平成27年度

食肉に関する
助成研究調査成果報告書

公益財団法人

伊藤記念財団

VOL. 34

「伊藤記念財団」設立趣意書
私，伊藤傳三は，昭和３年食肉加工業を創業して以来五十有余年の永きにわた
り食肉加工品の製造販売に従事して参ったところであります。
この間，昭和47年からは日本ハム・ソーセージ工業協同組合理事長，社団法人
日本食肉加工協会理事長，加えて，ハンバーグ・ハンバーガー協会理事長等の重責を担わせていただく等，業界団体の役員を勤めさせていただいてきたところであります。
こうした中で昭和55年，はからずも勲二等瑞宝章受章という身にあまる栄誉に浴したのでありますが，受章に際し私自身の過ぎ来し方を振り返り，食肉及び食
肉加工業界の行く末に思いを致し，２つの事柄を決意致しました。
第１は，食肉加工団体の指導体制の若返りであり，第２は，食肉加工業の基礎的研究の充実であります。
諸情勢が激しく変わりつつある中で食肉加工業界をさらに大きく発展させるには，新しいリーダーの登場が望ましいことは論をまちません。また，食肉加工品については，これまでも日本独自の技術開発は行われてきましたものの，いずれも企業内技術であると言っても過言でなく，大学等における基礎的研究の不足が将来の日本の食肉加工業の発展を遅らせるおそれがあり，この現状を打破する必要があると考えたところであります。
以上のような基本的考えの下に私は，食肉関係団体等の役員を辞すると共に，
食肉及び食肉加工に関する基礎的かつ広汎な研究を行い，あるいは助長するための財団の設立を発起するものであります。
昭和56年６月
設立発起人© The Ito Foundation

伊

藤

傳

三

Philosophy Behind the Establishment of
the Ito Foundation
Approximately half of a century has passed since I established a meat
packing corporation for commercial products in 1928. While involved in thisbusiness, I have had occasion to serve as chairman of the boards of trustees
of several organizations related to the meat industry, such as the HamSausage Industrial Association of Japan in 1972, the Meat Packing Industrial
Association of Japan, and the Hamburg-Hamburger Association of Japan.
In 1980, unexpectedly, I was highly honored to receive the Order of the
Sacred Treasure, Gold and Silver Star from the emperor in acknowledgement of my contributions to the meat industry and improved human nutrition
during my career. This illustrious award provided a strong impetus for me toact on my long-standing concern for the future of meat packing industries.
My commitment to the establishment of a new research foundation for thepromotion of meat science was based on two fundamental philosophies : first,
leadership of the Association of the Meat Packing Industry should be transferred to people with novel ideas and, second, an advanced system for basic
research should be established in meat industries. Clearly, fresh leadership isneeded in changing situations for intensive development in the meat packing
industry. Although some technical product developments have been achievedin certain individual corporations, the lack of basic research in meat scienceat universities and other research organizations certainly will impede future
development of Japanese meat packing industries. It is urgent to end the stagnation in the meat industry through research support.
On the basis of these philosophies, I myself will resign from any official
positions in meat-related associations and will establish a new researchfoundation to support and promote basic and applied research in meat
science.
Denzo Ito, Founder
June© The Ito Foundation

1981

事 業 の あ ら ま し（目

的）本財団は，食肉に関する研究及び調査を行い，もって畜産業及び食品産業の振興と国民食生活の安定に資することを目的とする。
（事業）

本財団は，上述の目的を達成するため，次の事業を行う。
⑴

食肉の生産，処理，加工等に関する基礎的研究及び調査⑵

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査を行う大学等の研究機関に対する助成⑶ 食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査に優れた業績が認められる研究者の表
彰⑷

食肉の生産，処理，加工等に関する情報の普及及び広報（事業実績）
年度
昭和57年度
58
59
60
61
62
63
平成元年度
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27

第１回
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34

研究調査助成48件 60,000千円
52
54,40060
49,80062
48,00070
53,00079
58,90095
70,50086
74,25079
60,00070
50,00086
60,00081
60,00081
60,00082
65,00081
69,10078
59,00082
60,00067
47,00057
41,00053
37,00058
40,00055
41,00055
48,00056
48,00011
10,00012
10,00015
16,90011
10,000
11
10,40012
12,00013
13,00038
37,00058
54,80069
66,000© The Ito Foundation

伊藤記念財団賞授賞

第１回

４名（8,000千円）

ご

挨

拶

当伊藤記念財団は，伊藤ハム株式会社の創業者故伊藤傳三による巻頭の「設立趣意書」に掲げた趣意をもって，昭和56年７月３日に財団法人として農林水産大臣から設立を許可され、平成24年４月１日に公益財団法人伊藤記念財団に移行登記したものであり，事業の内容は，「事業のあらまし」にあるとおりであります。
おかげ様で当財団は，平成24年度からは公益財団法人として活動することとなり，その活動は本年で35年となります。この間，当財団の研究調査助成事業の存在が畜産関係の方々の間に浸透いたし，事業内容も逐次充実して参りつつあります。
これは，ひとえに関係各位のご指導ご鞭撻の賜と深く感謝申し上げるとともに，今後とも，
食肉加工等の基礎的研究の充実を希う創設者の意志にそって，益々食肉産業ひいては畜産業の振興及び国民食生活の安定のために役立つべく，更に努力を重ねて参りたいと存じております。
本書は，第34回（平成27年度）助成事業における69件の研究調査助成対象研究者の皆様からいただいた研究成果報告とともに，第１回となります伊藤記念財団賞授賞事業の授賞者とその業績概要をとりまとめたものでありますが，以上の目的にしたがって，食肉産業の基礎的研究等に携わる諸氏の研究の一助ともなれば幸甚でございます。
平成28年11月

理事長

伊

藤

功

一

Dear Sir：
I am very pleased to send you and your organization a complimentary copy of theresearch reports of the Ito Foundation. This research foundation was founded by the late
Mr.Denzo Ito to advance research in meat science. The research reports are publishedannually. Unfortunately, the articles are largely in Japanease ; however, in the future wehope to contribute to the international development of meat science. Any constructive
suggestions or critiques from others involved in meat-related research would be accepted
gratefully.
You will find out philosophy behind the establishment of the Ito Foundation describedby Mr.Denzo Ito, in the research report of the Ito Foundation, Vol.34 enclosed here. We
appreciate any interest you may have in our research efforts.
It is my great pleasure to publish this report as the chief director.
Sincerely yours,
Nov. 2016
Koichi Ito
The chief director
The Ito Foundation© The Ito Foundation

i

研究助成事業目次

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究（その２）


増

田

俊

哉（大阪市立大学大学院生活科学研究科）

3

一（北海道大学北方生物圏フィールド科学センター）

12

ZnPP 形成能を有する微生物の探索と応用


若

松

純

筋タンパク質の死後分解に与えるオートファジーの影響：プロテオーム解析を用いたアプローチ


仲西

友紀・河原

聡（宮崎大学農学部応用生物科学科）

17

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究


根

岸

晴

夫（中部大学応用生物学部）

23

徹（帯広畜産大学畜産衛生学研究部門）

29

ミオシンの水溶化現象に関連する尾部領域の特定
早川

廃食肉中のタンパク質を用いた貴金属リサイクル技術の開発


丸

山

達

生（神戸大学大学院工学研究科）

34

食肉製品の塩漬熟成に伴う呈味性発現に関する研究（Ⅱ）－ヒポキサンチンによる呈味性発現機構－
市村

さやか・中村



幸信・吉田

由香・服部

昭仁
41

（一般社団法人食肉科学技術研究所）

鶏肉フライの加熱・保存過程におけるテクスチャーの決定要因と変化機構の解明
杉山

知未＊

寿美・野村

＊



49

（県立広島大学人間文化学部健康科学科， 広島女学院大学人間生活学部）

デジタル PCR 法を用いた食肉加工品中におけるリステリア菌の迅速定量法の開発
高橋肇（東京海洋大学学術研究院食品生産科学部門）

55

メタボロミクス解析結果に基づく黒毛和種牛肉の美味しさに関わる指標の検証鈴木

啓一1・加藤

和雄1・紅

玉1・鈴木

裕1・盧

尚建1・飯田文子2・小松

（1東北大学大学院農学研究科，2日本女子大学，3山形県総合農業センター）智彦3
61

野生動物肉の加工利用のための技術開発：加工適性に及ぼす血絞りと塩漬法の効果
坂田


亮一・時田

昇臣＊・押田敏雄＊（麻布大学獣医学部， 日本獣医生命科学大学動物科学科）

67

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その２）


西村

敏英・江草

愛（日本獣医生命科学大学応用生命科学部食品科学科）

72

畜産物由来ペプチドの肝障害改善の効果について


實

安

隆

興（神戸大学大学院農学研究科）© The Ito Foundation81

ii
肥満に伴う認知症の発症予防における豚肉摂取の効果
後藤


孔郎・加隈

哲也・柴田

洋孝

（大分大学医学部内分泌代謝膠原病腎臓内科学講座）

85

牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究長岡利（岐阜大学応用生物科学部）

91

新規な発酵食肉製品の機能性について
六車

三治男・川越

聖人・木本

早紀・川北

久美子・竹之山愼一（南九州大学健康栄養学部）

96

芳晴（鳥取大学農学部）

104

勝子（鹿児島大学農学部）

108

豚レバーパウダーの脂質代謝に及ぼす影響岡本

機能性食肉の開発を目指した「身体に効く成分」の分析


加治屋

血中トリプトファン濃度とうつ状態との関連：双極性と単極性の鑑別を目指して
堀


宏治・富岡

大・葉梨

喬広・高尾

哲也＊

清水

史子＊・高田明和＊＊（昭和大学横浜市北部病院メンタルケアセンター，*昭和女子大学生活科学部，**

NPO法人 食と健康Project）



113

食肉および家畜の微生物制御に資する乳酸菌由来抗菌ペプチドの探索


善

藤

威

史（九州大学大学院農学研究院）

117

成長期女子スポーツ選手の食事摂取状況と畜産物由来ヘム鉄摂取の有効性についての検討～特に貧血予防とメンタルヘルスに及ぼすヘム鉄の影響に着目して～


吉川

豊・坂元

美子（神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科）

123

豚増体量に及ぼす暑熱ストレス耐性の遺伝的ばらつきの原因遺伝子を探る


山

田

宜

永（新潟大学農学部）

130

泉（明治大学農学部，明治大学大学院農学研究科）

137

揮発性脂肪酸が牛筋肉内脂肪細胞分化に及ぼす影響


溝口

康・松野

ブランド豚肉生産用原種豚の遺伝的多様性の維持に関する研究


古川

力・野村

こう・高橋

幸水（東京農業大学農学部）

142

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わるゲノム育種価の推定
山崎

瑞穂・柴田

愛梨・河野




幸雄・渡邊

敏夫＊・杉本喜憲＊（広島県立総合技術研究所畜産技術センター，＊

公益社団法人畜産技術協会附属動物遺伝研究所）

148

黒毛和種牛のルーメン絨毛組織の発達関連遺伝子の網羅的解析に関する研究盧尚建（東北大学大学院農学研究科）© The Ito Foundation

156

iii
牛 CHFR および RB1 遺伝子プロモーター流域の DNA メチル化多型と肉質形質との関係に関する分子遺伝的研究


須

田

義

人（宮城大学食産業学部）

160

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養技術の開発


高島

誠司・保地

眞一（信州大学繊維学部）

165

乳牛における炎症性子宮疾患の迅速診断を目指した子宮の炎症度スコアの確立清水隆（帯広畜産大学畜産衛生学研究部門）

170

元宏・三浦

175

異なる発情判定基準による牛人工授精適期の再設定


坂口

実・菊池

弘（北里大学獣医学部）

氷晶形成抑制効果の高いアミノ酸を利用した豚卵巣および精液の過冷却保存


星

野

由

美（広島大学大学院生物圏科学研究科）

181

赤外線深度センサーによる和牛の分娩予測技術の検討


岡山

毅・佐藤

晴香・小針

大助（茨城大学農学部）

186之（山形大学大学院理工学研究科）

191

佐（農業生物資源研究所動物発生分化研究ユニット）

197

ミトコンドリア機能解析に基づく家畜優良胚選別法の開発


阿

部

宏

牛伸長胚の生育に関わる子宮内膜細胞因子の探索


細

江

実

Rhizopus oryzae 水抽出物の肝障害抑制効果を応用した牛受精卵生産技術の向上
鈴木

武人1・堀

登2・林

みち子2・内尾

陽子2・牛越設男3

 （1麻布大学獣医学部，2石川県農林総合研究センター畜産試験場，3㈱牛越生理学研究所）

202

繁殖疫学の手法を用いた黒毛和種牛繁殖農場の飼養形態の違いが繁殖成績に及ぼす影響の定量佐々木

瑞穂＊・北原羊介・上松

豪＊＊・大澤健司＊＊（宮崎大学テニュアトラック推進機構，＊NOSAIみやざき，＊＊宮崎大学農学部）

209

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発
ツェンコヴァ ルミアナ・窪田


陽介・古川

茜・ジア アシフ（神戸大学農学研究科生体計測工学研究室）

214

種雄牛の受胎性評価に資する精子メチル化可変部位の解明
武田

久美子・小林栄治（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

220

肥育前の和牛雌子牛の摘出卵巣からの胚生産に関する研究
的場


理子・平尾

雄二・武田

久美子

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

225

牛白血病ウイルス高感染牛の予後の評価


目

堅

博

久（宮崎大学テニュアトラック推進機構）

231

鶏糞由来バイオセラミックによるウイルスの伝播抑制


竹

原

一

明（東京農工大学大学院農学研究）© The Ito Foundation

237

iv
シカ肉に寄生する住肉胞子虫の形態学的・分子生物学的同定ならびに腸管毒性評価


松田

一哉・平田

晴之・臼井

優（酪農学園大学獣医学群獣医学類）

242

肉用鶏における Salmonella Agona の emerging とその発生要因の解析
鳥居


恭司・村上

栄二＊

覚史・横山

（東京農業大学農学部畜産学科，＊千葉県衛生研究所）

248

マダニの酸化ストレス制御分子を標的とした抗マダニワクチンの開発
田仲

哲也・草木迫浩大・宮田健＊（鹿児島大学共同獣医学部，＊鹿児島大学農学部）

253

食肉からの感染源となるトキソプラズマの休眠型虫体に関する研究

加藤健太郎（帯広畜産大学原虫病研究センター）

258

鶏肉の生産性向上を目指した安全な原虫防除法の開発


松林

誠・谷

浩行（大阪府立大学大学院生命環境科学研究科）

262

豚マイコプラズマ性肺炎抗病性育種ランドレース豚と一般ランドレース豚との自然免疫関連分子および腸内環境比較
佐久間

晶子・吉野

須田


伸和・野地

智法＊

義人＊＊・麻生久＊

淳良・高橋（宮城県畜産試験場，＊東北大学大学院農学研究科，＊＊宮城大学食産業学部）

266

磁気ビーズルシフェラーゼ免疫沈降法による抗豚流行性下痢ウイルス抗体検出系の開発


堀

江

真

行（鹿児島大学共同獣医学部附属越境性動物疾病制御研究センター）

272

豚デルタコロナウイルスの感染動態に関する研究
鈴木


亨・大橋

誠一

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究所）

278

国際競争に勝つ『サルモネラ - ゼロ』モデル養豚場の作出


末

吉

益

雄（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）

283

動物由来コロナウイルスの遺伝子操作系の確立と感染予防への応用
神


谷

亘

（大阪大学微生物病研究所感染症国際研究センター臨床感染症学研究グループ）288

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発


久米

新一・谷口

紗耶（京都大学大学院農学研究科）

293

飼養環境下の牛群におけるマイコトキシン浸潤動態の検証－内分泌撹乱作用の有無と繁殖性に与える影響の解明
髙木


光博・宇野

誠一＊・國師恵美子＊（山口大学共同獣医学部臨床獣医学講座, ＊鹿児島大学）

298

非侵襲的生体電気インピーダンス法による牛枝肉脂肪交雑の推定
橋元


大介・福田

修＊

（長崎県農林技術開発センター，＊佐賀大学大学院工学系研究科）© The Ito Foundation

303

v
食肉特性の向上を目指して：ポリフェノール給餌による遅筋型筋線維の形成誘導
辰巳

隆一・水野谷
鈴木

航・宮原

秀雄・岡本

慎平・赤星

眞理子

貴弘・ド

マイコイ・大坪

秀明・小宮

祐介

チャハラ

モクラン・中村

真子・池内

義秀



（九州大学大学院農学研究院）

309

リンゴジュース粕の機能性を生かした高付加価値豚肉生産技術の開発房

家 琛（弘前大学農学生命科学部）

315「乳質の良さ」が注目されるブラウンスイス種乳牛の栄養・繁殖特性の解明
遠藤

なつ美・田中知己（東京農工大学農学部）

321

黒毛和種における RBP4 多型と枝肉形質の関連解析


平野

貴・原

ひろみ・半澤惠（東京農業大学農学部）

326

一（東北大学農学研究科）

332

衆介（帝京科学大学生命環境学部）

338

脂質代謝および感染症研究のための豚・牛由来肝臓細胞の樹立


福

田

智

籾米の給与を軸とした日本型動物福祉鶏肉生産技術の開発


有賀

小百合・佐藤初期成長期のミオスタチン制御が黒毛和牛の肉質に及ぼす影響


髙

橋

秀

之（九州大学農学部附属農場）

343

也（帯広畜産大学畜産学部）

347

賀久（名古屋大学大学院生命農学研究科）

351

放牧養豚用アニマルウェルフェア評価法の開発


瀬

尾

哲

効率的な家畜生産に資する生殖中枢メカニズムの解明
上野山

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発
木下


英樹・石川

潤一＊

（東海大学農学部バイオサイエンス学科，＊宮城大学大学院食産業学研究科）

354

黒毛和種子牛における呼吸器病の血清亜鉛濃度および亜鉛投与による臨床的な症状改善効果の検討
乙丸

孝之介・窪田

力・米重隆一＊・時森麻紀子＊（鹿児島大学共同獣医学部，＊北薩農業共済組合）363

難培養性乳酸菌を用いた第 3 世代サイレージ添加剤の開発


西

野

直

樹（岡山大学大学院環境生命科学研究科）

367

食肉由来病原体に対する腸管免疫に関与する血清アミロイド A の機能解析


猪

島

康

雄（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

372

牛肉の各部位に含まれる機能性成分に与える品種の影響について


平

山

琢

二（滋賀県立大学環境科学部）

377

充（京都府立大学大学院生命環境科学研究科）

383

同腹産仔間で成長が異なる仔豚の代謝特性比較


塚

原

隆

© The Ito Foundation

vi

CONTENTS
Studies on fresh color preservation of meats by use of the potent reducing activity ofpolyphenols，part II
Toshiya Masuda（Graduate School of Human Life Science, Osaka City University）

3

Searching for microorganisms with a high ZnPP-forming ability and its application to meatproducts
Jun-ichi Wakamatsu（Field Science Center for Northern Biosphere, Hokkaido University）

12

Effects of autophagy on postmortem proteolysis in skeletal muscle: An approach using
proteomic analysis
Tomonori Nakanishi and Satoshi Kawahara（Department of Biochemistry and Applied Biosciences, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）


17

Study on processing technology and characteristics of fermented meat products produced using
lactic acid bacteria cultures for dairy products
Haruo Negishi（College of Bioscience and Biotechnology, Chubu University）

23

The identification of myosin rod region involved in the solubilization under the low ionicstrength condition
Toru Hayakawa（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, Department of Animal and Food Hygiene）


29

Recycle of precious metal ions using proteins derived from waste meat
Tatsuo Maruyama（Graduate school of engineering, Kobe University）

34

Studies on the formation of specific meat taste in cured meat products（II）- Specific meat taste induced by hypoxanthine Sayaka Ichimura, Yukinobu Nakamura, Yuka Yoshida and Akihito Hattori（Japan Meat Science and Technology Institute）

© The Ito Foundation

41

vii
Elucidation of the determining factor of the textural properties in the heating and storage
process of fried chicken
Sumi Sugiyama and Satomi Nomura＊（Faculty of Human Culture and Science, Prefectural University of Hiroshima，＊Faculty of Human Life
Science, Hiroshima Jogakuin University）

49

Establishment of the rapid enumeration method for Listeria monocytogenes by using the Digital
PCR
Hajime Takahashi（Laboratory of food microbiology, Department of Food Science and Technology, Tokyo University ofMarine Science and Technology）

55

Verification of index related to delicious of Japanese Black Cattle Beef meat based on
metabolomics analytical result
Keiichi Suzuki1, Kazuo Katoh1, Hong Yu1, Yutaka Suzuki1, Sanggun Roh1, Fumiko Iida2 andTomohiko Komatsu3（1Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, 2Japan Women’s University, 3LivestockExperiment Station of Yamagata Integrated Agricultural Research Center）

61

Technology for game meat utilization and effects of pre-salting and curing on meat processing
Ryoichi Sakata, Norio Tokita＊ and Toshio Oshida（Facultul of Veterinary Medicine, Azabu University, ＊Department of Animal Science, Nippon Veterinary
and Life Science University）

67

Studies on clarification of the compounds involved in “koku attributes” of pork sausages（Part 2）
Toshihide Nishimura and Ai Egusa（Department of Food Science and Technology, Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary andLife Science University）

72

Effect of dietary animal peptides on hepatic injury
Takaoki Saneyasu（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

81

Effect of the pork intake on the prevention of dementia related with obesity
Koro Gotoh, Tetsuya Kakuma and Hirotaka Shibata（Department of Endocrinology, Metabolism, Rheumatology and Nephrology, Faculty of Medicine, Oita
University）

85

Basic study of the development of an innovative hypocholesterolemic food materials using cattle
heart peptides
Satoshi Nagaoka（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

© The Ito Foundation

91

viii
Functional properties of novel fermented meat products
Michio Muguruma, Masato Kawagoe, Saki Kimoto, Kumiko Kawakita and Shinichi Takenoyama.
（Faculty of Health and Nutrition, Minami Kyushu University）

96

Effects of porcine liver powder on intestinal environment and lipid metabolism
Yoshiharu Okamoto（Faculty of Agriculture, Tottori University）

104

Analysis of the “ingredients that have effects on the body” in order to develop potential meatbased functional foods
Katsuko Kajiya（Faculty of Agriculture, Kagoshima University）

108

Relationship between plasma tryptophan concentration and depression : for discrimination
bipolar and monopolar depression
Koji Hori, Hiroi Tomioka, Takahiro Hanashi, Tetuya Takao＊, Fusako Shimizu＊ and Akikazu
Takada＊＊（Showa University Northern Yokohama Hospital, ＊Department of Human Health and Design, Showa
Women’s University, ＊＊International Projects on Food and Health（NPO））

113

Screening and characterization of antimicrobial peptides produced by lactic acid bacteria for
microbial control of meat and livestock
Takeshi Zendo（Faculty of Agriculture, Kyushu University）

117

The study of dietary intake status and effectiveness of heme iron intake derived from animal
products with growing girls sports player
Yutaka Yoshikawa and Yoshiko Sakamoto（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Women’s University）

123

Exploration of genes involved in genetic variation in heat stress tolerance for growth rate offinishing pig
Takahisa Yamada（Faculty of Agriculture, Niigata University）

130

Effect of volatile fatty acid on bovine intramuscular adipocyte differentiation
Yasushi Mizoguchi and Izumi Matsuno（School of Agriculture, Meiji University）

137

Sustainability of genetic diversity in original pig strains used for branding pork
Tsutomu Furukawa, Koh Nomura and Yukimizu Takahashi（Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture）

© The Ito Foundation

142

ix
Prediction of genomic breeding values for meat color defined by myoglobin content inlongissimus muscle of Japanese Black cattle
Mizuho Yamasaki, Eri Shibata, Sachio Kouno, Toshio Watanabe＊ and Yoshikazu Sugimoto＊（Hiroshima Prefectural Technology Research Institute, Livestock Research Center, ＊Shirakawa Instituteof Animal Genetics）

148

Study on the global analysis of genes related with development of rumen papillae in JapaneseBlack cattle
Sang-gun Roh（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

156

Molecular research for relationship between DNA methylation in bovine CHFR or RB1 gene’s
promoter region and meat quality
Yoshihito Suda
（School of Food, Agricultural and Environmental Sciences, Miyagi University）

160

Development of porcine/bovine germline stem cell technology using novel growth factor
Seiji Takashima and Sinichi Hochi（Faculty of Textile Science and Technology, Shinshu University）

165

Establishment of the scoring of uterine inflammation in dairy cows for a rapid diagnosis
Takashi Shimizu（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, Department of Animal and Food Hygiene）


170

Novel standard for artificial insemination timing based on different estrous detection criteria incattleMinoru Sakaguchi, Motohiro Kikuchi and Hiroshi Miura（School of Veterinary Medicine, Kitasato University）

175

Supercooling preservation of pig ovaries and the semen by using an amino acid that effectively
inhibits ice crystal formation
Yumi Hoshino（Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University）

181

Development of prediction technique of parturition by an IR depth sensor in beef cattle
Tsuyoshi Okayama, Haruka Sato and Daisuke Kohari（College of Agriculture, Ibaraki University）

186

Development of novel system for quality evaluation of bovine embryos by analysis of
mitochondrial function
Hiroyuki Abe（Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University）

© The Ito Foundation

191

x
Screening of endometrium cell-derived factors involved in bovine elongated embryo survival
Misa Hosoe（National Institute of Agrobiological Sciences, Animal Development and Differentiation Research Unit）


197

Improvement of the fertilized ovum production technique using liver damage suppressant effectof Rhizopus oryzae aqueous extract in cattle
Takehito Suzuki1, Noboru Hori2, Michiko Hayashi2, Yoko Uchio2 and Setsuo Ushikoshi3（1School of Veterinary Medicine, Azabu University, 2Ishikawa Prefectural Agriculture And Forestry
Research Center Livestock Experimental Station, 3Ushikoshi Research Institute for Physiology Co., Ltd.）

202

Standard operation procedures for Japanese Black cattle related to reproductive performance
Yosuke Sasaki, Mizuho Uematsu＊, Go Kitahara＊＊ and Takeshi Osawa＊＊（Organization for Promotion of Tenure Track, University of Miyazaki, ＊NOSAI Miyazaki,＊＊

Faculty ofAgriculture, University of Miyazaki）

209

Development of rapid and non-destructive diagnostic system for cow’s estrus and pregnancy
Roumiana Tsenkova, Yosuke Kubota, Akane Furukawa and Zia Asif Iqbal（Biomeasurement Laboratory, Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

214

Identification of differentially methylated sites in sperm DNA and their contribution to theevaluation of bull fertility
Kumiko Takeda and Eiji Kobayashi（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

220

Studies of in vitro embryo production using growing oocytes collected from the ovaries
removed from Japanese beef calves before fattening
Satoko Matoba, Yuji Hirao and Kumiko Takeda（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

225

Prognosis evaluation of high-viral-load BLV-infected cattle
Hirohisa Mekata（Organization for Promotion of Tenure Track, University of Miyazaki）

231

Inhibition of transmission of viruses using bioceramic derived from chicken feces
Kazuaki Takehara（Institute of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

237

Morphological and molecular identification, and evaluation of enterotoxicity of Sarcocystis spp.
isolated from muscular tissue of sika deer
Kazuya Matsuda, Haruyuki Hirata and Masaru Usui
（Department of Veterinary Medicine, School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University）

© The Ito Foundation

242

xi
Emergency and analysis of the causes of Salmonella Agona in broiler chicken
Yasushi Torii, Satoshi Murakami and Eiji Yokoyama＊（Department of Animal Science, Graduate School of Agriculture, Tokyo University of Agriculture,＊

Chiba Prefectural Institute of Public Health）

248

The development of anti-tick vaccine as a target against regulating molecule for oxidant stress
Tetsuya Tanaka, Kodai Kusakisako and Takeshi Miyata＊（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, ＊Faculty of Agriculture, Kagoshima
University）

253

Studies on Toxoplasma dormant parasite as a source of food-borne disease
Kentaro Kato
（National Research Center for Protozoan Diseases, Obihiro University of Agriculture and Veterinary
Medicine ）

258

Construction of protective system against protozoan diseases for productivity improvement inpoultry industry
Makoto Matsubayashi and Hiroyuki Tani
（Graduate School of Life and Environmental Sciences, Osaka Prefecture University）

262

Comparison of innate immune related molecules and an entrail environment between landrace
pigs that have been selected for genetic resistance to mycoplasmal pneumonia of swine（MPS）
and normal landrace pigs
Akiko Sakuma, Jyunryo Yoshino, Nobukazu Takahashi, Tomonori Nochi＊, Yoshihito Suda＊＊ andHisashi Aso＊
（Miyagi Livestock Experimental Station, Miyagi, Japan, ＊Graduate School of Agricultural Science,
Tohoku University, ＊＊Department of Food, Agriculture and Environment, Miyagi University ）

266

Development of a luciferase immunoprecipitation assay for detection of antibodies against
porcine epidemic diarrhea viruses
Masayuki Horie（Transboundary Animal Diseases Research Center, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima
University）

272

Experimental infection with porcine deltacoronavirus in pigs
Tohru Suzuki and Seiichi Ohashi（National Institute of Animal Health, National Agriculture and Food Research Organization（NARO）
）


278

Construction of the“Salmonella-free”model pig farm to be able to win international
competition
Masuo Sueyoshi（The Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki）

© The Ito Foundation

283

xii
Establishment of reverse genetics system for animal coronavirus
Wataru Kamitani（Laboratory of Clinical Research on Infectious Diseases, Research Center for Infectious Disease Control,
Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University）

288

Effects of functional components in grass on enhancing immunoglobulin in colostrum
Shinichi Kume and Saya Taniguchi（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

293

Monitoring of naturally contaminated mycotoxin concentrations in feeding environment of
cattle―Effects as endocrine disruptors and reproductive efficacy
Mitsuhiro Takagi, Seiichi Uno＊ and Emiko Kokushi＊（Department of Clinical Veterinary Science, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Yamaguchi University,＊

Kagoshima University）

298

Estimation of beef marbling standard number based on non-invasive bioelectrical impedance
analysis
Daisuke Hashimoto and Osamu Fukuda＊（Nagasaki Agricultural and Forestry Technical Development Center, ＊Graduate School of Science andEngineering, University of Saga）

303

Slow-myofiber generation induced by dietary polyphenol feeding, toward enhancing meat quality
Ryuichi Tatsumi, Wataru Mizunoya, Hideo Miyahara, Shinpei Okamoto, Mariko Akahoshi,
Takahiro Suzuki, Mai-Khoi Q. Do, Hideaki Ohtsubo, Yusuke Komiya, Mulan Qahar, Mako
Nakamura and Yoshihide Ikeuchi（Graduate School of Agriculture, Kyushu University）

309

Development of high value-added pork production technology using functionality of apple
pomaceJiachen Fang
（Faculty of Agriculture and life Science, Hirosaki University）

315

Characteristics of nutrition and reproductive physiology of the high-quality milk producer ofBrown Swiss dairy cattle
Natsumi Endo and Tomomi Tanaka（Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

321

Association analysis between RBP4 gene polymorphisms and carcass traits in Japanese black
cattleTakashi Hirano, Hiromi Hara and Kei Hanzawa（Tokyo University of Agriculture, Faculty of Agriculture）

© The Ito Foundation

326

xiii
Establishment of bovine and swine derived hepatocytes for the lipid metabolism and infection
study
Tomokazu Fukuda（Tohoku University, Graduate School of Agricultural Science）

332

Development of animal welfare friendly broiler production system by unhusked rice feeding inJapan
Sayuri Ariga and Shusuke Sato
（Teikyo University of Science, Faculty of Life and Environmental Sciences）

338

Effect of myostatin control during early growth period on meat quality of Japanese Black cattle
Hideyuki Takahashi（Kuju Agricultural Research Center, Kyushu University）

343

Development of on-farm pastured pig welfare assessment protocol
Tetsuya Seo（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

347

Elucidation of central mechanism controlling reproduction to improve production efficiency oflivestock
Yoshihisa Uenoyama（Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University）

351

Bactericidal effect of multi-drug resistance bacteria using lactic acid bacteria and developmentof functional domestic animal fodder
Hideki Kinoshita and Junichi Ishikawa＊（Department of Bioscience, School of Agriculture, Tokai University, ＊Graduate School of Food,
Agricultural and Environmental Sciences, Miyagi University）

354

Serum zinc value of respiratory disease calves in Japanese Black and effect of supplemental zincin Japanese Black calves against clinical respiratory diseases
Konosuke Otomaru, Chikara Kubota, Ryuichi Yonesige＊ and Makiko Tokimori＊（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, ＊Hokusatsu Agricultural Mutual Aid
Associations）

363

Development of third-generation silage inoculant using difficult-to-culture lactic acid bacteria
Naoki Nishino（Graduate School of Life and Environmental Science, Okayama University）

367

Biological characterization of serum amyloid A in intestinal immunity against edible meat-borne
pathogensYasuo Inoshima（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu
University）

372© The Ito Foundationxiv
Effect of bleed on the functionality composition of beef
Takuji Hirayama（School of Environmental Science, University of the Shiga Prefecture）

377

Analysis on the metabolic profiles between healthy and mal-development piglets in same
littermates
Takamitsu Tsukahara（Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University）

© The Ito Foundation

383

xv

伊藤記念財団賞
目

尾

嶋

孝

次

一（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

畜産研究部門畜産物研究領域

上級研究員）

骨格筋細胞における筋原線維の形成とその構成タンパク質分解に関する分子細胞生物学的研究


山

397

内

啓太郎（東京大学大学院農学生命科学研究科

准教授）

骨格筋前駆細胞群の分化制御機構解明を通じた高付加価値食肉生産のための知的基盤の確立 

盧尚建（東北大学大学院農学研究科

准教授）

高品質牛肉の産肉性を特徴づける脂肪細胞由来の新規調節因子の解明に関する研究 

若

松

純

398

一（北海道大学北方生物圏フィールド科学センター准教授）

食肉製品中の新規赤色色素の形成機構および食肉の体熱産生機構に関する研究 © The Ito Foundation

399

400

研究助成事業© The Ito Foundation3

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究（その２）
Studies on fresh color preservation of meats by use of the potent reducing
activity of polyphenols, part II

増

田

俊

哉

（大阪市立大学大学院生活科学研究科）

Toshiya Masuda（Graduate School of Human Life Science, Osaka City University）

During our project for meat color preservation by polyphenols, we have found thatcysteine can support polyphenol's reducing activity from metmyoglobin （MetMb） tooxymyoglobin（MbO2）. In this report, we present development of new cysteine-polyphenol
reagents for the meat color preservation. Preparation of the reagents was carried out by
peroxidase-catalyzed oxidation of polyphenols in the presence of cysteine. Cysteinyl polyphenols
were prepared from catechin, chlorogenic acid, dihydrocaffeic acid, hydroxytyrosol,
nordihydroguaiaretic acid, and rosmarinic acid. These cysteinyl polyphenols showed aconcentration-dependent reducing activity for MetMb to MbO2 for initial one hour. However,after one hour, some of them decreased the amount of MbO2 produced. The effect of thenumber of cysteinyl sulfur substitutions in polyphenols on both MetMb reduction and MbO2
maintenance was examined using hydroxytyrosols with different numbers of cysteine
substitutions; these hydroxytyrosols were synthesized from hydroxytyrosol andN-acetylcysteine methyl ester. The hydroxytyrosol derivative that substituted with two
N-acetylcysteine esters exhibited the most effective reducing activity without any effect on
MbO2．

１．目

的変色）
。この褐変化現象は消費者による食肉の的新鮮さのイメージを低下させ１），その市場価値に食肉の鮮やかな赤色はその新鮮さの指標とされる。食肉の鮮赤色は，食肉加工時のブルーミング影響するため，その鮮赤色を保持することは食肉流通上重要な課題とされてきた２）。

過程において酸素分子がヘムタンパク質であるミ

ところで，ポリフェノールは，植物および植物

オグロビン（Mb）と反応して生成するオキシミ

由来の食品に特徴的に存在する機能性成分であ

オグロビン（MbO2）に由来する。なおこのMbO2る。ポリフェノールにはこれまで様々な機能が見はそれほど安定ではなく，徐々に茶色のメトミオ

出されてきているが，物質本来の性質としては，

グロビン（MetMb）へと変化する（MbO2の酸化

生体成分の酸化を抑制する抗酸化能やそれに関連© The Ito Foundation

4

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

した強い還元性があげられる。我々はMbO2の酸化的褐変を防止するために，このポリフェノール

２．方法の利用の可能性を検討してきた。その過程で，強2.1

力な抗酸化性を有するポリフェノールがむしろMetMb 溶 液 は MbO2 溶 液 に ヘ キ サ シ ア ノ 鉄

MbO2 の酸化を加速させることを発見した 。ま（Ⅲ）カリウムを添加して調製した。MbO2（120

た別のアプローチとして，ポリフェノールの高い

μmol/l）のストックリン酸緩衝溶液（pH7.4, ３

還 元 力 を 利 用 し て ，MetMb を 還 元 し 鮮 赤 色 のml）にヘキサシアノ鉄（Ⅲ）カリウム（２㎎）

MbO2に変換することを試みた。その結果，ケルを加え，23℃，５分間穏やかに撹拌した後，溶液

セチンおよびケンフェロールなどのフラボノール

をAmicon Ultra-0.5限外濾過膜を用いて，４℃，

型ポリフェノールに，MetMbを還元しMbO2とす

６分間、14,000ｇの遠心操作で脱塩を行った。残る能力を初めて見出し，昨年度の本財団助成研究

存溶液を緩衝液で希釈しMetMbの溶液（120μ

報告書において報告した 。しかしながらフラボ

mol/l）３mLを得た。MetMb液の純度と濃度はノールのMetMbからMbO2への変換効率はそれほ

UV/VIS分光光度計を用いて確認した。

３）

４）

ど高くなく，その実用性に問題が残された。なおケルセチンを用いて，MetMbからMbO2への変換

MetMbの調製

2 . 2 ポリフェノール－システイン複合体の調製

反 応 機 構 を 解 析 し た と こ ろ ，ケ ル セ チ ン が各 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 水 溶 液（18 mmol/l ，１

MetMbを還元する段階で生じるキノン性物質が，ml）をシステイン水溶液（18 mmol/l，１ml）にせっかく生じたMbO2の酸化を促進していること

混合し，その溶液にペルオキシダーゼ（60μmol/が示唆された。すなわち，MbO2から生じてくるL ，20 μＬ），お よ び H2O2 （400 mmol/l ，30 μl）

褐色のMetMbを効率的に鮮赤色のMbO2に戻し，を添加し，溶液を水で４mlにした。溶液を８分

それを維持するには，還元性の強いポリフェノー

間25℃でインキュベートし，酸化ポリフェノール

ルを用い，その還元反応で生じるプロオキシダン

溶 液（使 用 ポ リ フ ェ ノ ー ル 濃 度 に 基 づ き ，4.5

ト性のキノン物質をいかに速く消去するかが鍵とmmol/l）を得た。対照サンプル溶液は，システなると考えられた。そこで，ポリフェノールによインを添加せずに同様の手順で調製した。

るMetMb還元反応系に，求核性の高いチオール

2 . 3 MetMb還元によるMbO2化率の測定基を有するシステインを添加したところ，非常にリン酸緩衝液（pH7.4，250μl），MetMb（120

効率的にMbO2 化が可能なことを見出した５）。さμmol/l ，150 μl），DMSO10 μl ，試 料 溶 液（4.5

らに研究を進めると，システインのチオール基のmmol/l，40μl）を順に96ウェルマイクロプレー

効果は，ポリフェノール由来のキノン物質の消去

トに加え，マイクロプレートリーダー中で１時

のみならず，置換反応によるポリフェノールの還間，37℃でインキュベートし，その後，吸光度を元性自体への影響も考えられたため，その効果を500 nmおよび582 nmで測定した。MbO2 の生成詳細に解明し，実用化可能な食肉新鮮色維持に繋量は，MbO2（μmol/l）＝（89.7×Ａ582）－（32.9

がるポリフェノール系物質の開発に貢献すべく，

×Ａ500）式を用いて計算し，MetMbからMbO2へ

今回の助成研究を進めることにした。

の還元的換効率として表した。

© The Ito Foundation

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究（その２）2 . 4 システイニルポリフェノールの調製と構

5

C18H18NO8S, 408.0753 ; found, 408.0745 ; 1H NMR（400 MHz, CD3OD）δ 4.47（1H, d, J ＝ 7.6 Hz,造の同定
各種システイニルポリフェノール調製法の一例

H2）,3.91（1H, ddd, J ＝ 8.8, 7.6 and 5.6 Hz, H2）,としてシステイニルカテキンの調製および精製法

2.88（1H, dd, J＝16.2 and 5.6 Hz, H4a）, 2.46（1H,を示した。カテキン（50 ㎎）のメタノール（４dd, J＝16.2 and 8.8 Hz, H4b）, 5.90（1H, s, H6）,ml）－水（12 ml）溶液に，システイン（42 ㎎）

5.80（1H, brs, H8）, 6.88（1H, d, J＝1.8 Hz, H2'）,を 添 加 し ，ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ（4.6 ㎎ ）と H2O2

7.00（1H, d, J＝1.8 Hz, H6'）, 3.49（1H, dd, J＝14.6（0.4 mol/1，360μl）を加えた。室温で撹拌し，

and 4.0 Hz, H2″a）, 3.15（1H, dd, J＝14.6 and 8.8

数分後に溶液中のメタノールを減圧下で除去し，Hz, H2″b）, 3.86（1H, dd, J＝8.8 and 4.0 Hz, H3″）;

得 ら れ た 溶 液 を 分 取 HPLC に て 精 製 し た 。

13

C NMR（100 MHz, CD3OD）δ 82.9（C2）, 69.2

［column ： Cosmosil 5C18-AR-II （250 ㎜ x 20 ㎜

（C3）, 29.4（C4）,158.1（C5 or C7）, 96（C6, veryi.d.）；solvent : CH3CN：0.1％ trifluoroacetic acidweak peak）, 157.8（C7 or C5）, 95（C8, very

aq. ＝ 5 ： 95（v/v）； flow rate（ml/min）： 11 ；weak peak）, 157.0（C9）, 101.1（C10）, 132.8（C1'）,

peak retention time（min）48 and 57］2'-S-

116.7（C2'）, 147.0（C3'）, 147.8（C4'）, 118.7（C5'）,

cysteinylcatechin（1）および5'-S-cysteinylcatechin

126.3（C6'）, 36.4（C2″）, 54.1（C3″）,171.2（C4″）. 2″（2）を16％および22％の収率で得た。以下同様に-S-Cysteinylchlorogenic acid（3）. HR-ESI-MS

各種システイニルポリフェノール（3―12）を得（m/z）［M-H］－ calcd for C19H22NO11S : 472.0914,て，下記の分析データより化学構造を確定した。

Found : 472.0893 ; １H NMR（400 MHz, CD3OD）

2'-S-Cysteinylcatechin（1）. HR-ESI-MS（m/z）δ 6.34（1H, d, J＝16.0 Hz, H2'）, 8.36（1H, d, J＝［M-H］ calcd for C18H18NO8S, 408. 0753 ; found,

16.0 Hz, H3'）, 6.87（1H, d, J＝8.4 Hz, H5″）, 7.23

408.0742. H NMR（400 MHz, CD3OD）δ 5.54

（1H, d, J＝8.4 Hz, H6″）, 5.33（1H, m, H3）, 3.71（1H, d, J＝9.0 Hz, H2）, 4.11（1H, dt, J＝9.0 and 5.2（1H, brd, J＝7.6 Hz, H4）, 4.14（1H, m, H5）, 1.98-

Hz, H3）, 2.59（1H, dd, J＝16.0 and 5.2 Hz, H4a）,2.19（4H, overlapped m, H2 and H6）, 3.30（2H,

2.98（1H, dd, J＝16.0 and 9.0 Hz, H4b）
, 5.95（1H,

overlapped with solvent signals, H2'''）, 3.93（1H,s, H6）, 5.80（1H, brs, H8）, 6.92（1H, d, J＝8.4 Hz,

br, H3'''）. 2',5' （or 5',6'）-Bis（ S-cysteinyl）

H5' or H6'）
, 6.94（1H, d, J＝8.4 Hz, H5' and H6'）,

dihydrocaffeic acid（4）: HR-ESI-MS（m/z）－

13.67（1H, dd, J＝14.8 and 4.0 Hz, H2″a）, 3.12（1H,－［M-H］
calcd for C15H19N2O8S2 : 419.0583, Found :dd, J ＝ 14.8 and 9.6 Hz, H2 ″b）, 3.94（1H, dd, J ＝419. 0572 ; 1H NMR（400 MHz, CD3OD）δ 3.00-

4.0 and 9.6 Hz, H3″）; 13C NMR （100 MHz,

3.20（2H, complexed m, H2, NOE from H6'）, 2.59

CD3OD）δ 80.4（C2）, 69.1（C3）, 30.2（C4）, 158.1（2H, m, H3, NOE from H6'）
, 7.01（1H, s, H6'）,

（C5 or C7）, 96（C6, very weak peak）, 157.8（C53.25-3.35（3H, overlapped with solvent signals,

or C7）, 95（C8, very weak peak）, 157.4（C9）,H2″and H2'''b）,3.89（1H, dd, J ＝ 6.4 and 5.9 Hz,

101.4（C10）, 135.1（C1'）, 119.6（C2'）, 148.4（C3'）,H3″）, 3.42（1H, dd, J＝16.0 and 4.0 Hz, H2'''a）,

146.8（C4'）, 117.6（C5'）, 120.8（C6'）, 36.4（C2 ″）,3 . 5 9 （ 1 H , d d , J ＝7 . 2 a n d 4 . 0 H z , H 3 ' ' ' ）.

54.0（C3 ″）, 170.9（C4″）. 5'-S-Cysteinylcatechin

5'-S-Cysteinyldihydrocaffeic acid（5）: HR-（2）. HR-ESI-MS （m/z）［M-H］ calcd for－
ESI-MS（m/z）［M-H］
calcd for C12H14NO6S :－© The Ito Foundation

6

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

300.0542, Found : 300.0527 ; 1H NMR（400 MHz,

ESI-MS（m/z）［M-H］－ calcd for C21H20NO10S :CD3OD）δ 2.76（2H, t, J＝7.6 Hz, H2）, 2.54（2H, t,

478.0808, Found : 478.0794 ; 1H NMR（400 MHz,

J＝7.6 Hz, H3）, 6.72（1H, d, J＝2.4 Hz, H2'）
, 6.84acetone-d6）δ 5.21（1H, dd, J＝9.2 and 4.0 Hz,（1H, d, J＝2.4 Hz, H6'）
, 3.48（1H, dd, J＝14.4 andH2）［5.24（1H, dd, J＝9.2 and 4.0 Hz, H2）］, 3.11-

4.0 Hz, H2″a）, 3.16（1H, dd, J＝14.4 and 9.2 Hz, H2″

3.18（1H, m, H3a）, 2.98-3.05（1H, m, H3b）, 6.84

b）
, 3.91（1H, dd, J＝9.2 and 4.0 Hz, H3″）
. 2',5'（1H, d, J＝1.6 Hz, H2'）
［6.86（1H, d, J＝1.6 Hz,（or 5',6'）-Bis（S-cysteinyl）hydroxytyrosol（6）:H2'）］, 6.76（1H, d, J＝8.4 Hz, H5'）
［6.78（1H, d, J

H R - E S I - M S （ m / z ）［ M - H ］ c a l c d f o r＝8.4 Hz, H5'）］, 6.69（1H, dd, J＝8.4 and 1.6 Hz,

C 14H 19N 2O 7S 2 : 391.0634, Found : 391.0633 ; H

H6'）［6.70（1H, dd, J＝8.4 and 1.6 Hz, H6'）］, 6.35

NMR（400MHz, D2O）δ 3.83-3.70（4H, complex,（1H, d, J＝16.0 Hz, H2″）
［6.38（1H, d, J＝16.0 Hz,

H1, H3″, and H3'''）, 7.03（1H, s, H6'）
, 3.42（2H,H2）］, 8.41（1H, d, J＝16.0 Hz, H3″）
［8.31（1H, d,brd, J＝14.0 Hz, H2″
a and H2'''a）, 3.28-3.15（2H,

J＝16.0 Hz, H3″）, 6.99（1H, d, J＝8.4 Hz, H5'''）,

complex, H2″band H2'''b）, 3.02（2H, m, H2）.

7.35（1H, d, J＝8.4 Hz, H6'''）,3.36（1H, dd, J＝14.2

5'-S-Cysteinylhydroxytyrosol（7）, HR-ESI-MS

and 8.0 Hz, H2''''a）［3.71（1H, brd, J＝14.2 Hz, ,（m/z）［M-H］－ calcd for C11H14NO5S : 272.0593,

H2''''a）］, 3.43（1H, dd, J＝14.2 and 3.6 Hz, H2''''b）

Found : 272.0591 ; H NMR（400 MHz, CD3OD）［3.50（1H, dd, J＝14.2 and 10.4 Hz, H2''''b）］, 4.21

δ 3.69（2H, t, J＝7.0 Hz, H1）, 2.66（2H, t, J＝7.0（1H, m, H3''''）［4.76（1H, brd, J＝10.4 Hz, H3''''）］

Hz, H2）, 6.70（1H, d, J＝1.8 Hz, H2'）
, 6.85（1H, d,

1 0 . H R - E S I - M S （ m / z ）［ M - H ］－ c a l c d f o r

J＝1.8 Hz, H6'）, 3.52-3.45（2H, complex, H2″a

C14H18NO6S : 328.0855, Found : 328.0847 ; 1H NMR

and H3″）, 2.96（1H, dd, J＝15.6 and 11.6 Hz, H2″（400 MHz, acetone-d6）δ3.62-3.72（2H, m H1）,b）. 5'-S-Cysteinylnordihydroguaiaretic acid（12.64（2H, m, H2）, 6.71（1H, d, J＝1.6 Hz, H2'）,: 1 mixture of diastereomers）（8）, HR-ESI-MS

6.80（1H, d, J＝1.6 Hz, H6'）, 3.25（1H, dd, J＝13.9（m/z）［M-H］－ calcd for C21H26NO6S : 420.1481,

and 5.2 Hz, H2″a）, 3.14（1H, dd, J＝13.9 and 7.6

Found : 420.1474 ; H NMR（400 MHz, CD3OD）

Hz, H2″b）, 4.61（1H, m, H3″）, 7.52（1H, d, J＝6.0

δ 2.20（2H, m, H1a and H4a）, 2.65（2H, m, H1b

Hz, NH）, 1.92（3H, s, COCH3）, 3.58（3H, s, OCH3）,

and H4b）, 1.70（2H, m, H2 and H3）, 0.82（6H, d,7.70（1H, brs, OH）, 8.00（1H, brs, OH）. 11.HR-

J＝5.2 Hz, 2-CH3 and 3-CH3）, 6.76（1H, d, J＝1.2

ESI-MS（m/z）［M-H］－ calcd for C20H27N2O9S2 :Hz, H2'）, 6.65（1H, overlapped with H5″signal,503.1158, Found : 503.1151 ; 1H NMR（400 MHz,H6'）, 6.58（1H, brs, H2″）, 6.66（1H, d, J＝7.6 Hz,

acetone-d6）δ 3.71（2H, m, H1, NOE observed

H5 ″）, 6.46（1H, dd, J＝7.6 and 1.8 Hz, H6 ″）, 3.49from H6'）, 3.00（2H, m, H2, NOE observed from

（1H, dd, J＝12.8 and 4.8 Hz, H1'''a）［3.46（1H, dd,H6'）, 6.93（1H, s, H6）, 3.32（1H, dd, J＝14.0 and

J＝12.8 and 4.8 Hz）］, 3.17（1H, dd, J＝12.8 and5.2 Hz, H2″a, NOE observed from H6'）,3.18-3.24

4.4 Hz, H1'''b）［3.14（1H, dd, J＝12.8 and 4.4（1H, complex, H2″b）, 4.63（1H, m, H3″）, 7.56Hz）］, 3.93（1H, dd, J＝4.8 and 4.4 Hz, H2'''）［3.91（1H, d, J＝8.0 Hz, 3″-NH）, 3.10-3.24 （2H,

（dd, J＝4.8 and 4.4 Hz）］. 2'''-S-Cysteinylrosmarinic

complex, H2'''）, 4.59（1H, m, H3'''）, 7.63（1H, d, Jacid（5 : 4 mixture of diastereomers）（9）: HR-＝7.6 Hz, 3'''-NH）, 1.91（3H, s, COCH3）, 1.93（3H,

－

1

1

１

© The Ito Foundation

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究（その２）

7s, COCH3）, 3.59（6H, s, OCH3 x 2）
. 12. HR-ESI-

液の機能を検討できる利点を有する。ポリフェ

MS （m/z）［M-H］ calcd for C 26H 36N 3O 12S 3 :ノールおよびシステイン等モルから調製した反応678.1461, Found : 678.1479 ; 1H NMR（400 MHz,

溶液の40μlのMetMb還元MbO2化活性を測定した

acetone-d6）δ 3.13-3.36（10H, complex, H1, H2,

結果をFig.１に示した。また比較対象として，シH2''', H2''', and H2''''）, 4.53-4.63（3H, complex, H3″,

ステインを用いない酸化反応溶液のデータも同時

H3''', and H3''''）, 7.58（1H, d, J＝8.0 Hz, NH）, 7.62に示している。Fig.１のデータからシステインな（1H, d, J＝8.0 Hz, NH）, 7.65（1H, d, J＝8.0 Hz,

しのペルオキシダーゼ酸化ポリフェノールはケン

NH）, 1.94（3H, s, COCH3）, 1.95（6H, s, COCH3 x

フェロールとモリンからの生成物を除いて高い活2）, 3.55（3H, s, OCH3）, 3.59（3H, s, OCH3）, 3.62性を示さなかったのに対し，ほとんどのシステイ（3H, s, OCH3）.

ン存在下での反応生成物は顕著なMetMb還元活－性を示した。検討したポリフェノールの中では，３．結果と考察ヒドロキシチロゾール，カテキン，およびカフェ

3 . 1 ポリフェノール－システイン反応生成物

酸は高い効率を示し，ケンフェロール，モリン，
タキシフォリン，ロスマリン酸，ノルジヒドログのメトミオグロビン還元活性
システインとポリフェノールの複合物質調製

アイアレチン酸がそれに続く活性を示した。これ

は，種々検討の結果，ペルオキシダーゼ－過酸化までの研究により，高活性ポリフェノールは，シ水素による酸化カップリング法を用いることにしステインの存在下で高いMetMb還元MbO2化能をた。本法は触媒量の酵素を使用するのみであり，示すことを明らかにしているが，今回の酸化反応操作が簡便で応用性が高く，またそのまま反応溶により生成したシステイニルポリフェノールが，

50

MbO２
（％）

40
30
20
10
0
-5

e

n
ei
st
cy
ne
ei
id＋
st
ac
cy
ic
e
in＋
in
in
ol
ar
te
xif n mta ifoli ros cid cys
x d a ＋
ta cte nic cida i a
re ar c id ine
ism in ac tero mar nic cyses inro mar trol＋ ine
ei
st
e
s
ro era ol stcyesv tr cy
id＋ teinre era ＋ac
sv tinys
re rce in uic cid ＋c
e t h a c dqu rce tec uic reti aci
e a h aqu toc tec uai etico a g rpr toc dro aia ine
o y u epr ih og strd
or d cym dihyin＋
r t
e
no ce
in
i
yr tin tem rice cys
e
y
in
m in＋
te
s
or
n
i
m n cy
i
e
st
or ＋
e
m olin
cy
in
＋
te
te
lu lin rol
ys
o
c
te fe
lu mp erol ol＋ ne
e f s
i
e
ka mp tyro ol ste
ine y s yteska rox tyro ＋ccy
d y idd＋
hy ox ace
dr c id ci
inhy tisi ac ic a id ste
n ic e c y
ge is ﬀ a c
nt ca eic d＋
ge ydrocaﬀ acidhdi dro nic ci e
hy e a indi rog ic telo en ysnech orogn＋c
ei
st
l i
cy
ch ech nt i ＋
ca ch cidte a
ca eic acidﬀ
ca eicﬀ
caFig. 1 Effects of the products（600μmol/l based on starting polyphenols）from polyphenols in peroxidase-catalyzed

oxidation in the presence or absence of cysteine on MetMb reduction. Results are expressed as mean±standard
deviation（SD）（n＝3）.

© The Ito Foundation

8

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

MetMbの還元MbO2化の原因物質である可能性が60μmol/lにおけるMetMb（60μmol/l）の還元反示唆された。

応で生成したMbO2 の経時的生成比率をFig.３に示した。Fig.３より，すべてのシステイニルポリ

3 . 2 システイニルポリフェノールの単離と構フェノールは，最初の１時間に顕著にかつ濃度依造同定
Fig.２に示した各種システイニルポリフェノー

存的にMetMbの還元活性を示した。その一方で，ルは，分取HPLCにて精製，単離の後，高分解能

システインポリフェノール５，
７，８，および９にESI-MS法により分子式を確定し，1D-NMRおよ

おいては，その後，明らかにMbO2の減少が観察

び2D-NMR法により，システイン（アセチルシされた。８と９すなわち，システイニルノルジヒ

ステインを含む）の置換位置を含めて，その化学

ドログアイアレチン酸およびシステイニルロスマ

構造を決定した。

リン酸は，二つのカテコール構造を有し，そのう
ちの一つはそのままの形で残っている物質であ3 . 3 システイニルポリフェノール（1-9）のる。我々はこれまでの研究で，カテコール構造を

MetMb還元MbO2化活性の測定

有する抗酸化性の強いポリフェノールは，同時に各種調製システイニルポリフェノールの600－

R

OH
HO

O

OH

OH

2
R
OH

HO

O

OH

R
２

OH HOOC

O

HO 5

R
２

HO

6

OH

HO

R

R

R

HO
HO

or

6
5

HO

R

R

R

O

OH

HOOO
5
OH
OH

5
R

OH
5
R

R
２ OH

O

OH

8

OH

7

6

HO

O

HO

OH

OH
OH

9

Fig. 2 Chemical structures of the prepared cysteinyl polyphenols© The Ito Foundation

R=

S

OH
OH

OH
OH

5

OH

5

O

HO

4
HO

R
２

3

HO

or

5
R

OH

2

O
OH

O

OH

OH

1

HO

5

CO2H
NH2

9

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究（その２）

20
2

100

MbO（
2 ％）

40
20
1

2

100

3（h）

MbO（
2 ％）

40
20
1

2

20
2

3（h）

60 μmol/L;

20

150 μmol/L;

40
20
1

2

300 μmol/L;

3（h）

9

60
40
20

0
-20 0

3（h）

3（h）

8

80

40

2

2

100

60

1

1

60

0
-20 0

3（h）

7

0
-20 0

20

80

40

1

40

100

60

0
-20 0

60

0
-20 0

3（h）

5

80

60

0
-20 0

2

100

6

80

1

80

60

0
-20 0

20

100

4

80
MbO（
2 ％）

3（h）

40

MbO（
2 ％）

1

60

0
-20 0

3

80
MbO（
2 ％）

MbO（
2 ％）

MbO（
2 ％）

40

100

2

80

60

0
-20 0

MbO（
2 ％）

100

1

80

MbO（
2 ％）

100

1

2

3（h）

600 μmol/L;

Fig. 3 Effects of cysteinyl polyphenols（1-9）on MetMb reduction. All analytical experiments were performed intriplicate and the data were expressed as means （SDs were smaller than symbols）. Compounds 1,2'--S-cysteinylcatechin；2, 5'-S-cysteinylcatechin；3, 2''-S-cysteinylchlorogenic acid ； 4, 2',5（or 5',6'）-bis（S-cysteinyl）
dihydrocaffeic acid；5, 5'-S-cysteinyldihydrocaffeic acid；6, 2',5'（or 5',6'）-bis（S-cysteinyl）hydroxytyrosol；7,5'-S-cysteinylhydroxytyrosol；8, 5'-S-cysteinylnordihydroguaiaretic acid；9, 2'''-S-cysteinylrosmarinic acid.

有するプロオキシダント性に起因するMbO2の酸化促進性を報告している３）。したがって，８およ

3 . 4 MbO2 の生成・維持に対するチオール置換数の影響

び９に残存したカテコール構造が最初に生成した

我々が以前行ったポリフェノ－ルの抗酸化性増MbO2の酸化を促進したと考えられた。また，シ

強作用の研究において，システイニルジヒドロカ

ステイニルポリフェノール５および７は非常に類

フェ酸の抗酸化性はチオール置換数によって異な似した構造を有する。これまでの研究から，モノ

り，またその置換は三つまで可能なことを報告しチオール置換は，反応性の高いポリフェノールのた ６）。このような効果がシステイニルポリフェ

プロオキシダント性を減少させることが判明してノールのMetMbの還元能と生成MbO2維持能に影いるが，これらのモノシステイン置換化合物には響を与えるか，ヒロドキシチロゾールを用いて検まだプロオキシダント性が認められたことにな討した。なお，ヒドロキシチロゾールはオリーブる。その理由として，これらのポリフェノールに由来の強力な抗酸化剤として知られている。なは抗酸化性およびプロオキシダント性の両方を減

お，トリシステイン置換ヒドロキシチロゾールの少させる共役電子吸引性の官能基はなく，システ

調製は，システインチオール部分の速い酸化によインチオール１個の置換では，MbO2の酸化を抑り，ペルオキシターゼ酸化法では困難であったた

えられないと考えられた。

め，α-アミノおよびカルボキシル基が保護され© The Ito Foundation

10

平成27年度HO

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

OH

HO
R

R
２

HO
HO

5

R

HO

OH

HO

or

5

10

OH
6
5

R

R

11
HO

R
２

HO
R

5

OH

R=

6
R

S

CO2CH3
NHAC

12
100

MbO2（％）

MbO2（％）

40
20
0

0

2

1

3

（h）

11

100
80

40
20
0

-20

MbO2（％）

20
0

1

2

60 μmol/L;

0

1

2

3

（h）

150 μmol/L;

3

（h）

12

80

40
0

60

100

60

-20

10

80

60

-20

MbO2（％）

100

Hydroxytyrosol

80

60
40
20
0

-20

0

1

300 μmol/L;

2

3

（h）

600 μmol/L;

Fig. 4 Structures and Effects of（N-acetyl-O-methyl）
cysteinyl hydroxytyrosols（10-12）and hydroxytyrosol on MetMb

reduction. All analytical experiments were performed in triplicate and the data were expressed as mean±standard
deviation（most SDs were smaller than symbols）．

ていることによりチオール部分の酸化を極めて遅ゾ ー ル（12）も 調 製 し た（Fig. ４）。得 ら れ た

くできるN-アセチルシステインメチルエステル

10，11，および12のMetMb還元活性を測定した（NAC-OCH3）を用いて行った 。酸化試薬としデータをFig.４に示した。11と12は強い濃度依存て，DPPH（2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジ

性還元活性を示したのに対し，10は無置換のヒドル）を使用し，等モルのNAC-OCH3 の存在下でロキシチロゾール同様にMetMb還元活性を持た21％および15％の収率でモノ置換ヒドロキシチロ

ないことが判明した。また，ジチオール置換化合ゾール（10）およびジ置換ヒドロキシチロゾール

物11が最も高いMetMb還元能を示すこともわ（11）を得た。さらに11をNAC-OCH3存在下で，かった。このジ置換ヒドロキシチロゾールの還元

再度DPPH酸化によりトリ置換ヒドロキシチロ

効率は，MetMb（60μmol/l）に対して600μmol/

７）© The Ito Foundation

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究（その２）lの濃度でほぼ100％に達し，これまでにない高効率であった。今後の食肉自体への応用研究に11またはそれに類するジシステイン置換ポリフェノー
ルに大いに期待が持たれる結果を得た。
４．要約

食肉の新鮮色に密接に関係のあるミオグロビンの鮮赤色の発現に，システイン等のチオールを導入したポリフェノールが有効であることを示した。特に，オリーブ由来の抗酸化物質として入手の容易なヒドロキシチロゾールに，食品添加物でもあるアセチルシステインを二置換したものは，非常に効率的な機能を示すことが判明した。実際の食肉における効果を今後，検討していくことにより，ポリフェノールから実用可能な食肉新鮮色
維持物質の開発が期待できる８）。
文 献１） Issanchu,S. : Consumer expectations andperceptions of meat and meat product quality, Meat
Sci., 43, S5-S19, 1999.

11２） Mancini, R. A., Hunt, M. C. : Current research inmeat color, Meat Sci., 71, 100～121, 2005.
３） Masuda, T., Inai, M., Miura, Y., Masuda, A.,
Yamauchi, S. : Effect of polyphenols on oxymyoglobinoxidation: Prooxidant activity of polyphenols in vitro
and inhibition by amino acid, J. Agric. Food Chem.,
61, 1097～1104, 2013.
４） Inai, M., Miura, Y., Honda, S., Masuda, A.,
Masuda, T. : Metmyoglobin reduction by
polyphenols and mechanism of the conversion ofmetmyoglobin to oxymyoglobin by quercetin, J.
Agric. Food Chem., 62, 893～901, 2014.
５） Miura Y., Inai, M., Honda, S., Masuda, A., Masuda,
T. : Reducing effects of polyphenols on metmyoglobin
and the in vitro regeneration of bright meat color
by polyphenols in the presence of cysteine, J. Agric.
Food Chem., 62, 9472～9478, 2014.
６） Fujimoto, A., Inai, M., Masuda, T. : Chemical
evidence for the synergistic effect of a cysteinyl
thiol on the antioxidant activity of caffeic anddihydrocaffeic esters, Food Chem., 138, 1483 ～ 1492,
2013.
７） Miura, Y., Honda, S., Masuda, A., Masuda, T. :Antioxidant activities of cysteine derivatives against
lipid oxidation in anhydrous media, Biosci.
Biotechnol. Biochem., 78，1452～1455，2014．
８） Honda, S., Miura, Y., Masuda, T., Masuda, A. :Effective conversion of metmyoglobin tooxymyoglobin by cysteine-substituted polyphenols, J.
Agric. Food Chem., 64, 806～811, 2016.

© The Ito Foundation

12

ZnPP形成能を有する微生物の探索と応用
Searching for microorganisms with a high ZnPP-forming ability and its
application to meat products

若

松

純

一

（北海道大学北方生物圏フィールド科学センター）

Jun-ichi Wakamatsu（Field Science Center for Northern Biosphere, Hokkaido University）

In order to improve the color of meat products, we searched for microorganisms that havea high ability to form ZnPP. Two bacteria with high ZnPP-forming ability were found frombacteria that were separated from pork homogenate incubated under an anaerobic condition.
Moreover, it was shown that four bacterial strains derived from food have a high ZnPP-forming
ability. By the addition of L. plantarum and S. proteamaculans related species, the formation of
ZnPP was significantly facilitated and the color of minced pork was reddened. These results
suggested that the color of meat products can be improved by using microbes with high ZnPPforming ability.

１．目

パルマハム中のZnPPはその製造中に形成されて的蓄積されたものである。生体の骨格肉内部は無菌

北イタリアで生産されるパルマハムは豚肉およ状態であり，肉塊を原料とするパルマハムにおいび海塩のみを原料とする長期熟成型の乾塩漬生ハてはその内部に存在する微生物も少ないこと３）か

ムであるが，発色剤だけでなく砂糖や香辛料の使

ら，ZnPP形成には豚肉の内在酵素が関与してい用は一切認められていない。しかしながら，発色ると考えられている。しかし，当時ZnPPの存在剤を添加しないにもかかわらず，その色調は鮮やは確認していなかったものの，Moritaら２）はパル

かな赤色を呈している。Wakamatsuら１）は，こマハムから単離したStaphylococci がパルマハムの赤色色素がプロトポルフィリンⅨ（PPIX）に中に形成される新規ミオグロビン誘導体，すなわ

亜鉛が配位した亜鉛プロトポルフィリンⅨ

ちZnPPの形成に関与していることを報告した。

（ZnPP）であることを明らかにした。ZnPPは安また，豚肉ホモジネートを用いたモデル実験系に定で鮮やかな赤色色素

であり，ZnPPを利用す

おいても抗生物質を添加しないと，ZnPPの形成ることによって，発色剤無添加であっても好まし量が増加することも示されている４）。このように，い色調を呈する食肉製品の開発に役立てられるの

ZnPP形成は食肉の内在酵素による反応に加えて，ではないかと考えられている。

微生物による関与も十分に考えられることから，

２）

豚骨格筋にはZnPPがほとんど存在しないため，微生物を利用したZnPP形成の促進によって，発© The Ito Foundation

ZnPP形成能を有する微生物の探索と応用

13

色剤を添加しない食肉製品の色調改善に役立てら1500R５）を用いてPCRを行った。DNAシークエンれるかもしれない。欧米では，発酵ソーセージがス 解 析 は 外 部 委 託 し ，相 同 性 検 索 プ ロ グ ラ ム

広く一般的に製造されており，品質の改善ならびBLASTNを用いて相同性の高い配列を検索した。

に安定化，有害微生物の生育阻止を目的としてス

さらに，分離同定した微生物は，無菌的に調製しターターカルチャーを添加することが多いことかた豚肉ホモジネートに菌数を揃えて播種後，同様

ら，ZnPP形成を促進する微生物を添加することに嫌気的にインキュベートして，75％アセトン抽で，好ましい色調も付与することが期待できる。

出 法 で ZnPP を 抽 出 し ， 蛍 光 強 度 （Ex/Em :しかしながら，どのような微生物がZnPP形成を

420/590 nm）を測定した。

高めるのかについては明らかにされていない。
そこで本研究では，ZnPP形成能の高い微生物

2 . 2 食品由来微生物のZnPP形成能と色調改善効果を探索するために，豚肉ホモジネートから微生物

無菌的に調製した豚肉ホモジネートに食塩を終の分離を行い，各微生物がZnPP形成に及ぼす影

濃度３％となるように加え，独立行政法人製品評

響を検討した。さらに，食経験がありZnPP形成

価技術基盤機構より入手した細菌株（７株）と，能の高い微生物を探索して，食肉製品に応用する

本研究で分離した細菌１株を，菌数を揃えて播種ことにより，発色剤を用いなくても色調の望ましし，嫌気的に25℃で14日間インキュベートしたい食肉製品の製造法の開発に関する基礎的データ

後，75％アセトン抽出法でZnPPを抽出し，蛍光を得ることを目的とした。

強度（Ex/Em : 420/590 nm）を測定した。

２．方

無菌的に調製した豚ひき肉に食塩を終濃度３％法となるように加え，菌数を揃えて上記微生物を混2 . 1 豚肉ホモジネートからZnPP形成能を有合して真空包装した後，18℃で14日間インキュベートした。微生物を接種していないものと亜硝する微生物の分離・同定
細切した豚肉に1.5倍量の純水を加えてホモジ酸ナトリウムを200 ppmとなるように添加したもナイズし，塩酸溶液を用いてpH 5.5に調整した後，のを対照区とした。インキュベート後に，色彩色

豚肉含量が終濃度10％となるように純水を加え差 計 に よ る 赤 色 度（a ＊ 値）と ，表 面 自 家 蛍 光て，25℃の暗所で嫌気的に５日間インキュベート（Ex/Em : 420/590 nm）を測定した。

した。その後，一部を生理食塩水で希釈して標準寒天培地に塗抹し，残りは75％アセトン抽出法でZnPPを抽出して，蛍光強度を測定した。ZnPP形
成量の多かった豚肉ホモジネートから，形成され３．結果と考察3 . 1 豚肉ホモジネートからZnPP形成能を有する微生物の分離・同定た単一のコロニーを釣菌し，酵母エキス，トリプ

インキュベート後にZnPPが多く形成した豚肉

トンおよびグルコースからなる液体培地に移してホモジネートから30株を分離し，16S rRNA遺伝

25℃の暗所で嫌気培養し，再度標準寒天培地に塗子の全長配列から，１つの乳酸桿菌と３つの腸内

抹し，25℃で嫌気的にインキュベートして単一コ細菌科の計４細菌を同定した（Table１）。これら

ロニーであることを確認した。分離したコロニーの４種の細菌を無菌的に調製した豚肉ホモジネー

からDNAを抽出後，真正細菌16S rRNA遺伝子のト に 接 種 し て イ ン キ ュ ベ ー ト す る と ， C.

全長配列を標的とするプライマーとして10Fとdivergens近縁種区とS. proteamaculans近縁種区© The Ito Foundation

14

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Table 1 Microorganisms separated and identified from pork homogenate

after incubation
Microorganisms

Homology

Carnobacterium divergens related species

1471/1475（99.7％）

Enterobacteriaceae bacterium related species

1467/1472（99.7％）

Enterobacter amnigenus related species

1466/1467（99.9％）

Serratia proteamaculans related species

1459/1471（99.2％）

が無添加区と比べて有意に高いZnPP形成量を示

硝酸塩はZnPP形成を阻害することが明らかにさした（Fig.１）。なお，無添加区は抗生物質添加れており６），この報告と合致する。赤色度（a＊値）

区と差がなかったことから，豚肉ホモジネートがについては，亜硝酸塩添加区が最も高いが，L.

無菌的に調製されていると考えられる。以上のこ

plantarumとS. proteamaculans近縁種添加区でもとから，ZnPP形成能の高い微生物の存在が明ら

無添加区と比べて有意に高かった。実際の色調にかになった。

つ い て も ，L. plantarum と S. proteamaculans 近

3 . 2 食品由来微生物のZnPP形成能と色調改

縁種添加区は他の試験区と比べて赤く見えたことから（データ示さず），高いZnPP形成能を有する

善効果
見出した２細菌は食経験が少ないことから，食微生物を用いることにより，食肉製品の色調を改品由来の細菌を用いて検証する必要がある。ま善できることが示唆された。今後は，より活性のた，食肉製品への応用のためには，食塩耐性も重高い微生物の探索や形成促進条件などの検討が必要である。そこで，無菌的に調製し，３％食塩を要であろう。

含む豚肉ホモジネートを用いて，食品由来細菌のZnPP形成能を評価した。インキュベートを25℃

４．要

約で 14 日 間 行 っ た と こ ろ ， 分 離 同 定 し た S.

発色剤を用いなくても色調の望ましい食肉製品

proteamaculans近縁種だけでなく，４細菌株（L.

の製造法を開発するために，ZnPP形成能の高い

plantarum, P. acidilactici, P. pentosaseus, L.

微生物を探索して，ZnPP形成に及ぼす影響を検rhamnosus）も高いZnPP形成能を示した（Fig.２）。

討した。豚肉ホモジネートから分離して同定した

一方，S. xylosusのようにZnPP形成能を示さない

４細菌から有意に高いZnPP形成能を有する細菌

微生物も存在した。

２株を見出した。食品由来の細菌７株について

次に，より製品に近い実験系でZnPP形成能とも，豚肉ホモジネートを用いてZnPP形成能を評

それに伴う色調改善効果について検討した。食塩

価したところ，４株が有意に高いZnPP形成能をを３％含む豚肉ミンチを無菌的に調製し，同様に示した。豚肉ミンチを用いて評価したところ，L.

食品由来細菌を接種して真空包装した後，18℃でplantarumとS. proteamaculans近縁種添加区は他

14日間インキュベートした。ZnPP形成を示す自の試験区と比べてZnPPが有意に多く形成され，家蛍光強度は，L. plantarumとS. proteamaculans

色調も赤くなった。以上の結果から，高いZnPP

近縁種添加区で有意に高く，豚肉ホモジネートの形成能を有する微生物を用いることにより，食肉結果と同じ傾向を示した（Fig.３）。一方，亜硝製品の色調を改善できることが示唆された。

酸塩添加区では無添加区と比べて有意に低く，亜© The Ito Foundation

15

Fluorescence intensity （Eｘ/Em：420/590 nm）

ZnPP形成能を有する微生物の探索と応用

200
＊＊
＊＊

150

100

50

0

l

tro

on

C

An

s

ic

ot

i
tib

i

.d

C

ns

ge

r
ve

m

riu

e
ct

ba

E.

us

en

E.

g
ni

am

ns

la

u
ac

am

te

o
pr

S.
＊＊：p<0.01（vs Control）
Bars：SEM（n=5）

Fig. 1 Effects of microorganisms separated from pork homogenate incubated anaerobically on the formation of ZnPP in

Fluorescence intensity （Eｘ/Em：420/590 nm）

pork homogenate

700
＊＊

600

＊＊
＊＊ ＊＊

500

＊＊

400
300
200
100
0
C

l

tro

on

An

s

ic

ot

i
tib

L.

a

pl

m

c
ila

d

ci

a
P.

i

P

c
sa

o

nt

e
.p

s

eu

tic

ru

a
nt

L.

am

rh

s

su

no

K.

ns

ia

r
va

S.

c

us

os

n
ar

S.

S.

us

os

l
xy
pr

a

am

e
ot

s

an

l
cu

＊＊：p<0.01（vsControl）
Bars：SEM（n=3）
Fig. 2 Effects of food-derived microorganisms on the formation of ZnPP in pork homogenate© The Ito Foundation

平成27年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

800

＊＊

Fluorescence intensity（Eｘ/Em：420/590 nm）

##

##
600

10

8

##
＊＊

6

a＊

16

400
4
200

2

＊＊

0
on

C

l

tro

e

it
irt

N

L

r

ta

an

l
.p

P.

um

a

c

ila

d
ci

i

tic

P.

c

sa

o
nt

pe

s
eu

L.

no

m

a
rh

s
su
K.

s
an

ri

va

s

n

ar

c
S.

u
os

S.

s

u
os

l

xy

te

ro

p
S.

0

ul

ac

am

s
an

＊＊，##：p<0.01（vsControl）
Bars：SEM（n=3）
Fig. 3 Effects of food-derived microorganisms on the formation of ZnPP and redness of minced meat文献１） Wakamatsu, J., Nishimura, T., Hattori, A. : A Znporphyrin complex contributes to bright red color
in Parma ham, Meat Sci., 67（1）,95～100, 2004.
２） Morita, H., Niu, J., Sakata, R., Nagata, Y. : Red
pigment of Parma ham and bacterial influence on its
formation, J Food Sci., 61（5）,1021～1023, 1996.
３） Toldra, F. : Proteolysis and lipolysis in flavour
development of dry-cured meat products, Meat Sci.,
49S1, S101-10, 1998.
４） Wakamatsu, J., Okui, J., Ikeda, Y., Nishimura, T.,

Hattori, A. : Establishment of a model experiment
system to elucidate the mechanism by which Znprotoporphyrin IX is formed in nitrite-free drycured ham, Meat Sci., 68（2）,313～317, 2004.
５） 厚生労働省：遺伝子解析による微生物の迅速同定方，第十六改正日本薬局方, 2029～2031, 2011.
６） Wakamatsu, J., Hayashi, N., Nishimura, T.,
Hattori, A. : Nitric oxide inhibits the formation ofzinc protoporphyrin IX and protoporphyrin IX, Meat
Sci., 84（1）,125～128, 2010.

© The Ito Foundation

17

筋タンパク質の死後分解に与えるオートファジーの影響：プロテオーム解析を用いたアプローチ
Effects of autophagy on postmortem proteolysis in skeletal muscle: An approach using proteomic analysis

仲

西

友

紀・河

原

聡

（宮崎大学農学部応用生物科学科）

Tomonori Nakanishi and Satoshi Kawahara（Department of Biochemistry and Applied Biosciences, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

The aging process, in which the fresh carcass or meat is kept at low temperature for acertain period of time, is essential for the conversion of skeletal muscle into edible meat.
Proteolysis plays a key role in metabolic, physical and structural alterations and affects meat
quality such as tenderness and flavor. A number of studies have addressed the mechanism ofproteolytic events during the aging process; however, its precise mechanism is not fully
understood. Autophagy is the bulk degradation process for intracellular proteins in eukaryotic
cells. In this study, we performed experiments to investigate the effects of autophagy on
postmortem proteolysis in mouse skeletal muscle using a proteome-based analysis. Mice were
fasted to induce autophagy, and intraperitoneally administered with or without the autophagy
inhibitor wortmannin, whereas control mice were given free access to diet. Mice weresacrificed 14 h after the start of fasting and administration of wortmannin, and skeletal muscles
collected from the femoral area were stored at 4℃. The skeletal muscle proteins wereextracted 48 h after sacrifice of mice. The skeletal muscle proteins labeled with IC5-Osu weremixed with internal standard proteins labeled with IC3-Osu, and subjected to two-dimensional
difference gel electrophoresis（2D-DIGE）analysis. The differentially expressed proteins amonggroups were analyzed by matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight mass
spectroscopy（MALDI-TOF MS）. Results on 2D-DIGE showed that mice starved before
sacrifice exhibited decreased expression of 21 proteins compared to control mice. In addition,
administration of wortmannin canceled starvation-induced proteolysis on more than half ofthese proteins. The molecular identification by MALDI-TOF MS analysis revealed that theseincluded proteins such as phosphoglucomutase 1 and lactate dehydrogenase A, which havebeen reported to be associated with meat quality. These findings suggest that autophagy is amediator of postmortem proteolysis in skeletal muscle and could affect meat quality.

１．目

ない，特有のテクスチャーや風味を獲得する。食的

肉の熟成は筋タンパク質分解を伴う反応であり，

食肉は熟成させることで，と畜直後の生肉にはカテプシンおよびカルパイン等の筋肉内在性プロ© The Ito Foundation

18

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

テアーゼが熟成に関与することが広く知られてい用させた研究例は少ない。特に，食肉の熟成機構

るにおけるオートファジーの役割については不明な。また，カルシウムイオンが直接的に筋原

１，２）線維構造を脆弱させることも報告されている３）。

点が多い。

しかしながら，熟成過程における肉質の変化は極そこで本研究では，食肉の熟成機構の解明を目めて複雑な化学的・生物学的反応によって制御さ指した基礎的研究として，筋タンパク質の死後分れており，メカニズムの詳細には未解明な点が多解に与えるオートファジーの影響を調査した。具

く残されている。

体的には，栄養学的・薬理学的処置でオートファ

オートファジーは酵母から哺乳類までよく保存ジーを促進もしくは阻害したマウスから骨格筋をされたタンパク質分解機構であり，オートファゴ

採取し，それぞれの骨格筋におけるタンパク質のソームに取り込んだ細胞質成分をリソソームに運死後変化をプロテオーム解析の手法で解析した。

び分解する。オートファジーにはシャペロン介在性オートファジー，ミクロオートファジー，マク２．方法

ロオートファジーの３種類の経路が知られている

2 . 1 実験動物と処置が，マクロオートファジーに関する研究が最も進

雌性C57BL/6マウスを試験に供した。マウスを展している。そのため，通常単にオートファジー

無作為に３群（ｎ＝３）に割り付け，そのうち２と表記した場合はマクロオートファジーを指すこ

群にはオートファジーを誘導するために絶食の処とが多く，本報告においてもその表記に従う。

置を施した。さらに，絶食処置を施した２群のうオートファジーで分解されるタンパク質量はユビ

ち，片方の群には生理食塩水を，もう片方の群にキチン－プロテアソーム系に匹敵すると考えられは0.2 mM wortmannin含有生理食塩水を，それているが，細胞内タンパク質を非特異的に分解でぞれ500μL腹腔内投与した。対照群には絶食処置

きる点でユビキチン－プロテアソーム系とは性質を施さず，生理食塩水を500μL腹腔内投与した。

が異なる。

絶食開始および腹腔内投与から14時間後にマウス

オートファジーの存在自体は1950年代後半からをと殺し，大腿部より骨格筋サンプルを採取した

知られているが，ここ10年間で飛躍的に研究が進後に４℃で保存した。なお，本研究は宮崎大学動み，その分子機構や生理的意義が明らかにされて物実験委員会の承認を得たうえで実施した（承認きた。現在では，栄養飢餓時のアミノ酸供給や，

番号：2014-001）。

異常タンパク質の分解を介して，オートファジー
が生体の恒常性維持に深く関与していることが知2 . 2 筋タンパク質の抽出およびプロテオーム
解析られている。骨格筋においても，オートファジー

４℃で48時間保存した骨格筋サンプルから70の重要性が明らかとなっており，オートファジー㎎程度を切り出した。これを１mLのプロテアー

異常と筋疾患の関連性が指摘されている４）。また，

ゼ阻害剤（Roche社製）含有水中でホモジナイズ

オートファジー関連遺伝子の一つであるATG7

し，9,400 rpmで15分間遠心分離した後の上清をを欠損させたマウスでは筋委縮や筋力低下が生じ

水溶性タンパク質溶液として得た。得られたタンることも報告されている 。一方で，食肉の大部

パク質はインドシアニン化合物（IC-Dye）を用

分は家畜・家禽の骨格筋に由来するにも関わらいた蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動

ず，オートファジーに関する知見を食肉生産に応（2D-DIGE）により解析した。実際の解析は榊原

５）© The Ito Foundation

筋タンパク質の死後分解に与えるオートファジーの影響：プロテオーム解析を用いたアプローチ

らの方法６）に従い，内部標準法を用いることで複数のサンプル間における比較定量を可能とした。

19

３．結果と考察

すなわち，それぞれのサンプルを個別にIC5-OSu

本研究では，オートファジーを制御する手法と（同仁化学社製）で標識し，内部標準サンプルはして，栄養学的および薬理学的処置をマウスに施IC3-OSu（同仁化学社製）で標識した。標識したした。事前の検討で，オートファジーの指標としサンプルと内部標準サンプルを混合し，IPGストて microtubule-associated protein 1 light chain 3

リップゲル（Bio-Rad社製）を用いて二次元電気（LC3）-IIの発現を評価したところ，と殺前14時

泳動を行った。内部標準サンプルにはすべてのサ間の絶食により骨格筋のLC-II発現が有意に増加

ンプルを混合したものを使用した。それぞれの蛍すること，またこの変化はwortmanninの腹腔内

光色素に適したゲルイメージを取得し，解析ソフ投与により50％程度抑制されることを確認していトProdigy SameSpotsを用いた解析を行った。こる。そこで，本研究では同様の処置を施したマウの時，内部標準サンプルのIC3-Osuゲルイメージ

スの骨格筋を48時間４℃で保存した後に，水溶性を補正に用いることで，各群の比較定量を行っタンパク質を抽出しプロテオーム解析に供した。

た。CBB染色後，各群間で発現に増減が認めら

2D-DIGE解析における典型的ゲル画像をFig．

れるタンパク質スポットを切り出して，トリプシ

１（Ａ）に示す。Fig．1（Ａ）はIC5-Osu（green：

ンによるゲル内消化処理を施した。トリプシン処

被験サンプル）とIC3-Osu（red：内部標準サン

理後のペプチド混合物はMALDI-TOF型質量分プル）の検出画像を重ね合わせた結果であり，白析装置（Autoflex III, Bruker社製）にて解析し，

黒画像では見づらいが，緑のスポットは被験サン

マススペクトルを取得した。取得した情報を既存

プルで発現量が多いスポット，赤のスポットは発マスリスト情報と照合し，Mascot検索すること

現量が少ないスポットとして表される。ゲルごと

でタンパク質の同定を行った。

に内部標準サンプルとの蛍光強度比を算出し，各スポットの定量解析を行った結果，群間で発現量が増減する37スポットが検出された。37スポット

10

Mr（kDa）（B）
200

Mr（kDa）

（A）
200

3

pI

10

10

3

pI

10

Fig. 1 Representative images of 2D-DIGE and CBB stained 2D gels.（A）The skeletal muscle proteins were labeledwith IC3-Osu（internal standard）and IC5-Osu（test sample）, mixed and subjected to 2D-DIGE analysis.（B）The
2D gels were also stained by CBB. The differentially expressed proteins among groups are indicated in the gel.

© The Ito Foundation

20

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

を，CBB染色後に撮影したゲル画像上に示した

肉中のLDH量とpHや明度の関係性を指摘した報のがFig．1（Ｂ）になる。これらのスポットのう

告もなされている９）。

ち21スポットは，非絶食群に比べて絶食により

本 研 究 に お い て オ ー ト フ ァ ジ ー が PGM1 や

オートファジーを誘導した群で発現が減少する傾LDHAの死後分解を加速する要因であることが示向が認められた。また興味深いことに，絶食にされたが，このことはオートファジーが食肉の肉よって減少するこれらスポットのうち，半数以上

質に影響を与えることを強く示唆している。本研はwortmanninの腹腔内投与によってその減少が究ではマウス骨格筋を用いた検討を行ったが，今抑制されることが明らかとなった。そこでこれら後，畜肉を用いた検討で再現性を確認し，さらにのスポットを切り出して，トリプシンによるゲル

実際の肉質評価等を実施することでオートファ

内消化処理を施し，MALDI-TOF型質量分析装

ジーが食肉の肉質に与える影響をより明確化する

置を用いた解析でタンパク質の同定を試みた。そ必要があると考えられる。

の 結 果 ， phosphoglucomutase 1 （PGM1） や
lactate dehydrogenase A（LDHA）な ど の 同 定

４．要約に成功した。各群におけるPGM1とLDHAの発現

食肉の熟成は筋タンパク質分解を伴う反応であの差異をFig.２およびFig.３に示す。いずれのタるが，その機構には未解明な点が残されている。

ンパク質もと殺前14時間の絶食により発現が減少

オートファジーは細胞内タンパク質のバルク分解

し，その作用はwortmanninの腹腔内投与で抑制経路であり，近年の研究で，骨格筋の成長や機能されることが分かる。

におけるオートファジーの重要性が明らかになり

PGMは糖代謝に関与する酵素であり，グルコー

つつある。一方で，食肉の熟成過程におけるオー

ス-1-リン酸とグルコース-6-リン酸の相互変換をトファジーの役割は未解明のままである。そこで触媒する。数種のアイソザイムの存在が知られて本研究では，マウス骨格筋を用いて，筋タンパク

いるが，PGM1がPGM活性の大部分を担う。これ

質の死後分解に与えるオートファジーの影響をプまでの研究でPGM1と食肉の肉質の関連が指摘さ

ロテオーム解析の手法で調査した。雌C57BL/6マ

れており，PSE豚肉のような異常肉の滲出液中にウスを試験に供し，群１：非絶食，群２：14時間

PGM1が多く存在することが明らかになってい絶食，群３：オートファジー阻害剤wortmannin

る。また，PGM1量が食肉のpHと負の相関を示

を腹腔内投与し14時間絶食，の３群を設定した。

す一方で，明度やドリップロス量とは正相関する

絶食および腹腔内投与処置から14時間後にマウスことが報告されている 。LDHAもまた糖代謝にをと殺し，大腿部より骨格筋を採取した。骨格筋

関与する酵素であり，NADH（NAD ）を補酵素

は48時間４℃で保存し，その後筋タンパク質を抽としてピルビン酸と乳酸の相互変換を触媒する。

出した。各群の筋タンパク質はIC5-Osuで標識し，

生 体 内 に お い て LDH は Ａ も し く は Ｂ の サ ブ ユ

IC3-Osuで標識した内部標準サンプルと混合したニットからなる４量体として存在するが，骨格筋後に，蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳

ではLDHAが主要構成因子となる。牛肉を用いた動（2D-DIGE）解析に供した。さらに，群間で過去の研究では，LDHによるNADH産生がミト

発 現 に 増 減 が 認 め ら れ る ス ポ ッ ト を MALDI-

コンドリアにおける酸化消費の増大を介して肉色

TOF型質量分析装置で解析し，タンパク質の同に影響を与えることが示されている 。また，豚定を行った。群１に比べて群２では，21のタンパ

７）

＋

８）

© The Ito Foundation

筋タンパク質の死後分解に与えるオートファジーの影響：プロテオーム解析を用いたアプローチ
（A）

（B）

（C）

Arbitrary unit

（D）
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0

21

SalineSalineWortmannin

Fed

FastedFastedFig. 2 Effect of starvation and administration of wortmannin on phosphoglucomutase 1 expression in mouse skeletal

muscle. The skeletal muscle proteins were extracted 48 h after sacrifice and equal amounts of proteins wereresolved by 2D-DIGE followed by CBB staining and MALDI-TOF analysis.（A-C）Representative spot patterns ofeach experimental group（A: Saline/Fed group, B: Saline/Fasted group, C: Wortmannin/Fasted group）.（D）
Difference in relative spot intensities among groups.

（A）

（B）

（C）

（D）
0.08
Arbitrary unit

0.06
0.04
0.02
0
-0.02
-0.04

SalineSalineWortmannin

Fed

FastedFastedFig. 3 Effect of starvation and administration of wortmannin on lactate dehydrogenase A expression in mouse skeletal

muscle. The skeletal muscle proteins were extracted 48 h after sacrifice and equal amounts of proteins wereresolved by 2D-DIGE followed by CBB staining and MALDI-TOF analysis.（A-C）Representative spot patterns ofeach experimental group（A: Saline/Fed group, B: Saline/Fasted group, C: Wortmannin/Fasted group）.（D）
Difference in relative spot intensities among groups.

© The Ito Foundation

22

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

ク質スポットが減少していた。また，21のタンパ
ク質のうち半数以上における変化は，群３で抑制されることも明らかになった。さらに，これらタンパク質をMALDI-TOF型質量分析装置を用いて 解 析 し た 結 果 ， phosphoglucomutase 1 や
lactate dehydrogenase Aなど，食肉の肉質に関与するタンパク質群の同定に成功した。これらの結果は，オートファジーがタンパク質死後分解の一翼を担うことを示しており，オートファジーの程度が食肉の肉質に影響を与える可能性を示唆している。
文
献１） Koohmaraie, M., Geesink, G.H. : Meat Science, 74,
34～43, 2006.

２） Kitamura, S., Kudo, K., Chikuni, K., Watanabe, T.,
Nishimura, T. : Animal Science Journal, 81, 501～505,
2010.
３） Takahashi, K. : Meat Science, 43, 67～80, 1996.
４） Malicdan, M.C., Noguchi, S., Nonaka, I., Saftig, P.,
Nishino, I. : Neuromuscular Diorders, 18, 521～529,
2008.
５） Masiero, E., Agatea, L., Mammucari, C., Blaauw,
B., Loro, E., Komatsu, M., Metzger, D., Reggiani, C.,
Schiaffino, S., Saddri, M. : Cell Metabolism, 10, 507～
515, 2009.
６） 榊原陽一，中原幸太，森永浩通，山崎正夫，西山和夫，水光正仁：生物工学会誌, 89, 593～596, 2011.
７） Zelechowska, E., Przybyiski, W., Jaworska, D.,
Sante-Lhoutellier, V. : European Food Research andTechnology, 234, 883～894, 2012.
８） Ramanathan, R., Mancini, R.A., Konda, M.R. :Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 1550
～1555, 2009.
９） D'Alessandro, A., Marroco, C., Zolla, V., D'Andrea,
M., Zolla, L. : Journal of Proteomics, 75, 610～627,
2011.

© The Ito Foundation

23

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究
Study on processing technology and characteristics of fermented meatproducts produced using lactic acid bacteria cultures for dairy products

根

岸

晴

夫

（中部大学応用生物学部）

Haruo Negishi（College of Bioscience and Biotechnology, Chubu University）

While numerous lactic acid bacteria（LAB）are used in the manufacture of various
fermented dairy products, the application of LAB in meat products is rare, except for dryfermented sausages. Therefore we have studied a dry-fermented meat product, fermented
pork jerky, using the mixed cultures of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus（Lb.
bulgaricus）and Streptococcus thermophilus（Stc. thermophilus）often used as starter culturesin the processing of yogurts.
This study was performed to evaluate microbiological and physico-chemical properties of
unheated minced pork jerky fermented with LAB starter cultures. The growth of coliform
bacteria in the jerky was inhibited by fermentation incubating for＞4 h at 43℃ after adding 1020％ LAB starter culture concentrates（LAB-C）. In the pork jerky made after addition of 10％
LAB-C, the shear force value was 1.54±0.52kg at pH4.73±0.04 with a 0.766±0.004 water
activity. Exopolysaccharides from the bacteria were found in the LAB starter culture. The
shear force of the jerky fermented with the LAB-C was lower than the control without the
LAB-C or in commercial minced jerky. SDS-PAGE indicated the myofibrillar proteins from theminced pork were partly degraded to polypeptides during fermentation with the LAB-C. The
viable cells of LAB at 10 7 to 10 8 cfu/g survived in the jerky. The developed products
demonstrate pork jerky may provide a technology to produce a novel probiotic dry meatproduct.

１．目の機能性食品の開発が進んでいる。食肉製品への的乳酸菌の利用は発酵ソーセージが知られている

近年，乳酸菌の機能性に関する研究は活発で，が，わが国では十分に普及せず新たな食肉製品へ

整腸，腫瘍抑制，アレルギー症状の緩和，およびの乳酸菌の利用技術の開発が望まれる。一般に発免疫賦活など優れた生体調節作用が報告されてい酵ソーセージでは，乳酸菌スターターの特性としる１）。食品への乳酸菌利用はヨーグルトなど乳製て耐塩性・耐亜硝酸性を有することが要求される品を中心に発展し，プロバイオティクス食品などため，使用できる菌種が制限される。そこで亜硝© The Ito Foundation

24

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

酸塩などの添加物を使用せずに乳酸菌を接種して2 . 2 市販ジャーキー

発酵させ，そのバイオプリザベーション作用で有市場から12種の製品を購入し試料とした。原料

害微生物を抑制する新規な発酵食肉製品として，

肉の種類・形態としては，豚スライス肉２種類，

発酵ジャーキーの加工技術を検討している。本技

豚再構成肉１種類，牛スライス肉６種類，および術では発酵乳などに使用される多種の乳酸菌が利牛再構成肉３種類であった。
2.3用できる可能性が示唆された 。
２）

濃縮乳酸菌カルチャーまた超高齢社会の下，高齢者の低栄養・低タン

Lb. bulgaricus/Stc. thermophilus 混合乳酸菌末

パク質状態の慢性化に伴うサルコペニアの進行，（DVS YC-380 ; Christian Hansen Horsholm,

腸内フローラの乱れなどによる生活機能障害のリDenmark）を，10％ホエイと0.5％ D-グルコースス ク 拡 大 が 懸 念 さ れ て い る 。目 標 と す る 発 酵から構成される培養基に1.5u/Lの割合で直接添加

ジャーキーは，良質な動物性タンパク質と乳酸菌

し，43℃でpH4.6に達するまで培養した。これをとを手軽に摂取できる特徴を併せもち，高齢者が10,000×ｇで遠心分離して濃縮乳酸菌カルチャー

食べやすいように軟らかな食感を有するテクスの沈殿物を得た。

チャーとした。すでに豚スライス肉を用いて，ヨーグルトに汎用されるLactobacillus delbrueckii

2 . 4 再構成の発酵ポークジャーキーの試作方
法

subsp bulgaricus（Lb. bulgaricus）/Streptococcus

発酵ポークジャーキーの試作は次の手順で行っ

thermophilus（Stc. thermophilus）混合菌を接種た。すなわち豚挽き肉に乳酸菌カルチャーをそれし，生育至適温度でpH4.2付近まで発酵させ，ぞれ０～20％の割合で混合してφ50 ㎜のファイ

20℃で低温乾燥して発酵ジャーキーを調製した。

ブラスケーシングに充填し約３～５㎜のシート状

発酵ジャーキーは，大腸菌群，E. coliとも陰性とに伸展した。次に43℃で６時間培養して発酵後，なり，乳酸菌が10 ～10 cfu/gレベル生残した 。

発酵肉を調味液とともにポリエチレン製の袋に入本研究では，スライス肉を利用したジャーキー

れて密封し５℃で12時間調味した。調味液の組成の加工技術をさらに発展させるために，スライスは醤油50％，みりん50％とした。調味後の発酵肉

肉よりも成形加工が容易な方法として，再構成肉をステンレス製の網に載せスモークハウス

発酵ジャーキーの加工技術について検討したので（Maurer TITAN, Germany）を使用し，庫内温報告する。

度20℃，水分活性（aw）0.87未満になるまで乾燥

６

２．方

７

３）

した。

法

2 . 5 pH，aw

2 . 1 豚肉試料

pHは液体試料では原液のまま，固体試料では試

原料肉は冷凍豚もも肉（国産：愛知県田原市）

料５ｇに蒸留水45mlを加えホモジナイズ処理したを使用し，３℃，３日間解凍後，脂肪層・筋膜を懸濁液を用いて測定した。乾燥豚肉のawは，aw計

可及的に除去した。得られた赤身肉から挽き肉（AquaLab LITE ; Decagon Devices, Washington,（径3.2㎜）を調製し，ナイロンポリ製フィルム

USA）を使用し25℃で測定した。

（ON15μｍ/PE60μｍ）の袋で真空包装，使用時まで－35℃に保管した。使用時には３℃で解凍した。

2 . 6 SDS-電気泳動（SDS-PAGE），せん断力価（SFV）
電気泳動用の筋原線維はOlsonらの方法４）で調© The Ito Foundation

25

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究製した。SDS-PAGEはLaemmli法５）に従って行っ

2 . 9 食味性

た。SFVはWARNER BRATZLERせん断力計を

発酵ジャーキーの食味性を非専門パネル100名用いて測定した。

で７点尺度法により評価した。評価項目は，外観
色調，味，食感，軟らかさ，および総合評価とし

2 . 7 乳酸菌カルチャー中の菌体外多糖（EPS）

た。

定量
Lb. bulgaricus/Stc. thermophilus を 添 加 し た

３．結果と考察

10％ホエイカルチャー中のEPSを西村らの方法６）に従って抽出し，フェノール硫酸法によりグル

3 . 1 再構成肉発酵中のpH，乳酸菌数，およびコースを標準糖として定量した。

大腸菌群
乳酸菌濃縮物を５，10，20％添加した再構成肉2 . 8 微生物検査
乳酸菌数の測定にはBCP加プレートカウントア

を43℃，６時間発酵させた。乳酸菌濃縮物無添加

ガールを使用した。大腸菌群にはデゾキシコレーの再構成肉をコントロール（無添加）として，同ト培地を使用した。以上の微生物検査，pH，様に処理を行った。Table１に示すように，発酵

aw ，SDS-PAGE，およびSFVの分析は既報

時間の経過に伴い再構成肉のpHは降下し，その３）に速度は乳酸菌濃縮物の添加割合が増すにつれ速ま従って行った。

り，20％添加では発酵２時間後にpH4.6付近まで

Table１ pH, LAB, and coliform bacteria counts in the minced pork during fermentation after addition of LAB starter

cultures concentrates（LAB-C）
Fermentation time（h）
0

2

4

6

Control１

5.85±0.07

5.84±0.06

5.83±0.07

5.82±0.07

５％LAB-C２

5.70±0.06

5.51±0.09

5.24±0.09

5.15±0.05

10％LAB-C３

5.61±0.08

5.13±0.11

4.76±0.07

4.58±0.06

20％LAB-C４

5.49±0.04

4.63±0.05

4.46±0.03

4.42±0.04

pH

LAB count（log cfu/g）
Control

4.68±0.14

4.96±0.21

5.24±0.20

5.22±0.27

５％LAB-C２

6.68±0.12

6.87±0.09

6.97±0.10

8.38±0.12

10％LAB-C３

7.83±0.08

7.99±0.05

8.26±0.138.73±0.12

20％LAB-C４

7.89±0.03

8.38±0.21

8.57±0.18

9.05±0.06

Control3.45±0.57

3.88±0.36

4.64±0.28

5.43±0.35

５％LAB-C２

3.32±0.49

3.11±0.422.72±0.25

ND５

10％LAB-C３

3.29±0.48

3.04±0.28

ND

ND

20％LAB-C４

2.99±0.18

2.78±0.28

ND

ND

Coliform count（log cfu/g）

１Control indicates minced pork of no addition of LAB-C．
２，３，４５％ LAB-C，10％ LAB-C, and 20％ LAB-C indicate the minced pork added 5, 10, and 20％ of the LAB-C, respectively．
５ND is not detected．

All values represent the mean and standard deviation from 3 measurements.

© The Ito Foundation

26

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）低下した。発酵豚肉のpHが4.6付近に降下するとの再構成肉の水分損失は，コントロールが最も速

乳酸菌数は10 ～10 cfu/gに達した。再構成肉中

く，乳酸菌濃縮物の添加量が増えるに伴って損失の大腸菌群は，乳酸菌濃縮物５％添加，４時間発

速度はやや遅くなる傾向を示した。awも水分と同酵の条件を除き，発酵４～６時間で陰性となっ様，乾燥に伴って低下したが水分の損失速度よりた。コントロールは同条件で貯蔵中，pH降下はも緩やかであった。こうした現象は乳酸菌濃縮物

観察されず，大腸菌群の増殖が認められた。再構の添加と発酵の進行によって，ジャーキーの水和

成肉中の有害菌を抑制するための条件として，乳性が増したことが影響していると考えられた。

８９酸菌濃縮物の添加量は10～20％，発酵時間は４時
間以上が好ましいと考えられた。

3 . 3 再構成発酵ジャーキーと市販ジャーキーのSFV，pHおよびawの比較

3 . 2 再構成肉発酵ジャーキーのpH，水分，aw

乳酸菌濃縮物を10％添加した発酵ジャーキーと市販ジャーキー12種類のSFV，pH，aw を分析しに及ぼす乾燥時間の影響
3 . 1と同様の条件で乳酸菌濃縮物を添加した再比較した。発酵ジャーキーはpH4.73±0.04と市販

構成肉を６時間発酵後，20℃，８時間乾燥中の品のpH5.62～6.31よりも低い酸性領域にあった。

ジャーキーのpH，水分，awをFig.１に示した。乾

aw は0.766±0.004で市販品とおおむね同じであっ燥中のpHは，いずれの条件においても発酵終了た。次に発酵ジャーキーの硬さを市販の再構成品

時のpHと同じで変動はみられなかった。乾燥中と比較すると，発酵ジャーキーのSFVが1.54±

a)

6

pH

0.52㎏に対して市販品は3.38～7.05㎏と大きく，

5
4

Moisture (%)

b)

70
60
50
40
30
20
10

c)

1.0

発酵ジャーキーの肉質の軟化に対する乳酸菌による発酵効果が期待された。
3 . 4 再構成発酵ジャーキーのSFVに及ぼすaw
0

2

4

6

8

aw

発酵ジャーキーのSFVと水分量，awとの関係を
Fig.２，３に示した。発酵ジャーキーのSFVは水
分量やawと負の相関を示し，水分量やawの低下に伴いSFVは増加した。乳酸菌濃縮物を10％添加し

0

2

4

6

8

た発酵ジャーキーのSFVはコントロール（無添加）と比較して低くなる傾向にあることが分かっ0.9た。その理由として，発酵中，乳酸菌により産生0.8

されるEPSあるいは乳酸菌濃縮物に含まれるホエ

0.7
0.6

と水分の影響

0

2

4

6

8

Drying time（h）
Fig. 1 pH（a）, moisture（b）and aw（c）during drying

for 8 h at 20 ℃ in the minced pork jerky fermented
at 43℃ after addition of 0, 5, 10, and 20％ of the
LAB-C ： 0 ％（no addition, control）（●）,５ ％（▲）,
10％（◆）,and 20％（■）.
E ach symbol represents mean and standard
deviation from 3 measurements.

イタンパク質の存在によって，ジャーキー内部の水和性が高まったことによると推定された。発酵
ジャーキーのSFVの低下は水分量やawと関係し，
水分25～40％の中間水分食品であることが軟らかさの一因と考えられた。

© The Ito Foundation

27

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究
4marker
（KD）
227
116
97.2
66.4

Shear force values（kg）

3.5
3

control
R² = 0.9928

2.5

0

10% LAB-C
R² = 0.9125

0

10

20

30

40

50

experimental minced pork jerky made by additionof 10％ LAB-C（◆）or in control（without addition）（●）: regression line（…）, correlation coefficient（r）.
Each jerky was dried for 4-8 h at 20℃.
4
3.5

Myosin
heavy
chain
actin
37kD
29kD
23kD
16
19kD

Fig. 4 SDS-12.5％ polyacrylamide gel electrophoretic

pattern of myofibrillar proteins prepared from theminced pork during fermentation for 0, 2, 4, and 6 h
at 43℃. Control shows no addition of the LAB, and
LAB the fermented-minced pork after addition of
10％ LAB-C.

ンパク質のプロテオリシスが起きていることが確

3
SFV（kg）

14.3

6h

6.5

Fig. 2 The correlation between moisture and SFV in thecontrolr=－0.982

2.5

認された７）。このプロテオリシスもジャーキーの軟化現象に影響を与えている可能性が考えられた。

2

3 . 6 乳酸菌が産生するEPS総量

1.5

供試乳酸菌の10％ホエイカルチャーには粘性

10% LAB-C
r=－0.953（データ略）があり，乳酸菌を墨汁染色で観察す

0.5
0
0.5

LAB
2 4

20.1

Moisture content（%）

1

0

35.7
32.0
29.0

1.5

0.5

Control
2 4 6

55.6
45.0

2

1

0

ると菌体周囲に多糖の存在が観察された（データ
0.6

0.7

aw

0.8

0.9

1

Fig. 3 The correlation between a w and SFV in theexperimental minced pork jerky made by additionof 10 ％ LAB-C（◆）or in control（without addition）（●）: regression line（…）, correlation coefficient（r）.
Each jerky was dried for 4-8h at 20℃.

略）
。乳酸菌カルチャーの発酵前後のEPS量は，
発酵前28.3±5.2μg/㎎に対して，発酵後133.0±7.1
μg/㎎と高値を示した。再構成肉発酵中の乳酸菌によるEPS産生によって，発酵ジャーキーの水和性が増し，後述の食味試験で軟らかさの評価を高めた一因と考えられた。EPSが発酵ジャーキーの3 . 5 再構成肉発酵中の筋原線維タンパク質のテクスチャーに与える影響についてさらに検討中である。

プロテオリシス
乳酸菌濃縮物を10％添加した再構成肉とコント

3 . 7 再構成ジャーキーの食味性

ロール（無添加）を０～６時間培養した時の再構

発酵ポークジャーキーの食味性を100名の非専

成豚肉の筋原線維のSDS-PAGEパターンをFig.４

門パネルで７点尺度法により評価した。外観色に示した。培養肉から調製した筋原線維の泳動バ

調，味，食感，軟らかさの各評価は，それぞれス

ンドはコントロールに比べ加水分解の現象が目

コア5.04～5.61の範囲にあり，やや良い以上であっ立った。再構成肉を乳酸菌で発酵中，筋原線維タた。特に軟らかさの評価スコアは5.61と高く，総© The Ito Foundation

28

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

合評価スコアは5.27±1.08で好まれた。このよう

酸菌カルチャーは粘性を呈しEPSの存在が確認さに，試作した再構成発酵ジャーキーの食味性は良れ，ジャーキーのソフト化への影響が予想され好であった。

た。食味試験から，発酵ジャーキーの色調，味，４．要

食感および総合評価は良好で，特に軟らかさで高約い評価が得られた。本研究で開発した発酵ポーク

本研究は豚挽肉に乳酸菌スターターを添加した

ジャーキーの加工技術は，プロバイオティクス乳

非加熱の再構成発酵ジャーキーの加工技術を開発

酸菌などの利用により新規な食肉加工技術としてすることを目的とした。濃縮乳酸菌カルチャーと期待される。

して，10％ホエイを含む乳酸菌カルチャーの遠心
分離後の沈殿物を使用した。ジャーキー中の大腸菌群の生育は，乳酸菌カルチャー濃縮物を挽肉に10－20％添加後，43℃で４時間以上発酵すること
によって抑制された。発酵後，20℃，８時間乾燥して発酵ジャーキーを作製した。発酵ジャーキーの 性 状 は SFV1.54 ± 0.52 ㎏， pH4.73 ± 0.04 ，
aw0.766±0.004，乳酸菌数10７～10８cfu/gとなった。
発酵処理肉の筋原線維タンパク質のSDS-PAGE分
析 の 結 果 ，200kDa 付 近 の バ ン ド が 薄 く な り ，
45kDa付近に新たなバンドが認められた。発酵中の筋原線維のプロテオリシスがジャーキーの軟化

文献１） 飯野久和，信田幸大：乳酸菌とビフィズス菌のサイエンス，第１版，495～551，京都大学学術出版会，
京都，2010.
２） 大橋勝太郎，根岸晴夫：日本畜産学会報，82, 53～60, 2011.
３） 大橋勝太郎，根岸晴夫，日本食品科学工学会誌，
59, 447～455, 2012.
４） Olson, D.G., Parrish, F.C.Jr., Stromer, M.H. : J.
Food Sci., 41, 1036～1041, 1976.
５） Laemmli, U. K. : Nature, 227, 680～685, 1970.
６） Nishimura, J., Kawai, Y., Aritomo, R., Ito, Y.,
Makino, S., Ikegami, S. et al. : Bioscience ofMicrobiota, Food and Health, 32, 23～32, 2012.
７） Ohashi, K., Negishi, H. : Food Science andTechnology Research, 20, 679～685, 2014.

現象に影響を与えている可能性が示唆された。乳© The Ito Foundation

29

ミオシンの水溶化現象に関連する尾部領域の特定
The identification of myosin rod region involved in the solubilization under
the low ionic strength condition

早

川

徹

（帯広畜産大学畜産衛生学研究部門）

Toru Hayakawa（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, Department of Animal and Food Hygiene）

Meat is rich in high quality protein containing all essential amino acids for human.
However, almost of meat proteins are insoluble for water or low salt concentrated solution
because high concentration of salt is needed for solubilization of them. If meat protein could besolubilized in water or low salt concentrated solution, meat and its proteins would be used invarious ways such as liquid diet. Although myosin, one of the major proteins of meat, is also
insoluble for water, we demonstrated myosin could be solubilized in low salt concentrated
solution containing L-histidine. The objective of this study is to identify the detail region of
myosin rod involving the solubilization in low salt concentrated solution in order to understandthe mechanism of solubilization. The hydrophobicity of LMM and C-terminus region in highsalt concentrated solution were increased compared to those in low salt concentrated solutions.
However, in the cases of 56 amino acids residues fragments of C-terminus region, there was nodifference between salt concentrated conditions and the presence of L-histidine. For NativePAGE analysis, in the cases of 2 fragments of 56 amino acids residue fragments, thesemobilities in solubilized condition（1 mM KCl, 5 mM L-histidine）were differed from those in
the other conditions. These results suggested that the surface charges in rod region of 17561868 amino acids residues were shifted although the structural changes were not occurred.

１．目

で，食肉を液状にすることでタンパク質の摂取を的促進させることも考えられるが，食肉のタンパク

食肉は必須アミノ酸を豊富に含む良質なタンパ

質の大半は水や低塩濃度溶液には溶解しない性質

ク質供給源であり，我々の健康な食生活には欠くを持つため，食品として扱いづらいものとなる。

ことのできない食品である。しかし，食肉を摂取もし，食肉のタンパク質を水もしくは低塩濃度溶する際には，衛生上，加熱調理が必須であり，ま液に溶解すること（以下，水溶化）ができれば，た調理によっても形態はほとんど変化させること

食肉タンパク質の利用性を拡大し，さらに新たなはできず，高齢者などの咀嚼や嚥下に困難のある

食肉加工品の開発も期待できる。

人にとっては摂取しづらい食品でもある。そこ

これまでに，鶏胸筋を水および低塩濃度溶液© The Ito Foundation

30

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）（25-150mM）を 用 い た 洗 浄 を 繰 り 返 す こ と で域を56残基ずつ四つに分割したような短いフラグ

90％以上の筋原線維タンパク質を水溶化できたとメント（アミノ酸残基1700‒1755，1756‒1811，の報告１）や，さらに超音波処理を施すことで鶏胸

1813‒1868，1869‒1924）を作製した。精製したフ筋筋原線維タンパク質を水溶化することができた

ラグメントは，0.6 M KCl，5 mMリン酸緩衝液，との報告がある。しかし，これらの報告は再pH 7.2からなる透析外液に対して透析し，高塩濃

現性が乏しかったり，あるいは操作が煩雑であっ度条件下のフラグメントとした。このフラグメン

たりと実用化には至っていないものの，筋原線維トを，1 mM KCl，5 mMヒスチジン，pH 7.2かタンパク質の溶解度を向上させるためにはミオシ

らなる透析外液に対して透析し，これを水溶化フンの抽出率を向上させることが重要であることがラグメントとした。また，低塩濃度条件下のフラ示された。そこで，ミオシンの水溶化特性についグメントとして，1 mM KCl，5 mMリン酸緩衝液，て検討したところ，ミオシン単独では超音波処理

pH 7.2の透析外液に対して透析したものを用いた。

を施さずともヒスチジンを含む低塩濃度溶液（１2 . 2 SDS‒ポリアクリルアミドゲル電気泳動mM）に水溶化することがわかった

精製した各フラグメントをSDS‒ポリアクリル

２，
３）

。

４，５）

ミオシンは主要な食肉タンパク質の一つであ

アミドゲル電気泳動（SDS‒PAGE）に供し，そのり，２本の重鎖と４本の軽鎖からなる六量体のタ

分子量を確認した。SDS‒PAGEはSchäggerの方ンパク質である。筋肉組織において，多数のミオ

法７）に従い，泳動ゲルは16％ポリアクリルアミド

シンが会合し，“太いフィラメント”と呼ばれるゲル（ビス比＝49.5：3 ）を，濃縮ゲルは４％ポ重合体を形成し，存在している。この状態でミオ

リアクリルアミドゲル（ビス比：同上）を用いた。

シンは，ATPの分解と同じ食肉タンパク質であLMMるアクチンとの相互作用を繰り返し，筋肉を収縮（1284-1941）させている。この“太いフィラメント”の形成機構は未解明な部分が多いが，非筋細胞ミオシンのC-terminus region

重合体形成については，その尾部領域が大きく関与しているとされている 。本研究では，ミオシ（1700-1941）６）ンの水溶化現象においてもミオシンの尾部領域が

1700
1755

関与しているとの仮説を立て，水溶化現象に関与

1756 1811

している尾部領域を特定することを目的とした。
２．方

1941

1813 1868
1869 1924

法

Fig. 1 Diagram of myosin heavy chain constructs. These2 . 1 フラグメントの作製
フ ラ グ メ ン ト の 作 製 に は ，Profinity eXactTM
Protein Purification System（Bio‒Rad）を用いた（Fig.１，Table１）。フラグメントは，鶏骨格筋ミオ シ ン 重 鎖 １ Ｃ（NM_001113709）を も と に ，LMM全領域（アミノ酸残基1284‒1941），Ｃ末端領域（アミノ酸残基1700‒1941），およびＣ末端領

constructs were expressed in E. coli. Construct
1700-1755 was expressed with promers #759 and#815, 1756-1811 was expressed with primers #761
and #816, 1813-1868 was expressed with primers#763 and #940, and 1869-1924 was expressed withprimers #765 and #818. As controls in this study,
construct 1700-1941 （C-terminus region） andconstruct 1285-1941（LMM）were expressed withprimers #636 and #815, primers #636 and #855,
respectively.

© The Ito Foundation

ミオシンの水溶化現象に関連する尾部領域の特定

31

Table１ List of PCR primers used in this study
Primer Seqence

Restriction enzyme＃636

5'-tttgaattctcactcttcctcttctatcttc-3'

EcoRI, STOP

＃759

5'-tttgaattcctaattgcgggcttcctgg-3'

EcoRI, STOP

＃761

5'-tttgaattcctacttcagggccagctgc-3'

EcoRI, STOP

＃763

5'-tttgaattcctatctaagaatgttcttgagatc-3'

EcoRI, STOP

＃765

5'-tttgaattcctacttgttgacctgtgactctgc-3'

EcoRI, STOP

＃815

5'-tttaagctttgacagagcgctcgagaaaag-3'

HindIII＃816

5'-tttaagctttgactgaagagaaggccaagaag-3'

HindIII＃818

5'-tttaagctttgctccaggatctggtggac-3'

HindIII＃855

5'-tttaagctttgctgcagacagaagcaggtgaata-3'

HindIII＃940

5'-tttaagctttgacaagtggcaagaagcaaattcag-3'

HindIII2 . 3 表面疎水性の測定と超音波処理によって鶏胸筋の筋原線維タンパク

各フラグメントの表面疎水性の測定は，質を溶解させることに成功した２，３）。このとき，Guerrieriらの方法に従った８）。フラグメント溶液

筋原線維タンパク質の低塩濃度溶液への溶解度は（50μg/ml）に10分の１量の3.2 mMアニリノナフ

ミオシンの溶解度に大きく依存することがわかっ

タレンスルホン酸（ANS）溶液を添加し，よくた。そこで，ミオシンの低塩濃度溶液への溶解特

混 ぜ た 。室 温 で 10 分 間 静 置 後 ，励 起 波 長 380

性について検討したところ，ミオシン単独の場合

nm，蛍光波長420-560 nmの蛍光スペクトルを，には，超音波処理の必要はなく，ヒスチジンを含分光蛍光光度計（FP-6200，日本分光）で測定し，む低塩濃度溶液に対して透析することで，80％以

そのピーク値を表面疎水性とした。

上のミオシンが溶解することがわかった４）。また，

2 . 4 ネイティブ‒PAGE

水溶化したミオシンではその尾部が長く伸びていネイティブ‒PAGEは，4 ％ポリアクリルアミたことから，水溶化に伴い尾部の構造変化が生じ

ドゲル（ビス比＝49.5：3 ）を用いた。泳動後のていることが示唆された。本研究では，ミオシン

ゲルは40％メタノールおよび10％酢酸からなる溶の重合体形成にも関与していると考えられている

液に30分間浸しタンパク質を固定した後，銀染色

尾部Ｃ末端領域に焦点を当て，水溶化に伴う構造

法 に よ っ て 染 色 し た 。銀 染 色 に は Silver Stain

変化を指標に水溶化に関与している領域を特定す

KANTO III（関東化学）を用いた。

ることを目的とした。
大腸菌を用いて作出し精製したフラグメントの３．結果と考察

電気泳動像をFig.２に示す。各フラグメントはお食肉は良質なタンパク質源でありながら，そのおよそ推定値どおりの分子量付近にバンドが確認

形状やタンパク質の溶解性のために幅広い食品形され，設計どおりにタンパク質が発現し，それを態への利用はなされていなかった。これまでに，回収できた。よって，これらのフラグメントを以食肉タンパク質の大半を占める筋原線維タンパク降の実験に供することとした。

質を水もしくは低塩濃度溶液に溶解させようと試

ミオシンの尾部領域は２本のα‒ヘリックス鎖

みられ，ヒスチジンを含む低塩濃度溶液での洗いが絡まったコイルドコイル構造をとる。このコイ© The Ito Foundation

32

平成27年度
M.M

1

2

3

4

5

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）
6

M.M

れなかった。LMM領域フラグメントおよびＣ末（kDa）

端領域フラグメントには，ミオシン尾部領域のＣ１００

末 端 で あ る 非 ヘ リ ッ ク ス 領 域 （non-helical75

tailpiece）を含むことから，この領域が塩濃度の50作用を受け，表面疎水性に変化が生じたと考えら37れる。しかし，水溶化条件と低塩濃度条件では表面疎水性に差が見られなかったことから，ヒスチ

25

ジンの存在による尾部領域の構造変化は生じてい20ないことがわかった。

15

続いて，これらのフラグメントが水溶化に関与しているのかどうかについて，水溶化による表面10電荷の変化を確認することとした。タンパク質の重合および脱重合には，タンパク質表面の電荷が5大きく影響しており，ミオシンの重合体形成にもFig. 2 SDS-PAGE pattern of purified constructs. Lane 1 :construct 1700-1755 ; lane 2 : construct 1755-1811 ;lane 3 : construct 1813-1868 ; lane 4 : construct 18691924 ; lane 5 : construct 1700-1941（C-terminus
region）; lane 6 : construct 1285-1941（LMM）. M.M.
lanes were loaded with molecular weight marker.

尾部領域の部分的な電荷の集まりが関与しているとの報告もある６）。そこで，ミオシン尾部領域の部分的な電荷の変化を捉えるために，各フラグメ
ントをネイティブ‒PAGEに供した。ネイティブ‒
PAGEはタンパク質を未変性のまま，SDSを含まないポリアクリルアミドゲル内で泳動させる方法

ルドコイルを形成する，すなわち二量体化するたであるため，タンパク質の移動度は自身の持つ電めには，α‒ヘリックス間の疎水性アミノ酸残基

荷に依存する。LMM領域フラグメントおよびＣによる疎水結合が主な要因であると考えられてい末端領域フラグメントでは，高塩濃度条件下に比る。そこで，各条件下のフラグメントの疎水性をべ，水溶化条件下および低塩濃度条件下におい測定することで構造変化を捉えることができるとて，より陽極側に濃いスポットが確認された。し考え，疎水性環境下で蛍光強度が変化する蛍光標

かし，水溶化条件下および低塩濃度条件下ではそ識であるANSを用いて，各フラグメントの表面の移動度に差は見られなかった。また，短いフラ

疎水性を測定した。その結果，LMM領域フラグ

グメントにおいても，Ｎ末端側およびＣ末端側のメント（アミノ酸残基1284‒1941）およびＣ末端

フ ラ グ メ ン ト （ア ミ ノ 酸 残 基 1700 ‒ 1755 ，

領域フラグメント（アミノ酸残基1700‒1941）で1869‒1924）では塩濃度条件による移動度の違い

は，高塩濃度条件下において水溶化条件および低は見られたが，水溶化条件下と低塩濃度条件下で塩濃度条件に比べ強い蛍光強度が見られたが，水は違いは見られなかった。中央部に位置する２つ

溶化条件および低塩濃度条件との間に差は見られの フ ラ グ メ ン ト（ア ミ ノ 酸 配 列 1756 ‒ 1811 ，なかった。また，他の短いフラグメント（アミノ1813‒1868）では，水溶化条件下では低塩濃度条

酸 残 基 1700 ‒ 1755 ，1756 ‒ 1811 ，1813 ‒ 1868 ，件下に比べ，より陽極側に濃いスポットが確認さ1869‒1924）では，条件間の蛍光強度に差は見られた。すなわち，この領域において水溶化に伴い© The Ito Foundation

ミオシンの水溶化現象に関連する尾部領域の特定表面電荷が変化していることを示している。
４．要

約

本研究では，ミオシンの水溶化現象の解明を目的とし，水溶化に関与しているミオシン尾部領域の特定を試みた。ミオシン尾部のアミノ酸残基1756‒1868領域において，水溶化条件下における構造変化は見られなかったが，表面電荷が変化しており，この領域が水溶化現象と関連している可能性が示唆された。今後は，この領域における表面電荷の変化がミオシンの水溶化現象にどのように関与しているのか追究する。

33

文献１） Krishnamurthy, G., Chang, H.S., Hultin, H.O.,
Feng, Y., Srinivasan, S., Kellar, S.D. : Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 44, 408～415, 1996.
２） Ito, Y., Tatsumi, R., Wakamatsu, J., Nishimura, T.,
Hattori, A. : Animal Science Journal, 74, 417～425,
2003.
３） Ito, Y., Toki, S., Omori, T., Ide, H., Tatsumi, R.,
Wakamatsu, J., Nishimura, T., Hattori, A. : Animal
Science Journal, 75, 59～65, 2004.
４） Hayakawa, T., Ito, T., Wakamatsu, J., Nishimura,T., Hattori, A. : Meat Science, 82, 151～154, 2009.
５） Hayakawa, T., Ito, T., Wakamatsu, J., Nishimura,T., Hattori, A. : Meat Science, 84, 742～746, 2010.
６） Nakasawa, T., Takahashi, M., Matsuzawa, F.,
Aikawa, S., Togashi, Y., Saitoh, T., Yamagishi, A.,
Yazawa, M. : Biochemistry, 44, 174～183, 2005.
７） Schägger, H. : Nature Protocols, 1, 16～22, 2006.
８） Guerrieri, N., Alberti, E., Lavelli, V., Cerletti, P. :Cereal Chemistry, 73, 368～374, 1996.

© The Ito Foundation

34

廃食肉中のタンパク質を用いた貴金属リサイクル技術の開発
Recycle of precious metal ions using proteins derived from waste meat

丸

山

達

生

（神戸大学大学院工学研究科）

Tatsuo Maruyama（Graduate school of engineering, Kobe University）

Recycling of precious metals from waste is now carried out in industry. However,environment-friendly recycling techniques with high selectivity and high yield are stillrequired. Of the techniques employed, adsorption of metal ions is still one of the most costefficient and effective approaches for recycling precious metal ions in hydrometallurgy. We
previously proposed the potential that proteins are able to adsorb precious metal ions, becauseof the strong and specific interactions between precious metal ions and proteins. Waste fromfood and agricultural industries contains high amounts of protein. This study investigated theadsorption of precious metal ions to protein-rich food-waste and proteins. Eleven kinds ofprotein-rich food-waste, including ground chicken, were selected and used as adsorbents,
because their protein contents were as high as 90 wt％．All of them, including ground chicken,
adsorbed gold and palladium ions selectively from a mixture of various kinds of metal ions inacidic solutions. In particular, egg-shell membrane exhibited the highest adsorption ability togold, palladium and platinum ions. Precious metal ions were also selectively recycled fromindustrial waste water using egg-shell membrane. Investigations on the adsorption mechanism
indicated that there were several adsorption mechanisms, which led to the high adsorption
ability of proteins. For example, a certain amino acid sequence of polypeptides can act as anadsorption site for gold and palladium ions. And the reducing ability of proteins and ofpolysaccharide displayed on proteins produced nanoparticles of precious metal ions, whichwere also adsorbed on proteins. In summary, the present study demonstrated that protein-richfood-waste can adsorb large amounts of precious metal ions and that it can be used forrecycling of precious metal ions from industrial waste water.

１．目

須金属イオンの生体への取り込みおよび体内輸

的送，さらには神経等のシグナル伝達に，金属イオ

生物無機化学の発展とともに，金属イオンがンと生体分子の相互作用は極めて重要な役割を演

様々な生体分子と相互作用し，また複合体を形成じている。なかでもペプチドやタンパク質は，ア

して，生命活動に深く関わっていることが明らか

ミノ酸残基に金属と結合する官能基を有し，金属になってきている。特に，酵素の触媒活性や，必配位子となりうることがいくつもの研究から明ら© The Ito Foundation

廃食肉中のタンパク質を用いた貴金属リサイクル技術の開発

35

かになっている１～３）。このことは，タンパク質がめ，吸着操作後ろ紙を用い，ろ液をICP発光分光

ある種の金属に対して吸着剤として機能すること

光度計により分析した。

を示唆している。

2 . 2 タンパク質高含有廃食品を用いた実在廃一方で，我が国の金属資源に対する極度の輸入

液からの貴金属吸着

依存と地政学的なリスクから，金属資源の安定的

実在廃液として，金属精錬および金属リサイク

確保および使用済み金属のリサイクルが重要な国

ル企業からいただいた金属廃液を用いた。実在廃家戦略の一つとなっている。我々の最近の研究成液10mlに卵殻膜を10㎎あるいは50㎎添加し24時

果から，タンパク質がパラジウムや白金等の貴金間攪拌した。濾過した後，ろ液中の金属イオン濃属を選択的に吸着可能であることが明らかになっ

度をICP分光発光装置で測定し，回収率を求めた。

てきた。しかしながら，生化学研究用に高度４～８）に精製されたタンパク質は非常に高価（10万円以

2 . 3 ペプチド合成による金イオン吸着サイトの探索上／㎏）であり，そのままでは産業レベルの金属

タンパク質とAuイオンおよびPdイオンの吸着

リサイクルに利用できない。食品産業および家庭サイトを同定するために，合成ペプチドに対するにおいては，恒常的に食品廃棄物が生じ，これら

AuイオンおよびPdイオンの吸着を検討した。モ

廃棄物にタンパク質が多く含まれることが多々あ

デルペプチドをFmoc法により樹脂上に固相合成る。そこで本研究では，廃食肉に代表される安価

し，このモデルペプチドのアミノ末端を無水酢酸

なタンパク質高含有廃食品を用いて金（Au），パ

でアセチル化（N-Ac化）した。合成したモデル

ラジウム（Pd）および白金（Pt）を選択的にリ

ペ プ チ ド（N-Ac-X-Gly-Leu-resin）は 樹 脂 の ま

サイクルするシステムの開発を目的としながら，ま，金属イオン吸着を検討した。乾燥したペプチタンパク質／貴金属イオン間の相互作用解明も試

ド樹脂2.5㎎（ペプチド約1.4mol分）に10ppmのみた。さらに，タンパク質高含有廃食品を吸着剤

金属イオン水溶液（pH4.0）5mlを加え，２時間として用い，使用済み製品から貴金属を浸出させ攪拌した。遠心分離後，上澄みの金属イオン濃度た実在金属溶液，メッキ廃液等の工業廃液から，を測定した。

金，パラジウムおよび白金を選択的に吸着回収することを試みた。
２．方

2 . 4 精製タンパク質を用いた金イオン吸着メ
カニズムの検討
精製タンパク質として，牛肉にも含まれる牛血法

清アルブミン，鶏卵由来オボアルブミン，西洋ワ

2 . 1 タンパク質高含有廃食品による金属イオ

サビ由来ペルオキシダーゼを用いた。糖鎖切断酵
素にはEndo-α-N-acetylgalactosaminidaseを用いンの吸着
鶏挽肉，卵殻膜，羽毛，魚卵皮（明太子皮），

た。pHを調整した200ppmの金属イオン水溶液５

牛皮，羊腸，大豆タンパク，卵黄，トウモロコシ

mlにタンパク質を所定量添加した後，１時間振タンパク，つみれ，鰹節をタンパク質高含有廃食

とうした。この溶液を限外ろ過膜でろ過し，ろ液品として用いた。鶏挽肉，つみれ，鰹節に関してを原子吸光光度計で測定した。

は煮出した後，凍結乾燥して実験に用いた。卵殻
膜はマヨネーズ製造における副産物である。今回用いたタンパク質高含有廃食品は水に不溶なた

2 . 5 ペプチドマッピングによる金イオン吸着
サイトの同定牛由来リボヌクレアーゼＡ（RNase A）を，過© The Ito Foundation

36

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

ギ酸酸化による酸化反応によってその分子内S-S

こでは，前述のタンパク質高含有廃食品を用いて結合を切断した。この酸化RNase Aに，トリプシ

金属イオン混合溶液（Zn, Cu, Pd, Pt, Au，それンのトリプシン溶液を加え，37℃で４時間振とう

ぞれ10ppm）からAu, Pd, Ptイオン等の金属イオした。凍結乾燥後，RNase A分解物を得た。これ

ンを吸着可能であるか，および吸着に選択性があをODSカラムのHPLCにより分析・分取した。

るのかを検討した。Fig.１に示すように，用いたすべての廃食品はある程度の貴金属イオン吸着能

３．結果および考察を示した。さらに，すべての廃食品もAuとPdイ

3 . 1 タンパク質高含有廃食品のタンパク質含オンを吸着する傾向が強かった。鶏挽肉，卵殻膜，
明 太 子 皮 お よ び 鰹 節 は Pt イ オ ン も 吸 着 し ，銅

量および硫黄含量
用いた各種廃食品のタンパク質含量および硫黄（Cu）や亜鉛（Zn）イオンをあまり吸着しなかっの含量を元素分析により求めた。その結果，今回た。Ptイオンの吸着は，精製タンパク質では観察用 い た 廃 食 品 は つ み れ と 羽 毛 以 外（そ れ ぞ れされなかった挙動であり，興味深い。従来，卵殻44％，74％），非常に高いタンパク質含量（約

膜には硫黄が多く含まれていることが金属吸着能90％）であることが分かった（Table１）。また硫に関与していると言われてきたが，硫黄含量の低

黄は卵殻膜および魚卵皮に比較的多く含まれていい鰹節も高いPt吸着能を示し，硫黄含量の高いゼることが分かった。

インはあまり顕著なPt吸着能を示さなかった。こ3 . 2 タンパク質高含有廃食品による競争吸着

れらの結果から，卵殻膜，鶏挽肉，鰹節はAu,

過去の検討結果より，生化学研究用に高度に精

Pd, Ptイオンの効果的な吸着剤として機能するこ製された一部のタンパク質がAu３＋イオンとPd２＋とが示唆された。

イオンを吸着可能であることが示されている。こ12Adsorbed metal ions
[mg-metal/g-biomass]

10

Au
Pd

8

Pt

6

Cu
Zn

4
2

br
an
e
er
as
on
po
m ed
wd
em p
er
br oll
an ac
e
k
Sh
-ro
ee
e
p
in
te
st
in
e
Co
wh
id
So
e
y
pr
ot
ei
n
Eg
g
yo
Co
lk
rn
pr
ot
ei
Gr
n
ou
nd
ﬁs
Dr
h
ie
d
bo
ni
to

em

th

Fe
a

Se

el
sh
Eg

g-

Gr

ou

lm

nd

ch

ic

ke

n

0

Protein-rich food-waste

Fig. 1 Competitive adsorption of metal ions to protein-rich food-wastes. Metal ion concentration was 10 ppm. The food-waste（10mg）was added to an aqueous solution（10ml）containing 5 kinds of metal ions and 0.1 M HCl.
Adsorption experiments were carried out at 25℃ for 24 h.

© The Ito Foundation

37

廃食肉中のタンパク質を用いた貴金属リサイクル技術の開発

3 . 3 単独吸着におけるタンパク質廃食品の吸ンに対して高い吸着能力を示すことが分かった。
例えば，鶏挽肉１ｇは，金（Au）イオンを約75

着能力の比較
前述の検討では比較的薄い金属イオン濃度かつ金属イオン混合溶液からの選択的吸着を検討し㎎，パラジウム（Pd）イオンを約50㎎，白金（Pt）
イオンを約40㎎吸着した。

た。ここでは，各種廃食品のAu, Pd, Ptイオンそ検討した廃食品のなかで，卵殻膜が最も高い吸れぞれに対する吸着能力を検討した。比較的高濃着能力を示し，次に鰹節，大豆たんぱく，鶏挽肉

度の金属イオン水溶液（金属混合物ではない）をという順で吸着能が高かった。Auイオンの吸着調製し，廃食品を添加，24時間吸着させ，金属イ

能が高い廃食品が，PdやPtイオンに対しても高オンの減少量を測定した（Fig.２）。競争吸着とい吸着能を示すことが分かった。今回用いた廃食同様単独吸着においても，どの廃食品もAuイオ品に含まれるタンパク質成分の違いおよび構造の

300
Au3+
Pd2+
Pt4+

Adsorbed metal ions
[mg-metal/g-biomass]

250
200
150
100
50

an
at
e
he
as
r
po
on
wd
m ed
em p
er
br olla a
Sh ne ckro
ee
e
p
in
te
st
in
e
Co
wh
id
So
e
y
pr
ot
ei
n
Eg
g
yo
Co
lk
rn
pr
ot
ei
Gr
n
ou
nd
ﬁs
Dr
h
ie
d
bo
ni
to

br

Se

Fe

em

lm
el

sh

Eg

g-

Gr

ou

nd

ch

ic

ke

n

0

Protein-rich food-waste

Fig. 2 Single adsorption of metal ions to protein-rich food-waste in the presence of an excessive amount of metal ions.

Metal ion concentration was 200 ppm. The food-waste（4mg）was added to a metal-ions solution（10ml）containing
0.1 M HCl. Adsorption experiments were carried out at 25℃ for 24 h.
Table 1 Recovery of precious metal ions from industrial waste solutions using egg-shell membrane
Waste solution

Food-waste
［g/l］

pH

TargetInitial concn.
［g/l］

Adsorption ratio［g-metal/㎏-Waste-food］

Recovery
［％］

Ａ

1

＜１

Au
Pd
Cu

0.063
0.0048
0.922

31.3
2.2
30.9

50
45
3

Ｂ

5

＜１

Au
Cu

0.049
1.700

14.0
0.1

＞99
0

Ｃ

1
1

＜１
＜１

Au
Pt

0.029
0.279

0.2
7.9

1
3

Ｄ

1

＜１

Au

0.831

16.5

2

Ｅ

1

＜１

Au

0.024

16.5

68

© The Ito Foundation

38

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

違いのために，金属イオン種間で吸着挙動に差が出たものと思われる。

3 . 5 合成ペプチドによる金イオン吸着サイトの同定

3 . 4 タンパク質高含有廃食品を用いた実在廃タンパク質はポリペプチド鎖からなっており，
タンパク質とある物質の相互作用は多くの場合ペ液からの貴金属回収
ここでは，上述検討で最も高い吸着能を示した

プチドのアミノ酸配列とアミノ酸側鎖が大きく関

卵殻膜を用いて実在廃液から貴金属の回収が可能

与している。そこで，ここではペプチドを，樹脂かどうかを検討した（Table１）。今回用いた金属

ビーズの上に合成し，このペプチドと金属イオン

廃液は主に電子材料の金属基板からの酸浸出液での相互作用を検討した。既報より，トリペプチドある。金（Au），銅（Cu），パラジウム（Pd）あGly-Gly-His中のHis残基側鎖を有するＮ原子が金

るいは白金（Pt）が含まれている。電子基板浸出（Au）イオンとパラジウム（Pd）イオンに配位

液Ⅰ（Table１，廃液Ａ）はCuを高い濃度で含んすることにより錯体を形成することが判明していでおり，その約15分の１程度のやや低い濃度のる２）。これは，タンパク質によるAuおよびPdイ

Auおよびさらに低い濃度のPdを含んでいる。吸オンの吸着において，His残基が吸着サイトとし

着操作後は，三種すべての金属イオンが吸着さて作用していることを示している。前述の検討でれ，溶液から減少していることが分かるが，吸着

リゾチームは，タンパク質一分子あたりのAuイ

後の廃食品には原液に比してAuとPdの割合（v.s.

オン吸着量が３程度と少なかった。リゾチームのCu）が増えている。一般の工業廃液やリサイク

アミノ酸組成を見てみると，His（ヒスチジン）

ル原液には，様々な濃度で多種の金属イオンが含は一つだけ含まれており，既報と合わせると，リ

まれており，一度の吸着操作だけでは存在量の多ゾチーム中のHisを含むアミノ酸配列がAuイオン

い金属イオンがどうしても回収されてしまう。その吸着サイトとして機能している可能性が示唆さのため，複数回吸着溶解の操作を繰り返す，あるれる。そこで，モデルペプチドを固相上（樹脂いは吸着操作後の廃食品を酸でよく洗浄し，Cu

ビーズ上）に合成し，金イオンの吸着サイトの同などの易溶性金属イオンを廃食品から脱着させ，定を試みた。ペプチド配列はリゾチームに含まれ吸着物質中の目的金属の純度を上げる必要があるているHis-Gly-Leuをモデル配列とした。数種のと考えられる。

X-Gly-Leu樹脂による吸着実験を行い，アミノ酸

一方，電子基板浸出液Ⅱ（廃液Ｂ）ではCuがの違いによる金イオン吸着への影響を評価した。

30倍ほどAuに比べて濃いが，一連の吸着回収操

その結果，HisおよびLysがAuイオンに対して高作後では，廃食品中のAu存在量が飛躍的に高い吸着能を示した。これは，これらのアミノ酸側まっていることが分かった。ここではAuのみを鎖にあるＮ原子がAuイオンに配位することによ

選択的にほぼ全量回収することに成功した。またるものだと考えられる。しかしながら，Hisだけ

蒸着原料溶出液，電子基板浸出液Ⅲ（廃液Ｃ）でではリゾチームに吸着した３つのAuイオンは説は含まれているAuおよびPtはあまり効率よく回明できない。またPdイオンの吸着量はAuイオン

収されなかった。この低回収・低吸着に関して

よりはるかに多い。Hisを含むペプチド配列を構は，廃液の液性や共存イオンによる影響が考えら成しているＮ原子による配位結合がAuイオンとれる。

Pdイオンの吸着に関わっていることは確からし
いが，これ以外にも多数の吸着サイトがあるもの© The Ito Foundation

39

廃食肉中のタンパク質を用いた貴金属リサイクル技術の開発と推察される。

3 . 8 精製タンパク質上の糖鎖が金イオン吸着

3 . 6 タンパク質高含有廃食品による金属イオに及ぼす影響一部のタンパク質は糖タンパク質と呼ばれ，タンの還元タンパク質による貴金属イオン吸着メカニズム

ンパク質表面上に結合した糖鎖を有する。この糖については未解明な部分が多い。吸着メカニズム

鎖にも生理的な機能が次々と見つかってきておの一つの可能性として考えられるのが，タンパクり，この糖鎖が金属吸着に関与している可能性も質による貴金属イオンの還元，および生じるナノ考えられる。ここでは，糖鎖切断酵素によりタン粒子の吸着である。そこで吸着操作後の卵殻膜上

パク質表面上の糖鎖を切断し，金属イオン吸着にで金属の還元が生じているかどうかを電子顕微鏡

対する糖鎖有無の影響を調べた。オボアルブミンにより観察した。また，精製タンパク質により貴および西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼの糖鎖

金属イオンの還元が起こりうるかを検討した。卵は，今回用いたEndo-α-N-acetylgalactosaminidase

殻膜によるAu, Pd, Ptイオンの吸着操作後，どの金属においても金属が還元したと思われるナノレ

9ベルの結晶が観察された。精製タンパク質（牛血貴金属イオンの還元・結晶成長が確認された。これらの結果から，多くのタンパク質でAu，Pdお11Intensity

清アルブミン）を用いた同様の検討においても，

12

12

よびPtイオンを還元可能であることが示唆され，

3 . 7 ペプチドマッピングによる金イオン吸着310このことが一つの吸着メカニズムであると考えら
れる。

4

5
6

20

15
14
13

8
10

7

30
40
50
60
Retention time [min]7080

Fig. 3 HPLC chromatogram of Au３＋/peptides complex

produced by trypsin-hydrolyzed RNaseA.

サイトの探索Native

ここでは牛由来のタンパク質であるリボヌクレ
アーゼＡ（RNase A）を，タンパク質分解酵素
せた多種ペプチドのどこに金イオンが吸着している か を 調 べ た 。RNase A の ト リ プ シ ン 分 解 物（Au ３ ＋ を 吸 着 後）の HPLC ク ロ マ ト グ ラ ム を
Fig.３に示す。このHPLCで観測された各ピーク

Adsorbed metal ions
[mg-metal/g-biomass]（トリプシン）により部分的に分解し，断片化さ

160
120

含量を調べた結果，ペプチド鎖中にシステインま
番号13，14，15）の吸着量が高かった。この結果
は，上記のペプチド合成による検討結果を支持し
ている。

80
40
0

フラクション（ペプチド断片）に含まれるAu３＋
たはヒスチジンを２つ以上含むペプチド（ピークAfter the cleavage of polysaccaride chain

Ovalbumin（OVA）

Horse radish Bovine serum
Peroxidase Albumin（BSA）（HRP）
ProteinFig. 4 Effect of the enzymatic cleavage of polysaccaride

chains in glycoproteins and non-glycoprotein on theadsorption of Au３＋. The adsorption experiments
were carried out by mixing a protein solution（0.15g/L, 10ml）with Au３＋ solution（1000ppm, 5ml）
and followed by stirring for 24 h at 25℃.

© The Ito Foundation

40

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）で切断可能である。また牛血清アルブミンは糖鎖

的には，タンパク質ポリペプチド鎖の一次構造のを有していない。Fig.４より，糖鎖切断により，アミノ酸配列，タンパク質表面の糖鎖，タンパクタンパク質のAu３＋ 吸着が減少することが明らか

質の有する金属還元能が，これら金属イオンの吸３＋になった。このことから，タンパク質によるAu

着に関わっている可能性が示唆された。以上よ

吸着には，タンパク質表面上の糖鎖も関与していり，タンパク質高含有廃食品が貴金属イオンに対ることが示された。

して選択性と高吸着容量を有する吸着剤として機能し，実際の工業用実廃液等からも貴金属を回収

約４．要可能であることを実証した。

本研究では，タンパク質と金（Au
ウム（Pd

２＋

）
，白金（Pt

４＋

）
，パラジ

３＋

）イオンとの相互作用に着目し，貴金属リサイクルにおける吸着剤としてタンパク質高含有廃食品が利用可能であるかどうかの検討を行った。鶏挽肉を含む11種のタンパ
ク質高含有廃食品を用いた結果，どの廃食品も金（Au３＋），パラジウム（Pd２＋）イオンを比較的選択的に吸着した。なかでも，卵殻膜が最も吸着能に優れ，Au３＋，Pd２＋，Pt４＋イオンを相当量吸着可能であることが判明した。特に，実在金属廃液や電子基板の酸浸出液からも，貴金属イオンを吸着回収可能であることを実証した。一方，吸着メ
カニズムの検討からは，タンパク質と貴金属イオ
ンとの相互作用は複数の吸着機構が存在し，高い文献１） Terashima, M., Oka, N., Sei, T., Yoshida, H. :Biotechnol. Prog., 18, 1318～1323, 2002.
２） Best,S. L., Chattopadhyay, T. K., Djuran, M. I.,
Palmer, R. A., Sadler, P. J., Sóvágó I., Varnagy, K. : J.
Chem. Soc., Dalton Trans., 15, 2587～2596, 1997.
３） Isab, A. A., Sadler, P. J. : Biochim. Biophys. Acta,
492, 322～330, 1977.
４） 丸山達生：バイオサイエンスとインダストリー，66, 20～21, 2008.
５） Maruyama, T., Matsushita, H., Shimada, Y.,
Kamata, I., Hanaki, M., Sonokawa, S., Kamiya, N.,
Goto, M. : Environ. Sci. Technol., 41, 1359～1364,
2007.
６） Maruyama, T., Sonokawa, S., Matsushita, H., Goto,
M. : J. Inorg. Biochem., 101, 180～186, 2007.
７） 丸 山 達 生 ，後 藤 雅 宏 ： 同 仁 ニ ュ ー ス ，117, 12,
2006.
８） Kiyoyama, S., Maruyama, T., Kamiya, N., Goto, M.
: Ind. Eng. Chem. Res., 47, 1527～1532, 2008.

