関を調べた。②につい与した。重曹は100ｇ／頭／日を朝夕の給与時にては，栄養的要因として配合飼料多給により発生

配合飼料に混和して給与した。８日間の予備飼育するエンドトキシンの影響を検討するため，重曹後，加速度計を用いて２日間連続で睡眠様姿勢の給与によってエンドトキシン産生抑制した時の睡発現を調査し，１日の総発現時間，バウト回数お眠様姿勢の発現を調査した。また，非栄養的要因

よび平均バウト時間を得た。睡眠様姿勢発現の調として粗飼料不足により行動が充足されないこと

査後にルーメン液および静脈血を採取し，ルーメによる影響を検討するため，粗飼料長を変えた時

ン液中のエンドトキシン濃度およびVFA濃度，の摂食・反芻時間の短縮と睡眠様姿勢の発現を調

血清中のエンドトキシン濃度および栄養代謝成分

査した。

濃度を測定した。分散分析により給与処理間の比２．方較を行った。

法2 . 2 . 2 配合飼料多給による摂食・反芻時間の本研究は東北大学動物実験委員会の承認を受け短縮が睡眠様姿勢の発現に与える影響て行った（2019-農動-019-02）。実験は東北大学

黒毛和種肥育牛８頭（４頭×２群）供試し，長農学研究科附属川渡フィールドセンターで実施しワラ給与と短ワラ給与による睡眠様姿勢発現の比た。

較を行った。短ワラ給与では配合飼料多給時と同

2 . 1 肥育期間の睡眠様姿勢の発現と枝肉・肉様に長ワラ給与に比べて摂食や反芻など咀嚼に要する時間（摂食＋立位反芻＋横臥位反芻時間）が質形質との関連黒毛和種肥育牛６頭を供試して，12，15，21お

短くなることから，行動充足が不十分なことに対© The Ito Foundation

420

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

する転位行動として睡眠様姿勢の発現が増加する

9.75-14.75回／日，平均バウト時間は6.18-7.45分と仮説を立てた。稲ワラは同一圃場から収穫され／回に分布した。繰り返しのある分散分析の結たものを用い，飼料長は長ワラ区で89.5±4.9cm，

果，いずれの形質についても月齢間に有意差はな

短ワラ区で3.2±0.5cmだった。両区とも１頭当たかった。Fukasawa４）は，ホルスタイン種雌牛ではり稲ワラを飽食，配合飼料を10kg／日を朝晩に12か月齢以降の睡眠様姿勢の発現が安定すること分けて給与した。８日間の予備飼育後，加速度計を示していて，今回の肥育期間（12～27か月齢）を用いて２日間の睡眠様姿勢の発現を調査し，１の睡眠様姿勢の発現も安定していたと考えられ日の総発現時間，バウト回数および平均バウト時た。肥育期間中の睡眠様姿勢の発現データの平均間を得た。赤外線カメラで撮影した動画から24時と日増体量および枝肉形質との相関をTable１に間の維持行動時間を調査した。睡眠様姿勢発現の示した。サンプル数が少ないことから，いずれの調査後にルーメン液および静脈血を採取し，ルー

形質とも有意な相関は認められなかったが，日増

メン液中のVFA濃度，血清中の栄養代謝成分濃

体量および枝肉重量との間には負の相関が認めら度を測定した。分散分析により給与処理間の比較

れ，歩留基準値との間に正の相関が認められた。

を行った。睡眠様姿勢の発現の分析には，睡眠様今後サンプル数を増やすことで相関係数の精度を

姿勢発現の個体差を排除するために，事前に全頭高める必要はあるが，前年度の結果と同様に肥育に飼料長20cmの稲わらを給与した条件で測定し期に睡眠様姿勢の発現が多いと日増体量や体重がた睡眠様姿勢の発現のデータを共変量としてモデ低下する傾向は同じであった。肉質形質は個体間ルに加えた。

のばらつきが少なく，相関を算出できなかった。
3 . 2 配合飼料多給による睡眠様姿勢発現の増３．結果と考察

加に対する栄養的および非栄養的要因の影

3 . 1 肥育期間の睡眠様姿勢の発現と枝肉・肉質形質との関連響3 . 2 . 1 配合飼料多給によるエンドトキシンの肥育期間中の睡眠様姿勢の発現をFig. １に示し発生が睡眠様姿勢の発現に与える影響

た。総発現時間は74.1-109.7分／日，バウト回数

ルーメン液中および血清中のエンドトキシン濃（a）Daily time（min/day）
150（b）Daily bout frequency（times/day）

8

15

100

6

10
50

4

5

0

2

0
12

15

21

Age（month）

27（c）Average bout time（min/time）
10

20

0
12

15

21

Age（month）

27

12

15

21

27

Age（month）

Fig. 1 Sleep-like postures expression of Japanese Black fattening cattle at 12, 15, 21, and 27 months of age（a）dailytime（min/day）,（b）daily bout frequency（times/day）and（c）average bout duration（min/times）
Bar and error bar represent mean and standard error．

© The Ito Foundation

421

睡眠様姿勢―肉用牛の生産性およびウェルフェアの新たな行動指標の検討（Ⅱ）
Table 1 C orrelations between the daily sleep-like posture expression and carcass traits

Daily weight gain

Unit

Mean ± SE

Daily time

Bout frequency

Bout time

kg/day0.82 ± 0.12

－0.26

－0.14

－0.46

kg

456.8 ± 62.6

－0.49

－0.33

－0.73

Carcass traits
Carcass weight
Rib eye areacm

2

67.8 ±

7.5

0.07

－0.02

0.39

Rib thickness

cm

7.4 ±

0.7

－0.07

0.09

－0.60

Subcutaneous fat thickness

cm

2.1 ±

0.6

－0.28

－0.28

－0.36

Dressing percentage%

75.6 ±

1.5

0.35

0.27

0.57

All correlation coefficients are not significant（p>0.05）
Table 2 The comparison of ruminal and serume endotoxin concentration, ruminal total VFA,

serum metabolite, serum hepatic enzymes, amd sleep-like posture expression incontrol and soda supprimented diet
Unit

Control

Soda

2.34 ± 0.58

1.42 ± 0.16＊

Endotoxin
Ruminal

mg/ml

Serum

pg/ml

29.0 ± 9.0

17.0 ± 9.3

mg/l

4682 ± 235

4412 ± 500

BUN

mg/ml

11.1 ± 1.3

12.7 ± 0.9

TC

mg/ml

146.3 ± 11.5

145.3 ± 4.1

NEFAmEq/ml

0.143 ± 0.018

0.148 ± 0.032

Glucosemg/ml

66.8 ± 1.3

65.3 ± 2.9

ALP

U/l

96.0 ± 18.7

95.8 ± 17.7

AST

U/l

71.5 ± 7.3

73.0 ± 5.8

LDH

U/l

1338 ± 131

1348 ± 118

min/day

91.1 ± 17.8

97.8 ± 5.3

Bout frequency

times/day

15.1 ± 2.4

15.1 ± 0.9

Bout time

min/time

6.16 ± 0.62

6.60 ± 0.49

Ruminal total VFA
Serum metabolite

Serum hepatic enzyme

Sleep-like posturedaily time

Average ± Standard error
Abbreviation
VFA：Volatile fatty acid, BUN: Blood urea nitrogen, TC：Total cholesterol, NEF：Non-esterified fatty
acid, ALP：Alkalinephospatase, AST：Aspartate aminotransferase, LDH：Lactose dehydrogenase＊：p<0.05

度，ルーメン液中の総VFA濃度，血清中代謝成はなかったものの，重曹給与で低くなった。ルー

分濃度および肝機能関連成分，睡眠様姿勢の発現

メン液中のVFA濃度，血清中栄養代謝成分およをTable２に示した。ルーメン液中のエンドトキ

び肝機能関連成分には給与間に差はなかった。こ

シン濃度は，重曹給与で対照給与よりも有意に低のことから重曹給与によりウシの栄養状態に影響くなった。血清中エンドトキシン濃度は，有意差を与えずエンドトキシンの発生を抑制できたと考© The Ito Foundation

422

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

えられる。新井５）は配合飼料多給牛でルーメン液

時間は短ワラ区で有意に短くなった（p＜0.001）。

中LPSの増加と肝障害を認めているが，今回の試ルーメン液中のVFA濃度および血清中栄養代謝

験と同様に血清中肝機能成分濃度は粗飼料多給牛

成分濃度には切断長による違いは認められず，行との間に差がなかったことを報告している。睡眠動の変化に栄養的な影響はなかったと考えられ様姿勢の発現は総発現時間，バウト回数およびバた。切断長の違う粗飼料の給与により，咀嚼時間

ウト時間のいずれにも重曹給与と対照給与に違いは変わらなかったものの，行動時間配分の変化がはなかった。籾田ら６）は極低用量LPS投与時には，引き起こされた。両区の１日の睡眠様姿勢発現を行動から推定したノンレム様睡眠のみが増加する

Fig. ２に示した。すべての形質について両区にはことを示した。本研究の睡眠様姿勢は脳波計から有意な差はなかった。想定した咀嚼時間の変化ははレム睡眠の状態であることが示されており ，得られなかったが，粗飼料切断長の違いによる維

エンドトキシンは睡眠様姿勢の発現増加に影響し持行動時間配分の変化は睡眠様姿勢発現への影響ないことが考えられる。

はないことが明らかになった。

７）3 . 2 . 2 摂食・反芻時間の短縮による行動欲求

以上の２つの試験では，肥育時の配合飼料多給

不満が睡眠様姿勢の発現に与える影響

でAW上の問題とされるエンドトキシンの発生や両区の１日の行動時間配分をTable３に示した。

維持行動時間配分の変化という条件では睡眠様姿

摂食時間は短ワラ区で長ワラ区よりも短い傾向を

勢発現の延長は認めらなかった。このことから配示した（p＝0.06）が，立位反芻時間，横臥反芻

合飼料多給による睡眠様姿勢の延長はAW上の問

時間，および咀嚼時間には切断長による有意な差

題と関連するものではないことが示唆された。

は な か っ た 。本 研 究 の 短 ワ ラ 給 与 で は ，Fukasawaら３）の配合飼料多給で見られた咀嚼時

約

４．要間の短縮は認められなかった。短ワラ区では横伏本研究では，①肥育牛の睡眠様姿勢の発現と成臥位休息が短くなる傾向（p＝0.06）を示したが，長および枝肉・肉質形質との関係を明らかにす

立位休息は有意に長くなった（p＜0.01）。横伏臥る，とともに，②配合飼料多給による睡眠様姿勢

Table 3 The comparison of daily maintenance behavior time（min/day）

between cattle fed short and long roughrageStanding Eating

Short

Long

p-value181.3 ± 27.9

248.8 ± 9.2

0.06

Rumination

55.0 ± 9.8

36.3 ± 14.9

N.S.

Idling372.5 ± 26.7

232.5 ± 13.8

<0.01

Rumination

248.8

231.3

Idling541.3 ± 32.2

Others
Mastificaton１）
Lying

790.0 ± 10.6

Lying

39.1

36.3

N.S.

647.5 ± 31.5

0.06

41.3 ± 9.0

43.8 ± 9.0

N.S.

485.0 ± 54.2

516.3 ± 34.7

N.S.

878.8 ± 10.1

<0.001１）Mastification

Average ± Standard error
is the sum of eating time, standing rumination time, and lying

rumination time.

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423

睡眠様姿勢―肉用牛の生産性およびウェルフェアの新たな行動指標の検討（Ⅱ）（a）Daily time（min/day）（b）Daily bout frequency（times/day）
20

150

15

100

（c）Average bout time（min/time）
15

10

10
50

0

5

5

Short

Long

0

Short

Long

0

Short

Long

Fig. 2 The comparison of Sleep-like postures expression of Japanese Black fattening cattle fed short and long roughage
（a）daily time（min/day）,（b）daily bout frequency（times/day）and（c）average bout duration（min/times）
Bar and error bar represent mean and standard error．

の発現の増加について，栄養的要因および非栄養がなかった。このことから配合飼料多給による睡的要因の影響を調査し，発現増加がウシのネガ

眠様姿勢の延長はAW上の問題と関連するものでティブな状況を示しているのかを検討することをはないことが示唆された。

目的とした。①肥育期間中の睡眠様姿勢の発現は安定していた。睡眠様姿勢の発現平均と日増体量
および枝肉形質との相関は，有意な関係は認められなかったが，日増体量および枝肉重量との間には負の相関が示され，歩留基準値との間に正の相関が示された。②配合給与によるエンドトキシン
産生の影響を検討するため，重曹給与によってエンドトキシン産生抑制した時の睡眠様姿勢の発現を調査した。重曹給与により配合飼料多給条件下においてエンドトキシンの発生を抑制することができた。しかし，睡眠様姿勢の発現には対照区と変わらなかったことから，エンドトキシンの発生による影響はないものと考えられた。また，粗飼料不足により行動が充足されないことによる影響を検討するため，粗飼料長を変えた時の摂食・反芻時間の短縮と睡眠様姿勢の発現を調査した。粗
飼料長を変えることで摂食時間は変わったものの，睡眠様姿勢の発現には粗飼料長の長さで違い

文献１）
 井上昌次郎：眠りを科学する，朝倉書店，東京，
2006．
 Ninomiya, S., Sato, S.：Effects of ‘Five freedomsʼ
２）
environmental enrichment on the welfare of calves
reared indoors, Animal Science Journal，80，347～
351，2009．
 Fukasawa, M., Komatsu, T., Higashiyama, Y.：
３）
The influence of concentrate-rich diet on daily
sleep and lying postures of Japanese black cows,
Animal Science Journal, 91, e13356，2020．
 Fukasawa, M.：The development of sleep-like４）posture expression with age in female Holsteincalves, Animal Science Journal, 94, e13816，2023．
５） 新井鍾蔵：牛のエンドトキシン血症における第一
胃運動，第四胃運動および肝臓への影響，産業動物
臨床医誌，10，１～16，2019．
 籾田康介，吉田茉純，宗田吉広，石崎宏，桑原正貴，
６）
小針大助，矢用健一：極低用量のリポ多糖（LPS）
投与による休息行動様態の変化，Animal Behaviourand Management，58，１～９，2022．
 Hunter, L. B., Haskell, M. J., Langford, F. M.,
７）Oʼ Connor, C., Webster, J. R., Stafford, K. J.：Heartrate and heart rate variability change with sleep
stage in dairy cows, Animals，11，2095，2021．

© The Ito Foundation

424

暑熱ストレス下におけるニワトリ筋タンパク質分解に対するＬ-シトルリンの新規機能の解明
Elucidation of the novel function of L-citrulline to protect muscle protein
breakdown under heat stress

スルチョードリビシュワジット（九州大学基幹教育院）

Sur Chowdhury Vishwajit（Graduate School of Bioresource and Bioenvironmental Science, Kyushu University）

It has been reported that citrulline contributes to the improvement of heat tolerance by
suppressing the increase in body temperature of chicks under heat environments. However,since heat stress also affects the meat quality and other products, it is necessary to examine
the prevention of deterioration of product quality as well as heat tolerance. In this study, weinvestigated the blood composition and cecum microbiota related to protein metabolism inchicks. In Experiment 1, broiler chicks fed citrulline were exposed to a high-temperatureenvironment for 1 hour, and then their blood parameters and cecum microbiota were analyzed.
The results showed that citrulline induced low levels of plasma calcium. In the cecum
microbiota, Bifidobacterium tended to increase, although no significant effect of citrulline
feeding was observed. In Experiment 2, chicks were fed citrulline from 2 days to 3 weeks ofage in a hot summer heat henhouse, and daily changes in rectal temperature and body weight
were recorded, and analysis of plasma amino acids and cecum microflora was investigated. The
results showed that plasma arginine, ornithine, carnosine, and lysine were higher in thecitrulline-fed group, but no difference was observed for 3-methyl-histidine. As for the cecum
microflora, Salmonella and Bifidobacterium showed lower levels in the citrulline-fed areas.
These results suggest that citrulline feeding affects muscle protein metabolism by altering thebalance of plasma amino acids and intestinal flora．

１．目

体の熱耐性とともに生産物の品質低下防止につい的ても検討する必要がある。これまでのところ，暑地球温暖化の進行に伴い，暑熱ストレスによる熱ストレスの緩和を目的とした飼料添加物の開発

家畜への被害はますます深刻化している。その対については，数多く取り組まれてきたが，暑熱に策の一つとして，飼料添加物が利用されており，対する品質保持対策における有効な飼料添加物は

過度な体温上昇や斃死に対してある程度の効果が提示されていない。我々は，これまでニワトリヒあることが報告されている。一方，暑熱ストレス

ナを用いた実験でシトルリンが体温を低下させるは，肉質など生産物としても影響を受けるため個ことを報告した１）。この作用は暑熱環境下におい© The Ito Foundation

425

暑熱ストレス下におけるニワトリ筋タンパク質分解に対するＬ-シトルリンの新規機能の解明ても有効でニワトリの熱耐性を向上させるこ

Germany）を用いてreal-time PCRを行った。得と ，さらに最近では中枢神経系におけるモノア

ら れ た 結 果 を Light Cycler Software （Roche

ミン代謝にもシトルリンが影響することを報告しDiagnostics, Mannheim, Germany）のてきた 。また，この効果はシトルリンを多く含

Derivative Maximum法を用いて，２ （ユニバー

むスイカ果皮（農業系副産物）を飼料に添加した

サル―目的遺伝子）×100により相対的定量を場合でも同様の効果があることを見出した 。一行った６）。また，統計解析を行う際は得られた数

方，筋タンパク質に及ぼすシトルリンの効果につ値の対数をとって使用した。なお，対象（目的遺いては，齧歯類の実験において，シトルリンがス

伝 子）と し た の は ，Lactobacillus ，Escherichia

トレス条件下での筋肉の機能を増進させることがcoli，Clostridium，Bifidobacterium，Salmonella

報告されているが ，鳥類，とりわけ家禽におけの５つであった。

２）

３）

４）

５）

Second２

る影響については不明である。そこで本研究で2 . 2 慢性暑熱ストレスによる筋タンパク質代

は，シトルリン給与が暑熱環境下で飼育されたブ謝に関わる血漿アミノ酸および細菌叢に及ロイラーのタンパク質代謝に及ぼす影響についぼすシトルリン給与の影響て，血液成分と盲腸内細菌叢の解析から検討するで，１区10羽で合計２区（対照区および試験区）こととした。
２．方供試動物は，２日齢ブロイラーヒナ（Chunky）に設定した。試験区ヒナにはシトルリン添加飼料法（１％），対照群には幼雛用飼料（豊橋飼料株式会

2 . 1 急性暑熱ストレスによる筋タンパク質代社，愛知，日本；代謝エネルギー，＞12.55MJ/謝に関わる血液成分および細菌叢に及ぼすkg以上，タンパク質23％以上）を給与した。試シトルリン給与の影響

験期間中は，夏期の開放鶏舎と同様の暑熱環境に供試動物は７日齢ブロイラーヒナ（Chunky）

３週間曝露するとともに，摂食量，直腸温およびで，１区10羽で合計４区に設定した。試験区ヒナ

体重を測定した。実験終了後，実験１と同様に血にはゾンデを用いてシトルリン（15mmol/10 ml/

液を採取し，血漿アミノ酸濃度を測定した。また，

kg体重）を２回（合計30mmol/head）経口投与

盲腸内細菌叢についても実験１と同様に解析した。

した。対照区は，シトルリンの溶剤として用いた
0.25％メチルセルロース溶液を同様に２回投与し３．結果と考察た。その後両区ヒナを，熱的中性圏28-30℃，あ実験１の結果，いずれの温度環境でもシトルリ

るいは暑熱温度35±１℃に１時間暴露した。試験

ンを経口投与することにより，体温が低下した。

終了後，ヒナはイソフルランにより過麻酔し，血また，食物摂取量もシトルリンの経口投与により液と盲腸内容物を採取した。血液は遠心分離後，減少した。血液成分については，血漿グルコース，

血漿成分の解析に使用した。盲腸内容物は，採取

総タンパク，総コレステロール，トリアシルグリ

後ただちに－80℃で保存して解析に使用した。内セロール，カルシウム，ナトリウム，カリウム，

容物は精製処理後，濃度を20μg/μlに調整し，塩素を分析したところ，血漿グルコース，総タン

FastStart Essential DNA Green Master （Roche

パク，総コレステロール，トリアシルグリセロー

Diagnostics, Mannheim, Germany）お よ び Lightルには群間で有意差はなかったが，血漿カルシウ

Cycle nano（Roche Diagnostics, Mannheim,

ムとコルチコリンが有意に減少した。一方，血漿© The Ito Foundation

426

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Corticosterone（ng/ml）

8

CT
HT

6

4

2

0
Control

L-Cit

Fig. 1 Effects of citrulline feeding on the level of plasma corticosterone in heat stressed chicks

コルチコステロン濃度は環境温度およびシトルリ

よる肉質への悪影響は熱性多呼吸が一因と考えら

ンのいずれの影響も受けなかった（Fig.１）。近れ，pHの低下，PSE肉の増加，保水性の低下な年，腸内細菌が宿主に及ぼす影響についてさまざ

どといった問題が生じた可能性がある８）。ブタにまな報告がある７）。本実験においては，暑熱暴露

おいてシトルリン添加飼料が夏季暑熱期の呼吸数によってクロストリジウム属が有意に増加し，暑増加を緩和することが報告されているが９），本実

熱ストレスが盲腸内細菌叢に影響を及ぼすことが験ではタンパク質分解にシトルリンが有効である示唆された。一方，シトルリン給与の影響についことの結果を示すことはできなかった。盲腸内細ては，有意な差は認められなかったがビフィズス菌叢については，いずれの属も減少傾向にあり，菌類が増加傾向にあった（Fig.２）。

特にサルモネラ属およびビフィズス菌類について

実験２の結果，直腸温はシトルリンの影響を受はシトルリン添加区のものが対照区よりも有意にけなかったが，シトルリンと投与日数の間に相関低い値となった（Fig.５）。このことは，実験１関係が認められ，15日目と18日目の直腸温は対照と異なり長期でのシトルリン給与は細菌叢のバラ群より低いことが示された（Fig.３）。体重は日ンスに大きく影響すること，今回測定していない

数の経過とともに有意に増加したが，シトルリン

細菌類，例えばバクテロイデス属などの増加が推の飼料投与による影響は認められなかった。血漿測され，これらがヒナのアミノ酸プールに影響し中の遊離アミノ酸については，血漿中のシトルリた可能性が考えられた。

ン，アルギニン，オルニチン，カルノシンおよび以上の結果から，シトルリン給与が暑熱環境下

リジンの濃度がシトルリン添加飼料によって有意ニワトリヒナの筋タンパク質代謝に有益な効果をに増加した。一方，血漿中のグルタミン酸およびもたらす明確な結果は得られなかったが，血漿アグルタミンは，シトルリン添加飼料により減少しミノ酸や腸内細菌叢のバランスに影響することがた（Fig.４）。筋肉タンパク質分解の指標となる認められた。

３-メチル-ヒスチジンの濃度は，変化しなかった。これらの結果から，シトルリンの食事投与は４．要

約

直腸温の低下のみならず血漿中の遊離アミノ酸にシトルリンは，その給与によって暑熱環境下ニ影響を及ぼすことが示唆された。暑熱ストレスにワトリヒナの体温上昇の抑制など熱耐性向上に寄© The Ito Foundation

暑熱ストレス下におけるニワトリ筋タンパク質分解に対するＬ-シトルリンの新規機能の解明
E. coli

LAA

0.7

5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0

H

C

H

C

MC

MC

L-Cit

L-Cit

Clost

H

C

H

C

MC

MC

L-Cit

L-Cit

H

C

H

C

MC

MC

L-Cit

L-Cit

L-cit : p= 0.2900
Heat : p= 0.0054
Int : p= 0.4255

Sal

Biﬁd

1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000

0.160
0.140
0.120
0.100
0.080
0.060
0.040
0.020
0.000

L-cit : p= 0.3139
Heat : p= 0.5739
Int : p= 0.2119

L-cit : p= 0.5207
Heat : p= 0.4724
Int : p= 0.6256

427

H

C

H

C

MC

MC

L-Cit

L-Cit

0.004
0.004
0.003
0.003
0.002
0.002
0.001
0.001
0.000

L-cit : p= 0.3424
Heat : p= 0.9086
Int : p= 0.9462

H

C

H

C

MC

MC

L-Cit

L-Cit

L-cit : p= 0.1849
Heat : p= 0.6184
Int : p= 0.3829

Fig. 2 Effects of citrulline feeding on the cecum microbiota in heat stressed chicks

RT_with Thomptson

Rectal tempertaure（℃）

41.5

Control
L-Cit

41.0

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

40.5
Age（days）
Fig. 3 Effects of citrulline feeding on the rectal temperature in chicks

与することが報告されてきた。しかし，暑熱ストる必要がある。そこで本研究では，タンパク質代

レスは，肉質など生産物にも影響するため熱耐性

謝に関連する血液成分と盲腸内細菌叢の解析からとともに生産物の品質低下防止についても検討す調査した。実験１では，シトルリンを給与したブ© The Ito Foundation

428

令和４年度
28
27

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）
1200

Carn

1100

26

1000

25

900

24

800

23

700

22

600

21

500

20

400

19

100
90

Control

300

L-Cit

180

Orn

170
160

80

L-Cit

Control

L-Cit

Lys

140

60

130

50

120
110

40

100

30

90
Control

80

L-Cit

1450

Gln

1400
1350

115

Glu

110
105

1300
1250

100

1200

95

1150

90

1100

85

1050
1000

Control

150

70

20

Arg

Control80

L-Cit

Control

L-Cit

Fig. 4 Effects of citrulline feeding on the levels of plasma amino acids in 3 wk old chicks

ロイラーヒナを高温環境下に１時間曝露して，そ

モネラ属およびビフィズス菌類がシトルリン添加の血液成分を解析した。その結果，シトルリンに

区で低い値を示した。以上の結果から，シトルリ

よって血漿カルシウムとコルチコリンが低値を示

ン給与は血漿アミノ酸や腸内細菌叢のバランスをした。盲腸内細菌叢では，シトルリン給与の有意変化させ，筋タンパク代謝に影響することが示唆な影響は認められなかったものの，ビフィズス菌された。

類が増加傾向にあった。実験２では，２日齢から３週齢まで夏季暑熱鶏舎でニワトリヒナにシトルリンを給与し，直腸温と体重の変化を毎日記録するとともに，血漿アミノ酸と盲腸内細菌叢の解析を行った。その結果，血漿中アルギニン，オルニ
チン，カルノシンおよびリジンがシトルリン給与
区で高い値を示したが，３-メチル-ヒスチジンは変化しなかった。盲腸内細菌叢については，サル

文献１） Chowdhury, V. S., Shigemura, A., Erwa, E., Ito, K.,
Mohammad, A. B., Tran, P. V., Furuse, M.：Oraladmission of L-citruline, but not Larginine or
L-ornithine, acts as a hypothermic agent in chicks,
Journal of Poultry Science, 52, 331～335, 2015.
 Chowdhury, V. S., Han, G., Bahry, M. A., Tran, P.
２）V., Do, P. H., Yang, H., Furuse, M.：L-Citrulline
acts as potential hypothermic agent to afford
thermotolerance in chicks, Journal of Thermal© The Ito Foundation

429

暑熱ストレス下におけるニワトリ筋タンパク質分解に対するＬ-シトルリンの新規機能の解明
p = 0.0732

p = 0.0668

1.4
1.2

1

1

0.8
0.6

1.4

0.8
0.6

1
0.8
0.6

0.4

0.4

0.4

0.2

0.2

0.2

Control

1.4

Biﬁd（AU）

0

L-Cit

Control

p = 0.0022

1.4

1.2

1.2

1

1

0.8
0.6

0.2

0.2
L-Cit

L-Cit

p = 0.3357

0.6
0.4

Control

Control

0.8

0.4

0

0

L-Cit

Clost（AU）0

p = 0.0309

1.2
Salmo（AU）

1.2
LAA（AU）

E. coli（AU）

1.4

0Control

L-Cit

Fig. 5 Effects of citrulline feeding on the cecum microbiota in 3 wk old chicks

Biology, 69, 163～170, 2017.
３） Chowdhury, V. S., Ouchi, Y., Han, G., Eltahan, H.
M., Haraguchi, S., Miyazaki, T., Shiraishi, J., Sugino,T., Bungo, T.：Oral administration of L-citrulline
changes the concentrations of plasma hormonesand biochemical profile in heat-exposed broilers,
Animal Science Journal, 92, e13578, 2021.
４） Nguyen, T. N. L., Han, G., Yang, H., Ikeda, H.,
Eltahan, H. M., Chowdhury, V. S., Furuse, M.：
Dried watermelon rind mash diet increases plasma
L-Citrulline level in chicks, Journal of Poultry
Science, 56, 65～70, 2019.
５） Faure, C., Raynaud-Simon, A., Ferry, A., Daugé,V., Cynober, L., Aussel, C., Moinard, C.：Leucine
and citrulline modulate muscle function in
malnourished aged rats, Amino Acids, 42, 1425～
1433, 2012.
６） Suzuki, N., Yoshida, A., Nakano, Y.：Quantitative

analysis of multi species oral biofilms by TaqMan
real time PCR, Clinical Medicine & Research, 3, 176～185, 2005.
７） Dayou, S., Lin, B., Qian Q., Shanshan, Z., Meimei,
Y., Shining, G., Qiuhong, L., Cui, L.：Impact of gut
microbiota structure in heat-stressed broilers,
Poultry Science, 98, 2405～2413, 2019.
８） Zaboli, G., Huang, X., Feng, X., Ahn, D. U.：How
can heat stress affect chicken meat quality? - areview, Poultry Science, 98, 1551～1556, 2019.
９） Liu, F., de Ruyter, E. M., Athorn, R. Z., Brewster,C. J., Henman, D. J., Morrison, R. S., Smits, R. J.,
Cottrell, J. J., Dunshea, F. R.：Effects of L-citrulline
supplementation on heat stress physiology,
lactation performance and subsequent reproductive
performance of sows in summer, Journal of Animal
Physiology and Animal Nutrition, 103, 251～257,
2019.

© The Ito Foundation

430

子牛における乳糖不耐症に関する研究
The study on lactose intolerance in calves

福

森

理

加

（酪農学園大学獣医学群）

Rika Fukumori（School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University）

Milk replacer contains lower fat and higher concentrations of lactose content than wholemilk. Fat has a high energy density, but excessive intake may lead to body fat accumulation.
On the other hand, lactose is less likely to be stored as body fat, but its low energy density
requires large amounts to be fed, and high concentrations of lactose may increase the risk ofincreased intestinal permeability and diarrhea due to increased osmotic pressure. Therefore,
the objective of this study was to evaluate the effects of different lactose content in milk
replacer on intestinal permeability and mRNA expression of growth- and inflammation-related
factors in the liver. Fifteen Holstein bull calves were placed in one of three treatments feeding
milk replacer with different lactose contents［L（38 ％）, Ｍ（41 ％）, and H（46 ％） ｎ ＝ ５］．
Milk replacer was fed three times a day and metabolizable energy and metabolizable protein
intake were equal in the treatments. The calves were kept until 30 to 36 days of age, theneuthanized and their intestinal tracts and livers were collected. After that Lucifer yellow（LY）
permeability and electrical resistance（TEER）of the intestinal tract were then measured using
a Ussing chamber. In addition, mRNA expression levels of IGF-1, GHR, and GHR1A as growthrelated factors and IL-6, IL―1 β，TNF―α，TLR-2, and TLR-4 as inflammation-related factors
in the liver were analyzed. LY permeability was higher in L compared to M and H in the
duodenum and ileum, and in L compared to H in the jejunum. Decrease rate of TEER was
higher in L compared to M and H in the duodenum and ileum. No significant differences inboth LY permeability and TEER were observed in the colon between treatments. Regarding
mRNA expression in the liver, GHR was lower in the M and H compared to the L. IL―1 β，TNF― α，and TLR-2 expression was lower in the M and H compared to the L, and TLR-4
expression was lower in the H compared to the M. In this study, increasing lactose content up
to 46％ did not increase intestinal permeability, but rather decreased it in the small intestine.
The decrease in permeability inhibited the amount of toxic substances transferred from theintestinal tract to the liver via the portal vein, suggesting that gene expression of
inflammation-related factors in the liver was reduced. Furthermore, increased lactose content
had less effect on growth-related factors in the liver．

© The Ito Foundation

子牛における乳糖不耐症に関する研究

１．目

431

り，これは体の成長および乳腺の発達に重要な役的割を担っている26）。IGF―1は肝臓から分泌され，近年，子牛の飼育現場では，離乳後の健康状態

総エネルギー摂取量と相関することや，IGF―1のや飼料効率および初産分娩後の生産成績向上を目

血漿中濃度は日平均増体量と相関することが示さ的として離乳前の成長を促すためのさまざまな栄

れている15）。また，肝臓におけるIGF―1と成長ホ養戦略が実施されている。その栄養戦略の一つにルモン受容体1A（GHR1A）のmRNA発現量は正

代用乳組成があげられる10）。代用乳中には全乳との相関があり５），両者の発現量はタンパク質制限

比較して高濃度の乳糖と低濃度の脂肪が含まれ飼料により減少することが示されている11）。しかる。この組成構成は，チーズやバターを生産した

し，代用乳中の乳糖含量割合の違いによるIGF―1

際に副産物として脱脂粉乳やホエイが入手できる

およびGHR1AのmRNA発現への影響は明らかにことや18，３），幼獣期の過度な脂肪の蓄積は将来のされていない。さらに，乳糖は脂肪と比べてエネ

産乳成績を低下させるため脂質を多量に給与すべ

ルギー密度が低いため高い増体を目指すためにはきではないという考え方に基づいている 。この多量に与える必要があり，高濃度の乳糖は浸透圧ように，飼料の低コスト化と無駄のない健全な成上昇に伴う腸管透過性の亢進による下痢のリスク

長を期待して，代用乳中に高濃度の脂肪を含めるが懸念される31）。また，同等の浸透圧でも消化許ことが敬遠されている10）。

容量を超えた乳糖は大腸での異常発酵により下痢

３）

乳糖は乳中の糖分画の８割以上を占めておを引き起こす可能性がある。腸管透過性はTight

り ，腸管内では単糖に比べ半分の浸透圧で同量

junction（TJ）に依存しており，TJは腸管上皮の栄養素が摂取できるため浸透圧上昇による下痢を介したイオン，溶質および水の傍細胞移動を制や腸管障害のリスクを軽減できる。また，多くの御することにより物理的な腸管バリアの機能に寄細菌に利用されづらく口内や腸管内に細菌が増殖与している19）。腸管内の浸透圧上昇によりTJが崩するのを防ぐことができることや29），乳糖の分解

壊すると毒素などの有害物質が腸管から門脈を介産物であるガラクトースはヒトでは新生児期や幼して肝臓に移行し，炎症を誘発させることが懸念

少期の脳の発達に寄与することなどが報告されてされる27）。

29）

いることから６），子牛の健康や成長に対してもさ

過去の研究において高浸透圧代用乳による腸管

まざまな利点が期待される。また，反芻動物の場

透過性の亢進は報告されているが，代用乳の組成

合，ATP―クエン酸リアーゼおよびNADP―リン

自体に違いがあっても浸透圧を同等に調整した場

ゴ酸脱水素酵素の活性がきわめて低く，余分なグ合の腸管への影響は明らかにされていない。まルコースは体脂肪として蓄積されにくいことが知た，タンパク質含量の違いによる肝臓の成長関連られている 。

因子への影響は報告されているが，乳糖含量の違２）

一般的に離乳前の体重増加量が大きく離乳後のいによる影響は明らかではない。そこで本研究で乾物摂取量が多いと，健康状態や飼料効率およびは，代用乳中の乳糖含量の違いが，腸管の透過性

初産産乳成績が向上するなど，短期的および長期と肝臓における成長関連因子および炎症関連因子

的なメリットがあると言われている 。子牛の成のmRNA発現量に及ぼす影響を評価した。

10）

長に深く関わる因子の１つとして成長ホルモン（GH）―インスリン様成長因子（IGF―1）軸があ© The Ito Foundation

432

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

代用乳を，１回の哺乳あたり９日齢まで粉体で

２．材料および方法

208.3ｇ，10～19日齢まで312.5ｇおよび20日齢以供試動物として本学酪農生産ステーションおよ

降 は 416.7 ｇ 与 え た 。Ｈ 区 で は ，ET を 43.8 ％，び大学近郊の１農場（江別市）で出生したホルスZeroを41.5％およびラクトース粉末を14.6％の割

タイン種雄子牛（15頭）を使用した。供試牛は，合で調合した代用乳を，１回の哺乳あたり９日齢

出生当日またはその翌日に本学動物実験ステーまで粉体で216.7ｇ，10～19日齢まで325.0ｇおよションに移動し，試験処理として乳糖含量割合のび20日齢以降は433.3ｇ与えた。代用乳はＬ区で異なる３種の代用乳給与区［Ｌ区（38％），Ｍ区

16.6％（w/w），Ｍ区で15.5％（w/w）およびＨ（41％），Ｈ区（46％）］に５頭ずつ配置し，その区で15.0％（w/w）となるようにお湯で溶解し後30～36日齢まで飼養した。子牛は導入時（出生た。また，腸管における浸透圧の影響を避けるた

後24～48時間以内）に頸静脈から採血し，血清総

め全処理区において浸透圧を451mOsm/lにした。

タンパク質濃度を屈折計（ATAGO）を用いて測各試験用代用乳の浸透圧は，IDF STANDARD

定し，5.2g/dl以上であった個体を実験に供試し

108A（1986）の方法17）に従って氷点降下度から換た。血清IgG濃度はELISA法25）により測定し，処算された。氷点降下度はCryoscope Model 4250

理 区 間 で 差 が な い こ と を 確 認 し た（Ｌ 区 ：（Advanced Instrument，米国）を用いて測定し24.5mg/dl ，Ｍ 区 ： 24.0mg/dl ，Ｈ 区 ： 21.5mg/

