令和３年度

食肉に関する
助成研究調査成果報告書

公益財団法人

伊藤記念財団

VOL. 40

「伊藤記念財団」設立趣意書
私，伊藤傳三は，昭和３年食肉加工業を創業して以来五十有余年の永きにわた
り食肉加工品の製造販売に従事して参ったところであります。
この間，昭和47年からは日本ハム・ソーセージ工業協同組合理事長，社団法人
日本食肉加工協会理事長，加えて，ハンバーグ・ハンバーガー協会理事長等の重責を担わせていただく等，業界団体の役員を勤めさせていただいてきたところであります。
こうした中で昭和55年，はからずも勲二等瑞宝章受章という身にあまる栄誉に浴したのでありますが，受章に際し私自身の過ぎ来し方を振り返り，食肉及び食
肉加工業界の行く末に思いを致し，２つの事柄を決意致しました。
第１は，食肉加工団体の指導体制の若返りであり，第２は，食肉加工業の基礎的研究の充実であります。
諸情勢が激しく変わりつつある中で食肉加工業界をさらに大きく発展させるには，新しいリーダーの登場が望ましいことは論をまちません。また，食肉加工品については，これまでも日本独自の技術開発は行われてきましたものの，いずれも企業内技術であると言っても過言でなく，大学等における基礎的研究の不足が将来の日本の食肉加工業の発展を遅らせるおそれがあり，この現状を打破する必要があると考えたところであります。
以上のような基本的考えの下に私は，食肉関係団体等の役員を辞すると共に，
食肉及び食肉加工に関する基礎的かつ広汎な研究を行い，あるいは助長するための財団の設立を発起するものであります。
昭和56年６月
設立発起人© The Ito Foundation

伊

藤

傳

三

Philosophy Behind the Establishment of
the Ito Foundation
Approximately half of a century has passed since I established a meat
packing corporation for commercial products in 1928. While involved in thisbusiness, I have had occasion to serve as chairman of the boards of trustees
of several organizations related to the meat industry, such as the HamSausage Industrial Association of Japan in 1972, the Meat Packing Industrial
Association of Japan, and the Hamburg-Hamburger Association of Japan.
In 1980, unexpectedly, I was highly honored to receive the Order of the
Sacred Treasure, Gold and Silver Star from the emperor in acknowledgement of my contributions to the meat industry and improved human nutrition
during my career. This illustrious award provided a strong impetus for me toact on my long-standing concern for the future of meat packing industries.
My commitment to the establishment of a new research foundation for thepromotion of meat science was based on two fundamental philosophies : first,
leadership of the Association of the Meat Packing Industry should be transferred to people with novel ideas and, second, an advanced system for basic
research should be established in meat industries. Clearly, fresh leadership isneeded in changing situations for intensive development in the meat packing
industry. Although some technical product developments have been achievedin certain individual corporations, the lack of basic research in meat scienceat universities and other research organizations certainly will impede future
development of Japanese meat packing industries. It is urgent to end the stagnation in the meat industry through research support.
On the basis of these philosophies, I myself will resign from any official
positions in meat-related associations and will establish a new researchfoundation to support and promote basic and applied research in meat
science.
Denzo Ito, Founder
June© The Ito Foundation

1981

事 業 の あ ら ま し（目

的）本財団は，食肉に関する研究及び調査を行い，もって畜産業及び食品産業の振興と国民食生活の安定に資することを目的とする。
（事業）

本財団は，上述の目的を達成するため，次の事業を行う。
⑴

食肉の生産，処理，加工等に関する基礎的研究及び調査⑵

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査を行う大学等の研究機関に対する助成⑶ 食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査に優れた業績が認められる研究者の表
彰⑷

食肉の生産，処理，加工等に関する情報の普及及び広報© The Ito Foundation

（事業実績）年度
昭和57年度
58
59
60
61
62
63
平成元年度
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31（令和元年度）
2
3

第１回
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40

研究調査助成48件 60,000千円
52
54,40060
49,80062
48,00070
53,00079
58,90095
70,50086
74,25079
60,00070
50,00086
60,00081
60,00081
60,00082
65,00081
69,10078
59,00082
60,00067
47,00057
41,00053
37,00058
40,00055
41,00055
48,00056
48,00011
10,00012
10,00015
16,90011
10,000
11
10,40012
12,00013
13,00038
37,00058
54,80069
66,00071
69,00074
75,00084 101,200
74 105,000
79 105,000
80 110,000

伊藤記念財団賞授賞

第１回
２
３
４
５
６
７

© The Ito Foundation

4名（8,000千円）
3名（6,000千円）
2名（4,000千円）
3名（6,000千円）
3名（6,000千円）
2名（4,000千円）
3名（6,000千円）

学会等助成事業

3団体（3,700千円）
2団体（2,500千円）
3団体（3,795千円）
3団体（4,990千円）
3団体（4,500千円）
3団体（6,000千円）

ご

挨

拶

当伊藤記念財団は，伊藤ハム株式会社の創業者故伊藤傳三による巻頭の「設立趣意書」に掲げた趣意をもって，昭和56年７月３日に財団法人として農林水産大臣から設立を許可され、平成24年４月１日に公益財団法人伊藤記念財団に移行登記したものであり，事業の内容は，「事業のあらまし」にあるとおりであります。
おかげ様で当財団は，平成24年度からは公益財団法人として活動することとなり，その活動は本年で40年となります。この間，当財団の研究調査助成事業の存在が畜産関係の方々の間に浸透いたし，事業内容も逐次充実して参りつつあります。
これは，ひとえに関係各位のご指導ご鞭撻の賜と深く感謝申し上げるとともに，今後とも，
食肉加工等の基礎的研究の充実を希う創設者の意志にそって，益々食肉産業ひいては畜産業の振興及び国民食生活の安定のために役立つべく，更に努力を重ねて参りたいと存じております。
本書は，40回（令和３年度）助成事業における80件の研究調査助成対象研究者の皆様からいただいた研究成果報告とともに，第７回となります伊藤記念財団賞授賞事業の受賞者とその業
績概要と学会等事業助成の概要をとりまとめたものでありますが，以上の目的にしたがって，
食肉産業の基礎的研究等に携わる諸氏の研究の一助ともなれば幸甚でございます。
令和４年11月

理事長

伊

藤

功

一

Dear Sir：
I am very pleased to send you and your organization a complimentary copy of theresearch reports of the Ito Foundation. This research foundation was founded by the late
Mr.Denzo Ito to advance research in meat science. The research reports are publishedannually. Unfortunately, the articles are largely in Japanease ; however, in the future wehope to contribute to the international development of meat science. Any constructive
suggestions or critiques from others involved in meat-related research would be accepted
gratefully.
You will find out philosophy behind the establishment of the Ito Foundation describedby Mr.Denzo Ito, in the research report of the Ito Foundation, Vol.40 enclosed here. We
appreciate any interest you may have in our research efforts.
It is my great pleasure to publish this report as the chief director.
Sincerely yours,
Nov. 2022
Koichi Ito
The chief director
The Ito Foundation© The Ito Foundation

i

研究助成事業目次

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンⅨの形成様相と存在形態に関する研究（Ⅲ）


若松

純一・阿部

悠・翟

洋（北海道大学大学院農学研究院）

3

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅲ）


竹

中

慎

治（神戸大学大学院農学研究科）

9

食肉加工品の塩漬熟成に認められる「塩なれ」に関する研究－食肉加工品の塩味に対する遊離脂肪酸の影響－
中村

幸信・内海

寛子・吉田

由香・猪口



由美

（一般社団法人食肉科学技術研究所）

16

食肉の品質を制御する遺伝的要因に関する多因子複雑系の解析：細胞骨格との関連からのアプローチ


灘

野

大

太（名古屋大学大学院生命農学研究科）

21

国内標準化を目的とした食肉の可食期間延長技術の検証
中


村

好

德

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センター）

26

枝肉の 3D グラフィック化システムの製作（Ⅲ）
本山

三知代・石田



翔太・渡邊

源哉・中島

郁世・佐々木啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

31

イミダゾール化合物が食肉の熟成に及ぼす影響について（Ⅱ）
早川徹（北海道大学大学院農学研究院）

37

ポークソーセージにおけるタンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明


西村

敏英・山口

千里（女子栄養大学栄養学部）

41

三治男（南九州大学健康栄養学部）

49

靖之（名古屋大学大学院生命農学研究科）

58

島

66

食肉加水分解物の栄養機能について


竹之山

愼一・川北

久美子・六車プレバイオティクスによる食肉の効果的な栄養利用の研究


大島

健司・髙原

彩那・北浦

鶏肉の低温調理におけるカンピロバクターの消長下優香子（相模女子大学栄養科学部）

ハム・ソーセージの食品添加物に関するスマート・リスクコミュニケーションの改良研究ならびに効果検証


山﨑

毅・山﨑

深雪（特定非営利活動法人食の安全と安心を科学する会）© The Ito Foundation74

ii
近赤外光と偏光，AI を組み合わせた食肉中の虫および異物検知技術の開発


山

口

堅

三（徳島大学ポストLEDフォトニクス研究所）

82

ニワトリ骨格筋成長に遺伝子変異が及ぼす影響の全ゲノム解析に基づく解明


石

原

慎

矢（日本獣医生命科学大学応用生命科学部）

87

早産を伴う子牛死亡に関連する遺伝的要因の解明
貴１ ・村木平野


英二２・佐々木慎二３（１東京農業大学農学部，２岐阜県畜産研究所飛騨牛研究部，３琉球大学農学部）

93

ウシ複合脊椎形成不全症の病態解析とウシの骨格成長に重要な糖鎖の同定


古

市

達

哉（岩手大学農学部共同獣医学科実験動物学研究室）

99

肥育豚の霜降り割合の指標となるバイオマーカーの特定

谷口雅章１・中島郁世１・荒川愛作１・吉岡豪２・鈴木香澄２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，
２

岐阜県畜産研究所養豚・養鶏研究部）

104

肉用牛の枝肉形質および肉質の診断マーカーとしての血中マイクロ RNA の動態解析（Ⅱ）


横

井

伯

英（京都大学大学院農学研究科）

110

則章（山形県農業総合研究センター畜産研究所）

115

黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立


中嶋

宏明・庄司

黒毛和種における経腟採卵前のヒアルロン酸添加ブタ FSH 製剤１回筋肉内注射の効果に関する研究（Ⅱ）


俊徳１・沼邊

及川孝２（１宮城県畜産試験場，２みやぎ農業振興公社）

123

ウシ二次卵胞の発育制御における TNFα受容体の役割


平

山

博

樹（東京農業大学生物産業学部）

129

体外受精由来ウシ胚盤胞の可逆的発生停止を誘導する体外培養法の開発ならびにその誘導による胚盤胞の胚質改善の可能性


石

井

利

通（三重県畜産研究所）

135

受精卵の未凍結保存における植物由来成分の有効性検証と配合の最適化


星

野

由

美（日本女子大学理学部）

140（１北海道立総合研究機構酪農試験場，２大阪公立大学大学院獣医学研究科）

145

内腔の有無に着目したウシ形成期黄体の機能解析
友瑛１・古山窪

敬祐２

牛黄体血流の多寡は子宮内膜機能の局所調節に関与するのか？


金澤

朋美・木崎

景一郎（岩手大学農学部共同獣医学科）

152

ウシにおけるルーメン非分解性ナイアシン給与による子宮，卵巣への血流促進による分娩後の繁殖性向上（Ⅱ）
森


田

康

広

（名古屋大学大学院生命農学研究科，名古屋大学アジアサテライトキャンパス学院）© The Ito Foundation

158

iii
黒毛和種における不明瞭な発情発生メカニズムの黄体退行の観点からの解明
法上


拓生・堀畑

慶

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センター）

165

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の確立（Ⅱ）
久保田

海雄・三輪



雅史・阪谷

美樹

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

171

生殖巣始原生殖細胞を用いた新規家禽遺伝資源保存法の開発


中

島

友

紀（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

177

機能性脂肪酸を活用した黄体機能強化による乳牛繁殖成績改善技術の確立
山口昇一郎・藤井直人１・山田

英之・青木



豊１・柿原

孝彦

（福岡県農林業総合試験場，１油化産業株式会社）183

卵胞刺激ホルモンを用いた夏季における繁殖母豚の発情回帰遅延対策技術の開発
 内倉

健造・田島

茂行・山本

るみ子・豊島浩一（愛知県農業総合試験場）

188

ウシ初期黄体における PG 抵抗性の解明－低酸素環境による抗アポトーシス機構－（Ⅱ）


西村

亮・菱沼

貢（鳥取大学農学部共同獣医学科獣医繁殖学）

194

発情期における牛子宮内膜機能調節因子および調節機序の解明（Ⅱ）


杉浦

智親・中田

健（酪農学園大学獣医学群動物生殖学ユニット）

199

ウシにおける排卵後の血中エストラジオール増加の検知による受胎性評価


松

井

基

純（帯広畜産大学獣医学研究部門）

205

黒毛和種雌牛の繁殖成績を改善するための栄養状態の最適化検討鍋

西久（北里大学獣医学部）

211

抗酸化物質を利用したウシ体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した
新規 OPU-IVF-ET による子牛生産システムの開発（Ⅱ）
日巻

武裕１，２・中川

裕喜１・多治見弘史３（１岐阜大学応用生物科学部，２岐阜大学自然科学技術研究科，３多治見牛ETクリニック）

217

分娩前の複合型アミノ酸ペレット給与が乳牛の繁殖成績に及ぼす影響


住

吉

俊

亮（日本大学生物資源科学部獣医学科）

224（１北海道立総合研究機構畜産試験場，２北海道立総合研究機構酪農試験場）

232

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討（Ⅱ）
小山


毅１・若槻

拓司２

アフリカ豚熱の侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅳ）


杉浦

勝明・芳賀

猛（東京大学大学院農学生命科学研究科）

239

尾根部の体表温度から黒毛和種育成子牛の発熱を検知する手法の開発（Ⅱ）
佐々木

瑞穂＊（宮崎大学農学部，＊NOSAI宮崎）247介（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

253

羊介・上松

イノシシにおける豚コロナウイルスの感染実態調査


中

川

敬

© The Ito Foundation

iv
PRRS ウイルス感染初期における鼻腔内ウイルス動態の解析


平

井

卓

哉（宮崎大学農学部）258

祐太（大阪大学微生物病研究所）

263

家畜に下痢を引き起こすロタウイルスの遺伝子改変技術
金

井

地方病性牛伝染性リンパ腫発症機序の解明と予後診断法の確立


森

宏・岡崎

克則（北海道医療大学薬学部）

270

牛伝染性リンパ腫ウイルス由来の非翻訳性 RNA と結合する宿主タンパク質の同定（Ⅱ）
安

藤



清

彦

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

276

牛のストレス応答における肝臓機能の解明
グルゲ


キールティ

シリ・吉岡

都

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

282

補体制御性タンパク質 CD46 の豚熱ウイルス受容体としての機能解析
岩丸

祥史１・池田圭吾１・原口清輝２（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構



２

１

動物衛生研究部門， 生物機能利用研究部門）

288

家畜用ワクチンのための新規ワクチンプラットフォームの構築


新

地

浩

之（鹿児島大学学術研究院理工学域工学系）

294

炎症マーカーの代わりに安価で簡単に測定できる血清 Fe 濃度で牛複合性呼吸器疾患の炎症評価が可能か？
鈴木

一由・塚野

健志・村上

義樹・大塚



まりな
（酪農学園大学獣医学群）

299

映像解析技術を用いたアブの吸血行動の定量的解析による病原体媒介リスクの可視化菅沼啓輔１・ Acosta J. Tomas２・齊藤

朋子２（１帯広畜産大学グローバルアグロメディシン研究センター・原虫病研究センター，

２

帯広畜産大学畜産学部）

305

サルモネラ鶏卵汚染・介卵感染に寄与する鶏卵巣での菌・宿主細胞間相互作用の解明


岡

村

雅

史（帯広畜産大学獣医学研究部門）

311

ジビエおよび家畜動物におけるトキソプラズマ感染の頻度と新規検査方法の開発
保科

斉生１，２・櫻井

達也３・嘉糠

洋陸２，３（東京慈恵会医科大学 １感染制御科，２実験動物研究施設，３熱帯医学講座）

318

網羅的ジェノタイピングによる新規牛伝染性リンパ腫抵抗性遺伝子の同定（Ⅲ）


目

堅

博

久（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）

323

牛の腸アミロイド症の根絶を目的とした AA アミロイド症原因遺伝子の同定
上家© The Ito Foundation

潤一（麻布大学獣医学部）329

v
牛伝染性リンパ腫ウイルス感染症に対する新規治療薬の開発


岡

川

朋

弘（北海道大学大学院獣医学研究院）

334

ルーメンアシドーシスに伴うエンドトキシン体内流入と肝機能障害を防除する技術の開発


米

倉

真

一（信州大学農学部）

340

作（広島大学大学院統合生命科学研究科）

344

母体の乳生産性向上による効率的な肥育を目指す基礎的研究


津

上

優

日本短角種去勢牛の２シーズン放牧肥育における放牧管理改善による肉質向上


上田

宏一郎・呉

成真（北海道大学大学院農学研究院）

350

夏季に調製した発酵混合飼料の泌乳牛における利用適正－窒素利用効率に基づく検証－
誠１・関田

近藤


梨々花１・股村真也１・永墓

訓明２・平岡啓司２（１三重大学大学院生物資源学研究科，２三重県畜産研究所）

356

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究（Ⅱ）
昌宏１，２・阿部

保田


信介１，３

（１宮崎大学大学院医学獣医学総合研究科，２宮崎大学農学部，３宮崎県農業共済組合）

362

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究（Ⅲ）－ Diet Selection 能力の活用によるアミノ酸給与の精密化－


勝

俣

昌

也（麻布大学獣医学部）

367

国産子実用トウモロコシの乾燥温度および貯蔵条件がトウモロコシの栄養価に及ぼす影響（Ⅱ）
善哉１・金井篠遠源太１・嶝野英子１・芦原茜２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター，
２

国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

372

多頭飼養の牛群において反芻を含む行動型判別を可能とする映像モニタリング技術の開発
多


田

慎

吾

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構北海道農業研究センター）

378

寒地型多年生牧草採草地が１年生イネ科草種（自生イタリアンライグラス－イヌビエ・メヒシバ）
交代植生に遷移する気候・土壌要因の解明と飼料価値の評価
池


田

堅太郎

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター）

385

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証（Ⅱ）
西本


完１・小林

寿美２・大津

晴彦２（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 １食品研究部門，２畜産研究部門）

391

子牛用疑似グルーミング装置利用モニタリングによる健康状態評価手法の開発
矢用

健一１・野上大史２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，２九州大学）

398

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可能性（Ⅲ）


松

﨑

正

© The Ito Foundation

敏（弘前大学農学生命科学部）

404

vi
木材クラフトパルプとカンショ焼酎粕を原料としたサイレージの給与が黒毛和種肥育牛の第一胃内発酵に及ぼす影響


前

田

友

香（宮崎県畜産試験場）409

採卵日齢に起因するヒナ品質がブロイラー異常硬化胸肉の発現に及ぼす影響の解明


岩

崎

智

仁（酪農学園大学農食環境学群）

416

乳用子牛における消化管機能強化および消化管由来の炎症予防に関する研究


福

森

理

加（酪農学園大学獣医学群）

423

睡眠様姿勢―肉用牛の生産性およびウェルフェアの新たな行動指標の検討


深澤

充・盧

尚健（東北大学大学院農学研究科）

431

裕（宮崎大学フロンティア科学総合研究センター）

437

ゲノム編集による高消化性暖地型イネ科牧草の開発（Ⅱ）


権

藤

崇

牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技術の開発（Ⅱ）
庄司

則章１・上野

豊２（１山形県農業総合研究センター畜産研究所，２信州大学農学部）443

畜産汚水処理施設の低コスト水質監視システムの開発
富谷

信一１・影山智明２，３・三浦政司３・宮崎隆４・堀尾靖史４（１鳥取県中小家畜試験場，２合同会社TURIPテクノロジズ，３鳥取大学学術研究院，
４

株式会社アクシス）



451

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響（Ⅱ）
松永

将伍１・深川

聡１・井尻



大地２

（１長崎県農林技術開発センター，２鹿児島大学農学部）

457

ウシの低受胎を改善する技術創出を目指した子宮マイクロバイオーム解析
内山淳平１・八木沢拓也２・片桐成二３（１岡山大学大学院医歯薬学総合研究科病原細菌学分野，２北海道中央農業共済組合，

３

北海道大学大学院獣医学研究院）

464－

牛ウイルス性下痢ウイルスの準種 END は弱毒生ワクチンになるか？（Ⅱ）－より効果的に免疫を誘導するための可能性の追求―塩川舞（日本獣医生命科学大学獣医学部獣医保健看護学科）© The Ito Foundation

472

vii

CONTENTS
Studies on the formation and the existence form of zinc protoporphyrin IX in dry-cured ham（Ⅲ）
Jun-ichi Wakamatsu, Haruka Abe and Yang Zhai
（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University） 

3Developments in technology for meat processing by fungal aspartic protease（Ⅲ）
Shinji Takenaka（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University） 

9Studies of mild saltiness induced by curing maturation－ Effects of free fatty acid on saltiness of meat products －Yukinobu Nakamura, Hiroko Utsumi, Yuka Yoshida and Yumi Inoguchi（Japan Meat Science and Technology Institute） 

16

Analysis of the complex system composed of multiple genetic factors regulating meat quality: approaches in relation to the cytoskeleton
Daita Nadano（Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University） 

21

Verification of edible period extension technology for meat for the purpose of domestic
standardization
Yoshi-nori Nakamura（Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, NARO） 

26

Development of a system for rendering 3D computer graphics of meat carcasses（Ⅲ）
Michiyo Motoyama, Shota Ishida, Genya Watanabe, Ikuyo Nakajima and Keisuke Sasaki（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

31

Effect of imidazole compounds on the aging of meat（Ⅱ）
Toru Hayakawa（Hokkaido University, Research Faculty of Agriculture） 

37Clarification of the mechanism for holding aroma compounds by proteins in pork sausages
Toshihide Nishimura and Chisato Yamaguchi（Faculty of Nutrition Science, Kagawa Nutrition University） 

41

Nutritional function of meat hydrolysates
Shinichi Takenoyama, Kumiko Kawakita and Michio Muguruma（Faculty of Health and Nutrition, Minami Kyushu University） © The Ito Foundation

49

viii
Studies on effective nutritional utilization of meat with prebiotics
Kenzi Oshima, Ayana Takahara and Yasuyuki Kitaura（Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University） 

58

Survival of Campylobacter jejuni/coli in low temperature cooking poultry meat
Yukako Shimojima（Faculty of Nutritional Science, Sagami Women’s University） 66

Improvement research and evaluation of smart risk communication on the food additives in
ham and sausage
Takeshi Yamasaki and Miyuki Yamasaki（NPO, Science of Food Safety and Security（SFSS））

74

Detecting foreign object in meat using near-infrared light with polarization and artificial
intelligence
Kenzo Yamaguchi（Institute of Post-LED Photonics, Tokushima University） 82

Whole-genome analysis of the effects of genetic mutations on chick skeletal muscle growth
Shinya Ishihara（Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary and Life Science University） 

87

Genetic factor associated with calf mortality with preterm birth
Takashi Hirano １, Eiji Muraki ２ and Shinji Sasaki ３（１Tokyo University of Agriculture, Faculty of Agriculture, ２ Gifu Prefectural Livestock ResearchInstitute, Hida Beef Cattle Research Department, ３Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus）



93

Pathophysiology analysis of bovine complex vertebral malformation and identification of sugar
chains important for bovine skeletal growth
Tatsuya Furuichi（Laboratory of Laboratory Animal Science and Medicine, Co-Department of Veterinary Medicine,
Faculty of Agriculture, Iwate University） 99Biomarker discovery for breeding highly marbled pork production
Masaaki Taniguchi １, Ikuyo Nakajima １, Aisaku Arakawa １, Go Yoshioka ２ and Kasumi Suzuki ２（１Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, ２Gifu Prefectural Livestock Research Institute）



104

Analysis of dynamics of circulating microRNAs as biomarkers for diagnosis of carcass traits
and meat quality in beef cattle（Ⅱ）
Norihide Yokoi（Graduate School of Agriculture, Kyoto University） © The Ito Foundation

110

ix
Establishment of breeding improvement method for “sweet smell” in Japanese Black beef
Hiroaki Nakajima and Noriaki Shoji（Livestock Research Institute, Yamagata Integrated Agricultural Research Center） 

115

Effect of single shot intramuscular injection of porcine FSH mixed with hyaluron acid prior to
ovum pick-up in Japanese Black cattle（Ⅱ）
Toshinori Oikawa １ and Takashi Numabe ２（１Miyagi Prefectural Livestock Experiment Station, ２Miyagi Agricultural Development Corporation）



123

Roles of TNFα receptors in development of bovine secondary follicles
Hiroki Hirayama（Faculty of bioindustry, Tokyo University of Agriculture） 

129

Possible improvement of embryonic quality of in vitro derived bovine blastocysts by inductionof diapause-like state in in vitro culture
Toshimichi Ishii（Mie Prefectural Livestock Research Center） 

135

Effects of plant-derived ingredients on non-cryogenic preservation of early embryos, and its
blending optimization
Yumi Hoshino（Faculty of Science, Japan Women’s University） 

140

Function analysis of the corpus luteum with cavity during luteal formation in cows
Tomoaki Kubo １ and Keisuke Koyama ２（１Dairy research center, Hokkaido research organization, ２Graduate school of veterinary science, Osaka
metropolitan university） 145

Is bovine blood flow involved in the local regulation of endometrial functions?
Tomomi Kanazawa and Keiichiro Kizaki（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University） 

152

Improvement of post-partum reproductive performance by rumen protected niacin
supplementation in cattle（Ⅱ）
Yasuhiro Morita（Graduate School of Bioagricultural Sciences, Asian Satellite Campuses Institute, Nagoya University）



158

Elucidation of mechanisms for silent heat from luteal regression in Japanese Black Cows
Takuo Hojo and Kei Horihata（Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, NARO） © The Ito Foundation

165

x
Identification of a molecular marker for the uterine involution to affirm the female fertility inJapanese Black cow（Ⅱ）
Kaiyu Kubota, Masafumi Miwa and Miki Sakatani（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

171

Developing new method of conservation of poultry genetic resources using gonadal primordial
germ cells
Yuki Nakajima（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

177

Functional fatty acid diet improves the reproductive performance of dairy cows by boosting
their luteal function
Shoichiro Yamaguchi, Hideyuki Fujii, Naoto Aoki １, Yutaka Yamada １ and Takahiko Kakihara（Fukuoka Agricultural Research Center, １Yuka Sangyo Co., Ltd.） 

183

The development of method of estrus induction for weaning sow in summer using follicular
stimulating hormone
Kenzo Uchikura, Shigeyuki Tajima, Rumiko Yamamoto and Koichi Toyoshima（Aichi Agricultural Research Center） 

188

The mechanisms of PG-resistance in bovine early corpus luteum － hypoxia-induced antiapoptotic mechanism －（Ⅱ）
Ryo Nishimura and Mitsugu Hishinuma（Laboratory of Theriogenology, Joint Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture,
Tottori University） 

194

Study on bovine endometrial function regulator and regulatory mechanism during estrus（Ⅱ）
Tomochika Sugiura and Ken Nakada（Laboratory of Theriogenology, Department of Veterinary Medicine, Rakunogakuen University） 

199

Evaluation of fertility by detecting increase in blood estradiol after ovulation in cattle
Motozumi Matsui（Department of Veterinary Medicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine ）

205

Optimizing nutritional status to improve the reproductive performance of Japanese Black cows
Hisashi Nabenishi（Department of Animal Science, School of Veterinary Medicine, Kitasato University） 

211

Improvement of bovine in vitro fertilized embryo production technology using antioxidants anddevelopment of calf production system by new OPU-IVF-ET method（Ⅱ）
Takehiro Himaki １，２, Hiroki Nakagawa １ and Hiroshi Tajimi ３（１Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University, ２ Graduate School of Natural Science andTechnology, Gifu University, ３Tajimi bovine ET clinic） © The Ito Foundation

217

xi
Effect of prepartum administration of rumen - protected complex amino acids pellet on
reproductive performance of the dairy cow
Toshiaki Sumiyoshi（Laboratory of Theriogenology, Department of Veterinary Medicine, College of Bioresource Science,
Nihon University） 

224

Examination of new selection method of recipient cow based on ovarian reserves（Ⅱ）
Takeshi Koyama １ and Takushi Wakatsuki ２（１Animal research center, Hokkaido research organization, ２Dairy research center, Hokkaido researchorganization） 

232

Epidemiological research on the risk assessment of introduction of African swine fever intoJapan
Katsuaki Sugiura and Takeshi Haga
（Department of Veterinary Medical Science, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The
University of Tokyo） 

239

Detection of fever of Japanese Black calves by ventral tail base surface temperature（Ⅱ）
Yosuke Sasaki and Mizuho Uematsu ＊（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki, ＊ NOSAI Miyazaki） 

247

Epidemiological survey of porcine coronavirus-infection in Japanese wild boars
Keisuke Nakagawa（Joint Department of Veterinary Medicine Faculty of Applied Biological Sciences,
Gifu University） 

253

Analysis of intranasal viral dynamics in the early stage of PRRS virus infection
Takuya Hirai（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki） 

258

Development of reverse genetics technology for rotaviruses of livestock
Yuta Kanai（Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University） 

263

Study for control of enzootic bovine leucosis
Hiroshi Mori and Katsunori Okazaki（Department of Pharmaceutical Sciences, Health Sciences University of Hokkaido） 270

Identification of host-derived proteins interacting with BLV non-coding RNA（Ⅱ）
Kiyohiko Andoh（National Institute of Animal Health, NARO） 

276

The role of the liver in the oxidative stress response of cattle
Keerthi S. Guruge and Miyako Yoshioka（National Institute of Animal Health, NARO） © The Ito Foundation

282

xii
Functional analysis of porcine complement regulatory protein CD46 upon classical swine fever
virus infection
Yoshifumi Iwamaru １, Keigo Ikeda １ and Seiki Haraguchi ２（１National Institute of Animal Health, ２Institute of Agrobiological Science, NARO） 

288

Development of a novel platform for veterinary vaccines
Hiroyuki Shinchi（Graduate School of Science and Engineering, Kagoshima University） 

294

Simple and inexpensive evaluation of inflammation in bovine respiratory disease complex using
serum Fe concentration as an alternative to inflammatory markers
Kazuyuki Suzuki, Kenshi Tsukano, Yoshiki Murakami and Marina Otsuka（School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University） 

299

The clarification of pathogen transmission risk by quantitative video image analysis of blood
sucking behavior of Tabanus flies
Keisuke Suganuma １,  Acosta J. Tomas ２ and Tomoko Saito ２（１National Research Center for Protozoan Diseases/Global Agromedicine Research Center, Obihiro
University of Agriculture and Veterinary Medicine, ２School of Agriculture Science, Obihiro Universityof Agriculture and Veterinary Medicine） 305

Elucidation of the interaction between Salmonella and host cells in avian ovary that underlies
egg contamination and transovarian infection
Masashi Okamura（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine） 311

Toxoplasma infection in wild and livestock animals；developing novel serological diagnostic
methods
Tokio Hoshina １，２， Tatsuya Sakurai ３ and Hirotaka Kanuka ２，３（The Jikei University School of Medicine

１

Department of Infectious Disease and Infection Control,

Laboratory Animal Facilities, Department of Tropical Medicine） 

２

３

318

Identification of novel bovine leukosis resistance-associated alleles by comprehensive genotyping（Ⅲ）
Hirohisa Mekata（Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki） 

323

Identification of causative gene of AA amyloidosis for eradicating intestinal amyloidosis incattleJunichi Kamiie（School of Veterinary Medicine, Azabu University） © The Ito Foundation

329

xiii
Development of a new therapeutic drug against bovine leukemia virus infection
Tomohiro Okagawa（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University） 

334

Development of technology to control endotoxin influx and liver dysfunction associated withrumen acidosis
Shinichi Yonekura（Faculty of Agriculture, Shinshu University） 

340

Efficient fattening by improving maternal milk production
Yusaku Tsugami（Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University） 

344

Effect of grazing management on meat quality in Japanese Shorthorn steers fattened under 2season grazing system
Koichiro Ueda and Seongjin Oh（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University） 

350

Seasonal effect on nitrogen utilization in lactating cows fed ensiled total mixed ration
Makoto Kondo1, Ririka Sekida1, Masaya Matamura1, Noriaki Nagahaka2 and Hiroshi Hiraoka2（1Graduate School of Bioresources, Mie University, 2Mie prefectural Livestock Institute） 356

Studies on the enhancement of calf immunity appraised by rumen mat score（Ⅱ）
Masahiro Yasuda １，２ and Shinsuke Abe １，３（ １Graduate School of Medicine and Veterinary Medicine, University of Miyazaki,

２

Faculty ofAgriculture, University of Miyazaki, Miyazaki Agricultural Mutual Aid Association） ３362

A study on requirement of lysine in weanling pigs（Ⅲ）- Precise feeding of amino acids byapplication of Diet Selection Masaya Katsumata（School of Veterinary Medicine, Azabu University） 

367

Effects of drying temperature and storage conditions on nutritive value of domestic grain ofcorn（Ⅱ）
Yoshiya Shinoto １, Genta Kanai １, Eiko Touno １ and Akane Ashihara ２（１Tohoku Agricultural Research Center, NARO, ２Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）



372

Development of video monitoring system for cattle herds that enables the discrimination of typeof behaviour including rumination
Shingo Tada
（Hokkaido Agricultural Research Center, NARO） © The Ito Foundation

378

xiv
Climate and soil factors of succession from temperate perennial grassland to annual grasslandand evaluation of the feeding value
KentaroIkeda（Tohoku Agricultural Research Center, NARO） 

385

Verification of the effect of feed supplemented with mass-producible oligosaccharides on the
improvement of intestinal flora in livestock（Ⅱ）
Mamoru Nishimoto １, Hisami Kobayashi ２ and Haruhiko Ohtsu ２（１Food Research Institute, ２Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

391

Development of health check system by monitoring usage frequency of mechanical grooming
brush for calves
Ken-ichi Yayou １ and Hirofumi Nogami ２（１Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, ２Kyushu University） 

398

Colostral programming of physiological properties related to meat production（Ⅲ）
Masatoshi Matsuzaki（Faculty of Agriculture and Life Science, Hirosaki University） 

404

Effect of feeding silage containing wood kraft pulp and sweet-potato shochu distillery on rumen
fermentation of Japanese Black fattening cattle
Yuka Maeda（Miyazaki Livestock Research Institute） 409

Effect of chick quality due to the age of egg collection on the development of wooden breast in
broilers
Tomohito Iwasaki（College of Agriculture, Food and Environment Sciences, Rakuno Gakuen University） 

416

The studies on the strengthening of gastrointestinal function and prevention of gut-derived
inflammation in dairy calves
Rika Fukumori（School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University） 

423

Sleep-like posture : Evaluation as a new behavioural indicator of beef cattle productivity andwelfareMichiru Fukasawa and Sanggun Roh（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University） 

431

Development of high digestibility warm-season forage grass by genome editing（Ⅱ）
Takahiro Gondo（Frontier Science Research Center, University of Miyazaki） © The Ito Foundation

437

xv
Development of fattening method that maintain the flavor of beef and shorten the feeding period
in Japanese Black cow（Ⅱ）
Noriaki Shoji １ and Yutaka Uyeno ２（１ Livestock Research Institute, Yamagata Integrated Agricultural Research Center, ２ Faculty ofAgriculture, Shinshu University） 

443

Development of low-cost water quality monitoring system for livestock wastewater treatment
facility
Shinichi Tomitani １, Tomoaki Kageyama ２，３, Masashi Miura ３, Takashi Miyazaki ４ and Yasushi
Horio ４
（１Tottori Swine&Poultry Experiment Station, ２GK TURIP technologies, ３Tottori University Academic
Research Institute, ４Axis CORPORATION） 451

Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed fermented loquat leaf tea ondevelopment and meat quality of Tushima-Jidori crossbred chicken for meat（Ⅱ）
Shogo Matsunaga １, Satoru Fukagawa １ and Daichi Ijiri ２（１Nagasaki Agricultural and Forestry Technical Development Center, ２Department of Agricultural
Sciences and Natural Resources, Kagoshima University） 

457

Microbiome analysis of bovine uterine, aiming to creation of novel technology improving low
fertility
Jumpei Uchiyama １, Takuya Yagisawa ２ and Seiji Katagiri ３（１Department of Bacteriology, Graduate School of Medicine Dentistry and Pharmaceutical Sciences,
Okayama University, ２ Hokkaido Chuo Agricultural Mutual Aid Association, ３ Graduate School of
Veterinary Medicine, Hokkaido University） 

464

Can END－, a quasispecies of bovine viral diarrhea virus, be a live-attenuated vaccine?（Ⅱ）－Pursing the possibility of inducing immunity more effectively－
Mai Shiokawa（School of Veterinary Nursing and Technology, Faculty of Veterinary Science, Nippon Veterinary andLife Science University） 

472© The Ito Foundation

xvi

伊藤記念財団賞
目加藤健太郎（東北大学大学院農学研究科

次教授）

食肉に関わる原虫感染症の病態発現メカニズムの解明と対策技術の確立 

東

山

由

美（農研機構東北農業研究センター研究推進部

事業化推進室事業化推進チーム

485
チーム長）

肉用家畜生産における栄養素配分調節機構ならびにストレス評価に関する研究 

上

田

修

司（神戸大学大学院農学研究科

486

助教）

畜産物の品質評価，付加価値の向上に向けたメタボロミクス技術の応用に関する研究 © The Ito Foundation

487

xvii

学会等事業助成目次

令和３年度学会等事業助成実施報告書
市民公開講座『牛伝染性リンパ腫の新規制御法の可能性を探る』に関する開催報告
公益社団法人日本獣医学会

代表理事

猪熊

壽（東京大学） 491

日本食肉科学会 令和３年度事業助成実施報告
日本食肉科学会理事長

坂田亮一（麻布大学名誉教授） 494

令和３年度事業実施報告書
日本畜産学会第 129 回大会オンラインシンポジウム「畜産学のレジリエンスと進化」
公益社団法人日本畜産学会

理事長

佐藤正寛（東北大学） © The Ito Foundation

498

研究助成事業© The Ito Foundation

3

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンⅨの形成様相と存在形態に関する研究（Ⅲ）
Studies on the formation and the existence form of zinc protoporphyrin IX
in dry-cured ham（Ⅲ）

若松

純一・阿部

悠・翟

洋

（北海道大学大学院農学研究院）

Jun-ichi Wakamatsu, Haruka Abe and Yang Zhai
（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

To elucidate the mechanism by which zinc protoporphyrin IX（ZnPP）is formed in nitrite/
nitrate free dry-cured meat products, we focused on hemoglobin（Hb）, which is dominated asa ZnPP-binding protein in Parma ham. We tried to investigate the cause why ZnPP-binding
Hb complex（ZnPP-Hb）is dominated over ZnPP-binding myoglobin complex（ZnPP-Mb）in
the water extract of Parma ham and post-translational modifications in Hb bound to ZnPP. In
meat homogenate model experiment, the addition of exogenous Hb resulted in significantly
higher total ZnPP, water-soluble ZnPP, and non-heme iron contents compared to the Mbadded group and control group. In addition, apoHb, from which heme was removed, wereshown to bind to ZnPP non-enzymatically. From these results, Hb is easier to release heme totransform ZnPP via the iron-removal and zinc-insertion reactions, consequently ZnPP-Hb isdominated over ZnPP-Mb in Parma ham by binding ZnPP to the separated apoHb nonenzymatically. On the other hand, the cause of plural bands corresponding with ZnPP-Hb inurea gel electrophoresis was investigated by immunological methods focusing on posttranslational modifications, indicating the possibility that carbamylation and succinylation are
occured rather than phosphorylation and acetylation．

１．目

食肉製品の色調改善へのZnPPの応用が期待され的るが，パルマハム中でのその形成機構は完全にはパルマハムは発色剤が使用されていない乾塩漬

明らかになっていない。

生 ハ ム で あ る が ，鮮 や か な 赤 色 を 呈 す る 。

パルマハムにおけるZnPP形成機構について，

Wakamatsuら１）は，この赤色色素が亜鉛プロト

複数の説が提唱されている。細菌由来の酵素によポルフィリンⅨ（ZnPP）であることを明らかにる説３）に加え，Adamsenら４）は，ZnPPはミオグした。ZnPPはプロトポルフィリンⅨ（PPIX）にロビンのヘム由来である説を唱えた。ヘムからの亜鉛が配位したものであるが，生体にはほとんど

脱鉄および亜鉛の挿入については，嫌気的条件下

含まれていないこと２）から，パルマハムの熟成中での非酵素的反応と，酵素的反応の両者が存在すに形成されるものと考えられる。発色剤無添加のると考えられており５），ヘム生合成に関わる酵素© The Ito Foundation

4

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

であるフェロケラターゼの関与が提唱されている

目し，パルマハム水抽出液におけるZnPP結合タが ，定説には至っていない。一方で我々は，ンパク質の大部分をヘモグロビンが占める原因，

ZnPPの形成機構解明の一環として，パルマハム

およびZnPPと結合しているヘモグロビンにおけにおけるその存在形態に着目してきた。そして，る翻訳後修飾の有無について検討した。

６）

パルマハムから水抽出できるZnPPのほとんどが，ヘモグロビンおよびミオグロビンとの複合体とし

２．方法て存在することを明らかにし，これらのヘムタン

2.1

パク質のZnPP形成機構への関与を提唱した 。

Wakamatsuら８）が構築したモデル実験系を改

一般に，食肉は放血してと畜するため，そのヘム

変して行った。ブタ胸最長筋に約50％（w/w）

色素の大部分は，血液由来のヘモグロビンではなとなるよう純水を加えてホモジナイズし，抗生物

く，肉由来のミオグロビンである。それにもかか質を添加した後，HClまたはNaOHを用いてpH 5.5

わらず，パルマハムにおけるZnPP結合タンパクに調整した。これにヘモグロビンまたはミオグロ

質としては，ミオグロビンよりもヘモグロビンのビン試薬を添加したものを，35℃の暗所で嫌気的ほうが約３倍多かった。このことから，ヘモグロに20日間インキュベートした。

７）

ZnPP形成モデル実験系

ビンがパルマハムにおけるZnPP形成に大きく寄

2.2

ZnPP形成量および非ヘム鉄含量の測定与していると考えられ，その原因を解明できれインキュベート後のホモジネートに３倍量のア

ば，ZnPP形成機構解明に向けた重要な知見となセトンを加えてZnPPを抽出し，抽出液の蛍光強りうる。

度（Ex/Em：420/590 nm）を ZnPP 相 当 量 と し一方で，パルマハム水抽出液の尿素ゲル電気泳た。非ヘム鉄は，ホモジネートにクエン酸－リン

動による分離では，ZnPPと結合したヘモグロビ

酸緩衝液（pH 5.5）およびアスコルビン酸を加ンのバンドが複数本観察されており ，これらはえ，インキュベートして抽出した。その後，トリ

ヘモグロビンの分解産物であると考えられていクロロ酢酸を加えて混合し，液体部分を回収してた。しかし，SDS-PAGEでは分子量の違いは観酢酸アンモニウムおよび1,10-フェナントロリン

察されず，尿素ゲル電気泳動における複数のバンを加えた。この抽出液の510 nmにおける吸光度

ドは，分解などの大きな分子量の変化を伴うもの

を測定し，検量線を用いて非ヘム鉄含量を算出しにはよらないと考えられた。これらの複数のバンた。

７）

ドは間隔の空いた明瞭なものであり，新鮮なヘモ
グロビンと比較して陽極側にみられることから，

2 . 3 アポヘモグロビンの調製およびZnPPとの反応

酸性基の付与といった翻訳後修飾に由来する可能

ブ タ ヘ モ グ ロ ビ ン 標 準 品 を Tris-HCl 緩 衝 液性が考えられた。リン酸化やアセチル化などは，（pH 8.2）に溶解し，氷冷アセトンに滴下した。

タンパク質の立体構造ならびにその安定性を変化

これをろ過して沈殿を回収し，ホウ酸緩衝液（pHさせることが数多く報告されていることから，ヘ

5.5）に溶解してアポヘモグロビン溶液を調製しモグロビンにおける翻訳後修飾がそのZnPP形成た。このアポヘモグロビン溶液に，ただちにジメ

能に影響を及ぼしている可能性がある。

チルホルムアミドに溶解したZnPP標準品を加え，そこで本研究では，パルマハムにおけるZnPP

冷却しながら１時間以上攪拌して反応を行った。

形成機構の解明を目的として，ヘモグロビンに着© The Ito Foundation

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンⅨの形成様相と存在形態に関する研究（Ⅲ）

2 . 4 尿素ゲル電気泳動および非変性ポリアク
リルアミドゲル電気泳動
Laemmliの緩衝液系を用いて，尿素ゲル電気泳動では0.1％SDSの代わりに４Ｍ尿素を加えたゲ

5

３．結果と考察3 . 1 ZnPP形成機構におけるPPIX供給源としてのヘモグロビンの特性

ルを，非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動でパルマハム中のZnPP形成機構において，ヘモ

はSDSを除いたゲルを調製した。なお，いずれにグロビンおよびミオグロビン中のヘムは，PPIX

おいても泳動緩衝液中のSDSも加えなかった。電の供給源となると考えられる。パルマハムにおけ

気泳動後，ただちに暗室内で，ガラス板から外さ

るZnPP結合タンパク質の大部分をヘモグロビン

ないで，420 nm付近の光を透過するバンドパスが占めていたことから，ヘモグロビンはミオグロ

フィルターを通して紫色LED（中心波長400ビンよりもPPIX供給源として優れている可能性nm）を照射して，600 nm付近の光を透過するバが考えられた。そこで，初めにPPIX供給源とし

ンドパスフィルターを装着したデジタルカメラでてのヘモグロビンの特性を明らかにするため，

ZnPPの自家蛍光を撮影した。

ZnPP形成モデル実験系を用いて，外因性のヘモ

2.5

パルマハム中のZnPPの水抽出

グロビンおよびミオグロビンの添加がZnPP形成

市販のパルマハム原木から大腿四頭筋を切り出に与える影響を検討した。水抽出できるZnPP量して細切し，４倍量の純水を加えてホモジナイズ

および総ZnPP量について，ヘモグロビン添加区した。これを遠心分離して上清を回収し，パルマ

では，インキュベート開始後５日においてミオグ

ハム水抽出液とした。

ロビン添加区および無添加区よりも有意に高くな

2.6

翻訳後修飾の免疫学的検討り（ｐ＜0.05），その後もインキュベート日数にパルマハム水抽出液を，尿素ゲル電気泳動また従って顕著な増加がみられた一方で，ミオグロビ

は非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供試

ン添加区では無添加区との間に有意な差は検出さしてZnPPの自家蛍光を撮影した後，ただちにゲれなかった（Fig. 1A, C）。また，非ヘム鉄含量をルからPVDF膜に分離タンパク質を転写した。リ

測定したところ，ヘモグロビン添加区ではイン

ン酸化タンパク質の検出は，Phos-tagテクノロ

キュベート開始後10日において，ミオグロビン添

ジーを用い，アセチル化およびカルバミル化タン

加区および無添加区の両者よりも有意に高くなり

パク質の検出は，抗アセチル化リジン抗体および（ｐ＜0.05），その後もインキュベート日数に伴っ抗カルバミル化タンパク質抗体を用いたウェスタて増加したが，ミオグロビン添加区および無添加

ンブロッティング法によって行った。また，カル区においてはインキュベート前後で非ヘム鉄含量

バミル化およびサクシニル化に関しては，ブタ血に有意な差はみられなかった（Fig. 1B）。これら液から調製した赤血球粗画分について，カルバミの結果から，ヘモグロビン中のヘムは，ミオグロ

ル化処理とサクシニル化処理を行ったものと，尿ビン中のヘムよりも容易にグロビンから解離して素ゲル電気泳動における移動度を比較して評価し脱鉄されることが示唆され，ZnPP形成機構におた。

いてミオグロビンよりも優れたPPIX供給源であると考えられた。また，ヘモグロビン添加によって水抽出できるZnPP量が増加したことから，ヘムの解離したアポヘモグロビンと形成された© The Ito Foundation

令和３年度A）

800

Control
Mb
Hb

Fluorescence intensity（Ex/Em:420/590 nm）

700
600

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

dx

300

by

200
100
0

0

c

Control
Mb
Hb

200

ay

ay

ay

ay

by

100

ay

c

by

50

10

15

Non-heme iron
（mg/L）C）

Control
Mb
Hb

0.40
0.35
0.30

0.20
0.15

ay

ay

ay
ay

ay

5

10

15

Incubation time
（day）

20

ax

0.45

0.25

ay

e
0

20

Incubation time
（day）

bx
cx

c
c

0
5

ax

dx

150

ay

by

e

300
250

cx

500
400

B）

ax
bx

Fluorescence intensity（Ex/Em:420/590 nm）

6

cd
d

e

d
0

cd

bx
bx

bcy

aby
aby

ay
ay

bcy

de

5

10

15

Incubation time
（day）

20

Fig. 1 Effect of the addition of hemoglobin（Hb）and myoglobin（Mb）on total ZnPP formation（A）, non-heme ironformation（B）,and water-soluble ZnPP formation（C）in the experimental model during incubation      Hb: 0.005%（w/w）porcine hemoglobin standard added group ; Mb : 0.005%（w/w）myoglobin standard

added group. Bars represent the standard errors（n = 3）. abcde: values with different letters within the samegroup indicate the significant differences during incubation ; xy : values with different letters within the same
incubation day indicate the significant differences among groups（p < 0.05）.

ZnPPとが結合し，水抽出できるZnPP-ヘモグロ（Fig.２ビン複合体が形成されたと考えられた。

ビン複合体のバンドの移動度と一致したことから

3 . 2 ZnPPとアポヘモグロビンの結合反応の（Fig.２

レーンPHE）におけるZnPP-ヘモグロ
バンド１，
２），アポヘモグロビンは非酵素的にZnPPと結合することで，ZnPP-ヘモグ

検証
前項の結果を受け，ZnPPがヘムの解離したア

ロビン複合体を形成することが示された。前項のポヘモグロビンと容易に結合するのか検討した。

結果とあわせて，ヘモグロビン中のヘムはミオグ

緩衝液中でアポヘモグロビンとZnPP標準品を混ロビン中のヘムよりも多くのPPIXを供給し，こ合して反応させ，これを尿素ゲル電気泳動に供試のPPIXから形成されたZnPPとアポヘモグロビン

したところ，ZnPPの自家蛍光のバンドが２本観が非酵素的に結合して多量のZnPP-ヘモグロビン

察された（Fig.２

レーンZHb）。これらの移動複合体が形成されたことで，パルマハム水抽出液

度が，ZnPP形成モデル実験系の水抽出液（Fig.

中のZnPPの大部分をヘモグロビンとの複合体が２レーンMOD）およびパルマハム水抽出液

占めていることが示唆された。

© The Ito Foundation

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンⅨの形成様相と存在形態に関する研究（Ⅲ）

が観察されたことから，ゲル中の尿素の影響では

ZnPP autoﬂuorescence
Apo-Hb

ZHb

MOD

7

ないことが確認された。一方，パルマハム水抽出PHE液におけるZnPP結合ヘモグロビンの複数のバンドについて，ウェスタンブロッティング法に供し12たところ，抗カルバミル化抗体との反応がみられた。さらに，赤血球粗画分においてはカルバミル化処理によってこれらのバンドと同じ位置に新しくバンドが出現した。以上の結果から，パルマハ
ムの熟成中にヘモグロビンがカルバミル化されたことで，尿素電気泳動における移動度が変化した可能性が示された。また，サクシニル化処理を行った赤血球粗画分についても，カルバミル化処理を行ったものと同様に陽極側に複数のバンドがFig. 2 Fluorescence image of apo-hemoglobin reacted

観察され，パルマハムにおいてZnPPと結合したwith ZnPP separated using urea-PAGE

ヘモグロビンの移動度と一致した。他方，Phos-reacted with ZnPP ; MOD : the supernatant ofexperimental model after incubation ; PHE: thewater extract of Parma ham ; Arrow 1 and 2 : ZnPP
fluorescent bands formed in ZHb/MOD.

tagおよび抗アセチル化リジン抗体と，複数のバ      Apo-Hb: apo-hemoglobin（apoHb）; ZHb: apoHb

ンドとの反応は検出されなかったことから，リン酸化およびアセチル化はこの複数のバンドの原因ではないと考えられた。以上より，パルマハム中でZnPPと結合したヘモグロビンの尿素ゲル電気

3 . 3 尿素電気泳動におけるZnPP結合ヘモグ

泳動における複数のバンドは，リン酸化やアセチル化によるものではなく，カルバミル化やサクシロビンの複数バンドの原因
パルマハム水抽出液を尿素ゲル電気泳動に供試して得られる，ZnPP結合ヘモグロビンの複数のバンドの原因として，翻訳後修飾について検討しニル化に由来する可能性が示された。
４．要

約

た。本実験で着目した翻訳後修飾は，データベー

本研究では，パルマハムにおけるZnPP形成機

ス（Uni Prot）より，ブタヘモグロビンにおいて構の解明を目的として，ヘモグロビンに着目し，発生が予測されているリン酸化，アセチル化，サパルマハム水抽出液中のZnPP結合タンパク質のクシニル化に加え，ヒトヘモグロビンにおいて報大 部 分 を ヘ モ グ ロ ビ ン が 占 め る 原 因 ，お よ び

告のあるカルバミル化である。このうち，カル

ZnPPと結合しているヘモグロビンにおける翻訳

バミル化は尿素の分解産物であるイソシアン酸に後修飾の有無について検討した。ZnPP形成モデ

よって引き起こされることから，電気泳動ゲル中

ル実験では，外因性ヘモグロビンの添加により，の尿素の影響で実験中に発生することが懸念され

総ZnPP量，水溶性ZnPP量，および非ヘム鉄含量た。しかし，パルマハム水抽出液を，尿素を含まがミオグロビン添加区および無添加区と比較してない非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供有意に高くなった。また，アポヘモグロビンと試しても尿素ゲル電気泳動と同様に複数のバンド

ZnPPは非酵素的に結合することが示された。こ９）© The Ito Foundation

8

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

れらの結果から，ヘモグロビン中のヘムはグロビンから解離，脱鉄されやすく，ZnPP形成機構においてより優れたPPIX供給源として働く一方，
PPIXから形成されたZnPPはアポヘモグロビンと非酵素的に結合することで，ZnPP-ヘモグロビン
複合体が多量に形成されることが示唆された。一方，尿素ゲル電気泳動における複数のZnPP-ヘモ
グロビン複合体の由来について，翻訳後修飾に着目して免疫学的手法で検討したところ，リン酸化やアセチル化ではなく，カルバミル化およびサクシニル化による可能性が示された。

文
献１）
 Wakamatsu, J., Nishimura, T., Hattori, A.：Meat
Sci., 67, 95～100, 2004.
２）
 Labbé, R. F., Vreman, H. J., Stevenson, D. K.,
Labbe, R. F.：Clin. Chem., 45, 2060～2072, 1999.
３）
 Morita, H., Niu, J., Sakata, R., Nagata, Y.：J. Food
Sci., 61, 1021～1023, 1996.
４）
 Adamsen, C. E., Moller, J. K. S., Hismani, R.,
Skibsted, L. H.：Eur. Food Res. Technol., 218, 403～409, 2004.
５）
 Becker, E. M., Westermann, S., Hansson, M.,
Skibsted, L. H.：Food Chem., 130, 832～840, 2012.
６）
 Taketani, S., Ishigaki, M., Mizutani, A., Uebayashi,M., Numata, M., Ohgari, Y., Kitajima, S.：
Biochemistry, 46, 15054～15061, 2007.
７）
 Wang, H. C., Hayakawa, T., Kumura, H.,
Wakamatsu, J. I.：Food Bioscience, 40, 100870, 2021.
８）
 Wakamatsu, J., Okui, J., Ikeda, Y., Nishimura, T.,
Hattori, A.：Meat Sci., 68, 313～317, 2004.
９） 島尻佳典，與那嶺正人，友寄毅昭，益崎裕章，三家登喜夫，原野恵子，和田芳直，古賀正史：糖尿病．
58, 915～922, 2015.

© The Ito Foundation

9

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅲ）
Developments in technology for meat processing by fungal aspartic
protease（Ⅲ）

竹

中

慎

治

（神戸大学大学院農学研究科）

Shinji Takenaka（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

During postmortem aging and meat processing, endogenous proteolytic degradation ofmuscle fibers into oligopeptides and release of nucleotides and free amino acids etc. lead toincrease meat flavor and taste. In addition, treatment by commercially obtained hydrolytic
enzymes is one of efficient methods to improve meat flavor and its texture with reducing
conditioning- and processing periods. In the food industry, several plant proteolytic enzymes
such as bromelain, ficin, and papain are widely used for proteolytic hydrolysis, to improve meattenderness. Fungal aspartic protease also shows potential hydrolytic activity not only towardheme proteins and casein but also matrix proteins, elastin and collagen. Our aim is to apply theability of limitedly hydrolysis of meat proteins by the aspartic protease for meat processing.
Hydrolytic profiles toward fractionated myofibrillar, myogenic, and extracellular matrix
proteins using the recombinant aspartic protease（rPepA）, bromelain, and papain werecompared. SDS-PAGE, tricine-SDS-PAGE, and size exclusion chromatography analyses
indicated that the hydrolysates by plant proteases contained much more 1.0- to 20 kDapeptides than that by rPepA. Amino acid composition in papain-treated hydrolysate wassimilar to that in rPepA-treated hydrolysate. The richness derived from umami and kokumi
tastes was also resemble, based on electronic tongue analysis. These findings indicate that beefmeat processing with rPepA probably would be expected to improve meat quality andrichness．

１．目

ロテアーゼによって自己消化を引き起こすことで的呈味性の遊離アミノ酸やペプチドの含量を増大さ

香味や食感に優れた食肉やハム，ソーセージ，

せることにある。一方，熟成期間を短縮化するこ

ベーコン等の食肉加工品を得るためには，低温熟とは，冷蔵・保蔵コストの削減，微生物による腐成を一定期間行うことが好ましいとされ，うま敗や品質劣化の防止につながるが，うま味を付与

味・こく味を増大させるために１週間から１か月するために別の熟成手段が必要となる。

以上も熟成させる。長期熟成の目的は，細胞内プ

食肉やその加工品のおいしさを決める重要な要© The Ito Foundation

10

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

因として「肉の柔らかさ」，「くちどけ」，「うま味」

結合組織タンパク質に対する分解特性や牛肉に作があげられる。肉はおいしさだけでなく，咀嚼し用させたサンプルの遊離成分を比較し，その食肉

やすいやわらかさも消化効率や栄養摂取の面で重処理におけるPepAの潜在能力を明らかにするこ要である。特に，高齢化が進む先進諸国では肉質とを目的とする。

の改善のためにプロテアーゼが検討されている。
例えば，植物由来のパパイン，ブロメライン，ア２．方法

クチニジンやコラーゲンを加水分解する微生物由2.1

来コラゲナーゼ等があげられる。一方，うま分解活性試験で使用した筋肉タンパク質類の味の因子のひとつである遊離アミノ酸含量の増大

分画はBuschらの方法を参考にした ９）。宮崎県のために，微生物由来プロテアーゼも検討されて産もも肉から調製した10ｇの挽肉と100mlの抽いる４）。近年，肉を「塩麴」に漬け込むことで「う出用緩衝液（0.1 M KCl，5 mM EDTA，20 mM

ま味やこく味を増しつつ，中までしっとりとした

KH2PO4-K2HPO4 （pH 7.0））を ミ ニ カ ッ プ に 入

深い味わい」を引き出す調理法が注目されておれ，クッキングミキサー（MX-Ｘ501，パナソニッ

り ，加水分解酵素群を用いた食肉やその加工品

ク株式会社）を用い，30秒間ホモジナイズした。

の高付加価値化は，これからますます重要視されこのホモジナイズ液を遠心分離（10,000×g，10

ると思われる。

min，４℃）して，上清部をmyofibril fraction 1

１～３）

５）

材料

申請者オリジナルの好乾性糸状菌由来アスパル（Fraction 1）として回収し，得られた沈殿に抽ティックプロテアーゼ（PepA）は，ヘムタンパ

出緩衝液を50ml加えて再び同条件でホモジナイ

ク質を限定分解する６）。同プロテアーゼとミオグ

ズ と 遠 心 分 離 を 行 っ た 。得 ら れ た 上 清 部 はロビンの加水分解によって生じるペプチドの配列

myofibril fraction 2（Fraction 2）として回収し，を解析した結果，同酵素がミオグロビンに含まれ沈殿部に抽出緩衝液を50ml加えてホモジナイズ

るヘムの近傍の３か所を加水分解できることか

後 ガ ー ゼ で ろ 過 し た 。ガ ー ゼ 上 の 残 渣 をら，ヘムの遊離によるミオグロビンの脱色が引き

connective tissue fraction（Fraction 3）として回起こされると考えられる 。また，ブロメライン

収した。これらを2.2で述べる基質タンパク質とやパパインとともに筋原線維・筋形成・結合組織

し た 。 Lowry 法 に よ る Bovain serum albumin

タンパク質（市販試薬）に対する分解特性を比較（BSA）換算で，Fraction 1，2および３のタンパ

すると，結合組織タンパク質に対する活性は低ク 質 濃 度 は ７ mg/ml ，12 mg/ml ，21 mg/ml でかった 。さらに，牛もも肉の酵素処理に関するあった。アスパルティックプロテアーゼ（rPepA）

予備的な試験結果からも ，既存のプロテアーゼ

は，既報の方法に従って調製した10）。ブロメライと比較してPepAの優位性が明らかになりつつあンおよびパパインは富士フィルム和光純薬株式会る。よって，同アスパルティックプロテアーゼは，社から購入した。

７）

７）

８）

肉由来のタンパク質を過剰に加水分解することなく，「肉の柔らかさ」と「うま味」両方をほどよ2 . 2 タンパク質分解酵素を用いた筋肉タンパ
ク質類の加水分解く改善できると期待される。そこで，市販のプロ

0.5％（w/v）基質タンパク質－50 mM酢酸ナ

テアーゼとともに同アスパルティックプロテアー

トリウム緩衝液（pH 5.0）5.0 mlに対して0.22％

ゼについて，牛肉を構成する筋原線維・筋形成・（w/v）プロテアーゼ溶液（精製rPepA，ブロメ© The Ito Foundation

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅲ）

ラインもしくはパパイン）を0.5 ml添加し，30℃

11にて分別定量した。

で３時間反応を行った。遊離したペプチドは，

2.6

Lowry 法（BSA 換 算）お よ び ニ ン ヒ ド リ ン 法

味認識装置には株式会社インテリジェントセン

（glycylglycylglycine換算）にて定量した。また，

サーテクノロジー製のSA402Bを使用した。既報

SDS－PAGEおよびTricin-SDS-PAGEにて分解の方法を参考に，味覚センサーは，CA0（酸味），パターンを調べた。

CT0（塩味），C00（苦味雑味），AE１（渋味刺2.3

味覚センサー（味認識装置）による測定

タンパク質分解酵素を用いた牛肉の処理激），AAE（旨味）の５種類を使用し，酸味，苦牛もも肉を繊維方向に平行に切り出した肉片

味雑味，渋味刺激，塩味，苦味，渋味，旨味コク，（10（縦）× ２（横）× 0.5（厚 さ）cm）お よ び

うま味の８項目とした。

0.22％（w/v）プロテアーゼ溶液１mlをチャック

2.7付きポリ袋入れ，15℃で24時間放置後，溶液を回各統計処理は，GraphPad Prism ver. 6を用い収した。SDS-PAGE,Tricin-SDS-PAGE，SEC分て1-way ANOVAおよびTukeyの多重比較検定

子ふるいクロマトグラフィーにて分解パターンをを行った。アミノ酸組成分析および呈味性試験以調べた。また，遊離したアミノ酸の組成および味外は，３回以上試験（ｎ＝３～５）し，サンプル覚を調べた。

間においてnot significant（ns）と判断されたもの

2 . 4 遊離ペプチドのサイズ排除クロマトグラ
フィー
溶 離 液 （100 mM KH2PO4-K2HPO4（pH 7.4）

統計処理について上付き文字で表示した。
３．結果と考察-acetonitrile（80 ： 20, v/v））に て 平 衡 化 し た

3.1

YMC-Pack Diol-60（4.6×300mm）（株式会社ワ

ブロメラインやパパインはmyofibril fractionに

イエムシィ，京都）にサンプルを導入した。流速

対する活性はきわめて高く，結合組織タンパク質は0.25ml/min，検出はUV216 とした。また，同条に対しても活性を示し11），反応が進みすぎるとド件 で 標 品 サ ン プ ル （myoglobin［M.M.（Da）,

リップの増大や肉の保水性を低下させる12）。分画

17,000］, cytochrome c［M.M., 12,400］, bacitracinの精度は低いが，ブロメライン，パパインおよび［ 1 , 4 2 2 ］, N - h i p p u r y l - H i s - L e u ［ 4 2 9 ］,

rPepAについて筋肉タンパク質分画物に対する加glycylglycylglycine［189］）に つ い て 分 子 質 量

水分解能を生成タンパク質およびそれらの分子量（対数）と溶出時間には直線関係があった。

分布を比較した（Fig.１，Table１）。プロテアー

2.5

アミノ酸組成分析

分画した筋肉タンパク質の加水分解

ゼ無添加の対象と比較してブロメラインやパパイ

文部科学省食品成分データベース（日本食品標

ン処理物では分子質量30 kDa以上のタンパク質

準成分表2015年版・七訂）記載の方法に準拠し，バンドは消失し（Fig. 1（A）），1.0から14 kDaまプレラベル法（OPA/FMOC）によるプレラベル

でのポリペプチドが生成した（Fig. 1（B））。一方，

HPLC分析法によった。2.3で述べたサンプル100

rPepA処理物では30 kDa以上のタンパク質バンμlに対して80％メタノール900 μlを加え，除タン

ドは残っており，1.0から14 kDaまでのポリペプパクを行った後，o-フタルアルデヒドおよび9-フチドの生成も少なかった（Fig.１）。電気泳動のルオレニルメチルクロロフォルメートによってラ

結果からは主要なタンパク質のバンドはさほど減ベル化し，Agilent Poroshell 120 EC-Ｃ18カラム

少していなかったが，遊離したアミノ酸やオリゴ© The Ito Foundation

12

令和３年度
Table 1

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Hydrolysis of protein fractions from beef meat by proteases.
（A）
Frac. 1

Frac. 2

Frac. 3

Bromelain0.17±0.006AB

0.53±0.026

1.07±0.055

Papain0.14±0.015A

0.33±0.012

0.66±0.01

rPepA

0.26±0.032B

0.46±0.01

0.83±0.036（B）
Frac. 1

Frac. 2

Frac. 3

Bromelain0.21±0.006

0.33±0.029A

0.84±0.012

Papain0.29±0.031A

0.25±0.051A

0.32±0.085A

rPepA

0.36±0.072A

0.13±0.059

0.50±0.047A# Fractions 1 and 2 mainly consist of myofibrillar components and fraction 3 is a connective
tissue. Produced amino acids/oligo- and poly-peptides were measured by Lowry method（A）
and Ninhydrin method（B）.

(A)

Frac. 1M1 a bc

Frac. 2
d

200
120
90
64
48

a b

c d a

Frac. 3b

Frac. 1(B)

M3 a bc d M2cFrac. 2
d

a

b c d

Frac. 3
a b c

d M3

111
85

29

48

36
28

36

20
9

20

17
14

28

6.5
3.5
1.0

Fig. 1 SDS-PAGE（A）and tricine-SDS-PAGE（B）profiles of proteolytic hydrolysis of fractionated beef proteins.

Fractions 1 and 2 mainly consist of myofibrillar components and fraction 3 is a connective tissue. Fractions weretreated without protease（a）and with bromelain（b）,papain（c）,and rPepA（d）.Lanes M1, M2, and M3 are broad
range, low range, and small protein markers, respectively.

ペ プ チ ド 量 を 比 較 す る と ，rPepA 処 理 物 中

ンパク質と長時間反応させると非特異的な作用も（myofibril fraction 1（Frac. 1））遊離量は多かっ徐々に進行し，これが遊離アミノ酸やオリゴペプ

た（Table１）。Penicllium camenberti由来アスパ

チド量の増加につながったと思われる。

ルティックプロテアーゼのインシュリンＢ鎖に対する加水分解では，反応時間を24時間とすると非3 . 2 タンパク質分解酵素にて処理した牛肉由来サンプルの分析

特異的な加水分解も進み，生成ペプチド数が増加

先行研究において，牛ミンチ肉を市販の0.5％する 。rPepAは，ヘムタンパク質に対する限定

プロテアーゼにて５時間処理したサンプル中のペ分解位置以外に ，ペプチドのP１部位に疎水性ア

プチド組成を比較している14）。エンド型およびエ

ミノ酸や塩基性アミノ酸残基を含む位置を好んで

キソ型プロテアーゼ処理サンプルと比較し，ブロ

加水分解する（未発表データ）。rPepAも牛肉タ

メラインやパパイン処理サンプルには高分子タン

13）

６）

© The Ito Foundation

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅲ）

13

Table 2 Concentration of released proteins and amino acids in beef
meat-hydrolysates treated with proteases
（A）

（B）

（a）Control

22.5±0.57A

9.21±0.46（b）Bromelain

23.6±0.60B

14.4±0.54（c）Papain

22.3±0.51A

11.5±0.63C（d）rPepA

24.2±0.43B

11.7±0.68C# Beef meats were incubated without protease and with bromelain,papain, and rPepA. Produced amino acids/oligo- and poly-peptides were
measured by Lowry method（A）and Ninhydrin method（B）.

(A)

111
85
48
36
28
20

M1 a b c d M2

(B)a b c d M3

200
120
90
64
48

29
17

36

14

28

6.5

20

3.5
1.0

9

Fig. 2 SDS-PAGE（A）and tricine-SDS-PAGE（B）profiles of released oligo- and poly-peptides during hydrolysis ofbeef meat. Lanes a - d are referred to protease-treated beef meat hydrolysates without protease（a）and withbromelain（b）,papain（c）,and rPepA（d）.Lanes M1, M2, and M3 are protein markers.

パク質も残存している14）。本研究において，タン

いて制御しやすいといえる。

パク質分解酵素を用いた牛肉の処理物由来タンパ

rPepAによる処理からアミノ酸の遊離が期待さ

ク質や可溶性ペプチドを比較すると，定量値に相れたことから（Table２），アミノ酸組成を比較し違は見られなかった（Table２）。しかし，電気泳

た（Table３）。その結果，ブロメライン処理サン動の結果では，ブロメラインやパパインは作用しプルは，うま味／酸味に寄与するGlu量や甘味にやすい牛肉タンパク質を加水分解し，1.0から14寄与するSer，Gly，ThrやPro量の増大だけでなく，kDaまでのポリペプチドの生成が顕著であった

苦みに寄与するPhe，Ile，LeuやLys量も増大し（Fig.２）。これは，サイズ排除クロマトグラフィーていた。パパイン処理サンプルは，苦みに寄与す

よる可溶性ペプチドの分子量分布からも類似した

るLeuやLys量が増大していた。一方，rPepA処結果が得られ，サンプルをフィルターろ過（30

理サンプルは，ブロメライン処理サンプルと類似

kDa以下）後，クロマトグラフィーに供すると，した傾向が見られた。処理サンプルには，アミノオリゴペプチドから分子質量２万以下のポリペプ

酸だけでなくオリゴペプチドは脂質等も含まれる

チドの生成に相違が見られた（Fig.３）。rPepAと考えられることから，これらが関わる甘味・苦は，ブロメラインやパパインよりも肉の軟化におみ・うま味は複雑な味となることから味覚セン© The Ito Foundation

14

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）(a)(b)

1300(c)(d) (e)1100

Control

900

Bromelain
Papain

700
mV

rPepA

500
300
100

-100 0

5

10Time (min)15

20

Fig. 3 Elution profiles of protease-treated beef meat hydrolysates by size exclusion chromatography. Authentic

proteins and peptides, myoglobin［a, M.M.（Da）, 17,000］, cytochrome c［b, 12,400］, bacitracin［c, 1,422］,
N-hippuryl-His-Leu［d, 429］,glycylglycylglycine［e, 189］were analyzed.

Table 3

Amino acid compositions in protease-treated beef meat hydrolysates
Asp

Glu

Asp

Ser

Gln

His

Gly

Thr

Arg

Ala

（a）

104

3,520

1,090

3,450

3,790

755

3,650

2,170

82

10,500

（b）

758

3,710

1,290

4,170

3,230

922

4,280

2,830

27

9,220

（c）

467

3,660

1,200

3,250

2,790

1,010

3,700

2,170

58

8,900

（d）

827

4,780

611

3,840

1,910

1,170

3,650

2,530

46

9,550

Tyr

Cys

Val

Met

Trp

Phe

Ile

Leu

Lys

Pro

（a）

14

N.D.

3,220

1,170

11

1,670

1,840

3,890

3,260

845

（b）

77

N.D.

3,500

2,280

56

3,000

3,010

6,710

5,560

1,150

（c）

74

N.D.

2,680

1,650

39

2,340

2,290

5,450

3,620

968

（d）

57

N.D.

3,910

1,860

61

3,380

3,080

6,930

4,520

1,080
（nmol/ml）#Samples: protease-treated beef meat hydrolysates without protease（a）and with bromelain（b）, papain（c）,and rPepA（d）.

サ ー を 用 い て 比 較 す る こ と に し た（Fig. ４）。

には，「肉の柔らかさ」，「くちどけ」，「うま味」

rPepA処理サンプルはブロメライン処理サンプル

といったおいしさを決める要因を向上しながら熟よりもアミノ酸の遊離量は低いが（Table 2（B）），

成期間を短縮化することが重要である。肉質改善

うま味コクの点で両者は同程度であることが分法の１つとして酵素処理法があげられる。本研究かった。

では，申請者オリジナルのアスパルティックプロ

４．要

テアーゼ（rPepA）および植物系プロテアーゼに

約

ついて，牛肉タンパク質および牛肉に対する分解

香味や食感に優れた食肉やハム，ソーセージ，

特性や処理サンプルの遊離アミノ酸や味覚を比較

ベーコン等の食肉加工品を効率よく製造するためした。処理した牛肉の剪断力やテクスチャーは不© The Ito Foundation

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅲ）

1501
Sourness
02
Aftertasteofbitterness

08 Umami

03
Aftertasteofastringency

07 Richness

06
Astringency

04 SaltinessControl
Bromelain
PapainrPepA

05
Bitterness

Fig. 4 Flavor evaluation of protease-treated beef meat hydrolysates by electronic tongue.

明であるが，ブロメラインは，牛肉タンパク質分解に伴う呈味性アミノ酸類の遊離は期待できるが，電気泳動の結果から，牛肉タンパク質を細分化することが予想される。一方，rPepAによる分
解はこれまでの結果のとおり限定的であるにも関わらず，コク味の向上も期待できることが分かった。
文 献１） 味の素株式会社，特開平05-007476
２） 昭和産業株式会社，特開平05-252911
３） エーザイ株式会社，特開平06-169729
４） 花王株式会社，特開平08－56664
５） 阿部真紀，秋田修：塩麹に含まれる麹由来酵素および食塩の食肉調理への効果，日本醸造協会誌，
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７） 竹中慎治：微生物由来アスパルティックプロテ
アーゼを利用した食肉加工技術の開発，平成31年度（令和元年度）食肉に関する助成研究報告書，38，9～14，2020.
８）
 竹中慎治：微生物由来アスパルティックプロテ
アーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅱ），令和
２年度 食肉に関する助成研究報告書，39，8～
14，2021.
９）
 Busch, W. A., Stromer, M. H., Goll, D. E., Suzuki,
A.：J. Cell Biol., 52（2）,367～381, 2013.
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 Takenaka, S., Umeda, M., Senba, H., Koyama, D.,
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Agric., 97, 95～101, 2016．
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https://doi.org/10.1016/j.cofs.2020.12.002
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 Chrzanowska, J., Kolaczkowska, M., Dryjański, M.,
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Technol., 17, 719～724, 1995.
https://doi.org/10.1016/0141-0229（94）00129-F
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https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.02.159© The Ito Foundation

16

食肉加工品の塩漬熟成に認められる「塩なれ」に関する研究―食肉加工品の塩味に対する遊離脂肪酸の影響―
Studies of mild saltiness induced by curing maturation- Effects of free fatty acid on saltiness of meat products -

中村

幸信・内海

寛子・吉田

由香・猪口

由美

（一般社団法人食肉科学技術研究所）

Yukinobu Nakamura, Hiroko Utsumi, Yuka Yoshida and Yumi Inoguchi（Japan Meat Science and Technology Institute）

The role of free fatty acid（FFA）in mild saltiness induced by curing maturation was
examined. Ten ml of the test solution adding FFA of 0.2％，hydrophobicity, was stabilized byhomogenizing at 3,000 rpm for 30 sec immediately before the sensory test. The effect of freeoleic acid and linoleic acid on saltiness was clear in the case of 1.0％ NaCl having a strong
saltiness. The strong saltiness of the first-taste was gradually weakened while tasting for a few
tens of seconds. This was an adaptation-like action. When there were umami and sourness
from a pork soup, saltiness of 1.0％ NaCl was first sensed, followed by umami and sourness.
FFA brought into the balance between saltiness and other taste resulting from an adaptationlike action to saltiness. Edible blended oil, which consist of linoleic acid（46.4％）and oleic acid（29.1％），had no effect on saltiness. It should be important that fatty acid is not as atriglyceride but as a free state. Thus mild saltiness in cured meat products may be induced byan increase of FFA during curing maturation. The results should provide basic information tolead to an in-depth understanding of the mild saltiness of cured meat products．

１．目

塩漬熟成による風味の向上に，ヒポキサンチンが的関与していることを明らかにした１）。この他，塩

塩漬では，発色剤の使用がその特徴と言えるが，塩漬剤の主成分は食塩であり，その役割はと漬期間中に遊離のアミノ酸や脂肪酸等が増加することも知られている２）。

ても重要である。塩漬における食塩の作用の１つ

食塩のもう１つの重要な作用は，味付け，塩味は，脱水と水分活性の低下に伴う微生物の増殖抑の付与である。一般的に，保存性が得られる食塩制である。これにより塩漬期間の延長が可能とな濃度の塩味は，かなり強く，塩辛いと表現される。

り，塩漬肉に生じ得る化学的変化はさらに進行す

しかし，生ハムに代表される非加熱食肉製品におる。この化学的変化によってもたらされるのが，いては，この強い塩味が品質特性となっており，風味の向上となる。これが“塩漬熟成”であり，塩漬熟成期間の延長によって変化することが経験

特色JAS規格の基となっている。Ichimuraらは，的に知られている。これは，「塩角がとれる」な© The Ito Foundation

食肉加工品の塩漬熟成に認められる「塩なれ」に関する研究―食肉加工品の塩味に対する遊離脂肪酸の影響―

17

どと表現され，“塩なれ”と呼ばれる塩辛さがやしたドリップを回収後，ろ過（５Ａ，アドバン

わらぐ現象と考えられる。この塩なれには，塩漬

テック社製）して得られたろ液をスープとし官能

熟成中に変化する成分が関与していると考えられ試験に用いた。

るが，食肉加工において，この要因は明らかにさ2.3

れていない。

2.3.1

官能試験
NaCl溶液の塩味に対するFFAの影響

先述のとおり，塩漬熟成期間中には，ヒポキサ

NaClは0，0.6，1.0％，FFAは0.2％となるよう超ンチンや遊離のアミノ酸および脂肪酸等が増加す

純水に加えた（終濃度）。FFAを均一化するためることから，これらが要因となる可能性が考えらにホモジナイズ（3,000 rpmで30秒間）し，得られる。このうち遊離脂肪酸（以下FFA）に関しれた懸濁液を試験液とした。FFAをEOに替えて，ては，リノール酸が塩化ナトリウム（以下NaCl）

同様に試験液を調製した。試験液はすべて，試験溶液の塩味の閾値を高くすること，塩味を弱める

直前に調製した。

ことなどが報告されている 。さらに，我々は，
３）

2 . 3 . 2 豚肉スープ中の塩味に対するFFAの影

外国産生ハムの官能的な塩味の強さとFFA含量との間に負の相関があることを示した 。
４）

本研究では，塩漬熟成における塩なれに対するFFAの影響を調べることを目的とする。FFAに響
2.3.1の超純水を豚肉スープに替えて，同様に処理し，1.0％ NaClとFFAあるいはEOを混合した試験液を調製した。

ついて，官能試験を実施した例は少なく，FFA

2.3.3が疎水性であることなどから，第一に試験液の調パネリストは，調製した試験液の全量である10

製方法を検討した。この試験液を使って，塩味にmlを口に含み，口に含んでいる30秒間，舌の動

対するFFAの作用を定性的に理解することを試

きの制限はなく，可能な限り塩味を感じるようにみた。

味わった。この間の塩味の変化を自由に書き表

２．方
2.1

官能試験

し，円卓法により評価した。

法

３．結果と考察材料

市販のカナダ産三元豚（LDW）のロースの胸

3.1

NaCl溶液の塩味に対するFFAの影響

最長筋（試料数３）を使用した。と畜日からの経FFAが疎水性であることから，試験液の調製

過日数は34日であった。FFAとして，オレイン

方法に関しては，乳化剤のカゼインナトリウム等

酸およびリノール酸の標準品，NaClをシグマアを使用して水層に均一化させることを検討した

ルドリッチから入手した。市販の大豆油およびなが，乳化剤由来の風味や物性への影響があった。

たね油からなる食用調合油（以下EO）を入手しそこで，液量を少量の10 mlとして，ホモジナイ

た。

ズによる用事調製としたところ，安定性のあるエ

2.2

マルションが得られた。

豚肉スープの調製

ロースから胸最長筋を取り出し，目立った脂肪

最初に，超純水にFFAまたはEOを加えた試験と結合組織を除去した。穴径５mmのプレートで液について，官能試験を実施した結果，各種試験

挽 肉 と し た 後 ，真 空 パ ッ ク（約 0.8 kPa）し ，

液は無味であることを確認した。EOを脂肪酸組

90℃の湯浴で１時間加熱した。加熱によって発生成分析に供した結果，脂肪酸組成の上位３種は，© The Ito Foundation

18

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

リノール酸（46.4％），オレイン酸（29.1％），パ

れた５，６）。先のNaCl 1.0％でのFFA添加による塩

ルミチン酸（9.4％）であった。

味の強さの低下は，この順応に似た現象であった。

予備的に，NaCl溶液にFFAを加えて官能試験

また，NaCl 1.0％の条件で，FFA 0.2％をEOを実施したところ，塩味に対するFFAの影響は，0.2％に替えて同様に処理したところ，先味およ

複雑な現象であることが分かった。この現象を整び後味ともに，塩味の強さに大きな変化はなく，理する必要があると考え，定性的に理解すること

順応様の現象は認められなかった（Table１）。すに重きを置くこととした。

なわち，FFAの塩味に対する作用は，塩味が強

塩味が強く感じられるNaCl 1.0％の条件で，オく感じられる条件において顕著であり，この条件

レイン酸またはリノール酸をそれぞれ0.2％添加

下でFFAを添加すると，塩味の強さが順応様にした液と無添加の液を調製し，両者の塩味を比較

弱くなることが確認された。

した（Table１）。FFAの濃度0.2％は，ヨーロッFFAの添加によって，塩味の強さが順応様に

パ産の長期塩漬熟成された生ハムのFFA含量の弱められた理由として，FFAの粘度の影響が考平均値に由来する 。まず，液を口に含んだ直後えられる。塩味の強さは，高い粘度によって弱め（先味）の塩味の強さについて，両者の間に違いられることが示されているが７），FFAの替わりには認められなかった。次に，舌の動きに制限がな

EOを用いた実験では，塩味の強さの順応様の低い状態で，液を十数秒間口に含んでいると（後下は確認できなかった。EOはトリグリセリド（以味），各種FFAを添加した液は，塩味の強さがし下TG）で構成されていることから，FFAより高だいに弱まり，その後強さが先味のレベルへと戻

い粘度を持つ８）。したがって，FFAの添加が示しることを確認した。これに対して，無添加は塩味

た塩味の強さの順応様の低下において，粘度の影の強さに大きな変化は認められなかった。FFA

響は大きくないと考えられた。また，今回使用しが添加された場合，塩味の強さの感覚は，口に含たEOは，リノール酸およびオレイン酸が主要なんでいる間，経時的に変化することが分かった。

構成要素であることから，塩味の強さの順応様の続いて，塩味が適度に感じられるNaCl 0.6％の低下は，脂肪酸の状態に影響されると考えられ条件で，NaCl 1.0％と同様に試験を実施したとこる。すなわち，当該現象は，脂肪酸がTGの状態

ろ，先味に違いはなく，液を一定時間含んで感じではなく，遊離の状態であるときに生じる可能性られる後味についても，ともに塩味の強さがしだが示唆された。

４）

いに弱くなることを認めた（Table１）
。この塩味

3.2

の強さがしだいに弱くなる現象は，順応と考えら調製した豚肉スープの味は，酸味とうま味が主

Table 1

豚肉スープ中の塩味に対するFFAの影響

Effect of FFA and EO on saltiness from 1.0 and 0.6% NaCl solution
Strength of saltinessFirst taste

NaCl sol.

1.0%

0.6%

A few tens of seconds later―

StrongStrong+ FFA

StrongModerate+ EO

StrongStrong―Moderate

Weak

+ FFA

Moderate

Weak© The Ito Foundation

食肉加工品の塩漬熟成に認められる「塩なれ」に関する研究―食肉加工品の塩味に対する遊離脂肪酸の影響―

19体であり，これらが強く感じられた。これに1.0％脂肪酸がTGの状態であると，塩味の順応様の低NaClを加えて，塩味，酸味およびうま味が感じ

下は認められなかった。Hiraokaらは 11），ラット

られる順序（反応速度）を確認したところ，最初を用いた試験において，口腔内でFFAは受容さに塩味が感じられた後，塩味がありながら酸味やれるが，TGは受容されないことを示しているこ

うま味が感じられた。すなわち，塩味に対する反とから，今回認められた塩味に対するFFAの作

応速度が豚肉スープ由来の味に比べて速いことを用が，FFAが持つ口腔内における生理的な作用確認した９，10）。

によって生じた可能性が推定される。塩漬熟成に塩味が強く感じられるNaCl 1.0％の条件で，おいては，脂質の主体であるTGがリパーゼにFFA 0.2％を添加したスープと無添加のスープを

よってFFAに分解される。すなわち，塩漬熟成

調製し，NaCl溶液の場合と同様に，両者の塩味中のFFAの増加が，塩なれの要因となる可能性

を定性的に捉えた（Table２）。スープを口に含んが示唆された。

だ直後（先味）の塩味の強さについては，２種の一般的に塩なれは，塩辛い食品に認められるこ

スープの間に違いは認められなかった。しかしなとから，塩味に対するFFAの作用が，強い塩味

がら，後味については違いが認められた。FFAの条件下で顕著であったことに矛盾はないと言えを添加した場合，先味で感じられた塩味の強さがる。さらに，FFAによって塩味が感じられなくしだいに弱くなることに相まって，スープに由来

なるような現象ではなく，塩味とうま味等がバラする酸味やうま味がメインとして感じられるようンスの良い状態となったことも，「塩味がやわらになり，塩味と他の味のバランスが取れた状態とぐ」と言う塩なれと一致している。本研究は，食なった。後味において，塩味の強さが弱くなった

肉製品における塩なれ現象をより深く理解するこことは，先の1.0％NaCl溶液で認められた塩味のとにつながる基礎的な結果を示した。

強 さ の 順 応 様 の 低 下 と 同 じ で あ っ た 。他 方 ，

塩味の抑制については，酸味を呈する有機酸に

FFA無添加は口に含んでいる間，塩味の強さによる対比効果がよく知られている12，13）。この効果変化は認められず，その強い塩味によって，味のは，酸味によって塩味が抑制されることである

バランスが損なわれた状態であった。

が，本研究との共通点を考察すると，有機酸と続いて，FFA 0.2％をEO 0.2％に替えて，NaCl

FFAがともにカルボキシル基を持つことがあげ

1.0％の条件で同様の試験を実施したところ，スーられる。脂肪酸のpKaは4.85であるから 14），生ハ

プの塩味の強さに変化は認められず，強い塩味に

ムのpH5.7～7.0では４），多くが解離状態にあるとよって味のバランスが損なわれた状態であった考えられる。このことは，TGからなるEOが塩味（Table２）。すなわち，NaCl溶液の場合と同様に，に作用しなかった理由に通じるかもしれない。酸Table 2

Effect of FFA and EO on saltiness from pork soup adding 1.0% NaCl
First taste
Saltiness

NaCl 1.0%

A few tens of seconds later
Saltiness

Balance with other taste―

StrongStrongOff-balanced+ FFA

StrongModerate

Balanced+ EO

StrongStrongOff-balanced© The Ito Foundation

20

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

味を呈さないFFAが塩味に作用したことは興味

期塩漬熟成におけるFFAの増加は，塩なれの要深い。

因となる可能性が示唆された。今回の結果は，塩最後に，リノール酸を豚肉スープに添加した場合に限って，スープを吐き出した後，複雑な濃厚

漬熟成における塩なれ現象のより深い理解を導く
基礎的知見となる。

感が感じられた。この結果は，オレイン酸とリノール酸の間に作用の違いがあること，リノール
酸と塩味以外の四味の間になんらかの関係性があることを意味する。Koriyamaらは，オレイン酸，
リノール酸，EPAおよびDHAの４種の不飽和脂肪酸うち，オレイン酸以外の不飽和脂肪酸が酸味，苦味およびうま味に変化を与えることを示している15）。我々は引き続き，呈味に対するリノール酸の作用に注目し，検討を行っている。
４．要

約

塩味に対するFFAの作用は，塩味が強いNaCl
1.0％の条件で顕著であり，先味に強く感じられる塩味がしだいに弱くなる順応様の現象が確認された。豚肉スープ由来のうま味等が共存する場
合，塩味に対する反応時間が最も短く，FFAの添加は，NaCl 1.0％の塩味の強さを順応様に弱め，塩味とうま味等のバランスが取れた状態となった。FFAをEOに替えて試験したところ，同様の作用は認められず，脂肪酸がTGではなく，FFA
であることが重要と考えられた。したがって，長文
献１） Ichimura, S., Nakamura, Y., Yoshida, Y., Hattori,
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５） 栗原堅三：計測と制御，20，43～50，1981．
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© The Ito Foundation

21

食肉の品質を制御する遺伝的要因に関する多因子
複雑系の解析：細胞骨格との関連からのアプローチ
Analysis of the complex system composed of multiple genetic factors
regulating meat quality : approaches in relation to the cytoskeleton

灘

野

大

太

（名古屋大学大学院生命農学研究科）

Daita Nadano（Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University）

Meat quality is considered to be a complex system, which is ultimately determined by themultiple interactions of numerous factors. As there are potentially so many factors, it is difficult
to obtain a real clue to analyze the quality. Some papers have reported that meat quality is atransmittable genetic trait. From this viewpoint, genetic approaches seem effective but havenot been fully successful so far. The present study was conducted on the basis of a larger andmore objective survey, genome wide association study（GWAS）, rather than a classical genetic
approach based somewhat on intuition and experience. The translational product of the target
gene lacked known functional domains and motifs, in addition to the fact that there arevirtually no reports on its function, and thus lacked clues to elucidate its importance in meat
quality. Therefore, we set out to analyze the product of this gene by biochemical and cellbiological methods. For example, the gene product was expressed in mammalian cells as aprotein fused with green fluorescent protein（GFP）and observed by confocal laser microscopy.
Since the cytoskeleton has been known to be associated with meat quality, our analysis focusedon this point. Our data have suggested that this protein has a selective affinity for microtubules,
especially their terminal ends, and migrates to the cell periphery near the plasma membrane,
providing new clues for further analysis．

１．目を含む品質の改善は食肉関連業界において高い優的先度で検討されてきた。しかし，残念ながら伝統豊かで多幸感のある食生活を支えるという意味

的な飼育・育種の方法に依存する限りにおいて，

において，食肉の重要性は国を問わず言をまたな

測定にかかるコスト高やと畜後に得られるデータ

い。食肉の食感として，完全性，新鮮さ，赤身のの限界から，肉質の改善は難題と言わざるを得な

程度，ジューシーさ，味感等があげられ，たとえい状態であった１）。

ば柔らかさは実際の消費者購買行動調査においてこの食の満足感に直結する肉質は，では遺伝学

も購買動機に最も影響を与える因子として報告さの進歩とどのように結び付けられてきたのであろれてきた。このような経緯から，食肉の柔らかさ

うか。おいしさの重要な要因である肉の柔らかさ© The Ito Foundation

22

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

について，測定によって客観的な評価しうる指標

2.2

である肉のせん断力に着目して遺伝的調査が行わ

上記の実験で遺伝子を導入した細胞を回収し，れたところ，中からやや高度程度に伝播可能な形

下記の電気泳動用の試料緩衝液に溶解し煮沸処理

質であることが示された 。こうした研究を踏まをした。各試料に含まれるタンパク質をラウリル

え，ごく最近になって形質を支える遺伝子が明ら

硫酸ナトリウム―ポリアクリルアミドゲル電気泳かになり，その潜在的重要性が指摘されている動によって分離した後，セミドライ式ブロッティ

が３），多因子により制御された複雑系とされる肉ング装置を用いてポリフッ化ビニリデン膜

質制御の分子レベルでの解明，ましてやその産業（Millipore）に転写した。この膜をスキムミルク

応用はいまだ黎明期と判断される状況である。

によってブロッキングした後，目的とするタンパ２）遺伝子産物の生物化学的解析

個体のすべての情報，すなわち全ゲノムレベル

ク質検出用の一次抗体，次に検出用に西洋ワサビ

での関連解析（genome-wide association study，

ペルオキシダーゼによって標識された二次抗体とGWAS）の一例として，食肉の品質に影響を与順次反応させた。緑色蛍光タンパク質（green

える遺伝性因子の探索が行われた。この研究におfluorescent protein，GFP）およびその融合タン

いて有力された遺伝子は，偶然にも代表研究者ら

パク質の検出用にMBL社のポリクローナル抗体により乳腺に関する生物学的研究（最近の例４））を一次抗体として用いた。イモビロンウェスタンにおいて同定されたものであり，これを研究成果

化学発光基質（Millipore）を用いて発色させ，ラの社会貢献に向けた独自の切り口として，この遺イトキャプチャー（アトー）を使用してブロット

伝性複雑系制御因子を分子レベルで解析すること

上の目的タンパク質をバンドとして検出した。
2.3

とした。
２．方
2.1

遺伝子産物の細胞生物学的解析

細胞培養用プラスチックディッシュ（滅菌済み

法のカバーガラス入り）に細胞を播種し，上記の発現ベクターを免疫ブロッティングの場合と同様に遺伝子発現系の構築

解析対象の遺伝子のcDNAをPCR法により増幅細胞へと導入した。遺伝子導入後，培養した細胞

し，哺乳類細胞発現用ベクターに同ベクターのマをパラホルムアルデヒド（室温で15分間）またはルチクローニングサイトを利用して，得られた－20℃の冷メタノールを用いて細胞を固定した。

cDNAを翻訳時の読み枠を考慮して挿入した。こ前者の場合に細胞内部の観察のため細胞透過処理

れ ら を 市 販 の キ ッ ト（Roche Applied Science）

を界面活性剤を用いて行い，ウシ血清アルブミンを用いて大量に調製した。得られたプラスミドベ

でブロッキングした。微小管の検出にモノクロー

クターについて，制限酵素処理産物のアガロース

ナ ル 抗 α- チ ュ ー ブ リ ン 抗 体（Sigma-Aldrich）

ゲル電気泳動およびDNA配列解析により当初の

お よ び そ の 蛍 光 標 識 特 異 二 次 抗 体（Thermo

予定どおりの発現ベクターが得られたことを確認

Fisher Scientific）を用いた。GFP融合タンパク

した。作製した哺乳類細胞用発現ベクターを，質の場合にはGFP由来の緑色蛍光を検出した。蛍

10％ウシ胎児血清を含む細胞培養培地に37℃およ

光染色像を共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss）にて

び５％CO２条件下で培養した細胞株へ，遺伝子導観 察 し た ５）。 ま た ， 微 小 管 の ノ コ ダ ゾ ー ル

入試薬としてポリエチレンイミンを用いて導入し（Sigma-Aldrich）および低温処理を組み合わせた 。

た選択的かつ完全な脱重合処理ならびにタキソー

４）© The Ito Foundation

食肉の品質を制御する遺伝的要因に関する多因子複雑系の解析：細胞骨格との関連からのアプローチ

ルを用いた微小管安定化処理については既報６）に23の発現量がGFPに比べて明らかに低かった。

したがった。細胞の蛍光動画撮影にCO２非供給型

次に，共焦点レーザー顕微鏡による蛍光顕微鏡のステージインキュベーターを組み合わせた共焦観察を行い，目的タンパク質の細胞内局在を調べ

点レーザー顕微鏡（Fluoview FV1000D，オリン

ることとした。上記のとおりＣ末端GFP融合タンパス）を用いた。

パク質について発現量が低かったため，Ｎ末端にGFPが融合された目的タンパク質の発現ベクター

３．結果と考察

をまず遺伝子導入・解析に用いることとした。蛍ゲノムワイド解析より今回の解析対象とした遺光顕微鏡で目的タンパク質の発現をGFPの蛍光か

伝子の遺伝子産物には，既知の機能ドメインやモら確認した後，共焦点レーザー顕微鏡を用いて，チーフがこれまでのところ見当たらないため，ア

細胞内局在を詳細に観察した。その結果，この遺ミノ酸配列から機能を推察することが困難であっ伝子産物が高発現している細胞において細胞質にた。肉質との関連を解明する手掛かりを得るた

繊維状の蛍光像が観察されたことから，細胞内のめ，このcDNAを哺乳細胞発現ベクターであるプ

代表的な繊維構造である細胞骨格との関連が推定

ラスミドDNAにクローニングした。そして，こされた（Fig.１）。対照として用いたGFP（未融合）

うして得られた遺伝子を哺乳類細胞に導入するこにおいてはこのような繊維状の観察像は見られとで解析を進めることとした。なお，細胞内局在ず，この観察像がGFPによるものではなく，目的が本遺伝子の翻訳産物の機能解明の手掛かりにな

タンパクの特性に由来することが示された。細胞ると考え，発現ベクターのひとつとしてGFPとの骨格は大きく分けて，径が最も細いアクチンフィ

融合タンパク質として細胞内で発現可能なベクラメント（別名Ｆ-アクチン，マイクロフィラメ

ターを用いた。GFPはその蛍光により対象タンパ

ント），径が最も大きくチューブリンダイマーのク質を蛍光顕微鏡下で観察できるメリットがある

重合体である微小管，さらに両者の中間の大きさ

半面，分子量が３万弱と比較的大きいことから，

である中間径フィラメント（組織により異なる，

その融合位置の違いによる影響が想定された。

たとえば上皮であればケラチンフィラメント）か

よって，目的タンパク質のＮ末端またはＣ末端にらなる。各細胞骨格を特異的に認識する抗体を用

GFPを融合した計２種類のベクターを調製した。

いて共染色実験を行ったところ，この遺伝子産物

また，コントロールとしてGFPそのもの（未融の観察像は抗チューブリン抗体による染色像と重合）の発現ベクターも同様に調製した。

なり合ったことから微小管に結合していることがこれらの発現ベクターを用いて各翻訳産物を培示唆された。加えて微小管脱重合処理を行った細養細胞に発現させ，まず遺伝子産物の発現を免疫胞においては上記の繊維状の観察像が失われ，細ブロッティングによって解析し，全長産物が分解

胞質にほぼ均一に広がる像が観察され，このことされることなく発現することを確認することとしからも微小管との会合が支持された（Fig.２）。

た。抗GFP抗体を用いて検出したところ，Ｎ末端

なお，上述のとおりＣ末端GFP融合タンパク質はにGFPを融合させた目的遺伝子産物は，計算分子

免疫ブロッティングにおいて発現が低かったが，量から推定される位置にGFP（未融合）と同程度

一過性遺伝子導入後に顕微鏡観察において，同タの発現量で明瞭に観察されたのに対し，Ｃ末端にンパク質を発現する細胞が少数ではあるが観察さ融合させたものは正確な原因は不明であるが，それた。これらの発現細胞を共焦点レーザー顕微鏡© The Ito Foundation

24

令和３年度

Fig. 1

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Observation of the GFP-tagged protein in the cell by using a confocal laser

macroscope. Bar, 10μm

MTs

MTdepolymerized

MTstabilized

target protein

Fig.2 Intracellular co-localization of the target protein and microtubules（MT）under
the MT-stabilized and-depolymerized conditions. Bar, 10μmで解析したところ，Ｎ末端融合タンパク質の場合近くの微小管の先端部分に強く検出される観察像と同様の微小管との共局在が観察された。よっが再現性よく得られた。微小管には動的不安定性て，上記の観察像に対するGFPの位置による影響があり，末端の伸長と脱重合，そしてそれに続くは認められないと推定された。そして，さらにこ再伸長への変化が観察される。この実験結果は，の蛍光顕微鏡観察を進めたところ，発現が中程度

同遺伝子産物が微小管選択的に細胞骨格に結合す

以下の場合において，この遺伝子産物が細胞表面るだけでなく，その動的な末端により強く結合す© The Ito Foundation

食肉の品質を制御する遺伝的要因に関する多因子複雑系の解析：細胞骨格との関連からのアプローチ25

ることを示唆する。このことはＮ末端GFP融合タに着目して解析した結果，このタンパク質が微小

ンパク質を発現した細胞の動画観察により，同タ管の末端部に選択的な親和性を持ち，細胞膜近く

ンパク質が微小管先端に沿って細胞膜近傍方向へである細胞辺縁部へと移動することが示され，さと移動する像が得られたことにより支持された。

らなる解析への手掛かりが得られた。

すなわち，同タンパク質は単に静的に細胞骨格に結合するのではなく微小管の末端に会合した状態
でダイナミックな動態を示すことが判明した。
４．要

約

肉質は多数の因子の複雑な相互作用によって最終的に決まってくると考えられる。ただ潜在的にあまりに多くの因子が想定されてしまい，実際の取っ掛かりが得難いことも事実であろう。「１．
目的」の項において記述したとおり，肉質は伝播可能な遺伝形質であり，その意味において遺伝学的なアプローチは有効であるにもかかわらず，これまで十分な成果が得られていなかった。本研究はこれまでのややもすれば勘や経験に基づいたアプローチではなく，GWASの大規模でより客観的な調査を背景に進められた。対象とした遺伝子の翻訳産物について機能に関して報告されていな
いことに加えて，既知のドメインやモチーフが見当たらず，肉質との関連を解明するうえでの手掛かりに欠けていた。そこで，この遺伝子産物であるタンパク質の解明を生化学・細胞生物学的手法を駆使して進めることとした。アクチンを含む細胞骨格は肉質との関連が報告されており，この点

文
献１） Raza, S. H. A., Khan, S., Amjadi, M., Abdelnour, S.
A., Ohran, H., Alanazi, K. M., Abd El-Hack, M. E.,
Taha, A. E., Khan, R., Gong, C., Schreurs, N. M.,
Zhao, C. P., Wei, D. W., Zan, L. S.：Genome-wide
association studies reveal novel loci associated withcarcass and body measures in beef cattle, Arch.
Biochem. Biophys., 694, 108543, 2020.
２）
 Miar, Y., Plastow, G. S., Moore, S. S., Manafiazar,G., Charagu, P., Kemp, R. A., Van Haandel, B.,
Huisman, A. E., Zhang, C. Y., McKay, R. M., Bruce,
H . L . , W a n g , Z . ：G e n e t i c a n d p h e n o t y p i cparameters for carcass and meat quality traits incommercial crossbred pigs, J. Anim. Sci., 92, 2869
～2884, 2014.
３）
 Mohammadabadi, M., Bordbar, F., Jensen, J., Du,
M., Guo, W.：Key Genes Regulating Skeletal
Muscle Development and Growth in Farm Animals,
Animals, 11, 835, 2021.
４）
 Shibayama, H., Yamamoto, T., Oshima, K.,
Matsuda, T., Nadano, D.：Transcription Factor
Sox4 as a Potential Player in Mammary GlandInvolution, DNA Cell Biol., 38, 1125～1133, 2019.
５）
 Muto, A., Sugihara, Y., Shibakawa, M., Oshima, K.,
Matsuda, T., Nadano, D.：The mRNA-binding
protein Serbp1 as an auxiliary protein associatedwith mammalian cytoplasmic ribosomes, Cell
Biochem. Funct., 36, 312～322, 2018.
６）
 Nadano, D., Nakayama, J., Matsuzawa, S., Sato, T.,
Matsuda, T., Fukuda, M. N.：Human tastin, aproline-rich cytoplasmic protein, associates withthe microtubular cytoskeleton, Biochem. J., 364, 669～677, 2002.

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26

国内標準化を目的とした食肉の可食期間延長技術の検証
Verification of edible period extension technology for meat for the purposeof domestic standardization

中

村

好

德

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センター）

Yoshi-nori Nakamura（Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, NARO）

In this work, we aimed to study the effect of super-chilled storage at －1℃ on the shelf
life of pork and chicken. Vacuum packaged pork and chicken were stored at －1℃ for 0 ～ 57days and 0 ～ 47 days, respectively. Sensory evaluation showed no abnormality until day 41 in
pork and 30 in chicken. Aerobic, psychrophilic, and anaerobic bacterial abundance increased
with super-chilled storage; however, the increase was lower than the regulation levels. The pH
and levels of metmyoglobin, thiobarbituric acid reactive substances, and volatile basic nitrogenindicated no adverse effects in terms of food sanitation. Therefore, we recommend setting theshelf life of pork and chicken at 32 and 24 days, respectively．

１．目

ʻ氷点下の未凍結貯蔵ʼとは，対象とする食品

的の凝固点から０℃までの過冷却温度域で貯蔵する

わが国で消費される牛肉，豚肉ならびに鶏肉は

流通・加工技術である。わが国ではさまざまな食流通段階で可食期間が設定される。国内の実質的品に適用され，食品の貯蔵，熟成，発酵，乾燥ななガイドラインである「食肉に関する期限表示フ

らびに濃縮過程において利用されている ２）。前

１）
レーム」には，食肉についての貯蔵温度，包装

報３）では，牛部分肉を用いて鮮度保持や肉質変化

形態と可食期間の目安が定められている。例えに及ぼす－１℃貯蔵の影響を調査したところ，既ば，原料肉が部分肉の場合，貯蔵温度が０℃（国存の０℃貯蔵よりも－１℃貯蔵では安全係数が内における未凍結状態での最低設定温度）で包装

0.8の場合に25日間の可食期間の延長が可能であ形態が真空包装の場合は，安全係数0.8を乗じたることを示した。しかし，－１℃貯蔵が豚肉と鶏可食期間の日数は牛肉で61日間，豚肉で20日間，肉の鮮度保持や肉質変化に及ぼす影響について調

鶏肉で12日間と記載されている。食品衛生法第19

べた報告は見られない。

条の規定により，食肉を加工および販売する事業

本研究では，－１℃貯蔵が豚肉と鶏肉の可食期

者は可食期間を表示する義務があるが，一般的に間に及ぼす影響を調査し，国内において未凍結状は検査費用や設備などの負担を考慮してガイドラ

態での最低設定温度である０℃貯蔵と比べて延長インを参考にすることが多い。

が可能かを検討した。

© The Ito Foundation

国内標準化を目的とした食肉の可食期間延長技術の検証

２．方
2.1

2.3.1

法

27

官能検査

１）
「食肉に関する期限表示フレーム」に準拠して，食肉に関する官能検査経験が豊富な５名の検材料筋肉

豚肉は，通称：三元交配豚［（ランドレース種

査員により色沢，外観，ドリップと臭いについて×大ヨークシャー種）×デュロック種］８頭（出評価を行った。色沢についてはʻ緑変，褐変があ荷時体重：約118kg）を用いた。と畜後，半丸枝るもの，色沢の劣化が進行しているものʼを，外肉から分割した部分肉を真空包装後に冷蔵輸送

観についてはʻ肉質が劣るもの，ネトや発泡が生し，と畜から２日以内に貯蔵試験に供した。鶏肉

じているもの，カビが発生しているもの，肉の表は，通称：地鶏（原種・天草大王×九州ロード

面が乾燥しているものʼを，ドリップについては種）12羽（出荷時体重：約3.5kg）の中抜き半丸

ʻ液汁に濁りが発生しているものʼを，臭いにつを真空包装後に冷蔵輸送し，と畜から２日以内にいてはʻ腐敗臭がするものʼを異常と判定した。
2.3.2

貯蔵試験に供した。
2.2

ドリップロス

材料筋肉を取り出し重量Ｗ（ｇ）を求め，貯蔵貯蔵試験

貯蔵試験はインバータ制御型氷温庫（日本軽金属，東京）を用いて行った。本機器は２回／日の試験前に測定しておいた重量Ｗ０（ｇ）とあわせて次式よりドリップ率（％）を算出した。

頻度で霜取り機能を設定したが，霜取りの有無にドリップロス（％）＝（Ｗ０－Ｗ）/Ｗ０×100

よる貯蔵庫内の温度変化（標準偏差）は約0.37℃

2.3.3（霜取り機能あり）と約0.11℃（なし）であった。

材料筋肉に生理食塩水（滅菌済み）を加えて磨貯蔵温度の設定は－１℃とした。貯蔵期間は，豚砕し均質化した後，混釈平板培養法で測定した。

肉については０日間（貯蔵なし），25日間，41日

培養条件については，一般細菌数は標準寒天培地

間ならびに57日間とし，鶏肉については０日間（極東製薬工業，東京）を用いて37±１℃で48時（貯蔵なし），15日間，30日間ならびに47日間とし間，低温細菌数は標準寒天培地（極東製薬工業）て材料部分肉をそれぞれ無作為に振り分けた。部を用いて７±１℃で10日間，嫌気性細菌数は標準

分肉の貯蔵期間に関する設定は「食肉に関する期寒天培地（極東製薬工業）を用いてアネロパック

限表示フレーム」 に準拠する必要があるが，（三菱ガス化学，東京）で嫌気的環境にした後，－１℃貯蔵については同フレームが適用されない

37±１℃で48時間，それぞれ培養を行った。一方，ため，前報３）を参考にして仮想の貯蔵期間を設定

大腸菌群数についてはデスオキシコレート培地

した。

（極東製薬工業）を用いて35±１℃で24時間行っ

１）

2.3

微生物検査

た。

分析項目および方法

貯蔵試験後，開封時の官能検査とドリップロス

2.3.4

pH

の測定を行った。その後，豚肉については部分肉

卓上型pHメータ（F-52，堀場製作所，京都）から最長筋（M.longissimus）を，鶏肉についてを用いて，等量の冷蒸留水を加えて磨砕し均質化

は 浅 胸 筋（M. pectoralis superficialis）を そ れ ぞ

した材料筋肉に電極を挿入してpH値を測定した。

れ摘出して分析に供した。化学成分の分析にはそ

2.3.5

れぞれ前，中および後部から等量を採取して，よ

尾藤の方法４）に準拠して行った。材料筋肉３ｇ

く混合したものを用いた。

メトミオグロビン含量に冷蒸留水10mlを加えて磨砕し10分間静置した。

© The Ito Foundation

28

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

遠心分離（3,000回転，10分間）後の上澄みを濾過し，水酸化ナトリウムでpH6.8に調整した。さ

３．結果と考察らに遠心分離後，上澄みをマイクロフィルター

本研究の結果から，－１℃貯蔵を行った豚部分（ポアサイズ0.45μｍ）で濾過し，0.2mol/lリン酸

肉の可食期間は安全係数が0.8の場合に，32日間

緩 衝 液 を ５ ml 加 え て 混 和 し た 。503nm お よ びの設定が可能となることが示唆された。これは豚540nm で 吸 光 度 を 測 定 し て 吸 光 度 の 比

部分肉が貯蔵41日目においても官能検査と微生物（540nm/503nm＝Ａ）を算出して，次式より材料検査において異常が認められなかったためであ

筋肉中の全ミオグロビン含量に対するメトミオグる。しかし，貯蔵57日目に８頭中１頭で腐敗臭がロビン含量の割合（メト化率，％）を算出した。

確認され異常と判定された。微生物検査においてメト化率（％）＝（30.6－10.6×Ａ）/（0.09×

は，一般細菌数，低温細菌数と嫌気性細菌数ともＡ＋0.191）に貯蔵により漸次増加したが，官能検査が異常と2.3.6

2-チオバルビツール酸反応性物質含量判定された貯蔵57日目でも規制値である10８cfu/g

材料筋肉６ｇに1.15％塩化カリウム溶液を加え以下で推移した（Fig.１）。したがって，41日間て磨砕し均質化した溶液を用いて，今成らの方×0.8（安全係数）＝約32日間と算出される。ま法５）を参考にして測定した。均質化した溶液にた，32日間の可食期間の設定は，わが国で推奨さ

SDS水溶液0.2ml，酢酸緩衝液1.5ml，BHT酢酸溶れている未凍結での最低設定温度である０℃貯蔵

液50μl，TBA水溶液1.5mlならびに超純水0.7mlをの20日間に比べて，12日間の可食期間の延長が可

加えて混和した。密封後，試験管を４℃で60分間能である。

静置し，沸騰水中で60分間加熱した。流水中で冷

一方，鶏中抜き半丸の可食期間は安全係数が0.8

却後，超純水0.7mlおよびブタノール―ピリジンの場合に，24日間の設定が可能となることが示唆

混合液5.0mlを加えて混和した。1.15％塩化カリウ

された。これは鶏中抜き半丸が貯蔵30日目においム溶液を試料とした対照についても同様の操作をても官能検査と微生物検査において異常が認めら行い，532nmの吸光度（ＡとＡ０）を測定して次式により試料１ｇから生成する赤色色素量から２-チ

aerobic bacteria

オバルビツール酸反応性物質（2-Thiobarbituric

psychrophilic bacteria
anaerobic bacteria

Acid Reactive Substances ： TBARS）の 含 量 を400,000

算出し脂質酸化の指標とした。
TBARS 含 量 （μ mol/g） ＝ ［（Ａ － Ａ ０）2.3.7

揮発性塩基窒素含量

cfu/g/156,000］×（5.8/10３）×（10２/３）×10６

100,000

30分間静置した。20％過塩素酸溶液１mlを加え0て遠心分離（3,000回転，10分間）後に上澄みを

a

a

a

0

25

41

57

storage time（day）

得て，コンウェイ微量拡散分析法６）により揮発性量を測定してタンパク質腐敗の指標とした。

aa200,000

材料筋肉１ｇに冷蒸留水８mlを加えて磨砕し塩基窒素（Volatile Basic Nitrogen：VBN）の含b

300,000

Fig. 1 Changes in the aerobic, psychrophilic and anaerobic
bacteria counts of pork during superchilled storage at－1℃．0～57 days：n＝4．a-b：p＜0.05.

© The Ito Foundation

国内標準化を目的とした食肉の可食期間延長技術の検証

肉質に関する理化学検査として，ドリップロス

aerobic bacteria

やpH以外にも色調変化の指標としてメト化率，

psychrophilic bacteria
anaerobic bacteria

脂質酸化の指標としてTBARS含量，タンパク質200,000bcfu/g

150,000
100,000
ab

50,000a

00の結果，豚部分肉では有意差が認められた項目はなかったが，鶏中抜き半丸ではpHとVBN含量がb－１℃貯蔵下でそれぞれ有意に変動した（Fig.
１）
３）
。「食肉に関する期限表示フレーム」
には理

a
30

15

腐敗の指標としてVBN含量の測定を行った。そ

b

a

a

29

47

storage time（day）
Fig. 2 Changes in the aerobic, psychrophilic and anaerobic

化学検査による規制値は記載されていないが，文献を参考にするとpHは6.0，メト化率は40％，
TBARS含量は0.500μmol/g，VBN含量は30mg％

bacteria counts of chicken during superchilled storage atを超えない範囲が規制の目安と考えられ７～10），本－1℃．0 day：n＝12，15～47 days：n＝4．a-b：p＜0.05.

研究の結果はこれらの数値以下で変動したため食

VBN

5.90

b
a

ab

bc

貯蔵すると，安全係数が0.8の場合，それぞれ32
10

ab

pH

したがって，豚部分肉と鶏中抜き半丸を－１℃

c
ab

5.80
5.70

た。

15

a

5

VBN（mg%）6.00

品衛生として問題のない範囲にあったと考えられpH

内における未凍結状態での最低設定温度である
０℃貯蔵よりもそれぞれ12日間の可食期間の延長が可能になることが示唆された。

5.60
5.50

日間と24日間の可食期間の設定が可能であり，国

0

15

30

47

0

４．要

約

storage time（day）

豚肉と鶏肉の可食期間に及ぼす氷点下の未凍結

Fig. 3 Changes in the pH and volatile basic nitrogen（VBN）

貯蔵の影響を調査した。真空包装された豚肉と鶏of chicken during superchilled storage at －1 ℃．0 day：

肉を－１℃でそれぞれ０～57日間と０～47日間貯

n＝12，15～47 days：n＝4．a-c：p＜0.05．

蔵した。官能評価は豚肉で41日目，鶏肉で30日目れなかったためである。しかし，貯蔵47日目に４まで異常は認められなかった。一般細菌数，低温

羽中４羽で緑変や腐敗臭が確認され異常と判定さ細菌数と嫌気性細菌数は貯蔵によりそれぞれ漸次れた。したがって，30日間×0.8＝24日間と算出増加したが規制値以下で推移した。pH，メトミ

され，24日間の可食期間の設定は，従来の０℃貯

オグロビン含量，2-チオバルビツール酸反応性物

蔵の12日間に比べて12日間の可食期間の延長が可質含量と揮発性塩基窒素含量は食品衛生として問能である。また，鶏中抜き半丸についても，官能題のない範囲で推移した。したがって，豚肉と鶏検査が異常と判定された貯蔵47日目でも各種細菌

肉について，それぞれ32日間と24日間の可食期間

数 は 規 制 値（10 ８ cfu/g）以 下 で 推 移 し た（Fig.

の設定が可能になることが示唆された。

２）。

© The Ito Foundation

30

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

文献１） 日本食肉加工協会：期限表示のための試験方法ガ
イ ド ラ イ ン〔食 肉（食 肉 加 工 品（半 製 品）を 含む。）〕，6，7，11，中央畜産会，東京，2006．
２） 山根昭彦：氷温食品入門，日本食糧新聞社，東京，
2015．
３） 中村好德，福間康文，細見亮太，細田謙次：日本
暖地畜産学会報，62，129～133，2019．
４） 尾 藤 方 通：日 本 水 産 学 会 誌 ，31 ，534～539 ，
1965．
５） 今成麻衣，柴伸弥，米内美晴，渡邊彰：日本畜産学会報，85，549～552，2014．

６） 安藤達彦，吉田宗弘（編著）：身のまわりの食品化 学 実 験 第 ２ 版 ，131～133 ，三 共 出 版 ，東 京 ，
2005．
７）
 細野明義，鈴木敦士：畜産加工，58，朝倉書店，
東京，1989．
８）
 高坂和久：畜産物の鮮度保持，48，52，56，筑波書房，東京，1991．
９） 日 本 食 品 衛 生 学 会（編 集）：食 品 安 全 の 事 典 ，392，朝倉書店，東京，2010．
10）
 田村一平（編集）：文献ガイド 水産物・畜産物の鮮度保持，150，流通システム研究センター，東京，
1991．

© The Ito Foundation

31

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作（Ⅲ）
Development of a system for rendering 3D computer graphics of meat
carcasses（Ⅲ）

本山

三知代・石田

翔太・渡邊

源哉・中島

郁世・佐々木啓介（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Michiyo Motoyama, Shota Ishida, Genya Watanabe, Ikuyo Nakajima and Keisuke Sasaki（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

With the recent improvement of computer performance, three-dimensional（3D）graphicthat visually expresses objects with a three-dimensional feeling on a two-dimensional monitor
has become our familiar technology. If it becomes possible to create 3D graphics for meat
carcasses, it will be possible to digitize information on the carcass shape and appearance thatare not currently evaluated. 3D graphics also enable us to easily check more realistic carcasses
from 360° around anywhere on portable devices such as smartphones with combining ICT
technology, which will lead to the creation of new value in meat production and distribution．
In the previous years, we had developed a basic technology for rendering 3D graphics ofmeat carcasses and its photogrammetric system. In the present study, to improve theprocessing capacity of the system to hundreds of carcasses per day, a new computer, a NAS（network attached storage）and a router were installed and built a local network in thesystem. In addition, a Web application was developed to enable us to access 3D graphics by theInternet was developed, and the applicability of a Web color management technique which wehave developed to 3D graphics was evaluated．
As a result, the system became to be able to perform fully automatically a series ofoperations, from photo shooting to uploading 3D graphics to the Internet. Within a few minutes
after photo shooting, we can find a carcass 3D graphic in a folder on the Internet. Carcass 3Dgraphics with an appropriate color calibration at any internet client environments will be alsoavailable．

１．目

我々の身近なものとなり，その作製と表示のため的の技術進歩と低価格化が目覚ましい。枝肉につい近年のコンピュータの性能向上により，物体やても３Ｄグラフィックが作製可能になれば，現在

空間を二次元のモニタ上に奥行き感（立体感）を

は枝肉の価格形成に活用されていない立体形態や持って視覚表現する三次元（３Ｄ）グラフィック

外観の情報を新たに数値化できるようになるだけ

技術は，さまざまなゲームやデジタル映像など

でなく，ICT技術と組み合わせることでスマート© The Ito Foundation

32

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

フォン等でよりリアルな枝肉を確認することが簡構築した。また，配布する３Ｄグラフィックの色

単に可能になり，新しい価値の創造に結び付くとの見えは表示媒体や環境に依存してクライアント

考えられる。

間で異なるが，これを補正して適切な色再現を可

申請者らはこれまでに，枝肉の３Ｄグラフィッ
クを作製するための基盤技術を開発し能にするために申請者らが別途開発したデジタル，本基

画像の色管理技術の３Ｄグラフィックへの適用可

盤技術を実用化に繋げるためのシステムを昨年度

能性検証を行うとともに，Webアプリケーショ

までの２年間に受けた貴助成金を活用して製作・ンの開発を行った。

１，２）

改良した。本システムを用いることで，生産ライ

2.1

ローカルネットワークの構築

ンを動く枝肉を静止させることなく３Ｄ計測が可

2.1.1

能となり，得られた３Ｄグラフィックから，これ

枝肉３Ｄシステムが扱う大量の画像データのスまで数値化が難しかった枝肉断面形状等の評価がトレージとして新たにNASを整備した。枝肉３可能となった。また３Ｄグラフィックは，それ自Ｄシステムから得られる画像データを圧縮せずに体がリアルな枝肉の品質情報であり，その活用の保存した場合，2,000頭規模の生産ラインでは１

ためには３Ｄグラフィックの作製から配布までを

日当たり0.7TBのデータを一時的にでも保存する

自動化可能とする，ICT技術を利用したネット必要があり，撮影から１か月程度の保存期間を想ワークの構築が有効であると考えられた。

定したストレージ容量を持ち（16TB），かつカメ

ネットワークストレージ（NAS）

また申請者らはこれまでに，デジタル画像の色

ラ40台により同時撮影された画像の転送速度に制管理に関する基盤技術も開発した（特許出願2021

約 が 生 じ な い よ う に ，次 世 代 高 速 デ ー タ 通 信

年４月）。本技術を用いれば，スマートフォンな（10GigE）に 対 応 し た も の と し た（I/O DATA

ど表示媒体に依存して異なる画像の発色を補正し社，HDL2-Z19SI3A-16）。

てクライアント間で揃えることができることか

2.1.2

３Ｄグラフィック計算用コンピュータ

ら，本技術を３Ｄグラフィックに適用し色も適切

これまで画像の撮影および保存と３Ｄ計算をコに再現可能にすることで，色が重要な品質項目でンピュータ１台で行っていたが，処理能力の改善

ある枝肉のオンライン取引等における３Ｄグラのためにローカルネットワーク内にGPUを搭載

フィックの有用性を高めることができる。

した高速画像処理が可能な３Ｄグラフィック計算

そこで本年度は，過年度までに製作した枝肉３

専 用 の コ ン ピ ュ ー タ を 追 加 し た（iiyama 社 ，ＤシステムをICTおよび色管理技術と融合させ，SENSE-F042-LCXW26-INX）。コンピュータに

適切に色管理された枝肉３Ｄグラフィックにインは，プログラミング言語Pythonによる自動制御

ターネット端末からアクセス可能にすることを目が可能な３Ｄグラフィック制作ソフトウエアであ的とした。

るMetashape Professional（Agisoft社）を新たに２．方導入し，計算の自動化を可能とした。

法

2.1.3

LAN/LTEハイブリッドルータ

枝肉３Ｄシステムを実際の生産ラインに導入

現場の枝肉生産ラインにはLANが整備されてし，１日に数百，数千の３Ｄグラフィックを作製いない場所も多いと考えられることから，枝肉３し配布可能とするために，新たに以下の機器を整Ｄシステムのインターネットへの接続には，３Ｇ

備し枝肉３Ｄシステムにローカルネットワークをや４Ｇなどの携帯電話回線も用いることができる© The Ito Foundation

33

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作（Ⅲ）

ル ー タ を 採 用 し た（I/O DATA 社 ，UD-LT1/

プログラムにより撮影から３Ｄグラフィックの計

EX）。

算までの一連の動作が自動で可能となった。

2 . 2．

アプリケーション開発

2.2.1

３Ｄグラフィックの色管理技術の開発

線センサーにより自動検出し，撮影用コン

申請者らが別途開発した色管理に関する基盤技

ピュータへ撮像トリガを入力する（昨年度製術３）① 枝肉生産ラインを流れる枝肉の位置を，赤外作）の３Ｄグラフィックに対する適用可能性を，

実際の枝肉とは異なり時間が経っても色が不変で② 撮影用コンピュータの撮影用プログラムがカある枝肉模型（過年度に製作）と色評価に適した

メラ40台にレリーズ信号を送る（昨年度製

演色性の高い照明（エコリカ社，ECL-LD2EGD-作）

L3A）を用いて検証した。
2.2.2③ カメラ40台（一昨年度および昨年度整備）がWebアプリケーション開発

枝肉を同時撮影する

枝肉３Ｄシステムにより作成された３Ｄグラ④ 撮影回ごとにNASにフォルダを新規作成し，フィックに，クライアントがインターネットを用

40枚の画像データを格納する（撮影から数秒

いてどこからでもアクセス可能とするパスワード以内に可能）

認証型Webアプリケーションの開発を試み，試⑤ 作 成したPythonプログラムにより，④で画験運用を行った。

像データがNASフォルダに格納されたこと
を計算用コンピュータが自動検知し，３Ｄグ

３．結果と考察

ラフィック計算ソフトウエアがフォルダ内の

枝肉３Ｄシステムのローカルネットワーク構築

画像データから３Ｄグラフィックを自動計算

およびアプリケーション開発により，生産ラインするを流れる枝肉を止めることなく，撮影からイン⑥ 計算結果は，一般的なインターネット接続環

ターネット上に３Ｄグラフィックをアップロード

境（1GigEや3G/4G，WiFi）でスマートフォするところまでを全自動で行えるシステムとしてンでも扱えるサイズのPDFファイルとして完成した（Fig.１）。以下に詳細を述べる。

自動出力する3.1

ローカルネットワークの構築⑦ 計算用コンピュータは，⑤と⑥を繰り返し，

新たに導入したNASおよびLAN/LTEハイブ

計算すべき対象のフォルダがなくなったら待リッドルータにより枝肉３Ｄシステム内の機器を機する

ローカルネットワークで繋ぎ，作成したPython

撮影から枝肉３Ｄグラフィックの出力まで（上現場で想定される各種インター
ネット接続環境

計算用
コンピュータトリガセンサ，
フラッシュ
カメラ
40台

制御マイコン
1GigE
10GigE

ルータ

100Mbps

10GigE

10GigE
撮影用
コンピュータHub

LAN/LTE
ルータ

携帯電話
回線
LAN
(無線LAN/WiFi)

NAS

Fig. 1

Schematic diagram of the improved system© The Ito Foundation

インターネット
サーバ（公開フォルダ）

34

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

述の①～⑥）を，３Ｄグラフィックの画質を中程一つであることから必要と考えられる。申請者ら度（Fig.２）とした場合，約１分で可能であった。

は色管理に関する基盤技術を別途開発してお画質向上とさらなる高速化を目指して計算方法のり３），デジタル画像が持つ本来の色を，ユーザー最適化のためのプログラム改修を引き続き実施すの任意のモニタや環境で再現することを可能にしる。

ている。本技術を用いて，枝肉３Ｄシステムで作

なお，①～④にかかる時間は数秒であった。枝肉生産ラインの速度は，例えば重量計測は枝肉あ製した枝肉模型の３Ｄグラフィックの色校正を行った（Photo１）。

たり５秒程度以上かかり，これに比べて撮影・保

その結果，モニタの特性（Photo１では青味が存の処理スピードは速いため枝肉生産ラインの流強くなっている）を校正し，データ本来の色を再れには干渉しないと考えられた。

現する方向に色味が調整できることを確認した。

また，ネットワークを構成する機材は可動式

一方，実用化に向けた課題としては，Photo１

サーバーラック１台にすべて格納できた。水濡れに示したユーザーインターフェースが現状では静や結露等，導入する現場環境に応じた調整が必要

止画像にしか対応しておらず，３Ｄグラフィックである。

の利点である自由視点表示ができないことがあっ

3.2

た。今後対策し，枝肉３Ｄグラフィック本来の色

アプリケーション開発

3.2.1

３Ｄグラフィックの色管理技術の開発を自由視点でクライアントが再現できるように展

クライアントに配布された３Ｄグラフィックが開を図る。

各種モニタや印刷物等の表示媒体において適切な

3.2.2

色で再現されることは，色が枝肉の重要な品質の新たに導入したLAN/LTEルータにより携帯電

Generated with Agisoft Metashape

Webアプリケーション開発

Generated with Agisoft Metashape

Fig. 2 3D graphic of the carcass dummy rendered by the newly introduced
software with medium image quality© The Ito Foundation

35

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作（Ⅲ）

Photo 1 A photograph showing the result of color calibration of the 3D graphic of carcass
dummy using an user interface application of the color calibration technology.（A）Standard white color swatch,（B）before calibration,（C）after calibration

現場で想定される各種インター
ネット接続環境

計算用
コンピュータトリガセンサ，フラッシュ

制御マイコン
1GigE
10GigE

カメラ
40台

ルータ

100Mbps

10GigE
Hub

10GigE
撮影用
コンピュータ

LAN/LTE
ルータ

携帯電話
回線
LAN
(無線LAN/WiFi)

インターネット
サーバ（公開フォルダ）

NAS

Fig. 3

Schematic diagram of the system with additional calculation computers

話の４Ｇ回線を利用して枝肉３Ｄシステムをイン動でアップロードされ，閲覧可能な状態になるこ

ターネットへ接続し，枝肉３Ｄグラフィックがオとが確認できた。クライアントがオンラインで閲

ンラインで閲覧できる仕組みを構築した。当初，

覧可能にするまでの本システムの処理能力は，単インターネット上に保存された３Ｄグラフィック

位時間当たりに換算すると20個体／時間，480個に，クライアントがどこからでもアクセス可能と体／日である。本システムの実用にあたっては，するパスワード認証型Webアプリケーションを

１日の枝肉処理数に応じて計算用コンピュータの開発し，サーバ等で試験運用することを目指した

高性能化あるいは増設を行う必要がある。なお，が，パスワード認証サーバの準備が職場になかっ

Fig.１に示した構成は，Fig.３のように拡張可能たことから，既存のパスワード認証型公開フォルであり，計算用コンピュータの増設は簡単である。

ダサービス（Google Drive）を暫定的に利用した。

ま た ，用 い た 携 帯 電 話 の ４ Ｇ 回 線 の 速 度 は

その結果，撮影から２～３分でインターネット

75Mbps～100Mbps で あ る が ， 枝 肉 ３ Ｄ グ ラ

上のフォルダ（Google Driveのフォルダ）内に自フィックのPDFファイル（３Mb程度）のアップ© The Ito Foundation

36

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

ロードにはまったく支障はなかった。
４．要

現場での活用に向け展開する。これにより，現在
は枝肉の価格形成に活用されていない立体形態や約

外観の情報の数値化や，スマートフォン等で色も生産ラインを流れる枝肉を止めることなくそのよりリアルな枝肉３Ｄグラフィックを確認するこ

３Ｄグラフィックを制作する本システムは，撮影とが簡単に可能になり，新しい価値の創造に結びからインターネット上への３Ｄグラフィックの付くと考えられる。

アップロードまでの一連の動作を全自動で行えるシステムとして完成した。
今 後 は ，本 シ ス テ ム か ら 得 ら れ る ３ Ｄ グ ラ
フィックの色再現性の確保や，３Ｄデータの畜産

文献１） 本山ら，特願（2019年２月28日）
２） 本山ら，特願（2020年２月28日）
３） 本山ら，特願（2020年４月30日）© The Ito Foundation

37

イミダゾール化合物が食肉の熟成に及ぼす影響について（Ⅱ）
Effect of imidazole compounds on the aging of meat（Ⅱ）

早

川

徹

（北海道大学大学院農学研究院）

Toru Hayakawa（Hokkaido University, Research Faculty of Agriculture）

Carnosine is a dipeptide, consisted of β-alanine and L-histidine, and is abundant inskeletal muscle. Calpain is a Ca ２＋ ion concentration-dependent proteolytic enzyme. To
elucidate the physiological role of carnosine during the transition from skeletal muscle to meat,
this study focused on calpain with particular emphasis on its involvement in tenderization fromrigor mortis. The addition of carnosine enhanced the degradation of myofibrillar proteins by
calpain, and the enhancement of protein degradation was also observed under low Ca２＋ ion
concentration conditions. This showed that carnosine enhanced the Ca２＋ ion sensitivity of
calpain and activated proteolysis. The reaction solution was subjected to SDS-PAGE, andseveral bands that appeared to be proteolytic products of calpain were identified. In addition,
darker bands were observed as the calcium ion concentration increased. The addition ofcarnosine did not increase the number of bands and did not change the density of thedegradation product bands. However, the myofibrillar proteins degraded by calpain were not
identified, and the involvement of meat ripening remained unresolved．

１．目

ンの存在により筋収縮に関与しているタンパク質的であるミオシンのカルシウム感受性を向上させてイミダゾール化合物はイミダゾール環と呼ばれいるためであると考えられている１）。このようにる五員環構造を含む化合物を指し，骨格筋およびカルノシンの機能には不明な部分が多く，新たな食肉においては，βアラニンとヒスチジンからな

機能を明らかにすることで，骨格筋に豊富に存在るジペプチドであるカルノシンが豊富に存在するする理由も解明されるだろう。

ことが知られている。イミダゾール化合物の生理

一方，骨格筋には種々のタンパク質分解酵素が的な役割については，緩衝作用や抗酸化作用を有存在する。これらの酵素は代謝に寄与するだけでするために細胞内の恒常性維持に寄与しているとなく，死後の硬直状態にあった骨格筋を軟化し，考えられている。また，近年，筋線維モデルを用食肉として適した硬さにするとされている。なかいた検討で，カルノシンが骨格筋の収縮運動を活でも，カルパインはカルシウムイオン濃度に応じ性化させるという報告がなされ，これはカルノシて分解活性が変化し，死後にカルシウムイオン濃© The Ito Foundation

38

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

度が上昇することで活性化され，骨格筋の軟化，
つまり食肉の熟成に関与しているとされていて得た上清を筋原線維タンパク質とした。
2 . 2 カルパインによる筋原線維タンパク質のる２）。しかしながら，死後のカルシウムイオン濃分解

度では活性化されないカルパインも存在するた

筋原線維タンパク質を含む反応溶液（タンパクめ，カルパインの熟成への関与については明らか

質濃度1.0 mg/ml）にカルパインを添加することになっていない部分も多い。

で分解反応を開始させた。反応溶液の組成は，いこれまでの検討で，カルノシンの添加により，ずれも終濃度で，0.5 M NaCl，0.1，10，および

低カルシウムイオン濃度条件下におけるカルパイ

1000μM CaCl２，100 mM Tris-HCl pH 6.5とし，ンの酵素活性が向上することを確認した 。本研

カルノシン（終濃度10 mM）の添加したものを究では，筋原線維タンパク質および筋原線維構造

CAR群，無添加のものを対照群とした。カルパに対するカルパインの分解酵素活性が，カルノシ

イン添加の前に30℃に設定したインキュベーター

ンによって向上するのか確認することを目的とし

内で10分間プレインキュベートし，反応開始後もた。

同インキュベーター内で保持した。反応時間は０

３）

２．方
2.1

および２日間とした。反応の停止は同量の10％ト法

リクロロ酢酸を加えた。反応停止後，４℃で15分間静置し，上清の280 nmにおける吸光度を測定

試料調製

カルパインはColleとDoumitの方法にならい調した。

製した 。ひき肉にした鶏浅胸筋に対し，３倍量2.3の 抽 出 液 （100 mM Tris， 10 mM EDTA， 10

上記2.2の分解反応において，反応停止前に一mM DTT，pH 8.3）を加え，ホモジナイズした部をサンプリングし，SDS-PAGE用の試料処理

のち，8,800Ｇで30分遠心分離した。上清を回収し，を行った。電気泳動には，４％ポリアクリルアミ

牛乳ろ紙でろ過したろ液をカルパイン溶液としドの濃縮ゲルと12％の分離ゲル，およびLaemmli

た。カルパイン溶液に30％グリセリンとなるようの泳動用緩衝液を用いた。泳動後のゲルは0.1％

十分冷却したグリセリンを加え，十分に混和し，Coomassie Brilliant Blue R-250溶液で染色し，現分注したものを液体窒素中で急速凍結し，使用時れたバンドを目視で確認した。

４）まで－80℃で保存した。

SDS-PAGEによるタンパク質分解の確認

2 . 4 ウエスタンブロット法によるタンパク質

筋原線維タンパク質は，新鮮な鶏浅胸筋からの同定

Hasselbach-Schneider溶液により抽出し，調製し

上記 2 . 3と同様の方法でSDS-PAGEを行い，泳た。鶏浅胸筋をひき肉にし，10倍量の蒸留水を加動後のゲルを一部切り出し，PVDFメンブレンにえホモジナイズ（10,000 rpm，30 sec）した。遠転写した。転写後のメンブレンをT-PBS（0.1％

心分離後（19,000 G，20 min）
，上清を捨て，得Tween 20， 137 mM NaCl， 2.68 mM KCl， 8.1

られた沈殿に15倍量のHasselbach-Schneider溶mM Na２HPO４ ，1.47 mM KH２PO４）で洗浄し，液（0.6 M KCl，1 mM MgCl２，10 mM Na４P２O７，

２％スキムミルク溶液を用いてブロッキングし0.1 M K-phosphate，pH 6.4）を加え，同様にホた。T-PBSで希釈した一次抗体（抗α-アクチニ

モジナイズした。懸濁液を冷蔵室にて12時間振とン・マウスモノクローナル抗体：Sigma-Aldrich

うした後，遠心分離（19,000 G，20 min）によっ

社；抗デスミン・マウスモノクローナル抗体：同© The Ito Foundation

イミダゾール化合物が食肉の熟成に及ぼす影響について（Ⅱ）

39

社；抗トロポミオシン・マウスモノクローナル抗の存在下において濃く確認できたものはなかっ体；同社）を添加し，抗体反応を行った。その後，た。カルパインによって分解されたタンパク質を

T-PBSで洗浄し，ペルオキシダーゼ標識幸マウ

同定するためにウエスタンブロッティングを試み

スIgG抗体（Bethyl Laboratories社）で二次抗体

たが，抗体反応がうまく作用せず，バンドの検出反応を行った。T-PBSで洗浄後，化学発光分析ができなかった。使用する抗体の見直しや，質量キ ッ ト（Chemi-Lumi One L：ナ カ ラ イ テ ス ク

分析による同定なども検討する必要がある。
骨格筋に含まれるカルパインには，mMオー社）を用い，検出した。

ダーのCa２＋ イオン存在下で活性化されるカルパ

３．結果と考察

イン-１と，μＭオーダーのCa２＋イオン存在下でタンパク質の分解の指標とした吸光度は，カル活性化されるカルパイン-２などがある。骨格筋

ノシン無添加の条件ではCa２＋ イオン濃度が下が中のCa２＋ イオン濃度を考慮するとタンパク質分

るにつれ，低下した。これはカルパインがCa２＋解に寄与しているのはカルパイン-２であるとさ

イオン濃度に依存したタンパク質分解活性であれてきた。本研究で用いたカルパインは，鶏浅胸り，低Ca

イオン濃度条件下では十分にタンパ筋より粗抽出したものであるため，これら２種類

ク質を分解できなかったためだと考えられる。一のカルパインが含まれていると考えられる。本研

方，カルノシンを添加した場合，Ca

イオン濃究では，10および0.1μM CaCl２添加区で，カルノ度の低下に伴い，吸光度も低下したものの，低下

シン存在下におけるタンパク質分解活性が向上しの程度はカルノシン無添加に比べ緩やかであったことが示された。このことは，カルノシンにた。各Ca２＋ イオン濃度条件におけるカルノシン

よって２種類のカルパインが活性化されたことをの添加・無添加で比較したところ，10μＭおよび示唆している。しかしながら，SDS-PAGEでは，

0.1μＭではカルノシン無添加に比べ，カルノシン

カルノシンの添加によるタンパク質分解の向上は添加で高い吸光度を示し，カルノシンの存在に確認できず，また，ウエスタンブロット法による

よってカルパインのタンパク質分解活性が向上しタンパク質同定もできなかったことから，より高たことを示唆した。

精度な解析手法による検討が必要であると考えら

２＋２＋カルパインによるタンパク質分解の程度を確認するため，タンパク質分解反応後の筋原線維タン
パク質懸濁液をSDS-PAGEに供した。Ca２＋ イオ

れる。
４．要

約

ン濃度およびカルノシンの有無に関わらず，確認

本研究は，骨格筋中に豊富に含まれるカルノシ

できたバンドパターンに大きな差異は見られず，ンの，骨格筋から食肉への転換期における生理的カルパインのタンパク質分解活性の向上により新な役割を解明するために，特に死後硬直からの軟

たなタンパク質の分解はないことが示された。ま化（熟成）への関与に焦点を当て，Ca２＋ イオン

た，一部のバンドでは，Ca２＋ イオン濃度が高い

濃度依存性のタンパク質分解酵素であるカルパイ

ほど濃く見えているものもあり，高Ca

イオン

ンに着目し検討を行った。カルノシンの添加によ濃度条件でカルパインによるタンパク質分解が活り，カルパインによる筋原線維タンパク質の分解発であったことが示された。しかし，カルパインが促進され，また低Ca２＋ イオン濃度条件においによる分解で得られたバンドのうち，カルノシンてもタンパク質分解の向上が確認できた。つま２＋© The Ito Foundation

40

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

り，カルノシンがカルパインのCa２＋ イオン感受性を向上させ，タンパク質分解を活性化させたことが示された。しかしながら，カルパインによって分解される筋原線維タンパク質の同定には至らず，食肉の熟成の関与については未解明であった。

文献１）
 Dutka, Travis L., Graham D. Lamb：Journal of
Muscle Research and Cell Motility, 25, 203～213,
2004.
２）
 Pomponio, Luigi, René Lametsch, Anders H.
Karlsson, Leonardo Nanni Costa, Alberto Grossi,
Per Ertbjerg：Meat Science, 80, 761～764, 2008.
３）
 早川徹：令和２年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，39，22～24，2021.
４） Colle, M. J., M. E. Doumit：Meat Science, 131, 142～145, 2017.

© The Ito Foundation

41

ポークソーセージにおけるタンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明
Clarification of the mechanism for holding aroma compounds by proteinsin pork sausages

西

村

敏

英・山

口

千

里

（女子栄養大学栄養学部）

Toshihide Nishimura and Chisato Yamaguchi（Faculty of Nutrition Science, Kagawa Nutrition University）

It is well known that pork sausage is very popular as one of delicious foods. Recently, it
has been shown that lipids in pork sausage gives us Koku attributes such as complexity andlastingness in the flavor sensation. This lastingness is thought to be caused by binding
property of aroma compounds with lipids in pork sausages. However, it is not clear that themechanisms for binding aroma compounds with lipids．
The present research was carried out to clarify which lipid in pork sausage contributed tohold aroma compounds. At first, lipids in pork sausage were extracted and fractionated totriacylglycerol, sugar lipid and phospholipids fractions by florisil column chromatography．
The holding capacity of aroma compounds by each lipid was evaluated by themeasurement of amounts of aroma compounds released from the mixture containing each lipid
after heating. Guaiacol, m-cresol and eugenol possessing log P less than 3 value were not heldby triacylglycerol, sugar lipids and phospholipids fractions. On the other hands, caryophyllene（log P; 4.4）was held by triacylglycerols, and D-limonene, nonanal and caryophyllene
possessing log P more than 3 were held by phospholipid fraction．
The casing composed by collagen and elastin is used to produce pork sausages. This
casing was shown to hold aroma compounds such as methyl propyl disulfide and nonanal.
Nonanal was bound with casing, because it possessed the log P of more than 3. As the log P of
methyl propyl disulfide was less than 3, the mechanism of holding this aroma compound withcasing seemed to be different from that with lipids．

１．目

品の１つであるポークソーセージのおいしさに関的して，コクに焦点を当て，ポークソーセージのコ

申請者は，最近，食べ物のコクに関する客観的評価系の確立を目指し，コクを３つの要素（複雑クの形成と増強に関わるメカニズムの解明を進めている10，11）。

さ，広がり，持続性）で構築し，それぞれの「見先の研究（貴財団からの助成研究）12～17）においえる化」を試みている１～９）。また，美味な食肉製て，ポークソーセージのコクは，うま味物質や脂© The Ito Foundation

42

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

質の添加により増強されていることを，官能評価

ソーセージに含まれる脂質による香気成分の保により明らかにした。また，ポークソーセージの持特性を調べた。ソーセージから脂質を抽出し，香りの特徴に関わる香気成分として，それをカラムクロマトグラフィーで，中性脂肪，

β-Pinene，3-Carene，D-Limoneneを含む16成糖脂質ならびに，リン脂質に分画した後，ソー分を同定し，それぞれの成分の香気的な特徴を明セージから検出された香気成分の脂質への結合性

らかにした。ソーセージ中の脂質と結合しているを調べた。

香気成分は，咀嚼中に口腔内の唾液により放出さ実験方法れることも示した。さらに，昨年度は，同定され（１） 試薬た16の香気成分が，ソーセージに含まれる脂質にトリオレインはSigma社から，メチルプロピル

よって保持されるか否かを検討し，これらの香気

ジスルフィド，L-α-ホスファチジルコリン・ジ成分の中で，脂質に保持されるものとそうでない

パルミトレインと特級メタノールは富士フイル

ものに分かれることが明らかとなった。香気成分

ム・和光純薬（株）から，フロリジル，ヨウ素，は，中性脂肪であるトリオレインにはほとんど結

チオ尿素，ジクロロメタンは関東化学（株）か合しないが，コレステロールやリン脂質に保持さら，アンスロン，D-リモネン，ノナナール，カ

れやすいことも判明した。香気成分の脂質への保リオフィレン，グアヤコール，m-クレゾール，

持のされやすさは，香気成分の有する特性，特にオイゲノール，ジメチルフタレート（内部標準物

log P（分配係数）に依存している可能性が示唆質），特級クロロホルムは東京化成工業（株）かされた。しかし，そのメカニズムは十分に解明さら購入した。シリカゲルプレートはメルク社かられておらず，さらなる解析が必要である。また，購入した。

ソーセージの成分で，脂質以外では，タンパク質（２） 脂質の抽出18）に香気成分の保持効果が知られている。例えば，

市販のウィンナーソーセージ（JAS特級）を細

乳タンパク質や大豆タンパク質にも香気成分の保切した後，10ｇの細切肉に，200mlのクロロホル

持効果があると言われている。しかし，食肉製品

ム：メタノール（２：１）混合液を添加し，ホモに存在するタンパク質の香気成分保持効果に関す

ジナイズした。これを濾過し，濾液を集めた。濾る研究は，これまでまったくなされていない。

液を分液ロートに移し，濾液容量の0.2倍の0.9％

そこで本年度は，まず，ポークソーセージに含食塩水を加えて転倒混和した。その後，30分静置

まれる香気成分の脂質への保持がどのような特性した。水相とクロロホルム相が分離した後，クロに起因しているかを検討するため，ソーセージのロホルム層を回収した結果，100mlの脂質サンプ

脂質を抽出，分画し，各脂質画分への香気成分の

ルが得られた。これを窒素充填し，－30℃の冷凍保持効果を検討した。また，食肉の研究分野では庫で保存した。

まったく未知の領域である「タンパク質による香（３） カラムクロマトグラフィーによる脂質の気成分の保持効果」に関する研究を実施した。

フロリジル樹脂を洗浄した後，乾燥し活性化し２．方法および結果と考察たカラムに，0.67mlの脂質サンプルをロードした１）ソーセージに含まれる脂質の種類の違いによる香気成分の保持特性

分画18）

後，カラムの10倍容のクロロホルムを流し，クロロホルム画分を得た。次に，カラムの20～40倍容© The Ito Foundation

ポークソーセージにおけるタンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明
Table 143

Amount of each lipid in fractionated fractions

画分（回収された脂質の種類）

画分の回収量（ｇ）

クロロホルム画分（主に中性脂肪）

0.102

アセトン画分（主に糖脂質）

0.007

メタノール画分（主にリン脂質）

0.027のアセトンを流し，アセトン画分を得た。さらに，した。

カラムの10倍容のメタノールを流し，メタノール

脂質と香気成分の混合溶液が入ったモノトラッ

画分を得た。各画分の溶媒を留去した後，重量をプ捕集ビンに，モノトラップ１枚を取り付けた測定した。得られたクロロホルム画分，アセトン

後，40℃で20分間加熱した。モノトラップを抽出

画分，メタノール画分には，それぞれ主に中性脂ビンに移した後，抽出溶媒としてジクロロメタン

肪，糖脂質，リン脂質が回収されたと推定し，こ１mlと内部標準物質（原液の1000倍希釈）20μlの操作を繰り返した（Table１）。

を加えて５分間超音波処理をして，香気物質を抽（４） 薄層クロマトグラフィーによる脂質の同出した。これをGC/MSの分析試料とした。

定（６） GC/MSによる香気成分の比較ならびに各脂質画分ならびに，標準試薬をシリカゲルプ
レートで展開し，脂質画分の種類の同定を試みた。
中性脂質の同定では，展開溶媒として，ヘキサ

同定
Mono Trapから得られた香気成分を，以下の条件で分析した。

ン：ジエチルエーテル：酢酸＝90：10：１を用

GC/MS は GCMS-QP2010（島 津 製 作 所（株））

い，ヨウ素で中性脂質を検出した。また，糖脂質

で，カラムはTC-wax（長さ60ｍ×内径0.25mmの同定では，展開溶媒として，クロロホルム：メi.d. ，膜 厚 0.25 μｍ ，使 用 温 度 上 限 260 ℃ ）（GL

タノール：水＝60：35：８を用い，アンスロン試Sciences（株））を使用した。

薬噴霧後の加熱により糖脂質を検出した。
（５） 脂質に吸着した香気成分のモノトラップ（シリカモノリス捕集剤）による捕集

GC/MSの昇温条件は，40℃（10min）→（５℃/min）→ 240℃（20min）で，合計70分間のプロ
グラムを用いた。検出器には，MS（250℃）を使試験管に0.05ｇの脂質を精秤した後，氷水中で，用した。注入量は２μl（スプリットレス）で，エタノールで４倍希釈した香気成分を20μl添加

内 部 標 準 物 質 と し て Dimethyl phthalate を 用 いした。この混合物を氷中で10分間静置した後，た。また，各成分の量的な変化は，サンプルに添10mlの冷やした蒸留水を加えた。次に，これを加した内部標準物質で補正した後，比較した。

90℃の温浴中で4.5時間加熱した。混合溶液が結果および考察

90℃に達してから，加熱時間を計測した。

１．ソーセージから抽出された脂質の香気成分

4.5時間加熱した混合溶液を氷中で冷やした後，蒸留水で10mlにメスアップした。メスアップ後の混合溶液をモノトラップ捕集ビンに移し，混合

保持効果（１） 抽出された脂質による香気成分の保持効
果溶液から放出される香気成分をモノトラップ（シ

脂質を抽出したクロロホルム溶液に窒素を吹き

リカモノリス捕集剤：GL Sciences（株））で捕集付けてクロロホルムを留去し，50mgの脂質を計© The Ito Foundation

44

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

量した。次に，メチルプロピルジスルフィド，ノ（２） 抽出した脂質の分画と確認

ナナール，グアヤコールがソーセージから抽出さポークソーセージからFolch法で抽出した脂質

れた脂質に結合するか否かを調べた。脂質に香気をフロリジルカラムクロマトグラフィーにより，成分を添加し，90℃で4.5時間加熱した後，40℃

クロロホルム画分，アセトン画分，メタノール画で加熱した時に放出される香気成分をモノトラッ

分に分画した。これらの画分には，それぞれ主にプによる捕集方法で調べた。

中性脂肪，糖脂質，リン脂質が回収されたと推定

Fig.１に示すように，メチルプロピルジスル
フィドとノナナールはソーセージの脂質に保持さし，シリカゲルによる薄層クロマトグラフィー（TLC）により確認した。

れることが明らかとなった。一方，グアヤコール

クロロホルム画分をTLCで展開した結果，Fig.

は，脂質無添加の場合にも保持されたことから，２の結果が得られた。クロロホルム画分①と②の脂質ではなく，水溶液中に保持されていると推察スポットのRf値は0.34を示した。標準物質としてされた。香気成分の脂質への保持には，香気成分

展開したトリオレインのRf値も0.34を示し，クロのlog Pが関わっており，log Pが3.56のノナナー

ロホルム画分の値とほぼ一致したことから，クロルが，脂質に最も強く結合していることが明らか

ロホルム画分の脂質が，中性脂肪であることが示となった。また，log Pが1.8のメチルプロピルジ

唆された。アセトン画分を展開しても何も検出さスルフィドも，脂質に結合していることが判明しれなかったことから，中性脂肪は存在しないと推た。しかし，log Pが1.32のグアヤコールは疎水性察された。

が低く，脂質に結合しなかったと推察された。こ次に，アセトン画分で溶出した脂質が，糖脂質れまでの研究では，香気成分の脂質への結合は，であるか否かを確認した。図には示さないが，アlog Pが３より大きいものが多いことから，メチ

セトン画分を展開した結果，Rf値が0.82を示した。

ルプロピルジスルフィドの脂質との結合メカニズ

また，クロロホルム画分を展開した結果，Rf値は

ムは，log P以外の要因が関わっている可能性が0.96を示し，標準物質であるトリオレインのRf値示唆された。

と一致したことから，アセトン画分は中性脂肪でPeak area (x 106)12

without lipids
with lipids

10
8
6
4
2
0

methyl propyl
disulﬁdenonanalguaiacolFig. 1 Amounts of aroma compounds released from lipids in pork sausages
after heating© The Ito Foundation

45

Direction

ポークソーセージにおけるタンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明

Chloroform
fraction (Fr.)①②

AcetoneFr.
① ②

trioleinα- phosphatidyl
di- palmitoyl

Fig. 2 Thin-layer chromatography of lipids fractionated by florisil column
chromatography

はなく，糖脂質を含んでいると推定された。
今回，エタノール画分に関しては検討できな

ル，オイゲノールは，いずれの脂質とも結合せず，水溶性の香気成分であると推定された。これらのかったが，文献18からリン脂質と推定された。

log Pは，それぞれ1.3，２，２で，３よりも小さかっ（３） 分画した脂質画分による香気成分の保持た。以前の研究で，脂質に結合するlog Pを３以上と考察したが，今回の結果も同様の結果となっ効果
フロリジルカラムクロマトグラフィーにより分た。

画されたクロロホルム画分，アセトン画分，メタ

一方，クロロホルム画分の中性脂肪には，カリノール画分を用いて，これらによる香気成分の保オフィレンが強く結合することが明らかとなっ持効果を調べた。この保持効果は，脂質に香気成た。カリオフィレンは，クローブ，ラベンダー，分を添加し，90℃で4.5時間加熱した後，40℃でレモン，グレープフルーツなどの精油に存在して加熱した時に放出される香気成分をモノトラップ

いる香気成分であり，ウッディ香が特徴である。

による捕集方法で調べた。

この成分はコレステロールに結合するとの結果

各画分の脂質50㎎に，ソーセージで検出されたが，すでに得られているが，中性脂肪に保持され６種類の香気成分，D-リモネン（D-limonene），

るという結果はまだ得られていない。今回分画さノ ナ ナ ー ル （nonanal），カ リ オ フ ィ レ ン

れたクロロホルム画分に，コレステロールが含ま（caryophyllene），グアヤコール（guaiacol)，m-れていないかを検討する必要がある。また，メタ

クレゾール（m-cresol），ならびにオイゲノール

ノール画分には，リモネン，ノナナール，カリオ（eugenol）を添加し，保持効果を調べた。６種類

フィレンが強く結合していることが明らかとなっの香気成分は，それぞれ保持時間で約23分，30分，た。この画分にはリン脂質が含まれていると考え

35分，41分，45.5分，47.5分で検出された（Fig.３）。

られる。リン脂質はこれまでの研究から，多種の各香気成分の脂質への結合性は，脂質の種類に香気成分が保持されることが明らかとなっている

よって異なっていた。グアヤコール，m-クレゾー

ので，今回のメタノール画分にはリン脂質が含ま© The Ito Foundation

46

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Chloroform Fr.

④

③

①

②

⑤

⑥

⑦

Peak intensity

Acetone Fr.

Methanol Fr.

without lipids

20

30

40

50

保持時間（分）Fig. 3 Chromatogram of aroma compounds released from the mixture containing each lipid after heating（①D-limonene，②nonanal，③caryophyllene，④guaiacol，⑤m-cresol，⑥eugenol，⑦Internal standard）

16

without lipids

Peak area (x 106)

14

Chloroform Fr.
Acetone Fr.

12

Methanol Fr.

10
8
6
4
2
0

Fig. 4D-limonene

nonanal caryophyllene guaiacol

m-cresoleugenol

Amounts of aroma compounds released from the mixture containing each lipid after heating

れていると示唆された。また，リモネン，ノナナー

ンパク質にも香気成分の保持効果があると言われ

ル，カリオフィレンのlog Pは，それぞれ4.57，ている。しかし，食肉製品に存在するタンパク質の3.27，4.4で，いずれも３より大きかった。このこ

香気成分保持効果に関する研究はまったくない。

とが，これらの香気成分が脂質に保持される１つの理由であると推察された（Fig.４）。

そこで，食肉の研究分野ではまったく未知の領域である「タンパク質による香気成分の保持効果」を調べた。

２）タンパク質による香気成分の保持効果
脂質以外では，タンパク質に香気成分の保持効
果が知られている。例えば，乳タンパク質や大豆タ

実験方法（１） 試薬ソーセージのケーシングとして使用される羊腸© The Ito Foundation

ポークソーセージにおけるタンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明

47

は，伊藤ハム米久ホールディングス（株）からごの香気成分で，羊腸には結合しない可能性が示唆提供いただいた。メチルプロピルジスルフィドは富された。一方，メチルプロピルジスルフィドとノ士フイルム・和光純薬（株）から，ノナナールとグ

ナナールは，log Pがそれぞれ1.8と3.27である。

アヤコールは東京化成工業（株）から購入した。

グアヤコールよりlog Pが高いことから，羊腸に（２） タンパク質による香気成分の保持特性より保持されたと推察され，羊腸の構成タンパク

羊腸を細切した後，試験管に0.05ｇを精秤した。

質に香気成分が保持される可能性が示唆された。

これに氷水中で，エタノールで４倍希釈した香気

羊腸の主要な構成タンパク質はコラーゲンやエラ

成分を20μl添加した。この混合物を氷中で10分

スチンである。これらのタンパク質は疎水性タン間静置した後，10mlの冷やした蒸留水を加えた。

パク質で，香気成分を保持する可能性が示唆され次に，これを90℃で4.5時間加熱した。

た。今後はタンパク質を用いて，香気成分保持の（３） モノトラップ（シリカモノリス捕集剤）

メカニズムを解明することは，興味深い課題である（Fig.５）。

による香気成分の捕集第１項の実験方法１－（５）と同様の方法で実験

また，メチルプロピルジスルフィドは，log Pを行った。

が1.8であり，３より小さいにも関わらず，羊腸（４） GC/MSによる香気成分の比較ならびにに結合したことから，脂質による保持効果とはメ

同定

カニズムが異なる可能性が示唆された。

Mono Trapから得られた試料を，第１項の実
験方法１－
（６）
と同じ条件で分析した。
結果および考察３．要約

ポークソーセージは美味な食品の１つであり，グアヤコールは，羊腸無添加のものと，添加しコクのある食品である。ポークソーセージに添加たものの両方で香気成分が保持されたことから，される脂肪が，ソーセージの特徴を示す香気成分

羊腸にグアヤコールの保持効果は認められなかっを保持し，味わいの広がりや持続性を強めて，ソーた。グアヤコールは，log Pが1.3であり，親水性セージのコクを増強することが明らかとなった。

Peak area (x 106)25
20

without casing
with casing

15
10
5
0

methyl propyl
disulﬁdenonanalguaiacolFig. 5 Amounts of aroma compounds released from the mixture containing casing after heating© The Ito Foundation

48

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

本研究では，ソーセージに含まれている脂質を抽出すると同時に，中性脂肪，糖脂質，リン脂質に分画し，どの脂質画分に香気成分が保持されるかを検討した。その結果，各香気成分の脂質への結合性は，脂質の種類によって異なっていた。グアヤコール，m-クレゾール，オイゲノールは，いずれの脂質とも結合しなかった。これらの香気
成分のlog Pは，それぞれ1.3，２，
２で３より小さかった。以前の研究で，脂質に結合するlog Pを３と考察したが，今回の結果も同様の結果となった。一方，クロロホルム画分の中性脂肪には，カリオフィレン（log P：4.4）が強く結合することが明らかとなった。カリオフィレンは以前の研究において，コレステロールに結合したという結果が得られているが，中性脂肪に保持されるという結果は初めてである。また，リン脂質が含まれる
メタノール画分には，リモネン，ノナナール，カリオフィレンが強く結合することが明らかとなった。
羊腸には，メチルプロピルジスルフィドとノナ
ナールが結合することが明らかとなった。これらの香気成分のlog Pはそれぞれ1.8と3.27であり，log Pが３よりも小さいメチルプロピルジスル
フィドが羊腸に保持されることが判明した。羊腸の構成成分であるコラーゲン等のタンパク質への香気成分の結合メカニズムを解明することが，次の興味深い課題である。
文
献１） Nishimura, T.：Definition of “Koku” Involved inFood Palatability （Koku in Food Science andPhysiology, Eds. Nishimura, T. & Kuroda, M.）, 1～
16, Springer Nature, Singapore, 2019.
２） 西 村 敏 英：食 品 の コ ク と そ の 生 成 メ カ ニ ズ ム（「食品のコクとは何か」，西村敏英・黒田素央編著），
１～21，恒星社厚生閣，2021．
３） 西村敏英：食肉のおいしさとそれを引き出すコクと は ！，JATAFF ジ ャ ー ナ ル ，3（12），29～35 ，
2015.

４）
 西村敏英：食品のおいしさを改善するコク増強物
質のチョイ足し技術，月刊フードケミカル，20179，23～27，2017.
５） 西村敏英：コクの要素と寄与成分を活かした食品
開発，食品と開発，53（6），20～23，2018.
６） 西村敏英：食品のコクとおいしさへの活用，醤油の研究と技術，45（3），161～168，2019.
７）
 Nishimura, T., Goto, S., Miura, K., Takakura, Y.,
Egusa, S. A., Wakabayashi, H.：Umami compounds
enhance the intensity of retronasal sensation ofaromas from model chicken soups, Food Chemistry,
196, 577～583, 2016.
８）
 Nishimura, T., Egusa, S. A., Nagao, A., Odahara,
T., Sugise, T., Mizoguchi, N., Nosho, Y.：
Phytosterols in onion contribute to a sensation of
lingering of aroma, a koku attribute, Food
Chemistry, 192, 724～728, 2016.
９） 西村敏英：食肉のおいしさを引き出すうま味物質の役割，食肉の科学，57（2），177～180，2016.
10）
 Nishimura, T., Saiga, A.：Umami Compounds
and Fats Involved in Koku Attribute of Pork
Sausages（Koku in Food Science and Physiology,
Eds. Nishimura, T. & Kuroda, M.）,47～58, Springer
Nature, Singapore, 2019.
11） 西 村 敏 英：食 肉・食 肉 製 品 の コ ク と お い し さ（「食品のコクとは何か」，西村敏英・黒田素央編著），
161～172，恒星社厚生閣，2021.
12） 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明（その３），平成28年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.35，31～
39，2017.
13）
 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明，平成26年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.33，101～108，2015.
14） 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの『こく』とその寄与因子の解明（その２），平成27年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.34，72～
80，2016.
15）
 西村敏英：ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂質の役割，平成29年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.36，59～67，2018.
16）
 西村敏英，力石麗奈：ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅱ），
平成31年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.38，33～41，2020.
17）
 西村敏英，山口千里：ポークソーセージにおける脂質のコク増強効果とそのメカニズムの解明（Ⅲ），
令和２年度 食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.39，25～33，2021.
18）
 生物化学実験法９ 脂質・酸化脂質分析法入門（宮澤陽夫・藤野泰郎編著），74～83，（株）学会出版センター，2000.