吸着容量を発揮していることが示唆された。具体© The Ito Foundation

41

食肉製品の塩漬熟成に伴う呈味性発現に関する研究（Ⅱ）―ヒポキサンチンによる呈味性発現機構―
Studies on the formation of specific meat taste in cured meat products（II）―Specific meat taste induced by hypoxanthine―

市村

さやか・中村

幸信・吉田

由香・服部

昭仁

（一般社団法人食肉科学技術研究所）

Sayaka Ichimura, Yukinobu Nakamura, Yuka Yoshida and Akihito Hattori（Japan Meat Science and Technology Institute）

We have already reported that hypoxanthine（Hx）is essential for the enhancement of thecured meat taste during maturation. In this study, we focused on bitter taste inherent to Hx, inorder to clarify the role of Hx on the enhancement of the cured meat taste. The effects ofbitter substances（Hx, caffeine and quinine sulfate）on the cure meat taste were examinedusing pork soups prepared from the heat-stable sarcoplasmic fraction and evaluated by thestrength of five basic tastes（sweet, salty, sour, bitter and umami）and kokumi tastes（mouthfulness, thickness, complexity and continuity）of the soups.
The strength of umami and kokumi tastes of the pork soups were enhanced by theaddition of all kind of bitter substances. However, when the concentration of Hx was increased,
resulting in the stronger bitter taste of the soup, the enhancement of umami and kokumi tastes
were seemed to weaken.
The involvement of Hx on the improvement of the meat taste during postmortem aging
was preliminarily examined using the aged beef. Consequently, the beef containing higher
concentration of Hx showed the higher strength of umami and kokumi tastes.
Because the bitter threshold of Hx is much lower than that of other bitter substancessuch as leucine and arginine in meat or meat products, Hx may be a key substance of bitter
taste in the enhancement of the cured meat taste during maturing and the improvement of themeat taste during postmortem aging.

１．目

あり１～３），低温での熟成（塩漬熟成）に伴い増強的されるが，その詳細は明らかにされていない。ま塩漬は，食肉製品の製造工程の一つである。食

た，塩漬肉特有の味に関する研究はほとんどな

肉を塩漬することにより，食感および保存性が向く，塩漬熟成した食肉のみに存在するような呈味

上し，さらに塩漬フレーバーと称される塩漬肉特性成分の特定には至っていない。

有の好ましい風味が付与される。塩漬フレーバー

食品の味は，甘味，塩味，酸味，苦味および旨の発現には，塩漬剤に含まれる亜硝酸塩が必須で味の五つの基本味と，基本となる味わいにまろや© The Ito Foundation

42

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

かさや持続性，厚みなどが加わるコク味で表現さを感じずにホタテの味の持続性，複雑さ，コク味れる 。食肉の味は，と畜後に一定期間熟成するなどを増加させ，その結果，嗜好性を向上させる

ことにより旨味やコク味が増強され，その主要因役割を担うと報告している。それゆえ，Hxの持は熟成に伴う食肉中の水溶性成分の増加であるとつ苦味が，塩漬熟成した食肉製品特有の旨味およ考えられている 。西村らびコク味の増強に寄与している可能性が考えられ

４）

５）

６，７）

は，食肉の熟成に伴う味の改善に食肉中の遊離アミノ酸および低分る。

子ペプチドの増加が関与すると報告している。そそこで，本研究では，Hxの特性の一つである

れゆえ，塩漬熟成に伴う塩漬肉特有の味の増強に苦味に着目し，塩漬肉特有の味の増強に対する苦も遊離アミノ酸，低分子ペプチドおよび核酸関連

味の影響を官能評価によって調べることにより，物質といった食肉中の筋漿画分が関与することがHxよって惹起される塩漬肉特有の味の増強機構考えられる。塩漬熟成に伴う味の増強機構が解明について検討する。

されれば，塩漬熟成期間の短縮や，より味わい深

さらに，食肉製品に限らず，と畜後の食肉を一い製品の生産が可能となり，さらには，と畜後の定期間熟成させた場合にもIMPが分解してHxが熟成に伴う食肉自体の味の改善機構の解明の手が蓄積されていくことから，と畜後の熟成に伴う食かりともなり得ると考えられる。

肉自体の味の改善に関しても，核酸関連物質にお本研究の目的は，塩漬熟成に伴う塩漬肉特有のいてはIMPよりもHxの関与の方が大きいとの可味の発現機構の解明である。我々は，これまでに，能性も否定できない。それゆえ，と畜後の食肉そ塩漬熟成に伴う筋漿画分中の含窒素成分の変化にれ自体の熟成に伴う味の改善に対するHxの関与着目して特有の味の増強に関与する因子を探索しについても解明するため，予備的な試験として長た。その結果，核酸関連物質の一つであるヒポキ

期熟成した牛肉中のIMPおよびHx含量と官能評

サンチン（Hx）を特定してきた 。Hxは食品中価の関係を調べたので，合わせて報告する。

８）の旨味成分として広く認知されるイノシン酸（IMP）の分解物であり，これまでに食肉の味に２．方法関与する成分としては否定されてきた６，９）。一方

2 . 1 豚の耐熱性筋漿画分の調製で，長期間塩漬して塩漬フレーバーが増強されたと畜後一週間経過したチルド豚ロース２本

食肉製品では，IMPの濃度が低下すると同時に（LWD種）から胸最長筋を切り出し，フードカッ

Hxが蓄積しており 10，11），食肉製品の味へのHxのターで細切後に袋（S‒WRAP, Star Plastic Industry

関与が強く示唆される。

Inc.）に入れて沸騰水中で20分間加熱した後，冷Hxは苦味を呈する物質であり，その苦味閾値
は0.73μmol/mlである 。Huberら
12）

13）

はチーズや

タンパク質の加水分解物の中には苦味を呈するペ却した。生じたドリップを3,000×ｇ，４℃で10分間遠心分離して得られた上清を耐熱性筋漿画分
とし，官能試験用スープの調製に供した。

プチドが含まれており，特有の味の発現に寄与す

2.2ると報告している。また，Michikawaらはホタ

食感の影響を受けずに味のみを評価するため，テ貝には苦味を呈するアミノ酸であるアルギニン

耐熱性筋漿画分に亜硝酸ナトリウムを添加した官が閾値（50㎎/100ml）を大きく越える濃度（323

能試験用のスープを調製した。

14）㎎/100ml）で含まれるのにもかかわらず，苦味

官能試験用スープの調製

豚の耐熱性筋漿画分40mlにNaClおよび亜硝酸© The Ito Foundation

食肉製品の塩漬熟成に伴う呈味性発現に関する研究（Ⅱ）

43ナトリウムをそれぞれ0.5，0.005％になるようにのを高速アミノ酸分析計（L－8900，（株）日立ハ

加え，蒸留水で全量を100mlとした後，70℃で20

イテクサイエンス社製）で測定した。

分間加熱し，氷水で冷却したものを官能試験用の

2 . 5 統計処理

基準スープとした。

すべての官能評価は平均値±標準誤差で算出

試験区として，Hxの濃度が0.7，3.5および7.0μmol/mlになるように添加したスープ，カフェ

し，統計学的有意差検定はＴ検定を用いて行い，有意水準は５％とした。

インの濃度が1.03μmol/mlになるように添加した

2 . 6 熟成後の牛肉の肉質評価

スープおよび硫酸キニーネの濃度が0.0051μmol/

３頭の交雑種牛のロースの片側を無包装，０―mlになるように添加したスープを調製し，それ１℃の条件で４週間ドライエイジング，一方の側ぞれを基準スープと同様に加熱および冷却処理しを真空包装し同様の条件でウエットエイジングしたものを試験用スープとした。

た後に胸最長筋を切り出し，官能試験および理化

すべてのスープは，官能試験に供する前に室温に戻してから，１回の試験につき 5 mlずつパネ
ルに提供した。

学試験に供した。
官能試験では，ロースから切り出した胸最長筋をさらに厚さ 5 ㎝，縦 5 ㎝，長さ10㎝角に切り出

2 . 3 官能試験方法

し，真空包装後に75℃の水浴中で50分間加熱し，基準スープの各味の強さを０点とした時の試験

厚さ 5 ㎜にスライスして試験に供した。評価方法

用スープの基本五味（甘味，塩味，酸味，苦味，

は，ウエットエイジング試料を０点とした場合の旨味）およびコク味（厚み，持続性，広がり）の

ドライエイジング試料の旨味，コク味（厚み，持強さを10段階（－５点～＋５点）で評価した。コ

続性および広がりを総合的に評価）および味のバ

ク味の評価項目については，事前にパネル間でランスの強さを７段階（－３～＋３）で評価した。

JAS熟成に格付されたロースハムとJAS標準に格

理化学試験では，切り出した胸最長筋をさらに付されたロースハムを比較し，熟成に伴う味の増

フードカッターで細切し，核酸関連物質および遊強を評価するのに適した官能評価項目を選抜し，離アミノ酸含量測定に供した。

また，その程度のすり合わせを行った。パネルは当研究所に所属する食肉製品の官能技術に熟練し３．結果と考察た官能検査員７名とし，ノーズクリップを用いて

3 . 1 理化学成分分析

鼻腔を閉じて香りの影響を排除した。

豚ロース肉から調製した官能試験用基準スープ

2 . 4 耐熱性筋漿画分および基準スープの理化のpH，NaCl濃度，窒素濃度，核酸関連物質濃度
および遊離アミノ酸濃度をTable１に示した。核学的成分分析
窒素濃度は燃焼法により測定した（スミグラフ

酸関連物質含量に関しては，含量が最も高いのはIMPで2.6μmol/gであるのに対し，Hx含量は低く

NC－220Ｆ，（株）住化分析センター製）。
核酸関連物質濃度は，北田らの方法 で測定し15）0.3μmol/gと閾値未満であった。遊離アミノ酸含量に関しては，甘味を呈すアミノ酸であるアラニた。
遊離アミノ酸濃度は，試料に蒸留水および10％ンが最も多く，旨味を呈すグルタミン酸，苦味をスルホサリチル酸溶液を加えてホモジナイズ後に呈すロイシンと続いた。ロイシンの苦味閾値は遠心分離し，得られた上清をヘキサン洗浄したも190㎎/100ｇであり 16），基準スープ中のロイシン© The Ito Foundation

44

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

なった。

Table 1 Profile of the sandard soup
standard soup

そこで，より単純な実験系で特有の味の強さの

pH

5.95

みを評価するべく，原料肉から不溶性の食肉成分

NaCl（％）

0.5

nitrogen（㎎/100ｇ）

284.2の影響を排除し，食感の影響を受けないスープ状

ATP-related
compounds（μmol/g）free amino acids（㎎/100ｇ）の試料において，Hxが基本五味およびコク味の

ATP

0.0

ADP
AMP

0.1
0.1

IMP

2.6

最初に，基準スープとして用いたHx無添加の

INO

1.5

Hx

0.3

スープを官能試験に供した結果，このスープは豚

Asp

1.0

Thr

3.3

Ser

4.3

Glu

8.1

Gly
Ala
Val
Cys
Met
Ile
Leu
Tyr
Phe
Trp
Lys
His
Arg
Pro

5.7
13.6
3.6
0.1
2.8
3.1
5.6
3.2
3.3
0.4
4.1
1.6
3.8
2.2

standard soup ; 40％ heat-stable sarcoplasmic fraction with
0.5％ NaCl and 0.005％ NaNO2 was heated at 70℃ for 20min.

増強に関与するか否かを確認した。

肉らしい旨味およびコク味を持つことが確認された。続いて，様々な濃度のHxを添加したスープを官能試験に供し，Hxの添加効果を調べた（Fig.
１）
。Hx の 濃 度 は ，苦 味 の 閾 値 濃 度 で あ る 0.7
μmol/ml，豚肉中のATP関連物質の総量に相当
する7.0μmol/mlおよびその半量の3.5μmol/mlとした。
この結果，Hxの添加により，基準スープ自体の持つ旨味，広がり，厚みおよび複雑さが増強し，3.5μmol/mlになるように添加した場合が最も強い結果となった（ｐ＜0.05）。0.7μmol/mlになる
ように添加した場合は，ヒトがわずかに苦味を感じるような薄い濃度にもかかわらず，広がり，厚みおよび複雑さが有意に強まった（ｐ＜0.05）。
一方，7.0μmol/mlになるように添加した場合は，の量は閾値よりもはるかに低い濃度であった。ま

3.5μmol/mlと比較して旨味が弱まり，またコク

た，その他の苦味を呈すアミノ酸も閾値未満の濃味はすべて同等となった。つまり，旨味やコク味度であった。

はHxの濃度に依存して増強するのではなく，Hx

3 . 2 五味およびコク味の増強に対するHxの添の濃度が高くなった場合には一定のレベルで維持されるか，あるいは減少するものと考えられた。

加効果
我々は，平成26年度の本助成研究において，原

Hx添加は，甘味，塩味および酸味に影響がな

料肉の塩づけに伴う筋漿画分中の含窒素成分の変いが，3.5および7.0μmol/mlになるように添加し化から，塩漬熟成に伴う特有の味の増強に関与すた場合に有意に苦味が強まったため（ｐ＜0.05），

る必須因子としてHxを特定した。すなわち，

苦味が強まることが旨味およびコク味の増強を惹

スライスした豚ロース肉を様々な濃度のHxを含起することが示唆された。また，Hxの添加によむピックルで塩漬したモデル試料を作製して官能るpH変化はなかったので，旨味およびコク味の評価した結果，モデル試料中のHxの濃度に依存

増強はpHの影響によるものではないことが確認

して塩漬肉特有の味が増強することが明らかに

された。

８，17）

© The Ito Foundation

45

食肉製品の塩漬熟成に伴う呈味性発現に関する研究（Ⅱ）
0.7μmol/ml

＊
＊

＊＊

＊
＊

＊＊
＊

＊

＊

＊

ty

s

ty

co
nt
in
ui

ex
i
co
m
pl

es

s

i

week －2.0

m
ou
th
fu
ln

um
am

r
tte
bi

ur
so

ty
sa
l

sw

－1.0

t

0.0

ee

strength of taste

＊

2.0
1.0

equal

7.0μmol/ml

＊

4.0
3.0

strong3.5μmol/ml

th
ic
kn
es

very
strongFig. 1 Effect of hypoxantine on the taste of soups
soups ; 40％ heat-stable sarcoplasmic fraction with 0.5％ NaCl, 0.005％ NaNO2 and several concentrations of Hx washeated at 70℃ for 20min.
 The strength of taste of the soups with Hx was compared with that of the standard soup. The values withasterisks are significantly different（p＜0.05）.Histograms show mean values±standard errors.

3 . 3 五味およびコク味の増強に対するカフェ

比較して基準スープ自体の持つ旨味およびコク味が増強する傾向にあり，旨味，厚みおよび複雑さ

インおよび硫酸キニーネの添加効果
Hxの添加が，耐熱性筋漿画分の旨味およびコは有意に強まった。また，カフェインおよび硫酸

ク味を増強することが確認された。Hxは苦味を

キニーネのいずれを添加した場合も甘味，塩味お呈する成分であることから，Hxが呈する苦味がよび酸味への影響はほとんどないが，苦味が強

塩漬熟成に伴う食肉製品の味の増強に寄与していまった。本試験では，カフェインおよび硫酸キる可能性が考えられる。そこで，官能パネリスト

ニーネの添加濃度を同等の苦味として感知する濃の訓練の際に苦味識別の指標として用いられるカ度に設定したにもかかわらず，カフェイン添加区

フェインおよび硫酸キニーネをHxと同様に基準においては硫酸キニーネ添加区と比べて苦味が強スープへ添加し，苦味が塩漬肉特有の味の増強へ

く，旨味およびコク味の増強効果が弱かった。食

与える影響を調べた。

肉中には様々な呈味物質が含まれており，苦味や苦味の識別テストに用いられる濃度に調製した酸味をマスキングするような緩衝作用が働くた

カフェインあるいは硫酸キニーネを添加したスー

め，苦味物質の食肉の味への作用は不明な点が多プを官能試験に供し，カフェインおよび硫酸キ

い。今後，食肉の味のモデル系を用いた苦味物質

ニーネの添加効果を調べた（Fig.２）。カフェイのオミッションテストや，ロイシンやアルギニン

ンを1.03μmol/ml添加したスープは，無添加の基といった食肉由来の苦味物質が旨味およびコク味

準スープと比較して基準スープ自体の持つ旨味おへ与える影響について，検討する必要があるだろ

よびコク味が増強する傾向にあり，持続性についう。

ては有意に強まった。硫酸キニーネを0.0051μ以上の結果から，基準スープに苦味物質を添加

mol/ml添加したスープは無添加の基準スープとすると，添加した物質の種類に関係なく，基準© The Ito Foundation

46

平成27年度very
strong

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

4.0

caﬀeinequinine sulfate

3.0
＊

＊

2.0

＊

1.0

ty

ex
ity
co
m
pl

th
ic
kn
es
s

i

m
ou
th
fu
ln
es
s

um
am

er
bi
tt

ur
so

ee
sw

－1.0

sa
lty

0.0
t

equal

＊

co
nt
in
ui

strength of taste

strong＊week －2.0
Fig. 2 Effect of caffeine and quinine sulfate on the taste of soups
soups ; 40％ heat-stable sarcoplasmic fraction with 0.5％ NaCl, 0.005％ NaNO2 and 1.03μmol/ml of caffeine or 0.0051

μmol/ml of quinine sulfate was heated at 70℃ for 20min.
 The strength of taste of the soups with caffeine or quinine sulfate was compared with that of the standard soup.

The values with asterisks are significantly different（p＜0.05）.Histograms show mean values±standard errors.

スープ自体の持つ旨味やコク味が増強されることると考えられるが，未だ定説はない。食肉中にはが明らかになった。また，苦味が一定のレベルを苦味を呈する成分が複数存在し，熟成に伴いロイ

超えると，旨味やコク味の増強効果が弱まると考シン，イソロイシン，バリンといった苦味を呈す

えられた。

るアミノ酸やペプチドが蓄積する。熟成に伴う豚

実際にHxが蓄積した状態の食肉製品中には，肉のスープ中の遊離アミノ酸含量の変化を調べた

塩漬熟成に伴って増加した遊離アミノ酸や低分子

西村らの結果６）によると，苦味を呈するアミノ酸

ペプチド，有機酸，ミネラル等の複数の呈味物質の中で最も増加するのがロイシンであり，と畜後が同様に蓄積しており，これらが相互作用して塩

６日には約１μmol/gとなった。しかし，この値

漬熟成特有の味を形成すると考えられる。しかはロイシンの苦味閾値である14.7μmol/gよりはし，本結果から，食肉製品の旨味およびコク味のるかに低いので，ロイシンが味の改善へどこまで増強にはHxの持つ苦味が不可欠であると推定さ寄与しているか不明である。一方で，Hxの苦味れた。

閾値は0.73μmol/mlであり，と畜後の熟成に伴い

3 . 4 と畜後の熟成に伴う食肉の味の改善にお閾値の数倍量食肉中に蓄積することから，食肉の苦味の鍵となる物質であると考えられる。すなわ

けるHxの関与
これまでに，塩漬熟成に伴う食肉製品の旨味やち，死後の熟成に伴う食肉自体の味の改善に関しコク味の増強にHxの呈する苦味が必須であるこても，Hxの関与が大きいと推定される。そこで，とを明らかにしてきた。一方，食肉自体のと畜後異なる方法で熟成した交雑牛肉を官能試験に供の熟成に伴う味の改善については熟成に伴う遊離し，Hx含量との関係を調べた。

アミノ酸や低分子ペプチド等の増加が関与していまず，ドライエイジングあるいはウエットエイ© The Ito Foundation

47

食肉製品の塩漬熟成に伴う呈味性発現に関する研究（Ⅱ）
Table 2 Concentration of ATP-related compounds and free amino acids of aged beef
wet-aged
ATP-related compounds（μmol/g）free amino acids（㎎/100ｇ）

dry-aged

IMP

3.2

0.9

Hx

1.3

2.8

Total
Glu

573.2
4.8

687.2
13.5

Ala

25.0

38.8

strength of tastevery 2.0
strongstrong 1.0

equal 0.0

umami

kokumibalanceweek－1.0
Fig. 3 Strength of taste of dry-aged beef he strength of taste of dry-aged beef was compared with that of wet-aged beef.
T

ジングした牛胸最長筋の遊離アミノ酸および核酸
関連物質含量をTable２に示した。遊離アミノ酸

４．要

約

総量，グルタミン酸量およびHx量は，いずれも本研究では，塩漬熟成に伴う塩漬肉特有の味のドライエイジングの方が高かった。この結果か増強に関与する因子であるHxの作用機序についら，ドライエイジングの方がウエットエイジングて，官能試験を用いて検討した。Hxの性質の一よりも熟成状態が進んでいるものと判断された。

つである苦味に着目し，特有の味の増強に対する

続いて，ウエットエイジングした試料の旨味お

苦味の影響を，豚肉の筋漿画分から調製したスー

よびコク味を０点としてドライエイジングした試

プ状の試料を用いて調べた。その結果，添加する料を75℃，50分間加熱したものを官能試験に供し苦味物質の種類に関係なく，苦味が一定程度加わた（Fig.３）。ドライエイジング試料は，ウエッることでスープの旨味およびコク味が増強される

トエイジング試料と比較して旨味およびコク味がことが明らかになった。また，苦味が一定のレベ

強く，さらにバランスが良い結果となり，Hxがルを超えると，旨味やコク味の増強の程度が弱ま蓄積した状態の食肉の嗜好性が高いものと推定さると考えられた。さらに，と畜後の熟成に伴う食れた。この結果は，と畜後の熟成に伴う味の改善

肉自体の味の改善におけるHxの関与についても，においても，Hxの関与が大きいことを示唆して長期熟成した牛肉を用いて予備的に調べた結果，おり，今後，この点からの研究を進展させたい。

Hx含量が多い食肉の官能的嗜好性が高い結果となった。Hxは食肉中の呈味成分の中でも苦味閾
値が低い物質であることから，塩漬熟成およびと© The Ito Foundation

48

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

畜後の熟成に伴う味の変化において鍵となる物質であると考えられた。
文献１） Cho, I. C., Bratzler, L. J. : Journal of Food Science,
35, 668～670, 1970.
２） Brown, C. L., Hedrick, H. B., Bailey, M. E. :Journal of Food Science, 39, 977～979, 1974.
３） Macdonald, B., Gray, J. I., Stanley, D. W., Usborne,
W. R. : Journal of Food Science, 45, 885～904, 1980.
４） Uchida, Y., Sakaguchi, M., Hirayama, K.,
Miyajima, R., Kimizuka, A. : Agricultural andBioligical Chemistry, 54, 163～169, 1990.
５） Okitani, A., Matsuishi, A., Nishimura, T. : 調理科学,
25（4）,314～326, 1992.
６） N i s h i m u r a , T . , K a t o , H . : F o o d R e v i e w s
International, 4, 175～194, 1988.
７） Nishimura, T., Rhue, M. R., Okitani, A., Kato, H. :Agricultural and Biological Chemistry, 52, 2323～
2330, 1988.
８） Ichimura, S., Nakamura, Y., Yoshida, Y., Hattori,
A. : Animal Science Journal, DOI : 10. 1111/asj.

12625.
９） Hayashi, T., Yamaguchi, K., Konosu, S. : Journalof Food Science, 46, 479～483, 1981.
10） Escudero, E., Mora, L., Aristoy, M., Toldrá, F. :Meat Science, 89, 536～539, 2011.
11） S h i b a t a , K . , Y o s h i d a , Y . , M a t s u n a g a , T . ,Nakashima, M., Inoguchi, Y., Shinmura, H., Hattori,
A. : 食肉の科学, 54（2）,165～174, 2013.
12） K o n o s u , S . : F o o d t a s t e c h e m i s t r y , A C S
Symposium series, No.115, 185～203, American
Chemical Society, Washing-ton. DC, 1979.
13） Huber, L., Klostermeyer, H. : Milchwissenschaften,
29, 449～455, 1974.
14） Michikawa, K. : Nippon Shokuhinn Kagaku
Kogaku Kaishi, 42（12）,982～988, 1995.
15） Kitada, Y., Hasuike, A., Sasaki, M., Tanigawa, K.,
Horiuchi, R., Yumiba, H. : 日 本 食 品 工 業 学 会 誌 , 30,
151～154, 1983.
16） Ninomiya, K. : 調理科学, 1, No.4, 185～197, 1968.
17） Ichimura, S., Nakamura, Y.,Yoshida, Y., Hattori,
A. : 平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，vol.33, 23～29, 2015.

© The Ito Foundation

49

鶏肉フライの加熱・保存過程におけるテクスチャーの決定要因と変化機構の解明
Elucidation of the determining factor of the textural properties in theheating and storage process of fried chicken

杉

山

寿

美・野

村

知

未＊

（県立広島大学人間文化学部健康科学科，＊広島女学院大学人間生活学部）

Sumi Sugiyama and Satomi Nomura＊（Faculty of Human Culture and Science, Prefectural University of Hiroshima, ＊Faculty of Human Life Science, Hiroshima Jogakuin University）

The crispy texture of the crust of battered, fried foods contributes to their distinctive
flavor and palatability. In the present study, we prepared battered chicken tenderloins andthighs using three kinds of batter mixtures with a similar degree of adhesion to the ingredients（pick-up）: A）flour and water（1 : 2.5）; B）flour, eggs, and water（1 : 1 : 2）; and C）flour,
potato starch, and water（0.7 : 0.3 : 2）, and examined the effects of “freezing before cooking”
and “storing after cooking” on the textural properties of the crust of the fried products to
explore factors affecting them. Freezing was performed at －20℃ for 2 nights, and postcooking storage at 4℃ for one night, followed by 65℃ for 2 hr.
Fried tenderloins and thighs prepared with the egg-containing batter（B）had a brittle
crust, as compared with those coated with batter A, and the texture and volume of the crust
were maintained after the storage process. The crust from batter B had higher moisture andfat contents. This was probably due to it containing egg white, which possibly functioned toretain water during heating, and egg yolk, which could generate porous structures thatfacilitate oil absorption during frying, suggesting that the structural components of the battercoating formed during heating may affect the post-storage textural characteristics of the crust.
Storage resulted in increased hardness of the crust of fried tenderloins and increased
tenderness of that of fried thighs, irrespective of the kinds of batter.
These results demonstrate that variations in the composition of batter mixtures and thefat content of ingredients affect the structural and, thereby, textural properties of the crust offried foods.

１．目

加熱時には発生する水蒸気による高い圧力に耐え的つつ，ゾルから多孔質ゲルへの構造変化を生じ，フライなどの揚げ物は，食材を覆う衣のサクサ

揚げ物のテクスチャーを決定，嗜好特性に著しくクしたテクスチャーが特有の美味しさを生みだし影響している。一方，揚げ物調理の外部化は著している。衣は揚げ油と食材の中間層となり，揚げく，家庭内で揚げ物調理を行うことは少なくなっ© The Ito Foundation

50

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）ている。このことは，これまでは考慮する必要性凍した。衣づけした試料は，ハロゲンヒーターをが低かった「加熱前の冷凍過程」や「加熱後の保用いて，キャノーラ油500mlを入れたビーカー内存過程」が揚げ物の性状，特に衣のサクサクしたで１個ずつ180℃で加熱した。揚げ加熱時間は，テクスチャーに及ぼす影響を明らかにする必要性

予備実験で試料の中心温度が75℃となり，嗜好的を生じさせている。しかし，この調理環境・工程にも好ましい状態と考えられる時間として３分の変化に対応した研究は十分でなく，市販品にお（冷凍試料は４分）に決定した。揚げ加熱後，いてはサクサクしたテクスチャーの消失要因であ

25℃で30分放冷したものを加熱後試料（コント

る食材から衣表面への水分移行を遅らせるためにロール）とし，加熱後，４℃で１晩冷蔵し，その硬く厚いバッター層を有する衣とすることや，食後ホットワゴンを用いて65℃に２時間置いたもの

肉に油脂を添加することで衣を内部からも揚げ加を保存試料とした。すなわち，ささみ肉およびも熱とすること等で対応がなされている。さらに，

も肉のフライをバッター３種で調製し，さらにそ

これまでの揚げ物の衣のテクスチャーや油脂量にれぞれに冷凍の有無および加熱後保存の有無の違関する研究は，ナゲットやイカリングを試料としいによる４種の試料を実験に用いた（２×３×４たものに限られ，HPMCの添加が吸油量を抑制す＝24種）。

ること，グルテンの添加が弾力性を有するテクス

2.2

チャーとすること，架橋澱粉の添加が衣を多孔質調製したバッターの動的粘弾性測定は，とすることなど対処法的な検討に限られ，揚げ物

RS6000（Therme HAAKE）で ，ダ ブ ル コ ー ンの衣に関する基礎的報告は少ない。そこで，センサー（φ60㎜）を用いて行った。応力依存性

本研究では，鶏肉フライを配合の異なるバッター

測定によって，線形領域を確認後，周波数依存性で調製し，「加熱前の冷凍過程」や「加熱後の保測定，温度依存性測定を行った。なお，測定に用存過程」の衣のテクスチャー変化とその決定要いたバッターは小麦粉，片栗粉の均一性を確保す

因・変化機構を解明することを目的として実験をるため，50℃まで加温して用いた。

１～４）

2.3

行った。
２．方
2.1

バッターの動的粘弾性測定

嗜好特性（衣のテクスチャー，色調測定）

鶏肉フライの硬さ（Ｎ），破断歪み（㎜）を，法

テクスチャーアナライザーEZ Test（島津）で，錘状治具（φ５㎜）を用いて行った。各試料に対バッターおよびフライの調製バッターは，ふるった小麦粉に10℃の水を加えしてストロークスピード50㎜/minで70％の圧縮て，均一になるまで撹拌，ストレーナーに通してで測定した。なお，最大試験力（Ｎ）を硬さ，破調製した。バッター配合は，pick up量がほぼ同断点（㎜）を破断歪みと定義した。衣の色調は，じとなるように水の配合量を検討した３種類

色彩色差計（CR-400）で測定した。

（Ａ：小麦粉：水＝１：2.5，Ｂ：小麦粉：卵：水

2.4＝１：１：２，Ｃ：小麦粉：片栗粉：水＝0.7：

鶏肉フライの体積は菜種法により測定した。あ0.3：２）とした。鶏肉はささみ肉およびもも肉

らかじめ菜種の体積から検量線を作成し，さらを使用し，20ｇ（4㎝×３㎝×1.5㎝）に成形，バッに，測定中に損失した菜種の補正を行い，１試料

ターへの浸漬とパン粉の付着を２回繰り返した。

を３回測定することで測定誤差が少なくなるよう

また，衣づけした試料の一部は，－20℃で２晩冷配慮した。

© The Ito Foundation

フライの体積測定と走査電子顕微鏡観察

鶏肉フライの加熱・保存過程におけるテクスチャーの決定要因と変化機構の解明

51

衣と食材の接触面および衣の断面の観察は，走周波数測定）の結果を示した。予備実験において査 電 子 顕 微 鏡 JCM6000（日 本 電 子）を 用 い て

バッターのpick up量が一定になるよう，配合を行った。衣を約５㎜角にかみそり刃で切りとり，

決定しており，周波数依存性は類似していた。一エタノールに一晩浸した後，t-ブチルアルコール

方，応力依存性は著しく異なり，線形領域はバッで脱水処理した。デシケーター内で乾燥後，試料

ターＡおよび卵を含むバッターＢで広く，澱粉ををカーボンテープと導体液を用いてステージに固含むバッターＣで狭かった。また，バッターＢの定し，加速電圧15kV，50～1000倍で，低真空条

Ｇ’は著しく高く，バッター中に含まれる卵白の件下で観察した。なお，観察は試料数の関係から，影響と考えられた。

バッターＢを中心に行った。

Fig.２に，鶏肉フライの衣の硬さと破断歪みの2 . 5 試料重量および衣の水分量，脂肪量の測結果を示した。ささみ肉では，衣の硬さはバッ
ターＡよりも，バッターＢ，Ｃで小さく，破断歪定バッターおよびパン粉の付着量（pick up量）

みはいずれのバッターも同程度であり，バッター

は，食材に衣をつけた重量から，食材重量を差しに卵や澱粉を混合することで衣が脆くなることが引くことで算出した。また，加熱前後，保存後の確認された。また，加熱後の保存（冷蔵・温め）

試料重量は１つずつ測定した。

によって，ささみ肉では衣が硬く，もも肉では脆

衣の水分量は，衣を試料から１つずつ剥がしとくなり，食材が衣の硬さの変化に影響を及ぼすこり，フードプロセッサーで粉砕後，ただちに天秤とが示された。なお，冷凍過程を有する試料では，式水分計MA-150（Sartorius）を用いて130℃で保存（冷蔵・温め）によって，ささみ肉，もも肉

測定した。

ともに脆くなった。官能評価においても，バッ

衣からの脂肪抽出は，水分量の測定と同様に，

ターＡよりも，バッターＢ，Ｃで脆く，ささみ肉

衣を試料から１つずつ剥がしとって行った。フーよりもも肉で脆いことが確認され，加えて，加熱

ドプロセッサーで粉砕した衣はBligh-Dyer法で直後の試料では冷凍の有無に関わらずバッター間脂質抽出を行い，内部標準物質としてトリペンタの差は小さいが，保存後ではバッターＢよりもデカノイン（Sigma, USA）を抽出脂質の一部にバッターＡ，Ｃで，ささみ肉よりもも肉で，ひき加え，５％塩酸メタノール（東京化成）を用いて（ガム性）が強いことが確認された。なお，バッ

メチル化した。脂肪酸分析はキャピラリーカラム

ターの色調については，卵を含むバッターＢの衣

DB-WAX（60 ｍ × φ 0.253 ㎜，J&W Scientific）のL＊ 値が低く，a＊ 値が高かった。また，加熱後を用いて，ガスクロマトグラフィーGC-2010（島の保存によりL＊ 値，a＊ 値，b＊ 値が低くなること

津）で行った。なお，脂肪量は，保存によって変が確認された。

化しないと考えられるため，保存後試料では行わなかった。

3 . 2 フライの体積と衣の多孔質構造（走査電子顕微鏡観察）鶏肉フライの体積は，揚げ加熱後ではバッター

３．結果と考察の種類に関わらず同程度であったが，加熱後に保3 . 1 バッターの動的粘弾性特性とフライの嗜

存（冷蔵・温め）すると体積が減少し，この体積減少はバッターＢで小さい傾向にあった。これは好特性
Fig.１に，バッターの動的粘弾性測定（応力，バッターＢに含まれる卵白の熱凝固性により衣の© The Ito Foundation

52

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

G’,G’’（Pa）

G’,G’’
（Pa）

105

105

104

104

103

103

102
0.1

1

10

102
0.01

0.1

τ （Pa）

1

10

100

ｆ （Hz）

Fig. 1 Amplitude and Frequency dependences of batter.（Gʼ : closed symbol, G” : open symbol, ● , 〇 : batter A, ■ , □ :batter B, ▲, △ : batter C）
Amplitude dependence test was performed at 1Hz and 20℃. Frequency dependence test was performed at at 5Pa and 20℃.

Hardness
（N）

＊
＊

4

＊

＊

＊
＊

3.1

＊

＊

＊

3.2

＊

2.6

2.5

＊

＊

3.1

＊

＊

2.6

2

0

B

A

B

A

C

A

Breaking strain
＊

（mm）
15

＊
＊

12.3

＊

＊
＊

12.9

＊

＊

＊

＊

＊

11.8

＊

＊

＊

13.0

＊

13.0

＊

＊

＊

＊ 13.4

＊

＊

＊

10

5

0

A

B

A

C

B

C

Fried thighs

Fried tenderloins
Fig. 2 Texture properties of fried chicken crust.（: control,: storing after cooking,: freezing and storing）
Columns and bars represent the median and standard deviation of 9 samples. ＊p＜0.05© The Ito Foundation: freezing before cooking,53

鶏肉フライの加熱・保存過程におけるテクスチャーの決定要因と変化機構の解明
a）

b）

c）

d）

Fig. 3 The scanning electron micrographs of fried chicken crust（50×）.（a, c : batter A, b, d : batter B, a, b : innersurface, c, d : cross-section）.
（%）
４0

＊
＊
＊ ＊ ＊

36.2

＊
＊
＊ ＊ ＊

36.3

＊
＊
＊ ＊ ＊

＊

35.4

35.2

＊
＊

＊
＊＊

36.1

＊

＊

＊

35.8

３0
２0
１0
0

A

B
C
Fried tenderloins

Fig. 4 Moisture contents of fried chicken crust.（

A: control,

B
Fried thighs: storing after cooking,C: freezing before cooking,:freezing and storing）
Columns and bars represent the median and standard deviation of 6 samples. ＊p＜0.05

（g）
4
3.0
2.6

3
2.3

2.5

2.8

2.2

2

1

0

A
B
Fried tenderloins

Fig. 5 Fat contents of fried chicken crust. （AC: control,

B
Fried things: storing after cooking,C: freezing before cooking,freezing and storing）
Columns and bars represent the median and standard deviation of 6 samples. Significant differences were not observed（p＞0.05）.

© The Ito Foundation:

54

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

形状が維持されたためと推察された。また，ももなお，加熱過程での重量変化は，バッターの水

肉は，冷凍過程を有すると加熱後の体積が大きく分の保持，揚げ油の吸着によって決定されるが，なり，もも肉に含まれる脂肪がバッターの膨張にバッターＡよりもバッターＢ，Ｃで重量減少が小影響していると考えられた。

さかった。また，いずれのバッターでも保存に

Fig.３に加熱後の衣の断面と内側の走査電子顕よって重量は90％程度となったが，冷凍過程を有微鏡観察画像を示した。衣の内側では，バッターする試料では重量変化は小さくなり，冷凍過程でＡ，Ｂで著しい差異は認められなかったが，衣のバッターが水分を保持するためと考えられた。

断面では，バッターＢの表面部分の空隙が大きく，かつ，不均一であることが観察できた。バッ

４．要

約

ターに含まれる卵黄は加熱中に揚げ油へ溶出する

本研究は，鶏肉フライを配合の異なるバッター

ことから，卵黄の溶出に伴う空隙の形成と考えらで調製し，「加熱前の冷凍過程」や「加熱後の保れた。

存過程」の衣のテクスチャー変化とその決定要

3.3

フライの重量変化と衣の水分量，脂肪量

Fig.４にフライの衣の水分量を示した。加熱に因・変化機構を解明することを目的として実験を行った。

より衣の水分量は，ささみ肉，もも肉のいずれも鶏肉フライにおいて，バッターＡと比較して，35％程度となり，保存（冷蔵・温め）により衣の卵を含むバッターＢは衣の水分量，脂肪量が多水分は減少した。しかし，バッターＢでは特に冷く，加熱時において，卵黄の溶出による空隙の形

凍過程を有した時に，Ａ，Ｃよりも水分量が高く，成，卵白による水分の保持によるものと考えら

冷凍過程を有さない場合と水分量はほぼ同値で

れ，このことが，バッターＢの衣が脆く，加熱保あった。これは，バッターＢに含まれる卵白が水存後もテクスチャーや体積の維持をもたらしたと分を保持したためと推察された。

考えられた。また，保存による硬さは，ささみ肉

Fig.５に衣の脂肪量をフライ１個あたりの値ででは高くなった一方，もも肉では低くなり，食材示した。衣の脂肪量は，もも肉でささみ肉よりもの脂肪量が保存時の衣のテクスチャーに影響を及多く，もも肉に含まれる脂肪に由来すると考えらぼすことが示された。以上のことから，バッターれた。この衣への脂肪の付着・浸透が，加熱過程

配合や食材の脂肪量の違いが，フライの衣の構造において衣を高温とし，前述のようにフライの体に影響し，テクスチャー変化をもたらしているこ積を大きく，衣を脆いものとし，さらに保存（冷とが示された。

蔵・温め）後の衣をひき（ガム性）のあるものにすると推察された。また，バッターＢでバッター
Ａ，Ｃよりも脂肪量が多かったが，卵に由来する
脂肪量は0.1ｇ程度であることから，この脂肪は揚げ油に由来すると考えられ，バッターＢが多孔質構造であるために，空隙に揚げ油が入り込んだものと推察された。

文献１） Altunakar, B., et al. : Eur. Food Res. Technol.,218, 318～322, 2004.
２） Salvador, A., et al. : Food Hydrocolloids, 19, 703 ～
708, 2005.
３） Martin, C. : Food Hydrocolloids, 28, 53～58, 2012.
４） Lalam, S., et al. : LWT-Food Sci. Technol., 50, 110～119, 2013.

© The Ito Foundation

55

デジタルPCR法を用いた食肉加工品中におけるリステリア菌の迅速定量法の開発
Establishment of the rapid enumeration method for Listeria monocytogenes
by using the Digital PCR

高

橋

肇

（東京海洋大学学術研究院食品生産科学部門）

Hajime Takahashi（Laboratory of food microbiology, Department of Food Science and Technology,
Tokyo University of Marine Science and Technology）

Listeria monocytogenes is a causative bacteria of listeriosis. The bacteria has isolated fromvegetables, milk products, seafood, and meat products. The mortality rate of the listeriosis ishigher than other foodborne pathogen disease, therefore EU, U.S. and Japan have a regulation
for this pathogen in ready-to-eat food. EU and Japan has established an action level of L.
monocytogenes for 100 cfu/g. The cultural method and real-time PCR method are generally
used for quantification of L. monocytogenes. However, the cultural method takes a lot of workand time. Additionally, real-time PCR method can not estimate a low number of bacteria.
Recently, the digital PCR technology has attracted attention. In the dPCR, samples are
separated into tens of thousands of wells and PCR is performed in each well. Positive/negative
wells are counted and the number of the pathogens are determined at the end of the PCR. In
this study, a new method was developed for the quantification for L. monocytogenes by usingdPCR.
Firstly, highly specific primer and probe sequences suitable for dPCR were designed.
Secondly, the PCR-inhibition effect of food residues in a variety of dilutions rate were
investigated. The results of this experiment showed that there was no negative effect on the
PCR at low dilution rates. Finally, the developed method was evaluated using a ham sample inwhich L. monocytogenes was inoculated. The method could quantify L. monocytogenes in meatproducts. The developed method could enumerate the number of L. monocytogenes even when
the contamination level was lower than 100 cfu/g.
The dPCR technology is highly sensitive and highly precise for quantification. In addition,
the method can determine the number of pathogens without the need for plotting a standard
curve. Therefore, the developed method will be considerably useful in the food industry.

１．目

菌で，生ハムなどの食肉加工品，ナチュラルチー

的ズなどの乳製品，スモークサーモン，ネギトロ，

Listeria monocytogenesはリステリア症の原因

魚卵などの水産加工品，サラダ類などから検出さ© The Ito Foundation

56

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

れている。L. monocytogenesに汚染されたこれら

小液滴に分配してPCRを行い，各液滴内での対象の食品を喫食した場合，人によりリステリア症を遺伝子の増幅の有無を検出し，増幅が検出された発症することが知られている。リステリア症の主液滴数から定量する絶対定量法である。dPCRは，症状は髄膜炎や敗血症であり，妊婦が発症した場

検量線が不要であり，サンプルを微小液滴に分配

合には流産を引き起こす。また，新生児や幼児，するために残渣によるPCR阻害が起こりにくいこ

高齢者が発症した場合には症状が重篤化し，死亡とが知られている４）。本研究では，食品中のL.

する場合もある。発症した場合のリステリア症の

monocytogenesをdPCRにより定量する技術の開致死率は28.4％と他の食中毒菌と比較して非常に発を行った。また，食肉加工品をはじめとするL.

高いため，本菌が問題となるような食品を生産しmonocytogenes食中毒の原因になりうると考えらている食品会社において問題視されている。

れている食品に本菌を接種し，開発した手法を用

リステリア症による健康被害を防止するため，世界各国では食品中のL. monocytogenes菌数に対して規制を敷いている。たとえば，コーデックス
基準では本菌の菌数を，増殖が起きるRTE食品
中では不検出／25ｇ，増殖が起きないRTE食品
中では100cfu/g以下と定めている。また日本ではいてその菌数を定量することで，手法の評価を
行った。
２．方

法

2 . 1 Digital PCRを用いたL. monocytogenes定量法の開発

非加熱食肉製品およびナチュラルチーズ中のL.

はじめに，L. monocytogenesに特異的な遺伝子

monocytogenesの菌数を100cfu/g以下と定めていであるinlAを標的遺伝子として，プライマーおよる１）。 EU や 日 本 に お い て ， 食 品 中 の L.

びプローブを設計した。設計したプライマーは本

monocytogenesは，ISOの定めた手法を用いて検研究室に保存されていたL. monocytogenes 36株

査されている。この手法はL. monocytogenesが特と，L. monocytogenes以外のListeria属の菌株お異的に生育可能である選択培地と鑑別培地を用いよびListeria属以外の標準菌株29株を用いてそのた培養法である。そのため，結果が出るまでに３特異性を確認した。

日以上を要し，これに代わる迅速な検査法の開発が求められている。

次に，10０～10５cfu/mlになるように調整したL.
monocytogenes CIP103575 （Scott A） の 希 釈 液

食中毒菌の迅速検査法として，Realtime PCRを

各１mlを遠心分離してペレットを得た。ペレッ用いた手法が数多く開発されている。しかし，これ

トから，NucleoSpinⓇFood kitを用いて，添付のまでに開発されたL. monocytogenesを対象としたプロトコールに従って，DNAを抽出した。ただし，Realtime PCR法の定量範囲は，L. monocytogenes

DNAは抽出液50μlに抽出した。

の規制値である100cfu/gを上回り ，また，RealtimedPCRの反応にはQuantstudio TM 3D Digital

PCRは食品残渣などによるPCR阻害効果の影響を

m a s t e r （ L i f e T e c h n o l o g i e s ）を 使 用 し，受けて，Ct値が変動しやすいため，菌数が少な

QuantStudioTM 3D digital PCR chip に 反 応 液 をい場合には正確に定量できないことが報告されてロードした。PCR増幅後，DNAの増幅の有無をいる 。

QuantStudio TM 3D digital PCR System （Life２）

３）

そこで，本研究では，近年開発されたDigital PCR（dPCR）に着目した。dPCRとは，サンプルを微Technologies）を用いて解析した。
dPCRによって得られた測定菌数と培養法に© The Ito Foundation

57

デジタルPCR法を用いた食肉加工品中におけるリステリア菌の迅速定量法の開発

Number of cells measured by dPCR
（log cell/ml）

６

５

４

Ｒ２＝0.9999

３

２

１

０
０

１

２

３

４

５

６

Number of cells measured by cultural method (log cfu/ml）
Fig. 1 Relation of the numbers of L. monocytogenes measured by dPCR and cultural method

よって測定されたL. monocytogenesの菌数から検量線を作成して，dPCRの精度を確認した。
2 . 2 食品中のL. monocytogenes濃縮法の確立

量線を作成し，相関係数を算出した。
2 . 3 D i g i t a l P C R を 用 い た 食 品 中 の L .
monocytogenesの定量

次に，食品中のL. monocytogenesの濃縮法を検L. monocytogenes CIP103575（Scott A）を，討した。L. monocytogenes CIP103575（Scott A）

市販されている生ハム25ｇに，終濃度が10１，10２，を，終濃度が10１，10２，10３，10４，10５，10６cfu/

10３ ，10４cfu/gとなるように接種した。接種後，gとなるようにエビ25ｇに接種し，生理食塩水を倍量の生理食塩水を加えてストマッカーで30秒間

それぞれ25，100，225ml加えた後，ストマッカー

混和したものを食品乳剤とした。食品乳剤10mlを用いて30秒間処理した。この食品乳剤10mlをを遠心分離し，得られたペレットから前述したよ遠心分離し，上清を除去してペレットを得た。まう に DNA 抽 出 を 行 っ た 。得 ら れ た DNA は ，た，各食品乳剤１mlを遠心分離したペレットもDigital PCRに供して菌数を測定し，測定結果を用意した。集菌した各ペレットは，STET（Toris

接種菌数と比較した。

20mM, EDTA 2mM, Triton１％，リゾチーム20㎎/ml）で前処理した後，NucleoSpinⓇFoodを用

３．結果と考察

い，添付のプロトコールに従って，DNAを抽出はじめに，L. monocytogenesに特異的なプライした。ただし，DNAは抽出液50μlに溶出した。

マーを設計し，36株のL. monocytogenes購入株と抽出したDNAサンプルは，開発したプライマー

29株の非L. monocytogenes菌株を用いてその特異およびプローブを用いたRealtime PCRに供し，性を確認した。その結果，設計したプライマーは得られたCt値を食品への接種菌数と比較して検L. monocytogenesにのみ特異的に反応することが© The Ito Foundation

58

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）bThreshold cycle(Ct）Threshold cycle(Ct）

a
4０
3０
2０

Ｒ２＝0.9944

1０
０

4０
3０
2０
1０
０

1

2

3

4

5

6

Number of cells measured by cultural method(log cfu/g）

Ｒ２＝0.9977

71

2０
Ｒ２＝0.9994

1０
０Threshold cycle(Ct）Threshold cycle(Ct）

3０

1

3

5

Number of cells measured by cultural method(log cfu/g）

7eThreshold cycle(Ct）Threshold cycle(Ct）

c
4０

4０
3０
2０
Ｒ ＝0.9938
２

1０
０

1

2

3

4

5

6

Number of cells measured by cultural method(log cfu/g）

7

2

3

4

5

6

Number of cells measured by cultural method(log cfu/g）

7

d
4０
3０
2０
Ｒ２＝0.9924

1０
０

1

3

5

Number of cells measured by cultural method(log cfu/g）

7

f
4０
3０
2０
Ｒ２＝0.9978

1０
０

1

2

3

4

5

6

Number of cells measured by cultural method(log cfu/g）

7

Fig. 2 Evaluation results of the PCR inhibition effect at different dilution factora 10-fold dilution・1ml harvest, b 10-fold dilution・10ml harvest,
c 5-fold dilution・1ml harvest, d 5-fold dilution・10ml harvest,
e 2-fold dilution・1ml harvest, f 2-fold dilution・10ml harvest

示された。

求められた菌数に高い相関性があることが確認さ設計したプライマーとプローブを用いて，れた。このことから，設計したプライマーおよびdPCR法によって得られた菌数と培養法によってプローブによるdPCRは，10１～10５cfu/mlの範囲

測 定 さ れ た 菌 数 の 相 関 を 確 認 し た（Fig. １）。

で精度の高い定量が可能なことが示された。一dPCRによる測定菌数は培養法によって求められ方，菌数が10０cfu/mlと非常に少ない場合，dPCR

る実際の菌数よりもやや少なくなったが，菌数がによる測定菌数は培養法での測定菌数よりも大き10 １ ～ 10 ５ cfu/ml の 範 囲 で の 相 関 係 数（R2）はな値となり，正確な定量は行えなかった。

0.9999となり，dPCRによる測定菌数と培養法で次に，食品中のL. monocytogenesの濃縮法を検© The Ito Foundation

59

Number of L. monocytogenes measured
by dPCR (log cell/g）

デジタルPCR法を用いた食肉加工品中におけるリステリア菌の迅速定量法の開発
5

4

3

2

Ｒ２＝0.9892

１

０
０

１

2

3

4

5

Number of L. monocytogenes measured by cultural method（log cfu/g）
Fig. 3 Relation of the number of L. monocytogenes measured by dPCR and cultural method in Ham
The dashed line represents the y＝x.

討した。２，５，10倍に希釈したL. monocytogenes

減少し，逆に，食品の希釈倍率が低い場合には，

接 種 食 品 検 体 を １ ml も し く は 10ml 集 菌 し て

食品成分の持ち込み量が多くなり，その影響によRealtime PCRに供し，Realtime PCRで得られた

りPCR効率が低下するなどの懸念事項があった。

Ct値と食品へのL. monocytogenesの接種菌数から本実験系においては，異なる希釈倍率の場合でも，検量線を作成した（Fig.２）。その結果，食品乳

Ct値と食品に接種したL. monocytogenesの菌数と剤１mlを集菌した時は，L. monocytogenesの接の相関係数がほぼ変わらなかったことから，希釈

種菌数が10２ ～10６cfu/gの場合に定量が可能であ

倍率によって，PCRの増幅効率はほとんど変わらり，10 cfu/gの場合には定量値が得られなかっないことが示された。

１た。食品乳剤10mlを集菌した場合には，検出感

最後に，L. monocytogenesを接種した生ハムを度が10倍高くなり，接種菌数が10 ～10 cfu/gの用いて，dPCRによる定量値と，培養法によって範囲で定量が可能であった。各希釈倍率，集菌量

求 め ら れ た 接 種 菌 数 を 比 較 し た 。そ の 結 果 ，のときの検量線から相関係数を算出したところ

dPCRによる定量値は接種菌数に非常に近い値を（Fig.２），どの条件においても相関係数の値に大示し（Fig.３），10１～10４cfu/gの範囲において測きな差は見られなかったことから，希釈倍率，集定菌数が相関した。両者の相関係数（R2）を求め

菌量の違いにおける食品残渣の阻害効果がないこ

た結果，0.9892と求められ，食品残渣によるPCRと が 確 認 さ れ た 。 こ れ ま で ， 食 品 中 の L.

の阻害はほとんどないものと判断された。このこ

monocytogenes数について検査を行う場合には，と か ら ，開 発 し た 濃 縮 法 と dPCR に よ る L.

食品を10倍希釈した食品乳剤を用意することが多monocytogenesの定量法は食肉加工品において有かった。食品の希釈倍率が高い場合，希釈倍率が用な手法であることが確認された。

１

６低い場合と比較して，食品から回収できる菌数が© The Ito Foundation

60
４．要

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）に菌数を算出することが可能であり，本菌の検査

約に有効であることが示された。今後，食品会社な本研究では，L. monocytogenesに特異的なプライマーを設計し，dPCRを用いた定量法を開発した。本法を，同時に開発した濃縮法と併用することで，食品中に10 １ cfu/mlレベルで存在するL.
monocytogenesを高感度に定量することが可能であった。一般的に，食品におけるL. monocytogenesの汚染菌数は少なく，また，国際的な本菌の規制
値が100cfu/gであることから，本菌の検査には，
検出感度，精度がともに高い定量法が必要である。本法は特に，低い菌数レベルにおいても正確どへ導入され，自主衛生検査法として普及することが望まれる。
文献１） 食品安全委員会：リステリア・モノサイトゲネスの検査について，平成26年11月28日付け食安発1128
第３号，2014年
２） Auvolat, A., Besse, N. G. : Food Microbiology, 53,
135～149，2016．
３） Wolffs, P., Norling, B., Hoorfar, J., Griffiths, M.,Rådström, P. : Applied and Environmental
Microbiology, 71, 5759～5764, 2005.
４） Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. : Water
Research, 70, 337～349, 2015.

© The Ito Foundation

61

メタボロミクス解析結果に基づく黒毛和種牛肉の美味しさに関わる指標の検証
Verification of index related to delicious of Japanese Black Cattle Beef
meat based on metabolomics analytical result

鈴木

啓一１・加藤

和雄１・紅

玉１・鈴木

裕１・盧

尚建１・飯田文子２・小松智彦３（１東北大学大学院農学研究科，２日本女子大学，３山形県総合農業センター）

Keiichi Suzuki１, Kazuo Katoh１, Hong Yu１, Yutaka Suzuki１, Sanggun Roh１, Fumiko Iida２
and Tomohiko Komatsu３（１Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, ２Japan Women's University,
３Livestock Experiment Station of Yamagata Integrated Agricultural Research Center）

The relations between the panel test item and glutathione concentration were examinedusing 31 Japanese black cattle beef. Negative significant correlations between “Tenderness ofmeat” and the total glutathione concentration, GSH concentration were detected. Moreover, thecorrelation of “Strength of aroma” and the GSSG concentration, GSSGP/GSHP showed asignificantly negative. These results suggest GSSG has the effect of decreasing “Strength ofaroma”. The partial correlation that considered the measurement days, fattening prefectureand sex as fixed effect, showed negative significant correlation between “Tenderness of meat”
and the total glutathione concentration. Moreover, relatively high negative correlations
between GSSG concentration or GSSGP/GSHP and the “Strength of aroma” were estimated as－0.526 and －0.508, respectively. These results suggested that the GSSG lowered the “Strengthof aroma”. In contrast, GSHP have positive correlation（0.364, p＜0.10）with “Strength ofaroma”, and causing a desirable effect for “Strength of aroma”.

１．目

標づくりが課題となってきている。

的申請者らは，これまで35頭の黒毛和種銘柄牛肉

我が国の黒毛和種牛肉は，都道府県や家畜改良を使った官能テストで美味しい牛肉の指標探索のセンターなどが実施する直接検定，現場後代検定

ため６つの黒毛和種銘柄牛肉についてパネルテスの成績から推定した育種価に基づく種雄牛の選抜

トと化学成分の分析を行った。その結果，パネルとその効率的利用など育種改良技術と飼養管理技

テストの「うま味の強さ」に関しては銘柄間の差術の改善が相まって，枝肉重量はもとより脂肪交が認められ，この項目と生肉および焼肉のイノシ

雑などの肉質は劇的に向上してきた 。しかし，

ン酸など核酸関連物質，カルノシン，タウリン，

長期的な視点から，新たな肉質評価基準が模索さ

アンセリン濃度が有意な正の相関を示し，牛肉のれており，より付加価値の高い美味しい牛肉の指美味しさに関わる指標として重要であることが示

１）© The Ito Foundation

62

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

唆された２）。さらに，「うま味の強さ」の牛肉高低

凍結のまま，約１㎏と500ｇに分割して真空パッ５頭ずつを選び，メタボロミクス解析を行った。

キング後１㎏を官能テスト用，残りから約100ｇ

その結果，統計的有差が得られた化合物が５つ検をGSSG，GSH濃度測定用として凍結保存した。

出され，「うま味の強さ」の低い方が高い方より

2 . 1 官能テスト

もOctanoylcarnitine, Spermidine, Glutathione

原則として３つの牛肉を３点比較法により，あ（GSSG）_divalent, Phosphorylcholine, γ-Glu-Cys

らかじめ訓練された９人のパネルにより銘柄牛肉の化合物が高く，これらが「うま味の強さ」を下げるについてそれぞれ官能テストを行った。官能テス

効果のある可能性が示唆された 。特にGlutathione

ト項目は，「やわらかさ（はじめの一噛み）」，「や（GSSG）_divalentとγ-Glu-CysはGlutathione代謝

わらかさ（咀嚼時）」，「線維感」，「多汁性」，「総に係わる物質である。
Glutathioneの生理的機能は，合的食感」，「甘い牛の香」，「悪い牛くささ」，「総生体内の主要な抗酸化成分であるチオールの細胞合的な香り」，「風味の強さ」，「うま味の強さ」，「総内での環境を維持することや，さらに，様々な毒合評価」の11項目である。評価は１から８の段階

物・薬物・伝達物質を細胞外に排出させ細胞を解で数字の大きい方が優れていることを示す。

３）

毒する機能がある。細胞中の還元型Glutathione（GSH）と酸化型Glutathione（GSSG）の比率は，

2 . 2 酸 化 型 Glutathione （GSSG） と 還 元 型
Glutathione（GSH）濃度の測定

しばしば細胞毒性の評価指標として科学的に用い

市 販 の 分 析 キ ッ ト を 使 い 酸 化 型 Glutathione

られる 。ところで，コク味は，甘味，塩味，酸味，（GSSH）と還元型Glutathione（GSH）濃度を測

苦味，うま味の５基本味では表せない味で，コク定した。はじめに下記の方法で試料の前処理を味機能を有する物質としてGlutathioneが知られ行った。凍結牛肉サンプルから約200㎎を1.5mlのている 。そこで，本研究では，ランダムに黒毛和チューブに採材し，５％の5-スルホサリサリチル

種牛肉を購入して官能テストを行い，これまで牛酸（SSA）を１ml加えてホモジナイズした後，肉の「うま味の強さ」との関連でメタボロミクス

8,000×ｇで10分間遠心した。上清を新しいチュー

解析の結果，検出された酸化型Glutathione（GSSG）

ブに移し，純水にてSSA濃度が0.5～１％になると還元型Glutathione（GSH）含量を調べ，官能テ

ように希釈したものを測定試料とした。次に，測スト項目との関連を検証することを目的とした。

定 キ ッ ト に 付 属 の Substrate working solution,

４）

５）

２．方

Enzyme working solution, Coenzyme working

法

solution, GSH standard solution, GSSG standard

本研究では，沖縄県石垣島，福島県，宮城県および山形県で肥育された黒毛和種牛肉31頭分を用

solution, Masking solutionをあらかじめ調整し，GSSG/GSHの分別測定を行った。

いた。食肉市場で食肉卸業者により取引された黒測定試料は同一のものを２つ（200μl×２）準毛和種牛肉のリブロースあるいはリブロースに近

備 し ，GSSH 測 定 用 と し て 測 定 試 料 200 μl にいサーロイン約1.5㎏を合計31頭分，流通業者か

Masking solutionを４μl加え，撹拌した（Sample

ら購入した。肥育産地は福島県，宮城県，山形県，A）。総グルタチオン測定用試料200μlをSample

沖縄県の４県であり，雌が18頭，去勢が13頭であBとした。次に，GSSG standard solutionを段階る。肉質等級は，３等級から５等級とし，２週間希釈し標準液（25.0，12.5，6.25，3.13，1.57，0.78，程度の熟成後凍結保存したものとした。入手後，0μM/l）とした。同様にGSH standard solution© The Ito Foundation

63

メタボロミクス解析結果に基づく黒毛和種牛肉の美味しさに関わる指標の検証
Table 1 Means and standard deviation of the traits of glutathione and panel test item
Traits１

Ｎ

Mean

sd

Minimum

Maximum

Total glutathione μM/l

31

8.56

2.23

4.60

13.70

GSSGC

μM/l

31

0.86

0.42

0.00

1.63

GSSGP

％

31

10.66

5.92

0.00

25.53

GSHC

μM/l

31

7.70

2.21

4.15

12.52

GSHP

％

31

89.34

5.91

74.47

100.00GSSGC/GSHC ％GSSGP/GSHP ％

31
31

12.42
1.00

7.79
0.53

0.00
0.00

34.29
2.19

Tenderness（First bite）

31

5.68

0.48

4.56

6.61

Tenderness（Chewing）

31

5.72

0.48

4.50

6.67

Fibrous feeling

31

5.42

0.48

4.38

6.39

Juiciness
Total texture

31
31

5.79
5.63

0.41
0.44

4.38
4.25

6.50
6.61

Sweet scent
Off flavor

31
31

5.55
5.43

0.39
0.41

4.44
4.44

6.22
6.33

Overall flavor
Strength of aroma
Umami intensity
Overall evaluation

31
31
31
31

5.47
5.52
5.62
5.70

0.40
0.30
0.36
0.47

4.38
4.81
4.73
4.25

6.17
6.28
6.19
6.44

１Total glutathione : GSSG＋GSH, GSSGC : Oxidized glutathione（GSSG）concentration, GSSGP : GSSGC/Total glutathione, GSHC :Reduced glutathione（GSH）concentration, GSHP : GSHC/Total glutathione.

を段階希釈し標準液（50.0，25.0，12.5，6.25，3.13，
1.57，0μM/l）を調整した。405nmのフィルター

３．結果と考察を使い，マイクロプレートリーダーにより吸光度31頭の牛肉について，総Glutathione濃度，酸を測定した。その後，GSSG検量線よりGSSG濃度

化 型 Glutathione（GSSG）濃 度（GSSGC）と 総を，GSH検量線より総グルタチオン濃度を求め

Glutathioneに対するGSSGの割合（GSSGP），還た。総グルタチオン（GSH＋GSSG）濃度とGSSG

元 型 Glutathione （GSH） 濃 度 （GSHC） と 総濃度より，下式によりGSH濃度を算出した。

Glutathioneに対するGSHの割合（GSHP），官能GSH濃度＝総グルタチオン濃度＋｛GSSG×２｝

テスト11項目についての平均値と標準偏差，最小

なお，測定は１サンプルについて３回繰り返値と最大値をTable１に示した。ここでGSSGとGSHの濃度を合計したものが総Glutathione濃度

し，全サンプルを三日間に分けて行った。
2 . 3 統計処理である。また，Glutathioneと官能テスト項目間

総Glutathione濃度，酸化型Glutathione（GSSG）の単相関係数をTable２に示した。総Glutathione

濃度と総Glutathioneに対するGSSGの割合，還元

濃度，GSHCが肉のTenderness, Totaltextureと型Glutathione（GSH）濃度と総Glutathioneに対負の有意な相関を示した。また，Overall flavor,

するGSHの割合，官能テスト11項目について，

Overall evaluation と も 負 の 相 関 を 示 し た 。総SASプログラムのproc correlationにより単相関

Glutathioneの大部分はGSHなので両者の相関はを計算し，次に，測定日，牛肉肥育県，去勢と雌0.982と高く（表には示さず），総Glutathioneと高の性を要因とした分散分析をproc GLMを使いい相関を示した感応テスト項目がGSH濃度とも行った。そして，測定日，肥育県，性を考慮して同様の有意な相関を示したことは当然と思われる

形質間の偏相関を計算した。

が，なぜ，GSH濃度が高いと硬い肉と感じるのか© The Ito Foundation

64

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Table 2 Simple correlations between glutathione and panel test items
Total
glutathione

GSSGC

GSSGP

GSHC

GSHP

Tenderness（First bite）－0.376－0.0040.227－0.377

Tenderness（Chewing）－0.378

0.084

0.300

－0.396

Fibrous feeling－0.187

0.076

0.210

Juiciness－0.227－0.006

0.152

Total texture－0.425－0.009Sweet scent－0.299－0.043

Off flavor－0.243Overall flavor
Strength of aroma

df＝31

GSSGC/GSHCGSSGP/GSHP－0.227

0.237

0.032

－0.300

0.307

0.118

－0.203－0.210

0.209

0.091

－0.227－0.153

0.164

0.025

0.240

－0.426－0.240

0.248

0.030

0.126

－0.292－0.1260.126－0.021－0.0560.101－0.234－0.1010.125－0.015－0.332－0.174－0.005－0.301

0.005－0.001－0.151－0.227－0.406－0.281－0.1510.281－0.280－0.403

Umami intensity－0.086－0.153－0.149－0.0580.149－0.150－0.158Overall evaluation－0.367－0.131

0.046－0.345－0.0460.046－0.111

１

Total glutathione : GSSG＋GSH, GSSGC : Oxidized glutathione（GSSG）concentration, GSSGP : GSSGC/Total glutathione, GSHC :Reduced glutathione（GSH）concentration, GSHP : GSHC/Total glutathione.
Bold character and bold oblique bold character show the statistical significant level at 5 and 10％, respectively.

Table 3 Effect of the measurement day, fattening prefecture and sex on the total glutathione concentration, GSSG, GSH

and panel test item
Sourcedf

Total
glutathion

GSSGC

GSSGP

GSHC

GSHP

GSSGC/GSHC

GSSGP/
GSHP

Tenderness
Tenderness（First bite） （Chewing）

Day
Place
Sex

2
3
1

ns
**
ns

ns
ns
ns

ns
†
ns

ns
**
ns

ns
†
ns

ns
＊
ns

ns
ns
ns

ns
＊
ns

ns
**
ns

Sourcedf

Fibrousfeeling

JuicinessTotal
texture

Sweet
scent

Off flavor

OverallflavorStrengthof aromaUmamiintensity

Overallevaluation

Day
Place
Sex

2
3
1

ns
†
＊

ns
ns
†

ns
＊
＊

ns
ns
ns

ns
†
ns

ns
ns
ns

ns
ns
ns

ns
ns
ns

ns
＊
＊

Day : glutathione measurement day, place: fattening prefecture, sex: heifer and castrate.
１

Total glutathione : GSSG＋GSH, GSSGC : Oxidized glutathione（GSSG）concentration, GSSGP : GSSGC/Total glutathione, GSHC :Reduced glutathione（GSH）concentration, GSHP : GSHC/Total glutathione.

は不明である。本研究で調査した牛肉の熟成の厳て，測定日，肥育県，性を要因とした分散分析結密な期間は不明のため断定できないが，還元型

果をTable３に示した。測定日はGlutathione諸形

Glutathione（GSH）濃度の高い牛肉の熟成期間

質，官能テストのすべての形質に対して影響しなが短いと仮定すると妥当な値と考えられる。一

いが，肥育県はGlutathione濃度，官能テスト項

方，Strength of aromaと酸化型Glutathione濃度

目に有意に影響していた。また，性についても線（GSSGC），GSSGP/GSHPとの相関がそれぞれ－維感，総合的食感，全体評価に影響することが明

0.406 と － 0.403 の 値 を 示 し た こ と は ，酸 化 型

らかとなった。そこで，これらの要因を考慮した

glutathioneであるGSSGが香りの強さを低減する

偏相関を算出し，Table４に示した。その結果，効果があると考えられる。

総glutathioneはTenderness, Total textureと負のGlutathione濃度形質と官能テスト項目につい相関を示し，香りの強さとも負の有意な相関を示© The Ito Foundation

メタボロミクス解析結果に基づく黒毛和種牛肉の美味しさに関わる指標の検証

65

Table 4 Partial correlation considering measurement day, fattening prefecture and sex
Total
glutathione

GSSGC

GSSGP

GSHC

Tenderness（First bite）－0.370－0.322－0.108－0.307

Tenderness（Chewing）－0.326－0.234－0.038－0.282

Fibrous feeling－0.152－0.1580.003

Juiciness
Total texture－0.329－0.424－0.180－0.298Sweet scent－0.253

Off flavor－0.333Overall flavor

df＝24

GSSGC/GSHCGSSGP/GSHP

0.108－0.089－0.2930.038－0.015－0.203－0.121－0.0030.023－0.1320.013－0.061－0.297－0.368－0.0140.060

0.037－0.039－0.142－0.262－0.167－0.044－0.2220.044－0.037－0.150－0.236－0.031－0.289

0.031

0.027

－0.169－0.365－0.328－0.171－0.3010.172－0.157－0.300Strength of aroma
Umami intensity－0.397－0.067－0.526－0.235－0.364－0.252－0.287－0.014

0.364
0.252

－0.352－0.234－0.508－0.226Overall evaluation－0.383－0.386－0.252－0.3060.252－0.247－0.372

１

GSHP

Total glutathione : GSSG＋GSH, GSSGC : Oxidized glutathione（GSSG）concentration, GSSGP : GSSGC/Total glutathione, GSHC :Reduced glutathione（GSH）concentration, GSHP : GSHC/Total glutathione.
Bold character and bold oblique bold character show the statistical significant level at 5 and 10％, respectively.

した。そして，酸化型GlutathioneであるGSSG濃ぼす影響について検討しGSHは基本味には影響

度，GSSGP/GSHPとStrength of aromaはいずれしないが，“こく味”および“牛肉らしさ”を有も－0.526と－0.508の比較的高い相関を示し，酸意に強め，GSHが牛肉の風味を構成する成分の一化型GSSGが香りの強さを低める効果のあることつであると報告している。さらに，各種食品にが明らかとなった。対照的にGSHPはStrength of

GSHを添加した場合の効果を調べたところ，予測

aroma と 0.364 の 正 の 相 関（ｐ ＜ 0.10）を 示 し ，通りGSHは畜肉を使用した食品において“こくGSHが香りの強さに好ましい効果を及ぼすこと味”や“畜肉らしさ”を強め，嗜好性を高めたとが示唆された。

報告している。ところで，Glutathioneはグルタ

本研究では，これまでの報告からGlutathione

ミ ン 酸（Glu），シ ス テ イ ン（Cys），グ リ シ ンがうま味，塩味，辛味，五味，苦味などの五味の（Gly）の三つのアミノ酸が結合したペプチドだ

他に味の深みを増す成分として考えていた。しかが，Kurodaら（2015）６）は，アミノ酸とペプチドし，今回の官能テストでUmami intensityとの間の認知に関する研究の結果，GSHがカルシウム感の相関はいずれも有意ではなかった。また，還元知受容体（CaSR）のアゴニストの１つであるこ型Glutathione（GSH）は有意ではないがUmamiと，CaSRがこく味物質の認知にかかわることをintensityと正の相関（0.252）を示し，さらに，明らかし，γグルタミルペプチドのCaSR活動とStrength of aroma と も 正 の 相 関（0.364 ，Ｐ ＜こく味強度の間に正の相関が存在することを報告

0.10）を示したことからGSHの割合が高いことがし て い る 。そ し て ，glutahione の Cys を バ リ ン

味や風味に良い効果をもたらすことが示唆され（Val）に変えたグルタミルバリルグリシン（γた。本研究では，サンプル数が31頭と少ないが，-Glu-Val-Gly）が強力なこく味ペプチドであり，

今後サンプル数を増やして官能テストと2014年８月に厚生労働省により食品添加物として

Glutathione濃度との関連を調査する必要がある

認可されている。この「グルタミルバリルグリシと考える。

ン」は，「グルタチオン」よりも強くカルシウム

Uedaら（1997） は，食品中のGSHの風味に及
５）受容体と反応し，コク味は「グルタチオン」の約© The Ito Foundation

66

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

10倍とされている。

の比較的高い相関を示し，酸化型GSSGが香りの本研究では，GSHの効果は明確ではないが，む強さを低める効果のあることが明らかとなった。

しろGSSGが味の強さや香りの強さを低める効果

対 照 的 に GSHP は「Strength of aroma」と 0.364を示唆する結果が得られた。これまで実際の官能の正の相関（ｐ＜0.10）を示し，GSHが香りの強テストによる風味や味の深さ（こく味）などと化さに好ましい効果を及ぼすことが示唆された。

学性成分との関連の研究報告は少ない。本研究では，サンプル数が31頭と少ないが，今後サンプル数をさらに増やして官能テストとGlutathione濃度との関連を調査する必要があると考える。
４．要約

31頭の黒毛和種牛肉を使い，牛肉の「うま味の強さ」と関連することが示唆されたGlutathione
形 質 と 官 能 テ ス ト の 関 連 を 検 討 し た 結 果 ，総Glutathione濃度，GSH濃度が肉の「Tenderness」と負の有意な相関を示した。また，「Strength ofaroma」とGSSG濃度，GSSGP/GSHPとの相関が負の有意な値を示し，GSSGの香りの強さを低減する効果が示唆された。測定日，肥育県，性を考慮した偏相関では，総glutathioneがTenderness，
Total texture と 負 の 相 関 を 示 し ，「Strength ofaroma」とも負の有意な相関を示した。酸化型
Glutathione で あ る GSSG 濃 度 ，GSSGP/GSHP と「Strength of aroma」はいずれも－0.526と－0.508

文献１） 家畜改良センター：全国域での種雄牛および繁殖
雌牛の遺伝的能力の推移について，家畜改良セン
タ ー，http://www.nlbc.go.jp/pdf/data/trend26s.pdf,
2015.
２） Suzuki, K., Hioura, H., Yokota, S., Katoh, K., Roh, S.,
Iida, F., Komatsu, T., Syoji, N., Sakuma, H., Yamada,S. : Search for an index for the taste of JapaneseBlack cattle beef by panel testing and chemicalcomposition analysis, Animal Science Journal, In
press, 2016.
３） 鈴木啓一，飯田文子，小松智彦，庄司則章，加藤
和雄：メタボロミクス解析による黒毛和種牛肉の美
味しさに係わる指標の探索，平成26年度食肉関する助成研究調査成果報告書，33, 73～78, 2015.
４） Pastore, A., Piemonte, F., Locatelli, M., Lo Russo,A., Gaeta, L. M., Tozzi, G., Federici, G. : Determinationof blood total, reduced, and oxidized glutathione inpediatric subjects, Clin. Chem., 47, 1467～1469, 2003.
５） Ueda, Y., Yonemitsu, M., Tsubuku, T., Sakaguchi,M., Miyajima, R. : Flavor characteristics ofglutathione in raw and cooked foodstuffs, Biosci.
Biotech. Biochem., 61, 1977～1980, 1997.
６） Kuroda, M., Miyamura, N. : Mechanism of theperception of“kokumi”substances and the sensory
characteristics of the“kokumi”peptide, γ-Glu-ValGly, Flavour, 2015, 4 : 11.

© The Ito Foundation

67

野生動物肉の加工利用のための技術開発：加工適性に及ぼす血絞りと塩漬法の効果
Technology for game meat utilization and effects of pre-salting and curing
on meat processing

坂

田

亮

一・時

田

昇

臣＊・押

田

敏

雄

（麻布大学獣医学部， 日本獣医生命科学大学動物科学科）＊

Ryoichi Sakata, Norio Tokita＊ and Toshio Oshida（Facultul of Veterinary Medicine, Azabu University，＊Department of Animal Science,
Nippon Veterinary and Life Science University）

The effects of pre-salting and curing on meat processing were investigated for deer andwild boar meat samples. Total heme of deer meat was found not to be effected by pre-salting,though anti-oxidative effects were evident by this process. The taste of deer bacon was foundto be lessened by pre-salting. Possibly the constituents responsible for taste were removed bywashing with water, subsequent to pre-salting. Sausage sample prepared from a mixture ofdeer and wild boar meat showed enhanced consumption quality according to the assessment of
taste judges. Some of the judges, however, considered meat color to be unacceptably dark,
especially in the case of game meat. The color of dried meat, jerky to which nitrite had been
added was considered satisfactory, though there was no improvement in aroma and taste.

１．目

残血による濃い肉色と臭いが問題となりうる。そ的のため，加工技術の中で血絞りによるシカ肉やイ

現在，野生動物による農作物の食害や接触事故

ノシシ肉の品質向上のために，それらジビエと言などが増加の一途をたどり，農水省の統計では有われる肉素材を用いた食肉加工品を作成し，野生

害鳥獣による農業被害額は近年200億円前後で推

動物肉の食肉利用の可能性について，まず検討し移している 。そのため，個体数の調整を含め，た。

１）

貴重な自然資源であるシカやイノシシをジビエと

また，これらの肉は凍結されて流通するものがして有効利用する試みが全国で行われ，地方創生多いが，ピックル解凍により最終収量が増加するを目指している２）。

という論文３）を参考に最終収量を測定し，この解シカ肉は牛肉や豚肉に比べ高タンパク質かつ低カロリーで高栄養価であり，現代人に不足しているとされる鉄分の含有量も非常に高い。しかし，

凍塩漬法の野生動物肉への適応について調べた。
＊

血絞り：肉を調理加工する前に塩漬剤で処理することで，血液除去を促進し血生臭さを抑える方法

シカ肉の特性については未だ不明な点も多い。しかも，シカ肉は狩猟後の取り扱いの不備等により© The Ito Foundation

68

平成27年度２．方

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

肉150±30ｇを解凍し，それぞれ血絞り無し乾塩法

漬（乾塩漬区），血絞り有り乾塩漬（血絞り区），

2 . 1 シカの肉質および加工適性に及ぼす血絞

湿塩漬（湿塩漬区），およびピックル解凍区とし，ベーコンを作製した。解凍は塩漬の前日に冷蔵庫りの効果
シカ肉（長野県，神奈川県で採取）を血絞りし（４℃）で一晩行った。血絞りと塩漬の後に流水たものを血絞り区，血絞りしていないものを無処で塩抜きを５分間行った後，燻煙加熱処理を行理区とし，血絞りには重量比１％のNaClと0.1％

い，作成した試料に関してクッキングロス，最終の塩漬剤（ニュー硝素，千代田化成）を用い，こ収量，pH，色調（L＊，a＊，b＊値），発色率４）およ

れらを乾塩漬方式でシカ肉表面に擦り込み，重石び残存亜硝酸塩量５）を測定した。

をして一晩置いた。それを流水で数分洗い，キッ2 . 3 シカ肉の脂質酸化に及ぼす血絞りの効果

チンタオルで肉表面の水気を除いた後，生肉の状

神奈川県丹沢湖周辺で捕獲されたシカ肉（モモ態で全ヘム色素量の測定を行った。また，pH部分）を用い，血絞りしたものを血絞り区，血絞値およびクッキングロス（加熱肉失率：75℃で20りしていないものを無処理区とし，それぞれで冷分間加熱し，肉重量に対し加熱で生じる肉汁量の蔵（０℃）または凍結（－20℃）保存を行った。

４）

シカ肉試料の冷蔵は０，15，30日，凍結では０，割合）を測定した。
次にシカ肉を解凍後，血絞り区と無処理区で湿

1.5，３，4.5ヵ月の各保存期間において，脂質酸塩漬にてベーコンを作成した。方法は７日間塩漬化の指標としてTBARS値（試料㎏当たりのマロ

し，55℃で温燻煙後（東京晃線TKG-SG40，ス

ンジアルデヒド㎎）を水蒸気蒸留法６）で測定しモークチップは渡辺林産工業サクラ100％Ｃ-Ｃをた。また血絞りしたシカ肉でベーコンを作成し使用），最終的に肉の中心温度が72℃まで加熱した。方法は上記 2 . 1の湿塩漬法で行い，出来上がった。試作したベーコンの重量を測定後，官能検査

た製品を－20℃で凍結保存した。

を評点法で実施し，最も好ましいものを３，最も

2 . 4 シカ肉ジャーキーにおける発色剤の効果

好ましくないものを－３とし，７段階で評価し神奈川県秦野市ヤビツ峠周辺で捕獲されたシカた。評価項目は色，香り，味，歯応えの４項目とのモモ肉を冷蔵庫（２℃）で７日間熟成させたもし，パネルは麻布大学で食品科学を専攻する20～のを解体し，残血を取り除くため食塩を加えた水

21歳の男女学生21人を対象にした。

で浸透圧を利用しながら15分～20分間洗い，さらまた，シカ肉を用いてシカ肉・イノシシ肉（伊に水洗いをした。その後，シカ肉発色剤無添加区

豆市より）混合ソーセージを常法で作成し（シカと 発 色 剤 添 加 区 （NaNO2 を 100ppm 添 加） の肉：イノシシ肉の重量≒３：１），アンケートにジャーキーを調製し，官能検査を行った。官能検より野生動物肉製品の消費者受容性を調べた。項

査の方法には評点法を用い，色調，香り，味，食

目は色，香り，味，歯応えおよび総合評価の５項

感の４項目について５段階評価で最も好ましいも目で行った。また，ソーセージに動物脂でなく植のを５，最も好ましくないものを１とした。パネ物油を用い，シカ肉の味を損なわないようにした。

ルは食品科学を専攻する20～22歳の麻布大学男女

2 . 2 ベーコンの品質に及ぼす凍結－解凍法と学生19人を対象とした。
ジャーキーの製造では，シカ肉を漬け込み液

血絞りによる影響－20℃で凍結貯蔵のイノシシおよびシカのモモ（赤ワインと醤油ベース，食塩２％）に24時間浸© The Ito Foundation

69

野生動物肉の加工利用のための技術開発

漬し，その後流水で10分間洗浄した。次に燻煙機

Table 1 Results of sensory evaluation for deer meat bacon

内に敷いた網の上に置き，乾燥（庫内温度20℃，50分），燻煙（庫内温度20℃，180分，室内温度
40℃，90分），加熱（庫内温度80℃，蒸煮無し）の順に工程を実施し，シカ肉の中心温度が70℃に達した後，30分以上保持した。さらに燻煙室内で
風乾（室温16.3℃，湿度50.7％，24時間）した後，真空包装し冷蔵条件（10℃以下）で保存した。

Item

ControlPre-salting

Color

0.65

1.00

Aroma

0.85

0.70

Taste

1.45ａ＊

Texture

1.00

0.35ｂ
0.60

＊Different letters indicate significant differences（P＜0.05）．

Table 2 Results of sensory evaluation for sausage preparedfrom a mixture of deer and wild boar meat
Item

３．結果と考察3 . 1 シカの肉質と加工適性に及ぼす血絞りの効果
全ヘム色素抽出後の吸光度（A383nm）を血絞り

Desirable

Undesirable

Color
Aroma

18
26

9
1

Taste

27

0

TextureOveralldesirability

24

3

27

0

区と無処理区を比較した場合，血絞り区が1.975，
無処理区が1.905の値を示し，血絞りによる影響

りによる影響は確認できなかった。

は確認できなかった。加工特性においてクッキン

シカ肉・イノシシ肉混合ソーセージのアンケー

グロスは血絞り区，無処理区両方とも30％前後をト（Table２）で色に対して好ましいが18人，好示した。pH値は血絞り区が5.68，無処理区が5.65

ましくないが９人で，３人に１人は赤い色を好まを示し，シカ肉の加工特性における血絞りの影響ない傾向が見られた。香りは好ましいが26人，好は特に認められなかった。

ましくないが１人，味は好ましいが27人，好まし

シカ肉ベーコンの官能検査（Table１）で，色くないが０人，歯応えは好ましいが24人，好ましは血絞り区が1.00，無処理区が0.65，香りは血絞

くないが３人で，それぞれの項目でこのソーセー

り区が0.70，無処理区が0.85でそれぞれの項目でジに対して高い消費者受容性が確認できた。総合

血絞りによる影響は確認できなかった。味は血絞評価でも好ましいが27人，好ましくないが０人でり区が0.35，無処理区が1.45で無処理区の方が有高い消費者受容性であった。

意に高い値を示し，血絞りにより味が低下する傾向が見られた。また，ベーコンの最終収量は両方
とも約90％であった。

3 . 2 ベーコンの品質に及ぼす凍結－解凍法と血絞りの影響最終収量はイノシシ肉ではピックル解凍区が最本来，血絞りは肉の品質向上に使われる技術

７）も高く，次いで湿塩漬区，血絞り区，乾塩漬区とであり，このような結果が出た原因として今回使なったのに対し，シカ肉では最も高かったのは湿用したシカ肉の放血状態が良かったことが考えら

塩漬区で，次いでピックル解凍区，乾塩漬区，血れる。おそらく今回の狩猟者のスキルが優れてい

絞り区となった。乾塩漬は塩漬によってほとんどて，シカの心臓を射抜いたと想像される。その場重量に変化は見られないが，湿塩漬は塩漬期間中合，血絞りで残血を取り除く必要性はなく，そのに重量が増している。塩漬期間に重量が増えるほ

水洗工程でうまみ成分が流出したと考えられる。

ど，クッキングロスも大きくなるという傾向が見

歯応えは血絞り区が0.60，無処理区が1.00で血絞られた。

© The Ito Foundation

70

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

発色率はイノシシとシカの両方に共通して，乾Table 3 Results of sensory evaluation for deer meat jerky

塩漬では血絞り無しの乾塩漬区の発色率が血絞り

ItemControl

Nitrite addition

有りよりもやや高くなった。湿塩漬では，イノシ

Color

2.68ａ＊

3.74ｂ

シはピックル解凍区が高いのに対し，シカでは湿

Aroma

3.37

3.26

Taste

3.79

Texture

3.53ｂ

3.72
2.68ａ

塩漬区が高くなる結果が出た（Fig.１とFig.２）。
残存亜硝酸塩量は，イノシシでは血絞り区が血＊Different letters indicate significant differences（P＜0.05）．

絞り無しの乾塩漬区よりやや低い値を示したが，シカではその逆の傾向を示し，血絞りが残存亜硝ある。またピックル解凍により残存亜硝酸塩量が酸塩（NO 2 ）量に影響を与えるとは言えなかっ

対照の湿塩漬区と比較して大幅に低下した。ピッた。一方，湿塩漬ではイノシシとシカに共通して，

クル解凍によって最終収量はイノシシでは増加しピックル解凍区が湿塩漬区よりも低いNO 2－値を示たが，シカでは低下した。参考にした論文３）ではした。

豚ロースでの実験だったため，豚に近いイノシシ－

血絞りによって発色率は下がり，TBARS値はでは同様の結果が得られたが，シカでは異なる結上がった（図表省略）。血絞りには発色剤を用い果が出た可能性が考えられる。今回，血絞りやるが，血絞り後に水洗によって塩抜きも行うた

ピックル解凍の影響はイノシシとシカで異なる結め，これが発色率を下げる要因になった可能性が果となったが，対象とした肉試料数が限られたため，これらの項目を再度調べる必要がある。

CFR (%)

3 . 3 シカ肉の脂質酸化に及ぼす血絞りの効果
TBARS値は，生肉冷蔵区で無処理区が０日目

70

60

Bar : Left → Rightに0.211から保存30日目で0.222，血絞り区は０日・Dry curing

目に0.096から30日目に0.152になったが，無処理

・Pre-salting+ Dry curing区と比べ血絞り区で有意に低い値となった（P＜・Wet curing
・Thawing and curing inpickle50
Fig. 1 Color forming ratio（CFR）of wild boar meatbacon0.05）。生肉凍結区では無処理区が０日で0.211から保存4.5ヵ月で0.297に，血絞り区は０日で0.096
から4.5ヵ月で0.112となった。
またベーコン凍結区では，無処理区と血絞り区間に有意な差は見られなかったが，これは塩漬に

CFR (%)

よって血絞りと同様の効果がもたらされたと考え100られる。生肉と製品を比較すると，製品の方が有意に低い結果が得られた（P＜0.05）ため，塩漬

Bar : Left → Right
75

を行う方が血絞りを行う以上に脂質の酸化が抑え

・Dry curing
・Pre-salting+ Dry curing

られる結果が本実験で示された。

・Wet curing

3 . 4 シカ肉ジャーキーにおける発色剤の効果

・Thawing and curing inpickleシカ肉ジャーキーの官能評価から（Table３），
色調において発色剤無添加区より発色剤添加区の50
Fig. 2 Color forming ratio（CFR）of deer meat bacon方が有意に高く，食感において発色剤無添加区よ© The Ito Foundation

野生動物肉の加工利用のための技術開発

り発色剤添加区で有意に低い結果となった（P＜71

ンケートで示された。

0.05）。ジャーキーでは食塩を添加することに加官能評価の結果として，発色剤添加ジャーキー

えて乾燥をよく行うので，保存に関して発色剤のの軟らかさは評価されなかったものの，色調にお添加が必須でないと考えられるが，色調に関していて良い評価が得られ，好ましい食感と感じるパ

は発色剤を添加した方が好ましい結果が得られネルが多いことが分かった。

た。一方で香りや味に有意差が認められず，食感では無添加区の評価が高かったことから，官能的特性として発色剤を添加する利点は一般の食肉製品より低いと思われる。
４．要

約

シカ肉の全ヘム色素量において血絞りによる影
響は認められなかったが，脂質酸化に対し血絞り自体は有効であった。シカ肉ベーコンの嗜好性で，血絞りによって味にマイナスの影響があった。その理由として血絞りの工程で塩漬剤を水で洗い流す際に，うまみ成分まで流れてしまったことが考えられる。一方で，シカ肉・イノシシ肉混
合ソーセージは高い消費者受容性を示し，味や香りに関してはほとんどのパネルが好ましいと評価した。色に関して好ましくないという意見があり，シカ肉およびイノシシ肉の特有の濃い肉色が文
献１） 農 林 水 産 省：鳥 獣 被 害 の 現 状 と 対 策 ，http://
www.maff.go.jp/j/seisan/tyozyu/higai/pdf/h2803_
meguji_zentai2.pdf, 2016.
２） 押田敏雄，坂田亮一：「第２回ジビエサミット」に参加して伝統食から外食産業へ―有害捕獲から地域・産業資源としての捕獲への転換―，畜産の研究，
70, 311～320, 2016.
３） 宮原昭義，赤尾まこと，桜井英敏，金山喜一，村上直哉：塩漬解凍法によるロースハムの品質と歩留まり，日本食品科学工学会誌，58（2）, 62～66, 2011.
４） 坂田亮一：食肉・食肉製品の分析技術／第２章食
肉・食肉製品の品質評価法／色調およびヘム色素，
食肉の科学，40, 221～224, 1999.
５） Mirna, A., Schüzt, G. : Verfahren zurgleichzeitigen
Bestimmung des Pokelfarb-stoffes sowie von Nitrit
und Nitrat inFleischerzeugnissen, Fleischwirtsch.,
52, 1337～1338, 1972.
６） 山内 清，安藤則秀：亜硝酸塩が存在する場合の肉のTBA number測定，日本畜産学会報，44, 155～158,1973.
７） 坂田亮一，押田敏雄：最近の食肉加工技術について；野生動物肉の研究例など，畜産技術，５月号，
34 ～39，2016.

消費者に好まれない印象を与えることも今回のア© The Ito Foundation

72

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その２）Studies on clarification of the compounds involved in “koku attributes” ofpork sausages（Part 2）

西

村

敏

英・江

草

愛

（日本獣医生命科学大学応用生命科学部食品科学科）

Toshihide Nishimura and Ai Egusa（Department of Food Science and Technology, Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary and Life Science University）

In Japan, the term of “koku attributes” as well as taste, aroma and texture, is commonlyused to assess palatable foods. Although “koku attributes” has not been defined clearly yet, it isthought to be the sensation through richness（complexity）, mouthfulness and lingering（continuity）in terms of taste, aroma, and texture of foods. In the previous research, thesensory characteristics in taste, aroma and texture of pork sausage were clarified by sensory
evaluation. Umami compounds were also shown to play an important role in “koku attribute” ofpork sausage. So, this research was carried on to clarify the role of umami compounds in thesensation of “koku attributes” and the aroma compounds contributing to the characteristic
aroma in pork sausages.
First, the sensation contributing to “koku attributes” of pork sausages containing thedifferent amount of umami compounds was examined by sensory evaluation. Sensory analyses
showed that umami compounds enhanced the strength of retronasal aroma sensation, richnessof flavor, lingering of taste as well as the strength of umami. This result indicated that umami
compounds seemed to be the enhancer of “koku attribute” in pork sausages as well as model
chicken soup.
Next, the aroma compounds contributing to the characteristic aroma of pork sausages
were examined by GC/MS and GC-O. GC-O and GC/MS analyses have shown that thecharacteristic aroma compounds of pork sausages in this research were identified to be
caryophyllene, 2-methoxy phenol, cresol, methyl eugenol and 2,6-diethoxy phenol.

１．目

さに寄与する呈味成分に関する研究は多く，グル的タミン酸やイノシン酸が主要なうま味成分である

食肉製品のおいしさに関する研究は，その原料ことが明らかとなっている。

となる牛肉，豚肉，鶏肉に関するものが多く，各一方，香気成分に関しては，加熱による香気成

食肉に含まれる呈味成分や加熱時の香気成分を分分の変化に関する多くのデータが蓄積されている

析した研究がほとんどである。その中で，おいしが，各食肉の特徴に寄与する香気成分の特定は，© The Ito Foundation

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その２）73

十分になされていないのが現状である。これま後をひく香り，広がりのある香り，スモーキー，

で，和牛肉では，ラクトン類が和牛肉を加熱した

スパイシーな香り」の５項目が，テクスチャーを時の甘い香りに関わっていることが明らかとなっ表現する用語としては，「弾力，歯ごたえ，ジューている 。また，鶏肉の不快臭の原因物質として，

シー，ぱりぱり，プリプリ」の５項目がソーセー

2,4-デカジエナールが特定されており，その生成ジを特徴付ける用語としてあげられた。また，コ量が増えることにより，おいしさが低下することクがあると評価されたポークソーセージからは，が知られている。しかし，豚肉を加熱した時の特原料である肉様香気と甘い香気成分が多く検出さ

徴的な香りやそれを原料としたポークソーセージ

れており，これら香気成分がコクの発現においのおいしさに寄与する香気成分は，ほとんど明らて，少なからず影響していると推察された。さらかにされていない。また，豚肉を主原料とした食に，上位ランクのソーセージには，うま味物質が肉製品では，Mottram ２）やRamarathnamら ３）の十分に含まれており，この風味増強作用がコク付

報告により，硝酸アルキル，ベンゾニトリル，4-与の１つの要因であると推察された。

１）

メチル-2-ペンタノン，2-ブチル-2-オクテナール

本申請課題では，昨年の成果を受けて，ポークなどの香気成分が亜硝酸塩を添加した製品から多ソーセージのコクに寄与する成分と考えられる

く検出されることが明らかとなっている。しか「うま味物質」が，ソーセージの風味に及ぼす影

し，どの成分が食肉製品のおいしさに関わってい響を調べた。また，ポークソーセージの特徴をもるかは，ほとんど研究がなされていない。

たらす香りに寄与する香気成分の同定を，GC/O

申請者らは，これまで食肉のおいしさを解明することを目的とし，食肉を熟成した時の呈味成分の変動ならびに，それにかかわるメカニズムに関並びにGC/MSで行った。
２．方法

する研究４）を進めてきた。近年，食肉のおいしさ

2 . 1 供試材料の研究に関して，うま味の役割を明らかにし，う

うま味物質添加量の異なる４種類のソーセージ

ま味物質は食肉の口中香を増強させる働きがある（通常濃度（対照），1/2 MSG濃度，1/10 MSG濃ことを解明した 。また，食べ物のコクを定義す

度，無添加）を調製した。冷凍保存したものを，るため，以下のような概念を提案している。すな

冷蔵庫（０℃）で一晩保存して解凍し，官能評価

わち，食べ物のコクは，味，香り，食感に関する用試料の調製に用いた。

５）

多くの刺激で複雑さが感じられ，それらが広が2 . 2 官能評価用の試料の調製方法

り，持続することによりもたらされる感覚である

ステンレス製鍋（24 ㎝φ×12 ㎝）に水を張と提案している。

り，さらに350 mlの水を入れた500 ml容のビー

昨年の助成による研究では，ポークソーセージ

カーを４つ入れ加温した。沸騰したところで，各の官能的特徴とコクに寄与する成分の解明を試ビーカーにソーセージを５本ずつ投入し，80 ℃

み，味を表現する用語としては，「脂っこい味，

で３分間加熱した。この際，中心温度は50 ℃付

うま味，塩味，香ばしい味，持続感，濃厚な味，

近であることを確認した。加熱が終了したソー

広がりのある味，深みのある味，力強い味，複雑

セージは，アルミホイルで包装し，官能評価用のな味，スパイシーな味，厚みのある味」の12項目

検体として提供した。なお，口濯ぎ用の水は，ソーが，香りを表現する用語としては，「香ばしい，

セージの脂並びに香辛料を口中から速やかに取り© The Ito Foundation

74

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

除くため，約60 ℃に温めたものを保温容器（ス
テンレス製マグボトル）に入れて提供した。

大きい香気成分の特定ａで調製した試料をGC-Oに供し，臭い嗅ぎを2 . 3 官能評価

実施して，ソーセージの香りに寄与の大きい成分

パネリストには，基本五味の識別，ならびに各を特定した。分析は，GC（GC-2014，（株）島津

味の濃度識別ができ，２カ月以上の訓練を行った

製作所）で，CP-wax 52 CB（30 m x 0.25 ㎜ i.d.，者を選定した 。パネリスト１名あたり，対照を0.25 μm film thickness）（ジ ー エ ル サ イ エ ン ス

２本と，うま味濃度の異なるソーセージ３種類を（株））カラムを用いた。分析条件は，40 ℃（５各種類１本ずつの，計５本を提供した。

min）→（10 ℃／min）→240 ℃（10 min）の昇６）

評価方法は評点法を用い，各評価項目に対し温プログラムを用いた。検出器にはFID（260 ℃）て，対照を基準としたときの各検体の強さを，点を 使 用 し た 。 臭 い 嗅 ぎ 装 置 は ， Sniffer 9000

数で評価した。評価の点数は，－３（非常に弱い）

System（アルファ・モス・ジャパン（株））を用から＋３（非常に強い）の範囲内で選択してもいた。ソーセージの香りに寄与の大きい成分の特らった（別紙）。

定 に は ， AEDA （Aroma extract dilution

官能評価結果の検定には，t 検定を用いた。

analysis）を用い，ジエチルエーテルで抽出した

2 . 4 コクの発現に寄与する呈味成分の分析

香気成分試料を，段階的に希釈したものを臭い嗅ぎに供した。最大希釈2048倍で検出できた香気成（遊離アミノ酸と核酸関連物質）
ブレンダーで細切した５ｇのソーセージに対分を最も寄与度の大きい香気成分とした。

し，20 mlの冷たい蒸留水を添加後，10000 rpm

ｃ：GC/MSによる香気成分の同定

で１分間，ホモジナイズした。得られたホモジ

ａ で 調 製 し た 試 料 を GC/MS（Agilent7890A

ネートを遠心分離（10,000ｇ，10 分間，４℃）し，GC-System, Agilent 7693 Auto-sampler, Agilent

上清に終濃度で３％となるようスルホサリチル酸

Technologies 5975C inert MSD with Triple-Axisを添加した。除タンパク後の上清をアミノ酸自動Detecter）に供し，香気成分を同定した。分析条

分析計（日本電子）に供し，Gluの定量を行った。

件は，GC-Oの場合と同じで，検出器にはMSをIMPの分析には，Asahipac-GS320 column（サイズ排除カラム，昭和電工）を用い，10 mMリン酸ナトリウム溶液（pH 5.8）を移動相としてア
イソクラティック法で分析した。なお，カラム温
度は40 ℃，検出には，260 nmの波長を用いた。

使用した。
３．実験結果と考察
3 . 1 うま味物質含量の違いが，ソーセージの風味に及ぼす影響2 . 5 ポークソーセージの香気成分分析

１：試作ソーセージ中のうま味物質含量

ａ：エーテル抽出ならびにSAFE蒸留による香肉製品を製造する際に，調味料としてグルタミ
ン酸ナトリウムやイノシン酸ナトリウムを添加す

気成分の捕集細切した５ｇのソーセージに20 mlのジエチル

ることはよく知られている。最近，うま味物質は，エーテルを添加し，２℃で一晩保存して，香気成

食べ物の口中香を増強し，味わい全体を強めてい分を抽出した。また，エーテル抽出した試料をることが明らかとなった。そこで，ポークソー

SAFE蒸留し，香気成分の濃縮試料を調製した。

セージの味わい，特に風味の感じ方に関して，うｂ：ポークソーセージの特徴的な風味に寄与のま味物質がどのような影響を与えているかを調べ© The Ito Foundation

75

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その２）＜別紙＞
ソーセージ官能評価

名前（1）ソーセージを 10 回以上咀嚼し，項目①から順に評価して下さい。
非常に

（＋３）

A

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

C

①

香りの強さ

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

②

香りの広がり

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

③

うま味

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

④

味わいの複雑さ

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

⑤

風味の広がり

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

⑥

味の持続

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

⑦

（＋２）

強い

D

かなり

B

（－１）

（＋１）

強い

（－２）

やや

（－３）

（０）

強い

＜記入例＞

どちら

付けて下さい。口濯ぎを必ず行ってください。

でも

（－１）

ない

やや

（－２）

弱い

かなり

B，C，D を（-3，-2，-1，
0，
+1，
+2，
+3）の中で点数を（－３）

弱い

非常に

弱い

下記のスケールを参考にＡを基準の０点として

香りの持続

た。

し，市販品を対照として評価した。

うま味物質であるグルタミン酸の含有量を，市それぞれの製品のうま味物質の測定値を，販の半分（1/2添加品），10分の１（1/10添加品）

Table１に示した。グルタミン酸は，無添加品にならびに，無添加（無添加品）とした製品を試作も若干含まれていた。熟成した豚肉には，約１© The Ito Foundation

76

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Table 1 市販品ならびに，うま味物質含量の異なる試作品のうま味物質含量
グルタミン酸含量

対照（市販品）

イノシン酸含量

％

mM

％

mM

0.288

19.6

0.120

3.5

0.145

9.8

0.096

2.8

1/10添加品

0.032

2.2

0.085

2.4

無添加品

0.011

0.8

0.071

2.0

うま味物質

1/2添加品

うま味物質
うま味物質

mMのグルタミン酸が含まれていると報告されてうま味物質は，すべての評価項目に影響を与えいることから，これは，原料となる豚肉由来のもることが明らかとなった。これらの中で，特にのであると推察された。また，市販品ならびに，「香りの強さ」，「風味の複雑さ」，ならびに「味の各 添 加 品 に は ， 19.6 mM （0.288 ％ ）， 9.8 mM

持続性」で有意な差異が認められ，うま味物質含（0.145％）ならびに，2.2 mM（0.032％）のグル量が多くなると，ソーセージの口中香が強く感じ

タミン酸が含まれていることが明らかとなった。

られると同時に，風味の複雑さを感じ，味の持続

一方，イノシン酸は，肉由来のものに若干の添加

性が強くなることが判明した。うま味物質の添加物由来のものがあると推定された。

が，口中香を高める効果に関して，モデルチキン

グルタミン酸ナトリウムの閾値は0.03％であスープでの報告５）はあるが，肉製品での報告は初り，これにイノシン酸ナトリウムが共存すると，めてである。また，「風味の複雑さ」や「味の持

うま味の相乗効果により，閾値が数倍以上に低下続性」は，コクの要因であることから，ポーク

し，うま味をより強く感じられるようになると報ソーセージにおいて，うま味物質がコク付与物質

告されている 。このことから，いずれの製品もであると推察された。

７）

うま味物質による風味の増強効果は認められてい3 . 2 ポークソーセージの特徴的な風味に寄与ると推定された。

の大きい香気成分の特定

２：うま味物質含量の異なるソーセージの食味
性の違い

コクの形成には香りは不可欠な要因であることはよく知られている。特に，香りはコクの形成にうま味物質含量の異なる４種類の試作品の食味

おいて，ベースの部分になると考えられる。そこ

性の違いを調べた。官能評価項目に関しては，昨で，ポークソーセージの特徴的な風味に寄与する年度の本事業において，市販ソーセージの食味性

香気成分を特定することとした。

を調べた結果に基づいて，コクに関連する「香りの強さ」，「香りの広がり」，「香りの持続性」，「う

１：異なる香気抽出方法で得られた香気成分の比較

ま味強度」，「風味の複雑さ」，「風味の広がり」，

香気成分の抽出方法として，エーテル抽出方法

ならびに，「味の持続性」の７項目とした。官能を用いた。さらに，この抽出物をSAFE蒸留し，評価は，市販品の点数を基準として，評価した。

より濃縮された香気分析試料を調製し，GC/MS

官能評価の結果をFig.１に示した。Fig.１では，で香気成分を分析し，結果をFig.２に示した。

市販品の評価を１点とし，1/2添加品，1/10添加

Fig.２の上段図が，エーテル抽出したもの，下品ならびに，無添加品の評価点数をプロットした。

段図がSAFE蒸留したものをGC/MSで分析した© The Ito Foundation

77

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その２）
1.5

1.5
＊

1.0

1.0

スコア

スコア

＊＊

うま味

複雑さ

＊

0.5

0.5
0.0

＊＊＊
＊＊

香りの強さ

香りの広がり

香りの持続

-0.5

0.0

風味の広がり味の持続

-0.5
-1.0

-1.0

-1.5

-1.5

-2.0
×１
×1/2
×1/10
無添加

×１

＊, ｐ＜ 0.05

×1/2＊＊, ｐ＜ 0.01

×1/10＊＊＊, ｐ＜ 0.001

無添加＊, ｐ＜ 0.05＊＊, ｐ＜ 0.01＊＊＊, ｐ＜ 0.001

Fig. 1 Effect of umami compounds on the flavor of pork sausages

エーテル抽 出検 出 強 度
保持時間（分）検 出 強 度

エーテル抽出物のS A F E蒸留

保持時間（分）Fig. 2 Comparison of aroma compounds in the ether extract and the SAFE distillation of ether extract© The Ito Foundation

78

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）①

uy （ｘ10,000）
1.2② ③④⑤ ⑥⑦⑧ ⑨⑩⑪ ⑫ ⑬ ⑭

クロマトグラム

希釈していない
サンプル

1.1
1.0

検 出

0.9

強

0.6

0.8
0.7

0.5

度

0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
-0.1

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

min

保持時間（分）希釈
倍率

FD2048
1024
512
256
128
64
32
1

1

2 3 4 5 6 78

910111213 14

ピーク番 号
Fig. 3 GC-O chromatogram（top）, and aromagram of pork sausages by AEDA method（bottom）（The peak numbers（①～⑭）in top indicate the position in which aroma was detected.）

クロマトグラムである。クロマトグラムの15分ま与の大きい香気成分の特定を試みた。

での低沸点香気成分の検出量は，両者において大エーテル抽出した試料を段階的に希釈し，きな違いは認められなかったが，SAFE蒸留した

GC-Oを実施し，寄与度の大きい香気成分を特定

試料のクロマトグラムでは，高沸点の香気成分がするAEDA法を実施した。Fig.３に示すように，あまり検出されないことが明らかとなった。ま希釈していないサンプルでは，14か所で臭いが検た，エーテル抽出物とSAFE蒸留試料の香りを比出された。
（Fig.３上段）さらに，段階希釈を行い，較した結果，エーテル抽出物からは，強いポーク

2048倍希釈サンプルでは⑥，⑦，⑨，⑩，⑫，⑭

ソーセージの香りが感じられたが，SAFE蒸留試の６か所まで絞り込むことができた（Fig.３下料からは，その香りが弱かった。この理由に関し

段）。

ては，今後検討する必要がある。

したがって，これら６成分が，本研究で用いた

２：特徴的な風味に寄与の大きい香気成分の特定と同定

市販ポークソーセージの香りの特徴に大きく寄与している成分であると特定された。

そこで，エーテル抽出試料を用いて，GC-O装

GC-Oで検知されたこれら香気成分の特徴は，

置を用いて，GCで検出された香気成分の臭い嗅⑥が「キノコ，草，カメムシ」，⑦が「カラメル，

ぎを行い，ポークソーセージの特徴的な風味に寄

焦げ，スモーク」，⑨が「脂，片栗粉，プラスチッ© The Ito Foundation

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その２）79

Table 2 ポークソーセージからエーテルで抽出された香気成分質と候補物質
番号

香りの質（記述）候補物質①

キノコ，酸っぱい，ワックス

D-limonene②

ワックス，プラスチック，粉

該当なし

③

酸っぱい，青臭い

acetic acid④

酸っぱい，チーズ

butanoic acid⑤

湿っぽい，足の裏

propanoic acid⑥

キノコ，草，カメムシ

該当なし

⑦

カラメル，薬，焦げ，樟脳，スモーク

caryophyllene⑧

カラメル，木，土，野菜，小豆

該当なし

⑨

脂，片栗粉，プラスチック

2-methoxy phenol⑩

醤油，柑橘，脂，スモーク

cresol

⑪

スモーク

該当なし

⑫

焦げ，カラメル，醤油，ハーブ

methyl eugenol⑬

薬，スモーク，脂eugenol⑭

スモーク，煙2,6-dimethoxy phenol

ク」，⑩が「醤油，脂，スモーク」，⑫が「焦げ，す影響を調べた。また，ポークソーセージの特徴

カラメル，醤油，ハーブ」，⑭が「スモーク，煙」

をもたらす香りに寄与する香気成分の同定をGC/を連想させることが明らかとなった。これらは，Oならびに，GC/MSで行った。

燻煙したポークソーセージに特徴的な香りに寄与していると推定された（Table２）。

その結果，うま味物質は，ポークソーセージの口中香を強く感じさせると同時に，風味の複雑さ

次に，エーテル抽出物のGC-Oで検出された14や味の持続性を強く感じさせることが判明した。

成分の物質同定をするため，GC/MSに供した。

この効果は，コクの要因であることから，ポーク

そ の 結 果 ， Table ２ に 示 す よ う に ， ⑦ がソーセージにおいて，うま味物質はコク付与物質

caryophyllene ， ⑨ が 2-methoxy phenol ， ⑩ がであると推察された。また，ポークソーセージか

cresol，⑫がmethyl eugenol，⑭が2,6-dimethoxy

らエーテルで抽出した香気成分をGC-OとGC/MS

phenolであると推定された。

で解析した結果，caryophyllene（クローブ精油），

このように，複数の香気成分がポークソーセー

2-methoxy phenol（脂，片栗粉，プラスチック），ジの特徴的な香気に寄与する成分として同定でき

cresol（醤油，脂，スモーク），methyl eugenol（焦たので，今後は，これらの標品を用いて再構成し，げ ， カ ラ メ ル ， 醤 油 ， ハ ー ブ）， な ら び に

ポークソーセージの香りを再現できるか否かを調

2,6-dimethoxy phenol（スモーク，煙）が特徴的

べる計画である。

な臭いに寄与する候補成分として特定ならびに，

４．要同定された。

約

本課題では，昨年の本事業での成果を受けて，ポークソーセージのコク付与に寄与する成分と考えられるうま味物質が，ソーセージの風味に及ぼ文献１） 右田光史郎，高濱結花，高萩康，杉山尚弥，菊池圭祐，松石昌典，沖谷明紘：日食工誌，59, 127～138,
2012.

© The Ito Foundation

80

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）２） Mottram, D. M. : Organic Nitrates and Nitriles inthe Volatiles of Cooked Cured Pork, J. Agric. Food
Chem., 32, 343～345, 1984.
３） Ramarathnam, N., Rubin, L.J., Diosady, L.L. :Studies on meat flavor. 3. A novel method fortrapping volatile components from uncured andcured pork, J. Agric. Food Chem., 41（6）, 933～938,
1993.
４） Nishimura, T. : Mechanism Involved in the
Improvement of Meat Taste during Postmortem
Aging, Food Sci. Technol. Int. Tokyo, 4（4）, 241～

249, 1988.
５） Nishimura, T., Goto, S., Miura, K., Takakura, Y.,
Egusa, S. A., Wakabayashi, H. : Umami compounds
enhance the intensity of retronasal sensation ofaromas from model chicken soups, Food Chemistry,
196, 577～583, 2016.
６） 古川秀子：おいしさを測る―食品官能検査の実際，幸書房，1994.
７） Yamaguchi, S. : Synergistic taste effect ofmonosodium glutamate and disodium 5'-inosinate, J.
Food Sci., 32, 473～478, 1967.

© The Ito Foundation

81

畜産物由来ペプチドの肝障害改善の効果について
Effect of dietary animal peptides on hepatic injury

實

安

隆

興

（神戸大学大学院農学研究科）

Takaoki Saneyasu（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

Not only edible meat products but also by-products are valuable sources of essential
nutrients such as protein, minerals, and vitamins. For example, liver contains an abundance ofprotein and vitamins. Nevertheless, there is little attention to the biological functions of theseproducts, and consequently they have been wasted. In the present study, we investigated theeffects of peptides from pig liver（liver peptide）on mouse liver after carbon tetrachlorideinduced injury. Dietary liver peptide does not significantly affect the body weight, tissue
weight, and plasma component（concentrations of glucose, triglyceride, and non-esterified fatty
acids; activities of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase）in mice. In
contrast, the mRNA levels of collagen α1（V）and α1（I）chain were decreased by dietary
liver peptide（P ＜ 0.05, P ＝ 0.07, respepctively）. It is therefore likely that dietary liver peptide
inhibits collagen production in mouse liver without inducing side effects.

１．目

レバーは，タンパク質とビタミンを豊富に含む的食材であるが，嗜好性が悪く，ヒトの食材として世界人口の恒常的な増加や農産物生産量の低は十分に活用されていない。しかしながら，古く

下，さらには穀物のバイオエタノール生産への利から，肝臓ペプチドを主成分とする肝水解物は肝用など，世界の食糧事情は今後もさらに厳しくな疾患用の薬として用いられており，最近では，健ることが予想される。ここで，我が国は，家畜の康ドリンク用の食品素材としても利用されつつあ

飼料原料のほとんどを輸入に依存していることかる。しかしながら，意外にもその肝機能改善作用

ら，畜産物は可能な限り無駄なく利用するべきで機構の詳細は明らかにされていない。それゆえ，あるが，食用に適さない内臓や血液等などの畜産

肝臓ペプチドの肝機能改善機構の詳細を明らかに副生物は，その高い栄養価にもかかわらず廃棄さすることができれば，機能性食品素材としての需れている。このことは，食物の有効利用の面に加要をさらに増加させることにより，廃棄食材の量

え，環境および廃棄コストの面からも解決するべの減少に寄与できると判断される。

き課題となっているが，未だ，十分な成果はあがっていない。

肝疾患に関しては，近年，ウイルス性肝障害のインターフェロン治療や抗ウイルス剤による治療© The Ito Foundation

82

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

法が確立されたが，食生活の乱れが原因となるア

肪組織，および腎周囲脂肪組織の重量をそれぞれ

ルコール性肝障害，および非アルコール性肝障害測定した。血中アラニアミノトランスフェラーゼは未だ解決すべき課題となっている。しかしなが（ALT）活性は市販キット（BioVision, Inc., CA）

ら，これらの肝障害の治療はもっぱら食生活の改を用いて測定した。また，肝臓からセパゾ－ル

善を主体とするものであり，本人の強い意志によRNA I（ナカライテスク株式会社）を用いて総る生活習慣の改善がほとんど唯一の根本的治療法

RNAを抽出し，コラーゲンの遺伝子発現量をとなるが，患者への動機づけは容易ではない。しABI 7300 Real Time PCR System（ア プ ラ イ ド

たがって，畜産ペプチドの肝機能改善効果が明ら

バ イ オ シ ス テ ム ズ ジ ャ パ ン 株 式 会 社）お よ び

かにできれば，それを用いて生活習慣を大きく変SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（タえる必要のない，患者のQOLを考えた新規の肝カラバイオ株式会社）を用いたリアルタイムPCR

障害の改善策を提案できる可能性があると考えらにより解析した。リアルタイムPCRに用いたプラれる。

イマーはTable２に示した。統計解析は二元配置

本研究では，畜産物の有効利用のための一環と分散分析により行った。

して，畜産物由来ペプチドの新規機能性開発を目的として，豚肝臓ペプチドの給与がマウスにおけ

Table 1 Composition of experimental diets

る四塩化炭素誘発性の肝障害に及ぼす影響につい（g/100g diet）

て調べた。
２．方

法

カゼインをタンパク質源とする対照試料，あるいはタンパク質換算で対照飼料中のカゼインの1/3 量 を 豚 肝 臓 ペ プ チ ド に 置 換 し た 試 験 飼 料（Table１）を６週齢のICRマウス（日本エスエル

CaseinPeptides from pig liver
L-CysteinCorn starch
SucroseSoybean oil
Cellulose
Mineral mixture１）

Control

Liver peptide

20
0
0.3
53
10
7
5

13.3
8.7
0.3
53
10
7
5

3.5
1
0.00140.25

3.5
10.00140.25

シー株式会社）に４週間給与した後，25㎎/㎏体

Vitamin mixture２）
tert-Butylhydroquinone
Choline-tartrate

重の四塩化炭素を腹腔内に投与した１）。24時間後１）AIN-93G Mineral mixture（Japan SLC, INC., Shizuoka,に体重を測定し，麻酔下で腹部大静脈より採血後，安楽死させ，肝臓，腓腹筋，精巣上体周囲脂Japan）
２）AIN-93G Vitamin mixture（Japan SLC, INC., Shizuoka,
Japan）

Table 2 Primer sequences used for real-time PCR analysis
Gene name
Collagen I A1

Forward primer
Reverse primer

5'-ggg cga gtg ctg tgc ttt-3'5'-ggt ccc tcg act cct aca tct tc-3'

Collagen III A1

Forward primer
Reverse primer

5'-ctg taa cat gga aac tgg gga aa-3'5'-cca tag ctg aac tga aaa cca cc-3'

Collagen V A1

Forward primer
Reverse primer

5'-gag gac cac aca ggg aag c-3'5'-ctt gta gac act gag agc aat tcg-3'

Ribosormal protein S17

Forward primer
Reverse primer

5'-ccg ggt cat cat cga gaa gt-3'
5'-gcg ctt gtt ggt gtg gaa gt-3'© The Ito Foundation

83

畜産物由来ペプチドの肝障害改善の効果について

Table 3 Effects of peptides from pig liver on body weights, tissue weights, and plasma alanine aminotransferase activity

in mice
Control

Liver peptide

Two-way ANOVASalineCCl4

Saline

CCl4

Diet

CCl4

Body weight（g）

45.5±2.843.6±1.743.3±1.242.3±1.1

0.96

0.63

Interaction
0.07

Liver weight（g）

2.18±0.13

1.87±0.10

2.11±0.06

2.07±0.06

0.48

0.07

0.18

Epididymal adipose tissue weight（g）

1.99±0.42

1.57±0.17

1.62±0.17

1.46±0.21

0.37

0.29

0.65

Perirenal adipose tissue wight（g）

0.58±0.13

0.59±0.09

0.56±0.04

0.46±0.07

0.71

0.24

0.53

Plasma alanine aminotransferase activity（U/l）

5.71±0.73

11.30±3.34

5.31±1.33

11.66±3.77

0.99

0.04

0.89

Values are means±SEM of five mice in each group．

COL1A1
果

豚肝臓ペプチドの給与および四塩化炭素の投与はマウスの体重，肝臓重量，精巣上体周囲脂肪重量，および腎周囲脂肪重量に有意な影響は及ぼさArbitrary unit

３．結

0.20

Diet
P = 0.07
CC14
P = 0.35
Interaction P = 0.05

0.15
0.10
0.05
0

なかった（Table３）。肝臓重量は四塩化炭素投与により減少する傾向を示し（Table 3, P＝0.07），

COL3A1

加した（Table 3, P＜0.05）。また，肝臓ペプチド2.0

給与により，Ｉ型コラーゲンα１鎖（COL1A1）の遺伝子発現量は減少する傾向を示し（Fig.1, P＝0.07），Ｖ型コラーゲンα１鎖（COL5A1）の遺Arbitrary unit

血中ALT活性は四塩化炭素投与により有意に増

2.5

Diet
P = 0.24
CC14
P = 0.57
Interaction P = 0.37

1.5
1.0
0.5
0

伝子発現量は有意に減少した（Fig.1, P＜0.05）。
一方，Ⅲ型コラーゲンα１鎖（COL3A1）の遺伝

COL5A1
0.6

素投与による有意な影響は認められなかった。
４．考察

本実験において，豚肝臓ペプチドの給与はマウ

Arbitrary unit

子発現量には，肝臓ペプチド給与および四塩化炭

なかった（Table３）。また，血糖値，血中トリグ
リセリド濃度，血中遊離脂肪酸濃度，血中ALT
活性（Table３），および血中アスパラギン酸トラ
ンスフェラーゼ活性にも肝臓ペプチドの給与による 有 意 な 影 響 は 認 め ら れ な か っ た（data not

0.4
0.3
0.2
0.1
0

スの体重，および組織重量に有意な影響を及ぼさDiet
P = 0.02
CC14
P = 0.27
Interaction P = 0.22

0.5

Diet

Control

Liver

Control

Liver

CC14

Saline

CC14

SalineCC14

Fig. 1 Effects of peptides from pig liver on collagenmRNA levels in mice liver.
Data are means±SEM of five mice in each group.

状に影響を及ぼさない可能性が示された。

shown）。これらのことから，本実験で設定した四塩化炭素は主としてCYP2E1によりトリクロ

添加量の豚肝臓ペプチドの給与はマウスの一般性

ロメチルフリーラジカルに代謝され，それが引き© The Ito Foundation

84

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

金となって肝障害を引き起こすことが知られていが四塩化炭素誘発性の肝障害後の治癒過程に及ぼるす影響を明らかにする必要がある。

。本実験において，四塩化炭素の投与によ

２,３）り血中ALT活性は増加したが，豚肝臓ペプチドの給与による有意な影響は認められなかった

５．要

約（Table３）。これらのことから，豚肝臓ペプチド

本研究では，畜産副生物の利用法開発のためのの給与は，CYP2E1の活性やトリクロロメチルフ

一環として，豚肝臓ペプチドの給与がマウスの四リーラジカルの産生に影響を及ぼさないものと推

塩化炭素誘発性の肝障害に及ぼす影響を調べた。

察された。

豚肝臓ペプチドの給与は，体重，肝臓重量，およコラーゲンは脊椎動物の体内に最も多く存在

び血中ALT活性に有意な影響を及ぼさなかった

し，組織や臓器の構造維持に必須の細胞外マトが，Ⅰ型コラーゲンα１鎖の遺伝子発現量を減少

リックスタンパク質である４）。また，組織損傷後させる傾向を示し（P＝0.07），Ⅴ型コラーゲンαの治癒過程において，コラーゲンは活性化した線

１鎖の遺伝子発現量を有意に減少させた（P＜

維芽細胞により産生・分泌され，損傷部の修復に0.05）。これらの結果から，豚肝臓ペプチドの給重要な役割を果たしている。その一方で，障害が与は，マウスの一般性状や肝臓における四塩化炭

慢性化すると線維芽細胞の活性化が持続し，その素の代謝に影響を及ぼさないが，肝臓のコラーゲ

結果，主としてコラーゲンからなる細胞外マトン産生を抑制することが示唆された。

リックスが過剰蓄積した状態（線維症）になる。
したがって，組織損傷後の治癒過程においては，
過剰のコラーゲン産生を抑制する必要があると考えられる。本研究において，豚肝臓ペプチドの給与によりCOL1A1のmRNA量は減少する傾向を示し（Fig.1, P＝0.07），COL5A1のmRNA量は有意に減少した（Fig.1, P＜0.05）。これらのことから，豚肝臓ペプチドは組織損傷後のコラーゲンの過剰産生を抑制し，線維症への進行を阻害する可能性が考えられる。今後，豚肝臓ペプチドの給与文献１） A n u t r i e n t m i x t u r e s u p p r e s s e s c a r b o n
tetrachloride-induced acute hepatic toxicity in ICR
mice, Hum Exp Toxicol, 27, 559～566, 2008.
２） 加藤隆一，鎌滝哲也編：薬物代謝学第２版，株式会社東京化学同人，東京，169～211, 2000.
３） Wong, F. W., Chan, W. Y., Lee, S. S. : Resistanceto carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity inmice which lack CYP2E1 expression, Toxicol Appl
Pharmacol., 153, 109～118, 1998.
４） Mander, L. N., Liu, H. W. : Comprehensive
natural products II : chemistry and biology, 469～
530, Elsevier, Oxford, 2010.

© The Ito Foundation

85

肥満に伴う認知症の発症予防における豚肉摂取の効果
Effect of the pork intake on the prevention of dementia related withobesity

後

藤

孔

郎・加

隈

哲

也・柴

田

洋

孝

（大分大学医学部内分泌代謝膠原病腎臓内科学講座）

Koro Gotoh, Tetsuya Kakuma and Hirotaka Shibata（Department of Endocrinology, Metabolism, Rheumatology and Nephrology, Faculty of Medicine, Oita University）

Obesity induces systemic low-grade chronic inflammation. Alzheimerʼs disease is deeply
related with amyloid deposition although the mechanism is uncertain. The development of
Alzheimerʼs disease is also associated with chronic inflammation by the activation of microglia
cells, and reduction of brain-derived neurotrophic factor（BDNF）expression in the brain.
BDNF is an important factor to prevent neuronal death which occurs in Alzheimerʼs disease.
The aim of this study is to clarify that the intake of carnosine included a lot in pork suppresses
obesity-induced inflammation in the brain. Male rats were divided into four groups and kept
for 2 months as follows, standard diet（Standard；20％ fat）
-fed group, high-fat diet（HF ; 60％fat）-fed group, standard-fed plus carnosine（250mg/kg body weight）group, and HF-fed plus
carnosine group for 2 months. During this examination, they were centrally administered withamyloid（Aβ ; 0.001mg/day）for a month. We evaluated 1）tumor-necrotizing factor-α（TNF-α）which is an inf lammatory cytokine, interleukin-10（IL-10）which is an antiinflammatory cytokine, and BDNF expression in brain, 2）the activation of microglia cells（MG）
and A deposits in the brain with innuno-histochemistry. Carnosine treatment inhibited HFinduced increase of TNF-α/IL-10 ratio in the brain, indicating that carnosine promotes antiinflammatory response. Moreover, carnosine also suppressed HF-induced MG activation in thebrain. In addition, carnosine treatment recovered HF-induced reduction of BDNF expression in
the brain. There was no difference among all groups in A deposits in the brain. We clarified
that carnosine suppresses obesity-induced inflammatory responses by inactivating MG as wellas promotes BDNF expression in the brain, although it does not affect A deposition. Thus it issuggested that carnosine intake might be effective to protect neurons from cell death by antiinflammatory responses and elevation of BDNF expression in the brain, preventing thedevelopment of Alzheimerʼs disease.

１．目

リックシンドロームの増加は世界的な問題となっ的ている。肥満は，全身性炎症性疾患と位置付けら肥満およびそれに関連した糖尿病などのメタボ

れており，肝臓や内臓脂肪のみならず脳内におい© The Ito Foundation

86

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）ても炎症性変化がみられるとされている。アルツ

るカルノシンを摂取すると，ミクログリア細胞をハイマー型認知症においては，かつては危険因子中心とした脳内炎症が抑制され，さらにアルツハとして体重減少に関心が寄せられていた。しかし

イマー型認知症の発症および進展予防に有効であながら，最近の研究では，むしろ肥満がアルツハる」という仮説を証明することにある。

イマー型認知症の危険因子であるというエビデン
スが集積されてきた。特に，中年期の肥満はアル２．方法

ツハイマー型認知症発症の重大な危険因子である

雄ラットに通常食（Standard ; St）または高脂ことが明らかにされてきた。さらにさかのぼって肪食（餌中の60％が脂肪成分，High fat ; HF）を小児期からの肥満の管理・予防が動脈硬化性心血摂取させ，通常食群と高脂肪食群に分ける。さら

管疾患のみならず，アルツハイマー型認知症の発に，各群をカルノシン添加群（carnosine ; carno,症予防にもきわめて重要であると考えられてい250㎎/㎏体重）と添加しないコントロール群に分る。アルツハイマー型認知症のメカニズムの詳細

け る 。し た が っ て ，通 常 食 ＋ コ ン ト ロ ー ル 群は不明であるが，神経細胞外のアミロイドβの沈（St），通常食＋カルノシン添加群（St＋ carno），

着のみならず，ミクログリア細胞の活性化とそれ

高脂肪食＋コントロール群（HF），高脂肪食＋カに伴う慢性炎症がアルツハイマー型認知症の病態

ルシノン添加群（HF＋ carno）の４群を作成し，生理に大きく関わるとされている。一方，脳由来

２ヶ月飼育する。ただし，最初の１ヶ月間は浸透神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor

圧ミニポンプを用いて，各群にAβ（0.001㎎／; BDNF）は神経細胞の発生や成長，維持，修復日）の持続中枢投与を行う。

など重要な働きをするタンパク質であるが，近ａ）炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ る tumor-

年，このBDNFの発現量がうつ病やアルツハイ

necrotizing factor（TNF）-α，抗炎症性サイトカ

マー病患者の脳で減少していることが確認されてインであるinterleukin（IL）-10の含有量を測定す

いる。

る。

最近，豚肉に多く含まれる“カルノシン”は脳神経細胞を保護し，認知症発症を予防する効果がｂ）ミクログリア細胞の活性化について，免疫組織学的検討を行う。

あることが知られている。ラットの実験においｃ）脳内BDNF発現を定量する。

て，カルノシンは，脳重量減少の抑制効果がある

ｄ）アミロイドβ（1-42）（Aβ1-42）の脳内ことが明らかになり，これにはカルノシンの強い沈着について，免疫組織学的および定量的に評価

抗酸化作用が関連していることが示唆されていする。

る。このようなカルノシンの抗酸化作用には，脳内における炎症性変化も抑制することが推測される。

３．結果と考察3 . 1 高脂肪負荷に伴う脳内炎症性変化に対す

今回，食餌誘導性肥満モデル動物を用いて，肥るカルノシンの効果

満由来の脳内炎症性変化，BDNF発現やアルツハ

高脂肪負荷によって脳内の炎症性サイトカイン

イマー型認知症関連タンパクの沈着の変化が，カであるTNF-α，抗炎症性サイトカインである

ルノシンの摂取によって改善するかについて検討

IL-10ともに増加するが，カルノシンを経口投与する。以上より本研究の目的は，「豚肉に含まれするとTNF-αおよびIL-10の増加が抑制される© The Ito Foundation

87

肥満に伴う認知症の発症予防における豚肉摂取の効果（Fig.１A，B）。ここで，炎症性変化の指標とし伴う疾患，特にアルツハイマー型認知症や糖尿病てよく用いられるTNF-α/IL-10を検討したとこ

合併症の予防に有効であると報告が散見される。

ろ，高脂肪負荷によりTNF-α/IL-10が増加する

事実，カルノシンは，アミロイドタンパクの活性が，その増加はカルノシンの投与によって抑制さを抑制していると考えられている３，４） 。本研究でれた（Fig.１C）。TNF-α/IL-10が高値であるほは，高脂肪食負荷に伴う脳内炎症性変化に対し

ど炎症性変化が強いと考えられることから，高脂て，カルノシンは抑制的な作用をもたらすことを肪負荷によって脳内のTNF-αとIL-10がともに認めた。アルツハイマー型認知症の発症にはAβ増加するが最終的には炎症性変化をもたらしていの沈着が最重要因子であるが，その沈着には炎症ると評価される。さらに，カルノシンを投与する性変化とも密接に関連していると考えられていとTNF-α/IL-10が低下したことから，高脂肪負荷による炎症性変化が抑制されたことが示唆される。
さらに脳内の主要な炎症制御細胞であるミクロ
グリア細胞の活性について評価を行った。高脂肪
負荷によってミクログリア細胞の活性化を示す細胞体の肥大を認めたが，カルノシンを投与するとその活性化は軽減された（Fig.２A-D）。

Ａ（pg/mg protein）
15０

TNF-α

10０
5０
０

St

3 . 2 高脂肪負荷に伴う脳内BDNFおよびAβ1-42の変化に対するカルノシンの効果
脳内BDNF発現について検討したところ，高脂肪負荷によりBDNF発現が低下したが，その低下
はカルノシン投与によって抑制された（Fig.３）。
Aβ1-42の脳内沈着について，組織学的（Fig.４
A-D）および定量的（Fig.５）に検討したが，高脂肪負荷やカルノシン投与により変化はみられな
かった。

St＋carno

HF

HF＋carno

HF

HF＋carnoＢ（pg/mg protein）
5０

IL-10

4０
3０
2０
1０
０

St

St＋carno

カルノシンはβアラニンとヒスチジンのジペプ

Cチドでβアラニン・ヒスチジンであり，特に豚や牛の筋肉中に高濃度に存在する。これらは，ヒスTNF-α／IL-104チジンの構成要素であるイミダゾールからイミダ
ゾールぺプチドと呼ばれ，内因性抗酸化物質としての役割を果たしている

2。カルノシンを摂取１，２）したラットでは筋肉中のカルノシン含有量が増加するとともに筋肉脂質の過酸化やタンパクの酸化０Stが抑制されることが知られている。また近年，カ＊p＜0.05 vs. St

ルノシンは加齢と深く関連のあるタンパク変性をFig. 1

© The Ito Foundation

St＋carno

HF

HF＋carno

88

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

A

St 群

C

HF 群

B

St＋carno群

D

HF＋carno群

A

St 群

C

HF 群

B

St＋carno群

D

HF＋carno群

Fig. 2

Fig. 4

© The Ito Foundation

肥満に伴う認知症の発症予防における豚肉摂取の効果（pg/mg protein）

89

イマー型認知症の発症予防に有効であることが示

BDNF

200

唆される５～７）。今後，カルノシンがどのようなメ

150

カニズムで炎症性変化を抑制したり，BDNF発現を亢進させたりするのかを解析する必要がある。

100

興味深いことにカルノシンのホモログであるホモ50０

カルノシンは髄液中に存在するが，カルノシン自St

St＋carno

HF

HF＋carno＊p＜0.05 vs. St

体はほとんど存在しない８，９）。したがって，カルノシンの一連の作用は，脳以外の部位から間接的にもたらされている可能性が高い。その間接的作

Fig. 3

用の候補として，カルノシンによる小腸での抗酸（pmol/g tissue）

化作用に伴う腸内環境の改善，さらには小腸から

Ａβ（1-42）

分泌されるglucagon-like peptide-1（GLP-1）の５分泌促進によるものがあげられると，我々は推測４している。これまで我々は，小腸から分泌される

３

GLP-1が門脈を経由して肝臓内のGLP-1受容体に２作用し，さらに肝臓からの求心性神経を介して脳1

内BDNF発現を高める，ということを明らかにしている10，11）。今後，以上のような視点からさらな

０St

St＋carno

HF

HF＋carno

Fig. 5る解析が必要である。
４．要約る。Aβを慢性投与した場合，カルノシンによっ肥満は，全身性炎症性疾患と位置付けられておて脳内Aβ沈着に変化がみられなかった。しかし，り，またアルツハイマー型認知症の危険因子であ炎症反応を惹起させる高脂肪負荷の場合においてるとされている。アルツハイマー型認知症のメカも脳内Aβ沈着に変化がなかったことを考慮する

ニズムの詳細は不明であるが，神経細胞外のアミと，今後，Aβの投与量について検討する必要が

ロイドβの沈着のみならず，慢性の炎症がアルツあると考えられる。いずれにしても，カルノシン

ハイマー型認知症の病態生理に大きく関わるとさは，炎症性変化による脳内のAβ合成を抑制するれている。一方，神経細胞の維持に必要なBDNF

ことが期待される。さらに本研究で，高脂肪負荷の発現量がうつ病やアルツハイマー型認知症患者

による脳内BDNF発現の低下が，カルノシンによの脳で減少している。最近，豚肉に多く含まれるり改善することが認められた。BDNFは神経細胞“カルノシン”は脳神経細胞を保護し，認知症発の維持をもたらす因子であることから，カルノシ症を予防する効果があることが知られている。本

ンはAβの沈着とは独立してBDNFによる神経保研究では，「豚肉に多く含まれるカルノシンを摂護作用が発揮されることが推測される。また，加取すると，脳内炎症が抑制され，アルツハイマー齢とともにカルノシンの組織中濃度が低下するた型認知症の発症および進展予防に有効である」と

め，カルノシンを多く含む豚肉の摂取がアルツハいうことを明らかにする。カルノシンは，肥満に© The Ito Foundation

90

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

よる脳内での炎症反応を抑制させ，BDNF発現の低下を回復させた。以上より，カルノシンを多くする豚肉の摂取は，アルツハイマー型認知症の発症もしくは進展予防に有効であることが示唆される。
文献１） Kohen, R., Yamamoto, Y., Cundy, K. C., Ames, B.
N. : Antioxidant activity of carnosine,
homocarnosine, and anserine present in muscle andbrain, Proc Natl Acad Sci USA, 85, 3175～3159, 1988.
２） Calabrese, V., Colombrita, C., Guagliano, E.,
Sapienza, M., Ravagna, A., Cardile, V., Scapagnini, G.,
Santoro, A. M., Mangiameli, A., Butterfield, D. A.,
Giuffrida Stella, A. M., Rizzarelli, E. : Protective
effect of carnosine during nitrosative stress inastroglial cell cultures, Neurochem Res, 30, 797～807,
2005.
３） Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T.,
Romero, I. A., Abbott, J. N. : Toxic effects of betaamyloid （25-35） on immortalised rat brain
endothelial cell : protection by carnosine,
homocarnosine and beta-alanine, Neurosci Lett, 242,
105～108, 1998.
４） Fu, Q., Dai, H., Hu, W., Fan, Y., Shen, Y., Zhang, W.,
Chen, Z. : Carnosine protects against Abeta42induced neurotoxicity in differentiated rat PC12
cells, Cell Mol Neurobiol, 28, 307～316, 2008.

５） Hipkiss, A. R. : Carnosine, a protective, antiageing peptide? Int J Biochem Cell Biol, 30, 863～
868, 1998.
６） Boldyrev, A. A., Gallant, S. C., Sukhich, G. T. :Carnosine, the protective, anti-aging peptide. Biosci
Rep, 19, 581～587, 1999.
７） Hipkiss, A.R. : On the enigma of carnosine's antiageing actions, Exp Gerontol, 44, 237～242, 2009.
８） Huang, Y., Duan, J., Jiang, X., Chen, H., Chen, G. :Separation and determination of enkephalin-related
peptides using capillary electrophoresis, J Sep Sci,
28, 2534～2539, 2005.
９） Jansen, E. E., Gibson, K. M., Shigematsu, Y.,
Jakobs, C., Verhoeven, N. M. : A novel, quantitative
assay for homocarnosine in cerebrospinal fluid using
stable-isotope dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry, J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci, 830, 196～200, 2006.
10） Fujiwara, K., Gotoh, K., Chiba, S., Masaki, T.,
Katsuragi, I., Kakuma, T., Yoshimatsu, H. :Intraportal administration of DPP-IV inhibitor
regulates insulin secretion and food intake mediatedby the hepatic vagal afferent nerve in rats, J
Neurochem, 121, 66～76, 2012.
11） Gotoh, K., Masaki, T., Chiba, S., Ando, H.,
Fujiwara, K., Shimasaki, T., Mitsutomi, K., Katsuragi,I., Kakuma, T., Sakata, T., Yoshimatsu, H. :Hypothalamic brain-derived neurotrophic factor
regulates glucagon secretion mediated by pancreaticefferent nerves, J Neuroendocrinol, 25, 302～311,
2013.

© The Ito Foundation

91

牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール
代謝改善素材開発のための基礎研究
Basic study of the development of an innovative hypocholesterolemic foodmaterials using cattle heart peptides

長

岡

利

（岐阜大学応用生物科学部）

Satoshi Nagaoka（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

Only a few reports have dealt with the effects of animal protein and animal proteinhydrolysate on cholesterol metabolism. The cattle heart protein hydrolysate ultra-filtrate（HPHU, MW ＜ ca. 1,000 Da peptides fraction）derived from HPH imparts a stronger
hypocholesterolemic activity than HPH in rats. Thus, after purification of HPHU by a reverse
phase chromatography and gel filtration chromatography, we try to identify the active
hypocholesterolic peptide derived from HPHU using in vitro assay related to micellar solubilityof cholesterol in vitro. Micellar solubility of cholesterol was significantly decreased by HPHU or
HRHUgf3-RPIB（purified by a gel filtration and a reverse phase chromatography）-groupcompared to CTH-group. Micellar solubility of cholesterol was significantly decreased by
HRHUgf3-RPIB2（purified by a gel filtration and a reverse phase chromatography and areverse phase chromatography）-group compared to CTH-group. Most active fraction, 62％ of
HRHUgf3-RPIB2 containing peptides is a moleclar weight 75～200. 33％ of HRHUgf3-RPIB2
containing peptides is a moleclar weight 200～700．

発現することを発見し検討している２，３）。また，

的

１．目

主要な食糧資源でありながら，従来ほとんど検討

一般に，大豆タンパク質などの植物性タンパクがなされていない畜産食品素材のうち，牛肉ペプ

質は，カゼインなどの動物性タンパク質と比較しチド，牛レバーペプチドが体内コレステロール低１）て，抗動脈硬化作用を有すると考えられている 。

下作用を有することも見出した６）。さらに，昨年

しかし，現在活発に行われている有効成分の検討

度の研究で，動物性食餌タンパク質である牛肉ににより，このような血清コレステロール低下

再度着目し，畜産資源の高度有効利用という観点

作用は動物性素材にも見られることが明らかにさから，廃棄部位を含めた各部位である牛肉，牛心れている。実際に，私は，牛乳の乳清タンパク質臓，牛赤血球，牛血漿加水分解物を用いた研究をが，動物性タンパク質でありながら大豆タンパク行った結果，特に牛心臓加水分解物（HPH）が質よりも，強力な血清コレステロール低下作用を強力なコレステロール代謝改善作用を発現するこ２～10）© The Ito Foundation

92

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）とを発見した７）。

作用を有する画分（IB）を４分画し，それぞれ
８～10）

さらに，我々の既報の研究手法を用いて，

IB1～IB４とした。それらをSOURCE 5 RPC ST

牛心臓タンパク質加水分解物（HPH）のコレス

4.6/150（GE Healthcare）カラムを用いた，逆相

テロール低下作用機構を明らかにした。コレステ

クロマトグラフィーで152回分画した。さらに，

ロールミセル溶解性はカゼインよりもHPHで有得られた４画分のin vitroでのコレステロールミ

意に低下した。Caco-2細胞のコレステロール吸セル溶解性試験を行った。

収抑制はカゼインミセルよりもHPHミセルで有実験３意に高かった。血清コレステロールはカゼインよAKTA avant 25で，上記〈実験２〉で得られりもHPHで有意に低かった。放射性コレステロー

た最もコレステロールミセル溶解性低下作用を有ルで測定したコレステロール吸収はカゼインと比す る 画 分（IB2）を ，Superdex Peptide 10/300

べてHPHで有意に減少し，HPHのコレステロー

GL（Amersham）カラムを用いた，ゲル濾過ク

ル低下作用は空腸のコレステロール吸収阻害によ

ロマトグラフィーで分画した。そして，IB２のるものである。さらに，HPH由来の牛心臓タン

分画と同じ装置およびカラムを用いて，基準ペプ

パク質加水分解物の限外濾過物（HPHU，分子量

チド（IIAEKK, IIAE, IIA, IA, G）を分画した。

約1000ダルトン以下のペプチド分画物）は，ラッ得られたピークの保留時間および基準ペプチドのトにおいてHPHよりも強力なコレステロール低分子量から分子量の検量線を作成した。この検量

下作用を示すことを発見し，報告した 。

線から，IB2に含まれるペプチドの分子量を推定

11）

そこで，本研究では，ペプチド混合物である
HPHUのコレステロール代謝改善作用に寄与する
活性ペプチドを特定するために，HPHU由来ペプ
チドの分画精製を実施し，in vitroのコレステロー
ルミセル溶解性試験を行い，活性ペプチドの特定

なお，実験結果の統計的分析には，Tukeyʼstestを用いた。
３．結果と考察
実験１

を試みた。
２．方

した。

Fig.１に，HPHUのRPCによる溶出パターンを法示した。
CHOLミセル溶解性はCTHと比較して，HRHU

実験１
これまでの実験で得られたgf3-RPIを逆相クロのGFC-RPC分画物I, IA, IB, IC, IDおよびIEではマトグラフィー（RPC）により６分画（分画物有意に低下した。IBで最大のCHOLミセル溶解性

IA～IF）し，CHOLミセル溶解性に対する影響の低下を示した（Table１）。

を評価した。RPCによる分画は，AKTA purifier

実験２

10 plus（GE Healthcare） に よ り ， SOURCE 5
RPC ST 4.6/150（GE Healthcare）を用いて行っ

Fig.２に，HRHUgf3-RPIBの逆相クロマトグラ
フィーによる溶出パターンを示した。

た。

HPHUの逆相クロマトグラフィーによる分画物

実験２であるHRHUgf3-RPIB2はCTHやHPHUと比較し

AKTA purifierを用い，RPIの分画物（RPIA～
RPIF）で最もコレステロールミセル溶解性低下て，コレステロールミセル溶解性が顕著に有意に低下した（Table２）。

© The Ito Foundation

93

牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究

実験３
Fig.３（IB2ゲル濾過溶出図）より，IB2に含ま４．要約

れるペプチドはFig.４の検量線から，分子量75～

私たちはHPH由来の牛心臓タンパク質加水分

200が全体の62％，分子量200～700が33％であっ解物の限外濾過物（HPHU，分子量約1000ダルト

た。

ン以下のペプチド分画物）は，ラットにおいて今後は，最大活性を発揮したIB2の活性ペプチ
ドをTOF/MS分析で特定し，動物実験を実施する計画である。

HPHよりも強力なコレステロール低下作用を示すことを発見し，報告した。
そこで，本研究では，ペプチド混合物である

215nm

ABS215nm (mAU）

Conc B

Conc
（％B）

6000

IA

IB

IC

ID

IE

120

IF

5000

100

4000

80

3000

60

2000

40

1000

20

０

０

10

20

30

40

elution volume (ml）

50

60

０

Fig. 1Table 1 Effects of samples（5㎎/ml）on micellar solubility of cholesterol.
sampleconcentration

micellar solubility of cholesterol（％）

CTH
HRHU
HRHUgf3-RPI

５㎎/ml
５㎎/ml
５㎎/ml

101.1±3.5 g
89.1±1.7 def
76.2±1.4 bc

HRHUgf3-RPIA
HRHUgf3-RPIB
HRHUgf3-RPIC
HRHUgf3-RPID
HRHUgf3-RPIE
HRHUgf3-RPIF

５㎎/ml
５㎎/ml
５㎎/ml
５㎎/ml
５㎎/ml
５㎎/ml

72.3±2.3 ab
66.8±2.6 a
86.7±2.8 cdef
75.2±1.3 b
82.4±2.1 bcd
94.5±1.9 efg

１．The data are Means±SEM of 4 samples per group.
２．Means with different letters are significantly（P<0.05）by Tukeyʼs test.
CTH：Casein Tryptic Hydolysate
HRHU：Cattle Heart Protein Hydrolysate Ultrafiltrate
HRHUgf3RPI：Cattle Heart Hydrolysate Ultrafiltrate Gel Filtaration Fraction 3 Reverse Phase Chromatography Fraction I
HRHUgf3-RPIA～IF：Cattle Heart Hydrolysate Ultrafiltrate Gel Filtaration Fraction 3 Reverse Phase Chromatography Fraction IA～IF© The Ito Foundation

94

平成27年度
2000

IB２

1800

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）
ABS 215nm

IB３

90

IB４

IB１

1600

100

80

1200

60

1000

50

800

40

600

30

400

20

200

10

Conc
（％B）

70

ABS 215nm (mAU）

1400

０

０
０

５

10

15
20
Elution volume (ml）2530Fig. 2
Table 2 Effects of samples（5㎎/ml）on micellar solubility of cholesterol.
sampleconcentration

micellar solubility of cholesterol（％）

５㎎/ml
５㎎/ml
５㎎/ml
５㎎/ml
５㎎/ml
５㎎/ml

105.9±10.9 c
90.0± 3.0 bc
78.4± 0.6 b
86.9± 4.6 bc
49.5± 2.9 a
93.7± 3.9 bc

CTH
HRHU
HRHUgf3-RPIB
HRHUgf3-RPIB1
HRHUgf3-RPIB2
HRHUgf3-RPIB3

１．The data are Means±SEM of 4 samples per group.
２．Means with different letters are significantly different（P＜0.05）by Tukeyʼs test.
CTH：Casein Tryptic Hydolysate
HRHU：Cattle Heart Protein Hydrolysate Ultrafiltrate
HRHUgf3RPIB：Cattle Heart Hydrolysate Ultrafiltrate Gel Filtaration Fraction 3 Reverse Phase Chromatography Fraction IB
HRHUgf3-RPIB1～B3：Cattle Heart Hydrolysate Ultrafiltrate Gel Filtaration Fraction 3 Reverse Phase Chromatography Fraction
IB1～IB3Ａ
IB２

IB2's ABS 220nm (mAU）

６

B

80

C

marker

70
60

５

50

４

40
３

30

２

20

１
０

10

27

29

31

33
35
37
Retention time (min）Fig. 3© The Ito Foundation

39

41

０

Marker's ABS 220nm (mAU）

７牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究
3.0

95

５．
IIAEKK (M.W.700.1）
３．
IIA (M.W.316.2）

2.5

２．
IA (M.W.201）

４．
IIAE (M.W.445.3）

log 10 M.W.