た。飼料分析はAOACに基づいて実施し１），成分dl）。体重および体尺（体高，十字部高，体長お表をTable１に示した。

よび胸囲）は出生後０，１，２，３および４週に測定した。

２および４週齢において，哺乳15分前から180分後まで５分おきに呼気の水素濃度を水素ガス測

出生から臍帯が乾くまで敷料を敷いたが，それ定計（ユーピー，神奈川，日本）で測定した。

以降は敷料の採食を防止するためマットのみを敷

また，腸管透過性および肝臓組織を採取するたいて飼育した。気温13℃以下の時にはペンの上にめに，約36日齢に安楽殺を行い，安楽殺後30分以

カーボンヒーターを吊り下げ，カーフジャケット

内に腸管の切り出しを行った。十二指腸は第四胃とネックウォーマーを個体ごとに装着して保温し幽門部から尾側方向に20cmの位置，空腸は第四た。

胃幽門部から尾側方向に150cmの位置，回腸は回１日齢から代用乳を１日３回（0700ｈ，1300

盲部から尾側方向に30cmの位置，盲腸は盲腸の

ｈ，1900ｈ）給与し，水はバケツから自由摂取さ

先端部，結腸近位は円盤結腸の中心部および結腸せた。代用乳は48℃前後のお湯に溶解し，哺乳バ

遠位は肛門から頭側方向に100cmの位置からそれケツで給与した。試験用代用乳は，カーフトップ

ぞれ５cmほど切り出した。切り出し後はただち

EX，カーフトップET，カーフトップZero（全酪に生理食塩水で腸管の内容物を洗い流し，氷冷し

連，東京，日本）およびラクトース粉末（Leprino

たHEPES緩衝液 21）に入れた。十二指腸，空腸，

Foods，米国）を調合して作製した。Ｌ区では，回腸，盲腸，結腸近位および結腸遠位はUssing

EXを１回の哺乳あたり，９日齢まで粉体で200

chamberに装着し，HEPES緩衝液10mlで15分間

ｇ，10～19日齢まで300ｇおよび20日齢以降は400安定化し常に100％酸素で連続曝露した。その後，ｇ与えた。Ｍ区では，ETを51.6％，Zeroを41.0％

粘 膜 側 に 傍 細 胞 透 過 性 マ ー カ ー で あ る Lucifer

およびラクトース粉末を7.4％の割合で調合した

Yellow CH Dilithium Salt（富士フィルム和光純© The Ito Foundation

433

子牛における乳糖不耐症に関する研究
Table１ Chemical composition of experimental feed
１Treatment milk replaser

Chemical composition

Ｌ

Ｍ

Ｈ

２
Dry matter（％）

92.9

93.4

93.2

Lactose（％）２

37.8

41.1

46.0

Crude protein（％ DM）２

25.2

25.4

24.4

Fat（％ DM）３

17.8

15.8

13.6

Crude ash（％ DM）３

6.18

5.62

5.21

Daily supply（At maximum feeding）
As fed（kg/day）

1.20

1.25

1.30

Dry matter（kg/day）２

1.16

1.21

1.26

Metabolizable protein supply（ｇ）３334.92337.84334.81

Metabolizable energy allowable growth（kg/day）３

0.81

0.82

0.81

Metabolizable protein allowable growth（kg/day）３

1.15

1.16

1.15

１Ｌ：Low lactose，Ｍ：Medium lactose，Ｈ：High lactose
２Measured by wet chemistry
３Estimated by AMTS ver4.1 lot16.9.1

薬株式会社，以下LYとする）を21.8μmol/lの濃度（TNF ― α），Toll-like receotor2（TLR ― 2）お よで添加した新鮮なHEPES緩衝液を，漿膜側に新びTLR―4のmRNA発現量の解析を行った。また，

鮮なHEPES緩衝液をそれぞれ10mlずつ同時に添GAPDH，β―actinおよびywhazの３種類の候補加した。添加した時点を０分とし，０分，10分後，から，統計ソフトEZR（自治医科大学）にて解析

20分後および30分後に粘膜側および漿膜側から添し，内在性コントロール因子としてGAPDHを選

加溶液を300μl採取し，マイクロウェルプレート

定した。それぞれのプライマー配列をTable２にに各採取溶液を70μlずつ分注し，ARVOTM SX示す。PCRプレート（イナ・オプティカ，大阪，

DELFIA 1420 MULTILABEL COUNTER

日本）にSYBR，各種プライマー，超純水および（PerkinElmer Japan，神奈川，日本）によって

cDNAを加え20μlとしたサンプルを用い，初期熱

485nmの励起波長および535nmの蛍光波長で測定

変性95℃，５分，熱変性95℃，15秒，アニーリン

し た 。傍 細 胞 透 過 性 の 測 定 と 並 行 し て Trans-

グ60℃，30秒および伸長反応72℃，30秒の３つを

epithelial electrical resistance （TEER） の 測 定

１サイクルとし，40サイクル行った。プライマーを短絡電流測定装置CEZ―9100（日本光電，東京，

対は融解曲線分析を行い，１つの産物だけが増幅日本）を用いて行った。

されていることを確認した。mRNA発現量の成®

肝臓サンプルからは，mRNA発現量の解析を行った。肝臓の成長関連因子としてInsulin-like

績はＬ区５頭の２－ΔΔCt値の平均値を１とした各サンプルの相対値を算出した。

growth factor 1 （IGF-1）, Growth hormone

すべての測定値は最小二乗平均±標準誤差で示

receptor（GHR）およびGrowth hormone receptor

された。データはJMP（version 13.0 for Windows,

1A（GHR1A），炎症関連因子としてInterleukin6

SAS Institute Inc.,Cary，NC，米国）を用いて分（IL-6）,IL ― 1 β，Tumour Necrosis Factor alpha析された。LY透過性およびTEERの結果につい© The Ito Foundation

434

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 2 Primer sequence
Primer sequence（5’→3’；Ｆ＝forward，Ｒ＝reverse）

Ampliconsize（bp）

Reference

Gene
GAPDH

F:GGCGTGAACCACGAGAAGTATAA
R:CCCTCCACGATGCCAAAGT

118

［23］

β-Actin

F:AGCAAGCAGGACTACGATGAG
R:ATCCAACCGACTGCTGTCA

241

［14］

ywhaz

F:GCATCCCACAGACTATTTCC
R:GCAAAGACAATGACAGACCA

120

［14］

IGF-1

F:ATGCCCAAGGCTCAGAAG
R:GGTGGCATGTCATTCTTCACT

115

［32］

GHR

F:ATGGCGGTATTGTGGATCAT
R:AGGATGTCGGCATGAATCTC

121

［32］

GHR1A

F:CCAGCCTCTGTTTCAGGAGTGT
R:TGCCACTGCCAAGGTCAAC

86

［32］

IL-1b

F:AGTGCCTACGCACATGTCTTC
R:TGCGTCACACAGAAACTCGTC

114

［14］

TNF-α

F:TCTTCTCAAGCCTCAAGTAACAAGC
R:CCATGAGGGCATTGGCATAC

418

［14］

TLR-2

F:CATTCCCTGGCAAGTGGATTATC
R:GGAATGGCCTTCTTGTCAATGG

195

［14］

TLR-4

F:CTTCCCGGGGGATGTTTCAA
R:CCTGAGGGGGTTTCTACTGG

169

［14］

て，モデルには処理区，時間および処理区×時間

かった（p＜0.05，Fig. 1B）。盲腸，結腸近位およが固定効果，牛番号がランダム効果として含まれ

び結腸遠位では処理区間における有意な差は認めた。qRT-PCRの結果について，モデルには処理

ら れ な か っ た 。な お ，実 験 開 始 前 の 新 鮮 な区が固定効果，牛がランダム効果として含まれ

HEPES溶液の平均相対蛍光強度は179であった。

た。また，すべての統計的推定は，p＜0.05を有十二指腸，空腸，回腸，盲腸，結腸近位および結意差あり，p＜0.10を傾向ありとした。

腸遠位におけるTEERの０分時点を100％とした

本研究は，酪農学園大学動物実験規定に基づき場合の減少率をFig. ２に示した。TEERは値が小実施され，動物実験委員会で承認されたものであ

さいほど，透過性が高いことを示している。十二る。

指腸および回腸においてＭ区およびＨ区と比較してＬ区で減少率が高かった（p＜0.05，Fig. 2Aお３．結果と考察

よび2C）。空腸，盲腸，結腸近位および結腸遠位

呼気水素濃度はいずれの処理からも検出されなかった（データなし）。

では処理区間における有意な差は認められなかった。LYの相対蛍光強度は十二指腸および回腸に

十二指腸，空腸，回腸，盲腸，結腸近位およびおいて，Ｍ区およびＨ区と比較してＬ区で高く，結腸遠位における漿膜側溶液の相対蛍光強度を空腸ではＨ区と比較してＬ区で高かった。また，

Fig. １に示した。なお，相対蛍光強度は値が強い

TEERの減少率は十二指腸および回腸において，

ほど，透過性が高いことを示している。十二指腸

Ｍ区およびＨ区と比較してＬ区で高かった。LY

および回腸においてＭ区およびＨ区と比較してＬ

透過性は相対蛍光強度が高くなるほど，TEERは区 で 相 対 強 度 が 高 く（p ＜ 0.05 ，Fig. 1A お よ び

減少率が高いほど腸管透過性の亢進を反映す

1C），空腸においてはＨ区と比較してＬ区で高る21）。本試験の結果より，代用乳中の乳糖含量を© The Ito Foundation

435

子牛における乳糖不耐症に関する研究

B)
L＞M,H

700

Time : p＝0.1733

350

600

Treatment : p＜0.05

300

500

Treatmant×Time : p＝0.1898

400

※
L

300

M

200

H

Relative Intensity

Relative Intensity

A)

100
0

0

10

20

Time（min）

L＞M,H

M
H

Time : p＜0.05
Treatment : p＜0.05

Relative Intensity

Relative Intensity

L

Treatmant×Time : p＝0.2811

0

10

20

Time（min）

30

0

10

20

Time（min）

350
300

L

250

M

200

30

Time : p＜0.05

100

Treatment : p＝0.6727

50

Treatmant×Time : p＝0.6177

F)

350

600

200

L

150

M
H

100

Time : p＜0.05

50

Treatment : p＝0.7169
Treatmant×Time : p＝0.7823

0

10

20

Time（min）

Relative Intensity

500

250

400

0

10

20

Time（min）

30

Time : p＜0.05
Treatment : p＝0.1381
Treatmant×Time : p＝0.1198

300

L

200

H

M

100
0

30

H

150

0

300

Relative Intensity

Treatmant×Time : p＝0.9181

400

E)

0

H

Treatment : p＜0.05

450

200

0

M

Time : p＝0.3875

100

500

250

50

L

150

D)

300

100

200

0

30

350

150

250

50

C)
400

L＞H

0

10

20

Time（min）

30

Fig. 1 The effect of lactose content in milk replacer on the relative intensity of fluorescence in the gastrointestinal tracts.
（A）Duodenum,（B）Jejunum,（C）Ileum,（D）Caecum,（E）Proximal colon,（F）Distal colon
Values are expressed as LSMEANS±SEM（ｎ＝５）．
Error bars indicate SEM for the Treatment×Time interaction．
※

L : Low lactose, M : Middle lactose, H : High lactose content in milk replacer.

増加させると小腸の透過性は減少することが示唆

依存し，TJは腸管上皮を介したイオン，溶質おされた。

よび水の傍細胞移動を制御することにより物理的

腸管の傍細胞透過性はTight junction（TJ）にな腸管バリアの機能に寄与している19）。本試験に© The Ito Foundation

436

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

A)

B)

120

1000
800

80

※
L

60
40
20
0

M

L＞M,H

H

Time : p＜0.05
Treatment : p＜0.05

1020

Time（min）

M

L＞M,H

H

Time : p＜0.05
Treatment : p＜0.05

TEER（％ of initial）

TEER（％ of initial）

L

Treatmant×Time : p＜0.05

0

10

20

Time（min）

30

L

80

M

60
40
20

500

Treatment : p＝0.707
Treatmant×Time : p＝0.6736

100

H

M

0

10

20

TEER（％ of initial）

TEER（％ of initial）

Time（min）

100

600

Time : p＝0.6336

L

ー 100

30

H

Time : p＝0.5831
Treatment : p＝0.8972
Treatmant×Time : p＝0.7118

0

10

20

Time（min）

30

F)

200

0

20

120

0

E)

300

10

140

60

400

H
0

160

80

500

M

0

D)

100

0

L

200

Time : p＝0.5506
Treatment : p＝0.5449
Treatmant×Time : p＝0.6203

120

20

400

－400

30

C)

40

600

－200

Treatmant×Time : p＜0.05

0TEER（％ of initial）

TEER（％ of initial）

100

400

Time : p＝0.6469
Treatment : p＝0.6951
Treatmant×Time : p＝0.7468

300

L

200

M
H

100
0

30

ー 100

Time（min）

0

10

20

Time（min）

30

Fig. 2 The effect of lactose content in milk replacer on TEER in the gastrointestinal tracts.
（A）Duodenum,（B）Jejunum,（C）Ileum,（D）Caecum,（E）Proximal colon,（F）Distal colon
The values are expressed as relative values with the 0 min point as 100％．
Values are expressed as LSMEANS±SEM（ｎ＝５）．
Error bars indicate SEM for the Treatment×Time interaction．
※ L：Low lactose, M：Middle lactose, H：High lactose content in milk replacer.

おいて，乳糖含量割合の高いＭ区およびＨ区で管のTJを強化する因子の１つとして，腸管からLY透過性およびTEERの減少率が低かったこと分泌されるGLP-2がある。GLP―2は33のアミノ酸から，TJが強化された可能性が考えられる。腸を持つプログルカゴン由来のペプチドで，主に回© The Ito Foundation

437

子牛における乳糖不耐症に関する研究

腸末端と結腸近位部の腸管上皮に存在するＬ細胞

GLP―2の作用は単一のGLP―2受容体（GLP-2R）により産生される 。GLP―2は，クリプト細胞のにより媒介される。過去の研究でGLP-2RmRNA

増殖や粘膜治癒の促進，腸管血流の増加，腸管バの発現はマウスでは胃から直腸まで検出され，特リア機能の改善および抗炎症作用を示すことが，に空腸で多く34），ウシでは十二指腸，空腸，回腸いくつかの研究により示されている ７）。TJはクおよび結腸で検出され，回腸において最大で，結ローディン，オクルディン，ZO―1，ZO―2および腸において最小となることが示されている28）。こＦ―アクチンなどのTJ関連タンパク質が集合してのことより，小腸におけるGLP-2Rの発現が多形成され ，GLP―2はクローディンおよびオクル

かったことから，小腸でのみ透過性の減少が見ら

ディンの発現を増加させることが示されていれたと考えられる。

７）19）。腸管内腔から腸管細胞へのグルコースのTJを強化するもう一つの因子として乳酸菌量

吸 収 は ，ナ ト リ ウ ム － グ ル コ ー ス 共 輸 送 体 １の増加が考えられる。乳酸菌はプロバイオティク（SGLT1）により行われ，SGLT1はGLP―2によりスの一つであり，プロバイオティクス株が存在す発現が促進されることが知られている 。ヒツジ

ると，細胞境界のタイトジャンクションタンパク

小腸を用いた過去の研究では，GLP―2を産生する質が増加することが示されている９）。また，腸管Ｌ細胞には甘味受容体であるT1R2およびT1R3が粘膜表面に付着した乳酸菌は，病原菌の付着を抑発現しており，これら受容体が内腔単糖や人工甘制しムチンの分泌を促進するため，粘膜バリア機

味料に応答してGLP―2の分泌を促進すると言われ能を向上させ高分子の物質や毒素の透過性を低下ている 。乳糖は小腸でラクターゼによりグルさせる９）。過去の研究では，スキムミルク培地中

コースおよびガラクトースに分解されるため，Ｍの乳糖含量を高めると乳酸菌の成長と増殖が促進

区およびＨ区では乳糖含量割合の増加により相対されることが示されており35），本実験でもＭ区お的にグルコース量が増加し，GLP―2の分泌量が増よびＨ区で乳酸菌量が増加した可能性が考えられ加したと考えられる。一方，大腸においては乳糖る。また，乳酸菌は代謝機能の特徴から，宿主の含量増加による透過性の減少は見られなかった。

食事から得られる炭水化物を容易に利用できる

る

７，
８）

22）

22）

Table 3 Effect of lactose content in milk replacer on the hepatic mRNA expression related to growthand inflammation

TreatmentＬＭ

Ｈ

p-value

IGF-1

Items

1.10±0.19

1.08±0.19

0.95±0.19

0.837

GHR

1.06±0.11Ａ

0.60±0.11Ｂ

0.51±0.11Ｂ

0.007

GHR1A

1.51±0.32

1.67±0.32

1.12±0.32

0.485

IL-1b

1.10±0.14Ａ

0.26±0.14Ｂ

0.29±0.14Ｂ

0.002

TNF-α

1.18±0.21Ａ

0.43±0.21Ｂ

0.47±0.21Ｂ

0.047

TLR-2

1.05±0.11Ａ

0.26±0.11Ｂ

0.23±0.11Ｂ

0.0002

TLR-4

1.01±0.1ab

1.17±0.1ａ

0.83±0.1ｂ

0.087

Values are expressed as LSMEANS±SEM（ｎ＝0.5）
AB : Means within a row with different letters differ（p＜0.05）
ab : Means within a row with different letters differ（p＜0.1）© The Ito Foundation

438

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

十二指腸や空腸といった小腸近位部において優勢

りIL―1βで処理したラット肝細胞はTNF―αを分な細菌の一つであるため ，小腸でのみ透過性の泌し，TNF―α mRNAがIL―1βにより特異的に減少が見られたと考えられる。

誘導されることが示されている33）。本試験では，30）

Ｌ区５頭の２－ΔΔCt値の平均値を１として，

Ｍ区およびＨ区において腸管のTJが強化されたＭ区およびＨ区における相対的mRNA発現量をことで，肝臓のTLR―2で認識される病原体が減Table ３ に 示 し た 。成 長 関 連 因 子 に 関 し て は ，少し，その結果IL―1βおよびTNF―αの転写量もGHRでＬ区と比較してＭ区およびＨ区で発現量減少したと考えられる。

が低かった（p＜0.05，Table３）。炎症関連因子に一方，TLR―4はグラム陰性菌の細胞壁成分で関しては，IL―1β，TNF―αおよびTLR―2においあるリポ多糖（LPS）を特異的に認識してTLR―2てＬ区と比較してＭ区およびＨ区で有意に低かっと同様にIL―6，IL―1βおよびTNF―αなどの炎症た（p＜0.05，Table３）。TLR―4では，Ｍ区と比較性サイトカインの転写を促進する20）。本試験では，してＨ区で有意に低かった（p＜0.1，Table３）。

Ｍ区と比較してＨ区で有意に低かった。しかし，

なお，IL―6は検出限界以下であった。

TLR―4以外の炎症関連因子はＭ区において発現

肝臓のmRNA発現に関して，炎症関連因子でが減少していたことから，腸管透過性亢進によっは，IL―1β，TNF―αおよびTLR―2においてＬ区て肝臓に到達したLPS量が増加したとは考えにくと比較してＭ区およびＨ区で有意に低かった。こい。過去の研究では，胃や小腸の運動機能の低下

れは，腸管透過性が抑制されたことで腸管から門により通過時間が長くなると，腸内細菌の過剰増脈を介して細菌や毒素などが肝臓に移行する量が殖が起こり，大腸の細菌が小腸に移動する状態に減少し，肝臓での炎症関連因子の遺伝子発現が抑なることが示されている12）。Ｍ区ではなんらかの制されたと考えられる。生理的条件下でも，肝臓原因で代用乳の胃腸での滞留時間が長くなり，過は門脈を通じて腸管由来の抗原に絶えず曝露さ剰増殖した腸内細菌由来のLPSにより肝臓でのれ，自然免疫反応および適応免疫反応に影響を及

TLR―4の発現が増加した可能性が考えられる。

ぼしている27）。また，腸の炎症などによりリーキー

成長関連因子ではGHRでＬ区と比較してＭ区ガットが引き起こされ腸管バリアが崩壊すると，およびＨ区で発現量が有意に低かった。４週齢に生きた細菌や細菌産物が消化管から門脈や全身循

行った採血では，代用乳給与後30分，45分，60分

環に移行し，肝臓の免疫細胞を活性化することがおよび75分の血液中のグルコース濃度がＭ区およある27）。本試験では，Ｍ区およびＨ区においてTJ

びＨ区と比較してＬ区で有意に高く 16），また，が強化されたことで門脈を通って肝臓に到達する

LY透過性とTEERの結果より小腸ではＬ区で透細菌などが減少したと考えられる。

過性が亢進していることから，Ｌ区において血流

TLRは，バクテリア，ウイルス，真菌およびを介して肝臓に運搬されるグルコース量が増加し寄生虫を含む複数の病原体の認識分子である24）。

た可能性が考えられる。豚の肝臓培養細胞を用い

TLR―2は，グラム陽性菌の細胞壁成分であるリ

た過去の研究では，培養液中のグルコース濃度を

ポタイコ酸や結核菌の細胞壁成分であるリポアラ

上昇させると，肝臓におけるGHRのmRNA発現

ビノマンナンなどさまざまな病原体を認識し，IL量が増加することが示されている４）。IGF―1およ―6，IL―1βおよびTNF―αなどの炎症性サイトカ

びGHR1Aでは処理区間で有意な差は認められなインの転写を促進する 。また，過去の研究によかった。IGF―1およびGHR1AのmRNA発現量に20）© The Ito Foundation

子牛における乳糖不耐症に関する研究

は正の相関が示されており５），若齢山羊を用いた
過去の研究では，タンパク質制限飼料を与えるとIGF ― 1 お よ び GHR1A の mRNA 発 現 量 が 減 少 した11）。また，ラットを用いた過去の研究では，血漿中IGF―1濃度は主に飼料中のタンパク質含有量に依存し，炭水化物含有量の影響は少なかったことが示されている13）。このことより，代用乳中の乳糖含量の増加による肝臓における成長関連因子への影響は少ないことが示唆された。
以上の結果より，代用乳中の乳糖含量を増やすと小腸のTJが強化され腸管から門脈を介して毒素などの有害物質が肝臓に移行する量が抑制されたことが分かった。また，乳糖含量の増加は肝臓における成長関連因子への影響は少ないことが示
唆された。
４．要

約

本研究では，代用乳中の乳糖含量の違い（Ｈ（高乳糖），Ｍ（中乳糖），Ｌ（低乳糖））が，腸管の透過性と肝臓における成長関連因子および炎症関連因子のmRNA発現量に及ぼす影響を評価した。その結果，乳糖含量を46％まで増加させても腸管透過性は上昇せず，むしろ小腸では減少した。また，透過性の減少により腸管から門脈を介して毒素などの有害物質が肝臓に移行する量が抑制されることで，肝臓での炎症関連因子の遺伝子発現が低下したことが示唆された。したがって，46％程度までの乳糖含量の増加は乳糖不耐症を引き起こす可能性が低いことが示された。
文
献１） AOAC international，2000．
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and growth performance in dairy calves, J Dairy

439

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440

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

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immune response of bovine mammary epithelial
cells to Mycoplasma bovis, J Vet Sci, 1 ； 19（1）， 79～87，2018 Jan．
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Immunol Res, 16；2018, 2645465, 2018 Dec．
20） Li, J., Lee, D. S., Madrenas, J.：Evolving Bacterial
Envelopes and Plasticity of TLR2-Dependent
Responses: Basic Research and Translational
Opportunities, Front Immunol, 28；4, 347, 2013
Oct．
21） Mineo, H., Hara, H., Shigematsu, N., Okuhara, Y.,
Tomita, F.：Melibiose, difructose anhydride III and
difructose anhydride IV enhance net calcium
absorption in rat small and large intestinal
epithelium by increasing the passage of tightjunctions in vitro, J Nutr, 132（11）, 3394～3399, 2002
Nov．
22） Moran, A. W., Al-Rammahi, M., Zhang, C., Bravo,D., Calsamiglia, S., Shirazi-Beechey, S. P.：Sweet
taste receptor expression in ruminant intestine andits activation by artificial sweeteners to regulate
glucose absorption, J Dairy Sci, 97（8）, 4955～72,
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23） Nishi K., Gondaira, S., Okamoto, M., Watanabe,R., Hirano, Y., Fujiki, J., Iwano, H., Higuchi,
H . ：M y c o p l a s m a b o v i s i n d u c e s m a t r i x
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cells via up-regulation of interleukin-1β expression
in mononuclear cells, Vet Immunol Immunopathol,
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Front Immunol, 18；3 79, 2012 Apr．
25） 佐藤瞳：カーフスターターのデンプン含量の違い
による乳用子牛の発育の評価，酪農学園大学2021年度卒業論文．
26） Schäff, C. T., Gruse, J., Maciej, J., Mielenz, M.,
Wirthgen, E., Hoeflich, A., Schmicke, M., Pfuhl,
R., Jawor, P., Stefaniak, T., Hammon, H. M.：Effects
of Feeding Milk Replacer Ad Libitum or in
Restricted Amounts for the First Five Weeks ofLife on the Growth, Metabolic Adaptation, andImmune Status of Newborn Calves, PLoS One,
30；11（12）,e0168974, 2016 Dec．
27） Taniki, N., Nakamoto, N., Chu, P. S., Mikami, Y.,
Amiya, T., Teratani, T., Suzuki, T., Tsukimi, T.,
Fukuda, S., Yamaguchi, A., Shiba, S., Miyake, R.,
Katayama, T., Ebinuma, H., Kanai, T.：Intestinal
barrier regulates immune responses in the liver via
IL-10-producing macrophages, JCI Insight, 21；3（12）,e91980, 2018 Jun．
28） Taylor-Edwards, C. C., Burrin, D. G., Holst, J. J.,
McLeod, K.R., Harmon, D. L.：Glucagon-like
peptide-2（GLP-2）increases small intestinal bloodflow and mucosal growth in ruminating calves, J
Dairy Sci，94（2），888～898，2011 Feb．
29） Urashima, T., Saito, T.：Why is Lactose a
Dominant Saccharide in Milk?, Journal of Applied
Glycoscience, Volume 52 Issue 1 Pages 65-70,
2005．
30） V é l e z , M . P . , D e K e e r s m a e c k e r , S . C . ,V a n d e r l e y d e n , J . ：A d h e r e n c e f a c t o r s o f
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31） Wilms, J., Berends, H., Martín-Tereso, J.：
Hypertonic milk replacers increase gastrointestinal
permeability in healthy dairy calves, J Dairy Sci,
102（2）,1237-1246, 2019 Feb．
32） Witte, S., Brockelmann, Y., Haeger, J. D.,
Schmicke, M.：Establishing a model of primarybovine hepatocytes with responsive growth
hormone receptor expression, J Dairy Sci，102（8），7522～7535，2019 Aug．
33） Won, S. M., Park, E., Jeong, J. J., Ganesan, R.,
Gupta, H., Gebru, Y. A., Sharma, S., Kim, D. J., Suk,
K. T.：The Gut Microbiota-Derived Immune
Response in Chronic Liver Disease, Int J Mol Sci,
2；22（15）,8309, 2021 Aug．
34） Yusta, B., Matthews, D., Koehler, J. A., Pujadas, G.,
Kaur, K. D., Drucker, D. J.：Localization of
Glucagon-Like Peptide-2 Receptor Expression in
the Mouse, Endocrinology, １；160（8）, 1950～1963,
2019 Aug．
35） Zang, J., Wang, T., Piotr, D., Zhao, H., Zhang, B.：
Increasing lactose concentration is a strategy to
improve the proliferation of Lactobacillushelveticus
in milk, Food Sci Nutr, 19；9（2）, 1050～1060, 2020
Dec．

© The Ito Foundation

441

暖地型牧草・芝草におけるゲノム編集による
冬期常緑性新規育種素材の開発
Development of new breeding materials for winter evergreen by genome
editing in warm-season forage and turf grasses

権

藤

崇

裕

（宮崎大学フロンティア科学総合研究センター）

Takahiro Gondo（Frontier Science Research Center, University of Miyazaki）

The objective of this study is to develop highly nutritious evergreen breeding materials
through genome editing by targeting chlorophyll-degrading genes in bahiagrass（Paspalum
notatum）for forage grasses and Zoysia matrella for turf grasses. We conducted genome editingof the NYC1 gene in Zoysia matrella prior to pasture research, and succeeded in producing
genome-edited plants in which all target loci of the A and B alleles were mutated. The NYC1
knockout plants showed suppressed chlorophyll degradation, and this result was expected tolead to research for application to forage grasses. In pasture bahiagrass, the SGR gene wasisolated and its expression increased with leaf senescence, and chlorophyll content decreased
as its degradation progressed. Therefore, the SGR gene isolated in this study is deeply
involved in leaf senescence and chlorophyll degradation in bahiagrass plants. In the next step,
genome editing of the bahiagrass SGR gene will be conducted, and new breeding material canbe developed for Zoysia grasses through evaluation of the trait under actual winter conditions
and removal of the transgenes．

１．目

植物の老化は，葉のクロロフィル分解と大きく的関係しており，日長，低温および乾燥などの環境

暖地型イネ科牧草・芝草は，夏期の飼料生産がストレスによりクロロフィル分解遺伝子が発現主で，その生産性は高いものの，冬期は葉が枯れし，それにより葉が黄化し枯れていく。クロロ

休眠するため，生産が望めないことが一般的であフィル分解遺伝子は，イネやシロイヌナズナなどる。通常，暖地型イネ科牧草は，６月から９月にのモデル植物を中心にその機能性が解析されてい生産のピークを迎え，その後，一気に栄養価が低る１）。イネ科では，SGRおよびNYC1遺伝子が知下するが，冬期においても長期間緑度を維持するられており，これらの遺伝子をノックアウトした

ことができれば，高品質の粗飼料を家畜に給与す変異体は，登熟期においてもクロロフィルの分解ることが可能となり，家畜の効率的な生産向上にが進まないため葉の老化が認められず，緑度を維つながる。

持するステイグリーンの形質を示すことが実証さ© The Ito Foundation

442

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

れている２，３）。また，これらの遺伝子発現の制御（Zoysia matrella）を用い６），NYC1遺伝子のゲノ

は，植物の乾燥ストレス耐性を向上することも報ム編集とクロロフィル分解の検証を行った。牧草

告されており４），飼料成分についてもペレニアル

では，バヒアグラスよりSGR遺伝子を単離し，ライグラスでは，刈取り後の植物のクロロフィル

その塩基配列を決定するとともに，牧草の葉の老分解を抑えることでタンパク質含量が減少せず，化に伴うSGR遺伝子の発現およびクロロフィル

結果的に乾草においても高い栄養価を維持してい分解との関係について明らかとした。

た５）。このようにクロロフィル分解遺伝子の制御
は，牧草の生産性を増加するだけでなく，その品質も向上するため，家畜生産性の飛躍的な増進に

２．方＜コウシュンシバNYC1遺伝子のゲノム編集＞
2.1

つながるものと期待される。

法

ゲノム編集ベクターの構築

ゲノム編集技術は，任意の配列を認識できる人

コウシュンシバNYC1遺伝子の塩基配列は，か工ヌクレアーゼ（CRISPR/Cas9）の働きにより，ず さ DNA 研 究 所 が 公 開 す る Zoysia Genome

狙った遺伝子をピンポイントで切断することがで

Database （http://zoysia.kazusa.or.jp/blast.html）

き，遺伝子のノックアウトを自在に行うことがでより検索した。ゲノム編集で標的となるガイド

きる画期的な技術である。医学，理学，農学系なRNAは，入手したNYC1遺伝子の塩基配列より設

どのさまざまな研究分野で活用されつつあり，植計し，PAM配列（NGG）の手前に制限酵素サイ物の分野については，作物の品種改良への利用がトを有する配列を公開ソフトウェアCRISPRDB

試みられ，遺伝子組換え技術とは異なる実用化を（https://crisprdb.org/index.html）およびRNAfold

見据えた新しい育種技術として注目されている。

WebServer（http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/

この技術は，外来遺伝子の導入を伴わないため，

RNAWebSuite/RNAfold.cgi）より選定した。な

これまでの遺伝子組換えの規制を受けず，日本でお，コウシュンシバのゲノム構成は，異質４倍体は，2019年度より，ゲノム編集により開発された（2n＝4x＝40）であり，２対の対立遺伝子（Ａア

食品は，遺伝子組換えの規制対象外として流通がリルおよびＢアリル）を持っているため，共通の認められている（厚生労働省，2019年９月13日発

配列部位でガイドRNAを設計した。設定したガ表）。そのため，本技術により実用化を見据えた

イ ド RNA は ，Hha I 制 限 酵 素 サ イ ト を 含 む 5’

牧草の品種開発が現実のものとなっている。

-TCGCGCACCTCTCCGTCCAC-3’ の 20bp で あ

著者は，本研究助成（R02-03）において，バ

り ，こ の 配 列 を ゲ ノ ム 編 集 ベ ク タ ー（pZH_

ヒアグラス（Paspalum notatum）について，初gYSA_PubiMMCas9，農研機構生物機能利用研

めてゲノム編集に成功しており，リグニン生合成究部門より譲渡）に挿入し，導入ベクターとしてで重要となるCAD遺伝子に変異を挿入したゲノ用いた。

ム編集個体を獲得している。本ゲノム編集個体

2.2

は，消化性も向上しており，現在，導入ベクター

形質転換に用いるコウシュンシバ品種「わかの除去およびCAD変異遺伝子座のホモ化を行い，ば」のエンブリオジェニックカルスは，腋芽成長

品種育成を進めている。本研究では，クロロフィ

点 よ り 誘 導 さ れ ，２ mgL － １ 2,4- Ｄ ，0.1mgL － １

ル分解遺伝子に着目し，芝草では，牧草研究に先BAP，5μM CuSO４および0.3％ゲランガムを添加

立ち，ゲノム情報が整備されたコウシュンシバ

したMS固形培地（DBCL培地）で継代培養して© The Ito Foundation

形質転換およびゲノム編集個体の選抜

暖地型牧草・芝草におけるゲノム編集による冬期常緑性新規育種素材の開発

443

いるものである。また，形質転換は，本研究室でバ，シーショアパスパラムのSGR遺伝子で保存確立したアグロバクテリウム法を用いて行い ，されている塩基配列をもとにプライマーを設計

ハイグロマイシン（Hm）により形質転換体を選し，３’側配列をもとに５’側配列を獲得した。

７）

2 . 5 葉の老化に伴うSGR遺伝子の発現および抜した。
形質転換カルスにおける標的配列の変異は，クロロフィル含量の分析

PCR/RE解析により評価した。すなわち，カルス

葉の老化は，温室で育成中のバヒアグラスの葉よりDNAを抽出した後，標的配列を含むDNA領

身を刈取り，蒸留水を含むキッチンペーパで挟域でPCRを行い，変異が挿入される配列に位置すみ，ジッパー付きビニール袋に入れて，28℃，明る制限酵素（Hha I）で処理した後，バンドパ所および暗所に静置し，０，３および６日目の葉

ターンの違いにより，変異の有無を確認した。変の黄化部位の長さを測定した。SGR遺伝子の発異が認められたカルス系統より再分化させた植物

現およびクロロフィル含量は，上記と同様に０，体は，土に順化した後，同じくPCR/RE解析を行

３および６日目の葉をサンプリングし，SGR遺い，PCR産物をExoSAP-IT処理後，ダイレクト

伝子の発現では，全RNAを抽出し，cDNAを合シ ー ク エ ン ス を 行 い ， ICE CRISPR Analysis

成した後，リアムタイムPCRを行った。クロロ

Tool（https://www.synthego.com/products/

フィル含量は，アセトン抽出法により行った。

bioinformatics/crispr-analysis）を用いて，波形データより変異インデルを解析した。
2.3

３．結果と考察＜コウシュンシバNYC1遺伝子のゲノム編集＞

クロロフィル含量の分析

ゲノム編集個体は，28℃，明所（16時間）／暗所（８時間）の条件下でインキュベーター内で栽

3 . 1 ゲノム編集個体の獲得および標的配列の変異

培し，クロロフィル含量の分析にはその第２葉のコウシュンシバの形質転換は，アグロバクテリ

展開葉を用いた。サンプリングは，葉身２cmをウム法により行い，合計441個のカルスを供試し

切取り，蒸留水を含むキッチンペーパで挟み，たところ，22個の形質転換カルスが得られた（形ジッパー付きビニール袋に入れて，28℃，暗所に

質転換効率は5.0％）。また，これらのカルス系統

静置し，クロロフィルの分解を促した。クロロ

についてPCR/RE解析を行った結果，18系統で変フィル含量の分析は，暗処理０日目と８日目の葉異の挿入を示すバンドが認められ，そのうち10系

より，アセトン抽出法によりクロロフィルを抽出

統でシーケンス解析においても標的配列の変異がし，葉の新鮮重当たりの含量を換算した。

確認された。最終的なゲノム編集効率は，45％＜バヒアグラスSGR遺伝子の単離とその発現解（10/22）と高いものの，このことはコウシュンシ

析＞

バが４倍体のため４つの標的遺伝子座が存在する

2.4

ためであり，２つの遺伝子座に換算すると，他のSGR遺伝子の単離供試材料は，バヒアグラス品種「ペンサコラ」

２倍体のイネやトマト等の植物に比べ８），同等のを用い，播種後14日目の葉より，全RNAを抽出効率であった。これらの形質転換カルスは，植物し た 。全 RNA は ，SMARTer RACE 5’ /3’ Kit

体を再生させ，土へと順化した。

Ⓡ（Takara）に従い，cDNAを合成し，同じC4植物

Table１は，順化した個体について，標的配列のソルガム，トウモロコシ，スイッチグラス，シのダイレクトシークエンスを行い，ICE CRISPR© The Ito Foundation

444

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table１ Summary of mutations at target NYC1 loci in genome-editied plants．
A alleleLine

Mutation
type１

1

Ｂ

2

Ｃ

3

B allele
Mutation
type１

２
Indel（％）

Ｈ－1（99）

Ｂ－1（78）/1（13）－4（22）/－4（24）/－1（45）－2（14）/－1（85）1Ｍ－1（10）/0（89）Ｍ

0（56）/1（39）2Ｍ－1（42）/0（55）Ｍ－1（16）/0（73）

3

WT

0（99）

Ｈ

－2（87）

1

Ｈ－7（92）

Ｈ

1（99）

Ｃ

－2（53）/－1（17）/0（21）

Ｈ

1（96）

3

Ｈ

－1（99）

Ｈ

2（80）

1
2
3

WT
Ｍ
Ｍ

0（99）
－2（16）/0（82）－2（40）/0（49）

Ｈ
Ｈ
Ｈ

1（99）
1（98）
1（98）

1

Ｍ

Ｍ

2

Ｃ

－1（35）/0（62）－2（48）/－1（14）/0（16）/1（17）3Ｍ0（59）/1（19）Ｃ－1（10）/0（79）－2（22）/－1（33）/1（34）－1（40）/0（38）/1（13）

10

1
2
3

Ｍ
Ｈ
Ｍ

－2（29）/0（59）－2（99）－1（32）/0（65）

Ｈ
Ｂ
Ｈ

1（98）
－1（49）/1（45）
1（98）

11

1
2
3

Ｍ
WT
WT

－2（25）/0（70）
0（92）
0（91）

Ｂ
Ｈ
Ｈ

1（86）/3（11）
1（99）
1（98）

1

Ｂ

Ｈ

1（95）

2

Ｃ

Ｈ

1（96）

3

Ｈ

－3（67）/－2（11）－3（19）/－3（29）/0（42）－1（97）

Ｈ

1（99）

1

Ｈ

－1（94）Ｃ

Ｈ－8（100）3Ｈ－1（99）－3（10）/－3（12）/－1（74）－3（90）

Ｈ

2

Ｈ－8（100）

1
2
3

Ｍ
Ｍ
Ｍ

－2（30）/0（53）－1（24）/0（74）－2（24）/0（63）

Ｈ
Ｈ
Ｈ

1（99）
1（98）
1（98）

1

3

5

6

8

16

19

20
１

Plant

2

２
Indel（％）Ｍ

0（61）/1（33）Ｂ－1（89）/2（10）Ｃ

The mutation type of each allele is shown as follows. WT : Wild Type ; B : Biallelic mutation ; M : Monoallelicmutation ; C : Chimeric mutation ; H : Homoallelic mutation．
２