© The Ito Foundation

49

食肉加水分解物の栄養機能について
Nutritional function of meat hydrolysates

竹之山

愼一・川北

久美子・六車三治男（南九州大学健康栄養学部）

Shinichi Takenoyama, Kumiko Kawakita and Michio Muguruma（Faculty of Health and Nutrition, Minami Kyushu University）

The objective of this research was to produce the drinkable meat proteins and theirpowders and pellets. The hydrolysates of chicken breast meat were prepared by digestion withfood grade enzyme. Degradation of proteins to the peptide level usually results in significant
bitterness, astringency and unpleasant odors in the degradation products. The solution wasmade possible by selecting enzyme and combining the optimum conditions and purification
method. A meat drink containing 8g of protein per 120 ml was produced. Based on SDS-PAGE
and size exclusion chromatography, the hydrolysates of chicken breast meat digested withprotamex contained peptides and amino acids with molecular weights of about 6,800 to 240.
Then, dry powders and tablets were made from the hydrolysates. The antioxidant activity of
the hydrolysates was determined by the DPPH radical scavenging assay. Angiotensin I
converting enzyme（ACE）inhibitory activity of the hydrolysates was determined by rabbit
lung enzyme. Hydrolysates of chicken breast meat showed the high DPPH inhibition activity
and high ACE inhibitory activity. In addition, it was rich in essential amino acids and functional
peptides such as BCAA and imidazole dipeptide. Based on their remarkable antioxidant
activity and ACE inhibitory activity and rich in essential amino acids and functional peptides
such as BCAA and imidazole dipeptide, we suggest that the hydrolysates of chicken breast
meat may have potential applications as functional food．
Functional peptide beverages, powders and tablets derived from meat with excellent
digestibility and absorbability have been developed. Meat protein with a high protein score is
now easily available to the elderly, toddlers, undernourished people, people with masticatory
and swallowing disorders and athletes anytime, anywhere．

１．目

適切なタンパク質（アミノ酸）の摂取が重要であ的ることは，筋量，筋力，運動機能などを指標とし

近年，高齢者はさまざまな理由で低栄養から筋た数多くの研究から明らかとなっている２～４）。日

肉量・筋力の低下（サルコペニア）や虚弱（フレ本人の食事摂取基準（2020年版）では，サルコペ

イル）になる問題が認識されている１）。高齢者のニアおよびフレイルの発症予防を目的とした場

サルコペニアやフレイルの予防に，運動とともに合，高齢者（65歳以上）では少なくとも１g/kg© The Ito Foundation

50

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

体重／日以上のタンパク質を摂取することが望ましいと記述されている５）。タンパク質を食品とし法

２．方て摂取する場合，必須アミノ酸組成がヒトの必要2.1とするアミノ酸バランスに近く，十分に消化され和牛肩赤身肉，国産豚ロース肉，国産鶏むね肉るものであれば栄養価の高いタンパク質と言えを実験材料として使用した。なお，実験の目的にる。食肉は良質なタンパク質を多く含んでおり，合う新鮮な実験材料は，宮崎市内の食肉専門店か

健康や長寿には不可欠な食品である６）。

ら購入した。

われわれは2003年以来，食肉由来の血圧降下作

2.2

実験材料

食肉の酵素処理用を有するペプチドを単離・精製し，その作用機

食肉タンパク質の高度加水分解のため，ノボザ

作を明らかにしてきた。食肉の消化酵素分解ペプ

イム社の酵素製品のアルカラーゼ（エンド型プロ

チドにACE阻害活性があり，動物実験においてテアーゼ），プロタメックス（エンド型プロテ血圧降下作用，抗酸化作用やⅡ型糖尿病予防作用アーゼ），フレーバーザイム（エンド型プロテを示す結果を得ており，それらの研究を取り

アーゼ，エキソ型ペプチダーゼ）の食品グレード

まとめ総説として報告している 。さらに，調理のタンパク質分解酵素を使用した。各原料ミンチ

加工した食肉・食肉製品を摂取した際にも，生の肉に加水（３倍量の蒸留水添加）し，各種酵素を対照肉に比較してACE阻害活性や抗酸化活性をそれぞれ単品で適量添加して撹拌しながら50℃で有する機能性ペプチドの産生の程度が増加するこ

90分間反応させた。100℃で２分間加熱して酵素とを明らかにした 。また，高い血圧上昇抑制効を失活後，冷却した加水分解物をガーゼでろ過し果や抗酸化活性を有し筋肉で代謝される分岐鎖アて 得 ら れ た ろ 液 を 遠 心 分 離（7,000rpm ，15 分）

ミノ酸（BCAA）も豊富に含み，スポーツ栄養のし，その上清画分を液状化加水分解物（ミートド

分野にも貢献できる鰹節菌で発酵した新規和風生リンク）とした。さらに，そのミートドリンクをハムを完成させた 。

噴霧乾燥してミートパウダーを調製し，そのミー

７～11）

12）

13）

14）

そのような良質なタンパク質を持つ食肉を「食トパウダーからミートペレットを調製した。な

べる食肉から飲む食肉」へと変換することによお，食肉加水分解物の栄養機能解析のため，それり，いつどこでも気軽に摂取でき，栄養価が高くらの試料を溶解し0.45μmメンブレンフィルター

生活習慣病予防効果も有する食品素材を開発する（アドバンティック東洋（株））でろ過したろ液をことが本研究の目的である。具体的には，食肉を実験に用いた。

各種食品用の酵素により分解してミートドリン
ク，ミートパウダーやミートペレットを作製し，

2 . 3 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）

それらの生理活性や栄養機能性を解析することに得られた試料の分子種や酵素処理による分解程

より，高齢者の生活機能の維持と生活習慣病の予度を調べるため，ドデシル硫酸ナトリウムポリア

防，特に血圧上昇抑制効果，抗酸化効果を持つ食ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動（SDS-PAGE）を材の開発を試みた。さらに，アスリート向けのス

Laemmliの方法15）で行った。アクリルアミド濃度7.5

ポーツニュートリションとしての効果の検討も視～17.5％のグラジエントゲルを用いてスラブ型の泳野に入れて開発・研究を行った。

動槽で行った。ゲルバンドの染色はクーマシーブ
リリアントブルーR-250（Bio-RAD Laboratories）© The Ito Foundation

食肉加水分解物の栄養機能についてにより行い，脱色には10％酢酸を用いた。
2 . 4 ゲルろ過高速液体クロマトグラフィー（HPLC）

51

pH６に調整したものを使用した。
2 . 7 アンギオテンシンⅠ変換酵素（ACE）阻
害活性の測定溶 離 液 は 0.05 Ｍ リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液

Cushman と Cheung の 方 法 19）に 準 じ て 測 定 し（pH7.0）300mM NaClを用いた。分析中は溶離液た。ACEはウサギ肺由来アンギオテンシンⅠ変を脱気装置（DGU-14A，島津製作所（株））に通換酵素（ACE，Peptidyl dipeptidase，EC 3.4.15.1，

し ， カ ラ ム は TSK-GEL G 2000SWXL （7.8 ×シグマ社）を用い，0.25Ｍホウ酸緩衝液で60unit/

300mm）（東 ソ ー （株））， 送 液 ポ ン プ は LC-

mlに調整し，測定時には0.25Ｍホウ酸緩衝液で１20AD（島 津 製 作 所（株）
）を 用 い ，流 速 2.0ml/

unit/mlに希釈し使用した。ACEとの反応基質とmin ，注 入 量 20 μl で 行 っ た 。検 出 器（SPD-

しては合成基質であるヒプリル-Ｌヒスチジル-Ｌ

10AVP，島津製作所（株））を用い，280nmの検

ロイシン（HHL，ナカライテスク社）を使用し出波長でペプチドの検出を行った。分子量マーた。このHHLを塩化ナトリウム（和光純薬工業），

カーは，BSA（MW：67,000），シトクロームＣ

0.25Ｍホウ酸緩衝液をそれぞれ0.608Ｍ，0.1Ｍに（MW：13,000），アプロチニン（MW：6,500），

なるようにMilli-Q水を用いて調整した溶液で溶

リボフラビン（MW：376）を用いた。

解した。

2.5

タンパク質の定量

タンパク質の定量はBiuret法

試料６μlに１unit/mlのACE溶液20μlおよびにより行った。

7.6mM HHL溶液50μlを添加し37℃で30分間反応

すなわち，タンパク質溶液に対し，４倍量のBiuret

させた。反応は0.1N HCl（和光純薬工業）554μl

試薬を加えて常温で30分間反応させた。反応液をを加えて停止させた。反応後には酢酸エチル（ナ島 津 製 作 所 （株）UV-VIS Spectrophotometer

カライテスク）1.5mlを加えてACEの作用により1240型分光光度計（吸光度：540nm）にて測定し遊離した馬尿酸を振とう抽出し，2,500rpm，15

た。また，分解物であるペプチドについてはUV

分間遠心分離を行った。上清の酢酸エチル層を１法17）を適用し，測定を行った。

ml分取し，100℃，10分間の加熱により蒸発乾固

2.6

16）

させた。乾固した馬尿酸を回収するために１ＭのDPPHラジカル消去活性の測定

DPPHラジカル消去活性の測定は，DPPH分光
測 定 法 に 準 じ て 行 っ た 。す な わ ち ，400 μM
18）

NaCl溶液を１ml加えボルテックスを行った。溶解した馬尿酸の吸光度を228nmで測定した。

DPPH, MES （2-morpholino-etanesulphonic

阻害率は試料の吸光度をＳ，試料の代わりにacid）buffer，20％エタノールを同量ずつ加え，

Milli-Q水を加えた時の吸光度をＣ，あらかじめ混液を作製した。混液を0.9ml分注し，80％エタ

ACEを失活させてから反応させた時の吸光度を

ノールを240μlとサンプルを60μl加え，20分間反

Ｂとして次式より求めた。
阻害率（％）＝｛（C－S/C－B）}×100

応させた。その後，サンプルを加えた順に前述の分光光度計にて吸光度520nmで測定した。また，

2.8

サンプルの代わりに，0.2mM Trolox（シグマ社）

遊離アミノ酸含量の測定については，分析試料

をサンプルとした測定値を基準として測定し，検の重量に対し３倍量のスルフォサリチル酸を加え量線からサンプルのTrolox相当量を算出した。

ホモジナイズ後，冷蔵庫で１時間静置してタンパ

MES BufferはMESを蒸留水に溶解し，NaOHでク質を変性・沈殿させた。その後，3,500xg，４℃© The Ito Foundation

遊離アミノ酸含量の測定

52

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

で15分間遠心分離を行った。上清を0.45μｍメン

チド由来の苦みも少ないチキンミートドリンクがブレンフィルターでろ過し，これをアミノ酸自動開発された。さらに，レトルト処理により長期間分析機（SHIMAZU LC-MS UF-Amino Station：

室温で保存可能な製品の作製が可能となった。な島津製作所（株））にて分析した。

お，牛肉や豚肉を原料とした場合には，味の改善

2.9

統計解析

を検討する必要があるが，目標とするタンパク質

試験結果の解析は，一元配置分散分析による多量に近い製品の製造も可能であった。使用する酵

重比較を行い，５％未満の水準でサンプルの効果

素の併用により加水分解物が増加するとの報告もが有意であった場合（ｐ＜0.05），Tukey法によあり21），今後検討が必要である。

る多重比較検定を行った。それぞれの値は平均値±標準偏差で表した。

本報告では，鶏むね肉のプロタメックス処理により作製された液状のチキンミートドリンク，粉末化したチキンミートパウダーや錠剤化したチキ

３．結果と考察

ンミートペレットの栄養機能について，得られた

3 . 1 ミートドリンク，ミートパウダーおよび結果を記載する。なお，チキンミートドリンクの粉末化と錠剤化は，マルナカフードにより行われた。

ミートペレットの開発
日本人の体重分布からすると，その平均は男性
70kg，女性55kgである。１g/kg体重/日以上のタ

3 . 2 SDS-PAGEおよびゲルろ過HPLCによる分子量分布の分析

ンパク質の摂取が筋肉量の低下を予防することを鶏むね肉からプロタメックス処理により生じる考慮すると ，平均で62.5ｇのタンパク質摂取が機能性ペプチドを含む分解物の産生過程を検討し必要となる。男性を対象とした場合には１日のタた。まず，SDS-PAGEにより酵素処理に伴うタンパク質の摂取量が約70ｇとなり，１食分の液状

ンパク質やペプチド成分の分子量分布を推定し，ドリンク（120ml）から，10分の１の量に当たる

さらに，ゲルろ過HPLCを用いた分析から，加水７ｇのタンパク質が摂取できるドリンクを作製す

分解物の溶解状態における分子量分布も推定した

る目標を立てた。

（Fig.１）。

20）

まず，実験材料の牛肉，豚肉，鶏肉を「食べるSDS-PAGEによる解析で（Fig. 1A），鶏むね肉

食肉から飲む食肉」への変換を目的に，アルカからプロタメックス処理（30分間）により，大部

ラーゼ，プロタメックス，フレーバーザイムによ分のミオシン重鎖（MW：230,000），Ｚ-線の構り各酵素の至適条件で加水分解した結果，鶏むね

成成分のα-アクチニン（MW：100,000）やアク肉のプロタメックス処理により，目的のタンパク

チン分子（MW：42,000）などの高分子量のタン質含量に近い液状化ドリンクが得られることが明

パク質が，低分子量のペプチド（MW：7,000以

らかになった。一般に，タンパク質をペプチドレ下）に分解されることが認められた。さらに90分

ベルまで分解すると，分解生成物には著しい苦間の酵素処理により，筋原線維を構成する未分解

味，渋み，不快臭が必ず発生する。その解決のたの筋肉構造タンパク質や調節タンパク質のほとん

め，活性炭処理と苦み改善剤のベネコート（花王

どが，低分子量ペプチド（MW：7,000以下）に（株））を添加することによりそれらは低減され分解されることが確認された。なお，加水分解物

た。その結果，鶏むね肉の酵素処理により120mlの活性炭処理によっても，MW：7,000以上の分

中約８ｇの液状化タンパク質を含み，臭いやペプ

子量を持つゲルバンドの消失が認められ，そのこ© The Ito Foundation

53

食肉加水分解物の栄養機能について

B

MW

MW

235,000
116,000
91,000120,000
91,00048,00038,00029,50021,00049,00036,0001 2 3 4

Absorbance at 280nm

A3

MW: 6,800
MW: 3,800

MW: 240

4

MW: 6,800
MW: 3,800
MW: 1,700
MW: 240

5

Retention time
Fig. 1 SDS-PAGE and HPLC profiles of chicken breast meat hydrolysates prepared by digestion with protamex. A：SDSpage profiles. B：HPLC chromatogram of hydrolysate eluted through TSXgel G2000SWxl column.1&5：molecularweight marker; 2：raw chicken meat; 3：hydrolysate digested for 30min.：4; hydrolysate digested for 90min．

とが不快臭低減の要因の一つと考えられた。

分 解 物（CM Hydrolysate）は 対 照 区（Chicken

次に，鶏肉加水分解物の溶解状態での分子量分Meat）と比較して約3.7倍の高い抗酸化活性を示

布を測定するため，0.45μｍのポアサイズのセルした。また，その噴霧乾燥物（CM Hydrolyzed

ロースアセテートメンブレンフィルターを通過しPowder）と 錠 剤（CM Hydrolyzed Pellet）も ，た試料を用いてHPLC分析を行った（Fig. 1B）。

それぞれ対照区と比較して約4.2倍と3.35倍の高い

その結果，30分間のプロタメックス処理により，抗酸化活性を保持していた。既知の抗酸化成分の

MW：6,800とMW：3,800のピークや，それよりカルノシンと比較しても，液状の加水分解物，噴低分子のMW：240に至る範囲にブロードなピー

霧乾燥物および錠剤の抗酸化活性値は，約1.9倍，クを持つペプチドに分解された。90分間の酵素処

2.2倍，および1.8倍を示した。

理により，さらに低分子量化が進行し，MW：

われわれは，各種食肉の消化酵素分解物の抗酸

1,700に小さなピークの出現が認められた。これ

化作用の比較検討を行い，牛肉，豚肉，鶏肉の消らの結果から，各ピークは約60残基から２残基の化酵素分解物に，既知の抗酸化成分のカルノシン

アミノ酸残基から構成される多数のペプチドとしと同等以上の抗酸化活性が産生されることを報告て存在することが推定された。このように，高度した22）。対照区の鶏むね肉の値は，畜種別差異を加水分解により液状化した鶏肉タンパク質のほと比較検討したその時の数値とほぼ同等の値を示し

んどが，ペプチドや遊離のアミノ酸として存在す

た。近年，食品の機能性成分の中で抗酸化成分は，ることが認められた。鶏肉タンパク質は，酵素に

生活習慣病，ガンおよび老化などの予防に有効でよってマイルドな条件下で加水分解されたので，あることが明らかになってきた。末綱は，魚肉の栄養的な価値を有する各種機能性ペプチドの発現

酵素分解物に含まれる11種類の抗酸化ペプチドをが期待された。

同定している23）。鶏むね肉加水分解物にも，内因

3.3

抗酸化活性の評価

性抗酸化物質としての機能を有するカルノシンや

鶏むね肉をプロタメックスで加水分解して得ら

アンセリンなどのイミダゾールジペプチドのほかれた加水分解物の抗酸化活性（DPPHラジカル消に，新規抗酸化ペプチドが存在して高い抗酸化活去活性）をFig.２に示した。液状の鶏むね肉加水性を発現していることが示唆された。

© The Ito Foundation

54
DPPH RS activity (μM TE)

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

160
140
120
100
80
60
40
20
0

Carnosine

ChickenMeat(CM)

CM
CM
Hydorolysate Hydrolyzed
PowderCM
Hydrolyzed
PelletFig. 2 DPPH radical scavenging（RS）activity of hydrolysates of chicken breast meat digested withprotamex. Associated graph shows the values of trolox equivalent（TE）. All samples were

ACE inhibitory activity (%)

assayed at a protein concentration of 10mg/ml. Error bars indicate standard deviation (n＝4）．

100

100

A

80

80

60

60

40

40

20

20

0

B

Carnosine

ChickenCM
CM
CM
Meat(CM) Hydrolysate Hydrolyzed Hydrolyzed
PowderPellet0

CarnosineCM
Hydrolyzed
PelletCoversylFig. 3 ACE inhibitory activity of hydrolysates of chicken breast meat digested with protamex.
Associated graph shows the values of ACE inhibition percentage. A：All samples wereassayed at a protein concentration of 10mg/ml. B：All samples were assayed at a protein
concentration of 1mg/ml. Error bars indicate standard deviation（n＝3）. Coversyl（Perindopril Erbumine）：hypertension treatment agent（Persistent tissue ACE inhibitor）．

3.4

ACE阻害活性の評価

肉加水分解物標品は約2.5倍以上のACE阻害活性

Fig. 3Aに，プロタメックスで鶏むね肉を加水を示した。

分解することにより得られた加水分解物（CM

食品中のACE阻害物質については，今までにHydrolysate）， 噴 霧 乾 燥 物 （CM Hydrolyzed

多くの研究が行われており，主としてタンパク質

Powder）お よ び 錠 剤（CM Hydrolyzed Pellet）

派生ペプチドの検索が行われ，多くのACE阻害のACE阻害活性を示した。10mg/ml濃度の試料

ペプチドが単離・同定されてきた。われわれは，を用いた結果から，鶏むね肉を加水分解すること

食肉や畜産副生物中に含まれるACE阻害ペプチにより対照区（Chicken Meat）と比較して，いドを単離・同定して報告してきた２～12，24，25）。また，

ずれの加水分解物標品も６倍以上で，90％以上の牛肉，豚肉，および鶏肉を用いて，それらを加熱

阻害率の非常に高いACE阻害活性を示すことが後，消化酵素のぺプシンおよびトリプシンで処理

明らかになった。また，既知のACE阻害物質のすると，鶏肉，豚肉，牛肉の順にACE阻害活性

カルノシン（Carnosine）と比較しても，鶏むねが増加することを認め，さらに各種食肉由来ペプ© The Ito Foundation

55

食肉加水分解物の栄養機能について

チ ド の IC50 （mg/ml）を 算 出 し た と こ ろ ，鶏 肉

（2.8ｇ）当たり，タンパク質2.0ｇ，脂質0.1ｇ，（3.55），豚肉（4.19），牛肉（9.02）であることを炭水化物0.2ｇ，食塩相当量0.1ｇを含んでいる。

報告した26）。これらのことから，鶏むね肉加水分

そこで，この錠剤を粉砕して得られた粉末から抽解物は高いACE阻害活性を発現する多くのペプ出した遊離アミノ酸組成をFig. 4Aに示した。濃チドを含んでいる可能性が示唆された。

い棒グラフは９種類の必須アミノ酸を示していコバシル（Perindopril Erbumine）は，おもにる。その結果。Glu，Ala，Leu，Asp，Argなど

高血圧症の治療に用いられている高血圧治療剤の ア ミ ノ 酸 が 多 く 含 有 さ れ て い た 。さ ら に ，（持続性組織ACE阻害剤）である。そこで，低濃Val，Leu，Ileの分岐鎖アミノ酸（BCAA）を含度（１mg/ml）の条件下で，鶏むね肉加水分解

む９種類の必須アミノ酸が多く含まれていた。

物 錠 剤（CM Hydrolyzed Pellet）と カ ル ノ シ ン

食肉中にはイミダゾールジペプチドが非常に高や コ バ シ ル と の ACE 阻 害 活 性 の 比 較 を 行 っ た

濃度に存在し，牛・豚は主にカルノシンを，鶏は（Fig. 3B）。そ の 結 果 ，加 水 分 解 物 錠 剤（CMカルノシンとアンセリン両方を含んでいる。最も高Hydrolyzed Pellet）の力価はカルノシンの約４濃度にイミダゾールジペプチドを含有している鶏倍，コバシルの約半分の力価に相当することが明

むね肉加水分解物中の遊離イミダゾールジペプチ

らかになった。臨床的に用いられているACE阻

ド組成をFig. 4Bに示した。その結果，加水分解物

害薬は非常に高いACE阻害活性を有しているが，には，カルノシン35mgとアンセリン102mgがいず

空咳や喉の違和感などの副作用が報告されていれも高濃度含まれていた。カルノシンとアンセリン

る 。しかし，ACE阻害ペプチドを含む食肉由来の割合は約１：３であった。加水分解物錠剤10粒の 鶏 む ね 肉 加 水 分 解 物 錠 剤（CM Hydrolyzed

当たり，約2,000mgのペプチドやアミノ酸が含有さ

Pellet）は，副作用の心配もなく高血圧予防作用れている。その中身は，遊離アミノ酸や遊離イミを発揮すると考えられる。

ダゾールジペプチドとして存在する成分が約７mg

27）

3 . 5

鶏 む ね 肉 加 水 分 解 物 錠 剤 （CMHydrolyzed Pellet）の遊離アミノ酸分析

一般にタンパク質は，摂取すると消化管の中でAFree imidazol dipeptides content(mg/100g Sample)

50

プチドやアミノ酸として存在すると想定された。

40
30
20
10
0

Asp
Glu
Asn
Ser
Gly
Gln
His
Thr
Ala
Arg
Pro
Val
Met
Lys
Ile
Leu
Phe
Trp

Free amino acid content (mg/100g Sample)

鶏むね肉加水分解物錠剤の栄養成分は，10粒で，残りの1,993mgが固体状のほぼ同様の組成のペ

120
100

B

80
60
40
20
0

Car

Ans

Fig. 4 Contents of free amino acids and imidazole dipeptides in a tablet of chicken breast meathydrolysates digested with protamex. A：Free amino acids. Dark bars in the figure
indicate essential amino acids. B：Free imidazole dipeptides（Carnosine and Anserine）．

© The Ito Foundation

56

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

３～４時間かけてアミノ酸やペプチドの状態に分

不快臭の低減などが今後の検討課題である。

解されて初めて吸収される。ペプチドやアミノ酸以上の結果から，本食肉加水分解物はペプチド

は，タンパク質に比較して消化過程が不要なこと

で，タンパク質含量が調整され，消化と吸収性にから短時間で体内に吸収される 。さらに，委縮

優れており，さらに機能性を有している。食肉由した筋肉の回復において，ホエイペプチドはホエ

来の機能性タンパク質飲料，パウダーやペレット

イタンパク質と比較し，より優れた効果を示すこが開発された。これにより，プロテインスコアのとが認められている29）。また，筋肉で代謝される

高い動物性タンパク質（食肉）を，高齢者，幼児，

BCAAは，医薬品や食品として肝硬変を対象とし低栄養者，咀嚼・嚥下障害者そしてアスリートがた栄養剤だけでなく，サプリメントやスポーツド

いつどこでも手軽に利用できるようになる。

28）

リンクなど，特に運動や骨格筋の維持・増強を目的として広く使用されるようになってきている。

４．要

約

鶏肉抽出物の摂取は，中高年の筋力の向上に効果タンパク質を食品として摂取する場合，必須アがあることも報告されている 。また，ロイシン

ミノ酸組成がヒトの必要とするアミノ酸バランス

高含有アミノ酸混合物が，運動後の筋合成促進作に近く，十分に消化されるものであれば栄養価の用および筋肉痛軽減作用を有するとの報告があ

高いタンパク質と言える。具体的には，食肉がある 。最近，卵白ペプチドは，吸収性の速さや吸げられる。そこで，食肉を酵素により分解して収後の優れたアミノ酸バランスによって，体タン「食べる食肉から飲む食肉」へと変換し，タンパ

パク質の合成速度も速く，抗酸化力や抗疲労効果

ク質飲料と，その粉末や錠剤を作製することが本が高いことも報告されている32）。一方，鶏むね肉研究の目的である。

30）

31）

加水分解物に豊富に含まれているイミダゾールジ

原料として，鶏むね肉を使用した。諸条件下でペプチドは，抗酸化作用，緩衝作用，抗疲労作用

食品用の酵素で分解し，精製を行った。それをレのほか記憶機能改善効果 や高齢者において摂取

トルト殺菌しミートドリンクを調製した。また，量が減少するイミダゾールジペプチド顆粒状の食その粉末や錠剤も調製した。さらに，それらの抗品を介して補うことにより，加齢により低下する

酸化活性とACE阻害活性，遊離アミノ酸および記憶機能を改善できることも報告されている 。

遊離イミダゾールジペプチド含量を測定した。

33）

34）

や食事とし

鶏むね肉のプロタメックス処理により，高分子て摂取した食品ペプチドによる血糖の制御の可能量のタンパク質が，分解後は約6,800から240まで性も示唆されている 。

の分子量のペプチドやアミノ酸にまで低分子化さ

このほか，肝臓水解物由来ペプチド

35）

36）

本研究で作製された鶏むね肉加水分解物は，それた。通常，タンパク質をペプチドレベルまで分の吸収性における利点に加えて，抗酸化作用や血解すると，分解生成物には，著しい苦味，渋み，

圧降下作用などの効果を有する機能性ペプチドが不快臭が必ず発生する。その解決は，分解酵素の豊富に含まれていることが栄養的利点である。今選定，至適条件と精製方法を組み合わせることに後は，ヒトに対する抗疲労効果や筋肉増強効果，

より可能になった。タンパク質含量は約７％で血糖調節効果などについて研究していく必要がああった。100ｇの原料肉から，120ml入りの飲料る。さらに，牛肉や豚肉についても，酵素の種類を作製し，約８ｇのタンパク質を含有できる製品

や併用とその分解条件，加水分解物の苦味，渋み，設計が可能になった。さらに，タンパク質分解物© The Ito Foundation

食肉加水分解物の栄養機能について

は，抗酸化活性とACE阻害活性が数倍に上昇していた。また。必須アミノ酸やBCAA，イミダゾー
ルジペプチドなどの機能性ペプチドが豊富に含まれていた。
本製品はペプチドでタンパク質含量が調整され，消化と吸収性に優れており，さらに機能性を有している。食肉由来の機能性タンパク質飲料，
粉末や錠剤が開発された。これによりプロテイン
スコアの高い食肉タンパク質を，高齢者，幼児，
低栄養者，咀嚼・嚥下障害者そしてアスリート
が，いつどこでも手軽に利用できるようになった。
文献１） 葛 谷 雅 文：日 本 内 科 学 会 雑 誌 ， 104 ， 2602～
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57

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14）
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19）
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20） 葛谷雅文：化学と生物，52，328～330，2014.
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27）
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内徳蔵・山路昭：医療薬学，27，605～609，2001.
28）
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30）
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31）
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M., Inoue, Y.：Amino Acids, 48, 2145～2155, 2012.
32）
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33） 片倉善範：化学と生物，57，596～600，2019.
34） 久恒辰博：化学と生物，54，892～900，2016.
35）
 井上尚典・日髙修二・三浦直良・山田耕太郎・深堀勝博・丸山眞杉・河原聡・太田一良・六車三治
男：YAKUGAKU ZASSHI，133，117～123，2013.
36） 比良徹：化学と生物，55，296～298，2017.

© The Ito Foundation

58

プレバイオティクスによる食肉の効果的な栄養利用の研究
Studies on effective nutritional utilization of meat with prebiotics

大島

健司・髙原

彩那・北浦

靖之

（名古屋大学大学院生命農学研究科）

Kenzi Oshima, Ayana Takahara and Yasuyuki Kitaura（Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University）

Meat is a useful source of proteins, essential minerals, and vitamins, and is also
recommended in dietary treatments for the improvement of sarcopenia. Thus meat is one of
the most important food sources from young children to the elderly. On the other hand,excessive protein intake alters the intestinal microbiota, and their metabolites can havepotentially harmful effects on the host. Oligosaccharides have been shown to be highly effective
in promoting the growth of certain bacteria and improving the intestinal environment. In thisstudy, fructooligosaccharides（FOS）were fed to mice with diets containing meat to examine
their effects on changes in the intestinal environment and host health due to meat consumption.
When mice were fed the meat diet with FOS for 2 weeks, FOS intake significantly increased
body weight gain, even though the caloric intake was similar to that of the control group. Since
there was no significant difference in triceps surae muscle weight among all groups, theincrease in body weight gain was attributed to an increase in non-muscle tissue weight. The
results of the cecum microbiota analysis formed by the high meat diet and FOS suggested thatmeat intake increased the diversity of the cecal microbiota and that FOS intake suppressed thechanges in the microbiota caused by the meat diet. Meat diet intake increased several bacteria
belonging to the order Oscillospirales and decreased genus Akkermansia. Fructooligosaccharide
suppressed these changes in bacterial abundance, suggesting that the simultaneous intake ofmeat and FOS improves the intestinal microbiota. In the future, it is necessary to verify thenutritional effects of meat and FOS intake on the intestinal microbiota in more detail byanalyzing bacterial metabolites such as amino acid metabolites, host blood constituents andtissue lipid levels, and gene expression in the liver and intestine．

１．目する食事療法やサルコペニアの改善などにも推奨的されるようになっている１，２）。また，食肉は高タ

食肉は栄養成分の供給に有用であり，幼児からンパク質源のみでなく，必須微量ミネラルやビタ

高齢者まで主要な食材の一つとして利用できる。

ミンなどの貴重な供給源でもあり，カルノシンなさらに近年，食肉を中心とした高タンパク質食

ど血中コレステロール低下作用や抗酸化作用を持が，アスリートの筋力増強だけでなく，肥満に対つ生理活性ペプチドが産生されることも報告され© The Ito Foundation

プレバイオティクスによる食肉の効果的な栄養利用の研究59ている。そのため食肉の摂取は安定した栄養摂料の組成をTable１に示す。フラクトオリゴ糖と取，高齢化社会における健康維持や疾病予防・治して，１－ケストース，ニストース，１Ｆ－β－フラ療に役立てられている３）。その一方，過剰なタン

クトフラノシルニストースの混合物を95.9％含む

パク質摂取により腸内でタンパク質・アミノ酸発メイオリゴＰ（明治フードマテリア）を使用した。

酵が活発に行われるようになり，生成するフェ2.2

ノール化合物，インドール化合物などは宿主に対６週齢のC57BL/6N系統雄マウス（日本SLC株

して潜在的に有害な作用を示す可能性がある４）。

式会社）20匹をコンベンショナルな環境で固形飼

また，タンパク質と脂肪に富んだ食生活では，大料（CE－２，日本クレア）と水道水を自由摂取さ腸ガン患者に多く見られるBacteroides型の腸内せることによって１週間順化飼育した後，５匹ず細菌叢が形成されることが報告されている 。しつ４群に分け２週間食肉成分を含む飼料（食肉飼

かしながら腸内細菌叢と健康への相関は複雑であ料）またはコントロール飼料を自由摂取させるとるため，より詳細な解析が求められている。

ともに，水道水または４％メイオリゴＰを含む水

５）

実験動物

オリゴ糖はプレバイオティクスとして知られ，

道水を自由摂取させた。飼育期間中定期的に体特定の細菌に対する増殖促進効果が高く，腸内環

重，摂餌量，摂水量の測定を行った。２週間後，境を整えることが示されている。我々は，ラット

マウスをセボフルラン（Wako）で安楽死させ，にフラクトオリゴ糖を摂取させると，盲腸内のビ

下腿三頭筋を摘出し重量を測定した。また盲腸のフィズス菌や酪酸産生菌，これらが産生する乳酸

内容物を回収し，－80℃で保存した。

や酪酸が増加することを見出している 。そこで，

2.3

食肉成分を主要とする飼料とともにオリゴ糖をマ

盲腸内容物から抽出したゲノムDNAから16S

ウスに与え，食肉食による腸内環境（細菌種，代rRNAのV3/V４領域を増幅し，MiSeqシステム

謝物）および宿主（血中成分）の変化に対するオ（Illumina）によりシーケンス解析を行った。ア

リゴ糖の影響を検討し，高食肉食による腸内環境

ンプリコンシーケンス解析は，株式会社生物技研

変化および宿主への作用に対するオリゴ糖の影響が実施した。得られたリード配列からQIIME２

を調べ，より健康的な食肉を加工するための基礎によりキメラ配列とノイズ配列を除去し，代表配的データを構築する。

列 を 得 た 。 代 表 配 列 と Silva 138 の 99 ％ OTU

６）

２．方
2.1

盲腸内に生息する腸内細菌叢解析

rRNA全長配列を比較し，系統推定を行った。群法

間のリード数の差を希薄化により補正し，
Shannon指数を用いてα多様性を解析した。菌叢

飼料

飼料に添加する食肉成分として，鶏肉パウダーの構造類似度の比較であるβ多様性は，

100（日本化工食品）を使用した。今回使用した

Weighted UniFrac距離に基づき解析し，検定に鶏肉パウダーは，鶏むね肉，鶏もも肉，鶏ささみ

は PERMANOVA 解 析 を 用 い た 。 Weightedの混合物を蒸した後にミンチ造粒し，乾燥冷却後

UniFrac距離の主座標分析結果は，QIIME2 veiwに 破 砕 し た も の で ，タ ン パ ク 質 72.5 ％，脂 質のEMPerorにより可視化した。また，得られた

27.1％，炭水化物0.0％，灰分2.0％を含む。鶏肉

配 列 か ら Linear discriminant analysis effect size

パウダーを含む飼料（食肉飼料）とコントロール（LEfSe）を用いて，群間比較解析を行った７）。

飼料は，日本クレアから購入した。それぞれの飼© The Ito Foundation

60

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 1 Ingredients of experimental diets（g/ 100 g diet）

Control diet（AIN-93G）

Cornstarch

39.75

a-cornstarch

13.20

Casein20.00

Meat diet

14.68

Chicken powder

64.77

Sucrose10.00

Soybean oil

7.00

8.08

Lard

3.32

Cellulose

5.00

3.54

Mineral mix

3.50

3.50

Vitamin mix

1.00

1.17

L-Cystine

0.30

0.70

Choline bitartrate

0.25

0.23

Tert-butylhydroquinone

0.0014

Total

100

100

g％

kcal/gkcal ％g％kcal/gkcal ％

17.29

0.69

18.8

46.97

1.88

40.2

Fat

7.67

0.69

18.76

20.98

1.89

40.4

Carbohydrate

57.45

2.30

62.44

22.66

0.91

19.4

3.68

100

4.67

100

Protein

Total（Fig. 1C）。摂取カロリーは各群で大きな差がな

３．結果と考察いにも関わらず，フラクトオリゴ糖摂取で有意に3 . 1 食肉成分とフラクトオリゴ糖摂取による

飼 育 ２ 週 間 の 体 重 増 加 量 が 上 昇 し た（Fig. 1B,D）。一方，餌の組成は体重増加に影響しなかった。

体重増加への影響
高食肉食を模倣するため，摂取エネルギーの体重に対する下腿三頭筋の重量を解析したとこ

40％がタンパク質，もう40％が脂質由来となる飼ろ，全群間で有意差は見られなかったため，体重料を使用した。各条件で飼育したマウスの摂餌量増加は非筋組織重量の増加によると考えられるを比較すると，コントロール飼料摂取群と食肉飼（Fig. 1E）。腸内細菌の主要な生育箇所である盲料 摂 取 群 の 間 で 有 意 な 差 が 見 ら れ た が（Fig.

腸の内容物重量は，フラクトオリゴ糖摂取群で有1A），摂取カロリーは水道水摂取条件ではコント意に増加していた（Fig. 1F）。一方，飼料の組成

ロ ー ル 飼 料 と 食 肉 飼 料 で 差 が な か っ た（Fig.

は盲腸内容物量に影響しなかった。

1B）。フラクトオリゴ糖の摂取は飼料の摂餌量に影響しなかった（Fig. 1A）。今回フラクトオリゴ

3 . 2 食肉成分とフラクトオリゴ糖摂取により形成される盲腸内細菌叢の解析

糖摂取条件ではコントロール飼料摂取群と食肉飼

高食肉食とオリゴ糖摂取により形成される盲腸料摂取群の間で摂取カロリーに有意差が見られた

内細菌叢解析の結果，４群の各個体から13,100±（Fig. 1B）
。飲水量は食肉飼料群で有意に上昇し，272リードの結合配列が得られた。平均リード数

フラクトオリゴ糖は飲水量に影響しなかったは，各群で有意な差はなかった。系統解析の結果© The Ito Foundation

61

プレバイオティクスによる食肉の効果的な栄養利用の研究

5
4
3
2
1
0

D
Average weight gain (g)＊＊＊＊ctrl + meat + ctrl + meat +tap
tap
FOS FOS
＊

4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

＊＊

＊

ctrl + meat + ctrl + meat +tap
tap
FOS FOS

C
25

＊

20
15
10
5
0

ctrl + meat + ctrl + meat +tap
tap
FOS FOSE

Average daily drinking water (g)

6

B

＊＊

8

5
4
3
2
1
0

ctrl + meat + ctrl + meat +tap
tap
FOS FOS

F
0.35

1

0.6
0.4
0.2
0

ctrl + meat + ctrl + meat +tap
tap
FOS FOS

＊＊

6

1.2

0.8

＊＊
＊＊

7

Cecum content (g)7＊＊

Average daily calorie intake (kcal)

Average daily food intake (g)＊＊Relative value of triceps suraemuscle weight / body weight

A

0.3

＊

＊＊

＊

0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0

ctrl + meat + ctrl + meat +tap
tap FOS FOS

Fig. 1 Average diet intake and weight gain of the mice fed the meat diet and fructooligosaccharides（FOS）. Mice were

fed in four groups with different diet and drink conditions for two weeks（n=5 each group）. Group1；control dietand tap water（ctrl + tap）, group2；meat diet and tap water（meat + tap）, group3；control diet and tap watercontaining 4% Meioligo P（ctrl + FOS）,group4；meat diet and tap water containing 4% Meioligo P（meat + FOS）.
（A）Average daily food intake of a mouse.（B）Average daily calorie intake of a mouse calculated from food anddrink intake.（C）Average daily amount of drinking water of a mouse.（D）Average weight gain after 2 week
feeding.（E）Relative values of triceps surae muscle weight divided by body weight. Triceps surae muscles weredissected after 2 week feeding and weighed.（F）Average weight of cecum contents. Cecum contents wereobtained from the dissected mice. Data are expressed as means ± s.e.m. Differences were analyzed by the TukeyKramer test; ＊p < 0.05, ＊＊p < 0.01.

全体で116属の菌が同定された。各個体の菌叢に（以下meat＋FOS群）の間にα多様性の差は見らついて，目レベルの系統解析の結果をFig. 2Aにれなかった。各個体間の菌叢構造の類似度を示す示す。各個体の盲腸内に生息する菌種の多様性でβ多様性についてWeighted－UniFrac距離を解析

あるα多様性について，Shannon指数を指標としした結果，ctrl＋FOS群とmeat＋FOS群の間ではて解析したところ，食肉飼料と水道水で飼育した

ｐ値が0.242となり，群内の多様性と群間の多様条件（以下meat＋tap群）で最もShannon エント性に有意な差はなく，似かよった菌叢構成になる

ロピーが高く，食肉摂取により盲腸内細菌叢の種ことが示された（Table２）。それ以外の群間では，多様性が高くなることが示された（Fig. 2B）。コ

有意な差があると考えられる。また，Weighted－

ントロール飼料・水道水群（以下ctrl＋tap群），

UniFrac距離の主座標分析からも，フラクトオリ

コントロール飼料・フラクトオリゴ糖群（以下ゴ糖を摂取した２群が類似することが分かる

ctrl＋FOS群），食肉飼料・フラクトオリゴ糖群（Fig. 2C）
。以上の結果から，食肉摂取により腸© The Ito Foundation

62

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

A

FOS（+）FOS（+）

control dietBmeat dietC＊＊＊

Shannon entropy＊＊

meat + FOS
meat + tap

ctrl + FOS

（n=5）

（n=5）

（n=5）

ctrl + tap（n=5）

Fig. 2 Microbiota within the cecum of the mice fed the meat diet and FOS.（A）Relative abundance of microbiota ineach mouse at the order levels by taxon-based analyses.（B）Alpha diversity of the cecum microbiota from themice fed the control and meat diets with or without FOS. Boxes represent the 25th, 50th, and 75th percentiles andwhiskers represent the 10th and 90th percentiles. Differences were analyzed by the pairwise Kruskal-Wallis test;＊p < 0.05, ＊＊p < 0.01.（C）Principal coordinates analysis of weighted UniFrac distance of the cecal microbiota. pvalue was determined by PERMANOVA.

内細菌叢の多様性が上昇すること，フラクトオリとが示唆された。

ゴ糖摂取で食肉食による菌叢変化が抑制されるこ© The Ito Foundation

63

プレバイオティクスによる食肉の効果的な栄養利用の研究
Table 2 Pairwise PERMANOVA results of Weighted-Unifrac distancesGroup 1

Group 2

Sample size

pseudo-F

p-valueq-value

ctrl-FOS

ctrl-tap

107.969504502

0.008

0.0096

ctrl-tap

meat-FOS

meat-FOS

10

1.210884965

0.242

0.242

meat-tap

1011.29477198

0.008

0.0096meat-FOS

10

8.563449571

0.005

0.0096meat-tap

109.417641478

0.006

0.0096meat-tap

108.447715003

0.008

0.00963 . 3 食肉成分とフラクトオリゴ糖摂取によりし，脂肪とグルコース代謝に影響して炎症性腸疾
患，肥満，糖尿病などと逆相関する12，13）。食肉の変化する細菌種の同定
各群間で有意に差のある菌種を属レベルで摂取により減少したAkkermansiaの量は，フラク

LEfSeにより解析したところ，meat＋tap群の盲

トオリゴ糖摂取により回復していた（Fig. 3B）。

腸 内 で ， Butyricicoccaceae 科 UCG_009 属 ，以上の結果から，食肉飼料とフラクトオリゴ糖

Oscillospiraceae科未同定属，Colidextribacter属，摂取により特徴的な菌叢が形成されることが明ら

Negativibacillus属の菌が特異的に増加しており，かとなった。今後は，アミノ酸代謝物などの腸内

こ れ ら は す べ て Oscillospirales 目 に 属 し て い た

細菌代謝物や，宿主の血中成分量や組織脂質量，（Fig. 3A）
。一方，ctrl＋tap群ではLactococcus属，

肝臓や腸管での遺伝子発現を解析することによmeat＋FOS群ではLachnospiraceae科ASF356属

り，さらに詳細に食肉とフラクトオリゴ糖摂取にの菌が他群よりも多くなっていた。meat＋tap群

よる腸内細菌叢を介した栄養効果を検証する。

で増加したColidextribacter属は短鎖脂肪酸を産生し，パーキンソン病患者で有意に減少し８），高４．要

約

脂血症と相関がある９）。また，Negativibacillus属

食肉を主要に含む飼料とともにフラクトオリゴ

は潰瘍性大腸炎患者で増加する一方10），記憶の改糖を２週間マウスに与え，腸内細菌叢および宿主

善とも関連性が示されている 。以上から，食肉の変化に対する影響を検討することで，食肉食に成分を摂取することで，神経疾患と負に関連する

よる腸内環境変化および宿主への作用に対するオ細菌を増やす一方，炎症や代謝疾患と関連する菌

リゴ糖の影響を調べた。コントロール群と摂取カも増殖することが示された。食肉成分とフラクト

ロリーは同程度であるにも関わらず，フラクトオ

オリゴ糖の同時摂取はこれらの菌を抑制すること

リゴ糖摂取で有意に体重増加量が上昇した。下腿が明らかとなった。

三頭筋の重量は全群間で有意差が見られなかった

11）

食肉の摂取により変動する菌種をさらに同定すため，体重増加は非筋組織重量の増加によると考るため，ctrl＋tap群とmeat＋tap群で群間比較解えられた。食肉食とオリゴ糖摂取により形成され析を行ったところ，前出のOscillospirales目菌のる盲腸内細菌叢解析の結果，食肉摂取により腸内

ほか，食肉飼料摂取群でClostridia_UCG_014属

細菌叢の多様性が上昇すること，フラクトオリゴ

菌 が 増 加 し て お り ， Erysipelotrichales 科 と糖摂取で食肉食による菌叢変化が抑制されること

Akkermansia属菌が減少していた。ムチン代謝菌が 示 唆 さ れ た 。食 肉 飼 料 摂 取 に よ り

であるAkkermansia属菌は代謝疾患患者で減少

Oscillospirales目に属する複数の細菌が増加し，© The Ito Foundation

64

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Ag_Lactococcus

0.02

0.003

Relative abundanceRelative abundance

0.00350.00250.002
0.00150.001
0.0005
0

0.015
0.01
0.005
0

ctrl + meat + ctrl + meat +tap
tap
FOS FOS

ctrl + meat + ctrl + meat +tap
tap
FOS FOS

0.03
f_Butyricicoccaceae-g__UCG_009
0.025

0.02
0.01
0
ctrl + meat + ctrl + meat +tap
tap
FOS FOS

Relative abundance

0.1

g_Akkermansia

0.02

Relative abundance

0.04

Relative abundanceRelative abundance

f__Lachnospiraceae-g__ASF356
0.04

B

g_Negativibacillus

g_Colidextribacter

0.03
0.02
0.01
0

0.015

ctrl + meat + ctrl + meat +tap
tap
FOS FOS

0.01
0.005
0
ctrl + meat + ctrl + meat +tap
tap
FOS FOS

0.08
0.06
0.04
0.02
0
ctrl + meat + ctrl + meat +tap
tap
FOS FOSFig. 3 Different dominant bacteria among the mice group fed the control and meat diets with or without FOS.（A）Circular cladogram represents the LEfSe results showing the significantly increased bacteria in the mouse groups
fed control diet and tap water（ctrl + tap）, meat diet and tap water（meat + tap）, and meat diet and tap watercontaining 4% Meioligo P（meat + FOS）. Relative abundance of each identified bacteria in the cecal microbiota isshown.（B）Significant decrease of relative Akkermansia abundance in the meat + tap group.

Akkermansia属菌が減少していた。フラクトオリ
ゴ糖摂取によりこれらの菌量変化が抑制されたため，食肉成分とフラクトオリゴ糖の同時摂取は腸内細菌叢の改善につながることが示唆された。今後は，アミノ酸代謝物などの腸内細菌代謝物や，宿主の血中成分量や組織脂質量，肝臓や腸管での遺伝子発現を解析することにより，さらに詳細に食肉とフラクトオリゴ糖摂取による腸内細菌叢を介した栄養効果を検証することが必要である。

文献１）
 S. M. Phillips：Meat Sci, 92, 174～178, 2012.
２）
 I. Janssen, D. S. Shepard, P. T. Katzmarzyk, R.
Roubenoff：J Am Geriatr Soc, 52, 80～85, 2004.
３）
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４）
 K. Windey, V. De Preter, K. Verbeke：Mol Nutr
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５）
 P. Louis, G. L. Hold, H. J. Flint：Nat Rev Microbiol,
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６）
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© The Ito Foundation

プレバイオティクスによる食肉の効果的な栄養利用の研究
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McGregor, A. Gorecki, M. Horne, B. Marshall, F. L.
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９） R. Duan, X. Guan, K. Huang, Y. Zhang, S. Li, J.
Xia, M. Shen：J Agric Food Chem, 69, 7629～7640,
2021.
10） M. V. Gryaznova, S. A. Solodskikh, A. V.
Panevina, M. Y. Syromyatnikov, Y. D. Dvoretskaya,
T. N. Sviridova, E. S. Popov, V. N. Popov：Heliyon,
7, e06432, 2021.

65

11）
 I. S. Sadovnikova, A. P. Gureev, D. A. Ignatyeva,
M. V. Gryaznova, E. V. Chernyshova, E. P.
Krutskikh, A. G. Novikova, V. N. Popov：
Pharmaceuticals, 14, 2021.
12） C. Depommier, A. Everard, C. Druart, H. Plovier,
M. Van Hul, S. Vieira-Silva, G. Falony, J. Raes, D.
Maiter, N. M. Delzenne, M. de Barsy, A. Loumaye,
M. P. Hermans, J. P. Thissen, W. M. de Vos, P. D.
Cani：Nat Med, 25, 1096～1103, 2019.
13）
 I. G. Macchione, L. R. Lopetuso, G. Ianiro, M.
Napoli, G. Gibiino, G. Rizzatti, V. Petito, A. Gasbarrini,
F. Scaldaferri：Eur Rev Med Pharmacol Sci, 23,8075～8083, 2019.

© The Ito Foundation

66

鶏肉の低温調理におけるカンピロバクターの消長
Survival of Campylobacter jejuni/coli in low temperature cooking poultry
meat

下

島

優香子

（相模女子大学栄養科学部）

Yukako Shimojima（Faculty of Nutritional Science, Sagami Women’s University）

Low-temperature-long-time（LT-LT）cooking, also known as sous vide cooking, in whichmeat is sealed in a bag and cooked in hot water at a relatively low-temperature of around
60℃, increased in popularity; indeed, home-use low-temperature cookers are now commerciallyavailable. However, after LT-LT cooking, if even a small number of foodborne bacteria remain,
they could cause infection and foodborne illnesses. Therefore, in the present study, we aimed
to determine the appropriate LT-LT cooking methods for chicken by assessing temperaturechanges and studying the bacteria in LT-LT cooked chicken meat. At set cooking
temperatures of 60℃ and 65℃, the temperature of a 300-g chicken breast increased rapidly inthe following order: at the surface, in the center of a single-layer sample, and in the center of adouble-layer sample. In these areas of chicken breast samples, the respective times required toreach 50℃ were 14, 28, and 35 min at the 60℃ cooking setting and 5, 26, and 33 min at the
65℃ cooking setting. When the meat was LT-LT cooked at 60℃ and 65℃ for 60 min, color
changes in the meat and heating of the meat were observed all the way to the interior.
Campylobacter jejuni, Salmonella O7 and Listeria monocytogenes were inoculated into chicken
breasts, which were then cooked at set temperatures of 60℃ and 65℃ for 15, 30, 60, 90, and
120 min. Campylobacter jejuni survived for up to 30 min of cooking, Salmonella O7 survived for
up to 60 min of cooking at 60℃ and 30 min at 65℃, and L. monocytogenes survived for up to
90 min of cooking at 60℃ and 60 min at 65℃. Thus, to prevent infection and illness caused by
the three tested bacteria species, LT-LT cooking for 120 min at 60 ℃ and 90 min at 65 ℃ is
recommended．

１．目が各種調理器具メーカーから市販されており，イ的

ンターネット上のレシピサイトやブログ等には食食肉を袋に密封し，60℃前後の比較的低温で湯肉の低温調理レシピが多く公開されている。しか煎調理する「低温調理」がジューシーな調理法とし国内には調理方法に法的な規定はなく，食中毒

して注目されている。鍋やタッパーを用いて湯温の要因となる危険性が指摘されている。

を一定温度に保つことが可能な家庭用低温調理器

食肉はさまざまな食中毒菌に汚染されており，© The Ito Foundation

鶏肉の低温調理におけるカンピロバクターの消長

67

食肉や食肉調理品は細菌性食中毒の原因食品と調理方法設定のための基礎資料とすることを目的

なっている 。わが国で最も多い細菌性食中毒はとし，鶏肉の低温調理による温度変化や細菌学的Campylobacter jejuni/coliによる食中毒であり，調査を実施した。

１）

その多くは生，または加熱不十分な鶏肉が原因と考えられている２）。鶏肉のC. jejuni/coli汚染率は

２．方法

高く，わが国に流通する国産鶏肉では約60％，輸

2.1

供試菌株

入鶏肉では約30％と報告されている２）。加えて２菌株は国産鶏肉分離株であるC. jejuni（CA21-～３log CFU程度の少量で感染が成立することか1）， S a l m o n e l l a O 7 群 （S a l 2 1 - 2 ）， L.

ら，鶏肉のC. jejuni/coliによる食中毒リスクは高monocytogenes（LM21-1）を供試した。C. jejuni

いと考えられる。また，鶏肉はSalmonella spp.

は馬血液寒天培地を用いて37℃で24～48時間微好分離率も高く，鶏肉を生，または加熱不十分な状気 培 養 し た も の を Brain heart infusion broth

態で食べることはSalmonella spp. による食中毒（BHI broth，BD）に接種し，37℃で24時間微好

要因のひとつと考えられる。Salmonella spp. に

気で振盪培養したものを接種用菌液とした。

よる食中毒は，食品中で本菌が増殖し，その食品

Salmonella O7 群 お よ び L. monocytogenes は BHIを喫食することが原因となると考えられている

brothに接種し，37℃で24時間静置培養したもの

が，１～３log CFU程度の少量摂取と推定されるを接種用菌液とした。

食 中 毒 の 報 告 も あ る 。さ ら に ，鶏 肉 で は

2.2

Listeria monocytogenesの分離も報告される 。L.

試料は国産鶏ムネ肉を供試した。300ｇをジッ

monocytogenesは，高齢者や妊婦などの易感染者

パー付きポリ袋にそのまま一層で入れ，厚さを3.5においては敗血症や髄膜炎などを引き起こし，重cmにしたもの（single-layer：SG）および二つ折症化することが知られている。健康なヒトの発症

りにして二層にして入れ，厚さを５cmにしたもには６log CFUを必要とするが，易感染者ではよの（double-layer：DB）を30分間氷冷し，家庭り少量でも発症すると考えられている。

用低温調理器BONIQ2.0（葉山社中）を用いて，

３）

４）

C. jejuni/coli， Salmonella spp. お よ び L.
monocytogenesは，適切な加熱により死滅させる

低温調理

低温調理器の設定温度60℃および65℃で120分間まで調理した後，30分間氷冷した。

ことができる。Ｄ値はC. jejuni/coliでは60℃で2.3

8.2 s，65℃で1.3 s，Salmonella spp. では60℃で低温調理中の試料の温度測定はTMB温度＋メ

24 s，65℃で2.6 s，L. monocytogenesでは60℃でモリボタン（大日電子）を用いて１分間隔で行っ

87 s，65℃で12 sとまとめられており ，低温調

た。中心温度測定は，試料SG，DBの中心部にメ理の設定温度である60℃前後における加熱調理に

モリボタンを配置して行った。表面温度測定は，より死滅させることができると考えられる。しか試料５ｇにメモリボタンを包んで，試料SGの表

し，中心温度が設定温度に達するのに要する時間

面に配置して行った（Surface：SF）。設定温度

や，実際の低温調理による食中毒菌の消長に関す

60℃および65℃で90分間調理し，測定は三重でる情報は少ない。特に少量でも感染が成立する食行った。

中毒菌は，低温調理後に残存することは健康被害

2.4のリスクがある。本研究では，鶏肉の適正な低温

試料SG，DBを設定温度60℃および65℃で15分

５）© The Ito Foundation

低温調理中の温度測定

低温調理後の観察および細菌検査

68

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

間，30分間および60分間調理して，断面の観察と2.5

細菌検査を行った。細菌検査は，試料SGは表面

材 料 ５ ｇ に C. jejuni 接 種 用 菌 液 は 200 μl ，および中心部，試料DBは中心部を採取し，一般

Salmonella O7群およびL. monocytogenes接種用

生 菌 数 ，大 腸 菌 群 ・ 大 腸 菌 の 定 量 試 験 ，C.

菌液はそれぞれ30 μl接種し，硫酸紙７×７cmでjejuni/coli ，Salmonella spp. ，L. monocytogenes

包み，ドリップ液に浸したものを材料SG，DBのの定性試験を行った。

中心部および材料SGの表面（SF）に配置し，設

添加実験

一般生菌数は標準寒天培地（栄研化学），大腸

定温度60℃および65℃で15分間，30分間，60分間，

菌群・大腸菌はXM-G寒天培地による混釈法で計90分間および120分間調理を行った。調理後，菌測した。C. jejuni/coliは，材料25ｇにプレストン

液を接種した材料５ｇを回収し，BPW 20 mlを増菌培地基礎培地（Nutrient broth No.2., Oxoid）

加えて混和して５倍希釈液を作製し，各菌株の定を30 ml入れて混和し，その10 mlに馬脱繊維血量試験および定性試験を行った。定量試験は，C.

液，発育剤および選択剤を添加して培養した後，jejuni は mCCDA ，Salmonella O7 群 は SS 寒 天 培

mCCDA培地に画線塗抹して培養した。Salmonella

地，L. monocytogenesはPALCAM寒天培地に塗spp. は ，材 料 25 ｇ に 緩 衝 ペ プ ト ン 水（BPW ，

抹して測定した。定性試験は，2.4に記載した増Oxoid）を225 ml加えて培養し，その0.1 mlをRV菌培地10 mlに５倍希釈液を１ml加えて，2.4と同培地（Oxoid）に加えて培養した後，SS寒天培地

様に行った。添加実験は三重で行った。

（栄 研 化 学） に 画 線 塗 抹 し て 培 養 し た 。 L.

３．結果と考察monocytogenesは，材料25ｇにhalf-Fraserブロス（Merck）225 mlを加えて一次増菌培養し，培養3.1

液 を CHROMagar Listeria（関 東 化 学）お よ び

低温調理中の温度は，設定温度60℃調理，65℃

PALCAM寒天培地（Merck）に画線塗抹すると調理いずれも，一層の試料表面（SF），一層の試ともに0.1 mlをFraserブロス（BD）10 mlに加え

料中心部（SG），二層の試料中心部（DB）の順て二次増菌培養した。二次増菌培養液も二種の選に早く上昇した（Fig.１）。食肉中の主な食中毒

択分離培地に画線塗抹培養した。

菌の増殖限度であり，加熱殺菌効果が認められる

低温調理中の温度測定

50℃に達する時間は，設定温度60℃でSF，SG，

A

B
70

Temperature (℃)

Temperature (℃)

80
60
40
SF

20

SG

0

DB
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Cooking time at 60℃ (min)

60
50
40
30

SF

20

SG

10
0

DB
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Cooking time at 65℃ (min)Fig. 1 Temperature change in chicken meat cooked at 60℃（A）and 65℃（B）over 120 min. SF, surface of
single-layer chicken meat；SG, center of single-layer chicken meat；DB, center of double-layer
chicken meat.

© The Ito Foundation

69

鶏肉の低温調理におけるカンピロバクターの消長

DBでそれぞれ14分，28分，35分で，設定温度

一 般 生 菌 数 は ，4.9 log CFU/g ，大 腸 菌 群 2.9

65℃ではそれぞれ５分，26分，33分であった。設log CFU/g，大腸菌1.3 log CFU/gは調理時間に定温度が低く，表面から離れているほど温度の上従い減少した（Fig.３）。低温調理器の設定温度

昇に時間を要した。なお，三重測定のばらつきはが低いほど，試料の厚さが厚いほど，長い時間菌

SFが最も大きかった。SFではメモリボタンを５数の生残が認められた。C. jejuni/coliは，試料ｇの鶏肉に包んで表面に配置したが，深さが１DBは設定温度60℃，30分間調理まで，試料DBのmmから５mmとばらつきがあったことと，表面設定温度65℃，試料SGは15分間調理まで分離さでも部位によって温度上昇に差がある可能性が考れ た 。Salmonella spp. お よ び L. monocytogenes

えられた。

はいずれも陰性であった。試料DBは鶏肉を二つ

3.2

低温調理後の観察および細菌検査

折りにして二層にして調理しており，厚さが厚く

低温調理後の試料の切断面は，15分間調理では中心部まで熱が伝わりにくいだけではなく，汚染

設定温度60℃および65℃いずれも，試料SGも試の多い調理前の鶏肉表面部分が加熱調理時には中料DBも表面の色が白く変わる程度であった。30

心部分になることからも，菌が生残しやすくなる

分間調理ではいずれも内部はピンク色で生っぽい可能性が考えられる。

状態であった。60分間調理では内部まで白く色が3.3

変わり，内部まで加熱されているように観察され添加実験では，５ｇの鶏肉に自然汚染を上回る

た（Fig.２）。

添加実験

多量の菌を接種して硫酸紙に包んで各部位に配置

A

15 min30 min60 min

SG

DB

B
SG

DB

Fig. 2 Cross section of chicken meat cooked at 60℃（A）and 65℃（B）. SG ； Singlelayer chicken meat, DB；Double-layer chicken meat

© The Ito Foundation

令和３年度No. of SPC (log10 cfu/g)

A

5

0 min

15 min

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

30 minB

60 minNo. of coliforms (log10 cfu/g)

70

4
3
2
1
0

SG60

DB60

SG65

No. of E. coli (log10 cju/g)

C

5

DB65

0 min

5

0 min

15 min30 min60 min

DB60

SG65

DB65

4
3
2
1
0

SG60

15 min30 min60 min

DB60

SG65

DB65

4
3
2
1
0

SG60

Fig. 3 Number of cells of standard plate counts（A）,coliforms（B）and Escherichia coli（C））.SG60；Single-layer
chicken meat cooked at 60℃, DB60；Double-layer chicken meat cooked at 60℃, SG65；Single-layer chicken
meat cooked at 65℃, DB65；Double-layer chicken meat cooked at 65℃して行った。なお，メモリボタンをそのままおよ（63.5℃）では陰性となった。試料DBでは設定温び硫酸紙に包んで試料SG中心部に配置して温度

度60℃調理時は調理時間30分（46.7℃）まで減少

測定を二重で行い比較したところ，50℃以上の温せず，調理時間60分（57.8℃）では陰性となり，度域では両者の温度差は１℃以内であり，硫酸紙

設定温度65℃調理時は調理時間30分（47.2℃）でに包むことで温度への影響はほとんどないと考え

1.0 log CFU/g 減 少 し ，調 理 時 間 60 分（61.3 ℃ ）られた（data not shown）。

では陰性となった。C. jejuniは温度が50℃に達す

C. jejuniは，試料SFでは設定温度60℃調理時
は調理時間30分（57.7℃）では検出限界以下で増る頃から減少し，15分～30分間で陰性となることが示された。

菌法では三重試験のうち１サンプルのみ陽性，調Salmonella O7群は，試料SFでは設定温度60℃

理時間60分（60.2℃）では陰性となり，設定温度

調 理 時 は 調 理 時 間 30 分（57.7 ℃ ）で は 2.3 log

65℃調理時は調理時間15分（60.8℃）で1.8 log

CFU/g減少し，設定温度65℃調理時は調理時間

CFU/g減少し，調理時間30分（64.0℃）で陰性と30分（64.0℃）では3.4 log CFU/g減少し，調理なった（Fig.４，Table１）。試料SGでは設定温度

時間60分（60.2℃および65.0℃）ではいずれも陰60℃調理時は調理時間30分（51.7℃）で1.2 log性となった。試料SGでは設定温度60℃および

CFU/g減少し，調理時間60分（59.5℃）では陰性

65℃調理時，調理時間30分（51.7℃および54.2℃）と な り ，設 定 温 度 65 ℃ 調 理 時 は 調 理 時 間 30 分まで菌数変化はなく，調理時間60分（59.5℃およ（54.2℃）では検出限界以下で増菌法では三重試

び63.5℃）では陰性となった。試料DBでは設定

験 の う ち １ サ ン プ ル の み 陽 性 ，調 理 時 間 60 分

温 度 60 ℃ 調 理 時 ，60 分（57.8 ℃ ）で は 2.3 log© The Ito Foundation

71

鶏肉の低温調理におけるカンピロバクターの消長D
No. of C. jejuni(log10CFU/g)

30 min
120 min

4
2
SF

8

SG

DB

0 3 3300 0 333000

0 min
60 min15 min90 min30 min
120 min

4
2
SF

8

SG

DB

0 3 3300 0 333300

0 min
60 min15 min90 min30 min
120 min

20SF

No.of positive
3331 0samplesSGDB

0 3 3330 0 333330

2
0

SF

SG

DB

0 3 3100 0 333000

0 min
60 min8

15 min90 min30 min
120 min

SG

DB

6
4
2
0

SF

F

4

30 min
120 min

4

No.of positive
3330 0samples6

15 min90 min

6

E

6

0

0 min
60 min8No.of positive
3300 0samplesNo. of Salmonella O7(log10CFU/g)0

No.of positive
3330 0samplesNo. of L. monocytogenes(log10CFU/g)C

15 min90 min6No.of positive
3310 0samplesNo. of Salmonella O7(log10CFU/g)

B

8

0 min
60 minNo. of L. monocytogenes(log10CFU/g)

No. of C. jejuni(log10CFU/g)

A

0 3 3300 0 333000

0 min
60 min8

15 min90 min30 min
120 min

6
4
2
0

SF

No.of positive
3330 0samplesSGDB

0 3 3300 0 333300

Fig. 4 Number of bacterial cells and samples（n = 3 samples）positive for Campylobacter jejuni（A, D）,Salmonella O7（B,E）, and Listeria monocytogenes（C, F）when inoculated chicken meat was cooked at 60℃（A–C）and 65℃（D–F）.

Table 1

Temperature at specific cooking time
Temperature（℃）

Cooking time

Cooked at 60℃

Cooked at 65℃

SF＊

SG

DB

SF

SG

DB

15 min

50.8

34.0

27.0

60.8

35.3

27.3

30 min

57.7

51.7

46.7

64.0

54.2

47.2

60 min

60.2

59.5

57.8

65.0

63.5

61.3

90 min

60.3

60.3

60.0

65.2

65.2

64.0

＊ 
Button-type temprerature recorders were placed on the surface of single-layer chicken meat（SF）
, at the center of single-layer chicken meat（SG）, and at the center of double-layer
chicken meat（DB）.

© The Ito Foundation

72

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

CFU/g減少し，調理時間90分（60.0℃）では陰性は厚さが薄いほうが，温度上昇が速く菌も早く死であった。設定温度65℃調理時は，30分（47.2℃）

滅するため，細菌汚染の多い鶏肉表面部分を内側まで菌数変化はなく，調理時間60分（61.3℃）でに折り込まないことと厚さを厚くしないことが望は陰性であった。Salmonella O7群は温度が55℃

ましいと考えられた。

に達する頃から減少し，30分間程度で陰性となると推定された。

４．要約

L. monocytogenes は ，試 料 SF で は 設 定 温 度

食肉を袋に密封し，60℃前後の比較的低温で湯60℃調理時は調理時間30分（57.7℃）では1.3 log

煎調理する「低温調理」が注目されており，家庭

CFU/g減少し，調理時間60分（60.2℃）では菌数

用低温調理器が市販されている。しかし低温調理は検出限界以下で増菌法では三重試験のうち１サ

後に少量でも感染が成立する食中毒菌が残存する

ンプルのみ陽性，調理時間90分で陰性になった。

と，食中毒を引き起こすリスクがある。鶏肉の適設定温度65℃調理時は調理時間30分（64.0℃）で正な低温調理方法設定のための基礎資料とするこは1.9 log CFU/g減少し，調理時間60分（65.0℃）とを目的とし，鶏肉の低温調理による温度変化やでは陰性となった。試料SGでは設定温度60℃調

細菌学的調査を実施した。鶏ムネ肉300ｇの設定

理時，調理時間60分（59.5℃）で2.5 log CFU/g

温度60℃および65℃による調理時の温度変化は，減少し，調理時間90分（60.3℃）では陰性であっ

表面，一層の試料中心部，二層の試料中心部の順た。65℃調理時，調理時間30分（54.2℃）まで菌に早く上昇した。50℃に達する時間は設定温度数変化はなく，調理時間60分（63.5℃）では陰性

60℃調理でそれぞれ14分，28分，35分，設定温度となった。試料DBでは設定温度60℃調理時，調65℃調理でそれぞれ５分，26分，33分であった。

理時間90分（60.0℃）で4.3 log CFU/g減少し，

低温調理後の試料の切断面は設定温度60℃および調理時間120分では陰性であった。設定温度65℃

65℃で60分間調理すると内部まで色が変わり，加調 理 時 は ，調 理 時 間 60 分（61.3 ℃ ）で は 5.3 log

熱されているように観察された。自然汚染のC.

CFU/g減少し，調理時間90分（64.0℃）では陰性

jejuni/coliは設定温度60℃調理時，一層の試料でであった。L. monocytogenesは温度が60℃に達す

は15分間調理まで，二層の試料では30分間調理まる頃から減少し，30分間程度で陰性になると推定で生存が認められた。C. jejuni/coli，Salmonella

された。

spp.，L. monocytogenesを接種して設定温度60℃

C. jejuniは設定温度60℃，65℃でいずれも60分

および65℃調理で15分，30分，60分，90分および調理で陰性となったが，生きているが培養できな

120分調理したところ，C. jejuni/coliは30分調理い状態の可能性もあるため注意を要する。三菌種まで，Salmonella spp. は設定温度60℃では60分の中で最も長く生存したL. monocytogenesは，二調 理 ，設 定 温 度 65 ℃ で は 30 分 調 理 ま で ，L.

つ折りにした二重の状態では設定温度60℃調理で

monocytogenesは設定温度60℃では90分調理，設

90分間調理，65℃調理で60分間調理まで生存して定温度65℃では60分調理まで生存が認められた。

いた。今回調査した三菌種の危害を防ぐために

これらの三菌種の危害を防ぐためには設定温度

は，設定温度60℃では120分間調理，設定温度60℃では120分間調理，設定温度65℃では90分間

65℃では90分間調理を要することが示された。加調理を要することが示された。

えて，中心部よりも表面のほうが，また中心部で© The Ito Foundation

鶏肉の低温調理におけるカンピロバクターの消長
文献１） Omer, M. K., Álvarez-Ordoñez, A., Prieto, M.,
Skjerve, E., Asehun, T., Alvseike, O. A.：A
systematic review of bacterial foodborne outbreaks
related to red meat and meat products, Foodborne
Pathog. Dis., 15, 598～611, 2018.
２） 食品安全委員会：食品健康影響評価のためのリス
ク プ ロ フ ァ イ ル～ 鶏 肉 等 に お け る Campylobacter
jejuni/coli～（改訂版），2021．

73３）
 食品安全委員会：食品健康影響評価のためのリス
クプロファイル～鶏肉におけるサルモネラ属菌～（改訂版），2012.
４） 食品安全委員会：微生物・ウイルス評価書食品中のリステリア・モノサイトゲネス，2013.
５）
 Sörqvist, S.：Heat resistance in liquids ofEnterococcus spp., Listeria spp., Escherichia coli,
Yersinia enterocolitica, Salmonella spp. andCampylobacter spp, Acta Vet Scand., 44, 1～19, 2003.

© The Ito Foundation

74

ハム・ソーセージの食品添加物に関する
スマート・リスクコミュニケーションの改良研究
ならびに効果検証
Improvement research and evaluation of smart risk communication on thefood additives in ham and sausage

山

﨑

毅・山

﨑

深

雪

（特定非営利活動法人食の安全と安心を科学する会）

Takeshi Yamasaki and Miyuki Yamasaki（NPO, Science of Food Safety and Security（SFSS））

Risk perception bias on certain food hazards is generated by consumers even when foodsafety experts evaluated them as safe. In this study, we aimed to verify the effect of “smart
risk communication” method targeting the risk perception bias, particularly “confirmation bias”
on food additives. We hypothesized the “smart risk communication” that the consumers should
understand the proper “risk size” of food hazards calmly when they are sympathized on theirrisk concerns and get the precise academic explanation on them. We also research the effect ofrisk communication method utilized by animation．
We performed the internet questionnaire survey to 200 female consumers（age 20’s to50’s）who have health concerns on the processed meat, such as ham, sausage, and bacon due tofood additives（who think that the processed meat with food additives is unhealthy）. After we
divided the respondents to two group where the one was received the text and the otherreceived the animation movie, of academic explanation（5 kinds）on the risk of food additives
in ham and sausage．
The health concerns of food additives were corrected up to 59 ％ of respondents by the
text of “smart risk communication”, compared as 74％ of respondents by the animation movieof same communication contents. Furthermore, the age difference of corrected percentage is asfollows: age 20’s（text：72％，animation：81％），30’s（text：52％，animation：62％），40’s（text：
63％，animation：74％），50’s（text：49％，animation：78％）. As a result, we found the effectof animation movie in smart risk communication is approximately 15 ％ higher correction ofrisk perception bias compared by the text communication, and the effect was more significant（30％ higher）in age 50’s．

１．目

し，リスク誤認を与えている典型例が食品添加物的である。2018年，山﨑らはリスク認知バイアスの

食品安全の専門家が安全と評価しているハザー

一つとして「確証バイアス」を採り上げ，食品添

ドにもかかわらず，消費者がリスクを過大に認知加物を対象として消費者の意識調査研究を実施し© The Ito Foundation

ハム・ソーセージの食品添加物に関するスマート・リスクコミュニケーションの改良研究ならびに効果検証

75た１）。その際に確証バイアスを補正するため，新かにそう思う」または「まあまあそう思う」と回たに開発したリスコミ手法が「スマート・リスク

答した女性218人（20歳代：56人／30歳代：52人

コミュニケーション」だ。

／40歳代：56人／50歳代：54人）をランダム抽出

すなわち，まず「確証バイアス」の要因となっている信念や不安に共感した設問を投げかけたう

し，テキスト説明群（108人）と動画説明群（110人）にグループ分けを行った。

えで，次に専門家から学術的説明をわかりやすく

なお，テキストと図表のみ（音声・映像なし）

提供することで，市民の不安要因への理解が深まによる設問：Ｑ１～Ｑ５は以下のとおり，消費者

り，自らリスクの大小を冷静に判断できるのではの食品添加物に対する不安要因に対して，共感しないかとの仮説をたて，効果検証を行った。イン

たうえで学術的な説明を加えるものとした。

ターネット調査の結果，「食品添加物は意識的に使わない」と回答のあった30歳代～40歳代の女性

Ｑ１

食品添加物の不安要因：「健康被害が起こった事故の歴史があると聞いたことがある」

100人において，スマート・リスコミ手法によりファシリテータ：「ハム・ソーセージ・ベーコ

79％の回答者で確証バイアスの補正を認めた。まンなどの加工肉は食品添加物が入っているので健た2020年度に，我々はハム・ソーセージ・ベーコ

康 に よ く な い っ て 言 っ て た け ど ，な ぜ な の かンなどの加工肉に配合される食品添加物の健康リ

な？」

スクに過敏な20代～50代の女性2,500名を抽出し，不安な消費者：「食品添加物が原因で，健康被上述のスマート・リスコミ手法の効果検証を試み害が起こった事故の歴史があると聞いたことがあたところ，30％～45％のインターネットモニター

る。そう聞くと不安だよね……」

参加者が食品添加物を使った加工肉食品を安心しリスクコミュニケータ：「わかるわかる。うちて食べられるとの回答を選択し，明確なリスク認の母親からもよく同じことを言われたのよね。で知バイアスの補正が認められた 。

も最近，食品添加物で食中毒が起こったって話は

２）

本研究では，ハム・ソーセージなどの加工肉食品における食品添加物の健康リスクに懸念を感じ聞かないような気がするけど，食品安全の専門家
はどう言ってるのかしら」ている20代から50代の女性に対して，従来のテキ

食品安全の専門家：「過去に食品添加物が原因

ストによる学術説明とともにアニメーション動画

で健康被害が起こった事故の歴史はたしかにありを応用したスマート・リスコミ手法の効果検証をますが，もう数十年以上前のことであり，日本国

インターネット調査により実施したので，以下に内ではそれ以降，何十年もの間事故は発生してい報告する。

ません。反対に食品添加物を使用しなかったこと

２．方により，Ｏ157などの食中毒死亡事故が何度も発法生しており，食品事故を未然に防ぐためには，食インターネットアンケート調査は，（株）マク

品添加物を適切に使用することが望まれます」

ロミルに委託して実施した。まず同社の日本人モ

あなた：「説明を読んで，ほぼ納得したので，ニターより最低週１回は料理をする方を抽出し，食品添加物の入った加工食品も安心して食べられその中から「ハム・ソーセージ・ベーコンなどのそうだ」

加工肉食品は，食品添加物が入っているので健康→選択枝：①たしかにそう思う，②まあまあそによくないと思いますか」という設問に，「たしう思う，③あまりそう思わない，④そう思わない© The Ito Foundation

76
Ｑ２

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

食品添加物の不安要因：「家庭科の授業で，できるだけ使わないように教わった」には，食品添加物が不可欠だよね」
食品安全の専門家：「食品添加物の使用目的は不安な消費者：「過去に家庭科の授業や栄養学

多種多様です。具体的には風味や食感・色調の改の講義で食品添加物はできるだけ使わないように

善，微生物の増殖を抑制して保存性を向上させる

教わったよ」

とともに，栄養強化・減塩食品への使用や低カロ

リスクコミュニケータ：「たしかに昔，そんなリーにするために使用されます。ハム・ソーセー

ことを家庭科で習った気がするわね。ただ，食品ジに用いられる食品添加物も，食材に適した調味安全の専門家たちは，食品添加物のリスク評価を料・発色剤・結着剤・保存料・酸化防止剤・着色

綿密に行ったうえで，現在の使用基準において安料などの役割を担っています。味や食感の改善，

全性に問題がないと保証しているので，それが学

食の安全・安心に貢献し，食べやすい動物性タン校の教科書に反映されていないってことではない

パクとしてさまざまなメニューの材料として便利

かと」に使用されています」

食品安全の専門家：「家庭科や栄養学の教科書には食品添加物を使用しない調理がよいなどの記

Ｑ４

食品添加物の不安要因：「無添加と添加物を比較すると無添加のほうが安全と思う」

載があるようですが，これまで文科省の教科書審

不安な消費者：「無添加食品と添加物使用の加

議会に食のリスクの専門家が含まれていなかった

工食品を比較すると，天然の無添加食品のほうがことも要因と言えるでしょう。家庭での料理を学

安全と思う」

ぶ際に，加工食品を使用せず，天然の食材を活か

リスクコミュニケータ：「「無添加」を強調する

した料理を学ぶこと自体は問題ありません。食の食品が多いので，やっぱりそちらのほうが健康にリスクに関して，正しいリスク評価を学ぶ環境のいいんだって思うわよね。ただ，天然の無添加食

必要性を強く感じます」

品と添加物を配合した加工食品を比較すると「無Ｑ３

食品添加物の不安要因：「知らない化学

添加」「天然」が安全そうに見えるけど，食の安物質が何の目的で使用されているのか分からな

全 の 専 門 家 に と っ て は ，む し ろ 逆 な ん だ っ て

い」

……」

不安な消費者：「ハム・ソーセージの食品ラベ

食品安全の専門家：「食品添加物は安全性試験

ルを見ると，知らない化学物質名（食品添加物）

をクリアし，リスクが無視できるものしか認可さが多く書かれていて，何の目的で使用されているれていないのに比べて，天然の食品は安全性の評のかよく分からないからかな」

価すらされておらず，相対的にみると天然物のほリスクコミュニケータ：「たしかに，ハム・

うが健康リスクは大きいと言われています。1980

ソーセージのラベルにはいろいろな化学物質名が年代に遺伝毒性試験を開発したエイムズ博士によ書かれていて，「なんでこんなに入れないといけ

ると，発がん物質の99.9％は天然物だと指摘してないの」って友達から聞かれたことがあるわ。でいます。そう考えると専門家のリスク評価では，も，加工食品は食品添加物を使わないと，製造し合成の食品添加物のほうが，むしろ安全性が高いて３日後には腐ってしまったり，見た目も変色しと言えます。あと，無添加が健康によいと思われて美味しくない食品になるんだって。加工食品はがちですが，添加物の小さなリスクを恐れ，食中

手作りの料理とは違って，保存性を維持するため毒の大きなリスクを抱えることにつながります© The Ito Foundation

ハム・ソーセージの食品添加物に関するスマート・リスクコミュニケーションの改良研究ならびに効果検証（「リスクのトレードオフ」と呼びます）
」
Ｑ５

77

日摂取許容量をADIと言い，国際的な機関が動物

食品添加物の不安要因：「一部ソルビン

実験により無害と確認した量の1/100に設定され酸や亜硝酸ナトリウムなど，健康によくないものています。またハム・ソーセージで食品添加物をがある」

使用することで，ボツリヌス菌の繁殖を抑える効

不安な消費者：「ハム・ソーセージによく入っている食品添加物の中でも，一部ソルビン酸や亜硝酸ナトリウムなど，健康によくないものがあるって聞いたことがあるからだね」

果もあります。安全を担保するためにもソルビン
酸や亜硝酸ナトリウムを配合しています」
アニメーション動画による設問：Q1a～Q5aは，上述のテキストによる設問とまったく同じ内

リスクコミュニケータ：「私の友人もネット情

容ながら，Fig.１のようなイメージのアニメー報をよく調べてるんだけど，食品添加物のうちションに音声を加えた動画を回答者に視聴してい「保存料」や「発色剤」など一部の化学物質は健ただいた後に，上述のテキストと同様，「説明を康に悪影響があると言っていたわね。でも食品安

読んで，ほぼ納得したので，食品添加物の入った全の専門家はどう言ってるのかな？」

加工食品も安心して食べられそうだ」に対して，

食品安全の専門家：「食品添加物は，「食品衛生①たしかにそう思う，②まあまあそう思う，③あ法」により１日摂取許容量を下回る使用基準が規まりそう思わない，④そう思わない，の選択肢を定されており，我々がソルビン酸や亜硝酸塩を一選んでもらった。

般食品からも摂取している事実も考慮されていま

なお，本研究のアニメーション動画は，動画編

す。ヒトが毎日食べ続けても安全と認められた１

集ソフトのDavinci Resolveを用いて我々自身で

Q1

Q4

Fig. 1 The characters and charts used in animation movie for the risk communication of food additives in ham and sausage.

© The Ito Foundation

78

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

編集・制作した（動画サイズ：横1920×縦1080，

ほぼ納得したので，食品添加物の入った加工食品

動画長さ：①②⑤１分30秒；③④２分，動画の見も安心して食べられそうだ」との回答を肯定した

せ方：キャラクターの口が動くようにした，背景

ことは前の報告と同様，スマート・リスコミ手法が流れるようにした，専門家の説明シーンは画像が機能していることを示している。これに対してとテロップを使用，黒板風枠にテロップを表示し動画説明群での肯定的回答は71％～77％まで有意た，音声：音読さん（音声読み上げソフト）→役に上がっており，この傾向はすべての世代で確認

柄に合う音声の種類を選択；高さ，速さを調整しできた。また，とくに設問Ｑ３：「知らない化学て，録音→Davinci Resolve編集時，さらに音声物質が何の目的で使用されているのか分からなをテンポよく仕上げた）。

い」に対する説明，ならびに設問Ｑ５：「一部ソ

なお，それぞれの回答傾向の相関関係に関する

ルビン酸や亜硝酸ナトリウムなど，健康によくな

統計解析については，統計解析ツール「Ｒ」を用いものがある」に対する説明において，動画説明

いて群間（テキストvs動画）や世代間の群間比により顕著な効果を認めた。

較についてピアソンのカイ二乗検定を行い，危険

さらに，世代間におけるテキスト説明群と動画率（p value）を求めて，危険率が0.05未満の場合

説明群での本リスコミ手法により効果の違いは，を有意差と評価した。

非常に興味深い結果をもたらしている。すなわ
ち，20歳代ではテキスト説明群で72.1％，動画説

３．結果と考察

明群で80.7％が安心を肯定したのに対して，50歳

上述のように食品添加物が健康によくないとい代ではテキスト説明群で49.2％，動画説明群でう「確証バイアス」にいたったであろう５つの不77.9％が安心して食べると回答したのだ。すなわ

安要因候補について，回答者の不安に共感を示す

ち，動画によるリスコミがより効果的なのは，対話（自分や自分の家族・友人も同じ不安をもっ我々の意に反して若者世代ではなく熟年世代といていたことなど）を展開したのちに，「でも食品うことは特筆すべきであろう。もちろん，回答者

安全の専門家はどうも違うことを言ってますよ

数が26－28人と少ないため，たまたま確証バイア……」として，回答者のリスク認知バイアスを補スの“強度”が高いモニターが，50歳代のテキス正することを試みた。その際のリスコミ定式としト説明群に偶然振り分けられた可能性も残ると考て，テキスト説明群（108人）と動画説明群（110

えると再検証の必要はある。そのほかの世代でも人）で不安から安心に転じた回答者，すなわち若干傾向が異なるように見えた（30歳代ではテキ「説明を読んで，ほぼ納得したので，食品添加物

スト説明群で51.5％，動画説明群で62.3％，40歳の入った加工食品も安心して食べられそうだ」の代ではテキスト説明群で62.9％，動画説明群で質問に対して，肯定的選択肢（①たしかにそう思

73.6％が安心を肯定）が，この数値が世代すべて

う，②まあまあそう思う）を選んだ回答者のパーを反映するとは言えないため，再検証の必要があ

センテージを世代ごとに集計したので，その結果りそうだ。
山﨑は2017年の日本リスク研究学会にて，リスをTable１に示す。
５つの不安要因に対する安心度を確認したが，

ク認知バイアスの原因をターゲットとした食のリテキストと図表のみ（静止画）による説明でも，スコミ手法を提案３）し，①二者択一の原理４），②

全世代でおおむね55％～66％が「説明を読んで，Slovicのリスクイメージ過大因子／未知性因子な© The Ito Foundation

ど５），③リスク情報発信者への不信感６），④リス

学会において，食品添加物の健康リスクに対する

クコミュニケーションのパラドックス など４つ

「確証バイアス」をターゲットとしたスマート・のリスク認知バイアスを逆手に取ったリスコミ手

リスコミの開発と効果検証について発表した１）。

法開発の可能性を考察した。また，2018年にも同

インターネットでの無機的な情報伝達に限界はあ

７）

55.6

65.7

57.4
59.3

Respondents who claimed no more
health concerns：Because I see many
unknown chemical names on the label of
ham and sausage, and do not know the
purpose of their role.

Respondents who claimed no more
health concerns：Because the natural
food without additives should be safer
than process food with additives.

Respondents who claimed no more
health concerns：Because some foodadditives, such as sorbic acid and sodium
nitrite, should be unhealthy.

Average of percentage in five questions：

Q４

Q５

55.6

Respondents who claimed no more
health concerns：Because I was taught
not to use food additives in nutrition classat school in the past.

Q２

Q３

62.0

Q１

© The Ito Foundation
73.8＊＊

77.3＊＊

72.7

75.5＊

71.8

71.8

110

108

No. of respondents：

text

All
animation
movie

Respondents who claimed no more
health concerns：Because there weresome histories of health accidents by foodadditives in the past.

Percentage of respondents where theirhealth concerns on food additives arecleared by the risk communication in text
or animation movie.

72.1

67.9

78.6

71.4

67.9

75

28

text

80.7

82.1

82.1

82.1

78.6

78.6

28

animation
movie

20’s

51.5

46.2

57.7

46.2

50.0

57.7

26

text

62.3＊

65.4＊

61.5

69.2

65.4

50.0

26

animation
movie

30’s

62.9

67.9

64.3

57.1

60.7

64.3

28

text

73.6*

75.0

71.4

71.4

71.4

78.6

28

animation
movie

40’s

animation movie. Significant difference between text and animation by Pearson’s Chi-squared test indicates＊：p<0.05, ＊＊：p<0.01.

49.2

46.2

61.5

46.2

42.3

50.0

26

text

77.9＊＊

85.7＊＊

75.0

78.6＊

71.4

78.6＊

28

animation
movie

50’s

Table 1 Results of Questionnaire：Percentage of respondents where their health concerns on food additives are cleared by the risk communication in text or

ハム・ソーセージの食品添加物に関するスマート・リスクコミュニケーションの改良研究ならびに効果検証

79

80

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

るものの，相当数の回答者で確証バイアスの補正が認められたことから，スマート・リスコミ手法

４．要約の有効性が示唆された。このように，安全・安心

食品安全の専門家がヒトへの健康リスクが十分につながるリスクコミュニケーションのポイント

小さく安全と評価しているハザードにもかかわらは，消費者市民のリスク認知バイアスの原因であず，一般消費者がリスクを過大に知覚／認識してる不安要因を具体的なターゲットとした情報発信いるために，ひとつのリスク認知バイアスを生み／議論と我々は考えている８）。

出し，社会に大きな影響を与えていることがあ

今回のインターネット消費者アンケート調査にる。そこで我々は，インターネット調査によりハおいても，ハム・ソーセージなどの加工肉食品にム・ソーセージなどの加工肉に配合される食品添配合された食品添加物の健康リスクについて不安

加物の健康リスクに過敏な20代～50代の女性を抽を感じる20歳代～50歳代の女性218人を，テキス

出し，リスク認知バイアス（とくに確証バイア

ト説明群と動画説明群にグループ分けして，スス）をターゲットとして開発したリスクコミュニ

マート・リスコミ手法の効果検証を行ったとこ

ケーション手法（スマート・リスクコミュニケー

ろ，それぞれの不安要因に関する学術的説明に対ション）について，テキストと図表（静止画）のして，テキスト説明群で平均59％，動画説明群でみの説明とアニメーション動画を活用した説明の平均77％の回答者が食品添加物を使った加工食品

効果の違いを検証した。インターネットでの情報を安心して食べられるとの選択肢を選んだ。ま

伝達に限界はあるものの，それぞれの不安要因にた，世代間でも動画によるリスコミの有効性の違関する学術的説明に対して，テキスト説明群で平いが認められた。以上の結果より「確証バイア

均59％，動画説明群で平均77％の回答者が食品添ス」の補正が一定程度認められたことから，消費加物を使った加工食品を安心して食べられるとの者の不安要因を傾聴によりみつけだして共感し，選択肢を選び，リスク認知バイアスの補正が明確

それぞれの不安要因にピンポイントで学術的説明に認められた。以上の結果より，スマート・リス

を提供する「スマート・リスクコミュニケーショ

クコミュニケーション手法開発の起点となることン」が動画を利用することがより効果的であるとが期待された。

の可能性を示唆する結果であった。
このスマート・リスコミ手法は，食品添加物だ
けでなく，ゲノム編集食品９）や残留農薬10）なども含めた種々のハザードに関しての社会実装が始まっており11），徳島県／消費者庁が主催で開講された消費者大学校大学院の食のリスクコミュニ
ケータ養成講座や農林水産省のFCP若手フォーラ
ムにおいても応用されている。今後のスマート・
リスコミ手法のさらなる改良／バージョンアップ
につながることを期待したい。

文献１）
 山﨑毅，大瀧直子，冨岡伸一，広田鉄磨，山口治子：リスク認知バイアスをターゲットとした食のリ
スクコミュニケーション手法の開発ならびに効果検証，日本リスク研究学会第31回年次大会，福島，講演論文集Vol.31，2018.
２）
 山﨑毅，山﨑深雪，阿紀雅敏：ハム・ソーセージに配合する食品添加物に関するリスクコミュニケー
ション手法の開発ならびに効果検証，伊藤記念財団
助成研究2020年度成果報告書，p161～p171，2021.
３）
 山﨑毅：リスク認知バイアスを逆手にとったリス
コミ，日本リスク研究学会第30回年次大会，滋賀，
講演論文集Vol.30, 2017.
４） 中谷内一也：リスクのモノサシ，NHK出版，東京，
2006.
５） 岡本浩一：リスク心理学入門，サイエンス社，東© The Ito Foundation

ハム・ソーセージの食品添加物に関するスマート・リスクコミュニケーションの改良研究ならびに効果検証
京，1992.
６） 広田すみれ，増田真也，坂上貴之：心理学が描く
リスクの世界，慶應義塾大学出版会，東京，2006.
７） 関谷直也：「災害」の社会心理，ワニ文庫（ベストセラーズ），東京，2011.
８） 山﨑毅：安全・安心とリスクコミュニケーション―食品分野を中心に，一橋ビジネスレビュー67-No.
3，『特集：安全・安心のイノベーション』，p92～
p102, 2019.
９） 山﨑毅，佐々義子，山口治子：ゲノム編集食品の81

スマート・リスクコミュニケーション，日本リスク学会第33回年次大会 講演論文集，Vol. 33, p46, 2020.
10） 大瀧直子，山﨑毅，山口治子：残留農薬のスマー
ト・リスクコミュニケーション，日本リスク研究学会第34回年次大会 講演論文集，Vol. 34, p86, 2021.
11）
 山﨑毅，小島正美，佐々義子，田中豊，大瀧直子，
山口治子：企画セッション開催報告 食品中の杞憂のリスクを議論する，リスク学研究31巻３号，p151～157, 2022.

© The Ito Foundation

82

近赤外光と偏光，AIを組み合わせた食肉中の虫および異物検知技術の開発
Detecting foreign object in meat using near-infrared light with polarization
and artificial intelligence

山

口

堅

三

（徳島大学ポストLEDフォトニクス研究所）

Kenzo Yamaguchi（Institute of Post-LED Photonics, Tokushima University）

A foreign body detection method using near-infrared light and polarized light was
successfully used to detect organic foreign object in meat. This proved the superiority ofpolarization, as it reduced the noise of stray light and identified the location of a foreignmaterial. Furthermore, although the polarization is lost with thick and fat of meat, the detection
accuracy can be improved by combining a reflective system and THz wave．

１．目

で最終確認を行うも，異物の完全な除去には至っ的ていない。そこで本研究は，食品中の有機異物を食品中への異物混入は，SNSでまたたく間に拡散され，メディアで取り上げられる。2014年度までの国民生活センターに寄せられた食品の異物混検知する技術開発を目的とした。
２．方法

入に関する相談の概要より１），1,852件の報告のう

異物検査装置は，金検やＸ線が主流である。最ち，食品別では調理食品が首位で，穀物，菓子類

近では，高感度な金属検出を実現した超電導磁気へと続く。ここで，85件（全件数の５％相当）のセンサ２），飲料やレトルトパックなどの流体中の肉への混入事例があった。また，異物別では，ゴ

異物検出が可能な超音波３），検出困難であった虫

キブリやハエなどの虫が最多で，次いでカッターやプラスチックなど誘電率の低い有機物を検出でや針金などの金属片，さらに毛髪や爪のヒト由来

きる近赤外（near infrared，以下NIR）光４）やテが続く。注目すべきは，その大半が有機物で，中ラヘルツ（terahertz，以下THz）波 ５）が次世代にはプラスチックや紙，骨，小動物の死骸や羽，異物検知技術として注目されている。

糞などがあった。

独自開発したNIR光異物検知法６～８）は，Fig.１

現在，食品製造現場で導入される金属検出機やより，近赤外光源と試料，カメラに２枚の偏光子

Ｘ線検査機は，金属や石などの無機物を検出する

を試料前後に配置した光学系である。光源からのも，虫や毛髪などの有機物や小骨は検知できてい検査光を試料に照射し，試料から透過する光をカない。このため，検査員の手作業による目視検査

メラで受光，撮像画像を解析することで異物検知© The Ito Foundation

近赤外光と偏光，AIを組み合わせた食肉中の虫および異物検知技術の開発

83

近赤外光×偏光＝光制御
平行(P)と直交(C)ニコルの検査像取得
透過軸を回転
90°回転

カメラ
／レンズ
第2偏光子
（A）

試料台
(食品)

透過軸を固定

第1偏光子

検査光

光源

透過軸
6

7
8
特許第 6454923 号，
特許第 6451980 号，
検査技術，
第 22 巻，6 号，58―61(2017 年 )Fig. 1

独自開発した近赤外光異物検知法

画像を得る。ここで，２枚の偏光子の透過軸方向認した。

を平行ニコル（以下P）と直交ニコル（以下C）

近赤外光異物検知法によるロースハムに混入しのそれぞれに配置した。偏光Pでは，試料からのた異物（天然ゴムラテックス製の手袋片）の撮像

正透過光と異物による光散乱の影響を受け，そのおよび解析結果をFig.３に示す。目視画像より，

一部の散乱光が第２の偏光子（Analyzer，以下A）

異物であるゴム手袋片は確認できない。偏光Pよを透過する。これに対し，偏光Cでは，試料からり，試料と異物の光吸収差から透過光量が変化の正透過光は偏光子Aで除去され，原理上その透し，赤身と脂身，異物を確認した。また，肉厚等

過光は０となる。しかし，先と同様で異物によるによる光学的不均一も鮮明に撮像された。偏光C

光散乱の影響を大きく受けた光のみが偏光子Aをでは，本来透過しない光が試料を介し，偏光を解透過する。ここでは，偏光保持のための治具を３消，そして偏光子Aを透過する偏光成分（散乱光）

Ｄプリンタで製作した。

を撮像した。これより，少ない透過光量で画像Pと異なる試料情報を得たと考える。そこで，画像３．結果と考察

Pを画像Cで差分，演算処理することで，ノイズ本研究開始前の事前検討で，近赤外領域におい成分を除去し，異物のみを抽出した異物検知画像て，ロースハムの光吸収が小さいことを確認したを得た（Fig.３の枠内参照）。本比較として，異（Fig.２参照）。これは，近赤外光をよく透過する

物有無の対照試料による異物検査を行うも，ノイことに相当する。そこで本研究では，中心波長ズがなくなり，異物の位置を特定できることから

850

nmのLED光源を用いた。なお，LEDの発偏光の優位性が容易に理解できる。以上のことか

光特性を同Fig.２に示す。また，これに並行して，

ら，光制御と画像処理を駆使することで食肉中のロースハムのハイパースペクトル像を取得し，素有機異物検知に成功した。

材面内での可視および近赤外領域での個体差を確

ロースハム（厚さ1.4mm／枚）中のゴム手袋片© The Ito Foundation

84

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

ハムは，波長850 nmを透過
近赤外光領域で，光吸収が小さい
5

発光強度（a.u.）

1.0

吸光度

4

0.5

3

ハム
LED

0

Fig. 2

0

1000
波長
（nm）

2000

ロースハムの吸光度スペクトルと、LED光源の関係

光制御＠850 nm×画像処理＝異物検知
偏光が迷光ノイズを消し，異物のある場所を特定
偏光 あり

異物

脂身

異物

目視
P
異物：ゴム手袋片
赤身(5 mm角,厚さ155μｍ）
偏光なし

異物あり

Fig. 3

C

検知像
ノイズ減

異物なし
（対照試料）

検知像
スケールバー：10 mm

異物検知例（ロースハム中のラテックス手袋片）の検知に成功した（Fig.３参照）。また，透過系

な反射系を構築し，ロースハム中の金属フィルムでの検討を進める中で，ハムの肉厚と脂身で偏光

片 の 検 知 を 検 討 し た と こ ろ ，こ れ に 成 功 し た性を失った。前者では，厚さ４～５mm（４枚相当）（Fig.４参照）。一方の後者では，ロースハム１枚になると，偏光由来の階調差が見られない。そこの厚みの脂身が，異物（手袋片）と同じように現で，反射系を組み合わせ，これで肉表層を捉え，れ，区別が難しい（脂身と異物の光吸収量が類

厚さの検知精度の向上を提案した。まずは，単純似）。そこで，THz波を組み合わせ，これで脂身© The Ito Foundation

近赤外光と偏光，AIを組み合わせた食肉中の虫および異物検知技術の開発

85

厚さがもたらす『偏光解消』を反射で解決
透過と反射系を組み合せ，計測厚さUP
反射系

1.4 mm
(１枚）

異物

250
階調
（bit）

200
150

偏光度差

100
50

P
C

0
0

200

250

厚み

C

で偏

5.6 mm
（4枚）

光度

差が

階調
（bit）

200

異物 なし

400 600 800 1000距離
（pixels）

150

ない

光源

カメラ

100
50
0
0

試料：ロースハム(1枚）
異物：アルミフィルム片(5 mm角，厚さ10 μm）

P
C
200

400 600 800 1000距離
（pixels）

Fig. 4

異物あり
スケールバー：10 mm

偏光で見る限界（厚み編）

脂身がもたらす『偏光解消』をTHzで解決
近赤外光とTHz波を組み合わせ，計測精度UP
THz波

異物
異物由来

250

脂身

のみ

階調
（bit）

P

200
150
100
50

C

0
0

過

P
C
200

400 600 800
距離（pixels）

250

1000

異物

脂身と異物
が重なる

光源
P
脂身
に隠

階調
（bit）

200
150

れる

100
50
0
0

を透

P
C
200

400 600 800 1000距離
（pixels）

Fig. 5カメラ

0透過光強度 255
スケールバー：10 mm

試料：ロースハム(1枚)
異物：なし

偏光で見る限界（脂身編）

内を捉え，部位の検知精度の向上を提案した。例
えば，THz波を用いると，脂身のみの透過を確認
し，この可能性を見出し（Fig.５参照）。一方で，

令和４年度研究助成申請書として提案する。
４．要

約

素材の個体差や異物種による多種多様な検知像，

近赤外光と偏光による異物検知法を用い，ロー

そこからの異物のみの抽出など，今後の課題も明

スハム中の有機異物の検知に成功した。これは，らかになった。これらは引き続き，伊藤記念財団

偏光を用いない異物有無の対照試料による異物検© The Ito Foundation

86

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

査法と比較しても，迷光ノイズを減らし，異物の位置を特定できることから，偏光の優位性を証明した。さらに，肉厚と脂身で偏光性を失うも，反射系やTHz波を組み合わせることで，検知精度の向上が期待できる。なお，これらの研究成果は，
雑誌２報と展示２件（うち１件は，口頭発表を含む）である９～12）。
文献１） https://www.kokusen.go.jp/news/data/n20150126_1.html
２） 田中三郎：高感度磁気センサの非破壊検査への応
用 SQUIDを用いた食品および電池内異物検査，非破壊検査，63，5，556～561，2014.
３） 穂積直裕，伊藤智啓，市毛将司，小林和人：超音波を利用した食品中異物検出の可能性，包装技術，
51，11，917～922，2013.
４） 早崎芳夫，武市裕司，坂東弘康，大田昌平：近赤外光による食品中の混入異物の検出，O plus E，

31，7，749～753，2009.
５） 萩行正憲，谷正彦，長島健：テラヘルツ波応用技
術，応用物理，74，6，709～717，2005.
６）
 森智博，德本真一，鳥飼仁，前田良栄，山口堅三，
中野聖司，益田一剛，服部修藏：食品検査装置，特許第6454923号，2018年12月28日登録７） 森智博，德本真一，鳥飼仁，前田良栄，山口堅三：
画像生成装置，特許第6451980号，2018年12月21日
登録８） 山口堅三，森智博，徳本真一，鳥飼仁：近赤外LED光による食品中の異物検出の最新動向，検査技術，22，6，58～61，2017.
９） 山口堅三，大津朋也，釜野勝，獅々堀正幹：食品
ロスゼロ社会を目指す光異物検査技術，FOOM技術
ジャーナル，16，2，25～32，2022.
10）
 山口堅三，大津朋也，獅々堀正幹，釜野勝：近赤
外光と偏光による食品の異物検知とその可視化，クリーンテクノロジー，32，6，54～58，2022.
11）
 山口堅三：イノベーションジャパン2021大学見本市Online，2021年８月23日-９月17日
12） 山口堅三：FOOMA JAPAN2022国際食品工業展，
東京ビッグサイト，2022年６月７日-10日© The Ito Foundation

87

ニワトリ骨格筋成長に遺伝子変異が及ぼす影響の全ゲノム解析に基づく解明
Whole-genome analysis of the effects of genetic mutations on chick skeletal
muscle growth

石

原

慎

矢

（日本獣医生命科学大学応用生命科学部）

Shinya Ishihara（Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary and Life Science University）

This study focused on broilers showing differences in growth rate even when reared
under identical conditions. The expression of various genes controls growth. Gene expression
varies depending on environmental and genetic factors. One of these factors is single nucleotide
polymorphisms（SNPs）,which affect gene expression levels. This study used a next-generation
sequencer to extract genetic variation between fast- and slow-growing individuals to search
for factors that influence growth differences within the same breed. Furthermore, to detectcharacteristic gene regions in Japanese native chickens, experiments were conducted on the
Yakido and Tosa-Jidori breeds to detect regions with significant genetic differentiation frombroilers. The next-generation sequencing analysis subjected four broilers from the Yakido andTosa-Jidori breeds to four broilers from the rapid- and slow-growing groups. The genemutations were extracted by in silico analysis for statistical analysis and ZFst calculation. SNPs
at 708 loci were found to be significantly segregating between the fast- and slow-growing
meat chicken groups（permutation test p＝0.01249）. In addition, 36 loci showed complete
segregation of genetic variation between the two groups（p<0.0001）. These mutations werelocated within the UCHL3 and DPP4 regions; ZFst was high for genes such as UCHL3 andPARK2. FGFR2 and FBXO30 were detected as genes related to growth among the genes thatshowed significant differences in the analysis by permutation test. Both Yakido and Tosa-Jidori
breeds of Japanese native chickens showed high Fst for the MYH1A gene. INSR in Yakido andMYH15 in Tosa-Jidori showed higher ZFst than broiler, respectively. Although further studies
are needed on the effects of these mutations on gene expression and individuals, the findings
on gene differences within the same breed and the unique gene regions of native Japanesechickens are expected to be applied to chicken meat production in Japan in the future．

１．目

パク質源である。しかしながら，生産現場では異的なる品種間においてはもちろんのこと，同一品種

肉用鶏は高い産肉性が得られるように選抜されの肉用鶏においても成長（体重や骨格筋の増加た系統であり，我が国における主要な動物性タン量）に大きな個体差が生じることが問題となって© The Ito Foundation

88

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

いる。個体間の成長差により，本来出荷できる日

土佐地鶏については健康なオスを４個体ずつそれ齢であっても飼養期間を延長する必要があり，飼ぞれ選抜した。これらの個体はブロイラーについ料などの生産コストが増大する１）。成長差の要因ては35日齢まで，八木戸種および土佐地鶏についとして外部からのストレスや飼料摂取量の違いなては14日齢まで同一条件で飼育し，安楽死後血液どからなる環境的要因と，遺伝子の違いから生じおよび組織を採取した。血液からDNAを抽出しる形質の差などの遺伝的要因に分けられる。可食急速発育群４羽，遅発育群４羽，八木戸種４羽お部の大半を担う骨格筋の重量は骨格筋の合成速度

よび土佐地鶏４羽の合計16羽について次世代シーと分解速度の調節によって維持されている 。同クエンサー解析（NovaSeq6000）を実施した。得様に骨格筋の合成と分解の差によって骨格筋成長られたショートリードシークエンスデータを３，４）は調節されていることが明らかになっており，

BWA－MEMプログラムを用いてニワトリのリそれぞれ多くの遺伝子が関与することが報告され

フ ァ レ ン ス ゲ ノ ム で あ る bGalGal1 maternalている 。成長の違いは関連遺伝子の遺伝子発現

broiler GRCg7b上にマッピングした。その後，全量に起因すると考えられるが，遺伝子発現量に影

ゲノム解析プログラムSamtools，Picardおよび響を与える要因として一塩基多型（SNP）が知ら

GATKのHaplotypeCallerおよびGenotypeGVCFs

れている。これまで肉用鶏の産肉増産に関する遺を用いて遺伝子変異を抽出した。また，GATKの伝的研究は国内外で広く行われているが，同一品

VariantFiltrationを用いて“QD＜2.0 || FS＞60.0 ||種内での比較はほとんど行われていない。本研究

M Q R a n k S u m ＜ －1 2 . 5 | | M Q ＜4 0 . 0 | |では，同一品種内での成長速度の差の要因を解明

ReadPosRankSum＜－8.0”の条件で，それぞれするため，次世代シークエンサー解析法を用いての遺伝子変異に対してフィルタリングを行った。

遺伝子変異のある座位（SNP）を特定することを

さらに，SNPeffプログラムを用いて各座位に遺伝目的とする。また，農林水産省の鶏の改良増殖目

子情報のアノテーションを行った。統計解析には

標では，消費者の多様なニーズに対応した鶏卵やゲノムワイド解析plinkプログラム６）を用いて，鶏肉の安定供給を実現するためには，日本の気候各群におけるSNPを並べ替え検定によって比較しなどの飼養条件に適応した多様な国産鶏種の改た。さらに，vcftoolsを用いて各群間における領良・育成が必要であるとしている 。本研究では，域ごとの遺伝的分化係数（Fst）を算出した。こ日本在来鶏における遺伝子にも着目し，次世代

こでwindow sizeは10000bpで行った。

２）

５）

１）

シークエンサー解析法を用いて肉用鶏と差異のある遺伝子領域を特定する。
２．方

３．結果と考察
3.1

法

肉用鶏品種内における遺伝子変異

肉用鶏の急速発育群と遅発育群において合計

飼養環境（飼料，環境温度）を揃えた条件で雄10,777,731の変異が確認された。ここで関連解析の肉用鶏（ブロイラー，ｎ＝100），八木戸種（ｎからSNPの分離が特に顕著であったもの（ｐ＝＝20）および土佐地鶏（ｎ＝20）をそれぞれ群飼

0.00006.33，0.0004192あるいは0.0001828）に着目育する。肉用鶏については初期成長期の増体量をすると708座位のSNPが確認できた。また，二群調べ，同品種内個体を急速発育群（上位５％），間で遺伝子変異に完全に分離が見られ，それぞれ遅発育群（下位５％）に分けた。八木戸種およびホモ接合であった座位は36箇所であった（ｐ＝© The Ito Foundation

ニワトリ骨格筋成長に遺伝子変異が及ぼす影響の全ゲノム解析に基づく解明

890.00006.33）。このうちUCHL３遺伝子をコードすとも報告されている。今回の研究で検出された変るchr１：154978458－154981453の領域に計10座

異が遺伝子発現にどのように影響を及ぼすかにつ位が存在していた。これ以外のSNPは完全に分離

いては今後さらなる調査が必要であるが，同じ系していたわけではないが，合計156の遺伝子上に統集団内で顕著な遺伝子変異が見られたこと，明

顕著な分離があるSNPが存在していた（並べ替え

確な成長速度の違いがあることからUCHL3や検定ｐ＝0.01249）。このうち骨格筋の成長に関連

DPP4の変異による影響が可能性の一つとして示する遺伝子として報告されており，かつ複数の遺唆された。

伝子変異を示したものはTBC1D4，FGFR2およ

このように同一品種内でも遺伝的分化あるいはびFBXO30などがあげられる。遺伝子内にそれぞ有意に変異が存在する遺伝子が複数同定された。

れ163，17および８座位の変異を持っており，急これらの変異はほとんどが非コード領域であるイ

速発育群と遅発育群間で片方の群がホモ接合なのントロンにおける変異である。近年の報告で塩基に対し，一方の群はヘテロあるいは異なる塩基にの変異は遺伝子発現量のみならずmicroRNAの構よるホモ接合であった。また，ZFstを調べたと造に影響を及ぼし，骨格筋成長に影響を及ぼす報

ころ，UCHL3，DPP4などの遺伝子において有意告もある。今回検出された変異が個体に与える生な差が見られた（Fig.１）。

物学的影響を明らかにしていくことで食肉生産の

UCHL3は脱ユビキチン化機能が強く示唆されている酵素をコードする遺伝子である。マウスを用いた研究ではUCHL3をノックアウトすること効率化に寄与することが期待できる。
3 . 2 肉用鶏－日本在来鶏間における遺伝子変
異で骨格筋にユビキチン化タンパク質が顕著に蓄積完全に分離が見られたSNPは肉用鶏－八木戸間

していた 。ユビキチン化されたタンパク質はプで290034座位，肉用鶏－土佐地鶏では201105座位

ロテアソームにより分解される標的となるため，であった。ZFstの結果をFig.１に示す。どちらの

UCHL3の発現が変化することで骨格筋分解に影

在来鶏でもMYH1Aの遺伝子が肉用鶏との間に高響を与えることが示唆されている。さらに，興味

いZFstを示していた。MYH1Aは，ミオシン重鎖

深いことにマウス細胞を用いた実験ではUCHL3（MYHC）ファミリーのメンバーであり，ミオシ

をノックアウトすると下流シグナルであるAktのンは筋収縮組織の構成要素である。中国在来鶏をリン酸化は起きるがFoxo1のリン酸化が起きなく用いた研究では４週齢と８週齢で発現が異なるこ

なった８）。ニワトリにおいてFoxo1はリン酸化さとが報告されており，MYH1Aが初期成長およびれることでatrogin－1やMuRFなどの骨格筋分解

発育に影響を与える可能性が示唆されている。八を促進するユビキチンリガーゼ遺伝子を抑制する

木戸および土佐地鶏がどちらも肉用鶏との間に高ことが知られている 。そのため，UCHL3が発

いZFstを示した遺伝子はSEMA3CとFAM19A5

現することでタンパク質分解は強く抑制される可があった。これらの遺伝子は骨格筋への影響は報能性が示唆された。

告されていないが，在来鶏特有の遺伝子型なのか

７）９）DPP4は，インスリン分泌促進ホルモンであるもしれない。

インクレチンを阻害する。そのため，DPP４阻害

八木戸－肉用鶏間のみに高いZFst見られた遺剤 が 糖 尿 病 の 薬 と し て 使 わ れ て い る 。ま た ，伝子としてINSRがある。INSRはインスリンレセ

DPP4は成長ホルモンであるIGF－1を分解するこ

プターをコードする遺伝子である。インスリンは© The Ito Foundation

90

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Broiler L vs Broiler S
CREB5

PARK2 RAP1GDS1ARFGAP3

BRD9
CHRM3
CCM2
HOP
EPYC RABL2UCHL3 PARD3
GNPAT
EYS
VGLL3
NAPRT
TPPP
CADM2
SASH1

PLEKHA3
NWB1
PCDH7
NPAS3

SDK1

DPP4NFIA
MAD1L1ITGA1Broiler vs Yakido

SEMA3CTHL ROBO2

PARD3
CNTN5

GNAL
LAMP5

IL2RA
FAM19A5

INSR

MYH1A

Broiler vs Tosa
TRBV6
-5
CBLB
SPRK2
FAM19A5
SEMA3C TMEM5
MYH15

CCT5

DPH6

DLG1
PID4
KIF14
NR5A2
GRK7

ARID1A
MYH1A

Fig. 1 Genetic differentiation coefficients at each genomic position in broilers, Yakido, and Tosa-Jidori chickens. Generegions with ZFst values greater than 3.925 are considered significant and are indicated by blue horizontal lines.
The horizontal axis shows each chromosome and genomic position, which does not include Z and W chromosomes.
Each point represents a 10 kb window and its ZFst. If the ZFst value is high and the corresponding region
encodes a gene, the gene name is noted. The top-left panel shows the ZFst between the fast and slow-growthgroups of broilers, the Bottom-left panel between broilers and Yakido, and the right panel between broilers andTosa-Jidori.

© The Ito Foundation

ニワトリ骨格筋成長に遺伝子変異が及ぼす影響の全ゲノム解析に基づく解明

91

骨格筋のタンパク質合成を促進して，分解を抑制

分化が顕著な領域の検出を目的として実験を行っする働きが知られている。高いZFstを示したこた。ブロイラーから急速発育群および遅発育群，とが必ずしも遺伝子発現に影響するわけではない

八木戸種および土佐地鶏からそれぞれ４個体を次が，高い遺伝子的な差異は個体の成長に影響を及世代シークエンサー解析に供した。In silico解析

ぼしているかもしれない。

に よ り 遺 伝 子 変 異 を 抽 出 し ，統 計 解 析 お よ び

土佐地鶏－肉用鶏間ではMYH15が高いZFstを

ZFstを算出した。肉用鶏の急速発育群と遅発育示した。MYH15もMYH1Aと同様に骨格筋構成

群から分離が顕著な708座位のSNPが確認できたに関わる遺伝子である。特に土佐地鶏は在来鶏の（並べ替え検定ｐ＝0.01249）。また，二群間で遺伝中でも小さい体躯が特徴的であり，MYH15の変子変異に完全に分離が見られた座位は36箇所で異は土佐地鶏の特徴に関与しているのかもしれなあった（ｐ＝0.00006.33）。これらの変異はUCHL3

い。

やDPP4領域内に存在していた。ZFstはUCHL3や本研究では，同一品種内で成長差を示した個体

PARK2などの遺伝子が高い値を示した。また，間におけるSNPについて次世代シークエンサーを並べ替え検定による解析で有意な差が見られた遺用いて検出した。さらに，日本在来鶏である八木伝子の中で成長に関わる遺伝子としてTBC1D4，

戸および土佐地鶏と肉用鶏間で遺伝的に分化してFGFR2およびFBXO30が検出された。日本在来いる領域を検出した。これらの変異が遺伝子発現

鶏 か ら は 八 木 戸 ，土 佐 地 鶏 ど ち ら の 品 種 もや個体に与える影響については，さらなる研究が

MYH1A遺伝子が高いFstを示した。また，八木必要である。しかしながら，同一品種内における戸においてはINSRが，土佐地鶏ではMYH15が肉遺伝子の差異および日本在来鶏固有の遺伝子領域

用鶏との間にそれぞれ高いZFstを示した。これについての知見は，今後の我が国における鶏肉生

らの変異が遺伝子発現や個体に与える影響につい産への応用が期待できる。

てはさらなる研究が必要であるが，同一品種内に４．要おける遺伝子の差異および日本在来鶏固有の遺伝

約

子領域についての知見は，今後の我が国における本研究では，肉用鶏であるブロイラーが同一条

鶏肉生産への応用が期待できる。

件で飼育しても成長速度に差異が生じることに着目した。成長はさまざまな遺伝子の発現によりコントロールされている。遺伝子発現は環境要因や遺伝的要因によって変化する。その要因のひとつとして一塩基多型（SNP）が遺伝子発現量に影響を与えることが知られている。そこで本研究では，同一品種内における成長差に影響を及ぼす要因を探索するため，成長の早い個体と遅い個体間における遺伝子変異について次世代シークエンサーを用いて抽出した。さらに，日本在来鶏における特徴ある遺伝子領域を検出するため，八木戸
品種および土佐地鶏品種について肉用鶏と遺伝的文
献１）
 農林水産省：鶏の改良増殖目標, 2021.
２）
 Russell, A. P.：Clinical and Experimental
Pharmacology and Physiology, 37（ 3）, 378～384,2010.
３）
 Goldspink, D. F.：Biochemical Journal, 156, 71～
80, 1976.
４）
 Goldspink, D. F., Goldspink, G.：Biochemical
Journal, 162, 191～194, 1977.
５）
 Mohammadabadi, M., Bordbar, F., Jensen, J., Du,
M., Guo, W.：Animals, 11（3）,1～25, 2021.
６）
 Purcell, S., Neale, B., Todd-Brown, K., Thomas, L.,
Ferreira, M. A. R., Bender, D., Maller, J., Sklar, P.,
De Bakker, P. I. W., Daly, M. J., Sham, P. C.：
American Journal of Human Genetics, 81（3）, 559～
575, 2007.

© The Ito Foundation

92

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

７） Setsuie, R., Suzuki, M., Tsuchiya, Y., Wada, K.：
Neurochemistry International, 56（ 8）, 911～918,
2010.
８） Suzuki, M., Setsuie, R., Wada, K.：Ubiquitin
carboxyl-terminal hydrolase L3 promotes insulin

signaling and adipogenesis, Endocrinology, 150（12）,5230～5239, 2009.
９）
 Shimamoto, S., Ijiri, D., Nakashima, K.,
K a w a g u c h i , M . , O h t s u k a , A . ：G e n e r a l a n dComparative Endocrinology, 267, 45～50, 2018.

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93

早産を伴う子牛死亡に関連する遺伝的要因の解明
Genetic factor associated with calf mortality with preterm birth

平野

貴１・村木

英二２・佐々木慎二３（１東京農業大学農学部，２岐阜県畜産研究所飛騨牛研究部，３琉球大学農学部）

Takashi Hirano１，Eiji Muraki２ and Shinji Sasaki３（１Tokyo University of Agriculture, Faculty of Agriculture, ２Gifu Prefectural Livestock Research Institute, Hida Beef Cattle
Research Department, ３Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus）

Weak calf syndrome（WCS) is a collective term for clinically unexplained calf weakness,and is thought to account for about 60% of neonatal deaths in Japanese Black cattle. IARS
disorder is recessive genetic disease, which is caused with IARS c.235G>C（p.Val79Leu）
mutation. The IARS mutation was identified as one of causative mutation for WCS. It had
started to perform a DNA test for IARS disorder, and it was shown that there was WCS,
which could not be accounted for by the IARS mutation. Therefore, to identify other causative
mutations for WCS, we had performed homozygosity mapping and linkage analysis in apaternal half-sib family using WCS affected offspring of Bull A, which was not carrier for the
IARS mutation. The analysis had made detect us candidate region-1 and 2 for WCS.
In candidate region-1 and 2, it was found that causative genes for same human genetic
renal disease were located（Gene-1 and 2, respectively）. Therefore, we hypothesized that
affected calves for the WCS carried a Gene-1 mutation by homozygous and a further Gene-2
mutation, and searched mutations of Gene-1 as a candidate gene. Five nonsynonymous
substitutions were detected in Gene-1. Of these 5 SNPs, 4 SNPs were predicted as “probably
damaging”, and 2 SNPs of the 4 SNPs were located in a region interacting with a protein codedby Gene-3. Furthermore, Gene-3 was a causative gene for same human genetic renal disease
as Gene-1 and 2. Therefore, it was thought that more detail analysis for Gene-1 was needed as
candidate gene.

１．目

は，さまざまな要因が関係していると考えられて的いるが，発症率が父方と母方の家系によって異な

虚 弱 子 牛 症 候 群 （WCS ： Weak Calf
Syndrome）は，吸乳欲の減退や起立困難などのることから，遺伝的要因が関係するものも存在すると考えられている１）。

虚弱症状を示し，発症の原因を臨床的に特定でき

IARS異常症は，イソロイシルtRNA合成酵素

ないものの総称である。また，子牛死亡の主要な（IARS：isoleucyl-tRNA synthetase）遺伝子の塩原因であり，黒毛和種における新生子死亡の約

基 置 換（c.235G>C）に 伴 う ア ミ ノ 酸 置 換（p.

60％を占めると考えられている。WCSの発症に

Val79Leu）が原因で発症する黒毛和種でみられ© The Ito Foundation

94

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

る常染色体劣性の遺伝的不良形質である。この2.2

IARS変異はWCSの原因の一つとして同定された候補原因遺伝子（Gene-1）のエクソンおよび

２）。しかし，このIARS変異を保有せず，IARS異その周辺に位置する変異を探索するために，常症とは異なる原因で死亡するWCS発症個体がGene-1の各エクソンをカバーするようにイント確認されている。そのため，黒毛和種の子牛死亡

ロン領域にプライマーを配置した（Fig.２）。プ発生を低減させるために，新たな子牛死亡の原因

ライマーの設計は，ゲノム配列（ARS－UCD1.2）

遺伝子変異を特定し，交配のコントロールを可能に基づいて行った。これらプライマーセットを用にするDNA診断法を開発する必要がある。

いて，変異探索用個体のゲノムDNAをテンプレー

変異探索

我々は，新たな子牛死亡の原因となる遺伝子変トとしてPCRし，得られた増幅産物をダイレクト

異を探索するために，生後20日以内に死亡した黒シーケンスすることで変異を探索した。検出され毛 和 種 子 牛 を 大 規 模 に 収 集 し た 。そ の う ち ，た変異でアミノ酸置換を伴うものについて，アミ

IARS c.235G>Cを保有しない特定種雄牛（種雄

ノ酸置換のタンパク質機能への影響を牛Ａ）の産子でWCSと診断され，しかも早産を

PolyPhen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/

伴う個体を用いてホモ接合マッピングを行った。

pph2/）で予測した。

また，この集団を父方半きょうだい家系として使用して連鎖解析を試みた。その結果，ホモ接合

３．結果と考察

マッピングと連鎖解析でそれぞれ異なる染色体領

黒毛和種多様体データベースより，候補領域－

域を１ヶ所ずつ検出した（候補領域－１と２）。こ１内に位置するSNPを抽出した。しかし，種雄牛のことから，このWCSはホモ接合マッピングにＡ産子で発症するWCSの原因と思われる変異はより検出された候補領域－１に位置する原因遺伝

検出されなかった（data not shown）。

子変異をホモで保有するとともに，連鎖解析に

多 様 体 デ ー タ ベ ー ス の SNP デ ー タ に は ，

よって検出された候補領域－２に位置する原因遺Hardy-Weinberg平衡（HWE）検定データが付

伝子変異をヘテロまたはホモで保有することによ

属されている。そこで，このデータを用いて，黒り発症すると考えた。

毛和種集団において候補領域－１内でアレル頻度

そこで，これら候補領域から遺伝子変異を同定に偏りがある部位を探索した。HWE検定（χ２検するために，黒毛和種多様体データベースより定）により有意差（p＜0.05）が検出されたSNP

SNPを抽出し３），変異探索を試みた。

の出現頻度を，18.8Mbにわたる候補領域－１を４分割して確認したところ，セントロメア側の区画

２．材料および方法
2.1（１～4,695,400nt）で最も頻度が高かった（Table１）。この区画における，HWEに従わないSNPの共試個体

候補原因遺伝子の変異を探索するために，マッ分布を確認したところ，有意SNPが集中する広いピングに用いた種雄牛Ａとその発症産子および正部位が存在し，この部位には６種の遺伝子が位置

常産子からなる父方半きょうだい家系から，変異していることが分かった（Fig.１）。これら６遺探索用個体として種雄牛Ａ，発症産子２頭および伝子の１種（Gene-1）は，ヒト遺伝性腎疾患の正常産子１頭を選抜し，これらのゲノムDNAを原因遺伝子の一つとして知られる遺伝子であっ用いた。

た。そこで，候補領域－２に位置する遺伝子を調© The Ito Foundation

95

早産を伴う子牛死亡に関連する遺伝的要因の解明
Table 1 Frequency of SNP which deviated from HWE
Relative positionin the candidate region-1

SNPs in the interval
p<0.05（χ2 test）

Freq. ofp<0.05 SNP

All

1

-

4,695,400

937

5,178

0.18

4,695,401-

9,388,500

481

7,425

0.06

9,388,501-

14,026,000

189

6,343

0.03

14,026,001-

18,781,788

176

5,798

0.03

Open circle indicate p-value detected with χ2 test of each SNPs. Arrow indicates gene and its direction.

Fig. 1 Distribution of p-values for each SNP deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium in candidate region-1

3,000,000
2,500,000
2,000,0000

500,000

1,000,000

1,500,000

Gene-1

0

1

2

3

5

6

7

4

Log（1/p）© The Ito Foundation

候補領域-1上の相対的位置（nt）

3,500,000

4,000,000

4,500,000

5,000,000

HWE : Hardy-Weinberg equilibrium

96

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

べたところ，同じ遺伝性腎疾患の別の原因遺伝子

SNPが検出され，これらの11 SNPsがエクソン領やこの腎疾患に関連すると思われる遺伝子が存在域に位置していた。さらに，これら11 SNPsの5することが分かった。これらのことから，この種

SNPsが非同義置換であり，2 SNPsが同義置換で

雄牛Ａ産子で見られるWCSは候補領域－１に位置あった。残りの4 SNPsは3’ UTRに位置していたする原因遺伝子変異をホモで保有し，さらに，候（Table ２ ， Fig. ２）。 非 同 義 置 換 の 5 SNPs は

補領域－２に位置する原因遺伝子変異を保有する

c.284C>T（p.Pro95Leu）， c.292C>A（p.

ことで発症すると考えた。したがって，Gene-1

Pro98Thr），c . 1 0 3 9 C > T （ p . A r g 3 4 7 C y s ），を候補領域－１の有力な候補原因遺伝子と考え，

c.1084C>T（p.Arg362Trp）およびc.2848A>T

変異を探索した。

（p.Thr950Ser）であり，これらアミノ酸置換のGene-1 は 25 種 の エ ク ソ ン か ら な る ゲ ノ ム のタンパク質機能への影響をPolyPhen-2によって

61,048bpにわたるアンチセンス鎖の遺伝子であ解析したところ，p.Pro95Leu， p.Pro98Thr，る。これらエクソンをカバーする各プライマー

p.Arg347Cysおよびp.Arg362Trpが「Possibly

セットを用いて変異を探索したところ，23種のd a m a g i n g 」と予測された。特に，c . 2 8 4 C > T

Table 2 Detected SNPs in Gene-1
Amino acidsubstitution

PolyPhen-2 resultsc.284C>T

p.Pro95Leu

Possibly damaging

c.292C>A

p.Pro98Thr

Possibly damaging

c.1039C>T

p.Arg347Cys

Possibly damaging

c.1084C>Tp.Arg362Trp

Possibly damaging

SNP

c.502+46C>A
c.503-45C>T
c.888+63T>G
c.889-15G>C

c.1117+60A>G
c.1308+33C>T
c.1308+45G>A
c.1677T>C

synonymousc.1879-201G>A
c.1879-192A>G
c.2308+12T>C
c.2764-34C>T
c.2848A>T

p.Thr950Ser

c.2889+141T>C
c.3019A>C

synonymous

c.＊183G>C

3’ UTR

c.＊238G>A

3’ UTR

c.＊283T>A

3’ UTR

c.＊1846G>T

3’ UTR© The Ito Foundation

© The Ito Foundation

342bp

23

366bp

22
▲c.3019A>C

8

413bp
9

437bp

1,593bp

287bp
383bp 395bp 407bp 396bp 481bp 267bp
987bp 351bp

24

382bp
25

2,524bp▲c.＊183G>C▲c.＊238G>A▲c.＊283T>A▲c.＊1846G>T

sF1 2 3 4 5 6▽p.Pro98Thr
p.Pro95Leu▽
154▼p.Thr950Ser

1,121 a.a.

Triangles indicate amino acid substitution, and open triangles are one predicted as “possibly damaging”. Shaded box（■）indicates a region interacted with Gene-3
coding protein.

Fig. 3 Position of amino acid substitution positions in Gene-1 coding protein.

▽p.Arg362Trp▽p.Arg347Cys

784bp
sF
sR

5
6 7
▲c.889-15G>C ▲c.1308+33C>T▲c.1308+45G>A△c.1039C>T△c.1084C>T▲c.1117+60A>G462bp

Boxes, filled triangles, and arrowheads indicate exons, detected SNP, and primers, respectively. Shaded box（■）indicates UTR.

interaction with
Gene-3 coding protein

1

3

2
4
△c.284C>Tc.503-45C>T▲△c.292C>A
c.888+63T>G▲▲c.502+46C>A

566bp

427bp

326bp
10
11
12
13 14
15
16
18 19
20
21
17
▲c.1677T>C▲c.2308+12T>C▲c.2764-34C>T▲c.1879-201G>A▲c.2848A>T▲c.1879-192A>G▲c.2889+141T>C

326bp

Fig. 2 Gene-1, primers for PCR and sequencing, and SNP position.

Exon 1

408bp
F
R

712bp
sF

早産を伴う子牛死亡に関連する遺伝的要因の解明

97

98

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）（p.Pro95Leu）はdbSNPに登録されていない新規による黒毛和種の劣性遺伝的不良形質である。しSNPであった。その他のSNPsでスプライシング

かし，IARS変異によらないWCSの発症が確認さに関係するなど遺伝子機能に影響すると思われる

れていることから，新たなWCSの原因遺伝子変ものはなかった。

異を特定するために解析を進めている。これまで

次に，Gene-1由来タンパク質において，検出に種雄牛Ａの産子で発症するWCSの候補領域－１

されたアミノ酸置換が位置するアミノ酸領域が機と２をそれぞれホモ接合マッピングと連鎖解析に能を有するかを確認するために，マウスGene-1

よって検出している。これら候補領域－１と２に由来タンパク質のアミノ酸配列を確認したとこ

は，同じヒト遺伝性腎疾患の原因遺伝子（それぞろ，１～154アミノ酸領域はGene-3にコードされれGene-1と2）が位置することから，Gene-1変るタンパク質と相互作用する領域であることが分異をホモで保有し，さらにGene-2変異を保有すかった（Fig.３）。しかも，Gene-3は，Gene-1とることで発症すると考えた。そこで，まず候補領同じヒト遺伝性腎疾患の原因遺伝子であることが域－１に位置するGene-1の変異を探索したとこ

示 さ れ て い た 。こ れ ら の こ と か ら ，改 め てろ，５種の非同義置換が検出された。これら5

Gene-1を候補遺伝子と考え，タンパク質機能に

SNPsの4 SNPsがタンパク質機能に影響があると影響すると予測されたc.284C>T（p.Pro95Leu），

予 測 さ れ た 。ま た ，こ の 4 SNPs の 2 SNPs はc.292C>A（p.Pro98Thr），c . 1 0 3 9 C > T （ p .

Gene-3がコードするタンパク質と相互作用する

Arg347Cy） お よ び c.1084C>T （p.Arg362Trp）領域に位置していた。さらに，このGene-3は，について，マッピングに用いた父方半きょうだい

Gene-1，2と同じ遺伝性腎疾患の原因遺伝子で家系を型判定し，リスクアレルとハプロタイプのあった。これらのことから，改めてGene-1を候関係を精査する必要がある。また，大規模な正常補遺伝子として，さらに詳細な解析が必要である

牛集団におけるアレル頻度を調査し，これら変異と思われた。

とWCSとの関連を詳細に解析していく必要があると思われた。さらに，候補領域－２に位置する
同じヒト遺伝性腎疾患の原因遺伝子（Gene-2）
または関連遺伝子を候補遺伝子として変異を探索し，同様に解析を進める必要があると思われた。
４．要約

虚弱子牛症候群（WCS）は，臨床的に原因が特定できない虚弱の総称であり，黒毛和種の新生
子 死 亡 の 約 60 ％ を 占 め る と 考 え ら れ て い る 。
IARS異常症はWCSの原因遺伝子変異の一つとして同定されたIARS c.235G>C（p.Val79Leu）変異文
献１）
 Ogata, Y., Nakao, T., Takahashi, K., Abe, H.,
Misawa, T., Urushiyama, Y., Sakai, J.:Intrauterine
growth retardation as a cause of perinatal
mortality in Japanese black beef calves, J. Vet.
Med. A., 46, 327~334, 1999.
２）
 Hirano, T., Kobayashi, N., Matsuhashi, T.,
Watanabe, D., Watanabe, T., Takasuga, A.,
Sugimoto, M., Sugimoto, Y.:Mapping and exome
sequencing identifies a mutation in the IARS geneas the cause of hereditary perinatal weak calf
syndrome, PLoS ONE, 21, e64036, 2013.
３）
 佐々木慎二，鈴木穣，森元学，秋山敬孝，福島護之，
北村夕貴，田淵一郎，有島太一，長谷川清寿，高山恵，
黒木一仁，渡邊学，菅野純夫，杉本喜憲：黒毛和種の生産阻害因子解明のための多様体データベースの構築，日本畜産学会第122回大会講演要旨，2017．

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99

ウシ複合脊椎形成不全症の病態解析とウシの骨格成長に重要な糖鎖の同定
Pathophysiology analysis of bovine complex vertebral malformation andidentification of sugar chains important for bovine skeletal growth

古

市

達

哉

（岩手大学農学部共同獣医学科実験動物学研究室）

Tatsuya Furuichi（Laboratory of Laboratory Animal Science and Medicine, Co-Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate
University）

Complex vertebral malformation（CVM）is an autosomal recessive severe skeletal
dysplasia in Holstein cattle. CVM consists of a range of complex anomalies of the vertebral
column and limbs, dysmorphic craniofacial features, cardiac anomalies, and spontaneousabortion or perinatal death. Bovine SLC35A3 gene has been identified as a CVM-causative gene.
SLC35A3 has been reported to be a UDP-N-GlcNAc transporter located in the Golgi
membrane, however the pathogenic mechanisms of CVM have been largely unspecified. To
address this issue, we generated a SLC35A3 knockout（KO）mouse strain using CRISPR/
Cas9-mediated genome editing. Three hundred and sixty zygotes injected with Cas9 and
SLC35A3 guide RNAs were transferred to pseudo-pregnant mice, and 32 F0 pups were born.
Among them, eight pups were dead after birth and exhibited dwarfism, whereas the others
were alive with normal body size. The DNA sequencing around the target site showed thatthe eight lethal pups had the frameshift deletions at both SLC35A3 alleles and the others had
either one or no targeted allele. A stable germline transmission of the edited allele wasconfirmed in several heterozygous F0 mice, and SLC35A3 KO mice used in the future
experiments were generated by crossing of the heterozygous breeding pairs lacking 17-bp of
the coding sequence. SLC35A3 KO mice at embryonic day 18.5 were found according to theMendelian ratio, died within a hour of birth, and exhibited severe dwarf phenotypes. SLC35A3
KO mice exhibited vertebral malformations, including misshaped vertebrae, fusion of vertebral
bodies, and fusion and bifurcation of rib. These vertebral malformations were similar to thosein CVM patients. In the growth plate cartilage of SLC35A3 KO embryos, extracellular space
was drastically reduced, and many flat proliferative chondrocytes were reshaped. In this study,
we succeed in generating SLC35A3 KO mice and show the usefulness of this mutant mice asan animal model for CVM. To elucidate the pathogenic mechanisms of CVM, we are going toperform the multiple analyses of SLC35A3 KO mice, including detailed histological, sugar
chain, and comprehensive gene expression analyses．

© The Ito Foundation

100

令和３年度

１．目

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

CRISPR/Cas9 ゲ ノ ム 編 集 シ ス テ ム を 用 い て的

SLC35A3 knockout（KO）マウスを作製した。

複合脊椎形成不全症（CVM）は，ホルスタイ

さらに同マウスの形態学的，組織学的解析を行ン種における周産期致死性の常染色体潜性遺伝病

い，CVMモデル動物として有用性を評価した。

である 。CVM発症個体は，椎骨や肋骨の欠損・
１）

癒合，頚椎や胸椎の短縮，側弯など重度の脊椎形

２．方法

成不全を示し，その約８割が妊娠260日までに死C57BL/6 マ ウ ス の 受 精 卵 に Cas9 タ ン パ ク と流産する。他にも四肢遠位関節の対称性異形成やSLC35A3をターゲットとしたguide RNAをエレ心奇形などの臨床症状が報告されている。CVM

クトロポレーション法で導入した。これらの受精

家系の連鎖解析から，CVMの原因遺伝子は糖ヌ

卵は偽妊娠雌ICRマウスの卵管へ移植し，産仔をクレオチド輸送体をコードするSLC35A3である得た。誕生したF0マウスからゲノムDNAを抽出２）ことが報告されている 。SLC35A3遺伝子はゴし，変異の導入をシークエンシングによって確認

ルジ体膜上に発現し，UDP-N-アセチルグルコサした。17 bpをヘテロ接合で欠失したF0マウスをミン（GlcNAc）を細胞質からゴルジ体内腔へ輸ライン化した。実験に供するSLC35A3 KOマウ

送する糖ヌクレオチド輸送体をコードしている。

スは17 bp欠失ヘテロマウス同士の交配で妊娠し糖鎖は末端に単糖が付加されることで形成され，たメスマウスから帝王切開で摘出し，同腹のヘテ

この反応は糖転移酵素によって触媒される。糖転

ロKOまたは野生型マウスをコントロールに用い移酵素は糖ヌクレオチド（糖供与体）を基質とした。胎生18.5日齢マウスの骨格標本を作製し，上て用い，糖ヌクレオチドの単糖を新しく合成され腕骨近位端および腰椎の組織切片を作製し，HEる糖鎖の末端に付加する反応を触媒する。すなわ

染色を行った。

ち，糖ヌクレオチド輸送体は，糖転移酵素の基質として用いられる糖ヌクレオチドを細胞質から糖３．結果と考察

鎖合成の場である小胞体あるいはゴルジ体の内腔

ゲノム編集処理した360個の受精卵を仮親に移へ輸送する役割を担っている 。したがって，植した結果，32匹のF0マウスが誕生し，そのう

CVMはSLC35A3の機能不全によって起こる糖鎖

ちの８匹は出生後に死亡した。死亡した５匹はの合成不全が原因で発症すると推測されるが，SLC35A3の両アレルに変異が導入されていたCVM個体ではどのような種類の糖鎖合成が影響（３匹は解析不可）。生存した24匹のうちの７匹でを受けているのか，そしてCVMの発症機序はほは片側アレルに変異が導入されており，15匹ではとんど解明されていない。これらを解明するため変異は導入されていなかった（２匹は解析不可）。

にはCVM発症個体のサンプルが必要であるが，以上の結果から，SLC35A3 KOマウスは周産期

CVMの発症頻度は著しく低く，実験に必要なサ致死となることが強く示唆されたため，以後の実ンプル数の確保は困難である。またCVM個体は験に供するSLC35A3 KOマウスは，17塩基対を周産期致死であるため，糖鎖解析をはじめとする

欠失するヘテロKOマウスをライン化し，ヘテロ

生化学解析が可能となる新鮮なサンプルの入手もKOマウス同士の交配で作製した（Fig. 1a）。胎生

困難である。したがって，SLC35A3の機能を欠

18.5日齢の胎児を帝王切開で摘出したところ，

損 す る モ デ ル 動 物 が 必 要 で あ り ，本 研 究 で はSLC35A3 KOマウスは矮小化を認め，摘出１時間

３）© The Ito Foundation

ウシ複合脊椎形成不全症の病態解析とウシの骨格成長に重要な糖鎖の同定

101以内に死亡した（Fig. 1c）。帝王切開で摘出したが，明らかに遅延していた（Fig. 2b，arrow）。

個体数は，野生型：15匹，hetero KO：26匹，以上の結果から，SLC35A3 KOマウスはCVM罹

homo KO：14匹であり，カイ二乗検定の結果，患ウシと同様に重度の脊椎形成不全を示すことがそれぞれの遺伝子型マウスの確率は，メンデルの明らかとなった。

法 則 に 従 っ た 。こ れ ら の 結 果 か ら ，SLC35A3

胎生18.5日胚の上腕骨および腰椎の組織切片をKOマウスは矮小化し，周産期致死となることが用いて，HE染色像を行った（Fig.３）
。野生型マ

示された。

ウスの長管骨では，端から円形増殖軟骨細胞，扁アルシアンブルー・アリザリンレッド二重染色

平増殖軟骨細胞，肥大軟骨細胞から形成される細による胎生18.5日胚の透明骨格標本を作製し，骨胞層が観察された。SLC35A3 KOマウスの上腕格 異 常 の 有 無 を 調 べ た （Fig. ２）。野 生 型 と骨は明らかに短縮していたが，３層の区別は可能

SLC35A3 KOマウスの二重染色の染色性に大きであった（Fig. 3a）。しかし，SLC35A3 KOマウな違いは見られなかったが，SLC35A3 KOマウスの円形増殖軟骨細胞，扁平増殖軟骨細胞層でスの骨格は全体的に矮小化していた（Fig. 2a）。

は，軟骨細胞外マトリックス領域が著明に減少し頭蓋骨の大きさについては，両者で顕著な違いはており，それに伴い，細胞密度は上昇していた

観察されなかった（Fig. 2b）。SLC35A3 KOマウ

（Fig. 3b）。KOマウスの扁平増殖軟骨層では扁平スの大腿骨および脛骨の長さは，コントロール化した細胞が減少しており，扁平増殖軟骨細胞の（野生型＋ヘテロKO）と比べ有意に短縮してい変形が観察された。KOマウスでは肥大軟骨細胞

た。SLC35A3 KOマウスの脊椎では，椎骨の癒の小型化も観察された（Fig. 3b）。

合・欠損・形態異常といった脊椎形成不全が観察

SLC35A3 KOマウスはCVMと同様に周産期致された（Fig. 2c）。野生型マウスの肋骨は13対（26

死となり，重度の脊椎形成不全を呈したことか本）であるが，KOマウスでは11対（22本）に減

ら，CVMモデル動物としての有用性が示された。

少していた（Fig. 2c）。KOマウスでは胸骨の癒合

脊椎は発生過程に一過性に現れる分節構造である
17 bp deletiona

G A A A C C C T G A A G C T C G C T A T C C C G T C A G G G A T A
E

WT

T

K

L

L

A

P

I

S

G

I

G A A A C C C T C A G G G A T A T A T A C T C T T C A G A A CA A
Y
S
S
E
T
L
R
D
E
Q
I

KO

c

b
＋/＋

＋/－

WT

Slc35a3KO－/－

200 bp100 bpFig. 1 Generation of Slc35a3 KO mice by genome editing．

（a）Sequence chromatograms of the edited genomic region in exon 3 of the Slc35a3 gene. A homozygous 17-bp
deletion（c. 256_273del）leading to frameshift occurred in Slc35a3 KO mice.（b）Agarose gel electrophoresis imageof PCR products for genotyping. ＋/＋：wild-type, ＋/－：Slc35a3 heterozygous KO, －/－：Slc35a3 homozygous
KO.（c）Gross appearance of wild-type（WT）and Slc35a3 KO littermate embryos at E18.5.

© The Ito Foundation

102

令和３年度

a

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）
WT

WT

Slc35a3KO

b

WT Slc35a3KOc

WT

WT Slc35a3KO

Slc35a3KO

WT

Slc35a3KO

Slc35a3KO

Fig. 2 Skeletal abnormalities in Slc35a3 KO mice．

Skeletal specimens of wild-type（WT）and Slc35a3 KO littermate embryos at E18.5 were prepared. Calcified

tissues were stained red with Alizarin red, and cartilage was stained blue with Alcian blue.（a）whole skeleton.（b）Skull（left）, hind limb（middle）and sternum and ribs（light）. The black arrow indicates delayed fusion of thesternal bands in Slc35a3 KO mice.（c）Dorsal view of spine and ribs. Slc35a3 KO mice exhibited vertebral
malformation, including misshaped vertebrae, fusion of vertebral bodies, and fusion and bifurcation of rib.

a

WT
RC
FC
HC

Slc35a3KO

b

WT

Slc35a3KO

RC
RC
FC

FC
HC

HC

Fig. 3 Cartilaginous extracellular matrix was severely reduced in Slc35a3 KO mice.

Humerus of wild-type（WT）and Slc35a3 KO littermate embryos at E18.5 were stained with hematoxylin-eosin（HE）solution.（a）low-power magnification image of humerus.（b）High-power magnification image of humerus.
PC: round chondrocyte zone, FC： flat chondrocyte zone, HC： hypertrophic chondrocyte zone. The round and flatchondrocytes were well spaced by extracellular matrix（ECM）in WT mice. In contrast, the ECM was decreased
and the cell density was increased in the round and flat chondrocyte zones in Slc35a3 KO mice. The shape of mostflat chondrocytes changes to a spindle-like one in the mutant. Scale bars: 100 μm（a）,20 μm（b）.

体節に由来しており，体節は胎生中期に未分節中接する細胞の膜上に発現するNotchリガンドが直胚葉の前方が一定周期でくびれ切れることで形成

接相互作用することによって，隣接する細胞間でされる球状の細胞塊である。体節形成は時間的かのシグナル伝達が行われる。Notchシグナル系遺つ空間的に厳密に制御されており，Notchシグナ

伝子のKOマウスでは体節の分節化が不規則に起ルが重要な役割を担っている４）。Notchシグナル

こり，体節が不整になる。Notch受容体には，細伝達では，細胞膜上に発現するNotch受容体と隣胞外ドメインに36個のEpidermal Growth Factor© The Ito Foundation

ウシ複合脊椎形成不全症の病態解析とウシの骨格成長に重要な糖鎖の同定（EGF）様ドメインの繰り返し構造が存在し，これらの細胞外EGFドメインには，O-フコース，
O-グルコース，O-GlcNAc糖鎖の３種類のＯ型糖

103

たGAG解析を予定している。
４．要

約

鎖修飾が起きる５）。Moloneyらは，Notchシグナ

私 た ち が 作 製 し た SLC35A3 KO マ ウ ス は ，ルの制御因子であることが知られていたLunatic

CVMに類似した重度の脊椎形成不全を示し，Fringeが，Notch受容体EGFドメイン上のO-フ

CVMモデル動物として有用であることが示されコース単糖にGlcNAcを転移する糖転移酵素であた。さらに，このKOマウスでは軟骨細胞外マトることを報告した。Lunatic Fringeをコードする

リックが著明に減少しており，SLC35A3は軟骨LFNGの機能消失変異は，ヒトとマウスで脊椎異細胞外マトリックの産生または恒常性維持におい常を引き起こすことから，Notch受容体上のO-フても重要な役割を担っていることが示された。今コースにGlcNAcが付加されることの重要性がう後はSLC35A3の生体内機能，そしてCVMの病態

か が え る 。こ れ ま で の 報 告 か ら SLC35A3 は機序の解明を目指し，同マウスを用いて，詳細なLunatic Fringe の 基 質 と し て 用 い ら れ る UDP-

組織学的解析，糖鎖解析，そして体節形成時期にGlcNAcをゴルジ体内腔へ輸送する主要な糖ヌク

おける網羅的な遺伝子発現解析などを行う予定で

レオチド輸送体であることが示唆されてきたが，ある。一方，糖ヌクレオチドは主に細胞内に存在

本研究の結果はこの説を強く支持するものであしているが，細胞外では唯一，乳中に検出されてる。今後，野生型およびSLC35A3 KOマウスのおり，ウシとヤギの初乳中にはSLC35A3によっ

体節形成期（胎生７日齢から13日齢）の未分節中て輸送されるUDP-GlcNAcが検出されている。

胚葉におけるSLC35A3発現，Notchシグナル遺したがって，糖ヌクレオチドは家畜の育児用調整

伝子の発現をin situハイブリゼーションによって乳や家畜飼料素材への機能性添加物として利用で調 べ る こ と で ，Notch シ グ ナ ル 伝 達 に お け る

きる可能性が指摘されており７），本研究は家畜飼

SLC35A3の役割を明らかにする予定である。

料学の方面にも発展させていきたいと考えている。

胎生18.5日齢のSLC35A3 KOマウスのHE染色
像では，細胞外マトリックスの減少，扁平増殖軟
骨細胞の変形，肥大軟骨細胞の小型化が観察された。軟骨細胞外マトリックス中に最も多く存在している糖鎖は，グリコサミノグリカン（GAG）の一種であるコンドロイチン硫酸（CS）である。
SLC35D1 KO マ ウ ス と Csgalnact1/2 double KO
マウスはともにCS代謝異常が主な原因で致死的な骨格異常を示すKOマウスであり，両マウスの軟骨組織に認められる異常は，SLC35A3 KOマウスに認められる異常と類似している ６）。したがって，SLC35A3 KOマウスではGAGの代謝異常が起きていることが推測されており，今後，
SLC35A3 KOマウスの軟骨組織サンプルを用い文献１）
 Ghanem, M. E., Akita, M., Suzuki, T., Kasuga, A.,
Nishibori, M.：Anim Reprod Sci, 103, 348～354,2008.
２）
 Thomsen,B., Horn, P., Panitz, F., Bendixen, E.,
Petersen, A. H., Holm, L. E., Nielsen, V. H.,
Agerholm, J. S., Arnbjerg, J., Bendixen, C.：
Genome Res, 16, 97～105, 2006.
３）
 Hadley, B., Litfin, T., Day, C. J., Haselhorst, T.,
Zhou, Y., Tiralongo, J.：Comput Struct Biotechnol J,
17, 1123～1134, 2019.
４）
 Maroto, M., Pourquié, O.：Curr Top Dev Biol, 51,
221～248, 2001.
５）
 Stanley, P., Okajima, T.：Curr Top Dev Biol, 92,
131～164, 2020.
６）
 Mizumoto, S., Yamada, S.：Front Cell Dev Biol,
doi：10.3389/fcell. 2021.764781, 2021.
７）
 浦本匡：科学研究費助成事業 研究成果報告（16Ｋ08003）.

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104

肥育豚の霜降り割合の指標となるバイオマーカーの特定
Biomarker discovery for breeding highly marbled pork production

谷口

雅章１・中島郁世１・荒川愛作１・吉岡豪２・鈴木香澄２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，２岐阜県畜産研究所養豚・養鶏研究部）

Masaaki Taniguchi1, Ikuyo Nakajima1, Aisaku Arakawa1, Go Yoshioka2 and Kasumi Suzuki2（１Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, ２Gifu Prefectural Livestock Research Institute）

There are a wide variety of approaches to improving the quality of pork. In order tostably produce the favorable meat with the consistent quality, we aimed to discover potential
biomarkers to enable estimating the pork meat quality especially intramuscular fat（IMF）
content during the fattening period. In this study, we investigated the metabolites and microRNA（miRNA）in serum of fattening Duroc pigs by gas-chromatography-mass-spectrometry（GCMS）metabolomics and small-RNA-sequencing. Duroc pigs were fed with conventional
feeding until 77 day-old and separated by 3 groups of different amino acid compositions：（1）control group was fed with 0.95％ lysine between 78d and 90d, with 0.58％ lysine between 90d
and 97d, and with 0.56％ lysine from 98d onward till slaughter,（2）Test 1 group was fed with
0.95％ lysine between 78d and 120d, and then with 0.56％ lysine from 121d onward tillslaughter, and（3）Test 2 group was fed with 0.95％ lysine between 78d and 120d, with 0.78％
lysine and a mixture of amino acids containing tryptophan, methionine and threonine from
121d onward till slaughter. Blood sampling was carried out at 90d, 120d and just before
slaughter. Results of the feeding tests showed body weight at 119d of pigs in Test 2 group
significantly decreased than that in Test 1（p<0.05）. Other than that, there was no significant
difference in body weight and the growth-related traits between the groups at any time points.
As per the marbling score, Test 2 group showed significantly greater value than those ofcontrol and Test 1（p<0.05）. The result of GCMS metabolomics indicated that there weredifferential metabolites between control and Test 1 and Test 2（p<0.05）. However, theenrichment analysis did not return any of significant metabolic pathways, due probably to thefewer number of metabolites detected at each time point. The small-RNA-seq analysis
identified 12 miRNAs with high expression levels in the pig serum, although no statisticalcomparison was examined. Once the relationship between the metabolite and miRNA isclarified, they may be the potential biomarkers for the IMF content in the fattening pigs．

１．目

優れるブタ品種である。そのため，デュロック種

的の生産性向上に向けた育種改良および飼養管理のデュロック種は肉量および肉質を含め産肉性に最適化は養豚業にとって主要な課題である。我が© The Ito Foundation

105

肥育豚の霜降り割合の指標となるバイオマーカーの特定国では適度な霜降り（筋肉内脂肪）の入った豚肉

どのように筋肉あるいは脂肪細胞へ変換するか，が高品質な豚肉として好まれる傾向がある。国産

分子生物学的メカニズムを解明する必要がある。

の品質豚肉を安定的に生産するためには，高能力

そこで本研究では，デュロック種肥育豚においのデュロック種系統豚を開発・普及させることがて異なるアミノ酸組成を持つ飼料給餌による増体必須である。

量，枝肉重量，筋肉内脂肪含量などへの影響につ岐阜県は遺伝的な特性から霜降り割合が６％をいて検討した。さらに，肥育期間中の血液におけ超える（一般的な豚肉は３％）特徴的な肉質を持る生体内低分子代謝物およびマイクロRNAを探つデュロック種系統豚ボーノブラウンを育種した索することにより，バイオマーカーとしての利用（農林水産省委託プロジェクト研究「生産システ

可能性を検討した。

ム革新のための研究開発」2012－2016）
。一方，

法

２．方

ブタの第一制限アミノ酸であるリジン含量の調整
や給餌のタイミング等により，霜降り割合を制御

本研究には，デュロック種48頭を16頭ずつの３する研究が進んでいる 。実際，ボーノブラウン

区に分け，以下の飼料を用いた肥育試験を行った種豚を利用したブランド豚肉生産に特化した飼料（Fig.１）。（１）対照区：生後78-90日齢までリジ開発も行われている。しかしながら，試料中のアン含量0.95％，90-97日齢までリジン含量0.58％，

ミノ酸組成と筋肉内脂肪蓄積に関する生物学的メ

98-出荷までリジン含量0.56％，（２）試験区１：

カニズムは未解明な部分があるため，肉豚の霜降

生後78－120日齢までリジン含量0.95％，121－出り割合にはばらつきが生じる。そこで，高霜降り荷まで0.56％，（３）生後78-120日齢までリジン

割合の豚肉を安定的に生産するデュロック種系統

含量0.95％，121-出荷まで0.78％に加え，トリプ

豚を供給するためには，給餌飼料中のリジン含量

トファン・トレオニン・メチオニン添加した飼料の違いにより飼料に含まれる栄養・エネルギーがを給与した。肥育試験期間中の90日齢および120

１）

1.00
0.80
0.60
0.40

158d

174

178

166

Control
170

162

154

146

150

138

142

144d

158

119d 120d

134

126

Test1
130

118

122

110

102

106

94

98

86

90d

114

78d

Test2
90

0.00

78
82

0.20

slaughter

Fig. 1 Difference in lysine content in the feed during fattening/finishing period of Duroc pigs used for this study.

Vertical axis denotes percentage（%）of lysine. Horizontal axis denotes days after birth. Open and filled arrows

denote the time points at body weight measurements and blood samplings, respectively.

© The Ito Foundation

106

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

日齢時，ならびに出荷時において採血を行い，血edgeR お よ び DESeq2 を 内 包 し た TCC パ ッ ケ ー

清を採取したのち－80℃で保存した。低分子代謝ジ６）を用いた。対照区と試験区１，試験区２の差物の分析は，ブタ血清，40μlに内部標準物質との検定は分散分析によって行い，得られたｐ値をして2-isopropyl malic acidを加え，超純水・メタ

False discovery ratio(FDR）補正したＱ＜0.05をノール・クロロフォルム前処理液抽出物を遠心分有意とした。

離した上清を乾固処理したものを誘導体化してから，島津QP2020ガスクロマトグラフィー質量分３．結果と考察析（GCMS）機を用いたメタボローム解析によりデュロック種肥育豚におけるアミノ酸含量を変行 っ た 。 代 謝 物 デ ー タ は Smart Metabolite

化させた飼養試験により，119日齢時において試Database お よ び MS-DIALを用いて同定した

験区１の生体重が，試験区２に比べ有意に高い値

後，MetaboAnalyst３）を用いて統計解析，ならびを示したが，これ以降，出荷時にかけてすべてのにエンリッチメント解析を行った。

区で生体重に差違は見られなかった（Fig.２）。

２）

マイクロRNAの特定には，ブタ血清200μlから

日増体量および出荷日齢に関しては，対照区が２抽出したRNAを用いて次世代シーケンサーによつの試験区に比べ，増体性がよく，早期に出荷とるsmall-RNA-seq解析により行った。Fastq形式

なったが有意差はなかった（Table１）。枝肉重量，で取得した。シーケンスリードは，HISAT2に

枝肉歩留に関しては，対照区と２つの試験区の間

よ り ブ タ リ フ ァ レ ン ス ゲ ノ ム（Sscrofa11.1 ：に差違は認められなかったが，肉質形質である筋

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/

肉内脂肪含量は試験区２が，試験区１より有意に84?genome_assembly_id＝317145）にマッピング

高い値を示した（Table２）。血清を用いたGCMS

し，発現情報取得にはStringTieを用いた。遺メタボローム解析により，対照区－試験区１およ伝子発現量のブタ胎児の大小差の比較解析には，

び対照区－試験区２の間で有意差を認めた代謝

５）

４）

120
100

＊

80
60
40
20
0

78

119
Control

144
Test1

158

Test2

Fig.2 Alternation of body weight of Duroc pigs from the

beginning to the finishing of the feeding test
X- and y-axes denote days-old and kg, respectively.
＊
Significant difference（p<0.05）is observed between
Test 1 and Test 2.

© The Ito Foundation

107

肥育豚の霜降り割合の指標となるバイオマーカーの特定
Table 1 Differences in growth traits between control, Test 1 and Test 2.
TraitsControl

Test 1

Test 2

Dairy gain（g/d）

927.9±111.0

876.2±112.1

898.8±114.1

Days-old at slaughter（d）

155.4±11.7160.8±12.1

159.8±11.3

Body weight at slaughter（kg）

114.6±3.5115.2±4.1

115.0±3.8

Table 2 Differences in carcass and meat quality related traits between control, Test 1 and Test 2.
TraitsControl

Test 1

Test 2

Carcass weight（kg）

77.59±2.6977.00±2.8578.19±2.64

Dressing percentage（%）

0.668±0.012

0.667±0.016

0.672±0.019

Backfat thickness（cm）

2.288±0.342

2.136±0.409

2.250±0.360

Marbling Score

2.64±0.175

2.59±0.205

2.79±0.266＊＊Significant difference was identified between Test1 and Test2（p<0.05）.

Table 3 Detection of differential metabolites between control and Tests at three timepoints.
Time point

Items

Day90

No. Metabolites

Day120Day-Slaughter

Control-Test1

Control-Test2

34

17

KEGG Pathways（FDR<0.05）

00

No. Metabolites

13

7

KEGG Pathways（FDR<0.05）

00

No. Metabolites

65

KEGG Pathways（FDR<0.05）00物，ならびに各時点で同定した代謝物によるエン反復実験ができず，対照区―試験区間の比較解析

リッチメント解析の結果をTable３に示した。いには至っていない。

ずれの比較においても有意差を示した代謝物数がしかしながら，ブタリファレンスゲノムに対し少なかったためか，エンリッチメント解析によりてSmall-RNA-seqリードをマッピングすること

有意水準Ｑ＜0.05を満たすKEGGパスウェイは同により，298種類のmiRNAが同定された。発現量定されなかった。しかしながら，119日齢時におの順に並べると上位12個のmiRNAが高い発現量

いて，試験区１が対照区に対して有意に７倍高いを示した（Fig.３）。これらは多様な生理機能に値を示した代謝物が含まれた。これはアミノ酸代

関わることが分かっており，未分化筋細胞の分化謝に関わることが示唆された。

活性があるものなども含まれている。発現量の高

Small-RNA-seq解析においては，血清から次さが機能的に重要とは限らないが，バイオマー

世代シーケンサーによる解析に耐えるだけの高収

カー候補として発現量の変動を同定できることが量かつ高濃度のRNAを抽出することが困難で必要条件である。今後，個別のブタ血清を用いたあったため，各時点において対照区，２試験区ごこれらの候補miRNAの発現量と飼料中アミノ酸とにRNAを集約する方法を採用した。このため組成による肉質の変化に関する再検討を行うこと© The Ito Foundation

令和３年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

36

61

108
1,800,000

1,600,000

1,400,000

1,200,000

1, 000,000

800,000

600,000

400,000

200,000

201

196

191

186

181

176

171

166

161

156

151

146

141

136

131

126

121

116

111

106

96

101

91

86

81

76

71

66

56

51

46

41

31

26

21

16

6

11

1

0

Fig. 3 Expression level of all miRNAs from the top to the bottom detected in Duroc serum.

Y-axis denotes expression level. X-axis denotes the order of miRNA by the expression level.

とする。

理の両面からさまざまな研究アプローチが行われ本研究の結果より，デュロック種肥育豚の飼料ている。一方，枝肉には品質のばらつきが現れる

中のアミノ酸組成の変化が増体性，枝肉成績に対ことが本題である。そこで，遺伝的および栄養学

して大きな影響は与えなかったが，筋肉内脂肪含

的に肥育期間中の調整を可能とすることにより，量には有意な差違をもたらした。120日齢時に対枝肉品質の斉一性が改善できれば養豚産業にとっ

照区と試験区１の間で，アミノ酸代謝に関連するて有用である。そこで，肥育期間中の肉質に関わ

血清代謝物の大きな変動を観察したことは飼料中る栄養状態をモニターできるバイオマーカー開発のアミノ酸組成が影響したことが考えられる。まに取り組んでいる。本研究から得られた知見よたmiRNAに関しては，複数の候補を検出したもり，候補代謝物およびmiRNAを同定した。今後のの，対照区－試験区間の有意差を検出するにはの研究で利用性の高いバイオマーカーを開発する。

至っておらず，今後も研究を進展させる必要がある。本研究で特定した代謝物およびmiRNAが制御する遺伝子－代謝物－肉質形質の関連性解析を継続し，育種による種豚開発および栄養成分の調整による再現性の高い肉豚生産への寄与に向け取
り組む。
４．要

約

肥育豚の肉質の改良に向け，育種および栄養管文
献１）
 Katsumata, M., Kobayashi, H., Ashihara, A.,
Ishida, A.：Effects of dietary lysine levels andlighting conditions on intramuscular fat
accumulation in growing pigs, Anim. Sci. J., 89（7）,988～993, 2018.
２）
 Lai, Z., Tsugawa, H., Wohlgemuth, G., et al.：Identifying metabolites by integrating metabolome
databases with mass spectrometry cheminformatics,
Nat. Methods, 15, 53～56, 2018.
３）
 C h o n g , J . , W i s h a r t , D . S . , X i a , J . ：U s i n g© The Ito Foundation

肥育豚の霜降り割合の指標となるバイオマーカーの特定
MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive andIntegrative Metabolomics Data Analysis, Current
Protocols in Bioinformatics, 68, e86, 2019.
４） Kim, D., Paggi, J. M., Park, C. Bennett, C.,
Salzberg, S. L.：Graph-based genome alignmentand genotyping with HISAT2 and HISATgenotype, Nat Biotechnol, 37, 907～915, 2019.
５） Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T.,

109

Salzberg, S. L.：Transcript-level expression
analysis of RNA-seq experiments with HISAT,
StringTie and Ballgown, Nat. Protocols, 11, 1650～
1667, 2016.
６）
 Su, W., Sun, J., Shimizu, K., Kadota, K.：TCCGUI：a Shiny-based application for differential
expression analysis of RNA-Seq count data, BMC
Research Notes, 12, 133, 2019.

© The Ito Foundation

110

肉用牛の枝肉形質および肉質の診断マーカーとしての血中マイクロRNAの動態解析（Ⅱ）
Analysis of dynamics of circulating microRNAs as biomarkers fordiagnosis of carcass traits and meat quality in beef cattle（Ⅱ）

横

井

伯

英

（京都大学大学院農学研究科）

Norihide Yokoi（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

Recently, many studies have focused on exosomal and non-exosomal microRNAs（miRNAs）in blood as novel biomarkers. To establish the blood miRNA-based diagnosis
method of carcass traits and meat quality in beef cattle, we have been investigating dynamics
of exosomal and non-exosomal miRNAs in Japanese Black cattle during fattening period．
In the present study, we performed miRNA-sequencing of plasma exosomal and nonexosomal miRNAs extracted from Japanese Black cattle at 20 and 25 months of age. Among a
total of about 520 miRNAs detected, about 300 miRNAs were detected in both exosomal andnon-exosomal fractions, about 20 miRNAs were specifically in exosomal fractions, and about
200 miRNAs were specifically in non-exosomal fractions. Principal component analysis revealed
that each sample group exhibited a specific profile and that exosomal fractions of both age
groups showed a similar profile while non-exosomal fractions of both age groups showeddistinct profiles. In exosomal fractions, there were several miRNAs which were specificallydetected in 25 months of age. In non-exosomal fractions, however, there was no suchphenomenon．
Further longitudinal and comprehensive studies are needed to identify novel biomarker
candidates for carcass traits and meat quality and to examine candidate miRNAs in large
populations of beef cattle．

１．目

定的にかつ低コストで生産するには，生体におい的て枝肉形質および脂肪の質を含めた肉質を的確に

近年の遺伝的改良および飼養法の進歩により，評価する技術の開発が必要である。生体における黒毛和種牛の脂肪交雑をはじめとする各種枝肉形

枝肉形質や肉質の評価法としては，超音波などを質は飛躍的に向上した。最近は筋肉内脂肪の量だ

用いて推定する方法と血液などに含まれるバイオ

けでなく，脂肪の質（脂肪酸組成）や筋肉内へのマーカーを用いて推定する方法が試みられてい入り方（サシ）の細かさも重要視されている。国る。前者は，専用機器を用いることが必要であり

際競争力が高く，安心・安全・高品質な牛肉を安汎用性に難がある。現状においては，血中バイオ© The Ito Foundation

肉用牛の枝肉形質および肉質の診断マーカーとしての血中マイクロRNAの動態解析（Ⅱ）

111

マーカーによる枝肉形質や肉質の診断技術は実用期の間で変動する傾向のある２種類のマイクロ化されていない。

RNAを同定した。さらに，血漿中に検出された

近年，血中に存在するマイクロRNAが疾患をマイクロRNAのうち８種類のマイクロRNAが肥はじめとする生体の状態の指標となる新たなバイ

育終了時の骨格筋および皮下脂肪において共通しオ マ ー カ ー と し て 注 目 さ れ て い る 。マ イ ク ロて存在することを確認した。

RNAは22塩基ほどの一本鎖RNAであり，真核生

今年度は，次世代シーケンサーによる網羅的な物において遺伝子発現制御に関与している１）。ママイクロRNAシーケンスを実施し，黒毛和種去

イクロRNAは細胞内に限らず，動物においては

勢肥育牛の20カ月齢と25カ月齢における血漿中に各種体液中にも存在しており，血液，尿，および存在するマイクロRNAのプロファイルを検討し唾液等で検出することができる 。これまで多くた。

２）の血中マイクロRNAの解析は，血中に存在する
エクソソーム（各種細胞から分泌される微小な膜
小胞顆粒）の中に存在するマイクロRNAに限定して行われてきた。しかし，血中マイクロRNA

２．方法

2 . 1 血中エクソソーム内外のマイクロRNAの抽出はエクソソーム以外にも多量に存在することが知京都大学農学研究科附属牧場において飼養中のられる。したがって，バイオマーカーとして血中

黒毛和種牛を対象として，肥育初期の10カ月齢か

マイクロRNAを検討するには，エクソソームにら肥育後期の30カ月齢まで，５カ月おきに経静脈

限らずに血中に存在するマイクロRNAを解析すからEDTA採血管（テルモ社）を用いて血液をることが必要である３）。

採取し，低温下での遠心により血漿を分離して凍そこで本研究では，血中マイクロRNAによる結保存した。次に，融解した血漿１mLをサンプ

肉用牛の枝肉形質および肉質の診断技術を開発す

ル と し て ， Plasma/Serum Exosome and Free-ることを最終目標として，血中のエクソソーム画

Circulating RNA Isolation Mini Kit（ノルジェン

分とそれ以外の画分の両者についてマイクロ社）を用いて血漿中のエクソソーム画分およびそRNAの経時的な動態を検討するとともに，肥育れ以外の画分からRNAを抽出した。

終了時における各種枝肉・肉質形質および骨格筋や脂肪組織中の各種成分との関連を検討する。

2 . 2 次世代シーケンサーを用いたマイクロRNAシーケンス解析

本 研 究 は 令 和 ２ （2020） 年 度 か ら 令 和 ４

上記のように血漿中のエクソソーム内外から抽（2022）年度までの３年間の計画で実施している。

出したRNAのうち20カ月齢と25カ月齢のサンプ

昨年度は，黒毛和種去勢肥育牛から採取した血漿ル（各ｎ＝３，合計12サンプル）について，専門中のエクソソーム画分とそれ以外の画分からのマ業者に依頼して次世代シーケンサーを用いた網羅

イクロRNAの抽出および検出方法，ならびに量的マイクロRNAシーケンス解析を行った。次に，的PCR（qPCR）における最適な内部コントロー

各サンプル中に検出されたマイクロRNAの種類

ルを決定した。また，ウシの血中および骨格筋におよびリード数に基づいてベン図の作成および主存在することが報告されている23種類のマイクロ成分分析を行った。さらに，edgeRによりフィル

RNAのうち血漿中エクソソーム内外において検タリング，正規化，月齢間で存在量が異なるマイ出可能なものを確認するとともに，肥育初期と後クロRNAの特定を行った。

© The Ito Foundation

112
2.3

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

qPCRによる検証

３．結果と考察

上記2.2の結果をqPCRにより検証するため，上記 2.1 と 同 様 に 同 一 個 体 か ら RNA を 抽 出 し ，

次世代シーケンサーを用いた網羅的マイクロ

Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit （タRNAシーケンス解析の結果，血漿中のエクソソー

カラバイオ社）を用いてcDNA合成を行った。

ム内では約320種，エクソソーム外では約500種のqPCR用のForward Primerは，マイクロRNAデー

マイクロRNAが検出された（Fig.１）。各月齢のタベース（miRBase，www.mirbase.org）からウ

血漿中のエクソソーム内外で共通して存在するマシのマイクロRNAの配列を入手し，配列中のウイクロRNAは約300種，エクソソーム内のみに見ラシルをチミンに置換して作製した。qPCR用のられるものは約20種，エクソソーム外のみに見らReverse Primer は Mir-X miRNA First-Strand

れるものは約200種であることが分かった。約300

Synthesis Kit（タカラバイオ社）付属のmRQ3’

種のマイクロRNAは，20カ月齢と25カ月齢の血

Primerを使用した。qPCRは，KOD SYBR qPCR

漿中のエクソソーム内外に共通して認められた。

Mix（TOYOBO社）を用いて反応液を調製した

主成分分析の結果，20カ月齢と25カ月齢の血漿後，qPCR マ シ ン （StepOne Plus，Applied

中のエクソソーム内外のサンプルがそれぞれクラBiosystems社）を用いて行った。また，特異的スターを形成した（Fig.２）。エクソソーム内のな増幅を確認するために，qPCR後に温度を0.3℃

サンプルのクラスターは近接して存在したのに対ごとに99℃まで上昇させて融解曲線を作成した。

して，エクソソーム外のクラスターは大きく離れて存在した。これらの結果から，20カ月齢と25カ
月齢の間において，血漿中のエクソソーム内に存

A

B

C

1

2
0

18
1

D
197

0

2

2

296
0

0
0

0
0

Fig. 1 Venn diagram of miRNAs detected in four sample groups

A ：exosomal fractions at 20 months of age, B：exosomal fractions at 25

months of age, C：non-exosomal fractions at 20 months of age, D：nonexosomal fractions at 25 months of age.

© The Ito Foundation

肉用牛の枝肉形質および肉質の診断マーカーとしての血中マイクロRNAの動態解析（Ⅱ）

在するマイクロRNAのプロファイルは類似性が高いのに対して，エクソソーム外のそれは大きく異なることが示唆された。

113

定した。
今後，同様な手法により肥育終了時の30カ月齢の血中マイクロRNAのプロファイルを明らかに

血漿中のエクソソーム内外それぞれにおいて月し，本研究の結果と比較解析することにより経時

齢による変動を検討したところ，複数のマイクロ的かつ網羅的な血中マイクロRNAのプロファイ

RNAに統計学的に有意な差が認められた。これ

ルの変動を解明する。さらに，肥育終了時におけらについてqPCRによる検証を行ったところ，月る各種枝肉・肉質形質および骨格筋や脂肪組織中

齢により大きく存在量が異なるマイクロRNAがの各種成分との関連を検討することにより，枝確認された（Fig.３）。エクソソーム内では，20

肉・肉質形質の指標となるバイオマーカー候補を

カ月齢と比較して25カ月齢において特異的に存在同定する。同定されたバイオマーカー候補についするものや存在量の高いものが多く認められた。

て多数頭の検討を行い，最終的にバイオマーカー

一方，エクソソーム外では，20カ月齢および25カとなり得るマイクロRNAを絞り込む。

月齢にそれぞれ特異的に存在するものが認められ
た。

約

４．要

血中マイクロRNAによる肉用牛の枝肉形質おクロRNAシーケンスにより，黒毛和種去勢肥育

よび肉質の診断技術を開発することを最終目標と牛の20カ月齢と25カ月齢における血漿中エクソ

して，本研究では次世代シーケンサーを用いたマ

ソーム内外に存在するマイクロRNAのプロファ

イクロRNAシーケンスにより，黒毛和種去勢肥

イルを明らかにするとともに，20カ月齢と25カ月

育牛の20カ月齢と25カ月齢における血漿中エクソ

齢の間で変動する複数の血中マイクロRNAを同

ソーム内外に存在するマイクロRNAのプロファ

15

本研究では，次世代シーケンサーを用いたマイ

5
0

A

-5

B
C

-10

PC2：13.3%

10

D

-20

-10

0

10

20

30

PC1：79.0%
Fig. 2 Principal component analysis of miRNAs detected in four

sample groups

A ：exosomal fractions at 20 months of age, B：exosomal

fractions at 25 months of age, C：non-exosomal fractions at 20
months of age, D：non-exosomal fractions at 25 months of age.

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114

令和３年度

2
1

Relative existenceA

B

miRNA-A

0

1 2 3 4 5 60

miRNA-E2

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6
20 m

25 m

0

0

miRNA-F

1 2 3 4 5 6
20 m

miRNA-G2

1 2 3 4 5 6
20 m

0

0

miRNA-D

ND

1 2 3 4 5 6
20 m

25 m

1
ND

2
1

25 m

1
ND

miRNA-C

2
1

ND

20 m

25 m

1
0

miRNA-B

1

20 m

2

2

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

2

25 m

miRNA-H

1ND

1 2 3 4 5 6

25 m

20 m

25 m

0

ND

1 2 3 4 5 6
20 m

25 m

Fig. 3 Differentially existing miRNAs between 20 and 25 months of age

Relative existence of miRNAs in plasma exosomal（A）and non-exosomal（B）fractions are presented as fold-change relative to those of animal No. 1 or No. 4. 20 m, 20 months of age; 25 m, 25 months of age; ND, not detected.

イルを検討するとともに，20カ月齢と25カ月齢の間で変動する血中マイクロRNAを探索した。

今後，経時的かつ網羅的な血中マイクロRNAのプロファイルの変動を解明し，枝肉・肉質形質次世代シーケンサーを用いた網羅的マイクロの指標となるバイオマーカー候補を同定する。同RNAシーケンス解析の結果，血漿中のエクソソー

定されたバイオマーカー候補について多数頭の検ム内外で共通して存在するマイクロRNAは約300討を行い，最終的にバイオマーカーとなり得るマ種，エクソソーム内のみに見られるものは約20

イクロRNAを絞り込む。

種，エクソソーム外のみに見られるものは約200種であることが分かった。主成分分析の結果，20

謝辞

カ月齢と25カ月齢の血漿中のエクソソーム内外の本研究の遂行にあたりご協力頂きました京都大サンプルがそれぞれ特徴的なプロファイルを有す

学農学研究科附属牧場の職員の皆様に感謝申し上る こ と ，エ ク ソ ソ ー ム 内 に 存 在 す る マ イ ク ロ

げます。

RNAのプロファイルは月齢間で類似性が高いのに対して，エクソソーム外のそれは大きく異なる
ことが示唆された。個々のマイクロRNAについて検討したところ，エクソソーム内では20カ月齢と比較して25カ月齢において特異的に存在するものや存在量の高いものが多く認められたが，エクソソーム外では20カ月齢および25カ月齢にそれぞ文
献１） Bartel, D. P.:MicroRNAs: genomics, biogenesis,
mechanism, and function. Cell, 116, 281～297, 2004.
２）
 梅村創：マイクロRNA解析の臨床応用．生物試料分析，39，311～320，2016.
３）
 足立裕哉，平野亘，谷口幸雄，横井伯英：肉用牛の肉量および肉質のバイオマーカーとしての血中マ
イクロRNAの可能性，肉用牛研究会報，111，7～
12，2021.

れ特異的に存在するものが認められた。

© The Ito Foundation

115

黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立
Establishment of breeding improvement method for “sweet smell” inJapanese Black beef

中

嶋

宏

明・庄

司

則

章

（山形県農業総合研究センター畜産研究所）

Hiroaki Nakajima and Noriaki Shoji（Livestock Research Institute, Yamagata Integrated Agricultural Research Center）

In order to clarify the precursor of the aroma component that contributes to the “sweet
aroma” that is the characteristic of Wagyu beef, investigated aging changes in grilled beefaroma and metabolites in raw beef, and changes in the amount of grilled beef aroma produced
by adding standard reagent. As a result, since both the grilled beef aroma and the metabolite
have a high correlation before and after aging, it was considered that the taste quality could be
evaluated using the sample before aging. It was also clarified that beef with a large amount ofsugar tends to generate an aroma component having a sweet scent or a roast-like scent, andbeef with a large amount of free fatty acid tends to generate an aroma component having an
unpleasant scent. Furthermore, it was suggested that the genotype of SCD could be a DNA
marker for the “sweet aroma” of beef.

１．目が多い。牛肉の食味には食感，味，香りの３つの的要素があり，最近の研究から香りが最も重要であ

黒毛和種牛肉（以下「和牛肉」とする）は脂肪

ることが明らかになりつつある。いくつかの品種

交雑量の多さが特長であり，これまで重点的に育の牛肉の比較試験においても，和牛肉は輸入牛肉

種改良が進められてきた。そのため，脂肪交雑はと比べて官能評価で明らかに甘い香りが強く，ま飛躍的に向上し，全国の令和３年枝肉格付におけた，交雑種や褐毛和種等の牛肉と比べても有意にる５等級率は10年前の３倍となる54％まで高まっ甘い香りが強い。和牛肉の特長は甘く脂っぽい香ている。BMS No．の現場後代検定成績が9.5を超りである「和牛香」にあるということが食肉関係

える種雄牛が続出していることから，全国の５等者の間では広く知られており，これらの品種比較

級率はさらに高まることが予想される。脂肪交雑をした試験成績からも和牛肉の特長は和牛香であ量の多い和牛肉生産が拡大する一方で，食肉流通

る こ と が 分 か る 。脂 肪 交 雑 量 が 強 く 影 響 す る

関係者には「脂肪交雑は多くなったが和牛独特の「脂っぽさ」は現状の和牛肉では十分であると考香りが弱くなった」，「甘みのある和牛肉が少なくえられることから，我々は「甘い香り」を高めてなった」といったような食味低下を危惧する意見

いくことが和牛肉の食味向上のうえで非常に重要© The Ito Foundation

116

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

であると考える。

肪酸を定量した。内部標準物質（Ｃ13：０）を添

そこで本研究では，和牛肉の「甘い香り」に寄加した牛肉よりメタノールで遊離脂肪酸を抽出

与する香気成分の前駆物質を明らかにするとともし，標準試薬により調製したQCサンプルとともに，市場に上場される枝肉から少量の分析用検体に ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ 質 量 分 析 計（カ ラ ム：を採取することを前提としたデータ蓄積手法を決INNOWAX 30m×0.25μｍ×0.25mmID）により定する。あわせて，想定される前駆物質の含有量

測定し，水溶性代謝物と同様に定量値の標準化をに影響する既知遺伝子の多型が香気生成に与える行った。焼成香気は，20mlバイアルに上記の牛効果を検証し，「甘い香り」のDNAマーカーとな

肉を３ｇ入れ，200℃で５分加熱して生成させた。

り得るか検討する。

これにエタノールを加えて65℃で３時間加温後，２．方

内部標準物質（シクロヘキサノール）と硫酸ナト

法

2 . 1 試験１

リウムを添加して焼成香気を抽出した。－10℃で焼成香気と代謝物に及ぼす熟成

遠心分離して得た上清を，固相抽出（InertSep
C18FF）により中性脂質を除去し，抽出液にヘの効果
和牛肉の「甘い香り」に寄与する香気成分は，

キサン・ジエチルエーテル混液を６倍量添加してと畜後の熟成や加熱調理により前駆物質から生成

糖とアミノ酸を除去後に濃縮した。この濃縮サンされると考えられる。そこで，熟成程度の異なる

プルを，標準試薬により調製したQCサンプルと和牛肉について焼成前の代謝物含量と焼成後の香ともにガスクロマトグラフ質量分析計（カラム：

気含量を調査した。山形県内で肥育された黒毛和InertCap PureWAX 60m×0.25μｍ×0.25mmID）

種38頭（去勢20頭，雌18頭）の枝肉より，と畜後で測定し，同様に定量値の標準化を行った。なお，

３～５日経過したリブロースを採取（熟成期間０

香気分析に用いた標準試薬には，予備試験にて和日）し，真空チルド状態にて14日間熟成後，スラ牛肉の焼成香気サンプルに含まれることが確認でイスして４℃下で１日冷蔵（熟成期間15日）しきた86化合物を用いた。

た。この熟成期間０日ならびに15日の胸最長筋を

2.2

試験２

焼成香気の前駆物質の特定ミンチにして分析まで－80℃で保存した。

試験１の熟成期間０日ならびに熟成期間15日の焼成香気の前駆物質として想定される生牛肉中

代謝物含量と焼成香気生成量をThe Unscramblerの水溶性代謝物（糖類，遊離アミノ酸，ジペプチ

X（CAMO社）によりPLS解析し，「甘い香り」

ドなど）はメタボロミクス前処理ハンドブック１）に寄与すると考えられる香気成分に対する変数重の方法によりサンプル調製を行い，ガスクロマト

要度や牛肉中含有量などを考慮して代謝物を選定

グラフ質量分析計（島津製作所製QP2010plus

し添加試験を行った。選定した代謝物は，添加試

カラム：DB-5 30ｍ×1.00μｍ×0.25mmID）およ験 １ で は Glucose， Glutamine， Carnosine，びSmart Metabolites Databaseにより測定した。

Palmitic acid， Glycerol， Hypoxanthine，

サンプル定量では，標準試薬より調製したQCサCreatine， 添 加 試 験 ２ で は Fructose， Glucose

ンプルを定期的に分析するとともに，LOWESS

6-phosphate， Alanine， Stearic acid， Oleic

平滑化とSplineによりQC定量値を補間し，そのacid， Linoleic acid， Taurine， Lactic acid，

補間値によりサンプルの定量値の標準化を行っ

Malic acid，Ureaの計17物質とした。この標準試

た 。また，脂溶性代謝物として生牛肉の遊離脂薬0.1mmolを熟成期間０日の和牛肉３ｇに均質と２）© The Ito Foundation

117

黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立

なるよう添加し，試験１と同様に焼成香気を定量

い香りを感じる香気成分，不快な香りを感じる香した（５反復）。

気成分について，熟成による焼成香気生成量の変2 . 3 試験３

化をTable１に示した。熟成により増加する香気成

焼成香気と代謝物に及ぼす既知分が多かったが，3,5－dimethyl－Benzaldehyde，

遺伝子の効果試 験 １ の 牛 肉 38 検 体 よ り， DNeasyR

γ－Nonalactone，2-Acetylpyrroleは熟成によりBlood&Tissue Kits（QAGEN社）を用いてDNA

生成量が減少した。またアルデヒド類を除き，熟３）を抽出し，CAPN1（カルパイン），CAST2（カ成前後で高い相関が認められる香気成分が多かっ

ルパスタチン） ，SCD（脂肪酸不飽和酵素） ，た。ラクトン類は甘い香りを感じ７），輸入牛肉にFASN（脂肪酸合成酵素）５），SREBP-1（脂質合比べて和牛肉に多い８）ことから，和牛肉の特長で

６）
成転写因子）
遺伝子の遺伝子型をPCR－RFLP法

ある「甘い香り」にはラクトン類が寄与すると推により判定した。これらの遺伝子型について，熟察されている。一般的に熟成により牛肉の風味が成期間15日の焼成香気生成量と生牛肉の水溶性な増すことから，ラクトン類は熟成で増加すると想らびに脂溶性代謝物含量に対する効果を検討した。

定 し て い た が ， δ－Tetradecalactone や γ－

３）４）Butyrolactoneは増加，γ－Nonalactoneは減少，３．結果と考察
3.1

γ－Crotolactoneは変化しなかったことから，化合物によって熟成の効果は大きく異なることが明試験１らかとなった。

焼成香気サンプルで定量した86化合物のうち，和牛肉において官能評価による「甘い香り」と関熟成による代謝物含量の変化をTable２に示し連性が認められた香気成分（未発表データ），甘た。Glucose 6-phosphateやDipeptide，Inosine，Table 1 Effect of aging on the production of grilled beef aroma（N=38）
Pyrazine
Aging
days

Aldehyde

Lactone3-ethyl2,5dimethyl-NonanalFurfuralPhenylacetaldehyde

3,5dimethylBenz
aldehyde

Hydroxy
methylfurfuralγ-Butyroγ-Crotoγ-Nonaδ-Tetra
deca

122

84

257

20

2582

16

80

1442

13486

45

1870

168

116

264

25

3826

12

94

1673

13410

33

4218

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊

＊＊＊

＊

＊＊＊

0.78

0.64

0.67

0.07

－0.15

－0.00

0.52

0.95

0.90

0.55

0.94

ethylLactate

2,5-Hexane
dione

2,3-Butane
diol

2,5dimethyl-

2,3,5trimethyl-

0

105

15

170

R


（ng/gWW）

0.03

Acid

Other

Aging
days

Butyric

Pentanoic

Hexanoic

Heptanoic

Octanoic

Decanoic

Furaneol

Maltol2-Acetylpyrrole

0

3392

165

490

59

195

455

343

28

143

2388

362

16396

15

4023

183

912

64

223

451

348

30

118

3057

472

18881

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊

＊＊＊

0.87

0.94

0.70

0.26

0.87

0.86

0.78

－0.82

0.98

R

0.59

0.83

＊＊＊：p<0.001，＊＊：p<0.01，＊：p<0.05

R：coefficient of correlation between Aging days 0 and 15.

© The Ito Foundation

0.17

118

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 2 Effect of aging on beef metabolite content（N=38）

Aging
days
0
15
R

Aging
days
0
15
R

Aging
days
0
15
R

Aging
days


（mg/gWW）

Suger

Free Amino acid

GlucoseGlucose 6phosphate

Fructose

MannoseRiboseGlutamine

AlanineLeucineLysineSerineValine

2.43

2.55

0.58

0.51

0.24

1.12

0.83

0.15

0.16

0.11

0.11

3.60

1.40

0.94

0.93

0.70

1.21

1.07

0.46

0.31

0.27

0.26

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

0.88

0.96

0.93

0.92

0.67

0.82

0.82

0.43

0.57

0.63

0.61

Free Amino acidPhenylalanine

GlycineTyrosine

Isoleucine

Methionine

Threonine

Asparagine

ProlineOrnithine

Histidineβalanine

0.09

0.15

0.08

0.08

0.05

0.08

0.11

0.07

0.08

0.03

0.02

0.12

0.25

0.23

0.22

0.20

0.17

0.17

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

0.62

0.76

0.60

0.71

0.59

0.55

Dipeptide－0.10

Nucleic acid-related substance

0.11

0.10

0.07

0.02

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

0.61

0.94

0.43

0.97

Free Fatty acid

Carnosine

Anserine

Hypoxanthine

Inosine

IMP

C18：1

C16：0

C18：0

C18：2

C16：1

4.29

1.15

0.45

0.70

0.37

0.54

0.19

0.18

0.12

0.03
0.03

3.81

1.03

1.02

0.47

0.06

0.65

0.25

0.19

0.15

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

＊

＊＊＊

0.90

0.89

0.70

0.45

0.46

0.93

0.94

0.83

0.75

Other
Lacticacid

Creatine

Glycerol

Urea

InositolTaurine

Malic
acid

Carnitine

Citric
acid

0

17.26

11.74

1.57

0.61

0.35

0.32

0.15

0.15

0.02

15

16.06

11.09

0.31

＊＊＊

R

0.46

0.73

0.18

1.86

0.59

0.43

＊＊＊

＊＊

＊＊＊

0.69

0.97

0.93

0.78

0.24

0.23

0.08

＊＊＊

＊＊＊

＊＊＊

0.81

0.10

0.50

＊＊＊：p<0.001，＊＊：p<0.01，＊：p<0.05

R：coefficient of correlation between Aging days 0 and 15.