2.0
1.5

１．
G (M.W.75）

ｙ＝－0.1124ｘ＋6.1017
Ｒ２ ＝0.99203

1.0
0.5
0.0

28

29

30

31

32
33
34
35
Retention time (min）

36

37

38

Fig. 4

HPHUのコレステロール代謝改善作用に寄与する
活性ペプチドを特定するために，HPHU由来ペプ
チドの分画精製を逆相クロマトグラフィーやゲル
濾過クロマトグラフィーにより実施し，分画物について，in vitroのコレステロールミセル溶解性試験を行った。
具体的には，RPCによるHPHU分画物である
gf3-RPIについて，活性ペプチドの特定のために，
gf3-RPI を RPC に よ り ６ 分 画（分 画 物 IA ～ IF）
し，CHOLミセル溶解性に対する影響を評価した。
IA～IFで最大活性のIBを特定した。さらに，IBの RPC 分 画 物（IB1 ～ 4）の 中 で 最 も コ レ ス テ
ロールミセル溶解性低下作用を有する画分は，IB2であることを明らかにした。IB2に含まれるペプチドは，分子量75～200のものが全体の62％
を示した。

文
献
１） Carroll, K. K., Hamilton, R. M. G. : J. Food Sci., 40,
18, 1975.
２） Nagaoka, S., Kanamaru, Y., Kuzuya, Y., Kojima, T.,
Kuwata, T. : Biosci. Biotch. Biochem., 56, 1484, 1992.
３） 長岡利：日本栄養・食糧学会誌，49, 303, 1996.
４） Iwami, K., Sakakibara, K., Ibuki, F. : Agric. Biol.
Chem., 50, 1217, 1986.
５） Sugano, M., Goto, S., Yamada, Y., Yosida, K.,
Hashimoto, Y., Matsuo, T., Kimoto, M. : J. Nutr., 120,
977, 1990.
６） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書，336, 1998.
７） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書，
378, 1999.
８） Nagaoka, S., Awano, T., Nagata, N., Masaoka, M.,
Hori, G., Hashimoto, K. : Biosci. Biotech. Biochem.,
61, 354, 1997.
９） Nagaoka, S., Miyazaki, H., Oda, H., Aoyama, Y.,
Yoshida, A. : J. Nutr., 120, 1134, 1990.
10） Nagaoka, S., Miwa, K., Eto, M., Kuzuya, Y., Hori, G.,
Yamamoto, K. : J. Nutr., 129, 1725, 1999.
11） Nakade, K., Kaneko, H. Oka, T., Ahhmed, A. M.,
Muguruma, M., Numata, M., Nagaoka, S. : Biosci.
Biotechnol. Biochem., 73, 607, 2009.

© The Ito Foundation

96

新規な発酵食肉製品の機能性について
Functional properties of novel fermented meat products

六車

三治男・川越

聖人・木本

早紀・川北

久美子・竹之山愼一（南九州大学健康栄養学部）

Michio Muguruma, Masato Kawagoe, Saki Kimoto, Kumiko Kawakita and Shinichi Takenoyama.
（Faculty of Health and Nutrition, Minami Kyushu University）

This research aimed to study and search the biological and functional properties as well
as physiological effects of hydrolysates of dry fermented ham splayed with dried bonito
bacteria（Eurotium herbariorum）. The fermentation of cured ham was carried out at 20℃ andwith humidity with 85％ for 10 days. After fermenting, the surface of samples was covered byblue mold. The drying and ripening of fermented ham were carried out at 18℃ and withhumidity with 65％ until the yield of each samples reduced to 70％（14 days storage），60％（32
days storage）and 50％（84 days storage）. The final pH of these dry fermented hams wereabout 6. The water activities in Experiment 1（70％ yield）, 2（60％ yield）and 3（50％ yield)
were 0.878, 0.869 and 0.802, respectively. All samples separately hydrolyzed with pepsin andtrypsin. Angiotensin I converting enzyme（ACE）inhibitory activity of the hydrolysates wasdetermined by rabbit lung enzyme. The antioxidant activity of the hydrolysates wasdetermined by the DPPH radical scavenging assay. Hydrolysates of dry fermented hams
showed the high ACE inhibitory activity and high DPPH inhibition activity. Free amino acids
increased during ripening. Glutamic acid（Glu）, alanine（Ala）, valine（Val）, leucine（Leu）andisoleucine（Ile）increased especially. This high level of Glu seemed to be related to Umami offermented ham. Val, Leu and Ile were related to a sports nutrition．
Based on their remarkable ACE inhibitory activity and antioxidant activity, we suggestthat the hydrolysates from dry fermented pork ham may have potential applications asfunctional food. These dry fermented hams inoculated with dried bonito bacteria showed theacceptable sensory quality characteristic．

１．目

用いた発酵乳製品が多く開発されているが，食肉的を用いた食品に関しては機能性を有する製品があ

ライフスタイルの変化に伴い，生活習慣病が増まり開発されていないのが現状である。しかし，加し，国民の健康への関心は極めて高くなってい食肉は良質なタンパク質を多く含んでおり健康やる。このような国民の健康志向に合わせて，現在，長寿には不可欠な食品であり，近年，食肉にも健多くの機能性食品が開発されている。特に，乳を康に寄与する生体調節機能が存在することが明ら© The Ito Foundation

97

新規な発酵食肉製品の機能性についてかになってきた１，２）。我々も，食肉に含まれるペプチドにACE阻害活性があり，動物実験におい２．方法て血圧降下作用，抗酸化作用やⅡ型糖尿病予防作

2 . 1 実験材料

用を示す結果を得ている。さらに，欧州の発食肉材料として，肉類のなかでも消費量が多

酵ソーセージ類から乳酸菌の選別を試み，食塩・く，食肉加工の主要な原料となっている豚肉を実

亜硝酸耐性を有する菌株を見出し，それらの菌株

験材料として使用した。市販の新鮮な国産豚肩を同定し，高い食肉タンパク質分解能を持つ乳酸

ロース肉を購入し，発酵生ハムの原料肉として用菌株を用いて，発酵食肉製品の製造を試みた。そ

いた。

３～11）

の結果，血圧上昇抑制効果や抗酸化活性を持ち，

2 . 2 発酵ハムの製造

嗜好性を高めた製品の開発が可能であることを明

新鮮な肩ロース肉700ｇを原料とし，これに食らかにした12）。これからの高齢化社会に向けて，

塩42ｇ，グルコース42ｇ，アスコルビン酸ナトリ

健康維持に寄与する機能性を強化した高品質・高ウム1.4ｇと酵母エキス0.4ｇとを乾塩法にて肉表機能発酵食肉製品を開発することは重要である。

面に塗布した。その後，温度４℃で７日間塩漬しまた，高齢者のみならず健常者にとっても，健康内部に浸透させた。冷蔵庫から取り出し，日本独維持に寄与する高い機能性を有し，日本人の食味

自の有用菌株であり，日本鰹節協会の鰹節優良カ

性にも合う発酵食肉製品を開発することは極めてビ菌である「ユーロティウム

重要である。

（Eurotium herbariorum）」（和名：カワキコウジ

ハーバリオラム

生ハムにはヨーロッパで自然に着生した酵母やカビ）を利用して，この鰹節菌液を塩漬肉の全面

カビで発酵し熟成するもの（発酵型）と燻煙するに噴霧した。なお，原料の温度や衛生面には十分もの（非発酵型）とがある。なお，日本産の生ハに注意を払い作業した。

ムは非発酵型である。日本の伝統的発酵食品は麹

次いで，カビ菌を噴霧した塩漬肉を温度20℃，や糠を利用したものが多い。鰹節菌を利用した鰹

湿度85％に調整した恒湿恒温乾燥機（カビ室）中

節もカビ菌による発酵食品である。周知のように吊り下げ，カビを発生させた。カビ室では，毎に，鰹節菌による発酵により，鰹節の中に核酸系

日１回の割合で，外気を取り入れて空気循環をよ

旨味成分（イノシシ酸）が産生し，代表的な旨味

くし，酸素の供給を行ってカビの発育を促進させ調味料としても利用されている。これを応用すれた。４日後に灰緑色したカビが塩漬肉の表面に発ば，生ハム中にもうまみ成分が産生され，熟成由

育し，10日後にその全面に増殖するようになった。

来のアミノ酸やペプチドの呈味成分と相乗効果をそれから，温度18℃，湿度65％に調整した恒湿

生じて濃厚な旨味を付与できることが予想される。

恒温器中で歩留り70％（試験区１），60％（試験

そこで，日本独自の有用菌株であり，日本鰹節

区２），50％（試験区３）になるまで熟成，乾燥協会の鰹節優良カビ菌「ユーロティウム

ハーバ

させた。

リオラム（Eurotium herbariorum）」（和名：カ2 . 3 水分含量および水分活性の測定

ワキコウジカビ）を利用して塩漬した豚肉を発酵

水分含量は，赤外線加熱乾燥法の原理に基づいさせ，さらに乾燥・熟成させることで，凝縮された加熱乾燥式水分計（ANDエー・アンド・ディ

た濃厚な旨味が付与された生ハムを作製すること（株），MF-50）により測定した。一方，水分活が本研究の目的である。

性 （Aw） は ポ ー タ ブ ル 水 分 活 性 測 定 装 置© The Ito Foundation

98

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）（AxAir 社 ，Novasina-ms1-aw, Switzerland）をmlに希釈し使用した。ACEとの反応基質として用いて測定した。

は合成基質であるヒプリル-Ｌヒスチジル-Ｌロイ

2 . 4 発酵ハムの消化酵素処理

シン（HHL，ナカライテスク社）を使用した。

発酵ハムに２倍量の蒸留水を添加してフードプ

このHHLを塩化ナトリウム（和光純薬工業），0.25

ロセッサー（Panasonic MK-K61）を用いて30秒

Ｍホウ酸緩衝液をそれぞれ0.608Ｍ，0.1Ｍになる

間，２回ホモジナイズした。その後，このホモジェ

ようにMilliQ水を用いて調整した溶液で溶解した。

ネートをHClでpH1.8に調整し，胃粘膜由来ペプ

試料６μlに60unit/mlのACE溶液20μlおよびシン（１：10000）（和光純薬工業株式会社製）を7.6mM HHL溶液50μlを添加し37℃で30分間反応

タンパク質量に対して1/1000倍量添加し，攪拌しさせた。反応は0.1NHCl（和光純薬工業）554μl

ながら37℃で１時間インキュベートした。NaOH

を加えて停止させた。反応後には酢酸エチル（ナを用いてpH6.8に調整し，10分間煮沸した後，溶カライテスク）1.5mlを加えてACEの作用により液温度を40℃まで低下させた。さらにトリプシン

遊離した馬尿酸を振とう抽出し，2,500rpm，15（和光純薬工業株式会社）およびパンクレアチン

分間遠心分離を行った。上清の酢酸エチル層を１（同会社）をそれぞれペプシンと同量添加し，再ml分取し，100℃，10分間の加熱により蒸発乾固び攪拌しながら37℃で１時間インキュベートしさせた。乾固した馬尿酸を回収するために１Ｍのた。最後に10分間煮沸した試料を発酵ハム由来ペ

NaCl溶液を１ml加えボルテックスを行った。溶プチドとした。

解した馬尿酸を吸光度228nmで測定した。
阻害率は肝臓水解物の吸光度をＳ，肝臓水解物

2 . 5 タンパク質の定量
タンパク質の定量はBiuret法13）により行った。

の代わりにMilliQ waterを加えた時の吸光度をすなわち，タンパク質溶液に対し，４倍量のBiuret

Ｃ，あらかじめACEを失活させてから反応させ試薬を加えて常温で30分間反応させた。反応液をた時の吸光度をＢとして次式より求めた。

島津製作所（株）製UV-VIS Spectrophotometer

阻害率（％）＝｛（C-S/C-B）｝×1001240型分光光度計（吸光度：540nm）にて測定し

2 . 7 DPPHラジカル消去活性の測定た。また分解物であるペプチドについてはUV

DPPHラジカル消去活性の測定は，DPPH分光法を適用し，測定を行った。すなわちタンパク測 定 法 に 準 じ て 行 っ た 16）。す な わ ち ，400 μM

質溶液の215nmの吸光度から225nmでの吸光度をDPPH, MES （2-morpholino-etanesulphonic

差し引き，144倍した時の数値をタンパク質濃度acid）buffer，20％エタノールを同量ずつ加え，とした。測定には上記と同じ分光光度計を使用し混液を作製した。混液を0.9ml分注し，80％エタ

た。

ノールを240μlとサンプルを60μl加え，20分間反14）

2 . 6 アンギオテンシンⅠ変換酵素（ACE）阻応させた。その後，サンプルを加えた順に前述の分光光度計にて吸光度520nmで測定した。また，害活性の測定に準じて測定した。ACEはサンプルの代わりに，0.2mM Trolox（Sigma社製）

ウサギ肺由来アンギオテンシンⅠ変換酵素を使って標準として測定し，検量線からサンプル（ACE, Peptidyldipeptidase, EC3.4.1

5.1，シグマのTrolox相当量を算出した。MES BufferはMES社）を用い，0.25Ｍホウ酸緩衝液で１unit/mlにを蒸留水に溶解し，NaOHでpH６に調整したも調整し，測定時には0.25Ｍホウ酸緩衝液で60unit/のを使用した。

Cushumanの方法

15）© The Ito Foundation

新規な発酵食肉製品の機能性について99

2 . 8 遊離アミノ酸含量の測定の ３ 種 類 の 製 品 を 作 製 し た 。そ れ か ら ，温 度

発酵ハムの遊離アミノ酸の分析は，分析試料の18℃，湿度65％に調整した恒湿恒温器中で歩留り重量に対し３倍量のスルフォサリチル酸を加え，70％（試験区１），60％（試験区２），50％（試験ホモジェネート後，冷蔵庫で１時間静置してタン

区３）になるまで熟成，乾燥させた。

パク質を変性・沈殿させた。その後，3,500xgでまず，発酵生ハムの製造過程の歩留りの変化に

15分間遠心分離を行った。上清を0.45μｍメンブ

ついて測定した結果をFig.１に示した。カビを噴

レンフィルターでろ過し，分析試料とした。これ

霧していない対照区は４日で歩留りが80％に，８をアミノ酸自動分析機JIC-500/V（日本電子株式

日で70％に低下した。さらに，25日で60％に低下

会社，東京）にて測定した。

し，65日経過して歩留りが50％にまで低下した。
この歩留り50％の最終標品を，カビを噴霧してい３．結果と考察ない対照区（Control）とした。

本研究は，鰹節菌による発酵により，核酸系旨カビを噴霧した試験区の歩留りは４日で歩留り

味成分を産生させ，さらに濃厚な旨味を付与するが90％に低下し，14日間で歩留りが70％にまで低ことを目指して実施した。そのためには，最適な，下した。この製品の水分含量を維持するために真鰹節菌のカビの発育条件を検討する必要がある。

空包装を施し，低温熟成を進めて機能性ペプチド

そこで，まず，国産豚肉の肩ロース部位を原料との発現を促すために，通気性のケーシングにて真して塩漬し，恒湿恒温器を用いて，温度と湿度を空包装して60日間冷蔵保存したものを試験区１

コントロールして，カビの最適発育条件を検討し（Fermented 70％）とした。次に，試験区２は，た。これらの製造は，食品衛生法・製造基準に準32日間熟成，乾燥させることによって歩留りが拠して行った。

60％に低下した。この標品を，先ほどと同様に

3 . 1 生ハムの発酵過程でのカビの発生と歩留

ケーシングにて真空包装し冷蔵保存したものを試験区２（Fermented 60％）とした。また，カビり変化
温度４℃で７日間塩漬した肩ロース肉を，温度が塩漬肉の全面に発生後，84日間の熟成，乾燥を20℃，湿度85％に調整した恒湿恒温乾燥機（カビ行うことにより歩留りは50％に低下し，この標品

室）中に吊り下げ，ユーロティウム

を試験区３（Fermented 50％）として機能性発ハーバリオ

ラム（Eurotium herbariorum）」を利用して，この鰹節菌液を塩漬肉の全面に噴霧し，カビを発生させた。カビ室では，毎日１回の割合で，外気を現等に関する実験に供した。
3 . 2 カビ発酵生ハムの水分含量および水分活
性の変化取り入れて空気循環をよくし，酸素の供給を行っ

水分含量の変化は，Fig.２-ａに示したようにてカビの発育を促進させた。４日後に灰緑色した

コントロールが25.73％，試験区１が53.66％，試

カビが塩漬肉表面に発育し，10日後に全面を覆う

験区２が48.63％，試験区３が34.90％を示した。

ように増殖した。カビの発育した生ハムを，恒湿

一方，いずれの製品もpHは約６位で，水分活性恒温器を用いて乾燥および熟成を進行させ，生ハ（Aw）は ，コ ン ト ロ ー ル が 0.687 ，試 験 区 １ がムのみならず，さらに乾燥状態が進行したドライ

0.874，試験区２が0.869，試験区３が0.802を示し

ハムやイタリア特産のコッパ風製品の製造も試みた（Fig.２-ｂ）。各試料の水分含量および水分活る目的で，製品の歩留りが70％，60％および50％

性の減少状態は，お互いに似たような傾向を示し© The Ito Foundation

100

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

た。食肉製品の規格基準に当てはめると17），これ

んだ軟らかい製品となり（データ未掲載），食感

ら製品の水分活性値は，非加熱食肉製品の成分規に富んだ発酵食肉製品として評価できると考えら

格の水分活性（0.95未満）よりも低い値であり，れた。なお，歩留りの変化，水分含量や水分活性

コントロールおよび試験区３の水分活性値は，乾にデータから試験区１と試験区２は生ハム，試験燥食肉製品の成分規格の水分活性値（0.87未満）

区３はドライハム類に相当する製品に分類されるよりもはるかに低値を示した。また，いずれの製と考えられた。

品も食肉製品の衛生規格，保存基準に適合する製

3 . 4 カビ発酵生ハムのACE阻害活性の評価品となった。コントロールと発酵製品50％の歩留

著者らは，高い食肉タンパク質分解能を持つ乳りはともに50％であったが，水分含量および水分酸菌を用いて高機能食肉製品の開発を試みた。そ活性ともに発酵製品が少し高い値を示した。破断の結果，乳酸菌による筋原線維タンパク質の分解強度を測定した結果からも，カビを噴霧して発酵に伴う機能性ペプチドや遊離アミノ酸の増加，高させた標品はコントロールと比較して柔軟性に富い血圧上昇抑制活性と抗酸化作用も有し，しかも100Control
Fermented 70％
Fermented 60％
Fermented 50％

80

Yield rate（％）

60

40

20

０

０

18

32

56

74 （Days）

Fig. 1 Yield rate curves of control and each fermented meat products.

1.0
Water activity(Aw）Moisture content
（％）

60.0

40.0

20.0

0.0

Control

Fermented 70％ Fermented 60％ Fermented 50％

Fig. 2-a Moisture contents in control and each fermented

meat products.

0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

Control

Fermented 70％ Fermented 60％ Fermented 50％

Fig. 2-b Water activities in control and fermented meatproducts.

© The Ito Foundation

101

新規な発酵食肉製品の機能性について

官能評価でも高い評価を受ける製品を開発できめられた。これらの結果は，我々が，昨年報告し

12）

た 。

た，調理加工食肉・食肉製品のおよびその発現に本研究でも，カビ発酵生ハムを，ヒトが食して関する研究から得られた結果とほぼ同様の値で消化したことを前提に，前回の報告に準じて酵素あった18）。カビ発酵食肉製品の酵素消化物のタン

消化しACE阻害活性の比較を行った（Fig.３）。

パク質成分の分子種や分子量を，SDS-PAGEや

その結果，いずれの製品も高いACE阻害活性を

HPLC分析により観察した結果，食肉を構成して示したが，コントロールと比較すると，カビを噴いる筋原線維タンパク質の分解に伴い出現した，

霧して発酵させた製品がさらに高いACE阻害活

分子量6,000～1,000Da間の成分の増加が観察され性を示し，生ハムからドライハム様の製品になる

た（データ未掲載）。

100

300

80

250

DPPH activity（μM TE）

ACE inhibitory activity（％）

につれ，さらにACE阻害活性が高まる傾向が認

60
40
20
0

Control

Fermented 70％ Fermented 60％ Fermented 50％

Fig. 3 ACE inhibitory activity of control and eachfermented meat products.

200
150
100
50
0

Raw meatFermented 70％ Fermented 60％ Fermented 50％

Fig. 4 DPPH radical scavenging activity of raw meatand each fermented meat products.
TE : Trolox equivalent.

Free amino acid content（㎎/100g Sample）

160
Law Meet

140

Control120

Fermented 50％

100
80
60
40
20
0

Asp Glu Asn Ser Gly Gln His Thr Ala Arg Pro Val Met Lys

Ile

Leu Phe Trp

Fig. 5 Free amino acid contents in raw meat, control sample and fermented meat produts（50％）.

© The Ito Foundation

102

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

3 . 5 カビ発酵生ハムの抗酸化活性の評価

評価では，熟成風味発現と弾力性で高評価を受け

Fig.４に，生の肩ロース肉および３種類のカビた20）。

発酵食肉製品から得られた酵素消化物の抗酸化活

鰹節製造におけるカビの役割は，水分の除去，性をDPPHラジカル消去法により測定した結果を脂肪の分解や香りの付与等の効果もあることや，示した。生肉に比較して発酵製品の試験区１は約４番カビまでカビ付けの操作を行うと本枯節と呼６倍，試験区２は約４倍，試験区３は約3.5倍近ばれる最終製品となることが報告されている21）。

い非常に高い抗酸化活性を示した。生肩ロース肉

今回の実験では，カビ付けは１番カビのみのでの値は以前の畜種別差異を比較検討した数値とほあったが，今後の課題としては，発酵ハムを製造

ぼ同等の数値を示した 。一方，発酵食肉製品のする際に２番カビ，３番カビまで繰り返してカビ試験区１～３は，調理加工食肉・食肉製品の機能付けをし，必要以上の乾燥を制御しながら，その性発現の研究で測定した生ハムの値とほぼ同等か効果をさらに向上するような試みを行いたい。さそれ以上の高い活性であった 。

らに，発酵ソーセージの製造にもカビ付け効果を

19）

18）

このように，カビ発酵させた製品からは，高い抗酸化活性が発現することが明らかになった。
3 . 6 カビ発酵生ハムの遊離アミノ酸分析

適用して発酵食肉製品の開発研究を行うことにより，食肉の消費拡大に貢献したい。
以上，日本独自の有用菌株である鰹節優良カビ

生肩ロース肉と，歩留り50％のカビを噴霧して菌「ユーロティウム ハーバリオラム（Eurotium

いないコントロールと歩留り50％の発酵生ハムの

herbariorum）」を利用して，塩漬した豚肉を発試験区３に含まれる遊離アミノ酸量を測定した

酵させ，さらに乾燥・熟成させることで，機能性（Fig.５）。その結果，生肉に比較してカビを噴霧

ペプチドや遊離アミノ酸の増加，高い血圧上昇抑していない乾燥肉も各種遊離アミノ酸は増加し，制活性と抗酸化作用も有し，しかも凝縮された濃なかでもAlaの増加が著しかった。しかし，さら厚な旨味が付与された発酵生ハムを作製できるこにカビ発酵させることによって，17種類の遊離アとが明らかになった。

ミノ酸量の顕著な増加が認められた。発酵ハム
100ｇ当たり，Ileが140㎎と最も多く，次いでAla

４．要

約とGluが約120㎎と高い値を示した。このように発本研究は，日本独自の有用菌株の鰹節カビ菌で酵ハム100ｇ当たりでみると，同じ歩留りのコン

ある「ユーロティウム ハーバリオラム（Eurotium

トロールに比較して，２～５倍と大きく増加しherbariorum）」を利用して，生ハムを発酵させ，た。しかし，一方ではGlnのように増加しないア

生理活性機能と旨味が付与された，市場にはまだミノ酸もあった。カビ発酵に伴い，Val, Leuおよ

存在しない新規な発酵食肉製品を開発する目的でびIleの筋肉で代謝される分岐鎖アミノ酸や，同行った。

じく筋肉で代謝されるAlaの有意な増加が認めら

豚 肩 ロ ー ス 肉 を 塩 漬 後 ，鰹 節 菌 を 噴 霧 し ，れ，スポーツ栄養の分野にも貢献できる可能性が20℃，湿度85％の条件下でカビを発生させた。さ示唆された。また，旨味に貢献するGluは，カビら に 18 ℃，湿 度 65 ％ の 条 件 下 で 歩 留 り 70 ％，発酵に伴って約3.2倍に増加したことから，発酵60％，50％になるまで熟成，乾燥させた。それら

ハムはコントロールに比較して旨味の顕著な増加のpH，水分含量，水分活性，ACE阻害活性，抗が推測された。さらに，今回製造した製品の官能酸化活性および遊離アミノ酸分析等を行った。鰹

© The Ito Foundation

新規な発酵食肉製品の機能性について

節菌の噴霧後４日でカビの発生が認められ，10日
で全面がカビで被覆された。歩留りが70％，60％
および50％になるまでに，それぞれ14日間，32日
間および84日間を要した。いずれの製品もpHは約６位で水分活性は0.89以下を示した。いずれのカビ発酵生ハムにも，製品の発酵・乾燥に伴う熟成過程で産生される高い血圧上昇抑制効果や抗酸化活性などの生理活性機能が認められた。また，
カビ発酵に伴い，Val, LeuおよびIleの筋肉で代謝される分岐鎖アミノ酸や，同じく筋肉で代謝されるAlaの有意な増加が認められ，スポーツ栄養の分野にも貢献できる可能性が示唆された。また，旨味に貢献するGluがカビ発酵に伴って顕著に増加し，旨味成分の凝縮された発酵ハムが製造された。
文
献１） 斉藤忠夫，西村敏英，松田幹編著：最新畜産物利
用学，朝倉書店，東京，123～124，2007．
２） Arihara, K., Nakashima, Y., Mukai, T., Ishikawa,T., Itou, M. : Meat. Sci., 57, 319～324, 2001.
３） Katayama, K., Fuchu, H., Sakata, A., Kawahara, S.,
Yamauchi, K., Kawamura, Y., Muguruma, M. :Asian-Aust. Anim. Sci. J., 16, 417～424, 2003.
４） Katayama, K., Tomatsu, M., Fuchu, H., Sugiyama,M., Kawahara, S., Yamauchi, K., Kawamura, Y.,
Muguruma, M. : Anim. Sci. J., 74, 53～58, 2003.
５） Katayama, K., Tomatsu, M., Kawahara, S.,
Yamauchi, K., Fuchu, H., Sugiyama, M., Kawamura,Y., Muguruma, M. : J. Agric. Food. Chem., 52, 771～
775, 2004.
６） Katayama, K., Jamhari, Mori, T., Kawahara, S.,

103

Miake, K., Kodama, Y., Sugiyama, M., Kawamura, Y.,
Nakayama, M., Mayuyama, M., Muguruma, M. : J.
Food.Sci., 72, S702-706, 2007.
７） Katayama, K., Anggraeni, H. E., Mori, T.,
Ahhmed, A. M., Kawahara, S., Sugiyama, M.,
Nakashima, T., Mayuyama, M., Muguruma, M. : J.
Agric. Food. Chem., 56, 355～360, 2008.
８） Muguruma, M., Ahhmed, A. M., Katayama, K.,
Kawahara, S., Maruyama, M., Nakamura, T. : Food.
Chem., 114, 516～522, 2009.
９） Ahhmed, Muguruma, M. : Meat Sci., 86, 110～118,2010.
10） 六車三治男：日本暖地畜産学会報，55（2）,85～91,
2012.
11） 竹田志郎，久保田大樹，竹之山愼一，河原聡，六車 三 治 男：日 本 暖 地 畜 産 学 会 報 ，57（2）,141 ～ 145,2014.
12） 六車三治男：高機能発酵食肉製品の開発，科学研
究費助成事業研究成果報告書，2013.
13） 岡田雅人，宮崎香：タンパク質実験ノート抽出と分離精製，羊土社，東京，29, 1996.
14） Murphy, J. B., Kies, M. W. : Biochim. Biophys.
Acta, 45, 382～384, 1960.
15） Cushman, D. W., Cheung, H. S. : Biochem.
Pharmacol., 20, 1637～1648, 1971.
16） Balyasnikova, I. V. : In Vitro Cell Dev. Biol.
Anim., 34, 545～554, 2001.
17） 斉藤忠夫，西村敏英，松田幹編著：最新畜産物利
用学，朝倉書店，東京，146～152, 2007.
18） 六車三治男，木本早紀，川北久美子，竹之山愼一：
平成26年度食肉に関する助成調査成果報告書，（公財）
伊藤記念財団，33, 30～38, 2015.
19） 竹田志郎，久保田大樹，竹之山愼一，河原聡，六車 三 治 男：日 本 暖 地 畜 産 学 会 報 ，57（2）,141 ～ 145,2014.
20） 六車三治男，木本早紀，川越聖人，川北久美子，竹之山愼一，中村豊郎：鰹節菌によるカビ発酵ハムの熟成風味発現について，日本畜産学会第121回大会
講演要旨集，p258, 2016.
21） 藤井建夫：魚の発酵食品，成山堂書店，東京，
126～129, 2005.

© The Ito Foundation

104

豚レバーパウダーの脂質代謝に及ぼす影響
Effects of porcine liver powder on intestinal environment and lipid
metabolism

岡

本

芳

晴

（鳥取大学農学部）

Yoshiharu Okamoto（Faculty of Agriculture, Tottori University）

We examined effects of degradation product from porcine liver（Liver Hi Ⓡ）on gene
expression related to lipid metabolism in HepG2 cells using real time PCR. In addition, weinvestigated liver function improvement effect of Liver HiⓇ on animals with high serum totalcholesterol. In gene analysis, it was found that Liver HiⓇ decreased monoacylglycerol
acyltransferase and diacylglycerol acyltransferase genes which are related to synthesis of
triglyceride. In 6 of 8 cases with serum total cholesterol, the levels of serum total cholesterol
were decreased when Liver HiⓇ was administered. These data suggest that Liver HiⓇ has apotency as a new functional food.

１．目

調節できる機能性食品（ヘルスフード）の摂取も的注目すべき改善方法として重要であると考えられ

厚生労働省の平成25年「国民健康・栄養調査」

る。さらには近年，犬・猫等のペットにおいても，によると，男性で28.6％，女性20.3％が肥満といその飼育頭数の増加に伴い肥満は増加しており，

う結果である。男性の場合，40代では34.9％と実人間同様に機能性食品素材への関心・ニーズが高に３人に１人が肥満という結果である１）。肥満はまっている。

高血圧，脂質異常症，高血糖等の生活習慣病を引筆者らは，過去２年間において，肥満に関する

き起こすことがよく知られている 。そのため肥機能性食品として，「豚レバーパウダー」を研究

満を改善することは，健康な生活を送るうえで極してきた。その結果，豚レバーパウダーを摂取す

めて重要であり，国にとっても医療費削減の大きることにより，悪玉と考えられるリポタンパク質な要因の一つととらえられている。

の分泌量が濃度依存的に有意に抑制するという結２）

肥満を改善するには，食事，運動，喫煙等の生果を得た３）。このことより，同パウダーは脂質代

活習慣の改善の他，医薬品の投与による内科的治

謝改善効果を有する有望な機能性食品素材となる療もあるが，軽度の場合には，日常の食生活に機可能性が高まった。また，高脂肪食負荷モデル動能性を付加することで余分な中性脂質を効率よく物を用いて同パウダーの効果を検証した結果，同© The Ito Foundation

105

豚レバーパウダーの脂質代謝に及ぼす影響

パウダーの摂取によってLDLコレステロールの（レバーHi，最終濃度2.0㎎/ml），レバーHi区に交減少，肝臓での脂肪滴減少，および空砲変性・脂換 し ，さ ら に ２ 日 間 培 養 を 続 け た 。総 RNA は

肪変性の減少が確認された３）。すなわち，中性脂

Total QuickGene RNA cultured cell kit S （富 士肪値の改善効果を有する可能性が示された。さらフイルム株式会社）を用いて回収し，鋳型cDNAにHepG2ヒト肝癌細胞を用いた遺伝子解析の結合成はPrimeScript RT reagent Kit（タカラバイ

果，豚レバーパウダーは肝細胞のLDLレセプター

オ株式会社）を用いて合成した。

の発現を亢進させることが明らかとなった４）。

リアルタイムRT-PCRは常法に従って行った。

LDLレセプターの発現の亢進は，肝臓における目的遺伝子の発現量は，GAPDHに対する相対発

LDLの吸収を増加させることを意味し，これまで現量で表し，未処理の区を100とした（n＝３）。

のin vivo試験結果を裏付けるものとなった。

2 . 2 自然発症肝疾患動物に対する効果

本研究では，豚レバーパウダーの生体への影響

鳥取大学農学部附属動物医療センターに来院しをより詳細に検討するため，in vitro実験下でのた犬の中で，血液検査の結果，コレステロール値

HepG2細胞の中性脂肪代謝関連遺伝子の発現量（T-Cho）が高値であった８例を対象とした。８をリアルタイムPCRにて確認し，遺伝子レベルに例の内訳はTable１に示した。

おける作用機序を検証した。さらに自然発症の脂レバーHiを１頭あたり0.5-1.5ｇ／日を30日間経

質代謝異常を有する犬猫に対して豚レバーパウ

口投与し，投与前後での数値を比較した。

ダーを投与し，その効果を検証した。
２．方
2.1

３．結果と考察法

3.1

in vitro実験（遺伝子発現解析）

in vitro実験（遺伝子発現解析）

Table２に中性脂肪合成系遺伝子の各群におけ５

HepG2細胞（2.5 ｘ 10 個）を12穴マイクロプ

る発現量を示した。中性脂肪合成系遺伝子では，

レートに播種し，２日間10％FCSを含むDEM培

未処理群に比べてオレイン酸群ではほとんど変化

地で前培養後，1.0％BSAを含むDMEMのみ（未がなかった。いっぽう，オレイン酸＋レバーHi群

処理 区）お よ び ，本培地に0.75mMオレイン酸

では，モノグリセリドをジグリセリドに変換する（オレイン酸区），オレイン酸＋豚レバーパウダー

合成酵素であるMGAT-1，MGAT-2，MGAT-3

Table 1 Summary of case
Case

Bleed

Age
（year）

Sex

Body
weight（㎏）

Dose（/day）

1

Papillon

14

Female

6.0

1.0

2

L Retriever

12

Female

31.6

3.0

3

Chihuahua

10

Female

4.5

0.5

4

Papillon

12

Female

1.5

0.5

5

T Poodle

2

Female

2.0

0.5

6

Chihuahua

8

Male

5.5

0.5

7

M Schnauzer

12

Male

7.5

2.0

8

Bernese Mountain Dog

7

Male

28.0

1.5

© The Ito Foundation

106

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Table 2 Expression of each geneUn-treatedoleic acidoleic acid＋
Liver-Hi

MGAT-1100.0±4.8111.0±12.3

69.7±5.2

MGAT-2100.0±11.9

98.7±8.952.4±1.9

MGAT-3100.0±9.8

88.7±12.9

100.9±2.6

DGAT-1100.0±5.4

93.3±2.040.9±2.0

DGAT-2100.0±12.5

93.2±18.6

37.1±1.5

Gene
monoglyceride→diglyceride

diglyceride→trilyceride

MGAT, monoacylglycerol acyltransferase ; DGAT, diacylglycerol acyltransferaseのうち，MGAT-1，MGAT-2の発現はそれぞれTable 3 Result of T-cho level

未処理群を100.0％として69.7および52.4％と有意

Case

Pre

Post

に低下していた。MGAT-3については変化はな

1

274

212

かった。

2

229

301

3

160

173

4

164

144

またジグリセリドをトリグリセリドに変換する合成酵素であるDGAT-1，DGAT-2の発現はそれ

5

387

274

ぞれ未処理群を100.0％として40.9および37.1％と

6

450

428

有意に低下していた。

7

419

410

8

313

286

以上より，レバーHiは中性脂肪合成系遺伝子での発現を抑制することで，中性脂肪の合成を抑制することが判明した。中性脂肪の減少はHDL-Ｃの増加を誘発させることが知られている。
HDL-Cの増加はLDL-Cの減少の誘因となる。つまり，本結果はこれまでに明らかとなっているレ
バーHiによるLDL-C減少の作用メカニズムの一つとして，肝臓でのトリグリセリドへの変換抑制も関与していることを示唆している。

Plasma T-cho levels（㎎/dL）あるMGAT-1，MGAT-2，DGAT-1，DGAT-2
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0

pre

post

Fig. 1 Results of the plasma T-cho levels

3 . 2 自然発症肝疾患動物に対する効果

Date are presented mean±SD

レバーHi摂取前後での血中T-cho濃度をTable３，
Fig.１に示した。その結果，血中T-cho値は８例

め，T-cho値も上昇した可能性が考えられる。

中６例で減少した。残りの２例は上昇がみられT-cho値が減少した６例ではコレステロール上昇

た。上昇がみられた２例はいずれも原疾患としてが胆泥症に関連するとみられるもの３例，原因不肝疾患を有していた。特にT-cho値の上昇ととも

明３例であった。筆者らは，これまでに高脂肪食に肝酵素の上昇も確認された。したがって，肝臓負荷モデル動物を用いたレバーHiの効果についでのHMG-CoA還元酵素の活性がより上昇したたて報告しており，レバーHiを摂取することによっ© The Ito Foundation

豚レバーパウダーの脂質代謝に及ぼす影響

107てLDLコレステロールの減少，肝臓での脂肪滴減であるMGAT-1，MGAT-2，DGAT-1，DGAT-2

少，および空砲変性・脂肪変性の減少を確認しての発現が低下することが判明した。また，実際のいる３）。今回の結果から，レバーHiは自然発症の脂質異常疾患を患っている動物に対してレバー

高コレステロール血症に対しても有効であること

Hiを投与した結果，約７割において脂質異常の改が示唆された。

善が認められた。したがって，レバーHiは有効な以上，本研究の結果は，実際の脂質異常疾患の機能性食品となることが示唆された。

動物においてもレバーHiが有効な機能性食品となることを示唆している。また投与期間中，食欲減退を含めて明らかな有害事象を認めなかった。
４．要

約

本研究の結果，遺伝子解析実験においてレバーHiを添加することにより，中性脂肪合成系遺伝子

参考文献１） 平成19年国民健康・栄養調査報告，厚生労働省，
2008.
２） 佐藤隆一郎，日本栄養・食料学会誌，66, 279～
285, 2013.
３） 岡本芳晴：平成25年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，伊藤記念財団，32, 57～61, 2014.
４） 岡本芳晴：平成26年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，伊藤記念財団，33, 97～100, 2015.

© The Ito Foundation

108

機能性食肉の開発を目指した「身体に効く成分」の分析
Analysis of the “ingredients that have effects on the body” in order todevelop potential meat-based functional foods

加治屋

勝

子

（鹿児島大学農学部）

Katsuko Kajiya（Faculty of Agriculture, Kagoshima University）

In addition to the westernization of our diet and the decrease in opportunities to exercise,
we are steadily becoming a truly aging society, and the number of people who have contracted
vascular disease, as well as the ones who are susceptible to it, is increasing. Thus, preventionof vascular diseases is an urgent issue in terms of national health. On the other hand, in theprefecture of Kagoshima that boasts of the 2nd largest production of green tea in the country,
it is expected to take a more proactive stance to consume green tea more effectively. To
develop functional meat products, we used green tea, which is effective in the prevention ofcardiovascular diseases. Research done so far suggests that the ingredients of green tea thatremain inside the meat may exhibit various physiological effects inside the bodies of people
who have ingested the meat. In addition, due to the acceleration in the metabolism of animals
that have ingested green tea, an improvement can be expected in the quality of meat evenduring the summertime when their appetite declines. It is necessary to solve the problem ofdisposing the large amount of tea dregs expelled during the processing of tea. This will lead toproactive use of food industry waste. With the goal of developing functional meat in mind, wewere able to obtain results beyond what was projected in this research by analyzing the“ingredients that have effects on the body”, but since this includes some unpublished data, wewould like to request you to understand that we cannot reveal part of the results. From here
on, we look forward to an industry involving the use of the new ingredients, the creation of
products, their commercialization, and the revitalization of the region.

１．目

者および予備群の人口は増加の一途をたどってお的り「いかに予防するか」が国民衛生上の緊急課題

高血圧や動脈硬化などの循環器疾患の悪化は，である。我々は，病気になった後にしか処方され

我が国死因の上位を占める脳梗塞や心筋梗塞を引ない医薬品ではなく，病気になる前から摂取可能

き起こす１）。食の欧米化や運動機会の減少に加え，な食品成分こそが健康長寿社会を支えると考え，本格的な高齢化社会に突入し，循環器疾患の罹患

長年，循環器疾患を対象とした機能性予防成分の© The Ito Foundation

機能性食肉の開発を目指した「身体に効く成分」の分析

109

探索や作用機構の解明を行ってきた。これまで

は，機能性成分としてカテキン含量の多い鹿児島に，突発する血管異常収縮（血管攣縮）の予防成

県産緑茶品種「べにふうき」（Fig.１a）を用い分として魚油由来のエイコサペンタエン酸を発見て，体内吸収量を明らかにすることを目的とす

し，高付加価値化した機能性食品として上市したる。緑茶には，抗酸化性，抗菌性，抗ウイルス性，ほか，血管弛緩作用を有するペプチドおよび血管

血糖上昇抑制効果，血圧上昇抑制効果，整腸作用，弛緩剤に関する特許を出願するなど，多数の成果

消臭効果，ガン予防効果等をはじめ，循環器疾患をあげてきた２～10）。

に対する高い予防効果が報告されている。そのた他方，個々の食材に含まれている機能性成分をめ，食肉中に残存した緑茶成分が，食肉を摂取し探索・同定し，これらを抽出して作製した機能性たヒトの体内で多彩な生理機能を発揮する可能性

食品よりも，高機能性の自然食材を摂取する機会が高い。特に，一般的な緑茶品種「やぶきた」にを増やすことこそが，より豊かな食生活を創造しは含まれず，「べにふうき」に高濃度で含まれる

食意識を高める，という考えに至った。しかしな

メチル化カテキン類は，抗アレルギー効果等の機

がら，一食材だけでは総摂取量を増やすことが困

能性が報告されており，緑茶を摂取する動物本体難であるため，高機能成分を含む新たな自然食材の代謝を促進することで，食欲が衰える夏場でもの構築に挑み，日々の料理，加工品，惣菜に使う肉質の向上が期待できる。産業動物としては，鹿ことで「食事として」の機能性成分の総摂取量増

児島県で飼養頭数が多い豚の産業化を念頭にお加を目指すことが理想的である。これまでに，日き，実験動物としてミニ豚（Fig.１b）を利用す

本人向けに新たな栄養基準を設定した血圧改善食る。本研究では，新たな機能性食肉を創出するたとして，食物繊維やミネラルを多く摂取するメ

めの基礎データを蓄積し，新たな食材の活用，製ニューを開発し，ヒト介入試験において，血圧の品化，商品化に関する産業ならびに地域の活性化改善作用に加えて，体重減少や血糖値の低下，メへ貢献することを最終目標としている。

タボリックシンドロームの改善にも繋がる成果を報告している11）。

２．方法と結果

我々の研究グループでは，機能性成分を含む食我々の研究グループでは，長年にわたり緑茶カ肉の開発を目指しており，産業動物を用いて機能

テキン類の生理活性利用に関する研究を行ってお性成分の体内分布解析を行っている。本研究でり，緑茶カテキン類の生理活性機構解明を目的とFig. 1 The photos of the green tea, Benifuki,（a）and the miniature swine（b）.

© The Ito Foundation

110

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

して，物理化学的手法によりカテキン類の細胞膜ロールとした。緑茶摂取開始１日目は，摂取後中における存在量や存在位置，配向性などを世界

１，
３，
５時間後に採血し，その後は２，
３，
４，

で初めて明らかにした12，13）。その成果は，論文賞

５，８，15日目に採血した。緑茶摂取終了後は，の受賞や，構造生物学・動的構造学の最新研究が体内残存率を調べるため，緑茶摂取終了１，７日

特集されるSpectroscopy NOWにおいて最も注目目に採血した。なお，鹿児島県産緑茶品種「べにすべき論文として掲載されたことからも当該分野

ふうき」の対照実験として，一般的な緑茶品種の関心の高さがうかがえる。一方，豚冠状動脈を「やぶきた」摂取群も設定し，同様に採血した。

用いて，突然死の主原因である血管異常収縮の病

2.4的経路を遮断する成分を天然物から突き止め，学

緑茶葉に含まれる栄養素ならびに機能性成分に

術新聞「メディカル・トリビューン誌」に掲載さついて，高速液体クロマトグラフィー（HPLC）

れ，日本生理学会誌の表紙でも特別解説されておを用いて定量した（Fig.２）。また，ミニ豚からり，循環器疾患を対象とした予防成分の探索・同採血した血液は質量分析計付きHPLC（LC/MS）

定においても多数の成果をあげている。本研により分析し，体内動態評価を行った。さらに，

究においても，これまでの研究手法を応用し，体一般的な血液生化学検査（白血球：WBC，ヘモ

内吸収量を明らかにするための成分分析を実施しグロビン：Hb，血小板：Plt，腎機能：Cre，肝た。

機能：AST，ALT）についても実施し，コント

2.1

２～11）

成分分析

ロール群（pre）と特殊飼料群（1st，2nd）の比

特殊飼料の作成

緑茶に含まれるカテキン類は酸化されやすいため，摂取直前に緑茶葉と一般飼料を混合し，特殊飼料とした。なお，緑茶葉に対するミニ豚の嗜好較を行った（投与実験１回目の結果抜粋，
Fig.３）。
３．考察

性を確認したところ，豚は雑食性であるため餌に本研究では，一般に知られている栄養素だけで緑茶葉を混合しても，一般飼料のみの食餌量と差はなく，機能性成分として注目されているカテキ

異はなかった。ただし，一般飼料に占める緑茶葉ン類やカフェイン等についても網羅的に分析を行

量が多くなり過ぎると下痢を起こすことから，豚い，緑茶中に含まれるこれらの成分の体内吸収量の嗜好性と体調を重視して緑茶葉の摂取量を設定を明らかにすることができた。また，ミニ豚は，した。

ヒトに近い代謝系を持つ動物であり，形態学的，

2.2

生理学的な類似性から医学，生物学，免疫学，薬採血カテーテル挿入および管理

本研究では，クラウン系ミニ豚，５ヵ月齢，15

理学，再生医療等の分野において広く利用されて㎏を用い，実験期間中のミニ豚の身体状況，下いる。近年，ミニ豚は飼育管理や遺伝的コント

痢・便秘，食餌摂取量変動等について管理した。

ロールの容易さから，産業動物の発生や代謝の分また，長期にわたり定期的な採血が必要となるた野においても活用されている。ミニ豚と一般的にめ，ミニ豚の頸静脈に採血カテーテルを挿入留置知られている食用豚との違いはサイズだけであした。カテーテルの挿入は，ミニ豚搬入後に環境

り，性周期，寿命などの生理的な特徴はほとんど適応期間を設け，一定期間飼育した後に実施した。

違いがない。そのため，ミニ豚を用いた体内代謝2.3に関する情報は，機能性食肉の開発に貢献でき，採血

緑茶摂取前に３日間連続して採血し，コント

さらに，機能性食肉を摂取することでヒトの循環© The Ito Foundation

111

機能性食肉の開発を目指した「身体に効く成分」の分析(μM)

Benifuki

200

Yabukita

150
100
50
0

EC

EGC

ECｇ

EGgC

C

GC

Cｇ

GCｇ

EGCｇ３̋ Me caﬀeine

Fig. 2

WBC

100
50

pre

0.5

60
40
20

pre

test

0

40
20

pre

test

ALT

40

（U/L）

1.0

60

0

test

AST

80

（U/L）

（mg/dL）

10

0

test

Cre

1.5

0.0

15

5

pre

Plt

80

（X104/uL）

150

0

Hb

20

（g/dL）（X102/uL）

200

30
20
10

pre

test

0

pre

test

Benifuki

Yabukita

Fig. 3器疾患の予防に活用することが期待できる。加えに予防するかが国民衛生上の緊急課題である。一て，食肉そのものの香りや色が向上する可能性が方，緑茶生産量全国２位を誇る鹿児島県では，緑期待され，食肉の販売促進に繋がる。

茶の消費向上に繋がる積極的な活用が期待されて４．要いる。我々は，循環器疾患予防効果を持つ緑茶を約用いた機能性食肉の開発を最終目的としている。

食の欧米化や運動機会の減少に加え，本格的な

これまでの研究により，食肉中に残存した緑茶成

高齢化社会に突入し，循環器疾患の罹患者および分が，食肉を摂取したヒトの体内で多彩な生理機予備群の人口は増加の一途をたどっており，いか能を発揮する可能性があるだけでなく，緑茶を摂© The Ito Foundation

112

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

取する動物個体の代謝を促進することで食欲が衰える夏場でも肉質の向上が期待できることを明らかにしてきた。本研究では，機能性食肉の開発を目指した「身体に効く成分」の分析を行うこと
で，幸いにも本研究では予想以上の成果が得られたが，未発表データを含んでいるため一部は公表
できないことをご了承いただきたい。今後，新たな食材の活用，製品化，商品化に関する産業ならびに地域の活性化に期待したい。
文献１） 厚生労働省人口動態調査（平成26年確定数）
２） Xu, D., Kishi, H., Kawamichi, H., Kajiya, K.,
Takada, Y., Kobayashi, S. : FEBS Letters, 581, 5227～
5233, 2007.
３） Kishi, H., Kawamichi, H., Kajiya, K., Kobayashi, S.
: Folia Pharmacologica Japonica., 129, 245～251, 2007.
４） Takada, Y., Tokumori, D., Kishi, H., Kawamichi, H.,
Kajiya, K., Guo, F., Xu, D., Wang, C., Matsuo, S.,
Ookouchi, M.,Kobayashi, S. : The Journal of

Physiological Science, 58, S212, 2008.
５） 加治屋勝子，岸博子，川道穂津美，小林誠：血管医学，メディカルレビュー社，43, 25～32, 2008.
６） Kajiya, K., Kishi, H., Kobayashi, S. : Experimental
and Clinical Cardiology, 14, 24, 2009.
７） 加治屋勝子：フードリサーチ（食品研究社），661,
36～38, 2010.
８） Xu, D., Kishi, H., Kawamichi, H., Kajiya, K.,
Takada, Y., Kobayashi, S. : Cellular Signaling, 24, 282～289, 2012.
９） Kajiya, K., Kishi, H., Takada, Y., Zhang, Y.,
Kimura, T., Miyanari, K., Hagihara, H., Kobayashi, S.
: Food and Food Ingredients Journal of Japan, 217,284～288, 2012.
10） 加治屋勝子：化学と生物，50, 269～276, 2012.
11） Kawamura, A., Kajiya, K., Kishi, H., Inagaki, J.,
Mitarai, M., Oda, H., Umemoto, S., Kobayashi, S. :Hypertension Research, 39, 1～9, 2016.
12） Kajiya, K., Kumazawa, S., Nakayama, T. :Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 65, 2638
～2643, 2001.
13） Kajiya, K., Kumazawa, S., Naito, A., Nakayama, T.
: Magnetic Resonance in Chemistry, 46, 174～177,
2008.

© The Ito Foundation

113

血中トリプトファン濃度とうつ状態との関連：双極性と単極性の鑑別を目指して
Relationship between plasma tryptophan concentration and depression :for discrimination bipolar and monopolar depression

堀

宏治・富岡

大・葉梨

喬広・高尾

哲也＊・清水史子＊・高田（昭和大学横浜市北部病院メンタルケアセンター，＊昭和女子大学生活科学部，＊＊NPO法人

明和＊＊

食と健康Project）

Koji Hori, Hiroi Tomioka, Takahiro Hanashi, Tetuya Takao＊，Fusako Shimizu＊
and Akikazu Takada＊＊（Showa University Northern Yokohama Hospital，＊Department of Human Health and Design, Showa Womenʼs University，＊＊International Projects on Food and Health（NPO））

We measured plasma tryptophan（Trp）and their metabolites in 7 depressive patientswith bipolarity. Plasma Trp level in patients was lower than that in controls and the ratio of
kynurenine（K）/Trp were higher. In addition, the level of plasma serotonin（5-HT）plasma
was not detected in 5 cases, but 5-HT was detected in two cases among 7 patients. From theseresults we considered that K system that is related to pro-inflammation system were enhanced
in depressive state, and it was thought that degradation of 5-HT by this was related todepressive state. However, because the cases that metabolism to 5-HT were kept in somecases, administration of antidepressant agent mainly SSRI caused enhancement of 5-HT forthese cases adversely. We consider that determination of plasma 5-HT was thought to predictthe patients who were lead to the manic state or instability of diseases by antidepressantagent.

１．目

北部病院メンタルケアセンター（当院当科）を受的診した，または通院中の７症例である。７症例に本研究は，トリプトファン（Trp）ないしそのつき，性，教育歴，発症時年齢，検査時年齢，う代謝産物の測定が抗うつ薬治療によるうつ状態のつ状態の重症度，bipolarityの有無，検査時の治症例の躁転ないしうつ状態の遷延化を予測できる療の有無を調べた。また，一か月以内の摂取カロか否かを調べることである。また，可能ならどのリー量などの食事量を推測するために，食事票を因子が躁転ないしうつ状態の遷延化と関連するか記入してもらったが，これは現在計算中であり，を調べることである。

今回の解析には間に合わなかった。

２．方

うつ状態の重症度については，自己評価式のう法

つ 状 態 評 価 法 で あ る SAS（Self Assessment for

対象は“うつ状態”を呈して，昭和大学横浜市

Depression）を用いた。本評価法は計20項目につ© The Ito Foundation

114

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

き，症状の重症度を０～４にわたり採点し，合計

的主旨，匿名性の維持，研究に伴う不利益を十分得点でうつ状態の重症度を評価するものである。

説明したうえで文書による同意を得た。その後，当院当科ではうつ症状を呈する症例に対してSAS

採血測定項目を追加したため，追加申請を受け，を施行しており，診断および薬剤効果の目安にし

口頭での再同意を得た。

ている。本検査に当たっては当院当科で著作権料を支払っている。

３．結果と考察

Bipolarityとは直接双極性障害（躁うつ病）やコントロール群と比較し，全７症例においては

躁状態と関連した症状ではないが，躁うつ病に準血漿Trp濃度およびキヌレニン（K）/Trpの比率

じた治療をすべきとされる，いわば“躁うつ病傾は低下していた。また，全７症例の中２例にのみ

向”ともいうべき症状である。過去の報告から，

セロトニン（5-HT）を血漿中に検出し，他の５躁うつ病との関連が深い，生来の気質（循環気質症例は5-HTが検出しえなかった。本２症例の血ないし発揚気質）ないしは躁うつ病やうつ病の遺漿Trp濃度は他の５症例のそれと比較し，低下し伝歴をもってbipolarityありとしている。最近，ていた。また，本２症例はいずれも若年の女性症

認知症における行動心理学的症候（問題行動のこ例である。

と 。B P S D , b e h a v i o r a l a n d p s y c h o l o g i c a l

今回の研究から２点が明らかになった。

symptoms of dementia）とbipolarityが関係する

まず，第一に全７症例のTrp濃度およびK/Trpと言われている。我々もBPSDとbipolarityが関係

比率はコントロール群と比較し，高値であった。

していることを報告した 。このため，認知症で最近，うつ状態ないしはうつ病に関してTrp代謝あり，BPSDが認められた患者を家族歴にもつ症と関連した炎症系の賦活化がその原因ではないか

例についても遺伝歴があるbipolarityとした。

と示唆されている２）。具体的には食物より摂取し１）

また，全症例につき検査時に肝機能，腎機能なたTrpが脳内に移行し，移行したTrpが5-HTにどの臨床検査とあわせて，血漿検体を２ml余分

代謝され，この5-HTが神経細胞の伝達物質としにいただき，Trpおよびその代謝産物の測定をて作用しているが，この5-HTが減少することが行った。当院当科では初診時および抗精神病薬のうつ状態，うつ病の症状出現の原因となっている

投薬後，投薬の良否を検討する一環として採血，とする考え方である。うつ病のモノアミン減少仮心電図を施行しているが，採血の負担を考慮し，説は古くからあり，この仮説から脳内の5-HTをこれらの採血時に研究用採血を行った。Trpおよ枯渇させるレセルピンによりうつ病が誘発される

びその代謝産物の測定は島津製作所に依頼し，同こと，現在の抗うつ薬の多くが5-HTなどのモノ社で高速液化クロマトグラフィー法にて施行した。

アミンの再取り込み阻害薬ないしは代謝酵素の阻７症例のTrpおよびその代謝産物の比較を以前害薬であることである。この5-HTが減少する原

我々が報告した若年正常女性群および中高年正常因としてTrpが炎症系であるＫ系のほうにより多男性群（コントロール群）との比較を行った。今く代謝されるためであるとされるようになり，こ回は症例数が少ないために対象群との統計比較はのために，5-HTが減少すると考えられるように行わず，主観的に検査結果の解釈を行った。

な っ た 。つ ま り ，う つ 状 態 な い し は う つ 病 は

本研究は昭和大学横浜市北部病院の倫理委員会

5-HT系と関係した炎症系の亢進がその病態であの承認を受けた。また，研究対象者には研究の目

り，主に5-HTを増加させる5-HT選択性再取り込© The Ito Foundation

血中トリプトファン濃度とうつ状態との関連：双極性と単極性の鑑別を目指して

115

み阻害薬（SSRI）などの抗うつ薬がその病態でである。このことは若年の女性症例に関しては安ある5-HTの低下を改善させ，シナプス間隙内の易に抗うつ薬を投与すべきでないことを示してい5-HTを増加させることによりうつ状態を改善さるのかもしれない。実際，bipolarityや双極性障せるとする考え方である。今回の結果はこれを支

害のうつ状態は若年発症や躁うつ混合状態と関係持する形となった。

しているとする報告が認められている３，４）。今回

一方，K/Trp比率の向上により，より低下しての結果は，若年発症のうつ病ないしはうつ状態はいると考えられる5-HT値は全７症例の平均値は双極性障害のうつ状態である可能性が高いことを低下しており，このこともTrp代謝と関連した炎示しており，若年発症のうつ状態の症例に関して症系の賦活化が関係していると示唆されている。

は安易に抗うつ薬，特に5-HTを選択的に高める

このために，Trpの血中濃度は低下していると考SSRIを投与すべきでないことを示しているのかえられる。実際，全７症例中５症例においては，もしれない。

血漿中に5-HT値は検出されなかった。逆に，全最後に，食物摂取の観点から考察する。最近，７症例中２症例で測定しえた。つまり，本２症例

正常若年健常者に高Trp食を摂取させると抑うつにおいては5-HTを増加させる抗うつ薬を投与すや不安が軽快するとの報告があった ５）。今回のることは逆にシナプス内の5-HTを必要以上に増我々の報告もこの報告を支持しているものと考え加させてしまう可能性があるということである。

た。つまり，今回の２症例を除く５症例において

最近，抗うつ薬の投与がactivation syndrome，は，5-HTを作成する材料であるTrpが低下して自殺企図の増加など衝動性の亢進を引き起こす可いるために5-HTの産出が低下していることが予能性が示唆され，特に，SSRIなどの抗うつ薬を想される。こうしたことから，血漿5-HTが検出投与すべきでないと考えられるようになった。まされない症例についてはTrpが多く含まれる食品

た，基盤にbipolarityの存在する症例についてはを摂取することは望まれるものと考察した。ま抗うつ薬の投与がかえってうつ状態を遷延化さた，血漿の5-HTを測定することが効率よく高せ，躁転させてしまうことが指摘されるように

Trp食の効果を引き出させるためにも必要であるなった。このことから，うつ状態のみを呈する単と考察した。

極性うつ病とうつ状態と躁状態の２症状を交互に，あるいは同時に存在する双極性うつ病を明確

４

要

約

に鑑別すべきと考えられるようになった。今回のうつ状態で当院を受診した症例のTrpおよびそ我々の研究からうつ状態を呈しながら，5-HTがの代謝産物の血漿中の濃度を測定した。若年女性

検出される症例の存在が認められ，かつこの２症

ないし中高年男性のコントロール群と比較し，今例の5-HT濃度は低下しているものの，5-HT系へ回の症例においては5-HT/Kの比率は低下していの経路もTrpの供給が比較的保たれ，それによりた。このことはTrpが炎症系であるＫ系のほうにさらにTrp濃度がより低下していることが予想さより多く代謝されるため，5-HTが減少することれる。したがって，こうしたことが単極性うつ病を示すものであると考えた。また，全７症例中２と双極性うつ病を鑑別する可能性があることを示

症例において5-HTが検出された。このことは，す研究と考えた。

本２症例は抗うつ薬を投与することは逆にシナプ

また，今回の２症例はいずれも若年の女性症例

ス内の5-HTを必要以上に増加させてしまう可能© The Ito Foundation

116

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）性があるということである。以上のことから，血漿 の 5-HT を 測 定 す る こ と は 躁 転 や activation
syndromeを引き起こしうる症例の鑑別に適していると考えた。
文献１） Tanaka, H., et al. : Brain Disord Ther, 3 : 5, 2014.

http://dx.doi.org/10.4172/2168-975X.1000144
２） Ogawa, S., et al. : J Clin Psychaitry, 28 ;e906-e915, 2013.
３） Takeshima, M., et al. : J Affect Disord, 147 ; 150155, 2013.
４） Nishi, A., et al. : Indian J Psychiatry, 57 ; 392-396,
2015.
５） Lindseth, G., et al. : Arch Psychiatric Nur, 29,
102-107, 2015.

© The Ito Foundation

117

食肉および家畜の微生物制御に資する乳酸菌由来抗菌ペプチドの探索
Screening and characterization of antimicrobial peptides produced bylactic acid bacteria for microbial control of meat and livestock

善

藤

威

史

（九州大学大学院農学研究院）

Takeshi Zendo（Faculty of Agriculture, Kyushu University）

Safe antimicrobial agents are being required for various purposes such as foodpreservation. Lactic acid bacteria （LAB）, which are generally considered as safe
microorganisms, contribute to preservation of fermentation foods and have been found to
produce various antimicrobial substances including antimicrobial peptides, bacteriocins as wellas organic acids such as lactic acid. This study aimed to obtain effective LAB bacteriocins tocontrol undesirable microorganisms in meat and livestock. First various isolation sources
including healthy cow were screened for bacteriocin-producing LAB, and 10 isolates were
found to show bacteriocin-like antimicrobial activity. Out of the isolates, strain MC1, showing
the highest bacteriocin activity, was selected for further characterization. A bacteriocin was
purified from the culture supernatant of strain MC1 by some chromatographic steps. Analysesof the purified peptide by ESI-TOF MS and Edman degradation determined the molecularmass to be 5220 and identified the N-terminal sequence with 20 residues to be almost identicalto enterocin L50A. In addition, PCR-sequencing analysis using various primer sets for reported
enterocins indicated that strain MC1 possesses structural genes of enterocins L50A, L50B and
P and produces them. These bacteriocins show antibacterial activity against Listeria and someGram-positive bacteria, indicating that they are effective on microbial control of meat andlivestock. In further work, in addition to the enterocins produced by strain MC1, bacteriocins
produced by the other isolates will be characterized for their structures and antimicrobialactivity to evaluate their effectiveness for microbial control of meat and livestock.

１．目

産する抗菌ペプチドであるバクテリオシンは，ヒ的トに対する毒性がなく，体内や環境中において分食品の保存にはさまざまな保存料が用いられて解されやすく，耐性菌が出現しにくいといった特いるが，従来用いられてきた合成保存料には健康性から，人体そして環境に優しく安心して使用でへの影響が懸念されており，生物由来の天然の保きる抗菌物質として注目され，安全な食品保存料

存料の利用が広まっている。中でも，乳酸菌が生として期待されている。

© The Ito Foundation

118

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

乳酸菌が生産するバクテリオシンは，一般のタンパク質と同様にしてリボソーム上で合成される

２．方法

ペプチドである。その構造・特性は多様で，ボツ

2 . 1 乳酸菌の分離

リヌス菌やセレウス菌，黄色ブドウ球菌，リステ

牛などの家畜の糞便，野菜・果実等の植物，土リア菌などの食中毒菌・病原菌に対して強い抗菌壌，サイレージなど，計37の試料を分離源として作用を示すものもある。一般に標的細菌に瞬時に乳酸菌の分離を試みた。まず，乳酸菌用の培地で作用し，体内および環境中で容易に分解されるペ

あるMRS培地もしくはＭ17培地に分離源を添加

プチドであり，かつ安全性の高い乳酸菌によってし，30℃もしくは37℃で２日間静置し，集積培養生産されることから，乳酸菌バクテリオシンは非を行った。次に，集積培養後の培養液を0.5％の常に高い安全性を有している。この安全性を基盤

炭酸カルシウムおよび1.5％の寒天を添加した炭として，乳酸菌バクテリオシンは食品保存料のみ

酸カルシウム含有MRS寒天プレートに塗布し，ならず，殺菌消毒剤や口腔ケア剤などへの応用も集積培養時と同じ30℃もしくは37℃で２日間培養試みられ，医療や畜水産分野など，安全な抗菌剤した。乳酸などの酸生産によって周辺の炭酸カルが求められるあらゆる分野に拡がってきていシウムを溶解しているコロニーをMRS液体培地

る１，２）。

に釣菌し，分離株とした。得られた分離株につい実際に，乳酸菌Lactococcus lactisの一部の株がて，カタラーゼ活性試験，バクテリオシン活性試

生産するナイシンＡは世界50ヶ国以上で食品保存験を行った。以降の実験でバクテリオシン生産が料として実用されており，日本においても2009年認められた分離株については，16S rRNA遺伝子に食品添加物の指定を受け，食品保存料としてのの配列解析を行い，菌種を同定した。

利用が広まりつつある。ナイシンＡは広い抗菌ス

2 . 2 バクテリオシン活性試験

ペクトルと強力な抗菌活性を有する優れたバクテ

バクテリオシンによる抗菌活性は，Direct法おリオシンであり，きわめて汎用性が高い。しかし，

よびSpot-on-lawn法にて試験した。Direct法で一方では，ある種の微生物に対してはナイシンＡは，MRS寒天プレート上に分離株を穿刺して一よりも優れた効果を発揮する乳酸菌バクテリオシ

晩培養し，分離株のコロニーを形成させた後，検ンも報告されている 。したがって，特性の異な定 菌 を 混 釈 し た Lactobacilli Agar AOAC 培 地るさまざまなバクテリオシンの中から，目的とす（LAA培地）を重層してさらに一晩培養し，分離る食品や微生物によって最適な特性をもつものを株コロニー周辺での生育阻止円の形成を観察し選択し利用することで，より効果的な微生物制御

た。Spot-on-lawn法では，MRS寒天プレートにの実現が期待される。そこで本研究は，食肉およ

検定菌を混釈したLAA培地を重層したものに，び家畜の微生物制御に有効な新奇乳酸菌バクテリ

分離株のMRS培養液上清を滴下して一晩培養し，オシンを探索し，その特性を明らかにすることを生育阻止円の形成を観察した。Spot-on-lawn法目的とした。バクテリオシンの利用対象から有効は，バクテリオシンの精製や特性の解析時の抗菌

なバクテリオシン生産乳酸菌が分離される例が多活性試験にも用いた。必要に応じて，精製試料等いことから，とくに健康な家畜等を分離源としてを滅菌水で２倍ずつに段階希釈したものを試験

バクテリオシン生産乳酸菌の分離を試みた。

し，抗菌活性の強度を評価した。検定菌には，こ３）れまでの研究で乳酸菌バクテリオシン高感受性菌© The Ito Foundation

食肉および家畜の微生物制御に資する乳酸菌由来抗菌ペプチドの探索として選抜された種々のグラム陽性菌を用いた。

119

あった。
これら10株の中から，最も強い抗菌活性を示し

2 . 3 バクテリオシンの精製前培養したバクテリオシン生産乳酸菌を１ＬのたMC1株を選択し，以降の解析を行うこととし

MRS培地に接種し，16時間静置培養した。遠心た。MC1株のMRS培養液上清は，用いたグラム

分離によって得た培養液上清中のバクテリオシン

陽 性 の 検 定 菌 に 広 く 抗 菌 活 性 を 示 し た（Table

を疎水性吸着剤であるAmberlite XAD-16（シグ１）。16S rRNA遺伝子配列解析の結果，MC1株マ）に吸着させ，活性画分として回収した。さらは乳酸菌の一種であるEnterococcus faeciumに分に，陽イオン交換クロマトグラフィー，Resourse

類されることが明らかとなった。

RPC逆相カラム（GEヘルスケア）を用いた高速

3 . 2 バクテリオシンの精製・構造解析

液体クロマトグラフィー（HPLC）により，バクMC1株のMRS培養液上清から，種々の液体ク

テリオシンを活性画分として精製した。

ロマトグラフィーを用いて，バクテリオシンを精2 . 4 バクテリオシンの構造解析製した。最終的に，逆相HPLCによって抗菌活性エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分を示す精製バクテリオシンを得ることができた

析計（ESI-TOF MS）を用いて，精製されたバ（Fig.１）。この精製画分をESI-TOF MSで分析しクテリオシンの分子量を測定した。また，プロテ

たところ，本バクテリオシンの分子量は5220でインシーケンサーを用いて，エドマン分解によっあった（Fig.２）。さらに，エドマン分解によって，Ｎ末端アミノ酸配列を解析した。得られた情てＮ末端アミノ酸配列を解析したところ，全体的報から，類似のアミノ酸配列を有すると予想されにやや信頼度が低かったものの20残基の配列が得る既知のバクテリオシン構造遺伝子に特異的なプられ，その配列はエンテロシンL50Aのものと完ライマーを構築し，PCRによってバクテリオシン

４）
全に一致した（Fig.３）。エンテロシンL50Aの構造遺伝子を取得した。得られた増幅断片のシー

分子量は5218であることから４，５），MC1株が生産

ケンス解析を行い，バクテリオシン構造遺伝子のするバクテリオシンはエンテロシンL50Aと同一

塩基配列情報から，バクテリオシンの全アミノ酸と推察された。

配列の決定を試みた。

これまでに報告のあるエンテロシンL50A生産
株 は ，同 時 に 類 似 の 配 列 を も つ エ ン テ ロ シ ン

３．結果と考察L50B（Fig.３）やエンテロシンＰなどを同時に生

3 . 1 バクテリオシン生産乳酸菌の分離産することが知られている５，６）。そこで，エンテ

家畜の糞便をはじめとするさまざまな分離源か

ロ シ ン L50A ，L50B ，P ，お よ び さ ら に 14 種 のら，集積培養を経て，269株の酸生産菌を得るこEnterococcus属由来バクテリオシンに特異的なプとができた。それらについて，Direct法で抗菌活ライマーを構築し，MC1株から抽出したゲノム性試験を行ったところ，48株にバクテリオシン様

DNAを鋳型としてPCRを行ったところ，エンテの抗菌活性が認められた。さらにSpot-on-lawn

ロシンL50A，L50B，Pの３種にのみ，増幅が確法によって，この48株の抗菌活性試験を行ったと認された。各増幅断片を精製し，DNA配列解析

ころ，牛の糞便より分離された10株に強いバクテを行ったところ，エンテロシンL50A，L50B，P

リオシン様の抗菌活性が確認された。これら10株の構造遺伝子であるentL50A，entL50B，entPのはいずれも他の乳酸菌と同じくカタラーゼ陰性で配列と完全に一致した。

© The Ito Foundation

120

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Table 1 Antimicrobial spectrum of the culture supernatant of Enterococcus faecium MC1
Indicator strain

Antimicrobial activity

Bacillus coagulans JCM 2257Ｔ＋＋＋

Micrococcus luteus NBRC 12708－

Listeria innocua ATCC 33090Ｔ＋

Pediococcus pentosaceus JCM 5885＋

Enterococcus faecalis JCM 5803Ｔ＋

Lactococcus lactis ssp. lactis ATCC 19435Ｔ＋＋

Lactobacillus sakei ssp. sakei JCM 1157Ｔ＋

More＋indicates higher activity ; －indicates no activity.

100

75
1
50
0.5

Acetonitrile（%）

Absorbance（220 nm）

1.5

25

0

0

5

10

15
20
Retention time（min）

25

30

35

0

Fig. 1 Reverse phase chromatography profile of a bacteriocin produced by E. faecium MC1. Dotted lines indicate thegradient of acetonitrile. An arrow indicates the peak showing bacteriocin activity.
100[M+4H]4+
Relative intensity（%）

M=5220.2

1306.06[M+5H]5+[M+3H]3+

1045.011741.10

0
500

1000
1500
Mass to charge ratio（m/z）

2000

Fig. 2 Electrospray ionization time-of-flight mass spectrum of a purified bacteriocin from E. faecium MC1. Multiple

charged ions detected are indicated.

© The Ito Foundation

121

食肉および家畜の微生物制御に資する乳酸菌由来抗菌ペプチドの探索
1

10

20

MC1

M G A I A K L V A K F G X P I V X K Y Yenterocin L50A

M G A I A K L V A K F G W P I V K K Y Yenterocin L50B

M G A I A K L V T K F G W P L I K K F Y

Fig. 3 Alignment of N-terminal amino acid sequences of a bacteriocin from E. faecium MC1 and enterocins L50A and

L50B. Twenty N-terminal amino acid residues were obtained by Edman degradation of a purified bacteriocin from
E. faecium MC1. X of MC1 bacteriocin indicates residues that were not identified by Edman degradation. Identicalresidues in more than two bacteriocins are shaded.

以上より，MC1株はエンテロシンL50Aを生産

ム陰性菌にも抗菌活性を示す乳酸も多く含まれるすることが明らかとなった。さらに，エンテロシと考えられ，これらの相乗的・相加的な作用に

ンL50BおよびＰの遺伝子を有しており，これら

よって，食肉や家畜の汚染微生物を効果的に制御も同時に生産している可能性が示唆された。

できる可能性がある。

MC1株からのエンテロシンL50Aの精製時に得られた活性ピークの前後のピークにも微弱な抗菌活性 が 認 め ら れ て お り ，そ れ ら が エ ン テ ロ シ ン

４．要

約

近年，食品の保存をはじめとするさまざまな分
野に安全な抗菌物質が求められている。安全性のL50BおよびＰに由来する可能性もある。
3 . 3 エンテロシンL50A，L50B，Pの特性高い微生物である乳酸菌は種々の発酵食品の保存

エンテロシンL50AとL50Bは類似した一次構造性の向上に寄与しており，乳酸等の有機酸をはじを有しており，その抗菌スペクトルも類似してい

め，抗菌ペプチドであるバクテリオシンなど，さる 。グラム陽性菌全般に広い抗菌スペクトルを

まざまな抗菌物質を生産することが知られてい示し，Table１の結果にも示したように，肉製品る。そこで，食肉や家畜の微生物制御に有効な乳の汚染菌となるListeria属細菌にも抗菌活性を示酸菌由来バクテリオシンを探索することとし，ます。また，エンテロシンL50AとL50Bは相乗的にずさまざまな分離源からバクテリオシン生産乳酸

作用し，さらに強力な抗菌活性を示すことが知ら菌の探索を行った。とくに健康な牛などを分離源れている。一方，エンテロシンＰは，エンテロシとして分離を試みたところ，10株のバクテリオシ

ンL50AやL50Bよりも狭い抗菌スペクトルをもン様抗菌物質生産株が得られ，その中で最も強い

ち，Enterococcus属細菌などに限定的な抗菌活性

抗菌活性を示したE. faecium MC1を選抜し，バを示す 。エンテロシンL50A，L50B，P生産株

クテリオシンの精製・構造解析を行った。種々のはサイレージからの分離例もあり ，サイレージ

液体クロマトグラフィーによって精製バクテリオの雑菌汚染を防いで保存性を高めつつ，サイレー

シンが得られ，その分子量は5220で，エンテロシ

ジを摂取する牛の健康への寄与も考えられる。

ンL50Aと同じＮ-末端アミノ酸配列を有すること

４）

５）

６）

このように，MC1株による生産あるいは生産が明らかとなった。さらにバクテリオシン構造遺の可能性が認められた３種のバクテリオシンは，

伝子のPCR・シーケンス解析によって，MC1株

新奇の構造をもつものではなかったものの，食肉はエンテロシンL50A，L50B，Pの３種のバクテや肉製品の汚染菌の一部に対して抗菌活性を示す

リオシンを生産していることが示唆された。これものであった。MC1株の培養液上清には，グラらのバクテリオシンは，Listeria属細菌等に抗菌© The Ito Foundation

122

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

活性を有することから，食肉や家畜の微生物制御に有効と考えられた。今後，他の分離株が生産するバクテリオシンも併せて，構造や抗菌作用の解析を進め，食肉や家畜の微生物制御への有効性を検証したい。
文献１） 善藤威史，石橋直樹，園元謙二：乳酸菌学会誌，25, 24～33, 2014.
２） Perez, R.H., Zendo, T., Sonomoto, K. : Microbial
Cell Factory, 13, S3, 2014.

３） Zendo, T. : Bioscience, Biotechnology, andBiochemistry, 77, 893～899, 2013.
４） Cintas, L.M., Casaus, P., Holo, H., Hernandez, P.E.,
Nes, I.F., Håvarstein, L.S. : Journal of Bacteriology,
180, 1988～1994, 1998.
５） Cintas, L.M., Casaus, P., Herranz, C., Håvarstein,
L.S., Holo, H., Hernández, P.E., Nes, I.F. : Journal of
Bacteriology, 182, 6806～6814, 2000.
６） Izquierdo, E., Bednarczyk, A., Schaeffer, C., Cai, Y.,
Marchioni, E., Van Dorsselaer, A., Ennahar, S. :Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 52, 1917～
1923, 2008.

© The Ito Foundation

123

成長期女子スポーツ選手の食事摂取状況と畜産物由来
ヘム鉄摂取の有効性についての検討～特に貧血予防とメンタルヘルスに及ぼすヘム鉄の影響に着目して～The study of dietary intake status and effectiveness of heme iron intake
derived from animal products with growing girls sports player

吉

川

豊・坂

元

美

子

（神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科）

Yutaka Yoshikawa and Yoshiko Sakamoto（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Women's University）

We measured the blood hemoglobin estimate and the body composition of girls football
players with endurance. Moreover, we used heme-iron supplement derived from animal
production for girls football players and measured the body composition, effects on nutrient
intake, and effects on spirits by using Profile of Mood States（POMS）test. Consequently, when
we administrated the heme-iron supplement derived from animal production for the anemia
girls football players, they improved the anemia states. However, only intake of the heme-iron
supplement derived from animal production did not change the body composition or spirits.
Intake of supplement corresponding to the nutrition intakes will be capital importance.

１．目

害，疲労骨折，鉄欠乏性貧血など様々な障害の要的因になる。特に，激しい運動が原因でおこる貧血

心身ともに発育期である高校生にとって，健全はスポーツ貧血とよばれている。貧血とは単位容な精神と肉体を育てるための手段としてスポーツ

積血液中の赤血球数またはヘモグロビン濃度が減を行うことは重要である。発育期におけるスポー

少した状態をいい，貧血症状としては，易疲労性

ツ選手は，身体発育に必要な食事量に加え，トや倦怠感，食欲不振，便秘，下痢，無月経，頭痛，

レーニング等による身体活動量の増加に見合った

めまい，耳鳴りなどがあげられる１）。赤血球の寿

多くの食事量を必要とするが，必要なエネルギー

命は通常約４か月であり，骨髄幹細胞で新しく作

摂取量や栄養素の充足に対する選手自身の認識はられることにより常に一定に保たれている。しか非常に薄く，日本人の食事摂取基準にも，ビタミ

し，壊れてしまう赤血球の数が新しく作られる数

ンやミネラル等の栄養素のスポーツ選手への適切を上回ると，血液中の赤血球数が減少し，貧血がな摂取量は示されていない。適切な食事量と栄養引き起こされることとなる。

摂取ができていない場合，健全な精神と肉体を育運動時における鉄の役割は，ヘモグロビンによてることが不可能になるばかりではなく，成長障

る酸素運搬だけではなく，筋肉中のミオグロビン© The Ito Foundation

124

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）による細胞内への酸素の取り込みや，ヘム鉄とし呈した場合には，医薬品の摂取をはじめとする治て含有されているシトクロム電子伝達系における療に頼らざるを得ない。そのため，貧血の症状をATP産生への影響，スーパーオキシドジスムター

呈する前に，簡便な検査や調査方法でアセスメン

ゼを代表とする活性酸素分解タンパク質の構成要トすることが非常に重要である。

素としての働きが特に重要であり，スポーツ選手

そこで，本研究では，持久的能力が必要なスの貧血は貧血の症状と同時に，競技能力の低下をポーツであるサッカー選手の血中ヘモグロビン推

もたらすことが問題視されている。特に持久系の定値と体組成を測定し，消費エネルギーや運動強運動の場合，エネルギーを作り出すために，グル

度に見合った栄養素摂取がなされているかについコースを燃焼させ，その後，脂肪や筋肉中のグリて 栄 養 調 査 を 行 い ，そ れ と 同 時 に 心 理 テ ス ト

コーゲンがエネルギー源として利用される。この（POMS心理テスト）による心理状態，特に疲労エネルギーの産生には酸素が必要であり，このと感との関係性を調査し，貧血予防やスポーツ選手

き全身に酸素を運ぶことがヘモグロビンの役割での理想的な体組成と栄養摂取状況，心理的状況ともある 。つまり，貧血状態になり，ヘモグロビの関連を検討することを目的とした。さらに，発ン量が低下すると，運搬される酸素量も減少する

育期女子スポーツ選手の畜産物由来ヘム鉄摂取のことになり，持久力の低下を引き起こし，試合の必要性を検討するため，３か月間のヘム鉄サプリ

終盤で取り返しのつかない判断ミスを引き起こす

メント（ILS ㈱より供与）の摂取を行い，その効ことにつながりかねないといわれている。

果と心理状態の間の関係性を検討することもあわ２）

スポーツ貧血が起こる原因として，鉄やたんぱ
く質等の栄養摂取不足，ランニングやジャンプ時の着地などへの衝撃による溶血，激しい運動時のせて実施した。
２．方法

血流亢進による赤血球の破壊による赤血球膜構造

本研究の調査対象は，兵庫県の高校サッカー部の可塑性の低下，発汗や尿・便などによる損失がに所属し，すべての測定を行うことができた女子

報告されている３）。特に成長期の女子選手では，部員20名。対象チームは，全国大会での優勝経験

月経による失血が加わって貧血を増長し，スポーを持つ高いレベルのチームである。

ツ貧血やエストロゲンの低下による月経障害も問

栄養摂取状況調査：対象者に，連続した３日間題視されている。通常では貧血の指標（ヘモグロの食事内容を評量法で測定，自記式記入法で調査

ビン値，ヘマトクリット値，血清鉄，総鉄結合能，用紙に記入した。エネルギー・栄養素摂取量は栄血清フェリチン値など）が正常値であっても，激養計算ソフトエクセル栄養君Ver.７（健帛社）をしい運動などで急激に赤血球やヘモグロビンが減用いて算出した。エネルギー摂取量の基準値は日少し，貧血の症状を呈することもあり，適切な栄本人の食事摂取基準2015年版４）の身体活動レベル

養素の摂取と基礎体力に見合ったトレーニングメ

３とし，たんぱく質（Ｐ），脂質（Ｆ），炭水化物

ニューの作成が必要と考えられる。また，貧血予（Ｃ）はPFC比率15：25：60で算出した。ビタミ

防や改善を食品中に含まれる鉄分やタンパク質のン，ミネラルについては，推奨量が設定されてい摂取によって期待できるのは，貧血の状態が軽度る栄養素（ビタミンA，B1，B２，ナイアシン，ビであるか，潜在性鉄欠乏状態のときのみであり，

タミンB6，B12，葉酸，ビタミンC，カルシウム，

激しいトレーニングによって急激に貧血の症状をマグネシウム，リン，鉄，亜鉛，銅，セレン）は© The Ito Foundation

成長期女子スポーツ選手の食事摂取状況と畜産物由来ヘム鉄摂取の有効性についての検討

125

推奨量を，それ以外の栄養素（ビタミンD，E，K）

受け，対象者とその保護者に対して，説明書を配は目安量とした。

布し口頭で説明したのち，被験者が20歳未満のたスポーツ貧血調査：非侵襲式血中ヘモグロビン量測定装置アストリムFIT（シスメックス社製）
を用いて血中ヘモグロビン推定値を測定した。
エネルギー消費量調査：カロリーカウンター
HJA-307IT（オムロン社製）を用いて，エネル
ギー消費量を測定した。

め対象者とその保護者，サッカー部の監督に書面により同意を得たうえで行った。
３．結果と考察3 . 1 サプリメントの摂取別体組成の変化とエ
ネルギー・栄養素摂取量の比較

身体計測：身長はSECA213（SECA社製）を

サプリメント非摂取群を１群，摂取群を２群と用いて，体組成はボディーコンポジションアナラ

してヘモグロビン推定値と身長，体重，体組成のイザーInBody720（株式会社バイオスペース社

３か月後の変化をTable１に，エネルギー消費量製）を用いて測定した。

とエネルギー，栄養素摂取量をTable２に示す。

気分プロフィール検査（POMS心理テスト）：

ヘモグロビン推定値，身長，体重，体組成に群間緊張（Tension-Anxiety）・抑うつ（Depression-

での有意差は見られなかったが，体重で，サプリ

dejection）
・怒り（A n g e r - H o s t i l i t y ）・活気

メント摂取群が増加傾向にあった。筋肉量は摂取（Vigor）・疲労（Fatigue）・混乱（Confusion）の群よりも非摂取群の方が減少しており，脂肪量は６ 因 子 が 同 時 に 測 定 で き る 心 理 テ ス ト POMS

非摂取群の方が多く増加していた。鉄の摂取量に（Profile of Mood State） により，栄養摂取状況

ついては，サプリメント摂取群はサプリメント摂調査と同時期の心理状況を調査した。

取量を差し引くと食事からの摂取量として２群と５）

調査方法：試合数が増加し始める７月に，研究も同じ程度摂取量が増加していた。どちらの群の目的と内容を説明し，同意を得たうえで，食事も，3000キロカロリーを大幅に超えるエネルギー調査を行い，食事調査と同じ日の３日間カロリーを消費しているにもかかわらず，摂取エネルギーカウンターを装着し，エネルギー消費量を測定しは2400キロカロリー前後と少なく，特にたんぱくた。同時に対象選手の身体計測，ヘモグロビン推

質と炭水化物は摂取量が減少しているうえに基準

定値測定，POMS心理テストによる心理状況調査

値を下回っている。このことから，サプリメントを行った。また，上記調査の後，７月から畜産物を摂取することによって鉄の摂取量は基準値を満由来ヘム鉄サプリメント3.5 ㎎／日（ 2 ％鉄分含

たすことができていても，スポーツ選手の体組成

有ヘム鉄使用）を，３か月間摂取させた後，同様を正常に維持，増加させるためには，必要な量のの調査を行った。

エネルギー摂取と，理想的なPFCバランスの食事

統計処理：結果は平均値±標準偏差で示した。
２群間の検定には対応のないｔ検定を，４群間の検定には一元配置分散分析を用いて多重比較検定を行った。解析にはIBM SPSS（ver.19）を用い，
p＜0.05を統計学的に有意とした。

を摂ることが必要であることが示唆された。
3 . 2 サプリメント摂取と心理テストによる気分の変化
POMS心理テストは，現在各種スポーツのメン
タルヘルスを知るための指標として使用され，ト

本研究は，神戸女子大学人間を対象とする研究

レーニングの強度と怪我やスポーツ障害の発生と倫理委員会（承認番号Ｈ27-7）の倫理審査承認をの関連を見る研究がなされるなど，多くのスポー© The Ito Foundation

12.6±1.0
12.4±0.8pre12.9±1.2
12.8±1.2－0.3±0.3－0.1±0.3⊿NSNS

24.8±2.1
22.6±1.5

pre

NS
NS

Ｐ
158.7±4.0
156.6±3.2

24.0±1.922.4±1.4

post－0.7±0.9－0.2±0.5

⊿
NS
NS

Ｐ

0.5±0.6
0.5±0.7⊿

Height（㎝）post

Skeletal muscle mass（㎏）158.2±4.2
156.1±3.1

pre10.3±2.6
8.8±1.5

pre

NS
NS

Ｐ

© The Ito Foundation

72±26
79±21
7±14

95±22
90±16

－5±22
25

pre
post
⊿

pre
post

⊿

3925±1675650

939±914864±1626

713±3043552±2416
2839±2186

2550

Vitamin A（μgRAE）

2550

Values are represented as mean±SD.
＊＊ p<0.01 vs control group（Studentʼs unpaired t-test）.

Referencegroup2（n＝9）

group1（n＝11）

Reference2515±552
66±5562337±639
2341±469
3±563
2450±376

Energy intake（Cal）

Selenium（㎎）3423±252
14±479

post
⊿

（n＝9）

group23437±352
3092±404－345±507
3409±353

pre
post
⊿
pre

group1（n＝11）

Energy consumption（Cal）－0.3±1.4
6.0

3.0±1.0
2.7±0.92.9±2.4
3.6±3.6
0.7±1.9

Vitamin D
（μg）

95.6

90.8±16.3－2.3±19.1

84.2±20.2
82.6±13.1－1.6±20.9
93.1±10.5

Protein（g）－0.1±1.9
6.0

6.9±1.4
6.8±2.3

6.0±1.9
6.7±2.8
0.7±2.7

Vitamin E
（㎎）

70.8

88.8±23.7
16.0±20.9

62.6±24.3
79.6±22.4
16.9±13.572.8±15.5Fat（g）－110±137160

357±118247±109300±225214±112－86±199

Vitamin K
（μg）

382.5

325.4±72.9－20.6±100.4

350.6±98.0
310.7±69.0－40.0±109.5
346.0±61.6

Carbohydrate（g）＊＊55.0±4.0
49.6±2.8

post

11.5±2.6
9.0±2.0post－0.3±0.5
1.2

1.3±0.5
1.3±0.3
0.0±0.6
1.6±0.4
1.4±0.3

Vitamin B1
（㎎）

2100

1916±1243－1545±989

2871±840
2733±741－148±975
3461±392

Potassium（㎎）

Calcium（㎎）

NSNS

0.4±0.4
1.4

1.4±0.4
1.7±0.4
0.3±0.4
1.7±0.3
2.1±0.3

Vitamin B2
（㎎）

650

813±187－22±249662±281564±188－99±208835±2091.2±1.4
0.1±2.9⊿Ｐ－0.1±0.8
0.7±1.0⊿

Body weight（㎏）Amount of body fat（㎏）55.0±4.1
49.0±3.2

pre

310

－1±9
13

33±7
32±6
－2±11
35±5
34±6

Niacin（㎎）

post－0.1±0.6
1.3

1.6±0.4
1.5±0.5－0.1±0.7
1.7±0.3
1.7±0.5

Vitamin B6
（㎎）

900

1378±224８±263

1202±323
1209±2086±273
1371±127

Phoshorus（㎎）－0.2±0.4
0.1±0.5⊿

20.0±1.4
18.7±1.1

post

＊＊

NS
NS

Ｐ

Ｐ

10.5

15.1±2.6
5.5±3.4

8.0±2.6
10.1±2.9
2.1±2.4
9.6±2.3

Iron（㎎）

18.6±4.1
16.1±3.4

pre

NS
NS

12.0±5.8
2.5

5.5±4.2
13.2±6.2
7.7±8.2
5.3±1.2
17.3±5.8⊿257±245250

372±131601±264229±192453±95710±157Ｐ

0.8

1.3±0.3
0.0±0.4

1.2±0.4
1.3±0.3
0.0±0.5
1.3±0.3

Copper（㎎）

NSNS－66±117100

181±121165±131－17±173227±84161±71

Vitamin C（㎎）

2.2±2.5
2.0±1.6

Foric acid
（μg）

8

12±3
1±3

10±2
11±2
1±2
11±1

Zinc
（㎎）

20.8±3.918.0±3.6

post

Body fat percentage（％）

Vitamin B12（μg）－0.6±0.7－0.1±0.3⊿

Intracelluler concent（l）

BMI

21.8±1.6
20.2±0.9274±86.0
256±61－18±96322±45276±70－46±84pre20.5±1.618.8±1.1

Magnesium（㎎）

22.0±1.8
20.1±1.2

pre

NS
NS

Ｐ

平成27年度

Table 2 The energy consumption, energy intake, and nutritional intake of the target person

11.7±0.7
10.8±0.5

post

Ｐ

0.2±0.7
0.4±1.1⊿

Hb（g/dl）

post

Extracellular water concent（l）（ｎ＝11） 12.0±0.8（ｎ＝９） 11.0±0.6pre（ｎ＝11） 15.9±0.9（ｎ＝９） 15.9±0.8

Values are represented as mean±SD.
NS：not significant

group1group2group1group2Age（years）

Table 1 The blood hemoglobin（Hb）concentration and physical situation of the target persons

126
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

成長期女子スポーツ選手の食事摂取状況と畜産物由来ヘム鉄摂取の有効性についての検討

127

Table 3 Effect of heme iron supplement on the ‘Profile of Mood States（POMS）
ʼ
group1（n＝11）
pre

post

group2（n＝9）
⊿

pre

post

⊿

Ｐ

Tension-Anxiety

46±7

44±7

－2±6

46±9

48±10

2±4

NS

Depression-Dejection
Anger-Hostility

49±9
51±10

48±7
51±7

－1±7
1±6

47±8
51±8

49±13
50±12

2±7
－1±8

NS
NS

Vigor

51±11

49±9

－3±9

57±11

51±13

－6±8

NS

Fatigue

50±9

49±8

0±4

44±8

44±9

0±3

NS

Confusion

48±9

46±7

－2±7

51±13

48±12

－3±8

NS

Values are represented as mean±SD.
NS : not significant

（％）

100
n=2
80

n=6

n=7

60
group of fatigue

n=9
40
20
0

n=7
n=5

group of vigor

n=4

post

pre

post

pre
group2group１

Fig. 1 Effect of heme iron supplement on the ‘Profile of Mood States（POMS）
ʼ

ツ現場で利用されている５）。特にオーバートレー

きく低下した。さらに，活気群と疲労群での検討

ニングの評価としてモニターに汎用されている

６）

では，１群，２群ともに３か月後に活気群の減少ことからも，発育期スポーツ選手のメンタルヘルが見られた。今回の調査では，気候の変化や全国スをアセスメントするツールの一つとして利用す大会に向けての試合数の増加などの要因が，サプることができるといわれている。サプリメント非リメント摂取による気分の変化よりも心理状態に摂取群を１群，サプリメント摂取群を２群として大きく影響を及ぼしていることが考えられ，サプ

POMS心理テストの気分の変化をTable３に，６リメント摂取による気分の変化の考察にはいたらつの気分尺度のうち，活気尺度（Vigor）よりもなかった。しかしながら，サプリメントの介入の疲 労 尺 度（Fatigue）の 方 が 低 い 群 を 活 気 群

時期や期間を再考し調査を行うと気分尺度への影（Vigor），疲労尺度よりも活気尺度の方が低い群

響も現われてくることが予想されるため，引き続を疲労群（Fatigue）として各群の人数をFig.１

き調査・検討が必要である。

に示す。群間では有意な差は見られなかったが，２群でサプリメント摂取後の活気の尺度が最も大© The Ito Foundation

128

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Table 4 The blood hemoglobin（Hb）concentration, energy consumption, energy intake, and nutritional intake of thetarget persons
Energy consumption

Energy intake

Protein

Fat

Carbohydrate

Iron
（㎎）

（g/dl）

（Cal）

（Cal）

（ｇ）

（ｇ）

（ｇ）

pre

11.5

3632

2209

82.9

50.3

340.3

6.3

Ａ

post
⊿

11.2
－0.3

2810
－822

2444
235

80.5
－2.4

63.7
13.4

328.8
－11.5

5.8
－0.5

pre

11.2

3203

1412

47.1

42.4

199.6

4.9

Ｂ

post

11.6

3330

2473

93.3

70.4

355.8

9.2

⊿

0.4

127

1061

46.2

28

156.2

4.3

Ｃ

pre
post

11.8
11.5

3793
3694

2751
3204

94.7
111.9

71.6
12.9.9

423.2
388.4

10.3
18.7

group1group2

Hb

Ｄ

Ｅ

⊿

－0.3

－99

452

17.2

58.2

－34.8

8.4

pre

11.5

3105

2272

95.6

58.8

332.9

8.2

post
⊿
pre
post

12.3
0.8
11.2
12.2

3076
－29
3605
3509

2199
－73
2740
3659

79.6
－16.1
95.7
122.3

73.4
14.6
106.2
124.6

295.7
－37.2
317.3
477.9

12.9
4.7
7.7

⊿

1.0

－96

919

26.6

18.4

160.6

15.7
8

2500

2500

95.6

70.8

382.5

10.5

Reference

3 . 3 貧血と推定される選手のエネルギー充足

満たし，貧血が改善されることが期待できることが示唆された。

と栄養素摂取量
介入前の測定において貧血と推定されるヘモグ
ロビン推定値である12 g/dl未満の選手は５名で４．要約あった。それぞれの選手のヘモグロビン推定値と持久的能力が必要なスポーツであるサッカー選

エネルギー消費量，エネルギー摂取量，栄養素摂手の血中ヘモグロビン推定値と体組成を測定し取量をTable４に示す。３か月後にヘモグロビン

た。さらに，消費エネルギーや運動強度に見合っ推定値が貧血の推定値から改善された選手はサプ

た栄養素摂取がなされているかを検討するためのリメント摂取群の２名であった。改善が認められ

栄養調査，発育期女子スポーツ選手の畜産物由来

なかったTable４中のＣの選手はサプリメント摂ヘム鉄摂取の必要性を検討するための３か月間の取前から鉄の摂取量は多いが，ヘモグロビン推定

ヘム鉄サプリメントの摂取を行い，体組成の変化

値が低いことから，ヘム鉄サプリメントで鉄の摂とエネルギー・栄養素摂取量への影響，ならびに取量を増加させても，効果的に吸収されていない

POMS心理テストを行うことにより，気分尺度へ

か体内で利用されていないことが考えられる。一の影響を調査した。その結果，サプリメントの摂方，サプリメント非摂取群の選手は，鉄の摂取量

取のみでは，スポーツ選手の体組成を正常に維を は じ め ，ス ポ ー ツ 選 手 と し て 必 要 な エ ネ ル

持，増加させることは難しいことが分かり，気分

ギー，栄養素摂取量を満たすことができておらの変化に対する影響も認められなかった。一方，ず，貧血の改善にはつながらなかった。以上のこ貧血と推定される選手が，ヘム鉄サプリメントをとから，貧血と推定される選手が，ヘム鉄サプリ

摂取することで，鉄の摂取量の基準値を満たし，メントを摂取することで，鉄の摂取量の基準値を貧血が改善されるデータも得られており，栄養素© The Ito Foundation

成長期女子スポーツ選手の食事摂取状況と畜産物由来ヘム鉄摂取の有効性についての検討

摂取量に応じたサプリメントの摂取が最も有効であることが示唆された。
文
献１） 樋口満：公認アスレティックトレーナー専門科目
テキスト，スポーツと栄養，財団法人日本体育協会，
48～55，財団法人日本体育協会，東京，2009．
２） 鯉川なつえ：陸上競技におけるスポーツ貧血の現状と対策，日本臨床スポーツ医学会誌，16（2）,216～
220, 2008.

129３） 坂本静男：貧血，臨床スポーツ医学，26（―）, 148～152, 2009.
４） 厚生労働省策定：日本人の食事摂取基準［2015年
版 ］の 概 要 ，h t t p : / / w w w . m h l w . g o . j p / f i l e / 0 4 Houdouhappyou.../0000041955.pdf，閲覧日2015/4/10
５）横山和仁，下光輝一，野村忍：診断指導に活かす
POMS事例集，1，金子書房，東京，2010.
６） 横山和仁，下光輝一，野村忍：診断指導に活かす
POMS事例集，29～40，金子書房，東京，2010.

© The Ito Foundation

130

豚増体量に及ぼす暑熱ストレス耐性の遺伝的ばらつきの原因遺伝子を探る
Exploration of genes involved in genetic variation in heat stress tolerance
for growth rate of finishing pig

山

田

宜

永

（新潟大学農学部）

Takahisa Yamada（Faculty of Agriculture, Niigata University）

Microarrays were used to investigate differences in skeletal muscle gene expression
profiles among two finishing pig groups（high-tolerant and low-tolerant）with divergent heatstress tolerance for growth rate under heat stress conditions and control finishing pig group
under non-heat stress conditions, in order to explore genes involved in genetic variation inheat stress tolerance for growth rate of finishing pig. A total of 1163 genes exhibited expression
differences between control group and high-tolerant or low-tolerant groups and also between
high-tolerant and low-tolerant groups, and 583 were upregulated and 580 downregulated in
low-tolerant group as compared to high-tolerant group. Among these genes, we showed that a
set of genes involved in oxidative phosphorylation pathway, for which the upregulated genes
were over-represented, were coordinately upregulated in only low-tolerant group among thethree pig groups. Further, we showed that peroxisome proliferator-activated receptor gamma,
coactivator 1 alpha（PPARGC1A）and fibroblast growth factor 21（FGF21）genes, which havebeen reported to have a role in the induction of expression of the genes involved in oxidative
phosphorylation and the PPARGC1A gene, respectively, exhibited differential expression
profile similar to the gene set. These results suggested that enhanced expression of the FGF21
in response to heat stress in low-tolerant group might affect low heat stress tolerance for
growth rate, as a trigger for heat stress-responsive activation of the PPARGC1A-regulatedoxidative phosphorylation pathway. We thus identified the FGF21 as a candidate for the gene
responsible for genetic variation in heat stress tolerance for growth rate of finishing pig.

１．目

なっている。これまでの肥育豚を用いた統計遺伝的学的研究から，増体量に及ぼす暑熱ストレス耐性

近年の地球温暖化に伴い，豚においては，暑熱（暑熱耐性：暑熱環境下の増体量―適温環境下のストレスによる増体量の低下が深刻な問題となっ増体量を指標とする）には個体間差がみられ，こている。そのために，暑熱ストレスによる増体量のような暑熱耐性のばらつきには遺伝的要因が関低下を抑制することが養豚業界の大きな課題とわるということが知られている１）。このことから，© The Ito Foundation

豚増体量に及ぼす暑熱ストレス耐性の遺伝的ばらつきの原因遺伝子を探る

豚暑熱耐性の遺伝的ばらつきの原因となるDNA

131

2 . 2 マイクロアレイによる発現プロファイリ

変異やその近傍のDNA多型を，当耐性と関連すングる分子マーカーとして取り入れたDNA育種技術

採取した15個（３個体群×５個体）の最長筋サを確立し，高い暑熱耐性へ向けた遺伝的改良を行

ンプルからそれぞれトータルRNAを抽出した。

うことにより，暑熱ストレスによる増体量低下を抽出したRNAとT7 promoter付加オリゴdTプラ

永続的かつ経済的に抑制することができると考えイマーを用いた逆転写により，二本鎖cDNAを合られている。しかし，これまでの研究では，豚暑成 し た 。 合 成 し た 二 本 鎖 cDNA ， T7 RNA

熱耐性と関連する分子マーカーは同定されておらpolymeraseおよびCy3－CTPを用いて，Cy3標識ず，このような分子マーカーの同定に必須な当耐のアンチセンスcRNAを合成し，精製によりプ性の遺伝的ばらつきの原因遺伝子についての知見

ローブを作製した。作製したプローブの定量，品もえられていない。そこで，本研究では，肥育豚

質確認の後，プローブの断片化および豚マイクロの最長筋を用いた発現プロファイリングにより，アレイ（Agilent）へのハイブリダイゼーション

豚暑熱耐性の遺伝的ばらつきと関連する暑熱ストを行った。スキャンニングによるハイブリダイ

レス応答性発現協調変動を示す分子パスウェイ

ゼーション画像データの読み取りおよびシグナル（遺伝子セット）を同定し，このような分子パスの数値化の後，GeneSpring GXプログラムを用いウェイの上流に位置する（トリガーとなりえる）て，15個のアレイの間のばらつきを補正した各個

発現協調変動遺伝子を当耐性についての原因遺伝

体の遺伝子発現量を解析した。シグナル品質の子の候補として同定することを目的とした。

フィルタリングをパスした補正遺伝子発現量に基

２．方
2.1

づき，対照群と高暑熱耐性群の間または対照群と法

低暑熱耐性群の間で発現変動をもち，かつ高暑熱

サンプル

耐性群と低暑熱耐性群の間で発現変動をもつ遺伝（ランドレース種×ラージホワイト種）×デュ子（豚暑熱耐性の遺伝的ばらつきと関連する暑熱

ロック種の三元交雑種の平成26年４月上旬出生のストレス応答性発現変動を示す遺伝子）を検出し雌豚を用いて，暑熱環境下での暑熱耐性にばらつた。

きがみられ始める時点（平成26年８月上旬）での

このような発現変動遺伝子について，Gene

選抜により，当耐性が極端に高い個体５頭を高暑

Cluster 3.0プログラムを用いた階層的クラスター

熱耐性群として，それが極端に低い個体５頭を低解析を行い，３個体群において発現が協調変動し暑熱耐性群として作出した。暑熱耐性は暑熱環境ている遺伝子を選出した。このような発現協調変下の増体量と適温環境下の増体量の差により評価

動遺伝子に相当するアレイ貼付の60mer塩基配列した。また，三元交雑種の平成26年１月中旬出生を用いた豚ゲノムデータベース，RefSeq RNAの雌豚５頭を対照群として作出した。なお，３個

データベースのBLAST検索，えられた遺伝子座体群の作出にあたって，血縁関係のない個体を用名を用いたOrthoデータベースの検索により，ヒいた。さらに，選抜群については選抜時に，対照

トオーソログ遺伝子を同定した。同定したヒト遺群については選抜群と同齢になる平成26年５月中伝子のアノテーション情報を用いて，発現協調変旬に，最長筋を採取した。

動遺伝子が集中する機能カテゴリーおよび分子パスウェイ（豚増体暑熱耐性の遺伝的ばらつきと関© The Ito Foundation

132

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

連する暑熱ストレス応答性発現協調変動を示す機群と高暑熱耐性群の間では発現変動をもっていな

能カテゴリーおよび分子パスウェイ）を同定しかった（Fig.１）。それらのうち60個の遺伝子は，た。さらに，このような分子パスウェイの上流遺対照群と高暑熱耐性群の間かつ対照群と低暑熱耐伝子を検索した。

性群の間で発現変動をもっていた（Fig.１）。こ

2 . 3 リアルタイムPCRによる発現プロファイ

れらの結果から，計1163個（533＋570＋60）の遺伝子は，豚暑熱耐性の遺伝的ばらつきと関連する

リング
このような上流遺伝子のゲノム配列情報に基づ

暑熱ストレス応答性発現変動を示す遺伝子に相当

き，プライマーを設計した。また，上記の15個のすると考えられた。1163個のうち583個の遺伝子

最長筋サンプルから抽出したトータルRNAの逆は，高暑熱耐性群に比べ低暑熱耐性群で発現が増転写によりcDNAを合成した。このようなプライ

加しており，残りの580個の遺伝子は高暑熱耐性

マーおよびcDNAを用いたリアルタイムPCRによ群に比べ低暑熱耐性群で発現が減少していたり，３個体群における上流遺伝子の発現パターン（Fig.２）。

を解析した。リアルタイムPCRでは，EvaGreen

このような1163個の遺伝子のヒトアノテーショ

をインターカレーションダイとしたトリプリケー

ン情報を用いて，発現が増加（583個）または減トでの解析を行い，内部標準としてGAPDH遺伝

少（580個）する遺伝子が集中する機能カテゴ子の発現レベルを用いた。さらに，合成cDNAのリーを解析したところ，発現増加を示す遺伝子

希釈系列を用いて上流遺伝子およびGAPDHのそは，酸化的リン酸化のカテゴリーに集中していれぞれのPCR増幅効率を測定し，これらの増幅効た。また，発現減少を示す遺伝子は，細胞増殖の率を利用した⊿⊿Ct法により各個体の上流遺伝

カテゴリーに集中していた。酸化的リン酸化に関子の発現量を解析した。このような解析により，わる発現増加遺伝子のほとんどは，対照群と高暑上記で同定した分子パスウェイと同様な発現協調

熱耐性群の間で発現変動をもっていないが，それ変動を示す上流遺伝子を同定した。

らの遺伝子のすべてが対照群に比べ低暑熱耐性群
で発現が増加していた（Table１）。つまり，酸化３．結果と考察

的リン酸化パスウェイに関わる遺伝子セットは，

マイクロアレイ解析により，3507個の遺伝子３個体群において低暑熱耐性群のみで協調的な発は，対照群と高暑熱耐性群の間または対照群と低Ｈ≠Ｌ

暑熱耐性群の間で発現変動をもっていた（Fig.
１）。こうして，これらの遺伝子は暑熱ストレス
応答性発現変動を示す遺伝子に相当すると考えら539れた。また，1702個の遺伝子は，高暑熱耐性群と533

低暑熱耐性群の間で発現変動をもっていた（Fig.
１）。1702個のうち533個の遺伝子は，対照群と高暑熱耐性群の間で発現変動をもつが，対照群と低暑熱耐性群の間では発現変動をもっていなかった（Fig.１）。それらのうち570個の遺伝子は，対照群と低暑熱耐性群の間で発現変動をもつが，対照

679

Ｃ≠Ｈ

60
804

570
861

Ｃ≠Ｌ

Fig. 1 Venn diagram of differentially expressed genes

among three pig groups : C ; control, H ; hightolerant and L ; low-tolerant© The Ito Foundation

133

豚増体量に及ぼす暑熱ストレス耐性の遺伝的ばらつきの原因遺伝子を探る
－0.10
－0.07
－0.03
0.00
0.03
0.07
0.10

Ｈ
Ｃ
Ｌ

580 genes (H＞L）

583 genes (H＞L）

Fig. 2 Cluster analysis of the 1163 genes showing expression differences between control

group and high-tolerant or low-tolerant groups and also between high-tolerant andlow-tolerant groups : C ; control, H ; high-tolerant and L ; low-tolerant

２

２

CRTC１

1
0

Expression levels

２

1

H

C

L

CREB１

1
0
２

２

H

C

L

BMP７

２

H

C

L

MAPK14

0
２

H

C

L

PPKAA１

0
２

0
２

H

C

L

TP53

0
２

H

C

L

PPP3CA

C

L

0

0.8
1.2

H

C

L

SIRT１

1

H

C

L

IRF４

1

H

MTOR

1

1

1

1
0

0

1.2

CRTC３

1

1

1
0

２

CRTC２

0
1.2

H

C

L

NOS２

1

H

C

L

0

H

C

L

AKT２

1

H

C

L

20

0

H

C

L
FGF21

15
10
５
0

H

Ｃ

Ｌ

Fig. 3 Expression profile of upstream genes which have been known to have a role in the regulation of

expression of the PPARGC1A gene : C ; control, H ; high-tolerant and L ; low-tolerant© The Ito Foundation

1.09

2.32

2.51
3.49
2.74
3.21
2.78
2.00
3.12
2.04
4.12
2.09
2.39

cytochrome c oxidase subunit VIII-H（heart/muscle）

NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 alpha subcomplex, 3, 9kDa

NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 alpha subcomplex, 6, 14kDa

NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 alpha subcomplex, 11, 14.7kDa

NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 beta subcomplex, 6, 17kDa

NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 beta subcomplex, 8, 19kDa

NADH dehydrogenase（ubiquinone）1, subcomplex unknown, 1, 6kDa

NADH dehydrogenase（ubiquinone）1, subcomplex unknown, 2, 14.5kDa

NADH dehydrogenase（ubiquinone）Fe-S protein 4, 18kDa（NADH-coenzyme Q
reductase）

NADH dehydrogenase（ubiquinone）Fe-S protein 7, 20kDa（NADH-coenzyme Q
reductase）

NADH dehydrogenase（ubiquinone）flavoprotein 3, 10kDa

succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein（Fp）

succinate dehydrogenase complex, subunit D, integral membrane protein

peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1 alphaNDUFA3

NDUFA6NDUFA11NDUFB6NDUFB8NDUFC1NDUFC2NDUFS4NDUFS7NDUFV3SDHA

SDHD

PPARGC1A

2.86

3.21

© The Ito Foundation

－1.26

1.31

1.33

1.54

1.19

－1.04

2.12

－1.71

1.29

1.70

－1.59

1.20

1.37

2.60

2.50

3.27

2.66

4.15

3.09

3.30

3.10

5.79

2.05

3.24

4.84

2.02

2.77

3.12

2.29

8.92

Fold change in expression
in low-tolerant relative tocontrol

平成27年度ａThe values with minus sign represent fold change in expression in control relative to high-tolerant

1.20

2.28

ATP synthase, H＋transporting, mitochondrial Fo complex, subunit C1（subunit 9）

COX8B

1.12

2.43

ATP5G1

2.04

3.67

ATP synthase, H＋transporting, mitochondrial F1 complex, gamma polypeptide 1

Fold change in expression
in high-tolerant relative
to controlａ

ATP synthase, H＋transporting, mitochondrial F1 complex, beta polypeptide

Fold change in expression
in low-tolerant relative tohigh-tolerant

ATP5B

Gene name

ATP5C1GenesymbolTable 1 List of the genes involved in oxidative phosphorylation upregulated in low-tolerant group as compared to high-tolerant group134
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

豚増体量に及ぼす暑熱ストレス耐性の遺伝的ばらつきの原因遺伝子を探る

135

現増加を示した。さらに，酸化的リン酸化パス

CRTC3，FGF21，IRF4，MAPK14，MTOR，

ウェイの活性化は増体量の低下と関連するというNOS2，PPP3CA，PRKAA1，SIRT1，TP53のことが報告されている２）。これらのことから，低３個体群における発現パターンをマイクロアレイ

暑熱耐性群では，酸化的リン酸化パスウェイが低により解析したところ，FGF21遺伝子６）が，唯暑熱耐性と関連する暑熱ストレス応答性活性化を

一３個体群間で発現変動を示し，PPARGC1Aや示すと示唆された。

酸化的リン酸化パスウェイに関わる遺伝子セット

PPARGC1A遺伝子は，酸化的リン酸化パスと同様な発現プロファイル（低暑熱耐性群のみでウェイに関わる遺伝子セットの発現を誘導すると協調的な発現増加）を示した（Fig.３）
。このよ

３）

いうことが知られている 。そこで，PPARGC1A

うな発現プロファイルはリアルタイムPCRによりの３個体群における発現パターンをマイクロアレ

確認された（Fig.４）。暑熱ストレスは，ヒトにイにより解析したところ，酸化的リン酸化パス

おいてFGF21の発現を増加させるということがウェイに関わる遺伝子セットと同様な発現プロ報告されている７）。また，FGF21のマウスでの過ファイル（低暑熱耐性群のみで協調的な発現増

剰発現は増体量を低下させるということが報告さ加）を示した（Table１とFig.３）。このような発れている８）。したがって，低暑熱耐性群でみられ

現プロファイルはリアルタイムPCRにより確認さる FGF21 の 暑 熱 ス ト レ ス 応 答 性 発 現 増 加 が ，れた。暑熱ストレスは，ヒト培養筋衛生細胞およPPARGC1Aを介した酸化的リン酸化パスウェイ

びマウスC2C12細胞においてPPARGC1Aの発現活性化のトリガーとなり，暑熱耐性の低下に影響を増加させるということが報告されている 。ますると示唆された。これらのことから，FGF21を，た，PPARGC1Aのマウスでの過剰発現は，増体

豚暑熱耐性の遺伝的ばらつきの原因遺伝子の候補量の低下につながるということが報告されていとして同定した。FGF21と同じFGFファミリーる 。これらのことから，低暑熱耐性群では，に属するFGF4遺伝子は，ホルスタイン種牛の泌

PPARGC1Aの暑熱ストレス応答性発現増加が，乳量に及ぼす暑熱ストレス耐性の遺伝的ばらつき

酸化的リン酸化パスウェイの活性化に関与し，暑の原因遺伝子の候補になるということが報告され

熱耐性の低下に影響すると示唆された。

ている９）。この報告は，原因遺伝子の有力候補と４）

５）

PPARGC1Aの発現を制御する上流遺伝子，

してのFGF21の同定を支持した。

AKT2，BMP7，CREB1，CRTC1，CRTC2，

Expression levels

3.00000
2.50000
2.00000
1.50000
1.00000
0.50000
0.00000

H

Ｃ

Ｌ

Fig. 4 Expression profile of the FGF21 gene obtained by real-time

PCR analysis : C ; control, H ; high-tolerant and L ; low-tolerant© The Ito Foundation

136
４．要

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

活性化のトリガーとなり，暑熱耐性の低下に影響

約すると示唆され，FGF21を，豚暑熱耐性の遺伝

本研究では，豚増体量に及ぼす暑熱ストレス耐的ばらつきの原因遺伝子の候補として同定した。

性（暑熱耐性）の遺伝的ばらつきの原因遺伝子を探索した。そのために，三元交雑種の肥育雌豚を用いて，暑熱環境下において暑熱耐性が極端に異なる選抜群（高低暑熱耐性群），適温環境下の対照群を作出し，これら３個体群の最長筋について
発現プロファイリングを行った。1163個の遺伝子が，対照群と高暑熱耐性群の間または対照群と低暑熱耐性群の間で発現変動をもち，かつ高暑熱耐性群と低暑熱耐性群の間で発現変動をもつ遺伝子として同定された。1163個のうち583個の遺伝子は，高暑熱耐性群に比べ低暑熱耐性群で発現が増加しており，残りの580個の遺伝子は高暑熱耐性
群に比べ低暑熱耐性群で発現が減少していた。このような遺伝子のうち，発現増加遺伝子が集中する酸化的リン酸化パスウェイに関わる遺伝子セッ
トは，３個体群において低暑熱耐性群のみで協調的な発現増加を示した。さらに，このような遺伝子セットの発現を誘導するPPARGC1A遺伝子お
よびPPARGC1Aの発現を誘導するFGF21遺伝子も同様に，低暑熱耐性群のみで発現増加を示した。これらの結果から，低暑熱耐性群でみられる
FGF21 の 暑 熱 ス ト レ ス 応 答 性 発 現 増 加 が ，
PPARGC1Aを介した酸化的リン酸化パスウェイ

文献１） Zumbach, B., Misztal, I., Tsuruta, S., Sanchez, J. P.,
Azain, M., Herring, W., Holl, J., Long, T., Culbertson,
M. : Journal of Animal Science, 86, 2076～2081, 2008.
２） Sudre, K., Cassar-Malek, I., Listrat, A., Ueda, Y.,
Leroux, C., Jurie, C., Auffray, C., Renand, G., Martin,P., Hocquette, J. F. : Meat Science, 70, 267～277, 2005.
３） Mootha, V.K., Lindgren, C.M., Eriksson, K. F.,
Subramanian, A., Sihag, S., Lehar, J., Puigserver, P.,
Carlsson, E., Ridderstrale, M., Laurila, E., Houstis, N.,
Daly, M. J., Patterson, N., Mesirov, J. P., Golub, T. R.,
Tamayo, P., Spiegelman, B., Lander, E. S.,
Hirschhorn, J. N., Altshuler, D., Groop, L. C. : Nature
Genetics, 34, 267～273, 2003.
４） Yamaguchi, T., Suzuki, T., Arai, H., Tanabe, S.,
Atomi, Y. : American Journal of Physiology. Cell
Physiology, 298, C140～148, 2010.
５） Miura, S., Tomitsuka, E., Kamei, Y., Yamazaki, T.,
Kai, Y., Tamura, M., Kita, K., Nishino, I., Ezaki, O. :American Journal of Pathology, 169, 1129～1139,
2006.
６） Potthoff, M. J., Inagaki, T., Satapati, S., Ding, X.,
He, T., Goetz, R., Mohammadi, M., Finck, B. N.,
Mangelsdorf, D. J., Kliewer, S. A., Burgess, S. C. :Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America, 106, 10853～10858,
2009．
７） Lee, J. B., Kim, T. W. : Journal of Thermal
Biology, 45, 163～167, 2014.
８） Goetz, R. : Nature Reviews. Endocrinology, 9, 506～508, 2013.
９） Hayes, B. J., Bowman, P. J., Chamberlain, A. J.,
Savin, K., van Tassell, C. P., Sonstegard, T. S.,
Goddard, M. E. : PLoS One, 4, e6676, 2009.

© The Ito Foundation

137

揮発性脂肪酸が牛筋肉内脂肪細胞分化に及ぼす影響
Effect of volatile fatty acid on bovine intramuscular adipocyte
differentiation

溝

口

康・松

野

泉

（明治大学農学部，明治大学大学院農学研究科）

Yasushi Mizoguchi and Izumi Matsuno（School of Agriculture, Meiji University）

In this study, to clarify the regulatory mechanism of bovine intramuscular adipogenesis,
we examined the effect of acetic acid （one of volatile fatty acids） and insulin on the
differentiation of adipocyte（triglyceride（TG）content and glucose uptake）and the gene
expression levels of glucose transporter （GLUT） 1 and GLUT4 using a clonal bovine
intramuscular preadipocyte（BIP）cell line. The BIP cells were harvested at six day after
adipogenic stimulation. The gene expression levels were validated by quantitative real-time
PCR. Lipids were extracted as TG according to the Bligh and Dyer method, and the amount of
TG was measured by enzyme method. The amount of glucose uptake in adipocyte measured
with a fluorescent 2-NBDG. Treatment of the BIP cells with 10μg/ml Insulin plus 100 mM
acetic acid significantly increased TG content and glucose uptake amount in adipocyte,
compared to non-treatment. Both insulin and acetic acid was increased GLUT4 gene
expression level, on the other hand, decreased GLUT1 gene expression level. These results
indicate that acetic acid and insulin are necessary for TG synthesis in bovine intramuscularadipogenesis.

１．目

味しさは筋肉内の脂肪細胞に含まれる脂肪の質と的量に大きく影響することが考えられる。

日本の在来種である黒毛和種は，筋肉内に脂肪

牛の飼料に含まれる炭水化物（糖質・食物繊が沈着する「霜降り」形質に長けており，経済的維）は，第１胃に生息している微生物によって酢にも価値がある。近年，より付加価値の高い牛肉

酸・プロピオン酸・酪酸などの揮発性脂肪酸が産生産を実現するために，美味しさに関連する因子生される。その生産割合は，酢酸55～70％，プロの探索が精力的に行われている。これまでの官能

ピオン酸20～30％，酪酸10～20％の範囲であると試験結果より，オレイン酸などの一価不飽和脂肪

報告されている２）。牛の脂肪組織における脂肪酸酸割合が高いほど，牛肉の風味の強さに影響して合成の主な基質は酢酸であると考えられておおり，さらに「霜降り」割合が高いほど，食感がり３），酢酸はアセチルCoAを経て脂肪酸合成経路

良くなるとの報告がある１）。すなわち，牛肉の美に入り，脂肪酸合成酵素（Fatty Acid Synthase :© The Ito Foundation

138

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

FASN）や脂肪酸不飽和化酵素（Stearoyl-CoA現しているのがグルコース輸送体１であり，これDesaturase : SCD）などの作用により様々な脂肪はほとんどすべての組織で発現し，グルコース輸酸が合成される３）。

送体４とは異なる調節機構で制御されている６）。

反芻動物において揮発性脂肪酸は，インスリン

揮発性脂肪酸の一種である酢酸とインスリンおよ

分泌を刺激することが知られている 。インスリ

びグルコース輸送体が，牛筋肉内脂肪細胞においンは，グルコースを細胞内に取り込ませることにて脂肪蓄積やグルコースの取り込みに影響していより血糖値を減少させ，脂肪細胞においては脂肪るかは不明である。

４）

蓄積を促進することによりその役割を担っていそこで本研究では，麻生らによって樹立されたる。インスリンは細胞膜に存在するインスリン受

黒毛和種由来の筋肉内脂肪前駆細胞株（Bovine

容体に結合すると，細胞質に存在するインスリン11）
Intramuscular Pre-adipocyte : BIP）の分化誘導

受容体基質をリン酸化することにより活性化させ系を「霜降り」形成のモデルと捉え，「酢酸」とる。その後，PI3KやAktを介したシグナル伝達に「インスリン」の脂肪蓄積と細胞内へのグルコーよりグルコース取り込みや脂肪酸合成酵素などのスの取り込みおよびグルコース輸送体遺伝子発現

発現を促進させる

動態への影響について，解析することとした。

。FASNやSCDなどの酵素

５，６）以外にも，脂肪酸合成にはステロール応答結合タン パ ク 質 な ど の 調 節 因 子 も 関 与 し て い る ３）。

２．方法

FASNはアセチルCoAからパルミチン酸合成に関2.1

与しており，SCDは飽和脂肪酸に炭素の二重結合

BIPは，10％牛胎児血清，ペニシリンとストレを付与することにより不飽和脂肪酸に変換させプトマイシンを含むDulbeccoʼs modified Eagleʼsる。黒毛和種において，これらの遺伝子多型が不培地で37℃・５％CO２条件下で培養を行った。本

飽和脂肪酸割合などに影響を及ぼすことが明らか

細胞株は，東北大学大学院農学研究科 麻生久教となっている。以上のことから揮発性脂肪酸

授に提供していただいた。常法に従い11），増殖おは，牛における脂肪細胞分化に直接的・間接的によび分化誘導（インスリン，デキサメタゾン，オ

深く関与しているとことが考えられる。

クタン酸，酢酸添加）を行った。インスリンおよ

７～９）

細胞培養および分化

牛筋肉内脂肪細胞においてグルコースも重要な

び酢酸濃度は，実験条件に従い添加した。分化誘基質であることも報告されている 。グルコース

導は６日間行い１日おきに分化誘導培地の交換を

は細胞膜においてグルコース輸送体により細胞内行った。

に取り込まれる。グルコース輸送体は，多くのア

2.2

イソフォームが存在しており，それぞれ組織特異RNA抽 出は ，ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep的に発現している10）。グルコース輸送体４は骨格

System（Promega）を用いて添付プロトコール

筋や脂肪組織などで発現している。グルコース輸に 従 い 実 施 し た 。 Total RNA 量 は ， 吸 光 度

送体４の特徴の一つとしてインスリン依存性があ（260nm）を測定し濃度を決定した。Total RNAる。通常グルコース輸送体４は細胞内小胞に存在は，電気泳動を行い28S rRNAと18S rRNAのバしており，インスリン刺激により細胞膜上へとトンドを目視することにより，RNAが分解していランスロケーションし，細胞内にグルコースの取ないことを確認した。

３）

り込みを促進させる。この他に脂肪組織で発

５，６）

2.3

© The Ito Foundation

RNA抽出

cDNA合成揮発性脂肪酸が牛筋肉内脂肪細胞分化に及ぼす影響

139

cDNA は Total RNA を 鋳 型 と し て ReverTra

群（０ng/mlインスリン・０mM酢酸）と比較しAce （TOYOBO）逆転写酵素による逆転写反応て有意に増加した。さらに，10μg/mlインスリ

によって合成した。

ン・100mM酢酸群は50ng/mlインスリン・10mMⓇ2.4

酢酸群と比べて有意に増加した。グルコースの取Real-time PCR

解析対象遺伝子は，グルコース輸送体１およびり込み量は，０ng/mlインスリン・10mM酢酸群，

グルコース輸送体４とした。cDNAを用いて，定50ng/mlインスリン・０mM酢酸群，50ng/mlイ

量Real-Time Polymerase Chain Reaction

ンスリン・10mM酢酸群は，対照群と比較して変（RT-PCR）に よ り 遺 伝 子 発 現 解 析 を 行 っ た 。

化はなかった。10μg/mlインスリン・100mM酢

RT-PCR は 7300 standard Real time PCR system

酸群は，他群と比較して有意に増加した。以上の（Applied Biosystems）を用いた。増幅反応試薬ことから，酢酸とインスリンは相乗してトリグリ

はセリド蓄積とグルコースの取り込み量を促す可能

的， THUNDERBIRD TM Probe qPCR Mix（TOYOBO）を用いた。解析方法はTaq Manプ

性を示唆した。

ローブを用い，⊿⊿ct法により数値化した。定量

10μg/mlインスリン・100mM酢酸群におけるで使用する内在性のコントロールには，ハウスグルコース輸送体４遺伝子発現量は，50ng/mlイ

キーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３-

ンスリン・10mM酢酸群と比較して有意に増加しリン酸脱水酵素（GAPDH）を用いた。

た。一方，10μg/mlインスリン・100mM酢酸群2.5におけるグルコース輸送体１遺伝子発現量は，トリグリセリドの抽出と測定に50ng/mlインスリン・10mM酢酸群と比較して減従 っ て 行 っ た 。ト リ グ リ セ リ ド の 定 量 は ，少傾向を示した。酢酸は濃度依存的にグルコース

triglyceride E-test kit（Wako）を用いた酵素法

輸送体４遺伝子の発現量を増加させること13），グにより決定した。

ルコース輸送体４はインスリンに応答して発現量

トリグリセリド抽出はBligh and Dyer法

2.6

12）

グルコースの取り込みが増加するという知見14）から，インスリンと酢酸

細胞内へのグルコース取り込み量の解析は，Glucose Uptake Cell-Based Assay Kit（Caymanの相乗効果によりグルコース輸送体４遺伝子発現量を増加させたと考察した。

chemical）を用いて，添付プロトコールに従っ

本研究で実施したトリグリセリド蓄積量，グルた。グルコース取り込み量は，励起光／蛍光＝コースの取り込み量，グルコース輸送体１および485/535nm条件のもと，マルチモードプレート

グルコース輸送体４遺伝子発現量の解析より，牛リーダー（Enspire, Perkin Elmer Japan）を用い

筋肉内脂肪細胞においてグルコース輸送体１ではて測定した。

なくグルコース輸送体４がインスリンと酢酸濃度

2.7

統計解析

依存的に増加し，グルコースの取り込み量を増加

分散分析後，Tukey法を用いて５％水準で有意差の有無を解析した。

させることで，その過剰なエネルギーをトリグリ
セリドにおける脂肪滴に蓄積した可能性を示唆した。反芻動物の脂肪組織や筋肉におけるグルコー

３．結果と考察ス輸送体４遺伝子・タンパク質発現やインスリン

分化誘導後６日目においてトリグリセリド蓄積に誘導されるグルコース輸送体４トランスロケー

量は，50ng/mlインスリン・10mM酢酸群は対照

ションは，ヒトやげっ歯類と比較するとその能力© The Ito Foundation

140

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）が低いと報告されている５）。このことから，グルリド蓄積には酢酸とインスリンの両方が重要であコースの取り込み量が単胃動物と比較して少ないると考察した。

ことが考えられる。本研究において，単胃動物との比較は行っていないが，牛筋肉内脂肪細胞におけるグルコースの取り込みは，インスリンだけではなく酢酸が加わることによって促進されることを示した。よって，インスリン伝達経路内で酢酸がどのプロセスに作用しているかを明らかにしていく必要があると考察した。本研究における分子
生物学的手法により，栄養素（揮発性脂肪酸・グルコース）とホルモン（インスリン）の調節が，「霜降り」牛肉生産の向上に重要であることを示唆した。今後は，より明確な指標を示すことができるよう、さらなる研究を推進していく予定であ
る。
４．要

約

本研究は，牛筋肉内脂肪細胞分化において揮発性脂肪酸の一種である酢酸とインスリンがどのような影響を与えるかを，トリグリセリド蓄積，グ
ルコースの取り込み量およびグルコース輸送体遺伝子発現より検討した。牛筋肉内脂肪前駆細胞株を用いて，酢酸濃度およびインスリン濃度を変化させた群を作成し，分化誘導後６日後にサンプリングを行った。グルコース輸送体１およびグルコース輸送体４遺伝子の発現解析をReal TimePCRによって実施した。トリグリセリドはBlighand Dyer法を用いて抽出した。トリグリセリド
含量は酵素法により測定した。グルコース取り込
み量は蛍光標識した２-NBDGを用いて測定した。
トリグリセリド蓄積量・グルコースの取り込み
量・グルコース輸送体４遺伝子発現量は，酢酸とインスリンによって相乗的に増加した。一方，グルコース輸送体１遺伝子発現量は，グルコース輸
送体４遺伝子発現量と逆の効果を示した。以上のことから，牛筋肉内脂肪細胞におけるトリグリセ

文献１） 農文協編：最新農業技術，畜産，vol.8，農山漁村
文化協会，東京，235～243, 2015.
２） 農文協編：肉牛大事典，農山漁村文化協会，東京，
153～165, 2013.
３） 肉用牛研究会：肉用牛の科学，養賢堂，東京，
295～298, 2015.
４） 佐野宏明：反芻動物における揮発性脂肪酸によるインスリン分泌および作用の調節，日本畜産学会報，
68, 993～1002, 2002.
５） Sasaki, S. : Mechanism of insulin actin on glucose
metabolism in ruminants, Animal Science Journal,
73, 423～433, 2002．
６） Madina, R. A., Owen, G. I. : Glucose transporters:
expression, regulateon and cancer,BiologicalResearch, 35, 9～26, 2002.
７） Taniguchi, M., Utsugi, T., Oyama, K., Mannen, H.,
Kobayashi, M., Tanabe, Y., Ogino, A., Tsuji, S. :Genotype of stearoyl-coA desaturase is associatedwith fatty acid composition in Japanese Black cattle,
Mammalian Genome, 15, 142～148, 2004.
８） Hoashi, S., Ashida, N., Ohsaki, H., Utsugi, T.,
Sasazaki, S., Taniguchi, M., Oyama, K., Mukai, F.,
Mannen, H.:Genotype of bovine sterol regulatory
element binding protein-1（SREBP-1）is associatedwith fatty acid composition in Japanese Black cattle,
Mammalian Genome, 18, 880～886, 2007.
９） Abe, T., Saburi, J., Hasebe, H., Nakagawa, T.,
Misumi, S., Nade, T., Nakajima, H., Shoji, N.,
Kobayashi, M., Kobayashi, E. : Novel mutations of
the FASN gene and their effect on fatty acidcomposition in Japanese Black beef, Biochemical
Genetics, 47, 397～411, 2009.
10） Mueckler, M., Thorens, B.:The SLC2（GLUT）
family of membrane transporters, Molecular Aspectsof Medicine, 121～138, 2013.
11） Aso, H., Abe, H., Nakajima, I., Ozutsumi, K.,
Yamaguchi, T., Takamori, Y., Kodama, A., Hoshino,
F. B., Takano, S. : A preadipocyte clonal line frombovine intramuscular adipose tissue : nonexpressionof GLUT-4 protein during adipocyte differentiation,
Biochemical and Biophysical ResearchCommunications, 213, 369～375, 1995.
12） Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. :Comparison of the Bligh and Dyer and Folch
Methods for Total Lipid Determination in a Broad
Range of Marine Tissue, Lipids, 36, 1283～ 1287,
2001.
13） 溝口康：牛肉の質に関連する新たな脂肪酸合成経路の探索とバイオマーカーの同定，公益財団法人伊© The Ito Foundation

揮発性脂肪酸が牛筋肉内脂肪細胞分化に及ぼす影響
藤記念財団，平成25年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，32, 84～89, 2014.
14） Suzuki, K., Kono, T. : Evidence that insulin causes
translocation of glucose transport activity to the141plasma membrane from an intracellular storagesite, Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America, 77, 2542～2545, 1980.

© The Ito Foundation

142

ブランド豚肉生産用原種豚の遺伝的多様性の維持に関する研究
Sustainability of genetic diversity in original pig strains used for branding
pork

古

川

力・野

村

こ

う・高

橋

幸

水

（東京農業大学農学部）

Tsutomu Furukawa, Koh Nomura and Yukimizu Takahashi（Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture）

Tokyo X was developed using Berkshire, Duroc, and Beijing black pig in 1997 as the first
synthetic pig strain in Japan and has been maintained for 17 years. Consequently, this strain
may contain less genetic diversity. In this study, a pedigree analysis was conducted to calculate
the observed inbreeding coefficient（F）, expected inbreeding coefficient under random mating（ f ）, the observed relationship coefficient（R）, and genetic contribution rate（GCR）. Further,estimation of the inbreeding depression of reproductive traits was conducted using a general
regression model. The data analyzed were the pedigree records from 1990 to 2014 and the
reproductive records from 1997 to 2014. The reproductive traits analyzed were the total
number of piglets born including mummification（TNB）, number of piglets born alive（NBA）,
number of piglets born dead（NBD）, and number of piglets weaned（NW）. In 1997, the meanF , f , and R values were 6.9％，9.3％，and 20.0％，
respectively. In 2014, the mean F , f , and R
values reached 11.8％，14.7％，and 26.6％，respectively. GCR in male founders began to change
in 2000 but has plateaued since 2004. In 2014, GCR differed widely depending on theindividuals. A similar result was shown in female founders. The effects of F in dams, sires, andlitters were not significant for all traits（P＞0.05）. The effects of F in dams tended to decrease
reproductive traits. In particular, TNB tended to decrease 0.88 piglets as F increased by 10％．
The estimates of heritability for TNB, NBA, NW, and NBD were 0.11, 0.07, 0.05, and 0.03,
respectively. This result indicates that the reproductive traits of Tokyo X can be improved.
The 30 microsatellite markers indicated large genetic diversity of Tokyo X and these markers
would be used to evaluate relationship among individuals. It was recommended that thegenetic structure using markers should be analyzed to maintain genetic diversity of Tokyo X.

１．目

TOKYO Xなどのブランド豚肉には系統豚が利用的されている。ここで，TOKYO Xは北京黒豚，バー

国産豚肉の高付加価値化としてブランド豚肉がクシャー種，デュロック種の３品種を基礎豚とす生産されている。ローズポーク，ハマユウポーク，

る日本初の合成系統であるトウキョウＸ１）のブラ© The Ito Foundation

ブランド豚肉生産用原種豚の遺伝的多様性の維持に関する研究

ンド豚肉である。

143

液サンプルを東京都農林水産振興財団青梅畜産セ

系統豚は50頭程度の小集団で選抜育種され，維ンターから入手した。血統情報は個体ごとに個体持されているため，維持年数が経過するに伴い血番号，父番号，母番号，性および生年月日より構縁のあるもの同士の交配が避けられない。そのた成されていた。繁殖記録は母豚番号，交配雄番号，

め，近交度の上昇に伴う遺伝的多様性の減少や繁

産歴，分娩年月日，総産子数（TNB），分娩総数，

殖能力の低下が危惧されている。一般に，系統豚生産頭数（NBA），死産頭数（NBD），黒子数，

では，近交度の上昇を避けるために，血統の管理

哺 乳 開 始 頭 数 ，哺 乳 中 死 亡 頭 数 ，離 乳 頭 数を厳密に行うとともに，種豚間の血縁係数を算出（NW），耳刻入頭数から構成されていた。

して血縁の遠いもの同士の交配を行うなどの対策

2.2がとられているが，繁殖能力に対する近交の影響先に開発した近交係数および遺伝的寄与率計算は明らかにされていない。

統計解析

シートcoanとGRC３）を用いて，系統造成開始以

従来の血統情報に基づく近交度の評価では，同降について年ごとの集団の近交係数（F ），共祖

じ血統情報を持つ個体は同祖的遺伝子をホモで持係数（ f ），血縁係数（R），遺伝的寄与率（GCR）

つ確率は等しくなり，同じ近交係数が算出されを計算し，年ごとの遺伝的多様性の推移を求めた。

る。しかし，ホモ化の確率は同じであっても，両次のモデルを用いて繁殖能力に影響する非遺伝

親の相同遺伝子のどちらを受け取るかは個体に的要因の効果，すなわち，年次，月，産次の主効

よって異なる。そこで，個体の遺伝子が両親の相果と母豚，父豚，子豚の近交係数の効果を求めた。

同遺伝子のどちらに由来するかを評価するため

xijkl＝μ＋yi＋mj＋pk＋b１Fd＋b２Fs＋b３Fo＋εijklに，多型性の高いDNAマーカーを指標に用いる

ここで，xijklは各繁殖形質の測定値，μは全平ことが考えられ，マイクロサテライトなどのホモ

均，yi，mj，pkは年次 i，月 j，産次k の母数効果，化の程度から近交度を評価する試みがなされていFd，Fs，Foは母豚，父豚，産子の近交係数，b1，

２）

る 。

b2，b3は母豚，父豚，産子の近交係数に対する偏ここでは，血統が詳細に判明している系統豚ト

回帰係数，εijklは残差である。解析には統計解析

ウキョウＸについて，まず，血統情報から個体のソフトウェアＲ４）のaov関数を用いた。

近交係数や個体間の血縁係数などを算出し，集団繁殖形質の遺伝率，永続的環境分散が表型分散の遺伝的多様性の推移を評価した。次に，系統豚に占める割合（以下永続的環境係数，pe２），表型維持群の繁殖成績から，近交度の上昇が繁殖能力相関および遺伝相関はプログラムVCE 6.0５）を用に及ぼす影響を検討した。さらに，現有集団のいた多形質反復率アニマルモデルにより推定し

DNAマーカーの遺伝子型を分析して，マーカー

た。母数効果は年次（1997年から2014年），産次

情報に基づく遺伝的多様性を評価した。

（初産から10産）とし，変量効果は母豚の相加的

２．方
2.1

遺伝効果，母豚に対する永続的環境効果とした。

法

解析形質はTNB，NBA，NBDおよびNWとし，材料分析に用いた統計モデルは以下のとおりである。

トウキョウＸについて，1991年の造成開始から

xijklm＝μ＋yi＋pj＋ak＋pel＋εijklm

2014年までの血統情報，1997年の維持開始から

ここで，xijklm は各繁殖形質の測定値，μは全2014年までの繁殖記録，2014年繁殖集団72頭の血平均，yi ，pj は年次 i，産次 jの母数効果，ak ，pel

© The Ito Foundation

144

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

は母豚 k の相加的遺伝効果および母豚 k に対する
永続的環境効果ｌの変量効果，εijklmは残差である。
2.3

３．結果と考察3.1

マイクロサテライト多型解析

血統情報に基づく遺伝的多様性の推移

2014年繁殖個体のDNAは，血液サンプルから

血統記録は，造成群は雄雌合計293頭，系統認

フェノール・クロロホルム法にて抽出した。抽出定を受けたのは雄10頭，雌32頭であり，維持群はしたDNAは国際動物遺伝学会議および国際連合

雄110頭，雌202頭により構成されたが，繁殖に寄食糧農業機関において推奨されているマイクロサ

与したのは雄72頭，雌101頭であった。

テライトマーカー30座位を用いてPCRにより目的

F, f および R はFig.１のとおりであり，維持開領域の増幅後，シークエンサーを用いてフラグメ

始時においてそれぞれ6.9％，9.3％，20.0％であっント解析を行った。フラグメント解析により決定

たが，2014年にはそれぞれ11.8％，14.7％，26.6％

し た 遺 伝 子 型 を も と に ，プ ロ グ ラ ム PopGeneに増加した。期間を通して年あたりの上昇率はそ

ver1.3を用いて平均対立遺伝子数（NA），有効対

れぞれ0.28％，0.29％，0.40％であったが，Fは立遺伝子数（NE），ヘテロ接合度の期待値（HE）

2002年，R は2005年を境に上昇率の鈍化がみられおよび観測値（HO），多型情報含有値（PIC），

た。年次あたりの上昇量で比較するとトウキョウ

Ｆ統計量（FIS）を算出した。また，METAPOP

Ｘは従来の系統豚維持群６，７）よりも小さく，近交を用いてマーカー近交度（FMS），マーカー共祖の抑制が効果的であったといえる。
認定豚のGCRは，雄集団では10頭で維持を開係数（ fMS）を求めた。

始しており，2000年付近から偏りが生じ始めた

30

y = 20.4 + 0.40x

25
20

y = 10.2 + 0.29x

% 15
10

y = 7.4 + 0.28x

5

19

97
19
98
19
99
20
00
20
01
20
02
20
03
20
04
20
05
20
06
20
07
20
08
20
09
20
10
20
11
20
12
20
13
20
14

0

f

F

R

Fig. 1 Annual changes in the observed relationship coefficient（R）, observed inbreeding

coefficient（F）,and expected inbreeding coefficient under random mating（f）© The Ito Foundation

145

ブランド豚肉生産用原種豚の遺伝的多様性の維持に関する研究が，2004年以降はおおむね横ばいになり，2014年

Table１に示した。遺伝率はTNBで0.11，NBAで時点では認定豚２頭の寄与率が０となっていた。

0.07，NWで0.05，NBDで0.03であった。遺伝相関

認定豚の雌のGCRは，雄の場合と同様に，2000

では，TNBとNBA，NW，NBD間およびNBAと年付近から変化し始め，2004年以降はおおむね横NW間で0.80以上の非常に高い相関を示した。

ばいになり，寄与率を持っている個体数は認定時

NBDとNBA，NW間の遺伝相関は0.6程度であっの32頭から2014年において22頭にまで減少した。

た が ，標 準 誤 差 が 大 き か っ た 。表 型 相 関 で は雄，雌とも，寄与率の推移は個体により大きく異TNB，NBA，NW間は0.6以上の相関であったが，なっていた。

NBDとNBA，NWとの間には負の低い相関がみ

3.2

繁殖形質における近交退化の評価られた。永続的環境係数はTNBの0.15からNBD

繁殖形質に及ぼす要因において，産次の効果はの0.06の範囲であった。繁殖形質の遺伝パラメー

すべての形質で有意性を示し，年次の効果は７形

タ推定値はこれまでの報告とおおむね一致し９），

質で有意であったが，月の効果はほとんど有意で遺伝率は低いが遺伝的改良の余地はあると考えらなかった。母豚，父豚，産子の各近交係数の効果れた。

はすべての形質において５％水準では有意性を示3.3

さなかったが，母豚の近交係数はTNBに対してマイクロサテライトマーカーにおける多様性指10％水準の影響がみられ，近交係数10％上昇あた

標の30座位平均はTable２のとおりであり，NAは

り0.88頭減少する傾向がみられた。これはランド

4.3，NEは2.77，PICは0.54と多型性にとみ，ヘテ

レース種維持集団における傾向とほぼ同程度のもロ接合性はHO が0.61，HE が0.60と観測値と期待のであり８），今後も計画的な交配により近交係数

値に差はなかった。F とFMS との相関は0.09と低を抑制することが可能と考えられた。

かったが，f とFMS との相関は0.48と有意であり主な繁殖形質における遺伝的パラメ－タをDNAマーカーに基づく遺伝的多様性（Fig.２），血縁関係の評価にはマイクロサテライ

Table 1 Estimates of genetic parameters for major reproductive traits
TNB

NBA

NW

NBD

TNB

0.11

0.96

0.88

0.80

NBA

0.76

0.07

0.95

0.62

NW

0.61

0.85

0.05

0.54

NBD

0.33

－0.32

－0.33

0.03

pe 2

0.15

0.10

0.12

0.06

Estimates of heritability（diagonal）, genetic correlation（above diagonal）, phenotypic correlation（below diagonal）, and permanent
environmental coefficient（ p 2e ＝σ2pe/σp2 ）. TNB : total number of born, NBA : number of born alive, NW : number of weaning, NBD :number of piglets born dead.
Table 2 Estimates of genetic diversity based on 30 microsatellite markers
NA

NE

HE

HO

PIC

FIS

Mean

4.30

2.77

0.603

0.610

0.544

－0.019

SD

1.86

0.86

0.139

0.152

0.175

NA : total number of alleles, NE : effective number of alleles, HO : observed heterozygosity, HE : expected heterozygosity under
Hardy-Weinberg equilibrium, PIC : polymorphic information contents, FIS : F-statistics．

© The Ito Foundation

146

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

70%
65%
60%
55%

fMS

50%
45%
40%
35%
30%
25%
20%
0%

5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45% 50% 55% 60%

fFig. 2 The correlation between coancestry estimated using pedigree records（f）

and that using MS markers（fMS）

トが有効であることが示された。小林ら１）はF とともに遺伝率を推定した。解析データはトウキョ

FMSとの間に高い相関を見いだしたが，トウキョ

ウＸの血統記録（1990年～2014年）および分娩記

ウＸは交配が計画的に管理されているため，血統録（1997年～2014年）であった。F，f およびRに基づく近交係数はきわめて均質となり，相関がは1997年ではそれぞれ6.9％，9.3％および20.0％

低くなったと考えられた。

であったが，2014年にはそれぞれ11.8％，14.7％以上のことから，トウキョウＸの遺伝的多様性

および26.6％まで上昇した。認定豚の雄のGCRはを維持するためには，マーカー情報をもとに遺伝

2000年頃から偏りが生じ始め，2004年以降はおお的構造を解析し，マーカー情報を用いた交配計画

むね横ばいであった。寄与率の推移は個体によりを検討する必要がある。

大きく異なり，雌のGCRでも類似した結果を示４．要した。繁殖形質に対する各近交度の効果は全形質

約において５％水準では有意性を示さなかったが，トウキョウＸはバークシャー種，デュロック

母豚の近交度の上昇に伴い繁殖性が低下する傾向

種，北京黒豚を基礎品種に1997年に系統認定されがみられ，TNBでは近交係数10％上昇あたり0.88

た日本初の合成系統豚である。トウキョウＸは系

頭 減 少 す る 傾 向 が み ら れ た 。遺 伝 率 は TNB ，

統認定後17年を経過しており，近交度の蓄積によ

NBA，NBDおよびNWでそれぞれ0.11，0.07，0.03

る近交退化が危惧されている。そこで血統情報かおよび0.05と推定され，繁殖形質の改良効率は高ら実際の平均近交係数（ F ），任意交配時の平均

くないが，育種改良の余地があることが示され

近交係数（ f ），平均血縁係数（R）および遺伝た。マイクロサテライトにもとづく遺伝的多様性的寄与率（GCR）を算出し，遺伝的多様性を評は高く，血縁度の評価には有効であることが示唆価した。総産子数（TNB），生産頭数（NBA），

された。トウキョウＸの遺伝的多様性を維持する

死産頭数（NBD）および離乳頭数（NW）に対すためには，マーカー情報をもとに遺伝的構造を解る母豚，父豚，産子の近交度の影響を分析すると析し，マーカー情報を用いた交配計画を検討する© The Ito Foundation

ブランド豚肉生産用原種豚の遺伝的多様性の維持に関する研究ことが求められた。
謝

辞

本研究にあたり東京都農林水産振興財団青梅畜産センターよりトウキョウＸの血統，繁殖成績，血液を提供いただいた。心より謝意を表する。

文献１） 小嶋禎夫，兵頭勲，内田哲二，渡辺彬：東京畜試研報，27, 18～25, 2004.
２） 小林栄治，西尾元秀，古川力：日豚会誌，51, 143～151, 2014.

147３） 永井健一，高橋幸水，野村こう，古川力：日豚会
誌，52, 29, 36, 2015.
４） Groeneveld, E., Kovac, M., Mielenz, N. : ftp://ftp.
tzv.fal.de/pub/latest_vce/doc/vce6-manual-3.1-A4.
pdf, 2010.
５） R Core Team : http://www.R-project.org/, 2013.
６） 中村真弓，小池達也，野沢久夫，阿部泰男，塚原均，
川野辺章夫，本沢延介，高橋一郎，大久保彰夫，中島芳郎，上野昌司：栃木畜試研報，18, 1～8, 2002.
７） 森直樹，新居雅宏，柏岡静：徳島畜研報，6, 18～
21, 2006.
８） 古川力，吉田力，村田亀松，日當信夫，北条貢，
落合昭吾：日豚研誌，23, 199, 1986.
９） Rothchild, M. F., Bidanel, J. P. : The Genetics of
the Pig, 313-343, CAB International, Wallingford,
1998.