Indels indicate－；deletion，＋；insertion and the number of nucleotides．

Analysis Toolにより変異インデルを個体ごとにアリルで３または４種類のインデルが認められる

まとめたものである。Ａアレル，Ｂアレルそれぞ

キメラ変異も認められた。両アリルにバイアレ

れ別々のプライマーを用いて解析を行い，変異イ

リック（表中の変異タイプＢ）もしくはホモプラ

ンデルを確認したところ，順化個体すべてに標的

スミック（表中の変異タイプＨ）な変異が認めら

配列の変異が認められ，そのほとんどが１またはれ，すべての遺伝子座で変異が挿入された個体

２塩基の挿入・欠失であった。また，それぞれの（遺伝子型aabb）は，合計10個体得られた。

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暖地型牧草・芝草におけるゲノム編集による冬期常緑性新規育種素材の開発

3 . 2 ゲノム編集個体におけるNYC1遺伝子の445のことから，本実験で単離したSGR遺伝子は，葉の老化とクロロフィル分解に深く関与しておノックアウトとクロロフィル分解
Fig.１は，ゲノム編集個体の葉における暗処理

り，栽培後期や冬期の葉の老化や刈取りに伴うク

０日後と８日後のクロロフィル含量をまとめたも

ロロフィル分解を抑制することで，栄養価の高いのである。ゲノム編集個体は，それぞれのアリル

飼料を開発することが期待される。

の標的遺伝子座の遺伝子型別にまとめ，それぞれ

以 上 の こ と か ら ，コ ウ シ ュ ン シ バ に お い ての平均値を野生型と比較し，有意差を判定した。

NYC1遺伝子のゲノム編集を行い，標的遺伝子を野生型では，暗処理８日後のクロロフィル含量はノックアウトした個体ではクロロフィルの分解が０日後に比べ，著しく低下し，葉が黄変した。暗抑制されたことを検証した。さらに，牧草のバヒ

処理８日後のゲノム編集個体のクロロフィル含量

アグラスよりSGR遺伝子を単離し，牧草の葉のは，すべての変異遺伝子型タイプにおいて，野生

老化に伴うSGR遺伝子の発現およびクロロフィ型に比べ有意に高い値であった。特に，すべてのル分解との関係について明らかとした。今後は，遺伝子座が変異した遺伝子型aabbタイプは，暗バヒアグラスSGR遺伝子のゲノム編集を進める

処理８日後においても葉の黄化が認められず，クとともに，シバについてもゲノム編集個体の冬期

ロロフィル含量は暗処理０日後の2/3程度も保持の緑度維持やクロロフィル分解および栄養価につしていた。この結果は，これまでのイネやシロイ

いても牧草研究に先行して実施していきたい。

ヌナズナのNYC1変異体の報告と同様であり

，

２，
３，
９）

コウシュンシバのNYC1遺伝子をノックアウトすることでクロロフィル分解が抑制され，緑度を保４．要約

本研究は，クロロフィル分解遺伝子を標的とし持できることが明らかとなった。

て，牧草ではバヒアグラスを，芝草ではコウシュ＜バヒアグラスSGR遺伝子の単離とその発現解

ンシバを用いて，ゲノム編集を行い，冬期におい

析＞ても長期間緑度を維持することができ，栄養価の3.3

高い常緑性育種素材を開発することを目的とす

SGR遺伝子の塩基配列の決定

単離したバヒアグラスのSGR遺伝子の塩基配る。今年度，コウシュンシバでは，牧草研究に先列は，全長が858bpで286のアミノ酸をコードし立ちNYC1遺伝子のゲノム編集を行い，Ａ，Ｂアており，そのアミノ酸配列は他のC4植物と高い

レルのすべての標的遺伝子座が変異したゲノム編

相同性を示していた（Fig.２）．

集個体の作出に成功した。このNYC1遺伝子が3 . 4 葉の老化に伴うSGR遺伝子の発現およびノックアウトされた個体ではクロロフィルの分解が抑制されており，この結果は牧草への応用研究

クロロフィル分解
Fig.３は，刈取り後の葉の老化とSGR遺伝子のにつながるものと期待された。牧草のバヒアグラ

発現およびクロロフィル含量についてまとめたもスでは，SGR遺伝子を単離し，牧草の葉の老化のである。老化により黄変した葉の長さは，刈取に伴うSGR遺伝子の発現およびクロロフィル分

り後日数が経過するにつれて高くなり，暗所条件

解との関係について明らかとした。今後は，バヒでより顕著にその効果が認められた。葉の老化にアグラスSGR遺伝子のゲノム編集を進めるとと伴い，SGR遺伝子の発現量も増加し，クロロフィ

もに，シバについても実際の冬期条件下での形質ルの分解が進んだことでその含量は減少した。こ

評価や導入ベクターを除去することで，新しい育© The Ito Foundation

令和４年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）
d

446

b

Mean

19-1

19-1
aabb

10-2
5-3

5-1

5-1
b

1-1
a

Mean

20-2

20-3
20-2
Aabb

20-1
11-1
6-3

10-3
10-1

6-2

6-3
c

6-2
ab

Mean
6-1

6-1

AAbb

11-2
bc

3-3
a

Mean

3-2

3-2
a

3-1
WT3

Day 0

WT2
0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

WT1

WT1

AABB

Day 8

a

Mean

6.0

AaBb

8-1
Chl content（nmol mg－1fw）

Fig. 1 Chlorophyll content at 0 and 8 days of dark treatment and leaves collar at 8 days of dark treatment for eachgenotype of target NYC1 loci in genome-edited plants．

The chlorophyll content is shown for each genotype of genome-edited plants at day 0 and day 8 of dark treatment.

The dotted lines indicate the average chlorophyll content of the wild type on dark treatment day 0 and day 8,
respectively. Photo is representative of genome-edited plants of each genotype on day 8 of dark treatment. Meansshows the averages for each genotype type, letters represent a significant difference on each dark treatment daysby Tukey’s test.

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暖地型牧草・芝草におけるゲノム編集による冬期常緑性新規育種素材の開発
Paspalum notatum SGR

97

Paspalum vaginatum KAJ1290549.1

44
15

C4 plant

447

Monocot

Panicum virgatum XP 039796113.1
Zoysia japonica AKA59741.1

75

Zea mays AAW82956.1

29

Sorghum bicolor XP 002462718.1

77

83

Panicum miliaceum RLN33362.1
100

Setaria italica XP 004957449.1
Oryza sativa XP 015611682.1
Brachypodium distachyon XP 003576766.1
82

100
97

Triticum aestivum XP 044382345.1
Hordeum vulgare KAI4989230.1
Poa pratensis UZP64735.1

96Lolium arundinaceum ADV57294.1

99

C3 plant

89

Lolium perenne XP 051189030.1

Nicotiana tabacum XP 016500144.1

86

Dicot

Solanum lycopersicum NP 001234723.1
Citrus sinensis KDO63636.1

56

Populus trichocarpa XP 052307239.1

34

Arabidopsis thaliana NP 001328989.1
100
26

Brassica napus XP 013737602.2

Glycine max NP 001236690.1
Pisum sativum A7VLV1.1

99

Trifolium pratense PNX74570.1

99

Medicago truncatula AEE00201.1

79

Legume0.10

98

Medicago sativa AEE00202.1

Fig. 2 Phylogenetic tree of SGR proteins in higher plants．

A phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences was created by the neighbor-joining method. Numbersb

Relative expression of SGR genea

Length of yellowed leave（cm）

at nodes correspond to 1,000 bootstrap replications. The top of the tree list is indicated bahiagrass（Paspalum
notatum）SGR proteins isolated in this study.

25
c

20
15
b

10

b
ab

5
0

a

16

b
b

12
ab
8
4

ab
a

0

c

Chl content（nmol mg－1 fw）

10
8

a

6

b

4

c

c

Dark

Light

2

d

0
0 daysLight

3 daysDark

6 daysFig. 3 Relationship between SGR gene expression and chlorophyll degradation during leaf senescence．

Leaf yellowing（a）, SGR gene expression（b）and chlorophyll content（c）at 3 and 6 days after harvest in light/

dark conditions.

© The Ito Foundation

448

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

種素材が開発できる。
文
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５）
 Xu, B., Yu, G., Li, H., Xie, Z., Wen, W., Zhang, J.,
Huang, B.：Plant and Cell Physiology, 60, 202～212,
2019.
 Tanaka, H., Hirakawa, H., Kosugi, S., Nakayama,
６）
S., Gondo, T., et al.：DNA Research, 23, 171～180,2016.
７）
 Ng, H. M., Gondo, T., Ushiyama, M., Cho, S.,
Maemura, S., Hashiguchi, M., Tanaka, H., Akashi,
R：Grassland Science, 69, 152～161, 2023.
８）
 Scott M. Schaeffer, Paul A. N.：Plant Science,
240, 130～142, 2015.
９）
 Sato, T., Shimoda, Y., Matsuda, K., Tanaka, A.,
Ito, H.：Journal of Plant Physiology, 222, 94～102,
2018.

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449

南九州における暖地型牧草の新規調製“霜熟”の開発―晩夏播きパールミレット霜枯れ草の収量，
サイレージ品質と選好性―
Frost-matured silage-processing of tropical grasses in southern Kyushu―Yield, silage quality and preference of late-summer sown pearl millet
foggage―

石井

康之・石垣

元気・井戸田幸子（宮崎大学農学部）

Yasuyuki Ishii, Genki Ishigaki and Sachiko Idota（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Pearl millet（Pennisetum typhoides）is the high dry matter（DM）yielder with highmoisture, which prohibits the silage processing and reduce cultivation areas of the genotype.
Late-heading cultivar “Natsu-Italian” heads two months after sowing, even when the grass issown in late-summer September. We examined the growth, DM yields in early December anddecline in DM percentage with frosts in two years, and processed round-bale silages todetermine silage quality and preference of the silage by breeding beef cows. Pearl millet was
sown at 1.5 and 1.75 g/m２ with non-till seeder in Miyazaki University on 1 September, 2021
and on 14 September, 2022, respectively. Plant height reached 200 cm and 160 cm, and heading
tiller percentage，70％ and 60％ in 2021 and 2022, respectively at the first frost which fell on 2
and 7 December, 2021 and 2022, respectively. The DM percentage increased rapidly in leaves
and heads, followed by stems with frosts to reach over than 40％ one month after the first
frost in two years. Plant DM percentage was positively correlated at １％ level with cumulative
frosting temperature（critical base temperature ＜ 2.2 ℃）. With frosts, in vitro DM digestibility（IVDMD）declined, and acid detergent fiber（ADF）content increased, which showed negative
correlation between these two characters. Animal preference tended to reduce the difference
between pearl millet silage and Italian ryegrass hay under the repeated cafeteria feeding
experiment. Silage quality of pearl millet foggage was examined to show moderately weakacidity at pH 5.0, lactic acid content at 1.1-2.8 ％ Fresh matter（FM）, acetic acid content at
0.06-0.18％ FM and no butyric acid content, estimating as “excellent” and “good” with Flieg’sscore and V-Score, respectively. Therefore, late-summer sown pearl millet can be processed to
low-moisture round bale silage one month after the first frost in January, the following year．
Keywords： Dry matter yield, Foggage, Late-summer sowing, Pearl millet, Preference,
Silage quality．

© The Ito Foundation

450
１．目

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

約３か月後以降に開封したサイレージの発酵品質

的および給与した黒毛和種繁殖牛に対する選好性を

世界的な食料供給の逼迫，飼料穀物価格の高騰
および円安の進行に伴い濃厚飼料価格の高騰を招いており，地域にあった良質自給粗飼料生産１）に明らかにすることを目的とした。
２．方法

対する需要が急速に高まっている。全球レベルで

2 . 1 晩夏播きパールミレット飼料畑における進行する気象変動・地球温暖化に対抗し，飼料作

定着，生育状況，降霜に伴う含水率低下お物を安定的に栽培するには，南九州等の暖地ではよび収量性の調査

台風害に遭いにくい暖地型牧草の活用が必須であ

宮崎大学農学部附属住吉フィールド飼料畑（１る 。南九州では晩夏播きのイモチ病耐性イタリ

筆５ha，１片450ｍ）において，パールミレット

ア ン ラ イ グ ラ ス（Lolium multiflorum）品 種 も「夏イタリアン（カネコ種苗）」を供試し，2021年

育成されているが，年内草の収量性は限定的であでは９月１日に不耕起播種機により畦間26cmでる 。そこで盛夏期間の台風・豪雨による気象災

1800ｍ２に1.75g/m２にて播種した。2022年では９

害によるトウモロコシの倒伏あるいは虫害の発生

月６日にロータリ耕し，９月10日に１区270ｍ２でによる収量減３）があった場合，晩夏播きでその収３区を設け，畦間50cm，1.5g/m２にて条播し，９量を補いうる良質でサイレージ調製可能な粗飼料

月14日に2880ｍ２ に不耕起播種機で1.5g/m２ にての栽培・調製体系の確立が求められている。青刈播種した。定着後に化成肥料（N，P２O５ ，K２O

作物パールミレット（Pennisetum typhoides）はの成分量で）５g/m２ を施用した。播種後１か月

台風で倒伏せず３か月間で乾物収量１t/10 a以上

ごとに草丈，茎数，出穂茎数と乾物重を測定し，をあげる多収草種であるが，多汁質で含水率が高2021年では12月２日，2022年では12月７日の初霜

く，サイレージ調製には不適であるため，その栽後，１週間ごとに部位別の生体重と乾物重の測定

培は青刈給与の少数頭飼育の繁殖牛生産者に限定と乾物率の変化を求め，１か月後の2022年１月４されている。一方，極晩生パールミレット品種

日，2023年１月５日にディスクモアで刈取り，乾「夏イタリアン」は，季節生産性を受けにくいた物収量を調査した。2022年では，初霜後の日最低

め，先行研究により，南九州で９月上旬に播種し気温の変化をおんどとり（株式会社ティアンドデ

ても出穂開始が11月になり，十分な栄養成長期間イ）で測定した。

２）

１）と収量性を確保できることが明らかとなった４）。
かつてロールベールサイレージ調製が導入される

2 . 2 霜枯れ草パールミレットの植物体器官別の飼料品質および発酵品質の調査

以前の1980年代までは，霜枯れ草の利用として収穫時の霜枯れ草をロールベールサイレージ調

は，九州地域でソルガムの２－３番草を降霜に遭製するとともに，霜枯れ期間に１週間ごとに採取

わせて圃場に立毛貯蔵し，越冬期間に徐々に刈りした植物体試料から，30ｌプラスチックサイロに取って繁殖母牛への自給粗飼料として給与する体より実験室規模サイレージを調製し，ともに発酵系が採られていたが，パールミレットへの適用は品質を調査した。霜枯れ過程の飼料品質として，

まだ試みられていない。そこで本研究では，大規in vitro 乾 物 消 化 率（IVDMD）お よ び 酸 性 デ模圃場試験により晩夏播きパールミレットを栽培

タージェント繊維（ADF）含量を測定した。ロー

し，降霜後のロールベールサイレージ調製，貯蔵

ルベールサイレージ開封時では，明るい色調で酢© The Ito Foundation

南九州における暖地型牧草の新規調製“霜熟”の開発―晩夏播きパールミレット霜枯れ草の収量，
サイレージ品質と選好性―

酸型の発酵臭を示した。

451

３．結果と考察2 . 3 霜枯れ草パールミレットサイレージの繁2021年，2022年ともに出穂開始は11月上旬以降

殖母牛に対する選好性の調査
３か月間貯蔵後の霜枯れパールミレットロールであったため，草高は2021年では約200cm，2022

ベールサイレージの選好性を，2022年４月20日お年では約160cmとなり，初霜時の出穂茎比率は，よび４月26日に，繁殖黒毛和種雌成牛３頭を３連それぞれ約70％，約60％に達した。降霜後の乾物で３回にわたり，イタリアンライグラス乾草およ

率の上昇は，葉身，穂で急速に進み（Fig.１），

び ア マ ラ ン サ ス（Amaranthus caudatus）サ イ

2022年では降霜温度積算値との間に正の相関が成レージと比較した。

り立った（Fig.２）。乾物収量は2022年では580～680g/m ２ で，両年ともにロールベールにより，2021年では生重600kg（ロール２個），2022年でPercentage of dry matter （%）

100

Severefrosts

80

First
frost

60
40
20
0

0

20

40

60

80

100

120

140

Days after sowing
Leaves

Stems

Ears

Whole plantFig. 1 Changes in dry matter percentage in each of plant fraction oflate-summer sown pearl millet with time after sowing．

Percentage of dry matter

60
50
40
30
y = 0.524x + 14.10

20

r２ = 0.938（ p<0.01）

10
0

0

20

40

60

80

100

Cumulative subfrosted temperature（Degree）
Fig. 2 Changes in cumulative subfrosted temperature after the first

frost and percentage of dry matter of whole plants in latesummer sown pearl millet. Subfrosted temperature：＜2.2 ℃．

© The Ito Foundation

452

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

は1695kg（ロール５個）が調製できた。調製・の３―４月には可能となるが，この時期は夏季に開封された霜枯れパールミレットサイレージは，収穫・調製した貯蔵粗飼料が枯渇する時期に相当

酢酸発酵型で明るい色調のサイレージが調製でき

し，イタリアンライグラスの青刈給与以外に給与た。イタリアンライグラス乾草と比較したカフェ

可能な粗飼料が不足するため，本サイレージの有テリア方式によるロールベールサイレージ

効活用が期待できる。

（pH5.0）の選好性は，給与試験を繰り返すと草種間差異が縮小した（Fig.３）。2021年では，葉身，４．要

約

茎，穂の粗タンパク質（CP）含量は，降霜に伴パールミレット（Pennisetum typhoides）は多

う変化は明瞭でなく（Fig. 4A），一方，IVDMD

汁質青刈作物であるためサイレージ調製が困難では降霜の進みに伴い低下し，ADF含量は増加しあるが，晩夏（９月）播種でも極晩生品種では播た た め ，両 者 の 間 に は 負 の 相 関 が 成 り 立 っ た

種後２か月後に出穂可能である。降霜に伴う地上（Fig. 4B）。また，パールミレット霜枯れ草サイ

部の枯れ上がり，含水率の低下後にロールベール

レージの発酵品質としては，pHは5.0であったが，調製し，飼料品質を検討した。パールミレット

乳酸含量は新鮮重当たり1.1－2.8％で，酢酸含量「夏イタリアン（カネコ種苗）」を供試し，2021年

は0.06－0.18％と低く，酪酸の発生は認められなでは９月１日に不耕起播種機により畦間26cmでかった。そこで，フリーク評点およびV-SCORE

1800ｍ２に1.75g/m２にて播種した。2022年では９による評価値は，それぞれ「秀」および「優」と月６日にロータリ耕し，９月10日に１区270ｍ２で評価された（Table１）。

３区を設け，畦間50cm，1.5g/m２にて条播し，９本研究の結果から，晩夏播きパールミレット

月14日に2880ｍ２ に不耕起播種機で1.5g/m２ にては，初霜後１か月で含水率が60％未満となったこ播種した。2021年では12月２日，2022年では12月とから，低水分ロールベールサイレージとして冬７日の初霜後，１週間ごとに部位別の生体重と乾季に調製可能であることが明らかとなった。収物重の測定と乾物率の変化を求め，約１か月後の

穫・サイレージ調製期間が厳冬期の12月下旬～１

2022年１月４日，2023年１月５日にディスクモア

月上旬であるため，この期間は圃場作業の閑散期で刈取り，ロールベールサイレージ調製した。

であること，低温・乾燥の季節であるため，集2021年，2022年ともに出穂開始は11月上旬以降で草・梱包の作業日程が組み入れやすいことも特長あったため，草高は2021年では約200cm，2022年である。また，収穫・サイレージ調製後の飼料畑

では約160cmとなり，初霜時の出穂茎比率は，そは，極早生イタリアンライグラスの播種により，れぞれ約70％，約60％に達した。降霜後の乾物率

年間３毛作（普通期トウモロコシ―晩夏播・霜枯の上昇は，葉身，穂で急速に進み，2022年では降れパールミレット―極早生イタリアンライグラ

霜温度積算値との間に正の相関が成り立った。乾ス）の導入が可能であり，普通期トウモロコシ以物収量は2022年では580～680g/m２ で，両年とも外の播種期は，夏作／冬作の繁茂期から外れるたにロールベールにより，2021年では生重600kg

め，作業日程の策定が容易になるものと考えられ（ロール２個），2022年では1695kg（ロール５個）

る。サイレージ貯蔵期間も低温で降雨の少ない季が 調 製 で き た 。2021 年 で は ，葉 身 ，茎 ，穂 の節であるため，サイレージの変敗が起こりにくい

IVDMDは降霜の進みに伴い低下した。イタリアと考えられる。さらに，サイレージの開封が早春

ンライグラス乾草と比較したカフェテリア方式に© The Ito Foundation

南九州における暖地型牧草の新規調製“霜熟”の開発―晩夏播きパールミレット霜枯れ草の収量，
サイレージ品質と選好性―

Percentage of intake（%）

100

453

（A）

80
60
40
20
0

1st-trial

2nd-trial

3rd-trial

1st-trial

20 April 2022

2nd-trial

3rd-trial

26 April, 2022

Examined date and No. of trial
Italian ryegrass-hay

Intake time（Second/head）

600

PM-silage

Amaranth-silage

（B）

500
400
300
200
100
00

1st-trial

2nd-trial

3rd-trial

1st-trial

20 April 2022

2nd-trial

3rd-trial

26 April, 2022

Examined date and No. of trial
Italian ryegrass-hay

PM-silage

Amaranth-silage

Fig. 3 Preference test of Italian ryegrass-hay, pearl millet（PM）

20

First Severe frosts
frost

（A）

80

12
8
4
0

（B）

70

16

IVDMD（%）

CP content（% DM）

silage and amaranth silage in intake percentage（A）and intaketime（B）by breeding Japanese-Black beef cows．

60
50
40
r = -0.783（ p< 0.01）

30
0

30

60

90

120

150

20

10

Days after sowing
Leaves

Stems

Ears

Whole plant

Leaves20
30
40
ADF content（% DM）
Stems

Ears

50

Whole plantFig. 4 Changes in crude protein（CP）content of late-summer sown pearl millet（A）and relationship between aciddetergent fiber（ADF）content and in vitro dry matter digestibility（IVDMD, B）in the late-summer sown pearl
millet．

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454

Good

た。パールミレット霜枯れ草サイレージの発酵品

94

質としては，pHは5.0であったが，乳酸含量は新
鮮重当たり1.1―2.8％で，酢酸含量は0.06―0.18％

Excellentと低く，酪酸の発生は認められなかった。そこで，フリーク評点およびV-SCOREによる評価値は，それぞれ「秀」および「優」と評価された。したがって，晩夏播きパールミレットは，初霜後１か

100

Good
Good
Good
92
95
91
Excellent
Excellent
Excellent
100
100
100

月で含水率が60％未満となったことから，低水分

8.2
61.3
Round-bale silage-3
4 January，2022

5.0

1.7

0.06

0.0

あることが明らかとなった５）。

†Percentage of volatile basic nitrogen to total nitrogen．

8.8
7.6
9.3
0.0
0.0
0.0
0.10
0.12
0.18
1.6
2.1
2.8
59.7
52.8
41.9
5.4
5.1
5.0
Plastic 30-L silo
Round-bale silage-1
Round-bale silage-2
4 January，2022
4 January，2022
4 January，2022

Evaluation

Good
Good
91
89

Point
Evaluation

Excellent
Excellent
100
100
9.5
10.1
0.0
0.0
0.09
0.08
1.1
1.5
79.7
69.8
4.9
4.7

Point

は，給与試験を繰り返すと草種間差異が縮小しロールベールサイレージとして冬季に調製可能でPlastic 30-L silo
Plastic 30-L silo

Flieg’s Score

VBN†
（％TN）
Butyric acid（％ DM）
Acetic acid（％ DM）
Lactic acid（％ DM）
Moisture（％ FM）
pH
Processing method
Date of processing

Table１ Silage fermentation quality of late－summer sown pearl millet in the 2021 experiment．

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

よるロールベールサイレージ（pH5.0）の選好性

23 December，2021
29 December，2021

V-Score

令和４年度

文
献
１）
 Li, B., Ishii, Y., Idota, S., Tobisa, M., Niimi, M.,
Yang, Y., Nishimura, K.：Yield and quality offorages in a triple cropping system in Southern
Kyushu, Japan, Agronomy, 9, 277. Doi:10.3390/
agronomy9060277, 2019．
２）
 Idota, S., Ohara, M., Kodani, R., Hongou, Y.,
Tobisa, M., Ishii, Y., Nishimura, K., Arima, N.：
Agronomic traits of high-yielding sorghum（Sorghum bicolor Moench ‘Tarzan’）in Miyazaki
Prefecture, Proceedings of the 7th Japan-ChinaKorea Grassland Conference, 210-211, 2018．
 石垣元気，井戸田幸子，石井康之：異なる生育段
３）
階の飼料用トウモロコシへの水溶性殺虫剤散布度模
擬調査，日本草地学会報，67（4）,183～188, 2022．
 Li, B., Ishii, Y., Idota, S., Yang, Y., Niimi, M.：
４）Growth and yield potentials of pearl millet（Pennisetum typhoides）under different sowing
dates in southern Kyushu, Japan, Wulfenia J, 27（3）,67～80, 2020．
 石井康之，重富ひかる，石垣元気，新美光弘，井５）
戸田幸子：晩夏播きパールミレットの生育，収量と霜枯れ草の飼料品質，日本草地学会報，69（別号）
11, 2023．

© The Ito Foundation

455

高品質な豚肉生産のためのエゴマ搾り粕の利用に関する研究
The study of utilizing perilla meal（Perilla frutescens）for producing highquality pork

田島

茂行・内倉

健造・長江

杏介・豊島

浩一

（愛知県農業総合試験場）

Shigeyuki Tajima, Kenzo Uchikura, Kosuke Nagae and Koichi Toyoshima（Aichi Agricultural Research Center）

In this study, we investigated the digestibility of perilla meal, and the effects of feeding
diet containing perilla meal on growth performance, carcass characteristics, and fatty acidcomposition of the subcutaneous inner fat. Four WLD gilts were used for the digestion test and
32 WLD（16 females and 16 gilts）were used for the feeding test. The digestion test was
conducted by the total feces collection method. For the feeding test, two females and two gilts
were assigned to each experimental group; a control group or a perilla meal group. Based on
the digestibility of the perilla meal from the result of the digestion test, each diet wasformulated to meet the nutrient requirements suggested by the Japanese Feeding Standard for
Swine. The diet of the perilla meal group contained 10％ of the perilla meal. Each diet was fed
from 70 to 110 kg body weight. In the result, the digestibility of the perilla meal was 63％，56％，０ ％，and 20％ for crude protein, crude fat, crude fiber, and nitrogen free extract,
respectively. In the feeding test, there were no significant differences in growth performance
between the groups, while the daily gain and feed intake in the perilla meal group tended to behigher than that in control group. For carcass characteristics, back loin length II and shoulder
fat thickness in the perilla meal group were significantly larger than that in control group.
Fatty acid composition in the perilla meal group showed a significant increase in α-linolenicacid content compared to the control group. The n-6/n-3 in the subcutaneous inner fat was 7.0
in the perilla meal group. These results clarified that the perilla meal can be used as feed
ingredients by using the digestibility of perilla meal calculated in this study, and the dietcontainig perilla meal can improve the n-6/n-3 ratio without affecting product performance．

１．目

るα―リノレン酸を豊富に含む。また，α―リノレ

的ン酸は体内で合成できない必須脂肪酸の一つで食

欧米化の進んだ今日の食生活では摂取しにくい

事中から摂取しなければならない。

ω３系脂肪酸（n―3）を補う食品としてエゴマ油

エゴマ油を搾油した後に排出される食品製造副があげられる。n―3は心血管系の疾病に効果があ産物であるエゴマ搾り粕は，エゴマ油と同様にαることが報告されており ，エゴマ油はn―3であ―リノレン酸を豊富に含んでいる。食事中のω６

１）© The Ito Foundation

456

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）系脂肪酸とω３系脂肪酸の比（n―6/n―3比）は4.0程度が適正とされている

勢豚４頭（三元交雑種WLD）を用いた。

が，豚肉では14.5であ

供試飼料は，基礎飼料として豚産肉能力検定飼ると報告されている３）。豚脂肪中の脂肪酸組成は

料 （total digestible nutrients （TDN）76.0 ％，給与飼料中の脂肪酸組成に影響されることが報告

crude protein（CP）15.5％）を用い，これにエされており ，特に，不飽和脂肪酸は飽和脂肪酸

ゴマ搾り粕を８：２の割合になるように配合しよりも優先的に体内に取り込まれる。そのため，た。飼料給与量は一日当たり2.5kgとし，午前

エゴマ搾り粕を豚に飼料原料として給与できれば（9：00）と午後（16：00）に等量給与した。飲水

豚脂肪中のn―3割合を高めることが可能である。

は自由とした。

２）

４）

また，エゴマ搾り粕は粗タンパク質含量が約37％

消化試験は全糞採取法により行った。予備期であり，大豆粕等の植物性タンパク質原料の代替

間，採糞期間はそれぞれ５日間とした。糞は飼料としての利用も期待できる。実際に，当場でエゴ

給与時に採取し，60℃で１―２日間，通風乾燥機

マ搾り粕配合飼料の給与試験を行ったところ，背で乾燥させた後，１―２日間室内に放置し，風乾

脂肪内層中のn―3割合が増加し，n―6/n―3比が約4.8

後重量を測定した。重量測定後，個体ごとに粉砕になることが明らかになった。

した糞をすべてポリエチレン製の袋に集め，よく一方で，エゴマ搾り粕は豚用飼料として活用さ

混合し，これをサンプルとした。給餌器に残ってれておらず，消化率も明らかにされていない。そいる飼料と食べこぼした飼料は，１日一回バットのため，以前当場で行った試験では植物性油粕類に集め糞と同様の工程で風乾後重量を測定した。

であるナタネ粕の消化率

飼料給与量から残飼量，こぼし量を差し引いて飼を用いてエゴマ搾り粕

５）

配合飼料を設計し，肥育後期の33日間給与した。

料摂取量とした。

その結果，対照区と比較してエゴマ搾り粕配合区

供試飼料および採取した糞はAOAC ６）に基づで飼料摂取量が増加し，飼料要求率が悪化した。

き，水分，粗タンパク質，粗脂肪，粗繊維および

これは，エゴマ搾り粕の消化率がナタネ粕の消化

粗灰分を測定し，100からこれらの百分率の合計率よりも低く，飼料中のエネルギー含量が不足しを引くことで可溶無窒素物とした。エゴマ搾り粕たことよるものと考えられた。

の消化率は，エゴマ搾り粕配合飼料の糞中成分量

そこで本研究では，エゴマ搾り粕の消化率を調から基礎飼料の糞中成分量を引いたものをエゴマ

査し，飼料設計を見直すことで，飼料摂取量と飼搾り粕による摂取成分量から引き，それをエゴマ

料要求率を改善し，エゴマ搾り粕の飼料としての搾り粕による摂取成分量で割ることで求めた。

利用価値を高め，豚用飼料原料としての普及およ

2.2

び推進に寄与することを目的とした。

供試豚は，2022年７月に生産された三元交雑種

２．方

WLD32頭（雌16頭，去勢16頭）を用いた。１群

法は雌２頭，去勢２頭の計４頭とし，平均体重が均

本研究は，愛知県農業総合試験場動物実験等実
施規定の承認を受けて実施した（承認番号2212）。
2.1

肥育試験

等となるように，豚房に配置した。
試験区分は，飼料の10％にエゴマ搾り粕を配合したエゴマ区および対照区の２区４反復を設け消化試験た。試験は各豚房の平均体重が70kgとなった時

供試豚は2022年３月20日，21日に生産された去点から開始し，110kgに到達した時点で試験終了© The Ito Foundation

457

高品質な豚肉生産のためのエゴマ搾り粕の利用に関する研究
Table 1 Chemical composition and digestibility of basal diet and perilla meal（％）．
Basal diet

Perilla meal

Chemicalcomposition

Digestibility

Chemicalcomposition

Digestibility

Moisture

12.12

Crude Protein

14.55

83.12±0.99

38.37

6.89

Crude Fat

2.57

55.60±3.89

7.53

59.37±2.80

Crude Fibre
Nitrogen Free Extracts

3.83
62.26

57.79±3.94
94.00±0.25

17.65
22.89

－32.64±7.09
20.15±14.38

Crude Ash

4.68

64.15±1.38

6.66

TDN

76.04

39.29

Data were shown as the mean±SEM（n＝4）．

とした。試験は2022年11月中旬から2023年１月上で測定した。肉色は，pork color standardsに基旬まで実施し，不断給餌で，ピックによる自由飲づいて調査した。Ｌ＊ 値，ａ＊ 値およびｂ＊値は色

水により行った。供試飼料については，対照区，差計（CR-21, Konica Minolta, Tokyo, Japan）をエゴマ区ともに日本飼養標準・豚（2013年版）

用いて測定した。

７）の養分要求量を満たし，飼料中の栄養成分が同等（TDN76.0％，CP15.5％）となるように設計した。
また，飼料の調製は山田らの報告を参考に，保脂肪酸組成は，一般財団法人日本食品分析セン
ターに分析を依頼し，測定した。

８）

存期間が約10日間となるように行った。
発育成績として，飼料摂取量および１日平均増

３．結果と考察3.1

消化試験

体量，飼料要求率を調査した。飼料摂取量につい

本試験に用いた基礎飼料およびエゴマ搾り粕のては，週に一度，残飼量を測り，飼料給与量から

栄養成分組成および消化率はTable１のとおりで差し引くことで測定した。また，試験終了日に体ある。基礎飼料の栄養成分および消化率を用いて重測定を行い，試験日数で除することにより１日算出したTDNは計算値とほぼ一致する76.04と平均増体量を算出した。さらに，飼料摂取量を１なった。エゴマ搾り粕の消化率において，粗繊維

日平均増体量で除することにより，飼料要求率をの数値がマイナスとなったため，粗繊維の消化率算出した。枝肉成績として，ロース断面積，枝肉は０とした。この消化率を用いて算出したエゴマ

重量，と体長，背腰長Ⅱ，肉色，背脂肪厚を調査

搾り粕のTDNは39.29となった。

した。ロース断面積は，体重約110kg到達時に超3.2

音波画像診断装置（HS-2000V, Honda electronics

消化試験の結果に基づいて設計した供試飼料のCo., LTD, Aichi, Japan）のリニアプローブを用配合割合および成分の試算値はTable２のとおり

いて左側胸最長筋上の体長の中間地点で測定し，で あ る 。両 区 と も ，飼 料 中 の 栄 養 成 分 が 同 等

フリー画像解析ソフト（Image J）を用いて面積（TDN 76.0％，CP 15.5％）となるように設計した。

を分析した。供試豚は試験終了後にと畜を行い，発育成績はTable３のとおりである。すべての１日放冷後に，枝肉重量，と体長，背腰長Ⅱ，肉項目で有意な差は見られなかったが，１日平均増

色，背脂肪厚を測定した。肉色とＬ＊値，ａ＊値お体量，飼料摂取量はエゴマ区で高くなる傾向が見

よびｂ 値は第４―５胸椎間の左側胸最長筋断面上られた（それぞれｐ＝0.058，ｐ＝0.094）。飼料摂＊© The Ito Foundation

肥育試験

458

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Table 2 Ingredients and calculated chemical composition of the experiment diet（％）．
Control diet

Perilla meal diet
74.17

Corn

73.96

Soybean meal

15.91

9.41

Wheat bran

5.47

0.00
10.00

Perilla meal

0.00

Fish meal（60％ CP）

1.51

1.51

Palm oil
L-lysin・hydrochloride

0.00
0.50

1.74
0.50

Calcium carbonate

0.65

0.50

Tricalcium phosphate

1.31

1.46

Salt

0.30

0.30

Vitamins and minerals

0.40

0.40

Crude protein

15.5

15.5

Ether extract

3.4

5.6

TDN

76.0

76.0

Table 3 Growth performance of pigs between conrol and perilla meal groups．
Control group

Perilla meal group

Starting weight（kg）

70.6±0.671.3±0.7

Finishing weight（kg）

108.0±0.4

108.6±0.7

Number of days for 70-110kg weight（d）

42.3±1.1

38.8±1.4

Daily gain（g/d）

886±19965±23

Feed intake（kg/head/d）

3.61±0.04

3.83±0.09

Feed conversion ratio

4.08±0.1

3.97±0.02

Data were shown as the mean±SEM（n＝4）．

取量の増加は，飼料要求率には影響を及ぼしてい肩脂肪厚で有意な差が見られた（それぞれｐ＜

ないことから，エゴマ搾り粕配合により飼料の嗜

0.05，ｐ＜0.01）。一方で，その他の産肉性に関わ好性が高まったと考えられる。一方，１日平均増

る項目では有意な差は見られなかった。

体量の増加については二つの要因が考えられる。

エゴマ搾り粕および各試験区の飼料における脂一つ目は，飼料摂取量の増加により摂取する総エ肪酸組成はTable５のとおりである。エゴマ搾り

ネルギー量が増加したと考えられる。二つ目は，

粕における脂肪酸組成はＣ18：３，Ｃ18：１，Ｃ

飼料中のω３系脂肪酸含量の増加による影響が考

18：２，Ｃ16：０，Ｃ18：０，Ｃ16：１の順に割えられる。McAfeeらは飼料中のω３系脂肪酸含合 が 大 き か っ た （そ れ ぞ れ 39.9 ％， 28.6 ％，

量を増加させることで，対照区と比較して同一期

18.8％，8.1％，2.3％，0.3％）。対照区飼料中の脂

間中の増体量が有意に増加したことを報告して肪酸組成はＣ18：２，Ｃ18：１，Ｃ16：０，Ｃいる。本研究でも，飼料中のω３系脂肪酸含量を

18：０，Ｃ18：３，Ｃ16：１，Ｃ14：０の順に割増加させたことで，１日平均増体重が増加したと合 が 大 き か っ た （そ れ ぞ れ 51.4 ％， 24.4 ％，考えられる。

16.3％，2.4％，2.2％，0.4％，0.2％）。一方，エゴ

９）

枝肉成績はTable４のとおりである。背腰長Ⅱ，

マ区ではＣ16：０，Ｃ18：２，Ｃ18：１，Ｃ18：© The Ito Foundation

459

高品質な豚肉生産のためのエゴマ搾り粕の利用に関する研究
Table 4 Carcass characteristics of pigs between conrol and perilla meal groups．
Control group