Inosine－monophosphate（IMP）などは熟成によの分析用検体を採取してデータ蓄積することが可り減少したが，多くの糖，遊離アミノ酸，遊離脂能であると考えられた。

肪酸は熟成により増加した。これらの代謝物の変3.2

化はこれまでの報告と一致していた。また，焼成前の生牛肉中の粗脂肪割合（Fat），Table

熟成前後で高い相関が認められる代謝物が多かっ

２の糖，遊離アミノ酸，ジペプチド，核酸関連物

た。以上より，熟成後の焼成香気生成量や想定前質，遊離脂肪酸のグループごとの合計値（Suger，

駆物質である代謝物含量は熟成前の牛肉より評価

FAA，DP，Nuc，FFA）の６成分を説明変数，

できることから，市場に上場される枝肉から少量

これまでの研究（未発表データ）から和牛肉と輸９～11）© The Ito Foundation

試験２

119

黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立
Table 3 Contribution rate and variable importance in PLS analysis
Numberoffactors

Cumulative
contribution rate

Variable importance

Calibration

Validation

Fat

Suger

FAA

DP

Nuc

FFA

2,5-dimethyl-Pyrazine

3

84.3

82.9

0.10

0.73

0.46

－0.13

0.03

－0.03

2,3,5-trimethyl-Pyrazine

3

74.1

71.6

0.10

0.81

0.29

－0.22

－0.00

－0.08

Furaneol

3

74.9

70.7

0.10

0.87

－0.02

－0.08

－0.07

－0.27

Phenylacetaldehyde

2

47.5

42.2

－0.00

0.30

0.40

0.03

0.10

0.22

ethyl-Lactate

3

63.7

59.7

0.31

0.82

0.19

－0.16

0.04

0.20

2-Acetylpyrrole

3

70.6

66.8

－0.04

0.67

－0.24

0.10

－0.01

－0.27

γ-Butyrolactone

3

38.6

28.8

－0.16

－0.35

0.60

－0.25

－0.12

－0.16

γ-Crotolactone

1

48.9

41.5

0.22

－0.20

－0.02

－0.19

－0.21

0.03

δ-Tetradecalactone

4

71.1

65.6

0.56

0.60

0.18

0.00

－0.08

0.50

Butyric acid

1

19.6

14.5

0.16

－0.07

0.08

－0.17

－0.10

0.06

Pentanoic acid

1

16.5

12.0

0.13

－0.06

0.05

－0.17

－0.13

－0.01

Hexanoic acid

2

41.5

35.7

0.19

0.00

0.38

－0.18

－0.01

0.26

Heptanoic acid

1

26.5

23.4

0.17

－0.13

0.03

－0.16

－0.13

0.08

Octanoic acid

2

53.2

49.7

0.19

－0.15

0.21

0.00

0.02

0.52

Decanoic acid

2

31.2

20.5

0.15

－0.16

0.12

0.18

－0.15

0.37

2,3-Butanediol

2

30.2

19.7

0.01

0.35

0.16

－0.06

0.04

－0.32

Furfural

1

28.1

25.0

－0.15

0.18

0.10

0.10

0.15

－0.03

Suger：Total of Glucose，Glucose 6-phosphate，Fructose，Mannose，Ribose
FAA：Total of Glutamine ， Alanine ， Leucine ， Lysine ， Serine ， Valine ， Phenylalanine ， Glycine ， Tyrosine ， Isoleucine ，Methionine，Threonine，Asparagine，Proline，Ornithine，Histidine，βalanine
DP：Total of Carnosine，Anserine
Nuc：Total of Hypoxanthine，Inosine，IMP
FFA：Total of Oleic acid，Palmitic acid，Stearic acid，Linoleic acid，Palmitoleic acid

入牛肉との間で有意な差が認められる焼成香気成Hexanoic acid， Octanoic acid， Decanoic acid で分を目的変数としたPLS解析の結果をTable３には正，Furaneol，2－Acetylpyrroleでは負の方向示した。ローストやナッツ様の香りを感じる2,5－に変数重要度が大きかった。

dimethyl－Pyrazine，2,3,5－trimethyl－Pyrazine，

Table２ならびにTable３の結果を考慮して選択

甘 い 香 り を 感 じ る Furaneol ，ethyl － Lactate ，

した標準試薬を，未熟成の和牛肉に添加して得ら

2-Acetylpyrrole，バター様の香りを感じるδ－れた焼成香気の生成量をTable４に示した。未熟Tetradecalactoneは累積寄与率が高く，６成分の成 和 牛 肉 の み （Control1， 2） に 比 べ ， 糖

説明変数により焼成香気中含量をある程度説明で（Glucose ，Fructose ，Glucose 6 － phosphate）のきると考えられた。また，これらの香気成分では

添 加 に よ り Phenylacetaldehyde ， Furaneol ，糖の変数重要度が大きかった。遊離アミノ酸は2,5Maltol，2-Acetylpyrroleなどの甘い香気成分が－dimethyl－Pyrazine，2,3,5－trimethyl－Pyrazine，増加した。アミノ酸（Glutamine，Alanine）のPhenylacetaldehyde，γ－Butyrolactone，Hexanoic

添 加 で は 甘 い 香 り を 感 じ る γ － Nonalactone ，acid で，遊 離 脂 肪 酸 は δ － Tetradecalactone，

2 - A c e t y l p y r r o l e ， E t h y l －L a c t a t e ， 2 , 5 －© The Ito Foundation

© The Ito Foundation

Control 1
GlucoseGlutamine
Carnosine
Palmitic acid
GlycerolHypoxanthine
Creatine
Control 2
Fructose
Glucose 6-phosphate
AlanineStearic acid
Oleic acid
Linoleic acid
TaurineLactic acid
Malic acid
Urea

standard
substance

c
c
d
a
d
b
d
d
C
A
BC
B
CD
E
E
E
DE
EF
F

3431
2893
2680
2509
2554
2866
2653
2674
3715
3230
3751
3553
4327
3959
4246
3521
3394
4822
3514

a
b
b
b
b
b
b
b
DEF
F
CDE
DEF
AB
BCD
BC
DEF
EF
A
DEF

Butyric

91
93
64
187
64
150
60
61
63
133
71
82
60
44
43
46
47
36
27

2,5-dimethyl-

b
c
cd
b
d
a
c
cd
AB
CD
CD
A
A
CD
CD
CD
BC
DE
E

134
135
147
121
137
137
129
132
178
176
188
181
221
207
237
180
178
213
179

ab
ab
a
b
ab
ab
b
ab
C
C
C
C
AB
B
A
C
C
B
C

Pentanoic

68
44
39
65
22
129
42
38
47
26
25
51
60
31
27
28
37
20
9

2,3,5-trimethyl-

Pyrazine

a
cd
d
BC
BC
B
A
B
BC
BC
B
B
BC
C

c
cd
cd
b

576
564
597
507
528
612
543
545
676
685
671
729
744
768
1058
701
691
676
700

Acid
abc
bcd
ab
e
de
a
cde
cde
EF
DEF
EF
BCD
BC
B
A
CDE
DE
EF
CDE

Hexanoic

48
34
33
105
ND
151
29
34
38
28
48
157
46
23
21
45
46
25
10

3-ethyl2,5-dimethyl-

There is a significant difference between different codes.

2

1

test

Control 1
GlucoseGlutamine
Carnosine
Palmitic acid
GlycerolHypoxanthine
Creatine
Control 2
Fructose
Glucose 6-phosphate
AlanineStearic acid
Oleic acid
Linoleic acid
TaurineLactic acid
Malic acid
Urea

standard
substance

bc
ab
bc
D
A
ABC
AB
CD
CD
AB
BCD
AB
CD
ABC

ab
ab
a

41
40
45
38
71
43
40
40
54
58
57
58
81
233
168
56
56
58
58

cd
cd
b
d
a
bc
cd
cd
D
D
D
D
C
A
B
D
D
D
D

Heptanoic

157
164
267
ND
ND
161
191
188
80
433
273
340
98
107
328
210
363
143
274

Nonanal
e
a
bc
de
b
cd
d
de
B
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B

150
155
160
145
335
159
140
135
202
200
207
225
267
532
1217
204
219
227
218

bcd
bc
b
bcd
a
b
cd
d
D
D
D
CD
C
B
A
D
CD
CD
CD

Octanoic

18
71
43
24
48
34
29
24
22
1568
60
22
28
29
25
31
27
49
32

Furfural

Aldehyde

c
a
c
c
bc
b
bc
c
CD
A
B
E
BCD
CD
BCD
D
BC
A
E

153
118
150
107
1518
114
146
153
104
341
261
140
465
407
452
276
137
202
162

b
b
b
b
a
b
b
b
E
BC
CD
E
A
AB
AB
CD
E
DE
DE

Decanoic

1043
1648
1062
955
1168
1379
1198
984
1477
2498
1886
712
1588
1410
1547
1285
1687
2259
899

Phenylacet
aldehyde

357
1295
194
96
158
299
230
281
252
1055
1268
187
219
147
225
149
102
99
26

b
a
cde
e
de
bc
bcd
bcd
C
B
A
CDE
CD
CD
CD
DE
EF
EF
F

Furaneol

ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
2 B
ND
ND
ND
ND
22 A
3 B
ND
ND
ND
ND

3,5-dimethylBenzaldehyde

23
87
25
ND
ND
24
24
21
31
1038
109
22
33
29
37
29
24
41
ND

b
b
b
B
A
B
B
B
B
B
B
B
B

b
a
b

MaltolHydroxy
methylfurfural
96 b
58 b
95 b
102 b
1131 a
117 b
47 b
142 b
33 C
667 AB399 BC
169 C
807 A
136 C
235 C
368 BC
115 C
304 BC
91 C
bc
b
a
c
a
b
a
a
G
B
A
EF
EF
FG
DE
C
C
A
CD

10846
9902
7723
9690
10249
9840
8653
9886
12490
10555
12225
12026
15050
13970
14511
11152
12471
16141
13305

a
ab
c
ab
ab
ab
bc
ab
CDEF
F
DEF
DEF
AB
BCD
ABC
F
CDEF
A
BCDE

γ-CrotoOther
2-Acetyl
Ethylpyrrole
Lactate96 c1913 d168 a2495 c150 b2766 abc
12 d1854 d88 c2823 ab84 c1916 d86 c2564 bc
81 c2895 a101 CDE1814 J
170 C
3080 D
1704 A
4222 C
268 B
2071 GHI
109 CDE
2291 EFG
110 CDE
1962 HIJ
110 CDE
2202 FGH
60 E
2500 E
104 CDE5587 A
140 CD5176 B
89 DE
2446 EF

1630
1725
2392
1433
2322
1870
2219
2394
1489
2567
2921
1784
1835
1634
1868
2197
2194
2986
2064

γ-Butyro
b
b
a
b
a
b
b
b
F
AB
A
DE
DE
DE
E
BC
DE
AB
CD

2,5-Hexane
dione
303 c
348 c
834 a
304 c
671 b
340 c
692 b
694 b
114 F
154 C
146 CD
249 A
126 EF124 EF
236 AB
142 CD
222 B
149 CD136 DE

37
37
62
35
64
33
40
29
20
93
83
54
56
50
45
76
57
81
65

γ-NonaLactone

bc
b
a
bc
c
bc
a
bc
B
B
A
B
B
B
B
B
B
AB
B

2,3-Butane
diol14020 a11954 cd13226 ab12394 bc
10714 e12715 bc
11839 cd11326 de9897 BC
10459 AB9967 BC
9904 BC
10127 BC
10242 ABC
11011 A
9582 CD
10221 BC
10335 ABC
9074 D

17
25
63
23
34
19
45
16
13
84
25
13
20
25
26
13
31
52
9

δ-Deca（ng/gWW）

令和３年度

2

1

test

Table 4 Effect of standard substances on the production of grilled beef aroma（N=5）

120
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

121

黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立

Hexanedione な ど が 増 加 し た 。ま た ，脂 肪 酸な差が認められた。試験２においてGlycerolや（Palmitoleic acid， Stearic acid， Oleic acid，

Alanineの添加によりロースト様や甘い香りを感

Linoleic acid） の 添 加 で は ヤ ギ 臭 を 感 じ る

じる焼成香気の生成が促進されることや，モノ不Heptanoic acidや腐敗臭を感じるOctanoic acid，

飽和脂肪酸割合は「甘い香り」と正の相関が認め

γ－Nonalactoneが増加し，ローストやナッツ様のられるとする報告12）などから，牛肉のモノ不飽和

香 り を 感 じ る 2,5 － dimethyl － Pyrazine， 2,3,5－脂肪酸割合に影響するSCD遺伝子型が和牛肉のtrimethyl－Pyrazineが減少した。また，ジペプチ

甘い香りのDNAマーカーとなり得る可能性があド の Carnosine 添 加 に よ り Furaneol ，Maltol ，る。今後，さらに検体数を増やして明らかにする

2-Acetylpyrroleが減少した。試験１ならびに２予定である。

より，焼成調理において糖含量の多い和牛肉では

４．要

甘い香りやロースト様の香りを感じやすく，遊離脂肪酸の多い和牛肉では不快な香りを感じやすい
可能性が示唆された。
3.3

約

和牛肉の特長である「甘い香り」に寄与する香気成分の前駆物質を明らかにするため，焼成香気

試験３および生牛肉中の代謝物の熟成変化と，標準品添

遺伝子型間で有意な差が認められた焼成香気と加による焼成香気の生成量の変化を調査した。そ代謝物をTable５に示した。CAPN1のCC，TT間の結果，焼成香気と代謝物はともに熟成前後の相では3,5－dimethyl－Benzaldehyde，SCDのAA，関が高いことから，熟成前の検体を用いて食味性

GG間ではGlycerol，Alanine，Malic acidに有意を評価できると考えられた。また，糖の多い和牛

Table 5 Effect of genotype on the production of grilled beef aroma and metabolite content

Gene
CAPN1

CAST2

SCD

FASN

SREBP1

NonanalFurfuralPhenylacet
aldehyde

14

275

22 B

3654

13

17

253

27 A

4049

Genotype

NumberCCCT

3,5-dimethylBenzaldehyde（ng/gWW）

Furaneol

GlycerolGlucose6-phosphate

Alanine

Malic
acid

A

310

1.86

1.19

1.08

0.25

12 AB

372

1.88

1.57

1.08

0.22

TT

7

271

25 AB

3627

9

362

1.81

1.42

1.03

0.23

AA

23

258

25

3712

11

B

352

1.85

1.42

1.06

0.21

AG

14

273

24

3998

12

346

1.87

1.42

1.10

0.26

GG

1

300

27

4026

13

280

1.93

0.88

1.03

0.33

AA

14

267

23 AB

3448 AB12303 B

1.89 A

1.13 B

1.13 A

0.30 A

AG

19

259

27 A

4262 A

12

392 A

1.89 A

1.64 A

1.07 AB

0.22 AB

GG

5

277

20 B

3223 B

12305 AB

1.67 B

1.26 AB0.91 B

0.13 B

AA

25

263

24

3769

11

343

1.86

1.30

1.10

0.26

GA

12

270

27

4061

13

369

1.87

1.66

1.02

0.21

GG

1

232

16

2423

ND

214

1.64

0.78

0.93

0.07

LL

17

283 A

24

3438 B

12

325

1.86

1.35

1.06

0.24

SL

18

247 B

26

4249 A

12

383

1.86

1.51

1.10

0.24

SS

3

267 AB

21

3482 AB

11

263

1.85

1.07

0.95

0.23

There is a significant difference between different codes.

© The Ito Foundation

122

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

肉では甘い香りやロースト様の香りを感じる香気成分が生成されやすく，遊離脂肪酸の多い和牛肉では不快な香りを感じる香気成分が生成されやすいことが明らかとなった。さらに，SCDの遺伝子型が和牛肉の「甘い香り」のDNAマーカーとなり得る可能性も示唆された。
文献１） 島 津 製 作 所：https：//www.an.shimadzu.co.jp/
si t e s/an.shi m a d zu . co. jp /files/ck ed itor/ap l/lifescience/metabolomics/c146-2181a.pdf
２） ESI友の会編：メタボロームデータの標準化方法,
https：//sites.google.com/site/esitomonokai/jie-xibu-wu/metaboromudetano-biao-zhun-hua-fangfa/2-lowesstosplineno-li-lun３） Calvo, J. H., et al.：A new single nucleotide
polymorphism in the calpastatin（CAST）gene
associated with beef tenderness, Meat Science, 96,775～782, 2014.
４） Taniguchi, M., et al.：Genotype of stearoyl-coA
desaturase is associated with fatty acid compositionin Japanese Black cattle, Mamm Genome,14, 142～
148, 2004.

５）
 Abe, T., et al.：Novel mutations of FASN geneeffect fatty acid composition in Japanese Black
beef, Biochem Genet, 47, 397～411, 2009.
６）
 Hoashi, S., et al.：Genotype of bovine sterol
regulatory element binding protein-1（SREBP-1）
is associated with fatty acid composition in
Japanese Black cattle, Mamm Genome, 18, 880～
886, 2007.
７） 沖谷明紘：牛肉熟成香とその生成機構，Japanese
Journal of Dairy Food Science, 44（2）,53～62, 1995．
８） 松石昌典ら：和牛肉と輸入牛肉の香気成分，日本
畜産学会報，75（3），409～415，2004．
９） 中村好徳ら：周年放牧肥育牛肉の特徴ならびに熟成による肉質の変化，日本暖地畜産学会報，58（2），209～215，2015．
10）
 小松智彦ら：黒毛和種牛肉の熟成過程におけるグ
リコーゲンおよび単糖類含量の変化，日本畜産学会
報，91（2），119～125，2020．
11）
 山之上稔ら：牛肉のおいしさに影響する筋内遊離
脂肪酸についての研究，食肉に関する助成研究調査
成果報告書，30，68～75，2011．
12） 佐久間弘典ら：黒毛和種肥育牛の胸最長筋における官能特性に及ぼす粗脂肪含量と脂肪酸組成の影響に つ い て ，日 本 畜 産 学 会 報 ，83（3），219～299 ，
2012．

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123

黒毛和種における経腟採卵前のヒアルロン酸添加
ブタFSH製剤１回筋肉内注射の効果に関する研究（Ⅱ）
Effect of single shot intramuscular injection of porcine FSH mixed withhyaluron acid prior to ovum pick-up in Japanese Black cattle（Ⅱ）

及

川

俊

徳１・沼

邊

孝２

（１宮城県畜産試験場，２みやぎ農業振興公社）

Toshinori Oikawa1 and Takashi Numabe2（１Miyagi Prefectural Livestock Experiment Station, ２Miyagi Agricultural Development Corporation）

The objective of this study was to compare the efficacy of superstimulation treatment
with porcine FSH（pFSH）plus hyaluronic acid（HA）before 72 hours in the ovum pick-up（OPU）on in vitro production（IVP）in Japanese black cattle. IVP after OPU was compared in
untreated Japanese black cattle oocyte donors and those superstimulated with a single
intramuscular（IM）injection of pFSH in HA, and pFSH only. The control group received notreatment, whereas the FSH group received 8AU of pFSH. The FSH＋HA group received 8AU
pFSH in 4ml of saline plus 4ml of a HA solution by a single IM injection. In Experiment 1, 6
animals were prepared for each test group and the study was performed. The pFSH-treatedgroups had a higher percentage of medium-sized follicles（6-10 mm）at the time of the OPU
than control group. The FSH＋HA group had significantly lower cleavage rate than the FSH
group. But blastocyst rate was no significant difference. In the field demonstration experimentof Experiment Ⅱ, we demonstrated the efficacy of superstimulation treatment with pFSH plus
HA before 48 and 72 hours in the ovum pick-up（OPU）. In A and B rank oocyte rates, 72
hours was significantly higher than that of 48 hours. But embryonic developmental result wasno significant difference. In conclusion, administration of pFSH combined with hyaluronic acidbefore OPU is collected high quality oocytes in OPU, but not improved the embryonicdevelopment results after in vitro fertilization．

１．目される子牛が減少し子牛価格の高騰が続いてお的り，牛肉需要はやや回復し枝肉価格は上昇傾向に牛の体外受精技術は食肉処理場由来卵巣を利用あるものの，肥育素牛価格の高騰が肥育農家の経することで急速に発展してきたが，近年，牛生体営を大きく圧迫している。OPUはホルモン製剤

から超音波診断装置でモニターしながら卵子を採を投与しなくても繰り返し実施することが可能で取する経腟採卵（OPU）-体外胚生産（IVP）技術あり，妊娠牛やホルモン剤に対する反応が低い牛が畜産現場でも実施される機会が増えている。肉にも応用できることから過剰排卵処理に代わる技

用牛では，繁殖雌牛の飼養頭数の減少に伴い生産術として期待されている。

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124

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

OPUはホルモン製剤を投与せずに実施可能で（AU）を生理食塩水４mlで溶解し筋肉内に投与あるが，OPU前に外因性の豚卵胞刺激ホルモン

するFSH区を設定し，pFSH製剤８AUを生理食（pFSH）製剤を投与すると卵胞が大きくなり作

塩水４mlで溶解し，ヒアルロン酸製剤（ハイオ

業がスムーズに行えること ，良好な胚発生成績

ネート：ベーリンガーインゲルハイムアニマルヘが得られることがメリットとしてある。pFSH

ルスジャパン株式会社）４mlを加え筋肉内に投製剤の投与は過剰排卵処理で用いられている投与

与するFSH＋HA区を設定した。対照区としては量で連続してOPUを実施した場合には牛生体へ

pFSH製剤未投与区を設定した。この３区を宮城の影響が考えられるが，我々の先行研究において

県畜産試験場で飼養する黒毛和種繁殖雌牛６頭を比較的低容量で連続して実施可能であることを明用いて実施した。OPU実施前に卵胞数をサイズらかにした。しかし，良質卵子の採取や採取卵子別に計測した。採取した未成熟卵子は卵丘細胞の数の増加等の成績を得ることはできなかった３）。

付着の程度で分類した（Ａランク：卵丘細胞が４Biancucciらは５％ヒアルロン酸溶液を溶媒に層以上付着，Ｂランク：卵丘細胞が２～３層付用いることで過剰排卵処置におけるゴナドトロピ

着，Ｃランク：卵丘細胞が１層付着，Ｄランク：

ン投与量・頻度が少なくてすむこと，受精卵数や卵丘細胞が部分的に付着，変性（degenerated）：

譲渡・凍結可能胚が増加することを報告してい卵細胞質が不均一で変性，裸化（denuded）：卵る 。昨年度は徐放性があることで知られている

丘 細 胞 が ま っ た く 付 着 し て い な い ，膨 化 卵 子

ヒアルロン酸製剤

をpFSHと混合し，OPU前48（expanded）：卵丘細胞が膨化）。採取卵子のうち，時間で筋肉内投与することが卵巣反応および採取

Ａ～Ｄランクの卵子を体外受精に供した。未成熟

卵子の体外受精後の胚発生成績に及ぼす影響を検

卵子の体外成熟培地は牛胎子血清（FBS），上皮

討することを目的とし試験を実施した。その結成 長 因 子（Epidermal Growth Factor ： EGF），

果，ヒアルロン酸添加・未添加に関わらずpFSH

卵胞刺激ホルモン（FSH），ピルビン酸ナトリウ

製剤の効果により中卵胞率が高くなること，対照

ムおよびゲンタマイシンを加えたMedium199を区と比較してヒアルロン酸添加により胚発生成績

使用し，38.5℃，５％CO2，95％airで約22時間成が高くなる成績が得られたが，pFSH単独とは同熟培養を実施した。体外受精は当場繋養の黒毛和等の成績であった。

種種雄牛１頭の凍結精液を使用し，媒精はカフェ

１）

２）

４）

５）

今年度は，ヒアルロン酸添加pFSHの投与からインおよびヘパリン添加mTALP液を使用し，OPUまでの時間を昨年度の48時間から72時間に38.5℃，５％CO2，95％airで約６時間培養した。

延長することがOPU成績および胚発生成績に及発 生 培 地 は BSA 添 加 mSOF 培 地 を 使 用 し ，ぼす影響について検討した。

38.5℃，５％CO2 ，5％Ｏ 2 ，90％N2 で体外受精後

２．方８日目まで培養を継続した。調査項目はOPU実法

施前の卵胞数，採取卵子数および胚発生成績とし

2 . 1 実 験 Ⅰ ： OPU 前 の ヒ ア ル ロ ン 酸 添 加

た。

pFSH製剤投与による採取卵子成績および2.2

体外受精成績の検討

みやぎ農業振興公社白石牧場で飼養する黒毛和実験Ⅱ：現場での実証試験

ホルモン製剤の投与はOPU実施72時間前とし，種繁殖牛をランダムに選定し，OPU実施48時間

試 験 区 と し て pFSH 製 剤 ８ ア ー マ ー ユ ニ ッ ト

前および72時間前にpFSH製剤８AUを生理食塩© The Ito Foundation

黒毛和種における経腟採卵前のヒアルロン酸添加ブタFSH製剤１回筋肉内注射の効果に関する研究（Ⅱ）

125

水４mlで溶解し，ハイオネート４mlを加え筋肉

ルロン酸製剤を添加したことで，pFSH製剤のみ内に投与しOPUを実施した。採取した未成熟卵での投与よりもより良質な卵子を採取できる可能

子は当場に輸送し体外受精を実施し胚発生成績を性が考えられた。

検討した。採取した未成熟卵子の輸送について

体外受精による胚発生成績をFig.２に示した。

は，昨年度検討した輸送ボックスを用いた。すな

卵割率においてFSH＋AH区はFSH区よりも有意

わち，採取した未成熟卵子は実験Ⅰと同様の体外に低い成績であった。胚盤胞率は有意な差は認め

成熟培地とともにポリスチレン製チューブに入られなかったものの，FSH区（26.9％）が高く

れ，アネロパックCO ２ でガス制御を行い，iP-

FSH＋HA区（15.0％）で最も低い成績であった。

TEC定温輸送ボックスで保温しながら輸送した。

昨年度は胚盤胞率においてFSH＋HA区は30.7％

輸送後の成熟培養，体外受精および発生培養は実であり，対照区の18.2％と比較して有意に高い成験Ⅰと同様の方法で実施し，OPU実施前の卵胞績であった。これはヒアルロン酸の徐放性効果に

数，採取卵子数および胚発生成績を調査した。

よりpFSHの影響が残ったことが胚発生成績に影2.3

響を及ぼしたと考えられたが，投与後の生体内の統計処理

パーセンテージのデータはχ二乗検定にて実施

pFSH測定を実施していないことから今後の課題した。統計的な有意差判定に用いたｐ値は５％未である。加えて良質な卵子が採取できることと胚満を有意差ありとした。

発生成績がリンクしない成績となったことから，
今後さらなる検討が必要である。

３．結果と考察
3.1

3.2

実験Ⅱ

白石牧場においてOPU実施48時間前および72

実験Ⅰ

OPU実施前の卵胞のサイズ別割合をFig. 1（A）

時間前でのFSH＋HAについて比較検討した。

に示した。中卵胞率は，FSH＋HA区およびFSH

OPU実施前の卵胞のサイズ別割合をFig. 3（A）に区が対照区と比較して有意に高い成績であった。

示したが有意な差は認められなかった。採取卵子

小卵胞率は，対照区が他の２区と比較して有意にのランク別割合をFig. 3（B）に示した。Ｄランク高い成績であった。我々の先行研究においても卵子率において48ｈ区は72ｈ区よりも有意に高い

pFSH 8AUを投与した場合に未投与の場合と比較成績であった。Ａ＋Ｂ卵子ランク率において72ｈ

して中卵胞率が高く，小卵胞率は未投与の場合が区は48ｈ区よりも有意に高い成績であった。これ高い成績であったが１），昨年度の成績同様に本研は72ｈ区では良質な卵子が採取可能であることを究においても同様の成績であり，pFSH製剤を投示唆している。Fig.４に胚発生成績を示したが有与することで中卵胞の割合が高くなることが明ら意な差は認められなかった。このことは実験Ⅰとかになった。採取卵子のランク別割合をFig. 1（B）

同様で良質卵子採取が胚発生成績の向上につながに示した。Ａランク卵子率においてFSH＋HA区

らなかった。

は対照区よりも有意に高い成績であった。Ｄラン

以上のことから，本研究課題の２年間の検討のク卵子率においてFSH＋HA区およびFSH区は対結 果 ，OPU 前 の ホ ル モ ン 製 剤 投 与 に つ い て ，

照区よりも有意に低い成績であった。以上の結果

OPU前48時間でヒアルロン酸を添加することでよりpFSHを投与することで良質な卵子の採取が良質卵子採取の可能性および体外受精後の高い胚可能であり，有意な差は認められなかったがヒア盤胞率が期待される。OPU前72時間ではヒアル© The Ito Foundation

126

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

(A)

Large

Follicle size proportion %

100

8.3
a

Medium

Small

9.6

10.5
b

31.5

32.7

a

14.9

a

60.2

a

57.7

74.6

FSH+HA

FSH

Control

80
60
40
20
0

b

(B)
(%)
40

FSH+HA

FSH

Control

b
30
20

a

b

10
0

aa

ab

A-rankB-rankC-rankD-rankDegenerated Denuded

ExpandedA-B rank

Category of oocyte

Fig. 1 Proportion of follicle size and oocyte category results by administration of pFSH combined with hyaluronic acid.

（A）Proportion of small（<6 mm）, medium（6-10 mm）, and large（>10 mm）follicles suitable for puncture
immediately before ovum pick-up （OPU） in Japanese black cattle submitted to OPU without previous
superstimulation treatment（control）, after treatment with pFSH（FSH）, or pFSH in hyaluronic acid（FSH+HA）.
（B）Recovered oocytes were classified into four morphological categories based on the number and density of
cumulus cell layers and the color and structure of the ooplasm.. a–b: Columns with different superscripts are
statistically significant（p<0.05）.

(%)

FSH+HAb

FSHControl

ab

70
a
50

30

10

Cleavage

Blastocysts

Fig. 2 Proportion of embryo development on in vitro fertilization after ovum pick-up in Japanese black cattle. a-b：

Columns with different superscripts are statistically significant（p<0.05）.

© The Ito Foundation

黒毛和種における経腟採卵前のヒアルロン酸添加ブタFSH製剤１回筋肉内注射の効果に関する研究（Ⅱ）

(A)

Small

Follicle population (%)

100

7.0

Large

7.8

21.3

80

Medium

127

29.5

60
40

71.7

62.7

20
0

HA48h

HA72h

(B)
(%)
40

HA48h

HA72h

a

b

30
b

20

a

10
0

A-rankB-rankC-rankD-rankDegenerated Denuded

ExpandedA-B rank

Proportion of follicle size and oocyte category results by administration of pFSH combined with hyaluronic
acid.（A）Proportion of small（<6 mm）, medium（6-10 mm）, and large（>10 mm）follicles suitable forpuncture immediately before ovum pick-up（OPU）in Japanese black cattle submitted to OPU without
previous superstimulation treatment（control）, after treatment with pFSH（FSH）, or pFSH in hyaluronic acid
（FSH+HA）.（B）Recovered oocytes were classified into four morphological categories based on the number
and density of cumulus cell layers and the color and structure of the ooplasm.. a–b：Columns with different
superscripts are statistically significant（p<0.05）.

Fig. 3

(%)

HA48h

HA72h

70

ロン酸添加で卵割率が低い成績であったが，これはヒアルロン酸の徐放効果によりpFSHの作用時間が長くなったことが影響したと推察された。今後は牛生体内でのホルモン動態を調査し，ヒアル50

ロン酸添加pFSHが生体に及ぼす影響について解
明したい。
４．要

30

約

本研究は，経腟採卵（OPU）技術の効率化を
10

Cleavage

Blastocyst

Fig. 4 Proportion of embryo development on in vitro

fertilization after ovum pick-up in Japanese black
cattle.

目的とし，OPU実施前72時間でヒアルロン酸製剤とブタ卵胞刺激ホルモン（pFSH）製剤を混合し筋肉内投与することが卵巣反応および採取卵子の体外受精成績に及ぼす影響を検討した。実験Ⅰ© The Ito Foundation

128

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

で は OPU 前 の pFSH 製 剤 投 与 量 は ８ AU と し ，の結果から，OPU前72時間投与ではヒアルロン

pFSH 製 剤 の み 投 与 の FSH 区 と 試 験 区 と し て酸添加で良質卵子の採取が可能であるが体外受精

pFSH製剤にヒアルロン酸製剤４mlを添加した

成績は低い成績であった。

FSH＋HA区，対照区としてpFSH製剤未投与区を設定した。OPU前の中卵胞率は，FSH＋HA区
およびFSH区が対照区と比較して有意に高い成績であった。また，体外受精後の胚盤胞率に有意な差は認められなかったが，FSH＋HA区で最も低い成績であった。実験Ⅱの実証実験において，
FSH＋HA区においてOPU前48時間と72時間投与について検討した。72時間区で良質卵子が採取可能であったが胚発生成績には差がなかった。以上

文
献１）
 Seneda, M. M., et al.：Animal Reproduction
Science., 67, 37～43, 2001.
２）
 Vieira, L. M., et al.：Theriogenology, 82, 318～324,2014.
３）
 及川俊徳，板橋知子，沼邊孝：東北畜産学会報，
66（3），57～64，2017.
４）
 Biancucci, A., et al.：Theriogenology, 85, 914～
921, 2016.
５） Jin, Yu-Jin, et al.：Jounal of Pharmaceutical
Investigation, Vol.40, Special issue, 33～43, 2010.

© The Ito Foundation

129

ウシ二次卵胞の発育制御におけるTNFα受容体の役割
Roles of TNFα receptors in development of bovine secondary follicles

平

山

博

樹

（東京農業大学生物産業学部）

Hiroki Hirayama（Faculty of bioindustry, Tokyo University of Agriculture）

To improve reproductive performance and embryo production efficiency in cattle, it isimportant to elucidate the mechanism of follicle development. The growth of secondary follicles
into antral follicles may be inhibited by the influence of physiological condition such as aging,disease, and nutrition state. In this study, we examined the effect of TNF α on the in vitro
growth of secondary follicles using a culture system in which only low concentrations of insulin
were added. The development of secondary follicles was maintained for 12 days in this study,
and the number of antral follicles did not affect the in vitro growth and survivability of
secondary follicles. TNF α, a cytokine that induces both cell death and cell proliferation,
significantly promoted secondary follicle growth up to day 4 of culture. However, TNF α
significantly inhibited secondary follicle growth after day 10 and significantly increased follicle
regression after day 6. The factors responsible for the time-dependent effect of TNF α on
secondary follicle growth were examined using TNFR1 antagonist and anti-TNFR2 antibody,but the relationship between receptor type and the action of TNF α was not clear. In addition,
TNF α showed a tendency to decrease the expression ratio of proapoptotic gene（BAX）toanti-apoptotic gene（BCL2A1）in secondary follicles on day 4, but the difference was notstatistically significant. The present study demonstrates that TNF α has opposing effects ofpromoting growth and inducing regression of secondary follicles under in vitro culture
conditions with low concentrations of growth factors. The results of this study suggest thatfurther research is needed to fully understand the mechanism of TNF α signaling in thegrowth of secondary follicles．

１．目の確保が課題となっている。超音波ガイド経膣採的卵（OPU）は生体卵子の供給方法として注目さ我が国では，ウシにおける人工授精受胎率の低れているが，吸引できる直径約３mm以上の胞状下等を背景に，繁殖雌牛の供用年数延長を目的と卵胞数は個体，年齢，健康状態などによって数個した受精卵移植の活用が進んでいる。特に，体外から50個以上と差が大きく，体外受精卵の生産効

受精卵の移植数は大きく増加し，体外受精用卵子率を低下させている。胞状卵胞数の少ない個体© The Ito Foundation

130

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

は，従来の過剰排卵処理でも受精卵の生産数が少et al２）に従って実施した。後期二次卵胞は，0.2％

ない。これらのことから，個体ごとの胞状卵胞数

BSA（037-23372，和光純薬）を含む２倍濃度のの増加は，受精卵移植による繁殖成績の改善を進Medium 199 （M2520 ， Sigma-Aldrich） と ３

めるうえで重要な課題と言える。近年，卵巣内のmg/mlコラーゲン酸性溶液（IAC-30，株式会社

原始卵胞数（卵胞リザーブ）と雌牛の繁殖機能の高研，東京）を等量混和した培地250μl/wellに包関係が注目されている。卵胞リザーブの多い個体

埋し，三次元培養した。包埋した卵胞は，0.1％

はそれに比例して胞状卵胞数が多く，胚死滅や繁BSA お よ び ２ mM ヒ ポ キ サ ン チ ン（H9636 ，

殖障害が少ない。リピートブリーダー牛は，正常Sigma-Aldrich）を添加したMedium 199（12340-

牛に比較して卵胞リザーブが少ないことも知られ

030，Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,ている。

USA）を基礎培地として500μl添加し，38.5℃，

卵胞リザーブは加齢とともに減少し，再び増加

５％CO2 in airで12日間培養した。培地は２日にすることはないとされている。しかし，我々は過一回交換した。卵胞は，培地交換時にZOE蛍光

剰排卵処理対象牛のなかには一旦減少した胞状卵

セ ル イ メ ー ジ ャ ー（BIO-RAD Richmond, CA,

胞数が再び増加し，採卵成績が回復する個体が存USA）を 用 い て 写 真 撮 影 し ，画 像 解 析 ソ フ ト

在することを報告している。また，黒毛和種牛の（ImageJ）を用いて直径を測定した。

生体内では，加齢とともに二次卵胞から胞状卵胞

実験１では，卵巣表面から視認できる胞状卵胞への発育停滞が発生することが報告されてい数が20個未満および50個以上の卵巣に分けて二次る 。これらの知見は，胞状卵胞数が卵胞リザー

卵胞の採取と培養を行った。基礎培地には，20

ブ以外の生理的要因で変動することを示唆していng/mlのインスリン（I1882，Sigma-Aldrich）をる。胞状卵胞への発育を促進する飼養管理やホル添加し，胞状卵胞数およびインスリン添加が卵胞

モン処理方法が開発できれば，体外受精卵の生産

直径および卵胞退行率に及ぼす影響を解析した。

効率や繁殖成績を向上させることができる。しか

実験２では，20 ng/mlのインスリンを含む基し，胞状卵胞へと発育する直前のステージである

礎培地に対する10 ng/mlのヒト組み換えTNFα

二次卵胞の発育制御機構は十分に解明されていな（HZ-1014，Proteintech Group, Inc, IL, USA）添い。

加が卵胞直径および卵胞退行率に及ぼす影響を解

１）

本研究は，ウシ二次卵胞の発育制御因子の役割析した。さらに，10μＭのTNFR1アンタゴニスを解明することを目的として，代謝異常時などにト（WP9QY, Cayman Chemical）お よ び ５ μg/

生産され，アポトーシス誘導，細胞増殖促進，細ml の 抗 TNFR2 抗 体 （10417-R00N6,Sino

胞のグルコース利用阻害など多面的な機能を持つ

Biological Inc., Beijing, China）の 添 加 が TNF α

腫瘍壊死因子（TNF）αがウシ二次卵胞の発育の作用に及ぼす影響を解析した。
実験３では，TNFαが二次卵胞のアポトーシに及ぼす影響を解析した。
２．方スに及ぼす影響を解析した。TNFαを添加して法

90時間培養した二次卵胞は，３個をプールしてホルスタイン種のウシ卵巣は食肉処理場で採取

NucleoSpin RNA XS（タカラバイオ株式会社，

し，切 り 出 し 法 に よ り二次卵胞（直径120-220

滋賀）を使用してRNAを抽出した。逆転写反応μm）を採取した。後期二次卵胞の培養は，Itoh,

は，iScript gDNA Clear cDNA Synthesis Kit© The Ito Foundation

131

ウシ二次卵胞の発育制御におけるTNFα受容体の役割（Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, USA）を用いてことを示唆している。本研究では，発育能力の異行った。BAXおよびBCL2A1のmRNA発現量は，なる二次卵胞を実験に使用することを避けるた

QuantiTect SYBR Green PCR Kit （Qiagen） おめ，実験１として胞状卵胞数と二次卵胞の発育能

よびCFX ConnectリアルタイムPCR解析システ

力の関係を解析した。その結果，インスリン添加

ム（Bio－Rad Laboratories, Inc．）を用いて解析の有無に関わらず，胞状卵胞数の多寡は二次卵胞した。

の発育能力に影響を及ぼさなかったことから，本研究では胞状卵胞数を考慮せずに以降の実験を実３．結果と考察施した（Fig.１）。

二次卵胞の体外培養の研究は，卵巣内に大量に

実験２では，低濃度のインスリン添加条件下で存在する前胞状卵胞から成熟卵母細胞を生産し，培養した二次卵胞の発育に対するTNFαの作用

家畜繁殖や希少動物の保存に利用することを目的を解析した。その結果，二次卵胞の培養液に対すに進められてきた。そのため，多くの培養系がイるTNFαの添加は，培養２-４日目の卵胞直径をン ス リ ン・ト ラ ン ス フ ェ リ ン・セ レ ン 混 合 物

有意に増加させた（Fig.２）。しかし，TNFα添（ITS）などの高濃度成長因子に加えて，ステロ

加区の卵胞直径は６日目以降減少し，培養10-12

イドホルモンや性腺刺激ホルモンなどを添加して日目では対照区に比較して有意に減少した。

いる。本研究では，無血清条件下で低濃度のイン

TNFα添加区の卵胞退行率は培養４日目から増スリンのみを添加した三次元培養により，TNF

加し，培養６日目以降は対照区に比較して有意にαの持つ作用を検討した。胞状卵胞の少ない個体

高い値を示した。この結果から，TNFαは培養の一部には，二次卵胞の発育が停滞している個体

初期の二次卵胞の発育を促進するのに対し，培養が 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ て い る 。ま た ，

期間の延長に伴い卵胞発育を抑制することが示唆

Nagai, et al は，胞状卵胞数の多い牛の卵巣におされた。Paulino, et al４）は，TNFαが体外培養しける初期胞状卵胞は顆粒層細胞の増殖能力が高い

たウシ二次卵胞の発育を促進することを報告して

１）

３）

Diameter change

Diameter change
（％）

110

Regression of follicle
100

Regression
（％）

100
90
80
70

High AFC-Cont
High AFC-Ins
Low AFC-Cont
Low AFC-Ins

0

2

4

High AFC-Cont
High AFC-Ins
Low AFC-Cont
Low AFC-Ins

75
50
25
0

6

Day

8

10

12

0

2

4

6

Day

8

10

12

Fig. 1 Effects of antral follicle counts（AFC）on in vitro growth of preantral follicles in the presence of insulin.

Preantral follicles derived from high（≥50）and low（<20）AFC ovaries were cultured with（Ins）or without（Cont）insulin.

© The Ito Foundation

132

令和３年度

Diameter change
A

Regression of follicle
100

A
A

110
B

B

100
90
80

B
B

Cont
TNFα

0

2

4

6

Day

8

10

Cont
TNFα

A

Regression
（％）

120

Diameter change（％）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

A
A

75
A

50

A
B

25
0
0

12

2

4

B

B

6

8

Day

B

10

12

Fig. 2 Effects of TNF α on in vitro growth of preantral follicles.

おり，本研究における培養初期の結果と一致しを目的として受容体阻害実験を行ったところ，た。しかし，Paulino, et alの報告とは異なり，

TNFR1アンタゴニスト（WP9QY）は二次卵胞

本研究では培養時間の延長に伴いTNFαがウシの発育と退行に対するTNFαの作用に有意な影

二次卵胞の退行を誘導した。これまでに，ウシの響を及ぼさなかった（Fig.３）。WP9QYによる胞状卵胞ではTNFαが顆粒層細胞と卵胞膜細胞

TNFαとTNFR1の結合阻害のIC50は，５μＭとの機能を抑制し，初期の卵胞発育の抑制や卵胞退されている。本研究ではIC50を上回る10μＭの行を誘導することが明らかとなっている 。本研WP9QYを添加したものの明確な効果が得られな究における培養６日目以降のウシ二次卵胞の退行かったことから，TNFαのTNFR1への結合阻害

は，TNFαによる顆粒層細胞および卵胞膜細胞効果を明らかにするためにはより高濃度の添加実の機能抑制によるものであると考えられた。本研

験を行う必要があると考えられた。抗TNFR2抗究の結果から，TNFαは二次卵胞に対して時間

体もTNFαによる卵胞発育に対する作用に影響

依存的に発育促進と退行誘導という相反する作用を及ぼさなかった（Fig.４）。しかし，抗TNFR2を示すことが明らかとなった。同様の研究を行っ抗体は，培養８-10日目におけるTNFαによる卵たPaulino, et alの報告では，卵胞刺激ホルモン

胞退行を抑制する傾向を示した。TNFαは，細に加えて成長因子として高濃度のITSを添加して胞死と細胞増殖の両方を誘導するサイトカインでおり，強い発育促進条件で実験が行われた。一方

あり，ブタ卵胞ではTNFR2を介したTNFシグナ

で，本研究では二次卵胞の発育を維持できる程度

ルが顆粒層細胞の生存に関与することが報告されの生理的濃度のインスリンのみを添加したことかている６）。TNFR1およびTNFR2を介したTNFシら，TNFαによる卵胞退行作用が検出されたとグナルの違いが二次卵胞の発育に及ぼす影響を明考えられた。

らかにするためには，受容体の阻害条件をさらに

４）

５）

４）

TNFαが二次卵胞の発育に及ぼす作用における培養時間依存的変化の機序を明らかにすること検討する必要があると考えられた。
実験３では，TNFαによる卵胞直径の増加が© The Ito Foundation

133

ウシ二次卵胞の発育制御におけるTNFα受容体の役割

Diameter change
100

A
A

110

B

100
90
80

Regression of follicle

Regression（％）

Diameter change
（％）

120

Cont
TNFα
WP9QY

0

2

Cont
TNFα
WP9QY

75

A
A

50

A

25

6

Day

8

10

0

12

2

4

B

B

6

8

Day

A

A

A

0
4

A

A

B

10

B

12

Fig. 3 Effects of TNFR1 antagonist（WP9QY）on the regulation of preantral follicle development by TNF α.

Diameter change

110
100

A

A

A

B

B

Regression of follicle
100

A
AB
B

90
80

A

Regression（％）

Diameter change
（％）

120

Cont
TNFα
anti-TNFR2

0

2

Cont
TNFα
anti-TNFR2

75

A
A

50

A

25

AB

0
4

6

Day

8

10

A

B

B

10

12

B

0

12

AB

2

4

6

Day

8

Fig. 4 Effects of anti-TNFR2 antibody on the regulation of preantral follicle development by TNF α.

認められる培養４日目の二次卵胞におけるアポ遺伝子の発現量を比較する必要がある。TNFR2

トーシス関連遺伝子の発現を解析した。その結は前述のように顆粒層細胞の生存に関与すること

果，TNFα区におけるアポトーシス抑制遺伝子が示唆されているものの，その役割は十分に解明（BCL2A1）に 対 す る ア ポ ト ー シ ス 促 進 遺 伝 子

されていない。今後は，ステロイド合性機能など（BAX）の発現量比は，対照区に比較して低かっも含めて，TNFαが二次卵胞の機能に及ぼす影

た が ，有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た（Fig. ５）。

響と受容体のタイプの関係を解析する必要がある

TNFαが二次卵胞の発育に及ぼす作用におけると考えられた。

培養時間依存的変化の機序を明らかにするためには，培養の初期と後期におけるアポトーシス関連© The Ito Foundation

134

令和３年度

BAX/BCL2A1

200

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

また，TNFαの添加は培養４日目の二次卵胞に

p=0.228

おけるアポトーシス抑制遺伝子（BCL2A1）に対するアポトーシス促進遺伝子（BAX）の発現

150

量比を低下させる傾向を示したが，統計学的有意100

差は認められなかった。本研究では，低濃度の成長因子を添加した体外培養条件下において，50

TNFαが二次卵胞の発育に対して促進と退行誘
導の相反する作用を有することを明らかにした。

0

Cont

TNFa

本研究の結果から，今後は二次卵胞の発育におけFig. 5 Effects of TNF α on the expression ratio ofproapoptotic gene （BAX） to anti-apoptotic gene
（BCL2A1）in preantral follicles cultured in vitro for 4
days.

４．要

約

ウシの繁殖成績や受精卵生産効率を向上させる
ためには，卵胞発育メカニズムを解明し胞状卵胞数を増加させるための技術開発が重要となる。二次卵胞から胞状卵胞への発育は，加齢や飼養管理などの影響を受けて停滞すると考えられている。
本研究では，低濃度のインスリンのみを添加した培養系を利用し，二次卵胞の体外発育に及ぼす
TNFαの作用を検討した。本研究の培養条件では，二次卵胞の発育が12日間維持され，胞状卵胞数の多寡は二次卵胞の体外発育成績に影響を及ぼさなかった。細胞死と細胞増殖の両方を誘導する
サイトカインであるTNFαは，二次卵胞の発育を培養４日目までは有意に促進し，10日目以降は有意に抑制した。TNFαは，培養６日目以降の卵胞退行を有意に増加させた。二次卵胞の発育に対するTNFαの作用が培養時間依存的に変化する 要 因 を 明 ら か に す る た め に TNFR1 お よ び
TNFR2の阻害実験を行ったが，受容体のタイプとTNFαの作用の関係は明らかとならなかった。

るTNFαシグナル伝達機構を詳細に検討する必要があると考えられた。
文
献１） Iwata, H.：Age-associated events in bovine
oocytes and possible countermeasures, Reprod Med
Biol, 15, 155～164, 2016.
２）
 Itoh, T., Kacchi, M., Abe, H., Sendai, Y., Hoshi, H.：
Growth, Antrum Formation, and Estradiol
Production of Bovine Preantral Follicles Cultured
in a Serum-Free Medium1, Biol Reprod, 67, 1099～
1105, 2002.
３）
 Nagai, K., Yanagawa, Y., Katagiri, S., Nagano, M.：
The relationship between antral follicle count in abovine ovary and developmental competence of invitro-grown oocytes derived from early antral
follicles, Biomed Res, 37, 63～71, 2016.
４）
 Paulino, L. R. F. M., Cunha, E. V., Barbalho Silva,
A. W., Souza, G. B., Lopes, E. P. F., Donato, M. A. M.,
Peixoto, C. A., Matos-Brito, B. G., van den Hurk, R.,
Silva, J. R. V.：Effects of tumour necrosis factoralpha and interleukin-1 beta on in vitro
development of bovine secondary follicles, Reprod
Domest Anim, 53, 997～1005, 2018.
５）
 Sakumoto, R., Shibaya, M., Okuda, K.：Tumor
necrosis factor-alpha （TNF alpha） inhibits
progesterone and estradiol-17beta production from
cultured granulosa cells：presence of TNFalphareceptors in bovine granulosa and theca cells, J
Reprod Dev, 49, 441～9, 2003.
６）
 Nakayama, M., Manabe, N., Inoue, N., Matsui, T.,
Miyamoto, H.：Changes in the expression of tumorn e c r o s i s f a c t o r （ T N F ）α, T N F α r e c e p t o r（TNFR） 2, and TNFR-associated factor 2 in
granulosa cells during atresia in pig ovaries, Biol
Reprod, 68, 530～535, 2003.

© The Ito Foundation

135

体外受精由来ウシ胚盤胞の可逆的発生停止を誘導する
体外培養法の開発ならびにその誘導による胚盤胞の胚質改善の可能性
Possible improvement of embryonic quality of in vitro derived bovine
blastocysts by induction of diapause-like state in in vitro culture

石

井

利

通

（三重県畜産研究所）

Toshimichi Ishii（Mie Prefectural Livestock Research Center）

Mouse blastocysts can be induced to enter a diapause-like paused state in in vitro culture
via inhibition of the cytoplasmic kinase mTOR, a major nutrient sensor and growth promotor,
by treating with a mTORC1/C2 inhibitor, INK128. The present study evaluated the possibilityof inducing a diapause-like state in bovine blastocysts developed in vitro by INK128
treatments. First, the effects of increasing concentrations（0-400 nM）of the inhibitor on theviability and hatching rates of day 7 blastocysts（day 0：in vitro fertilization）cultured untilday 10 were examined. Most embryos treated with 100 nM INK128 arrested at the nonhatching stage. However, embryo viability remained very high regardless of the inhibitor
treatments. Immunofluorescence staining experiments revealed that the expression levels ofphosphorylated 4EBP1, an mTORC1 target, in embryos treated with 100 nM INK128 weresignificantly decreased, compared to those with 0 nM INK128（p < 0.05）, whereas those ofphosphorylated AKT, an mTORC2 target, were not different between embryos treated withand without 100 nM INK128. These findings suggest that INK128 may modulate the processes
involved in developmental pause via the downregulation of mTORC1 activity in bovine
blastocysts.

１．目

多くのほ乳類動物では，胚盤胞が着床前の段階

的で一時的に発生を停止する休眠現象が起こること

ウシ胚生産技術の飛躍的な進展に伴い，世界中が知られている。また，子宮内で誘導されるマウで生産されるウシ胚の約半数が体外受精に由来す

ス休眠胚盤胞の特徴として，１）着床後の発生能ることが報告されている。一方で，ウシ体外受精が高くなる １），２）DNA損傷を修復する能力が胚の胚質に起因する低い耐凍性や低受胎が，利活ある２）等の休眠中に胚自身が胚質を改善するとの用に大きな障害となっている。すなわち，ウシ体外報告がなされている。非休眠動物と考えられてき受精胚の胚質改善は，胚移植によるウシ生産技術た反すう動物であるヒツジの胚盤胞においても胚のさらなる進展において喫緊の課題と考えられる。

の休眠状態が誘導され，休眠胚をヒツジ雌へ移植© The Ito Foundation

136

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

すると，非休眠胚盤胞の移植の場合よりも高い割

マ ウ ス 胚 盤 胞 を mTORC1/C2 阻 害 剤 INK128

合で産子が得られることが報告された 。もし，（200 nM）で処理することで胚の可逆的発生停止

同様に非休眠動物と考えられてきた反すう動物でが誘導される４）。そこで，IVPウシ胚盤胞の生存あるウシの胚盤胞でも休眠が誘導できるならば，性および形態的変化に及ぼすINK128（0，50，

胚質改善による産子への発生能の向上が期待で

100，200，400 nM）処理の各濃度における効果

き，さらには，体外培養で休眠誘導が可能となれを検証した。具体的には，７日目のIVPウシ胚盤

ば，凍結保存に代わる新たな胚の保存と移送技術

胞を用い実体顕微鏡下で胚を経日的に観察した。

の開発にもつながるであろう。

なお，ほとんどの細胞が黒色変化や壊死した胚を

３）

最近，体外培養マウス胚盤胞をmTORC1/C2（主要な栄養センサーで成長のプロモーター酵素）

変性胚とし，それ以外の胚を生存胚として胚の生存率を求めた５）。

の阻害剤であるINK128で処理することによって

2 . 3 INK128処理あるいは無処理IVPウシ胚盤

休眠様の可逆的発生停止（以下，可逆的発生停胞のmTORC1/C2活性の測定（実験２）止）を誘導できることが示され，可逆的発生停止

先の実験で明らかとなった発生停止様の変化がした胚盤胞は，胚移植により産子へ発生する能力生じたウシ胚盤胞のmTORC1/C2活性を以下の方を保持していることも明らかにされた４）。本研究

法で測定した。mTORC1活性については，そのでは，ウシ胚盤胞の体外培養での可逆的発生停止標的である4EBP1のリン酸化の程度を，そしてを誘導できる方法を開発するために，INK128処

mTORC2活性については，その標的であるAKT

理が体外授精由来ウシ胚盤胞（IVPウシ胚盤胞）のリン酸化の程度を，胚の免疫蛍光染色を行い，の発生に及ぼす効果を検証した。

その蛍光強度をImageJによって半定量的に求め２．方た。なお，本実験では，4EBP1抗体（Cell Signaling法

Technology，#9452），リン酸化4EBP1抗体（Cell2 . 1 ウシ卵巣の採取ならびにウシ胚の培養方

Signaling Technology， #9459）， AKT 抗 体（Proteintech Group Inc，10176-2-AP）ならびに

法
食肉処理場由来の卵巣から卵子卵丘細胞複合体（COCs）を回収した。回収したCOCsは，10％ウ

リ ン 酸 化 AKT 抗 体 （Bioss Inc, bs-0876R-TR）
を一次抗体として用いた。

シ胎児血清および0.20AU/ml卵胞刺激ホルモン添

2.4

加HEPES－TCM199で21時間培養した。その後，

INK128処理がウシ胚盤胞の生存性および形態

IVF100で６時間体外受精を行った。体外受精を的変化に及ぼす影響については，カイ二乗検定実施した受精卵は，５％ウシ胎児血清添加CR1aa（必要に応じ，フィッシャーの正確確率検定また液（500μl）で７日間培養した。試験には，７日

はイエーツの補正を実施），それ以外の有意差検目に発生したウシ胚盤胞を用い，10％ウシ胎児血定においては，ｔ－検定を用いた。p ＜ 0.05を統清添加KSOM液を用い96穴Ｕ底低吸着プレート

計学的に有意とした。

にて培養した。
2 . 2 mTORC1/C2阻害剤（INK128）処理による体外培養IVPウシ胚盤胞の形態的変化および生存性に及ぼす効果（実験１）統計解析

３．結果と考察
実験１では，100 nM以上のINK128処理ウシ胚盤胞において50 nMのINK128処理ならびに無処© The Ito Foundation

137

体外受精由来ウシ胚盤胞の可逆的発生停止を誘導する体外培養法の開発ならびにその誘導による胚盤胞の胚質改善の可能性

置のウシ胚盤胞と比べ，培養開始から培養４日目察された。一方，実験２では，mTORC2活性の

ま で の 透 明 帯 か ら の 孵 化 率 が 低 下 し た（p <標的であるAKTのリン酸化の程度は，INK128処

0.05）（Fig.１）。また，100 nMのINK128処理ウ

理区と無処理区において差が認められなかった

シIVP胚盤胞では，培養開始より培養３日目まで（Fig.２）。mTORC2は，細胞骨格の維持，細胞のは，50 nMのINK128のならびに無処置のウシ胚生存性，糖代謝および脂質代謝の調整に深く関与

盤胞と生存性に差が認められなかった（Fig.１）。

していることが報告されており６），体外培養マウ

以上の結果より，100 nMのINK128処理によってス胚盤胞の可逆的発生停止が誘導された胚におい

ウシIVP胚盤胞の発生停止が誘導されることが示ては，mTORC2活性の低下に起因する細胞内の唆された。実験２では，mTORC1の標的である

脂肪分解の増加が胚の生存性の向上に重要である

4EBP1のリン酸化の程度がINK128（100 nM）処ことが報告されている７）。また，体外培養マウス

理 区 に お い て 減 少 し た（p < 0.05）（Fig. ２）。

胚盤胞のINK128処理による可逆的発生停止胚で

mTORC１は，翻訳に関与する因子や転写因子をは，4EBP1ならびにAKTのリン酸化の程度が低介して細胞周期の進行を調整していることが報告下していることが報告されており４），mTORC1/されており６），本実験におけるINK128（100 nM

C2の活性を同時に低下させることが可逆的発生

以上）処理ウシ胚での孵化率低下は，胚の細胞周停止の誘導に必要なのかもしれない。本実験で期の調整による発生停止に起因していることが推は ，INK128 処 理 し た IVP ウ シ 胚 盤 胞 で は ，

Day 7

Bl

Hatch-Bl

Day 8

Deg

100

100

％
75

%
75

50

50

25

25

0

0

0

50

100

200

400

Day10
g, i

g

100

g

75
d

d

b

e

h
ef

ef

75

e
bc

bc

a

bc

bc

a
100

200

h, i

75
50

e
d

400

a

a
50

100

200

400

0
nM

a
0

0
nM

h
f

h

bc

bc

bc

100

200

400

f

e

0

b
50

nM

h, i
e

h,j

d

25

0

g

g

%

bc

f

25

50

g

d

g

50

b
0

g

100
%

d

100
h, J
e

25
0

ef

Day 11

%

50

nM

Day 9
ef

a
50

e
b

b

b

100

200

400

nM

Fig. 1 Morphological changes in day 7 bovine blastocysts cultured in vitro for 4 days in different concentrations of

INK128（0, 50, 100, 200 and 400 nM）. Blastocysts obtained 7 days post IVF were assigned randomly to thefollowing five groups： 0 nM（n = 85）, 50 nM（n = 20）, 100 nM（n = 24）, 200 nM（n = 60）, and 400 nM（n = 42）.
The experiments were repeated six times. Values designated by separate superscript letters within eachmorphological category differ significantly（p < 0.05）. Morphological categories： blastocyst（Bl）, hatching
blastocyst（Hatch-Bl）,and degenerated embryo（Deg）.

© The Ito Foundation

138

令和３年度

Ａ

Ｃ

4EBP1

15
10
5

40

20

0

0
0nM
（n=11）

Ｂ

100nM（n=16）

0nM（n=15）

Ｄ

p4EBP1100nM（n=15）

pAKT
60

＊

40

20

0
0nM
（n=15）

Mean integerity per pixel

60
Mean integerity per pixel

AKT

60
Mean integerity per pixel

20
Mean integerity per pixel

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

40

20

0

100nM
（n=14）

0nM（n=17）

100nM（n=13）

Fig. 2 Expression levels of 4EBP1, p4EBP1, AKT, and pAKT in bovine embryos treated with or without 100 nM

INK128 for 3 days. Individual mean pixel intensity was measured per embryo using ImageJ software, and mean
pixel intensities of 4EBP1（A）, p4EBP1（B）, AKT（C）and pAKT（D）are depicted. Bars represent SEM. ＊（p <0.05）

mTORC2の活性が抑制されておらず，このこと停止）が誘導できるかは不明である。本実験でが，培養３日目以降のINK128処理のウシ胚で生は，細胞代謝や成長の調整因子であるmTORC1/

存性が高率に維持されなかった理由の１つとも推C2の阻害剤であるINK128でウシIVP胚盤胞を処察された。

理することにより，可逆的胚発生停止が誘導でき

本実験は，ウシIVP胚盤胞をmTORC1/C2阻害

る か を 検 証 し た 。そ の 結 果 ，100 nM 以 上 の剤であるINK128で処理することで，胚の透明帯

INK128処理胚では，50 nM INK128処理ならびにからの孵化率が低下し，これがmTORC1活性の無処理胚と比べ，透明帯からの孵化率は有意に低低下に起因する可能性があることを見出した。今下した。また，100 nM INK128処理胚の培養開後 は ，本 実 験 で は 得 る こ と が で き な か っ た

始から３日目までの生存率は，50 nM INK128処

mTORC2活性の抑制手法について検討を行い，理ならびに無処理胚と比べて差が認められなかっ

ウシIVP胚盤胞の体外培養での可逆的発生停止のた。さらに，INK128（100 nM）処理によって誘導を目指す。

ウシIVP胚盤胞におけるmTORC1活性の標的で４．要ある4EBP1のリン酸化の程度が無処理胚に比べて約有意に低下した。本実験において，ウシIVP胚盤

ウシの胚盤胞において休眠現象（可逆的胚発生胞のmTORC1の活性がINK128処理によって抑制© The Ito Foundation

体外受精由来ウシ胚盤胞の可逆的発生停止を誘導する体外培養法の開発ならびにその誘導による胚盤胞の胚質改善の可能性され，その結果，３日間と短期間ではあるが，胚の発生休止が誘導されたことが示唆された。今後
は ，本 実 験 で は 得 る こ と の で き な か っ た
mTORC2活性の抑制手法についてさらなる検討を行い，ウシIVP胚盤胞の体外培養でのより長期間の可逆的発生停止の誘導を目指す。
文献１） Kaufman, M. H., Barton, S. C., Surani, M. A.：
Nature, 256, 53～55, 1977.
２） Surani, M. A. H., Fishel, S. B.：J Reprod Fertil, 29,
159～172, 1981.

139

３）
 Grazyna, E. P., Emanuela, T., Marta, C., Paola, T,
Jacek, A. M., Pasqualino, L.：PLoS One, 7, e33027,
2012.
４）
 Aydan, B.-K., Steffen, B., Hu, J., Trisha, A. M.,
Miroslav, H., Marina, G., Jun, S. S., Miguel, R.-S.：
Nature, 540, 119～123, 2016.
５）
 Ishii, T., Kawano, K., Tanaka, N., Tomita, K.,
Saito, N., Yamada, M.：J Reprod Dev, 65, 275～280,2019.
６）
 Roberto, Z., Alejo, E., David, M. S.：Nat Rev Mol
Cell Biol, 12, 21～35, 2011.
７）
 Abdiasis, M. H., Yuliang, W., Julie, M., Lilyana, M.,
Chaozhong, S., Daniel, C. J., Christopher, C., Jason,
W. M., Elisabeth, M., Megan, R. S., Walter, L. R.,
Oliver, F., Carol, B. W., C, Anthony, B., Hannele, R.B.：Dev Cell, 52, 236～250, 2020.

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140

受精卵の未凍結保存における植物由来成分の有効性検証と配合の最適化
Effects of plant-derived ingredients on non-cryogenic preservation of early
embryos, and its blending optimization

星

野

由

美

（日本女子大学理学部）

Yumi Hoshino（Faculty of Science, Japan Women’s University）

This study investigated the effectiveness and optimal conditions for the use of plantderived components in the preservation of 2-cell embryos without freezing under asupercooling condition. Our previous studies showed that the University of Wisconsin cold
storage solution（UW solution）effectively preserves oocytes without freezing. In this study, a
UW solution was used as the basic preservation solution. Coffee lees extract with asupercooling effect suppressing the formation of ice crystals was added as a plant-derived
component to test its effectiveness in preserving early embryos. Results indicated that early
embryos could be stored at －6 ℃ for 72 h using UW solution; however, some of these early
embryos showed cell membrane deformation. This could be mitigated by adding 10% coffee
lees extract（containing caffeine, caffeic acid, chlorogenic acid, and quinic acid）with no evident
morphological damage to early embryos. To identify the active components for cellpreservation, we verified the individual effects of caffeine and chlorogenic acid, both of which
are known to exhibit antioxidant activities and suppress ice nucleation. Caffeine was found tobe effective for early embryo storage when 10 times the quantity（173 µg/ml）was added.
However, as caffeine concentration increased, damage（such as tearing of the zona pellucida）
was observed. A high concentration（623 µg/ml）of chlorogenic acid, although slightly effective
in preserving early embryos, damaged cell membranes. Therefore, chlorogenic acid alone was
not suitable. Since cells are probably injured by low temperatures, early embryos could be
stored in a healthy state by adding coffee lees extract before storage. In the caffeine-onlygroup, the morphological damage of cells that occurred at －6℃ could be eliminated by storage
at 4℃. We will verify the combination of active components and storage temperature in future
research to make long-term preservation of embryos easier.

１．目

有効であり，重要な技術として位置づけられてい的る。細胞の長期保存には，ガラス化法や緩慢凍結

受精卵を含む生殖細胞の保存は，優良形質をも法などの凍結保存法が広く用いられており，液体つ家畜遺伝資源の活用や希少動物の遺伝子保存に

窒素中で半永久的な保存が可能である。しかし，© The Ito Foundation

受精卵の未凍結保存における植物由来成分の有効性検証と配合の最適化

141

凍結により生じる細胞膜へのダメージや，保存液分の分析については，関西大学の河原秀久教授のに含まれる凍害保護物質による細胞毒性は，現行協力を得た。過冷却促進物質として低温環境下での凍結保存法では避けることができない１．２）。まの効果が期待される候補物質の中から，抗氷核活

た最近の研究によると，保存液に含まれる凍害保性値が高く，抗酸化効果も期待されるコーヒー粕

護物質が受精卵移植後に子宮内で炎症を引き起こ

抽出液を細胞保護剤の代替として選択した。

す原因になることも指摘されている。受精卵が受本研究では，マウスの受精卵を研究対象としけるダメージは，その後の発生に大きく影響するて，常法に従い体外受精を行うことで受精卵を獲ことから，細胞へのダメージの少ない未凍結での得した５）。体外受精後，卵子をKSOM培地に移し保存法の確立に取り組むこととした。

て体外培養し，翌日，受精卵（２細胞期胚）を得

これまでのところ，細胞の未凍結保存の成功事た。受精卵の保存は，UW液（アステラス製薬）

例は少ない。2014年に米国ハーバード大学の研究を基礎保存液として，コーヒー粕抽出液を終濃度

グループがラットの肝臓を臓器保存液であるベル

５％または10％添加することで，その効果を検証

ザーUW液（以下，UW液）に，細胞保護剤としした。さらに，コーヒー粕抽出液の含有成分のうて3-O-メチル-D-グルコースを添加して，－６℃

ち，主要成分であり抗氷核形成阻害作用が高いカ

で72時間の未凍結保存に成功したと報告した３）。

フェインと，抗酸化効果が期待されるクロロゲン

一方，関西大学の河原秀久教授らは，植物（ヒノ酸に着目し，受精卵保存への有効性を検証した。

キ，大根など）や食品廃棄物（コーヒー粕，あん各条件，保存液100μlに受精卵（５～10個）を浸粕など）から氷晶形成抑制物質を発見し，その抽

し，超低温アルミブロック恒温槽（クライオポー

出に成功した４）。氷晶形成抑制物質には，不凍タ

ター，サイニクス）を使用し，20℃から２℃/min

ンパク質や過冷却促進物質として分類されるものの速度で段階的に冷却し－６℃で72時間保持しがある。これを適切な濃度で使用すると，低温下た。温度制御は，Berendsenらの方法に準じて行っ

でも氷核形成が抑制されるため，過冷却状態を維た３）。保存期間終了後，受精卵は－６℃から２℃

持させることができる。一般に液体が凝固点以下/minの速度で段階的に20℃まで加温し，２％パでも固体にならない状態を過冷却と言うが，液体

ラホルムアルデヒドで固定した後，核と細胞膜を中に異物が存在すると過冷却温度は上昇し凍結し

そ れ ぞ れ Propidium Iodide（PI）と Phalloidin でやすくなる。しかし，氷晶形成抑制物質を添加す

染色し，共焦点レーザー顕微鏡（FV 1200，オリ

ることで過冷却温度を下げることが可能になるたンパス）で観察することで，受精卵の健常性を評

め，細胞や組織の保存に有効であると考えられ価した。

る。そこで本研究では，これらの報告を参考に
UW液を基礎保存液として用い，細胞保護剤の代３．結果と考察

わりに細胞毒性のない植物由来物質を添加するこコーヒー粕抽出液１㎎/mlに含まれる成分を分とで，受精卵の未凍結保存への有効性を検証した。

析したところ，カフェイン，カフェ酸，クロロゲ

２．方ン酸，クマル酸が主として含まれていることが明法らかになった。それぞれの濃度と抗氷核活性値を植物由来の抽出液に含まれる過冷却促進物質

比較したところ，弱酸性フェノール層にカフェイ（氷晶形成抑制物質）の単離・精製および含有成

ンが多く含まれ，抗氷核活性が最も高かった。カ

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142

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

フェインは哺乳動物の卵子や受精卵の活性を維持考えられた。

する効果があり，培養液にも添加されることが多次に，コーヒー粕抽出液の含有成分であるカい６）。また，クロロゲン酸はカフェ酸とキナ酸がフェインについて未凍結保存への効果を検証しエステル結合したポリフェノールであり，一般的

た。カフェインには氷核形成阻害作用がある４）。

に抗酸化作用が知られている。このことから，本コーヒー粕抽出液におけるカフェインの濃度は研究ではコーヒー粕抽出液とカフェイン，クロロ

173μg/mlであったことから，この値を基準に高ゲン酸を過冷却促進物質として使用し，受精卵の濃度区（1.73×10３μg/ml），中濃度区（1.73×10２

未凍結保存への有効性を検証した。

μg/ml），低濃度区（1.73×10１μg/ml，コーヒー

まず，UW液単独で受精卵を保存したところ，

粕抽出液10％添加と同濃度）で効果を比較した。

細胞膜に歪みなどの変形が認められたが，細胞死その結果，カフェイン添加のいずれの濃度でも細を意味する核凝縮は認められなかったことから，胞へのダメージ軽減の効果があり，未凍結保存へ

UW液は受精卵の保存に有効であると考えられたの有効性が認められた。特に，中濃度区で効果が（Fig.１）。そのうえで，コーヒー粕抽出液が受精高く，コーヒー粕抽出液10％添加区と同等の効果

卵の未凍結保存にどのような効果をもたらすのかが得られた（Fig.２）。しかし，高濃度区では割を検証したところ，コーヒー粕抽出液添加区では球の変形を示す受精卵も複数認められたことか

UW液単独区と比較すると濃度依存的に細胞膜のら，カフェイン単独での効果には限界があると考歪みが改善され，新鮮な受精卵に近い形態で保存えられた。次に，クロロゲン酸についてその有効できることを確認した（Fig.１）。このことから，性を検証した。コーヒー粕抽出液におけるクロロ

コーヒー粕抽出液の含有成分がマウス受精卵の未ゲン酸の濃度は62.3μg/mlであったことから，こ凍結保存において細胞膜の保護に作用したものとの値を基準として，高濃度区（62.3×10－５g/ml）

F-actin

Nucleus

Bright ﬁeld

Merge

UW only

5% cof

10% cofFig.1 Effects of coffee lees extract on non-cryogenic preservation of 2-cell embryo.

It shows the morphology of 2-cell after adding 5%（middle panel）or 10%（lower panel）coffee lees extract（cof）toUW solution, and storing at －6 ℃ for 72 hours. Upper panel shows using UW solution alone. F-actin（green）and
nucleus（red）were stained with Phalloidin and PI.

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受精卵の未凍結保存における植物由来成分の有効性検証と配合の最適化
F-actin

Nucleus

Bright ﬁeld

143

Merge

High

Same as10% cof

Low

Fig.2 Effects of caffeine with different concentrations on non-cryogenic preservation of 2-cell embryo.

Caffeine was most effective for early embryo storage when same as concentration of 10% coffee lees extract（sameas 10% cof）was added.

F-actin

Nucleus

Bright ﬁeld

Merge

High

Same as10% cof

Low

Fig.3 Effects of chlorogenic acid with different concentrations on non-cryogenic preservation of 2-cell embryo.

A high concentration of chlorogenic acid, although effective in preserving early embryos, damaged cell membranes（upper panel）.

中濃度区（62.3×10－６g/ml，コーヒー粕抽出液添の歪みや割球の変形が認められ，クロロゲン酸単

加10％と同濃度），低濃度区（62.3×10

g/ml）

独での効果は低かった。前述のとおり，クロロゲ

で効果を比較した。その結果，今回比較した濃度

ン酸には抗酸化作用があるが，受精卵の未凍結保条件では，高濃度で細胞膜へのダメージが少な

存では，低温によるダメージが生じていた可能性

く，未凍結保存への有効性が認められた（Fig.

があり，抗酸化効果を発揮するに至らなかったと

３）。しかし，中・低濃度区においては，細胞膜考えられる。

－７© The Ito Foundation

144

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

本研究では，コーヒー粕抽出液とその成分であ

フェイン単独でもコーヒー粕抽出液に含まれる同るカフェインおよびクロロゲン酸をUW液に添加

成分の10倍量を添加することで，保存に有効であすることで，受精卵の未凍結保存が可能であるこることを確認した。しかし，カフェイン濃度を上とを示した。動物種や対象細胞に最適な条件検討

げていくと，ピペッティング操作によって透明帯を行う必要はあるが，適切な条件を構築できれが破れるなどの細胞損傷も認められた。一方，ク

ば，新規保存法としての発展が期待されるため，

ロロゲン酸単独では，高濃度区において受精卵の引き続き生殖細胞の未凍結保存に有効な成分を探保存に有効であったが，細胞膜へのダメージも認索し，保存条件の最適化を図っていく予定である。

められたことから，単独での効果は低いと考えら

４．要れた。低温に暴露することにより，細胞は低温障

約害を起こしている可能性が考えられるが，コー

本研究では，未凍結での受精卵の保存法の確立

ヒー粕抽出液の添加によって，受精卵を良好な状を目指して，植物由来成分の有効性と至適条件の態で保存できたことから，コーヒー粕抽出液には検討を行った。研究代表者によるこれまでの研究

低温障害から細胞を保護する効果があったと考えから，臓器保存液として利用されているUW液が，られる。今後の研究で成分の組み合わせや保存温

生殖細胞の未凍結保存に有効であることが明らか

度についても検証し，長期間の保存を目指すととになっていることから，本研究ではUW液を基礎

もに，より簡便な保存法の確立に繋げていく。

保存液として用いた。添加する植物由来成分には，過冷却促進作用と抗氷核活性の高いコーヒー
粕抽出液を選択し，その含有成分と合わせて未凍結保存への有効性を検証した。その結果，受精卵（２細胞期胚）はUW液を用いた場合，－６℃の温度条件で72時間保存することができたが，一部の受精卵では細胞膜の変形が認められた。このダメージは，コーヒー粕抽出液（終濃度10％）を添加することで軽減させることができた。コーヒー
粕抽出液を添加した条件では，形態的なダメージは確認されず，－６℃の条件下で良好な状態で受精卵を保存できた。コーヒー粕抽出液にはカフェ
イン，カフェ酸，クロロゲン酸，キナ酸が含まれている。保存への有効成分を特定するため，この含有成分のうち氷核形成阻害作用と抗酸化作用が知られているカフェインとクロロゲン酸に注目し，その単独での効果を検証した。その結果，カ文
献１） Mandawala, A. A., et al.：Cryopreservation ofanimal oocytes and embryos：Current progress
and future prospects, Theriogenology, 86（7）, 1637
～1644, 2016.
２）
 Saragusty, J., Arav, A.：Current progress inoocyte and embryo cryopreservation by slow
freezing and vitrification, Reproduction, 141（1）, 1～
19, 2011.
３）
 Berendsen, T. A., et al.：Supercooling enables
long-term transplantation survival following 4 daysof liver preservation, Nat Med, 20（ 7）, 790～793,
2014.
４）
 Kawahara, H., et al.：Characterization of AntiIce Nucleation Activity of the Extract from Coffee
Refuse, Biocontrol Sci, 22（4）,205～211, 2017.
５）
 Hoshino, Y., Sato, E.：Protein kinase B（PKB/
Akt）is required for the completion of meiosis inmouse oocytes, Dev Biol, 314（1）,215～223, 2008.
６）
 Ariu, F., et al.：Effect of caffeine treatment
before vitrification on MPF and MAPK activity
and spontaneous parthenogenetic activation of invitro matured ovine oocytes, Cryo Letters, 35（6）,530～536, 2014.

© The Ito Foundation

145

内腔の有無に着目したウシ形成期黄体の機能解析
Function analysis of the corpus luteum with cavity during luteal formationin cows

窪

友

瑛１・古

山

敬

祐２

（１北海道立総合研究機構酪農試験場，２大阪公立大学大学院獣医学研究科）

Tomoaki Kubo１ and Keisuke Koyama２（１Dairy research center, Hokkaido research organization, ２Graduate school of veterinary science, Osaka metropolitan university）

The purpose of this study was to determine the relationship between the presence of acavity in corpus luteum（CL）during luteal formation and that luteal function. Forty-five
Holstein lactating cows were inseminated at day 0 and classified into Compact CL, Small-cavity
CL（the cavity size to the total CL size ratio below median）, and Large-cavity CL（that ratio
above median）groups based on the presence of cavity and the size of cavity on day 5. The
conception rate at day 30 was significantly higher in the Small-cavity CL group（80.0%）thanin the Compact CL group（26.7%）. Comparison of luteal blood flow area by color Doppler
ultrasonography showed that the area was significantly larger in the Small-cavity CL groupthan in the Compact CL group on day 5, while no difference was observed in the luteal tissue
area and the plasma progesterone（P4）concentration. Therefore, the higher conception rate
observed in the Small-cavity CL group was presumably related to increased luteal blood flow.
Fifty-two formative luteal corpora lutea were obtained from ovaries derived fromslaughterhouses of meat breeds, and the experiment groups were classified in the samemanner as described above. Concentrations of P4, total cholesterol, and glucose in the luteal
tissue were analyzed. Although there were no significant differences in P4 and total cholesterol
concentrations in the CL tissue between the groups, the glucose concentration in the tissue ofthe Large-cavity CL group was lower than that of the Compact CL group and the Smallcavity CL groups. This result was suggesting that the CL with large cavity may have lower P4
production capacity. These results provide the evidence for the high fertility in cows withsmall- to medium-sized cavity in the CL during luteal formation.

１．目

合があることが知られており，超音波検査で黄体的を観察すると，内腔の存在が容易に確認できる。

黄体は，妊娠の成立と維持に必須のステロイド

これまで複数の研究１～３）において，黄体におけるホルモンであるプロジェステロン（P４）を分泌内腔の有無により，人工授精（AI）あるいは受する内分泌器官である。ウシにおいては，黄体の精卵移植（ET）後のウシの受胎率に差はないと中心部に内容液が貯留した腔（内腔）を有する場

報告されてきた。我々は，AI後の泌乳牛におけ© The Ito Foundation

146

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

る内腔の有無と受胎率との関係について，内腔の確認時期や内腔サイズを考慮して解析した結果，
黄体開花期での内腔の有無で受胎率に差はない
が，黄体形成期において内腔がある場合に受胎率

２．方法

2 . 1 形成期黄体の内腔の有無による黄体血流量の比較が有意に高いこと，さらに同時期において内腔サ

北海道立総合研究機構酪農試験場のフリース

イズが大きくなると受胎率が低下することを明ら

トール牛舎で飼養されているホルスタイン種泌乳かにした。これらの結果は，形成期黄体において

牛のべ45頭（産次：2.2±0.9産，分娩後日数：93.2

小さい内腔が存在することが，ウシの受胎性にポ±35.6日，乳量：36.8±6.3kg／日，平均±SD）を

ジティブな影響を与えている可能性を示している。

供試した。歩数計による活動量増加またはスタン

黄体形成期において，妊娠の成立に対する黄体

ディング行動が確認された個体においてAIを実由来P４ の役割は特に重要である。妊娠牛は，非施し，AI後24時間以内の排卵確認および１個排妊娠牛に比べAI後５日目頃から血中P４ 濃度が高卵した個体のみを調査対象とした。AI日を０日

く推移している 。また，AI後５日目のウシに腟目として，AI後５および12日目にカラードプラ

内留置型P４製剤を投与すると，胚伸長が早まり，機能付き超音波検査装置（HS－1600Ｖ，本多電子）

妊娠シグナル物質であるIFNτの分泌量が高まるを使用した経直腸超音波検査およびヘパリン加真

ことも知られている 。これらのことから，形成

空採血管（VP－H100K，テルモ）を用いた採血を期黄体から分泌されるP４ は，近傍の卵管・子宮実施した。供試牛は，AI後30日目に超音波検査に作用し，胚発生および発育を支える局所環境のにより妊娠診断を実施した。

４）

５）構築を促すことで，ウシの高い受胎性に寄与する

超音波検査は，Ｂモードおよびパワードプラと考えられている。一方，酪農試験場の泌乳牛にモード（Fig.１）で黄体画像を撮影し，画像解析

おいて，黄体形成期の血中P４濃度を調べた結果，ソフト（Image J，NIH）を使用して黄体全体面

内腔の有無で血中P４ 濃度に差は認められなかっ積，黄体内腔面積および黄体血流面積を測定した。しかし，先行研究において，開花期黄体の組た。測定したデータから黄体組織面積（黄体全体

織中P４ 濃度は，内腔のない黄体と比較して内腔

面積－黄体内腔面積）および黄体内腔比（黄体内を有する黄体で有意に高いことが報告されている

腔面積／黄体全体面積）を算出した。AI後５日

ため ，内腔を有する形成期黄体は，局所におけ目の黄体における内腔の有無および黄体内腔比のるP４ 産生能が高く，ウシの高い受胎性に寄与し違 い に 基 づ き ，内 腔 の な い 個 体 を 無 腔 群ている可能性がある。

（Compact CL），内腔比が10.2％（中央値）未満

６）以上より本研究では，形成期黄体における内腔の 個 体 を 小 腔 群 （Small － cavity CL） お よ びの存在と卵巣局所における黄体機能との関連性を10.2 ％ 以 上 の 個 体 を 大 腔 群（Large － cavity CL）

明らかにすることを目的として，近年，黄体機能に分類し，AI後30日目の受胎率，黄体組織面積，の評価指標として活用されているカラードプラ超

黄体血流面積および血中P４濃度を比較した。

音波検査による黄体血流量の評価，および食肉処

採取した血液は，４℃，1,500ｇ，30分間の遠理場由来卵巣から採取した黄体組織におけるP ４

心分離後に血漿サンプルとし，血中P４ 濃度測定

濃度の解析を実施した。

まで－30℃で保管した。血中P ４ 濃度測定は，
Takenouchiら７）の方法に則り実施した。受胎率© The Ito Foundation

内腔の有無に着目したウシ形成期黄体の機能解析

147

Fig. 1 Example of a luteal blood flow image taken in the power Doppler mode of ultrasonography.

The colored area surrounding the corpus luteum was calculated using Image J software and defined as the luteal

blood flow area.

の統計解析については，受胎の有無を目的変数と黄体から５mm角程度の組織を切り出し，重量し，試験群および産次を説明変数とした一般化線

測定後に15秒以上液体窒素に浸漬し，その後解析形モデル（リンク関数：ロジット関数）を実施しまで－80℃で保管した。黄体組織0.1ｇ当たり１％た。その他の項目の統計解析は，Tukey HSD法

BSA － PBS を １ mL を 加 え ，ホ モ ジ ナ イ ザ ー

により多重比較を実施した。解析には，Ｒソフト（TH115－PCR，OMNI）で15,000rpm，２分間ホウェア（ver．4.0.2）を使用した。

モジナイズを実施した。得られた懸濁液を1,500

2 . 2 形成期黄体の内腔の有無による黄体組織

ｇ，15分間遠心分離し，上清を採取した。黄体組
織中P４ 濃度測定は，上清サンプルを用いて前述

中P４濃度の比較
食肉処理場（京都食肉市場（株））において，

した手法で実施した。なお，希釈倍率は500倍と黒毛和種またはＦ１種のと殺後の卵巣を採取し，した。また，上清サンプル中の総コレステロール

卵巣の肉眼的所見から卵巣周期のステージを推定

濃度およびグルコース濃度は，生化学自動分析装

し８），黄体形成期に相当する黄体を52個取得した。

置（3100，日立）を用いて測定した。統計解析は，取得した黄体に割入れを実施し，黄体全体および試験群間の各測定値について，Tukey HSD法に内腔の長径および短径を記録し，黄体全体面積おより多重比較を実施した。

よび黄体内腔面積を測定した 。前述と同様に，
９）

黄体組織面積および黄体内腔比を算出した。内腔のない黄体を無腔群，内腔比が7.0％（中央値）
未満の黄体を小腔群および7.0％以上の黄体を大３．結果と考察3 . 1 形成期黄体の内腔の有無による黄体血流量の比較

腔群に分類し，黄体組織面積，黄体組織中のP４各試験群におけるAI後30日目の受胎率をTable

濃度，総コレステロール濃度およびグルコース濃１に示した。受胎率は，無腔群（26.7％）と比較

度を比較した。

して小腔群（80.0％）において有意に高かった。

© The Ito Foundation

148

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 1 Comparison of conception rate, luteal tissue area and plasma progesterone concentration after artificial

insemination in dairy cows with corpus luteum（CL）having cavity or not.
day5

day12

Conception
rate（%）

Luteal tissue area
（mm２）

Plasma P４＊２
（ng/ml）

Luteal tissue area
（mm２）

Plasma P４＊２
（ng/ml）

Compact CL（n=15）

26.7ａ302.4±14.9

1.31±0.09

535.4±22.4

5.62±0.30ａ

Small-cavity CL＊１（n=15）80.0ｂ339.3±12.5

1.54±0.11

551.5±20.6ａ

5.64±0.37ａ

Large-cavity CL ＊１（n=15）

53.3

310.0±27.9

1.36±0.09

483.6±22.7ｃ

4.66±0.28ｃ

Experiment groups＊１：At day 5 after insemination, the experimental groups were classified as having the median luteal cavity ratio（the ratio of

luteal cavity area to the total luteal area）of less than 10.2%（Small-cavity CL）and greater than 10.2%（Large-cavity CL）.
＊２：progesterone

Data are shown as mean±SEM. Different superscript letters indicate significant differences（ab：p<0.01, ac：p<0.05）between
groups.

これまで我々は，黄体形成期にあたるAI後４－

0.10）。ET後に妊娠した泌乳牛は，非妊娠牛と比６日目の泌乳牛において，内腔がない黄体を有す

較してET時の黄体血流面積が約1.42倍大きいこる個体と比較して，内腔がある黄体を有する個体とが報告されており11），黄体形成期における黄体の受胎率が高く，内腔がある黄体を有する個体の血流量の増加が，ウシの高い受胎性に繋がること

中でも，黄体内腔比が中央値未満の内腔がある黄が明らかとなっている。一方，この報告において体を有する個体と比較して中央値以上の内腔があは，妊娠牛と非妊娠牛間のET時の血中P４濃度にる黄体を有する個体で受胎率が低下することを明差は認めていなかった。これらのことから，本研

らかにしている（投稿準備中）。さらに，ET時の究において小腔群で認められた高い受胎率は，黄黄体に内腔を有するホルスタイン種未経産牛の受体組織面積や血中P４ 濃度の影響ではなく，黄体

胎率は，内腔のない黄体を有する個体と比較して血流量の増加が関与していると推察された。黄体

有意に高いことが本年報告されている 。

血流量が増加することが，ウシの受胎性を向上さ

10）

AI後５日目の黄体組織面積および血中P４ 濃度

せる要因についてはよく分かっていない。黄体のについては，試験群間で有意差は認められず，ある卵巣と同側の卵管 13）および子宮角 14）のP４ 濃

AI後12日目の黄体組織面積および血中P４濃度は，度は，反対側のそれらよりも高くなることが示さ小腔群と比較して大腔群で低値を認めたれている。黄体内の活発な血流は，P４ 合成に必

（p<0.05）（Table１）。先行研究において，黄体内

要な栄養および基質を供給し，局所的な分泌によ腔の有無は血中P４濃度に影響しないことや，り黄体と同側の卵管や子宮角のP４ 濃度を高め，80mm を超える大きな内腔を有する黄体の場合胚の生存と妊娠の成立に寄与する可能性が考えら

は，血中P４ 濃度が低下することが示されておれる。今後，黄体における内腔の有無と卵管おより，本研究結果はこれらの結果を支持するものでび子宮角におけるP４ 濃度の関係性を明らかにすある。Fig.２に，各試験群におけるAI後５およびる必要がある。

６，12）

２

１）

12日目の黄体血流面積を示した。AI後５日目の黄体血流面積は，無腔群と比較して小腔群で大き3 . 2 形成期黄体の内腔の有無による黄体組織
中P４濃度の比較

く（p<0.05），AI後12日目についても，無腔群と黄体組織面積，黄体組織中P４ 濃度および総コ

比 較 し て 小 腔 群 で 大 き い 傾 向 を 認 め た（ｐ ＜レステロール濃度は，各試験群間でいずれも有意© The Ito Foundation

149

Luteal blood ﬂow area（mm2）

内腔の有無に着目したウシ形成期黄体の機能解析
70

Compact CL

60

Small-cavity CL

50

Large-cavity CL

40

b

B

A

30
20

a

10
0

5

days after insemination

12

Fig. 2 Comparison of luteal blood flow area between the experiment groups.

At day 5 after insemination, the experimental groups were classified as having the median cavity ratio（the ratioof luteal cavity area to the total luteal area）in the corpus luteum（CL）of less than 10.2%（Small-cavity CL）and
greater than 10.2%（Large-cavity CL）.
Data are shown as mean±SEM. Different superscript letters on the same day indicate significant difference orsignificant tendency（ab：p<0.05, AB：p<0.10）between groups.

Table 2 Comparison of luteal tissue area, concentrations of progesterone, total-choresterol and glucose in the formative

corpus luteum（CL）tissues in beef cows.
Experiment groups

Luteal tissue area
（mm２）

Progesterone（µg/g）

Total choresterol（mg/g）

Glucose（mg/g）

Compact CL（n=25）

276.4±15.3

27.2±2.0

185.6±10.0

32.0±2.2a

Small-cavity CL＊（n=13）

280.4±25.1

26.3±2.8

188.5±16.4

32.3±3.0Ａ

Large-cavity CL＊（n=14）

230.2±23.7

21.4±1.9

209.3±16.6

23.6±1.7bＢ＊：The experimental groups were classified as having the median luteal cavity ratio（the ratio of luteal cavity area to the totalluteal area）of less than 7.0%（Small-cavity CL）and greater than 7.0%（Large-cavity CL）.
Data are shown as mean±SEM. Different superscript letters indicate significant difference or significant tendency（ab：p<0.05,
AB：p<0.10）between groups.

差を認めなかった（Table２）。内腔の有無に着目

テージの中では黄体形成期に最も高いことが示さして黄体組織中P４ 濃度測定を実施した研究は，れている15）。そのため，黄体形成期において黄体

私の知る限り１報６）のみである。この研究では，内腔に貯留した内腔液がP４ 前駆体の供給源としホルスタイン種の開花期黄体を対象としており，て機能し，黄体組織中のコレステロール濃度が上

黄体組織中P４ 濃度は，内腔がある場合に有意に昇する可能性が考えられたが，本研究ではそのよ

高いことを示している。本研究では，肉用種の形

うな結果は得られなかった。一方，大腔群におけ

成期黄体を対象としたため，品種や卵巣周期のスる黄体組織中グルコース濃度は，無腔群および小テージの違いが影響した可能性はあるが，詳細は腔群と比較して低かった（それぞれｐ＜0.05およ

不明である。

びｐ＜0.10）。グルコースは，形成期黄体細胞のコレステロールはP４ の前駆体であり，黄体内培養実験において，P４ 産生を増加させることが腔液中のコレステロール濃度は，卵巣周期のス示されている16）。また，有意差はないものの，黄© The Ito Foundation

150

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

体組織中P４濃度は大腔群で最も低い数値であり，ス濃度の解析を実施した。黄体組織中P４ および

これらのことから，内腔の大きい黄体のP４ 産生

総コレステロール濃度は，各試験群間でいずれも能は低い可能性がある。さらに，Table１に示し有意差を認めなかった。一方，大腔群における黄たAI後12日目の泌乳牛のデータでは，大腔群に体組織中グルコース濃度は，無腔群および小腔群

おける黄体組織面積が有意に小さかった。そのたと比較して低く，内腔の大きい形成期黄体はP４

め，内腔の大きい黄体は，P４ を産生する組織量

産生能が低い可能性が示された。以上より本研究および産生能の２つの側面で，内腔の小さい黄体

結果は，小～中程度サイズの内腔のある黄体を持よりも劣ると考えられる。

つウシの高い受胎性を裏付ける基礎的知見となる以上より本研究結果は，小～中程度サイズの内と考えられる。

腔のある黄体を持つウシの高い受胎性を裏付ける
基礎的知見となると考えられる。また，黄体内腔の評価は今後，受卵牛選定の際や，AI後早期のホルモン剤投与による不妊治療を実施する際の新たな指標として活用され，ウシの受胎率向上に寄与することが期待できる。
４．要

約

本研究では，形成期黄体における内腔の存在と卵巣局所における黄体機能との関連性を明らかにすることを目的とした。人工授精（AI）後のホ
ルスタイン種泌乳牛45頭を供試し，AI後５日目の黄体内腔の有無および内腔サイズに基づき，無腔群，小腔群（黄体全体に対する内腔の比率が中央値未満）および大腔群（同比率が中央値以上）に分類した。AI後の受胎率は，無腔群（26.7％）と比較して小腔群（80.0％）において有意に高かった。カラードプラ超音波検査による黄体血流面積の比較では，AI後５日目の黄体血流面積は，無腔群と比較して小腔群で有意に大きかった一方，黄体組織面積や血中プロジェステロン（P４）濃度に差は認められなかった。そのため，小腔群で認められた高い受胎率は，黄体血流量の増加が関与していると推察された。また，肉用種における食肉処理場由来卵巣から形成期黄体を52個取得
し，上述と同様に試験群の分類を実施し，黄体組
織におけるP４，総コレステロールおよびグルコー

文献１） Kastelic, J. P., Bergfelt, D. R., Finther, O. J.：
Theriogenology, 33（6）,1269～1278, 1990.
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３）
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Y.：J Reprod Dev., 47, 283～294, 2001.
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 Jaśkowski, B. M., Herudzińska, M., Gehrke, M.,Niżański, W.：Theriogenology, 178, 73～76, 2022.
11）
 Kanazawa, T., Seki, M., Ishiyama, K., Kubo, T.,
Kaneda, Y., Sakaguchi, M., Izaike, Y., Takahashi,
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12） Perez-Marin, C.：Reprod Dom Anim., 44, 384～
389, 2009.
13）
 Wijayagunawardane, M. P. B., Cerbito, W. A.,
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K., Sato, K.：Theriogenology, 46（ 7）, 1149～1158,
1996.
14）
 Takahashi, H., Haneda, S., Kayano, M., Matsui,
M.：J Vet Med Sci., 78（4）,613～618, 2016.
15）
 Rizzo, A., Stefani, A. L., Piccinno, M., Roncetti, M.,
D’Onghia, G., Sciorsci, R. L.：Res Vet Sci., 109, 56～
58, 2016.
16）
 Nishimura, R., Hasegawa, H., Yamashita, M., Ito,
N., Okamoto, Y., Takeuchi, T., Kubo, T., Iga, K.,
Kimura, K., Hishinuma, M., Okuda, K.：J Vet Med© The Ito Foundation

内腔の有無に着目したウシ形成期黄体の機能解析
Sci., 79, 1878～1883, 2017.

© The Ito Foundation

151

152

牛黄体血流の多寡は子宮内膜機能の局所調節に関与するのか？
Is bovine blood flow involved in the local regulation of endometrial
functions?

金

澤

朋

美・木

崎

景一郎

（岩手大学農学部共同獣医学科）

Tomomi Kanazawa and Keiichiro Kizaki（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University）

Luteal vascularity is essential for progesterone（P4）biosynthesis from corpus luteum, andinfluences fertility in cattle. However, no studies have investigated the mechanism that luteal
vascularity controls fertility. The present study was conducted to investigate influences ofluteal vascularity on endometrial functions. Ultrasound examinations were performed on 6
Japanese Black cattle to evaluated maximum diameter of corpus luteum（CL）, CL area, CL
tissue area, and blood flow area（BFA）on Day 7（Day 0 = the day of estrus）. After ultrasoundexamination, endometrial biopsy samples and blood samples were collected from these cattle.
Plasma and endometrial P4 concentrations were measured by enzyme immunoassay analysis.
RNA-sequencing（RNA-seq）was performed to determine endometrial gene expression. No
differences in CL area, CL tissue area, and plasma and endometrial P4 concentrations wereobserved between high（HV；n = 3）and low vascularity（LV； n = 3）groups. BFA was
greater in HV group than in LV group（p < 0.01）. RNA-seq dataset revealed that highvascularity of the CL altered the expression of 386 differentially expressed genes（DEGs；248
up- and 138 down-regulated）. In addition, DEGs were retrieved for gene ontology enrichment
analysis. Up-regulated genes were mainly associated with cell adhesion, extracellular matrixorganization, and regulation of leukocyte apoptotic process. In conclusion, it was suggested thatendometrial gene expression on Day 7 may change according to the amount of luteal
vascularity, and thereby influence fertility.

１．目

で維持され，胚の正常な発育と着床に適した子宮的内環境の構築が必要不可欠である。近年，超音波

近年，牛の繁殖成績の低下は深刻な問題であドプラ法が牛の繁殖領域に応用されたことで黄体り，受胎性に関わる要因の探索，ならびに受胎性血流の観察が容易となり，新たな黄体機能評価法

向上に資する技術の開発は急務である。牛の妊娠として注目されている。これまで，胚移植（ET）

成立には，卵巣に機能的な黄体が存在し，妊娠維

時とET後７日（発情後７および14日）において持に必要なプロジェステロン（P４）が高い濃度

受胎牛の黄体血流は不受胎牛と比較して多く，黄© The Ito Foundation

牛黄体血流の多寡は子宮内膜機能の局所調節に関与するのか？

153

体血流が受胎性に関与していることが明らかににより，最大直径，黄体面積（最大直径での断面なっている 。しかし，受胎牛と不受胎牛では末積），黄体内腔面積（内腔が存在した場合：最大梢血中P４濃度の推移に差がなく１），黄体血流の多直径での黄体内腔の断面積），黄体組織面積（黄寡が受胎性に影響を及ぼすメカニズムは解明され体面積と黄体内腔面積の差）および黄体血流面積ていない。一方，黄体と同側子宮角先端の内膜組（BFA）を算出し，３回の平均値をデータとして織のP４ 濃度は反対側と比較して高く，黄体から

使用した。

１）

分泌されたP４ が卵巣静脈，動脈および子宮動脈

2.3を介し同側子宮角へ局所的に作用することが示唆

子宮内膜組織採取前に頸部静脈よりヘパリン加されている 。また，子宮内膜組織のP４濃度は，真空採血を用いて採血を行った。血液を遠心分離

受胎性関連遺伝子の発現に影響を及ぼすことが明後，血漿を採取しP４ の測定まで－35℃で保存しらかにされている２，３）。これらのことから，黄体た。キシラジン製剤（セデラック２％注射液，日

血流と受胎性には卵巣・子宮間の局所的なメカニ

本全薬工業（株））0.05mg/kgを用いて鎮静後，ズムが存在し，黄体血流の多寡が黄体と同側子宮２％リドカイン（キシロカイン注射液２％，アス

角内膜組織のP４ 濃度や妊娠成立に関与する遺伝

ペンジャパン（株））により尾椎硬膜外麻酔を子発現に影響を及ぼし，胚の着床・受胎を制御し行った。滅菌済み子宮内膜採取器（富士平工業ている可能性が推察される。

（株））を用いて，黄体側子宮角先端の子宮内膜組

２）

子宮内膜組織および血液の採取

そこで本研究では，子宮内膜組織の網羅的遺伝織を採取した。採取した子宮内膜組織は液体窒素

子発現解析を行い，黄体血流量と子宮内膜組織のにて凍結し，P４の測定およびRNA抽出まで－80℃

P４ 濃度および発現変動遺伝子との関係を調べ，で保存した。内膜組織採取後，トラネキサム酸製

黄体血流の多寡が子宮内膜の局所的な機能調節に剤（トラムリン，日本全薬工業（株））を10mg/

関与しているか否かを明らかにすることを目的と

kg，サリチル酸ナトリウム製剤（ザルソブロガ

した。

糖注NZ，日本全薬工業（株））を6.5mg/kg静脈

２．方
2.1

内投与した。

法

2.4

供試材料

P４濃度の測定

血漿および子宮内膜組織中P４ 濃度を酵素免疫

健康で発情周期が正常な黒毛和種経産牛６頭を測定法により測定した。

供試した。発情日をDay ０とし，Day ７に卵巣2.5の超音波検査を行い，同時に子宮内膜組織および

子 宮 内 膜 バ イ オ プ シ ー 試 料 か ら TRIzol 試 薬

血液を採取した。
2.2

RNA抽出

（Thermo Fisher Scientific）を 使 用 し て 総 RNA

超音波検査による黄体血流量の測定を抽出した。抽出したRNAの濃度および品質は，

Day ７ に 超 音 波 画 像 診 断 装 置（MyLab One

RNA 6000 Pico kit（Agilent）を用いて，Agilent

Vet，Esaote SpA）を用いて卵巣の観察を行っ

Bioanalyzer 2100を使用して測定した。得られたた。はじめにＢ－モードを用いて黄体の静止画をRNAの品質は，RNA Integrity Number値はいず

３回記録し，次にカラーフローマッピングモード

れも7.5以上であったことから，RNAシークエンを用いて黄体のドプラ画像を３回記録した。画像

シング（RNA－seq）による網羅的遺伝子発現解解析ソフト（Image J，Wayne Rasband（NIH））

析に供した。

© The Ito Foundation

154
2.6

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

黄 体 の 最 大 直 径 ，黄 体 面 積 ，黄 体 組 織 面 積 ，RNA－seq解析

抽 出 RNA か ら NEBNext Poly （A）mRNA

BFA お よ び P ４ 濃 度 の ２ 群 間 の 差 の 検 定 に はMagnetic Isolation Module （New England

Brunner－Munzel検定を行い，危険率５％未満をBiolabs）を用いてPoly（A）を分離，NEBNext

有意差ありとした。すべてのデータは平均±標準ⓇⓇ

誤差で示した。

UltraTMII Directional RNA Library Prep Kit を使用してRNA－seqのライブラを調製した。デー

３．結果と考察タ取得には，Illumina NovaSeq 6000 Sequencing
system（Illumina）を使用した。生シークエンシ

3.1

ングデータは，ソフトウエアFastQC v0.11.7によBFAに基づき分類したHV群およびLV群につる品質チェック，Trimmomatic v0.38によるシー

いて，黄体の最大直径，黄体面積，黄体組織面積

ケンスリードのトリミング，HISAT2 v2.1.0によおよびBFAの比較を行った（Table１）。黄体の最るマッピングした。マッピングにはBos taurus

大直径，面積および組織面積は２群間で差が認め

ARS－UCD1.2 （http://asia.ensembl.org/Bos_

られなかった。黒毛和種牛において，Day ７のtaurus/Info/Index）をリファレンスゲノムとし黄体の最大直径は平均22～23mmと報告されておて使用した。標準化した発現量は，ソフトウエアり４），本研究においても同様の結果となった。まfeatureCounts v1.6.3を用いてマッピングされたた，BFAは，HV群（92.97±15.92mm２）とLV群

フラグメントのカウントを行い，transcripts per（43.56±1.62mm２）で有意な差が認められた（Pmillion（TPM）値として算出した。また，ソフ＜0.01）。ET時（Day ７）のBFAによる受胎性診

トウエアstats v3.6.1による階層型クラスター解

断基準は43.0mm２であり１），それ以下の牛では受析，主成分分析，相関評価，ヒートマップ作成を

胎性が低い。したがって，本研究のLV群は受胎実施するとともに，DESeq2 v1.24.0による発現変性が低い牛群であると考えられた。

動遺伝子の抽出，plotly v4.9.2.1によるVolcanoプ
ロット作成を行った。Gene ontologyエンリッチ
メント（GO）解析は，DAVID webservice v1.22.0を使用して実施した。
2.7

各群の黄体の形態および血流量の比較

3 . 2 黄体血流量が血漿および子宮内膜組織中
P４濃度に及ぼす影響
各群の血漿および黄体側子宮角先端の子宮内膜
組織中P４ 濃度をTable２に示した。血漿・子宮内統計解析

膜組織中P４ 濃度ともにHV群とLV群で差は認め

BFAに基づき，供試牛を血流の多い群（HV，られなかった。乳用種において，Day ５または

n＝３）と少ない群（LV，n＝３）に分類した。

６の子宮内膜組織中P４ 濃度は，黄体側子宮角先Table 1 Features of the corpus luteum（CL）in the high（HV）and low（LV）vascularity

groups on Day 7.

Item

HV（n = 3）

LV（n = 3）

p value

CL maximum diameter（mm）

22.3 ± 0.8

23.5 ± 1.7

0.62

CL area（mm２）341.48 ± 25.13

370.33 ± 44.71

0.62

CL tissue area（mm２）322.20 ± 43.34

353.71 ± 39.82

0.26

BFA（mm２）

92.97 ± 15.92

43.56 ± 1.62

<0.01

Abbreviation : BFA, blood flow area.

© The Ito Foundation

155

牛黄体血流の多寡は子宮内膜機能の局所調節に関与するのか？
Table 2 Plasma and endometrial progesterone（P４）concentrations on Day 7.
P４ concentrations
Group

Plasma（ng/ml）

Endometrium（ng/g）

HV（n = 3）

2.25 ± 0.10

6.94 ± 0.51

LV（n = 3）

1.97 ± 0.14

6.32 ± 0.39

Table 3 Summary showing various endopoints form RNA-sequencing of endometrial

samples.

Group

Number of
total reads

Number oftrimmed reads

Number of
mapped reads

Mapping rate（%）

HV（n = 3）

31,706,692—
35,930,820

31,244,730—
35,469,172

30,670,678—
33,531,666

98.16—98.19

LV（n = 3）

29,315,820—
36,257,882

28,903.21235,781,076

28,405,523—
35,079,523

98.04—98.28

端・外側分岐部付近でそれぞれ32.6±3.7ng/gお実施したRNA－seq実験はより信頼性が高い結果

よび16.4±4.2ng/gと報告されている２）。本研究でであると考えている。また，検出された子宮内膜

は，HV群・LV群ともにこれらの報告に比較してに発現している遺伝子数は13,000程度であり，低値を示した。

Mesquitaらの解析で得られた14,000遺伝子と同程3.3度であった。

RNA－seq実験の評価

黄体血流量の多寡が子宮内膜組織の遺伝子発現に及ぼす影響を明らかにするため，HV群（ｎ＝3 . 4 子宮内膜組織における網羅的遺伝子発現解析３）およびLV側（ｎ＝３）の子宮内膜組織から前述の3.3において得られたRNA－seqデータを抽出したRNAからRNA－seq用ライブラリーを調もとに解析を進めた。HV群およびLV群の子宮内製した。各試料からは約3000万程度の生シーケン

膜組織で検出された約13,000遺伝子の発現強度をスリードを得ることができた（Table３）。品質のFig.１に示した。HV群およびLV群の子宮内膜組低いリードやアダプター配列，短いリードをトリ織の群間において一定の傾向は認められず，HV

ミングで除去し，リファレンスゲノムへマッピン

群・LV群を問わず各試料で特徴的な発現強度をグしたところ，いずれも98％程度であった。検出示していた。さらに，主成分分析による各試料にされた遺伝子数としては，HV群およびLV群の両おける遺伝子発現全体のパターンの類似性を調べ方で約13,000だった。

たところ，HV群およびLV群の子宮内膜組織間でMesquitaらによるウシ子宮内膜組織のRNA－

特徴的なパターンは認められなかった（Fig.２）。

seqによる解析では，トリミング後のリード数はしたがって，これらの結果から，黄体血流の多寡

1000万から3000万であり，試料間によって大きなによって子宮内膜組織における遺伝子発現のパ差異が認められ，さらにマッピング率は60％程度

ターンは大きく影響を受けないことが考えられた。

だった 。本研究では，トリミング後のリード数

一方，HV群およびLV群の子宮内膜組織間で発に試料間での大きな差異は認められず，マッピン

現 の 差 異 が 認 め ら れ る 遺 伝 子（Differentially

グ率も約98％と高値を示したことから，本研究でexpressed genes，DEGs）を抽出したところ，

５）© The Ito Foundation

156

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Cow No.

4

6

5
LV

1
Group

2

3

HV

Fig. 1 Heatmap of gene expression in endometrium on the high（HV ; n = 3）and low（LV ; n = 3）vascularity groups.

Profile of gene expression in endometrium were measured by RNA-seq. Each columns represent gene expression

intensities. The gradation from blue to red in the columns indicates the intensity of each gene. Blue column, low
expression; Red, high expression.

2

トーシス制御に関する遺伝子群の変動が認められ4た。DEGの各遺伝子については，今後，定量的PC2 : 28% variance50

リアルタイムRT－PCR法にて検証するとともに，詳細を精査する予定である。

0
3

6

1

今回得られた研究結果から，黄体血流の多寡により子宮内膜の遺伝子発現の全体像は大きく変動－50

しないが，少なからず影響を受ける遺伝子も存在
5

－50

0
50
PC1: 31% variance100

Fig. 2 Principal component analysis of endometrium on

the high（HV ; n = 3）and low（LV ; n = 3）vascularity
groups.
Profile of gene expression were measured by RNAseq. Principal component analysis （PCA） was
performed by stats v3.6.1. The numbers wereindicated the endometrium samples on the HV（No.
1―3）and LV（No. 4―5）groups.

すること，さらに，これらの遺伝子の変動が受胎性に影響を及ぼす可能性が考えられた。
４．要

約

本研究では，黄体血流の多寡が子宮内膜の局所的な機能調節に関与しているか否かを明らかにするため，発情後７日の子宮内膜組織の網羅的遺伝
子発現解析を行い，黄体血流量と血漿・子宮内膜
組織中P４ 濃度および発現変動遺伝子との関係を

HV群の子宮内膜組織において高発現であった調べた。その結果，黄体血流の多い群（HV群）

248遺伝子および低発現であった138遺伝子を同定と少ない群（LV群）では血漿および子宮内膜組した（log2 Fold change >1，p＜0.05）。これらの織中P４ 濃度に差が認められなかった。一方，子遺伝子について，GO解析を実施したところ，細宮内膜組織のRNA－seqデータに基づく主成分分

胞接着や細胞外マトリックス構築，白血球のアポ析により遺伝子発現全体のパターンの類似性を調© The Ito Foundation

牛黄体血流の多寡は子宮内膜機能の局所調節に関与するのか？

べたところ，HV群およびLV群の子宮内膜組織間で特徴的なパターンは認められなかった。したがって，黄体血流の多寡によって子宮内膜組織における遺伝子発現のパターンは大きく影響を受けな い と 考 え ら れ た 。し か し ，発 現 変 動 遺 伝 子（DEG）の抽出を行い，HV群の子宮内膜組織において高発現であった248遺伝子および低発現であった138遺伝子を同定した。さらに，抽出した
DEGについてGO解析を行ったところ，細胞接着や細胞外マトリックス構築，白血球のアポトーシ
ス制御に関する遺伝子群の変動が認められた。以上のことから，Day ７の黄体血流の多寡により

157

文
献
１）
 Kanazawa, T., Seki, M., Ishiyama, K., Kubo, T.,
Kaneda, Y., Sakaguchi, M., Izaike, Y., Takahashi,
T.：Theriogenology, 86, 1436～1444, 2016.
２）
 Takahashi, H., Haneda, S., Kayano, M., Matsui,
M.：J Vet Med Sci, 78（4）,613～618, 2016.
３）
 Forde, N., Beltman, M. E., Duffy, G. B., Duffy, P.,
Mehta, J. P., Ó’Gaora, P., Roche, J. F., Lonergan, P.,
Crowe, M. A.：Biol Reprod, 84, 266～278, 2011.
４）
 上村俊一，小野雅幸，鮫島秀暢，榎元勝治，浜名克己，後藤和文，柳田宏一：鹿大農学術報告, 44, 29～34, 1994.
５）
 Mesquita, F. S., Ramos , R. S., Pugliesi, G.,
Andrade, S. C. S., V Van Hoeck , Langbeen, A.,
Oliveira, M. L., Gonella-Diaza, A. M., Gasparin, G.,
Fukumasu, H., Pulz, L. H., Membrive, C. M.,
Coutinho, L. L., Binell. M.：Biol Reprod, 93（2）
, 52,
2015.

黄体側子宮角の内膜組織において遺伝子発現が変動し，受胎性に影響を及ぼす可能性が示唆された。

© The Ito Foundation

158

ウシにおけるルーメン非分解性ナイアシン給与による子宮，卵巣への血流促進による分娩後の繁殖性向上（Ⅱ）
Improvement of post－partum reproductive performance by rumen
protected niacin supplementation in cattle（II）

森

田

康

広

（名古屋大学大学院生命農学研究科，名古屋大学アジアサテライトキャンパス学院）

Yasuhiro Morita（Graduate School of Bioagricultural Sciences, Asian Satellite Campuses Institute, Nagoya University）

Niacin is a water-soluble vitamin B and it has a variety of physiological functions. Niacin
promotes lipolysis and is used as a drug for lipid metabolism disorders in human medicine. Fat
mobilization is one of the essential energic pathways in the postpartum period in cows. In thepresent study, we investigated the effects of oral administration of rumen-protected niacin（RPN）in metabolites in postpartum cattle by using metabolome analysis. Six healthy
postpartum Japanese Black cows were randomly assigned to a niacin-administrated group（supplement group, n = 3）or control group（n = 3）
. The supplement group was fed 15 g RPN（7.75 g niacin）mixed with 100 g concentrates once a day from one week postpartum to 8
weeks. Control group was fed only 100 g concentrates. Blood sampling was conducted at 1 and8 weeks postpartum for metabolome analysis. In the metabolome analysis, there were six
metabolites were more abundant in supplement group compared with control group at week 8.
Three metabolites were more abundant in samples at week 8 rather than week 1, and otherthree metabolites decreased in samples at week 8 in supplement group. In this study, we foundthe differences in amino acid metabolism rather than fatty acid metabolism, particularly
branched-chain amino acids metabolism in plasma samples in supplement group. It suggeststhat RPN administration may promote amino acid metabolism and improve energy cycle inJapanese Black beef cows during the postpartum period.

１．目

回路で補酵素として働くことで，エネルギー代謝的において重要な役割を担っている１）。ナイアシン

ナイアシンは水溶性のビタミンＢの一種で，ニにはさまざまな生理機能があり，その中で着目さコチン酸，ニコチンアミドの総称である。また，れている作用は血管拡張作用と脂肪分解抑制作用

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドである。ナイアシンは，ルーメンバイパス処理を（Nicotinamide adenine dinucleotide ， NAD） のしたもの（Rumen protected niacin，RPN）が暑前駆体であり，ミトコンドリアにおけるクエン酸

熱対策として，一部飼料へ添加されており，乳牛© The Ito Foundation

ウシにおけるルーメン非分解性ナイアシン給与による子宮，卵巣への血流促進による分娩後の繁殖性向上（Ⅱ）

159の夏季における乳汁生産量の増加，体温低下作用

由に摂取させた。本研究における動物実験は，「名が報告されている 。また，ナイアシンは血清中

古屋大学における動物実験等に関する取扱規程」の低密度リポタンパク質コレステロールとトリグに準拠し，名古屋大学大学院生命農学研究科動物

リセリドの濃度を低下させ，高密度にリポタンパ

実験委員会の審査承認を得て実施した。

２）

ク質コレステロールの濃度を上昇させる働きがあ

2.2

実験プロトコールり，ヒトの医療分野では脂質代謝異常の治療薬の正常に分娩した黒毛和種経産牛６頭を供試し，１つとして利用されている３）。これはナイアシン

ナイアシンを給与した群（投与群，Control，n＝がその受容体（GPR109A）を介して，肥満細胞

３）と給与しなかった群（対照群，Supplement，においてトリグリセリドが脂肪酸とグリセリンに

n＝３）にランダムに割り振った。投与群には離分解される反応を抑制するためである。

乳させる分娩後１週間後から８週目まで，１日１

申請者は，伊藤記念財団研究助成課題におい回15ｇのRPN（ナイアシンとして7.75ｇ）を配合て，RPNの経口投与によって子宮動脈の血管が飼料100ｇに混合したものを夕方の給餌に合わせ拡張すること，それにより繁殖性が向上する可能

給与し，対照群には同じ条件で配合飼料100ｇの性があることを報告している 。また，上記の血みを与えた。分娩後１週目と８週目に採血を行管拡張作用のほかに，ナイアシンにおける脂肪分

い，血液中の代謝産物のメタボローム解析を行っ

解促進作用が知られており，また，ウシでは産後た。採血は頸静脈から行い，血液はヘパリンと混の低エネルギー状態において脂肪動員が見られる

和した後に氷上に静置し，速やかに実験室に移動ことから，本研究では，分娩後のウシにおいて後，遠心分離（1500×ｇ，30min，４℃）を行っ

RPNの経口投与による産後の各種代謝関連へのた。得られた血漿は－30℃で測定まで保存した。

４）

作用について，メタボローム解析を用いることで

2.3

総合的に検討した。

本研究におけるメタボローム解析はヒューマ

２．方
2.1

メタボローム解析

ン・メ タ ボ ロ ー ム・テ ク ノ ロ ジ ー ズ 株 式 会 社

法（HTM社，山形）に委託し，検出された物質は
HMT 社 の 代 謝 物 質 ラ イ ブ ラ リ お よ び Known －動物

本実験には，名古屋大学大学院生命農学研究科
附属フィールド科学教育研究センター東郷フィー

Unknownライブラリに登録された全物質との照合，検索を行った。

ルドで飼育されている黒毛和種経産牛を６頭供試2.4した。正常分娩した６頭を３頭ずつ対照群と試験

メタボローム解析の主成分分析（PCA），階層

群にランダムに分け，それぞれ分娩後１週間まで的クラスタリング解析（HCA）およびHeatmap

はコンクリート床にオガクズを敷いた牛房に仔牛

表記は統計解析ソフトウェア（HMT社開発）をと同居させ，分娩から１週間後に母子分離し，個用いて行った。

別に管理した。また両群とも仔牛の哺乳制限は行わなかった。給餌は朝夕の２回行い，スーダング

統計解析

３．結果と考察

ラスとチモシーグラスのみを日本家畜管理飼養標

3.1

準（和牛編）に従い規定量給与した。水と固形塩

ウシ血漿についてCE－TOFMSによるメタボ（SALT LICK，共立製薬株式会社，東京）は自ローム解析を行った結果，188個のピークが検出© The Ito Foundation

結果

160

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

され，177のピーク（カチオンモード112ピーク，

ついて，各群の相対面積値比の算出およびWelch

アニオンモード65ピーク）においてライブラリよのｔ－検定を実施した。177個の化合物のうち，対り候補化合物が割り当てられた。検出されたピー

照群の第８週と投与群の第８週において有意差がクを用いて主成分分析を行った結果と階層的クラ認められた化合物は９種類，投与群の第１週と投スタリングを行って得られたHeatMapをそれぞ

与群の第８週において有意差が認められた化合物

れFig.１およびFig.２に示す。

は６種類，対照群の第１週と対照群の第８週において有意差が認められた化合物は６種類存在した

また，候補化合物が絞り込まれた177ピークに

8Control wk1
Control wk8
Supplement wk1
Supplement wk8

6
4

PC2
（15.3％）

2
0
－2
－4
－6
－8
－10
－12
－10 －8－6 －4 －2 0
2
PC1
（19.3％）

4

6

8

Fig. 1 Principal component analysis（PCA）of metabolite in plasma samples from control group（n=3）and supplement

group（n=3）in week 1 and week 8.

3

2

1

0

－1

－2

－3

Control wk1

Control wk8

Supplement wk1

Supplement wk8

Fig. 2 Heatmap of metabolite in plasma samples from control group（n=3）and supplement group（n=3）in week 1 andweek 8.

© The Ito Foundation

ウシにおけるルーメン非分解性ナイアシン給与による子宮，卵巣への血流促進による分娩後の繁殖性向上（Ⅱ）（Fig.３～５）。

161

コール酸（ｐ＝0.009）の３種類であった（Fig.

対照群の第８週と投与群の第８週において有意３）。また，投与群内において第１週に比較し，差が認められた９種類の化合物のうち，対照群と第８週において血漿中の存在量が有意に増加して比較して投与群で血漿中の存在量が有意に高かっいた化合物はアスパラギン（ｐ＝0.019），クエン

たのはニコチンアミド（ｐ＝0.024），分枝鎖α－酸（ｐ＝0.009），馬尿酸（ｐ＝0.034）の３種類，

ケト酸（ｐ＝0.015），尿酸（ｐ＝0.025），2－ヒド

減 少 し て い た 化 合 物 は イ ソ ロ イ シ ン（ｐ ＝ロキシ酪酸（ｐ＝0.034），N5－エチルグルタミン

0.049），L－アセチルカルニチン（ｐ＝0.037），コ（ｐ＝0.018），馬尿酸（ｐ＝0.049）の６種類であリン（ｐ＝0.038）の３種類であり（Fig.４），対り ，一 方 で 存 在 量 が 低 か っ た の は 尿 素（ｐ ＝照群内において第１週に比較し，第８週において0.004），システイン（ｐ＝0.041），ウレイドグリ

血漿中の存在量が増加していた化合物は，5－ヒド

Nicotinamido

1
0.5
0

x 10－3

2
1

0

＊

0.8

0.4

0

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

x 10－30.05
0Ureidoglycolic acid

0.8
0.6
0.4

0

＊＊
1.5

0.2
Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

＊
Relative Area

Relative Area

Relative Area

0.1

0.01

0

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

1

0.2
0.15

0.02

Cysteine

＊＊ ＊＊

＊

0.005

0.2
x 10－3

＊
0.025

0.015

0.6

Urea
0.25

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

Hippuric acid

Relative Area

Relative Area

Relative Area

0.5

x 10－3N5-Ethylglutamine
1

1

1

0

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

2-Hydoroxybutyric acid

＊

1.5

0.5
x 10－3

2
1.5

＊

2

3

0

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

2.5

Relative Area

1.5

Uric acid＊4＊
Relative Area

Relative Area2

branched-chain α-ketoasid

x 10－3
Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

1
0.5
0

x 10－3
Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

Fig. 3 Relative quantity of metabolites in plasma samples from control group（n=3）and supplement group（n=3）inweek 1 and week 8. There were significant differences in nine metabolites between control samples andsupplement samples at week 8. Six metabolites were more abundant in samples of supplement group comparedwith control group.（＊＊p<0.01, ＊p<0.05, Welch t-test）.

© The Ito Foundation

162

令和３年度
Asn

Citric acid

＊

＊＊

0.05

3
2
1

0.04
0.03
0.02

0

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

ｌ
le
0.01

0.05

Relative Area

Relative Area

0.06
0.04
0.03
0.02

0

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

Choline
＊

＊

8

0.008
0.006
0.004
0.002

0.01
0

0.01

o-Acetylcarnitine

＊

0.07

0.02
0.015

0.005

0.01
x 10－30

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

＊

＊

0.025

Relative Area0

Hippuric acid

Relative Area

4

Relative Area

Relative Area

5

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

6
4
2
0

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

x 10－3
Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

Fig. 4 Relative quantity of metabolites in plasma samples from control group（n=3）and supplement group（n=3）inweek 1 and week 8. There were significant differences in six metabolites between week 1 and 8 in supplement
group. Three metabolites were more abundant in samples at week 8 rather than week 1, and other threemetabolites decreased in samples at week 8. ＊＊p<0.01, ＊p<0.05, Welch t-test.

5-Hydoroxypentanoic acid
0.25

＊

3
2.5
2
1.5
1

0.15
0.1

0

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

S-Methylmethionie
0.025
Relative Area

Relative Area

2
1.5
1
0.5
Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

＊

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

＊＊

8
7

0.02
0.015
0.01

0

x 10－32-Aminoisobutyric acid, 2-Aminobutyric acid0.005
x 10－30

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

Pro

＊

2.5

0

1

0.05
x 10－3

Relative Area

0

＊

2

0.2
Relative Area

Relative Area

3.5

lsoglutamic acid＊＊ ＊＊Relative Area

4

0.5

Urea

6
5
4
3
2
1

Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

0

x 10－3
Supplement Control Supplement Control
wk1
wk1
wk8
wk8

Fig. 5 Relative quantity of metabolites in plasma samples from control group（n=3）and supplement group（n=3）inweek 1 and week 8. There were significant differences in six metabolites between week 1 and 8 in control group.
Three metabolites were more abundant in samples at week 8 rather than week 1, and other three metabolites
decreased in samples at week 8. ＊＊p<0.01, ＊p<0.05, Welch t-test .

© The Ito Foundation

ウシにおけるルーメン非分解性ナイアシン給与による子宮，卵巣への血流促進による分娩後の繁殖性向上（Ⅱ）

163

ロ キ シ ペ ン タ ン 酸（ｐ ＝ 0.049），尿 素（ｐ ＝complex，BCKDC）による分岐鎖α－ケト酸の不0.005），イソグルタミン酸（ｐ＝0.030）の３種類，

可逆的な酸化的脱炭酸反応である６，７）。投与群で減少していた化合物は，S－メチルメチオニン（ｐは第８週において血漿中の分岐鎖α－ケト酸量が＝0.031），プロリン（ｐ＝0.027），2－アミノ酪酸

対照群より高く維持されていたことから，骨格筋

2－アミノイソ酪酸（ｐ＝0.002）の３種類であっにおける分枝鎖アミノ酸の分解系が亢進していたた（Fig.５）。

可能性が示唆された。また，投与群の分娩後第８

3.2

考察

週では第１週に比べ，血漿中のイソロイシン量がメタボローム解析の結果，本研究においては，有意に低下していた。これは分枝鎖アミノ酸の分

RPN投与群における血漿中において，脂質代謝解が亢進していたことによるものだと考えられに関わる代謝産物よりも，分枝鎖アミノ酸代謝にた。また，Yepes, F. L. らの研究では，ルーメン

関わる代謝産物に変化が見られた。このことか

バイパス処置をした分枝鎖アミノ酸を飼料に混合

ら，黒毛和種経産牛の分娩後において，中期的にしてホルスタイン牛に給与すると血漿尿素窒素量はRPNの投与は骨格筋におけるアミノ酸代謝経が増加したことが示されている７）。本実験の対照路を活性化し，エネルギー消費を促進する可能性群において，血漿中の尿素量が対照群より高くが示唆された。

なっていたのは，分枝鎖アミノ酸の分解が投与群

本実験では，分娩後のナイアシンの継続投与はに比べ抑えられていたためと考えられた。

分枝鎖アミノ酸を含むアミノ酸代謝へ影響を与えこれまでの研究からナイアシンは脂肪の分解をる可能性が示された。分枝鎖α－ケト酸は，分娩後抑制することで脂質代謝を変化させることが知ら第８週において対照群と比較して投与群で血漿中れている８）が，分枝鎖アミノ酸を含むアミノ酸代の存在量が有意に高かった化合物の１つである。

謝に対する影響については報告がない。今回の実

分枝鎖α－ケト酸（branched－chain α－ketoacid，

験によって黒毛和種牛では，ナイアシンがより広BCKA）は，ケトロイシン，3-メチル-2-オキソ

い範囲の代謝経路に対して影響を与える可能性が

吉草酸，２－ケトヘキサン酸の総称であり，体内示唆された。しかしながら，ナイアシンが体内でで の 分 枝 鎖 ア ミ ノ 酸（branched － chain amino

どのような経路で分枝鎖アミノ酸の代謝を変化さ

acids，BCAA）の分解反応における一次中間代

せたかは，今回の実験では不明であった。また，謝物である 。分枝鎖アミノ酸にはバリン，ロイ

今回観察された分枝鎖アミノ酸の代謝変化は，ナシン，イソロイシンの３種類があり，これらは他イアシンが直接的に経路を調節したのか，それとのアミノ酸が肝臓で代謝されるのに対して，肝臓もナイアシン投与によって調節された他の代謝経ではあまり代謝されず代わりに骨格筋で代謝され路の変化による間接的なものなのかは判定できな

る。分枝鎖アミノ酸の分解系は，最初の２つかった。そのため，ナイアシン投与後に主なアミのステップは３つに共通しており，第一ステップ

ノ酸代謝場所である骨格筋や肝臓のメタボローム

は，分枝鎖アミノ酸アミノ基転移酵素（branched

解析を行い，アミノ酸代謝に関わる種々の物質の－chain aminotransferase，BCAT）による分枝鎖変化を調べることや，アミノ酸代謝に関わる酵素

アミノ酸の可逆的なアミノ基転移反応である。第がナイアシンによってその発現量や活性を変化さ二ステップは，分岐鎖α－ケト酸脱水素酵素複合

せるのかなどを検討するなど，さらなる研究が必体 （branched－chain α－ketoacid dehydrogenase

要である。

５）

５，
６）

© The Ito Foundation

164
４．要

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

約

ナイアシンは水溶性のビタミンＢの一種であり，さまざまな生理機能がある。本研究では，ナイアシンの脂質代謝促進作用に着目し，分娩後のウシにおいてRPNの経口投与による産後の各種代謝関連への作用について，メタボローム解析を用いることで総合的に検討した。正常に分娩した
黒毛和種経産牛６頭を供試し，ナイアシンを給与した群（ｎ＝３）と給与しなかった群（ｎ＝３）にランダムに割り振った。分娩後１週目と８週目に採血を行い，血液中の代謝産物のメタボローム
解析を行った。メタボローム解析の結果，対照群の第８週と投与群の第８週において有意差が認められた化合物は９種類，投与群の第１週と投与群の第８週において有意差が認められた化合物は６種類，対照群の第１週と対照群の第８週において有意差が認められた化合物は６種類存在した。本
研究においては，RPN投与群における血漿中において，脂質代謝に関わる代謝産物よりも，分枝鎖アミノ酸代謝に関わる代謝産物に変化が見られた。このことから，黒毛和種経産牛の分娩後において，中期的にはRPNの投与は骨格筋における

文
献１）
 Carlson, L. A.：Nicotinic acid： the broadspectrum lipid drug. A 50th anniversary review, J.
Inter. Med, 258（2）,94～114, 2005.
２）
 Pineda, A., Drackley, J. K., Garrett, J., Cardoso, F.
C.：Effects of rumen-protected niacin on milk
production and body temperature of middle andlate lactation Holstein cows, Livest Sci, 187, 16～23,2016.
３）
 Lauring, B., Taggart, A. K. P., Tata, J. R., Dunbar,
R., Caro, L., Cheng, K., Chin, J., Colletti, S. L., Cote, J.,
Khalilieh, S., et al.：Niacin lipid efficacy is
independent of both the niacin receptor GPR109A
and free fatty acid suppression, Sci. Transl. Med,4（148）,146ra115, 2012.
４）
 森田康広，松山秀一：令和２年度食肉に関する助成研究調査成果報告書, 39, 195～201, 2021.
５） 下村吉治：分枝鎖アミノ酸の代謝機構，日本栄養・食糧学会誌, 65（3）,97～103, 2012.
６）
 Hatazawa, Y., Tadaishi, M., Nagaike, Y., Morita, A.,
Ogawa, Y., Ezaki, O., Takai-Igarashi, T., Kitaura, Y.,
Shimomura, Y., Kamei, Y., Miura, S.：PGC-1α-mediated branched-chain amino acid metabolism
in the skeletal muscle, PloS One, 9（3）,e91006, 2014.
７）
 Yepes, F. L., Mann, S., Overton, T. R., Ryan, C. M.,
Bristol, L. S., Granados, G. E., Nydam, D.V.,
Wakshlag, J. J.：Effect of rumen-protectedbranched-chain amino acid supplementation on
production-and energy-related metabolites during
the first 35 days in milk in Holstein dairy cows, J.
Dairy Sci., 102（6）,5657～5672, 2019.
８）
 Kamanna, V. S., Kashyap, M. L.：Mechanism ofaction of niacin, Am. J. Cardiol, 101（8）, 20～26,2008.

アミノ酸代謝経路を活性化し，エネルギー消費を促進する可能性が示唆された© The Ito Foundation

165

黒毛和種における不明瞭な発情発生メカニズムの
黄体退行の観点からの解明
Elucidation of mechanisms for silent heat from luteal regression in
Japanese Black Cows

法

上

拓

生・堀

畑

慶

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センター）

Takuo Hojo and Kei Horihata（Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, NARO）

Summer heat stress（HS）is a known cause of reduced reproductive ability in dairy cows.
Heat stress affects the functions of various reproductive organs, including the corpus luteum（CL）.Currently, the effects of HS on luteal function in beef cattle are unclear. Therefore, in thepresent study, we investigated the effects of HS on CL functions, including intracellularsignaling underlying apoptosis and progesterone（P4）secretion, to clarify the influence of HS
on reproductivity in beef cattle. Isolated luteal steroidogenic cells（LSCs）from the mid CL
were cultured at 38.5 or 40.0°C（representing HS conditions）in 5% CO2 for 6 h. Thereafter,
LSCs were treated at 38.5°C for 12 or 48 h with tumor necrosis factor-alpha（TNF: 50 ng/ml）,interferon gamma（IFNG: 50 ng/ml）, and Fas ligand（FASL: 100 ng/ml）, which were known
stimulators of apoptosis and luteal regression in bovine CL, or luteinizing hormone（10 ng/ml）,
which stimulates P4 secretion. We then investigated the viability, mRNA-level expression of
apoptosis-related factors（CASP3, CASP8, BCL2 and BAX）, P4 secretion, and mRNA-level
expression of P4 synthesis-related factors（3βHSD, StAR, SCARB1 and LDLR）in LSCs. HS
downregulated TNF+IFNG+FASL-induced cell death and tended to decrease CASP3 and
CASP8 mRNA expression in LSCs. By contrast, HS did not affect P4 secretion or expression of
3βHSD, StAR, SCARB1 and LDLR mRNA. Overall, these results suggest that HS reduces
apoptotic signals but does not affect P4 secretion in bovine luteal cells. HS may thus beconsidered to influence reproductivity in beef cattle by affecting CL function.

１．目

近年，気候温暖化に伴い，牛における夏季の繁的殖成績低下が大きな問題となっている。その一因

本研究は，肉用牛において夏季の高温環境下でとして，夏季における発情行動（乗駕許容行動）

増加することが報告されている不明瞭な発情の発が発現しない不明瞭な発情の増加が指摘されてい生メカニズムの一端を，卵巣上に形成される内分る。黒毛和種において，不明瞭な発情が冷涼期と泌器官である黄体機能の観点から明らかにするこ

比較して夏季に約30％増加すること１），また，夏とを目的とする。

季の授精頭数当たりの受胎率は低下していないに© The Ito Foundation

166

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

も関わらず，受胎頭数は他の季節と比較し夏季に一晩前培養した。単離直後にトリパンブルー染色

約30％低下すること（家畜改良事業団調べ）が報により細胞生存率が85％以上であることを確認し告されている。これらの報告から不明瞭な発情発ている。

現が直接肉用牛における繁殖効率を低下させるこ

本試験では高温環境条件として，予備試験によとが示唆されており，このような夏季における不り確認した40℃，６時間の培養条件を用いた。黄

明瞭な発情の増加は肉用牛生産において喫緊の課

体細胞を38.5℃または40℃で６時間培養後，P4分

題となっている。

泌を刺激するためにLH（10ng/ml）またはアポ不明瞭な発情の対策を開発するためには，発生トーシスを刺激するためにTNF（50ng/ml），IFNGのメカニズムを解明する必要がある。これまで（50ng/ml）ならびにFASL（100ng/ml）を組みに，不明瞭な発情発生のメカニズムの一つとし合わせて添加しさらに38.5℃で培養を継続した。

て，卵巣に発現する黄体の関与が示唆されてい

2.2

る。黄体は妊娠の成立・維持に必須のプロジェス

細胞生存率に及ぼす高温環境の影響を調べるた

テロン（P4）を分泌する内分泌器官であるが，め，高温条件で培養した細胞にTNF＋IFNG＋妊娠が成立しなかった場合，次の排卵が起こるた

FASLを添加（以後サイトカイン添加区）し，

めに黄体はP4分泌能が衰退するとともに（機能38.5℃でさらに18時間培養した後，再度高温環境

的黄体退行），卵巣上から消失する（構造的黄体下で培養した。２度目の高温環境下での培養終了

退行）。発情前のウシ体内では黄体退行に伴うP4

後 38.5 ℃ で 18 時 間 培 養 を 継 続 し ，培 養 終 了 後

濃度の急激な低下と，黄体退行の開始とほぼ同時

AlamarBlueによって細胞生存率を調べた３）。

細胞生存率とP4分泌能に発育を開始する主席卵胞からのエストラジオー

P4分泌能に及ぼす高温環境の影響を調べるた

ル（E2）の上昇が観察され，E2/P4が最高値に達め，高温条件で培養した細胞にLHを添加し，した時点で乗駕許容が開始する。不明瞭な発情を

38.5℃で12時間培養した。培養終了後，培養上清示すウシでは明瞭な発情のウシと比較し黄体の退を回収し，enzyme immune assay（EIA）によっ

行が緩慢になること１），また，夏季において不明て上清中のP4濃度を調べた。

瞭な発情が増加することから，夏季の高温環境

2.3

は，黄体退行への影響を介して不明瞭な発情を誘

LHまたはTNF＋IFNG＋FASLを添加し12時間導すると考えられるが詳細は不明である。本研究培養後，total RNAを回収し，コレステロールのでは，開花期黄体より単離した黄体ステロイド合

細胞内への取り込みに重要なタンパク質をコード

成細胞（以下黄体細胞）を用いて，高温環境が構

す る SCARB1 お よ び LDLR ，P4 合 成 関 連 因 子

造的黄体退行の主な要因であるアポトーシスと細StARおよび3βHSD，アポトーシス誘導経路に

胞内アポトーシス誘導経路ならびにP4分泌能と関連するタンパク質をコードするcaspase（CASP）

P4合成経路に及ぼす影響を検証する。

8，3，BAXおよびBCL2 mRNA発現をreal－time

２．方
2.1

遺伝子解析

qPCR に よ り 測 定 し た 。内 部 標 準 に はβ － actin

法（ACTB）を用いた。

黄体細胞の単離と培養

食肉処理場由来の肉用牛開花期黄体から過去に報告のある環流法により２），黄体細胞を単離し，３．結果と考察
通常の培養温度である38.5℃培養では，サイト© The Ito Foundation

黒毛和種における不明瞭な発情発生メカニズムの黄体退行の観点からの解明

167

カイン添加区において無添加区と比較し細胞生存

サイトカイン添加区の間に有意な差はなかった

率が低下したが，40℃培養では無添加区とサイト（Fig. 2A，B）。CASP3は細胞内のアポトーシス

カイン添加区との間に有意な差はなかった（Fig.

誘導経路における最も下流に位置するアポトーシ

１）。予 備 試 験 の 結 果 か ら ，ウ シ 黄 体 細 胞 をス実行因子である６）。40℃培養においてサイトカ

40℃，６時間で培養することで暑熱ストレスマー

インによるCASP3 mRNA発現の上昇が抑制されカーのヒートショックタンパク（HSP）70をコーたのは，高温環境下の熱ストレスによって増加しドする遺伝子であるHSPA1 mRNA発現が増加す

たHSP70がCASP3よりも上流の因子に作用し，ることを確認している。HSPはさまざまな細胞にアポトーシス誘導経路を阻害していることを示唆発現し，細胞の恒常性を保つシャペロン機能を有し て い る 。過 去 の 研 究 に お い て も HSP70 はするタンパク質であり，数種類あるHSPのうち分

CASP3よりも上流のCASP9に作用することでア

子量が70kDaのHSP70は細胞の恒常性維持に特にポトーシスに影響することが報告されており５），

重要な役割を果たすことが知られている４）。また，本研究の結果と一致している。一方で，CASP9

HSP70はラットの細胞においてアポトーシスを阻よりも上流に位置するCASP8 mRNA発現にも高害することが報告されている 。これらの報告は

温 環 境 の 影 響 が 見 ら れ た こ と は ６），HSP70 が本研究において高温環境での培養によってウシ黄

CASP8よりも上流にも作用することを示唆して体細胞にアポトーシス誘導処理をしても細胞生存いる。今後，CASP8よりも上流である細胞膜上率が維持された結果と一致しており，ウシ黄体細のTNFレセプターやFASなどのデスレセプター

胞においても高温環境の培養で増加したHSP70が発現に及ぼすHSP70の影響についても検証する必

アポトーシスを阻害することが示唆された。

要 が あ る 。ア ポ ト ー シ ス 誘 導 経 路 に 関 連 す る

５）

アポトーシス誘導経路に関連する遺伝子発現にBCL2スーパーファミリー７）であるBAXならびに及ぼす高温環境の影響を調べた結果，CASP3おBCL2遺伝子発現はいずれの区においても有意なよびCASP8 mRNA発現は38.5℃培養において，差はなかった（Fig. 2C，D）。この結果より高温

無添加区と比較しサイトカイン添加区で有意に高環境ならびにHSP70はこれらのタンパク質が関連かったが（ｐ＜0.05），40℃培養では無添加区とする経路には影響しないことが示唆された。

Viability （% of control）

120
100

＊

80
38.5℃

60

40℃

40
20
0

Cont

TNF+IFNG+FASL

Fig. 1 Effects of heat stress and TNF, IFNG and FASL on viability in bovine luteal cells. The cells were cultured in themedium with or without TNF（50ng/ml）+IFNG（50ng/ml）+FASL（100ng/ml）under 38.5 or 40℃ for 48h.
Asterisk indicate significant difference（p<0.05）, as determined by ANOVA followed by a multiple comparison
with Bonferroni correction.

© The Ito Foundation

168
1.8

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Ｂ

b

1.6
1.4
1.2
1

a

a

0.8

2.50

Ratio mRNA（CASP8/ACTB）

Ratio mRNA（CASP3/ACTB）

Ａ

令和３年度

ab

0.6
0.4
0.2
0

Ｄ

2.50

1.00
0.50

a

a

Cont

TNF+IFNG+FASLCont

TNF+IFNG+FASL

1.60
1.40

2.00
1.50
1.00
0.50
0.00

ab

1.50

0.00

TNF+IFNG+FASL

Ratio mRNA
（BAX/ACTB）

Ratio mRNA
（BCL2/ACTB）

Ｃ

Cont

b

2.00

1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20

Cont

TNF+IFNG+FASL
38.5℃

0.00
40℃

Fig. 2 Effects of heat stress and TNF, IFNG and FASL on expression of CASP3（A）, CASP8（B）,BCL2（C）and BAX（D）mRNA in bovine luteal cells. The cells were cultured in the medium with or without TNF+IFNG+FASL
under 38.5 or 40℃ for 12h. The amount of each mRNA is expressed relative to the amount of ACTB. In（A）and（B）, different letters indicate significant differences（p<0.05）, as determined by ANOVA followed by a multiple
comparison with Bonferroni correction.

培養上清中のP4濃度はLH添加によって上昇しれに伴って増加するHSP70がP4分泌に及ぼす影

たが，38.5℃培養区と40℃培養区の間に有意な差

響については，より詳細な検証が必要である。

は見られなかった（p<0.05；Fig.３）。このこと

本 研 究 の 結 果 よ り ，高 温 環 境 下 で 増 加 し たは高温環境やHSP70がP4分泌に影響しないこと

HSP70はウシ黄体細胞においてTNF＋IFNG＋を示唆している。黄体細胞内において，P4合成

FASLによって刺激されるCASP3およびCASP8に 関 連 す る 遺 伝 子 で あ る 3βHSD お よ び StAR

mRNA発現を抑制し，アポトーシスを阻害してmRNA発現はLHの有無にかかわらず培養温度にいる可能性が示された。生体内においても，暑熱よるに差は見られなかった（Fig. 4A，B）。黄体

期の熱ストレスによって黄体組織内で増加した細胞の細胞内部へのコレステロールの取り込みに

HSP70が黄体を構成する細胞のアポトーシスを阻

関 与 し ， P4 合 成 に 重 要 な 役 割 を 果 た す ８）

害することで緩慢な黄体退行を引き起こし，鈍性

SCARB1ならびにLDLR mRNA発現も同様にLH

発情の一因となっているのかもしれない。今後はによって増加したが，培養温度による差は見られ

HSP70の活性阻害剤を用いて，HSP70が黄体細胞なかった（Fig. 4C，D）。このことからも，本研の機能に及ぼす影響についてより詳細に検証する。

究の高温環境条件はP4合成経路に影響しないことが示されたが，高温環境下での培養ならびにそ© The Ito Foundation

169

黒毛和種における不明瞭な発情発生メカニズムの黄体退行の観点からの解明

Progesterone production（ng/ml/2x105 cells）

300

b

b

250
200
150

a

100

38.5℃
40℃

a

50
0

Cont

LH

Fig. 3 Effects of heat stress and LH on P4 secretion in bovine luteal cells. The cells were cultured in the medium withor without LH（10ng/ml）under 38.5 or 40℃ for 12h. Different letters indicate significant differences（p<0.05）, as
determined by ANOVA followed by a multiple comparison with Bonferroni correction.

Ａ

Ｂ

9

Ratio mRNA
（3βHSD/ACTB）

8
Ratio mRNA
（StAR/ACTB）

7
6
5
4
3
2
1
0

2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

LH

Ｄ

b

LH

Cont

LH

1.6
b

a

Cont

1.8

Ratio mRNA（LDLR/ACTB）

Ratio mRNA
（SCARB1/ACTB）

Ｃ

Cont

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

a

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2

Cont

0.0

LH
38.5℃

40℃

Fig. 4 Effects of heat stress and LH on expression of 3βHSD（A）, StAR（B）, SCARB1（C）and LDLR（D）mRNA inbovine luteal cells. The cells were cultured in the medium with or without LH under 38.5 or 40℃ for 12h. The
amount of each mRNA is expressed relative to the amount of ACTB. In（C）, different letters indicate significant
differences（p<0.05）,as determined by ANOVA followed by a multiple comparison with Bonferroni correction.

４．要ン（P4）分泌能に及ぼす影響について調べた。

約

開花期黄体より黄体細胞を単離し，通常の温度環

高温環境における暑熱ストレスがウシの黄体ス

境（38.5℃）または高温環境下（40℃）で６時間

テロイド合成細胞（黄体細胞）の主要な機能であ

前培養後，アポトーシスを誘導するためのサイト

るアポトーシス誘導機構ならびにプロジェステロ

カ イ ン と し て 腫 瘍 壊 死 因 子（Tumor necrosis© The Ito Foundation

170
factor

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

α ； TNF ： 50ng/ml）， interferonγ

合成関連因子の遺伝子発現はいずれもP4濃度と（IFNG：50ng/ml）ならびにFAS Ligand（FASL）

類似の推移を示した。これらの結果より，高温環

ま た は P4 分 泌 を 刺 激 す る 黄 体 形 成 ホ ル モ ン

境はウシ黄体細胞においてP4の分泌には影響し（LH：10ng/ml）を添加した。サイトカイン添加

な い が ，サ イ ト カ イ ン に よ っ て 刺 激 さ れ た

後12時間培養し，黄体細胞におけるアポトーシス

CASP3およびCASP8 mRNA発現を抑制し，ア

誘 導 経 路 に 関 連 す る 因 子（CASP3 ，CASP8 ，ポトーシスを阻害する可能性が示された。肉用牛BCL2ならびにBAX）の遺伝子発現を調べた。まにおいて暑熱環境下で増加したHSP70は黄体を構た，添加後48時間培養し，細胞生存率を調べた。

成する細胞のアポトーシスを抑制することで，黄さらに，LH添加後12時間培養し，培養上清中の体退行を緩慢にすることが示唆された。

P4濃度を測定するとともに，細胞中のステロイ
ド合成関連因子（3βHSD，StAR，SCARB1およ び LDLR）の 遺 伝 子 発 現 を 調 べ た 。【結 果】
38.5℃での培養において，サイトカイン添加によ っ て 細 胞 生 存 率 が 低 下 し た が（ｐ ＜ 0.05），
40℃での培養で培養することで細胞生存率の低下が阻害された。38.5℃の培養ではサイトカイン添加区において無添加区と比較しCASP3および
CASP8 mRNA発現が有意に高かったが（ｐ＜0.05），40℃での培養では無添加区とサイトカイ
ン添加区との間にCASPs mRNA発現に有意な差はなかった。BAXならびにBCL2 mRNA発現はいずれの区において有意な差はなかった。培養上
清中のP4濃度はLHによって刺激されたが（ｐ＜文献１） 竹之内直樹，福重直輝：日本胚移植学雑誌, 35, 97～108, 2013.
２）
 Okuda, K., Miyamoto, A., Sauerwein, H.,
Schweigert, F. J., Schams, D.：Biol Reprod, 46, 1001
～1006, 1992.
３）
 Hojo, T., Siemieniuch, M. J., Lukasik, K.,
Piotrowska-Tomala, K. K., Jonczyk, A. W., Okuda,K., Skarzynski, D. J.：Sci Rep, 6, 38211, 2016.
４）
 Fernández-Fernández, M. R., Valpuesta, J. M.：
F1000Res, 7, F1000, 2018.
５）
 Beere, H. M., Wolf, B. B., Cain, K., Mosser, D. D.,
Mahboubi, A., Kuwana, T., Tailor, P., Morimoto, R. I.,
Cohen, G. M., Green, D. R.：Nat Cell Biol, 2, 469～
475, 2000.
６）
 Cohen, G. M.：Biochem J, 326, 1, 1997.
７）
 Antonsson, B.：Cell Tissue Res, 306, 347～361,
2001.
８）
 Davis, J. S., LaVoie H. A.：The ovary（Third
edition）,237～253, 2019.

0.05），培養温度による差は見られなかった。P4© The Ito Foundation

171

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の確立（Ⅱ）
Identification of a molecular marker for the uterine involution to affirm
the female fertility in Japanese Black cow（Ⅱ）

久保田

海雄・三輪

雅史・阪谷

美樹

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Kaiyu Kubota, Masafumi Miwa and Miki Sakatani（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

Longer post-partum interval causes huge economic loss in the cattle management. Fullrecovery of the uterus from the damage by parturition, so-called “uterine involution” isnecessary to achieve the subsequent embryonic implantation into uterus for pregnancy
success. Even to date, the conventional rectal palpation with ultrasonography is the almost only
choice to evaluate the genital tract, however, it only gives a gross information, e.g. size ofuterus and loss of discharge, but not the details including the probability to become pregnant,i.e. fertility. Therefore, the ultimate goal of the present study was to establish a quantitativeand reliable molecular marker for the uterine involution to affirm the female fertility. We
collected endometrial samples from Japanese Black cows by cytobrush during the uterine
involution for RT-qPCR gene expression analyses of insulin-like growth factor 1（IGF1）
pathway factors. IGF1 function was evaluated by wound healing assay using cultured
endometrial epithelial cells with IGF1 signaling inhibitor. Cervicovaginal mucus（CVM）
contains uterine proteins and we hypothesized that uterine IGF1 is released into CVM.
Therefore, concentration of IGF1 in CVM was determined by ELISA assay, for future use of
CVM to evaluate involution. The results showed that the expression of IGF1 was high at
involution and decreased after recovery beyond the timing of lochia loss. IGF1 receptor（IGF1R）and IGF binding protein（IGFBP）1-6 were also expressed in the bovine endometrial
epithelial cells during involution. IGF1 is known to function in cell proliferation and the role inuterine involution was confirmed since IGF1R inhibitor attenuated the wound healing. IGF1
concentrations in CVM were not altered before and after involution. In conclusion, althoughuterine local IGF1 expression was high only during involution and seems as a potential
candidate of a marker for uterine involution, the IGF1 assay using CVM is not an optimal
strategy to evaluate uterine involution.

１．目ため，分娩後なるべく早期に受胎させる必要があ的る。令和元年度の乳用牛空胎日数は最頻値80日で分娩間隔の延長は農業経営に負の影響を与える

あるが，平均値では160日となっており，一部の© The Ito Foundation

172

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

牛が平均値を間延びさせている。分娩後初回人工産現場へ普及することも考えられる。IGF等の液授精日数は初産牛で最頻値70日（平均値89日），

性因子は体液や粘液中に分泌されること，さらに経産牛で最頻値76日（平均値94日）であり，初回

子宮粘液は腟内に漏出することから，腟粘液を利

日数に問題はないことから，一度の交配では受胎用して子宮内膜の状態を把握・評価する方法を着しない，複数回交配が必要な牛を検出・改善して想した。本研究では，子宮修復期のIGF1シグナ

いく必要がある。受胎が成立するためには前回のルについてさらなる詳細を明らかにするととも分娩により損傷した子宮が元に戻る必要があるに，腟粘液中に分泌されていると仮定したIGF1（子宮修復）。直腸検査・超音波診断によると，子のタンパク質量を測定し，子宮修復時の子宮内膜

宮内滞留物は分娩約30日後までに排出され，子宮における発現変動を反映しているかを調査し，そ角・頚は40日後までに妊娠前の大きさに戻るが，の結果としてIGF1をマーカーとした腟粘液によこの方法では受胎性までは判断できない。子宮修

る子宮修復評価法を確立することを目的とした。

復が未完であることも受胎不成立や早期胚死滅の加えて，人工授精時に腟粘液を採取し，受胎の成要因の一つとして考えられることから，交配時に否との相関を比較することで，受胎性マーカーと受胎性を持った状態まで子宮修復が完了しているしての適性評価を試みた。

かを判断するシステムが必要である。
我々は子宮修復を客観的に評価できる分子マー

２．方法

カーの確立を目指して，分娩後子宮修復期に経時

2.1

的にサンプリングを行い，その分子生物学的機

子宮内膜炎や乳房炎等の外的要因が少ない黒毛

構・特徴の解明に取り組んできた。昨年度には，

和種妊娠牛31頭を初産・経産の区別なくランダムインスリン様成長因子（IGF1）の発現が子宮修に供試した。本研究に用いた母牛は分娩前後とも

復 時 に の み 高 い こ と ，ま た ム チ ン タ ン パ ク

臨床上異常所見がなく正常分娩と考えられた。分

（MUC1）の発現が子宮修復後に上昇し長期空胎娩予定日１週前に分娩房へ移動し，分娩後約10日

牛で高いこと等を明らかにした。このMUC1に関間は子牛同居の元で分娩房にて管理した。分娩後しては，その発現挙動と性ホルモンによる発現制

約10日目に屋外コンクリートパドックへ移し，自御機構を学術誌に報告した 。これら我々が明ら由採食（乾草），自由飲水条件下で集団での親子かにした知見を含めた子宮修復機構の情報を活用

飼育を分娩後約90日の離乳まで継続した。

１）

供試牛

し，分子マーカーによって子宮修復を判断し，繁昨年度，本牛群の一部の牛において10日ごとの殖処置（人工授精，受精卵移植）の実施判断や淘

超音波診断および２－３日ごとのプロゲステロン

汰牛の選定を行うことが最終目標であるが，その濃度を測定した。その結果，本牛群における悪露ために遺伝子・タンパク質解析を生産現場で行う消失は41.0±1.8日目，初回排卵は44.0±6.2日目，ことは困難である。

初回発情は53.9±5.9日目であった。

ヒトにおけるインフルエンザ診断キットや妊娠

2.2

遺伝子発現解析（RT－qPCR解析）

検査薬は，ウイルスを構成するタンパク質や妊娠

細胞診用サイトブラシを用いて，分娩後20日目により胎盤が分泌するホルモン（hCG）を検知す

より50日目まで10日ごとに経時的に子宮内膜上皮ることを原理としている。このように迅速かつ容細 胞 検 体 を 採 取 し た 。そ れ ぞ れ の 検 体 よ り 全

易な判定法が牛の子宮修復にも開発されれば，生RNAを抽出し，cDNAに逆転写後に定量的リア© The Ito Foundation

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の確立（Ⅱ）

173

ルタイムPCR（RT－qPCR）によりIGF1シグナル

肝臓由来であり，子宮局所的なIGF1産生やその因子群（IGF1，受容体IGF1R，結合因子IGFBP

機能，そして子宮修復への関与についてはまだ研

１－６）の発現解析を行った。解析には18S rRNA

究の余地が残っている。実際，ヒトの子宮内膜にを内部標準として，ΔΔCT法を用いて相対的発

おいては月経周期中の内膜の亢進に関与すると考現量を評価した。

えられており３），さらに牛子宮においては子宮よ2 . 3 培養細胞におけるIGF1機能評価（創傷り産生されたIGF1が胚の発生を促すと考えられている４）。

アッセイ）
細胞診用サイトブラシを用いて，分娩後20日目

本研究では，最初に牛子宮内膜における発現動の子宮体部内膜から上皮細胞を単離し，10％牛血態を解析した。マウス子宮においては，卵胞ホル

清を含むダルベッコ改変培地/Ｆ12培地により培

モンにより子宮内膜間質細胞で誘導・産生された養した。サブコンフルエント後に１mlチップのIGF1が子宮内膜上皮細胞のIGF1受容体（IGF1R）

先端で疑似傷（ギャップ）を作成し，IGF1R阻害を介してその細胞増殖に作用することが報告され剤（Picropodophyllin，１μＭ）で48時間処理後，ている５）。我々は昨年度からの研究において，分顕微鏡下で創傷部位を観察した。

娩後子宮修復期には子宮内膜間質細胞ではなく上2 . 4 腟粘液中のIGF1タンパク定量（ELISA

皮細胞自身がIGF1を発現していることを明らかにしてきた（Fig.１）。その発現は子宮修復時にアッセイ）
分娩後20日目，30日目，および子宮修復後（分のみ高く分娩後50日目には減少し，その後も低値

娩50日目以降）の発情期において，腟鏡下で鉗子を示していた（データ未発表）。子宮修復期に上に挟んだ脱脂綿により外子宮口付近を拭い，腟粘

皮細胞におけるIGF1の発現を誘導・制御するメ液を採取した。検体は遠心により固形物を除去

カニズムは今後，明らかにしていく必要がある。

し，上清を分注後に解析に用いるまで即座に凍結

IGF1は結合タンパク（IGFBPs）に結合するこ

保 存 し た 。IGF1 タ ン パ ク 質 の 定 量 は ，R&Dとでその安定性や機能を制御されており，またそsystems製ヒト用IGF1 Enzyme－Linked Immunoのシグナルは受容体IGF1Rを介して伝達される。

Sorbent Assay（ELISA）キットを用いてプロト

分娩後牛子宮内膜におけるIGF1Rに関しては，子コルに従い測定した。

宮修復期に若干高い傾向を示すものの一貫して子宮内膜上皮細胞で発現していた（Fig.１）。また

３．結果と考察IGFBPsに関して，IGFBP3は分娩20日目に高値

IGF1は肝臓をはじめとした多様な組織で生産を 示 し そ の 後 減 少 し た （Fig. １）。そ の 他 のされ，さまざまな細胞の増殖・分化に必須であIGFBPsに関しては，子宮修復に関連した挙動やり，多くの臓器の機能維持に貢献している。繁殖

一貫した発現変動は認められない（Fig.１）。こ雌牛の産褥に対しては以前よりIGF1の寄与が知れらの結合タンパクはその発現や機能について他られている。分娩後早期に排卵する個体では血中臓器においてもまだ不明な部分が多く，子宮特異IGF1濃度が高く，この高いIGF1に曝された卵胞的な発現制御機構や機能も含めて今後，さらなるが排卵に至る 。一方で過度な負のエネルギーバ

研究が必要とされる。

２）

ランスに陥った個体では血中IGF1濃度が低いた

続いて，分娩後子宮修復時の子宮内膜上皮細胞

め排卵しない。ここで，これら血中IGF1は主にに対するIGF1の機能を検討するために，本研究© The Ito Foundation

174

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

IGF1

IGF1R

1.5

3.0

1.0

2.0

0.5

1.0

0.0

0.0

IGFBP1IGFBP2

3.0

2.0

2.0
1.0
Relative expression

1.0
0.0

0.0

IGFBP3

IGFBP4

1.5

1.5

1.0

1.0

0.5

0.5

0.0

0.0

IGFBP5IGFBP6

2.0

1.5
1.0

1.0
0.5
0.0

20

30

40

50

0.0

20

30

40

50

Days post parturition
Fig.1 Time-course change of the expression of IGF1, IGF1R and IGFBP1-6 in the endometrium of Japanese Black

cattle during the uterine involution. Expressions were analyzed by RT-qPCR. Data are presented as the mean ±standard error.

では培養細胞モデルを用いて創傷アッセイを行っ

較して創傷部位の修復遅延が起きたため，IGF1

た。この方法では遺伝子の強制発現・抑制や薬剤は細胞の増殖を調節することで分娩後の子宮修復処理と並行して，人工的に作り出した傷（ギャッに寄与していることが示唆された（Fig.２）。

プ）の修復される面積や速度を解析することで標

最後に，腟粘液中のIGF1を指標として子宮修的因子の機能解析を行うことが可能である。その復を評価可能であるかを確かめるために，子宮修結果，IGF1Rの機能阻害剤処理により対照区と比復前後の腟粘液中のIGF1濃度を測定した。腟粘

© The Ito Foundation

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の確立（Ⅱ）
IGF1 inhibitor

48 h

0h

ctrl

175

Fig.2 Role of the IGF1 in the uterine endometrial epithelial wound healing. A representative picture of the wound

IGF1 concentration in CVM（pg/ml）

healing assay using uterine endometrial epithelial cells cultured with IGF1 inhibitor（Picropodophyllin, 1 µM）. ctrl;
control（without treatment）.Scale bar = 200 µm.

りIGF1濃度を測定した。その結果，遺伝子発現800と相反して，腟粘液中では調べた３時点において差は認められず一定のIGF1濃度を示した（Fig.

600３）。その理由として，子宮内膜で発現したIGF1400が子宮内腔液や腟粘液に分泌されないこと，結合タンパクがないため安定せず即座に分解されてし200

まうこと，肝臓やその他臓器で産生されたIGF1
0

20

30

estrusDays post parturition
Fig.3 IGF1 concentration in cervicovaginal mucus（CVM） of Japanese Black cattle during uterine
involution and estrus after involution. IGF1
concentration was analyzed by ELISA. Data arepresented as the mean ± standard error.

が混入することで子宮内膜由来のIGF1がマスクされていること等のさまざまな可能性が考えられ，現段階では本研究の目的である腟粘液中のIGF1を指標として用いることが困難であった。
また，人工授精の成否とIGF1の相関についても，サンプル数の不足等の影響もあり，残念ながら現時点において結論には至っていない。

液は子宮からの悪露や液性因子の漏出を受け，有機化合物とともにムチンやインターロイキン等の４．要

約

液性因子が含まれる。実際，子宮内膜炎牛の腟粘

牛の分娩間隔短縮を達成するために，子宮修復液にはインターロイキン等の炎症因子が高いことを客観的に評価する分子マーカー確立を目指しが報告されている 。本研究では，ⅰ）子宮で分て，黒毛和種繁殖雌牛の分娩後子宮内膜の分子プ

娩後の汚染により炎症が起こっている分娩後20日

ロファイルを解析し，IGF1に注目し研究を行っ

目，ⅱ）炎症が治まっているが依然子宮修復中でた。IGF1は子宮修復時に発現が高く修復に伴いある分娩後30日目，そしてⅲ）子宮修復後の発情減少した。IGF1の受容体や結合タンパクも子宮期，の３時点で腟粘液を回収し，ELISA法によ

内膜上皮において発現していた。腟粘液中IGF1

６）© The Ito Foundation

176

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

濃度を測定したが，子宮内膜における発現とは一致しておらず，残念ながら腟粘液を用いてIGF1濃度を指標に子宮修復を判断することは困難であった。今後は，腟粘液に代わり直接的に子宮内膜を評価する方法や，IGF1以外のマーカーを検討することによって，子宮修復・受胎性を客観的に評価するマーカーを検出していくことで分娩間隔短縮を達成する必要がある。

文献１）
 Kubota, K., Miwa, M., Hayashi, K. G., Hosoe, M.,
Sakatani, M.：J Reprod Dev, 67, 386～391, 2021.
２）
 Butler, W. R.：Anim Reprod Sci, 60-61, 449～57,
2000.
３）
 Zhou, J., Dsupin, B. A., Giudice, L. C., Bondy, C.
A.：J Clin Endocrinol Metab, 79, 1723～1734, 1994.
４）
 Hansen, P. J., Tríbulo, P.：Biol Reprod, 101, 526～
537, 2019.
５）
 Zhu, L., Pollard, J. W.：Proc Natl Acad Sci USA,104, 15847～15851, 2007.
６）
 Adnane, M., Chapwanya, A., Kaidi, R., Meade, K.
G., O’Farrelly, C.：Theriogenology, 103, 117～122,2017.

© The Ito Foundation

177

生殖巣始原生殖細胞を用いた新規家禽遺伝資源保存法の開発
Developing new method of conservation of poultry genetic resources
using gonadal primordial germ cells

中

島

友

紀

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Yuki Nakajima（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

The technology for long-term conservation of poultry genetic resources is necessary forstable production of native chicken. Cryopreservation of primordial germ cells（PGCs）,
progenitor cells of sperm and ova, has been developed as technology for long-term
conservation of poultry genetic resources. However, recovery of PGCs require special technique
and/or expensive machine. In the present study, therefore, efficient method forcryopreservation of poultry genetic resources was developed using gonadal PGCs（gPGC）,
which present in embryonic gonad. Embryonic gonads were removed from 5-, 7- and 9-dayold tdTomato induced chick embryo, then placed in cryotube containing cryoprotectant
including 1）10% dimethyl sulfoxide（DMSO）and serum, 2）10% DMSO and 3）10% propylene
glycol（PG）. Cryotubes were cryopreserved by slow freezing and stored for more than amonth in liquid N２. Then, gPGCs were recovered by incubation of frozen-thawed gonads in
phosphate buffered saline（PBS）at 37℃ for 3 h. After incubation, the number, survival rate
and purity of gPGCs recovered from gonads were measured. Additionally, migratory andproliferative abilities of gPGCs recovered from frozen-thaw gonads in each cryoprotectant was
analyzed to evaluate physiological function in recipient embryos. Efficiency of recovery ofgPGCs from frozen-thaw gonads were higher when 1）was used in both 5- and 7-day-old
embryo. In 9-day-old embryo, efficiency of recovery of gPGC cryopreserved in 2）was higher
than other cryoprotectants. However, in 5- and 9-day-old embryo, migratory and proliferative
ability of recovered gPGCs from frozen-thaw gonads were lower than conventional method. In
the present study, therefore, a new method of conservation of poultry genetic resources using
gPGCs were developed by directly cryopreservation of embryonic gonads.

１．目

ンザ等の感染症や地震・台風・大雨等の災害によ的り，一度に多数の種鶏を失う可能性がある。その安定的な地鶏生産のためには，種鶏となる家禽

ため，地鶏の種鶏を保有する都道府県では遺伝資を安定的に維持・供給する必要がある。しかし，源保存技術の関心が年々高まっており，地鶏生産

現在の飼育による個体での維持は，鳥インフルエの種鶏となる品種や系統における遺伝資源の早急© The Ito Foundation

178

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

な保存がきわめて重要である。
形態的・生理的に哺乳類とは異なる家禽の遺伝

２．方法

資源の保存については，卵や精子の源である始原

赤色蛍光を示すtdTomato導入ニワトリの受精生殖細胞（PGC）を用いた独自の方法が開発され卵を孵卵し，孵卵後５日，７日および９日の胚をている。この方法では，ニワトリ2.5日胚の血液供試した。tdTomato陽性を示す雌雄の胚から生中に存在するPGC（cPGC）を分離して凍結保存

殖巣を採取し，50μlのCa２＋およびMg２＋を含まなする。凍結保存後に融解したcPGCを宿主胚に移いリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で２回洗うこと植して作製した雌雄のキメラニワトリを交配する

で中腎組織片や血球を取り除き，４℃に冷却したことにより個体の復元が可能である 。

200μlの凍結保護溶液に浸漬し，－１℃/分の速１）

現在はcPGCの利用が主流であるが，cPGCの分度で－80℃まで冷却した後，－196℃の液体窒素

離には特殊な器具，高価な試薬や機械の導入が必内で１か月以上保存した。凍結保護溶液には，①須である。また，それらの技術習得には時間を要血清および10％ジメチルスルホキシド（DMSO）

するため，早急な対応が困難な場合が考えられ

添加，②血清添加なし，10％DMSO添加，③血清る。さらに，cPGCを使用する場合，回収できる添加なし，10％プロピレングリコール（PG）添胚発生時期が孵卵２日後の数時間程度であり，一加の３種で比較した。融解時には，凍結チューブ

つの胚から採取可能なcPGCの数は10～200個程度

を37℃のウォーターバス内に入れて急速融解し，と少ない。そこで，これらの問題を解決するため，取り出した生殖巣をただちに50μlのPBSで２回生殖巣で増殖したPGC（gPGC）の利用に着目し洗浄し，200μlのPBSに浸漬して，37℃，３時間

た。gPGCは一つの胚から多数の細胞を確実に得

インキュベーションした。その後，チューブ内のることが可能であり，採取可能な胚発生期間もPBSをゆっくりピペッティングし，得られた細胞

cPGC に 比 べ て 数 日 以 上 長 い 。ま た ，gPGC は懸濁液10μlのトリパンブルー染色を行い，生殖cPGCと同様に凍結保存が可能なため，前記した巣から分離された生存gPGC数，死滅gPGC数，

事項とあわせ遺伝資源保存試料としての利点が多体細胞数をそれぞれ測定した。対照区として，従い 。そこで，本研究ではgPGCを用いた特別な来法と同様に生殖巣から取り出したgPGCを凍結機器や技術を必要としない効率的かつ簡便な家禽保存した３）。具体的には，生殖巣を200μlのPBS

遺伝資源の保存法の開発を目的とする。具体的にに浸漬し，37℃，３時間インキュベーションしては，従来の「細胞を分離した後に凍結保存する」

分離したgPGC数を測定した。また，分離したという手順を省くため，胚から採取した生殖巣を

gPGCを①，②，③の凍結保護溶液で同様に保存，直接凍結保存する。保存した生殖巣からgPGCを融解し，それぞれの細胞数を測定した。

２）

分離し，分離したgPGCを宿主胚に移植し，宿主次に，分離したgPGCの生体内における移住能

胚の生殖巣への移住および増殖能を解析すること

および増殖能を解析するため，上法によりそれぞで新たな保存法の有効性を検証し，特殊な技術やれの胚から分離したgPGC50個を野生型の白色レ機械を必要としないまったく新しい効率的な家禽

グホーン（WL）2.5日胚の血管内に移植した。移遺伝資源保存法を開発する。

植５日後，WLの生殖巣を取り出し，生殖巣に存在するtdTomato陽性gPGC数を測定し，移住能の有無および移植したgPGC数に対する増殖率を算© The Ito Foundation

生殖巣始原生殖細胞を用いた新規家禽遺伝資源保存法の開発

いずれの凍結法および凍結保護溶液においても有出した。

意な差は認められず，凍結法と凍結保護溶液間の３．結果と考察
3.1

179

交互作用は認められなかった。一方，７日胚および９日胚においては，対照区に対し試験区では凍結生殖巣からのgPGC分離

Fig.１に①の凍結保護溶液を用いて凍結保存しgPGC純度が有意に低くなった（ｐ＜0.05）。また，た生殖巣から分離したgPGC（試験区，Fig. 1A）

凍結保護溶液は①の場合，②および③に比べて有と，生殖巣から分離し①を用いて凍結保存を行っ意にgPGC純度が高く，保存法と凍結保護溶液のたgPGC（対照区，Fig. 1B）の鏡検像を示した。

間 に 有 意 な 交 互 作 用 が 認 め ら れ た（p<0.05）

試験区と対照区では分離したgPGCにおいて形態（Fig.４）。以上より，生殖巣のまま凍結保存する的な差異は認められなかった。一つの胚から分離

場合，生存しているgPGCを効率的に分離できる可能なgPGC数について，凍結・融解後の生殖巣

条件は，５日胚では②の凍結保護溶液，７およびから分離した場合（試験区）と凍結保存を行う前

９日胚では①の凍結保護溶液を使用した場合であに生殖巣から分離した場合（対照区）で比較しることが示された。

た。その結果，５日胚および９日胚では対照区お3 . 2 凍結生殖巣から分離したgPGCにおけるよび凍結保護溶液間で有意な差は認められなかっ宿主胚生殖巣への移住・増殖能の解析た。一方，７日胚では①の凍結保護溶液を用いた

3 . 1の各凍結保存条件におけるgPGCの生理的場合，対照区と同等の細胞数が分離可能であり，機 能 を 明 ら か に す る た め に ，3 . 1 で 分 離 し た②および③を用いた場合に比べて有意に多くの細gPGCを宿主胚に移植し，移植５日後の生殖巣へ胞の分離が可能であった（p<0.05）（Fig.２）。次の移住・増殖能を解析した。その結果を移住能のに，gPGCの生存率は，５，７および９日胚いず

有無についてはFig. 5Aに，増殖能（率）についれもgPGCで保存した対照区より試験区の場合にてはFig. 5Bにそれぞれ示した。gPGCで保存した

有意に低くなった（ｐ＜0.05）。また，試験区で

対照区では，５日胚の場合いずれの凍結保護溶液

はすべての発生段階で①または②の凍結保護溶液

でも移植したうちの63～70％が移住能を示した。

を使用した場合，③に対し有意に高い生存率を示

また，増殖率は①および③では1.5～1.8倍であっした（p<0.05）（Fig.３）。gPGC純度（分離されたのに対し，②では0.7倍であった。７日胚の場合，た総細胞に対するgPGCの割合）は，５日胚では①では移植したうち88.8％が移住能を示したのにFig. 1 Gonadal PGCs recovered from frozen-thaw gonads of 7-day-old chick male embryo. A）GGCs recovered fromfrozen-thaw gonad. B）Frozen-thaw GGCs（Ctrl）.Arrow: gPGC, Bar = 50µm.

© The Ito Foundation

180

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

5000
4000

a

3000

ab

2000

b

b

1000
0

Ctrl

①

②

③

Fig. 2 Total number of gPGCs recovered from frozen-thaw gonads of 7-day-old chick embryo（means±95%

confidence intervals（CI））.

Notations : Ctrl ; gPGCs recovered from unfrozen gonads,① ; cryoprotectant containing 10% DMSO and serum,② ; cryoprotectant containing 10% DMSO, ③ ; cryoprotectant containing 10% PG
a, b : Numbers with different letters are significantly different at p<0.05.
（％）
100
90

A

a

80
70

ab ab
b

60
50

α

αβαβ
b

βγ

B

40

γ

B

30

c

20

C

10
0

A

A

5d ① 5d ② 5d ③

δ

7d ① 7d ② 7d ③
9d ① 9d ② 9d ③
Ctrl Frozen-thaw gonads

Fig. 3 Survival rate of gPGCs recovered from frozen-thaw gonads of 5-, 7- and 9-day-old chick embryo（means±95% CI）.
Notations : 5d ; 5-day-old embryo, 7d ; 7-day-old embryo, 9d ; 9-day-old embryo, Ctrl ; frozen-thaw gPGCs after

recovering from unfrozen gonads, ① ; cryoprotectant containing 10% DMSO and serum, ② ; cryoprotectant
containing 10% DMSO, ③ ; cryoprotectant containing 10% PG
a bc, ABC, αβγδ : Survival rate with different letters are significantly different at p<0.05 among samedevelopmental stage.
（％）
70

ab

60
50

b
A

40
ab

30
20
10
0

b
BC

b

b

7d ②

7d ③

B
BC

BC
C

7d ①

Ctrl

9d ①

9d ②

9d ③

Frozen-thaw gonads

Fig. 4 Purity of gPGCs recovered from frozen-thaw gonads of 7- and 9-day-old chick embryo（means±95% CI）.

Notations: 7d ; 7-day-old embryo, 9d ; 9-day-old embryo, Ctrl ; frozen-thaw gPGCs after recovering from unfrozen

gonads, ① ; cryoprotectant containing 10% DMSO and serum, ② ; cryoprotectant containing 10% DMSO,③ ; cryoprotectant containing 10% PG
abc, ABC : Purity with different letters are significantly different at p<0.05 among same developmental stage.

© The Ito Foundation

生殖巣始原生殖細胞を用いた新規家禽遺伝資源保存法の開発

181

A
（％）
100
80
60
40
20
0

5d①

5d②

5d③

7d①
Ctrl

7d②

7d③

9d①

9d②

9d③

Frozen-thaw gonads

B
160
140
120
100
80
60
40
20
0

5d①

5d②
Ctrl

7d①

7d②

Frozen-thaw gonads

Fig.5 Migratory and proliferative ability of gPGCs recovered from frozen-thaw gonads of 5-, 7- and 9-day-old chickembryo. A）Proportion of migratory ability of gPGCs to the gonads of recipient embryos. B）The number of
tdTomato-positive gPGCs in the gonad of recipient embryos（means±95% CI）.
Notations: 5d ; 5-day-old embryo, 7d ; 7-day-old embryo, 9d ; 9-day-old embryo, Ctrl ; frozen-thaw gPGCs after
recovering from unfrozen gonads, ① ; cryoprotectant containing 10% DMSO and serum, ② ; cryoprotectant
containing 10% DMSO, ③ ; cryoprotectant containing 10% PG

対し，②および③では16.7％および33.3％となっ９日胚では，移住能を示したのは②の凍結保護溶

た。また，増殖率は①，②および③でそれぞれ0.7，

液のみで，①および③では移住能は認められな

0.1および0.3倍であった。９日胚の場合，①およかった（Fig. 5A）。増殖率については，５日胚のび②で移住能を示したが，③については移住能を場合，①および②いずれも0.4倍程度で，対照区示さなかった。増殖率については，有意差は認めより有意に低くなった（ｐ＜0.05）（Fig. 5B）。一られなかったが，①が②よりも高い傾向にあっ方，７日胚では①および②の増殖率はそれぞれ1.7た。これらのことから，分離後に凍結保存したおよび１倍で対照区より有意に高くなった（ｐ＜gPGCでは凍結保護溶液により移住・増殖能が異0.05）（Fig. 5B）。９日胚の②の凍結保護溶液の場なることが示唆された。一方，試験区である凍結合，増殖率は対照区と同程度であった。

保存した生殖巣から分離したgPGCでは，５日胚

以 上 の 結 果 よ り ，移 住・増 殖 能 を 維 持 し たおよび７日胚の場合，①の凍結保護溶液ではそれgPGCを凍結保存した生殖巣から分離することがぞれ81.8％および90.9％が移住能を示したのに対可能であることが明らかになった。また，凍結保

し，②ではいずれも50％，③では移住能を示さな

護溶液を比較した結果，５および７日胚では①のい，もしくは移植できるgPGCが得られなかった。

凍結保護溶液，９日胚では②の凍結保護溶液が最© The Ito Foundation

182

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）も効果的であることが示唆された。しかし，対照

生殖巣を取り出し，①10％ジメチルスルホキシド区と比較すると５日胚および９日胚では移住・増（DMSO）および血清添加，②10％DMSO添加，殖能を維持したままgPGCを分離する方法とし③10％プロピレングリコールを添加した３種の凍て，効率が低かった。そのため，本研究で目的と結保護溶液中にそれぞれ浸漬し，緩慢凍結法を用している「生殖巣をそのまま凍結保存する技術」

いて凍結保存を行った。－196℃下で１か月以上を遺伝資源保存へ応用するためには，今後，保存保存した生殖巣を融解し，リン酸緩衝生理食塩水

対象の胚発生段階に合わせた凍結法の改良が必要

内に浸漬し，37℃，３時間インキュベーションすであると考えられる。しかし一方で，意外なことることにより分離したgPGCの数，生存率およびに，７日胚では対照区よりも高い増殖能を維持し体細胞に対するgPGCの純度を測定した。次に，ている可能性が示された。このことから，本研究

凍結生殖巣から分離したgPGCの生理的機能を評により，７日胚に関しては，生殖巣のまま凍結保価するため，それぞれの凍結保護溶液で保存した存することにより従来法に比べて短時間かつ簡便生殖巣から分離したgPGCの生体内における移に遺伝資源を保存できることが示された。

住・増殖能を解析した。その結果，５および７日

最後に，今後の課題として，本研究で開発した

胚では①の凍結保護溶液で保存した場合，９日胚方法を実用化するにあたっては，保存した７日胚では②の凍結保護溶液の場合にgPGCの保存効率のgPGCにおける配偶子形成能および個体形成能が最も高くなった。しかし，５および９日胚におの解析が必要であると考えられる。

いては，gPGCを分離した後に凍結する従来の凍４．要結保存法よりもgPGCの移住・増殖能を保持した

約

まま保存する効率は低かった。以上より，本研究

安定的な地鶏生産のためには，家禽遺伝資源を長期保存する技術が必要である。家禽遺伝資源ので７日胚において，従来法に比べて短時間かつ効率的な遺伝資源の新規保存法が開発された。

長期保存法として，精子や卵の源である始原生殖細胞（PGC）の凍結保存技術が開発されている。
しかし，PGCの採取には特殊な技術や高価な機械が必要である。そこで，本研究では，生殖巣に存在するPGC（gPGC）に着目し，特殊な技術や高価な機械を必要としない，簡便かつ短時間で効率的な家禽の遺伝資源保存法の開発を試みた。ま文献１） Naito, M., Tajima, A., Tagami, T., Yasuda, Y.,
Kuwana, T.：Journal of Reproduction and Fertility,
102, 321～325, 1994.
２）
 Tajima, A., Naito, M., Yasuda, Y., Kuwana, T.：
Journal of Experimental Zoology, 280, 265～267,
1998.
３）
 Nakajima, Y., Asano, A., Tajima, T.：British
Poultry Science, 63, 46～53, 2022.