© The Ito Foundation

148

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わる
ゲノム育種価の推定
Prediction of genomic breeding values for meat color defined bymyoglobin content in longissimus muscle of Japanese Black cattle

山崎

瑞穂・柴田

愛梨・河野

幸雄・渡邊

敏夫＊・杉本喜憲＊（広島県立総合技術研究所畜産技術センター，＊公益社団法人畜産技術協会附属動物遺伝研究所）

Mizuho Yamasaki, Eri Shibata, Sachio Kouno, Toshio Watanabe＊ and Yoshikazu Sugimoto＊（Hiroshima Prefectural Technology Research Institute, Livestock Research Center, ＊Shirakawa Institute of Animal Genetics）

We previously reported that myoglobin（Mb）contents in the fat-free dry matter served
as a novel indicator for genomic improvement of Japanese cattle beef color trait. In the present
study, genomic breeding values of the Mb contents were estimated. In this report, we
attempted to improve the evaluation accuracy of the genomic breeding values by collecting
more data on SNP and Mb contents. The genomic breeding values estimated with SNP datafrom 1,197 steers were strongly correlated with breeding values with pedigree information（r=0.92）, demonstrating improved evaluation accuracy, as compared with that of previously
reported（739steers, r=0.86）.
In Japanese Black cattle, light-colored meat is highly rated. However, such color
improvement may cause deteriorating of Fe contents in the meat and blood, because Mb is a
Fe-binding protein. In the present study, we demonstrated that deteriorating of Mb contents
were likely to cause deteriorating of Fe contents in meat. Several studies have reported that
Fe contents in the meat influence beef palatability traits. Therefore, it is necessary to examine
the effects of meat color on the taste. On the other hand, Mb contents were not correlated with
Fe contents in the blood, suggesting that low Mb contents are unlikely to affect cattle health（e.g., anemia）.

１．目

色 が 少 な く 扱 い や す い」等 の 回 答 が あ っ た的（2013，未発表）。しかし，黒毛和種において肉色

黒毛和種牛牛肉（黒毛和牛）において，肉色はの育種改良は進んでいない。この理由として，適消費者の購買行動を大きく左右し，流通業者から切な育種改良指標が存在しないことがある。現の改善要望も大きい。我々が広島県内の小売業者

在，枝肉購買時の評価指標には，「BCS No.（Beefに実施した意向調査では，黒毛和牛は淡い色の方

Color Standard Number）」（日本食肉格付協会）が好まれることが明らかになった。調査した11社があるが，目視による主観的評価であり，特に脂中８社が淡い肉色への改良を要望し，「牛肉は色肪交雑の程度に影響されやすいこと，黒毛和種のの淡いものから売れていく」，「淡い色の牛肉は変大部分が３区分に格付けされ評価範囲が狭いこと© The Ito Foundation

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わるゲノム育種価の推定

149から，育種改良指標には適さないと考えられる。

び血液中の「鉄」含量も低下する懸念があった。

一方，黒毛和種種雄牛の遺伝的能力評価には，したがって今回，Mb含量と肉中鉄含量の関係を血統情報に基づく「育種価」が広く利用されてい調査した。さらに血液中鉄含量の低下は貧血等，る。しかし「育種価」は，個体の正確な評価値を

健康に影響を与える可能性もあることから，各種得るためには多数の後代データが必要であり，評

血液成分値との関係も調査した。

価に多くの時間と費用を必要とする。また，メンデリアンサンプリングを考慮できないため，全２．方法

きょうだいの能力差を評価できない等の課題もあ

2.1

る 。 近 年 ， 高 密 度 な SNP （Single Nucleotide

平成15～27年にと畜された広島県産黒毛和牛

Polymorphism）情報を安価で利用できるように（肥育牛，去勢）について，と畜後に第６～７肋なり，ゲノム全体に分布するSNPが変数としてす

骨間のロース芯部分を採取した。採取した肉につべての遺伝的要素を説明するとの仮定に基づく

いて，交雑脂肪を除いた赤身部分のみに存在する「ゲノム育種価」の活用が進んでいる。
「ゲノム育Mbを正確に評価するため脂肪含量および水分含種価」では，全きょうだいの能力差を評価できる量を除した無脂肪乾物中Mb含量を求めた。具体

うえ，後代のいない若齢牛の段階で評価できるな

的には，Boccardら３）の方法によりMb含量，ソッ

ど，改良速度の向上に利点がある。欧米では乳牛

クスレー抽出法により脂肪含量，凍結真空乾燥法

において，精度の高いゲノム育種価評価が実現しにより水分含量を測定した（以下，「Mb含量」とており，種雄牛だけでなく泌乳牛の遺伝的能力評

記述したものは「無脂肪乾物中Mb含量」を示価にも活用されている。しかし，黒毛和種においす）。

ては，いくつかの研究報告があるものの実用化に2.2は至っていない。

広島県内に後代牛情報のある種雄牛27頭についミオグロビン含量の測定

後代育種価の算出

本研究では，より高付加価値な和牛肉の生産をて，1,523頭の後代肥育牛との血縁関係から計算

目指し，肉色の新たな育種改良指標として肉の色された相加的血縁行列を用いて，アニマルモデル

素 の 主 要 成 分 で あ る「ミ オ グ ロ ビ ン（Mb）含BLUP法により，Mb含量の遺伝分散と残差分散量」を用い，ゲノム育種価による能力評価を試みを推定し，遺伝率および育種価（以後「後代育種た。平成26年度は，Mb含量が肉色の新たな育種価」と記述）を算出した。枝肉６形質（枝肉重改良指標となりうることを報告した１，２）。Mb含量

量，ロース芯面積，ばらの厚さ，皮下脂肪厚，歩はBCS No.と相関があり，遺伝による影響が大き

留基準値，脂肪交雑）についても，同様に平成３い（遺伝率0.43）ことが分かった。一方，ゲノム～27年にと畜された41,426頭の後代肥育牛との血育種価による評価は，Mb含量情報を持つ肥育牛縁関係から，遺伝率および後代育種価を算出した。

数が少ないために，十分な評価精度を得ることが2.3

できなかった。平成27年度は，肥育牛数を拡大す

肥育牛1,197頭の肉片，種雄牛27頭の精液から，ることで評価精度の向上を図った。また，Mb含フェノール・クロロホルム法によりDNAを抽出

量を指標とした育種改良の実用化を想定した時，した。肥育牛については，Illumina BovineLDも肉色を淡く，Mb含量を低下させる方向への改良

しくはGeneSeekSuperLD v1, v2によりSNP情報を行えば，Mbはヘム鉄を構成するため，肉およを得た。得られた情報のうち，個体・SNPあたり© The Ito Foundation

SNPタイピング

150

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）のコールレート＜0.95，ハーディー・ワインベル

よび鉄代謝関連成分（ヘモグロビン量，血漿中鉄グ平衡からの乖離Ｐ＜0.0001，マイナーアリル頻

含量，総鉄結合能，赤血球数，ヘマトクリット値）

度＜0.01のSNPを除き，ソフトウェアBEAGLE3.3.2を測定した。なお，この肥育牛個体は2 . 5に示し（BrowningとBrowing2008）により，欠損値の補た個体とは異なる。

完および高密度SNPデータへのデータ補完を行った。最終的に1,197頭の常染色体上33,580SNPを以３．結果と考察

降 の 解 析 に 利 用 し た 。種 雄 牛 に つ い て は ，

3.1

Illumina BovineHDによりSNP情報を得た。

SNP情報を取得した肥育牛1,197頭のMb含量の2.4

分散成分の推定

SNP効果推定，ゲノム育種価算出

平均値±標準偏差は24.75±5.34㎎/g，最大値はSNP効果推定はベイズＢ法を用い，分散成分を48.97㎎/g，最小値は7.99㎎/gであった。ゲノム関推 定 し ，SNP 置 換 効 果 を 算 出 し た（Burn-in 回

係行列および相加的血縁行列によるMb含量の遺数：50,000，反復回数：100,000，サンプリング：

伝率はそれぞれ0.33および0.37と近い値であった

10回ごと，Metropolis-Hasting反復回数：50）。

（Table１）。枝肉６形質については，ゲノム関係

ゲノム育種価の推定は，肥育牛のSNP型から計行列による遺伝率が相加的血縁行列より低くなる算されるゲノム関係行列を用いるG-BLUP法を用傾向が認められた。この理由は不明であるが，用いた。ゲノム関係行列は，VanRaden（2008）のいた肥育牛の頭数やと畜年次が異なるためと推測方法による。母数効果・共変量は，と畜年次（平される。

成15～27年），市場（３市場）および月齢（１次

3.2

および２次）を取り上げた。分散成分推定はAI-

最も高い効果が推定されたSNPは５番染色体

REML法により行った。広島県内に後代牛情報の80.7Mb付近に存在した（Fig.１）。このSNPは，ある種雄牛27頭について，Mb含量のゲノム育種

脂肪酸の分解に関与するFAR2遺伝子上に存在す価を算出した。枝肉６形質についても同様に算出る。しかし，アリル置換効果は＋0.052，SNPがした。ゲノム育種価の評価精度を検証するため，説明する分散は0.0046，寄与率（全相加的遺伝分「後代育種価」と「ゲノム育種価」の相関係数を散に占めるSNPが説明する分散の割合）0.00082

求めた。

と非常に小さい効果であった。今回の結果から

2.5

は，Mb含量は小さな効果を持つポリジーンによ

肉中鉄含量測定

SNP効果推定

2 . 1に示した広島県産黒毛和牛（肥育牛，去勢）る影響を受けているものと推測された。したがっのうち412頭について，と畜後に第６～７肋骨間て，メジャージーンによるQTLマーカーを用いのロース芯部分を採取し，ICP発光分光分析法にた育種改良よりも，ゲノム育種価による育種改良

より，無脂肪乾物中鉄含量を算出した（以下，「肉が適すると考えられる。

中鉄含量」と記載したものは「無脂肪乾物中鉄含3.3量」を示す）。

相加的血縁行列により種雄牛27頭の育種価を算

2.6

血液成分測定ゲノム育種価算出

出した場合の平均正確度は，Mb含量において0.82

広島県産黒毛和牛（肥育牛，去勢）455頭につとなった。枝肉６形質では，いずれの形質でも0.97

いて，と畜２日前に採血を実施し，一般血液成分

以上の値を示した。ゲノム関係行列により種雄牛（総コレステロール，遊離脂肪酸，尿素窒素），お27頭の育種価を算出した場合の平均正確度は，© The Ito Foundation

151

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わるゲノム育種価の推定
Table１

The mean and standard deviation of Mb content, carcass weight（CW）, longissimus muscle areas（LMA）, rib thickness（RT）,subcutaneous fat thickness（SFT）,yield estimates（YE）,and beef marbling scores（BMS No.）
Genetic（Vg）and residual（Ve）variance and heritability±standard deviation（h2）estimated for each trait using
G-BLUP and BLUP
G-BLUPTrait
Mb content（㎎/g）

Mean±SD

ｎ

BLUP

Vg

Ve

h２±SE

Mean±SD

ｎ

Vg

Ve

h２±SE
0.37±0.09

24.75± 5.34

1,197

5.66

11.34

0.33±0.06

23.57± 5.40

1,523

7.14

12.36

CW

（㎏）

481.57±54.50

1,197

1271.53

1247.090.50±0.06

442.39±58.49

41,426996.821403.57

0.42±0.02

LMA

（㎝２）

57.27± 8.18

1,197

20.35

40.59

0.33±0.06

54.12± 8.31

41,426

31.11

34.45

0.48±0.02

RT（㎝）

7.11± 0.82

1,197

0.20

0.37

0.35±0.06

7.24± 0.95

41,4260.25

0.55

0.31±0.02

SFT
YE

（㎝）

2.59± 0.88
73.30± 1.46

1,197
1,197

0.27
0.71

0.47
1.11

0.37±0.06
0.39±0.06

2.57± 0.82
73.44± 1.40

41,426
41,426

0.37
1.11

0.35
0.90

0.52±0.02
0.55±0.02

1.19± 0.60

1,197

0.07

0.18

0.29±0.06

1.37± 0.47

41,4260.23

0.26

0.47±0.02

BMS No

（Ａ）

0.06

0.04
0.03
0.02

SNP eﬀects

0.05

（Ｂ）

2,500,000,000

2,400,000,000

2,300,000,000

2,200,000,000

2,100,000,000

2,000,000,000

1,900,000,000

1,800,000,000

1,700,000,000

1,600,000,000

1,500,000,000

1,400,000,000

1,300,000,000

1,200,000,000

1,100,000,000

900,000,000

1,000,000,000

800,000,000

700,000,000

600,000,000

500,000,000

400,000,000

300,000,000

200,000,000

0.01
00.00500.00450.00400.00350.00300.00250.00200.00150.00100.00050.0000100,000,000

Variance explained by SNP

vriance explained by SNPs (odd chr.）vriance explained by SNPs (even chr.）
SNP eﬀects (odd chr.）
SNP eﬀects (even chr.）

０

6
4
2

-8

-6

-4

-2

0

０

2

4

6

-2
-4
-6

ｙ＝0.8792ｘ＋0.0915
Ｒ２＝0.8539-8

Fig. 1（Ａ）Effectsof SNP substitutions and variance explained by SNP for Mb content estimated by the BayesB method（Ｂ） Scatter plot of breeding values calculated using G-BLUP（genomic breeding values）and BLUP（true breedingvalues）for Mb content
Genomic and true breeding values were estimated in 27 Japanese Black bulls.

© The Ito Foundation

152

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Mb含量において，種雄牛27頭平均で0.86となり，への改良は，肉中の鉄含量も低下させる可能性が

平成26年度に報告した739頭の肥育牛集団を用い高いことが明らかになった（Fig.２，Table３）。

て同じ種雄牛を算出した場合の平均0.87と同程度3.5であった（Table２）。

血液成分のうち，一般血液成分である総コレス

血液成分と肉中ミオグロビン含量の関係

相加的血縁行列による育種価を「遺伝的能力値

テロール，遊離脂肪酸，尿素窒素については，の正解」とみなし，ゲノム育種価との相関係数を455頭すべてがおおむね正常範囲内であった４）。

求めた。この結果，Mb含量において0.92と非常

また，Mb含量との相関は総コレステロールr＝に高い相関を示した（Fig.１）。平成26年度，739

0.06，遊離脂肪酸r＝0.01，尿素窒素r＝－0.02と認頭の肥育牛集団を用いた際の相関係数は0.86であめられなかった（Table３）。

り，分析個体を追加したことで推定精度が向上し血液中の鉄の大部分はミオグロビンと同じくヘたものと考えられる。枝肉６形質においても同様

ム鉄を構成する「ヘモグロビン」として赤血球中に，相加的血縁行列による育種価とゲノム育種価に含まれ，血漿中にもわずかに存在する５）。ヘモの相関係数を求めると，枝肉重量0.94，ロース芯

グ ロ ビ ン 量 は 平 均 値 ± 標 準 偏 差 13.66 ± 1.65g/

面積0.37，バラ厚0.76，皮下脂肪厚0.76，歩留基

dL，血清中鉄含量は149.20±49.09μg/dLであっ

準値0.54，BMS基準値0.41と形質によってバラツた。Mb含量との相関は，ヘモグロビン量で認めキがあった。しかし，いずれの形質においても平られなかった（r＝0.10）。一方，血清中鉄含量で成26年度よりも高い値となり，推定精度が向上しはr＝0.20となり，ごく弱い正の相関がある可能たものと考えられる（Table２）。

性も考えられる（Fig.２）。その他，貧血の指標

3 . 4 肉中鉄含量と肉中ミオグロビン含量の関係

である各項目については，総鉄結合能r＝－0.04，

肥育牛412頭の鉄含量の平均値±標準偏差は

赤血球数r＝－0.06，ヘマトクリット値r＝0.10と11.84±2.21㎎/100ｇ，最大値は19.08㎎/100ｇ，相関は認められなかった（Table３）。

最小値は6.08㎎/100ｇであった。Mb含量と肉中本研究では，黒毛和牛の新たな付加価値・差別

鉄含量には，正の相関があった（r＝0.48）。予想

化要素となることを期待して，肉色のゲノム育種

どおり，肉色を淡く，Mb含量を低下させる方向

価による評価を試みた。この結果，Mb含量が黒Table２
（Ａ）Accuracyof genomic breeding values and true breeding values
（Ｂ）Correlation
coefficient（r）between genomic breeding values and true breeding values（Ａ）（Ｂ）
G-BLUPTrait

Mb content
CW
LMA
RT
SFT
YE
BMS No.

G-BLUP

BLUP

ｎaccuracy（mean）

ｎaccuracy（mean）

ｎaccuracy（mean）

Trait

739
739
739
739
739
739
739

0.87
0.91
0.87
0.85
0.86
0.88
0.82

1,197
1,197
1,197
1,197
1,197
1,197
1,197

0.86
0.90
0.86
0.87
0.87
0.88
0.85

1,523
41,426
41,426
41,426
41,426
41,426
41,426

0.82
0.98
0.98
0.97
0.98
0.98
0.98

Mb content
CW
LMA
RT
SFT
YE
BMS No.

© The Ito Foundation

n＝1,197

n＝739

ｒ

ｒ

0.92
0.94
0.37
0.76
0.76
0.54
0.41

0.86
0.86
0.10
0.68
0.37
0.33
0.12

153

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わるゲノム育種価の推定
40A
Mb content
（㎎/ｇ）

35
30
25
20
15
10

ｒ＝0.48

５
０

０

５

10

15

20

25

Fe content（㎎/100ｇ）

45

45
40

40

35

35

30

30

25
20
15
10

ｒ＝0.10

０
０

８

12

16

Mb content（㎎/ｇ）

Mb content
（㎎/ｇ）

B

25
20
15
10

ｒ＝0.20

５
０

20

０

100

Hemoglobin (g/dL）

200

300

Serum Fe（μg/dL）

Fig. 2
（Ａ）Relationshipbetween Mb content and Fe content in the fat-free dry matter of longissimus muscles（Ｂ）Relationship between Mb content and each blood component（Hemoglobin and Serum Fe）

Table３
The maximum value, minimum value, mean and standard deviation of Total cholesterol,

Non-esterified fatty acid, Blood urea nitrogen, Hemoglobin, Serum Fe, Total iron-binding
capacity, Number of red cell, Hematocrit
Correlation coefficient（r）between the Mb contents and each blood component
Trait

Max.

（mg/dL）（mEq/l）（㎎/dL）

143.22 ± 29.14
0.27 ± 0.19
15.70 ± 3.46

236.00
1.06
26.10

53.00
0.06
6.60

0.06
0.01
－0.02

Hemoglobin
Serum Fe（μg/dL）
Total iron-binding capacity （μg/dL）

13.66 ± 1.65
149.20 ± 49.09
433.69 ± 48.39

18.50
270.00595.009.70
22.00
323.00

0.10
0.20
－0.04

（×10４/μl） 824.13 ± 99.82

1129.00
55.30

567.00
27.50

－0.06
0.10

Total cholesterol
Non-esterified fatty acid
Blood urea nitrogen

Number of red cell
Hematocrit（％）

40.06 ±

4.88

© The Ito FoundationMin.

Mb content

Mean±SDｒ

154

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

毛和種において肉色の新たな育種改良指標とな

認められなかった。Garryらが，Mbノックアウ

り，さらにゲノム育種価による能力評価が可能でトマウスにおいて健康上の問題がほとんど生じなあることが明らかになった。今回，SNP情報を持かったと報告していることからも８），Mb含量のつ肥育牛集団を千数百頭まで拡大することで，利低減が牛の健康を害する可能性は低いと考える。

用した33,580SNPは遺伝分散をよく捉えており，
推定精度が大きく向上した。今後は，この能力評

４．要約

価システムを実際の改良現場でどのように活用す本研究では平成26年度，黒毛和種において，肉るか検討が必要である。現在，黒毛和種において中のミオグロビン（Mb）含量（無脂肪乾物中）

若齢の種雄牛候補を選抜する際には「後代育種が肉色の新たな育種改良指標となることを明らか価」が得られないため，評価精度の劣る「両親のにし，ゲノム育種価による能力評価を試みた。平

後代育種価の平均」を用いるしかない。渡邊ら

成27年度は，Mb含量情報を持つ肥育牛を拡大す

は，SNP情報を持つ肥育牛集団から評価対象牛のることで，評価精度の向上を目指した。肥育牛

後代を除いてゲノム育種価を算出することで，こ1197頭のSNP情報を用いたゲノム育種価は，後代の状況を再現している 。この結果，枝肉６形質

育種価と高い相関（0.92）を示し，平成26年度のにおいては，「両親の後代育種価の平均」よりも，739頭のSNP情報を用いた場合（0.86）から評価

約6,000頭の肥育集団から得た「ゲノム育種価」

精度が向上した。

６）の方が評価精度は高く，実際の種雄牛選抜におけまた，黒毛和牛の肉色は淡いほど評価が高い

るゲノム育種価の有用性を示した。今後は，このが，Mb含量を低下させる改良を行えば，Mbはヘような手法も用いながら，肉色のゲノム育種価評

ム鉄を構成するため，肉および血液中の鉄含量も価の有用性を示し，現場での活用を促す必要があ低下する懸念があった。今回，Mb含量の低下にる。また，本報告では述べていないが，Mb含量

より肉中鉄含量も低下する可能性が高いことが明には性差があり，雌の方が含量は高い。これまで

らかになった。鉄含量の多少が牛肉らしい風味に

SNP情報を持つ肥育牛集団には去勢牛のみを用い影響するとの報告もあることから，肉色の改良がてきたが，性染色体の持つ効果についても検討が食味に与える影響についても検討する必要があ必要と考える。

る。一方，血液中鉄含量の低下は認められず，

また今回，Mb含量と肉中鉄含量の関係を調査した。Mb含量と肉中鉄含量には正の相関があり，Mb含量の低下が，貧血等で牛の健康に影響を与える可能性は低いと考えられる。

肉色を淡くする改良により肉中の鉄含量も低下することが明らかになった。Mateescuらは，官能検査により，牛肉中の鉄含量が「牛肉らしい風味」に影響を与えると報告している７）。今後は，和牛肉の肉色が「食味」に与える影響についても詳細に調査する必要がある。一方，Mb含量とヘモグロビン量および血清中鉄含量に関連は認められず，Mb含量の低下により血液中の鉄含量は低下しないと考えられる。懸念した貧血との関連も

文
献１） 山崎瑞穂，戸水一志，河野幸雄，渡邊敏夫，杉本
喜憲：平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報
告書Vol.33，308～313, 2014.
２） 河野幸雄，坂井宏行，長尾かおり：肉用牛研究会
報，68, 27～29, 2005.
３） Bo㏄ard, B., Buchter, L., Casteels, E., Cosentino, E.,
Dransfield, E., Hood, D. E., Joseph, R. L., Macdougall,
D. B., Rhodes, D. N., Schon, I., Tinbergen, B. J.,
Touraille, C. : Livestock Production Science, 8, 385 ～
397, 1981.

© The Ito Foundation

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わるゲノム育種価の推定４） Adachi, K., Kawano, H., Tsuno, K., Nomura, Y.,
Katsura, N., Arikawa, A., Tsuji, A., OnimaruT. : The
Journal of Veterinary Medical Science, 59, 873～877,
1997.
５） Fairbanks, V. F., Fahey, J. L., Beulter, E. : Clinical
Disorders of Iron Metabolism, 2nd Ed., Grune andStrhratton, New York, 1971.
６） 渡邊敏夫：The Journal of Animal Genetics, 44, 3～10, 2016.

155７） Mateescu, R. G., Garmyn, A. J., Tait Jr., R. G.,
Duan, Q., Liu, Q., Mayes, M. S., Garrick, D. J.,
VanEenennaam, A. L., VanOverbeke, D. L., Hilton, G.
G., Beitz, D. C., Reecy, J. M. : Journal of Animal
Science, 91, 1067～1075, 2013.
８） Daniel, J., Garry, George, A., Ordway, John, N.,
Lorenz, Nina, B., Radford, Eva, R., Chin, Robert, W.,
Grange, Rhonda, Bassel-Duby & R. : Nature, 395, 905～908, 1998.

© The Ito Foundation

156

黒毛和種牛のルーメン絨毛組織の発達関連遺伝子の網羅的解析に関する研究
Study on the global analysis of genes related with development of rumen
papillae in Japanese Black cattle

盧

尚

建

（東北大学大学院農学研究科）

Sang-gun Roh（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

The comprehensive transcriptome analysis using RNA-seq method was performed toinvestigate the profiles of gene expression profiling in the rumen epithelial tissue of theJapanese Black cattle during weaning. Rumen papillae samples gathered from 10 JapaneseBlack cattle（pre-weaning group（n＝5）, 5 weeks old; weaned group（n＝5）, 15 weeks old）
were used for RNA extraction. RNA samples were applied to RNA-seq using Illuminaʼs HiSeq
2500, and the resulting data of sequencing were used for Ingenuity Pathway Analysis（IPA）inorder to analyze the canonical pathway, upstream regulators, gene network and so on. 871
differentially expressed genes were screened by IPA, and fold changes of 466 genes wereincreased after weaning, and those of 405 genes were decreased. As the result of pathway
analysis, PPAR-α was identified as one of the most related with rumen development. In
conclusion, functions of these genes may be related to energy production and harmonization of
intraruminal conditions. In addition, it will be important to further assay the new candidate
genes found in this work that showed changes in the rumen of Japanese Black calves between
pre-and post-weaning.

１．目

VFA（揮発性脂肪酸（粗飼料と濃厚飼料等の給的与））で発育すると知られている。絨毛は形も大反芻動物のルーメンは，ヒトやマウスなどの単きく数も密で，それだけ表面積が広く，結果とし胃動物と異なり，飼料の発酵に重要な役割を果たてVFAの吸収能力に優れている。しかし，現在，している器官である。特に，仔牛の離乳前後にお肉牛一貫経営や酪農経営など集約経営の場合，超ける適切な栄養・飼養管理によるルーメン発達を

早期母子分離による人工哺乳が増加し，主流と促すことは重要であり，丈夫なルーメンづくりとなっている。黒毛和種牛の早期離乳は子牛には離は，その容積とともに筋肉層と上皮層（第一胃乳乳によるストレス（栄養性ストレス）を与え，頭・絨毛）の両方を発育させることである。筋肉

ルーメンの未成熟と未発達を引き起こし，哺乳期層は物性（硬めの粗飼料等の給与），上皮層はから育成期に移行が不完全となって，育成期と肥© The Ito Foundation

黒毛和種牛のルーメン絨毛組織の発達関連遺伝子の網羅的解析に関する研究

157

育期の成長に大きな被害と障害を生じる。しかしに回収した。回収したRNAisoにクロロホルム100μl

ながら，哺乳期と離乳後にルーメン絨毛（上皮を入れて，ボルテックス（10sec）後室温にて３分層）の分化・形成のプロセスに関する詳細な機構

静置し，12,000×ｇ，15min，４℃で遠心した。そは明らかにされてない。Rohら（2007）は第１，の後，上清のみを回収し，ほぼ等量の70％EtOHを２，３，
４胃の遺伝子発現量の網羅的解析により第加え，３～４回転倒混和した。混合液をNucleoSpin

１胃で高い発現量示す遺伝子を報告した 。また，

RNA Columnにいれ，11,000×ｇ，30secで遠心した。

ル ー メ ン 絨 毛 組 織 に お い て SREBP2 and LXR/

その 後 回 収した 液 を 350μl の MDB（Membrane

RXRの転写因子は濃厚飼料多給によって発現量

Desalting Buffer）と混 合し ，Silica membraneをが誘導されることを報告している 。しかし，反用いて11,000×ｇ，1minで遠心し脱塩した。その後

芻動物のルーメン（特にルーメン上皮組織）発達

Silica membraneに95μlのDNase reaction mixtureに関わる関連遺伝子の解析や外因的な因子によるを加え，室温で15分放置した。Silica membraneを制御機構については詳細に明らかにされてない。

洗 浄 ，乾 燥 するため Buffer RAW2を 200μl 加え

そこで，本研究は次世代シーケンサーを用いて黒NucleoSpin RNA Columnを用いて，11,000×ｇ，

毛和種牛の離乳前後のルーメン絨毛組織の遺伝子

30secで遠心した。次にBuffer RA3を600μl加え，頻度を比較し，ルーメン発達に関連する分子機構

11,000×ｇ，30secで遠心した。その後，Bufferを解析した。

RA3を250μl加え，11,000×ｇ，2minで遠心した。

１）

２）

２．方
2.1

最後にRNase-free H2Oを60μl加え，11,000×ｇ，

法

1minで遠心しRNAを回収した。

供試動物と組織サンプリング

2 . 3 次世代シーケンサーを用いたRNA-Seqに

離乳前の黒毛和種の仔ウシ雄５頭（51.5±1.8

よる遺伝子発現頻度の解析㎏，３週齢）と離乳後の仔ウシ雄５頭（126.3±8.3

イルミナ社のTruSeq RNA Sample Prep Kit v2㎏，15週齢）を用い，麻酔および放血と殺後，採を用いて調整したcDNAライブラリはアジレント

取したルーメン組織を適当な大きさに切除し，液社バイオアナライザのAgilent DNA1000キットで体窒素に浸して凍結させた。その後，RNA抽出

クオリティチェックが行われ，日本ジェネティク

まで－80℃で保存した。

ス社のKAPA Library Quantification Kitを使って

2.2

ルーメン組織からのRNA抽出

10nMに希釈され，さらに，NaOHで変性させて最各サンプルチューブにRNAiso Plus300μlを注ぎ急速冷凍させた。その後，各チューブに冷やし

終 的 に は 10pM の 濃 度 で シ ー ケ ン サ ー（Hiseq2500）にかけられた。

たメタルビーズおよび凍結サンプルを少量入れ得られたシーケンサデータはシーケンスの際にた。マルチビーズショッカー（安井器械）を用い使用するアダプター配列やサンプルごとの区別にて17,000rpm，20sec，１回で組織を破砕し，各サ使用するインデックス配列，クオリティの低い配ンプルチューブにRNAiso plus200μlを入れて引列 等 を 取 り 除 い た あ と ，牛 の ゲ ノ ム 配 列

き続き融解させた。融けてきたものは室温で10分（UMD3）にマッピングが行われた。これらの作

ほど融かし，粉砕し切れていないものは，もう一

業にはCLC Genomics work benchというソフト

度マルチビーズショッカーで10秒弱だけ粉砕した。

が使用された。発現量の補正のため，log変換，すべて融けきった後にRNAisoを1.5mlチューブ

ノーマライズ処理，RPKM補正が行われた。２群© The Ito Foundation

158

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）間の発現量比の検定にはEDGE testという検定が行われ，多重検定の補正にはFDRという方法が４．要約用いられた。CLCで計算した各遺伝子の発現量か

黒毛和種牛ルーメンの離乳前後における絨毛組

ら 算 出 し た 発 現 量 比 と p-value, q-value の 値 を織の形態的および機能的発達に関連する遺伝子を

IPAのプログラムに入力し，IPAでの解析を行っ同定することを目的とした。離乳前後の絨毛組織た。

に関して次世代シークエンサーによる網羅的な遺伝子発現解析を行い，離乳前後のルーメン絨毛組

３．結果と考察

織における遺伝子発現の変動を比較，検討した。

次世代シークエンサーによる遺伝子発現解析の離乳前区（n＝5，３週齢）および離乳後区（n＝結果，離乳前後のルーメン組織で遺伝子発現に変

5，15週齢）の去勢黒毛和種牛より採取したルー化が見られたものは全部で871個であった。そのメン絨毛組織からRNAを抽出し，RNA-Seqによ

うちの466個の遺伝子発現が離乳後に上昇しておりライブラリ作製およびシークエンス解析を行っ

り，405個が減少していた（Fig.１）。パスウェイた。得られたシークエンス情報を用いて，解析ソ

解析の結果，PPARαが離乳後に活性化している

フトのCLCにより離乳前後における遺伝子発現量

レギュレーターとして同定され（Fig.２），そのの比較を行い，発現量に差があったものについて

標的遺伝子群の中に離乳前後におけるルーメン発

パスウェイ解析を行った。離乳前後で遺伝子発現

達関連遺伝子が存在する可能性が示唆された。ケに変化が見られたものは871個の遺伝子であり，トン体生成に関与する遺伝子の発現が離乳後に上その内466個の発現が離乳後に上昇，405個が減少

昇することから，ルーメン発達のマーカーとしてしていた。パスウェイ解析の結果，PPARαが離

これらの遺伝子は利用できる可能性が示唆された。

乳後に活性化しているレギュレーターとして同定され，その標的遺伝子群の中に離乳前後におけるDataset（Volcano plot）

increased: 466 genes

20
18-log10（FDR）

16decreased: 405 genes

14
12
10
8
6
4
2

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7

Log2（Fold change）

Fig. 1 Volcano plot showing the Bonferroni cut-off and the two-fold change. Comparisons of RNA expression between

pre- and post-weaning young cattle© The Ito Foundation

黒毛和種牛のルーメン絨毛組織の発達関連遺伝子の網羅的解析に関する研究

159

Fig. 2 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）解析により判明したPPAR-αによって調節される遺伝子

ルーメン発達関連遺伝子が存在する可能性が示唆された。また，ケトン体生成に関与する遺伝子の発現が離乳後に上昇することから，ルーメン発達のマーカーとしてこれらの遺伝子は利用できる可能性が示唆された。
文
献１） Roh, S. G., Kuno, M., Hishikawa, D., Hong, Y.H.,

Katoh, K., Obara, Y., Hidari, H., Sasaki, S. :Identification of differentially expressed transcripts
in bovine rumen and abomasum using a differential
display method, Journal of Animal Science, 85, 395～
403, 2007.
２） Steele, M. A., Vandervoort, G., AlZahal, O., Hook,
S. E., James, C., Matthews, J. C., McBride, B.W. :Rumen epithelial adaptation to high-grain diets
involves the coordinatedregulation of genes involvedin cholesterol homeostasis, Physiol Genomics, 43, 308～316, 2011.

© The Ito Foundation

160

牛CHFRおよびRB1遺伝子プロモーター流域のDNAメチル化多型と肉質形質との関係に関する
分子遺伝的研究
Molecular research for relationship between DNA methylation in bovine
CHFR or RB1 geneʼs promoter region and meat quality

須

田

義

人

（宮城大学食産業学部）

Yoshihito Suda
（School of Food, Agricultural and Environmental Sciences, Miyagi University）

Since we think that quantitative traits of Japanese Black cattle（JB）has been controlled
by genetic effects and environmental effects, molecular markers reflected environmental effects
are required to develop meat quality efficiently. Recently, we know that DNA methylation to
CG rich regions in the upstream region of start codon, ATG, controls the expression of many
genes on a genome wide level, and a part of methylation patterns（DMP）is specific by eachtissue and differentiation stage. So the relationships among quantitative traits are affected byenvironmental effects and these might also be affected by DNA methylation. This studyʼs aims
are to examine relationships among DMP of promoter regions in CHFR and RB1 genes fromloin eyeʼs meat and the quality. Genomic DNA samples were extracted from loin eyeʼs meats in
10 heads of A5 and 7 head of A3 ranks. To search DMP, EpiXplore Methylated DNA
Enrichment Kit, EpiScope Promoter qPCR Array（Human）and SYBR Premix Ex Taq GC（Perfect Real Time）of TAKARA was used respectively. Correlation analysis and analysis ofvariance（ANOVA）are performed by using SAS program, version 9.1. The CG rich regions in
the upstream regions of two genes, CHFR from less than A3 rank and RB1 from A5 rank werevery high DNA methylation level. Correlation between BMS and DMP in CHFR was negative,
and between in RB1 was negative at 5％ significance level. Because DMPs in their two genes
were recognized in the specific locus, we thought that DMPs in their genes might be effective
markers to develop meat quality.

１．目

いると考えられ，その貢献遺伝子群の特定や形成的機構の解明は困難を極めている。他方，特に黒毛近年，分子生物学的技術が発達し，ヒトや豚と和種の枝肉ロース芯部に見られるいわゆる霜降り

ともにゲノム解析が進んでいることで，脂肪交雑

形質という特性は，遺伝率が約60％と遺伝性が高や肉質特性に関わる分子形成メカニズムの解明もく，特定品種かつ特定家系での現出は貢献遺伝子近いと考えられてきたが，量的形質である多くの群の存在を強く期待させるものである。近年の経済形質にはおびただしい数の遺伝子が関与して

QTL情報やSNP情報の経済形質への寄与率は低© The Ito Foundation

牛CHFRおよびRB1遺伝子プロモーター流域のDNAメチル化多型と肉質形質との関係に関する分子遺伝的研究

161

く，２万から３万個あるとされる遺伝子群からこべての操作は専用プロトコールに従った。抽出後れらの情報を用いて量的形質に関わる貢献遺伝子に，Nano Drop Spectrophotometer ND-1000（エを絞り込むことは現段階では見通しが立っていな

ル・エム・エス社）を用いてDNA溶液の濃度おい。また，量的形質の多くは，遺伝要因のみならよび純度を測定し，純度が260nm/280nmOD比1.9

ず環境要因の影響も強いことから，改良マーカー

以上のものを以後の実験に供した。

として安定的にかつ早期に判断できるものとして

2.2

は，遺伝要因のみならず“環境要因”の両面を反抽出したゲノムDNAを冷却下で超音波剪断処

映させるものであることが必須であり，また多く理を行い断片化した。条件はAMPL30％で35秒との遺伝子に共通した分子メカニズムを持っているした。EpiXploreTM Methylated DNA Enrichment

ことが重要である１）。昨年度に本財団より助成をKit（タカラバイオ社）を用いてメチル化DNAの受けて，ヒトゲノムにおけるエピジェネティック

濃縮を行い，以後の手順は専用プロトコールに情報をもとに開発されたDNAメチル化解析シス従った。濃縮したメチル化DNAを精製するため

テムを用いて，そのシステムでターゲットにするに エ タ ノ ー ル 沈 殿 法 で 行 い ，さ ら に CENTRI-

遺伝子のすべてにおける相同性が牛のそれらと比SEP Spin Columns（Princeton Separations社）

較し80％以上で高いことを明らかにし，特に枝肉を用いて精製した。得られたサンプルを以後の解成績と関連性が高いと考えられた２つの遺伝子，析に供した。メチル化度の解析にはEpiScope Ⓡ

CHFR （checkpoint with forkhead and ring

Promoter qPCR Array（Human）およびSYBRⓇ

finger domains） と RB1 （retinoblastoma 1） に

Premix Ex TaqTM GC（Perfect Real Time）（タ

絞り込んだ２）。これらはいずれもヒトにおいては

カラバイオ社）を用いて行った。各サンプルおけ

癌抑制遺伝子であることが知られており，異常メ

るDNAの相対量を推定するためにリアルタイム

チル化によってmRNA発現が過剰に抑制される

PCR法を用い，そのときのThreshold（dRn）値ことで必要な細胞増殖が阻害されて機能が低下すを0.02に設定した。

ゲノムDNAのメチル化度の解析についてることが考えられる３～５）。そこで本研究では，こ2 . 3 CHFR 遺 伝 子 お よ び RB1 遺 伝 子 上 流 域

れら２遺伝子のプロモーター領域のメチル化状況（プロモーター）のメチル化解析についてをさらに調査し，特に肉質などの枝肉成績との関ゲノミックDNAのバイサルファイト反応は，係が高い分子マーカーの特定を目的とした。
２．方CpGenomeTM Universal DNA Modification Kit（Millipore社）を用いて行った。以後の操作は専法

用プロトコールに従った。上流域のPCR増幅のた

2 . 1 供試サンプルとゲノミックDNAの抽出にめに用いたプライアーはTable１に示した。これ
ら の 設 計 に は ，CHFR 遺 伝 子 に は GenBank のついて
約28カ月齢で出荷された黒毛和種枝肉のうち，

J062517.1を，RB1についてはGenBankのGJ062071.1

公益社団法人日本食肉格付協会によってA5ラン

をそれぞれ参照した。PCR産物のシーケンス解析

クおよびA3ランク以下と格付けされたロース芯にはABI3130型ジェネティックアナライザーを用部組織をそれぞれ10および７サンプル準備し，そいた。以下，CHFR遺伝子の上流域をCHFR，RB1

れぞれ約20㎎を用いて抽出を行った。抽出には遺伝子の上流域をRB1とする。

QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を用いす© The Ito Foundation

162

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Table 1 Primer information
RegionSense primer

Antisense promer

Product（bp）

CHFR１）GGCATTTCCTGTCCTTTCACATGGTCCACTCCCGTTTC

1,118

RB1２）

TCGTCCCATACTTGGTCTCC

TCGTCCCATACTTGGTCTCC

1,116１）GenBank: GJ062517.1
２）GenBank: GJ062071.1

2.4

統計解析

CHFRおよびRB1のメチル化度と肉質などの枝統計解析には，SAS（バージョン9.1）プログ

肉成績との相関性をTable２に示した。CHFRは

ラムおよびGLMプロシージャを用いた。今回分

脂肪交雑と有意な負の相関（p＜0.05）が，皮下析に用いた枝肉成績は，出荷月齢が有意であるも脂肪厚とは高度に有意な正の相関があった（p＜のについて平均月齢に線形補正し，高メチル化割0.01）。また，RB1においては，脂肪交雑や枝肉合（メ チ ル 化 度）の 肉 質 な ど を 含 む 格 付 け 間

重量とは有意な正の相関が見られた（p＜0.05）。

（A5およびA3ランク以下）での２群比較，さらこれらのことは前述の結果と整合性があり，細胞には相関解析を行った。相関解析では５％水準で周期に関連する遺伝子の発現動態が肉質などに影無相関検定を行った。

響すると考えられた。
CHFRおよびRB1のCGリッチ領域におけるシ

３．結果と考察

トシンのメチル化パターンの多型（以下，メチル

昨年度の成果を元に，特に枝肉成績と関連性が化多型）が見られる座位をFig.３およびFig.４に高いと考えられたC H F R （ c h e c k p o i n t w i t h示した。いずれの領域においてもCGリッチ領域

forkhead and ring finger domains）とRB1が存在するももの散らばりがあった。そして，複（retinoblastoma 1）各遺伝子の上流域に絞り込ん

数ではあるものの特定座位において多型が確認さで検討した結果，A3ランク以下ではCHFRが，れた。これらの座位におけるメチル化パターンを

A5ランクではBR1がそれぞれ有意に高くメチル

マーカーとし肉質改良の効率化が期待できる。

化 を 受 け て い る こ と が 明 ら か と な っ た（p ＜0.05）。これらの遺伝子は，人においては癌抑制

４．要

約

遺伝子であることが知られており，高度にメチル

特に黒毛和種の量的形質の多くは，遺伝要因の化を受けることによってmRNA発現が過剰に抑みならず環境要因の影響も強いことから，改良

制されることで正常な細胞増殖様式が制御不能にマーカーとして安定的にかつ早期に判断できるもなる。牛においては，CHRFがA3以下ではメチのとしては，遺伝要因のみならず“環境要因”のル化度が高く，A5においてはメチル化度が低い

両面を反映させるものであることが必須であり，ことで脂肪細胞や骨格筋細胞の増殖や分化がしやまた多くの遺伝子に共通した分子メカニズムをすい状態にあることが推察された。また，RB1が持っていることが重要ある。昨年度に本財団よりＡ3以下ではメチル化度が低く，Ａ5ではメチル化助成を受けて，ヒトゲノムにおけるエピジェネ

度が高かった。RB1の発現が抑制されることで，

ティック情報をもとに開発されたDNAメチル化解細胞周期の回転を高めCHFRを支持して共役的に析システムを用いて，そのシステムでターゲット

機能していると推察された（Fig.１，Fig.２）。

にする遺伝子のすべてにおける相動性が牛のそれ© The Ito Foundation

163

30

a

A5

25

Methylation degree（％）

Methylation degree（％）

牛CHFRおよびRB1遺伝子プロモーター流域のDNAメチル化多型と肉質形質との関係に関する分子遺伝的研究

less than A3

20
15
b

10
５
０

A5

120
100

a

A5
less than A3

80
60
40

b

20
０

less than A3

A5

Carcass rank

less than A3
Carcass rank

Fig. 1 Comparison between the methyltion degrees inFig. 2 Comparison between the methyltion degrees in

upstream region of bovine CHFR gene by carcass
ranks

upstream region of bovine RB1 gene by carcass
ranksa, b ; The difference between menas with different superscripts

a, b ; The difference between menas with different superscripts

was significant at 5％ level.

was significant at 5％ level.

Table 2 Correlation between methylation degree of bovine CHFR and RB1ʼs upstream region（CpG）and carcass traits
Gene

BMS

Carcass weight

Loin eyeʼs areaRibʼs thickness

Subcutaneous
thickness

CHFR－0.38＊

－0.26

0.1

0.05

0.78＊＊

RB1

0.65＊

0.34＊

0.2

0.03

0.34

＊；p＜0.05，＊＊；p＜0.01

CTCCCAGGGTACTATCAACTTTCCGATCGCCAGAAAAATGGCCTTGGGAAATTTCAACTTGCATTTACCTCGTCAGATGTAAGGCAGACCGTCGCTTCGCACTTCTAAACGCCATCTGCACTTCCAACGCAGCTTTGGGAGTTTGCTTAGGTGCCCAATGCTCGTTACTCTGACCCCTTTGCGCGGACTTAAC
ATGTGGCTGACCTCACCTACTTCCGAGATCCGGGAACACCAAGTTGTCCCGGCCAACATCAAAGATGGCGTCCAAGCCCGCAACCTATCCTCTGCGCAGCTCCGCTAGCCTCCACGTGTCCACTCTCGATGCCCGTCCCCCAGGTTCCACTCTAGCCGCCGCGTTCAGTGGTTGCCACCGCCCGCCAATCGCAGGGCAAGGACGCTGTGGGCCCCGCCCAGCGGATCAGCTGAGGGATCTGCGATGTCTGTTG
ACAGCAGCGGTGGCTGCGCGGCCGGTTCCGGGTTCGGCGCGGGGCGGGGGGTAAGCTGGCGACGGGCGCGGGCGTCCGGCGGGACGCTGGGGAGGCTCGCGGCGCGGGCCGCAGCGGTGGGGC
GCGGGCGCCGAGGACCAGCGGCAGGCCGCAGCCTCTGCCCTTGCGGTCCGGGTCTCACCCGACGTTTCCGGGTCTCGTCAGATG□；Cytosine detected methylation polymorphism
Fig. 3 Cytosine detected methylation polymorphism in Bovine CHFR（checkpoint with forkhead andring finger domains）geneʼs upstream region

らと比較し80％以上で高いことを明らかにし，特ring finger domains）と RB1（retinoblastoma 1）に枝肉成績と関連性が高いと考えられた２つの遺に絞り込んだ。そこで本研究では，これら２遺伝

伝 子 ， CHFR （checkpoint with forkhead and子のプロモーター領域のメチル化状況をさらに調© The Ito Foundation

164

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

AGCTTAACGGATTGAGCGGGAGGAGCGCGGGCGAGCGGGAGGGTGCCGCCCACGGAAGAGAG
GGGCGTGCCCGCCCCGGGTGCGCTCGCCCGATACTCCCCGGCGGGGGCCTCGGCTGCAGTCCCGGATCCACCCGGCTATAGCGAGGGAGCCCGCGCGTACCCACCGGGCCGGGCAGCGCCCTTAC
TCGGCCACCCACGCCCGCAGGGGCGAGTTTCGAGAAGAGGCAGGCTGAGGCGGCGGCAGCGG
CTGCTGCCTCCGGGCGGCCGCCTGGGTTGCCGGCCCGGGACTCCCCGCCCGCCCGGCCCGCG
CCTCGCCTCGCCGGGCCTCGCCTAGCCCAGCACCCCGGTGCCCTCCCGACGCCGGCGGGCCCGGGAGCCTCGCGGACGTGACGCCGCGGGCGGAAGTGACGTTTTCCCG□；Cytosine detected methylation polymorphism
Fig. 4 Cytosine detected methylation polymorphism in Bovine RB1（retinoblastoma 1）geneʼs upstream

region

査し，特に肉質などの枝肉成績との関係が高い分子マーカーの特定を目的とした。A3ランク以下
ではCHFRが，A5ランクではBR1がそれぞれ有意に高くメチル化を受けていることが明らかとなった。またRB1がA3以下ではメチル化度が低く，
A5ではメチル化度が高かった。CHFRは脂肪交雑と有意な負の相関（p＜0.05）が，皮下脂肪厚とは高度に有意な正の相関があった（p＜0.01）。
また，RB1においては，脂肪交雑，キメ・しまり，そして枝肉重量とは有意な正の相関が見られた（p＜0.05）。これらのことから細胞周期に関連する遺伝子の発現動態が肉質などに影響すると考えられた。CHFRおよびRB1のメチル化多型について，複数ではあるものの特定座位において確認された。これらの座位におけるメチル化パターンをマーカーとし肉質改良の効率化が期待できる。

文献１） 豊田実，鈴木拓，今井浩三，篠村恭久：癌のエピ
ジェネティクス異常，蛋白質核酸酵素，51, 2043～
2048, 2006.
２） 須田義人：黒毛和種ゲノムDNAメチル化多型と肉質形質との関係に関する研究，平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.33, 173～178,
2015.
３） Kaneda,M., Akagi, S., Watanabe, S., Nagai, T. :Comparison of DNA methylation levels of repetitive
loci during bovine development, BMC Proc. Jun 3 ; 5
Suppl 4 : S3. doi : 10.1186/1753-6561-5-S4-S3, 2011.
４） Fraga, M. F., Ballestar, E., Paz, M. F., Ropero, S.,
Setien, F., Ballestar, M. L., Heine-Suñer, D., Cigudosa,
J. C., Urioste, M., Benitez, J., Boix-Chornet, M.,
Sanchez-Aguilera, A., Ling, C., Carlsson, E., Poulsen,
P., Vaag, A., Stephan, Z., Spector, T. D., Wu, Y. Z.,
Plass, C., Esteller, M. : Epigenetic differences arise
during the lifetime of monozygotic twins, Proc Natl
AcadSci USA, 102（30）,10604～10609, 2005.
５） Daugela, L., Nüsgen, N., Walier, M., Oldenburg, J.,
Schwaab, R., El-Maarri, O. : Measurements of DNA
methylation at seven loci in various tissues of CD1
mice, PLoS One, 7（9）: e44585. doi : 10.1371/journal.
pone.0044585. Epub 2012 Sep7, 2012.

© The Ito Foundation

165

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養技術の開発
Development of porcine/bovine germline stem cell technology using novel
growth factor

高

島

誠

司・保

地

眞

一

（信州大学繊維学部）

Seiji Takashima and Sinichi Hochi（Faculty of Textile Science and Technology, Shinshu University）

Spermatogonial stem cells are foundation for male reproductive system. In 2003, Shinohara
and colleagues established spermatogonial stem cell line termed germline stem（GS）cells. GS
cells are derived from mouse testis and can be expanded under the stimulation with glial cellline-derived neurotrophic factor（GDNF）. In addition, GS cellscan colonize the infertile testis,
resume spermatogenesis, produce sperm, and restore fertility. Moreover, GS cells can beapplicable for gene modification including gene trap mutagenesis, gene transfection, genetargeting technology, and CRISPR/Cas9 system. These properties led us to seek establishing
GS cells from economic animals.
In the previous fiscal year, we reported the protocol for the isolation of pig seminiferous
tubule. Based on this protocol, in this report, we tried to establish GS cells from pig testis.
Although testis somatic cells proliferated progressively when culture medium containing 1 ％fetal bovine serum, low serum condition suppressed the somatic cell proliferation. In thiscondition, non-spreading, round shaped cells were expanded instead of somatic cells dependingon the stimulation with fibroblast growth factor 2（FGF2）. We also tried to find the genetic
marker to distinguish the FGF2 dependent spermatogonial stem cells from otherspermatogonia to improve the efficiency of GS cell establishment. By comparing the expressionof spermatogonia-related genes of FGF2-dependent spermatogonia with GDNF-dependent
spermatogonia, we identified genes differentially expressed between these cells.

１．目

したフィーダー，あるいはラミニンコートされた的ディッシュ上に幼若マウス精巣細胞（体細胞，生研究代表者の研究対象である精子幹細胞は，精殖細胞を含む）を播種，自己複製促進因子Glial

巣中で個体の生涯にわたり精子を作り続ける源とcell line-derived neurotrophic factor（GDNF）

なる細胞である。この細胞の試験管内培養技術は，

およびFibroblast growth factor 2（FGF2）を添

2003年，京都大の篠原により確立された。マイト

加し培養すると，ぶどうの房状の増殖コロニーがマイシンＣ処理済みマウス胎児線維芽細胞で作成出現する。この細胞を不妊マウス精巣へ移植する© The Ito Foundation

166

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）と生着し精子形成を再開，子孫を得られることか存して増殖する細胞集団を見いだした。不妊マウ

ら，培養精子幹細胞（Germline Stem Cell: GS細ス精巣へ移植すると生着し精子形成を再開，子孫胞）と命名された１）。この細胞は試験管内で個体も作成できたことから，上記の細胞集団は精子幹の寿命を超えて培養できるだけでなく，遺伝子導細胞であることが判明した７）。この発見は，『精入や相同組み替えが可能である２～４）。また，横浜

子幹細胞の自己複製にはGDNFが必須である』と

市立大の小川らは精巣の器官培養により試験管内

いう10年以上にわたり信じられてきた定説を覆すで精子形成を誘導する技術を確立しており，GSものであった。

細胞を移植された精巣の器官培養によりGS細胞

こうした背景から研究代表者は，自身が発見し。これらた自己複製因子FGF2を用い，これまで成功例のの技術はマウスで達成されたものであるが，理論ない豚および牛の精子幹細胞の純化・培養法の確上はより大型の経済家畜でも可能であると考えら立を目的とし，研究を進めてきた。今回の報告でれる。

は，GDNF-free培養法による豚精巣細胞培養のの試験管内精子形成も達成している

５，６）

現行の繁殖工学技術は卵子を対象としたものである。この技術はすでに経済動物の繁殖制御に活用されているが，卵子が増殖しない細胞であることから，今後の技術の発展の余地は大きくない。

検討と，新しい精子幹細胞マーカー探索の結果について報告する。
２．方法

研 究 代 表 者 は ，経 済 動 物 繁 殖 工 学 の プ ラ ッ ト

2.1

フォームを，『増殖しない卵子』から『試験管内豚精巣は長野県畜産試験場にて去勢により摘出で半永久的に増殖する精子幹細胞』に転換するこされたものを譲渡していただき研究に供した。豚とで，繁殖技術をさらに発展させたいと考えていはDuroc種の８週齢のものを使用した。譲渡される。

た検体は，常温で研究室まで運搬し，PBS（－）

精子幹細胞技術は『純化』『試験管内培養』『ゲ

精巣材料の入手

で血液などを洗浄した後培養に供した。

ノム編集』『試験管内精子形成』の４つの技術で2.2成立する。マウスではこれらの技術が確立されて精巣組織は鋭利なはさみで３㎜角程度の大きさ

いるが，残念ながら経済家畜では成功した例は報に細切し，５mlの２㎎/mlのCollagenase type II

告されていない。マウスの場合精巣から精子幹細で37℃，15分手動で振盪しながら酵素反応を行っ胞を純化することなく培養樹立が可能であるが，た。反応後，HBSS（－）バッファーを加えて全

それはマウスの精巣体細胞の増殖力が弱いためで量を50mlにし静置，精細管を沈殿させ，浮いてある。一方経済動物である牛や豚の場合，体細胞

い る 間 質 細 胞 を ピ ペ ッ ト で 除 去 し た 。さ ら にの増殖力が高く精子幹細胞を淘汰してしまうこと

HBSS（－）バッファーで全量を50mlにし同様のが，GS細胞樹立を阻む主要因となっている。また，作業を行うことで，間質細胞を除去した。得られマウスの場合GS細胞の増殖因子としてGDNFがた 精 細 管 を さ ら に 0.25 ％ ト リ プ シ ン ・ １ mM用いられてきたが，牛・豚では異なる可能性もあEDTAで消化することで精細管をシングルセルる。

にした。トリプシンの反応は最終濃度10％となる研究代表者はマウス精子幹細胞自己複製メカニ

豚精巣細胞の単離と培養

ようFBSを添加することで停止させた。

ズム解析の過程で，GDNF非存在下，FGF2に依© The Ito Foundation

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養技術の開発

2.3

豚精巣細胞の培養167を行ったが，ラミニンコートディッシュには体細得られた細胞は，24well plate（IWAKI）に播

胞以外の細胞は接着しないことを目視で確認し種し37℃５％CO2 条件で培養した。基礎培地はた。そこで次に，ファイブロネクチンをコートし

StemPro 34

を基本とした培地，およびIMDM

たディッシュ上での培養を行ったところ，体細胞培地にKnockout Serum Replacement（Invitrogenとは異なる円形の細胞が接着していることを見い; KSR）を添加したIscove培地の二種類を使用しだし，培養を継続した。培地の条件は，５，10，た８）。得られた細胞は，ゼラチンコートした6well

20％終濃度でKSRを添加したIscove培地およびtissue culture plate（IWAKI）に５×10 cells/well

StemPro34培地に10ng/mlでFGF2を添加したもで播種し37℃５％CO2条件で24時間培養の後，浮のを基本培地とし，１％，0.1％での血清添加，

遊細胞をさらにラミニンまたはフィブロネクチン

あるいは１μM PD0325901の添加を検討した。

１）

5をコートした24well tissue culture plate（IWAKI）

ファイブロネクチン上で培養した場合，血清を１％から0.1％に下げることで体細胞の増殖を抑に移し培養を続けた。
2 . 4 マ ウ ス 精 子 幹 細 胞 の 培 養 と real-time

制することができたが，血清を入れない場合はいずれの細胞も接着しなかった。一方，PD0325901

PCR
マウス精子幹細胞の培養については，2015年にを添加すると血清存在下でも体細胞の生存・増殖発表した文献に従い行い，RNAを抽出し，real-を協力に抑制できたが，生殖細胞様細胞の増殖もtime PCRで遺伝子発現を比較した 。使用した認められなかった。Stem Pro34培地に血清を１％

プライマーはTable１に示す。

添加し培養した場合，一ヶ月後に進展せずに丸い

７）

３．結

形態を保った接着細胞が徐々に増殖することが確果認できた。しかしこの条件では体細胞も増殖し，

3 . 1 豚精巣細胞の培養

この細胞を淘汰しつつあった。この条件で血清を８週齢Duroc種より得た精細管構成細胞（セル0.1％に減らすと体細胞の増殖は抑制されたが，トリ細胞，精原細胞を含む）を，種々の条件で試生殖細胞様の細胞も減少した。一方Iscove培地に験管内培養し，観察を行った。まず，接着条件と20 ％ KSR ， 0.1 ％ FBS を 添 加 し た 条 件 で はしてマウス同様ラミニンコートした培養皿で培養

StemPro培地よりも体細胞の増殖が抑制され，生Table 1 Primers for real-time PCR
Gene
Dazl
Hprt
Kit
Neurog3
Rarg
Sall4
Sohlh1
Sohlh2
Sox3
Stra8
T
Uchl1

Forward primer
AAGGCAAAATCATGCCAAAC
GCTGGTGAAAAGGACCTCT
GGGCTAGCCAGAGACATCAG
AGCAGAGAGGCTCAGCTATCCAGGTCACCAGAAATCGATGC
TTCGTGTGTAACATATGCGG
ATGGAGCACCCTTTCTGATGTCTCAGCCACATCACAGAGGCGTAACTGTCGGGGTTTTGT
GACTGACTCGTCAGGGCTTCGCCAAAGAAAGAAACGACCAGATTAACCCCGAGATGCTGA

Reverse primer
TTCTGCACATCCACGTCATT
CACAGGACTAGAACACCTGC
AGGAGAAGAGCTCCCAGAGG
AACTGAGCACTTCGTGGTCC
CTGGCAGAGTGAGGGAAAAGGTGTACTGGTTCCAGGAGGC
ACAGCTCCCCAGCAAACTAATCATGGGGAGAGACAGTTCCAACCTAGGAATCCGGGAAGACATCATCACTGGGTTGGTTGTGACCGGTGGTTCCTTAGAG
CCTGTCCCTTCAGTTCCTCA© The Ito Foundation

168

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

殖細胞様の細胞はプレートから脱離しやすくなっ

候補遺伝子として精原細胞に発現するとされていていたものの，増殖は維持されていた（Fig.１）。

る16遺伝子を解析し，うち15遺伝子が差次的発現

3.2

新しい精子幹細胞マーカーの探索を示した。15遺伝子のうちGDNF依存性に発現すマウスの精子幹細胞はGDNFあるいはFGF2刺る遺伝子は T のみであり，残り14遺伝子はすべ

激により増殖させることができたが，豚の場合てFGF2依存性精子幹細胞で高発現を示してい

GDNFでは増殖させることができない可能性があた。細胞表面タンパクをコードする遺伝子はKitる。そこで豚精巣からGDNF非依存性，つまりのみであり，FGF2依存性精子幹細胞で高発現をFGF2に反応して増える精子幹細胞を精製するた示していた。残りはDNAまたはRNAに結合し遺めのマーカー探索を行った。マウス精巣由来の伝子機能を制御・修飾するものをコードする遺伝

GDNF依存性精子幹細胞とFGF2依存性精子幹細子であった。差次的発現を示さない遺伝子はSox2胞よりRNAを回収，real-time PCRによりマーであり，元々精子幹細胞での発現は低いことがカー候補遺伝子の発現比較を行った（Fig.２）。

RNAおよびタンパクレベルで示されているもの
であった。
４．考

察

前年度に確立した豚精巣シングルセル調製法により間質細胞混入の少ない生殖細胞集団を得て，培養を行った。結果として体細胞とは形態の異なる集団を培養することに成功しているが，現在のところこの細胞が生殖細胞かどうかは確定していない。
これまでは豚精巣細胞を培養すると体細胞の過増殖により生殖細胞が淘汰されてしまっていた。
今年度はこの点を克服するための対策として『PD0325901の添加』『無血清／低血清培養』について検討を行った。前者については効果的に体細Fig. 1 Cultured cell from 8 weeks old pig testis under

Relative
expression（Fold）

low serum condition. Cells were seeded onto
fibronectin-coated dish and cultured with Iscove
medium containing 20％ KSR, 0.1％ fetal bovine
serum, and 10 ng/ml FGF2.

2.5

F-SPG

2.0

G-SPG

胞の増殖を抑制したが，生殖細胞様の細胞コロニーも認められなかった。無血清培養の場合も同様であった。一方，血清濃度を0.1％に減じるこ** P＜0.05

1.5
1.0
0.5
0

*

*

*

*

Kit

Dazl

Ddx4

Rarg

*

*

*

*

*

*

Sall4 Sohlh1 Sohlh2 Sox2 Sox3 Stra8 Uchl1

T

Fig. 2 Spermatogonial marker expression in FGF2-/GDNF-cultured spermatogonia（F-/G-SPG）in vitro.

© The Ito Foundation

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養技術の開発

169とで体細胞とは異なり丸い形態を保ちつつ徐々にで，試験管内培養の成功率を改善できる可能性が増殖する細胞集団が現れた。この細胞が生殖細胞ある。

マーカーを発現していれば，精子幹細胞である可能性が高い。この細胞の出現に関する再現性をとるとともに，遺伝子発現解析等により確認をとり
たい。

５．要

約

今年度の研究では，豚精巣由来細胞を低血清下，FGF2刺激を加えて培養することで，精巣体加えて，試験管内で培養可能な豚精子幹細胞を細胞の増殖を抑えられること，および体細胞とは精巣から効率よく抽出・評価するためのマーカー

異なる円形の盛り上がった細胞が増殖してくるこ候補を探索した。マウスでは精子幹細胞の自己複とを見いだした。加えて，FGF2依存性に増殖す製にはGDNF依存性，FGF2依存性の２つの様式

る精子幹細胞を純化するためのマーカー遺伝子をがあることが分かっていた。一方，牛・豚精子幹複数同定した。今後，これらの知見を活かし牛・細胞は培養が成功していない。この原因の一つと豚精子幹細胞培養法の確立を目指す。

して，牛・豚精子幹細胞がGDNF依存性ではない
可能性があげられる。そこで，FGF2依存性に増殖する精子幹細胞特異的なマーカーを用いた純化法により，試験管内培養が可能な牛・豚精子幹細胞が純化できる可能性があると考え，この実験を行った。結果としてKITがFGF2依存性精子幹細胞の細胞表面マーカーとなりうること，FGF2依存性／GDNF依存性に増殖する精子幹細胞で発現が高い遺伝子マーカーを同定することができた。
これらを指標に牛・豚精子幹細胞を純化すること

引用文献１） Shinohara, K. et al. : Biol. Reprod., 69, 612～616,
2003.
２） Shinohara, K. et al. : Development, 132, 4155～63,
2005.
３） Shinohara, K. et al. : Biol. Reprod., 72, 236～240,
2005.
４） Shinohara, K. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA,103, 8018～8023, 2000.
５） Sato et al. : Nature, 471, 504～507, 2011.
６） Sato et al. : Nature Commun., 2, 472, 2011.
７） Takashima et al. : Stem Cell Reports, 4, 489～502,
2015.
８） Shinohara, K. et al. : Biol. Reprod., 91, 88, 2014.

© The Ito Foundation

170

乳牛における炎症性子宮疾患の迅速診断を目指した
子宮の炎症度スコアの確立
Establishment of the scoring of uterine inflammation in dairy cows for a
rapid diagnosis

清

水

隆

（帯広畜産大学畜産衛生学研究部門）

Takashi Shimizu（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, Department of Animal and Food Hygiene）

Inflammatory uterine diseases that are developed by infection of gram-negative bacteria
affect ovarian function in dairy cows. However, relationship between inflammation score ofuterus and ovarian function is unknown yet. In the present study, we examined effect ofuterine inflammation score（Score 0-3）on concentration of lipopolysaccharide（LPS）andmalondialdehyde（MDA, oxidation stress marker）in ovarian follicular fluid by using uterus
and ovaries that were collected from slaughterhouse. Escherichia coli, β-streptococcus group
G, Acinetobacter loffii, Pasteurella sp, Stenotrophomonas maltophilia, Enterobacter sp, Klebsiellasp, and Pseudomonas fluorescens were isolated from uterus which caused inflammation.
Pathogenic bacteria were detected in uterus that have uterine fluid and Score more than 2.
There were no significant differences between concentration of LPS in follicular fluid anduterine inflammation score. The same tendency was also observed in concentration of MDA infollicular fluid. The results from the present study suggest that degree of uterine inflammation
may be not associated with ovarian follicular functions in dairy cows. We are not able to know
the days after calving because we used the samples that were collected from slaughterhouse.
Therefore, to examine in detail, we have to use ovaries and uterus that are collected from cowsthat develop uterine inflammatory disease. It is very important to examine the relationshipbetween degree of uterine inflammation and ovarian function for improvement of reproductionof dairy cows.

１．目より，子宮の炎症スコアと子宮の性状性や卵巣機的能との相互連関を明確化することを目的とした。

本研究課題では，１）子宮の炎症度合の基準化（スコア化）を行うとともに，２）子宮内貯留液
中のリポポリサッカライド（LPS）濃度と卵胞内のマロンジアルデヒド（MDA）濃度やLPS濃度とが炎症スコアと関連するのかを検証することに

２．方法

研究課題１．子宮の炎症のスコア化と子宮内貯留液のLPS濃度との相互連関の検証
炎症を起こした子宮には様々な炎症状態が認め© The Ito Foundation

乳牛における炎症性子宮疾患の迅速診断を目指した子宮の炎症度スコアの確立

171られる。子宮の炎症度合について子宮内膜層の充３に分類した（Fig.１）。スコアリングは，子宮血度合を指標とした分類（スコア化）はこれまで

内膜の充血がないものをスコア０，子宮内膜全体にされていない。また，その時の子宮内貯留液中の50％以下の部分が赤味を帯びているものをスコの細菌種やLPS濃度を詳細に検証した報告はない。

ア１，子宮内膜全体の50％以上の部分が赤味を帯

そこで本研究課題では，食肉処理場由来の乳牛

びているものをスコア２，子宮内膜全体が爛れての生殖器を利用し，子宮内膜層の充血度合によりいるものをスコア３とした。

炎 症 の 状 態 を ス コ ア ０（正 常），ス コ ア １（軽本研究において，子宮内膜の充血度から炎症性度），スコア２（中度），スコア３（重度）の４段

子宮疾患へのアプローチを試みた。子宮内貯留液

階に分類するとともに，子宮内貯留液を採取すが存在していた子宮に膿片を含む貯留液や膿粘性る。採取した子宮内貯留液は，LPS測定キットの貯留液を確認した。さらに貯留液の存在する子（Endospecy ES-24S kit, Seikagaku Biobusiness）

宮で子宮疾患を引き起こす可能性のある病原性細を用いて測定すると同時に細菌検査を行った。

菌を検出した（Fig.２）。子宮から検出された細菌研究課題２．子宮炎症のスコアと卵巣内卵胞のLPS濃度およびMDA濃度との関連解析

は，Escherichia coli（大腸菌），β-streptococcus
group G, Acinetobacter loffii, Pasteurella sp,

申請者は，これまでに卵巣内卵胞にLPSが存在

Stenotrophomonas maltophilia, Enterobacter sp,

すること，またLPS濃度の高い卵胞と低い卵胞がKlebsiella sp, Pseudomonas fluorescensであった。

存在することを明らかにした。また，LPS濃度のスコア０およびスコア１における病原性細菌と日高い卵胞では，ステロイドホルモンの産生能が低和見細菌の検出率についてみてみると，いずれの下していることも発見した。そこで，本研究課題

スコアにおいても病原性細菌の検出率と日和見細では，子宮の炎症度合（スコア）と卵胞内LPS濃菌の検出率との間に有意な差は認められなかっ度との関係性を検証するとともに，卵胞内の酸化た。スコア１で子宮内貯留液が認められた場合でストレス状態を同時に測定することによって，子は，病原性細菌の検出率が日和見細菌の検出率に

宮の炎症度合と卵胞の生理学的状態との関係性を比べ高い傾向が認められた（Fig.３）。スコア２

詳細に調べた。研究課題１と同様に，子宮の炎症

以上で子宮内貯留液が認められた子宮では，病原スコアの分類時に，その子宮に付随している卵巣性細菌のみ観察された。

内の大卵胞から卵胞液を採取する。採取した卵胞

子宮から膣への滲出液に存在する膿の割合をス

液は，LPS測定キットを用いたLPS濃度の測定にコア化し，子宮内の病原性細菌との関連性を調べ供した。さらに，酸化ストレスの指標であるマロ

た過去の研究では１），膣滲出液のスコアと病原性

ンジアルデヒド（MDA）キット（Japan Institute

細菌の検出との間に有意な正の相関が認められる

for the Control of Aging, Shizuoka, Japan）を用ことが報告された。また，超音波画像診断を用い

いて卵胞液中のMDA濃度を測定した。

て子宮内貯留液の蓄積量を分類した研究では，貯留液の蓄積量が多い子宮は子宮内細菌の増殖や病３．結果と考察

原性細菌の高い検出が認められた２）。これらのこ

3 . 1 子宮の炎症のスコア化と子宮内貯留液のとから，子宮内に膿を含む貯留液が存在すること

LPS濃度との相互連関の検証について

は，炎症性子宮疾患を引き起こす病原性細菌が感子宮内膜の充血度をもとにスコア０からスコア染している可能性のあることが推察される。した© The Ito Foundation

172

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Score 0Score 1

Score 2

Score 3Fig. 1 Photos and score of uterine endometrium
Score0, no hyperemia ; Score1, hyperemia at ＜50％ of the endometrial surface ; Score2, hyperemia at ＜50％ of the endometrial
surface ; Score3, brown and grey colored endometrial surface.

Bacteria detection
rares（ %）100%がって，本研究の結果から，牛子宮内に貯留液が80%溜まっており充血が認められる子宮は炎症性子宮

60%

疾患に罹患している可能性が高いことが示唆され

40%

た。

20%

3 . 2 子宮炎症のスコアと卵巣内卵胞のLPS濃0%度およびMDA濃度との関連解析について
Uterine

子宮内膜充血度スコアと卵胞液中のLPS濃度おﬂuid

Fig. 2 Bacteria detection rates from bovine uterus
Opportunist bacteria（white bar）and pathogenic bacteria（black bar）isolated from uterus of bovine（n＝37）. Uterine
fluid negative : n＝27, Uterine fluid positive : n＝10.
Values are shown as percent（％）.ａ-b, P＜0.01

れにおいても子宮内膜充血度スコアとの関連性が認められなかった（Fig.４，Fig.５）。
子宮内に存在した病原性細菌から放出される

100%
Bacteria detection rates（%）

よびMDA濃度との関係性を検証した結果，いずLPSが，血中に移行するのか否かは不明である。

80%

しかしながら，本研究室の過去の研究では，炎症60%

性子宮疾患を患った乳牛の血中にはLPSが高濃度40%に存在することが確認されていることから，卵巣内卵胞に認められたLPSが子宮由来である可能性

20%0%は否定できない。本研究成果において，子宮内細
0

1

1+

2

2+

Endometrial hyperemic score（Uterine ﬂuid）

3+

菌の有無に関係なく卵胞液中には一定量のLPSが検出された。このことは，子宮の炎症が回復した

Fig. 3 Bacteria detection rates from bovine uterus
Opportunist bacteria（white bar）and pathogenic bacteria（black bar）isolated from bovine uterus（n＝37）. Score0（n＝18）, Score1（n＝6）, Score1＋（n＝6）, Score2（n＝3）, Score2＋（n＝2）, Score3＋（n＝2）．＋ : Uterus include uterine fluid.

後も卵胞内にLPSが留まる可能性を示唆している。事実，臨床の現場では，子宮の炎症が認められない乳牛に人工授精を施行しても受胎しない© The Ito Foundation

LP S conc.（E U/ml）

乳牛における炎症性子宮疾患の迅速診断を目指した子宮の炎症度スコアの確立
1.0

処理場由来のものであり，その個体の血中MDA

0.8

濃度がどの程度であったかは解析することができない。細菌感染によって生体内が酸化ストレス状

0.6態になりやすいことを考慮すると，本研究に用い

0.4た子宮内膜充血度スコアが高い乳牛の生体内では0.2

酸化ストレス状態になっていることが予測できる

0.0

が，卵胞液中MDA濃度には反映されていない。
0

1

1+

２

2+

3

Hyperemic score of endometrium
Fig. 4 LPS concentration in follicular fluid of large follicle

from bovine ovary and hyperemic score ofendometrium
Score0 : n ＝ 23, Score1 : n ＝ 8, Score1 ＋ : n ＝ 8, Score2 : n ＝ 3,
Score2＋ : n＝3, Score3＋ : n＝3. ‘＋’ means presence of uterine
fluid. All values are shown as mean±SEM.

４．要約

本研究課題では，子宮の炎症スコアと子宮の性状性や卵巣機能との相互連関を明確化することを目的とし，食肉処理場由来の卵巣および子宮を用いて検証した。子宮内膜充血度スコア，貯留液の有無と卵胞液中LPS濃度および酸化ストレス状態

1.6
MDA conc.
（μM）

173

1.4

との間には明確な関連性は認められなかった。し1.2

かしながら，子宮内膜充血度スコアと検出細菌と

1.0
0.8

の関係性においては，充血度スコア２および３で0.6

は病原性細菌の検出割合が高いことが示された。

0.4

このことは，病原性細菌が子宮内の炎症を誘発し

0.2
0.0

0

1

1+

2

2+

Hyperemic score of endometrium
Fig. 5 MDA concentration in follicular fluid of large

follicle from bovine ovary and hyperemic score ofendometrium
Score0 : n ＝ 22, Score1 : n ＝ 8, Score1 ＋ : n ＝ 6, Score2 : n ＝ 3,
Score2＋ : n＝3. ‘＋’ means presence of uterine fluid. All values
are shown as mean±SEM.

ている可能性を示唆している。
本研究課題の成果から，炎症性子宮疾患による細菌感染や酸化ストレス状態は卵胞機能に直接的には影響しない可能性が推察された。前述したとおり本研究に用いた乳牛の子宮および卵巣は食肉処理場由来のものであり，研究に用いた乳牛の分
娩後の経過日数が不明である。酪農現場で簡易にケースが見受けられる。このようなことから，卵判断できる炎症スコアを確立するために，今後は胞内に長期間留まっているLPSが卵胞発育や卵子分娩後の日数を考慮し継続的に観察することが可の質に影響している可能性が推察される。

能な炎症性子宮疾患の罹患牛を用い，子宮内膜のまた，子宮内細菌および子宮内貯留液と卵胞液

充血度，細菌および貯留液の有無と卵胞液中LPS

中のMDA濃度との間に関連性は認められなかっ濃度および酸化ストレス状態との関連性をより詳た。細菌感染によって引き起こされる疾患に乳房細に解析することが必要であると考えられる。こ炎がある。乳房炎に罹患した乳牛の血中MDAをのような対策を行うことにより，乳牛の生産性向調べた研究では，血中MDA濃度が健康牛に比べ上を目指した取り組みが可能になる。

て乳房炎牛で増加することが報告されている３）。
本研究に用いた炎症性子宮疾患牛の卵巣は，食肉© The Ito Foundation

174

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

文献１） Dohmen, M. J. W., Lohuis, A. C. M., Huszenicza,
G.y., Nagy, P., Gacs, M. : Theriogenology, 43, 1379～
1388, 1995.

２） Mateus, L., Lopes da Costa, L., Bernardo, F.,
Robalo Silva, J. : Domest. Anim., 37, 31～35, 2002.
３） Jhambh, R., Dimri, U., Gupta, V. K., Rathore, R. :Veterinary World, 6, 271～273, 2013.

© The Ito Foundation

175

異なる発情判定基準による牛人工授精適期の再設定
Novel standard for artificial insemination timing based on different estrous
detection criteria in cattle

坂

口

実・菊

池

元

宏・三

浦

弘

（北里大学獣医学部）

Minoru Sakaguchi, Motohiro Kikuchi and Hiroshi Miura（School of Veterinary Medicine, Kitasato University）

Detection of estrus is prerequisite for optimal timing of insemination. Recently, however, it
is becoming difficult to detect standing estrus, which is the primary sign of true estrus. In thisstudy we tried to evaluate other estrus-related behaviors and increased activity as estrus
signs for the purposes of determining more optimal timing of insemination. Visual or continuous
observation using a video system and activity monitoring using an automated pedometry
system were performed in Japanese beef cows and the frequency and duration of estrous
behaviors of these cows were analyzed. The intervals from the onset or the end of estrus
confirmed by the different detection methods to ovulation were significantly variable. Thesevariance must be taken into consideration when using the different methods for determining
optimal timing of insemination. In this study, because estrus was synchronized and 2 or more
cows were in estrus simultaneously, it was easy to find the standing and mounting activities,
and other two behavior（chin resting and sniffing vagina）will be supplemental methods toincrease sensitivity to predict optimal timing of insemination. In addition, it was preliminary
confirmed that social order of the cows may affect the expression of estrous behavior. To apply
these information for increasing sensitivity of the prediction methods for optimal timing of
insemination, further investigation is needed to clarify the effects of number of cows in estrus
on the estrus length and estrous sign in relation to the social order of cows.

１．目（ST）発情をゴールドスタンダードとして設定さ的れてきたが，これに代わる指標が求められてい酪農および肉牛繁殖経営において，繁殖効率はる。その理由として，乳牛では高泌乳化に伴う発収益性を左右する重要な要因である。我が国で情行動，特にST行動の微弱化と持続期間短縮，は，乳用牛のみならず肉用牛のほぼすべてが人工

肉牛では多頭化等による発情見逃しの増加があげ

授精によって繁殖されており，経営者が望む時期

られる１，２）。また両者に共通して，発情発見スキに，確実に受胎させることが必要である。牛におルの低下も問題視されている。客観的な手法とし

け る 人 工 授 精 の 適 期 は ，従 来 ス タ ン デ ィ ン グて，行動量（歩数）の変化による発情の自動検出© The Ito Foundation

176

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

システムが開発され，急速に普及しつつあるが，省力化および発見率の向上を第一の目的とし，そ

発情から排卵までの時間的関係は，どの基準で発れらの結果から，これまで適期と考えられていた情と判定するかにより異なる ３）。また，ST行動

授精時期について再検討することにより，低受胎以外の発情関連行動の発現時期や頻度と，排卵時率牛群の受胎率向上対策策定の一助とすることを間との関係についてはこれまでほとんど検討され最終的な目的とした。

ていない。さらに牛群内には通常，一定の序列（順位）が存在し行動に影響するため，発情関連

２．方法

行動を個体間の相互作用として捉えることによ北里大学（青森県十和田市）にて飼養されていり，より柔軟かつ実用的な授精適期の設定が可能

た肉用繁殖牛14頭を供試し，前肢に発情検出用のになると考えた。

無線送信歩数計（牛歩，コムテック㈱）を装着し国外ではEU諸国を中心に，発情行動そのものた。供試牛の発情行動を目視（2 . 1）あるいはビに焦点をあてた研究が，2000年代に入り目立つよ

デオカメラ（RD-4402，（株）アルコム）によっ

うになってきている 。こうした研究では，行動て記録した（2 . 2，2 . 3）。

４）

量の自動計測（歩数計，加速度計）を組み合わせた研究も多く，ホルモン剤を用いた繁殖性向上技

2 . 1 目視による発情関連行動記録と排卵時刻の関係

術に対する，消費者の拒否感を背景にしていると予備的な検討として，14頭中６頭の未経産牛を考えられる 。発情観察の必要がないオブシンク

対象に発情同期化処置後，３時間ごとに30分間目に代表される，ホルモン剤使用プログラムが広く視観察し，Van Eerdenburgら７）による発情スコ

普及してきた米国でも，2010年代に入り，ホルモ

ア表に基づいて記録し，２回の連続した観察時

ンプログラム単独での繁殖管理の限界を認識し始に，スコアが50点を超えた時点を発情開始としめた研究グループにより，行動量計測をホルモンた７）。スコアが50以下となった時点から３時間ごプログラムと組み合わせて，繁殖性向上をはかるとに排卵確認を実施し，排卵時刻（卵胞消滅の1.5

研究が見られるようになった６）。

時間前）を推定し，基準とする発情行動が，発情５）

欧米諸国におけるこうした研究は乳牛中心に取開始から排卵までの時間にどのように影響するかり組まれており，肉牛に関する報告は極めて少な解析した。歩数上昇による発情判定は，過去10日

い。これに対し，我が国では，高泌乳牛の繁殖性間の平均値から，２倍以上へ２時間連続して上昇低下の問題については共通であるが，黒毛和種をすることを条件とした。また６時間ごとに採血主体とした肉牛では，素牛価格がはるかに高価でし，血漿中エストラジオール-17β（E2）濃度をあり，ほぼ100％が人工授精あるいは胚移植によ測定した。

り素牛生産が維持されている。肉用牛の受胎性についても乳牛同様に低下しているといわれてお2 . 2 連続観察による発情行動解析と排卵時刻の関係

り，乳牛と同様の発情行動に関する詳細な再検討

経産牛13頭を供試し，プロスタグランディンと，これらに基づいた授精適期の再定義が求めら

F2α投与による発情同期化処置後，３台のビデれている。

オカメラにより，のべ24回の発情行動を記録し，そこで本研究では，行動観察と歩数計による行投与２日後から，１日４回の給餌時に排卵確認を

動量計測を組み合わせることによる，発情観察の実施し排卵時刻を推定（卵胞消滅の３時間前）し© The Ito Foundation

異なる発情判定基準による牛人工授精適期の再設定177た。前出の発情スコア表に記載された行動に加えが逃げる，STの４項目については，観察されなて他の個体を舐める行動も解析対象とし，排卵60

いこともあった。各発情関連行動の開始から排卵時間前からの記録映像より各行動の開始と終了おまでの平均時間を，発情検出率とともにTable１

よび頻度を抽出し，30分ごとの発情スコアを算出に示した。排卵までの平均時間は，陰部嗅ぎ，顎した。スコア合計が100点を上回った時点を発情

のせ行動，発情スコアおよび歩数上昇と比べて，開始と判定し，下回った時点を終了とした。歩数

ST行動で有意に短かった（p＜0.05）。供試牛の上昇は，過去７日間の平均からの1.6倍以上への血漿中E2濃度がピークに達した６時間後に発情ス

上昇を基準とした。

コアのピークが見られ，陰部嗅ぎおよび顎のせ行

2.3

牛群内順位と発情行動の関係

近藤らの提示した餌槽優先法

動とE2 濃度最高値との間に正の相関（p＜0.01）

を一部改変し，８）を認めた。

牛群内の順位付けを実施，発情行動とその後の排これらの結果から，ST行動か歩数上昇を基準

卵時刻への影響を解析した。2 . 2で得られた行動とした場合は，発情を見逃すことがあることが分

データのうち，順位を確定できなかった１頭の２かった。また，発情行動としては陰部嗅ぎが最も発情を除いた，12頭の22発情について，上位６頭，早く発現し，これが発情スコアに反映されている

下位６頭に分けて発情行動の頻度を比較した。

ことも示された。発情開始から排卵までの時間間隔については，ST行動を基準とした場合が最も３．結果と考察

短く，歩数上昇および陰部嗅ぎとの時間差は７～

3 . 1 目視で確認した発情行動発現と排卵時刻８時間あることが分かり，これら異なる指標に基づく人工授精適期の見極めには注意が必要であるの関係
発情スコアを基準とした平均発情持続時間（±
SD）は17.8±7.2時間であり，最大30時間，最小と考えられた。
3 . 2 連続観察による異なる発情判定基準の比６時間であった。排卵は，発情開始から平均32.9

較±5.5時間で，発情終了から平均12.2±5.4時間で次にビデオ記録による連続観察の結果をTable２

観察された。陰部嗅ぎ，顎のせ，およびマウンティに示す。MT，顎のせ，陰部嗅ぎの各行動およびング（MT）行動はすべての発情期間で観察され発情スコアによる方法では，すべての発情を検出たが，フレーメン，頭側からのMT，乗駕されるできたが，歩数上昇も含めたその他の行動では，Table 1 Estrous detection rates and intervals between the onset of different estrous-

related behaviors and subsequent ovulation of cows observed in 3-hour interval
Detected estrusper
11 estrous events（％）

Interval between the onset of
behavior and ovulation（hour, Mean±SD）

Standing heat10（ 91）25.9±7.4aMounting other cows

11（100）30.1±6.1ab

Resting with chin on other cows

11（100）30.1±5.8ab

Sniffing vagina of other cows

11（100）33.1±5.3b

Increased activity10（ 91）33.7±7.8b

Total estrous score11（100）32.9±5.5b

Estrous-related behavior

abValues with different superscript significantly differ（p＜0.05）.

© The Ito Foundation

178

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Table 2 Estrous detection rates and intervals between the onset and the endof different estrous-related behaviors of cows observed continuously
and subsequent ovulation observed 6-hour interval
Estrous-related
behavior

Intervals to ovulation
Detected（hours, Mean±SD）
estrusper
24 estrous
events（％） From the onset From the end（Ａ）（Ｂ）

Estrouspersistence（A-B hours,
Mean±SD）

Standing heat23（ 96）32.8± 7.7a

19.0＋ 7.1b

13.9± 5.4aMounting
other cows

24（100）37.8± 7.7ab

18.7＋ 8.8b

19.1± 7.1ab

Resting withchin onother cows

24（100）39.6± 8.2ab

16.4＋ 8.6ab

23.1± 8.0ab

Sniffing vagina
of other cows

24（100）43.3± 9.1b

14.3＋ 8.4ab

29.0±13.9b

Lickingother cows

18（ 75）38.4±16.4ab

14.7＋11.1ab

23.6±19.0ab

Increased
activity

22（ 92）35.9±13.0ab

7.7＋ 9.2a

28.2±15.5b

Total estrousscore

24（100）35.8± 7.5ab

19.5＋ 8.2b

16.3± 7.4aabValues with different superscript significantly differ（p＜0.05）.

発情を検出できない場合もあることが示された。

いても一般的な範囲にあったのはST行動と発情排卵を起点とした各行動の開始は2 . 2同様，陰部

スコアによる判定のみであった。したがって，嗅ぎで最も早く，ST行動では最も遅く平均で10ST行動を確認した場合を除き，他の発情行動に時間余りの差を認めた。終了から排卵までの時間

より授精適期を決定する際には，このような時間

は，約８時間であった歩数上昇を除き，14～20時

的なずれを考慮すべきであると考えられた。

間の範囲にあった。開始から終了までの持続時間

６種類の発情行動の頻度をTable３に示す。同については，ST行動が最も短く，最も長かった

時発情の条件下ではMT行動の頻度が最も高いこ

歩数上昇との間に，14時間余りの差を認めた。

とが分かった。また，発情期間中の１時間あたりST行動を指標とした，一般的な牛の発情開始の行動回数で見ると，舐め行動が１回以下と低頻および終了から排卵までの平均時間（範囲）は，度であるのに対し，ST，MT，顎のせの各行動はそれぞれ28（24～34）時間および12（10～15）時

2.4回以上と高頻度で発現しており，陰部嗅ぎは間で，持続時間は15（12～18）時間とされていそれらの中間であった。

る 。今回の解析では，発情を同期化したため，これらの結果と時間的な解析をあわせると，少すべての発情発現時に他の発情牛が存在していなくとも同時発情の条件下では，STおよびMT行た。このため，開始時間で一般的な範囲にあった動は見つかりやすく，顎のせと陰部嗅ぎ行動を参のはST行動のみであり，終了時間では，陰部嗅考にすることで発情発見および授精適期推定精度

ぎ，舐め行動のみであった。また，持続時間につを向上できるものと考えられた。ただし，授精適

９）© The Ito Foundation

179

異なる発情判定基準による牛人工授精適期の再設定
Table 3 Frequency ofestrous-related behaviors of cows observed continuously
Frequency

Estrous-related
behavior

Number of
estrousperiods

Total

Per one estrous
periodPer hour during
estrusStanding heat

23

1015

44.1

3.1±1.9bc

Mounting
other cows

24

1480

61.7

3.3±1.8c

Resting withchin onother cows

24

1315

54.8

2.4±1.7bc

Sniffing vagina
of other cows

24

1121

46.7

1.9±1.5ab

Lickingother cows

18

349

19.2

0.9±1.0aabcValues with different superscript significantly differ（p＜0.05）.

Table 4 Comparison of the frequencies of estrous-related behaviors between

dominant and non-dominant cows observed continuously
Estrous-related
behavior

Total frequency（No. of cows）

Per hour during estrus

Dominant

Non-dominant

Dominant

Non-dominantStanding heat

628（10）361（9）

3.4＋2.2

2.8±1.8

Mounting
other cows878（12）546（10）3.9＋2.1

2.9±1.5

Resting withchin onother cows

742（12）527（10）2.4＋1.7

2.6±1.7

Sniffing vagina
of other cows

601（12）456（10）2.2＋1.2

1.6±1.9

Lickingother cows

230（9）

96（7）1.3＋1.2

0.4±0.5

期推定には各行動と排卵までの時間的関係に注意

Table４に示す。発情期間中のそれぞれの行動のが必要である。さらに今回示していないが，単独総回数は，いずれも上位牛で多く観察された。一発情では，行動開始の遅延および持続時間の短縮

時間あたりの平均回数で比較すると，顎のせ行動が見られ，各行動の頻度も下がることを予備的なを除いて上位牛で多かったが，いずれの行動につ検討で確認していることから，ビデオ映像によるいても，有意な差を認めなかった。個体間の行動

同様の解析を単独発情でも実施し，同時発情での頻度のばらつきが大きいことが，有意差を検出で結果と比較することが，現場応用には必須と思わきなかった原因の一つと推測された。したがっれる。

て，こうした情報を授精適期推定の精度向上に利

3.3

牛群内順位と発情行動発現との関係用するためには，同時発情牛との社会的関係（順

牛群内順位と発情行動発現頻度との関係を

位の違い）や，発情行動開始のタイミングとの関© The Ito Foundation

180

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

係をより詳細に調べることが必要である。

上に使えることが分かった。個体間の社会的関係

今後はこうした社会的関係も含め，単独発情でに関する情報を授精適期推定の精度向上に利用すも同様の観察実験を実施し，同時発情での結果とるためには，相手牛の順位や，発情行動開始のタ比較することにより，生産現場でのより正確な授イミングとの関係についてもより詳細に調べる必

精適期推定に結びつけていく予定である。

要がある。単独発情では，行動の開始および持続４．要時間は短縮し，頻度も下がると予測されるため，

約

同様の観察実験を単独発情についても実施し同時目視観察の予備的検討結果から，陰部嗅ぎ行動が最も早く発現し，ST行動か歩数上昇を基準と発情の結果と比較することで，より応用範囲の広い情報が得られると考えた。

した場合，発情を見逃す可能性のあることが分かった。発情開始から排卵までの時間間隔はST
行動を基準とした場合が最も短く，歩数上昇および陰部嗅ぎとの時間差は７～８時間あり，用いる指標によって人工授精適期が異なることが示された。ビデオによる連続観察では，開始時間が一般的な範囲にあったのはST行動のみであり，終了
時間では，陰部嗅ぎ，舐め行動のみであった。持続時間で一般的な範囲にあったのはST行動と発情スコアのみであった。したがって，ST行動を確認した場合を除き，他の発情行動により授精適期を決定する際には，こうした時間的なずれを考慮する必要がある。今回の同時発情条件下では，
STおよびMT行動は容易に発現し，顎のせと陰部

文献１） 坂口実：畜産の研究，61, 75～80, 2007.
２） 坂口実：農業技術体系，畜産編（追録26号），第２巻，乳牛①，基礎編，乳牛の生理，繁殖生理pp.基126の8～15，農山漁村文化協会，2007.
３） Sakaguchi, M., et al. : J. Reprod. Dev., 53, 819～
828, 2007.
４） Kerbrat, S., Disenhaus, C. : Appl. Anim Behav.
Sci., 87, 223～238, 2004.
５） Refsdal, A. O. : Anim. Reprod. Sci., 60-61, 109～
119, 2000.
６） Fricke, P. M., et al. : J. Dairy Sci., 97, 2771～2781,
2014.
７） Van Eerdenburg, F. J. C. M., et al. : Vet. Quart.,
18, 52-54, 1996.
８） 近藤誠司：北海道大学農学部紀要，15, 192-233,
1987.
９） 中尾敏彦，津曲茂久，片桐成二編：獣医繁殖学，第４版，1～545，文永堂出版，東京，2012.

嗅ぎ行動を発情発見および授精適期推定精度の向© The Ito Foundation

181

氷晶形成抑制効果の高いアミノ酸を利用した豚卵巣および精液の過冷却保存
Supercooling preservation of pig ovaries and the semen by using an aminoacid that effectively inhibits ice crystal formation

星

野

由

美

（広島大学大学院生物圏科学研究科）

Yumi Hoshino（Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University）

Cryopreservation is extensively used for the preservation of reproductive cells（oocytes
and sperm）. This method offers a major advantage as the frozen material can be preserved
almost permanently in liquid nitrogen. However, DMSO and ethylene glycol used in thepreservation solution are known to be cytotoxic, and cellular damage by freezing injury is
responsible for the low fertilization and development rate. Efforts have been made in recent
years for ovary and oocyte preservation such that the ovary functionis maintained. However,the success rate of ovary cryopreservation is very low owing to the complicated structure ofovaries. Therefore, novel technologies need to be explored for ovary preservation. In this study,
the validity of a non-cryopreserve compound and an amino acid that is expected to have asupercooling-promoting effect were inspected with the aim of developing a non-freeze
preservation technology for the preservation of ovaries and semen. The coffee extracts caffeine,
hypoxanthine, and uric acid were used as supercooling-accelerating substances. Based on the
structural properties of amino acids, threonine, serine, and tyrosine were chosen and peptidesof each amino acid were synthesized and the supercooling-promoting effect was observed toelucidate as to which amino acid exhibited anti-ice nucleation activity. A supercoolingpromoting effect was observed with all the compounds and peptides tested. However, acollapse in the organizational structure of the ovaries was observed in ovaries treated with allcompounds other than those treated with the coffee extract. This was attributed to the
influence of chilling injury. It was hypothesized that the polyphenols in the coffee extract
exhibited anti-oxidant activity and protected the ovaries from damage at low temperatures.
Chilling injury could be reduced by combining a non-freezing protein, an antioxidant, and asupercooling-accelerating substance. In this study, supercooling preservation of ovaries wasachieved by using supercooling-accelerating substances and an amino acid. When theappropriate condition can be built, non-cryopreserve of an ovary would become possible.

© The Ito Foundation

182
１．目

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）の技術の確立が必要である。

的研究代表者らのこれまでの研究で，食品廃棄物

生殖細胞の保存には，ガラス化法や緩慢凍結法に含まれる植物由来の抽出液が，卵子の過冷却保などの超低温保存法が広く用いられている。凍結存に有効であることを明らかにした（投稿準備を伴う保存は，液体窒素中で半永久的に保存でき中）。研究分担者である関西大学の河原秀久教授

るメリットがあるが，保存液に含まれる凍害保護のグループは，植物由来抽出物の氷晶形成抑制効

物質の細胞毒性や凍結させることで生じる凍結障果について研究を進め，氷晶形成の抑制効果はア

害による細胞へのダメージが大きく，受精率や発ミノ酸組成に大きく依存することを突き止めてい生率を低下させる原因となっている 。例えば，る（未発表データ）。すなわち，食品廃棄物を使保存液に添加されることの多いエチレングリコー

用せずとも，そこに含まれるアミノ酸を特定でき

ル（EG）やジメチルスルホキシド（DMSO）はれば，簡便で安定した保存法を確立できるものとDNA・染色体の構造変化やDNAのメチル化に影期待される。そこで本研究では，氷晶形成抑制効

響を及ぼしていると報告されている。このよ

果をもつ食品廃棄物に共通するアミノ酸を同定す

うな中，医学分野においては臓器移植のための臓るとともに，精製したアミノ酸のペプチドを用い器保存の研究も進められている。2014年にはハーて卵巣および精液の過冷却保存の有効性を検証す

バード大学の研究チームによって，ラットの肝臓ることとした。

１）

２，３）を過冷却保存し，移植後に肝臓機能を回復させる
ことに成功したとの報告がなされた４）。このこと

２．方法

は，凍結しなくとも過冷却状態を維持させること

卵巣における過冷却保存の条件を検討するたで，組織や臓器を保存できることを示している。

め，サイズが小さく，入手が容易なマウスを用い卵巣は，卵子を作る器官であるが，同時にエスて予備実験を重ねた。卵巣の過冷却保存の流れはトロゲン（卵胞ホルモン）やプロゲステロン（黄以下のとおりであった。卵巣はPMSG投与46時間

体ホルモン）を分泌する役割も担っており，排卵後の３週齢ICR雌マウスから摘出し，200ulの臓や妊娠維持に重要な臓器である。これまで，卵子器保存液（UW液）に卵巣１個を浸漬した。温度の保存は個々の細胞の保存を目的に行われてきた

制御と過冷却維持には超低温アルミブロック恒温

が，卵巣保存が可能になれば，卵巣内に含まれる槽（サイニクス社，クライオポーター）を使用

多様なステージの卵子を保存でき，また卵巣機能し，20℃から段階的（0.1℃／分）に温度を下げ，も維持させることができることから，そのメリッ－６～－10℃の温度下で24時間以上の保存を行っトは大きい。一方，雄の生殖細胞である精子は，た。温度の回復には，段階的（0.1℃／分）に温

家畜の場合，人工授精用にストローで保存されて度を上げ，４℃または20℃で卵巣を回収した。温いる。牛の凍結精液は広く利用されているが，豚度制御については，Berendsenらの方法に準じての精子は温度感受性が高いことから低温保存は難設定を行った４）。過冷却促進効果が報告されてい

しく，一般的な技術には至っていない。今後，豚るカフェインの構造を指標にして，カフェイン，の育種改良や繁殖増産を展開していくためには，

テオフィリン，テオブロミン，尿酸，グアニン，

安定した人工授精の実現が不可欠である。そのた

キサンチン，ヒポキサンチン，アデニンの抗氷核

めには，液状精液を安定的に長期間保存するため活性を比較し，候補化合物を選定した。抗氷核活© The Ito Foundation

183

氷晶形成抑制効果の高いアミノ酸を利用した豚卵巣および精液の過冷却保存性を期待できるアミノ酸の候補を選定し，併せてあった。いずれも抗氷核活性は高いことが確認で重合度による影響も解析した。コントロールとしきたが，本実験では入手と取り扱いが容易な，カて，研究代表者らによる研究で卵子の過冷却保存

フェイン，ヒポキサンチン，尿酸を候補物質としへの有効性が実証されているコーヒー粕抽出液をて選定した。また，抗氷核活性の期待できるアミ添加した区を設けた。過冷却促進効果を検証する

ノ酸には，スレオニン，セリン，チロシンを選定

ため，化合物とアミノ酸およびそのペプチドはし，それぞれ重合度の異なるペプチド（２量体，UW液に０，0.5，1.0㎎/mlの濃度で添加した。過３量体，４量体）を作製した。それぞれを0.5ま

冷却保存後，卵巣の健常性を評価するために卵巣たは1.0㎎/mlの濃度になるようUW液に添加し，はホルマリンで固定し，ヘマトキシリン・エオシ

過冷却促進効果を検証したところ，いずれの化合

ン（HE）染色による組織学的解析を行った。ま物・ペプチドを添加した場合でも，－６～－10℃

た，保存後の卵巣から卵胞を切り出し，アルギンの温度条件では過冷却状態を維持できることを確

酸ゲルで卵胞をコーティングした後，DMEM培認した。24時間保存後の卵巣を組織解析に供試し

地で24時間，37℃，５％CO2の条件下で培養した。

たところ，卵胞膜の硬化と卵胞構造の崩れが認め

培養後，卵胞はアルギン酸ゲルから外してホルマられた（Fig.１）。一方，カフェインを含むコーヒー

リン固定を行い，組織学的解析に供した。精液用

粕由来抽出液添加区では，保存後の卵巣形態は未の保存液は，卵巣保存に用いた液と同様であっ

処理の卵巣と遜色なく維持されていた。過冷却保た。保存液のスケールアップによる保存性および存後の卵巣を卵胞培養に供試して卵胞構造を評価

安定性への影響を解析した。

したところ，ヒポキサンチン添加区は卵胞内の細胞間に多くの間隙が認められ，卵胞構造が崩れて３．結果と考察いる様子が観察された。コーヒー粕由来抽出液添

化合物の抗氷核活性値を測定したところ，それ加区では，その構造は維持されていた（Fig.２）。

ぞれの活性値は，カフェイン（1.3℃），テオフィ

保存液のスケールアップによる影響を解析したとリ ン （2.0 ℃ ）， テ オ ブ ロ ミ ン （1.2 ℃ ），尿 酸

ころ，10mlまでは安定して保存できることを確（1.8℃），グアニン（1.0℃），キサンチン（0.1℃），認した。過冷却状態を安定して維持するために

ヒポキサンチン（2.1℃），アデニン（4.8℃）では，保存容器の材質や形状も重要な要素である。

UW solution

Coﬀee 0.5㎎/ml

Coﬀee 1.0㎎/ml

Hx 0.5㎎/ml

Hx 1.0㎎/ml

Magniﬁed (x20）

Wide (x10）salineFig. 1 Morphological evaluation of hematoxylin and eosin（HE）-stained histological sections of the ovaries after

supercooling preservation. The ovaries treated with saline, UW solution, coffee extract, or hypoxanthine（Hx）for
24 hours at －6℃.

© The Ito Foundation

184

平成27年度Coﬀee 1.0㎎/ml

Hx 1.0㎎/ml

Magniﬁed (x20）

Wide (x10）

UW solution

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Fig. 2 Morphological evaluation after follicle culture of supercooling-preserved ovaries. The ovaries treated with UW

solution, coffee extract, or hypoxanthine（Hx）for 24 hours at －6℃. Histological sections were stained with HE.

豚の卵巣を保存する場合には，十分な液量で卵巣を浸漬できるように，保存に適した容器を開発することが必要である。

４．要

約

生殖細胞の保存には凍結保存法が広く用いられ

一般的に生殖細胞の体外操作では，酸化ストレているが，細胞へのダメージは避けることはできスが生じやすく，それによって生殖細胞はダメー

ず，融解後の受精や発生に影響を及ぼしている。

ジを受ける 。コーヒー粕由来の抽出液には，ポ現状の問題点としては，①凍結することにより生

リフェノールやクロロゲン酸などが含まれておじる細胞膜の損傷，②保存液に含まれる凍害保護

り，これらの物質が過冷却促進物質であるカフェ物質による細胞毒性，である。この問題を解決す

インと相乗して，卵巣保存に機能したと考えられるために，研究代表者らは，未凍結での保存の可る。また，今回検討した化合物やアミノ酸（ペプ

能性を追求し，これまでに植物由来の過冷却促進チド）には過冷却促進効果が認められたことか物質を利用して，卵子の未凍結保存（過冷却保ら，不凍タンパク質や抗酸化物質と組み合わせる存）が可能であることを示してきた。近年では卵ことによって，低温障害を軽減できるものと考え

巣機能を温存させることを目的に，卵巣保存も注られる。本研究では，化合物やアミノ酸の構造特目されている。しかしながら，卵巣は複雑な構造性を利用して過冷却状態を維持できることを示しで維持されているため，凍結保存は極めて困難でた。適切な条件を構築できれば，過冷却状態を維あり，卵巣保存に向けての新たな保存技術の開発

持しながら細胞・組織の低温障害を軽減できる可が必要となっている。そこで本研究では，過冷却能性があり，卵巣の過冷却保存の実現も期待され促進作用のある化合物とアミノ酸（ペプチド）をる。

利用した，卵巣の過冷却保存の可能性を検討し５）た。過冷却促進作用が確認されているカフェイン© The Ito Foundation

氷晶形成抑制効果の高いアミノ酸を利用した豚卵巣および精液の過冷却保存

185の構造に基づいて，構造特性の類似したヒポキサ

ば，臓器の新しい保存法の開発に繋がるものと期

ンチンと尿酸を候補物質として選定した。また，待される。

抗氷核活性の高いアミノ酸としては，スレオニ
ン，セリン，チロシン，フェニルアラニンを選定
し，それぞれ重合度の異なるペプチド（２量体，３量体，４量体）で検討した。その結果，いずれの化合物ならびにペプチドを添加した場合でも過冷却状態を維持できたが，組織解析の結果からは，過冷却促進物質単独の添加では，低温障害を回避できないことが明らかになった。一方，コーヒー粕抽出液添加区では，保存後の卵巣構造は維持されていた。このことは，コーヒー粕抽出液に含まれるポリフェノールやクロロゲン酸が過冷却促進物質であるカフェインと相乗して，卵巣保存に機能したものと考えられる。今回検討した化合物やアミノ酸（ペプチド）には過冷却促進効果が認められたことから，不凍タンパク質や抗酸化物
質と組み合わせることによって，低温障害を軽減できる可能性がある。適切な条件を構築できれ文献１） Kopeika, J., Thornhill, A., Khalaf, Y. : The effectof cryopreservation on the genome of gametes andembryos : principles of cryobiology and criticalappraisal of the evidence, Human reproduction
update，21（2）,209～227, 2015.
２） Schwartz, A. M., Fasman, G. D. : Thermal
denaturation of chromatin and lysine copolymerDNA complexes. Effects of ethylene glycol,
Biopolymers, 18（5）,1045～1063, 1979.
３） Nelson, R. G., Johnson, W. C. Jr. : Conformation of
DNA in ethylene glycol, Biochemical and biophysicalresearch communications, 41（1）,211～216, 1970.
４） Berendsen, T. A., Bruinsma, B. G., Puts, C. F.,
Saeidi, N., Usta, O. B., Uygun, B. E., Izamis, M. L.,
Toner, M., Yarmush, M. L., Uygun, K. : Supercoolingenables long-term transplantation survival following
4 days of liver preservation, Nature medicine, 20（7）,790～793, 2014.
５） Agarwal, A., Aponte-Mellado, A., Premkumar, B.
J., Shaman, A., Gupta, S. : The effects of oxidative
stress on female reproduction : a review.
Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 10,49, 2012.

© The Ito Foundation

186

赤外線深度センサーによる和牛の分娩予測技術の検討
Development of prediction technique of parturition by an IR depth sensor
in beef cattle

岡

山

毅・佐

藤

晴

香・小

針

大

助

（茨城大学農学部）

Tsuyoshi Okayama, Haruka Sato and Daisuke Kohari（College of Agriculture, Ibaraki University）

Recently, computer-based image analysis has gained popularity in analyses of animal
behavior. Various devices to observe or record the behavior of animals have been developed.
However, most of the devices were designed to analyze behaviors in two dimensions, whilealmost animals behave in three dimensions（3D）. Therefore, in order to conduct precise
behavioral analysis, it is necessary to collect 3D data regarding animal behaviors. IR depthsensor camera systems have recently become commercially available at reasonable cost. In thisstudy, we used an IR depth camera for assessing the pre-parturition behavior of breeding
cattle and tried to develop an automatic behavior analysis system of posture change（standing,lying down）and position of body part（the neck, the body, the tail, etc.）. An IR depth-sensor
camera was placed at the calving pen in the Field Science Center of Ibaraki University, anddepth images were collected every 5 seconds. Data were analyzed using software（Python ver.
2.7 and OpenCV library ver. 2.4.8）.As results, the cow could be extracted from the backgroundclearly, and the concordance rats between manual and automatic classification of posturechange（standing, lying down）was over 90％. Body parts of cattle could be detected in mostdata. However, in some data, the depth data was missing in some region because of sunlightcoming from the skylight window or postures of the cow. Detection of tail lifting was alsodifficult, because precision of detecting body parts was poor. In future study, image processing
algorithms should be improved and uses multiple IR depth-sensor cameras for a more robust
automatic behavior analysis system.

１．目

牛肉（プライムビーフ）の作出を試みてきた。そ的の結果，日本の和牛は「WAGYU（わぎゅう）」

肉牛生産を取り巻く状況が年々厳しくなる中，としてブランド化され，世界に広く認知されると我が国ではそれぞれ特徴のある肉牛系統の性質をころとなっている。一方で，TPP・EPAなどに熟知した個々の農家のきめ細やかな管理により，よる農産物の市場開放の世界的な動向は，近い将

工業的リーンビーフ生産とは一線を画す，高品質

来，オーストラリアやアメリカなどから大量に© The Ito Foundation

赤外線深度センサーによる和牛の分娩予測技術の検討

187

入ってくると予想される超格安輸入牛肉とのテー的変化をより精密に捉えるには，自動判別法の開ブルミート競争に対抗していくために，農家に対発が必要である。そこで本研究では，牛の行動をしてこれまで以上に効率的な生産を求めることと自動的に判別する手法の開発を試みた。

なり，我が国の肉牛農家は，現在の品質を維持しつつ，新たな管理対策にせまられている。
家畜の効率的管理のためには，従来必要な動物法

２．方2 . 1 供試牛と飼養方法の情報をなるべく単純化し，平均化した特性に合調査は茨城大学付属フィールドサイエンス教育

わせて管理システムを構築することが一般的な対研究センターの牛舎で行った。供試牛は，黒毛和策とされてきた。しかし，近年は異なる飼育環境

種繁殖牛で，分娩予定日の１～２週間前に通常飼においても複雑な現象をそのまま複雑なものとし育している妊娠牛群から奥行き4.0ｍ，幅3.0ｍのて捉え，個々の動物の特性を生かし，遺伝的能力

分娩房に移動し，調査に供した。給餌は１日１回を最大限発揮させるオーダーメイド型管理が注目

16時に乾草・デントコーンサイレージ・濃厚飼料

されている。特に，和牛生産の基盤となる繁殖牛を給餌した。

管理の様々な場面では，個々の農家の努力によ

2 . 2 調査に使用した機器と設置方法

る，まさに後者によるところが大きく，この負担

本研究で使用した赤外線深度センサーカメラ

をいかに軽労化していくのかということが，和牛（以下深度カメラ）はASUS社製のXtion PROLIVE

生産の効率化対策のポイントとなると考えられる。

である。撮影対象である分娩房の床面全体が撮影

我々は，昨年から赤外線深度センサーカメラ

範囲に収まるように，深度カメラを床から高さ4.0（IR depth sensor camera）という３次元情報のｍの位置に設置した。深度カメラは制御・データ計測が可能なセンサーカメラを用いて，繁殖牛を記録用にノートパソコン（U24A-PX3210R, ASUS対象とした簡易かつ高精度の分娩予測技術の確立

社製）に接続した。距離情報を持つ深度画像（320のための研究を試みてきた。本深度センサーは，×240画素）は５秒ごとに撮影した。解析に用い対象の３次元的な形態変化を数値データ化し，直たデータは分娩から遡って24時間とした。

接扱うことができることから，動物の複雑な行動

2.3

変化であってもすべて情報化することが可能であ深度画像の処理には，Python2.7.9とOpenCV2.4.8

画像処理方法る。これは，従来繁殖農家の大きな負担となってを用いた。

いた分娩予定日前後の監視業務を補助する「目」

2.3.1とすることが可能となることを意味する。牛の分初めに解析対象である牛のみを得られた深度画

娩前には，いくつかの特徴的な行動変化が見られ像から抽出するために，柵，壁，餌槽，床面，敷ることが知られているが，昨年は，本研究助成を料等の背景の除去を行った。２次元画像の場合，受け，それら行動のうち，分娩前の繁殖牛の姿勢

通常はカラー情報の違いから背景と対象物の識別

変化や尾挙げ行動

が，有用な分娩予測指標となを行う２）が，この場合は対象物と背景が類似したることを明らかにするとともに，本センサーによ

カラー情報を持つ場合，識別が困難である。一方る分娩房内での姿勢変化や旋回行動の検知精度ので深度情報がある場合は空間情報を利用すること高さについても明らかにしてきた。一方で，姿勢ができるので，事前に背景とみなす物体の空間情や尾の状態を目視で判断していたので，行動の量報を取得しておけば，容易に背景から牛を抽出す

１）© The Ito Foundation

背景除去

188

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

ることが可能である。具体的には，牛が存在しな

較して，首が除去されている方を首元とし，そのい分娩房の深度画像から，柵，餌槽，壁面の位置

反対を尾元とした。首先と尾先の検出について情報を取得し，その情報を解析すべき深度画像とは，尾無画像と胴体画像の差分をとることで，首比較し，背景と同じ位置に存在する物体を除去すの画像を取得し，その首画像の中で首元から最もることで牛が抽出できる。ただし，この方法では遠い点を首先，また全体画像から尾無画像の差分

位置や形状が頻繁に変化する敷料への対応が困難

をとることで，尾の画像を得，その尾画像の中でであったので，敷料が存在すると思われる床面か尾元から最も遠い点を尾先とした。

ら高さ40㎝未満の物体はすべて背景として除去し
た。
2.3.2

全体画像と尾無画像の矩形長辺方向の長さ比較すると，尾挙げが検出されていない場合はその領ノイズ除去と牛の抽出域に差は生じないが，尾挙げ行動が認識される場

得られた牛のみの深度画像には，センサーの特合は，尾の部分だけ全体画像のほうが長くなる。

性によるノイズや，除去しきれなかった背景の一

この差を利用して尾挙げ行動の認識を試みた。

部が入り込んでいるので，これをオープニング処
理で除去した。オープニング処理とは画像を収縮

３．結果と考察することで微細な部位を消去し，再び元の大きさ3.1に戻す処理である。収縮・膨張させる範囲（カー得られた深度データの深度の解像度は，牛の背ネルと呼ぶ）の大きさを指定することで除去する

中が写るセンサーからの距離250㎝（床面から150程度を調節可能である。ノイズの除去ではカーネ㎝）では，約2.0㎝であった。

データの収集状況について

ルのサイズを５画素とした。それでも除去しきれ

全体的には深度カメラからの深度画像は全体的ない大きなノイズが残ることがあったので，残っに安定的に撮影することができていた。ただし，た物体の各画素数を計算し，最も大きい画素数の撮影に用いた分娩房には天窓があり，そこから日ものを牛とした。

光が入射する午前の時間帯には，深度画像にデー2.3.3抽出された牛の深度画像の評価

タが欠損している部分，つまり深度を計測できて抽出された牛の深度画像を用いて，首の位置，いない部分があった。また敷料交換のために分娩

胴体（背中）の位置および方向，尾挙げ行動の有房のシャッターを開けた際には，外部から入射す

無を検出するために以下の処理を行った。

る強い光も深度データの計測を妨げた。シャッ全体画像に先ほどノイズの除去に利用したオーターが閉まっており，天窓からの直射日光がな

プニング処理を用いカーネルのサイズを調節する

い，午後から夜間にかけては安定してデータを取ことで，尾を除去した深度画像（カーネルサイズ

得することができていた。

を10画素）（以下尾無画像），首を除去した深度画今回用いた深度カメラ（Xtion PROLIVE）の像（カーネルサイズを27画素）（以下胴体画像）

画角が狭いことも問題となった。センサーを地上を得ることができる。それぞれの画像に矩形を当から高さ4.0ｍの高所に設置したが，奥行き4.0ｍ，てはめることで長辺と短辺長さで形状を評価する

幅3.0ｍの分娩房をカバーするのが精一杯であり，ことができる。また胴体画像に楕円を当てはめる

牛が首を柵外へ出した場合には，撮影範囲外とことで，胴体が向いている角度と首元部と尾部のなった。

候補を得る。この２点と全体画像と胴体画像を比© The Ito Foundation

赤外線深度センサーによる和牛の分娩予測技術の検討

3.2

部位の検出について

189

牛は出産間際になると腹部を気にかける首振り行

部位を検出した画像の一例をFig.１に示す。楕動の頻度が上昇する。この時の首部が胴体から離円は牛の胴体と合致しており，牛の方向，中心付れている場合は，オープニング処理で首を除去す

近の位置が明確に認識されている。首先はややずる画像処理が機能するが，首が胴体と密着していれているものの，ほぼ認識することができている場合は首の検出ができなかった。これが原因る。次に尾挙げ行動を示している牛の深度画像をで，首先位置の検出ができなかったり，牛の前後

Fig.２に示す。画像処理によって尾挙げが認識さ方向を誤認識する場合があった。

れていることがわかる。これら検出された特徴点

3.3の３次座標を評価することで，従来の２次元画像

抽出した牛の深度情報から牛の平均高さを計算では得ることできなかった情報を得ることが期待し，その値を用いて立位と座位の識別を実施しできる。以上の２つは画像処理がうまく機能した

た。この識別と目視による識別と比較した結果，例であり，うまく機能しなかった例も少なからず

分娩前の24時間では一致率は約90.5％であった。

あった。その原因のひとつは，牛の柔軟性である。

識別に失敗したデータでは，先ほど述べた天窓か

立位と座位の判別について

ら太陽光が入りデータ欠損が生じた場合や，敷料交換のためにシャッターを開けて作業中のもので深度データに欠損がある場合が多かった。それらの撮影条件が悪いデータを除いた11：00以降のデータでは，一致率は95.3％であった。
3.4

尾挙げ行動の検出

尾挙げ行動は誤認識が多く，尾挙げ行動のみを検出することは困難であった。この主な原因は首が認識されなかったことによる矩形の長さが変化したことで，尾挙げ行動が見られない場合でも，尾挙げ行動をしていると認識される場合があっ

Fig. 1 An example of a processed depth image.

た。尾挙げ行動をしている牛のほとんどの画像では，尾が認識されていたことから，尾挙げ行動を検出するアルゴリズムを改良することで，尾挙げ行動の検出が可能であると考えられる。
おおむね，牛の重心，首元，尾元，首先および尾先の検出は可能であり，それらの３次元的な計測が可能であることから，２次元画像では検出が困難であった行動の検出が可能である。しかしながら，それらの精度が低い場合も見受けられ，その精度の低さが尾挙げ行動の検出精度の低さにもFig. 2 An example of a processed depth image of a tail-lifted cow.

つながった。その主な原因は深度データの欠損である。外部から太陽光の照射が原因でデータが欠© The Ito Foundation

190

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

損することもあったが，牛の姿勢によっては部分して，取得した深度画像から牛の行動を自動判別

的に深度データが取得できない領域も存在し，そするシステムの開発を試みた。その結果，座位との欠損領域が画像処理の精度に影響を与えた。今立位の判別は目視の判断と比較して90％以上の一後の課題としては，このデータが欠損する領域を致率であった。また，部位（首先，首元，胴体の補完する方法の開発が必要である。また，今回は中心，尾元，尾先）の検出を試みたところ，ほと

深度カメラを１台で観察したが，撮影範囲の拡張

んどの場合で検出可能であった。しかし，尾挙げおよびカメラの死角の減少という点で複数台の深行動の検出では，さきほどの部位検出の精度が低度カメラを同時に利用することも有効であると考

いこともあり，誤認識率が高く課題が残った。今えられる。その場合には，深度画像から点群（３後の課題としては，検出アルゴリズムの改良とと次元情報を持つ点の集まり）に変換し位置合わせ

もに，計測範囲の拡大と死角の減少のために複数を行う必要がある。今回は３次元情報を持つ深度

台の赤外線深度センサーカメラの利用等があげら

画像を利用したものの，処理自体は２次元画像用れる。

のライブラリを利用した。今後は点群を直接処理することで，牛の分娩前の体型変化などを計測可
能なシステムを構築する予定である。
４．要

約

本研究では，赤外線深度センサーカメラを利用

文献１） 小迫孝実，井村毅，河野道治，野田博士：日本草地学会，37, 311～312, 1991.
２） Cangar, O., Leroy, T., Guarino, M., Vranken, E.,
Fallon, R., Lenehan, J., Mee, J., Berckmans, D. :COMPUTERS AND ELECTRONICS IN
AGRICULTURE, 64, 53～60, 2008.

した和牛の非侵襲的分娩予測技術の開発を目的と© The Ito Foundation

191

ミトコンドリア機能解析に基づく家畜優良胚選別法の開発
Development of novel system for quality evaluation of bovine embryos byanalysis of mitochondrial function

阿

部

宏

之

（山形大学大学院理工学研究科）

Hiroyuki Abe（Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University）

Respiration is useful parameter for evaluating embryo quality as it provides important
information about metabolic activity. In this study, we have examined a scanningelectrochemical microscopy（SECM）technique that is a non-invasive and sensitive method formeasuring oxygen consumption by individual bovine embryos. SECM is a technique in which
the tip of a microelectrode is used to scan and monitor the local distribution of electro-active
species near the sample surface. We have developed a SECM measuring system, to establish
the accurate method for embryo quality evaluation. With this system, oxygen consumption of
single, identical bovine embryos at different developmental stages has been monitored. Oxygen
consumption rates（ F ）of the single embryos were low from 2-cell to 8-cell stages. The
increase of oxygen consumption rate was found at the morula stage and blastocysts showedlarge oxygen consumption rate. Ultrastructural study demonstrated that most of themitochondria in the embryos up to the 8-cell stage were of an immature form such as sphericaland ovoid shape. Changes in mitochondrial ultrastructure were observed in bovine embryos atmorula stage. Many elongated mitochondria were found in morulae and even more inblastocysts. Staining with JC-10 revealed the increase of mitochondrial membrane potential inmorulae and blastocysts. Development of mitochondria corresponds to the increase of oxygen
consumption rates during the development of bovine embryos. The morulae with higher
oxygen consumption have strong potentiality for further development into good quality
embryos such as expanded and hatched blastocysts. These results suggest that the SECM
technique is able to non-invasively assess the respiration rate of individual bovine embryos
and the embryo quality. The SECM procedure may contribute to improvements inreproductive technologies in domestic animals.

１．目

受胎率は伸び悩んでいる。この原因の一つとし的て，移植する胚の選別法の精度に問題があると考

体外受精技術は牛の品種改良や増産を可能とすえられている。現在，移植に供する牛受精卵は割る基盤技術として広く普及しているが，移植胚の球などの形態学的特徴を指標に品質判定されてい© The Ito Foundation

192

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

るが，受精卵は発生過程においてリアルタイムで形態が変化するために，ワンポイントでの形態学的評価のみでは厳密な胚の品質評価はできない。

く新しい家畜優良胚選別法の開発である。
２．方法

そのため，形態観察のみによる評価法では本来移

2.1

高感度細胞呼吸測定システムの開発

植に適さない胚を移植胚として選別している可能

電気化学計測の基盤である走査型電気化学顕微鏡（scanning electrochemical microsocopy ;性が高い。
これまで我々は，牛胚の品質とミトコンドリア

SECM）は，局所領域における生体反応を高感の呼吸機能が密接に関連していることを明らかに

度・非侵襲的にモニタできる装置である。これましてきた。ミトコンドリアは酸化的リン酸化

でに，酸素還元電流を検出できる微小電極をプ（呼吸）により細胞活動に必須のエネルギーであローブとするSECMを用いて単一受精卵の呼吸活

るアデノシン三リン酸（ATP）を産生し，胚の性測定に成功し，SECMを応用した細胞呼吸測定

発生等に深く関与していることから，精度の高いの基盤技術を開発している ３～５）。本研究では，

細胞呼吸測定技術は受精卵の品質評価や細胞の呼SECMをベースとする牛胚の呼吸活性測定に特化

吸機能診断に極めて有効な技術となる。本研究でした細胞呼吸測定システムの開発を目的とした。

は，ミトコンドリア呼吸機能を指標とする精度の具体的には，（１）単一牛受精卵の酸素消費量を高い受精卵品質評価法の開発を目的とした。具体測定するための高感度センサープローブ電極，

的には，電気化学計測技術の基盤となる走査型電（２）受精卵のミトコンドリア機能と計測感度影

気化学顕微鏡をベースに，単一の牛受精卵の酸素

響しない呼吸測定液の開発を行った。これらの要消費量（呼吸）を無侵襲的に測定できるシステム

素技術と，すでに開発済の多検体測定プレートおを開発し，受精卵の培養実験やミトコンドリア呼よび呼吸解析ソフトをシステム化した「細胞呼吸吸機能の生物学的解析により，この測定システム

測定システム」を構築した（Fig.１）
。

１，
２）

の有効性と安全を評価した。本研究の最終目標

2 . 2 牛受精卵の培養は，ミトコンドリア呼吸という客観的基準に基づ

2 . 1で構築した細胞呼吸測定システムの性能をFig. 1 A modified scanning electrochemical microscopy（SECM）measuring system. SECM system includes ameasuring instrument on the inverted optical microscope stage（a）, potentiostat（b）, notebook computer（c）, amicroelectrode（e）, and a plate（f）for measuring respiration activity of embryos. The plate has six cone-shaped
microwells（arrow in b）. Individual bovine embryos are transferred into a microwell filled with medium. The
embryo sinks down to the bottom of the well, remaining at the lowest point（g）. Microelectrode（arrowhead in g）
is scanned along the z-axis from the side point of embryo（h）.

© The Ito Foundation

ミトコンドリア機能解析に基づく家畜優良胚選別法の開発

193評価するために，牛体外受精胚の酸素消費量測定－1.0nA以下の感度を有するディスク型マイクロを行った。牛卵巣から回収した卵丘細胞－卵子複電極を作製することができた。電極サイズが酸素合体（COC）を無血清培地IVMD101（機能性ペ消費量計測に及ぼす影響について検討した結果，

プチド研究所）で成熟培養を行い，体外受精によ単一牛胚の呼吸量計測に適した電極サイズは，白り受精卵を得た。受精卵は無血清培地IVD101培

金先端径が２～５μｍであることが分かった。

地（機能性ペプチド研究所）を用いて培養し，２電気化学計測では感度が向上するにつれて，溶細胞期胚から胚盤胞のステージの胚を回収し種々液中の電解質組成やタンパク質が計測感度に影響の実験に用いた。

を及ぼす可能性がある。そこで，成分組成が異な

2 . 3 ミトコンドリア呼吸機能の細胞生物学的る数種類の培養液中での計測感度を解析した。その結果，TCM199, DMEM, RPMI1940など一般に解析
高感度ミトコンドリア膜電位アッセイキットで細胞培養に用いられている培養液を測定に用いたあるJ C - 1 0 （5 , 5 ʼ , 6 , 6 ʼ - t e t r a c h l o r o - 1 , 1 ʼ , 3 , 3 ʼ -場合，測定開始直後に還元電流が急速に低下し，

tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide

測定開始約30分後には測定が不可能になった。一derivative）を用いて，各発生ステージの牛胚を方，受精卵の培養に用いられ，比較的単純な組成

染色し，共焦点レーザー顕微鏡を用いてミトコン

であるHTF（human tubal fluid）培地やヒト胚

ドリア膜電位を検出した。JC-10は，ミトコンドの培養に用いられているHFF99培地（扶桑薬品

リアの脂質二重膜に取り込まれ，膜電位を有する

工業）を測定液として用いた場合，長時間にわ

ミトコンドリアでは凝集して赤色蛍光（highΔΨ

たって安定した還元電流を計測することができm）を 発 し ，Mt 膜 電 位 が 消 失 す る と 緑 色 蛍 光

た。これらの結果から，本研究ではHTF培地を（lowΔΨm）を発する。相対膜電位（highΔΨ基本とする呼吸測定液を牛胚の呼吸測定に用いる

m/lowΔΨm）および色蛍光の強度を測定するこことにした。

とで，ミトコンドリア電子伝達系呼吸鎖複合体の以上，新たに開発した高感度マイクロ電極と呼吸測定液をSECMに組み入れた細胞呼吸測定シス

活性を解析した。
ミトコンドリアの微細構造を観察するために，各発生ステージの牛胚を2.5％グルタルアルデヒ

テムを用いることで，単一牛胚の酸素消費量の安定した測定が可能となった。

ドおよび１％オスミック酸で固定した。エタノー

3.2

呼吸測定による牛胚の品質評価

ルで脱水後エポキシ樹脂に包埋し，超薄切片を透呼吸測定液を用いて牛胚の呼吸量を測定し，受精卵に対する侵襲性の有無を調べた。呼吸測定後過型電子顕微鏡で観察した。

の受精卵を追加培養し発生率の変化を調べた結３．結果と考察果，対照区（呼吸測定を行わなかった受精卵）と3 . 1 高感度細胞呼吸測定システムの性能評価

比べて胚の発生率の低下は起こらず，電子顕微鏡

マイクロ電極の感度を向上させるために，白金

観察によっても細胞膜や細胞小器官などに損傷は電極の電解エッチング法，白金電極をガラスキャ認められなかった。これらの結果から，HTF培

ピラリーに封入するための熱封止および封止後の地をベースに製作した測定液は胚に対して非侵襲電極研磨のそれぞれの工程を改良した結果，酸素的であり，高感度の電気化学呼吸測定に有効であ

還元条件下（－0.6Ｖ荷電下）において還元電流ることが示された。

© The Ito Foundation

194

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

細胞呼吸測定システムを用いた受精卵品質評価

次に，呼吸活性を指標とする受精卵品質評価シ法の有用性を検証するために，体外受精により作

ステムの有効性を検証するために，「受精卵呼吸製した牛受精卵の呼吸量を測定した。受精後の発測定装置」により呼吸測定した牛受精卵の発生能

生過程における呼吸量変化を調べた結果，桑実胚を調べた。受精６日目の桑実胚の呼吸量を測定しから胚盤胞のステージにおいて有意に呼吸量が上た後，IVD101培地を用いて５％CO2/５％O2/90％

昇し，孵化胚盤胞において最大になった（Table１）。

N2，38.5℃の条件で３日間個別に追加培養を行い，呼吸活性の変化とミトコンドリア呼吸機能との関

胚盤胞数および孵化胚盤胞数を調べた。その結係を調べるために，ミトコンドリアの膜電位と微果，呼吸量が1.0×1014/mol・s－1以上の胚では胚盤細構造変化を解析した。その結果，呼吸量が増加

胞発生率（89.3％）および孵化胚盤胞率（62.5％）する桑実胚期から胚盤胞期にかけてクリステの伸が最も高く，呼吸量が低下するに従い胚盤胞発生張などミトコンドリアの顕著な形態変化が観察さ率および孵化胚盤胞率が低下することが明らかにれ，呼吸量の増加とミトコンドリアの発達が一致なった（Table３）。以上の結果から，本研究で開することが明らかになった（Fig.２）。また，呼発した「細胞呼吸測定システム」は，単一受精卵

吸量が増加する桑実胚期から胚盤胞期にかけてミ

レベルでミトコンドリア呼吸機能の変化を高精度

トコンドリアの膜電位活性の上昇が観察されたで検出することが可能であることが分かった。さ（Table２）。

らに，呼吸能を基準に牛胚の発生能を評価できる
Table 1 Oxygen consumption rates of bovine embryos cultured in a serum-free

medium（IVD101）at various developmental stages
Embryonicstage

No. of embryos
measured

Oxygen consumption rate
（Fx10-14/mol s1）

２cell

15

0.46±0.05a

４cell

17

0.45±0.03a

８cell

18

0.46±0.02a

Morula48

1.03±0.05b

Blastocyst

55

1.86±0.07c

Hatched blastocyst

24

3.01±0.07d

Values with different superscripts in each column are significantly different（P＜0.05）.

Fig. 2 Electron micrographs of bovine embryos derived from in vitro-matured and in vitro-fertilized oocytes at 2-cell（a）,

morula（b）, and blastocyst（c）stages. a : Note immature mitochondria showing ovoid structures with a hooded
appearance and a dark electron-dense matrix. b, c : Note presence of elongated mitochondria with transverse
cristae. Bars＝0.5μｍ.

© The Ito Foundation

ミトコンドリア機能解析に基づく家畜優良胚選別法の開発

195

Table 2 Relative membrane potential of mitochondoria in bovine embryos cultured in a serum-free

medium（IVD101）at various developmental stages
Embryonicstage

No. of embryos
measured

Relative membrane potential（highΔΨm/lowΔΨm）

２cell

16

0.416±0.020a

４cell

13

0.393±0.012a

８cell

18

0.596±0.029b

Morula16

0.826±0.033c

Blastocyst

20

0.774±0.030c

Hatched blastocyst

27

0.849±0.034c

Values with different superscripts in each column are significantly different（P＜0.05）．

Table 3 Relationship between oxygen consumption and developmental potentialof morulae cultured in serum-free IVD101 medium
Oxygenconsumption rate
（Fx10－14/mol s1）＊

No. ofembryos
measured＊

No. of embryos
developed to blastocyst
after 96 h（％）

No. of blastocysts
expanded or hatched
after 96 h（％）

F＞
＿ 1.0

56

50（89.3）

35（62.5）

0.8＜＿ F ＜1.04430（77.3）

20（50.0）

F ＜0.8107

49（45.8）28（26.2）

Bovine embryos at the morula stage were selected at day 6 after in vitro fertilization.

After measurement by modified SECM, embryos were incubated in IVD101 medium for 4days in a humidified atmosphere of 5％ CO2/5％ O2/90％ N2 at 38.5℃.

ことが示唆された。

牛胚の呼吸測定に特化した高感度マイクロ電極と電気化学計測技術を基盤とする細胞呼吸測定法

非侵襲測定液を開発し，SECMをベースにこれらは，真核細胞に存在するミトコンドリアの呼吸を要素技術をシステム化した細胞呼吸測定システム

検出することからほとんどの動物細胞に応用できを構築することができた。この測定システムを用る。また，この測定技術は非侵襲的であることか

いて単一牛胚の酸素消費量を測定した結果，牛胚ら，医療分野における応用も期待できる。すでには桑実胚から胚盤胞にかけて呼吸量が増加し，こ

我々は，SECMを用いたヒト余剰胚の呼吸測定にれに伴いミトコンドリアの形態的な発達と膜電位成功し，初期胚や凍結保存胚の品質評価に対する活性の上昇が起こることが明らかになった。さら有用性を報告している

６，７）。今後は，牛や豚などに，呼吸測定した受精卵の培養実験により，受精

家畜全体に応用範囲を広げ，家畜受精卵移植分野

卵の品質とミトコンドリア呼吸機能が密接な関係

での実用化を目指す。また，現在有効な品質評価にあることが示された。以上，本研究で開発した法が開発されていない卵母細胞の品質評価や種々

細胞呼吸測定システムは，ミトコンドリア呼吸機の幹細胞の機能診断などへの応用が期待される。

能を高精度で検出し，ミトコンドリア機能に基づ

４．要

く新しい胚品質評価法の基盤技術となることが示約された。今後は，呼吸測定した胚の移植試験，電本研究では，ミトコンドリア呼吸機能を指標と子伝達系呼吸鎖複合体の細胞生物学的および分子する精度の高い牛胚品質評価法の開発を行った。

生物学的解析を行い，ミトコンドリア機能解析に© The Ito Foundation

196

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

基づく牛胚品質評価技術の有用性と安全性を科学的に実証する予定である。
文献１） Abe, H., Yamashita, S., Satoh, T., Hoshi, H. :Molecular Reproduction and Development, 61, 57～
66, 2002.
２） Abe, H., Matsuzaki, S., Hoshi, H. : Theriogenology,
57, 1273～1283, 2002.
３） Shiku, H., Shiraishi, T., Ohya, H., Matsue, T., Abe,
H., Hoshi, H., Kobayashi, M. : Analytical Chemistry,73, 3751～3758, 2001.

４） Shiku, H., Shiraishi, T., Aoyagi, S., Utsumi, Y.,
Matsudaira, M., Abe, H., Hoshi, H., Kasai, S., Ohya, H.,
Matsue, T. : Analytica Chimica Acta, 522, 51～58,
2004.
５） Shiku, H., Torisawa, Y., Takagi, A., Aoyagi, S.,
Abe, H., Hoshi, H., Matsue, T. : Sensors and Actuators
B, 108, 597～602, 2005.
６） Goto, K., Koike, M., Kumasako, Y., Utsunomiya, T.,
Araki, Y., Abe, H. : Journal of Fertilization and
Implatation, 27, 53～58, 2010.
７） Yamanaka, M., Hashimoto, S., Amo, A., Ito-Sasaki,T., Abe, H., Morimoto, Y. : Human Reproduction, 26,
3366～3371, 2011.

© The Ito Foundation

197

牛伸長胚の生育に関わる子宮内膜細胞因子の探索
Screening of endometrium cell-derived factors involved in bovine
elongated embryo survival

細

江

実

佐

（農業生物資源研究所動物発生分化研究ユニット）

Misa Hosoe（National Institute of Agrobiological Sciences, Animal Development and Differentiation Research Unit）

In cattle, hatched blastocyst remains free-floating for 3 weeks, and the elongation of thetrophoblast during this period provides maternal-embryo communication that are essential forsurvival of the conceptus. To identify the endometrium-derived factors involved in the early
development of embryo, we established the embryo-endometrium coculture system. Day 6 IVF
embryos were transferred to a recipient cow once, and after 3 days, Day 9 embryos werecollected by non surgical uterine flashing. Recovered embryos were cultured on endometriummonolayer cells, and after 24 and 48hrs, total RNAs were purified from endometrium cells andsubjected to RNA-seq analysis. We also examined gene expression profiles of endometrium
cells without embryos and exposed to IFNtau to identified the genes whose expression levels
were varied by the presence of embryos and/or IFNtau. Total 24,551 annotated genes werescreened, and 377 genes were identified as being upregulated with a more than 2-folddifference in cocultured endometrium cells at 24hrs, and 140 of these genes kept highexpression levels at 48hrs. Of these genes, 120 genes（85.7％）showed a more than 2-foldupregulated in IFNtau-stimulated cells. Among 97 genes were expressed only detectable incocultured endometrium cells at both 24 and 48hrs, 57 genes（58.8％）were expressed
correspondingly in IFNtau-stimulated endometrium cells. These results suggest that IFNtau
secreted from trophoblast has great influence on the transcriptome profile of endometrium
cells. As expected, known to IFNtau stimulating genes, such as ISG15, MX1 and MX2 were
found to be upregulated genes, and these elevations in expression were confirmed by qRTPCR. In this study, 24 upregulated transcripts that could be closely related to the maternalembryo communications, such as adhesion molecules, cell surface molecules and extracellularmatrices were identified, and also found 59 genes that upregulated in cocultured endometrium
cells regardless of IFNtau stimulation.

１．目

間，着床することなく子宮内を浮遊しながら伸長的する，独特の発生形態をとる。牛の場合，胚の伸牛や豚などの家畜の胚は，受精後およそ３週

長は受精後10日目ごろから顕著になるが，これは© The Ito Foundation

198

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

主に胎盤の構成組織となる栄養膜細胞の増殖によ法

２．方るものである。この時期，将来胎子へ発生する胚体外胚葉においても，内部に生じた腔が開裂して2.1

胚表面で平板化した胚盤となり，さらに羊膜腔が発情周期15日目の黒毛和種雌牛から子宮内膜上形成されるなど，大きな形態変化が起きる。通常皮細胞を採取し，５％牛胎子血清添加DMEM培

受精卵を移植する場合，受精７日目前後で移植に地，38℃，５％O2，95％airの条件下で培養，増殖

十分な胚盤胞にまで発生するため，これまで伸長させて継代した。一方，常法で作成した２）体外発

胚が繁殖技術研究の対象になることはなかった。

生胚を媒精後６日目に発情同期化した雌牛２頭のしかし最近，14日目前後の伸長胚（長さ0.5～15

黄体側子宮に各50個移植し，３日目に子宮から非㎜）を子宮から回収し，その一部を切り取って侵襲的に回収してあらかじめ培養していた子宮内（バイオプシー）性判別などの診断をした後に再膜上皮細胞とともに48時間共培養した。また，胚び子宮に戻して産子を得る技術が開発された 。

が分泌しているインターフェロンタウ（IFNtau）

従来より胚盤胞でも診断は可能であったが，目にが子宮内膜上皮細胞に及ぼす影響とそれ以外の要みえる大きさの伸長胚を利用できるようになった

因を切り分けるため，胚がこの時期に分泌することで，現場での迅速な診断が可能となった。まIFNtauの活性を当研究室で樹立したＩ型IFN活

た，伸長胚バイオプシーは多くの診断用細胞を提性を測定するバイオアッセイ系によって調べ，ほ供できるため，ゲノム育種等の遺伝子診断にも最ぼ等量のIFNtau（24hr：0.5ng/ml, 48hr：2.0ng/

適な方法である。この技術をさらに発展させ，体ml）を子宮内膜上皮細胞の培地に添加した。対外受精胚から直接移植可能な伸長胚を作成するこ

照 と し て 非 共 培 養 区 を 設 定 し ，共 培 養 区 ，とができれば，より効率的な遺伝子診断が可能と

IFNtau添加区の３区について，子宮内膜上皮細なり，家畜改良にかかる期間とコストの削減につ胞を24時間おきに２日間採取した（Fig.１）。こ

ながる画期的な育種繁殖技術となる。そこで本課

れ ら の 細 胞 か ら ，RNA を 抽 出（RNeasy Micro

題では，胎子への生育能力のある伸長胚を体外でKit, QIAGEN）してRNA-seq解析および定量的作製するため，特に牛伸長胚と子宮内膜細胞の相RT-PCR解析に供した。

１）

供試材料およびRNA抽出

互作用に注目し，伸長胚の発生・分化を維持・促

2.2

RNA-Seq解析

進する子宮内膜細胞由来の物質の同定することをマクロジェン・ジャパン社に依頼し，Illumina
HiSeq2000による次世代シーケンシング解析用ラ目的とする。

イブラリ調製およびその配列解読を行った。解読
した配列データをTopHat３）を用いて牛のゲノム

embryoembryo+

0

24

48h

coculturestartsampling

sampling

RNAseq & qRT-PCR

IFNtau+Fig. 1 Schematic protocol for screening of endometrium cell-derived factors using the coculture system.

© The Ito Foundation

牛伸長胚の生育に関わる子宮内膜細胞因子の探索

上にマッピングし，Cufflinks４）によりマッピング
結果をもとにそれぞれの遺伝子領域に何個のシー

199

３．結果と考察

ケンスリードがマッピングされたかをカウントす２頭の受胚牛に媒精後６日目の胚を50個移植ることにより遺伝子発現量を推定した。各区で発し，３日後に回収したところ，18個の生存胚が得現パターンが異なる遺伝子をスクリーニングするられ，そのうち９個を24時間共培養区，９個を48ために，Cuffdiffにより胚もしくはIFNtau添加区

時間共培養区に用いた（Fig.２）。牛ゲノム上のと非添加区における子宮内膜上皮細胞の遺伝子発28,005個の遺伝子のうち，アノテーションが可能

現量を比較して，５％の棄却率で同一であることであった24,551個の遺伝子を各区で比較解析したが矛盾すると推定される遺伝子群を抽出した。抽ところ，胚と子宮内膜細胞との共培養区における出した遺伝子群について，細胞接着分子，細胞外

子宮内膜細胞の遺伝子発現が，非共培養区のもの

マトリクス，細胞表面タンパクなど伸長胚の発よりも２倍以上高かった遺伝子は，培養後24時間

生・分化に関連しており培地に添加できる可能性

で377個，48時間で453個あり，そのうち共通するのあるものや着床に関与すると考えられるサイト

遺伝子は140個であった（Fig.３A）。このうち，

カイン，転写因子についてgene ontology（GO）

IFNtau添加区でも同様に高かった遺伝子は120個に基づき遺伝子を抽出した。

（85.7％），GO解析で選別された細胞接着分子は2.3

定量的RT-PCR

12個，細胞外マトリクスは１個，細胞表面タンパ

定 量 的 RT-PCR は 既 報 に 準 じ て 行 っ た 。

クは３個，サイトカインは２個，転写因子は１個

GAPDH発現量を内部標準として，IFNtau関連遺であった。また，非共培養区ではまったく発現が伝子であるISG15，MX1，MX2の各遺伝子の相対

みられなかったが，共培養区で発現がみられるよ発現量を算出した。

うになった遺伝子は，培養後24時間で616個，48

５）

時間で487個あり，そのうち共通する遺伝子は97

Fig. 2 Day 11 embryos in coculture with endometrium cell monolayers at 48 hours. Scale bar indicates 100μｍ.

© The Ito Foundation

200

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

AC

1.0 ISG1524h48he m b r y o -＜e m b r y o +2-folddiﬀerence

237

0.5

48h

140

313

B
24h
expressing onlyin cocultured
cells

519

48h

97

relative value（ % of GAPDH）

24h

0
0.4

MX1

0.2
0
0.01

MX2

390
0.005
0
embryo-embryo+IFNtauFig. 3 Venn diagram of differentially expressed genes in endometrial cells cocultured with day 9-10 embryos.（A）Number of upregulated genes with 2-fold difference and（B）expressing only in coculutred endometrium cells at
24 and 48 hours.（C）Quantitative RT-PCR analysis of known IFN-induced genes in cocultured endometrium cells.

個であった（Fig.３B）。このうち，IFNtau添加区
でも同様に高かった遺伝子は57個（58.8％）であ

４．要

約り，細胞接着分子は４個，細胞外マトリクスは２胎子への生育能力のある伸長胚を体外で作製す

個，細胞表面タンパクは２個であり，サイトカイるため，特に牛伸長胚と子宮内膜細胞の相互作用

ン，転写因子はなかった。RNA-seq解析においに注目し，伸長胚の発生・分化を維持・促進するて共培養区で発現が高かった遺伝子のうち，子宮内膜細胞由来の物質のスクリーニングを試み

ISG15，MX1，MX2について定量的RT-PCRで検た。24および48時間培養した子宮内膜上皮細胞，証を行った結果，RNA-Seq解析の結果と同様，

媒精後９日目の胚と共培養したものおよび胚との共培養区およびIFNtau添加区における発IFNtauを培地に添加したものの３区について，現量は，非添加区の発現量より高かった（Fig.３

RNA-Seq解析および定量的RT-PCR解析を行いC）。本解析の結果から，D9の胚の存在下で子宮発現の違いを抽出した。胚と子宮内膜細胞との共内膜細胞の多くの遺伝子発現が変動しており，そ培養区で非共培養区よりも２倍以上高かった遺伝のなかでもIFNtauに関連する遺伝子の割合が大子のうち，培養後24時間と48時間で共通するもの

きいことが明らかになった。また，本解析によっは140個，このうちIFNtau添加区でも同様に高て胚存在下で変動する細胞接着分子，細胞外マト

かった遺伝子は120個（85.7％）であった。また，

リクス，細胞表面タンパク等が明らかとなり，今共培養区のみで発現が確認された遺伝子のうち，後，伸長胚培養系の改良への寄与が期待される添培養後24時間と48時間で共通するものは97個，こ加物質が同定された。

のうちIFNtau添加区でも同様に高かった遺伝子© The Ito Foundation

牛伸長胚の生育に関わる子宮内膜細胞因子の探索は57個（58.8％）であった。本研究において，細胞表面分子，細胞外マトリクスのような母体－胚間のコミュニケーションに関わる分子のうち，胚の存在下で発現が亢進する24個の遺伝子が同定され，また，IFNtau以外の胚からの刺激によって発現が亢進すると思われる59個の遺伝子が同定さ
れた。

201

文
献
１） Kimura, K., Matsuyama, S. : J Reprod Dev, 60, 210～215, 2014.
２） Hosoe, M.,Shioya, Y. : Zygote, 5, 371～376, 1997.
３） Trapnell, C., Pachter, J., Salzberg, S. L. :Bioinfomatics, 25, 1105～1111, 2009.
４） Trapnell, C. : Nat Biotechnol, 28, 511～515, 2010.
５） F u r u s a w a , T . , O h k o s h i , K . , K i m u r a , K . ,Matsuyama, S., Akagi, S., Kaneda, M., Ikeda, M.,
Hosoe, M., Kizaki, K., Tokunaga, T. : Biol Reprod, 89,
1～12, 2013.