Perilla meal group

Carcass weight（kg）

77.2±1.277.4±1.0

Carcass length（cm）

93.0±0.593.2±0.4

Back loin length Ⅱ（cm）

66.6±0.468.1±0.3＊

Pork color standard
Muscle color, L＊

3.6±0.1
49.1±0.5

3.5±0.1
48.5±0.6a＊20.2±0.3

20.6±0.3b＊5.3±0.2

5.3±0.2

Thickness of backfat
Shoulder（mm）

37.3±1.0

41.2±0.7＊＊

Back（mm）

22.7±0.923.2±1.0

Loin（mm）
Loin area（cm２）34.5±1.0
40.1±1.0

33.9±1.0
40.5±0.8

Data were shown as the mean±SEM（perilla meal and diet n＝1, fat n＝4）. Significant difference
was identified between control and perilla meal groups（＊ p＜0.05, ＊＊p＜0.01）. Loin area wasmeasured on left longissimus dorsi muscle at tne site of half the body length．

Table 5 Fatty acid composition（％）and n-6/n-3 of perilla meal, diet and subcutaneous inner

fat of pigs between conrol and perilla meal groups.
Perilla meal

Control group

Perilla meal group

Diet

Fat

Diet

Fat

C14 : 0
C16 : 0
C16 : 1
C18 : 0C18 : 1
C18 : 2
C18 : 3

0.0
8.1
0.3
2.3
28.6
18.8
39.9

0.2
16.3
0.4
2.4
24.4
51.4
2.2

1.3±0.1
25.7±0.4
1.8±0.1
17.1±0.542.8±0.4
7.3±0.1
0.5±0.0

0.4
46.7
0.3
1.7
18.8
27.4
2.7

1.3±0.025.5±0.2
1.9±0.1
16.3±0.642.9±0.7
7.7±0.2
0.9±0.0＊＊

SFA
n-6
n-3

11
18.9
39.9

19.9
51.4
3.1

45.1±0.5
7.8±0.1
0.6±0.0

49.6
27.4
3.1

44.0±0.8
8.3±0.2
1.2±0.1＊＊

n-6/n-3

0.47

16.6

12.7±0.78.84

7.0±0.6＊＊

Data were shown as the mean ± SEM （perilla meal and diet n＝1, fat n＝4）.Significant difference was
identified between control and perilla meal groups（＊＊ｐ＜0.01）．

３，Ｃ18：０，Ｃ14：０，Ｃ16：１の順に割合がれなかった。一方，Ｃ18：３では対照区およびエ大きかった（それぞれ46.7％，27.4％，18.8％，

ゴマ区との間に有意な差が見られた（それぞれ2.7％，1.7％，0.4％，0.3％）。また，各試験区の0.5％および0.9％）。また，n―6/n―3も対照区およ飼料におけるω６系脂肪酸とω３系脂肪酸の比

びエゴマ区との間で有意な差が見られた（それぞ（n ― 6/n ― 3 比）は 対 照 区 ，エ ゴ マ 区 で そ れ ぞ れ

れ12.7および7.0）。
これらの結果から，本研究で算出したエゴマ搾

16.6，8.8であった。
背脂肪内層における脂肪酸組成はTable５のとり粕の消化率を用いることで，適正な飼料設計がおりである。Ｃ14：０，Ｃ16：０，Ｃ16：１，Ｃ可能になり，エゴマ搾り粕配合飼料は生産性に影

18：０，Ｃ18：１，Ｃ18：２では有意な差は見ら響を与えず，脂肪酸組成のn―6/n―3比を改善可能© The Ito Foundation

460

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

であることが明らかとなった。今後は，エゴマ搾から，本研究で算出したエゴマ搾り粕の消化率をり粕配合飼料給与豚の肉質および食味に関する調用いることで，適正な飼料設計が可能になり，エ査が必要である。

ゴマ搾り粕配合飼料は生産性に影響を与えず，脂４．要肪酸組成のn―6/n―3比を改善可能であることが明約らかとなった。

エゴマ搾り粕の消化率およびエゴマ搾り粕配合
飼料給与による発育成績，産肉成績および背脂肪
内層の脂肪酸組成への影響を調査した。供試豚は消 化 試 験 で は WLD 去 勢 ４ 頭 ，肥 育 試 験 で は
WLD32頭（雌16頭と去勢16頭）を用いた。消化試験は，予備期間，採糞期間はそれぞれ５日間の全糞採取法で行った。肥育試験は，１群に雌，去勢各２頭を配置し，エゴマ区，対照区の２試験区
４反復を設けた。消化試験で得られたエゴマ搾り
粕の消化率をもとに，各飼料とも粗タンパク質
15.5％，TDN76.0％を充足するように設計した。
エゴマ区にはエゴマ搾り粕を10％配合した。各飼料を体重70―110kgの間給与し，発育，産肉成績
および背脂肪内層の脂肪酸組成を調査した。発育成績では，すべての項目で有意な差は見られなかったが，１日平均増体量と飼料摂取量がエゴマ
区で高い傾向が見られた。産肉成績では，背腰長
Ⅱ，肩脂肪厚がエゴマ区で有意に大きかった。脂肪酸組成では，α―リノレン酸含量が対照区と比較して，有意に増加した。また，背脂肪内層中の文
献１）
 Ninomiya, T., Nagata, M., Hata, J., Hirakawa, Y.,
Ozawa, M., Yoshida, D., Ohara, T., Kishimoto, H.,
Mukai, N., Fukuhara, M., Kitazono, T., Kiyohara
Y.：Atherosclerosis, 231, 261～267, 2013.
２）
 Ma, X., Jiang, Z., Lai, C.：Crit. Rev. Food. Sci.
Nutr., 56, １～13, 2016.
 Ishida, S., Hayasawa, H., Shimizu, R., Tamaki, M.,
３）Aii, T.：J. Anim. Sci. Tech., 66（10）,889～897, 1995.
４）
 Irie, M., Nishimura, K.：Jpn. J. Zootech. Sci., 57（8）,642～648, 1986.
 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構：
５）
日本標準飼料成分表（2009年版），106～133，中央
畜産会，東京, 2009.
６）
 Association of official analytical chemists, Official
methods of analysis of the association of official
analytical chemists, 13th ed., 125～142, AOAC,
Washington, DC, 1980.
７）
 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構：
日本飼養標準・豚（2013年版），16～19，中央畜産会，
東京, 2013.
 山田未知，中村フチ子、西牧由佳、宮本拓平，山８）
田幸二，大槻健治，佐藤茂次，松井滋：日豚会誌,
47（2）,47～54, 2010.
 McAfee, J. M., Kattesh, H. G., Lindemann, M. D.,
９）Voy, B. H., Kojima, C. J., Burdick Sanchez, N. G.,
Carroll, J. A., Gillespie, B. E., Saxton, A. M.：J.
Anim. Sci., 97（11）,4453～4463, 2019.

n―6/n―3はエゴマ区で7.0となった。これらの結果© The Ito Foundation

461

ルーメン細菌叢制御を目指した子ウシ唾液抗体の分泌機能の解明
Capacity of salivary immunoglobulin secretion and its development
associated with the growth of calves

鈴

木

裕

（北海道大学大学院農学研究院）

Yutaka Suzuki（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

The developmental process of antibody secretory capacity in bovine salivary glands was
examined, which will provide the basic information for the future application of vaccine control
of bovine ruminal microbial activity. First, we investigated the changes in the concentration ofeach class of antibodies, and found that only the concentration of IgA increased gradually alongwith calves’ growth. The concentration IgA was also higher compared to those of IgG and IgM
after 2 weeks of age. These indicates that the salivary glands may start to develop a function
to secrete IgA at the early stage of calves’ life. Next, we examined the IgA production of eachsalivary gland and the developmental mechanism of its secretion by gene expression analysis.
The results showed that IGA was highly expressed in the mandibular and sublingual glands.
In addition, the expression levels of PIGR and CCL28 in the mandibular gland increased withcalf growth. Therefore, the mandibular gland is the major secretory tissue for IgA, indicatingthat IgA production and secretory capacity may develop as the calves grow. This study
revealed that the major antibody class in calf saliva is IgA, and that its secretory level
increases from the age of 1 week onward. It was also suggested that increased expression ofchemokines and transporters contribute to the development of its secretory capacity. In order
to apply the information obtained in this study to the development of vaccines against rumen
bacteria, it will be important to examine what rumen bacteria salivary IgA binds to and how it
modifies their activity in the future study．

１．目

するアプローチが試みられているが，耐性菌出現的の懸念や使用コストなどの課題が多い。

近年の肉牛・乳牛の生産では，アシドーシスやルーメンには反芻により大量の唾液が流入してメタン排出のように，第一胃（ルーメン）内の微

おり，唾液に多量に含まれる重炭酸や尿素がルー

生物相のアンバランスや機能不全に起因する問題

メン微生物の活性や増殖を制御している。一方が顕在化している。これらの問題に対して，抗生で，抗体は唾液中に比較的多く含まれる成分であ物質や飼料添加物によってルーメン細菌叢を制御

り，細菌の活性を抑制する働きを持つ。一般に抗© The Ito Foundation

462

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）体の反応性はワクチンにより制御できることか

週齢の離乳後子牛：５頭）を供試した。子牛にはら，アシドーシスやメタン産生を抑制するワクチ

分娩から半日以内に初乳リプレーサー0.75ｌを，ンが提唱されている。ルーメン液バッチ培養など次の哺乳で自家産凍結初乳２ｌを給与し，その後のin vitro系を用いた先行研究

では，抗体はは代用乳を１日あたり３～６ｌ与えた。３週齢で高いメタン抑制効果を持つことが確認された一方組織採取を行った個体には，解剖日まで固形飼料

で，in vivoでのワクチン投与試験では顕著な効果は給与せずに飼育した。13週齢の個体には，１週は見られていない３，４）。

齢の時点からスターターの給与を開始し，５～６

１，２）

ウシでは，唾液中の主要抗体クラスはどれなの

週齢頃から細断した乾草を自由摂取させ７週齢頃

か，また唾液中への抗体分泌能力はいつ成熟するに離乳させた。採取した唾液腺（下顎腺，舌下腺，のかといった基盤情報が不足しており，効率的なおよび耳下腺）はただちに液体窒素で凍結し，そワクチネーションのために必要な投与経路や抗原の後は－80℃で保存した。

投与の時期を検討するうえでの妨げとなっている。本研究では，成長中の子牛における各抗体ク

2 . 2 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）による抗体濃度の測定

ラス（IgA，IgG，IgM）の唾液中濃度の比較や，

唾液中抗体濃度の測定は，市販のAnti-IgG抗その分泌機序を検討することにより，ウシ唾液腺体，Anti-IgA抗体，およびAnti-IgM抗体（いずにおける主要抗体クラス，および抗体分泌機能のれもFortis life sciences, Walthum, MA, USA）を

発達時期を明らかにすることを目的とした。

使用して確立したSandwich-ELISAにより行った。ELISAプレート（住友ベークライト株式会

２．材料・方法
2.1

社，東京）に，捕捉抗体を固相化した後，ブロッ
キングバッファー（0.5％ collagen solution）を分

供試動物およびサンプル採取

本研究は，北海道大学動物実験委員会の承認の注し，１時間インキュベーションした。洗浄バッ
ファー（TBST）による洗浄を行った後，段階希下に行った（No.19-0020）。
唾液の採取には，北海道内の預託牧場で飼育さ釈した検量線用スタンダードと唾液サンプルを分れたホルスタイン種メス子牛（１～６週齢：計87

注し，室温にて一晩振盪しながらインキュベート

頭）を供試した。子牛は10日齢まで導入舎（単した。スタンダードとサンプルの反応終了後，飼）にて飼育し，１日あたり代用乳８ｌを給与しTBSTによりプレートを洗浄した後，希釈した検た。10日齢を過ぎた個体は順次，哺育舎へと移行

出抗体を分注し，室温で１時間インキュベーショ

し，哺乳ロボットにより１日あたり代用乳８ｌをンした。TBSTにより洗浄した後，OPD発色試薬

給与し，粗飼料は自由採食させた。また，スター（富士フイルム和光純薬，大阪）を分注し，一定

ターは２～６週齢の個体には１日あたり0.1～

時間発色させた。その後，プレートリーダーで２kg給与し，８週齢以降の個体には２kg給与

490nmにおける吸光度を測定した。Ｒ（ver.4.2.2）

した。唾液の採取には口腔スワブ（Salimetrics,のnplrパッケージを用いてスタンダードの吸光度

Carlsbad, CA, USA）を用いた。採取後のスワブから４係数ロジスティック曲線を描き，サンプルは5.0mlチューブに入れ，－80℃で保存した。

中の抗体濃度を算出した。なお，ELISAの希釈

唾液腺組織サンプルの採取には，ホルスタイン
種オス子牛（約３週齢の離乳前子牛：５頭，約13

直線性，添加回収性は誤差±20％以内となることを事前に確認した。

© The Ito Foundation

463

ルーメン細菌叢制御を目指した子ウシ唾液抗体の分泌機能の解明

2.3

RNA抽出およびqRT-PCR

2.4

統計手法

唾液腺組織をRNA抽出試薬（タカラバイオ，

統 計 解 析 は Ｒ（ver.4.2.2）の multcomp パ ッ滋賀）とともにホモジナイズし，total RNAを抽ケ ー ジ を 用 い た 。二 群 間 の 比 較 に は Student’s

出した。抽出したtotal RNAはNanodrop（Thermo

t-test を 行 い ， 三 群 間 の 比 較 に は one-way

Scientific, Walthum, MA, USA）およびアガロー

ANOVAおよびTukey法による多重比較検定を

スゲル電気泳動により濃度と品質の確認を行った。p＜0.05の場合に群間に有意な差がある

行 っ た 。 500ng/sample の total RNA を 逆 転 写とした。

（Revertra-ase RT-kit；東洋紡，大阪）に供し，３．結果と考察cDNA を 作 製 し て ，real-time PCR に 供 し た 。
Real-time PCRにはLightCycler 480（Roche

3 . 1 各抗体クラスの唾液中濃度の比較と成長

Applied Science, Penzberg, Germany）を用いによる変化た。標的遺伝子はIGA，PIGR，CCL28，CCR10，

子牛の唾液中抗体濃度の測定結果をFig.１に示

お よ び 内 部 標 準 遺 伝 子 で あ る ACTB ，UXT ，す。IgG濃度は１週齢から６週齢において有意な

RSPQ と し た 。 Real-time PCR の 結 果 か ら ，

変化はなかったが，２週齢にて最高値（40.1±5.1

ACTB，UXT，RPSQのCt値の幾何平均を内部

μg/ml）を示し，３週齢にて最低値（27.3±2.6標準として，ddCt法により各標的遺伝子の相対μg/ml）に低下した。IgM濃度についても有意な的発現量を求めた。

変化はなかったが，１週齢にて最低値（17.5±4.8
Salivary IgA

Salivary IgG
140

1600

120

1400

μg/ml

μg/ml

1000

80
60
40

a

3ｗ

4ｗ

5ｗ

6ｗ

a

a

600
b

200
0
1ｗ

2ｗ

3ｗ

4ｗ

5ｗ

6ｗ

1ｗ

2ｗ

Salivary IgM

Salivary Igs

140

400

120
μg/ml

100
μg/ml

a

ab

800
400

20

80
60
40

1ｗ

2ｗ

3ｗ

4ｗ

5ｗ

IgG
IgA
IgM

200

a

0

6ｗ

a

300

100

20
0

a

1200

100

0

ab

a
ab
b
1w

Fig. 1 Concentrations of immunoglobulins in saliva of calves．
（ p＜0.05）
ab© The Ito Foundation

a

b
b
2w

b

b

b

b

b

b

b

b

3w

4w

5w

6w

464

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

μg/ml）を示し，２週齢にて最高値（24.3±3.9の発現量を，組織間で比較した結果をFig.２に示

μg/ml）であった。一方で，IgA濃度は１～４週

す。IGA mRNAについては有意な差ではなかっ

齢にかけて上昇し（25.5±3.3μg/ml-312.3±42.1

たが，耳下腺（相対発現レベル；1.00±0.21）とμg/ml），５および６週齢においても高い値を維比 較 し て ，下 顎 腺（1031 ± 201）お よ び 舌 下 腺

持した。また，IgAは２週齢以降ではIgGおよび（3150±1970）において非常に高い発現量を示しIgMと比較して有意に高い濃度であり，IgGに対た。また，IgAタンパク質については，舌下腺（相する濃度比は最大で約11倍，IgMに対しては最大対値；0.26±0.11）および耳下腺（0.35±0.08）とで約17倍であった。ウシの母乳中にはIgGが全抗比較して，下顎腺（1.12±0.18）において高い発体の約90％と多く含まれておりIgAの濃度は低い

現 量 を 示 し た 。次 に ，各 唾 液 腺 に お け る IGA

ことから ，唾液中で検出されたIgAは子牛自身

mRNAおよびIgAタンパク質の発現量を，３週齢が産生したものであると考えられる。また，久馬および13週齢の間で比較した結果をFig.３に示らの報告 では，４週齢から52週齢にかけて唾液す。IGA mRNA発現量については，下顎腺にお中IgA濃度が上昇していたが，本研究の結果はよいて13週齢（３週齢；1.00±0.52，13週齢；2.76

り早い時期から唾液IgA分泌能の発達が始まるこ±0.54）で発現量の上昇が見られた。舌下腺におとを示している。以上のことから，子牛の唾液中

いても，有意な変化ではないが大きく発現量が上における主要な抗体クラスはIgAであり，唾液腺

昇 し た（３ 週 齢；1.00 ± 0.49 ，13 週 齢；12.26 ±における分泌能は１週齢以降という比較的早い時

7.67）。IgAタンパク質については，下顎腺におい期から発達が始まることが明らかになった。

てのみ13週齢で発現量の上昇が見られた（３週

５）

６）

3 . 2 唾液腺におけるIgAの発現量と成長によ

齢；1.00±0.25，13週齢；7.28±1.73）。Sakaguchi
らは，成牛の下顎腺および舌下腺にはIgA産生細る変化
哺乳期の子牛の唾液中においてもIgA濃度が高胞が多数存在し，特に舌下腺において分泌能が高いことが明らかになったため，以降の解析はIgA

いと報告しており７），本研究の結果はこれと矛盾に絞った。子牛（13週齢）の下顎腺，舌下腺およしない。一方で，タンパク質レベルでは下顎腺に

び耳下腺におけるIGA mRNAとIgAタンパク質

おける発現量が他の唾液腺に比べて有意に高かっ
IgA protein

IGA mRNA
IgA

6000

Tubulin
1.5

4000
Relative levels

2000
1000

1
0.5

b

Su
bm
an
di
bu
la
r

Pa
ro
tid

0
Su
bl
in
gu
al

Su
bm
an
di
bu
la
r

0

b

Pa
ro
tid

3000

a

Su
bl
in
gu
al

Relative levels

5000

Fig. 2 Comparison of expressional levels of mRNA and protein of IgA between salivary glands of calves．
（abp＜0.05）© The Ito Foundation

465

ルーメン細菌叢制御を目指した子ウシ唾液抗体の分泌機能の解明た。これは，耳下腺においては血中から腺房に取PIGR，CCL28およびCCR10のmRNA発現を測り込んだIgAを検出した可能性が考えられる。今定した結果をFig.４に示す。下顎腺においては，

後はIgAの産性能と分泌能を分けて評価する必要

PIGR（３週齢；1.00±0.11，13週齢；1.87±0.34）があると考えられる。まとめると，子牛においておよびCCL28（３週齢；1.00±0.08，13週齢；1.44は下顎腺のIgA分泌能が高い可能性を示された。

±0.10）のmRNA発現量が13週齢で上昇した。舌3 . 3 IgA産生・分泌関連因子発現量の成長に下腺においては有意な発現量差は見られなかっよる変化た。耳下腺においては，PIGRのmRNA発現量が本研究ではさらに，各唾液腺におけるIgAの産13週齢で低下した（３週齢；1.00±0.13，13週齢；

生および分泌に関連する因子について，子牛の成0.41±0.17）。下顎腺のみにおいて遺伝子発現の上長に伴う発現変化を検討した。唾液腺における昇が見られたことから，下顎腺ではケモカインでIgA の 産 生 お よ び 分 泌 に 関 与 す る 因 子 と し てあるCCL28によるIgA産生細胞の誘引作用が強ま
IgA protein

IGA mRNA＊5

13 （w）

3w
13 w

6
4
2
0
Su
bm
an
di
bu
la
r

Pa
ro
tid

Su
bm
an
di
bu
la
r

Su
bl
in
gu
al

0

3

13

8

Relative levels

10

3

＊

10

15

13

3

Pa
ro
tid

20
Relative levels

IgA
Tubulin

3w
13 w

Su
bl
in
gu
al

25

Fig. 3 Comparison of expressional levels of mRNA and protein of IgA in salivary glands of calves with different ages．
（＊p＜0.05）

Submandibular

Parotid

Sublingual

33w

Relative levels

＊

13 w

2

＊
＊

1

0
C
R1
C

L2
8
C
C

R
G
PI

0
R1
C
C

8
L2
C

C

R
G
PI

R1
0
C
C

L2
8
C
C

PI

G
R

0

Fig. 4 Comparison of expressional levels of IgA-associated genes in salivary glands of calves with different ages．
（＊p＜0.05）© The Ito Foundation

466

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

ると同時に，腺房細胞におけるpIgRを介したIgAなった。また，その分泌能の発達にはケモカイン

分泌能も発達したと考えられる。下顎腺におけるや輸送体の発現上昇が寄与することが示唆されIgA分泌能が発達した要因の一つとしては，成長た。本研究で得られた情報をルーメン細菌のワクに伴う腸内細菌の増加や多様化が考えられる。腸チン開発に発展させるにためは，唾液中IgAがど管共生細菌による抗原刺激は，腸管上皮組織ののようなルーメン内細菌に結合するのか，またそ

IgA産生細胞を増加させることが知られている。

の活性をどのように変化させるのかを検討するこ

反芻動物においても生後約３週間にかけて腸管共とが今後の課題となると考えられる。

生細菌の数・種類が増加することや，回腸パイエ
ル板から全身へとＢ細胞が移行することが知られている 。口腔を含む全身の粘膜組織は共通粘膜
８）免疫機構（CMIS）により関連性をもつことか
ら，小腸において増殖・成熟したIgA産生細胞がCMISを介して唾液腺に移行した可能性が示唆される。一方で，IGA発現量の高い舌下腺において分泌関連因子の発現量が上昇しなかった要因は不明であり，今後さらなる研究が必要である。
４．要約

将来的なワクチンによる唾液抗体の制御を念頭に，その基盤情報となるウシの唾液腺における抗体分泌能の発達過程を検討した。はじめに子牛唾
液中の各クラスの抗体濃度を比較したところ，２
週齢以降ではIgAがIgGとIgMと比較して高濃度で検出された。IgAの成長に伴う濃度変化を検討
すると，１－６週齢にかけて唾液中濃度は徐々に増加しており，唾液腺のIgA分泌機能が発達する可能性が示された。次に，遺伝子発現解析により各唾液腺のIgA産性能と，唾液IgA分泌の発達機序について検討した。その結果，下顎腺および舌下腺においてIgAが高発現していた。また，下顎線ではPIGRとCCL28の発現量が子牛の成長に伴い上昇した。したがって，IgAの主要な分泌組織は下顎腺であり，子牛の成長に伴いIgA産生や分泌能が発達する可能性が示された。本研究より，
子牛唾液中の主要な抗体クラスはIgAであり，１

文献１）
 Cook, S. R., Maiti P. K., Chaves, A. V., Benchaar, C.,
Beauchemin, K. A., McAllister, T. A.：Avian（IgY）
anti-methanogen antibodies for reducing ruminal
methane production: In vitro assessment of theireffects, Aust. J. Exp. Agric., 48, 260～264, 2008.
２）
 Wedlock, D. N., Pedersen, G., Denis, M., Buddle, B.
M., Dey, D., Janssen, P. H.：Development of a
vaccine to mitigate greenhouse gas emissions inagriculture: vaccination of sheep with methanogenfractions induces antibodies that block methane
production in vitro, N. Z. Vet. J., 58, 29～36, 2010.
 Williams, Y. J., Popovski, S., Rea, S. M., Skillman, L.
３）
C., Toovey, A. F., Northwood, K. S., Wright, A. D.
G.：A vaccine against rumen methanogens canalter the composition of archaeal populations, Appl.
Environ. Microbiol., 75, 1860～1866, 2009.
 Zhang, L., Huang, X., Xue, B., Peng, Q., Wang, Z.,
４）
Yan, T., Wang, L.：Immunization against rumen
methanogenesis by vaccination with a newrecombinant protein, PLoS ONE, 10, e0140086,
2015.
５）
 Ahmann, J., Steinhoff-Wagner, J., Büscher, W.：
Determining Immunoglobulin Content of Bovine
Colostrum and Factors Affecting the Outcome: A
Review, Animals, 11, 3587, 2021.
 久馬忠，田中彰治，高橋政義，米内美晴：子牛の６）
唾液腺におけるIgA産生能の発達，日本畜産学会報，
57, 568～574, 1986.
 Sakaguchi, K., Yokota, H., Miyasho, T., Nakamura,
７）
K., Onaga, T., Koiwa, M., Matsuda, K., Okamoto, M.,
H i r a y a m a , K . , T a n i y a m a , H . ：P o l y m e r i cimmunoglobulin receptor expression and local
immunoglobulin A production in bovine sublingual,submandibular and parotid salivary glands, Vet. J.,
197, 291～296, 2013.
８）
 Meale, S. J., Li, S., Azevedo, P., Derakhshani, H.,
Plaizier, J. C., Khafipour, E., Steele, M. A.：
Development of ruminal and fecal microbiomes areaffected by weaning but not weaning strategy indairy calves, Front. Microbiol., 7, 582, 2016.

週齢以降から分泌量が上昇することが明らかに© The Ito Foundation

467

多機能性因子の合成を介した筋衛星細胞による自律的な筋肥大誘導機構の解釈を利用した
新プラットフォームの形成
The novel platform for the autonomous regulatory system of myogenic
hypertrophy by multi-functional modulators synthesized in satellite cells

鈴木

貴弘・前野

岳大・今給黎 耀・川崎 佑華・中田 后紀・
室田 大輝・中村 真子・辰巳 隆一（九州大学大学院農学研究院）

Takahiro Suzuki, Takahiro Maeno, Hikaru Imakyure, Yuka Kawasaki, Minori Nakada,
Daiki Murota, Mako Nakamura and Ryuichi Tatsumi（Research Faculty of Agriculture, Graduate School of Agriculture, Kyushu University）

Myogenic stem cells（satellite cells）are indispensable for skeletal muscle hypertrophy byforming nascent myofibers（myotubes）and fusing to existed myofibers. As they have thefunctional heterogeneities, one group of satellite cells may have a high capability to form
myotubes contributing to the meat production and the health sciences. While the mechanismsof myotubes formation are complicated with cell-cell communications in skeletal muscle, we
focus on the strong autonomous regulation systems by satellite cells. Satellite cells can
synthesize multi-potent modulators like semaphorins（Sema3A, 3D, and 3E）and netrins（netrin-1, -3, and -4）, originally found as classical neural axon guidance molecules, during the
myogenic differentiation phase. We have found that semaphorin 3A and netrin-1 synthesizedin satellite cells would have key roles to regulate myofiber types of myotubes. However, themyogenic significances of other semaphorins and netrins subtypes are still unclear．
This study examined whether Sema3E may regulate myotube formation in satellite cells.
Initially, the Sema3E expression profiles were analyzed in satellite cells isolated from the soleus
muscle（slow-twitch myofiber-abundant）and the extensor digitorum longus muscle（EDL;
fast-type abundant）.Both satellite cells were synthesized Sema3E during the initiation stage of
myogenic differentiation. Sema3E knockdown in EDL-derived satellite cells reduced theexpression levels of the myotube markers, while myogenic regulatory factors were not affected.
Furthermore, Sema3E knockdown also inhibited myotube formation. These data suggest thatsatellite cells synthesize Sema3E would promote their own fusion, stimulating the expression
levels of the muscle-specific myoblast fusion associated proteins．

１．目て，効率的な食肉生産技術の開発へ寄与できると的期待される。しかし，骨格筋細胞（細長い構造の動物（家畜や家禽）の骨格筋は食肉の主原料とために“筋線維”と示される）は最終分化しておなるため，１個体あたりの骨格筋量の増加によっり，自身で増殖することができないため，その数© The Ito Foundation

468

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

や容積を増加させることは困難である１）。一方で，イプの発現も確認しているが，それらの分化・融骨格筋には筋再生に重要な役割を担う筋衛星細胞

合能に対する生理機能については不明である。こ（衛星細胞）が局在している。衛星細胞は，筋線

れらの因子が，Sema3Aやnetrin-1と協調して遅維の基底膜と細胞膜の間隙に位置し ，普段は休筋型または速筋型といったいわゆる“筋タイプ”

止状態にある。筋線維の損傷，筋疾患や老化などの制御に関与する可能性も考えられるが，同時にに伴う筋萎縮が引き起こされた際には，活性化状細胞の分化・融合能を促進することも期待され態に入り３～５），増殖して筋芽細胞へと分化，細胞る。そこで，我々はSema3D，Sema3E，および同士で互いに融合して新生筋線維（筋管）を形成

netrin-4が衛星細胞による自律的な筋肥大を促す

したり，ダメージを受けた筋線維に融合すること

キーファクターとなるか検証している。本稿でで損傷部を修復する 。よって，衛星細胞は筋線

は，特にSema3Eに着目したアプローチについて

維数や容積を増加させるポテンシャルを持ってい報告をする。Sema3EはSema3Aとは異なる細胞るため，この能力を最大限に発揮することで効率

膜受容体を要求するため10），ユニークな生理機能的な筋肥大に貢献できると考えている。そのためを示す可能性が高いと考えたためである。まず，には，衛星細胞の分化や筋芽細胞の融合といった衛星細胞の培養系において分化誘導条件下での動態を制御するシステムの理解が必須である。こSema3Eの合成パターンを詳細に調べ，続いて発れまでも，筋再生過程における細胞の分化・融合

現抑制実験系における分化・融合能への影響を解能の制御に関する研究は展開されてきたが，その

析した。

２）

６）

多くが筋損傷を受けた際に筋内外の細胞や組織から産生される「増殖因子」や「サイトカイン」を

２．方法

メインに捉えたアプローチであった６）。本研究で2.1

は ，衛 星 細 胞 自 身 が 合 成 す る 多 機 能 性 因 子

本 研 究 で は ，８ 週 齢 の C57BL/6JJcl マ ウ ス（semaphorinおよびnetrinのサブタイプ）に着目（ジャクソンラボラトリーズジャパン社）雄個体

して，各因子がオートクライン，パラクライン様の骨格筋から単離した衛星細胞の培養系を使用し式で作用する「自律的な筋肥大システム」の構築た。本研究における動物実験（動物実験承認番と理解を目的としている。

号：Ａ21-039）は，関係法令や九州大学動物実験

これまでに著者らの研究グループでは，
semaphorinのサブタイプの１つsemaphorin 3A
が遅筋であるヒラメ筋の衛星細胞で多量に合成・分泌され ，遅筋型の筋管形成に寄与することを
７）

実験動物

規則ならびに九州大学動物実験規則実施細則に従った。
2 . 2 単一筋線維法を用いた衛星細胞の単離，培養報告した 。さらに最近では，速筋型筋線維優勢

本研究では，各文献を参考にして，骨格筋からの長趾伸筋を由来とする衛星細胞ではnetrinファ摘出した単一筋線維の培養中に，ディッシュ上にミリーのサブタイプnetrin-1が多量に合成され衛星細胞が遊走する性質を利用した「単一筋線維て，速筋型の筋管形成を促進することを明らかと法」による単離，培養方法を採用した11～14）。

８）した９）。なお我々は，衛星細胞の分化過程においまず，マウス後肢骨格筋（ヒラメ筋；soleus，てSema3AだけでなくSema3D，Sema3E，およ長 趾 伸 筋 ； extensor digitorum longus muscle

びnetrin-1に加えてnetrin-4といった他のサブタ［EDL］）を摘出し，37℃に温めたリン酸緩衝生© The Ito Foundation

多機能性因子の合成を介した筋衛星細胞による自律的な筋肥大誘導機構の解釈を利用した新プラットフォームの形成469

理食塩水（PBS）を用いて洗浄後，collagenase

ml Matrigelをダブルコートした24well poly-L-

type I（Worthington）を 濃 度 0.5 ％ と な る よ う

lysine coatedマルチプレート（IWAKI）に，１DMEM基礎培養液（Gibco）で希釈した酵素処理

wellあたり2.5ｘ10４cellsずつ播種し，24時間培養液に浸し，CO２ インキュベータ内（５％ CO２ ，し た 。 そ の 後 ， 分 化 誘 導 培 養 液 （５ ％ HS-

95％大気，37℃）で反応させた。なお，soleusは2.5

DMEM）に切り換えて，分化24時間または筋管時間，EDLは2.0時間で酵素反応を行った。同時に，形成が認められた分化120時間目まで培養した。

筋 線 維 の 付 着 を 防 ぐ た め に ウ マ 血 清（HS）でなお，本法を用いて単離した細胞は，増殖誘導コートしたディッシュを準備し，DMEMを加え培養液で24時間培養した際，衛星細胞マーカーてCO２ インキュベータ内で静置した。酵素反応

Pax７およびMyoDがそれぞれ95％以上陽性であ後，各骨格筋はheat polishした細口パスツールピ

ることを確認した（Maeno et al., 2023, Exp. Cell

ペットを用いて，HSコート済みディッシュに移Res．）。

して単一筋線維に分離されるまでトリチュレートに供試し，分離後１日CO２インキュベータ内で培

2 . 3 RNA干渉法を用いたSema3Eノックダウ
ン処理
Suzukiら（2021年）の方法に基づいて，上項2. 2

養した。
翌日，浮遊している間質細胞，神経，血管およにおける単離した衛星細胞を５％ HS-DMEMにび過収縮を起こした筋線維を含むデブリなどを取切り換えて分化誘導を開始するタイミングと同時

り除くため，単一筋線維をピックアップして，に，濃度40nMに調製したSema3E特異的なsiRNA

37℃に温めたDMEMを入れたディッシュに移動（stealth siRNAシリーズ［Stealth_964はSema3Eさせた。また，poly-L-lysineがプレコートされsiRNA①，Stealth_2657はSema3E siRNA②とした ６ well 培 養 プ レ ー ト（IWAKI）に １ mg/mlて使用］，Invitrogen）をsiRNA transfection

Matrigel（CORNING）をダブルコートし，2.5ng/

reagent（Screen FectTM，WAKO）を用いて，トml リ コ ン ビ ナ ン ト 線 維 芽 細 胞 増 殖 因 子 FGF-2

ランスフェクションし，Sema3E発現抑制のため（R&D systems）溶液を添加した30％ウシ胎児血のノックダウン処理を行った９）。なお，対照とし清（FBS）含有DMEMを，衛星細胞の増殖培養て濃度40nMのControl siRNA（AllStars Negative

液 （30 ％ FBS-DMEM with bFGF） と し て プ

Control siRNA, QIAGEN） を 同 様 に ト ラ ン ス

レートに加えてCO２ インキュベータ内で静置しフェクションした。

た。移動させた単一筋線維約50-60本を改めて

2 . 4 タンパク質の抽出およびWestern Blotting

ピックアップし，増殖培養液中に播種して３日間

培 養 細 胞 を PBS で 洗 浄 後 ，Laemmli sample

CO２ インキュベータ内で培養した。３日後，ピ

bufferでタンパク質を抽出した。サンプルは10％

ペットマンに装着したチップを用いて筋線維をプ

ポリアクリルアミドゲルによるSDS-PAGEに供レートから除去し，プレートに残った衛星細胞を試し，泳動後のゲルよりPVDFメンブレンにタン

約80％以上のコンフルエントになるまで増殖させパク質を転写した。転写後のメンブレンは，５％た。

（w/v）のスキムミルクを添加したtween 20含有

増 殖 さ せ た 衛 星 細 胞 を 0.05 ％ ト リ プ シ ン －トリス緩衝液により30分間ブロッキングし，免疫EDTA溶液（Gibco）を用いて剥離し，遠心分離

反応促進試薬（Can Get Signal, TOYOBO）で希にて回収してから増殖培養液を加えた。１mg/

釈した１次抗体溶液中で一晩インキュベーション© The Ito Foundation

470

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

した。メンブレンを洗浄後，同様に希釈したHRP様に希釈した蛍光標識２次抗体溶液で１時間

標識２次抗体溶液で１時間インキュベーションしインキュベーションした。その後，ProLongTMた。その後，ECL Western Blotting Reagents（GEDiamond Antifade Mountant with DAPI

Helth care）とメンブレンを反応させ，ケミルミ（Invitrogen）で封入し，蛍光フィルターキュー

イ メ ー ジ ン グ シ ス テ ム FUSION （Vilber-

ブを搭載した倒立顕微鏡DMI6000 B（Leica）を

Lourmat）を用いて化学発光検出を行った。

用いて観察した。

2.5

RNA抽出およびreal-time qRT-PCR

2.7

統計解析

培 養 細 胞 を PBS で 洗 浄 後 ，RNA 抽 出 試 薬

測定値は平均値±標準誤差で示した。フリー統（ISOGEN II，ニッポンジーン）により溶解し，

計ソフトEZR（Easy R）を用いて，各測定値かメーカー推奨のプロトコルに従ってtotal RNAをら得られたデータをTukeyの多重比較により有意抽出した。total RNAの濃度を50-100ng/μlに希差検定を行い，ｐ＜0.05をもって統計学的に有意釈してから，逆転写に供試して（ReverTra Aceであるとした。EZRはＲおよびＲコマンダーの機

qPCR RT Kit，TOYOBO），cDNAを作成した。

能を拡張した統計ソフトウェアであり，自治医科

作 製 し た cDNA を 含 む 逆 転 写 反 応 液 を 鋳 型と大学付属さいたま医療センターのホームページでし，SYBER Green assayを用いたreal-time

無償配布されている。

qRT-PCR （Light Cycler 96 system, Roche） に

３．結果と考察

よって定量的解析を行った。データの分析は，添付のソフトウェアを用いて行った。
2.6

3 . 1 衛 星 細 胞 の 分 化 誘 導 過 程 に お け る

培養細胞の蛍光免疫染色

Sema3E合成パターン

培養細胞をPBSで洗浄後，４％パラホルムアル

Sema3Eが衛星細胞（筋芽細胞）の分化・融合

デ ヒ ド で 固 定 し た 。固 定 し た 細 胞 は ，0.2 ％能に与える影響を検証するため，はじめにその詳

Triton X-100（Shigma-Aldrich）で 15 分 間 処 理

細な合成パターンをWestern Blottingを用いて調後，３％（w/v）の牛血清アルブミンを添加したべた（Fig.１）。soleusより単離した衛星細胞では，

tween 20含有PBSにより40分間ブロッキングし，

分化誘導24時間後にピークを迎え，48から120時

同ブロッキング液で希釈した１次抗体溶液中で一間目にかけて分化誘導開始時と同レベルの晩インキュベーションした。細胞を洗浄後，同

Sema3E合成量を示した。EDL由来の衛星細胞でWestern Blotting
Sema3E（86 kDa）
α-tubulin（55 kDa）

0

24 48 72

96 1200

24 48

soleus72

96 120 （h）

EDL

Fig. 1 Sema3E synthesis patterns in satellite cells during myogenic differentiation.