ず，tdTomato導入ニワトリ５，
７および９日胚の© The Ito Foundation

183

機能性脂肪酸を活用した黄体機能強化による乳牛繁殖成績改善技術の確立
Functional fatty acid diet improves the reproductive performance of dairy
cows by boosting their luteal function

山口

昇一郎・藤井英之・青木直人１・山田豊１・柿原孝彦（福岡県農林業総合試験場， 油化産業株式会社）１

Shoichiro Yamaguchi, Hideyuki Fujii, Naoto Aoki1, Yutaka Yamada1 and Takahiko Kakihara（Fukuoka Agricultural Research Center, 1Yuka Sangyo Co., Ltd.）In this study, we investigated the effect of feeding a diet containing calcium salts of
α-linolenic acid fatty acids to lactating dairy cows on milk yield and reproduction. The
experimental diet consisted of total mixed rations, which was mainly Italian ryegrass silage.
The α-linolenic acid group was supplied with 100 g of calcium salts of α-linolenic acid by oral
administration daily from 3 weeks postpartum．
Results showed that the milk yield was higher by 1.1 kg/day in the α-linolenic acid groupthan in the control group. The α-linolenic acid levels in the blood of the treatment groupincreased 2.4 times compared to that in the control group. There was no difference in the luteal
blood flow on the 7th day after artificial insemination, but it tended to be higher in the
α-linolenic acid group on the 14th day（p < 0.1）
. The conception rate tended to be higher inthe α-linolenic acid group than in the control group; however, there was no significant
difference．
In conclusion, it is suggested that feeding a diet containing calcium salts of α-linolenicacid to lactating dairy cows from 3 weeks postpartum may improve the milk yield and luteal
function, thereby improving the conception rate．

１．目

ルギーバランスとなっており，これが繁殖成績低的

下の大きな要因となっている。酪農現場では，繁近年，乳牛の受胎率が低下し，酪農現場で大き殖性向上や乳量および乳脂肪向上を目的として従な問題となっている。福岡県内における乳牛の平来からリノール酸やパーム油脂などのバイパス脂

均分娩間隔は約460日であるが，目標となる400日

肪酸が用いられている。近年，泌乳牛にn-3系脂程度に短縮することができれば50頭規模の農家換肪酸であるα-リノレン酸含有脂肪酸カルシウム

算において子牛生産頭数は，年間で７頭増加するを給与すると分娩後初回授精日数や受胎までの日計算となり，乳量増加も考慮すると繁殖成績の向数が短くなることが報告された １）。同様に同じ上が経営に与える影響は非常に大きい。

n-3系の脂肪酸であるDHAを分娩４週目からの泌

分娩後の乳牛は，泌乳量の急増に伴い負のエネ

乳牛に給与したところ，インターフェロン刺激遺© The Ito Foundation

184

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

伝子の発現を向上させ妊娠率を向上させる２）など

α-リノレン酸区は，分娩後３週目からトップドn-3系脂肪酸に関する繁殖性向上に関する知見がレスでα-リノレン酸脂肪酸カルシウム（ファイ

報告されている。

ンメイト，油化産業株式会社，東京）を100ｇ夕

そこで本研究では，泌乳初期牛にアマニ油由来方に給与した。卵巣および子宮修復診断は，毎週のα-リノレン酸含有脂肪酸カルシウムを給与す

１回超音波画像診断装置（HS-101Ｖ，本田電子

ることで，乳量や乳成分および血液成分に及ぼす

株式会社，愛知）で行い，子宮修復は子宮腔貯留影響を検討するとともに，性選別精液の人工授精

物スコア４）によってスコア０で修復とした。人工を行って，受胎率や妊娠維持に関与する黄体血流

授精（AI）は，分娩後80日以降で黄体を確認後，量等を明らかにする。

プロスタグランジンF2α製剤（動物用プロナル
ゴンＦ注射液，Zoetis，東京）を投与し，その48

法

２．方

時間後に酢酸フェルチレリン（コンセラール注射

供試牛は福岡県農林業総合試験場で飼養する２液，MSDアニマルヘルス，東京）を200μg投与し，産以上のホルスタイン種経産牛12頭（対照区：６

その24時間後に定時AIを行った。人工授精に際頭および試験区：６頭）を用いた。試験牛はフし て は ，主 席 卵 胞 側 の 子 宮 角 内 で 深 部 注 入 器

リーストール牛舎で飼養し，ドアフィーダによっ（YTガン，ヤマネテック，長野）の先端から内芯て個体ごとに飼料摂取量を計測した。搾乳はミルを押し出して先端チューブを子宮角深部に挿入しキングパーラーで８：45と17：15の１日２回行った状態でホルスタイン種性選別精液を注入した。

た。体重は毎日測定し，乳成分は分娩後２週間に黄体血流量は，AI後７日目および14日目にカラー

１回乳サンプルを用いて，MILKO-SCAN FT＋

ドップラー（MyLabOne VET，メディカルタス

（Foss Electric ，Hillererod ，Denmark）で 分 析

クフォース，大阪）によって測定した。統計処理した。試験期間は，分娩後３週から21週とした。

は，Studentのｔ検定またはχ二乗検定で行った。

採血は３週間に１回行い，ヘパリン入り真空採血管を用いて採血して，冷却遠心（3,000rpm，30

３．結果と考察分間）によって得られた血漿を検体とした。血漿

乾物摂取量は，対照区が27.8kg／日およびα-

中 の 血 糖 ，総 コ レ ス テ ロ ー ル ，総 タ ン パ ク ，

リノレン酸区が27.6kg／日となり，差は認められ

BUN，GOTおよびGGTは，乾式血液自動分析装なかった。トップドレスでα-リノレン酸含有脂置（富士ドライケム，富士メディカルシステム，

肪酸カルシウムを給与したが，乾物摂取量には影東京）で分析した。血中のα-リノレン酸含量は，響を与えないことが明らかとなった。試験期間中

石田らの変法によって行った。なお，血中のαの平均乳量は，対照区が46.1kg／日およびα-リ-リノレン酸含量は，対照区２頭およびα-リノレ

ノレン酸区が47.2kg／日となり，有意差は認めら

ン酸区が３頭のデータである（有意差検定なし）。

れないもののα-リノレン酸区が1.1kg／日多く

すべての試験用飼料は，カッターで細断した粗飼なった（Table１）。乳成分については，脂肪にお料と濃厚飼料を合わせて混合飼料（TMR）に調

いて対照区の3.7％に対してα-リノレン酸区が製 し た 。 TMR の 養 分 含 量 は ， TDN71 ％，

3.5％と有意差はないものの低い傾向にあった。

CP15.5％となるように濃厚飼料と場内産イタリア

他の乳成分には差が認められなかった。α-リノ

ンライグラスサイレージを組み合わせ給与した。

レン酸区の脂肪が低かった要因は，乳量が多かっ

３）© The Ito Foundation

185

機能性脂肪酸を活用した黄体機能強化による乳牛繁殖成績改善技術の確立
Table 1 Effect of feeding α-linolenic acid on lactation performance in Holstein cows.
Milk yield

Fat

Solids not fat

Protein

MUN

kg/day

％

％

％

mg/dl

α-linolenic acid

47.2

3.5

8.6

3.1

12.7

Control

46.1

3.7

8.6

3.1

12.3

Table 2 Effect of feeding α-linolenic acid on metabolic parameters in Holstein cows.
GlucoseProtein

BUN

GOT

GGT

α-linolenicacid（before
the test）

α-linolenicacid（before
AI）

mg/dl

g/dl

mg/dl

U/l

U/l

μg/ml

μg/ml

α-linolenic acid

66.3†

8.3＊

14.3

88.4

40.0

35.4

101.9

Control

62.0

7.7

14.0

84.5

38.4

40.1

42.5

＊p＜0.05，†p＜0.1

α-linolenic acid

mg/dl
250

Control

200
150
100
50
1

3

6

9

12

15

18

21

Postpartum weeks

Fig. 1 Effect of feeding α-linolenic acid on total cholesterol in plasmain Holstein cows.

たことが考えられる。

ノレン酸区が高く推移した（Fig.１）。血中α-リ

血液成分については，血糖において対照区がノレン酸含量は，試験開始前（分娩３週目）は，

62.0mg/dlおよびα-リノレン酸区が66.3mg/dlと両区ともほぼ同程度であったが，AI前の分娩80

な り α- リ ノ レ ン 酸 区 が 高 い 傾 向 に あ っ た

日目には，対照区では増加していないのに対して（p<0.1）（Table２）。また，タンパクについては，

α-リノレン酸区では2.9倍に増加した。その他の対照区が7.7g/dlおよびα-リノレン酸区が8.3g/dl

血液成分には差が認められなかった。

となりα-リノレン酸区が有意に高くなった（p黄体血流量については，AI７日目には有意差＜0.05）。この理由については，α-リノレン酸含が認められなかったが，14日目にはα-リノレン

有脂肪酸カルシウムに血糖やタンパクに影響を与酸 区 が 高 い 傾 向 に あ っ た（p<0.1）（Fig. ２）。

える成分が含まれていないため原因は明らかには

Sakumotoら５）は，in vitroにおいて牛子宮内膜組できなかった。総コレステロールについては，有織をα-リノレン酸存在下で培養したところ，プ

意差は認められないものの給与期間中は，α-リ

ロスタグランジン（PG）E2の産生が有意に増加© The Ito Foundation

186

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

mm2
120

α-linolenic acid†Control

100
80
60
40
20
0
day7

day14

Fig. 2 Effect of feeding α-linolenic acid on changes in the bloodflow area of the CL in Holstein cows.

†p<0.1

Table 3 Effect of feeding α-linolenic acid on reproductive performance in Holstein cows．
Rate of weight gain
（12week/3week）

Postpartum uterine
recoveryFirst postpartum
insemination

Conception rate at
first insemination

％

day

day

％

α-linolenic acid

104

24

95

43（3/7）

Control

111

30

87

33（2/6）したことを明らかにした。
PGE2は黄体のプロジェ

管形成が高まることにより，黄体への栄養やP4ステロン（P4）合成を促進する機能亢進作用がの基質供給量を増加させ，局所循環を介して黄体知られ，また血管新生を促す作用を有することか側の子宮角のP4濃度を増加させるためと推測さら，黄体での血管新生が促進され，その結果，黄れている６）。また，泌乳牛にDHAを給与するこ

体の血流が増加したものと推察された。一方，コとによりIFN-τに関係する遺伝子発現が高くな

レステロールは，ステロイドホルモン合成の基質

り受胎率が高くなる２）ことも報告されている。こになり，α-リノレン酸区は試験期間を通じて総れらのことから，α-リノレン酸含有脂肪酸カル

コレステロールが高く推移したことから黄体細胞

シウムを泌乳牛に給与することにより黄体機能がが活性化した可能性も考えられる。

高まるとともに妊娠維持に関する機構が向上する

体重増加率，分娩後子宮修復日数および初回授ことによって受胎率が高くなる可能性が示された。

精 日 数 は ，試 験 区 間 で 差 が 認 め ら れ な か っ た

以上のことから，分娩後３週目の泌乳牛にα-（Table３）。受胎率は，有意差は認められないもリノレン酸含有脂肪酸カルシウムを給与することののα-リノレン酸区が高い傾向が認められた。

によって乳量が向上するとともに黄体機能が向上

受胎率が高く推移している理由として，黄体機能することによって受胎率が向上する可能性が示唆が高かったことが考えられる。黄体血流面積が大された。

きい牛の受胎率が高くなる理由として，黄体の血© The Ito Foundation

機能性脂肪酸を活用した黄体機能強化による乳牛繁殖成績改善技術の確立

４．要

187

リノレン酸含有脂肪酸カルシウムを給与すること

約

によって乳量が向上するとともに黄体機能が向上

本研究では，泌乳牛へのα-リノレン酸含有脂肪酸カルシウムの給与が乳量や繁殖に及ぼす影響

することによって受胎率が向上する可能性が示唆された。

を検討した。試験飼料は，イタリアンライグラス
サイレージを主体としたTMRとした。α-リノレ
ン酸区には，α-リノレン酸含有脂肪酸カルシウ
ムを分娩後３週目から100ｇ／日トップドレスで投与した。検討の結果，乳量は対照区に比べαリノレン酸区は1.1kg／日多くなった。血液中のα-リノレン酸含量は，対照区に比べ2.4倍増加した。黄体血流量は，人工授精７日目には差が認められなかったが，14日目にはα-リノレン酸区が高い傾向にあった（p＜0.1）。受胎率は，α-リノ
レン酸区が有意差はないものの高い傾向にあった。

文献１）
 Meignan, T., Madouasse, A., Beaudeau, F., Ariza,
J. M., Lechartier, C., Bareille, N.：Theriogenology,
125, 293～301, 2019.
２）
 Sinedino, L. D., Honda, P. M., Souza, L. R., Lock, A.
L., Boland, M. P., Staples, C. R., Thatcher, W. W.,
Santos, J. E.：Reproduction, 153（5）,707～723, 2017.
３）
 石田修三，早澤宏紀，清水隆司，玉城政信，相井孝允：日畜会報，66（10），889～897，1995.
４）
 小山毅：北海道獣医師会雑誌，56（1），10～15，
2012.
５）
 Sakumoto, R., Hayashi, K. G., Iga, K.：J Reprod
Dev, 68（1）,62～67, 2022.
６）
 金澤朋美：臨床獣医臨時創刊号，35，45～48，
2017.

以上のことから，分娩後３週目の泌乳牛にα-© The Ito Foundation

188

卵胞刺激ホルモンを用いた夏季における繁殖母豚の発情回帰遅延対策技術の開発
The development of method of estrus induction for weaning sow insummer using follicular stimulating hormone

内倉

健造・田島

茂行・山本

るみ子・豊島浩一（愛知県農業総合試験場）

Kenzo Uchikura, Shigeyuki Tajima, Rumiko Yamamoto and Koichi Toyoshima（Aichi Agricultural Research Center）

The purpose of this study was to investigate whether subcutaneous administration offollicle-stimulating hormone（FSH）can be used to delay the return to estrus in breeding sowsduring the summer season, and whether subcutaneous administration of FSH can be used for
estrus induction of weaning sows, and piglet production. Subcutaneous administration of FSH
to weaning sows during the non-thermal period showed the same efficacy as intramuscularadministration of equine chorionic gonadotropin（eCG）. Subsequently, artificial inseminationand farrowing were performed, and these results suggested that normal piglet production was
possible. FSH or FSH with human chorionic gonadotropin （hCG） was administeredsubcutaneously at weaning to multiparous sows during the heat period, and estrus wasobserved in only one of the four sows treated with administration of FSH, whereas estrus wasobserved in all four sows treated with administration of FSH/hCG. However, in subsequentexamination, estrus was observed in all three primiparous sows in the FSH group, whereas in
the FSH/hCG group, estrus was observed in only one of the three primiparous sows. These
results suggest that subcutaneous administration of FSH at weaning can be used to induce
estrus as an alternative to intramuscular administration of eCG in the conventional method,and can be used in piglet production. On the other hand, the optimal method of using FSH as acountermeasure for delayed return to estrus in sows during the summer season needs to befurther investigated．

１．目

情回帰が遅延する傾向が強いことが知られてお的り，生産性低下の原因になっている。

近年，豚の繁殖性に関する育種改良が進み，産こうした発情回帰遅延を防ぐため，または発情

子数や泌乳能力の向上に伴って，授乳中におけるの同期化や定時人工授精を行う目的で国内の８割

母豚への負荷が増大している。そのため，母豚の程度の農場が交配前のホルモン投与を利用してお適切な飼養管理がより重要となっている。特に成り，さらに３割程度の農場は恒常的に利用してい長途上にある初産後の母豚は，夏季の離乳後に発ると報告されている。また，それら農場内で使用© The Ito Foundation

卵胞刺激ホルモンを用いた夏季における繁殖母豚の発情回帰遅延対策技術の開発

189されるホルモンの80％以上は馬絨毛性性腺刺激ホ

ラ ン ド レ ー ス（Ｌ）種 お よ び 大 ヨ ー ク シ ャ ールモン（eCG）であったと報告されている 。交（Ｗ）種母豚を用いて，離乳日にFSH 2.5 AU（ア

配前にホルモンを用いた際の分娩率の向上や産子

ントリン10，共立製薬株式会社）をNS25 mlに溶数の増加といった有益な効果については農場に

解（試験区分：FSH 2.5/25区（AU/ml）），もしよって成績が異なる。一方で，雌豚にホルモ

く は FSH 5 AU を NS50 ml（試 験 区 分：FSH 5/ンを用いた場合，卵胞嚢腫や卵胞の早期黄体化が50区）に溶解し皮下に投与した。皮下投与の方法

発生すると言われており４），ホルモンの利用が繁は過去の報告９）に従って行った。慣行区として離殖障害のリスクになることも指摘されている。

乳日にeCG 1000 IU（セラルモン1000，共立製薬

１）

２，３）

牛の胚採取のための過剰排卵処理では，卵胞発株式会社，試験区分：eCG区）をNS3 mlに溶解

育促進の目的でeCGを使用すると異常な大型卵胞し筋肉内投与した。すべての区において離乳後72の形成が起こることが報告されている５～７）。この時間後に排卵誘起を目的としてヒト絨毛性性腺刺ため牛では一般的に半減期の短い卵胞刺激ホルモ

激ホルモン（hCG）1000 IU（ゲストロン1500，ン（FSH）が用いられているが，FSHは半減期が共立製薬株式会社）を投与し，その24時間後に発短いことから１日２回，３～４日間投与する必要

情発現を確認し，発情の有無にかかわらず当場慣がある。この点について近年，多量の生理食塩水

行法で人工授精を１回行った。人工授精後25日目（NS）や徐放化溶液にFSHを溶解し，皮下投与すに超音波診断装置で受胎の確認を行い，受胎が確ることで体内半減期を調節し，省力化を行う試み認された母豚は分娩させ，総産子数，生存産子数がされている 。

および子豚の生時体重を測定した。離乳後の子豚

８）豚においてもFSHの単回投与で発情誘起や定については出荷時体重および出荷日齢を測定した。

時人工授精が可能になれば，繁殖障害のリスクを2.2

抑えながら母豚の発情回帰日数が短縮することが秋期（10月27日～11月29日）の種豚場において期待される。過去に我々は，雌豚にFSHを多量のＬ種とＷ種の経産豚を用いて，上記2.1の方法とNSに希釈し皮下に単回投与することで発情を誘同様に種豚場職員が離乳時にFSH 5 AUをNS50起可能であること，さらにその後人工授精を行mlに溶解し皮下投与を実施した。離乳後毎日発い，採卵で正常胚を採取可能であることを明らか

情発現の確認を行い，発情が確認された個体につにした 。本研究では，夏季における母豚の発情いては当該種豚場の慣行法を用いて人工授精を

回帰遅延対策の確立を目的に母豚へのFSHの投行った（試験区）。対照区では10頭のＬ種，Ｗ種

与法の検討を行い，発情が正常に回帰するかどうおよびデュロック種の経産豚を用いて，ホルモンかを検証するとともに，分娩させ産子数や発育へ投与を行わず，同様に発情確認および人工授精をの影響について調査した。

行った。人工授精後25日に妊娠鑑定を行い，受胎

９）

２．方

種豚場における投与方法の検証を確認した。

法2 . 3 暑熱におけるFSHおよびhCGの投与の検2 . 1 非暑熱期におけるFSHの単回投与量およ討
暑熱期（８月７日～９月17日）において，２もび投与方法の検討
暑熱ストレスが少ないと考えられる春期（４月

しくは３産後のＬ種およびＷ種母豚を用いて，８日～５月23日）において，初産および２産後のFSH 5 AU も し く は ，FSH 5 AU お よ び hCG200© The Ito Foundation

190

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

IUをNS50 mlに溶解し，離乳日に皮下投与した

せた。

（それぞれFSH区およびFSH/hCG区）。また，慣

３．結果と考察行法として離乳時にeCG 1000 IUを筋肉内投与するeCG区を設定した。離乳後３～７日目に朝夕２

春期における離乳時の経産豚にFSHを皮下投回，2.1と同様に発情発現を確認し，発情終了ま与した場合の発情発現率，受胎率，分娩率，平均で確認を継続した。発情終了後６日目に経直腸卵

総産子数および平均生存産子数をTable１に示し

巣診断を行い，触知で黄体数を計測した。また，

た。FSH 2.5/25区では５頭中３頭で発現し，人工

その際に1.5 cm以上の卵胞が存在した場合，卵巣授精後４頭が受胎に至った一方で，FSH 5/50区

嚢腫と判定した。

では４頭すべてで発情，受胎した。FSH 2.5/25区，
FSH 5/50区およびeCG区の平均総産子数につい2 . 4 暑熱期における初産後の母豚へのFSHおてはそれぞれ9.0±4.1，11.0±1.4および11.5±3.9

よびhCGの投与の検討
暑熱期（７月26日～９月17日）において，初産頭で有意差は見られなかった。これらのことから後のＬ種とＷ種の交雑種豚を用いて，FSH 5 AU

FSHの皮下投与による発情誘起が子豚生産に用もしくは，FSH 5 AUおよびhCG200 IUをNS50いることが可能であり，FSHの投与量は 5 AUがmlに溶解し，離乳日に皮下投与した（それぞれ適していることが示唆された。Table２に各試験

FSH区およびFSH/hCG区）。また，慣行法として

区の出生子豚の平均生時体重，平均離乳体重，平離乳時にeCG 1000 IUを筋肉内投与するeCG区を

均出荷体重および平均出荷日齢を示した。Rayer設定した。対照区では離乳時のホルモン投与を行らはホルモン投与後の交配により，分娩された子わなかった。離乳後３～７日目に朝夕２回，2.1

豚の生時体重，離乳時体重，８週齢体重が有意にと同様に発情発現を確認し，発情開始から発情終大きくなると報告している10）が，本研究の各試験了まで１日１回当場慣行法で人工授精を行った。

区間で出生子豚についての生時体重やその後の発受胎確認は初回人工授精25日後に超音波診断装置

育に有意な差は見られなかった。

で行い，受胎が確認された母豚については分娩さ

種豚場において，離乳後７日以内に発情が回帰

Table 1 Effect of amount of FSH on estrus expression of sows.
No. of sows（%）
Group

N

Estrusexpression

Pregnant

Farrowed

Litter size

No. of live
piglet

FSH2.5 / 25

5

3（60）

4（80）

4（80）

9.0 ± 4.1

8.8 ± 4.5

FSH5 / 50

44（100）

4（100）

4（100）

11.0 ± 1.4

11.0 ± 1.4

eCG1000

4

4（100）

3（75）

3（75）

11.5 ± 3.9

11.3 ± 3.3

Table 2 Effect of amount of FSH on growth of piglet.
Group

N

Birth B.W.
（kg）

Weanimg
B.W.（kg）

Fnishing B.W.
（kg）

Finishing age（date）

FSH2.5 / 25

89

1.43 ± 0.3

5.6 ± 1.6

115.7 ± 5.6

162.5 ± 15.4

FSH5 / 50

79

1.5 ± 0.3

6.5 ± 1.0

110.4 ± 9.7

159.5 ± 10.7

eCG100092

1.7 ± 0.5

6.4 ± 1.7

113.5 ± 2.9

165.6 ± 6.4© The Ito Foundation

卵胞刺激ホルモンを用いた夏季における繁殖母豚の発情回帰遅延対策技術の開発

191

Fig. 1 FSH administration to subcutaneous in the abdomen region of the sow.

Table 3 Effect of FSH/hCG on estrus expression of multiparous sows in hot season.
No. of sows（%）
Group

N

Estrus expression

Ovariancyst

No. of corpus
luteum＊

FSH

4

1（25）

1（25）

8

FSH / hCG44（100）

1（25）

13.3

eCG1000

3

2（66）

1（33）

10

＊only data from sows expressed estrus

した母豚は試験区では３頭中２頭，対照区では10形成ホルモン（LH）の分泌頻度と発情回帰日数頭中８頭であった。平均発情回帰日数はそれぞれ

は負の相関があった11）とされている。また，夏期試験区で11.0±12.0日，対照区で5.0±2.0日であり，に多い授乳中の栄養摂取低下は母豚におけるLH

有意差は見られなかったものの，種豚場において分泌の強度を低下させる12）と報告されている。こも本方法が実施可能であることが分かった。まれらのことから本実験ではLH作用をもつhCGをた，種豚場職員がFSHを溶解したNSを50 mlを下添加した試験区において卵胞発育がより促進され傔部に皮下投与する際（Fig.１）に半量程度投与たことが考えられる。各試験区とも黄体数や嚢腫した段階で豚が動くことが多いことから，NSをの発生数に大きな差は見られないことから，夏期半量にできれば作業性がより向上することが考えの複数産次の経産豚においてhCGを添加したFSHられた。

の皮下投与は慣行法であるeCGの筋肉内投与と同夏期における離乳時の２および３産後の経産豚等の発情誘起効果があることが示唆された。

にホルモン投与した場合の発情発現率，卵巣嚢腫

夏期の離乳時において初産後の母豚にホルモンの発現率および黄体数をTable３に示した。FSH

皮下投与した場合の発情発現率，受胎率および分区では４頭中１頭のみで発情発現が認められた一娩率をTable４に示した。複数産次の母豚とは異方で，FSH/hCG区では４頭すべてで発情発現がなり，FSH区では３頭すべてで発情発現が認めら認められた。過去の報告では母豚の離乳後の黄体れた一方で，FSH/hCG区では３頭中１頭のみで© The Ito Foundation

192

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 4 Effect of FSH/hCG on estrus expression of primiparous sows in hot season.
No. of sows（%）
Group

N

Estrus expression

Pregnant

Farrowed

Control

3

1（33）

1（33）

1（33）

FSH

3

3（100）

2（66）

2（66）

FSH / hCG

3

1（33）

1（33）

1（33）

eCG1000

3

2（66）

2（66）

1（33）

発情発現が認められた。初産後の母豚は２産後以能であった。次に暑熱期において複数産次後の母

上の母豚より発情回帰日数が長いと報告され豚にFSH単体もしくはヒト絨毛性性腺刺激ホルているとともに，発情期間の長さや排卵時期が異モン（hCG）を添加して（FSH/hCG）皮下投与

なると報告されている。これらのことから初産したところ，FSH皮下投与では４頭中１頭のみ発後の母豚では離乳時における卵胞の発育段階が複情が観察されたのに対して，FSH/hCGの皮下投

数産次の経産豚と異なることが考えられ，hCGの与では４頭すべてで発情が確認された。一方，初添加効果が異なったのかもしれない。

産後の母豚で同様の処理を行ったところ，FSH区

13，14）

15）

本研究により，離乳豚に対してFSHの皮下投与

では３頭すべてで発情発現が認められたのに対しを行い，発現した発情において人工授精を行うこて，FSH/hCG区では３頭中１頭のみで発情発現とで子豚の生産が可能であることが分かった。こが認められた。以上のことから，離乳時におけるのことから肉豚生産において発情誘起の目的で

FSHの皮下投与は慣行法のeCGの筋肉内投与の代

eCGの筋肉内投与の代替としてFSHの皮下投与の替として発情誘起に用いることができ，肉豚生産利用が可能であることが示唆された。一方で，暑に利用できることが示唆された。一方で，夏期の熱期では離乳時における母豚内の卵巣内卵胞の発

母豚の発情回帰遅延の対策としてのFSHを用い育ステージが個体ごとに大きく異なることが考えた最適な方法については，今後より検討が必要でられ，離乳前の卵胞発育を促進する方法の検討があると考えられた。

今後必要と考えられる。
４．要

約

本研究では，卵胞刺激ホルモン（FSH）を用いた夏季における繁殖母豚の発情回帰遅延対策技術の確立を目的とし，FSHの皮下投与が離乳豚の発情回帰，子豚生産に用いることができるかを検討した。まず，非暑熱期において離乳豚にFSHの皮下投与を行ったところ，慣行法である馬絨毛性性腺刺激ホルモン（eCG）の筋肉内投与と同等の発情誘起効果が示唆された。また，その後に人工授精を行い分娩させたところ，正常な子豚生産が可文
献
１）
 河 原 崎 達 雄 ，片 岡 岳 志：日 豚 会 誌 ，56 ，106～
118，2019.
２）
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３）
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Kauffold, J., Wähner, M.：Soc Reprod Fertil Suppl.,
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Theriogenology, 21, 103～116, 1984.
７）
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卵胞刺激ホルモンを用いた夏季における繁殖母豚の発情回帰遅延対策技術の開発
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８） Hiraizumi, S., Nishinomiya, H., Oikawa, T.,
Sakagami, N., Sano, F., Nishino, O., Kurahara, T.,
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11） Shaw, H. J., Foxcroft, G. R.：J. Reprod. Fertil, 75,

193

17～28, 1985.
12）
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1992.
13）
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Theriogenology, 26, 1986.
14）
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15）
 Soede, N. M., Kemp, B.：J. Reprod. Fertil. Suppl,
52, 91～103, 1997.

© The Ito Foundation

194

ウシ初期黄体におけるPG抵抗性の解明―低酸素環境による抗アポトーシス機構―（Ⅱ）
The mechanisms of PG-resistance in bovine early corpus luteum－hypoxia-induced anti-apoptotic mechanism－（Ⅱ）

西

村

亮・菱

沼

貢

（鳥取大学農学部共同獣医学科獣医繁殖学）

Ryo Nishimura and Mitsugu Hishinuma（Laboratory of Theriogenology, Joint Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Tottori University）

Transforming growth factor（TGF）-β superfamily is known to play important roles invarious reproductive functions including cellular growth, development and angiogenesis, bybinding to specific serine/threonine kinase receptors. Several TGF-β binding proteins（TGFBPs）, such as follistatin, gremlin, noggin and chordin, have been known to modulate theaction of TGF-β superfamily proteins. To clarify possible physiological roles of TGFBPs inbovine corpus luteum（CL）, we examined mRNA expressions of TGFBPs in bovine CL
corrected at each stage of estrous cycle. We also investigated the effects of human chorionicgonadotropin（hCG）and hypoxia on these mRNA expressions in cultured bovine early luteal
cells. Luteal cells obtained from early CL were incubated under different O2 concentrations（20％, ３％ O2）with or without hCG（1 U/ml）for 24 hr. TGFBP mRNAs were expressed
during the estrous cycle. Follistatin mRNA expression were higher at early luteal stage.
Gremlin mRNA expression was higher at early and regressed luteal stages, compared with theother luteal stages. Noggin mRNA expression was higher at regressed luteal stage. In earlyluteal cells, TGFBP mRNA expressions were not significantly affected by hCG nor hypoxia.
The overall results suggest that TGFBPs have some physiological roles for luteal formation
and regression, and that these expressions were regulated not significantly by luteinizing
hormone nor by hypoxic conditions．

１．目

低酸素環境に曝された細胞の多くは低酸素誘導性

的

転 写 因 子 （Hypoxia-inducible factor 1 ； HIF1）

黄体は排卵後に卵胞の構成細胞から形成され，の活性化を介してさまざまな遺伝子発現を誘導す妊娠の成立および維持に必須であるプロジェステることで低酸素環境へ適応することが知られておロンを合成・分泌する一過性の内分泌器官であり，ウシの初期黄体においてもHIF１の機能するる。ウシ卵巣動脈の血流量は黄体退行期から減少ことが明らかにされている１）。

し，排卵後の黄体初期においても低く，初期黄体Transforming growth factor（TGF）-βスーパー細胞（初期細胞）は低酸素環境に曝されている。

ファミリーは，さまざまな細胞の増殖，分化に関© The Ito Foundation

ウシ初期黄体におけるPG抵抗性の解明―低酸素環境による抗アポトーシス機構―（Ⅱ）

わっているサイトカインであり，TGF-β1，アク チ ビ ン ， イ ン ヒ ビ ン ， bone morphogenic

195

2 . 2 ウ シ 黄 体 に お け る 発 情 周 期 を 通 じ た
TGFBPsのmRNA発現

proteins（BMPs）などを含む２）。TGF-βスーパー

発情周期各期のウシ黄体組織から抽出したtotal

フ ァ ミ リ ー の 受 容 体 に は ，Ⅰ 型 受 容 体

RNAからcDNAを合成し，real-time PCRにより（TGFBR1）とⅡ型受容体（TGFBR2）が存在し，

TGFBPs（follistatin，gremlin，noggin，chordin）

これらがヘテロ四量体を形成することで，のmRNA発現量を調べた。

TGFBR2に結合したTGF-βスーパーファミリーのリガンドがTGFBR１をリン酸化し，Smadを介

2 . 3 初期細胞のTGFBPs mRNA発現に及ぼす
低酸素環境およびhCGの影響した細胞内シグナル伝達が励起される 。これら

黄体期初期の黄体を有するウシ卵巣（１回の実のシグナルはTGF-βスーパーファミリーのリガ

験につき２－４卵巣）から初期細胞を単離し，培ン ド に 結 合 す る タ ン パ ク 質（TGF-β binding

養プレートに播種して12時間培養後，hCG（1.0protein；TGFBP）による調節を受けることが知U/ml）を添加し，通常の培養環境（20％ Ｏ２ ，られており，ウシの卵巣においてTGFBPである

５％ CO ２ ，75％ Ｎ ２）および低酸素環境（３％follistatin, gremlin, noggin お よ び chordin の 発 現

Ｏ 2 ，５％ CO２ ，92％ Ｎ２）において24時間培養が報告されているが４），ウシの黄体におけるこれ

した。

３）

らの生理的な役割は明らかにされていない。

2.4

total RNAの抽出とcDNAの合成

本研究では，TGFBPsのウシ黄体における生理2 . 2 における発情周期各期のウシ黄体組織と，的な役割を明らかにする目的で，１）ウシの黄体

2 . 3 において24時間培養したウシ黄体細胞からにおけるTGFBPs（follistatin，gremlin，noggin，

RNeasy mini kit（Qiagen，74106）を用いてtotal

chordin）のmRNA発現量について発情周期を通RNA を 抽 出 し た 。total RNA（１μg）か ら ，じて調べるとともに，２）培養したウシの黄体期

PrimeScript TM RT reagent Kit （Takara,

初期の黄体細胞（初期細胞）におけるTGFBPsの

RR037A）を用いて一本鎖cDNAを合成し，real-mRNA発現に及ぼす低酸素環境およびヒト絨毛

time PCRに供した。

性性腺刺激ホルモン（hCG）の影響について検討

2.5

した。

2 . 2 および 2 . 3 におけるreal-time PCRには7500

２．方
2.1

real-time PCR

FAST thermal cycler（Applied Biosystems） お法

よびKAPA FAST ABI prism qPCR kit（KAPA,

ウシ卵巣の採取

KK4604）を用いた。内部標準には18S ribosomal

と畜場においてと畜直後のウシより発情周期各RNA（18S rRNA）を用い，各遺伝子のmRNA発期（初期（Ｅ）：排卵後２－３日，形成期（Ｄ）：

現量は，ΔΔCt法で算出した。実験に用いたウシ

５－６日，中期（Ｍ）：８－12日，後期（Ｌ）：15

特異的プライマーをTable１に示す。

－17日，退行期（Ｒ）：19－21日）のウシ黄体を採取し，組織中のmRNA発現解析用に液体窒素

３．結果と考察中で凍結した。細胞培養用には，初期黄体を有す

ウ シ の 黄 体 に お い て ，検 討 し た す べ て のる卵巣を選抜し，氷冷した生理食塩水に浸漬し，

TGFBPs mRNA発現が発情周期を通じて認めら研究室に運搬した。

れた。follistatinのmRNA発現は初期および後期© The Ito Foundation

196

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

黄体において高い傾向が認められ，初期において低 酸 素 環 境 あ る い は hCG の 影 響 は い ず れ の形成期と比較して有意に高かった（Fig. 1（A））
。

TGFBPs mRNA発現においても認められなかっgremlinのmRNA発現は初期および退行期黄体にた （Fig.２）。 follistatin は 多 数 の リ ガ ン ド

おいて顕著に高く，他期と比較して有意に高かっ（activin，inhibin，BMP2，4，6，7，15）と結合た（Fig. 1（B））
。nogginのmRNA発現は初期，形して作用を抑制することが知られている５）。この成期および退行期黄体において高い傾向が認めら

うち，activin Aがウシの黄体退行に関わること

れ，退行期において中期および後期と比較して有を こ れ ま で に 見 出 し て お り ６），初 期 に 高 ま る意に高かった（Fig. 1（C））
。chordinのmRNA発

follistatinの発現は黄体の形成される初期におい現において周期中の有意な発現の差は認められなてactivin Aなどの黄体退行因子の作用を抑制す

かった（Fig. 1（D））
。培養した初期細胞において，る 機 構 の 一 つ か も し れ な い 。gremlin お よ び

Table 1 Primers used in real-time PCR.

(Arbitrary units [x10-3])

noggin mRNA(C)

(Arbitrary units [x10-5])(A)follistatin mRNA

chordin

1.2

5’- AAACGGCTACCACATCCAAG -3’

forward:5’- TGAGCAAGGAGGAGTGTTGCAGCA -4’

reverse:5’- CATCTGGCCTTGAGGAGTGCACATTC -4’

forward:5’- GAAGCGAGACTGGTGCAAAACCCA -3’

reverse:5’- TATGCAACGGCACTGCTTGACACG -3’

forward:5’- CAAGAAGCAGCGCCTGAGCAAGA -4’

reverse:5’- GAAACAGCTGCCCACCTTCACGTAG -4’

forward:5’-CCTACCCGAATCCGCTTCTCTGACTCC -3’

reverse:5’- GACAACCGAGGCACTGCCCGC -3’

a

(B)
ab

0.6

b
0

E

D

ab

M

L

0

R
b

1.8

0.9

ab

ab

E

ab

D

a

a

M

L

gremlin mRNA

nogginreverse:(Arbitrary units [x10-5])

gremlin5’- TCGCGGAAGGATTTAAAGTG -3’

(D)

0.3
0.2

a
a

0.1
0

b

b

b

E

D

M

L

R

E

D

M

L

R

0.3

chordin mRNAfollistatin

forward:(Arbitrary units [x10-5])

18SrRNA

R

0.2
0.1
0

Fig. 1 Change in the relative amounts of TGFBPs（（A）follistatin,（B）gremlin,（C）noggin,（D）chordin）mRNA in thebovine CL throughout the estrous cycle（E：early, Days 2-3；D：developing, Days 5-6；M：mid, Days 8-12；L：late, Days 15-17；R：regressed luteal stages, Days 19-21）. Data are the means ± SEM for 4 samples/stage andare expressed as relative ratios of follistatin, gremlin, noggin or chordin mRNA to 18SrRNA. Different letters
indicate significant differences（p<0.05）, as determined by ANOVA followed by a multiple comparison with
Bonferroni correction.

© The Ito Foundation

197

ウシ初期黄体におけるPG抵抗性の解明―低酸素環境による抗アポトーシス機構―（Ⅱ）

(B)

None

3%

20%

hCG

3%

O2

0.009

0

20%

None

3%

20%

3%

20%

hCG

3%

O2

3%

O2

(D)

20%

None

3%

20%

hCG

3%

O2

0.07
(Arbitrary units)

0.009

0

0.018
(Arbitrary units)

20%

chordin mRNA

0

0.018
(Arbitrary units)

noggin mRNA

(C)

0.008

gremlin mRNA

0.016
(Arbitrary units)follistatin mRNA

(A)

0.035

0

20%

None

hCG

Fig. 2 Effects of hCG and hypoxia on TGFBPs（（A）follistatin,（B）gremlin,（C）noggin,（D）chordin）mRNA

expression in bovine early luteal cells（means ± SEM ; n ＝ ３）.The cells were cultured in the medium without orwith hCG（1.0 U/ml）under 20% O2 or 3% O2 for 24 hr. The amount of follistatin, gremlin, noggin or chordin mRNAis expressed relative to the amounts of 18SrRNA.

nogginはともにBMP2およびBMP4との親和性が酸素環境およびCGシグナルとの関わりを精査し高く，これらとⅠ型受容体との結合を抑制するこつつ，その生理機能，とくに初期黄体のアポトーとで作用を抑える。BMP4はBMP6とともにウシス抑制への関与について，高親和性リガンドでシの黄体退行に関与する可能性が示唆されているあるactivinおよびBMP4の作用・発現とあわせてことから ，初期あるいは形成期において高い検討を進めることで，ウシ黄体の形成あるいは機

gremlinおよびnogginの発現はBMP4の黄体退行

能維持におけるTGFBPsの生理的意義について解作用を抑制することで黄体形成に寄与している可

明する。

７，
８）

９）

能性が考えられる。今回の検討で周期的発現が変動していなかったchordinもBMP4との親和性が４．要約高いことが知られていることから10），定常的に発Transforming growth factor （TGF）-β ス ー

現することでBMP4の黄体退行シグナルを抑制しパーファミリーの機能を調節するリガンド結合タて黄体の維持に寄与している可能性が考えられンパク質（TGFBP）のウシ黄体における発現やる。初期細胞を用いた検討において，低酸素環境

機能は不明である。本研究では，ウシ黄体の機能

およびhCGのTGFBPs発現に及ぼす統計学的に有調節におけるTGFBPの役割を明らかにする目的

意な影響を認めなかった。この背景として，初期

で ，黄 体 に お け る 発 情 周 期 を 通 じ た TGFBP

細胞の単離の難度から，検討例数が少なかったこ（follistatin，gremlin，noggin，chordin）のmRNAとが一つの要因と考えられ，今後も検討を追加す

発現を調べるとともに，その発現量に及ぼすhCGる必要性がある。

の影響について培養ウシ黄体初期細胞を用いて検本研究において，ウシの黄体の形成あるいは維討した。排卵直後の黄体内は低酸素環境であるこ持におけるTGFBPsの生理的役割が示唆された。

とから，黄体細胞のTGFBP mRNA発現に及ぼす

現在，TGFBPsの生理的役割について引き続き低低酸素環境の影響についても検討した。その結© The Ito Foundation

198

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

果，follistatinの発現は初期および後期黄体において高い傾向が認められ，gremlinの発現は初期および退行期黄体において顕著に高く，nogginのmRNA発現は初期，形成期および退行期黄体において高い傾向が認められた。培養ウシ初期黄体細胞において，低酸素環境あるいはhCGの影響はいずれのTGFBP mRNA発現においても認められなかった。TGFBPが高い親和性で結合するリガンドは黄体退行に関与することから，本研究において初期あるいは形成期の黄体において高い発現を認めたTGFBPsが黄体退行性のTGF-βスー
パーファミリーリガンドの作用を抑制することで黄体の形成あるいは維持に関与する可能性が示唆された。
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Zubieta, C., Schuermann, J. P., Taylor, A. B.,
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６）
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８）
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Ferst, J. G., Bridi, A., Bordignon, V., Duggavathi, R.,
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10）
 Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M.：
Cell, 86, 589～598, 1996.

© The Ito Foundation

199

発情期における牛子宮内膜機能調節因子および調節機序の解明（Ⅱ）
Study on bovine endometrial function regulator and regulatory mechanism
during estrus（Ⅱ）

杉

浦

智

親・中

田

健

（酪農学園大学獣医学群動物生殖学ユニット）

Tomochika Sugiura and Ken Nakada（Laboratory of Theriogenology, Department of Veterinary Medicine, Rakunogakuen University）

Recently, poor reproductive efficiency in cattle has become serious problem. Expression ofendometrial epidermal growth factor（EGF）on days 3 and 14 after estrus is one of theindicators of normal functioning on the bovine endometrium. The objective of study was toclarify the physiological function of bovine uterus, which is the place of conception. The
relationship between the increase in endometrial thickness induced by the expression ofvascular endothelial growth factor（VEGF）in the endometrial tissue and the expression ofendometrial EGF on the third day after estrus, and the effect of sex steroid hormones during
the estrus phase were investigated. The results suggest that the increase in endometrial
thickness during estrus is affected by E2 concentration during estrus and correlates withendometrial EGF expression on the third day after estrus, which affects the fertility. Further
data accumulation and analysis are needed to clarify the relationship between E2 concentrationand subsequent endometrial EGF expression. The physiological changes that occur in bovine
endometrium from the estrous period to the third day after estrus are a series of reactions thathave a positive relationship with each other. It may be an important physiological response
leading to the expression of endometrial EGF, which is essential for conception．

１．目

うち約50％は不受胎に終わり，発情が回帰する。

的

発情徴候が著明であっても受胎しない要因の一つ

近年，飼養管理の改善や遺伝的改良により家畜として，子宮内膜機能の異常が指摘されている。

としての牛の能力が飛躍し続ける一方で，肉用お牛子宮内膜は黄体期から発情期にかけてその厚さよび乳用牛ともに，その受胎率は低迷し続け，繁が増加して一時的に厚くなり，発情終了後に元の殖雌牛（母体）の確保あるいは生産効率の低下が厚さに戻るという周期を繰り返しているが，発情問題となっている。現在，国内の食用肉牛は90％期の子宮内膜がより厚くなるほうが高い受胎性を以上が人工授精による産子であり，雌牛（母牛）示すことが示唆されている１）。そのため，本研究の発情時には人工授精が実施されるものの，その（Ⅰ）において，発情期の牛子宮内膜厚の増加調© The Ito Foundation

200

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）節（血管透過性亢進）に関与する因子として血管上の高産乳牛）18頭を供試し，腟内留置型プロ透過性亢進因子である血管内皮細胞増殖因子

ジェステロン徐放剤（CIDR）とプロスタグラン（VEGF）に着目し，発情期における牛子宮内膜

ジン（PG）F2α製剤を組み合わせたプロトコール

厚と子宮内膜組織中のVEGF発現との関係，ならにて１回目の発情を誘起した（Fig.１）。その後，

びにその調節機序を明らかにした。

自然発情を追って２回目の排卵を確認した10頭10

一方で，正常な子宮機能の牛では発情後３日目

例を自然発情群とし，１回目の誘起発情18例と，および14日目に子宮内膜上皮成長因子（EGF）

その後同じプロトコールにて発情を誘起し排卵をの二峰性ピークが認められたが，長期不受胎牛の認めた７頭７例の計25例を誘起発情群とした。誘うち70％では認められなかったという子宮内膜機起発情群での超音波検査は，PG製剤投与の少な能異常が報告されていることから ，子宮内膜がくとも６時間前より，排卵後24時間目までは６時

正常に機能する指標として子宮内膜EGF発現の間ごとに実施し，排卵後２および３～７日目まで重要性が示唆されている。そこで，本研究（Ⅱ）

48時間ごとに実施した。自然発情群では，１回目

で は 次 な る ス テ ッ プ と し て ，子 宮 内 膜 組 織 中の排卵後３～15日目までは48時間ごとに，その後VEGF発現により誘引された子宮内膜厚の増加と遅くとも排卵後18日目から２回目の排卵後24時間

発情後３日目における子宮内膜EGF発現との関目まで６時間ごとに実施した。超音波検査スケ

係性，さらに発情期間中の性ステロイドホルモン

ジュールに合わせて採血も実施した。

２）

2.1

濃度の影響について検討した。
２．方

超音波検査による子宮内膜厚の測定方法

我々のこれまでの研究報告と同様に３），経直腸法

超音波診断装置を用いて牛の左右子宮角の角間間

本研究には，生殖器に異常のない分娩後30～86

膜付着部における横断面像を描出し，画像解析ソ

日のホルスタイン種経産牛（年間乳量9,500 ㎏以

フトを用いて計測した。子宮内膜の形態は円形か
PGF2α

Induced estrus(n=7)

7 days

CIDR
every 6 h

every 48 h
Induced estrus(n=18)

PGF2α
5-7 days
CIDR
USG andBlood collection
The ﬁrst dayof thetreatment

7

3

14

0

estrus

0

1

2

1

2

3

7

Natural estrus(n=10)

biopsyevery 6 h

every 48 h

every 6 h

every 48 h
3

15-18

0

every 48 h
1

2

3

7

Days after ovulation

Fig. 1 Schedules of treatments and examinations of animals.

E ighteen cows were treated with a combination of a controlled internal drug release（CIDR）device andprostaglandin（PG）F2α（25 mg, dinoprost tromethamine）to induce estrus. Ten cows were allowed to show natural
estrus（lower line）, while estrus was induced for the second time in 7 cows（upper line）. One cow was excluded
because of no ovulation（upper line）. The presence of the corpus luteum and dominant follicle was confirmed on
the day of the first CIDR treatment by ultrasonography（USG）.Day 0 = Day of ovulation.

© The Ito Foundation

201

発情期における牛子宮内膜機能調節因子および調節機序の解明（Ⅱ）

ら楕円形を呈すことが多いため，子宮内膜領域の長径および短径の平均値を直径として算出した。
子宮内腔領域があった場合，子宮内腔領域の長径および短径の平均値を同様に算出し，子宮内膜領３．結果と考察3 . 1 子宮内膜厚変化と子宮内膜EGF濃度との相関性

域の直径から減じた。この測定方法によって左右Day 13を基準とし，自然発情群の発情期には角それぞれ子宮内膜厚を測定し，左右子宮内膜厚

子宮内膜厚が約1.3倍に，誘起発情群では子宮内の平均値を子宮内膜厚とした。また，黄体期の子膜厚が約1.5倍に増加し，誘起発情群の発情期に宮内膜厚は産次数に応じて個体差があることを考おける子宮内膜は自然発情群の子宮内膜よりも有慮し，子宮内膜厚の変化を客観的に評価するため意に厚かった（＊ p < 0.05，Fig.２）。この結果をに 実 測 値 を 用 い る の で は な く ，黄 体 期（Day受け，自然発情とPGF2α製剤を用いた誘起発情で13，排卵日＝Day 0）の子宮内膜厚に対する変化

は，発情後３日目において子宮内膜に発現するの割合に換算し，発情期の子宮内膜厚変化率を比

EGF濃度が異なる可能性を考慮し，自然発情お較した。なお，発情期の子宮内膜厚は，発情徴候

よび誘起発情に分けて，発情期の子宮内膜厚と発が観察された検査回を含む前後12時間ずつ（４回

情後３日目の子宮内膜EGF濃度を比較した（Fig.

分）の子宮内膜厚測定値の平均値とした。

３）。分娩後の高産乳牛の子宮内膜EGF濃度の回2.2

子宮内膜組織の採取およびEGF濃度測定

復時期は，分娩後４～７週目に始まる発情周期に子宮内膜組織の採取は，自然発情群および誘起

集中するとされ，受胎成績低下に影響する組織中発情群ともに，Day 2（発情日後３日目に相当）のEGF濃度の基準は5.0 ng/g組織重量ということに実施した。まず，２％リドカインにより尾椎硬が示唆されている４）。そのため，本研究において

膜外麻酔処置を行い，滅菌したバイオプシーガン

測定した子宮内膜EGF濃度結果が5.0 ng/g組織重を用いて子宮角分岐部から卵管子宮接合部のおお量未満だった検体については，分娩後の子宮内膜

よそ中間地点まで挿入し，直腸壁越しに子宮内膜

EGF濃度の周期的変化が未回復段階と判断し，組織を左右の子宮角それぞれ12時，３時，９時方

自然発情群では３例，誘起発情群では９例を解析

向の３箇所から，合計６箇所採取した。採取した

1.7
Converted endometrial thickness

子宮内膜組織中のうち，少なくとも50 mg以上の組織を採取後すぐに－80℃で保管した。子宮内膜
EGF濃度はKatagiriらの方法に従い２），96ウェル
マイクロプレートを用いた酵素免疫測定法により
測定した。
2.3

性ステロイドホルモン濃度測定

採取した血液から血漿を分離後，プロジェステ

およびE２ 濃度は，発情期の子宮内膜厚と同様に発情徴候が観察された検査回を含む前後12時間ずつ（４回分）のホルモン値の平均値を利用した。

1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0

ロン（P４）およびエストラジオール（E２）濃度を酵素免疫測定法により測定した。発情期のP４＊

1.6

naturalinducedFig. 2 Comparison of endometrial thickness during

natural and induced estrus.

E ndometrial thickness was converted to a ratio

based on the reference day（Day 13 ）. Data wereshown as the mean ± SEM. ＊p < 0.05.

© The Ito Foundation

202

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

(b)
8.0

y = 1.6691x + 3.9501
R² = 0.196

7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0

1

1.2
1.4
1.6
Converted endometrial thickness

Endometrial EGF concentrations(ng/g tissue weight)

Endometrial EGF concentrations(ng/g tissue weight)

(a)

8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0

y = 2.6012x + 2.4149
R² = 0.3044
1

1.2
1.4
1.6
1.8
Converted endometrial thickness

2

Fig. 3 Correlation between endometrial thickness and endometrial tissue EGF concentrations in natural estrus（a）andinduced estrus（b）.

Endometrial thickness were converted to a ratio based on the Day 13 in panel（a）and（b）. Positive correlation

between converted endometrial thickness and EGF concentrations was suggested in the induced estrus.

データから除外した。その結果，誘起発情群にお群では，発情期E２ 濃度によらず，発情後３日目

いて，発情期の子宮内膜厚変化率と発情後３日目の子宮内膜EGF濃度は一定の値を示した。なお，の子宮内膜EGF濃度には，正の相関のある傾向

自然発情群と誘起発情群において，発情期E２ 濃が認められた（Fig. 3b）。なお，誘起発情群で除度に差は認められなかった（7.1±0.8 vs 8.2±0.4

外例が９例と多かったが，分娩後50日未満での１

pg/ml，標準誤差，p＝0.2）。

回目の誘起発情の占める割合が高く，子宮内膜
EGF周期が未回復であったと考えられる。
3 . 2 発情期の性ステロイドホルモン濃度との以上の結果より，発情期の子宮内膜厚の増加強度は，その後の子宮内膜EGF発現に影響する可能性が示唆された。本研究（Ⅰ）において，発情期の子宮内膜組織中のVEGF発現により子宮内膜関係
発情期における子宮内膜厚の変化と性ステロイの血管透過性が亢進し，子宮内膜厚の増加につなドホルモンとの関係について解析した。子宮内膜

がることを明らかにしたが，本研究（Ⅱ）によ厚とP４ との相関性は自然発情群および誘起発情り，子宮内膜厚の増加は，受胎性に影響する発情群ともに認められなかった。一方で，誘起発情群

後３日目の子宮内膜EGF発現と相関することがにおける子宮内膜厚の変化と発情期E２ 濃度には示唆され，発情期から発情後３日目までの子宮内正の相関が認められた（Fig. 4a, b）。次に，発情膜で起こる生理的変化は，相互に正の関係を持っ期の性ステロイドホルモン平均濃度と発情後３日ている一連の反応であることが推測された。ま目の子宮内膜EGF濃度の関係について解析した。

た，発情期E２ 濃度は子宮内膜厚の増加に影響す

子宮内膜厚の変化と同様，発情期のP４ 濃度と発ることが明らかとなり，発情後３日目の子宮内膜

情後３日目の子宮内膜EGF濃度との相関性は，

EGF発現に間接的に関与することが示唆された。

自然発情群および誘起発情群ともに認められな

ただし，本研究で得られた自然発情群のｎ数の規かった。しかしながら，自然発情群における発情模が小さかったことから，発情期E２ 濃度とその期E２ 濃度と発情後３日目の子宮内膜EGF濃度に後の子宮内膜EGF発現との関係を明確にするには正の相関が認められた（Fig. 4c, d）。誘起発情

は，さらなるデータの蓄積と解析が必要である。

© The Ito Foundation

203

発情期における牛子宮内膜機能調節因子および調節機序の解明（Ⅱ）

2.0
y = -0.0053x + 1.3504
R² = 0.0202

1.8
1.6
1.4
1.2
1.0

2

7
E₂ concentrations (pg/ml)

12

Converted endometrial thickness

8.0
7.0
6.0
5.0
4.0

y = 0.1024x + 5.433
R² = 0.5371

3.0
2.0

2

7
E₂ concentrations (pg/ml)

12

(d)

(b)
2.0

y = 0.0867x + 0.7544
R² = 0.5732

1.8
1.6
1.4
1.2
1.0

Endometrial EGF concentrations(ng/g tissue weight)

(c)

2

7
E₂ concentrations (pg/ml)

12Endometrial EGF concentrations(ng/g tissue weight)

Converted endometrial thickness

(a)

8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0

y = 0.0169x + 6.193
R² = 0.0015
27
E₂ concentrations (pg/ml)

12

Fig. 4 Correlation between endometrial thickness or endometrial tissue epidermal growth factor（EGF）concentrations

and estradiol（E2）concentrations in natural estrus（a, c）and induced estrus（b, d）.

Endometrial thickness were converted to a ratio based on the Day 13 in panel（a）and（b）. Positive correlation

between converted endometrial thickness and E2 concentrations, and EGF and E2 concentrations were suggested.

また，発情期E２濃度とVEGFとの相互作用の解明

受胎の場となる子宮の生理的機能の解明を目的も課題である。子宮内膜厚増加という生理的反応に ，子 宮 内 膜 組 織 中 の 血 管 内 皮 細 胞 増 殖 因 子

は，人医療において「妊娠への準備」とされる（VEGF）発現により誘引された子宮内膜厚の増が，具体的な意義は明らかにされていない 。本加と発情後３日目における子宮内膜EGF発現と研究を通して，牛の発情期における子宮内膜厚増の関係性，さらに発情期間中の性ステロイドホル

加は，その後の子宮内膜EGFという受胎には不モン濃度の影響について検討した。その結果，発可欠な因子の発現を誘引する重要な生理反応であ

情期の子宮内膜厚の増加は，発情期E２ 濃度の影る可能性が示された。

響を受け，受胎性に影響する発情後３日目の子宮

５）

４．要

内膜EGF発現と相関することが示唆された。発約

情期から発情後３日目までに牛子宮内膜で起こる肉用および乳用牛ともに生産効率の向上には，生理的変化は，相互に正の関係を持っている一連

低迷する受胎性の改善が重要な課題となっていの反応であり，発情期E２とVEGF発現による子宮る。牛子宮内膜が正常に機能する指標として，発内膜厚の増加は受胎に不可欠な子宮内膜EGF発

情後３日目および14日目の子宮内膜上皮成長因子

現につながる重要な生理反応の可能性がある。

（EGF）の二峰性発現があげられる。本研究では，© The Ito Foundation

204

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

文献１） 杉浦智親，奥山みなみ，中田健，片桐成二：第162回日本獣医学会学術集会講演要旨集，p264，つくば，2019.
２） Katagiri, S., Takahashi, Y.：Theriogenology, 62,
103～112, 2004.
３） Sugiura, T., Akiyoshi, S., Inoue, F., Yanagawa, Y.,

Moriyoshi, M., Tajima, M., Katagiri, S.：J. Reprod.
Dev, 64, 135～143, 2018.
４）
 Katagiri, S.：J. Reprod. Dev, 52（suppl）, 133～137,2006.
５）
 Rockwell, L. C., Pillai, S., Olson, C. E., Koos, R. D.：
Biol Reprod, 67, 1804～1810, 2002.

© The Ito Foundation

205

ウシにおける排卵後の血中エストラジオール増加の検知による受胎性評価
Evaluation of fertility by detecting increase in blood estradiol after
ovulation in cattle

松

井

基

純

（帯広畜産大学獣医学研究部門）

Motozumi Matsui（Department of Veterinary Medicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

Estrogen secreted from follicles that develop after ovulation in cattle is associated with thefunction of the corpus luteum formed, and higher plasma estrogen（E2）levels early after
ovulation is known to be low fertility. Since the amount of activity and cervical mucus electricalresistance （CER） change during estrus period when the E2 concentration rises, therelationship between endocrine, activity, CER up to one week after ovulation and conception
after artificial insemination（AI）or embryo transfer（ET）were examined. Using Holstein
multiparous lactating cows, plasma progesterone（P4）and E2 concentrations, activity and CER
were measured each day from 4 to 7 days after ovulation. P4 levels increased with the passageof days, but E2 levels did not change up to 7 days after ovulation. The amount of activity did
not change throughout the period and was not associated with P4 and E2 levels. The CER
showed a significant positive correlation with the E2 levels and the E2/P4 ratio on the 6 day
after ovulation. In Holstein multiparous cows, between pregnant and non-pregnant cows afterAI, no differences in activity amount, CER, plasma P4 and E2 levels from 4 to 7 days after
ovulation were observed. On the other hand, it was clarified that decrease in the E2/P4 ratio
was faster in pregnant cows than in non-pregnant cows. In cross－bred beef cattle, between
pregnant and non-pregnant cows after ET, no differences in vaginal mucus electricalresistance, plasma P4 and E2 levels at the day of transfer（7 days after ovulation）wereobserved. Present study showed that it is difficult to predict the fertility of cattle using anactivity meter and a measuring device for mucus electrical resistance in the cervix or vagina
up to one week after ovulation．

１．目

では，排卵後の黄体形成とともに，新たな卵胞が的発育する。その卵胞の機能は，Ｐ４により抑制さウシの妊娠の成立にとって，排卵後に形成されれるが，黄体の機能が不十分な場合，卵胞からのる黄体から分泌されるプロジェステロン（Ｐ４）エストロジェン（エストラジオール：Ｅ２）の分は不可欠である。黄体の機能が弱く，血中Ｐ４濃泌が高まり，排卵後５-７日頃に少量ながら血中度が低い場合には，受胎成績は低下する 。ウシ

Ｅ２濃度が増加する２）。つまり，Ｅ２増加は不十１）© The Ito Foundation

206

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

分な黄体機能を示し，その個体の受胎性が低いこて，直腸検査により発情および排卵を診断した。

とを示唆している。よって，発情後１週間頃の血排卵確認日をday 1として，day 4からday 7ま中Ｅ２濃度から，受胎性の推察が可能であると考で，内分泌状況と活動量，子宮頸管粘液電気抵抗

えられるが，臨床現場で速やかにホルモン濃度をを調べた。

測定することは難しい。

尾静脈より採血を行い，遠心処理により血漿を発情時の血中Ｅ２濃度上昇に応じて，活動量の分離した。ジエチルエーテルを用い，血漿からＰ増加３）や子宮頸管粘液の電気抵抗の低下４）が知ら

４あるいはＥ２を抽出し，それぞれEIA法あるい

れており，その変化を利用した発情発見デバイス

はELISA法により，血中Ｐ４あるいはＥ２濃度が開発されている。これらのデバイスを用いて，を測定した。

発情後１週間頃の血中Ｅ２濃度の増加を検知でき

活 動 量 は ，発 情 ・ 疾 病 兆 候 検 知 セ ン サ ー

れば，その個体の受胎性を推察できると考えられ（Farmnote Color，株式会社ファームノート）をる。

用いて記録されたデータを基に作成されたグラフ

本研究では，排卵後１週間頃までの内分泌（血を画像解析ソフトに取り込み，活動量の領域を選

中Ｐ４およびＥ２濃度），活動量，子宮頸管粘液

択し，総ピクセル数を求め，day 4からday 7まで，の電気抵抗および人工授精あるいは受精卵移植後１日ごとの活動量とした（Fig.１）。

の受胎成績との関係を明らかにし，簡易なデバイ

インピーダンス・チェッカーMK 12（室町機械スによるウシ受胎性の推察を試みた。
２．方子宮頸管粘液電気抵抗の評価には，ラット用腟
株式会社）を用いた。受精卵移植機を支軸とし法て，先端にプローブを固定した（Fig.２）。プロー
排卵後１週間までの内分泌状況

ブにシース管カバーをかぶせた状態で腟内に挿入と活動量，子宮頸管粘液電気抵抗との関係

し，外子宮口に挿入する直前にシース管カバーを

ホルスタイン種経産泌乳牛24頭を用いた。自然破り，子宮頸管内へ挿入し電気抵抗値を測定した。

2 . 1 試験①

Activity

発情あるいは定時人工授精プログラムに基づい

0:00

4

24:00

5

6

7

Days after ovulation
Fig. 1 Representative data of changes in activity from day 4 to day 7

The graph created based on the activity data was imported into the image analysis software.

The number of pixels of selected area of activity for each date was calculated as activity value.

© The Ito Foundation

ウシにおける排卵後の血中エストラジオール増加の検知による受胎性評価

207

Fig. 2 A device that measures the electrical resistance of the cervix and vagina

2 . 2 試験②

排卵後１週間頃の活動量，子宮頸管粘液電気抵抗と人工授精あるいは受精

2.3

統計解析

内分泌状況と活動量，子宮頸管粘液電気抵抗値との関係について，ノンパラメトリック分析の卵移植後の受胎成績との関係
人工授精後の受胎成績との関係については，試Spearmanの順位相関を行った。受胎牛と不受胎

験①の供試牛のうち22頭に対し，自然発情あるい牛の群間の活動量，子宮頸管粘液電気抵抗値の比は定時人工授精プログラムに基づいて人工授精を較についてScheffeの多重比較検定を行った。こ実施した。内分泌状況と活動量，子宮頸管粘液電れらの検定において危険率５％未満（p＜0.05）

気抵抗値は，試験①のデータを用い，受胎牛と不の場合に有意差があると判定した。

受胎牛を比較した。
受精卵移植後の受胎成績との関係については，

３．結果と考察北海道士幌町の和牛繁殖農場に繋養されるホルス3.1

タイン種と黒毛和種の交雑種43頭を用いた。ホル

【結果】

試験①

モン処置による発情同期化を行った供試牛に対血中Ｐ４濃度は，day 4は1.4±0.6 ng/ml（平均し，発情日を０日として７日目に受精卵を移植し±標準偏差），day 5は1.9±0.6 ng/ml，day 6は3.0た。インピーダンス・チェッカーを用いた電気抵±0.4 ng/mlおよびday 7は3.8±0.4 ng/mlであり，抗値測定は，移植時の子宮頸管の汚染を避けるた

排卵後日数の増加に伴い上昇した。一方，血中Ｅめに，移植日にプローブを外陰部から25cmの位２濃度は，day 4は2.5±0.2 pg/ml，day 5は2.9±0.3

置に挿入し，試験①と同様の方法で，腟部の電気

pg/ml，day 6は2.6±0.2 pg/mlおよびday 7は2.3

抵抗値を測定した。内分泌状況を調べるために，±0.4 pg/mlであり，変動はみられなかった。

移植日に採血を行い，試験①と同様に血中Ｐ４お各個体のday 4の活動量に対するday 5，6および７の活動量の割合を算出し比較した。day 4のよびＥ２濃度を測定した。
人工授精後35日目あるいは受精卵移植後28日目

活動量に対し，day 5は97.3％，day 6は95.0％，に，超音波画像診断装置を用い，妊娠診断を行っ

day 7は93.6％であり，活動量に有意な変化はみた。

られなかった。活動量と血中Ｐ４あるいはＥ２濃© The Ito Foundation

208

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 1 Spearman’s rank correlation coefficient（rs）and p values between impedance at

cervix and plasma hormone concentrations.

Impedance at cervix（kΩ）
Days after ovulation

Variable

4

5

6

7

r

p

r

p

r

p

r

p

P4（ng/ml）

0.12

0.76

0.10

0.87

0.13

0.69

0.18

0.56

E2（pg/ml）

0.09

0.32

0.38

0.19

0.54

0.05

0.20

0.51

E2/P4 ratio

0.13

0.68

0.12

0.76

0.58

0.03

0.33

0.28

度との間に有意な相関関係は認められなかった。

れず，さらに，Ｅ２/P４比と正の相関がみられ子宮頸管内の電気抵抗値と血中Ｐ４濃度，血中たことから，子宮頸管粘液のなんらかの成分が血Ｅ２濃度およびＥ２濃度とＰ４濃度の比（以下，中Ｅ２およびＰ４濃度のバランスにより変動して

Ｅ２/P４比）との相関について，Table１に示しいる可能性がある。今後，詳細な検証が必要と考た。排卵後６日目において，電気抵抗値は，血中えられる。

Ｅ２濃度およびＥ２/P４比と有意な正の相関を
示した。

3.2

試験②

【結果】

【考察】

人工授精後の受胎性成績は，受胎牛11頭，不受

血中Ｐ４濃度は排卵後日数の経過に伴い上昇し胎牛11頭であった。血中Ｐ４およびＥ２濃度におたが，血中Ｅ２濃度は，４日目（day 4）から７

いて，受胎牛と不受胎牛との間で差異はなく，Ｐ日目（day 7）までの期間では変動はみられず，４濃度は排卵後日数の増加に伴い上昇し，Ｅ２濃供試牛では，卵胞からのＥ２分泌が高まっていな度の変動はみられなかった。一方，Ｅ２/P４比

かったと考えられた。これまで，黄体の機能が不について，受胎牛ではday 4からday 5にかけて有十分な場合，排卵後５-７日頃に血中Ｅ２濃度が意な低下がみられるのに対し，不受胎牛ではday

増加することが知られているが，本試験では，

5からday 6に低下がみられ，Ｅ２/P４比の低下

黄体機能が十分であったと考えられる。血中Ｅ２する時期が異なることが示された（Fig. 3aおよび濃度が上昇しなかったため，活動量が変動しな

Fig. 3b）。活動量および子宮頸管内の電気抵抗値

かったと考えられる。また，血中Ｐ４濃度が上昇の変動は，受胎牛と不受胎牛との間で差異はな

し，発情時のような基底値ではなかったため，活

かった。

２）

動量が増加しなかった可能性も考えられる。一受精卵移植後の受胎性成績は，受胎牛34頭，不方，排卵後６日目に，子宮頸管粘液電気抵抗値と受胎牛９頭であった。血中Ｐ４およびＥ２濃度に

血中Ｅ２濃度およびＥ２/P４比との間に相関がおいて，受胎牛と不受胎牛との間で差異はなかっみられたことから，血中Ｅ２濃度が子宮頸管粘液

た（Fig. 4aおよびFig. 4b）。移植日（day 7）の腟

電気抵抗に影響している可能性が示された。これ

部の電気抵抗値において，受胎牛と不受胎牛とのまで，血中Ｅ２濃度が上昇する発情時には，子宮間で差異はなかった（Fig. 4c）。

頸管粘液電気抵抗は低下することが知られてい

【考察】

る

４）

が，本試験では，血中Ｅ２濃度の変動はみら

人工授精において，受胎牛と不受胎牛との間© The Ito Foundation

209

ウシにおける排卵後の血中エストラジオール増加の検知による受胎性評価a) Non-pregnantb) Pregnant

a

2.5

2.0

b

1.5

E2/P4 ratio

E2/P4 ratio

2.5

a

b

1.0
0.5
0.0

4

5

6

2.0

b

1.5

b

1.0

b

0.5
0.0

7

a

4

Day after ovulation

5

6

7

Day after ovulation

Pregnantb) Plasma E2

Non-pregnant

E2(pg/ml)

P4(ng/ml)a) Plasma P4
6
5
4
3
2
1
0

4
3
2
1
0

Pregnant

Non-pregnant

Impedance(kΩ)

Fig. 3 Changes in ratio of plasma E2 to P4 from day 4 to day 7c) Impedance at vagina
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

Pregnant

Non-pregnant

Fig. 4 Comparison of plasma P4, E2 and impedance at vagina on day 7 between pregnant and non-pregnant

cattleで，活動量および子宮頸管粘液電気抵抗の変動に/P４比も差異はみられなかった。また，腟部粘

差異は認められなかった。これは，受胎の有無に

液電気抵抗においても差異はなかった。試験①でよる，血中Ｐ４およびＥ２濃度の変動に差異がな

は，Ｅ２/P４比における排卵後の経時的な変動かったためと考えられる。試験②では，Ｅ２/P

が受胎性に関与する可能性が示されており，試験

４比は，排卵後日数の経過に伴い低下し，受胎牛②では，移植日（排卵後７日目）のみでの検査ででは，Ｅ２/P４比の低下するタイミングが，不あったため，差異がみられなかった可能性があ

受胎に比べ早いことが示された。排卵後６あるいる。本試験では，事前の検査において，黄体の小は７日目にＥ２/P４比が高い受胚牛は受胎率がさい個体や子宮に収縮感が認められた個体は，移低いことが報告され，Ｐ４濃度が低く，Ｅ２濃度

植対象から除外されていた。このような個体でが高い子宮内環境が胚死滅を引き起こす可能性がは，血中Ｐ４およびＥ２濃度あるいは腟部粘液電示唆されている５）。本試験の結果とあわせて，血気抵抗において，なんらかの違いがみられた可能中Ｅ２およびＰ４濃度のバランスおよびその経時性がある。今後，移植に不適と判定された個体を的変化が受胎性に関与することが明らかとなっ用いた試験が必要と考えられた。

た。一方，試験①では，子宮頸管粘液電気抵抗が本試験の結果から，排卵後１週間頃までの活動

Ｅ２/P４比と相関を示していたが，試験②で，量計および子宮頸管部あるいは腟部の粘液電気抵

受胎の有無による差異がみられなかった理由は明抗測定器を用いた，ウシの受胎性の推察は難しい

らかでない。今後，電気抵抗値測定の感度を上げことが示された。一方，排卵後７日までのＥ２/るなど，詳細な検査が必要と考えられる。

P４比の変動が受胎性に関与する可能性が示され受精卵移植において，受胎牛と不受胎牛との間たことから，その変動を感知できる指標やその測で，血中Ｐ４およびＥ２濃度に差異はなく，Ｅ２定法を開発することで，早期の受胎性推定が可能© The Ito Foundation

210

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）となると考えられた。
４．要

頸管粘液電気抵抗を調べた結果，活動量および電気抵抗値の変動は，受胎牛と不受胎牛との間で差約

異はなかった。排卵後４から７日目までの血中Ｐ

ウシの排卵後に発育する卵胞からのエストロ

４およびＥ２濃度の変動においても，受胎に有無

ジェン分泌は，形成される黄体の機能と関連してによる差はなかった。一方，Ｅ２/P４比が，受おり，排卵後早期に血中エストロジェン（Ｅ２）

胎牛では，不受胎に比べ早く低下することが明ら

濃度の高い場合に受胎性が低いことが知られていかなった。

る。本研究では，血中Ｅ２濃度が上昇する発情時

排卵後７日目の交雑種牛への受精卵移植時に，に変動する活動量および子宮頸管粘液電気抵抗に

血中Ｐ４およびＥ２濃度，腟部粘液電気抵抗を調着目し，排卵後１週間頃までの内分泌，活動量，べた結果，受胎牛と不受胎牛との間で差異はみら

子宮頸管粘液電気抵抗および人工授精あるいは受れなかった。

精卵移植後の受胎成績との関係を明らかにし，ウ
シ受胎性の推察法の開発を試みた。

以上のことから，発情・排卵後１週間頃までの活動量計および子宮頸管部あるいは腟部の粘液電

ホルスタイン種経産泌乳牛を用い，排卵後４から７日目までの各日の血中プロジェステロン（Ｐ

気抵抗測定器を用いた，ウシの受胎性の推察は難しいことが示された。

４）およびＥ２濃度，活動量および子宮頸管粘液
電気抵抗を測定した。血中Ｐ４濃度は日数の経過に伴い上昇したが，血中Ｅ２濃度は，４から７日目までの期間では変動はみられなかった。活動量
は期間を通じて変動がなく，血中Ｐ４およびＥ２濃度との関連もみられなかった。電気抵抗値は，排卵後６日目において，血中Ｅ２濃度およびＥ２/P４比と有意な正の相関を示した。
人工授精後のホルスタイン種経産泌乳牛において，血中Ｐ４およびＥ２濃度，活動量および子宮文
献１）
 Mcneill, R. E., Diskin, M. G., Sreenan, J. M.,
Morris, D. G.：Theriogenology, 65, 1435～1441, 2006.
２）
 Kaneko, H., Kishi, H., Watanabe, G., Taya, K.,
Sasamoto, S., Hasegawa, Y.：J. Reprod. Dev., 41,
311～320, 1995.
３）
 Gaillard, C., Barbu, H., Sorensen, M. T., Sehested,J., Callesen, H., Vestergaard, M.：J. Dairy Sci., 99,
3134～3143, 2016.
４）
 Kitwood, S. E., Phillips, C. J. C., Weise, M.：
Theriogenology, 40, 559～569, 1993.
５）
 Nishigai, M., Kamomae, H., Tanaka, T., Kaneda,
Y.：J. Reprod. Dev., 46, 235～243, 2000.

© The Ito Foundation

211

黒毛和種雌牛の繁殖成績を改善するための栄養状態の最適化検討
Optimizing nutritional status to improve the reproductive performance ofJapanese Black cows

鍋

西

久

（北里大学獣医学部）

Hisashi Nabenishi（Department of Animal Science, School of Veterinary Medicine, Kitasato University）

Using 115 Japanese Black cows kept on a commercial farm in Aomori Prefecture, we
conducted monthly nutritional assessment and blood sampling for biochemical and steroid
hormone analysis for 5 months before and after calving（from 1 month before to 3 months
after calving）to examine the relationship between nutritional status and reproductive
performance. Regarding the calving to first AI interval, cows with a BCS of 4 postpartum weresignificantly prolonged. These cows had lower blood progesterone levels in the month ofcalving and a higher percentage of anovulatory, suggesting delayed recovery of ovarianfunction. In addition, days open（cows with empty uterus or without pregnancy）was alsosignificantly prolonged in the cows with lower post-partum nutritional status. Comparison ofpre- and post-parturition nutritional status between the first AI（＋）and first AI（－）groups
showed that nutritional status significantly decreased from 1 months before calving to themonth of calving in the first AI（－）group, whereas there was no significant decrease in thefirst AI（＋）group, indicating a significant difference in nutritional status in the month ofcalving. No significant differences in general biochemical parameters depending on first AI
performance, but NEFA concentrations in the first AI（－）group remained high in the 1month before calving and in the 1-2 months after calving, suggesting that body fat mobilization
was caused by energy deficiency. Therefore, the importance of feeding management to control
the significant decline in nutritional status after calving is clear for improving reproductive
performance of Japanese Black cows.

１．目

１）る。農林水産省が公表している「畜産統計」に的

よると，肉用牛の飼養戸数は前年比4.1％減であっ

肉用牛の飼養農家戸数と飼養頭数は近年減少傾

たが子取り用雌牛の飼養頭数は減少傾向に歯止め

向で推移しており，慢性的な素牛不足と子牛価格がかかり，前年比2.5％の増加となった。そのため，高騰の要因として大きな問題となっている。した今後は子牛の生産効率を高めることが求められがって，繁殖基盤の強化が喫緊の課題であり，増る。一方で，一戸当たりの飼養頭数は増加傾向で頭事業などの対策が講じられているところであ推移しており，大規模化が進展していることから© The Ito Foundation

212

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

１頭当たりに要する労働時間は短くなるため，個る２～４）。肉用牛においても，分娩前後の栄養状態

体管理の重要性が高まっている。

が繁殖成績に影響を及ぼすことが推察されるが，肉用牛繁殖経営において，子牛を確実に生ませ

黒毛和種繁殖雌牛における分娩前後の栄養状態とることは収益に直結する重要なポイントである。

その後の繁殖成績との関連についての知見は少な

すなわち，繁殖雌牛の繁殖管理技術を向上させ，い。さらに，分娩前後における栄養状態の推移

発情発見率や受胎率を高めることにより分娩間隔（トレンド）が繁殖成績にどのように影響していを短縮することが求められる。しかしながら，わるかは不明である。そのため，生産現場におけるが国における肉用牛の分娩間隔は13.2ヵ月となっ栄養管理技術として活用できる情報はほとんどなており，経営目標である“１年１産”にはほど遠い。そこで本研究では，黒毛和種繁殖雌牛を対象

い状況のため，繁殖成績の改善が最重要課題ととして分娩前後の栄養状態と繁殖成績との関連になっている。

ついて検討するとともに，繁殖成績を改善するた

肉用牛における繁殖成績低下の要因のひとつとめの栄養状態の最適化指標を設定し，生産現場でして，飼養管理技術の過誤による栄養充足率の過活用可能な技術情報として提供することを目的と不足が考えられる。肉用牛の飼料給与量の目安とした。

しては，成長過程や生産性などに応じた適正な養分要求量が日本飼養標準で示されており，妊娠期

２．方法の養分要求量については，胎子の急速な成長がみ

供試動物として，青森県内の大規模繁殖農場でられる妊娠末期２ヵ月間において，維持養分量に飼養されている黒毛和種繁殖雌牛115頭を供試し，

胎子やその付属物の成長に必要とされる量を加算

分娩予定日の１ヵ月前から分娩３ヵ月後まで採材するように提唱されている。一方で，肉用牛の繁（採血，栄養状態の評価）を実施した。採血は，殖成績に影響する繁殖疾患のうち卵巣静止，卵胞

供試牛の頸部静脈から真空採血管にて採取した。

嚢腫，黄体遺残および排卵遅延の発生が全体の約

栄養状態の判定は，公益社団法人全国和牛登録協

84％を占めているとの報告がある。これらの疾病

会の栄養度判定要領５）に基づき，全期間を通してには飼料給与量や栄養バランスが大きく関わってすべての供試牛で同一の判定者が実施した。

いる。また，飼料給与量の制限による低栄養飼養

採取した血液から得られた血漿を用いて，一般によって起こる発情持続時間の短縮と発情行動の生化学性状としてグルコース（GLU），総コレス

鈍性化が，発情発見率の低下ひいては受胎率低下

テロール（TCHO），トリグリセロール（TG），の要因となることが示唆されている。逆に，妊娠

総タンパク（TP），尿素窒素（BUN），アルブミ

期の高栄養飼養は母体の過肥を招き，死産（難ン（ALB），グルタミン酸ピルビン酸トランスア

産）の多発，分娩後の泌乳量および受胎率の低下

ミラーゼ（GPT）およびグルタミン酸オキサロをもたらすことが報告されている。したがって，

酢酸トランスアミラーゼ（GOT）の８項目，血栄養状態を個体ごとに把握しながら適切な飼養管

中遊離脂肪酸（NEFA）濃度および血中プロジェ

理を行うことが求められる。

ステロン（P4）濃度を測定した。なお，血中P4

泌乳によって負のエネルギーバランスに陥りや濃度の測定は，分娩後の個体のみに限定して実施

すい乳用牛においては，分娩後の低栄養状態が繁し，分娩後の発情回帰の指標とした。これらの血殖成績を悪化させるとの知見が多く報告されてい液性状と分娩前後における栄養状態推移（トレン© The Ito Foundation

213

黒毛和種雌牛の繁殖成績を改善するための栄養状態の最適化検討ド），繁殖成績との関連性について評価した。

血中P4濃度に応じて，機能的な黄体が存在して分娩後の繁殖成績として初回人工授精（AI）いるとされる血液１ml当たり１ng以上を発情回

日数，実空胎日数，空胎日数，発情発見率，受胎帰，１ng未満を発情未回帰とした。分娩月におに要したAI回数および受胎率を評価項目としてける栄養度が低いほど，発情未回帰の牛の割合が解析を行った。

高くなる傾向が認められ，栄養度４の牛では67％
が発情未回帰であった。分娩前の栄養状態が分娩３．結果と考察後の繁殖成績に及ぼす影響は栄養水準の程度やそ対象農場における期間中の平均初回AI日数はの期間によって異なり，さらに分娩後の栄養水準

76.9±1.8日で，分布では61－90日が最も多く全体とも密接な関係を持つ６）。黒毛和種繁殖雌牛を供の約50％を占めた。空胎日数の最頻値は，１年１試した本研究においては，分娩後に栄養度４の牛産が可能な80日以内であったが，平均空胎日数はは，栄養度５，６の牛と比較して初回AI日数が有

133.1±6.3日であった。

意に延長し，また分娩月における栄養度が低いほ分娩後３ヵ月間の栄養度と初回AI日数との関

ど発情回帰の割合が低かったことから，分娩直後係をFig.１に示した。栄養度４の牛は85.9±4.1日，において栄養度が低い牛では，卵巣機能回復が遅栄養度５の牛は71.7±2.1日，栄養度６の牛は68.8

延したことが，初回AI日数延長の要因であると±2.2日であり，栄養度４の牛は栄養度５，６の牛考えられた。

と比較して初回AI日数が有意に延長した（ｐ＜0.05）
。

分娩前後における栄養度の推移（トレンド）と初回AI成績（受胎：＋，不受胎：－）との関係

分娩月における栄養度が発情回帰に及ぼす影響

をFig.３に示した。初回AI（－）牛群では，分娩について，Fig.２に示した。発情回帰の判断は，前１ヵ月から分娩月にかけて栄養度が有意に低下

100

Anovulatory cows

Calving to ﬁrst AI interval（days）

a
80

b

b

80%

60

60%

40

40%

20

0

Ovulatory cows

100%

20%

4

5
BCS

0%

6

Fig. 1 Relationship between nutritional status in the

pre- and postpartum and calving to first AI
interval. Statistically significant differences areindicated by different letters（p < 0.05）.

4

5
BCS

6

Fig. 2 Effect of nutritional status in the calving monthon estrus regression.

© The Ito Foundation

214

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）
First AI（＋）

6.4

First AI（－）

6.2

BCS

6.0
p<0.05

5.8
5.6
5.4
5.2
5.0

－1

0

1

2

3

Relative to parturition（mo）
Fig. 3 Relationship between nutritional status and first AI performance.
First AI（+）: Did conceive at first AI

First AI（-）: Did not conceive at first AI

Day open ≦80

6.4

Days open 81-160

Days open ≧161

6.2

BCS

6.0
5.8
5.6
5.4
5.2
5.0

－1

0

1

2

3

Relative to parturition（mo）
Fig. 4 Relationship between nutritional status and days open（cows with empty uterus or without pregnancy）.

したのに対し（ｐ＜0.05），初回AI（＋）牛群で分娩月の栄養度が空胎日数＜80日，81－160日のは有意な低下は認められず，かつ分娩月の栄養度

牛と比較して低く推移し，分娩前１ヵ月から分娩差は有意であった（ｐ＜0.05）。

直後にかけての栄養度低下率が大きかった。実空

分娩前後における栄養度の推移（トレンド）と胎日数は，発情発見効率と受胎率によって決定さ空胎日数（＜80日，81－160日，＞161日）との関れる。本研究においては，分娩後における栄養度係をFig.４に示した。空胎日数＞161日の牛では，にかかわらず，発情発見効率はほぼ一定であった© The Ito Foundation

215

黒毛和種雌牛の繁殖成績を改善するための栄養状態の最適化検討
First AI（＋）

0.16

First AI（－）

NEFA（mEq/L）

0.14

0.12

0.10

0.08

0.06

p<0.1

p=0.17

－1

0

1

2

3

Relative to parturition（mo）
Fig. 5 Relationship between NEFA concentration and first AI performance.
First AI（＋）: Did conceive at first AI

First AI（－）: Did not conceive at first AI

こと，また分娩月における栄養度が低い牛では受

け る 初 回 AI（＋）牛 群 と 初 回 AI（－）牛 群 の胎に要したAI回数が多い，すなわち受胎率が低

NEFA濃度の推移をFig.５に示した。初回AI（－）

かったことから，実空胎日数の延長の要因として群のNEFA濃度は，分娩前１ヵ月，分娩後１，２ヵは，栄養度が低いことによる受胎率の低下による月で（＋）牛群よりも有意に高く推移した（ｐ＜ものと示唆された。初回AIにおける不受胎牛で0.05）。また，栄養度４の牛では，栄養度５～７は，分娩直後の栄養度低下率が大きく，また栄養の牛と比較して，分娩後３ヵ月間のNEFA濃度が度の低下に伴い，初回AI受胎率も低下した。阿

有意に高かった（ｐ＜0.05）。初回AIの妊否によ

部らは，乳用牛において，分娩後にBCSが1.25

る血液一般生化学性状に有意な差は認められな以上低下した場合に，1.0以下の牛と比較して初かったが，初回AI（－）牛群は受胎牛群と比較

回AI日数が約15日延長し，授精後にBCSが回復して分娩前後のNEFA濃度が高かった。また，栄すると受胎率が約20％上昇したと報告している。

養度４の牛では，NEFA濃度が高かった。このこ

鍋西ら

は，分娩後の皮下脂肪蓄積状態が減少でとから，初回AI（－）牛群では，エネルギー不推移した牛群では増加で推移した牛群と比較して足による体脂肪動員が亢進していたものと考えら

空胎日数が延長することを観察している。前述しれ，その結果として栄養度が低下したものと考えたように，実空胎日数の延長要因も受胎率の低下られた。分娩後のNEBはLHパルス頻度を低下さによるものと推察されたことから，分娩前後におせ，分娩後の無排卵期間を延長させる９）。したがっける低い栄養度と分娩後の急激な栄養度低下は，て，分娩後にNEBになり，栄養度が低下した牛

その後の受胎率低下の要因にもなり得ることが示

では，卵子の品質低下，または発情が回帰し授精唆された。

を実施したとしても，無排卵のために受胎しな

７）８）

分娩前１ヵ月から分娩後３ヵ月までの期間におかった可能性が示唆された。

© The Ito Foundation

216

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

以上のことより，黒毛和種繁殖雌牛における分

前２，
１ヵ月から分娩月にかけて栄養度が有意に娩前後の栄養度および栄養度推移が，初回AI日

低下したのに対し，初回AI（＋）牛群では有意数，受胎率，実空胎日数，空胎日数に影響を及ぼな低下は認められず，分娩月の栄養度差は有意ですこと，分娩直後の栄養度低下率が大きい場合にあった。一般生化学性状については，初回AI妊

繁殖成績が低下すること，さらに初回AI（－）

否による有意な差は認められなかったが，初回牛群では，エネルギー不足による体脂肪の動員がAI（－）牛群のNEFA濃度が分娩前１ヵ月，分

亢進している可能性が示唆された。

娩後１，
２ヵ月で高く推移したことから，エネル

したがって，黒毛和種繁殖雌牛の繁殖成績改善

ギー不足による体脂肪動員が推察された。したのためには，分娩後における著しい栄養状態の低がって，黒毛和種繁殖雌牛の繁殖成績改善のため

下を抑制する飼養管理の重要性が明らかとなった。

には，分娩後における著しい栄養状態の低下を抑４．要制する飼養管理の重要性が明らかとなった。

約

青森県内の民間農場で飼養されている黒毛和種
繁殖雌牛115頭を用い，分娩前後５ヵ月間（分娩１ヵ月前～分娩３ヵ月後）にわたって月１回の栄養度評価と採血による生化学分析と性ホルモン分析を実施し，繁殖成績との関連を検討した。
初回AI日数については，分娩後４ヵ月間の栄養度が４の牛群では有意に延長した。この牛群では分娩月の血中プロジェステロン濃度が低く，発情未回帰の割合が高いことから，卵巣機能の回復が遅延したものと考えられた。さらに，分娩後４ヵ月間の栄養度が低い牛群では実空胎日数が延長し，空胎日数も有意に延長した。分娩前後の栄
養度推移を初回AI受胎（＋）・不受胎（－）牛群

文
献１）
 農林水産省：畜産統計, 2020.
２）
 平 子 誠 ， 高 橋 ひ と み ， 櫛 引 史 郎：Journal ofJapanese for clinical infectious disease in farmanimals, Vol.6, No.3, 2011.
３）
 坂口実，笹本良彦，鈴木貴博，高橋芳幸，山田豊：
北畜会報, 45, 33～40, 2003.
４）
 Humblot, P.：Theriogenology, 56, 1417～1433,
2001.
５）
 公益社団法人 全国和牛登録協会：和牛登録事務必携, 2009.
６）
 鈴木修，佐藤匡美：草地試験場研究報告, 23, 79～
86, 1982.
７） 阿部榮，植松正巳，斎藤博水，渡辺大作：家畜臨
床誌, 27（2）,46～50, 2004.
８） 鍋西久，坂口浩平，亀樋成美，黒木幹也：肉用牛研究会報, 101, 6～11, 2016.
９）
 Bulter, W. R.：Livestock Production Science, 83,
211～218, 2003.

で比較したところ，初回AI（－）牛群では分娩© The Ito Foundation

217

抗酸化物質を利用したウシ体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発（Ⅱ）
Improvement of bovine in vitro fertilized embryo production technology
using antioxidants and development of calf production system by new
OPU-IVF-ET method（Ⅱ）

日巻

武裕１，２・中川

裕喜１・多治見弘史３（１岐阜大学応用生物科学部，２岐阜大学自然科学技術研究科，３多治見牛ETクリニック）

Takehiro Himaki１，２，Hiroki Nakagawa１and Hiroshi Tajimi３（１Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University，
２Graduate School of Natural Science and Technology, Gifu University，
３Tajimi bovine ET clinic）

One of the factors that influencing the in vitro embryo production efficiency is oxidative
stress. The purpose of this study is to investigate the effect of α-lipoic acid（ALA）treatment
during in vitro maturation culture of bovine oocytes, which is a strong antioxidant, on thequality of matured oocyte. Furthermore, evaluated the in vivo developmental ability andnormality of calves produced in in vitro fertilized（IVF）embryos derived from ALA treatment.
Oocytes collected from slaughterhouse were cultured for 22 h in maturation medium
supplemented with 0, 50, 100 or 200 µM ALA. At first, examined on mitochondrial activity ofmatured oocytes, the 50 µM treatment group showed a significantly higher value（p ＜ 0.05）
than all other treatment groups. In addition, the 100 µM treatment group also showed asignificantly higher value（p ＜ 0.05）than the 200 µM treatment group. Next, examined on the
mitochondrial content of matured oocytes, the 50 µM treatment group showed a significantly
higher value（p ＜ 0.05）compared to all other treatment groups. In addition, examined on early
apoptosis of matured oocytes, the 50 µM treatment group showed significantly lower values（p＜ 0.05）than the 0 µM and 200 µM treatment group. Finally, after treating the immature
oocytes collected by Ovum Pick Up（OPU）with 50 µM ALA, IVF embryos were produced,
and fresh embryo or freeze-thawed embryo were transferred to recipient respectively. As aresult, conception was confirmed in both cases and recipient cows successfully completed theirgestation period and succeeded in producing two offspring. Both calves born weremorphologically normal and continued to grow normally. In conclusion, it was revealed thattreatment with 50 µM ALA during in vitro maturation was effective in improving thedevelopmental capacity of bovine in vitro matured oocyte and had no negative effects on thedevelopmental ability on in vivo and normal calf production．

© The Ito Foundation

218
１．目

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

なメカニズムは十分に解明されていない。また，的誕生した子牛の正常性を評価することも今後の畜

国内における畜産業は，畜産農家の減少に伴

産現場への技術普及にとって重要である。

い，多頭飼養形態や複合経営が主流になりつつあ

そこで本研究は，この新技術によって培養したる。特にウシにおいては，このような多頭飼養形

体外成熟卵子について，胚発生能に関わる品質を態の弊害として，授精適期の見逃しによる人工授詳細に解析するとともに，産出子牛の正常性につ精受胎率の低下が問題となっている。その結果，いて評価し，新技術を取り入れたOPU-IVF-ET

子牛生産頭数の減少にもつながっており，これまによる子牛生産システムの現場応用の実現性を明

での和牛生産を一新する効率的な増産体制の確立

確にすることを目的とした。

が急務である。今世紀に入り，世界では，経膣採卵法（OPU）による生体由来卵子の採取と体外受精（IVF）卵の生産，そして受精卵移植（ET）
による産子生産が急激に増加している 。国内に
１）

２．方

法

2 . 1 種々濃度のALA処理によって培養した体外成熟卵子の品質の評価

おいても近年，IVF卵のETによる産子生産は増食肉処理場由来卵巣から卵丘細胞―卵母細胞複加傾向にある。特に，和牛受精卵を移植する個体

合体（COCs）を採取した。COCsは，10％FBSに乳用牛を選択することで，乳用牛は乳生産に利添加HEPES-M199を基礎培地として，ALAを０，用でき，産出子牛は高値で販売できるため酪農家

50，100または200μＭ添加したそれぞれの成熟培の経営を助ける手段として応用されている。しか地微小滴で22時間培養した。その後，卵丘細胞をし，IVF卵は体内受精卵と比較して品質に劣り，剥離し，第一極体の放出が確認された成熟卵子を受胎率が低いことが問題視されており，IVF-ET

選抜した。成熟卵子は，１）ミトコンドリア活性の普及がなかなか進まない理由の一因となっていの評価，２）ミトコンドリア含有量の評価，３）る。この受胎性に影響を及ぼす要因には，受胚牛

成熟卵子細胞質の初期アポトーシス出現割合の評の諸要因も存在するが，なによりも受精卵が順調

価，を行った。１）ミトコンドリアの活性評価にに体内発生する能力を有することが最も重要にな

つ い て は ， Lee, et al. の 方 法 ３） を 参 考 に し ，る。すなわち，受精卵が正常かつ品質に優れてい

MitoProbeTM JC-1 Assay Kit（Invitrogen）を 使ることが大前提である。

用した。２）ミトコンドリア含有量については，

そこで申請者は，IVF卵の発生能や品質に悪影

Zeng, et al.の方法４）を参考にし，Mito TrackerTM

響を及ぼす酸化ストレスを抑制するために，抗酸Red CMXRos（Invitrogen）を使用した。３）成化剤であるα-リポ酸をIVF卵生産過程に添加し，熟卵子細胞質の初期アポトーシス出現割合についその改善効果を検討した。その結果，酸化ストレては，Xu, et al.の方法５）を参考にし，Annexin-

スを軽減させ，IVF卵の生産効率ならびに品質を

V-FLUOS Staining Kit（Roche）を 使 用 し た 。

改善することを初めて明らかにした 。さらに，それぞれの染色法で染色し，作製したホールマウ

α-リポ酸処理によって生産した和牛のIVF卵をン ト 標 本 は ，共 焦 点 レ ー ザ ー ス キ ャ ン 顕 微 鏡

乳用牛に移植して受胎させることにも成功し，順（Carl Zeiss；LSM710）を用いて蛍光画像を記録

調な妊娠経過を観察している２）。しかし，α-リ

し，ImageJソフトウェアを用いて，蛍光輝度を

ポ酸処理による発生能および品質改善効果の詳細数値化することで各検討項目を定量的に解析した。

２）© The Ito Foundation

抗酸化物質を利用したウシ体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発（Ⅱ）

2 . 2 ALA処理によって生産した胚に由来する
産子の発育正常性の評価
本学附属岐阜フィールド科学教育研究センター
美濃加茂農場で飼養されている黒毛和種より219

３．結果と考察3 . 1 種々濃度のALA処理によって培養した体外成熟卵子の品質の評価

OPUで未成熟卵子を採取した。その後，50μＭのミトコンドリアは生命活動に必要なエネルギー

ALAを添加した成熟培地で22時間培養後，IVF源であるATPを産生するだけでなく，代謝や恒卵を生産した。媒精から７日後に得られた胚盤胞

常性の維持，アポトーシスにおいて重要な役割をのうち形態的に良好なものを１個選抜し，ホルモ担っている７）。受精卵において，ミトコンドリア

ン処理にて発情周期を同期化した本学附属岐阜の複製は卵子の成熟後，桑実期胚まで抑制されてフィールド科学教育研究センター柳戸農場で飼養

おり８），成熟卵子が貯蔵しているミトコンドリアされている未経産のホルスタイン牛の子宮深部にの量やその品質は初期胚発生に非常に重要であETした。残りの胚盤胞はガラス化凍結保存し，る９）。したがって，ミトコンドリア量や品質の評

自然発情が観察された未経産のホルスタイン牛の価は，細胞質成熟を評価する指標として有効であ

子宮深部に融解後の回復が良好な胚盤胞を１個選る。また，ミトコンドリア活性は，細胞生存の重抜しETした。後日，２頭の受胚牛は超音波画像

要な指標とされ10），その減少はミトコンドリア機

診断によって受胎を確認した。２頭とも順調な妊能障害につながる可能性がある。そこで，ALA

娠経過をたどったが，出産予定日に分娩の兆候が処理がミトコンドリア活性に及ぼす影響についてみられなかったため，発情から286日後に，一般検討した結果，ミトコンドリア活性は，50μＭ処

的なホルモン処理（プロスタグランジンF2αとエ理区がその他のすべての処理区と比較して有意

ストラジオール安息香酸エステルの筋肉内注射な（p＜0.05）に高い値を示した。また，100μＭ処理

らびに合成副腎皮質ホルモンの皮下注射）による区も200μＭ処理区と比較して有意（p＜0.05）に分娩誘起処理を施した。２頭とも翌日に自然分娩高い値を示した（Fig.１）。本研究で使用したJC-に至り，形態的に正常な子牛を出産した。産まれ

１は，活性化および非活性化ミトコンドリアを判た子牛は初乳を与える前に，速やかに生時体重お別することができ，この相対的な膜電位差を解析

よび体尺を測定した。なお，体尺測定の調査項目することで，ミトコンドリア活性の評価が可能では，全国和牛登録協会が発行する黒毛和種正常発ある。膜電位差は，ATPが産生される電子伝達

育曲線６）に従った。その後，１ヵ月おきに生後系において，ミトコンドリア内膜全体に水素イオ

６ヵ月まで体重と体尺を測定し，発育正常性を評ンが送られる過程で生じる。したがって，ミトコ価した。

ンドリア膜電位差は，ATP産生に密接に関わっ2.3ている。本研究において，50または100μＭ添加

統計解析

ミトコンドリア活性，ミトコンドリア含有量な区においてミトコンドリア活性が改善されたこと

らびに初期アポトーシスの評価は，One-Factor

は，卵子細胞質の成熟が向上することを示唆した。

ANOVA に て 検 定 を 行 い ， 多 重 比 較 と し て細胞質内のミトコンドリア含有量が多い卵子

Turkey Kramerの検定を行った。

は，含有量が少ない卵子と比較してATP産生量が多いだけでなく，IVF後の胚盤胞形成率が高く，
胚盤胞総細胞数や胚盤胞のATP含有量も多いこ© The Ito Foundation

220

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Fluorescence intensity

30

a

23.8

20

10

8.3

11.0b

bc

c

5.2

0
0

50

100

200

Concentrations of α-lipoic acid (μM)
Fig. 1 Effect of α-lipoic acid treatments of the IVM period

on mitochondrial activity in matured bovine oocytes.
Different superscripts indicate a significant difference（p<0.05）. Experiments repeated three times（Sample
numbers of each groups = 30）.

100
Fluorescence intensity

71.5

a

b

49.7
50

b

36.4

b

39.5

0
0

50

100

200

Concentrations of α-lipoic acid (μM)
Fig. 2 Effect of α-lipoic acid treatments of the IVM period

on mitochondrial content in matured bovine oocytes.
Different superscripts indicate a significant difference（p<0.05）. Experiments repeated four times（Sample
numbers of each groups = 40）.

とが報告されている11）。そこで，ALA処理がミトらかにした。損傷したミトコンドリアは，ROSのコンドリア含有量に及ぼす影響について検討した生成により卵子に酸化ストレスを与える13）。した

結果，50μＭ処理区がその他のすべての処理区とがって，ALA処理による酸化ストレスの軽減が，比較して有意（p＜0.05）に高い値を示した（Fig.

ミトコンドリアの損傷を抑え，アポトーシスが減２）。ミトコンドリア含有量の増加は，卵子細胞

少したことでミトコンドリア含有量の有意な増加

質の成熟状況およびその後の胚発生の増加と関連につながったと考えられる。

している 。さらに我々は，先行研究 において，

上述のとおり，卵子におけるアポトーシスは，

IVM過程におけるALA処理が卵細胞質内の活性

その後の胚発生に直接的な影響を及ぼす。そこ

酸素種（ROS）量を有意に減少させることを明で，ALA処理が初期アポトーシス状況に及ぼす

12）

２）

© The Ito Foundation

抗酸化物質を利用したウシ体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発（Ⅱ）

Fluorescence intensity

30

221

b

23.3

ab

19.3

b

22.7

a

15.6
15

0
0

50

100

200

Concentrations of α-lipoic acid (μM)
Fig. 3 Effect of α-lipoic acid treatments of the IVM period

on early apoptosis in matured bovine oocytes. Different
superscripts indicate a significant difference（p<0.05）.
Experiments repeated four times（Sample numbers ofeach groups = 40）.

影響について検討した結果，初期アポトーシス
は，50μＭ処理区が０μＭ処理区および200μＭ処

3 . 2 ALA処理によって生産した胚に由来する
産子の発育正常性の評価

理区と比較して有意（p＜0.05）に低い値を示し

新鮮胚，凍結融解胚を移植した受胚牛の両個体た（Fig.３）。卵子細胞質内のミトコンドリアは，において，出産予定日から２日後に正常な雄子牛

アポトーシス促進因子を貯蔵する機能を有すを産出することに成功した。超音波画像妊娠診断

る 。アポトーシス促進因子は，ミトコンドリア

では，新鮮胚移植した個体は，ETから55日後に膜の透過性を調節し，ミトコンドリアからサイト

胎仔の心拍ならびに形態を確認し，凍結融解胚をゾルへのシトクロムＣなどのアポトーシス誘導物

移植した個体は，ETから38日後に胎膜および胎質の放出を調節する。ミトコンドリアのアポトー

仔の心拍を確認した。先行研究において我々は，

シス誘導物質のサイトゾルへの放出は，カスパー

ALA処理によってIVFに由来する胚盤胞期胚のゼカスケードの活性化をもたらし，一度活性化さ総細胞数ならびに内部細胞塊が有意に増加するこれると，カスパーゼカスケードはアポトーシスをとを明らかにした２）。総細胞数や内部細胞塊が多もたらす15）。したがって，本研究において，ALA

い胚ほど受胎率が高い16）。したがって，本実験に処理は，ミトコンドリア活性の向上ならびにROS

おいて，２頭とも受胎したことは，胚盤胞の品質の減少に有益であり，初期アポトーシスの原因と改善が貢献した可能性がある。その後は順調な妊なる諸要因を抑制したと考えられる。

娠経過をたどったが，ETでは頻発しがちな分娩

14）以上の結果から，本実験において，50μＭ添加

日の遅れが観察された。そこで，本実験では過大

区においてミトコンドリア活性や含有量，初期ア

仔による難産を避けるため２頭ともホルモン処理

ポトーシスが改善されたことは，卵子細胞質成熟による人為的な分娩誘起を行った。両個体とも予状況の改善を示すものであり，先行研究 の結果

定日より２日遅れての分娩となったが，生時体重であるIVF胚の発生能の有意な改善を支持するもは，１頭目（No.１）が28.3kg，２頭目（No.２）のである。

が26.2kgであり，２頭ともやや低体重であったも２）© The Ito Foundation

222

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 1 Growth dynamics of calves derived from in vitro fertilized embryos after 50 μM ALA treatment during invitro maturation culture.

No.1

No.2

Month
old

Body
weight（kg）

Withersheight（cm）

Hipheight（cm）

Body
length
（cm）

Chest
girth
（cm）

Chest
depth
（cm）

Chest
width
（cm）

Rump
length
（cm）

Hip
width
（cm）

Thurl
width
（cm）

Pin bone
width
（cm）

0

28.3

66.8

67.4

54.9

71.0

25.7

13.5

17.2

12.4

13.6

10.0

1

53.0

76.6

81.6

69.0

87.0

32.0

19.0

25.4

19.0

21.0

12.2

2

71.5

79.8

85.0

80.0

96.8

33.0

21.5

28.0

20.0

24.0

14.0

3

102.5

92.5

94.4

95.5

109.0

39.8

24.0

28.9

22.5

24.5

17.0

4

131.0

94.0

96.2

102.0

120.0

41.8

27.8

34.4

25.5

26.5

19.0

5

144.0

98.2

99.8

110.0

124.0

43.6

31.0

35.1

28.5

30.2

20.5

6

171.0

102.4

104.6

115.0

134.0

45.5

32.2

38.8

31.2

31.5

21.0

0

26.2

67.6

68.0

56.6

74.0

25.2

14.4

19.1

13.1

16.7

9.7

1

47.5

72.7

80.6

74.5

85.5

30.4

17.4

23.0

16.2

20.0

11.8

2

73.5

86.8

89.1

82.1

101.0

36.8

19.2

26.5

20.1

21.5

15.5

3

91.0

90.0

91.0

90.0

110.0

37.4

20.0

28.2

22.5

25.5

16.0

4

108.0

92.5

95.8

101.0

112.5

43.0

22.0

30.2

25.2

26.5

17.5

5

135.5

97.2

101.6

107.0

123.0

45.5

26.0

34.5

28.5

29.2

19.0

6

179.5

104.0

107.2

113.0

130.0

48.5

29.5

39.2

30.0

31.5

20.5

Fig. 4 Photographs of calves derived from in vitro fertilized

embryos after 50 μM ALA treatment during in vitro
maturation culture（right：8 months old, left：6 months
old）.

のの黒毛和種正常発育曲線の下限から外れることはなかった。その後も順調な発育を示し，月齢が経過するにしたがって黒毛和種正常発育曲線の平の減少等はみられず順調に発育した（Fig.４）
。
４．要

約

均値に近づいた（Table１）。なお，１頭目（No.１）

本研究では，強力な抗酸化物質であるα-リポ

は出産後166日目に，２頭目（No.２）は出産後酸（ALA）処理によるウシ体外受精（IVF）卵

152日目に去勢施術を実施したが，その後も体重生産技術の高度化と開発した培養技術の現場応用© The Ito Foundation

抗酸化物質を利用したウシ体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生産システムの開発（Ⅱ）

を目的として，まず，ALA処理が体外成熟卵子の品質に及ぼす影響を評価した。さらに，ALA処理に由来するIVF卵を受精卵移植（ET）し，体内発生能と得られた産子の正常性に及ぼす影響を検討した。
その結果，体外成熟培養過程における50μM
ALA処理は，ミトコンドリアの活性と含有量を有意に改善し，ATP産生による胚発生能の改善が示された。加えて，成熟卵子の初期アポトーシ
ス発現状況を改善し，IVF卵の発生能と品質が向上することが明らかとなった。ET後の体内発生
能では，無事に妊娠期間を全うし，ALA処理によるIVF卵に由来する正常子牛の産出に世界で初めて成功した。その後の産子の発育状況も良好
で，ALA処理が子牛生産に悪影響を及ぼさないことが明らかとなった。
結論として，本研究は，ウシIVF卵生産技術の発展に新たな知見を提供し，産子生産への応用の可能性が示された。本研究で得られた知見は，ウシIVF卵研究の基盤となり，畜産現場における効率的かつ発展的な産子生産システムの確立に大いに貢献することが期待される。

223

文
献
１）
 IETS Data Retrieval Committee Reports.：
Embryo Technology Newsletter, 39, n.4, 2021.
２）
 日巻武裕，草薙志穂，多治見弘史：公益財団法人
伊藤記念財団 令和２年度食肉に関する助成研究調
査成果報告書，39，167～173，2021.
３）
 Lee, S. K., Zhao, M. H., Kwon, J. W., Li, Y. H., Lin, Z.
L., Jin, Y. X., Kim, N. H., Cui X. S.：J Reprod Dev,
60, 128～35, 2014.
４）
 Zeng, Y., Shinada, K., Hano, K., Sui, L., Yang, T.,
Li, X., Himaki T.：Theriogenology, 162, 32～41,
2021.
５）
 Xu, D., Jiang, X., He, H., Liu, D., Yang, L., Chen, H.,
Wu, L., Geng, G., Li, Q.：Life Sci, 232, 116639, 2019.
６） 全国和牛登録協会：黒毛和種正常発育曲線，2004.
７）
 Babayev, E., Seli, E.：Curr Opin Obstet Gynecol,
27, 175～181, 2015.
８）
 Dalton, C. M., Carroll, J.：J Cell Sci, 126, 2955～
2964, 2013.
９）
 Grindler, N. M., Moley, K. H.：Medicine, 19, 486～
494, 2013.
10）
 Abdulhasan, M. K., Li, Q., Dai, J., Abu-Soud, H. M.,
Puscheck, E. E., Rappolee, D. A.：J Assist Reprod
Genet, 34, 1595～1607, 2017.
11）
 Stojkovic, M., Machado, S. A., Stojkovic, P.,
Zakhartchenko, V., Hutzler, P., Gonçalves, P. B.,
Wolf, E.：Biol Reprod, 64, 904～909, 2001.
12）
 Nie, J., Yan, K., Sui, L., Zhang, H., Zhang, H.,
Yang, X., Lu, S., Lu, K., Liang, X.：Theriogenology,
141, 35～40, 2020.
13）
 Saita, S., Shirane, M., Nakayama, K. I.：Nat
Commun, 4, 1410, 2013.
14）
 Wang, L. Y., Wang, D. H., Zou, X. Y., Xu, C. M.：J
Zhejiang Univ Sci B, 10, 483～492, 2009.
15）
 Kosaka, N., Sudo, N., Miyamoto, A., Shimizu, T.：
Biochem Biophys Res Commun, 363, 733～737, 2007.
16）
 Zullo, G., Albero, G., Neglia, G., De Canditiis, C.,
Bifulco, G., Campanile, G., Gasparrini, B.：
Theriogenology, 85, 688～697, 2016.

© The Ito Foundation

224

分娩前の複合型アミノ酸ペレット給与が乳牛の繁殖成績に及ぼす影響
Effect of prepartum administration of rumen - protected complex aminoacids pellet on reproductive performance of the dairy cow

住

吉

俊

亮

（日本大学生物資源科学部獣医学科）

Toshiaki Sumiyoshi（Laboratory of Theriogenology, Department of Veterinary Medicine, College of Bioresource Science, Nihon University）

The purpose of this study is to reveal the effect of administration of rumen - protectedcomplex amino acids pellet on the health condition of dams and offsprings, as well as on the
reproductive performance. Data were collected from 10 Holstein-Friesian cows with clinically
healthy. These 10 cows were divided into the 2 groups of 5 cows each, amino acids groups andcontrol groups. The amino acids group was fed 50 g of rumen - protected complex amino acids
pellet added feed from 60 days before estimated day of parturition to the day of parturition. A
total of 16 items of Glucose（Glu）, non-esterified fatty acid（NEFA）, 3-hydroxybutyric acid,total ketone body, acetoacetic acid, urea nitrogen（BUN）, albumin（Alb）, total protein（TP）,
total cholesterol（T-Cho）, γ-glutamyl transpeptidase（γ-GT）, aspartate aminotransferase（AST）, creatinine（CRE）, creatine kinase（CK）, phosphorus（iP）, magnesium（Mg）, calcium（Ca）were measured. In addition, a total of 20 amino acids such as Arginine（Arg）, Isoleucine（Ile）, Leucine（Leu）, Lysine（Lys）, Methionine（Met）, Phenylalanine（Phe）, Tyrosine（Tyr）,
Valine（Val）,Alanine（Ala）,Asparagine（Asn）, Aspartic Acid（Asp）, cystine, Glutamine（Gln）,
Glutamic Acid（Glu）, Glycine（Gly）, Histidine（His）, Proline（Pro）, Serine（Ser）, Threonine（Thr）, and Tryptophan（Trp）, or 40 items by adding 20 items of α-aminoadipic acid, α-amino-n-butyric acid, Anserine（An）, Aminopimelic acid（Apm）, β-Alanine（β-Ala）, β-Amino-iso-butyric acid（β-AIBA）, Carnosine（Carno）, Citrulline（Cit）, Cystathionine（Cysthio）, gamma-Aminobutyric acid（GABA）, Glycylproline, σ-Hydroxylysine（σ-Hyl）,
4-Hydroxyproline（4-Hyp）, quinurenin, 1-Methylhistidine（1-Me His）
, 3-Methylhistidine（3Me-His）, Ornithine（Orni）, prolyl-Hydroxyproline（prolyl-Hyp）, Sarcosine（Sar）, andthioproline to these above 20 items were measured. Regarding the reproductive performance,
first ovulation day, vaginal mucus properties, cytological count, first insemination day, days
after parturition and number of inseminations were investigated. The blood acetoacetic acidconcentration tended to be significantly lower in 3 days after parturition and tended to belower in 5 and 7 days after parturition in the amino acids group. The blood Cre and CK
concentration significantly lower in 3 days after parturition and tended to be lower in 5 and 7
days after parturition in the amino acids group. The number of days of initial ovulation was
50.4 ± 17.4 days in the amino acids group and 74.2 ± 20.2 days in the control group, indicating© The Ito Foundation

分娩前の複合型アミノ酸ペレット給与が乳牛の繁殖成績に及ぼす影響

225

that the number of days tended to be shortened by feeding the rumen - protected complex
amino acids pellet added feed. In the future, we plan to continue sampling and data analysis toelucidate the factors that affected reproductive performance by feeding amino acid added
feeds.

１．目

0.7産であり，５段階で評価したボディコンディ

的

ションスコア（BCS）12）は2.5±0.3であった。搾乳

最近50年における乳牛の改良や飼養管理技術の回数は朝夕２回であり，１頭あたりの305日換算

発展により，全世界における乳牛の個体乳量は飛

平均乳量はおよそ9,000kgであった。飼料給与状

躍的に増加した。しかし，それとともに乳牛の繁況は日本飼養標準（2017年）に準拠して混合飼料

殖成績は全世界的に低下している。この繁殖（TMR）および乾草を給与していた。給与群には

成績の低下の原因は多岐にわたるが，その一要因

アミノ酸添加飼料（ベストバランス・Ｗ，あすか

として周産期にエネルギー収支バランスがマイナ

アニマルヘルス株式会社，東京）を１日50ｇ，分スに陥る，いわゆる負のエネルギーバランス状態

娩前60日から分娩日までTMRにトップドレスし，が関わっていることが指摘されている。負のエネ

朝の給餌時に給与した。なお，本研究は日本大学

ルギーバランス状態が長引けば，それだけ繁殖機

動物病院における臨床研究の承認を受けている能回復が遅れるとされている。特に高泌乳牛では（承認番号1－005）。

１～８）

エネルギー要求量も大きくなるため，負のエネル

2.2

ギー状態に陥りやすいと考えられる。近年，乳牛

母牛は分娩前60，42，14，７，０，分娩後１，３，の周産期における負のエネルギーバランスの改善

５，７，14，28，35，42，63，84，105日に正中尾や泌乳成績の向上のために，アミノ酸添加飼料が静脈より採血を行った。また，子牛については出利用され，一定の効果が得られている。しか生後０，７，14，28日に経静脈より採血を行った。

し，アミノ酸の給与が繁殖成績に及ぼす影響につ採取した血液は，ただちに1,500 g で15分間遠心分

いての報告は少ない。そこで本研究では，周産期離を行い，血清および血漿を分離後，測定まで－のアミノ酸添加飼料の給与が母牛の健康状態維

30℃で保存した。

９～11）

採血

持，産子の健康，分娩時の酸化ストレスに与える

2.3

影響に加え，繁殖成績に及ぼす影響について明ら

母牛は，各採血日にBCSの測定を行った。また，子牛については各採血日に体重および胸腺スコア

かにすることを目的とした。

の測定を行った。

２．材料と方法
2.1

BCS，体重，胸腺スコアの測定

2.4

血液化学検査

各採血日の血液を用い，母牛，子牛についてエ

供試動物

供試牛は2021年10月から2022年６月の間に，神ネルギー代謝の指標として血糖（Glu），遊離脂肪

奈川県下の民間のタイストール形式の牧場に飼養酸（NEFA），３ヒドロキシ酪酸，総ケトン体，されている一般健康状態の良好なホルスタイン種

アセト酢酸，タンパク質代謝の指標として尿素窒経産搾乳牛10頭である。10頭の供試牛を無給与群

素 （BUN）， ア ル ブ ミ ン （Alb）， 総 タ ン パ ク

５頭，給与群５頭に振り分けた。供試牛の供試時（TP），肝機能の指標として総コレステロールの年齢は4.0±0.9（平均±SD）歳，産次数は1.7±（T-Cho），γ－グルタミルトランスぺプチターゼ© The Ito Foundation

226

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）（γ－GT），アスパラギン酸アミノトランスフェ

2.6

ラーゼ（AST），腎機能の指標としてクレアチニ

母牛は，分娩後に週１回，各採血実施日に直腸ン（CRE），クレアチンキナーゼ（CK），ミネラ

検査および超音波画像診断装置（トリンガリニ

ルの指標としてリン（iP），マグネシウム（Mg），

ア，Esaote Europe B.V., Netherlands）を用いてカルシウム（Ca）の計16項目について測定した。

卵巣および子宮を観察した。黄体が初めて確認さ測定は民間の検査施設（株式会社保健科学，神奈

れた日を初回排卵日とした。また分娩後１～７週川）に依頼した。

にメトリチェックによる腟粘液性状検査およびサ

2.5

繁殖成績

イトブラシによる子宮内膜細胞診を実施した。ま血清アミノ酸濃度の測定

アミノ酸の測定項目はアルギンニン（Arg），

た，供試牛は初回授精日数，空胎日数，授精回数

イソロイシン（Ile），ロイシン（Leu），リシン

および産褥期疾患等の疾病罹患の有無について受（Lys），メチオニン（Met），フェニルアラニン

胎するまで追跡調査を行った。

（Phe），チロシン（Tyr），バリン（Val）
，アラニ

2.7

ン（Ala），アスパラギン（Asn），アスパラギン測定を行った各項目について，給与群と無給与酸（Asp），シスチン，グルタミン（Gln），グル

群で比較を行った。初回排卵日数，初回授精日数，

タミン酸（Glu），グリシン（Gly），ヒスチジン

空胎日数の比較は，スチューデントのｔ検定（エ（His），プロリン（Pro），セリン（Ser），トレオ

クセル統計，オーエムエス出版，東京）を用いた。

ニン（Thr），トリプトファン（Trp）の計20項

血液生化学検査，血清アミノ酸濃度，その他の血目あるいは，この20項目にα－アミノアジピン酸，

液検査項目についての群間の比較は，正規性によ

α－アミノ－ｎ－酪酸，アンセリン（Ans），アミノ

り，スチューデントのｔ検定またはマン・ホイッ

ピメリン酸（Apm），βアラニン（β－Ala），β

トニ検定を用いた。ｐ＜0.05を有意差あり，ｐ＜

ア ミ ノ イ ソ 酪 酸 （β － AIBA），カ ル ノ シ ン

0.1を有意傾向ありとした。データは平均±標準（Carno），シ ト ル リ ン（Cit），シ ス タ チ オ ニ ン

偏差で示した。

（Cysthio），γ－アミノ酪酸（GABA），グリシル
プロリン，σ－ヒドロキシリシン（σ－Hyl）
，4－

統計解析

３．結果と考察ヒドロキシプロリン（4－Hyp），キヌレニン，1－

試験開始時のBCSは給与群2.4±0.3，無給与群

メチルヒスチジン（1Me－His），3－メチルヒスチ

2.6±0.3であり，両群間に差は認められなかった。

ジン（3Me－His），オルニチン（Orni），プロリル

また，子牛の出生時体重，出生後28日までの増加－ヒドロキシプロリン（prolyl－Hyp），サルコシン

体重，胸腺スコアについても差は認められなかっ（Sar），チオプロリンを加えた40項目について測た。

定した。すなわち，母牛については，分娩前60，

繁殖成績は，初回授精日数，空胎日数，授精回

14，分娩後７，42，63，105日に20項目を，分娩数および受胎率については現在追跡調査および

前７，０，分娩後１，14，28，84日について40項

データ解析中であるが，初回排卵日数については目を測定した。子牛は，産後０，７，14，28日に

給与群が50.4±17.4日，無給与群が74.2±20.2日と20項目について測定を行った。測定は民間の検査なり，アミノ酸添加飼料の給与により日数が短縮

施設（日本動物特殊診断（株），北海道）に依頼する傾向が認められた（Fig.１）。メトリチェッ

した。

クおよびサイトブラシによる子宮の回復状況につ© The Ito Foundation

227

分娩前の複合型アミノ酸ペレット給与が乳牛の繁殖成績に及ぼす影響

いては両群に差は認められなかった。

了しているデータについて，有意差および有意な

血液生化学検査，血清アミノ酸濃度の結果につ傾向が認められたものについてのみ記載する。エいては，まだサンプリングおよび測定がすべて終

ネルギー代謝の指標については，血糖（Glu）濃了していないので，現在までにサンプリングが終度は，母牛において実験開始時の分娩前60日で，給与群が有意に高かった。また，血中アセト酢酸
濃度は母牛において分娩後３日で給与群が有意に100

低く，分娩後５，７日で給与群が低値を示す傾向

90
80
70

が認められた（Fig.２）。NEFA，３ヒドロキシ60

酪酸，総ケトン体については，両群間に有意な差50は認められなかったが，アミノ酸製剤の給与によ40り，負のエネルギーバランスが改善され，脂肪組3020織の分解が抑制され，給与群のアセト酢酸濃度が100Amino acids
n=5

低値となった可能性が示唆される。タンパク質代

Controln=5

謝の指標については，BUN濃度は，子牛においFig. 1 Days to first postpartum ovulation.

て分娩後14日で，給与群が有意に高かった。また，

Date are presented as the mean ± SEM.

血中Alb濃度は子牛において分娩後７日で無給与

Blood Glucose concentration（mg/dl）† ; p < 0.1

100
90
80

Amino acids
Control
＊

70
60
50
40
30

－60 －42 －14 －7

0

1

3

5

7

14

＊

†

†

3

5

7

21

28

35

42

63

84 105350

Blood Aacetoacetic acidconcentration（mg/dl）

Days after parturition（days）

†

300
250
200
150
100
50
0
－50

－60 －42 －14 －7

0

1

14

21

28

35

42

63

84 105

Days after parturition
Fig. 2 Blood concentration of biochemical parameters for Indicator of energy metabolism in calving cows.
Date are presented as the mean ± SEM.
 ；p <0.05 †；p < 0.1＊© The Ito Foundation

228

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Blood BUN concentration（mg/dl）

35
Amino acids
Control

30
25

＊

20
15
10
5
0

0

7

14

21

28

14

21

28

Blood Albumine concentration（g/dl）

3.5

3

＊

2.5

2

1.5

1

0

7

Days after birthFig. 3 Blood concentration of biochemical parameters for Indicator of protein metabolism in calves.
Date are presented as the mean ± SEM.
＊；p <0.05

群が有意に高かった（Fig.３）。腎機能の指標にた。アミノ酸添加飼料の給与が繁殖成績に影響を関しては，血中Cre濃度および血中CK濃度はと与えた要因の解明に関しては，さらなるデータのもに，母牛において分娩後３日において給与群が測定および解析が必要であり，引き続き解析を続有意に低く，分娩後５，７日で低値を示す傾向がける予定である。

認められた（Fig.４）。これには分娩後の筋肉分解が関与している可能性があり，アミノ酸給与に４．要

約より分娩後の筋肉分解が抑えられ，給与群におい本研究の目的は，周産期のアミノ酸添加飼料のてCreおよびCKが低値となった可能性が考えら

給与が母牛および産子の健康状態に与える影響にれる。ミネラルの指標については，血中Mg濃度

加え，繁殖成績に及ぼす影響について明らかにすは，母牛において分娩日で，給与群が高値を示することである。本研究には，一般健康状態の良好傾向が認められた（Fig.５）。

なホルスタイン種経産搾乳牛10頭を供試した。こ

今回の研究において，アミノ酸添加飼料の給与の10頭の供試牛を無給与群５頭，給与群５頭に振は繁殖成績の向上に有効である可能性が示唆され

り分け，給与群にはアミノ酸添加飼料を１日50© The Ito Foundation

Blood Creatinine concentration（mg/dl）

分娩前の複合型アミノ酸ペレット給与が乳牛の繁殖成績に及ぼす影響

229

1.8
1.6
Amino acids

1.4
＊

1.2

†

†

5

7

†

†

5

7

Control

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

－60 －42 －14 －7

0

1

3

14

21

28

14

21

28

35

42

63

84 105

Blood CK conxentration（U/L）

1400
1200
1000
800

＊

600
400
200
0
－200
－400

－60 －42 －14 －7

0

1

3

35

42

63

84 105

Days after parturition
Fig. 4 Blood concentration of biochemical parameters for Indicator of renal function in calving cows.
Date are presented as the mean ± SEM.
 ；p <0.05 †；p < 0.1＊

ｇ，分娩前60日から分娩日まで給与した。母牛に項目について測定した。加えて，アミノ酸としてついては分娩前60，42，14，７，０，分娩後１，３，

アルギニン（Arg），イソロイシン（Ile），ロイシ

５，７，14，28，35，42，63，84，105日に，子牛ン（Leu），リシン（Lys），メチオニン（Met），

については出生後０，７，14，28日に採血を行い，フェニルアラニン（Phe），チロシン（Tyr），バ血糖（Glu），遊離脂肪酸（NEFA），３ヒドロキリ ン（Val），ア ラ ニ ン（Ala），ア ス パ ラ ギ ン

シ 酪 酸 ，総 ケ ト ン 体 ，ア セ ト 酢 酸 ，尿 素 窒 素（Asn），アスパラギン酸（Asp），シスチン，グ（BUN），アルブミン（Alb），総タンパク（TP），

ルタミン（Gln），グルタミン酸（Glu），グリシン

総コレステロール（T－Cho），γ－グルタミルトラ（Gly），ヒスチジン（His），プロリン（Pro），センスぺプチターゼ（γ－GT），アスパラギン酸アリン（Ser），トレオニン（Thr），トリプトファミノトランスフェラーゼ（AST），クレアチニンン（Trp）の計20項目，あるいは，この20項目に（CRE），クレアチンキナーゼ（CK），リン（iP），

α－アミノアジピン酸，α－アミノ－ｎ－酪酸，アン

マグネシウム（Mg），カルシウム（Ca）の計16セリン（Ans），アミノピメリン酸（Apm），β© The Ito Foundation

230

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Blood Mg concentration（mg/dl）

3.00

Amino acids

Control

†
2.50

2.00

1.50

1.00

－60 －42 －14 －7

0

1

3

5

7

14

21

28

35

42

63

84 105

Days after parturition
Fig. 5 Blood concentration of biochemical parameters for mineral index in calving cows.
Date are presented as the mean ± SEM.
† ; p < 0.1

ア ラ ニ ン（β － Ala）
，β ア ミ ノ イ ソ 酪 酸（β －ミノ酸製剤の給与により，負のエネルギーバラン

AIBA），カルノシン（Carno），シトルリン（Cit），

スが改善され，脂肪組織の分解が抑制され，給与

シ ス タ チ オ ニ ン（Cysthio），γ － ア ミ ノ 酪 酸

群のアセト酢酸濃度が低値となった可能性が示唆（GABA），グリシルプロリン，σ－ヒドロキシリされる。BUN濃度は，子牛において分娩後14日で，シ ン（σ － Hyl）
，4 － ヒ ド ロ キ シ プ ロ リ ン（4 －給与群が有意に高かった。また，血中Alb濃度はHyp），キヌレニン，1－メチルヒスチジン（1Me－

子牛において分娩後７日で無給与群が有意に高His），3－メチルヒスチジン（3Me－His），オルニ

かった。血中Cre濃度および血中CK濃度はとも

チ ン（Orni），プ ロ リ ル － ヒ ド ロ キ シ プ ロ リ ンに，母牛において分娩後３日において給与群が有（prolyl－Hyp），サルコシン（Sar），チオプロリン

意に低く，分娩後５，７日で低値を示す傾向が認を加えた40項目について測定した。

められた。これには分娩後日での筋肉分解が関与

繁 殖 成 績 に つ い て は ，初 回 排 卵 日 ，メ ト リ

している可能性があり，アミノ酸給与により分娩チェックによる腟粘液性状検査およびサイトブラ

後の筋肉分解が抑えられ，給与群においてCreおシによる子宮内膜細胞診に加えて，初回授精日

よびCKが低値となった可能性が考えられる。血数，空胎日数，授精回数および産褥期疾患等の疾

中Mg濃度は，母牛において分娩日で，給与群が病罹患の有無について追跡調査を行った。血液生

高値を示す傾向が認められた。繁殖成績に関して化学において，血中Glu濃度は，母牛において実は，初回排卵日数については給与群が50.4±17.4

験開始時の分娩前60日で，給与群が有意に高かっ日，無給与群が74.2±20.2日となり，アミノ酸添た。また，血中アセト酢酸濃度は母牛において分加飼料の給与により日数が短縮する傾向が認めら

娩後３日で給与群が有意に低く，分娩後５，７日れた。今後は，サンプリングおよびデータ解析をで給与群が低値を示す傾向が認められた。

継続し，アミノ酸添加飼料の給与が繁殖成績に影NEFA，３ヒドロキシ酪酸，総ケトン体について響を与えた要因の解明を続ける予定である。

は，両群間に有意な差は認められなかったが，ア© The Ito Foundation

分娩前の複合型アミノ酸ペレット給与が乳牛の繁殖成績に及ぼす影響文
献１） Lucy, M. C.：J Dairy Sci, 84, 1277～1293, 2001.
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３） Reimers, T. J., Smith, R. D., Newman, S. K.：J
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４） Van Eerdenburg, F. J. C. M., Loeffler, H. S. H.,
Van Vliet, J. H.：Vet Q, 50, 57～69, 1996.
５） Van Vliet, J. H., Van Eerdenburg, F. J. C.M.：
Appl Anim Behav Sci, 50, 57～69, 1996.
６） Butler, W. R., Smith, R. D.：J Dairy Sci, 72, 767～
783, 1989.
７） Royal, M. D., Darwash, A. O., Flint, A. P. F.,

231

Webb, R., Woolliams, J. A., Lamming, G. E.：Anim
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８） Butler, W. R.：J Dairy Sci, 81, 2533～2539, 1998.
９）
 Colin-Schoellen, O., Laurent, F., Vignon, B.,
Robert, J. C., Sloan, B.：J Dairy Sci, 78, 2807～2818,
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10）
 Donkins, S. S., Varga, G. A., Sweeney, T. F.,
Muller, L. D.：J Dairy Sci, 72, 1484～1491, 1989.
11）
 Misciatteilli, L., Kristensen, V. F., Vestergaard, M.,
Welsbjerg, M. R., Sejrsen, K., Hvelplund, T.：J
Dairy Sci, 86, 275～286, 2003.
12）
 Ferguson, J. D., Galligan, D. T., Thomsen, N.：J
Dairy Sci, 77, 2695～2703, 1994.

© The Ito Foundation

232

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討（Ⅱ）
Examination of new selection method of recipient cow based on ovarian
reserves（Ⅱ）

小

山

毅１・若

槻

拓

司２

（１北海道立総合研究機構畜産試験場，２北海道立総合研究機構酪農試験場）

Takeshi Koyama１ and Takushi Wakatsuki２（１Animal research center, Hokkaido research organization, ２Dairy research center, Hokkaido research organization）

The aims of this study were to（1）determine the optimal evaluation time of antiMüllerian（AMH）hormone concentration before and after calving and to（2）evaluate the risk
factors affect the change in AMH concentration before and after calving in Holstein dairy cows.
In experiment 1, plasma samples for AMH were collected from 142 Holstein dairy cows at 21
days before calving（prepartum）, 21 days after calving（puerperal）, and 42 days after calving（peak lactation）. The relationship between AMH concentration at each evaluation time andconception at 100 days after calving was investigated by logistic regression models. There wassignificant relationship between AMH concentration at the peak lactation and conception at
100 days after calving. In experiment 2, the same cows as in experiment 1 were tested. The
AMH ratio was calculated by dividing the AMH concentration at the peak lactation by the
AMH concentration at prepartum and tested cows were classified into 3 categories（high,medium, and low）according to AMH ratio. The relationship between AMH ratio and milkyield after calving, dry matter intake, total digestible nutrients（TDN）sufficiency rate, blood
metabolite concentrations were investigated by multiple regression models. Compared with H
group, M and L group showed decreased serum albumin, magnesium, inorganic phosphorus,
and calcium concentrations after calving. These findings suggested that inflammatory diseases
occurred, and feed intake was low in M and L groups. Furthermore, TDN sufficiency rate in
the M and L groups were lower than that in the H group. In conclusion, 1）AMH concentration
at the peak lactation was appropriate for the evaluation of AMH concentration before and after
calving, and 2）it was possible that changes in AMH concentration before and after calving
were affected by prepartum and puerperal nutritional status．

１．目

から行われてきた高品質卵回収の効率化や回収卵

的の保存，培養技術の改良など，主に供卵牛側から受精卵移植（ET）技術を活用して効率よく改良を行っていくためには，ET受胎成績の向上および高位安定化が必要である。そのためには従来の取り組みに加え，受卵牛側からのアプローチが必要不可欠である。
近年，ウシの繁殖領域において卵巣予備能が注© The Ito Foundation

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討（Ⅱ）

233

目されている。卵巣予備能は卵巣における卵胞のいた，ホルスタイン種142頭（平均産次：2.2±1.7，量と定義され，末梢血中の抗ミューラー管ホルモ

分娩時の平均年齢：3.2±1.3）を供試した。分娩ン（anti-Müllerian hormone ，AMH）濃 度 等 に

２週前（分娩前），分娩後３（産褥期）および６

よって評価することが可能である。卵巣予備能が週 目（泌 乳 最 盛 期）に 抗 凝 固 剤 と し て EDTA-高いウシでは発情周期中のプロジェステロンやエ2Naが封入された真空採血管を用いて採血し，遠ストラジオールなどの性ホルモン濃度が高く，子心分離後血漿サンプルを得た。血漿サンプル中の宮内膜が厚い１）ことが報告されており，卵巣予備AMH濃度はウシAMH専用キット（Ansh Lab社，

能が高いウシは受胎しやすい可能性がある。この

AL-114）を用いて測定した。供試牛について，ため，受卵牛の卵巣予備能を評価することで，分娩状況（難産，死産，双子分娩，胎盤停滞の有

ETの受胎確率が高い牛を選定することが可能で無），初回授精日数，授精に対する受胎の有無，あると考えられる。

除籍日および除籍理由，分娩後100日以内の周産

畜産現場で本技術を検証するにあたり，実際に期疾病（第四胃変位，ケトーシス，産褥熱，胎盤

黒毛和種受精卵の受卵牛として用いられるウシの停滞，低カルシウム血症，蹄病，乳房炎）治療の多くが乳牛であることを考慮する必要がある。北

有無，分娩後100日以内の繁殖疾病治療の有無，

海道では黒毛和種体内胚のETに用いられた受卵

分娩前21日から分娩後100日までの可消化養分総牛の約80％が乳牛であった 。乳牛と肉牛の最大量（TDN：日本飼養標準・乳牛2017年版を用いの違いは，分娩後の乳量の急増と飼料摂取量の不て算出）充足率，を調べた。統計解析は，分娩後均衡に伴う深刻な負のエネルギーバランス

100日時点の受胎の有無を目的変数とした，ロジ（NEB）が発生しやすいことである。分娩後のスティック回帰分析を行った。目的変数と各説明

NEBは卵巣機能の低下を引き起こすため，卵胞変数の関係を単変量解析で調べ，ｐ＜0.15の説明の顆粒層細胞から分泌されるAMH濃度が低下す

変数を多変量解析における説明変数の候補としる可能性が指摘されている。これは乳牛でた。最終モデルに投入する説明変数を，変数増加

AMH濃度を評価する場合，泌乳ステージ（乾乳，法により選んだ。ｐ＜0.05の説明変数または交互

産褥期，泌乳前期等）を考慮する必要があること作用を説明モデルとした。AMH濃度と分娩時のを意味する。

年齢は強制的にモデルに投入した。分娩後100日

１）

２，３）

本研究では，卵巣予備能を活用した受卵牛選定

時点の受胎と関係が認められたAMH濃度の評価技術を開発するために，主たる受卵牛の品種であ時期を，分娩前後における適切なAMH濃度の評

るホルスタイン種経産牛を用いて，１）分娩前後

価時期とした。

における適当なAMH濃度の評価時期，および２）

2 . 2 ホルスタイン種経産牛の分娩前後におけ

分娩前後におけるAMH濃度の変動に影響を及ぼるAMH濃度の変動に影響を及ぼす要因のす要因，を明らかにすることを目的とした。

検討

２．方

試験 2 . 1 と同じ供試牛を用いた。分娩前，産褥

法

期および泌乳最盛期に採血を行い，血清および血2 . 1 ホルスタイン種経産牛におけるAMH濃糖値測定用の血漿サンプルを得た。各サンプル中の血中栄養代謝産物濃度を生化学自動分析機（日度の評価時期の検討
北海道立総合研究機構酪農試験場で飼養されて立 ，3100）に よ っ て 測 定 し た 。泌 乳 最 盛 期 の© The Ito Foundation

234

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

AMH濃度を分娩前のそれで除してAMH ratioを要があると考えられた。

算出し，３区分（Ｈ，ＭおよびＬ群）した。分娩Table2-1に，AMH評価時期と分娩後100日時点

前，産褥期，および泌乳最盛期の血中栄養代謝産の受胎の有無との関係を示した。事前の解析で，物濃度，乾物摂取量，乳量およびTDN充足率のAMH濃度と受胎の間に二次回帰的な関係が認めそれぞれを目的変数とし，産次およびAMH ratio

られたため，モデルにはAMH濃度の二乗項を投区分を説明変数とした重回帰分析を行い，AMH入した。分娩後100日時点の受胎と関係が認めら

ratioと各目的変数の関係を調べた。

れたのは泌乳最盛期のAMH濃度であった。二乗項の係数が正であることから，AMH濃度が低い

３．結果と考察または高い場合に受胎確率が高いことが推察され

3 . 1 ホルスタイン種経産牛におけるAMH濃た。AMH濃度が低かった個体には，分娩時の年齢が低い個体が多かったため，年齢の影響を受け度の評価時期の検討
分娩前，産褥期および泌乳最盛期のAMH濃度ている可能性が考えられた。そこで分娩時年齢のの中央値（幅）は141（８―788），147（９―827）

中央値である３歳を基準に２群に分け（３歳以上および142（８―793）pg/mlであり，採血時期の群，または３歳未満群），それぞれの群において間で差は認められなかった。Table１に，AMH評

再度AMH濃度と分娩後100日時点の受胎との関価時期間のAMH濃度の相関係数を示した。採血係を調べ，Table2-2に示した。分娩時年齢が３歳時期間の相関係数は0.7～0.9であり，強い正の相以上の個体では，泌乳最盛期のAMH濃度が上昇関を示した。AMH濃度は同一個体であれば採血すると受胎確率が上昇したのに対し，３歳未満の時期が異なっても，その再現性が高いことが報告

場合はAMH濃度と受胎に関係が認められなかっされている 。一方で，乾乳，分娩，泌乳などのた。年齢が若い牛における卵巣予備能と繁殖性とライフサイクルにおいて，AMH濃度は少なからの関係については不明な点も多いため６），今後さず変動することが報告されている２～４）。採血時期

らなる検討が必要である。以上の結果から，分娩ごとに，供試牛をAMH濃度によって３区分（高，前後にAMH濃度が変動する個体が多く，分娩後中および低群）し，個体ごとに分娩前後におけるの受胎性と関係が認められたのは泌乳最盛期のAMH濃度区分の変動を調べた。その結果40％のAMH濃度であったことから，分娩前後において個体で，分娩前から泌乳最盛期までの間にAMH

AMH濃度を評価する時期は，泌乳最盛期が適し

濃度区分が変動した。この結果から，分娩前後にていると考えた。

５）

AMH濃度を評価する場合は，時期を統一する必Table 1 Correlation coefficients for AMH concentrations at all sampling points.
prepartum AMH

puerperal AMH

peak lactation AMH

prepartum1）AMH

1.000

0.826

0.775

puerperal2）AMH

0.826

1.000

0.910

peak lactation3）AMH

0.775

0.910

1.000

1）21 days before calving2）21 days after calving
3）42 days after calving© The Ito Foundation

235

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討（Ⅱ）
Table 2-1 Final logistic regression models of factors related to pregnancy at postpartum 100 days
Models
Prepartum1）AMH

Puerperal2）AMH

Peak lactation3）AMH

Variables

Estimate

Standard error

p value

1.240E-06

3.413E-06

0.722

Age at calving-0.152

0.169

0.371

First AI4）days after calving-0.0640.013< 0.013.029E-06

2.109E-06

0.151

Age at calving-0.227

0.180

0.206

First AI days after calving-0.0660.014< 0.01

Quadratic term of peak lactation AMH

0.061

0.026

0.020

Age at calving-0.275

0.178

0.122

First AI days after calving-0.0680.014< 0.01

Quadratic term of prepartum AMH

Quadratic term of puerperal AMH

1）21 days before calving2）21 days after calving
3）42 days after calving4）artificial insemination

Table 2-2 Final logistic regression models of factors related to pregnancy at postpartum 100 days by age at calving
Estimate

Standard error

p value

Cows of 3 years old andModelsPeak lactation1）AMH

Variables

0.004

0.002

0.037

over at calving

Age at calving-0.203

0.277

0.465

First AI2）days after calving-0.0690.019< 0.01

Cows of under 3 years

Peak lactation AMH-0.002

0.002

0.401

old at calving

Age at calving

0.646

0.641

0.733

First AI days after calving-0.065-3.180< 0.011）42 days after calving2）artificial insemination

3 . 2 ホルスタイン種経産牛の分娩前後におけ機リン（iP）およびマグネシウム（Mg）との関るAMH濃度の変動に影響を及ぼす要因の係に注目した。アルブミンは総合的な栄養摂取状検討

況および肝機能障害や慢性炎症の存在を反映して

泌乳最盛期のAMH濃度を分娩前のそれで割変化する。本試験では泌乳最盛期において，Ｈ群

り，AMH ratioを算出し，分布を基に３区分したと比較してＭおよびＬ群のアルブミン濃度が低（Ｈ，ＭおよびＬ群）。各群のAMH ratioは，Ｈ群かった。両群のTP，ASTおよびγGTPはおおむ

で平均2.40（1.43―10.63），Ｍ群で平均1.15（0.93

ね正常範囲内であるため，タンパク不足や肝機能―1.42），およびＬ群で平均0.69（0.23―0.93）で障害は考えにくい。Okawaら７）は分娩後にAMHあった。採血時期ごとのAMH ratioと各栄養代謝濃度が低下した個体ではアルブミン濃度とアルブ

産物濃度の関係をTable３に示した。本研究では，

ミン―グロブリン比が低下し，子宮内膜炎の発生

AMH ratioとアルブミン，カルシウム（Ca），無が認められたことを報告している。本試験ではグ© The Ito Foundation

23.0 ± 0.7

0.20 ± 0.01

93.7 ± 3.4

10.1 ± 1.0

67.2 ± 0.99.72 ± 0.07

6.35 ± 0.11

2.39 ± 0.06

529 ± 19

γGTP （IU/l）

FFA（mEq/l）

Tchol（mg/dl）

BUN（mg/dl）

Glu （mg/dl）

Ca（mg/dl）

iP（mg/dl）

Mg（mg/dl）© The Ito Foundation

BHBA（mol/l）

522 ± 18542 ± 18

2.42 ± 0.06

5.87＊ ± 0.10

6.05＊ ± 0.10

2.47 ± 0.06

9.56 ± 0.07

68.4 ± 0.9

11.4 ± 0.9

99.8 ± 3.2

0.21 ± 0.01

21.0＊ ± 0.6

60.8 ± 2.5

9.70 ± 0.07

68.5 ± 0.8

9.8 ± 0.9

98.1 ± 3.3

0.21 ± 0.01

22.2 ± 0.7

60.6 ± 2.6

3.98† ± 0.03

7.20 ± 0.17

L1）1,427 ± 143

1,107 ± 147

1,188 ± 148

2.52 ± 0.05

5.17 ± 0.12

9.55＊ ± 0.10

56.3 ± 1.4

10.6 ± 0.5

953 ± 96

2.71 ± 0.05

5.33 ± 0.12

9.85 ± 0.10

56.0 ± 0.9

11.4 ± 0.5

180 ± 70.26 ± 0.02

133 ± 526.3 ± 12.7

0.41† ± 0.03

77.2 ± 2.5

4.24 ± 0.05

7.47 ± 0.10

H

24.6 ± 9.2

80.5 ± 3.3

3.83＊ ± 0.05

7.63 ± 0.08L968 ± 94

2.58＊ ± 0.05

5.21 ± 0.12

9.69 ± 0.10

57.3 ± 0.9

11.6 ± 0.5

191 ± 60.26 ± 0.02

51.0 ± 12.4

73.9 ± 2.5

4.10＊ ± 0.05

996 ± 91

2.58＊ ± 0.04

5.42 ± 0.12

9.59† ± 0.10

58.3† ± 0.9

11.0 ± 0.5

186 ± 70.22 ± 0.02

25.8 ± 12.0

68.6＊ ± 2.4

4.00＊ ± 0.04

L
7.76＊ ± 0.09

M
7.71† ± 0.10

Peak lactation3）

Compared to AMH ratio H group, ＊：p<0.05，†：p<0.1

cholesterol；BUN： blood urea nitrogen；Glu： glucose；iP： inorganic phosphorus；Mg：magnesium；BHBA：β-hydroxybutyric acid.

AMH ratio medium, L： AMH ratio low）
. TP：total protein；Alb： albumin；AST： asparete aminotransferase；γGTP：γ-glutamyltransferase；FFA：free fatty acid；Tchol：total

4）The AMH ratio was calculated by dividing the AMH concentration at the peak lactation by the AMH concentration at prepartum and classified into 3 categories（H：AMH ratio high, M：

2.53 ± 0.05

5.05 ± 0.12

9.74 ± 0.10

55.1 ± 1.3

10.2 ± 0.5

133 ± 50.43 ± 0.03

44.1 ± 9.5

86.2 ± 3.4

3.99 ± 0.05

7.63 ± 0.09

M

2.52 ± 0.05

5.08 ± 0.12

9.92 ± 0.10

54.9 ± 1.4

11.0 ± 0.5

124 ± 50.51 ± 0.04

23.4 ± 9.8

86.2 ± 3.5

4.09 ± 0.06

7.45 ± 0.09

H

Puerperal2）

令和３年度1）21 days before calving, 2）21 days after calving, 3）42 days after calving

63.2 ± 2.7

AST（IU/l）

4.02 ± 0.03

7.42 ± 0.17

7.16 ± 0.18

4.07 ± 0.03

TP（g/dl）

Alb（g/dl）

M1）

H1）

Prepartum1）

Table 3 Blood metabolite concentrations before and after calving for each AMH ratio group236
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

摂取量が少なかった可能性がある。

Table４に，AMH ratioごとの乳量，乾物摂取

量および可消化養分総量（TDN）充足率を示した。Ｈ群と比較すると，ＭおよびＬ群では分娩前および産褥期のTDN充足率が低かった。この時期の栄養状態は分娩後に排卵する卵胞の発育に影響を及ぼす可能性がある。Fairら８）は，Hulshof９）

ら，Lussierら 10）の研究結果に基づき，原始卵胞から排卵卵胞までの発育に要する時間を約50～80

日であることを示した。それに基づくと，泌乳最

盛期にAMHを分泌していると考えられる前胞状

卵胞から小型胞状卵胞は，分娩前後から産褥期にかけては原始卵胞から二次卵胞などの初期卵胞であったことが推察される。初期卵胞の発育にはイ

ンスリン様成長因子やインスリン等のホルモンの影響を受けることが報告されている11）。分娩後にAMH濃度が低下した牛では相対的に栄養充足率が低かったため，これら成長因子の濃度が低かった可能性がある。そのため，泌乳最盛期にAMHを分泌していた主要な小型卵胞のホルモン産生能が低下し，AMH濃度が低下した可能性が考えられた。

本研究の結果から，ホルスタイン種乳牛において分娩前後にAMH濃度を評価するのに適しているのは，当該産次の繁殖成績と関連が認められた

泌乳最盛期であること，分娩前後のAMH濃度の変動は，分娩前から産褥期の栄養状態に影響を受ける可能性があることが明らかになった。本研究

結果は，AMH濃度を用いて受卵牛を選定する場© The Ito Foundation

110 ± 2＊33.5 ± 0.5

28.6 ± 0.5＊

31.9 ± 0.5＊
14.2 ± 0.3＊

15.8 ± 0.3＊

16.7 ± 0.3

DMI
（kg）

21 days after calving

67.8 ± 1.2＊

70.2 ± 1.2＊

72.6 ± 1.1

TDN sufficiencyrate（%）

35.0 ± 0.5＊

37.6 ± 0.5＊

39.2 ± 0.5

Milk yield（kg）

19.2 ± 0.3＊

20.2 ± 0.3†

21.2 ± 0.3

DMI
（kg）

82.2 ± 1.1

82.3 ± 1.1

83.6 ± 1.1

TDN sufficiencyrate（%）

22-42 days after calving

ロブリン濃度の測定，および子宮内膜炎の調査は行っていないが，ＭおよびＬ群では子宮内膜炎等の炎症性疾患が発生していたため，アルブミン濃度が低下した可能性が考えられた。乳牛においCompared to AMH ratio H group, ＊：p<0.05，†：p<0.12）Dry matter intake, 3）Total digestible nutrients sufficiency rate calculated by Japanese feeding standard for dairy cattle（2017）

high, M：AMH ratio medium, L：AMH ratio low）.

1）The AMH ratio was calucuralted by dividing the AMH concentraiton at the peak lactation by the AMH concentration at prepartum, and classfied into 3 categories（H：AMH ratio

10.7 ± 0.2＊

L

123 ± 2＊132 ± 212.8 ± 0.2

11.8 ± 0.2＊

H

M

Milk yield（kg）

低下は，飼料摂取量の低下が直接的原因であると

TDN sufficiency
rate3）（%）

21 days before calvingて，Ca，iPおよびMgといったミネラル類の濃度

DMI2）
（kg）

されている。ＭおよびＬ群はＨ群と比較して飼料

AMH ratio1）
Category

Table 4 Dry matter intake, milk yield and total digestible nutrients sufficiency rate before and after calving for each AMH ratio group.

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討（Ⅱ）

237

238

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

合の基礎的知見となるとともに，ホルスタイン種

分娩後のAMH濃度の低下は分娩前後の栄養状態

乳牛の繁殖成績の改善に貢献できると考えられた。

の影響を受けていることが推察された。

４．要

約

本研究では，黒毛和種受精卵の受卵牛として主要な品種であるホルスタイン種142頭を供試し，
抗ミューラー管ホルモン（AMH）濃度を用いた受卵牛選定技術の基礎的知見を得るために，分娩前後における適切なAMH濃度評価時期の検討，および分娩前後のAMH濃度変化に影響を及ぼす要因の検討を行った。分娩前21日（分娩前），分娩後21日（産褥期）および分娩後42日（泌乳最盛期）に血漿中AMH濃度を測定し，分娩後100日時
点の受胎の有無との関係を調べた。泌乳最盛期におけるAMH濃度が受胎の有無と関係していたことから，分娩前後のAMH評価時期は泌乳最盛期が適していると考えた。泌乳最盛期と分娩前のAMH濃度の比率（AMH ratio）を算出して３区分（Ｈ，ＭおよびＬ群）し，分娩前後の血中の代謝産物濃度および飼養成績との関係を調べた。Ｈ
群と比較して，ＭおよびＬ群は分娩後に血清中アルブミン，マグネシウム，無機リン，およびカル
シウム濃度の低下が認められ，炎症性疾患の発生
および飼料摂取量が少ないことが推察された。ま文
献１） 一般社団法人北海道家畜人工授精師協会：北海道
乳・肉用牛人工授精・受精卵移植実施成績，p.43，
2019.
２）
 Jimenez-Krassel, F., Folger, J. K., Ireland, J. L. H.,
Smith, G. W., Hou, X., Davis, L. S., Lonergan, P.,
Evans, A. C. O., Ireland, J. J.：Biol Reprod., 80, 1272
～1281, 2009.
３）
 Monniaux, D., Drouilhet, L., Rico, C., Estienne, A.,
Jarrier, P., Touzé, J. L., Sapa, J., Phocas, F., Dupont,J., Dalbiès-Tran, R., Fabre, S.：Reprod. Fertil. Dev.,
25（1）,１～16, 2012.
４）
 Alward, K. J., Graves, W. M., Palomares, R. A.,
Ely, L.O., Bohlen, J. F.：Theriogenology, 168, 83～
89, 2021.
５）
 Gobikrushanth, M., Dutra, P. A., Bruinjé, T. C.,
Colazo, M. G., Butler, S. T., Ambrose, D. J.：
Theriogenology, 92, 90～94, 2017.
６）
 Umer, S., Zhao, S., Sammad, A., Sahlu, B., Yunwei,
P., Zhu, H.：Genes, 10, 1009, 2019.
７）
 Okawa, H., Monniaux, D., Mizokami, C., Fujikura,A., Takano, T., Sato, S., Shinya, U., Kawashima, C.,
Yamato, O., Fushimi, Y., Vos PLAM, Taniguchi, M.,
Takagi, M.：Animal（Basel）,26, 11（5）,1241, 2021.
８） Fair, T.：Anim Reprod. Sci. 78, 203～216, 2003.
９）
 Hulshof, S. C., Figueiredo, J. R., Beckers, J. F.,
Bevers, M. M., van den Hurk, R.：Vet. Q., 16, 78～
80, 1994.
10）
 Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J.：J, Reprod,
Fertil., 81, 301～307, 1987.
11）
 Beam, S. W., Butler, W. R.：J. Reprod. Fertil.
Suppl., 54, 411～424, 1999.

た，ＭおよびＬ群の分娩前および産褥期の可消化養分総量充足率は，Ｈ群のそれと比較して低く，© The Ito Foundation

239

アフリカ豚熱の侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅳ）
Epidemiological research on the risk assessment of introduction of Africanswine fever into Japan

杉

浦

勝

明・芳

賀

猛

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Katsuaki Sugiura and Takeshi Haga
（Department of Veterinary Medical Science, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

There are several routes of African swine fever（ASF）introduction into a country.
Among the possible routes of entry, quarantine policies determine the possibility of
introduction by legal import of live pigs. This study aimed at assessing the probability of ASF
introduction through legal import of live pigs during the high-risk period using a quantitative
stochastic approach during 2011-2020. Scenario tree modelling was used with the following
entry and exposure pathway considered to be the most likely route of ASF entry：an ASF
infected pig is selected for export in the country of origin during the high-risk period；the pig
survives ASF infection；the pig survives transportation to Japan; the imported pig is notquarantined, or the imported pig is quarantined but undetected during quarantine. The result
indicates that the mean annual probability of ASF introduction by legal import of live pig was，of which Denmark and Canada
1.88 × 10－９（90 ％ prediction interval：0.74 － 3.92 × 10－９）
assumed 44.2％ and 39.3％ of the mean annual risk, respectively. Monthly probability of ASF
introduction was highest in June, followed by July, March and September. The current importquarantine policy of Japanese government may be enough to block the introduction of thevirus via legal import of live pigs, and it should be continually enforced. This result can help toelucidate source of infection and to minimize the catastrophic consequences of the potential
ASF introduction into Japan by designing risk mitigation strategies such as preventing ASF
free countries from exporting live pigs during the high-risk period once they are affected with
ASF．

１．目

在せず，国内で発生した場合には養豚産業に甚大的な被害をもたらすため，家畜伝染病予防法に基づ

アフリカ豚熱（ASF）は，ASFウイルスによっき家畜伝染病に指定されている。

て引き起こされる豚やイノシシの感染症である。

ASFは2006年まで主にアフリカで発生が確認

きわめて伝播力が高く，ダニや感染動物との直接されていたが，2007年コーカサス地方のジョージ

的または間接的接触により感染する。致死率はほアで突如として確認され，その後，東欧諸国およぼ100％に達する。有効なワクチンや治療法は存びロシアに拡がった。2018年中国で初めて確認さ© The Ito Foundation

240

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

れ，中国国内で急速に拡がるとともに隣国の韓

む豚製品は，合法的に搬出され，清浄国に輸出さ国，モンゴル，さらに東南アジア諸国でも発生がれる可能性がある１）。一方，ASFと同様に伝播力

確 認 さ れ 甚 大 な 被 害 を も た ら し て い る 。現 在の強い口蹄疫および豚熱については，最近の一部（2022年３月）までにアジア15か国に拡がり，日のヨーロッパ諸国では高リスク期間中の家畜の移本への侵入リスクはかつてなく高まっている。

動を通じてわずか１～２週間で広範な拡散が生じ

ASFウイルスの侵入経路はさまざまである。

ることが示されている２，３）。

豚肉や豚肉製品中に長期間生存することから，か

このような状況にかんがみ，本研究では，日本

つて豚肉製品の違法持ち込みにより侵入を許したが生きた豚の輸入を認めている清浄国にASFが事例が多数報告されている（スペイン，キュー

侵入し最初の感染豚が確認され輸出禁止措置がとバ，ブラジル，モーリシャス，ジョージアなど）。

られるまでの高リスク期間に生きた豚が輸出さ

また，最近のヨーロッパでの拡大では，感染イノ

れ，日本にASFが侵入するリスクを定量的に評

シシや豚の移動が原因となった事例が報告されて

価した。

いる。
生きた豚および豚肉製品の輸入はASFの重要

２．材料と方法な 侵 入 経 路 で あ る こ と か ら ，国 際 獣 疫 事 務 局

2.1（OIE）は，国際基準に則った輸入検疫を実施す

生きた豚の輸入を通じた日本へのASF侵入リ

るか，リスク評価の結果に基づき必要なリスク管

スクの定量的評価は，先行研究で使用されたモデ理を実施することを奨励している。OIE陸生動物

ルと同様のモデルを用いて行った４，５）（Fig.１）。

衛生コードによると，ASF汚染国または地域か

分析対象国については，過去10年間に日本への豚ら生きた豚を輸入する場合には，過去３カ月間の輸出実績があったカナダ，米国，フランス，ドASFの発生のない経営体で飼養されたか，検疫

イツ，デンマーク，オランダ，英国およびアイル

を少なくとも30日間受け検疫開始21日以降にウイランドの８か国とした。なお，これらの国ではい

ルス学的および血清学的検査を受け陰性であるこずれも過去10年間，豚でのASF発生の報告はなとを輸入条件として要求すべきとしている。

かった（Table１）。

リスク評価モデル

日本は，家畜伝染病予防法に基づきASF発生

まず，ある月mのある輸出国oからの生きた豚

国からの生きた豚，豚肉の輸入を禁止するという輸入に伴うASF発生リスクP_odmを，①侵入リOIE基準より厳しい水際措置を講じている。また，ス ク P_re（輸 出 国 か ら 輸 入 さ れ た １ 頭 の 豚 がASF清浄国からの生きた豚，豚肉の輸入にあたっ

ASFウイルスに感染している確率），②仮にASFても，ASFが発生した場合にはただちに日本向ウイルス感染豚が日本に輸入された場合に国内のけの輸出を停止することなどの条件を輸出国当局

豚と接触し，ASFウイルス感染を生じる確率（P_と取り決めており，この条件に基づきASF清浄ex）および③月mに輸出国oから日本に輸入され国でASFの発生が確認されると，生きた豚とそる生きた豚の頭数（n_odm）から，二項プロセスの製品の輸出はただちに禁止される。しかし，最を用いて，次式により予測した。

初に感染した豚が発見され当局に通報され禁止措

P_odm＝１－（１－P_re×P_ex）n_odm

置がとられるまでの間（高リスク期間），ASFウ

次に，月別の全世界からの侵入リスクP_mは，

イルスに感染した生きた豚とASFウイルスを含© The Ito Foundation

241

アフリカ豚熱の侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅳ）
Country of origin(1-P1)

P1

No ASF infection

ASF infection(1-P2)

P2

Not selected

Infected pig selected
Release(1-P3)

P2

No survival

Pig survives ASF infection(1-P4)

P4

No survival
Pig survives transportation

Imported pigs
1-Pq

Pq

Imported pigs notquarantined

Imported pigs
quarantined
1-Pu

Exposure
Pu

Infected pig detectedduring quarantine

Infected pig undetectedduring quarantine
ASF introduction into Japan by legal import of live pigs

Fig. 1 A scenario tree used to assess the risk of ASF introduction into Japan via

legal importation of live pigs

Table 1 Number of pigs imported to Japan and ASF status of the country of origin
Country of origin

Pigs imported into Japan from 2011 to 2020
Heads

ASF status％

Canada

3,526

33.7％

Free

United States of America

1429

13.6％

Free

France

303

2.9％

Free

Germany

6

0.1％

Free

Denmark

4189

40.0％

Free

Netherlands

503

4.8％

Free

United Kingdom

488

4.7％

Free

Ireland

26

0.2％

Free

10,470100.0％

Total© The Ito Foundation

242

令和３年度

P_m＝１－

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

じる確率（P_ex）は，次式により推定した。

∏（１－P_odm）

P_ex＝P_q＋（１－P_q）×P_uo

ただし，P_qは輸入されたASFウイルス感染豚

次に，国別の年間侵入リスクP_oは，
P_o＝１－

が検疫を受けない確率であり，P_uは検疫を受け∏（１－P_odm）

た感染豚が検疫中に確認されない確率である。

m

最後に，全世界からの年間侵入リスクP_fは，
P_f＝１－

2.4

入力変数およびデータ源

輸出国でのASFウイルス感染の確率（P 1）は，∏（１－P_o）o

ベータ分布Beta（α１，α２）を用いてモデル化しこれらの確率を推定するために，４つの仮定をた。α１は国内で未確認のASFの発生が少なくと行った。①分析対象とした10年間に輸出国でASFも１回あった月数＋１であり、α２は分析対象期の発生報告がなかった場合，その国でのASF発間の月数－α１＋１である６）（Table２）。ASF発生

生は最大で1,000年に１回とする，②高リスク期

頭数は，OIEへの緊急およびフォローアップ通報

間中のASF発生数を推定にあたり，いずれの輸のデータをもとに推定した６）。

出国においてもサーベイランスおよび輸出検査能ASFウイルスに感染した豚がある月mに輸出用力は同等レベルとする，③輸入された豚はすべてに選択される確率（P 2）についても，Beta分布

日本国内の養豚場へ仕向けられる，④感染ウイルを用いてモデル化した。ベータ分布の形は，原産

スは，アジアにおける豚での発生の原因となって国 で ASF の 発 生 が 確 認 さ れ る 前 に 推 定 さ れ る

いる急性型ASFウイルスとする。

ASFウイルス感染豚の頭数（NI）と輸出国にお2.2

侵入リスク評価

ける豚飼養頭数（No）をもとに推定した。NIは，侵入リスク（輸出国から輸入された１頭の豚が３つの独立したパラメータの積として推定した。

ASFウイルスに感染している確率）は，特定のすなわち，①各輸出国における高リスク期間中に月mに輸出国から高リスク期間中にASFウイルス

検出されなかった発生農家戸数（Ou）６）（Pert分に感染した豚が摘発されずに日本に輸入される確

布を用いてモデル化），②輸出国内の養豚場の平率である。P_reは，次の４つの条件付き確率を

均飼養頭数（To）（輸出国における養豚農家戸数

もとに次式により推定した。①輸出国でのASF（So）および総飼養頭数（No）７）から推定）（平均

ウイルス感染の確率（P 1），②輸出国でASF感染

値（μ）および標準偏差（σ）で表される正規分豚が確認される前に（すなわち，高リスク期間中６）布を用いてモデル化），③ASF群内有病率（Hp）に）ASF感染豚が輸出用に選択される確率（P 2），への報告データから得られた感受性動物に対する③ ASF 感 染 豚 が ASF に よ り 死 亡 し な い 確 率

症例の割合の最小値，最大値および平均値を用い（P 3），④ASFウイルス感染豚が輸出国から日本てPert分布によりモデル化）。

への輸送中にASF以外の原因で死亡しない確率（P 4）。

（P 4）については，先行研究８，９）に基づきPert分
P_re＝P 1×P 2×P 3×P 4

2.3

ASF 感 染 豚 の 生 存 率（P 3）と 輸 送 生 存 率
布を用いてモデル化した。

曝露評価

輸入されたASFウイルス感染豚が検疫を受け

仮にASFウイルス感染豚が日本に輸入されたない確率（Pq）は，日本では輸入される豚はす場合，国内の豚と接触しASFウイルス感染を生べて動物検疫と着地検疫の対象となることから，© The Ito Foundation

243

アフリカ豚熱の侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅳ）

Table 2 Description and parameterization of model inputs for assessing the risk of ASF introduction into Japan via legal

import of live pigs

Notation
P１

Definition

Parameterization

Prob of ASF infection in the
country of origin

Beta（X＋1，M－X＋1）

Values
X：number of months
with undetected ASF
outbreaks; M: numberof months subjected toanalysis
ASF free countries:
Beta（2, 12000）

SourceOIE（2021）

Ou

Number of undetected outbreaks
during high-risk period（HRP）

Pert（min, most likely, max）

Free countries: Pert（1, Mur et al.
1, 1）（2012）

No

Pig population in the country oforiginFixed value

Ireland：1644121

So

Number of pig establishments in the
country of origin

Fixed value

Ireland：1631

To

Average herd size in the country oforiginNo/So

Ireland：1008

Hp

Intraherd prevalencePert（min, most likely, max）

Free countries（0, 0.21,
1）NI

Number of ASF infected pigs in the
country of origin

Ou×To×Hp

Derived from otherparameters.

P２

Prob of selecting ASF infected pig

Beta（NI＋1，No－NI＋1）

Derived from otherparameters.

P３

Prob that an ASF infected pig survives
the infection

Pert（min, most likely, max）

Pert（0.05, 0.2, 0.8）

Spickler andRoth（2006）

P４

Prob that an ASF infected pig survives
the transportation

Pert（min, most likely, max）

Pert（0.0005, 0.0027,
0.092）

Murray andJohnson（1998）

Pre

Prob than an ASF-infected pig fromorigin country enters a farm in Korea

Pre＝P1×P2×P3×P4

Derived from otherparameters.

Pq

Prob that imported pigs were notquarantined

Fixed value

0

Pu

Prob that an ASF-infected pig
passes undetected during
quarantine

Parameters reflect the belief
that, most likely, infected pigs
will be detected during thequarantine in 99％ of thecases with 95％ confidence
that the probability ofdetection is not less than 90％.

Beta（1.33, 34.16）

Pex

Prob of an imported ASF-infected
pig coming into contact with pigs
in Korea

Pex＝Pq＋［1－Pq］×Pu

Derived from otherparameters.

nodm

Imports of live pigs from origin
country

Normal（μ,σ）

Denmark/January：
Normal（11.4, 28.4）

Pf

Probability that an ASF-infected
pig from origin country enters afarm and results in transmission in
Japan in month m

nodm
Pf＝Σ1－（1－Pre×Pex）

Derived from otherparameters.