© The Ito Foundation

202

Rhizopus oryzae水抽出物の肝障害抑制効果を応用した牛受精卵生産技術の向上
Improvement of the fertilized ovum production technique using liver
damage suppressant effect of Rhizopus oryzae aqueous extract in cattle

鈴木

武人１・堀

登２・林

みち子２・内尾

陽子２・牛越設男３（１麻布大学獣医学部，２石川県農林総合研究センター畜産試験場，３㈱牛越生理学研究所）

Takehito Suzuki１, Noboru Hori２, Michiko Hayashi２, Yoko Uchio２ and Setsuo Ushikoshi３（１School of Veterinary Medicine, Azabu University，２Ishikawa Prefectural Agriculture And Forestry Research Center LivestockExperimental Station，３Ushikoshi Research Institute for Physiology Co., Ltd.）

Performance improvement effect of embryo production from donors of Japanese black
cattle when R. oryzae U-1 aqueous extract was showed protective effect on liver injury wasevaluated in this study. The embryos or oocytes were provided from a donor by threeconsecutive collections at an interval for 90 days of each ovum collections, and the donors weretreated ROU-ae from 30 days before each ovum collection. In the embryo production by
superovulation and artificial insemination, ratio of normal embryos and transferable embryos
were significantly improved in the ROU-ae treated group. Meanwhile, in the embryo
production by OPU-IVF, performance improvement of ovum collection was not superficiallyconfirmed, but significantly increase of serum IGF-1 level and increasing tendency of serum
DHEA level were detected by the ROU-ae treatment. IGF-1 secretion from liver is
indispensable for the follicle growth with the ovary, and excessive androgen which is one of
the causes of the ovulation disorder is inactivated by the metabolism in the liver. ROU-ae
treatment induced IGF-1 secretion and improvement of metabolic homeostasis of the steroid
hormone in the liver, and it was thought that these effects caused the improvement of theovarian function secondarily.

１．目排卵させ，優秀な雄牛の精子を受精させることで的得られた胚を受胚牛に移植することで，優秀な資農水省公表の牛受精卵移植実施状況によると，質を受け継いだ子牛を多数生産することが可能と胚移植（ET）による産子数は５千頭程度だったなる。また，牛は単胎動物で約１年に１産しかし平成元年から年々右肩上がりに増加し，ここ数年ないことから，優良牛の効率的な生産にはETがは２万頭前後で推移している。胚移植に用いる胚

欠かせない方法の１つとなっている。しかし，は，過剰排卵処理とそれに続く人工授精によってETによる受胎率は，全国平均で新鮮１個胚移植得られた受精卵を子宮灌流により採取することで51％，凍結１個胚移植46％と，肉牛の人工授精受行われる。したがって，優秀な雌牛に多数の卵を胎率56％には及ばない。ETに用いる胚は，過剰© The Ito Foundation

Rhizopus oryzae水抽出物の肝障害抑制効果を応用した牛受精卵生産技術の向上

203

排卵処理に続く人工授精後に子宮灌流によって採採卵は，膣内留置型プロジェステロン製剤（P）

卵する方法や，と畜後の卵巣から採取した卵に体を留置し，エストラジオール（E2）による卵胞波

外受精を施す方法などにより生産されている。過初期化後，卵胞刺激ホルモン（FSH）およびプロ

剰排卵処理により採取される卵の数や質は供卵牛

スタグランジン（PG）投与およびＰの抜去，性の個体差が大きく，ETによる子牛生産効率向上

腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）投与によの方策の１つとして，高グレードの胚を多数得る

るSOVに続けて人工授精後に子宮内灌流法によ方法の確立が望まれる。

り行った。これを90日間隔で２回連続して行い，一方，肝臓廃棄となるような肝臓に障害のある

24頭のうちランダムに選択した12頭にはそれぞれ

牛では卵巣内の卵の品質が低いと報告されていの採卵予定日30日前から採卵日までR. oryzae水る 。肝臓から分泌されるインスリン様成長因子

抽 出 物 （R. oryzae U-1 aqueous extract ; ROU-

（IGF-1）は卵胞の発育に重要な因子のひとつで，ae，㈱牛越生理学研究所）を20ｇ／頭／日の用量

肝障害により分泌量が低下すると正常な卵巣周期で給与した。

１）が阻害され，繁殖障害の原因となることから ，②OPU-IVF法による受精卵生産

卵の高品質化には肝機能の改善が欠かせない。そ試験には石川県農林総合センター畜産試験場でこで本研究では，我々がラットおよび乳牛で肝障飼育されている前産時採卵歴のある黒毛和種供卵害抑制効果を報告しているRhizopus oryzae水抽

牛６頭を用いた。これらの牛は日本飼養標準の採出物を和牛に給与し，採卵成績の向上を目指

卵牛と通常期の２ステージに分け，それぞれの栄すことを目的とした。具体的には，和牛における養 要 求 量 を ベ ー ス に ， 充 足 率 が TDN100 ～２回の連続した過剰排卵処理（SOV）による採110％，CP90～100％となるよう飼料を給与した。

卵前にそれぞれ30日間給与し，非給与群に対する卵子の採取は，的場らの報告５）に準じて，Pを採卵成績（採卵数，正常胚数，移植可能胚数など）留置し，優勢卵胞除去による卵胞波初期化後，の改善効果を評価した。同様の実験を経膣採卵―

FSHおよびPG投与およびPの抜去，GnRH投与に体外受精（OPU-IVF）法でも行い，過剰排卵処

よるSOVに続けてOPUにより行い，当場のIVF

理による採卵成績と比較した。

法により受精卵を作出した。これを90日間隔で２

２）

３，
４）

２．方

回連続して行い，６頭のうちランダムに選択した

法

３頭にはそれぞれの採卵予定日30日前から採卵日

2 . 1 供卵牛へのRhizopus oryzae水抽出物の給までROU-aeを20ｇ／頭／日の用量で給与した。
これらの動物実験は麻布大学動物実験委員会の与試験承認を受け，本委員会の規則に則り実施した。

①SOVと人工授精による受精卵生産
試験には石川県農林総合センター畜産試験場能登畜産センターで飼育されている前産時採卵歴のある黒毛和種供卵牛24頭を用いた。これらの牛は
日本飼養標準の採卵牛，妊娠末期，授乳期（分娩2 . 2 受精卵生産におけるROU-ae給与効果の評価
ROU-ae給与の効果は以下の各項目を測定する
ことで評価した。

舎・１号舎），通常期の５ステージに分け，それ①採卵成績（SOVと人工授精：推定横体数，

ぞれの栄養要求量をベースに，充足率がTDN110

採卵総数，正常卵数（率），供給可能卵数（率），～130％，
CP70～100％となるよう飼料を給与した。

正常卵に対する供給可能卵の割合，OPU-IVF：© The Ito Foundation

204

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

卵胞数，回収卵子数（率），卵子品質，分割卵数

ROU-ae給与前のROU-ae給与区と対照区の正（率），胚盤胞数（率），凍結可能胚盤胞数（率））

常卵数の比較で，給与区が有意に多い（P＜0.05）②血中の生化学指標

結果が得られたため，正常卵率および供給可能卵

血液生化学検査（TP，ALB，BUN，GOT，γ率により採卵成績を評価した。ROU-ae給与前の-GTP，グルコース，T-CHO，Ca，IP，LDH，

正常卵率，供給可能卵率は両区とも50～70％の範CPK，NEFA，β-ヒドロキシ酪酸）は自動分析囲にあったが，給与開始後１回目の採卵では，対装置を用いて測定した。

照区正常卵率21.1±32.8％，供給可能卵率17.3±③各種ホルモンの血中濃度

26.8％に対して，給与区はそれぞれ69.1±39.2％，

インスリン様成長因子（IGF-1），抗ミューラー56.7±43.0％とほぼ低下せず，対照区に対して有管ホルモン（AMH），アンドロゲン，デヒドロエ

意に高い値を示した（P＜0.05；Fig.１）。給与後

ピ ア ン ド ロ ス テ ロ ン（DHEA），ビ タ ミ ン Ｄ

２回目の採卵では，対照区正常卵率34.6±33.9％，（V.D）はELISA法，黄体形成ホルモン（LH）は供給可能卵率31.4±33.9％に対して，給与区はそ

時間分解蛍光法によりそれぞれ測定した。AMH

れぞれ55.1±37.0％，52.9±35.6％と有意な差はな

は卵胞数の指標となることを分担者・堀のグルー

いものの，卵質は維持される傾向にあった（Fig.

プやVernunftらが報告している６，７）。DHEAとV.D

１）。各種ホルモンの血中動態では，各測定項目

はヒトで卵子数と関係があるとの報告

とも両区で試験期間中にほぼ差はなかったが，

８～10）

があ

ROU-ae給与２回目の採卵時の発情時にIGF-1濃り，牛での測定を試みた。
2 . 3 統計処理度が有意に上昇（P＜0.05）した（Fig.２）。血液得られた各データの統計処理は，一元配置の分

生化学検査値は試験期間を通じて正常範囲内を維散分析あるいは多重比較検定をEZR ver.1.3.2によ持しており，ROU-ae給与が要因と思われるようり行った 。

な変化も認められなかった。

11）

3 . 2 OPU-IVF法による受精卵生産における３．結果と考察ROU-aeの給与効果
受精卵生産の成績に関して，試験前のROU-ae

3 . 1 SOVと人工授精による受精卵生産におけ給与区と対照区の間にほぼ差はなかったが，給与るROU-aeの給与効果（Ａ）

ROU-ae

100

＊

80
60
40
20
0
-20

Pre-dose

120

Cont.

Post-dose (1st）

Post-dose (2nd）

Ratio of transferable emblyos（％）

Ratio of normal embryos
（％）

120

（Ｂ）

Cont.
ROU-ae

100
80

＊

60
40
20
0
-20

Pre-dose

Post-dose (1st）

Post-dose (2nd）Fig. 1 Summary of embryo collection after superovulation and artificial insemination in control and ROU-ae treateddonors.（A）Ratio of normal embryos.（B）Ratio of transferable embryos. Data represent the means±SEM.
＊P＜0.05 vs Control group.

© The Ito Foundation

Serum level of IGF-1（ng/ml）

Rhizopus oryzae水抽出物の肝障害抑制効果を応用した牛受精卵生産技術の向上
1400

205

Cont.

1200

ROU-ae

1000
800
600
＊

400
200

Post-dose (1st）embryo collection

estrus7 days after

previous estrus

embryo collection

estrus7 days after

previous estrus

0

Post-dose (2nd）Fig. 2 Change of serum IGF-1 level in consecutive embryo collection in control and ROU-ae treated donors. Previous

estrus shows estrus before one month of the embryo collection. Data represent the means±SEM.
＊P＜0.05 vs Control group.

Table 1 Summary of oocyte and embryo results after OPU-IVF in control and ROU-ae treated donors. Data represent

the means±SEM. ＊P＜0.05 vs Control group.
Number and size of follicle

pre
Cont

ROU-aeCont

ROU-aeLarge

Medium

small

total

Total oocyte
retrieved

6.7±9.0

6.0±6.612.3±9.1

25.0±6.2

27.7±16.2

post（1st）14.3±23.1

3.7±2.1

20.3±14.838.3±8.7

19.3±13.1

post（2nd）

15.0±22.5

2.0±1.7

18.0±15.1

35.0±9.2

18.0±10.8pre13.0±9.8

5.0±1.0

8.7±13.3

26.7±3.5

20.0±1.0

post（1st）8.7±8.1

5.3±3.2

16.7±24.7

30.7±21.1

15.7±7.4

post（2nd）

15.3±12.1

2.7±1.59.3±13.7

27.3±8.1

16.0±21.7

COCs cultured

Cleavagerate, ％

Blastocyst
rate, ％

Embryos
produced
rate, ％

pre21.3±12.779.1±15.3

26.2±23.7

18.9±16.5

post（1st）

17.0±10.885.2±12.8

50.6±1.043.5±7.2

post（2nd）

16.0±11.0

89.6±18.0

47.2±20.5

30.6±25.1

pre11.7±5.5

86.6±12.1

59.3±7.0

57.4±9.8

post（1st）13.7±4.0

4.4±4.0＊

4.4±4.0＊

4.4±4.0＊

post（2nd）

14.0±18.2

69.4±20.8

36.5±33.8

23.5±20.4

後１回目の卵割率，胚盤胞率，凍結可能胚盤胞率

では両区の差はなかった。各種ホルモンの血中動においてROU-ae給与区が有意に低い値を示した

態では，IGF-1およびDHEAにおいて給与区が対（P＜0.05；Table１）。一方，給与後２回目の成績

照区よりも常に高い平均値を示し，特にIGF-1は© The Ito Foundation

206

Serum level of IGF-1（ng/ml）

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

180 （Ａ）
160

Cont.
ROU-ae

140
120
100
80
60
40

Pre

Estrus(pre）

OPU

Pre-dose

Estrus(pre）

OPU

Post-dose (1st）

Estrus(pre）

OPU

EstrusPost-dose (2nd）

50 （Ｂ）
Serum level of DHEA
（ng/ml）

40
30
20
10
Cont.

０

－10

ROU-aePre

Estrus(pre）

OPU

Pre-dose

Estrus(pre）

OPU

Post-dose (1st）

Estrus(pre）

OPU

Post-dose (2nd）

160 （Ｃ）
Serum level of V.D (ng/ml）

EstrusCont.

140

ROU-ae

120
100
80
60
40

Pre

Estrus(pre）

OPU

Pre-dose

Estrus(pre）

OPU

Post-dose (1st）

Estrus(pre）

OPU

EstrusPost-dose (2nd）Fig. 3 Change of serum hormone levels in consecutive ovum pick-upin control and ROU-ae treated donors.（A : IGF-1,

B : dehydroepiandrosterone, C : Vitamin D）. Estrus（pre）shows estrus just prior to ovum collection. Data
represent the means±SEM. A dose effect of ROU-ae was significantly accepted for change of serum IGF-1 level.

ROU-ae 給 与 効 果 の 有 意 性 が 認 め ら れ（P ＜量のアンドロゲンが一時的に存在している。採卵0.05），V.Dも高値を示す傾向にあった（Fig.３）。

のためのSOVによって多数の成熟卵胞が形成さ

また，２回目のOPU実施前のγ-GTP値も，対照れると，排卵時には多量のLHが分泌される。過区22.7±1.2U/Lに対し，給与区は19.3±1.5U/Lと剰なLHは卵胞でのアンドロゲン生産を促進する

有意に低下していた。

とともに，過剰なアンドロゲンは排卵障害を引き卵胞の莢膜細胞では黄体形成ホルモン（LH）

起こすことが報告されている12）。アンドロゲンはの作用によりコレステロールからアンドロゲンを肝臓で代謝されて不活化されるが，肝機能低下時

産生し，顆粒膜細胞はアンドロゲンからエストラに頻回のSOVを行うと，上記機序により採卵成

ジオールを産生する。そのため成熟卵胞内には多績が低下する確率が高まると考えられる。

© The Ito Foundation

Rhizopus oryzae水抽出物の肝障害抑制効果を応用した牛受精卵生産技術の向上

ROU-aeは肝障害モデルラットで肝再生を促進
し，分娩直後の乳牛における肝機能低下による血中NEFA濃度の上昇を抑制するなど，肝機能を改善する働きが認められている ３，４）。本研究でも207効果的な利用方法が確立でき，利用価値が高まる
ものと考えられる。
４．要約

SOVと人工授精による受精卵生産のROU-ae給与

本研究は供卵牛からの連続的な受精卵生産の成区では，連続した採卵にもかかわらず卵質が低下

績向上を目的とし，肝障害改善効果が報告されてせず，一時的ではあるが有意な血中IGF-1濃度のいるROU-aeの給与効果を検討した。90日間隔で上 昇 も 認 め ら れ て い た 。OPU-IVF で も 血 中

２回連続した採卵のそれぞれ30日前からROU-ae

IGF-1濃度の上昇にROU-aeの給与効果が認めらを給与した結果，過剰排卵処理と人工授精によるれており，γ-GTP値も正常範囲内の変動ではあ

受精卵生産では正常卵率，供給可能卵率の有意なるが給与によって有意に低下していた。これらの上昇が認められ，OPU-IVF法では受精卵生産の変化はいずれもROU-aeの肝機能改善効果から予成績向上は認められなかったものの血中IGF-1濃想される反応に合致しており，肝機能改善による度上昇における有意な給与効果と血中DHEA濃IGF-1分泌やステロイドホルモンの代謝恒常性の度の増加傾向が認められた。ROU-aeの肝機能改改善とそれに伴う卵巣機能の向上に対するROU-

善機能がIGF-1分泌やステロイドホルモンの代謝

aeの有効性が示唆され，優良な遺伝資源の有効利

恒常性を改善し，卵巣機能を向上させたと考えら用に利用することが期待できる。一方で，OPU-れた。

IVFでは給与後１回目の採卵で明らかに成績が低下していたが，採卵数に影響する中・小卵胞数は差がなかった。採取した卵子は卵丘細胞の付着状
態による形態的特徴によりＡ～Ｆの６つにランク分けしているが，各ランクの卵子数にも給与による差はなかった。卵胞発育を誘起させるホルモン剤により卵子の発育ステージ（核相）と卵胞発育が必ずしも一致しないことが報告されており13，14），
ステージの違いは後のIVFの胚成長にも大きな影響を与える。ROU-ae給与はIGF-1分泌を促進して卵胞の発育を促す可能性が高いことから，卵子の発育ステージも対照区と異なる可能性がある。
今後は卵子の核相検査による発育ステージの確認
や，今回測定できなかった性ホルモンやインスリンなど卵胞の発育・排卵に関与するホルモンのより詳細な動態解析を行い，ROU-aeの受精卵生産における効果メカニズムを明らかにすれば，より

文献１） 田中裕志，芝野健一，増田恵，岩田尚孝，桑山岳人，
門司恭典：ウシ肝臓の状態と卵子形成および卵子の発育能力について，日本胚移植学雑誌，31, 61, 2009.
２） Kawashima, C., Fukihara, S., Maeda, M., Kaneko,E., Montoya, C. A., Matsui, M., Shimizu, T.,
Matsunaga, N., Kida, K., Miyake, Y., Schams, D.,
Miyamoto, A. : Relationship between metabolic
hormones and ovulation of dominant follicle during
the first follicular wave post-partum in highproducing dairy cows, Reproduction, 133, 155～163,2007.
３） 北田菜津美，北満夫，林みち子，坂口政信，牛越設男，滝沢達也，福岡秀雄，鈴木武人：Rhizopusoryzae
水抽出物投与によるウシ血中IGF-Ⅰおよび性ホルモン濃度の変化が繁殖成績に与える影響，第155回日本獣医学会学術集会（2013年３月）
４） Suzuki, T., Fukuoka, H., Ushikoshi, S., Satho, R.,
Morita, H., Takizawa, T. : Protective effect of
aqueous extracts from Rhizopus oryzae on liver
injury induced by carbon tetrachloride in rats,
AnimSci J, 86, 532～540, 2015.
５） Matoba, S., Yoshioka, H., Matsuda, H., Sugimura,S., Aikawa, Y., Ohtake, M., Hshiyada, Y., Seta, T.,
Nakagawa, K., Lonergan, P., Imai,K. : Optimizing
production of in vivo-matured oocytes fromsuperstimulated Holstein cows for in vitro© The Ito Foundation

208

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

production of embryos using X-sorted sperm,
J.Dairy Sci., 97, 743～753, 2014.
６） 河合愛美，堀登，上地正英：黒毛和種供卵牛の血中抗ミューラー管ホルモン濃度と採卵成績の関係，
北信越畜産学会報，107, 17, 2013.
７） Vernunft, A., Schwerhoff, M., Viergutz, T.,
Diederich, M., Kuwer, A. : Anti-Muellerian hormone
levels in plasma of Holstein-Friesian heifers as apredictive parameter for ovum pick-up and embryo
production outcomes, J Reprod Dev, 61, 74～79, 2015.
８） 大 塩 達 弥 ： 加 齢 女 性 生 殖 機 能 低 下 に 対 す る
dehydro-epiandrosterone 併 用 に よ る 不 妊 治 療 ，JReprod Engineer, 14, 1～5, 2011.
９） Zhang, J., Qiu, X., Gui, Y., Xu, Y., Li, D., Wang, L. :Dehydroepiandrosterone improves the ovarian
reserve of women with diminished ovarian reserveand is a potential regulator of the immune responsein the ovaries, Biosci Trends, 9, 350～359, 2015.
10） Merhi, Z. O., Seifer, D. B., Weedon, J., Adeyemi, O.,
Holman, S., Anastos, K., Golub, E. T., Young, M.,
Karim, R., Greenblatt, R., Minkoff, H. : Circulating

vitamin D correlates with serum antim€ullerian
hormone levels in late-reproductive-aged women :Womenʼs Interagency HIV Study, Fertil Steril, 98,
228～234, 2012.
11） Kanda, Y. : Investigation of the freely-available
easy-to-use software “EZR”（Easy R）for medical
statistics, Bone Marrow Transplant, 48, 452～458,2013.
12） Walters, K. A. : Role of androgens in normal andpathological ovarian function, Reproduction, 149, 193～218, 2015.
13） Blondin, P., Coenen, K., Guilbault, L. A., Sirard, M.
A. : Superovulation can reduce the developmental
competence of bovine embryos, Theriogenology, 46,
1191～1203, 1996.
14） Blondin, P., Coenen, K., Sirard, M. A. : The timeinterval between FSH-P administration andslaughter can influence the developmental
competence of beef heifer oocytes, Theriogenology,
48, 803～813, 1997.

© The Ito Foundation

209

繁殖疫学の手法を用いた黒毛和種牛繁殖農場の飼養形態の違いが繁殖成績に及ぼす影響の定量
Standard operation procedures for Japanese Black cattle related toreproductive performance

佐々木

羊介・上松

瑞穂＊・北原豪＊＊・大澤健司＊＊（宮崎大学テニュアトラック推進機構，＊NOSAIみやざき，＊＊宮崎大学農学部）

Yosuke Sasaki, Mizuho Uematsu＊, Go Kitahara＊＊ and Takeshi Osawa**（Organization for Promotion of Tenure Track, University of Miyazaki, ＊NOSAI Miyazaki,＊＊Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

The Japanese Black is the most common breed of beef cattle in Japan. To declare therelationship between standard operation procedures and reproductive performance in JapaneseBlack cattle, we investigated the production system and management procedures andexamined the association with production performance. In addition, the relationship between
management to reduce cold stress and stillbirth rate was examined. The target population forthe present study comprised beef cattle farms located in Miyazaki prefecture, Japan. A
questionnaire survey was conducted by clinical veterinarians to ask the production system andmanagement procedures. A total of 331 farms were participated in the present study. The 331
farms were categorized into three groups based on the average cow inventory : small（1 to 10
cows ; n＝148）, middle（11 to 50 cows ; n＝90）and large（more than 51 cows ; n＝93）. The
results of questionnaire survey showed small farms had higher proportions of farms remaining
cows in the calving room after service than large farms（P＜0.05）. Large farms had higher
proportion of farms using ICT devices to predict the timing of parturition and to find estrus ofcows compared to the other farms（P＜0.05）. In addition, days when estrus detection performs
for cows after calving was shorter in large farms compared to small farms（P＜0.05 ; 41.3 vs.
47.9 days）. Proportions of farms having heater for management to reduce cold stress in large
farms was higher than small farms（P＜0.05 ; 67％ vs. 43％）. Consequently, cows in farms
having heater for management to reduce cold stress had a lower probability of having stillbirththan those in farms not having heater（0.89％ vs. 1.71％ ; 0.05＜P＜0.10）. Additionally, cows infarms having windshield for management to reduce cold stress had a lower probability of
having stillbirth than those in farms not having windshield（1.54％ vs. 3.11％ ; P＜0.05）. Basedon these results, it is recommended improving standard operating procedures to enhance
production efficiency in beef cattle production．

© The Ito Foundation

210
１．目

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

産の発生５，６）に対するこれらの飼養管理の影響も的定量する必要がある。そこで，本研究では，黒毛黒毛和種牛の飼養戸数は年々減少する一方で，

和種牛農場の飼養形態のさらなる実態調査の実施

１農場あたりの飼養頭数は増加傾向にあり，少頭と，寒冷期の飼養管理が死産率および難産率に及数飼育から多頭数経営へと推移してきている 。

ぼす影響の調査を目的とした。

１）

この多頭化と反比例して，黒毛和種牛の繁殖成績は年々低下しており，ここ20年で黒毛和種牛の受２．方法

胎率は約10％低下している２）。さらに，黒毛和種

2.1

牛繁殖農場は，国際競争力の激化や飼料や資材の本研究の調査では，宮崎県内における黒毛和種

高騰などの問題を抱えており，生産現場では繁殖

牛繁殖農場を対象として，農場の飼養形態と繁殖成績を向上させる効率的な飼養形態の確立が求め和牛に対する飼養管理についてアンケート調査をられている 。

行った。調査は，宮崎県営農支援課やNOSAIみ３）

調査対象とした集団

このような背景から，筆者らは昨年度に宮崎県やざきが主催する黒毛和種牛繁殖農場を対象とし

内の黒毛和種牛繁殖農場を対象として，繁殖疫学

た勉強会または集会において実施し，参加した生の手法を用いた黒毛和種牛農場の飼養形態の実態

産者に各々の農場の飼養形態や飼養管理について

調 査 を 大 規 模 に 行 っ た 。繁 殖 疫 学 と は 動 物 を回答を依頼した。勉強会および集会は県内の地域「群」として認識し，各個体から得られる莫大な単位（宮崎・東諸，児湯・西都，南那珂，都城）

データを活用して飼養形態や環境要因が繁殖成績で複数回開催された。

に与えるリスクを抽出する手法である。昨年度の2.2

調査に用いた質問票

調査には189農場の黒毛和種牛繁殖農場が聞き取

アンケート調査に使用した質問票は，黒毛和種

り調査に協力し，飼養に関わる因子として，６つ牛繁殖農場の飼養形態と繁殖和牛に対する飼養管の飼養管理（農場の飼養形態，分娩に関する飼養理について昨年度調査した質問票をもとに作成し管理，種付けに関する飼養管理，給餌に関する飼た。昨年度に使用した質問票に関して，聞き取り

養管理，暑熱・寒冷対策の実施，廃用に関する飼調査を実施した臨床獣医師から提供された改善点養管理）を調査した。

を反映させ，昨年度の調査よりも詳細かつ実用的

昨年度の調査から，AI以降の母牛の飼養形態な質問票を本調査に用いた。質問票は，農場の飼や発情管理の方法など，繁殖成績に影響を及ぼす

養形態，分娩に関する飼養管理，種付けに関する

複数の因子を明らかにすることができた 。しか飼養管理，給餌に関する飼養管理，暑熱・寒冷対

し，昨年度の調査では臨床獣医師が定期巡回して策の実施の５つのセクションで構築した。各々のいる農場を中心としてデータを収集したため，限セクションに関する質問項目をTable１に示した。

４）られた農場を対象とした調査となった。調査から2.3得られた因子を考慮した適切な飼養管理方法を構

繁殖成績を算出するために，各農場における黒築するためには，さらなる農場数の増加が必要で毛和種牛の生産記録を収集した。各生産記録は電ある。また，昨年度の調査より，寒冷期における子ファイルとして抽出し，繁殖和牛の個体情報，

飼養管理が繁殖成績と関連していたことから，黒分娩成績，種付け成績などを収集した。収集した毛和種牛で問題となっている冬季の死産および難生産記録を元に，各農場における繁殖成績を算出© The Ito Foundation

生産記録の収集

繁殖疫学の手法を用いた黒毛和種牛繁殖農場の飼養形態の違いが繁殖成績に及ぼす影響の定量

211

Table 1 The questionnaire items in each section
SectionQuestionnaire items

Farm basic information

Average cow inventory
Average calf inventory
Type of barn at calving
Type of barn at insemination
Number of calving barn
Distance from house to farmManagement for cows in calving

How to predict the timing of calving of cows
Days when cows move from calving barn
Weaning age
Bedding materials

Management for cows during estrus

Days when estrus detection performs
Methods for estrus detection
Days when pregnancy diagnosis performs
Methods for pregnancy diagnosis

Feeding program

Feed amount of roughages per day
Feed amount of concentrate feeds per day
Feed ingredients of roughages
Feedingredients of concentrate

Management to reduce heat stress andcold stress

Management to reduce heat stress for cows
Management to reduce heat stress for calves
Management to reduce cold stress for cows
Management to reduce cold stress for calves

した。また，各個体の分娩時の分娩状態について有意な関連性がみられた項目に関して，多重比較調査を行い，それぞれの分娩状態を正常産，死産，が必要な際はTukey-Kramerによる多重比較を実難産に分類した。飼養規模に関して，各農場にお施した。また，寒冷対策と死産率および難産率のける飼養頭数をもとに，農場を３つのグループに関連性はa mixed-effects logistic regression model

分類した。分類の基準として，母牛の飼養頭数がを用いて検定した。

１～10頭の農場を小規模農場，11～20頭の農場を
中規模農場，21頭以上の農場を大規模農場と分類した。
2.4

３．結果と考察
本調査に協力した農場は339農場であった。こ

統計解析のうち，８農場において，飼養頭数が０頭であっ統 計 解 析 に は SAS ソ フ ト ウ ェ ア Version 9.4たことより，これらの農場の記録は分析より除外（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）を用いた。

し，331農場の記録を分析に使用した。331農場の調査した飼養形態および飼養管理に関して，地域

平均飼養母牛頭数は21頭であった。飼養規模別の（宮崎・東諸，児湯・西都，南那珂，都城）や飼農場数は，小規模農場が148農場，中規模農場が養規模との関連性を分析した。分析に関して，

90農場，大規模農場が93農場であった。

Continues variableの解析にはMIXED procedure

母牛の飼養形態として，分娩前後の時期では，によるA linear mixed-effects modelを，Binomial

すべての飼養規模グループにおいて，分娩房で母

variableの解析にはGLIMMIX procedureによるa

牛を飼育していた農場の割合が多かった。一方，

mixed-effects logistic regression modelを用いた。

AI前後の時期では，母牛をスタンチョン牛舎で© The Ito Foundation

212

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

飼育していた農場割合は大規模農場では51％で

暑熱対策として，ほぼすべての農場が扇風機をあったが，小規模農場では７％であり，大規模農設置していた。一方寒冷紗の使用割合は約２割程場が有意に高かった（P＜0.05）。一方，小規模農度であった。寒冷対策では，約７割の農場が風よ場や中規模農場では，AI前後の時期につなぎでけの設置を行っていた。また，ヒーターを設置し飼育している農場が大規模農場よりも多かったている農場割合は，大規模農場が小規模農場より（P＜0.05；57％，66％ vs. 38％）。

も多かった（P＜0.05；67％ vs. 43％）。

分娩に関する飼養管理として，母牛の分娩時期飼養管理と死産および難産の発生率との関連性の予測方法は，目視による行動観察や乳房の張りに関して，寒冷対策との関連性について調査をを実施して予測している農場が６割以上存在し行った。母牛に対する寒冷対策に関して，ヒー

た。一方，牛温恵などのセンサーや牛舎の設置カ

ターを設置している農場は，設置していない農場

メラなどのICT機材を活用している農場は，大規と比較して，死産率が低い傾向があった（0.89％

模農場で２割程度であったが，小規模農場ではvs. 1.71％；0.05＜P＜0.10）。同様に，風よけを設５％であった。床敷の種類は，おがくず，もみが置している農場は，設置していない農場と比較しら，稲わらが主流な材料であった。大規模農場でて，死産率が低かった（1.54％ vs. 3.11％；P＜

は８割以上の農場がおがくずを使用していたが，0.05）。

小規模農場ではおがくずを使用していた農場は５本研究では，昨年度の調査からさらなる農場数割程度であった。一方，稲わらを使用していた農を対象として調査を実施した。昨年度と同様に，

場割合は大規模農場では２割程度であったが，小本研究においても小規模農場では発情確認の手規模農場では５割程度であった。分娩後の離乳日法，発情確認のタイミング，発情確認期間中にお齢は，平均が約99日であり，飼養規模による有意

ける飼養形態が大規模農場と異なっていた。小規

な差はみられなかった。

模農場では，他の農場と比較して，牛歩計の使用

種付けに関する飼養管理として，未経産牛に対割合が低く，ICT機器を用いた発情確認を実施しして発情確認を開始するタイミングは11.4ヶ月齢ている農場が少なかった。これらの機器は，目視であり，飼養規模と関連がみられなかった。一方による行動観察という主観的な評価に，客観的な経産牛に対して発情確認を開始するタイミングは評価を加えることができ，発情確認の精度を向上

分娩後44.7日であり，大規模農場が小規模農場よさせることが可能である。特に，小規模農場ではりも早い傾向にあった（41.3日 vs. 47.9日）。発情

AI前後の時期に発情確認が難しい飼養形態で母確認の手法は，粘液の確認が約８割，牛の鳴き声

牛を飼育している農場が多いため，発情発見の精が約６割，行動確認が約７割であった。牛歩計を度を高めるためにもこれらのICT機器の活用が必使用している農場割合は，大規模農場が小規模農要となると考えられる。また，経産牛に対する発場より有意に高かった（Ｐ＜0.05；10％ vs. １％）。

情確認のタイミングが遅いことも明らかになっ給餌に関する飼養管理として，粗飼料の成分

た。早期の発情確認を実施することにより，分娩は，主にイタリアン，飼料イネ，エンバクが使用

後の発情回帰を早期に発見することができるたされていた。また，粗飼料の成分には地域差がみ

め，発情確認を適切な時期に開始する必要がある。

られ，特にトウモロコシの使用割合は地域によっ

また，本研究では寒冷期における飼養管理と死て75％から11％までバラツキがみられた。

産率との関連性を調査した。調査の結果，寒冷対© The Ito Foundation

繁殖疫学の手法を用いた黒毛和種牛繁殖農場の飼養形態の違いが繁殖成績に及ぼす影響の定量策を施している農場において死産率が有意に低くなり，これは黒毛和種牛で問題となっている冬季

４．要

213

約

の死産および難産の発生５，６）が寒冷対策と関連し本研究では，宮崎県内における黒毛和牛の繁殖ている可能性を示唆している。冬季には，繁殖成農家を対象とし，飼養管理の実態と飼養規模との績だけでなく，母牛の死産および難産のリスクが関連性を明らかにした。本研究により，飼養管理有意に上昇すると報告されており ，死産およびは飼養規模によって大きく異なり，この差が繁殖

難産を経験した母牛はその後の繁殖成績が低下す

成績の差に繋がっていると考えられる。これらのる傾向にある 。本研究の結果より，寒冷ストレ知見を基に，繁殖生産性を向上させるために，飼スに対する対策を施すことにより，死産率を低減

養管理の改善点を明確にする必要がある。また，できる可能性が示唆された。今後は寒冷ストレス

冬季における寒冷対策を施している農場では死産の軽減が繁殖成績の向上に寄与する可能性を調査

率が低かった。寒冷期における死産率の上昇は繁する必要がある。

殖農家の経営に大きな損失を与えることより，適５）６）

本研究では，給餌に関する飼養管理において，切な寒冷対策を施す必要性がある。

粗飼料の成分に大きな地域差がみられた。これは各地域における粗飼料の飼養環境や栽培条件の違いを反映していると考えられる。しかしながら，粗飼料の成分が異なることにより，母牛が給餌する栄養価にバラツキが生じる可能性があることより，各給餌プログラムにおける母牛を対象として，栄養状態を調査する必要があると考えられる。特に，昨年度の調査や本研究において，冬季における繁殖成績の低下や死産率の増加がみられていることより，熱生産の代謝が活発になる寒冷期における給餌プログラムと栄養状態の評価を追跡調査することが生産性向上のために必要となる。

文献１） 農林水産省：畜産統計調査，2015．http://www.
e-stat.go.jp/SG1/estat/Xlsdl.do?sinf id=000031316429
２） 家畜改良事業団：受胎調査成績，2013．http://
liaj.or.jp/giken/gijutsubu/seieki/jyutai.htm
３） Osawa, T. : International perspectives on theimpacts of reproductive technologies on foodproduction in Asia, Adv. Exp. Med. Biol., 752, 213～
228, 2014.
４） 佐々木羊介，上松瑞穂，北原豪，大澤健司，末吉
益雄：宮崎県内における黒毛和牛繁殖農家の飼養管
理と飼養規模との関連性，第119回大会日本畜産学会
大会講演要旨，2015.
５） Uematsu, M., Sasaki, Y., Kitahara, G., Sameshima,
H., Osawa, T. : Risk factors for stillbirth and dystocia
in Japanese Black cattle, Vet. J., 198, 212～216, 2013.
６） Sasaki, Y., Uematsu, M., Kitahara, G., Osawa, T.
and Sueyoshi, M. : Effects of stillbirth and dystocia
on subsequent reproductive performance inJapanese Black cattle, Vet. J., 200, 462～463, 2014.

© The Ito Foundation

214

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発
Development of rapid and non-destructive diagnostic system for cowʼs
estrus and pregnancy

ツェンコヴァ

ルミアナ・窪田

陽介・古川

茜・ジア

アシフ

（神戸大学農学研究科生体計測工学研究室）

Roumiana Tsenkova, Yosuke Kubota, Akane Furukawa and Zia Asif Iqbal（Biomeasurement Laboratory, Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

The purpose of this research is to develop a system which enables us to diagnose cow's
estrus non-destructively, rapidly and easily by means of near infrared spectroscopy（NIRS）
and Aquaphotomics proposed as new NIRS analytical method recently. Aquaphotomics is themethod that can measure changes of solutes in solution by observing water NIR spectra which
is changed by changes of solutes, so this method is very useful to measure changes in bio
systems.
This research examines the possibility that NIR spectra of vein andudder of dairy cow
can be used to diagnose estrus which caused by sexual hormone（progesterone）.
6 cows whose estruses were induced by hormone infusion were used. Sampling period
contained planned estrus days in the middle of it.
Progesterone concentration of serum samples was measured by enzyme immunoassay
which was used as conventional method to measure sexual hormone. Progesterone
concentration decrease just before estrus period, so we divide the samples high progesterone
period and low progesterone period.
From the results of vein and udder, the wavelength ranges of water which showed theidentifiability of the estrus cows and the control cowswere investigated. In the future, withknowledge acquired, we will try to construct small, cheap NIR sensor for easy and fast estrus
detection.

１．目

代表される発情に関係する体液中性ホルモン濃度

的変化を測定する手法についても，同様に多大な時

近年，乳牛の繁殖成績は低下の一途をたどり，間や労力，薬品を要する。そこで，本研究では新酪農業では多大な損害が生じている。乳牛の繁殖

たな発情診断手法として迅速，簡便に測定可能なには発情診断が重要であるが，行動観察などに代近赤外分光法と水分子情報を基とする分析手法表される従来の診断手法は曖昧であり，時間や労（アクアフォトミクス）に着目した１）。アクアフォ

力面において課題を有している。また，EIA法にトミクスは，生体液内のホルモン等，水溶液中の© The Ito Foundation

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発

215

溶質の種類やそれらの濃度変化がもたらす水の物

路農業技術センターのホルスタイン牛８頭を供試

理化学的構造変化を水の近赤外吸収スペクトルの牛とした。８頭の内，６頭はホルモン製剤によっ変化から読み取るものである。この方法であらゆて発情同期された発情同期牛群（発情同期牛ａ－

る生体液中の溶質の変化を水鏡に映し出されたよｆ）とし，残りの２頭（コントロール牛ａ－ｂ）

うに，水の近赤外吸収スペクトルの変化から推測

は発情同期をせず，かつ非発情時期のコントロー

することができる。アクアフォトミクスを用いた

ル牛群とした。供試牛の体表面における測定部位

先行研究としては，生乳中の成分分析２），乳牛には，乳房の側面６点，臀部４点の計10点とし，静おける乳房炎診断があり，近年では，ジャイ脈については５点を設定した（Fig.１）。各測定

およびオランウータン の尿スペ部位において，近赤外分光器Micro NIR（JDSU社）

クトルから水分子構造が尿中物質濃度を反映してを用いて，３回連続照射によるスペクトル測定をいることが示唆され，迅速かつ非破壊の絶滅危惧行った（Fig.２）。測定日数は８日間とし，１日

動物発情診断への応用可能性が示された。

目午後から８日目午前まで，午前と午後に１回ず

３～５）

アントバンダ６）

７）

本研究では，近赤外分光法によるアクアフォト

つのスペクトル測定を行った。また，性ホルモン

ミクスを用いて，牛の発情・妊娠に関するホルモ測定のために血清サンプルも合わせて採材し，血ンの分泌状況から牛の発情・妊娠時に特徴的な近赤外スペクトルパターンを明らかにし，これを非破壊，迅速かつ簡便に検出する診断システムを開発する。将来的にはこのシステムを用いて畜産農家が日々の業務の中で利用できる小型，安価かつ簡易なセンサーを開発することを目指す。
特に本稿では牛の発情について，発情時期の直前に血液や生乳中でその濃度が急低下するという特徴を持つ，性ホルモンであるプロジェステロン
（以下，P4）濃度に基づく発情診断を目的とした。
２．方法

Fig. 1 Spectral measuring point（udder and vein）

牛の発情時期の直前には，血中P4濃度が大きく低下することが報告されている８）。また，血中P4濃度の変化は生乳中の同濃度に反映され，高い相関関係があるため，本研究では発情時期を含む一定期間，供試牛の体表面（乳房および静脈）の近赤外スペクトルを測定した。また，血清サンプル
は，各供試牛から60mL採血し，37℃で30分間インキュベートを行った後に０℃，3000rpmの条件
下で15分間遠心分離を行い精製した。
本実験では，兵庫県立農林水産技術センター淡Fig. 2 Micro NIR© The Ito Foundation

平成27年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

中P4 濃度をKinoshitaら６）の手法に基づいてエン
ザイムイムノアッセイ（EIA）法を用いてマイクロプレートリーダiMark（BioRad社）により測定した。スペクトル解析については，乳房および静脈のスペクトル測定日１～３日目（発情前段階），
４～５日目（発情），６～８日目（発情後段階）に分類し，SIMCA（Soft Independent Modelingof Class Analogy）法 に よ り 識 別 精 度 を 算 出 し

6P４ concentration[ng/ml］

216

Estrus a
Estrus b
Estrus c
Estrus d
Estrus e
Estrus f
Control aControl b

５
４
３
２
１
０

day１ day２ day３ day４ day５ day６ day７ day８

Fig. 3 Concentration of serum samples measured by EIA

た。また，発情段階にP4濃度の高低期の分類を加え，発情前段階かつ高P4濃度期１日目，２日目の濃度の操作は成功していたことが確認された乳房および静脈の平均スペクトルと発情かつ低P4（Fig.３）。

濃度期４日目，５日目の平均スペクトルを用い

3 . 2 . 乳房および静脈におけるスペクトル解析て，アクアグラムを作成し，発情同期牛とコント

3.2.1.

ロール牛の識別の可能性を検討した。

近赤外分光器Micro NIRにより３回連続で測定

本年度の研究成果として，「乳房」，「静脈」のスペクトル解析による結果を報告する。

した乳房および静脈スペクトルに対して，スペク
トルのランダムノイズ低減のために平滑化を行った後，ベースライン補正としてMSC（Multiplicative

３．結果および考察
3.1

SIMCA法によるスペクトル解析

Scattering Correlation）を適用した。その後，発EIA法による血中P4濃度測定

情同期牛６頭およびコントロール牛２頭に対し牛の性周期は約21日間であり，その中で卵巣内て，測定日１日目のスペクトルから測定日２～７に黄体が形成され，血中プロジェステロン濃度が日目の各スペクトルの差を算出し，各牛群の平均高い値を保つ時期（以下，高P4期）と黄体が退行スペクトルを差スペクトルとして算出し，して低い値を保つ時期（以下，低P4期）があり，SIMCA法により，識別精度（式１）を算出した。

高P4期と低P4期の境界では，P4濃度の急低下が観

また，スペクトル解析には，945～1645nmおよび察される。発情は，血中P4濃度の急低下が起きた

1300～1600nmの水の第一倍音領域を解析波長と３～４日後（人工授精適期）に発生する。その性し，牛の組み合わせは，コントロール牛ａ・ｂの周期を利用するホルモン製剤による発情の誘起

２頭と発情同期牛２頭の組み合わせは，発情同期

は，膣内留置型ホルモン製剤（PRIDもしくは

牛ａ・ｂ，ｃ・ｄ，ｅ・ｆの３パターンを選定しCIDR）を挿入し，人工的に牛の体内P4 濃度を高た。

い水準に保ち，適当な期間留置した後，製剤を除識別精度［％］＝

去することで体内P4濃度を人工的に急激に低下さ

正しくクラス分けされたサンプル数×100（1）
全サンプル数せることで行う。
EIA法による血清中P4 濃度（ng/ml）を測定しSIMCA法による発情同期牛とコントロール牛た結果，コントロール牛を除くすべての牛で，膣の識別精度を検証した結果，乳房スペクトルにお内留置型ホルモン製剤の除去前後でP4濃度に大きいて1300～1600nmの波長領域では，発情前段階

な高低差が確認され，ホルモン製剤による体内P4の１～３日目においては，80％以上の識別精度が© The Ito Foundation

217

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発

保たれていたが，発情（４～５日目）において識ルが，牛の発情診断に有用であることが示された。

別精度の低下が確認された（Fig.４）。これに対

3 . 2 . 2 . アクアグラムによる発情同期牛とコし，同波長領域における静脈スペクトルでは，発ントロール牛の識別

情前段階から90％以上の識別精度を有し，発情お

本解析では，アクアフォトミクスを基とし，水よび発情後段階においても識別精度に顕著な低下

構造システムと関係が深い12波長（1342，1360，が確認されなかった（Fig.５）。この結果から，1373 ，1385 ，1410 ，1428 ，1441 ，1453 ，1459 ，

1300～1600nmの波長領域における静脈スペクト

1478，1484，1509nm）を選定し，アクアグラム

100％

Discriminating power

90％
80％
70％
60％

a & b

50％

c & d

40％

e & f

30％

control

20％
10％

dav８

day７

day７

day６

day６

dav５

day５

day４

day４

day３

day３

day２

day２

day１

０％

day1,2 day2,3 day3,4 day4,5 day5,6 day6,7 day7,8
Fig. 4 Discriminating power of udder（1300-1600nm）

100％

Discriminating power

90％
80％
70％
60％

a & b

50％

c & d

40％

e & f

30％

control

20％
10％

dav８

d ay７

d ay７

d ay６

d ay６

d av５

d ay５

d ay４

d ay４

d ay３

d ay３

d ay２

d ay２

d ay１

０％

day1,2 day2,3 day3,4 day4,5 day5,6 day6,7 day7,8
Fig. 5 Discriminating power of vein（1300-1600nm）© The Ito Foundation

218

平成27年度

1509nm1484nm1478nm1342nm
1.5
１
0.5
０
－0.5
－１
－1.5

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

1360nm1484nm1373nm1385nm1459nm1478nm1373nm1385nm1428nm1453n m1428nm1360nm

1410nm1459nm

1410nm

1 453nm

1342nm
1.5
１
0.5
０
－0.5
－１
－1.5

1509nm1441nm1441nm

E stru s a & b Pre -e s tru s

C o n t r o l a & b P r e - e st r u s

E stru s a & b Es tru s

C o n t r o l a & b E st r u ss

Fig. 6 Aquagrams of udder（left）and vein（right）

を作成した。アクアグラムとは，次式（２）によした際，低波長側から高波長側にアクアグラムがり特定波長の吸光度を標準化した値（アクアグラ

移動していっていることより，日を追うに従ってム値）をレーダーチャートとして図示したもので水素結合の数が増えていった可能性が考えられる。

ある。これにより，発情同期牛とコントロール牛

乳房スペクトルを用いたアクアグラムにおいてを視覚的に比較することが可能となる。

は，発情期のアクアグラム値に注目して発情同期
牛とコントロール牛とを比較した際，発情同期牛

Aqgλ＝

xλ－xλ
σλ

は1342，1360，1373nmで発情同期牛とコントロー（２）

ル牛に大きな差が確認された（Fig.６）。

Aqgλ：波長λのアクアグラム値

以上の結果から発情同期牛とコントロール牛のxλ：サンプルのλにおける吸光度

間にアクアグラム値の差が見られたことから近赤xλ：λにおける全サンプルの吸光度の平均外分光法およびアクアフォトミクスを用いて牛のσλ：λにおける全サンプルの吸光度の標準偏差発情診断ができる可能性が示唆された。

アクアグラムにより，発情前段階と発情期にお４．要

約

ける発情同期牛とコントロール牛の識別を行った

本研究では近赤外分光法と，近年提唱されてい結果，静脈スペクトルを用いたアクアグラムにおる近赤外分光法における新たな分析手法であるア

いては，発情同期牛，コントロール牛において高クアフォトミクスを用いて，非破壊，迅速かつ簡波長領域でアクアグラム値の上昇が観察された。

便に牛の発情診断を行うシステム開発を目的とす

また，同アクアグラムにおいて発情同期牛とコンる。アクアフォトミクスとは，水溶液中の溶質のトロール牛を比較した場合，1342nm，1509nmで変化に伴う水分子の変化を近赤外スペクトルの変は 発 情 同 期 牛 が ，1385 ，1410 ，1428 ，1441 ，化から読み取る手法であり，生体内の変化を診断

1453，1459nmではコントロール牛のアクアグラするのに適している。本研究では牛の体表面（乳ム値が特徴的に現れている。全体としてコント

房 お よ び 静 脈）の 近 赤 外 ス ペ ク ト ル か ら ，

ロール牛も発情同期牛も発情前段階と発情を比較

SIMCA法，アクアグラムにより，発情診断の可© The Ito Foundation

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発

能性を検討した。従来の性ホルモン濃度測定法であるEIA法によって，ホルモン製剤によって発情を同期した６頭およびコントロール牛２頭のP4濃度の変化を測定し，高P4期と低P4期を把握し，発情前後および発情期を分類したうえで乳房および静脈の近赤外スペクトルを解析した結果，発情同期牛とコントロール牛の識別の可能であることが分かり，近赤外分光法およびアクアフォトミクス
を用いて牛の発情診断ができる可能性が示唆された。今後は，得られた知見を用いて小型，安価で簡易なセンサーの開発を目指す。
文献１） Tsenkova, R. : Introduction aquaphotomics :Dynamic spectroscopy of aqueous and biologicalsystems describes peculiarities of water, Journal ofnear infrared spectroscopy, 17, 303～314, 2009.
２） Tsenkova, R., Atanassova, S., Itoh, K., Ozaki, Y.,
Toyoda, K. : The World Wide Web at : Near infrared
spectroscopy for biomonitoring : Cow milk
composition measurement in a spectral region from219

1, 100 to 2. 400 nm 1, Journal of animal science, 78,
515～522, 2000.
３） Tsenkova, R., Atanassova, S., Morita, H., Ikuta, K.,
Toyoda, K., Iordanova, I. K., Hakogi, E. : Near
infrared spectra of cowsʼ milk for milk quality
evaluation : disease diagnosis and pathogen
identification, Journal of near infrared spectroscopy,
14（6）,363～370, 2006.
４） Tsenkova, R. : Introduction aquaphotomics :Dynamic spectroscopy of aqueous and biologicalsystems describes peculiarities of water, Journal ofnear infrared spectroscopy, 17, 303～314, 2009.
５） Morita, H., Kuroki, S., Ikuta, K., Tsenkova, R. :Real-time near infrared spectral monitoring of
mammary gland for inflammation diagnosis in dairy
cows, Journal of near infrared spectroscopy, 21（5）,427～433, 2013.
６） Kinoshita, K., Miyazaki, M., Morita, H., Vassileva,
M., Tang, C., Li, D., Ishikawa, O., Kusunoki, H.,
Tsenkova, R. : Spectral pattern of urinary water asa biomarker of estrus in the giant panda, Scienti f ic
Reports, 2, 856, 2012.
７） 木下こづえ：近赤外分光法を用いた野生動物の生理モニタリング技術の開発，第30回記念近赤外フォー
ラム講演要旨集，つくば，91～94, 2014.
８） 中尾敏彦：最新・乳牛の繁殖管理指針，37，57，
酪農総合研究所，札幌市，2000.

© The Ito Foundation

220

種雄牛の受胎性評価に資する精子メチル化可変部位の解明
Identification of differentially methylated sites in sperm DNA and theircontribution to the evaluation of bull fertility

武

田

久美子・小

林

栄

治

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Kumiko Takeda and Eiji Kobayashi（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

The aim of this study was to detect differentially methylated CpG sites on sperm DNA
and their contribution to bull fertility. It is known that the methylation profile of sperm DNA isdifferent in each individual bull. However, the relationship between bull fertility and the
methylation status is not elucidated. In this study, genome-wide methylated DNA modificationsof bull spermatozoa were analyzed using a human DNA methylation microarray. Frozen semenwere obtained from a bull at different ages and two other bulls with different IVF results, andused for analysis. Approximately 50,000 CpG sites were expected to be useful for analyzingthe
bovine genome. Differentially methylated profiles were found among the samples. The
differentially methylated CpG sites were selected among samples with different ages, thebovine sequences were determined and the methylation levels were verified by combined
bisulfate restriction analysis（COBRA）. One CpG site could reflectanage-related change ofmethylation levels. Differentially methylated CpG sites were found among the samples withdifferent IVF results. Different methylation levels were also observed in some CpG sites by
COBRA. In conclusion, we identified differentially methylated genes in sperm DNA which
involved in bull fertility, using human microarray combined with COBRA. This method will bebeneficial for the evaluation of breeding bulls in the future.

１．目には，精液性状が正常であるにもかかわらず人工的授精に使用してみると受胎性の著しく低い精液がわが国における牛の交配はほぼ凍結精液を用い存在している。これら低受胎を示す精液は，精子た人工授精で行われているが，人工授精による受活力や生存率，精子濃度など精液性状に基づく検胎率はここ15年間低下し続けている（家畜改良事

査では発見することは困難であるため，ある程度

業団資料より）。人工授精における受胎率低下にの規模で人工授精が行われた後に低い受胎率が発は雌雄双方の要因が関与しており，雄側からの要覚した時には大きな経済的損失が発生することと因解明の取り組みも必要である１）。優秀な遺伝形なる。近年，遺伝的要因以外であるエピジェネ

質を持つと期待され選抜された種雄牛候補の一部

ティクス異常が男性不妊の要因のひとつとして注© The Ito Foundation

種雄牛の受胎性評価に資する精子メチル化可変部位の解明

221

目されている。ヒトでは男性不妊患者における精とで，人工授精に用いる受胎性の低い凍結精液を子のインプリント遺伝子のメチル化異常や，老前もって排除できれば経済的な効果は非常に高化に伴って精子のメチル化が変化することが報告い。そこで本研究では，牛凍結精液の受胎性評価されている 。エピジェネティクスの要因のひとに資するため，ヒト用メチル化解析用チップを用つであるDNAメチル化修飾は，組織ごとに特異いて種雄牛の受胎性に影響しうる精子メチル化可的なDNAメチル化プロファイルをもち，形質発

変部位を特定することを目的とした。

２）

３）

現に重要な影響を及ぼしている。DNAメチル化の動態は生殖系列細胞において大きく変化してお２．方法り４），精子形成過程においてDNAメチル化修飾2.1に異常が発生しうる。生殖系列細胞のDNAメチ

本研究で使用した牛凍結精液は，農研機構畜産

ル化はすでに胎子期の環境に影響を受けることが草地研究所で飼養している雄牛より採取した。精知られており，種雄牛によって精子核DNAの全液の凍結は希釈液（20％卵黄，0.13M Tris，0.05

体的なメチル化状態やメチル化パターンに個体差

Mクエン酸，0.04Ｍラクトース，0.04Ｍラフィノーがあることが知られている。しかし，現在まス，0.5㎎/mlゲンタマイシン，600IU/mlペニシで牛では遺伝子情報を伴ったメチル化プロファイ

リンＧカリウム）で１次希釈し，一晩冷蔵後，

ルはほとんど解明されていない。個々の遺伝子を７％グリセロールによる２次希釈後，0.5mlスト

ターゲットとした，Combined Bisulfate Restriction

ローに封入，液体窒素上のラックに並べた後，液Analysis（COBRA）法やバイサルファイトシー

体窒素中に浸漬し凍結した。

５，６）

牛凍結精液およびDNA抽出

クエンス法によるメチル化可変部位のスクリーニ
ングには限界がある。我々は現在まで低受胎とさ比較１．精液性状，体外受精後の胚発生率に差がれる牛凍結精液について個々の遺伝子のメチル化あることが判明している雄牛から採取した精液

可変部位についてスクリーニングを行ったが，メ（黒毛和種雄牛２頭，Ａ，Ｂ）を用いた（Table１）。

チル化異常は検出できなかった７）。そこで，飛躍的に効率良くかつ低コストでDNAメチル化プロ比較２．同一個体でありながら精液性状の異なるファイルの評価および目的遺伝子の探索をする方

精液の解析として，ホルスタイン種雄牛の性成熟法として，ヒトDNAメチル化解析用アレイチッ

期（H1，44週齢，H2，46週齢）から繁殖供用期

プを利用するのが有効ではないかと考えた。ヒト（H3，67週齢，H4，111週齢）に採取した凍結精では高密度なDNAメチル化解析用チップの開発液を用いた（Table２）。

により，48万箇所のCpGサイトのメチル化の状態を解析することが可能となっており８），精子の解凍結精液は38℃の温湯に15秒浸すことにより融析においても不妊に関連するメチル化状態の可変解した。融解した精液はD-PBS（－）にて２回化部位が明らかにされている 。そこで我々は，洗浄した。１mlの精子浮遊液を1.5ml遠心チュー

牛ゲノムDNAについてヒト用DNAメチル化解析

ブに移し，2,300ｇで精子を沈殿させた。精子ペ用チップによる解析を評価したところ，約５万箇

レ ッ ト よ り DNA 抽 出 キ ッ ト（DNeasy Blood &所のメチル化サイトが利用可能との結果を得た10）。

Tissue Kit，キアゲン社）を用いてDNAを精製しメチル化異常を指標とした新たな評価を加えるこた。DTTを添加することで懸濁液は完全に溶解

９）© The Ito Foundation

222

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Table 1 Results of sperm parameters of the frozen

semen from two bulls（A, B）.

a, b

行った。バイサルファイト処理したDNAを鋳型にバイサルファイト処理DNA断片をPCR増幅し，

Bull

Age
（years）

Motility（％）

Concentration
（/ml）

IVF
blastocyst
（％）

A

13

73a

1.2Ｘ109

22.8a

B

6

45b

1.0Ｘ109

8.9b

Different superscript indicate significant difference within

CpG部位をターゲットとする制限酵素処理を行った。DNA断片を３％アガロースゲルによって電気泳動を行い，切断の程度によってメチル化可変部位が検出できるかどうかの確認を行った。

the column（P＜0.05）.

３．結果と考察
Table 2 Results of sperm parameters for single ejaculatesof the frozen bull semen collected at different ages
（H1-4）.
Semen

Age
Motility（weeks） （％）

Concentration
（/ml）

IVF
blastocyst（％）

3 . 1 牛精子の網羅的なメチル化状態の解明と可変部位の検出
網羅的なメチル化パターンを比較するため，各CpG部位のメチル化度をヒートマップで示したと

H1

44

3

1.1Ｘ108

0.0

H2

46

5

2.4Ｘ108

0.0

H3

67

80

5.2Ｘ108

29.5

異なっており，また性成熟期のH1-2と繁殖供用

H4

111

70

2.7Ｘ10842.9

期と同等の精液性状を示したH3-4の精子との間ころ，精子は他の臓器と明らかにメチル化状態がにメチル化状態の差異が検出された（Fig.１）。
した。精製したDNAはヒト用メチル化解析用チッ3 . 2 牛精子のメチル化可変部位の特定と検証

プ（Human Methylation450 Bead Chip ，イ ル ミ

性成熟期（H1-2）と繁殖共用期（H3-4）とのナ社）による解析を依頼した。解析結果について間でメチル化度の異なるCpG部位を107個抽出し，は，信頼性の指標であるP-val値および総蛍光強牛のゲノム配列とのホモロジー検索の結果36領域

度により有効と判断したCpGサイトについて試料がヒットした。その中で制限酵素部位のあるCpG間の比較解析を行い，メチル化可変部位を抽出し部位は12箇所であった。COBRA法による差異検リストアップした10）。

出を試みたところ，１箇所のCpG部位でメチル化

2 . 2 牛精子のメチル化可変部位の特定と検証度の違いが検出できた（Fig.２a）。さらに，IVF

2 . 1でリストアップしたメチル化可変部位につ胚発生率の良好なH4，Ａと低いＢとの間で抽出しいてヒトプローブの牛ゲノム配列に対するたCpG部位についても同様にCOBRA法によってBLAST検索によりヒト―牛間の塩基配列の相同メチル化度の違いが検出可能であった（Fig.２b）。

性を確認し，遺伝子名およびCpG部位の位置を特し か し ，同 じ く IVF 胚 発 生 率 の 異 な る H1-2 と定した。次に抽出した牛の塩基配列からターゲッ

H3-4の間でメチル化度の違いは反映されず，個トCpG部位に制限酵素認識部位を持つ配列を選択

体間で検出したCpG部位のメチル化度の差は，発し，同CpG部位を含む領域をターゲットとしたプ

育に伴って変化したものではなく，個体差である

ラ イ マ ー を MethPrimerと示唆された。

11）

ソフトにより設計した。2 . 1で精製したDNAは，COBRA法に供する

ヒト用DNAメチル化解析用チップのメチル化

た め ，キ ッ ト（Methyl Easy Xceed Rapid DNA

度の結果とCOBRA法による電気泳動像を比較しBisulphite Modification Kit, Human Genetic

た結果，これらのCpG部位においては牛凍結精液

Signatures社）を用いてバイサルファイト処理を間のメチル化状態の違いをおおむね反映している© The Ito Foundation

種雄牛の受胎性評価に資する精子メチル化可変部位の解明
Color Key

０0.2

Methylation rate on HSA22223

CpG部位およびCpG部位を含む領域としてのメチ
ル化度の差異を明らかにし，メチル化可変領域であるかどうかを確認する必要がある。また，実際

0.6
Value

に人工授精後の受胎率の明らかな凍結精液に適用し，凍結精液の受胎性評価の指標に資するか否かの検討を進める必要がある。
４．要

約

本研究の目的は，種雄牛の受胎性に影響する精子核DNAメチル化可変部位を特定し，凍結精液
Ｈ１Ｈ２Ｈ３Ｈ４ＡＢ

Lv

Ms

Br

Fig. 1 Cluster heat map for methylation profiles of all

CpG sites with detection p-value＝0 on humanchromosome 22（n＝757）. Sperm DNA（H1-4, A,
and B） showed different methylation profiles
compared with other organs, such as, liver（Lv）,
muscle （Ms）, and brain （Br）. Black indicates
hypermethylated, whereas white indicateshypomethylated.

の評価に資することである。種雄牛によって精子核DNAのメチル化状態に個体差のあることが知られている。本研究では，ヒト用DNAメチル化
解析チップを利用することで，より安価に簡便な方法で牛精子DNAメチル化可変部位を特定する。
同一個体で性成熟期から繁殖共用期の精液性状が大きく変化する時期に採取した凍結精液間，体外
受精後の胚発生率の異なる凍結精液間のメチル化

Ｈ１ Ｈ２ Ｈ３ Ｈ４

Ｂ

度の違いを検討した。その結果，雄牛ごと，またＡ採取時期の異なる同一個体においてもメチル化状（ａ）

態の差異が検出可能なことを明らかにした。ヒト
60

79

86

用DNAメチル化解析用チップの解析結果より抽Ｈ１ Ｈ２ Ｈ３ Ｈ４ＢＡ

出したメチル化可変部位について，COBRA法に

31

33

53

よるメチル化状態の差異検出を試みたところ，発（ｂ）

育に伴って変化しうるCpG部位のうち１箇所で
51

71

COBRA法によるメチル化度の違いが検出可能で

89

Fig. 2 Methylation level differences analyzed by

COBRA. Target CpG sites were selected from theresults of human methylation beadchip array. The
methylation level analyzed by array is indicatedbelow each lane.

あった。同領域は雄牛ごとにメチル化度が異なっており，個体間においてもメチル化可変部位であることが明らかとなった。また，IVF発生率の異なる雄牛から採取した凍結精液間でメチル化度に差異のあるCpG部位についても同様にCOBRA法
によってメチル化度の差異が検出できた。今後，ことが確認できた。
以上の結果から，ヒト用DNAメチル化解析チップを利用することで，牛精子DNAメチル化可変

メチル化度の差異を指標とした凍結精液の受胎性評価へ資すると期待される。

部位の検出が可能となった。今後は，バイサル
ファイトシークエンスによってこれらターゲット© The Ito Foundation

224

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

文献１） 渡辺伸也，武田久美子：種雄牛が有する繁殖能力の把握に向けて：精子の受精能力を多面的に評価するための新しい視点，日本胚移植学雑誌，60（3）,135～140, 2014.
２） Sato, A., Hiura, H., Okae, H., Miyauchi, N., Abe, Y.,
Utsunomiya, T., Yaegashi, N., Arima, T. : Assessing
loss of imprint methylation in sperm from subfertile
men using novel methylation polymerase chain
reaction Luminex analysis, Fertil Steril, 95, 129～134,
134 e121～124, 2011.
３） Jenkins, T. G., Aston, K. I., Pflueger, C., Cairns, B.
R., Carrell, D. T. : Age-associated sperm DNA
methylation alterations : possible implications inoffspring disease susceptibility, PLoS Genet, 10,e1004458, 2014.
４） 白根健次郎，佐々木裕之：生殖系列におけるエピ
ゲノムサイクルとその制御，実験医学，32（6）,847～
852, 2014.
５） 岸本学，甲田俊夫，加藤博巳，三谷匡，松本和也，
佐伯和弘，細井美彦，入谷明：ウシ精子頭部DNAの全体的なメチル化状態の検討方法の開発，Memoirsof Institute of Advanced Technology, Kinki
University, 12, 43～50, 2007.
６） Carvalho, J. O., Michalczechen-Lacerda, V. A.,

Sartori, R., Rodrigues, F. C., Bravim, O., Franco, M.
M., Dode, M. A. : The methylation patterns of the
IGF2 and IGF2R genes in bovine spermatozoa are
not affected by flow-cytometric sex sorting, Mol
Reprod Dev, 79, 77～84, 2012.
７） 金田正弘：エピジェネティックスと牛精子DNAの メ チ ル 化 ： 獲 得 形 質 の 遺 伝 は 存 在 す る か ？，Japanese Journal of Embryo Transfer, 36（3）, 141～
148, 2014.
８） Sandoval, J., Heyn, H., Moran, S., Serra-Musach, J.,
Pujana, M. A., Bibikova, M., Esteller, M. : Validationof a DNA methylation microarray for 450,000 CpG
sites in the human genome, Epigenetics, 6, 692～702,
2011.
９） Krausz, C., Sandoval, J., Sayols, S., Chianese, C.,
Giachini, C., Heyn, H., Esteller, M. : Novel insights
into DNA methylation features in spermatozoa :stability and peculiarities, PLoS One, 7, e44479, 2012.
10） Kobayashi, E., Takeda, K. : A data driven
approach to utilizing Human Methylation arrays ingenome-wide study for bovine DNA methylation, J .
Anim. Genet., in printing.
11） Li, L. C., Dahiya, R. : MethPrimer : designing
primers for methylation PCRs, Bioinformatics, 18,1427～1431, 2002.

© The Ito Foundation

225

肥育前の和牛雌子牛の摘出卵巣からの胚生産に関する研究
Studies of in vitro embryo production using growing oocytes collectedfrom the ovaries removed from Japanese beef calves before fattening

的

場

理

子・平

尾

雄

二・武

田

久美子

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Satoko Matoba, Yuji Hirao and Kumiko Takeda（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

The production of embryos using growing oocytes collected from the ovaries of calves
just before fattening（approximately 9.5-month-old）is beneficial for the rescue of genetic
resources. Although last year we established embryo production by in vitro maturation,
fertilization and culture（IVM-IVF-IVC）using both fully grown immature（IM, 120μm in
diameter）and in vitro grown（IVG）oocytes collected at the growing stage（100μm in
diameter）obtained from the same ovaries, percentage of embryo production were not stable.
Oocyte developmental competence might be influenced by puberty. The aim of this study was
to investigate the correlation between the developmental potential of both IM and IVG oocytes
and the presence or absence of the corpus luteum（CL＋ or CL－）, an indicator of puberty. IM
oocytes were subjected to IVM-IVF-IVC. IVG oocytes were subjected to IVM-IVF-IVC after
IVG culture for 14 days. In both groups, each presumptive zygote was cultured in an individual
isolated microwell in culture dishes. Embryo production in in vitro was observed in both typesof oocytes either with CL＋ or CL－. In IM oocytes, higher blastocyst formation rates were
derived with CL＋ than with CL－. Mitochondrial DNA copy numbers were similar between
IM and IVG oocytes irrespective of the presence/ absence of CL and the maturity of the donor（calf vs. cow）
. In both the IM and IVG groups, conception was achieved after the transfer
resultant embryos into the recipient cows. In conclusion, we demonstrated the possibility ofembryo production after IVM-IVF using both fully grown and growing stage oocytes collectedfrom the same ovary from calves either presence or absence of CL before fattening. Although
puberty can affect the developmental competence of IM oocytes, it may not strongly affect it in
IVG oocytes. Further study is required to confirm the production of calves following embryotransfer to the recipient cows.

１．目

卵巣を利用できれば，血統の明らかな雌牛の後代的を生産することが可能となる。体外受精で用いる

黒毛和種雌牛の肥育において，子牛の段階で肥卵子は，少数で培養すると発生率が低く１），摘出

育前に去勢（卵巣を摘出）され，廃棄されている卵巣からの卵子採取は１回限りであるため，１頭© The Ito Foundation

226

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）（卵巣は１頭あたり２個）あたりの採取卵子数が植後に受胎性を有するかの検証も必要であると考少ない場合の発生率の向上が欠かせない。また，えられた。

性成熟に達していない若齢牛の未熟な卵巣から得そこで，本研究では，肥育前雌子牛を性成熟前られる卵子は既存の体外受精・培養法では発生率

か後かに分けて，通常サイズの卵子および発育途が低いという報告がある 。我々は，少数の卵子

上卵母細胞を採取して胚生産を検討した。また，においても，体外発生能を最大限引き出せる個別

性成熟前および後から採取した卵子および体外発識別可能な個別卵子・胚培養システムを開発して育卵子について，体外成熟後にmtDNAコピー数

いる 。さらに，若齢牛の未熟な卵巣には，成牛を計測し，体内で発育した成雌牛の卵子と同等での成熟した卵巣に比べて多数の発育途上の卵胞をあるか否かを検証した。さらに，生産胚のうち移含む様々な直径の卵胞に，様々な直径の卵子や発植可能な品質の胚を受胚牛へ移植して，その受胎育途上の卵母細胞が存在している。これら卵胞卵性についても検証した。

２）３）子や発育途上の卵母細胞を利用できれば，体外受精に用いる通常サイズの卵子（直径約120μm）と合わせて雌子牛１頭から数多くの卵子を活用できる。我々は，成牛から採取した直径約100μmの

２．方法

2 . 1 黄体の存在別の若齢雌子牛由来卵子，卵母細胞からの胚生産の検討

中型卵母細胞の長期培養によって体外受精に用い民間農場で飼養されている黒毛和種の肥育前若ることが可能な成熟卵子を得る技術を確立し ，齢雌子牛（平均9.5か月齢）を性成熟前後の時期

発育途上の卵母細胞由来の子牛生産を可能として別に分け，それらの摘出卵巣から採取した卵子のいる５）。

発生能を検討した。性成熟に達したかどうかの判

４）

昨年度の本助成では，肥育前雌子牛の卵巣から断基準には卵巣に黄体が存在するかどうかが指標

通常サイズの卵子だけでなく，発育途上の中型卵となるため，黄体の有無別に各個体の卵巣を分類

母細胞も14日間の体外発育培養ののち，体外成して現地から実験室まで約５時間輸送後，直径２熟・受精・発生培養により卵子の一部は胚盤胞期～６㎜の卵胞から吸引採取した直径約120μmの胚への発生が可能であることを明らかとした。卵

未成熟卵子（通常サイズの卵子）を採取し，体外子に数多く含まれているミトコンドリアDNA

成熟培養を輸送後から約１時間後に開始した。体（mtDNA）により卵子や体外発育卵母細胞の１外成熟，体外受精および体外発生培養は，既報７）

個１個の正常性を体外受精前に評価することが可に従って実施した。発生培養には，個別識別培養

能 と考えられ，新培養液を用いて体外発育培養皿８）を用い，卵巣に存在する黄体の有無別に，卵した発育途上の卵母細胞が，体内発育卵子と同等子の発生能の検証と胚の生産性について，媒精後となることも見出した。しかし，発育途上卵母細48時間の初期卵割および７～９日目の胚盤胞期胚

胞だけでなく，通常サイズの卵子においても胚のへの発生成績により検討した（IM oocytes, CL

発生率が安定していなかった。その理由として，＋；黄体あり，n＝132，IM oocytes, CL－；黄体

卵巣摘出した肥育前雌子牛が性成熟前か後かになし，n＝41）。

６）

よって，採取卵子の発生能が異なるのではないか

通常サイズの卵子採取終了後に，直径0.5～0.8と推察され，その検討が課題として残った。さら㎜の卵胞から発育途上卵母細胞（直径約100μm）に，生産胚が受胚牛へ移植可能な品質であり，移の採取を開始し，その体外発育培養を輸送後から© The Ito Foundation

肥育前の和牛雌子牛の摘出卵巣からの胚生産に関する研究

227

約５時間後に開始した。発育途上卵母細胞の採取

および体外発育した卵母細胞について，分子レベと体外発育培養および成熟培養は既報に従っ

ルの正常性を比較検証した。卵巣の黄体の有無別

た。すなわち，卵巣表面の皮質を薄く切り出し，に採取した通常サイズの卵子から体外成熟培養し得られた卵胞を切開して直径約100μmの発育途た一部の卵子（IM oocytes, CL＋；黄体あり，n

上卵母細胞と顆粒膜細胞の複合体を採取し，14日＝３，IM oocytes, CL－；黄体なし，n＝３）か間の体外発育培養を実施した。培養液には平成26

ら卵丘細胞を除去後，PVPを添加したPBS－で洗年度の本助成で開発した添加剤を，基本培養液に浄し，個別の卵子ごとにDNA抽出キット（QIAamp

添加して用い，体外発育培養は，この培養液を入

DNA micro Kit, Qiagen）を用いてDNAを抽出しれたセルカルチャーインサート上で，38.5℃，５％た。卵子１個あたりのmtDNAのコピー数の計測

CO2，５％O2および90％N2の加湿気相下で14日間

は，Cytochrome c oxidase I（COX1）および行った。体外発育培養後の卵子の体外成熟は，

Cytochrome B（CYTB）遺伝子をターゲットと200μＭアスコルビン酸２-グルコシド，１mMピルしたリアルタイムPCR（LightCycler 1.5, Roche）

ビン酸ナトリウム，0.55mMシステイン，100ng/

により既報６）に従って行った。対照区には，黒毛ml FSH，500ng/ml LH，10ng/ml EGF，５％FBS

和種成雌牛２頭から採取した生体卵子吸引によっ

添加TCM199を用い，通常サイズの卵子と同気相て採取した卵子（OPU）を用いた（n＝４）。

下で同時間の培養により行った。また，成熟卵子

直径約100μmの卵母細胞を２週間体外培養し，の体外受精・発生培養は，通常サイズの卵子と同これらから発育した成熟卵子（IVG oocytes）の様とした。これらの発育途上の卵母細胞につい一部（n＝３）より，通常サイズの卵子の場合とて，体外発育培養による体外受精可能な成熟卵子

同様にDNAを抽出し，卵子１個あたりのmtDNAの生産や，その後の体外受精による胚の生産性

コピー数の計測を行った。対照区には，食肉処理を，黄体の存在の有無別に検討した（IVG oocytes,場から採取した成牛卵巣由来体外成熟卵子

CL＋；黄体あり，n＝29，IVG oocytes, CL－；

（IVM oocytes）を用いた（n＝４）。

４）

黄体なし，n＝32）。

３．結果と考察2 . 2 個体別の胚の生産性の検討
素性が明らかな後継牛を生産するためには，本研究で生産した胚の由来となる個体を明らかにす

黄体の存在した個体は平均9.8か月齢，存在しなかった個体は平均8.8か月齢であった。

る必要がある。そこで，一部の卵巣には個体別に通常サイズの卵子において，黄体あり，黄体な

発育途上卵母細胞を採取し，個体別の胚の生産性

しの両区の初期卵割率に有意な差はなく，一般的を検討した。

な発生率であった（Fig.１A）。黄体あり区は成牛

2.3と同等の一般的な胚盤胞期胚発生率であったが，移植後の胚の受胎性の検討

生産した胚盤胞期胚の一部は，体外受精日と同黄体なし区は黄体あり区に比べて低かった（P＜日の発情が確認された受胚牛の黄体側卵巣の子宮0.05）。黄体なし区の卵子数や胚盤胞期胚への発角に移植し，通常サイズの卵子および発育途上卵

生率は，黄体あり区に比較して実験回次によりバ

母細胞から生産された胚の受胎性を検証した。

ラツキが大きかった。Mullaartら２）らは，性成熟2.4生産された卵子・胚の正常性の検証

後の９～10か月齢の子牛の胚盤胞期への発生率は卵巣摘出子牛の黄体の存在別に採取された卵子

14.6％，１頭あたりの生産胚数が１回あたり平均© The Ito Foundation

228

Embryo Development after IVF

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

（Ａ）

（Ｂ）

（％）

IM oocytes,CL+

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
０

IM oocytes,CL-＊

Cleaved（％）

IVG oocytes,CL+

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
０

Blastocyst formation

IVG oocytes,CL-

CleavedBlastocyst formation

Fig. 1 The effect of the presence or absence of the corpus luteum on development of bovine calf embryos in vitro. In

vitro fertilized embryos were derived from fully grown immature oocytes of approximately 120μm in diameter（IM oocytes）after aspiration（A）or from growing stage oocytes（approximately 100μm in diameter at the timeof collection）after in vitro growth culture and in vitro maturation（IM oocytes）isolated from the same ovary fromcalves with（CL＋） or without corpus luteum（CL－）, respectively（B）. Note that Day 0＝in vitro fertilization（IVF）,Day 2＝cleaved and Day 7-9＝blastocyst formation. ＊ ; Significant difference（P＜0.05, t -test）.

約１個であることを示している。本研究におい100μmの発育途上卵母細胞を採取した。両区とて，性成熟前の個体はMullaartらの報告と同等も体外発育培養が可能であり，初期卵割率およびであったが，性成熟後の個体は胚の発生率および

胚盤胞期胚への発生率は食肉処理場由来の成牛卵

１頭あたりの生産胚数が１回あたり平均約２個で巣の卵胞から採取した卵子と同等であり，個体別あり，大幅に向上することが明らかとなった。この胚生産は可能であることが示された。しかし，れらのことから，直径約120μm卵子は，性成熟操作には５時間の卵巣輸送後に追加して通常卵子に達することにより，性成熟前に比べ，正常な発の採取後の開始となること，個体別の操作には長育が安定的に促されて卵子の発生能が向上する可時間を有することから，一度に多頭数の処理を行能性が示された。

う場合の卵子の生存性の低下に対する検討が必要

２）

発育途上卵母細胞において，黄体あり，黄体なであると考えられる。

しの両区の初期卵割率および胚盤胞期胚発生率に

通常サイズの卵子および発育途上卵母細胞から有意差は認められなかった（Fig.１B）。それぞれ生産された胚盤胞期胚の一部を卵巣摘出農場に新の区の１頭あたりの生産胚数は１回あたり平均

鮮な状態で５時間輸送したのち，受胚牛へ移植

0.5個および1.7個であったが，有意差は認められ

し，それぞれ２頭，計４頭の受胎が得られた。こなかった。これらのことから，発育途上卵母細胞のことから，肥育前子牛から生産された胚は，成は，通常サイズまで発育した卵子が受けた性成熟

牛から生産された胚と同様に受胎性に問題のないによる影響を受ける前の時期に採取されたと考えことが示唆された。今後は，受胎胚からの子牛へられる。黄体なし区の成績は，実験回次により，の生産性の検証や卵子の由来となる卵巣摘出子牛

成績が大きくばらついたが，実験回数が十分ではを特定するための親子鑑定による検証が必要であ

なく，その検証については課題が残った。

ると考えられる。

平均9.5か月齢の６頭のうち３頭は個体別の卵

黄体の存在の有無別に分けた若齢雌牛卵巣由来

巣から，残りの３頭の卵巣からはまとめて直径約卵子（IM oocytes, CL＋；黄体あり，IM oocytes,© The Ito Foundation

肥育前の和牛雌子牛の摘出卵巣からの胚生産に関する研究
3.E+05OPU

1.50E+05

IM oocytes,CL+

mtDNA copies/oocyte

IM oocytes,CL-

mtDNA copies/oocyte

229

1.00E+05

5.00E+04

2.E+05
2.E+05
1.E+055.E+040.E+000.00E+00
OPU

IM oocytes, IM oocytes,
CL+
CL-

Fig. 2 Mitochondrial DNA（mtDNA）copy number in in

vitro matured oocyte analyzed by COX1 gene. The
experimental groups were derived from fully grown
immature oocytes of approximately 120μm in
diameter after aspiration of calf ovaries with orwithout corpus luteum（IM oocytes either CL＋ or
CL－）, respectively. The OPU group represents invitro matured oocytes from cow ovaries obtained
from transvaginal ovum pick-up. No significant
difference was found among groups （P＞0.05,
t -test）.

IVM oocytes

IVG oocytes

Fig. 3 Mitochondrial DNA（mtDNA）copy number ingrowing stage oocyte（approximately 100μm in
diameter at the time of collection）after in vitro
growth culture and in vitro maturation （IVG
oocytes）analyzed by COX1 gene. The IVM grouprepresents in vitro matured oocytes collected fromcow ovaries obtained from a local abattoir（IVMoocytes）. No significant difference was foundbetween the groups（P＞0.05, t -test）.

CL－；黄体なし）間でmtDNAコピー数に有意なる可能性が示唆された。一方，発育途上卵母細胞差は認められず，またOPU卵子とも遜色なかっはその影響を強く受けていない可能性が示唆された（P＞0.05, Fig.２）。さらに，発育途上卵母細胞

た。mtDNAコピー数は，性成熟の影響なく，通を体外発育培養後に体外成熟した卵子のmtDNA

常サイズの卵子，体外発育培養を経た発育途上のコピー数は通常の体外成熟卵子と遜色なかった

卵母細胞ともに成牛と差が認められず正常であっ（Ｐ＞0.05, Fig.３）。これらの結果から，若齢雌子

た。生産胚の一部を受胚牛に移植し，受胎例が得

牛由来の通常サイズの卵子は，黄体の存在にかかられた。今後は，これらの生産胚の子牛への生産

わらず，成牛と同等の正常なmtDNAコピー数を性の検証および親子鑑定の検討を実施する必要が有しており，発育途上の卵母細胞においても，食あると考えられる。

肉処理場由来の成牛と差のない正常なmtDNAコ
ピー数の増幅が検証された。
４．要約

約9.5か月齢の肥育前若齢雌子牛は性成熟前後にかかわらず，通常サイズの卵子および発育途上
卵母細胞から胚生産が可能であるが，通常サイズの卵子は性成熟により，胚の発生能に影響を受け

文献１） Carolan, C., Lonergan, P., Khatir, H., Mermillod, P.
: Mol Reprod Dev, 45, 145～150, 1996.
２） Mulaart, E., Dotinga, F., Flapper, H., van de
Brink, A., Pietersma, N., Schouten, J. : Reprod Fertil
Dev, 27, 209～210, 2015.
３） Matoba, S., Fair, T., Lonergan, P. : Reprod Fertil
Dev, 22, 839～851, 2010.
４） Hirao, Y., Somafai, T., Naruse, K. : J Reprod Dev,
60, 68～72, 2014.

© The Ito Foundation

230

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）５） Hirao, Y., Naruse, K., Kaneda, M., Somfai, T., Iga,
K., Shimizu, M., Akagi, S., Cao, F., Kono, T., Nagai, T.,
Takenouchi, N. : Biol Reprod, 89, 1～11, 2013.
６） Takeda, K., Srirattana, K., Matsukawa, K., Akagi,S., Kaneda, M., Tasai, M., Nirasawa, K., Pinkert, C. A.,
Parnpai, R., Nagai, T. : J Reprod Dev, 58, 323～329,
2012.
７） Matoba, S., Yoshioka, H., Matsuda, H., Sugimura,S., Aikawa, Y., Ohtake, M., Hashiyada, Y., Seta, T.,
Nakagawa, K., Lonergan, P., Imai, K. : J Dairy Sci, 97,
743～753, 2014.
８） Sugimura, S., Akai, T., Somfai, T., Hirayama, M.,
Aikawa, Y., Ohtake, M., Hattori, H., Kobayashi, S.,
Hashiyada, Y., Konishi, K., Imai, K. : Biol Reprod, 83,
970～978, 2010.

© The Ito Foundation

231

牛白血病ウイルス高感染牛の予後の評価
Prognosis evaluation of high-viral-load BLV-infected cattle

目

堅

博

久

（宮崎大学テニュアトラック推進機構）

Hirohisa Mekata（Organization for Promotion of Tenure Track, University of Miyazaki）

Bovine leukemia virus（BLV）infection is widespread in the Japanese livestock industry.
A part of BLV infection progress to fatal lymphosarcoma, named enzootic bovine leukosis（EBL）. One third of BLV-infected cattle with high proviral load cause abnormal immune
function. Therefore, the preventive measure against EBL and BLV-related disorder are
required. The purpose of this study was to clarify the accident risk of BLV-infected cattle andto establish a proviral load criteria of high risk cattle identification. It would help farmers or
veterinarians to decide which cattle should be slaughtered as priority and reduce the incidenceof EBL or economical loss by BLV infection. To clarify the relationship between BLV proviralload and prognosis of infected cattle, quantitative polymerase chain reaction method and online
traceability system were used. We classified BLV-infected cattle into “Breeding”, “Slaughter”
and “Accidental death”, and investigated a correlation between each proviral load andprognosis of classified cattle. The mean proviral load for “Accidental death” was 1109.1
copies/10 ng which was significantly higher than that for both “Breeding” and “Slaughtered”.
The occurrence of accidental death increased depending on BLV proviral load. We establishedthe criteria of high risk and extremely high risk at 735.2 and 1009 copies/10 ng which
specificity and sensitivity were 90 and 53.8％ and 95 and 38.4％，respectively. The diagnostic
outcomes of accidental death with high proviral load were not only EBL but also other diseases
such as gastroenteritis and mastitis. This might be attributed to immune dysfunction caused
by BLV infection, constituting a large part of BLV-related losses. Therefore, early slaughter ofhigh risk animals based on the criteria would effectively reduce loss by BLV infection in a
farm.

１．目

る１）。BLVは北米，南米，アジアなど世界各国で的流行が確認されている２～８）。いっぽう，西ヨーロッ

牛白血病ウイルス（bovine leukemia virus：以

パ諸国やオセアニア地域では感染牛の摘発淘汰に

下，BLV）はレトロウイルス科デルタレトロウ

よって国もしくは地域単位でのBLV清浄化が達

イルス属に分類され，届出伝染病である地方病性成されている ９，10）。日本では全国規模の調査に牛白血病（以下，牛白血病）の原因ウイルスであよって，抗体陽性率が約35％であることや牛白血© The Ito Foundation

232

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

病届出数の増加傾向が報告されているが 11～13），農場や地域単位での自主的な対策の実施にとどまっているのが現状である。

２．方法

2 . 1 農場におけるBLV感染ウイルス量の変動

多くのBLV感染牛は臨床症状をまったく示さ

１農場計30頭の牛を18ヶ月間調査した。第２，ない無症候性キャリアである。約３割の感染牛は３回目の測定は初回の測定から６，18ヶ月後に行

外見上は臨床症状を伴わないものの，恒常的なリい，０ヶ月測定時との相対比で感染ウイルス量のンパ球数の増加を主徴とする持続性リンパ球増多変動を表した。

症となる。約１‒５％の感染牛は感染から数

14，15）

年後に牛白血病を発症する。牛白血病は致死的で

2 . 2 BLV感染牛のスクリーニングと感染ウイ
ルス量の測定あるうえに，と畜場法によって由来産物の食品へ

2013年６月から2015年５月までにBLV感染症の利用が禁止されている。そのため，牛白血病の診断のために宮崎大学産業動物防疫リサーチセン

発症は農家および畜産業に多大な損害をもたらターに提出された血液検体を用いた。すべての血す。また，BLV感染症による損失は牛白血病の液検体は遠心後（1,500ｇ，５分）に血漿分離を発症だけに限らない。これまで，未発症BLV感

行 い ，製 品 の 指 示 書 に 従 っ て enzyme-linked

染牛では経済的な損失はないと考えられてきた

immunosorbent assay（ELISA）法によるBLV感

が，近年になって複数の報告により持続性リンパ染診断を行った（JNC社，東京）。抗BLV抗体陽球増多症や感染ウイルス量の多い牛で免疫細胞の性であった計925検体からWizard Genomic DNA

疲弊化や機能低下が明らかになってきた。

Purification Kit（Promega社，Fitchburg，米国）

BLV感染症は１度の感染が生涯持続するうえに，を用いて製品の指示書に従いゲノムDNAの抽出

牛白血病発症やBLV感染を防ぐワクチンはない。

を行った。抽出したDNAの濃度および純度は分そのため，畜産現場ではBLVへの感染と牛白血

光光度計（N a n o D r o p 8 0 0 0 , T h e r m o F i s h e r病の発症に対する実用的な対策法が求められていScientific社，Waltham，米国）を用いて測定した。

る。

リアルタイムPCR法による感染ウイルス量の測定

16～20）

BLV感染症による損失を最小限に抑えるためは Light Cycler 96 シ ス テ ム（Roche life scienceには，感染牛の事故リスクを把握し，高リスク牛社，Mannheim，ドイツ）を使用した。遺伝子増の更新順序を早めることが有効である。本研究の幅 反 応 は 2x CycleavePCR Reaction Mix を ５μl,

目的は，高リスクBLV感染牛を決定する判断基

Probe/Primer Mix for BLVを0.2μl（タカラバイ

準を確立し，農場における牛白血病を含めたBLV

オ社，大津），抽出したゲノムDNAを20ngに超純感染症による損失を未然に防ぐことである。同じ

水を加えて全量10μlで行った。検量線は増幅対デルタレトロウイルス属であるヒトの成人Ｔ細胞

象遺伝子を組み込んだ既知濃度のプラスミドを10

白 血 病 ウ イ ル ス （human T-cell lymphotropic

倍段階希釈して作成した。すべての反応は重複しvirus type 1：以下，HTLV-1）感染症では，高て行い，10ngゲノムDNA中のBLVコピー数で感

プロウイルス量が成人T細胞白血病発症のバイオ

染ウイルス量を表した。

マーカーであることが知られている。本研究

21～23）

では，BLV感染ウイルス量と感染牛の予後との相関から更新の判断基準を確立する。

2 . 3 BLV感染牛の状態
2015年12月～2016年１月，牛の個体識別番号および個体識別情報検索サービス（https://www.

© The Ito Foundation

233

牛白血病ウイルス高感染牛の予後の評価

id.nlbc.go.jp/top.html）を用いて感染ウイルス量

ルス量が４倍以上減少した。これは，最初の測定を測定した牛の状態を特定し，牛を“飼養中”，が急性期であったと想定される。このことから，“と畜”，“死亡”に分類した。
“飼養中”は検索時

感染ウイルス量の決定は半年から１年の間隔をあに農場で飼養中の牛を，“と畜”は検索時にすでけた２度の測定が必要であることが示唆される。

にと畜された牛を，“死亡”は検索時にすでに農次いで，感染ウイルス量と予後との相関を解析

場で死亡した牛を意味する。個体識別情報検索

した。計925頭のBLV感染牛のうち，573頭は“飼サービスから使用する情報は最小限にとどめ，特養中”であり，305頭は“と畜”，26頭は“死亡”に農家の個人情報については一切使用しなかった。

であった。また，21頭は個体識別番号が未登録で

2 . 4 統計解析
一元配置分散分析法，Turkey法，Dunnett法

Table 1 Kinetics of BLV proviral load during 18 months

study

お よ び 受 信 者 動 作 （ROC） 曲 線 は GraphPad
Prismソフト（バーション6.0）を用いて解析および作成した。P＜0.05を有意差ありとした。
３．結果と考察

Proviral load kinetics

6 months

within 2-fold
2 to 4-foldDecreased more than 4-foldIncreased more than 4-fold

66.6％（20/30） 43.3％（13/30）
16.6％（5/30） 36.6％（11/30）
13.3％（4/30） 13.3％（4/30）
3.3％（1/30） 6.6％（2/30）

感染実験においてBLV感染ウイルス量は急性報告されている 。そこで本研究では，はじめに
24）

農場における感染ウイルス量の変動を確かめた。
第１回目の測定から６ヶ月後，66.6％（20/30）の牛の感染ウイルス量の変動幅が２倍以内，

Proviral load
（copies/10ng）期に増加後，減少し，慢性期では安定することが1500の牛の感染ウイルス量の変動幅が２倍以内，

**

1000

500

0

83.3％（25/30）が４倍以内であった（Table１）。
第１回目の測定から18ヶ月後，43.3％（13/30）

18 months

Breeding

Slaughter Accidental deathFig. 1 Average proviral load of the group of breeding,slaughter, and accidental death.

80.0％（24/30）が４倍以内であった。以上から，

Average proviral load of the group of breeding, slaughter,

80％以上の牛の感染ウイルス量の変動幅がフィー

copies/10ng. The error bars indicate standard error ofand accidental death were 247.4, 295.4, and 1109.1

ルドにおいて18ヶ月間経過しても４倍以内に収まthe mean. Double asterisks indicate that p-value between

ることが明らかになった。また，４頭の感染ウイ

death were less than 0.01.

breeding vs. accidental death and slaughter vs. accidental

Table 2 Detail information about BLV-infected cattle
Breeding
Number of cattle
573
Average proviral load（copies/10ng）
247.4
Maximum proviral load（copies/10ng）
5774.0
Proportion of less than 4.0 copies/10ng（％） 33.8
Age（month）
78.8＊
Age of BLV inspection（month）

62.0

Slaughter

Accidental death

305
295.4
1752.611.8

261109.15122.2
11.5

80.8
71.8

66.0
61.0

＊The age when confirmation of breeding using online traceability system© The Ito Foundation

234

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

これは，高リスク群（735.2copies/10ng）およびRate of accidental death

0.25

**

0.20

超高リスク群（1009copies/10ng）の優先的な更新によって，効率的に事故死を防ぐことができる

**

0.15

可能性を示している。

*

0.10

死亡群のうち，診断名が明らかになった18頭の

0.05
0.00

診断結果をTable３に記載した。高ウイルス感染
Total＞516.4＞735.2＞1009（copies/10ng）
Fig. 2 The correlation between proviral load and rate ofaccidental death.

牛における死因は牛白血病が最も多かったが，胃腸炎や乳房炎など他の診断結果も含まれていた。
この結果は，一部の牛白血病は他の疾病によってAccidental death rate of total, more than 516.4, 735.2, and見逃されているか，考えられているより牛白血病

1009 copies/10ng were 2.8, 8.9, 13.9, and 20.0％. Single andが多様な病態を示す可能性を示している。

double asterisks indicate that p-value between the groupof total were less than 0.05 and 0.01.

以前に報告された論文では食肉衛生検査所において，牛白血病の65.6％，BLV感染未発症牛のあったために解析から除外した。“飼養中”，“と10.8％の末梢血中で感染ウイルス量が1000copies/

畜”，“死亡”の感染ウイルス量はそれぞれ247.4，

10ngを超えていたことが報告されている25）。この

295.4，1109.1copies/10ngであり，“死亡”ではそ

報告は，735.2もしくは1009copies/10ngが農場にれ以外と比べて有意に高い値であった（Fig.１，

おける高リスクの境界値であるという本研究の結Table２）。飼育中の牛の中には明らかに感染ウイ

果を支持するものである。発がんウイルスでは感ルス量が多い個体が存在していた。今後，こう染期間が重要な発症のリスク因子であることが分いった牛がと畜まで順調に飼育を続けられるのかかっている 21，22，26～29）。HTLV-1やHIVなどのヒト注視する必要がある。感染ウイルス量と死亡率との感染症では，感染者の行動の振り返りによっての相関を解析したところ，感染ウイルス量の増加

感染時期を特定することが可能である。しかし，に伴い，死亡率の増加が認められた。更新する牛

BLV感染症では感染経路が多岐にわたること，の選択に用いる基準値を作成するため，死亡群と感染牛による振り返りが不可能なことから，感染

それ以外の群との間でROC曲線を作成した。特時期を特定することは難しい。

異度を80，90，95％に設定すると，感度はそれぞ

本 研 究 で は ，735.2 も し く は 1009BLV copies/

れ 65.3 ，53.8 ，38.4 ％ で あ り ，基 準 値 は 516.4 ，10ngがBLV感染症において，死亡リスクの基準

735.2，1009copies/10ngとなった。また，それぞとなること，基準値以上の感染ウイルス量を持つれの死亡率は8.9，13.9，20.0％であった（Fig.2）。

牛を優先的に更新することが，牛白血病とBLV

Table 3 Diagnosed disorder list of accidental death in this study
Proviral load

Risk classification

Diagnosed disorder (number）＞1009
735.2-1009
516.4-735.2

Extremely high-riskHigh-risk
Slightly high-risk＜516.4

Low-riskEBL（3）, rumen impaction, gastroenteritis, mastitis（1）EBL, gastroenteritis, heart failure（1）EBL, mastitis, gastroenteritis（1）EBL, acute inflammatory response, gastroenteritis,
pueperal fever, heart failure（1）© The Ito Foundation

牛白血病ウイルス高感染牛の予後の評価

235関連疾患による損失を減らすことにつながること症による免疫機能の低下が無視できるものでないを明らかにした。著者らは感染ウイルス量の多いこと，BLV感染症による損失は牛白血病に限ら牛が農場における水平および垂直伝播の感染源とない可能性を示唆している。著者らはこれまでになることをすでに報告している。そのため，

感染ウイルス量の多い牛が農場における感染源と感染ウイルス量の多い牛の優先的な更新が農場でなることを報告している。それゆえ，本研究で定の事故および感染を防ぐことが分かった。

めた基準値を使った感染牛の早期更新が牛白血病

４．要30～32）

ウイルス感染症に伴う損失と感染の効率的な制御

約につながると考える。

日本では，近年，牛白血病ウイルスの感染が急速に拡大している。一部の感染牛は地方病性牛白血病と呼ばれる致死的なリンパ肉腫を発症する。
約３分の１を占める高ウイルス感染牛は免疫機能の低下を伴うことが示唆されている。そのため，
牛白血病の発症および牛白血病ウイルス感染対策の確立が求められている。本研究の目的は牛白血病ウイルス感染牛の事故リスクを明らかにし，高リスク群を判断する基準値を設けることである。
これによって，農家や臨床獣医師がどの感染牛を優先的に淘汰更新すべきかの判断材料となり，牛白血病やBLV感染症による経済的損失の減少につながる。本研究では，感染ウイルス量とBLV
感染牛の予後を明らかにするため，リアルタイム
PCR法および個体識別番号による検索システムを利用した。感染ウイルス量を測定した牛を“飼養中”，“と畜”，“死亡”に分類し，感染ウイルス量との相関を解析した。
“飼養中”
，
“と畜”
，
“死亡”
の平均感染ウイルス量はそれぞれ247.4，295.4，
1109.1copies/10ngであり，“死亡”はそれ以外と比較して有意に高い値であった。また，感染ウイ
ルス量の増加に伴い，死亡率が増加するため，高リスク群を判断する基準値を設けた。735.2および1009copies/10ngに基準値を設けると，特異度はそれぞれ90％，95％であり，感度は53.8％，
38.4％であった。感染ウイルス量の多い牛の死因を調べると，牛白血病だけでなく，乳房炎や胃腸炎も認められた。これは，牛白血病ウイルス感染

文献１） Barez, P. Y., et al. : Viruses, 7, 6080～6088, 2015.
２） Trono, K. G., et al. : Vet. Microbiol., 83, 235～248,
2001.
３） Gutiérrez, G., et al. : Vet. Microbiol., 151, 255～
263, 2011.
４） Erskine, R. J., et al. : J. Dairy Sci., 95, 727～734,
2012.
５） Bartlett, P. C., et al. : J. Dairy Sci., 96, 1591～1597,
2013.
６） Nekouei, O., et al. : Prev. Vet. Med., 119, 105～113,2015.
７） Lee, E., et al. : Virol. J., 12, 64, 2015.
８） Yang, Y., et al. : J. Dairy Sci., in press.
９） Nuotio, L., et al. : Prev. Vet. Med., 59, 43～49,
2003.
10） Maresca, C., et al. : Prev. Vet. Med., 119, 222～226,2015.
11） Murakami, K., et al. : J. Vet. Med. Sci., 75, 1123～
1126, 2013.
12） Murakami, K., et al. : Vet. Microbiol., 148, 84～88,2011.
13） 農林水産省ホームページ，届出伝染病発生状況の累 年 比 較 ， http://www.maff.go.jp/j/syouan/douei/
kansi_densen/pdf/h27_todokede_ruinen.pdf
14） Gillet, N., et al. : Retrovirology, 4, 18, 2007.
15） Lairmore, M. D. : Annu. Rev. Anim. Biosci., 2,
189～208, 2014.
16） Ikebuchi, R., et al. : Vet. Res., 42, 103, 2011.
17） Libera Della, A. M., et al. : Vet. Res., 46, 2, 2015.
18） Frie, M. C., Coussens, P. M. : Vet. Immunol.
Immunopathol. 163, 1～12, 2014.
19） Okagawa, T., et al. : Vet. Res., 43, 45, 2012.
20） Suzuki, S., et al. : Microbiol. Immunol., 57, 600～
604, 2013.
21） Iwanaga, M., et al. : Blood, 116, 1211～1219, 2010.
22） Kira, J., et al. : Ann. Neurol., 29, 194～201, 1991.
23） Paiva, A., Casseb, J. : Rev. Soc. Bras. Med. Trop.,47, 265～274, 2014.
24） Gillet, N. A., et al. : PLoS Pathog., 9, e1003687,
2013.

© The Ito Foundation

236

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）25） Somura, Y., et al. : Arch. Virol., 159, 2693～2697,
2014.
26） Mellors, J. W., et al. : Ann. Intern. Med., 126, 946～954, 1997.
27） Rodriguez, B., et al. : JAMA, 296, 1498～1506,
2006.
28） Ogg, G. S., et al. : Science, 279, 2103～2106, 1998.

29） OʼBrien, T. R., et al. : JAMA, 276, 105～110, 1996.
30） Mekata, H., et al. : Vet. Rec., 176, 254～254, 2015.
31） Mekata, H., et al. ： J. Vet. Med. Sci., 77, 1115～
1120, 2015.
32） 目堅博久：公益法人伊藤記念財団平成26年度食肉
に 関 す る 助 成 研 究 調 査 成 果 報 告 書 ，33, 179～183,
2015.

© The Ito Foundation

237

鶏糞由来バイオセラミックによるウイルスの伝播抑制
Inhibition of transmission of viruses using bioceramic derived fromchicken feces

竹

原

一

明

（東京農工大学大学院農学研究）

Kazuaki Takehara（Institute of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

Bioceramic derived from chicken feces（BCX）is a material produced by sintering process,purposed for using in animal farms, in order to control livestock infectious diseases. BCX had
been shown to have virucidal activities toward avian influenza virus（AIV）and avian
adenovirus（AAV）.It could also inactivate infectious bursal disease virus（IBDV）within 3 min
and could inhibit transmission of IBDV to the sentinel chicks.
In the present study, BCX at pH 13 was evaluated for the durability of its virucidal
activity in simulated field conditions. First it was shown that BCX had the activity toward
Newcastle disease virus（NDV）,IBDV and goose parvovirus（GPV）within 3 min, while toward
AIV within 1 hr. BCX was further tested by keeping it under simulated harsh environmental
conditions with sunlight for several weeks, as well as by soaking it with water and drying
under sunlight repeatedly many times. After sampling every 2 consecutive weeks and 2
consecutive resuspensions, BCX was evaluated for its efficacy against AIV. Evaluation under
the harsh conditions illustrated that BCX could retain its satisfactory efficacy toward
AIV throughout 7 weeks or 9 resuspensions. It is hence concluded that BCX is an excellent
material for applying in livestock farming as trapping disinfectant due to its efficacy toinactivate various viruses, and that this efficacy prolongs under harsh environmental conditions.
Further, BCX was applied to bedding materials for chicks to completely inhibittransmission of IBDV, however, it could not completely inhibit transmission of IBDV to thecage mates. When bedding materials contaminated with IBDV in feces, long exposure period（6hr）after mix with BCX and the bedding materials was required for inactivation of IBDV.

１．目症の防除が重要となってきている。また，環太平

的

洋戦略的経済連携協定（TPP）や欧州農業生産

サルモネラや病原性大腸菌O157等による食中工程管理（Global G.A.P.）など，国際化の進展と毒の発生，口蹄疫（FMD）・高病原性鳥インフルも相まって，食品の生産現場における安全性と品

エンザ（HPAI），豚流行性下痢（PED）等によ

質の確保，さらに生産性の向上は，わが国畜産にる家畜感染症の発生など，食の安全性確保と感染とって必須である。農林水産省は，2009年に「畜© The Ito Foundation

238

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

産現場における飼養衛生管理向上の取組（農場
HACCP）認 証 基 準」を 公 表 し ，2018 年 ま で に500戸の農場に農場HACCP認証を取得させる目に期待される。
２．方法

標を立てた１）。一方，近年の家畜の能力の限界を

2 . 1 各種ウイルスに対する不活化効果

超えた発育と生産から，乳房炎や日和見感染症

BCXは，NMG環境開発株式会社（東京都）が等，様々な病気が「生産病」として出現しておバイオセラミック製造装置を用いて，製造した。

り，罹患率を低減化させる必要があるが，畜産の粉体の10％上清は，pH13.0だった。まず，様々な現場では，搾乳牛の潜在性乳房炎の罹患率は50％

ウイルス性家きん病原体に対するBCXの殺ウイにも達し，対応に苦慮している。さらに，上に掲

ルス効果を調べた。エンベロープを有するウイル

げたこれらの感染症はワクチンでの予防が困難なス と し て ，鳥 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス（AIV

病原体を原因としており，ワクチン以外による防

５）
H7N1）
およびニューカッスル病ウイルス

御戦略が必要とされている。現状では，前述の農６）（NDV-Sato, NDV-Ishii），エンベロープを持た

場HACCPにおいても，具体的な消毒剤や消毒のず，比較的消毒薬に対して抵抗性である伝染性

やり方は細かく規定されておらず，バイオセキュ

ファブリキウス嚢病ウイルス（IBDV-D78：ワク

リティの強化については具体的な手法が示されてチン株＜株式会社インターベット＞）
，同様にエ

いない。

ンベロープを持たず，非常に消毒薬や理化学的処

本研究は，鶏糞を還元焼結処理して得られるバ

理に抵抗性を示すガチョウパルボウイルス

イオセラミック（BCX）の３つの特徴，すなわ（GPV-IHC）７）を用いた。各ウイルスとBCXとをち，ａ）短期間（３分以内）に病原体を元の量の混合後，室温（25℃）で３分間あるいは１時間感

1000分の１以下に殺滅できる殺微生物効果 ，ｂ）

作させ，維持培地で残存ウイルスを抽出し，遠心餌として家畜・家禽に給与できる ，ｃ）敷料に後，上清を10倍階段希釈し，適宜，感受性細胞で混合して家畜や家禽を飼養できる性状，を利あ る MDCK 細 胞 （AIV） や 鶏 胚 線 維 芽 細 胞

用して，１）農場内への病原体の侵入を阻止，２）（NDV, IBDV）において，50％組織培養感染量

農場内の病原体の伝播・まん延防止，の２点に関（TCID50/ml）としてウイルス力価測定を行った。

２）

３）

２，３）

する実験室内での基礎研究を行い，BCXの家畜

2.2

農場での応用に寄与することを目的としている。

畜産農場での待ち受け消毒を考慮し，直射日光

これまでの多くの消毒薬は，有機物存在下で効下にBCXを曝し，あるいは，雨を想定して水で果が著しく減弱 し，家畜に投与した場合，一定

濡らして乾燥させ，定期的にBCXを回収して，期間の畜産物の出荷が制限されることから，採卵殺ウイルス効果の持続性を調べた。通常の農場で鶏や乳牛においては，使用に制限があった。今回の散布（約500ｇ/㎡）を想定し，90㎜プラスチッのBCXは，有機物存在下で効果が維持され，さクシャーレに3.0ｇのBCXを入れ，ふたをせずに，らに，「ひなの成長試験」で体重に影響が認めら

日中のみ屋外に設置した。なお，雨天の場合は屋れなかったことから，農林水産省からも「飼外には出さず，日付のカウントを行わなかった。

料」（家保衛飼538号）として認可されており，使雨 天 を 模 倣 し た 実 験 で は ，90 ㎜ プ ラ ス チ ッ ク

用にあたり，通常の消毒薬とは異なり出荷制限期

シャーレに3.0ｇのBCXを入れ，水道水を10ml加間を設ける必要はなく，畜産現場での利用が大い

えた後，直射日光下で乾燥させた。

４）

３）© The Ito Foundation

BCXの待ち受け消毒としての持続性

239

鶏糞由来バイオセラミックによるウイルスの伝播抑制
Table 1 Inactivation efficacy of BCX towards poultry viruses at 3 min of incubation period（Mean±SD）.
Viruses

Virus titer（Log10TCID50/ml）

RF

TreatedControl

NDV-Sato＜＿ 2.5±0.00

8.50±0.25＞＿ 6.00±0.25

NDV-Ishii＜＿2.5±0.00

7.92±0.52＞＿ 5.42±0.52

IBDV-D78＿ 2.5±0.00＜

6.83±0.14＞＿ 4.33±0.14

GPV-IHC＜＿ 2.5±0.00

6.92±0.38＞＿ 4.42±0.38

AIVH7N１8.58±0.14

8.58±0.14

0.00

Viruses were incubated with BCX for 3 min, and the remaining virus titers were shown as log10TCID50/ml（Mean±SD）. Detection
limits of viruses were 2.5log10TCID50/ml.
Untreated viruses kept at room temperature for 3 min were titrated as controls.
RF : Reduction factor.
When incubation period for AIV was extended to 1 hr, the titer became under detection limit（2.5log10TCID50/ml）and the RF was
calculatedas＞＿ 6.08±0.14．

2 . 3 BCXを用いたIBDVの伝播抑制試験

カリ環境下でも得られており，AIVの不活化には，さ ら に ，鶏 飼 育 用 の 敷 料 に BCX を 混 合 し ，

強アルカリの下，１時間の感作を要した１）。

IBDV感染鶏ひなと未感染ひなを同居させ，ウイ

3 . 2 そこで，待ち受け消毒用のBCXの殺ウイ

ルスの伝播を逆転写－PCR（RT-PCR）法と血清

ルス効果の持続性の判定には，AIVを用いのウイルス中和試験を用いて調べた。

ることとした。
直射日光下に置いた１週後から毎週のBCXの３．結果と考察3.1

AIV不活化効果は，Fig.１に示した。直射日光下

各種ウイルスとBCXとを混合３分後に維に曝した３週後では，１週間処理と比較してRF持培地で回収し，力価測定した。結果をTable１

値は有意に低下したが，実験終了の７週後まで殺に示す。NDV，IBDVおよびGPVは，３分間の感

ウイルス効果が有効であるRF＝3.0以上を示した。

作により，ウイルスは検出限界未満となり，未処

雨天を模倣した試験では，Fig.２に示すように，

理対照ウイルスの力価と処理ウイルスの力価の比

水濡れと乾燥を９回繰り返しても，RFの低下は（減少指数：RF）は，いずれも殺ウイルス効果を認められず，4.0以上を維持した。なお，各乾燥

示す3.0よりも大きかった。しかし，AIVは，３後のpHをFig.３に示す。BCXのpHは，５回後で分間感作では力価の低下は認められなかった。感11.5と低下し，６回後以降は11.0にまで下がった

作時間を１時間に延長したところ，検出限界未満

が，RFの低下は認められなかった。高pHが不活となり，RFは３よりも大きかった。通常，GPV化能に直接結びついているのではないことが推察

やIBDVは，消毒薬や理化学的な処理に対しては，された。

著しい抵抗性を示すが，強アルカリに対しては，

3.3

弱いことが明らかとなった。それに対し，一般的

SPF鶏ひなに，IBDVを感染させたのち，未感な消毒薬で容易に不活化されるAIVは，アルカリ

染ひな（おとりひな）を１週間同居させたとこには抵抗性を示し，３分間の感作では，なんら力

ろ，各群３羽のおとり中，１羽はRT-PCRで陽性，価は低下しなかった。同様の結果は，鶏卵卵殻由中和抗体も陽性となり，完全な伝播抑制はできな

来焼成カルシウム（Egg-CaO）を用いた強アルかった。3 . 1で，IBDVが３分間感作で不活化さ© The Ito Foundation

IBDVの伝播抑制試験

240

平成27年度７RF

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）
13.5

*

６

13.0

５

12.5

４

12.0

pH

11.5

３

11.0

２

10.5

１
０

10.0
０

２

１

３

４

５

６

７

８

Weeks
Fig. 1 Reduction factor（RF）against AIV of BCX kept

under sunlight（mean±SD）. Three gram of BCX
was measured in a 90 mm petri dish for 3 dishes.
Sampling was carried out every 2 consecutive
weeks, altogether 7 weeks, from each dish,separately. The evaluation was carried out using
100 mg of the collected BCX samples mixed with 50
μl of AIV by incubating at room temperature for 1
hr. RF illustrated higher than 3 from 1-7 weeks.
The RF reduced significantly from 1st and 3rd
weeks（P＜0.05）.

０

１

2

3

4

5

6

7

8

9

Times of resuspension
Fig. 3 pH of BCX collected after resuspension with tap

water for 9 times. Initial pH was 13 at firstresuspension, and then decreased to be 12.5 at 2-4
resuspensions. The pH decreased steeply down to
11 on the 6th suspension, and retained this level
during all further resuspensions.

れていることは明らかだが（Table１），糞便中の
IBDVの不活化を試みたところ，６時間を要することが明らかとなった。この値は，以前，in vivo
で得られたIBDV汚染鶏糞ケージの不活化に要し

６た時間２）と同じだった。すなわち，大量の有機物

５存在下では，殺ウイルス効果を発揮するまでに，

４

時間を要することが分かった。
BCXは，これまで調べられてきたように，有RF ３機物存在下においても殺ウイルス効果を発揮し，

２

野外散布後，比較的長期間，殺ウイルスを保つこ

１０とが明らかとなった。これは，待ち受け消毒資材
０

１

２

３

４

５

６

７

８

９

10

として，適すると考えられた。なお，動物飼養下での利用の場合，糞便など大量の有機物が存在す

Times of resuspension
Fig. 2 Reduction factor （RF） against AIV of BCX

collected after resuspension with tap water（mean±SD）. Three gram of BCX was measured in a 90mm petri dish for 3 dishes. The dishes were
subjected for making suspension with 10 ml of tap
water, and dried under sunlight. Sampling was
carried out every 2 consecutive resuspensions,altogether 9 resuspensions, from each dish,separately. The evaluation was carried out using
100 mg of the collected BCX samples mixed with 50
μl of AIV by incubating at room temperature for 1
hr. RF illustrated higher than 3 throughout theexperimental period.

ることから，殺ウイルス効果は短時間では発揮が困難で，完全な伝播抑制は難しいことが懸念された。しかし，時間の経過とともにウイルスは不活化されており，長期にわたり使用することで，畜産農場内の病原体を徐々に低減できると期待された。
なお，本研究での成果の一部は，「Virucidal
properties of bioceramic derived from chicken
feces pH 13 and its stability in harsh© The Ito Foundation

鶏糞由来バイオセラミックによるウイルスの伝播抑制

environments」と し て ，Avian Diseases に ア ク
セプトされた 。
８）

４．要

約

鶏糞を還元焼結処理して得られるBCX（pH13.0）
は，NDVのみならず，消毒薬に対して比較的抵抗性を示すウイルス（IBDVおよびGPV）に対しても，３分間という短時間で殺ウイルス効果を発揮した。AIVの不活化に際しては，１時間の感作が必要だった。また，屋外環境下でもその殺ウイ
ルス効果の持続性から，BCXは畜産農場での畜舎・鶏舎周辺での待ち受け消毒として利用できると考えられた。なお，敷料への応用では，ある程度効果が認められるが，糞便などの有機物が大量に存在する場合，ウイルスの不活化には時間がかかることから，完全な伝播抑制よりは，BCXを用いることで，徐々に，農場内の病原体が低減していくことが期待された。

241

文
献
１） O t a , M . , T o y o f u k u , C . , T h a m m a k a r n , C . ,Sangsriratanakul, N., Yamada, M., Nakajima, K.,
Kitazawa, M., Hakim, H., Alam, M. S., Shoham, D.,
Takehara, K. : JVet Med Sci, 78, 831～836, 2016.
２） Thammakarn, C., Ishida, Y., Suguro, A., Hakim, H.,
Nakajima, K., Kitazawa, M., Takehara, K. : Virus Res,
204, 6～12, 2015.
３） Takehara, K., Chinen, O., Jahangir, A., Miyoshi, Y.,
Ueno, Y., Ueda, S., Takada, Y., Ruenphet, S., Mutoh,
K., Okamura, M., Nakamura, M. : Avian Dis, 53, 34～
38, 2009.
４） Hakim, H., Thammakarn, C., Suguro, A., Ishida, Y.,
Kawamura, A., Tamura, M., Satoh, K., Tsujimura, M.,
Hasegawa, T., Takehara, K. : J. Vet. Med. Sci., 77,
211～215, 2015.
５） Jahangir, A., Ruenphet, S., Shoham, D., Okamura,M., Nakamaura, M., Takehara, K. : Virus Genes, 40,
94～105, 2010.
６） Takehara, K., Shinomiya, T., Kobayashi, H.,
Azuma, Y., Yamagami, T., Yoshimura, M. : Avian
Dis, 31, 125～129, 1987.
７） Takehara, K., Hyakutake, K., Imamura, T.,
Mutoh, K., Yoshimura, M. : Avian Dis, 38, 810～815,
1994.
８） Thammakarn, C., Sangsriratanakul, N., Ishida, Y.,
Suguro, A., Yamada, M., Toyofuku, C., Nakajima, K.,
Kitazawa, M., Ota, M., Hakim, H., Alam, M. S.,,
Shoham, D., Takehara, K. : Avian Dis, in press, 2016.

© The Ito Foundation

242

シカ肉に寄生する住肉胞子虫の形態学的・分子生物学的同定ならびに腸管毒性評価
Morphological and molecular identification, and evaluation ofenterotoxicity of Sarcocystis spp. isolated from muscular tissue of sika deer

松

田

一

哉・平

田

晴

之・臼

井

優

（酪農学園大学獣医学群獣医学類）

Kazuya Matsuda, Haruyuki Hirata and Masaru Usui
（Department of Veterinary Medicine, School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University）

Deer meat has become popular food with an increase in the number of hunted animals as
the number of wild sika deer increased and their habitat range expanded. Sika deer（Cervus
nippon）is known to be infected by Sarcocystis sp. with a high probability and Sarcocystis sp. in
the sika deer is considered to have diarrheal toxin similar to those in Sarcocystis fayeri in horse
meat. For the progression of study on Sarcocystis sp. and their toxin from sika deer, the species
identification of the Sarcocystis sp. is absolutely necessary. In this study, we purposed thespecies identification of Sarcocystis sp. by uniting the morphological characteristics and genetic
information. By the morphological examinations using light, transmission and scanning electron
microscopes, morphological characteristics of three species of Sarcocystis sp. were clarified.
Sarcocyst type A was large ellipsoid cysts with thick cyst wall composed of thick finger-like
protrusions which had broad base and slightly curved distal segment with jagged surface andelectron-dense granules. Sarcocyst type B was slender spindle-shaped cysts with thick cyst
wall composed of tightly-packed, thin, finger-like protrusions. Sarcocyst type C was slender
spindle-shaped cysts with thin cyst wall composed of filamentous, thread-like protrusions
which were compressed by the cytoplasm of the host cells. These results revealed themorphological resemblance to those in red deer（Cervus elaphus）. It is necessary that we pushforward with the molecular research, exactly identify the species of Sarcocystis sp. in sika deer
by combining morphological and molecular data, and evaluate the toxicity of each species.

１．目

頭数を適正に保つための個体数調整が進められ，的同時に，シカ肉を食肉資源として有効活用する動近年，ニホンジカの生息頭数増加と生息域拡大

きが進められている。かつて野生鳥獣はジビエとによって，農作物や森林の食害による経済的損称されて高級食材とされていたが，食肉利用を目

失，生態系への影響，交通事故発生などの深刻な的とした捕獲頭数増加に伴い，より一般的な食材問題が起きている。こうした状況に対して，生息として消費が拡大する社会的動向がある。

© The Ito Foundation

シカ肉に寄生する住肉胞子虫の形態学的・分子生物学的同定ならびに腸管毒性評価

243

住肉胞子虫（Sarcocystis）は草食獣を中間宿

ゾシカ肉は国内で最もシカ肉としての利用が進ん

主，肉食獣を終宿主とする生活環をとるコクシジでいる。本研究はエゾシカ肉を使用して実施した。

ウム属の原虫であり，現在までに200近い種が報2 . 1 . 1 住肉胞子虫シストの光学顕微鏡による告されている。シカは中間宿主として感染し，筋観察

組織内にシストが形成されるが，ニホンジカにお食肉利用のために解体処理されたエゾシカからける住肉胞子虫の感染率は牛や馬などの他の家畜採取した食道筋層の冷蔵保存サンプルもしくは凍と比較して極めて高いことが知られている。さら結保存後解凍したサンプルを用いた。筋組織からに，一定量の筋組織に存在する住肉胞子虫シスト

実体顕微鏡下でシストを摘出し，光学顕微鏡で観の数は，ニホンジカでは牛や豚，羊に比べて著し察した。

く多いことも報告されている。ニホンジカの筋組

2 . 1 . 2 住肉胞子虫シストの走査型顕微鏡によ

織に寄生する住肉胞子虫について，日本国内の研る観察究グループによって計５種の寄生が報告されてい実体顕微鏡下において，エゾシカ食道筋層からるが，形態学的特徴と遺伝子情報とが統合的に解住肉胞子虫シストを摘出し，表面に付着する筋線

析されていないために，種の同定が不確定な状況

維を丁寧に除去した。2.5％グルタールアルデヒ

である。また，シカ寄生種のヒトへの感染の可能

ド溶液および１％オスミウム酸溶液で固定後，性は不明であるが，現在，住肉胞子虫は食中毒の１％タンニン酸溶液による導電染色を実施した。

原因として重要視されている。馬刺し（生食用馬

凍結乾燥ならびに白金蒸着の後，走査型電子顕微肉）の摂食による食中毒の原因調査の結果，馬寄

鏡で観察した。

生種Sarcocystis fayeriの約15kDの構造タンパク2 . 1 . 3 住肉胞子虫シストの透過型顕微鏡によが下痢原性毒素として同定され，同じタンパクがシカ寄生種にも存在することが示されており，生食による食中毒が危惧されている。

る観察
エゾシカ食道筋層組織からシストを含む組織片を切り出し，2.5％グルタールアルデヒド溶液にこのように，シカ肉の食材としての利用が広くよる前固定ならびに１％オスミウム酸溶液による進められる一方，シカ肉には食中毒の原因として後固定を行った。次に，組織片を樹脂ブロック中指摘される住肉胞子虫が極めて高率に感染していに包埋した。超薄切片を作製後，EMステイナーる。これらの状況を受け，本研究ではニホンジカ

およびクエン酸鉛による電子染色を実施し，透過に寄生する住肉胞子虫について形態学的特徴と遺型電子顕微鏡で観察した。

伝子情報を統合的に解析することにより種を同定2.1.4すること，さらに，各種についての腸管毒性を評

エゾシカ食道筋組織を切り出した後，４％ホル価することを目的とした。

住肉胞子虫シストの組織学的観察

ムアルデヒド溶液で固定し，パラフィン包埋ブ
ロックを作製した。組織切片を作製後，ヘマトキ

２．材料と方法

シリン・エオジン染色を実施し，光学顕微鏡で観2 . 1 シカ肉に寄生する住肉胞子虫の形態学的観察察した。
2 . 2 シカ肉に寄生する住肉胞子虫の分子生物

エゾシカ（Cervus nippon yezoensis）はニホン
ジカ（Cervus nippon）の北海道亜種であり，エ

学的検索
実体顕微鏡下でエゾシカ食道筋組織から住肉胞© The Ito Foundation

244

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

子虫シストを摘出し，－30℃で保存して凍結サン

であり，シスト壁は厚く，太指状の表面突起が認プルとした。凍結サンプルを融解後，DNAを抽められた（Fig.１A）。摘出したシストは大型で太出し住肉胞子虫の18s rRNAをコードする領域のく，先端がやや鈍な形態であることが確認された

PCRを実施した。PCRに用いたプライマーならび（長さ1176～2799μm，太さ219～558μm）（Fig.１B）。

２）に条件はDahlgren and Gjerde ならびにPrittら

透過型電子顕微鏡による観察により，シスト壁のの方法を参考に設定した。次に，得られたPCR産

表面突起はシスト表面から直立し，基部側は幅広物のダイレクトシークエンスを実施した。

く（約４μm），先端にかけて軽度の湾曲が認め

１）

られ，先端部は粗造で内部に電子密度の高い粒子

３．結果と考察状物が観察された（Fig.１C）。走査型電子顕微鏡

3 . 1 シカ肉に寄生する住肉胞子虫シストの形による観察で，表面突起はシスト全周に密に存在することが明らかとなった（Fig.１D）。

態学的特徴
食道筋層組織の組織学的検索の結果，形態学的シストＢは組織学的に筋線維３，４本程度の太さに識別される４種類の住肉胞子虫のシストが確認のシストであり，シスト壁は厚く，細指状の表面された。以下，シストＡ～Ｄとしてその形態学的突起が認められた（Fig.２A）。摘出したシストは特徴を示す。シストＡは組織学的に大型のシスト

細長く，先端が鋭な形態であることが確認されたFig. 1 Morphology of the Sarcocyst type A from Hokkaido sika deer（Cervus nippon yesoensis）. A. A large sarcocyst in

the muscular layer of the esophagus. The cyst wall is thick with thick finger-like protrusions. Histological sections
stained with hematoxylin and eosin. B. A large ellipsoid cyst. Light microscopy. C. The protrusions have broadbase and slightly curved distal segment with jagged surface and electron-dense granules. Transmission electron
microscopy. D. The cyst surface is diffusely covered with the protrusions. Scanning electron microscopy.

© The Ito Foundation

シカ肉に寄生する住肉胞子虫の形態学的・分子生物学的同定ならびに腸管毒性評価245（長さ705～1272μm，太さ73～165μm）（Fig.２B）。

確認された（Fig.３C）。走査型電子顕微鏡による透過型電子顕微鏡による観察により，シスト壁の観察では細長いフィラメント状の表面突起が認め

表面突起はシスト表面から直立し，幅が均等でられ，特定の方向性を持たずに分布していること（約１μm），細長い（長さ約５～７μm）構造でが明らかとなった（Fig.３D）。

あることが明らかとなった（Fig.２C）。走査型電シストＤは組織学的に大型のシストであり，明子顕微鏡による観察で，表面突起はシスト全周に瞭なシスト壁構造を欠き，結合組織性の被膜に包密に存在していることが確認された（Fig.２D）。

まれていた。

シストＣは組織学的にシストＢと同様の太さで

18S rRNA遺伝子を標的としたPCRを実施したあり，シスト壁は薄く，明らかな表面突起が認め

結果，Primer 1L/Primer 3H, S5/S4, ERIB1/

られない（Fig.３A）。摘出したシストは細長く，Primer B １） な ら び に 18S1F/18S11R ２） の プ ラ イ

先端が鋭な形態であることが確認され（長さ726

マーの組み合わせで目的とする分子量の増幅産物～1202μm，太さ58～100μm），微毛状の表面突を確認した。PCR産物のダイレクトシークエンス

起が認められた（Fig.３B）。透過型電子顕微鏡にについて，試料調整方法の条件を検討中である。

よる観察により，幅約0.2μmの表面突起は周囲を本研究によって，ニホンジカ（Cervusnippon）

囲む宿主筋線維の細胞質に圧排されている様子がの 北 海 道 亜 種 で あ る エ ゾ シ カ（Cervus nippon

Fig. 2 Morphology of the Sarcocyst type B from Hokkaido sika deer（Cervus nippon yesoensis）. A. A small sarcocyst

with thick cyst wall composed of thin finger-like protrusions. Histological sections stained with hematoxylin andeosin. B. A slender spindle-shaped cyst. Light microscopy. C. The cyst wall is composed of tightly packed, thin,finger-like protrusions. Transmission electron microscopy. D. The cyst surface is diffusely covered with the tightly
packed protrusions. Scanning electron microscopy.

© The Ito Foundation

246

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Fig. 3 Morphology of the Sarcocyst type C from Hokkaido sika deer（Cervus nippon yesoensis）. A. A small sarcocyst

with thin cyst wall without conspicuous protrusions. Histological sections stained with hematoxylin and eosin. B. A
slender spindle-shaped cyst. Light microscopy. C. The cyst wall has thin protrusions which are compressed by thecytoplasm of the host cell. Transmission electron microscopy. D. The cyst surface is covered with filamentous,
thread-like protrusions. Scanning electron microscopy.

yesoensis）の筋組織に寄生する住肉胞子虫シスト

tarandiをS. elongataと再分類している ４）。今回の形態学的特徴を明らかにすることができた。シ

我々が認めたシストＡはS. truncata（S. rangiferi）

カ科（Cervidae）動物にはニホンジカやトナカのシストと類似していたが，シストＡは大きさがイ，ヘラジカなどが含まれ，17～19属に分類されより大きくなる傾向が認められ，また，周囲からている。ニホンジカはシカ属（Cervus）に属し，連続する隔壁が内部を区画する点が異なってい同じシカ属にはヨーロッパや北南米，オーストラた。シストＢはS. elongata（S. tarandi）のシスリアなどに生息するアカシカ（Cervus elaphus）

トと非常に類似していた。また，斉藤らがホンが属しており，アカシカに寄生する住肉胞子虫にシュウジカから得た住肉胞子虫シストとも類似しついてはGjerdeらのグループによって詳細な研究ており，彼らは本種がS. sybillensisと形態学的にが実施されている３，４）。Gjerdeらは形態学的特徴

類似していることを指摘している５）。シストＣはならびに18S rRNA遺伝子の分子系統解析から，

Gjerdeらの報告したS. hjortiと非常に類似してい５ 種（Sarcocystis hjorti, S. hardangeri, S. ovalis,

ることが確認された。住肉胞子虫は１つの動物種

S. rangiferi, S. tarandi）を同定しており ，そのに複数種の住肉胞子虫が寄生し，また，１種の住後，ミトコンドリアCOX1遺伝子の分子系統解析

肉胞子虫が複数の動物種に寄生することが知られを加えることにより，S. rangiferiをS. truncata, S.

ている。今回得られた結果から，同じCervus属

３）© The Ito Foundation

シカ肉に寄生する住肉胞子虫の形態学的・分子生物学的同定ならびに腸管毒性評価247に属するニホンジカとアカシカに寄生する住肉胞学的解析の結果，ニホンジカに寄生する３種の形

子虫が形態学的に非常に類似していることが確認

態学的特徴が同じCervus属に属するアカシカのされ，このことから，ニホンジカとアカシカに分寄生種と非常に類似していることが明らかとなっかれる以前の共通の祖先動物の時代から住肉胞子た。引き続き分子生物学的検索を進め，形態学的虫と共生している可能性が考えられ，非常に興味

特徴と合わせた種の同定を完遂させ，それらの各深い知見であると考えられた。住肉胞子虫の種の種の腸管毒性を評価する必要がある。

同定にはこれまでに得た形態学的特徴に加え，現在検索中である遺伝子情報を含めた解析が不可欠であり，住肉胞子虫の食中毒原因物質としての毒性評価を行うために，種の同定を完遂する必要性
がある。
４．要

約

ニホンジカの生息頭数増加と生息域拡大に対する個体数調整に伴って，シカ肉を食肉として活用する動きが進んでいる。ニホンジカには住肉胞子虫が高率に感染していることが知られており，さらに，馬寄生種Sarcocystis fayeriに含まれる下痢
原性毒素がシカ寄生種にも含まれると指摘されている。シカに寄生する住肉胞子虫とその毒素に関する研究を進めるにあたり，ニホンジカに寄生する住肉胞子虫の種の同定が不可欠である。本研究では形態学的ならびに分子生物学的検索を統合的に解析して種を同定することを目的とした。形態

文献１） Dahlgren, S. S., Gjerde, B. : Genetic characterisationof six Sarcocystis species from reindeer（Rangifer
tarandus tarandus）in Norway based on the small
subunit rRNA gene, Vet. Parasitol., 146, 204～213,
2007.
２） Pritt, B., Trainer, T., Simmons-Arnold, L., Evans,M., Dunams, D., Rosenthal, B. M. : Detection of
Sarcocystis parasites in retail beef : a regional
survey combining histological and genetic detection
methods, J. Food Protec., 71, 2144～2147.
３） D a h l g r e n , S . S . , G j e r d e , B . : M o l e c u l a r
characterization of five Sarcocystis species in reddeer（Cervus elaphus）,including Sarcocystis hjorti n.
sp., reveals that these species are not intermediate
host specific, Parasitology, 137, 815～840.
４） Gjerde, B. : Sarcocystis species in red deerrevisited : with a re-description of two known
species as Sarcocystis elongata n. sp. and Sarcocystis
truncata n. sp. based on mitochondrial cox1
sequences, Parasitology, 141, 441～452.
５） Saito, M., Itagaki, T., Shibata, Y.,Itagaki, H. :Morphology and experimental definitive hosts ofSarcocystis sp. from sika deer, Cervus nippon
centralis, in Japan, Jpn. J. Parasitol., 44, 218～221.

© The Ito Foundation

248

肉用鶏におけるSalmonella Agonaのemergingとその発生要因の解析
Emergency and analysis of the causes of Salmonella Agona in broiler
chicken

鳥

居

恭

司・村

上

覚

史・横

山

栄

二＊

（東京農業大学農学部畜産学科，＊千葉県衛生研究所）

Yasushi Torii, Satoshi Murakami and Eiji Yokoyama＊（Department of Animal Science, Graduate School of Agriculture, Tokyo University of Agriculture，＊Chiba Prefectural Institute of Public Health）

We have investigated Salmonella sp. strains in broiler chicken at a slaughter center. S.
Infantis strains had been isolated from many broiler chickens until 2012. However, S. Infantis
strains were not detected, and S. Agona strains were isolated from many chickens in 2014. The
breeder of broiler chickens are introduced from some broiler breeder centers. We can notconsider that this case was emerging of S. Agona in a limited zone. The strains have a risk ofoutbreak of food poison from chicken. We investigated molecular epidemiological andpathogenicity studies of the strains from chickens and humans.
In molecular epidemiological study, strainsʼ genomes from chickens were same PFDE
patterns. Phylogenetic tree was made by NGS analysis, and strains from chickens wereseparated three groups. Strains from human were included into these groups. Pathogenic of
Salmonella was evaluated by invasion of HeLa cells. Invasion efficacy of two groups with thestrains from chickens were 0.35 and 0.53％. S. Infantis which is low pathogenicity was 0.31％,
and S. Typhimurium which high pathogenicity was 1.24％. Invasion efficacies of the strains
were equal to that of S. Infantis, and the results indicated that the strains were low
pathogenicity.

１．目

年度の同一食鳥処理場における調査ではS. Infantis

的はほとんど分離されず，代わってS. Agonaが多数

ヒトにおけるサルモネラ食中毒は鶏肉や鶏卵食分離された。現在，肉用鶏農場が導入するコマー

品を介して発生するが，わが国では主にSalmonella

シャル鶏は複数の種鶏場から導入されており，今Enteritidisは鶏卵，S. Infantisでは鶏肉がその汚回調査した農場も同様である。このことを考慮す

染源として重要である 。これまでの調査により，ると一地域に限定されたS. Agonaの新興とは考

平成23（2011）年度のある県の一食鳥処理場におえにくい。S. Agonaは1970～80年代にヒトの食けるサルモネラ調査で，複数の農場の肉用鶏から中毒事例から検出されていたが，その後検出数がS. Infantisが分離されていたが，平成26（2014）

激減していた。今回の肉用鶏における本血清型の

１）© The Ito Foundation

肉用鶏におけるSalmonella Agonaのemergingとその発生要因の解析

249

新興により鶏肉を介したヒトのサラモネラ感染症

サルモネラ菌の病原性の指標である細胞侵入性のリスクが高まる可能性は否定できない。そこでを 調 べ る た め ，Gentamycin Protection Assay ４）

本研究では，我々が肉用鶏から分離した株，国内を次のとおりに行った。供試菌株は，全ゲノム解でヒトから分離された株，さらに市販鶏肉から分析で分類したそれぞれの進化系統グループから任離された株の分子疫学的解析を実施し，今回の肉意に８株を選択し，対照として市販鶏肉から得ら用鶏におけるS. Agonaの新興状況を確認した。

れ た S. Infantis, S. Typhimurium, S. Manhattan,

さらにその発生要因を解析するため，S. Agona

S. Schwarzengroundを使用した。細胞侵入性をの感染性および病原性を調査するとともに，次世評価する細胞はヒト子宮癌由来細胞HeLa細胞を代シークエンサー（NGS）による全ゲノム解析

使 用 し た 。 HeLa 細 胞 を Dulbeccoʼs Modifiedを実施し，肉用鶏分離株とヒト分離株との関連をEagleʼs Medium（DMEM）-10％ Fetal calf serum

解明してその情報を生産者サイドへ提供すること（FCS）培地を用いて24ウェルプレートで37℃，

で，S. Agonaの養鶏場およびヒトへの蔓延防止

５％CO2環境で１晩培養した。サルモネラ菌はLBに生かしていくことを目的とした。

培地で37℃ OD630が0.5になるまで振盪培養し２．方た。HeLa細胞にMultiplicity of Infection 100でサ法

ルモネラ菌を添加し，37℃，５％CO2環境下で102 . 1 分子疫学的解析および全ゲノム解析

分間静置後，PBSで３回洗浄し，さらに20分感染

肉用鶏におけるS. Agonaの新興状況を把握すさせた。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で１回洗るために，2014～2015年に肉用鶏から分離した菌

浄後，培地を200μg/ml Gentamycin含有DMEM-株（87菌株），2013～2014年にヒトから分離され10％ FCS培地に交換して細胞内に侵入していなた菌株（５菌株）のDNAをパルスフィールド電

い 菌 を 殺 菌 し た 。細 胞 を PBS で 洗 浄 後 0.5 ％気泳動（PFGE）を既報に準じて行った 。制限

TritonX-100含有PBSを500μl添加して細胞を溶酵素はXbaIおよびBlnIを用いた。また，対照と解した。細胞溶解液を生理食塩液により10倍階段

して千葉県衛生研究所に保存されている菌株（63

希釈し，各希釈液をLB寒天培地に50μlずつ塗布

菌株，1993～2008年に分離）も同様にPFGEをして37℃で１晩培養した。培地に生育したコロ行った。PFGEデータはBio Numerics（Applied

ニー数をカウントし，HeLa細胞内部に侵入した

Maths）によりクラスター解析してデンドログラ

サルモネラ菌を計測し，細胞内への侵入効率を算ムを作成した。さらに，Minimum spanning tree

出した。

２）

（MPT）解析を行って，各菌株の類似度により被2 . 3 肉用鶏生産業者に対する講習会の開催

験菌株をgeno-groupに分けた。

平成28年３月16日にS. Agonaが分離された肉

それぞれのgeno-groupから任意に65菌株を選び出し，NGSによる全ゲノム解析を既報に準じて行った 。得られた全ゲノム・データからS. Agona

用鶏生産業者および県食肉衛生研究所の担当者を交えた講習会を実施した。

３）の進化系統を解明するのに必要な変異を抽出し，被験菌株を進化系統グループに分類した。

3 . 1 分子疫学的解析および全ゲノム解析

2 . 2 in vitroにおけるS. Agonaの病原性に関する調査

３．結果と考察

肉用鶏から分離した菌株のPFGE解析の結果，Xba Iのデンドログラムは類似度90％以上で１つ© The Ito Foundation

250

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）の集団となり，Bln Iのデンドログラムは類似度

以上で12の集団に分かれており，Bln Iのデンド

90％以上では３つの集団に分かれ，類似度85％以ログラムでは90％以上で15の集団に分かれた。肉上で１つの集団となった。肉用鶏からの分離株と用鶏およびヒト分離株は千葉県衛生研究所保存株

ヒト分離株のPFGE解析のバンドパターンは大変との間で類似度は低かった。すべてのPFGEデー

酷似していた。対照の千葉県衛生研究所保存株を

タ を MST 解 析 し ，geno-type を clonal complex

合わせたXba Iのデンドログラムでは類似度90％（CC）によりグループ分けを行ったところ，Xba

CC1

Y13085, Y13136, Y12215（from human）

Y14008（from human）
CC7
CC5

CC6
CC4

CC2

CC3

Fig. 1 Minimum spanning tree constructed using the PFGE-Xba I patterns of S.Agona strains from chickens andhuman in 2014

CC5
CC4

CC3

CC6
CC7

CC2

CC9

CC8
Y14008（from human）
Y12215, Y13085（from human）

CC1

Fig. 2 Minimum spanning tree constructed using the PFGE-Bln I patterns of S.Agona strains from chickens andhuman in 2014

© The Ito Foundation

251

肉用鶏におけるSalmonella Agonaのemergingとその発生要因の解析

Iでは７つ，Bln Iでは９つのCCが形成された。肉ヒトと肉用鶏との因果関係は不明であるが，なん

用鶏由来株は両制限酵素において，１つの大きならかの繋がりがあったものと考えられた。また，集団（CC1）を形成し，ヒト分離株はXba Iでは

NGS解析において，多くの菌株が含まれた２つの５株中４株，Bln Iでは３株がCC１に分類されたグループのうちの１つのグループは，Reference（Fig.１，２）。

で使用したSL483株（アメリカ

ワオミング州分各CCから任意に選択した菌株のNGS解析の結果離株）が含まれており，海外からなんらかの経路を進化系統グループに大別したところ，肉用鶏かで入ってきた菌株である可能性が考えられた。

らの分離株は３つのグループに分かれた。多くの

3 . 2 in vitroにおけるS. Agonaの病原性に関菌株は２つのグループに含まれており，ヒト分離する調査

類 し た そ れ ぞ れ の 進 化 系 統 グ ル ー プ お よ び S.

ンである可能性が非常に高いことが示された。こAgona以外の血清型の菌株の病原性について検討

れにより，肉用鶏からヒトへの感染があった可能した。S. AgonaのHeLa細胞への侵入性について性が示唆された。今回のS. Agonaが分離されたは，細胞侵入効率が0.3～1.1％であった（Table１）
。

07

SA0

TUASA

069

Y1

4

08

A0

S
UA

T

T

4

00

A0

S
UA

3

01
SA0

TUA
0
A003
TUAS

C4

5

TUASA107C60

TUASA1074

C30

TUASA0087

C3

Y1221

C２

5

TUA

C18

C29

C5

1

2
C11

C4

C5

A1

05

059

8

TU

AS

A1

07

0

0

5

C8

C1

Reference

C14

C23

C56

C20

C16
7

C4

5

C1

4

C2

C55

8

C3

Y1
31
08

7

C2

6

064

SA1

AS

C2

SA1

TUA

TU

C6
3

C

0

06

A1

AS

TU

0063

57

2

04

A0

AS

TU

C6

0

TUA

9

6

08

36

31

Y1
C25

C4

4
C3
2
C5 32
C

C3

C4

40

A0

85

AS

Y1

30

A0

TU

TU

AS

SA1

TUASA

TUA

TUASA0180

C59

0.5

5

株のうち４株は肉用鶏からの分離株と同一クロー

073

原性発揮の発端となると考え，全ゲノム解析で分

054

PFGEおよびNGS解析の結果，ヒト分離株の５0199

サルモネラ菌の病原性は宿主細胞への侵入が病TUASA1071

株の５株のうち４株もそれに含まれた（Fig.３）。

Fig. 3 Phylogenetic tree of S.Agona strains from chickens and human in 2014（gray zone: Strains from chickens,↑ : Strains from food poisoning case in human）
Strains derived from chickens were separated into three groups. Four-fives of strains from human included insame group.

© The Ito Foundation

252

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Table 1 Invasion efficacies of S. Agona into HeLa cells

サルモネラ調査を行ってきた。今までの調査ではStrains

Invasion efficacies（％）

肉用鶏からS. Infantisが分離されていたが，平成

TUASA0004（from chicken in 2014）

0.35

TUASA1064（from chicken in 2014）0.53

肉用鶏の種鶏は複数の種鶏場から導入されておC25（control strain from Chiba）

0.30

り，一地域に限定されたS. Agonaの新興とは考C40（control strain from Chiba）

0.68

C57（control strain from Chiba）

1.10

えにくい。今回の肉用鶏における本血清型の新興

S.Infantis

0.31

S.Manhattan

0.91

S.Typhimurium

1.24

本研究では肉用鶏およびヒトから分離された株のS.Schwarzengrund

0.53

分子疫学的解析および病原性の解析を実施した。

26年度の調査ではS. Agonaが多数分離された。

により鶏肉を介したヒトのサルモネラ感染症のリスクが高まる可能性は否定できない。このため，

分子疫学的解析において，PFGE解析の結果，肉用鶏からの分離株が多く含まれた２つのグルー

肉用鶏から分離された菌株の遺伝子は非常に類似

プの細胞侵入効率は0.35および0.53％であった。

していることが示され，同一クローン由来である

他 の 血 清 型 に お い て は ，S. Infantis 0.31 ％，S.

可能性が示された。NGS解析の結果を進化系統グ

Typhimurium 1.24 ％，S. Manhattan 0.91 ％ お よ

ループに大別したところ，肉用鶏からの分離株はびS. Schwarzenground 0.53％であった。高病原３つのグループに分かれた。多くの菌株は２つの性で知られるS. Typhimuriumは他の血清型の菌グループに含まれており，ヒト分離株の５株のう株よりも高い細胞侵入性を示した。肉用鶏が多く

ち４株もそれに含まれた。

含まれた分離株の細胞侵入性はS. Infantisと同等

サルモネラ菌の病原性はHeLa細胞への侵入をであり，病原性は低いことが示唆された。ただし，指標に評価した。肉用鶏からの分離株が多く含ま

S. Agonaでも他のグループに含まれていた菌株

れた２つのグループの細胞侵入効率は0.35およびではS. Typhimuriumに近い細胞侵入性が確認さ0.53％であった。他の血清型においては，病原性れたため，菌株によっては病原性が高いものも存が 低 い S. Infantis は 0.31 ％， 病 原 性 が 高 い S.

在していることが示唆された。

Typhimuriumは1.24％であった。肉用鶏が多く含3.3

肉用鶏生産業者に対する講習会の開催

講習会においては，本研究結果の情報に提供

まれた分離株の細胞侵入性はS. Infantisと同等であり，病原性は低いことが示唆された。

し，生産現場での衛生管理について議論を行った。生産現場の担当者の話では，今回のS. Agona
が生産現場に侵入した経路および汚染が広がった
経路については不明であった。今回の講習会を行ったことで，生産現場の担当者から今後食中毒
菌への意識を高め，生産現場の衛生管理の徹底を行っていきたいとの感想をいただいた。
４．要

約

文
献
１） National Institute of Infectious Disease, Infect.
Agent Serv. Rep., 30, 203～204, 2009.
２） Center for Disease Control and Prevention（CDC）Pathogens and Protocols/Pulse Net PFGE
Protocols.
３） Yokoyama, E., Ando, N., Ohta, T., Kanada, A.,
Shiwa, Y., Ishige, T., Murakami, K., Kikuchi, T.,
Murakami, S. : Vet. Microbiol., 175, 312～318, 2015.
４） Steele-Mortimer, O. : Methods Mol. Biol., 431, 201～211, 2008.

我々はある県の一食鳥処理場において継続的に© The Ito Foundation

253

マダニの酸化ストレス制御分子を標的とした
抗マダニワクチンの開発
The development of anti-tick vaccine as a target against regulating
molecule for oxidant stress

田

仲

哲

也・草木迫

浩

大・宮

田

健＊

（鹿児島大学共同獣医学部，＊鹿児島大学農学部）

Tetsuya Tanaka, Kodai Kusakisako and Takeshi Miyata＊（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, ＊Faculty of Agriculture, Kagoshima University）

The objective of this research was to evaluate the efficacy of tick peroxiredoxin as antigen
candidate for vaccine. When the rabbits were vaccinated with a recombinant tickperoxiredoxin（rHlPrx2）expressed through Escherichia coli system, high antibody titeragainst the recombinant protein can be induced. Moreover, the effect of specific antibody
against rHlPrx2 in the rabbit was also evaluated by tick infestation. Although the rHlPrx2
vaccination to rabbit did not significantly affect ticksʼ engorgement, engorged body weight, egg
weight, and hatching rate after tick infestation, the rHlPrx2 vaccination without adjuvantslightly depress the ticksʼ engorged body weight and egg weight. Therefore, there is apossibility that the rHlPrx2 vaccination without adjuvant can be useful in vaccination againsttick infestation, although rHlPrx2 vaccination showed no significant effects on tick infestation.
On the other hand, the peroxiredoxins were also considered as an inducer of Th2 immune
response of host in other parasites, like helminths and protozoans. For this reason, we consider
that further studies are needed for assess the viability of tick peroxiredoxin as a vaccine
candidate.