The proliferated soleus- and extensor digitorum longus（EDL）-derived satellite cell single-subcultures weremaintained in differentiation medium（DMEM supplemented with 5% horse serum, 0.5% gentamicin reagent, 1%
antibiotic-antimycotic solution）until 120 h. Sema3E protein expression level in the satellite cells during the
myogenic differentiation phase was detected with Western Blotting, standardized to α-tubulin expression level.

© The Ito Foundation

471

多機能性因子の合成を介した筋衛星細胞による自律的な筋肥大誘導機構の解釈を利用した新プラットフォームの形成

は ，分 化 誘 導 開 始 時 か ら 24 時 間 目 に か け て

Sema3Eの機能を解析するため，特異的siRNAト

Sema3Eの合成量が最大であり，その後徐々に減

ランスフェクションによるノックダウン処理を行少することが確認された。なお，マウス由来筋芽い，Sema3E発現抑制実験系における分化・融合細胞株C2C12を分化誘導した際のSema3Eの発現能の変化を調べた。本項では，EDLより単離しパターンについては過去に別の研究グループよりた衛星細胞を用いて検証作業を進めた。

報告があり，細胞での合成量は分化開始時にピー

Sema3Eの発現レベルがピークを迎える分化24

クを迎えること，ならびに細胞からの分泌量は分

時間目において，Sema3Eならびに筋管形成の制化誘導48時間目にピークを迎えて，その後減少す

御に深く関わる転写因子群myogenic regulatory

ることが分かっている 。細胞種や培養条件の違

factors（MyoD，myogenin）の発現量を調べた

いから，本研究で得られた結果と過去の知見は完（Fig.２）。２種の特異的siRNAトランスフェク

全に一致はしないが，Sema3Eは衛星細胞の分化

ションによって，効率的なSema3Eノックダウン

誘導初期に多量に合成されるという共通点が明らが確認された。MyoDならびにmyogeninの発現

か と な っ た 。よ っ て ，衛 星 細 胞 で 合 成 さ れ る

量は，Sema3E siRNA①のトランスフェクション

Sema3Eが分化誘導過程で生理機能を有する可能による変化は認められなかったが，siRNA②では性が高まった。

myogeninの有意な増加が認められた。つまり，

15）

3 . 2 Sema3Eノックダウン処理による衛星細Sema3Eは筋管の形成にはネガティブな作用を有することが示唆された。

胞の筋分化および筋管形成能の変化

続いて，衛星細胞（筋芽細胞）同士が融合する

分化誘導過程にある衛星細胞（筋芽細胞）でのTarget genes / HPRT (relative unit)

real-time RT-qPCR
Sema3E

2

MyoD

myogenin
＊＊

1.5

1

0.5

0

Control
siRNA

＊＊

＊＊

①

②

Sema3E siRNA

Control
siRNA

①

②

Sema3E siRNA

Control
siRNA

①

②

Sema3E siRNA

Fig. 2 Myogenic Regulatory Factors（MRFs）expression profiles following Sema3E knockdown treatment in satellite

cells at the early myogenic differentiation phase．

The single-subcultures of each satellite cell isolated from EDL muscle were proliferated for 24 h, transfected withSema3E-speific small-interfering RNAs（siRNAs）, and maintained in differentiation medium for 24 h. The mRNA
expression level of Sema3E, MyoD, and myogenin was evaluated by real-time RT-qPCR normalized tohypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase（HPRT）level. The bars depict the mean ± standard error ofmean（SEM）of three independent cultures by relative units, compared to control-siRNA-treated culture.
Significant differences from the mean of control-siRNA-treated cultures（the left-most open bar）at p<0.01 are
indicated by double asterisks, respectively．

© The Ito Foundation

472

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Target genes / HPRT (relative unit)

real-time RT-qPCR
Sema3E

1.2

embryonic MyHC

developmental MyHC

1
＊

0.8
＊＊

0.6

＊＊

0.4

＊

＊＊

0.2
0

Control
siRNA

①

②

Sema3E siRNA

Control
siRNA

①

②

Sema3E siRNA

Control
siRNA

①

②

Sema3E siRNA

Fig. 3 Myosin heavy chain（MyHC）isoforms expression levels following Sema3E expression knockdown in satellite

cells at the early myogenic differentiation phase．

As well as Figure 2, proliferated the single-subcultures of each satellite cell isolated from EDL muscle were

cultured in differentiation medium transfected with Sema3E-specific siRNAs for 120 h. The mRNA expression
level of Sema3E, embryonic MyHC, and developmental MyHC was evaluated by real-time RT-qPCR normalized to
HPRT level. The bars depict the mean ± SEM of three independent cultures by relative units, compared tocontrol-siRNA-treated culture. Significant differences from the mean of control culture（the left-most open bar）at
p<0.05 or p<0.01 is indicated by single or double asterisks, respectively．

ことで筋管の形成が進んだ状態にある分化

とんど確認できなかったため，明らかな筋管形成

120時間目まで，Sema3Eノックダウン処理を維能の低下が認められた。よって，Sema3Eは筋管持したサンプルを用いて，筋管マーカーとなる形成誘導，すなわち衛星細胞（筋芽細胞）同士のミ オ シ ン 重 鎖（myosin heavy chain ； MyHC）

融合を促進する機能を有することが認められた。

ア イ ソ フ ォ ー ム の embryonic MyHC な ら び に

本見解は，Sema3Eノックダウン処理を行った

developmental MyHC の 発 現 量 を 調 べ た（Fig.

分化24時間目でのMRFs，特にmyogeninの発現３）。本タイミングにおいても，Sema3Eのノッ

増加とは矛盾する可能性があるが，Sema3Eの制

クダウンが確認された。Sema3E siRNAトランス

御下にある因子はMRFsではなく，筋管形成に必

フ ェ ク シ ョ ン に よ っ て Control siRNA よ り も須とされる筋融合促進タンパク質のMyomakerや

embryonic MyHC の 発 現 量 は 有 意 に 減 少 し ，Myomixerなどをターゲットとしているのではな

siRNA②ではdevelopmental MyHCの発現量も有いかと予想している 16，17）。今後は，Sema3Eの特意に減少した。本タイミングでの結果は，先の結異的受容体であるplexin D１や，他の多機能性因果に基づく予想に反してSema3Eは筋管形成に必子Sema3Dおよびnetrin-4といった因子にも着目

須であることが示唆された。

したアプローチを展開する。各研究成果を通しそこで，総ミオシン重鎖（total MyHC）陽性て，衛星細胞が産生する多機能性因子を介した自な 筋 管 を ，蛍 光 免 疫 染 色 法 を 用 い て 検 出 し た

律的筋肥大システムのプラットフォームを形成（Fig.４）。本免疫染色像において，Sema3Eノッし，食肉生産現場への応用を目指したい。

クダウン処理によりtotal MyHC陽性の細胞がほ© The Ito Foundation

多機能性因子の合成を介した筋衛星細胞による自律的な筋肥大誘導機構の解釈を利用した新プラットフォームの形成

473

Immunocytochemistry
Sema3E siRNA ①

Sema3E siRNA ②

total MyHC / DAPI

Control siRNA

Fig. 4 Myotubes fusion would be regulated after Sema3E knockdown treatment．

As well as Figure 2 and 3, the single-subcultures of each satellite cell isolated from EDL muscle were grown inproliferation medium for 24 h, transfected with Sema3E-specific siRNAs in differentiation medium, and incubatedfor 120 h. Immunofluorescence microscopy for total myosin heavy chain（MyHC）（red）and DAPI（blue）at 120 h
after Sema3E knockdown shows myotubes containing all myofiber types and nuclei, respectively. The scale bar
represents 250μｍ．

４．要は衛星細胞が筋管を形成するために必須であると約推測できる。今後は，Sema3E特異的受容体にも効率的な食肉生産技術開発のためには，家畜や着目して，筋管形成に関わる分子メカニズムにつ家禽といった動物１個体あたりの骨格筋量を増加

いての検証を進める必要がある。同時に，他の多させる必要がある。骨格筋細胞（筋線維）の数や機能性因子の生理機能も明らかとして，衛星細胞容積の増加は困難であるが，組織特異的な幹細胞による自律的な筋肥大システムのプラットフォー

である筋衛星細胞（衛星細胞）の分化や筋芽細胞ム形成を目指す。

の融合能が高まることで，飼育時から出荷時まで
効率的に筋量が増加し，生産量の増大が可能となることを期待している。我々は，衛星細胞自身が産生する多機能性因子を介して，分化・融合能のポテンシャルを最大限に発揮する自律的筋肥大シ
ステムの解明を目指している。本研究では，多機能性因子の１つであるsemaphorin 3E（Sema3E）に着目して，分化誘導過程における衛星細胞での合成量プロファイル，ならびに発現抑制実験系にて衛星細胞（筋芽細胞）の分化・融合能の変化を調べた。Sema3Eは，分化誘導のごく初期段階で多量に合成され，その後低下する合成パターンであることを確認した。Sema3Eの発現抑制処理は，
筋分化の制御に関わる転写因子myogeninの発現量を増加させる傾向を示したが，筋管の形成すな
わち融合能の低下を起こした。よって，Sema3E

文献１）
 水野谷航：食肉の科学, 57, 7～17, 2016.
 Mauro, A.：J. Biophys. Biochem. Cytol., 9, 493～
２）495, 1961.
３）
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290, 2008.
４）
 Tatsumi, R.：Anim. Sci. J., 81, 11～20, 2010.
 Hara, M., Tabata, K., Suzuki, T., Do, M.-K. Q.,
５）
Mizunoya, W., Nakamura, M., Nishimura, S., Tabata,S., Ikeuchi, Y., Sunagawa, K., Anderson, J. E., Allen,
R. E., Tatsumi, R.：Am. J. Physiol. Cell Physiol.,
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７） Suzuki, T., Do, M.-K. Q., Sato, Y., Ojima, K., Hara,
M., Mizunoya, W., Nakamura, M., Furuse, M.,
Ikeuchi, Y., Anderson, J. E., Tatsumi, R.：Int. J.
Bichem. Cell Biol., 45, 476～482, 2013.
８）
 Tatsumi, R., Suzuki, T., Do, M.-K. Q., Ohya, Y.,
Anderson, J. E., Shibata, A., Kawaguchi, M., Ohya,
S., Ohtsubo, H., Mizunoya, W., Sawano, S., Komiya,Y., Ichitsubo, R., Ojima, K., Nishimatsu, S-I., Nohno,© The Ito Foundation

474

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

T., Ohsawa, Y., Sunada, Y., Nakamura, M., Furuse,
M., Ikeuchi, Y., Nishimura, T., Yagi, T., Allen, R.
E.：STEM CELLS, 35, 1815～1834, 2017.
９） Suzuki, T., Mori, A., Maeno, T., Arimatsu, R.,
Ichimura, E., Nishi, Y., Hisaeda, K., Yamaya, Y.,
Kobayashi, K., Nakamura, M., Tatsumi, R., Ojima, K.,
Nishimura, T.：Int. J. Mol. Sci., 22, 4499, 2021.
10） Alto, L. T., Terman J. R.：Methods Mol. Biol.,
1493, 1～25, 2017.
11） Rosenblatt, J. D., Parry, D. J., Partridge T. A.：
Differentiation, 60, 39～45, 1996.
12） Collins, C. A., Zammit, P. S.：J. Audet, W.L.
Stanford（Eds.）, Stem Cells Regen. Med., Humana
Press, 319～330, 2009.
13） Kitajima, Y., Ogawa, S., Ono, Y.：Methods Mol.

Biol., 1516, 183～193, 2016.
14） Oe, M., Ojima, K., Muroya, S.：Physiol. Genomics,
53, 69～83, 2021.
15） Henningsen, J., Rigbolt, K. T. G., Blagoev, B.,
Pedersen, B. K., Kratchmarova, I.：Mol. Cell.
Proteomics., 9, 2482～2496, 2010.
16） Millay, D. P., O’Rourke, J. R., Sutherland, L. B.,
Bezprozvannaya, S., Shelton, J. M., Bassel-Duby, R.,
Olson, E. N.：Nature, 499, 301～305, 2013.
17） Bi, P., Ranirez-Martinez, A., Li, H., Cannavino, J.,
McAnally, J. R., Shelton, J. M., Sanchez-Ortiz, E.,
Bassel-Duby, R., Olson, E. N.：Science, 356, 323～
327, 2017.

© The Ito Foundation

475

食肉の複素誘電応答に基づく肉質評価技術の開発
Meat quality evaluation based on complex dielectric response

村

松

大

陸

（電気通信大学大学院情報理工学研究科）

Dairoku Muramatsu（Graduate School of Informatics and Engineering, The University of Electro-Communications）

Commercial meats are labeled with information such as place of origin, species, and part ofthe meat, and this information is used as a criterion for consumers when making purchases.
However, detailed information on meat “palatability” such as fat content, texture, and flavor isgenerally not indicated. To analyze such information on meat quality, sensory and physical/
chemical tests by evaluators with special identification abilities are required, which are costly
and time-consuming. Furthermore, these analytical methods require sample preparation andsolution extraction, making it difficult to analyze all of the various meat qualities obtained froma single animal. It is also important to analyze meat quality in its final commercial state, since
texture and flavor are greatly affected by enzymatic self-digestion, or aging, that occurs after
rigor mortis. In this study, we focused on the fact that the electrical constants of meat dependon the meat quality, and conducted a basic study to develop a simple, rapid, and nondestructive
meat quality evaluation technique based on the electromagnetic response to electromagnetic
waves in the intermediate frequency range. In this study, we focused on the fact that theelectrical constants of meat depend on meat quality, and aimed to develop a meat quality
evaluation technique based on the electromagnetic response to electromagnetic waves in theintermediate frequency band. As a basic study, a method for controlling/measuring meat
samples and a probe structure effective for evaluating meat quality based on electromagnetic
response were investigated. As a result, it was confirmed that the developed multi-channel
measurement system for the meat aging process can measure the electromagnetic response ofmeat during the aging process. In addition, the system was used to measure theelectromagnetic response of beef rounds. The characteristics of the proposed probe structure
were discussed by measuring changes in bioimpedance over time using two types of samples．

１．目

感，風味といった食肉の「おいしさ」に関係する的詳細な情報は表示されていないのが一般的であ市販の食肉には，原産地，畜種，部位，消費期

る。これらの肉質に関する情報を分析するために限などが表示されており，消費者が購入する際のは，特殊な識別能力を持った評価者による官能検

重要な基準となっている。しかし，脂肪交雑，食査や，大規模な装置を用いた理化学検査が必要で© The Ito Foundation

476

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

あり，多大なコストと時間を要する。さらに，こる。このように食肉の品質や鮮度を電気的に評価

れらの分析手法はサンプルの調理や溶液抽出が必する試みは一定の注目を集めているが，用いられ要な破壊検査であり，１頭の個体から得られるさているのはインピーダンスの「大きさ」という一

まざまな肉質の食肉をすべて分析することはきわ次元量であり，脂肪量や水分量といった限定されめて困難である。また，食感や風味は死後硬直後たパラメータの評価にとどまっているのが現状でに生じる肉内部の酵素による自己消化，すなわちある。一方，食肉ではなく人体組織の複素誘電特熟成により大きく変化するため，熟成を経て最終性を再現する電磁ファントムの検討は，医療機器

的に市販される状態で肉質を分析することも重要

や通信システム開発の分野で多数の例があり，著となる。本研究では，食肉の電気定数が脂肪交雑者らも長年取り組んでいる８）。ただし，従来ファや熟成の進行状況といった肉質に依存することにントムが再現するのは生体，すなわち生きている

着目し，中間周波数（kHz～MHz）帯の電磁波に組織の複素誘電特性であり，と殺後に時間が経過

対する電磁応答を評価基準とした簡便・迅速・非して細胞構造の破壊が進んだ食肉とは異なる特性

破壊的な肉質評価技術の開発を目指す。具体的にを持つと予想される。また，従来ファントム，特はFig.１に示すように，食肉表面に接触や刺突しに寒天主材の高含水ゲルファントムなどは，測定たプローブから電磁波を肉内部に入力する。脂肪直前に試薬を混合・成形して作製し，保水量の変含有量や熟成の進行に伴う保水量の変化に応じて化などに起因する電気定数の変化を嫌って実験後

食肉の電気定数も変化するため，肉質状態は電磁には速やかに廃棄する場合が多い。このため，食応答（例えばバイオインピーダンスの変化）とし肉の熟成過程を評価する際に必要となる適正な管て現れると予想される。この応答をプローブで検理方法や経時的な特性変化の測定方法も確立され出し肉質を推定・評価する。

ていない。このように，食肉と電磁波の相互作用

食肉の品質や鮮度を工学的手法で評価する試み
は国内外に多数存在するの品質評価への応用は一定の期待と基盤が存在す。特に本研究と関連る一方，研究分野や産業手法としては未開拓といの深いインピーダンスに基づく方法では，牛肉のえる。このため本研究では，（１）対象となる食品種と部位を特定する試み ，カット肉の脂肪量

肉サンプルの管理／測定方法，（２）電磁応答に

推定 ，肉牛の脂肪交雑値推定 ，筋線維の方向基づく食肉品質評価に有効なプローブ構造，の基を考慮したテクスチャ（食感）推定 ，電気定数

礎的な項目に特に注目して検討を行った。

１，２）

３）

４）

５）

６）

測定による食肉の鮮度評価７），などが行われていMeasurement device
Measurement probe

Electromagnetic response
based on meat quality
Fig. 1 Meat quality evaluation based on electromagnetic response© The Ito Foundation

食肉の複素誘電応答に基づく肉質評価技術の開発

磁応答のうち，規模の小さな装置でも比較的容易

法

２．方

477

に測定できるバイオインピーダンスを評価パラ

本研究では，熟成に適した温度や湿度，腐敗をメータとして採用した。バイオインピーダンスの防ぐ適切な衛生状態などが保たれた管理環境と，測定にはインピーダンスアナライザ（Keysight，

熟成の進行に伴う電磁応答特性を長期間かつ安定

E4990A）を用いる。本研究では，より多角的か的に評価できる環境を両立することが必須であつ詳細に提案手法の評価を行えるように，「複数る。まず食肉の熟成には，骨つき枝肉や塊肉のまの異なる種類の食肉を」「複数の異なる構造のプ

ま温湿度を管理した庫内で熟成を進めるドライエ

ローブで」「同時に」「長期間安定して」評価可能

イジングと，細かく分割した食肉を真空パックやなシステムを構築した。前述した熟成庫と測定機

脱水シートに包み外気から遮断して熟成を進める材を統合した食肉熟成過程の多チャンネル測定シ

ウェットエイジングの方法がある。２つの方法を

ステムをFig.２に示す。本測定システムは，熟成それぞれ試し，熟成の進行が速いこと，プローブ庫，無線温湿度計，プローブ，同軸切替装置，イの装着が容易なこと，そして産業的な食肉熟成に

ンピーダンスアナライザで構成されている。熟成

多く用いられることなどを考慮し，専用の熟成庫

庫内に配置された食肉には複数の異なるプローブ（Landig＋ Lava GmbH&Co.KG, DRY AGER

（詳細は後述）が取り付けられており，各プロー

DX500P）を用いたドライエイジングを本研究でブは同軸切替装置を介してインピーダンスアナラ

は採用した。本熟成庫は熟成に適した温度１～

イザに接続されている。同軸切替装置はプローブ

３℃，湿度60～80％程度を維持可能で，活性炭側が８チャネルあり，いずれのチャネルをインフィルターUVC滅菌システムにより庫内の有害ピーダンスアナライザに接続するかをスイッチでな細菌を滅菌して衛生状態を保つことが可能であ容易に切り替えることができる。これにより，測る。また，庫内のトレイ位置や配置方法（トレイ

定対象の食肉やプローブの種類を変更するたびにに置く，ハンガーで吊す）は柔軟に変更可能であ

熟成庫内から食肉サンプルを取り出しプローブのり，後述する測定機器やプローブを容易に食肉に脱着を行う必要がなくなり，電気的に安定した測接続できる。

定が可能となる。また，本同軸切替装置の内部回

次に電磁応答の測定システムについて述べる。

路は単純なスイッチやリレーで接続有無を切り替

本研究では，電磁波の透過／反射の度合いを表す

えているわけではなく，接続チャネルに対してはSパラメータや複素誘電率といったさまざまな電

インピーダンス整合を維持して伝送路における不Battery

Controller
Coaxial switches

Impedance
analyzer
Controller

Aging fridge
Fig. 2 Multi-channel measurement system for aging process© The Ito Foundation

478

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

要な反射を防いでいる。接続時の入出力VSWRは基材として表面をAuメッキ処理することで電極1.3以下であり，本同軸切替装置がインピーダンを構成した。電極は各８×24mm２の矩形形状で，ス測定に与える影響はきわめて微小と考えられ８mmの間隔で配置した。両電極は同軸コネクタ

る。さらに，非接続チャネルはすべて内部終端回の内外導体にそれぞれ接続されている。本電極は路に接続される仕様としており，非測定チャネル

容易に屈曲させることができ，食肉のさまざまなからの外乱を抑制する効果がある。加えて，熟成

部位に密着して配置可能である。また，使用後は庫の扉開閉も不要となるため，開閉時のケーブル

表面を洗浄することで繰り返し使用も可能であの位置ズレや庫内温湿度の変動も極限まで抑制する。穿刺型セミリジッド同軸電極は，食肉に突きることができる。測定期間中の温湿度を１分ごと刺すことで内部品質を安定して計測することを目に測定し2.4GHz帯無線でサーバに送信し記録し的に開発した。内導体は２mm，外導体は10mm

た結果，きわめて安定した庫内環境を実現していの長さで，内外導体間には２mmの誘電体を残しることを確認している。

てある。
開発した２種類のプローブ構造を評価するた

３．結果と考察め，実際の食肉サンプルおよび先に述べた食肉熟

本研究では，提案法におけるバイオインピーダ

成過程の多チャンネル測定システムを用いて食肉ンス測定に有効なプローブとして，Fig. 3（ａ）にのバイオインピーダンス測定を行った。食肉サン

示す表面貼付型フレキシブル電極と，（ｂ）に示す

プルをFig. 4（ａ）に，実験の様子を（ｂ）に示す。

穿刺型セミリジッド同軸電極の，２種類の構造に食肉部位としては容易に入手が可能な牛もも肉ブ

ついて検討した。表面貼付型フレキシブル電極はロックを選択し，赤身が多い豪州産牛もも肉と適ポリイミド素材を基板とし，基板上に圧延Cuを

度な脂肪交雑がある和牛もも肉の２種類を用い

（a）

（b）

Fig. 3 （a）Surface-applied type flexible electrode （b）Puncture-type semi-rigid coaxial electrode© The Ito Foundation

食肉の複素誘電応答に基づく肉質評価技術の開発

479

（a）

Australian beef round

Japanese beef round

Coaxial switches
Aging fridge
Impedance analyzer（b）Beef sample

Fig. 4 （a）Meat samples（Australian beef round and Japanese beef round）
（b）
Experiments using the developed measurement system and probes

た。面貼付型フレキシブル電極は初期配置からず電極で観測されるが，今回の測定では表面貼付型

れないように，表面をパラフィルムで覆い固定しフレキシブル電極および穿刺型セミリジッド同軸た。いずれのサンプルも60×60×100mm のブ

電極の両方で同様の短期的なインピーダンス増加

ロックとなるように測定開始前にトリミングをが観測された。食肉品質の評価を正確に行うため行った。食肉サンプルのバイオインピーダンスのには，電極装着後に電極―境界面状態が安定する

10MHzにおける測定結果をFig.５に示す。上段はまで一定時間待つ，あるいは境界面状態の変動を

バイオインピーダンス測定値そのままの値とし予測して電磁応答特性を評価する必要があると考て，下段はバイオインピーダンスを各プローブおえられる。次に，食肉サンプルごとのインピーダ

よび食肉の測定開始時点のインピーダンスで規格

ンス変化について考察する。まず，豪州産牛もも化した値として示した。Fig.５から分かるように，

肉のインピーダンスは和牛もも肉に比較してバイいずれの食肉サンプルおよびプローブ使用の場合

オインピーダンスは小さな値となった。これは両でも，測定開始直後はバイオインピーダンスの実

畜種の脂肪交雑の違いに影響されており，脂肪交部と虚部はともに増加することが分かった。この雑が小さい赤身の肉ほど導電率が大きく，インインピーダンスの変動は数時間という短時間の間

ピーダンスが小さくなったと考えられる。次にプに生じているため，肉内部の酵素による自己消

ローブごとのインピーダンス変化について考察す化，すなわち熟成の影響とは考えにくく，プロー

る。同一の食肉サンプルを用いた場合は，穿刺型

ブと食肉の境界面状態の変化による影響と考えら

セミリジッド同軸電極に比較して表面貼付型フレれる。このような変化は一般に接触面積の大きな

キシブル電極のほうが小さなインピーダンスを示

３© The Ito Foundation

480

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

1.5
Re（Zin）JP-Cax.

Bioimpedance Zin［kΩ］

1.0

Re（Zin）OG-Cax.
0.5

Re（Zin）JP-Flx.

Re（Zin）OG-Flx.

Im（Zin）OG-Flx.

0.0
Im（Zin）JP-Flx.

－0.5

－1.0

Im（Zin）JP-Cax.

Im（Zin）OG-Cax.

1

2
Day

3

1.6

Normalized bioimpedanceIm（Zin）JP-Cax.

1.4
Im（Zin）OG-Flx. Im（Zin）JP-Flx.
Im（Zin）OG-Cax.
1.2

1.0

Re（Zin）JP-Cax.

Re（Zin）JP-Flx.

Re（Zin）OG-Cax.

1

Re（Zin）OG-Flx.

2
Day

3

Fig. 5 Measure bioimpedance of meat samples（top：raw value, bottom：normalized value）

している。これは表面貼付型フレキシブル電極が応じて詳細な構造寸法を調整する予定である。ま

各８×24mm の矩形形状で比較的接触面積が大た，熟成開始から１週間程度を過ぎると食肉の保きいのに対し，穿刺型セミリジッド同軸電極は内水量が低下し，プローブ電極と食肉サンプルの間

導体の接触部分が２mmしかないことが理由と考に空隙が生じる場合があることを確認している。

えられる。数値電磁界解析により表面貼付型フレ

このような空隙が生じると食肉品質の評価に影響

キシブル電極および赤身肉をモデル化し電極入力を与えることから，プローブの固定法についてもインピーダンスを計算した結果，実験で得られたより詳細な検討が必要であると考えられる。

２

値50Ω程度とほぼ一致することを確認している。
現状ではいずれのプローブ構造がより食肉の品質を正確に評価できるかは検討段階であり，必要に４．要

約

本研究では，食肉の電気定数が肉質に依存する© The Ito Foundation

食肉の複素誘電応答に基づく肉質評価技術の開発ことに着目し，中間周波数帯の電磁波に対する電磁応答を評価基準とした肉質評価技術の開発を目指した。基礎的な検討として，食肉サンプルの管理／測定方法および電磁応答に基づく食肉品質評
価に有効なプローブ構造について検討を行った。
その結果，開発した食肉熟成過程の多チャンネル
測定システムで食肉の熟成過程の電磁応答を測定可能なことを確認した。さらに。豪州産牛もも肉と和牛もも肉の２種類のサンプルを用いてバイオ
インピーダンスの経時変化を測定し，提案プロー
ブ構造の特徴について考察した。
文献１） Liyun, Z., et al.：Quality Evaluation of Meat Cuts,
Computer Vision Technology for Food Quality
Evaluation, 111～138, 2008．

481

２）
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 谷原礼諭他：生体電気インピーダンス解析による
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６）
測定による牛肉テクスチャの非破壊推定，日本畜産学会報，88，2017．
７）
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８）
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Communication Considering Tissue Structure of
Human Arm, Trans. JIEP, 17（1）,63～68, 2014．

© The Ito Foundation

482

プラズマを用いた食中毒誘発因子の分解・不活化技術の開発
Development of plasma technology for degrading and inactivating thecausative agents of foodborne disease

作

道

章

一

（岡山理科大学獣医学部獣医学科）

Akikazu Sakudo（School of Veterinary Medicine, Okayama University of Science）

We previously demonstrated that an atmospheric pressure dielectric barrier discharge（APDBD）plasma generated by a roller conveyer plasma instrument is effective for killing
bacteria and fungi in foods. In the present study, we have further investigated whether theroller conveyer plasma instrument can be used to degrade toxins of foodborne bacterial
pathogens, including Staphylococcus aureus enterotoxin B and Bacillus cereus cereulide. Eachtoxin was spotted on an aluminum plate, allowed to dry, and then treated with APDBD plasma
applied by a roller conveyer plasma instrument for 0, 15, and 30 min. Enzyme-linked
immunosorbent assay showed that the amount of enterotoxin B was reduced in a timedependent manner. In addition, a latex agglutination test using anti-enterotoxin B antibodycoated latex beads supported the degradation of enterotoxin B by APDBD plasma. Liquid
chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）analysis further showed that theamount of cereulide decreased after treatment with APDBD plasma. Taken together, thesefindings suggest that the foodborne toxins can be degraded by APDBD plasma treatmentusing a roller conveyer plasma instrument. Therefore, this plasma method may be potentially
useful for eliminating toxins from foods or contaminated materials．

１．目（Staphylococcus aureus）はエンテロトキシンを的産生し，食中毒を引き起こす。これらセレウリド

食中毒は多くの場合，ウイルスや細菌などに汚やエンテロトキシンは，加熱や酸，アルカリ，消染した食品を摂取することにより生じるが，微生化酵素で分解されず加熱調理しても分解しない。

物が産生する毒素を介して食中毒を引き起こすこ

このことから，食中毒を防ぐには，菌だけでなく，ともある 。例えば，穀類やその加工品（焼飯類，これらの食中毒誘発物質も無害化させることが必

米飯類，麺類）が汚染することの多いセレウス菌

要である。

１）

（Bacillus cereus）はセレウリドを産生して嘔吐

最近，申請者らは，物理的処理技術の一つであを伴う食中毒を引き起こす。一方，デンプン質のるプラズマを用いて，さまざまな細菌やカビの殺多い食品で増殖しやすい黄色ブドウ球菌菌に成功した２～５）。さらに，ローラーコンベア型© The Ito Foundation

プラズマを用いた食中毒誘発因子の分解・不活化技術の開発

483

プラズマ装置と名付けた果実の殺菌に適した独自

2.2のプラズマ装置を用いて細菌やカビの不活化が可

黄色ブドウ球菌Ｓ６株よりSchantzらの方法８）能であることを明らかにした６，７）。

毒素でイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製さそこで本研究では，ローラーコンベア型プラズ

れ た 0.5mg/ml エ ン テ ロ ト キ シ ン Ｂ （LIST

マ装置を用いてプラズマ処理によりセレウリドや

BIOLOGICAL LABORATORIES INC, Productエンテロトキシンの分解が可能かについて解析を#122）を用いた。また，和光純薬より入手し

行った。
２．方

たセレウリド標準液（50μg/ml）も用いた。
2 . 3 Enzyme-linked immunosorbent assay

法（ELISA）による黄色ブドウ球菌エンテロ

2 . 1 ローラーコンベア型プラズマ装置を用いたプラズマ処理

トキシンの定量
RIDASCREENⓇ SET Total（CAT No. R4105，

本研究では，以前に報告したローラーコンベア

r-Biopharm）を用いて，インストラクションに型プラズマ装置を用いてプラズマ処理を行っ従いエンテロトキシンの定量を行った。吸光度はた 。30mmの直径のプラスチック製の棒のまわ

マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー（Model680 ，Bio-

りをアルミで包み，さらに，その上を0.5mmの厚Rad）を用いて450nm（参照波長630nm）を測定

さのシリコンシートで覆った構造を持つローラー

し，希釈したエンテロトキシンを用いて作成したを電極として50mm間隔で高電圧電極と接地電極検量線から吸光度を指標に濃度を算出した。なとして交互に配置した（Fig.１）。この電極の間

お，本ELISAキットはエンテロトキシンＡ，Ｂ，にはVpp（ピークピーク値）10kV，周波数10kHz

Ｃ，Ｄ，Ｅのいずれも検出できる。

６）（LHV-10AC，ロジー電子）の高電圧電源を接続

2 . 4 ラテックス凝集アッセイによる黄色ブド
ウ球菌エンテロトキシンの解析

し ， 大 気 圧 誘 電 体 バ リ ア 放 電 （APDBD ：Atmospheric Pressure Dielectric barrier

SET-RPLA「生研」（デンカ生研）を用いて，

discharge）による空気由来のプラズマを発生さ

インストラクションに従いＶ底マイクロプレート

せた。毒素サンプルは0.3mmの厚さのアルミニウ

での凝集反応を指標にエンテロトキシンの検出を

ム板上に20μｌ滴下乾燥した。そして，アルミニ

行った。検出には抗ブドウ球菌エンテロトキシン

ウム板を高電圧電極と接地電極の間に設置してプ

Ｂ抗体感作ラテックスを用い，コントロールとし

ラズマ処理を行った。

て対照ラテックスを用いた。

A

B

Aluminum sheet
Plastic rod
Silicon sheet

Fig. 1 Schematic showing atmospheric pressure dielectric barrier discharge（APDBD）plasma treatment of bacterial

toxins.（A）Toxins are applied to an aluminum plate and subjected to APDBD treatment using a roller conveyer
plasma instrument consisting of high-voltage electrodes and earth electrodes.（B）Both electrodes comprise aplastic rod（30 mm diameter）covered with an aluminum sheet（0.02 mm thickness）and a silicon sheet（0.5 mm
thickness）.A high-voltage-power supply [10 kHz, 10 kV（Vpeak to peak）] is used to generate the APDBD plasma７）．

© The Ito Foundation

484

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

2 . 5 液体クロマトグラフ―タンデム型質量分析

2.6

統計解析

計（LC-MS/MS）によるセレウリドの測定

GraphPad Prism 7（GraphPad Software）を用い希釈した検量線用標準溶液２μｌをLC-MS/てNon-repeated ANOVA followed by Bonferroni

MSに注入し，得られたセレウリドのピーク面積

correctionにより有意差検定を行った。なお，数から検量線を作成した。そして，同様に試料溶液

値は平均 ± SEM（standard error of the mean）

２μｌをLC-MS/MSへ注入し，検量線との面積で表示した。

の比較から，試料溶液中のセレウリドの濃度を算出した。なお，LC-MS/MSの測定条件は下記の３．結果と考察
まず，プラズマ処理が黄色ブドウ球菌のエンテとおりである。
LC部：LC-30AD（島津製作所）

ロトキシンに与える影響を明らかにするために，

MS部：Triple Quad 6500＋（AB SCIEX Pte.