OIE（2019）
OIE（2019）
OIE（2019）
OIE（2021）

Assumption

Martinez-Lopezet al．（2009）

Ministry of
Finance（2021）

０％とした。検疫を受けた感染豚が検疫中に確認

2020年までの10年間の国別および月別の豚の輸入されない確率（Pu）は検疫中に臨床症状に基づ

頭数12）をもとに平均値および標準偏差を求め，正いて豚熱感染豚が検出されない確率を用いて推定

規分布を用いてモデル化した。

した 。ASFと豚熱は，類似の臨床症状を示す
10）

11）

ことから合理的な仮定である（Table２）。

2.5

シミュレーション計算

リ ス ク 評 価 モ デ ル は ，＠ Risk バ ー ジ ョ ン 7.6

ある特定の月mに輸出国oから日本に輸入され（Palisade, Ithaca, New York）をアッドオンした

る生きた豚の頭数（n_odm）については，2011～

MicrosoftⓇExcel 2013を用いて作成した。シミュ© The Ito Foundation

244

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

レーションは，ラテンハイパーキューブ法抽出に年に１回，10年に１回または１年に１回に変化さよる10000回反復計算により行った。モデル出力せることにより日本への侵入リスクがどう変化す

結果は，平均値（５パーセンタイル，95パーセンるかを検証した。

タイル）で表示した。
2.6

３．結果と考察シナリオアナリシス

ベースラインモデルでは，清浄国における生き生きた豚の合法的な輸入による日本へのASF

た 豚 の 感 染 の 確 率（P1）に つ い て は ，先 行 研

侵入の年間確率は，1.88×10－９（0.74×10－９，3.92

究４，５）にならい侵入リスクを1000年に１回と仮定

×10－９）と推定された。この年間確率は，6.91×した。しかしながら，ヨーロッパ諸国ではイノシ

10８（0.26×10８，1.34×10８）年に１回の侵入に相シの移動を通じて感染が拡大していることを考え当する。デンマークが年間確率の44.2％を占め，ると，侵入リスクはさらに高いことも予想され

カナダ（39.3％），オランダ（6.1％），英国（5.1％）

る。そこでこれらの国における侵入リスクを100と続いた（Fig.２）。月別の侵入確率については，

2.5

Probability (x10-9)

2.0
1.5
1.0
0.5

CanadaUSA

FranceDenmark

Netherlands

UK

Ireland0.0

Fig. 2 Probability of ASF introduction into Japan via legally imported pigs bycountry（P_o）.For each box-whisker plot, the line in the box indicates themean; the length of the box indicates the inter-quartile range; the whiskers
indicate the 5th percentile and the 95th percentile respectively．

1.2

Probability (x10-9)

1.0
0.8
0.6
0.4
0.2

DecemberNovember

October

SeptemberAugust

July

June

May

April

March

February

January

0.0

Fig. 3 Probability of ASF introduction into Japan via legally imported pigs bymonth（P_m）. For each box-whisker plot, the line in the box indicates themean; the length of the box indicates the inter-quartile range; the whiskers
indicate the 5th percentile and the 95th percentile respectively．

© The Ito Foundation

245

10000
1000
100
10

Once every year

Once every 10years

Once every 100years

1
0.1

Once every 1000years

Probability of ASF introduction (in Billionths)

アフリカ豚熱の侵入リスク評価に関する疫学研究（Ⅳ）

Fig. 4 Scenario analysis depicting the effects of tested scenarios on theprobability of ASF intoruction into Japan via legally imported pigs（P_f）.
For each box-whisker plot, the line in the box indicates the mean; thelength of the box indicates the inter-quartile range; the whiskers indicate
the 5th percentile and the 95th percentile respectively．

６月が最も侵入確率が高く，続いて７月，３月，年２月に報告されたことから，家畜衛生条件に基９月が高かった（Fig.３）。

づき最初の発生が報告された後，ただちに日本へ

シナリオアナリシスの結果，清浄国における侵の生きた豚の輸入停止措置がとられた。これらの入確率が100年に１回，10年に１回，１年に１回

国からはたまたま日本への生きた豚の輸入は行わと高くなると，日本への侵入確率も1.89×10－８

れていなかったことから，これらの国からの生き（7.49 × 10 －９ ，3.92 × 10 －８），1.86 × 10 －７ （7.40 ×

た豚の輸入に伴うリスクはなかった。しかしなが10 ，3.87×10 ），1.62×10 （6.58×10 ，3.33

ら，輸入実績のあるデンマーク，オランダ，英国

×10 ）と増加した（Fig.４）。

や今後潜在的に日本への輸出の可能性があるその

－８

－７

－８

－７

－６

生きた豚の合法的な輸入に伴い，日本にASF

他の清浄国・地域のうち，ヨーロッパ大陸に存在が侵入する確率はきわめて低いことが分かった。

する国・地域ではイノシシの移動による侵入リス

きわめて低いながらも，日本への輸出実績のある

クは高まっている。これらの国からの生きた豚の８か国中ではデンマークおよびカナダの２か国が輸入にあたっては，最初の発生が確認された直後

日本への輸出頭数が多いことから侵入リスクの大から日本への輸出を停止することが条件付けられ部分を占めることが分かった。

ているが，シナリオアナリシスの結果を踏まえる

日本への生きた豚の輸入が認められている国・と，万一侵入した場合に高リスク期間中に輸出さ地域は，現在33ある 。これらの国・地域の家畜れないようにする対策をとることがリスク管理に

衛生当局と日本の家畜衛生当局との間で事前に取効果的と考えられる。

13）

り決められた家畜衛生条件に基づき，ASFの発生が確認された場合には日本への生きた豚の輸出４．要約をただちに停止することとされている。これらの

アフリカ豚熱（ASF）について考えられるさ国・地域のうちドイツ，ハンガリー，ベルギーおまざまな侵入経路のうち生きた豚の合法的輸入によびポーランドでは最近ASFの発生がそれぞれよる侵入の可能性は，どのような検疫措置がとら2020年９月，2018年４月，2018年９月および2014

れるかにより左右される。本研究の目的は，2011© The Ito Foundation

246

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

年から2020年までのデータと定量的確率論的アプ
ローチを用いて輸出国から高リスク期間に合法的に輸出され日本に輸入される生きた豚によるASF侵入の可能性を評価することである。シナ
リオツリーを用いてASFの侵入経路として最も可能性が高いと考えられる以下の侵入および暴露経路を前提としたリスク評価モデルを作成した。
すなわち，日本向けに輸出される豚はASFウイルスに感染していても農場で死亡せず，日本への輸送中にも死亡せず，輸入後も検疫を免れるか，検疫を受けてもASFが検出されない場合に侵入すると仮定した。リスク評価の結果，生きた豚の合法的輸入によるASF年間侵入確率は，1.88×
10－９（90％予測区間：0.74－3.92×10－９）であり，
デンマークおよびカナダが侵入確率の44.2％および39.3％をそれぞれ占めた。月別のASF侵入確率については，６月が最も高く，続いて７月，３月，９月が高かった。日本の現行の輸入検疫措置は，生きた豚の輸入に伴うASFウイルスの侵入阻止には十分である可能性が高く，今後も引き続き適用されることが望まれる。本研究の結果から，
ASF清浄国が侵入時に早期に感染源を発見し，ASF感染の高リスク期間中に生きた豚を輸出することを防止するなどのリスク低減措置をとることにより、潜在的な日本への侵入に伴う壊滅的な結果を最小限に抑えるのに有用であることが分かった。
文献１） Horst, H. S., et al.：Introduction of contagious
animal diseases into The Netherlands: elicitation ofexpert opinions, Livestock Production Science,
53（3）,253～264, 1998.
２） Bouma, A., et al.:The foot-and-mouth disease

epidemic in The Netherlands in 2001, Preventive
Veterinary Medicine, 57（3）,155～166, 2003.
３）
 Greiser-Wilke, I., et al.：Molecular epidemiology
of a large classical swine fever epidemic in theEuropean Union in 1997-1998, Veterinary
Microbiology, 77（1-2）,17～27, 2000.
４）
 Herrera-Ibatá, D. M., et al.：Quantitative
approach for the risk assessment of African swine
fever and Classical swine fever introduction into
the United States through legal imports of pigs andswine products, PLoS One, 12（8）,e0182850, 2017.
５）
 Cho, K. H., et al.：Quantitative risk assessment of
the African swine fever introduction into the
Republic of Korea via legal import of live pigs andpig products, Transbound Emerg Dis., 68（2）, 385～
396, 2021.
６）
 World Organization for Animal Health（OIE）.
2019. WAHID database. Immediate notifications
and follow-ups. Retrieved from http://web.oie.int/
wahis_2/public_wahid.php/Diseaseinformation/
Immsummary.
７） World Organization for Animal Health（OIE）.
2021. WAHID database. Animal Population,
Country information. Retrieved from http://web.
oie.int/wahis_2/public_wahid.php/
Diseaseinformation/Animalpopulation.
８）
 Spickler, A. R., et al.：Peste Porcina Africana,College of Veterinary Medicine: Iowa State
University, 2006. Retrieved from http://www.cfsph.
iastate.edu/?lang=en.
９） Murray, A. C., et al.：Impact of the halothanegene on muscle quality and pre-slaughter deathsin Western Canadian pigs, Canadian Journal ofAnimal Science, 78, 543～548, 1998.
10）
 Martínez-López, B., et al.：A stochastic model toquantify the risk of introduction of classical swine
fever virus through import of domestic and wildboars, Epidemiology and Infection, 137（1）, 1505～
1515, 2009.
11）
 Sánchez-Vizcaíno, J. M., et al.：Chapter 25
African swine fever virus. In B. E. Straw, J. J.
Zimmerman, S. D’Allaire, & D. J. Taylor（Eds.）,
Diseases of Swine, 9th ed.（pp. 291-298）, Ames, IA:
Blackwell Publishing Professional, 2006．
12） 財務省：貿易統計 https://www.customs.go.jp/
toukei/info/13）
 農 林 水 産 省：家 畜 伝 染 病 予 防 法 施 行 規 則
h t t p s : / / e l a w s . e - g o v . g o . j p /document?lawid=326M50010000035© The Ito Foundation

247

尾根部の体表温度から黒毛和種育成子牛の発熱を検知する手法の開発（Ⅱ）
Detection of fever of Japanese Black calves by ventral tail base surface
temperature（Ⅱ）

佐々木

羊

介・上

松

瑞

穂＊

（宮崎大学農学部，＊NOSAI宮崎）

Yosuke Sasaki and Mizuho Uematsu＊（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki，＊NOSAI Miyazaki）

Bovine respiratory disease is the most common and costly disease of beef cattle. Our
research goal is to identify sustainable approaches to reducing bovine respiratory disease
impacts by assessing fever of Japanese Black calves by ventral tail base surface temperature（ST）. The present study investigated appropriate methods for attachment of sensor for calves
to measure their ST and evaluated diagnostic accuracy of assessment for fever by the ST.
Data were collected from 19 Japanese Black calves aged 4 to 7 months. A wearable wirelessST sensor was attached to the surface of ventral tail base of each calf. Two types of tailattached methods were performed to compare the effectiveness of the methods: Method 1 usedattachment unit with a rubber loop with hook-and-loop fasteners（N＝9），and Method 2 usedattachment unit that drilled hole by punching pliers without the rubber loop（N＝10）．Of 19calves, proportions of calves that not drop their sensor in both methods were 100％．Bothmethods were able to attach the sensor more than one month. Some calves in Method 1 had
hair loss in the position of sensor attached, whereas no calves had hair loss in Method 2. ST
was ranged from 36℃ to 37℃ during the studied period, but slight drop of ST was found in 30
days or later after attachment. Additionally, circadian change of ST was found: the lowest andhighest ST were observed around 6 am and 5 pm, respectively. In this study, no calves showedclinical sing of respiratory disease during experimental period, and we were not able to develop
fever prediction model. In conclusion, the present study found appropriate method to obtainventral tail base ST．

１．目

る死廃事故や病傷事故の多発傾向が続いており，的多大な経済損失が発生している。農林水産省の家

黒毛和種牛の飼養戸数は年々減少する一方で，畜共済統計表によると，平成29年度における呼吸

１農場あたりの飼養頭数は増加傾向にあり，少頭器病を原因とする死廃事故および病傷事故はそれ数飼育から多頭経営へと推移してきている１）。こぞれ15.8％および35.5％と報告されている２）。子の多頭化と反比例して，肉用子牛の呼吸器病によ

牛の肺炎は，主に哺乳期から育成期の子牛に発生© The Ito Foundation

248

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

し，呼吸不全により死亡することがあるほか，慢ムを用いた異常検知の自動検出法の開発が必要で性化し発育不良を呈する症例も多い。育成子牛のある。

預託育成農場では，肺炎を主徴として治療された

そこで本研究では，無線小型センサの安定的か

育成子牛は約50％存在し，治療された子牛はそのつ非侵襲的な装着方法を検討すること，そして得後の増体成績が低下したと報告されている 。子られた体表温度のデータから異常検知を効果的に

牛の呼吸器病の発生には，環境・病原体・個体の検出するために，機械学習アルゴリズムを用いた

感染性と複雑な要因が絡むため，一般的には牛呼異常検知の自動検出法を開発することを目的とし吸器病症候群と呼称される。牛呼吸器病症候群た。

３）は，輸送や環境変化等に伴うストレス感作（離乳，群編成，寒暖の変化，換気不良等）や，ウイ

２．方法

ルス・細菌等の病原微生物による感染が複雑に絡

2.1

試験実施農場および供試個体

み合って発生する。牛呼吸器病症候群は経済的損

本研究では，宮崎県内における黒毛和種牛農場

失が大きい疾病であり，発症した場合には早期ので飼育されている育成子牛を対象として，育成子治療が重要である。そのため，牛呼吸器病症候群

牛の尾根部に無線小型センサを装着した。宮崎県

やその他発熱を伴う問題を早期に発見するために内における複数の黒毛和種牛農場を対象として，は，簡易的かつ迅速なモニタリング技術を確立す

試験実施期間における育成子牛の飼養頭数およびる必要がある。疾病の早期発見は，症状の重篤化

その子牛群の日齢や健康状態を調査し，試験実施を防ぐことだけではなく，その治療に要する日数の協力農場を選定した。試験実施農場は預託育成

およびコストの低減にも繋がる。

農場１農場であり，本農場では県内の黒毛和種繁これらの課題を解決するために，我々は昨年度殖農場から３―４ヶ月齢の子牛を導入して10ヶ月に無線小型センサを活用した黒毛和種育成子牛の齢まで育成していた。子牛はフリーストールで群

発熱検知手法の開発を試みた。この研究により，飼育され，１ストール当たり５―７頭で飼育され子牛の尾根部の体表温度を無線小型センサによっていた。

て非侵襲的にリアルタイムに測定することによ

試験は2021年８月から2022年２月までに実施しり，黒毛和種育成子牛の発熱を早期に検知するこた。上記期間において飼養されていた個体のうとが可能であることを明らかにした。しかし，課ち，以下５つの除外条件に当てはまらない牛を選題として，無線小型センサの安定的な装着方法の定した。除外条件：①過去１ヶ月の間に治療履歴確立およびセンサ装着箇所の脱毛等の外貌所見へがある，②同月齢の育成子牛と比較して体重が極の影響があげられた。そのため，本手法を生産現端に低い，③同月齢の育成子牛と比較して体重が場で普及していくためには，これらの点を改善す

極端に高い，④将来の種雄牛候補の血統であるる必要があることが明らかになった。また，昨年牛，⑤子牛の所有者が試験に供することを拒否し度の研究では異常検知の敏感度は高く，真に発熱ている。その結果，本試験では生後４―７ヶ月齢がみられた個体は100％異常を検知できたものの，の育成子牛19頭（去勢牛５頭，雌牛14頭）を供試

偽陽性の検知も多かったことにより，全体の陽性した。

反応的中度は低かった。このことより，陽性反応

2.2

的中度を向上させるために，機械学習アルゴリズ

試験には無線小型センサ（縦26mm×横21mm© The Ito Foundation

試験方法

尾根部の体表温度から黒毛和種育成子牛の発熱を検知する手法の開発（Ⅱ）

A

B

C

D

249

Fig. 1 Structure and usage of the wearable wireless surface temperature（ST）sensor. A）ST

sensor in an attachment unit. Left unit is method 1, and right unit is method 2. B）A
rubber loop with hook-and-loop fasteners that used for method 1 to stabilize the sensor. C）
Sensor attachment unit fixed on the surface of the ventral tail base. D）Sensor attachment
unit suspended from the back of the animal and wrapped with elastic medical bandages．

×高さ9.7mm）を用いた。本センサを子牛の尾根試験に用いたセンサの形状およびセンサの装着部の体表面に装着し，体表温度のデータを経時的に用いたベルトをFig.１に示した。試験区１は９に収集した。センサの装着方法として，昨年度に頭，試験区２には10頭の子牛を用いた。

実施した試験結果を参考に，以下２つの装着手法を用いた。

センサ装着時点における子牛の平均日齢は158±22日であった。センサは約１ヶ月間の装着を予試験区１：成牛用に用いられている資材（脱落

定したが，センサのズレや明らかな脱落兆候，も防止用腰部補助布およびセンサ梱包用マジックベ

しくはセンサ装着部位やその周囲に明らかな外貌ルト） を子牛用に改良した資材（昨年度に実施

異常がみられた際はセンサを取り外した。また，した装着方法のうち，最も装着が安定していた１ヶ月を経過しても異常がみられなかった場合

が，センサ装着箇所に脱毛あり）で，昨年度よりは，２ヶ月を上限としてセンサの取付を継続しも脱落防止用腰部補助布の形状を大幅に縮小した

た。センサの取り外し後は，センサの接触部位で資材ある尾根部の体表面を観察し，切傷の有無を確認

４）

試験区２：試験区１の資材に用いるセンサ梱包

した。

用マジックベルトにペンチで細かい穴を複数箇所

データの収集方法として，センサに内蔵されてに開け，その穴の部分に被毛が絡まる形状とし，いる無線アンテナの受信機を試験農場に設置し，脱落防止用腰部補助布は使用しない

体表温度を装着後10分間隔で収集した。また，食© The Ito Foundation

250

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 1 Comparisons of proportions of calves that not drop their sensor and the number ofdays from attachment to removal of sensor between two types of tail-attached methods

Types１

Proportions of calves thatnot drop their sensor

Number of days from attachment
to removal of sensor（±SD）

Method 1

100％（9/9）40.9±13.3days

Method 2

100％（10/10）

43.2±14.9days

１

Method 1 used attachment unit with a rubber loop with hook-and-loop fasteners. Method 2 usedattachment unit that drilled hole by punching pliers without the rubber loop．

欲不振や呼吸器疾患異常がみられた際はセンサ装まで，センサのズレや明らかな脱落兆候，センサ

着牛を繋留し，直腸温度を計測した。

装着部位やその周囲の外貌異常がみられず，体表

2.3

統計解析

温度の数値も安定していた。２つの装着方法に関統計解析として，分析には一般化線形モデルをする非脱落割合および装着日数をTable１に示し

用 い た （SAS ver. 9.4, SAS Inst. Inc., Cary, NC,

た。両試験区において，非脱落割合は100％であUSA）。装着方法の検討として，２つの装着方法

り，装着日数は試験区１で40.9日，試験区２で間で非脱落割合および装着日数を比較した。脱落

43.2日であり，両試験区の間で有意な差はなかっ

は，体表温度が24時間以上30℃を下回った場合とた。また，センサを取り外した際に，試験区１で定義した。次に，収集した体表温度の実測値の変は，一部の個体において，脱落防止用腰部補助布換を行った。異常値の除去（≦30℃，≧45℃，連を装着していた箇所に被毛短縮が確認された。試続記録が±１℃以上等）を行い，１時間幅で最大

験区２では，センサ取り外し後における装着部分

値を算出することにより，１時間ごとの温度に変の被毛短縮はほとんど確認されなかった。また，換した。また発熱の定義として，昨年度の解析に

両試験区において，センサ接触部分における重篤おいて用いた「体表温度の実測値が４時間以上な切傷は確認されなかった。

39℃を超えた場合」または「過去３日間の同時刻

本試験の結果より，両試験区ともに安定した装平均値が４時間以上１℃を超えた場合」の２つを着方法であることが明らかになった。しかし，試主軸として用いた。

験区１の欠点として，装着に時間を要すること，取り外した後に，装着部分の被毛短縮がみられた

３．結果と考察ことがあげられる。一方，試験区２では，装着に本試験に用いた育成子牛19頭のうち，すべての要する時間が試験区１よりも短いこと，装着部分

子牛で，装着予定期間である１ヶ月間の装着がでの被毛短縮がみられないことが利点としてあげらきた。このうち６頭（試験区１で３頭，試験区２れた。そのため，センサ装着の簡易化および外貌で３頭）は，試験農場の飼養管理上の理由で，初見への影響を軽減する観点より，試験区２で活１ヶ月が経過した後にセンサの取り外しを行っ用した資材を用いることが有用であると考えられた。残りの13頭は，センサのズレや明らかな脱落る。ただし，今回の試験では子牛の毛が生え変わ兆候，センサ装着部位やその周囲の外貌異常がみる時期に試験を行えなかったことより，今後は１られず，体表温度の数値も安定していたため，セ

年を通じて試験区２で用いた資材の効果を検証す

ンサの装着を継続した。その結果，13頭のうち，る必要がある。

すべての子牛でセンサの取付の上限である２ヶ月

体表温度の実測値に関して，本試験に用いた育© The Ito Foundation

Ventral tail base surface temperature, ℃

Ventral tail base surface temperature, ℃

尾根部の体表温度から黒毛和種育成子牛の発熱を検知する手法の開発（Ⅱ）251a)Daily change

38

37

36

35

34

0

38

5

10

15

20

25

30

35

Days from attachment

40

45

50

b)Circadian change

37
Feeding
Feeding

36

35

34

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Time (hour)Fig. 2 Daily change （a） and circadian change （b） ofventral tail base surface temperature

成子牛19頭の経時的変化および日内変動の推移をの体表温度を測定したデータは成牛では多く報告

Fig.２に示した。体表温度の実測値は36―37℃のされているが５～８），子牛のデータはあまり報告さ間で推移していたが，装着経過日数が30日を超えれていないため，今後も継続した調査が必要であたあたりにおいて，体表温度がやや低下している。

た。これは装着日数の経過に伴い，センサ装着部

本試験に用いた育成子牛19頭のうち，装着期間

位がややずれていたことが可能性として考えられ中に呼吸器疾患異常がみられた個体はいなかっる。そのため，装着日数が長くなった際は，センた。同様に，「体表温度の実測値が４時間以上

サの装着部位を定期的に確認することが推奨され39℃を超えた子牛」または「過去３日間の同時刻る。また，体表温度の実測値には日内変動がみら

平均値が４時間以上１℃を超えた子牛」もいな

れ，６時前後に最も体表温度が低くなり，17時前かった。本研究では，呼吸器疾患異常や発熱がみ後において最も高くなった。この時間帯は，それられた個体を対象として，これらの兆候を早期にぞれ午前および午後の給餌の時間帯であった。こ検知するための機械学習アルゴリズムの開発を目

れは，夜間において，休息行動をしていた際に体指していたが，対象となる子牛のデータを収集す

温が低下し，朝の給餌に伴う活動量の増加によっることができなかったため，この開発を行うことて体温が上がり始めたことが考えられる。尾根部ができなかった。今後の展望として，呼吸器疾患© The Ito Foundation

252

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

異常や発熱がみられた個体における体表温度を複疾患異常がみられた個体はいなかったことより，数等から収集することにより，発熱が検知される

呼吸器疾患異常や発熱となる子牛のデータを収集

前における体表温度の各種数値および個体の血統することができなかったため，機械学習アルゴリ

情報や飼養環境などの情報を用いて，異常の自動ズムの開発を行うことができなかった。結論とし検出に関する最適な予測検知モデルを開発するこて，子牛の体表温度を安定して測定するためにとが望まれる。

は，センサ装着の簡易化および外貌初見への影響

４．要を軽減する観点より，試験区２で活用した資材を約用いることが有用であると考えられる。

牛呼吸器病症候群は，経済的損失が大きい疾病であり，肉用牛において好発する疾病である。本
研究では，無線小型センサの安定的かつ非侵襲的な装着方法を検討すること，そして得られた体表
温度のデータから異常検知を効果的に検出するた
めに，機械学習アルゴリズムを用いた異常検知の自動検出法を開発することを目的とした。データ
は４―７ヶ月齢の黒毛和種育成子牛19頭から収集した。無線小型センサを子牛の尾根部の体表面に装着し，体表温度のデータを経時的に収集した。
センサの装着方法として，以下２つの方法を用いて有効性を検討した：試験区１．成牛用に用いられている資材（脱落防止用腰部補助布およびセン
サ梱包用マジックベルト）を子牛用に改良した資材（Ｎ＝９），試験区２．試験区１の資材に用いるセンサ梱包用マジックベルトにペンチで穴を開け，その部分に被毛が絡まる形状とし，脱落防止用腰部補助布は使用しない（Ｎ＝10）。両試験区において，センサの非脱落割合は100％であり，センサは１ヶ月以上安定して装着できた。センサを取り外した際に，試験区１では一部の個体で被毛短縮が確認されたが，試験区２ではほとんど確認されなかった。体表温度の実測値は36―37℃の間で推移していたが，装着経過日数が30日を超えたあたりにおいて，体表温度がやや低下していた。体表温度の実測値には日内変動がみられ，６時前後に最も体表温度が低くなり，17時前後にお文
献１）
 農林水産省：畜産統計調査2020
https://www.e-stat.go.jp/stat-search/file-downloa
d?statInfId=000032029741&fileKind=0２）
 農林水産省：家畜共済統計表2017https://www.e-stat.go.jp/stat-search/file-downloa
d?statInfId=000031766760&fileKind=0３）
 Sasaki, Y., Hashimoto, K., Iki, Y., Anan, T.,
Hayashi, J., Uematsu, M.：Associations between
calf factors of Japanese Black calves arriving at abackgrounding operation and bovine respiratory
disease, Prev. Vet. Med., 182, 105100, 2020.
４）
 Higaki, S., Koyama, K., Sasaki, Y., Abe, K.,
Honkawa, K., Horii, Y., Minamino, T., Mikurino, Y.,
Okada, H., Miwakeichi, F., Darhan, H., Yoshioka,
K.：Technical note: Calving prediction in dairy
cattle based on continuous measurements ofventral tail base skin temperature using supervisedmachine learning, J. Dairy Sci., 103, 8535～8540,2020．
５）
 Miwa, M., Matsuyama, S., Nakamura, S., Noda, K.,
Sakatani, M.：Prepartum change in ventral tailbase surface temperature in beef cattle: comparison
with vaginal temperature and behavior indices, andeffect of ambient temperature, J. Reprod. Dev., 65,
515～525, 2019.
６）
 Andersson, L. M., Okada, H., Miura, R., Zhang, Y.,
Yoshioka, K., Aso, H., Itoh, T.：Wearable wireless
estrus detection sensor for cows, Comp. Elect.
Agric., 127, 101～108, 2016.
７） Miura, R., Yoshioka, K., Miyamoto, T., Nogami, H.,
O k a d a , H . , I t o h T . ：E s t r o u s d e t e c t i o n b ymonitoring ventral tail base surface temperatureusing a wearable wireless sensor in cattle, Anim.
Reprod. Sci., 180, 50～57, 2017.
８）
 Koyama, K., Koyama, T., Sugimoto, M., Kusakari,N., Miura, R., Yoshioka, K., Hirako, M.：Predictionof calving time in Holstein dairy cows bymonitoring the ventral tail base surface
temperature, Vet. J., 240, 1～5, 2018.

いて最も高くなった。また，装着期間中に呼吸器© The Ito Foundation

253

イノシシにおける豚コロナウイルスの感染実態調査
Epidemiological survey of porcine coronavirus-infection in Japanese wild
boars

中

川

敬

介

（岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科）

Keisuke Nakagawa（Joint Department of Veterinary Medicine Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

In Japan, infectious diseases remain to pose a threat to swine industry. Once swine
infectious diseases unfortunately spread to wild boars, it takes a long time to make themdisease-free, as shown by a recent epidemic of classical swine fever in Japan. This factindicates that wild boars may play a role as potential transmitters or reservoirs of swine
pathogens. Therefore, it is important for control of swine diseases to understand the status ofprevalence of them in wild boars. Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）and transmissible
gastroenteritis virus（TGEV）cause a big problem in swine industry because of the high levelof pathogenicity for swine. Especially, PEDV caused an epidemic in Japan during 2013-2015，
leading to vast economic loss. Cases of TGEV are also reported every year in Japan. Thus, theboth viruses sporadically emerge and prevail to swine from unknown routes. To identify thetransmission routes of them should be useful information to control the swine coronavirus
diseases. Here, we conducted serological and molecular surveys for PEDV and TGEV amongwild boars in Gifu Prefecture, Japan. We found that the wild boars have a high level ofantibody positive rates against TGEV and PEDV by ELISA（84％ and 71％，respectively）.
Also, we detected PEDV gene from some of tonsil and spleen specimens of the wild boars by
real-time PCR. Our findings strongly suggested that wild boars in Japan may play a role oftransmitters/reservoirs for TGEV and PEDV．

１．目

おける豚の感染症の流行実態を把握することは，的豚への感染防止対策を取るうえできわめて重要な

昨今の豚熱の流行が示すように，感染症は養豚情報となる。

産業の脅威となり続けている。また，豚と遺伝的

豚流行性下痢ウイルスや豚伝染性胃腸炎ウイルに近縁であるイノシシに感染症が定着してしまう

スに代表される豚コロナウイルスは，特に幼豚にと，その感染症の清浄化には長い時間と労力が必高い致死性を示すことから，養豚業界では大きな要となる。すなわち，イノシシは豚の病原体を保問題となっている。例えば，豚流行性下痢ウイル

持する可能性をもつ野生動物であり，イノシシにスを原因とする哺乳豚の死亡は，2013―15年のみ© The Ito Foundation

254

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

で約10億円の経済被害をもたらした１）。また，豚きる情報提供を目指した。本研究の概要をFig.１

伝染性胃腸炎ウイルスの感染も，日本の豚においに示した。

て毎年の発生が報告されている。幸いなことに両感染症に対するワクチンが存在する一方，突発的

２．材料と方法に感染拡大することが知られ，その侵入経路につ

2.1

いてはいまだに不明な点が多い 。

本研究では，2018年から採材された野生イノシ

２）

材料とそれらの取り扱い

以上より，これら豚コロナウイルスの侵入経路

シの血清，扁桃乳剤および脾臓乳剤を使用した。

ならびに野生動物におけるウイルスの保有・流行

イノシシ血清は血清疫学調査に供した。なお，下状況を明らかにすることは，養豚へのウイルス感

痢症を引き起こす豚コロナウイルスは腸管のみな染対策をたてるうえできわめて重要な意味をもらず，脾臓など他の臓器にも分布することが分つ。しかしながら，日本の野生動物における，豚かっているため２），扁桃乳剤および脾臓乳剤を分コロナウイルスの感染実態（ウイルス保有状況や子疫学調査に用いた。2018年から現在までに採取

感染歴）を調べた研究は実施されていない。

されたこれらサンプル数はすでに合計500を超え

そこで本研究では，豚の近縁野生種であるイノており，申請課題後にもサンプル数は増える予定

シシを対象として，豚コロナウイルスである豚流である。なお，これらサンプルは豚熱の調査を目

行性下痢ウイルスおよび豚伝染性胃腸炎ウイルス

的に採材されたものであり，豚熱ウイルスを含むの感染実態を調査する。本研究を通じて，これら可能性が考えられた。そのため，これらのサンプ

豚コロナウイルス媒介動物としての野生イノシシ

ルは岐阜県中央家畜保健衛生所のBSL３実験施設を評価し，豚コロナウイルス感染症対策に貢献でにて以下の適切なウイルス不活化処置を施した後2018年（平成30年）から集められているイノシシ由来サンプル

岐阜県
イノシシが潜在的に豚コロナウイルスを保持？

・分子疫学調査（ウイルス遺伝子の検出）・血清疫学調査（ELISA抗体価の検出）
対象ウイルス： 豚伝染性下痢ウイルス
豚伝染性胃腸炎ウイルス
Fig.1 Overview of the current study© The Ito Foundation

イノシシにおける豚コロナウイルスの感染実態調査

255に実験に供することとした。すなわち，血清サン

VetMAX PEDV/TGEV Kit）を用いた。なお，

プルは，豚熱ウイルスを不活化する目的で，0.1％

本実験は添付の使用説明書に従って実施された。

v/vのβ-プロピオラクトン（FUJIFILM社）添加後，37℃で２時間処理し，岐阜大学へ移動させた。さらに，扁桃乳剤および脾臓乳剤については，
RNA抽出試薬（Invitrogen社：TRIzol Reagent）

３．結果と考察3 . 1 岐阜大学へのイノシシ由来検体の移送と保管

添加後に破砕したものを使用した。これらの臓器本研究助成より支援を賜われることが決定した

乳剤はフェノール乳剤であることから，これらサ

のち，岐阜県中央家畜保健衛生所のBSL３実験施

ンプル中に感染性を保持した豚熱ウイルスが残存設に保管されているイノシシ由来検体の不活化処することはない。

理から着手した。上述した方法にて処理した血清

2 . 2 イノシシ血清を用いた豚コロナウイルス

409サンプル，扁桃乳剤339サンプル，脾臓394サ
ンプルを岐阜大学に移送させた。これらのサンプに対する血清疫学調査
上述した不活化処理を施したイノシシ血清を用

ルは岐阜県との合意の下，岐阜大学にて保管さいて，豚伝染性下痢ウイルスと豚伝染性胃腸炎ウれ，今後の貴重な調査試料として活用される予定

イルスに対する抗体価を調べた。抗体価は市販のである。

両ウイルスに対するELISAキット（Abbexa社：
Pig Epidemic Diarrhea Virus Antibody ELISA

3 . 2 イノシシ血清中のPEDVとTGEVに対するELISA抗体の検出

Kit お よ び Pig Transmissible Gastroenteritis

上述したサンプルのうち，174サンプルを用い

Virus Antibody ELISA kit）により測定した。なてELISA抗体価を測定した。その結果，PEDVにお，両ウイルスに対する抗体は交差性がなく，こ対するELISA抗体価陽性率は約71％（125/174サの２つのキットを使用することにより豚流行性下ン プ ル），TGEV に 対 す る ELISA 抗 体 価 は ，約

痢ウイルスと豚伝染性胃腸炎ウイルスのいずれの84％（147/174サンプル）ときわめて高い陽性率

感染歴があるか区別することが可能である。なを示すことが分かった。これらの結果は，日本のお，本実験は添付の使用説明書に従って実施されイノシシがPEDVとTGEVに対して高い感染歴をた。

有していることを示している。すなわち，日本の2 . 3 イノシシ扁桃乳剤および腸管乳剤を用いイノシシが生涯のうちに両ウイルスに暴露される

た豚コロナウイルスに対する分子疫学調査

機会はきわめて高く，イノシシが両ウイルスを豚上記のイノシシ扁桃乳剤と脾臓乳剤からRNAへと伝播しうることを示している。なお，使用しを抽出した（Zymo社：Direct-zol RNA miniprep

た ELISA キ ッ ト に 添 付 さ れ て い る 陽 性 コ ン トkit）。抽出されたRNAを逆転写酵素（Invitrogen

ロールと陰性コントロールを，イノシシ血清と同社 ： Superscript Ⅲ Reverse Transcriptase） を様に0.1％（v/v）のβ-プロピオラクトンで処理用いてcDNAに変換し，これらを鋳型にリアルタしてもELISAのOD値に影響を及ぼさないことを

イムPCRを実施した。本リアルタイムPCRには豚確認した。

流行性下痢ウイルス，豚伝染性胃腸炎ウイルスおこれまで，イノシシを対象とした抗PEDV抗体

よび豚デルタコロナウイルスRNAを同時に検出の血清疫学調査は報告がなく，本調査が世界初とで き る キ ッ ト （Applied Biosystems 社 ：なる。一方，海外で実施されたイノシシに対する© The Ito Foundation

256

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

抗TGEV抗体調査では，2013年にトルコで実施さみイノシシの扁桃と脾臓よりウイルス遺伝子の存れたものの，陽性検体は報告されなかった 。こ在が示されたことから，TGEVは感染個体内におれまで，2009年にドイツのイノシシにおいて抗けるウイルス動態がPEDVと異なる，あるいは体TGEV抗体（ELISA抗体）陽性率が1.59％を示し

内でウイルスが存在する期間が短い可能性が考えたことのみが報告されている 。すなわち，過去られた。

の報告と比べ，今回の抗体調査はきわめて高い抗3.4体陽性率を示したことが分かる。なお，イノシシ

今回，調査したイノシシ血清のTGEVとPEDVの個体情報から体重20kg未満のものを幼獣とし，に対するELISA抗体陽性率は海外報告と比べて20kg以上の体重のものを成獣とし，両群においも，非常に高い陽性率となった。調査したイノシて抗体陽性率を比較したところ，PEDV抗体陽性

シ血清によっては，キットが支持するCutoff値よ率は幼獣60.2％および成獣88.7％，TGEV抗体陽りも低いOD値を示したものも複数検出されたの性率は幼獣76.7％および成獣95.8％を示した。

で，イノシシ血清が使用したELISAキットの陽PEDV抗体陽性率およびTGEV抗体陽性率のいず性率を上昇させる物質を含んでいる可能性は低い

れにおいても，幼獣群と成獣群間でウイルス抗体と考えられる。現在，実験的にも「血清へのβプ

陽性率に有意な差が認められた（フィッシャーのロピオラクトン処理が本ELISAキットのOD値を

正確確率検定 p＜0.01）。すなわち，イノシシが成上昇させない」ことを実験的に示すために，ワク

長するに従い，ウイルスに暴露される機会が増え

チン未接種豚由来血清の手配を進めており，本調ていることを示しており，本調査における高いウ査で得られたELISA抗体陽性率の信頼性をさら

イルス抗体陽性率について，一定の信頼性を担保に高める実験を計画している。

４）

５）

今後の展望

現在，PEDVの遺伝子の存在が示されたRNAしていると言える。
3 . 3 イノシシ脾臓乳剤および扁桃乳剤中のより，PEDVのＳ遺伝子配列の検出を試みており，
さらなる系統学的解析も計画している。日本ではPEDVおよびTGEV遺伝子の検出
VetMAX PEDV/TGEV Kitを用いて，上述し2013年にPEDVの大流行が発生していることかたサンプルのうち脾臓乳剤394サンプルおよび扁ら，本系統学的解析は，2013年に豚にて流行した

桃乳剤388サンプル中のPEDVおよびTGEV遺伝PEDVがイノシシに定着した可能性と，イノシシ子の検出を試みた。その結果，PEDV遺伝子は脾が独自のPEDVを保持している可能性のいずれか

臓乳剤６サンプルにおいて陽性，扁桃乳剤53サンを示すことができると考えられる。いずれの結果

プルにおいて陽性を示した。一方，TGEV遺伝子になるとしても，イノシシにおけるPEDVの新たは脾臓乳剤および扁桃乳剤いずれのサンプルにおな感染実態を示すことが期待できる。PEDVとイ

いてウイルス遺伝子は検出されなかった。これら

ノシシの関連を示した報告は少なく，本調査結果の結果は，PEDVが野生のイノシシの脾臓およびは世界的にもきわめて貴重かつ重要な知見を含ん扁桃中に存在していることを示唆している。

でいると考えられる。

豚への感染実験により，PEDVは腸管の他に腎本調査を通じて，大量のイノシシ由来血清およ

臓および脾臓にも分布することが明らかとされてび臓器乳剤を岐阜大学に保管することができた。

いる一方３），TGEVについては豚での体内動態の本試料は今後，イノシシが豚コロナウイルス以外

詳細が報告されていない。本調査によりPEDVのの病原体を保有・伝播させる役割をもつか否かを© The Ito Foundation

イノシシにおける豚コロナウイルスの感染実態調査

257

調査するうえできわめて貴重な試料と言える。今の日本の養豚業界の豚コロナウイルス対策の一助

後，本検体を用いて，さまざまな感染症に対するとなると考えられた。

血清疫学および分子疫学の展開が期待できる。
４．要

約

本 調 査 に よ り ，日 本 の イ ノ シ シ が PEDV とTGEVに対する高い感染歴を有していることが示唆された。また，いくつかのイノシシでは脾臓と扁桃にPEDV遺伝子の存在を示すデータを得ることができた。これらの結果は，イノシシが豚コロ
ナウイルスを保有している高い可能性を示しており，ウイルス学的にきわめて貴重かつ重要な知見を含んでいる。また，学術的のみならず，養豚家に対し「イノシシは豚熱ウイルス以外にも，豚コ
ロナウイルスを伝播させ得る存在である」ということを警鐘するうえできわめて高い説得力をもつ文献１）
 Sasaki, Y., Kawabata, T., Nakatake, S., Kohigashi,T., Toya, R., Uemura, R., Sueyoshi, M.：Assessmentof reproductive and growth performance of pigs oncommercial swine farms in southern Kyushu,
Japan, Anim Sci J, 91, 2020.
２）
 中川敬介：豚のコロナウイルス感染症，All about
SWINE 59, 2021．
３）
 Park, J. E., Shin, H. J.：Porcine epidemic diarrhea
virus infects and replicates in porcine alveolar
macrophages, Virus Res, 191, 2014.
４）
 Albayrak, H., Ozan, E., Cavunt, A.：A serologicalsurvey of selected pathogens in wild boar (Sus
scrofa) in northern Turkey, Eur J Wildl Res, 59,2013.
５） Kaden, V., Lange, E., Hänel, A., Hlinak, A.,
Mewes, L., Hergarten, G., Irsch, B., Dedek, J., Bruer,
W.：Retrospective serological survey on selectedviral pathogens in wild boar populations inGermany, Eur J Wildl Res, 55, 2009.

データを得ることができた。本調査結果は，今後© The Ito Foundation

258

PRRSウイルス感染初期における鼻腔内ウイルス動態の解析
Analysis of intranasal viral dynamics in the early stage of PRRS virus
infection

平

井

卓

哉

（宮崎大学農学部）

Takuya Hirai（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Porcine respiratory disease complex（PRDC）has an important impact on swine producers
worldwide. Common primary viral contributors to PRDC are porcine reproductive andrespiratory syndrome virus（PRRSV）and porcine circovirus 2（PCV2）. PRDC-affected pigs
often show poor growth with respiratory symptoms. Nasopharynx-associated lymphoid tissue（NALT）plays an important role in the up taking of pathogens and defense of the nasal
mucosa. However, there were few academic reports about pathological analysis of NALT in
pigs. In this study, the histopathological examination of NALT, in situ hybridization andquantitative（q）PCR and was performed in the PRDC-affected pigs. Histopathologicalexamination revealed catarrh nasopharyngitis with goblet cell hyperplasia and neutrophils
infiltration in follicle-associated epithelium covering NALT. There are neutrophils andmononuclear cells infiltration in degenerated crypt epithelium near NALT. By in situ
hybridization, PRRSV nucleic acid were detected in cytoplasm of cells resembling macrophages
beneath the crypt near the NALT. These cells were positive for Iba-1 which was macrophage
marker. Streptococcus suis was also isolated from nasal swab in same pigs which were infectedby PRRSV. By quantitative PCR, PRRSV was detected ranging from 2.6×10３ to 4.1×10６
copies/µl in NALT and from 1.0×10４ to 6.9×10６ in lung, respectively. The results of thisstudy show that PRRSV replicates in monocyte/macrophage lineage cells. It is speculated that
the PRRSV-infected antigen-presenting cells may affect IgA production and induce local
immunosuppression in upper respiratory tract. It causes microbiota dysbiosis, induces
nasopharyngitis and develops into pneumonia. We believe that PRRSV enters the NALT via
degenerative epithelium, M cells, or hematogenous routes. Further investigation is needed forclarifying the pathogenesis of viral and bacterial infection in NALT and lung of pigs．

１．目

イルスⅡ型（PCV2），豚呼吸器コロナウイルス，的

豚インフルエンザウイルスなどのウイルスの他，

子豚の呼吸器複合感染症は，豚繁殖・呼吸障害

各種細菌の重感染により起こる疾患である。その症候群（PRRS）ウイルスを基本に，豚サーコウ

推定損失額は全国で年間280億円にものぼり，養© The Ito FoundationPRRSウイルス感染初期における鼻腔内ウイルス動態の解析

豚業界では呼吸器病対策が最も重要な課題になっている。本研究は，PRRSウイルス感染時における鼻咽頭病変の病理学的解明とともに，子豚の呼吸器複合感染症の防除対策を目指すのが目的である。

259の動態を明らかにし，推察を実証することである。
２．方法

６農場から41～120日齢の死亡豚73頭を入手し，生材料として鼻咽頭ぬぐい液，NALTおよび肺を近年，ヒトとマウスでは鼻咽頭関連リンパ組織採取した。NALTを含む鼻咽頭粘膜組織および肺（nasopharynx-associated lymphoid tissue：

はホルマリン固定後にパラフィン包埋を行い，NALT）が感染初期における生体防御に重要な役

HE染色標本を作製した。また，と畜場にて健常割を担っていることが解明された。NALTには，

豚３頭（168日齢）の頭部からNALTを含む鼻咽樹状細胞，Ｔ細胞，Ｂ細胞などが集結することか

頭粘膜組織を採取した。これらはPRRS陰性農場

ら，粘膜組織に侵入するウイルスと病原細菌に対由来の豚で，コントロールとして用いた。Ｍ細胞する防御免疫システムを構築している。NALTを

特異的モノクローナル抗体glycoprotein2（GP2）覆う上皮層は特殊に分化しており，そこには外来およびcytokeratin18（CK18）を用いて，鼻咽頭抗原の取り込みを専門に行うMicrofold細胞（Ｍ

粘膜を免疫組織化学（IHC）法で検索した。さら細胞）が存在し，外来抗原はＭ細胞に取り込まれに，NALTおよび肺を用いてin situ hybridization

た後に上皮直下に存在するマクロファージと樹状（ISH）法によるPRRSウイルス感染細胞の検出と細胞に受け渡され，リンパ球へと抗原提示が行わ

その細胞種の特定を試みた。２農場から採取したれる。多くのウイルスや細菌が呼吸器を介して感各４例についてはNALTおよび肺のリアルタイム

染することより，感染初発部位の粘膜面に抗原特PCRを実施し，PRRSおよびPCV2のウイルス量

異的な分泌型IgA産生と細胞性免疫を誘導できるを測定した。一部の症例については鼻咽頭ぬぐい

NALTの役割はきわめて重要である。

液および肺を用いて細菌の分離・同定を行った。

PRRSウイルスは鼻粘膜から感染し，一次増殖後に肺病変を形成する。本ウイルスの標的細胞は

３．結果と考察

マクロファージであるが，ウイルス動態，すなわ

3.1

ち本ウイルスがどのように上皮バリアーを通過しNALTを含む鼻咽頭は，硬口蓋と軟口蓋の境界て，粘膜下のマクロファージに感染・増殖するか部の背側から咽頭にかけて存在し，頭蓋基底部とについては解明されていない。その原因として，軟口蓋に囲まれており，文献報告と同様であっ

鼻咽腔壁を覆う鼻骨や頭蓋骨が標本作製の妨げとた１，２）。同部は頭蓋底の骨から比較的容易に剥離なり，鼻粘膜でのウイルス抗原の検出が難しく，可能であった。NALTを含む鼻咽頭は骨を含まな

NALTの存在すら知られていなかったからであ

いで採材可能であり，各種抗原や遺伝子の検出にる。申請者は，PRRSウイルスがNALTのＭ細胞

支障がなく，今後，呼吸器病を引き起こす病原体

を介して侵入し，上皮下のマクロファージで増殖の上部気道における病態解析や肺病変との関連性

する可能性を推測している。

を調べるうえで，有用な採材手法と考えられた。

Ｍ細胞についての検索

本研究の目的は，NALTにおけるＭ細胞の分布

HE染色では，健常豚のNALTを覆う濾胞関連

およびPRRSウイルスの増殖を組織上で可視化さ上皮は多列繊毛上皮細胞であり（Fig. 1A），咽頭せることにより，豚の鼻咽頭における本ウイルス

側では重層扁平上皮へと上皮形態の移行が認めら© The Ito Foundation

260

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

れた。IHC法では，健常豚の多列繊毛上皮から構3.2

成される濾胞関連上皮の一部領域で抗GP2抗体陽剖検の肉眼所見にて44頭（62％）で鼻咽腔内に性細胞が観察された（Fig. 1B）。抗CK18抗体に滲出液の貯留が認められた。病理組織学的検査で対しては，多列繊毛上皮の濾胞関連上皮では多く

は，鼻咽腔には粘液の貯留および好中球の浸潤がの細胞が陽性を示し，強陽性細胞と弱陽性細胞の認められ，粘膜上皮において杯細胞の過形成がみ両方が認められた。IHC法において，健常豚のられた（Fig. 1C）。粘膜上皮細胞の一部は変性・NALTの濾胞関連上皮で，抗GP2抗体および抗壊死・剥離し，粘膜上皮内にも好中球を主としたCK18抗体に強陽性を示す細胞が観察されたこと

炎症細胞が浸潤していた。陰窩腔においてさまざより，Ｍ細胞の存在が示唆された。

まな程度に陰窩上皮細胞の変性・壊死・剥離，好病理学的検査および細菌検査

B
B

A

100 µm

25 µm

D

C

50 µm

E

＊

25 µm

F

＊

25 µm

25 µm

Fig.1
A. NALT in the nasopharynx. NALT is covered by follicular associated epithelium. HE.

B. N ALT in the nasopharynx. GP2-positive M cells（arrow）are observed in follicular associated epithelium.

Immunohistochemistry．

C. NALT in the nasopharynx. Goblet cells hyperplasia and infiltration of neutrophils are present in follicular associatedepithelium. HE．

D. Crypt in the nasopharynx. Degeneration of epithelium and mononuclear cell infiltration（arrow）are seen in thecrypt. HE．

E. NALT near the crypt in the nasopharynx. Positive signals of PRRSV nucleic acid are present in cytoplasm ofmacrophage-like cells（arrow）beneath the crypt（asterisk）.In situ hybridization．

F. NALT near the crypt in the nasopharynx. Iba-1 positive macrophages are scattered beneath the crypt（asterisk）.

Immunohistochemistry．

© The Ito Foundation

261

PRRSウイルス感染初期における鼻腔内ウイルス動態の解析

中球および単核細胞の浸潤が認められた（Fig.

発揮に共生関係が成立している。常在細菌叢は，

1D）。PRRSプローブを用いたISH法ではウイルス

非病原性細菌のみならず，一定量の病原性細菌も陽性シグナルが主に陰窩近傍のマクロファージ様分布しているが，感染症を生じることはない３）。

細胞の細胞質に検出された（Fig. 1E）。連続標本

PRRSウイルス感染により，局所免疫抑制が起こを用いたIHC法で，これらの細胞はマクロファー

れば，常在細菌叢の乱れが生じ，病原性細菌の増ジマーカーであるIba1に陽性を示した。以上よ殖により鼻咽頭炎が引き起こされ，肺炎等に進展

り，NALTにおいてPRRSウイルスが単球・マクする機序が考えられる。今回の研究では，Ｈ農場

ロファージ系細胞で増殖することが示された。

の全症例において鼻咽頭ぬぐい液から

PRRSウイルスが上皮下に存在する樹状細胞など

Streptococcus suisが検出されており，PRRSウイの抗原提示細胞に感染すれば，抗原提示能の障害

ルスの感染から細菌感染症を続発した可能性が示

によりIgAの産生が影響され，上部気道における唆された。

局所免疫が抑制される可能性が考えられた。

3 . 3 リアルタイムPCR法によるPRRSウイル

検索した症例の全例に肺炎があり，化膿性気管

ス量の測定

支肺炎および間質性肺炎が混在して認められた。

検索した一部の症例について，PRRSウイルス

病理組織学的には気管支腔および肺胞腔内に好中

お よ び PCV2 の リ ア ル タ イ ム PCR を 実 施 し た球を主とした炎症細胞浸潤があり，肺胞壁もしく（Table１）。カタール性鼻咽頭炎を示したＨ農場

は肺胞腔内にはマクロファージが増生していた。

の２症例（No.１：41日齢，No.４：63日齢）では

PRRSプローブを用いたISH法でこれらのマクロ

鼻咽頭ぬぐい液で3.5×10５copy/μℓ以上のPRRS

ファージの細胞質に陽性シグナルが検出された。

ウイルスが検出され，肺におけるウイルス量と同細菌検査では，Ｈ農場の全症例において鼻咽頭ぬ等レベルであった。Ｔ農場の120日齢の症例では，ぐい液からStreptococcus suisが検出された。ま

４例中３例のNALTにおいて2.3×10５copy/μℓ

た ，２ 例（Nos. １ ＆ ２）に お い て Haemophilus

以上のPRRSウイルスが検出された。加えて，parasuisが分離された。肺からは細菌は分離されPCV2のリアルタイムPCRを実施したところ，1.3なかった。

×10６copy/μℓ以上のPCV2が検出された。

鼻咽腔内には常在細菌叢が分布し，正常機能のＴ農場の120日齢の症例ではNALTにおいて

Table 1 Results of PRRSV and PCV2 quantitative PCR in different tissues．
Sample No.

FarmAge（days）

PRRSV qPCR（copy/μl）

PCV2 qPCR（copy/μl）

NALT

Lung

NALT

Mesenteric lymph node

1.3×10６

No.１

41

1.6×10６

―

―

No.２

44

1.3×10４

1.5×10６――47

2.6×10３

5.4×10５―

5.0×10５63

3.5×10５

6.9×10６――120

1.3×10６

1.0× 10４

1.1 × 10８

3.6 × 10８120

4.1×10６

8.7× 10４

1.3 × 10６

2.2 × 10６120

9.4×10３

1.0× 10４

4.3 × 10７

2.4 × 10７120

2.3×10５−

1.1 × 10８

1.1 × 10８No.３

H farm

No.４
No.５
No.６
No.７

T farm

No.８
ND：Not done，―：Negative© The Ito Foundation

262

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

PRRSウイルスとPCV2の両ウイルスの増殖が示病原菌によって鼻咽頭炎が引き起こされ，肺炎に唆された。臨床現場において両ウイルスの混合感進展する機序が推測された。感染経路として，Ｍ染は多く確認されており，両ウイルスとも単球・細胞を介しての侵入，粘膜上皮の損傷部位より侵マクロファージ系細胞を標的として宿主の感染防入，血行性に侵入が考えられた。豚のNALTおよ

御能を低下させ，免疫抑制につながることが報告

び肺におけるウイルスと細菌感染による病態を明されている。NALTにおいて両ウイルスが増殖すらかにするためには，さらなる研究が必要である。

ることは豚呼吸器複合感染症の病理発生を解明す
るうえできわめて重要な所見と考えられた。
４．要約

NALTの単球・マクロファージ系細胞において
PRRSウイルスが増殖することが示された。ウイ
ルス増殖により，IgAの産生に影響が出て，上部
気道における局所免疫が抑制された可能性が考えられた。また，常在細菌叢が乱れることで，外来

文献１）
 Liebler-Tenorio, E. M., Pabst, R.：MALT
structure and function in farm animals, Vet Res, 37（3）,257～80, 2006, May-Jun.
２）
 Yang, J., Dai, L., Yu, Q., Yang, Q.：Histologicaland anatomical structure of the nasal cavity ofBama minipigs, PLoS One, 12（3）, e0173902, 2017,
Mar, 24.
３）
 Zeineldin, M., Lowe, J., Aldridge, B.：Contributionof the mucosal microbiota to bovine respiratory
Health, Trends Microbiol, 27（9）, 753～770, 2019,Sep.

© The Ito Foundation

263

家畜に下痢を引き起こすロタウイルスの遺伝子改変技術
Development of reverse genetics technology for rotaviruses of livestock

金

井

祐

太

（大阪大学微生物病研究所）

Yuta Kanai（Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University）

Rotavirus is one of the leading causes of diarrhea in livestock. Rotavirus infection induces
severe diarrhea in young animals such as cattle, pigs, and horses, and can cause death due toexcessive dehydration. There is no specific treatment for this disease, and it is treated bysupplemental fluids and other symptomatic therapies. Viral reverse genetic system is atechnique for engineering of viral genome or generation of artificial recombinant viruses. So
far, reverse genetics system of rotavirus have been developed using simian rotavirus andhuman rotavirus strains but reverse genetics of rotavirus strains of livestock have not been
available. Rotaviruses are highly host-specific, and bovine rotaviruses and porcine rotaviruseshave different properties from human rotaviruses. Thus, the establishment of reverse genetics
systems of animal rotaviruses is required for molecular biological studies of rotaviruses fromdomestic animals．
In this study, the first reverse genetics system for bovine rotavirus was established using
bovine rotavirus strain KM3 isolated from a dairy cow with diarrhea in Japan in 2017. The
reverse genetics system of bovine rotavirus was applied to study the viral genome packaging
signal sequence of NSP1 gene which antagonizes interferon responses. The recombinant virus,
rKM3_NSP1_Δ1178 carrying deletion mutant NSP1 gene which kept only 200bp of 5’ and 3’
region of NSP1 gene segment was generated. rKM3_NSP1_Δ1178 was replication competentand replication kinetics was similar to wild-type KM3 indicating 200bp of 5’ and 3’ terminal
regions of NSP1 gene contained sufficient genome packaging signals. Further, recombinantbovine rotaviruses expressing red fluorescent protein（rKM3-mScarlet）was generated. The
rKM3-mScarlet infected cells exhibited red fluorescent signals. Since the reverse genetics
technology enable for generation of mutant virus with any gene mutation, the techniqueestablished in this study will contribute for molecular biology of viral pathogenesis and vaccine
development of bovine rotavirus．

１．目

ゲノムDNA・RNAを細胞にトランスフェクショ

的ンすることで感染性ウイルスを得る人工合成技術

ウイルスの遺伝子操作系は，精製したウイルスであり，任意の遺伝子変異を持つ組換えウイルス© The Ito Foundation

264

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）を作製できることからウイルスの分子生物学的研究に必須の技術である。これまで多くのウイルス

２．方法

でウイルス種固有の遺伝子組換え技術が開発さ

2.1

れ，病原性解析やワクチン開発などに応用されてウイルス材料として，2017年に岐阜県の農場でいた。本研究対象であるロタウイルスは，家畜の下痢を呈したウシから分離されたウシロタウイル

幼獣に重篤な下痢を引き起こし産業上きわめて重スKM1～KM11株（松尾加代子博士提供）を実験

要なウイルスである。ロタウイルスは11分節の二に供した。ウイルスの増殖および感染実験には

本鎖RNAゲノムを持ち，他のウイルス科には見MA104 細 胞 株（サ ル 腎 臓 由 来）を 使 用 し た 。

られない複雑なゲノム構造が原因で遺伝子組換え

MA104細胞の培養には５％牛胎児血清を加えた技術は永らく確立されていなかった。申請者は，

DMEM培地を用い，37℃，５％CO２で培養を行っロタウイルスの遺伝子組換え技術の開発のため，た。ロタウイルスの感染は，５％血清加DMEM

サルロタウイルスの11分節遺伝子をコードする11培地中でウイルスを吸着後，培地を豚膵臓由来ト

種のプラスミドに加え，新規ロタウイルス増殖促

リプシン（Sigma T0303，0.5μg/ml）を添加し進 因 子 と し て ，ネ ル ソ ン ベ イ レ オ ウ イ ル ス のた無血清のDMEMに置換し，37℃，５％CO２ でFASTタンパク質およびワクシニアウイルス由来培養を行った。ウイルス感染価測定のため，希釈のRNAキャッピング酵素を同時に細胞に発現すしたウイルスをMA104に感染し，感染後16時間ることで，感染性ロタウイルスの人工合成に世界

におけるウイルス感染細胞をウサギ抗ロタウイル

で初めて成功した 。また，同様の技術によりヒスNSP4抗体およびヤギ抗ウサギIgG-CF488を用

トロタウイルスの遺伝子操作系も確立した２）。こいて検出し，focus forming unit（ffu）/ mlにて算の遺伝子操作系を利用し，抗原性を変化させた次

出した。

１）

世代ロタウイルスワクチン候補株の開発 や，外３）来遺伝子を発現するロタウイルスベクター の開４）

ウイルスおよび細胞2 . 2 ウイルス由来RNAゲノムのクローニング
および配列決定発を行ってきた。一方，ロタウイルスは宿主特異

ウ イ ル ス 培 養 液 か ら TRIzol LS （Thermo

性が高く，家畜に病原性を示すウシロタウイルス

Fisher）を用いてウイルス由来RNAを精製した。

やブタロタウイルスは感染に必要な細胞表面の受ウイルスゲノムRNAの末端は配列はFull-Length

容体分子がヒトロタウイルスと異なることが知ら

Amplification of cDNAs法５）により以下のとおり

れており，分子生物学的な研究を遂行するうえで行った。精製したウイルスRNAの末端にRNA

家畜由来ロタウイルスを用いた遺伝子操作系の確ligase（takara）を用いてリンカー配列である5’-

立は不可欠である。

GACCTCTGAGGATTCTAAAC/iSp9/

本研究では，2017年に日本国内で下痢を呈した

TCCAGTTTAGAATCC-3’を付加し，逆転写酵

乳牛から分離されたウシロタウイルスKM3株を素 （Revert Aid, Thermo Fisher） を 用 い て用いた遺伝子操作系の確立を試みた。さらに遺伝

cDNAの合成を行った。cDNAを鋳型とし，リン子操作系を利用することで，外来遺伝子であるレカ ー 配 列 に 相 補 的 な プ ラ イ マ ー 5’-

ポーター遺伝子（蛍光タンパク質等）を発現する

GTTTAGAATCCTCAGAGGTC-3’を用いてPCR

組換えウシロタウイルスを作成し，感染の可視化を行い，増幅したロタウイルス各遺伝子分節に相と簡便な検出系の構築を試みた。

当するバンドからDNAを精製し，プラスミド© The Ito Foundation

265

家畜に下痢を引き起こすロタウイルスの遺伝子改変技術

pBluescriptへのクローニングを行った。クロー

遺伝子をKM3 NSP1遺伝子の106番目の塩基の後ニングした各遺伝子分節の全配列を決定した。

に挿入し，さらに外来遺伝子の安定性を上昇させ

2 . 3 ウイルス人工合成のためのプラスミド構築

るため，NSP1遺伝子の107-1378番目の塩基を除KM1およびKM3のそれぞれ11分節に由来する

去したプラスミド，pT7_KM3_NSP1_mScarletを

cDNAをロタウイルス人工合成に使用するプラス作製した。

ミドにクローニングした（Fig.１）。プラスミド2.4からの正確なウイルスRNAの転写のため，各ウ

ロタウイルスの11遺伝子分節をそれぞれコード

イルス遺伝子の上流にはT7プロモーターを配置する11種のプラスミドを同時にT7ポリメラーゼ

し，下流にはＤ型肝炎ウイルス由来のリボザイム

発現細胞であるBHK T7細胞にトランスフェク

配列を配置した。NSP1変異組換えウイルス作成

ションした。トランスフェクションから48時間後のため，KM3株のNSP1遺伝子をコードするプラに培地をトリプシンを加えたDMEM培地に交換

ス ミ ド （pT7_KM3_NSP1） を 用 い て ， PCR

し５日間培養した。ウイルス感染確認のため，培

mutagenesisにより５’および３’末端からそれぞれ

養上清をMA104細胞株に加えトリプシンを加え

200 ｂ の み を 持 つ 変 異 NSP1 発 現 プ ラ ス ミ ド ，たDMEM培地で最長で１週間培養し，細胞変性

pT7_KM3_NSP1_Δ1178を作製した。mScarletタ

効果の有無を観察した。また，NSP1変異ウイル

ンパク質を発現する組換えウイルス作成のため，スおよびmScarlet発現ウイルス作成のため，野生

pT7_KM3_NSP1プラスミドを用いて，mScarlet

型 NSP1 遺 伝 子 発 現 プ ラ ス ミ ド に 代 え ，pT7_

11-segmented
dsRNA genome

1
KM 0
11

9

KM

8

KM

7

KM

6

5

KM

KM

4

KM

3

KM

KM

KM

KM

VP4

2

B
1

A

組換えウシロタウイルスの人工合成

VP1
VP2/VP3
VP4
NSP1
VP6

VP7

NSP2/NSP3
/VP7
NSP4
NSP5

C
Rotavirus

RNA puriﬁcation,
cDNA synthesis

plasmid construction
VP1

VP2

Transfection,
recombinant virus production

VP3

VP4

VP6

VP7

NSP1

NSP2

NSP3

NSP4

NSP5

Fig. 1 Schematic strategy for developing reverse genetics system of bovine rotavirus. A. Schematic

structure of the rotavirus virion. The outer capsid layer is composed of VP7 and VP4, which
determine the G（glycoprotein）and P（protease sensitive）type antigens. B. Electrophoretic
migration profile of the 11 segments of bovine rotavirus KM1 to KM11 strains isolated inJapan. C. Schematic strategy for rotavirus reverse genetics.

© The Ito Foundation

266

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

KM3_NSP1_Δ1178 も し く は pT7_KM3_NSP1_子に異なるパターンが認められた（Fig. 1B）。そmScarletをウイルス人工合成に使用した。

こで，異なる電気泳動パターンを示したKM1株とKM3株からそれぞれ11分節の二本鎖RNAゲノ

３．結果と考察
3.1

ムを精製し，末端配列を含む全ウイルスゲノムのウシロタウイルス遺伝子型の解析

単離と配列決定を行った。ロタウイルスの粒子表

我々は，これまでに2017年に岐阜県の農場で下面は外殻タンパク質であるVP7およびVP4タンパ

痢を発症した牛から分離されたロタウイルス臨床

ク質に覆われ，ロタウイルスの抗原決定基となっ株を11株（KM1～KM11株）入手した。これら11て い る（Fig. 1A）。VP7 は Ｇ（Glycoprotein）タ

株の二本鎖RNAゲノムの電気泳動パターンを比イ プ 抗 原 を 規 定 し ， VP4 は Ｐ （Protease較したところ，インターフェロン抑制機能を持つ

sensitive）タイプ抗原を規定する。ＧおよびＰタ

NSP1遺伝子と，外殻タンパク質であるVP7遺伝

イプ抗原性は，ワクチンの有効性に大きな影響をA

ST3 G4
Hochi G4BWa G1

RRV G3
RO1845 G3
EDIM G16
SA11 G3
US1205 G9116E G9
Wi61 G9F45 G969M G8B223 G10
WC3 G6KM1 VP7
KM3 VP7OSU G5
L26 G12
L338 G13
DS-1 G2CH2 G7

RRV P[3]RO1845 P[3]
SA11 P[2]OSU P[7]
NCDV P[1]L338 P[18]69M P[10]EDIM P[16]AU-1 P[9]WC3 P[5]KM1 VP4
KM3 VP4ST3 P[6]US1205P[6]DS-1 P[4]L26 P[4]Wa P[8]
Hochi P[8]Wi61 P[8]F45 P[8]I321 P[11]116E P[11]B223 P[11]Fig. 2 Phylogenetic analysis of VP7 and VP4 of bovine rotavirus KM1 and KM3 strains.

The deduced amino acid sequences of（A）VP7 and（B）VP4 of KM1 and KM3
strains were aligned with VP7 and VP4 of reference strains deposited in GenBank.
Phylogenetic trees were constructed using the maximum likelihood method. KM1and KM3 were indicated by black circles．

© The Ito Foundation

267

家畜に下痢を引き起こすロタウイルスの遺伝子改変技術及ぼすためロタウイルスの野外調査にきわめて重ル腎臓由来のMA104細胞株に加え37℃で培養し要な意義を持つ。本研究で使用したKM1株およたところ，感染２日後に細胞変性効果が認めらびKM3株のVP7およびVP4の系統樹解析を行った

れ，感染４日後にはすべての細胞が死滅していところ，両株ともVP7はG6型，VP4はP［5］型でた。この細胞溶解液からRNAを精製し，10％アあり，ウシロタウイルスとして日本では優勢に検

クリルアミドゲル電気泳動を行ったところ，11分

出されているG6P［5］型であった （Fig. 2A, B）。

節二本鎖RNAゲノムに相当するバンドが認めら

６）

ウシロタウイルス遺伝子操作系の確立れた（Fig.３）。電気泳動パターンは親株である

次に，KM1およびKM3株の遺伝子操作系（もKM3 と 同 一 で あ っ た こ と か ら 人 工 合 成 さ れ た

しくは人工合成法）確立のため，それぞれのウイ

KM3 株 で あ る こ と が 確 認 さ れ ， rKM3

ルス株から単離した各11分節由来のcDNAをロタ（recombinant KM3）と名付けた。一方，KM1株

ウイルス人工合成用のプラスミドにクローニングの遺伝子を導入した細胞からはウイルスが回収さした。KM1もしくはKM3由来の遺伝子を含むそれなかった。

3.2

れぞれ11種のプラスミドを同時にBHK-T７細胞

3 . 3 ロタウイルスのゲノムパッケージングシにトランスフェクションし，トリプシンを加えた

グナルの解析

培地中で５日間培養した。さらに，培養上清をサ

A

次にKM3株の人工合成技術を用いて，ロタウ

Untranslated
regionUntranslated
regionORF

Wild-type NSP1 gene

NSP1

NSP1∆1178 gene

Putative genome packaging signal

B

_N
M3

10 6

Viral titer (FFU/ml)

rK

M3

wt

rK

KM

3

SP

1∆

11

78

C

NSP1

NSP1
∆1178

10 5
10 4
wtKM3

10 3

rKM3

10 2
10 1

rKM3_NSPΔ1178
0

12

24

48

72

96

Time post infection (h)Fig. 3 Generation of recombinant KM3 viruses by reverse genetics. A. Schematic

design of NSP1 mutant gene lacking 1178bp. B. Electropherotypes of dsRNA
genome purified from wild-type KM3（wtKM3）, recombinant KM3（rKM3）
and rKM3 carrying NSP1 deletion mutant gene（rKM3_NSP1_Δ1178）. C.
Replication kinetics of wtKM3, rKM3 and rKM3_NSP1_Δ1178 in MA104
cells.

© The Ito Foundation

268

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

イルス遺伝子のパッケージングシグナルの解析を

rKM3_NSP1_Δ1178からゲノムRNAを精製し電行った。ロタウイルスのように多分節に分かれた

気泳動に供したところ，短縮したNSP1_Δ1178がRNAをウイルスゲノムとして持つウイルスの細確 認 さ れ た（Fig. 3B）。ま た ，rKM3_NSP1_Δ

胞内におけるウイルス複製の際には，合成された

1178の増殖能を測定したところ，野生型ウイルス

ウイルスゲノム（遺伝子分節）を正確に新規ウイであるrKM3と同等であった（Fig. 3C）。このこ

ルス粒子に取り込む必要があるため，「ゲノムとから，NSP1遺伝子のパッケージングには両端パッケージング」と呼ばれる，正確にそれぞれの200bpで十分であることが示された。

遺伝子分節を取り込む機構があると考えられてい3 . 4 赤色蛍光タンパク質発現レポーターウイ

る。ロタウイルス遺伝子分節は，タンパク質翻訳

ルスの作製

領 域 で あ る ORF（open reading frame）の５’ お

次に，外来遺伝子であるmScarletタンパク質をよ び３’ 側 に 非 翻 訳 領 域 （UTR ： untranslated

発現する組換えKM3ウイルスの作製を行った。

region）を持ち，各遺伝子分節両端の数十～数百

申請者は以前の研究で，サルロタウイルスSA11

塩基がパッケージングシグナルであると想定され株のNSP1遺伝子に蛍光タンパク質（GFP等）やて い る（Fig. 3A）。そ こ で NSP1 遺 伝 子 の 両 端

発光タンパク質（ルシフェラーゼ等）を挿入し，200bpを残し，ORFの1178bpを削除したNSP1_

ウイルス感染の可視化や定量に成功している４）。

Δ1178遺伝子を作製し，ウイルス人工合成の際にそこで同様の手法により，mScarlet遺伝子を挿入

野生型NSP1遺伝子に代わりNSP1_Δ1178遺伝子

したNSP1遺伝子（NSP1_mScarlet）を作製し，を使用することで，欠損型NSP1遺伝子を持つ組

ウイルス人工合成の際に野生型NSP1遺伝子に代換えウイルスrKM3_NSP1_Δ1178を作製した。

わりNSP1_mScarlet遺伝子を使用することで，組A
Wild-type NSP1 gene

NSP1

NSP1_mScarlet genemScarlet

1271bp deletion

3_
ｍS
c

C

rKM

rKM
3

arl
e

t

B

Uninfected

rKM3-mScarlet

NSP1
NSP1
mScarletFig. 4 Generation of recombinant KM3 viruses expressing red fluorescentprotein. A. Schematic design of NSP1_mScarlet gene. B. Electropherotypes
of dsRNA genome purified from rKM3 and rKM3_mScarlet. C. Visualizationof rKM3_mScarlet infected cells．

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家畜に下痢を引き起こすロタウイルスの遺伝子改変技術

269

換 え ウ イ ル ス rKM3_mScarlet を 作 製 し た（Fig.

作製し，ウイルス感染細胞が赤色蛍光を呈し，ロ4A）。rKM3_mScarletのゲノムRNAを電気泳動

タウイルス感染の可視化に成功した。遺伝子組換したところ，目的のサイズのバンドが確認されたえ技術により任意の遺伝子変異を持つロタウイル（Fig. 4B）
。rKM3_mScarletをMA104細胞に感染

スが作製可能になるため，病原性解析やワクチン

し，蛍光顕微鏡で観察したところ赤色蛍光が観察開発などに応用可能である。

され，ウイルス感染の可視化に成功した（Fig.
4C）
。
４．要

約

ロタウイルスはウシ，ブタ，ウマなどさまざまな家畜の幼獣に重篤な下痢症を引き起こし，公衆衛生上きわめて重要なウイルスである。本研究では，本邦で下痢症を呈したウシより分離されたロタウイルス株を用いて，世界初となるウシロタウ
イルスの遺伝子組換え法を確立した。遺伝子組換え技術により，ロタウイルスのインターフェロン
抑制遺伝子であるNSP1の変異ウイルスを作製し，NSP1遺伝子分節の５’および３’末端からそれぞれ
200bpの領域があることでゲノムパッケージング
シグナルとして機能し，ウイルス粒子に取り込まれることを示した。さらに，蛍光タンパク質であ文献１） Kanai, Y., Komoto, S., Kawagishi, T., Nouda, R.,
Nagasawa, N., Onishi, M., Matsuura, Y., Taniguchi,
K., Kobayashi, T.：Proc Natl Acad Sci USA, 114,
2349～54, 2017.
２）
 Kawagishi, T., Nurdin, J. A., Onishi, M., Nouda, R.,
Kanai, Y., Tajima, T., Ushijima, H., Kobayashi, T.：J
Virol, 94, e00963～19, 2019.
３）
 Kanai, Y., Onishi, M., Kawagishi, T., Pannacha, P.,
Nurdin, J. A., Nouda, R., Yamasaki, M., Lusiany, T.,
Khamrin, P., Okitsu, S., Hayakawa, S., Ebina, H.,
Ushijima, H., Kobayashi, T.：J Virol, 95, e01374～
20, 2020.
４）
 Kanai, Y., Kawagishi, T., Nouda, R., Onishi, M.,
Pannacha, P., Nurdin, J. A., Nomura, K., Matsuura,Y., Kobayashi, T.：J Virol, 93, e01774～18, 2019．
５）
 Maan, S., Rao, S., Maan, N. S., Anthony, S. J.,
Attoui, H., Samuel, A. R., Mertens, P. P.：J Virol
Methods, 143, 132～９, 2007.
６） Odagiri, K., Yoshizawa, N., Sakihara, H., Umeda,
K., Rahman, S., Nguyen, S. V., Suzuki, T.：Viruses,
12（12）,1386, 2020.

るmScarletを発現するレポーターロタウイルスを© The Ito Foundation

270

地方病性牛伝染性リンパ腫発症機序の解明と予後診断法の確立
Study for control of enzootic bovine leucosis

森

宏・岡

崎

克

則

（北海道医療大学薬学部）

Hiroshi Mori and Katsunori Okazaki（Department of Pharmaceutical Sciences, Health Sciences University of Hokkaido）

Enzootic bovine leucosis（EBL）is caused by infection with bovine leukemia virus（BLV）.
Most BLV-infected cattle are asymptomatic carriers but 2-3％ of those develop tumors after along incubation period. The details of the mechanism developing tumor are unknown. The
number of EBL case in Japan has rapidly increased in the past 20 years and, therefore, theestablishment of new countermeasures against EBL is urgently needed．
We previously reported that BLV is divided into two types: L233-Tax- and P233-Taxcarrying viruses, according to the amino acid at position 233 of Tax, and that L233-Taxcarrying virus had a significantly shorter incubation period than P233-Tax-carrying one for
EBL developing. In addition, we showed that L233-Tax-expressing rat fibroblast cells secreted
a number of molecules playing critical roles in vesicular development, including annexin A3（ANXA3）and extracellular matrix protein 1（ECMP1）, and formed larger tumor than P233Tax-expressing cells through a murine subcutaneous xenograft study．
In this study, we carried out murine xenograft study using Tax-expressing bovine cells inorder to elucidate mechanism developing EBL by BLV. Unlike rat fibroblast cells, however, notumor developed, probably due to insufficient number of cells or usage of differentiated cells.
We also generated CRISPR/Cas9 RNP cleaving BLV provirus genome to determine theintegration sites of the genome. Then, we established a sandwich ELISA system measuring
ANXA3 concentration in blood of cattle to prognose BLV-infected animals for EBL onset. Since
demonstration experiment using field EBL samples could not verify its usefulness, we made apurified ECMP1 preparation as another target molecule for EBL prognosis．

１．目

子Taxあるいはプロウイルス挿入部位などが関与的すると考えられているが，その詳細は不明である

地方病性牛伝染性リンパ腫（EBL）は牛伝染性。EBLに対する有効なワクチンおよび治療法は

１）リンパ腫ウイルス（BLV）を病因とする。BLV

存在しないが，ヨーロッパ諸国の一部では抗体陽感染牛の多くは無症状であり，リンパ腫を発症す

性牛の摘発・淘汰によってBLVの清浄化に成功

るのは感染牛全体の２-３％のみである。リンパした。一方，我が国におけるEBLの報告数はこの腫発症には宿主のMHCやウイルスの転写調節因20年間で急増しており２），感染牛の摘発・淘汰に© The Ito Foundation

271

地方病性牛伝染性リンパ腫発症機序の解明と予後診断法の確立

よるBLVの清浄化は困難になっている。そのたな診断標的分子としてウシECMP1を発現し，精め，BLVによるリンパ腫の発症機構を解明して製標品を得た。

EBLの発症予防あるいは治療法の開発に繋げること，ならびに，予期せぬEBL発症による経済損失を防ぐためにBLV感染牛の予後診断法を開発することを目的として本研究を計画した。

２．方法

2 . 1 Tax発現ウシ細胞のヌードマウス皮下移
植実験

我々は，BLVがTaxの233番アミノ酸により二ウシ腎由来MDBK細胞にL233-Tax発現プラス

分され，Pro（L233-Tax）であるBLVに感染しミド３）を導入し，Ｇ418で選択した。Taxの発現た ウ シ の EBL 平 均 発 症 月 齢 は Leu（L233-Tax）

はSPHERICALPLATE 5D（水戸工業株式会社）のそれに比べ有意に高いことを報告した 。また，上でのスフェロイド形成試験により確認した。2.8

Tax発現ラット繊維芽細胞をヌードマウス皮下に×10５cells/100μlに調製したTax発現細胞および移植し，L233-Tax発現細胞はP233-Tax発現細胞

対照細胞を６週齢雌Balb/c（nu/nu）マウス（日に比べ，脈管新生を伴う有意に大きな腫瘍を形成本クレア）背側部皮下に接種し，６週間観察した。

することを示した 。さらに，L233-Tax発現細2 . 2 BLVプロウイルスDNA切断用CRISPR/

３）４）

胞は脈管新生に関与するとされるアネキシンA3

Cas9複合体の作製（ANXA3） お よ び 細 胞 外 基 質 タ ン パ ク 質 １

CRISPR direct （https://crispr.dbcls.jp） を 使（ECMP1）をP233-Tax発現細胞および対照細胞用してBLVプロウイルスゲノムの1160番，2815に比べ大量に分泌することを示した 。

番および8179番塩基３’側を切断するcrRNA1，２

５）

本研究では，BLVによるEBL発症機構を解明

および３を設計した。ウシゲノム上にはcrRNAするため，Tax発現ウシ細胞を用いてヌードマウ

１および２に対する12塩基長のオフターゲット配ス皮下移植実験を行った。また，BLVプロウイ

列は存在しないが，crRNA３では59カ所予想さルス挿入部位を決定するため，CRISPER/Cas9をれ た （Table １）。 こ れ ら を Integrated DNA

用いたプロウイルスゲノムDNAのin vitro切断法

Technologies（IDT）に 委 託 し て 合 成 し た 。各を開発した。さらに，BLV感染牛の予後診断法

crRNA（100 μM）1 μl ，tracrRNA（100 μM ，として，ウシANXA3の定量系を確立し，野外のIDT）１ μl お よ び Nuclease Free Duplex Buffer

EBL検体を用いた実証実験を行った。また，新た（IDT）８μlを混合し，95℃で加熱後，室温まで

Table1 crRNA for CRISPR/Cas9 RNP and target sequence of BLV provirus genome.
TargetcrRNA

Number of off target position

Sequence

StrandNucleotide
number

Hit_20mer

Hit_12mer

Hit_8mer

1

TTCCCCGGTCGACCAAACGG＋

1138-1160

0

0

393

2

CCTTATCGCTTCGCCTACAG－

2816-2838

0

0

506

3

CTCTCCCGCCTTTTTTGAGG＋

8160-8182

0

59

10879

target： target sequence, target strand and nucleotide number of the BLV genome.
hit_（N）
mer: off-target search results against bovine genome. The number of target sites with perfect match isshown.（N）mer＋PAM：The target sequence（Nmer）adjacent to the PAM is searched against the genome. Zero（'0'）in this column means that the sequence has no match in the genomic sequence.

© The Ito Foundation

272

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

冷却した。これに滅菌蒸留水79.2μl，Reactionク）をpCold Pro S2に挿入した（pWT）。これをBuffer（Oxford Nanopore Technologies）10μl，制限酵素SphIおよびStuIで消化し，T4 DNAポリ

G u i d e - i t T M R e c o m b i n a n t C a s 9 （ 3 μg / μl )メラーゼで平滑末端化後，環状化してpΔSSを得（Takara）2.4 μl を 加 え ， 室 温 30 分 放 置 し てた。同様に，StuI/PpuMI処理後平滑末端化して

CRISPR/Cas9 RNPを形成させた。

環状化したpΔSPを得た。pWT，pΔSSおよびpEBL腫瘍ゲノムDNAを鋳型にPCRでBLVプロ

ΔSPを大腸菌に導入し，発現を確認した。可溶

ウイルスゲノム塩基番号１-4855（4855bp）およ

性画分に目的タンパク質が認められた発現プラス

び7051-8720（1670bp）断片を増幅した。これら

ミドで大腸菌BL21を形質転換し，ウシANXA3ととCRISPR/Cas9 RNPを37℃で15分，72℃で５分同様の方法で精製した。

間反応させ，アガロースゲル電気泳動により特異的切断活性を確認した。
2 . 3 ウシアネキシンＡ３定量系の開発と実証
実験

３．結果と考察3 . 1 Tax発現ウシ細胞のヌードマウス皮下における腫瘍形成能

ウシANXA3の異なる抗原決定基を認識するモ

MDBK細胞にL233-Tax発現ベクター３）を導入

ノクローナル抗体23-１および67-１を用いたサン

し ， G418 耐 性 細 胞 を 選 択 し た 。

ドイッチELISAを確立した。すなわち，23-１を

SPHERICALPLATE 5D に 1000cells/well と な る捕捉抗体としてELISAプレートに固相化し，検よう分注して10日間培養したところ，対照細胞は出抗体としてHRP標識した67-１を用いた。反応

すべて単層を形成したのに対し，Ｇ418耐性細胞

基 質 と し て 1-Step UltraTMB-ELISA（Thermo

はいずれもスフェロイドを形成した（Fig.１）。

Scientific）を用いた。

薬剤耐性細胞は足場非依存性増殖能を獲得していpCold Pro S2ベクター（Takara）に化学合成したウシANXA3遺伝子（ファスマック）を挿入たことから，Taxを発現しているものと考えられた６）。

し，説明書に従い大腸菌BL21で発現させた。得

この細胞を2.8×10５cells/100μlに調製し，ヌー

ら れ た His タ グ 融 合 タ ン パ ク 質 を HCV 3C

ドマウス皮下に接種した。その結果，６週を経てprotease（Takara）で 消 化 し て HisTrap

FF カも対照細胞と同様，腫瘍は形成されなかった。細

ラム（GE Healthcare）に添加し，素通り画分を胞数が少なかった可能性がある。また，MDBK

精製ウシANXA3とした。精製標品のタンパク質

細胞は腎上皮細胞に分化した細胞であり，腫瘍形

濃度はBCA法で決定した。実証実験では浅頚リ成にはより未分化なウシ細胞を用いる必要がある

ンパ節の腫脹によりEBLが疑われた黒毛和牛のペのかもしれない。当初の実験計画ではTax発現

ア血清（北里大学 夏堀博士より分与）および食MDBK細胞で腫瘍が形成されなかった場合，ラッ肉衛生検査所においてEBLと診断されたホルスタ

ト繊維芽細胞の系で抗ANXA3抗体の抗腫瘍作用

イン牛の血清３検体を用いた。精製ウシANXA3を確認する予定であった。しかしながら，後述のを用いた検量線から各血清中のANXA3濃度を求ようにウシANXA3の血中濃度とEBL発症に関連めた。

が認められなかったことから，この実験は取りや

TM

2.4

ウシ細胞外マトリクスタンパク１の調製めた。

化学合成したウシECMP1遺伝子（ファスマッ© The Ito Foundation

273

地方病性牛伝染性リンパ腫発症機序の解明と予後診断法の確立

abFig. 1 Anchorage independent growth of Tax-expressing MDBK cells.

Tax-expressing MDBK cells（a）or normal MDBK cells（b）were propagated in

SPHERICALPLATE 5D for 10 days.

M

3 . 2 BLVプロウイルスDNA切断用CRISPER/

1

2

3

4

5

Cas9複合体の作製
crRNA1および２を含むCRISPER/Cas9 RNPをBLVプロウイルスゲノム由来５kbのPCR産物と反応させたところ，切断活性は認められなかった。一方，crRNA3を含むRNPを同1.5kb産物と反応させた場合には，約1.5kbと0.5kbへの切断が認められた（Fig.２）。crRNA3を含むRNPによる予想切断長は1129bpおよび541bpであることから，本RNPは特異的にBLVプロウイルスゲノムを切断するものと考えられた。crRNA1および２で切断活性が認められなかった原因は不明である。
近年，次世代シーケンサーを用いた全ゲノム解析によりさまざまなレトロウイルスの組み込み部
位の解析が行われているが，特定ゲノム領域の濃縮法はいまだ確立されていない。一方，宿主ゲノFig. 2 In vitro digestion of BLV-derived DNA fragment

by CRISPR/Cas9 RNPs．

B LV 5kb fragment （lane 1） was digested by

crRNA1 containing RNP （lane 2） or crRNA2
containing RNP（lane 3）. BLV 1.5kb fragment（lane4）was digested by crRNA3 containing RNP（lane3）.
The reaction mixtures were analysed by agarose
gel electrophoresis. Lane M, 2-log ladder．

ムを脱リン酸化後，CRISPR/Cas9によりプロウに比較することにより，EBL発症機構を解明する

イルスゲノム内で切断すると，切断点のみにナノことができるかもしれない。加えて，CRISPR/

ポアシーケンシングアダプターを導入することがCas9はin vivoにおいて疾患の原因となる遺伝子できる。ナノポアシーケンシングではロングリー

を直接編集することが可能であることから，本研

ドを得ることができるため，効率よく組み込み部

究 で 得 ら れ た CRISPR/Cas9 RNP の 応 用 に よ り

位の同定が可能となる。BLV感染未発症牛とEBL

EBLの治療が可能となるかもしれない。

発症牛におけるプロウイルス組み込み部位を詳細© The Ito Foundation

274

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

0

1

2
1.8
1.6

OD 620nm

1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
2

3

4

5

Bovine ANXA3 (ng/ml)

Fig.3 Calibration curve of the sandwich ELISA measuring bovine

ANXA3 concentration.
V ariable concentrations of recombinant bovine ANXA3 were
subjected to the ELISA in duplicate.

3 . 3 ウシアネキシンＡ３定量系の開発と野外清を本サンドイッチELISAに供したところ，いずれも検出濃度未満であった。血中ANXA3濃度材料を用いた実証
階段希釈した捕捉抗体23-１をELISAプレート

はヒト大腸がんおよび膵臓がんにおいて病態とのに固相化し，一定濃度の精製ウシANXA3および相関が認められる ７）。一方，EBLの発症と血中標識抗体67-１を反応させ，捕捉抗体の至適濃度

ANXA3濃度には相関はないのかもしれない。

を決定した。至適濃度の捕捉抗体を固相化した

3.4

ELISAプレートに一定濃度の抗原を加え，階段

血中ANXA3濃度とEBL発症の関連が認められ希釈した標識抗体を用いて反応を行った。得られなかったことから，新たな標的分子としてウシた結果から検出抗体の至適濃度を決定し，ウシ

ECMP1の発現を試みた。野生型ウシECMP1発現

ANXA3検出サンドイッチELISAを確立した。

pCold Pro S2ベクターpWTで形質転換した大腸

0.01-５ng/mlに調製した精製ウシANXA3を上記

菌JM109を37℃で培養した。OD600が0.3-0.5になっのサンドイッチELISAに供し，検量線を作成した時点で15℃に移し，１mM IPTG存在下で発現た。Fig.３に示すように，ウシANXA3濃度0.02-を誘導したところ，その後の菌の増殖はほとんど

５ng/mlで直線性が認められた。したがって，本認められなかった。溶菌後，SDS-PAGEに供しサンドイッチELISAがウシANXA3定量系としてた結果，不溶性画分にのみ74Ｋバンドが認められ使用可能であることが分かった。

た。そこでpΔSSおよびpΔSPで大腸菌を形質転

ウシ細胞基質タンパク質１の調製

そこで，EBL野外材料を用いて本サンドイッチ

換し，同様の実験を行った。その結果，pΔSP形

ELISAがBLV感染牛の予後診断に有用であるか

質転換体はpWTと同様誘導後の増殖は認められの確認を試みた。浅頚リンパ節の腫脹によりEBL

ず，不溶性画分に63Ｋバンドが認められた。一方，が疑われたウシの血清および同一個体の６カ月前

pΔSS形質転換体は誘導中も増殖を続けたが，の血清中のANXA3濃度を測定したところ，前血SDS-PAGEでは両画分ともに誘導産物は認めら

清は0.8ng/ml，後血清は50ng/mlであった。そこ

れ な か っ た 。そ こ で ，可 溶 性 画 分 に Profinity

で，食肉衛生検査所でEBLと診断されたウシの血

IMACNi-ChargedResin（BIO-RAD）を 加 え て© The Ito Foundation

地方病性牛伝染性リンパ腫発症機序の解明と予後診断法の確立

M

1

2

3

4

275

務となっている。
本研究では，BLVによるEBL発症のメカニズ
ムを解明するため，Tax発現ウシ細胞のヌードマ
ウス皮下移植試験を行ったが，腫瘍は形成されな

55Kかった。より多くの細胞あるいはより未分化な細

40K
35K

胞を使う必要があったと考えられる。また，BLV
プロウイルスゲノム挿入部位を決定するため，プ

20K

ロウイルスゲノムを特異的に切断するCRISPER/
Cas9 RNPを作製した。次いで，予後診断法として，ウシの血中ANXA3濃度を測定するサンドイッチELISAを確立した。しかしながら，野外

Fig. 4 Purification of truncated bovine ECMP1.

L ysate of the cells expressing truncated bovine

ECMP1 （lane 1） was subjected to HisTrap FF
column and His-taged protein was purified（lane 2）,
followed by digestion with HRV C3 protease（lane3）. The digestive products were subjected to
HisTrap FF column and passing fractions（lane 4）
were analysed by SDS-PAGE. M, molecular weightmarker.

Hisタグ融合タンパク質を分離し，SDS-PAGEにのEBL材料を用いた実験では実証に至らなかった。新たなEBL予後診断の標的分子としてウシ
ECMP1の精製標品を得た。
謝

辞

本研究の遂行に当たりご協力頂きました北里大
学獣医学部の夏堀教授および帯広食肉衛生検査所の職員の皆様に感謝申し上げます。

供したところ，43Ｋにバンドを認めた。そこで，
pΔSSで大腸菌BL21を形質転換し，ANXA3と同様にして20ＫのＮ末端欠損ウシECMP1を得た（Fig.４）。pΔSP産物は野生型517アミノ酸中の339-497番アミノ酸，pΔSS産物は13-338番アミノ酸を欠く。したがって，ウシECMP1の13-338
アミノ酸が封入体形成に関与し，細胞毒性を示したために菌の増殖が抑えられたものと考えられる。今後，ウシECMP1を標的とした予後診断法
開発のため高度免疫血清およびモノクローナル抗体を作製する予定である。
４．要

約

EBLはBLV感染牛の２-３％が長い潜伏期間の後に発症する全身性腫瘍で，その発症機構の詳細は不明である。近年急激に報告数が増え大きな経文献１） Aida, Y., et al.：Mechanisms of pathogenesis
induced by bovine leukemia virus as a model forhuman T-cell leukemia virus, Front. Microbiol., 4,2013.
２） 農林水産省：監視伝染病発生年報３）
 Inoue, E., et al.：L233P mutation of the Tax
protein strongly correlated with leukemogenicity
of bovine leukemia virus, Vet. Microbiol., 167, 364～
371, 2013.
４）
 Mori, H., et al.：L233P mutation in the bovine
leukemia virus Tax protein depresses endothelial
cell recruitment and tumorigenesis in athymic
nude mice, Arch. Virol., 164, 1343～1351, 2019．
５）
 Tomiyasu, T., et al.：L233P mutation in thebovine leukemia virus Tax protein has impact onannexin A3 and type I collagen secretion by hostcells, Vet. Microbiol., 256, 109042, 2021．
６） 森宏：牛白血病ウイルスによる白血病発症機構の解明―Taxの変異と腫瘍原性に関する研究―，北海
道医療大学大学院薬学研究科学位論文，2019．
７） Wu, N., et al.：The role of annexin A3 playing incancers, Clin. Transl. Oncol., 15, 106～110, 2013.

済的損失をもたらしており，EBL対策の確立が急© The Ito Foundation

276

牛伝染性リンパ腫ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する宿主タンパク質の同定（Ⅱ）
Identification of host-derived proteins interacting with BLV non-coding
RNA（Ⅱ）安藤清彦（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

Kiyohiko Andoh（National Institute of Animal Health, NARO）

Bovine leukemia virus（BLV）infects bovine B-cells and causes a malignant lymphoma,
resulting in severe economic losses in livestock industry. To date, although a number of studies
have been intended to clarify molecular mechanisms of BLV pathogenesis, the detail of themechanism is still enigmatic. Recent studies revealed that BLV genome encodes some novel
long non-coding RNAs, and one of the non-coding RNA, AS1-S, is expressed in both latently
infected cells and lymphoma cells, suggesting that the AS1-S RNA might play an importantrole in BLV pathogenesis. Previously, we identified an hnRNPM as the biding partner of theAS1-S RNA, and in the present study, we intended to clarify the molecular function broughtby the interaction between the AS1-S and the hnRNPM using transcriptome and knock-down
analysis. Transcriptome analysis suggested that cells expressing the AS1-S RNA altered theexpression levels of several genes which are correlating with response to stimulus or signaltransduction. Furthermore, knock-down analysis using a virus-producing cell line showed thatthe expression of BLV-derived proteins was not affected by knock-down of the hnRNPM,
suggesting that the interaction between the AS1-S RNA and the hnRNPM might beunnecessary in active infected cells. Although further studies are required, these findings cancontribute to understand the molecular mechanism of BLV pathogenesis in detail．

１．目

伝染性リンパ腫」を引き起こす。リンパ腫を発症

的した牛は全廃棄の対象となり畜産業に大きな経済本研究の目的は，牛伝染性リンパ腫ウイルス的被害を引き起こすため，その原因となるBLV（BLV）がコードする非翻訳性RNA AS1-Sと宿への対策は現場における大きな課題となってい主タンパク質hnRNPMの相互作用がもたらす細る。しかしながら，BLVに対する有効な制御法

胞機能の変化を解明することである。

（ワクチンや治療薬）は存在せず，現場におけるBLVはレトロウイルス科に属する腫瘍ウイル

対策は一般的な衛生管理など限定的なものにとどスであり，ウシのＢ細胞に感染した後，長い潜伏まっているため，国内の牛伝染性リンパ腫発生件

期を経て致死性のリンパ腫である届出伝染病「牛数は年々増加している現状である１）。BLVに対す© The Ito Foundation

牛伝染性リンパ腫ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する宿主タンパク質の同定（Ⅱ）

277

る有効な制御法の開発を困難にしている一因とし

TruSeq stranded mRNA（Illumina）を用いてラて，その病態進行やリンパ腫発症機構の詳細が解

イ ブ ラ リ ー を 調 製 し て RNA-seq を 実 施 し た

明されていないことがあげられ，実際，BLVに（NovaSeq 6000，4 Gb，100 bp paired-end，n＝感染した個体の大半は無症状でありリンパ腫を発２）。得られたデータから両細胞で発現量に差が症するのはわずか数％のみであるが，その要因は

あ る 遺 伝 子 を 探 索 し ，g:Profiler（https://biit.

明らかになっていない。

cs.ut.ee/gprofiler/gost）を用いたGene Ontology

BLVは，感染細胞においてタンパク質に翻訳されない非翻訳性RNAを複数発現していることが報告されているが，それらの転写産物の機能の多くはいまだ解明されていない。この非翻訳

２，３）（GO）解析により発現変動している遺伝子群の機能的特徴を解析した。
2 . 2 siRNA処理によるBLV感染ウシＢ細胞のhnRNPMノックダウン

性RNAの一つであるAS1-Sは，他のウイルス因

Stealth RNAi （Thermo Fisher Scientific） に子が発現しない潜伏状態にある腫瘍細胞でも恒常

よ り hnRNPM に 対 す る ２ 種 類 の siRNA的に発現しているため，BLV感染症の病態進行（siRNA#1，siRNA#2）をデザインし，合成したにおいて重要な役割を果たすことが示唆されsiRNAをNucleofector 2b（Lonza）を用いてBLVる２，４）。2020年度の伊藤記念財団助成において，

感染ウシＢ細胞であるBL3.1細胞（ATCC，CRL-

我々はAS1-S RNAの細胞内における結合パート

2306）に 導 入 し た 。遺 伝 子 導 入 ３ 日 後 に RIPA

ナ ー と し て 宿 主 由 来 RNA 結 合 タ ン パ ク 質

buffer（Thermo Fisher Scientific）を用いて細胞

hnRNPMを同定した。hnRNPMは核内に存在す溶解液を回収し，hnRNPMおよびBLV由来タンるRNA結合タンパク質であり，mRNAのプロセッ

パク質であるgp51とｐ24の発現をウェスタンブ

シングや自然免疫活性化など多様な機能を持つこ

ロットで検出した。

とが報告されている。そのため，AS1-S RNAとウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト 解 析 は ，４ × Laemmli

hnRNPMとの相互作用により発揮される生物学

Sample Buffer（Bio-Rad）を 加 え て 95 ℃ で ５ 分的機能の解明は，BLVの病態理解に大きく貢献

間熱変性させたサンプルをSDS-PAGEで分離後すると考えられる。

PVDF膜に転写し，５％スキムミルクでブロッキ

本課題では，AS1-S RNA発現細胞のトランス

ン グ ，各 タ ン パ ク 質 に 対 す る １ 次 抗 体（gp51

ク リ プ ト ー ム 解 析 や BLV 感 染 細 胞 の hnRNPM（VMRD），p24（VMRD），hnRNPM（abcam），

ノックダウン解析により，発現変動する遺伝子や

beta-tubulin（Merck））ならびに対応する２次タンパク質の詳細を明らかにする。

抗体（HRP標識抗ウサギ抗体（Zymed）または

２．方

抗マウス抗体（abcam））でそれぞれ室温１時間法

感 作 し ， SuperSignal West Dura Extended

2 . 1 AS1-S cDNAを導入した細胞のトランス

Duration Substrate （Thermo Fisher Scientific）
による検出を行った。

クリプトーム解析
2020年度の伊藤記念財団助成において樹立した
AS1-S RNA発現細胞MDBK/AS1-S細胞および2 . 3 AS1-S RNA発現細胞の自然免疫関連シ
グナル因子の発現解析

対 照 細 胞 か ら NucleoSpin RNA Plus（マ ッ ハ ラ

MDBK/AS1-S細胞および対照細胞を10μg/ml

イ ・ ナ ー ゲ ル 社）を 用 い て RNA を 抽 出 し ，のpoly（I : C）
（Invivogen）存在下で培養し，poly© The Ito Foundation

278

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）（I : C）刺 激 後 ０，５ ，15 ，30 分 の 時 点 で RIPA

３．結果と考察

bufferを用いて細胞溶解液を回収した。回収した
細胞溶解液を用いて，NFκB，IκB，リン酸化3 . 1 AS1-S RNAの導入により発現変動する

Akt，IRF3およびリン酸化IRF3の経時的な発現遺伝子群の同定

変化をウェスタンブロットで検出した。

トランスクリプトーム解析の結果，MDBK/

ウェスタンブロット解析は，各タンパク質に対AS1-S細胞と対照細胞において168個の遺伝子がす る １ 次 抗 体 （NFκB（Cell Signaling

２倍以上の発現変動を示し，MDBK/AS1-S細胞

T e c h n o l o g y ）， I κB （ C e l l S i g n a l i n gで発現上昇または減少している遺伝子数はそれぞTechnology）， リ ン 酸 化 Akt （Cell Signaling

れ51個と117個であった（Fig. 1a）。168個の発現Technology）， IRF3 （abcam）， リ ン 酸 化 IRF3

変動遺伝子についてGO解析を実施した結果，（abcam））ならびに対応する２次抗体（HRP標識「regulation of response to stimulus」 や 「signal

抗 ウ サ ギ 抗 体（Zymed）ま た は 抗 マ ウ ス 抗 体

receptor binding」，「positive regulation of signal（abcam））を用い，2 . 2と同様の方法で実施した。

transduction」など，主に細胞への刺激に対する応答やシグナル伝達などの機能にかかわる遺伝子(a)
MA plot

Volcano plot
UP (51 genes)

100

2
75

- log (p value)log2 fc

0-2

DOWN (117 genes)

-4

50

25

0
1

2

3

log10 baseMean

4

5

-4

-2

log2 fc

0

2(b)regulation of multicellular organismal processregulation of response to stimulus
signaling receptor binding
regulation of nervous system development
semaphorin receptor binding
positive regulation of signal transduction
regulation of cell motility
regulation of cell migration
cell migration
positive regulation of cell communication
regulation of locomotion
positive regulation of signaling
regulation of cell communication
negative regulation of axon extension
regulation of cellular component movement
regulation of signaling
receptor ligand activity
chemorepellent activity
neurogenesis

0

1

2

3

4

- log10（p value）

5

6

7

Fig. 1 （a）MA plot and volcano plot of the transcriptome analysis. The differentially expression genes（DEGs）

identified between MDBK/AS1-S and mock cells are shown in black.（b）Result of gene ontology（GO）analysis.
Total of 168 DEGs are used for the analysis, and enriched terms are shown; GO analysis was performed using g：
Profiler web server（https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost）with default parameters and “Bos taurus” option.

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279

牛伝染性リンパ腫ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する宿主タンパク質の同定（Ⅱ）

状態にあっても恒常的に発現していることが群が有意に抽出された（Fig. 1b）。
この結果は，2020年度の伊藤記念財団助成研究

AS1-S RNAの大きな特徴であり，ウイルスが潜において示唆されたAS1-S RNA導入細胞におけ伏している状況下において潜伏感染の維持や感染るpoly（I : C）刺激応答性の変化を裏付けるもの

細胞の病態進行に重要な役割を果たしている可能であり，さらに，AS1-S RNAが自然免疫以外に性が考えられるため，常にBLVが強い活性化状もさまざまな細胞内シグナルに干渉している可能態にあるBL3.1細胞はAS1-SとhnRNPMの相互作性が示唆された。

用を解析するには不適であった可能性がある。そ3 . 2 siRNA処理によりhnRNPMをノックダウのため，BLV感染とhnRNPMの関係性についてンしたBLV感染ウシＢ細胞のタンパク質発は，潜伏感染を評価可能な材料を用いてさらなる現解析検証を行う必要がある。

BLVが持続感染しているBL3.1細胞において，
hnRNPM 標 的 siRNA（siRNA# １ ，siRNA# ２）

3 . 3 Poly（I : C）刺激したMDBK/AS1-S細胞の自然免疫シグナル因子の解析

およびコントロールsiRNAによるノックダウンを2020年度の伊藤記念財団助成において得られた

実施し，ウェスタンブロットにより各種タンパク

成果と今回得られたトランスクリプトーム解析の質の発現を解析した。その結果，siRNAを導入し結果から，自然免疫シグナルを指標としてAS1-S

た細胞においてhnRNPMの発現が減少している

RNAによる細胞シグナルの干渉メカニズムを評ことを確認できたが，BL3.1細胞が発現するBLV

価できると考えられたため，AS1-S発現細胞にお由来タンパク質gp51およびp24の発現量には変化ける各種免疫シグナル因子の発現を解析した。しが認められなかった（Fig.２）。

かしながら，MDBK/AS1-S細胞と対照細胞のど

この結果から，BL3.1細胞においてhnRNPMのちらにおいてもpoly（I : C）刺激条件下において存在はBLVの転写翻訳活性には関与しないこと

NFκＢとＩκＢの明瞭な発現量の変化を認めずが示唆された。しかしながら，BLVが潜伏感染（Fig.３），リン酸化Aktについても非常に薄いバ

r

nt

Co

NA

iR

s
ol

#1

NA

siR

#2

NA

siR

gp51(BLV)
mock

p24(BLV)
0

5

15

MDBK/AS1-S
30

0

5

15

30

min

hnRNPM

NFκB

B-tubulin

IκB

Fig. 2 Immunoblot analysis of the knock down cells.

BL3.1 cells were introduced with siRNAs, and thenexpression of BLV-derived（gp51 and p24）andhost-derived（hnRNPM and beta-tubulin）proteins
was confirmed．

Fig. 3 Immunoblot analysis of MDBK/AS1-S and mockcells. Both cells were incubated in the presence ofpoly（I：C）and sequentially collected to evaluate
the expression of NFκB and IκB.

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280

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

ンドを確認できたのみで発現量の変化を認めならかとなった。今後は，BLVの潜伏感染状態をかった（Fig.省略）。さらにIRF3については，ウ

評価可能な培養細胞の作出を試みるとともに，昨シIRF3を検出可能な抗体を入手できず，検証を年度の助成研究で実績があるRNA-タンパク質結行うことができなかった。そのため本課題では，

合解析とハイスループットシークエンスを組み合

AS1-S RNAとhnRNPMの相互作用の標的となり

わ せ た 解 析 を 実 施 す る こ と で ，今 回 見 出 し たえるシグナル因子を特定することはできなかった。

AS1-S RNAによる宿主遺伝子発現変化を引き起

なお，当初はsiRNAによるノックダウンを行っこす分子機構をより詳細に解析する予定である。

たBL3.1細胞でも同様に自然免疫シグナルタンパ
ク質の発現解析を実施する予定であったが，実験４．要約の過程でATCCから購入したBL3.1細胞が自然免

牛白血病ウイルス（BLV）は，ウシのＢ細胞

疫シグナルの阻害を引き起こす牛ウイルス性下痢に感染して致死性のリンパ腫を引き起こし，畜産

ウイルス（BVDV）に汚染されていることが判明

業に大きな経済的被害を与える病原体である。

したため，BL3.1細胞の免疫関連因子の解析は不BLVの病態メカニズムを解明するためにこれま可能と判断し，以降の解析は断念した。

でさまざまな研究が行われてきたが，その発症メ

3.4

総括

カニズムの詳細はいまだ解明されていない。最近

トランスクリプトーム解析によって，AS1-Sの研究により，BLVは複数のウイルス由来非翻RNAを導入した細胞では刺激に対する応答やシ

訳性RNAをコードしていることが報告されておグナル伝達など多様な機能が影響を受ける可能性

り，その一つであるAS1-S RNAは，潜伏状態にが示唆された。またノックダウン解析の結果よある感染細胞やリンパ腫細胞において恒常的に発り，BLVが強い活性化状態にあるBL3.1細胞では現していることが明らかとなっている。この事実

hnRNPMのノックダウンによるウイルス転写翻は，AS1-S RNAがBLV感染症の病態において広訳活性への影響は認められず，BLVが潜伏感染

く重要な役割を担っている可能性を示唆してい状態にある細胞を用いたAS1-S RNAの機能評価る。2020年度の伊藤記念財団助成において，我々の必要性が示唆された。

はAS1-S RNAの結合パートナーとして宿主由来

本研究では，入手可能な材料の制限などの問題

RNA結合タンパク質hnRNPMを同定した。そこ

により，hnRNPMのノックダウンがBLVの動態で本研究では，トランスクリプトーム解析やノッに与える影響やAS1-S RNAとhnRNPMの相互作

クダウン解析により，BLVが発現する非翻訳性用によるシグナル経路の変化などの詳細な解明に

RNA AS1-S と そ の 結 合 パ ー ト ナ ー で あ るは至らなかった。現在入手可能なウシＢ細胞株は

hnRNPMの相互作用がもたらす細胞機能の変化

すべてBLVに感染しているため非感染Ｂ細胞株

をより詳細に解析した。トランスクリプトーム解を対照として設定することができず，加えて，培析の結果，AS1-S RNAを導入した細胞は刺激に養細胞ではBLVが強い活性化状態にあるために対する応答やシグナル伝達など多様な機能が影響

潜伏感染状態の評価が不可能であることが大きなを受ける可能性が示唆された。さらにノックダウ課題である。さらに，一部の細胞はBVDVに汚染

ン解析の結果から，BLVが強い活性化状態にあされているため，各種刺激に対する細胞の免疫応る培養細胞ではhnRNPMのノックダウンによる答を評価する試験系の実施も困難であることが明影響が認められず，AS1-S RNAとhnRNPMの相© The Ito Foundation

牛伝染性リンパ腫ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する宿主タンパク質の同定（Ⅱ）

互作用が活性化状態にある細胞に与える影響は小さいことが明らかとなった。BLVが発現する非翻訳性RNAが持つ多彩な機能の解明にはさらなる検証が必要であるが，本研究の推進はBLVの病態理解への貢献が期待される。

281

文
献
１） 農林水産省：監視伝染病発生年報２） Durkin, et al.：Retrovirology, 13, 33, 2016.
３）
 Safari, et al.：PLoS Pathog., 16（ 5）, e1008502,
2020.
４） Andoh, et al.：Arch. Virol., 165（12）, 2869～2876,
2020.

© The Ito Foundation

282

牛のストレス応答における肝臓機能の解明
The role of the liver in the oxidative stress response of cattle

グルゲ

キールティ

シリ・吉

岡

都

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

Keerthi S. Guruge and Miyako Yoshioka（National Institute of Animal Health, NARO）

Oxidative stress has an unwarranted influence on the metabolic activity of various organs
and tissues and is considered to be associated with the ruminant productivity. However, therole of liver during the stress response of cattle is not well known, and its detailed mechanism
has not been elucidated. To carry out extensive exposure experiments using cattle is difficult
because of laboriousness, high cost and animal welfare concern. Therefore, an in vitro assay
system that maintains the liver function of cattle to detect oxidative stress on the liver isdesirable. It has previously been clarified that co-culturing of bovine hepatic parenchymal celllines and sinusoidal endothelial cell lines improves hepatic functions such as drug metabolism.
Therefore, in this experiment, those cell-lines were used to evaluate oxidative stress responseof cattle using lipopolysaccharides as an inducer．
The microarray analysis followed by the stress-related gene set enrichment analysis（GSEA）showed significant gene elevation of cytokines such as prostaglandin-endoperoxide
synthase 2（COX-2）, CCL5（C-C motif chemokine ligand 5）and IL-19, which are known as
inflammatory markers. In addition, a significant increase in gene expression of oxidases such as
NADPH oxidase 1 was observed. However, the elevated gene expressions of superoxide
dismutase 2（SOD2）, which is an antioxidant enzyme, and metallothionein（MT）-3, which is ahydroxyl radical scavenger, suggest a protective role against oxidative stress. The metabolome
analysis of intracellular metabolites revealed an increased production of antioxidants such aspolyamines suggesting a biological defense response to the oxidative stress in the liver.
Collectively, these results shown that the bovine-derived liver cell culture assay could be auseful tool for evaluating the mechanism of pathological conditions such as inflammatory
reaction in bovine oxidative stress and the biological defense response to it. This assay could
be used to exploring new antioxidants that protect against oxidative stress in cattle．

１．目

用い，牛に対する種々の酸化ストレスが肝機能に的及ぼす影響について，抗酸化ストレス関連の遺伝

本研究は，牛の肝臓機能の状態をin vitroで再子および代謝変動などを指標として解析し，牛の現・解析可能な牛肝臓由来細胞株の複合培養系を酸化ストレス応答における肝臓の役割を明らかに© The Ito Foundation

牛のストレス応答における肝臓機能の解明することを目的としている。

283

管理技術や畜産物の安全性確保技術への応用が期

肥育牛や乳用牛の飼養管理における輸送や群構
成，濃厚飼料の多給，高泌乳牛の分娩や泌乳開始に伴う体脂肪動員等は，内因的および外因的ストレスとなる。とくに乳牛では，高いエネルギー産

待される。
２．方

法

2 . 1 牛由来肝細胞株共培養の酸化ストレスモ

生のために好気的代謝が高まり，肝臓では酸化代デル

謝産物による酸化ストレスの増大が考えられる。

牛の肝臓機能の状態をin vitroで再現・解析可これらのストレッサーによって体内で活性酸素の能な牛肝臓由来細胞共培養系として，肝実質細胞

産生が高まり，抗酸化防御機構が十分に機能しな株であるBH４細胞と非実質細胞である類洞内皮

くなると，牛は酸化ストレス状態に陥る。酸化ス

細胞株であるＢ46細胞を用いた。それぞれの細胞

トレスあるいは酸化によるダメージは，さまざま

は既報に準じて，10％FCS加のWillam’s E培地で，な臓器・組織の代謝活性に大きな影響を与え，生BH４細胞とB46細胞の細胞数の比率が１：２に産性阻害要因になると考えられている。近年，ヒなるように６ウェルプレートに播種し，培養48時

トでは肝臓病の発症には酸化ストレスが関与する

間後にコンフルエントな状態になった後，無血清と言われているが１），牛のストレス応答において，培地に交換して実験に供した。この共培養系に，肝臓がどのような役割を果たしているか，詳細な炎症を介した酸化ストレス誘発剤としてLPS（１メカニズムは解明されていない。しかし，大動物

μg/ml）で48時間刺激後の細胞からtotal RNAをである牛を用いた飼養試験は，経済的にも環境負抽出した。細胞は３回の実験で１ウェルから抽出

荷の点でも負担が大きい。また，牛は反芻動物でしたtotal RNAを３本プールして１つのマイクロあるため，実験動物のマウスやラット等とは代謝アレイ用のサンプルとした。

機能が大きく異なっており，牛特有の肝臓機能に

2.2

マイクロアレイによる遺伝子発現解析

及ぼす酸化ストレスの影響を評価するためには，

2 . 1 で 採 取 し た total RNA は NanoDrop One で牛の肝機能を維持した代替細胞を用いた迅速・簡

RNA濃度および純度を算出し，Ａ260/280≥1.8，

便なin vitroアッセイ系の活用が非常に有用であＡ260/Ａ230≥1.5のサンプルを以後の解析に用いると考えられる。

た。また，バイオアナライザ解析のRIN（RNA

代謝の中枢である肝臓は，代謝の場である肝実Integrity Number）値 お よ び RNA 比（28 Ｓ /18

質細胞のほかクッパー細胞，類洞内皮細胞，星細Ｓ）からRIN≥7.0であることを確認した。マイク

胞等の非実質細胞から構成されており，これらのロ ア レ イ に は ，Agilent 社 の B.taurus（Bovine）

非実質細胞と肝実質細胞との協働によって，薬物

Oligoマイクロアレイver．2.0を用いて，100ngの代謝などの肝臓機能が調節されている。本課題でtotal RNAを鋳型として，一色法のプロトコール

は，我々が確立した牛肝臓由来不死化細胞株の共の方法に準じて実施した。無処理の対照群と比較

培養アッセイ系を用いて，牛の酸化ストレスして，２倍以上もしくは0.5倍以下に発現変動しにおける種々の代謝および遺伝子発現の応答性をた遺伝子群を抽出した。ヒトおよびマウス酸化ス

解析する。このような牛の酸化ストレス時の肝臓トレス関連遺伝子セットからウシ酸化ストレス関の応答性を明らかにすることで，酸化ストレスを連遺伝子セットを作製し，アレイで得られたデー防御する新規の抗酸化物質の探索など，牛の飼養

タ に つ い て ， Gene Set Enrichment Analysis

２，３）© The Ito Foundation

284

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）（GSEA）解析を用いて，発現遺伝子群中で特定からプロスタグランジンＨ２の生成を高めているの機能を持つ遺伝子群がどのように変動していると考えられる。炎症性マーカーとしては，CCL5かについて検討した。

（C-C motif chemokine ligand 5）やIL-19のサイ

2.3

メタボローム解析

トカインも発現上昇遺伝子の上位に観察された。

牛実質細胞株BH４と類洞内皮細胞株Ｂ46の共

CCL５は，Ｔ細胞や血小板，マクロファージや内培養系を用いて，2 . 1と同様に無血清培地でLPS

皮細胞など多様な細胞から分泌され，炎症部位にを１μg/ml存在下で48時間培養後，５％（w/w）

白血球を動員する炎症性ケモカインの一種であ

マンニトール水溶液で２回洗浄後，メタノールをる。一方，IL-19は，IL-10ファミリーに属する免添加によって得た抽出液をメタボローム解析に供

疫抑制性サイトカインであるが，マウスのLPS投した。細胞中の代謝物質は，CE-TOFMSまたは与モデルでは，心臓，肺，腎臓のほか，肝臓でCE system お よ び TripleQuad LC/MS （CE-

IL-19遺伝子発現が上昇することが報告されていQqQMS）を用いて測定した。標準部物質ピークる５）。また，肝臓細胞株であるHuh-７細胞にお情報から得られたピーク面積値は相対面積値に変いて，IL-19刺激により活性酸素種（ROS）の産換後，標準部物質を用いて絶対定量値に換算し，生が誘導されることから，牛肝臓ではLPSによる

各代謝物質について三点検量線より濃度を算出し酸化ストレスで誘導されたIL-19がさらに酸化スた。

トレスを増強している可能性がある。
LPSによって誘導される酸化ストレスに対し

３．結果と考察て，NADPH oxidase１などの酸化酵素の遺伝子

3 . 1 牛肝臓酸化ストレスモデルにおけるマイ発現の上昇が有意に認められるが，それを打ち消す 抗 酸 化 剤 で あ る Superoxide dismutase 2

クロアレイのGSEA解析
GSEA解析の結果，Fig.１に示すようなエンリッ（SOD2） や ヒ ド ロ キ シ ラ ジ カ ル の ス カ ベ ン

チメントプロットが得られ，牛酸化ストレス関連

ジャーになると考えられている金属結合性低タン

遺伝子セットの中で，エンリッチメントへの寄与

パク質のMetallothione（MT）-３の有意な遺伝度が高いと判定された遺伝子はTable１のとおり

子発現上昇が観察された。SOD２はマンガン依となった。すなわち，牛肝臓由来細胞を用いた酸存性のSODであり，ROSの一種であるスーパー化ストレス応答において，Table１に示す遺伝子

オキシド（Ｏ２－）を過酸化水素と酸素に変換し，の発現上昇が有意に認められた。

過酸化水素はさらにカタラーゼによって酸素と水

最もエンリッチメントへの寄与度が高いと判定に分解される。牛肝臓酸化ストレスモデルにおい

さ れ た Prostaglandin-endoperoxide synthase 2ては，他の代表的な抗酸化酵素であるグルタチオ

は，Cyclooxygenase-2（COX-2）として知られ

ンペルオキシダーゼやカタラーゼの遺伝子上昇がる炎症マーカーであり，正常な状態では多くの細上位に観察されなかったことから，SOD２が肝胞でほとんど発現しておらず，炎症が起きると血臓保護に重要な役割を有することが示唆された。

管内皮細胞や血管平滑筋細胞等での発現が上昇す

また，MTは低分子の金属結合タンパク質で，る 。今回の牛由来肝細胞株共培養の酸化ストレ

Ⅰ～Ⅳまでの４種のアイソフォームが存在し，活スモデルでは，類洞内皮細胞由来であるＢ46細胞

性酸素のスカベンジャーとして抗酸化作用を有すにおいてCOX-２の発現が亢進し，アラキドン酸

る。Ⅰ，Ⅱ型は肝臓などのほとんどの組織に分布

４）© The Ito Foundation

285

牛のストレス応答における肝臓機能の解明

Enrichment plot: OXIDATIVE_STRESS

Enrichment score (ES)

0.20
0.15
0.10
0.05

Ranked list metric (Ratio_of_Classes)

0.00

80

‘1’(positively correlated）

60

Zero cross at 17150

40
20
0

‘0’(negatively correlated）
0

2,000

4,000

6,000

8,000

10,00012,00014,00016,000Rank in Ordered Dataset
Enrichment proﬁleHits

Ranking metric scoresFig. 1 Enrichment plot of bovine oxidative stress response gene set

Table 1 Enrichment score for genes contributed significantly to enrichment in the bovine oxidative stress gene set
SYMBOL

TITLE

Metric Score

Enrichment Score

PTGS2
CCL5

prostaglandine endoperoxide synthase 2

9.53

0.0066C-C motif chemokine ligand 5

7.58

0.119

MT3

metallothionein 3

4.07

0.146

IL19

interleukin 19

2.33

0.155

SOD2

superoxide dismutase 2

2.07

0.168

LOC788751

eosinophil peroxidase

2.00

0.180

IPCEF1interaction protein for cytohesin exchange factors 1

2.00

0.191

TXNDC2thioredoxin domain containing 2

2.00

0.204

NOX1

NADPH oxidase 1

1.50

0.192

SGK2

serum/glucocorticoid regulated kinase 2

1.50

0.200

CTGB

cytoglobin

1.43

0.203

AOX1

Aldehyde oxidase 1

1.38

0.208

© The Ito Foundation

286

令和３年度

Putrescine80

2

Spermidine

1.6

60

1.2

40

0.8

20
0

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

0.4
cont

LPS

0

cont

LPS

12
10
8
6
4
2
0

Spermine

cont

LPS

Fig. 2 Polyamine concentration（pmol/10６cells）induced by in vitro assay of bovine oxidative stress

しているが，MT-３はとくに脳での局在が報告

ストレス応答において，肝臓がどのような役割をされている等，その遺伝子発現制御は他のMTs

果たしているか，詳細なメカニズムは解明されてと異なっている６）。牛の肝臓酸化ストレスモデル

いない。しかし，牛を用いた飼養試験は，経済的でのMT-３遺伝子の発現上昇は，牛の肝臓におおよび動物福祉の観点から実施が困難であるた

いてもなんらかの役割を果たしている可能性があめ，牛の肝機能を維持したin vitroアッセイ系をるが，今後の詳細な解析が必要である。

用いて，牛特有の肝臓機能に及ぼす酸化ストレス3 . 2 牛肝臓酸化ストレスモデルにおけるメタの影響を評価する必要がある。我々の開発したinvitroアッセイ系は，種々の代謝の中心である肝ボローム解析
細胞内代謝産物のメタボローム解析では，酸化実質細胞株と類洞内皮細胞株の共培養系であり，ストレスによって抗酸化作用のあるグルタチオン

これらの非実質細胞と肝実質細胞との協働によっ

濃度の上昇や，グルタチオン産生を促進して肝機て，薬物代謝などの肝臓機能が向上することを明能改善作用のあるベタイン，生体内でラジカルス

らかにしている。そのため本実験では，これらのカベンジャーとして働くイミダゾールペプチドの牛由来肝細胞共培養アッセイ系を用いて，LPSを一種であるカルノシンの増加傾向が認められた誘導剤として牛の酸化ストレス応答性を解析した。

が，有意な上昇は認められなかった。また，プト

マイクロアレイによるGSEA解析では，炎症性レシン，スペルミジン，スペルミンなどのポリア

マ ー カ ー と し て 知 ら れ る Prostaglandin-

ミン類の濃度が上昇した（Fig.２）。ポリアミン

endoperoxide synthase 2（COX-2）やCCL5は細胞の成長や増殖作用を有し，細胞への影響や（C-C motif chemokine ligand 5）やIL-19のサイ

動物試験などからアンチエイジングや肝機能改善

トカインの遺伝子上昇が有意に認められた。ま作用が注目されている 。しかし，酸化ストレス

た，NADPH oxidase１などの酸化酵素の遺伝子時に，肝臓細胞によるポリアミンの産生増加が牛発現の上昇が有意に認められたが，それに対抗すの酸化ストレスにどのように関与するのか，さらる 抗 酸 化 酵 素 で あ る Superoxide dismutase 2なる検討が必要である。

（SOD2） や ヒ ド ロ キ シ ラ ジ カ ル の ス カ ベ ン

７）

４．要

ジャーであるMetallothionein（MT）-３の遺伝子

約発現も上昇していた。細胞内代謝物のメタボロー

牛の飼養管理における酸化ストレスは，さまざ

ム解析では，ポリアミン等の抗酸化物質の産生がまな臓器・組織の代謝活性に大きな影響を与え，増加しており，肝臓での酸化ストレスに対する生生産性阻害要因になると考えられているが，牛の体防御反応が明らかとなった。これらのことか© The Ito Foundation

牛のストレス応答における肝臓機能の解明

ら，牛由来肝臓細胞培養アッセイ系では，牛の酸化ストレスにおける炎症反応等の病態のメカニズ
ムやそれに対する生体防御応答性を解析する有用なツールであることが示された。今後，本アッセイ系を用いた酸化ストレスを防御する新規の抗酸化物質の探索など，畜産物の安全性評価への応用が期待される。
文献１） 坪内博仁ら：肝とストレス，肝臓，56（7）, 313～
323, 2015.
２） Yoshioka, M., Takenouchi, T., Kitani, H., Guruge,
K. S., Yamanaka N.：Synergistic induction of drugmetabolizing enzymes in co-culture of bovine
hepatocytic and sinisoidai cell line, In Vitro Cell

287

Dev. Biol. Anim, 56（1）,2～9, 2020.
３）
 Yoshioka, M., Takenouchi, T., Kitani, H., Okada, H.,
Yamanaka N.：Establishment of SV40 large T
antigen-immortalized bovine liver sinusoidal celllines and their immunological responses todeoxynivalenol and lipopolysaccharide, Cell Biol
Int, 40（12）,1372～1379, 2016.
４）
 Sanz, P. M., Hortelano, S., Bosca, L., Casado, M.：
Cyclooxygenase 2: understanding thepathophysiological role through genetically alterd
mouse models, Front Biosci, 11, 2876～2888, 2006.
５）
 Chung-His, H., Chiau-Juon, C., Lih-Yun, C.,
Chuan-Chih, H., Ming-Shi, C.：IL-19 is involved in
the pathogenesis of endotoxic shock, Shock, 29（1）,7～15, 2008.
６）
 Coyle, P., Philcox, J. C., Carey, L. C., Rofe, M.：
Metallothionein: The multipurpose protein, Cell
Mol Life Sci, 59, 627～647, 2002.
７）
 Madeo, F., Eisenberg, T., Pietrocola, F., Kroemer,
G.：Spermidine in health and disease, Science, 359,
eaan2778, 2018.

© The Ito Foundation

288

補体制御性タンパク質CD46の豚熱ウイルス受容体としての機能解析
Functional analysis of porcine complement regulatory protein CD46 uponclassical swine fever virus infection

岩丸（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

祥史１・池田圭吾１・原口清輝２

動物衛生研究部門，２生物機能利用研究部門）

１

Yoshifumi Iwamaru１, Keigo Ikeda１ and Seiki Haraguchi２（１National Institute of Animal Health, ２Institute of Agrobiological Science, NARO）

Classical swine fever（CSF）is a highly contagious viral disease of swine, which causes
significant economic losses in the swine industry. CSF is a disease listed by the World
Organisation for Animal Health（OIE）Terrestrial Animal Health Code and reportable to OIE.
The responsible pathogen, CSF virus（CSFV）is a member of the genus Pestivirus of thefamily Flaviviridae. In the closely related bovine viral diarrhea virus, complement regulatory
protein CD46 is identified as a cellular receptor. CD46 is reported as a candidate receptor for
CSFV, whereas there are conflicting reports for its function and it remains to be re-examined
the role of CD46 in CSFV infection．
In this study, we generated CD46 knockout cells to examine whether the complement
regulatory protein CD46 has a receptor function for CSFV. CD46 was ablated in PPK3F cells
by CRISPR-Cas9-mediated gene targeting. Using the GPE－ strain as the test CSFV, we
compared the efficiency for（1）viral replication,（2）viral attachment and entry into cells, and（3）intercellular viral diffusion between CD46 knockout cells and its parental PPK3F cells. As aresult, CD46 knockout cells showed no significant reduction in each indicator in comparison to
the PPK3F cells. Although we performed the study with only one live attenuated vaccine
strain, our results suggest the possibility that CD46 does not act as a receptor for CSFV atleast in this model.

１．目（BVDウイルス２），ペスチウイルスＤに分類さ的れている。豚熱ウイルスに感染した豚には発熱や豚熱ウイルス（CSFV）は，エンベロープを有白血球減少が認められ，出血性病変を形成し数日する１本鎖RNAウイルスであり，フラビウイル

から２週間で死亡することが多い。我が国では，

ス科ペスチウイルス属ペスチウイルスＣに分類さ1992年の熊本県での最終発生以降，豚熱の発生報れる。ペスチウイルス属には，牛ウイルス性下痢

告はなかった。しかし，2018年９月９日の岐阜県（BVD）ウイルスやボーダー病ウイルスがあり，での発生を皮切りに，2022年３月現在，16県で計

各々ペスチウイルスＡ（BVDウイルス１）とＢ

77事例発生している。これまでに約28万頭の豚が© The Ito Foundation

補体制御性タンパク質CD46の豚熱ウイルス受容体としての機能解析

289

殺処分されており，養豚業界に甚大な被害を引き

2.2

CD46タンパク質の検出

起こしている。さらに，野生イノシシにおいて豚PPK3F細胞とCD46欠損細胞から，界面活性剤

熱ウイルスが拡散していることから，豚熱の発生

添加緩衝液でタンパク質を抽出し，SDS-PAGEが長期化する恐れがある。

後，抗CD46抗体（BioRad）を用いたウエスタン

CSFVは，３つのエンベロープタンパク質，

ブロット法でCD46タンパク質を検出した。各細E ，E1，E2を持っている。E とE2はウイルス

胞をパラホルムアルデヒドで固定後，細胞膜透過

エンベロープの外側に露出しており，中和抗体の処理し，CD46タンパク質を上記の抗体を用いて主要な標的となる。E2に対する抗体は，CSFV感

間接蛍光抗体法で検出した。

rns

rns

染を完全に防御するのに対し，E に対する抗体

2.3

は，部分的な防御にとどまる。ヘパラン硫酸とラ

CSFVウイルスとして，生ワクチンとして使用

ミニン受容体は，Erns を介したCSFVの接着因子されている弱毒CSFV GPE－株を使用した。各細として報告されている１，２）。また，細胞表層に存胞を洗浄後，各感染多重度（MOI）のウイルス

在するTNF-a切断酵素であるADAM17が，E2を液と細胞を，37℃で１時間インキュベートした。

介したCSFVの接着因子であることが，ごく最近

ウイルス液を洗浄除去後，培地を添加し60時間培報告された３）。補体制御タンパク質であるCD46

養した。半量の培養上清を回収し，残りの培養上に関しては，CSFVの主要な受容体であるという

清と細胞を同時に回収した。回収した各検体の感報告

染価を，PPK3F細胞を用いて測定した。

rns

２）

がある一方，これと相反する報告

４）もあ

GPE－株感染試験

り，結論が出ていない。CSFVの病原性発現機構

2.4の解明には，CD46がウイルスの増殖に果たす役

感染細胞を洗浄し室温で乾燥させた後，80℃で割を明らかにすることが重要である。本研究で１時間熱処理した。HRP標識した抗E2タンパク

は，ゲノム編集技術によりCD46欠損細胞を作出

質マウスモノクローナル抗体（WH303，APHA）

し，CSFV感染後のウイルス増殖動態を親細胞とを固定した細胞と反応させ，洗浄後にHRP発色比較を行うことで，CD46がCSFV増殖に果たす

試薬（PIERCE）で検出した。
2.5

役割の解析を目的とする
２．方
2.1

CSFV E２タンパク質の免疫染色フォーカスアッセイ

ウイルス感染前日に，各細胞を48wellプレート法に培養した。ウイルスをヘパリン存在／非存在下で，37℃で１時間インキュベートした。各ウイル

CD46欠損細胞の樹立

CSFV研究に汎用されている豚腎臓上皮由来株

ス液と各細胞を，37℃あるいは４℃で１時間イン化細胞PK15細胞のクローン株である，PPK3F細キュベートした。細胞をPBSで洗浄後，１％アガ胞のCD46遺伝子配列のシーケンスを行い，デー

ロース加培地を重層し，固化後，37℃で24時間培

タベースに登録されている豚のCD46遺伝子塩基養した。その後，E2タンパク質の免疫染色を行い，配列情報と比較した。切断標的DNA配列を決定

光学顕微鏡で取得した画像のフォーカス数と面積

後 ， Guide-it CRISPR/Cas9 System （TaKaRa）

をImageJ（NIH）で解析した。

を利用したゲノム編集技術により，CD46欠損細2.6

GPE－株遺伝子量の解析胞を作出，樹立した。

４℃で１時間GPE－株を吸着させた各細胞を洗浄後，NucleoSpin RNA Plus（TaKaRa）を用い© The Ito Foundation

290

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）てRNAを抽出した。One Step PrimeScript RT-ても，PPK3F細胞と比較しCD46欠損細胞のほうPCR Kit（Perfect Real time）（TaKaRa）を用いが多い傾向がみられた（Fig. 2A）。GPE－ 株感染て，GPE－株の遺伝子量を測定し，βアクチンの60時間後の各細胞における，培養上清の感染価を発現量で補正し比較した。

測定したところ，CD46欠損細胞のほうが低値であったが，細胞と培養上清を合わせた感染価を測３．結果と考察

定すると，CD46欠損細胞のほうが高値であった

各細胞におけるCD46タンパク質の発現レベル（Fig. 2B）。以上の結果から，CD46タンパク質のを，ウエスタンブロット法と免疫染色法により評欠損はGPE－株の細胞における増殖に影響してい価した結果（Fig.１），樹立したCD46欠損細胞にない可能性が示唆された。

おいてCD46タンパク質は発現していないことを次に，各細胞におけるGPE－株の吸着・侵入・確認した。

増殖に違いがあるかを，フォーカス形成法で詳細

GPE 株感染60時間後の各細胞における，E2タに解析した。GPE－株は細胞表面に存在するヘパ

ンパク質染色部の面積は，いずれのMOIにおい

ラン硫酸依存性に接着することが知られているた

－

(A)

(B)
WT

CD46
KO

Phase

CD46 and DAPI

WT
CD46

CD46
KO
b-tub

Fig. 1 Expression levels of CD46 in CD46 knockout（CD46 KO）cell and its parental PPK3F（WT）cell.（A）Western

blot analysis of CD46 expression. b-tubulin（b-tub）was used as a control to confirm the protein content of the cell
extracts.（B）Immunocytochemical analysis of CD46 expression. Phase indicated phase-contrast microscopic image.
Nuclei were stained with DAPI. Scale bar indicated 100 μm.

0.25
WT
CD46
KO

(B)

CSFV/GPE-(MOI)
0.025

0.00258NC
Log TCID50/mL(A)

CSFV/GPE-(MOI = 0.25)

7

WT

CD46 KO

*

6
5
4
3
2
1
0

Cell + Sup

Sup

Fig. 2 Replication characteristics of GPE－ strain in CD46 KO and WT cells.（A）Cells were infected at different MOI

with GPE－ strain and visualized with direct immunoperoxidase staining of the viral glycoprotein E2 after 60 h.（B）The cells were infected at MOI=0.25 with GPE－ strain. At 60 h after infection, the half of culture supernatant（Sup）or cells together with the rest of Sup（Cell+Sup）were collected. Virus titers in Sup or Cell+Sup were
determined by end-point dilution. Welch’s t-test was performed to determine the statistical differences（＊p＜0.05）.

© The Ito Foundation

補体制御性タンパク質CD46の豚熱ウイルス受容体としての機能解析

291

め，あらかじめウイルスをヘパリン非処理・処理

3B）。４℃でウイルスを吸着させた直後のウイルを行い，解析を行った。37℃でウイルス吸着・侵ス遺伝子量を細胞間で比較した場合，ヘパリン処入させ24時間培養した場合，ヘパリン非処理条件

理の有無にかかわらず，遺伝子量はCD46欠損細下でのフォーカス形成数は，CD46欠損細胞のほ胞のほうが多い傾向があった（Fig.４）。これら

うが多かったが，ヘパリン処理条件では両細胞との結果から，CD46タンパク質の欠損はGPE－株のもフォーカス形成数が減少し，かつPPK3F細胞

細胞吸着・侵入に影響していない可能性が示唆さのほうがわずかに多くなった（Fig. 3A）
。４℃で

れた。

ウイルス吸着させ，37℃で24時間培養した場合，最後に，各細胞間でGPE－株の細胞間拡散に違

ヘパリン処理の有無にかかわらず，フォーカス形

いがあるかを解析した。４℃でウイルス吸着さ

成 数 は CD46 欠 損 細 胞 の ほ う が 多 か っ た（Fig.

せ ，37 ℃ で 24 時 間 培 養 し た 場 合 ，両 細 胞 間 で

(A)

(B)

Focuses/0.835 cm2

3500
3000

WT

1000

CD46 KO

*

2500
2000
1500

*

1000
500
0

WT

900

Focuses/0.835 cm2

4000

CD46 KO

800

*

700
600
500

*

400
300
200
100

Heparin(－)

0

Heparin(+)

Heparin(－)

CSFV/GPE－, 37℃

Heparin(+)

CSFV/GPE－, 4℃

Fig. 3 CSFV focus assay. GPE－ strain was treated with heparin （＋）or mock treated（－）for 1 h at 37℃． The cells

were then infected with the virus for 1 h at 37（A）or 4（B）℃. After incubation for 24 h at 37℃ under a solid
agarose/medium overlay, the infected cells were visualized with indirect immunoperoxidase staining of the viral
glycoprotein E2. Number of focuses per indicated area on WT（black）and CD46 KO（grey）cells are presented asbox-and-whisker plots. Welch’s t-test was performed to determine the statistical differences（＊p＜0.05）.

Genome copy number/ µL

1400

WT

CD46 KO

1200
1000
800
600
400
200
0

Heparin(－)

Heparin(+)

CSFV/GPE－, 4℃

Fig. 4 CSFV binding assay. GPE－ strain was treated with heparin（＋）or mock treated（－）for 1 h at 37℃．The cells

were then infected with the virus for 1 h at 4℃. Cells were washed before quantitative RT-PCR. Viral RNA from
WT（black）and CD46 KO（grey）was quantified using the standard curve and viral copies normalized to theexpression of b-actin were presented as box-and-whisker plots. Welch’s t-test was performed to determine thestatistical differences（＊p＜0.05）.

© The Ito Foundation

292

令和３年度

(A)

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

CSFV(GPE－)

WT

Focus area (pixels)

WT

(B)

CD46
KO

CD46 KO

300

200

100

0

CSFV/GPE－, 4℃

Fig. 5 CSFV cell-to-cell spread assay. GPE－ strain was mock-treated for 1 h at 37℃. The cells were then infectedwith the virus for 1 h at 4℃．After incubation for 24 h at 37℃ under a solid agarose/medium overlay, the infected
cells were visualized with indirect immunoperoxidase staining of the viral glycoprotein E2（A）. Focus area from
WT（black）and CD46 KO（grey）was measured by ImageJ software and presented as violin plots with meanvalue（white circle）（B）.Welch’s t-test was performed to determine the statistical differences（＊p＜0.05）.

フォーカス面積に差は認められなかった（Fig.
５）
。

果たす役割を再検討する必要があった。
本研究では補体制御性タンパク質CD46が，

以 上 の 結 果 は ，弱 毒 化 生 ワ ク チ ン 株 で あ る

CSFVの受容体機能を持つかどうかを，ゲノム編

GPE 株を使用して得られたことを留意する必要

集技術によりCD46を欠損させた細胞を用いて検があるが，これらの結果はCD46がCSFVの受容証した。供試CSFVとしてGPE－ 株を用いて，各体としての機能を果たしていないことを示唆す

細胞における①増殖能，②細胞への吸着・侵入る。CD46欠損により，CSFVに非特異的に結合能，③細胞間拡散能，を評価した結果，CD46欠する分子群が除去されている可能性があることか

損細胞は親細胞であるPPK3F細胞と比較して，ら，今回作出された細胞は，CSFV新規受容体探各指標の低下は認められなかった。弱毒化生ワク

索の有用なツールになると考えられる。

チン株であるGPE－株を使用した実験結果である－

４．要点に留意する必要があるが，これらの結果は，

約

CD46がCSFVの受容体としての機能を果たして豚熱（CSF）は，伝染力の強い豚のウイルス性いないことを示唆する。

疾病であり，養豚業界に多大な経済的被害をもたらす。そのため，CSFは国際獣疫事務局において届け出義務のある疾病のひとつである。原因とな
るCSFウイルス（CSFV）は，フラビウイルス科
ペスチウイルス属に分類される。CSFVに近縁である牛ウイルス性下痢症ウイルスでは，受容体として補体制御タンパク質であるCD46が同定された。CD46はCSFVにおいても受容体として機能するという報告がある一方，これと相反する報告も最近なされ，CD46が培養細胞でCSFV感染に文
献１）
 Chen, J., He, W. R., Shen, L., Dong, H., Yu, J.,
Wang, X., Yu, S., Li, Y., Li, S., Luo, Y., Sun, Y., Qiu,
H. J.：The laminin receptor is a cellular attachment
receptor for classical Swine Fever virus, J Virol, 89,4894～906, 2015.
２）
 D r ä g e r , C . , B e e r , M . , B l o m e , S . ：P o r c i n ecomplement regulatory protein CD46 and heparansulfates are the major factors for classical swine
fever virus attachment in vitro, Arch Virol, 160,
739～46, 2015.
３）
 Yuan, F., Li, D., Li, C., Zhang, Y., Song, H., Li, S.,
Deng, H., Gao, G. F., Zheng, A.：ADAM17 is an© The Ito Foundation

補体制御性タンパク質CD46の豚熱ウイルス受容体としての機能解析
essential attachment factor for classical swine fever
virus, PLoS Pathog, 17, e1009393, 2021.
４） Cagatay, G. N., Antos, A., Suckstorff, O., Isken, O.,
T a u t z , N . , B e c h e r , P . , P o s t e l , A . ：P o r c i n e

293

Complement Regulatory Protein CD46 Is a Major
Receptor for Atypical Porcine Pestivirus but Not
for Classical Swine Fever Virus, J Virol, 95, 2021.

© The Ito Foundation

294

家畜用ワクチンのための新規ワクチン
プラットフォームの構築
Development of a novel platform for veterinary vaccines

新

地

浩

之

（鹿児島大学学術研究院理工学域工学系）

Hiroyuki Shinchi（Graduate School of Science and Engineering, Kagoshima University）

In recent years, the risks for livestock infectious diseases is increasing due to globalization.
An outbreak of a new infectious disease may require massive culling of livestock, which could
result in enormous economic losses. Therefore, the vaccination strategy against infectious
diseases is crucially important for the livestock industry. Vaccines are mainly classified into
live attenuated and inactivated vaccines. Live attenuated vaccines provide strong immune
responses. However, i）there is a possibility that induces infectious diseases, ii）vaccination
may affect meat exports, and iii）it takes a long time to develop the vaccine. In contrast,
inactivated vaccines do not cause infectious disease, and vaccines can be produced once thepathogen is isolated and cultured. However, their immunogenicity is lower and less sustained
efficacy than live attenuated vaccines. Thus, it is necessary to add adjuvants（immunostimulants）to enhance the effectiveness of inactivated vaccines. Recently, wedeveloped Glyco-nanoadjuvants that can induce strong immune responses, predominantly
cellular immunity. In this study, we addressed developing novel vaccine materials consisting of
Glyco-nanoadjuvants conjugated with recombinant protein antigens. Glyco-nanoadjuvants
could be a versatile platform for the development of various vaccines against livestock
infectious diseases. Thus, it is expected that vaccines can be supplied promptly when emerging
and re-emerging infectious diseases occur, leading to reduced prevention measures against
infectious diseases and a stable supply of meat．

１．目ては，これまでに28万頭を超える豚が殺処分さ

的れ，きわめて大きな損失が生じている。したがっ近年，人や物流等の国際化に伴い，近隣諸国かて，これらの感染症を予防・軽減するワクチンをら家畜感染症が持ち込まれる可能性が増加してい迅速に開発する技術の確立は，畜産業においてきる。新たな感染症が流行すると，大規模な家畜のわめて重要な課題である。

殺処分等が必要になる場合があり，甚大な経済的ワクチンは，弱毒化した生きた病原体を接種す損失が発生する恐れがある。実際に，2018年に日る『生ワクチン』と，不活化した病原体やその抗本で26年ぶりに発生した豚熱（豚コレラ）におい

原の一部を接種する『不活化ワクチン』に大別さ© The Ito Foundation

家畜用ワクチンのための新規ワクチンプラットフォームの構築

295れる。生ワクチンは，生きた病原体を接種するた

成低分子Toll様受容体７（TLR7）リガンドおよ

め，高い感染防御効果が得られる。しかし，１）

び糖分子を共固定化した金ナノ粒子）３）のワクチ

病原性が復帰し感染症を誘発する恐れがあるこ

ンプラットフォームとしての有用性を示すためと，２）当該感染症（例：豚熱）の清浄国では生に，１）組換えタンパク質抗原とグライコナノア

ワクチンの接種によって食肉の輸出に影響を及ぼ

ジュバントを一体化したワクチン材料の調製，す場合があること，３）開発に長期間を要するこ

２）細胞レベルでのグライコナノアジュバントのと，などが課題である。一方，不活化ワクチンは，免疫刺激活性評価，３）動物体内でのワクチン材

感染症の恐れがなく，病原体を分離・培養できれ料の免疫誘導能を評価した。

ば，ただちにワクチンを製造することができる。

2 . 1 組換えタンパク質抗原とグライコナノア

したがって，安全性の高い不活化ワクチンへの置

ジュバントを一体化したワクチン材料の調換が進められている。一方，不活化ワクチンは，

製

生ワクチンに比べて，免疫誘導能が低く，効果のグライコナノアジュバントは，既報を参考に調持続性に乏しいことが課題である。ワクチンの効

製した３）。本研究で用いたグライコナノアジュバ

果を増強するためには，アジュバント（免疫増強

ントには，合成低分子TLR7リガンド誘導体（＝剤）の添加が必要であるが，既存のアジュバント

アジュバント）および糖誘導体（＝免疫細胞をは，抗体産生に寄与する液性免疫を増強する一方

ターゲティング）に加えて，組換えタンパク質をで，ウイルス感染細胞の除去などに重要な細胞性固定化するためのリンカー分子を共固定化した。

免疫の誘導能が低い。したがって，不活化ワクチ

まず，塩化金ナトリウムを水素化ホウ素ナトリウ

ンで，病原体に対する強力な免疫を誘導するにムで還元して金ナノ粒子（GNP）を合成した。

は，液性免疫と細胞性免疫の両方を誘導するア

続いて，TLR7リガンド誘導体，糖誘導体，タンジュバントが鍵になる。さらに，病原体に対するパク質固定化用リンカー分子の３種類を特定のモ免疫を効率的に誘導するには，同一の免疫細胞にル比で混合した溶液を加えて，GNP表面に固定

抗原分子とアジュバントの両方を輸送して活性化化した。得られたグライコナノアジュバントは，することも重要である。従来のワクチンは，抗原

透析で精製した。次に，グライコナノアジュバン

分子とアジュバントの混合物として投与する場合

ト表面のタンパク質固定化用リンカー分子に組換が多いが，これらを一体化して，免疫細胞選択的

えタンパク質抗原を固定化して，ワクチン材料をに輸送できれば，より効率的に免疫を誘導するワ調製した。

クチンになると考えられる。本研究は，ワク

１，２）

2 . 2 マウス骨髄由来樹状細胞を用いたグライ

チン開発における上記問題点を解決するために，

コナノアジュバントのIL-6誘導活性評価

独自開発した細胞性免疫誘導能を有するアジュバ

96ウェルプレートに１ウェル当たりの細胞数が３）ント（＝グライコナノアジュバント）を抗原分

１×10５個になるように，マウス骨髄由来樹状細子のキャリアに用いたワクチンプラットフォーム

胞（BMDCs）を播種した。グライコナノアジュを構築することを目的とした。

バントを加え，37℃，５％CO２の条件下で18時間

２．方培養後，培養上清に産生されたインターロイキン

法-6（IL-6）をELISA法で定量した。

本研究では，グライコナノアジュバント（＝合© The Ito Foundation

296

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

2 . 3 ワクチン材料のマウス体内での免疫誘導

中での粒径を動的光散乱（DLS）法で測定したところ，平均粒径は約10nmであった（Fig. 1B）。

活性評価
グライコナノアジュバントと組換えタンパク質

これらはGNP表面に固定化した分子を含む理論

抗原を一体化したワクチン材料を，C57BL/６マ

的な分子サイズに一致することから，いずれのグ

ウスに，０日目と21日目に皮内注射した。免疫28

ライコナノアジュバントも，PBS中で単一の粒子

日目に眼窩静脈叢から血液を採取し，血清中のタとして分散していると考えられた。GNP表面にンパク質抗原に対するIgG１，またはIgG2c抗体

固定化したTLR7リガンド誘導体および糖誘導体の抗体価（産生量）を，ELISA法で決定した。

を，既報３）に従ってHPLCで定量したところ，そなお，本実験は鹿児島大学動物実験委員会承認の固定化比率は，調製時の混合モル比と同程度で（承認番号：VM20010）のもと，動物愛護に十分あった。なお，タンパク質固定化用リンカー分子に配慮して行った。

は，吸光係数が小さく，HPLCでの定量が困難であり，今後定量方法を検討する必要がある。以上

３．結果と考察
3.1の結果から，タンパク質固定化用リンカー分子のグライコナノアジュバントの特性解析

固定化は，GNPの粒径や水分散性，各分子の固より多くの組換えタンパク質抗原を固定化可能定化比率に大きく影響しないことが示唆された。

なグライコナノアジュバントを調製するために，

3 . 2 グライコナノアジュバントの細胞レベル

TLR7リガンド誘導体，糖誘導体，タンパク質固での免疫刺激活性

定化用リンカー分子の固定化比率が異なる３種類

３種類のグライコナノアジュバントの免疫刺激のグライコナノアジュバントを調製した。それぞ

活性を，マウスBMDCsを用いて評価した。そのれの粒子径を，透過型電子顕微鏡（TEM）を用

結果，タンパク質固定化用リンカーの固定化量がいて測定したところ，コアとなるGNPの平均粒多くなると，IL-6の誘導活性が低下する傾向に径は，いずれも約４nmであった（Fig. 1A）。PBSあった。グライコナノアジュバントには，糖誘導

A)

B)

Number
（％）

20

15

10

5

50 nm
D = 3.8±0.8 nm (n = 100)

0

1

10

100

D = 7.7±2.3nm

Fig. 1 Representative particle size of Glyco-nanoadjuvants. A）TEM images and B）hydrodynamic

diameters measured by dynamic light scattering．

© The Ito Foundation

家畜用ワクチンのための新規ワクチンプラットフォームの構築

297

体が固定化されており，免疫細胞表層の糖結合受用いた。組換えタンパク質抗原の固定化量の異な容体を介したエンドサイトーシスによって，免疫る３種類のグライコナノアジュバント溶液，また刺激活性が増強されることが示されている４）。しは組換えタンパク質抗原とグライコナノアジュバ

たがって，タンパク質固定化用リンカーの固定化

ントを単純に混合した溶液をマウスに投与し，血量が多くなると，共固定化した糖誘導体の固定化

清中の組換えタンパク質抗原に特異的な抗体の抗量が相対的に下がり，糖受容体を介した免疫細胞

体価をELISA法によって評価したところ，IgG2cへの取り込み量が減少してIL-6の誘導活性が低下

抗体の産生において，グライコナノアジュバント

したことが考えられる。

の添加によって抗体価が有意に上昇した（Fig.

3 . 3 グライコナノアジュバントへのタンパク２）。しかし，組換えタンパク質抗原のグライコ
ナノアジュバントへの固定化の有無や固定化量の質抗原の固定化
３種類のグライコナノアジュバントに対して，違いで，IgG2c抗体の抗体価には有意な差がな

組換えタンパク質抗原の固定化を検討した。グラ

かった。また，IgG1抗体の産生においては，アジュ

イコナノアジュバントに対して，４当量の組換え

バントの添加の有無に関わらず，抗体価には有意タンパク質抗原を固定化後，超遠心分離によってな差がなかった。以上のことから，組換えタンパ

グライコナノアジュバントを含む沈殿と上清に分ク質抗原に対する抗体の誘導においては，グライ

離し，各画分をSDS-PAGEで解析した。その結果，

コナノアジュバントの添加によって抗体価が上昇

タンパク質固定化用リンカーの固定化量が少ない

するが，組換えタンパク質抗原と一体化しても抗と，超遠心分離後の上清に多くのタンパク質が残体誘導活性に大きく影響しないことが示唆され存しており，沈殿画分には仕込み量の40％程度した。現在，抗原特異的な細胞性免疫の誘導活性等

か検出されなかった。一方，タンパク質固定化用について評価している。

リンカーの固定化量が多いグライコナノアジュバ
ントでは，上清に検出されたタンパク質は10％以４．要

約下であり，約80％が沈殿画分に存在した。した

本研究では，グライコナノアジュバントを家畜がって，グライコナノアジュバント１個に３～４のウイルス感染症ワクチンに応用することを目指

個のタンパク質を固定化するためには，タンパクし，グライコナノアジュバントと組換えタンパク質固定化用リンカーの最適な固定化量があること

質抗原を一体化したワクチン材料の調製についてが示された。

検討した。その結果，サイトカイン誘導活性を維3 . 4 グライコナノアジュバントと組換えタン

持したまま，より多くの組換えタンパク質抗原を

パク質抗原を一体化したワクチンのマウス固定化するためには，各化合物の最適な固定化量

体内での免疫誘導活性があることを見出した。グライコナノアジュバン

グライコナノアジュバント１個当たりに，組換

トと組換えタンパク質抗原を一体化したワクチン

えタンパク質抗原を１～４個固定化したワクチン

材料をマウスに免疫したところ，液性免疫の誘導

材料を用いて，抗原特異的な免疫誘導活性を評価

能には，顕著な差が見られなかった。現在，細胞した。この際，グライコナノアジュバントには，性免疫の誘導活性等について評価を行っており，

IL-6の誘導活性を低下させず，なおかつ，より多

今後ワクチン材料のデザインを最適化する予定で

くの組換えタンパク質抗原を固定化できるものをある。グライコナノアジュバントは，家畜感染症© The Ito Foundation

298

令和３年度

lgG1 against protein antigenＢ）

lgG2c against protein antigen

８

10

10８

10７

10７

lgG2c [Arb. unit]

10６
10

５

10

４

10３

10５
10４
10３

.）
eq
4

.）
eq

va
n（
t

Ag

-G
ly

co

-n
a

no

ad

ju

2

eq
ad

ju

1

va
n（
t

ju

no

ad
-G
ly

co

-n
a

no
-n
a

va
n（
t

t

S

uv
an

oa

dj

+P
B

co

+G
Ag

Ag

Ag

no

ly
co

ad

-n

ju

an

eq
4

Ag

eq
2

va
n（
t

.）

.）

.）
eq
ju
Ag

-G
ly

co

no
-n
a
co

-G
ly
Ag

-n
a

ad

ad
no

-n
a

co

va
n（
t

1

ju

va
n（
t

uv
an

t

S
an

oa

dj

+P
B
Ag

-n
ly
co
+G

-G
ly

Ag

.）

10２

10

２

Ag

10６

-G
ly

lgG1 [Arb. unit]Ａ）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Fig. 2 IgG antibodies against protein antigen produced in C57BL/6 mice. The mice（n＝4 mice）

were intradermally vaccinated with protein antigen conjugated Glyco-nanoadjuvant（protein antigen：3μg, TLR7 ligand：0.2 nmol）in the tail on days 0 and 21. Blood wasthen collected on day 28 and the levels of protein antigen specific（A）IgG1 or（C）IgG2c
antibodies were determined by ELISA. Data shown are means±SEM（n＝4 mice）.

に対するさまざまなワクチンを開発するための有用なプラットフォームになると考えられる。したがって，新興・再興感染症が発生した際に，迅速にワクチンを供給できるようになり，畜産農家の防疫対策の軽減や食肉の安定供給などに繋がると期待できる。
文献１） Yao, L., Yannan, Y., Zhengying, G., Jun, Z., Hao, S.,
Guangya, X., Chengzhong, Y.：Biomaterials, 175, 82～92, 2018.

２）
 Weiss, A. M., Ajit, J., Albin, T. J., Kapoor, N.,
Maroju, S., Berges, A., Pill, L., Fairman, J., EsserKahn, A. P.：Sci. Rep., 11, 6267, 2021.
３）
 Shinchi, H., Yamaguchi, T., Moroishi, T., Yuki, M.,
Wakao, M., Cottam, H., Hayashi, T., Carson, D.,
Suda, Y.：Bioconjugate Chem., 30（11）, 2811～2821,
2019.
４）
 Shinchi, H.＊, Yuki, M.＊, Yamauchi, T., Niimura, M.,
Wakao, M., Cottam, H. B., Hayashi, T., Carson, D. A.,
Moroishi, T., Suda, Y.（＊Equal contribution）：ACS
Appl. Bio Mater., 4（3）,2732～2741, 2021.

© The Ito Foundation

299

炎症マーカーの代わりに安価で簡単に測定できる血清Fe濃度で牛複合性呼吸器疾患の炎症評価が可能か？
Simple and inexpensive evaluation of inflammation in bovine respiratory
disease complex using serum Fe concentration as an alternative to
inflammatory markers

鈴木

一由・塚野

健志・村上

義樹・大塚

まりな

（酪農学園大学獣医学群）

Kazuyuki Suzuki, Kenshi Tsukano, Yoshiki Murakami and Marina Otsuka（School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University）

The objective of this study was to examine whether serum iron（Fe）concentration isuseful as a prognostic biomarker for cows with acute coliform mastitis（ACM）. Aims of ourstudy was clarifying the sequential changes in serum Fe concentration in cattle that received
endotoxin. Ten young cattle aged

176.8 ± 23.7

days were enrolled in this study. Five young

cattle received endotoxin（LPS group）and the remaining five received physiological saline（control group）.Blood collections were carried out before endotoxin challenge（pre）, and 0.5, 1,
2, 4, 8, 12, 24, and 48 h after the challenge. As a result, a significant decrease in serum Fe
concentration was not observed until 24 h after endotoxin challenge. As a result, it wasclarified that hepcidin expression is induced by inflammation in cattle as well as in humans,
and the serum Fe concentration decreases. On the other hand, it became clear that it wasdifficult to confirm the decrease in serum Fe concentration within at least 8 hours after theadministration of endotoxin. In this study, a significant decrease in serum Fe concentration
could not be confirmed until 24 h after endotoxin administration. In order to use the serum Fe
concentration as an inflammation marker in cattle, it is considered necessary to have passed 24
hours or more after the disease．

１．目

ると考えられている１）。すなわち，ACMはエン

的ドトキシン由来の炎症反応の重篤度により予後がエンドトキシンは，マクロファージを刺激して大きく異なり，しばしば致命的である１）。ACM

腫 瘍 壊 死 因 子 α （TNF-α: Tumor Necrosis

に対する治療が奏功するかどうかは，早期診断おFactor-α），インターロイキン（IL：Interleukin）

よび予後評価などの適切な判断に左右される。し-１および６などのサイトカインを放出させるこ

たがって，ACMの重症度を反映する鋭敏なバイとが知られている 。これらの内因性炎症メディオマーカーが利用できれば，予後評価に有用な

エーターの循環系への放出は，重篤化した甚急性マーカーとなり得る。

１）

乳房炎（ACM）が呈する諸症状の主な原因であ

炎症に対する宿主の反応，つまり急性相反応© The Ito Foundation

300

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

は，血漿タンパク濃度の著しい変化を伴う一連の生理学的反応である２）。炎症性サイトカインに対２．方法する全身反応には，肝臓からの急性相タンパク質

本研究は酪農学園大学動物実験委員会の承認（APPs）の産生と分泌が含まれる 。APPsは炎（Approval#：VC15H2）に基づいて実施した。

症反応の初期に放出されるため，APPsを測定す

本研究では，日齢176.8±23.7日，体重178.7±33.0

ることにより炎症の早期発見が可能である。例え

kgの雌雄各５頭，合計10頭のホルスタイン種育ば，人で汎用されているＣ反応性タンパク（CRP：

成牛を供試した。供試牛のうち５頭にエンドトキ

C reactive Protein）は，牛での応用がなされてシン（LPS投与群），残り５頭に生理食塩液（対いない 。牛において測定可能な主なAPPsはハ照群）を投与した。エンドトキシンまたは生理食

プトグロビン（Hp：Haptoglobin），血清アミロ

塩液の投与直前に頸静脈カテーテルを留置した。

イドA（SAA：Serum Amyloid A），α1酸性糖LPS投与群には2.5 μg/kgのO111：B4 LPS（L4391；

タンパクおよびトランスフェリンであり ，これSigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A）を 自 家 血らはACMに有用なマーカーとなり得る。しかし，

清10 mlに混和調整した。また，対照群には生理これらの炎症マーカーおよび炎症性サイトカイン

食塩液（生理食塩水；日本全薬工業，福島，日本）の測定は牛に特異的な抗体を有していない一般的

10 mlをそれぞれ頸静脈より投与した。LPSまたな検査会社では難しいために経費，労力，時間的は生理食塩液の投与前（pre），投与後0.5，１，２，

な制限がある。

４，
８，12，24および48時間において10 mlを反対

３）

４）

５）

人や動物における多くの慢性疾患は，数種の元側の頸静脈より採血した。採血した血液はただち素の蓄積を誘導する細胞外基質の代謝の変化に関に10 mlの血清分離用真空採血管およびヘパリン

連している。したがって，炎症と微量元素との関

添加採血管に分注した。血清および血漿はそれぞ係を知ることは有用である。例えば，急性炎症をれ分注後４℃で保存し，3,000 ×ｇ，15分で遠心生じている患者の血液中Fe濃度は著分離して得た。これらのサンプルは測定まで－しく減少することが報告されている。例えば，80℃で保存した。第10-11肋間において2.5 mlのNeumann

は ，炎 症 性 疾 患 を 患 っ て い る 猫 の２％リドカイン（キシロカイン注２％；アストラ

90％および犬の60％で血清中Fe濃度が低下した

ゼネカ，大阪，日本）により局所麻酔を行い，ことを報告した。この炎症による血清中Fe濃度

pre，投与後0.5，１，
２，
４，
８，12，24および48時間の減少は，腸管でのFe吸収の減少および細網内において超音波ガイド下で肝生検を行った。生検

皮細胞によるFeの放出減少に起因している。血には14Ｇの生検針（クイックカットC2；株式会

清中Fe濃度の測定は，一般的な検査会社で１検社八光，東京，日本）を用いた。肝生検により得体当たり200～300円程度での測定が可能であるこた 組 織 を た だ ち に RNAlater RNA stabilizationとから，血清中Fe濃度が炎症に関連しているの

reagent（Qiagen, Hilden, Germany）に浸漬し，であれば牛の炎症性マーカーとして条件を満たす

採 取 後 24 時 間 以 内 に 使 い 捨 て ホ モ ジ ナ イ ザ ー

可能性がある。すなわち本研究では，エンドトキ（bio-masher Ⅱ；和光純薬工業，東京，日本）を

シン由来全身性炎症モデルを用いてFe調節タン

用いてホモジナイズしたのち測定まで－80℃で保パクであるヘプシジンのmRNAレベルを指標に炎

存した。

８）

６）

や動物

７）

症により血清Fe濃度が減少する機序を解明した。

測定の直前に血漿をエンドトキシンフリー蒸留© The Ito Foundation

炎症マーカーの代わりに安価で簡単に測定できる血清Fe濃度で牛複合性呼吸器疾患の炎症評価が可能か？

301

水（大塚蒸留水；大塚製薬，東京，日本）を用い

ルタイムPCR（Light-Cycler 480 system II; Rocheて20倍希釈し，ボルテックスミキサーで10秒間混

Diagnostics, Basel, Switzerland）に よ り 測 定 し和した。その後，阻害物質を不活化するため80℃た。逆転写およびリアルタイムPCRは市販のキッで10分間加熱した。血漿中エンドトキシン活性値

ト（Light-CyclerⓇ Multiplex RNA Virus Masterはリムルス比濁時間分析法（LAL-KTA：Limulus

version 3；Roche Diagnostics）を用いたワンス

Amebocyte Lysate-Kinetic Turbidimetric;

テップ法により行った。リアルタイムPCRは96穴Charles River）により測定した。すべての測定プレートで行い，最終量は20 μlとした。PCRミッには，エンドトキシンフリー蒸留水を陰性対照，

クスには５μlのテンプレートRNA，各プライマー

リ フ ァ レ ン ス ス タ ン ダ ー ド（CSE, Control Std（リバースおよびフォワード）１μl（0.5 μＭ），

Endotoxin；Charles River, Charleston, SC, U.

ユニバーサルプローブ0.4 μl，RT-PCR reaction

S.A.）を10,000（EU）／バイアルに調整したエン

mix ４ μl, RT-Enzyme solution 0.1 μl お よ び 水

ドトキシンを陽性対照として使用した。β-グル

8.5 μlを含む。牛ヘプシジンおよびIL-6に対する

カンによる反応阻害をさけるため，カイネティッ

プライマーおよびユニバーサルプローブは

ク 比 濁 時 間 用 LAL 試 薬 （Endosafe KTA2；

PubMedで遺伝子情報を得た後にロシュのホーム

Charles River）をEndotoxin-Specific Buffer

ペ ー ジ （https://lifescience.roche.com/global_

Solution（Charles River）に よ り 再 融 解 し た 。

en/brands/universal-probe-library.html） で 設

LAL-KTA法は96穴マイクロプレート（Endosafe計をした。添付文書に従い，増幅条件は50℃で1096-well, flat bottom microplate M9001 ； Charles

分（逆転写），95℃で30秒（プレインキュベート），River）を 用 い ，マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー

95℃で５秒および60℃で30秒を計45サイクル（増（SunriseTM；Tecan Group Ltd., Mannedorf,幅）とした。結果は，リファレンス遺伝子である

Switzerland）およびエンドトキシン測定ソフト

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

ウェアEndoScan-VTM（Charles River）により（GAPDH）-mRNAに対する相対発現量を市販の測定した。各測定ではLAL試薬の添付文書に従ソ フ ト ウ ェ ア （E-method; Roche Diagnostics）

い，0.003 EU/mlから3.0 EU/mlの範囲の検量線を用いて算出した。

ⓇⓇ

を作成した。検出限界値は0.028 EU/mlであっ統計解析は市販のソフトウェア（IBM SPSS
Statistics v.21；IBM Co, Armonk, NY, U.S.A.）

た。
血清中Fe濃度は，市販のキット（N-アッセイ

を用いて行った。データが正規分布する場合は平L Fe-Ｈニットーボー；ニットーボーメディカ

均値±標準偏差，非正規分布の場合は中央値で示ル，東京，日本）を用いて，波長753 nmにおいした。血漿中エンドトキシン活性値および血清中て 全 自 動 血 液 生 化 学 ア ナ ラ イ ザ ー

Fe濃度の群内および群間変数は二元配置分散分（LABOSPECT 003；日立ハイテクノロジーズ，

析 を 用 い て 分 散 を 評 価 し た の ち ，群 間 比 較 を東京，日本）によりNitroso-PSAP法により測定

Student’s t検定（血清中Fe濃度，IL-6 mRNAおした。測定は２回行い，平均濃度を統計解析に用よびヘプシジンmRNA）およびMann-Whitney

いた。

U検定（血漿中エンドトキシン活性値）を用いてエンドトキシンチャレンジモデルより得た肝臓のヘプシジンおよびIL-6のmRNA発現量をリア解析した。また，pre値に対する経時的変化は，Dunnett検定を用いた。

© The Ito Foundation

302

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Plasma Endotoxin activity (EU/ml)

2.5

**
2.0

Control*LPS

p<0.05

1.5

1.0

*
0.5

*

0.0

Serum Iron (Fe) concentration (µg/ml)

300

250

**

Control**LPS

p<0.05

200

150

100

50

0

0 2

4

8

12

**

*

24

48

Times after the endotoxin challenge (hr)Fig. 1 Sequential changes in plasma endotoxin activity and iron (Fe) concentrations inendotoxin challenge model. ＊ ；vs pre p＜0.05，＊＊ ；vs pre p<0.01 by Dunnett-test
after 2-way ANOVA as the F test.

ジ後0.5時間目において1.239±0.881 EU/mlを最高３．結果と考察

値とする有意な上昇を示した（p＜0.001）。そのFig.１にエンドトキシンを投与した牛の血漿中後，投与後４時間目にpre値に復した。一方で，エンドトキシン活性値および血清中Fe濃度の経対照群の血漿中エンドトキシン活性値に有意な差

時的変化をそれぞれ示した。Pre値の血漿中エンは認められなかった。血清中Fe濃度の有意な経ドトキシン活性値はすべての牛で検出限界値以下

時的変化はエンドトキシンをチャレンジした牛でであった（検出限界：0.028 EU/ml）。血漿中エのみ認められた。エンドトキシンをチャレンジさンドトキシン活性値は，エンドトキシンチャレン

れた牛において，チャレンジ後４時間目に血清中© The Ito Foundation

炎症マーカーの代わりに安価で簡単に測定できる血清Fe濃度で牛複合性呼吸器疾患の炎症評価が可能か？

303

Fe濃度は207.4±46.6 μg/dlに達し，pre値と比較

後24時間目でベースラインに復した。ヘプシジン

して有意に上昇したが，チャレンジ後８時間目ま

および血清中Fe濃度の継時的変化は，IL-6を投でにpre値に復した。その後，血清中Fe濃度は投与した人において観察されたものと類似してい

与後24時間目をピークに30.4±15.7 μg/dlまで低た10）。炎症に反応して血清中Fe濃度が急速に低下

下し，pre値と比較して有意な変動を示した（p＜することは，宿主防御機構として説明できる11）。

0.001）。その結果，血清中Fe濃度は投与後24から

生体内でのFeが隔離された結果生じる低Fe環境

48時間目において，pre値と比較して有意に低値

は細菌の増殖を制御するため，生体の血液，リンを維持した（p＜0.001）。エンドトキシンをチャ

パ液および滲出液における静菌または殺菌機構にレンジされた牛において，チャレンジ後２時間目

とって不可欠である12）。本試験の結果は，牛におに 肝 臓 に お け る IL-6 の mRNA 発 現 量 （IL-

いても人と同様に炎症によりヘプシジン発現が誘6mRNA/GAPDH）は0.006±0.008 μg/dlに達し，導され，血清中Fe濃度が低下することを明らか

pre値（0.0006±0.0005）と比較して有意に上昇しにした。一方で，血清中Fe濃度の低下は，エン（p＜0.01），チャレンジ後８時間目まで有意に高ドトキシン投与後少なくとも８時間以内に確認す

値を維持した。同様にエンドトキシンをチャレンることは困難であることが明らかとなった。

ジされた牛において，チャレンジ後２時間目より

Erskineら 13）は大腸菌の乳房内感染後20～24時間

肝臓におけるヘプシジンのmRNA発現量（ヘプで血清中Fe濃度の低下が認められたと報告して

シジンmRNA/GAPDH）はpre値（0.5±0.5）といる。本試験においても，エンドトキシン投与24比較して有意に上昇し，チャレンジ後８時間目

時間後まで血清中Fe濃度の有意な減少を確認で（6.7±1.0）をピークに，12時間後まで有意に高値

きず，24時間後に低下したことは，Erskineらのを維持した（p＜0.01）。

報告を支持する結果となった。血清中Fe濃度を本研究において，エンドトキシンチャレンジモ

牛の炎症マーカーとして利用するためには疾病罹

デルを用いてエンドトキシン由来の炎症がヘプシ

患後24時間以上経過している必要があると考えら

ジン発現を誘導し，血清中Fe濃度へ影響を及ぼれた。

すかどうかを調査した。エンドトキシンはtolllike receptor 4シグナル伝達を活性化し，それに４．要約よりマクロファージのIL-6の産生を促進する３）。

本研究の目的は，血清鉄（Fe）濃度が急性大Nemethら９）は，ヘプシジンはIL-6により誘導さ腸 菌 型 乳 房 炎（ACM）の 牛 の 予 後 バ イ オ マ ーれるが，IL-1またはTNF-αによっては誘導されカーとして有用であるかを明らかにすることでないことを示し，炎症によるヘプシジン誘導はヒあった。すなわち，エンドトキシンをチャレンジ

トにおけるⅡ型急性期反応であることを報告しした育成牛の血清Fe濃度の経時的変化を明らかた。この炎症により惹起されるIL-6-ヘプシジンにすることであった。５頭の若い牛はエンドトキ

経路によって血清中Fe濃度が調節を受ける。本シンを投与され（LPS投与群），残りの５頭は生研究の結果では，エンドトキシンを投与した牛の理食塩水を投与した（対照群）。採血は，エンド肝臓組織におけるIL-6およびヘプシジンmRNA

トキシンチャレンジ直前（pre），およびチャレンの発現は，エンドトキシン投与後２～８時間目でジの0.5，１，
２，
４，
８，12，24，および48時間後高レベルに維持され，その後エンドトキシン投与に実行した。その結果，牛においても人と同様に© The Ito Foundation

304

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

炎症によりヘプシジン発現が誘導され，血清中Fe濃度が低下することを明らかにした。一方で，血清中Fe濃度の低下は，エンドトキシン投与後少なくとも８時間以内に確認することは困難であることが明らかとなった。本試験では，エンドトキシン投与24時間後まで血清中Fe濃度の有意な減少を確認できず，血清中Fe濃度を牛の炎症マーカーとして利用するためには疾病罹患後24時間以上経過している必要があると考えられた。
文献１） Ziv, G.：Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract.,
8, 1～15, 1992.
２） Bertsch, T., Triebel, J., Bollheimer, C., Christ, M.,
Sieber, C., Fassbender, K., Heppner, H. J. Z.：
Gerontol. Geriatr., 48, 595～600, 2015.
３） Constante, M., Jiang, W., Wang, D., Raymond, V.
A., Bilodeau, M., Santos, M. M.：Am. J. Physiol.

Gastrointest. Liver Physiol., 291, G229～Ｇ237, 2006.
４）
 Black, S., Kushner, I., Samols, D.：J. Biol. Chem.,
279, 48487～48490, 2004.
５） Eckersall, P. D., Bell, R.：Vet. J., 185, 23～27, 2010.
６）
 Ullah, Z., Ullah, M. I., Hussain, S., Kaul, H., Lone, K.
P.：Biol Trace Elem Res., 175, 10～16, 2017.
７）
 Ilbäck, N. G., Benyamin, G., Lindh, U., Fohlman, J.,
Friman, G.：Pancreasz., 26, 190～196, 2003.
８）
 Neumann, S.：Comp. Clin. Path., 12, 90～94,
2003.
９） Nemeth, E., Valore, E. V., Territo, M., Schiller, G.,
Lichtenstein, A., Ganz, T.：Blood, 101, 2461～2463,
2003.
10）
 Burvenich, C., Bannerman, D. D., Lippolis, J. D.,
Peelman, L., Nonnecke, B. J., Kehrli, M. E. Jr.,
Paape, M. J.：J. Dairy Sci., 90 Suppl, 1, E39-54,
2007.
11）
 Borges, A. S., Divers, T. J., Stokol, T., Mohammed,
O. H.：J. Vet. Intern. Med., 21, 489～494, 2007.
12）
 Ward, C. G., Bullen, J. J., Rogers, H. J.：J.
Trauma, 41, 356～364, 1996.
13）
 Erskine, R. J., Bartlett, P. C.：J. Dairy. Sci., 76,
408～413, 1993.

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305

映像解析技術を用いたアブの吸血行動の定量的解析
による病原体媒介リスクの可視化
The clarification of pathogen transmission risk by quantitative video
image analysis of blood sucking behavior of Tabanus flies

菅沼啓輔１・Acosta J. Tomas２・齊藤

朋子２（１帯広畜産大学グローバルアグロメディシン研究センター・原虫病研究センター，２帯広畜産大学畜産学部）

Keisuke Suganuma１, Acosta J. Tomas２ and Tomoko Saito２（１National Research Center for Protozoan Diseases/Global Agromedicine Research Center, Obihiro University of Agriculture andVeterinary Medicine, 2 School of Agriculture Science, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

Horse flies have negative impacts against domestic animals by frequently blood sucking
behavior and transmission of several pathogens. However, the negative impact by horse flies isrelatively ignored due to the limited information of their seasonal prevalence and their carrying
pathogens. The aim of this study is to reveal the risk of horse flies against domestic animals inTokachi district, Hokkaido prefecture where is one of the leading farming areas in Japan. In
the study revealed that the occurrence of horse flies in Tokachi district was from end of Julyto early of October. The dominant species were Haematopota tristis and Tabanus nipponicus.
The occurrence period and dominant species were different from that of previous studies
published on 1990. This could be explained by the changing of farming environment andclimate change during the last three decades. The prevalence of Trypanosoma（Megatrypanum）spp. was 38 ％ in five species of horse flies. A previous study revealed that
Trypanosoma（Megatrypanum）theileri was widely infected in dairy cattle in the study area
and caused negative impact on their productivity. In addition, Trypanosoma（Megatrypanum）
spp. was also widely infected in wild Ezo sika deer（Cevus nippon yesoensis）in the same area.
Therefore, the control of horse flies could reduce a risk of trypanosome infection via blood
sucking of horse flies and might improve productivity. Finally, blood sucking behavior of horse
flies and evasive behavior of domestic animals were analyzed by video and motion sensor. The
results suggested that the improvement of automatic analysis may contribute to establishing
control strategy for horse flies．

１．目

らにはピロプラズマやトリパノソーマなどの寄生的虫類を吸血に伴い機械的に伝播する１）。また，アアブ類（双翅目アブ科）は，家畜伝染病予防法

ブ類は執拗な吸血習性をもち，何度も繰り返し吸に定められる法定もしくは届出伝染病の病原体で血を行う。さらに，アブ類はサシバエなどの小型あるウシ伝染性リンパ腫ウイルスなどのウイルス

吸血性昆虫に比べ大きいため吸血量が多く飛翔能類，アナプラズマなどの細菌・リケッチア類，さ力も高い。そのため，広範囲の多数の動物に病原© The Ito Foundation

306

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

体を伝播する。すなわち，アブ類は病原体を効率的に媒介する能力を有し，家畜感染症の伝播を防

２．方法

ぐために積極的な防除が求められる重要な衛生昆

2.1

虫である。アブ類によって媒介される感染症の中北海道十勝地方の三ヶ所の農場（Ａ地点：ウシ

でもウシ伝染性リンパ腫は年々増加傾向にあり，の放牧，Ｂ地点：乗馬クラブ，Ｃ地点：ウシのフ2011年には30％を超える抗体陽性ウシ

や2019年

リーストール）を選定した。それぞれの地点にには4,000頭を超える症例が報告３）され，日本全

H-trap（アブキャップ，ファームエイジ株式会社）

国で蔓延している。ウシ伝染性リンパ腫発症ウシ

を二基ずつ，５月下旬から10月上旬まで設置し，の摘発淘汰や，と殺時検査陽性症例の全廃棄，清定期的に採集されたアブを回収した。

２）

アブ類の発生動態の調査

浄化のための未発症ウシの淘汰が畜産経営に与え2.2

採集されたアブの種同定る打撃は大きい。そのため，アブ類によって媒介回収されたアブは形態学的に種同定を行った。

される感染症の予防は畜産経営の改善に直結する。

各月を上旬，中旬，下旬と約10日ごとに区切って，蚊によって媒介されるウエストナイルウイルス

サンプリング地点ごとにトラップで採集された１の場合，１）吸血昆虫の発生数の季節変動，２）

日当たりのアブ数（fly/trap/day）を算出した。

吸血昆虫の病原体保有率，そして，３）吸血昆虫

2.3

による吸血行動（吸血時間，吸血頻度）の定量に採集されたアブ類の個体数の多かったＡ地点およって，媒介蚊ごとの病原体感染リスクを定量的よびＢ地点で採集され，種同定を行ったアブの一に評価できるとされている 。しかしアブ類にお部を解剖し消化管を顕微鏡下で観察した。さらいては，家畜動物にたかる多数のアブ類の吸血行に，同じサンプルからDNAを抽出した。抽出し動を人による直接観察で定量的に記録・解析する

たDNAを鋳型として，アブの媒介するトリパノ

ことは困難である。一方で，録画映像を用いた解ソ ー マ （Trypanosoma （Megatrypanum）spp.）

析の利点として，「繰り返し解析が可能である」，を検出するためにCathepsin L遺伝子を標的とし「同一記録から多様な解析を実施できる」，「自動たPCR５）を実施した。

４）保有病原体（トリパノソーマ）の解析

解析により大量のデータを処理できる」といった

2.4

点があげられる。このような映像解析技術の利点

採取されたアブ類の個体数の多かったＢ地点にを活かすことで，アブ類の吸血行動を録画後に解おいて，ビデオ撮影条件の検討を行った。馬２頭

析し正確に把握できる，すなわち，ビデオ映像解を係留して用い，１）馬体の横・２）馬体の上か析によりアブ類の吸血行動を定量的に解析できるらの撮影を行った。撮影は各10分程度行い，同時と考えられる。そこで本研究は，北海道十勝地方にアブの飛来について目視にて確認を行った。

ビデオ撮影条件および忌避行動の検討の牧場を調査地として，そこで飼養されている家

また，動物のアブに対する忌避行動の確認とし畜動物に飛来する吸血性アブが媒介する家畜感染て，帯広畜産大学において飼養されているウシを症病原体の媒介リスクを定量化することを目的と利用して２つの実験を行った。１つ目はウシの尾して，アブ類の発生動態とその吸血行動および家にマーカーをつけてソフトウェアにより追尾を目

畜動物の忌避行動の解析を実施した。

指したもの，２つ目は１つ目の結果を受けてウシの尾に３軸加速度センサーをつけてウシの尾の動きの定量化を目指したものである。

© The Ito Foundation

307

映像解析技術を用いたアブの吸血行動の定量的解析による病原体媒介リスクの可視化

捕 獲 数 が 44 匹 と 少 な く（Fig. 1C），サ シ バ エ

３．結果と考察3.1（Stomoxys calcitrans）がアブの約６倍（247匹）

アブ類の発生動態

捕獲された。全体では９種3,140匹であり，アブ調査期間中に捕獲されたアブは，Ａ牧場では８の発生は６月下旬から始まり，10月上旬までに終月上・中旬が捕獲数のピークであり，優占種は８了した（Fig. 1D）。農場ごとに捕獲されたアブ種

月上旬から中旬にかけてはゴマフアブの構成・アブの個体数が異なったことから，アブ（Haematopota tristis）であり，７月下旬までとの発生動態の解明とその防除対策には，調査地点

８月下旬からはニッポンシロフアブ（Tabanusを増やして幼虫の生息環境である農場周囲の環境

nipponicus）であった（Fig. 1A）。Ｂ牧場で７月

および飼養されている家畜の種類などを含めた解中旬が捕獲数のピークであり，優占種は７月下旬

析が必要であると考えられる。

から８月上旬にかけてはゴマフアブであり，７月

過去に北海道十勝地方で行われた研究６）では，中旬までと８月中旬からはニッポンシロフアブで発生は７月下旬から８月上旬をピークとして６月あった（Fig. 1B）。一方，Ｃ牧場では，アブの総下旬から９月上旬までであった。一方で，３ヶ所

A.

B.
18

Tabanus ruﬁdens

14

Hybomitra distinguenda

30

ﬂies/trap/day

Tabanus sapporoenus
Haematopota tristis

8

Tabanus ruﬁdens
Tabanus kinositai

25

Tabanus chrysurus10

Horse ﬂy sp
Hirosia sapporoensis

16

12

Tabanus nipponicus

6

Hybomitra distinguenda
Tabanus chrysurus

20

Tabanus sapporoenus
Crysops suavis

15

Haematopota tristis
Tabanus nipponicus

10

4

5

2

Ea
pt

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En

ne

0
e

0

Ea

ﬂies/trap/day

35

Horse ﬂy sp

D.
1

16

Tabanus chrysurus

0.9
Haematopota tristis

0.8

Tabanus nipponicus
ﬂies/trap/day

0.6
0.5
0.4
0.3

Hirosia sapporoensis
Tabanus ruﬁdens

12

Tabanus kinositai

10

Hybomitra distinguenda
Tabanus chrysurus

8

Tabanus sapporoenus
Chrysops suavis

6

Haematopota tristis

4

0.2

Tabanus nipponicus

2

0.1

ct

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Ju

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M

En

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M
d,

rly

Ea

En

un

0
ay

0

En

ﬂies/trap/day

0.7

Horse ﬂy sp

14

Fig. 1 Seasonal prevalence of horse flies in three farms in Tokachi district, Hokkaido.