１．目

べての発育期に有効性を発揮し，（３）付与した的免疫能が長期間継続し，（４）媒介疾病の感染をワクチネーションによってマダニを駆除しよう阻止するとともに，（５）ワクチン抵抗性の獲得という抗マダニワクチンのアイデアはかなり古くがなく，（６）低価格であるなどの特徴を備えてからあったが，1994年に市販されたオウシマダニ

いるべきであると考えられるが，上記のBm86ワ

防除を目的としたマダニ中腸膜タンパク質Bm86

クチンを含めて，これらの条件をすべて満足させベースの抗マダニワクチンを唯一の例外として，るものは存在しないのが現状である。したがっ今日に至るまで実用化されたワクチンは皆無であて，Bm86のような膜タンパク質ではなくフェリる 。理想的な抗マダニワクチンとは，（１）人チンやペルオキシレドキシンのような分泌タンパ

獣加害性のすべてのマダニに対して有効であるとク質を標的とした有用な新規抗マダニワクチンのともに，（２）卵，幼ダニ，若ダニ，成ダニのす開発が必要とされている。

１）© The Ito Foundation

254

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

本研究では，酸化ストレスに対する防御に重要な役割を担っているマダニフェリチン

由来抗マウスイムノグロブリン（Dako Corporation,

やマダ

Carpinteria, CA, USA）を2,000倍希釈で用いた。

ニペルオキシレドキシン５）に着目し，これらの活その後TMB溶液（SurModics, Eden Prairie, MN,性阻害によって，吸血プロセスの破綻を起こし，USA）を用いて発色を行い，マイクロプレート

マダニを駆除できるのではないかと考えた。我々

リーダー（BioRad, Hercules, CA, USA）で450nm

は，組換えペルオキシレドキシンを作製し，これの吸光を測定した。得られた結果は，450nmの吸らを宿主に免疫することによって，抗マダニ効果

光度が0.5以下となる抗血清の希釈倍率を抗体価を調べ，新規抗マダニワクチンの開発の基盤を確とし，log10の値を用いてグラフを作製した。

２～４）

立することを本研究の主目的とした。
２．方

2 . 3 マダニの吸血，産卵，孵化率に及ぼす組
換えワクチンの影響

法

３回目の免疫から２週間後にウサギへ32匹の雌

2 . 1 ワクチン抗原としての組換えペルオキシ

成ダニを吸血させ，飽血率，飽血後の成ダニ体重，
産下された卵重量，幼ダニの孵化率について調べ

レドキシンの精製
RT-PCR法によって増幅したペルオキシレドキ

た。また，マダニ吸血後のウサギ血清を回収し，

シ ン の cDNA を 大 腸 菌 発 現 ベ ク タ ー（pRSET）

2 . 2と同様にELISAを用いて，抗原特異的抗体価に組み込んだ後，大腸菌BL21（DE3）にトランを測定した。

スフォーメンションし，組換えペルオキシレドキ

2 . 4 統計解析

シンを発現する大腸菌を得た。ワクチン抗原とし飽血後の成ダニ体重，産下された卵重量について十分な量を確保するために，大腸菌の大量培養ては，ウェルチの t 検定を用いた。飽血率ならびを行い，得られた組換え体についてはHis-tagカに産下された卵の幼ダニへの孵化率については，

ラムを用いたクロマトグラフィによって精製を

χ二乗検定を用いた。すべての検定においてP＜行った。

0.05で有意差ありとした。

2 . 2 組換えペルオキシレドキシンの免疫
日本白色ウサギ１羽あたり，同量のフロイント
不完全アジュバント（IFA）と混合した100μgの組換えペルオキシレドキシンまたは100μgの組換３．結果と考察3 . 1 ワクチン抗原としての組換えペルオキシ
レドキシンの精製

えペルオキシレドキシンのみをそれぞれ皮下に２ワクチン抗原として十分な量を確保するため

週間間隔で３回免疫を行った。コントロール群にに，大腸菌の大量培養を行い，得られた組換え体

はIFAと混合したリン酸緩衝液（PBS）またはについてはHis-tagカラムを用いたクロマトグラ

PBSのみを投与した。各群１羽のウサギを実験に

フィによって精製を行った後，SDS-PAGEで確供した。ELISAによって抗原特異的抗体応答を認を行った（Fig.１）。その結果，His-tagタンパ

確認するために，それぞれの群の抗血清を免疫

ク質の約３kDaを含めた約27kDaの分子量付近に０，１，
３，
５週間後に回収した。一次抗体は，得組換えペルオキシレドキシン（rHlPrx2）が認められた抗血清を50倍希釈から156,250倍希釈の５られた（矢印）。

倍階段希釈列として用いた。二次抗体は，西洋ワ

組換えペルオキシレドキシンは，大腸菌を用いサビペルオキシダーゼ（HRP）で標識されたヤギ

た大量培養を行ったところ，可溶性画分に検出さ© The Ito Foundation

マダニの酸化ストレス制御分子を標的とした抗マダニワクチンの開発

ol
Pu i lys
a
riﬁ
ed te
pr
ot
ei

n

免疫の宿主に対する効果およびマダニの吸血，産卵，孵化率に及ぼすワクチンの影響

E.
c

（kDa）

255

コントロール群（PBS, PBS＋IFA）ではほと96 66 -

んど組換えペルオキシレドキシンに対する特異的抗体価の上昇が観察されなかった（Fig.２）
。組

45 -

換えペルオキシレドキシンのみおよび組換えペルオキシレドキシン＋IFAを免疫した群（rHlPrx2,

30 -rHlPrx2＋IFA）において，組換えペルオキシレ
21.1 -

ドキシンに対する顕著な抗体価の増加が認めら

Fig. 1 Purification of recombinant Haemaphysalis

longicornis 2-Cys Peroxiredoxin（rHlPrx2）. rHlPrx2
was expressed in E. coli and the purified by FPLC.
The E. coli lysate and purified rHlPrx2 wereanalyzed by SDS-PAGE and CBB stain. Molecularweight is shown on left side of the figure.

れ，IFAとともに免疫した群において２回目免疫以降の抗血清では，抗体価が一定となった（Fig.
２）
。しかし，組換えペルオキシレドキシンのみの免疫でも特異的抗体価の増加が確認され，アジュバントなしでも宿主免疫を誘導できることがAntibody titer（log10）

明らかとなった（Fig.２）。また，３回目免疫後6のウサギで雌成ダニを吸血させたところ，組換え

5ペルオキシレドキシンのみを免疫した群において

4
3

PBS
PBS+IFArHlPrx2
rHlPrx2+IFA

特異的抗体価の増加が観察され，組換えペルオキ
シレドキシンに対する抗体は，組換えペルオキシ
レドキシンのみならず雌成ダニの内在型のペルオ

2キシレドキシンに反応を示すことが推察された

1
0（Fig.２）。
Tick Inf.

肝姪において，宿主への感染後，宿主体内中にFig. 2 Antibody titer （log 10 ） in a vaccinated rabbit

ペルオキシレドキシンを分泌し，獲得免疫を司る

Pre

1st

2nd

3rd

serum. Antibody titers were defined as the dilutionrate（log10）under 0.5＜OD450nm. Pre, Pre-vaccination（0 week）; 1st, 1st vaccination after 1 week（1week） ; 2nd, 2nd vaccination after 1 week （3weeks）; 3rd, 3rd vaccination after 1week（5 weeks）; Tick Inf., after Tick infestation.

Th2免疫経路を活性化し，Th1免疫経路を主とする宿主の非特異的な自然免疫から免れている可能性が示唆されている６）。また，リューシュマニア
原虫の組換えペルオキシレドキシンをマウスに免疫するとTh2免疫経路が活性化されることも示されたため，正しい巻き戻しが行われていることがれている７）。これらのことから，マダニにおいて考えられた。

も宿主体内へペルオキシレドキシンを放出するこ

また，組換え体のHis-tagカラムを用いたクロとで，宿主のTh2免疫経路を活性化し，マクロ

マトグラフィによる精製により，大腸菌由来タン

ファージ，樹状細胞，そして好中球の遊走などにパク質を十分に排除でき，免疫に使用可能な濃度

つながるTh1免疫経路活性化を抑制し，吸血をよを確保することに成功した。

り成功しやすくしている可能性が考えられた。

3 . 2 組換えペルオキシレドキシンのワクチン

免疫宿主で吸血させた雌成ダニでは，飽血率，© The Ito Foundation

256

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

飽血体重，卵重量，孵化率において有意な差は認で吸血させた雌成ダニにおいて，飽血体重およびめられなかった（Fig.３A and B, Table１）。ところ

卵重量の減少傾向が認められた（Fig.３A and B）。

が，組換えペルオキシレドキシンのみ免疫ウサギ

以上のことから，ウサギにおいて，組換えペルオキシレドキシン免疫はマダニの吸血および産卵Aへの顕著な影響は及ぼさないが，マダニの吸血おEngorged body weight （mg）

400

よび産卵を抑制する可能性が示唆された。さらに，組換えペルオキシレドキシンのみ免疫により300

マダニの飽血体重および卵重量で減少傾向を示したことから，アジュバントなし免疫への応用の可200

能性が十分に考えられた。この組換えペルオキシ
レドキシンがアジュバントなしに宿主へ免疫を付

100

与することは，ペルオキシレドキシンが10量体という高分子を形成することに起因すると考えられ

0
PBS

PBS
+IFA

rHlPrx2る５）。しかし，ペルオキシレドキシンの上述のよ

rHlPrx2+IFA

うなTh1/Th2免疫経路への作用がある可能性がB

マダニにおいても十分に想定されるため，免疫経300

Egg weight（mg）

路に関する詳細な検討が必要であると考えられる。
４．要

200

約

今回，我々は，マダニ由来ペルオキシレドキシ
100ンを用いたマダニワクチンの検討を行った。大腸菌を用いて作製した組換えマダニペルオキシレド

0
PBS

PBS
+IFA

rHlPrx2

キシンでウサギを免疫したところ，組換えペルオ

rHlPrx2+IFA

キシレドキシンのみでも十分な抗体価を誘導でFig. 3 Effects of rHlPrx2 vaccination to adult female

き，さらに，ウサギ体内にできた特異的抗体が，ticks. Thirty four ticks were infested to each rabbit.
（A）Engorged body weight of adult female ticks.
（B）Weight of eggs laid by engorged adult female
ticks. The bars in each box plot indicate the medianof each group.

マダニ吸血に対し反応を示した。実際に免疫ウサギで雌成ダニを吸血させたところ，飽血率，飽血
体重，卵重量，孵化率において有意な差は認めら

Table 1 Effects of rHlPrx2 vaccination to female ticks in rabbit
AntigenEngorged rate（％）

Engorged body weight（㎎）

Egg weight（㎎）

Hatching rate（％）

PBS
PBS＋IFArHlPrx2
rHlPrx2＋IFA

91.3
82.6
95.7
100

273.2±56.8
278.5±53.4
242.8±79.9
286.9±54.9

159±32167±27138±57170±28

100
100
90.5
100

PBS, Phosphate Buffered Saline ; IFA, Incomplete Freundʼs Adjuvant ; rHlPrx2, recombinant Haemaphysalis longicornis 2-Cys
Perxiredoxin.

© The Ito Foundation

マダニの酸化ストレス制御分子を標的とした抗マダニワクチンの開発れなかったが，組換えペルオキシレドキシンのみ
免疫群において飽血体重と卵重量の抑制効果が観察された。以上の結果から，組換えマダニペルオ
キシレドキシンによる免疫は雌成ダニの吸血に大きな影響を及ぼさないが，アジュバントなし免疫への応用の可能性が十分に考えられた。しかし，他の寄生虫では免疫応答経路特異的な作用も考えられるため，より詳細な検討が必要であると考えられる。
文献１） Willadsen, P., Bird, P., Cobon, G.S., Hungerford, J.
: Commercialisation ofarecombinant vaccine against
Boophilus microplus, Parasiol., 110, 43～50, 1995.
２） Galay, R.L., Aung, K.M., Umemiya-Shirafuji, R.,
Maeda, H., Matsuo, T., Kawaguchi, H., Miyoshi, N.,
Suzuki, H., Xuan, X., Mochizuki, M., Fujisaki, K.,
Tanaka, T. : Multiple ferritins are vital to successful
blood feeding and reproduction of the hard tick
Haemaphysalis longicornis, J. Exp. Biol., 216, 1905～
1915, 2013.
３） Galay, R. L., Umemiya-Shirafuji, R., Bacolod, E.T.,
Maeda, H., Kusakisako, K., Koyama, J., Tsuji, N.,

257

Mochizuki, M., Fujisaki, K.,Tanaka, T. : Two kinds offerritin protect ixodid ticks from iron overload andconsequent oxidative stress, PLoS ONE, 9, e90661,
2014.
４） Galay, R.L., Miyata, T., Umemiya-Shirafuji, R.,
Maeda, H., Kusakisako, K., Tsuji, N., Mochizuki, M.,
Fujisaki, K., Tanaka, T. : Evaluation and comparisonof the potential of two ferritins as anti-tick vaccines
against Haemaphysalis longicornis, Parasit Vectors,
7, 482, 2014.
５） Kusakisako, K., Masatani, T., Miyata, T., Galay,
R.L., Maeda, H., Talactac, M.R., Tsuji, N., Mochizuki,M., Fujisaki, K., Tanaka, T. : Functional analysis ofrecombinant 2-Cys peroxiredoxin from the hardtick Haemaphysalis longicornis, Insect Mol Biol., 25,
16～23, 2016.
６） Donnelly, S., Stack, C.M., OʼNeill, S.M., Sayed, A.A.,
Williams, D.L., Dalton, J.P. : Helminth 2-Cys
peroxiredoxin drives Th2 responses through amechanism involving alternatively activatedmacrophages, FASEB J., 22, 4022～4032, 2008.
７） D a i f a l l a , N . S . , B a y i h , A . G . , G e d a m u , L . :Immunogenicity of Leishmania donovani ironsuperoxide dismutase B1 and peroxiredoxin 4 in
BALB/c mice : the contribution of Toll-like receptor
agonists as adjuvant, Exp Parasitol., 129, 292～298,
2011.

© The Ito Foundation

258

食肉からの感染源となるトキソプラズマの休眠型虫体に関する研究Studies on Toxoplasma dormant parasite as a source of food-borne disease

加

藤

健太郎

（帯広畜産大学原虫病研究センター）

Kentaro Kato
（National Research Center for Protozoan Diseases, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

The parasite could not be eliminated completely in farm animal because actual antiToxoplasma drug induces the transfer from active form to dormant form of Toxoplasma gondii.
Therefore, the strategy to eliminate the domant parasite which might become reservoir of
Toxoplasma in meat for eating should be established. The aim of this research is to detect the
drug seed which eliminate the dormant parasite in meat and analyze the mechanism for
Toxoplasma gondii to transfer to dormant form, reservoir of Toxoplasma in meat for eating. To
accelerate the investigation of bradyzoite differentiation mechanisms, we constructed reporter
parasite for high throughput assay. Actually the drug screening to inhibit the tachyzoite
growth has been performed using the national compound library. Next the toxicologic test to
the host cells have been performed using the compounds selected at the above screening. The
inhibition tests for the transfer to domant parasite have been performed. Finally we havesucceeded in obtaining 2 compunds.

１．目などの臓器を破壊する。予防するためのワクチン的はない。2012年９月23日に先天性トキソプラズマ

トキソプラズマ原虫は，マラリア原虫等と同じ＆サイトメガロウイルス感染症患者会（トーチのくアピコンプレックス門に属する原虫であり，猫会）が設立され，NHKでもその被害が取り上げ科動物を終宿主とする人獣共通感染症である。世られた。三井記念病院の小島俊行医師らの報告で界中で発症が見られ，ヒトでも高い感染率を示しは，ユッケやレバ刺しの食用等の近年の食習慣のている。妊婦が感染すると，流産や胎児の脳症，変化に伴い，先天性トキソプラズマ症が拡大し，痙攣，水頭症，頭蓋内石灰化等を起こす。健康な思春期に症状が出ることもあることから無自覚の

成人では通常無症状であるが，胎児・幼児，臓器ものも含めると我が国の新生児において年数百件

移植やエイズの患者など，免疫抑制状態にある場の被害があると推定されている。このような状況

合には重症化して死に至ることもあり，重篤な日の中，研究代表者はトキソプラズマ原虫の急性感

和見感染症である。重症化した場合には，脳炎や染虫体の増殖と潜伏感染への移行をともに阻止す

神経系疾患を起こしたり，肺・心臓・肝臓・眼球る 薬 剤 の ス ク リ ー ニ ン グ 系 を 開 発 し た（特 願© The Ito Foundation

259

食肉からの感染源となるトキソプラズマの休眠型虫体に関する研究

2014-109262）１）。本研究では，このスクリーニン

マ薬はサルファ剤を基本とした古典的なものであグ系を用いて同定した薬剤を使って潜伏感染誘導

り，また病態を引き起こす急性感染虫体（栄養機構について解析を行う。

型）を潜伏感染虫体（休眠型）へと移行させるだ

トキソプラズマ原虫は他の原虫と同様に，独特けで根本的な駆虫に至らないものである。したで複雑なライフサイクル（感染環）を持ち，基本

がって，トキソプラズマの感染源となる食肉中の的には栄養型（タキゾイト），休眠型（シスト：

潜伏感染虫体の性状解析を行うことで潜伏感染虫

数千に及ぶブラディゾイトが充填），虫卵（オー

体を防除できる方策を確立する必要性がある。本シスト）の３つの形態をとる。ヒトを含めてほぼ研究の目的は，食肉がトキソプラズマの感染源とすべての哺乳類，鳥類に感染する可能性があるこなる原因である潜伏感染が起こる仕組みの解明をとから，食肉は種類によらず感染源になりうる。

行うことである。

感染動物由来の食肉を生食したり，加熱が不十分である場合，あるいは終宿主であるネコの糞中のトキソプラズマのオーシストが口の中に入ることによって，ヒトを含め，様々な動物がトキソプラ

２．方法

2 . 1 栄養型虫体の虫体を抑える薬剤のスクリーニングズマに感染し，感染した動物の組織内でシストを我々は潜伏感染特異的に発現する遺伝子のプロ形成する。本研究では，食肉由来感染症のトキソ

モータの下流にレポーター遺伝子（ホタルルシ

プラズマについてこの感染阻止を目指して，実際フェラーゼ）を組入れたトキソプラズマ原虫株をの感染源となる休眠型虫体の性状解析を行う。

作成した。また，同時に当原虫株は恒常的に発現

我が国において近年問題となっている妊婦の初する遺伝子のプロモータの下流に別のレポーター

感染による胎児へのトキソプラズマの垂直感染の遺伝子（ウミシイタケルシフェラーゼ）を組入れ

大きなリスク因子は肉の生食習慣にあることが，たことで，潜伏感染状態，および原虫の増殖を同

2012年に報告された 。食肉用の生産家畜に対す時に，高感度で多検体を評価できる系の確立に成る有効なワクチンは我が国では認可されているも功した（特願2014-109262；Fig.１）１）。本研究でのがない。また，薬剤による治療は急性トキソプ

は，まずこのトキソプラズマ原虫株と東京大学のラズマ症を阻止することはできるものの，感染源

創薬オープンイノベーションセンターの約3000種

２）となる潜伏感染虫体を排除できないため，トキソプラズマ症と判断されない食肉が市場に出回る原因となっている。トキソプラズマ研究においては，フラスコ内で容易に実験が可能な急性感染期（栄養型）に関するものが多いが，一方，宿主体
内における潜伏感染期（休眠型）への移行の仕組
みや潜伏感染を司る機構については未解明の部分が大きい。そこで，我々はこれまでに潜伏感染への移行の鍵となるシグナル因子の機構解析や抗原

Vero cell

O/N culture

1000/well
PLK/DLUC1C９

2 day culture

Drugtreatment
2 day culture
DUAL/
LUCIFERASE
assay

Renilla luc intensity（TUB1 promoter）->parasite number->drug eﬀect on parasite growth
Fireﬂy luc intensity（BAG1 promoter）->parasite number * bradyzoite status
Fireﬂy luc/Renilla luc->drug eﬀect on bradyzoite induction

虫薬の開発を行ってきた３～６）。
現在のところ，畜産動物に対するトキソプラズ

Fig. 1 Overview of drug screening.

© The Ito Foundation

260

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

類の公的化合物ライブラリを用いて，栄養型虫体

た ，90 ‒ 100 ％ の も の は ，28 化 合 物 で あ っ た 。

の増殖を抑える薬剤（薬剤濃度：10μM）のスク

100％以上を示した化合物の中で既知の薬剤の内リーニングを行った。

訳は，抗生物質，抗真菌薬，抗マラリア薬，抗精2.2

宿主細胞への毒性試験

神病薬，抗癌薬等であった。

2 . 1で得られた化合物について，宿主細胞への上記のスクリーニングで絞り込まれた85化合物

毒性試験を行った。つまり，将来的に薬剤としてについて宿主細胞への毒性試験（薬剤濃度：10μ

使用することを考え，ヒトを含めた宿主動物へのM）を行った結果，宿主細胞生存率が60％以上の副作用（毒性）のある化合物を除外することを目ものについて細胞毒性が低いと評価した。その結的とした解析である。また，本実験は被検化合物

果，細胞毒性が低いとされる32化合物を絞り込ん自体が宿主細胞を死滅させることの影響から一見だ。これらの既知化合物の内訳は，抗精神病薬８

原虫自体が死滅しているように見えているケース

化合物，イオンチャネル作動薬５化合物，抗生物を除外するためでもある。本実験ではCell titer

質５化合物，キナーゼ阻害薬２化合物，微小管形

Glo（Promega）を用いて，宿主細胞のATP活性成阻害薬２化合物，抗腫瘍薬２化合物，HDAC1

測定することで，細胞の生死判定を行った。

阻害薬２化合物，その他６化合物である。

2 . 3 栄養型虫体から休眠型虫体への移行を抑次に，ここまで絞り込まれた32化合物について，潜伏感染への移行に抑制的に働く薬剤のスク制する薬剤のスクリーニング
2 . 2で得られた化合物について，我々の開発しリーニングを行った。その結果，２化合物についたトキソプラズマ株（特願2014-109262）を用いて潜伏感染への移行が陰性コントローグの薬剤とて潜伏感染への移行を反映するルシフェラーゼ活

比較して有意に抑制した。

性を測定することで潜伏活性の阻止効果の評価を我々が開発したトキソプラズマの薬剤スクリー行った。結果として，栄養型虫体の増殖と抑制し，ニング系について実際に薬剤ライブラリを用いる

宿主への毒性も低く，休眠型虫体への移行も抑制

ことで，薬剤スクリーニングが可能であることをする薬剤シーズをスクリーニングすることができ明らかにした。さらに薬剤スクリーニングと宿主る。

細胞への毒性試験，休眠型虫体への移行抑制試験の結果，被検化合物数1148個中，栄養型虫体およ３．結果と考察

び休眠型虫体の両方の増殖，移行抑制に効果のあ

栄養型虫体の増殖阻害率の解析を行った。解析を行った約3000種類の化合物について，解析のブる薬剤候補化合物として２化合物を得ることに成功した。

レの度合いが統計的な有意値の閾値（Z’値が0.5以

従来までのトキソプラズマ研究は，栄養型のタ上）の中に収まったものは，1148種類であった。

キゾイドによる活性化期の研究が盛んに行われて当初の予想より解析のブレが大きく，ブレが大ききたが，休眠型のブラディゾイトを内包するシス

いものは再度解析をやり直し，一回目の結果と合トによる潜伏期に関する研究はほとんど行われてわせて，最終的な解析結果を得た。原虫の増殖をいないことから，本研究は独創的な研究成果であ阻止する薬剤の陽性対照としてピリメタミンを用る。潜伏感染へ誘導せずに虫体を根治できる，あいた。増殖阻害活性が100％以上のもの（ピリメ

るいは休眠型虫体を特異的に破壊する理想的な抗タミンより高いもの）は，85化合物得られた。まトキソプラズマ薬の開発に直接つながる意義があ© The Ito Foundation食肉からの感染源となるトキソプラズマの休眠型虫体に関する研究

る。
４．要

約

畜産動物に対するトキソプラズマ薬では病態を引き起こす急性感染虫体を潜伏感染虫体へと移行させるだけで根本的な駆虫に至らないため，トキソプラズマの感染源となる食肉中の潜伏感染虫体を防除できる方策を確立する必要性がある。本研
究の目標は，トキソプラズマの感染源となる潜伏感染を阻害できる薬剤の同定を行うことで，食肉がトキソプラズマの感染源となる原因である潜伏
感染が起こる仕組みを解明することである。多検体で高感度に原虫の潜伏感染状態と増殖を評価できる系を確立し，公的化合物ライブラリを用いて栄養型虫体の増殖を抑える薬剤のスクリーニングに成功した。次に，得られた薬剤について宿主細胞への毒性試験も行った。さらに，ここまで絞り込まれた薬剤シーズについて潜伏感染への移行抑制試験を行い，２化合物を得ることに成功した。

261

文
献
１） Sugi, T., Masatani, T., Murakoshi, F., Kawazu, S.,
Kato, K. : Microplate assay for screening
Toxoplasma gondii bradyzoite differentiation with
DUAL luciferase assay, Anal Biochem, 464C, 9～11,2014.
２） Sakikawa, M., Noda, S., Hanaoka, M., Nakayama,
H., Hojo, S., Kakinoki, S., Nakata, M., Yasuda, T.,
Ikenoue, T., Kojima, T. : Anti-Toxoplasma antibody
prevalence, primary infection rate, and risk factors
in a study of toxoplasmosis in 4,466 pregnant womenin Japan, Clin Vaccine Immunol, 19, 365～367, 2012.
３） Sugi, T., Kawazu, S., Horimoto, T., Kato, K. : A
single mutation in the gatekeeper residue in
TgMAPKL-1 restores the effect of bumped kinase
inhibitor on cytokinesis arrest, Int J Parasitol Drugs
Drug Resist, 5, 18, 2015.
４） Sugi, T., Kobayashi, K., Gong, H.,Takemae, H.,
Ishiwa, A., Iwanaga, T., Horimoto, T., Akashi, H.,
Kato, K. : Identification of mutations in TgMAPK1of Toxoplasma gondii conferring the resistance to
1NM-PP1, Int J Parasitol Drugs Drug Resist, 3,93101, 2013.
５） Kato, K., Ishiwa, A. : Roles of carbohydrates in
the infection strategies of enteric pathogens, Trop
Med Health, 43, 41～52, 2015.
６） Kato, K., Murata, Y., Horiuchi, N., Inomata, A.,
Terkawi, M. A., Ishiwa, A., Ogawa, Y., Fukumoto, S.,
Matsuhisa, F., Koyama, K. : Dextran sulfate inhibits
acute Toxoplama gondii infection in pigs, Parasit
Vectors, 9, 134, 2016.

© The Ito Foundation

262

鶏肉の生産性向上を目指した安全な原虫防除法の開発
Construction of protective system against protozoan diseases for
productivity improvement in poultry industry

松

林

誠・谷

浩

行

（大阪府立大学大学院生命環境科学研究科）

Makoto Matsubayashi and Hiroyuki Tani
（Graduate School of Life and Environmental Sciences, Osaka Prefecture University）

Chicken coccidiosis is caused by protozoan parasites, Eimeria spp., which are members of
the phylum Apicomplexa. The disease is characterized as watery or bloody diarrhea inchickens, resulting in death, and thus, this possesses high impact in the poultry industry
worldwide. After ingestion of the oocysts by the host, Eimeria tenella generates a complex life
cycle including several asexual reproductions followed by sexual reproduction in the caeca. In
this process, the second-generation schizonts grow extremely huge including many merozoites
in the lamina propria, and consequently destroy the tissues. In the present study, weconstructed E. tenella specific DNA microarray using EST sequences registered in database,and analyzed by cDNAs during the development of the schizonts to identify the vaccine
candidates against the disease. As results, the up-regulated genes in an early development of
the schizonts were found to be involved in cytoskeletal genes or some peptidases, and while,some proteases or mitochondrial related genes were up-regulated at latter development. Now,
we try to construct the oral immune system using nonpathogenic Escherichia coli, on whichsurface membrane target proteins are expressed. These data are useful for screening the key
genes for the developments of the schizonts, and the molecules could be targets to produce
mucosal immunity for controlling the chicken coccidiosis.

１．目

われた生産現場におけるEimeria属原虫の全国調

的査では，肉用鶏農家で７割，採卵鶏農家で５割の鶏コクシジウム症は，Eimeria属原虫によって引き起こされる感染症である。感染した鶏は下痢

陽性率であり，本原虫は我が国で広く存在し，常在化していることが示されている１）。

や血便を呈し，重篤化した場合は死亡する。成鶏

鶏に寄生するEimeria属原虫の生活環は，以下では一般に無症状で耐過することも多い。しかのとおりである。感染鶏の糞便とともに排泄されし，採卵鶏では産卵率の低下をまねき，また幼雛たオーシスト（虫卵のようなもの）は，鶏の体外では感受性が高く，感染鶏が致死しない場合ででその内部にスポロゾイトと呼ばれる虫体を形成

も，肥育効率の著しい低下をきたす。2007年に行する。このオーシストは強固な殻に包まれてお© The Ito Foundation

263

鶏肉の生産性向上を目指した安全な原虫防除法の開発

り，外界環境下で長期間生存でき，かつ農家で一るため，シゾント形成に必須となる遺伝子の同定

般に使用される薬剤に対して強い抵抗性を有すを試みた。

る。そのため，いったん，農場がオーシストにより汚染されると，清浄化は極めて困難となる。感

２．方法

染は，このオーシストを鶏が経口的に摂取するこ2.1とによる。摂取されたオーシストは腸管内で脱嚢

２週齢の幼雛にE. tenella胞子形成オーシスト

し，つまりオーシストからスポロゾイトが遊離を２ｘ104 個投与し，経時的に寄生部位である盲

し，腸管粘膜に侵入する。その後，粘膜内で数回腸を採取した。盲腸は，滅菌PBSで洗浄後，ティの無性生殖，そして有性生殖を行い，新たなオーシュー・テックO.C.T.コンパウンド（サクラファ

シストが産出される。この増殖の過程において，インテックジャパン）に包埋し，使用まで－80℃

腸管粘膜は損傷し，感染鶏は下痢および血便症状で保管した（動物実験承認番号を生じることとなる。

感染盲腸の採取第12-072号）。

2 . 2 第２代無性生殖期虫体の採取

鶏コクシジウム症の予防としては，抗コクシジ

包埋した感染盲腸は，凍結状態のままクリオス

ウム作用を有する飼料添加物が使用されている。

タット（Leica Microsystems）により薄切し，トしかし，鶏畜産物への残留問題や副作用等から，ルイジンブルーで染色した。顕微鏡下で第２代シ

鶏には低用量で使用されるため，原虫の感染を完

ゾントを鑑別し，形態的に４つのステージ（１：

全に阻止できない。そのため，発症は予防できて虫体の直径15μm以下の発育初期未成熟シゾント，

も，消化管内で増殖した原虫は糞便とともに排泄２：15～30μmの発育中期未成熟シゾント，３：される。また，採卵鶏では使用は認められておら30μm以上の発育後期未成熟シゾント，４：30μm

ず，肉用鶏では出荷前には投薬ができない等，使以上のメロゾイト包含成熟シゾント）に分類し，用には厳しい制限がある。そのため，原虫の感染

それぞれの虫体をレーザーマイクロダイセクショ

を完全に阻止できる防除方法の開発が強く希求さ

ンシステム（LMD6000 MPP, Leica Microsystems）

れている。

により採取した。採取した原虫のtotal RNAは

本研究課題では，Eimeria属原虫の中でも，最RNeasy Mini Kit（Qiagen）で 抽 出 後 ，Takara

も病原性が高いとされる盲腸寄生性のEimeria

RNA PCR Kit（AMV）Ver3.0（Takara Bio）に

tenellaについて，以下の解析を行った。これまで

よりcDNAを合成した。

に我々は，E. tenellaの病態発現は，第２代目の2 . 3 マイクロアレイの構築とデータ解析

２）

無性生殖に大きく依存することを確認している 。

NCBI お よ び TGI database に 登 録 さ れ て い る

つまり，３代あるうちの第２代目の無性生殖期のEST情報を基に，約3,000の遺伝子について特異み，シゾントとよばれる分裂体（繁殖体）は腸管

プ ロ ー ブ を 設 計 し ，カ ス タ ム マ イ ク ロ ア レ イ

粘膜深層に寄生し，また大きく発育し，組織を著（Agilent Technologies）を作製した。プローブ

しく破壊する。この点に着目し，第２代シゾントと し た 遺 伝 子 情 報 の 最 適 化 は ，CLC Genomicsの形成を阻止すれば，病態は発現せず，かつE.

Workbenchを用いて再BLAST検索を行い，最新

tenellaの生活環を遮断できると考えた。本研究でのアノテーション付けを行った。合成した各発育は，薬剤を使用しない新規防除方法を提案すべ

ステージのcDNAとハイブリダイゼーションを行

く，新たなワクチン抗原となる標的分子を探索すい，Array-Pro Analyzerにより蛍光強度値の定© The Ito Foundation

264

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

量を行った。シゾントの形成過程において，強発ていた。ステージ３から４では，シゾント内部に現する遺伝子を選別した。

おいて多数のメロゾイトが形成され，成熟した

2 . 4 選定遺伝子の発現解析

後，これらのメロゾイトは遊離する。その後，メマイクロアレイ解析により発現の変動が認めら

ロゾイトは再度，腸管粘膜に侵入し，第３代目のれた遺伝子について，いくつかを抽出し，同上の無性生殖を行う。したがって，ステージ３から４

方法によりcDNAを合成し，リアルタイムPCR

は，次世代の侵入型の虫体の分化期と位置づけら（PCR LightCyclerⓇ 1.5, Roche Diagnostics）を行

れ，これらの遺伝子はメロゾイトの成熟に必須のい，比較Ct法により発現解析を行った。

遺伝子が含まれている可能性があると考えられた。
第２代無性生殖期の虫体の発育に伴って，発現３．結果と考察上昇が認められたいくつかの遺伝子について，リマイクロアレイ解析のプローブとしたEST遺

アルタイムPCRにより，発現変動を確認した。そ伝子情報について，再BLASTによる最適化をの結果の１部をFig.１に示す。ToxomepsinはE.

行ったところ，遺伝子情報が不明であった435遺

tenellaと極めて近縁な原虫であるトキソプラズマ

伝子について，新たにアノテーションを付加する

原虫が産生するaspartic proteaseの１種であり３），ことができた。マイクロアレイの結果の集計は，Cathepsin C3 は lysosomal cysteine protease の １

各ステージにおいて２倍以上発現が変動している

種４），Microneme protein 3は，Eimeria原虫の宿遺伝子を抽出した。その結果，シゾントの内部に主細胞への侵入に関与すると考えられている５）。

おける細胞分裂期と考えられるステージ１からその結果，抽出した遺伝子において，リアルタイ

２，および２から３では，それぞれ412，523の遺ムPCRとマイクロアレイの結果との整合性を得る

伝子（細胞骨格関連遺伝子やペプチダーゼ等）のことができた。

発現が上昇していた。この時期において，シゾン

現在，我々は，非病原性大腸菌の表層に標的分

ト内部では核分裂とそれに続く細胞質の分裂が行子を発現させ，死菌として鶏に経口的に摂取さわれていると考えられ，これらの遺伝子は虫体のせ，粘膜免疫を惹起させるシステムの開発に取り分裂期に関与することが示唆された。ステージ３組んでいる。マイクロアレイの結果については，

から４では，システインプロテアーゼやミトコン

現在，さらに詳細にデータ解析を進めている段階

ドリア関連遺伝子等，190の遺伝子が発現上昇しではあるが，これらのシゾント形成に関与する遺A. Toxomepsin

B. Cathepsin C３

C. Microneme protein ３

50

30

25

40

25

20

20

30

15

15

20

10

10

10

５

０

０

１

２

３

４

５
１

２

３

４

０

１

２

３

４

Fig. 1 mRNA expression levels of some genes in four types for developmental stages of E. tenella（1, ＜10μm earlystage ; 2, 10-25μm small immature schizonts ; 3, 25-30μm large immature schizonts ; 4, ＞30μm mature schizonts）.
The vertical axes show the fold of relative mRNA expression levels compared with those of No. 1. A : Toxomepsin,
B : Cathepsin C3, C : Microneme protein 3.

© The Ito Foundation

鶏肉の生産性向上を目指した安全な原虫防除法の開発

265

伝子は，その有効なワクチン抗原となると期待さゾントの内部で次世代の侵入型の虫体を形成するれる。

分化・成熟期では，システインプロテアーゼやミ

４．要

トコンドリア関連遺伝子等，190の遺伝子が発現

約上昇していた。これらの遺伝子には，虫体の分本研究課題では，養鶏現場において多大な損害をもたらす鶏コクシジウム症について，現行の抗化・増殖に必須の遺伝子が含まれていると考えられた。

コクシジウム剤に代わる新規防除方法を開発するために，以下の解析を行った。高病原性であるE.
tenellaについて，鶏体内での増殖を遮断するため，その分化・増殖に必須となる遺伝子の同定を試みた。E. tenellaでは，鶏盲腸粘膜内での第２代目の無性生殖期において，鶏が致死する等の病態が発現する。このため，E. tenellaに特異的なマイクロアレイを構築し，第２代無性生殖期における網羅的発現解析を行った。その結果，シゾン
トの内部における細胞分裂期と考えられるステー
ジでは，細胞骨格関連遺伝子やペプチダーゼ等，

文献１） Nakamura, Y., Kanehira, K., Isobe, T., Kamio, T. :Bull Natl Inst Anim Health, 117, 1～10, 2010.
２） Matsubayashi, M., Hatta, T., Miyoshi, T.,
Anisuzzaman Alim, M. A., Yamaji, K., Shimura, K.,
Isobe, T., Tsuji, N. : Parasitology, 139, 1553 ～ 1561,
2012.
３） Zhao, G., Zhou, A., Lu, G., Meng, M., Sun, M., Bai,
Y., Han, Y., Wang, L., Zhou, H., Cong, H., Zhao, Q.,
Zhu, X. Q., He, S. : Parasit Vectors, 6, 175, 2013.
４） Turk, B., Turk, D., Turk, V. : Biochim Biophys
Acta, 1477, 98～111, 2000.
５） Labbé, M., de Venevelles, P., Girard-Misguich, F.,
Bourdieu, C., Guillaume, A., Péry, P. : Mol Biochem
Parasitol, 140, 43～53, 2005.

約500の遺伝子の発現が上昇していた。また，シ© The Ito Foundation

266

豚マイコプラズマ性肺炎抗病性育種ランドレース豚と一般
ランドレース豚との自然免疫関連分子および腸内環境比較
Comparison of innate immune related molecules and an entrail
environment between landrace pigs that have been selected for genetic
resistance to mycoplasmal pneumonia of swine (MPS) and normal landrace
pigs

佐久間

晶子・吉野

淳良・高橋

伸和・野地

智法＊・須田義人＊＊・麻生久＊（宮城県畜産試験場，＊東北大学大学院農学研究科，＊＊宮城大学食産業学部）

Akiko Sakuma, Jyunryo Yoshino, Nobukazu Takahashi, Tomonori Nochi＊，Yoshihito Suda＊＊ and Hisashi Aso＊
（Miyagi Livestock Experimental Station, Miyagi, Japan, ＊Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University,＊＊Department of Food, Agriculture and Environment, Miyagi University）

Chronic respiratory infectious disease of swine poses a huge economic threat to the swine
industry. The over-use of antibiotics could result in drug resistant bacteria, while antibiotics
are commonly used to avoid these infectious diseases. We dereloped the landrace pig breed tobe genetically resistant to Mycoplasmal pneumoniae of swine（MPS）caused by Mycoplasma
hyopneumoniae（M.hp）. In this study, we fed the MPS resistant landrace pig breed（LA）andthe general landrace pig breed（Cont.）without a vaccination for MPS and compared between
the MPS resistant landrace pig breed（LA）and the general landrace pig breed（Cont.）
pathologically and immunologically. We also compared intestinal flora between them. LA hasless macroscopic and microscopic lung lesions than Cont. and has more OTU area of
Clostridium cluster Ⅳ. The quantity of TLR2, IL-12p40, TNF-α, and IFN-γ in LA have aless tendency than Cont. The histological lung lesion scores in LA have a positive correlation
with the quantity of TLR2 and IFN-γ, and they also has a negative correlation with thequantity IL-12p40 in spite of the histological lung lesion score in LB having a negative
correlation with the quantity TLR2 and IFN-γ. Also, the histological lung lesion scores have anegative correlation with the OTU area of Clostridium cluster Ⅳ in all samples. In conclusion,these findings suggest that LA has a MPS resistance without having a vaccination for MPS,
and it also suggests that LA has a different immunological mechanism than Cont. Additionally,
Clostridium species in intestinal flora might play a role in lung lesions occuring in pigs.

１．目

hyopneumoniae（M.hp）により引き起こされる１～３）。

的

また，MPSは豚呼吸器複合感染症の一つの原因

豚マイコプラズマ性肺炎（MPS）は，豚の慢性として考えられており，養豚業界に多大な経済的

呼吸器感染症の一つとして知られ，Mycoplasma

損失を生んでいる４）。M.hpが宿主の肺に感染し，© The Ito Foundation

豚マイコプラズマ性肺炎抗病性育種ランドレース豚と一般ランドレース豚との自然免疫関連分子および腸内環境比較

267

MPSが発症すると，肺は肉眼的に赤色から暗赤

じ一般飼育豚舎にて，抗菌性物質無添加飼料を飽

色調を呈し，触診では肝臓のような充実性の組織食させ，飼養し，171.2日齢にて，と畜をした。

に変化する。この病変は，肺の赤色肝変化病変と全供試豚に対し，試験開始前までに豚胸膜性肺言われ，MPSの肉眼的特徴病変として知られて炎，豚丹毒，豚サーコウィルス関連疾病のワクチ

おり，と畜時の内臓検査で多く認められる肉眼病

ンを接種し，MPSワクチンのみ接種しなかった。

変である

飼養後，採血・採糞し，血清生化学的に，TP,

。

１～３，
５）

このような感染症の制御方法として，ワクチン

Alb, A/G, Tchol, Glu, AST, GT, BUN, CRPを測定

接種，抗菌性物質投与，SPF豚の利用などがある

し ， Porcine Chemokine/Cytokine Panel 9plex

が，養豚農家の経済負担は大きく，さらに豚へのKit（affymetrix, Austria）を用いて，IFN-α，抗菌性物質の過剰使用は，ヒトの医療現場でも問IFN-γ，IL-1β，L-10，IL-12p40, IL-4，L-6，

題である薬剤耐性菌出現の可能性を増大させる６）。

IL-8，TNF-αをマルチプレックスアッセイ法

近年，豚の感染症防御策の一つとして，抗病性（Bio-Plex MAGPIX system （BIO-RAD, USA））

育種が注目され，宮城県畜産試験場では，MPSにより測定した。

肉眼的特徴病変「両側性赤色肝変化病変」の面積

2 . 2 肺病変調査およびM.hp抗原量測定を少なくする方向に改良を重ね，MPS病変面積

供試豚から，と畜時の内臓検査の際に肺を採取

育種価が低いランドレース種系統豚「ミヤギノ

し，検体ごとに肉眼的にMPS肺変化病変面積を測

L2」（LA）の造成に成功した

定した11）。また，１検体ごとに肺左側前葉後部の

。

７，８）

MPS病変は，M.hpへの宿主免疫の過剰反応に

右側中葉辺縁部の２カ所を採取し，一部をマイルより起こり，豚の肺のMPS病変形成には，自然ドホルム（Wako, Japan）にて固定後，パラフィ免疫に関与するパターン認識受容体（TLR）のンブロックを作成し，もう一部は，５×５㎜以下

TLR2およびTLR6が，強く関与していることがに加工後，Allprotect tissue reagent（QIAGEN,示唆されている 。また近年，腸内細菌叢は，生Germany）にて固定し，RNA抽出時まで－80℃

体免疫に大きな影響を及ぼし，感染防御や様々なにて保管した。パラフィン切片をHE染色し，組

内科的疾病に大きく関与していることが示唆さ

織学的病変スコアを測定した12）。組織学的に観察れ，ヒトの医療現場だけでなく，畜産業界でも注さ れ た 病 変 ４ 項 目 ，肺 胞 壁 の 肥 厚（Alveolar

目されている 。

Septal Infiltration），肺 胞 腔 へ の 炎 症 細 胞 浸 潤

9）

10）

今回，MPSワクチン未接種のLAと一般ランド（Alveolar Exudate），気管支周囲リンパ組織の発レース純粋種（Cont.）を同一環境下で飼育し，達（Peribronchiolar Lymphoid Hyperplasia），

肺の肉眼および組織学的病変を調査し，M.hp抗気管支粘膜への炎症細胞浸潤（Inflammation of

原量，TLR2・TLR6 mRNA量を比較した。さらLamina Propria）について，その程度と，出現度に，腸内細菌叢調査し，病変との比較を行なった。

に応じてスコアリングし（０：病変なし，１：軽２．方度・散在，２：軽度・びまん性，３：中程度・散法

在，４：中程度・びまん性，５：高度・散在，６：

2 . 1 供試豚および血清学的調査

高度・びまん性），さらに，各項目スコアを合計

豚 繁 殖・呼 吸 障 害 症 候 群 陰 性 養 豚 場 か ら ，し た 組 織 合 計 ス コ ア（Total Micscopic Lesion

103.2日齢のLA（６頭）とControl（６頭）を，同Score）についても，調査対象とした 12）。また，© The Ito Foundation

268

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

M.hpに対する免疫組織化学染色も行い，抗原陽

病理組織学的には，LAはCont.と比較して，組織性度合いに応じて，M.hp抗原量を測定した（０：

合計スコアが少なく，内訳として肺胞壁肥厚スコ

陰性，１：＋，２：＋＋，３：＋＋＋）。

ア，肺胞腔内の炎症細胞浸潤スコア，気管支粘膜
固有層への炎症細胞浸潤スコアで，有意に少な2 . 3 mRNA相対定量
保 存 肺 生 材 料 か ら ，Total RNA を 抽 出 し ，かった（p＜0.05）。これらのことから，MPSワク

cDNA を 作 成 後 ， Thermal Cycler Dice Real

チン未接種でも，LAはCont.よりも，MPS関連病

Time System Lite（Takara, Japan）を用いて，変が有意に少なく，MPS抗病性を示すことが示

TLR2, TLR6, IL12-p40, TNF-α，IFN-γの

唆された。

Ⓡ

mRNAを相対定量した（Ｈ遺伝子：βactin）。

免疫関連分子mRNA定量結果を，Table３に記

2 . 4 腸内細菌叢調査載した。上述のように，LAとCont.で病変スコア

糞便からDNAを抽出し，T-RFLP法を用いてに 差 が み ら れ た が ， 肺 内 の TLR2, IL-12p40,
TNF-α，IFN-γ量は，Cont.でやや多く発現し調査した（テクノスルガ・ラボ，Japan）。
2 . 5 統計解析ていたが，有意な差はなかった。TLR6量は，い

全統計量は，LAとCont.間の比較のため，Ｆ検ずれの個体も検出限界以下だった。

定 後 ，Ｔ 検 定 を 行 い ，定 性 結 果 に つ い て は ，

出荷時の腸内細菌叢（T-RFLP法）結果は，

Fisherʼs extract検定を行った。また，肉眼およ

Table４に記載した。LAは，Cont，と比較して，

び組織学的病変スコアと各定量結果について，Clostridium cluster IVのOTU面積が有意に大きPearson相関解析を行った。

く（p＜0.05）, Clostridium subcluster XIVaのOTU
は ，LA の み に 確 認 さ れ た（p ＜ 0.05）。ま た ，

３．結果と考察Clostridium cluster IV ・ Spirochaetes 門 の OTU

出荷時血清生化学的検査結果をTable１に記載

面積は，LAで，有意に小さかった（p＜0.1）。

した。いずれも，正常値範囲内であり，LAは

今回得られた，各病変スコアや抗原量の結果と，Cont.と比較して，Alb, A/G, Gluが有意に高かっ

血液生化学，mRNA量，腸内細菌叢結果とで相た（p＜0.05）。また，マルチプレックスアッセイ

関解析を行った（Table５）。すべての検体を用いでは，IL-12p40のみが検出され，Cont., LA間にた解析で，正相関がγGT-肺胞壁肥厚スコア（p差はなかった（Table１）。

＝ 0.06）， Clostridium cluster IV ・ Spirochaetes

出荷時の肺の，内臓検査，肉眼および組織学的

門OTU面積-M.hp抗原量（p＝0.07）でみられ，病変調査結果，ならびに，免疫組織化学染色結果

負 の 相 関 が ，A/G- 肉 眼 病 変 面 積（p ＝ 0.03），

について，Table２に記載した。と畜時の肉眼的Glu- 肉 眼 病 変 面 積（p ＝ 0.03），Bacteroides 目

内臓検査により，定性的にMPSと判定された個-M.hp抗原量（p＝0.06），Clostridium cluster IV

体数について，LA, Cont.で差はなかったが，豚（肺胞腔内炎症細胞浸潤スコア：p＝0.10，気管支

胸膜性肺炎と診断された個体数はCont.で有意に粘膜固有層への炎症細胞浸潤スコア：p＜0.01，

多かった（p＜0.1）。また，Cont.では６頭中２頭

組織合計スコア：p＝0.03），Clostridium cluster

で，免疫組織化学的にM.hp陽性と判断された。

IV‒気管支粘膜固有層への炎症細胞浸潤スコア

肉眼的肺肝変化病変面積は，Cont. 8.3％，LA 2.8％

（p＝0.10），で認められた。

となり，LAで有意に少なかった（p＜0.1）。また，

LA, Cont.をそれぞれに解析したところ，LAで© The Ito Foundation†：p＜0.1
Quantitive analusys resultsCont.
LA n＝6

6/6
5/6

4/6
0/6†

2/6
0/6

Cont. n＝6LA n＝6

Average±SD
Average±SD

Macroscopic MPS lesion area inlungs（％）
8.3±5.4
2.8±1.6†

Total Micscopic Lesion
score
Alveolar Septal Infiltration
7.1±2.7
2.1±1.8＊2.9±1.4
0.6±0.8＊

Alveolar Exudate
Peribronchiolar Lymphoid
Hyperplasia
Infla㎜ation of Lamina
Propria0.5±0.3
0.0±0.0＊

1.4±1.4
0.8±0.7

2.3±0.8
0.7±0.8＊

IHC of M.hp＊：p＜0.05

0.6±1.0

0.0±0.0

Table 3 Results of Relative Quantitation of real time PCRLA

Targets

Average±SD

Average±SD

TLR2
IL-12p40
TNFα
IFN-γ

1.7Ｅ-01±2.6Ｅ-01
2.3Ｅ-05±1.7Ｅ-05
1.1Ｅ-03±8.3Ｅ-04
2.5Ｅ-05±5.2Ｅ-05

1.4Ｅ-01±2.4Ｅ-01
1.8Ｅ-05±8.3Ｅ-06
8.2Ｅ-04±3.8Ｅ-04
1.8Ｅ-05±3.4Ｅ-05© The Ito Foundation
100

Each DNA samples from feces were cut by Bsl I restriction enzyme. †：p＜0.1；＊：p＜0.05

100

IHC of M.hp
Cont. n＝6100

Mycoplasmal
Pneumoniae of
Swine
PorcinePleuropneumonia

100

Qualitative analysis results

100

microscopic lesion and immunohistochemistry（IHC）of M.hp in this study

100

100

100

2.5
0.0
46.3
5.4
0.0
0.0
12.0
5.2
21.3
0.0
0.8
3.0
0.0
1.4
2.1

Table 2 Qualitative and Quantitive results of macroscopic,

1.3
0.0
44.0
8.3
0.0
1.9
12.5
4.4
24.5
0.0
0.0
1.0
0.0
0.0
2.0

100

2.7
0.0
18.2
10.6
0.0
0.6
12.5
13.6
38.5
0.0
0.0
1.1
0.0
0.0
2.2

100

1.2
0.0
57.5
4.0
0.0
0.9
11.7
2.2
15.3
0.0
1.1
2.5
0.0
0.0
3.6

＊：p＜0.05

2.6
0.0
36.9
2.3
0.0
0.0
5.3
20.2
27.4
0.0
0.5
1.8
0.0
0.0
3.0

100

2.0
0.0
28.6
3.8
0.0
0.0
7.4
23.4
29.5
0.0
0.0
1.8
0.0
0.0
3.7

85.17±5.0＊

2.8
0.0
47.1
4.1
0.0
0.0
19.0
1.8
19.3
0.0
1.0
3.1
0.0
0.0
1.9

10.78±1.4
98.83±4.9

3.4
0.0
17.4
3.0
0.0
0.0
9.7
25.6
34.7
0.0
0.0
3.3
0.0
0.0
2.9

35.33±7.212.50±3.594.83±5.8

3.1
0.0
36.5
2.6
0.0
0.0
7.0
20.8
24.9
0.0
0.0
2.6
0.0
0.0
2.6

47.33±14.8

g/dl
g/dl

2.1
0.0
31.3
4.4
0.0
0.0
9.8
15.7
27.5
0.0
1.6
1.7
0.0
0.0
5.9

g/dl

BUN
Tchol

6.4
0.0
18.0
2.3
0.0
0.0
4.4
32.4
31.1
0.0
0.0
3.4
0.0
0.0
1.9

γGT

100

4.1
0.0
34.5
7.7
0.0
2.5
19.3
6.1
18.9
0.0
1.6
3.5
0.0
0.0
1.8

100.0

3.4
0.0
31.2
3.1
0.0
0.0
9.2
19.4
27.5
0.0
0.5
2.6
0.0
0.0
3.0

Cont

100.0

2.3
0.0
38.2
6.6＊
0.0
1.0＊
12.6
9.1†
24.7
0.0
0.6
2.1
0.0
0.2
2.6

LA

Average area ratio of OTU（％）

34.50±17.9LA62.37±0.3＊

22.83±9.0

LA5111.01±92.5

1.93±0.2

g/dl

Streptoco㏄us
Actinobacteria
Bacteroides
Clostridium cluster IV
Clostridium cluster IX
Clostridium subcluster XIVa
Clostridium cluster
Clostridium cluster IV，Spirochaetes
Clostridium cluster IV，Bacteroides
Lactobacillales, Clostridium cluster IV
Firmicutes
Lactobacillales, Clostridium subcluster XIVa
Deltaproteobacteria
Betaproteobacteria
None

LA4

131.5717±155.3

g/dl

LA3

Obs. Conc．

A/G

AST

LA2

0.12±0.1

IL-12p40
4.87±0.3＊LA10.08±0.0

6.93±0.3

4.55±0.1

Cont.679.00±3.4g/dl
6.93±0.2

g/dl

Samples area ratio of OTU（％）

g/dl
g/dl

Cont.5

Glu

CRP
TP

Alb

Cont.4

Average±SD

Cont.3

Average±SD

Cont.2

LA

Cont.1

Table 1 Results of blood serum biochemical analysis

Presumed Bacterial Groups

theslaughtering
inspections
results
Cont.

Table 4 The result of T-RFLP

Microscopic Lung
Lesion score

豚マイコプラズマ性肺炎抗病性育種ランドレース豚と一般ランドレース豚との自然免疫関連分子および腸内環境比較

269

Table 5 The results of correlation analysis（correlation coefficients）

平成27年度OTU

270
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）© The Ito Foundation

豚マイコプラズマ性肺炎抗病性育種ランドレース豚と一般ランドレース豚との自然免疫関連分子および腸内環境比較

271

は，TLR2とIFN-γで組織病変と正の相関があり

MPS抗病性が発揮されており，LAとCont.で病変（気管支周囲リンパ組織の発達スコア：p＝0.03，形成に関わる免疫機構が異なる可能性が示唆され気管支粘膜固有層への炎症細胞浸潤スコア：p＝た。さらに，肺の病変形成にも，腸内Clostridium

0.02），IL-12ｐ40と肺胞壁肥厚スコアで負の相関属菌の関与が示唆された。

があった（p＝0.01）。一方，Cont.では，組織学的病変と，TLR2, IFN-γで負相関が認められた（肺胞腔への炎症細胞浸潤スコア：p＝0.07）。また ，LA の み 観 察 さ れ た Clostridium subcluster
XIVaのOTU面積は，LAの肺胞壁肥厚スコアと正相関があった（r＝0.80，p＝0.06）。
これらの相関解析結果から，病変が少ないLA
で多くみられたClostridium cluster IVに分類される腸内細菌を多く保有している豚ほど，組織学的病変が少ない可能性が示唆された。腸内細菌の中でClostridium属菌は，免疫抑制に関与する制御生Ｔ細胞（Treg）産生を誘導することが知ら
れ て い る 13）。今 回 ，Treg が 産 生 す る IL-10 のmRNA量の調査は行っていないが，LAの肺内の各サイトカイン量は，Cont.よりも，全体的に少ない傾向にあったことから，腸内Clostridium属菌が誘導したTregにより，病原体に対する免疫応
答が抑制され，肺病変形成が軽度化した可能性も示唆された。
４．要約

豚慢性呼吸器感染症は，養豚業に多大な経済的損失を生んでおり，感染症制御策として用いられる抗菌性物質は，薬剤耐性菌出現の可能性が懸念されている。今回，MPSの肉眼病変面積を少なくする方向に抗病性育種を行ったLAとCont.を，
MPSワクチン未接種下で飼養し，肺の病理学的検索を行い，さらに，MPS感染関連免疫関連分子（Toll like receptor（TLR）2・TLR6・IL-12p40・
TNF-α・IFN-γ）mRNA量や，直腸内細菌叢を比較し，病理学的検索結果との相関解析を行っ文献１） Jubb, K. J. F. et al., ed. : The respiratory system.
In, Pathology of Domestic Animals, 5th ed. Vol.2, 579～594, Saunders Ltd, 2007.
２） 久保正法，石川弘道，共著：豚病診断カラーアト
ラス―同一症例に迫る臨床と病理―，初版，40～
44，有限会社ベネット，2009.
３） 日本獣医病理学会編：動物病理カラーアトラス，
１版，73，文永堂出版株式会社，2007.
４） Yamamoto, K. : Porcine Respiratory Disease
Complex, Por. Jpn. Pig. Vet. Soc., 43, 7～8, 2003.
５） 宮城県食肉衛生検査所：平成26年度事業概要，
2015.
６） Tamura, Y. : Trends in Antimicrobial agents for
Veterinary Use and Control MeasuresofAntimicrobial Resistance, J. Jpn. Vet. Med. Assoc.,
56, 685～691, 2003.
７） Kadowaki, H., et al. : Selection for resistance toswine mycoplasmal pneumonia over 5 generationsin Landrace pigs, Livestock Science, 147, 20～26,
2012.
８） Katayama, M., et al. : Immunophenotype
Characterization for Swine Selected Line, Which is
Resistant for the Mycoplasma Pneumonia, AsianAust. J. Anim. Sci., 24, 889～897, 2011.
９） Muneta, Y., et al. ： Porcine TLR2 and TLR6 ：identification and their involvement in Mycoplasma
hyopneumoniae infection, J. Interferon. Cytokine.
Res., 23, 583～90, 2003.
10） Biedermann, L., et al. : The intestinal microbiota :its role in health and disease, Eur J Pediatr., 174, 151～67, 2015.
11） Goodwin, R. F., et al. : Enzootic pneumonia ofpigs : immunization attempts inoculating
Mycoplasma suipneumoniae antigen by various
routes and with different adjuvants, Br. Vet. J., 129,456～64, 1973.
12） Opriessnig, T., et al. : Experimental reproductionof postweaningmultisystemic wasting syndrome inpigs by dual infection with Mycoplasma
hyopneumoniae and porcine circovirus type 2, Vet
Pathol., 41, 624～40, 2004.
13） Atarashi, K., et al. : Induction of colonic
regulatory T cells by indigenous Clostridium
species, Science, 21, 337～41, 2011.

た。結果，LAはMPSワクチンの接種に関わらず，© The Ito Foundation

272

磁気ビーズルシフェラーゼ免疫沈降法による抗豚流行性下痢ウイルス抗体検出系の開発
Development of a luciferase immunoprecipitation assay for detection of
antibodies against porcine epidemic diarrhea viruses

堀

江

真

行

（鹿児島大学共同獣医学部附属越境性動物疾病制御研究センター）

Masayuki Horie（Transboundary Animal Diseases Research Center, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）is the causative agent of PED that is a highly
contagious enteric disease in pigs. In Japan, big PED outbreaks started in 2013, which havecaused serious economic losses in the swine industry. Serological assay is widely used forsurveillance of PEDV invasion in swine herds. Currently, neutralization test（NT）is used for
detection of anti-PEDV antibodies in Japan. However, NT is time-consuming and laborious,and needs special equipment such as a biosafety cabinet because infectious virus is used forthe assay. Thus, easier antibody detection methods are warranted. Gaussia luciferase
immunoprecipitation（GLIP）assay is an antibody-detection system that utilizes Gaussia
luciferase-fused target antigens. GLIP is high-throughput and have been reported to be
applied to detection of antibodies against several pathogens. Thus, in this study, I tried todevelop a GLIP to detect anti-PEDV antibodies（PEDV-GLIP）. I constructed a plasmid vector
pGLIP2-PEDV N, which expresses Gluc-fused PEDV N protein. First, I tested a GLIP using
PEDV N（PEDV N-GLIP）using 2 pig sera negative for NT and an anti-PEDV N mousemonoclonal antibody, revealing that the PEDV N-GLIP can specifically detect anti-PEDV
antibodies. I further performed the PEDV N-GLIP using several pig sera. Some serum samples
showed inconsistent results in NT and PEDV N-GLIP. This might be due to a non-specificanti-PEDV inhibitor（s）in NT, or non-specific antibodies in PEDV N-GLIP. Alternatively, thesera contains different types of antibodies. Further studies are needed to assess the possibilities.
On the other hand, the constructed plasmid vectors are applicable for other pathogens, andthus they would be useful to develop novel antibody detection systems.

１．目て長年，PEDは散発的にしか見られていなかっ的

たが，2013年末より全国において爆発的流行が起

豚流行性下痢ウイルス（PEDV）は豚に感染

こり，これまでに約50万頭もの新生仔豚がPEDし，嘔吐・下痢を主症状とするPEDを引き起こ

によって死亡した（2016年４月18日現在）。PED

す。PEDは特に新生仔豚で被害が甚大であり，は現在も日本国内において流行しており，PEDV

死亡率が100％に達することもある。日本においは常在化したと考えられる。

© The Ito Foundation

磁気ビーズルシフェラーゼ免疫沈降法による抗豚流行性下痢ウイルス抗体検出系の開発

豚群におけるPEDVの浸潤状況の調査にはウイルス核酸を検出するPCR法に加え，抗体検出法が広く用いられている。近年，農林水産省の主導のもとに，中和抗体検出法による抗PEDV抗体保有

273に免疫沈降に磁気ビーズを使用することによる省力化を試みる。
２．材料と方法

状況が全国において調査された。しかし，中和抗2.1

体検査は適切な細胞数の培養細胞の準備，血清と血清サンプルは大分県家畜保健衛生所より分与

ウイルスの混合，ウイルス感染および観察など非いただいた。これらの血清に関して，PEDVの常に手間と時間がかかる。代替法として免疫蛍光

NK94P6株を用いた中和試験が大分県家畜保健衛抗体法が存在するが，抗原としてウイルス感染細生所にて行われた。陽性コントロールとして抗胞を用い，顕微鏡下での観察を必要とするため中PEDV S 3F12マウスモノクローナル抗体（Median

和抗体検査と同じく手間と時間がかかる。さらにDiagnostics）を用いた。なお，抗PEDV Sマウス

両検出法ともウイルスの感染が必要となるため，

モノクローナル抗体は実際にはPEDV Nタンパク

バイオセーフティレベル２の施設が必要となる。

質を特異的に認識したため，本稿では抗PEDV N

そのため，より簡便なPEDV抗体検出法の開発が抗体と記す。

望まれている。

2.2

血清サンプルと抗体

GLIP抗原発現プラスミドベクター

ル シ フ ェ ラ ー ゼ 免 疫 沈 降 法 （luc iferase

本研究ではGLIP抗原発現プラスミドベクターとimmunoprecipitation system : LIPS）は培養細胞してpGLIP2（Fig.２a）およびpGLIP3（Fig.２b）において発現させたウイルスタンパク質－ルシを構築した。本稿ではプラスミド構築に関する詳

フェラーゼの融合タンパク質を抗原とし，免疫沈細を省略する。

降とルシフェラーゼによる発光を利用した抗体検

PEDV N-GLIP抗原発現プラスミドは以下のよ

出法（Fig.１）である 。LIPSは他の検出法と比うに構築した。なお本稿では遺伝子クローニング

較してより迅速・簡便で，ウイルスそのものを使などの詳細は省略する。PEDVの生ワクチン（日用しないため，抗PEDV抗体検査に極めて適した

生研PED生ワクチン；日生研）あるいは野外株系である。本研究ではLIPSを利用した抗PEDV抗よりRNAを抽出し，逆転写PCRによってＮ遺伝体検出系の開発を行う。さらに効率のよい検出を子増幅し，pGLIP2ベクターに挿入した。得られ目指し従来のRenillaルシフェラーゼの代わりに，

たプラスミドをpGLIP2-PEDV-Nと名付けた。

１）

より活性が高く安定なGaussiaルシフェラーゼ

PEDV M-GLIP発現プラスミドとして，Ｎ遺伝（Gluc）を用いたLIPS（GLIP）を開発する。さら子と同様にPCRにより増幅したＭ遺伝子全長をIuminescence
Serum sample

Viral protein

Ab（＋）
Cetrifugation
Wash

Gluc
SubstrateAb（－）

Anti-viral protein
Protein A/G

Fig. 1 A schematic figure of LIPS. The theory of LIPS is shown. Ab, antibodies.

© The Ito Foundation

274

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

CMV

３xFLAGCAG

MCS

apGLIP２

Gluc

MCS

b
pGLIP３

Gluc

FLAG

IRES

PuroＲ

Fig. 2 pGLIP2 and pGLIP3 vector plasmids. Schematic figures of pGLIP2（a）and pGLIP3（b）are shown. Promoters

are indicated by black boxes and white letters. Gluc, Gaussia luciferase ; MCS, multi cloning site ; IRES, internal
ribosome entry site ; PuroR, puromycin resistant gene.

pGLIP3ベクターへ，Ｍ遺伝子の細胞質内領域をいはAnti-Rabbit Immunoglobulins/HRP（Dako）

pGLIP2ベクターへと挿入した。これらのプラスを用いた。シグナルの検出にはECL prime（GE

ミドをpGLIP3-PEDV-MおよびpGLIP2-PEDV-

ヘルスケア）を用いた。

Mcytoと名付けた。

2.5

GLIPアッセイ

PEDV S-GLIP抗原発現プラスミドとして，同１検体当たり１×10７のGLIP抗原を用いてGLIP

様にPEDV SのS2領域をpGLIP3へクローニング

アッセイを行った。GLIP抗原および血清検体はした。得られたプラスミドをpGLIP3-PEDV-S2

Buffer A（50mM Tris pH7.5, 100mM NaCl, 5mMと名付けた。

MgCl2，１％ Triton-X100）を用いて希釈した。

2.3

PEDV-GLIP抗原の作成

100μlのGLIP抗原液と100μlの血清希釈液を混合

６ウェルプレートに7.5×10５293Ｔ細胞を播種し，ローテーターを用いて室温１時間反応させし，翌日にLipofectamine 2000を用いてGLIP抗原

た。免疫沈降には１検体当たり20μlのSureBeads

発現プラスミドのトランスフェクションを行っ

Protein G（Bio-Rad）を添付の説明書に従って加た。トランスフェクションには２μgのプラスミド

えた。ローテーターにて室温30分反応させた後，と４μLのLipofectamine 2000 reagentを用いた。

500μlのBuffer Aを用いて４回洗浄を行った後，48時間後に500μLのRenilla lysis buffer（Promega）

Renilla Luciferase Assay System（Promega）をにより細胞を溶解し，遠心（20,600×ｇ，10min，

用いてルシフェラーゼ活性を測定した。

４℃）にて細胞残渣を除いたものをGLIP抗原として使用した。
2.4

３．結果と考察3.1

ウエスタンブロット

新規GLIP発現プラスミドベクターの構築

定法に従ってSDS-PAGEを行い，PVDFメン

本研究ではPEDVのスパイクタンパク質（Ｓ），

ブレンに転写した後，ブロッキングワン（ナカラメンブレンタンパク質（Ｍ）およびヌクレオカプイ）にて室温１時間のブロッキングを行った。一シドタンパク質（Ｎ）をGLIPに用いる抗原とし

次抗体は2000倍希釈の抗FLAGマウスモノクローて選択した。これらのタンパク質はPEDV構造タナル抗体M2（SIGMA）あるいは1000倍希釈のンパク質の中で抗原性が高く，過去の抗体検出系

Anti-DDDDK-tag ウ サ ギ ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体でも抗原として用いられている。また，Ｍおよび（MBL）を用いた。二次抗体にはそれぞれ2000倍

Ｎタンパク質はウイルス株間でよく保存されてい希 釈 の Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP あ る

るため，広範な抗PEDV抗体検出が可能であると© The Ito Foundation

磁気ビーズルシフェラーゼ免疫沈降法による抗豚流行性下痢ウイルス抗体検出系の開発考えられた。

275

をコードする配列を挿入した（Fig.２b）。これら

著者は過去にGLIP発現プラスミドベクター
pGLIPを作成した２）が，さらなる利便性を追求しのプラスミドにPEDVの各遺伝子をpGLIP2ある
いはpGLIP3に挿入した（材料と方法参照）。

新規GLIP発現プラスミドベクターを構築した。

3.2

pGLIP2ベクターはpGLIPベクターよりGlucのシ

はじめに，それぞれのプラスミドを293Ｔ細胞

グ ナ ル ペ プ チ ド 領 域 を 削 除 し た（Fig. ２ a）。

に導入し，細胞溶解液のルシフェラーゼ活性を測

pGLIP3ベクターはpMN1Purベクター３）をバック定した。すべてのプラスミド導入細胞において，ボーンとする。pMN1PurベクターはCAGプロ

非導入細胞と比べて高いルシフェラーゼ活性が確

モーターを持つため，CMVプロモーター依存性認された（Fig.３a）。pGLIP2-PEDV-Nでは非常にのpGLIP2より強力な発現が期待される。また高いルシフェラーゼ活性が得られたが，pGLIP3-

pMN1Purベクターの特徴として安定発現株を容PEDV-S2ではやや活性が低く，pGLIP3-PEDV-

易に作成することができることがあげられる 。

M，pGLIP2-PEDV-Mcyto に関してはかなり活性

本研究ではpMN1PurのMCSにGlucとFLAGタグが低かった。

３）ａ

PEDV-GLIP抗原の発現

107
106
105
104
103
102
101

PEDV MPEDV S２PEDV N

-

Empty

ｂ

PEDV
Mcyto

ｃ

95
72

-

PEDV Mcyto

PEDV N PEDV S２ PEDV MPEDV M

Empty

PEDV S２

-

empty

100

PEDV Mcyto

Luclferase unit
per 10μl cell lysate

108

95
72

55

55

43

43

34

34
26

26

Fig. 3 Expression of GLIP antigens. Expression ofGLIP antigens were confirmed by luciferase assay（a）and western

blotting（b and c）.（a）Transfected cells were lysed and measured the luciferase activity. Empty, pGLIP2 plasmid.
（b and c）Western blotting analysis using anti-FLAG antibody.（b）Cells were lysed and directly used as antigens.
（c）Cell lysate were immunoprecipitated with anti-FLAG antibodies, and used as antigens. Numbers indicate
molecular weight（kDa）.

© The Ito Foundation

276

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

次にFLAG抗体を用いたウエスタンブロット法

PEDV N-GLIPについて検討を行った。

により目的の抗原タンパク質の発現を確認した

最初にPEDV中和抗体陰性の血清２検体（#25，（Fig.３b）。その結果，pGLIP2-PEDV-NとpGLIP2-#26）を陰性コントロール，抗PEDV Nマウスモ

Mcyto では目的の分子量のバンドが得られた。一ノクローナル抗体を陽性コントロールとして用方 ，pGLIP3-PEDV-S2 ，pGLIP3-PEDV-M で はい，GLIPアッセイを行った（Fig.４a）。抗PEDV

目的のバンドは観察されなかった。そのため抗中和抗体陰性血清に関しては，最適な希釈倍率をFLAG抗体による免疫沈降後にウエスタンブロッ

決定するために10倍および100倍希釈にて行った。

トを行ったところ，すべてのPEDV GLIP抗原の抗PEDV N抗体ではそれぞれ4.08×10５LUが観察

発現が確認された（Fig.３c）。このことから，された。一方，抗PEDV中和抗体陰性血清では9.96

pGLIP3-PEDV-S2，pGLIP3-PEDV-M，pGLIP2-×10２ ～6.71×10３LUと，血清非含有検体とほぼ

PEDV-Mcyto導入細胞では目的抗原が発現してい同等のシグナルが観察された。これらのことかるものの，その発現量が少ないことが示された。

ら，PEDV N-GLIPは抗PEDV N特異的抗体を検

GLIP抗原の発現量が低かったS2およびＭにつ出できることが示された。

いて，これらのGLIP抗原の安定発現細胞株の作

次に７検体の中和抗体陰性血清と９検体の中和成を試みた。ピューロマイシンを用いた選択に抗体陽性血清（中和抗体価128倍以上）を用いてよって安定発現細胞株を得，２週間の培養後再び

PEDV N GLIPアッセイを行った（Fig.４b）。上ルシフェラーゼ活性を測定したところ，ルシフェ

記の条件検討において陰性血清では希釈倍率にかラーゼ活性は一過性発現と同程度であった（data

かわらずほぼ同じルシフェラーゼ活性を示したた

not shown）。今後，発現量の高い安定発現細胞

め，10倍希釈血清を用いた。中和抗体陰性血清でのクローニングや，ヒト細胞用に塩基配列を最適は６検体で低いルシフェラーゼ活性が観察された化することが必要である。

が，１検体において7.72×10４LUと非常に高い活

3.4

PEDV N-GLIPアッセイの検討性が見られた。中和抗体陽性血清では９検体中７

GLIPアッセイに十分なルシフェラーゼ活性が検体において高いルシフェラーゼ活性が観察され

得 ら れ た 抗 原 は PEDV N の み で あ っ た た め ，た。しかし，２検体では比較的低いシグナルが得

ａ

b
10６

10５

No serum
NAb
（－）
sera

10４

Anti-N mAb

10３
10２

-

x100
N1

x10

x100

x10

P

N２

Luclferase unit

Luclferase unit

10６

10５
10４
10３
10２

-

NAb
（－）

NAb
（＋）

Fig. 4 PEDV N-GLIP assay. Results of PEDV N-GLIP assays are shown.（a）PEDV N-GLIP assay was conductedusing 2 pig sera negative for neutralizing test（N1 and N2）and anti-PEDV N monoclonal antibody（P）.（b）PEDVN-GLIP assays was performed with 7 and 9 pig sera that are negative and positive for neutralization test,
respectively. NAb, neutralizing antibodies. Bars indicate advantages.

© The Ito Foundation

磁気ビーズルシフェラーゼ免疫沈降法による抗豚流行性下痢ウイルス抗体検出系の開発

277

られたのみであった。これらのことから中和試験

抗PEDV抗体検出法の開発を目的として行った。

とPEDV N-GLIPの結果は一致しないことが示さ

本研究ではルシフェラーゼとしてガウシアルシれた。

フェラーゼ（Gluc）を使用するGLIP法の開発を中和試験と本研究におけるGLIPの結果が一致試みた。ウイルス抗原としては抗原性が高くGluc

しなかった理由について，以下の３つの可能性がとの融合タンパク質の発現量が多かったPEDV N

考えられる。１つ目に，血清に含まれる抗体の種タンパク質を用いた。少数の中和試験陰性血清と類が異なる可能性がある。抗Ｎ抗体はウイルスの抗PEDV Nマウスモノクローナル抗体を用いてＮ

中和には関与しないため，中和抗体の有無と抗Ｎタンパク質のGLIPアッセイ（PEDV N-GLIP）を

抗体の有無は必ずしも一致しない。この場合は中検討したところ，PEDV N-GLIPは抗PEDV N抗和試験とGLIP法の結果は一致しない。２つ目に，体を特異的に検出できることが示された。しか血清が抗体以外の抗PEDV阻害物質を含む可能性

し，検体数を増やして中和試験陰性血清と陽性血である。この場合，中和試験で陽性であっても清を用いてPEDV N-GLIPを行ったところ，GLIP

GLIP法では陰性になる。３つ目に，血清中にの結果と中和試験の結果が一致しない検体が散見

PEDV N-GLIP抗原に非特異的に結合する抗体がされた。必ずしも中和試験の結果が抗PEDV抗体

存在する可能性である。この場合，中和試験で陰の有無を反映しているわけではないため，今後，性であってもGLIP法では陽性となる。これらの他の検出系において抗PEDV抗体の有無を検討す

可能性を検討するために，他の手法において抗体る必要がある。一方，本研究にて作成したプラスの存在を検討する必要があるが，これまでに信頼

ミドベクターは容易に外来遺伝子を容易に挿入可性のある抗PEDV抗体検出法は存在しない。現在，能であり，安定発現細胞株の作成も容易であるこ

抗PEDV抗体を検出できるウエスタンブロット法とから，本研究にて作成したツールは様々な動物や蛍光抗体法を検討している。

感染症の抗体検出系に応用可能である。

４．要

約

豚流行性下痢ウイルス（PEDV）は新生仔豚において致死的な下痢を引き起こすPEDの原因ウ
イルスである。PEDVの浸潤状況の調査には核酸
検 出 法 と 抗 体 検 出 法 が 用 い ら れ る 。現 在 ，抗PEDV抗体検出には中和試験が用いられているが，中和試験は操作が煩雑で時間がかかるうえ，
感染性ウイルスを用いるため相応の施設が必要となる。ルシフェラーゼ免疫沈降法（LIPS）は目的抗原とルシフェラーゼ融合タンパク質を用いた抗体検出系であり，ウイルスそのものを使わず，抗原の準備が比較的容易であることから，様々な感染症に対するハイスループット抗体検出法とし

文
献１） Burbelo, P.D., Goldman, R., Mattson, T.L. : A
simplified immunoprecipitation method forquantitatively measuring antibody responses inclinical sera samples by using mammalian-produced
Renilla luciferase-antigen fusion proteins, BMC
Biotechnol, 5, 22, 2005.
２） Matsuu, A., Hobo, S., Ando, K., Sanekata, T., Sato,F., Endo, Y., Amaya, T., Osaki, T., Horie, M.,
Masatani, T., Ozawa, M., Tsukiyama-Kohara, K. :Genetic and serological surveillance for non-primate
hepacivirus in horses in Japan,Vet Microbiol, 179,
219～227, 2015.
３） Iha, M., Watanabe, M., Kihara, Y., Sugawara, S.,
Saito, K., Soma, M., Sato, S., Mori, Y., Kasuga, K.,
Kojima, I., Sasamura, R., Murata, J., Kobayashi, M. :Effect of ectopic expression of homeoprotein
EGAM1C on the cell morphology, growth, anddifferentiation in a mouse embryonic stem cell line,
MG1.19 cells, Reproduction, 143, 477～489, 2012.

て近年注目を集めている。本研究はLIPSによる© The Ito Foundation

278

豚デルタコロナウイルスの感染動態に関する研究
Experimental infection with porcine deltacoronavirus in pigs

鈴

木

亨・大

橋

誠

一

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究所）

Tohru Suzuki and Seiichi Ohashi（National Institute of Animal Health, National Agriculture and Food Research Organization（NARO））

Deltacoronaviruses were first detected in rectal swabs from birds and pigs collected in
Hong Kong in 2009. Detection of porcine deltacoronaviruses（PDCoVs）, which are geneticallysimilar to the Chinese PDCoVs, was reported in United States for the first time in 2014. PDCoV
could be infected into pigs alone and induced diarrheas, although PDCoV co-infections withother enteric viruses were more common. Thus, PDCoV is currently one of common entericviral pathogen in pigs. In Japan, we identified recently multiple PDCoVs from fecal samples
with PEDV-specific RT-PCR negative and TGEV-specific RT-PCR negative. In the wholegenome analysis of those viruses using next generation sequencer, we discovered thatJapanese PDCoVs were genetically distinctive from US PDCoVs. In the present study, we
compared and analyzed symptoms, viral shedding and distribution in gnotobiotic piglets（3days old）orally inoculated with two PDCoV isolates（US PDCoV : MI/8977/2014, Japanese
PDCoV : YMG/JPN/2014）maintained in ST cell culture respectively, in order to understandtheir pathogenesis and pathogenicity. The piglets inoculated with both PDCoV developed
moderate to severe diarrhea, but all survived. The PDCoV-inoculated piglets shed increasing
amount of virus in feces and sera especially from 2 to 8 days post inoculation. The piglets
inoculated with US and Japanese PDCoV observed microscopic lesions in small and large
intestines with viral antigen confirmed by immunohistochemistry staining at 4 days post
inoculation, but there were differences in virus distribution and propagation between them.
This study experimentally confirmed pathogenesis of PDCoV and demonstrated characteristic
pathogenicity of two PDCoVs in neonatal piglets.

１．目

る新型コロナウイルスが様々な鳥種やレパードで的検出された。Wooらの研究グループは2009年に香2013 年 後 半 か ら 我 が 国 で は 豚 流 行 性 下 痢

港で採取した豚糞便から新たに豚デルタコロナウ（PED）が流行しているが，PEDウイルスによらイルスを検出した １）。米国でも，豚流行性下痢

ない下痢も同時に発生している。近年，アルファ，（PED）が流行している最中，2014年に下痢を呈ベータ，ガンマコロナウイルス属に次ぐ４番目のした個体から豚デルタコロナウイルスが検出され新しい属（デルタコロナウイルス属）に分類された２）。その後の調査から，豚デルタコロナウイル© The Ito Foundation

豚デルタコロナウイルスの感染動態に関する研究

279

スは比較的高い割合で下痢と関連しており，また施し，それら豚デルタコロナウイルス株に特徴的

他の豚消化器ウイルスとの混合感染のみならず，な臨床症状や感染動態を明らかにすることを目的

単独感染でも下痢を引き起こすことが明らかと

とした。

なってきた

。さらに，Thachilらは豚デルタコ

３，
４）

ロナウイルス特異抗体検出のためのELISA法を

２．方法開発し，近年の米国における浸潤状況調査を実施

2.1

ウイルスと細胞した ５）。その結果，豚デルタコロナウイルスは国外株には2014年に米国で分離された豚デルタ

PEDウイルスとは時を画し，2010年にはすでにコロナウイルス株（MI/8977/2014：APHISより米国に侵入していたことが明らかとなった。

導入，導入時に豚精巣（ST）株化細胞で10回継

米国での豚デルタコロナウイルスの発見を受け代）を使用した。国内株には山形県で発生した豚て，2014年我が国でもPEDの発生が続いている

デルタコロナウイルス病を発症した豚の小腸内容

最中，当所において，主に豚伝染性胃腸炎（TGE）

10 ％ 乳 剤 か ら 分 離 し た も の（YMG/JPN/2014）

ウイルス陰性かつPEDウイルス陰性であり下痢を使用した。それぞれのウイルス株を同一培養条が発生した農場の検体を対象に，豚デルタコロナ

件下でST細胞（ATCCより入手）において４回ウイルスの浸潤状況調査を実施した。その結果，継代し，ほぼ同一の感染価（10 ６ TCID50/ml）を我が国では少なくとも2014年２月の時点で豚デル示すことを確認した上で，感染実験に供した。な

タコロナウイルスが国内に侵入していたことが明お，用いた両株の各遺伝子の配列を比較・解析しらかとなった。また用途別の陽性数は哺乳豚が最た結果，特にＳ遺伝子やNS7遺伝子に関して両株も高いものの，肥育豚や繁殖豚などの年齢が進ん間で配列に相違があることが明らかである。

だ成豚でも比較的高い割合で陽性個体が検出され2.2ることが明らかとなった。

当所動物施設において，動物実験実施要領を遵

豚への感染実験

米国ではすでに２つの研究グループによって，守しながら，子宮摘出初乳未摂取豚（母豚２頭

子豚を用いた感染実験が実施されているが６，７），

分：計15頭）を得た。得られた子豚は２群に分け使用しているウイルス株や豚の日齢が異なるため（国内株投与群８頭，国外株投与群７頭），それぞに，少なくとも子豚に対して下痢を引き起こすこれの投与群に対して３日齢時で該当ウイルス株をとは明らかであるものの，両者の結果はあまり一２mlずつ経口投与し，投与後28日目（４週間）

致していない。そのため，豚デルタコロナウイル

まで臨床症状を観察した。ウイルス投与後から８スの臨床的特徴や感染動態は未だに把握できない

日間，糞便は毎日，血液は２日おきに各個体からままである。また，各生育ステージの豚における採取した。８日目以降は，糞便，血液ともに３-豚デルタコロナウイルスの感染動態を明らかにす

４日間隔で経時的に採取した。また，各ウイルス

ることは，PEDやTGEとの類症鑑別上不可欠で株の体内分布を調べるために，投与後４日目と７ある。

日目で，各群３頭ずつを解剖し，残りの個体は観そこで申請者は，当所において同一条件で増察終了時に解剖した。解剖時には，主要臓器，消殖・管理し，かつ遺伝学的相違が明確である国内

化器官（胃，小腸，大腸）ならびに免疫器官（腸および国外豚デルタコロナウイルス２株を用い管リンパ節，扁桃）を採取し，ウイルス学的解析て，子宮摘出初乳未摂取豚に対する感染実験を実ならびに病理学的解析に供した。

© The Ito Foundation

280

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

2 . 3 ウイルス学的解析

症状に大きな相違は認められなかった。本結果は採取した糞便はリン酸緩衝液で希釈して20％乳

これまでの報告を支持する結果であり６，７），豚デ剤を作成し，遠心分離（3000×ｇ，10分）によりルタコロナウイルスは単独感染においても下痢を夾雑物を取り除いた上で，上清をRNA抽出に供発症することが明らかとなった。

した。また，採取した血液は遠心分離（3000×ｇ，

3 . 2 糞便中および血中におけるウイルス排泄量10分）を行い，血清のみを使用した。解剖時に採各投与群における糞便中および血中に排泄され取した各種臓器はホモジナイザーにより粉砕したるウイルス量の経時的変化をFig.１に示した。糞後，リン酸緩衝液で希釈して10％乳剤を作成し，便中に排泄されるウイルス量は両群ともに投与後遠心分離（3000×ｇ，10分）により夾雑物を取り１日目から急激に上昇し，投与後２日目から８日除いた上で，上清をRNA抽出に供した。ウイル

目にかけて高コピー数のウイルスを排泄し続ける

スRNAは市販のキット（QIAmp viral RNA mini

ことが明らかとなった。また，両群間でピーク時kit）を用いて，手順書に従って抽出した。抽出のウイルス排泄量に相違はなく，いずれも糞便１gしたウイルスRNAは豚デルタコロナウイルスのあたり1010-1011コピー数のウイルスを排泄した。

Ｍ遺伝子をターゲットとしたプライマー・プロー

投与後８日目以降は徐々に排泄量は低下し，観察

ブセットならびにスタンダードを用いてリアルタ

終了時には糞便１gあたり10 ５ コピー数以下とイムRT-PCRで定量・解析した。

なった。以前の報告では感染初期においてウイル

2.4

病理学的解析

ス排泄量が高いことが認められているが６，７），本

解剖時に採取した各種臓器は10％ホルマリン溶

結果はそれらの結果を支持する結果となった。

液に浸漬固定した後，パラフィン包埋を行い，ミ血中に排泄されるウイルスの排泄期間ならびにクロトームで切片を作製した。作製した切片のう

量に関して，両群間で顕著な相違は認められな

ち，一枚はヘマトキシリン・エオジン（HE）染かった。投与後２日目から血中のウイルス量は急色を施し，もう一枚は当所で作製した豚デルタコ

激に上昇し，投与後２日目から８日目にかけて高ロナウイルスに特異的な家兎免疫血清を用いて免いウイルス排泄を持続するが，投与後14日目には

疫組織化学染色を施し，両群間で組織傷害性，抗検出限界以下となった。糞便中に排泄されるウイ原の分布や量について，光学顕微鏡で観察・比較

ルス量と比べて，血中に排泄されるウイルス量した。抗原の分布や量については，陽性シグナル（糞便１gあたり10５-10６コピー数）は少なく，ま数に準じて半定量的に評価・解析した。

た排泄期間も短いことが明らかとなった。さらに，本結果より豚デルタコロナウイルス病を発症

３．結果と考察
3.1

した子豚はウイルス血症を示すことが明らかと臨床症状なった６，７）。

豚デルタコロナウイルス投与群はいずれも個体

3.3

豚デルタコロナウイルスの体内分布間で程度に差はあるが，投与後２日目より元気消

それぞれの投与群に関して，解剖時に採取した失，食欲不振ならびに激しい下痢を呈した。下痢

各種臓器におけるウイルス量を定量・解析するとは10日前後続いたが，投与後８日目から個体はともに，HE染色や免疫組織化学染色を施した切徐々に元気を取り戻し，観察期間を通じて死亡す

片について，組織傷害性やウイルス抗原の半定量る個体は観察されなかった。また，両群間で臨床解析を実施し，両群間で比較・解析した。リアル© The Ito Foundation

281

豚デルタコロナウイルスの感染動態に関する研究

US PDCoVJapanese PDCoV
1.00.E+13

1.00.E+11

1.00.E+11

1.00.E+09

1.00.E+09

1.00.E+07

1.00.E+07

1.00.E+05

1.00.E+05

1.00.E+03

1.00.E+03

US PDCoVJapanese PDCoV

1.00.E+13

1.00.E+13

1.00.E+11

1.00.E+11

1.00.E+09

1.00.E+09

1.00.E+07

1.00.E+07

1.00.E+05

1.00.E+05

20dpi

14dpi

11dpi

8dpi

7dpi

6dpi

4dpi

20dpi

14dpi

8dpi

11dpi

7dpi

6dpi

4dpi

2dpi

0dpi

2dpi

1.00.E+03

1.00.E+03

0dpi

Genomic copies/ml

（B）

0d
pi
2d
pi
4d
pi
6d
pi
8d
pi
14
dp
i
20
dp
i
27
dp
i

1.00.E+13

0d
pi
2d
pi
4d
pi
6d
pi
8d
pi
14
dp
i
20
dp
i
27
dp
i

Genomic copies/ml（A）

Fig. 1 Virus shedding in feces（A）and sera（B）of piglets inoculates with Japanese porcine deltacoronavirus（YMG/

JPN/2014) and US porcine deltacoronavirus（MI/8977/2014）.
Indivisual virus shedding（shown in different colos）was detected by a quantitative PDCoV M specific realtime RT-PCR at eachtime point.

タイムRT-PCRを用いたウイルス学的解析では，限界以下であることが明らかとなった。

投与後４日目および７日目ともに両群間で顕著な病理学的解析では，投与後４日目に解剖した個相違は認められなかった。投与後４日目では，両体の小腸および大腸において，両群間で特に小腸群ともにウイルスは主に空腸から大腸にかけて広で抗原の分布や量に相違が認められることが示唆

くかつ多数存在することが明らかとなった。またされた。また，両群間で相違が認められた小腸お投与後７日目では，両群ともにそれぞれの臓器に

よび大腸においては組織傷害性（絨毛の萎縮や脱おいて４日目と比べてウイルス量は減り，特に回落など）についても相違が認められる可能性が示

腸から大腸にかけてウイルスが顕著に検出される唆された。投与後７日目に解剖した国外株投与群

ことが明らかとなった。さらに観察終了時では，（Ｎ＝３）では１個体を除き，各種臓器において両群ともにほとんどすべての臓器において，検出

ウイルス抗原は検出されなかったが，国内投与群© The Ito Foundation

282

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）（Ｎ＝３）ではいずれの個体も結腸でわずかなウ同様に，短期間ではあるが，ウイルス血症を示す

イルス抗原が検出された。これらの結果は現在もことも明らかとなった。糞便中および血中のウイ精査・解析中であるため，具体的なデータを示す

ルス排泄期間と量に関して，国内分離株と国外分ことはできないが，少なくとも病理学的解析で離株との間で相違は認められなかったが，子豚のは，両群間でウイルスの体内分布や増殖性に相違

消化器官内におけるウイルスの分布と増殖性に相があることが示唆された。

違が認められた。今後は生育ステージが異なる豚リアルタイムRT-PCRは感染性や増殖性を問わを対象に，同様の感染実験を実施し，それら豚にず，感度よく遺伝子断片を検出する手法である。

おける本ウイルス特有の臨床症状や感染動態を明一方，免役組織化学染色はウイルス抗原，すなわ

らかにし，他の豚消化器病との類症鑑別や防除技

ち当該臓器でのウイルスの増殖を検出する手法で術の開発に役立てていきたい。

ある７）。これまでも多くの研究において，両手法を用いた解析が行われているが，結果を解釈する際には上記のような注意が必要である。したがって，今回の解析から，少なくとも豚デルタコロナ
ウイルス国内分離株と国外分離株とでは子豚の消化器官におけるウイルスの局在性と増殖性に差がある可能性が示唆された。今後はＳ遺伝子あるいはNS7遺伝子における相違との関連性を考慮・精査しながら，それらの相違に関わる責任遺伝子（あるいは責任遺伝子領域）を特定するつもりである。また，子豚以外の異なる生育ステージの豚を用いた感染実験を実施し，今回の結果が再現されるかどうかも合わせて検討するつもりである。
４．要

約

遺伝的背景が異なる２種類の豚デルタコロナウ
イルス分離株を子宮摘出初乳未摂取豚に経口投与
し，本ウイルス特有の子豚における臨床症状を明らかにするとともに，それらの株に特徴的な体内動態や病原性を明らかにすることを試みた。本研
究では３日齢の子豚を用いたが，これまでの研究と同様に，本ウイルスは単独で激しい下痢を引き起こすことが明らかとなった。加えて，投与後10日前後は顕著な臨床症状を示すものの，その後元気を回復し，観察期間を通じて生存することも明らかとなった。さらに，他の豚消化管ウイルスと文
献１） Woo, P., Lau, S., Lam, C., Lau, C., Tsang, A., Lau, J.,
Bai, R., Teng, J., Tsang, C., Wang, M., Zheng, B., Chan,K., Yuen, K. : Discovery of seven novel mammalian
and avian coronaviruses in the genus deltacoronavirus
supports bat coronaviruses as the gene source ofalphacoronavirus and betacoronavirus and avian
coronaviruses as the gene source of
gammacoronavirus and deltacoronavirus, J Virol, 86,3995～4008, 2012.
２） Wang, L., Byrum, B., Zhang, Y. : Detection andgenetic characterization of deltacoronavirus in pigs,
Ohio, USA, 2014, Emerg Infect Dis, 20, 1227～1230,
2014.
３） Marthaler, D., Raymond, L., Jiang, Y., Collins, J.,
Rossow, K., Rovira, A. : Rapid detection, complete
genome sequencing, and phylogenetic analysis of
porcine deltacoronavirus, Emerg Infect Dis, 20, 1347
～1350, 2014.
４） Ma, Y., Zhang, Y., Liang, X., Lou, F., Oglesbee, M.,
Krakowka, S., Li, J. : Origin, evolution, and virulenceof porcine deltacoronaviruses in the United States,mBio, 6, q00064-15, 2015.
５） Thachil, A., Gerber, P. F., Xiao, C., Huang, Y.,
Opriessnig, T. : Development and application of an
ELISA for the detection of porcine deltacoronavirus
IgG antibodies, PLoS One, 10, e0124363, 2015.
６） Jung, K., Hu, H., Eyerly, B., Lu, Z., Chepngeno, J.,
Saif, L. J.:Pathogenicity of 2 porcine deltacoronavirus
strains in gnotobiotic pigs, Emerg Infect Dis, 21, 650～654, 2015.
７） Chen, Q., Guger, P., Stafne, M., Thomas, J.,
Arruda, P., Burrough, E., Madson, D., Brodie, J.,
Magstadt, D., Derscheid, R., Welch, M., Zhang,
J.:Pathogenicity and pathogenesis of a United States
porcine deltacoronavirus cell culture isolate in
5-day-old neonatal piglets, Virology, 482, 51～59,
2015.

© The Ito Foundation

283

国際競争に勝つ『サルモネラ－ゼロ』モデル養豚場の作出
Construction of the “Salmonella-free” model pig farm to be able to wininternational competition

末

吉

益

雄

（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）

Masuo Sueyoshi（The Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki）

The presence of salmonellosis occurrence and the Salmonella carriage in the pig farm
results in a bad influence in the productivity of pigs and the health for human. The clearanceof the breeding environment of the pig is the most basic as Salmonella sanitization measures.
In other words, we must perform a washing/disinfection of the farm environment
appropriately. We performed this study in the pig farm where salmonellosis was exposed. We
compared the antiseptic effect with the foaming and fog. It was aimed for that we contributed
to clearance of Salmonella and clean maintenance. As disinfection, we performed it in eachcombination of the compound hypochlorous acid, peroxide and aldehyde preparation byfoaming and the fog disinfection. We performed a washing/disinfection by three different
processes. We wiped off the floors of the pigpen before and after a washing/disinfection andexamined it. Other than Salmonella, we examined it for the environmental bacteria, coliform,
Clostridium perfringens. We chose effective washing/disinfection technique and, forapproximately one year, performed environmental wiping test before and after a washing/disinfection and the examination for anti-Salmonella antibodies of pigs. As a result, after awashing/disinfection, 90.79％ of coliform had decrease in the environmental bacteria more thanan average of 99.99％ . The antibody positive rate of Salmonella was observed in the range of
88.9％ from 0％. In this study, Salmonella was not detected before the disinfection either.
However, the risk of the salmonellosis occurrence is present because the antibody was
detected. We prevented salmonellosis by fixing a washing/disinfection technique chosen in thisstudy, and a farm was suggested in the future that it was possible for Salmonella-free.

１．目

性サルモネラが出現してきていることから抗菌剤

的は適切な使用が求められている。一方で，ヒトのサルモネラに感染した豚は，下痢や敗血症など

食中毒に深く関係するのは，臨床症状が認められ重篤な症状を引き起こす場合と，症状がみられなないサルモネラ保菌豚である。生体検査では，無い場合がある。症状が観察された場合，抗菌剤に症状のため，健常豚として，食肉処理場で処理さよる治療が行われている。しかし，最近，多剤耐れ，市場に流通する危険性がある。本研究の目的© The Ito Foundation

284

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

は，食中毒の原因菌であり，家畜の監視伝染病のさらに，ノボビオシン加DHL寒天培地で無色ま原因菌でもあるサルモネラの抜本的対策として，

たは黒色，X－SAL寒天培地で緑色または黒色，

サルモネラ「ゼロ」農場を作出し，食の「安全ノボビオシン含有ESサルモネラ寒天培地Ⅱで桃性」を生産現場で確立し，消費者の信頼を得るこ色であった集落に対して各々Mullre Hinton Agarとである。

（MHA；OXOID LTD.）を用いて継代し，37℃，
18～24時間，培養した。一般生菌については普通

２．材料および方法

寒 天 培 地（ニ ッ ス イ）を 用 い ，好 気 条 件 下 で洗浄・消毒法

37℃，24時間培養した。大腸菌群についてはデソ

2.1

キシコレート寒天培地（ニッスイ）を用い，好気供試消毒剤・殺虫剤

消毒剤として，複合次亜塩素酸系消毒剤（アン

条件下で37℃，24時間培養した。ウェルシュ菌に

テックビルコンＳ，バイエル），過酸化物（ハイ

ついては卵黄エマルジョン50％（無菌）（Merk）

ペロックス，バイエル），アルデヒド製剤（グル添加硫酸カナマイシン（0.2ｇ/60ｇ）含有CW寒タＺ，ゼノアック）を供試した。殺虫剤として，

天基礎培地（ニッスイ）を用い，嫌気条件下でピレスロイド系ハエ成虫駆除剤（バイオフライ，

37℃，24～48時間培養した。乳光反応がみられたバイエル）と（ゴキラート，住友化学），および集落についてPCR法を用いてα毒素産生遺伝子のカーバメート系殺虫剤（ボルホ，バイエル）を供

検出を行った。

試した。

（２） 菌数測定

洗浄・消毒工程として，Ａ，ＢおよびＣ法を実採材した菌液を10－１とし10－８まで10倍段階希釈施した（Fig.１）。

後，各段階の希釈液を上記の培地に20μL直接滴2 . 2 供試材料

下し，コンラージを用いて均一に塗布・培養し，養豚場内に入る際にはシャワーを浴び作業着，発育集落を測定し各菌数を算出した。

マスク，ゴム手袋，長靴，帽子を着用した。採材

2.4

はふきふきチェックⅡ（栄研化学株式会社）を用

毎月オールイン・オールアウト時に肥育豚舎のいた。肥育豚舎の飼槽周辺の床面３か所とビニル

飼槽周辺の床面３か所と壁面１か所について５㎝

ダクトまたは壁面１か所について，豚導入直前，

×５㎝を採材した。

豚搬出直後に５㎝×５㎝の箇所を採材した。

2.5

洗浄・消毒のモニタリング（１年間）

血清学的検査細菌検査法

当該農場の出荷豚（総計725頭）の血清を採材（１） 供試培地

し，SALMOTYPEⓇPig Screen（Labor Diagnostik

サルモネラについては，ノボビオシン（SIGMA

Leipzig）を用いて，サルモネラ抗体を測定した。

2.3

CHEMICAL.CO）0.02g/l加DHL寒天培地（ニッスイ），X-SAL寒天培地（ニッスイ），ノボビオ

３．結果と考察

シン含有ESサルモネラ寒天培地Ⅱ（栄研）を用

3.1

い，好気条件下で37℃，24～72時間培養した。ま

洗浄・消毒前，サルモネラとウェルシュ菌はいた，EEMブイヨン（ニッスイ），セレナイト・シ

ずれの検体からも検出されなかった。一般生菌数

スチン基礎培地（ニッスイ）を用い，37℃，20時

は床面３か所で8.18±0.55（log10cfu/25㎝2），ビニ間，震蘯増菌培養し，菌数測定用培地に塗布した。

ルダクトで6.57（log10cfu/25㎝2）だった。大腸菌© The Ito Foundation

消毒法Ａ（Table１）

285

国際競争に勝つ『サルモネラ－ゼロ』モデル養豚場の作出
Ａ法（ビルコン発泡消毒とグルタ煙霧消毒）
一日目

二日目

午前

午後

豚搬出，

予備水洗，

午前

殺虫剤噴霧

バイオソルブ午後
水洗チェック

仕上げ水洗

再水洗（バイオフライ） 発泡

四日目

三日目

五日目

午前

午後

乾燥

乾燥

六日目

七日目

午前

午後

午前

午後

午前

午後

午前

ビルコン発泡

乾燥

乾燥

乾燥

乾燥

グルタ煙霧

密閉

午後
殺虫剤
（ゴキラート）

八日目
午前
豚搬入

Ｂ法（ビルコン発泡消毒とハイペロックス煙霧消毒）
一日目
午前

二日目
午後

午前

豚搬出，
予備水洗，
殺虫剤噴霧
バイオソルブ（バイオフライ） 発泡

四日目

仕上げ水洗

午前

五日目
午後

ビルコン発泡

乾燥

午前
乾燥

三日目
午後

午前

午後

水洗チェック
再水洗

乾燥

乾燥

六日目

午後
乾燥

七日目

午前

午後

乾燥

ハイペロックス
煙霧

八日目

午前

午後

午前

密閉

殺虫剤
（ボルホ）

豚搬入

Ｃ法（グルタ発泡消毒とグルタ煙霧消毒）
一日目
午前
豚搬出，
殺虫剤噴霧
（ゴキラート）

二日目
午後

午前

予備水洗，
αフォーム
発泡

仕上げ水洗

四日目

五日目

三日目
午後

午前

午後

水洗チェック
再水洗

乾燥

乾燥

六日目

七日目

午前

午後

午前

午後

午前

午後

午前

グルタ発泡

乾燥

乾燥

乾燥

乾燥

グルタ煙霧

密閉

午後
殺虫剤

八日目
午前
豚搬入

Fig.１ Process of a washing/disinfection method

群数は床面３か所で4.13±1.73（log10cfu/25㎝2），されなかった。

ビニルダクトからは検出されなかった。洗浄・消3 . 2 消毒法Ｂ

毒後，サルモネラとウェルシュ菌は検出されな

洗浄・消毒前，サルモネラは検出されなかった。

かった。一般生菌数は床面３か所で3.28±1.18

一般生菌数は床面３か所で7.75±0.20（log10cfu/（log10cfu/25㎝ 2）だった。大腸菌群数は床面１か25㎝2）だった。大腸菌群数は床面３か所で3.78±

所で2.10（log10cfu/25㎝ 2），床２か所からは検出

0.43（log10cfu/25㎝2）だった。ウェルシュ菌は床© The Ito Foundation

286

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

面１か所で3.88（log10cfu/25㎝ 2），床２か所から

以上，サルモネラ症が時折発生する養豚場では検出されなかった。洗浄・消毒後，サルモネラ

あったが，検査期間中にその発生はなく，また，は検出されなかった。一般生菌数は床面３か所ですべてのサンプルから増菌法を含めてサルモネラ

4.54±0.16（log10cfu/25㎝ ）だった。大腸菌群数は検出されなかった。しかし，その他の細菌で比は床面１か所で2.57（log10cfu/25㎝ ），床２か所

較すると，消毒法Ａが最も減少率が大きかったこ

からは検出されなかった。ウェルシュ菌はいずれとから，本法を日常実施することにした。

22の検体からも検出されなかった。

3 . 4 洗浄・消毒のモニタリング（１年間）

3 . 3 消毒法Ｃ

当該期間もサルモネラは検出されなかった。一

洗浄・消毒前，サルモネラは検出されなかった。

般生菌数は，毎回洗浄・消毒後安定して，大幅に一般生菌数は床面３か所で8.67±0.42（log10cfu/

減少していた（平均：床面99.42％，壁面99.97％

25㎝ 2），壁面１か所で3.78（log10cfu/25㎝ 2）だっ減少）。大腸菌群とウェルシュ菌については，６た。大腸菌群数は床面３か所で4.53±0.49（log10cfu/

月と７月を除いて，洗浄・消毒後には検出され25㎝ ），壁面からは検出されなかった。ウェルシュ

ず，検出されてもそれぞれ洗浄・消毒前よりも大菌数は床面１か所で2.40（log10cfu/25㎝ ），床２

幅に減少していた（大腸菌群数：99.61％，ウェ

か所，壁面からは検出されなかった。洗浄・消毒

ルシュ菌数：98.33％減少）。餌槽周辺の床に残存

後，サルモネラは検出されなかった。一般生菌数する傾向があった。

22は床面３か所で4.10±0.60（log10cfu/25㎝ ），壁面

3 . 5 血清学的検査（Table２）

１か所で3.27（log10cfu/25㎝ ）だった。大腸菌群

サルモネラ抗体陽性率が８月で88.9％。９月で数は床面１か所で4.54（log10cfu/25㎝ 2），床２か75％と高い数値を示した。当該出荷豚のサルモネ

所，壁面からは検出されなかった。ウェルシュ菌

ラ感染履歴が明らかとなった。環境中の拭き取り

はいずれの検体からも検出されなかった。

検査から，サルモネラは検出されなかったことか2

2

Table１ The results of washing/disinfection method A
採材場所
洗浄前
床１
床２
床３
ダクト

一般生菌数※

大腸菌群数※

ウェルシュ菌数※

サルモネラ※

8.01
7.81
8.73
6.57

5.18
4.81
2.40
0

0
0
0
0

0
0
0
0

4.05
2.10
3.68
0

2.10
0
0
0

0
0
0
0

0
0
0
0

洗浄後
床１
床２
床３
ダクト
※

log10cfu/25cm2

Table２ The anti-Salmonella antibody positive rate

平均陽性率

７月

８月

９月

10月

11月

12月

１月

２月

３月

４月

11.4

88.9

75.0

27.8

22.9

44.4

2.8

41.7

17.6

5.6

© The Ito Foundation

国際競争に勝つ『サルモネラ－ゼロ』モデル養豚場の作出

287

ら，サルモネラ感染や排菌は証明されなかった

程で洗浄・消毒を行い，オールアウト後（洗浄・が，サルモネラ保菌豚が潜在しているリスクを念消毒前）およびオールイン前（洗浄・消毒後）の頭に環境の洗浄・消毒を徹底させる必要性がある。

豚舎床などを拭き取り検体とし，比較試験を行っ４．要

た。サルモネラの他，一般生菌，大腸菌群，ウェ

約

ルシュ菌についても分離・培養・検出を行い，菌養豚場におけるサルモネラ症発生およびサルモ数測定した。次に，効果的な洗浄・消毒方法を選

ネラ保菌の存在は豚の生産性の低下およびその肉定し，約１年間洗浄・消毒前後の環境拭き取りとの摂食したヒトの健康保持に悪影響をもたらす。

肥育豚のサルモネラ抗体検査を実施した。その結サルモネラ除菌対策として飼育環境の清浄化維持

果，洗浄・消毒後，一般生菌は平均99.99％以上，は最も基本的手段である。農場内環境の洗浄・消大腸菌群は90.79％減少がみられた。サルモネラ

毒を適切に行わなければならない。本研究では，の月ごとの抗体検査では，2.8％から88.9％の範囲

サルモネラ症が摘発されている養豚場を選定し，で抗体陽性が認められた。本研究期間中サルモネ

当該豚舎の発泡・煙霧消毒効果を比較検討し，サラ本菌は検出されなかったが，その抗体が検出さルモネラの清浄化および清浄維持の一助とするこれたことから，サルモネラ症発生のリスクは存在とを目的とした。

しており，本試験で有効と判断された洗浄・消毒

消毒法として，発泡消毒と煙霧消毒法による複法を，当該農場に定着させることで，サルモネラ

合次亜塩素酸系消毒剤，過酸化物およびアルデヒ症を予防し，将来的に農場をサルモネラフリーに

ド製剤の各組み合わせで実施し，３つの異なる工できると示唆された。

© The Ito Foundation

288

動物由来コロナウイルスの遺伝子操作系の確立と感染予防への応用
Establishment of reverse genetics system for animal coronavirus

神

谷

亘

（大阪大学微生物病研究所感染症国際研究センター臨床感染症学研究グループ）

Wataru Kamitani（Laboratory of Clinical Research on Infectious Diseases, Research Center for Infectious Disease Control, Research Institute forMicrobial Diseases, Osaka University）

Coronaviruses are an enveloped virus carrying a long（～27 kb）, single-stranded,
positive-sense RNA genome. Coronaviruses have been identified in mice, chickens, pigs, dogs,
cats, and humans. Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）, which belongs to the familyCoronaviridae, is a highly pathogenic alphacoronavirus. PEDV cause between 80 and 100％
mortality in suckling piglets and rapidly transmitted between animals and farms.
Reverse genetic system is very powerful tool in Virology filed. We employed Bacterial
Artificial Chromosome（BAC）system to generate PEDV infectious cDNA. Using this reverse
genetic system, we replaced open reading frame 3（ORF3）with a green fluorescent protein（GFP）gene to generate recombinant PEDV carrying GFP（pBAC PEDV-GFP）. This pBAC
PEDV-GFP DNA was transfected into Huh-7 cells. Following transfection with the cDNA
clone, infectious virus was rescued in Vero cells. We confirmed the expression of GFP and
induction of syncytium formation in both transfected and infected cells. Our recombinant
PEDV carrying GFP is useful to understand the replication and pathogenesis of PEDV.

１．目ス（Porcine Epidemic Diarrhea Virus : PEDウイ

的ルス）は，迅速な感染症対策と基礎ウイルス学にコロナウイルスは，ヒトおよび動物に様々な病よる病原性解明の必要な病原体である。

気を引き起こすことが知られている。ヒトにおいコロナウイルスのウイルス学的特徴は，RNAては2002年度に発生した重症急性呼吸器症候群コウイルスの中で最長のゲノムを持つエンベロープ

ロナウイルスや2012年度から中東地域を中心に発ウイルスである。コロナウイルスの基礎ウイルス

生している中東呼吸器症候群コロナウイルスが重学研究は，そのウイルスゲノムが最長であるた

篤な肺炎を引き起こすことで知られている。

め，現在の基礎ウイルス学分野において必須の技

一方，獣医領域においてもコロナウイルスは重術である遺伝子操作系の確立が難しく限られた研要なウイルス感染症の一つである。特に，最近，究グループのみで成功しているのが現状である１，２）。

養豚業界において重大な被害をもたらした豚流行

このため，PEDウイルスなどの動物由来コロナ性下痢の原因ウイルスである豚流行性下痢ウイル

ウイルスの基礎研究においても遺伝子操作系を扱© The Ito Foundation

動物由来コロナウイルスの遺伝子操作系の確立と感染予防への応用

えるのはごく限られた研究グループである３，４）。

289

２．方

法

変異を導入できる遺伝子操作系は，個々のウイル

2.1

胞

スタンパク質の病原性の解明や病原性発現機序のVero細胞（CCL-81）は，the American Tissues

解明，さらには，ワクチンの開発や抗ウイルス薬

Culture Collection（ATCC）よ り 入 手 し た 。ヒの開発を進めるうえで重要な基礎技術である。

ト肝癌由来細胞株Huh-7細胞は，大阪大学微生物

特に，基礎ウイルス学におけるウイルスに任意の細本研究課題では，今まで困難であったコロナウ病研究所・分子ウイルス分野・松浦善治教授よりイ ル ス の 遺 伝 子 操 作 系 を Bacterial Artificial

分与された。すべての細胞は10％牛胎児血清を含Chromosome（BAC）を用いて完全長のcDNAク

むダルベッコ変法最小必須培地（DMEM，ナカ

ローンを作製する。BACのシステムは，大腸菌ライ）で培養した。

の中でそのコピー数が１コピーと少なく，そのた

2.2

めコロナウイルスのような長いウイルスゲノム由Bacterial Artificial Chromosome（BAC）を 用

来のcDNAを保持するのに優れている。実際に，いたPEDウイルスの感染性cDNAは，昨年度の方

申請者は，SARSコロナウイルスの遺伝子操作系

法に従い作製した。以下に簡単に方法を記す。

にこのBACシステムを用いることで，組換えウ

PEDウイルス（CV777株）を感染させた培養上清

イルスの作製に成功している。さらに，昨年度にから，TRIzolを用いてウイルスRNAの抽出を行おいてPEDウイルスの完全長のcDNAをBACにい，逆転写酵素によりウイルスcDNA合成を行っ挿入するのに成功している。

た。PEDウイルスの遺伝子断片をサイトメガロウ

コンストラクト

そこで，本研究課題では，昨年度より行ってきイルスのプロモーターとBGHポリＡシグナルのている「動物由来コロナウイルスの遺伝子操作系

間に挿入した。さらに，完全長のPEDウイルスの確立と感染予防への応用」の研究課題を継続・

cDNAの3’末端には25塩基のＡ（polyA-25）を付発展させることで，豚流行性下痢ウイルスの遺伝

加し，BGHポリＡシグナルとpolyA-25の間には，子操作系を確立し，その方法を用いて野外流行株

Ｄ型肝炎ウイルス由来のリボザイム配列を挿入とのキメラウイルスを作製し，野外流行株のウイ

し，完全長のPEDウイルスcDNAを保持するBAC

ルス学的性状を明らかにするための基盤の構築をクローン（pBAC-PEDV-FL）を作製した。

行った。今後は，上述の遺伝子操作技術を用いてさらに，感染の指標を容易にするために，レ

個々のウイルスタンパク質の解析を行い，新規のポーター遺伝子であるGFPを上述のRed/ETによワクチン開発および抗ウイルス薬の開発につなげる相同組換え方を用いて，PEDウイルスの遺伝る。

子上のORF3をGFPに置き換えた（pBAC PEDV-

さらに，今後は，この遺伝子操作系により作製

GFP）。

した組換えPEDウイルスを用いることで，野外

2.3

流行株のウイルス学的性状を明らかにして，PED

BACのDNAを大腸菌へ形質転換するときは，ウイルスの感染防御の開発のための基盤技術の作エレクトロポレーション法により行った。30ulの出を目指す。

コンピテントセルNEB10beta（NEB）を用いてエ大腸菌へのBACの形質転換

レクトロポレーション法にて形質転換を行った。
エレクトロポレーションは，0.1㎜ギャップのキュ© The Ito Foundation

290

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

ベット（Nepagene）を用いて，1700Ｖの条件でイルス添加後，感染の有無をGFPの蛍光シグナル

エポレーター（Roche）を用い行った。その後，を指標に継時的に観察した。

FastGene Xpress Plasmid PLUS kit （FastGene）
を用いて，pBAC PEDV-GFPのDNAを精製した。
2.4

Red/ETによる相同組換え

３．結果と考察
今回，Bacterial Artificial Chromosome（BAC）

完全長のcDNA へ の 変 異 の 導 入 に は Red/ETを用いて，豚流行性下痢ウイルス（PEDウイルス）

Recombination System（GENE BRIDGES）を用のCV777株を元に，GFPを保持した感染性クローいて行った。プロトコールに従い，導入したい領ンの構築を試みた。感染の有無の指標を容易にす

域に50塩基の相同配列を持つセレクションマー

るために，PEDウイルスのウイルスゲノム上へのカー遺伝子をPCRにより増幅し，Red/ETにより

GFP遺伝子の挿入を行った。GFPはPEDウイルス

相同組換え反応を行った。つぎに，導入したい目（CV777株）のORF3遺伝子領域に相当する24789

的の配列に，50塩基の相同配列を持つ領域をPCR

番目から25416番目の塩基をGFP遺伝子に置き換にて増幅し，セレクションマーカーと置き換わるえた。ORF3遺伝子は，Ｓ遺伝子とＥ遺伝子の間ように，Red/ETにて相同組換え反応を行った。

に存在する675塩基からなるウイルス複製に必須

2.5

感染性PEDウイルスの作製でないウイルス遺伝子である。そこで，ORF3を

各種培養細胞を1.5Ｘ10^5cell /wellになるように，

GFP遺伝子に置き換えることで，GFPをウイルス

12well培養プレートに播種した。細胞へのpBAC

ゲノムに保持するPEDウイルスの感染性cDNAク

PEDV-GFP の 導 入 に は ，４ ug の pBAC PEDV-

ローン（pBAC PEDV GFP）を作出した（Fig.１）。

GFPと12ulのFuGENE6を用いて，FuGENE6のプ

pBAC PEDV GFPをVero細胞およびHuh-7細

ロトコールに従いトランスフェクションを行い，胞にFuGENE6を用いて導入したところ，Huh-7

24時間後に培地交換を行った。トランスフェク細胞においては，２日後からGFP陽性の細胞が観ション３日後，トリプシン処理するために培地を察された（Fig.２A and B）。さらに，３日後に，無血清培地で４回洗浄し，各種濃度のトリプシン

無血清培地にて洗浄し，トリプシン添加無血清培

添加無血清培地で６時間から18時間培養を行った。

地で培養したところ，GFP陽性細胞数が増加する

その後，培養細胞をPBS（－）で洗浄し回収し，ことが確かめられた。また，トリプシン添加によ凍結融解を三回行うことで，細胞内のPEDウイ

り隣接する細胞同士が融合する細胞融合（シンシ

ルスを回収した。回収したPEDウイルスをVero

チウム形成）が認められた（Fig.２C）。

細胞へトリプシン添加無血清培地にて加えた。ウ

一方，PEDウイルスに感受性を示すVero細胞

SfoI

RsrII

ORF1ab

GFP

E

M

N

A
（25） Rz

pBAC PEDV-GFP

BGH

pCMV

S

Fig. 1 Schematic representation of the recombinant PEDV genome carrying GFP gene
The ORF3 was substituted by GFP. CMV promoter（pCMV）, HDV ribozyme（Rz）, BGH termination and polyadenylation sequence（BGH）are shown.

© The Ito Foundation

動物由来コロナウイルスの遺伝子操作系の確立と感染予防への応用
2 d.p.tA

3 d.p.t291

3 d.p.t., w/trypsin

B

C

Fig. 2 Expression of GFP in Huh-7 cells transfected with pBAC PEDV-GFP
Huh-7 cells were transfected with pBAC PEDV-GFP. The GFP expression were analyzed at the indicated time points by
microscopy assay.

Fig. 3 Identification of the virus recovered from cDNA clone
Vero cells were infected with the rPEDV-GFP rescued in Huh cells. The GFP expression and induction of syncytium formation
were analyzed 2 d.p.i by microscopy assay. The arrow represented the syncytium.

では，GFP陽性細胞はほとんど検出されなかった。

き，細胞内の感染性粒子の回収を行った。その後，

これは，Vero細胞におけるトランスフェクショ

トリプシン添加無血清培地に交換したVero細胞

ン効率が悪いためであると思われる。

へ回収したウイルス液を添加した。継時的にGFP

今 回 の 結 果 か ら ，ヒ ト 由 来 肝 臓 細 胞 で あ るのシグナルを蛍光顕微鏡にて観察を行った結果，

Huh-7 細 胞 に お い て ，導 入 し た pBAC PEDV-

２日後にGFP陽性細胞を確認できた（Fig.３）。

GFPからRNAへの転写が行われ，ウイルスタン

この結果から，PEDVの遺伝子をBACに組み込んパク質が産生され，レポータータンパク質である

だcDNAから感染性を持つウイルス粒子の産生にGFPを検出できたと考えられる。PEDウイルス成功したと考えられる。

は豚に感染性を示すコロナウイルスであるが，培養細胞を用いた実験からヒト由来の細胞でも感染

４．要

約

できることが報告されている５）。また，Huh-7細RNAウイルスをウイルスゲノムとして持つコ胞は一般的にトランスフェクション効率もよいこ

ロナウイルスは，ヒトを含む様々な動物に感染すとから，PEDウイルスの組換えウイルスを産生る。特に，豚におけるコロナウイルス感染症の中する細胞として優れていると思われる。

でも，豚流行性下痢ウイルス感染は哺乳豚に下痢

次に，Huh-7細胞から感染性粒子が産生されてを引き起こし，養豚産業に大きな被害をもたらす。

いるか否かを検討するために，上述の方法によこのPEDウイルスのウイルス学的性状を解析す

り，Huh-7細胞にpBAC PEDV-GFPをトランスるためには，ウイルスゲノムに任意の変異を導入

フェクションし，３日後に細胞を回収し，凍結融できる遺伝子操作系が必須である。しかしなが解を３回行い，デブリスを遠心操作にて取り除ら，コロナウイルスの場合，その長いウイルスゲ© The Ito Foundation

292

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

ノムRNAのため遺伝子操作系が煩雑で困難であに改良は必要であるが，今回の方法は，PEDウる。我々は，長鎖核酸の保持に優れたBacterial

イルスの抗ウイルス薬のスクリーニングやワクチ

Artificial Chromosome（BAC）を用いてコロナン開発に役立つと思われる。

ウイルスの遺伝子操作系の確立に取り組んでいる。
昨 年 度 に 完 成 し た PED ウ イ ル ス の CV777 株
ベースのBACクローンを用いて，レポーター遺伝子であるGFPをPEDウイルスのORF3遺伝子と置き換えることにより導入した。GFPのシグナル
は，トランスフェクション後２日から観察でき，３日後にトリプシンを添加することでシンシチウ
ムを観察できた。さらに，シンシチウム形成後の細胞からウイルス粒子を回収し，Vero細胞に感染させることにより，２日後にVero細胞でGFPのシグナルとシンシチウムの形成を認めた。このことから，我々が用いたpBAC PEDV-GFPの感染性cDNAからPEDウイルスの感染性粒子を回収することに成功した。
今後，より高力価の組換えウイルス産生のため

文献１） Yount, B., Curtis, K. M., Fritz, E. A., Hensley, L. E.,
Jahrling, P. B., Prentice, E., Denison, M. R., Geisbert,
T. W., Baric, R. S. : Proc Natl AcadSci USA, 100（22）,12995～13000, 2003.
２） Almazán, F., Dediego, M.L., Galán, C., Escors, D.,
Alvarez, E., Ortego, J., Sola, I., Zuñiga, S., Alonso, S.,
Moreno, J.L., Nogales, A., Capiscol, C., Enjuanes, L. :J Virolo, 80（21）,10900～109006.
３） Chunhua Li, Zhen Li, Yong Zou, Oliver Wicht,
Frank J M van Kuppeveld, Peter J M Rottier,
Berend Jan Bosch : PLos one, 8（8）,e6997, 2013.
４） Beall, A., Yount, B., Lin, C. M., Hou, Y., Wang, Q.,
Saif, L., Baric, R. : Characterization of a Pathogenic
Full-Length cDNA Clone and Transmission Modelfor Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain PC22A,
MBio, 5 ; 7（1）,e01451-15, 2016.
５） Liu, C., Tang, J., Ma, Y., Liang, X., Yang, Y., Peng,
G., Qi, Q., Jiang, S., Li, J., Du, L., Li, F. : Receptor
usage and cell entry of porcine epidemic diarrhea
coronavirus, J Virol, 89（11）,6121-5, 2015.

© The Ito Foundation

293

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発
Effects of functional components in grass on enhancing immunoglobulin incolostrum

久

米

新

一・谷

口

紗

耶

（京都大学大学院農学研究科）

Shinichi Kume and Saya Taniguchi（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

Passive immunity is critical to the survival and health of neonates, and colostrum is asource of nutrients and immune components for neonatal calves. The first study was conducted
to clarify the relationships among Immunoglobulin（Ig）M, IgG, IgA，β-carotene, vitamin A
and α-tocopherol contents in colostrum of 24 Japanese Black multiparous cows in order toevaluate the role of IgM on colostral IgG and IgA production. Compared with colostral IgG,
colostral IgM and IgA were very low but varied widely. There was positive correlation
between colostral IgM and IgG, but colostral IgM was not related with colostral IgA. There
was no relationship between colostral IgM and age of cows, although colostral IgG wasincreased with aging. There were positive correlations among colostral β-carotene, vitamin A
and α -tocopherol and these vitamins were positively correlated with colostral IgM or IgG.
The second study was conducted to clarify the effects of dry carrots feeding on colostral Ig
contents in 11 Japanese Black cows fed grass silage based diet. Experimental diets were
control diet and control plus dry carrots（138 mg β-carotene/day）diet, and dry carrots were
offered from 3 weeks before the expecting calving day to parturition. Plasma β-carotene
contents in the control and dry carrot groups at parturition were 378 and 475μg/dL, but
feeding dry carrots had no effects on β-carotene, IgG, IgA and IgM contents in plasma andcolostrum of cows.

１．目

し，黒毛和種子牛の発育改善と疾病予防に適した的

新たな人工ほ乳技術を開発した。しかし，黒毛和

わが国の肉用牛経営では規模拡大や生産性向上

種子牛には初乳由来の免疫グロブリンＧ（IgG）

が急速に進んでいるものの，下痢などによる子牛と免疫グロブリンＡ（IgA）が不足して，下痢のの損耗増加は黒毛和種繁殖経営に多大な経済的損発生するケースが多数認められたため，初乳中の失をもたらしている。代表研究者らは，農林水産

免疫グロブリンを高める方法を開発して，下痢な省の実用技術開発事業で「ホエー代用乳を用いたどの疾病を予防することが重要と考えられた。

近畿産ブランド和牛のほ乳期発育改善」を実施

飼料中には栄養素だけでなく，家畜の生理機能© The Ito Foundation

294

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）や免疫機能を高める機能性成分が含まれているたを多量に含有した乾燥ニンジンを黒毛和種繁殖牛

め，子牛の下痢予防では飼料中の機能性成分を活に給与し，繁殖牛の初乳と血漿中免疫グロブリン

用することが効果的である。特に，安全・安心な含量に及ぼす乾燥ニンジン給与の影響を調べた。

牛肉生産では抗生物質などの使用量低減が求められるが，機能性成分を活用した下痢などの疾病予防方法の開発は抗生物質の使用量低減を可能にする。また，草食動物である牛は牧草中に豊富に含２．方法

2 . 1 黒毛和種繁殖牛の初乳中免疫グロブリンと脂溶性ビタミンの関係まれているβ-カロテンやビタミンＥなどを有効試験には，京都大学附属牧場で分娩した黒毛和利用して健康を維持しているが，筆者らはβ-カ

種経産牛24頭を用いた。分娩前の牛には日本飼養

ロテンによる新生子牛の下痢予防効果を見いだし

標準の繁殖牛のTDN要求量を満たすように，フス

た１）。しかし，黒毛和種繁殖牛に良質の牧草が給

マ２㎏／日とイタリアンライグラスサイレージ，

与されない場合には初乳中のβ-カロテンなどがスーダングラスサイレージなどを給与し，分娩直不足して，子牛の下痢発生率を高めることが危惧

後に初乳を約100ml採取した。初乳中のIgG，IgA

された 。

およびIgM含量をELISA法で，β-カロテン，ビ２）

そこで，平成25‒26年度には牧草サイレージ主

タミンＡおよびα-トコフェロール含量を高速液体で飼養した黒毛和種繁殖牛19頭から初乳を採取

体クロマトグラフ法で測定し，初乳中の脂溶性ビ

し，初乳中IgG，IgAと脂溶性ビタミンの関係を

タミンと免疫グロブリンの相関関係などをSASで調べたところ，初乳中のβ-カロテン，ビタミン解析した。さらに，黒毛和種繁殖牛の分娩前の体Ａおよびα-トコフェロール含量間に正の相関が重と健康状態，その子牛の分娩時の体重と事故・認められただけでなく，初乳中の脂溶性ビタミン

疾病などの発生状況を調査した。

含量が増加すると初乳中IgG含量が増加した 。
３）さらに，初乳中のIgG含量は年齢と初乳中ビタミ

2 . 2 黒毛和種繁殖牛の初乳中免疫グロブリンに及ぼす乾燥ニンジン給与の影響

ンＡ含量を変数にした重回帰式から精度よく推定

牧草サイレージ主体で飼養した黒毛和種繁殖牛できたため，繁殖牛のビタミン栄養の改善が初乳11頭を対照区（n＝５）および乾燥ニンジン区

中IgG含量の増加に効果的なことが示唆された。

（n＝６）に割り当てて，対照区ではフスマ２㎏

一方，初乳中のIgGとIgAは免疫グロブリンＭ／日，配合飼料0.5㎏／日およびイタリアンライ（IgM）のクラススイッチによって生成するため，

グラスサイレージを給与した。乾燥ニンジン区で初乳中IgMと脂溶性ビタミンの関係を調べること

は対照区の飼料に加えて，分娩予定日の３週間前と，飼料由来の機能性成分の給与による初乳中免から分娩日まで乾燥ニンジンを300ｇ／日（β-カ

疫グロブリンの改善方法の開発が課題として残さ

ロテンとして138㎎／日）給与した。分娩予定日れた。

の10日前に繁殖牛の体重を測定し，血液サンプル

以上のことを踏まえて，本研究では初乳中のを10時に採取した。分娩後に繁殖牛と子牛の体重

IgGとIgA産生におけるIgMの役割を明らかにすを測定し，繁殖牛の初乳および血液サンプルは分るために，黒毛和種経産牛24頭の初乳中IgG，

娩後１～６時間内に採取した。初乳と血漿中のIgA，IgM，β-カロテン，ビタミンＡとα-トコ

IgG，IgAおよびIgM含量をELISA法で，初乳，フェロールの関係を調べた。次に，β-カロテン

血漿と飼料中のβ-カロテン含量を高速液体クロ© The Ito Foundation

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発

マトグラフ法で測定した。

295

することが認められた。したがって，高品質サイ
レージを分娩前の黒毛和種繁殖牛に給与すると初３．結果と考察

乳中IgG含量とIgM含量の増加に貢献することが期待された。また，動物の免疫反応の初期には

3 . 1 黒毛和種繁殖牛の初乳中免疫グロブリンと脂溶性ビタミンの関係

IgMが産生され，その後抗原刺激に対応してIgM

４）

黒毛和種繁殖牛の初乳中の平均IgG含量（範がIgGとIgAにクラススイッチするが，初乳中IgG囲）は139㎎/mL（65～208㎎/mL）と高い値で含量とIgM含量間に正の相関が認められたことかあったが，初乳中の平均IgA含量とIgM含量（範ら，初乳中IgMは初乳中IgGの増加に関与してい囲）はそれぞれ7.5㎎/mL（1.0～34.6㎎/mL）と9.3

ることが推察された。

㎎/mL（1.2～22.0㎎/mL）とともに低い値であっ3 . 2 黒毛和種繁殖牛の初乳中免疫グロブリン

た（Table１）。初乳中IgG含量は加齢に伴って増に及ぼす乾燥ニンジン給与の影響５）加した（P＜0.001）が，初乳中のIgM含量には加乾燥ニンジン区の分娩直後の血漿β-カロテン

齢による影響は認められなかった。初乳中ビタミ

含量は475μg/dLと対照区の378μg/dLよりやや

ンＡ含量とβ-カロテン含量間（P＜0.001），初乳

高い値であったが，繁殖牛の血漿および初乳中β中ビタミンＡ含量とα-トコフェロール含量間-カロテン含量には乾燥ニンジン給与による影響（P＜0.001）と初乳中β-カロテン含量とα-トコは認められなかった。この結果は，サイレージ由

フェロール含量間（P＜0.01）に正の相関が認め

来のβ-カロテン摂取量がサイレージのβ-カロテ

られ，また初乳中脂溶性ビタミン含量とIgG含量

ン含量（乾物当たりで12.0～62.3㎎/㎏）から60～間，初乳中脂溶性ビタミン含量とIgM含量間と初312㎎／日と推定され，乾燥ニンジン由来のβ-カ

乳中IgG含量とIgM含量間にも正の相関が認めら

ロテン摂取量（138㎎／日）より多い事例もみられた（Table１）。

れたことが影響しているが，初乳と血漿中のIgG，以上の結果から，牧草サイレージ主体で飼養しIgAおよびIgM含量にも乾燥ニンジン給与の影響た黒毛和種経産牛では初乳中脂溶性ビタミン含量は認められなかった（Table２）。一方，繁殖牛のの増加に伴って初乳中IgG含量とIgM含量が増加

血漿IgM含量と初乳IgM含量間（P＜0.05）に正Table 1 Correlation between IgM, IgG, IgA and fat-soluble vitamins incolostrum of Japanese Black multiparous cows（n＝24）.

Age, months
Gestation length, days
Colostrum
β-carotene, μg/dl
Vitamin A, μg/dl
α-tocopherol, μg/dl
IgA, ㎎/ml
IgG, ㎎/ml
IgM, ㎎/ml

Mean

SD

Min.

Max.

69.6
287.3

22.4
4.8

34.0
277.0

112.0

54.4

40.0

ｒ
IgM

IgG

118.3
296.0

0.06
0.19

0.65＊＊＊
0.14

221.0

0.53＊＊
0.44＊

0.41＊
0.69＊＊＊
0.58＊＊
0.32

474.8
936.5
7.5
138.5

251.9
520.1
8.9
32.6

69.0
117.0
1.0
65.0

1096.02606.034.6
208.0

0.56＊＊
0.35
0.44＊

9.3

4.9

1.2

22.0

―

＊＊＊ P ＜0.001，＊＊ P ＜0.01，＊ P ＜0.05.

© The Ito Foundation

―
―

296

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Table 2 Immunoglobulin in plasma and colostrum and β-carotene in colostrum of the control and carrot groups
in Japanese Black cows at parturition（Mean±SE）.
Control
Number of cows

CarrotP

5

6

Parity4.6±0.6

5.8±0.5

Age, months

66.9±7.681.4±6.9

NS

Gestation length, days
Calf birth weight, ㎏

292±２
33.1±2.6289±２34.8±2.4

NS
NS

NS

PlasmaIgG, ㎎/mL

16.5±1.2

16.4±1.1

NS

IgA, ㎎/mL

0.20±0.07

0.17±0.06

NS

IgM, ㎎/mL
Colostrum

1.8±0.2

1.5±0.2

NS

IgG, ㎎/mL
IgA, ㎎/mL

97.1±13.3
7.0±1.778.9±12.1
4.9±1.5

NS
NS

IgM, ㎎/mL
β-carotene，μg/dL

7.1±1.7

5.1±1.6

NS

138±34124±31NS

15

R 2=0.61, P<0.01

15

Colostral IgA（mg/mL）

R 2=0.52, P<0.05

10

5
0

0

150

1
2
Plasma IgM（mg/mL）

3

R 2=0.50, P<0.05

100

50

0

0

10
5
0

0

15
Colostral IgA（mg/mL)

Colostral IgG（mg/mL）

Colostral IgM（mg/ｍL）

NS, not significant.

5
1015
Colostral IgM（mg/mL）

50
100
150
Colostral IgG（mg/mL）
R 2=0.61, P<0.01

10

5

0

0

5
10
15
Colostral IgM（mg/mL）

Fig. 1 Relationship between plasma IgM and colostral IgM, relationship between colostral IgG and colostral IgA, andrelationships between colostral IgM and colostral IgG or colostral IgA of Japanese Black cows（n＝11）atparturition.

の相関が認められ，初乳IgM含量と初乳IgG含量とから，初乳中のIgGとIgAの産生にIgMの関与

間（P＜0.05），初乳IgM含量と初乳IgA含量間（Pしていることが示唆された。

＜0.01）および初乳IgG含量と初乳IgA含量間（P以上の結果から，β-カロテンの栄養状態が良＜0.01）にも正の相関が認められた（Fig.１）こ好な黒毛和種繁殖牛ではβ-カロテンを多量に含© The Ito Foundation

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発

297

有した乾燥ニンジンを給与しても初乳中の免疫グ

毛和種繁殖牛に分娩予定日の３週間前から分娩日

ロブリンが改善されないことが推察された。しかまでβ-カロテンを多量に含有した乾燥ニンジン

し，分娩前の黒毛和種繁殖牛には低品質の粗飼料を300ｇ／日（β-カロテンとして138㎎／日）給を給与している事例も多いことから，今後はβ-

与し，繁殖牛の初乳と血漿中免疫グロブリン含量

カロテンの不足している黒毛和種繁殖牛に乾燥ニに及ぼす乾燥ニンジン給与の影響を調べた。そのンジンを給与して，初乳中の免疫グロブリンなど

結果，乾燥ニンジン区の分娩直後の血漿β-カロに及ぼす効果を調べることが必要である。

テン含量は475μg/dLと対照区の378μg/dLより４．要

やや高い値であったが，繁殖牛の初乳と血漿中の約

β-カロテン，IgG，IgAおよびIgMには乾燥ニン

初乳中のIgGとIgA産生におけるIgMの役割を

ジン給与の影響は認められなかった。

明らかにするために，黒毛和種経産牛24頭の初乳
中IgG，IgA，IgM，β-カロテン，ビタミンＡとα-トコフェロールの関係を調べた。初乳中IgG含量と比較すると，初乳中IgM含量とIgA含量は非常に低い値であり，また変動が大きかった。初
乳中IgM含量は初乳中IgG含量と正の相関が認められたが，初乳中IgA含量とは相関関係が認められなかった。初乳中IgG含量は加齢に伴って増加したが，初乳中IgM含量には加齢による影響は認められなかった，初乳中ビタミンＡ含量，β-カ
ロテン含量とα-トコフェロール含量間に正の相関が認められ，また初乳中脂溶性ビタミン含量と初乳中IgM含量，IgG含量間にも正の相関が認められた。次に，牧草サイレージ主体で飼養した黒文
献１） Kume, S., Toharmat, T. : Livestock Production
Science, 68, 61～65, 2001.
２） Nishiyama, Y., Yasumatsuya, K., Kasai, K., Sakase,M., Nishino, O., Akaike, M., Nagase, T., Sugimoto, M.,
Ikeda, S., Kume, S. : Livestock Science, 137, 95～100,
2011.
３） Wang, M., Ikeda, S., Yoshioka, H., Nagase, H.,
Kitamura, S., Itoyama, E., Murakami, H., Sugimoto,M., Kume, S. : Animal Science Journal, 86, 673～678,
2015.
４） Taniguchi, S., Wang, M., Ikeda, S., Yoshioka, H.,
Nagase, H., Kitamura, S., Itoyama, E., Murakami, H.,
Sugimoto, M., Kume, S. : Animal Science Journal, 87,
536～540, 2016.
５） 谷口紗耶，王蒙東，池田俊太郎，吉岡秀貢，長瀬祐士，北村祥子，糸山恵理奈，村上弘明，小草啓輔，
佐藤健史，杉本実紀，久米新一：日本畜産学会報，
86, 473～479, 2015.

© The Ito Foundation

298

飼養環境下の牛群におけるマイコトキシン浸潤動態の検証―内分泌撹乱作用の有無と繁殖性に与える影響の解明
Monitoring of naturally contaminated mycotoxin concentrations in feeding
environment of cattle―Effects as endocrine disruptors and reproductive efficacy

髙

木

光

博・宇

野

誠

一＊・國

師

恵美子＊

（山口大学共同獣医学部臨床獣医学講座，＊鹿児島大学）

Mitsuhiro Takagi, Seiichi Uno＊ and Emiko Kokushi＊（Department of Clinical Veterinary Science, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Yamaguchi University, ＊Kagoshima University）

We investigated the effects of in vivo exposure to low zearalenone levels on the antiMüllerian hormone endocrine levels and the reproductive performance of cattle. Urine andblood samples and reproductive records were collected from two Japanese Black breeding
female cattle herds with dietary zearalenone contamination below the threshold levels（＜１ppm） at 30 d after calving. Urinary zearalenone，α-zearalenol, and β-zearalenol
concentrations were measured by chromatography tandem mass spectrometry, and serumanti-Müllerian hormone concentrations were determined along with serum biochemicalparameters. Urinary concentrations of α-zearalenol were significantly higher（p＜0.05）in
cattle in Herd 1 than in cattle in Herd 2, reflecting the different amounts of zearalenone in thediet of the two herds. Although the number of 5-mm and 10-mm follicles of the herds andtheir fertility after artificial insemination were similar, the serum anti-Müllerian hormone
concentrations in Herds 1 and 2 were 438.9 ± 48.6 pg/ml and 618.9 80.0 pg/ml, respectively,
with a trend toward a significant difference（p＝0.053）, which may indicatedifferences in theantral follicle populations between herds. Thus, zearalenone intake from dietary feed, evenwhen below the threshold zearalenone contamination level permitted in Japan, may affect theovarian antral follicle populations, but not the fertility, of postpartum cows.

１．目の構築とその有用性１），２）モニタリング結果を的基にした我が国の暫定基準値を超えるZEN自然申請者らはこれまでに，Fusarium属真菌由来

汚染稲ワラ給与を原因とするMT汚染牛群の初摘

マイコトキシン（MT）で，エストロジェン類似

発例 ２），および３）尿中ZEN濃度を指標とした作用を持つことから家畜に繁殖障害などを引き起MT吸着剤添加効果の客観的評価法の確立３）など

こす可能性が示唆されるゼアラレノン（ZEN）

を報告しており，生体由来サンプルである尿を用に着目し，１）尿中ZEN濃度を指標とした飼養いたMTモニタリングシステムを確立するととも環境下の牛群におけるMTモニタリングシステムに，飼養環境下の家畜（牛および豚）における© The Ito Foundation

飼養環境下の牛群におけるマイコトキシン浸潤動態の検証―内分泌撹乱作用の有無と繁殖性に与える影響の解明

MT浸潤動態の検証およびデータベースの蓄積を進めている。

299

コー（US）を用いた生殖器の観察を行った。
2 . 2 飼料中ZEN濃度測定

近年，ZEN暴露が雌性動物に与える要因の１つとして，卵胞内の顆粒膜細胞（GC）に対する

３）
Fushimi ら（2014）の 報 告 に 従 い ，LC/MS/

MS法による公定法を用いて測定を行った。

アポトーシス誘導とそれに続く卵胞発育の閉鎖，

2 . 3 尿中ZEN濃度測定

退行が報告されている。一方，組織の成長や分化

尿サンプルの調整は我々の既報１）に従い，βに関わる糖タンパクである抗ミューラー管ホルモ-Glucuronidase/arylsulfatase 添 加 に よ る 前 処 理

ン（AMH）は，雌性動物の胞状卵胞のGCから分を行った尿サンプルを固相抽出後にLC/MS/MS泌され，牛では卵巣内にプールされたゴナドトロ

測定に供した。結果はZENとその代謝物α-およピン反応性の胞状卵胞数をモニターするためのバ

びβ-ゼアラレノール（α-ZOLおよびβ-ZOL）

イオマーカーとなることが報告されている４）。し濃度を測定した。

たがって，ZEN汚染飼料が給与された雌牛群に

2 . 4 血清AMH濃度測定

おいては，ZEN暴露によるGCのアポトーシス誘

血清AMH濃度の測定は，AMH Gen II ELISA

導で胞状卵胞が閉鎖し，結果として血中AMH濃kit （Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA） を度の低下が予想される。飼養環境下の牛群におけ用い，Ricoら（2011）４）の方法に準じて血清サン

るMT浸潤動態と血中AMH動態との関連性の有プル50μlを用いて行った。本測定系の測定感度無を検証することは，ZENが持つ内分泌撹乱作は15pg/mlであった。

用を生体レベルで明らかにするために重要なアプ

2 . 5 血清生化学検査

ローチである。

両試験牛群の栄養状態をモニターするために，以上のことから，本申請課題においては，黒毛

我々の既報に従って血清生化学検査を行った（使和 種 繁 殖 雌 牛 群 に お い て ZEN 浸 潤（あ る い は

５）
用器機：Labospect 7180 autoanalyzer, Hitachi）。

ZENを含む複数のMT浸潤）と血中AMH濃度に測定項目はエネルギー代謝：グルコース，遊離脂関するデータベースを蓄積するとともに，各牛群

肪酸（FFA），総コレステロール（TC）；タンパの繁殖成績（空胎日数など）とも併せて，飼養環

ク質代謝：総タンパク（TP），血清アルブミン

境下の繁殖雌牛群におけるMT浸潤動態―血中（Alb），アルブミン／グロブリン比（Ａ：Ｇ），

AMH動態―牛群の繁殖成績の間の関連性の有無

血中尿素窒素（BUN）；肝機能：AST,GGT；ミを検証することを目的とするものである。

ネラル：カルシウム（Ca），マグネシウム（Mg），

２．方無機リン（iP），肝臓代謝：IGF１，の各項目の法測定を行った。

2 . 1 黒毛和種牛群の概要とサンプリング法

2 . 6 繁殖検診成績

黒毛和種繁殖雌の２牛群（Herd１およびHerd

各試験対象牛の分娩後30日目に繁殖検診を行っ

２）を本実験に供した。両牛群ともに自家産粗飼た。直腸検査およびUSを用いて各牛の子宮の回料と購入濃厚飼料が給与されており，試験開始前

復状況（両子宮角サイズ，内腔の貯留卵巣内卵胞に LC/MS/MS 法 に よ る 飼 料 中 ZEN 濃 度 分 析 をおよび黄体の有無），卵胞（＞５㎜）や黄体（＞行った。分娩後30日目の牛を無作為に試験牛とし５㎜）の長径およびそれらの個数を観察，記録して尿および血液の採取を行うとともに，超音波エ

た。併せて，サンプリング終了時に対象牛の繁殖© The Ito Foundation

300

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

履歴を確認して，分娩後初回人工授精（AI）日，

Table１ Mean concentrations of（1）urinary ZEN（±

SEM）and its metabolites and（2）serum antiMüllerian hormone （AMH） related to thereproductive performance of the two JapaneseBlack breeding cattle herds examined.

受胎に至るまでのAI回数と分娩後の空胎日数を確認した。
2 . 7 各成績の取りまとめ

Herd１

Herd２

No. Ca ttle Examined（mean age±SEM）

ｎ＝17（5.4±0.7）aｎ＝13b（8.0±1.0）

ZEN concentrationin dietary feeds（ppm）

Fescue＜0.01, oats
hay 0.1,
concentrates＜0.01

Orchard grass 0.01,
WCS＜0.01,
concentrates 0.05

ZEN
（pg/㎎ creatinine）

235.3±103.2C

45.6±14.2d

α-ZOL（pg/㎎ creatinine）

133.2±39.9a

16.5±5.6b３．結果と考察

β-ZOL（pg/㎎ creatinine）

341.2±84.9220.2±60.4

本試験では２牛群Herd１（n＝17）とHerd２

ΣZEN（pg/㎎ creatinine）

709.7±224.0C

282.3±63.0d

AMH（pg/ml）

438.9±48.6C

618.9±80.0d

5㎜, 4.1±0.9 ; 10㎜,
0.8±0.15㎜, 3.0±0.5 ; 10㎜,
0.7±0.2

11（64.7％）

7（53.8％）尿中ZEN，α-ZOL，β-ZOLおよびそれらの合計（ΣZEN）濃度，血中AMH濃度，各血清生
化学検査項目濃度，各繁殖成績項目は平均SEMで算出した。各項目についてHerd１とHerd２の２群間での比較検討を行った。

（n＝13）からデータを得た。２牛群間で試験牛の年齢に有意な差が見られ，Herd１が全体としNo. folliclesて若い牛群であった。両牛群の飼料中ZEN濃度

Cattle with CL

は，我国のZEN暫定基準値である1.0ppm以下であった。尿中ZEN，α-ZOLおよびΣZENにおいてHerd１がHerd２よりも有意に高い値となり，それらは２牛群間の飼料中ZEN濃度の差を反映するものと思われた。一方，血中AMH濃度は

Day of first AI

50.2±4.0

No. of AIs

1.9±0.4

Day-open period

C82.2±16.1d＊77.1±12.3（n＝10）＊
2.4±0.4（n＝10）Cd＊128.3±17.5（n＝10）＊：Only 10 animals in Herd 2 were examined because three animals
were excluded before their first AI.
a b, ：Significant difference（ p＜0.05）between columns.
c d, ：Trend toward significant difference（0.05＜ p＜0.1）between
columns.

Herd２においてHerd１よりも有意に高い傾向（P＝0.053）が得られた。分娩30日後の卵巣内のことができれば，ZEN暴露あるいはZENを含む

卵胞および黄体の数は両群間で有意差は見られな

複数のMT暴露が家畜の繁殖性に与える影響を生かった。両群間の繁殖成績では，分娩後初回AI

体レベルで客観的に評価することが可能になると日と空胎日数においてHerd１がHerd２よりも有思われる。飼養環境下の牛群におけるMT浸潤動

意に短くなる傾向が得られた（Table１）。

態と血中AMH動態との関連性の有無を検証する

一方，血清生化学検査項目では，BUNとTC濃ことは，ZENが持つ内分泌撹乱作用を生体レベ度において２群間に有意差が見られたが，その他

ルで明らかにするために重要かつ極めて斬新なアの項目においては有意な差は認められなかった

プローチであると思われる。我々はこれまでに摘（Table２）。

発したZEN浸潤牛群の血液サンプルを用いた予近年の体外培養系実験結果から，ZEN暴露が備試験として，血中AMH濃度測定を行い，ZEN

雌性動物の繁殖性に影響を与える要因の１つとし浸潤群においてはAMH濃度の低下傾向が認めらて，卵胞内の顆粒膜細胞に対するアポトーシス誘れることを報告している３）。本試験においては，

導とそれに続く卵胞発育の閉鎖，退行が報告され我々の予備試験結果と同様，上述した仮説を裏付ている６，７）。したがって，顆粒膜細胞の生存性やける結果が得られた。抗ミューラー管ホルモン

活力を反映する内分泌バイオマーカーを測定する

は，組織の成長や分化に関わるTGF-βスーパー© The Ito Foundation

飼養環境下の牛群におけるマイコトキシン浸潤動態の検証―内分泌撹乱作用の有無と繁殖性に与える影響の解明
Table２ Results of serum biochemical analyses（meanSEM）of the two Japanese Black breeding cattle
herds examined.