黄色ブドウ球菌Ｓ６株より精製して得られたエン
テロトキシンＢに対してローラーコンベア型プラ

Ltd．
）
カラム：Mightysil RP-18 GP，φ2mmX50mm

ズマ装置を用いてAPDBDプラズマ処理を行った。そうして得られたエンテロトキシンＢの量を（関東化学）
カラム温度：40℃

ELISAにより定量した結果，プラズマ処理前（０

移動相：Ａ 液（２mmol/lギ酸アンモニウム溶min）のエンテロトキシン量は62.67±3.46μg/ml

液およびギ酸の混合溶液（1000：１）（0min）であったのに対し，15minのプラズマ処

Ｂ 液（メタノールおよび0.2mol/lギ酸

理により19.17±1.74μg/ml，30minのプラズマ処

アンモニウム溶液の混合溶液（990：10）

理では1.43±0.11μg/mlへと有意にエンテロトキ

グラジエント：Ａ 液 お よ び Ｂ 液 の 混 合 溶 液

シン量が減少した（Fig.２）。
さらに，ラテックス凝集アッセイで凝集価を測（20：80）０min
Ａ 液 お よ び Ｂ 液 の 混 合 溶 液

定したところ，０minでは２ 11 以上であったもの（10：90）０min→10minが30min処理では２０以下であり，０minと比較し

Ａ 液 お よ び Ｂ 液 の 混 合 溶 液て顕著な減少が観察された。

（10：90）10min→16min

次に，プラズマ処理がセレウリドに与える影響

流量：0.2ml/minを調べた。ローラーコンベア型プラズマ装置によ注入量：２μｌ

るAPDBD処理後のセレウリドをLC-MS/MSで解イオン化法：ESI（正イオン検出モード）

析した。セレウリド標準液で見られたピーク位置

イオン化温度：450℃と 質 量 分 析（m/z 1171 → 357）で セ レ ウ リ ド の

イオン化電圧：5500Ｖ

ピークを同定した。そのピーク強度をクロマトグ

DP電圧：166Ｖ

ラムで比較したところ，APDBDプラズマ処理にコリジョンガス：窒素

より，顕著にセレウリドのピークが低下すること

セレウリド測定のための設定質量（m/z）およが明らかとなった（Fig.３）。また，ピークの面

びコリジョンエネルギー（CE）：1171→357（定積を指標に半定量した結果，０minでは0.14μg/量イオン）および91eV；1171→314（確認イオ

mlであったものが，15min処理および30minではン）および97eV

検出限界以下であった。

© The Ito Foundation

Enterotoxin type B
from Staphylococcus aureus［µg/ml］

プラズマを用いた食中毒誘発因子の分解・不活化技術の開発

485

80
60
40
＊＊
20
＊＊
0

0min

15min

30min

Fig. 2 Enterotoxin type B derived from Staphylococcus aureus was subjected to APDBD treatment for 0, 15, and 30

min using a roller conveyer plasma instrument. The amount of enterotoxin type B in the recovered samples was
subsequently measured by enzyme-linked immunosorbent assay．＊＊ｐ＜0.01（vs 0 min）．

20000
18000

0 min

Intensity［cps］

16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0

1

2

3

4

5

6

4

5

6

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

7

8

9

10

11

12

13

14

15

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Time［min］

20000
18000

Intensity［cps］

16000

15 min

14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0

1

2

3

Time［min］

20000
18000

Intensity［cps］

16000

30 min

14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0

1

2

3

Time［min］

Fig. 3 Cereulide derived from Bacillus cereus was subjected to treatment with APDBD plasma for 0, 15, and 30 min

using a roller conveyer plasma instrument. The recovered samples were analyzed by liquid chromatographytandem mass spectrometry and the chromatograms are shown. Peaks due to cereulide（assigned to m/z
1171→357）are indicated（▼）．X-axis, retention time ; Y-axis, signal intensity ; Cps, counts per second．

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486

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

本研究により，APDBDプラズマ処理後のエン
テロトキシンおよびセレウリドを測定した結果，

謝辞

プラズマにより経時的に分解できることが示唆さ

本研究を進めるにあたり，ご協力いただきましれる。以前の著者らの研究で窒素ガスプラズマ処

た独立行政法人国立高等専門学校機構佐世保工業理によりカビ毒のアフラトキシン や細菌毒素の高等専門学校の柳生義人先生に深く感謝いたしま

志賀毒素

す。

９）

が分解できることが明らかになってお10）り，これらの結果を総合すると，プラズマ処理は広範な毒素に対して分解効果を持つものと考えられる。これまでの研究でプラズマ発生時にラジカ
ル等の活性種が発生することが明らかとなっていることから，活性種が酸化ストレス作用をもたらして毒素を分解したものと推測される。今後詳細に解析を進め，毒素の分解メカニズムが明確化することで，さらなる分解効果の効率化も可能になり，プラズマ殺菌の実用化が促進されるものと期
待される。
４．要

約

これまでに，著者らはローラーコンベア型プラズマ装置を用いて，大気圧誘電体バリア放電プラ
ズマ処理による細菌やカビの殺菌効果を確認している。本研究では，それらの研究を発展させ，プ
ラズマ処理に毒素の分解効果があるのかについて解析した。その結果，黄色ブドウ球菌エンテロト
キシンやセレウス菌が産生するセレウリドがプラズマ処理により減少することが分かった。以前の研究で窒素ガスプラズマ処理によりカビ毒のアフ
ラトキシンが分解できることを著者らは明らかにしており，今回の結果はこれに加え，プラズマ処理がエンテロトキシンやセレウリドも分解できることを示唆している。以上の結果より，プラズマ
殺菌は広範な毒素の分解に効果的な高度消毒技術であることが明らかとなった。

文献１）
 小塚諭：イラスト食品の安全性（第４版），東京
教学社，2021．
 Shintani, H., Sakudo, A.：Gas Plasma Sterilization２）
in Microbiology: Theory, Applications, Pitfalls and
New Perspectives, Caister Academic Press, Poole,UK, 2016．
 Sakudo, A., Shintani, H.：Sterilization and３）disinfection by plasma: Sterilization mechanisms,
biological and medical applications, NOVA Science
Publishers, Hauppauge, New York, 2011．
 作道章一，山城梨沙，三沢達也：薬剤耐性菌のガ
４）スプラズマ殺菌効果とメカニズム解析，平成29年度
食肉に関する助成研究調査成果報告書，公益財団法人伊藤記念財団，36，3～7，2018．
 作道章一，三沢達也：薬剤耐性菌のガスプラズマ
５）
殺菌機構解明に向けた分子論的アプローチ，平成30
年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，公益財団法人伊藤記念財団，37，118～122，2019．
６）
 Sakudo, A., Yagyu, Y.：Application of a roller
conveyor type plasma disinfection device with
fungus-contaminated citrus fruits, AMB Express,
11（1）,16, 2021．
７）
 Toyokawa, Y., Yagyu, Y., Misawa, T., Sakudo,
A.：A new roller conveyer system of non-thermal
gas plasma as a potential control measure of plant
pathogenic bacteria in primary food production,
Food Control, 72, 62～72, 2017．
８）
 Schantz, E. J., Roessler, W. G., Wagman, J., Spero,
L., Dunnery, D. A., Bergdoll, M. S.：Purification of
Staphylococcal Enterotoxin B, Biochemistry, 4（6）,1011～1016, 1965．
９） Sakudo, A., Toyokawa, Y., Misawa, T., Imanishi,
Y.：Degradation and detoxification of aflatoxin B１
using nitrogen gas plasma generated by a staticinduction thyristor as a pulsed power supply, FoodControl, 73, 619～626, 2017．
10） Sakudo, A., Imanishi, Y.：Degradation andinactivation of Shiga toxins by nitrogen gas plasma,
AMB Express, 7（1）,77, 2017．

© The Ito Foundation

487

国産ジビエの衛生管理に資する迅速簡便検査法の開発
Development of rapid detection methods for game meat hygiene

山﨑朗子１・鎌田洋一２・中曽譲３・彦野

弘一４・峯岸恭孝５（１岩手大学農学部共同獣医学科，２千里金蘭大学，３株式会社ファスマック，４帝京科学大学，５株式会社ニッポンジーン）

Akiko Yamazaki１，Yoichi Kamata２，Yuzuru Nakaso３，Koichi Hikono４and Yasutaka Minegishi５（１Cooperative Department of Veterinary Medicine, Iwate University，２Senri Kinran University，３Fasmac Co., Ltd.，
４Teikyo University of Science，５NIPPON GENE Co., Ltd．
）

In this study, we conducted a field test using a simple rapid test method for game meat.
This test method is a fluorescent gene amplification method that can be performed in the field
and uses a portable detector based on the LAMP method. E. coli, Salmonella, andCampylobacter jejuni were targeted in this study. Homogenized meat samples of Sika deer
from Hokkaido, Mie, and Nagasaki prefectures, which were processed for personal consumtion
by disassembly methods that did not follow the guidelines, were used as samples, mixed withgene amplification reagents, and then detected under reaction conditions at 65℃ for 25
minutes. The results showed that all three bacteria were detected to the same extent in all
three prefectures. Although background disturbance was observed in some tests andreconfirmation was necessary to determine the detection of the target pathogen, compared toconventional genetic testing methods, such as PCR, the detection time was as short as 25
minutes, a thermal cycler was not necessary because genes could be amplified by maintaining
a single temperature. The results also showed that confirmation by electrophoresis was notnecessary. Based on these findings, NiGii8 is considered to be a testing method and equipmentthat can be well used at game meat dismantling sites．

１．目

らの検査については，専門機関等に外注されてい的るため，受検に対するコストの発生と検査結果が昨今，我が国では野生動物による農林被害対策

出るまでに数日間の日数を要する。そこで本研究として捕獲したシカやイノシシの肉を，ジビエとでは，食肉利用を目的とする捕獲野生動物（シして有効活用する地域振興事業が行われていカ・イノシシ）が保有する危害性微生物のうち，る 。食肉生産においては衛生管理基準が定めら

国内での感染事例があり，かつ重篤な症状を引きれており，施設や生産物に対する定期的な衛生検

起こす感染症および食中毒症を標的として，それ査や衛生指導などが実施されているが，イノシシ

らを簡易に検査できる衛生検査システムを提案すやニホンジカ等の解体処理施設において同様のシる。

１）

ステムが導入されることは多くない。また，これ© The Ito Foundation

488

令和４年度

２．方
2.1

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

増幅時間25分に設定した。

法

2.3

野外試料採取実証試験

本検査機器，試薬および核酸クロマト検査キッ

これまでの研究で協力を頂いていた三重県，長トをジビエ解体施設に持参し，捕獲従事者，解体

崎県と，本研究から新たに北海道の協力を得て，従事者自身に検査を体験して頂いた。使用した感

令和３年５月から令和５年３月までサンプリング

想および要望を伺い，ニーズに基づいた改善をを行った。新型コロナウイルス蔓延の状況下によ行った。対象施設として実際に訪問したのは，三り，日本政府から行動制限がかかったため，当初

重県名張市の名張市猟友会保有の解体施設である。

計画していた数の現地への渡航はかなわず，数を2.4減じた。そのため，猟友会を通じて試料のサンプ

本研究の検査システムをより多くの事業者へのリングと郵送をお願いした。当初計画していた試周知を目指すため，2022年度アグリビジネス創出

料には，血液や唾液，鼻汁，糞を含む拭い液を想フェアに参加して，アウトリーチ活動を行った。

定していたが，新型コロナウイルス感染回避のた

また，食肉衛生関係者に対し，現場で使用できる

め，血液や臓器内容物，唾液，鼻汁等との接触を簡易的検査法の要望についてアンケート調査を避けたいとのサンプリング協力者の希望により，行った。

骨格筋を試料とした。捕獲動物の危害性菌の保有状況を把握するため，本研究の試料は捕獲者の自普及活動

３．結果と考察

家消費用に解体ガイドラインに沿わず，捕獲現場

試料採取協力を依頼していた自治体のうち，北で内臓を除いた開腹状態で解体施設に運搬し，解海道，三重県，長崎県から野生ニホンジカの骨格体されたものを使用した。日本政府による行動制筋75頭分（25頭／県）が郵送された。（株）ニッ

限のため，頻繁に捕獲に出られないことから，試ポンジーン社の小型蛍光遺伝子検出器NiGii８を料はある程度の数を冷凍保存にて確保してから－用いた検査の結果，３道県のニホンジカ骨格筋か20℃の冷凍で岩手大学に郵送された。

ら 検 査 時 間 25 分 以 内 に E.coli ，Salmonella ，

2.2

検証試験

Campylobacter jejuniのそれぞれが検出された。

上記野外試料を用いて検証試験を行った。夾雑

対象病原体の遺伝子増幅が確認された反応時間を物の阻害の検証として，各試料を解凍後10ｇはか表に示す（Table１）。検査機器の駆動アプリにはり取り，30mlのリン酸緩衝液（PBS）とホモジ

リアルタイムで遺伝子増幅のグラフが表示され，ネーションし，その上清を実験試料として用い

１試験８サンプルのうち，陽性であった試料中のた。検査法は株式会社ニッポンジーン社の小型遺ターゲット遺伝子が増幅されている様子が認めら

伝子蛍光検出器NiGii８を用い，検出作業の煩雑れた（Fig.１）。しかし，陽性と判断された試料

さ，検出時間を確認した。検出対象は，E.coli，のいくつかは，遺伝子増幅グラフを確認したとこ

Salmonella，Campylobacter jejuniの三種である。

ろ，バックグラウンドの乱れや，標的遺伝子増幅

12.5μlの×２ Master Mix（ニッポンジーン），2.5

によるグラフの立ち上がりでなく，なんらかの原

μlのprimer mix（ニッポンジーン），９μlのＨ２Ｏ，因による増幅反応の乱れ等が認められた（Fig.

１μlの試料を混合して８連マイクロチューブに２）。これらのような偽陽性検出は，検出時間が注入し，NiGii８にセットした。増幅温度65℃，

10分以内の早い反応時間で起こっていたため，本© The Ito Foundation

489

国産ジビエの衛生管理に資する迅速簡便検査法の開発
Table１ Detection of pathogenic bacteria in venison by using the NiGii8 compact fluorescentgene detector（Reaction time of detection）

Area
Mie

Hokkaido

NagasakiNo.

E. coli（vt1）

Salmonella

Campylobacter jejuni

1

－

－

－

2

－

－

－

3

10:40

－

16:14

4

－

－

－

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6
7

－
－

－
－

－
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8

－

－

－

9

20:36

－

－

10

－

14:34

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11
12

－
27:09

－
5:32

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－

13
14
15
16
17
18
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20
21
22
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25
1
2
3
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5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

－
20:56
－
－
21:55
27:50
－
－
－
－
21:30
－
－
－
4:49
8:50
6:20
7:01
5:22
－
23:12
－
－
－
－
－
－
17:19
－

－
－
－
－
－
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18:39
16:46
23:49
－
24:20
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11:26
22:00
22:21
－
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－
－
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－
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－

－
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－
－
17:00
22:07
－
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－
－
22:47
16:47
20:27
－
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－
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19:06
20:25
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19:25

17
18
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21

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22
23
24
25
1
2

－
18:57
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－
15:37
－

－
21:34
－
－
－
－

－
－
－
－
1:01
－

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490

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

3

－

－

4

－

－

－
－

5

15:37

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6
7

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－

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22:09

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13:02
23:20

8

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－

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－

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－

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16
17

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－
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－
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－
－
－
－
－
－

21:12
－
－
14:47
0:39
14:40

Fig. 1 Detection results using the NiGii8 compact fluorescent gene detector．

A test report summarizing the detection results and a gene amplification graph that can be checked in real time,

displayed after the test．

検査にて10分以内の早い段階で陽性が検出された

いしているため，動物体内や環境に存在する各種

場合は，リアルタイムの遺伝子増幅のグラフを確

微生物が付着した状態である。さらに大量のシカ

認 す る 必 要 が あ る と 考 え ら れ た 。本 検 査 機 器

由来ゲノムも混入しているため，そのような混合

２）

NiGii８の感度は，0.01～0.1fgと確認されている 。

ゲノムに対しても標的遺伝子の増幅が可能である

今回の試料は，危害性菌検出のため，本来のジビことは，本検査システムの高い感度と特異性の証

エ解体ガイドラインにあえて従わずに解体をお願明である。現在日本に分布しているニホンジカ© The Ito Foundation

国産ジビエの衛生管理に資する迅速簡便検査法の開発

491

Fig. 2 False positive example of a test using the NiGii8 compact fluorescent gene detector.

Depending on the condition of the sample, the gene amplification may be disturbed. In such cases, it is necessary

to check not only the result on the test report form but also the graph of gene amplification．

は，異なる地域に異なる亜種が存在している３，４）。

る。しかし，本来はクリーンルームの検査室でし亜種の相違によるゲノムの違いが検出結果に影響か行えないリアルタイムの遺伝子増幅を検出までを及ぼす可能性を鑑み，本研究では北海道のエゾハンディで行えることは非常に有意義であり，反シカ，三重県のホンシュウジカ，長崎県のキュウ

応時間も25分という遺伝増幅・検出試験としては

シュウジカの試料を用いたが，道県別に大きな違

非常に短い時間である程度のスクリーニングと菌いが認められなかったため，本検査法は日本で多数の把握が可能であることは，今後のジビエ産業

く流通する鹿肉に対しては産地の区別なく使用でへの大きな貢献が期待できる。

きると考えられる。しかし，純粋培養菌液や抽出

本機器の実証試験として，三重県名張市の名張

ゲノムを試料として用いた際には認められなかっ

市猟友会に本検査を実施して頂いた。結果は，免たグラフの乱れは，試料中の夾雑物の影響が考え

疫クロマト，小型遺伝子蛍光検出器（NiGii８），られるため，増幅の安定性を改善する必要があ

核酸クロマトの順にニーズが高かった。NiGii８© The Ito Foundation

492

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）は遺伝子増幅・検出を行う本体と駆動アプリが分が一つもない施設があったり，遺伝子検査は試料かれている部分について，一体型であるほうが使をまとめて月に一度郵送するという状況の施設もいやすい等の意見があった。免疫クロマトの手軽あった。衛生検査を行う場についても状況は都道さが現場での検査において求められるポイントで府県によってばらつきがあったため，ジビエ解体

あるが，開発に時間と手間を要し，また，感度に施設で施行できる検査法については，やはり“どついては遺伝子検査と同等まで向上させることがんな人でもできる検査法”を目指す必要がある。

難しいため結果的に高額になる可能性が高い。ジ

現場から求められる検査法の重要な点は，簡便でビエ産業において，現場で気軽に検査を行うためあることと安価であることであった。

にはコストも重要であり，持続的に検査を行うに本研究期間に得られた検査機器NiGii８の改善あたって経済的負担の少ない検査法という面もさ

要求点について，株式会社ニッポンジーン社によらに考慮すべきニーズである。

り，駆動アプリと機器本体を一体化しタッチパネ

普及活動として，2022年度アグリビジネス創出
フェアに出展した（https://agribiz.maff.go.jp/）。
このフェアでは，ジビエの生産，流通・消費に関わる企業，行政等の幅広い事業関係者に紹介で

ル式に改変した新版機器を試作したことを加えて記載する（Fig.３）
。
４．要

約

きた。最も多かった質問事項は検査にかかる金額

本研究では，ジビエの簡易迅速検査法を用いたであったが，これまでに行っていた，検査機関に実地試験を行った。本検査法は野外で行える蛍光

依頼する場合の検査料と比較してかなり低額であ遺伝子増幅法であり，LAMP法を基礎としたポー

ること，検査に要する時間が大幅に短縮されるこ

タブル型の検出器を用いて行うものである。本研とから，非常に有用であるとの意見が多かった。

究では，E. coli，Salmonella，Campylobacter

衛生状態が不安視されるジビエについて，衛生の

jejuniを対象とした。北海道，三重県，長崎県か担保という付加価値を付けることができる点も評

ら自家消費用にガイドラインに沿わない解体法で価された。さらに，本検査システムは人獣共通感処理したニホンジカ肉をホモジネーションしたも染症の検査も可能であり，本研究で示したとおのを試料とし，試薬と混合の後，65℃25分間の反り，夾雑物が存在する状態の試料でも標的遺伝子

応条件で検出した。その結果，すべての道県からの検出ができるため，解体前の感染リスクが少な同じ程度に３つの菌が検出された。試験によってい状態で検査を行い，陽性の場合は解体施設まで

はバックグラウンドの乱れを認め，標的病原体の運ばず捕獲現場で廃棄処分することで，捕獲者・検出の判定に再確認を要するものもあるが，従来解体者の感染防御の一助となる。

の遺伝子検査法と比較して，25分と短時間で済む

また，41都道府県の食肉衛生に関わる現場の声

こと，１温度固定のため，サーマルサイクラーがとして，簡易検査法についてさまざまな意見が得不要であること，結果の確認に電気泳動が不要でられた（Table２）。都道府県によっては微生物のあること等を考慮すると，十分にジビエの解体現培養，病理検査といった生物学的検査，遺伝子検場で活用できる検査法および検査機器である。

査のすべてを行える者がいない，また，検査設備© The Ito Foundation

493

国産ジビエの衛生管理に資する迅速簡便検査法の開発

Table 2  Current inspection methods in the municipality and opinions/needs for novel inspection systems that will be useful in the field.
現在行っている検査法
自治体

PCR

RTPCR

1

○

○

real time
PCR
○

2

拭取り
検査

ELISA

電気
泳動

遺伝子
抽出

病理組
織検査

LAMP
法

○

3

○

4

○

希望する検査法

微生物培養

操作が簡便かつ検査結果が迅速に出るほうが望ましい。
常時検査において人を当てられないので、簡便で時間のかからないものマニュアル等があれば簡単な遺伝子検査
ができる。

5
6

○

7

○

○

8
9

簡便で低価格、短時間でできる
○

○

10
11

○

迅速に結果が出せる検査法

○

12

○

13

○

14

○

○
○

導入する場合、価格が安価であるといい。
○

15

○

○

簡単なキットで短時間でできること。
結果が、ひと目でわかること。
室温で判定できること。
検体の処理が不要なこと。

○

16
17
18

○

手順が簡便なもの

○

○

19
20

○

21

○

22

○

23

○

24

○

25

○

26

○

27
28

簡便な検査で時間のかからないもの
・ペトリフィルムで培養しカウントする
・圧ペイ標本によるトリヒナ検査やディフクイック染色による直接顕微など○○○

時間のかからない簡便な検査法○○○

前処理を含めて2-3時間で結果が出る検査○

29

体制が整ってマニュアルが作成されている

30

○

31

○

32

○

33

○

34

○

35

○

36

○

37

○

38

○

39

○

40
41

検査を実施する人の物理的・微生物的に安全を第一に考えた検査法ディスポーザブルな器具を用いた検査。

○

○

○

○

○

簡単（高齢の非常勤職員でもできる）
安価
早く結果が出ること
安価で特殊な機器を利用しない検査簡便であること
○

○

簡単で安価

○

簡便な方法
○

© The Ito Foundation

前処理から測定にかけるまで短時間であること。
普段の管理が簡単なもので一度にある程度の検体数が検査できること。
コントロールの扱いが簡易であること。

494

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Fig. 3 Prototype NiGii8 improved version based on field opinions and needs．

An improved version was prototyped based on the opinions and needs obtained through field research andoutreach activities, including this study. The main device for gene amplification and the driving application were
integrated into one unit, and the operation system was changed to a touch panel format．

文献１）
 Kojima, M.：J. Vet. Epidemiol., 24, 55～59, 2020.
 山﨑朗子，原口浩幸，中曽譲，峯岸恭孝，藻寄茜，
２）
鎌田洋一：ジビエ利用の推進に資する鳥獣対策技術の開発，スマート捕獲・スマートジビエ技術の確立「生産性革命に向けた革新的技術開発事業」終了時
評価用構成員別研究成果報告書（生物系特定産業技術研究支援センター（BRAIN）），pp. 50-56, 2021.

３）
 McCullough, D. R., Takatsuki, S., Kaji, K.：Sika
deer: biology and management of native andintroduced populations, Springer Science &Business Media, 2008.
 Ohtaishi, N.：Mammalian Sci, 53, 13～17，1986.
４）© The Ito Foundation

495

鶏肉・鶏卵の生産性向上を目指した安全なワクモ防除法の開発
Construction of a protective system against poultry red mite, Dermanyssus
gallinae, for the improvement and development of the poultry industry

辻

尚利１・川田逸人１・小田憲司２（１北里大学医学部，２一般社団法人生物科学安全研究所）

Naotoshi Tsuji１，Hayato Kawada１ and Kenji Oda２
（１Kitasato University School of Medicine，２Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology（RIAS））

Dermanyssus gallinae is causing serious damage to the poultry industry worldwide,
reducing egg productivity and causing major social problems such as discomfort to poultry
farmers. More than 80% of farms infested with the mite in Japan are estimated to be morethan 6.6 billion yen in damage annually. In addition, although it is difficult to directly assess theimpact of D. gallinae on the global economy, production losses, and treatment and prevention
costs for approximately 600 million laying hens in the EU are estimated to be about 250 million
Euros per year. Therefore, the establishment of control measures for D. gallinae is now aninternational challenge. In this study, we established an experimental system to evaluate thegrowth of D. gallinae on a laboratory scale. The growth boxes constructed in this study
provided an ideal environment for D. gallinae and successfully produced sufficient amounts ofmites on time. Pathological analysis of the skin of chickens bitten by D. gallinae showed
subcutaneous inflammation and hemorrhage, which is expected to help elucidate the bloodsucking mechanism of D. gallinae. The box also made it possible to evaluate the efficacy ofcommercially available miticides, and transcriptome analysis provided hints for vaccine
development targeting biologically important protein for the mites such as histamine releasefactor. In the future, we would like to evaluate the mite vaccine candidate molecules obtainedby transcriptome analysis and elucidate the mites’ blood-sucking mechanism．

１．目

済的影響を特定することは困難だが，EUの約的６億羽の産卵鶏の生産損失と治療および予防費用

国内外の養鶏産業に深刻な打撃を与えているワ

は，年間約２億5000万ユーロと推定されている２）。

クモは，鶏肉などの生産性低下を招くだけでな

このように，ワクモ防除対策の確立は現在，国際く，人が不快感を覚え，離職につながるなど大き的な課題となっている。

な社会問題を起こしている。本邦での農場ワクモ

ワクモ（Dermanyssus gallinae）は，ダニ目ワ

汚染率は80％以上，被害額は年間66億円以上にのクモ科に属する吸血ダニで，家禽や鳥類の外部寄

ぼる 。また，ワクモに直接起因する世界的な経生虫である。ワクモの生活環は８～９日と短く，

１）© The Ito Foundation

496

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

夜間に宿主鳥類を吸血することにより短期間で大Eri tech）を入れた。給水器，給餌器を飼育ケー量発生する。近年，ワクモが殺ダニ剤抵抗性を獲ジに設置し，フタにはメッシュをかけて照明と通得し始めているにもかかわらず，鶏舎での薬剤使

気性を確保し，これをワクモ増殖箱とした。ワク用規制が強化され，殺ダニ剤の使用自体が難しく

モ増殖箱を界面活性剤入りのトレーにセットしなってきたことなどの複合的な理由から，ワクモ

た。１週齢の雛（品種：もみじ，株式会社後藤孵

防除はきわめて難しい局面を迎えている。さら卵場）を鶏飼育ケージに導入し，毎日給餌（SDLに，一度鶏舎がワクモで汚染されると，その駆除

幼雛用飼料：フィードワン株式会社）および給水は非常に困難であることもワクモの汚染問題を複を実施した。雛を導入してから２週間飼育し，３雑にしている。

週齢で新しい雛に交換した（Fig.１）。

家畜体表に寄生・吸血するダニ類の予防法とし動物実験は，一般財団法人生物科学安全研究所て近年注目を集めているのが「ダニワクチン」で動物実験委員会（承認番号210708-1，210721-1，

ある 。ダニが生存するために必須のダニ由来の210930-1）および北里大学動物実験委員会の承認

タンパク質成分で宿主（ワクモの場合は鶏）を免（承認番号2023-149，2023-150，2023-151）を得

疫すると，その宿主は投与されたダニ成分に対て実施された。

３）

し，特異的な抗体を産生する。この抗ダニ抗体は，

2.2

ワクモの継代維持

ダニがその宿主から吸血する際，宿主の血液と一ワクモは，2021年６月に神奈川県相模原市の養緒にダニの体内に取り込まれる。このように，ダ

鶏場から入手した。この農場では，ワクモの防除

ニに取り込まれた抗ダニ抗体は，ダニの生存に必のためプロポクスルとトリクロルフォンが使用さ須の標的タンパク質の機能を阻害する。この機能れていた。採集にあたり，10cm×15cmの段ボー阻害が原因となってダニの代謝系は撹乱され，発ル片をいくつかの鶏ケージの上に１週間置き，そ

育異常やダニ産下卵率が低下するなどが引き起この後，絵筆で段ボールの表面から虫体を採取しされ，ダニ生活環の遮断からダニ個体が消滅する。

た。実体顕微鏡下で形態学的にワクモであること

本研究では，著者らが培ってきた牛寄生性ダニを同定した後，約50mgのワクモ（発育期は分けの繁殖技術をワクモに応用し，本邦で初のワクモていない）を増殖箱に放虫した。増殖したワクモ

繁殖コロニーを構築する。実験室内評価系が国内

は段ボールにて採集し，ジップロックに入れてかに存在しないところで，野外試験に至っている現ら使用時まで冷蔵庫にて保存した。

状を変え，真にワクモに対して有効とされ，科学

2.3

的リテラシーを備えたワクチン等の防除技術の開

ワクモ増殖箱を12箱作成し，１週齢の雛を導入してワクモを20～55mgで放虫した。ワクモ放虫発に資することを目的とした。
２．方
2.1

ワクモ増殖判定試験

から７日，14日，21日，28日目に３箱ずつワクモ

法の回収を行い，回収した増殖箱は取り潰した。回
収はi-Trap Ⅱ（近藤電子株式会社）を用いて，ワクモ増殖箱発 泡 ス チ ロ ー ル （外 寸 46.5cm × 35.7cm ×

回収日の24時間前に飼育ケージ上部にセットし32.3cm，内寸42.0cm×31.3cm×27.0cm：笠原工

た。回収したi-Trap Ⅱを48時間以上冷凍し，計業株式会社）に鶏飼育ケージ（13cm×15cm×

測時は常温に30分以上置き，トラップを破壊して19.5cm）を二つ並べ，データロガー（GSP-6：

ワクモを取り出した。パスツールピペットに綿栓© The Ito Foundation

鶏肉・鶏卵の生産性向上を目指した安全なワクモ防除法の開発

497

A

food

water

food

loggerchickenchickenwater

Detergent
B
Styrofoam box

Tray
Fig. 1 Overview of the proliferation box for D. gallinae. A data logger（temperature and humidity）and two chicken

cages with a water dispenser and feeder box were placed inside the Styrofoam box. The lid of the Styrofoam box
was meshed to ensure lighting and ventilation.（A）View from the above.（B）View from the side．

をしてあらかじめ重量を計測し，ポンプ（リニコゾルトⓇ（MSDアニマルヘルス株式会社）を用い

ンLV-125A）に装着し，ワクモをピペット内にた。対照群はワクモ放虫から２週ごとに雛を交換吸引して，定量を行った。

し，６週間飼育した。蔓延防止群はワクモ放虫１2 . 4 雛におけるワクモ吸血部位皮膚の病理組

日前と６日後に殺ダニ剤を雛に飲用させ，２週ごとに雛を交換しながら６週間飼育した。駆除群は織学的解析
ワクモフリーの環境で飼育した雛（３週齢）

ワクモ放虫後，２週ごとに雛を交換し，４週目のと，ワクモ増殖箱内で20～55mgのワクモに２週

ワクモ回収が終わった直後と５週目に殺ダニ剤を間暴露させた雛（３週齢）およびワクモ継代用に飲用させ，６週目まで飼育した。

400mg以上のワクモに２週間暴露させた雛（３週

2 . 6 ワクモ遺伝子のトランスクリプトーム解析

齢）を二酸化炭素で安楽殺し，総排泄口周辺を切次世代シーケンスによる転写産物解析に供する

除した，切除後のサンプルは４％パラホルムアルために必要なRNAを抽出するため，吸血個体をデヒド（富士フイルム和光）に24時間浸漬し，

含 む ワ ク モ（各 ス テ ー ジ 混 合）約 160mg よ り

70％エタノールに置換し，24時間後に再度70％エ

RNA抽出を行った。－80℃にて凍結保存状態のタノールを交換した。パラフィンに包埋後，３μｍ

ワクモを，液体窒素にて冷却した乳鉢，乳棒を用に薄切し，HE染色を行った。

いて粉末状になるまでホモゲナイズし，TaKaRa

2.5

市販殺ダニ剤試験のNucleoSpin RNA Plus Kitを用いてプロトコー

ワクモ増殖箱を，対照群，蔓延防止群，駆除群

ル に 従 い RNA を 抽 出 し ，Kit 付 属 の 溶 出 バ ッの３群に３箱ずつ計９箱準備した。暴露するワク

ファー（RNase free water）30μｌにて溶出し，

モ は 20～55mg と し ，放 虫 か ら ２ 週 間 ご と に

約21μｇのTotal RNAを得た（in house NanoDropi-Trap Ⅱでワクモを回収した。殺ダニ剤はエグ

assay）。次世代シークエンス解析は，上記RNA© The Ito Foundation

498

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

サンプルをAzenta Japan Lab．において，ライ

気と照明確保のため，発泡スチロールのフタにワ

ブラリ調製，Illumina NovaSeqにてシーケンス

クモ逃走防止措置を施した。これをワクモ増殖箱

RUN（Paired End，２×150bp）を行った。得らとして合計12箱作成し，その中にワクモを20～れた配列データのQC解析（Fast QC v0.11.4を使55mg放虫した。その後毎週３箱ずつワクモ回収用）により，取得したリードの99％以上についのため取り潰し，４週間繰り返した。ワクモの回て，150bp全塩基において99.9％以上の正確な塩収は，回収日24時間前にi-Trap Ⅱ（近藤電子株

基情報を取得することができた。Cutadapt（ｖ式会社）を鶏飼育ケージ上に設置し，トラップ内

1.9.1）にて，アダプター配列，低品質塩基情報，に集まったワクモを吸虫管により回収し定量しトリミング後75bp長以下の配列を除外し，デー

た。その結果，１週目は4.3±1.2mg，２週目はタ解析（Trinity（ｖ2.2.0）によるde novoアセン10.4±8.3mg，３週目は80.4±26.2mg，４週目はブル，TransDecoder（ｖ3.0.0）によるORF予測，

201.4±56.5mgであった（Fig. 2A）。また，飼育期

アノテーション付加）を実施した。

間中の温度は22.3±1.5℃，湿度は78.7±9.2％であった（Fig. 2B）。１週目に比べ，２週目までは３．結果と考察
幼雛を用いたワクモ吸血実験系の確立

目（ｐ＝0.0078）に有意差が得られた。また，３

発泡スチロールに鶏飼育ケージと温湿度ロガー

週目以降，放虫したワクモ量よりも多くトラップ

を入れ，孵化後１週齢の幼雛を２羽導入した。換されているため，増殖が確認できた。これはワク

B

＊＊
250
200
150

＊

100
50
0

7

Day

21

28

Temperature
Humidity

30
Temperature（℃）

14

100
90

25

80
70

20

60
50

15
10

40
0

7

14
Day

21

28

HumidityRH（%）

A

Weights of D.gallinae（mg）

3.1

有意差が得られず，３週目（ｐ＝0.0156），４週

30

Fig. 2 Performance of the proliferation box.（A）Kinetics of the number of D. gallinae in the proliferation box. The

weight of the mites on day 21（p ＝ 0.0156）and 28（p ＝ 0.0078）was significantly higher than the that on day 7.（B）Kinetics of relative humidity and temperature during the study period. Stable condition was observed．

© The Ito Foundation

鶏肉・鶏卵の生産性向上を目指した安全なワクモ防除法の開発
Regular infestation

499

Extreme infestation

A

B

C

D

Fig. 3 Histopathological analysis of the biting site of D. gallinae.（A, C）Overview and histological section of the cloaca

from the chick infested by regular number of mites.（B, D）Overview and histological section from the cloaca of
the chick infested by extreme number of mites. Sections were stained by H & E. Scale bar＝25μｍ．

モの生活環が８～９日間であることに起因するも対 照 群 22.59 ± 10.15mg ，蔓 延 防 止 群 は ０ ± ０のと示唆され，本増殖箱を用いた試験系が再現性

mg，駆除群は58.69±37.93mg，６週目は対照群に優れており，殺ワクモ剤やワクチン効果の判定

34.08±1.29mg，蔓延防止群は0.51±0.89mg，駆試験の実施を簡便なものとする利便性にも優れて除群は0.98±0.45mgであった。対照群と蔓延防止いることを示唆する。温湿度についても，増殖箱群の比較では，２週目（ｐ＝0.037），４週目（ｐでは雛がいることと給水器の影響で，ワクモに＝0.037），６週目（ｐ＝0.046）いずれも，有意にとって理想的な環境が構築できていると考えられ蔓延防止群のワクモ重量が少なく，対照群と駆除る。

群の比較では，ダニ剤を投与した後の６週目（ｐワクモ吸血刺咬部位における皮下出血＝0.0495）のみ有意に駆除群のワクモ重量が少な

ワクモを400mg以上，２週間暴露した鶏の雛のかった（Fig.４）。これは，今回使用したエグゾ

総排泄口周囲にのみ紅斑が確認され，皮下病理像

ルトがワクモの蔓延防止，駆除に効果的であるとを確認すると，アレルギー反応ではなく，内出血

いうMSD社臨床試験の結果を反映できているこであることが確認できた（Fig.３）。増殖箱を使とから，我々が構築したワクモ増殖箱が薬剤アッ用することでワクモの暴露有無による比較が容易

セイにも適していることを示している。

3.2となり，ワクモの吸血メカニズム解明につながる物解析ことが期待できる。
3.3

3 . 4 次世代シーケンスによるワクモの転写産継代維持に成功したワクモ-RIAS系統を用いて殺ダニ剤効果判定試験結果

3 . 1で確立に成功したワクモ増殖箱を用いて，実施したRNA-seq解析では，シーケンシング後，市販のダニワクチンであるエグゾルト （MSDア

Raw data（87,928,572 reads）からアダプター，

ニマルヘルス株式会社）の評価を実施した。そのインデックス，および低品質のデータを除いた，

結果，２週目は対照群5.57±0.55mg，蔓延防止群

Filtered data（86,961,960 reads，11,976,934,274nt）

は０±０mg，駆除群は7.53±1.86mg，４週目はを得た。Filtered dataから，ニワトリ宿主由来配Ⓡ© The Ito Foundation

500

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

Weight of D.gallinae（mg）

80

60

40

20

0

＊
2

non-treatment

＊＊＊＊
＊＊＊

＊＊
4

6

week
prophylactic assay

therapeutic assay

Fig. 4 Acaricidal effect of ExzoltⓇ on D. gallinae in the proliferation box. The mean recovery weight of D. gallinae in the

non-treatment group（NT, open circle）was steadily increased during the experiment. In the prophylactic assay（PA, open triangle）, the growth of mites was suppressed effectively during the experimental period. In the therapeutic
assay（TA, closed square）of treatment at 4 week after the start, the population growth was drastically suppressed.
Each point was averaged from three independent experiments. ＊p＝0.037（PA vs NT）, ＊＊p＝0.037（PA vs NT）,＊＊＊
p＝0.046（PA vs NT）,＊＊＊＊p＝0.0495（TA vs NT）．

列および重複配列を除いた後，contigにアセンブ

発現レベルを順位づけることができた高発現遺伝

リーした。アセンブリーされたcontigは4,454,698

子は，そのほとんどがribosome proteinなど恒常個であり，それらの平均の塩基配列長は，54.56nt

発現遺伝子であった。比較的高発現している遺伝できわめて低値であった。次に，それらのcontig

子 群 に は ， 既 報 の Histamine Release Factor

より冗長配列を除外しコンセンサス配列とした（FM179713）を見出すことができた。本分子にunigeneは116,144個であり，それらの平均の塩基特異的な抗体を経口投与されたワクモ集団は，そ

配列鎖長は，contigとは異なり637.44ntと成績がの数を減じることが知られており，ワクチン抗原向上した。unigeneの過半数が200～500bpで構成として有望視されている４）。

されており，2000bp以上の長鎖となったトラン

また，ワクモは，前述したように夜間吸血性のスクリプトは約６％見出された。それぞれの配列

行動様式をとる。すなわち，ワクモ体内には厳密を ク エ リ と し た Blast 解 析 に よ り ，Nr ま た はに制御された体内時計を有している可能性が示唆

Swissprot の タ ン パ ク 質 デ ー タ ベ ー ス 上 に ，される。そこで，本実験にて取得したトランスク

e-valueが0.00001以下の相同性が高いと判断されリプトーム情報を精査したところ，ショウジョウ

たunigeneは，それぞれ27652と13808個得られた。

バエではPER-TIM複合体を形成し概日時計制御

次に分子機能データベースであるKEGGおよびのコア振動体の一員５）である主要な転写因子であ

COGデータベース上に，近似する機能が予測さるtimeless様ホモログを見出すことができた。本

れたunigeneが，それぞれ1558と14187個得られ解析ではその他の時計遺伝子を見出していない

た。Bowtie2（ｖ2.2.6）を用いて，Filtered data

が，今後さらに精査する必要がある。

をunigeneにマッピングしたところ，約87％の以上のように，本研究において整備された遺伝リードがマッピングされ，各リードカウントから

子情報は，本研究が目指す「鶏体ワクチンによる© The Ito Foundation

鶏肉・鶏卵の生産性向上を目指した安全なワクモ防除法の開発

501

ワクモ防除法」を開発するための研究基盤としてとができたことから，新規殺ダニ剤やワクモワク

重要な遺伝子情報プラットフォームであることをチン開発に必要な予備データを得ることができた

意味している。

と考えている。今後は，トランスクリプトーム解

４．要

析で得られたワクモワクチン候補分子の評価や，

約

吸血メカニズムの解明に注力したい。

ワクモは世界の養鶏業に深刻な被害をもたらし，鶏卵の生産性を低下させ，従業員に不快感を与えるなどの大きな社会問題を引き起こしている。日本では８割以上の農場にて発生しており，年間の被害額は約66億円以上と推定されている。
EUでは約６億羽の産卵鶏の生産損失と予防コストが年間約２億５千万ユーロと見積もられており，国際的な課題となっている。本研究では，ワクモの増殖を評価する実験系を確立した。増殖箱
はワクモにとって理想的な環境であり，十分な量のワクモを定期的に生産することに成功した。ワ
クモ感染鶏の皮膚病理学的解析より皮下炎症と出血が確認されたため，今後ワクモの吸血メカニズ
ムの解明が期待できる。また，市販の飲水型殺ダニ剤の有効性評価が行えることや，トランスクリ
プトーム解析からワクモにとって重要な遺伝子（ヒスタミン放出因子など）の発現を確認するこ

文
献１）
 村野多可子：鶏外部寄生虫（ワクモ・トリサシダニ）の防除技術の確立，千葉畜草研，成果情報，
2004～2011年度．
２）
 Waap, H., Nunes, T., Mul, M. F., Gomes, J., Bartley,
K.：Survey on the prevalence of Dermanyssus
gallinae in commercial laying farms in Portugal,
Avian Pathol., 48（sup1）,S2-S9, 2019.
 Bartley, K., Wright, H. W., Huntley, J. F., Manson,
３）
E. D. T., Inglis, N. F., McLean, K., Nath, M., Bartley,Y., Nisbet, A. J.：Identification and evaluation of
vaccine candidate antigens from the poultry redmite（Dermanyssus gallinae）, Int. J. Parasitol., 45（13）,819～830, 2015.
４）
 Bartley, K., Nisbet, A. J., Offer, J. E., Sparks, N. H.
C., Wright, H. W., Huntley, J. F.：Histamine releasefactor from Dermanyssus gallinae（De Geer）：
Characterization and in vitro assessment as aprotective antigen, Int. J. Parasitol., 39（4）, 447～
456, 2009.
 Myers, M. P., Wager-Smith, K., Wesley, C. S.,
５）Young, M. W., Sehgal, A.：Positional cloning andsequence analysis of the Drosophila clock gene,timeless, Science, 270（5237）,805～808, 1995.