X-axis：Average numbers of captured flies in each trap in each day（flies/trap/day）, Y-axis：Sampling term. A：

Seasonal prevalence of horse flies at A farm, B：Seasonal prevalence of horse flies at B farm, C：Seasonal
prevalence of horse flies at C farm, D：Seasonal prevalence of horse flies at three farms© The Ito Foundation

308

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）の調査地点で行われた本研究で確認されたアブ類

3.2の発生は，７月下旬をピークとして６月下旬から採集したアブを解剖し消化管を顕微鏡で観察し10月上旬までであった。近年の地球温暖化を反映た結果，すべてのアブでトリパノソーマの感染はしたためか，過去の報告に比べてアブ類の発生期

認 め ら れ な か っ た（0/150 ，（0.0 ％ ））。一 方 で間が延長している可能性が示唆された。そのたPCRによる分子生物学的解析の結果，38.0％のア

め，農家ではより長期間のアブ類の防除が必要とブ（57/150）にトリパノソーマの感染が認められなるとともにアブによって媒介される感染症の蔓た（Table１，Fig.２）。複数種のアブ属（Tabanus

延や吸血による増体抑制など経営コストの増加がspp.），キンメアブ属（Chrysops spp.），ゴマフア

危惧される。

ブ属（Haematopota spp.）などからウシに生産性

同じ報告

アブ類のトリパノソーマ保有率

では34ヶ所の調査で15種類のアブ類

低下を引き起こすTrypanosoma theileriもしくはが採集された。また，その他の研究とあわせて22

その近縁種であるTrypanosoma（Megatrypanum）

種類のアブ類が十勝地方では確認されている。一spp.が見出され，ベクターであると考えられてい方で，３ヶ所の調査地点で行われた本研究で確認る ７）。本 邦 で は ヤ マ ト ア ブ（Tabanus rufidens）

されたアブ類の発生は，９種類のアブ類が採集さからTrypanosoma（Megatrypanum）spp.の遺伝れ た 。ま た ，文 献 ７ で は 優 占 種 が ゴ マ フ ア ブ

子断片が検出されている８）とともに，アカウシア（66.4％）でニッポンシロフアブが占める割合はブ（Tabanus chrysurus）消化管に感染ステージ

小さかった（7.0％） が，本研究では文献７と同の Trypanosoma（Megatrypanum）spp ．が 認 め

じ８月に採集されたアブ類では，ゴマフアブが優られている９）。本研究で解析したアブ類のなかに，

占種（52.6％）であったが，ニッポンシロフアブ

顕微鏡観察で感染ステージのトリパノソーマを有も39.8％と大きな割合を占めた。本研究と文献６する個体は認められなかったが，38.0％と多くのでは調査地点の数や調査地点が異なるものの，畜アブ類から遺伝子断片を検出したことから，これ

産経営形態および農家周囲の自然環境の変化，さら の ア ブ 類 が 本 邦 に お け る Trypanosoma

らには気候変動を反映し，発生しているアブ類の（Megatrypanum）spp.のベクターである可能性が種や種構成が変改している可能性が示唆された。

高い。これらのアブの防除を行うことで，トリパ

６）７）Table 1Summary of PCR against Trypanosoma（Megatrypanum）spp.
No. of positive（%）

Horse fly species

NumberMicroscopic observation

PCR

Haematopota tristis

410（0.0）

17（41.5）

Tabanus nipponicus

860（0.0）

33（38.4）

Tabanus rufidens

40（0.0）

2（50.0）Tabanus chrysurus

110（0.0）

4（36.4）

Tabanus sapporoenus

20（0.0）

0（0.0）

Tabanus kinoshitai

20（0.0）

0（0.0）

Chrysops japonicus

10（0.0）

1（100.0）

Chrysops suavis

30（0.0）

0（0.0）

Total

150

0（0.0）

57（38.0）© The Ito Foundation

309

映像解析技術を用いたアブの吸血行動の定量的解析による病原体媒介リスクの可視化
Samples

Samples

M

M

P

N

→

Fig. 2 PCR results of Trypanosoma（Megatrypanum）spp. in horse flies.

 row shows amplicons of partial-CATL gene（~300 bp）
A. M：Marker, P：Positive control, N：Negative control

ノソーマ感染による乳牛生産性にあたえる悪影響

尾ふりの定量化については，尾にマーカーをつけを低減できると考えられる。今後，ウシ伝染性リて自動追尾する方法は難しいことが明らかとなっンパ腫ウイルスやウシパピローマウイルスなどよた。ウシが尾を振るとマーカーに当たる光の向き

り悪影響の大きい感染症について同様の研究を進が変化し，それによって色が異なって認識されてめるとともに，保有病原体叢について網羅的な解

しまい識別および定量化が難しかった。一方で３析を実施することで，アブ類の家畜感染症媒介に

軸加速度センサーを利用した場合は，通常時に対おける役割を可視化し防除を進めることにつながし尾を振ったときに数値が大きく変化したことかると考えられる。

ら，動物のアブへの忌避行動としての尾ふりを定3 . 3 吸血行動および忌避行動解析の予備的検量化し計測するためには，３軸加速度センサーが最適であることが明らかとなった。

討
アブ類の吸血行動を定量化するためのビデオ撮
影条件については，アブが大きい種類（アカウシ

４．要

約

アブ，ヤマトアブ，アカアブなど）の場合は映像

日本有数の畜産業集積地である北海道十勝地方から確認できた。しかし，中型～小型のアブの場

において，家畜生産に悪影響を与えるアブの発生合（ニッポンシロフアブ，ゴマフアブなど），馬

動態，保有病原体，および吸血行動と家畜の忌避の毛色によっては，特に黒や灰色の毛色の馬の場

行動を解析した。アブの採集を行った３ヶ所の農合，馬の体と色が同一色となってしまい，目視で場では９種3,140匹のアブが採集され，その発生もソフトウェアを利用しても撮影された映像からは６月下旬から10月上旬でありピークは８月では吸血の判別が難しいことが明らかとなった。こあった。また，アブが保有・媒介する病原体のうの点は今後，さらなる研究が必要であると考えら

ち，トリパノソーマは５種57個体（38.0％）のア

れた。

ブで検出された。このことからアブは高い比率で一方，動物のアブへの忌避行動としてのウシのトリパノソーマを保有，家畜動物に媒介している© The Ito Foundation

310

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

ことが示唆された。検出されたトリパノソーマは乳牛に感染し生産性を低下させること，またエゾ
シカに広く感染が認められていることから，アブの防除によりトリパノソーマ感染リスクを低減し家畜生産性を向上させることが可能である。さらに，映像解析で吸血するアブ種の同定，および家畜の忌避行動を解析するための基礎的な情報収集が行われた。本研究をもとに，家畜および畜産経営に対して悪影響を与えるアブ種の同定とそのアブに対する重点的な対策の立案が期待される。
謝

辞

アブ類の採集にご協力いただきました農家の皆様，採集したアブの種同定にご協力いただきました帯広畜産大学畜産学部
獣医学部

山内健生准教授，共同

安馬英斗さんに深謝いたします。

文献１） Baldacchino, F., Desquesnes, M., Mihok, S., Foil, L.
D., Duvallet, G., Jittapalapong, S.：Tabanids：
Neglected subjects of research, but important
vectors of disease agents!, Infection, Genetics andEvolution, 28, 596～615, 2014.
２） Murakami, K., Kobayashi, S., Konishi, M.,
Kameyama, K., Tsutsui, T.：Nationwide Survey of
Bovine Leukemia Virus Infection among Dairy and
Beef Breeding Cattle in Japan from 2010-2011,

Journal of Veterinary Medical Science, 75（8）, 1123
～1126, 2013.
３）
 農 林 水 産 省：監 視 伝 染 病 の 発 生 状 況 https://www.maff.go.jp/j/syouan/douei/kansi_densen/
kansi_densen.html
４） Kilpatrick, M., Kramer,L. D., Campbell, S. C.,
Alleyne, O., Dobson, A. P., Daszak, P.：West Nile
Virus Risk Assessment and the Bridge Vector
Paradigm, Emerging Infectious Diseases, 11（3）, 425～429, 2005
５）
 Suganuma, K., Kondoh, D., Sivakumar, T.,
Mizushima, D., Elata, A., Thekisoe, O., Yokoyama,N., Inoue N.：Molecular characterization of a new
Trypanosoma （Megatrypanum） theileri isolate
supports the two main phylogenetic lineages of thisspecies in Japanese cattle, Parasitology Research,
118, 1927～1935, 2019.
６）
 早川博文：北海道十勝地方におけるアブ類の発生調査，衛生動物，40（3）,181～186, 1989.
７）
 Werszko, J., Szewczyk, T., SteinerBogdaszewska, Ż., Wróblewski, P., Karbowiak, G.,
L a s k o w s k i Z . ；M o l e c u l a r d e t e c t i o n o f
Megatrypanum trypanosomes in tabanid flies,
Medical and Veterinary Entomology, 34, 69～73,
2020.
８） Kobayashi, D., Faizah, A. N., Amoa-Bosompem, B.,
Watanabe, M., Maekawa, Y., Hayashi, T., Higa, Y.,
Sawabe, K., Isawa, H.：Analysis of Trypanosoma
sequences from Haemaphysalis flava （Acari：
Ixodidae） and Tabanus rufidens （Diptera：
Tabanidae）collected in Ishikawa, Japan, Medical
Entomology and Zoology, 71（4）,79～288, 2020.
９）
 菅沼啓輔，安馬英斗，洪祐天，河津信一郎：北海道十勝地方で発生するアブの季節消長とその保有病原体に関する予備的調査，日本寄生虫学会・日本衛生動物学会第67回北日本支部合同大会，2021.

© The Ito Foundation

311

サルモネラ鶏卵汚染・介卵感染に寄与する鶏卵巣での菌・宿主細胞間相互作用の解明
Elucidation of the interaction between Salmonella and host cells in avian
ovary that underlies egg contamination and transovarian infection

岡

村

雅

史

（帯広畜産大学獣医学研究部門）

Masashi Okamura（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Pullorum（SP）, the causative agent ofpullorum disease in chicks, a legally contagious disease in Japan, is transmitted vertically fromasymptomatic, infected hens through ovarian infection, followed by the death of the progeny,
and then horizontal dissemination in the flock. Resultant high mortality rate finally leads tosignificant economic damage worldwide. We have focused on the granulosa membrane cells（cGCs）surrounding the oocyte as a route of SP transfer to the reproductive organs andidentified OmpA as a protein on the SP outer membrane that binds to the cGC membraneprotein. In this study, we generated an ompA-deficient strain（ΔompA）and tested the
involvement of OmpA in virulence in SP infection. In vitro，ΔompA significantly reduced thenumber of intracellular invading bacteria（p<0.01）in experimental infection of cGCs comparedto the wild type（WT）. To further evaluate the in vivo virulence of ΔompA, experimental
infection was performed using adult chickens; the number of bacteria recovered in the cecal
tonsils, cecum contents, follicles, ovaries and oviducts of ΔompA-inoculated chickens at 15
days post-infection was lower compared to WT-infected chickens. On the other hand, anumber of candidate proteins were detected to serve as receptors for OmpA, suggesting that
one or more of these factors may be involved in the interaction with OmpA in concert．

１．目

ラ食中毒の原因食品としては依然として的

Salmonella enterica血清型Enteritidis汚染鶏卵がサルモネラ食中毒の発生は，1999年の年間825

多く，喫食時の加熱調理の徹底のみならず，採卵件をピークとしてその後，2019年の同21件まで減養鶏場においても鶏卵汚染を防止するためのワク

少傾向にある。しかし，サルモネラ食中毒では死チン接種や衛生管理の徹底をはじめとした対策が亡事例が発生しており，逆に現在発生件数が増加

継続的に行われている。我々はこれまで，2,500傾向にあるカンピロバクター食中毒では死亡事例

種類以上あるサルモネラ血清型のなかでもがゼロである点を考慮すると，サルモネラ食中毒

Enteritidisが鶏の卵巣・卵管に強い親和性を有すは重症化しやすいということがわかる。サルモネることを証明し１，２），それが鶏卵汚染につながる© The Ito Foundation

312

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

メカニズムに寄与していると考えている。また，

菌 側 の 因 子 と し て Outer membrane protein A

血清型Gallinarumを構成する生物型Gallinarumと（OmpA）を検出・同定した（未発表）。OmpAとPullorumは鳥類だけを自然宿主とし，感染する相互作用するcGC膜タンパク質構成成分は，まだとひな白痢や家禽チフスと呼ばれる致死性の高い同定に至っていない。

急性敗血症制疾患を引き起こす。これらはいずれ

そこで本研究では，OmpAがサルモネラの鶏生もわが国では家畜伝染病予防法で法定伝染病に指殖器感染時における細胞との相互作用において果定 さ れ る 重 大 な 感 染 症 で あ る 。特 に 生 物 型

たす役割を明らかにし，さらにその宿主細胞表面

Pullorum（以下SP）は母鶏に全身感染後，卵巣のレセプターを同定することにより，最終的にサや卵管組織に侵入し，その後産出される有精卵にルモネラが鶏卵汚染あるいは鶏胚に介卵感染する

移行することでその中で成熟するひなにも感染メカニズムを解明することを目的とした。

（介卵感染）するため，世界中で経済被害をもたら し て い る 。 SP に よ る 鶏 卵 汚 染 の 頻 度 は

２．方法Enteritidisよりも非常に高いため，我々はSPを用

2.1

いて，前述のEnteritidisに対する市販ワクチンのSP野生型（WT，2001年に千葉県で発生したひ鶏卵汚染防止効果を評価することに成功したと同な 白 痢 事 例 由 来 分 離 株）を 親 株 と し ，λ-red

時に，SPの介卵感染がEnteritidisの鶏卵汚染と共homologous recombination法９）によりΔompAを通のメカニズムによって起こる可能性を示すこと作製した。

ができた 。

ΔompAの作製

2 . 2 in vitro培養細胞を用いたΔompA感染実

３）

一方で，SPの介卵感染のメカニズムについて験は，性成熟に伴う一過性の免疫能の低下が介卵感

採卵鶏廃鶏より成熟卵胞を採取し，コラゲナー

染に関与するという報告 がなされているのみでゼ処理により消化して鶏卵巣顆粒膜細胞（cGC）

あり，SPが卵巣に到達した後，卵母細胞に大量を 単 離 し た 。細 胞 数 を 調 整 し て Ｍ 199 培 地 でに含まれる卵黄へ移行するメカニズムについても

37℃，５％CO２で24時間培養した。並行して培養

いまだ明らかにされていない。鶏の卵胞は，外側しておいたSPのWTおよびΔompAを，培養細胞から順に，卵胞膜，基底膜，顆粒膜，透明帯の４に１細胞あたり50-100個の菌が感染するように接層で包まれており，透明帯の内側に卵母細胞が存種した。３時間後に培養液を除去し，ゲンタマイ

在する５，６）。卵巣顆粒膜細胞（chicken Granulosa

シンを添加して細胞外の菌を殺菌した。さらにハCells：以下cGC）は卵母細胞に最も近い細胞であンクスバッファーで洗浄後，一部のウェルについり，SPの卵黄への移行においてなんらかの形でてはTritonX-100処理により得られた細胞溶解液

通 過 す る 必 要 が あ る 。我 々 は こ れ ま で ，をDHL平板培地に塗抹して細胞内菌数を測定し，Enteritidis７，８）と同様にSPもcGCに接着・侵入す

これを０時間後とした。残りのウェルにはＭ199

ることを見出した（未発表）。さらに，その接着・培地を加えて培養を続け，数時間おきに一部の侵入経路解明の足掛かりとして，cGC膜タンパク

ウェルについてTritonX-100処理により得られた質を表面にカップリングした磁気ビーズにSPの細胞溶解液をDHL平板培地に塗抹して細胞内菌

外膜タンパク質を反応させるプルダウンアッセイ数を測定し，菌株間で比較した。なお，感染性のを行い，cGC膜タンパク質ビーズと相互作用したない大腸菌実験室株であるJM109を陰性対照とし

４）© The Ito Foundation

サルモネラ鶏卵汚染・介卵感染に寄与する鶏卵巣での菌・宿主細胞間相互作用の解明

て用いた。
2.3

313

置を陰性コントロールと比較した。rOmpAビー

鶏を用いたin vivoでのΔompA感染実験

ズとcGC膜タンパク質を反応させた溶出液のレー

120 日 齢 の 採 卵 鶏（ボ リ ス ブ ラ ウ ン）４ 羽 にンを，ビーズのみとcGC膜タンパク質を反応させWTを，５羽にΔompAを経口接種（1.4－8.0×10

7た溶出液のレーンおよびrOmpAビーズのみを溶

CFU／羽）し，その後15日間にわたり回収され出させた溶出液のレーンを比較し，最初のレーンた卵を採材し，産卵率とSP汚染率を算出した。

のみに見られたバンドをrOmpAと相互作用する

また，最終的に全羽安楽殺後，盲腸扁桃，盲腸内cGC膜タンパク質側の因子と考えた。

容，肝臓，脾臓，卵胞，卵巣，卵管を採取した。

2.8

PBSでこれら組織の懸濁液とその10倍階段希釈液

陰性コントロールと比較してバンドが認められを作製してDHL寒天平板培地に100μＬ塗抹し，た ゲ ル を 切 り 出 し ，LC-MS/MS 解 析 お よ び

単位量あたりの生菌数を測定し，群間で比較した。

Mascotデータベース検索により，バンドに含ま

2 . 4 組換えOmpA（rOmpA）の磁気ビーズ
へのカップリング
すでに作製済みのrOmpA 7.5 μgをDynabeads
Co-immunoprecipitation kit（Thermo Fisher

れる当該タンパク質の同定を試みた。
３．結果と考察3 . 1 in vitro培養細胞を用いたΔompA感染実

Scientific，14321D）に含まれるDynabeads M-270
Epoxy 7.5 mgにカップリングした。
2.5

タンパク質解析験
ΔompA感染cGCにおけるcGC細胞内生菌数の

鶏卵巣顆粒膜細胞の膜タンパク質の抽出

平均値は4.57±0.28 log10 CFU/well，JM109感染

前述実験１と同様の手順で鶏卵巣顆粒膜細胞をcGCにおける細胞内生菌数の平均値は3.79±0.07

単 離 し ， Plasma Membrane Protein Extraction

log10 CFU/wellであり，いずれもWT感染cGCにKit（コスモ・バイオ，東京，Ｐ503）を用いて細おける5.38±0.32 log10 CFU/wellよりも有意に（p胞膜タンパク質を抽出した。

＜0.01）低かった（Fig.１）。

2.6

プルダウンアッセイ

3.2

鶏を用いたin vivoでのΔompA感染実験

rOmpAをカップリングしたビーズ（rOmpA

感染15日後の臓器内生菌数は，盲腸扁桃においビーズ）にcGC膜タンパク質0.21 mgを反応させ，てWT群で103.05 CFU/gに対してΔompA群で101.50

洗浄した後，rOmpAビーズと相互作用したcGC

CFU/gと後者での回収菌数は低くなった（p＜膜タンパク質を溶出した。なお，陰性コントロー

0.05）。盲腸内容物や肝臓，脾臓，卵胞，卵巣おルとして，rOmpAをカップリングせずに同様のよび卵管においては，肝臓と脾臓を除いていずれ操作を行ったビーズにも同量のcGC膜タンパク質

もΔompA群においてWT群よりも少ない菌数がを反応させた。溶出したタンパク質を遠心真空濃回収されたが，統計学的な違いはなかった（Fig.

縮器（TOMY，MV-100）により30 μlまで乾燥

２）
。

させた。
2.7

3.3

cGC表面のOmpAレセプターの同定

SDS-PAGEによる溶出タンパク質の展開

rOmpAビーズとcGC膜タンパク質を反応させ溶出タンパク質を10％SDS-PAGEで展開後，た溶出液のレーンに，ビーズのみとcGC膜タンパ

Oriole Fluorescent Get Stain （BIO-RAD ， 161-

ク質を反応させた溶出液のレーンおよびrOmpA0496）を用いて染色し，可視化されたバンドの位

ビーズのみを溶出させた溶出液のレーンには見ら© The Ito Foundation

314

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

6＊log10 CFU/well

5

＊

4
3
2
1
0
WT

ΔompA

JM109

Fig. 1 Mean intracellular bacterial counts in cGC cell monolayer＊p＜0.019log10 CFU/g tissue

8
7

WT

ΔOmpA

6
5
4
3

＊

2
1
0
Cecal
tonsils

Cecal
contents

Liver

SpleenFollicles

Ovary

Oviduct

TissuesFig. 2 Bacterial burdens in layer chickens at 15 days post infection with S. Pullorum wild type（WT）and ΔompA＊p＜0.05

れなかったバンドが２か所に観察された（約26

体での卵汚染にも大きく関与すると考えられた。

kDaおよび約45 kDa）（Fig.３）。いずれのバンド

一方で，OmpAを欠損させてもSPの接着と侵入にも複数の候補タンパク質が含まれており，これが完全には阻害されなかった。OmpAはグラム陰らの一つあるいは複数がOmpAのレセプターと性細菌に見られ，菌体構造の維持に関わる重要なしての役割を果たしているものと示唆された

外膜タンパク質であり10），ペリプラズムに存在す（Table１）。

るＣ末端部分がペプチドグリカンと相互作用する

3.4

ことで膜の安定性に関与している11，12）。その機能

本研究の意義と今後の展望

以上のことから，ΔompAはWTと比較して細は細菌の病原性におけるいくつかの重要なプロセ

胞接着・侵入が低下するとともに，感染鶏においスに寄与する13）と考えられている。菌の宿主上皮て も 産 出 卵 の 汚 染 率 が 低 下 し た 。す な わ ち ，細胞への侵入は多くの細菌感染の病因における重OmpAはcGCへの接着・侵入に不可欠であり，生

要 な ス テ ッ プ で あ り ，さ ま ざ ま な 菌 に お い て© The Ito Foundation

サルモネラ鶏卵汚染・介卵感染に寄与する鶏卵巣での菌・宿主細胞間相互作用の解明

315

Pre
elutionPost elution
Beads

+

+

+

-

-

rOmpA

+

-

+

+

-

cGC MP

+

+

-

-

+

Size (kDa)
75
50

37

25

Fig. 3 cGC membrane proteins（cGC MP, arrows）interactingwith recombinant OmpA（rOmpA）from S. Pullorum

Table 1Candidate cGC membrane proteins interacting as surface receptor(s) with OmpA from S. Pullorum

Band

Accession

Score

emPAI

1

E1C1V31087

1.63

Junction plakoglobin

Description

1

Q766V2635

1.58

Zona pellucida protein D

1

E1BWI0920

0.45

SH3 domain-containing protein

1

F1NSV634

0.24

Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta

1

A0A1D5PWL2

29

0.14

Uncharacterized protein

1

A0A3Q2TVC5

48

0.09

Uncharacterized protein

1

E1BUH523

0.08

Zona pellucida sperm-binding protein 3

1

F1NPI1213

0.05

Transporter

1

A0A1L1RQA3

21

0.05

Sodium/potassium/calcium exchanger 2

1

F1NAN427

0.02

Uncharacterized protein

2

A0A1D5PNK3

105

0.41

Uncharacterized protein

2

F1NL8559

0.23

Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein
glycosyltransferase subunit MAGT1

2

A0A1D5PJK2

16

0.18

Uncharacterized protein

2

A0A3Q2UHG3

39

0.17

Endostatin domain-containing protein

2

A0A1D5PM72

25

0.09

Uncharacterized protein

2

E1BWI068

0.04

SH3 domain-containing protein

2

F1NS6119

0.03

Uncharacterized protein

2

F1NFL649

0.02

Phosvitin

OmpAが細胞への接着・侵入に関与することは（INT407）への接着 14），Acinetobacter baumannii

数 多 く 報 告 さ れ て い る 。例 え ば ，Cronobacter（A. baumannii）の宿主上皮細胞への接着15）およsakazakii（C. sakazakii）の 腸 管 由 来 株 化 細 胞

び腸管出血性大腸菌（EHEC）のヒト子宮頸癌由© The Ito Foundation

316

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

来株化細胞（HeLa細胞）への接着 16）には，いずより垂直伝播することで後代鶏を死に至らしめ，

れもOmpAが介在し，各菌の病原性に関与していさらには水平感染により同居ひなへ伝播し高確率ることから，SPの病原性におけるOmpAの潜在で死亡させるため，世界的に経済被害が大きい。

的 関 与 も 推 測 で き る 。な か で も C. sakazakii は

我々はこれまでSPの生殖器への移行経路として

INT407腸細胞株の細菌侵入にOmpAを必要とす

卵母細胞を取り囲む顆粒膜細胞（cGC）に着目

るが，微小管とマイクロフィラメントの凝縮も侵し，cGC膜タンパク質と結合するSP側のタンパ

入プロセスに重要であることが報告されておク質として，OmpAを同定した。そこで本研究でり ，我々がOmpAを細胞接着因子として検出しは，ompA欠損株（ΔompA）を作製し，SP感染た研究では，E. coliにおいて哺乳動物の細胞へのにおけるOmpAの病原性への関与を検証した。Δ

接着および侵入に関与するOmpXなどの病原性ompAはin vitroにおいて，野生型（WT）と比較に関与するタンパク質がcGCと相互作用する因子

して増殖能が低下し，cGCへの感染実験では細胞として検出されている（未発表）。これらを考慮内侵入菌数が顕著に減少した。さらにΔompAのすると，菌の細胞侵入において他の菌側因子が協in vivoにおける病原性を評価するため，成鶏を用働している可能性は否定できない。一方，本研究

いて感染実験を行った。ΔompA経口接種鶏では，ではcGC膜タンパク質において複数のOmpAレセ

WT感染鶏と比較して，感染15日後の盲腸扁桃，

プター候補が特定された。プロテインスコアや盲腸内容物，卵胞，卵巣および卵管において回収

emPAIなどの指標と，細胞内における当該タン

菌数が低下した。一方，OmpAのレセプターとし

パク質の存在箇所，さらにcGCにおける特異性をての役割を果たす候補タンパク質は多数検出さ考慮すると，バンド１に含まれるZona pelucida

れ，このうち一つあるいは複数の因子が協働してprotein DがOmpAとの相互作用に関与している

OmpAとの相互作用に関与している可能性が示可能性が強く示唆される。今後は同定されたタン

唆された。

14）

17）

パク質の機能解析を行うことでOmpAとの相互作用の意義を探り，SP感染を防御するための糸口となることを期待したい。
また，ひな白痢はその呼称のとおりひなに強い病原性を示す。本研究結果に示すように，成鶏は明らかな臨床症状を見せずに汚染卵を産出するため，SPの病原性を直接評価するのは容易ではない。そこで，ひなを用いた感染実験を実施するな
どして，より評価しやすい表現型に基づいて，
OmpAの病原性への関与を調べる必要があろう。
４．要約

法定伝染病であるひな白痢の原因菌Salmonella
enterica血清型Gallinarum生物型Pullorum（SP）
は，感染後耐過した無症状保菌鶏から介卵感染に文
献１）
 Okamura, M., Kamijima, Y., Miyamoto, T., Tani,
H., Sasai, K., Baba, E.：Differences among six
Salmonella serovars in abilities to colonize
reproductive organs and to contaminate eggs inlaying hens, Avian Dis., 45, 61～9, 2001.
２）
 Okamura, M., Miyamoto, T., Kamijima, Y., Tani,
H., Sasai, K., Baba, E.：Differences in abilities tocolonize reproductive organs and to contaminate
eggs in intravaginally inoculated hens and in vitro
adherences to vaginal explants between Salmonella
enteritidis and other Salmonella serovars, Avian
Dis., 45, 962～71, 2001.
３）
 Okamura, M., Tachizaki, H., Kubo, T., Kikuchi, S.,
Suzuki, A., Takehara, K., Nakamura, M.：
Comparative evaluation of a bivalent killed
Salmonella vaccine to prevent egg contamination
with Salmonella enterica serovars Enteritidis,
Typhimurium, and Gallinarum biovar Pullorum,
using 4 different challenge models, Vaccine, 25,4837～44, 2007.

© The Ito Foundation

サルモネラ鶏卵汚染・介卵感染に寄与する鶏卵巣での菌・宿主細胞間相互作用の解明
４） Wigley, P., Hulme, S. D., Powers, C., Beal, R. K.,
Berchieri, A. Jr., Smith, A., Barrow, P.：Infection of
the reproductive tract and eggs with Salmonella
enterica serovar pullorum in the chicken isassociated with suppression of cellular immunity at
sexual maturity, Infect. Immun., 73, 2986～90, 2005.
５） Reaven, E., Lua, Y., Nomoto, A., Temel, R.,
Williams, D. L., Van der Westhuyzen, D. R., Azhar,
S.：The selective pathway and a high-density
lipoprotein receptor（SR-BI）in ovarian granulosa
cells of the mouse, Biochim. Biophys. Acta., 1436,
565～76, 1999.
６） S c h n e i d e r , W . J . ：R e c e p t o r - m e d i a t e d
m e c ha ni sm s i n ov arian follicle an d oocy tedevelopment, Gen. Comp. Endocrinol., 163, 18～23,
2009.
７） Thiagarajan, D., Saeed, M., Asem, E. K.：
Mechanism of transovarian transmission of
Salmonella enteritidis in laying hens, Poult. Sci., 73,
89～98, 1994.
８） Thiagarajan, D., Saeed, M., Turek, J., Asem, E.
K.：In vitro Attachment and invasion of chicken
ovarian granulosa cells by Salmonella enteritidis
phage type 8, Infect. Immun., 64, 5015～21, 1996.
９） Murphy, K. C.：Use of bacteriophage lambda
recombination functions to promote genereplacement in Escherichia coli, J. Bacteriol., 180,2063～2071, 1998.
10） Krishnan, S., Prasadarao, N. V.：Outer membraneprotein A and OprF：versatile roles in Gramnegative bacterial infections, FEBS J., 279, 919～31,
2012.
11） De Mot, R., Vanderleyden, J.：The C-terminal
sequence conservation between OmpA-related

317

outer membrane proteins and MotB suggests a
common function in both gram- positive andgram-negative bacteria, possibly in the interactionof these domains with peptidoglycan, Mol.
Microbiol., 12, 333～334, 1994.
12）
 Koebnik, R., Krämer, L.：Membrane assembly of
circularly permuted variants of the E. coli outermembrane protein OmpA, J. Mol. Biol., 250, 617～
626, 1995.
13）
 Naylor, K. L., Widziolek, M., Hunt, S., Conolly, M.
Hicks, M. Stafford, P., Potempa, J., Craig, Murdoch.,lan Douglas, C. W., Stafford, G. P.：Role of OmpA2
surface regions of Porphyromonas gingivalis in
host-pathogen interactions with oral epithelial cells,
Microbiology Open., 6, 1～11, 2017.
14）
 Nair, M. K., Venkitanarayanan, K.：Role ofbacterial OmpA and host cytoskeleton in theinvasion of human intestinal epithelial cells byEnterobacter sakazakii, Pediatr. Res., 62, 664～9,
2007.
15）
 Mortensen, B. L., Skaar, E. P.：The contributionof nutrient metal acquisition and metabolism toAcinetobacter baumannii survival within the host,Front. Cell Infect. Microbiol., 3, 1～10, 2013.
16）
 Prasadarao, N. V., Wass, C. A., Weiser, J. N., Stins,
M. F., Huang, S. H., Kim, K. S.：Outer membraneprotein A of Escherichia coli contributes toinvasion of brain microvascular endothelial cells,
Infect. Immun., 64, 146～153, 1996.
17）
 Joachim, V., Schulz, G. E.：The structure of outermembrane protein OmpX from Escherichia coli
reveals possible mechanisms of virulence, Structure,
7, 1301～9, 1999.

© The Ito Foundation

318

ジビエおよび家畜動物におけるトキソプラズマ感染の頻度と新規検査方法の開発
Toxoplasma infection in wild and livestock animals；developing novel
serological diagnostic methods

保科（東京慈恵会医科大学

斉生１，２・櫻井

達也３・嘉糠

洋陸２，３

感染制御科，２実験動物研究施設，３熱帯医学講座）

１

Tokio Hoshina１，２, Tatsuya Sakurai３ and Hirotaka Kanuka２，３（The Jikei University School of Medicine 1 Department of Infectious Disease and Infection Control,
2 Laboratory Animal Facilities, 3 Department of Tropical Medicine）

Toxoplasmosis is caused by Toxoplasma gondii, a zoonotic protozoan infection of foodorigin. It is believed that about 1/3 of the world’s population is infected with T. gondii, andinfections have been reported worldwide. Toxoplasma can infect almost all warm-blooded
animals, with no exceptions for humans and food-producing domestic animals. It has been
noted that human Toxoplasma infections in Japan may be of meat origin, and pork, which iseaten widely, is a particular risk for infection. This study conducted experimental infections
using four micro-mini pigs and measured antibody trends using the Sabin-Feldman dye test
（SFDT）and the TOKIO test, a modified SFDT. Type 3 T. gondii（Gifu clinical isolate）
tachyzoites were used in the infection experiments. The results of the SFDT and TOKIO tests
were correlated and showed a strong correlation with a Spearman rank correlation coefficientof 0.90 and a 95％ confidence interval of 0.84-0.92. As a result, the majority of titers of positive
specimens were SFDT 1:16 and TOKIO test 1：16-1：64. In one pig, antibody titers after PID
126 were negative in both tests, suggesting that SFDT, the golden standard for serologicaltesting, maybe a false negative. The small number of micro-mini pigs in this study was alimitation of this research. In addition, there were no studies that used SFDT to track changes
in antibody titers due to infection against domestic isolates, and further exploration is
warranted．

１．目

動物に感染可能であり，ヒトも家畜も例外なく感的染する。日本国内のヒトのトキソプラズマ感染のトキソプラズマ感染症は，Toxoplasma gondii

多くは，食肉由来であるとの可能性が示唆されての感染が原因であり，食品由来の人獣共通の原虫

おり，特に調理不十分な豚肉や山羊肉の摂取はリ感染症である。感染者は世界人口の約1/3に達す

スクであると考えられている１）。本邦の妊婦を対ると考えられており，世界中で感染が報告されて象とした疫学調査では，約10％の妊婦が抗体を保いる。またトキソプラズマは，ほぼすべての温血有しており２），我々が行ったHIV感染者を対象と© The Ito Foundation

ジビエおよび家畜動物におけるトキソプラズマ感染の頻度と新規検査方法の開発

319

した調査では，抗体保有率が8.3％であることがObservation Test（TOKIOテスト）で測定した。

判明した 。妊婦や免疫抑制者では重篤な病態を

SFDTは，生鮮虫体（タキゾイト）を被験血清引き起こすため，注意が必要な感染症である。

と反応させた後にメチレンブルーで染色し，虫体３）

家畜におけるトキソプラズマ症は，無症状またの傷害程度を評価する。本研究で行ったSFDTのはサブクリニカルな場合が多く，急性期感染でな

プ ロ ト コ ル は ，過 去 の 報 告 と 同 様 に 実 施 し ，い限り，解体時にトキソプラズマ感染を検出する

Type 1 T. gondiiを使用し，希釈血清（１：４，

ことは難しい。よって，トキソプラズマに感染し

１：16，１：64，１：256，１：1024）においてた大部分の家畜は，と畜場における検査で検出で青染虫体が50％未満となる，最高希釈濃度を抗体きない可能性が高い 。特に感染リスクが比較的価とした７）。SFDTは検査を２回行い，得られた高いブタでは，正確な診断方法が必要である４）。

抗体価の平均値を結果として用いた。TOKIOテ

一般的に感染の検出には，血清学的検査（ELISA

ストでは，GFP発現T. gondiiのタキゾイトを用法など）が使用される頻度が高い。一方で，血清い，虫体の傷害をGFPの消退として観察した。

学的検査のゴールドスタンダードであるSabin-

TOKIOテストの工程はSFDTと同様に行い，蛍Feldman Dye Test（以下SFDT）は高い感度と光顕微鏡（×400倍）を用いてGFPの発光像を撮

特異度を有すが，手技が煩雑であり，評価には習影した。撮影は一希釈検体あたり５視野とし，画熟したスキルを要すため，検査が可能な機関は限像解析ソフトImage Jを用いて発光範囲の平均面られている 。我々はSFDTの改良が，正確なト積を算出した。各希釈検体の発光面積を，陰性コ

キソプラズマ診断に寄与する可能性を考え，本研ントロールの発光面積で除した数値が0.5未満と究を計画した。本研究では，感染マイクロミニ

なる最高希釈濃度を抗体価とした。いずれのテス

ピッグにおけるトキソプラズマ感染後の抗体価

トも１：16以上の結果を陽性と判定し，それ未満

を，SFDTと改良SFDTで測定し，検査性能の比を陰性と判定した ８）。感染前の血液検体をPost

較，抗体価の推移を明らかにした。

Infection Days（PID）０とし，以降１週間ごと

４）

５）

２．方

の血液検体をPID182まで評価した。

法

本研究ではType 3 T. gondii（岐阜臨床分離株）

３．結果と考察を用いた感染実験を行った６）。一般的に，Type

トキソプラズマのシストを経口投与した４頭の３のトキソプラズマは，マウスに対して低病原性

マイクロミニピッグは観察期間中，無症状であであり，感染後も無症候であることが多いが，本り，182日間生存した。４頭のSFDTの抗体価の株はシストの経口摂取によりマウスでも高い病原推移をFig.１に，TOKIOテストの抗体価の推移性を示すことが知られている。本株のタキゾイト

をFig.２にまとめた。１頭（Ａ）ではシストの経をマウスの腹腔内に接種し，感染マウスを作成

口摂取から182日間にわたり，SFDTとTOKIOテし，その脳乳化液（多数のブラディゾイトを内包

ストが，カットオフ値である１：16以上にならするシストを約900個含有）を用意した。この脳ず，感染の不成立，または抗体の非産生が示唆さ

乳化液を４頭のマイクロミニピッグに経口投与れた。他の３頭（B，C，D）ではPID 21以内にし，感染後182日までの抗体価の推移をSFDTと抗体価の上昇が認められた。PID 14の時点で，改 良 SFDT で あ る Toxoplasma Killing

１頭（Ｄ）でSFDT，２頭（B，D）でTOKIOテ© The Ito Foundation

320

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

1:256

SFDT

1:64

1:16

1:4

A

C

y1
82

da

y1
68

da

y1
54

da

y1
40

da

y1
26

da

y1
12

y9
8

B

da

da

y8
4
da

y7
0
da

y5
6
da

y4
2
da

y2
8
da

y1
4
da

da

y0

0

D

Fig. 1 The following figure shows the trends in antibody titers （SFDT） after

Toxoplasma infection in four micro-mini pigs. The values on the vertical axis
represent the dilution fold of the tested sera. A result of 1:16 or greater was
defined as positive.

>1:1024

TOKIO test

1:1024

1:256

1:64

1:16

1:4

A

B

C

82
y1

da

68
y1

da

54
y1
da

40

da
y1

26
da

y1

12
da
y1

8
da

y9

4
y8
da

0
y7
da

6
y5
da

2
y4
da

8
y2
da

4
y1
da

da
y

0

0

D

Fig. 2 The following figure shows the trends in antibody titers（TOKIO test）after

Toxoplasma infection in four micro-mini pigs. The values on the vertical axis
represent the dilution fold of the tested sera. A result of 1:16 or greater was
defined as positive.

ストの陽転化が認められた。抗体価の最高値は，1024以上の抗体価を認めた。同個体の両検査の抗いずれもＢ個体で認められ，SFDTではPID 56に

体価は経過とともに漸減し，PID 70以降は１：

１：64-１：256，TOKIOテストではPID 49に１：16の抗体価で安定し，PID 126には１：４（カッ© The Ito Foundation

ジビエおよび家畜動物におけるトキソプラズマ感染の頻度と新規検査方法の開発>1:1024321

ρ=0.90,95%CI (0.84-0.92)

1:1024
1:256
1:64
1:16
1:4

1:4

1:16

1:64

1:256

Fig. 3 The correlation between the SFDT and TOKIO test is summarized in a

bubble chart. The size of the circles in the figure represents the number of
specimens matching equal titers. Light gray circles indicate negative samples forboth tests, and dark gray circles indicate positive samples for at least one of thetests.

トオフ値以下）まで低下した。他の２頭（Ｃ，Ｄ）

強い相関関係にあることが明らかになった。Ａのは，SFDTでPID 21をピークに，TOKIOテスト

個体の抗体価は，SFDTとTOKIOテストで一致

ではPID 35（C）とPID 42（D）をピークに抗体しており，観察期間中はいずれも陰性であった。

価の安定を認めた。以降の期間は，SFDTで１：

原因として感染の不成立，もしくはトキソプラズ

16以上の保持を認めたが，TOKIOテストではＣ

マ抗体の非産生があると考えられた。Ｃ，Ｄの個個体においてPID133-140の間，抗体価が１：４

体は，一度抗体価が上昇した後に，長期にわたりまで低下した。PID 147以降は１：16まで再上昇

抗体価が維持され，双方の検査は矛盾をしない結し，以降は安定を認めた。

果であった。一方で，一部の検査では結果が乖離

４頭のマイクロミニピッグにおける，SFDTとした。特にＢ個体の検査で見られた，PID 133-

TOKIOテストの検査結果を経時的に比較し，そ140のTOKIOテストの陰転化については，臨床検の関係をFig.３のバブルチャートにまとめた。図

査上，偽陰性になるため注意が必要である。また中の円のサイズは，その条件に一致する検体数をＢ 個 体 で は ， 感 染 の 約 ２ ヶ 月 後 に SFDT と表す。また，淡いグレーの円は両検査が陰性の検

TOKIOテストで高い抗体価が見られたが，その体を，濃いグレーの円は，少なくとも一方の検査

後抗体価は漸減し，PID 133以降は両テストともが陽性の検体を示している。SFDTとTOKIOテに陰転化を認めた。これまでは，トキソプラズマ

ストの結果は，スピアマン順位相関係数（ρ）に感染した個体は，長期間にわたり抗体価が持続

0.90，95％信頼区間0.84-0.92と強い相関関係を認すると考えられていたが，感染後早期に抗体が陰めた。結果として，検査で得られた陽性検体の多転化する個体の存在が示された。稀ではあるが，

くは，SFDT 1：16，TOKIOテスト１：16-１：

ヒトでもトキソプラズマIgG陰性の感染再燃例が64であった。

報告されており，発症の数ヶ月後に抗体が陽性転

本研究の結果から，SFDTとTOKIOテストは化した症例が報告されている９）。本研究のＢ個体© The Ito Foundation

322

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

でも，同様の反応が起きていた可能性がある。なある。

お，今回の研究で対象としたマイクロミニピッグの頭数が少なかった点は，本研究の制約である。
ただし，国内の分離株を用いて，感染実験により抗体価の推移を追跡した研究は少なく，重要な知見が得られたと考えている。本研究の結果は，飼育されたマイクロミニピッグにおける検証に限られているが，今後は野生のイノシシやシカを対象にした研究を展開したい。
４．要約

本 研 究 で は ，国 内 で 分 離 さ れ た Type 3 T.
gondiiをマイクロミニピッグ４頭に経口感染させ，その後の抗体価の推移をSFDTとTOKIOテ
ストを用いて明らかにした。SFDTとTOKIOテストの結果は強く相関した（スピアマン順位相関係数0.90，95％信頼区間0.84-0.92）。一部の検査結果には乖離が見られ，解釈には注意を要すが，TOKIOテストの結果はSFDTに近似することが示された。また，観察期間中に抗体価が漸減し，両テストともに陰転化する個体が確認された。ヒトのトキソプラズマ感染症では，稀に血清学的検
査が陰性になることが報告されており，マイクロ文
献１）
 Konishi, E., Takahashi, J.：Int. J. Epidemiol., 16,277～281, 1987.
２）
 Sakikawa, M., Noda, S., Hanaoka, M., Nakayama,
H., Hojo, S., Kakinoki, S., Nakata, M., Yasuda, T.,
Ikenoue, T., Kojima, T.：Clin. Vaccine. Immunol.,19, 365～367, 2012.
３）
 Hoshina, T., Horino, T., Saiki, E., Aonuma, H.,
Sawaki, K., Miyajima, M., Lee, K., Nakaharai, K.,
Shimizu, A., Hosaka, Y., Kato, T., Sato, F.,
Nakazawa, Y., Yoshikawa, K., Yoshida, M., Hori, S.,
Kanuka, H.：J Infect Chemother., 26, 33～37, 2020.
４）
 松尾加代子：IASR, 43, 53～54, 2022.
（https://www.niid.go.jp/niid/ja/typhi-m/iasr
reference/2563-related-articles/related-articles505/11037-505r03.html, 2022/4/17アクセス）５）
 Reiter-Owona, I., Petersen, E., Joynson, D.,
Aspöck, H., Dardé, M. L., Disko, R., Dreazen. O.,
Dumon, H., Grillo, R., Gross, U., Hayde, M., Holliman,
R., Ho-Yen, D. O., Janitschke, K., Jenum, P. A.,
Naser, K., Olszewski, M., Thulliez, P., Seitz, H. M.：
Bull. World Health Organ., 77, 929～935, 1999.
６）
 Taniguchi, Y., Appiah-Kwarteng, C., Murakami,M., Fukumoto, J., Nagamune, K., Matsuo, T.,
Masatani, T., Kanuka, H., Hoshina, T., Kitoh, K.,
Takashima, Y.：Parasitol. Int., 67, 587～592, 2018.
７）
 Sabin, A. B., Feldman, H. A.：Science, 10, 660～
663, 1948.
８） 保科斉生，青沼宏佳，堀誠治，嘉糠洋陸：Clin.
Parasitol., 27, 105～108, 2016.
９）
 Shiojiri, D., Kinai, E., Teruya, K., Kikuchi, Y., Oka,
S.：Emerg. Infect. Dis., 25, 841～843, 2019.

ミニピッグでも同様の現象が起きていた可能性が© The Ito Foundation

323

網羅的ジェノタイピングによる新規牛伝染性リンパ腫抵抗性遺伝子の同定（Ⅲ）
Identification of novel bovine leukosis resistance-associated alleles bycomprehensive genotyping（Ⅲ）

目

堅

博

久

（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）

Hirohisa Mekata（Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki）

Bovine leukemia virus（BLV）is an etiological agent of malignant lymphoma in cattle
which is called enzootic bovine leukosis（EBL）. Approximately 35％ of cattle in Japan havebeen infected with BLV. BLV can cause lifelong infection, and no vaccines or therapeutic
procedures are currently available to prevent BLV infection or EBL development. Therefore,
novel control methods to reduce the incidence of EBL are required from livestock industries.
Cattle with higher BLV proviral loads represent a higher risk of both horizontal and verticaltransmission. Thus, the development of methods reducing the proviral load in cattle should be
effective to protect BLV-free cattle. A genome-wide association study to identify single
nucleotide polymorphisms（SNPs）associated with BLV proviral load was conducted in thisstudy. The study examined 142 cattle with a low proviral load and 146 with a high proviralload. Single SNP（ID; AX-168291905）on chromosome 1 was correlated with the proviral load.
To follow up on the result of GWAS, we investigated the correlation between the proviral load
and allele of the SNP（AX-168291905） in additional 1,425 samples. Mean（median）values ofproviral loads were 1,796 copies/50 ng of genomic DNA（1,289 copies/50 ng）in the A_A allele,
1398 copies/50 ng（876 copies/50 ng）in the A_G allele and 1053 copies/µl（557 copies/50 ng）
in the G_G allele. Significant differences were confirmed between A_A and A_G, and A_A and
G_G. These results showed that the SNP would be associated with the proviral load. We
believe that this study will promote the construction of effective measures to prevent BLV
infection and control the spread of BLV．

１．目ス （bovine leukemia virus：BLV） の 感 染 を的原因とする。BLV感染牛の約５％が，感染か

家畜監視伝染病のうち，牛の伝染病で最も多ら数年後にEBLを発症して予後不良や全廃棄処く報告されているのが牛伝染性リンパ腫（旧分となるため，畜産業にとって大きな経済的損

名：牛白血病）である。牛伝染性リンパ腫のほ失となる。日本では，約35％の牛がBLVに感と ん ど を 占 め る 地 方 病 型（Enzootic bovine

染しているが，豪州やニュージーランド，西欧leukosis：EBL）は，牛伝染性リンパ腫ウイル

諸国では清浄化されている１）。デルタレトロウ© The Ito Foundation

324

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

イルス属に分類されるBLVは，宿主の染色体

るリンパ球の多様性消失に繋がる。そのため，にウイルス遺伝子を組み込むため，生涯にわ

BLV以外の特定の感染症に対して，牛群全体

たって感染を持続させることができる。感染やが強い感受性を示す可能性が否めない。そのた発症を防ぐワクチンおよび治療薬がないことかめ，BoLA以外の宿主遺伝子からBLV抵抗性に

ら，BLVに感染させないことがEBL被害を防関与する遺伝子を明らかにする必要がある。

ぐ，唯一の方法である。

0902遺伝子は6.8％の牛が保有しているが６），黒BLV感染から半年ほど経過するとセットポ毛和種の1/2から1/3は低リスク牛である。すな

イント期となり，血液中のプロウイルス量が安わち，BoLA class Ⅱ遺伝子以外にもBLV抵抗定する。我々はこれまでに，BLVを他の牛に性に関与する遺伝子が存在するのではないか。

伝播する感染源リスクとセットポイント期におそこで本研究では，ウイルス量と宿主の一塩基

けるプロウイルス量との相関を明らかにしてき多型（SNP）との網羅的比較解析から，新規た 。500 copies/50 ng of genomic DNA 以 上 のBLV抵抗性遺伝子を同定することを目的とし牛が水平および垂直感染の主要な感染源となるた。

高リスク牛であり，それ以下が感染源とはなりにくい低リスク牛である２～４）。つまり，すべて

２．方法の感染牛を対象とした対策よりも，高リスク牛

2.1

検体

に対象を絞ったBLV対策が効率的である。

2018年４月から2021年２月にBLV検査を目的

感染率が高い地域では，経営を維持するためとして採取した血液（12ヶ月齢以上，雌）のうにも高リスク母牛による繁殖が欠かせない。しち，BLV感染を確認した血液のゲノムDNAを使かし，高リスク母牛は約40％の確率でBLVを用した。なお，BLV検査の際に，獣医師を通し母子間伝播する。つまり，新生子牛への母てウシの所有者に本研究への検体利用に関する同子間伝播を防ぐ，もしくは新生子牛のプロウイ

意を得ている。本研究では，ELISAとリアルタ

ルス量を抑えて，子牛を新たな感染源としない

イムPCRでともに陽性の検体をBLV感染とした。

方法が必要である。牛のMHCクラスⅡ遺伝子

ELISAは，市販のELISAキット（牛伝染性リンで あ る BoLA class Ⅱ は 牛 の 23 番 染 色 体 上 に

パ腫エライザキット；ニッポン・ジーン，東京，

コードされている。このうちDRB３遺伝子に日 本） を 用 い た 。 リ ア ル タ イ ム PCR は ，は多型が存在し，そのタイプによってBLVのmagLEAD 12gc（プレシジョン・システム・サ

ウイルス量が明確に決定されることが明らかとイエンス，松戸，日本）でゲノムDNAを抽出しなっている 。それらのうち，DRB3 0902遺伝て濃度を調整後，既報のプライマー／プローブを子（0902遺伝子）はBLV抵抗性遺伝子と呼ば一部修正してプロウイルス量を定量した７）。

３，
４）

５）

＊

れ，この遺伝子をヘテロもしくはホモで持つウ

2.2

シは，例外なくウイルス量が低い 。そのため，

SNPアレイ解析には計288検体の黒毛和種のゲ

高リスク母牛に0902遺伝子を持つ種牛を交配す

ノムDNAを使用した。リアルタイムPCRの結果，ることで，新生子牛を50％以上の確率で抵抗性

2,000 copies/50 ng を 超 え た 146 検 体 を 高 リ ス ク

牛にすることができる。

群，100 copies/50 ng以下の142検体を低リスク

６）

一方，MHC class Ⅱの偏りは，集団におけ

SNPアレイ解析群とした。なお，遺伝的な偏りを防ぐため，１農© The Ito Foundation

網羅的ジェノタイピングによる新規牛伝染性リンパ腫抵抗性遺伝子の同定（Ⅲ）

325

場 あ た り 最 大 ３ 検 体 を 供 し た 。SNP ア レ イ

い て ，以 下 の プ ラ イ マ ー を 設 計 し た 。Allele-（GeneTitan, Axiom Bovine Genotyping v3

specific primer：5’-CTCTGTTTCACCACCAC

Array；サーモサイエンティフィック社）はタカ［A/G］ ACTGT-3’，Locus-specific reverse

ラバイオ社（草津，日本）およびサーモサイエン

primer：5’-GCCATGCAGCCTATATAAGTGA

ティフィック社（東京，日本）に受託解析した。

TGTTCTTGT-3’。検体には，黒毛和種を1,342検

データ解析には，SNP & Variation Suite Ver8.9.0

体 と ホ ル ス タ イ ン 種 を 83 検 体 を 用 い た 。

（ゴールデンヘリックス社，ボーズマン，米国）

Combined Master Mix and Reporter Mix を 5.0を用いた。ゲノム参照配列にBos taurus UMD3.1

μl，rhAmp SNP Assayを0.3 μl，ゲノムDNAを（GCA_000003055.3）を，SNPマーカーマップに

20 ng加え，さらに超純水で全量を10 μlとした。

Axiom BovMDv３（サーモサイエンティフィッ

PCR条件は，95℃10分の後，95℃10秒，60℃30秒，

ク社）を用いた。サンプルデータのクオリティー

68℃20秒を40サイクル行い，FAMでメジャーア

チェックはCall rate ＞0.95を，ジェノタイピング

レルのＡを，VICでマイナーアレルのＧを検出しデータのクオリティチェックはCall rate >0.95,

た。各アレルとプロウイルス量の統計解析は，ク

Minor allele frequency >0.01, Hardy Weinberg平ラスカル・ウォリス検定およびダンの多重比較検衡＞0.001を条件とした。さらに，連鎖不平行解定を用いた。また，p ＜0.05を有意差ありとした。

析を行い，関連性の高いSNP（r ＞0.9）を解析
２から除外した。相加，優性および劣性モデルを用

３．結果と考察

い て ， 各 SNP と 各 リ ス ク 群 と の 相 関 を

SNP Arrayに供した全288検体がサンプルのク

correlation-trend testで解析した。各モデルにおオリティコントロールを満たした。また，SNPのい て genomic inflation factor（λ）を 算 出 し ，クオリティコントロールおよび連鎖不平衡解析のgenomic control法でサンプルのバイアス補正を結果，34,491個のSNPを以下の解析に用いた。こした。統計解析はフィッシャーの正確確率検定で

れら34,491個のSNPsについて相加，優性および行 い ，ボ ン フ ェ ロ ー ニ 補 正 よ り 算 出 し た 値

劣性モデルにおいてプロウイルス量との相関解析－6（0.05/34,491＝1.449×10 ）をゲノムワイド関連を行い，マンハッタンプロットに描出した（Fig.

解 析 に お け る 有 意 差 の 基 準 と し た 。ま た ，１）。すべてのモデルにおいて，ゲノムワイド関

genomic control法が保守的な補正方法であり，連解析における有意水準（p＝1.449×10－6）を満

偽陰性が多くなることから，p ＜1.0×10－5を緩やたしたSNPは存在しなかった。一方，１番染色体

かな有意差ありとした。

上の95,193,165（SNP ID：AX-168291905）に位置

2 . 3 リアルタイムPCR法によるSNPジェノタ

するSNP，および23番染色体上の25,642,674（SNP
ID：AX-124375550），28,568,745（SNP ID：AX-

イピング
SNP ジ ェ ノ タ イ ピ ン グ に は ， rhAmp SNP

185116447），30,773,701（SNP ID：AX-115113358）

Genotyping System（IDT社，コーラルビル，米国）に位置する３つのSNPが，相加モデルにおいて，を 用 い た 。初 め に ，標 的 と し た SNP（Chr1；

緩 や か な 有 意 水 準（p ＝ 1.0 × 10 ５）を 満 た し た

95,193,165）の前後500塩基配列を公共データベー（Fig. 1a）。また，AX-168291905は，優性モデル

ス よ り 抽 出 し た 。続 い て ，抽 出 し た 配 列 か ら

においても緩やかな有意水準を満たした（Fig.

rhAmp Genotyping Design Tool（IDT 社）を 用1b）。なお，劣性モデルでは緩やかな有意水準を© The Ito Foundation

326

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

(a)

7

6

-log10(p)

5

4

3

2

1

(b)

7

6

-log10(p)

5

4

3

2

1

(c)

7

6

-log10(p)

5

4

3

2

1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 26 27 29
25
28

Chromosome

Fig. 1 Manhattan plot of a genome-wide association study on bovine leukemia virus proviral loadin 288 cattle.

Manhattan plots of additive, dominant and recessive models are depicted. The number ofchromosomes and the negative logarithm of the association p values are displayed along thex-axis and y-axis, respectively. p value was calculated by Fisher’s exact test, and the bold andthin lines indicated the p value of 1.449×10-6 and 1.0×10-5, respectively.

満 た す SNP は 存 在 し な か っ た（Fig. 1c）。AX-

6（GPX6, Chr1；95,159,026-95,166,199） お よ び

168291905 は ウ シ の spermatogenesis associatedzinc finger and SCAN domain containing 23

protein 16（SPATA16, Chr1；94,965,198-（ZSCAN23, Chr1；95,203,732-95,206,770）

95,364,350）をコードする遺伝子のイントロンにコードするため，このSNPがこれらの遺伝子発現位置する。また，近傍にglutathione peroxidaseなどに影響している可能性がある。

© The Ito FoundationをFluorescence intensityof VIC (G)

網羅的ジェノタイピングによる新規牛伝染性リンパ腫抵抗性遺伝子の同定（Ⅲ）

327

G_G
G_A

A_A
Fluorescence intensity of FAM (A)Fig. 2 Allelic discrimination plots by rhAmp SNP genotyping assays.

Allelic discrimination plots for the target SNP（Chr1；95,193,165）were

obtained using rhAmp SNP genotyping assays on 95 samples. The dots
located near the y-axis and x-axis represent the homozygous genotypes（y-axis：G_G, x-axis: A_A）and the dots located far from the y- and x-axis
represent the heterozygous genotypes（A_G）.

SNPアレイの結果，AX-168291905において，

３）。統計解析の結果，Ａ_AとＡ_GおよびＡ_A

マイナーアレルであるＧを持つウシは，メジャーとＧ_Gの間で有意な差が認められた。以上から，

アレルであるＡを持つウシに比べて，低リスク群

１番染色体上の95,193,165番に位置するSNP（ID：が多いことが示された。しかし，SNPアレイでは

AX-168291905）において，マイナーアレルＧを数万を超えるSNPを解析するため，そのうちの１持つウシは，メジャーアレルＡを持つウシに比べつが偶然に有意水準を満たすこともある。そこて有意にBLVのプロウイルス量が低くなること

で，さらに検体数を増やして，プロウイルス量とが明らかとなった。

の関連性について検討する必要があった。本研究では，AX-168291905におけるアレルを簡便に検４．要約出する方法としてrhAmp SNPジェノタイピング

牛伝染性リンパ腫ウイルス（BLV）の感染をの確立を試みた。この方法により，１ランのリア主因とする牛伝染性リンパ腫は，2008年以降，最ルタイムPCRで，95検体のAX－168291905におも多い牛の監視伝染病である。日本では約35％のけるアレル（Ａ_A, A_G, G_G）を簡便に区別す

牛がBLVに感染していることから，新たな対策

ることが可能となった（Fig.２）。そこで，プロ法の開発が必要である。すべての感染牛がBLV

ウイルス量を測定済みのウシのゲノム1,425検体の感染源となるのではなく，プロウイルス量が高（黒毛和種1,342検体，ホルスタイン種83検体）のい牛のみが感染源となる。そこで，プロウイルス

AX-168291905におけるアレルを決定し，プロウ

量を遺伝学的な手法で抑えるアプローチが有効か

イルス量とアレルとの相関解析を行った。その結もしれない。牛の23番染色体に位置するBoLA

果，Ａ_Ａを持つ感染牛768頭のプロウイルス量のclass Ⅱの多型領域は，個体により大きく異なり，

平 均 値 （中 央 値） は 1,796 copies/50 ng （1,289

それがセットポイント期のプロウイルス量に寄与

copies/50 ng），A_Gを持つ感染牛555頭のプロウ

する。多くの研究者がこの部位の解析に取り組ん

イ ル ス 量 の 平 均 値（中 央 値）は 1,398 copies/50

でいる一方で，23番染色体以外にもプロウイルス

ng（876 copies/50 ng），G_Gを持つ感染牛102頭量に寄与する遺伝子があるのかはまったく不明での プ ロ ウ イ ル ス 量 の 平 均 値（中 央 値）は 1,053あった。そこで，ゲノムワイド関連解析からBLV

copies/50 ng（557 copies/50 ng）であった（Fig.

のプロウイルス量に関与する遺伝子があるのかを© The Ito Foundation

328

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）
p< 0.05
p< 0.05

Bovine leukemia virus proviral load
(copies/50 ng of genomic DNA)

2000

1500

1000

500

A_A
(n=768)A_G(n=555)

G_G(n=102)

Fig. 3 Comparison of bovine leukemia virus proviral load among cattle withhomozygous and heterozygous genotypes in the target SNP.

Bovine leukemia virus proviral loads were compared among cattle with A_

A, A_G, and G_G alleles in the target SNP（Chr1；95,193,165）. Mean
（median）values of proviral loads were 1,796 copies/50 ng（1,289 copies/50ng）in the A_A allele, 1398 copies/50 ng（876 copies/50 ng）in the A_G
allele, and 1053 copies/50 ng（557 copies/50 ng）in the G_G allele.

明らかにすることを本研究の目的とした。本研究の結果，１番染色体上の１つのSNP（ID：AX168291905）がプロウイルス量に影響を与えることが明らかとなった。AX-168291905は１番染色体上95,193,165bpに位置し，SPATA16遺伝子をコードする領域に位置する。今後は，このSNPと連動する遺伝子を見つけ出し，その遺伝子の多型や発現量がプロウイルス量と相関するのかを解明

文献１）
 Murakami, K., et al.：J. Vet. Med. Sci., 75, 1123～
1126, 2013.
２）
 Mekata, H., et al.：Jpn. J. Vet. Res., 66, 157～163,2018.
３） Mekata, H., et al.：Vet. Rec., 176, 254, 2015.
４） Mekata, H., et al.：Vet. Sci., 27, 255, 2021.
５） Lo, CW. et al.：Viruses, 12, 352, 2020.
６）
 Hayashi, T., et al.：J. Vet. Med. Sci., 79, 1552～
1555, 2017.
７）
 Takeshima, S.-N., et al.：Arch. Virol., 160, 1325～
1332, 2015.

したい。

© The Ito Foundation

329

牛の腸アミロイド症の根絶を目的とした
AAアミロイド症原因遺伝子の同定
Identification of causative gene of AA amyloidosis for eradicating
intestinal amyloidosis in cattle

上

家

潤

一

（麻布大学獣医学部）

Junichi Kamiie（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

This study revealed that the deposited amyloid in the organs contained both of wild-type
and mutant SAA in bovine AA amyloidosis by mass spectrometry. Since mutant SAA has
been detected in the deposited amyloid in all of 33 cases, the involvement of mutant SAA in
the formation of amyloid genesis was considered important in the pathogenesis of AA
amyloidosis.
Although the gene encoding mutant SAA was not detected by real time PCR, digital PCR
could detect the mutant SAA gene in the liver of all cases affected with amyloidosis at afrequency of 0.25％. This low mutation rates suggest that the mutation of SAA gene werecaused by somatic mutation in the liver. Those findings indicate a pathogenesis of AA
amyloidosis triggered by mutant SAA generated in hepatocytes. To prove this novel
pathogenesis of AA amyloidosis, it is necessary to exhibit the high amyloidogenicity of mutant
SAA. Unfortunately, we could not show the amyloidogenicity of mutant SAA in this study. We
would like to try amyloid fibrils formation assay in the further study using recombinant SAA
created in this study．

１．目

い。根本的な治療法はなく，治療は対症療法に限的られている。AAアミロイド症は哺乳類，鳥類に

本研究の目的は，牛の難治性下痢の要因である

共通して発生する疾患であるが，発生頻度には著腸アミロイド症の根絶のために，AAアミロイド

しい動物種差が存在する。牛では頻発する疾患で症の原因遺伝子を明らかにすることである。

あるが，豚では非常にまれである。現在のAAア

Amyloid A （AA） ア ミ ロ イ ド 症 は Serum

ミロイド症の発生機序は，炎症刺激により血中

amyloid A protein（SAA）を前駆タンパク質とSAA上昇することが原因とされている。しかし，する線維状のAAアミロイドが全身諸臓器に沈着

豚でも炎症時には血中SAAは上昇することが報する疾患である。特に腸粘膜にAAアミロイド症

告されており，SAA濃度上昇だけでは発生頻度が沈着する腸アミロイド症は，牛の難治性下痢のの種差は説明できない。牛で高率にAAアミロイ

主要な原因の一つであり，生産性への影響が大きド症が発生する原因は，SAA濃度の上昇以外に© The Ito Foundation

330

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）あると考えられる。牛の腸アミロイド症の予防・

time PCR（StepOne, Applide Biosystems）お よ治療法の開発，疾患根絶のためには病理発生機序

びdigital PCR（Clarity, JN Medsys）を用いて野を解明し，真のリスクファクターを明らかにする

生型，変異型SAA遺伝子のジェノタイピングをことが重要であるが，詳細はいまだに不明である。

行った。コントロールとして合成した野生型，変豚では変異型SAAがAAアミロイド症の病理発生に関与することが報告されている 。本研究で１）異型遺伝子を組込んだプラスミドを用いた。
2 . 4 変異型，野生型SAAのアミロイド線維形

は，牛のAAアミロイド症における変異型SAAの証明とアミロイド線維形成への関与を明らかにすることを目的とした。
２．方
2.1

成性の比較
野生型と変異型SAAのHisタグラベルされた全長タンパク質を大腸菌発現にて作成した。リコン
ビナントSAAは，His精製し，SDSPAGEで発現法を確認した。

病理組織学的解析

2 . 5 リコンビナントタンパク質のアミロイド

過去にAAアミロイド症と診断された牛33例の線維形成

全身臓器について，HE染色，コンゴーレッド染

作成した各リコンビナントSAAを10％酢酸溶

色，SAAの免疫染色を実施し，AAアミロイドの液に１mg/mlの濃度で溶解し，37℃で１週間静沈着を確認した。

置した。溶解液を蒸留水で100倍に希釈したもの

2.2

沈着SAA型の同定

申請者の開発したアミロイド抽出をコロイド膜グリッド上に滴下し，negative 染に従い，沈色（EMステイナー，日新EM）して透過型電子着臓器のパラフィン切片からDMSOを用いてア顕微鏡（JEM-1400，日本電子）により観察した。

２）

ミロイドを抽出した。抽出物をトリプシン消化し，LC-MS/MS（Orbi-Trap, ThermoScientific）

３．結果と考察で測定した。検出はSelected reaction modeで行

3.1

い，野生型SAAと，豚で検出された中央部のア33例すべてにアミロイドの沈着を確認した。すラニンがバリンに変化した変異型SAAの変異部

べての症例で肝臓のディッセ腔，腎臓髄質の間質位を含む配列（Fig.１）をペプチドの質量特異的に均質無構造の好酸性物質の沈着を認めた。特にに検出した。

肝臓への沈着が高度であった。これらの沈着物は

2.3

コンゴーレッド染色にて偏光顕微鏡下で緑色を呈SAA遺伝子ジェノタイピング

各 症 例 の 肝 臓 組 織 か ら DNA を 抽 出 し ，realProtein

Genome病理組織学的解析

し（Fig.２），抗SAA抗体を用いた免疫染色に陽Wild

GPGGAWAAK

MutantGPGGVWAAKWild

GGACCTGGGGGCGCTTGGGCGGCCAAA

Mutant

GGACCTGGGGGCGTTTGGGCGGCCAAA

Fig. 1 Protein and gene sequence of SAA. Boxes indicate mutation site.

© The Ito Foundation

牛の腸アミロイド症の根絶を目的としたAAアミロイド症原因遺伝子の同定

331

Fig. 2 Histological findings of bovine liver affected with AA amyloidosis. （Left）HE stain of the liver of a cow withAmyloidosis. Severe amyloid deposition in the disse space.（Right）Congo-red stain. Amyloid deposited has
characteristic green birefringence under polarized light.

Case1

intensity(10×3)

140

GPGGVWAAK（Mutant）

120
100
80
60
40

GPGGAWAAK（Wild）

20
00intensity(10×3)

Signal intensity

250

20

30

40

50

10

20

30

40

50

10

20

30

40

50

200

150

100

50

0
250

intensity(10×3)

10

Case2

0

Case3

200

150

100

50

0

0

Column retention time (min)Fig. 3 SRM chromatogram of extracted amyloid from3cases. Specific peptide derived from wild and mutant
SAA were detected.

性を示した。
3.2

SAAの両タンパク質を含むことが明らかとなっAAアミロイドを構成するSAA型

た。すべての症例で検出したことから，アミロイ

33症例について沈着AAアミロイドの質量分析

ドの形成には野生型と変異型の両SAAが関与しを行ったところ，すべての症例で溶出時間15分にていることが示唆された。

野 生 型 ，溶 出 時 間 22 分 に 変 異 型 SAA を 検 出 し

3.3（Fig.３），沈着AAアミロイドは野生型と変異型

Real time PCRによるSAA遺伝子のジェノタイ© The Ito Foundation

SAA遺伝子のジェノタイピング

332

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）
Ａllelic Discrimination Plot

1.1

0.9

C

0.7

0.5

0.3

0.1

✕
-0.1

0.4

0.9

1.4

Legend▲ Homozygous T/T■ Heterozygous T/C

1.9

T

2.4

2.9

● Homozygous C/C
× Undetermined

SAA gene mutation rate(%:Mutant/Wild)

Fig. 4 Genotyping of SAA gene using real time PCR.

0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Control(Non-Amyloidosis)

Amyloidosis

Fig. 5 SAA gene mutation rate. digital PCR could detect the mutant SAA genein the liver of all cases affected with amyloidosis at a frequency of 0.25%.

ピングの結果，すべての症例は野生型SAA遺伝

伝子を検出した（Fig.５）。変異率の低さから，子のホモ個体であった（Fig.４）。この結果は野

変異体は遺伝ではなく，生後に体細胞変異によっ

生型と変異型の両SAAを検出した質量分析の結て生じることが示唆される。SAAは主に肝臓で果と異なる。変異型SAAをコードする遺伝子は発現することから，肝細胞の体細胞変異によってなぜ検出されないのか？

生じた変異型SAA遺伝子が原因となり，炎症時

SAA遺伝子の変異がreal time PCRの検出限界以下の頻度で生じていに変異型SAAを発現させていると考えられる。

る可能性を考え，高感度なdigital PCRを用いて

3.4

SAA遺伝子のジェノタイピングを実施したとこ

大腸菌を用いて野生型，変異型SAAを作成し，ろ，肝臓において0.25％の低頻度で変異型SAA遺His精製により高純度タンパク質を得た。しかし，© The Ito Foundation

SAAのアミロイド線維形成

牛の腸アミロイド症の根絶を目的としたAAアミロイド症原因遺伝子の同定

333

今回のアミロイド線維形成試験では，両タンパク

変 異 型 SAA を コ ー ド す る 遺 伝 子 は real time

質からアミロイド線維の形成には成功していな

PCRでは検出されず，digital PCRを用いることい。今後はタンパク質濃度，溶液のpH，塩濃度ではじめて全症例の肝臓から0.25％の低頻度で検を検討し，線維形成の条件を確定する。

出された。この変異率の低さは，SAA遺伝子変

野生型と変異型SAAの線維形成性が確認でき

異は体細胞変異によって生じることを示唆する。

ておらず，両SAAのアミロイド線維への直接的

上記の結果から，肝細胞で生じたSAA遺伝子

な関与は証明されていない。しかし，全症例で沈の体細胞変異が引き金となるAAアミロイド症の

着アミロイドに両SAAが含まれていること，ま新しい病理発生機序が示唆された。本機序の証明

た，肝臓においてSAA遺伝子の変異を検出してには変異型SAAのアミロイド原性の高さを証明いることから，変異型SAAを起点とするAAアミする必要がある。今後の研究として，本研究で作ロイド症の発生機序が示唆される。

成した野生型および変異型のリコンビナント

４．要

SAAを用いたアミロイド線維形成実験を行い，

約

各SAAのアミロイド原性を証明していきたい。

本研究では，牛のAAアミロイド症において，臓器に沈着するアミロイド中には野生型SAAと変異型SAAが含まれていることが明らかになった。変異型SAAは33症例すべての症例の沈着ア
ミロイド中に検出されていることから，従来のAAアミロイド症の発生機序として考えられていた血清SAAの上昇に加え，変異型SAAの関与が文
献１）
 Kamiie, J., Sugahara, G., Yoshimoto, S., Aihara, N.,
Mineshige, T., Uetsuka, K., Shirota, K.：Vet Pathol.,54, 111～118, 2017.
２）
 Kamiie, J., Aihara, N., Uchida, Y., Kobayashi, D.,
Yoshida, Y., Kuroda, T., Sakaue, M., Sugihara, Y.,
Rezeli, M., Marko-Varga, G.：MethodsX, 27, 100770,
2020.

AAアミロイド形成に重要であると考えられる。

© The Ito Foundation

334

牛伝染性リンパ腫ウイルス感染症に対する新規治療薬の開発
Development of a new therapeutic drug against bovine leukemia virus
infection

岡

川

朋

弘

（北海道大学大学院獣医学研究院）

Tomohiro Okagawa（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University）

Bovine leukemia is a malignant B-cell lymphoma in cattle and caused by infection ofbovine leukemia virus（BLV）. Recently, BLV infection is widely spread in most farms
throughout Japan. Accordingly, the number of cases of bovine leukemia in Japan has been
increased 42-fold in 21 years, from 99 in 1998 to 4,197 in 2020. Bovine leukemia is the mostcommon among the monitored infectious diseases of cattle and cause huge economic losses inlivestock industry in Japan. Therefore, a new strategy is required to establish a novel control
method for BLV infection. This study aims to develop a targeting antibody against a B-cell
antigen as a molecular targeted drug to eliminate BLV-infected B cells and reduce viral load incattle.
First, the nucleotide sequence of a B cell antigen “X” was determined, and an expression
plasmid encoding antigen X was generated. The expression plasmid was immunized to rats,and hybridomas producing specific antibodies were established. The antibodies produced by
the hybridomas were evaluated for their binding activities to antigen X-overexpressing cells
and bovine B cell lines using flow cytometry. Finally, four clones of monoclonal antibodies（mAbs）that bind strongly to the overexpressing cells and bovine B cells were selected as
candidates for antibody drugs. The mAbs established in this study are expected to be potential
seeds of antibody drugs for EBL. Further studies are warranted to examine the cytotoxic
activity of the mAbs against bovine B cells and establish therapeutic antibodies for the control
of EBL.

１．目

拡大しており，2009～2011年の全国調査によると的日本国内の肉牛の28.7％，乳牛の40.9％がBLVに

牛伝染性リンパ腫ウイルス（bovine leukemia

感染している１）。BLVの蔓延に伴い，その感染にvirus；BLV）は，ウシのＢ細胞に持続感染し，起因するEBLの発生も国内で急増している。農林

Ｂ細胞性リンパ腫である地方病型牛伝染性リンパ水産省の統計によると，牛伝染性リンパ腫の発生腫（Enzootic bovine leukemia；EBL）を引き起数は1998年の99頭から2020年の4,197頭へと，22

こす。近年，日本国内の農場ではBLVの感染が年間で42倍に増加している。牛伝染性リンパ腫は© The Ito Foundation

牛伝染性リンパ腫ウイルス感染症に対する新規治療薬の開発

335

家畜伝染病予防法により届出伝染病（監視伝染を低減させることで，EBLの発症リスクとBLV病）に指定され，腫瘍を発症した牛は淘汰（全廃の感染拡大リスクを軽減できると期待される。

棄）が義務付けられている。牛伝染性リンパ腫
は，牛の監視伝染病の中で最も発生が多く，その経済的被害は大きい。

２．方法

2 . 1 抗原Ｘ遺伝子の塩基配列同定および発現

我々は，BLV感染症ならびにEBLに対する新

プラスミドの作製

規制御法の確立を目指して，ウシ用の分子標的薬

ウ シ の 末 梢 血 単 核 球 か ら Trizol Reagentの開発を進め，ウシの免疫抑制因子PD－1および（Thermo Fisher Scientific）を 用 い て RNA を 抽

PD－L1を標的とした抗体薬を樹立した。BLV

出 し ， mRNA を 鋳 型 に PrimeScript Reverse

感染牛における臨床試験において，抗PD－L1抗体

Transcriptase（Takara Bio）を 用 い て ，cDNA

はウイルス量の低い感染牛に対してはＴ細胞応答を合成した。GenBankに登録された抗原Ｘ遺伝の活性化により抗ウイルス効果を発揮したが，ウ子 に 特 異 的 な プ ラ イ マ ー を 設 計 し ，合 成 し た

イルス量の高い感染牛（ハイリスク牛）に対して

cDNA を 鋳 型 に Ex Taq Polymerase （Takara

は十分な免疫活性化効果がなく，抗ウイルス効果

Bio）を用いて，Ｘ遺伝子のコーディング領域全は限定的であった３，４）。ハイリスク牛は，EBLの長を増幅した。増幅産物をpMD20 vector（Takara

発症リスクが高いだけでなく，農場内で子牛やまB i o ）に 挿 入 し ，E . c o l i H S T 0 8 P r e m i u m

わりの牛にウイルスを拡散するリスクも高い。さCompetent Cell（Takara Bio）を用いてクローニ

らに，ハイリスク牛は免疫抑制による日和見感染

ングを行った。クローニングしたプラスミドを症を併発しやすく，枝肉重量や乳量も低下するこ

DTCS Quick Start Master Mix （Beckmanとから，農場経営に対する直接的な被害も大き

Coulter）を 用 い て 増 幅 し ，GenomeLab GeXP

い。そのため，農場におけるBLV対策を進める

Genetic Analysis System（SCIEX）を 用 い て 塩

うえでは，ハイリスク牛をいかに減らすかが重要

基配列を決定した。さらに，Ｘ遺伝子の塩基配列になる。また，BLVは細胞に持続感染するとウおよびアミノ酸配列について相同性解析を実施しイルスタンパク質やウイルス粒子をほとんど形成てＸの細胞外領域を特定し，Ｘ遺伝子の細胞外領しない。そのため，BLVに対して有効なワクチ

域を含む塩基配列をタンパク質発現用のプラスミンや抗ウイルス薬の開発は非常に難しいと考えらドに導入した。

２，３）

れている。このような背景から，ハイリスク牛に対する新規制御法の確立には新たな戦略が求められる。

2 . 2 抗体産生細胞株（ハイブリドーマ）の樹立
ラットに抗原Ｘの発現プラスミドを接種した。

そこで，本研究課題ではハイリスク牛に対して抗体価の上昇を確認した後に追加免疫を行い，脾も有効な新規制御法の確立を目指して，ウシのＢ

臓およびリンパ節からリンパ球を分離した。これ

細胞に対する分子標的薬（抗体薬）を開発する。

らのリンパ球とマウスミエローマ細胞株について

Ｂ細胞はBLVが持続感染する細胞であり，BLV

細胞融合を行い，抗体を産生するハイブリドーマ

感染Ｂ細胞が腫瘍化するとEBLを発症する。その（ポリクローナルプール）を樹立した。これらのため，Ｂ細胞を標的とする抗体薬は，ハイリスク

ハイブリドーマが産生するポリクローナル抗体に牛においてBLV感染細胞を排除し，ウイルス量

ついて，2 . 4に示す方法で抗体の結合活性を解析© The Ito Foundation

336

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

し，強い結合活性を示す抗体を産生するハイブリ
ドーマについてクローニングを行い，シングルコ
ロニーを分離した。
2.3体が結合した）と判断した。
３．結果と考察本研究ではBLV感染牛に対する有効な新規制

抗原Ｘ発現細胞の樹立

Expi293F 細 胞 株 （Thermo Fisher Scientific）

御法の確立を目指して，ウシのＢ細胞に対する分に 対 し て ，抗 原 Ｘ の 発 現 プ ラ ス ミ ド を子標的薬となりうるモノクローナル抗体を開発しExpiFectamine 293 Transfection Kit （Thermo

た（Fig.１）。

Fisher Scientific）を用いて導入し，抗原Ｘ発現

遺伝子の塩基配列を決定した。Ｘ遺伝子のアミノ細胞を樹立した。
2.4

はじめに，標的となるＢ細胞抗原Ｘについて，

フローサイトメトリーによる抗体の結合酸配列を解析したところ，Ｘは膜貫通領域を有しており，細胞膜表面に発現するタンパク質である

活性解析
上述のとおり取得したハイブリドーマ（ポリクことが確認された。

ローナルプールあるいはシングルコロニー）を液

次に，抗原Ｘの発現プラスミドをラットに免疫体培地で培養し，培養上清に含まれる抗体を回収し，Ｘに対するポリクローナル抗体を産生するハした。まず，各抗体について，抗原Ｘ発現細胞にイブリドーマを384種類樹立した。そして，フロー

対する結合活性をフローサイトメトリーにより検サイトメトリーを用いて，これらのポリクローナ

証した。抗原Ｘ発現細胞を各抗体と25℃で20分間

ル抗体のうち，抗原Ｘに対して特異的な結合活性

反 応 さ せ た 後 に ， APC 標 識 抗 ラ ッ トを有する抗体を選抜した。その結果，22種類のポ

immunoglobulin抗体（Southern Biotech）と25℃

リクローナル抗体が抗原Ｘ発現細胞に結合したで20分間反応させ，蛍光標識を行った。そして，（Table１）。さらに，22種類のポリクローナル抗細胞の蛍光強度をフローサイトメーター

体のうち，５種類の抗体がウシＢ細胞株に対して

FACSLyric（BD Bioscience）を用いて測定した。

も結合した（Table１）。

次に各抗体について，ウシＢ細胞に対する結合

そこで，５種類のハイブリドーマについてク

活性をフローサイトメトリーにより検証した。ウ

ローニングを行い，モノクローナルなハイブリ

シＢ細胞株としてKU－1細胞株を用いた。また，

ドーマ480株を樹立した。これらのハイブリドー

陰 性 対 照 の 細 胞 と し て ，ウ シ Ｔ 細 胞 株 で あ るマが産生するモノクローナル抗体480クローンにBTL26細胞株を用いた。KU－1細胞株とBTL26細

ついて，再度フローサイトメトリーによる選抜を

胞株を１：１で混合したものに対して，各抗体と実施した。その結果，24クローンのモノクローナ

25℃で20分間反応させた。さらに，これらの細胞ル抗体が抗原Ｘ発現細胞に結合した（Fig.２，

を APC 標 識 抗 ラ ッ ト immunoglobulin 抗 体

Table１）。さらに，24クローンのモノクローナル（Southern Biotech）と25℃で20分間反応させ，抗体のうち，21クローンの抗体がウシＢ細胞株に蛍光標識を行った。そして，細胞の蛍光強度をフ対しても結合した（Fig.３，Table１）。２つの解

ローサイトメーターFACSLyric（BD Bioscience）

析結果を比較したところ，抗原Ｘ発現細胞に強くを 用 い て 測 定 し た 。 測 定 結 果 を FACSuite

結合したモノクローナル抗体は，ウシＢ細胞株にSoftware（BD Bioscience）で解析し，陰性対照

対しても強く結合する傾向が認められた（Fig.

と比較して細胞の蛍光強度が高い検体を陽性（抗２，３）。また，ウシＢ細胞株に対して結合した抗© The Ito Foundation

337

牛伝染性リンパ腫ウイルス感染症に対する新規治療薬の開発
B-cellantigen

Rat

Immunization

Hybridoma
Myelomacell line

Lymphocyte+
Cell fusion

Cloning of hybridoma

High-throughput screening of mAbs by ﬂow cytometry

1. B-cell antigen
overexpressing cells

2. Bovine B cell lines

Selection of novel mAbs
targeting bovine B cells

Fig. 1 Outline of the development of novel monoclonal antibodies（mAbs）against bovine B cells.

Plasmid encoding the B-cell antigen was immunized with rats. Hybridomas producing antibodies were establishedby cell fusion of immunized lymphocytes and myeloma cells. The mAbs produced from the cloned hybridomas
were tested for their binding ability against B-cell antigen overexpressing cells and bovine B cell lines. Finally,mAbs with the high binding ability were selected as candidates of targeting mAbs against bovine B cells.

Table 1 Screening of antibodies against the B-cell antigen.

The numbers of the polyclonal and monoclonal antibodies were listed based on the results of the flow cytometricscreening of their binding activities.

No. of the tested
antibody

No. of the antibody binding toOverexpressing cell

Bovine B cell

No. of the selected
antibody

Polyclonal antibody

384

22

5

5

Monoclonal antibody

480

24

21

4

体はいずれも，ウシＴ細胞株に対しては結合が認

は，EBLのＢ細胞を標的とした分子標的薬のシーめられなかった（Fig.３）。これらの結果より，

ズとして有望であると期待される。今後はまず，抗原Ｘへの結合活性を示したモノクローナル抗体

本研究で樹立したモノクローナル抗体のＢ細胞にのうち，特に強い結合活性を示した４クローンの対する傷害活性を検討し，分子標的薬としての有抗体（mAb clone#１～４）をウシのＢ細胞に用性をさらに検証したい。さらに，抗体の免疫原

対する標的抗体候補として決定した（Fig.２，３）。

性を低減し，生体に投与した際の副作用を抑える

標的抗原ＸはウシのＢ細胞に恒常的に発現し，ために，抗体の定常領域をウシ型に改変した治療

EBLの腫瘍細胞でも発現が認められる。以上のこ用抗体の樹立を進めていきたい。

とから，本研究で樹立したモノクローナル抗体© The Ito Foundation

338

Antibody binding（APC）

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Negative control

mAb clone #1

mAb clone #3

mAb clone #4

mAb clone #2

Cell size（FSC）
Fig. 2 Binding of the selected mAb clones to antigen X overexpressing cells.

Flow cytometric analysis of the binding of the mAb clones to antigen X overexpressing cells. The overexpressing

Antibody binding（APC）

Expi293F cells were stained with mAb clones and APC-conjugated secondary antibody. The cells stained with thesecondary antibody only were used as a negative control. The horizontal axis shows forward scatter（FSC）which
represents the cell size. The vertical axis shows fluorochrome intensity of APC which represents the binding
intensity of the mAbs.

Negative control

mAb clone #1

mAb clone #3

mAb clone #4

mAb clone #2

KU-1（B cells）
BTL26（T cells）

Cell size（FSC）
Fig. 3 Binding of the selected mAb clones to bovine B cells.

Flow cytometric analysis of the binding of the mAb clones to bovine B cells. The mixture of bovine B cells（KU-1）

and T cells（BTL26）were stained with mAb clones and APC-conjugated secondary antibody. The cells stainedwith the secondary antibody only were used as a negative control. The horizontal axis shows forward scatter（FSC）which represents the cell size. The vertical axis shows fluorochrome intensity of APC which represents thebinding intensity of the mAbs. KU-1 and BTL26 were can be distinguished on the plot according to the size ofeach cell.

４．要性リンパ腫ウイルス（BLV）に感染に起因する

約

Ｂ細胞性の腫瘍疾患である。近年，日本国内の農地方病型牛伝染性リンパ腫（EBL）は，牛伝染場ではBLV感染が蔓延しており，それに伴い国© The Ito Foundation

牛伝染性リンパ腫ウイルス感染症に対する新規治療薬の開発

339

内でのEBLの発生は急増している。牛伝染性リンころ，抗原Ｘ発現細胞ならびにウシＢ細胞株に結パ腫は家畜伝染病予防法により届出伝染病（監視合する抗体を確認した。その中から，抗原Ｘ発現伝染病）に指定され，腫瘍を発症した牛は淘汰細胞ならびにウシＢ細胞に強く結合するモノク（全廃棄）が義務付けられている。牛伝染性リン

ローナル抗体を４クローン，抗体薬の候補として

パ腫は，牛の監視伝染病の中で最も発生が多く，選抜した。本研究で樹立したモノクローナル抗体

その経済的被害は大きい。しかし，BLV感染牛

は，EBLのＢ細胞を標的とした分子標的薬のシーに対して十分な抗ウイルス効果を発揮する治療薬

ズとして有望であると期待される。今後はまず，やワクチンは存在しないため，新規制御法の確立

本研究で樹立したモノクローナル抗体のＢ細胞にが求められている。

対する傷害活性を検討した上で，抗体の定常領域

そこで本研究では，本研究課題ではBLV感染
牛に対する有効な新規制御法の確立を目指して，をウシ型に改変した治療用抗体の樹立を進めていきたい。

ウシのＢ細胞に対する分子標的薬（抗体薬）の開発を目的とした。まず，標的として有望なＢ細胞
抗原Ｘについて，遺伝子の塩基配列を決定し，抗原Ｘの発現プラスミドを作成した。抗原Ｘの発現
プラスミドをラットに免疫し，特異的抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。次に，ハイブリ
ドーマから産生された抗体について，フローサイ

文献１） Murakami, K., et al.：J. Vet. Med. Sci., 75, 1123～
1126, 2013.
２）
 Okagawa, T., et al.：Front. Immunol., 8, 650,
2017.
３）
 Nishimori, A., et al.：PLOS One., 12, e0174916,
2017.
４）
 Sajiki, Y., et al.：J. Immunol., 203, 1313～1324,
2019.

トメトリーを用いて抗体の結合活性を評価したと© The Ito Foundation

340

ルーメンアシドーシスに伴うエンドトキシン体内流入と肝機能障害を防除する技術の開発
Development of technology to control endotoxin influx and liver
dysfunction associated with rumen acidosis

米

倉

真

一

（信州大学農学部）

Shinichi Yonekura（Faculty of Agriculture, Shinshu University）

The endoplasmic reticulum stress is expected to be a factor in the loss of rumen epithelial
barrier function and liver damage in subacute ruminal acidosis（SARA）. The author has
previously found that dietary supplementation of 5-amino levulinic acid（5-ALA）to dairy
cattle diets alleviates endoplasmic reticulum stress in the liver caused by fasting. The purposeof this study was to determine whether dietary supplementation of 5-ALA is effective in
reducing endotoxin influx and liver damage caused by high-concentrate diet．
The results showed that 5-ALA had no effect on the decrease in rumen pH caused byhigh-concentrate diet, and contrary to expectations, LPS activity in the rumen juice washigher in the 5-ALA-diet group than in the high-concentrate-diet group. In addition, theexpression of inflammation-related genes in liver tissue was examined. The mRNA expressionof TRAF6, IL1 β and TNFα were significantly upregulated in the high-concentrate-dietcompared to the control a, while no increase was observed in the liver of the 5-ALA-dietgroup. The results suggest that feeding 5-ALA reduces the inflammation in liver tissue causedby feeding high-concentrated diet．
These results indicate that dietary supplementation of 5-ALA is effective in the treatmentof liver damage caused at least in part by high-concentrate diet．

１．目

ンドトキシンは肝臓で解毒されるが，ルーメンア

的シドーシスが持続されると肝障害が発生し，その濃厚飼料多給に起因する亜急性ルーメンアシ

ことが代謝病の発症と関連していることが示唆さ

ド ー シ ス（Subacute ruminal acidosis ： SARA）

れている１）。ルーメンアシドーシスの病態が臨床の発生が，乳牛および肉牛生産において大きな問症状として顕在化する急性アシドーシスに比べ，題となっている。ルーメン液pHの低下によりルー

SARAは臨床症状が潜在化しやすく，周産期におメン上皮のバリア機能が損なわれ，ルーメン細菌

けるSARAは代謝病や繁殖障害の原因となることが死滅することで発生したエンドトキシンが体内が示唆されている。SARAは経済性にも甚大な悪に流入すると考えられている。血液に流入したエ影響をもたらすため，SARAの診断・予防の重要© The Ito Foundation

ルーメンアシドーシスに伴うエンドトキシン体内流入と肝機能障害を防除する技術の開発性が国内外で認識されているところである。
SARAの予防において，良好なルーメン環境を

２．方

341

法

維持することは言うまでもないことであるが，エ2.1

ネルギー要求の高い泌乳初期や脂肪沈着を図る肥

健康な乾乳期のホルスタイン種経産牛３頭（平育後期には，穀物主体の飼養体系にならざるをえ

均体重735kg）を用い，対照区，濃厚飼料多給区，ないのが現状である。よって，ルーメン上皮のバ

5-ALA添加区（濃厚飼料多給）を配置し，3ｘ3リア機能を強化することでエンドトキシンの体内のラテン方格法による飼養試験を実施した。試験

侵入を防ぐことや，エンドトキシンによる肝機能期間は３週間として，最初の14日間は粗飼料を多障害を緩和することもSARAによる生産性低下を給し（１日当たり乾草９kg，市販の配合飼料３

抑止する鍵となる。

kgを給餌），その後，濃厚飼料多給（１日当たり

供試牛および給与方法

これまでマウスを用いた研究より，pH低下は乾草３kg，市販の配合飼料３kg，圧ペン大麦６上皮細胞に対して小胞体ストレスを惹起し，バリkg を 給 餌）に 切 り 替 え て ７ 日 間 の 給 餌 試 験 を

ア機能を損失させることが報告されている 。ま行った（対照区は粗飼料多給を継続）。5-ALA添

た，エンドトキシンは肝細胞に対して小胞体スト

加区は試験期間を通して5-ALA（100㎎／頭／日）

レスを惹起し，その結果，肝障害が生じることもを飼料へ添加給与した。供試牛はスタンチョンで報告されている 。すなわち，SARAにおけるルー

飼育し，飲水は自由で，１日２回の給餌制限とし

メン上皮のバリア機能の損失や肝障害の要因も小た。試験期間終了より２週間，乾草を飽食させて胞体ストレスの発生が考えられるため，SARAにから区を入れ替えた。動物実験は信州大学動物実

よって惹起されるルーメン上皮および肝臓での小験委員会の承認を受けて行った。

２）

３）胞体ストレスを抑制する技術が有効であると考え

2.2

採材

た。

第一胃液は飼料変換の当日と試験最終日に，ル

著者はこれまで，ウシの培養細胞を用いた研究

ミナー胃汁採取器（富士平工業，東京）を用いて

か ら 5-Amino Levulinic Acid（5-ALA）に 小 胞

経口的に採取した。採取後，ただちにコンパクト

体ストレスを緩和する効果を有していることを明pHメータLAQUAtwin（堀場アドバンスドテク

らかにしている。さ ら に ，乳 牛 の 飼 料 にノ，京都）を用いて胃液のpHを測定した。また

5-ALAを添加することで，絶食によって発生す

LPS測定用に，採取した胃液を速やかに２重ガー

る肝臓の小胞体ストレスが緩和することも見出し

ゼでろ過した後，遠心分離（遠心加速度12,000ｇ，た。すなわち5-ALAを飼料に添加することによっ

30分，４℃）し，上清を－30℃で凍結保存した。

て，SARAによって惹起されるルーメン上皮およ肝臓組織は生検（バードマグナム，メディコ

び肝臓での小胞体ストレスを抑制できることが期

ン，大阪）により飼料変換の当日と試験最終日の待される。

計２回採取した。

４，
５）

よって本研究では，5-ALAの給与が，濃厚飼

2.3

第一胃液のLPS活性値

料多給に起因するエンドトキシンの体内流入や肝Lipopolysaccharides（LPS）活 性 値 は Kinetic-

障害に及ぼす影響を明らかにすることを目的に検QCL 192テスト（ロンザ，東京）を用いたカイネ討した。

ティック比色法により測定した。

© The Ito Foundation

342

令和３年度

2.4

肝臓組織の遺伝子発現解析

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）が両区で変わりがないことを考えると，エンドト

ト ー タ ル RNA 抽 出 に は TRIzol を 使 用 し た 。

キシン産生量に違いがないことが予想される。マTaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with

ウスの研究より，低pHによる胃腸管バリアの破gDNA Eraser（Perfect Real Time）の 手 順 に 従

綻に小胞体ストレスが起因していることが報告さ

い ， cDNA を 作 成 し た 。 PCR 反 応 試 薬 に はれている６）。よって小胞体ストレスを低減する効TaKaRa SYBR Premix ExTaq（Perfect Real果のある5-ALAがルーメンバリアを保護し，体Time）を 用 い ，リ ア ル タ イ ム PCR を 行 っ た 。

内に流入したエンドトキシン量が濃厚飼料多給区

GAPDHを内部標準として相対定量解析を行った。

より減少した結果，5-ALA添加区における第一胃液のLPS活性値が高かったことも考えられる。

３．結果と考察

一方，5-ALAがルーメン細菌叢に影響を及ぼし

3 . 1 5-ALA給与が第一胃液のLPS活性値に及た結果であることも排除できない。よって，ルー
メンバリア，ルーメン細菌叢に着目した詳細な検ぼす影響
試験期間を通してすべての区において給与試料を完食し，飼料摂取量に区間の差がないことを確認している。まずは本試験の濃厚飼料多給による討が必要であると考える。
3 . 2 5-ALA給与が肝臓の炎症関連遺伝子発現に及ぼす影響第一胃pHの影響を検討した。その結果，対照区

肝臓の炎症性関連遺伝子発現の解析を行ったに比べて濃厚飼料多給区の第一胃pHが有意に減（Table２）。その結果，濃厚飼料多給区の肝臓に少していることが明らかとなった（Table１）。まおけるTRAF6，p38，ERK，IL1β，TNFα遺伝

た，濃厚飼料多給区と5-ALA添加区の第一胃pH子発現量が対照区に比べて有意に上昇しているこにおいて有意な変化が認められなかったことかとが明らかとなった。また，これら遺伝子の中でら，少なくとも5-ALAには濃厚飼料多給によるTRAF6 ， IL1 β ， TNF α 遺 伝 子 に つ い て は第一胃pHの減少に影響を及ぼさないことが明ら

5-ALA添加区の肝臓において発現上昇が認めらかとなった。

れなかった。TLR4，TRIF遺伝子については，

続いて第一胃液のLPS活性値について検討を区間で有意な変化は認められなかった。これら結行った。その結果，対称区に比べて濃厚飼料多給

果より，濃厚飼料多給により肝臓組織の炎症が上区で有意に高い値を示し，また5-ALA添加区で昇しているが，5-ALAを給与することで炎症がは濃厚飼料多給区よりも高い値であることが明ら軽減していることが考えられた。著者は，これまかとなった（Table１）。この5-ALA添加区におけで5-ALA給与により絶食によって発生する肝臓

る第一胃液のLPS活性値が濃厚飼料多給区であるの小胞体ストレスが緩和することを明らかにしてという結果は予想外のものであった。第一胃pHいる。よって，5-ALAが直接的に肝臓に作用しTable 1. Rumen pH and LPS activity
Acidosis challenge
Control―

5-ALA

Ruminal pH

a7.14

b6.15

b6.24

LPS concentration in the rumen liquid（EU/mL）

a3,644b22,150

c45,339

a,b,c

Means in the same line with different superscripts differ（p<0.05）© The Ito Foundation

ルーメンアシドーシスに伴うエンドトキシン体内流入と肝機能障害を防除する技術の開発

343

Table 2 Relative mRNA abundance of inflammation-related genes in the liver of cows.
Acidosis challenge

Gene

a,b

Control

―

5-ALA

TLR4

1.00

1.10

1.05

TRIF

1.00

1.05

1.08

TRAF6

a1.00

b1.40

a1.15

p38

a1.00

b2.13

b1.95

ERK

a1.00

b1.52

b1.42

IL1β

a1.00

b1.70

ab1.40

TNFα

a1.00

b2.50

ab1.80Means in the same line with different superscripts differ（p<0.05）

1 Presented mRNA abundance is expressed relative to mRNA abundances of Control groupて炎症を低減していることが考えられる。一方，

昇している一方，5-ALA添加区の肝臓において先ほども言及したが，5-ALAがルーメンバリア発現上昇が認められなかった。よって5-ALA給を保護し，体内に流入したエンドトキシン量が濃与により，濃厚飼料多給に起因する肝臓組織の炎

厚飼料多給区より減少したことにより，炎症の発症が軽減することが示唆された。

生が抑えられた可能性もある。今後，5-ALAの本研究結果より，少なくとも濃厚飼料多給に起作用機序に関するさらなる検討が必要である。

因する肝障害に対して5-ALA給与が有効である

４．要ことが明らかとなった。一方，その低減の機序は約不明である。今後，ルーメンバリア，ルーメン細SARAにおけるルーメン上皮のバリア機能の損菌叢に着目した詳細な検討をすることで，失や肝障害の要因に小胞体ストレスの発生が予想

5-ALAが第一胃機能に及ぼす影響を明らかにしされる。著者はこれまで，乳牛の飼料に5-ALAていく予定である。

を添加することで，絶食によって発生する肝臓の小胞体ストレスが緩和することを見出している。
よって，本研究では5-ALAの給与が，濃厚飼料
多給に起因するエンドトキシンの体内流入や肝障害の低減に効果を有するのか明らかにすることを目的に検討した。その結果，5-ALAには濃厚飼料多給による第一胃pHの減少に影響を及ぼさな
いこと，予想に反して第一胃液のLPS活性値は，
濃厚飼料多給区よりも5-ALA添加区において高い値であることが明らかとなった
また，肝臓組織における炎症関連遺伝子発現を検討した結果，濃厚飼料多給区のTRAF6，IL1β，
TNFα遺伝子発現量が対照区に比べて有意に上文献１） Guo, J., Chang, G., Zhang, K., Xu, L., Jin, D., Bilal, M.
S., Shen, X.：Oncotarget, 8, 46769～46780, 2017.
２）
 Maeyashiki, C., Melhem, H., Hering, L., Baebler, K.,
Cosin-Roger, J., Schefer, F., Weder, B., Hausmann,
M., Scharl, M., Rogler, G., de Vallière, C., Ruiz, P.
A.：Scientific Reports, 10, 1438, 2020.
３）
 Wang, J., Dong, R., Zheng, S.：Molecular Medicine
Reports, 19, 3～14, 2019.
４） Sharmin, M. M., Islam, M. A., Yamamoto, I.,
Taniguchi, S., Yonekura, S.：Molecules, 26, 1183,
2021.
５）
 Islam, M. A., Noguchi, Y., Taniguchi, S.,
Yonekura, S.：Animal Bioscience, 34, 1006～1013,
2021.
６）
 Eugene, S. P., Reddy, V. S., Trinath, J.：Frontiersin Immunology, 11, 543022, 2020.

© The Ito Foundation

344

母体の乳生産性向上による効率的な肥育を目指す
基礎的研究
Efficient fattening by improving maternal milk production

津

上

優

作

（広島大学大学院統合生命科学研究科）

Yusaku Tsugami（Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University）

Improving maternal milk production contributes to the growth of suckling offspring. In
contrast, mastitis causes decrease in the milk yield and quality. In mammary glands, formationof less-permeable tight junctions（TJs）and production of antimicrobial components areimportant for preventing mastitis. This study investigated the effect of resveratrol on TJs andantimicrobial components using mammary epithelial cells（MECs）and udders of lactatinggoats. For in vitro experiments, MECs were cultured and treated with resveratrol depending
on concentrations or days. For in vivo experiments, 1 mL of 100 μM resveratrol in 70％
ethanol was topical applicated to goat udders for 7 days. The results showed that MECs
treated with resveratrol at 10 μM for 3 days increased the amount of claudin-3，which is amain component of less-permeable TJs during lactation. Moreover, by measuringtransepithelial resistance, it revealed that resveratrol enhances TJ barrier function. In addition,
resveratrol promoted production of antimicrobial components, such as β-defensin-1 and
S100A7. The topical application of resveratrol to udders decreased somatic cell counts and Na＋
concentration in milk after days 5-7，which means resveratrol enhanced in vivo TJ barrier
function. Moreover, resveratrol increased concentrations of β-defensin-1 and S100A7 in milk
after day 3 and day 7, respectively. Resveratrol has been reported to exhibit an anti-oxidant
activity. Reactive oxygen species（ROS）induced with milk component synthesis impairs
viability and TJ barrier function in MECs. Thus, resveratrol may ameliorate the damage
caused by ROS resulted in improvement of antimicrobial component production and TJ barrier
function. Further study needs to investigate the effect to growth of suckling offspring. In
conclusion, it revealed that topical application of resveratrol to udders enhances defense system
in lactating mammary glands, which contributes to stable maternal milk production．

１．目

パク質・乳脂肪・乳糖）の増加を介した乳生産性的の改善は，子豚の日増体量を向上させることが報

肉牛や豚は，分娩直後から離乳前までは母体で告されている１）。乳生産性を低下させる疾病とし産生される乳によるところが大きい。分娩前後のて乳房炎があげられる。乳房炎は病原体が乳頭か

母豚へのアミノ酸給与による主要乳成分（乳タンら侵入し，乳腺内で炎症を引き起こすことで発症© The Ito Foundation

母体の乳生産性向上による効率的な肥育を目指す基礎的研究

345

する。乳腺には，侵入した病原体に対抗するため，

DMEM/F12）に変更し，２日間培養した。その①抗菌因子産生による化学的バリア，②タイト

後，レスベラトロール（東京化成工業）を添加

ジャンクション（TJ）形成による物理的バリア

し，その影響を調べた。なお分化培地以降，インの乳腺防御機構が存在する。本研究では，乳腺防サートを用いた場合には上層にHBSSを添加し御機構を調節しうる因子としてレスベラトロール

た。溶媒コントロールとして0.1％ DMSOを使用に着目した。レスベラトロールはブドウに多く含した。経上皮電気抵抗値はMillicell-ERS-2を用いまれるポリフェノールであり，抗酸化作用を示すて測定した。

ことが知られている。ポリフェノールは経口摂取

2.2した場合，生体内での代謝変換や抱合体形成によ泌乳期トカラヤギ乳房へ100 μＭレスベラト

り標的組織での生理活性が低減することが予想さ

ロールを含む70％エタノールを1 ml搾乳後に７日れる。そこで，レスベラトロールの乳房塗布によ間塗布した。反対側の乳房には溶媒コントロール

り経皮吸収を介して乳腺防御機構を調節できない

として0.2％ DMSOを含む70％エタノールを塗布しかと考えた。以上より，本研究は，母体の乳生産た。採取した乳汁は，Countess II FL Automated性の向上による効率的な哺育，ひいては肥育成績

Cell Counter（Thermo Fisher Scientific）を 用 いの向上を目指すため，乳腺上皮細胞へのポリフェ

た 乳 中 体 細 胞 数（SCC）の 測 定 や LAQUAtwin

ノール処理および乳房へのポリフェノール塗布がNa-11（HORIBA）を 用 い た Na ＋ 濃 度 の 測 定 ，

乳腺防御機構に及ぼす影響を調べた。

ELISAによる各抗菌因子濃度の測定に供試した。

２．方
2.1

2.3

法

乳房への塗布試験

ウェスタンブロッティング

レスベラトロール処理した乳腺上皮細胞層を供

乳腺上皮細胞の培養試した。SDS-PAGE後，PVDF膜に転写した。

泌乳期トカラヤギから乳腺を採材し，PBSで洗ブロッキング溶液として４％スキムミルク／

浄後，メスを用いて細切した。続いて，1 mg/ml

PBS-T 溶 液 を 使 用 し た 。一 次 抗 体 に は ，抗コラゲナーゼを含むDMEM/F12培地中で３時間

claudin-3 抗 体 ，（Thermo Fisher Scientific） お振盪した。その後，トリプシン処理と密度勾配遠よび抗α-tubulin抗体（GeneTex）を使用した。

心を２回行い，乳腺上皮細胞塊を単離して使用時

二次抗体は，Bio-Radから購入したHorseradish

まで凍結保存した。

peroxidase標識した抗ウサギあるいは抗マウス

乳腺上皮細胞塊を解凍後，24ウェルプレートもIgG抗体（×2500-5000）を使用した。バンドのしくはコラーゲンゲル（cellmatrix type 1A，新検出には，発光基質溶液であるImmobilon Forte

田ゼラチン）を被覆したセルカルチャーインサー

Western HRP Substrate （Millipore） とト上に播種し，増殖培地（５％ウシ胎子血清，5Capture II（ATTO）を用いた。

Ez-

μg/ml ITS-X，10 ng/ml上皮成長因子，5 mM

2.4

酢酸ナトリウムを含むDMEM/F12）でコンフル

競合ELISAによってβ-defensin-1，S100A7，

エントになるまで培養した。続いて，分化培地

lactoferrinを測定した。抗β-defensin-1 抗体と（１％ウシ胎子血清，5 μg/ml ITS-X，1 ng/ml

抗S100A7抗体は合成ペプチドをウサギへ免疫し上皮成長因子，5 mM酢酸ナトリウム，1 μg/mlて作製し，抗lactoferrin抗体はLife Laboratoryかプ ロ ラ ク チ ン ，1 μＭ デ キ サ メ タ ゾ ン を 含 む

ら 購 入 し た 。 ペ プ チ ド へ の Horseradish© The Ito Foundation

ELISA

346

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

peroxidase 標 識 は Peroxidase Labeling Kit-NH2

３．結果と考察もしくはKit-SH（Dojindo Laboratories）を用い，発色にはTMBを用いた。
2.5

泌乳期の乳腺TJはクローディン-３を主体に構定量PCR成され，透過性の低い強固なバリア機能を示す。

セパゾールRNA I Super G（ナカライ）を用い各濃度のレスベラトロールを３日間処理したとこて RNA を 抽 出 し ， ReverTra Ace qPCR RT

ろ，10 μＭ処理群においてクローディン-３量のMaster Mix with gDNA Remover （東 洋 紡） を有意な増加が確認された（Fig. 1A）。また，10 μ用いてcDNAを作製した。リアルタイムPCRはＭ処理による経上皮電気抵抗値の経時的変化を調

Brilliant III Ultra-Fast SYBR QRTPCRとべたところ，処理３日後と４日後においてコント

AriaMx Real-Time PCR System （Agilent

ロール群より高い値を示していた（Fig. 1B）。以technologies）を用いて行った。

上より，レスベラトロールは乳腺上皮細胞のTJ

2.6

統計解析

バリア機能を強化することが判明した。

数値データはｎ＝８以上の平均値とし，統計分

乳 腺 上 皮 細 胞 で は β -defensin-1 ，S100A7 ，

析はスチューデントのｔ検定もしくはダネット検

lactoferrinなどの抗菌因子が産生・分泌されてい定を用い，p＜0.05を有意とした。また，再現性る。各濃度のレスベラトロールを３日間処理したを確かめるため，異なるヤギ由来による独立したと こ ろ ， 10 μＭ 処 理 群 に お い て 細 胞 内培養実験を３回以上行い，塗布実験を９回行った。

β-defensin-１濃度およびS100A７濃度が有意になお，本研究における動物実験は，広島大学動増加し，1 μＭ処理群において細胞内lactoferrin

物実験委員会の承認を得て行った（no. C21-20）。

濃度が有意に増加していた（Fig. 2A）。また，10
μＭで３日間処理したところ，β-defensin-1と

(B)

(A)

400

α-tubulinclaudin-3 (ratio)

ctrl 0.5 1
2

5 10 50
(μM)

*

1
0

TEER (Ω × cm2)

claudin-3

300

*

1

3

*

200
100
0

ctrl 0.5 1

control
resveratrol

0

2

4
(day)

5 10 50

Fig. 1 The influence of resveratrol on tight junction barrier in goat mammary epithelial cells（GMECs）.（A）GMECs

were treated with resveratrol at each concentration for 3 days. The bands show claudin-3 and α-tubulin bywestern blot. The graph shows the result for the densitometry analysis of the bands for claudin-3. Alpha-tubulin
was used as an internal control.（B）The graph shows the transepithelial electrical resistance（TEER）in GMECs
treated with resveratrol at 10 μM for 4 days. The data are presented as the mean ± SEM（n=8-12）. Asterisks
show a significant difference（p<0.05 versus control）.

© The Ito Foundation

347

母体の乳生産性向上による効率的な肥育を目指す基礎的研究(A)

β-defensin-1

6

BD1

b

5

2

5

0.5

5

a

2

0

10 50
(μM)

S100A7b

3

ctrl 0.5

a

1

0
ctrl

0

res

ctrl

5

3

1
ctrl res

1

(C)

LTF

2

3

1
0

1

4

4
3

1

0.5
ctrl 0.5

*

1.5

1

0.5

(B)

2

1.5

1

lactoferrin

2.5

*

2

1.5

0

expression (ratio)

2.5

*

2

S100A73

secretion (ratio)

concentration (ratio)

2.5

res

0

10 50

β-defensin-1

2

b
a

5

ctrl 0.5

S100A7

b

5

3

10 50

lactoferrin

4
2

3
2

1

1

a

1

1
0

ctrl

res

0

ctrl

res

0

ctrl

res

Fig. 2

The influence of resveratrol on antimicrobial component production in goat mammary epithelial cells（GMECs）.
（A）GMECs were treated with resveratrol at each concentration for 3 days. The graphs show intracellularconcentration of β-defensin-1, S100A7, and lactoferrin detected using ELISA.（B, C）GMECs were treated withresveratrol（res）at 10 μM for 3 days. The graphs show mRNA expression of BD1（β-defensin-1）, S100A7, andLTF（lactoferrin）detected using qPCR（B）and each protein concentration in medium detected using ELISA（C）.
The data are presented as the mean ± SEM（n=8-12）.Asterisks or different alphabetical letters show a significant
difference（p<0.05 versus control）.

S100A7 の mRNA 発 現 量 が 有 意 に 増 加 し（Fig.

が高まることが判明した。

2B），インサート上層の培地中への分泌量も増加

レスベラトロールは抗酸化作用を示すことが知していた（Fig. 2C）。以上より，レスベラトロー

られている４）。泌乳期乳腺上皮細胞では活発な乳

ルは乳腺上皮細胞の抗菌因子産生を高めることが生産に伴い，多くの活性酸素種（ROS）が産生さ判明した。

れ，乳生産性を低下させると予想されている５）。

乳房へのレスベラトロール塗布が及ぼす影響を

乳房へのレスベラトロール塗布は乳産生に伴い発調べた（Fig.３）。乳量は塗布後，顕著な変化は生するROSの影響を緩和し，TJバリア機能や抗観察されなかったが，SCCとNa 濃度は塗布５，

菌因子産生を調節したのかもしれない。乳腺の７日後において処理前より有意に低下していた。

TJバリア機能と抗菌因子産生の向上は，母体のSCCとNa＋濃度はTJバリア機能の指標であり，バ高品質で安定的な乳生産ならびに分娩直後の効率

リア機能の強化に伴い，その値は低下する。

的な成長・増体に寄与すると考えられる。今後のまた，乳中抗菌因子濃度は，β-defensin-1が塗実験では，分娩前後から乳房への塗布を行い，日布３日後，S100A７が塗布７日後に有意に増加し増体量への効果を検証する必要がある。また，本ていた。以上より，乳房へのレスベラトロール塗研究では乳房へのポリフェノール塗布により乳腺布によって乳腺のTJバリア機能と抗菌因子産生機能を調節できることが実証された。さらなる検

＋

２，３）

© The Ito Foundation食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

milk yield2(ratio)(ratio)1.5
10.5

β-defensin-1

2(ratio)

1.5

0.5

-1

0

1

3

5

*

*

1

-1

0

1

3

5

7

0

*

*

5

7

5

7

0.5

-1

0

1

3

lactoferrin

2

0.5

0.5

1

0

7

S100A7

1.5

*

Na+

1.5

*

2

1

0

1

0

-1 0 1 2 3 4 5 6 7(day)(ratio)

0

SCC

1.5

(ratio)

令和３年度

1.5(ratio)

348

1
0.5

-1

0

1

3

5

7

0

-1

0

1

3

Fig. 3 The influence of topical application of resveratrol to lactating goat udders. One mL of 100 μM resveratrol in

70% ethanol containing 0.2% dimethyl sulfoxide was applicated to the udder of lactating goats on days 0-6 after
milking. The data are presented as the mean ± SEM（n=9）.Asterisks show a significant difference（p<0.05 versus
pre-treatment）.

証により，酪農を含めた畜産業界全体の発展に寄として，100 μＭレスベラトロールを含む70％エ

与することが期待される。

タノール1 mlを泌乳期ヤギ乳房へ７日間塗布し４．要た。その結果，塗布５日後には乳中体細胞数と約

Na ＋ 濃 度 の 低 下 が 確 認 さ れ ，β -defensin-1 と本研究では，母体の乳生産向上による増体効率

S100A7濃度の有意な増加も認められ，レスベラの改善を目指し，高品質で安定的な乳生産を維持

トロール塗布が生体レベルでも有効であることがするために必要な乳腺の感染防御機構の向上を乳証明された。以上より，乳房へのレスベラトロー

房へのレスベラトロール塗布により試みた。まル塗布によりTJバリア機能と抗菌因子産生が向ず，ヤギ乳腺上皮細胞の培養モデルを用いてレス上し，乳腺の感染防御機構が強化されることが判

ベラトロールがタイトジャンクション（TJ）バ

明した。今後の実験では，分娩前後から乳房へのリア機能と抗菌因子産生に及ぼす影響を調べた。

塗布を行い，実際に仔の日増体量に効果があるか

その結果，レスベラトロール処理によって，泌乳を検証する必要がある。

期乳腺TJの主要タンパク質であるクローディン-3 量の増加とともに，TJバリア機能も向上する
こ と が 証 明 さ れ た 。ま た ，抗 菌 因 子 で あ る
β-defensin-1とS100A７の産生と分泌も促進されることが判明した。さらに，生体レベルの実験

文献１） Kaiguo, G., Xiaolu, W., Chunyan, G., Li W., Wenjie,B., Xuefen, Y., Zhijun, W., Zongyong, J.：Journal ofAnimal Science, 98, skaa261, 2020.
２）
 Rupert, M. B., Daniel, W., Martin, W., Susanne, S.,© The Ito Foundation

母体の乳生産性向上による効率的な肥育を目指す基礎的研究
Georg, W.：Journal of Dairy Research, 71, 316～321,
2004.
３） Michael, R. A., Stephen, C. N.：Journal of
Mammary Gland Biology and Neoplasia, 16, 275～
289, 2011.
４） Juliana, F. S., Viviane de, O. L., Peter, S., Josè C. C.

349-E., Denise, M.：Oxidative Medicine and Cellular
Longevity, 963217, 2013.
５）
 Xiaolu, J., Kai, W., Hongyun, L., Fuliang, H.,
Fengqi, Z., Jianxin, L.：Oxidative Medicine andCellular Longevity, 2572175, 2016.

© The Ito Foundation

350

日本短角種去勢牛の２シーズン放牧肥育における放牧管理改善による肉質向上
Effect of grazing management on meat quality in Japanese Shorthornsteers fattened under 2 season grazing system

上

田

宏一郎・呉

成

真

（北海道大学大学院農学研究院）

Koichiro Ueda and Seongjin Oh（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

This study aimed to clarify the effect of difference in daily body weight gain duringsecond grazing period of Japanese Shorthorn beef steers fattened under 2-season grazing
system on their carcass performance and physico-chemical trait of meat. An increase inpasture area and herbage mass for a steer during the second grazing season improved average
bodyweight gain of steers. The improved body weight was maintained during the fattening
period for the steers allowed greater pasture area during grazing season. After fattening
period, these steers produced carcasses with thicker rib and longissimus muscle with higher
crude fat concentration and lower shear fore value compared to the steers with less bodyweight gain during the second grazing period. The results indicate that increased pastureallowance during the second grazing season could improve the quality of carcass meat fromJapanese Shorthorn steers fattened under 2-season grazing system．

１．目

牛肉生産システムは上記の課題を解決するうえで的きわめて有効である。しかし，生産者が肥育牛の日本短角種の肉は，黒毛和種と比べると脂肪交

十分な増体を維持して市場価値の高い枝肉を生産

雑は低く市場価値は高くはない。しかし，最近でしつつ，現在の消費者が嗜好する品質の牛肉とす

は消費者の健康志向等などにより国産赤身牛肉へ

るには，この２シーズン放牧肥育システムには改の関心が高まっている。一方で，肉牛生産者は善が必要である。

年々減少しており，耕作放棄地が増えている。こ日本短角種の２シーズン放牧肥育において，１のような中，地域の自給飼料資源を有効に利用し夏目の放牧時では子牛は自然哺乳で飼育され，日つつ，消費者に安全で安心な国産牛肉を供給する

本短角種の母牛の泌乳量が多い特性のため子牛のことはわが国の畜産業にとって重要な課題となっ増体は非常に良好な成績を示す。しかし，２夏目ている。日本短角種は他の和牛に比べて高い粗飼の放牧肥育期では通常は放牧草のみで飼育するた料利用能力を有しており，伝統的に２シーズン放め増体が停滞することが多い。とくに，放牧地の牧肥育システムによる肥育が行われてきた。この

草量や栄養価が低下する夏季以降においては肥育© The Ito Foundation

日本短角種去勢牛の２シーズン放牧肥育における放牧管理改善による肉質向上

351

牛の増体は停滞してしまう。放牧後の冬季では，

ンサイレージを給与して飼育した。再度，２夏目

肉量と肉質の向上のため舎内において濃厚飼料をの放牧を５月初旬より放牧し，供試牛を６月下旬補給する仕上げ肥育を行う。しかしながら，既往に７頭ずつの２群に分け，片方の群は放牧強度の研究では放牧肥育期の日増体量が0.6kgより低1.59頭／ha（Control区），もう一方の群は0.96頭／

くなると，仕上げ肥育を行っても期待される増体

ha（Test区）となるように放牧地面積とその他が得られないことが報告されている 。

の牛群を用いて調節し，それぞれ異なる放牧地に

１）

日本短角種去勢牛の２シーズン放牧を取り入れ

おいて別群として11月初旬まで輪換放牧により飼た肥育において，肉の「締まり」が悪いために低育した。すなわち，Control区は春からの放牧強く格付けされる場合がある。竹中ら は，２シー度と同一で一般的な方法であるのに対し，Test

ズン放牧肥育による日本短角種去勢牛の枝肉格付

区では夏以降の草量と草質が低下する時期に１頭

けと放牧肥育時の増体との関係を検討し，放牧期

あたり草量を増やす処理であった。放牧終了後

間中の日増体量が低かった肥育牛は，仕上げ肥育は，舎内でイネ科乾草，コーンサイレージ，ふす

後の枝肉の格付けが低くなる場合が多いことを明

ま，大麦を増体にあわせて調節しつつ給与して仕らかにした。

上げ肥育を行い，体重700㎏以上を目標として26２）

これらから，日本短角種２シーズン放牧肥育シ～30カ月齢で出荷した。出荷は全頭同時には不可ステムによる牛肉生産において，生産者と消費者能であったため，Control区とTest区の１頭ずつが求める枝肉量と肉質を担保するためには，放牧をペアにして，同時期に２頭ずつ体重の大きいペ肥育期の放牧管理等による増体速度の改善が必要

アから順に出荷した。

不可欠であろう。しかし，放牧肥育期の増体速度

供試牛全頭について，２夏目放牧期以降から出が理化学的特性等の詳細な肉質に及ぼす影響は明荷まで２～３週間おきに体重および体格（体高，

らかではない。

胸囲，腹囲）を測定した。毎回の体重測定と同時

本研究では，２シーズン放牧肥育システムの２に頚静脈より血液サンプルを採取した。出荷後，夏目の放牧期において，放牧管理により操作したと畜場で行われる枝肉評価のデータを得た。と畜

日本短角種去勢の増体速度の違いが，仕上げ肥育

７日後に枝肉を解体し，第６-７肋骨断面胸最長後の枝肉成績と肉の理化学的に及ぼす影響を明ら

筋と大腿２頭筋を５cm厚でサンプル肉を採取しかにすることを目的とした。あわせて，体重変化

た。

および血液中代謝物質への影響も検討した。
２．方

血液サンプルは遠心分離により血漿を分離後，血漿中の尿素態窒素，クレアチニン，遊離脂肪酸，法

グルコース，コレステロール，リン脂質の濃度を，

本研究は北海道大学動物実験委員会の承認を受分析キットを用いて測定した。肉サンプル採取
後，ただちにpH，肉色，加熱損失およびせん断

けて実施した（承認No. 20-0016）。
春生まれ日本短角種去勢牛14頭を用いた。これ

力価の測定を行った。加熱損失については，ビらの供試牛は以下のような２シーズン放牧肥育シ

ニール袋に入れた肉塊を70℃のウォータバースにステムで飼養した。１夏目は５月初旬より母子放１時間浸漬し，水分を取り除いた後の重量減少か牧で飼育し，11月初旬の放牧期の終了とともに離ら測定した。せん断力価はこの加温後の肉塊を用乳し，その後の冬期間は舎内でイネ科乾草とコー

いてレオメーターにより測定した。肉サンプルの© The Ito Foundation

352

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

一部は採取後にミンチ肉とし化学成分分析のためも同様にControl区に比べTest区で有意に高い値に保存し，水分，粗脂肪，粗タンパク質の分析をを示した（p＜0.01）。放牧処理期間中の去勢牛の行った。

平均日増体量は，Control区は0.44，Test区は0.71

各測定値はJMP Pro 15ソフトウェアを用いて，であり，Control区に比べTest区で有意に高い値

去勢牛を変量効果，処理を固定効果とする混合モを示した（p＜0.01）。Control区よりもTest区でデルにより放牧処理による効果を検定した。血液は放牧処理期において１頭あたりの面積を大きく成分については，放牧処理期および舎飼肥育期のし１頭あたりに草量を多く割り当てられたことにそれぞれについて去勢牛ごとの反復測定はARより，放牧処理期における去勢牛の牧草の摂取量（１）モデルを指定して解析した。解析された処が多くなり日増体量が高まったと考えられる。出

理間の差は，p＜0.05を有意とし，p＜0.1を傾向と荷直前では，去勢牛の各体格値にはControl区とした。

Test区の間に差はなかったが，体重はControl区に 比 べ Test 区 で 有 意 に 高 い 値 を 示 し た（p ＜３．結果と考察0.05）。し た が っ て ，放 牧 処 理 に よ っ て 生 じ た

放牧処理直前，舎飼肥育直前，および出荷直前

Control区とTest区の去勢牛の体重差は，舎飼肥における去勢牛の体重と各体格値をTable１に示

育期間中も継続して維持され，舎飼開始時に低した。放牧処理開始前の去勢牛の体重と各体格値

かったControl区の体重が肥育期間中にTest区とには，処理間で差はなかった。舎飼肥育直前の去同等になるような代償的発育は認められなかった。

勢牛の体重は，Control区に比べTest区で有意に日本短角種の２シーズン放牧肥育において，小高い値を示した（p＜0.05）。また，胸囲について

山ら３）は１冬目舎飼期から２夏目放牧期終了まで

Table 1 Body weight and conformation trait of steers.
Control

Testp=

Body weight（kg）

455

454

NS

Withers height（cm）

127

127

NS

Heart girth（cm）

177

176

NS

Abdominal girth（cm）

217

218

NS

Body weight（kg）

507

540

＊

Withers height（cm）

130

131

NS

Heart girth（cm）

184

190

＊＊

Abdominal girth（cm）

230

233

NS

Body weight（kg）

735

759

＊

Withers height（cm）

139

140

NS

Heart girth（cm）

220

224

NS

Abdominal girth（cm）

254

256

NS

Immediately before grazing treatment

Immediately before fattening period

Immediately before shipment

NS：Not siginificant＊＊p < 0.01, ＊p<0.05© The Ito Foundation

日本短角種去勢牛の２シーズン放牧肥育における放牧管理改善による肉質向上

353の増体は出荷までの全期間の増体と強い正の相関

た。放牧期間中においては，去勢牛のグルコースがあることを見出した。また，梨木ら

は日本短

濃度はControl区に比べTest区で有意に高い値を角種去勢牛の２夏目放牧期の夏以降に採草兼用地示した（p＜0.05）。また，リン脂質濃度もControl

を用いることで，夏から秋における増体を高め，区に比べTest区で高い傾向を示した（p＜0.1）。

良好な年間の日増体量が得られることを明らかに

この結果は，放牧処理期において去勢牛の体重増した。さらに，柴らは放牧時の増体を0.6以上

加がControl区に比べTest区で有意に高い値を示にすることで最も出荷に至るまでの増体成績が良したことを裏付けるものと考えられる。すなわ

くなることを報告した。これらの先行研究の結果

ち，放牧期間中においてControl区に比べTest区から，日本短角種の２シーズン放牧肥育におけるの割り当て面積と草量を多くしたことが牧草摂取

２夏目放牧時の放牧管理を改善することは，放牧量を高め，それによりControl区の去勢牛はTest

時の増体のみならず仕上期の増体にも大きく影響

区の去勢牛よりも多くのエネルギーを摂取していすることが示唆される。本研究においても，２夏たこと，それにより日増体量も高まったことを示

目放牧時の１頭あたりの面積増加によって１頭あ唆している。一方，肥育期間中においては，いずたりに割り当てる草量を増やす放牧管理の改善のれの代謝産物濃度においても処理間で差は認めら

結果，放牧終了時の体重が高まるだけでなく，出れなかった。したがって，肥育期間中においては荷時の体重も高まることが示された。

両区の去勢牛は同量の養分およびエネルギーを摂１）４）

放牧処理期間中および舎飼肥育期間中の去勢牛の血漿中代謝産物濃度の平均値をTable２に示し取していたものと考えられる。
と畜月齢，枝肉成績，および胸最長筋の理化学

Table 2 Metabolite concentration in blood of steers
Control

Testp=

Glucose（mg/dL）

67.7

71.5

＊

Urea nitrogen（mg/dL）

17.1

17.8

NS

Non-esterified fatty acid（μEq/dL）

246

222

NS

During grazing treatment

Total cholesterol（mg/dL）

129

138

NS

Creatinine（mg/dL）

1.13

1.18

NS

Triglyceride（mg/dL）

17.8

17.6

NS

Phospholipid（mg/dL）

127

142

†

Glucose（mg/dL）

76.4

74.1

NS

Urea nitrogen（mg/dL）

10.8

11.7

NS

Non-esterified fatty acid（μEq/dL）

101

107

NS

Total cholesterol（mg/dL）

94.8

108

NS

Creatinine（mg/dL）

1.23

1.21

NS

Triglyceride（mg/dL）

13.2

13.4

NS

Phospholipid（mg/dL）

104

117

NS

During fattening period

NS：Not siginificant＊p<0.05, †p<0.1© The Ito Foundation

354

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 3 Carcass trait and physico-chemical trait of logissmus muscle of steers
Control

Test

p=

28.3

28.2

NS

Carcass weight（kg）

412

426

NS

Longissimus muscle area（cm2）

43.7

46.3

NS

Rib thickness（cm）

6.3

6.8

＊

Subcutaneous fat thickness（cm）

2.3

2.6

NS

Water（%）

65.2

63.5

NS

Crude protein（%）

21.1

20.4

†

Crude fat（%）

10.0

12.9

†

Cooking loss（%）

27.2

25.9

＊

Water retention capacity（%）

54.0

52.5

NS

pH

5.56

5.55

NS

Shear force value（g/cm2）

3.51

3.28

†

Months of age at shipping
Carcass trait

Physico-chemical trait of longissimus
muscle

NS：Not siginificant＊p<0.05, †p<0.1

的特性をTable３に示した。出荷・と畜した去勢（p＜0.1）。Control区よりもTest区の胸最長筋に牛の平均月齢はControl区とTest区に差はなく，は多くの脂肪が蓄積した結果，これに伴って加熱

両区とも28カ月齢程度であった。枝肉重量，胸最損失およびせん断力価も低くなったものと考えら

長筋面積および皮下脂肪厚には，両区間に差はなれる。したがって，２夏目放牧時の放牧管理の改かった。出荷時においてControl区に比べTest区

善によって出荷時に体重が高まると，胸最長筋のの体重が有意に大きかったのに対し，枝肉重量に

肉は脂肪含量が高くせん断力価の低いものとなるは区間に差がなかったことは，Control区よりもことが示唆された。

Test区では出荷時の内蔵重量が多かったことを先行研究では，日本短角種去勢牛の２シーズン

示 唆 す る も の で あ る 。バ ラ 厚 に つ い て は ，放牧を取り入れた肥育において，枝肉は「締まControl区に比べTest区で有意に大きい値を示しり」が悪いために低く格付けされる場合があり，た（p＜0.05）。

このような低評価には２夏目の放牧期の増体停滞

胸最長筋の粗脂肪含量はControl区よりもTestが影響している可能性が示唆されている。竹中区において高い傾向を示し（p＜0.1），粗タンパら２）は，２シーズン放牧肥育の日本短角種去勢牛

ク質含量についてはこれとは逆の結果であったの２夏目放牧時の増体成績と仕上げ肥育後の枝肉（p＜0.1）。この結果は，Control区に比べてTest

成績との関連を検討した。その結果，放牧開始２区では胸最長筋に筋間脂肪が多く蓄積しているこ

カ月までにおける増体の個体間変動は枝肉成績のとを示唆するものである。加熱損失およびせん断

違いと関連性は見られなかった。しかし，放牧開力価はともに，Control区よりもTest区において始２カ月以降における日増体が0.6㎏以上の個体有意に低い（p＜0.05）および低い傾向を示したは枝肉の評価は多くが２等級であったが，0.6㎏© The Ito Foundation

日本短角種去勢牛の２シーズン放牧肥育における放牧管理改善による肉質向上

355を下回る個体ではロース芯面積と歩留基準値が低

体量を高めた。放牧終了時における体重の差は舎いため１等級となるものが多かった。したがっ

飼肥育時においても維持され，出荷時において縮て，本研究の結果を含めて考慮すると，２シーズ

小することはなかった。さらに，放牧終了時におン放牧肥育における２夏目放牧期の増体は，そのいて高体重であった去勢牛の肥育後の枝肉は，バ仕上げ期の増体への影響を介して肉質に影響する

ラ厚が大きく，胸最長筋の脂肪含量が多く，せん可能性が高いと考えられた。

断力価を低いことが示された。日本短角種去勢牛

以上の結果から，日本短角種去勢牛の２シーズの２シーズン放牧を取り入れた肥育では，２夏目ン放牧を取り入れた肥育において，２夏目放牧時の放牧管理を改善することにより枝肉の肉質が向の増体成績を改善すると，舎飼肥育後の枝肉のバ上する可能性がある。

ラ厚を増加させ，胸最長筋の脂肪含量を高めると同時にせん断力価を下げることが示された。日本
短角種去勢牛の２シーズン放牧を取り入れた肥育では，２夏目の放牧管理を改善することにより枝肉の肉質が向上する可能性がある。
４．要

約

２シーズン放牧肥育システムの２夏目の放牧期において，放牧管理により操作した日本短角種去勢の増体速度の違いが，仕上げ肥育後の枝肉成績と肉の理化学的に及ぼす影響を検討した。１頭あたりの割り当て面積の増加は，１頭あたりの割り
当て草量の増加をもたらし，放牧中の去勢牛の増文
献１）
 柴伸弥，樋口幹人，今成麻衣，米内美晴，東山雅一，
渡邊彰：日本短角種去勢牛の２シーズン放牧肥育における放牧中の適正な増体量，東北農業研究セン
ター研究報告，117，51～58，2015.
２）
 竹中昭雄，澁谷幸憲，須山哲男，篠田満，近藤恒夫：日本短角種の放牧育成中の増体量が肉質に大きく影響する，東北農業研究成果情報，2001.
３） 小山錦也，嶽肇：放牧をとりいれた日本短角種（春産子）の肥育法の確立 第Ⅰ報 冬期育成期と放牧期の飼養条件の差が放牧期，仕上げ期の増体，摂取量，産肉などに及ぼす影響，青森県畜産試験場
報告，13，1～36，1981.
４） 梨木守，目黒良平，福田栄紀，須山哲男，太田顯：
日本短角種の秋子と春子の冬期育成期及び放牧育成
期の日増体量の比較，日本草地学会誌，43，489～
491，1998.

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356

夏季に調製した発酵混合飼料の泌乳牛における利用適正―窒素利用効率に基づく検証―
Seasonal effect on nitrogen utilization in lactating cows fed ensiled total
mixed ration

近藤

誠１・関田

梨々花１・股村真也１・永墓

訓明２・平岡啓司２（１三重大学大学院生物資源学研究科，２三重県畜産研究所）

Makoto Kondo1, Ririka Sekida1, Masaya Matamura1, Noriaki Nagahaka2 and Hiroshi Hiraoka２（１Graduate School of Bioresources, Mie University, 2Mie prefectural Livestock Institute）

We determine the effect of season on nitrogen utilization in lactating dairy cow fed ensiled
total mixed ration（TMR）. The TMR ensiled in summer contained comparable organic matter,
crude protein（CP）, starch, soluble sugars, neutral detergent fiber contents with the TMR
ensiled in spring. Soluble CP content in a CP basis in the TMR ensiled in summer was almost
50％ that was higher than that in the TMR ensiled in spring. Lactic acid, acetic acid,ammonia-N were higher and pH was lower in the ensiled TMR in summer as compared tothan in that in spring. Dry matter intake（DMI）by lactating cows in summer was significantly
lower than those in spring. Milk yield was not significantly different between seasons; however,it was numerically lower in summer than in spring. Milk protein and solid non-fat contents
were significantly lower in summer than in spring, but fat, lactose and urea-N contents were
not significantly different between seasons. Nitrogen intake in lactating cows was lower insummer than in spring in according to DMI. Microbial N synthesis in rumen, urinary N output,
fecal N output, milk N yield per day were significantly lower in summer than in spring, but
retained N was not significantly different. Based on the amount of N intake, the ratio of rumen
microbial N synthesis was significantly lower in summer, but those of N output in urine, feces
and milk and retained N were not affected by the seasons. It was concluded that feeding
ensiled TMR in summer may be paid attention to lower synthetic efficiency of microbial-N inrumen．

１．目

担の一部となっている。近年，この混合飼料の調的製を個々の酪農家に代わり企業や組合が行う事例

乳牛の飼養頭数が多い酪農家では，乳牛の栄養が増えつつあり，特に貯蔵や流通させるためにサ要求量を満たすように牧草類に穀物などを組み合イレージ化した発酵混合飼料が一部の地域で使わわせた混合飼料を調製して給与する方法が行われれている。

ている。この混合飼料は日持ちがしないため毎日

しかし発酵混合飼料では，トウモロコシや大豆調製する必要があり，今日の酪農家では労働の負などの穀物もサイレージとして発酵が進むため，© The Ito Foundation

夏季に調製した発酵混合飼料の泌乳牛における利用適正―窒素利用効率に基づく検証―

栄養成分の変化が起きる。先行研究では発酵により可溶性糖類が７～９割程度消費されることに加えて，粗タンパク質の一部が発酵により分解さ357

正を検証することを目的とした。
２．方法

れ，アンモニアや遊離アミノ酸などの溶解性画分

発酵混合飼料を春季（２月～４月）および夏季が増加することが報告されている 。特に夏季の（７月～９月）に調製を行った。乳牛用の混合飼ような高温期では発酵が進むため，他の季節に調料（粗飼料：コーンサイレージ，イタリアンライ

製された発酵混合飼料と比べて，粗タンパク質のグラスサイレージ，濃厚飼料：圧ペントウモロコ

うち溶解性画分の増加が著しい 。つまり，常にシ，圧ペン大麦，加熱大豆，大豆粕，ビートパル

同じ飼料原料や配合割合で混合飼料を設計していプ，フスマ，コーングルテンフィード）を細断型ても，乳牛が採食する段階（発酵後）では，栄養

ロールベーラーで成形後，ラッピングマシーンに素の組成が季節によって異なっていることが予想

より密封し屋外にて貯蔵した。発酵期間はいずれされる。

の 季 節 も 45～70 日 間 で ，平 均 気 温 は 春 季 で は１）

１）

乳牛が体内で利用するタンパク質の７割程度

10.3℃，夏季では26.5℃であった。

は，ルーメン内の微生物体タンパク質により供給

発酵混合飼料の乳牛への給与は，各季節に泌乳されている２）。この微生物体タンパク質は飼料中

中～後期の泌乳牛を６頭ずつ供試した。馴致期間の糖類などから得られるエネルギーとタンパク質を14日間とし，その後連続した５日間に次の試料から得られるアンモニアや遊離アミノ酸（窒素を採取した。給与飼料と残食は毎日全量を記録源）を使い合成される。しかし発酵混合飼料でし，一部を分析まで冷凍保存した（－28℃）。糞は，糖類が減少している一方で，粗タンパク質のと尿は午前および午後に１回ずつ５日間採取し，うち溶解性窒素画分が増えているためルーメン内

分析まで冷凍保存した（－28℃）。乳量は毎日で炭素と窒素のバランスが合わず，ルーメン内の

朝・夕２回ずつ記録し，一部の生乳を採取し乳成微生物体タンパク質合成量が低下することが懸念分の測定に用いた。本試験は「産業動物の飼養及される。一般にルーメン内で余剰となった窒素はび保管に関する基準（昭和62年総理府告示第22尿中へ排泄されるため，摂取した窒素源が乳生産号）に基づき実施した。

にまわらず，乳牛としては窒素の利用効率が低下

飼料および糞中の成分は粗飼料の品質評価ガイする。これまでに，非発酵の混合飼料と発酵混合

ドブックに基づいて分析した ４）。可溶性糖類は飼料を乳牛に給与した結果，後者では尿中への窒フェノール硫酸法５），デンプンは酵素法６）により素排泄量が増加することが報告されている３）。こ測定した。部分的に採取した糞から１日に排泄されらのことから，サイレージ発酵により混合飼料

れた糞量の推定には，酸不溶性灰分を用いた。尿中の溶解性窒素画分が増える夏季では，ルーメン中に含まれるクレアチニンはGeorge et al．
（2006）

内の微生物体タンパク質合成量が低下し，乳牛にの方法に準じてHPLCにより分析した７）。また，

よる窒素利用効率が低下している可能性がある。

尿中に含まれる窒素はケルダール法により測定しそこで本研究では，発酵混合飼料を給与する体系

た。部分的に採取した尿から１日に排泄された尿において泌乳牛のルーメン内の微生物体タンパク量の推定にはクレアチニンを指標に田村ら

質合成量と乳生産に使われる窒素利用効率を定量（2007）の方法により推計した８）。また，ルーメ的に把握し，夏季における発酵混合飼料の利用適ン内における微生物体窒素合成量はIAEA（1997）© The Ito Foundation

358

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

により算出した９）。

で行った本研究の結果を支持している。
Table２に春季および夏季に調製した発酵混合

３．結果と考察

飼料を採食した泌乳牛による乾物摂取量，乳量，Table１に春季および夏季に調製した発酵混合

乳成分を示した。乾物摂取量は夏季で有意に低下

飼料の化学成分を示した。有機物含量や粗タンパした。乳量は統計解析による有意な差は認められ

ク質，デンプン，可溶性糖類，中性デタージェン

なかったが，数値上夏季のほうが春季と比べて低ト繊維（NDF）含量では季節による顕著な差は値を示した。乳成分では乳脂肪，乳糖，尿素窒素

認められなかった。一方，粗タンパク質のうちのでは季節による違いは認められず，乳タンパク

溶解性画分は春季と比べて夏季では高く，約50％

質，無脂固形分は夏季のほうが有意に低い値を示

程度と高い値を示した。発酵の様相として，夏季した。本研究を行った期間における牛舎内の平均では春季と比べて乳酸や酢酸，アンモニア態窒素

温度と湿度，温湿度指数（THI）は，春季ではその含量が高く，pHは低い値を示した。これらのれぞれ13.5℃，66.8％，57.1であったのに対して，

ことから，夏季ではサイロ内の微生物の代謝が春

夏季ではそれぞれ26.7℃，85.2％，78.2であった。

季と比べて亢進することで，タンパク質の分解やまた，対象とした泌乳牛の１分間あたりの呼吸数

糖から有機酸への発酵がより進んでいたと考えら

は春季で39.2回であったのに対して，夏季ではれた。一方，可溶性糖類はいずれの季節でも１％

57.6回と増加した。阪谷（2014）では一般に乳牛DM程度と低く，発酵期間の温度によらず残存ははTHI68～70で暑熱ストレスを受け始めると報告少ないことが示された。Kondo et al.（2016）では，

しており10），本研究でも乳牛は暑熱ストレスを受

実験室内の小規模のサイロを用いて混合飼料を発けていたと判断できる。

酵させた際，15℃と比べて30℃の環境で発酵させTable３に春季および夏季に調製した発酵混合

た場合に，有機酸含量とタンパク質の溶解性画分

飼料を採食した泌乳牛の窒素分配およびルーメンの割合が増加することを示している 。また，同内微生物による窒素合成量を示した。夏季では乾報告では残存する可溶性糖類の含量は温度によら物摂取量の低下に伴い，窒素摂取量も有意に低下

ずほぼ消費されることを報告しており，実用規模した。また，ルーメン内微生物による窒素合成量，１）Table 1 Chemical composition of fermented total mixed ration used in this experiment.
SpringSummerOrganic matter（%DM）

91.4

92.8

Crude protein, CP（%DM）

17.2

16.5

Soluble CP（%CP）

39.7

46.9

Starch（%DM）

19.1

17.9

NDF（%DM）

35.6

36.5

Soluble sugar（%DM）

1.5

1.0

pH

4.32

4.04

Lactic acid（%DM）

5.15

8.06

Acetic acid（%DM）

2.27

3.47

Ammonia-N（%total N）

2.28

3.14

© The Ito Foundation

夏季に調製した発酵混合飼料の泌乳牛における利用適正―窒素利用効率に基づく検証―

359

Table 2 Feed intake, milk yield and composition in dairy cows fed fermented total

mixed ration in spring or summer.

SpringSummerp-value

Dry matte intake（kg/day）

24.5

21.6

0.018

Milk yield（kg/day）

33.8

31.0

0.226

Fat（%）

4.23

3.85

0.170

Protein（%）

3.36

3.08

0.035

Lactose（%）

4.68

4.99

0.140

Solid non-fat（%）

9.02

8.66

0.012

Urea nitrogen（mg/dl）

11.4

10.1

0.250

Milk composition

Table 3 Nitrogen utilization in dairy cows fed fermented total mixed ration in spring orsummer.

SpringSummerp-value

681

573

0.003

g/day

178

149

0.009

% N intake

26.2

25.9

0.817

g/day

198

165

0.024

% N intake

29.1

28.8

0.843

N intake（g/day）
Milk N yield

Fecal N excretion

Urinary N excretion
g/day

257

206

0.011

% N intake

37.9

36.0

0.402

g/day

42.9

50.3

0.585

% N intake

6.8

9.3

0.281

N retention

Rumen microbial N synthesis
g/day

473

344

<0.001% N intake

69.6

60.0

0.011

尿中窒素排泄量，糞中窒素排泄量，乳中窒素移行

量，乳中への窒素移行量が有意に低下した原因と量が春季と比べて有意に低下した。体窒素蓄積量

しては，暑熱ストレスにより乾物摂取量が低下しについては季節による影響は認められなかった。

たことに伴い，窒素摂取量が低下した影響が大き

一方，摂取窒素量あたりで窒素分配量を比較する

いと考えられる。Kamiya et al.（2005）では室温と，ルーメン内微生物体窒素合成量は夏季で有意を制御した環境下において18℃に対して28℃で乳に低下したが，他の窒素分配率については季節に牛を飼養した際に，乾物摂取量が低下し，摂取窒よる影響は認められなかった。

素量，糞中窒素排泄量，乳中窒素移行量が低下し春季と比較して夏季にルーメン内における微生たことを示しており11），本研究の結果を支持して

物体窒素の合成量や尿中および糞中への窒素排泄いる。一方，本研究では摂取窒素量で換算した糞© The Ito Foundation

360

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

および尿中への窒素排泄量，体窒素蓄積量，乳中al.（2018）では混合飼料を発酵貯蔵させた場合，への窒素移行率については季節による影響は認め

粗タンパク質中の溶解性画分が約37％から約49％

られなかった。Kamiya et al.（2005）では短期的に高まるとともに，ルーメン内のアンモニア態窒に暑熱環境に晒した場合，摂取窒素量の低下に加素濃度や乳中尿素窒素濃度が高まっていた３）。まえて，摂取窒素量あたりの尿中への窒素排泄量がた，同報告では乳牛の摂取窒素量あたりの尿中へ40％程度まで高まり，体窒素蓄積量も－12％と低の窒素排泄量が約21％から約25％に増加してお下している。本研究では摂取窒素量あたりの窒素り，体蓄積窒素量が約８％から３％へ低下してい排泄量や体窒素蓄積量はそれぞれ26％，19％であた。本研究では，乳中の尿素態窒素が夏季では増り，Kamiya et al.（2005）とは分配率が異なる。

加していなかったことからも，ルーメン内で余剰

山岸ら（1995）は温湿度に日内変動のある暑熱環にアンモニアが生じていたと判断できず，摂取窒

境では日内変動のない人工気象室のような恒温暑

素量あたりの尿中への窒素排泄量も影響がなかっ

熱環境よりも泌乳牛への暑熱の影響が小さかった

たと考えられる。また，乳牛が体内で代謝するタと報告しており ，本研究は自然環境下で行った

ンパク質の供給源としては，ルーメン内で合成さことから乳牛への暑熱ストレスの影響は比較的穏れる微生物体タンパク質に加えて，飼料由来のタやかであった可能性がある。

ンパク質がルーメン内での分解を逃れ，小腸に到

12）

夏季において摂取窒素あたりの微生物体窒素合達 す る RUP（ruminally undegradable protein：

成量，すなわち微生物体窒素合成効率が低下してルーメン非分解性タンパク質）がある。飼料中のいた。ルーメン内での微生物体窒素の合成には摂RUPは小腸での消化率が50～100％と範囲が広取したルーメン内で分解可能なタンパク質が利用

く，代謝タンパク質に占める割合は飼料によってされる。この合成にはエネルギー源としてルーメ異なる13）。本研究でRUPの消化率が春季より夏季

ン内で消化可能な飼料中の炭水化物が必要であに高まったことで，体内で代謝可能なタンパク質り，このエネルギーとタンパク質の供給バランス量を補った可能性も考えられるが，詳細は不明でが効率的な微生物の増殖に関わっている13）。本研ある。今後，発酵混合飼料中のタンパク質画分に究では給与飼料中のデンプン含量について季節についてより詳細に明らかにすることが必要である。

よる影響は認められなかった。デンプンと同様にエネルギー源として利用される可溶性糖類はいず

４．要

約

れの季節も含量が低く，夏季で見られた微生物体

本研究では，春季および夏季に調製した発酵混

窒素合成効率の低下に影響していないと考えられ

合飼料が泌乳牛の窒素利用に与える影響を調べる。一方，飼料中タンパク質の溶解性窒素画分のた。その結果，夏季に調製した発酵混合飼料では増加に伴い，ルーメン内の微生物へ遊離アミノ酸

タンパク質中の溶解性タンパク質が高まり，採食やアンモニア等の窒素源の供給が増加したため，した乳牛のルーメン内では微生物体窒素合成効率

炭水化物との供給バランスが崩れ，微生物体窒素は低下するものの，乳牛体内での窒素利用効率に合成効率が低下したと考えられる。

は顕著な影響を及ぼさなかった。

本研究では季節によるルーメン内の微生物体窒
素合成効率の違いは乳牛の窒素利用効率にまで影響 を 与 え る ほ ど の 量 で は な か っ た 。Miyaji et© The Ito Foundation

夏季に調製した発酵混合飼料の泌乳牛における利用適正―窒素利用効率に基づく検証―文献１） Kondo, M., Shimizu, K., Jayanegara, A., Mishima,T., Matsui, H., Karita, S., Goto, M., Fujihara, T.：J
Sci Food Agri, 96, 1175～1180, 2016.
２） AFRC：Energy and protein requirements ofruminants, 57～72, CAB International, 1993.
３） Miyaji, M., Nonaka, K.：J Dairy Sci, 101, 5092～
5101, 2018.
４） 自給飼料利用研究会編：三訂版粗飼料の品質評価
ガ イ ド ブ ッ ク ，4～32 ，日 本 草 地 畜 産 種 子 協 会 ，
2009.
５） Kondo, M., Mulianda, R., Matamura, M., Shibata,T., Mishima, T., Jayanegara, A., Isono, N.：
Validation of a phenol-sulfuric acid method in a
microplate format for the quantification of soluble
sugars in ruminant feeds, Anim Sci J, 92, e13530,
2021.
６） Hall, M. B.：Determination of dietary starch inanimal feeds and pet food by an enzymaticcolorimetric method：collaborative study, J AOAC
Int, 98, 397～409, 2015.

361

７）
 George, S. K., Dipu, M. T., Mehra, U. R., Singh, P.,
Verma, A. K., Ramgaokar, J. S.：J Chromato B, 832,
134～137, 2006.
８） 田村哲生，井上和典，篠原晃，古賀照章：日本畜産学会報，78，311～316，2007.
９）
 IAEA：A laboratory manual for FAO/IAEA
Co-ordinated Research Programme, IAEATECDOC-945, IAEA, Vienna. 1997. https：//www.iaea.org/publications/5597/estimation-ofrumen-microbial-protein-production-from-purinederivatives-in-urine
10） 阪谷美樹：産業動物臨床医誌，５（増刊号），238～246，2015.
11）
 Kamiya, M., Iwama, Y., Tanaka, M., Shioya, S.：
Anim Sci J, 76, 217～223, 2005.
12） 山岸規昭，三橋俊彦，宍戸弘明：畜産試験場研究報告，55号，21～30，1995.
13）
 National Research Council（NRC）2001：NRC 乳
牛飼養標準 第７版，284～293，（株）デーリィ・ジャパン社，東京.

© The Ito Foundation

362

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究（Ⅱ）
Studies on the enhancement of calf immunity appraised by rumen matscore（Ⅱ）

保田昌

宏１，２・阿部

信介１，３（１宮崎大学大学院医学獣医学総合研究科，２宮崎大学農学部，３宮崎県農業共済組合）

Masahiro Yasuda1, 2 and Shinsuke Abe１，３（１Graduate School of Medicine and Veterinary Medicine, University of Miyazaki, 2Faculty of Agriculture, University of Miyazaki,
3Miyazaki Agricultural Mutual Aid Association）

The immunity of Japanese Black calves with significantly higher score of ruminal mattformation（RMF）was evaluated by veterinarians’ guidance on improving feeding management
for farmers with a high mortality. As a result, the number of monocytes after the improvementof feeding management was significantly reduced. Furthermore, in lymphocyte subset analysis,
the number of B cells and the number of MHC class Ⅱ＋ cells increased significantly after the
improvement of feeding management. The mortality also decreased after the feeding
management was improved. In conclusion, the evaluation of score of RMF can be useful forunderstanding health condition of calves. In addition, the feeding management for making highscore of RMF calves may be possible to reduce antimicrobial agent usage and production loss
due to disease．

１．目

係が調査され，第一胃が粘土状で固い子牛が多く的なるように給餌管理すると，疾病の発症率が有意

牛の第一胃内容物は，気体層，固体層および液に減少することが報告された。つまり，RMスコ層からなる階層構造をなしており，液層に浮いたアの利用は牛群の管理に有用で，事故発生リスク

状態で存在する固体層はルーメンマット（RM）の評価に使えると考えられる。

と称される。乳用種成牛のRMは給与飼料によっ

これまでに申請者は，家畜の免疫に関する研究て固さと厚さが変化することや，固さと厚さが１と，宮崎県および鹿児島県内の死廃家畜の病理解

日の総反芻時間と正の相関があることが示されて

剖に関する研究，さらに農業共済獣医師および宮いる。一方，子牛のRM形成に関する報告は

崎県畜産試験場などと連携して，牛，豚および鶏ほとんどなく，子牛の粗飼料給与の是非についての飼養管理と抗病性の評価について研究を実施しは見解が分かれている。しかしながら近年，阿部てきた４，５）。その中で家畜の免疫能について，胸ら３）によって，離乳後子牛群のRMスコアと哺育

腺スコア，末梢血サブセット解析，顆粒球や単球

育成期の死亡事故率と給与飼料の粗飼料割合の関の貪食能，末梢血単核球のサイトカイン発現など

１，
２）© The Ito Foundation

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究（Ⅱ）

363を指標にして，自然免疫，細胞性免疫および液性から採血を実施した。血液を大学へ持ち帰り下記

免疫を評価してきた実績があり，家畜の免疫系のの研究方法2. 4に記載した方法で免疫系の評価を評価方法は確立できている６，７）。

実施した。事故率の高い農家の子牛の飼養環境，

さらに昨年までの結果から，第一胃が粘土状でルーメンマットスコア，末梢血サブセット解析，

固い子牛が多くなるように給餌管理すると，疾病

顆粒球や単球の貪食能，末梢血単核球のサイトカの発症率が有意に減少し抗病性が向上することを

イン発現などの評価によって現状を分析し，子牛明らかにした（投稿準備中）。具体的には，月齢，の健康状態や飼養管理の問題点を把握した。

胸囲および腹囲が同じ値である子牛（81.0±5.0日

2 . 2 飼養環境を改善した後の農場の子牛の状齢）を選別してルーメンマット形成良好群とルー態を評価（飼養改善後）

メンマット形成不良群について免疫系のパラメー実験１で得られた結果を元にして，各調査農家

ターを比較した。その結果，Ｂ細胞数はルーメンで可能な飼養改善を実施し，事故率を調査した。

マット形成良好群で有意に多い結果が得られた

飼養管理の改善後に臨床上呼吸器症状などの異常（p＝0.03）。CD4 細胞数（p＝0.06），
CD8 細胞数（pの認められない子牛から採血と下記の研究方法＝0.07），MHC class Ⅱ 細胞数（p＝0.06）はルー

2. 3で示したようにルーメンマットスコアの測定

メンマット形成良好群で多い傾向が認められた。

を行った。採取した血液は下記の研究方法2. 4にルーメンマット形成良好群の顆粒球の貪食率は有記載した方法で免疫系の評価を実施した。実験１

意に高かった（p＝0.01）。さらに，ルーメンマットと実験２で得られた免疫学的な結果を比較解析

形成良好群の単球の貪食率も高い傾向が認められし，飼養環境を改善することによって，子牛の事た（p＝0.05）。つまり，ルーメンマットスコアの利

故率や，自然免疫，細胞性免疫，液性免疫の変化

用は牛群の管理に有用で，事故発生リスクの評価を評価した。

＋＋＋に使え，免疫を増強させることが明らかになった。

2.3

ルーメンマットスコアの測定と基準

そこで本研究では，事故率の高い農家を選抜対象となる子牛を頭絡で保定し，左膁部に拳をし，飼養管理の改善前後の末梢血サブセット解体表に当てた状態で10回連続して強く反復圧迫す

析，顆粒球や単球の貪食能，末梢血単核球のサイる。圧迫する強さは供試子牛を軽く動かす程度とトカイン発現，疾病の発症率とルーメンマットのし，反復圧迫の頻度は10回／10～15秒とする。内固さをスコア化した基準を比較評価した。

容物の固体と液体が混和されて液状化することによって，粗飼料充満度が低い場合は，少ない圧迫

２．材料および方法

回数で波動感を認めるようになり（ルーメンマッ

2 . 1 呼吸器病での事故率の高い農場の現状を

トスコア１），粗飼料充満度が高い場合は，10回の反復圧迫終了後も固いままで波動感を認めない

評価（飼養改善前）
宮崎県内の農場で，過去の治療歴や死亡・廃用（ルーメンマットスコア５）。まとめると，ルーメ

履歴から呼吸器病での事故率が高い農家を16件選

ンマットスコア１は１回目の圧迫で波動感を認め抜した。農場の飼養環境，母牛や子牛への飼料給るもの，スコア２は２～５回の反復圧迫で波動感与などの聞き取り調査を実施し，下記の研究方法を認めるもの，スコア３は６～10回の反復圧迫で

2. 3で示したようにルーメンマットスコアの測定，

波動感を認めるもの，スコア４は10回の反復圧迫

臨床上呼吸器症状などの異常の認められない子牛で波動感を認めないが，内容物が軟らかいもの，© The Ito Foundation

364

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

スコア５は10回の反復圧迫で波動感を認めず，内（TH14B）を用いた。単球と顆粒球ゲートを用い容物が粘土状で固いものとする（Abe et al., 投て各細胞分画の陽性率を算出した。

稿中）
。
2.4

2.5
免疫学的検査方法

統計処理

サ ブ セ ッ ト 結 果 お よ び 貪 食 結 果 は Mann-

血液サンプルを比重遠心分離して末梢血単核球

Whitney U testを用いて解析し，p＜0.05を有意を回収した。赤血球を溶血させリン酸緩衝液で洗と評価した。データは平均±標準偏差で示した。

浄したのち，細胞を蛍光標識した抗体と４℃で１時間反応させ洗浄後，リンパ球ゲートを用いフ
ローサイトメーターで陽性細胞率を測定した。リ

３．結果と考察3 . 1 実験群の内訳およびルーメンマットスコ

ンパ球サブセット解析の表面抗原と標識は，Ｔ細ア

胞 の マ ー カ ー と し て 抗 CD ４ 抗 体 （ILA11A,

子牛末梢血サブセットは月齢によって増減する

Monoclonal Antibody Center at Washington

ことが知られており８），飼養改善前後の比較のたState University, Pullman, WA, USA）
，抗 CD ８めに同じ農家内で月齢がほぼ同じサンプルを抽出

抗体（CC63, Bio Rad, Tokyo, Japan）および抗γして解析した。その結果，のべ10農場で飼養改善

δＴ抗体（GB21A, Monoclonal Antibody Center

前（幼齢改善前群30頭：62±14日齢，若齢改善前

at Washington State University）を，NK細胞の群20頭：107±12日齢）と飼養改善後（幼齢改善マーカーとして抗CD335抗体（AKS1, Bio Rad）

後群30頭：59±９日齢，若齢改善後群20頭：107

を，Ｂ細胞のマーカーとして抗MHC classⅡ抗体±11日齢）を本研究では解析対象とした。幼齢群（TH14B, Monoclonal Antibody Center at

および若齢群とも飼養改善後のルーメンマットス

Washington State University）および抗IgM抗体

コアは改善前に比べて有意に高値であった（P-PIG45A2, Monoclonal Antibody Center at（Table１）。

Washington State University）を 用 い た 。各 サ

3.2

ブセット細胞数は，サブセット比率（％），白血

幼齢群も若齢群も改善後に末梢血１μlあたり球数（個／ml）およびリンパ球比率（％）からの単球数が有意に減少した（Table２）。それ以外

実数値を算出した。貪食率の解析は，バフィーの末梢血白血球数，リンパ球数，顆粒球数などにコートを採取し，赤血球を溶血後，細胞数を調整は差が認められなかった。事故率の高い農家の子し10％牛胎子血清添加RPMI1640溶液に，φ1μｍ

牛は単球数の増加が認められ，飼養改善によっての 蛍 光 標 識 し た ラ テ ッ ク ス ビ ー ズ（No. 1030,

単球数が減少したことは，事故率の高い農家の子

Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO, USA）

牛には自然免疫系が活性化し続け炎症傾向が認めを加え，37℃で１時間培養しラテックスビーズをられた。我々は，慢性肺炎などの慢性炎症で廃用貪食させたのち洗浄して，蛍光標識した抗体でリとなった子牛を剖検しその免疫性状を報告していンパ球サブセットと同様に細胞を染色した。顆粒

る４）。慢性炎症の場合，自然免疫系の亢進を獲得

球のマーカーとして蛍光標識した抗顆粒球抗体

免疫系が制御できなくなっていることが明らかに（CH138A, Monoclonal Antibody Center atなっている。

血液一般検査Washington State University），単球のマーカー

3.3と し て 蛍 光 標 識 し た 抗 MHC class Ⅱ 抗 体

末梢血サブセットは血液１μlあたりの実数値© The Ito Foundation

末梢血サブセット解析

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究（Ⅱ）

365

Table 1 The score of ruminal matt formation pre and post improvement offeeding management
stage

pre

post

juvenile period

1.2±0.5

2.5±1.1＊＊

young period

2.7±0.9

3.5±1.1＊＊p<0.05 vs pre, ＊＊p<0.01 vs preTable 2 Monocyte number pre and post improvement of feeding management
pre

post

juvenile period

Stage

219.7±131.5（cells/ ml）

112.2±49.0＊＊

young period

213.0±86.4

130.0±63.2＊＊＊＊p<0.01 vs preTable 3 Peripheral lymphocyte subset analysis pre and post improvement offeeding managementStage

subsetjuvenile period

young period

pre

post

CD4

1211.8 ± 352.6（cells/ ml） 1153.2 ± 295.9

CD8459.4 ± 126.5

435.8 ± 123.7

CD4CD810.2 ± 4.2

7.4 ± 3.9＊＊γδ946.4 ± 336.0

1142.4 ± 248.3

MHC class Ⅱ

1829.7 ± 451.4

2165.8 ± 604.1＊

B-cell801.7 ± 328.5

1275.4 ± 432.1＊＊

NK

273.1 ± 105.4

291.9 ± 189.5

CD41348.2 ± 295.0

1174.9 ± 302.6

CD8

464.6 ± 155.7

497.1 ± 191.0

CD4CD810.4 ± 6.5

6.3 ± 2.9＊γδ1021.4 ± 441.7

957.2 ± 322.1

MHC class Ⅱ

1895.4 ± 680.4

2355.3 ± 804.2

B-cell894.0 ± 423.9

1417.9 ± 555.3＊＊

NK

299.6 ± 182.0

274.9 ± 131.5＊p<0.05 vs pre, ＊＊p<0.01 vs pre

で 示 し た 。サ ブ セ ッ ト 解 析 時 の フ ォ ワ ー ド ス

トスコアが上がることでＢ細胞数が有意に増加す

キャッターとサイドスキャッターはリンパ球をることは昨年と同じ結果が得られ再現性が認めら

タ ー ゲ ッ ト と し た 。CD4 細 胞 ，CD8 細 胞 ，れた。CD4＋CD8＋細胞は末梢血中の細胞数も少な

γδＴ細胞は各群間で有意な差は認められなかっ

く，その機能も明かになっていないので，今後さた（Table３）。飼養管理改善後の幼齢および若齢らなる解析が必要と思われる。また，飼養改善後

群では，改善前と比べてCD4 CD8 細胞は有意にには単球数が有意に減少する一方で，リンパ球と減少した。同様に飼養管理改善後の幼齢および若同じ大きさのMHC class Ⅱ＋ 細胞数が有意に増加

齢群では，改善前と比べてＢ細胞数とMHC class

したことから，機能的に異なる抗原提示細胞の存

Ⅱ 細胞数は有意に高値となった。ルーメンマッ

在が示唆された。今後この細胞分画が樹状細胞な

＋

＋

＋

＋

＋

© The Ito Foundation

366

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 4 Monocyte and granulocyte phagocytosis pre and post improvement offeeding managementStagephagocytosis

pre

post

juvenile period

monocyte

48.9 ± 11.7（%）

44.6 ± 11.7

granulocyte

70.0 ± 17.8

58.2 ± 14.7

monocyte

52.9 ± 12.7

42.2 ± 10.2＊＊

granulocyte

74.8 ± 12.7

63.5 ± 14.4＊

young period＊p<0.05 vs pre, ＊＊p<0.01 vs pre

どの抗原提示細胞であるかどうか機能解析も含めて詳細な研究を進めていきたい。
3.4

末梢血単球および顆粒球貪食能

幼齢群では顆粒球および単球の貪食能に飼養改
善前後で差は認められなかった（Table４）。しかしながら，飼養改善後には若齢群では顆粒球および単球の貪食能が飼養改善前に比べて有意に低い結果が得られた。この結果から，飼養改善によって単球の数と貪食する機能が抑制されていると考
えられた。
3.5

飼養管理改善前後の事故率

飼養管理改善前後の事故率は，改善前の3.5±
5.2％から改善後には1.6±1.6％となった。
４．要約

獣医師による事故率の高い農家に対する飼養改
善指導によって，ルーメンマットスコアが有意に高くなった子牛の免疫能を評価した。その結果，飼養改善後の単球数が有意に減少した。さらにリンパ球サブセット解析では，飼養改善後にＢ細胞数とMHC class Ⅱ＋ 細胞数が有意に増加した。飼養改善後には事故率も低下した。つまり，ルーメ
ンマットスコアを上げる飼養管理を行うことで子牛の免疫能を向上させ事故率の軽減にもつながることが明らかになった。加えてルーメンマットス
コアを用いた飼養改善により抗生剤の使用などを減じることも可能であると思われる。

文献１）
 Izumi, K., Unno, C.：Effects of feeding ratio ofbeet pulp to alfalfa hay or grass hay on ruminal
mat characteristics and chewing activity in
Holstein dry cows, Anim. Sci. J., 81, 180～186, 2010.
２）
 Izumi, K., Tamura, T., Fujii, R., Nakatsuji, H.,
Morita, S.：Effects of substituting kraft pulp withcorn silage on dry matter intake, ruminal mat
formation, rumen fermentation, and rumination
activity in non-lactating cows, Anim. Sci. J., 90, 205～213, 2019.
３）
 阿部信介，出口祐一郎，壱岐佳浩：ルーメンマッ
トスコア低値持続子牛における血液性状の特徴と病
態生理，家畜診療，66（2），87～96，2019.
４）
 Isashiki, Y., Ohashi, Y., Imatake, S., Baakhtari, M.,
Ramah, A., Kida, T., Yanagita, T., Yasuda, M.：
Studies on the immune status of calves withchronic inflammation and thymus atrophy, J. Vet.
Med. Sci., in press.
５）
 Wakitani, S., Kawabata, R., Yasuda, M.：
Insufficiency of CD205-positive cortical thymic
epithelial cells in immature Japanese Black cattlewith severe thymic abnormalities and poor
prognosis, Vet. Immunol. Immunopathol., 245,
110379, 2022.
６）
 Baakhtari, M., Imaizumi, N., Kida, T., Yanagita, T.,
Ramah, A., Ahmadi, P., Takebe, N., Iwamoto, Y.,
Korosue, K., Tsuzuki, N., Yasuda, M.：Effects ofBranched-chain Amino Acids on Immune Status of
Young Racing Horses, J. Vet. Med. Sci., in press.
７）
 Ramah, A., Yasuda, M., Ohashi, Y., Urakawa, M.,
Kida, T., Yanagita, T., Uemura, R., Bakery, H. H.,
Abdelaleem, N. M., El-Shewy, E. A.：Different
doses of tannin reflect a double-edged impact on
broiler chicken immunity, Vet. Immunol.
Immunopathol., 220, 109991, 2020.
８）
 Hisazumi, R., Kayumi, M., Zhang, W., Kikukawa, R.
Nasu, T., Yasuda, M.：Evaluation of bovine thymic
function by measurement of signal joint T-cell
receptor excision circles, Vet. Immunol.
Immunopathol., 169, 74～78, 2016.

© The Ito Foundation

367

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究（Ⅲ）―Diet Selection能力の活用によるアミノ酸給与の精密化―
A study on requirement of lysine in weanling pigs（Ⅲ）－Precise feedingof amino acids by application of Diet Selection－

勝

俣

昌

也

（麻布大学獣医学部）

Masaya Katsumata（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

This study was conducted to confirm that pigs could display the ability of diet selection as
they could select dietary protein intake meeting their protein and/or amino acids requirements.
We prepared two test diets: high protein diet（HCP diet, crude protein concentration was
26.7％ and that of total lysine was 1.85％，respectively）and low protein diet（LCP diet，14.2％
and 0.81％，respectively）. We conducted two diet selection trials. Four three-week-old
barrows were used in each trial. After acclimatization periods, the pigs were subjected totraining periods（8 days）and then subjected to diet selection periods（2 or 3 weeks, 2 weeks
for the first trail and 3 weeks for the second trial）. During the training periods, the pigs wereallowed access either HCP or LCP diet every other day-the LCP diet on the days 1, 3, 5, and 7
and the HCP diet on the days 2, 4, 6, 8. As for during the diet selection periods, the pigs wereallowed to access both diets every day. The initial body weighs of the pigs on the first day ofthe diet selection period were 15.6 to 17.2kg for the first trial while 8.8 to 11.8 kg for the second
trial. The selected CP concentration on the last days of the diet selection periods were lower
than those of the first days of the diet selection periods（p ＜0.05）-the first trial: 14.7 vs 16.2％；
the second trial: 15.9 vs 21.0％. Thus, we conclude that we succeeded to observe ability of dietselection of the pigs. However, we could not confirm that the pigs could select dietary protein
intake meeting their protein and/or amino acids requirements because the selected CP and/or
total lysine were lower than their requirements．

１．目

飼料中の総リジン濃度として1.27％，標準化可消的化（SID）リジン濃度として1.19％，95％信頼区

わたしたちは，離乳育成豚のリジン要求量を推間を想定すれば，それぞれ1.53％と1.46％という定するための試験研究に2019年度から取り組んで推定値を得た。これらの推定値は日本飼養標準・いる。そして，離乳育成豚（体重10～20kg）の豚2013年版の1.13％と0.96％よりは高い１）。95％

リジン要求量は，95％信頼区間を想定しなければ信頼区間を想定した推定値は米国のNRC飼養標© The Ito Foundation

368

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

準2012年版の1.40％と1.23％よりも高い２）。この

供試豚とした。

ことは，育種改良によってブタの能力が高くなる

１回目の飼養試験は2021年９月７日に供試豚をのに伴い，アミノ酸要求量も高くなっていること

４頭導入，市販人工乳を給与して豚房へ馴致させを示している。

る期間を８日間，供試飼料に馴致させる期間を３

ところで，ブタのアミノ酸要求量は日々変化

日間おいた。幅1.8ｍ×奥行1.6ｍの豚房の両端にし，漸次低下していく。日々変化するアミノ酸要

向かい合うように２つの飼槽を設置した。導入後求量にあわせて飼料を給与するためには，ブタの12日目からLCP飼料とHCP飼料を１日おきに交Diet Selection能力（Kyriazakisら）を活用すれば互に給与するトレーニング期間を８日間おいた。

よい 。10～20kgのブタのリジン要求量は飼料中したがって，供試豚はLCP飼料を１日おきに４の総リジン濃度として1.53％であるが，体重10kg

日，HCP飼料を１日おきに４日摂取したことにのブタには1.53％は低すぎ，20kgのブタには高すなる。トレーニング期間中は豚房の２つの飼槽のぎる。期間の平均としてのアミノ酸要求量を推定両方にLCP飼料あるいはHCP飼料を投入した。そできたとしても，アミノ酸給与をさらに精密化すの後，２週間の選択摂取期間を供試豚に経験させるためには，漸次低下する要求量にあわせて飼料た。選択摂取期間中は豚房の２つの飼槽の一方にを給与するのが望ましい。

LCP飼料を，もう一方にHCP飼料を投入した。そ３）

ブタへのアミノ酸給与をさらに精密化することして，翌日には同じ飼槽に投入する飼料は入れ替を目指して，これまでに推定したリジン要求量えた。つまり，各飼槽には１日おきにLCP飼料と1.53％に近い濃度となるよう体重10～20kgのブタ

HCP飼料が投入されたことになる。飼料の投入が選択摂取できることを明らかにするために，本量，残飼量から摂取量を毎日計算した。１回目の研究を実施した。

飼養試験の選択摂取期間を始めるときの供試豚の２．方

体重は15.5kg，16.5kg，17.0kg，17.2kg，選択摂法

取期間を終えたときの体重は26.7kg，27.8kg，

本研究は麻布大学動物実験委員会により審査され，承認を受けて麻布大学の豚舎施設で実施した

28.4kg，28.9kgだった。
１回目の飼養試験では供試豚が選択したCP濃度が予想より低かった。開始時体重が大きかった（承認番号210811-4）。
トウモロコシ，脱脂粉乳，魚粉，大豆粕をおもことがその理由と考え，開始時体重が10kg前後

な原料として粗タンパク質（CP）含量26.7％の高となるように調整して２回目の飼養試験を実施しタンパク質飼料（総リジン濃度1.85％，可消化エ

た。２回目の飼養試験は2022年２月22日に供試豚

ネルギー濃度3.54Mcal/kg，HCP飼料）と14.2％を４頭導入，市販人工乳を給与して豚房へ馴致さの低タンパク質飼料（総リジン濃度0.81％，可消せる期間を５日間，トレーニング期間を８日間お化エネルギー濃度3.55Mcal/kg，LCP飼料）を調いた。その後，３週間の選択摂取期間を供試豚に製した。飼料の粗タンパク質含量が飼料の嗜好性経験させた。２回目の飼養試験の選択摂取期間をに影響を及ぼすことが考えられたので，サッカリ

始 め る と き の 供 試 豚 の 体 重 は 9.9kg ，8.8kg ，ンナトリウムを甘味料として両方の飼料に0.5％

10.6kg，11.8kg，選択摂取期間を終えたときの体配合した。４週齢の去勢雄豚（系統名スイートマ

重は25.6kg，25.2kg，26.9kg，29.2kgだった。

ミー）を株式会社シムコの館山農場から導入して© The Ito Foundation

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究（Ⅲ）―Diet Selection能力の活用によるアミノ酸給与の精密化―

369

間の増体量（kg）／21日間のCP摂取量（kg））は３．結果と考察3.09，2.51，3.44，2.42，それぞれの測定値の変動

１回目の飼養試験の供試豚の日増体量（g/d）

係数（％）は6.0，16.5，10.6，18.8，14.7だった。

は798，809，814，838，全飼料摂取量（ｇ／14日）

３週間の選択摂取期間中に１頭の供試豚（日増体は20,990，19,975，19,131，22,895，飼料効率は0.53，

量が784g/dのブタ）は選択摂取能力を発揮しな

0.57 ，0.60 ，0.51 ，全 CP 摂 取 量（g/14days）はかった。このブタが選択したCP濃度は漸減せず

3527，3204，2979，3457，CPの利用効率（14日

３週間の平均値は24.6±2.6％だった。そのため，間の増体量（kg）／14日間のCP摂取量（kg））はその豚を除外した３頭の供試豚が選択したCP濃3.43，3.53，3.83，3.39，それぞれの測定値の変動度の平均値を日ごとにプロットしたのがFig.２で係数（％）は1.8，6.8，6.3，6.6，4.9だった。２週ある。開始日に選択したCP濃度は21.0％，11日目

間の選択摂取期間中に４頭の供試豚が選択したには18.2％，終了日には15.9％だった。供試豚がCP濃度の平均値を日ごとにプロットしたのがFig.

選 択 し た 総 リ ジ ン 濃 度 は 順 に 1.37 ％，1.14 ％，１である。開始日に選択したCP濃度は16.2％，７0.95％だった。CP濃度もリジン濃度も開始時と終

日目には15.4％，終了日には14.7％だった。供試了時には差があった（p＜0.05）。

豚が選択した総リジン濃度は順に0.98％，0.92％，

供試した８頭中，７頭のブタは日齢が進むと0.86％だった。CP濃度も総リジン濃度も開始時と（体重が大きくなると）選択するCP濃度が低下し終了時には差があった（p＜0.05）。

た。また，１回目と２回目の飼養試験で選択した
CPと総リジンの濃度を比較すると２回目のほうは700，784，774，829，全飼料摂取量（g/21days）

が高かった。これは２回目の開始時の日齢が７日

は25,540，26,550，28,780，37,950，飼料効率は0.58，

早く，開始時体重の平均値が6.3kg小さかったこ

0.62 ，0.56 ，0.46 ，全 CP 摂 取 量（g/14days）はとが理由だろう。以上のことから，本研究でもブ

4745，6561，4731，7185，CPの利用効率（21日タによるCPの選択摂取を観察できたと結論する。

Selected crude protein concentrations (%)

２回目の飼養試験の供試豚の日増体量（g/d）

18

17

16

15

14

0

5

10
days

Fig. 1 Selected crude protein concentrations of the first feeding trial（n=4）.

Each dot is average of selected crude protein concentrations by four pigs.

© The Ito Foundation

15

370
Selected crude protein concentrations(%)

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

22
21
20
19
18
17
16
15

0

5

10

15

20

days
Fig. 2 Selected crude protein concentrations of the second feeding trial（n=3）.

Each dot is average of selected crude protein concentrations by three pigs.

