学位論文内容の要旨

博士の専攻分野の名称

博士（医 学）氏 名

市之川 正臣学 位 論 文 題 名
マウス癌精巣抗原 Ssxa の配列同定および生物学的特徴に関する研究【背景と目的】マウスにおける癌ワクチン研究では、Ovalbumin(以下 OVA)等の免疫原性外来抗原を仮想癌抗原として強制発現させた腫瘍細胞を用いた癌ワクチンモデルが知られている。この実験系においては、マウスに OVA ワクチンを投与することによって OVA 特異的細胞障害性 T リンパ球が誘導され、OVA 過剰発現癌細胞に対する腫瘍増大抑制効果が示されている。一方で癌細胞は元来宿主の細胞から発生するため、宿主由来の蛋白を癌抗原とした免疫誘導が惹起されることが、本来の腫瘍免疫と同等の現象を反映する系である。
OVA 等の外来抗原を仮想癌抗原とするマウスの腫瘍モデルは、腫瘍免疫のメカニズムを解明するという役割においては有用であるが、宿主に存在しない異種の蛋白、すなわち異物を癌細胞に強制発現させているため、宿主から発生した癌よりも免疫反応が誘導されやすい可能性がある。以上より、ヒトの生体内で起こっている腫瘍免疫反応をより正確に再現する実験系として、宿主由来の自己抗原に対する癌ワクチンの動物モデルが必要であると考えた。腫瘍免疫を誘導する癌抗原として代表的なものに癌精巣抗原がある。癌精巣抗原
は精巣または卵巣といった生殖組織と癌組織のみで発現し、他の正常組織では発現していない蛋白であるため、癌ワクチンの標的抗原として有望視されている。ヒトでは NY-ESO-1や MAGE-A4 をはじめとして 40 種類以上癌精巣抗原が同定されているが、現在マウスではSsxa、Tsga10、Mage-b、OY-MS-4 などの数種類しか同定されていない。以上を踏まえた上で、マウス癌精巣抗原について解析を進めていたところ、その 1 つである Ssxa の発現解析結果が従来の報告と異なることが明らかとなった。そこで 3’-rapid amplification ofcDNA ends（3’-RACE）法を用いて Ssxa 遺伝子配列の再同定を行ってこれが従来報告されていた配列と異なることを明らかにした後に、新たに同定された配列の mRNA がマウス腫瘍細胞およびマウス精巣において特異的に発現していることを明らかにした。続いて、大腸菌の系を用いて産生させたリコンビナント Ssxa 蛋白を精製し、これを認識するポリクローナル抗体の作製を行った。最後に上記抗体を用いて Ssxa 蛋白の生物学的特徴について解析を行った。
【材料と方法】(1)Ssxa 塩基配列同定: BALB/c マウスの正常精巣から抽出した mRNA を材料に 3’-RACE 法を施行し、Ssxa cDNA を合成、DNA シーケンス解析にて Ssxa 遺伝子塩基配列の確認を行った。 (2)リコンビナント Ssxa 蛋白精製：GST 法にて大腸菌で産生された Ssxa 蛋白を精製した。 (3)抗 Ssxa ウサギポリクローナル抗体作製：Ssxa 蛋白の中で Kolaskar & Tongaonkar Antigenisity 法にて抗原性が一番高いと予測された C1 ペプチ
ド VTKSVLSDSDEVSS と今回同定された ExonX に相当する C2 ペプチド DKRKNPVVでウサギに免疫（200μg/週×6 回）し、ポリクローナル抗体を作製した。 (4)Ssxa 発現ベク タ ー の 構 築 ： 先 に 増 幅 さ せ た Ssxa cDNA を プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー で あ る
pcDNA3.1(+)_IRES_GFP (pGFP) に導入した。このベクターは導入した遺伝子と同時に