© The Ito Foundation

502

反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索（Ⅲ）
Investigation of the physiological markers indicating‘nausea' in domestic

ruminants（Ⅲ）

青

山

真

人１・蕪

山

由己人２

（１宇都宮大学農学部生物資源科学科，２宇都宮大学農学部応用生命化学科）

Masato Aoyama１ and Yukihito Kabuyama２（１Department of Agrobiology and Bioresources, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University，
２Department of Applied Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University）

Introduction : Farm ruminants, such as cattle, sheep and goats, don’t possess the emetic
reflex, thus there have been no reports investigating the nausea in them. The aim of this study
is to find the physiological marker（s）for nausea in goats. In this research, we investigated theeffects of administration of cisplatin（CDDP）, a common emetic agent, on the behavior andblood concentrations of some hormones in goats. In addition, the effects of CDDP on theactivation in the medulla oblongata, especially in the nucleus of the solitary tract（NTS）, that is
involved in nausea, is examined．
Methods: Six adult Shiba goats received intravenous administration of CDDP（or saline as
the control）. The behavior of animals was observed for four hours. The blood samples werecollected for the assays of plasma levels of cortisol（Cor）, arginine vasopressin（AVP）and
oxytocin（OXT）. Two goats were selected from the six, and the number of the c-Fos protein
positive cells in the medulla oblongata were counted．
Results: All of the CDDP administrated goats lay down, meanwhile no control goats lay
down. The plasma Cor levels in CDDP administrated goats was significantly higher than thosein controls or pre-administration. CDDP did not influenced plasma AVP level. Although it was
not statistically significant, the plasma OXT level in the CDDP administrated goats was tended
to be lower than that in the controls. The number of c-Fos positive cells in CDDP
administrated goat was remarkably higher than that in control goat．
Conclusion: CDDP induced the remarkable behavioral changes in goats, and thesebehavioral responses seemed to be induced by the severe stress because the plasma Cor levels
were increased. CDDP activated some neurons in the NTS. These results indicate that CDDP
might induce nausea or some similar aversion in goats. Further works are required to find thephysiological marker（s）for nausea in goats．

© The Ito Foundation反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索（Ⅲ）

１．目

503

ついても検討した。

的「悪心」（おしん）（「気分が悪い」という感覚）

２．方法

は，「痛み」や「暑さ・寒さ」と同じく代表的な

2.1

不快感の一つである。人を含めたいくつかの動物実験にはシバ山羊（Capra hircus）６（オス２種において，悪心によって起こる最も明確な反応

頭，メス４頭，２～４歳）を使用した。実験は，は「嘔吐」である。一方，齧歯目，兎，馬など，

宇 都 宮 大 学 動 物 実 験 委 員 会 の 承 認（承 認 No.

嘔吐反射を持たず，嘔吐をしない動物種も少なく

A21-0011）を得て，同大学動物実験等管理規程

ない 。しかし，齧歯目であるラットやマウスにに従って行った。餌と水は不断給餌とし，毎日

おいては，嘔吐はしないが悪心は感じると考えら

10：00に新しいものに交換した。

１）

実験動物

2 . 2 実験１：シスプラチン投与による血中成れている２，３）。
牛や羊，山羊などの反芻動物も嘔吐をしない。

分の反応

そのため，反芻動物における悪心の研究はこれま2 . 2 . 1 シスプラチンの投与でにない。一方，本報告書の著者の青山は，山羊

６頭の山羊について，同じ性のペア３組に分けを反芻家畜のモデルとして家畜の輸送ストレスをた。９：00に，各ペアのうち一方にはCDDPを投研究してきた過程から，山羊は嘔吐をしない

与した。投与法については，CDDPを2.0mg/1.0

が，輸送中の様子から乗り物酔いをしている，つmlとなるように生理食塩水に溶解し，これを山まり，悪心を感じているのではないかと考えてき羊の体重１kgあたりCDDPとして1.0mgとなる量た。著者はこのような観点から，催吐剤であるシを静脈内に注入した。もう一方の山羊には，対照ス プ ラ チ ン （cis-diamminedichloro-platinum

として同じ量の生理食塩水を投与した。１～２週（Ⅱ）：CDDP）（抗癌剤であるが，副作用として間の間隔を空け，各個体の処置を入れ替えて再び強い悪心・嘔吐を引き起こす ）の投与が，山羊実験を行った。

４）５）において悪心を引き起こす可能性について検討

2.2.2

し，結果を近年報告した 。

山羊の行動を，８：30（投与30分前）から13：

６）

行動観察

一方，悪心経験時に特異的に起こる生理学的反00（投与４時間後）まで，ビデオカメラで撮影し応，特に血液中に現れる成分についてはまだ明確た。10：00の飼料の交換後に，伏臥位姿勢を取るな知見が得られていない。悪心経験時に特異的にまでの時間（投与からの時間），伏臥位姿勢で起こる，嘔吐に代わる指標があれば，反芻家畜をあった時間について実験区間で比較した。観察時含めた嘔吐をしない動物における悪心の研究に非間中に起こらなかった行動については，それが起常に役立つ。本研究の目的は，反芻動物においてこるまでの時間は便宜的に240分（投与から観察

悪心の生理学的指標を見つけ出すことである。伊

時間終了までの時間）とした。

藤記念財団からの三回目の助成となる今回（令和2.2.3

３～４年度）の研究では，やはりCDDP投与によ９：00（投与直前）と13：00（投与４時間後）る 血 中 成 分 の 反 応 に つ い て 検 討 し た 。ま た ，に頚静脈より血液を採取し，ストレスの生理的CDDP投与による延髄（悪心や嘔吐にかかわるいマーカーとして一般に用いられているコルチゾル

くつかの神経核が分布している）における反応に（Cor），嘔吐動物において悪心との関連が報告さ© The Ito Foundation

血中成分の分析

504

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

れているアルギニンバソプレッシン（AVP），お（NA）について比較した。

よびラットにおいて悪心との関連が指摘されてい2.3.3

るオキシトシン（OXT）の血中濃度を測定した。

実験１において，生理食塩水を投与した対照区

Corについては得たそれぞれの実験区の投与直をSal区，CDDPを投与した区をCDDP区として，前，240分後の２回分のサンプルを測定し，AVP両実験区を比較した。行動については，Wilcoxon

およびOXTについて投与240分後のサンプルのみの符号化順位検定によって比較した。血中Cor濃を測定し，対照区とCDDP区間で比較した。

度については二元配置（処置×時間）反復測定分

2 . 3 実験２：シスプラチン投与による延髄における反応

散分析によって比較した。また，血中AVPおよびOXT濃度については，Sal区とCDDP区を対応

2 . 3 . 1 シスプラチン投与および血中成分の分析

のあるｔ検定によって比較した。実験２においては，頭数が各実験区で１頭ずつであり，統計解析

実験１を実施して数か月後に，用いた６頭のう
ちメス２頭を使用した。上述と同じ方法で，１頭は生理食塩水を，残る１頭にはCDDPを投与した。

は行わなかった。
３．結果と考察投与直前と180分後に血液を採取し，そのCor濃3.1

度を測定した。

3.1.1

2.3.2

統計解析

延髄における反応の解析

実験１
行動Sal区において，飼料交換後は，６頭中すべて

投与180分後，深麻酔下で山羊を安楽殺後，心の個体が一度も伏臥位姿勢を取らなかったが，臓より灌流固定し，延髄を採取し，厚さ50μｍのCDDP区においては６頭すべてが遅くとも投与か前額断凍結切片を作成した。その後，免疫組織化

ら157分後に伏臥位姿勢を取った（Table１）。伏学法により，延髄におけるc-Fosタンパク質（神臥位姿勢を取るまでの時間は，CDDP区ではSal

経細胞活動のマーカーとなる）（以下，Fos）陽区と比較して有意に早く（p＜0.05），伏臥位姿勢性細胞の数を，神経核ごとに計測した。神経核のを取っていた時間は有意に長かった（p＜0.05）。

特定は，以前に本研究室で作成したシバ山羊の脳

今回，写真は示さないが，CDDP区において伏臥幹アトラスに従った。本研究では，悪心の発生に位を取っている個体は瞼を閉じ，顔を下に向けてかかわるとされる孤束核（NTS），嘔吐にかかわ

じっとしている様子が確認できた。CDDP投与にるとされる迷走神経運動背側核（DMV），疑核よるこれらの行動学的反応は犬においても報告さ

Table１ The effects of cisplatin administration on lying behavior in goats
Treatment
Saline（control）

Cisplatin

Latency to lying（min）

240.0±0.0（240－240）121.5±9.5＊（98－157）

Total time spent in lying（min）

0.0±0.0（0.0－0.0）56.2±7.7＊（33－85）

Each data represents the averaged±SE and（minimum value – maximum value）of six goats.
＊ : S ignificant difference from the results in the saline administrated control test（p< 0.05,
Wilcoxon signed rank test）.

© The Ito Foundation

505

反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索（Ⅲ）

れており７），また，山羊において起こることを著

中AVP濃度が変化するのは嘔吐した結果起こる者らも報告している 。

反応であり，嘔吐をしない動物には起こらないの

６）

3.1.2

かも知れない。

血中コルチゾル濃度

Sal区においては，血中Cor濃度は投与の前後で3.1.4

血中オキシトシン濃度変化がなかった（Fig. 1A）。一方，CDDP区にお血中OXT濃度については，有意ではなかった

いては，投与240分後は投与前よりも（p＜0.01），

がCDDP区のほうがSal区と比較して低い傾向に

また，Sal区の同じ時刻のそれよりも（p＜0.01）あった（p＝0.051）（Fig. 1C）。ラットにおいては有意に増加していた。悪心を引き起こす処置に悪心を引き起こす処置によってOXTの血中濃度

よってCorの血中濃度が増加することは犬 ，山が増加することが報告されている10）。今回，山羊羊６）やラット（ただしラットではコルチコステロ

ではなぜラットとは逆に血中OXT濃度が低い傾９）ン）
でも報告されている。血中Cor濃度の増加向にあったのかは不明であるが，このことが山羊はなんらかのストレスを感じていることを示してにおいて悪心の指標となり得るかも知れない。

８）

おり，CDDP投与によって山羊はやはり悪心（少3.2

なくともそれに類似した嫌悪感）を感じていると

3.2.1

考えられた。

生理食塩水を投与した個体（Sal個体）は180分

3.1.3

間伏臥位姿勢を取らなかったが，CDDPを投与し血中アルギニンバソプレッシン濃度

実験２
行動および血中コルチゾル濃度

血中AVPについては，Sal区とCDDP区の間にた個体（CDDP個体）は113分後に伏臥位姿勢を差は見られなかった（Fig. 1B）。AVPは嘔吐に取り，累積伏臥位時間は14分であった。血中のコ

伴って血中濃度が増加することが報告されておルチゾル濃度は，Sal個体では投与前は15.0，180

り，悪心の生理学的指標となり得るという説も存

分後は10.7であり，CDDP個体では投与前6.1，

在する 。一方，嘔吐をしないラットにおいては180分後69.6（いずれも単位はng/ml）であった。

血中AVP濃度は増加しなかった 。ラットと同

今回は各処置１頭ずつであったので統計解析は実様，山羊においてもCDDPによって血中AVP濃度

施していないが，やはりCDDP投与によりストレの変化は伴わなかった。嘔吐は脱水症状を引き起スを感じ，伏臥位姿勢になった。

１）

10）

150

A

0 min

240 min

＊＃

100
50
0

Saline

CDDP

30

B

20
10
0

SalineCDDP

Blood OXT level (pg/ml)

200

Blood AVP level (pg/ml)

Blood Cor level (ng/ml)

こすことがあり，嘔吐する動物で悪心に伴って血

30

C

20

10
0

SalineCDDP

Fig. 1 The effects of cisplatin（CDDP）administration on blood levels of cortisol（Cor）（A）,arginine vasopressin（AVP）（B）or oxytocin（OXT）（C）. The same volume of saline was administrated as the control. The blood levels at 240
min after the administration were presented, while the levels at 0 min（just before the administration）were alsopresented only for Cor．
‘＊ ’：significant differed from the results at 0 min within each treatment（p ＜ 0.05），‘ # ’：significant differed from the resultsin the saline administrated control at the same period（p＜0.05）,（repeated measures two way ANOVA）．

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506

令和４年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.41）

3 . 2 . 2 延髄におけるc-Fosタンパク質陽性細胞数ものと考えられた。一方，DMNにおいては嘔吐する動物ではCDDP投与によりFosは増加する

Fosを検出する免疫組織化学法により得られたが 12）ラットでは顕著な反応はなかった 13）。DMN

組織像を，NTSの領域を例としてFig. ２に示し

は迷走神経を介して消化管の運動にかかわる部位

た。Fig. ２において矢印で示したFos陽性細胞のであり，悪心そのものよりも嘔吐を引き起こす役

数を，神経核ごとに数え，Table２に示した。今割があるので，嘔吐動物では反応し，嘔吐をしな

回は１頭ずつの検討であったので統計解析はしてい動物では反応しないのだと考えられた。

いないが，CDDP個体のNTSにおけるFos陽性細胞数は，Sal個体のそれの３倍以上であった。一方，

約

４．要

DMVおよびNAにおけるそれは両個体間で顕著

牛や山羊などの反芻動物は嘔吐反射を持たない

な違いはなかった。NTSは悪心にかかわる部位

ため，これまで「悪心」（気分が悪いこと）を経とされており，嘔吐をする動物であるフェレッ

験するとは考えられておらず，その研究も皆無でトやトガリネズミ（ネズミとついているが齧歯ある。本研究は，反芻動物である山羊において悪目ではなく食虫目） ，嘔吐をしないラットにお心を示す生理学的マーカーを探索することを目的

いてもCDDP投与によりNTSのFos陽性細胞数はとした。特に今回は，悪心を引き起こす副作用の増加する 。このことからも山羊，そしておそら

ある抗癌剤「シスプラチン」（CDDP）を山羊にく他の反芻家畜も嘔吐はしないが悪心は経験する

投与し，その行動学的変化および血中の各種ホル

11）

12）

13）

Fig. 2 The c-Fos protein positive cells in the nucleus of the solitary tract of thesaline（left panel）or cisplatin（right panel）administrated goat. The c-Fos
protein positive cells are indicated with the white arrows. Scale bar＝200μm.
CDDP： cisplatin．

Table 2 The number of the c-Fos protein positive cells in each region of the medulla

oblongata in each goat

Treatment
Saline（control）

Cisplatin

Nucleus of the Solitary Tract

296

1105

Dorsal Motor Nucleus of the Vagus

575

622

Nucleus Ambiguus

40

34

Each data represents the data from one female goat, respectively.

© The Ito Foundation反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索（Ⅲ）

モン濃度の変化を検討した。さらに，CDDP投与
による延髄，特に悪心の発生にかかわるとされている孤束核（NTS）における反応を検討した。
投与後４時間の行動を記録し，また，血中のコルチ ゾ ル （Cor）， ア ル ギ ニ ン バ ソ プ レ ッ シ ン（AVP），オキシトシン（OXT）の濃度を測定した 。そ の 後 ，２ 頭 の 山 羊 を 選 び ，１ 頭 に はCDDP，もう１頭には生理食塩水を投与し，延髄におけるc-Fosタンパク質陽性細胞を計測した。
CDDP投与により，６頭すべての山羊が約120分後に伏臥位姿勢を取った。また，CDDP投与によりストレスマーカーとなる血中Cor濃度が有意に増加した。血中AVP濃度はCDDP投与の影響を受けなかった。一方，統計的に有意ではないがCDDP投与により血中OXT濃度が減少する傾向があった。延髄におけるc-Fosタンパク質陽性細胞数は，悪心の発生にかかわると考えられている部位である孤束核において，CDDP投与をした個
体は生理食塩水投与の個体に比べ顕著に多かった。
これらのことから山羊は嘔吐しないが，CDDP
投与によって確かに悪心を経験するものと思われた。一方，悪心に特異的な生理学的マーカーについては，今回オキシトシンが一つの候補としてあげられたが，今後も探求を続けることが必要である。
文献１） Andrews, P. L. R., Horn, C. C.：Signals for nausea
and emesis: implications for models of uppergastrointestinal diseases, Auton Neurosci, 125, 100～115，2006．
２） Takeda, N., Hasegawa, S., et al.：Pica in rats is
analogous to emesis: an animal model in emesis
research, Pharmacol Biochem Behav, 45, 817～
821，1993．
３） De Jonghe, B. C., Lawler, M.P., et al.：Pica as an507

adaptive response: Kaolin consumption helps rats
recover from chemotherapy-induced illness,
Physiol Behav，97，87～90，2009．
４） Aoyama, M., Negishi, A., et al.：Short-termtransportation in a small vehicle affects thephysiological state and subsequent water
consumption in goats, Anim Sci J, 79, 526～-533,
2008．
５） Hesketh, P. J.：Chemotherapy-induced nausea
and vomiting, N. Engl. J. Med., 358, 2482～2494,
2008．
６） Aoyama, M., Shioya, M., Tsukamoto, Y., Sugita,
S.：The effects of cisplatin, an emetic agent, on
behavior and plasma cortisol levels in goats, Anim
Sci J, doi/10.1111/asj．13607．2021．
７）
 Kenward, H., Pelligand, L., Elliott, J.：Assessmentof low-dose cisplatin as a model of nausea andemesis in beagle dogs, potential for repeatedadministration, Exp. Brain Res., 232, 2685～2697,
2014．
８） Kenward, H., Pelligand, L., Savary-Bataille, K.,
E l l i o t t , J . ：N a u s e a : C u r r e n t k n o w l e d g e o fmechanisms, measurement and clinical impact, The
Vet. J., 203，36～43，2015．
９） Tohei, A., Kojima, S., Ikeda, M., Hokao, R.,
Shinoda, M.：Effects of cyclophosphamide on the
kaolin consumption（pica behavior）in five strainsof adult male rats, J. Vet. Med. Sci., 73, 901～906,
2011．
10） Verbalis, J. G., McHale, C. M., et al.：Oxytocin
and vasopressin secretion in response to stimuli
producing learned taste aversions in rats, Behav
Neurosci，100，466～475，1986．
11） Reynolds, D. J. M., Barber, N. A., Grahame-Smith,
D. G., Leslie, R. A.：Cisplatin-evoked induction ofc-fos protein in the brainstem of the ferret : theeffect of cervical vagotomy and the anti-emetic
5-HT ３ receptor antagonist granisetron（BRL
43694）,Brain Research，565，231～236．1991．
12）
 Ray, A. P., Seetha Chebolu, S., Darmani, N. A.：
Receptor-selective agonists induce emesis and Fos
expression in the brain and enteric nervous systemof the least shrew（Cryptotis parva）, Pharmacol
Biochem Behav，94，211～218，2009．
 Horn, C. C.：Brain Fos expression induced by13）
the chemotherapy agent cisplatin in the rat ispartially dependent on an intact abdominal vagus,
Autonom Neurosci : Basic and Clinical, 148, 76～
82．2009．

© The Ito Foundation

令和４年度助成研究調査一覧

本年度の対象とする研究または調査：
食肉に関する研究または調査（品質・製造加工技術，食品的価値，食品安全，遺伝育種，繁殖，動物
衛生，家畜飼養・飼料など）
単位：千円
研
Ⅰａ

究

課

継続
年数

題

代

表

代表者名

研

究

者

所属機関

助成金額

品質・製造加工技術 （調理加工技術含む）（８件）

調味液浸透肉の電子レンジ加熱硬化特性とその食感品
質に関する研究河野俊夫

高知大学教育研究部
自然科学系農学部門

1,750

加圧CO２ 環境下での酵素加水分解を利用したポーク
ミートエキスの製造法の開発

野間誠司

佐賀大学農学部

1,800

食用ブドウ球菌によるZnPP形成と食肉製品の色調改善効果に関する研究若松純一

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,800

生理的に調節しうる濃度のカルノシンの添加は，鶏肉の匂いを改善するか？

渡邊

源哉

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

900

工業型畜産の課題解決に向けた培養肉の生産技術開発

岡村大治

近畿大学農学部

1,950

乾燥熟成牛肉より分離された真菌の生理特性およびその利用に関する研究中川麻衣

一般社団法人食肉
科学技術研究所

1,050

西村

敏英

女 子 栄 養 大 学
栄 養 学 部

1,400

上田

修司

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,800

神田

英輝

名古屋大学大学院
工 学 研 究 科

1,750

竹之山

愼一

南 九 州 大 学
健 康 栄 養 学 部

1,800

河原

聡

宮崎大学農学部

1,200

細菌のファージ感受性増大およびスーパーファージ作
製に関する研究宮本敬久

九州大学大学院
農 学 研 究 院

1,650

近赤外光と偏光，AIを組み合わせた食肉中の虫およ R3～
び異物検知技術の開発（Ⅱ）

山口堅三

徳 島 大 学ポ ス ト LED
フォトニクス研究所

1,800

高酸素ガス置換包装が食中毒菌の生存性に与える影響
の検証

岡田

彩加

岐 阜 大 学
応用生物科学部
共 同 獣 医 学 科

1,650

ポークソーセージにおけるタンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ）

R3～

黒毛和種牛肉の香り特性の改善に関わる脂質過酸化反応系の解析―コールドチェーン物流の転換に向けた科学的アプローチ―
Ⅰｂ

食肉の食品的価値 （３件）

畜産副生物から作成された再生医療部材の引張強度の解明
食肉加水分解物の栄養機能について（Ⅱ）

R3～

豚のオス臭を形成する臭気成分の分析とそれを記述す
る用語の同定Ⅰｃ

食品安全 （３件）© The Ito Foundation

Ⅱａ

遺伝育種 （８件）

ウシ複合脊椎形成不全症の病態解析とウシの骨格成長に重要な糖鎖の同定（Ⅱ）

R3～

古市

達哉

岩手大学農学部
共 同 獣 医 学 科
実験動物学研究室

1,850

早産を伴う子牛死亡に関連する遺伝的要因の解明
（Ⅱ）

R3～

平野

貴

東 京 農 業 大 学
農
学
部

1,200

近交度の高い金華豚集団の遺伝的多様性に関する評価塩谷聡子

静岡県畜産技術研究所中小家畜研 究 セ ン タ ー

1,600

表型値間因果構造を利用した豚繁殖形質の正確な同時改良手法開発岡村俊宏

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

850

庄司

則章

山 形 県 農 業
総合研究センター
畜 産 研 究 所

2,000

新たに見つかった黒毛和種牛の筋ジストロフィーの病態解明と遺伝的統御法の確立

保田昌宏

宮崎大学農学部

1,300

鶏の暑熱耐性を担うCCKARおよびHSP70遺伝子多型に関する研究福原絵里子

福 岡 県 農 林 業
総 合 試 験 場

1,600

鈴木

洋美

北海道立総合研究機構畜産試験場

1,000

多機能尾部センサを用いた重種馬の分娩予知滄木孝弘

帯広畜産大学グローバルアグロメディ
シン研究センター

2,000

哺乳期の栄養環境が繁殖機能に与える影響髙橋

秀之

九州大学農学部
附 属 農 場1,300

黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立（Ⅱ）

黒毛和種における体型評価部位「肋付き」の客観的評
価手法の開発（Ⅱ）
Ⅱｂ

R3～

R2～

繁殖 （17件）

黒毛和種における不明瞭な発情発生メカニズムの黄体退行の観点からの解明（Ⅱ）

R3～

法上

拓生

農研機構九州沖縄
農業研究センター

950

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討（Ⅲ）

R2～

小山

毅

北海道立総合研究機構畜産試験場

1,700

吉田

智佳子

新潟大学農学部

650

ロボット搾乳システム牛群での発情検知情報と乳汁中
プロジェステロン濃度の推移による鈍正発情牛の検出と授精適期の評価
受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の
確立（Ⅲ）

R2～

久保田

海雄

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

1,700

生殖巣始原生殖細胞を用いた新規家禽遺伝資源保存法の開発（Ⅱ）

R3～

中島

友紀

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

2,000

古山

敬祐

大阪公立大学大学
院獣医学研究科

1,400

ホルスタイン種牛の妊娠期における卵巣予備能維持機
構
抗酸化物資を利用したウシ体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発（Ⅲ）

R2～

日巻

武裕

岐 阜 大 学
応用生物科学部

750

ウシ初期黄体におけるPG抵抗性の解明―低酸素環境による抗アポトーシス機構―（Ⅲ）

R2～

西村

亮

鳥取大学農学部
共 同 獣 医 学 科
獣 医 繁 殖 学

1,700

牛黄体血流の多寡は子宮内膜機能の局所調節に関与するのか？（Ⅱ）

R3～

金澤

朋美

岩手大学農学部
共 同 獣 医 学 科

2,000

小胞体ストレス制御によるウシ体外生産胚の耐凍性向上に関する研究山中賢一

佐賀大学農学部

1,100

乳牛のルーメン内環境が肝臓の炎症を介して繁殖機能に及ぼす影響大滝忠利

日 本 大 学
生物資源科学部
獣 医 学 科 獣医
臨床繁殖学研究室

1,200© The Ito Foundation

平山

祐理

独立行政法人家畜改 良 セ ン タ ー

1,700

山口

昇一郎

福 岡 県 農 林 業
総 合 試 験 場

1,600

松井

基純

帯 広 畜 産 大 学
獣医学研究部門

1,100

鍋西

久

北里大学獣医学部

1,850

南西諸島地域における肉用ヤギの消化管内部寄生線虫
感染症に関する実態調査

波平知之

琉球大学農学部附属亜熱帯フィールド科
学教育研究センター

1,400

遺伝性心筋症による豚の突然死の病態解明と生前検査
法の確立

相原

尚之

麻布大学獣医学部

1,400

安藤

清彦

農 研 機 構動物衛生研究部門

1,500

豚熱ウイルス受容体候補タンパク質の網羅的探索池田圭吾

農 研 機 構動物衛生研究部門

1,400

Clostridium novyi sensu lato の新しい鑑別法の開発へ向けた国内家畜由来株のゲノム解析

高松大輔

農 研 機 構動物衛生研究部門

2,000

ブタ呼吸器複合感染症の原因ウイルスを解析する新たな in vitroモデルの確立

宮澤

光太郎

農 研 機 構動物衛生研究部門

1,500

牛呼吸器病症候群（BRDC）の悪化におけるバイオ
フィルム形成の関与

帆保誠二

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,500

畜産農場に生息するハツカネズミの免疫関連遺伝子の多様性と病原体媒介能力

高島康弘

岐 阜 大 学
応用生物科学部

1,400

牛マイコプラズマによる気管傷害と細胞内侵入過程の
解明

平野

佑気

北海道立総合研究機構畜産試験場

1,800

黒毛和種牛における血液中のビタミンDの状況把握と牛におけるビタミンDの免疫賦活作用および抗炎症作
用の検討

乙丸

孝之介

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

800

牛呼吸器病ウイルスの鼻咽頭関連リンパ組織におけるウイルス増殖と病態解析

平井卓哉

宮崎大学農学部

2,000

中川

敬介

岐 阜 大 学
応用生物科学部
共 同 獣 医 学 科

2,000

ウシRSウイルス研究に最適な細胞株の樹立

齊藤暁

宮崎大学農学部

1,300

ライフサイクルに応じたパイエル板の機能解明と制御
因子の探索

古川

睦実

東北大学大学院
農 学 研 究 科

2,000

岡村

雅史

帯 広 畜 産 大 学
獣医学研究部門

1,900

地方病性牛伝染リンパ腫発症牛におけるゲノムワイド
なDNAメチル化解析

前澤誠希

東京大学大学院
農学生命科学研究科

1,400

ブタにおける医薬品の適正使用に向けた薬物代謝酵素
の解析

宇野

泰広

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,500

飼料費低減に向けた低硝酸態窒素と高粗タンパク質を両立する夏季牧草の窒素管理技術

林征幸

農研機構九州沖縄
農業研究センター

700

筋肉タンパク質合成・分解を制御する植物性成分による畜肉生産の向上研究

佐藤

隆一郎

東京大学大学院
農学生命科学研究科

1,700

豚胚品質の客観的評価法の確立に関する研究
機能性脂肪酸を活用した黄体機能強化による乳牛繁殖
成績改善技術の確立（Ⅱ）

R3～排卵後早期の卵巣形態と性ステロイドホルモンバラン
スがウシ子宮の免疫機能に及ぼす影響
黒毛和種雌牛の繁殖成績を改善するための栄養状態の最適化検討（Ⅱ）Ⅲ

動物衛生 （17件）

牛伝染性リンパ腫ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する宿主たんぱく質の同定（Ⅲ）

イノシシにおける豚コロナウイルスの感染実態調査（Ⅱ）

サルモネラ鶏卵汚染・介卵感染に寄与する鶏卵巣での菌・宿主細胞間相互作用の解明（Ⅱ）

Ⅳ

R3～

R2～

R3～

R3～

家畜飼養，飼料など （23件）© The Ito Foundation

母体の乳生産性向上による効率的な肥育を目指す基礎的研究（Ⅱ）

R3～

津上

優作

広島大学大学院
統合生命科学研究科

950

寒地型多年生牧草採草地が1年生イネ科草種（自生イ
タリアンライグラス―イヌビエ・メヒシバ）交代植生 R3～に遷移する気候・土壌要因の解明と飼料価値の評価
（Ⅱ）

池田

堅太郎

農研機構九州沖縄
農業研究センター

1,000

骨格筋の成長と炎症予防（抑制）を目的としたPGC-
1αアイソフォームの発現制御に関する研究

實安隆興

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,100

畜産動物の脂肪酸味覚受容体の機能解析吉田悠太

茨城大学農学部
食 生 命 科 学 科

1,600

衛星コンステレーション画像の時系列深層学習による低コストな飼料用トウモロコシ収量予測手法の開発

小花和

宏之

農研機構北海道
農業研究センター

1,850

西本

完

農 研 機 構食 品 研 究 部 門

1,850

暖地で冬期に高品質な粗飼料を生産するイタリアンラ
イグラス夏播き栽培技術の開発

加藤直樹

農研機構九州沖縄
農業研究センター

800

和牛向け稲発酵粗飼料および発酵完全混合飼料を厳冬期でも高品質調製するための新規乳酸菌の添加効果の
検証

遠野

雅徳

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

2,000

生時低体重でも生後発育回復できる子豚は何が違うのか？―血液指標の探索―

中島郁世

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

1,800

矢用

健一

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

1,700

ニワトリヒナに備わる抗炎症能力の解明～抗酸化能に
注目して～

橘

哲也

愛媛大学大学院
農 学 研 究 科

1,800

沖縄アグー豚育成豚における飼料中のタンパク質水準の違いが増体および背脂肪厚の発達に及ぼす影響

普照恭多

沖縄県農林水産部
畜産研究センター

1,350

深澤

充

東北大学大学院
農 学 研 究 科

1,850

暑熱ストレス下におけるニワトリ筋タンパク質分解に対するL-シトルリンの新規機能の解明

スルチョードリ・ビジュワジット

九 州 大 学基 幹 教 育 院

1,450

子牛における乳糖不耐性に関する研究

福森理加

酪 農 学 園 大 学
獣 医 学 群1,900

暖地型牧草・芝草におけるゲノム編集による冬期常緑性新規育種素材の開発

権藤崇裕

宮 崎 大 学
フロンティア科学
総合研究センター

1,700

南九州における暖地型牧草の新規調製“霜熟”の開発―晩夏播きパールミレット霜枯れ草の収量，サイレー
ジ品質と選好性―石井康之

宮崎大学農学部

1,000

高品質な豚肉生産のためのエゴマ搾り粕の利用に関す
る研究

田島

茂行

愛 知 県 農 業
総 合 試 験 場

1,600

ルーメン細菌叢制御を目指した子ウシ唾液抗体の分泌
機能の解明

鈴木

裕

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,700

多機能性因子の合成を介した筋衛星細胞による自律的な筋肥大誘導機構の解釈を利用した新プラットフォー
ムの形成

鈴木

貴弘

九州大学大学院
農 学 研 究 院

1,700

食肉処理場から排出される牛ルーメン液の潜在的資源
価値の具現化～メタン発酵技術を用いた肥料化の検討～阿部憲一

新潟食料農業大学
食 料 産 業 学 部

1,700

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家
畜腸内細菌叢改善効果の検証（Ⅲ）

子牛用疑似グルーミング装置利用モニタリングによる健康状態評価手法の開発（Ⅱ）

睡眠様姿勢一肉用牛の生産性およびウェルフェアの新
たな行動指標の検討（Ⅱ）

合

計

R2～

R3～

R3～

79件

120,000© The Ito Foundation

伊藤記念財団賞© The Ito Foundation

515

山

田

知

農研機構西日本農業研究センター

哉
上級研究員

〔業績の課題名〕

肥育牛におけるアディポジェネシス制御機構の解明に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
脂肪組織が成長する一連の過程は，「アディポジェネシス」と総称される。肉牛では蓄積部位によって脂肪の経済価値が大きく異なることから，ウシ品種や給与飼料の特性に応じた牛肉生産を考える場合
において，蓄積部位別に脂肪組織成長能力を的確に把握することが重要となってくる。しかし，脂肪部
位別のアディポジェネシス制御機構の詳細に関しては，ヒトや実験動物を含めこれまで不明であった。
受賞者は研究代表者として６件の伊藤記念財団研究助成金採択を受けて，肥育牛におけるアディポジェ
ネシス制御機構の解明に関する一連の研究を実施し，以下の成果をあげた。
（１） 脂肪細胞分化制御因子が肥育牛のアディポジェネシスに及ぼす影響
脂肪細胞分化制御因子が肥育牛のアディポジェネシスに及ぼす影響を検討した結果，肥育の進行に伴い脂肪細胞における分化促進因子C/EBPファミリーの発現が増加することを見いだした。また脂肪蓄積能力の高い黒毛和種は，C/EBPファミリーの発現がホルスタイン種より高いことを明らかにした。
給与飼料の影響を検討した結果，粗飼料多給区と比較し，濃厚飼料多給区ではC/EBPファミリーの発現が増加していることを見いだした。さらに，脂肪蓄積部位によって分化制御因子の発現量が異なっており，発現量と脂肪細胞の肥大化間に相関があることを明らかにした。
（２） 免疫細胞が肥育牛のアディポジェネシスに及ぼす影響
免疫細胞が肥育牛のアディポジェネシスに及ぼす影響を検討した結果，内臓脂肪では皮下脂肪より免
疫細胞浸潤が増加しており，組織の炎症や老化が進行していること，細胞老化促進因子であるｐ53遺伝
子が脂肪組織の炎症や老化を制御していることを明らかにした。さらに，ウシ品種差の影響を検討した
結果，黒毛和種では内臓脂肪における組織の炎症ならびに組織老化がホルスタイン種より亢進しており，内臓脂肪への免疫細胞浸潤亢進に伴って内臓脂肪での脂肪蓄積能力が低下し，余剰エネルギー蓄積部位が筋肉内脂肪部位に遷移する新たな筋肉内脂肪の蓄積制御機構を見いだした。
（３） メタボロミクス解析を活用した肥育牛のアディポジェネシス制御機構の研究
メタボロミクス解析は，これまで主に医学分野において，疾病特異的なバイオマーカーの同定を目的として用いられてきた。そこで，肥育牛の筋肉内脂肪蓄積能力に関連するバイオマーカーを同定するため，筋肉内脂肪蓄積能力の大きく異なる黒毛和種とホルスタイン種肥育牛を用いて，血漿および筋肉内
脂肪細胞のメタボロミクス解析を実施した。その結果，脂質合成や脂肪酸代謝およびグルコース代謝等に影響している代謝産物を，肥育牛の筋肉内脂肪蓄積能力に関連する血中および脂肪細胞中のバイオマーカーとして同定することに初めて成功した。

© The Ito Foundation

516

鍋

西

久

北里大学獣医学部動物資源科学科

准教授〔業績の課題名〕

家畜に及ぼす熱環境の影響評価と対策技術の開発ならびに畜産分野へのICT 導入に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕（１） 肉牛生産における熱環境の影響評価と対策技術に関する研究
気候変動に伴う熱環境変化による生産性低下が大きな問題となるなか，肉牛生産現場において温暖化適応策を実践するための技術情報は著しく不足していた。そこで，熱環境指標として温湿度指数（THI）に着目し，大規模な野外調査データをもとに解析することで，生産現場における子牛の生産性，雌牛の繁殖性に及ぼす熱環境の影響を明らかにした。子牛の生産性に対する熱環境要因として，THIと疾病発
生件数，発症疾病との関係性を見出し，発育については，出生後３ケ月と４～６ケ月間で寒冷・暑熱に対する反応性に違いがあることを示した。これらの知見は，発育ステージに応じた適切な飼養管理対策（寒冷・暑熱）に寄与するものである。肉用繁殖雌牛における人工授精のTHIと受胎率との間に明瞭な関係性があることを明らかにし，THIが低い場合に受胎率が有意に低下することを示し，同様の現象を胚移植成績でも確認した。この要因として，寒冷時におけるエネルギー充足率の不足に起因する卵子の品質低下の可能性を示唆し，その後の経腟採卵による研究で寒冷時の卵子品質の低下を確認した。寒冷時の受胎率低下を報告した初めての論文であり，冬期における飼養管理の重要性が広く認識されることとなった。また，重要な肉牛生産基盤である乳牛の繁殖性に対する熱環境の影響評価についても研究を進め，夏季受胎率低下の現状と要因解明に取り組んだ。暑熱期の体温日リズムを再現した培養系で，暑熱負荷が卵母細胞の成熟に及ぼす影響を検証し，暑熱負荷によって核成熟とその後の胚発生を阻害することを証明し，酸化ストレスの関与を明らかにした。
（２） 畜産分野への情報通信技術（ICT）の導入に関する研究
我が国の肉牛生産においては，生産基盤強化を図るうえで繁殖成績改善，子牛の事故率低減および労働負担の軽減が重要な課題である。これらの課題を解決するため，早くから畜産分野へのICT導入に関する研究に取り組み，飼養管理の効率化を目的とした研究を展開してきた。大規模な繁殖履歴データを詳細に解析した研究において，分娩間隔が延長している繁殖経営では，発情発見効率を改善することが，分娩間隔短縮の近道になることとあわせて繁殖管理の重要性を示した。そこで，中小規模経営でも導入しやすい安価で普及性が高い発情発見装置を開発するとともに，当時では初となる繁殖管理用スマートフォンアプリを開発した。肉牛生産における分娩事故は，収益面だけではなく飼養者の精神面にも影響を及ぼす。さらに，昼夜を問わない監視作業が大きな労働負担となっている。そこで，遠赤外線カメラと画像認識技術の活用による分娩前兆候検出について検討を行い，非接触手法で肉用牛の分娩前兆候を検出できることを明らかにした。これは現在大いに注目されている畜産におけるICT導入の基本技術の一つとなっている。