しかし，これまでに推定したリジン要求量に近いの飼料を調製するのは難しい。NRCに記載され濃度となるよう体重10～20kgのブタが選択摂取ているCPの要求量はアミノ酸バランスの良い飼できることは確認できなかった。

料を想定しているようだ。生産現場で実際に使わ本研究でブタが選択したCPと総リジン濃度をれている飼料よりもCPの要求量が低く設定されNRC飼養標準（NRC2012）に記載されている数ていると言ってよい。以上のことから，本研究で値と比較した。NRC飼養標準では総窒素と表示

ブタが自ら選択したCPと総リジンの濃度は，そさ れ て い る の で 6.25 を か け て CP に 変 換 し た 。

のブタの要求量（遺伝的能力を発揮するのに必要

NRCに記載されているCP要求量は７-11kgではな摂取量）よりも低い値で推移したと考えてい20.6 ％，11-25kg で は 18.9 ％，25-50kg に な る とる。実際，2019年度と2020年度に推定した離乳育

15.7％である。１回目の飼養試験は11-25kg，２

成豚（体重10～20kg）の総リジン要求量は，本回目は７-11kg，11-25kgに対応している。１回研究でブタが選択した総リジン濃度よりも高かっ

目の飼養試験はNRCより低いCP濃度を，２回目た 。こ の と き ，総 リ ジ ン 濃 度 0.95 ％，1.20 ％，は同等のCP濃度を選択したことになる。一方，

1.70％，1.95％の飼料を給与したときの飼料効率

NRCに記載されている総リジン要求量は７-11kg

は0.54，0.61，0.64，0.62だった。本研究では，選が 1.53 ％，11-25kg は 1.40 ％，25-50kg に な る と択摂取能力を発揮しなかったブタの飼料効率が1.12％である。高めの濃度を選択した２回目の飼0.62で，1.20％，1.70％，1.95％の飼料を給与した

養 試 験 で あ っ て も ，選 択 し た 総 リ ジ ン 濃 度 はときの飼料効率と同等であった。しかし，それ以NRCに記載されている要求量よりも低かった。

外のブタの飼料効率は0.46～0.60であり，リジン

NRCは７-11kgのブタのCP要求量を20.6％と記が充足していない飼料を摂取させたブタの飼料効載している。きわめてアミノ酸バランスが良い飼率と同等であった。ブタは自らの要求量を満た料でなければ，このCP濃度で総リジン濃度1.53％

す，つまり遺伝的能力を発揮できるように選択摂© The Ito Foundation

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究（Ⅲ）―Diet Selection能力の活用によるアミノ酸給与の精密化―

371

取すると考えていたが，間違った予想だったかも

低タンパク質飼料（総リジン濃度0.81％，LCP飼しれない。ブタの立場に立つと，遺伝的能力を発料）を調製した。飼養試験は２回実施し，１回の揮するということは，代謝能力を100％あるいは飼養試験には４頭供試した。３週齢の去勢雄豚をそれ以上に発揮することになる。タンパク質の代導入，馴致期間をおいてから，トレーニング期間

謝回転速度を想定すると分かりやすい。これはブ（８日間）と選択摂取期間を２週間（１回目の飼タにとって負担が大きいのではないだろうか。す養試験）あるいは３週間（２回目の飼養試験）設でに述べたように，本研究でもブタによるCPの定した。トレーニング期間にはHCP飼料とLCP飼

選択摂取を観察できたと結論する。しかし，それ料を隔日で交互に摂取させ，選択摂取期間にははブタにとって負担の少ない範囲でCP濃度を選HCP飼料とLCP飼料の両方を摂取させた。選択摂択したのであって，遺伝的能力を発揮してほしい

取期間開始時の体重は１回目が15.6～17.2kg，２という人間側の都合とは違った反応だったと現在

回目は8.8kg～11.8kgだった。いずれの飼養試験は考えている。

でも選択摂取期間の開始日に選択したCP濃度よ動物福祉への対応が進むと，代謝上の負担につりも終了時に選択したCP濃度のほうが低かった

いても目配りすることを求められるかもしれな（１回目；16.2％ vs 14.7％，２回目21.0％ vs 15.9％，い。長い目で見ると，ブタの負担が少ない飼料給ｐ＜0.05）だった。以上より，ブタによるCPの選与が必要になることもあるだろう。本研究で実施

択摂取を観察できたと結論する。しかし，供試豚

した選択摂取モデルも使い，要求量を満たした飼が選択したCP濃度（あるいはリジン濃度）は要

料をブタが摂取したときの代謝上の負担を評価す

求量よりも低く，要求量を満たすように選択摂取ることも重要な研究課題となろう。

できることは確認できなかった。

４．要

約

ブタへのアミノ酸給与をさらに精密化することを目指して，これまでに推定したリジン要求量
1.53％に近い濃度となるよう体重10～20kgのブタが選択摂取できることを明らかにするために，本研究を実施した。CP含量26.7％の高タンパク質飼料（総リジン濃度1.85％，HCP飼料）と14.2％の文
献１） 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構：
日本飼養標準・豚，2013年版，18，中央畜産会，東京，
2013.
２） National Research Council of the National
Academies：Nutrient Requirements of Swine, 11th
Revised Edition, 211, The National Academies
Press, Washington, D.C., 2012.
３）
 Kyriazakis, I., et al.：Physiology & Behavior, 50,
1197～1203, 1991.

© The Ito Foundation

372

国産子実用トウモロコシの乾燥温度および貯蔵条件がトウモロコシの栄養価に及ぼす影響（Ⅱ）
Effects of drying temperature and storage conditions on nutritive value ofdomestic grain of corn（Ⅱ）

篠遠

善哉１・金井源太１・嶝野英子１・芦原茜２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター，
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

２

Yoshiya Shinoto１, Genta Kanai１, Eiko Touno１ and Akane Ashihara２（１Tohoku Agricultural Research Center, NARO, ２Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

Expansion of the cultivation area of domestic corn grain at the site of production isbottlenecked by post-harvest drying and year-round storage. To determine the optimal drying
and storage conditions of corn grain, the effects of two different drying temperatures（40 or
70℃）after harvesting, two moisture levels（9 or 13％）at the start of storage and threestorage conditions（cold storage at 13℃ in flexible container bags; storage in flexible container
bags under normal temperature; and storage in flexible container bags by a wrapping machine
under normal temperature）on the nutritional value of corn as swine feed were examined byin vitro digestion methods. The effect of drying temperature was assessed at 40℃ with aJapanese domestic recirculating dryer and at 70℃ with an Italian recirculating dryer. There
was no effect of drying temperature（40 or 70℃）on the estimated nutritional values（drymatter, DM；crude protein, CP; gross energy, GE; lysine）. The digestibility of DM and CP of
the grain with standard moisture content（13％）was decreased during storage in flexible
container bags at normal temperature to a greater extent than that at cold temperature or in
the flexible container bags by a wrapping machine at normal temperature. In contrast, in thegrain with lower moisture content（9 ％），no clear difference in the digestibility of DM, CP andlysine was observed among all storage conditions examined. Moreover, in the case of cold
storage, the digestibility of DM, CP, GE and lysine was not decreased for stored grain withstandard moisture（13％）. In conclusion, it is suggested that domestic corn grain should bedried under a lower moisture condition than the standard condition, and the grain should be
stored at a low temperature or in the flexible container bags by wrapping machine duringextended storage to prevent quality deterioration．

１．目

は乾燥調製と通年貯蔵のポストハーベストの部分的である。他の土地利用型作物である水稲・麦・大生産現場における国産トウモロコシ子実（子実豆と比較して，子実用トウモロコシは単位面積当

用トウモロコシ）の栽培面積拡大のボトルネック

たりの収量が多い。栽培から収穫までは高速作業© The Ito Foundation

国産子実用トウモロコシの乾燥温度および貯蔵条件がトウモロコシの栄養価に及ぼす影響（Ⅱ）

373

体系が開発されているが，既存の乾燥機では処理て2021年５月12日に条間76 cm，株間17 cmの設能力が追いつかず，特に府県では栽培面積の拡大

定で行った。収穫作業は，2021年10月21日に子実が停滞している。また，子実用トウモロコシの実

用トウモロコシの収穫を想定して試験用部品を装需者である畜産農家では，輸入，国産に関わらず着した普通コンバイン（WRH1000c，クボタ社）

通年供給が求められることから，国産の子実用トにタイ製サードパーティー品（３条刈仕様，KIJ

ウモロコシの通年貯蔵は必須である。しかし，輸VANICH社）を装着して行った。なお，収穫時入元の主要産地であるアメリカ等と比較して，梅の立毛子実水分は23％であった。

雨や夏季に高温多湿条件となる我が国の貯蔵条件

2021年10月18日に３カ所において，隣接する２では，カビや腐敗など貯蔵中の品質低下が懸念さ条を２ｍの長さ（3.0 ｍ２）で雌穂を収穫して，坪れる。府県において東北地域は，子実用トウモロ

刈収量を調査した。

コシの栽培面積が最大である。しかし，現状で国産の子実用トウモロコシの通年貯蔵方法に関する2 . 2 子実用トウモロコシの乾燥および貯蔵試
験

知見が少なく，東北地域では，これまで貯蔵中の乾燥試験は，コンバインで収穫した子実用トウ

品質低下が原因で子実用トウモロコシを廃棄する

モロコシを供試した。試験区は，循環式乾燥機事例も報告され，多くの場合が冬季に全量を使い（RTM250-XLD5，金子農機社）を用いてコムギ切る体系で利用されている。そのため今後，府県の 乾 燥 の 慣 行 温 度（約 40 ℃ ）で 乾 燥 す る 低 温において子実用トウモロコシの栽培面積の拡大と（LT）区と高速高温乾燥機（AGD10，Agrex社）

安定供給のためには高速乾燥技術と通年蔵技術にを 用 い て 高 い 温 度（70 ℃ ）で 乾 燥 す る 高 温

関する知見の集積がきわめて重要である。

（HT）区を設け，飼料として適した水分15％以下

そこで本研究では，国産の子実用トウモロコシの高速高温乾燥と通年貯蔵の条件がそれぞれ豚のとなるまでの乾減率と除水量当たりの消費熱量を調査した。

飼料としての栄養価に及ぼす影響をin vitroの人貯蔵試験は，2020年11月上旬に収穫した子実用

工消化法を用いて明らかにし，効率と品質を両立

トウモロコシを11％-13％以下に乾燥させた13％させる子実用トウモロコシの乾燥・貯蔵体系の社（対照：慣行水分区）と９％（低水分区）まで乾会実装へ向けた基礎的知見を得ることを目的とす

燥した試料をそれぞれ供試した。なお，乾燥にはる。

循環式乾燥機（RTM250-XLD5，金子農機社）を

２．方用いて，乾燥温度はコムギの乾燥の慣行温度（約法40℃）とした。試験は，耕種農家が特別な施設や

2 . 1 子実用トウモロコシの栽培試験および収装置を必要とせず手持ちの営農機械で通年貯蔵を行えるように，乾燥終了時の子実用トウモロコシ

穫試験
試験は，2021年に農研機構東北農業研究センの水分を慣行水分（13％，HM）と低水分（９％，ター内（岩手県盛岡市）でトウモロコシ（ZeaLM）で変えた条件とフレコンバッグを用いた３mays L., cv. LG3490）を供試して実施した。

種類の貯蔵方法を組み合わせた合計６条件で検討

施肥は，牛糞堆肥を１t/10a，基肥として配合した。貯蔵試験は，東北地域における通年貯蔵を

肥料をN，P2O5 ，K2Oの成分でそれぞれ20，10，

想定して2020年秋の収穫後から約１年後の2021年

10 g/m 施用した。播種は，不耕起播種機を用い９月下旬まで東北農業研究センター（岩手県盛岡２© The Ito Foundation

374

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

市）で実施した（対照区の低温貯蔵試験のみ茨城
県つくば市で実施した）。貯蔵方法は，2021年３３．結果と考察

月下旬までフレコンバッグで常温貯蔵した後に常3.1

湿低温貯蔵（13℃）したものを対照とし，他の処

コンバインによる全刈収量は977 kg/10a，坪刈

理区は温度調節の機能を持たない一般的な飼料保収量は1,142 kg/10aであった。乾燥後の仕上水分管庫で実施し，フレコンバッグで貯蔵する区（貯は，LT区およびHT区ともにそれぞれ13.4％，

蔵の面では劣るが最も簡易かつ安価な方法），フ12.5％であり，おおむね目標水分の15％以下でレコンラップで貯蔵する区（2020年秋の収穫，乾あった。乾燥温度について，慣行水分区ではLT燥後にフレコンラップ調製：最も通年貯蔵に適し区で31.3℃，HT区では68.8℃であり，LT区よりているがラッピングマシーンやラッピング代等にHT区で37.5℃高く，１時間当たりの水分の減少

より貯蔵に係る費用が最も高い）とした。調査

程度を示す乾減率はLT区，HT区それぞれ1.5％，

は，低温貯蔵前（３月下旬）と貯蔵後（９月下3.1％であり，HT区はLT区の２倍程度であった．

旬）のカビ毒濃度（フモニシン）および生菌数

除水量当たりエネルギー消費量はLT区とHT区で（カビ数，酵母数，大腸菌数）について調査した。

それぞれ5.8 MJ/kg-water，8.4 MJ/kg-waterで

2 . 3 子実用トウモロコシの栄養価に関する試

乾燥試験および貯蔵試験あり，HT区で大きかった。
岩手県盛岡市における貯蔵試験では，2020年11験①高速高温乾燥試験：循環式乾燥機を用いて月から３月までの冬季の平均温度は1.2℃，平均40℃，70℃で乾燥処理した子実用トウモロコシ２

湿度は76.4％であった。一方，４月-９月の温度

種類，および②通年貯蔵試験：13％と９％まで乾は６月に入ると20℃を超え，８月には日平均温度

燥した子実用トウモロコシをフレコンバッグまたが34℃となり，８月中旬より徐々に低下したが，はフレコンラップで常温下において2020年10月か20℃を下回ることはなかった。４月-９月の湿度ら2021年３月末まで保管した後，フレコンバッグ

は最低34.6％，最高87.1％，平均湿度は62％であっ

貯蔵の一部は2021年４月上旬から９月上旬まで冷た。生菌数については，いずれの乾燥水分におい蔵貯蔵した子実用トウモロコシ６種類，についてても貯蔵前にはカビ数で4.6-4.8 log CFU/gFM，それぞれの栄養価を明らかにするために，豚の消酵母数で1.0-4.1 log CFU/gFM，大腸菌数で3.2-化管における消化・吸収反応を試験管内で再現し4.3 log CFU/gFM検出されたが，貯蔵１年後にはた人工消化法により，各種栄養素の利用性を評価

酵母数は検出限界以下となり，カビ数，大腸菌数し た 。人 工 消 化 は ，Boisen ら（1997） お よ び

も低く抑えられ，いずれの処理区においても良好

Regmiら（2009） の方法に従い，ペプシンとパな貯蔵状態を保っていた（Table１）
。

１）

２）

ンクレアチンを消化酵素として用いた２段階の消化反応を行った後，ろ過による残さを不消化物と3 . 2 乾燥温度および貯蔵条件が子実用トウモ
ロコシの栄養価に及ぼす影響

みなし，栄養成分（乾物：DM，粗タンパク質：①高速高温乾燥試験に用いた子実用トウモロコ

CP，総エネルギー：GE，リジン）の消化率を算

シの一般成分値をTable２に，人工消化試験結果

出し，飼料タンパク質としての栄養価を低温貯蔵

をTable３に示した。40℃あるいは70℃で乾燥後前（３月下旬）と貯蔵後（９月下旬）について評の一般成分値は両トウモロコシ間で違いはなく，価した。

また，DM，CP，GEおよびリジン消化率はいず© The Ito Foundation

375

国産子実用トウモロコシの乾燥温度および貯蔵条件がトウモロコシの栄養価に及ぼす影響（Ⅱ）
Table 1 Microbial flora of dry corn grain（log CFU/gFM）

Storage condition

Moisturelevels at thestart ofstorage

Fungi

Yeast

Coliform
bacteria

before storage

13%

4.8A

1.0B

4.3A

before storage

9%

4.6A

4.1A

3.2A

in bag

13%

1.5B

ND

0.7B

in bag

9%

1.5B

ND

0.7B

in wrap

13%

ND

ND

0.7B

9%

2.3B

ND

0.8B

in wrap

in bag, storage in flexible container bag；in wrap, storage in flexible container bag bywrapping machine.
ND： not detected.
Values are expressed as least square means. A, B：p<0.05.

Table 2 Chemical analysis of corn（on a DM basis）harvested in 2021
Drying condition

DM（%）

CP（%）

CA（%）

EE（%）

CF（%）

GE（MJ/g）

40°
C

87.1

8.4

1.4

4.1

2.3

18.7

70°
C

88.1

8.3

1.5

4.0

2.1

18.6

DM, dry matter；CP, crude protein；CA, crude ash；EE, ethyl extract；CF, crude fiber；GE, gross energy.

Table 3 In vitro digestion test ① after drying at two different temperatures
Drying condition

DM（%）

CP（%）

GE（%）

Lysine（%）

40℃

76.1

83.5

99.9

92.1

70℃

76.4

83.7

99.9

92.0

DM, dry matter；CP, crude protein；GE, gross energy.
In vitro digestion test ①：The effect of two different drying temperature on the nutritive balue of domestic
corn grain.

Table 4 Chemical analysis of corn（on a DM basis）harvested in 2020
Storage condition

Moisture level at start ofstorage

DM（%）

CP（%）

CA（%）

EE（%）

CF（%）

GE（MJ/g）

before storage

13%

87.4

8.5

1.6

4.07

2.76

18.8

before storage

9%

90.4

9.0

1.5

3.82

2.12

18.8

cold

13%

88.1

8.4

1.5

4.11

2.39

18.6

cold

9%

88.7

9.1

1.5

4.18

2.20

18.6

in bag

13%

87.8

8.3

1.4

4.15

2.45

18.5

in bag

9%

90.9

9.0

1.3

4.09

2.34

18.4

in wrap

13%

86.5

8.5

1.4

4.29

2.46

18.6

in wrap

9%

91.5

8.8

1.4

4.31

2.29

18.5

DM, dry matter；CP, crude protein；CA, crude ash；EE, ethyl extract；CF, crude fiber；GE, gross energy；in bag, storage in
flexible container bag；in wrap, storage in flexible container bag by wrapping machine.

© The Ito Foundation

376

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 5 In vitro digestion test ② following storage under conditions of cold, in flexible container

bags or in flexible container bags by wrapping machine

Storage condition

Moisture level at start ofstorage

DM（%）

CP（%）

GE（%）

Lysine（%）

before storage

13%

74.8AB

85.3AB

99.8AB

90.3ABC

before storage

9%

76.8A

86.5A

99.8A

90.7ABC

cold

13%

76.6A

85.2AB

99.8AB

90.6ABC

cold

9%

76.5A

86.5A

99.8AB

91.0AB

in bag

13%

73.0B

82.1C

99.7B

89.5BC

in bag9%75.0AB

84.9AB

99.8A

91.9A

in wrap

13%

76.2AB

83.1BC

99.8AB

89.0C

in wrap

9%

78.0A

85.2AB

99.8A

90.5ABC

DM, dry matter；CP, crude protein；CA, crude ash；EE, ethyl extract；CF, crude fiber；GE, gross energy；
in bag, storage in flexible container bag；in wrap, storage in flexible container bag by wrapping machine.
Values are expressed as least square means. A, B, C： p<0.05.
In vitro digestion test ②：The effect of storage conditions on the nutritive value of domestic corn grain

れも差はなかった。

影響を及ぼさず，また水分含量の違いによっても②通年貯蔵条件試験に用いた子実用トウモロコ

消化率の違いは見られなかった。以上から，貯蔵シの一般成分値をTable４に，人工消化試験結果

前と比較して，冷蔵やフレコンラップで貯蔵したをTable５に示した。貯蔵前と冷蔵，フレコンバッ

場合は，子実用トウモロコシの水分含量に関わら

グ，フレコンラップで貯蔵後の人工消化の結果

ず消化率は低下しないが，フレコンバッグで貯蔵は，冷蔵で貯蔵すれば，子実用トウモロコシの水した場合は，13％の水分含量の子実用トウモロコ

分含量に関わらず貯蔵前と比較して有意差はな

シは貯蔵前や９％の水分含量の子実用トウモロコ

かったが，フレコンバッグで貯蔵した場合は，シと比較して，消化率が低下することが明らかと13％の水分含量のトウモロコシは，CP消化率なった。これらのことは，秋に収穫した子実用ト（85.3％ vs 82.1％）において貯蔵前より有意に低ウモロコシを，消化率を低下させずに長期間貯蔵

くなり，また，フレコンバッグで貯蔵した13％とするには，冷蔵あるいはフレコンラップが適して９％の子実用トウモロコシ間で比較すると，CPいる可能性が示唆された。なお，本研究は2020年

消化率（82.1％ vs 84.9％），GE消化率（99.7％ vs

度に収穫した子実用トウモロコシのみの結果であ99.8％）およびリジン消化率（89.5％ vs 91.9％）

るため，今後，再現性を確認する必要がある。

において，13％の子実用トウモロコシのほうが貯蔵前のフモニシン濃度は13％の水分含量より９％よりも有意に低い値であった。このことは，９％の水分含量で低い傾向であり，貯蔵後のフモ

フレコンバッグで貯蔵した場合は，13％の水分含

ニシン濃度は13％および９％の水分含量ともに冷量の子実用トウモロコシは消化率が低下する可能

蔵貯蔵もしくはフレコンバッグであれば増加する性があり，９％まで水分含量を低下させることにことはなかった。また，フレコンラップでは貯蔵より消化率の低下は抑制できる可能性が考えられ前後でフモニシン濃度に大きな変化は見られなた。一方，フレコンラップで貯蔵した場合は，貯かった。

蔵前と比較して，子実用トウモロコシの消化率に© The Ito Foundation

国産子実用トウモロコシの乾燥温度および貯蔵条件がトウモロコシの栄養価に及ぼす影響（Ⅱ）

４．要

377

レコンバッグで貯蔵したものが冷蔵やフレコン

約

ラップで貯蔵したものより低く，冷蔵およびフレ

本研究では，収穫した国産子実用トウモロコシ

コンラップで貯蔵したものは貯蔵前と消化率の違を異なる温度水準（40℃ vs 70℃）で乾燥し，さいはなかった。一方で，９％の水分含量の子実用らに異なる水分含量（13％ vs ９％）のトウモロ

トウモロコシのDM，CPおよびリジンの消化率はコシを異なる条件下（冷蔵，フレコンバッグ，フ貯蔵方法の違いによる影響は受けず，貯蔵前と消レ コ ン ラ ッ プ）で 貯 蔵 し た 後 ，豚 に お け る in

化率の違いはなかった。以上から，国産子実用ト

vitroの人工消化法を用いて栄養価を比較検討す

ウモロコシの栄養価を低下させることなく豚に給ることにより，国産子実用トウモロコシの乾燥・与するには，低水分まで乾燥した国産子実用トウ

貯蔵についての好適条件を明らかにすることを目モロコシを使用すること，また品質の低下を防ぐ的とした。約40℃で通風を行う国産循環式乾燥機

ためには冷蔵あるいはフレコンラップで貯蔵すると約70℃で通風を行う外国製高温高速乾燥機を用必要が示唆された。

いることで，２つの温度水準での乾燥を行った。
①異なる温度（40℃と70℃）で乾燥した子実用
トウモロコシの人工消化率は，乾物（DM），粗タンパク質（CP），総エネルギー（GE），リジンのいずれも差がなかった。②13％の水分含量の子

文献１）
 Boisen, S., Fernandez, J. A.：Animal Feed Scienceand Technology, 68, 277～286, 1997.
２）
 Regmi, P. R., Ferguson, N. S., Zijlstra, R. T.：
Journal of Animal Science, 87, 3620～3629, 2009.

実用トウモロコシのDMおよびCPの消化率はフ© The Ito Foundation

378

多頭飼養の牛群において反芻を含む行動型判別を可能とする映像モニタリング技術の開発
Development of video monitoring system for cattle herds that enables thediscrimination of type of behaviour including rumination

多

田

慎

吾

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構北海道農業研究センター）

Shingo Tada
（Hokkaido Agricultural Research Center, NARO）

In this study, we developed the video monitoring system for cattle herds that enables thediscrimination of type of behaviour including rumination. Using the video data acquired by the
network camera, more than three thousand images of a cattle were clipped and seventeen
keypoint positions of the cattle body in the image were annotated. Using the annotated datafor deep learning, we developed an artificial intelligence model that can detect the keypoint
position of the cattle body with high accuracy. Then, applying the developed model, the timeseries information of the keypoint positions of each type of behaviour（“foraging”，“standingruminating”，“standing-idling”，“lying-ruminating” and “lying-idling”）were obtained. Using
these data, we developed the support vector machine model that enables the discrimination oftype of behaviour. When applying the model for the videos that mouth of cattle was visible, theaccuracy rate of the discrimination among “foraging”，“standing” and “lying” was close to90％，and the accuracy rate for discrimination between “ruminating” and “idling” when the
cattle were “standing” or “lying” was about 70％. Furthermore, we presented a video analysis
system that can executes discrimination of type of behaviour for multiple individuals of cattle
simultaneously．

１．目

傾向に伴い，近年１戸当たり飼養頭数は大きく増的えている。飼養頭数の大規模化に伴って群飼肉用

肉用牛生産においては，アニマルウェルフェア

牛の行動把握および個体ごとの精密な飼養管理がのレベルを維持しつつ，採食や休息といった個体

より困難な状況となっており，異常発見の遅れや維持行動が正常に保たれるよう飼養管理すること

症状の重篤化，その対処に伴う労力の増加を招くが求められる。これには日常的に各個体の行動をケースも多い。

把握することが重要である。飼養頭数が中規模程

このような課題を解決する目的で，近年，ウシ度であれば，各個体に目が行き届きやすく，異常を対象とした映像解析に基づく行動モニタリングが生じた場合でも早期対応を図ることができる場

技術が開発されつつある１～５）。同様の目的のもの合も多い。しかしながら，肉用牛飼養戸数の減少にウシに万歩計や加速度計のようなウェアラブル

© The Ito Foundation

多頭飼養の牛群において反芻を含む行動型判別を可能とする映像モニタリング技術の開発

379

センサを装着し行動データを収集する手法もある

および角度からの映像を利用することで，ウシのが，映像解析に基づく手法はカメラさえ設置すれ映り方によらない汎用性の高い行動型判別技術をば各個体へセンサを取り付ける費用や労力が生じ開発することを目的とした。取得された映像はないため，低コストかつ省力的なシステムとしてネットワーク経由でネットワークディスクレコー

実用化が期待されている。一方，これまで提案さダー（Panasonic社，WJ-NX200）に記録し，同れている映像解析による手法は，主に滞在場所やデータをハードディスクドライブに保存して，行動量の把握を目的とするものであり，反芻行動

パーソナルコンピュータでの解析に供した。

を含めた行動型を把握できるものは存在していな
い。行動型の中でも特に反芻行動は，飼料摂取量

2 . 1 牛体画像を対象としたキーポイント検知
モデルの開発をはじめ各種疾病の徴候や回復状態，あるいはス

取得した牛舎映像データを基にウシ１頭が映る

トレス状態を反映するバロメーターとなる有用な範囲を画像として切り出し，合計3,438枚の画像情報となるため，これを把握できるウェアラブル

データを得た。画像の切り出しは，画像・映像処

センサシステムにおいての明確な優位点となって理用の計算ライブラリであるOpenCV（https://

いる。

opencv.org/）を用いて行った。この大量のウシ

そこで本研究では，映像解析により反芻行動を画像について，牛体のキーポイント位置を指定す含む行動型把握を可能とすることを目的として，るアノテーション作業を実施した（Fig.１）。ア

近年ヒトを対象として研究が進んでいる，１）深ノテーション作業にはCOCO Annotator（https://層学習手法による画像からの関節位置キーポイン

github.com/jsbroks/coco-annotator）を用いた。

ト検知技術のウシへの応用と，２）そこから得ら指定するキーポイントの数としては，ヒトの骨格れる情報の時系列解析による行動型判別技術の開検知の分野にて代表的なデータセットである

発に取り組む。そして，３）これらと調査者が開COCO dataset （https://cocodataset.org/） で も発を進めている牛群映像解析技術用いられる計17点の設定が本研究の目的において

３，４）

を組み合わ

せ，多頭飼養の肉用牛各個体の行動型を自動かつ同時に把握できる映像モニタリングシステムを構築することを目的とする。本成果により，コストが高くなりがちなウェアラブルセンサを利用することなく，省力的かつ容易に多頭飼養肉用牛の精密個体管理を可能とする飼養管理者補助システムを提供することを目指す。
２．方法

本研究では，農研機構北海道農業研究センター
および協力農家の放し飼い方式の搾乳牛牛舎に設置の複数の撮影条件の有線LAN接続ネットワー
クカメラからのべ約25ヵ月分の映像データを取得，蓄積し，これを用いた。さまざまな撮影位置

Fig. 1 An example of the keypoint annotation of cattle

in this study.

© The Ito Foundation

380

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

も充分と考えたため，この設定を踏襲してウシのしを示す）。

口元，左目，右目，左耳，右耳，左肩，右肩，左OKS ＝Σ［expi（－di2/2s2κi2）
δ（vi ＞ ０）
］
/Σ［δ
i
（vi

前肢踵，右前肢踵，左前肢蹄，右前肢蹄，左臀部，＞０）］

右臀部，左後肢踵，右後肢踵，左後肢蹄，右後肢

di：検出されたキーポイント位置と正解の位置と蹄，の計17点についてアノテーションした。アノの距離，ｓ：対象の全体の矩形領域面積，κi：定テーション画像のうち，3,127枚を画像キーポイ

数（本研究ではヒトの骨格検出に採用される値をント検知モデルの学習用データとし，残りの311

用いた），δ（vi＞０）：正解データにてアノテーショ

枚は精度検証のためのテストデータとした。

ンされていれば１。

画像からのキーポイント検知手法として，本研
究ではHRNet

そして，Precisionはすべての検出のうち，OKSと呼ばれる手法を応用して牛体が0.5以上での予測に成功した割合を表す。また，画像を対象に適用した。同手法は画像中の対象をRecallは検出されるべき総数のうち，OKSが0.5以検出した後に同範囲内でキーポイントを検知する

上で検出できた割合を表す。

６）

トップダウン方式の手法であり，牛体範囲を検出する機能を有する映像によるウシ個体識別・追跡

2 . 2 牛体キーポイント位置座標の時系列情報に基づいた行動型判別モデルの開発

プログラム３，４）と親和性が高く，また，同方式の取得した牛舎映像データを基に，判別を目指す手法の中でも精度および計算速度が高い方法としそれぞれの行動型（“採食”，“立位反芻”，“立位て知られている。本研究では，同手法のPython

休息”，“横臥反芻”，“横臥休息”）について，ウ

言 語 の 公 開 プ ロ グ ラ ム コ ー ド（https://github.

シ１頭が口元を含めて映っている15秒程度の動画

com/HRNet/HRNet-Human-Pose-Estimation）

ファイル（10フレーム／秒）を各15個以上，合計

を 自 身 の 開 発 環 境 （Windows 10, Anaconda

で120個切り出した（Fig.２）。各行動型の動画に（https://www.anaconda.com/）を 利 用）に て 実

ついて150秒分を精度検証用として，残りを学習行し，上述のアノテーション済みデータセットを用として用いた。これらの動画ファイルを対象に同モデルに学習させることで，牛体のキーポイン

2.1で作成したキーポイント検出モデルを適用し，ト位置を検出できるオリジナルのモデルを作成し１フレームごとに各キーポイント位置データを取た。機械学習のエポック数（一つの訓練データを得した。

繰り返して学習させる回数）は最大210回とし，本研究では，牛体キーポイント位置座標情報に最終的に得られたモデルを本研究のキーポイント

基づき，まず“採食”，“立位”，“横臥”のいずれ検出モデルとして採用した。

の姿勢であるか判別し（段階１），“立位”もしく

上記で学習に用いなかったテストデータ311枚

は“横臥”と判別されたものについて，“反芻”に対して，作成したモデルによるキーポイント検か“休息”かの判別を行う（段階２）方法をとっ出を試行し，精度評価を行った。評価指標としてた。予備検討から，段階１の姿勢の判別には，ウOKS（Object Keypoint Similarity）の 閾 値 を 0.5

シの前半身の各キーポイント位置間の距離（口元以上とした際のPrecisionとRecallを用いた。OKSと左肩，口元と右肩，口元と左前肢踵，口元と右とは，モデルにより検出されたキーポイント位置

前肢踵，口元と左前肢蹄，口元と右前肢蹄，左肩と正解の位置との類似度の平均の指標で，以下のと左前肢踵，左肩と左前肢蹄，左前肢踵と左前肢式で計算される（1.0で完全一致，0.0で重なりな

蹄，右肩と右前肢踵，右肩と右前肢蹄，右前肢踵

© The Ito Foundation

多頭飼養の牛群において反芻を含む行動型判別を可能とする映像モニタリング技術の開発

381

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

Fig. 2 Example of cattle images for each type of behaviour.（a）Foraging.（b）Standing-

Ruminating.（c）Standing-Idling.（d）Lying-Ruminating.（e）Lying-Idling.

と右前肢蹄）計12個のパラメータを用いることとメータを入力として，段階１および２の判別を行した。また，段階２の“反芻”か“休息”かの判うサポートベクターマシン（SVM）モデルをそ

別には，ウシの口元の動きを表すパラメータとしれぞれ作成した。SVMモデルの作成にはPythonて，過去１秒間（10フレーム）のフレーム間（0.1の 機 械 学 習 ラ イ ブ ラ リ で あ る scikit-learn

秒ごと）の口元の位置の距離変位の絶対値（ｎ＝（https://scikit-learn.org/）を用いた。

９）および合計，ｘ軸方向の変位（ｎ＝９）およ2 . 3 映像による行動モニタリングシステムへ

び合計，ｙ軸方向の変位（ｎ＝９）および合計，の牛体キーポイント検知および行動型判別

加えて段階１で用いた位置間の距離の，計42個の機能の実装

パラメータを用いることとした。これらのパラ調査者が開発を進めているウシ個体識別・追跡© The Ito Foundation

382

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

プログラム３，４）は，映像上に映る複数頭のウシ個

3 . 2 牛体キーポイント位置座標の時系列情報

体について同時に牛体範囲を検出する機能を有すに基づいた行動型判別モデルの開発る。この牛体範囲検知ステップに，前項2. 1，2. 2

牛体キーポイント位置座標の時系列情報に基づで開発した牛体キーポイント検知および行動型判く，“採食”，“立位”，“横臥”のいずれの姿勢で別機能を組み込み，多頭のウシの行動型を自動か

あ る か の SVM に よ る 判 別（段 階 １）の 全 体 のつ同時に把握できるプログラムのコードを作成しAccuracy（正解率）は88.0％となり，高い確率でた。具体的には，対象のウシが１秒以上持続してウシの姿勢の判別が可能であった（Table１）。た

同じ位置で矩形検出された場合に，キーポイント

だし，“横臥”を正しく判別できる確率は非常に検知および行動型判別を実行し，判別結果を画面高かったものの，“採食”と“立位”を誤識別す

上に表示する構成とした。プログラミング言語にるケースがやや多く認められた。これは判別のた

はPythonを用いた。

めのパラメータとして用いたウシの各キーポイン
ト位置間の距離の，各姿勢間の差異程度を反映し３．結果と考察た結果と考えられた。
一方で，段階１で“立位”もしくは“横臥”と

3 . 1 牛体画像を対象としたキーポイント検知

判別されたものについて行う“反芻”か“休息”モデルの開発本研究にて作成した牛体キーポイント検知モデ

かのSVMによる判別（段階２）については，“立ルの精度指標は，OKSの閾値を0.5以上とした場

位”の際の正解率が72.0％，“横臥”の際の正解

合，Precisionが90.8％，Recallが91.6％であった。

率が71.3％にとどまった（Table２）。本研究ではPrecisionの値はどれだけ正確にキーポイント検“反芻”か“休息”かの判別には主にウシの口元出できたかを示す。すなわち，すべての検出のうの位置変化に関する情報を用いたが，ウシの首振

ち，90.8％と非常に高い割合がOKS 0.5以上の検りのような他の動作での口元の動きが誤判別の大出であったこととなる。また，Recallの値は検出きな要因と推察された。このような反芻でない動

漏 れ の 少 な さ を 示 し ，検 出 す べ き 総 数 の う ち

きのデータも蓄積し，判別モデルに反映させるこ

91.6％をOKSが0.5以上にて検出できたことを意味とで，さらなる精度向上が期待される。他方で，する。このように本研究で作成したキーポイント

さらに精密に口元位置を検出できるモデルを作成

検出モデルは，アノテーションした画面上に映る

し，反芻時の口元の細かな位置変化をより正確に

キーポイントに関して正確に検出可能かつ検出漏捉えることで，判別精度を向上させられる可能性

れも非常に少ないと考えられた。

も考えられた。

Table 1 Confusion matrix of SVM for classifying “Foraging”, “Standing” or “Lying”.
Predicted（sec）
Foraging

Standing

Lying

Recall（%）

Foraging

112

34

1

76.4

True
（sec） Standing
Lying

29

254

5

88.1

Precision（%）

9

12

294

93.4

74.5

84.7

98.1

Accuracy（%）88.0© The Ito Foundation

多頭飼養の牛群において反芻を含む行動型判別を可能とする映像モニタリング技術の開発

383

Table 2 Confusion matrix of SVM for classifying “Ruminating” or “Idling”

when the cattle was standing（a）and lying（b）.

（a）
Predicted（sec）
Ruminating

IdlingRecall（%）

Ruminating

121

55

68.8

29

95

76.6

Precision（%）

80.7

63.3

Accuracy（%）72.0

True（sec） Idling（b）
Predicted（sec）

True
（sec）

Ruminating

IdlingRecall（%）

Ruminating

108

44

71.1

Idling

42

106

71.6

Precision（%）

72.0

70.7

Accuracy（%）71.3

Standing
Lying

Lying
Ly
Lying

Standing
Standing _ R
LyingStanding

Standing

Lying

Fig. 3 Application example of video analyzing program for cattle herds that enables thediscrimination of type of behaviour. “_R” measns “Ruminating”.

3 . 3 映像による行動モニタリングシステムへ

判別モデルの精度向上に加え，密集により映像上の牛体キーポイント検知および行動型判別

でウシが重なった際にキーポイント検出自体の精機能の実装度が落ちてしまうほか，そもそも口元が映らない

本研究にて開発した技術を実装し，映像から各場合への対処，同じ位置にとどまっているウシしとともに，各個体のキーポイ

か対象とできない点の解決，取得する行動型デー

ント位置データに基づき行動型を判別するプログ

タと各個体IDとの紐づけを可能とする高精度なラムを作成した（Fig.３）。これにより映像中の個体識別技術の開発，幅広い撮影条件における開複数の個体について行動型を同時かつ自動で判別

発技術の汎用性の検証，といった課題も多く，今できる。しかしながら，実用のためには，行動型

後これらの技術開発に努める。

個体を検出する

３，
４）© The Ito Foundation

384
４．要

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

謝

約

辞

本研究は，農研機構北海道農業研究センターの山

さまざまな撮影条件で取得した大量の牛舎内映

形麻利子氏，農研機構北海道技術支援センター第１像からウシ１頭が映る範囲を切り出した合計３千

業務科の職員諸氏，漆原牧場の漆原俊之氏のご協力枚超の画像について，牛体のキーポイント位置をのもと行われた。ここに記して感謝の意を表する。

アノテーションした。これを機械学習に用いて，画像中の牛体のキーポイント位置を高精度に検出できるモデルを作成した。そして，同モデルを用いて取得される“採食”，“立位反芻”，“立位休
息”，“横臥反芻”，“横臥休息”の各行動型のキー
ポイント位置の時系列変化を入力データとして，
これらの行動型を判別するモデルを作成した。口
元が映るウシの映像を対象に検証を行った結果，“採食”，“立位”，“横臥”の判別については９割に近い正解率で，“立位”もしくは“横臥”の際の“反芻”か“休息”かの判別については７割程
度の正解率で判別が可能であった。さらに，以上の技術を開発中の牛舎内映像解析プログラムと組
み合わせ，実用化に向けて課題はあるものの，映像中の複数の個体について同時に行動型判別を実行するシステムを提示した。

文献１）
 コンピューター総合研究所：牛の行動監視システ
ム MOH-CAL, https://moh-cal.com/［ホームペー
ジ］，2017.
２）
 東京理科大学：北海道初！５ＧとAI技術による乳用牛の映像を用いた個体管理システムの実証実験を開始［プレリリース］，2019.
３）
 農研機構：学習用データ生成装置，学習装置，行動 分 析 装 置 ，プ ロ グ ラ ム ，及 び 記 録 媒 体 ，特 願2020-114316，発明者：多田慎吾［特許出願］，2020.
４）
 農研機構：学習用データ生成装置，学習装置，行動分析装置，行動型分析装置，プログラム，及び記録媒体，特願2021-110070，発明者：多田慎吾［特許出願］，2021.
５）
 Tassinari, P., Bovo, M., Benni, S., Franzoni, S.,
Poggi, M., Mammi, L. M. E., Mattoccia, S., Stefano, L.
D., Bonora, F., Barbaresi, A., Santolini, E.,
Torreggiani, D.：A computer vision approachbased on deep learning for the detection of dairy
cows in free stall barn, Computers and Electronics
in Agriculture, 2021.
６）
 Sun, Ke., Xiao, B., Liu, D., Wang. J.：Deep HighResolution Representation Learning for Human
Pose Estimation, CVPR, 2019.

© The Ito Foundation

385

寒地型多年生牧草採草地が１年生イネ科草種（自生イタリアンライグラス―イヌビエ・メヒシバ）
交代植生に遷移する気候・土壌要因の解明と飼料価値の評価
Climate and soil factors of succession from temperate perennial grassland
to annual grassland and evaluation of the feeding value

池

田

堅太郎

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構東北農業研究センター）

Kentaro Ikeda（Tohoku Agricultural Research Center, NARO）

Orchardgrass（Dactylis glomerata L.）, one of the primary temperate perennial grasses, issown in the grasslands of Japan. However, due to recent global warming, orchardgrass is dying
out. Orchardgrass vegetation is transitioning to alternate annual grass vegetation, in which
native Italian ryegrass（Lolium multiflorum Lam）. and tropical annual grasses（barnyardgrass（Echinochloa crus-galli（L.））and southern crabgrass（Digitaria adscendens（H.B.K.）Henr）
renovate and alternate with each other by natural reseeding. Therefore, the following tests
were carried out in this study：1）Climatic conditions under which annual grass species
alternate vegetation is distributed were analyzed using GPS data and mesh climate maps, 2）
the yield and nutrition were evaluated for each cutting time and grass species. 3）the effects ofsummer cutting timing（second flush）and post-cutting nitrogen fertilization on fall（third
flush）grass species composition in a meadow were investigated. The results showed that 1）
annual grass species alternate vegetation was widely distributed from Tohoku to Kyushu, andwas found in regions with little snow cover in March, 2）annual grass alternate vegetation had
more dry matter yield than orchardgrass vegetation, and the TDN of annual grass was higher
than that of orchardgrass. 3）Early harvesting of the second flush and nitrogen fertilization
after the second flush were significant factors that weakened the orchardgrass community．

１．目いる２）。替わって，播種していないイタリアンラ的イグラス（Lolium multiflorum Lam）（以下，自わが国の採草地には，これまで，栄養価の高い

生イタリアンライグラス）が春～初夏に，暖地型

寒地型多年生牧草が導入されてきた 。しかし近１ 年 生 イ ネ 科 草 種 （イ ヌ ビ エ （Echinochloa

年 の 温 暖 化 に よ り ，オ ー チ ャ ー ド グ ラ ス

crus-galli（L.）とメヒシバ（Digitaria adscendens（Dactylis glomerata L．）の著しい枯死が生じて（H.B.K.）Henr））が夏～秋に優占する植生（以１）© The Ito Foundation

386

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

下，１年生イネ科草種交代植生）へと急速に遷移

リアンライグラスが１年を通して優占する採草地している。１年生イネ科草種交代植生を構成するを自生イタリアンライグラス単一植生とした。植イタリアンライグラス，イヌビエ，メヒシバは牛生調査を行った採草地はGPS情報（緯度，経度，の 嗜 好 性 が 良 好 な た め ，収 量 と 栄 養 価 が オ ー

標高）を取得した。根雪期間の長さの指標としてチャードグラスに匹敵すれば，わが国の気候に適

日本全土の３月の最深積雪深（cm）データを，応した省力的かつ持続的に生産可能な粗飼料とし３月の積雪のない温暖地においては年平均気温て期待できる。

（℃）（国土数値情報ダウンロードサービス）をそこで本研究では，１）１年生イネ科草種交代

GIS（QGIS）により１km×１kmメッシュ地図を

植生の乾物収量と栄養価を評価し，２）分布地域

作成し，取得した自生イタリアンライグラス優占に共通する気候条件を解明し，３）自生イタリア

採草地のGPS情報をレイヤーとして重ねること

ンライグラスの雪腐病抵抗性の差異を明らかにすで，１年生イネ科草種交代植生と気候条件の関係

るとともに，４）夏季（２番草）の刈取時期と窒性を地図化した。

素施肥がイヌビエ・メヒシバとオーチャードグラ
スの種間競争に与える影響を調査した。
２．方

2 . 3 自生イタリアンライグラスの雪腐病抵抗性の差異
自生イタリアンライグラスが越冬するために

法

は，積雪の間，雪腐病４）に耐えられるかにかかっ

2 . 1 １年生イネ科草種交代植生の生産性の評ている。そこで採草地から採種した自生イタリア
ンライグラスと，雪腐病抵抗性が既知の市販品種

価
１年生イネ科草種交代植生（構成草種は自生イ
タリアンライグラス，イヌビエ，メヒシバ）と，を積雪地域（岩手県盛岡市：根雪期間80日）において圃場検定による３反復の比較を行った。

オーチャードグラス優占植生を，オーチャードグ

2 . 4 夏季の窒素施肥がイヌビエ・メヒシバとラスの草地管理指標 に準じて施肥と年３回の刈オーチャードグラスの種間競争に与える影り取りを行い，１～３番草の草種ごとの乾物収量響１）と栄養価（TDN，CP）を比較した。１番草は５夏季（２番草）の刈取時期（早刈，遅刈）と窒

月25日，２番草は７月19日，３番草は10月14日に

素施肥の有無（＋Ｎ，－Ｎ）の試験区を設けて，１ｍ ，草高７cmで刈り取り，草種ごとの乾物収

３番草の草種構成に与える影響を４反復で比較し量と栄養価（TDN，CP）を各４反復で測定した。

た。50cm×65cmのコンテナに市販の黒ボク土を２分布地域に共通する気候条件の解明

詰め，10cm株のオーチャードグラスを４月に12

北海道南部～北関東と九州の採草地において，株移植した。表層には盛岡市の１年生イネ科草交

初夏と初秋の年２回以上，草種別の冠部被度を１

代植生の表土100ｇ（発生可能な埋土種子イヌビ

ｍ２コドラート法３）で６箇所調査した。植生調査

エ約900個・メヒシバ約1700個を含む）を散布しの結果から，初夏（１番草か２番草）で自生イタた。施肥は化成肥料8-8-8を早春（８kgN/10a）

リアンライグラス（芒を有するライグラスをイタと１番草収穫後（５kgN/10a）に行った。刈り取

リアンライグラスと定義）が優占し，初秋（３番りは，１番草を５月21日に，２番草を早刈が７月草）でイヌビエとメヒシバが優占する採草地を１15日，遅刈は８月４日に行った。２番草刈取後の

年生イネ科草種交代植生とした。また，自生イタ

窒素施肥は＋Ｎが尿素で５kgN/10aを施用し，

2.2© The Ito Foundation

387

寒地型多年生牧草採草地が１年生イネ科草種（自生イタリアンライグラス―イヌビエ・メヒシバ）交代植生に遷移する気候・土壌要因の解明と飼料価値の評価－Ｎは施肥無とした。３番草は９月24日に収穫
し，草種ごとの乾物収量を測定した。

オーチャードグラス区の乾物収量と差はなかった。
Table１にはオーチャードグラス，自生イタリ
アンライグラス，イヌビエ，メヒシバの１～３番

３．結果と考察

草ごとのTDNとCPを示した。１番草の自生イタ

3 . 1 １年生イネ科草種交代植生の生産性の評

リアンライグラスのTDNはオーチャードグラス
より高く，CPはオーチャードグラスのほうが高価
Fig.１にオーチャードグラス区と１年生イネ科

い値を示した。２番草の自生イタリアンライグラ

草交代植生区の番草ごとの乾物収量を示した。１

スはTDNとCPともにオーチャードグラスが高

年生イネ科草交代植生区の１番草は自生イタリアかった。３番草のイヌビエとメヒシバのTDNはンライグラスが優占し，オーチャードグラスより

オーチャードグラスより低かったが，CPはイヌも高い乾物収量を示した（p＜0.01）。２番草の優ビエとメヒシバのほうが高かった。

占種も自生イタリアンライグラスであったが，１年生イネ科草交代植生の利点は，最も栄養価

オーチャードグラス区と乾物収量に差は見られなの高い１番草の乾物収量が多い点にある。１番草かった。３番草はイヌビエとメヒシバが優占し，で重点的に高栄養牧草を確保するのに適した植生

1600

＊＊

Dry matter yield（g/m2）

1400
1200
1000
800

ns

ns

600
400
200
0

Orchardgrass
dominance

Annual grasses
dominance

Orchardgrass
dominance

Annual grasses
dominance

Orchardgrass
dominance

Third cutting(Oct. 14)

Second cutting(July 19)

First cutting(May 25): p<0.01, ns：not signiﬁciant
Orchardgrass
Italian ryegrass(ecotype)

Annual grasses
dominance＊＊

BarnyardgrassSouthern Crabgrass

OthersFig. 1 Dry matter yield of Orchardgrass dominance vegetation and annual grass dominance vegetation.
Table 1 Nutritive value of Orchardgrass, Italian ryegrass（ecotype）,

Barnyardgrass and Southern crabgrass

TDN（%）CP（%）

First cutting（May 25）

Orchardgrass
Italian ryegrass（ecotype）

59.5
61.0

17.4
12.6

Second cutting（July 19）

Orchardgrass
Italian ryegrass（ecotype）

60.7
56.5

15.4
11.1

Third cutting（Oct. 14）

Orchardgrass
BarnyardgrassSouthern crabgrass

60.2
57.0
57.4

12.5
13.0
15.0

© The Ito Foundation

388

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

である。一方，オーチャードグラスの利点は１年雪腐病に弱いイタリアンライグラスにとって，を通じてTDN60前後で安定した栄養価の粗飼料

根雪期間の長さに耐えられるか否かが，寒冷地でを調達できる点にある。よって，１年生イネ科草

栽培するうえで重要な課題である４）。本研究の結交代植生を利用する場合は，高栄養の１番草を搾果から，寒冷地における自生イタリアンライグラ

乳牛や肉用育成牛に，２番草と３番草は肉用繁殖

スの生育分布は根雪期間により制限されていると雌牛に給与するのが望ましい利用方法であると考考えられる。また，１年生イネ科草種交代植生採える。

草地より，さらに高緯度地域にはイヌビエとメヒ

3.2

分布地域に共通する気候条件の解明

シバが生育できずに，自生イタリアンライグラス

Fig.２には自生イタリアンライグラス優占採草が１年を通して優占する単一植生が分布している

地と１年生イネ科草種交代植生採草地の分布ならことも明らかとなった。自生イタリアンライグラ

びに，自生イタリアンライグラスの２倍体集団とス の 中 で ，４ 倍 体 集 団 は ３ 月 最 深 積 雪 深 30～

４倍体集団の分布を示した。寒冷地の分布は３月100cmの地域に分布していることから，自生イタ

最深積雪深（cm）を，温暖地の分布は年平均気リアンライグラスの２倍体集団と４倍体集団で温（℃）の平年値データをメッシュ地図に重ね合は，雪腐病抵抗性が異なるため，より長い根雪期

わせて表示した。寒冷地の自生イタリアンライグ間の地域に４倍体集団が分布したと考える。温暖ラス優占採草地は３月最深積雪深100cm以下の地

地における分布は，阿蘇・くじゅうといった，比域に分布していた。その中で，４倍体自生集団は

較的高標高の高原地域で確認された。ただし，調30～100cmの地域に，２倍体自生集団は30cm未査できた地域が少なかったことから，西日本～九満の地域に分布していた。

州における分布状況を把握するためには，さらな

Italian ryegrass ecotype
year-round vegetation
Annual grassalternate vegetation
Deepest snow depth
in March（cm）
0.0

Annual mean air
temperature（℃）

0.0-10.0

Below 8.0

10.0-30.0

8.0-10.0

30.0-100.0

10.0-12.0
12.0-14.0
14.0-16.0

Over 100.0● Tetraploid (4n) ecotype○ Diploid (2n) ecotype

Over 16.0

Fig. 2 Distribution of diploid and tetraploid ecotypes Italian ryegrass populations.

© The Ito Foundation

389

9
8
7
6
5
4
3
2
1

Gulf(cv.)

Kujyu(ecotype)

Morioka(ecotype)(In wheat ﬁeld)

Ofunato(ecotype)Nasushiobara(ecotype)

Hakodate(Ⅱ)(ecotype)

Hitachihikari(cv.)

Yahaba(ecotype)(In wheat ﬁeld)

Fukushima(ecotype)Namie(ecotype)

Osaki(ecotype)

Sumita(ecotype)

Hakodate(Ⅰ)(ecotype)

Hanamaki(ecotype)(In wheat ﬁeld)

Morioka(Ⅰ)(ecotype)

Yukituyosi(cv.)

Takizawa(ecotype)

Karumai(ecotype)

Nagahahikari(cv.)

0Waseaoba(ecotype)(In wheat ﬁeld)

Snow endurance (1:Poor‒ 9:Excellent）

寒地型多年生牧草採草地が１年生イネ科草種（自生イタリアンライグラス―イヌビエ・メヒシバ）交代植生に遷移する気候・土壌要因の解明と飼料価値の評価

Fig. 3 Snow endurance of cultivars and ecotypes of Italian ryegrass.
Bold print is tetraploid and narrow is diploid Italian ryegrass.

る分布地域を明らかにする必要がある。

草を早刈りし，２番草後に窒素施肥を行うと，総3 . 3 自生イタリアンライグラスの雪腐病耐性

乾物収量は大きく増加した（p＜0.05）。しかし，
オーチャードグラスの乾物収量は最も低かったの差異
Fig.３には市販品種と自生イタリアンライグラ（p＜0.05）。一方，２番草の刈取時期を遅らせ，

スの雪腐病抵抗性を示した。４倍体（Fig.３太字）

窒素施肥を行わないと，総乾物収量は少ないが，の自生集団は雪腐病抵抗性の高い市販品種と同等

オーチャードグラスの乾物収量は高い値を示したの抵抗性を示した。一方，２倍体自生集団は４倍（p＜0.05）。これまで採草地の牧草は，高栄養の体自生集団に比べて雪腐病抵抗性が低い傾向で粗飼料を得るために早刈りし，高収量を得るためあった。倍数性による雪腐病抵抗性の差異が，寒に施肥を行うことが推奨されてきた１）。夏季の草

冷地における２倍体と４倍体の自生イタリアンラ

地管理方法がオーチャードグラス植生から１年生

イグラスの分布地域に違いをもたらしている要因

イネ科草種交代植生へ遷移させている要因の１つであると考える。

と考えられる。

3 . 4 夏季の窒素施肥がイヌビエ・メヒシバと以上のことから，１年生イネ科草種交代植生

オーチャードグラスの種間競争に与える影

は，東北～九州の根雪期間が短い地域に分布して響いること，オーチャードグラスよりも１番草の乾Fig.４には２番草の刈取時期と２番草後の窒素物収量とTDNが高いこと，２番草の早刈と２番

施肥が３番草の草種構成に与える影響を示した。

草後の窒素施肥がオーチャードグラス植生から１２番草の刈取時期を遅らせると，総乾物収量は大年生イネ科草種交代植生への遷移を助長している

きく増加する。しかし，オーチャードグラスの乾ことが明らかとなった。今後は本研究から得られ物収量は変わらず，イヌビエとメヒシバが有意にた知見をもとに，気象データを用いたメッシュ地増加した（p＜0.05）。３番草の乾物収量は，２番図を作成し，１年生イネ科草種交代植生の分布地© The Ito Foundation

390

令和３年度

Dry matter yield(ｇDM)

160

350

Dry matter yield of second cutting

140
120
100

＊＊

300

＊＊

250

＊

80
60
40

ns

Dry matter yield(gDM)

180

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

20

Dry matter yield of third cutting
c

200
150
100

b

50

b
a

0

0
Early cutting

Late cuttingaba＋N・Early－N・Early

b
a
b

a
a
a
b

＋N・Late－N・Lateab

N fertilization and Cutting time

Cutting time
＊＊

b

c

: p<0.01, ＊ : p<0.05, ns : not sigiﬁciant．
There is a signiﬁcant diﬀerence between diﬀerent letters at p<0.05.
Orchardgrass
BarnyardgrassSouthern Crabgrass Dead material

Fig. 4 Effect of cutting time and N fertilization on dry matter yield of different grass species in summer（second

cutting）

域を予測することで，全国の広範囲におよぶ分布

その結果，１年生イネ科草種交代植生は岩手県北を明らかにする必要がある。

部から九州の広範囲に分布していること，オー

４．要

チャードグラス採草地よりも乾物収量が多いこ

約と，１番草のTDNはオーチャードグラスより高都府県の採草地では寒地型多年生牧草のオー

いこと，２番草の早刈と２番草後の窒素施肥がチャードグラスが播種される。しかし，近年の温オーチャードグラスの衰退を助長することが明ら

暖化により，オーチャードグラスが枯死し，替かになった。

わって自生のイタリアンライグラスと暖地型１年生イネ科草種（イヌビエとメヒシバ）が自然下種
により，交互に入れ替わる植生（１年生イネ科草種交代植生）へ遷移が発生している。そこで本研
究では，本植生が分布する気候条件をGPS位置情報とメッシュ気候地図により明らかにし，番草と草種ごとの収量と栄養価を評価した。さらに，採草地の夏季（２番草）の利用方法の違いが秋季

文
献１）
 農林水産省生産局：草地管理指標 草地の管理作業及び草地の採草利用編，40～90，日本草地種子協会，東京，2018.
２）
 樽見恵梨奈・築城幹典・森昭憲：システム農学，
34（1），7～15，2018.
３）
 日 本 草 地 学 会：草 地 科 学 実 験・調 査 法 ，185～
221，全国農村教育協会，東京，2004.
４） 田瀬和浩・小林真：日本草地学会誌，40（3），246～256，1994.

（３番草）の草種構成に与える影響を調査した。

© The Ito Foundation

391

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による
家畜腸内細菌叢改善効果の検証（Ⅱ）
Verification of the effect of feed supplemented with mass－producible
oligosaccharides on the improvement of intestinal flora in livestock（Ⅱ）

西本

完１・小林

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

寿美２・大津

晴彦２

食品研究部門，２畜産研究部門）

１

Mamoru Nishimoto１, Hisami Kobayashi２ and Haruhiko Ohtsu２（１Food Research Institute, ２Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

In the previous year’s study, we found that ryegrass seed composition increased the bodyweight of chicks. In this study, to confirm the reproducibility of the effect and to verify theamount of ryegrass seed composition necessary to achieve the same effect, we conducted afeeding test using Chunky, a representative meat breed, using a larger breeding scale andreducing the amount of ryegrass seed composition by half. In addition, the effect of ryegrassseed composition on the intestinal microflora was also verified by conducting a microflora
analysis of the digestive tract contents collected in the previous year’s second feeding test.
Moreover, the oligosaccharide loliose, which is considered to be the active ingredient of theryegrass seed composition, was tested for microbial metabolization using the genus of
Bifidobacterium. The results of these study showed that the ryegrass seed composition
significantly increased the body weight of chicks even when the amount of ryegrass seed
composition was reduced by half, and that a type of lactic acid bacteria known as a usefulbacterium characteristically increased its occupancy rate in the ryegrass seed composition
feed. Therefore, it was found that the ingestion of the ryegrass seed composition had an effectof increasing body weight and improving the intestinal microflora. It was also found that manybifidobacteria grew well in the medium with loliose as the only carbon source. This suggeststhat loliose could be used as a selective growth reagent for useful intestinal bacteria. Further
studies are needed to determine what linkage exits between these effects．

１．目ある。近年，腸内細菌叢の改善が，ヒトも含めた的

動物の健康に重要な働きをすることが明らかにさ国際的な人口増加を受け，畜産物の生産量増大れつつあり，いわゆる善玉菌によるプロバイオは急務である。一方で，家畜の成長促進を目的とティクスや，それらを増やすオリゴ糖を利用した

した抗生物質の飼料への添加は，薬剤耐性菌の蔓

プレバイオティクスが畜産業界においても注目を延を招くことから著しく制限され始めており，抗集めている１）。実際，酵母や乳酸菌等の生菌剤や生物質の代替となる素材が求められている現状が機能性オリゴ糖を添加した飼料が国内・海外を問© The Ito Foundation

392

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

わず販売されている。このため，飼料に添加する
機能性素材に関する研究分野は非常に注目度が高

２．方法

く，さまざまな研究が実施されているのだが，ど2.1

れほど優れた機能性を有する素材であっても，飼ロリオースを含有するイタリアンライグラス種

料用添加物に見合った価格でなければ実用化には子は，市販の「ワセアオバ」（雪印種苗株式会社）

たどり着けないことから，実際に市販されているを用い，給与試験に用いる種子組成物を以下のと機能性素材の種類が限られている現状がある。

おり調製した。種子は，低速撹拌によるもみすり

種子組成物の調製

昨年度実施した新たな機能性素材候補の探索にを行った後，超遠心粉砕機（ZM-100，レッチェ

おいて，いくつかのオリゴ糖含有素材の中から，

社）にて，１mmメッシュのスクリーンで粉砕し牧草栽培に用いられているライグラス種子より調た。また，ロリオース含有量を高めるため，粉砕製した組成物にニワトリヒナ増体効果があること

後に180 μｍのふるいを通過した微細な画分を除を見出した 。本効果はニワトリの出荷までの期去したものをライグラス種子組成物として用い間を短縮することで生産性向上に資するものであた。また，エンバクは農研機構で育成された「たり，生産者の収益向上にもつながる。本組成物はちあかね」をライグラス種子組成物と同様に調製

ライグラス種子を原材料としていることから，栽した。

培面積を拡大することで容易に生産量を増大で2.2

き，生産コストも高価ではないという利点がある。

微生物培養試験に用いるロリオース標品を上記

そこで本研究では，このライグラス種子組成物

ライグラス種子組成物から既報６）に従って以下のを早期に実用化するために必要なデータ，異なると お り 精 製 し た 。400 g の 種 子 組 成 物 に 1.6 l の鶏種での有効性，最少有効量の検証，および給与80％（v/v）エタノールを加えオリゴ糖画分を抽によって選択的に増殖した腸内細菌の同定等を実出した。懸濁液をろ過によりろ液と沈殿に分画施した。また，ライグラス種子組成物中の有効成

後 ，沈 殿 に 対 し て 再 度 1.6 l の 80 ％（v/v）エ タ

分と目されるオリゴ糖「ロリオース」は，1958年

ノールを加え再抽出した。得られたろ液（３l）にライグラス種子に存在することが報告されたもをエバポレータで１lまで濃縮後，1.4 lの水を加えのの ，その後の研究例は糖の構造解析や耐乾てろ過することにより水に不溶性の画分を除去し燥性とは無関係 ，という数報しかなく，生合成

た。得られたろ液を精密ろ過（PMP003膜，旭化機構や植物体にとっての生理的役割などに関する成），および限外ろ過（SLP0053膜，旭化成）に研究例は少ない。そこで今回，ロリオースのオリより分子量10,000以上の夾雑物を除去した。また，

ゴ糖自体の健康機能性を探るべく，前年度の給与得られたろ液（1.6 l）にDEAE-セルロース担体試験において採取した消化管内容物中の腸内細菌を加えて撹拌しろ過することで，負電荷の夾雑物叢を解析するとともに，グラム単位で調製したロを担体に吸着させ除去した。得られたろ液（2.2 l）

リオース標品を用い，それを添加した培地でビをエバポレータで50 mlまで濃縮し，ゲルろ過

フィズス菌を培養することで，その資化性につい（担体TOYOPEARL HW40S，東ソー，カラム径ても検証を行った。これにより，ロリオースと増

φ５㎝，高さ90 ㎝）に供し，ロリオース画分を体効果との関連性を評価するための足掛かりにな回収した。回収画分を濃縮・凍結乾燥することにればと期待している。

より，純度95％以上のロリオース標品3.0 gを得た。

２）

３）

４）

５）

© The Ito Foundation

ロリオース標品の調製

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証（Ⅱ）

2.3

第三次給与試験393

期幼雛の養分要求量を満たすように設計したトウ

本研究は前年度からの継続研究課題であること

モロコシ，大豆粕主体の対照飼料（Table１）をから，各給与試験の名称を通し番号で識別できる

給与した①対照区，2.1に記述したように粉砕・よう，前年度の第一次・第二次給与試験に続き，製粉したライグラス種子組成物を50％配合した②

今年度は第三次・第四次給与試験と称することとライグラス50％区（Table１），対照区とライグラした。また，本研究における動物実験は，農研機

ス50％区を等量混合した③ライグラス25％区，エ

構動物実験委員会の承認を受け，農研機構動物実

ン バ ク 種 子 組 成 物 を 50 ％ 配 合 し た ④ エ ン バ ク

験等実施規程に従って行っている。

（Oats）50％区の合計４区を設け，14日間の飼養

15日齢の横斑プリマスロック種の雄ヒナを試験試験を行った。

に供し，各区５羽（単飼），計20羽を用いて試験2.4を行った。試験区は，日本飼養標準の卵用鶏育成

ブロイラー（チャンキー）初生雛160羽を供試

第四次給与試験

Table 1 Composition of experimental dietControl dietSeed（50）diet

65.73

21.00

－

50.00

31.14

16.10

－

4.00

Vegetable oil

－

5.00

Dicalcium phosphate

1.27

1.50

Calcium carbonate

1.22

1.05

Sodium chloride

0.34

0.35

L-Lysine-Cl

－

0.35

DL-Methionine

－

0.15

L-Threonine

－

0.10

Vitamin mixture

0.20

0.20

Mineral mixture

0.10

0.10

Chromic oxide

0.10

0.10

Ingredients, %Corn
Dehulled ryegrass seed
Soybean meal
Corn gluten meal

Calculated value（%）
Metabolizable energy（kcal/g）

2.90

2.90

Crude protein

19.01

19.03

Calcium

0.87

0.88

Total phosphorus

0.62

0.64

Non-phytate phosphorus

0.40

0.40

Methionine + Cystine

0.61

0.52＊
＊Content in seeds unknown

Lysine1.06

1.05

Threonine

0.73

0.73

© The Ito Foundation

394

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

して給与試験を行った。これまでの試験と比較す

後，糖源フリー基礎培地２）にロリオースを最終濃るため，①対照区，②ライグラス50％区，③ライ

度１％（w/v）添加した条件にて72時間嫌気条件

グラス25％区においては第三次給与試験と同様の下で培養した。ネガティブコントロールとして糖飼料を調製し，さらに，対照飼料にフラクトオリ

質無添加区（none），ポジティブコントロールとゴ糖（富士フイルム和光純薬株式会社）を３％添してグルコース添加区（Glc），機能性オリゴ糖の加した④フラクトオリゴ糖添加区（FOS）を試比較対象としてフラクトオリゴ糖添加区（FOS）

験として設けた（ただし，すべての飼料においてについても同時に試験を行った。培養終了後の培

酸化クロム不含）。それぞれの試験区に，１群10

養上清pHと濁度（OD600）を測定することによ

羽４反復の計40羽ヒナを配置し，23日間の飼養試り，各菌株の各種糖質資化性を判定した。

験を行った。飼料摂取量は各群について試験期間
中の摂取量を測定し，１羽あたりの量を算出し３．結果と考察た。試験終了時に，すべての鳥の体重を測定し，3.1

群の体重の平均値および１羽あたりの試験期間中

本試験においては，増体効果を示すライグラスの飼料摂取量を用いて増大量，飼料効率を算出し

種子組成物の有効量を検証するため，飼料に配合た。

する量を従来の50％から25％に半減させた飼料を

2.5

腸内細菌叢解析第三次給与試験給与した区を設け，試験を行った。さらに，これ前年度に実施した第二次給与試験における供試までライグラス種子給与により得られた増体効果

ヒナの腸内細菌叢解析を行った。給与試験後に採がロリオースを含有する種子に特異的な効果であ取 し た 盲 腸 内 容 物 を た だ ち に DNA 保 存 試 薬るかを検証するため，同じイネ科の牧草でロリ（DNA/RNA Shield，ザイモリサーチ社）中で懸オースを含まないエンバク種子組成物を配合した

濁し，－20℃で保存していた懸濁液からDNA抽

飼料を給与したエンバク50％区における検証もあ

出 キ ッ ト（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit ，

わせて行った。本第三次給与試験の飼養成績を

QIAGEN社）を用いてメタゲノムDNAを調製しTable２に示す。その結果，①対照区での14日間た。得られたDNAの16S rRNA領域を増幅させ，の平均増大量は227 gであるのに対し，②ライグ

その塩基配列を次世代シーケンサーで解析を行

ラス50％区では248 g，③ライグラス25％区ではい，データベースに対する相同性検索および系統

258 gとなり，高い値を示すものの，統計的な有分類解析により，各微生物目の占有割合を評価し意差は見られなかった。その要因の一つとしてた。

は，供試個体数の少なさによるばらつきがあげら

2.6

ロリオース資化性試験

れる。また，④エンバク50％区では平均増大量は昨年度のオリゴ糖資化性試験で用いた

222 gとなり，①対照区とほぼ同等の成績であっBifidobacterium属細菌の基準株について，これた。次の第四次給与試験ではロリオースの作用をらのロリオースに対する資化性を検討した。なさらに詳細に検討するために，オリゴ糖の対照区

お，2.1で調製したロリオース量の制約により，として，フラクトオリゴ糖添加区を設定すること

単離源が家畜である９菌種を用いて培養試験をとした。

行った。使用した培地は昨年度と同様に，前培養

3.2

用の培地

第三次給与試験において，体重の増加傾向は認を用いて24時間嫌気条件で前培養した

２）© The Ito Foundation

第四次給与試験

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証（Ⅱ）

395

Table 2 Effect of feeding ryegrass seeds on growth performance in chicks
Third trial
Control
Body weight gain

Ryegrass（50）Ryegrass（25）Oats（50）227±8248±13258±9222±14569±13ab563±24ab620±21a507±20b0.399±0.008

0.441±0.012

0.417±0.009

0.442±0.033

Control

Ryegrass（50）（g/14 days）
Feed intake（g/14 days）
Feed efficiency
Fourth trial

Body weight gain

Ryegrass（25）FOS630±14b

777±6a722±24a624±21b1275±32ab

1386±19a

1340±29ab1225±33b

0.495±0.003b

0.561±0.004a

0.539±0.010a

0.509±0.007b（g/23 days）
Feed intake（g/ 23 days）
Feed efficiency

Mean±S.E., n=5（Third trial）,n=4（Fourth trial）
Means within rows with no common superscript differ significantly（p<0.05）

められるものの，有意差までは得られなかったこ

加区では対照区と比較して目立った変化は認めらとから，供試個体数を大幅に増加させた第四次給れなかった。以上のことから，ライグラス種子組

与試験を実施した。また，飼育方法も単飼から，成物によるニワトリ雛増体効果の再現性を確認す

10羽１群の群飼に切り替え，さらに，供試種も卵るとともに，従来の半量でも十分効果が得られる

肉兼用の横斑プリマスロックからより成長速度のこと，ブロイラーにおいても同様の効果があるこ

速い肉用種のブロイラー（チャンキー）に変更しとが示された。今後，段階的に配合量を少なく設た。設定した試験区は第三次給与試験と同様の①定した試験を行うことで，新たな飼料素材として

対照区，②ライグラス50％区，③ライグラス25％の実用化が期待される。

区に加え，プレバイオティクス効果を狙って添加3.3

される④フラクトオリゴ糖添加区，の４試験区で前年度の第２次給与試験における飼養成績の結あり，その飼養成績をTable２に示す。その結果，果を受け，対照区と増体効果が観察されたライグ

対照区においては，平均増大量は630 gであるのラス種子組成物50％配合区について，給与試験後に対し，ライグラス50％区では，777 g，ライグに－20℃で保存していた消化管内容物よりゲノム

ラス25％区では722 gと有意に高い値を示した。

DNAを抽出し，菌叢解析を行った。その結果をまた，飼料効率も同様に，ライグラス50％，ライ

Table ３ に 示 す 。ど ち ら の 試 験 区 も ８ 割 以 上 は

グラス25％区で対照区に比べ，有意に高くなっ「Clostridiales」であったが，ライグラス種子組

た。以上のように，ライグラスの25％配合におい成物50％配合区では，「Lactobacillales」の占有率ても，50％配合と同様の有意な増体効果，およびが10倍以上高く，また，「Enterobacteriales」も

飼料効率の向上が確認できた。一方，一般的なプ

２ 倍 ほ ど 高 い と い う 特 徴 が あ っ た 。

レバイオティック素材であるフラクトオリゴ糖添「Lactobacillales」にはいわゆる善玉菌とされる© The Ito Foundation

消化管内容物中の菌叢解析

396

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 3 Microbial occupancy in gastrointestinal tract contents
Occupancy (%)

Order

Control

Ryegrass（50）Clostridiales

89.83

82.03

Erysipelotricharles

8.16

6.94

Lactobacillales

0.60

9.06

Enterobacteriales

0.53

1.09

Coriobacteriales

0.45

0.64

Xanthomonadales

0.25

0.21

Bifidobacteriales

0.01

0.01

Other

0.18

0.01

Mean, n=5

Table 4 Growth of bifidobacteria in the presence of various sugars
Bifidobacterium species

StrainIsolation source

B. animalis subsp. animalis

JCM 1190T

B. thermophilum

JCM 1207T

B. boum
B. pullorum subsp. gallinarum

Growth and Acid production from：
none

Glc

FOS

Lol

Rat feces

−

＋

＋

＋

Swine feces

−

＋

＋

＋

JCM 1211T

Rumen of cattle

−

＋

−

－

JCM 6291T

Chicken cecum

−

＋

＋

＋

B. merycicumJCM 8219T

Bovine rumen

−

＋

＋

＋

B. ruminantium

JCM 8222T

Bovine rumen

−

＋

＋

＋

B. psychraerophilum

JCM 15958T

Porcine caecum

−

＋

＋

＋

B. porcinum

JCM 16945T

Piglet feces

−

＋

＋

＋

B. longum subsp. suillum

JCM 19995T

Piglet feces

−

＋

−

＋

乳酸菌類が多く属しており，それらの占有率の向能であることが分かった。機能性オリゴ糖として上による腸内細菌叢の改善，ならびに健康増進が知られるフラクトオリゴ糖（FOS）を添加した示唆された。今後，さらに詳細な解析により，占場合も同様の資化性（９菌株中７菌株）が観察さ有率を向上させた菌種の同定が期待される。

れており，ロリオースもビフィズス菌に対して汎3.4

ロリオース資化性試験

用的なプレバイオティクスとして有用であること

家畜を単離源とするビフィズス菌株９株に対しが示唆された。一方，B. longum subsp. suillumて，精製したロリオース標品を添加した培地を用

JCM 19995TのようにFOSを資化することができ

いて資化性試験を実施した。使用した菌種，菌株ないにもかかわらず，ロリオースに対する資化性

番号，単離源，および培養終了後における各菌株を示す菌株が認められたことから，菌種による選の培養上清の濁度およびpHから判断したオリゴ

択的な増殖促進剤としての利用価値についても示

糖資化能をTable４に示す。その結果，９菌株中唆された。今回，調製したロリオース標品の量的８菌株がロリオースを唯一の炭素源として増殖可な制約により，ビフィズス菌に対する資化性につ© The Ito Foundation

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証（Ⅱ）

397

いて，十分な検証ができたとは言えないが，家畜して知られる乳酸菌目腸内細菌がライグラス種子の消化管に由来する多くのビフィズス菌が利用可

組成物配合飼料中で特徴的に占有率を拡大してい能である，という傾向を把握することができた。

ることが明らかになった。このことは，ライグラ

今後，ロリオース標品を大量に調製することで，ス種子組成物の摂取による体重増加効果の再現性

前項で示唆された本組成物の給与により占有率をが示されるとともに，腸内細菌叢の改善効果があ拡大させた「Lactobacillales」等，さまざまな微ることを示唆するものである。また，ロリオース

生物における詳細な資化性試験を実施していく必

のみを炭素源とする培地では，多くのビフィズス要がある。

菌が増殖可能であることが分かった。このことから，ロリオースを有用腸内細菌の選択的増殖剤と以上，本研究の成果を基礎的知見とし，今後，して利用できる可能性が示唆された。今後のさらライグラス種子組成物給与による増体効果とロリなる研究により，これらの効果にどのような関連

オースによる腸内細菌叢改善効果との関連性を明性が存在しているかを検証することが重要である。

らかにすることで，ニワトリにおける作用機序の解明，新たな飼料用素材としての実用化に取り組んでいきたい。
４．要

約

前年度の研究で，ライグラス種子組成物がヒナの体重を増加させることを明らかにした。今回，その効果の再現性を確認するとともに，同様の効果を得るために必要なライグラス種子組成物の量を検証するため，飼育規模を拡大するとともに，
ライグラス種子組成物の量を半減させ，代表的な肉用種「チャンキー」を用いた給与試験を実施した。また，前年度の飼育試験で採取した消化管内
容物の菌叢解析を行い，ライグラス種子組成物の腸内細菌叢への影響も評価した。さらに，ライグラス種子組成物の有効成分と目されるオリゴ糖「ロリオース」について，ビフィドバクテリウム
属細菌を用いて微生物培養試験を行った。それらの結果，ライグラス種子組成物の配合量を半減してもヒナの体重が有意に増加すること，有用菌と文
献１）
 Kiyohara, M., Tachizawa, A., Niahimoto, M.,
Kitaoka, M., Ashida, H., Yamamoto, K.：Prebiotic
effect of lacto-N-biose I on bifidobacterial growth,
Biosci. Biotechnol. Biochem., 73（ 5）, 1175～1179,2009.
２）
 西本完，山崎信，遠野雅徳：量産可能なオリゴ糖
素材を添加した飼料給餌による家畜腸内細菌叢改善効果の検証，令和２年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，公益財団法人伊藤記念財団，39，380～385，2021.
３）
 Macleod, A. M., Mccorquodale, H.：
Trisaccharides of Lolium and Festuca, Nature, 182（4638）,815～816, 1958.
４）
 Chatterton, N. J.：Loliose - a novel trisaccharide
in leaves of Lolium and Festuca species, Plant
Physiology（Life Science Advance）, 12, 113～116,
1993.
５）
 Amiard, V., Morvan-Bertland, A., Billard, J. P.,
Huault, C., Keller, F., Prud’homme, M. P.：Fructans,but not the sucrosyl-galactosides, raffinose andloliose, are affected by drought stress in perennial
ryegrass, Plant Physiol., 132（4）,2218～2229, 2003.
６） 西本完：イネ科牧草に含まれるα-ガラクトシド
含有オリゴ糖の特性評価およびその利活用に向けた調製技術の開発，平成30年度年報 公益財団法人飯島藤十郎記念食品科学振興財団，34，243～247，
2019.

© The Ito Foundation

398

子牛用疑似グルーミング装置利用モニタリングによる健康状態評価手法の開発
Development of health check system by monitoring usage frequency of
mechanical grooming brush for calves

矢

用

健

一１・野

上

大

史２

（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，２九州大学）

Ken-ichi Yayou１ and Hirofumi Nogami２（１Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, ２Kyushu University）

Usage of automatic grooming brush for calves had a lower priority than the desire forbehavior such as eating and resting, and decreased quickly as the health condition deteriorated.
For this reason, the purpose of this study was to enable monitoring of the use of thisequipment in group raring and to use it as a health condition evaluation method．
A wireless 3-axis accelerometer was attached to 4 calves around the neck, and vibration
during use of the device was measured. As a result of frequency analysis of this measurement
signal, we found signal characteristics that appear only when the device is used，From theseresults, it was found that the brush usage time is an important index for judging the individual
who used the brush. We proposed a new judgment system using the brush usage time and theacceleration sensor data of each individual, and applied for a patent.
Regarding the relationship between the frequency of use of the device and deteriorationof health, daily records of 4 Holstein calves from birth to weaning, body temperature before
feeding at 9 am, remaining feed amount, and the presence or absence of diarrhea and coughing.
However, there was no deterioration in health that required medical treatment．
In the future, surveys should be targeting 1 to 2 weeks after the transfer to a groupwhere frequent occurrence of diarrhea and pneumonia are problems, or early mother-childseparation in Japanese black cattle for which mother-child separation immediately after birth
is not customary. We would like to add more numbers while utilizing the brush usage time
sensor applied for a patent．

１．目

ログラム」の中で設定された１）。繁殖雌牛の増頭的に主眼が置かれているが，出生した子牛の死廃率

牛肉の国内需要の増加への対応と輸出の一層の（現在優良農家で５％程度）を下げる対策も重要拡大を目指すため，令和元年12月に，和牛の生産である。特に黒毛和種はホルスタイン種に比べて量を平成30年度の14.9万トンから令和17年度に30

生時体重が小さいため免疫機能が劣っており，下万トンに増やす政策目標が「農業生産基盤強化プ

痢，肺炎等による成長遅延，死廃の問題は，特に© The Ito Foundation

子牛用疑似グルーミング装置利用モニタリングによる健康状態評価手法の開発

399

増頭のための早期母子分離や乳牛への和牛ETに境に優しく安全安心な牛肉の生産にも貢献可能で

おいて大きく，早急に解決すべき課題である。

ある。

解決には子牛の健康状態把握が肝要であるが，増頭対策のために増えつつある“母牛から早期分２．方法

離し哺乳ロボットで群管理するシステム”では健

本研究は，（国研）農研機構の動物実験規定に

康状態悪化個体は目に見える症状が出て初めて発基づき計画を立案し，同機構動物実験委員会の承見されるため，治療にも時間を要し，死廃率も高認を得たうえで行った。

くなる。“もの”のインターネット，IoTが畜産

2.1

分野にも適用されつつあるが，採食量（哺乳量）

無線式３軸加速度センサ端末を子牛の首周りにの低下や，発熱の検知など，目に見える症状を検取り付け，装置使用時の振動を測定した。この測出することが目的であることがほとんどであり，定信号の特徴を抽出し，装置利用時のみ現れる信それよりもさらに早期検出が可能な技術を新たに

号特性について明らかにした。その信号特性を利開発したいと考えた。

用したブラシ利用時間自動判定アルゴリズムを提申請者は母牛が子牛に対して行う舐め行動（グブラシ利用時間センサの開発

案，その実現可能性を示した。

ルーミング）の代替となる子牛用疑似グルーミン

実験では，無線式３軸加速度センサ端末を複数グ装置を開発した（特許第6449028号） 。子牛は頭（４頭）の子牛の首周りに取り付け，加速度をグルーミングを受けたいという体幹刺激への欲求測定した（Fig.１）。各センサのサンプリング周が強く，多くの個体は１日20分程度，毎日一定の波数は50Hzであり，子牛の行動を計測するには時間を装置利用に費やすことが分かっており，装十分であった。ブラシ使用時の状態と加速度を比置を利用することで日増体重の向上や，群からの較するため，カメラは子牛用疑似グルーミング装離脱率の低減といった効果があることを明らかに置の周囲に３台設置し動画撮影を行った。本条件

してきている。

にて，24時間の実験を２回行い，解析を行った。

２）

本課題では，このシステムをさらに発展させて子牛の死廃率を２％台まで下げることを可能にす

2 . 2 センサの利用頻度と健康状態低下との関連解明る技術の開発を目指す。具体的には，採食や休息

子牛用疑似グルーミング装置の１日あたりの利といった行動の欲求と比べてプライオリティが低用頻度を調べるため，ブラシの回転数のカウン

いと考えられるグルーミングへの欲求は，健康状

ターを農研機構が所有する疑似グルーミング装置

態の悪化に伴っていち早く減少するのではないかに取り付けた（Fig.２）。近接センサでブラシのと予想しており，採食量（哺乳量）の低下や，発軸に取り付けた突起物を軸１回転につき１回カウ

熱の検知など，目に見える症状の検出よりも早期ントするシステムとした。

に疾病発症の危険がある子牛を発見可能と考えて試験には農研機構で飼育しているホルスタインいる。早期に発見し，早期に治療が可能となるこ種雌子牛４頭を用いた。出生直後からロール乾草とで，子牛の死廃率を低減するとともに，増体のを敷料とした個別のペン（1.2x1.5m）で飼育したよい強い素牛作りに貢献できる。また，早期治療（Fig.３）。毎朝子牛の健康状態を確認するため，が可能となることで，治療コストが低減できると朝９時の哺乳前に体温，残飼量，下痢や咳の有無

ともに，薬剤，特に抗菌剤使用の低減によって環をチェックした。また，治療した場合にはその記© The Ito Foundation

400

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Neck type wireless 3-axis acc. Sensor nodes

Fig. 1 The scene of the experiment using the neck type wireless 3-axis acc. Sensor nodes.

ＡＣ１００ＶＬＣ２Ｈ－ＦＥ－ＦＶ－３０
電子カウンター

ＣＷ（時計回り）①② ③④

Ｅ２Ｆ－Ｘ５Ｙ１
近接センサー

黒
茶
オレンジ
ＣＯＭ

ＮＣ

ＦＨＲ－Ｆ－４５

付属コンデンサー

白灰

ヒューズ３Ａ

ギヤモーター 住友
Ｇ９Ｂ５０ＫＨ＋Ａ９Ｍ６０ＡＨ
ギヤヘッド１ . ４ ｋ ｇ ＋ モ ー タ ー２ . ４４ ｋ ｇ

Ｚ－１５ＧＱ２２－Ｂ
マイクロＳＷ

オムロン

減速比
出力回転数
出力トルウ

５０
５０Ｈｚ
６０Ｈｚ
５０Ｈｚ
６０Ｈｚ

３０
３６
１６ . １７Ｎｍ
１２ . ９４Ｎｍ

Fig. 2 The design drawing of the counter（left）and photo（right）that measure the brush rotation frequency of

the automatic grooming device for calves.

録も行った。その際，装置の利用頻度を前日24時間の値として記録した。
３．結果と考察
3.1

ブラシ利用時間センサの開発

動画解析からブラシを使用した個体および時間を判定し，その時の加速度について解析した結果，ブラシの使用前・中・後において，特に，ブラシを使用する前後において特徴的な加速度を示
す場合が多いことが判明した（Fig.４）。例えば，ブラシを使用する前はブラシへ歩行して接近する
Fig. 3 The scene of the experiment.

ため，歩行による動加速度の変化が計測された。

© The Ito Foundation

401

子牛用疑似グルーミング装置利用モニタリングによる健康状態評価手法の開発

Cow is using the grooming device.
1.00

accx.txt
accy.txt
accz.txt

0.75

0.50

0.25

0.00

-0.25

-0.50

-0.75

5 sec
-1.00
50

55

60

65
Time
［sec］

70

75

80

Fig. 4 Measurement result of the 3 axis acc. data when cow using the grooming device.

ブラシ使用開始時は立位・姿勢が保持された状態（AI）を用いた個体識別アルゴリズムの試作をであり，動加速度の変化は小さく，また姿勢保持行っており，高精度でブラシを使用した個体を推の特徴である静止加速度が一定時間変化しないこ

定することが可能となる。

とを確認できた。ブラシ使用終了時の前後でもこれらと同様の特徴を確認することができた。

今後は，個体識別の高精度化（識別率90％以上）に向けて多様な教師データの収集を行う。例

Fig.４以外にも加速度とビデオ観察との比較をえば，グルーミング装置を使用した部位（頭，腹，行い，グルーミング装置使用時刻そのものが判明

耳，首など）やグルーミング装置と複数のウシのしている場合，ブラシ使用前・中・後のこれら特位置関係について，加速度データおよび撮影動画

徴的な加速度を判別できることが確認され，ブラの解析を行い，明瞭な教師データを充実，これら

シ使用時刻，各個体の加速度センサデータを用い教師データをAIに組み込み，個体識別の高精度

た，ブラシ使用個体・使用時間判定システムを新化を実現する。

たに提案し，特許出願した（グルーミング情報収集システム，個体判別システム，データセットの生 成 方 法 ，及 び ，個 体 判 別 方 法

3 . 2 センサの利用頻度と健康状態低下との関連解明

特 願 2022-

調査した４個体それぞれの１日あたりの装置利

79382）。現在，グルーミング装置使用時刻と各個用頻度と朝の体温を図に示した（Fig.５）。すべ

体 の 加 速 度 セ ン サ デ ー タ を 用 い た ，機 械 学 習ての個体が生後１日目から装置を利用した（Ｈ© The Ito Foundation

回転数
平均
平均+1SD
平均-1SD
体温

800

40.2

H093

1000

40.2

40

40

39.8
39.6

600

39.4
39.2

400

39

38.8
200

38.6

800

39.8
39.6

600

39.4
39.2

400

39

38.8
200

38.6

38.4
0

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41

38.4
0

38.2

1

3

5

7

9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33

出生後日数(日)
1000

H095

40.2

1000

H096

40.2
40

39.8
39.6

600

39.4
39.2

400

39

38.8
200

38.6

前日24時間のブラシ回転数

800

直腸温(℃)

前日24時間のブラシ回転数38.2

出生後日数(日)

40
800

39.8
39.6

600

39.4
39.2

400

39

38.8
200

38.6

38.4
0

直腸温(℃)H092

直腸温(℃)

前日24時間のブラシ回転数

1000

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41

38.2

直腸温(℃)

令和３年度

前日24時間のブラシ回転数

402

38.4
0

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41

出生後日数(日)38.2

出生後日数(日)Fig. 5 Daily device usage frequency（solid line）and morning body temperature（dotted line）for each of the four

surveyed individuals.

092：221回，Ｈ093：501回，Ｈ095：182回，Ｈかった。体温はＨ096の生後21日のみ40℃を超え

096：368回）。装置の利用頻度は，個体ごとに差る発熱が認められた。その前日および当日，つまが認められた（調査期間の平均値は，Ｈ092：

り48時間前から平均値から標準偏差を除した値を232.6回／日，Ｈ093：441.0回／日，Ｈ095：146.1

下回る利用頻度の低下は認められたものの，その回／日，Ｈ096：474.1回／日）。標準偏差もそれ他の個体でも，体温の上昇を伴わない同様の利用

ぞれ，H092：26.0，H093：152.3，H095：57.3，

頻度低下は認められた。したがって，今回の４頭

H096：202.3と大きいものであったが，変動係数の結果のみからでは，体調悪化の前段階として装はH092：0.54，H093：0.35，H095：0.39，H096：

置利用頻度低下が起こることを明らかにすること

0.43であり，利用頻度のばらつきに大きな差がな

はできなかった。

いことが明らかとなった。したがって，個体に例数が少なかったこともあるが，生後すぐに母よって利用頻度のレベルには差があるものの，出子分離し，人工哺乳で飼育することが慣行化して生後すぐに装置を利用し始めること，装置利用頻いるホルスタイン種であったことや，個別飼育に度は一定のばらつきの範囲で離乳まで推移するこ

よって社会的ストレスがなかったことなどが，健とが明らかとなった。

康悪化例が少なかった原因と考えられた。生後すすべての個体において調査期間中，食欲不振，

ぐの母子分離が慣行化していない黒毛和種子牛で下痢および咳といった疾病の兆候は認められなの早期母子分離や，下痢・肺炎が多発することが© The Ito Foundation

子牛用疑似グルーミング装置利用モニタリングによる健康状態評価手法の開発

403

問題となっている群飼移行後１から２週間を対象

定システムを新たに提案し，特許出願した（グとした調査例数の追加を今後行っていきたい。特ルーミング情報収集システム，個体判別システ

許出願した群飼におけるブラシ利用時間センサを

ム，データセットの生成方法，及び，個体判別方

活用し，取り組む予定である。

法

４．要特願2022-79382）。
装置利用頻度と健康悪化との関係については，

約

ホルスタイン種雌子牛４頭を出生直後から離乳ま

子牛用疑似グルーミング装置の利用は，採食やでの間，朝９時の哺乳前の体温，残飼量，下痢や休息といった行動の欲求と比べてプライオリティ

咳の有無を毎日記録したが，治療を要するようなが低く，健康状態の悪化に伴っていち早く減少す

健康状態の悪化は見られなかった。

ると考えた。このため，群飼における装置利用モ

今後，生後すぐの母子分離が慣行化していない

ニタリングを可能にし，健康状態評価手法とする

黒毛和種子牛での早期母子分離や，下痢・肺炎がことを目的とした。

多発することが問題となっている群飼移行後１か複数の育成牛に無線式３軸加速度センサ端末をら２週間を対象とした調査例数の追加を，特許出

首周りに取り付け，装置使用時の振動を測定し願した群飼におけるブラシ利用時間センサを活用た。この測定信号の特徴を抽出し，装置利用時のしつつ行っていきたい。

み現れる信号特性を明らかにした。これら解析結果からブラシ使用時刻そのものが，ブラシを使用した個体を判定するための重要な指標となることが分かり，ブラシ使用時刻，各個体の加速度セン
サデータを用いた，ブラシ使用個体・使用時間判文
献１）
 農 林 水 産 省：農 業 生 産 基 盤 強 化 プ ロ グ ラ ム ，
2020．
２）
 矢用健一：子牛の疑似グルーミング装置及び飼育管理法，特許第6449028号，2018.

© The Ito Foundation

404

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可能性（Ⅲ）
Colostral programming of physiological properties related to meatproduction（Ⅲ）

松

﨑

正

敏

（弘前大学農学生命科学部）

Masatoshi Matsuzaki（Faculty of Agriculture and Life Science, Hirosaki University）

Effects of oral selenium administration on growth and plasma immunoglobulin levels were
examined in newborn sheep, however, no beneficial effect was observed. Relationships between
colostral constituents, lamb’s birth weight and average daily gain during suckling period were
investigated in 30 pregnancies with 44 lambs born alive and 37 weaned lambs. Positive
correlation was observed between colostral leptin and adiponectin, also between glucose andNEFA. Colostral cortisol and NEFA were negatively associated. Average daily gain during
suckling period was positively correlated with colostral insulin and birth weight. A tendency
toward positive association between colostral insulin and birth weight was observed. These
results suggested that maternal nutritional status during gestation would reflect concentrations
in colostral constituents and thus fetal and postnatal growth of their offspring．

１．目

ココルチコイドなどが母乳哺育児の成長や発達，的

さらには食欲やエネルギーバランスの調節に影響

初乳は豊富な栄養素に加えて，母から子への移して，成人期の肥満の予防に関与することが示唆

行抗体の供給源として家畜の新生子の受動免疫確されている５～７）。さらに，母乳中のエクソソーム

立に不可欠である。さらに最近では，初乳中のホに含まれるメッセージ物質による産子の生理機能

ルモンその他のメッセージ物質が新生子の成長やの発達や成長に及ぼす影響が研究され始めている

生理特性の形成に不可逆的な影響を及ぼしうるこ

８）とが明らかにされつつある 。初乳中のメッセーの反芻家畜の初乳中含有量に関する知見はきわめジ物質としてIGF-Ｉやインスリンなどのホルモて少なく，産子の成長後の生理特性との関連を解ンが新生子期の急速な成長や腸管の発達，体タン析した研究はみあたらない。

１）

パク質蓄積や糖代謝の活性化に大きな影響を及ぼ。しかしながら，これらの乳中メッセージ物質

本研究では，一昨年度に妊娠末期と哺育中の母。乳中にめん羊の栄養制御を行う実験モデルを用いて，母含まれるその他のホルモン類として，レプチン，

畜の初乳中ホルモン濃度と産子の成長および生理

アディポネクチン，グレリン，レジスチンやグル特性の関連を調べた。その結果，初乳中のインスしていることが明らかにされている

２～４）© The Ito Foundation

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可能性（Ⅲ）

405

リンが分娩直後の母畜血中に比べてきわめて高濃３腹）のうち，５頭をセレン給与区，６頭を対照度で存在しており，妊娠末期の母畜への給与タン区に配置して，出生直後の経口セレン投与が産子

パク質レベルに反応して初乳中の濃度が変化するの発育や血中免疫グロブリン濃度に及ぼす影響を可能性が示唆された。そこで昨年度は，初乳中の調査した。３組の双胎同腹産子については一方をインスリンが反芻家畜の産肉特性に長期的かつ不セレン給与区，もう一方を対照区とした。セレン

可逆的な代謝的プログラミングを引き起こす可能

給与区の子めん羊には，出生後できるだけ速やか性を検討した。すなわち，出生直後のめん羊双子に亜セレン酸ナトリウム水溶液（セレン0.06mg/

産 子 の 一 方 に 生 理 的 レ ベ ル の イ ン ス リ ン（2.5ml）5ml，すなわちセレン0.3mgを，口腔内に到

μg/kg生時体重）の経口投与を行い，その後の成達する長さのシリコンチューブを装着したシリン

長，飼養成績ならびに血中の代謝成分やホルモン

ジで経口投与した。対照区の子めん羊には処置し濃度を調べたが，明らかな影響は認められなかっなかった。出生からセレン給与，ならびに初乳吸た。

入介助までの時間は，単胎および双胎の各１腹は

今年度は，新生子畜の強健性や発育に最も大き３～５時間と推定されたが，その他はおおむね２な影響を及ぼしている免疫グロブリンの吸収促進

時間以内であった。産子は生時体重の測定の後，に有効とされるセレンの経口投与９）の効果を検証

３，７，14，28および56日齢に体重測定を行い，するとともに，初乳中メッセージ物質の生理的意

１，３，７，14，28および56日齢に頸静脈血を採取

義の解明を目指して，本研究でこれまでに集積しして，血漿中の免疫グロブリン濃度をサンドイッ

た初乳サンプル中のメッセージ物質の定量を行チELISA測定試薬セット（Bethyl Laboratories）

い，産子の発育データとの関連を解析した。

により定量した。

２．方

2.2

法

初乳成分と産子の発育との関係

上述の方式で交配し，周産期から哺育期の給与

新生子めん羊へのセレンの経口投与試験

TDNレベルを統一した飼養管理を行った母めん

同一の種雄畜との自然交配により妊娠したサ羊が2018年から2021年の４年間に分娩したのべ30

フォーク種母めん羊を供試して，妊娠末期（交配腹から分娩後できるだけ速やかに初乳サンプルを開始後16週以降）から自然分娩を経て産子が８週採取するとともに，哺乳中の産子の発育成績を調齢で離乳するまで個別飼育ペンに収容して飼養試査した。初乳中のコルチゾール，インスリン，

験を実施した。妊娠末期の母めん羊には，双胎妊

IGF-Ｉ，レプチンおよびアディポネクチンを，娠末期に必要なTDN要求量を市販の配合飼料

ELISA 測 定 試 薬 キ ッ ト （Enzo Lifesciences ，（CP12％，TDN75％）から50％，アルファルファ

Mercodia な ら び に Cloud Clone 社 製）で 定 量 し

ペレットから45％，イネ科乾草から５％，それぞた。また，乳中のグルコースおよびNEFA濃度はれ充足するように給与した。分娩後１週間から８

FUJIFILM Wako社製の酵素法の測定キットで定週間までは哺育頭数に応じたTDN要求量を妊娠量した。これらの初乳中濃度と産子の発育データ

末期と同様に給与したが，TDN供給量は配合飼との相関係数を算出した。

2.1

料から50％，アルファルファペレットから40％，
イネ科乾草からは10％とした。
自然分娩で出生した産子11頭（単胎５腹，双胎３．結果と考察
出生直後のセレンの経口投与は，哺乳期めん羊© The Ito Foundation

406

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

30.0
25.0

BW(kg)

20.0
15.0
10.0
5.0
0.0
0

10

20

30

40

50

60

Age(d)
Fig. 1 Body weighs（BW）of lambs in either control（●；n=6）or

Se administered（△；n=5）groups during suckling period.

30.0

IgG(mg/ml)

25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
0.0
0

10

20

30

40

50

60

Age(d)
Fig. 2 Plasma IgG concentrations of lambs in either control（●；n=6）or Se administered（△；n=5）groups during suckling period.

産子の増体ならびに血漿中免疫グロブリン濃度にの違い，両試験区の母めん羊のセレン摂取レベルは影響しなかった（Fig.１およびFig.２）。血漿中や投与量の影響などが考えられるが，特定には至IgGだけでなく，IgMあるいはIgAのいずれにおらなかった。妊娠末期の母畜へのセレン添加給与

いても，セレンの経口投与の効果は認められなも含めて，今後の検討が待たれる。

かった。本研究で採用した出生直後の子羊へのセTable１には，30腹の分娩で得られた出生時のレン投与量0.3mgは，体重が約10倍程度大きい子

生存産子44頭，自然哺育で56日齢の離乳を迎えた

牛で効果を認めた１頭あたりの投与量３mgの産子37頭を対象として，初乳中のメッセージ物質

10分の１として設定した。本研究においてセレンと代謝成分の濃度，産子の生時体重ならびに出生投与効果が認められなかった理由として，動物種から離乳までの平均日増体量の間で算出した相関９）© The Ito Foundation

407

初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可能性（Ⅲ）

Table 1 Correlation coefficients between colostral constituents, birth weight and average daily gain（ADG）during

suckling period of sheep offspring.

Cortisol
InsulinInsulinIGF-1

LeptinAdiponectin

Glucose

◤

◤

◤

◤

◤

－0.136－0.152◤－0.001－0.034

◤

◤

0.175

◤

IGF－1

◤

－0.032

Leptin0.186－0.097

◤

0.199

◤

0.150
0.460 ＊＊

Adiponectin

0.060
0.024

NEFA
－0.342 ＊◤－0.107◤0.076

Birth weight ADG
◤

0.136

◤

0.284

◤

0.103

◤

◤

◤

◤

◤

◤

－0.192－0.139－0.211－0.1170.301＊

GlucoseNEFA◤◤－0.0270.341 ＊

◤

◤

◤

◤

◤

－0.073－0.129Birth weight

0.211

◤

0.223
0.034

0.070

0.160

－0.105－0.1300.552 ＊＊＊＊：p<0.05，＊＊：p<0.01，＊＊＊：p<0.001

係数を示した。初乳中成分間では，レプチンとア速度の間に高い正の相関が認められた。初乳中イ

ディポネクチン，ならびにグルコースとNEFAとンスリンと生時体重との関連は，妊娠中の栄養状の間に正の関係が認められた。また，コルチゾー

態が初乳中インスリンレベルならびに妊娠末期のルとNEFAとの間には有意な負の相関係数が得ら

急速な胎子発育に反映され，さらには哺乳中の増れた。初乳中レプチンと哺乳中の平均日増体量と体速度にも影響しうるものと考えられた。すなわの間で，また，生時体重と哺乳中の平均日増体量

ち，妊娠中の栄養状態が初乳中成分や胎子発育，との間で，有意な正の相関係数が認められた。初

ひいては出生後の初期成長にも大きな影響を及ぼ

乳中インスリンと生時体重との間にも，正の関連しているものと考えられた。

を示唆する相関係数が得られた（p＝0.06）。
初乳中のIGF-1，IgGならびにビタミンＡの濃４．要約

度が出生後１ヶ月の哺乳子ヤギの増体と関連があ

初乳中免疫グロブリンの吸収促進効果が示唆さる と す る 報 告 10） や SGA（small-for-gestational-

れている出生直後のセレンの経口投与（0.3mg／age）児の新生児期の急速な発育速度と初乳中の頭）の可能性を検討したが，哺乳中産子の増体あレプチンとインスリン濃度の常乳における急激なるいは血中免疫グロブリン濃度のいずれにも影響減少との関連を見出した報告 など，初乳中成分が認められなかった。出生後の産子の成長や生理が産子の成長速度に影響しうることが明らかにさ特性を左右する初乳中成分の探索を目指して，30れている。本研究においても，初乳中のレプチン

腹のめん羊母子の初乳中成分と産子の発育との関濃度が哺乳中の増体速度と正の相関が認められ連を調べたところ，レプチンとインスリンの関与た。また，有意ではないものの，初乳中インスリを示唆する結果が得られた。これらの初乳中濃度

ンと産子の生時体重との正の関連がみられたことは母畜の栄養状態の影響が大きいものと考えられから，初乳中のこれらのホルモンが産子の発育促ることから，妊娠中の母畜の良好な栄養状態確保進に関与する可能性が示された。めん羊においての重要性が再認識された。

11）

は，出生時点での発育が哺乳中の増体や損耗率低減に影響することはよく観察されるところであるが，本研究においても，生時体重と哺乳中の増体© The Ito Foundation

408

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

文献１） Hammon, H. M., Liermann, W., Frieten, D., Koch,
C.：Importance of colostrum supply and milk
feeding intensity on gastrointestinal and systemic
development in calves, Animal, 14：S1, s133-s143,
2020.
２） Blum, J. W.：Nutritional physiology of neonatal
calves, Journal of Animal Physiology and Animal
Nutrition, 90, １～11, 2006.
３） Hammon, H. M., Steinhoff-Wagner, J., Flor, J.,
Schönhusen, U., Metges, C. C.：Lactation Biology
Symposium：role of colostrum and colostrum
components on glucose metabolism in neonatal
calves, Journal of Animal Science, 91, 685～695,
2013.
４） Ontsouka, E. C., Albrecht, C., Bruckmaier, R. M.：
Invited review：growth promoting effects ofcolostrum in calves based on interaction withintestinal cell surface receptors and receptor-like
transporters, Journal of Daily Science, 99, 4111～
4123, 2016.
５） Savino, F., Liguori, S. A., Lupica, M. M.：
Adipokines in breast milk and preterm infants,
Early Human Development, 86, S77-S80, 2010.
６） Eilers, E., Ziska, T., Harder, T., Plagemann, A.,
Obladen, M., Loui, A.：Leptin determination incolostrum and early human milk from mothers ofpreterm and term infants, Early Human
Development, 87, 415～419, 2011.

７）
 Hollanders, J. J., Heijboer, A. C., van der Voorn, B.,
R o t t e v e e l , J . , F i n k e n , M . J . J . ：N u t r i t i o n a lprogramming by glucocorticoids in breast milk：
Targets, mechanisms and possible implications,Best Practice & Research Clinical Endocrinology &Metabolism, 31, 397～408, 2017.
８）
 Samuel, M., Chisanga, D., Liem, M., Keerthikumar,S., Anad, S., Ang, C. S., Versteegen, E., Jois, M.,
Mathivanan, S.：Bovine milk-derived exosomesfrom colostrum are enriched with proteins
implicated in immune response and growth,
Scientific Reports, 19, 5933, 2017.
９） Kamada, H., Nonaka, I., Ueda, Y., Murai, M.：
Selenium addition to colostrum increases
immunoglobulin G absorption by newborn calves,
Journal of Dairy Science, 90, 5665～5670, 2007.
10）
 Buranakarl, C., Thammacharoen, S.,
Semsirmboon, S., Sutayatram, S., Nuntapaitoon, M.,
Kato, K.：Impact of insulin-like growth factor 1,
immunoglobulin G and vitamin A in colostrum on
growth of newborn Black Bengal goats and its
crossbred, Journal of Animal Physiology andAnimal Nutrition, DOI：10.1111/jpn.13671, 2021.
11）
 Nunes, M., Homrich da Silva, C., Lucia, Vera.,
Bernardi, J. R., Werlang I. C. R., Goldani, M. Z.：
Could a remarkable decrease in leptin and insulinlevels from colostrum to mature milk contribute toearly growth catch-up of SGA infants?, BMC
Pregnancy Childbirth, 17, 410, 2017.

© The Ito Foundation

409

木材クラフトパルプとカンショ焼酎粕を原料としたサイレージの給与が黒毛和種肥育牛の第一胃内発酵に及ぼす影響
Effect of feeding silage containing wood kraft pulp and sweet-potatoshochu distillery on rumen fermentation of Japanese Black fattening cattle

前

田

友

香

（宮崎県畜産試験場）

Yuka Maeda（Miyazaki Livestock Research Institute）

The effect of wood kraft pulp（KP）and sweet-potato shochu distillery by-product（SDP）
mixtures on the fermentation quality of the silage was examined by mixing KP：SDP in fiveratios of 2：1（I）,3：2（Ⅱ）,1：1（Ⅲ）,2：3（Ⅳ）,and 1：2（Ⅴ）on a fresh matter basis（Experiment1）. The V-SCORE of all the silage except I exceeded 90 points at 30, 60, and 120 days offermentation；this indicated good fermentation quality. Silage I is not suitable for long-term
storage. In experiment 2, we carried out the digestion trial with 10 Japanese Black steer 11months of age. Five steer were fed timothy hay and commercial concentrate feed（control
group）, and another steer were fed timothy hay, commercial concentrate feed, and the KP
silage. Steers in the KP group were provided KP silage Ⅱ to replace 10％（dry matter bases）
of the timothy hay. The experimental period is 17-day. The feed intake and blood profiles of
the control group were not significantly different from the KP group. The total concentrationand molar composition of the ruminal volatile fatty acids did not differ between the two groups.
However, the activity of ruminal lipopolysaccharide（LPS）in the KP group was significantly
lower than in the control group. Our results indicate that the fermentation quality of KP silage
stabilizes as SDP content increases. Furthermore, KP silage does not affect the feed intake andblood profile of the Japanese Black steer, although it is possible that feeding them KP silage
may decrease ruminal LPS activity．

１．目

これにより第一胃の消化機能が低下し，食欲不的

振，下痢，および鼓張症などの臨床症状の発症に

黒毛和種肥育牛は生産効率向上のため濃厚飼料

つながる１）。したがって，黒毛和種肥育牛の生産

多給で飼養される１）。しかし，濃厚飼料多給は，現場では，濃厚飼料多給を維持しながらも，第一易発酵性炭水化物の過剰摂取や粗飼料摂取量不足

胃内発酵を安定的に維持できる飼養管理技術の開につながりやすく，第一胃内での揮発性脂肪酸発が求められている。

（VFA）の生成が亢進し，胃液pHが低下する。

近年，木材チップ由来の飼料である木材クラフ© The Ito Foundation

410

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

トパルプ（KP）（日本製紙株式会社，東京）が開

２．材料および方法発された。KPは消化性に優れるため，繊維質飼料でありながら，トウモロコシと同等の可消化養2 . 1 試験１ KPとSDPを原料としたサイレー

分総量（TDN）を有する 。よって，KPを黒毛ジの発酵品質の検討

２）

和種肥育牛へ給与することで，エネルギー摂取量

KP （日 本 製 紙 株 式 会 社 ， 東 京）（DM ，を減少させることなく，第一胃内発酵を安定的に48.0 ％；CP ，0.4 ％ DM；NDF ，98.1 ％ DM）と維持できると考えられる。これまでの研究で，SDP（霧島酒造株式会社，宮崎）（DM，5.5％；

KPは黒毛和種肥育牛へ濃厚飼料の代替として給CP，23.6％DM；NDF，0％DM）を用いて，原与可能であるが，濃厚飼料の給与量がきわめて多物当たりの比率が，KP：SDPで，２：１（Ⅰ），

い肥育中期 や肥育後期 では，第一胃内発酵に

３：２（Ⅱ），１：１（Ⅲ），２：３（Ⅳ），およ

対する影響はほぼ認められていない。しかし，肥び１：２（Ⅴ）の５種類の混合飼料を４㎏ずつ調

育前期の黒毛和種牛に対するKP給与の影響は，製した。各飼料の化学成分の設計値をTable１にいまだ検討されていない。

示した。調製した飼料は，ポリエチレン／ナイロ

３）

４）

一方，宮崎県を含む南九州地域は焼酎の生産がンの積層フィルム（飛竜，旭化成ポリプレックス

盛んな地域であり，その製造副産物である焼酎粕株式会社，東京）に，原物で約300 gずつ充填し，も多量に排出される。これまでに，カンショ焼酎

真空梱包機（SQ-303，サランラップ販売株式会

粕（SDP）を有効活用する方法として，飼料化

５）社，東京）で脱気・密閉後，室温環境下で保管しについて検討されており，黒毛た。そして，調製後０日，30日，60日，および和種肥育牛へ給与しても健常性に悪影響を及ぼさ120日目に，各飼料とも３袋ずつ開封した。開封ないことが明らかにされている。

した飼料は，それぞれ50 gを300 mlの蒸留水に浸と牛への給与６，
７）

そこで本研究では，KPとSDPを混合して調製

漬し一晩４℃で冷蔵保管した後，４重ガーゼで濾したサイレージの発酵品質を検討するとともに，過した。濾液は，pHを測定し（FEP 20，メト

そのサイレージを肥育前期の黒毛和種去勢牛へ給ラー・トレド株式会社，東京），遠心分離（1840

与した場合の第一胃内発酵に及ぼす影響を検討し

g×４℃，10分）後，その上澄みを，乳酸，有機酸，

た。

および塩基態窒素を測定するまで－30℃で保管しTable 1 Ingredients and nutritional compositions of the experimental diets in experiment 1
Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

Ⅴ

KP

94.6

92.9

89.7

85.3

81.4

SDP

5.4

7.1

10.3

14.7

18.6

DM, %

33.8

31.0

26.8

22.5

19.7

CP, DM%

1.7

2.0

2.8

3.8

4.7

TDN, DM%

94.1

93.6

92.6

91.3

90.1

Ingredient, DM %Chemical composition†

DM, dry matter；KP, wood kraft pulp；SDP, sweet-potato shochu distillery by-product；CP, crude
protein；TDN, total digestible nutrient.

© The Ito Foundation木材クラフトパルプとカンショ焼酎粕を原料としたサイレージの給与が黒毛和種肥育牛の第一胃内発酵に及ぼす影響

411

た。残りの飼料は60℃で24時間乾燥させた後，１胃液および血液は，試験最終日の朝の飼料給与

mmメッシュのウィリーミルで粉砕し，各化学成

前の９：00と，飼料給与４時間後の13：00に採取

分 分 析 に 供 し た 。飼 料 の 乾 物（DM），有 機 物した。血液は，頸静脈よりヘパリン入り真空採血（OM），粗タンパク質（CP），粗脂肪（EE），粗管（Venoject Ⅱ VP-H100K，テルモ株式会社，

灰分（CA），および可溶性炭水化物（WSC）含東京）およびエチレンジアミン四酢酸（EDTA）

量は常法

により測定し，耐熱性α-アミラーゼ

入り真空採血管（Venoject Ⅱ VP-DK050K，テ

処理中性デタージェント繊維（aNDFom）含量

ルモ株式会社，東京）を用いて採取し，速やかにはVan Soestらの方法で定量した。抽出液中の冷却した。遠心分離（1870 g×15分，４℃）後，乳酸および有機酸は，高速液体クロマトグラフ

得られた血漿を分析に供するまで－30℃で保管し（HPLC）（CLASS-LC10；島津製作所株式会社，た。ヘパリン入り真空採血管で採取した血漿は，

京都）によるブロモチモールブルー（BTB）ポ

オートアナライザー（HITACHI7070，株式会社

ス ト ラ ベ ル 法 （カ ラ ム：Shodex Rspak（KC-

日 立 製 作 所 ，東 京）を 用 い て ，総 タ ン パ ク 質

811，昭和電工株式会社，東京），カラム温度：（TP），ア ル ブ ミ ン（Alb），総 コ レ ス テ ロ ー ル

60℃，移動相：３mmol過塩素酸溶液，流量：0.7（T-cho），アスパラギン酸トランスフェラーゼml／分および検出波長：455 nm）により測定し（AST），および尿素窒素（UN）を，HPLC（HPLC

た。塩基態窒素は，アンモニアメーター（TiN-

L-2130，株式会社日立製作所，東京）を用いて9001，株式会社東興化学研究所，東京）を用いてビタミンA（VA）を，それぞれ測定した。また，定量した。

EDTA入り真空採血管で採取した血漿は，市販の

８）

９）

８）

2 . 2 試験２

黒毛和種去勢牛へのKPサイレー

キットを用いて，リポポリサッカライド（LPS）
結 合 タ ン パ ク 質 （LBP）（HK503 kit ， Hycult

ジ給与試験
供試牛は11カ月齢の黒毛和種去勢牛10頭とし，Biotech，オランダ），血清アミロイドA（SAA）

17日間の飼養試験を実施した。処理区は，チモ（TP-802，Tri-Delta Diagnostics Inc．，アメリカ

シ ー 乾 草 （DM ， 90.9 ％ ； CP ， 14.5 ％ DM ；合衆国）
，およびハプトグロビン（Hp）（HAPT-aNDFom，63.4％DM）と市販の配合飼料（DM，11，Life Diagnostics, Inc．，アメリカ合衆国）を89.3％；CP，21.3％DM；aNDFom，14.9％DM）

定量した。胃液は，経口カテーテル（NFM90，を給与する対照区と，チモシー乾草，市販の配合

富士平工業株式会社，東京）を用いて採取し，滅飼料，および試験１の比率Ⅱのサイレージ（KP

菌４重ガーゼで濾過した後，分析に供するまで

サ イ レ ー ジ ，DM ，28.6 ％ ； CP ，4.1 ％ DM ；－ 30 ℃ で 保 管 し た 。乳 酸 お よ び 揮 発 性 脂 肪 酸

aNDFom，86.5％DM）を給与するKP区の２区と（VFA）は，試験１で示したBTBポストラベル法

し，それぞれに供試牛を５頭配置した。なおKPで測定した。LPS活性は，Hirabayashiら 10）の方区では，チモシー給与量のDM当たり10％の代替法で，アンモニア態窒素濃度は市販のキット（アとしてKPサイレージを給与した。給与量は，日ンモニアテスト，富士フイルム和光純薬株式会

本飼養標準肉用牛社，大阪）を用いて，それぞれ定量した。

１）に基づき，日増体量1.0 kgに要するCPおよびTDN要求量を充足する量とした。粗濃比は４：６とした。飼料は，１日量を９：本試験は，宮崎県畜産試験場動物実験委員会による承認を得て実施したものである。

00と16：00の２回に分けて給与した。

© The Ito Foundation

412
2.3

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

統計解析てのサンプルはpHが4.2以下と良好 ８）であった

統 計 解 析 に は ， SAS （JMP Ⓡ R15.2.1 ； SAS
Institute Inc．
，アメリカ合衆国）を用いた。
サイレージの発酵品質は，以下の混合モデルにが，比率Ⅰの混合飼料ではpHが4.2以下を示したのは120日のみであった。乳酸および酢酸は，
SDP 割 合 が 増 え る と 増 加 し た （p ＜ 0.05）。
V-SCOREは，比率Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，およびⅤの混合より解析した。
Yij＝μ＋αｉ＋a×βj＋b×βj^２＋eij

飼料は，いずれの日数でも90点以上の良好な発酵

ここで，Yij ＝観測値，μ＝総平均，αｉ ＝処理品質を示した８）。しかし，比率Ⅰの混合飼料は30

区ｉの効果，βｊ＝調整後日数j，eij＝誤差，そし日で62点，120日では28点に低下した。したがってａとｂはβｉとβｉ^２の回帰係数である。

て，KPに混合するSDPの量が増えると発酵品質

血液性状および胃液性状は，以下の混合モデル

レージは長期保存性に難があり，供用には適さなにより解析した。
Yijk＝μ＋αｉ＋βｊ＋γijk＋δｌ＋βδjl＋eijkl
ここで，Yijk＝観測値，μ＝総平均，αｉ＝測定
グループｉの効果（変量効果），βｊ ＝処理効果
ｊ，γijk＝供試牛ijkの効果（変量効果），δｌ＝採材時間ｌ，βδ jl ＝処理効果ｊと採材時間ｌの交いことが明らかになった。
3.2

試験２

飼養試験中のDM摂取量は，両処理区間に有意差は認められなかった（データ未提示）。
血液性状と胃液性状をTable２に示した。本試
験で調査した血液成分には，いずれの項目もKP

互作用，eijkl＝誤差である。
得られた解析結果は，p＜0.05を有意差ありとサイレージ給与の影響は認められなかった。胃液
性状では，両区の総VFA含量，VFA組成，およ判断した。

びアンモニア態窒素濃度に有意な差は認められな３．結果と考察
3.1

が安定することと，本試験における比率Ⅰのサイかった。しかし，胃液LPS活性値は対照区に比べてKP区で有意に低かった。これまでに，乳用牛

試験１

混合飼料の調製後０日の化学成分は，比率Ｉ，へKPを給与すると胃液LPS活性が低下すること

Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，およびⅤの順に，DMは，30.9％，が報告されている 11）。Nishimuraら 11）はこの原因

28.4％，24.8％，21.3％，および19.3％，DM中のとして，KP給与によりaNDFom摂取量が増加し，CP濃度は，2.8％，3.1％，4.2％，5.6％，および6.7％，

かつ，デンプン摂取量が減少したことで，胃液

aNDFom 濃 度 は ， 82.8 ％， 81.2 ％， 77.3 ％，pH低下が抑制されたことをあげている。本試験

73.0％，および69.4％，WSC濃度は，1.1％，1.2％，

では，aNDFomおよびデンプンの摂取量にKPサ

1.4％，2.1％，および2.4％であった。KPへのSDP

イレージ給与の影響は認められていない（データ

混合割合が高まると，飼料中のDM，CP，および未提示）。したがって，本試験の結果からはKPサ

WSC含量が有意に増加し，逆に，aNDFomは有イレージ給与により胃液LPS活性値が低下した原意に減少した。この変化は，配合飼料にSDPの濃因は不明であった。今後は，第一胃内pHの測定

縮液を添加した神谷ら の報告と一致した。

などを実施し，その原因を検討する必要がある。

６）

抽出液のpH，乳酸，酢酸，およびV-SCOREの以上より，KPにSDPを混合したサイレージは推移をFig.１に示した。比率Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，およびSDPの混合割合が高まると発酵品質が安定するこⅤの混合飼料において，０日のものを除いたすべとが明らかになった。そして，KPサイレージを© The Ito Foundation木材クラフトパルプとカンショ焼酎粕を原料としたサイレージの給与が黒毛和種肥育牛の第一胃内発酵に及ぼす影響

413

7.0
Ⅰ

6.5

Ⅱ

Ⅲ

6.0

Ⅴ

Treatment；p=0.1685
Day；p<0.0001
Day×Day；p=0.0022
Treatment×Day；p=0.7972

5.5

pH

Ⅳ

5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
1.4

Lactic acid, FM%

1.2
1.0

Treatment；p=0.0382
Day；p<0.0001
Day×Day；p=0.0031
Treatment×Day；p=0.6705

0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

Butyric acid, FM%

1.0
0.8
0.6

Treatment；p<0.0001
Day；p=0.0075
Day×Day；p=0.1082
Treatment×Day；p=0.0032

0.4
0.2
0.0
100

V-SCORE

80
60
40
20
0

Treatment；p<0.0001
Day；p=0.0008
Day×Day；p=0.2645
Treatment×Day；p=0.0003
0

30

60

120

Day of fermentation

Fig. 1 Diurnal variation in fermentation quality of the wood kraft pulp

silage（Ⅰ, black circles ； Ⅱ, white circles ； Ⅲ, black squares ； Ⅳ,
white squares；Ⅴ；black rhombuses）over time.

肥育前期の黒毛和種去勢牛へチモシー乾草の10％することが示された。また，その他の胃液性状や代替として給与することで，胃液LPS活性が低下

血液性状には影響は認められなかった。

© The Ito Foundation

４．要

約
1.08
111
57
15.4
99
233.5
8.03
0.43

A/G ratio

T-Cho, mg/dl

AST, U/l

UN, mg/dl

VA, IU/dl

LBP, ng/ml

SAA, μg/ml

Hp, µg/ml© The Ito Foundation
9.6
4.22

LPS, log10 EU/ml

3.89

9.8

4.1

18.6

15.0

62.2

86.0

0.72

14.03

259.8

84

13.9

51

95

1.07

3.5

6.9

0.12

1.9

0.3

3.3

0.9

4.7

5.5

0.13

4.87

42.3

8

1.2

6

10

0.05

0.1

0.2

SEM†

4.11

12.7

4.8

19.0

13.4

63.3

77.2

0.62

12.45

249

92

14.2

52

102

1.06

3.5

6.9

am

4.00

6.7

3.9

16.4

16.4

63.7

93.5

0.53

9.62

244.3

91

15.1

55

104

1.08

3.5

6.8

pm

0.11

1.5

0.2

3.3

0.5

4.7

4.8

0.11

3.7

36.3

6

0.9

6

7

0.04

0

0.2

SEM†

0.03340.95040.32530.13480.87510.10800.82860.14030.4084

0.58350.16800.42620.11590.29940.8854

0.94790.7225Treatment

0.01690.00010.00200.0120<.00010.65250.0023

0.4861

0.32230.75160.74570.00800.00500.12100.57360.28550.7156Time

p-value

0.25330.88650.60380.85530.97990.92600.42020.20140.4294

0.97630.74550.35040.7996

0.96170.1366

0.55480.2037

Treatment×Time†Standard error of the mean.

VA, vitamin A；LBP, lipopolysaccharide-binding protein；SAA, serum amyloid A；Hp, haptoglobin；VFA, volatile fatty acid；LPS, lipopolysacharide.

KP, kraft pulp；TP, total protein；Alb, albumin；A/G, albumin/globulin；T-Cho, total cholesterol；AST, aspartate transaminase；UN, urea nitrogen；4.7

Ammonia-Nitrogen, mg/dl

16.8

Butyric acidAcetic：Propionic

64.7
14.8

Acetic acid

Propionic acid

Composition, mol%

Total VFA, mmol/l

84.6

3.5

Alb, g/dl

KP group

令和３年度

Ruminal profiels

6.8

TP, g/dl

Blood profiles

Control group

Table 2 Effect of feeding kraft pulp silage on blood profiles and ruminal profiles in the Japanese Black fattening steers414
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

ジの給与が肥育前期の黒毛和種去勢牛の第一胃内発酵に及ぼす影響を検討した。まず，KPとSDP

木材クラフトパルプ（KP）にカンショ焼酎粕

の混合比率の異なる５種類の飼料を調製（KP：（SDP）を添加して調製したサイレージ（KPサイ

SDPは，２：１（Ⅰ），３：２（Ⅱ），１：１（Ⅲ），

レージ）の発酵品質の検討と，そのKPサイレー

２：３（Ⅳ），１：２（Ⅴ））し，パウチ法により

木材クラフトパルプとカンショ焼酎粕を原料としたサイレージの給与が黒毛和種肥育牛の第一胃内発酵に及ぼす影響

発酵品質を検討した。その結果，発酵品質はSDPの混合割合が高まると安定し，比率Ⅰの混合飼料
は，V-SCOREが著しく低く長期間の保存には不向きであることが分かった。次に，11カ月齢の黒毛和種去勢牛10頭を用いて飼養試験を実施した。
処理区は，KP無給与の対照区（ｎ＝５）と，比率ⅡのKPサイレージをチモシー給与量のDM当たり10％代替として給与するKP区（ｎ＝５）の２区とした。DM摂取量および血液性状にはKP
サイレージ給与の影響は認められなかった。胃液
性状では，総VFA含量，VFA組成，およびアン
モニア態窒素濃度には両処理区に有意差は認められなかった。しかし，胃液LPS活性値はKPサイ
レージ給与により低下した（p＜0.05）。これらのことから，KPにSDPを混合したサイレージは，
SDPの混合割合が高まると発酵品質が安定することと，肥育前期の黒毛和種去勢牛へ給与すると，胃液LPS活性値が有意に低下することが明らかに
なった。

415

文
献
１）
 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構（編）：日本飼養標準・肉用牛 2008年度版，１～
234，中央畜産会，東京，2009.
２）
 Hada, M.,Yashiro, J.,Machida, M.,Kajikawa, H.：
Japanese Patent No.5994964, granted 2 September
2016.
３）
 Mizuguchi, H.,Maeda, Y.,Nishimura, K.,Shinkura,
H.,Kurosu, K.,Terada, F.,Kushibiki, S.：Animal
Science Journal, 92, e13589, 2021.
４）
 Maeda, Y.,Nishimura, K.,Kurosu, K.,Mizuguchi,
H.,Sato, S.,Terada, F.,Kushibiki, S.：Animal Science
Journal, 90, 523～532, 2019.
５） 林國興：日本暖地畜産学会報，55，101～107，2012.
６）
 神谷充，服部育男，上村昌志，佐藤健次：日本暖地畜産学会報，54（2）, 149～159, 2011.
７）
 神谷充，服部育男，神谷裕子，佐藤健次，林義朗：
日本畜産学会報，84，395～401，2013.
８） 自給飼料利用研究会（編）：粗飼料の品質評価ガ
イドブック，三訂版，1-196，日本草地畜産種子協会，
東京，2009.
９）
 Van Soest, P. J.,Robertson, J. B.,Lewis, B. A.：
Journal of Dairy Science, 74, 3583～3597, 1991.
10）
 Hirabayashi, H.,Kawashima, K.,Okimura,T.,Tateno, A.,Suzuki, A.,Asakuma, S.,Isobe,
N.,Obitsu, T.,Sugino, T.,Kushibiki, S.：Animal
Science Journal, 88, 1162～1170，2017.
11）
 Nishimura, K.,Kurosu, K.,Terada, F.,Mizuguchi,
H.,Sato, S.,Kushibiki, S.：Animal Science Journal, 90,
189～195, 2019.

© The Ito Foundation

416

採卵日齢に起因するヒナ品質がブロイラー異常
硬化胸肉の発現に及ぼす影響の解明
Effect of chick quality due to the age of egg collection on the developmentof wooden breast in broilers

岩

崎

智

仁

（酪農学園大学農食環境学群）

Tomohito Iwasaki（College of Agriculture, Food and Environment Sciences, Rakuno Gakuen University）

In recent years, abnormalities in broiler breast meat have been occurring worldwide in
the poultry industry, and researchers in many countries have reported cases of the wooden
breast（WB）, in which the breast meat becomes abnormally hard. Although the effects ofgrowth rate and sex differences have been reported on abnormal wooden breasts, there are noreports on the impact of the age at which eggs were taken on WB expression, which wasinvestigated in this study. Fertilized eggs from 201（young；Yg）, 306（middle；Md）, and 446
（old ; Od）day-old hens were hatched and reared for 46 days and analyzed for WB expression
indices such as wing contact test, the circularity of muscle fibers, lipofuscin accumulation, as
well as for antioxidant enzyme-related gene groups associated with WB expression and gene
expression analyses were carried out for genes related to mitochondrial dynamics. The wing
contact test and circularity analysis of muscle fibers showed significantly higher values in theMd group（306 day-old）,but no difference was observed in lipofuscin accumulation. In addition,
there were no significant differences in the expression of various genes, including those related
to antioxidant enzymes and those related to mitochondrial dynamics, between the three groups
Yg, Md, and Od. These results suggest that chick quality due to the age of the egg-laying date
may not contribute significantly to WB expression．

１．目

Wooden Breast（以下，WB）と呼ばれる，胸肉的が異常硬化する等の胸肉異常が発生して問題と世界的な人口増加に伴う食料供給の観点から，なっている。WBは肉眼所見では表面が淡い色を食肉の増産は大切な課題であり，家畜１頭当たり呈しており，粘性滲出液や胸肉表面に斑点状の出の筋重量を増やすことを目的とした育種改良等が血があり，加えて尾部の膨らんだ外観を持つ。そ

行われている。鶏肉は，胸肉が消費者に好まれての胸肉は品質および外観を損なうため廃棄対象と消費されていることから，胸肉重量の増加を目指なり問題になっている１）。WBの筋組織を観察す

した産肉性向上のための育種改良が行われていると多数の筋線維を含む広範囲な損傷が認めらる 。こ の よ う に 生 産 効 率 を 追 求 す る 中 で ，れ，残存する筋線維は丸みを帯びた形態が観察さ© The Ito Foundation

採卵日齢に起因するヒナ品質がブロイラー異常硬化胸肉の発現に及ぼす影響の解明

れる２）。WB発現のメカニズムは明確に理解され417

程（承認番号DH21A3）」に従って実施した。

ていないが，成長スピードが速い個体ほど胸筋の2.2筋変性が生じ，日齢とともに筋変性の頻度が高く

46日齢のニワトリに対して，80 mg/kgとなるなることが明らかとなっている 。一方，ヒナのようにペンタバルビタールNaを翼下静脈に注射

品質は種鶏の採卵日齢に関係しており，採卵日齢し，深麻酔下で放血し，浅胸筋を採取した。採取の若い種鶏の場合にはヒナ重量が低い 。この採した浅胸筋を組織観察用の凍結切片用試料とし卵日齢とWBの発現に関する報告がなく，その発て，１cm四方に加工したコルクボードの上にト

現への影響についてはまったく明らかにされていランガカントガムを載せ，その上に筋線維方向がない。このことから本研究では種鶏の採卵日齢に上になるように固定した。これを液体窒素下で冷着目し，ヒナの生体重が軽い（品質が低い）場合却したイソペンタン中で急速冷凍した。各種理化には，WBを発現しやすいのではないかと仮説を学分析用試料については液体窒素下で急速冷凍し立て実験を実施した。

た 。な お ，遺 伝 子 解 析 用 試 料 に つ い て は ，

３）

４）

試料の採材

RNAlater（Thermo Fisher Scientific）に浸漬し２．材料と方法て４℃下で一晩保管して翌日にRNAlaterを除い

2 . 1 ブロイラー（Ros308系）の選抜および飼た。すべての試料は使用まで－80℃で保存した。
2.3

育方法

異常硬化胸肉の組織観察

日齢201日，306日および446日の種鶏それぞれ

凍結切片用試料を－24℃に設定したクリオス

から受精卵を各30個得て，それらをYoung（Yg），

タット内にセットし，厚さ10 μｍの連続凍結切

Middle（Md），およびOld（Od）とした。孵卵片を作製して，常法にてHE染色ならびにAzan染

０－18日目は正確に37℃湿度60％以上で維持し，色を行い組織観察と顕微解析による真円度計測に孵卵19日目から36℃で維持した。孵化後の各群の供した。真円度は各採卵日齢群でそれぞれ約3,000

ヒナは雌雄でそれぞれ最も体重が軽い２羽，最も本の筋線維から求めた。また，リポフスチン蓄積

体重が重い２羽，体重が中央値の２羽の計12羽

量については，それ自身が自家蛍光物質であるこ（雄６羽，雌６羽）を選抜し飼育実験に用いた。

とを利用した蛍光顕微鏡による定量解析を先行研

ブロイラーは本学の実験鶏舎で46日齢まで飼育し究を参考に実施した６）。なお，すべての顕微解析た。なお，飼育０日齢から12日齢までを飼育前期に は Image J （https://imagej.nih.gov/ij/） を 用とし育雛前期飼料（くみあい飼料，育雛前期Ａ）

いた。

にて育雛器で飼育し，13日齢から46日齢を飼育後

2 . 4 qPCR法による抗酸化酵素関連遺伝子な期として後期飼料（中部飼料，あおぞら仕上げ）

らびにミトコンドリアダイナミクス関連遺にて平飼いで飼育した。飼育期間中には，２日ご

伝子等の発現解析とに体重測定を行い，46日齢のと殺時には，川崎らの方法

と殺後のニワトリ浅胸筋を裁断しRNAlaterにを用いた挙上試験にてWBを鑑別し，浸漬して所定の処理を行い，使用まで－80℃で保ブロイラーの左右の翼が接触するものをWB非発存した。
RNAの抽出にはTRIzol Reagent（Thermo

現（挙上プラス），左右の翼が接触しないものを

Fisher Scientific）を使用して行った。cDNAは

WB発現（挙上マイナス）とした。なお，本実験

Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix with

は「酪農学園大学における動物実験等に関する規

gDNA Remover THUNDERBIRD SYBR qPCR

５）© The Ito Foundation

418

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Mix（Toyobo Co., ltd）を用い，抽出したRNA濃３．結果と考察

度を0.5 ng/μlになるよう調整して仕様書に記載された方法で実施した。得られたcDNAは使用す

3.1

るまで－80℃で保存した。qPCRはSYBR qPCR

導入時の卵重量はYgが55.4±3.2 gと最も軽く，Mixを用いたSYBR Green検出系によって，次にヒ ナ の 初 期 体 重（０ 日 齢）に つ い て も Yg 群 で示 し た 各 遺 伝 子（抗 酸 化 酵 素 関 連 遺 伝 子 群：

39.92±3.30ｇとなり有意に軽かった。これらの結SOD1，SOD2，CAT，GPX，PRDX；ミトコン

果は予想していたとおりであり，採卵日齢がヒナ

ド リ ア ダ イ ナ ミ ク ス 関 連 遺 伝 子 群：MFN1 ，の体重（品質）に影響していることが確認された

MFN2，OPA1，DRP１；オートファジー関連遺（Table１）。

伝子群：MAP1LC3，MAP1LC3，PARK２）の3.2

発現解析を行った。なお，ハウスキーピング遺伝

WBは成長速度の速い個体で発現しやすいこと

子にはβ-Actinを用い，比較定量法（ΔΔCt法）

から，孵化直後からの体重の推移を調べてTableにて得られた相対値で比較した。

２に示した。１週間の平均増体重は，21日齢まで

2.5

卵日齢とヒナ品質について

体重の推移と挙上試験はいずれの群においても同様に推移していたが，統計検定

３群間の比較はKaleida Graph ver. 3.6を用い

21-28日齢においてYg，MdおよびOdはそれぞれてTukey HSD検定を行った。数値は，遺伝子発187.3 g，124.5 g，および151.8 gとなり，Mdが他

現解析は平均値±標準誤差で記し，それ以外は平群と比べ増体重が緩やかになった。35-46日齢で均値±標準偏差で示した。有意水準はp＜0.05との 平 均 増 体 重 は Yg ，Md お よ び Od で そ れ ぞ れした。

241.8 g，314 gおよび212 gとなり，Mdが他群と比べ増加傾向にあった。と殺時の46日齢での生体重に有意差はなかった。46日齢に，川崎らの報告５）に基づき挙上試験を実施したところ，挙上（マイTable 1 Effects of egg-laying date on egg weight, hatchling weight, live weight at 46days, and wing contact test of broiler.
Yg

Md

Od

egg weight / g

55.4±3.2（30）62.7±5.0（30）64.4±6.7（30）hatching weight / g

39.7±2.7（24）43.6±4.2（27）46.9±4.8（22）2785.8±203.7（11）2763.3±429.0（12）2759.1±417.5（12）

45.5

66.7

41.7

live weight at 46 day / gwing contact（–）％

Data represent mean±SD
Numbers in brackets indicate the number of used.
Table 2 Effect of age of egg-laying on the average weekly weight gain of broiler.
0-8

8-14

14-21

21-28

28-35

35-46

Yg

Day

74.5

82.4

211.3

187.3

105.5

241.8

Md

86.1

87.1

208.6

124.5

137.8

314.0

Od

87.6

91.9

225.9

151.8

97.7

212.3
（g）

© The Ito Foundation

採卵日齢に起因するヒナ品質がブロイラー異常硬化胸肉の発現に及ぼす影響の解明

419

ナ ス）割 合 は Md で 最 も 高 い 66.7 ％ を 示 し た

3.4（Table１）。このことはMd群でWBの発現割合が各遺伝子の発現量の比較を行いFig.３とFig.４

高い可能性を示唆している。

胸肉中の各種遺伝子の発現量解析に示した。SOD1を含むと抗酸化酵素関連遺伝子

3 . 3 筋線維の真円度と筋組織中のリポフスチ

群では，採卵日齢の影響は確認できず，ヒナ品質がこれら遺伝子の発現に及ぼす影響は小さいと考ン蓄積量
WBを発現した胸筋組織の筋線維は円形化するえられた（Fig.３）。一方，これまでに我々は，ことが形態学的に報告されている３）。円形化の指WBを発現したニワトリは胸筋中でミトコンドリ

標である真円度は１に近いほど真円を示すが，そアのマイトファジーが生じていること，その結果の真円度の平均はYg，MdおよびOdでそれぞれ，としてミトコンドリアの活動が亢進している可能

0.800±0.097，0.854±0.087，および0.813±0.009

性を示唆した７）。したがって，それらの活動に関と な り Md 群 の 筋 線 維 が 最 も 円 形 化 し て い た

わる遺伝子群の発現解析を実施してFig.４に示し（Fig.１）。一方，リポフスチンは，筋組織中のネた。ミトコンドリアダイナミクスに関連する遺伝クローシス領域に局在する傾向があり（Fig. 2A

子 群（MFN1 ，MFN2 ，OPA1 ，DRP1）に つ い

矢じり），その蓄積量はOdが有意に低い結果を示ては，いずれも採卵日齢が若いほど発現量が低くした（Fig. 2B）。これらの結果は挙上試験の結果なる傾向を示しているものの有意な差は得られなと一致しなかった。

かった。マイトファジーに関連するMAP1LC3，300

Normal

WB

0.709

0.865

Muscle ﬁber number

250

200

Yg:

150

Md:
Od:

100

50

0

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

Circularity of muscle ﬁbers
Fig. 1 Circularity distribution of the pectoralis major muscle fibers in eachgroup. The inset images show a typical myofiber image（Azan stain）, andthe numbers represent the circularity of myofiber. Yg（n=11）, Md（n=12）,
and Od（n=12）indicate each group of fertilized eggs from 201, 306, and446 day-old hens, respectively.

© The Ito Foundation

420

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

A
a

b

c

d

B

0.14
I

Lipofuscin accumulation(% area)

0.12
I
0.1

II

0.08

0.06

0.04

0.02

0
Yg

Md

Od

Fig. 2 Lipofuscin in the wooden breast muscle. （A）：Typical images of lipofuscin

autofluorescence and H&E-stained tissue in frozen serial sections of the wooden andnormal breast.（a）and（b）：H&E stain,（c）and（d）：lipofuscin autofluorescence.
Normal breast（a）and（c）, and wooden breast（b）and（d）. White dots in（d）
indicated arrowhead represent lipofuscin autofluorescence granules.（B）：Lipofuscin
accumulation（% area）of breast tissue of each group. Error bars indicate standard
deviation. Roman numerals indicate a significant difference between groups（Ⅰ andⅡ；p<0.05）.

MAP1LC３，ならびにPARK2の発現量は，真円

VEGFA （vascular endothelial growth factor A）

率が最も１に近いと判断されたMd群で高い傾向の遺伝子発現についても各群間での有意差は認めを示したが有意差はなかった。また，結果には示られなかった。

し て い な い が ，低 酸 素 適 応 型 遺 伝 子 の HIF1A

以上の結果からWBの発現に及ぼすヒナ品質の（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha） と影響は小さいと考えられた。ただし，本研究では© The Ito Foundation

421

採卵日齢に起因するヒナ品質がブロイラー異常硬化胸肉の発現に及ぼす影響の解明
2.0

2.0

catalase

2.0

GPX

1.5

1.5

1.5

1.0

1.0

1.0

0.5

0.5

0.5

0

Yg
2.0

Md

0

Od

SOD1

1.5

1.0

1.0

0.5

0.5

Yg

Md

2.0

1.5

0

Yg

Md

0

Od

0

Od

PRDX

Yg

Md

Od

SOD2

Yg

Md

Od

Fig. 3 Antioxidant enzyme-related gene expression includes catalase, glutathione peroxidase（GPX）,

peroxiredoxin（PRDX）,superoxide dismutase（SOD1 and SOD2）in the breast muscle of each groupof fertilized eggs. Data representing the means± SEM were shown as relative values of β-actin.
A
2.0

2.0

MFN1

2.0

MFN2

2.0

OPA1

1.5

1.5

1.5

1.5

1.0

1.0

1.0

1.0

0.5

0.5

0.5

0.5

0

Yg

Md

Od

0

Yg

Md

Od

0

Yg

Md

Od

0

DRP1

Yg

Md

Od

B
2.0

2.0

MAP1LC3A

2.0

MAP1LC3B

1.5

1.5

1.5

1.0

1.0

1.0

0.5

0.5

0.5

0

Yg

Md

Od

0

Yg

Md

Od

0

PARK2

Yg

Md

Od

Fig. 4 Relationship of gene expression levels in the breast muscle of each group of fertilized eggs.（A）Mitochondrial dynamics-related gene expression, including mitofusion 1, 2（MFN1, 2）, mitochondrial
dynamin-like GTPase （OPA1）, and dynamin-related protein 1 （DRP1）.（B） Autophagy-/
mitophagy-related gene expression, including microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha,beta（MAP1LC3A, B）and parkin RBR E3 ubiquitin-protein ligase（PARK2）. Data representing themeans ± SEM were shown as relative values of β-actin.

各群の筋ミトコンドリアの構造を観察していない

続き解析を進め，ヒナ品質がブロイラーの胸肉異ことから，Md群で筋ミトコンドリアの構造に異常に及ぼす影響について調査を進める必要がある。

常が見られる可能性は否定できない。今後も引き© The Ito Foundation

422
４．要

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

酸化酵素関連遺伝子群とミトコンドリアダイナミ

約クスの関連遺伝子群等の各種遺伝子の発現におい

近年，養鶏業界において全世界的にブロイラーても，３群間に有意差は認められなかった。以上の胸肉異常が生じており，特に胸肉が異常に硬くのことから，採卵日齢に起因するヒナ品質はWB

なる異常硬化胸肉（wooden breast，WB）につの発現に大きくは影響しない可能性が示唆された。

いては，各国の研究者が症例報告等を行っている。鶏の成長速度ならびに性差が胸肉の異常硬化に及ぼす影響についての報告はあるが，採卵日齢がWBの発現に及ぼす影響についての報告はない
ことから，本研究にて調査を行った。日齢201日（Yg），306日（Md）および446日（Od）の種鶏から得られた受精卵を孵化させ，46日齢まで飼育してWBの発現指標である挙上試験，筋線維の真円度，ならびにリポフスチンの蓄積量の解析のほ
かに，WBの発現に関連する抗酸化酵素関連遺伝
子群とミトコンドリアダイナミクスの関連遺伝子群等について発現解析を行った。挙上試験ならびに筋線維の真円度解析では，採卵日齢306日のMd群が有意に高い数値を示したが，リポフスチンの文
献１） Sihvo, H. K., Immonen, K., Puolanne, E.：Vet.
Pathol., 51, 619～623, 2014.
２）
 Bailey, R. A., Watson, K. A., Bilgili, S. F.,
Avendano, S.：Poult Sci., 94, 2870～2879, 2015.
３）
 Petracci, M., Soglia, F., Madruga, M., Carvalho, L.,
Ida, E., Estevez, M.：Compr. Rev. Food Sci. Food
Saf., 18, 565～583, 2019.
４）
 Tufft, L. S., Jensen, L. S.：Poult Sci., 70, 2411～
2418, 1991.
５）
 Kawasaki, T., Yoshida, T., Watanabe, T.：J.
Poultry Sci., 53, 291～297, 2016.
６）
 Hasegawa, Y., Kawasaki, T., Maeda, N., Yamada,M., Takahashi, N., Watanabe, T., Iwasaki, T.：AnimSci J, 92, e13517, 2021.
７）
 Hosotani, M., Kametani, K., Ohno, N., Hiramatsu,
K., Kawasaki, T., Hasegawa, Y., Iwasaki, T.,
Watanabe, T.：J. Vet. Med. Sci., 83, 1764～1771,
2021.

蓄積量では差異は認められなかった。加えて，抗© The Ito Foundation

423

乳用子牛における消化管機能強化および消化管由来の炎症予防に関する研究
The studies on the strengthening of gastrointestinal function andprevention of gut-derived inflammation in dairy calves

福

森

理

加

（酪農学園大学獣医学群）

Rika Fukumori（School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University）

Our objective was to evaluate the relationship between solid feed consumed by calves anddiarrhea, gut function, feed intake, growth in calves during the weaning transition period.
Twenty-seven Holstein calves weaned at 8 wk of age were used until 13 wk of age in thisstudy. The calves were fed calf starter ad libitum until 3.5 kg/d（as fed）and chopped hay ad
libitum. Calves were randomly assigned to 3 dietary groups that consumed calf starters withdifferent starch contents［High（H）：40％, Medium（M）：30％, Low（L）：20 ％, ｎ＝９］
. During
the post-weaning period, starter DMI was higher in H calves than in L calves（p<0.05）. No
differences in hay intake were observed in any period. Averaged daily gain was higher in H
than in L in post-weaning period（p<0.05）. There were no differences between treatments infecal pH and starch contents, and the number of days of diarrhea（p＝0.147）. There were nodifferences in total VFA concentration and pH in the rumen between treatments, but there
were differences in the percentage of various VFA. The molar proportion of acetic acid washigher in M and L than in H and the proportion of propionic acid was higher in H than in M
and L（p<0.05）.No differences in serum glucose and born alkaline phospholipase concentrations
were observed between treatments. Serum urea nitrogen was higher in L than in H at 9 wk ofage, and in the order of L, M, and H at 10 and 13 wk of age. Serum beta-hydroxybutyrate
concentrations were higher at 11 wk of age in M and L than in H, and at 13 wk of age in M
than in H. No differences in plasma insulin, GLP-1 and GLP-2 concentrations were observed
between treatments. GH was higher in L than in H at 4 wk of age. IGF-1 was higher in H thanin L at 13 wk of age. From the results of this study, it was found that a high-starch diet during
the weaning period has merits for achieving high growth without damaging the digestive tractof calves．

１．目

期に促すことを目的とする。生乳や代用乳の給与

的は固形飼料に比べコストがかかるため，哺乳量の早期離乳法は哺乳量を制限することでカーフス制限や哺乳期間の短縮の子牛育成における飼料コ

ターターの摂取量を増やし，ルーメンの発達を早ストを抑えることにつながると考えられてきた。

© The Ito Foundation

424

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

しかし，哺乳を制限することで子牛は空腹やストレス徴候を示し，成長率が低下するため，最近で２．材料および方法

は哺乳期の発育や健康，動物福祉および将来性を本試験は酪農学園大学動物実験委員会の承認

１）

重視する目的で高栄養哺乳が普及してきている 。

（VH20 C12）を受け，酪農学園フィールド教育研

高栄養哺乳は哺乳量を増やすことで哺乳期間中究センター酪農生産ステーションにおいて実施しの成長率を高めるが，一方でスターター摂取量のた。供試動物としてホルスタイン種子牛27頭（雌減少を引き起こす。スターター摂取量の低下は，14頭，雄13頭）を使用し，出生後３時間以内に初

離乳時にルーメンの発達を制限し，発育を低下さ

乳を２Ｌ以上，24時間以内に合計４Ｌ以上を給与せるおそれがある。さらに，離乳後にスターターした。体重は出生後毎週測定した。子牛はスチー

摂取量が急激に増加することで，未発達のルーメ

ル製のファームゲートで仕切られたペン（2.42ｍ

ンに大きな負担がかかる。スターターに含まれる

×１m，2.42m２／頭）で１頭ずつ飼養し，各ペン

主な炭水化物源はデンプンであるが，未発達なにはラバーマットおよび麦稈を敷料として使用しルーメンではその発酵産物である揮発性脂肪酸

た。４日齢まで移行乳を，５日齢からは代用乳（VFA）をルーメン上皮細胞から効率的に吸収で（カーフトップEX，全酪連，東京；粗タンパク質

きず，唾液による緩衝作用も弱いため，酸の蓄積

28 ％，粗 脂 肪 15 ％ ）を 43 ℃ の お 湯 に 溶 か しによるルーメンアシドーシスのリスクが増加す（16.7％（w/v）），哺乳バケツで給与した。代用る。また，ルーメン内における不十分な発酵に乳は粉体で14日齢まで600ｇ／日，15～21日齢まよって未消化デンプンが下部消化管に流入し，小で800ｇ／日，22～42日齢まで1200ｇ与え，その腸で膵アミラーゼやマルトースによって消化が行

後漸減し，43～48日齢まで800ｇ／日，49～55日

われるが，哺乳期のアミラーゼ活性は成牛に比べ齢まで600ｇ／日与え56日齢で完全離乳した。

て低いことが報告されている 。このため，未消

カーフスターター，乾草および水は５日齢から給化のデンプンが大腸に多量に流入し，微生物発酵与した。乾草（粗タンパク質12.6％，可消化養分を受けることで生じる大腸性アシドーシスなども

総量58％）および水はバケツから自由摂取させ懸念される。これらによって発生する消化性の下た。なお，哺乳およびスターター給与は１日２回

痢は，発育に必要な栄養やエネルギーの損失につ行われた（0700h，1600h）。また，乾草は２cmにながる。一方で，消化管トラブルを回避するため細断したのち給与した。試験処理として，デンプにデンプン含量を抑えることは，発育の低下につン含量の異なる３種のスターター区［Ｈ区（デン

ながる可能性がある。

プン濃度：乾物あたり40％），Ｍ区（30％），Ｌ区

２）

スターターのデンプン含量が子牛の発育や離乳（20％）］に９頭ずつランダムに配置した。スターに及ぼす影響に関する情報はいまだ少なく，そのターは摂取上限を原物量で3.5kg／日とした。試影響は哺乳プログラム（哺乳量や漸減方法，離乳験はスターター給与を開始する５日齢から13週齢時期）によって異なることが予想される。本研究まで行われた。

の目的は，高栄養哺乳プログラムで８週齢離乳し採血（15mL）は，４，６，７，８，９，10，11，た乳用子牛において，スターターのデンプン含量

12および13週齢に朝の給飼前（0700ｈ）に頚静脈の違いが発育，糞性状および血液性状に及ぼす影から行い，プレイン管とヘパリン管に保存した。

響を評価することであった。

糞のサンプルは６，８，10および13週齢に，午前© The Ito Foundation

乳用子牛における消化管機能強化および消化管由来の炎症予防に関する研究

425

７時の給飼前に直腸糞を用手によって採取した。

血清骨型アルカリホスファターゼ（BAP）濃度

採取した糞の一部は速やかにpH（LAQUAtwin-

を市販のアルカリホスファターゼ（ALP）アッ

pH-22，HORIBA，京都府，日本）を測定し，セイキット（LabAssay ALP，富士フィルムワ

Megazyme kit（日本バイオコン，東京，日本）

コーシバヤギ株式会社，群馬，日本）を用いて測を用いて糞中デンプン濃度を測定した。また，文定した。

献３の方法に基づいて糞性状スコアを毎日２回

すべての測定値は最小二乗平均±標準誤差で示（0700h，1600h）記録した。ルーメン液は，６，

さ れ た 。 デ ー タ は JMP （version 13.0 for

10および13週齢の朝の給飼前に経口で採取した。

Windows, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）

ルーメン液は採取後，速やかにpHを測定した。

を用いて分析し，p＜0.05を有意差あり，p＜0.10

ル ー メ ン 液 の VFA 濃 度 は ガ ス ク ロ マ ト グ ラ

を傾向ありとした。

フ ィ ー （GASCHROMATOGRAPH GC-2014 ，
SHIMADZU，東京，日本）にて測定した。

３．結果と考察

血清生化学成分［グルコース，非エステル型脂離乳後（64-91d）で，Ｌ区に比べＨ区でスター

肪酸（NEFA），血液尿素窒素（BUN）および3-ターの乾物摂取量が多かった（p<0.05，Table１）。

ヒドロキシ酪酸（BHBA）］濃度は自動分析装置

体重の推移には処理区間の差が認められなかった（OLYMPUS「AU680」，オリンパス株式会社，が（Fig. 1A），日増体量は離乳後（64-91d）で，東京，日本）で測定された。時間分解蛍光免疫測

Ｌ区に比べＨ区で高かった（p<0.05，Fig. 1B）。

定法（競合固相免疫測定法）によりホルモン（イこれは，離乳前の摂取量には差がなかったが，Ｈン ス リ ン ，GH ，IGF-1 ，GLP-1 お よ び GLP-2）

区における離乳後のスターター摂取量がＬ区に比の血漿濃度を測定した。骨形成状態の指標となる

べて多かったためと考えられる。

Table 1 Dry matter intake of calf starter and grass hay for each period
Treatment calf starter1
Item

H

M

L

SEM

p-valueStarter intake（g/d）
preweaning（5-42d）

195

172

202

29.4

0.745

transition（43-63d）

1570

1350

1470

106

0.319

postweaning（64-91d）

2979a

2923ab

2828b

43.6

0.067

Average starter intake for3 days before weaning

1641

1368

1517

152

0.447

Day of age when calvesconsumed 1.5kg/d of starter2

52.8a

56.2b

54.2abpreweaning（5-42d）

31.2

44.5

41.4

9.61

0.593

transition（43-63d）

232

276

271

26.9

0.458

postweaning（64-91d）

567

651

758

93.1

0.377

0.116

Hay intake（g/d）

a, b Means within row with a common superscript differ（p<0.05）
1H：High starch starter, M：Medium starch starter, L：Low starch starter
2Means age when 1.5 kg / d（DM）is achieved for 3 consecutive days

© The Ito Foundation

426

令和３年度

BW(kg)

A)

140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Weaning

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13

Calf age(wk)
L-StarterB)

M-Starter

H-Starter

1.40

a

1.20

ab

b

ADG(kg/d)

1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00

preweaning(0-5wk)

transition(6-8wk)

postweaning(9-13wk)

Ｈ区

0.80

1.17

1.16

Ｍ区

0.74

1.02

1.09

Ｌ区

0.78

1.22

1.01

a,b (p<0.05)

Fig. 1 Effects of dietary starch content on body weight （A） andaveraged daily gain（ADG：B）in calves before and after weaning.

A）
3.5

Days of fecal score≥33.0

p=0.9452.5
2.0

p=0.1471.5

p=0.238

1.0
0.5
0.0

preweaningtransition
H

B）

postweaning

L
C）
Fecal starch concentration(mg/100g)

7.4
7.2
Fecal pH

M

7
6.8
6.6
6.4
6.2
6

wk：p<0.01
Treatment：p＝0.139
Treatment×wk：p＝0.952

6

8
10
Calf age (wk)
H
M
L

13

Treatment：p＝0.451

350
300
250
200
150
100
50
0

H

M

L

Fig. 2 Effects of dietary starch content on fecal score（A）, fecal pH（B）, and fecal starch concentration（C）before and after weaning.

© The Ito Foundation

3.2
6.99

0.2

7.4
1.0
1.7

22.0
0.8

78.8
67.0

2.4
7.08

0.4

11.1
1.0
2.2

24.9
0.7

77.9
59.8

8wk

3.0
6.84

0.3

10.8
1.7
1.4

21.4
1.1

60.8
63.2

10wk

3.9
7.27

0.3

9.4
2.2
1.2

17.7
1.4

61.1
67.8

13wk

3.0
6.83

0.2

10.2
0.9
1.7

22.3
0.7

67.4
64.0

6wk

5L>M>H（p<0.05）

4L, M<H（p<0.05）

3L, M<H（p<0.05）

2L, M>H（p<0.05）

2.6
7.08

0.5

12.1
0.9
2.3

24.0
0.6

96.5
59.7

8wk

2.4
6.54

2.3
0.5

12.5
1.2

24.8
0.7

91.1
58.0

10wk

3.1
6.8

1.6
0.5

10.4
1.9

21.4
1.0

61.9
63.2

13wk

Treatment calf starter1
M

1H：High starch starter, M：Medium starch starter, L：Low starch starter

A/P
pH

nC6, %

nC4, %
iC5, %
nC5, %C3, %iC4, %

total VFA, mM
C2, %

6wk

L

Table 2 Ruminal fluid properties at various weeks

2.7
7.12

2.8
0.4

8.5
0.7

2.0
7.16

3.6
0.6

10.6
1.4

28.3
0.9

75.3
54.7

59.2
61.4
25.5
0.7

8wk

6wk

H

1.7
6.95

3.8
0.6

11.0
1.0

31.0
0.5

75.4
52.1

10wk

3.0
7.07

1.4
0.2

9.5
1.9

22.0
1.2

52.3
63.8

13wk

0.2
0.2

0.4
0.1

1.3
0.2

1.5
0.1

9.3
2.1

SEM

<0.015
0.37

0.014
0.37

0.14
0.31

<0.0130.09

Startertreatment
0.12<0.012

<0.01
0.17

<0.01
0.04

0.052
<0.01

<0.01
<0.01
<0.01

0.01

wk

p-value

0.34
0.83

0.05
0.40

0.99
0.42

0.48
0.20
0.17

Starter×wk
0.37

乳用子牛における消化管機能強化および消化管由来の炎症予防に関する研究© The Ito Foundation427

ルーメン液性状について，総VFA濃度に処理区間の差はなかったが，Ｍ区およびＬ区では酢酸

割合が，Ｈ区ではプロピオン酸割合が高くなっていた（p<0.05，Table２）。これは，Ｍ区およびＬ区で繊維発酵が，Ｈ区でデンプン発酵が多く行われていたことが示唆される。酪酸およびプロピオ

ン酸はルーメン上皮を発達させることが知られて

おり４），本研究では処理区間に酪酸割合の差がな

かったことから，Ｈ区ではプロピオン酸の刺激を受けて，ルーメン上皮の発達が促された可能性がある。本研究では，サンプリング期間を通じて

ルーメンpHに処理区間の差はなかった（Table２）。一般的に，デンプン濃度の高い飼料を与えられたほうが，高繊維質飼料を与えられたときよ

りもルーメンpHが低下することが知られている。

哺育期では，与えられた固形飼料の質によりルーメン絨毛の発達が異なることが知られており，哺乳期の子牛にミルクとともに穀類と草を与えた子

牛では，ルーメン絨毛が発達していたのに対し，

ミルクと草のみを与えられた子牛では，同じ月齢

でもルーメン絨毛が発達していなかったことが観察されている５）。このことから本研究では，Ｈ区のスターターには多くの穀類が含まれており，絨毛が早期に発達していたことで，発生したVFAの吸収が効率よく行われていたと考えられる。以上のことからＨ区ではルーメンの発達が他の処理区よりも進んでおり，離乳後のスターター摂取量も伸び，日増体量が高くなったと考えられる。

糞便pHに差はなかったが，週齢が進むにつれて低下していた（Fig. 2B）。これは，週齢が進むにつれてスターター摂取量が増加したことで，未消化デンプンの下部消化管への流入が増加し，大腸内で発酵を受けたことを反映していると考えられる。糞便pHは6.5から7.4の範囲であり，おおよそ正常便であったと思われる。糞中のデンプン濃度の増加はルーメン，小腸および大腸で未消化な

428

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）
B)

120

0.5

110

0.4

100
90
wk：p＜0.01
Treatment：p=0.360
Treatment×wk：p=0.678

80
70
60

4

6

7

8
9
10
Calf age(wk)
H

M

11

12

wk：p＜0.01
Treatment：p=0.305
Treatment×wk：p=0.732

0.3
0.2
0.1
0

13

4

6

7

L

8
9
10
Calf age(wk)
H

M

11

12

13

L

D)
18
16

L,M>H

14

ab

12

b

10

b

b

c

c

4

6

7

8
9
10
Calf age (wk)
H

M

450

a

M>H

a

a

350

ab

b

b

250

wk：p＜0.01
Treatment：p=0.012
Treatment×wk：p=0.053

8
6

a

a

a

BHBA(mM)

C)

BUN(mgN/dL)

NEFA(mEq/L)

Glucose(mg/dL)

A)

11

12

13

wk：p＜0.01
Treatment：p=0.057
Treatment×wk：p=0.460

150
50

4

L

6

7

8
9
10
Calf age(wk)
H

M

11

12

13

L

BAP(U/L)

E)
160
140
120
100
80
60
40
20
0

wk：p＜0.01
Treatment：p=0.549
Treatment×wk：p=0.431

6

10
Calf age(wk)
H
M
L

13

Fig. 3 Effects of dietary starch content on serum glucose（A）, non-esterified fatty acids（NEFA：B）, blood urea nitrogen（BUN：C）, beta-hydroxybutyrate（BHBA：D）,
and borne alkaline phospholipase（BAP：E）

デンプンが排出されたことを意味する。このこと低下することなく推移したと考えられる（Fig.

は糞中pHの低下と同様に大腸性アシドーシスの4A）。NEFAは離乳に伴い減少したが，離乳前はリスクとなることを示唆するが６），離乳後pHが代用乳中の脂肪の吸収が反映されていると考えら大きく低下した10週齢における糞中デンプン濃度れる（Fig. 3B）。

に差はなかった。また，スコア３以上の日数に処

BUNは離乳後にＨ区で低く，Ｈ区で菌体タン

理区間の差は認められず（Fig. 2A），デンプン含パク質の合成が進んでいたことが推察される

量の違いは糞性状に影響を及ぼさなかった。

（Fig. 3C）。Ｈ区では摂取デンプン濃度が多く，ルーメンが未熟な子牛はグルコースが主なエネ

これが微生物のエネルギー源となったと考えられルギー源となるが，離乳後はルーメンの発達に伴る。IGF-1は13週齢にＨ区で高くなっていた。菌い減少する。今回は，グルコースは離乳後も高い体タンパク質の合成が進み，離乳後に利用できる値を推移していた（Fig. 3A）。インスリンはグルタンパク質が増えたことでＨ区の高発育につなコースが離乳後に減少しなかったために離乳後もがったと思われる。IGF-1に差が出た一方で，© The Ito Foundation

429

乳用子牛における消化管機能強化および消化管由来の炎症予防に関する研究
A)

B)

10
wk：p<0.01
Treatment：p=0.661
Treatment×wk：p=0.845

5
0

4

6

7
H

8
9
10
Calf age(wk)
M
L

11

12

13

45
40
35
30
25
20
15
10
5
0

a

wk：p<0.01
Treatment：p＝0.533
Treatment×wk：p＝0.503

ab
b

4

6

7
H

C)

IGF-1(ng/mL)

GH(ng/mL)

15

8
9
10
Calf age(wk)
M
L

11

12

13

D)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0

0.5

a
ab
b
wk：p＜0.01
Treatment：p＝0.413
Treatment×wk：p＝0.647

4

6

7

8
9
10
Calf age(wk)
H
M
L

11

12

13

8
9
10 11
Calf age(wk)
H
M
L

12

13

GLP-1(ng/mL)

Insulin(ng/mL)

20

0.4
0.3
0.2

wk：p＜0.01
Treatment：p＝0.880
Treatment×wk：p＝0.898

0.1
0

4

6

7

8
9
10
Calf age(wk)
H
M
L

11

12

13

E)

GLP-2(ng/mL)

0.5
0.4
0.3

wk：p＜0.01
Treatment：p＝0.824
Treatment×wk：p＝0.679

0.2
0.1
0

4

6

7

Fig. 4 Effects of dietary starch content on plasma insulin（A）, growth hormone（GH：B）,insulin-like growth factor-1（IGF-1：C）, glucagon-like peptide-1（GLP-1：D）,
and GLP-2（Ｅ）

GHには処理区間の差が認められなかった（Fig.

ることから，VFAの吸収効率がよく，Ｌ区およ4B，C）。IGF-1の分泌は高タンパク質の食餌にびＭ区と比較してBHBAは高くなることが予想さ

よって増加することが報告されており ，タンパ

れる。さらに，BHBAは低エネルギー状態におけ

ク質を効率よく吸収できていたＨ区でIGF-1が上る脂肪動員により上昇するが，NEFAには処理区昇していたと思われる。

間の違いは認められなかったため，Ｍ区およびＬ

７）

BHBAはルーメン発達の指標として有用であ区で低エネルギー状態になっていた可能性は低

り ，どの処理区でも離乳に伴い増加したことかい。BHBAは，ｎ酪酸がルーメン上皮で代謝され

ら，ルーメンの発達が進んでいたことが分かる。

て産生されるほか，酢酸の一部もBHBAに変換さ

血清BHBA濃度は離乳後にＨ区で低くなっていたれることから，Ｍ区およびＬ区の血中BHBA濃度

が（Fig. 3D），ルーメン内のｎ酪酸の割合には差の増加はルーメン内の酢酸割合が高いためであるが認められなかった。総VFA濃度にも差が認めと考えられた。

３）

られなかったため，ｎ酪酸の産生量に違いはな

これらのことから，スターターのデンプン含量

い。Ｈ区ではルーメンが発達していたと考えられを40％まで高めても，Ｍ区およびＬ区と同様に© The Ito Foundation

430

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

ルーメン内や小腸で消化を十分に行うことがで期間を通してＬ区に比べＨ区で高かった。Ｈ区でき，腸管に悪影響を及ぼすことなく，発育に問題は，消化管への悪影響が見られず，ルーメンでのないことが示された。

菌体タンパク合成量が多く，血中のIGF-1濃度が４．要

高まったことから離乳後の高発育につながったと

約推察された。

本研究では，哺育期の飼養管理が離乳ストレ
ス，特に腸管の健全性に及ぼす影響を検討するた
めに，スターターのデンプン含量の違いが発育，
糞性状および血液性状に及ぼす影響を評価した。
ホルスタイン種子牛雌雄27頭を，デンプン含量の異なる３種のスターター区［Ｈ区（40％），Ｍ区（30％），Ｌ区（20％）］に９頭ずつ配置した。代用乳は最大1.2kg／日給与し，６週齢から漸減し８週齢で離乳した。スターター（摂取上限3.5kg／日）および乾草は５日齢より自由摂取させた。
採血は４～13週齢に行った。体重は毎週記録し，
４，
８，10および13週齢に体測を行った。糞スコ
アを毎日記録し下痢を示した日数（≧スコア３）
を集計した。６，８，10および13週齢にルーメン
pH，糞便pHおよび糞中デンプン濃度を測定した。
離乳後の日増体量はＬ区と比べＨ区で高かった。
離乳前３日間の平均スターター摂取量は処理区間に差はなく，おおむね離乳時の目標摂取量に到達していた。離乳後のスターター摂取量はＬ区と比べＨ区で多かった。糞中のpHの推移および10週
齢時の糞中デンプン濃度に処理区間の違いは見られず，下痢の日数にも差が認められなかった。離乳後の血清BUN濃度はＬおよびＭ区と比べてＨ区で低く，血漿IGF-1濃度がＬ区と比べてＨ区で高かった。ルーメン内のプロピオン酸割合は試験文
献１）
 Soberon, F., Raffrenato, E., Everett, R. W., Van
Amburgh, M. E：Preweaning milk replacer intake
and effects on long-term productivity of dairy
calves, J Dairy Sci, 95, 783～793, 2012.
２）
 Guilloteau, P., Corring, T., Garnot, P., Martin, P.,
Toullec, R., Durand, G.：Effects of Age andWeaning on Enzyme Activities of Abomasum andPancreas of the Lamb, J Dairy Sci, 66, 2373～2385,
1983.
３）
 Kertz1, A. F., Chester-Jones, H.：Invited
Review：Guidelines for Measuring and Reporting
Calf and Heifer Experimental Data, J Dairy Sci, 87,
3377～3380, 2004.
４）
 Sander, E. G., Warner, R. G., Harrison, H. N.,
Loosli, J. K.：The Stimulatory Effect of Sodium
Butyrate and Sodium Propionate on theDevelopment of Rumen Mucosa in the Young Calf,
J Dairy Sci, 42, 1600～1605, 1959.
５）
 Heinrichs, A. J., Lesmeister, K. E.：Rumen
development in the dairy calf. Calf and heifer
rearing：principles of rearing the modern dairy
heifer from calf to calving, 60th University of
Nottingham Easter School in Agricultural Science,
Nottingham, UK, pp.53-65, 2004.
６）
 Eckert, E., Brown, H. E., Leslie, K. E., DeVries, T.
J., Steele, M. A.：Weaning age affects growth, feedintake, gastrointestinal development, and behavior
in Holstein calves fed an elevated plane of nutrition
during the preweaning stage, J Dairy Sci, 98, 6315
～6326, 2015.
７）
 Lee, H. G., Choi, Y. J., Lee, S. R., Kuwayama, H.,
Hidari, H., Yo, S. K.：Effects of dietary protein andgrowth hormone-releasing peptide（GHRP-2）onplasma IGF-1 and IGFBPs in Holstein steers,
Domest Anim Endocrinol, 28, 134～146, 2004.

© The Ito Foundation

431

睡眠様姿勢―肉用牛の生産性およびウェルフェアの新たな行動指標の検討
Sleep-like posture : Evaluation as a new behavioural indicator of beef cattle
productivity and welfare

深

澤

充・盧

尚

健

（東北大学大学院農学研究科）

Michiru Fukasawa and Sanggun Roh（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

In this study, we investigated（1）the relationship between the expression of a sleep-likeposture（a resting posture with the neck bent and the head pulled over the abdomen whenlying down）and growth during the suckling（1-3 months of age）and early fattening（12-15
months of age）period in Japanese Black cattle, and（2）the effect of floor cleanness on theexpression of a sleep-like posture.（1）During the suckling period, the daily expression time ofsleep-like posture was decreased with month. A positive correlation was found between the
average daily expression time of sleep-like posture and daily weight gain during the sucklingperiod. A positive correlation was also found between the average daily expression time ofsleep-like posture and plasma glucose concentration, suggesting that calves with a longer
expression time of sleep-like posture may have better nutritional intake and show better
growth. On the other hand, a negative trend was observed between the average daily
expression time of sleep-like posture and daily body weight gain in early fattening cattle. Thissuggests that the effect of the expression of sleep-like posture on growth differs between thesuckling and early fattening period.（2）As for the effects of bedding cleanness on the sleeplike posture expression, the sleep-like posture shift from the recumbent position to the flat-out
position when the bedding is changed and clean, although the total expression time of sleeplike posture remains the same. This suggests that the daily expression time of the sleep-likeposture is fixed, however, the pattern of its expression may change depending on the comfort
level of management．

１．目

いることが明らかになっている１）。そのため，睡的

眠は肉用牛の成長にも深く関連することが予想さ

睡眠は単純な休息ではなく，動物の成長や健康れ，その発現の適正化を図ることは家畜生産性のに深く関わる行動である。ヒトでは睡眠時には成向上につながることが期待できる。また，近年で長ホルモンや甲状腺刺激ホルモン等の物質が分泌は肉用牛においてもアニマルウェルフェア（以され，健全な心身の発達や維持に大きく寄与して下，AW）への配慮が求められている。AWの向© The Ito Foundation

432

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）て行った（2019-農動-019-02）。実験はすべて東北大学農学研究科附属川渡フィールドセンターにおいて実施された。
2 . 1 肉用牛の睡眠様姿勢の発現と成長との関係
2.1.1

哺乳期の睡眠様姿勢の発現と成長

黒毛和種子牛10頭を供試して，出生後の１-３か月齢時に調査を行った。
子牛は出生後２週間以内に母子分離して，乾草を敷料にしたカーフハッチ（1.7 ｍ×1.7 ｍ）でFig. 1 Sleep-like posture of cattleA cow in a lying position with neck bent and headresting on its flank（Photoby Fukasawa M）

単飼した。子牛には１日朝夕２回人工乳（オートリ―ミルク，株式会社オールインワン）およびスターター（ミルキースターターPFS，明治飼糧）

上にはストレスや怪我，疾病のような負の状態をを週齢ごとのメーカーの推奨量を給与した。乾草減らすことに加え，喜びや快，安寧などの動物にと水は自由摂取とした。

とって望ましい正の情動の評価とその促進が求め

出生後１，２，３か月齢時にウシの睡眠様姿勢のられている。肉用牛生産においてもAWに配慮し発現を，Fukasawaら５）の方法に従い，加速度計

た飼育管理をすることで，ストレスや疾病が減を用いて２日間連続で調べた。加速度計（Onset,

り，結果として，生産性の向上や安全な畜産物のUA-004-64，58×33×23mm，18 g）は頭絡を用生産にもつながることが期待される。

いて後頭部付近に固定し，10秒間隔でデータを記

本研究では，睡眠との関連が深いとされる録した。回収したデータはHOBOware（バージョウシの睡眠様姿勢（Fig.１）に着目し，本姿勢をン3.7.23. Onset）により睡眠様姿勢の開始と終了

高い生産性を示す良好なAWの飼育管理の行動指の時刻を目視で判定し，各バウトの持続時間を求標として用いることを検討した。本申請では，めた。持続時間が２分以下のバウトは集計から除（１）肉用牛の睡眠様姿勢の発現と成長との関係，外した。睡眠様姿勢の発現について１日の総発現（２）飼養管理による安寧性の違いが肉用牛の睡時間，バウト回数，平均バウト時間を求めた。

２～４）

眠様姿勢の発現に与える影響，について調査，検

睡眠様姿勢の測定後に体重測定および経静脈か討した。
（１）については，黒毛和種の哺乳期（１らの採血（ヘパリン管，10 ml）を行った。遠心

－３か月齢）および肥育前期（12－15か月齢）の分離した血漿は分注し，測定まで－20℃で凍結保増体や成長に関連する血液成分の動態と睡眠様姿存した。血漿中の代謝成分（グルコース，遊離脂勢の発現の関係を調査した。また（２）について

肪酸，コレステロール濃度等）を測定した。

は，牛床の清潔度が黒毛和種肥育牛の睡眠様姿勢の発現に与える影響について調査を行った。
２．方

統計にはSPSSを用いた。各月齢間の睡眠様姿
勢のデータは繰り返しのある分散分析で比較した。また，個体ごとの１-３か月の睡眠様姿勢の法

総発現時間の曲線下面積を求め，その間の日数で本研究は東北大学動物実験委員会の承認を受け除して睡眠様姿勢の平均日発現時間とした。各血© The Ito Foundation

睡眠様姿勢―肉用牛の生産性およびウェルフェアの新たな行動指標の検討433

漿中代謝成分についても同様に曲線下面積をそのた。２つの睡眠様姿勢（伏臥位姿勢と横臥位姿間の日数で除して平均濃度を求めた。平均日発現勢）の１日の発現時間，バウト回数および平均バ

時間と，期間中の各血漿中代謝成分の平均濃度おウト時間をそれぞれペンごとに算出した。伏臥位

よび日増体量とのPeasonの相関係数を求めた。

および横臥位の睡眠様姿勢の発現時間の合計を算

2.1.2

肥育前期の睡眠様姿勢の発現と成長出し，１日の総発現時間とした。牛床清潔度とし

黒毛和種肥育牛６頭を供試して，12か月齢時とてペンごとの空気中アンモニア濃度および敷料の15か月齢時に調査を行った。肥育牛はペン（4.6

水分含量を測定した。反転法により，実験前期とｍ×4.8 ｍ）に10か月齢時に２頭ずつ導入した。

後期で清掃群と対照群に割り当てるグループを入

１日朝夕２回給餌した。１日当たりの給与量は12

れ替えて同じ実験を行った。睡眠様姿勢と牛床清か月齢時には市販肥育前期用配合飼料６kgと自潔度の各測定項目を従属変数として，処理（清家製グラスサイレージ４kg，15か月齢時には市掃，対照）と時期（清掃前，清掃後）とグループ

販肥育後期用配合飼料９kgと稲わら２kgであっの効果および処理と時期の交互作用を固定効果，

た。

またグループ内ペンの効果を変量効果とする一般

12か月および15か月齢時に，子牛と同様の方法
で，ウシの睡眠様姿勢の発現について加速度計を用いて２日間連続で調べ，１日の総発現時間，バ
ウト回数および平均バウト時間を得た。睡眠様姿

化線形混合モデルにより解析した。
３．結果と考察3 . 1 肉用牛の睡眠様姿勢の発現と成長との関勢の測定後に体重測定および経静脈からの採血

係（ヘパリン管，10 ml）を行った。遠心分離した血3.1.1

漿は分注し，測定まで－20℃で凍結保存し，血漿子牛の睡眠様姿勢の発現をFig.２に示した。１中の代謝成分を測定した。

哺乳期の睡眠様姿勢の発現と成長

日の総発現時間に対して，月齢の効果は有意で12か月齢および15か月齢の睡眠様姿勢のデータあった。１日の総発現時間は月齢にともない減少は対応あるｔ検定で比較した。子牛と同様に睡眠し，１か月齢時（262.0±20.2分／日，平均値±標様姿勢の平均日発現時間，各血漿中代謝成分の平準誤差）よりも２か月齢（217.2±23.1分／日）は均濃度および期間中の日増体量を求め，Peason

短くなる傾向を示し，３か月齢（202.5±13.8分／の相関係数を求めた。

日）は有意に短くなった（Fig. 2a）。バウト回数

2 . 2 牛床の清潔度が睡眠様姿勢の発現に与え（Fig. 2b）および平均バウト時間（Fig. 2c）には月齢の効果は有意ではなかった。

る影響
黒毛和種肥育牛８頭を供試した。ウシは２頭ず

睡眠様姿勢の平均日発現時間と日増体量およびつ計４つのペンで飼育され，２ペンを１つのグ

血漿中代謝成分濃度との相関をTable１に示した。

ループとして清掃群と対照群に振り分けた。清掃

日増体量との間にはｒ＝0.65と有意な正の相関が群では各期間内の７日目に牛床清掃として敷料認められた（ｐ＜0.05）。また，血漿中グルコー（オガクズ）の入れ替えを行い，対照群は各期間ス濃度との間にｒ＝0.56と正の相関を示す傾向が内に牛床清掃を行わなかった。清掃前２日間と清あった（ｐ＝0.09）。それ以外にｐ＝0.1を下回る

掃後２日間について以下の調査を行った。ウシの相関はなかった。このことから，睡眠様姿勢の発

睡眠様姿勢の発現を加速度計とビデオで測定し現時間の長い子牛は，人工乳やスターターの摂取© The Ito Foundation

434

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）(a)Daily expression time
300(b)Daily bout frequency(c)Average bout time

30

15

200

20

10

100

10

5

a
ab
b

0

0
1

2

3

0
1

age
（month）

2

3

age（month）

1

2

3

age
（month）

Fig. 2 Sleep-like postures of Japanese Black suckling calves at 1, 2, and 3 months of age（a）daily expressiontime（min/day）,（b）daily bout frequency（times/day）and（c）average bout duration（min / times）

Symbols and error bar represent mean and standard error.
a, b represents significant difference among months.