GFP 遺伝子も発現するベクターである。作製したベクターpcDNA3.1(+)_Ssxa_IRES_GFP(pSsxa)をコンピテント細胞 JM109 へ熱ショック法を用いて遺伝子導入して形質転換を行い、適切なプラスミドベクターが導入された JM109 株を採取してアンピシリン添加 LB 培地で培養した後 pSsxa を精製、DNA シーケンス解析で塩基配列を確認した。同様の方法でSsxa と GFP の融合蛋白である Ssxa-GFP と GFP-Ssxa を導入したプラスミドベクター
pcDNA3.1(+)_Ssxa-GFP (pSsxa-GFP)、pcDNA3.1(+)_GFP-Ssxa(pGFP-Ssxa)も作製した。
精製したプラスミドベクターを HEK293FT 細胞に遺伝子導入し、引き続いてウェスタンブロットおよび免疫組織染色を施行して Ssxa の生物学的特徴を解析した。
【結果】(1)Ssxa には従来報告されていた Exon5 の配列は存在せず、その 662 塩基下流に位置する新たな配列が Exon（ExonX）であることが判明した。Exon 5 では終止コドンが未同定であったのに対し、ExonX を含む Ssxa の cDNA 塩基配列では終止コドンを有しており、Ssxa 蛋白は 101 アミノ酸から成ることが示された。The general proprotein
convertase cleavage site predictor により Ssxa 蛋白は Lys78 と Ser79 の間で分解されることが予想された。Exon2 と ExonX との間で RT-PCR を施行したところ、精巣における SsxamRNA 発現を確認した。また BALB/c 8 週齢の脳・心臓・肺・肝臓・脾臓・腎臓・骨格筋においては Ssxa の発現は認めなかった。マウス癌細胞株である CT26, B16, EL4, LLC では Ssxa mRNA の発現を認め、線維芽細胞株である NIH/3T3 では Ssxa mRNA の発現を認めなかった。(2)GST 法によるリコンビナント Ssxa 蛋白精製後、SDS-PAGE および 銀染色を行うことによって、Ssxa 蛋白の分子量は 12kDa であることが判明した。(3)ポリクローナル抗体として mSSXA-C1 と mSSXA-C2 と 2 種類を作製したが、ウェスタンブロットの結果からリコンビナント Ssxa 蛋白を良好に認識するのは mSSXA-C2 であることが判明した。mSSXA-C2 を一次抗体として使用した免疫組織染色では、陰性対照と比較して明らかに濃染された組織は精巣のみであり、他の正常組織では陰性対照と同様の染色態度であった。(4)分子量の小さな Ssxa 蛋白を解析すること、および Ssxa 蛋白の細胞内における局在を調べることを目的として、Ssxa と GFP の融合蛋白を作製した。蛍光顕微鏡にて
pSsxa-GFP 導入細胞では GFP が細胞質に局在していたのに対し、pGFP-Ssxa 導入細胞では GFP は細胞質よりも細胞核に局在することが確認された。同様に抗 GFP 抗体を一次抗体として使用した免疫染色で pSsxa-GFP 導入細胞は細胞質のみが染色されていたのに対し、
pGFP-Ssxa 導入細胞は細胞質だけでなく細胞核も染色されていた。以上より、Ssxa は生体内で分解され、N 末端側分解産物は核に移行していることが示された。
【考察】(i)今回同定した配列の特徴は終止コドンを有するという点である。以前の報告と異なるが、今回同定した配列は確実に存在し、癌精巣抗原として矛盾しない発現パターンであった。(ii)マウス Ssxa のホモログであるヒト SSX は核に存在し、転写抑制因子として働いていると報告されている。Ssxa の N 末端側分解産物には核移行シグナルである KRABドメインが含まれており、Ssxa も分解されることで核移行し、転写に関与している可能性がある。
【結論】Ssxa の塩基配列を再確認し、完全なる蛋白コード配列を決定した。また、マウス
正常精巣と癌細胞株 4 種でその mRNA 発現を確認した。分子量 12kDa の Ssxa は細胞内で分解され、N 末端側分解産物は核移行することを示した。今後 Ssxa を用いた同種同系癌精巣抗原ペプチドワクチンモデルを構築することで最適な免疫プロトコールを模索し、その結果に基づいた強力な補助療法が臨床開発されることを期待する。