© The Ito Foundation

517

竹之山

愼

南九州大学健康栄養学部

一教授〔業績の課題名〕

機能性に基づいた食肉の付加価値向上および持続可能な食肉生産に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
食肉・食肉製品は我々の食生活では必要な脂質，タンパク質，ビタミン，ミネラル等の重要な供給源であり，これらの栄養特性，機能性に関する研究は最重要課題である。生活習慣病等との関連から健康に対して消費者に負の影響を与えがちな食肉・食肉製品において，機能性脂肪酸である共役リノール
酸，食肉加水分解物における機能性向上に関する研究を行ってきた。さらに，食肉生産における食品副産物の有効利用を目的として，食肉の栄養特性の研究について継続的に行っている。その研究は以下の（１）～（３）に大別される。
（１） 食肉・食肉製品の共役リノール酸に関する研究
食肉・食肉製品の摂取は，生活習慣病や肥満等との関連から，健康に対して負の影響を与えると考えられている。一方で，反芻動物の乳・肉中に見出された共役リノール酸（conjugated linoleic acid：
CLA）が抗ガン作用等を有することが明らかとなった。いち早くCLAに注目し，その簡便な定量法を確立するとともに，食肉・食肉製品や乳製品中のCLA含量を報告した。それらの報文において，反芻
家畜由来の食肉製品，乳製品にCLAは多く含有され，発酵や給与飼料の相違により含量が増減することを示した。
（２） 食肉タンパク質の機能性に関する研究
近年，タンパク質摂取が高齢者の運動機能低下の予防や，スポーツ選手の筋力維持，向上につながることから食肉由来タンパク質への期待が高まっている。直接タンパク質を摂取するのではなくタンパク
質を酵素分解した食肉酵素加水分解物由来の機能性について研究し，DPPHラジカル消去活性，ACE阻
害活性が上昇することを示し，食肉製品摂取が健康の維持増進に重要であることを示した。
（３） 食品副産物の給与により生産された食肉の品質に関する研究
食肉生産性や飼料自給率の向上，飼料コスト削減，さらに付加価値向上は，日本の畜産業が抱える恒久的な課題である。食品製造残渣等の有効利用による課題解決を目的として，南九州地域とくに宮崎県
で多量に排出されるカンショ茎葉，ワイン搾汁残渣，ヘベス搾汁残渣，焼酎粕残渣の家畜飼料（エコフィード）化に勢力的に取り組んでいる。とくに，エコフィードの給与が肉質や肉の栄養特性に及ぼす影響について数多く検討し，それぞれの素材が飼料として利用可能であること，そして肉質・栄養特性等向上させる可能性があることを示した。

© The Ito Foundation

学会等事業助成© The Ito Foundation

521

令和４年度学会等事業助成実施報告書
市民公開講座『ジビエにおける食品衛生上の問題点―寄生虫汚染を中心に―』に関する開催報告
公益社団法人日本獣医学会

代表理事

猪熊

壽（東京大学）〔開催主旨〕
我が国の高齢化や産業構造の変化，特に農業就業者の減少の結果，野生動物が増え，さらに農産物被害が深刻化している。政府は野生動物の駆除とともに，駆除した野生動物の利活用を推進した。その利活用のひとつとして，ジビエ（野生動物の肉）としての利用があげられる。最近では，ジビエが市場に出回ることが多くなり，スーパーマーケット等でも牛肉や豚肉のとなりに，イノシシ肉やシカ肉も見かけるようになった。しかし，「と畜場法」という法律の下で１頭ごとに獣医師による検査（と畜検査）が行われる家畜とは対照的に，野生動物を対象とした検査は実施されていない。さらに，衛生的な飼育管理が行われる家畜とは異なり，野生動物は自然界でさまざまな病原体に感染している可能性が高い。
したがって，ジビエは，一般的な牛肉や豚肉よりも消費者に健康被害をもたらすリスクが高いと言える。
実際，ジビエを原因とした食中毒の事例は，日本でも数多く報告されている。一方で，ジビエの喫食がもたらすリスクを正確に理解し，正しく調理をすることで食中毒を効果的に予防することが可能である。そこで今回の市民公開講座では，ジビエの食品衛生，特にジビエの寄生虫汚染とその対策について理解を深める目的で，４名の専門家を招き，イノシシ・シカの肺吸虫症，シカにおける住肉胞子虫寄生，イノシシ・シカの病原細菌保有状況に関して講演いただいた。
今回の公開講座が一般市民の方々に獣医学に関心を持っていただき，獣医学の社会貢献についてご理解いただける契機となること，さらにジビエに携わる関係各位，消費者が食品衛生についてご理解を深めるための一助となることを祈念する。
〔開催概要〕
令和５年２月４日（土曜日）13：00－17：00 に現地講演およびZOOMライブ配信を併用した「ハイブリッド方式」にて，一般市民を対象とした市民公開講座を開催した。事前に327名の申込があり，当日の参加者は265名（現地参加29名，オンライン参加236名）であった。
また市民公開講座の講演内容は動画に編集し，本学会HPにて，同年３月31日まで一般に無料公開した。さらに，講演内容については小冊子にまとめ，現地参加者に配布するとともに，本講座開催の記録とした。
〔市民公開講座プログラム〕「ジビエにおける食品衛生上の問題点―寄生虫汚染を中心に―」© The Ito Foundation

522
座長：森田幸雄（麻布大学獣医学部 教授）
伊藤直人（岐阜大学応用生物科学部 教授）
１．開会挨拶
２．講演１

猪熊壽（公益社団法人日本獣医学会 理事長）

イノシシの肺吸虫症

講師：入江隆夫（宮崎大学農学部 准教授）
３．講演２

シカの肺吸虫症

講師：松尾加代子（熊本県阿蘇保健所衛生環境課，岐阜大学応用生物科学部 客員獣医系教授）
４．講演３

シカにおける住肉胞子虫の保有状況

講師：山崎朗子（岩手大学農学部 助教）
５．講演４

野生鳥獣における病原細菌保有状況

講師：壁谷英則（日本大学生物資源科学部 教授）
６．総合討論〔講演概要〕
講演１「イノシシの肺吸虫症」
講師

入江隆夫（宮崎大学農学部 准教授）

肺吸虫症は，かつては「肺ジストマ症」と呼ばれ，国内で30－50万人が感染していたと推定される国民病であった。その後，集団検診・集団駆虫により患者数は激減したが，近年でも，年間50例ほどの肺吸虫の症例がかつての流行地域を中心に散見されている。ヒトが肺吸虫に感染すると，感染後３～４週間ほどで胸膜炎による胸水貯留や気胸による胸痛などが出現する。その後，発咳や血痰などといった呼吸器症状が認められる。これらの症状だけでは診断が困難な場合も多いため，「食歴」の情報が診断において非常に重要となる。
ヒトやイヌなど終宿主への感染は，第二中間宿主（淡水産カニ）体内のメタセルカリア，もしくは待機宿主であるイノシシ体内の幼若虫の経口摂取により起こる。特にイノシシについては，狩猟および有害捕獲による捕獲頭数が年々増加しており，令和３年度は，イノシシの感染症（豚熱）の影響もありやや減少したものの，年間53万頭ものイノシシが捕獲され，このうち一部は食用流通している。食用として販売されていた九州産イノシシ肉の33％からウエステルマン肺吸虫の幼虫が検出された報告があることから，イノシシ肉を介した肺吸虫感染のリスクに注意が必要である。イノシシ肉の摂食に際しては，冷凍処理または加熱調理を徹底することが肺吸虫症の予防対策として有効である。
講演２「シカの肺吸虫症」
講師

松尾加代子（熊本県阿蘇保健所衛生環境課，岐阜大学応用生物科学部 客員獣医系教授）

肺吸虫はその名のとおり，肺に寄生する丸い豆のような形をした吸虫である。肺に寄生した場合，症状として胸の痛み，息苦しさ，血液まじりの痰などの呼吸器症状が認められる。脳に寄生した場合は，痙攣，嘔吐，麻痺，視覚障害などの神経症状が出現する場合もある。人は，メタセルカリアと呼ばれる幼虫が寄生したサワガニやモクズガニなどの生食や，感染カニを捕食したイノシシなどの筋肉に潜んだ幼虫を食べることで感染する。一方，シカ肉を食べて肺吸虫に感染した患者が約20年前から多数報告さ© The Ito Foundation

523
れている。当時，草食のシカがサワガニを捕食するとは信じられていなかったが，講師は岐阜県で捕獲された肺吸虫抗体陽性のシカの胃内容物にサワガニが含まれることを証明した。シカ肉も肺吸虫の感染源となることが判明した今日，十分な加熱調理による予防がきわめて重要となっている。特に，重症化しやすい子供，妊婦，高齢者などはシカの生肉や加熱不十分な肉を摂食しないよう十分に注意する必要がある。
講演３「シカにおける住肉胞子虫の保有状況」
講師

山崎朗子（岩手大学農学部 助教）

最近，2011年に報告された馬刺の食中毒事例で新規食中毒起因微生物として発見された住肉胞子虫
Sarcocystis sp．が野生ニホンジカにも寄生していることが分かり，2014年に馬刺同様シカ肉の生食で食中毒事例を起こした。野生動物であるニホンジカは，広範囲を行き来しながら複数の家畜生息域と接触することが考えられ，すでにウシとも接触していると考えられる。このように，野生ニホンジカに寄生している住肉胞子虫はジビエ喫食時のリスクに加え，家畜への感染源となる可能性も想定される。しかし，これまでに報告された疫学研究は，調査地域の偏りや，検体数の数などの点からも十分でないう
えに，寄生量についての調査は詳細に行われていなかった。そこで本研究では，全国規模での野生ニホ
ンジカにおける住肉胞子虫の寄生量に重点を置いた疫学調査を行った。その結果，住肉胞子虫の寄生数
は性別や加齢でなく，生息地域に依存することが示唆された。ただし，生息地間で認められた寄生量の相違は，宿主であるニホンジカの種類に依存するものか，シカの生息地に分布している住肉胞子虫の種類によるものか，複数の可能性がある。
ウマに寄生する住肉胞子虫とシカに寄生する住肉胞子虫は種が異なるため，毒性についても異なることが予想される。毒性の差異は，強度，性質，作用機序など，多数の点での違いが想定されるため，毒性解明を目的とした比較毒性研究が期待される。毒性解明の結果を基にした，効果的な無毒および減弱化の処理法を構築することは，安全なジビエの流通に大きく貢献できる。
講演４「野生鳥獣における病原細菌保有状況」
講師

壁谷英則（日本大学生物資源科学部 教授）

現在，野生のシカやイノシシと人が接触する機会は以前に比べ格段に増加しており，実際にジビエを原因とするさまざまな人獣共通感染症の事例も散発的に報告されている。しかしながら，シカ，イノシ
シなどのジビエは，と畜場法によると畜検査の対象外であり，わが国のシカ，イノシシ由来の各種人獣共通感染症に関するリスク評価ならびにリスク管理は，必ずしも十分行われていない。
野生鳥獣を食用として利活用する際の人への危害要因を整理するには，①経口感染（食肉の喫食による感染），②創傷感染，③ベクターによる感染，の３つの感染経路を想定する必要がある。今回の講演
では，特に講師らが研究を進めているシカやイノシシを原因とする人獣共通感染症について，上記感染経路別に，疫学情報および感染事例を中心に概説した。具体的には，経口感染する細菌として，
Campylobacter属菌，Salmonella属菌，志賀毒素産生大腸菌を例として，国内外のシカやイノシシにおける保有状況について説明した。また，ベクター媒介性感染，創傷・接触感染する細菌として，豚丹毒菌，Bartonella属菌を例としてシカやイノシシにおける流行状況に関して解説した。
捕獲された野生鳥獣を有効に活用するため，食肉に利用する試みが進められている。厚生労働省は© The Ito Foundation

524「野生鳥獣肉の衛生管理に関するガイドライン」を策定，令和２年５月には一部改正し，野生鳥獣肉の衛生管理の徹底を推進している。一連の食肉処理工程における糞便や土壌からの細菌汚染防止のため，衛生的な処理方法を啓蒙していく必要がある。しかしながら，野生鳥獣の場合，糞便，土壌汚染を完全に排除しても安全とは言えない。野生鳥獣肉は十分な加熱が必須であることを改めて強調したい。

© The Ito Foundation

525

日本食肉科学会
日本食肉科学会

前理事長

令和４年度事業助成実施報告坂田亮一（麻布大学名誉教授・明治大学客員研究員）

１．はじめに
標記の事業の項目として，（公財）伊藤記念財団から今回の助成を受けたのは，（１）第68回国際食肉科学技術会議（ICoMST2022，令和４年８月神戸開催，日本食肉科学会主催）の運営助成，（２）国内における学会大会での特別セミナーの助成（外国人研究者の招聘講演，大会の補助など）である。
昨年８月に実施された（１），それに伴うICoMST2022組織委員会の活動，および今年３月に行った（２）まで，各項目の実施内容を順次報告するが，これらの助成を受けた「日本食肉科学会」の概要について以下に記す。
２．日本食肉科学会の概要
本学会（以下，本会）は昭和34年（1959年）４月に「日本食肉研究会」として発足し，食肉に関する分野について広く学界，業界，団体関係者がお互いの研鑽の場として，学術と産業の発展を目指し，活動を行ってきた。本会では毎年，学術講演会の開催ならびに会誌として「食肉の科学」を発行している。
大会は通常，日本畜産学会大会の開催に合わせて春に実施され，食肉および食肉加工に関連する分野のエキスパートによる特別講演ならびに会員による研究発表を行い，活発な意見交換がなされてきた。これらの研究発表要旨ならびに，総説，解説，海外事情，最近の文献紹介などが「食肉の科学」に満載されている。
本会は，2021年度から「日本食肉科学会」に改称・改組した。その理由は，2022年８月に神戸で開催される第68回国際食肉科学技術会議を成功させるために産官学からの会員が一体となって内部強化を図ること，また関係諸方面に主催団体の理念と活動内容をアピールするためにも，学会化は必須であるとの会員の総意を受けてのことである。この学会化にあわせて本会が発行している「食肉の科学」のバッ
クナンバーすべてを電子化し，会員は全巻をオンラインで閲覧が可能となった。
本会の会員数は，本年２月28日現在で，正会員182名（前年181名），学生会員４名（前年８名）賛助
会員３社（前年５社），特別会員29社（前年29社），法人６団体（新設），名誉会員７名（前年８名），功労会員６名（新設）である（令和５年度の総会資料より）。
３．今回の助成結果（１） 第68回国際食肉科学技術会議（ICoMST2022，令和４年８月神戸開催）の補助
国際食肉科学技術会議，通称ICoMSTは毎年８月中旬に世界各地で開催され，日本食肉研究会の時代
より会員から１名を派遣してきた。また，その際に行われる各国代表者会議にも出席し，すべての会議
出席報告を本会機関誌の「食肉の科学」に掲載し，会員に周知してきた。伊藤記念財団からこの海外派
遣事業の補助も受けるようになり，2022年に神戸で開催される68回会議（ICoMST2022）に向けてその© The Ito Foundation

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４年前に本格的に組織委員会を立ち上げ，本事業助成の始まった2019年の第65回会議（ドイツ，ポツダ
ムで開催）には本会から会員４名が参加した１）。
その後，世界中で新型コロナウイルスの感染拡大という想定外の事態が生じ，2020年８月米国フロリダ州オーランドでの国際会議（第66回大会）では，急遽オンラインの開催となったが，我々組織委員会
として，この海外派遣事業の補助を活用し，ICoMST2020に大いに参加を呼びかけた。その結果，人数は30名にのぼり，これは主催の米国に次ぐ人数であった２）。
本来，顔と顔を合わせ１週間近く一緒に同じ空気を吸うことで，学術上の意見交換が保たれ国際的な人的交流も図られるのがこの会議の伝統であり特徴である。2021年の第67回大会はポーランドのクラク
フで開催され（ハイブリッド形式），第68回大会委員長として坂田が実参加し現地で各国代表会議にも出席し，日本開催の広報活動を行った。アジア地域から唯一の実参加でもあった。また我が国から組織委員会委員の大半がこの会議にリモート参加し，次の会議を主管する立場として情報収集に努めた３）。
ICoMST2022組織委員会は2020年からピッチを上げてほぼ２か月ごとに会議を開き，そこで活発な意
見交換を行ってきた。農林水産省，厚生労働省ならびに各種食肉関連団体，学会等から後援を得ており，作成した趣意書を関連企業や団体に配布し，協賛金の依頼活動を展開した。そのためにNews Letterも発行し，組織委員会活動の広報に努めた。図は会議終了時に会場で配布したもので，ここまで合計10回
作成している（図１，２）。
会議の開催内容は，「食肉の科学」第63巻２号４）を参照いただきたい。コロナウイルス感染が収まらない中で，ICoMST国際本部（アイルランド）と連携し，神戸国際会議場を基点に現地およびWeb開催とし，種々難航しながらも無事終了した。参加国は32か国，参加者は300名強あり，伝統あるこの国際

図１ ICoMST2022 会 議 の 最 後 に 配 布 し た News LetterNo. 10の表頁

図２ ICoMST2022会議News Letter No. 10の２頁目© The Ito Foundation

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会議の名を汚すことなく遂行できたことに組織委員会一同安堵し，次の会議を開催国のイタリアに引き継いだ。
なお，この国際会議の開催運営の記録を残し，後世に伝えるために記念誌の作成を会議終了後に開始し，令和５年に発行予定で編纂作業を進めている。
（２） 国内における学会大会での特別セミナー（外国人研究者の招聘講演など）の助成
日本食肉科学会の第64回学会大会を，2023年３月25日に日本獣医生命科学大学で開催した。この大会
ではオンラインに頼らず，すべて対面で行った。このような大会様式は４年ぶりのことであったが，参加者で会場の大講義室はほぼ埋まり，まず若手優秀発表（７演題）と一般発表（５演題）で，活発に質疑応答が行われた。
特別講演として，令和３年度伊藤記念財団賞の受賞講演を上田修司会員（神戸大学）が行った（図３）。本講演は『畜産物の品質評価，付加価値の向上に向けたメタボロミクス技術の応用に関する研究』と題され，前回の本財団賞受賞者の酪農学園大学の岩崎智仁会員を座長として，進められた。
その受賞講演では，生体内に含まれる代謝物（糖質，アミノ酸，有機酸，脂肪酸）の網羅的解析（メタボロミクス）が目まぐるしく進歩していくなか，畜産分野において畜産物の品質評価や付加価値の向上に向けたこれまでの上田会員の取り組みについて紹介された。メタボロミクス技術により食肉品質の特徴となる代謝物を見つけ出し，その点を深く追求する一連の研究過程が説明された。畜産物加工や食肉流通に貢献していきたいとの今後の研究展望も述べられ，さらなる研究の発展が期待される。
続いて海外からの特別講演で，ICoMST2023イタ
リ ア 代 表 の Dr. Antonella Dalle Zotte（Padova， Traditional
University 教 授） を 招 き （図 ４）
Italian meats and cold cuts ： a valuable support
for economic sustainability and/or animal
biodiversity（伝統的なイタリアの食肉と冷製食肉

図３ 令和３年度伊藤記念財団賞受賞の上田修司会員による特別講演

加工品：経済的持続可能性と動物の多様性）と題した講演が行われた。講演冒頭に，今年８月20～25日にイタリアPadovaで開催されるICoMST2023について熱のこもった紹介があった。会議の開催方式
は ，コ ロ ナ 禍 以 前 の 対 面 形 式 に 戻 っ て 行 い ，ICoMST国際事務局長のDr. Troy Declan（アイルランド，昨年神戸での会議にも現地参加）を司会としたパネルディスカッションなどを特徴としたプログラムが予定され，テクニカルツアー内容も充実していることが伝えられた。

図４ ICoMST2023開催のイタリア代表
Prof. Antonella Dalle Zotteを招聘し特別講演実施© The Ito Foundation

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本講演では，まずイタリアの食肉生産・消費に関して日本と比較しながら紹介があり，鶏肉・豚肉・牛肉・馬肉の生産・消費の規模は日本と大きく変わらないが，ウサギ，ウズラが異なる点であることが紹介された。２つ目として，イタリアの特徴的な食肉消費である，white veal，馬，ウサギ，ウズラ，
冷製食肉加工品について説明があった。最後にまとめとして，伝統的なイタリアの食肉と冷製食肉加工品は経済的重要性が高く（300億ユーロ／年），伝統的な製造では小規模農家が必要で持続可能な農業にも貢献していることに加え，地中海食ピラミッド（赤肉を２回未満／週，冷製食肉加工品１回未満／週を摂取）が紹介され，イタリアのバランスの良い食構成の中の食肉の位置づけについても確認された。
コロナ禍の中，昨年までライブ配信で海外からの講演を行ってきたが５），今回のように海外の研究者を招聘し実際に接することで，講演者との距離が大いに縮まり，交流の輪が拡がり，本学会の国際化を大いに振興している。お互いに前もって顔合わせすることで，今年のICoMSTにも日本の研究者が参加しやすくなり，今後もこのようにトップの外国人研究者の招聘を本助成事業で継続する所存である。
４．おわりに（公財）伊藤記念財団からの学会等学術団体への活動助成は今年で８回目となった。平成30年度まで
順調に学会大会を開催し，外国人研究者の招聘等を実施することができた。しかし，その後の予期せぬ新型コロナウイルスの流行・蔓延により，大会の中止に至るなど混乱を極めた。このパンデミックの中で，リモート方式を駆使し，神戸での国際会議を実施できたことは歴史的な出来事で，本会を運営する
上でも大きな進歩と言える。本学会での助成事業で培ってきた英語でのコミュニケーションが，神戸での国際会議で実証できたことは，この助成による大きな成果であると感謝する。
本会は，研究会から学会となってまだ間もなく，学術団体として種々見直しをはかる課題を有している。例えば，学術会議協力団体加盟を目指すことや，従来春に学会大会を開催してきたものを今後どう行うか（関連学会として畜産学会大会の実施変更に伴い）など，現在ワーキンググループを立ち上げ，検討を諮っている。SDGs，動物福祉など食肉を取り囲む情勢は刻々と変化しており，学会として新しい課題を目指す必要があり，常に活性化が求められる。そのためにも本会の事業への御理解と御支援を願う次第である。
ここに，多大なる助成をいただいている（公財）伊藤記念財団に深謝し，引き続き本助成の増強を日
本食肉科学会として衷心よりお願い申し上げます。
参考資料１）
 坂 田 亮 一 ，山 之 上 稔 ，若 松 純 一 ，本 山 三 知 代 ，林 利 哉 ，他 参 加 者 12 名：第 65 回 国 際 食 肉 科 学 技 術 会 議（ICoMST2019）に出席して，食肉の科学，60（2），203～217，2019．
 坂田亮一：日本食肉研究会への平成31年度・令和元年度事業助成実施報告，令和元年度食肉に関する助成研究調２）
査成果報告書，Vol. 38，443～447，2020．
３）
 坂田亮一，松石昌典，有原圭三，水野谷 航，早川 徹，他参加者30名：第67回国際食肉科学技術会議（ICoMST2021）に参加して，食肉の科学，62（2），145～177，2021．
 坂田亮一，松石昌典，佐々木啓介，琴浦 聡，他参加者44名：第68回国際食肉科学技術会議（ICoMST2022）を開４）
催して，食肉の科学，63（2），141～165，2021．
５） 坂田亮一：日本食肉科学会 令和３年度事業助成実施報告，令和３年度食肉に関する助成研究成果報告書，Vol．
40，494～497，2022．

© The Ito Foundation

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令和４年度事業実施報告書
日本畜産学会第 130 回大会 公開シンポジウム「未来をになう Animal Science の発展と展開」
公益社団法人日本畜産学会

理事長

小澤壯行（日本獣医生命科学大学）〔日時〕2022年９月17日（土）13：30～18：30〔会場〕東京農業大学農学部トリニティホールおよびZoom中継教室（学内関係者）
Zoomによるライブ配信（大会参加者）
YouTubeによるライブ配信（一般）〔主催〕公益社団法人日本畜産学会〔企画〕日本畜産学会第130回大会実行委員会（大会長：半澤惠）〔プログラム〕
冒頭挨拶「開催にあたって」
半澤

惠（東京農業大学農学部）

第１部「世界の家畜を視野に入れた多様な家畜の可能性」
招待講演１．
「世界で主要な家畜，ヤギ」
林

義明（名城大学農学部）

招待講演２．
「新規動物資源エゾシカとエミューの産業化と研究支援」
相馬幸作（東京農業大学生物産業学部）
招待講演３．
「６次産業化を目指したホロホロチョウ生産」
小川

博（（公財）山階鳥類研究所）

第２部「野生動物から生命科学まで」
招待講演４．
「野生ウシ・ボルネオバンテンは実在するのか？」
松林尚志（東京農業大学農学部）
招待講演５．
「畜産の発展と牛伝染性リンパ腫ウイルスの過去・現在・未来」
小林朋子（東京農業大学農学部）
招待講演６．
「生命をつなぐ生殖細胞～受精卵ができるまで～」
尾畑やよい（東京農業大学生命科学部）
第３部「SDGsへの取り組み」
招待講演７．
「陸の豊かさを守る手段としての放牧」
八代田真人（岐阜大学応用生物科学部）
招待講演８．
「“ウシの妊娠”は私たちの生活に重要でしょうか？」© The Ito Foundation

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白砂孔明（東京農業大学農学部）
招待講演９．
「培養肉：おいしいお肉を食べ続けるための新しい選択肢」
島亜衣（東京大学大学院情報理工学系研究科）
   （それぞれ約20分の講演）                         総合司会者：半澤惠（東京農業大学農学部）〔開催概要〕
動物性タンパク質の安定的な生産を継続するために解決すべき課題は，資源（野生）動物の保全，動物福祉，環境負荷（温室効果ガス，廃棄物，エネルギー出納），感染症対策（不顕性感染，獣畜共通感染），
担い手不足とスマート化など多岐にわたる。これに対し家畜生産を支える畜産学は，科学と社会の発展に伴い深化と拡大をとげ，広大な領域をカバーするようになった。一方，本来は緊密に連関している基礎研究を産業から乖離したものとして排除したり，動物福祉，環境保全，代替畜産物などの視点をアンチ畜産と捉える見方も存在するが，これらの視点は対立軸ではなく，むしろ本来の畜産のあるべき姿と捉えることができる。現に畜産学分野からは，医学・分子生命科学，生態学・行動学・管理学，野生動
物学，環境共生科学，栄養学等の研究者が多数輩出され，それぞれの立場から人と関わりを持つあらゆる動物との共生を追求している。そこで本申請事業，日本畜産学会第130回大会公開シンポジウムは，「未来をになうAnimal Scienceの発展と展開」と題し，未来を担う若人および一般消費者に，畜産業，畜産学の深化と拡大が，持続可能な豊かな社会を構築するための重要な鍵であることを認識し，その一翼を担う動機づけとすることを目指した。
本シンポジウムは，大会開催校である東京農業大学のトリニティホールを使用した対面形式と，
ZoomおよびYouTubeによるライブ配信によるハイブリッド開催とした。開催趣旨に沿って，ポスターを作成し，東京農業大学からポスターを配布することで，学内関係者だけではなく，広く高校生にも参加を呼びかけた。学生を含む学内関係者は対面で，日本畜産学会第130回大会参加者はZoomによるオンラインで，参加を呼びかけた高校生を含む一般消費者はYouTubeによる配信での参加とした。講演時
間は20分を予定し，各シンポジストからそれぞれの専門分野について，ご講演いただいた。熱のこもったご講演が開催時間終了間際まで続き，最後にシンポジスト全員から総合討論に代わって，まとめのご挨拶をいただき，公開シンポジウムを終了した。今回，シンポジスト９名のうち８名が会場に来ていただくことでき，対面での参加がかなった学生はほとんどの講演を生の声で聴くことができた。参加人数
は，シンポジスト９名，対面参加200名，Zoom視聴者50名，YouTube視聴者50名であり，大会最終日の土曜で関連学会以外，他のプログラムがすべて終了したなか，長時間にわたる開催であったにも関わらず最後まで多数のご参加をいただいた。最後に，開催を無事成功に終えることができ，貴財団のご理解と助成に心より感謝の意を表する。

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獣医学教育シンポジウム〈獣医学教育環境の更なる整備充実に向けて〉
に関する開催報告
非営利活動法人獣医系大学間獣医学教育支援機構〔日時〕2022年11月13日

理事長

髙井伸二

13：00～15：10〔会場〕ホテル福岡シーホーク ナビスA（第21回アジア獣医師会連合（FAVA）大会会場）および動画配信
本シンポジウムは，日本獣医師会の提案により，日本獣医師会獣医学術学会年次大会において開催されることになり，獣医系全17大学が会員となって運営されている全国大学獣医学関係代表者協議会が主催した。今回は，アジア獣医師会連合（FAVA）およびアジア獣医大学協会（AAVS）との共催として，アジア諸国および国内の獣医学関係者が参加することに合わせて，その招待講演として開催した。上記
国際会議参加者100名以上が聴講するとともに，動画配信も行った。以下に，本シンポジウムのプログ
ラムと各講演の概要を報告する。
座長：久和茂（東京大学）

〔内容〕
１．講演
（１）
 「FAVAストラテジックプラン（獣医学教育）の紹介」：バンバン・ポンジョ・プリオセリャン
ト（FAVA事務局長／ボゴール農科大学）
FAVAの2021-2025戦略プランは，FAVA理事会ですでに承認されている。このプランは，「アジアオ
セアニア地域の環境のみならず，人類および動物の要望や福祉にも役立つ卓越した専門的獣医師の集まりとして一般市民および政府機関に認知される」というFAVAのビジョンを実現するための手段の一つであり，内部および外部との協働，ワンヘルス，獣医学教育，動物福祉，薬剤管理，および食の安心・安全の６本柱からなる。このうち，アジアオセアニア地域の特性に合う獣医学教育の確立が強く望まれている。FAVAは，獣医学教育の質保証と自己点検を促進することにより，継続的にこの地域に求められる獣医学教育を考え，獣医学教育の改善を援助する必要がある。この獣医学教育における戦略プラ
ンの目標は，アジア獣医大学協会（AAVS）または他の組織との共同により，１）加盟国の獣医学教育の質と地位を向上させ，２）獣医学教育規準を強化し，および３）標準的な自己点検方法を開発することである。これら３つの目標は，FAVA-Websiteのプラットフォーム開発，FAVA内の獣医学教育委
員会の設立，獣医学教育に関するWOAH，EAEVE，AVMAおよびAVBCとの協議，加盟国間の調和，
ASEAN関係国ネットワークとの協議，加盟国におけるコアカリキュラムおよびDay-1能力に関する調
査実施，FAVAおよびAAVS共同獣医学教育委員会の設置等の活動に分けられる。戦略プランに含まれ© The Ito Foundation

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る上記すべての活動は，人類，動物，および環境の調和に基づくより良いQOLを支える良質で高質な獣医学教育を実現するために重要な役割を果たす。
（２）「日本の獣医学教育の歩みと改善への取組み」：佐藤晃一（山口大学）
日本における獣医学教育は，1984年に４年制から６年制へ移行した。その後，社会的ニーズの変化や国際的な通用性の確保，獣医師の活動分野等の偏在など我が国における獣医学教育をめぐる状況を踏まえ，文部科学省が2008年に設置した調査研究協力者会議が大学における獣医学教育の在り方について検討を行い，2011年に「今後の獣医学教育の改善・充実方策に関する報告書」の中で，以下の改革５本柱を公表した。①大学間連携の促進などによる教育研究体制の充実，②獣医学モデル・コア・カリキュラ
ムの策定，③分野別第三者評価の実施による獣医学教育の質の保証，④共用試験の導入（CBTおよびOSCE），⑤実習室等の教育環境および附属動物病院の充実や，外部機関等との連携による臨床教育等の充実。さらに，獣医学教育改革のゴールとして，包括的な獣医学教育実践を促進し，国際標準の獣医学教育を提供する質の保証システムを構築することが推奨された。
現在，日本の獣医学教育システムは上記５本柱に集中し，各大学は教育の質保証に注力している。加
えて，４大学は獣医学教育に関する欧州のEAEVE認証を取得し，２大学が認証取得の準備中である。
 「獣医学教育改善に向けた北海道大学獣医学部 ‐ 帯広畜産大学畜産学部共同獣医学課程の取組（３）
み」：滝口満喜（北海道大学）
我が国の獣医学教育体制は，欧米と比べて獣医科大学の規模が小さく，このままの状態が続けば，欧米水準の国際通用性を有する獣医学教育が実施できず，やがて，日本の獣医学および獣医師の国際的信頼が失墜しかねないという問題を抱えていた。この問題を解消するために，2012年に北海道大学獣医学部と帯広畜産大学畜産学部は，お互いの大学の特徴・強みを併せ持つ，共同獣医学課程（VNJ：
VetNorth Japan）を開設した。北海道大学は，伴侶動物臨床，感染症，ライフサイエンスの教育研究に強みがあり，帯広畜産大学は，生産動物臨床，食品衛生の教育研究に強みを持つ。得意分野を両大学が相互に提供して共同で獣医学教育を実施することで，教員数が100名規模のスケールで獣医学教育を実施する，我が国随一の獣医学教育体制が誕生した。
共同獣医学課程を開設したもう一つの目的は，我々が実施する獣医学教育が欧米と同等の水準にあることを国際的な獣医学教育の評価機関に評価してもらうことであった。結果として，2019年に欧州獣医学教育機関協会（EAEVE）の完全認証を取得した。この認証は，実施する獣医学教育が欧米水準の国際通用性を有することを国際的評価機関に認められたことを意味する。我々はこの間，特に臨床教育の充実に取り組むとともに，学生および外部有識者が参加する教育の質保証を導入し，自律的に継続的な教育改善が実施できる教育体制を整えた。EAEVEの認証校を卒業したからといって，すぐに欧米で獣医師として働けるわけではないが，EAEVEの認証取得とその継続により，間違いなく，これまでよりも充実した獣医学教育・獣医師養成教育を学生に提供できると自負している。
（４）「AVMA認証後のソウル大学獣医学部における獣医学教育の最新動向」：リ・インヒョン（ソウル大学）
ソウル大学獣医学部における教育改革の出発点は，アメリカ獣医師会（AVMA）への認証申請であった。2018年のAVMAによる包括的site visitにおいて，克服すべき多くの障壁や多くの弱点が見つかり，© The Ito Foundation

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なかでも，外科手技に関する技術レベルの低さおよび学生の解剖経験のないことが二大弱点として報告された。獣医学教育においては，生きた動物にアクセスすることは重要であり，学生や獣医師は必要な技術を習得することができる。しかしながら，実際の教育現場では限界があり，予期せぬ害から動物を守るためにも，シミュレーションに基づく学習が重要になってきている。ソウル大学では，2021年に獣医学生のために最新のシミュレーションラボを作った。このラボは，注射，縫合法，麻酔，内視鏡，超音波，および卵巣子宮摘出術を含む多くの臨床技術に関する14のステーションからなっている。2022年
度の終了から，このラボは卒業のためのOSCE試験に使用する予定である。学生は，このシミュレーショ
ンラボでの経験を踏まえ，ボランティアの一員として保護施設におけるワクチン接種，去勢，卵巣子宮摘出に参加している。
 「アジア獣医大学協会（AAVS）：これまでの取組みと課題，そして今後の方向性」：芳賀（５）

猛（東京大学）
アジア獣医大学協会（AAVS）は，獣医学教育，研究および公共サービスを促進し，改善する目的で2001年に設立されたアジアの獣医学教育機関の国際組織であり，20年以上にわたって加盟機関間の友好関係および情報交換の促進に貢献してきた。現在，東アジア，東南アジアおよび南アジアの40以上の教育機関が参加している。2016年には，第４回OIE/WOAH国際会議が開催され，アジアにおける獣医学
教育の認証機関としてAAVSが活動することが確認された。2017年には，東京大学を事務局として法的に登録された。COVID-19の影響で2020年以降，対面会議は実施されていないが，オンライン技術の進歩により，オンライン会議で「コロナ禍における獣医学教育」，「アジアにおける獣医学教育機関の認証」などのオンラインセミナーを開催し，教育に関する技術プラットフォームを確立した。
国，言語，教育環境等の多様性により，獣医学教育に関する共通概念を構築することは容易ではないが，アジア特有の環境や，アジアが直面する国境を越えた動物疾患の流行等もあり，アジアの国々における獣医学教育に関する調和や質の改善は重要な事項である。AAVSでは，１）獣医学教育の推進，２）訓練および開発プログラムの促進，３）ワンヘルス概念の強化，４）操作およびパートナーシップの促進の４つの戦略ゴールからなる2022-2026の５年間の戦略プランを構築した。獣医学教育に関する二つのワーキンググループ（VEEおよびVER）を設置するとともに，FAVAとの共同委員会を設置した。
ワンヘルスの概念のもと，AAVSの戦略プランは，時代の要求に応える獣医師の養成に貢献することが期待されている。
２．パネルディスカッションとまとめ
各発表者を中心に，「アジアの獣医学教育に関するAAVSとFAVAとの連携」についてパネルディス
カッションを行い，今後の協力体制を確認し，シンポジウムを終了した。

© The Ito Foundation食肉に関する助成研究調査成果報告書
Final Reports for Research Grants for Meat and Meat Products

令和４年度（Vol. 41）
2023年11月

発行

編集・発行 ― 公益財団法人伊藤記念財団
THE ITO FOUNDATION
東京都目黒区下目黒一丁目 8 番 1 号 アルコタワー12階〒 153-0064
ArcoTower12F, 1-8-1 Shimomeguro, Meguro-ku, TOKYO
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