Table 1 Correlations between the average daily expression time of sleep-like postures and the daily

weight gain and plasma metabolic component concentrations of Japanese Black suckling calvesduring 1 to 3 month of age
Average daily expression
time of sleep-like postures（min/day）
Unit

Mean ± SE

220.3±17.6（kg/day）

0.73±0.03

0.65

Total protein（g/dl）

6.05±0.12

0.29

Blood urea nitrogen（mg/dl）

11.5±0.5－0.27

Total cholesterol（mg/dl）

133.0±14.5－0.13Triglyseride（mg/dl）

17.6±1.5－0.09

Free fatty acid（mEq/l）

0.184±0.023

0.12

Sodium（mEq/l）

144.7±0.3

0.11

Chlorine（mEq/l）

102.5±0.2

－0.08

ALP

（U/l）

659.1±52.5

0.09

AST

（U/l）

50.41±2.19

0.23

ALT

（U/l）

9.55±0.43

－0.17

LDH

（U/l）

829.4±22.9

－0.44

γ-GT

（U/l）

21.0±1.1－0.05

Albumin（g/dl）

3.65±0.04

0.27

HDL-cholesterol（mg/dl）

105.3±12.9－0.11

LDL-cholesterol（mg/dl）

45.5±7.2－0.12

Glucose（mg/dl）

106.0±4.4

0.56

BHB

（μmol/l）167.5±12.4

0.33

Total ketone（μmol/l）168.1±12.4

0.33

Daily weight gain
Plasma metabolic component

Bold figure represent significant correlation with the average daily expression time of sleep-like posture（p<0.05）
ALP : alkaline phosphatase, AST：aspartate aminotransferase, ALT：alanine aminotransferase,
LDH : lactate dehydrogenase, γ-GT：γ-glutamyl transpeptidase, BHB：D-β-Hydroxybutyric acid

© The Ito Foundation

睡眠様姿勢―肉用牛の生産性およびウェルフェアの新たな行動指標の検討が多く，良好な発育を示す可能性が示唆された。
3.1.2

肥育前期の睡眠様姿勢の発現と成長435

乳期と肥育前期で影響が異なる可能性が示唆された。哺乳期には両者の間に正の関係が認められ肥育牛の睡眠様姿勢について，１日の総発現時た。ヒトでは深いノンレム睡眠時に成長ホルモン間は12か月齢（74.1±10.7分／日）より15か月齢が放出される（井上，2006）。本姿勢時にはレム（109.7 ± 6.1 分 ／ 日）で 有 意 に 長 く な り（ｐ ＜睡眠であることが多い２～４）とされているが，哺乳0.05），バウト回数は12か月齢（9.8±1.1回／日）

類の通常の睡眠ではレム睡眠とノンレム睡眠は関より15か月齢（14.8±0.6回／日）で有意に多く連し，レム睡眠の増加はノンレム睡眠の増加も反なった（ｐ＜0.05）。平均バウト時間は月間で違映している７）こと，GHの投与はレム睡眠を増加

いはなかった。Fukasawaら６）は，給与飼料中のさせる８）ことから，ノンレム睡眠時の高いGH分

濃厚飼料の比率が上がると，睡眠様姿勢の総発現

泌がレム睡眠を誘発していることで，睡眠様姿勢

時間が長くなることを報告しており，本調査でもの日発現時間と日増体量との間に正の関係が認め15か月齢時に配合飼料の割合が増加したことが月られた可能性が考えられた。

齢間の差に影響していると考えられた。

一方，肥育前期には両者の間には負の相関が示

12か月齢時および15か月齢時の睡眠様姿勢の平唆された。Fukasawaら６）は配合飼料の多給によ

均日総発現時間とその間の日増体量の関係をFig.

るエンドトキシンの発生や摂食・反芻時間の短縮

３に示した。両者の相関はｒ＝－0.29（ｐ＝0.58）などのAW上の負の影響が，本姿勢の発現時間がで有意ではなかった。しかし，１点離れ値があり，増加につながる可能性をあげている。配合飼料のそれを除くと負の関係（ｒ＝－0.88，p < 0.05，n

多給がウシの健康性や行動充足など，生産性や＝５）が認められた。そのため，今後サンプル数

AW的に負の要因が睡眠様姿勢の発現に与える影を増やして検討する必要がある。睡眠様姿勢の平響については，今後検討する必要がある。

均日発現時間と血漿中代謝成分との間には有意な相関はなかった。

3 . 2 牛床の清潔度が睡眠様姿勢の発現に与える影響

睡眠様姿勢の発現と増体の関係については，哺清掃群では対照群と比べ，空気中アンモニア濃度と牛床水分含量が清掃後に有意に低下した（ｐ＜0.01）。伏臥位睡眠様姿勢の１日の総発現時間

Daily weight gain (kg / day)

1.5

およびバウト回数，また横臥位睡眠様姿勢の総発
現時間とバウト回数で処理と時期の有意な交互作

1.0

用がみられた（ｐ＜0.05）。清掃後が清掃前と比べて対照群では伏臥位睡眠様姿勢の総発現時間0.5（ｐ＜0.05）およびバウト回数（ｐ＜0.01）が増加
し，清掃群では横臥位睡眠様姿勢の総発現時間（ｐ＜0.1）とバウト回数（ｐ＜0.01）が増加する

0.0
0

50

100

150

傾向を示した。２つの睡眠様姿勢の合計発現時間

Averaged daily expression time(min/day)Fig. 3 Scatterplot of average daily expression time ofsleep-like posture and daily weight gain of JapaneseBlack fattening cattle during 12 to 15 months of ageには処理と時期の交互作用はみられず，清掃前後で合計発現時間は変わらないものの，伏臥位から横臥位に睡眠様姿勢がシフトした。このことから© The Ito Foundation

436

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

睡眠様姿勢の１日の総発現時間は固定的だが，飼示唆している。

育環境の快適性によって発現様相が変わることを示唆している。
４．要

約

本研究では黒毛和種における睡眠様姿勢（伏臥時に頸を曲げ，頭部を腹部に寄せて休息する姿勢）の発現の（１）哺乳期（１-３か月齢）および肥育前期（12-15か月齢）の成長との関係，および（２）牛床状態の違いによる影響，について検討した。（１）哺乳期には睡眠様姿勢の平均日発現時間と日増体量との間に正の相関が認められた。また，睡眠様姿勢の平均日発現時間と血漿中
グルコース濃度との間に正の相関が認められ，睡眠様姿勢の発現時間の長い子牛は，栄養摂取が良好で，良好な発育を示す可能性が示唆された。一方，肥育牛では，睡眠様姿勢の平均日発現時間と日増体量との間に負の傾向が認められた。このことから哺乳期と肥育前期では睡眠様姿勢の発現が増体に対して与える影響が異なることが示唆された。（２）牛床が清潔になることで，伏臥位から横臥位に睡眠様姿勢がシフトした。このことから
睡眠様姿勢の１日の総発現時間は固定的だが，飼文
献１） 井上昌次郎：眠りを科学する，朝倉書店，東京，
2006.
２）
 Ｈänninen, L., Mäkelä, J. P., Rushen, J., de Passillé,A. M., Saloniemi, H.:Assessing sleep state in calvesthrough electrophysiological and behaviouralrecordings: A preliminary study, Applied Animal
Behaviour Science, 111, 235～250, 2008.
３）
 Ternman, E., Matti Pastell, M., Agenäs, S.,
Strasser, C., Winckler, C., Nielsen, P. P., Hänninen,
L.:Agreement between different sleep states andbehaviour indicators in dairy cows, Applied Animal
Behaviour Science, 160, 12～18, 2014.
４）
 Hunter, L. B., Haskell, M. J., Langford, F. M.,
O’Connor, C., Webster, J. R., Stafford, K. J.:Heartrate and heart rate variability change with sleep
stage in dairy cows, Animals, 11, 2095, 2021.
５） Fukasawa, M., Komatsu, T., Higashiyama, Y.,
Oshibe, A.:The use of accelerometer to measure
sleeping posture of beef cow, Animal Science
Journal, 89, 488～493, 2018.
６）
 Fukasawa, M., Komatsu, T., Higashiyama, Y.:Theinfluence of concentrate-rich diet on daily sleep
and lying postures of Japanese black cows, Animal
Science Journal, 91, e13356, 2020.
７）
 Ternman, E., Nilsson, E., Nielsen, P. P., Pastell, M.,
Hänninen, L., Agenäs, S.:Rapid eye movement sleep
time in dairy cows changes during the lactation
cycle, Journal of Dairy Science, 102, 5458～5465,
2021.
８） 田ヶ谷浩邦：睡眠関連ホルモンの計測，生体医工学，46，169～176，2008.

育環境の快適性によって発現様相が変わることを© The Ito Foundation

437

ゲノム編集による高消化性暖地型イネ科牧草の開発（Ⅱ）Development of high digestibility warm-season forage grass by genome
editing（Ⅱ）

権

藤

崇

裕

（宮崎大学フロンティア科学総合研究センター）

Takahiro Gondo（Frontier Science Research Center, University of Miyazaki）

In this study, we evaluated characteristics of morphology, yield, and fiber composition of
genome-edited bahiagrass plants with a mutation of the CAD gene and investigated thegenetic segregation of the CAD mutant locus and the inserted vector in the T1 progeny aswith previous year. Among the three genome-edited lines, the E26 line, with the mutation
inserted in both CAD alleles, showed lower plant height and reduced dry matter yield. In
contrast, the lignin content of this line was significantly reduced and digestibility was increasedaround 10％ over the wild type. These results showed that mutations in both CAD alleles moresignificantly affected morphology and fiber composition. Crossing the three genome-editedlines with seed-derived wild type as pollen parents, only the E9 line with the mutation inserted
in single CAD allele produced the seeds. Subsequently, we investigated the presence of the
CAD mutant locus and the bar gene of the vector in the T1 progeny, resulting in a genetic
segregation of approximately 1:1. In addition, 7 out of 42 plants were found to be nullsegregants with a CAD mutant locus and the bar gene removed. These plants were subjected
to PCR at four sites of the vector, and no bands were detected at all PCR sites, whichsuggested that the vector was completely removed in the selected null-segregants. For the
next step, we will carry open cross of the null-segregants, and aim to be the homozygous CAD
mutant loci and genetically fix them for developing a new cultivar．

１．目

よび生産性は，飼料の品質に大きく左右され，牧的草のリグニン含量を１％減少させた場合，消化率

暖地型イネ科牧草は，乾物生産性は高いもの

が約10％上がると試算され１），牧草のリグニン含の，家畜による消化性に問題があるため，消化性量の減少は，家畜生産性の飛躍的な向上に繋がるの向上は，重要な育種課題の一つである。飼料成と考えられる。

分の一つであるリグニンは，牧草の消化性に深く

これまで，遺伝子組換えによりリグニン生合成

関わっており，その含量は，草種や生育段階で大遺伝子を逆方向（アンチセンス）または逆位反復きく異なるが，約５～10％である。家畜の肉質お（RNAi）に導入することで標的遺伝子の発現を© The Ito Foundation

438

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

抑制し，リグニン含量を低下させた成功例がトー

究では，第１に，上記のゲノム編集個体３系統にルフェスク ，ペレニアルライグラス ，スイッ

ついて，形態調査を行うとともに，その繊維成分

チグラス等４）で報告されている。また，著者らも，についても評価した。一方で，これらの個体は，バヒアグラスにおいてリグニン生合成のキー酵素

ゲノムにベクターが組み込まれているため，遺伝であるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ

子組換え体として扱われ，今後，新品種を育成す（CAD）の発現を抑制した高消化性暖地型イネ科

るためにはベクターの除去が必要となる。そのた牧草の開発に成功している５）。しかしながら，こめ，第２に，上記ゲノム編集個体と野生型を交配れら開発した遺伝子組換え体については，外来遺し，CAD標的配列に変異が挿入され，かつベク

伝子の拡散や安全性などの規制が厳しく，また，ターが除去されたヌル分離個体を作出した。

２）

３）

社会的にも容認されていないため，品種として実用化することは困難である。
ゲノム編集技術は，任意の配列を認識できる人

２．方
2.1

法

供試材料

工ヌクレアーゼ（CRISPR/Cas9）の働きにより，供試材料は，バヒアグラスのCAD遺伝子に変狙った遺伝子をピンポイントで切断することがで異を挿入したゲノム編集個体である。この編集個

き，遺伝子のノックアウトを自在に行うことがで体は，CAD標的配列の対立遺伝子の片方に変異きる画期的な技術である。医学，理学，農学系なが挿入されたE9系統（Ｔの挿入）とE13系統（20

どのさまざまな研究分野で活用されつつあり，植塩基の欠失），その両方に変異が挿入されたE26

物の分野については，作物の品種改良への利用が系統（Ｔの挿入およびGTの挿入）であり，ベク

試みられ，遺伝子組換え技術とは異なる実用化を

ターのみ導入され変異の挿入が認められないV1

見据えた新しい育種技術として注目されている。

系統も用いた。野生型（WT）としては，同じカ

この技術は，外来遺伝子の導入を伴わないため，

ルス系統由来の再分化植物体を供試した。これら

これまでの遺伝子組換えの規制を受けず，日本での植物体は，2021年３月２日に1/5000ａポットには2019年度より，ゲノム編集により開発された食５株ずつ移植し，１系統につき３ポットずつ特定品は，遺伝子組換えの規制対象外として流通が認

網室内で育成した。

められている（厚生労働省，2019年９月13日発

2.2表）。そのため，本技術により，牧草の実用化を

形態調査は，2021年10月25日に実施し，草丈，見据えた品種開発が現実のものとなっている。

葉身長および葉幅を調査した。その後の収量調査

著者は，前年度（令和２年度）の本研究助成において，バヒアグラスについて，初めてゲノム編

形態および収量調査

は，植物体を地表より１cmで刈取り，乾物重を測定することにより行った。

集に成功しており，リグニン生合成で重要となる

2.3

CAD遺伝子に変異を挿入したゲノム編集個体を

上記の乾物重を測定したサンプルは，それぞれ３系統得ている。また，両方のCAD対立遺伝子

１mm程度に粉砕し，その0.5ｇをフィルターバッに変異が挿入された個体では，野生型に比べ，約クに入れた後，中性デタージェント繊維（NDF）

40％のリグニン含量の減少が認められ，ゲノム編

はデタージェント法により，in vitro消化率はペ集技術により標的配列に変異を挿入し，それが形

プシン・セルラーゼ法により分析した。リグニン質に影響を及ぼすことを明らかとしている。本研

含量は，TissueLyserⅡ（QIAGEN）でさらに細© The Ito Foundation

繊維成分の調査

ゲノム編集による高消化性暖地型イネ科牧草の開発（Ⅱ）

439

かく粉状に粉砕し，蒸留水とメタノールで脱脂処

統は，草丈が最も低く，野生型に比べ，0.1％水理を行った後，細胞壁試料（20mg）を用いて，準の有意差を示した。葉幅は，E9およびE26系統

島田ら６）の迅速チオグリコール酸リグニン定量法

で野生型に比べ有意に広いものの，葉身長では（rTGA法）により解析した。

E26系統で有意に低かった。収量は，E26系統に

2 . 4 ゲノム編集個体後代におけるCAD変異遺おいて野生型に比べ有意に低く，Fig.２のゲノム
編集個体の表現型からも，対立遺伝子の両方に変伝子座とbar遺伝子の確認
ゲノム編集個体（E9，E13，E26系統）を種子
親に野生型と交配したところ，E9系統のみで種異が挿入されたE26系統は草型が小型で収量が低いことが判断できた。

子を採種することができた。得られた種子は，滅3.2

菌 処 理 後 ，寒 天 培 地 で 発 芽 さ せ ，植 物 体 よ り

リグニン含量は，E26系統において大幅に減少

DNAを抽出した後，CAD変異遺伝子座と導入ベ

し，野生型との間で0.1％水準で有意差が認めら

クターの一部であるbar遺伝子の有無を確認した。

れた。また，本系統は，NDF含量も低く，消化CAD標的遺伝子座の変異の有無は，PCR/RE解

率は，野生型に比べ10％程増加しており，CAD

析により行った。すなわち，CAD標的配列を含対立遺伝子両方の変異は，リグニンの合成を抑制

むDNA領域でPCRを行い，変異が挿入される配し，消化性を向上することを明らかとした（Fig.

列に位置する制限酵素（RsaⅠ）で処理した後，

３）。

バンドパターンの違いにより，変異の有無を確認した。bar遺伝子は通常どおり，PCR後の目的バ
ンドの有無で後代への遺伝分離を確認した。
2 . 5 ヌル分離個体における導入ベクターの確

ゲノム編集個体の繊維成分

3 . 3 ゲノム編集個体後代におけるCAD変異遺伝子座とbar遺伝子の遺伝分離
ゲノム編集個体３系統について，種子由来野生型を花粉親として交配させたところ，E9系統でのみ種子が採種された。Fig.４は，その後代にお認
上記実験で選抜したCAD標的配列に変異が挿けるCAD変異遺伝子座とベクターの一部である

入され，かつbar遺伝子のバンドが認められない

bar遺伝子の有無を個体ごとにまとめたものであ

ヌル分離個体は，他のベクター配列についても調る。標的配列の変異により制限酵素（RsaⅠ）の査され，ベクターの挿入を確認した。プライマー

消化を受けない個体（236bpのバンドが認められは，ベクターの４箇所に設計し（Fig. 5a），それた個体）は，42個体のうち約半数認められ，E9

ぞれの系統についてPCRを行い，バンドの有無を系統後代ではCAD変異遺伝子座がおよそ１：１

確認した。

の比で分離していた（Fig. 4a）。また，同様にbar
遺伝子についても，その有無は，１：１に分離し３．結果と考察ていた（Fig. 4b）。さらに，CAD変異遺伝子座をゲノム編集個体の形態および収量保持し，かつ，bar遺伝子が除去されたヌル分離

Fig.１は，ゲノム編集個体の形態および収量を個体は，７個体認められ，そのうち正常に生育し3.1

まとめたものである。野生型とＶ１系統は，すべての形質について，一貫して有意差が認められず同等であった。草丈は，E9系統が最も高く，野生型に比べ，有意差が認められた。一方，E26系

た５個体を以下の解析に供試した。
3 . 4 ヌル分離個体における導入ベクターの確
認
ヌル分離個体におけるゲノムでの導入ベクター© The Ito Foundation

440

令和３年度
70

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）
5Plant hight(cm)

50

a)

0

40

＊＊

30
20
10

WT

V1

E9

E13

E26

Leaf width(mm)

＊

60

4

b)

0

c)

3
2
1

WT

V1

E9

E13

E26

12

50

＊

40

＊＊

30
20
10
0

WT

V1

E9

E13

E26

Dry matter(g pot-1)

Leaf length(cm)

60

＊＊

＊

10

d)

0

8
6
＊

4
2

WT

V1

E9

E13

E26

Fig. 1 Morphological characterization and dry matter of wild type（WT）, non-mutated transgenic plants（V1）and

mutated transgenic plants（E9, E13, E26）in bahiagrass. Each graph indicates plant height（a）, Leaf width（b）,
Leaf length（c）and dry matter（d）. ＊ and ＊＊ represent significant difference at p < 0.05 and < 0.01 between the
WT, respectively.
WT

V1

E9

E13

E26

Fig. 2 Phenotypes of wild type（WT）, non-mutated transgenic plants（V1）and mutated transgenic plants（E9, E13,

12

＊＊

10
8
6
4
2
0

WT

V1

E9

E13

In vitro digestibility(DM%)

a)

70

14

NDF contents(DM %)Lignin contents of cell wall(%)E26）in bahiagrass. Pot size was 20 cm in diameter.

c)

E26

＊

＊

＊＊

60
50
40
30
20
10
0

b)

70

WT

V1

E9

E13

E26

＊
＊

60
50
40
30
20
10
0

WT

V1

E9

E13

E26

Fig. 3 Evaluation of fiber composition of wild type（WT）, non-mutated transgenic plants（V1）and mutated transgenic

plants（E9, E13, E26）in bahiagrass. Each graph indicates lignin contents of cell wall（a）, NDF contents（b）, in
vitro digestibility（c）. ＊ and ＊＊ represent significant difference at p < 0.05 and < 0.01 between the WT,
respectively.

© The Ito Foundation

WT/U
WT/C
E9 Line(T0)

ゲノム編集による高消化性暖地型イネ科牧草の開発（Ⅱ）a) 236bp

441

T1 Progeny of E9 Line(E9×WT)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839404142

172bp

64bp

VectorWT
E9 Line(T0)b) 432bp

Fig. 4 Genetic segregation of the CAD mutant locus（a）and transgenes（bar gene）（b）of 42 T1 progeny of E9

mutated transgenic line（E9 × WT）in bahiagrass. a）Confirmation of mutations by PCR and restriction with Rsa I
in T1 progeny of E9 mutated transgenic line. PCR products amplified by primers Pn_CAD_F514 and Pn_CAD_
R749 were digested with Rsa I. Lanes labelled WT/C and U are PCR fragments amplified from wild type plants
digested with and without Rsa I. Lanes labelled E9 line（T0）is E9 mutated transgenic line in T0 generation. Lanes
1-42 show blots of PCR fragments amplified from T1 progeny of E9 mutated transgenic line digested with Rsa I.
The 236 bp bands are showed inherited the CAD mutant locus in T1 progeny. b）Detection of bar gene with
vector in T1 progeny. PCR products amplified by primers BAR_F92 and BAR_R523. Lanes labelled vector isplasmid vector used in genetic transformation by particle bombardment. The 432 bp bands are showed inheritedbar gene with vector. Lanes with a circle indicated null-segregants with a CAD mutant locus and the bar gene
removed in T1 progeny.

Cas9_R3823

Kan R

C

pU

④

Cas9_F3478

ri

O

CRISPR_L
9665 bp
BAR

BAR_R523①
BAR_F92

(N

s9

35

S

Ca
)

Cas9_R858

a)gRNA
35S scaﬀold

③

U6

②

Cas9_F471

U6 Pro_F103

E9 Line(T0)

WT

VectorgRNA scaﬀold_R540

T1 Progeny of E9 Line(E9×WT)
9

32

33

37

38

①

②

③

b)

④

Fig. 5 Detection of vector sequence in the null-segregants of T1 progeny of E9 mutated transgenic line（E9 × WT）in

bahiagrass. a）Schematic structure of the plasmid vector, CRISPR-L, and primer sets （① - ④）used for transgene
detection. b）Detection of transgene using primer sets （① - ④）.Lanes labelled WT is wild type. Lanes labelled E9line（T0）is E9 mutated transgenic line in T0 generation. Lanes 9, 32, 33, 37 and 38 is null-segregants of T1progeny in E9 line.

の存在は，上記のbar遺伝子のプライマー以外に，れたすべてのプライマーについて増幅バンドが認ベクターの３箇所で他のプライマーを設計し，められず，これらの個体は，導入ベクターが完全

PCR増幅バンドの有無で判断された（Fig. 5a）。

に除去されたものと推察された（Fig. 5b）。

得られたヌル分離個体は，導入ベクターに設計さ以上のことから，本研究において，ゲノム編集© The Ito Foundation

442

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

によるCAD遺伝子の変異により，バヒアグラス

分 離 が 認 め ら れ た 。ま た ，い く つ か の 個 体 でのリグニン含量の低下および消化率の向上を明ら

CAD変異遺伝子座を保持し，かつbar遺伝子が除かとした。また，交配により導入ベクターが除去去されたヌル分離個体が確認され，その個数は供されたヌル分離個体を作出したことから，本個体

試42個体のうち７個体であった。これらの個体にを用いた今後の新規品種育成が期待される。

ついて，導入ベクターの４箇所でPCRを行った結

４．要果，すべてのPCR箇所でバンドが認められず，選約抜したヌル分離個体は導入ベクターが完全に除去

本研究は，前年度につづき，バヒアグラスのされたものと推察された。今後は，得られたヌル

CAD遺伝子に変異が挿入されたゲノム編集個体

分離個体で放任授粉を行い，CAD変異遺伝子座について，形態，収量および繊維成分の評価と後をホモ化し，遺伝的に固定することで品種化を目

代におけるCAD変異遺伝子座および導入ベク指す。

ターの遺伝分離について調査した。ゲノム編集個
体３系統のうちCAD対立遺伝子の両方に変異が挿入されたE26系統は，草丈が低く，乾物収量も減少した。一方で，本系統は，リグニン含量が大幅に減少し，消化率も野生型より10％程度増加しており，CAD対立遺伝子の両方の変異がより顕著に形態および繊維成分に影響を与えることを明らかとした。ゲノム編集個体３系統について，種子由来野生型を花粉親に交配させたところ，
CAD対立遺伝子の片方に変異が挿入されたE9系
統でのみ，種子が採種された。その後，後代におけるCAD変異遺伝子座および導入ベクターのbar

文献１） Halpin, C.：Current Opinion Biotech, 56, 223～
229, 2019.
２）
 Chen, L., Auh, C. K., Dowling, P., Bell, J., Chen, F.,
Hopkins, A., Dixon, R. A., Wang, Z. Y.：Plant
Biotechnology Journal, 1, 437～449, 2003.
３）
 Tu, Y., Rochfort, S., Liu, Z., Ran, Y., Griffith, M.,
Badenhorst, P., Louie, G. V., Bowman, M. E., Smith,
K. F., Noel, J. P., Mouradov, A., Spangenberg, G.：
The Plant Cell, 22, 3357～3373, 2010.
４）
 Nelson, R. S., Stewart, J. C. N., Davison, B. H.：
Biotechnology for Biofuels, 10, Article No. 309, 2017.
５）
 Muguerza, M., Gondo, T., Ishigaki, G., Akashi, R.：
Asian Journal of Plant Sciences, 13, 8～17, 2014.
６） 島田菜津美，津山濯，亀井一郎：木材学会誌，
65，25～32，2019.

遺伝子の有無を調査したところ，約１：１の遺伝© The Ito Foundation

443

牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技術の開発（Ⅱ）
Development of fattening method that maintain the flavor of beef andshorten the feeding period in Japanese Black cow（Ⅱ）

庄

司

則

章１・上

野

豊２

（１山形県農業総合研究センター畜産研究所，２信州大学農学部）

Noriaki Shoji1 and Yutaka Uyeno2（１Livestock Research Institute, Yamagata Integrated Agricultural Research Center, ２Faculty of Agriculture, Shinshu University）

In order to develop a technique for shortening the fattening period that can maintaincarcass weight, BMS, and beef flavor, we examined the feeding effect of SF（feed fermented byadding sake lees to steamed grain mixed feed）using Japanese Black cows. Compared withGroup C, which was fed the conventional diet, in the 50％ SF group in which 50％ of thecompound feed was replaced with SF, the daily gain decreased between 21 and 27 months ofage, and there was no difference in body weight between the two groups at 27 months of age.
Therefore, it was considered difficult to shorten the fattening period. In the50％

SF group,

blood retinol concentration decreased to deficiency at 24 months of age. In addition, the bloodlevels of branched-chain amino acids and restricted amino acids involved in protein metabolism
decreased. It was speculated that these affected the decrease in daily gain．

１．目

場合には枝肉重量や脂肪交雑量を確保するために的飼料の増給速度を速めたり給与量を増量したりし肥育経営のコスト低減には肥育期間の短縮が効て肥育期間の短縮を図る必要があるが，ルーメン

果的である。令和２年３月に公表された「家畜改アシドーシスや肝機能低下，ビタミンＡ欠乏等の良増殖目標」においても，黒毛和種の現在の出荷トラブルが生じやすくなることがあげられる。ま

平均29.5ヵ月齢を26～28ヵ月齢に短縮することをた，脂肪交雑量は十分であっても，経験的に肥育目標としている。去勢牛では肥育開始月齢を早め期間を短縮することにより牛肉の風味が低下する

たり肥育前期の粗タンパク質（CP）含量を高めことが知られており，去勢牛よりも風味が重視さたりするなどの対応により，３ヵ月齢程度の早期れる黒毛和種雌肥育では特に肥育期間の短縮を望出荷が可能であることが報告されている。しかまない枝肉購買者が多い。

し，生産現場では肥育期間短縮への取り組みが広牛肉の風味向上には「炊いた飼料」を給与するがらない。その理由として，子牛市場から肥育素ことが効果的であることが経験的に知られてお牛を導入する場合には肥育開始月齢を早めること

り，枝肉成績も良好であることから市場取引でもが困難であること，肥育開始月齢が変更できない

高い評価を得ている。一方で，なぜそのような効© The Ito Foundation

444

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

果が現れるのかについて，科学的な検証はなされでの肥育前期の状況について報告した。

ていない。我々は飼料を蒸して軟らかい状態に維

今年度は継続調査を実施し，飼料摂取量（牛房持する新たな飼料調製技術を開発した１，２）。本技ごと），体重（21，27カ月齢時）より牛房ごとの術により調製した飼料は消化性が高いうえ，既存

飼料要求率を算出した。血液を18，21，24，27ヵ配合飼料と組み合わせて給与することにより，肥月齢時，糞を18，21，24ヵ月齢時にそれぞれ朝の育牛のルーメンアシドーシスを抑制できる。ま飼料給与６時間後に採取した。血液は一般生化学

た，酒粕を加工して飼料に添加し発酵させる飼料

検査とメタボローム解析，糞はメタボローム解析

調製技術も開発しており ，本技術により調製しと細菌叢解析を行った。メタボローム解析では，た飼料を肥育牛に給与することにより，肥育期間

メタボロミクス前処理ハンドブック４）の方法によ

中の肝機能を良好に維持したり，と畜時の肝臓廃りサンプル調製を行い，島津製作所製GCMS-

棄率を低減したりすることができる。

QP2010plusおよびSmart Metabolites Databaseに

３）

この２つの技術を組み合わせた新たな飼料（以より測定した。メタボローム解析におけるサンプ

下「膨潤酒粕発酵飼料」）を肥育牛に給与するこ

ル定量では，前報で調製したQCサンプルを定期とにより，高い消化性や疾病低減により良好な枝的に分析するとともに，LOWESS平滑化とSpline

肉格付成績が得られるとともに，肥育期間短縮時

によりQC定量値を補間し，その補間値によりサの風味低下を抑制できる可能性が高い。そこで本ンプルの定量値の標準化を行った５）。糞中揮発性

研究では前報に続き，本飼料を既存配合飼料と組脂 肪 酸（VFA）濃 度 は 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ

み合わせて給与することにより，従来の肥育開始

フィー（日本分光 LC-2000システム）により測月齢を維持したまま，枝肉重量と脂肪交雑量に加定した。細菌叢構成の測定では糞から微生物ゲノ

えて牛肉の風味も維持するとともに，肥育期間中

ムDNAを抽出後，リアルタイムPCR法により細の疾病が少なく生産現場で受け入れやすい黒毛和菌16S rRNA遺伝子配列に基づくプライマーセッ

種雌牛の短期肥育技術の確立を目的として給与試

トを用いて総細菌数を求めた。また抽出ゲノム験を実施した。

DNAを用いて次世代シーケンシング（MiSeq）

２．方により網羅的塩基配列情報を取得し，アンプリコ法

ン解析ソフトウェア（QIIME）により細菌叢構

現地農場の協力を得て給与試験を実施した。農場で利用している配合飼料を105℃で40分間蒸煮
し，酒粕溶解液を添加して水分率約45％に調製し成を定量した。
３．結果と考察た 後 ，外 気 の 逆 流 防 止 弁 の あ る ビ ニ ー ル 袋 に

両区とも９頭ずつ配置したが，Ｃ区には採血，20kgずつ包装し，常温で２週間程度発酵させて採糞，体重測定ができない牛が１頭いたため８頭

膨潤酒粕発酵飼料を調製した。農場の慣行体系のの調査となった。発育成績をTable１に示した。

飼料を給与するＣ区，慣行体系で給与する配合飼体重ならびに日増体量は，21ヵ月齢では50％SF料の原物重量50％を膨潤酒粕発酵飼料で代替する

区 536kg，0.77kg／日，Ｃ区 498kg，0.73kg／日，

50％SF区を設定した。約10ヵ月齢の黒毛和種雌27ヵ月齢では50％SF区 633kg，0.54kg／日，Ｃ

子牛を３頭ずつの群飼とし，Ｃ区ならびに50％

区 624kg，0.73kg／日であった。50％SF区におSF区に９頭ずつ配置した。前報では15ヵ月齢まいて21から27ヵ月齢間の日増体量が低下するとと© The Ito Foundation

445

牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技術の開発（Ⅱ）
Table 1 Weight gain and feed conversion ratio
Age

Group

Number（months）
21

body
weight（kg）

Averageweight gain（kg/head）（kg/day）

Dry matterintake（kg）

Feed
conversion ratio

Dairy gain

50%SF

9

536

145

0.77

1559

11.0

C

8

498

139

0.73

1724

12.5

＊

27

50%SF

9

633

97

0.54

1511

15.9

C

6

624

132

0.73

1728

13.2

＊

＊

＊：p<0.05

もに，牛房ごとの飼料要求率は15.9とＣ区13.2にSF区の21から27ヵ月齢間における日増体量の低比べ高くなった。Ｃ区では令和３年８月に肺炎に

下は血中レチノール濃度低下が影響していた可能

よる病畜出荷が１頭（23ヵ月齢），令和３年10月

性 が 高 い 。膨 潤 酒 粕 発 酵 飼 料 は ，配 合 飼 料 をに突然死が１頭（25ヵ月齢）あったため最終的な105℃で40分間蒸煮した後に２週間程度発酵させ

調査牛は６頭となった。

てから給与したが，調製した発酵飼料を給与し終血液性状の推移をTable２に示した。肝機能のえるまでには最大で２ヵ月程度を要するため，発指標となるGGTは50％SF区で低く推移し肝機能

酵期間が長くなった飼料を給与する期間が生じは良好に保たれており，膨潤酒粕発酵飼料中の酒る。飼料中のβカロテンは腸管粘膜でレチノール

粕の効果２，６）によるものと考えられた。黒毛和種に変換されて体内に吸収される。βカロテンは熱牛の肥育では脂肪交雑度を高めるために肥育中後に強い８）が発酵過程で減少する９）ことから，24ヵ期の血中レチノール濃度を低く保つ飼養管理が行

月齢前後の血中レチノール濃度の低下は暑熱期のわれるが，50％SF区では24ヵ月齢ならびに27ヵ

損耗に加えて膨潤酒粕発酵飼料中のβカロテン含

月齢時においてＣ区よりも有意に低くなった。特量の減少が影響したのかもしれない。膨潤酒粕発に24ヵ月齢時では平均12 IU/dLと非常に低く４酵飼料を給与する際には，飼料中βカロテン含量

IU/dLの個体も認めれられた。本農場では21ヵ月

もしくは血中レチノール濃度に十分配慮するとと齢となる令和３年６月より毎月７日間，レチノー

もに，本飼料の給与効果を評価するためにはこのル補給のために肥育前期飼料を１kg／日・頭ず

点に留意した再試験の実施が必要と考えられる。

つ給与したが，50％SF区では令和３年９月のまた，24ヵ月齢時において，50％SF区の血中分24ヵ月齢時において血中レチノール濃度が非常に

岐鎖アミノ酸（バリン，ロイシン，イソロイシン）

低く欠乏状態にあり，暑熱期におけるレチノール

濃度が有意に低下していた。分岐鎖アミノ酸はタの損耗が大きかったのではないかと考えられた。

ンパク質代謝やグルコース代謝を調節する生理機

レチノールを制限している期間には増体量が低下

能を持ち，特にロイシンはタンパク質分解を抑制

しやすく，血中レチノール濃度が30 IU/dl以下にする10）。ヒトでは体内の遊離分岐鎖アミノ酸濃度なるとその症状は顕著となり，30 IU/dl以下とは厳密に制御されており，分岐鎖アミノ酸を摂取なった当該月もしくは翌月には日増体量が0.5kg

すると30分後にピークに達し，その後漸減して２／日を下回る可能性が高くなる ことから，50％

時間後には元のレベルに回復する10）。本研究にお７）© The Ito Foundation

446

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 2 Transition of plasma biochemical components
Age（months）
18
Group1
50%SF C
Number
9
8
GGT
（U/L）
29
49
Urea nitrogen（mg/dL） 11.1 11.9
Albmine（g/dL）
3.5
3.6
Total Protein（g/dL）
6.5
6.2
General（mg/dL） 129
146
biochemi Total choresterolcal
Glucose（mg/dL） 70
70
test
Triglyceride（mg/dL） 21
22
Retinol（IU/dL）
47
47
α-Tocopherol（μg/dL） 308
346
β-Carotene（μg/dL） 14
12
5-Oxoproline-2TMS
0.83 0.92
Alanine-2TMS
0.85 0.97
Glycine-3TMS
0.90 0.93
Isoleucine-2TMS
0.95 1.01
Leucine-2TMS
0.97 1.09
Lysine-4TMS
1.10 1.17
Amino
Methionine-2TMS
1.21 1.15
Acid
Ornithine-4TMS
1.24 1.48
Phenylalanine-2TMS
0.99 1.15
Serine-3TMS
1.11 1.23
Threonine-3TMS
1.00 1.02
Tyrosine-3TMS
1.22 1.16
Valine-2TMS
0.97 1.04
Glucose-5TMS（1）0.86 0.87
Glucose-meto-5TMS（1）0.89 0.96
Suger
Glucose-meto-5TMS（2）1.01 1.16
Mannose-5TMS（2）0.83 1.03
Decanoic acid-TMS
0.69 0.68
Lauric acid-TMS
0.87 0.84
Margaric acid-TMS
0.88 0.93
Metabol
Myristic acid-TMS
0.90 0.98
omic
Fatty
analysis2 Acid
Nonanoic acid-TMS
0.90 0.83
Oleic acid-TMS
0.96 0.73
Palmitic acid-TMS
0.87 0.91
Stearic acid-TMS
0.88 0.96
3-Hydroxybutyric acid-2TMS
0.87 0.80
3-Hydroxypropionic acid-2TMS
1.27 0.98
Benzoic acid-TMS
0.59 0.66
Citric acid-4TMS
1.39 0.94
Creatinine-3TMS
1.83 1.50
Glucono-1,4-lactone-4TMS
0.85 0.90
Hypoxanthine-2TMS
1.05 1.12
Inositol-6TMS（2）0.95 0.99
Other
Lactic acid-2TMS
1.12 1.15
Phosphoric acid-3TMS
0.84 0.98
Pyruvic acid-meto-TMS
0.98 0.96
Succinic acid-2TMS
0.90 0.96
Taurine-3TMS
1.30 1.61
Urea-2TMS
1.06 1.16
Ureidosuccinic acid-3TMS
0.89 0.95
Uric acid-4TMS
1.17 1.33

＊

＊

＊

+

+

+

＊

＊＊

+

50%SF
9
40
13.8
3.7
7.0
128
73
21
44
262
8
0.66
1.07
1.02
0.96
1.02
1.44
1.47
1.59
1.20
1.20
1.07
1.20
0.98
1.20
0.79
0.88
0.79
0.99
0.65
0.87
1.16
1.04
0.64
1.01
0.97
0.85
0.65
0.82
1.33
1.84
0.88
1.09
1.16
1.36
0.72
1.18
1.12
1.71
1.25
0.94
1.18

21

C
8
51
15.0
3.7
7.4
131
73
21
30
283
8
0.65
0.87
0.90
1.02
1.09
1.27
1.28
1.67
1.16
1.14
1.03
1.29
1.02
1.24
0.77
0.90
1.16
1.05
0.67
0.93
1.17
0.98
0.95
1.08
1.03
0.84
0.65
0.99
1.13
1.84
0.93
0.97
1.05
1.31
0.71
0.98
1.18
1.51
1.35
0.98
1.09

＊

+

＊

+

50%SF
9
35
12.9
3.8
7.1
129
71
20
12
232
5
1.03
0.83
0.87
0.73
0.79
0.90
0.87
1.04
1.07
0.96
0.72
0.89
0.76
0.26
1.05
0.97
0.54
0.69
0.52
0.76
0.98
0.56
2.11
0.93
0.87
0.85
0.96
0.58
0.96
1.15
0.96
0.91
1.10
0.95
0.60
1.05
0.91
1.24
1.30
0.91
0.69

Group1：50%SF：50% Steamed fermented feed and 50% Grain mixed feed，C：Grain mixed feed
Metabolomic analysis2：Standardized data by Quality Control sample
Significant difference＊＊：p<0.01，＊：p<0.05，+：p<0.1© The Ito Foundation

24

C
7
42
11.9
3.8
6.9
144
70
26
47
317
7
0.99
0.88
0.91
0.97
1.05
1.26
1.05
1.57
1.18
1.25
0.99
1.06
1.00
0.41
0.72
0.93
0.76
0.77
0.57
0.80
1.05
0.67
1.37
0.97
0.90
0.83
0.78
0.65
1.10
1.23
0.82
0.91
1.11
0.94
0.77
0.91
0.95
1.29
1.23
0.92
1.08

＊
＊

＊
＊＊
＊＊

＊

＊
＊

＊＊
＊
＊

+

＊
＊＊

＊

+

＊

50%SF
9
30
15.3
3.6
7.4
171
69
31
54
607
17
0.98
0.69
0.87
1.03
0.99
1.15
1.04
1.44
1.11
0.98
1.03
1.07
1.00
0.54
0.67
0.92
1.05
0.73
0.54
0.79
1.09
0.65
1.67
0.99
0.92
1.09
0.91
0.64
1.48
1.32
0.93
0.89
1.07
1.31
0.79
0.93
0.99
1.11
1.61
0.94
1.24

27

C
6
42
15.1
3.5
7.7
170
73
27
85
418
12
1.00
0.95
0.92
0.90
1.00
1.15
0.91
1.42
0.99
1.21
0.98
0.94
0.99
0.39
0.66
1.02
0.80
0.69
0.54
0.76
1.02
0.56
0.66
0.97
0.90
0.94
0.86
0.58
1.12
1.22
1.04
0.83
1.14
1.35
0.85
1.11
0.95
1.39
1.57
0.96
0.91

＊

＊
＊
＊

＊＊

+

+
+

＊

＊

＊＊

+

牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技術の開発（Ⅱ）

447

いて血中分岐鎖アミノ酸濃度は50％SF区の24ヵ

動物の消化管でよく検出される菌が多い傾向に

月齢時を除いてはおおむね同等のレベルであった

あった。これは，膨潤酒粕発酵飼料給与によりことから，ヒトと同様に制御されていると考えら

ルーメン細菌叢が変化したことを反映しているのれるが，24ヵ月齢時に低下した原因については不か，それともルーメンをバイパスする栄養素に明である。さらに，24ヵ月齢時には第一制限アミよって生じた下部消化管の環境変化を反映していノ酸でリジンに加え，制限アミノ酸の可能性が報るのか，さらなる調査が必要である。

告11）されているスレオニンやイソロイシンも低下

本研究では，ルーメン内消化速度の速い膨潤酒していた。分岐鎖アミノ酸の低下とあわせて制限

粕発酵飼料を通常の配合飼料と組み合わせて給与

アミノ酸の低下が，21から27ヵ月齢間の日増体量することにより，濃厚飼料を増給してもルーメンが低下に影響したのではないかと推察される。

内環境を維持して増体速度を向上させ，通常の糞の性状をTable３に示した。メタボローム解

３ヵ月間の肥育期間短縮による29ヵ月齢での出荷

析では前報と同じQCサンプルを用いて各成分をを目標とした。しかし，27ヵ月齢時点での体重は定量しており，前報の11，13，15ヵ月齢時に比べＣ区と同等であり，29ヵ月齢での出荷は枝肉重量て18，21，24ヵ月齢時では糞中のアミノ酸，糖，低下による収益性の大幅な悪化を招く可能性が高

核酸関連物質など，脂肪酸を除くほとんどの成分

いため，肥育期間の３ヵ月短縮を断念することとが大幅に増加していた。肥育が進行するに従い，した。一方，膨潤酒粕発酵飼料の給与による牛肉

給与飼料量が増加し飼料要求率は高くなっていたの風味向上やと畜時の内臓廃棄率の低減についてことから，腸管膜で吸収しきれないアミノ酸や糖は効果が期待できることから，通常の肥育期間でなどが糞中に残留したものと考えられた。

出荷する試験牛について継続調査する予定である。

3-Aminopropanoic acid，Thymine，Mannitolな
ど18，21，24ヵ月齢時において50％SF区で有意４．要約に増減した成分がいくつか認められたが，膨潤酒

枝肉重量，BMS No，牛肉の風味を維持した肥粕発酵飼料の消化特性との関連性を明らかにする

育期間の短縮技術を開発するため，黒毛和種雌牛ことはできなかった。メタボローム解析の結果とを用いて，膨潤酒粕発酵飼料（SF：蒸煮した穀同様に，糞中VFA総量についても，前報と比較

物混合飼料に酒粕を添加して発酵させた飼料）のして総量が大きく増加しており，消化吸収されな給与効果について前報に続き継続調査した。慣行

かった成分が大腸内で微生物発酵を受けているこ

体系の飼料を給与したＣ区に比べ，配合飼料のとが推察された。その一方で，対照区と50％SF

50％をSFで代替した50％SF区では，21から27ヵ区の間では，VFA総量，VFA組成ともに有意な

月齢間の日増体量が低下し，27ヵ月齢時点での体増減は認められなかった。

重は両区で差が認められなかった。そのため，肥糞中の細菌叢構成をTable４に示した。対照区

育期間の短縮は困難であると考えられた。50％

ではLachnospiraceae，Ruminococcaceae，

SF区の24ヵ月齢時において，血中レチノール濃Coprostanoligenesのような繊維分解能力の高い，度が欠乏状態まで低下したとともに，タンパク質

ルーメン細菌群集を構成している菌が目立ったの代謝に関与する分岐鎖アミノ酸や制限アミノ酸のに対し，50％ S F 区ではO s c i l l o s p i r a c e a e ，

血中濃度の低下が認められ，このことが日増体量

Erysipelotrichaceae，Rikenellaceaeのような単胃の低下に影響したのではないかと推察された。

© The Ito Foundation

448

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 3 Transition of fecal properties
Age（months）
Group1
NumberVolatile fatty acid

Amino Acid

Pentose

Suger

HexoseDisaccharide
Metabolomic
analysis2

Fatty Acid

Nucleic Acid
Rerated Substance

Other

50%SF
9
Total VFA（mmol/g）
65.1
Acetate（mol%）
55.8
Propionate（mol%）
21.2
Butyrate（mol%）
23.0
3-Aminopropanoic acid-3TMS
2.13
4-Aminobutyric acid-3TMS
2.61
5-Oxoproline-2TMS
2.42
Alanine-2TMS
3.84
Glycine-3TMS
2.77
Isoleucine-2TMS
2.85
Leucine-2TMS
2.70
Lysine-4TMS
2.83
Ornithine-4TMS
3.25
Phenylalanine-2TMS
2.54
Threonine-3TMS
3.11
Valine-2TMS
2.72
Arabinose-meto-4TMS
5.41
Ribose-4TMS（1）2.08
Ribose-meto-4TMS
3.89
Xylose-4TMS（2）2.62
Fructose-meto-5TMS（1）4.27
Fructose-meto-5TMS（2）5.32
Fucose-meto-4TMS（1）4.08
Glucose-5TMS（1）5.11
Glucose-meto-5TMS（1）8.42
Glucose-meto-5TMS（2）3.03
Maltose-meto-8TMS（1）
3.04
Maltose-meto-8TMS（2）4.08
Lauric acid-TMS
0.35
Margaric acid-TMS
0.86
Myristic acid-TMS
1.07
Palmitic acid-TMS
0.98
Stearic acid-TMS
1.01
Hypoxanthine-2TMS
2.98
Inosine-4TMS
1.54
Thymine-2TMS
3.03
Uracil-2TMS
3.18
3-Hydroxybenzoic acid-2TMS
1.90
3-Hydroxypropionic acid-2TMS
1.25
5-Aminovaleric acid-3TMS
0.23
Azelaic acid-2TMS
1.47
Erythrulose-meto-3TMS（1）
1.03
Galacturonic acid-5TMS（1）1.58
Glucuronic acid-meto-5TMS（1）
4.97
Glutaric acid-2TMS
1.89
Glyceric acid-3TMS
2.12
Glycerol-3TMS
3.32
Malic acid-3TMS
0.33
Mannitol-6TMS
4.33
N-Acetylmannosamine-meto-4TMS（1） 5.22
N-Acetylmannosamine-meto-4TMS（2） 6.81
N-Acetylneuraminic acid-6TMS
4.41
Nicotinic acid-TMS
2.14
Pantothenic acid-3TMS
1.57© The Ito Foundation

18

C
7
60.1
57.8
19.7
22.5
1.03
2.88
2.21
4.08
2.96
2.86
2.66
2.40
3.23
2.58
3.04
2.70
3.27
2.10
3.30
1.73
4.12
3.99
4.06
6.37
4.82
2.38
0.64
0.93
0.38
0.91
0.99
1.03
0.99
2.16
0.79
2.28
2.58
2.28
1.19
0.58
1.41
1.04
1.42
3.94
1.55
2.76
2.74
1.89
2.26
5.03
7.38
1.10
1.80
1.75

＊＊

＊

+

＊

＊＊
＊

21
50%SF C98
66.3 70.1
57.8 60.0
17.7 17.1
24.5 23.0
1.95 1.52
5.18 1.25
2.64 3.14
5.69 7.11
3.87 4.96
4.31 4.62
4.01 4.90
3.53 3.72
4.84 4.87
3.53 4.32
4.80 4.79
3.90 4.40
4.80 6.52
3.32 4.30
4.27 5.13
2.45 3.47
4.75 7.23 +5.01 6.22
6.20 5.15
8.34 3.91 +6.33 6.25
2.98 2.91
2.87 1.71
3.82 2.12
0.43 0.47
0.82 0.80
1.04 1.04
0.95 0.94
0.91 0.89
3.34 3.25
2.16 1.11
4.27 3.51
3.90 4.08
2.65 2.43
1.29 1.70
0.31 1.59
2.00 2.06
1.02 1.00
1.67 1.32
5.09 5.79
2.57 2.33
2.00 2.05
4.08 3.95
3.91 4.22
5.21 4.05
6.87 6.35
11.50 10.54
3.61 2.21
2.49 2.15
2.30 2.28

2450%SF C9
7
62.9 72.0
57.5 55.6
18.0 17.7
24.6 26.7
1.56 1.28
3.56 2.39
2.42 2.73
5.57 5.00
3.91 3.10
4.09 2.86 +4.58 2.60 ＊3.60 2.91
4.34 4.40
3.83 2.77
4.28 3.22
3.84 2.74
4.28 7.81 ＊2.45 1.96
4.01 4.22
5.95 5.44
5.44 10.08
4.82 8.91
5.82 6.53
3.84 3.75
10.37 6.71
2.72 4.09 ＊2.94 5.83
6.72 7.96
0.55 0.55
0.84 0.78
1.06 0.99
0.96 0.86
0.91 0.84
2.36 2.45
2.15 2.04
2.91 1.82 ＊3.19 2.69
2.98 3.19
1.39 1.54
0.32 0.33
2.44 2.70
1.03 0.96
1.07 2.38 ＊3.40 6.46 ＊2.74 2.04
1.68 1.93
3.87 3.47
3.40 2.59
6.53 2.43 ＊＊6.13 6.64
10.03 10.23
8.78 7.46
2.51 2.99
2.02 3.10 ＊449

牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技術の開発（Ⅱ）

Metabolomic
analysis2

Phosphoric acid-3TMS
Propionylglycine-TMS
Putrescine-4TMS
Succinic acid-2TMS
Urea-2TMS
Ureidosuccinic acid-3TMS
Xanthine-3TMS

Other

1.07
9.16
2.11
1.10
1.00
1.44
2.62

1.05
7.77
1.60
1.06
0.98
1.06
1.79

1.06
9.40
2.99
1.09
0.88
1.36
2.93

＊

0.94
7.36
2.32
1.17
1.08
1.36
3.27

0.86
5.22
2.47
1.06
1.31
1.35
2.48

0.96
4.56
3.14
1.18
1.03
1.72
2.13

+
+

Group1： 50%SF：50% Steamed fermented feed and 50% Grain mixed feed，C：Grain mixed feed
Metabolomic analysis2： Standardized data by Quality Control sample
Significant difference＊＊：p<0.01，＊：p<0.05，+：p<0.1

Table 4 Fecal bacterial flora composition
Age（months）

18

21

24

Group

50%SF

C

50%SF

C

50%SF

C

Firmicutes

0.450

0.480

0.493

0.560

0.497

0.523

_Clostridia;o__Oscillospirales;f__Oscillospiraceae

0.116

0.103

0.126

0.118

0.118

0.083

_Clostridia;o__Lachnospirales;f__Lachnospiraceae

0.076

0.088

0.090

0.120

0.099

0.168

_Clostridia;o__Oscillospirales;f__Ruminococcaceae

0.049

0.055

0.037

0.036

0.029

0.043

_Clostridia;o__Oscillospirales;f__[Eubacterium]_coprostanoligenes

0.026

0.039

0.027

0.042

0.018

0.026

_Clostridia;o__Oscillospirales;f__UCG-010

0.029

0.032

0.022

0.020

0.025

0.017

_Clostridia;o__Peptostreptococcales-Tissierellales

0.010

0.014

0.024

0.023

0.026

0.033

_Bacilli;o__RF39;f__RF39

0.019

0.018

0.023

0.029

0.022

0.018

_Clostridia;o__Clostridiales;f__Clostridiaceae

0.016

0.015

0.020

0.029

0.025

0.020

_Bacilli;o__Erysipelotrichales;f__Erysipelotrichaceae

0.015

0.016

0.021

0.024

0.031

0.018

_Clostridia;o__Clostridia_UCG-014;f__Clostridia_UCG-014

0.016

0.020

0.020

0.026

0.017

0.019

_Clostridia;o__Monoglobales;f__Monoglobaceae

0.015

0.016

0.024

0.027

0.020

0.017

_Clostridia;o__Christensenellales;f__Christensenellaceae

0.009

0.010

0.012

0.016

0.015

0.011

_Negativicutes;o__Acidaminococcales;f__Acidaminococcaceae

0.015

0.014

0.008

0.006

0.009

0.012

_Clostridia;o__Oscillospirales;__

0.010

0.012

0.009

0.008

0.005

0.008

Bacteroidota

0.429

0.421

0.416

0.389

0.401

0.415

_Bacteroidales;f__Prevotellaceae

0.106

0.143

0.191

0.194

0.154

0.214

_Bacteroidales;f__Rikenellaceae

0.137

0.108

0.088

0.073

0.086

0.073

_Bacteroidales;f__Muribaculaceae

0.063

0.065

0.069

0.072

0.080

0.046

_Bacteroidales;f__Bacteroidaceae

0.053

0.050

0.024

0.020

0.041

0.039

_Bacteroidales;f__Bacteroidales_RF16_group

0.043

0.031

0.026

0.009

0.012

0.021

_Bacteroidales;f__Tannerellaceae

0.013

0.016

0.009

0.011

0.009

0.010

Spirochaetota

0.092

0.055

0.073

0.027

0.062

0.044

Proteobacteria

0.018

0.037

0.012

0.016

0.025

0.010

Verrucomicrobiota

0.007

0.001

0.003

0.002

0.010

0.001

Fibrobacterota

0.001

0.001

0.001

0.002

0.001

0.002

Elusimicrobiota

0.001

0.002

0.000

0.002

0.001

0.003

Actinobacteriota

0.001

0.002

0.001

0.001

0.000

0.002

Cyanobacteria

0.001

0.000

0.001

0.001

0.002

0.001

Fusobacteriota

0.000

0.000

0.000

0.000

0.001

0.000

Campilobacterota

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

Unidentified

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

Patescibacteria

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

Planctomycetota

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

Desulfobacterota

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

© The Ito Foundation

450

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

文献１） 庄司則章，野川勝弘：穀物発酵飼料の製造方法，
および，それによる穀物発酵飼料，特許第5391506号，
2013.
２） 庄司則章，野川勝弘：膨潤化穀物発酵飼料の製造方法，および，それによる膨潤化玄米発酵飼料，特許第5887673号，2016.
３） 庄司則章，野川勝弘：酒粕添加発酵飼料の製造方法，特許第6547959号，2019.
４） 島津製作所，https://www.an.shimadzu.co.jp/sites/an.shimadzu.co.jp/files/ckeditor/apl/lifescience/
metabolomics/c146-2181a.pdf５） ESI友の会編：メタボロームデータの標準化方法，
https://sites.google.com/site/esitomonokai/jie-xibu-wu/metaboromudetano-biao-zhun-hua-fangfa/2-lowesstosplineno-li-lun

６） 藤井力，伊豆英恵，松原主典：発酵食品「酒粕」
による老化抑制および脳機能活性化の検討，生物工学，97（10），595～598，2019.
７）
 社団法人畜産技術協会編：ビタミンＡのコント
ロールを用いた効率的肥育技術Q&A Vol. 2，2005.
８） 上原剛，市田雪子，岩井健：過熱蒸気を用いた野菜蒸煮処理，宮崎県工業技術センター・宮崎県食品
開発センター研究報告，46，139～141，2001.
９） 小林亮英，山崎昭夫，三上昇，鳶野保：アルファルファとオーチャードグラスのβ-カロテン含量に及ぼす貯蔵方法の影響，日畜会報，57（11），881～
886，1986.
10） 下村吉治：分岐鎖アミノ酸代謝の調節機構，日本
栄養・食糧学会誌，65（3），97～103，2012.
11） 肉用牛研究会編：肉用牛の科学，92～100，2015.

© The Ito Foundation

451

畜産汚水処理施設の低コスト水質監視システムの開発
Development of low-cost water quality monitoring system for livestock
wastewater treatment facility

富谷

信一１・影山智明２，３・三浦政司３・宮崎隆４・堀尾靖史４（１鳥取県中小家畜試験場，２合同会社TURIPテクノロジズ，３鳥取大学学術研究院，４株式会社アクシス）

Shinichi Tomitani１, Tomoaki Kageyama２，３, Masashi Miura３, Takashi Miyazaki４ and Yasushi Horio４（１Tottori Swine&Poultry Experiment Station, ２GK TURIP technologies, ３Tottori University Academic Research Institute,
４Axis CORPORATION）

By using commercially available water quality measurement sensors, communication
modules, etc., it was possible to manufacture a water quality remote monitoring device at low
cost. In addition, even 10 months after the installation, there were no problems such as
breakdowns, and there was no problem in acquiring water quality measurement data.
When the correlation between the ORP and the BOD concentration of the treated water
was examined, the BOD concentration tended to decrease as the ORP increased, but thecorrelation was low. In addition, since the measurement may not be performed correctly due tothe influence of the biofilm adhering to the surface of the ORP sensor, it is necessary toconsider the suppression of the adhesion of the biofilm for the estimation of the BOD
concentration by the ORP. On the other hand, the ammonia nitrogen concentration of thetreated water was highly correlated with EC, suggesting that EC can be used for remotemonitoring in real time as an alternative index for estimating the ammonia nitrogenconcentration of the treated water.
In addition, EC was found to have a high correlation with the ammoniacal nitrogenconcentration in raw water, and it was thought that EC could be used as a guideline forgrasping the BOD concentration to some extent.
In this test, no clear correlation was obtained for the estimation of nitrate nitrogen andnitrite nitrogen concentrations, so it was not possible to create an alternative index that canestimate nitrate nitrogen and the like. In addition, although useful data could not be obtained
for the estimation of the BOD concentration of the treated water this time, the results that canbe expected to estimate the BOD concentration by the transparency were obtained, so we willconsider creating an alternative index of the transparency in the future. However, we would
like to verify whether the BOD concentration can be estimated.

１．目

る排水基準値が適用されており，この基準に適合的しなければ公共水域へ放流できない。平成13年に畜産施設から出る汚水は水質汚濁防止法に定め「硝酸性窒素等」の一般排水基準が100mg/Lに設© The Ito Foundation

452

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

定されたが，畜産施設から出る汚水の窒素濃度は

バーおよび端末で構成される水質遠隔監視システ

きわめて高く，畜産農家等についてはただちに一ムを製作し２），このシステムによって取得した測般排水基準を達成することが困難であることか

定データを基に実際の水質（窒素濃度，BOD濃ら，500mg/Lの暫定基準値が設定されている。

度）を推定できるか検証する。これにより水温等

近 い 将 来 ，畜 産 業 に お い て も 一 般 基 準 で あ るの環境変化や汚水処理施設への流入汚水濃度等の100mg/Lが適用される可能性がある一方 ，畜産変化による水質悪化の危険予測にも対応可能で，施設の汚水処理施設から出る処理水の硝酸性窒素

機能・コストともに実用性の高いシステムの構築

等の濃度は季節変動が大きく，常に100mg/L以を目指すことを目的としている。

１）

下を維持するのは困難なのが実態である。
常に一般基準値100mg/L以下を維持するには，

２．方法

より規模の大きい汚水処理施設の新設が考えられ

2.1

水質遠隔監視システム試作機の設置るが，多くの農家にとって汚水処理施設への新規

市販の水質測定用センサーと通信モジュールお

投資は経済負担が大きいため，新たな投資を伴わよび液晶モニターで構成される試作機をインターず既存の汚水処理施設の浄化機能を最大限発揮さ

ネット回線（無線）に接続し，測定データをサーせ，常に安定した水質を維持できる方法が求めらバーに蓄積させてwebブラウザーでパソコンまたれている。

はスマートフォンから測定値を閲覧できるよう設そのためには，汚水処理施設の浄化処理状況を定した。試作機は鳥取県中小家畜試験場汚水処理

常に把握して水質悪化等のトラブルに対し迅速に

施 設 最 終 処 理 槽 横 に 設 置 し（Fig. １），通 信 モ

対応することが重要であることから，リアルタイ

ジュールおよび液晶モニターからなる測定・通信

ムで水質を遠隔監視でき，かつ低コストなシステ

装置に，汚水処理施設の最終処理槽および原水槽

ムの開発を試みる。

に設置した水質測定用センサーを接続して水質測

具体的には，市販の水質測定用センサーをベースとした低コストなハードウェアとクラウドサー

定データを取得した（Fig.１）。
また，水質測定項目は，最終処理槽では水温・Fig. 1 Water quality remote monitoring system prototype

and data browsing© The Ito Foundation

453

畜産汚水処理施設の低コスト水質監視システムの開発

pH・酸化還元電位（ORP）・電気伝導率（EC）・
色度とし，原水槽については水温・pH・ORP・

３．結果と考察ECとした。

3.1

水質遠隔監視システム試作機の設置※鳥取県中小家畜試験場汚水処理施設の概要

処理水の測定は初夏から冬期にかけて，原水の測定は冬期に実施した。その結果をTable１に示す。

処理方式：回分式活性汚泥法

処理水における測定期間を通しての平均値は水＜諸元＞
処理対象汚水量：15ｍ３／日

温 22.2 ℃（n ： 85），pH 値 7.12（n ： 85），ORP-

処理前BOD濃度：3,334mg/L

263.0mV（n：85），EC873μS（n：36），色度は処理前SS濃度：5,334mg/L

Red値38.8（n：25），Blue値28.4（n：25），Green

処理後BOD濃度：60mg/L

値18.6（n：25）であった。なお色度比は，Ｒ・処理後SS濃度：90mg/L

Ｂ・Ｇの色度値合計に対する各色度値の割合を示

最終処理槽（処理水）の水質推定したもので，Ｒ値の割合が最も高くなった。処理最終処理槽の処理水を２～３日に１回の頻度で水に浸漬させたセンサーは２か月程度経過するとサンプリングして水質分析を行い，試作機の測定

表面に汚泥などのいわゆるバイオフィルムの付着データと水質分析値との相関分析を行った。水質が見られるようになったため，定期的に水洗浄を

分析項目は，BOD・SS・透視度・アンモニア性実施した。水温およびpHの測定値についてはバ

窒素・硝酸性窒素・亜硝酸性窒素とし，BODはイオフィルム付着による影響は見られなかった

BODセンサーによる５日間培養，SSはガラス濾

が，ORPは水洗浄後に測定値が急上昇する傾向

紙法，透視度は透視度計による測定，アンモニアが見られたことから，バイオフィルムはORP測性窒素，硝酸性窒素，亜硝酸性窒素はイオンクロ定に影響することが考えられた。一方，原水の平マトグラフ法により行った。

均値は水温9.1℃（n：46），pH値8.68（n：46），

2.2

2.3

ORP-412.8mV（n：45），EC3,285μS（n：46）で原水槽（原水）の水質推定

曝気槽流入前の原水は水質の日変動が大きいこあったが，原水の測定は冬期に実施したため，処とから１日に３～４回の頻度でサンプリングして理水の水温よりかなり低い状態となった。また，

水質分析を行い，処理水と同様の方法で相関分析

ECの標準偏差は処理水と比較して大きい結果とを行った。水質分析項目はBOD・pH・アンモニなった。これは，原水槽に流入する畜舎排水の濃ア性窒素・硝酸性窒素・亜硝酸性窒素とした。

度変動が大きいことが要因と考えられた。

Table 1 Average value of measurement data（±standard deviation）

treated water

raw water

temperature
（℃）

pH

ORP
（mV）

EC
（μS）

22.2

7.12

－263.0873

chromaticity（value）
R value

B value

G value

R ratio

G ratio

B ratio

38.8

28.4

18.6

45.2%

33.1%

21.7%

（±4.6）（±0.4） （±207.8） （±265） （±53.5）（±41.7）（±27.3）（n : 85）（n : 85）（n : 85）8.68－412.89.1（±9.4） （±2.5） （±7.5）（n : 36） （n : 25） （n : 25） （n : 25）3,285（±0.8）（±0.3） （±138.3） （±1,436）（n : 46）（n : 46）（n : 45）

chromaticity（ratio）－（n : 46）© The Ito Foundation

－

－

－

－

－

454
3.2

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

最終処理槽（処理水）の水質推定

般排水基準値に定められている「硝酸性窒素等」

ORPは汚水の生物学的処理において重要な要をモニタリングするためにはアンモニア性窒素濃因の一つとされていることから，水質評価の指標度に加え，硝酸性窒素濃度および亜硝酸性窒素濃となるBOD濃度との相関について検証した。そ度も把握する必要があるため，これらの推定方法の結果，処理水のORPが上昇するに従いBOD濃については今後も引き続き検討する必要がある。

度は減少していく傾向が見られたものの，相関係

3.3

数は0.1730と低い結果となった（Fig.２左）。また，曝気槽流入前の原水は，処理水の水質に大きく

ORPセンサー表面に付着したバイオフィルムの影響するため，原水の水質をモニタリングするこ影響により正しく計測されないことがあったたとによって曝気時間の調整や処理水悪化などの危め，今後はこのバイオフィルムの付着抑制につい

険予測に役立つことが期待できる。そこで，原水て検討する必要がある。また，本試験でBOD濃の窒素やBOD濃度との相関について検証した。

度は透視度による推定が期待できる結果が得られその結果，原水のアンモニア性窒素濃度とECとたので，今後は透視度の代替指標の作出についての相関係数は0.9908と高い相関が認められ（Fig.

も検討し，BOD濃度の推定が可能かどうか検証

３左），処理水と同様にECはアンモニア性窒素濃を行うこととしたい。一方，ECとアンモニア性度推定の代替指標としてリアルタイムで遠隔監視

窒素濃度との関係について検証したところ，相関に活用できるのではないかと考えられた。また，係数は0.9930となり，両者には高い相関が認めら原水のBOD濃度についてもECが上昇するに従いれた（Fig.２右）。このことから，アンモニア性高くなる傾向が見られ，相関係数は0.9177であっ

窒素についてはECにより高い精度で推定可能でた（Fig.３右）。これは曝気槽流入前であるためあることが示唆され，ECはアンモニア性窒素濃生物学的処理の影響を受けておらず，BODを指度推定の代替指標としてリアルタイムで遠隔監視標とする汚濁物質濃度とアンモニア性窒素とは関に活用できるのではないかと考えられた。なお，

連しているためではないかと推察される。

原水槽（原水）の水質推定

硝酸性窒素濃度および亜硝酸性窒素濃度に対する今回の結果から，ECの測定により原水のアン

相関係数はすべて低く，有用なデータは得られなモニア性窒素濃度の推定およびBOD濃度の把握

かった（Table２）。しかし，水質汚濁防止法の一が可能であることが示唆された。これにより窒素

100
90

250
200
150

r=0.1730

100
50
0－600 －500 －400 －300 －200 －100

ORP（mV）

0

100 200 300

Ammoniacal nitrogenconcentration（mg/L）

BOD concentration（mg/L）

300

80

r=0.9930

70
60
50
40
30
20
10

0
500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400

EC（μS）

Fig. 2 Correlation in treated water（left：Relationship between BOD and ORP, right：Relationship between

ammoniacal nitrogen and EC）© The Ito Foundation

455

畜産汚水処理施設の低コスト水質監視システムの開発
Table 2 Correlation coefficient between measured data and water quality analysis value
BOD

SS

transparency

ammonical
nitrogennitric acid +nitrite nitrogentemperature

0.0883－0.0298

0.1638－0.0136－0.1264

treated waterpH－0.05900.04220.2780－0.2530－0.0657

ORP

0.1730－0.5761－0.1424－0.06200.1757EC

0.50800.1409－0.5668

0.99300.11430.25490.0591－0.6486

0.3558－0.1832

chromaticity

R ratio
G ratio－0.1775－0.0077

0.4256－0.3462－0.0100

B ratio－0.2645－0.07200.6782－0.33250.2336－0.0833－－

0.11980.1554raw water
temperaturepH

0.0908－－0.23810.0720ORP－0.3898－－－0.4973

0.3404EC

0.9177－－0.9908－0.4460

5000

Ammoniacal nitrogenconcentration（mg/L）

900
800
700

r=0.990

600
500

400
300
200
100
0

0

1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

EC（μS）

BOD concentration（mg/L）

1,000

r=0.9177

4000
3000
2000
1000
0

0

1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

EC（μS）

Fig. 3 Correlation in Raw water（left：Relationship between ammoniacal nitrogen and EC, right：

Relationship between BOD and EC）

除去に対応した適切な曝気調整や処理水質悪化の

水質測定データの取得に支障をきたすことはな

危険予測と迅速対応への活用が可能ではないかとかった。
ばっ気槽のORPと処理水のBODとの間には関考えられた。
４．要係があることが分かっているが３），本研究におい

約て処理水のORPとBOD濃度との相関を検証した

市販品の水質測定用センサーおよび通信モ

ところ，ORPの上昇に伴いBOD濃度が減少してジュール等を使用することにより，低コストで水いく傾向が見られたものの相関は低い結果となっ

質遠隔監視装置を製作することができた。また，

た。また，ORPセンサー表面に付着したバイオ

設置後10か月経過しても故障等の不具合はなく，フィルムの影響により正しく計測されないことが© The Ito Foundation

456

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）あったため，ORPによるBOD濃度の推定につい濃度の推定についても今回有用なデータは得られてはバイオフィルムの付着抑制について検討するなかったが，BOD濃度は透視度による推定が期必要がある。一方，処理水のアンモニア性窒素濃待できる結果が得られたので，今後は透視度の代度についてはECと高い相関が認められ，ECは処替指標の作出について検討し，BOD濃度の推定

理水のアンモニア性窒素濃度推定の代替指標としが可能かどうか検証を行うこととしたい。

てリアルタイムで遠隔監視に活用できることが示唆された。
また，原水についてもECはアンモニア性窒素
濃度と高い相関が認められ，さらに，ECはBOD
濃度に対してもある程度把握できる目安とすることが可能であると思われた。
今回の試験では硝酸性窒素および亜硝酸性窒素
濃度の推定については明確な相関は得られなかったため，硝酸性窒素等を推定できる代替指標の作出までには至らなかった。また，処理水のBOD

文献１）
 横山浩，山下恭広：BOD監視システムを利用した
新しい養豚廃水処理，養豚の友４月号，20～24，
2020．
２）
 Kageyama, T., Miura, M., Maeda, A., Mori., A.,
Lee, S.：A Wireless Sensor Network Platform For
Water Quality Monitoring, 2018 13TH ANNUALIEEE INTERNATIONAL CONFERENCE ON
NANO/MICRO ENGINEERED AND
MOLECULAR SYSTEMS., 553-556, 2018.
３）
 藤井正博，近藤三雄：都市下水活性汚泥処理の酸化還元電位の研究，日本水処理技術研究会，水処理技術，23（7），617～625，1982．

© The Ito Foundation

457

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用
交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響（Ⅱ）
Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed fermented
loquat leaf tea on development and meat quality of Tushima-Jidori
crossbred chicken for meat（Ⅱ）

松永

将伍１・深川聡１・井尻

大地２（１長崎県農林技術開発センター，２鹿児島大学農学部）

Shogo Matsunaga１, Satoru Fukagawa１ and Daichi Ijiri２（１Nagasaki Agricultural and Forestry Technical Development Center, ２Department of Agricultural
Sciences and Natural Resources, Kagoshima University）

The residue from the manufacturing process of fermented tea containing loquat leaves isa high-capacity scavenger of reactive oxygen species. For this study, the residue was given as
an antioxidant to meat-type Tsushima-jidori crossbred chickens in a hot environment with theaim of producing jidori-chicken meat stably in the hot environment. The residue effects on
growth, meat quality, and stress indices were investigated．
Body weight at the end of treatment and body weight gain decreased by the treatment
with the residue from the manufacturing process of fermented tea containing loquat leaves
compared to untreated animals, although the treatment did not affect yield. Lipid peroxidationin the plasma was decreased by the treatment. The ratio of the thymus, which is an organ
involved in immunity, to the live body weight tended to be higher. Moreover, the expression of
IFN-β in cytokine mRNAs in the spleen tended to be suppressed in treated animals. These
results indicate the possibility that the residue can improve stress in the hot environment．

１．目

化物質等の給与による鶏体内の抗酸化能を上げる

的研究が広く行われている。

鶏は汗腺を持たず，体温が高いため他の家畜に

令和２年度の本財団研究助成により，長崎県で比べて暑熱ストレスの感受性が高い。暑熱環境下排出され抗酸化活性が高いビワ葉混合発酵茶製造

では各組織で活性酸素が増加し，その結果，発育加工残査を1.0％添加した飼料を，適温環境下の成績の低下や鶏肉中の脂質酸化分解の増加，ド対馬地鶏肉用交雑鶏の仕上げ期４週間に給与する

リップロスの増加等の肉質の低下を引き起こすだと，ビワ葉混合発酵茶製造加工残査を添加していけでなく，最悪の場合，熱射病による事故を引きない飼料を給与した場合と比べて，飼料摂取量お起こし，生産者の経営に大きな打撃を与える。こ

よび増体量などの発育成績や正肉重量および組織のため，比較的安価に取り組むことができる抗酸重量などの解体成績に影響を及ぼさず，ムネ肉中© The Ito Foundation

458

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）の鮮度指標であるＫ値の上昇を抑制し，保水性に績（試験開始時体重，試験終了時体重，増体量，関わるドリップロスを低減でき，肉質の改善効果

飼料摂取量，飼料要求率）を調査した。解体調査が期待できることを示した１）。

は12週齢の体重が部屋ごとに平均値に比較的近い

そこで本研究では，暑熱環境下においても安定２羽をそれぞれ選び，18時間絶食させた後，と体した地鶏肉生産を目指し，まず，抗酸化資材としを解体して，正肉重量（ムネ，モモ，ササミ），て活性酸素除去能が高いビワ葉混合発酵茶製造加

組織重量（心臓，肝臓，筋胃，および腹腔内脂肪工残渣を暑熱環境下の対馬地鶏肉用交雑鶏に給与量）および色差計を用いてムネ筋の肉色を測定しし，発育や肉質への効果を解明する。あわせて，た。左ムネ肉重量を測定後（皮付き），真空パッ

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣およびピリミジン

クしてから５℃の冷蔵庫で24時間静置した後に左塩基の前駆体であるオロト酸を併用した組み合わ

ムネ肉重量を測定し，ドリップロスを算出した。

せによる地鶏の暑熱ストレス低減の可能性を調査

ドリップロスの測定後，４cm×２cm×1.5cmをした。

２片切り出して70℃のウォーターバスに１時間浸

２．方
2.1

漬させ，加熱損失率を測定した。残った部位はプ法

ロセッサーを用いてミンチ状にし，遊離アミノ酸
組成，イノシン酸含量を分析した。加熱損失率お

供試動物および実験計画

動物実験は「実験動物の飼養及び保管並びに苦よびイノシン酸含量は食肉の理化学分析および官痛の 軽 減 に 関 す る 基 準」（環境省2006）に則り

２）
能評価マニュアル（Ⅰ理化学分析）
，遊離アミ

行った。

ノ酸組成はAzuma et al. ３）に各々準じて分析を

2021年７月28日餌付けの対馬地鶏肉用交雑鶏の行った。

雄74羽を用い，餌付けから27日齢まではバタリー

2.3

ブルーダーで育成し，28日齢以降から試験終了ま

絶食処理前の個体の翼下静脈から採血し，遠心では長崎県農林技術開発センター内の開放鶏舎で分離（22,000×ｇ，５分間）を行った後，血漿を平飼いとした。試験期間は2021年９月29日～10月

遊離アミノ酸およびTBARSの分析に供した。遊26日（９週齢から12週齢）までの４週間とし，ビ

離 ア ミ ノ 酸 組 成 は Azuma et al. ３），TBARS は

ワ葉混合発酵茶製造加工残査を配合飼料（CPYagi et al.４）に各々準じて分析を行った。

16.5％，ME 2,990 kcal）に１％を給与するビワ葉
混合発酵茶区（ビワ茶区），ビワ葉混合発酵茶製

血漿中の遊離アミノ酸およびTBARS

2 . 4 免疫関連組織の生体重量比および脾臓中のサイトカインmRNA発現量

造加工残渣１％に加え，さらにオロト酸を0.7％解体後のと体から胸腺およびファブリキウス

添加した区（ビワ茶＋オロト酸区）および配合飼（Ｆ）嚢を採材してからそれぞれ重量を測定し，料のみを給与する区（対照区）との３区を設け，

生体重（解体直前時）との比率を算出した。次１区７羽の各区４反復とした。なお，鶏舎内は保に，脾臓を５mm以下の厚さに切開し，各サンプ

温ビニールシートで覆い，いずれの区においてもル に つ い て ４ 片 ず つ RNAlater （Ambion,

各部屋にコルツヒーターを設置し，24時間の暑熱

Waltham, MA, USA）を入れたチューブに入れ，感化を行った。

分析まで－20℃で保存した。分析項目は脾臓細胞

2.2

発育成績，解体成績および肉質分析

中 の サ イ ト カ イ ン 遺 伝 子（IFN- β 遺 伝 子）の試験期間中（９週齢～12週齢）における発育成

mRNA発現強度とした。なお，mRNA発現強度© The Ito Foundation

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響（Ⅱ）

は内部標準物質を18s ribosomal RNAとし，ElDeep et al.５）に準じて分析を行った。
2.5

統計処理

459

３．結果と考察3 . 1 発育成績，解体成績および肉質成績（加発育成績，解体成績，肉質分析およびストレス

熱損失率およびドリップロス）

指標の調査項目は平均値±標準誤差で示し，一元

発育成績，解体成績および肉質成績をTable１

配置分散分析を実施後，有意差が認められたものに示した。試験終了時体重および増体量はビワ茶

はTukeyの多重比較検定を実施した。

区およびビワ茶＋オロト酸区で対照区よりも有意に低下した。先行研究では，ウインドレス鶏舎で適温下に制御された対馬地鶏肉用交雑鶏にビワ茶

Table 1 Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed fermented loquat leat tea on

growth performance parameters, weight and meat quality of Tsushima-Jidori crossbred
chickens under high ambient temperatures.
Control

Biwa tea

Biwa tea+ Orotic acid

Initial body weight（g）

1961.43±89.10

1962.50 ±101.65

1962.50±110.44

Final body weight（g）

3282.68±155.88a

3158.93±163.02b

3163.04±180.33b

Body weight gain（g）

1321.25±107.57a

1196.43 ±114.79b

1200.54±147.41b

Feed intake（g/d）

148.61±11.78

131.68 ±18.91

128.04±7.89

Feed conversion ratio

3.04±0.16

2.96

±0.24

2.88±0.18

Body temperature（℃）

41.68±0.46

41.71

±0.38

41.47±0.41

Breast muscle（g）

406.83±8.47a

395.31 ±9.37ab

377.82±5.74b

Breast tender muscle（g）

102.90±3.43102.29 ±2.53

97.91±1.59

Leg muscle（g）

717.42±13.95a

Liver（g）

40.79±1.89

Measuements
Growth performance parameters

Weight of tissue（g）

699.47±10.96a655.19±11.19b

38.66

±1.08

40.29±1.17Heart（g）

15.22±0.55

14.69

±0.38

14.76±0.70

Muscular stomach（g）

33.50±1.67

35.65

±1.36

37.22±1.24

Abdiminal fat tissue（g）

83.34±11.88

67.09

±7.32

75.21±6.08

L＊50.19±0.30

48.55

±1.38

51.63±1.12a＊0.15±0.09

0.39

±0.35

0.04±0.39b＊11.62±0.74

12.12

±1.05

12.35±0.83

Cooking loss（%）

18.99±0.17

18.77

±0.34

19.15±0.30

Drip loss（%）

1.75±0.31

1.59

±0.22

2.10±0.11

Meat quality
Color of breast muscles

1）Value with small letters（a, b）within the same row differ significantly at the 5% levels.
2）Means±SE.

© The Ito Foundation

460

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

を１％給与しても発育成績および解体成績に悪影

ワ葉混合発酵茶製造加工残渣給与による飼料摂取

響がないことを報告している 。本研究では有意量の低下がアミノ酸の代謝に影響したことが考え差はないものの，飼料摂取量がビワ茶区およびビられる。また，イノシン酸は試験区間で有意な差

ワ茶＋オロト酸区が対照区よりも低い値を示したは見られなかった。

１）

ことが鶏の増体の低下に影響したと考えられる。

3.3

血漿中の遊離アミノ酸

次に，正肉重量は対照区およびビワ茶区では有血漿中の遊離アミノ酸組成をTable３に示した。

意差は認められず，ビワ茶＋オロト酸区ではムネ

対照区およびビワ茶区では有意差は見られなかっ

肉重量が対照区よりも小さく，モモ肉重量が対照

たが，ビワ茶＋オロト酸区では他の試験区よりも区およびビワ茶区よりも小さくなった。内臓重チロシンが低く，シスチンおよびタウリンが有意量，腹腔内脂肪含量，肉色，加熱損失率およびドに多かった。Simamoto et al.６）はブロイラーにオリップロスには試験区間で有意差が認められな

ロト酸を給与することで，無添加よりも血漿中のかった。Shimamoto et al.

は暑熱環境下のブロ

アスパラギン酸およびグルタミン酸含量を増加さイラーにオロト酸を0.7％添加して給与しても，せ，チロシン濃度が低くなることを報告してお

発育成績および解体成績に悪影響がないことを報り，本研究でもチロシンにおいては同様の結果が告しているが，本研究ではビワ葉混合発酵茶およ得られた。しかし，アスパラギン酸およびグルタ

びオロト酸の併用給与によって発育成績および解

ミン酸含量は本研究で増加しなかったことから，

体成績の低下が見られた。このことから，対馬地

オロト酸のみの給与と比べて，ビワ葉混合発酵茶

鶏肉用交雑鶏においてビワ葉混合発酵茶製造加工

製造加工残渣との併用給与により代謝物やアミノ

残渣およびオロト酸を給与する際のそれぞれの添

酸含量の変化があったと推測される。

６）

加割合について，再度検討すべき事項と考えられた。

3 . 4 免疫関連組織の生体重量比，血漿中脂質
過酸化度（TABRS）および脾臓中のサイ3 . 2 肉質成績（遊離アミノ酸およびイノシン

トカインmRNA発現量
免疫関連組織であるＦ嚢および胸腺の生体重比

酸）
ムネ肉中の遊離アミノ酸含量をTable２に示しをTable４に示した。Ｆ嚢の生体重比は試験区間た。21種類の遊離アミノ酸が検出され，うち18種で有意差がなかったが，胸腺の生体重比ではビワ類の遊離アミノ酸含量はビワ茶区およびビワ茶＋茶区が対照区よりも増加する傾向が見られた。岩

オロト酸区が対照区よりも有意に低下した。鶏の澤ら７）は緑茶抽出物を駿河若シャモに給与するこ

必須アミノ酸であるアルギニン，ヒスチジン，イとで鶏のストレスを抑制し，免疫増強効果がある

ソロイシン，ロイシン，リジン，メチオニン，フェことを報告しており，立川ら８）は肉用奥美濃古地

ニルアラニン，トレオニン，バリンの低下が見ら鶏において，緑茶抽出物と同様に免疫増強効果がれたムネ肉中の遊離アミノ酸について，暑熱環境あるサトウキビ抽出物を給与すると，胸腺の生体

下 の ブ ロ イ ラ ー に オ ロ ト 酸 を 0.7 ％ 給 与 し た

重比を無添加よりも高める傾向があるとしてい

Shimamoto et al.

の実験では影響が認められなる。このことから，ビワ葉混合発酵茶においてもかったが，先行研究ではビワ葉混合発酵茶製造加

免疫増強効果があることから，胸腺の生体重比を工残渣の給与によるヒスチジン，アルギニンおよ

高めたと考えられる。

６）

びアラニンが低下する傾向が見られており ，ビ１）

血漿中の脂質過酸化度（TBARS）および脾臓

© The Ito Foundation

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響（Ⅱ）

461

Table 2 Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed fermented loquat leaf tea on

free amino acids and nucleic acid - related substances in the breast muscle of Tsushima Jidori crossbred chickens under high ambient temperatures.
Control

Biwa tea

Biwa tea+ Orotic acid

Aspartic Acid

37.84±9.55a

14.89±2.56b

13.79±1.49b

Glutamic Acid

129.17±32.42a

57.61±8.83b

59.48±6.11b

Asparagine

8.64±2.38a

3.24±0.58b

3.51±0.63b

Serine56.89±14.14a

26.9±4.47b

26.37±2.95b

Glutamine

52.19±11.64a

21.76±3.57b

21.3±2.90b

Histidine

14.43±3.36a

5.42±1.00b

4.96±0.63b

Glycine25.17±5.38a

13.14±2.12b

12.18±1.16b

Threonine

41.82±10.40a

18.03±3.00b

18.31±1.92b

Arginine

32.32±7.17a13.94±2.33b

14.15±1.90b

Tyrosine

26.52±5.81a

11.71±2.29b

11.24±0.98b

Valine38.19±8.60a

16.28±2.71b

16.35±1.65b

Methionine

31.99±6.61a

13.69±2.43b

13.6±1.28b

Norvaline

96.97±18.46a

48.09±8.64b

51.71±4.52b

Cystine281.59±58.29a

144.17±26.83b

149.6±20.11b

Tryptophane

1.15±0.3

0.52±0.15

0.51±0.14

Phenylalanine

21.42±5.32a

8.48±1.37b

8.75±1.15b

Isoleucine

26.88±5.63a

11.48±1.78b

11.55±1.26b

Leucine52.67±11.01a

22.67±3.56b

23.14±2.12b

Lysine28.42±7.40a

11.76±2.10b

11.4±2.14b

Proline3.84±0.84

2.26±0.49

2.28±0.36

Beta-Alanine

1.10±0.20b

2.07±0.21a

1.79±0.22b

233.4±25.36

207.05±25.50

203.46±25.37（mg / 100 g）
Free amino acids

Nucleic acid - related substances
IMP1）Value with small letters（a, b）within the same row differ significantly at the 5% levels.
2）Means±SE.

中のサイトカインmRNA発現量（IFN5-β）を高いビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与は地鶏

Fig.１に示した。ビワ葉区は対照区よりも血漿中の暑熱ストレスを低減できる可能性を示唆するも

TBARSの上昇を抑制できる傾向が見られた。Lin

のと考えられる。

et al.

は暑熱環境下で飼育したブロイラーは適

ビワ茶区のIFN-β発現量は対照区よりも高く

温環境下よりも血漿中TBARSが上昇することをなる傾向が見られた。Wanqiu et al.11）は抗酸化作報告しており，山根ら10）は産卵鶏に直茶温湯抽出用があるアガリクス・ブラゼイ・ムリル多糖類物を給与することで血清中のTBARSを低減でき（ABP）をブロイラーに給与することで，カドミると報告している。本研究により，抗酸化作用がウム給与による酸化ストレスおよび炎症性障害に

９）© The Ito Foundation

462

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Table 3 Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed fermented loquat leaf tea

on plasma - free amino acids of Tsushima - Jidori crossbred chickens under high ambient
temperatures.

（μmol / L）

Control

Biwa tea

Biwa tea+ Orotic acid

Aspartic Acid

125.50±12.20

107.83±11.23

90.95±6.90

Glutamic Acid

290.25±17.55

294.65±25.10

295.92±17.41

Asparagine

52.93±8.2845.34±6.98

53.67±4.13

Serine543.38±25.39

612.50±31.17

613.79±50.46

Glutamine

770.69±31.99

658.01±36.22

733.81±42.89

Histidine

115.36±10.80

97.49±8.42

97.98±8.49

Glycine451.04±30.37

464.96±20.69

467.91±25.65

Threonine405.31±24.57

397.80±33.04

390.94±14.46

Arginine

493.77±34.48

411.62±22.85

545.07±87.90

Tyrosine

179.61±16.17a

189.76±16.75a

131.60±7.06b

Valine269.02±19.97

240.44±16.21

245.63±12.97

Methionine

137.03±16.64

123.03±6.12126.77±5.16

Cystine62.38±7.45b

61.99±3.63b103.58±15.53a

Tryptophan

51.79±4.1852.12±2.66

51.20±3.54

Phenylalanine

130.00±6.04

126.50±4.94133.78±5.14

Isoleucine

143.06±13.51

135.53±9.23

138.95±6.49

Leucine265.86±17.58

239.47±16.24

254.45±11.16

Lysine356.22±48.92

409.40±72.63

316.53±26.94

Proline534.12±78.91

420.14±54.44

469.97±72.17

Taurine270.08±35.30b

303.76±33.30b

495.73±49.58a

19.1±3.21

21.24±3.76

32.36±4.42

Beta-Alanine

1）Value with small letters（a, b）within the same row differ significantly at the 5% levels.
2）Means±SE.
Table 4 Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed fermented loquat leaf tea on the ratioof the bursa of fabricius and the thymus to the body weight in Tsushima - Jidori crossbred chickens
under high ambient temperatures.
Control

Biwa tea

Biwa tea+ Orotic acid

The ratio of the bursa of fabricius to the body weight

0.14±0.03

0.14±0.01

0.15±0.03

The ratio of the thymus to the body weight

0.32±0.04β

0.48±0.04α

0.36±0.05αβ1）Value with Greek alphabets（α, β）within the same row differ significantly at the 10% levels.
2）Means±SE.

よるIFN-βのmRNA発現量の増加を抑制できることを報告している。本研究で用いたビワ葉混合４．要

約

発酵茶においても，抗酸化作用が鶏体内に働き，本研究では，暑熱環境下において安定した地鶏

同様に暑熱ストレスによるIFN-βmRNA発現量

肉の生産を目指し，抗酸化資材として活性酸素除の増加を抑制できたと考えられる。

去能が高いビワ葉混合発酵茶製造加工残渣を暑熱© The Ito Foundation

463

ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響（Ⅱ）
1.5
αβ

α
40

β

30
20
10
0

Control

Biwa tea

Biwa tea + Orotic
acid

Rerative IFN-β expression

nmol MDA equivalents / mL

50

α

1
αβ
0.5

β
0

Control

Biwa tea

Biwa tea + Orotic
acid

Fig. 1 Effect of feeding manufacturing processed residues of mixed fermented loquat leaf tea on the plasma

malondialdehyde concentraitions and mRNA expression of IFN-β of Tsushima - Jidori crossbred chickens underhigh ambient temperatures（means±SE）. Value with Greek alphabets（α, β）within the same row differ
significantly at the 10% levels.

環境下の対馬地鶏肉用交雑鶏に給与し，発育，肉質およびストレス指標への効果を調査した。
ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与は，無添加と比べて終了時体重および増体量を低下させたが，解体成績に影響を及ぼさず，血漿中TBARSの上昇を低減させ，免疫に関係する臓器である胸腺の生体重比は高い傾向があり，脾臓中のサイト
カインmRNAにおけるIFN-βの発現量を抑制する傾向が見られたことから，暑熱環境下におけるストレスを改善できる可能性が示された。しかし，ピリミジン塩基の前駆体であるオロト酸をビ
ワ葉混合発酵茶製造加工残渣と併用給与すると発育成績および解体成績が低下し，ストレス指標を改善することができなかったことから，今後，それぞれの添加割合をさらに検討する必要がある。
謝

辞

本研究の実施にあたり，ビワ葉発酵茶製造加工
残査は株式会社サンダイから，オロト酸は株式会
社古川リサーチオフィスから各々提供頂いた。こ文
献１） 深川聡，松永将伍：ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響，令和２年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，39，453～459，2021.
２）
 家畜改良センター：技術マニュアル「食肉の理化学分析及び官能評価マニュアル」（Ｉ．理化学分析），
18～76，2010.
３）
 Azuma, K., Hirao, Y., Hayakawa, Y., Murahata, Y.,
Osaki, T., Tsuka, T., Imagawa, T., Okamoto, Y., Ito,N.：Metabolites., 6（1）,3, 2016.
４）
 Yagi, K.：Biochem. Med., 15, 212～216, 1976.
５）
 El-Deep., Ijiri, D., Ebeid, T. A., Ohtsuka, A.：J.
Poult. Sci., 53, 274～283, 2016.
６）
 Shimamoto, S., Nakamura, K., Tomonaga, S.,
Furukawa, S., Ohtuka, A., Ijiri, D.：Metabolites, 10（5）,189, 2020.
７）
 岩澤敏幸，池谷守司：静岡県中小家畜試験場研究報告，15，19～23，2004.
８）
 立川昌子，石川寿美子，田中巖，小川正幸：岐阜
県畜産研究所研究報告，5，89～94，2005.
９）
 Lin, H., Decuypere, E., Buyse, J.：Comp. Biochem.
Physiol. A Mol. Integr. Physiol., 144（1）, 11～17,
2006.
10）
 山根哲夫，後藤尚也，高橋大三，武田英嗣，乙脇研 仁 ，土 田 孝 雄：日 本 家 禽 学 会 誌 ，36（1），31～
37，1999.
11）
 Wanqiu, X., Ai, L., Ruyue, L., Zequn, T., Dexing,
M., Xiaodan, H., Ruili, Z.：Biological Trace Element
Research., 184, 247～258, 2018.

こに厚く御礼申し上げます。

© The Ito Foundation

464

ウシの低受胎を改善する技術創出を目指した
子宮マイクロバイオーム解析
Microbiome analysis of bovine uterine, aiming to creation of novel
technology improving low fertility

内山

淳平１・八木沢拓也２・片桐成二３（１岡山大学大学院医歯薬学総合研究科病原細菌学分野，２北海道中央農業共済組合，３北海道大学大学院獣医学研究院）

Jumpei Uchiyama１, Takuya Yagisawa２ and Seiji Katagiri３（１Department of Bacteriology, Graduate School of Medicine Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University,
２Hokkaido Chuo Agricultural Mutual Aid Association, ３Graduate School of Veterinary Medicine, Hokkaido University）

Repeat breeding is an infertility status that a cow with functional ovaries and uterus andwith normal estrous cycle has difficulty in implantation even after repeated artificial
insemination. Since the repeat breeding causes great economic losses, the issue should beovercome urgently. In the recent years, investigation of the microbial flora of human uterus by
next-generation sequencing shows that the infertility is associated with a decrease in
implantation and fertility rates. Since the uterine microflora is shown to be possibly present in
the cows, the repeat breading can modulate the uterus microflora. Thus, we investigated theuterine microbiome associated with repeat breading in cows by 16S rRNA ampliconsequencing．
We collected the uterus tissues aseptically from the cows. We performed themeasurements of polymorphonuclear leukocyte rate for diagnosis of endometritis and thebacterial test for infections in uterus, using the collected tissues. After extracting the DNAs
from tissues, the V3-V4 regions of 16S rRNA gene were amplified and analyzed．
We sampled the uterus tissues of 59 cows and uterus microbiome were analyzed. The
major bacteria taxa were Firmicutes（46％），Bacteroidota（11％），Proteobacteria（６％）， andActinobacteriota（５％）. Moreover, we selected 20 cows from them and analyzed the uterus
microbiome to eliminate confounding factors of endometritis and bacterial infections.
Microbiome diversity in various metrics was initially compared between non-repeat-breading
and repeat-breading cows. Although microbiome diversities in most of the metrics was notdifferent, that in Pielou’s evenness metric showed significant difference. Moreover, analyzing
the differential abundance of microbiome between non-repeat-breading and repeat-breading
cows, the non-repeat-breading cows tended to have higher rates of butyrate-producing
bacteria, Lachnospiraceae, than the repeat-breading cows. The further study is required tounderstand the causal relationship between uterus microbiome and repeat breeding．

© The Ito Foundation

ウシの低受胎を改善する技術創出を目指した子宮マイクロバイオーム解析

１．目

465

ブリーダー発生減少のための新規技術の創出を目的指して，ウシの着床に関連した子宮マイクロバイ

リピートブリーダーとは，卵巣・子宮に異常がなく，発情周期も正常であるにも関わらず，人工授精を３回以上繰り返しても着床しない低受胎なオームの解析を行った。
２．方法

ウシのことをいう。リピートブリーダーでは，分

2.1

娩間隔が延長する。国内のリピートブリーダーの

北海道美瑛町の酪農場で飼養される，分娩後日占める割合は５～24％であり，この分娩間隔の延数が60～85日の初回人工授精前のホルスタイン種

長により１日700円／頭もの経済的損失が生じて雌牛を使用した。サイトブラシ（オネストメディ

いる 。これまで，リピートブリーダーを発生す

カル

る原因の一つとして，子宮内膜炎が考えられてきの粘膜細胞を採材した（採材期間は2020年４月～た。しかしながら，子宮内膜炎を発症していない

12月まで）。また，子宮内膜採取器具（富士平工

ウシでも，低受胎となる場合がある。その原業）を使用し，子宮体部から子宮角先端へ３cm

因は詳しく分かっていない。そのため，詳しい原挿入した部位の左右の子宮角を採材した。採材し因を究明することが急務である。

た組織の一部は，細菌検査で使用した。残りの組

１）

１～３）

動物の子宮は，無菌状態であると考えられてきた。しかしながら，近年，高速シークエンサーを採材と臨床データの収集

オネストブラッシュ）を利用し，子宮体部

織は－80℃で保存した。本研究は麻布大学動物倫
理員会の承認を得て，研究を遂行した。

利用し，ヒトの子宮内膜の細菌叢（以下，マイク

2.2

ロバイオーム）解析が行われた。その結果，子宮粘膜細胞組織を採材直後に，スライドグラスににもマイクロバイオームが存在し，マイクロバイ

塗抹し，その日のうちにメイギムザ染色にて染色

オームの失調と着床率や出生率の低下が関連してした。顕微鏡で観察し，視野における多形核好中いることが示唆されており球の占有率を算出した。占有率が２％以上を子宮，ヒトにおいて子４，５）

宮マイクロバイオーム解析は着床不全の新たな検

子宮内膜炎の診断

内膜炎と診断した。

査として認知され始めている。また，ウシにおい2.3ても子宮に多様な細菌群が存在する可能性が示唆

子宮内膜組織をリン酸バッファーに懸濁し，されているものの ，リピートブリーダーに関連

懸 濁 液 を 血 液 寒 天 培 地 に 塗 布 し ，好 気 的 お よした子宮マイクロバイオームの研究はほとんど行

び嫌気的に培養する細菌の同定試験を行った。

われていない。そのため，ウシにおいても子宮マ

また，組織をビーズ破砕法によりDNAを調製

イクロバイオーム解析が新たな検査法の１つとしし た 後 ，16S rRNA 遺 伝 子 を 標 的 と し た PCRて確立できる可能性がある。

を ユ ニ バ ー サ ル プ ラ イ マ ー （Pro341F ， 5’

６）

細菌検査

近年，さまざまな疾患とマイクロバイオームの-CCTACGGGNBGCASCAG-3’ ； Pro805R ， 5’

関連解析が行われ，医療ではマイクロバイオーム-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3’） を 使 用を利用した治療法が創出されている。子宮マイク

し 行 っ た ７）。 PCR 酵 素 に は ， KAPA2G Fast

ロバイオームのデータの蓄積により，リピートブ

HotStart ReadyMix （Roche, Basel, Swiss） を 使

リーダー発生を減少させる新たな技術の創出が期用した。

待されている。以上から，本研究では，リピート© The Ito Foundation

466

令和３年度

2.4

16S rRNAアンプリコン解析

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

Trueperella sp., α-Streptococcus, Corynebacterium

PCR 産 物 を キ ッ ト （FastGenetm Gel/PCR

sp., Actinobacillus sp., Proteus mirabilis,

Extraction Kit）を使用し，精製した。精製したEnterococcus faecalisがあった。子宮内膜炎は分PCR 産 物 か ら ，ラ イ ブ ラ リ ー 調 製 を 行 っ た 。

娩後の子宮内での細菌感染が原因とされ，その原

Illumina社のキットを利用した。高速シークエン因菌としてE. coli，T. pyogenesが主に分離されサーIllumina社MiSeqにより解読した。MiSeqでる11～13）。非リピートブリーダー群では，細胞診の取得したデータの処理やマイクロバイオーム多様

データと細菌検出が関連しているウシが存在した。

性 の 比 較 に は ，メ タ ゲ ノ ム 解 析 パ イ プ ラ イ ン

3.2

QiiME2を使用した 。16S rRNAデータベースに59頭のすべてのウシに対して細菌検出用のPCR

はSilva138を使用した 。また，リピートブリーの 結 果 ，非 リ ピ ー ト ブ リ ー ダ ー 群 で は 93.6 ％ダーと正常牛のマイクロバイオームの細菌種の存（44/47）， リ ピ ー ト ブ リ ー ダ ー 群 で は 100 ％在比を統計学的に比較し，それぞれに特徴的な細（12/12）でPCRが陽性であった。これらの検体の菌種を検討した。DAtestと言われる多変量解析

うち，ウシの子宮マイクロバイオームの構成を知

ソフトを統計解析ソフトＲへ実装し，解析を行っるために，リピートブリーダー群を含む48検体でた10）。

16S rRNAアンプリコン解析を行った。PCRで陽８）９）性であった検体に関して，16S rRNA遺伝子の３．結果と考察3.1

ウシの子宮マイクロバイオーム

V3-V4領域を標的としてPCRで再増幅後，高速シークエンサー解読した。計1,585,801read（mean

解析したウシの群

本研究では，２-６産次の59頭のウシの群を解±standard deviation，33,037.5±5,710.1／ sample）

析した。このうち，非リピートブリーダーは47頭のシークエンスを解析した。メタゲノムパイプラ（No. 1～47のウシ），リピートブリーダーは12頭

インQIIME2中のDADA2を利用しシークエンス（No. 48～59のウシ）であった（Table１）。はじめのトリミングおよびキメラ配列の除去を行った。

に，子宮内膜の細胞診を行ったところ，49頭からそ の 結 果 ，計 719,554read（719,554 ± 3,332.6 ／データが得られた。この細胞診のデータ（多形核sample）のシークエンスを取得した。この校正

白血球の占有率）に関して非リピートブリーダー

した配列を使用し，細菌の平均構成比を取得した

群（38頭）とリピートブリーダー群（11頭）で比（Fig.１）。子宮マイクロバイオームの主要細菌群較を行ったところ，有意な差は認められなかった

は，Firmicutes門（46％），Bacteroidota門（11％），（p>0.05；Mann-Whitney’s U test）。また，59頭Proteobacteria 門 （６ ％ ）， Actinobacteriota 門に対して培養法による細菌検査を行ったところ，（５％）であった。また，解析でどの配列にも分細菌検出率は非リピートブリーダー群では25.5％

類できないUnassignedが25％存在した。加えて，（12/47）であり，リピートブリーダー群では０％分類ができない細菌群が３％存在した。

（0/12）であった。細菌検出率に関して，非リピー

3 . 3 非リピートブリーダー群とリピートブ

トブリーダー群とリピートブリーダー群で比較検討

リーダー群の子宮マイクロバイオームの比した結果，非リピートブリーダー群で高い細菌の較

検 出 率 が 認 め ら れ た（p<0.05 ； Fisher’s exact

非リピートブリーダー群とリピートブリーダー

test）。検出された細菌には，Escherichia coli，

群の子宮マイクロバイオームの比較をするために© The Ito Foundation

467

ウシの低受胎を改善する技術創出を目指した子宮マイクロバイオーム解析
Table 1 解析に使用したウシの情報
No.

採材時までに出産した回数

1
2
3
4
5
6
7
8

4
2
2
4
2
2
3
2

細菌検査の結果a

ND
ND
Escherichia coli
ND
α-Streptococcus
ND
Trueperella sp.
Trueperella sp.
Trueperella sp.,93α-Streptococcus
10
2
ND
11
3
α-Streptococcus
12
2
ND
13
2
ND
14
3
ND
15
2
ND
16
2
Escherichia coli
17
2
ND
18
3
ND
19
2
ND
20
3
ND
21
2
Escherichia coli
22
4
ND
23
3
ND
24
3
ND
25
3
Corynebacterium sp.
262α-Streptococcus
27
2
ND
28
2
ND
29
3
ND
α-Streptococcus,
30
3
Actinobacillus sp.
31
4
Corynebacterium sp.
32
4
ND
33
3
ND
34
2
ND
35
2
ND
36
3
ND
37
2
ND
38
3
ND
Proteus mirabilis,
39
3Enterococcus faecalis
40
2
ND
41
3
ND
42
2
ND
43
2
ND
44
4
ND
45
2
α-Streptococcus
46
4
ND
47
4
ND
48
6
ND
49
3
ND
50
4
ND
51
2
ND
52
2
ND
53
3
ND
54
2
ND
55
2
ND
56
3
ND
57
3
ND
58
3
ND
59
4
ND
a, not detected, ND；b, not tested, NT.

細菌検 採材時の人工出PCR 授精の回数

多形核白血球のb
占有率（%）

受胎に要した
人工授精の回数

空胎日数

NT
NT
NT
NT
NT
5.67
50
0

3
3
2
1
2
2
1
3

130
154
105
66
90
101
86
157

＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋

0
0
0
0
0
0
0
0

＋

0

0

3

147

＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

0.33
0
0
0
0
0
2.33
0
1.67
0
0
0
0
0.67
0
0
3
3.67
NT
2

３回以上（5回）
2
3
10
３回以上（4回）
3
３回以上（4回）
３回以上（5回）
３回以上（4回）
2
3
1
2
1
３回以上（5回）
2
1
2
除外
3回以上（17回）

243
95
108
676
215
140
196
190
139
107
113
68
115
82
224
93
86
107
485

＋

0

0

３回以上（5回）

192

＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋

0
0
0
0
0
0
0
0

NT
0.67
1.67
0
0.33
0
0
0.33

３回以上（5回）
３回以上（7回）
3
2
３回以上（5回）
３回以上（5回）
1
３回以上（4回）

261
131
95
271
231
77
203

＋

0

0

1

78

＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋

0
0
0
0
0
0
0
0
6
10
4
15
9
5
5
4
5
4
4
5

NT
NT
2.67
0
0
1.33
1.67
5.67
0
0.33
2
0.67
0
0
0
0
0.33
NT
1.33
0

2
３回以上（4回）
3
３回以上（4回）
３回以上（5回）
2
1
2
繁殖障害で廃用繁殖障害で廃用繁殖障害で廃用繁殖障害で廃用繁殖障害で廃用14
繁殖障害で廃用6
繁殖障害で廃用
6
7
7

91
192
172
186
251
140
83
118
557
267
288
228
386

© The Ito Foundation

468

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

0.5% p_Patescibacteria

0.4% p_Verrucomicrobiota

1% p_Spirochaetota
2% d_Archaea；p_Euryarchaeota

1% Other bacterial taxa

3% d_Bacteria
5% p_Actinobacteriota
6% p_Proteobacteria

46% p_Firmicutes

11% p_Bacteroidota

25% Unassigned

Fig. 1 ウシの子宮マイクロバイオームの主要細菌の存在比

は，解析に影響する交絡因子を除去する必要があると考えた。そのため，細菌培養検査で細菌が検出されたウシ，子宮内膜炎と診断されたウシ（細胞診で２％以上の値）の検体を除いて解析を行っ

Table 2 非リピートブリーダー群とリピートブリーダー群とのマイクロバイオーム多様性比較

p値
α多様性指標Chao1

0.24

Shannon0.34

リ ー ダ ー 群 は 11 頭 を 解 析 し た 。計 695,985read

Pielou’s evenness

0.04（34,799.3±6,910.5／sample）のシークエンスを解Faith’s phylogenetic diversity

0.12

た。非リピートブリーダー群は９頭，リピートブ析した。メタゲノムパイプラインQIIME2中のDADA2によるデータ処理により，計314,749read（15,737.5±4,239.0／sample）のシークエンスを取得した。この配列を使用し，解析を進めた。
はじめに，マイクロバイオーム多様性比較を

β多様性指標Unweighted UniFrac distance

0.44

Weighted UniFrac distance

0.24

Bray-Curtis distance

0.10

Jaccard distance

0.43

行 っ た （Table ２）。 α 多 様 性 の 指 標 に は ，
Chao1，Shannon，Pielou’s evenness，Faith’s

用した）。一方，α多様性の指標であるPielou’s

phylogenetic diversityを使用した。β多様性のevennessでのみ統計学的な有意差が認められた

指 標 に は，Unweighted UniFrac distance，（p＜0.05）。そのため，大きくマイクロバイオー

Weighted UniFrac distance，Bray-Curtis

ムの構成比の変動は認められないが，細菌種は変

distance，Jaccard distanceを使用した。非リピー動している可能性が考えられた。

トブリーダー群とリピートブリーダー群を比較し次に，どの細菌が非リピートブリーダー群とリたところ，ほとんどすべての多様性の指標においピートブリーダー群で有意に存在するかの検討をて，統計学的な差は見られなかった（p＞0.05；

行った（Differential abundance解析）。得られた

α多様性の指標の検討はKruskal-Wallis test，α

マイクロバイオームを属レベルまで分類したデー

多様性の指標の検討にはPERMANOVA testを使タを取得した，存在比が１％以下のものをすべて© The Ito Foundation

469

ウシの低受胎を改善する技術創出を目指した子宮マイクロバイオーム解析

Other bacterial taxaとした。はじめに，DAtest

p 値 ＝ 0.09）。こ の 属 が 分 類 さ れ な いを使用し，得られたマイクロバイオームデータにLachnospiraceae科の細菌は，Lachnospiraceae科

使用する統計手法を決定する解析を行った。そのの中で最も存在比が高く，非リピートブリーダー

結果，LIMMAという統計法が選択された。次に，群で平均約４％，リピートブリーダー群で平均約

LIMMAを使用し，非リピートブリーダー群とリ２％存在した。

ピートブリーダー群の比較解析を行った（Table

3 . 4 ウシにおける子宮内マイクロバイオーム

３）。その結果，統計学的に有意な細菌群の検出を起因とする繁殖障害の可能性はされなかったものの，属レベルの分類がされな

ウシの子宮には，細菌量はきわめて少ないもの

いLachnospiraceae科の細菌が非リピートブリーの，子宮マイクロバイオームが存在することが知ダー群で高い傾向にあることが示唆された（補正られている６）。本研究では，非リピートブリーダー

Table 3 非リピートブリーダー群とリピートブリーダー群とのDifferential abundance解析
Bacterial taxonomy

logFC

AveExpr

t

p値

補正p値

B

Orderinga

d_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Lachnospirales;f_Lachnospiraceae－0.020

0.030

－3.12

0.01

0.09

－3.37

非RB > RB

d_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia;
o_Peptostreptococcales-Tissierellales;
f_Peptostreptococcaceae; g_Romboutsia－0.019

0.052

－1.78

0.09

0.60

－5.96

非RB > RB

d_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia;
o_Peptostreptococcales-Tissierellales;
f_Peptostreptococcaceae; g_Paeniclostridium－0.013

0.029

－1.60

0.13

0.60

－6.23

非RB > RB

0.012

0.049

1.37

0.19

0.60

－6.56

RB > 非RB－0.012

0.037

－1.33

0.20

0.60

－6.61

非RB > RB

0.048

0.262

1.21

0.24

0.60

－6.76

RB > 非RB

d_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Clostridiales;
f_Clostridiaceae; g_Clostridium_sensu_stricto_1－0.009

0.022

－1.20

0.25

0.60

－6.77

非RB > RB

d_Bacteria; p_Bacteroidota; c_Bacteroidia;
o_Bacteroidales; f_Bacteroidaceae; g_Bacteroides－0.007

0.020

－1.06

0.30

0.61

－6.92

非RB > RB

Other bacterial taxa (< 1%)－0.034

0.267

－1.00

0.33

0.61

－6.98

非RB > RB

d_Bacteria; p_Firmicutes; c_Bacilli; o_Mycoplasmatales;
f_Mycoplasmataceae; g_Ureaplasma

0.051

0.030

0.92

0.37

0.61

－7.06

RB > 非RB

d_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Oscillospirales;
f_UCG-010; g_UCG-010－0.003

0.013

－0.81

0.43

0.61

－7.16

非RB > RB

d_Bacteria; p_Bacteroidota; c_Bacteroidia;
o_Bacteroidales; f_Rikenellaceae;
g_Rikenellaceae_RC9_gut_group－0.003

0.012

－0.78

0.44

0.61

－7.18

非RB > RB

d_Bacteria; p_Actinobacteriota; c_Actinobacteria;
o_Corynebacteriales; f_Corynebacteriaceae;
g_Corynebacterium－0.004

0.013

－0.74

0.47

0.61

－7.22

非RB > RB

d_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Oscillospirales;
f_Ruminococcaceae; g_Ruminococcus－0.002

0.013

－0.62

0.54

0.63

－7.30

非RB > RB

d_Bacteria; p_Firmicutes; c_Bacilli; o_Mycoplasmatales;
f_Mycoplasmataceae; g_Mycoplasma－0.007

0.011

－0.58

0.57

0.63

－7.32

非RB > RB

d_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Lachnospirales;f_Lachnospiraceae; g_Lachnospiraceae_NK3A20_group－0.002

0.011

－0.54

0.60

0.63

－7.35

非RB > RB

d_Bacteria; p_Firmicutes; c_Bacilli; o_Erysipelotrichales;
f_Erysipelotrichaceae; g_Turicibacter－0.002

0.027

－0.29

0.77

0.77

－7.45

非RB > RB

d_Bacteria
d_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Oscillospirales;
f_Oscillospiraceae; g_UCG-005
Unassigneda, RB, リピートブリーダー.

© The Ito Foundation

470

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

群とリピートブリーダー群で子宮マイクロバイ
オーム解析を行った。その結果，統計学的な有意４．要約

差はないものの非リピートブリーダー群でリピートブリーダーとは，卵巣・子宮に異常がLachnospiraceae科の細菌が高い存在比を示した。

なく，発情周期も正常であるにも関わらず，人工Lachnospiraceae科の細菌は酪酸を産生すること授精を繰り返しても着床しない低受胎なウシであで 知 ら れ て い る 。一 方 ，ヒ ト に お い てる。リピートブリーダーは，畜産業に多大な経済

Lactobacillus属の細菌の優勢が着床に関連してい的損失を生じており，早急に解決すべき課題であることが示唆された 。Lactobacillus属の細菌はる。近年，高速シークエンサーを利用し，ヒトの乳酸を産生することが知られている。

子宮のマイクロバイオーム解析が行われ，マイク

14）

これらの細菌で共通することは，両細菌とも短ロバイオームの失調と着床率や出生率の低下が関

鎖脂肪酸（酪酸や乳酸）を産生することである。

連していることが示唆された。また，ウシにおいマイクロバイオーム研究では，「ニワトリが先かても子宮マイクロバイオームが存在する可能性が卵が先か」という因果関係に関する問題が議論に示唆されており，マイクロバイオームを利用したなる。本研究でも，「子宮の細菌群の変動がリピー治療法や検査法の確立が期待される。そのため本トブリーダーを生み出しているのか？」あるいは研究では，リピートブリーダー発生減少のための「リピートブリーダーになることで子宮の細菌群

新規技術の創出を目指して，ウシの着床に関連しの変動が起きるのか？」は不明のままである。もた子宮マイクロバイオームの解析を行った。

し，前者の議論が正しいと仮定した場合，子宮内59頭のウシから無菌的に子宮組織を採取した。

のpHの変動が着床になんらかの影響を与えてい子宮内膜の多形核白血球率の測定（子宮内膜炎のる可能性や，産生する短鎖脂肪酸（酪酸や乳酸）

診断）および子宮内感染症の細菌検査を行った。

は免疫に影響するなど機能分子であることが知ら組織からDNAを抽出した後，16S rRNA遺伝子のれており，子宮内の上皮細胞あるいは卵子に影響

V3-V4領域を増幅して高速シークエンサーで解を与えている可能性が考えられる。

読した。データ解析はQIIME2およびＲを使用し現在，解析するウシの頭数を増やし，解析を進て行った。

めている。飼育方法やエサで子宮マイクロバイ

採材した試料のうち48頭のウシに対して，子宮オームが変動することが明らかとなり始めていマイクロバイオームの解析を行った。その結果，る。今後，ネットワーク分析などの細かい統計解

主 要 な 細 菌 分 類 群 は ，Firmicutes 門（46 ％ ），析を行い，ウシにおける子宮マイクロバイオーム

Bacteroidota門（11％），Proteobacteria門（６％），

に関して赴任となる細菌因子や着床に関与する細およびActinobacteriota門（５％）であった。次菌因子が探索できればと考えている。今後，さらに，子宮内膜炎および子宮感染が疑われた検体をなる研究の進展が期待される。本研究は，ウシの除外した計20頭の牛を選択し，子宮マイクロバイ

着床と子宮マイクロバイオームを解析した初めて

オーム解析を行った。マイクロバイオーム多様性の研究である。今後，このような研究が活性化し，をさまざまな評価基準を利用し，非リピートブ

リピートブリーダー発生減少のための新規技術のリーダー群とリピートブリーダー群で比較したと創出が達成できることが期待される。

ころ，ほとんどの評価指標に関して違いは見られなかったが，Pielou’s evennessに関して統計学的© The Ito Foundation

ウシの低受胎を改善する技術創出を目指した子宮マイクロバイオーム解析に有意な差が認められた。加えて，微生物叢の存在量の違いを分析すると，非リピートブリーダー
は，リピートブリーダーよりも酪酸産生細菌であるLachnospiraceae科の細菌の存在割合が高い傾向にあった。子宮マイクロバイオームとリピート
ブリーダーとの因果関係を理解するには，さらなる研究が必要と考えられる。
文献１） Yusuf, M., Nakao, T., Ranasinghe, R. B., Gautam,
G., Long, S. T., Yoshida, C., Koike, K., Hayashi, A.：
Reproductive performance of repeat breeders indairy herds, Theriogenology, 73, 1220～9, 2010.
２） P o t h m a n n , H . , P r u n n e r , I . , W a g e n e r , K . ,Jaureguiberry, M., de la Sota, R. L., Erber, R.,
Aurich, C., Ehling-Schulz, M., Drillich, M.：The
prevalence of subclinical endometritis andintrauterine infections in repeat breeder cows,
Theriogenology, 83, 1249～53, 2015.
３） Katagiri, S., Moriyoshi, M.：Alteration of theendometrial EGF profile as a potential mechanism
connecting the alterations in the ovarian steroid
hormone profile to embryonic loss in repeat
breeders and high-producing cows, J Reprod Dev,
59, 415～20, 2013.
４） Moreno, I., Codoner, F. M., Vilella, F., Valbuena, D.,
Martinez-Blanch, J. F., Jimenez-Almazan, J.,
Alonso, R., Alama, P., Remohi, J., Pellicer, A.,
R a m o n , D . , S i m o n , C . ：E v i d e n c e t h a t t h eendometrial microbiota has an effect on
implantation success or failure, Am J Obstet
Gynecol, 215, 684～703, 2016.
５） Franasiak, J. M., Werner, M. D., Juneau, C. R.,
Tao, X., Landis, J., Zhan, Y., Treff, N. R., Scott, R.
T.：Endometrial microbiome at the time of embryotransfer：next-generation sequencing of the 16S
ribosomal subunit, J Assist Reprod Genet, 33, 129～36, 2016.
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471

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J., Brown, C. T., Callahan, B. J., CaraballoRodriguez, A. M., Chase, J., Cope, E. K., Da Silva, R.,
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© The Ito Foundation

472

牛ウイルス性下痢ウイルスの準種END－は
弱毒生ワクチンになるか？（Ⅱ）―より効果的に免疫を誘導するための可能性の追求―
Can END－，a quasispecies of bovine viral diarrhea virus, be a liveattenuated vaccine?（II）―Pursing the possibility of inducing immunity
more effectively―

塩

川

舞

（日本獣医生命科学大学獣医学部獣医保健看護学科）

Mai Shiokawa（School of Veterinary Nursing and Technology, Faculty of Veterinary Science, Nippon Veterinary and Life Science University）

Bovine viral diarrhea virus（BVDV）is an RNA virus classified in the genus Pestivirus of
the family Flaviviridae and is in the same genus as classical swine fever virus（CSFV）. BVDVand CSFV form quasispecies and contain at least two quasispecies. There are at least two
quasispecies, an END＋ virus that suppresses the host’s innate immune response and an END－
virus that induces it; the ability of the END－ virus to induce an innate immune response isseen as a valuable property for attenuated live vaccine even though it harms viral propagation.
Japan’s attenuated live vaccines for CSFV are produced with END－ virus as the seed virus. In
2020, with the support of this research grant, we succeeded in generating BVDV adapted torabbit-derived cultured cells（aRb/END＋ and aRb/END－）. We examined whether this year,
the adapted BVDVs are capable of infecting rabbits and whether differences in immunologicalproperties of the quasispecies will affect antibody induction. Neutralization antibodies weredetected in the sera of aRb/END＋ and aRb/END－ inoculation groups, with higher antibody
titers in the aRb/END＋ group than those in the aRb/END－ group. BVDV-RNA was detectedin some stools and tissues collected, but no infectious particles were detected. This study
showed that BVDV adapted to cultured cells derived from rabbits can infect rabbits across thehost range. The aRb/END－ immunization group had a lower antibody titer than the aRb/
END＋ immunization group; however, whether END－ virus can be attenuated live vaccine for
BVDV depends on its pathogenicity against cattle. Further studies are also needed to examine
factors other than antibody titers．

１．目る１）。PI牛の存在は乳量の低下や繁殖障害を誘発

的し，生産性の低下および経済的損失に直結する。

牛ウイルス性下痢ウイルス（BVDV）の持続感

そのため，PI牛を産ませないこと，または，PI牛

染牛（PI牛）は，自身の分泌液からウイルスを排をいかに早期摘発できるかが生産の安定性や出し続けるため農場内の慢性的な汚染源とな

BVDV感染症を制御するうえで重要である。しか© The Ito Foundation

牛ウイルス性下痢ウイルスの準種END－は弱毒生ワクチンになるか？（Ⅱ）―より効果的に免疫を誘導するための可能性の追求―

473

し，国内外においてBVDV用ワクチンがあるにも

BVDVのワクチンはさまざまあるが，準種であかかわらず発生が後を絶たない。これを改善する

るEND－をもとに製造されたBVDV用弱毒生ワク

ために，より効果的に免疫を付与できるBVDV用チンは国内外を問わず存在していない。BVDV/

弱毒生ワクチンを作出することを最終目標として

END－がより効果的に免疫を誘導し，感染を確実研究を行ってきた。

に防御できる弱毒生ワクチン株として利用できれ

BVDVや同属の豚熱ウイルスは免疫学的性状がば，今後のBVDVの防疫対策に大きく貢献できる

異なる２つのウイルス準種を包含する。感染するだけでなく，感染が散発している国内の現状を変と宿主の自然免疫応答を抑制するEND ウイルスえることができると考えている。

＋と，それを強く誘導するEND ウイルスという２－つの準種が混ざりあってウイルス集団内に存在している２，３）。申請者は，培養が容易で実験室株と

２．方法

2 . 1 ウサギを用いたaRb/END － およびaRb/

して汎用されるEND＋ ウイルスではなく，END－

END＋の感染実験

ウイルスをBVDVの弱毒生ワクチン株に応用する

各馴化ウイルス（aRb/END－およびaRb/END＋

ことができれば，既存のものよりも効果的に免疫のP.40；ウサギ由来培養細胞で40回継代されたもを付与できるのではないかと考えた。

の）をウサギ（約1.5―1.99kg，２または３羽/群）

令和元年度は，BVDV/END の弱毒化を図るに対して筋肉内接種（約10 4.0 TCID 50/羽）した。

ために，自然宿主（牛）ではない異種動物由来細コントロール群（２羽）も設定し，ウイルス液と胞を用いてウイルスの馴化作業を行った。そ同量の培養液を接種した。試験期間は中和抗体価の結果，BVDV/END－をウサギ由来細胞で維持・の上昇を捉えるために約３週間設定し，そのスケ培養することに成功し，得られた馴化ウイルス

ジュールをFig.１に示した。試験期間中は，体温（adapted Rabbit/END ；aRb/END ）が宿主のの測定，下痢や嘔吐の有無，食欲・飲水量の確認

免疫を誘導するEND の性状を保持していることを定期的に行った。また，ウイルス血症が生じるがin vitroの実験から明らかになっている。そこかどうか確認するために，ウイルス接種から１週で本年度は，令和元年度に得られたaRb/END の間は毎日採血を行った。その後は14日目と最終日

馴化の程度や，aRb/END に対する免疫応答（抗の21日目に採血を行った。接種した馴化ウイルス体誘導能を含む）を，ウサギを用いたin vivoで評が体外に排出されるか確認するために１週間ごと

価し，牛における免疫原性の評価に繋げるデータに糞便を回収した。試験終了時には，血液に加えを収集することを目的として研究を行う。また，てウイルスが増殖する可能性がある組織（扁桃，

令和元年度に本助成による支援を受けて，

脾臓，腎臓，肝臓，腸間膜リンパ節）の一部を採BVDV/END だけでなく，BVDV/END もウサ

取し，ウイルス増殖の確認に使用した。本実験は，

ギ由来細胞に馴化させることに成功し，aRb/

日本獣医生命科学大学動物実験規定（承認番号

END も獲得することができた。これら馴化ウイ

2021S-49）および病原体等安全管理規定に沿っルスのin vivoにおけるウイルスの増殖動態，免疫て適切に実施された。

－

－

４，５）

－

－

－

－

－

＋

＋

誘導能を比較検討することで，aRb/END がより

2.2

有効な弱毒生ワクチン株になり得るかどうかを評回収した組織，糞便，血液試料からBVDV-－

価できると考えている。

RT-PCR法によるウイルスの遺伝子検出

RNAの検出を試みた。組織と糞便は，10％乳剤© The Ito Foundation

474

令和３年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）

No.5 No.6 No.7

aRb/END－
No.2 No.3 No.4

aRb/END＋
No.1 No.8

Mock-infected
Sampling

14

0 1 2 3 4 5 6 7

21dpi：Blood：Stool：Tissues

Measure body temperature,check for diarrhea, vomiting, amount of drinking water, and appetite.

Fig. 1 Infection experiments using rabbits

The schedule of the infection experiments is shown. Three rabbits were used for each viral inoculation group, andtwo rabbits were used for the mock-infected group. Mock-infected rabbits were nos. 1 and 8；aRb/END＋
inoculation rabbits were nos. 2, 3, and 4; and aRb/END－ inoculation rabbits were nos. 5, 6, and 7. The virus was
intramuscularly inoculated into 10 4.0 TCID 50/rabbit, and the mock-infected group was inoculated with the same
volume of culture medium as the viral solution. Blood, stool, and tissue sampling was performed on the dateindicated by arrows．

を作製してからその遠心上清を核酸抽出に使用し回収し，再度MDBK細胞に感染させた。この上た。核酸抽出はHigh Pure Viral Nucleic Acid Kit

清継代を３回実施し，最終的に得られた培養上清（日本ジェネティクス）を用いて実施し，抽出し中にウイルス遺伝子および感染性粒子が存在してた核酸をRT-PCRの鋳型に使用した。プライマーいるかどうかをRT-PCRまたは免疫染色法で確認

はペスチウイルスの５’非翻訳領域を検出するした。

324/326プライマーペアを使用し ，RT-PCRに

2.4

はPrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2（タ血清中の中和抗体価をウイルス中和試験で測定

カラバイオ）を使用した。RT-PCR反応後は，した。試料は，ウイルス接種から7，14，21日目

２％アガロースゲルを用いた電気泳動によって目に回収した各血清を用いた。指示ウイルスは，的遺伝子の増幅（約290bp）を確認した。

RK/END ＋ （P.1，馴化前のもの）を10 3.3 TCID 50/

６）

2.3

ウイルス中和試験による抗体価の測定

糞便および組織試料からのウイルス分離

mlに調整したものを使用した。細胞は，牛腎由

上記2 . 2「RT-PCR法によるウイルスの遺伝子

来株化MDBK細胞を使用した。血清試料を２～検出」でBVDV-RNAが検出された試料から感染

2048倍まで２倍階段希釈し，希釈した血清50μｌ

性粒子が分離できるかどうか確認した。ウイルスと指示ウイルス50μｌを混合して，37℃で１時間

遺伝子の検出が確認された試料の10％乳剤を遠心反応させた。中和反応済み混合液をMDBK細胞し，その上清を使用した。フィルター（0.45μｍに接種し，５日間培養した。培養後に免疫染色を

ポアサイズ）処理した上清200μｌをMDBK細胞実施し，抗体価を算出した。また，バックタイトに接種し，４―５日間培養した。培養後に上清をレーションを試験ごとに設定し，指示ウイルスが© The Ito Foundation

牛ウイルス性下痢ウイルスの準種END－は弱毒生ワクチンになるか？（Ⅱ）―より効果的に免疫を誘導するための可能性の追求―

475

3 . 2 採材した試料（血液，糞便，組織）から適切な接種量で添加されていることを毎回確認しのウイルス遺伝子の検出ながら試験を行った。

まず，試験期間中にウイルス血症が生じていた

３．結果と考察

か ど う か を 確 認 す る た め に ，血 液 試 料 か ら の

3 . 1 ウサギを用いたaRb/END およびaRb/－

BVDV-RNAの検出を行った。その結果，aRb/
END－ 接種群の個体No.５の感染後６および７日

END の感染実験（Fig.１）＋

試験期間中，ウイルス接種に伴う体温の大きな目の血液から微量のウイルス遺伝子が検出された変化は認められなかった。体温は全個体で38.5～

が，その他の個体からウイルス遺伝子が検出され41.2℃の間で推移したが，Mock群の体温と比べることはなかった（データ未掲載）。aRb/END－てもウイルス感染によって体温が上昇していると接種群のウサギNo.５だけ一時的にウイルス血症は言えない結果であった（データ未掲載）。食になっていた可能性が考えられるが，血中のウイ

欲・飲水量の低下，下痢や嘔吐は試験期間を通し

ルス量はごく微量であると推察された。

ていずれの個体でも認められなかった。以上よ

続いて，ウイルスが体外に排出されていたかど

り，aRb/END およびaRb/END の接種に伴う臨うか確認するために，糞便試料からのBVDV-

床所見の変化は認められなかった。

RNAの検出も実施した。その結果，aRb/END＋－＋接種群のNo.２，３，４およびaRb/END－ 接種群の

A

B

Mock
No.1

No.8

1w 2w 3w

1w 2w 3w

No.2

No.3

aRb/END＋
No.2
NC PC

No.4

1w 2w 3w

No.6

No.3

aRb/END－
No.4

1w 2w 3w 1w 2w 3w

No.5

No.6

No.7

1w 2w 3w 1w 2w 3w 1w 2w 3w

No.7

NC 1w 2w 3w 1w 2w 3w 1w 2w 3w 1w 2w 3w 1w 2w 3w PC

Fig. 2 Detection of BVDV-RNA from stool samples using RT-PCR（A）
BVDV-RNA was found in feces collected each week after viral injection. A 10 ％ emulsion was prepared fromthe stools, and nucleic acid extraction was performed from the centrifugal supernatant. RT-PCR was performed
using the extracted nucleic acids as a template. BVDV-RNA was detected in the stool samples of rabbits no. 2, 3, 4,
6, and 7.（B）The infectious particles from stool samples in stools were detected, and the isolation of detected viral
RNA was attempted. No BVDV-RNA was seen in the supernatant after three blind passages．

© The Ito Foundation

476

令和３年度

A

No.1
T

NC PC

S

K

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.40）
No.8

L

M

T

S

K L

M

T : Tonsil
S : Spleen
K : Kidney
L : Liver
M : Mesenteric lymph node

Mock
NC PC

No.2
T

S K L M

T

No.3

No.4

S K L MS K L M K

T

aRb/END＋

B

No.6

T S K L M

T S K L M

No.7
TS K L M

aRb/END－
No.7

NC T

NC PC

No.5

S K

No.5
L

M

T

PC

Fig. 3 Detection of BVDV-RNA from tissue samples using RT-PCR

（A）
Viral RNA was detected in tissues（tonsils, spleen, kidney, liver, and mesenteric lymph nodes）collected on
the last day of the infection experiment（day 21）.The tissues were processed into a 10％ emulsion, and the nucleic
acid was extracted from the centrifugal supernatant. RT-PCR was performed using the extracted nucleic acids asa template, and BVDV-RNA was detected in rabbit no. 5 tonsils but found in the tonsils, spleen, kidney, liver, andmesenteric lymph node of rabbit no. 7.（B）Isolation of infectious particles from tissue samples where viral RNA
was detected was attempted. No BVDV-RNA was seen in the supernatant after three blind passages．

No.６，７の糞便からウイルス遺伝子が検出された

桃，No.７の扁桃，脾臓，腎臓，肝臓，腸間膜リ（Fig. 2A）。感染性粒子が排出されていた可能性

ン パ 節 か ら BVDV-RNA が 検 出 さ れ た （Fig.

が考えられたため，これらの試料をウイルス分離3A）。ウイルス分離に供し，得られたP.3上清をに供した。上清の盲継代を３回実施したあとに得解析したところ，ウイルス遺伝子および感染性粒られたP.3培養上清中からウイルス遺伝子は検出

子ともに検出されず，組織でウイルスRNAの複されず（Fig. 2B），P.3上清を接種したMDBK細製が生じていたものの，感染性粒子の産生にまで

胞から抗原陽性細胞が検出されなかったことからは至らなかった可能性が考えられた（Fig. 3B）。

（データ未掲載），感染性粒子の排出は起きていな

以上の結果から，ウサギ由来培養細胞に馴化しいことが確認できた。

たaRb/END＋およびaRb/END－がウサギ個体に感採取した組織からのウイルス遺伝子の検出も行った。その結果，aRb/END 接種群No.５の扁－染可能であるが，体外への排出は生じていないことが確認された。

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牛ウイルス性下痢ウイルスの準種END－は弱毒生ワクチンになるか？（Ⅱ）―より効果的に免疫を誘導するための可能性の追求―
Table 1 Measurement of antibody titer using viral

neutralization test

infection
with
mock

aRb/
END+

aRb/
END-

４．要

477

約

Rabbit No.

7 dpi

14 dpi21 dpi

本申請課題によって作出されたウサギ由来細胞

No.1

<2

<2

<2

馴化BVDV；aRb/END＋およびaRb/END－が，実

No.8

<2

<2

<2

No.2

<2

16 － 32

32 － 64

際にウサギ個体に感染できることが分かった。特

No.3

<2

8 － 16

8 － 16

No.4

<2

8

128 － 256

No.5

<2

2

2－4

率よくウイルスが増殖した可能性も考えられる。

No.6

<2

2

8

本申請課題の目的は，aRb/END－の免疫学的性

No.7

<2

<2

<2

状を活かして，より効果的に免疫を付与できる弱に，aRb/END＋接種群では，個体によっては比較的高い抗体価が検出されており，ウサギ体内で効

毒生ワクチンを産生することである。本研究の結3.3

果から，aRb/END－接種群で産生される抗体価が中和抗体価の測定

ウイルス接種から１週間ごとに採取した血清試

aRb/END＋接種群よりも低かったが，牛に対する料を用いて，中和抗体価を測定した（Table１）。

病原性の強さや抗体の持続期間なども比較したうMock群のウサギから抗体は検出されず，いずれ

えで，END－ウイルスがBVDVの弱毒生ワクチンの個体でも抗体価は２倍以下であった。aRb/として応用可能かどうか判断する必要があるだろ

END 接種群では，３羽すべてで抗体の存在が確う。予想以上にウサギへの感染効率がよい傾向が認され，８―256倍の抗体価を示した。一方で，認められたことからも，培養細胞を用いた繰り返

aRb/END－ 接種群では，ウサギNo.７で抗体の産し継代によってウサギへの馴化の精度を高められ生が認められなかった。Fig. 3Bの結果より，ウている可能性が高い。このウイルスが牛に感染しサギNo.７の組織でウイルスRNAが検出されたのた時にどのような病原性・免疫誘導能を示すのかは，ウイルスが感染していたにもかかわらず抗体

非常に興味深く，今後の研究展開の基盤となる成が産生されていないことが原因であると考えられ果が得られた。

＋

た。しかしながら，No.７で抗体が産生されなかった理由が個体差なのか，END－ウイルスの性状によるものなのかは明らかにできなかった。aRb/
END－接種群のウサギNo.５およびNo.６では，抗体 の 存 在 が 確 認 で き た も の の ，そ の 値 は Rb/
END＋接種群と比較すると低く，ウイルスの増殖効率が影響している可能性が考えられた。aRb/
END－接種群における抗体価は２―８倍であった。
以 上 よ り ，抗 体 価 に 差 は あ る も の の ，aRb/
END＋およびaRb/END－接種によって抗体産生が誘導されること，加えて，ウサギ由来培養細胞に馴化したBVDVが，自然宿主ではないウサギに感染できるようになったことが示された。

文
献１）
 Fourichon, C., Beaudeau, F., Bareille, N., Seegers,
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２）
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Nagai, M., Mizutani, T., Sakoda, Y., Fukusho, A.,
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３）
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Aoki, H., Ishimaru, M., Nakamura, S., Okamatsu, M.,
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© The Ito Foundation

令和３年度助成研究調査一覧

本年度の対象とする研究または調査：
食肉に関する研究または調査（品質・製造加工技術，食品的価値，食品安全，遺伝育種，繁殖，動物
衛生，家畜飼養・飼料など）
単位：千円
研
Ⅰａ

究

課

継続
年数

題

代

表

代表者名

研

究

者

所属機関

助成金額

食肉の品質、製造加工技術 （９件）

乾塩漬ハム中の亜鉛プロトポルフィリンIXの形成様 R1～
相と存在形態に関する研究（Ⅲ）

若松純一

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,600

微生物由来アスパルティックプロテアーゼを利用した食肉加工技術の開発（Ⅲ）

竹中慎治

神 戸 大 学 大 学 院農 学 研 究 科

900

食肉加工品の塩漬熟成に認められる「塩なれ」に関する研究―食肉加工品の塩味に対する遊離脂肪酸の影
響―

中村

幸信

一 般 社 団 法 人
食肉科学技術研究所

1,600

食肉の品質を制御する遺伝的要因に関する多因子複雑系の解析：細胞骨格との関連からのアプローチ

灘野大太

名古屋大学大学院
生命農学研究科

1,300

国内標準化を目的とした食肉の可食期間延長技術の検
証

中村

好徳

農研機構九州沖縄
農業研究センター

1,800

R1～

枝肉の３Ｄグラフィック化システムの製作（Ⅲ）

R1～

本山三知代

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

1,900

イミダゾール化合物が食肉の熟成に及ぼす影響につい
て（Ⅱ）

R2～

早川

徹

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,600

食肉の複素誘電応答に基づく肉質評価技術の開発

村松大陸

東 京 理 科 大 学
研 究 推 進 機 構
総 合 研 究 院

900

ポークソーセージにおけるタンパク質の香り保持効果とそのメカニズムの解明

西村敏英

女 子 栄 養 大 学栄 養 学 部

1,300

食肉加水分解物の栄養機能について竹之山愼一

南 九 州 大 学
健 康 栄 養 学 部

1,600

プレバイオティクスによる食肉の効果的な栄養利用の
研究

大島

健司

名古屋大学大学院
生命農学研究科

1,800

プラズマを用いた食中毒誘発因子の分解・不活化技術
の開発

作道

章一

岡 山 理 科 大 学獣 医 学 部900

国産ジビエの衛生管理に資する迅速簡便検査法の開発

山﨑朗子

岩手大学農学部
共 同 獣 医 学 科

1,300

鶏肉の低温調理におけるカンピロバクターの消長

下島優香子

相 模 女 子 大 学
栄 養 科 学 部

1,600

ハム・ソーセージの食品添加物に関するスマート・リ
スクコミュニケーションの改良研究ならびに効果検証

山﨑

（特非）
食の安全と
安心を科学する会

1,500

Ⅰｂ

Ⅰｃ

食肉の食品的価値 （２件）

食品安全（５件）© The Ito Foundation

毅

山口

堅三

徳 島 大 学ポ ス ト LED
フォトニクス研究所

1,800

ニワトリ骨格筋成長に遺伝子変異が及ぼす影響の全ゲノム解析に基づく解明石原慎矢

日本獣医生命科学大学
応用生命科学部

1,400

早産を伴う子牛死亡に関連する遺伝的要因の解明

平野貴

東 京 農 業 大 学
農
学
部

1,400

ウシ複合脊椎形成不全症の病態解析とウシの骨格成長に重要な糖鎖の同定

古市達哉

岩 手 大 学
農学部共同獣医学科

1,300

肥育豚の霜降り割合の指標となるバイオマーカーの特
定

谷口

雅章

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

1,600

横井

伯英

京 都 大 学 大 学 院農 学 研 究 科

1,400

中嶋

宏明

山 形 県 農 業 総 合研 究 セ ン タ ー
畜 産 研 究 所

2,000

及川

俊徳

宮城県畜産試験場

1,300

ウシ二次卵胞の発育制御におけるTNFα受容体の役
割

平山

博樹

東 京 農 業 大 学
生 物 産 業 学 部

1,300

体外受精由来ウシ胚盤胞の可逆的発生停止を誘導する
体外培養法の開発ならびにその誘導による胚盤胞の胚質改善の可能性石井利通

三重県畜産研究所

900

受精卵の未凍結保存における植物由来成分の有効性検証と配合の最適化

星野由美

日 本 女 子 大 学
理
学
部

1,200

内腔の有無に着目したウシ形成期黄体の機能解析窪友瑛

北海道立総合研究機構酪農試験場

1,400

牛黄体血流の多寡は子宮内膜機能の局所調節に関与す
るのか？

金澤

朋美

岩 手 大 学
農学部共同獣医学科

1,800

ウシにおけるルーメン非分解性ナイアシン給与による子宮、卵巣への血流促進による分娩後の繁殖性向上 R2～
（Ⅱ）

森田

康広

名古屋大学大学院
生命農学研究科1,400

黒毛和種における不明瞭な発情発生メカニズムの黄体退行の観点からの解明

法上拓生

農研機構九州沖縄
農業研究センター

1,100

久保田海雄

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

1,300

生殖巣始原生殖細胞を用いた新規家禽遺伝資源保存法
の開発

中島

友紀

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

1,600

機能性脂肪酸を活用した黄体機能強化による乳牛繁殖
成績改善技術の確立

山口昇一郎

福 岡 県 農 林 業
総 合 試 験 場

1,100

卵胞刺激ホルモンを用いた夏季における繁殖母豚の発情回帰遅延対策技術の開発

内倉健造

愛知県農業総合
試
験
場

1,300

近赤外光と偏光、AIを組み合わせた食肉中の虫および異物検知技術の開発
Ⅱａ

遺伝育種（６件）

肉用牛の枝肉形質および肉質の診断マーカーとしての血中マイクロRNAの動態解析（Ⅱ）

R2～

黒毛和種牛肉における「甘い香り」の育種改良手法の確立
Ⅱｂ

繁殖（19件）

黒毛和種における経腟採卵前のヒアルロン酸添加ブタ
FSH製剤1回筋肉内注射の効果に関する研究（Ⅱ）

受胎性を裏付ける黒毛和種牛の分娩後子宮修復指標の
確立（Ⅱ）

R2～

R2～

ウシ初期黄体におけるPG抵抗性の解明―低酸素環境による抗アポトーシス機構―（Ⅱ）

R2～

西村

亮

鳥 取 大 学
農学部共同獣医学科

1,400

発情期における牛子宮内膜機能調節因子および調節機序の解明（Ⅱ）

R2～

杉浦

智親

酪 農 学 園 大 学
獣 医 学 群
動物生殖学ユニット

800

松井

基純

帯 広 畜 産 大 学
獣医学研究部門

1,100

ウシにおける排卵後の血中エストラジオール増加の検知による受胎性評価© The Ito Foundation

黒毛和種雌牛の繁殖成績を改善するための栄養状態の
最適化検討

鍋西

久

北里大学獣医学部

1,400

抗酸化物資を利用したウシ体外受精卵生産技術の高度化とそれを応用した新規OPU-IVF-ETによる子牛生 R2～産システムの開発（Ⅱ）

日巻武裕

岐 阜 大 学
応用生物科学部

1,200

分娩前の複合型アミノ酸ペレット給与が乳牛の繁殖成績に及ぼす影響住吉俊亮

日 本 大 学
生物資源科学部

1,400

R2～

小山

毅

北海道立総合研究機構畜産試験場

1,300

アフリカ豚熱の侵入リスク評価に関する疫学研究
（Ⅳ）

H30～

杉浦

勝明

東 京 大 学 大 学 院農学生命科学研究科

1,600

尾根部の体表温度から黒毛和種育成子牛の発熱を検知する手法の開発（Ⅱ）

R2～

佐々木羊介

宮崎大学農学部

800

イノシシにおける豚コロナウイルスの感染実態調査中川敬介

岐 阜 大 学応 用 生 物 科 学 部共 同 獣 医 学 科

1,700

PRRSウイルス感染初期における鼻腔内ウイルス動態
の解析

平井

卓哉

宮
農

学
部

1,200

家畜に下痢を引き起こすロタウイルスの遺伝子改変技
術

金井

祐太

大 阪 大 学微生物病研究所

1,300

地方病性牛伝染性リンパ腫発症機序の解明と予後診断
法の確立

森

宏

北 海 道 医 療 大 学
薬
学
部

1,600

鶏肉・鶏卵の生産性向上を目指した安全なワクモ防除
法の開発

辻

尚利

北里大学医学部

1,600

安藤

清彦

農 研 機 構
動物衛生研究部門

1,700

牛のストレス応答における肝臓機能の解明

グルゲ キー
ルティ シリ

農 研 機 構
動物衛生研究部門

1,100

補体制御性タンパク質CD46の豚熱ウイルス受容体としての機能解析岩丸祥史

農 研 機 構
動物衛生研究部門

1,300

家畜用ワクチンのための新規ワクチンプラットフォー
ムの構築

新地

浩之

鹿 児 島 大 学学 術 研 究 院理工学域工学系

1,650

炎症マーカーの代わりに安価で簡単に測定できる血清Fe濃度で牛複合性呼吸器疾患の炎症評価が可能か？

鈴木一由

酪 農 学 園 大 学獣 医 学 群1,400

映像解析技術を用いたアブの吸血行動の定量的解析による病原体媒介リスクの可視化

菅沼啓輔

帯 広 畜 産 大 学
原虫病研究センター

1,300

サルモネラ鶏卵汚染・介卵感染に寄与する鶏卵巣での菌・宿主細胞間相互作用の解明

岡村雅史

帯 広 畜 産 大 学
獣医学研究部門

1,650

ジビエおよび家畜動物におけるトキソプラズマ感染の頻度と新規検査方法の開発

保科斉生

東京慈恵会医科大学
感 染 制 御 科

1,600

反芻家畜の「悪心」を示す生理学的マーカーの探索
Ｈ30～
（Ⅲ）

青山

真人

宇都宮大学農学部

1,400

網羅的ジェノタイピングによる新規牛伝染性リンパ腫
抵抗性遺伝子の同定（Ⅲ）

目堅博久

宮 崎 大 学
産 業 動 物 防 疫リサーチセンター

800

牛の腸アミロイド症の根絶を目的としたAAアミロイド症原因遺伝子の同定

上家潤一

麻布大学獣医学部

1,600

牛伝染性リンパ腫ウイルス感染症に対する新規治療薬
の開発

岡川

朋弘

北海道大学大学院
獣 医 学 研 究 院

1,300

卵巣予備能に基づく新規受卵牛選定技術の検討（Ⅱ）Ⅲ

動物衛生 （19件）

牛伝染性リンパ腫ウイルス由来の非翻訳性RNAと結合する宿主タンパク質の同定（Ⅱ）

R2～

R1～

© The Ito Foundation

崎

学

大

Ⅳ

家畜飼養、飼料など （20件）

ルーメンアシドーシスに伴うエンドトキシン体内流入と肝機能障害を防除する技術の開発

米倉真一

信州大学農学部

1,500

母体の乳生産性向上による効率的な肥育を目指す基礎
的研究

津上

優作

広 島 大 学 大 学 院
統合生命科学研究科

500

日本短角種去勢牛の２シーズン放牧肥育における放牧管理改善による肉質向上

上田宏一郎

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,400

夏季に調製した発酵混合飼料の泌乳牛における利用適
正―窒素利用効率に基づく検証―

近藤誠

三 重 大 学 大 学 院
生物資源学研究科

1,400

ルーメンマットスコアを指標にした子牛の免疫強化法の研究（Ⅱ）

R2～

保田

昌宏

宮 崎 大 学 大 学 院医学獣医学総合研究科

1,300

離乳育成豚のリジン要求量に関する研究（Ⅲ）―Diet
Selection能力の活用によるアミノ酸給与の精密化―

R1～

勝俣

昌也

麻布大学獣医学部

800

国産子実用トウモロコシの乾燥温度および貯蔵条件がトウモロコシの栄養価に及ぼす影響（Ⅱ）

R2～

篠遠

善哉

農研機構東北農業
研 究 セ ン タ ー

1,300

多頭飼養の牛群において反芻を含む行動型判別を可能とする映像モニタリング技術の開発

多田慎吾

農研機構北海道農業研究センター1,800

寒地型多年生牧草採草地が1年生イネ科草種（自生イ
タリアンライグラス―イヌビエ・メヒシバ）交代植生に遷移する気候・土壌要因の解明と飼料価値の評価

池田堅太郎

農研機構東北農業
研 究 セ ン タ ー

800

西本

完

農 研 機 構
食 品 研 究 部 門

1,800

矢用

健一

農 研 機 構畜 産 研 究 部 門

1,500

松﨑

正敏

弘 前 大 学農学生命科学部

1,200

木材クラフトパルプとカンショ焼酎粕を原料としたサ
イレージの給与が黒毛和種肥育牛の第一胃内発酵に及
ぼす影響

前田

友香

宮崎県畜産試験場

1,700

採卵日齢に起因するヒナ品質がブロイラー異常硬化胸肉の発現に及ぼす影響の解明岩崎智仁

酪 農 学 園 大 学
農 食 環 境 学 群

1,200

乳用子牛における消化管機能強化および消化管由来の炎症予防に関する研究

福森理加

酪 農 学 園 大 学
獣 医 学 群1,700

睡眠様姿勢―肉用牛の生産性およびウェルフェアの新
たな行動指標の検討

深澤充

東 北 大 学 大 学 院農 学 研 究 科

1,500

量産可能なオリゴ糖素材を添加した飼料給餌による家
畜腸内細菌叢改善効果の検証（Ⅱ）

R2～

子牛用疑似グルーミング装置利用モニタリングによる健康状態評価手法の開発
初乳成分による産肉特性の代謝的プログラミングの可
能性（Ⅲ）

R1～

ゲノム編集による高消化性暖地型イネ科牧草の開発
（Ⅱ）

R2～

権藤

崇裕

宮 崎 大 学フロンティア科学
総合研究センター

1,000

牛肉の風味を維持した黒毛和種雌牛の肥育期間短縮技術の開発（Ⅱ）

R2～

庄司

則章

山 形 県 農 業 総 合研 究 セ ン タ ー
畜 産 研 究 所

1,600

富谷

信一

鳥
取
県
中小家畜試験場

1,000

松永

将伍

長崎県農林技術
開 発 セ ン タ ー

1,600

畜産汚水処理施設の低コスト水質監視システムの開発
ビワ葉混合発酵茶製造加工残渣の給与が対馬地鶏肉用
交雑鶏の発育および肉質に及ぼす影響（Ⅱ）
合

計

R2～

80件

110,000© The Ito Foundation

伊藤記念財団賞© The Ito Foundation

485

加藤

健太郎

東北大学大学院農学研究科

教授〔業績の課題名〕

食肉に関わる原虫感染症の病態発現メカニズムの解明と対策技術の確立〔業績の概要（受賞理由）〕
畜産業は，原虫病を含めた感染症によって大きな経済的打撃を被ってきた。原虫病は，感染による畜産動物の生産性の低下，泌乳量の減少等の直接的な影響だけでなく，食の安全性に対する国民の危機感とそれに伴った風評被害の蔓延につながる。
受賞者は畜産業を脅かす原虫感染症の中でも，人獣共通感染症であるトキソプラズマ症を主な研究対
象とし，特にこれらの感染対策技術の研究開発に焦点を当ててきた。トキソプラズマ症は，家畜伝染病予防法において，めん羊，山羊，豚，いのししを対象とした届出伝染病に指定されている。加熱調理等が不十分な肉の食用や近年の食習慣の変化の影響もあり，妊婦の初感染が原因である先天性トキソプラ
ズマ症の症例数が増加しており，流産や胎児の脳症，痙攣，水頭症，頭蓋内石灰化等を起こしている。
2012年９月には患者会が設立され社会的な問題となっている。
ところが食肉用家畜，鶏卵，乳産業における原虫感染症による被害は甚大であるという状況にありな
がら，その対策はサルファ剤等の古典的な化学薬剤に頼ったものであり，耐性原虫の出現も多く根本的な駆虫には至っておらず，原虫病に対するワクチンに至ってはいまだ開発されていないのが現状である。このような現状の中，受賞者は以下のような研究を行ってきた。
（１）原虫の感染レセプター同定系を独自に開発し，レセプターとして糖鎖分子を同定した。同定したヘパラン硫酸，コンドロイチン硫酸が糖鎖の一種であったことから，また，タイレリア，クリプトスポ
リジウム，マラリア原虫でも同様にヘパラン硫酸が宿主細胞への侵入に関わっているという知見を得た
ため，糖鎖を抗原虫薬のシーズとして用いるという実用化を目指し着想を得た。
（２）原虫プロテインキナーゼ（PK）の機能解析を行った結果，トキソプラズマの宿主細胞侵入，増殖，潜伏感染への移行，宿主細胞からの脱出といった複雑なライフサイクルの各ステージにおいて原虫PKが重要な役割を果たし，これらをターゲットとした薬剤が宿主細胞への侵入を実際に阻害することを見出した。また，急性感染期と潜伏感染期の虫体をともに抑制することができる薬剤のスクリーニング系の開発に成功した。
（３）金属ナノ粒子が原虫の増殖阻止に働くメカニズムを解明し，アミノ酸被覆を行うことでその効果が増強されることを明らかにした。本技術を基として，今後，原虫特異的に増殖阻止効果のある動物用医療品の開発，あるいは原虫特異的に薬剤を運ぶトラックデリバリーシステムに活用できる担体の開発というまったく新しい技術の創出につながる。受賞者が開発した以上の抗原虫薬のシーズが動物薬として市場に出ることで，将来的に畜産業および食品産業の振興と国民食生活の安定に寄与することが期待できる。

© The Ito Foundation

486

東 山
農研機構東北農業研究センター研究推進部

由 美
事業化推進室事業化推進チーム

チーム長〔業績の課題名〕

肉用家畜生産における栄養素配分調節機構ならびにストレス評価に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
経済のグローバル化により畜産物の輸入量は今後ますます増加すると見られ，国際競争力の強化に向け家畜を最大限効率的に飼養する技術が必要である。一方，畜産物の輸出量は，近年拡大傾向にあり，さらなる飛躍に向けて，国際基準のアニマルウェルフェアを意識した取り組みも必須である。受賞者は，肉用家畜における飼料中の栄養素の家畜体内での配分調節機構の解明に取り組み，栄養素の効率的な畜産物への配分制御技術開発を目指すとともに，アニマルウェルフェアの視点から家畜のストレスについて独創的な研究を行い，それぞれ成果をあげてきた。
（１）肉用家畜における栄養素の配分調節機構
脂肪細胞から分泌され，食欲の調節やエネルギー代謝に関連するホルモンであるレプチンについて，
ウシでの測定法を確立し，肉用牛におけるレプチン分泌の日内変動は反芻動物特有であること，黒毛和種去勢牛では肥育に伴い血中レプチンは上昇するが，採食量との相関は認められないこと，さらに，黒毛和種去勢牛はホルスタイン種去勢牛より血中レプチン濃度および脂肪組織におけるレプチンmRNA
発現量が高いことを明らかにし，筋肉内に著しく脂肪を貯める黒毛和種の特性との関連を示した。また，
骨格筋や脂肪組織に存在し末梢組織へ糖を取り込むグルコース輸送担体（GLUT）のうち，インスリン依存症のGLUT４タンパク質発現は，ウシでは出生から成長に伴い低下し反芻動物におけるインスリン抵抗性と関連があること，ブタでは飼料中の脂肪酸により発現量は変化することを明らかにした。
（２）ウシにおける種々の飼養環境下でのストレス評価
ウシにおいて，非侵襲的に採取できるスポット尿を用いた尿中コルチゾールレベル（対クレアチニン
比，以下UC）は，一般的なストレス指標である血液中コルチゾール濃度に代わるストレス指標として有効で，除角・去勢，社会的隔離といった身体的，精神的負荷で上昇すること，舎飼いや放牧といった飼養環境によるUCの反応は品種により異なることを明らかにし，家畜の快適な飼養環境の実現のためには品種特有の背景を考慮する必要があることを示した。また子牛について，離乳ストレス軽減のため離乳時期を慣行より遅らせると，粗飼料多給下でも子牛の発育成績は優れ，ルーメンの機能的発達を見極めた離乳時期の判断の重要性を示した。

© The Ito Foundation

487

上 田

修 司

神戸大学大学院農学研究科

助教〔業績の課題名〕

畜産物の品質評価，付加価値の向上に向けた
メタボロミクス技術の応用に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
メタボロミクス解析は技術的な進歩が目覚ましく，さまざまな分野に活用範囲が拡がっている。黒毛和種牛肉は，筋内脂肪が多く，脂肪交雑の割合によって肉質が大きく変化する。受賞者は，質量分析計
を最適化することで脂肪交雑のバラツキによる機器分析の精度への影響を抑え，牛肉の「代謝物」，「脂質」，「香気成分」の網羅的解析を可能にし，黒毛和種牛の肉質評価に繋がる成果を収めた。
（１）ガスクロマトグラフィー質量分析を用いた黒毛和種牛肉の栄養成分の比較解析
ガスクロマトグラフィー質量分析法（GC/MS）を用いたメタボロミクス解析により，畜肉に含まれる80種以上の代謝物を同定し，黒毛和種牛肉の脂肪交雑の割合と相関する指標として，筋内脂肪組織に由来する中鎖脂肪酸など複数の化合物を同定した。また，黒毛和種牛肉の脂っぽい風味，和牛香と高い相関を示す複数の化合物を見出し，GC/MS分析が牛肉の品種，肉質，生産地の判別に活かせることを示した。
（２）黒毛和種の香気成分と代謝物に関する研究
黒毛和種牛肉の甘い香りに寄与する代謝物の指標を明らかにするため，真空蒸留によって得られた加熱調理後の牛肉の揮発性画分をGC-olfactometry分析を行い，匂い物質を探索した。黒毛和種，乳用種の比較により，γ―ヘキサラクトン，γ―デカラクトン，γ―ウンデカラクトンが黒毛和種牛肉の特徴的な香りに寄与することを示した。次に，メタボロミクス研究のデータと比較することで，グルタミン，
デカン酸，リン酸，乳酸，クレアチニン，ヒポキサンチンなどの成分が黒毛和種牛肉の甘い香りの指標となることを示した。
（３）黒毛和種の脂質組成とラクトン香の形成に関する研究
黒毛和種牛肉の香りの形成メカニズムを探るため，黒毛和種牛肉に含まれる脂質を検討した。液体ク
ロマトグラフ質量分析計で８種類の脂質クラスを網羅的に分析し，さらに高速液体クロマトグラフィー
によって14種のトリアシルグリセリドを明らかにした。牛肉の加熱調理で生じるラクトンのうち，黒毛和種牛肉の霜降りと関連するγ―ヘキサラクトンは，多価不飽和脂肪酸のリノール酸と相関することを見出し，脂肪酸組成が黒毛和種牛肉から生じるラクトン酸のプロファイルに影響を与えることを示した。

© The Ito Foundation

学会等事業助成© The Ito Foundation

491

令和３年度学会等事業助成実施報告書
市民公開講座『牛伝染性リンパ腫の新規制御法の可能性を探る』に関する開催報告
公益社団法人日本獣医学会

代表理事

猪熊

壽（東京大学）〔開催主旨〕
現在，全世界的に新型コロナウイルス感染症COVID-19が蔓延し，私たちの生活に多くの影響を与えているが，新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）は，もともと野生動物のウイルスであったと予想されている。我々の生活や健康に関係の深い動物の感染症についての研究も含め，幅広く動物と人間の健康と福祉に貢献するのが獣医学の責務である。今回の市民公開講座では，そのような動物の感染症のひとつである「牛伝染性リンパ腫」をテーマとして取り上げた。
本疾患は，牛の血液のがんの一種であるリンパ腫の発症を特徴とするが，ウイルス感染症としての側面も持つ。本疾患の基本的な特徴については基調講演で概述する。本疾患は現在の我が国の畜産生産に大きな影響を与えており，この病気の制圧は，畜産・獣医業界の非常に大きな重要課題となっている。
このため牛伝染性リンパ腫の新しい制御法について，本疾患の専門家である日本獣医学会の２名の会員より，その研究成果を紹介いただいた。北海道大学・感染症学研究室の今内 覚会員には，免疫制御因
子をコントロールするという観点から，また，東京大学・地球規模感染症制御学講座の間 陽子会員に
は牛伝染性リンパ腫に対する牛の抵抗性の側面から，あるいは新規ワクチン開発の可能性などを講演いただいた。
今回の公開講座の内容が，一般市民の方々に獣医学に関心を持っていただき，獣医学をご理解いただ
ける契機になり，さらに家畜衛生に携わる関係各位の日常業務や牛伝染性リンパ腫の理解の一助となることを祈念する。なお，本企画計画当初は，対面での市民公開講座開催を目指していたが，COVID-19の全国的な蔓延現状を考慮して，昨年度に引き続きZOOMを利用したオンラインセミナー方式での開催とした。
〔開催概要〕
令和４年２月５日（土曜日）14：00－15：40にZOOMを利用したオンラインセミナー方式にて，一般市民を対象とした市民公開講座を開催した。事前に248名の申込があり，当日の参加者は168名であった。
また，市民公開講座の講演内容は動画に編集し，本学会HPにて，同年３月31日まで一般に無料公開した。さらに，講演内容については小冊子にまとめ，3000部を印刷し，関係機関（獣医系大学等）へ無償配布した。

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492〔市民公開講座プログラム〕『牛伝染性リンパ腫の新規制御法の可能性を探る』
１．開会挨拶

猪熊 壽（公益社団法人日本獣医学会 理事長）

２．基調講演猪熊 壽（東京大学大学院農学生命科学研究科 教授）

３．講演１

牛伝染性リンパ腫における免疫学的解析を基盤とした新制御法の試み

講師：今内 覚（北海道大学大学院獣医学研究院 准教授）
座長：猪熊 壽（東京大学大学院農学生命科学研究科 教授）
４．講演２

感受性・抵抗性牛を利用した新しい牛伝染性リンパ腫制圧戦略

講師：間 陽子（東京大学大学院農学国際専攻 特任教授）
座長：堀本泰介（東京大学大学院農学生命科学研究科 教授）
５．総合討論
司会：内田和幸（日本獣医学会 理事）〔講演概要〕
基調講演「牛伝染性リンパ腫―現状と問題点」
猪熊 壽（東京大学大学院産業動物臨床学研究室 教授）
講演１「牛伝染性リンパ腫における免疫学的解析を基盤とした新制御法の試み」
今内 覚（北海道大学大学院獣医学研究院 准教授）
牛伝染性リンパ腫（旧名：牛白血病）は，増加の一途をたどり，日本の畜産業に甚大な被害をもたらす家畜衛生上の重大な課題となった。北海道大学大学院獣医学研究院では，古くから迅速診断に基づく
農場での感染防疫対策を生産者個人から各団体・機関までを対象に幅広く長年行ってきた。一方，提供された臨床検体を用いて，本病の病態発生機序の研究も行ってきた。感染免疫・腫瘍免疫において病原体や腫瘍を排除する活性化リンパ球は，『免疫チェックポイント因子』によって制御され過剰な免疫応答が抑えられている。しかし一方で，牛伝染性リンパ腫を含む難治性疾病では，種々の免疫制御因子の暴走が，病態の進行および維持に関連することが示唆され，感染細胞や腫瘍細胞が排除されない免疫回避機序の一因であることを明らかにした。また，これらに対する抗体により，疲弊化した免疫が再活性化され，抗ウイルス効果を示すことを確認した。本病に対する新規制御法の可能性について各機関と共同研究を進めており，本講座ではその一部を紹介したい。
講演２「感受性・抵抗性牛を利用した新しい牛伝染性リンパ腫制圧戦略」
間 陽子（東京大学大学院生命科学研究科 教授）
牛伝染性リンパ種ウイルス（BLV）は牛の悪性Ｂリンパ腫である地方病性牛伝染性リンパ種（EBL）
を誘発する。我々は最近，プロウイルス量が低値を示し発症し難い“抵抗性”牛と，反対の“感受性”
牛の存在を発見した。そこで，BLVが蔓延している我が国において，経済的損失を最小限に抑えながらBLVの清浄化を進めていくためには，これまでのEBL対策に“疾患感受性の個体差”という新たな視点を加えて，“抵抗性牛”を生物学的防壁として活用する陽転阻止と感受性牛の特定によるBLV伝播
高リスク牛の排除を同時に進めることで，感染牛と非感染牛を混合飼育しながらでもBLV陽転率を最© The Ito Foundation

493
大限に抑制可能なより広範な農家で実施できる「BLV清浄化対策」を提案したい。加えて，抵抗性牛を指標として発症し難い，さらにプロウイルス量が上昇しない牛集団を作出するという「育種戦略」，
あるいは感受性牛を標的とした「ワクチン開発」によるプロウイルス量の低下による，伝播の抑制や感染率の低下，といったEBLの新しい制圧戦略について紹介したい。

© The Ito Foundation

494

日本食肉科学会 令和３年度事業助成実施報告
日本食肉科学会理事長

坂田亮一（麻布大学名誉教授）

１．はじめに
標記の事業の項目として，（公財）伊藤記念財団から今回の助成を受けたのは，（１）海外派遣事業の補助（国際食肉科学技術会議派遣），（２）国内における学会大会，および（３）第68回国際食肉科学技術会議（2022年神戸開催，日本食肉科学会主催）組織委員会の運営の補助などである。
昨年８月に実施された（１），および今年３月に行った（２），および昨年度の組織委員会の活動（３）まで，各項目の実施内容を順次報告するが，これらの助成を受けた「日本食肉科学会」の概要について
以下に記す。
２．日本食肉科学会の概要
本会は昭和34年（1959年）４月に「日本食肉研究会」として発足し，食肉に関する分野について広く
学界，業界，団体関係者がお互いの研鑽の場として，学術と産業の発展を目指し，活動を行ってきた。
本会では毎年，学術講演会の開催ならびに会誌として「食肉の科学」を発行している。大会は通常，
日本畜産学会大会の開催に合わせて春に実施され，食肉および食肉加工に関連する分野のエキスパート
による特別講演ならびに会員による研究発表を行い，活発な意見交換がなされている。これらの研究発表要旨ならびに，総説，解説，海外事情，最近の文献紹介などが「食肉の科学」に満載されている。
本会は，2021年度から「日本食肉科学会」に改称した。その理由は，今年８月に神戸で開催される第68回国際食肉科学技術会議を成功させるために産官学からの会員が一体となって内部強化を図ることが急務であること，また関係諸方面に主催団体の活動を訴えるためにも，学会化は必須であるとの会員の声を受けてのことである。この学会化にあわせて本会が発行している「食肉の科学」のバックナンバー
すべてを電子化し，会員は全巻をオンラインで閲覧が可能となった。
本学会の会員数は，本年２月28日現在で，正会員182名（前年172名），学生会員10名（前年６名），賛助会員５社（前年５社），特別会員29社（前年32社），名誉会員８名（前年８名）である（令和４年度の総会資料より）。
３．今回の助成結果（１） 海外派遣事業の補助
国際食肉科学技術会議，通称ICoMSTは毎年８月中旬に世界各地で開催され，日本食肉研究会時代か
ら役員の中より１名を派遣してきた。また，その際に行われる各国代表者会議にも出席し，すべての会
議出席報告を本学会機関誌の「食肉の科学」に掲載し，会員に周知してきた。伊藤記念財団からこの海外派遣事業の補助も受けるようになり，2022年に神戸で開催される第68回会議（ICoMST2022）に向けて組織委員会を立ち上げ，2019年の第65回会議（ドイツ，ポツダムで開催）には本学会から多くの会員© The Ito Foundation

495が参加した１）。
2020年８月USAフロリダ州オーランドでの第66回会議では，ICoMST2022組織委員会
から多数参加すべく準備を行っていたが，その年になって新型コロナウイルスの感染拡大という思いもしない事態が生じ，会議がオンラインで行われるようになった。この会議に我々組織委員会としても，この海外派遣事業の補助を活用し，大いに参加を呼びかけた結果，参加人数は30名にのぼり，これは主催の

図１ ICoMST2022の紹介，委員長がクラクフの会議に参加，

Closing ceremonyでスピーチを行った。

米国に次ぐ人数であった２）。
本来，顔と顔を合わせ１週間近く一緒に同じ空気を吸うことで，学術上の意見交換が保たれ国際的な人的交流も図られるのが，この会議の伝統であり特徴である。前回，2021年の第67回大会はポーランドのクラクフで開催され，対面式が復活かと思われたが，参加登録の時期になってハイブリッド形式に変更された。ICoMST2022組織委員会からは坂田委員長が実参加し，現地で各国代表会議に出席し，第68回日本開催の広報活動を行った（図１）。また，組織委員会委員の大半がこの会議にリモート参加し，次の会議を主管する立場として情報収集に努めた３）。
（２） 国内における学会大会の補助学会大会をオンラインで行うことが一般的になり，2021年３月の定例大会（第62回日本食肉研究会大会）もその形式で開催されたことを，前回の事業報告書に記載した４）。その際に，令和２年度伊藤記念財団賞の受賞講演を佐々木啓介会員（農研機構）が行い，特別講演で，Dr. Wangang Zhang（南京農業大学教授）ならびにDr. Peter McGilchrist（University of New England上級講師）がその内容をビデオ配信し，質疑応答をライブで行い，海外とも問題なくつながることが確信できた大会であった。
2022年の第63回大会は本年３月26日に開催され，本年８月に迫った国際会議開催のシミュレーション
として，神戸国際会議場をキーステーションに当学会メンバーが運営に携わった。今回もリモート開催となったが，口頭発表の演者で希望があれば現地において配信を行うように設定した。今大会では，兵庫県の畜産行政側から神戸ビーフなど地元畜産をまず紹介し，これもICoMST2022において，世界に向けて日本の食肉生産のPRを想定したプログラムであった。
一般研究発表で昨年を上回る演題数（ポスター17題，口頭４題）があり，本学会の趣旨とする若手研究者の奨励推進が図られている。また，特別講演（国内）で第６回伊藤記念財団賞受賞講演『食肉加工への超高圧利用，新規顕微鏡による食肉の顕微解析ならびに鶏の異常硬化胸肉に関する研究』を岩崎智
仁 会 員（酪 農 学 園 大 学）が 行 っ た 。海 外 か ら は ２ 題 の 講 演 が あ り ，Dr. Troy Declan（ICoMSTExecutive director, Director of Teagasc Food Research Centre, Ashtown, Dublin 15, Ireland）に よ り『The International Congress of Meat Science and Technology（ICoMST）-A global science-based
forum for meat scientists in a time of need』（図 ２），な ら び に Dr. Irina Chernukha（Professor, V.M.

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Gorbatov Federal Research Center for Food
Systems of Russian Academy of Sciences,
M o s c o w ）に よ り 『 I n p i g w e t r u s t - M e a t
consumption in Russian Federation andintroduction of some local pig breeds』が配信され，英語での討論が時間いっぱいに行われた。
今回の成功により本助成による国際交流事業を継続できたことは，今年８月に迫った国際会議の主催にあたり大きな収穫であった。
（３） 第68回国際食肉科学技術会議運営の助成

図２ ICoMST 国 際 事 務 局 長 の Dr.Troy Declan に よ る 講

演，アイルランドから配信。

ICoMST2022神戸開催を目指し，組織委員会を４年前に立ち上げ，鋭意準備を進めている。昨年
８月は，上記の通りポーランドでの67th ICoMSTがハイブリッド形式になったが，実際の渡航は入国隔離期間があって組織委員会からの派遣は委員長の坂田のみとなった。その状況下でも，大勢の組織委員会メンバーがon-lineで参加し，主催側からも感謝された。
一昨年から組織委員会はほぼ２か月ごとに会議を開き，そこで活発な意見交換を行っている。農林水産省，厚生労働省ならびに各種食肉関連団
体，学会等から後援を得ており，作成した趣意書
を関連企業や団体に配布し，協賛金の依頼活動を展開している。そのためにNews Letterを発行し，組織委員会活動の広報に努めている（図３）。
いまだコロナウイルス感染拡大の中で，会議の様式について，ICoMST国際本部（アイルランド）と連携し，神戸国際会議場を基点に現地および

図３ 第68回国際食肉科学技術会議組織委員会のNews

Letter No.1

Web開催とし，国際情勢も見ながら鋭意準備を行っている。
４．おわりに（公財）伊藤記念財団からの学会等学術団体への活動助成は今年で７回目となった。平成30年度まで
順調に大会を開催し，外国人研究者の招聘等を実施することができた。しかし，その後の予期せぬ新型
コロナウイルスの発生により，大会の中止に至るなど混乱を極めた。このパンデミックの中で，リモー© The Ito Foundation

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ト方式を駆使し，すべての助成事業を行うことができたことは本会を運営するうえでも大きな進歩と言える。国際会議参加，今年神戸での国際会議開催を見据えて諸外国のキーパーソンとの交流など，この海外派遣とセミナーの事業助成効果は確実に上がってきたと判断する。実際，昨年度の活動の中で画面越しに英語でのコミュニケーションも図られたことは，この助成による成果であると感謝する。
今年８月の神戸開催が予定通りできるよう，コロナ禍社会の中でもできる限りの準備を，組織委員会をフルに稼働させ進める方針である。
ここに，助成をいただいた（公財）伊藤記念財団の皆様に深謝し，引き続き本助成の増強を日本食肉科学会として衷心よりお願い申し上げます。
参考資料１）
 坂 田 亮 一 ，山 之 上 稔 ，若 松 純 一 ，本 山 三 知 代 ，林 利 哉 ，他 参 加 者 12 名：第 65 回 国 際 食 肉 科 学 技 術 会 議（ICoMST2019）に出席して，食肉の科学，Vol.60, No.2, 203～217, 2019.
２）
 坂田亮一：日本食肉研究会への平成31年度・令和元年度事業助成実施報告，令和元年度食肉に関する助成研究調
査成果報告書，Vol.38, 443～447, 2020.
３）
 坂田亮一，松石昌典，有原圭三，水野谷 航，早川 徹，他参加者30名：第67回国際食肉科学技術会議（ICoMST2021）に参加して，食肉の科学，Vol.62, No.2, 145～177, 2021.
４） 坂田亮一：日本食肉研究会 令和２年度事業助成の実施報告，令和２年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.39, 495～500, 2021.

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令和３年度事業実施報告書
日本畜産学会第 129 回大会オンラインシンポジウム「畜産学のレジリエンスと進化」
公益社団法人日本畜産学会

理事長

佐藤正寛（東北大学）〔日時〕2021年９月14日（日）14：30～18：00〔主催〕公益社団法人

日本畜産学会〔共催〕東北大学大学院農学研究科〔企画〕日本畜産学会第129回大会実行委員会（大会長：北澤春樹）〔プログラム〕
講演１．大会長特別提言「健全畜産シナジー強化の創出」14：30－15：00
北澤春樹（東北大学大学院農学研究科）
講演２．基調講演「畜産学に裏打ちされた畜産業の展望」15：00－15：40
眞鍋 昇（大阪国際大学，（独）家畜改良センター）
講演３．招待講演「異分野融合によるアニマルウェルフェア配慮型の家畜管理技術研究」
15：50－16：10
竹田謙一（信州大学農学部）
講演４．招待講演「マウスを用いた基礎研究からブタの産子数向上技術へのトランスレーション」
16：10－16：30
島田昌之（広島大学大学院統合生命科学研究科）
講演５．招待講演「豚熱の現状および今後の防疫対策」16：40－17：00
亀山健一郎（（国研）農業・食品産業技術総合研究機構・動物衛生研究部門）
講演６．招待講演「環境が求める乳牛飼養研究のこれから」17：00－17：20
真貝拓三（（国研）農業・食品産業技術総合研究機構・畜産研究部門）
総合討論

17：20－17：50

総合司会者（座長）
大会長

北澤春樹（東北大学大学院農学研究科）

実行委員長

米山 裕（東北大学大学院農学研究科）

講演，総合討論
Zoomの挙手機能より質問を受け付けた。講演・討論はいずれもライブ形式で開催した。

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499〔開催概要〕
現在の世界人口は70億人を超え，2050年には約97億人に達する見込みである。動物性タンパク質の生産量も1.6倍（2018年比）に増えると予測されており，畜産業の重要性はますます高まるばかりである。
しかし，現在の畜産には多数の解決すべき問題を抱えており，この解決なくして，未来における安心安全な畜産物の持続的生産は成し得ない。近年，畜産領域を取り巻く問題として，家畜（動物）福祉，温室効果ガス（主にメタンガス）の発生，グローバル化にともなう国境を越えた新興・再興感染症の拡大や，気候変動にともなう環境ストレスがあげられる。これらのような問題に対し，我々研究者は高度な科学力・研究力をもって，動物にも地球にもやさしく，かつ高効率，省力的な生産体系の実現に貢献しなければならない。これに向けては，繁殖，育種，生理，栄養，行動，微生物

畜産物，環境といった多様な畜産研究領域の融合からなる「しなやかな強さ（レジリエンス）」による畜産学の“進化”が必要である。本事業では，上記各領域におけるトップレベルの専門家を６名招聘し，畜産業における“今とこれから”ならびに“畜産学による貢献と将来”を講演いただき，講演後には参加者と総合討論を行った。
本シンポジウムにより，研究者および一般参加者において，現在の畜産が抱える問題に加え，これからの畜産学の方向性・目標が広く共有できた。また，参加者からも意義深いシンポジウムであったとの声が多数寄せられた。シンポジウムでは研究・教育機関，民間企業より約260名の方に参加いただき，
参加者数は第128回大会の約70％増になった。数社の報道機関も参加し，講演内容の積極的な取材が行われたと考えられた。
本シンポジウムを含む第129回大会は，開催直前まで一部対面式で実施する予定であったが，新型コロナウイルスの感染拡大によりオンライン式への変更を余儀なくされた。このため，当初予定していた
予算通りに執行することが困難となったが，助成金は本シンポジウムの運営に適切に支出したことを申し添えたい。最後に，貴財団のご理解と助成に深い感謝の意を表する。

© The Ito Foundation食肉に関する助成研究調査成果報告書
Final Reports for Research Grants for Meat and Meat Products

令和３年度（Vol. 40）
2022年11月

発行

編集・発行 ― 公益財団法人伊藤記念財団
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