No. Cattle Examined

Herd１

Herd２

n＝17

n＝13

301

牛群の分娩後繁殖成績においては，初回AI日数および空胎日数においてHerd１が有意に短くなった。一方で，血液生化学検査から，Herd１
においてエネルギー代謝の指標となる総コレステ
ロール濃度がHerd２よりも有意に高い結果が得

Energy metabolism
Blood glucose（㎎/dL）

45.1±2.946.5±3.4

Free fatty acids（μEq/L）

107.0±12.0

101.3±9.4

Total cholesterol（㎎/dL）

119.9±4.7a

89.0±3.3b

Total protein（g/dL）

6.4±0.1

6.6±0.1

Serum albumin（g/dL）
A：G ratio

3.1±0.1
0.94±0.04

3.1±0.1
0.89±0.04

BUN（㎎/dL）

8.0±0.3a

10.3±0.7b

AST（IU/L）
GGT（IU/L）

63.0±2.2
14.3±1.4

63.6±3.0
24.9±8.5

況が分娩後の繁殖成績に大きく影響を及ぼす可能

Minerals
Ca（㎎/dL）
Mg（㎎/dL）
iP（㎎/dL）

9.1±0.1
1.94±0.04
5.6±0.2

9.0±0.1
1.91±0.04
5.2±0.3をさらに増やしてデータベースの拡充をはかり，Liver metabolism
IGF1（ng/ml）

64.6±4.1

72.3±7.6

Protein metabolism

Liver functionられた。さらに，分娩後30日におけるUS観察による長径５㎜以上の卵胞数に両群間に差が認められなかったことから，いわゆる我が国の暫定基準を下回るような程度（１ppm以下）のZENの飼料汚染では，特に反芻動物である牛への内分泌撹
乱作用は極めて低く，むしろ各牛群の飼養管理状性が示唆された。今後，飼養環境下の牛群の例数
飼料中ZEN浸潤状況と牛群の繁殖性についてさらに詳細な検討が必要であると思われた。
約a, b : Significant difference（ p＜0.01）between columns.

４．要

ファミリーに属する糖タンパクであり，雌性動物

黒毛和種繁殖雌牛群における尿中ZEN濃度との胞状卵胞の顆粒膜細胞から分泌され，牛では卵繁殖成績との関連性を検証するとともに，血清中巣内にプールされたゴナドトロピン反応性の胞状AMH濃度の測定を行って，ZEN浸潤による内分卵胞数をモニターするためのバイオマーカーとな

泌撹乱作用の有無，および牛群の繁殖性に与えるることが報告されている。つまり，ZENあるい影響の一端を明らかにすることを目的とした。黒はZENを含む複数のMTに汚染された飼料を給与

毛和種繁殖牛群２群を選定し，分娩後30日に尿おされた雌牛群においては，ZEN暴露により顆粒

よび血液のサンプリングを行うとともに，超音波

膜細胞のアポトーシスが誘導されて胞状卵胞が閉診断装置を用いた生殖器の詳細な観察を行った。

鎖し，結果として血中AMH濃度が低下すること

尿 サ ン プ ル は LC/MS/MS 法 に よ り 尿 中 ZEN ，が予想された。一般的に血液中AMH濃度は年齢

α-ZOLおよびβ-ZOL濃度の測定を行った。さらとともに低下することが示唆されており，本試験に血中AMH濃度を測定し，２群間での比較検討

においては，Herd１の平均年齢がHerd２よりもを行った。その結果，尿中ZEN濃度が有意に高有意に低かったにもかかわらず，血中AMH濃度

い牛群において，AMH濃度は有意に低い結果とが低い値を示したことも，上述の仮説を支持するなり，ZEN浸潤動態と血清中AMH濃度との関連ものと思われた。

性が示唆された。一方，繁殖成績ではZEN濃度

一方，本試験では２つの試験牛群間で尿中ZENが高い牛群において分娩後空胎日数が有意に短い濃度に有意差が認められ，Herd１においてHerd

結果となり，低レベルZEN浸潤は繁殖性に直接２よりも高い尿中濃度であったにもかかわらず，的な影響を及ぼすものではないことが示唆された。

© The Ito Foundation

302

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

文献１） Takagi, M., Uno, S., Kokushi, E., Shiga, S., Mukai,S., Kuriyagawa, T., Takagaki, K., Hasunuma, H.,
Matsumoto, D., Okamoto, K., Shahada, F., Chenga, T.,
Deguchi, E., Fink-Gremmels, J. J. : AnimSci, 89, 287～296, 2011.
２） Hasunuma, H., Takagi, M., Kawamura, O.,
Taniguchi, C., Nakamura, M., Chuma, T.,Uno, S.,
Kokushi, E., Matsumoto, D., Tshering, C., Deguchi, E.,
Fink-Gremmels, J. : Anim Sci, 90, 1610～1616, 2012.
３） Fushimi, Y., Takagi, M., Hasunuma, H., Uno, S.,
Kokushi, E., Watanabe, U., Liu, J., Marey, M.,
Miyamoto, A., Otoi, T., Deguchi, E., Fink-Gremmels,
J. : World Mycotoxin J, 7, 367～378, 2014.
４） Rico, C., Medigue, C., Fabre, A., Jarrier, P.,
Bontoux, M., Clement, F., Monniaux, D. : Regulationof anti-Müllerian hormone production in the cow : amultiscale study at endocrine, ovarian, follicular, andgranulose cell level, Bio lReprod, 84, 560～571, 2011.
５） Watanabe, U., Takagi, M., Yamato, O., Otoi, T.,
Tshering, C., Okamoto, K. : Metabolic profile ofJapanese Black breeding cattle herds：usefulness inselection for nutritional supplementation to enhance
reproductive performance and regional differences,
J Vet Med Sci, 75, 481～487, 2013.
６） Minervini, F., Giannoccaro, A., Fornelli, F., Dell'
Aquila, M. E., Minoia, P., Visconti, A. : Influence of
mycotoxin zearalenone and its derivatives（alphaand beta zearalenol）on apoptosis and proliferationof cultured granulose cells from equine ovaries,
Reprod Biol Endocrinol, 4, 62, 2006.
７） Zhu, L., Yuan, H., Guo, C., Lu, Y., Deng, S., Yang, Y.,
Wei, Q., Wen, H. : Zearalenone induce apoptosis andnecrosis in porcine granulose cells via a caspase-3
and caspase-9-dependent mitochondrial signaling
pathway, J cell Physiol, 227, 1814～1820, 2012.

© The Ito Foundation

303

非侵襲的生体電気インピーダンス法による牛枝肉
脂肪交雑の推定Estimation of beef marbling standard number based on non-invasive
bioelectrical impedance analysis

橋

元

大

介・福

田

修＊

（長崎県農林技術開発センター，＊佐賀大学大学院工学系研究科）

Daisuke Hashimoto and Osamu Fukuda＊（Nagasaki Agricultural and Forestry Technical Development Center,＊Graduate School of Science and Engineering, University of Saga）

To investigate relationship between non-invasive bioelectrical impedance values and Beef
Marbling Standard（BMS）numbers measured from the surface of the sirloin part in live
fattening cattle within one month before slaughter, the extracellular resistance values（Rex）,
the intracellular resistance values（Rin）and the cellular membrane capacitance（Cm）were
calculated using the measurement values in bioelectrical impedance analysis（BIA）. The
measurement was conducted with 33 beef cattle one month before slaughter treatment. The
electrode pads were on the surface of a body to the four points : 100, 125, 225, 250［mm］in aline from the last lumbar vertebra. As the result, a significant correlation was observed among
Rin, and BMS values. The results suggested that the non-invasive BIA could be useful toestimate the BMS number in live fattening cattle.

１．目

改善や適切な出荷時期の判断に応用できる。

的

これまでに超音波や生体バイオプシーを用いた

わが国の肉用牛生産において高品質な牛肉生産

BMS No.推定に関する報告１～３）がある。しかし，を行う場合，脂肪交雑（以下，BMS No.）が重視

超音波装置は，非常に高価であり，生産農家が購され，BMS No.が牛枝肉単価の決定に大きく影響

入し活用することは困難である。また，生体バイを及ぼしている。特に黒毛和種肥育牛生産は約

オプシーは，侵襲的であるため牛体への負担が大20ヵ月間を要し，長い肥育期間中の飼養管理など

きく，麻酔等を実施する観点からも生産農家は取の問題点を把握するには，と畜後の枝肉からのみり組み難い。

である。そのため肥育生体時にBMS No.を高精度

著者らはこれまでに，生体インピーダンス法で推定する技術が求められている。また，推定技（Bioelectrical Impedance Analysis：以 下 ，BIA）

術を用いて肥育中のBMS No.の経時的変化を明らに着目し，BIAを用いたBMS No.推定について検かにすることができれば，肥育中に出荷後の肉討した。その結果，出荷１ヵ月前の肥育牛最後位

質，品質を予測できる可能性があり，飼養管理の胸椎位の胸最長筋（以下，サーロイン）のBIA測© The Ito Foundation

304

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

定から得られる細胞内抵抗値（以下，Rin）によっルVer.２６）に基づいて，粗脂肪含量を測定した。

てBMS No.および枝肉のリブロースの粗脂肪含量

出荷１ヵ月前に非侵襲的BIAを実施した。実施を推定する可能性が示唆され，BIA法は肉用牛生

方法は，供試牛を保定枠に入れて鎮静し（セラク

体時における脂肪交雑推定法の１つになり得るこ

タール２％注射液１ml，バイエル薬品株式会社，とを明らかにした 。しかし，そのBIAは，牛体大阪），牛体左側の第１腰椎位から頭方へ（縦200サーロイン内部に電極を差し込み測定する侵襲的㎜×幅300 ㎜）剃毛した。その後，非侵襲的BIA手法であり，牛への負担があることが課題であのため最後位腰椎より腹側約100 ㎜から頭方へる。そのため，肥育牛の体表からBIA測定を可能

25,100および25 ㎜間隔で同一線上の４ヵ所に心とする，非侵襲的BIAによるBMS No.推定手法を

電図用ペースト（カルジオクリーム，日本光電工

検討する必要がある。

業株式会社，東京）を塗布した電極パッド（アク４）

本研究では，BIAを用いた非侵襲的肥育牛生体

セルガード50×90 ㎜，伊藤超短波株式会社，東時BMS No.の推定法を確立するため，肥育牛生体京）を体表に貼付した。電極パッドは，外側を電時のサーロイン部位体表でBIAを行い，その電気

流印可用電極，内側を電圧計測用電極とし測定し的特性とBMS No.の関係を明らかにすることを目た（Fig.１）。インピーダンス測定には，ケミカ的とする。

ルインピーダンスメーター（3532-80，日置電機

２．方株式会社，長野）を用い，周波数１k～1000 k［Hz］

法（1.00 k，1.15 k，1.33 k，1.53 k，1.76 k，2.02 k，

供試牛には，長崎県農林技術開発センターで飼2.33 k，2.68 k，3.09 k，3.56 k，4.10 k，4.72 k，5.43 k，

養され，2010年12月から2014年５月に長崎県の佐6.25 k，7.20 k，8.29 k，9.54 k，10.99 k，12.65 k，

世保食肉センター株式会社に出荷された黒毛和種

14.56 k ， 16.77 k ， 19.31 k ， 22.23 k ， 25.60 k ，

肥育去勢牛21頭（平均月齢±標準偏差：28.4±

29.47 k ， 33.93 k ， 39.07 k ， 44.98 k ， 51.79 k ，

1.5ヵ月齢，平均体重±標準偏差：840.5±81.7 ㎏）

59.64 k ，68.66 k ，79.06 k ，91.03 k ，104.80 k ，ならびにホルスタイン種肥育去勢牛11頭（平均月120.70 k，138.90 k，160.00 k，184.20 k，212.10 k，

齢±標準偏差：22.1±0.3ヵ月齢，平均体重±標準244.20 k，281.20 k，323.70 k，372.80 k，429.20 k，偏差：814.7±33.0 ㎏）を用いた。枝肉格付成績494.20 k，596.00 k，655.10 k，754.30 k，868.50 k

は，（公社）日本食肉格付協会による評価

を用および1000.00ｋの50点）に変化させながら電気いた。供試牛のBMS No.は２～11の範囲であり，的特性を連続測定し，その測定時間は30秒であっその平均値は6.0，標準偏差は3.2であった。なお，

た。測定項目はそれぞれの周波数（単位：Hz，

本研究で供した黒毛和種には，BMS No.２または表記：ｆ）に対するインピーダンス値（単位：３である個体が含まれておらず，BMS No.が低い

Ω，表記：Ｚ），純抵抗値（単位：Ω，表記：Ｒ）

個体としてホルスタイン種（BMS No.２の８頭おおよびリアクタンス値（単位：Ω，表記：Ｘ）とよびBMS No.３の３頭の計11頭）を加えた。リブ

した。得られたインピーダンス値を用い，細胞外

ロースについては，屠場で枝肉の第６―７肋骨間抵抗（単位：Ω，表記：Rex），細胞内抵抗（単切開面頭側を約50 ㎜の厚さにカットした。その

位：Ω，表記：Rin）および細胞膜容量（単位：

胸最長筋のみをフードプロセッサーでミンチにＦ，表記：Cm）を算出した７～11）。Rex，Rinまたは

し，牛肉の品質評価のための理化学分析マニュア

Cm とBMS No.およびリブロースの粗脂肪含量と５）© The Ito Foundation

305

非侵襲的生体電気インピーダンス法による牛枝肉脂肪交雑の推定

Chemical Impedance Meter（HIOKI E.E.CORPORATION）
A
Impedance measurement

V
25mm

25mm
100mm

Shaved hair
Electrode pad（AXEL GAARD,50×90mm）
Applied paste for electrocardiograms
between an electrode and a bodyFig. 1 Measuring setup for Non-invasive BIAの関係について単回帰分析を行い，単回帰における分散分析から相関係数（ｒ）と残差標準偏差
BMS No.

（RSD）を算出し，各回帰式の推定精度を比較検討した12）。
３．結果と考察
非侵襲的BIAによる肥育牛の生体時における
サ ー ロ イ ン の Rex と 枝 肉 の BMS No. お よ び リ ブ

12 Ｙ=－4.61+0.35X
11 r=0.66,RSD=±2.4
10 （P＜0.01）
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0

ロース粗脂肪含量との関係をFig.２に示した。

10

ぞれＹ＝－4.61＋0.35Ｘ（ただし，21.9≦Ｘ≦49.3

0.66 ，RSD ＝ ± 2.4 ，Ｐ ＜ 0.01 お よ び ｒ ＝ 0.66 ，
RSD＝±12.0，Ｐ＜0.01）。枝肉において，BMS
No.とRexとの間には，有意な正の相関が認められていない13）。また，侵襲的BIAによる橋元らの報
告

４）

40
30
20

く異なり，筋肉外組織，皮下脂肪組織，表皮など

Ｙ=－15.89+0.76X
r=0.66,RSD=±12.0（P＜0.01）

10
0
0

10

20

30

40

50

60

Rex
（Ω）

量との間には，相関が認められておらずこれまで
は，侵襲的BIAの場合と電流の流れる経路が大き6050でRex とBMS No.およびリブロース粗脂肪含の報告と矛盾する結果となった。非侵襲的BIAで

50

60
crude fat in ribulose（％）

れる有意な回帰式が得られた（それぞれ，ｒ＝40（a）
BMS No.
（n=32）びリブロース粗脂肪含量（Ｙ）との間には，それだし，21.9≦Ｘ≦49.3かつ12.4≦Ｙ≦56.8）で示さ

30
Rex
（Ω）

サーロイン体表のRex（X）とBMS No.（Y）およかつ２≦Ｙ≦11）およびＹ＝－15.89＋0.76Ｘ（た20（b）Crude fat in ribulose（n=32）

Fig. 2 Simple correlation coefficients between Non-invasive extracellular resistance（Rex）and BMS No.
or crude fat in ribulose of live fattening cattle.

© The Ito Foundation

306

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）のサーロイン筋肉組織以外の情報も計測される。
このことが，Rex の計測値に何らかの影響を与え
合は生検針が筋内に到達しており，Rex の細胞情報は，主に筋細胞外電解質の濃度変化および電解質物質の変性とされる13）。これに対して，非侵襲

BMS No.

たと考えられる。前述のように，侵襲的BIAの場

的BIAの場合は，筋細胞に加えて，サーロイン筋
肉組織以外の電解質の影響が大きく計測されたと

12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

考えられる。しかし，まだ明確な考察が得られな

Ｙ=1.61+0.06X
r=0.67,RSD=±2.4（P＜0.01）0

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
R（Ω）
in

いため，今後も計測データの蓄積を行い，解析を（a）
BMS No.
（n=32）

進める必要がある。
非侵襲的BIAによる肥育牛の生体時における
サ ー ロ イ ン の Rin と 枝 肉 の BMS No. お よ び リ ブ
サーロインのRin（X）とBMS No.（Y）およびリ
ブロース粗脂肪含量（Ｙ）との間には，それぞれ
Ｙ＝1.61＋0.06Ｘ（ただし，21.5≦Ｘ≦168.4かつ２≦Ｙ≦11）およびＹ＝13.51＋0.31X（ただし，21.5≦Ｘ≦168.4かつ12.4≦Ｙ≦56.8）で示される有意な回帰式が得られた（それぞれ，ｒ＝0.67，

crude fat in ribulose（％）

ロース粗脂肪含量との関係をFig.３に示した。

60
50
40
30
20

Ｙ=13.51+0.31X
r=0.74,RSD=±10.8（P＜0.01）100

0

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
R（Ω）
in

RSD＝±2.4，Ｐ＜0.01およびｒ＝0.74，RSD＝±10.8，Ｐ＜0.01）。これは，前述した侵襲的BIAに（b）
Crude fat in ribulose（n=32）

よるサーロインのRin とBMS No.およびリブロー

Fig. 3 Simple correlation coefficients between Non-

スの粗脂肪含量との間の相関，谷原ら14）の報告おinvasive intracellular resistance（Rin）and BMS No.
or crude fat in ribulose of live fattening cattle.

よび橋元らの報告４）より若干弱い相関であるものの，正の相関が得られたことから，非侵襲的BIAによると，枝肉のCm とBMS No.との間には，高による肥育牛サーロインBIAによって得られるい相関（ｒ＝－0.938～－0.975）がみられたとさ

Rin によりBMS No.および枝肉リブロースの粗脂れている。また，前述したCm とBMS No.および

肪含量を推定できることが示唆された。

リブロースの粗脂肪含量との相関や橋元らの報

非侵襲的BIAによる肥育牛の生体時における告４）での結果と矛盾する。
Hayden modelパラメー

サ ー ロ イ ン の Cm と 枝 肉 の BMS No. お よ び リ ブ

タで検出されると考えられるCm の情報は，細胞ロースの粗脂肪含量との関係をFig.４に示した。

膜の機械的損傷や膜組成の変化などとされていサーロインのCm（X）とBMS No.（Y）およびリる。非侵襲的BIAでは，表皮と電極間に大きな容

ブロース粗脂肪含量（Ｙ）との間には，いずれも量結合が存在し，体毛の処理や導電性ゲルの塗布

有意な相関は認められなかった（それぞれ，ｒ＝状況によっても，その状況が大きく変動する可能0.07，Ｐ＞0.1およびｒ＝0.14，Ｐ＞0.1）。谷原ら

性がある。このため本論文で使用したHayden

13）© The Ito Foundation

非侵襲的生体電気インピーダンス法による牛枝肉脂肪交雑の推定

BMS No.

r=0.07
RSD=±3.2（P＞0.1）のBMS No.推定能を比較すると，両手法ともに

12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

-100 -80 -60 -40 -20

Rin とBMS No.との間の相関が高いものの，その相関係数を比較すると，侵襲的BIAの方が高い。
これは，非侵襲的BIAが皮膚，皮下脂肪およびサーロインのすべてを測定しているのに対し，侵襲的BIAは測定標的であるサーロイン内部に電極が存在し，かつ皮下脂肪への通電を留置針により
0

20

40

60

80 100Cm（nF）

た本研究で供試した個体では，皮下脂肪の厚さが1.0～5.0 ㎝とそのばらつきは大きい。このことが，60
crude fat in ribulose（％）

遮っているため，サーロインのみの情報を的確に測定できていることに起因すると考えられる。ま（a）
BMS No.
（n=32）

Rin のばらつきを大きくしている可能性がある。

50

r=0.14
RSD=±15.9（P＞0.1）

307

本研究では，超音波装置もしくは生検針を用いて40

皮下脂肪の厚さを計測している。今後は，非侵襲

30

的BIAにおいて，皮下脂肪の厚さを同時に測定し，

20

Rin に与える影響を除外する手法を明らかにする

10

ことが課題となる。
推定機器開発には，ヒトでの体脂肪率測定機器

0-100 -80 -60 -40 -20

0

20

40

60

80 100Cm（nF）

が参考となるが，その測定では，身長，体重，年齢などのパラメータを入力し，測定能を高めてい（b）
Crude fat in ribulose（n=32）

Fig. 4 Simple correlation coefficients between Non-invasive Cellular membrane capacitance（Cm）and
BMS No. or crude fat in ribulose of live fattening
cattle.

る15）。牛における非侵襲的BIAでは，電極間の距離が一定であるが，皮下脂肪の厚さやサーロインの断面積は個体で異なる。そのため，より精度の高いBIAを測定するためには，皮下脂肪の厚さやmodelでのパラメータ推定において，Cmの推定にサーロイン面積をパラメータとして用いることが大きな誤差を発生したと考えている。

望ましい。皮下脂肪については，前述したように本研究で提案した非侵襲的BIAは，侵襲的BIA

BIAと同時にその厚さを計測する手法を検討するに比べ，牛体への負担が少なく，最終的なユー必要がある。サーロイン面積は，超音波肉質診断

ザーとなる生産者が容易に利用できることが予想

装置を用いなければ難しいことから，肥育牛の体される。特に，測定の準備に関して，侵襲的BIA格を表わす体重，体高などの体尺測定値や個体のが鎮静剤等の獣医師の指示を要するのに対し，非肉質能力を示す育種価などが，推定精度を高める

侵襲的BIAでは体表に電極パッドを貼り付けるこ

補正用パラメータとなり得るかの検討が必要であとから，鎮静剤等を要しない。実際に本研究でも，る。

非侵襲的BIAの測定時に供試牛が不快感を示すよ

さらに，ヒトの体脂肪計測定用に一般家庭用に販売されている機器は，一人で簡便に測定するこ

うな行動はみられなかった。
一方，非侵襲的BIAと橋元らによる侵襲的BIAとが可能であり，価格面でも安価に手に入れるこ© The Ito Foundation

308

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）とができる15）。本研究における非侵襲的BIAは，単回帰式が得られ（ｒ＝0.67，RSD＝±2.4，Ｐ＜

牛体が動いたときに電極パッドがずれることが散

0.01およびｒ＝0.74，RSD＝±10.8，Ｐ＜0.01），

見されることから，牛体に密着させやすく，かつ非侵襲的BIAによって牛枝肉脂肪交雑を生体時に一人で簡便に測定できるパッケージングが必要と推定する可能性が示唆された。

なる。また，1ｋ～1000ｋ［Hz］の幅広い周波数を測定している。ヒトの体脂肪計の多くは定電流源として，50 kHzで500μＡの電流を人体に流す16～18）ことで測定を単純化し，製造コストを抑えていると思われる。今後は，肉用牛の脂肪交雑推定に適切な定電流源を明らかにするとともに，定電流源を設置した安価な測定機器の開発が必要であると考える。
以上から，出荷１ヵ月前の肥育牛サーロインの非侵襲的BIA測定から得られるRin によってBMS
No.および枝肉のリブロースの粗脂肪含量を推定する可能性が示唆され，本法は肉用牛生体時における非侵襲的BIAによるBMS No.推定法の１つになり得るものと考えられた。
４．要約

BIAを用いた非侵襲的肥育牛生体時BMS No.の推定法を確立するため，肥育牛のサーロインの非侵襲的BIA，BMS No.およびリブロース粗脂肪含
量の相互関係を検討した。出荷約１ヵ月前の黒毛和種肥育牛去勢21頭ならびにホルスタイン種肥育
去勢牛11頭に対し，牛体左側の最後位腰椎より腹側約100 ㎜から頭方へ25,100および25 ㎜間隔で同一線上の４ヵ所に心電図用ペーストを塗布した電極パッドを体表に貼付し，外側を電流印可，内側を電圧計測とし，インピーダンスメーターによりBIA値を測定した。そのBIA値からRex ，Rin およびCmを算出した。その結果，RinとBMS No.およびリブロース粗脂肪含量の間に，それぞれ有意な

文献１） 宮 嶋 恒 晴：西 日 本 畜 産 学 会 報 ，44 ，35 ～ 42 ，2001．
２） 橋元大介，福田修，鍋岡奈津子，中西良孝：日本
畜産学会報，85-１，51～60，2014．
３） 橋元大介，岩元禎，早田剛，中西良孝：日本暖地
畜産学会報，57-２，141～146，2014．
４） 橋元大介，福田修，早田剛：計測自動学会論文集，
52-３，印刷中，2016．
５）（社）日本食肉格付協会：牛・豚・枝肉・部分肉
取引規格解説書，６～29，（社）日本食肉格付協会，
東京，2010．
６）（社）畜産技術協会：牛肉の品質評価のための理
化学分析マニュアル，Ver.2，3～21，（社）畜産技術協会，東京，2003．
７） 逢坂哲彌，小山昇，大坂武男：電気化学法・基礎測定マニュアル，157～182，講談社サイエンティフィ
ク，東京，1998．
８） 逢坂哲彌，小山昇：電気化学法・応用測定マニュ
アル，193～196，講談社サイエンティフィク，東京，
1999．
９） 中村隆夫，山本尚武：岡山大学医学部保健学科紀要，10-１，15～22，1999．
10） 藤嶋昭，相澤益男，井上徹：電気化学測定法・上，209～222，技報道出版株式会社，東京，2000．
11） 大堺利行，加納健司，桑畑進：ベーシック電気化学，130～136，化学同人，京都，2001．
12） 応用統計ハンドブック編集委員会（代表者奥野忠一）編：応用統計ハンドブック，91～120，養賢堂，東京，1989．
13） 谷原礼諭，豊田淨彦，口田圭吾，橋本和博，渡邊
朋子，中嶋哲治，十川政典，岡昌秀，日浦千尋，岡田栄一，新居康生，斉藤武司，田淵賢治：香川県畜産試験場研究報告，38，10～28，2003．
14） 谷原礼論：養牛の友，360，34～40，2006．
15） 佐藤哲也，大島秀武：計測技術，32，10～13，
2004．
16） 竹原克：計測技術，32-8，14～20，2004．
17） 石 黒 憲 子 ，角 田 直 也 ： THE Annual Reports ofHealth, Physical Education and Sport Science ，25 ，63～39，2006．
18） 水野増彦，村松愛梨奈，石井隆士，井川正治：日本体育大学スポーツ科学研究，1，22～27，2012．

© The Ito Foundation

309

食肉特性の向上を目指して：ポリフェノール給餌による遅筋型筋線維の形成誘導
Slow-myofiber generation induced by dietary polyphenol feeding, towardenhancing meat qualityド

辰巳 隆一・水野谷 航・宮原 秀雄・岡本
マイコイ・大坪 秀明・小宮 祐介・チャハラ

慎平・赤星 眞理子・鈴木 貴弘・
モクラン・中村 真子・池内 義秀（九州大学大学院農学研究院）

Ryuichi Tatsumi, Wataru Mizunoya, Hideo Miyahara, Shinpei Okamoto, Mariko Akahoshi, Takahiro Suzuki,
Mai-Khoi Q. Do, Hideaki Ohtsubo, Yusuke Komiya, Mulan Qahar, Mako Nakamura and Yoshihide Ikeuchi（Graduate School of Agriculture, Kyushu University）

Muscle fiber type proportions are responsible for a variety of properties of skeletal muscle,
including contractile, metabolic, and sensory（differential tasting-component contents and fat
deposition）; therefore mechanisms that regulate these properties, and their manipulation are
hot targets of research for meat-animal production and human sports and health. We very
recently found that resident myogenic stem satellite cells produce and secrete semaphorin 3A（Sema3A）protein exclusively to impact the formation of slow-twitch fibers through a cellmembrane receptor/myogenin/MEF2D/slow-myosin signaling pathway. Here we report thatan 8-week intake of apple polyphenol（APP ; prepared from unripe apples）in the diet, may
stimulate the Sema3A ligand-dependent pathway concerned. Results demonstrated significant
improvement of lower hind-limb muscle endurance based on increased proportions of fatigueresistant myofibers（types IIx, IIa, and I）by the APP-feeding to young-adult rats（P ＜ 0.05）.
There was no significant difference in the animal body-phenotypes or locomotor activity shownas total moving distance in light and dark periods, indicating that the shift in myosin heavy
chain（MyHC）isoforms from fast-to-slow did not include a bias due to greater exercise
behavior by the treated rats. Notably, a subsequent in vitro study showed that supplementationof APP（500 ng/ml）or the major component chlorogenic acid（10 ng/ml）also up-regulated
the expression of slow MyHC and the up-stream signaling molecules, myogenin and MEF2D,
in primary cultures of differentiating myoblasts（P ＜ 0.05）. Other major polyphenols found in
APP（procyanidin B1, B2, phloridzin, and catechin）in a range of 10-1000 ng/ml did not induce
these effects. Therefore, the present study highlights a promising contribution of dietary APP
intake to increasing intermediate/slow fibers and may help in developing a novel strategy for
application in meat production technologies and human sports and age-related health sciences.

１．目

なので“筋線維”と呼ばれる）はその収縮特性や的エネルギー代謝特性の違いから「遅筋型」と「速骨格筋の主体である筋細胞（細長く巨大な細胞筋型」に分類される。遅筋型筋線維は速筋型に比© The Ito Foundation

310

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

べて直径が小さく（“キメ”が細かく軟らかい），
脂肪が沈着しやすい他，旨味成分やヘム鉄・タウ

２．方法

リン・カルニチンなどの機能性栄養成分の含量が

2.1

摂餌実験

高いことが知られている。また遅筋型筋線維の収実験動物として，９週齢の雄性Fischer F344系

縮タンパク質である遅筋型ミオシンは速筋型ミオラット（KBTオリエンタル社）を供試した。搬シンに比べ加熱ゲル強度や保水性も高い。した

入後約２週間の馴致飼育の後（室温22 ±２℃，がって，筋線維型は食肉および加熱食肉製品の品

湿度55±10％，12：12 明暗サイクル），AIN-93

質および栄養機能性を決める重要な要素であり，Ｇ準拠食にAPP（アサヒビール社製）を５％（w/

これを制御している分子機構を明らかにする意義

w）添加した飼料を８週間，pair-feeding法によは極めて大きいと言える。

り制限給餌した（n＝９匹）。初期体重，総摂食

申請者は，筋肥大・再生に関わる筋幹細胞（衛量および体重増加量が対照群（APP非給餌群，n星細胞）が活性化・増殖し分化・融合期に至る＝９匹）と同じになるように調整した。また同様と ， 多 機 能 性 細 胞 制 御 因 子 semaphorin 3Aに ，0.5 ％ APP 給 餌 実 験 に は 12 週 齢 の Sprague-（Sema3A）を合成・分泌し遅筋型筋線維の形成

Dawley系雄性ラットを用い，自由摂食飲水条件

を 誘 導 す る こ と を 見 出 し た １ ～ ６）。こ の こ と はにて８週間飼育した。この場合も，初期体重，総Sema3Aの細胞膜受容体のアゴニストにより遅筋

摂食量および体重増加量はいずれも対照群と有意型筋線維の形成を促進できることを示唆していな差がないことを確認した。

る。リンゴ幼果皮（未利用食品資源）から調製し

Iwataら８）の方法を一部改変し，筋持久力を測たポリフェノール画分を５％（w/w）添加した

定した。すなわち，麻酔下で脛骨神経の電気刺激

飼料を成熟ラットに８週間給餌すると筋持久力が（電圧60Ｖ，パルス幅１ms，250 Hz）により後肢有意に向上することがNakazatoら

により報告

下腿部後方筋（ふくらはぎの筋）の最大発揮張力

さ れ て い る の で ，こ の リ ン ゴ ポ リ フ ェ ノ ー ルを測定し，その経時的減衰曲線からAPP給餌群（APPと略記）に上記のアゴニスト成分が含まれと 対 照 群 の 筋 持 久 力 を 比 較 し た 。ま た ，ているのではないかと予想した。このような特性

Mizunoyaら９）の高分解能SDS-PAGE法により，を持つ食品成分はこれまでに報告がない。

後肢下腿部筋のミオシン重鎖（MyHC）アイソ

７）

本研究は，上述のAPPを給餌すると遅筋型筋

フォーム発現量を解析し，筋線維型組成の変化を線維の割合が増加するかどうかを明らかにすると調べた。また，ミオグロビンの発現変化はアクチ

ともに，APPに含まれると期待されるSema3A受ンを内部標準としたECL-Western blotting法に容体のアゴニスト成分（遅筋型筋線維の形成誘導より解析した。これらの動物実験はすべて，日本

成分）を同定しその作用機構を検証することを目

学術会議が定める動物実験実施ガイドラインに従的として実施した。これは，先の「筋幹細胞の分い九州大学動物実験審査委員会の承認のもと実施

泌因子Sema3Aによる遅筋型筋線維の形成誘導」

した。

の生理学的重要性と新規性を傍証する意味でも重2.2

要である。成熟ラットに対するAPP給餌実験おSprague-Dawley系雄性ラットの背部および後

よび衛星細胞初代培養系への添加実験の結果を報

肢大腿部の骨格筋より，Allenら 10）の方法に従い告する。

衛星細胞を調製した。パーコール密度勾配遠心分© The Ito Foundation

衛星細胞初代培養系への添加実験

311

食肉特性の向上を目指して：ポリフェノール給餌による遅筋型筋線維の形成誘導

離 法 に よ り 衛 星 細 胞 を 単 離 し た 後 ，poly-L-

３．結果と考察lysine・fibronectin・lamininで３重コートした培
養用プレートに１ｘ10４個／㎝２の細胞密度で衛星

3.1

細胞を播種した。10％正常ウマ血清（HS）を含

成熟ラットにAPPを５％含む通常食を８週間

むαMEM培地で２日間前培養した後，２％HS-給餌すると，脛骨神経の電気刺激により発生する

OptiMEM分化誘導培地で４日間培養し，遅筋型

後肢下腿部筋の最大発揮張力の経時的減衰が有意

MyHCアイソフォーム（MyHC I）・myogenin・に抑制された（Fig.１）。0.5％APP摂餌実験でもMEF2Dの発現をリアルタイムRT-qPCRにより同様の傾向が見られたことから（F（98，1372）

調べた（TaqMan Probe法；内部標準はHPRT）。

＝1.246，P＝0.0574），APP摂取により筋持久力

上記の分化誘導培地には，リンゴポリフェノールが向上することが確認された。後肢下腿部筋を高およびポリフェノール精製標品（クロロゲン酸，

分解能SDS-PAGEで解析したところ（0.5％APP

フロリジン，プロシアニジンＢ１，プロシアニジ給餌区），速筋型筋線維が優勢な足底筋およびンＢ２，エピカテキン）を種々の濃度で添加した。

EDL筋のミオシン重鎖アイソフォーム組成が遅APP摂取が筋線維型組成に及ぼす影響

筋型方向へ有意にシフトしていることが分かった

700initial value（at 0 s）

ANS
（p=0.66）

60
0
50
0
40
0
30
0
20
0
10
0
0

CNT 5%APP

time course（at 1-100 s）

1.2

B

1.0

（relative value）

80

Maximum PlanterーFlexion TorqueMaximum Planter-Flexion Torque（mN・m）（Fig.２）。具体的には，IIb型の減少とIIx・IIa・

5%APP
＊

0.8
0.6

＊＊

CNT

＊

0.4
0.2
0.0

0

20

40

60

80

100

Time
（s）
Fig. 1Improvement of muscle endurance by 5％ APP feeding. Maximum isometric planter-flexion force torquewas measured under anesthesia after 8-wk feeding of the control or 5％-APP diet. A hook-shaped
electrode connected to an electronic-stimulator module generated a stimulus train（60 V, 250 Hz : pulse
width 1 ms, duration 160 ms with intervals of 3 ms）delivered to the right tibial nerve branch thatinnervates calf muscles of the lower hind limb, including plantaris, soleus, and gastrocnemius muscles.
Maximum-contraction forces measured were converted to torque（mN・m）by multiplying by the length
between the medial malleolus and the head of the first metatarsal bone ; the initial value at the firststimulation（at 0-s）and the time-course change in response to 100-s successive stimulation (expressed
relative to the initial value) are shown in panels A and B, respectively. Data points and bars depict themean ± SE for nine rats in each group fed with control（open circle and bar）or the 5％-APP diet (closed
circle and bar) and significant differences from control at P ＜ 0.05 and P ＜ 0.01 are indicated by（＊）and（＊＊）, respectively. NS, no significant difference.

© The Ito Foundation

平成27年度

MyHC Isoforms
（%）

A 70

SDS-PAGE and densitometry
P＝0.020

＊

60

CNT;

P＝0.025

0.5%APP＊

50
40

plantaris

30
20
10
0
0

Ⅰ

B 60
MyHC Isoforms（%）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Ⅱa

50

Ⅱx

Ⅱb

c 100
MyHC Isoforms
（%）

312

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0

NS
（P＝0.18）

soleusNS（P＝0.16）

Ⅰ

Ⅱa

Ⅱx

Ⅱb

NS
（P=0.10）

40
EDL

30
20
10
0

P＝0.040
P＝0.00092

0

＊

＊＊

Ⅰ

Ⅱa

Ⅱx

Ⅱb

Fig. 2
Fast-to-slower type shift of MyHC isoform composition by 0.5％ APP feeding. Plantaris（panel A）, EDL（B）,
and soleus（C）muscles from control and 0.5％-APP diet groups（after 8-wk feeding）were analyzed for eachthe ratio of each MyHC isoform（％）relative to total MyHC, by combination of SDS-PAGE system and thesubsequent densitometry. Data bars depict the mean±SE for nine rats per group fed with control（openbars）or an 0.5％ -APP diet（closed bars）and significant differences from control means at P ＜ 0.05 and P ＜0.01 are indicated by（＊）and（＊＊）,respectively. NS, no significant difference.

Ⅰ型の増加であり，また，遅筋型筋線維に多く含で 添 加 し（最 終 濃 度 10-10000 ng/ml），遅 筋 型

まれるミオグロビンの含量も有意に増加した

MyHC（MyHC I）の発現に及ぼす影響を調べた（data not shown）。0.5％APP給餌によってラッ（Fig.３A）。MyHC IのmRNA発現は有意に増加

トの明期・暗期の自発運動量に有意な差は認めら

し ，そ の 効 果 は 500 ng/ml で 最 大 と な っ た 。

れなかったことから，上記の遅筋型方向へのシフ

MyHC I 発 現 量 の 増 加 は Western blotting（総トは運動による２次的効果ではないと考えられた

MyHC 量 で 標 準 化）で も 確 認 さ れ た（data not（data not shown）。これらの結果より，APP摂取

shown）。また，Sema3A依存的なMyHC I発現誘により筋線維型組成が持久性に富む遅筋型方向へ

導シグナリング軸を構成するmyogeninおよびシフトすることが明らかになった。

MEF2Dの発現もAPP添加により大きく増加し，

3 . 2 ポリフェノール添加による遅筋型MyHC

その効果も500 ng/mlで最大となった（Fig.３B）。
Sema3Aの発現はAPP添加によりほとんど変化しの発現増加
前項の筋線維型組成シフトを担う分子機構を追な い こ と か ら ，上 記 の myogenin ・ MEF2D ・究するため，衛星細胞が分化・融合し筋管（幼若MyHC Iの発現増加がSema3A発現増加によるもな筋線維）を形成する時期にAPPを種々の濃度のではなく，APP成分による直接的な効果であ© The Ito Foundation

313

食肉特性の向上を目指して：ポリフェノール給餌による遅筋型筋線維の形成誘導
real-time RT-qPCR ＜at 4-days post-diﬀerentiation（APP treatment）＞

MyHC lTarget Gene/HPRT（relative unit）

3.5

A

3.0
0

＊

B

6

2.5

5

2.0
0

4

1.5

3

1.0
0

2

0.5

1

0

myogenin7

Sema3A

＊＊

＊＊

＊
＊

＊＊

＊

0

0 10 500 10000
100 1000

MEF2D

0 10 500 10000
100 1000APP Dose（ng/ml）

0 10 500 10000
100 1000＊＊

0 10 500 10000
100 1000APP Dose（ng/ml）

Fig. 3Up-regulation of MyHC I（slow MyHC）, myogenin, and MEF2D expression by APP supplementation todifferentiation cultures of myoblasts. Primary cultures of rat satellite cells were maintained for 4 days in
differentiation media additionally containing 10-10000 ng/ml APP and evaluated for MyHC I, myogenin,
MEF2D, and Sema3A expression by RT-qPCR（TaqMan Probe assay）standardized with HPRT. Data bars
depict the mean±SE for three cultures per group and significant differences from control means（whitebars）at P＜0.05 and P＜0.01 are indicated by（＊）and（＊＊）,respectively.

Target Gene/HPRT（relative unit）

real-time RT-qPCR

2.5

MyHC lA＜at 4-days post-diﬀerentiation（polyphenol treatment）
＞

4

＊＊ ＊＊

2.0

MEF2D

B

3

＊

1.5

myogenin

＊＊

＊

＊＊

＊

2

＊

1.0
1

0.5
0

0

10 100 1000 10 100 1000

chlorogenic phlorhizin（ng/ml）
acid

0

＊

0

＊

10 100 1000 10 100 1000

chlorogenic phlorhizin
acid0

10 100 1000 10 1001000

chlorogenic phlorhizin（ng/ml）
acid

Fig. 4
U p-regulation of MyHC I （slow MyHC）, myogenin, and MEF2D expression by chlorogenic acidsupplementation to differentiation cultures of myoblasts. Primary cultures of rat satellite cells were maintainedfor 4 days in differentiation media additionally containing 10-1000 ng/ml chlorogenic acid（red bars）or
phlorhizin（blue bars）and evaluated for MyHC I, myogenin, and MEF2D expression by RT-qPCR（TaqMan
Probe assay）standardized with HPRT. Data bars depict the mean±SE for three cultures per group andsignificant differences from control means（white bars）at P ＜ 0.05 and P ＜ 0.01 are indicated by（＊）and（＊ ＊）,respectively.

ると考えられた。

Ｂ１，Ｂ２・エピカテキン）の精製標品に対して

次に，APPに含まれる主要なポリフェノール

先と同様の添加実験を行った（最終濃度10-1000

成分（クロロゲン酸・フロリジン・プロシアニジ

ng/ml）。Fig.４Aに示すように，クロロゲン酸に© The Ito Foundation

314

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

強力なMyHC I発現効果が認められ，その効果は要がある。また，成長期のマウスに対して同様に

10 ng/mlで最大となった。フロリジン（10 ng/

クロロゲン酸を給餌すると遅筋型筋線維の割合がml）にも有意な効果が認められたが，その程度増加するかどうかを調べる予定である。

はクロロゲン酸に比べ小さいものであった。ま

研究成果は前述の食肉生産科学の他，加齢筋医

た ，Fig. ４ B に 示 す よ う に ，myogenin お よ び

科学・健康科学・スポーツ科学への食品機能学的MEF2Dの発現も10 ng/mlクロロゲン酸添加によ貢献が強く期待される。すなわち，本研究は加齢り有意に増加した。一方，フロリジンを添加するや不活動（寝たきりや無重力環境暴露）に伴う筋と myogenin の 発 現 が 減 少 し た こ と か ら ，先 の持久力の低下を抑制することやアスリートの持久

APP添加実験ではクロロゲン酸（促進因子）と運動能力の向上も指向しており，また，脂肪酸をフロリジン（抑制因子）が拮抗的に作用している

β酸化しエネルギー源として代謝する遅筋型筋線と推察され，これがAPPの濃度依存性がベル型

維の増加は体脂肪を減少させ，生活習慣病の予防となる要因であると考察された。

ひいては健康寿命の延長やQOLの改善に寄与す

以上の結果から，APPに含まれるクロロゲンると考えられる。

酸 が 活 性 成 分 で あ り ，MyHC I ・ myogenin ・
MEF2Dの発現を誘導する因子であることが明らか に な っ た 。し た が っ て ，ク ロ ロ ゲ ン 酸 が
Sema3A細胞膜受容体に結合すると前述の細胞膜受容体／myogenin/MEF2Dからなるシグナリン
グ軸が活性化されMyHC Iの発現誘導，すなわち，
遅筋型筋線維の形成が促進されると考えられた。
４．要

約

リンゴポリフェノール（種々のポリフェノール
成分の混合物）を成熟ラットに８週間給餌すると，後肢下腿部筋のミオシン重鎖アイソフォーム
組成が遅筋型方向へシフトし筋持久力が有意に向上することが確認された。また，リンゴポリフェ
ノールに含まれるクロロゲン酸がSema3A細胞膜受容体のアゴニストになりうると考えられた。
Sema3A-myogenin/MEF2D-遅筋型ミオシンのシグナリング軸は遅筋型筋線維の形成を誘導することから，クロロゲン酸の給餌によって遅筋型筋線維の形成を促進できると期待された。今後，衛星細胞特異的Sema3A-cKOマウス（Pax7CreERT2Sema3Aflox）にクロロゲン酸を給餌する実験を行文献１） Tatsumi, R., Sankoda, Y., Anderson, J. E., Sato, Y.,
Mizunoya, W., Shimizu, N., Suzuki, T., Yamada, M.,
Rhoads, R. P. Jr., Ikeuchi, Y., Allen, R. E. : Am. J.
Physiol. Cell Physiol., 297 : C238-C252, 2009.
２） Do, M.-K. Q., Sato, Y., Shimizu, N., Suzuki, T.,
Shono, J., Mizunoya, W., Nakamura, M., Ikeuchi, Y.,
Anderson, J. E., Tatsumi, R. : Am. J. Physiol. Cell
Physiol., 301 : C1270-C1279, 2011.
３） Do, M.-K. Q., Suzuki, T., Gerelt, B., Sato, Y.,
Mizunoya, W., Nakamura, M., Ikeuchi, Y., Anderson,
J. E., Tatsumi, R. : Anim. Sci. J., 83 : 712-717, 2012.
４） Sato, Y., Do, M.-K. Q., Suzuki, T., Ohtsubo, H.,
Mizunoya, W., Nakamura, M., Furuse, M., Ikeuchi, Y.,
Tatsumi, R. : Anim. Sci. J., 84 : 185-189, 2013.
５） Suzuki, T., Do, M.-K, Q., Sato, Y., Ojima, K., Hara,
M., Mizunoya, W., Nakamura, M., Furuse, M.,
Ikeuchi, Y., Anderson, J. E., Tatsumi, R. : Int. J.
Biochem. Cell Biol., 45 : 476-482, 2013.
６） Suzuki, T., Ojima, K., Do, M.-K. Q., Hara, M.,
Mizunoya, W., Nakamura, M., Ikeuchi, Y., Anderson,
J. E., Tatsumi, R., : In abstract of the EMBO
Workshop on Semaphorin Function and Mechanismin Action, Cemay-la-Ville, France, 2013.
７） Nakazato, K., Song, H., Waga, T. : Med. Sci.
Sports Exerc., 39 : 934-940, 2007.
８） Iwata, A., Fuchioka, S., Hiraoka, K., Masuhara, M.,
Kami, K. : Muscle Nerve, 41 : 694-701, 2010.
９） Mizunoya, W., Wakamatsu, J.-I., Tatsumi, R.,
Ikeuchi, Y. : Anal. Biochem., 377 : 111-113, 2008.
10） Allen, R. E., Temm-Grove, C. J., Sheehan, S. M.,
Rice, G. M. : Methods in Cell Biol., 52 : 155-176, 1997.

い，クロロゲン酸のアゴニスト活性を証明する必© The Ito Foundation

315

リンゴジュース粕の機能性を生かした高付加価値豚肉生産技術の開発
Development of high value-added pork production technology using
functionality of apple pomace

房

家

琛

（弘前大学農学生命科学部）

Jiachen Fang
（Faculty of Agriculture and life Science, Hirosaki University）

This study determined the effects of fresh apple pomace on the growth and meat qualityof pigs. Experimental feed was prepared using formula feed（control）and fresh apple pomace.
The experimental treatments consisted of a control，2％，4％，6％，and 8％ apple pomace inmixed feed dry matter（DM）（AP2％, AP4％, AP6％, and AP8％, respectively）. The moisture
contents of these mixed feeds were adjusted to 40％ and the feeds were sealed for 21 days toallow fermentation. Then, pigs weighing 70-110kg were fed these feeds to determine theeffects of the amount of apple pomace on growth and meat quality. In addition, AP2％ feed was
fed to pigs weighing 30, 50, and 70kg to determine the effects of the timing of feeding. All of
the mixed feeds were thoroughly fermented and the generation of acetic acid, lactic acid, andethanol changed with the proportion of pomace. The growth performance and feed conversion
ratio improved significantly with the AP2％ treatment, while the feed conversion ratio
deteriorated with the AP4％, AP6％, and AP8％ treatments although the growth was similar
to the control treatment. In addition, the growth of pigs weighing 30 kg that were fed AP2％was similar to the control treatment. Regarding meat quality, apple pomace ingestion affected
the drip loss and cooking loss of meat and fatty acid composition of back fat, especially the
AP2％ treatment. These results indicate that the proportion of fermented apple pomace affectthe feed efficiency and meat quality of pigs, and that the proportion of pomace in feed shouldbe less than 2％ of the DM.

１．目ジュース粕（以下リンゴ粕）にも健康成分が多く的含まれている。青森県は全国で随一のリンゴ産地

リンゴは世界的に人気で消費量の高い果物であであり，リンゴ粕も年間約1.5万トンが産出されり，抗がん，整腸，活性酸素抑制や血液浄化などる。生リンゴ粕は家畜の嗜好性に優れ，乾物当たの様々な健康効果が注目されている。リンゴは生り栄養分含量の高い副産物飼料資源であり，産出

食の他，ジュースなど果汁素材としても用いられ

後フレコンバッグで貯蔵・流通する際，自然にアており，リンゴジュース製造副産物となるリンゴ

ルコールが２-４％，乳酸が１-２％程度生成され© The Ito Foundation

316

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

る。アルコールは中枢神経機能に対し抑制的に作

試豚は不断給餌，自由飲水により飼養管理を行っ用して，密飼いや長時間の繋留によるストレスのた。体重は毎週１回測定し，日平均増体量，日平緩和効果があり，継続的摂取が肉質改善に寄与し

均飼料摂取量および飼料要求率を算出した。

ているものと推察される。

供試豚の平均体重が110㎏に到達した時点で飼

近年，食品残さは発酵TMR技術やリキッド

育試験を終了とし，と畜解体を行い，翌日に枝肉

フィーディング養豚システムの導入拡大に伴い飼調査とサンプル採取を行った。冷屠体の左半丸を料利用が広がっている。さらに，機能性成分を含対象として枝肉重量と背脂肪厚を測定後，第４，む食品残さ飼料を給与することで，畜産物の機能

５胸椎間から約15㎝のロース芯を取り出し，一般性成分を増加させ，ブランド畜産物として確立さ成分，pH，保水性，加熱損失，硬さ，コレステローせる事例が増加している。このような機能性を持

ル含量および脂肪酸組成の分析用サンプルとした。

つ食品残さの利用によるブランド畜産物の生産体

2.2制の確立は，環境保全，飼料自給率向上や地域活対照区には市販の肥育前期および後期飼料を用性化に大きな意義をもっている。

給与期間試験

いた。各試験区の飼料は対照区の飼料にリンゴ粕

一方，リンゴ粕はまだ有効活用されておらず，を乾物当たり２％添加し，水分を40％に調整し堆肥化，焼却されている現状であり，飼料利用のた。原料を十分に混合してから，200Ｌドラム缶研究による実例実証もまだ少ないため，飼料利用に詰め込んで踏圧により脱気密封し，屋外で３週を推進するうえで，家畜への給与試験は重要であ間貯蔵した（7.6－18.8℃）。

る。

供試豚はLWD三元交雑種の去勢豚計16頭を用そこで，本研究では，生リンゴ粕を用いて，配いた。供試豚は市販飼料を肥育全期間給与する対合飼料へのリンゴ粕の添加量および給与期間の違照区と生体重がそれぞれ30㎏，50㎏および70㎏にいが肥育豚の発育，枝肉形質および肉質に及ぼす達した時点で試験飼料を給与開始する30㎏区，50

影響を検討した。

㎏区および70㎏区に各４頭ずつ配分した。肥育試

２．方
2.1

験は（株）木村牧場肥育豚舎にて単飼ケージに豚

法を１頭ずつ収容し，平均体重110㎏まで肥育した。

給与量試験

供試豚は不断給餌，自由飲水により飼養管理を対照区には市販の肥育後期飼料を用いた。試験行った。

区飼料は対照区飼料に生リンゴ粕を乾物当たり

供試豚の体重が110㎏に到達した時点で飼育試２％（AP２％区），４％（AP４％区），６％（AP

験を終了とし，と畜解体を行い，翌日に枝肉調査６％区）および８％（AP８％区）添加し水分をとサンプル採取を行った。冷屠体の左半丸を対象

40％に調整した。原料を十分に混合してから，として枝肉重量と背脂肪厚を測定後，第４，５胸

200Ｌドラム缶に詰め込んで踏圧により脱気密封

椎間から約15㎝のロース芯を取り出し，一般成

し，屋外で３週間貯蔵した（9.7－20.1℃）。

分，pH，保水性，加熱損失，硬さ，コレステロー

供試豚のLWD三元交雑種去勢15頭は対照区および試験区に各３頭ずつ配分した。給与試験は（株）木村牧場肥育豚舎にて単飼ケージに豚を１頭ずつ収容し，平均体重110㎏まで肥育した。供

ル含量および脂肪酸組成分析用サンプルとした。
３．結果と考察
供試飼料の化学成分および発酵品質をTable１© The Ito Foundation

317

リンゴジュース粕の機能性を生かした高付加価値豚肉生産技術の開発に示した。飼料中においてリンゴ粕の混合割合の

体重および日増体量において大きな変化がなかっ

増加に従い粗タンパク質が低くなったが，粗脂肪

たが，日平均飼料摂取量の大幅増加により飼料要含量に顕著な変化はなかった。リンゴ粕を添加し求率が有意に高くなった。枝肉重量と背脂肪厚はた４種類の発酵飼料における乳酸含量は新鮮物中

AP２％区ではそれぞれ74.2㎏と2.3㎝と最も高0.25－1.08％であり，リンゴ粕の混合割合の高い

かったが，他の試験区間に差はみられなかった。

ほど低かった。アルコール含量が0.37－2.34％で肥育後期豚へ上記の各種発酵飼料を給与したとあり，AP６％においてアルコール含量が最も高きの肉質の理化学特性をTable３に示した。リン

かった。pHは4.5－4.9とやや高かったが，乳酸とゴ粕割合の増加に従いロース肉のドリップロー

アルコール生成量から総合的に判断すると発酵品

ス，加熱損失率，保水力などの調理物性が対照区

質は良好であった。

に比べ様々な変化があったが，AP２％区におい肥育後期豚へ上記の各種発酵飼料を給与した発て変化が最も顕著であった。健康や味の観点から

育成績と枝肉形質の結果をTable２に示した。対

注目されている背脂肪中オレイン酸含量はAP

照区に比べAP２％区が終了時体重，日増体量，２％区が最も低く，他の試験区間に差はみられな

飼料要求率がそれぞれ改善された。リンゴ粕をかった。
上記の肥育試験で，リンゴ粕を２％添加した混４％以上添加した各試験区は対照区に比べ終了時

Table 1 Chemical composition and fermentation quality of experimental feed
Item
Chemical composition
Crude Protein（％DM）
Ether Extract（％DM）
Fermentation quality
pH
Lactic acid（％FM）
Acetic acid（％FM）
Ethanol（％FM）

Control

AP2％

AP4％

AP6％

AP8％

17.9
4.4

17.7
4.4

17.5
4.4

17.2
4.5

17.0
4.5

―
―
―
―

4.5
1.08
0.11
0.37

4.5
0.69
0.23
1.48

4.8
0.38
0.33
2.34

4.9
0.25
0.26
1.98

AP2％, AP4％, AP6％ and AP8％, mixed feed containing 2％, 4％, 6％ and 8％ of apple pomace on DM basis,
respectively ; DM, dry matter ; FM, fresh matter.
Table 2 Growth performance and carcass characteristics of pig fed mixed feed containing various proportion of apple

pomaceItem

Treatment

SEM

P-value

71.6
109.3
738.5

0.355
1.456
30.136

0.295
0.084
0.117

2.7AB
3.6AB
69.8
1.8

0.082
0.146
0.919
0.729

0.037
0.001
0.113
0.517

Control

AP2％

AP4％

AP6％

AP8％

Initial body weight（㎏）Finished body weight（㎏）Dairy gain（g）
Dairy feed intake（㎏ of DM）

70.3
109.6
771.2
2.6Ｂ

70.6
116.6
901.9

71.3
109.0
738.5

72.3
112.6
790.8

Feed conversion ratio
Carcass weight（㎏）Back fat thickness（㎝）

3.2BC
72.3
1.9

2.8AB
3.1Ｃ
74.2
2.3

2.8AB
3.8Ａ
70.0
1.8

2.9Ａ
3.7Ａ
71.5
1.7

AP2％, AP4％, AP6％ and AP8％, mixed feed containing 2％, 4％, 6％ and 8％ of apple pomace on DM basis, respectively. DM, drymatter ; SEM, standard error of the mean, n＝3．
Means within a row with different letters differ（P＜0.05）．

© The Ito Foundation

318

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

合飼料が最もよい増体や飼料効率を得たため，市低タンパク質であるため，肥育豚の発育成績が低

販の肥育前期および後期飼料にリンゴ粕を２％添下した報告が多かった１）。本研究では，生リンゴ

加した発酵飼料を体重30㎏，50㎏および70㎏の去粕を飼料に４-８％添加した結果，飼料要求率が

勢 豚 に 給 与 し た 。発 育 成 績 お よ び 枝 肉 形 質 を高まったが，発育成績と枝肉形質に影響がみられTable４に示した。枝肉重量および背脂肪厚におなかった。また，２％添加したAP２％区では発いて各試験区間に差はみられなかった。ロース肉

育成績と要求率が著しく改善されたことは意外なの理化学特性をTable５に示した。ドリップロー

結果であった。このことについて肥育豚へ発酵しス，加熱損失率はリンゴ粕の添加により高くなる

た生リンゴ粕を給与した場合，既往の乾燥リンゴ傾向を示した。背脂肪中オレイン酸含量は30㎏区粕給与した発育パターンとの違いを要因としてあにおいて最も低い値であったが，他の試験区間にげるなら，発酵過程に生成されたアルコールや乳おいて差がみられなかった。

酸などによる可能性があり２，３），非常に興味深い。

リンゴ粕の肥育豚利用については乾燥リンゴ粕

また，背脂肪中オレイン酸において，AP２％区を利用した研究が多く，また成分特徴は高繊維，が他の試験区より低いこともアルコール摂取に起Table 3 Meat quality of pigs fed mixed feed containing various proportion of apple pomace
Item

Treatment

SEM

P-value

5.4
72.2
23.3
3.2

0.090
0.275
0.154
0.244

0.054
0.367
0.357
0.549

1.9Ｂ
25.0AB
79.2
2.3

3.6AB
22.7Ｂ
79.8
2.7

0.376
1.214
0.276
0.226

0.033
0.004
0.105
0.080

1.5Ｂ
1.7
42.9
38.6

2.5Ａ
1.0
42.8
31.6

1.5Ｂ
1.5
42.6
44.0

0.211
0.143
0.561
2.891

0.017
0.162
0.078
0.281

42.8AB
8.3Ｂ

42.2AB
8.9AB

43.0AB
9.5Ａ

0.401
0.170

0.018
0.046

Control

AP2％

AP4％

AP6％

AP8％

pH
Moisture（％）
Crude protein（％）
Ether extract（％）
Drip loss（％）

5.4
73.3
22.7
2.5
2.3AB

5.4
73.5
23.4
1.9

5.3
72.7
23.6
2.3

5.5
72.2
23.5
3.1

Cooking loss（％）
Water holding capacity（％）
Marbling score
Pork color standard

28.7Ａ
78.1
1.7
2.2AB

3.8Ａ
29.1Ａ
78.6
1.7

2.7AB
27.5Ａ
79.2
1.5

Back fat color standard
Back fat melting point（℃）
Cholesterol（㎎/100g）
Oleic acid（％）

1.3
41.9
47.0
43.4Ａ

1.5Ｂ
1.8
45.2
46.6

Linoleic acid（％）

8.1Ｂ

40.4Ｂ
8.4AB

AP2 ％ , AP4 ％ , AP6 ％ and AP8 ％ , mixed feed containing 2 ％ , 4 ％ , 6 ％ and 8 ％ of apple pomace on DM basis, respectively. SEM,
standard error of the mean, n＝3．
Means within a row with different letters differ（P＜0.05）．

Table 4 Growth performance and carcass characteristics of pig fed mixed feed containing apple pomace for various

periods
Item

Control

Initial body weight（㎏）Finished body weight（㎏）Carcass weight（㎏）Back fat thickness（㎝）

30.3
109.7
72.5
2.3

Initial bodyweight
30㎏

50㎏

70㎏

30.6
110.7
71.9
2.3

51.3
109.0
71.4
2.0

72.3
111.0
72.3
2.1

DM, dry matter ; SEM, standard error of the mean, n＝4．

© The Ito Foundation

SEM

P-value

―
0.458
0.213
0.072

―
0.916
0.944
0.784

319

リンゴジュース粕の機能性を生かした高付加価値豚肉生産技術の開発
Table 5 Meat quality of pig fed mixed feed containing apple pomace for various periods
Item

Control

Initial bodyweight
30㎏

50㎏

70㎏

SEM

P-value

pH

5.6

5.6

5.6

5.5

0.016

0.219

Moisture（％）
Crude protein（％）

72.8
23.2

72.6
23.5

73.5
23.1

74.0
23.1

0.318
0.095

0.071
0.643

Ether extract（％）

2.0

1.9

2.0

1.9

0.165

0.754

Drip loss（％）

2.8

3.2

3.3

3.8

0.162

0.438

Cooking loss（％）

26.9

27.2

29.9

28.3

0.659

0.191

Water holding capacity（％）
Marbling score

78.7
1.5

80.6
1.7

77.2
1.7

77.3
1.8

0.783
0.068

0.354
0.487

Pork color standard

3.0

3.0

3.2

3.3

0.079

0.219

Back fat color standard

1.0

1.0

1.2

1.0

0.042

0.441

Cholesterol（㎎/100g）

44.0

33.3

31.6

38.6

2.793

0.566

Back fat melting point（℃）
Oleic acid（％）

43.3
43.4

43.0
41.1

46.3
42.8

43.0
42.2

0.801
0.795

0.413
0.060

Linoleic acid（％）

8.2

7.5

8.3

7.9

0.175

0.103

SEM, standard error of the mean, n＝4．

因する可能性があり４，５），今後発育・肉質と発酵始し，リンゴ粕給与期間の違いが発育成績および過程で生成されたアルコールや乳酸との関連につ肉質に及ぼす影響も検討した。その結果，リンゴ

いて深く検討する必要がある。さらにリンゴ粕を

粕は飼料に２％添加すれば，発育成績および飼料

２％とより低い割合で添加した場合，肥育豚体重要求率が顕著に改善されたが，４％以上の添加は30㎏から給与しても発育や枝肉形質に問題がな

発育に影響がなく，飼料要求率が高くなった。肉く，長期給与できることが示唆された。押田ら

６）質においてはリンゴ粕添加によりドリップロー

はリンゴ粕から抽出したアップルファイバーの給ス，加熱損失率が高くなり，AP２％区において与が，肥育豚ロース肉のコレステロール含量を低最も著しかった。またリンゴ粕を飼料に２％添加減したことを報告した。本研究も同様に期待した

した場合，肥育豚体重30㎏からより長期間給与しが，結果のバラツキが大きく，差がみられなかっても，発育と枝肉形質に影響がみられなかった。

た。肉質の理化学特性においても，ドリップロー

ドリップロースと加熱損失率以外の肉質項目では

スと加熱損失率以外の項目は多岐な傾向を示し，リンゴ粕給与量および給与期間の違いによる影響

今後試験頭数を増やして検討する必要がある。

がほぼみられなかった。以上の結果より，肉豚飼

４．要料への発酵した生リンゴ粕の添加において，給与約量の違いが，飼料効率および肉質に影響すること

本研究はリンゴ粕の肉豚飼料利用を目的に，リが示された。

ンゴ粕２-８％を慣行飼料に添加し発酵飼料を調製した。化学成分および発酵品質を調査するとともに，リンゴ粕添加量の違いが肥育後期豚の発育成績および肉質に及ぼす影響について検討した。
また，リンゴ粕を２％添加した混合飼料を去勢豚へ体重30㎏，50㎏および70㎏からそれぞれ給与開文献１） Bowden, D., Berry, J. : Canadian Journal ofAnimal Science, 39, 26～33, 1958.
２） アルコール飼料化推進委員会：日本畜産学会報，
62, 781～805, 1991.
３） Canibe, N., Jensen, B. : Journal of Animal Science,81, 2019～2031, 2003.

© The Ito Foundation

320

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）４） Baraona, E., Lieber, C. : Journal of Lipid Research,
20, 289～315, 1979.
５） Lieber, C., Schmid, R. : The Journal of clinicalinvestigation, 40, 394～399, 1961.
６） 押田敏雄，坂田亮一，山田静香，堀口恵子，伊東正吾，松村浩明，神田智正：家畜衛生研究会報，27（2），78～83，2002．

© The Ito Foundation

321「乳質の良さ」が注目されるブラウンスイス種乳牛の栄養・繁殖特性の解明
Characteristics of nutrition and reproductive physiology of the highquality milk producer of Brown Swiss dairy cattle

遠

藤

なつ美・田

中

知

己

（東京農工大学農学部）

Natsumi Endo and Tomomi Tanaka（Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

We investigated the productive and reproductive characteristics of Brown Swiss（B）cows
by comparing those of Holstein（H）cows that were housed in the same barn. Reproductive
performance of nulliparous heifers（number of artificial insemination per pregnancy, age of firstservice, and age of pregnancy）were not different significantly between the breeds. B cows has
lower 305-d milk yields and peak milk yield, higher milk fat rate than H cows, but milk protein
rate were not different between the breeds. Resumption of ovarian activity and nutrition status
after parturition were investigated for B cows（n＝5, 1 primi-and 4 multiparous cows）and H
cows（n ＝ 11, 3 primi-and 8 multiparous cows）. The proportion of cows that resumed ovarian
activity within 45 days after parturition tended to be different between B and H cows（5/5［100％］and 5/11［45.5％］, P ＝ 0.06）, suggesting that resumption of ovarian activity in B cows
occurs earlier than H cows. Expression of estrus behavior in B cows appeared to be less clear
than H cows. In particular, mounting behavior did not observed during the investigation period,
although the reason should be clarified in future.

１．目がホルスタイン種乳牛よりも強いこと１），粗飼料

的の利用効率が良く低コストでの乳肉生産が可能でホルスタイン種乳牛（Ｈ牛）の泌乳能力は格段あることなどの魅力が再評価されており，独自ブに上昇したが，泌乳量増加に伴う生理的負担はまランドの乳製品を製造する酪農家を中心にブラウすます過大となり，疾病の増加や繁殖成績の低下

ンスイス種の導入が増えつつある。

が深刻な課題となっている。そうした現状の中，しかし，その一方で，Ｂ牛は過肥になりやすく「牛乳本来のおいしさ，乳質の良さ」を有するブ

安定した産乳量を得るための飼育管理が難しい，

ラウンスイス種乳牛（Ｂ牛）に注目が集まってい発情が分かりにくく繁殖成績がＨ牛に比べて劣る

る。Ｂ牛は，スイス原産のスイス・ブラウン種がといった声も聞かれる。こうした繁殖の諸問題にアメリカで乳用種として改良された品種である。

対処するためには，十分な現状の調査を行うとと近年，本品種特有の濃厚な乳質がチーズなどの加もに栄養学的・内分泌学的な背景を踏まえてその工品に適していること，暑熱ストレスへの抵抗性機序の解明に取り組むことが必要である。そこで© The Ito Foundation

322

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

本研究では，東京郊外でＢ牛とＨ牛を混合飼育し体が確認された場合はそれ以前に初回排卵が起こている酪農家において調査を行い，Ｂ牛の泌乳・り卵巣機能の回復ありと判断し，黄体が確認され

栄養代謝機能，卵巣機能，発情の発現状況に焦点なかった場合は２～３週間隔で黄体が確認されるを当て，同一環境で飼育されるＨ牛と比較検討すまで調査を継続した。黄体が確認された後は，発ることにより，本品種の飼養・繁殖特性を明らか

情や人工授精の実施状況の聞き取り調査に加え，にすることを目的とする。

必要に応じて直腸検査を実施し，発情周期が正常

２．方
2.1

に回帰していることを確認した。また，卵巣機能法の回復時の栄養状態を調べるため，ボディコン

供試動物

ディションスコア（BCS）をFergusonらの方法２）

東京都郊外の１戸の酪農家において飼育されてに従って１～５の５段階で評価した。また調査期

いるＢ牛とＨ牛を調査対象とした。この牧場では間中の乳中尿素窒素（MUN）濃度は，牛群検定

Ｂ牛とＨ牛の他にジャージー種乳牛も飼育しておにおいて月に１度計測した値を用いてＢ牛とＨ牛り，合計40～50頭の牛がフリーバーン式牛舎で混を比較した。

合飼育されていた。搾乳牛の餌は，乾草，配合飼

2.5

料 ，ビ ー ル 粕 等 を 主 体 と し た 完 全 混 合 飼 料調査を行った牧場では，繁殖業務の担当者１～（TMR）を自由採食させるとともに，乳量に応じ２名が朝夕の搾乳時に発情観察を行い，他の牛のた量の配合飼料を自動給餌機より追加給与してい乗駕を許容するスタンディング行動に加えて，他た。搾乳は１日２回（７：00～９：00と18：00～の牛へ乗駕する行動，落ち着きなく歩き回る，咆

20：00）行われていた。

哮するなどの発情徴候が認められた牛に対して人

2.2

未経産牛の繁殖成績

発情行動の発現状況

工授精を実施していた。本研究では，2015年７月

2011年２月～2016年３月に人工授精を行い，受～2016年３月にＢ牛に実施した人工授精について胎を確認したＢ種８頭とＨ種23頭の未経産牛につ聞き取り調査を行い，Ｂ牛の発情の発現状況を調いて，初回人工授精時の月齢および受胎率，受胎べた。

月齢，受胎に要した授精回数を調査した。また，

2.6

調査期間中に分娩に至ったＢ種５頭とＨ種17頭にデータはすべて平均±標準偏差（SD）で示しついては，妊娠期間の比較も行った。
2.3

データの解析

た。調査項目の解析は基本的にＢ牛とＨ牛の２群泌乳量および乳成分間の比較を行った。平均値の比較にはStudentの調査牧場におけるＢ牛とＨ牛の泌乳水準を比較

ｔ 検 定 を 用 い ，受 胎 率 な ど の 比 率 の 比 較 に はするため，2011年～2016年の牛群検定成績結果かFisherの正確確立検定を用い，Ｐ＜0.05を有意差

ら，１乳期（305日）の乳量および最高乳量，乳あり，Ｐ＜0.1を有意な傾向ありとした。

成分（１乳期の平均乳脂率，蛋白質率，無脂固形分率）をＢ群とＨ群で比較した。
2.4

分娩後の卵巣機能の回復状況と栄養状態

３．結果と考察3.1

未経産牛の繁殖成績

2015年６月～2016年２月に分娩した牛を調査対

未経産のＢ牛（ｎ＝８）とＨ牛（ｎ＝23）の初象とし，分娩後30～45日に直腸検査および超音波

回授精月齢（16.1±1.2 vs. 15.2±1.8ヶ月齢），受画像検査を実施した。分娩後45日までに機能性黄胎月齢（19.9±5.0 vs. 17.1±2.9ヶ月齢），初回授© The Ito Foundation

323「乳質の良さ」が注目されるブラウンスイス種乳牛の栄養・繁殖特性の解明

精時の受胎率（25％ vs. 23.3％），受胎に要した

3.2

授精回数（2.4±1.1 vs. 2.3±1.3回）に有意な差は両品種の乳量および乳成分を産次数別（初産

みられなかった。また，これらの牛の中で調査期

vs. ２産以上の経産牛）に比較した結果をTable１

間中に分娩に至ったＢ牛５頭とＨ牛17頭の妊娠期に示した。Ｂ牛の305日乳量は，初産牛，経産牛

間は，286.1±2.1と281.4±8.0日であり，有意な差

ともにＨ牛と有意な差が認められ（Ｐ＜0.05），

はみられなかった（Ｐ＞0.1）。未経産Ｈ牛の初回ピーク乳量についても経産のＨ牛は平均46.1±2.5

授精時期は，15ヶ月前後で体高125～130㎝，体重㎏/dであったのに対しＢ牛では平均35.8±1.5㎏/

350～400㎏が必要である 。今回の調査では，体d で 両 品 種 間 で 有 意 な 差 が 認 め ら れ た（Ｐ ＜重や体高に関するデータを得られなかったが，本0.05）。乳成分については，Ｂ牛は乳脂肪分率お牧場では両品種とも適切な時期に初回授精が行わ

よび乳タンパク質率がＨ牛に比べて高く，チーズ

れていることが示唆された。しかしながら，初回作りに適した乳質であると言われているが，本調授精時の受胎率は，平成20年の調査による全国

査では，乳脂肪分率（3.7±0.3 vs. 3.4±0.5％），

平均の60％よりも低く，授精回数も全国平均の1.6

無脂乳固形分率（8.9±0.3 vs. 9.1±0.3％）にＢ牛回に比べて多い傾向にあった。

とＨ牛で有意な差が認められたが，乳タンパク質３）

４）

乳量および乳成分

Table 1 Milk yield and its composition of Brown Swiss（B, 4 primi-and 14 multiparouscows）and Holstein（H, 11 primi-and 17 multiparous cows）cows
Breed
Item

ParityB cowsH cowsPrimiparous

6,352±438＊
8,247±1,612＊
28.3±4.045†
35.8±1.5＊
3.7±0.3＊

7,989±948
10,280±2,062
33.3±4.746.1±2.5

Milk fat（％）

Multiparous
Primiparous
MultiparousAll

Milk protein（％）
Non-fat milk solids（％）

All
All

Total milk yield (㎏/305 d）
Peak milk yield (㎏/d）

3.4±0.5
3.5±0.3
9.1±0.3

3.4±0.3
8.9±0.3＊

Data are mean±SD．
＊Different significantly（P＜0.05）as compared with H cows．
†Tend to be different（P＜0.1）as compared with H cows．

Table 2 Resumption of ovarian activity in postpartum Brown Swiss (B) and Holstein (H) cows
Breed
Item
Proportion of cows with resumption of ovarian activity

B cowsH cows＜45ｄ１＜75ｄ5/5（100％）†
0/5（0％）

5/11（45.5％）
5/11（45.5％）＜105ｄ

0/5（0％）
0/5（0％）
3.60±0.34†

1/11（9.1％）
2/11（18.2％）

Incidence of follicular cyst
BCS at the resumption of ovarian activity

3.16±0.45

Data are mean±SD. Body condition scores（BCS）were measured according to the method of Ferguson et２）
al.（1994）
１Days postpartum．
†Tend to be different (P＜0.1) as compared with H cows．

© The Ito Foundation

324

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

存率や黄体機能といった繁殖性に大きく影響する率には有意な差が認められなかった。
分娩後の卵巣機能の回復と栄養状態ことが知られている。一方，MUNの低下は給与

2015年７月～2016年３月までの９ヶ月間に週１

飼料のエネルギー不足を示唆しており，飼料設計

回の繁殖検診を実施し，Ｂ牛５頭（初産１頭，２の見直しが必要とされるが，今回の調査では，

産以上４頭）とＨ牛11頭（初産３頭，２産以上８

MUNや乳成分の値から繁殖性低下につながる明頭）について分娩後の卵巣機能の回復状況を調査

らかな要因は認められなかった。

3.3

した（Table２）。分娩後45日以内に黄体が確認さ3.4

れたのはＢ牛では5/5頭（100％）であったのに対調査牧場の管理者への聞き取り調査では，Ｂ牛

し，Ｈ牛では5/11頭（45.5％）と低い傾向が認めの発情行動はＨ牛に比べて不明瞭で発見しにくいられた（Ｐ＝0.06）。また，Ｈ牛では分娩後45日とのことだった。そこで２頭のＢ牛にプロジェス

以内の検査で2/11頭で卵胞嚢腫の発生を認めた

テロン徐放剤を用いた発情同期化処置を行った結が，Ｂ牛では観察された牛はいなかった。黄体が果，スタンディング発情と落ち着きなく歩き回る

確認された日に計測したBCSは，Ｂ牛の方がＨ牛

行動上の変化が２頭とも明瞭に観察された。まよりも高い傾向が認められた（Ｐ＝0.07）。分娩た，調査期間中に未経産のＢ牛２頭の自然発情を後の泌乳量増加に伴う負のエネルギーバランスの観察する機会があったが，乗駕行動やスタンディ

増大は，黄体形成ホルモンのパルス状分泌を抑制

ング行動は認められないものの，落ち着きなく歩する結果，卵胞の発育が遅延し，分娩後の初回排き回り人に盛んに近寄ってくる行動上の変化が２卵および卵巣機能の回復に大きく影響することが頭とも明瞭に認められた。しかしながら，乗駕行

知られている５）。Ｂ牛の泌乳量はＨ牛に比べて少動については調査した４頭の牛で観察されず，人なく，粗飼料の利用効率が良いという特性を有し工授精を実施したＢ牛についての聞き取り調査にており，今回の調査でもＢ牛の305日乳量およびおいても乗駕行動が明瞭に認められた牛はいな

ピーク乳量はＨ牛に比べて少ないことが明らかとかった。乗駕行動は発情前期から発情期に認めらなった。したがって，Ｂ牛では分娩後のエネル

れる発情行動の１つであり，スタンディング発情ギーバランスが負となる期間と程度がＨ牛よりもが観察されない場合でも，乗駕行動の観察により短く少なく，その結果として分娩後の卵巣機能の発情を検出し，人工授精を実施することが可能で回復がＨ牛よりも早期に認められたと考えられある。これまでにＢ牛の発情行動の特徴に関するる。その一方で，Ｂ牛は元々肉用種の系統が乳用研究報告はなく，この点についてはより詳細な観種として改良されているため，過肥になりやすい

察や発情行動の発現に関わるエストロジェンなどことが知られている。今後の研究では，過肥がＢの繁殖ホルモンの血中動態と合わせて解明する必牛の繁殖機能にどのように影響するかを明らかに要があるが，Ｂ牛では乗駕行動を示す牛が少ないするため，分娩後日数の経過に伴うBCSの推移をことが，Ｂ牛の発情発見を困難にしている可能性

Ｈ牛と比較調査する予定である。

が考えられた。

調査期間中の平均MUN濃度は，Ｂ牛とＨ牛でそれぞれ12.0±4.3と11.0±3.6㎎/dlで有意な差は発情行動の発現状況と繁殖成績

４．要

約なく，適正値の範囲内（10～14㎎/dl）で推移し

本研究では，ブラウンスイス種乳牛（Ｂ牛）とていた。MUNの上昇は，卵子の受精能力，胚生ホルスタイン種乳牛（Ｈ牛）を混合飼育している© The Ito Foundation

「乳質の良さ」が注目されるブラウンスイス種乳牛の栄養・繁殖特性の解明

325

酪農家において調査を行い，Ｂ牛の泌乳・栄養状

唆された。Ｂ牛の発情行動の発現状況について

態，分娩後の卵巣機能の回復，発情の発現状況おは，Ｈ牛に比べて不明瞭で発見しにくく，乗駕行

よび繁殖成績についてＨ牛と比較して調べた。未動の発現が明瞭でないことが推測されたが，今後経産牛の繁殖成績は両品種で明確な差がみられなの調査でより詳細な観察をもとに検討していく必かった。乳量および乳成分については，Ｂ牛の要がある。

305日乳量・ピーク乳量はＨ牛よりも少なく，Ｂ
牛の乳脂肪分率はＨ牛よりも高かったが，乳タンパク質率には有意な差が認められなかった。分娩後の卵巣機能の回復と栄養状態をＢ牛５頭（初産１頭，２産以上４頭）とＨ牛11頭（初産３頭，２産以上８頭）について調査した結果，分娩後29～
45日の検査で黄体が確認されたのはＢ牛では5/5
頭（100％）であったのに対し，Ｈ牛では5/11頭（45.5％）と低い傾向が認められ（Ｐ＝0.06），分
娩後の卵巣機能の回復はＨ牛よりも早いことが示

文献１） Correa-Calderon, A., Armstrong, D., Ray, D.,
DeNise, S., Enns, M., Howison, C. : Int J Biometeorol,
48, 142～148, 2003.
２） Ferguson, J. D., Galligan, D. T., Thomsen, N. : J
Dairy Sci, 77, 2695～2703, 1994.
３） 相原光夫：今日も明日も牛群検定が約束するあな
たの酪農経営，P.78，（株）デーリィ・ジャパン社，東京，2013．
４） 家畜人工授精師協会：牛受胎率改善対策事業に係る受胎率調査（平成20年）
５） Butler, W. R., Smith, R. D. : J Dairy Sci, 72, 767～
783, 1989．

© The Ito Foundation

326

黒毛和種におけるRBP4 多型と枝肉形質の関連解析
Association analysis between RBP4 gene polymorphisms and carcass
traits in Japanese black cattle

平

野

貴・原

ひろみ・半

澤

惠

（東京農業大学農学部）

Takashi Hirano, Hiromi Hara and Kei Hanzawa（Tokyo University of Agriculture, Faculty of Agriculture）

Marbling is most characteristic feature in Japanese black cattle, and it is known that thevitamin A restriction improves marbling significantly. In addition, it is known that vitamin A（VA）has many physiological functions. RBP4 transports retinol, which is a converted VA inliver, to the target tissues（cells）from liver. Therefore, it was suggested that polymorphisms
on RBP4 gene affects to marbling and other carcass traits. We had tried to searchpolymorphisms on RBP4 with the population composed of died calves before 20 days old, anddetected c.237C＞G, c.355＋26C＞T and c.＊50A＞G. In this study, we performed an association
analysis between these SNPs and major carcass traits in Japanese black cattle, using population
composed of normally fattened steers. Furthermore, it was examined whether the 3 SNPs
associated with the calf death by comparing genotype frequencies in calf death and fattened
population. It was detected that c.355＋26C＞T associated with carcass weight marginally（P＜0.1）. The analysis using RBP4 genotype indicated by the 3 SNPs suggested that RBP4
significantly associated with carcass weight（P ＜0.05）. In addition, there was no significant
difference in frequency of each genotype between these two populations, and it was suggested
that the 3 SNPs were not related to a calf death.

１．目

slow type）の5ʼまたは3ʼUTRやプロモーター領域的に位置するSNPと脂肪交雑の関連が示されるなど，

黒毛和種は脂肪交雑に優れた品種であり，これ

脂肪交雑関連遺伝子の探索が進められている２～４）。

までに，特定種雄牛の肥育産子200頭以上からなる

しかし，脂肪交雑形成メカニズムは不明な部分が父方半きょうだい家系によるQTL（Quantitative

多い。

trait locus）解析が15頭の種雄牛に対して実施さ黒毛和種の肥育は伝統的に濃厚飼料を多給し，れ，脂肪交雑と関連する染色体領域が検出されて粗飼料にβカロテン量の少ない稲わらを給与するいる 。また，EDG1（Endothelial differentiation

ことで血中ビタミンＡ（VA）を低レベルにして

sphingolipid G-protein-coupled receptor 1），TTN

行われてきたと考えられている５，６）。実際に，黒（Titin）やMYBPC1（Myosin binding protein C,

毛和種去勢牛における血中VA濃度と脂肪交雑に

１）© The Ito Foundation

327

黒毛和種におけるRBP4 多型と枝肉形質の関連解析

有意な負の相関があることや，肥育牛に由来する
脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化をVAが抑制するこ

２．材料および方法
2.1とが示されている７，８）。

共試個体

ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体γ（PPAR

RBP4多型を確認するために，2009～2010年のγ）は脂肪細胞分化の主要な制御因子であり，レ

期間に耳片組織が収集された生後20日以内に死亡

チ ノ イ ド Ｘ 受 容 体（RXR）と 二 量 体 を 形 成 す

した黒毛和種490頭から同一種雄牛の産子が２頭

る９，10）。VAは，レチノール，レチナール，レチを超えないように選抜した69頭のゲノムDNAを

ノイン酸などの総称であり，レチノイン酸はレチ用いた。また，RBP4多型と主要な枝肉形質（枝ノイン酸受容体（RAR）と結合し，PPARγの発肉重量，ロース芯面積，バラ厚，皮下脂肪厚，推現を抑制するとともに，RARの発現を促進する。

定歩留，BMS）の関連を調べるために，2003～

さらに，RARはRXRと二量体を形成するため，

2008年の期間に東京都中央卸売市場食肉市場およPPARγと競合する。その結果，PPARγとRXR

び大阪市中央卸売市場南港市場で腎周囲脂肪組織の二量体が減少し，脂肪細胞分化が抑制されるとと各種枝肉形質データが収集され，月齢が23～考えられている 。すなわち，VAは筋肉内脂肪39ヶ月，枝肉重量が300～700㎏の範囲である肥育前駆細胞の分化を抑制しているが，VAの給与制

去勢牛20,493頭から同一種雄牛の産子が３頭を超限はその分化抑制を解除し，脂肪交雑形成が高まえないように選抜した1,234頭のゲノムDNAのうると考えられている。また，VAの生理作用は視ち，2003年サンプルから同一種雄牛の産子を含ま覚維持，成長作用，生殖作用，上皮組織の維持，ないように選抜した176頭を共試した（Table１）。

８）

味覚機能，細胞増殖・分化，免疫機構，転写調節，

2.2

抗がん作用など多岐にわたることが知られている。

RBP4 c.237C＞G, c.355＋26C＞Tおよびc.＊50A

VAはレチニルエステルとして小腸絨毛から吸＞G（Fig.１）を型判定するために３種のプライ

収され，リンパ管を経て肝臓へ送られた後，レチ

マーセットを使用した（Table２）。PCRは，プレノールに変換されて血管を通して各臓器へ輸送さ

熱 変 性 （94 ℃ ： ２ 分） を 行 っ た 後 ， 熱 変 性

れる。Retinol-binding protein（RBP）4は，この（94℃：１分），アニーリング（60℃：１分），伸

肝臓からの輸送を担うタンパクである。この

長反応（72℃：１分）を35サイクル繰り返し，最RBP4遺伝子の多型は脂肪交雑をはじめとする枝終伸長反応（72℃：10分）を行った。得られた増肉形質に影響すると考え，我々は黒毛和種におけ

幅産物を鋳型としてシーケンス反応を行った。

るRBP4多型を探索し，c.237C＞G（同義置換：エCleanSEQ（Beckman Coulter）で処理したシー

キソン３），c.355＋26C＞T（イントロン４）おケ ン ス 反 応 産 物 を 用 い て ，Genetic Analyzer

よびc. 50A＞G（3ʼUTR：エキソン６）の3 SNPs

3130 （Applied Biosystems）

を検出した13）。

Analysis version 5.2（Applied Biosystems）で塩

11，12）＊

そこで，本研究は，これら３SNPsと脂肪交雑を含む各種枝肉形質の関連解析，および各SNPの多型性再確認を目的とした。

型判定とSequencing

基配列を決定した。決定した塩基配列に基づいて，各SNPの型判定を行った。
2.3

統計解析

多型確認用集団と関連解析用集団におけるジェノタイプ頻度の差をχ 2 検定で解析した。また，© The Ito Foundation

328

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Table 1 Phenotypes in the population（n＝176）
Mean

SE

Minimum

Maximum

CW（㎏）462.32

3.40

347.60584.00

REA（㎝2）

53.32

0.64

33.00

95.00

RT（㎝）

7.53

0.06

5.10

9.70

SFT（㎝）YEP（％）

2.57
73.29

0.06
0.11

1.00
69.80

4.50
78.90

BMS

4.94

0.12

2.00

10.00

CW : Carcass weight

REA : Area of rib eye

RT : Rib thickness

SFT : Subcutaneous fat thikness

YEP : Yield estimated percentage
BMS : Beef marbling standard

Exon

１

２
ATG

３
c.237C＞G４５

６c.355＋26C＞TTAG c.＊50A>G

Fig. 1 RBP4 gene and SNP position. Boxes indicate exons, and filled triangles indicate each SNP position. ATG is

initiation codon, and TAG is stop codon.

Table 2 Primers for each SNPs
SNP

Primer sequence（5ʼ→3ʼ）

Size（bp）

c.237C＞GF GAGAACTTCGACAAGGCTCGR ACACACGTCCCAGTTACTGC

438

c.355＋26C＞TF TCCGTCTCTTAAAGTCAGTGC
R AGTTCTGGCTACTTACACACG

407

c.＊50A＞GF TTACAAGTACATCTAGCTGTCCR GCTAGAACAGACCGAAGGTC

590

関連解析用集団における各ジェノタイプ間の枝肉

C/C型：0.277と0.324，C/G型：0.508と0489，G/

形質平均値差を統計ソフトＲのaov関数を用いて

G型：0.215と0.188であり，各アレル頻度はＣア

分散分析を行った。

レル：0.531と0.568，Ｇアレル：0.469と0.432であ っ た 。両 集 団 と も に ，Hardy-Weinberg 平 衡

３．結果と考察（HWE）に従っていた。また，多型確認用集団とRBP4 c.237C＞G, c.355＋26C＞Tとc. 50A＞G

関連解析用集団間のジェノタイプ頻度の差をχ2の多型性を確認するために多型確認用集団69頭の検定で解析したが有意な差は見られなかった

型判定と，これらSNPsと各種枝肉形質の関連を（Table３）。さらに，関連解析用集団の176頭をジェ調べるために関連解析用集団176頭の型判定をノタイプに従ってグループ分けし，各枝肉形質の行った（Table３）。

平均値差を分散分析で解析したが，有意差は見ら＊同義置換であるc.237C＞Gのジェノタイプは，れなかった（Table４）。

多型確認用集団の65頭と関連解析用集団の176頭

イントロン４に位置するc.355＋26C＞Tの多型について決定できた。多型確認用集団と関連解析

確認用集団（69頭）と関連解析用集団（174頭）

用集団における各ジェノタイプ頻度は，それぞれにおける各ジェノタイプ頻度は，C/C型：0.159© The Ito Foundation

329

黒毛和種におけるRBP4 多型と枝肉形質の関連解析
Table 3 Genotype and allele frequency of RBP4 SNPs
SNP

Population

c.237C＞G（synonymous）
c.355＋26C＞T（intron 4）
c.＊50A＞G（3ʼUTR）

n＊

Genotype frequency（n）
W/W

W/M

M/M

χ2
P（df＝2）

Allele frequency
Ｗ

Ｍ

Varidation

65

0.277（18）0.508（33）0.215（14）

0.560

0.531

0.469

Association

176

0.324（57）0.489（86）0.188（33）

＞0.7

0.568

0.432

Varidation

69

0.159（11）0.536（37）0.304（21）

0.926

0.428

0.572

Association

174

0.155（27）0.477（83）0.368（64）

＞0.5

0.394

0.606

Varidation
Association

69
174

0.275（19）0.322（56）0.507（35）0.494（86）0.217（15）0.184（32）

0.645
＞0.7

0.529
0.569

0.471
0.431

W : Reference type allele
M : Substitute type allele＊ : Successfully genotyped

Table 4 Association analysis between RBP4 and carcass traits
genotypen

CW（㎏）

REA（㎝2）

RT（㎝）

SFT（㎝）YEP（％）

BMS

c.237C＞G

C/C
C/G
G/G
P

57
86
33

468.21±5.72
461.20±5.07
455.05±7.58
0.1＜P＜152.89±0.99
52.83±0.8655.36±1.95
0.1＜P＜1

7.54±0.11
7.56±0.09
7.42±0.16
0.1＜P＜12.66±0.10
2.52±0.09
2.54±0.13
0.1＜P＜173.08±0.1873.30±0.16
73.60±0.29
0.1＜P＜14.95±0.23
4.90±0.16
5.03±0.31
0.1＜P＜1c.355＋26C＞T

C/C
C/T
T/T
P

27
83
64

477.41±6.86462.94±4.64454.99±6.33
0.05＜P＜0.1

52.81±1.2753.47±0.9653.36±1.14
0.1＜P＜17.77±0.14
7.55±0.10
7.39±0.11
0.1＜P＜12.63±0.11
2.49±0.09
2.63±0.11
0.1＜P＜173.14±0.26
73.38±0.1773.25±0.19
0.1＜P＜14.74±0.37
4.83±0.16
5.20±0.21
0.1＜P＜1c.＊50A＞G

A/A
A/G
G/G
P

56
86
32

468.50±5.81461.19±5.07455.99±7.76
0.1＜P＜152.98±1.0152.85±0.8655.38±2.01
0.1＜P＜1

7.54±0.11
7.56±0.09
7.44±0.16
0.1＜P＜12.67±0.10
2.51±0.09
2.52±0.14
0.1＜P＜173.08±0.19
73.32±0.16
73.62±0.30
0.1＜P＜14.96±0.24
4.92±0.16
5.00±0.32
0.1＜P＜1

3SNPs
Homozygous

C-C-A/C-C-A
C-T-A/C-T-A
G-T-G/G-T-G

12
14
19

474.77±10.67
478.71±12.75
443.96±9.73

51.00±1.9656.14±2.32
55.21±2.79

7.79±0.23
7.66±0.20
7.18±0.21

2.68±0.13
2.94±0.22
2.49±0.18

72.91±0.4273.21±0.40
73.60±0.43

4.58±0.51
5.43±0.54
5.26±0.42

0.01＜P＜0.05

0.1＜P＜1

0.1＜P＜1

0.1＜P＜1

0.1＜P＜1

0.1＜P＜1Pと0.155，C/T型：0.536と0.477，T/T型：0.304とアレルに増加効果，Ｔアレルに低下効果が示唆さ

0.368であり，各アレル頻度はＣアレル：0.428とれた（Table１，４）。

0.394，Ｔアレル：0.572と0.606であった。これら

3ʼUTRに位置するc.＊50A＞Gの多型確認用集団

頻度はHWEに従い，また，両集団間のジェノタ（69頭）と関連解析用集団（174頭）における各イプ頻度に有意差はなかった（Table３）。さらに，

ジェノタイプ頻度は，A/A型：0.275と0.322，A/

関連解析用集団を同様にジェノタイプに従ってグ

G型：0.507と0.494，G/G型：0.217と0.184であっループ分けし，各枝肉形質の平均値差を解析した

た 。ま た ，各 ア レ ル 頻 度 は Ａ ア レ ル：0.529 とところ，枝肉重量で有意傾向（0.05＜P＜0.1）が0.569，Ｇアレル：0.471と0.431であった。これら

見 ら れ た（Table ４）。枝 肉 重 量 176 頭 の 平 均 値

はHWEに従い，また，両集団間のジェノタイプ

（462.32±3.40㎏）に比べ，Ｃアレルホモは高く頻度に有意差はなかった（Table３）。さらに，関（477.41±6.86），Ｔアレルホモは低く（454.99±

連解析用集団における各ジェノタイプの各枝肉形

6.33），ヘテロは同等（462.94±4.64）であり，Ｃ質平均値に有意差は見られなかった（Table４）。

© The Ito Foundation

330

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

さらに，3 SNPsによるRBP4遺伝子型（c.237C

雑形成が高まることが示されている。また，VA＞G-c.355＋26C＞T-c. 50A＞G）と各枝肉形質のは様々な生理作用を持つことが知られている。

関連を調べるために，3 SNPsすべてがホモ接合

RBP4は肝臓でレチノールに変換されたVAを標である個体を探索したところ，C-C-Aホモ（12的臓器（細胞）に輸送するタンパクである。この頭），C-T-Aホモ（14頭）とG-T-Gホモ（19頭）

ことから，RBP4遺伝子の多型は脂肪交雑をはじが検出された。これら遺伝子型間の枝肉重量に有めとする枝肉形質に影響すると考え，これまでに意差（P＜0.05）が見られ，C-C-A型に増加効果，

子牛死亡集団を多型探索用集団として，黒毛和種

全SNPsが置換型アレルのG-T-G型に低下効果がに存在するRBP4多型を探索してc.237C＞G, c.355

見られた（Table４）。また，チューキー法で各群＋26C＞Tおよびc.＊50A＞Gの3 SNPsを検出した。

間に有意差は検出されなかったが，c.355＋26C＞

そこで，これらSNPsと脂肪交雑をはじめとするTの低下効果が示唆されたＴアレルを含む

枝肉形質との関連を，食肉市場で採取した関連解

C-T-A 型 の 平 均 値 （478.71 ± 12.75 ㎏ ） は ，

析用集団を用いて解析した。また，両集団におけ

C-C-A 型（474.77 ± 10.67 ㎏ ）と 同 等 で あ り ，るジェノタイプ頻度を比較することで，これら

C-T-A型に低下効果は見られなかった。

SNPsが子牛死亡と関連するかを検討した。その＊これらのことから，RBP4遺伝子が枝肉重量と結果，c.355＋26C＞Tと枝肉重量の関連が示され関連する可能性が示された。しかし，c.355＋26Cた。また，3 SNPsによるRBP4遺伝子型での解析＞Tの低下効果を示すＴアレルを含む遺伝子型のによって，RBP4遺伝子が枝肉重量と関連する可C-T-A型に低下効果が見られなかったこと，c.355

能性が示されが，これはc.355＋26C＞Tによるも＋ 26C ＞ T は イ ン ト ロ ン に 位 置 す る こ と か らのではないことが示唆されたため，遺伝子上流を（Fig.１），検出された効果はこのSNPによるもの

含む領域の解析が必要と思われる。また，多型探ではなく，多型探索していない遺伝子上流やシー

索用集団と関連解析用集団における各SNPのジェ

ケンシングが困難なため十分な頭数で多型探索さノタイプ頻度に差がなかったことから，これられていないエクソン１および２に位置する多型がSNPsは子牛死亡と関連しないことが示唆された。

影響している可能性があるため ，これら領域の
13）

多 型 探 索 を 同 規 模 で 行 う 必 要 が あ る 。ま た ，
RBP4遺伝子型と各種枝肉形質の関連は各遺伝子型ホモ個体を用いたが，各グループの頭数が少な
いため，解析頭数を増やして解析する必要がある。最後に，多型確認用集団（死亡子牛集団）と関連解析用集団（正常肥育去勢牛集団）の各ジェ
ノタイプ頻度に差がなかったことから，これら塩
基置換は子牛死亡に関連しないことが示唆された。
４．要

約

黒毛和種は脂肪交雑に優れた品種であり，肥育
中期にVA給与を制限することによって，脂肪交文献１） Takasuga, A., Watanabe, T., Mizoguchi, Y.,
Hirano, T., Ihara, N., Takano, A., Yokouchi, K.,
Fujikawa, A., Chiba, K., Kobayashi, N., Tatsuda, K.,
Oe, T., Furukawa-Kuroiwa, M., Nishimura-Abe, A.,
Fujita, T., Mizoshita, K., Ogino, A., Sugimoto, Y. :Identification of bovine QTL for growth and carcass
traits in Japanese Black cattle by replication andidentical-by-descent mapping, Mammalian Genome,
18, 125～136, 2007.
２） Yamada, T., Itoh, M., Nishimura, S., Taniguchi, Y.,
Miyake, T., Sasaki, S., Yoshioka, S., Fujita, T., Shiga,K., Morita, M., Sasaki, Y. : Association of single
nucleotide polymorphisms in the endothelial
differentiation sphingolipid G-protein-coupled
receptor 1 gene with marbling in Japanese Black
beef cattle, Animal Genetics, 40, 209～216, 2008.
３） Sasaki, S., Itoh, T., Ogino, A., Kimura, H. : Effects© The Ito Foundation

黒毛和種におけるRBP4 多型と枝肉形質の関連解析
of a single nucleotide polymorpism in EDG1 andTTN genes with meat production and carcass traits
in Japanese Black beef cattle. 34th Conference ofInternational Society for Animal genetics abstract
book, 168, 2014.
４） Tong, B., Sasaki, S., Fujita, T., Yamada, T. :Association of the SNP in the MYBPC1 gene withmarbling in Japanese Black beef cattle. 34th
Conference of International Society for Animal
genetics abstract book, 149～150, 2014.
５） 社団法人畜産技術協会：ビタミンＡのコントロー
ルを用いた効率的肥育技術Q&A, Vol.2, 29, 2005.
６） 肉牛大辞典飼育の基本から最新研究まで，農分協，
2013.
７） 岡章生：黒毛和種肥育牛の肉質・増体に対するビタ ミ ン Ａ の 影 響 ，動 物 遺 伝 研 究 会 誌 ，24, 31 ～ 36,1996.
８） 松井徹，鳥居伸一郎，矢野秀雄：ビタミンＡとウ

331

シの脂肪細胞分化，動物遺伝研究会誌，24, 37～44,
1996.
９） Mandrup, S., Lane, M.D. : Regulating adipogenesis,
Journal of Biological Chemistry, 272, 5367～5370,
1997.
10） 今川正良：核内受容体PPARγを介した脂肪細胞
分化の分子機構，脂質栄養学，12, 54～64, 2013.
11） 渭原博：レチノール結合蛋白－４，生物試料分析，
34, 354～358, 2011.
12） Sun, H., Kawaguchi, R. : The membrane receptor
for plasma retinol-binding protein, a new type ofcell-surface receptor, International Review of Celland Molecular Biology, 288, 7～9, 2011.
13） 平野貴，原ひろみ，半澤惠：黒毛和種の脂肪交雑形成に影響するビタミンＡを輸送するRBP4のDNA
多型探索，平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，33, 210～215, 2015.

© The Ito Foundation

332

脂質代謝および感染症研究のための豚・牛由来
肝臓細胞の樹立
Establishment of bovine and swine derived hepatocytes for the lipid
metabolism and infection study

福

田

智

一

（東北大学農学研究科）

Tomokazu Fukuda（Tohoku University, Graduate School of Agricultural Science）

The liver is the most important organ for the metabolism of lipid and glucose. The growth
speed of the livestock is largely affected by the function of the liver. Furthermore, the liver isthe target organ of various types of infectious diseases, including hepatitis E virus. The
establishment of the in vitro cell culture system is essential to investigate the detailed functionof the liver in the livestock. However, as far as we know, the successful establishment of cattle
or pig liver derived cell has been not reported yet.
We successfully obtained primary cattle derived liver cells with special medium, including
various growth factors. From its cell morphology, the established cell would be expected to be
derived from hepatocyte itself, or hepatic endothelial cells. To induce the infinite cell division ofobtained cells, we constructed genetic cassette which encodes the mutant CDK4, Cyclin D,
EGFP with polycistronic fashion. The recombinant retrovirus which contains above mentioned
three genes showed efficient introduction ratio around 50％. The expression of abovementioned three genes did not show major morphological change of the introduced cells,suggesting that our applied immortalized method keeps original nature of the cells. As thenext step of this study, we are planning to characterize the biological feature of the obtained
cells.

している可能性が高く，畜産産業の効率化には家

１．研究の目的および背景

畜の肝臓細胞の機能の解析が重要である。

肝臓はヒトや動物の体内で最大のサイズと重量

さらに肝臓は多くの感染症の原因となる臓器でを持つ臓器である。特に産業用家畜，牛や豚におある。最もよく知られるものでは，Ｅ型肝炎ウィ

いては，飼料を消化した後に生育のためのエネル

ルスがある。Ｅ型肝炎ウィルスは人畜共通感染症

ギーを産生するための主たる臓器である。肝臓のであり，そのことが主要因として豚の生食が制限

機能によって動物の生育は大きく影響されるとされている。Ｅ型肝炎は食肉の安全性を確保する

いっても過言ではない。肝臓における糖・エネル

うえで大きなリスク要因である。しかしこれらのギー・脂質の代謝能力が家畜の発育に大きく影響

感染症の研究を進めるためには，試験管内の実験© The Ito Foundation

脂質代謝および感染症研究のための豚・牛由来肝臓細胞の樹立

333系が必須である。Ｅ型肝炎ウィルスを含む感染症

10％ FBS, 10 nM Insulin,EGF（Epidermal Growth

に関する研究を行ううえで，動物への感染実験でfactor）, HGF（Hepatocyte Growth Factor）を添

は大きなリスクを伴う。試験管内にて効率よく増加した培地を用いて，牛由来初代肝臓細胞を培養殖する肝臓由来の培養細胞が存在すれば，Ｅ型肝することに成功した（未発表データ，昨年度財団

炎ウィルスに関する研究が大きく進展すると考え報告書）。我々の樹立した細胞は島状の上皮由来られる。

の形態を示し，肝実質もしくは類洞上皮細胞由来

ヒト由来の肝臓癌由来の培養細胞はHepG２細であることが推測された。本研究では，まず細胞胞を含めて，全世界で様々な研究に汎用されてい分裂に伴って蓄積する老化タンパク質であるp16

る 。しかし，これらの肝臓癌由来の細胞は，癌の負の制御を乗り越えるために，p16の結合部位化する過程でゲノムの不安定性を引き起こしておであるCDK4の24番目のアミノ酸を置換した変異り，元の肝臓細胞の性質の一部を失っている２）。

型遺伝子，加えてサイクリンＤを導入し，無限分

また，食肉の安全を確保するうえでは家畜由来の裂化を試みた。

１）

肝臓細胞が必要とされるが，現在までに牛，豚由来の肝臓細胞の樹立は報告されていない。我々は

２．材料および方法

今までサイクリン依存性キナーゼ４（CDK4），

2.1

サイクリンＤ，テロメラーゼ由来酵素サブユニッ

ホルスタイン種，雄牛５週齢の個体を使用しト（TERT）のたった３種の遺伝子を入れることた。動物を用いた実験内容に関しては東北大学動で，豚および牛由来の線維芽細胞を無限分裂へ導物実験委員会へ実験内容を申請した。動物へ鎮静くことができることを明らかにした３）。またこれ剤を注入し，その後頚動脈にカニューレを挿入しらの細胞は元のゲノム状態や細胞の性質を保持し放血による安楽死を施した。肝臓組織約100－150ており，従来の癌遺伝子を用いた無限分裂細胞のｇを得た後に，組織内の血管へカニューレを挿入

誘導とは異なることを示した 。驚くべきことに，し，コラゲナーゼを含む消化溶液にて灌流した。

我々はこの無限分裂誘導技術はヒトやサル，牛，

十分な量の酵素液で組織を分解した後に，肝臓組豚といった幅広い動物種を超えて適用可能である

織由来の細胞液を得た。

３）

ことを明らかにした。CDK4，サイクリンＤ，

３～５）

2.2

肝臓組織の培養前処理

肝臓組織の培養TERTといった遺伝子群は酵母からヒトに至るま

肝臓細胞の培養には新たに我々が開発した培地

で，遺伝子における配列が高く保存されているこ

条件を用いた。高グルコースDMEM/F12に100U/とが知られている。この高い保存性のために，幅mL penicillin，100μg/mL streptomycin，10％広い動物種で無限分裂細胞の誘導が可能になるとFBS, 10 nM Insulin, EGF（Epidermal Growth

考えられる。我々はこの無限分裂細胞誘導技術を

factor）, HGF（Hepatocyte Growth Factor）を添

牛肝臓由来初代培養細胞に適用すれば，元の正常加した培地を用いた。培養プラスチックディッ

な機能をできる限り損なうことなく，自由に増殖

シュにはコラーゲン処理を行い，細胞の張り付きさせることが可能となる新たな細胞株を作成するを加速されるように前処理を行った。培養開始

ことができると発想した。

後，24時間，72時間後と経過観察を行った。細胞加えて，我々は新たに高グルコースDMEM/F12が培養ディッシュ底面に一杯に増殖した時点でコに100U/mL penicillin，100μg/mL streptomycin，

ンフルエントと判断し，継代操作を行った。継代© The Ito Foundation

334

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

に際してはアキュターゼによって単一細胞にまで

一部は国立がんセンター，がん予防研究部の清野分散を行った。

透部長より提供を受けた。リポフェクションによ2 . 3 組み換えレンチおよびレトロウィルスのる導入後48時間目に10μＭのフォルスコリンを含む培地に交換し，さらに48時間培養を継続した。

作成
肝臓細胞へ遺伝子導入を行うための最適条件を

その後細胞上清を回収後，0.45μmのフィルター探索した。具体的には組み換えレンチおよびレトにて濾過を行った。さらに30mlの濾過細胞上清

ロウィルスを使用した。細胞を無限分裂へ導くたウ ィ ル ス 液 に 10ml の ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル

めに，変異型CDK4，サイクリンＤ，TERTを発6000を主成分とするウィルス濃縮溶液を加えた。

現 す る レ ン チ ウ ィ ル ス ３ 種 （CSII-CMV-

４℃で一晩静置し沈殿を形成させた後に3500rpm

CDK4R24C, CSII-CMV-CyclinD, CSII-CMV-

にて１時間遠心分離を行った。得られた組み換え

TERT）を作成し，混合溶液とした。また別の方

ウィルスペレットを1.5mlの培養液にてサスペン法として，変異型CDK4，サイクリンＤ，EGFP（オドし感染用ウィルス液とした。これらの詳細な手

ワンクラゲの蛍光タンパク質）の遺伝子を自己消法に関しては我々の過去の原著論文を参照してい

化性２Ａペプチドで連結した遺伝子を化学合成しただきたい。

た。化学合成にあたっては遺伝子からのタンパク

2 . 4 肝臓細胞における遺伝子導入の検出

質の翻訳効率を上げるために，牛の遺伝子として得られた初代培養肝臓細胞を3.5㎝プラスチッ

コドン最適化を行った。最適化した2Aペプチド

クディッシュあたり１Ｘ10５細胞播種した。翌日，によって連結した遺伝子は，シャトルベクターで遠心分離およびポリエチレングルコールによってあるpUC57より制限酵素で切断，アガロースゲル

濃縮された組み換えウィルス溶液を暴露した。感にて電気泳動後，インサートをゲルから回収し染は細胞の様子を観察しながら行い，最大で48時た。回収したインサートをレトロウィルスベク

間行ったが，細胞の形態から生存率の低下が認めターであるQCXINのマルチクローニングサイト

られた場合，その時点で感染を終了した。遺伝子へサブクローニングを行った。組み換えウィルス

導入後48時間目にキーエンス社のボックス型蛍光の作成にはヒト胎児由来腎臓上皮細胞である

顕微鏡，BZ9000によってEGFPの蛍光を通じて遺293Tを用いた。レンチウィルスの場合，リポフェ

伝子発現をモニタリングした。

クションによってパッケージングプラスミドである HIV-gp お よ び pCMV-VSV-G-RSV-Rev と

３．結果および考察

CSIIを骨格とする発現プラスミドを導入した。

我 々 は 高 グ ル コ ー ス DMEM/F12 に 100U/mL

パッケージングプラスミドおよびCSIIを骨格とす

penicillin，100μg/mL streptomycin，10％ FBS,

るレンチウィルスプラスミドは理化学研究所，バ10 nM Insulin, EGF（Epidermal Growth factor）,

イオリソースセンターの三好浩之チームリーダー

HGF（Hepatocyte Growth Factor）を 添 加 し た

より提供を受けた。レトロウィルスの場合，リポ培地を用いて，再現よく肝臓上皮細胞由来と考え

フェクションによってパッケージングプラスミド

られる初代培養細胞を得た。細胞増殖は島状になであるpCL-gag polおよびpCMV-VSV-G-RSV-

り，またその円形の核を持つ細胞形態から，肝実RevとQCXINを骨格とするレトロウィルスプラ

質もしくは類洞上皮細胞由来と考えられた。また

スミドを導入した。パッケージングプラスミドの重要なことはアキュターゼのようなコラーゲンを© The Ito Foundation

335

脂質代謝および感染症研究のための豚・牛由来肝臓細胞の樹立

主成分とした酵素溶液によって細胞の剥離と継代物を１つのオープンリーディングフレームで導入が可能であった。

が可能である。我々は変異型CDK4，サイクリン

この細胞を材料に，レンチウィルスを用いて変Ｄ，EGFPを2Aペプチドで連結したレトロウィル

異型CDK4，サイクリンＤ，TERT遺伝子の導入

スベクターを作成した７）。このベクターの利点は，を行った（図１Ａ）。我々の過去の牛の線維芽細

一度の感染で変異型CDK4およびサイクリンＤの胞の研究結果から，これらの３種の遺伝子を多重両方の遺伝子を同時に導入できること，また遺伝に導入された細胞が優先的に細胞増殖することが子導入の効率を遺伝子構築の一番後ろのEGFPの判明している

蛍光によって検出が可能となる点である。

。しかしEGFPのみを発現する

３～５）

レンチウィルスを感染させた結果，驚くべきこと

感染後，48時間後に細胞の蛍光を検出した結果に遺伝子導入効率が10％以下と低かった。このこを図２に示す。低倍率で観察されるように，おおとは多重感染を行った場合でも，３つの遺伝子をよそ50－60％の細胞に遺伝子導入が可能であっ同時に導入した細胞を得ることはかなり困難であた。導入された細胞において，細胞形態に大きなることを示している。

差はなく，我々の従来の報告と同様に，変異型

これらの遺伝子導入効率の低さを補うために，

CDK4，サイクリンＤの導入は元の細胞の性質を

我々は自己消化性2Aペプチドを利用した単一レ損なうことなく無限分裂に至った結果と一致しトロウィルスによる複数遺伝子の導入を試みた

た。これらの導入した細胞における導入遺伝子の（図１Ｂ）。自己消化性ペプチドは翻訳後に迅速に発現を特異的抗体を用いたウェスタンブロットお細胞の内在性プロテアーゼによって複数のタンパ

よびゲノムDNA由来のPCRを用いて検出する予

ク質に切断される６）。このため，複数の遺伝子産定である。さらに得られた細胞が無限分裂するこ

Ａ

B

LTR

CMV

CDK４

2A
peptide2A
peptide

LTR
LTR

LTR

CMV

Cyclin

LTR

LTR

CMV

TERT

LTR

CMV

CDK４

CyclinEGFP

CDK４

Cyclin

EGFP

LTR

Mixture of recombinantviruses
CDK４

Cyclin

EGFP

Quick protein degradation
図１ 導入したCDK4, Cyclin D, TERTの遺伝子構造
A：CDK4, Cyclin D, TERTを発現するレンチウィルスを混合し，重感染を行った。B：CDK4, Cyclin D, EGFPの３種のタンパク質を同時に発現するレトロウィルスの構造。自己消化性2Aペプチドの存在によって，迅速にタンパク質が３種に分かれる。

© The Ito Foundation

336

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Low maginiﬁcation

EGFP

Merge

DIC

EGFP

Merge

High maginiﬁcation

DIC

図２ CDK4, Cyclin D, EGFPを一括して導入された牛由来肝臓細胞の形態
上段は低倍率（X4対物レンズ），下段は高倍率（X20対物レンズ）を示す。おおよそ50％程度の割合の細胞へ遺伝子が導入されたことが検出された。

とを連続的な連続継代によって検出する予定であ必須であるが，いまだ牛，豚の肝臓由来の樹立のる。

報告はない。

本研究によって牛肝臓由来の細胞株を無限分裂

我々は独自に工夫した特殊培地を用いて，島状へ誘導できる可能性が示された。本細胞は畜産業に増殖する牛肝臓由来初代培養細胞を作成した。

にとって大きな懸念である人畜共通感染症の試験

それらの細胞は細胞形態から，肝実質細胞もしく管内における感染実験系を構築できる可能性があは類洞上皮細胞由来と推測された。さらにこの初る。

代培養細胞を無限分裂化させるために，変異型

４．要

CDK4およびサイクリンＤ，EGFPを発現する発約

現カセットをレトロウィルスを介して導入した。

肝臓は糖・脂質を代謝において最も重要な臓器導入効率はおおよそ50％程度であった。導入されである。家畜の生育は肝臓の代謝機能に大きく影た細胞は元の初代肝臓細胞と大きな形態学的な変響される。さらにＥ型肝炎を代表する様々な感染化は認められず，本手法による無限分裂化は元の症の標的臓器でもある。これらの肝臓の重要な機細胞の性質を保持していると考えられた。今後，能を詳細に研究するためには試験管内での実験が得られた細胞の性質を明らかにする予定である。

© The Ito Foundation

脂質代謝および感染症研究のための豚・牛由来肝臓細胞の樹立
参考文献
１） Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. : Human
hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major
plasma proteins and hepatitis B surface antigen,
Science, 209, 497～499, 1980.
２） Darlington, G. J., Kelly, J. H., Buffone, G. J. :Growth and hepatospecific gene expression ofhuman hepatoma cells in a defined medium, In Vitro
Cell Dev Biol, 23, 349～354, 1987.
３） Donai, K., Inagaki, A., So, K. H., Kuroda, K., Sone,
H., Kobayashi, M., Nishimori, K., Fukuda, T. : Lowmolecular-weight inhibitors of cell differentiation
enable efficient growth of mouse iPS cells underfeeder-free conditions, Cytotechnology, 67, 191～197,
2015.
４） Kuroda, K., Kiyono, T., Eitsuka, T., Isogai, H.,
Takahashi, K., Donai, K., Isogai, E., Fukuda, T. :Establishment of cell lines derived from the genus
macaca through controlled expression of cell cycle
regulators, Journal of cellular biochemistry, 116, 205

337～211, 2015.
５） Kuroda, K., Kiyono, T., Isogai, E., Masuda, M.,
Narita, M., Okuno, K., Koyanagi, Y., Fukuda, T. :Immortalization of fetal bovine colon epithelial cellsby xxpression of human cyclin D1, mutant cyclin
dependent kinase 4, and telomerase reverse
transcriptase : An in vitro model for bacterial
infection, PLoS One, 10 : e0143473, 2015.
６） Kim, J. H., Lee, S. R., Li, L. H., Park, H. J., Park, J. H.,
Lee, K. Y., Kim, M. K., Shin, B. A., Choi, S. Y. : Highcleavage efficiency of a 2A peptide derived from
porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish
and mice, PLoS One, 6 : e18556, 2011.
７） Fukuda, T., Iino, Y., Onuma, M., Gen, B., InoueMurayama, M., Kiyono, T. : Expression of humancell cycle regulators in the primary cell line of theAfrican savannah elephant（loxodonta africana）
increases proliferation until senescence, but does not
induce immortalization, In Vitro Cell Dev Biol Anim,
52, 20～26, 2015.

© The Ito Foundation

338

籾米の給与を軸とした日本型動物福祉鶏肉生産技術の開発
Development of animal welfare friendly broiler production system byunhusked rice feeding in Japan

有

賀

小百合・佐

藤

衆

介

（帝京科学大学生命環境学部）

Sayuri Ariga and Shusuke Sato
（Teikyo University of Science, Faculty of Life and Environmental Sciences）

Broilers being fed on rations containing 30％ of unhusked rice spent more time preening
and moving, and their chronic stress decreased than on conventional rations mainly consistingof corn（Ohara, 2015）. We suggested that feeding on unhusked rice has behavioural andpsychological calming effect on broiler chickens. This study aimed to investigate the factor ofthis effect by observing precisely feeding behaviour on unhusked rice. 15 male broilers reared
individually in a wire cage（34 ＊ 31cm/broiler) were equally allocated into three treatments：
100％ unhusked rice feed（UR）, 98％ corn feed（CO）, and ration containing 30％ of unhusked
rice（RC）for 10 min, respectively. The pecking success on rations and appetitive behaviour
such as pulling rations toward by bill and sorting out rations by a bill for the first 1 min soonafter feeding were observed.（1）The success rate（％）of pecking on rations was 70.1 ± 14.8
in the UR which was less than in the CO（89.5 ± 5.6；P ＜ 0.1）and the RC（85.5 ± 4.0；P ＜ 0.1）.
（2）The number of sorting out rations by a bill was more in the UR than in the othertreatment（UR：1.9 ± 1.6；CO：0.2 ± 0.3；RC：0.9 ± 1.0；P ＝ 0.066）（3）.
Bill-wiping behaviour
was performed only by the UR broilers.
In conclusion, it is difficult for broilers to get successfully the unhusked rice, and broilers
are needed appetitive behaviour for getting the unhusked rice. These behavioural changes by
the partial unhusked rice feeding may have the behavioural and psychological calming effecton the broiler chicken.
Keyword：Appetitive behaviour; Broiler; Calming; Foraging behaviour; Unhusked rice
feed

１．目

う飼育管理の家畜福祉世界基準を作成した。日本

的の畜産も国際情勢との整合性を取ることが求めら

OIE（世界動物保健機構）は，2004年以来，陸れる。また，畜産の輸出産業化においては，世界

生動物健康規約に動物福祉の章を追記し，2013年に通用する高福祉畜産の構築が不可欠である。

には「家畜福祉とブロイラー生産システム」とい我が国では，近年，飼料の自給率向上を目的と© The Ito Foundation

籾米の給与を軸とした日本型動物福祉鶏肉生産技術の開発

339

し，肉用鶏への飼料用籾米の給与に関する研究が飼いした。敷料には籾殻を使用し，約10㎝の厚さ

盛んに行われている。我々

は，鶏の福祉改善ので敷き詰めた。導入直後から10日齢までは，プラ一方策として籾米給与に着目し，肉用鶏に全飼料

スチック製容器（直径35㎝，深さ2.5㎝）にてス

中重量比30％の籾米配合飼料を給与した結果，慣ターターを，ステンレス製容器（縦横34.5㎝，深行的なコーン主体配合飼料を給与した鶏と比較しさ2.5㎝）にて籾米を不断給餌した。11日齢からて，活動量や慰安行動である身繕い行動が増加

23日齢までは，プラスチック製給餌器（直径43し，慢性ストレス指標である偽好酸球／リンパ球㎝，深さ８㎝）にて，自家配合した重量比30％籾

（H/L）比率が低下したことを報告し，鶏の慢性米配合の前期飼料を不断給餌した。24日齢から43

ストレスを改善させると示唆した。また，籾米

日齢（出荷）まで，単飼ケージ（奥行34×横31×30％配合飼料を給与した鶏では，摂食時のつつき

高さ45㎝）で１羽ずつ飼養した。そこでは，プラ速度（回／分）が増加し，籾米は嗜好性が高いこ

スチック製容器（奥行13.8×横20.3×深さ5.2㎝／

とも明らかにした。そして，籾米の給与は，肉用羽）にて，自家配合した重量比30％籾米配合の後鶏に行動的・心理的安寧をもたらし，福祉性を改期飼料を不断給餌した。いずれの期間も不断給水善させると示唆した 。

した。

１）

１）

摂食行動は，動物において最も強く動機づけら

2.2

試験方法

れている行動である。飼育動物における異常行動

籾米，コーン，籾米30％配合飼料のそれぞれのや問題行動は，不適切または不十分な採食や摂食

摂食行動パターンを明らかにするため，供試鶏に行動が原因となっていることが多く，採食・摂食

各飼料を10分間提示し，摂食行動を観察した。試行動の発現状況は，動物の行動的・心理的健康性

験の日程（日齢）は，10月28日（29），10月30日に大きな影響を与える。このことから，籾米配合（31），11月２日（34），11月４日（36），11月６日

飼料による行動的・心理的安寧化効果は，飼料へ（38），11月９日（41）であった。

の籾米添加により，摂食行動パターンに何らかの24日齢以降，供試鶏を５羽ずつランダムに籾米変化が生じたことに起因すると考えた。そこで本区，コーン区，通常区に配分した。籾米区では籾

研究では，籾米摂食時の行動パターンをより詳細

米 100 ％ 飼 料 を ，コ ー ン 区 で は 二 種 混 合 飼 料に解明することで，籾米配合飼料の給与による行（コーン98％，魚粉２％）を，通常区では通常飼

動的・心理的安寧化効果の要因を明らかにするこ料（籾米30％配合後期飼料）を特定飼料として定とを目的とした。

義し，日々の飼養管理で用いていたプラスチック

２．方
2.1

製容器と同型の別容器（奥行13.8×横20.3×深さ

法5.2㎝）に各々20ｇを入れ，10分間提示した。各
試験日の朝09：00から，以下の工程で試験を実施

飼養方法

東京農業大学（神奈川県厚木市）の実験用無窓

した：①全区における30分間の絶食，②全区への畜舎にて，2015年９月30日から11月12日にかけ10分間の通常飼料の提示（以下，通常第１期），て，肉用鶏チャンキー種オス16羽（株式会社松本③各区への籾米，コーンまたは通常飼料の10分間

鶏園）を供試した。導入鶏の内，15羽を実際の試の提示（以下，特定飼料期），④全区への10分間

験に使用し，１羽は予備個体として飼育した。全の通常飼料の提示（以下，通常第２期）。通常第羽を導入直後から，奥行180×横90㎝のペンで平

１期，特定飼料期，通常第２期の行動を高速度ビ© The Ito Foundation

340

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

デ オ カ メ ラ（AX200v, AX100v ，ソ ニ ー マ ー ケ
ティング株式会社，東京）により記録した。飼料

３．結果と考察

容器の入れ替え作業やカメラ設置に対する馴致

3.1

は，10月25日，26日，27日に実施した。

コーン区では，５羽中２羽が行動観察中に摂食

2.3

行動観察

摂食成功率

行動を発現しなかったため，摂食成功率が算出で各試験日において，各区の特定飼料期の特定飼きなかった。そこで，摂食成功率の分析において

料摂食量（ｇ）を記録した。試験日のうち特定飼は，当２羽のデータは除外し，残りの３羽から得料摂食量が多かった上位３日間（11月２日，４られたデータを分析に供試した。

日，９日）のビデオ映像にて行動観察を行った。

籾米区（ｎ＝５）おいて，特定飼料期の摂食成

通常第１期，特定飼料期，通常第２期のそれぞれ功率（％）は70.1±14.8で，通常第１期の86.8±3.1において，最も活発に摂食行動が発現していた初および第２期の85.1±2.6と比較して低かった（各めの１分間の映像を分析に供試した。パソコン用

期間でｐ＜0.05）。コーン区および通常区では，無料動画再生ソフトGOM Playerにより，0.2倍速

期間に差はなかった。特定飼料期において籾米区

でビデオを再生し，連続観察法により行動観察をの摂食成功率（％）は70.1±14.8（ｎ＝５）で，行った。行動観察項目はTable１に示したとおり

コーン区の89.5±5.6（ｎ＝３）および通常区のである。摂食成功回数，摂食失敗回数，全つつき85.5±4.0（ｎ＝５）と比較して，低い傾向があっ

回数，摂食成功率を，通常第１期，特定飼料期，

た（Kruskal-Wallis, P＜0.05；Bonferroni，それ通常第２期において観測した。摂食に対する欲求

ぞれｐ＜0.1）。これらの結果から，籾米100％飼行動の発現回数は，特定飼料期においてのみ観測

料は，コーン飼料や籾米30％配合飼料と比較しした。各行動観察項目において，Kruskal-Wallisて，飼料摂取の成功がより困難であることが明ら

testを用いて区間および期間の差の有無を分析かとなった。

し，有意差が認められた場合，事後検定として
Bonferroni testを行った。

環境エンリッチメントとは，飼育環境の改変に
より自然な行動発現を促進させること，およびその技術を指し，動物園動物を中心に開発が進められている。環境エンリッチメントの一手法としTable 1 Behavioural category
行動観察項目
摂食行動

定義

摂食成功回数飼料をつついた後，嘴を数度にわたり開閉し，飲み込み動作が確認できた場合，摂食成功とした。一つつきを１回とした。

摂食失敗回数飼料をつついた後，嘴の開閉，飲み込み動作が確認できなかった場合，摂食失敗とした。一つつきを１回とした。

全つつき回数

摂食成功回数および失敗回数の合計値。

摂食成功率

摂食成功回数／全つつき回数×100％

摂食に対する欲 引き寄せ回数
求行動

嘴を使い飼料を引き寄せる行動。鶏から見て，給餌器の奥から手前へ，餌箱を引っ掻くように嘴を動かす。一引き寄せを１回とした。

選り分け回数

嘴を左右に動かし，飼料を左右に飛び散らかす行動。一方向への一振りを１回とした。

頭振り回数

飼料を嘴で摘みながら頭を振る行動。一振りを１回とした。

嘴ぬぐい回数嘴を給餌器やケージに擦り付ける行動。一擦りを１回とした。

© The Ito Foundation

籾米の給与を軸とした日本型動物福祉鶏肉生産技術の開発

341て，採食エンリッチメントがあり，飼料の提示方効果がある可能性が考えられ，それは，我々１）が法の複雑化，飼料の獲得の困難化，飼料内容の多観察した行動的・心理的安寧化効果の一要因とな様化などの方法がある２）。飼料の獲得の困難化は，る可能性が考えられた。

霊長類や馬において問題行動や攻撃行動の減少，

3.3

総

括

探査行動や移動行動の促進効果があることが明ら

我々は先行研究１）において，籾米30％配合飼料

かとなっている２）。本研究から，我々１）が確認しは，慣行的なコーン主体飼料と比較し，行動的・た籾米配合飼料による活動性の向上や慰安行動の心理的安寧をもたらす効果があることを示唆し増加，慢性ストレスの軽減は，籾米による摂食行た。本研究において籾米30％配合飼料によるこの動の成功の困難化が一要因である可能性が示唆さ効果は，通常飼料への籾米の一部添加により，摂れた。

食行動の成功がやや困難となり，摂食に関連する
摂食に対する欲求行動の発現回数

欲求行動や正常行動の発現が促進し，それに伴

特定飼料期における選り分け行動回数（回／い，行動的満足感が増したことが一要因であると3.2

分）では，区間に有意差がある傾向が認められ（籾米区：1.93±1.59，コーン区：0.20±0.30，通常 区：0.93 ± 1.01 ，そ れ ぞ れ ｎ ＝ ５；Kruskal-

示唆された。
４．要

約

Wallis, p＝0.066），籾米区にて他区より多く発現

我々は先行研究１）において，肉用鶏に重量比していた。有意差はなかったが，嘴ぬぐい行動

30％の籾米配合飼料を給与することで，活動量や（回／分）は籾米区でのみ発現した（籾米区：

慰安行動の増加，慢性ストレス軽減などの福祉性

0.07±0.15，コーン区：0.00±0.00，通常区：0.00

改善効果を報告し，飼料用米の新たな機能性を示±0.00）。引き寄せ行動（籾米区：1.20±2.68，コー

唆した。本研究では，籾米摂食時の行動パターン

ン区：1.53±2.88，通常区：0.53±0.40）と頭振りをより詳細に解明することで，籾米配合飼料の給行動（籾米区：0.87±0.93，コーン区：0.53±0.51，

与による行動的・心理的安寧化効果の要因を明ら

通常区：0.40±0.44）は，有意差がなかった。

かにすることを目的とした。

正常な摂食行動の発現パターンは，欲求行動

供試鶏はチャンキー種オス15羽であり，５羽ず（飼料の探査，加工）と完了行動（飼料の摂取）

つ籾米区，コーン区，通常区に配分した。籾米区とで構成されており，動物は完了行動だけでなでは籾米100％飼料を，コーン区では二種混合飼

く，欲求行動に対しても生得的に強く動機づけら料（コーン98％，魚粉２％）を，通常区では通常れている 。欲求行動の発現が可能な環境は，正飼料（籾米30％配合飼料）を各20ｇ，10分間提示

常行動の発現や慢性ストレスの軽減などの効果がし，摂食行動を高速度ビデオカメラにて記録しあり ，行動における福祉性の改善において，非た。初めの１分間の摂食成功率および摂食関連行

常に重要である４）。選り分け行動は，鶏の摂食に動回数を連続観察により計測した。

３）

２）

対する欲求行動であるとされている 。また，嘴籾米区の摂食成功率（％）は70.1±14.8（ｎ＝ぬぐい行動は，嘴の清潔性や摂食に適した嘴の形

５）で，コーン区の89.5±5.6（ｎ＝３）および通状を維持する働きがあり ，鶏にとって必要不可

常区の85.5±4.0（ｎ＝５）より低かった（それぞ欠な正常行動の一つである３）。籾米飼料は，摂食

れｐ＜0.1）。籾米区の選り分け行動回数（回／分）に対する欲求行動や正常行動の発現を促進させるは1.9±1.6で，コーン区の0.2±0.3や通常区の0.9±

４）５）© The Ito Foundation

342

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

1.0よりも多い傾向にあった（Ｐ＝0.066）。嘴ぬぐい行動（回／分）は籾米区でのみ発現した。以上
より，我々が示唆した籾米30％配合飼料による肉用鶏の行動的・心理的安寧化効果は，籾米飼料の摂食成功率の低下，ならびに摂食に対する欲求行動の発現に伴う正常行動の適切な発現が要因であると示唆された。

文献１） 小原愛：日本のブロイラー生産における福祉的飼育法の提案，東北大学大学院農学研究科博士論文，
http://hdl.handle.net/10097/61423，2015．
２） 村田浩一，楠田哲士：動物園学，第８章環境エン
リッチメント，264～275，文永堂出版，東京，2011．
３） Duncan, I. J. H. : Behavior and behavioralneeds,
Poultry Science, 77, 1766～1772, 1998.
４） Appleby, M. C., Mench, J. A., Hughes, B. O. :Poultry Behaviour and Welfare, 48～51, CABI
Publishing, Wallingford, 2004.
５） Cuthill, I., Witter, M., Clarke, L. : The function ofbill-wiping, Animal Behaviour, 43, 103～115, 1992.

© The Ito Foundation

343

初期成長期のミオスタチン制御が黒毛和牛の肉質に及ぼす影響
Effect of myostatin control during early growth period on meat quality ofJapanese Black cattle

髙

橋

秀

之

（九州大学農学部附属農場）

Hideyuki Takahashi（Kuju Agricultural Research Center, Kyushu University）

This study aimed to determine effects of feeding increased volume of high-fat milk during
early post-natal life on concentrations of metabolites in blood, the expression of key genes
regulating intermediary metabolism in skeletal muscle and the rate of growth of JapaneseBlack cattle. All calves were fed a high-fat milk replacer（crude protein, 26％ ; crude fat,
25.5％ ; total dissolved nitrogen, 116％）.Control calves（male : n＝4, female : n＝2）were nursedwith 500 g（4 L/day）milk replacer until 107 days of age and were then weaned. In theexperimental group（male : n＝4, female : n＝2）
, calves were nursed with 1,800 g（9 L/day）milk replacer until 107 days and were then weaned. From weaning to 7 months of age, bothgroups were fed concentrate（1.5％ of body weight［BW］）and hay（ad libitum）. Body weight
was significantly higher in the experimental group than in the control group at 107 days and5
months of age.However, there was no difference at 7 months of age. Plasma concentrations ofgrowth hormone（GH）and Insulin like growth factor-1（IGF-1）were no difference between
the two groups. Expression of myostatin mRNA were also no difference in the M. longissimus
thoracis between the two groups. These results suggested that the IGF-1 secretion of theinitial growth phase according high plane of nutrition during early post-natal life may influence
not only intake of milk replacer but also the ingestion of colostrum.

１．目

成を促進する一方で，ミオスタチンの欠損は骨格的筋量を増大して脂肪量を減少させる１）。近年，初高齢者人口の増加，健康志向の高まりにより消期成長期の栄養とそれによる成長促進は，産肉性費者の食肉嗜好は多様化してきているため，国内や肉質に多大な影響を及ぼし２），初期成長期に獲での牛肉生産においても，霜降り肉の生産だけで得した代謝生理機能はその後の成長や肉質に不可なく赤身肉の生産量を増加させることは必須であ

逆的な影響を及ぼすことが報告されている。黒毛る。

和牛において，高脂肪ミルクの多給与は筋肉・脂ミオスタチンは産肉量と脂肪量を制御する主要肪細胞増殖を増加させるインスリン様成長因子-1な因子であり主に骨格筋において産生され脂肪形（IGF-1）濃度および筋タンパク合成を促し脂肪© The Ito Foundation

344

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

分解を促進する成長ホルモン（GH）濃度を増加に行い，胸最長筋（LT）の微量組織サンプルはさせる 。離乳後はIGF-1濃度の増加が維持され，

５および７ヵ月齢時にバイオプシー法を用いて採

ミオスタチン発現は発現量の緩やかな減少が起こ取した。

る 。したがって，初期成長期の栄養素による内2.2

分泌管理はミオスタチン発現を制御する可能性を

３，
５および７ヵ月齢時において，朝の給餌前

強く示唆するが詳細は明らかとなっていない。マに，頸静脈よりヘパリン処理真空採血管を用いてウスにおいてミオスタチン発現はGH投与により血液サンプルを採取した。すべての血液サンプル抑制される（Janny et al, 2009）が，過去の報告

は，室温で2,000×ｇ，20分間の遠心処理を行い，では離乳後のGH濃度は高脂肪ミルクの多給与に血漿サンプルを採取した。採取した血漿サンプルよる明確な差は見られなかった。そこで，本研究は，分析を行うまで－80℃で保存した。

３）

３）

血液サンプル

では初期成長期の栄養素により離乳後のGH分泌

血液成分の分析項目は，GHおよびIGF-1とし，およびミオスタチン発現を制御することを目的とこれらの血漿成分はそれぞれ時間分解蛍光免疫測

し，黒毛和種子牛を用いて初期成長期の栄養素に定法（TR-FIA）を用いて測定した。

よる内分泌管理が成長やミオスタチン発現に与え2.3

る影響を検討した。

LTの微量組織はバイオプシー法を用いて採取

２．方
2.1

バイオプシー

し た 。サ ン プ ル 採 取 前 に ，ス キ ル ペ ン（Ltd.

法Intervet, Osaka, Japan）0.3㎎/100㎏BWの筋内注
射およびキシロカイン（AsraZeneca KK, Osaka,

供試牛および飼養方法

本研究では，12頭の黒毛和種子牛を用いて，強Japan）5mlの皮下注射によって全身麻酔および化区（雄４頭，雌２頭）および対照区（雄４頭，局所麻酔を行った後に，ニードルバイオプシーに

雌２頭）の２区を設定した。両区の供試牛は，生よって胸最長筋（LT）の微量組織サンプルを採後３日で母牛より分離し，哺乳ロボットによる哺取した。LTは，７ヵ月齢時において，ニードル

乳試験を開始した。強化区は，哺乳ロボットによバイオプシーにて第12－13胸椎間より総計８㎝のり 代 用 乳 （CP ： 26 ％， CF ： 25.5 ％， TDN ：組織を採取した。採取した組織サンプルは，ただ116％）を最大1,800g/dayの条件で107日齢時まで

ちに液体窒素内で凍結させ，解析を行うまで－給与し，107日齢以降は体重比1.5％相当量の育成

80℃で保存した。

用 濃 厚 飼 料（CP ： 18 ％，CF ： ２ ％，TDN ：2.4

RNA抽出および定量的リアルタイムPCR72％）および粗飼料は飽食条件で管理した。一

Total RNAは，ISOGEN（NIPPON GENE CO.,方，対照区は，強化区と同様の代用乳を哺乳ロ

LTD. Tokyo, Japan），クロロホルムおよびイソ

ボットにより500g/dayの条件で107日齢時まで給

プロパノールによって抽出し，complementary

与し，107日齢以降は強化区と同様の飼養管理方

DNA （以 下 ， cDNA） は ， SuperScript VILO法を施した。本研究での対照区における代用乳の

Master Mix （Life Technologies Japan Ltd.

給与量は，肉用牛の日本飼養標準（中央畜産会，Tokyo, Japan）を用いて，1.5μgのtotal RNAよ2008年）に基づき設定した。

り 合 成 し た 。 合 成 し た cDNA 1μL と SYBER

また，生後から７ヵ月齢時までの各月においてGreenをプレート内で混合し，Thermal Cycler

体重測定を行い，採血は３，５および７ヵ月齢時

Dice Real Time System （TaKaRa Bio, Shiga,© The Ito Foundation

初期成長期のミオスタチン制御が黒毛和牛の肉質に及ぼす影響

345

Japan）によって定量的リアルタイムPCR処理をが示唆されており２），離乳後に摂取した飼料の利行った。その後，StepOne Plus Real Time PCR用が滞った可能性が考えられる。今後は，代用乳

System （Life Technologies Japan Ltd., Tokyo,の効果を維持しながらルーメン発達を促す飼養管Japan）に よ っ て ，Myostatin（MSTN）の 遺 伝

理技術の開発が必要であると考えられる。

子発現量を測定した。また，本実験では内部標準

血液成分は，血漿GHおよびIGF-1濃度は哺乳遺伝子としてハウスキーピング遺伝子である

期間中および離乳後ともに両区の間に差は見られ

RPS18を採用し，発現解析を行う遺伝子と併用しなかった。過去の報告では試験に供試した子牛はて測定を行うことによって，逆転写効率および17日齢で母子分離され代用乳を給与されたが，本Ct値を補正することとした。それぞれの遺伝子試験では３日齢で母子分離を行い４日齢から子牛は，牛の塩基配列を元に設計されたプライマーをに代用乳が給与された。したがって，母牛からの用いて測定した。

初乳摂取が十分に行われなかった可能性が推察さ

2.5

統計処理

れる。GHやIGF-1は初乳に含まれ子牛に移行す

すべての実験データは，２対の標本におけるｔ検定を用いて有意差検定を行った。

る４）。また，初乳構成成分は子牛の発達に影響を及ぼしその後の体質や生理機能を変化させることが報告されている ５）。したがって，初乳による３．結果と考察IGF-1の十分な摂取と強化哺乳の組み合わせるこ

104日間の哺乳期間に摂取した代用乳は，乾物とで，離乳後の高いIGF-1濃度を維持できる可能量で有意な差が見られた（Ｐ＜0.01）。また，代性が示唆された。一方で，過去の報告と本試験結用乳由来のCP（粗タンパク）摂取量およびCF（粗果よりGHは哺乳期の代用乳多給与だけでは離乳脂肪）摂取量は，強化区が有意に多かった（P＜後の維持は難しい可能性が示唆された。GHは放0.05，P＜0.05，respectively）。

牧飼育により増加する６）。このことから，今後は体重の変化は，離乳時の107日齢時から５ヵ月

哺乳期の強化哺乳と離乳後の放牧を組み合わせる

齢時にかけて，強化区が対照区区と比較し有意にことにより，高いGH濃度の維持が可能になると高かった（Ｐ＜0.05）。一方で，７ヵ月齢時にお推察される。

いては強化区と対照区を比較し差が見られなかった。

ミオスタチン発現については哺乳期間中および離乳後ともに両区の間に差は見られなかった。過哺乳期間終了時である107日齢時では，強化区去の報告では３ヵ月間の強化哺乳を行った子牛のの体重が対照区に比べ有意に高かったことから，

ミオスタチン発現は，５ヵ月齢時において対照区

哺乳量および代用乳からの栄養摂取量が多かった

区と比較して発現量の減少傾向が見られた３）が，ため代用乳由来のタンパクや脂肪の吸収および代７ヵ月齢時では両区の間に差は見られなかった。

謝が促されたことが増体に繋がったものと考えらしたがって，初期成長期の栄養環境により離乳後れる。一方で，離乳後の採食量は両区の間で差がのミオスタチン発現を制御することは可能である

なかったにも関わらず体重は離乳後の５ヵ月齢時と推察されるが，初期成長期の代用乳多給によるから差が小さくなり７ヵ月齢時においては有意なGH分泌とミオスタチン発現が連動しないことか差が認められなかった。黒毛和牛において哺乳期

ら単胃動物で報告されているようなGHとミオスの代用乳の多給与はルーメン発達が遅延すること

タチンの関係性が黒毛和牛では少ない可能性が示© The Ito Foundation

346

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

唆された。今後はGH投与や放牧を行いGH分泌とけて，強化区が対照区と比較し有意に重かった

ミオスタチン発現の関係を詳細に検討する必要が（Ｐ＜0.05）が，７ヵ月齢時においては両区の間ある。さらに初乳中にミオスタチン抑制物質が存に差が見られなかった。血漿GHおよびIGF-1濃在する可能性も考えられることから，初乳のメタ度は哺乳期間中および離乳後ともに両区の間に差ボローム解析等を行いミオスタチン抑制物質の探は見られなかった。また，LTにおけるミオスタ

索を行う必要がある。肉質に関しては，脂肪形成

チン発現についても哺乳期間中および離乳後ともや筋線維型を示唆する遺伝子発現に変化がなかっに両区の間に差は見られなかった。以上より，初たことから肉質に差はないと考えられるが，今後期成長期の栄養素によるIGF-1分泌は哺乳量だけの検討が必要である。

ではなく初乳の摂取に影響され制御される可能性

４．要が示唆された。今後，離乳後のGH分泌およびミ約

オスタチン発現制御機構を検討する必要がある。

哺乳期間中の代用乳多給は子牛の成長を促進
し，初期成長期の栄養制御は，その後の増体や肉質に影響を及ぼす。高脂肪ミルクの多給与は筋肉・脂肪細胞増殖を増加させるIGF-1濃度および筋タンパク合成を促し脂肪分解を促進する成長ホ
ルモンGH濃度を増加させ，離乳後はIGF-1濃度の増加とミオスタチン発現の緩やかな減少が起こる。そこで本研究では，初期成長期の栄養素により離乳後のGH分泌およびミオスタチン発現を制御することを目的とし，黒毛和種子牛を用いて初期成長期の栄養素による内分泌管理が成長やミオ
スタチン発現に与える影響を検討した哺乳期間中における代用乳給与量の差が初期成長期の成長やミオスタチン発現に及ぼす影響を検討した。

文献１） Hayashi, S., Miyake, M., Watanabe, K., Aso, H.,
Hayashi, S., Ohwada, S., Yamaguchi, T. : Proc
JpnAcadSer B, Phys Biol Sci, 84, 354～362, 2008.
２） Matsubara, A., Takahashi, H., Saito, A., Nomura,A., Khounsaknalath, S., Christopher, D. M., Fujino, R.,
Shiotsuka, Y., Etoh, T., Furuse, M., Gotoh, T. : Anim
Sci J, In press, 2015.
３） 髙橋秀之：平成26年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，公益財団法人伊藤記念財団，33，160～
163，2015．
４） Oda, S., Satoh, H., Sugawara, T., Matsunaga, N.,
Kuhara, T., Katoh, K., Shoji, Y., Nihei, A., Ohta, M.,
Sasaki, Y. : Comp Biochem and Phys, A, 94, 805～
808, 1989.
５） Bartol, F. F., Wiley, A. A., Bagnell, C. A. : Reprod
Domest Anim, 43, 273～279, 2008.
６） Barton, R. K., Krysl, L. J., Judkins, M. B.,
Holcombe, D. W., Broesder, J. T., Gunter,S. A., Beam,
S. W. : J Anim Sci, 70, 547～558, 1992.

体重は離乳時の107日齢時から５ヵ月齢時にか© The Ito Foundation

347

放牧養豚用アニマルウェルフェア評価法の開発
Development of on-farm pastured pig welfare assessment protocol

瀬

尾

哲

也

（帯広畜産大学畜産学部）

Tetsuya Seo（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

In recent years, concern related to farm animal welfare has increased worldwide. Although
the concern expressed by Japanese consumers and producers remains low. We preparedanimal welfare assessment protocol for pastured pig in fattening period. The assessment
method we prepared consists of three bases of animal, faci1ity and management, includes 29
parameters in all. We assessed the welfare level in four outdoor swine farm. The welfare levels
in animal base were higher, however the level of facility base was lower. Further research isneeded to refine this protocol in the view of animal diseases.

１．目

関する検討が積極的に進められている。

的

しかし日本ではまだその整備が遅れており，平近年の国際情勢からみると，日本においてもア

成22年度に各家畜の飼養管理指針１）が作成された

ニマルウェルフェア（家畜福祉）に対応せざる得程度で，アニマルウェルフェアを実際に評価してない状況にきている。EUでは採卵鶏のバタリー商品化することはできていない。アニマルウェル

ケージが禁止され，妊娠豚の受胎後４週間から分

フェアという概念を生産者や消費者に目に見える娩１週間前までの期間のストール飼育禁止などの形にするためには，アニマルウェルフェアの基準

法整備が進められている。OIE（国際獣疫事務局）

を明確化し，それを満たしているかを判定できるでは，動物の健康とウェルフェアの間には強い関評価法が必要である。

連性があるということから，輸送，食用のための日本でいくつかの農場が「アニマルウェルフェと畜などに関する規約を作成し，2012年にアニマア商品」と畜産物に記載し販売しているが，客観

ルウェルフェアと肉用牛生産システム，2013年に的評価がない自己判断であり，単に販売戦略としアニマルウェルフェアとブロイラー生産システムて使われていく可能性が懸念される。

に関する規約，2015年にはアニマルウェルフェア

申請者はこれまで全国の酪農家を訪問して乳牛と乳用牛生産システムに関する規約が制定されのアニマルウェルフェア評価法を開発し，酪農家

た。ISO（国際標準化機構）でもアニマルウェルの飼育管理を評価してきた２）。そして，その基準

フェアの技術仕様書の作成に関する検討を始めるを満たした農場からの生乳を使った牛乳の商品化など，国際機関においてアニマルウェルフェアにが行われている。しかしながら，養豚に関しては© The Ito Foundation

348

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

これまで評価が行われていない。

2015年から2016年の冬季に上記の農場を訪問し本研究の目的は，これまでの研究知見と現場で作成した肥育豚アニマルウェルフェア評価法を用の試験的評価から，日本型のアニマルウェルフェ

いて評価を行った。はじめに管理者に対し管理方

ア評価法を作成し，放牧養豚でそれを適用し評価法などを聞き取る15分ほどのアンケート調査を行することである。

い，その後，調査者のみで動物の状態や施設，設２．方備を評価する測定調査を行った。

法

2 . 1 肥育豚アニマルウェルフェア評価法の作３．結果と考察3.1

成肥育豚アニマルウェルフェア評価法

肥育豚の大規模で放牧養豚を行っている北海道

作成した評価法の項目一覧をTable１に示す。

のある養豚場において，畜産技術協会が発表して動物ベース：９，施設ベース：12，管理ベース：

いる豚のアニマルウェルフェア評価法 により，８項目で合計29項目となっている。すべての項目

アニマルウェルフェア調査を試行的に行い，基準に評価基準とチェック方法（評価者の測定の仕方が曖昧で評価を行いにくい項目や，不明確であっや調査頭数など）を別途作成している。

３）

た測定方法などを明らかにした。次に，それによ

3.2

評価結果

り見直す必要があると考えられた項目に関して，

動物ベースの得点率は３農場が100％であった

海外のアニマルウェルフェア評価法などからの基が，１農場は９項目中１項目のみの基準を満たし

準の引用や，研究知見を参考にして評価法の基準ておらず，88.9％であった。このように動物ベーを検討し，養豚場での追調査も実施した。それら

スは基準を満たしやすいことが認められたが，本の調査により評価法を完成させた。これを，これ研究で評価した農場はすべて放牧飼養であるた

以後「肥育豚アニマルウェルフェア評価法」とす

め，今後は一般的な豚舎での評価も必要である。
施 設 ベ ー ス の 得 点 率 は ，一 番 低 い 農 場 がる。
本評価法は動物の状態を調査する動物ベース，

58.3％，一番高い農場が83.3％となった。施設ベー施設や設備を調査する施設ベース，管理方法を調スの得点率の低い項目を順に列挙する（基準を満査する管理ベースに分けられており，それぞれのたしていない農場数）と，シェルター（４農場），

項目で基準を満たしていれば「○」，基準を満た給水器（３農場），給餌器（２農場），照度（１農

していなければ「×」をつける。各ベースにおい場），防疫設備（１農場），施設の不良（１農場）て全項目中に占める〇の割合で得点率（％）を計であった。全農場で満たしていなかった項目は算する。アニマルウェルフェア認証をするために「シェルター」で，シェルターの面積が不足しては各ベースすべてで80％を上回ることを条件と仮いた。２番目に基準を満たせなかった項目は「給定した。

水器の数」である。冬季には気温が低いため夏季

2 . 2 肥育豚アニマルウェルフェア評価法によのように水分を豚は必要とせず，放牧地では水たまりや湧水，雪などから水の摂取が可能であるとる評価
肥育豚を放牧飼養している北海道３農場および
関東１農場の合計４農場で行った。各農場の総飼養頭数は，892，24，26および108頭であった。

飼育者は考えており，放牧地での給水については重要視してないようであった。
管 理 ベ ー ス の 得 点 率 は ，一 番 低 い 農 場 が© The Ito Foundation

349

放牧養豚用アニマルウェルフェア評価法の開発
Table 1 Measures in animal welfare assessment for fattening pigs

Animal base

Hunger and Thirst

Discomfort

Pain,Injury or Disease Normal Behaviour

Fear and Distress

BCS

Panting

Wounds on body

Environmental

Flight response

Shiveringlamenessenrichment on

Huddling

behaviour

Cleanliness of body
Facility baseFeederShelter

Slatted floor

Space allowance

Drinker

Wallowing

Hygiene facilities

ProvidingIllumination

Housing for animals

environmental

Air quality

under treatment

enrichment

Failure of facilities
Management base Inspection andmaintenance of feeder

Inspectionand

Health check

maintenance of air

Teeth clipping

Handling

Inspectionandand heating facilities Tail docking
maintenance of drinker
Castration

62.5％，一番高い農場が87.5％となった。管理ベーていた。ニッパーを使用する場合は，根元から歯スの得点率の低い項目を順に列挙する（基準を満を切断する。アンケートの結果から，歯の根元かたしていない農場）と，順に健康状態の点検・記らの切断が日本では主流であり，「歯の先端のみ」

録（３農場），歯切り（２農場），断尾（１農場）の切除を基準にすると，現実的ではない可能性がであった。最も満たせていなかった項目は「健康ある。EU，米国，オーストラリアでは歯の先端状態の点検・記録」の基準であった。どの農場ものみを切除することが基準となっているが，今後毎日豚の健康状態は確認しているものの，記録をはどのような方法が正しく，豚にとってよい方法

行っておらず，また，掲示板や記録簿などを利用であるのかをより検討する必要がある。

して飼育者間で情報の共有をしていなかった。健認証基準の目安としたすべてのベースで80％以康状態を毎日記録することは豚の健康管理を行う

上とした場合，評価結果は１農場のみが認証できうえで重要であるため，飼育者にこれを推奨した

るという結果となった。２農場はそれぞれ施設

い。２番目に満たされにくかった項目は「歯切ベースが，１農場は管理ベースがそれを下回ったり」である。１農場は歯切りを行っている子豚をため，認証できないという結果となった。本評価導入しているため，基準を満たすことができな

法による認証はかなり高いレベルの基準と言えるかった。自農場で歯切りを行っている１農場は，であろう。

歯切りは，飼養管理上で問題が起こった場合のみ

本評価法には豚体の傷に関する評価項目を設定しか行っていないが，歯切りを行う際に根元からしているが，疾病自体を評価する項目は設定してニッパーで切断するということであった。基準はいない。EUで開発されたWelfare Quality５）では歯切りを行う際は「歯の先端のみ」の切断しか許疾病の項目が10項目あり，この点については今後容されていないため，結果は基準を満たせていな

獣医師と協力して研究を進める必要がある。

いということになった。「豚の飼養実態調査アン
ケート報告書」４）によると，歯切りを行っている

４．要約

農場において，ニッパーを使用している割合は約

世界的にアニマルウェルフェアに対する関心は95％であり，ほとんどの農場でニッパーを使用し急速に高まりつつある。豚のアニマルウェルフェ© The Ito Foundation

350

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

ア評価法は2011年に畜産技術協会が文献をもとにであろう。本評価法は動物，施設，管理の３つの作成したが養豚現場で評価したことはなく，実際ベースから多面的な評価が可能である。また，本に評価を試行してみると豚の多様な飼養管理に即評価法は基準に〇か×を付ける２項分類であるたしておらず，また認証のための評価法として用い

め，改善点がどこであるかを容易に見つけることることは難しいと考えられた。よって，本研究はができ，認証に使うことだけの利用ではなく，農畜産技術協会の肥育豚のアニマルウェルフェア評

場におけるアニマルウェルフェアの改善点を明ら

価法をもとに評価法を作成し，実際の放牧養豚場

かにすることができる。しかしながら，本評価法で評価することを目的とした。評価する養豚場はの今後の課題としては，疾病を評価する基準も作

将来的なアニマルウェルフェア認証を見据え，放成していくことがあげられる。

牧養豚場を対象とした。
作成した評価法の評価項目数は動物ベース８項
目，施設ベース12項目，管理ベース８項目の全29
項目となった。評価方法は基準を満たしているものには〇，そうでないものには×をつけ，認証のためには各ベースで得点率が８割以上であることを条件とした。
その評価法により冬季に４戸の放牧養豚場で調査した。その結果，４農場のうち，１農場のみがすべてのベースで８割を上回っていた。２農場は施設ベースが，１農場は管理ベースが８割を下回っていた。もしこの基準を認証基準とした場
合，１農場しか認証できないという結果となり，本評価法はかなり高いレベルの認証基準と言える

文献１） 公益社団法人畜産技術協会：アニマルウェルフェアの考え方に対応した豚の飼養管理指針，http://jlta.
lin.gr.jp/report/animalwelfare/shishin/pig.pdf, 2011.
２） Seo, T. : On-Farm Assessment of Animal
Welfare in Japanese Dairy Cattle, Journal of
Integrated Field Science, 8, 35～40, 2011.
３） 小針大助：アニマルウェルフェア評価法報告書豚のAW評価法，102～－125，公益社団法人畜産技術協会，東京，2011．
４） 公益社団法人畜産技術協会：豚の飼養管理実態調
査 http://jlta.lin.gr.jp/report/animalwelfare/H26/
factual_investigation_pig_h26.pdf, 2015.
５） Welfare QualityⓇ, Welfare QualityⓇ Assessment
protocol for Pigs（growing and finishing pigs）, In :Dalmau, A., Velarde, A., Scott, K., Edwards, S.,
Veissier, I., Keeling, L., Butterworth A （eds）,
Welfare Quality Ⓡ Consortium, Lelystad, theNetherlands, 2009.

© The Ito Foundation

351

効率的な家畜生産に資する生殖中枢メカニズムの解明
Elucidation of central mechanism controlling reproduction to improve
production efficiency of livestock

上野山

賀久

（名古屋大学大学院生命農学研究科）

Yoshihisa Uenoyama（Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University）

Kisspeptin encoded by Kiss1 gene is now considered to be a master regulator of
reproduction in mammals. To understand the mechanism regulating Kiss1/kisspeptin
expression is a promising strategy for the improvement of the production efficiency of livestockin order to meet an ever-increasing demand. The present study tried to generate targetedgene-floxed rats in order to uncover the mechanisms controlling Kiss1/kisspeptin expression
by using CRISPR/Cas9 gene editing. Expression vectors carrying Cas9 nuclease and a guideRNA were microinjected into a pronucleus of the zygotes obtained from superovulated female
rats. The zygotes were cultured overnight and then transferred into the oviductal ampulla ofpseudopregnant rats. The genome editing in the targeted gene locus was successfully detected
at the morula stage. The generation of targeted-gene-floxed animals is currently underway byusing the validated expression vectors in combination with targeting vectors including the 34bp loxP sequence.

１．目

ペプチンニューロンは，性腺刺激ホルモン放出ホ

的ルモン（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）

畜産物の需要は，開発途上国の人口の増加と富分泌を制御するマスターレギュレータと考えられ裕化により，世界中で今後ますます増加すると予て い る ３）。こ れ ま で の 研 究 か ら ，性 成 熟 期 の測されている１）。この需要の増加に見合う畜産物

GnRH分泌の高進や，泌乳期におけるGnRH分泌の供給を可能とする動物生産を実現するためにの停止は，キスペプチンをコードするKiss1遺伝

は，家畜をより一層効率的に繁殖させる必要があ

子の発現制御やキスペプチンの分泌制御を介してる。現実は，たとえば，乳用牛の初回受胎率が調節されていることが示唆されている４～６）。

50％以下と低く，近年の繁殖成績の低下傾向が大きな問題となっている 。

そこで本研究では，キスペプチンニューロンにおけるKiss1発現やキスペプチン分泌を制御する

２）

家畜を含むほ乳類の生殖機能は，脳により制御

メ カ ニ ズ ム を 解 明 す る た め に ，キ ス ペ プ チ ン

されている。とりわけ，視床下部に局在するキスニューロンに発現するＧタンパク質共役受容体の© The Ito Foundation

352

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

探索結果をもとにCRISPR/Cas9法により各受容体遺伝子のfloxedラットの作製を試みた。
２．方た。
交配が成功した雌ラットを同日午後にと殺し，
卵管灌流により受精卵を回収した。ヒアルロニ法

ダーゼを含むＭ２培地においてピペッティングに

CRISPR/Cas９法により，キスペプチンニューより卵丘細胞を除去した後，顕微鏡下において，

ロンに発現するＧタンパク質共役受容体をコード

受精卵の前核にCas9発現ベクターをマイクロイする遺伝子のfloxedラットを作成するため，候補

ンジェクションした。インジェクション後，卵子となるひとつのＧタンパク質共役受容体遺伝子のをＭ16培地に移し，炭酸ガス培養装置で１晩培養

５ ʼ 上 流 お よ び ３ ʼ 下 流 に 存 在 す る Proto-spacer

した。翌日，卵子の発生状況を確認した後，偽妊

adjacent motif（PAM）ド メ イ ン（5ʼ-NGG-3ʼ）を娠雌ラットの卵管膨大部に移植した。

含む23bpのDNA配列それぞれ20個を選択した。

５ʼ上流域の標的候補配列であるseq１，seq２

各DNA配列について，３塩基以内のミスマッチ

を含む２種類のCas9発現ベクターをマイクロイ

を 含 む ラ ッ ト ゲ ノ ム 配 列 の 数 を GGGenome

ンジェクションした卵子を，移植３日後，卵管灌（https://gggenome.dbcls.jp/ja/, last accessed

流により回収し，桑実期胚に発生した卵子の数をMarch 2016）により解析した後，ミスマッチ数

調べた後に，各桑実期胚のゲノムDNAを鋳型との少ないDNA配列をオフターゲット効果が少な

してPCRおよびDNA多型検出法により遺伝子型

いことが期待できる標的候補配列として５ʼ上流を解析し，Cas９ nucleaseによるゲノム編集の効

および３ʼ下流にそれぞれふたつずつ選抜した率を検討した。３ʼ下流域の標的候補配列である（Fig.１）。標的候補配列のいずれかひとつを含む

seq３，seq４を含む２種類のCas9発現ベクター

guide RNA と Cas9 nuclease を 共 発 現 す る ベ クをマイクロインジェクションした卵子について

ター（Cas９発現ベクター）をそれぞれ作製した。

も，同様の方法によりCas9 nucleaseによるゲノ

Wistar-Imamichi系統の雌ラットを用い，腟ス
メアにより発情周期を確認し，発情休止期第１日の 午 前 11 時 に ，ウ マ 絨 毛 性 性 腺 刺 激 ホ ル モ ン

ム編集の効率を検討した。
３．結果と考察（150IU/㎏）を，その48時間後にヒト絨毛性性腺

５ʼ上流域の標的候補配列であるseq1，seq2を

刺 激 ホ ル モ ン（human chorionic gonadotropin,含む２種類のCas9ベクターを54個の受精卵にマ

hCG；75 IU/㎏）を腹腔内投与し，過剰排卵を誘イクロインジェクションして，１晩培養した後起した。hCG投与後，同系統の雄ラットと同居さに，15個の２細胞期胚と，14個の健常な１細胞期

せ，翌日，腟栓の有無により交配の成否を確認し胚を得た。それらを１匹の偽妊娠ラットに移植し

seq１

seq２

seq３

seq４

Targeted gene locus
Fig. 1 Schematic illustration of the locations of four guide RNA candidates（arrows）in a targeted

gene locus in order to generate the targeted-gene-floxed animals.

© The Ito Foundation効率的な家畜生産に資する生殖中枢メカニズムの解明た３日後に，13個の健常な桑実期胚を回収した。
各桑実期胚のゲノムDNAを鋳型として，PCRお

４．要

353

約

よびDNA多型検出法により遺伝子型を解析した

ほ乳類の生殖中枢であるキスペプチンニューロ

結果，３個の桑実期胚において，seq１およびseq

ンに発現するＧタンパク質共役受容体のノックア

２のふたつの標的候補配列の両方でゲノム編集がウトラットの作製をCRISPR/Cas９法により試み生じ，その間の約230bpのDNA配列の欠損を認めた。桑実期胚において，標的遺伝子座におけるゲた。標的候補配列のいずれか一方においてのみゲノム編集の成否を確認することに成功した。標的

ノム編集の生じた桑実期胚は認められなかった。

遺伝子座にloxP配列を挿入したfloxedラットの作

この結果から，５ʼ上流域のふたつの標的候補配製を現在継続中である。

列は20％強の確率でゲノム編集が生じることが示された。
３ʼ下流域の標的候補配であるseq３，seq４を含む２種類のCas９ベクターを184個の受精卵にマイクロインジェクションして，１晩培養した後に，114個の２細胞期胚と，24個の健常な１細胞期胚を得た。それらを２匹の偽妊娠ラットに移植した３日後に８個の健常な桑実期胚を回収した。
PCRおよびDNA多型検出法により遺伝子型を解析した結果，１個の桑実期胚においてseq３近傍で，別の１個の桑実胚においてseq３およびseq４の両方の近傍でゲノム編集を認めた。この結果か
ら，効率は低いものの，３ʼ下流域のふたつの標的候補配列においてもゲノム編集が生じることが示された。
上記の結果をもとに，５ʼ上流域の標的候補配列であるseq２を含むCas９発現ベクター，３ʼ下流域の標的候補配列であるseq４を含むCas９発
現ベクター，loxP配列と標的候補配列seq２ある
いはseq４の近傍と相同なホモロジーアームを有する１本鎖DNAであるターゲッティングベク
ターを，受精卵にマイクロインジェクションし，
キスペプチンニューロンに発現するＧタンパク質文
献１） FAO：World Livestock 2011-Livestock in foodsecurity. Rome, FAO, 2011.
２） Butler, W. R. : Review : effect of protein nutrition
on ovarian and uterine physiology in dairy cattle, J
Dairy Sci, 81, 2533～2539, 1998.
３） Uenoyama, Y., Nakamura, S., Hayakawa, Y.,
Ikegami, K., Watanabe, Y., Deura, C., Minabe, S.,
Tomikawa, J., Goto, T., Ieda, N., Inoue, N., Sanbo, M.,
Tamura, C., Hirabayashi, M., Maeda, K. I.,
Tsukamura, H. : Lack of pulse and surge modes andglutamatergic stimulation of LH release in Kiss1
knockout rats, J Neuroendocrinol, 27, 187～197, 2015.
４） Yamada, S., Uenoyama, Y., Deura, C., Minabe, S.,
Naniwa, Y., Iwata, K., Kawata, M., Maeda, K. I.,
Tsukamura, H. : Oestrogen-Dependent Suppressionof Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion andKiss1 mRNA Expression in the Arcuate Nucleus
During Late Lactation in Rats, J Neuroendocrinol,
24, 1234～1242, 2012.
５） Takase, K., Uenoyama, Y., Inoue, N., Matsui, H.,
Yamada, S., Shimizu, M., Homma, T., Tomikawa, J.,
Kanda, S., Matsumoto, H., Oka, Y., Tsukamura, H.,
Maeda, K. I. : Possible role of oestrogen in pubertal
increase of Kiss1/kisspeptin expression in discrete
hypothalamic areas of female rats, J
Neuroendocrinol, 21, 527～537, 2009.
６） Yamada, S., Uenoyama, Y., Kinoshita, M., Iwata,K., Takase, K., Matsui, H., Adachi, S., Inoue, K.,
Maeda, K. I., Tsukamura, H. : Inhibition of Metastin（Kisspeptin-54）-GPR 54 Signaling in the Arcuate
Nucleus-Median Eminence Region during Lactationin Rats, Endocrinology, 148, 2226～2232, 2007.

共役受容体の遺伝子座の５ʼ上流域および３ʼ下流域に，loxP配列を挿入したfloxedラットの作製を現在継続中である。

© The Ito Foundation

354

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性
家畜飼料の開発
Bactericidal effect of multi-drug resistance bacteria using lactic acidbacteria and development of functional domestic animal fodder

木

下

英

樹・石

川

潤

一＊

（東海大学農学部バイオサイエンス学科，＊宮城大学大学院食産業学研究科）

Hideki Kinoshita and Junichi Ishikawa＊（Department of Bioscience, School of Agriculture, Tokai University, ＊Graduate School of Food, Agricultural and Environmental
Sciences, Miyagi University）

Recently, it has emerged a number of multi-drug resistance bacteria through the use of
inappropriate antibiotics, which have been feared the spread of infection to humans. On theother hand, lactic acid bacteria（LAB）are known as useful microorganisms. Especially, LAB
are found in traditional fermented foods, and have been widely applied to food industry.
Bacteriocins from LAB, for example, nisin A is known to be antimicrobial by forming pores in
the cell membrane of Gram-positive bacteria. In this study, we examined whether thebacteriocins produced by LAB can suppress drug resistance bacteria effectively.
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM1002T and 13 strains of drug resistancebacteria were used as the indicator bacteria for anti-bacterial assay. The culture supernatants
containing antibacterial substance from 27 LAB strains that selected from 944 of LAB strains
were used as samples for antibacterial assay. Characterization of samples were investigatedafter pH adjustment at 6.2, protease treatment at 37℃ for 18 h, and heat treatment at 121℃ for
15 min. The antibacterial activities were tested against 13 strains having potential drug
resistance, and heat-map dendrogram was constructed. SDS-PAGE and in situ anti-bacterial
assay were performed after crude purification using reverse-phase chromatography.
In the pH-neutralization and heat treatments, the antimicrobial activity of eachsupernatant was grouped by pH-dependence and heat resistance. Many samples showed antibacterial activities against multi-drug resistance bacteria. Especially, the culture supernatantof Lactococcus lactis MBR916 showed higher protease stability and anti-bacterial activity
against all multi-drug resistance bacteria without Bacillus sp. R11. The antimicrobial spectrumof the MBR916 bacteriocin suggests Lc. lactis MBR916 produces a nisin-like bacteriocin. The
molecular weight of MBR916 bacteriocin, however, was speculated at 3.7 kDa by SDS-PAGE
and in situ anti-bacterial assay that was different from the nisin A standard. This suggeststhat this bacteriocin may be novel.

© The Ito Foundation

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発

１．目

355

本的に細胞膜に孔を形成することによって殺菌的的に働くため，耐性菌が出現しづらいという特徴が

現在，病院での抗菌薬の過度の処方および家畜ある。そこで本研究ではこれまでに分離した多剤

餌への日常的な使用により，抗菌薬に耐性を示す

耐性菌を指標菌として用い，バクテリオシンによ菌が多く出現している。中でも複数の抗菌薬に耐る殺菌効果を検討するとともに，新奇性が期待さ性を示す多剤耐性菌はヒトへの感染とその拡大がれるバクテリオシンについての特徴付けを行った。

危惧されている１，２）。2010年にWHOが各国政府に対し多剤耐性菌の対策推進を呼びかけたこともあ

２．方法

り，我が国においても使用する抗菌薬の種類を減2.1

使用菌株と培養条件

らすなど，家畜への抗菌薬使用について見直しがバクテリオシン産生株は，宮城県産業技術総合センター保有の乳酸菌944菌株から選抜した27菌進められている。
一方，乳酸菌には様々な健康保健効果が知られ株を用いた。コントロールとしてナイシンＡ産生ており，一部，抗生物質の代替品としての利用が株であるLactococcus lactis NBRC12007（以下検討されている 。しかしながら，これらの試み

NBRC12007株）およびガセリシンＡ産生株であるは一定の効果は見られるものの，試験的な試みでLactobacillus gasseri LA39（以 下 LA39 株）を 用あり，まだまだ子豚等の幼若動物については抗菌

いた。

３）

薬に頼らざるを得ないのが現状である。我々は，指標菌には，乳業用乳酸菌であるLb. delbrueckii

昨年までの研究で900菌株以上の乳酸菌からバクsubsp. bulgaricus JCM1002 Ｔ （以 下 JCM1002 株）

テリオシン産生株をスクリーニングし，多剤耐性および以前分離した薬剤耐性菌を含む13菌株を用菌に対しても抗菌作用を示すバクテリオシンが存いた（Table１）。

在することを明らかにした。バクテリオシンは基バ ク テ リ オ シ ン 産 生 株 お よ び JCM1002 株 はTable 1 The indicator bacteria for bacteriocin assay used in this study
StrainSpecies

SourceAntibiotic resistance

JCM1002Ｔ
MYU562
MYU564
MYU572A
MYU598
MYU599A
MYU599B
MYU636
MYU644A
MYU644B
MYU677

Lactobacillus delbrueckii subsp. blugaricus
Not identified（Staphyloccci）
Lactobacillus sakei
Enterococcus faecalis
Staphylococcus warneri
Bacillus sp.
Bacillus sp.
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus warneri
Staphylococcus warneri
Staphylococcus epidermidis

Milk
Cucumber Karashizuke
Cucumber Karashizuke
Wasabizuke
Kimchi
Kimchi
KimchiLettuce
CabbageCabbageTomatoR08

Cellulosimicrobium sp.

Feces（swine）

R11

Bacillus sp.

Feces（swine）

R18

Lactococcus lactis

Feces（swine）―
GM, KM, ABPCSXT, VCM
RFP, AMK, GM, KM，
KM
CPFX, RFP, EM, CP, TC, AMK, GM, KM, SXT
CPFX, RFP, EM, CP, TC, AMK, GM, KM, SXT
Undefined
Undefined
RFP（induction）
EM, SXTCPFX, AMK, IPM（Screened by antibiotic medium）
CPFX, AMK, IPM（Screened by antibiotic medium）
CPFX, AMK, IPM（Screened by antibiotic medium）

GM ; gentamicin, KM ; kanamycin, ABPC ; ampicillin, SXT ; trimethoprim/sulfamethoxazole, VCM ; vancomycin, RFP ; rifampicin
AMK ; amikacin, CPFX ; ciprofloxacin, EM ; erythromycin, CP ; chloramphenicol, TC ; tetracycline, IPM ; imipenem© The Ito Foundation

356

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

MRS broth（Difco Laboratories, Detroit, MI,

し，各乳酸菌上清について（ｒ－μsup）/σsup をUSA）を用い，30℃または37℃で24時間，静置

求め，得られた値についてウォード法によるクラ培養した。JCM1002株を除く指標菌は，SCD培

スタリング解析を行い，乳酸菌上清と指標菌の地（日水製薬株式会社，東京）を用い，37℃で18

ヒートマップ・デンドログラムを作成した。

時間静置培養した。
2.2

2.5

抗菌活性試験

バクテリオシンの簡易精製

新奇性が高いと推測されるLc. lactis MBR916

抗菌活性試験は，ペニシリンカップ法によりのバクテリオシンの簡易精製を行った。まず，余行った。指標菌を0.25％となるよう接種した0.75％

計な培地成分を除くためにSCD培地（日水製薬

MRS agar（Difco Laboratories, Detroit, MI,株式会社，東京）をMWCO3500の透析膜で透析

USA）を作成し，その上にペニシリンカップ（外し，透析外液を用いて菌の培養を行った。遠心分

径８㎜，内径６㎜）を静置した。次にペニシリン

離（3000 rpm, 15 min）した後，得られた上清をカップの中に培養上清100μlを添加し，37℃で一逆相カラムクロマトグラフィーに供した。カラム

晩培養後，阻止円の直径（㎜）を測定した。また，は ， Bond Elut C18 （C18 ; Agilent technologies,

コントロールとしてナイシンＡ（100U, Sigma-

Santa Clara, CA, USA）およびOasis HLB（HLB ;Aldorich, St. Louis, MO, USA）も 同 様 に 試 験 しWaters, Milford, MA, USA）を使用した。まず，た。

上清をＣ18カラムに通過させた後，蒸留水および

2.3

バクテリオシンの特徴付け

30％イソプロピルアルコール（IPA；和光純薬工

バクテリオシンの特徴付けは，JCM1002株を業株式会社，大阪）で洗浄後，40％，50％および指標菌にして行った。培養上清を下記のとおり処60％IPAで溶出した。溶出液を遠心真空乾燥機で理した後，抗菌活性試験を行った。中性化処理で

乾 燥 さ せ ，10 mM ク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液

はNaOHを用いてpHを6.2に調整した。プロテアー（pH 4.4）に再溶解し，HLBカラムに供した。次ゼ処理では，アクチナーゼＥ（科研製薬株式会

いで，蒸留水，IPA，アセトニトリル（AcCN；社，東京）を10 mM CaCl2 含有20 mM Tris-HCl

和光純薬工業株式会社，大阪）を用いて10％ずつ

緩衝液（pH 8.0）に２㎎/mlで溶解し，培養上清の濃度勾配（10％～90％）でステップワイズ溶出と等量混合して37℃で18時間作用させた。熱耐性

した。活性が確認できたものについて，SDS-

試験では121℃，15分間のオートクレーブ処理を

PAGEおよびin situ抗菌活性試験を行った。

行った。結果は阻止円の直径（㎜）で示した。
2.4

ヒートマップ・デンドログラムの作成

2 . 6 SDS-PAGEおよびin situ抗菌活性試験によるバクテリオシン分子量の推定

乳酸菌上清の抗菌活性について，群間比較を行

簡易精製により得られた抽出物のうち，抗菌活う目的でクラスタリング解析に供した。JCM1002

性が認められたサンプル10 mlを乾燥し，50μlの

株は，未処理での結果に加え，熱処理，pH処理，SDS化試薬で処理後，トリシンを使用したSDS-

プロテアーゼ処理した培養上清での結果も使用しPAGEに供した。各サンプルは10μlずつウェルにた。解析プログラムは，R（Ver. 3.1.2）を使用し添加し（ナイシンＡスタンダードは５μl），２枚た。抗菌活性試験によって得られた阻止円直径をのゲルに対して40 mA印加し，280分間電気泳動

ｒ，乳酸菌上清ごとの阻止円直径の平均値μsup，

し た 。マ ー カ ー は ，Amersham ECL Rainbow

乳酸菌上清ごとの阻止円直径の標準偏差をσsupとMolecular Weight Markers（GEHealthcare,© The Ito Foundation

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発

357

Little Chalfont, England）を使用した。泳動終了見られた（データ示さず）。阻止円の不鮮明さは

後，２枚のうち１枚のゲルはCBB染色し，もうLA39株の培養上清（ガセリシンＡ）と類似して

１枚は，JCM1002株を添加した軟寒天培地上におり，特徴も類似していることからMBR916株の静置し，37℃で一晩培養した（in situ抗菌活性試

バクテリオシンは，環状化バクテリオシンである験）。培養後，阻止帯からLc. lactis MBR916のバ可能性も示された。

クテリオシンの分子量を推定した。

Table３には，乳酸菌培養上清の耐性菌群への抗菌効果について示した。コントロールとして用い

３．結果と考察たナイシンＡはグラム陽性菌には有効であるが，Table２には，様々な条件で培養上清を処理しEnterococcus faecalis MYU572AやBacillus sp.

た後のJCM1002株に対する生育阻止円の直径を

R11のようにほとんど効かない菌もあった。特徴示した。培養上清は大きく，中性化処理で活性が的なものとしてMBR738株の培養上清は，他の培減少しなかったグループと活性が激減したグルー

養上清と比較して，Lc. lactis R18に対する抗菌

プに分けられた。活性が減少しなかったグループ

活性が著しく高かった。それ以外にも，ナイシン

は，プロテアーゼで活性が消失し，121℃，15分

Ａと比較して抗菌活性が高い培養上清が多く見ら

間の加熱処理でも強い活性を維持するという共通れた。また，MBR325株のバクテリオシンは，活点が見られた。これはナイシンＡ産生株である

性自体は微弱であったが供試したすべての耐性菌

NBRC12007株の培養上清と同じ挙動であった。

に有効であった。また，複数の培養上清を組み合本グループは，ほとんどの株がLc. lactisである

わせることで幅広い多剤耐性菌の殺菌に有効であことから，ナイシン様抗菌物質を産生しているこる可能性が示された。

とが強く示唆された。一方，中性化により活性のFig.１には，阻止円の直径により作成したヒー消失が認められたグループは，さらに耐熱性のペ

トマップ・デンドログラムを示した。デンドログ

プチド性グループ，熱感受性のペプチド性グルーラムにより，乳酸菌の培養上清は２つの大きなク

プ ，そ の 他 に 分 け ら れ た 。興 味 深 い こ と にラスターに分けられ，ナイシン様バクテリオシン

MBR916株は，どのグループにも属さず，すべてを産生していると思われる上清が同じクラスターの処理（pH，プロテアーゼ，熱）の影響を受けを形成した。本クラスターは，乳酸菌群への抗菌なかった。同様の特徴を示したサンプルは，コン活性が強い傾向にあることが示唆され，MBR916

トロールとして用いた市販の精製ナイシンＡとガ株も本クラスターに分類された。一方，中性化にセリシンＡ産生株（LA39株）の培養上清のみでより抗菌活性が低下した上清のクラスターは，あった。ナイシンＡ産生株のNBRC12007株はプ

Bacillus属やStaphylococcus属への抗菌活性が高

ロテアーゼ処理で活性が完全に消失したことかい傾向が見られ，これらの乳酸菌により産生されら，市販の精製されたナイシンＡは一部不溶化しる抗菌物質は，ナイシン様抗菌物質とは異なるこてプロテアーゼが作用しにくくなっている可能性とが示唆された。

が 示 唆 さ れ た 。ま た ，精 製 ナ イ シ ン Ａ お よ び

MBR916株のバクテリオシンは，クラスター解

NBRC12007株の培養上清の阻止円は境界面がク

析ではナイシン様バクテリオシンに分類されたリアであるのに対し，MBR916株のバクテリオシ

が，その培養上清は，NBRC12007株の培養上清ンでは境界面が不鮮明であるという特徴の違いもと比較して８倍の活性値を示したこと（データ示© The Ito Foundation

© The Ito Foundation
seawaterseawaterseawater

not identified（coccoid lactic acid bacteria）

not identified（coccoid lactic acid bacteria）

Lactobacillus zeae

MBR921

MBR922

MBR756raw milk

seawaterhuckleberry

raw milk

not identified（coccoid lactic acid bacteria）

Lactococcus lactis

MBR837raw milk

MBR920Lactococcus lactis

MBR832

raw milk

Lactococcus lactis

Lactococcus lactis

MBR826flower（Gentiana triflora）

flower（Gentiana triflora）

not identified（coccoid lactic acid bacteria）

Lactococcus lactis

MBR739

MBR919Lactococcus lactis

MBR738flower（Gentiana triflora）

seawaterseawaterseawaterflower（Hosta sieboldii）

flower（Hosta sieboldii）

flower（Hosta sieboldii）

flower（Hosta sieboldii）

flower（Hosta sieboldii）

MBR916

not identified（coccoid lactic acid bacteria）

not identified（coccoid lactic acid bacteria）

MBR708

not identified（coccoid lactic acid bacteria）

not identified（coccoid lactic acid bacteria）

MBR707

MBR711

Lactococcus lactis

MBR656

MBR736

Lactococcus lactis

MBR655

Leuconostoc lactis

Lactococcus lactis

MBR653

Leuconostoc sp.

Lactococcus lactis

MBR652

MBR710spring water

Lactococcus lactis

MBR648

8

20

21

22.5

23

23.5

24

25

24

23.5

24.5

16.5

18

18

18

20.5

22

25.5

25.5

25.5

25

25

17

22

14

24

21

18

25

28

0

11

0

8

9.5

21.5

21

22.5

22.5

21.5

23

6

0

0

0

9

11.5

22.5

22

19.5

23.5

24

12.5

13

0

22

23

18

25.5

28

Non-treatment
pH adjusted（acidic condition）
at 6.2

0

0

6

0

0

22

24

28

23

24

24

8

8

8

8

12

17

24

24

23

23

24

8

13

19

23

23

14

19.5

22

Non-proteasetreatment

0

0

0

0

0

20

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

6

8

8

0

6

0

0

0

0

0

13

0

21.5

13

6

10.5

0

0

29

27

24

23

23

22.5

6

10

0

0

9.5

14.5

22

22

22

21.5

22

8

13

0

20.5

20.5

18

22.5

26

Protease treatment Heat treatment（Actinase E） （121℃，15 min）

平成27年度MBR709spring water

Lactococcus lactis

MBR514nasuzuke

eggplant（raw）

not identified（coccoid lactic acid bacteria）

MBR479sake bluwery
meat processing plant

Lactococcus lactis

cut pine apple

not identified（coccoid lactic acid bacteria）

MBR21

―

MBR325

Lactococcus lactis

LA39

MBR286

Lactococcus lactis（Nisin A producer）

Lactobacillus gasseri（Gassserisin A producer）

NBRC12007―

Saurce―SpeciesNisin A（100 U） ―SampleTable 2 Anti-bacterial assay for culture supernatants of selected LAB against Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus JCM1002T after pH-, protease- and heat-treatments358
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

© The Ito Foundation

NT

10

10

10

9

9

6

9

12

10.5

11

10

10

9

9

10

10

10

13

10.5

NT

MBR653

MBR655

MBR656

MBR707

MBR708

MBR709

MBR710

MBR711

MBR736

MBR738

MBR739

MBR826

MBR832

MBR837

MBR916

MBR919

MBR920

MBR921

MBR922± : weak activity

NT : not tested

MBR756

0

11

MBR652

6

8

0

0

6

10

8

8

8

9.5

0

8

6

6

0

0

8

6

6

9

10

9

6

10

MBR4796

6

MBR648

10.5

MBR325

6

6

MYU564

MBR51410

9.5

MBR286

10.5

8

MYU562

MBR21

Nisin A（100U）

Sample

0

0

0

0

0

10

9.5

9

10

9

9.5

0

0

0

0

0

9.5

9.5

9.5

9.5

10.5

10

0

0

8

9.5

10.5

0

MYU572A

NT

8

8

6

7

8

8

8

8

8

8

8

8

6

6

0

6

8

8

8

8

8

6

8

6

8

8

8

MYU598

NT

6

9

6

6

6

6

8

6

6

6

6

6

6

6

0

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

MYU599B

10

0

11.5

0

0

10.5

8

8

6

6

8

6

10

6

6

0

0

8

8

8

6

8

6

6

6

6

6

6

MYU599C

NT

0

9.5

6

6

8

10

10

10

10.5

11.5

8

11

8

8

8

9

12

12

12

12

12

8

6

8

11

11

8

MYU636

NT

8

11

6

8

8

6

6

6

6

6

8

9.5

8

8

0

6

8

8

8

6

8

8

8

6

6

6

8

MYU644A

Strain No. of the indicator bacteria

Table 3 Anti-bacterial assay for culture supernatants of selected LAB against the drug-resistance bacteria

NT

6

10.5

6

6

8

6

6

6

6

6

6

10

6

6

0

6

6

8

8

6

6

6

6

6

0

0

9

MYU644B

NT

0

10

0

0

6

9

9

9

9

10

0

9

8

8

0

0

10

9

9

10

9

8

8

6

8.5

9

9.5

MYU677A

19

12

21.5

11

11

22.5

19

19

19

21

21.5

13

18.5

13

13

15

14

21.5

21

22

21.5

23

23

14

6

20

21

16.5

Ｒ08

0

0

±

0

0

0

0

0

0

0

0

0

±

0

0

±

0

0

0

0

0

0

±

±

±

0

0

±

Ｒ11

8

8

8

8

8

13

8.5

9

9

14

24

6

8

8

8

8

14

14

13.5

14.5

13.5

14

8

8.5

8

13.5

14

8

Ｒ18

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発

359

360

平成27年度strong

R11

MYU677A

MYU564

MYU636

R08

MYU572A

JCM1002-Protease

JCM1002-pH

JCM1002-Heat

R18

JCM1002

MYU644B

MYU599C

MYU562

MYU644A

MYU598

MYU599B

MBR710
MBR709
MBR325
MBR514
MBR479
MBR921
MBR711
MBR920
MBR919
MBR922
MBR736
MBR707
MBR708
MBR837
MBR826
MBR832
MBRC12007
LA39
MBR656
MBR648
MBR655
MBR653
MBR739
MBR652
MBR916
MBR738
MBR286
MBR21
NisinA

Culture supernatantweak

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Indicator bacteria
Fig. 1 Heat-map dendrogram in the anti-bacterial assay against drug-resistance bacteria
JCM1002 : using an untreated sample, JCM1002-Heat, pH or Protease : using a heat－, pH－ or protease-treated sample, respectively.

さず），前述したように阻止円の特徴が異なるこンの阻止円の大きさはナイシンＡ（10 ㎎/ml，２μlと，抗菌スペクトルが異なることから非常に特徴添加）より大きかったが，SDS-PAGEにおいて明的なバクテリオシンである可能性が示唆された。

確なバンドを得ることができなかった（Fig.２A）。

そのため，本バクテリオシンを簡易精製しSDS-

これはナイシンＡに比べて活性値が非常に大きい

PAGEおよびin situ抗菌活性試験にて分子量の推

か，芳香族アミノ酸が少なくCBBでは染色され定を試みた（Fig.２）。その結果，70－90％IPA抽にくいことが考えられた。本バクテリオシンは銀出物において生育阻止円が見られた（Fig.２B）。

染色でも染色されなかったことから，非常に少量

MBR916株のバクテリオシンは，ナイシンＡ（3.4で強い活性を示す可能性が高いと考えれた。Lc.

kDa）より分子量が大きく約3.7kDaを示した。分lactisが産生するバクテリオシンはナイシンＡの子量については構造により泳動位置が大きく変化

ほか，ナイシンＺ，ナイシンＱ，ラクティシン

するため（例えば環状構造をとっている場合は実481，ラクトサイクリシンＱ，ラクトコッシンＱ際の分子量より小さい位置にバンドが現れる），など様々なものが報告されている４，５）。MBR916

今後，正確な分子量についてはTOF-MS解析で株について，既知の12種類のプライマーペアにて決定していく予定である。また，本バクテリオシ

遺伝子の検出を試みたがいずれのプライマーペア© The Ito Foundation

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発

A

361

B
SDS-PAGE

In situ anti-bacterial assay

M 1 2 3 4 5 M 6 ７ 8 9 10 11 M

M 1 2 3 4 5 M 6 ７ 8 9 10 11 M

Fig. 2 SDS-PAGE（A) and in situ anti-bacterial assay（B) after column chromatography
M : molecular weight marker, 1 : the permeate of HLB column, 2 : water and 10-20％ IPA extract, 3 : 30％ IPA extract, 4 : 40-60％
IPA extract, 5 : nisin A standard（10 mg/ml）,6 : 70-90％ IPA extract, 7 : 30 ％ AcCN extract, 8 : 60％ AcCN extract, 9 : 90％ AcCN
extract, 10 : MeOH extract, 11 : 40-60％ IPA extract after reverse-phase chromatography.
The arrows indicate clear zones.

でも増幅は確認できなかった（データ示さず）。

性を示す27菌株についてJCM1002株を指標菌とこれらのことからMBR916株のバクテリオシンはして，pH中性化処理，プロテアーゼ処理，熱処新奇バクテリオシンである可能性が示唆された。

理を行った後抗菌性を試験した。熱および中性化

現在，本バクテリオシンの完全精製を試みてお処理により，各上清の抗菌活性は熱耐性およびり，アミノ酸の一次構造等を決定し，バクテリオ

pH依存性によってグループ化できた。また，プシンの同定を行う予定である。

ロテアーゼ試験により，Lc. lactis MBR916株の本研究では，多剤耐性菌を乳酸菌バクテリオシ

培養上清が高いプロテアーゼ耐性を示した。本上ン に よ り 殺 菌 で き る 可 能 性 が 示 さ れ た 。特 に清は，Bacillus sp. R11を除きすべての薬剤耐性

MBR916株のバクテリオシンは，抗菌スペクトル菌に対して抗菌活性を示した。MBR916株のバクが広く，pH，プロテアーゼ，熱安定性も非常に

テリオシンは，抗菌活性スペクトルを比較する

高いため，機能性家畜飼料の開発へと繋がる有用と，ナイシン様バクテリオシンであることが推察なバクテリオシンである可能性が示された。現在されたが，推定された分子量は，ナイシンＡと比T-RFLPを用いた菌叢解析を行っており，実際に較してわずかに高分子量であったことから新奇バ

バクテリオシンが豚糞便中で多剤耐性菌を効果的

クテリオシンである可能性も示唆された。今後，に抑えることが可能かを検証している。

アミノ酸の一次構造を決定し，遺伝子の解析を行

４．要

う予定である。

約

本研究において，乳酸菌のバクテリオシンを用

近年，多量の抗生物質の使用により多剤耐性菌

いた多剤耐性菌の殺菌の可能性が示された。現が数多く出現しており，ヒトへの感染拡大が危惧

在，応用研究として豚糞便を用いたバクテリオシ

されている。そこで抗生物質に代わり，安全性のンでの多剤耐性菌殺菌効果の検証を進めており，高い乳酸菌のバクテリオシンを使用して，多剤耐多剤耐性菌を抑える家畜用の機能性飼料開発が期性菌のリスクを低減できないかと考えた。昨年ま待される。

での研究で944菌株の乳酸菌から選抜した抗菌活© The Ito Foundation

362

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

文献１） Tsuji, A., Kobayashi, I., Oguri, T., Inoue, M.,
Yabuuchi, E., Goto, S. : J Infect Chemother, 11, 64～
70, 2005.
２） Hirakata, Y., Yamaguchi, T., Nakano, M.,
Izumikawa, K., Mine, M., Aoki, S., Kondoh, A.,
Matsuda, J., Hirayama, M., Yanagihara, K., Miyazaki,Y., Tomono, K., Yamada, Y., Kamihira, S., Kohno, S. :Clin Infect Dis, 37, 26～32, 2003.

３） Suda, Y., Villena, J., Takahashi, Y., Hosoya, S.,
Tomosada, Y., Tsukida, K., Shimazu, T., Aso, H.,
Tohno, M., Ishida, M., Makino, S., Ikegami, S.,
Kitazawa, H. : BMC Immunol, 15, 24～41, 2014.
４） 日本乳酸菌学会編：乳酸菌とビフィズス菌のサイ
エンス，初版，309～324，京都大学学術出版会，京都，
2010.
５） 石橋直樹，善藤威史，園元謙二：日本乳酸菌学会
誌，22巻, 38～48, 2011.

© The Ito Foundation

363

黒毛和種子牛における呼吸器病の血清亜鉛濃度および亜鉛投与による臨床的な症状改善効果の検討
Serum zinc value of respiratory disease calves in Japanese Black andeffect of supplemental zinc in Japanese Black calves against clinicalrespiratory diseases

乙丸

孝之介・窪田力・米重隆一＊・時森麻紀子＊（鹿児島大学共同獣医学部，＊北薩農業共済組合）

Konosuke Otomaru, Chikara Kubota, Ryuichi Yonesige＊ and Makiko Tokimori＊（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, ＊Hokusatsu Agricultural Mutual Aid Associations）

Respiratory disease occurs in all species of mammals including cattle and human.
Respiratory disease is most commonly observed in calves, and it causes high economic losses.
Zinc（Zn）is essential micronutrient in cattle diets. They are also essential antioxidants thatplay an important defensive role in the prevention of free radical induced damage to tissues formaintaining the health. In human, it has been reported that Zn has stimulatory effects on
immunity, and those levels in blood are severely decreased with respiratory diseases. In cattle,
mastitis condition decreases the serum Zn. However, alterations of Zn levels in calves withrespiratory symptoms have not been reported. Therefore, This study was conducted todetermine serum biochemical values in Japanese Black steer calves with respiratory symptoms
at one ordinary farm in Kagoshima Prefecture, Japan. Ten Japanese Black calves withrespiratory symptoms（respiratory group; rectal temperature ≧ 39.7℃, with symptoms ofnasal discharge and coughing）, and ten clinically healthy calves（control group）were used inthis study. The following biochemical parameters were determined using a autoanalyzer: total
protein（TP）, albumin（Alb）, globulin（Glb）, Alb/Glb（A/G）ratio, urea nitrogen（UN）,
creatinine（Cre）, total cholesterol（T-Cho）, triglyceride（TG）, nonesterified fatty acids（NEFA）, beta-hydroxybutyrate（βHB）, aspartate aminotransferase （AST）, γ-glutamyltransferase（GGT）, alkaline phosphatase（ALP）, creatine kinase（CK）, calcium（Ca）,
inorganic phosphorus（iP）,magnesium（Mg）and Zn. The mean concentration of the serum Zn
in the respiratory group were significantly lower than those in the control group（P＜0.01）.
The other items were not significantly different between the two groups. These results
suggested that the serum Zn values in calves with respiratory symptoms might be lower thanclinically healthy calves due to consumption for inflammation.

１．目

である１，２）。呼吸器病は牛において，もっとも頻的繁に起こる病気の１つであり，重要な生産性阻害

呼吸器病は，すべての哺乳動物にみられる疾病

要因となっている１）。亜鉛は牛において必須の微© The Ito Foundation

364

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

量ミネラルであり３），抗酸化物質として重要な役

表１ 給与飼料中の成分（乾物中）割を担っている 。ヒトにおいて，亜鉛は免疫の

粗タンパク

（％）

13.7

可消化養分総量（％）

66.4

吸器病を呈すると血液中の濃度は低下すると報告

中性デタージェント繊維
非繊維炭水化物

（％）
（％）

34.8
38.2

されている２，５）。牛においては，これまで乳房炎

粗脂肪

（％）

2.5

Ca

（％）

0.58

を呈した乳牛では，血液中の亜鉛が低値であった

Ｐ

（％）

0.48

との報告がある６）。しかしながら，呼吸器病と血

Mg

（％）

0.22

Ｋ

（％）

1.12

Na
Cl

（％）
（％）

0.30
0.46

Zn

㎎/㎏

65

４）

向上効果があると報告されているとともに４），呼液中の亜鉛濃度との関連性については報告されていない。そこで，本研究では，臨床的に呼吸器病を示した黒毛和種子牛の血清中の生化学性状を調査した。

採血された。血清分離用採血管は採血後，遮光下で２～３時間常温に静置したのち，3,000rpmで２．材料と方法

20分間遠心して血清を分離し，－30℃で測定日ま本研究は，鹿児島県内の１農場で実施された。

で保存した。白血球数は採血後２時間以内に，自供試牛は黒毛和種去勢子牛20頭で，Galyeanら７）動血球計算機（Sysmex, pocH-100i，東京）を用の報告に準じ，直腸温39.7℃以上，鼻汁，発咳，

いて測定された。血清中のアスパラギン酸アミノ

活力低下などにより臨床的に呼吸器病症状を示し

トランスフェラーゼ（AST），γ-グルタミルトた子牛を呼吸器病群（n＝10），臨床的に健康でランスフェラーゼ（GGT），尿素窒素（UN），ク

あった子牛を対照群（n＝10）として区分した。

レアチニン（Cre），総タンパク（TP），アルブミ

供試牛の月齢は６～８ヵ月齢であり，呼吸器病群

ン（Alb），総コレステロール（T-Cho），トリグ

および対照群の平均月齢はそれぞれ7.4±0.9（平リセリド（TG），遊離脂肪酸（FFA）
，βヒドロ

均±SD）
，7.6±0.9ヵ月齢であった。呼吸器病群

キシ酪酸（βHB），カルシウム（Ca），無機リンおよび対照群の平均体重はそれぞれ，220.1±22.5（iP），マグネシウム（Mg）および亜鉛（Zn）濃（平均±SD），238.4±29.5㎏であった。また，す度については自動分析装置（7020型，日立ハイテ

べての供試牛は調査前に局所あるいは全身的な薬

クフィールディング，東京）にて測定を行った。

剤の投与を受けておらず，下痢等の疾病の発生も

血清グロブリン（Glb）値は，TP値からAlb値をなかった。供試牛は，１日あたり濃厚飼料（ぴか

引いて求めた。

いち，南日本くみあい飼料，鹿児島）を５㎏，チ得られたデータは平均±標準偏差で示し，群間

モシー１㎏，稲ワラ１㎏が給与され，日本飼養標の比較をStudent's-T検定により行った。いずれ

準も５％未満の危険率を有意な差とした。

８）

およびNRC飼養標準９）に満たした飼養給与が行われていた（表１）。呼吸器病群の子牛は呼吸器病発症日に，頚静脈より血清分離用真空採血

３．結果と考察管（ベノジェクトⅡVP-S100K，テルモ，東京），

臨床所見および白血球数を表２に示した。呼吸およびEDTA-2AK添加，一般血液検査用真空採器病群の体温および呼吸数は，対照群と比較し有血管（ベノジェクトⅡVP-TK052K，テルモ，東意に高かった（P＜0.01，P＜0.01）。血清生化学京）を用いて採血された。対照群の子牛も同様に検査値を表３に示した。呼吸器病群の血清Zn濃© The Ito Foundation

黒毛和種子牛における呼吸器病の血清亜鉛濃度および亜鉛投与による臨床的な症状改善効果の検討

365と報告されている２，５）。また，ヒトにおいては血表２ 臨床所見および白血球数
対照群（n＝10） 呼吸器病群（n＝10）
体温（℃）

39.1±0.740.5±0.3＊＊

心拍数

（/分）

101.4±11.1

103.2±9.6

呼吸数 （/分）
白血球数 （/μl）

36.4±1.79090±2483

51.2±3.0＊＊10410±2685

数値は平均±標準偏差．群間の有意差；＊＊P＜0.01．

液中の亜鉛濃度が低い状態では呼吸器病の発症のリスクが高いと報告されている12，13）。本研究において，呼吸器病群の血清亜鉛濃度は低値であったが，その要因として，呼吸器病群の子牛は，呼吸器病群の子牛には発熱などがみられたことから，炎症状態であったために血液中の亜鉛は消費さ

表３ 各群の血清成分値
対照群（n＝10） 呼吸器病群（n＝10）

れ，血清亜鉛濃度が減少した，あるいは，なんらかの理由で呼吸器病発症前にすでに亜鉛濃度が低TP（g/dl）

6.2±0.3

6.3±0.3

Alb（g/dl）

3.2±0.2

3.1±0.3

Glb（g/dl）

3.0±0.2

3.2±0.3

1.1±0.1

1.0±0.2

吸器病起因病原体の検出は行っていないが，本研

11.6±1.3
0.8±0.1
106.5±35.3
15.2±3.3
56.3±10.1
16.7±3.9
197.0±52.3
106.0±46.2
601.5±130.3
10.0±0.2
8.5±0.7
1.9±0.2
106.7±8.0

9.8±3.2
0.8±0.1
92.6±26.1
13.0±5.553.4±9.518.8±3.0
183.0±53.5
103.0±49.2
516.0±167.0
10.0±0.3
7.9±0.6
1.9±0.3
68.1±17.9＊＊

究の結果から，呼吸器病症状を示している子牛

A/G
UN（㎎/dl）
Cre（㎎/dl）
T-Cho（㎎/dl）
TG（㎎/dl）
AST（IU/l）
GGT（IU/l）
CK（IU/l）
FFA（μEq/l）
βHB（μmol/l）
Ca（㎎/dl）
iP（㎎/dl）
Mg（㎎/dl）
Zn（μg/dl）

値であった可能性が考えられた。本研究では，呼は，健康子牛と比較し血清亜鉛濃度は低い状態であることが示唆された。今後，呼吸器病症状を示
す子牛に対する血清亜鉛濃度減少の機序を明らかにするとともに，ヒトにおいては，呼吸器病患者に亜鉛を経口投与すると治療日数が減少したという報告があることから14），血液中の亜鉛濃度が減少している呼吸器病子牛に対して，亜鉛を添加することにより，血液中の亜鉛濃度が改善され，呼数値は平均±標準偏差。群間の有意差；＊＊P＜0.01．

吸器病治療に効果があるか検討する必要があると度は対照群と比較し有意に低値であった（P＜0.01）
。その他の項目については有意な差は認められなかった。

考えられた。
４．要

約

本研究において，呼吸器病群の血清亜鉛濃度は

黒毛和種子牛における呼吸器病の血液生化学性

対照群と比較し有意な低値であった。対照群の血状の調査を行った。供試牛は，鹿児島県内の１農

清亜鉛濃度は参照値内（80－120μg/dl）であっ場において飼養されていた去勢子牛20頭で，体温た 。一方，呼吸器病群では，飼料給与量は飼養

39.7℃以上，鼻汁および発咳など呼吸器病症状を基準を満たしていたにも関わらず，血清亜鉛濃度示した初診日の子牛10頭を呼吸器病群，臨床的には，基準値未満であった。亜鉛は抗酸化作用を有健康であった子牛10頭を対照群として比較した。

し，フリーラジカル形成を防ぐ作用があるとされその結果，血清アスパラギン酸アミノ基転移酵ている。血液中の亜鉛濃度は，これまで酸化素，γ-グルタミルトランスフェラーゼ，尿素窒

ストレスにより消費され，炎症状態で減少すると

素，クレアチニン，総タンパク，アルブミン，グ

報告されている。ヒトにおいて，呼吸器病

ロブリン，総コレステロール，トリグリセリド，

は炎症や酸化ストレスを引き起こし，ホメオスタ

カルシウム，リンおよびマグネシウム濃度の平均

シス変化させて，血液中の亜鉛濃度を減少させる

値は両群に有意な差は認められなかった。いっぽ

10）

３，11）

３，
６，11）

© The Ito Foundation

366

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

う，血清亜鉛濃度の平均値は，呼吸器病群68.1
μg/dl，対照群106.7μg/dlであり，呼吸器病では
対 照 群 と 比 較 し て 有 意 に 低 値 で あ っ た（P ＜0.01）。また，呼吸器病の血清亜鉛濃度は，参照
値80～120μg/dlを下回る値であった。これらの結果から，呼吸器病症状を呈した黒毛和種子牛は，血清亜鉛濃度が低下している可能性が示唆された。
文
献１） Bryson, D. G. : Calf pneumonia, Vet Clin North
Am Food Anim Pract, 1, 237～257, 1985.
２） Shakur, M. S., et al. : Zinc status in well nourished
Bangladeshi children suffering from acute lower
respiratory infection, Indian Pediatr, 41, 478～481.
2004.
３） Spears, J. W. : Micronutrients and immune
function in cattle, Proc Nutr Soc, 59, 587～594, 2000.
４） Stefanidou, M., et al. : Zinc : a multipurpose traceelement, Arch Toxicol, 80, 1～9, 2006.
５） Ibraheem, R. M., et al. : Serum zinc levels in
hospitalized children with acute lower respiratory
infections in the north-central region of Nigeria, Afr
Health Sci, 14, 136～142, 2014.
６） Naresh, R., et al. : Zinc, copper, and cobalt
concentrations in blood during inflammation of
mammary gland in dairy cows, Asian Australasian J

Anim Sci, 14, 564～566, 2001.
７） Galyean, M. L., et al. : Effects of arrival
medication with tilmicosin phosphate on health andperformance of newly received beef cattle, J Anim
Sci, 73, 1219～1226, 1995.
８） 日本飼養標準・肉用牛，農業・食品産業技術総合研究機構編，2008年版，中央畜産会，東京，2008.
９） Nutrient requirements of beef cattle, National
Research Council ed, National Academy press,
Washington, 2000.
10） Radostits, O. M., et al. : Disease associated withnutritional deficiencies. pp1698-1770. In : Veterinary
Medicine, 10th ed. A Textbook of the Diseases ofCattle, Horses, Sheep, Pigs and Goats. Saunders Ltd,
London, 2007.
11） Galyean, M. L., et al. : Interaction of cattle health/immunity and nutrition, J Anim Sci, 77, 1120～1134,
1999.
12） Meydani, S. N., et al. : Serum zinc and pneumonia
in nursing home elderly, Am J Clin Nutr, 86, 1167～
1173, 2007.
13） Shakur, M. S., et al. : Zinc status in well nourished
Bangladeshi children suffering from acute lower
respiratory infection, Indian Pediatr, 41, 478～481,
2004.
14） Mahalanabis, D., et al. : Randomized, doubleblind, placebo-controlled clinical trial of the efficacyof treatment with zinc or vitamin A in infants andyoung children with severe acute lower respiratory
infection, Am J Clin Nutr, 79, 430～436, 2004.

© The Ito Foundation

367

難培養性乳酸菌を用いた第３世代サイレージ添加剤の開発
Development of third-generation silage inoculant using difficult-to-culture
lactic acid bacteria

西

野

直

樹

（岡山大学大学院環境生命科学研究科）

Naoki Nishino（Graduate School of Life and Environmental Science, Okayama University）

To examine potential as a third-generation silage inoculant, antimicrobial activity,
inoculation effects on whole crop corn silage, and survival in the cow gut of Lactobacillus
acetotolerans and Lactobacillus pontis were examined. A number of bacteria and fungi
associated with aerobic spoilage of silage were tested as the undesirable target and inoculation
study was performed with single and combined addition of L. acetotolerans and L. pontis. A
practical survey was made to determine survival in the gut; samples of silage and feces werecollected from a total of thirty silage-fed cows at six farms. Detection and identification of L.
acetotolerans, L. pontis, and other bacteria were performed by denaturing gradient gelelectrophoresis and quantitative real-time PCR.
In the soft-agar overlay assay, L. acetotolerans demonstrated inhibitory activity against
Aspergilllus fumigatus and Bacillus subtilis, and L. pontis inhibited A. fumigatus. The inhibitory
activity of L. acetotolerans was also seen in the inoculation study with whole crop corn silage ;aerobic spoilage was suppressed by single addition of L. acetotolerans and the effect of spoilage
inhibition was greatly enhanced by combined use of L. acetotolerans and L. pontis. Survival of
L. acetotolerans in the cow gut was well demonstrated by the practical survey, because L.
acetotolerans DNA was detectable at any farms for both silage and feces samples. However,despite that L. acetotolerans was present at 10６ cfu/g level in silage, the population in feces
was as low as 10４ cfu/g level ; hence, it appeared difficult to exert health-promoting effect of L.
acetotolerans, if any, through providing inoculated silage to dairy cows.

１．目

貯蔵されている。サイレージ生産者の約５割は乳的酸菌製剤を使用しており，効果が大きい新製品へ

サイレージ化（発酵貯蔵）は自給飼料の主要なの期待およびその普及性は非常に高い。第１世代

貯蔵形態であり，牧草，飼料作物，食品副産物なの乳酸菌製剤は，貯蔵中の栄養素損失と有害微生

ど多種多様な飼料素材が，ロールベール，バン

物の生育を抑える目的で開発され，ホモ発酵型乳カー，トランスバッグなど様々なサイロに密封・酸菌の選抜によって技術的に見ればそれらの取組© The Ito Foundation

368

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

みはほぼ終了した。一方，開封後の好気的変敗や明および腸内生残性に関わる微生物学的解析を

長期貯蔵時のカビ発生は，関連技術が進展した現行った。

代の方が解決困難になっている。ロールベールは強く予乾した低水分材料を用いることが多く，十２．方法

分な圧密が困難なこともあって，好気性細菌，酵2 . 1 好気的変敗抑制作用の確認と機序解明

母およびカビが生育しやすい。バンカーサイロはL. acetotoleransとL. pontisの純粋培養物を用細断した高あるいは中水分材料を用いるが，サイい，Aspergillus fumigatus, Bacillus subtilis,

ロ上部から微量の空気が侵入しやすく，開封後はAcetobacter pasteurianus, Saccharomyces

取り出し面すべてが空気にさらされる。当然，酵

cerevisiae, Pichia anomala お よ び Candida krusei

母やカビの増殖リスクは大きく，特に高エネルに対する抗菌作用をソフトアガー重層法で調査しギー飼料のトウモロコシWCSでは好気的変敗がた。B. subtilisとA. pasteurianusは真菌ではない

起こりやすい。空気の存在下で乳酸を代謝する細が，好気的変敗を起こしたイネ科牧草サイレージ菌，酵母およびカビは多く，乳酸優勢のいわゆるおよびトウモロコシWCSにしばしば認められる。

良質サイレージは開封後かえって好気的変敗を起P. anomalaとC. kruseiを抑制する乳酸菌は世界こしやすい。第１世代の添加剤開発では，乳酸生

的にもほとんど例がなく，L. acetotoleransとL.

成をいかに促進するかがキーポイントとされた

pontisにその作用が認められれば，新規添加剤候が，酵母やカビを抑える第２世代では，発想の転補としての優位性が際立つと考えた。なお，A.

換ならびに新技術の開発が必要である。現在，L.

fumigatus, B. subtilis お よ び A. pasteurianus に 抑buchneriという１菌種が第２世代の乳酸菌製剤と制効果を示せば，第２世代添加剤としての評価はして普及している。多量の酢酸を生成するヘテロ十分可能である。

発酵型菌種であり，関係者の誰もがさらなる改良
および機能強化を求めている。

L. acetotoleransとL. pontisの好気的変敗抑制
効果は，トウモロコシWCSを材料としてパウチ研究代表者らは，サイレージの貯蔵特性と細菌サイロで評価した。MRS培地でL. acetotolerans

フローラを調べ，それらを品質制御に応用する研とL. pontisを培養し，滅菌生理食塩水で洗浄した

究を継続的に行ってきた。実規模サイロの実態調

乳酸菌を10５cfu/gレベルで添加して，２ヶ月間室査も続けており，サイレージ乳酸菌の腸内生残性

温で保存した。開封後，発酵生成物と細菌フローを評価する研究も行っている。それらの取組みのラを調べるとともに，一部のサイレージを１週間中で，これまでサイレージから分離されたことが空気にさらして好気的変敗試験を行った。

ないL. acetotoleransやL. pontisが，乳牛腸内で高2 . 2 腸内生残性の評価

い生残性を示すことを明らかにした。これらの乳

トウモロコシWCSを生産および給与している酸菌を分離することにも成功しており，有用乳酸

酪農家計６件を訪問し，サイレージと糞便（直腸菌をサイレージ調製過程で増菌し，動物の疾病予

糞）を採取した。いずれもバンカーサイロでトウ

防および健康増進につなげるという，第３世代のモロコシWCSを生産しており，TMR中の混合割

添加剤開発に向けた研究の準備が整ってきた。本合（DM当たり）は20～40％であった。サイレー研究では，上記２菌種を中心に，第２世代に求めジは代表的サンプルを，糞便は乳牛５頭から採取られる好気的変敗抑制作用の確認と作用機序の解した。

© The Ito Foundation

難培養性乳酸菌を用いた第３世代サイレージ添加剤の開発

369

細菌フローラの解析は，変性剤濃度勾配ゲル電

acetotoleransとL. pontisを混合添加すると（Fig.１

気泳動法（DGGE）とリアルタイムPCR（qPCR）のLA＋LP），好気的変敗に伴う発熱が開封後１で行った。市販キット（DNeasy Blood & Tissue

週間まったく観察されなくなった。L. pontisの単

KitおよびQIAamp DNA Stool Mini Kit）を用い

独添加はまったく効果がなく，開封後２日以内にて細菌DNAを精製し，16S rRNA遺伝子のV3領

サイレージは発熱して変敗した。細菌フローラを域を対象とするユニバーサルプライマーを用いた調べたところ，L. acetotoleransおよびL. pontisのDGGEおよびnested-PCRを応用したLactobacillus

添加に関わらず，Weissella cibaria, L. plantarum,

特異的DGGEを行った。主要なDNAバンドを切Lactobacillus brevis, Lactococcus lactisといった多り出してTAクローニングを行い，DNAの塩基配様な乳酸菌が確認された。L. acetotoleransはこ列を測定してBLASTによる菌種同定を行った。

れらと共存する形で検出されたが，L. pontisは変qPCRは全細菌とL. acetotoleransを対象として敗抑制効果を示したL. acetotoleransとの混合添行い，全細菌数の推定にはE. coliの16S RNA遺加でもそのDNAを確認することはできなかった。

伝子を含むプラスミドを，L. acetotoleransの推

好気的変敗を起こした無添加およびL. pontis添加定にはL. acetotoleransの16S rRNA遺伝子を含む

サイレージではBacillus sp.およびPaenibacillus

プラスミドを用いた。L. pontisのqPCRも試みた

sp.が検出されたが，L. acetotoleransを添加したが，L. pontisだけを検出するプライマーが設計でサイレージではそれらが見られず，抗菌活性の情きなかった（Fig.１）。

報が反映された結果となった。
腸内生残性の評価で調べたトウモロコシWCS

３．結果と考察はすべて無添加で調製されていたが，いずれのサ

L. acetotolerans は A. fumigatus と B. subtilis に

イ レ ー ジ に も L. acetotolerans が 検 出 さ れ た 。

対して抗菌活性を示したが，A. pasteurianus, S.

Farm １，
２，
４ お よ び ６ の サ イ レ ー ジ に は L.

cerevisiae, P. anomalaおよびC. kruseiを抑制しな

pontisも検出されており，トウモロコシWCSはL.

かった。また，L. pontisはA. fumigatusにのみ抗acetotoleransとL. pontisが生育，生残しやすい飼

菌活性を示した。P. anomalaとC. kruseiに抗菌活料であると考えられた。Lactobacillus fermentum性を示せば強力な変敗抑制効果が期待できるが，やLactobacillus amylolyticus等，サイレージ中にL. acetotoleransとL. pontisのいずれもそれらを抑存在する乳酸菌は必ずしも糞便まで到達しないと制することはなかった。一方，L. acetotolerans

考えられたが，L. acetotoleransは安定して，L.

の培養上清を濾過滅菌してアガーウエル拡散法でpontisも多くの事例で糞便にも検出された（Fig.３）。

抗 菌 活 性 を 調 べ た と こ ろ ，A. fumigatus と B.

qPCRで定量的な解析を行ったところ，サイ

subtilisに対する抗菌活性はいずれも見られなくレージ中のL. acetotoleransは10６cfu/gレベルで全なった。機序解明の試みは現在も続けており，L.

細菌数の100分の１程度であった。一方，糞便中

acetotoleransがフェニル乳酸を生成することは確のL. acetotoleransは10４cfu/gレベルで全細菌数の認できている。抗菌活性の測定法を改良するなど

10,000分の１程度に過ぎず，Bacteroides spp.やして，機序解明を進めたい（Fig.２）。

Clostridium spp.が優勢の牛腸内で健康増進効果

ト ウ モ ロ コ シ WCS へ の 添 加 効 果 は ， L.

を期待することは容易ではないと考えられた。L.

acetotolerans 単 独 で も 認 め ら れ た が ， L.

acetotoleransを添加したトウモロコシWCSの給与© The Ito Foundation

370

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

1
2
3
4

5

8
9

6

10

Weissella cibaria
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus brevis
Lactobacillus acetotolerans
Sphingobacterium sp.
Lactococcus lactis
Enterobacter sp.
Paenibacillus sp.
Clostridium sp.
Bacillus sp.
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Acetobacter pasteurianus

11

7

13

12

Control
LA
LP
LA+LP
Control
LA
LP
LA+LP

14

At siloAfter
opening spoilage test
Fig. 1 Bacteria community of laboratory-scale whole crop corn silage inoculated with and without Lactobacillus

acetotolerans（LA）and Lactobacillus pontis（LP）.Silages were examined at silo opening and after aerobic exposure
for seven days.

28
25

15
16

22

29 31

17
1８
19
20

30

23
21

34

27

24 26

36
35

33

37
38

S1
F1
F2
F3
S2
F4
F5
F6
S3
F7
F8
F9
S4
F10
F11
F12
S5
F13
F14
F15
S6
F16
F17
F18

32

Farm1

Farm2

Farm3

Farm4

Farm5

15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38

Lactobacillus acetotolerans
Lactobacillus pontis
Lactobacillus helveticus
Lactobacillus pontis
Lactobacillus vini
Lactobacillus reuteri
Uncultured bacterium
Uncultured bacterium
Lactobacillus pontis
Lactobacillus casei
Lactobacillus acetotolerans
Lactobacillus casei
Weissella paramesenteroides
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus pontis
Lactobacillus pontis
Lactobacillus pontis
Lactobacillus diolivorans
Lactobacillus casei
Lactobacillus amylolyticus
Lactobacillus helveticus
Uncultured bacterium
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei

Farm6

Fig. 2 Lactic acid bacteria communities of bunker-made whole crop corn silage and dairy cow feces from six farms. S

and F indicate silage and fecal samples respectively.

© The Ito Foundation

b
8.0

371

つであることは間違いなく，今後も選抜を続ける

a

10.0

予定である。
c

４．要

6.0

約

トウモロコシWCSから分離したL. acetotolerans
およびL. pontisを用い，サイレージの好気的変敗

d4.0に関わる細菌および真菌に対する抗菌活性を測定した。トウモロコシWCSに単独および混合添加するサイレージ調製試験も行い，好気的変敗の抑Feces L. acetotolerans

Feces total bacteria

Silage L. acetotolerans

2.0

Silage total bacteria

Population（log10 gene copies g－1）

難培養性乳酸菌を用いた第３世代サイレージ添加剤の開発

制効果も検証した。腸内生残性はトウモロコシ
WCSを生産，給与する酪農家６件の実態調査で評価し，乳牛計30頭の糞便フローラを調べてL.
acetotoleransとL. pontisの有無を調べた。

Fig. 3 Q u a n t i t a t i v e r e a l - t i m e P C R a n a l y s i s f o r

populations of total bacteria and Lactobacillus
acetotolerans in whole crop corn silage and feces ofsilage-fed dairy cows. Columns indicate meanvalues for silage and feces with standard deviations
represented by vertical bars.

L. acetotoleransはA. fumigatusとB. subtilisに，
L. pontisはA. fumigatusに抗菌活性を示した。L.
acetotoleransの変敗抑制効果は単独添加でも確認されたが，L. pontisと混合添加すると抑制作用は
顕 著 に 高 ま っ た 。腸 内 生 残 性 の 評 価 で も ，L.
acetotoleransは非常に優れた乳酸菌種であると判試験は現在実施中であるが，サイレージ中の割合断された。ただし，サイレージ中に10６cfu/gレベを高めても糞便で検出されるL. acetotoleransのルで存在しても糞便には10４cfu/gレベルでしか検レベルを10６cfu/g以上にすることは難しい。動物

出されず，牛腸内で優勢菌種となることは難しいの疾病予防および健康増進につなげる第３世代のと考えられた。

添加剤としては能力が十分でないが，候補のひと© The Ito Foundation

372

食肉由来病原体に対する腸管免疫に関与する血清
アミロイドＡの機能解析
Biological characterization of serum amyloid A in intestinal
immunity against edible meat-borne pathogens

猪

島

康

雄

（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

Yasuo Inoshima（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

Serum amyloid A（SAA）protein is known as the major acute phase protein, and as aprecursor of amyloid A（AA）protein in AA amyloidosis, which is a serious complication ofchronic diseases. SAA isoforms, such as SAA1, SAA2, SAA3, and SAA4, have been identified.
Although the biological functions of SAA3 are not completely understood, recent studies
suggested that SAA might play a role in host defense. Expression of SAA3 was increased inmouse colon surface in the presence of microbiota in vivo, and SAA3 increased mucin2（MUC2）mRNA expression in the murine colonic epithelial cells in vitro. Mucin is the major
component of the protective mucus barrier in the intestinal tract. However, it is not understood
how SAA3 and other SAAs differ with respect to in the up-regulation of MUC2 expression.
This study aimed to identify the regions in amino acid sequence of SAA3 that influence
MUC2 expression. For this, recombinant murine SAA1（rSAA1）, rSAA3, rSAA1/3, which wasconstructed from mature SAA1（1-36 amino acids）and SAA3（37-103 amino acids）, andrSAA3/1, which was constructed vice versa as rSAA1/3, were obtained using Escherichia coli.
The mRNA expression of MUC2 was measured in murine colonic epithelial CMT-93 cells
treated with rSAA1, rSAA3, rSAA1/3, or rSAA3/1. Up-regulation of MUC2 mRNA expression
was strongly stimulated by rSAA3 and rSAA3/1. Significant difference in protein structure
was not expected among the four rSAAs. These results suggest that the region between 1-36
amino acids in SAA3 may be responsible for up-regulation of MUC2 expression.

１．目

腸管の免疫応答が重要な役割を果たしている。腸的管では抗菌物質の分泌や病原体に特異的なIgA抗ヒトは食肉を介して様々な病原体を経口的に摂体が産生されるほか，ムチンを主成分とする粘液取するリスクに対し，生体内の免疫応答により感が分泌され物理的な感染防御機能を発揮してい染の防御や病原体の排除を行っている。特に腸管る。近年，Reigstadらによりマウス腸管上皮におに感染し下痢や出血を引き起こす病原体や腸管かいて血清アミロイドＡ（Serum amyloid A, SAA）

ら取り込まれ全身に移行する病原体に対しては，ファミリーの一つであるSAA3が発現しているこ© The Ito Foundation

373

食肉由来病原体に対する腸管免疫に関与する血清アミロイドＡの機能解析と，無菌マウスではその発現が見られないことが報告され，SAA3が腸管上皮における免疫機構になんらかの関わりを有することが示唆された１）。

２．方
2.1

法

組換えタンパク

SAAは，炎症時に血中濃度が通常の1,000倍以マ ウ ス の SAA1（GenBank accession No.

上増加する急性期タンパクの一つであり，鳥類をBC087933）およびSAA3（NM011315）遺伝子情含めほとんどの動物に存在することが知られてい報をもとに，アミノ酸配列を変化させず塩基配列る２）。SAAはアミロイドの前駆タンパクとしてもを大腸菌発現システムに最適化させたDNAフラグ

知られ，なんらかのきっかけにより立体構造が不メントを合成した。合成したDNAをタンパク発現

溶性のアミロイドＡ（AA）に変換し，臓器や組

プラスミドpRSET A（Invitrogen）にクローニ

織に凝集，沈着，蓄積すると臓器不全を引き起こ

ングし，大腸菌BL21（DE3）pLysS（Invitrogen）

しAAアミロイドーシス（ヒトでは厚生労働省がにトランスフォーム後培養し，得られた発現タン

指定する難病の一つ）の原因となる 。SAAには

パクをニッケルアフィニティーカラムで精製，透アミノ酸配列の異なる複数のアイソフォームが知析 ，限 外 ろ 過 に よ り 濃 縮 し ，組 換 え タ ン パ ク

られており，マウスではSAA1～4のアイソフォーrSAA1およびrSAA3を作製した。またアミノ酸

ムが存在する２）。しかし炎症時に血中濃度が増加

配列の前半（36アミノ酸残基）をSAA1，後半

するのは主にSAA１であり，さらに構造変換し（67アミノ酸残基）をSAA3に組み換えたキメラてアミロイドとなるのも主にSAA1である 。一タンパクrSAA1/3，およびその逆のrSAA3/1も方，その他のアイソフォームの生物学的な機能や作 製 し た 。作 製 し た 組 換 え タ ン パ ク は ，DC

生体内での役割はいまだ明らかになっていない。

Protein Assay Kit（Bio-Rad）に よ り 定 量 し ，我々は，腸管感染病原体である原虫，ウイルス，

SDSポリアクリルアミド電気泳動後Coomassie

３）４）

細菌として，トキソプラズマ，ロタウイルス，ブドウ球菌，大腸菌Ｏ-157をマウスの腸管上皮由来

A

CMT-93細胞に添加すると，大腸菌Ｏ-157添加で

rSAA１のみSAA3のmRNA発現が特異的に上昇することを発見した５）。さらに大腸菌発現により作製した組 換 え SAA3 を 細 胞 に 添 加 す る と ，ム チ ン ２

SAA１

rSAA1/3

SAA１

SAA３

rSAA3/1

SAA３

SAA１

（MUC2）のmRNA発現量が上昇することを明ら

rSAA３

かにし，SAA3が粘液ムチンの分泌を促進することで腸管免疫に関与していることを示唆した５）。

SAA３

B

そこで本研究では，SAA3のMUC2発現に関与するアミノ酸領域の同定を試みた。また，抗菌タン

１rSAA
３ 1/3 3/1

パク発現に対するSAA3の関与についても検討した。

Fig. 1 Production of recombinant SAA（rSAA）.（A）

Scheme of construction of rSAA1 and rSAA3, andchimeric rSAA1/3 and rSAA3/1.（B）Detection ofrSAAs by Western blot analysis using anti-Xpress
tag antibody.

© The Ito Foundation

374

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

Brilliant Blue（CBB）染色，および抗Xpressタ

ら SWISS-MODEL11 ，12） に よ り 解 析 し ，PyMOL

グ抗体（Invitrogen）を用いたウェスタンブロッ

Molecular Graphics System Version 0.99rc9

ティングにより確認した（Fig.１）。

（Schrödinger, LLC, NY, http://www.pymol.

2.2

リアルタイムPCRorg/）によりグラフィック化した。

マウス腸管上皮由来CMT-93細胞（ECACCから購入）にそれぞれのrSAAを添加し２時間後，

３．結果と考察

RNeasy Mini Kit（Qiagen）を 用 い て ト ー タ ル

CMT-93細胞においてrSAA無添加を基準としRNAを回収した。DNaseI処理後，cDNAを合成し，た MUC2 の mRNA 発 現 量 は ， rSAA3 お よ び

Fa st SY B R G r ee n Mast er Mix （Ap p liedrSAA3/1の添加で顕著な上昇が見られた。一方，Biosystems）を用いてMUC2および抗菌タンパrSAA1およびrSAA1/3の添加では有意な上昇はクであるregenerating islet-derived III（REG III）

見られなかった（Table２）。SAA3がMUC2以外-γ ，αdefensin（Def） , βDef-3 ，βDef-4 ，のタンパク発現にも関与している可能性を検討す

お よ び 内 在 性 コ ン ト ロ ー ル glyceraldehyde-3-

るため，抗菌タンパクとして腸管で発現するREG

phosphate dehydrogenase （GAPDH） の mRNA

III-γ，αDef, βDef-3，およびβDef-4のmRNAの発現をリアルタイムPCRで検出し，相対発現量について解析したが，それぞれのrSAA添加によをΔΔCt法 により定量した（Table１）。

る変化は見られなかったことから，SAA3はこれ

７）

８）

６）

９）

９）

10）

2 . 3 立体構造モデル解析

らの抗菌タンパク分泌には関与しないことが示唆

組換えタンパクrSAA1，3，1/3，および3/1のされた。以上の結果より，ムチン発現上昇に重要予想される立体構造をそれぞれのアミノ酸配列かな領域はSAA3のＮ末端（１～36のアミノ酸配Table 1 Oligonucleotide primers used for real-time PCR
Target＊Sequence（5ʼ-3ʼ）

Reference

MUC2 F
MUC2 RREG III-γF
REG III-γR
αDef F
αDef R
βDef-3 F
βDef-3 R
βDef-4 F
βDef-4 R
GAPDH FGAPDH RGCTGACGAGTGGTTGGTGAATGGATGAGGTGGCAGACAGGAGACTTCCTGTCCTCCATGATCAAAACATCCACCTCTGTTGGGTTCAAAGAGACTAAAACTGAGGAGCAGC
GGTGATCATCAGACCCCAGCATCAGT
CCTTCTCTTTGCATTTCTCCTGG
CATTTGAGGAAAGGAACTCCACAA
TCTTCACATTTCTCCTGGTGCTGCTG
TTGCTGGTTCTTCATCTTTTTATCTTGCACCACCACCAACTGCTTAG
GGATGCAGGGATGATGTTC

Wlodarska et al.，2011＊MUC2,Cash et al.，2006
Clarke et al.，2004
Rahman et al.，2010
Rahman et al.，2010
Shigemura et al.，2014

mucin 2 ; REG III-γ, regenerating islet-derived III-γ: Def, defensin ; GAPDH,

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

Table 2 Relative mRNA expression of MUC2 in CMT93 cells by rSAAs

Mean relative mRNAexpression level（±SD）
P

Control

rSAA1

rSAA3

rSAA1/3

rSAA3/1

12.4（±0.9）

12.3（±2.9）

2.5（±1.7）

8.52（±0.9）

＞0.05

＜0.01

＞0.05

＜0.01

© The Ito Foundation

食肉由来病原体に対する腸管免疫に関与する血清アミロイドＡの機能解析
SAA1

SAA3

４．要

375

約

血清アミロイドＡタンパク（SAA）は鳥類を含め多くの動物に存在する急性相タンパクであり，AAアミロイドの前駆タンパクとしても知ら
SAA1/3

SAA3/1

れている。SAAにはアミノ酸配列の異なる複数のアイソフォームが知られており，マウスでは
SAA1～4のアイソフォームが存在する。SAA3の生物学的機能はいまだ明らかにされていないが，
近年SAA3が細菌に対する感染防御に関与していFig. 2 Expected protein structures of rSAAs. One chain

indicates structure of SAA monomer; the chainsform tetramer. Right and left sides of the chainsindicate the N-and C-terminals, respectively.

る可能性を示唆するデータが報告された。我々は，腸管感染病原体である原虫，ウイルス，細菌として，トキソプラズマ，ロタウイルス，ブドウ
球 菌 ，大 腸 菌 O-157 を マ ウ ス の 腸 管 上 皮 由 来列）に存在すると考えられた。

CMT-93細胞に添加すると，大腸菌O-157添加で

rSAA1とrSAA3のアミノ酸配列の違いがタンのみSAA３のmRNA発現が特異的に上昇するこパクの立体構造に大きく影響し，MUC2 mRNAとを発見し，組換えSAA3を細胞に添加すると，発現の違いの原因となる可能性を考え，rSAAのムチン２（MUC2）のmRNA発現量が上昇する予想される立体構造を解析したが，見かけ上のわことを明らかにした。そこで本研究では，SAA3

ずかな違いは見られるもののダイナミックな構造のMUC2発現に関与するアミノ酸領域の同定を試的 な 違 い は 見 ら れ な か っ た 。rSAA1/3 お よ び

みた。また，抗菌タンパクとしてREG III-γ，ディrSAA3/1の立体構造についても同様に大きな違フェンシンの発現に対するSAA3の関与についていは見られなかったことから，MUC2 mRNA発も検討し，SAA3の予想される立体構造について

現の上昇はSAA3タンパクの立体構造に起因するも解析した。大腸菌により組換えマウスSAA1

ものではないことが示唆された（Fig.２）。

（rSAA1）とrSAA3を作製し，さらにSAA1の１

合成ペプチドを用いた実験により，SAA3の24～36番とSAA3の37～103番のアミノ酸配列から～38番目のアミノ酸残基が細胞表面のtoll-like

なるrSAA1/3，およびその逆からなるrSAA3/1

receptor 4（TLR4）/MD2複合体に結合するといを作製した。これらをCMT-93細胞に添加後，う報告がある 。今後は，１アミノ酸ずつSAA1

real-time PCRを用いて，MUC2や抗菌タンパクのアミノ酸に置換したSAA3を作製し，TLR4/の 発 現 を mRNA レ ベ ル で 評 価 し た 。rSAA3 とMD2との結合性，TLR4の下流に存在するNF-kB

rSAA3/1 は ，rSAA1 と rSAA1/3 と 比 較 し て ，の活性化，NF-kB活性化によるMUC2発現の増MUC2のmRNAの発現を強く亢進した。いずれの加，さらにはSAA3添加による各種サイトカイン

抗菌タンパクについても各種SAA添加による発の動態についても解析し，SAA3が腸管免疫に果現の影響は見られなかった。４種類のSAAの立たす役割とそのメカニズムについても明らかにし体構造に大きな違いは認められなかった。これらていく予定である。

の 結 果 か ら ，MUC2mRNA 発 現 の 上 昇 に は ，

13）© The Ito Foundation

376

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

SAA3の１～36番までのアミノ酸配列内に重要な領域が存在していることが示唆された。
文献１） Reigstad, C. S., Lundén, G. O., Felin, J., Bäckhed, F.
: PLoS One, 4, e5842, 2009.
２） Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. : Eur. J. Biochem.,
265, 501～523, 1999.
３） Obici, L., Merlini, G. : Swiss Med. Wkly., 142,
w13580, 2012.
４） Westermark, G. T., Fändrich, M., Westermark, P.
: Annu. Rev. Pathol., 10, 321～344, 2015.
５） Shigemura, H., Ishiguro, N., Inoshima, Y. : J. Vet.
Med. Sci., 76, 985～991, 2014.
６） Wlodarska, M., Willing, B., Keeney, K. M.,
Menendez, A., Bergstrom, K. S., Gill, N., Russel, S. L.,
Vallance, B. A., Finlay, B. B. : Infect. Immun., 79,
1536～1545, 2011.
７） Cash, H. L., Whitham, C. V., Behrendt, C. L.,

Hooper, L. V. : Science, 313, 1126～1130, 2006.
８） Clarke, L. L., Gawenis, L. R., Bradford, E. M.,
Judd, L. M., Boyle, K. T., Simpson, J. E., Shull, G. E.,
Tanabe, H., Ouellette, A. J., Franklin, C. L., Walker,
N. M. : Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.,
286, G1050～G1058, 2004.
９） Rahman, A., Fahlgren, A., Sundstedt, C.,
Hammarström, S., Danielsson, Å., Hammarström, M.
L. : Clin. Exp. Immunol., 163, 123～130, 2010.
10） Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Jr. :BMC Bioinformatics, 7, 85, 2006.
11） Arnold, K., Bordoli, L., Kopp, J., Schwede, T. :Bioinformatics, 22, 195～201, 2006.
12） Biasini, M., Bienert, S., Waterhouse, A., Arnold, K.,
Studer, G., Schmidt, T., Kiefer, F., Cassarino, T. G.,
Bertoni, M., Bordoli, L., Schwede, T. : Nucleic Acids
Res., 42, W252-W258, 2014.
13） Deguchi, A., Tomita, T., Omori, T., Komatsu, A.,
Ohto, U., Takahashi, S., Tanimura, N., AkashiTakamura, S., Miyake, K., Maru, Y. : J. Immunol.,
191, 1856～1864, 2013.

© The Ito Foundation

377

牛肉の各部位に含まれる機能性成分に与える品種の影響についてEffect of bleed on the functionality composition of beef

平

山

琢

二

（滋賀県立大学環境科学部）

Takuji Hirayama（School of Environmental Science,University of the Shiga Prefecture）

In this examination, we studied the effect of breed（Wagyu, Holstein and F1）and region（ribulose and round）on the functionality composition of meat（36 head sample ; Wagyu : 11
head, Holstein : 13 head and F1 : 12 head）. In fatty acid, myristic acid, palmitic acid, a stearicacid, a milli strain acid, palmitoleic acid, an oleic acid and a linoleic acid were detected. In aminoacid, an aspartic acid, a glutamicacid, an asparagine, serine, a glycine, threonine, an alanine,lysine, proline, histidine, arginine, tyrosine, 2-amino-3-methylbutyric acid, methionine, a
tryptophan, a phenylalanine, Iso leucine, a leucine, glutamine, carnosine, towering, anserine anda cystine were detected. In the meat of wagyu, hematin, oleic acid, sweetness, bitterness
content was higher than other breed meat. From this result, there is a possibility of explaining
the flavor and taste of Wagyu brand beef which is the worldwide brand. In future, it'll benecessary to consider the relation between the fattening period and the genetic polymorphism.

１．目

下するとされており，新たな肥育技術の確立が要的求されている。また，カルノシンなどの運動能力

健康食ブームに関連して「牛肉」の持つ機能性を向上させる水溶性低分子化合物についても同様が問われている。これまで牛肉，特に和牛肉は嗜なことが言われている状況であり，給与飼料や肥好品としての価値が高く機能性に関する意識は希

育期間などを含めた総合的な検討が必要である。

薄であり，消費者視点もない場合が多かった。しこれまでに報告されてきた牛肉の機能性としかし，時勢を背景に今後の和牛肉の生産拡大を考て，健脳効果，脂肪燃焼促進作用，貧血予防効果，

えた場合，和牛肉の持つ機能性を最大限にアピー

酸化抑制作用，血圧降下作用，体脂肪低減効果なルしていく必要がある。しかし，機能性を持ったどがある。これまでの牛肉に対する“美味しい牛

牛肉，もしくは人の健康に貢献できる抗酸化作用

肉”に加えてこのような健康維持および健康促進を強く有する牛肉を安定的に生産できる技術の確につながる機能性成分をより多く含有する牛肉の立など，課題は山積みである。ダイエットなどで安定的な生産を行うことで，和牛肉消費をより一取り上げられるカルニチンは，牛肉中に多量に含層促進させ，産業の活性化に貢献できる。また，有されるが，これまでの肥育法ではその含量は低

牛肉の赤身肉には貧血予防に効果的とされるヘム© The Ito Foundation

378

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

鉄や，脳機能を維持し，うつ病を改善するセロト

み成分（リジン，ロイシン，イソロイシン，フェニンを合成するトリプトファン，血圧降下作用，

ニルアラニン，トリプトファン，メチオニン，バ

肝機能向上作用があるタウリンといった機能性を

リン，チロシン，アルギニン，ヒスチジン）およ

有したアミノ酸が多く含まれていることが報告さ

び機能性成分（アンセリン，カルノシン―タウリ

れており，牛肉の赤身部位は我々消費者の健康増

ン，ベータアラニン，グルタミン）に分けて検討

進において今後ますます重要な食材だと考えられした。

る１～３）。
いっぽう，牛肉は，部位によって脂質やタンパ

３．結果と考察

ク質量など成分組成が大きく異なり，さらにそれFig.１にサンプル肉中に含まれるカルニチン含

らは品種によっても異なり，それらが食味などに量を示した。肉中に含まれるカルニチン割合は，影響を与えることが報告されている ４，５）。した和牛，ホルスタインおよびF1間で有意な差は認がって，牛肉の成分について部位や品種の関連性

められなかった。L-カルニチンは，アミノ酸のについて検討することで，消費者のニーズにマッ

L-リジンとL-メチオニンを原料として肝臓や腎チした牛肉生産が促進されるものと考える。

臓で合成される機能性ペプチドで，特に反芻動物

上述したことを背景に，今回の研究では，ミーである牛や羊で合成能が高く，その肉中に多く含

トエフェクトと呼ばれる機能性成分（カルニチ

まれるとされている。また，L-カルニチンは放ン，アミノ酸，脂肪酸など）の牛肉中の含有量と牧などで飼育される繁殖牛の肉中に豊富に含まれ品種や部位の関連性について検討し，成分組成やることが報告されている。今回はいずれの品種も牛肉に含まれる機能性成分にあたえる因子につい去勢であったことから，品種間差がみられなかって検討することを目的とした。

たものと考えられる。しかし，その一方で和牛と２．方

F1ではリブロース部位に比べモモ部位でカルニ法

チン含量が高くなる傾向が認められた。ホルスタ

本試験では，国内で肥育された市販の黒毛和種
去勢牛11頭，ホルスタイン去勢牛13頭およびF1

インでは逆にリブロース部位に比べモモ部位で低くなる傾向がみられた。

去勢牛12頭の合計36頭の牛肉（いずれもリブロー
ス部位およびモモ部位）を供試した。サンプル牛
肉は，サンプル採取後，分析に供するまで－30℃120

下で保存した。分析項目は，得られた肉サンプル

100

中の総カルニチン，ヘム鉄，脂肪酸組成，およびアミノ酸組成とした。得られた結果について，供試牛の品種および性を要因として分析を行い，それらの関連性について検討した。なお，脂肪酸組

round

60
40
20

ミノ酸組成は，旨み成分（アスパラギン，グルタ

0

アラニン，トレオニン，グリシン，セリン），苦ribulose80

成は飽和および不飽和脂肪酸に分けて分析し，ア
ミン酸，アスパラギン酸），甘み成分（プロリン，㎎/100ｇwagyu

holstein

Ｆ１

Fig. 1 Carnitine content of wagyu, holstein and F1 meat（ribulose and round）© The Ito Foundation

379

牛肉の各部位に含まれる機能性成分に与える品種の影響について

Fig.２にサンプル肉中に含まれるヘム鉄割合を24示した。ヘム鉄割合は，和牛肉がホルスタインお23

よびF1牛肉に比べ高くなった。また，和牛肉と22

F1牛肉では，リブロース部位に比べモモ部位で21

その割合が高くなる傾向にあり，ホルスタイン牛

20

肉では，その逆の傾向を示した。ヘム鉄は赤身部

19分などの色が濃く肉色素含量が多い部位に多く含18

まれている。ヘム鉄は鉄欠乏性貧血予防効果があ17るとされ，特に肉色素中のヘム鉄は，腸管での吸る。今回の調査から，和牛肉はF1肉やホルスタ
イン肉よりも多くのヘム鉄が含まれている可能性

ribulose
round

wagyu

60 （％）
50

wagyuが示唆された。また，部位による含量の差は，品

holstein30

Ｆ１

種によって異なる可能性も示唆された。

20

Fig.３およびFig.４にサンプル肉中に含まれる

10

脂肪酸組成を示した。いずれの牛肉においても飽０

びステアリン酸，モノ不飽和脂肪酸であるミリス

Ｆ１（ribulose and round）

40

和脂肪酸であるミリスチン酸，パルミチン酸およholstein

Fig. 2 Hematin content of wagyu, holstein and F1 meat

収率が野菜などに含まれるヘム鉄に比べ高いことから，鉄欠乏性貧血予防効果が高いと言われてい％

１ Ｃ16：
０ Ｃ16：
１ Ｃ18：
０ Ｃ18：
１ Ｃ18：
２Ｃ14：
０ Ｃ14：
Fig. 3 Fatty acid composition of wagyu, holstein and F1meat（ribulose）

トレイン酸，パルミトレイン酸およびオレイン
酸，ジ不飽和脂肪酸であるリノール酸が検出された。脂肪酸割合では，オレイン酸割合が最も高くなり，次いでパルミチン酸，ステアリン酸が高くなった。また，オレイン酸はいずれの部位においても和牛肉がホルスタインおよびF1肉に比べ高くなる傾向にあった。パルミチン酸は，逆に品種間の差よりもむしろ部位による違いが認められた。すなわち，リブロース部位に比べモモ部位で，その割合が高くなる傾向がみられた。ステアリン

５0 （％）
4５
40
wagyu
3５
holstein
30
2５
Ｆ１
20
1５
10
５
０
１ Ｃ16：
０ Ｃ16：
１ Ｃ18：
０ Ｃ18：
１ Ｃ18：
２Ｃ14：
０ Ｃ14：
Fig. 4 Fatty acid composition of wagyu, holstein and F1meat（round）

酸は，パルミチン酸と同様に，リブロース部位に比べモモ部位で高くなる傾向が認められたが，モの部位においても和牛肉で最も高くなったことはモ部位では，品種間差も認められた。すなわちモ

我が国におけるブランド牛肉の美味しさを考える

モ部位におけるステアリン酸割合は，ホルスタイ

うえで大変興味深い結果である６）。

ン肉が最も高く，次いでF1，和牛肉の順となった。

Fig.５にサンプル肉中に含まれる脂肪酸組成を

この中でオレイン酸は牛肉の美味しさの指標にも飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸に分けて示した。

用いられる場合があり，本調査において，いずれ

飽和脂肪酸の割合は，リブロース部位に比べモモ© The Ito Foundation

380

平成27年度

70 （％）

wagyu

holstein

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

おいても旨み成分とされるアスパラギン酸，グルＦ１60

タミン酸およびアスパラギン，甘み成分とされる

50

セリン，グリシン，スレオニン，アラニン，リジ

4030

ンおよびプロリン，苦み成分とされるヒスチジ

20ン，アルギニン，チロシン，バリン，メチオニン，

10トリプトファン，フェニルアラニン，イソロイシ

０
SFA

MUFA

SFA

ribulose

MUFA
round

Fig. 5 SFA and MUFA content of wagyu, holstein andF1 meat（ribulose and round）

ンおよびロイシン，機能性成分とされるグルタミ
ン，カルノシンとタウリン，アンセリンおよびシスチンが検出された。いずれの牛肉においてもカルノシンとタウリン割合が最も高くなり，さらに和牛肉が最も高く，次いでF1肉，ホルスタイン部位で高くなる傾向にあり，リブロース部位では肉の順となった。また，牛肉の美味しさと関連の品種間差がみられなかったが，モモ部位ではホル深いとされるグルタミン酸は，部位によって品種

スタイン肉が最も高く，次いでF1，和牛肉の順

間差がみられ，モモ部位においては，和牛肉がホとなった。不飽和脂肪酸の割合は飽和脂肪酸割合

ルスタイン肉やF1肉に比べ割合が高くなる傾向とは逆にリブロース部位がモモ部位に比べ高くなにあり，脂肪酸組成と合わせて，牛肉の美味しさる傾向にあった。また，いずれの部位においてもという点で大変興味深い結果が得られた８，９）。

品種間差が認められ，和牛肉が最も高く，F1おFig.８にサンプル肉中に含まれる旨み成分，甘よびホルスタイン肉の順に低くなった。肉中の不み成分，苦み成分および機能性成分割合を示し

飽和脂肪酸割合は，食味官能評価試験との関連性た。今回の調査において，肉中に含まれる甘み成が高く，特に多汁性との関連性が示唆されてい分および苦み成分割合は，いずれも部位においてる 。一般的に和牛肉がホルスタイン肉やF1肉にも和牛肉がホルスタイン肉やF1肉と比べて高く

比べ美味しいと評価される場合が多く，本調査になった。また，機能性成分の割合では和牛肉が最おいて，和牛肉の不飽和脂肪酸割合が最も高かっも高く，次いでF1およびホルスタイン肉の順とたこととの関連性が示唆され，オレイン酸含量となった。牛肉の美味しさに関連する甘みおよび苦の関連も含め，今後詳細に検討する必要があろ

みの成分割合が和牛肉で最も高くなったことは，う。またその一方で，肉中脂肪酸の不飽和度は，オレイン酸含量と合わせて極めて興味深い結果を肉質に関連する遺伝子多型との関連性が認められ示している10）。一方で，カルニチン含量では品種ており，その点で今後，SCD遺伝子型やFASN遺間差は認められず，部位間で差が認められてお伝子型などの肉中脂肪酸の不飽和化に関連性のあり，筋肉組織の機能性の点から詳細な検討が必要

る遺伝子多型の違いも含めて検討する必要があろ

であろう。

７）

う。またこれらの遺伝子発現には飼育期間も関連

今回の調査では，和牛肉がホルスタインやF1

している可能性があることから，肥育期間につい肉に比べ，機能性成分やヘム鉄割合が高く，美味ても合わせて検討する必要があると考える。

しさに関連の深いオレイン酸，さらに甘みおよびFig.６およびFig.７にサンプル肉中に含まれる

苦み成分などにおいて高くなる傾向がみられた。

アミノ酸組成を示した。いずれの牛肉サンプルに

これは，和牛ブランド肉の美味しさを説明できる© The Ito Foundation

381

牛肉の各部位に含まれる機能性成分に与える品種の影響について
14 （％）
12
10

wagyu

holstein

Ｆ１

８
６
４
２

o
Pr

Le
u
Le

Ly
s

Ile
Ile

Va
l
M
et
Tr
p
Ph
e

Ty
r

C

Al
ar a
_T
au
An
s

is

Th
r
Ar
g

H

Se
r
G
ln
G
ly
si
n

p

G

As

lu
t
As
n

０

Fig. 6 Amino acid content of wagyu, holstein and F1 meat (ribulose）

18 （％）
16
14
12

wagyu

10

holstein

８

Ｆ１

６
４
２
o
Pr

s
Ly

u

e

p

Ph

et

Tr

M

l
Va

r
Ty

au
An
s

a
C

ar

_T

g

Al

r

Ar

Th

n

is
H

ln

si

G

G

ly

r
Se

t

n

As

lu

G

As

p

０

Fig. 7 Amino acid content of wagyu, holstein and F1 meat（round）

20 （％）
18

wagyu

16

holstein

14

Ｆ１

12
10
８
６
４
２
０

FlavorSweetness

Bitterness

Fanctionality

Flavorribulose

Sweetness

Bitterness

round

Fig. 8 Fanctionality composition of wagyu, holstein and F1 meat（ribulose and round）© The Ito Foundation

Fanctionality

382

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

可能性があり，その点でこれら成分との関連性の重要性が示唆された。今後，肥育期間との関連についても検討する必要がある。その一方で，機能性成分の一つであるカルニチン含量が部位による差が，品種間による差よりも大きかったことについて，筋肉組織の機能面も含め今後詳細に検討する必要がある。
４．要

約

今回の研究では，ミートエフェクトと呼ばれる機能性成分（アミノ酸，脂肪酸など）の牛肉中の含有量と品種や部位の関連性について検討することを目的とし，国内で肥育された市販の黒毛和種
去勢牛11頭，ホルスタイン去勢牛13頭およびF1
去勢牛12頭の合計36頭の牛肉（いずれもリブロー
ス部位およびモモ部位）を供試して，試験を実施した。和牛肉がホルスタインやF1肉に比べ，機能性成分やヘム鉄割合が高く，美味しさに関連の深いオレイン酸，さらに甘みおよび苦み成分などにおいて高くなる傾向がみられ，和牛肉の美味しさが成分組成や部位と大きく関連している可能性が示唆された。

文献１） 中井博康，池田敏雄，安藤四郎，小堤恭平，田村久子，荒牧秀俊：市場牛肉質性状の実態調査，畜産試験場年報，25, 151～162, 1987.
２） 岩間永子，谷田部隆，齋藤隆夫，合原義人：銘柄牛のうま味成分に関する試験研究，茨城県畜産セン
ター研究報告，43, 32～34, 2010.
３） 古賀照章，中島純子，近藤君夫，唐沢秀行：牛肉の脂肪酸組成およびアミノ酸組成に及ぼす各種要因について，長野県畜産試験場松本家畜保健衛生所，https://www.pref.nagano.lg.jp/enchiku/sangyo/
nogyo/chikusan/kairyou/documents/saport04.
pdf.2008.
４） 織田一恵，岡幸宏：黒毛和種去勢牛肉の脂肪含量の異なる部位での熟成効果の検討，愛媛畜研セ研報，
2, 35～42, 2014.
５） 平田祐介，河原貴裕，栗木隆吉：機能性成分を生かしたジャージー生産物の付加価値向上技術の開発，
岡山総畜研報，19, 5～10, 2010.
６） 平山琢二，北内毅，眞榮田知美，藤原望，平川守彦，及川卓郎：長期肥育和牛肉の食感および食味に関する官能評価について，日本暖地畜産学会報，56（1）,67～71, 2013.
７） 板倉弘重，柴田博，高田明和，松川正，西村敏英，
沖谷明紘：牛肉の魅力，（財）日本食肉消費総合セン
ター，8～65, 2010.
８） 渡辺彰，滝本勇治，西村宏一，常石英作：肥育牛の各種筋肉間における熟成後の遊離アミノ酸およびタウリン含量の差異，日畜会報，60, 303～305, 1988.
９） 本郷富士弥，加香芳孝：食肉の風味成分に関する研究，琉球大学農学部学術報告，第20号，253～259,
1973.
10） Hornstein, I., Crowe, P. E., Sulzbacher, W. L. :Constituents of meat flavor : beef, J Agr, Food
Chem, 8, 65～67, 1960.

© The Ito Foundation

383

同腹産仔間で成長が異なる仔豚の代謝特性比較
Analysis on the metabolic profiles between healthy and mal-development
piglets in same littermates

塚

原

隆

充

（京都府立大学大学院生命環境科学研究科）

Takamitsu Tsukahara（Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University）

Retarded growth is one of the serious economic problems on swine industry and is caused
by many factors such as infections and stresses. To date, no comprehensive analysis on
metabolites of such piglets is conducted. In this study, we detected the metabolic abnormalities
in plasma and muscle of piglets with colibacillosis or runt piglets using a metabolome inclusive
analysis. Further a quantitative analyses of amino acids were performed to determine themetabolic disorder among amino acids.
Plasma and longissimus dorsi muscle were collected from 36-days-old LWD piglets ;healthy growing（n ＝ 4）, mild colibacillosis（n ＝ 4）, serious colibacillosis（n ＝ 4）and runt（n＝ 4）piglets. Metabolome analysis was determined by gas chromatography mass spectrometry.
The data were identified and analyzed using MetAlign software and AIoutput2 software.
Additionally, quantitative assay of amino acids was used ultra-performance liquid
chromatography tandem mass spectrometry. From these results, metabolic pathway differenceswere evaluated by MetaboAnalyst 3.0 software.
In plasma, many metabolomic pathways were differed among the groups; biotin
metabolism, taurine and hypotaurine metabolism, pantothenate and CoA biosynthesis, andmany amino acid metabolisms such as methionine, alanine, glycine, serine and threonine.
Meanwhile, the pathways of ammonia recycling, protein biosynthesis, taurine and hypotaurine
metabolism, and some amino acid metabolisms such as histidine metabolism and lysine
degradation were altered in muscle among the groups. According to the quantitative analysesof amino acids, lysine concentration was drastically higher in the plasma of piglets withcolibacillosis and runt piglets than those of healthy growing piglets; furthermore, lysine
concentration was higher in the muscle of piglets with colibacillosis than those of healthy
growing piglets.
Many metabolic pathways were altered by colibacillosis and retarded growth on weaned
piglets. Particularly, colibacillosis or healthy but stunted piglets might be affected by themetabolic disorder of lysine.

© The Ito Foundation

384
１．目

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

近年，網羅解析の発達によって，生体の変化の的全体像を捉えることが可能になった。本申請課題

繁殖母豚は１回の分娩で約10頭の仔を娩出す

では，代謝物の網羅解析であるメタボローム解析

る。養豚経営の効率化のためには，分娩時体重やを行うことで，出生時矮小仔豚および出生後発育

その後の発育ができるだけ揃うことが望ましい

不良仔豚と，発育良好豚での血液および筋肉でのが，しばしば分娩時には極端に大きな仔や小さな代謝変動の全体像を捉えることを目的とする。な仔が認められる。大きな仔はともかく，小さな仔

お出生後発育不良仔豚は，大腸菌を感染させるこはその後成長を挽回することは難しくいわゆるとで人為的に作成した。
本研究実施によって，『出生時矮小仔豚および「ヒネ豚」になりがちである。
また，娩出時には比較的体重が同一である産仔

出生後発育不良仔豚では発育良好豚と代謝が異なも，その後の成長に差が出る場合がある。これはることを確認する』という重要な基盤情報を得る

第一には感染症の関与が考えられる。とくに下痢ことができ，これらの基盤情報を活用すること

または発咳などの臨床的な症状が確認できない不で，上記発育不良豚にある種の栄養成分を飼料中

顕性感染は，増体の悪化のみが主徴として発現すに添加することで，発育不良を改善させることがるため，養豚農家は特別な対処を行っていない。

可能となるかもしれない。本成果によって，養豚

これら出生時矮小仔豚および出生後発育不良仔

農家の潜在的なコスト増加要因と考えられる発育

豚は，離乳舎移動時または育成舎移動時に体重を目安に豚房を分けて飼育するケースが一般的であるが，給与する飼料は豚舎ごとにラインで管理さ不良仔豚の育成改善を行える可能性がある。
２．方法

れているため，同一飼料を摂取している。日本飼

2 . 1 動物の飼育養標準ならびに飼料会社が販売する飼料設計は，一般的な一貫経営の養豚場から，健康な，分娩元々発育が良好である豚にあわせて設計している

予定日が同日の妊娠母豚３頭を導入した。導入はため，発育不良豚では栄養成分がマッチしていな

分娩前２週間とし，導入後は分娩ストール内に個い可能性がある。

体ごとに収容し，飼育した。母豚へは，分娩前か最近，マイコプラズマ性肺炎とインフルエンザ

ら分娩，離乳を通して市販繁殖豚用飼料ブリーとの混合感染時に特定のアミノ酸が血中で不足しミールマキシム（フィードワン株式会社製）を推ている事例が報告されており１），また特定のアミノ奨量給与した。

２）

酸を強化した飼料を給与した豚に病原性大腸菌

分娩予定日に分娩が揃うように，分娩前日に分または豚繁殖障害・呼吸障害症候群ウイルス を

娩誘発剤α-クロプロステノール製剤（ダルマジ

感染させたところ成長改善が認められたという報ン，共立）を用法用量どおり投与した。各豚とも告がある。これは疾病罹患時にはある種の栄養成

正常な分娩を行い，母豚１から13頭，母豚２から分が不足するため，増体不良が起きる可能性を示

11頭，母豚３から15頭の生存産仔を得た。産仔用唆している。以上のことから，出生時矮小仔豚おの 飼 料 は ， 剖 検 時 （36 日 齢） ま で SDS No.1

よび出生後発育不良仔豚もある種の栄養成分の不（フィードワン株式会社製）とし，７日齢以降餌足が起こり，さらなる増体不良の悪循環に陥って付け飼料としても使用した。なお，飼料成分は既いる可能性がある。

報のとおりである４）。21日齢で離乳を行った。こ３）© The Ito Foundation

同腹産仔間で成長が異なる仔豚の代謝特性比較

385の中で，生時体重が小さく，その後の発育も不良

処理液250μLを添加しホモジナイズ処理を行い，であった４頭をヒネ豚群とした。また，良好な発37℃，1,200rpmの条件で30分間振盪した。その後，育を示した仔豚の中で，剖検時まで健康にあった

４℃，５分間，16,000×ｇで遠心分離し，上清

仔豚４頭を健常群とした。25日齢で，良好な発育180μLを蒸留水200μLと混合しボルテックス後，を示した仔豚に病原性大腸菌を感染させた。感染

再び４℃，５分間，16,000×ｇの条件で遠心分離の手法は既報のとおりとした 。感染後，大腸菌を行った。以降の手順は血漿と同様とした。分析症を発症したものの増体が健常対照群と変わらなにはGCMS-QP2010 Ultra（Shimadzu）を用い，かった群（n＝４），大腸菌症を発症し増体が著

カ ラ ム は InertCap 5MS/NP（GL Science）を 使

しく悪化した群（n＝４）を設けた。剖検前日の用した。カラム温度は，分析開始後２分間は80℃

17時から絶食させた。剖検は，ペントバルビターに維持し，その後は１分につき15℃のペースでル麻酔後，開腹して腹部大静脈からヘパリン血を330℃まで加温し６分間維持した。インジェク

採取し，背最長筋を採取した。血液は速やかに遠ション温度は230℃，ヘリウムガス流速は１mL/

心分離後，血漿を分取し，分析まで凍結保存した。

min，ライン温度は250℃，イオン源温度は200℃

５）

2.2

に 設 定 し た 。 得 ら れ た デ ー タ は MetAlign

代謝物網羅解析

血漿50μLに対し，内部標準物質である2-イソ

software（Wageningen UR） お よ び AIoutput2

プロピルリンゴ酸５μLおよび前処理液（メタsoftware６）を用いて解析し，内部標準物質のピー

ノール：超純水：クロロホルム＝2.5：１：１）

ク面積に対する各物質のピーク面積の割合で示しを添加しボルテックス後，暗所，37℃，1,200rpmた。結果は後述のアミノ酸分析のものとあわせての条件で30分間振盪した。その後，４℃，５分間，

MetaboAnalyst 3.0 software７）により統計解析を

16,000×ｇで遠心分離し，上清225μLを蒸留水行うとともに，影響が大きいと予想される代謝経

200μLと混合しボルテックス後，再び４℃，５分路を選別した。

間，16,000×ｇの条件で遠心分離を行った。得ら

2 . 3 アミノ酸分析

れた上清250μLを室温，真空下で20分間遠心濃縮

血漿に等量の0.4Ｍ過塩素酸を添加しボルテッを行い，－80℃のディプフリーザーで凍結させた

クス後，暗所，４℃で30分間静置した。その後，後，減圧乾固させた。その際余った上清をすべて

０℃，20,000×ｇの条件で15分間遠心分離を行っのサンプルから等量ずつ混合し，クオリティコン

た。得られた上清100μLに対しタンパク質構成ア

トロールとして用いた。完全に乾燥したことを確

ミノ酸の安定同位体混合液を５μL添加し分析を認し，メトキシアミン塩酸塩のピリジン溶液40μL行った。

を添加しボルテックス後，暗所，30℃，1,200rpm

背最長筋には５容量の0.2Ｍ過塩素酸を加え，の条件で90分間振盪した。さらにN-メチル-N-ト

ビートビーダー（Tomy）を用いて3,000rpmの条

リメチルシリルトリフルオロアセトアミドを20μL

件で30秒間破砕処理を行い，暗所，４℃で30分間添加しボルテックス後，暗所，37℃，1,200rpm

静置した。以降の手順は血漿と同様であった。分の条件で45分間振盪し，４℃で10分間冷却し分析

析にはACQUITY UPLC-MS/MS（TQD, Waters）

を行った。

およびIntradaカラム（Imtakt）を用いた。カラ

背最長筋は液体窒素による凍結粉砕後，20㎎をム温度は35℃に設定した。グラジェント条件は

秤量し，2-イソプロピルリンゴ酸５μLおよび前

バッファーＡ（アセトニトリル：テトラヒドロフ© The Ito Foundation

386

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

ルラン：25mMギ酸アンモニウム：ギ酸＝90：

おいて，血漿中成分ではビオチン代謝，タウリン

750：160：３）およびバッファーＢ（アセトニト

およびヒポタウリン代謝，パントテン酸およびリル：100mMギ酸アンモニウム＝１：４）を，

CoA生合成，メチオニン代謝，アラニン代謝，グＡ 液 100 ％（０ - ３ min) ，Ａ 液 100-83 ％（３ - ９

リシン，セリンおよびトレオニン代謝，グルコーmin)，Ａ液０％（９-16min）に設定した。

ス―アラニン回路，フェニルアラニンおよびチロ
シン代謝，イノシトール代謝，リジン分解，チロ

３．結果と考察

シン代謝，およびグルタチオン代謝が顕著に変化

代謝パスウェイ解析の結果，健常対照群，大腸した（Fig.１）。一方，背最長筋では，アンモニ

菌症軽度群，大腸菌症重度群およびヒネ豚群間にア再利用，タンパク質生合成，タウリンおよびヒMetabolite Sets Enrichment Overview

BIOTIN METABOLISMTAURINE AND HYPOTAURINE METABOLISM
PANTOTHENATE AND COA BIOSYNTHESISMETHIONINE METABOLISM
ALANINE METABOLISMGLYCINE, SERINE AND THREONINE METABOLISM
GLUCOSE-ALANINE CYCLEPHENYLALANINE AND TYROSINE METABOLISM
INOSITOL METABOLISM
LYSINE DEGRADATIONTYROSINE METABOLISM
GLUTATHIONE METABOLISMTRYPTOPHAN METABOLISMPROTEIN BIOSYNTHESISCATECHOLAMINE BIOSYNTHESISCYSTEINE METABOLISM
SPHINGOLIPID METABOLISM
GLUCONEOGENESISHISTIDINE METABOLISMINTRACELLULAR SIGNALLING THROUGH…
VALINE, LEUCINE AND ISOLEUCINE DEGRADATIONSTARCH AND SUCROSE METABOLISM
PORPHYRIN METABOLISMPENTOSE PHOSPHATE PATHWAY
EXCITATORY NEURAL SIGNALLING THROUGH…
GALACTOSE METABOLISM
BETAINE METABOLISM
GLUTAMATE METABOLISMCITRIC ACID CYCLE
MITOCHONDRIAL ELECTRON TRANSPORT CHAIN
AMINO SUGAR METABOLISM
GLYCOLYSISFRUCTOSE AND MANNOSE DEGRADATION
MALATE-ASPARTATE SHUTTLEASPARTATE METABOLISM
BILE ACID BIOSYNTHESISGLYCEROLIPID METABOLISMFATTY ACID METABOLISMFATTY ACID ELONGATION IN MITOCHONDRIAAMMONIA RECYCLING
BETA-ALANINE METABOLISM
UREA CYCLEPURINE METABOLISM
ARGININE AND PROLINE METABOLISMINSULIN SIGNALLINGPYRIMIDINE METABOLISM
PHOSPHOLIPID BIOSYNTHESISBETA OXIDATION OF VERY LONG CHAIN FATTY ACIDSPROPANOATE METABOLISM

P value
1e－01

6e－01

1e＋00

0.0

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

Fold Enrichment
Fig. 1 MetaboAnalyst 3.0 softwareを用いた血漿における代謝パスウェイ解析結果© The Ito Foundation

387

同腹産仔間で成長が異なる仔豚の代謝特性比較

ポタウリン代謝，胆汁酸生合成，ヒスチジン代謝，しそれぞれ有意（p＜0.05）に高い値を示した。

リジン分解，ビオチン代謝，カテコールアミン生背最長筋では（μmol/㎏），健常対照群で52.6，大合成，クエン酸回路，アミノ糖代謝，パントテン

腸菌症軽度群で199.8，大腸菌症重度群で436.8，

酸およびCoA生合成，およびリン脂質生合成が顕ヒネ豚群で177.8と，健常対照群に対し大腸菌症

著に変化した（Fig.２）。

軽度および重度群が有意に高い値を示した。また

遊離アミノ酸の定量分析の結果から，血漿中の背最長筋中遊離アルギニン濃度は（μmol/㎏），

遊離リジン濃度（μmol/L）は，健常対照群の52.3

健常対照群で125.3，大腸菌症軽度群で111.8，大に対し，大腸菌症軽度群で135.9，大腸菌症重度

腸菌症重度群で250.1，ヒネ豚群で131.0と健常対群で193.3，ヒネ豚群で154.8と，健常対照群に対照群に対し大腸菌症重度群が有意（p＜0.05）にMetabolite Sets Enrichment Overview

AMMONIA RECYCLING
PROTEIN BIOSYNTHESISTAURINE ANO HYPOTAURINE METABOLISM
BILE ACID BIOSYNTHESISHISTIDINE METABOLISM
LYSINE DEGRADATIONBIOTIN METABOLISMCATECHOLAMINE BIOSYNTHESISAMINO SUGAR METABOLISM
PANTOTHENATE AND COA BIOSYNTHESISPHOSPHOLIPID BIOSYNTHESISGLUTATHIONE METABOLISM
FRUCTOSE AND MANNOSE DEGRADATIONSTARCH AND SUCROSE METABIOLSM
PURINE METABOLISM
BETA-ALANINE METABOLISM
BETAINE METABOLISMCYSTEINE METABOLISMCITRIC ACID CYCLEPHENYLALANINE AND TYROSINE METABOLISM
ARGININE AND PROLINE METABOLISM
UREA CYCLE
FATTY ACID METABOLISMFATTY ACID ELONGATION IN MITOCHONDRIATYROSIME METABOLISM
VALINE, LEUCINE AND ISOLEUCINE DEGRADATIONGLYCEROLIPID METABOLISM
GLYCOLYSISKETONE BODY METABOLISMBUTYRATE METABOLISM
MITOCHONDRIAL ELECTRON TRANSPORT CHAIN
SPHINGOLIPID METABOLISMPENTOSE PHOSPHATE PATHWAY
GLUCONEOGENESISINSULIN SIGNALLINGPROPANOATE METABOLISMGLYCINE, SERINE AND THREONINE METABOLISMMETHIONINE METABOLISMGALACTOSE METABOLISMTRYPTOPHAN METABOLISM
GLUCOSE-ALANINE CYCLE
PORPHYRIN METABOLISMPYRIMIDINE METABOLISMASPARTATE METABOLISM
MALATE-ASPARTATE SHUTTLE
GLUTAMATE METABOLISM
INOSITOL METABOLISMPYRUVATE METABOLISM

P value
9e－03

5e－01

1e＋C0

０

１

２

３

４

Fold Enrichment
Fig. 2 MetaboAnalyst 3.0 softwareを用いた背最長筋における代謝パスウェイ解析結果© The Ito Foundation

388

平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.34）

高い値を示した。背最長筋中遊離チロシン濃度はた。血漿および筋肉の代謝物網羅解析はガスクロ（μmol/㎏），健常対照群で53.1，大腸菌症軽度群

マトグラフィー質量分析計を用いて行った。得らで46.1，大腸菌症重度群で108.1，ヒネ豚群で82.9れたデータの解析は，MetAlign softwareおよびと健常対照群に対し大腸菌症重度群が有意（p＜AIoutput2 softwareを用いた。また，パスウェイ0.05）に高い値を示した。

解 析 は ，MetaboAnalyst 3.0 software を 用 い て

以上の結果から，血漿および背最長筋におけるビオチン代謝，タウリンおよびヒポタウリン代行った。さらに，アミノ酸濃度を定量解析した。
解析はUPLC-MS/MSを用いて行った。

謝，パントテン酸およびCoA生合成，およびリジ

多くの代謝物パスウェイが，群間で変動した。

ン分解の代謝経路は大腸菌症発症豚およびヒネ豚

血漿ではビオチン代謝，タウリンおよびヒポタウに共通して関わっている可能性が示唆された。こリン代謝，パントテン酸およびCoA生合成，メチ

れらの代謝経路の中で，リジン分解経路はアセチ

オニン代謝，アラニン代謝，グリシン，セリンおルCoAを介してクエン酸回路に関わるほかにも，

よびトレオニン代謝などが顕著に変化した。一方

ピペコリン酸経路に接続していることから生体内で背最長筋では，アンモニア再利用，タンパク質においてとくに重要な経路であると考えられる。

生合成，タウリンおよびヒポタウリン代謝，ヒス

したがって，大腸菌症発症豚およびヒネ豚はリジチジン代謝，リジン分解などが顕著に変化した。

ンの一次代謝が正常に行われず，その下流の代謝

アミノ酸定量解析の結果，血漿中のリジン濃度が経路の活性も低下している可能性が示唆された。

大腸菌症およびヒネ豚群で健常対照群よりも有意

また，健常対照群および大腸菌症軽度群と比較すに高値を示した。さらにリジン濃度は，筋肉中でると，大腸菌症重度群は体内のアミノ酸恒常性がも大腸菌症豚で健常対照群よりも有意に高値を示維持できていないことから，大腸菌症を発症し，した。

増体に支障が認められる個体は，複数のアミノ酸

多くの代謝物パスウェイが，発育不良時に変化

代謝異常が発生している可能性が考えられた。

した。とくに，発育不良時にはリジンの代謝異常

４．要が顕著になることが示唆された。

約

疾病罹患やストレスによって起こる豚の発育不良は，養豚経営上深刻な問題である。これら発育不良豚の代謝に関する検討はこれまで行われてこなかった。本検討では，母豚３腹から娩出した仔豚を用い，発育不良による末梢血漿中および背最長筋中の代謝物を，代謝物網羅解析で比較した。
また，アミノ酸に関する異常が多く認められたた
め，アミノ酸の定量解析もあわせて実施した。
36日齢の，健常発育豚（n＝４），大腸菌症軽度発症豚（n＝４），大腸菌症重度発症豚（n＝４），ヒネ豚（n＝４）を剖検し，末梢血および
背最長筋を採取した。末梢血からは血漿を分取し文献１） Le Flocʼh, N., Deblanc, C., Cariolet, R., GautierBouchardon, A. V., Merlot, E., Simon, G. : Effect offeed restriction on performance and postprandial
nutrient metabolism in pigs co-infected with
Mycoplasma hyopneumoniae and swine influenza
virus, PLOS ONE 9, e104605, 2014.
２） Trevisi, et al. : A tryptophan-enriched diet
improves feed intake and growth performance ofsusceptible weanling pigs orally challenged with
Escherichia coli K88, J. Anim. Sci., 87, 148～156,
2009.
３） Oota, Y., Tsukahara, T., Fujieda, T. : Uniqueamino acid composition in plasma during porcine
reproductive and respiratory syndrome virus
viremia. Proceedings of “The 7th International
Symposium on Emerging and Re-emerging Pig
Diseases”, Kyoto, Japan, 2015.

© The Ito Foundation

同腹産仔間で成長が異なる仔豚の代謝特性比較
４） Tsukahara, T., Iwasaki, Y., Nakayama, K., Ushida,
K. ： Stimulation of butyrate production in the large
intestine of weaning piglets by dietaryfructooligosaccharides and its influence on thehistological variables of the large intestinal mucosa,
J. Nutr. Sci. Vitaminol., 49, 414～421, 2003.
５） Tsukahara, T., Nakanishi, N., Nakayama, K.,
Matsubara, N., Ushida, K. : Experimental infection ofenterotoxemic Escherichia coli associated withporcine edema disease and its pathogenic
chracteristics in the intestine, J. Vet. Med. Sci., 67,1167～1171, 2005.
６） Tsugawa, H., Tsujimoto, Y., Arita, M., Bamba, T.,
Fukusaki, E. : GC/MS based metabolomics :development of a data mining system for metabolite

389

identif ication by using soft independent modeling ofclass analogy（SIMCA）, BMC Bioinformatics, 12,131, 2011.
７） Xia, J., Sinelnikov, I., Han, B., Wishart, D. S. :MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics moremeaningful, Nucl. Acids Res., 43（W1）, W251-7,
2015.

© The Ito Foundation

平成27年度助成研究調査一覧

本年度の対象とする研究または調査：
食肉に関する研究または調査（製造加工，食品的価値，家畜生産，飼料，疾病，食肉・食肉製品の流
通など）
単位：千円
継続
年数

代

H.26～

増田

俊哉

大阪市立大学大学
院生活科学研究科

1,000

ZnPP形成能を有する微生物の探索と応用

若松純一

北海道大学北方
生物圏フィールド
科 学 セ ン タ ー

1,000

筋タンパク質の死後分解に与えるオートファジーの影
響：プロテオーム解析を用いたアプローチ仲西友紀

宮崎大学農学部
応用生物科学科

1,000

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究根岸晴夫

中 部 大 学応 用 生 物 学 部

1,250

早川

徹

帯広畜産大学畜産衛生学研究部門

1,000

丸山

達生

神戸大学大学院
工 学 研 究 科

1,000

服部

昭仁

（一 社）食 肉 科 学
技 術 研 究 所

1,300

鶏肉フライの加熱・保存過程におけるテクスチャーの決定要因と変化機構の解明

杉山寿美

県 立 広 島 大 学
人 間 文 化 学 部
健 康 科 学 科

1,000

デジタルPCR法を用いた食肉加工品中におけるリステ
リア菌の迅速定量法の開発

高橋肇

東 京 海 洋 大 学
学 術 研 究 院
食品生産科学部門

1,000

鈴木

啓一

東北大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

坂田

亮一

麻布大学獣医学部

750

西村

敏英

日 本 獣 医生 命 科 学 大 学
応用生命科学部
食 品 科 学 科

1,000

畜産物由来ペプチドの肝障害改善の効果について

實安

隆興

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

肥満に伴う認知症の発症予防における豚肉摂取の効果

後藤孔郎

大分大学医学部
内分泌代謝膠原病
腎臓内科学講座

1,000

研

究

課

題

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究（その２）ミオシンの水溶化現象に関連する尾部領域の特定

H.26～

廃食肉中のタンパク質を用いた貴金属リサイクル技術の開発
食肉製品の塩漬熟成に伴う呈味性発現に関する研究（Ⅱ）―ヒポキサンチンによる呈味性発現機構―

メタボロミクス解析結果に基づく黒毛和種牛肉の美味しさに関わる指標の検証

H.26～

H.26～

野生動物肉の加工利用のための技術開発：加工適性に及ぼす血絞りと塩漬法の効果
ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明
（その２）

H.26～

© The Ito Foundation

表

代表者名

研

究

者

所属機関

助成金額

牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール
代謝改善素材開発のための基礎研究

利岐 阜 大 学
応用生物科学部

1,000

新規な発酵食肉製品の機能性について

六車三治男

南 九 州 大 学
健 康 栄 養 学 部

1,200

豚レバーパウダーの脂質代謝に及ぼす影響

岡本芳晴

鳥取大学農学部

1,000

機能性食肉の開発を目指した ｢身体に効く成分｣ の分
析

加治屋勝子

鹿児島大学農学部

1,000

血中トリプトファン濃度とうつ状態との関連：双極性と単極性の鑑別を目指して

堀宏治

昭 和 大 学
横浜市北部病院
メ ン タ ル ケ ア
セ ン タ ー800

食肉および家畜の微生物制御に資する乳酸菌由来抗菌ペプチドの探索善藤

威史

九州大学大学院
農 学 研 究 院

800

800

H.26～

長岡

成長期女子スポーツ選手の食事摂取状況と畜産物由来
ヘム鉄摂取の有効性についての検討～特に貧血予防とメンタルヘルスに及ぼすヘム鉄の影響に着目して～

吉川

豊神 戸 女 子 大 学
健 康 福 祉 学 部
健康スポーツ栄養学科

豚増体量に及ぼす暑熱ストレス耐性の遺伝的ばらつきの原因遺伝子を探る

山田宜永

新潟大学農学部

900

揮発性脂肪酸が牛筋肉内脂肪細胞分化に及ぼす影響溝口康

明治大学農学部

800

ブランド豚肉生産用原種豚の遺伝的多様性の維持に関
する研究

古川

力

東 京 農 業 大 学
農
学
部

800

山崎

瑞穂

広島県立総合技術
研究所畜産技術
セ ン タ ー

1,000

盧

尚建

東北大学大学院
農 学 研 究 科

900

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わるゲ
ノム育種価の推定

H.26～

黒毛和種牛のルーメン絨毛組織の発達関連遺伝子の網羅的解析に関する研究
牛CHFRおよびRB1遺伝子プロモーター流域のDNA
メチル化多型と肉質形質との関係に関する分子遺伝的
研究

H.26～

須田

義人

宮 城 大 学
食 産 業 学 部

1,000

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養
技術の開発

H.26～

高島

誠司

信州大学繊維学部

900

乳牛における炎症性子宮疾患の迅速診断を目指した子宮の炎症度スコアの確立清水隆

帯広畜産大学畜産衛生学研究部門

1,200

異なる発情判定基準による牛人工授精適期の再設定

坂口実

北里大学獣医学部

1,000

氷晶形成抑制効果の高いアミノ酸を利用した豚卵巣および精液の過冷却保存

星野由美

広島大学大学院
生物圏科学研究科

900

小針

大助

茨城大学農学部

1,100

阿部

宏之

山形大学大学院
理 工 学 研 究 科

1,000

800

赤外線深度センサーによる和牛の分娩予測技術の検討

H.26～

ミトコンドリア機能解析に基づく家畜優良胚選別法の開発
牛伸長胚の生育に関わる子宮内膜細胞因子の探索細江実佐

農 業 生 物 資 源
研
究所
動物発生分化研究
ユ ニ ッ トRhizopus oryzae水抽出物の肝障害抑制効果を応用した牛受精卵生産技術の向上

鈴木武人

麻布大学獣医学部

1,200

佐々木羊介

宮崎大学テニュア
トラック推進機構

900

繁殖疫学の手法を用いた黒毛和種牛繁殖農場の飼養形態の違いが繁殖成績に及ぼす影響の定量

H.26～© The Ito Foundation

神 戸 大 学
ツェンコヴァ 農 学 研 究 科
ルミアナ
生 体 計 測 工 学
研
究
室

1,000

武田久美子

農業･食品産業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,000

的場

理子

農業･食品産業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

900

牛白血病ウイルス高感染牛の予後の評価

目堅博久

宮 崎 大 学
テニュアトラック推 進 機 構1,100

鶏糞由来バイオセラミックによるウイルスの伝播抑制

竹原一明

東京農工大学大学
院 農 学 研 究

1,200

シカ肉に寄生する住肉胞子虫の形態学的・分子生物学的同定ならびに腸管毒性評価松田一哉

酪 農 学 園 大 学
獣医学群獣医学類

1,000

肉用鶏におけるSalmonella Agonaのemergingとその発生要因の解析鳥居恭司

東 京 農 業 大 学
農学部畜産学科

1,000

マダニの酸化ストレス制御分子を標的とした抗マダニワクチンの開発田仲哲也

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

800

食肉からの感染源となるトキソプラズマの休眠型虫体に関する研究加藤健太郎

帯広畜産大学原虫病研究センター800

鶏肉の生産性向上を目指した安全な原虫防除法の開発

松林誠

大 阪 府 立 大 学
大学院生命環境科 学 研 究 科

800

豚マイコプラズマ性肺炎抗病性育種ランドレース豚と一般ランドレース豚との自然免疫関連分子および腸内
環境比較

佐久間晶子

宮城県畜産試験場

1,100

磁気ビーズルシフェラーゼ免疫沈降法による抗豚流行性下痢ウイルス抗体検出系の開発

堀江真行

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部
附属越境性動物
疾 病 制 御 研 究
セ ン タ ー800

豚デルタコロナウイルスの感染動態に関する研究鈴木亨

農業･食品産業
技術総合研究機構
動物衛生研究所

1,200

国際競争に勝つ『サルモネラ‐ゼロ』モデル養豚場の
作出

末吉

益雄

宮 崎 大 学産 業 動 物 防 疫
リサーチセンター

1,000

900

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システム
の開発

H.25～

種雄牛の受胎性評価に資する精子メチル化可変部位の解明
肥育前の和牛雌子牛の摘出卵巣からの胚生産に関する
研究

H.26～

動物由来コロナウイルスの遺伝子操作系の確立と感染予防への応用

H.26～

神谷

亘

大阪大学微生物病研究所感染症
国際研究センター
臨床感染症学研究
グ ル ー プ

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発

H.25～

久米

新一

京都大学大学院
農 学 研 究 科

900

飼養環境下の牛群におけるマイコトキシン浸潤動態の検証―内分泌撹乱作用の有無と繁殖性に与える影響の
解明

髙木

光博

山 口 大 学
共 同 獣 医 学 部
臨床獣医学講座

800

非侵襲的生体電気インピーダンス法による牛枝肉脂肪
交雑の推定

橋元

大介

長崎県農林技術
開 発 セ ン タ ー

1,000© The Ito Foundation

食肉特性の向上を目指して：ポリフェノール給餌による遅筋型筋線維の形成誘導

辰巳隆一

九州大学大学院
農 学 研 究 院

1,200

リンゴジュース粕の機能性を生かした高付加価値豚肉生産技術の開発房

家琛

弘前大学農学生命
科
学
部

650

｢乳質の良さ｣ が注目されるブラウンスイス種乳牛の栄養･繁殖特性の解明

遠藤なつ美

東 京 農 工 大 学
農
学
部

1,000

黒毛和種におけるRBP4多型と枝肉形質の関連解析

H.25～

平野

貴

東 京 農 業 大 学
農
学
部

1,100

脂質代謝および感染症研究のための豚・牛由来肝臓細
胞の樹立

H.26～

福田

智一

東 北 大 学農 学 研 究 科

1,200

佐藤

衆介

帝 京 科 学 大 学
生 命 環 境 学 部

1,000

髙橋

秀之

九 州 大 学
農学部附属農場

900

放牧養豚用アニマルウェルフェア評価法の開発

瀬尾哲也

帯 広 畜 産 大 学
畜 産 学 部

600

効率的な家畜生産に資する生殖中枢メカニズムの解明

上野山賀久

名古屋大学大学院
生命農学研究科

1,100

木下

英樹

東海大学農学部
バイオサイエンス
学科

800

黒毛和種子牛における呼吸器病の血清亜鉛濃度および亜鉛投与による臨床的な症状改善効果の検討

乙丸孝之介

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

450

難培養性乳酸菌を用いた第３世代サイレージ添加剤の
開発

西野

直樹

岡山大学大学院環境生命科学研究科

800

食肉由来病原体に対する腸管免疫に関与する血清アミ
ロイドAの機能解析

猪島康雄

岐 阜 大 学
応用生物科学部
共 同 獣 医 学 科

600

平山

琢二

滋 賀 県 立 大 学
環 境 科 学 部

900

塚原

隆充

京 都 府 立 大 学
大学院生命環境科 学 研 究 科

1,100

籾米の給与を軸とした日本型動物福祉鶏肉生産技術の開発
初期成長期のミオスタチン制御が黒毛和牛の肉質に及ぼす影響

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性
家畜飼料の開発

牛肉の各部位に含まれる機能性成分に与える品種の影
響について

H.26～

H.26～

H.26～

同腹産仔間で成長が異なる仔豚の代謝特性比較
合

計

６９件

66,000© The Ito Foundation

伊藤記念財団賞© The Ito Foundation

397

尾嶋

孝一

国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

畜産研究部門畜産物研究領域

上級研究員〔業績の課題名〕

骨格筋細胞における筋原線維の形成とその構成タンパク質分解に関する
分子細胞生物学的研究〔業績の概要（受賞理由）〕
家畜の骨格筋形成過程では，形成初期段階で単核の筋芽細胞が分化することで多核の筋管細胞を形成し，筋線維へと成熟する。そのプロセスは食肉の生産効率性と品質に大きく影響し，その中で規則正しく形成される微細なタンパク質複合体の構造と性質が，テーブルミートや加工用原料肉の保水性等品質に直結する。
受賞者はこれまで，家畜よりも効率的に研究を推進できるマウスをモデル動物に用い，骨格筋組織の形成メカニズムの解明を進めてきた。
筋芽細胞については分泌するタンパク質性因子を網羅的に解析し，細胞分泌因子が筋形成に深く関与する可能性を明らかにした。また，霜降り肉に存在する脂肪細胞についても分泌性因子の網羅的解析を行い，筋細胞の場合との相違や，分泌性因子を介した異種細胞間の相互作用についての解析により，脂肪交雑形成において骨格筋および脂肪細胞が分泌する因子の重要性を見出している。筋分化した筋線維については，内部のタンパク質高次構造体（太いフィラメントと細いフィラメント）の伸張や代謝に関するメカニズムについて詳細を明らかにした。これらはミオシン等，
筋原線維タンパク質の性質の理解を前進させるものであり，その分子レベルの理解が新たな食肉加工品を設計する上で重要な基盤となるものと期待される。
さらに受賞者は，タンパク質分解酵素カルパインのうち，骨格筋特異的なカルパイン 3（ｐ94）に注目し，その生理的意義と酵素学的性質について追及した。その結果，ｐ94 のリン酸化の筋原線維形成への関与，筋小胞体上で Ca2+ 放出制御への関与，食肉の構造タンパク質コネクチンに結合すると不活化される特性，
その細胞内局在の筋原線維（サルコメア）の伸張・収縮等による変化，
またそのプロテアー
ゼ活性が骨格筋の運動ストレス緩和に関与する可能性等，他のカルパインにはない性質を明らかにした。
これらは，運動という骨格筋の本質やその細胞内のタンパク質蓄積メカニズムにｐ94 が密接に関係することを示唆し，家畜の筋量増加やその指標にｐ94 が応用できる可能性を示している。また，タンパ
ク質の高次構造形成に関与するｐ94 の作用機序解明は，食肉熟成中の筋原線維の崩壊メカニズムの解明に寄与し，食肉の軟化機構解明を前進させるものと期待される。以上のような成果は，筋細胞内での分子複合体構築等，基礎的な骨格筋形成メカニズムの解明に貢献してきただけでなく，今後，家畜改良のための育種メーカー開発や，食肉構成分子の性質を踏まえた食肉加工法開発など，効率的な食肉生産
技術や品質向上技術の開発に大きく寄与できる。

© The Ito Foundation

398

山内

啓太郎

東京大学大学院農学生命科学研究科

准教授〔業績の課題名〕

骨格筋前駆細胞群の分化制御機構解明を通じた高付加価値食肉生産のための知的基盤の確立〔業績の概要（受賞理由）〕
脂肪交雑割合や柔らかさ等，付加価値の高い食肉の生産は重要な課題であり，我が国の食肉産業の国
際競争力強化にも資するものである。現在，付加価値をもつ食肉生産は和牛に見られるように主として遺伝的な選抜と飼養管理によりなされているが，さらなる向上に向けた新技術開発には脂肪交雑成立のメカニズムや肉の柔らかさに影響を与えるコラーゲンの蓄積等についての科学的な理解が重要である。
受賞者はこれまでに骨格筋内に存在するさまざまな前駆細胞群の分化制御に関する研究に従事し，高付加価値の食肉生産のための知的基盤となり得る成果を多数あげてきた。以下にこれまでの主要な研究成果を示す。
１．筋発達制御における非筋細胞及び内分泌性液性因子の関与
骨格筋発達を負に制御する myostatin が骨格筋線維芽細胞で発現していることや，筋前駆細胞である
筋衛星細胞の活性化を担う HGF が脾臓から血流を介して供給されることを初めて見いだした。また，独自に開発した測定系により泌乳期や副腎機能低下時の活性型 myostatin の血中動態を明らかにし，これが胎子の骨格筋発達に深く関連している可能性を提示した。これらの知見は，骨格筋の発達が骨格筋内に存在する筋細胞以外の細胞や内分泌性因子による多様な制御を受けることを示すだけでなく，これらの細胞や因子が肉質改変の上で重要な標的となり得ることを明らかにしたものである。
２．骨格筋内脂肪細胞の起源である間葉系前駆細胞の同定及び筋分化−脂肪分化間の相互分化制御作用の発見
骨格筋内における脂肪交雑成立機序を解明する一端として，実験動物から家畜に至るまで骨格筋内には脂肪分化能やコラーゲンを産生する線維芽細胞への分化能をもつ間葉系前駆細胞群が存在することを示し，その性質を安定かつ忠実に維持した間葉系前駆細胞クローン 2G11 細胞の取得に成功した。この細胞を利用した研究により，骨格筋に存在する間葉系前駆細胞の脂肪分化能維持には FGF が必須であること，また間葉系前駆細胞が脂肪細胞へと分化した際には筋発達を負に制御することを見いだした。
同時に，筋衛星細胞の筋分化が活発に生じている環境では間葉系前駆細胞の脂肪分化は著しく制御されることから，筋発達（筋分化）と脂肪交雑（脂肪分化）との間に相互分化制御作用が存在することを明らかにした。さらに間葉系前駆細胞の分化制御に関わる因子を複数発見し（SPARC，CSPG4 など），
その新規作用調節機序について解明を行ってきた。これらの知見は，科学的な新規知見に基づいた脂肪蓄積（脂肪交雑）やコラーゲン蓄積の人為的制御による高付加価値食肉生産の方法論を開発する上で極めて有用である。

© The Ito Foundation

399

盧

尚

建

東北大学大学院農学研究科

准教授〔業績の課題名〕

高品質牛肉の産肉性を特徴づける脂肪細胞由来の新規調節因子の解明に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
食肉の肉質を評価する上で，「脂肪交雑」と「脂肪の質」は重要な形質である。育種改良や飼養技術の改善によりこれらの形質は改善されるが，そのためには，体内での皮下，内臓，筋肉内脂肪組織における脂肪細胞の形成と脂肪酸などの合成過程に関わる新規調節因子の解明など，応用技術を支える基礎
的な研究情報の蓄積がきわめて重要となる。受賞者はこれまで脂肪細胞由来の脂肪蓄積に関連する因子について同定と解析を行い，さらに産肉性との関連を調査して以下のような研究成果をあげている。
１．新規脂肪細胞由来のウシケメリン遺伝子の同定と脂肪蓄積との関連性の解析①

肝臓と脂肪組織で高いケメリン遺伝子の発現を確認した。また，ウシ培養脂肪細胞への分化過程
においてウシケメリン遺伝子の発現量が上昇し，ウシ脂肪細胞において脂肪細胞由来のアディポカ
イン，ケメリンが存在することを明らかにした。

②

ケメリンアナログペプチドを投与してインスリン分泌を刺激し，ケメリンが糖脂質代謝の調節作用を持つことを明らかにした。

③

ウシ培養脂肪細胞と肝細胞において，アディポカインや脂肪酸の自己分泌／傍分泌的な作用によりケメリンの発現が調節され，体内ではエネルギーの放出や取り込みを制御する可能性を示唆する結果を得た。

２．黒毛和種牛のケメリン遺伝子一塩基多型が枝肉形質および遺伝子発現に与える影響
ケメリン遺伝子のコード領域内に 3 箇所の一塩基多型（c.12A ＞ G（4aa），c.276C ＞ T（92aa），c.321
Ａ＞ G（107aa））を発見し，枝肉形質との関連性を調べたところ，c.276C ＞Ｔの一塩基多型と経済形質である BMS NO. 等との間に関連性があることを明らかにした。
３．反芻動物の産肉性に関わる脂肪細胞分化と形成に関わる遺伝子について解析し，脂肪蓄積を調節す
るシグナルおよびメカニズムの解析に共役リノール酸，TNF−α，adipogenin などの果たす役割が大きいことを報告した。
４．新規脂肪蓄積調節因子を探索するために，ウシの皮下および内臓脂肪組織において網羅的遺伝子解析を行い，脂肪蓄積に関連する遺伝子を同定し，解析を行った。
以上の研究成果は，ケメリンが牛肉の脂肪交雑に関して重要な役割を果たすと同時にその一塩基多型
が BMS No. を高める上で重要な遺伝的指標となることを明らかにしたものである。基礎的研究情報を
高品質牛肉生産を特徴付ける応用技術として発展させその利用可能性を検討した内容である。

© The Ito Foundation

400

若 松

純 一

北海道大学北方生物圏フィールド科学センター

准教授〔業績の課題名〕

食肉製品中の新規赤色色素の形成機構および食肉の体熱産生機構に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
受賞者は，非加熱食肉製品中で形成される新規赤色色素・亜鉛プロトポルフィリン IX（ZnPP）の形
成機構ならびに食肉の体熱産生機構に関する研究を行ってきている。主要な成果は以下に要約される。
１．食肉製品中の新規赤色色素の形成機構に関する研究
イタリアのパルマハムなどでは発色剤を使用していないにもかかわらず好ましい色調を発現するが，その色調発現機構は不明であった。受賞者はパルマハム中の色素の同定を試み，パルマハムではヘム内の鉄が亜鉛に置き換わった赤色色素・亜鉛プロトポルフィリン IX（ZnPP）が形成されていることを世界で初めて明らかにし，食肉研究の分野で国際的にも高い評価を得た。その ZnPP 形成機構を解明する手法としてモデル実験系を開発し，ZnPP 形成には食肉の内在性酵素が関与すること，酸素存在下で
ZnPP 形成は阻害されることを示した。さらに，金属キレート剤を加えると前駆物質であるプロトポル
フィリン IX（PPIX）が形成・蓄積され，ZnPP 形成にはミオグロビンのヘムの関与は小さいことから，
ZnPP は PPIX に亜鉛が挿入されて形成される可能性が高いことを示した。また，紫色 LED を照射してZnPP の自家蛍光を観察する方法を開発し，パルマハム中の ZnPP の分布を調べた結果，肉塊の中心部と脂肪組織に比較的強い ZnPP の蛍光が観察され，空気の触れる肉塊切開面直下では ZnPP がほとんど形成されないことを示した。また，ZnPP，PPIX，ヘムの一括抽出・同時測定法を確立し，パルマハム
中で ZnPP 量はヘムの約 2 倍含まれており，ZnPP がパルマハムの色調に大きく寄与することを示した。
２．食肉と健康関連・食肉の体熱産生能機構に関する研究
食肉には，畜種によって我々の体を温めたり冷やしたりする効果があることが古くから経験的に知られているが，そのメカニズムは不明であった。そこで，食肉による食餌誘発性体熱産生能の違いとそのメカニズムについて栄養学的研究を行った。羊肉，豚肉，牛肉および兎肉をタンパク資源ならびに脂質原としてラットに与えた結果，食後の体温は兎肉，牛肉，豚肉，羊肉の順に高くなり，体を温めると言われている羊肉で体温を上昇させる効果があることを実証した。そこで，羊肉を分画してラットに与えたところ，精製タンパク質画分は脱脂羊肉画分と同様に高い体温上昇効果が示され，羊肉タンパク質摂取時には甲状腺ホルモンの分泌促進とエネルギー代謝促進が関与していることが示唆された。また，羊肉，鶏肉，豚肉，牛肉，馬肉からタンパク質を精製してラットに与えた結果，鶏肉ならびに羊肉タンパ
ク質の摂取により食後の体温が有意に上昇し，甲状腺ホルモンの標的遺伝子およびタンパク質の発現量が有意に増加した。以上の結果から，畜種による食肉の食餌誘発性体熱産生能の違いは，食肉タンパク質に起因すること，ならびに甲状腺ホルモンが深く関係することを明らかにした。

© The Ito Foundation食肉に関する助成研究調査成果報告書
Final Reports for Research Grants for Meat and Meat Products

平成27年度（Vol. 34）
2016年11月

発行

編集・発行 ― 公益財団法人伊藤記念財団
THE ITO FOUNDATION
東京都目黒区三田 1 丁目 6 番21号

アルト伊藤ビル〒 153-8587
Alt Ito Building, 1 -6 - 21 Mita, Meguro - ku, TOKYO
153-8587 JAPANTEL：03（5720）8611
FAX：03（5720）8612
印刷・製本 ― 株式会社友楽社＜非売品・無断禁転載＞© The Ito Foundation